Analisis Mobilisasi Sel T CD4 + dan CD8 + pada Timus Ayam Pedaging Pasca Infeksi Salmonella typhimurium dan Pemberian Simplisia Polyscias obtusa
Swastika Pinca 1 , Muhammad Sasmito Djati 1 , Muhaimin Rifa’i 1
1 Laboratorium Fisiologi Hewan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Brawijaya, Malang
Swastika Pinca: swastika.pinca@gmail.com
M. Sasmito Djati: msdjati@ub.ac.id

## ABSTRAK
Penggunaan  antibiotik  dalam  pakan  sebagai  perlindungan  bagi  ternak  dari  penyakit  memiliki dampak negatif yakni adanya kandungan residu sehingga diperlukan adanya bahan substitusi antibiotik. Simplisia  daun  kedondong  laut  ( Polyscias  obtusa )  diduga  mengandung  senyawa  flavonoid  yang  diduga dapat  berperan  sebagai  agen  imunomodulator  dalam  sistem  imun  seluler.  Tujuan  dari  penelitian  ini adalah untuk  mengetahui  peran kandungan simplisia daun Polyscias obtusa dalam  pakan ayam  sebagai imunomodulator  pada  ayam  yang  telah  diinfeksi  bakteri Salmonella  typhimurium ,  ditinjau  dari  profil ekspresi  CD4 + ,  CD8 + dan  B220 + yang  dianalisis  melalui  Flowcytometri.  Tahapan  penelitian  meliputi  uji konfirmasi bakteri S.typhimurium , persiapan kultur bakteri dan simplisia daun P. obtusa , infeksi bakteri secara  oral  500  µl,  pembuatan  pakan  konversi  dengan  perlakuan  simplisia  dosis  1  (0.08%),  dosis  2 (0.16%) dan dosis 3 (0.26%), isolasi organ timus dan sel T-limfosit dan analisis flowcytometri. Hasil yang diperoleh  menunjukan  bahwa  jumlah  relatif  CD4 + ,  CD8 + dan  B220 + mengalami  peningkatan  pada perlakuan  pakan  pabrik+infeksi  bakteri Salmonella dan  perlakuan  penambahan  simplisia  dosis  2 (0.16%)  dengan  hasil  yang berbeda  nyata  berdasarkan  waktu  pemberian  pada  jumlah  relatif  sel  CD8 + . Hal  ini  membuktikan  bahwa  simplisia  daun P.  obtusa memiliki  kemampuan  dalam  memaksimalkan fungsi sistem imun.
Kata Kunci : Ayam Pedaging, Polyscias obtusa, Salmonella typhimurium, T-limfosit dan Timus

## ABSTRACT
Antibiotics  usually  use  to  protect  the  animals  from  pathogens,  but  antibiotics  have  a  residues which  have  negative  side  efect.  Antibiotics  can  substituted  with Polyscias  obtusa simplicia  because  this plant  contains  a  chemical  compound  called  Flavonoid  which  can  play  role  immune  system  as immunomodulator. This study aimed to determine the mobilization and development of CD4 + , CD8 + and B220 + T Cells lymphocytes from thymus of broiler that have been given additional feed Polyscias obtusa after  infected Salmonella  typhimurium and  determine  the  optimum  dose  of  the  addition  of  simplicia’s Polyscias obtusa which can influence the  mobilization of T  Cells lymphocyte  in  Thymus.  The procedure are  confirmation  of  the Salmonella  typhimurium isolates,  prepare  the  simplicia’s Polyscias  obtusa and Salmonella  typhimurium bacterial  culture,  orally  infections  in  500  µl,  prepare  supplemented  feeds  by three doses there are dose 1 (0.08%), dose 2 (0.16%) and dose 3 (0.26%), thymus and T Cells lymphocytes isolation and Flow Cytometry analysis. The results showed that feeding with antibiotical feed+ Salmonella infection and natural feed with additional Polyscias obtusa simplicia’s dose 2 (0.16%) have to incarase the relativity  amount  CD4 + ,  CD8 + and  B220 + T  Cells  lymphocytes  of  thymus  with  that  time  feeding  period have  significantly  differences  for  relativity  amount  of  CD8 + .  This  result  give  evidence Polyscias  obtusa simplicia’s have an ability and influence to increasing the body's immune system.
Keywords : Broiler, Polyscias obtusa, Salmonella typhimurium, T-Cells lymphocyte and Thymus

## PENDAHULUAN
Penggunaan antibiotik
Bacitracin,
kuramicin,  higramomicin,  kolistin,  kiamisin, spiramisin,  tiamulin,  virginiamisin,  aviamisin ,flavomisin  dan  tetrasiklin  biasa  ditambahkan kedalam dalam pakan sebagai perlindungan bagi ternak  dari  penyakit  [1].  Hal  tersebut  memiliki
dampak  negatif  yakni  adanya  kandungan  residu sehingga  diperlukan  adanya  bahan  substitusi antibiotik karena antibiotik kimiawi dalam pakan ayam dapat terakumulasi dalam tubuh dan dapat menyebabkan  resistensi  [2].  Simplisia  daun kedondong  laut  ( Polyscias  obtusa )  diduga mengandung  senyawa  flavonoid  yang  diduga
dapat  berperan  sebagai  agen  imunomodulator dalam sistem imun seluler.
Senyawa  dalam P. obtusa diduga  memiliki kemampuan  sebagai  imunomodulator  karena berdasarkan  hasil  fitokimia  sebagian  besar tanaman Polyscias mengandung  flavonoid  yang berupa senyawa steroid dan glikosida triterpenoid. Senyawa flavonoid dikenal berperan sebagai agen imunomodulator, antiviral dan antioksidan [3]. Kandungan flavonoid dalam daun  kedondong  laut  diharapkan  dapat  menjadi induksi  bagi  produksi  sel  imunnomodulator khususnya sel CD4 + dan CD8 + pada organ timus. Senyawa  flavonoid  diduga  mempunyai aktivitas  seperti  IFN-γ  yang  menginduksi  dan mengaktivasi  makrofag  dan  limfosit T.  Aktivasi makrofag  akan  mensekresi  sitokin  (IL-1,  IL-6, IL-12  dan  TNF-α)  dan  mengaktivasi  sel  T. Aktivasi  sel  T  tersebut  mensekresi  IFN-γ  yang menginhibisi  diferensiasi  produksi  antibodi  oleh sel  B.  Aktivitas  IFN-γ  yang  mampu  memediasi respon  imun  seluler  teraktivasi,  ketika  respon imun humoral ditekan produksinya [4]. Senyawa flavonoid  diduga  juga  dapat  memacu  proliferasi limfosit,  meningkatkan  jumlah  sel  T  dan meningkatkan aktivitas IL-2 [5].
Sistem  kekebalan  pada  unggas  terdiri  dari innate  immunity  (kekebalan  nonspesifik)  yakni heterophils, sel makrofag dan sel NK, sedangkan sistem  kekebalan  spesifik  terdiri  dari  dua kelompok  utama,  yaitu  kekebalan  humoral  dan Cell Mediated Immunity (CMI) [6]. Sistem imun ayam  dalam  penelitian  ini  ditantang  dengan infeksi  bkteri Salmonella  typhimurium yang merupakan bakteri penyebab penyakit pencernaan  pada  hewan  ternak.  Bakteri  ini bersifat  patogen,  tahapan  yakni  infeksinya meliputi  proses  perusakan  dinding  usus  dengan degramadasi epitel dan infeksi dinding usus yang dapat  menyebabkan  ganguan  metabolism  dan pertumbuhan mikroflora [7].

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Kegiatan penelitian dilakukan pada Maret- September  2012  di  laboratorium  Mikrobiologi, Laboratorium  Fisiologi  Hewan,  Fakultas  MIPA, Jurusan  Biologi,  serta  Laboratorium  Lapang Sumber Sekar-DAU Fakultas Peternakan, Universitas Brawijaya, Malang.

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini antara lain adalah kandang, lampu, tempat pakan
dan  tempat  minum  ayam,  sekam,  tabung  reaksi, cawan  petri,  oose,  bunsen,  pipet  volume,  bola hisap,  Erlenmeyer,  mikropipet  dan blue  tip . sedangkan  bahan-bahan  yang  digunakan  antara lain adalah media XLD, KIA, LIA, NB, NA, cat gram  A,  B,  C  dan  D,  larutan  H 2 O 2 ,  aquades, pakan  pabrik  BR1,  ransum  (jagung  kuning,  DL Metionin,  tepung  ikan,  precampuran,  bungkil kopra,  bungkil  kedelai  dan  garam)  dan  air mineral.

## Uji Konfirmasi Uji Media XLD
Koloni  hasil  peremajaan  diinokulasikan pada  media  XLD  ( Xylose  Lysine  Deoxycholate ) dan  diinkubasi    selama  24  jam  37 0 C.  Koloni positif  pada  media  XLD  ditunjukkan  dengan koloni  berwarna  hitam,  diambil  dan  dilanjutkan pada uji selanjutnya.
Uji Katalase
Isolat  bakteri  murni  hasil  diletakkan  pada gelas obyek yang telah ditetesi dengan hidrogen peroksida  (H 2 O 2 )  3%  sebanyak  satu  tetes.  Uji positif  ditunjukkan  ketika  terdapat  gelembung gas pada hasil akhir.
Uji Pewarnaan Cat Gram
Koloni  positif    pada  XLD  diapus  diatas gelas objek steril, kemudian gelas objek difiksasi diatas  api  dan  ditetesi  cat  gram  A  ( Hucker's crystal  violet ),  cat  gram  B  ( Lugol'siodine ),  cat gram  C  (alkohol),  cat  gram  D  (safranin)  secara berurutan  masing-masing  selama  1  menit  dan dicuci  dengan  air  mengalir  kemudian  dibiarkan hingga  kering  dan  diamati  morfologinya.  Hasil menunjukan  bahwa  bakteri  bersifat  gram negative karena menunjukkan warna merah.

## Uji KIA LIA
Koloni  positif  diambil  dengan  jarum  enten dan  ditusukkan  pada  media  KIA  dan  LIA  slant dan  ditarik  garis  hingga  terbentuk  belahan  pada slant,  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37 0 C selama  24-48  jam  dan  diamati  perubahannya. Koloni  hitam  pada  media  menandakan  hasil positif.
Kurva Pertumbuhan
Kultur  bakteri  diambil  1  ose  kemudian ditumbuhkan  pada  media Nutrien  Broth 10  ml dan  diinkubasi  suhu  37 0 C  selama  24  jam.  6  ml kultur dan dicampur 54 ml media NB. Kemudian dilakukan  sampling  setiap  1  jam,  dengan mengambil  4  ml  dan  ditambah  500  µl  formalin
yang selanjutnya dihitung absorbansinya dengan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang 600nm  dan  diukur  jumlah  selnya  dengan haemocytometer.

## Kurva Standar
Suspensi  isolate  dikultur  dengan  media Nutrien  Broth dengan  perbandingan  konsentrasi berbeda (Pengenceran). Masing-masing suspensi dihitung absorbansinya dengan spektrofotometer pada  panjang  gelombang  600  nm  dan  diukur jumlah  selnya  dengan  haemocytometer.  Tabel  1 menunjukkan  Perbandingan  antara  media  steril dan kultur.
Tabel  1.  Perbandingan  stok  bakteri Salmonella typhimurium dengan media steril Perbandingan Stok kultur (ml) Media Steril (ml) 8:0 0 4 7:1 0,5 3,5 6:2 1 3 5:3 1,5 2,5 4:4 2 2 3:5 2,5 1,5 2:6 3 1 1:7 3,5 0,5 0:8 4 ml 0

## Pembuatan Pakan Konversi
Daun P. obtusa dicuci, dikering anginkan dan dihaluskan dengan blender kering, kemudian ditimbang untuk bahan tambahan pada pakan  konversi  sesuai  perlakuan  yakni  dosis  1 0,08%  dari  total  jumlah  pakan,  dosis  2  0,16% dan  dosis  3  sebanyak  0,26%  simplisia  dari  total jumlah  pakan.  Pembuatan  pakan  konversi dilakukan secara bertahap yakni dengan komposisi  pakan  dengan  persentase  paling rendah hingga paling tinggi.
Infeksi Oral Salmonella typhimurium Bakteri Salmonella  typhimurium dalam Nutrient  Broth disentrifuse  dengan  kecepatan 10.000  rpm  selama  10  menit  suhu  25 0 C.  Pellet yang  diperoleh  diresuspensi  dengan  larutan garam  fisiologis  NaCl  0,9%  yang  kemudian diambil sebanyak 500 µl dan dicekokkan secara oral (melewati mulut) pada pada ayam perlakuan infeksi.

## Isolasi Sel Limfosit
Isolasi  sel  limfosit  dilakukan  dalam  2 tahap yakni tahap starter yaitu pembedahan pada umur  17  hari  dan  tahap  finisher  yaitu
pembedahan  pada  umur  35  hari.  Timus  hasil isolasi  digerus  dengan  pangkal  spuit  diatas wire steril sebagai filter. Homogenat yang didapatkan dimasukkan kedalam tabung propilen 15 ml dan ditambahkan  PBS  yang  kemudian  disentrifugasi dengan  kecepatan  2500  rpm,  pada  suhu  4 0 C, selama  5  menit  hingga  didapatkan  pellet kemudian disentrifugasi kembali hingga didapatkan pellet yang merupakan sel limfosit.

## Analisis Flowcytometri
Sel-sel hasil isolasi dari organ timus  yang telah  ditambahkan  antibodi  Mouse  anti-CD4, Mouse anti-CD8 dan Mouse anti-B220 dikonjugasi  dengan  label  PE  untuk  CD8,  PerCP untuk  CD45  atau  B220,  dan  FITC  untuk  CD4. Sampel  tersebut  kemudian  ditambah  1  ml  PBS dan  ditempatkan  pada  kuvet  flowcytometer. Flowcytometer akan menghitung jumlah sel total serta  jumlah  sel  yang  terdeteksi  oleh  label antibody,  kemudian  hasil  yang  diperoleh  diolah dengan program BD cellquest Pro TM .

## Analisis Statistika
Analisis data dilakukan dnegan menggunakan  metode One Way ANOVA RAL- Faktorial pada program SPSS 16 for Windows.
Analisis  selanjutnya  dengan  menggunakan analisis  varian  ganda.  Apabila  diperoleh  hasil yang  signifikan  maka  dilakukan  uji  lanjut Duncan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis  Jumlah  Relatif  Sel  CD4 + dan  CD8 + pada  organ  Timus  Fase  Starter  dengan Flowcytometry
Hasil  jumlah  relatif  sel  CD4 + dan  CD8 + dengan analisa Flowcytometry tidak menunjukan perbedaan  yang  signifikan  dari  masing-masing perlakuan  pada  timus  hasil  pembedahan  fase starter.  Perlakuan  pemberian  pakan  pabrik (A1B1)  dan  pemberian  pakan  pabrik+infeksi S.typhimurium (A2B1)  menunjukkan  jumlah relatif  sel  CD8 + yang  lebih  tinggi  dari  jumlah CD4 + yakni sebesar 0,31% dan 0,5%. Perlakuan pemberian  pakan  konversi  dosis  1,  dosis  2  dan dosis  3  (A3B1,  A4B1  dan  A5B1)  juga menunjukkan jumlah sel CD8 + yang lebih tinggi dari  jumlah  CD4 + secara  berturut-turut  yakni 0,6%, 0,7% dan 0,5% .
100 101 102 103 104 CD4 FITC Data.064 Gambar 1. Profil Jumlah Relatif Sel CD4 + dan CD8 + Fase Starter
Analisis  Jumlah  Relatif  Sel  CD4 + dan  CD8 + pada  organ  Timus  Fase  Finisher  dengan Flowcytometry
Hasil  jumlah  relatif  sel  CD4 + dan  CD8 + dengan  analisa  Flowcytometry  menunjukan bahwa  jumlah  relatif  sel  limfosit  dari  masing- masing  perlakuan  pada  timus  hasil  pembedahan fase  finisher  tidak  menunjukan  perbedaan  yang signifikan.  Jumlah  relatif  sel  CD8 + tertinggi terdapat  pada  perlakuan  kontrol  negatif  (A1B2) yakni dengan pemberian pakan pabrik saja yaitu sebesar 1,6%, sedangkan jumlah relatif sel CD4 + tertinggi  terdapat  pada  perlakuan  pemberian pakan  konversi  dosis  2  (A4B2)  yaitu  sebesar 0,9%.
Gambar 2. Profil Jumlah Relatif Sel CD4 + dan CD8 +

## Fase Finisher
Hasil  jumlah  relatif  sel  limfosit  yang menunjukkan  perbedaan  yang  tidak  signifikan ini  diduga  karena  waktu  perlakuan  yang  masih dalam  tahap  adaptasi.  Respon  antibodi  pada hewan  muda  mungkin  hanya  terbatas  pada epitop antigen tertentu karena pada hewan muda respon  imunologiknya  masih  berada  pada tingkatan imunologis paling rendah [8].
Pemberian  antigen S.  typhimurium pada anak ayam umur 1–2 minggu hanya menimbulkan  respon  antibodi  yang  lemah. Kondisi  ini  mungkin  disebabkan  oleh  sifat hiporesponsif sel-sel pada system imunitas yang belum  berfungsi  secara  mature,  atau  diseminasi jaringan  limfoid  masih  sangat  muda  dan  fungsi pembentukan antibodi belum sempurna, sehingga  antibodi  yang  terbentuk  pada  anak ayam rendah [9].
Perbandingan  Rata-rata  Jumlah  Relatif  Sel CD4 + dan  CD8 + pada  organ  Timus  Fase Starter dan Finisher
Hasil yang didapatkan dari hasil perbandingan jumlah relatif sel CD4 + fase starter dan  finisher  menunjukkan  jumlah  yang  tidak signifikan.  Jumlah  rata-rata  tertinggi  baik  pada fase  starter  dan  finisher  didapatkan  pada perlakuan A2 yakni pemberian pakan pabrik dan infeksi S.typhimurium yaitu  0,81%  pada  fase starter dan 1,79% pada fase finisher.
Gambar 3. Rata-rata Jumlah Sel T CD4 + (%) fase
Starter dan Finisher   (p<0.05) Hasil yang didapatkan dari hasil perbandingan jumlah relatif sel CD8 + fase starter dan  finisher  juga  menunjukkan  jumlah  yang tidak  signifikan.  Jumlah  rata-rata  tertinggi  baik pada  fase  starter  dan  finisher  didapatkan  pada perlakuan A2 yakni pemberian pakan pabrik dan infeksi S.typhimurium yaitu  1,24%  pada  fase starter dan 2,56% pada fase finisher.
100 101 102 103 104 CD4-Height Data.081 100 101 102 103 104 CD4-Height Data.085 100 101 102 103 104 CD4-Height Data.082 100 101 102 103 104 CD4-Height Data.084 100 101 102 103 104 CD4 FITC Data.063 100 101 102 103 104 CD4 FITC Data.087 100 101 102 103 104 CD4 FITC Data.072 100 101 102 103 104 CD4 FITC Data.077 Pakan Pabrik P.Pabr ik+ S.typhi muri… Pakan dosis 1 (0,08% )+… Pakan dosis 2 (0,16% )+… Pakan dosis 3 (0,26% )+… Starter 0,66 0,81 0,64 0,74 0,88 Finisher 1,48 1,79 1,32 1,46 1,23 Persentas e J um la h … Rerata Jumlah Relatif CD4 + di Timus
Pakan Pabrik P.Pabr ik+ S.typhi muri… Pakan dosis 1 (0,08% )+… Pakan dosis 2 (0,16% )+… Pakan dosis 3 (0,26% )+… Starter 0,92 1,24 1,22 1,24 1,26 Finisher 1,45 2,56 1,84 1,85 1,84
Persentas e
J um la h … Rerata Jumlah Relatif CD8 + di …
P.Pabrik Dosis 2(0,16%)+ S.typhimurium 100 101 102 103 104 CD4-Height Data.077 P.Pabrik+ S.typhimurium Dosis 1(0,8%)+ S.typhimurium P.Pabrik P.Pabrik+ S.typhimurium Dosis 1(0,08%)+ S.typhimurium Dosis 2(0,16%)+ S.typhimurium Dosis 3(0,26%)+
S.typhimurium
Dosis 3(0,26%)+
S.typhimurium
Gambar 4. Rata-rata Jumlah Sel T CD8 + (%) fase Starter dan Finisher (p<0.05) Sifat  flavonoid  sebagai  imunomodulator dapat berubah menjadi imunosupressan terhadap rerata  indeks  daya  fagosit  makrofag,  ketika diberikan  dalam  dosis  yang  besar  dan  dalam jangka  waktu  yang  lama.  Hal  ini  diduga mempengaruhi  hasil  jumlah  relatif  CD8 + yang berbeda nyata (signifikan) antara fase starter dan finisher.  Perbandingan  jumlah  relatif  yang  tidak berbeda  nyata  pada  CD4 + diduga  diakibatkan adanya  produksi  hormon  kortisol  akibat  stres pada hewan coba (ayam), ketika jumlah hormon kortisol  naik  maka  dapat  menghambat  produksi IL-1 pada makrofag dan IL-2 pada sel T, hal ini mengakibatkan  respon  sel  T  terhadap  antigen menjadi berkurang dan menurunkan jumlah sel T dan sel B [10].
Perbandingan  jumlah  relatif  sel  CD8 + pada fase  starter  dan  finisher  setelah  dilakukan analisis  ANOVA  menunjukkan  hasil  yang berbeda  nyata  yakni  sebesar  0,001  pada  lama perlakuan  yang  dibedakan  menjadi  starter  dan finisher,  hal  ini  menunjukkan  bahwa  lamanya perlakuan  dapat  menimbulkan  hasil  yang berbeda nyata pada jumlah relatif sel CD8 + .
Tabel  2.  Hasil  Analisis  Ragam  ANOVA  Jumlah Relatif Sel T CD4 + pada Timus fase Starter dan Finisher (p<0.05)

## KESIMPULAN
hasil  yakni  tidak  terdapat  perbedaan  yang signifikan dari jumlah relatif sel limfosit ditinjau dari  profil  sel  CD4 + dan  CD8 + berdasarkan analisis flowcytometry. Perlakuan  yang  paling berperan  dalam  peningkatan  jumlah  sel  limfosit adalah  perlakuan  A2  yakni  perlakuan  dengan pemberian  pakan  pabrik  dengan  infeksi  bakteri Salmonella  typhimurium dan  dari  analisis ANOVA  diketahui  bahwa  pengaruh  lama perlakuan  menghasilkan  hasil  yang  berbeda nyata pada jumlah relatif sel CD8 + .
UCAPAN TERIMA KASIH
Bapak  Dr.  Ir.  Moch.Sasmito  Djati.,MS  dan Bapak  Muhaimin  Rifa’i.,PhD.Med.Sc  selaku dosen pembimbing. Bapak Widodo.,PhD., Med.Sc  selaku  dosen  penguji,  Ibu  Nanik  Utami dan  Bapak  Djatmiko  E.S.  selaku  kedua  orang tua,  Mbak  Dewi  Satwika,  Mbak  Septi  Utami, Andi Rizky, Mutya Farsely, Erin Kurnianingtyas selaku  partner  tim  penelitian,  S.  Fatiyatur Rahmah,  Roudotul  Jannah  dan  Bayu  Hendra sebagai sahabat yang selalu mendukung, Teman- teman  “BIO  2009”  serta semua  pihak  lain  yang turut  mendukung  kelancaran  penelitian,  serta Jurusan  Biologi,  FMIPA,  Universitas  Brawijaya Malang sebagai almamater tercinta

## DAFTAR PUSTAKA
[1] [1]Direktorat  Jenderal  Peternakan.  1991.
Ringkasan imbuhan pakan (Feed
Additive) untuk hewan. Edisi II.
Direktorat Jenderal Peternakan. Jakarta.
[2]  Zhang.  X,  Roland,  D.  A.  and  S.  K.  Roat. 1999. Effect of naturphos phytase supllementation  to  feed  on  performance and ileal digestibility of protein and amino acid of broiler. Poultry Sci.
[3] Francis, G., Zohar K., Harinder, P.S.M., dan Klaus  B.  2002.  The  biological  action  of flavonoids  in  animal  sistems.  British Journal of Nutrition Vol.88, 587–605.
[4]Takagi,  Y.,  Choi,  I.,  Yamashita,  T.,
Nakamura,  T.,  Suzuki,  I.,  hasegawa,  T.,
Oshima,  M.,  Gu,  Y.  2005.  Immune
Activation and Radioprotection by Propolis.  The  American  Journal  of Chinese Medicine. Vol 33 No. 3 231-240
[5]  Abbas  AK,  Litchman  AH,  Pober  JS.  1994. Cellular  Immunology  in:  Cellular  and molecular immunology, 2nd ed.
Philadelphia: WB. Saunders Company.
[6]  Schat,  K.A.  1994.  Cell-Mediated  Immune Effector  Functions  In  Chickens.  Poult. Sci. 73: 1077 – 1081.
[7]Lay  B.  W.  dan  Hastowo  S.  1992. Mikrobiologi. Rajawali Press: Jakarta.
[8] Thorns, C.J., I.M. Mc Laren And M.G. Sojka 1994. The Use Of Latex Agglutination To
Specifically Detect Salmonella Enteritidis. Int. J. Food Microbiol. 21: 47– 49.
[9] Jeurissen, S.H.M., E.M. Janse, G. Koch And G.F. Deboer. 1989. Post Natal Development Of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue In Chickens. Cell Tissue
Res. 258: 119 – 124.
[10] Mc Cance K.L. and J. Shelby. 1995. Stress and  Disease.  In  :  Pathophisiology.  The Biologic  Basis  in  Adult  and  Children, London.
[11]Rifa’i, M., Lee, YH (2011), CD4+CD25+FOXP3+ Regulatory T Cells In Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation, Jtrolis., 1 (2), 69-75.
[12] YH Lee, Y Ishida, M Rifa’i, Z Shi, K Isobe, H  Suzuki  .  2008.  Essential  role  of  CD8+ CD122+ regulatory T cells in the recovery from experimental
autoimmune encephalomyelitis. The Journal of
Immunology 180 (2), 825-832
[13]  M  Rifa’i,  Y  Kawamoto,  I  Nakashima,  H Suzuki  .  2004.  Essential  roles  of CD8+CD122+  regulatory  T  cells  in  the maintenance  of  T  cell  homeostasis.  The Journal of experimental medicine 200 (9), 1123-1134
[14]  Endharti  AT,  Rifa'i  M,  Shi  Z,  Fukuoka  Y, Nakahara  Cutting  edge:  CD8+CD122+ regulatory  T  cells  produce  IL-10  to suppress  IFN-gamma  production  and proliferation  of  CD8+  T  cells.  Journal  of immunology 175 (11), 7093-7097
[15] YH Lee, Y Ishida, M Rifa’i, Z Shi, K Isobe, H  Suzuki  .  2008.  Essential  role  of CD8+CD122+  regulatory  T  cells  in  the recovery  from  experimental  autoimmune encephalomyelitis. The Journal of
Immunology 180 (2), 825-832
[16]  M  Rifa’i,  Z  Shi,  SY  Zhang,  YH  Lee,  H Shiku,  K  Isobe,  H  Suzuki  .  2008. CD8+CD12+ regulatory T cells recognize activated  T  cells  via  conventional  MHC class I–αβTCR interaction and become IL- 10-producing  active  regulatory  cells. International immunology 20 (7), 937-947
[17]  Z  Shi,  Y  Okuno,  M Rifa'i,  AT  Endharti, K Akane, K Isobe, H Suzuki . 2009. Human CD8+CXCR3+  T  cells  have  the  same function as murine CD8+CD122+ Treg European  journal  of  immunology  39  (8),  2106-
2119
[18] Z Shi, M Rifa’i, YH Lee, H Shiku, K Isobe, H Suzuki. 2008. Importance of
CD80/CD86–CD28  interactions  in  the recognition of target cells by CD8+CD122+ regulatory T cells.
Immunology 124 (1), 121-128 [19] Rifai'i, M. 2010. Andrographolide
ameliorate rheumatoid arthritis by
promoting  the  development  of  regulatory T cells. Journal of Tropical Life Science 1
(1), pp. 5-8
[20]  YH  Lee,  M  Rifa'i.  2011.  CD4+CD25+
FOXP3+ Regulatory T Cells In Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation.  Journal  of  Tropical  Life Science 1 (2), 69-75