## PERUBAHAN KIMIA DAN MIKROBIOLOGI TEMPE BUSUK SELAMA FERMENTASI
Chemical and Microbiological Changes of Over Fermented Tempeh During Fermentation
- Vivi Nuraini 1) * , Irvia Resti Puyanda 1) , Widasari Atrilania Sri Kunciati 1) , Laurensia Atha Margareta 1)
1) Fakultas Teknologi dan Industri Pangan, Universitas Slamet Riyadi Surakarta Jalan Sumpah Pemuda No.18, Kadipiro, Kec. Banjarsari, Kota Surakarta, Jawa Tengah, Indonesia
* Korespondensi Penulis: nurainivivi@gmail.com

## … ABSTRACT
Tempeh  is  a  very  popular  food  because  it  is  delicious  and  has  good  nutritional  value.  Over- fermented  tempeh  is  used  as  a  seasoning  in  dishes  such  as lodeh and sambal  tumpang .  Thus,  it  is necessary to know the length of time tempeh fermentation is safe for consumption. The purpose of this study  was to  determine  the  chemical  and  microbiological  quality  of  over-fermented  tempeh  and  the effect of the packaging used. This study used a 2-factor factorial completely randomized design. The first factor is the storage time of tempeh (1, 3, 5, 7, and 9 days), and the second factor is the type of tempeh  packaging  (plastic,  teak  leaves,  and  banana  leaves).  The  results  of  the  water  content  test showed  that  the  tempeh  began  to  decay  in  storage  for  5  days.  Teak  leaf  packaging  has  the  lowest water  content  of  the  others.  Tempeh,  which  has  the  highest  protein  content  of  0.60  g/L,  is  tempeh packaged  in  teak  leaves  that  has  been  stored  for  3  days. Tempeh  stored  for  9  days  has  high  water content, exceeding the maximum SNI standard (SNI 3144:2015) by about 65%. Soluble protein levels increased  and  then  decreased  during  the  decomposition  process.  Free  fatty  acids  continued  to experience a decrease in storage for 9 days, which indicated that the process of decay had occurred. The highest free fatty acids were found after 3 days of storage in plastic packaging, which reached 6.2 mg NaOH/g, while tempeh packaged with teak on the third day still showed a lower value of 3.83 mg NaOH/g.  The  total  bacteria  test  showed  an  increasing  trend  from  the  first  day  to  the  ninth day  of storage. Tempeh was still suitable for consumption up to five days after being stored. After 5 days of storage,  tempeh  has  decreased  in  quality.  Teak  leaves  have  been  proven to  be  able  to  maintain  the quality of tempeh better than plastic packaging or banana leaf packaging.
Keywords : banana leaf, FFA (free fatty acid), teak leaf, tempeh

## PENDAHULUAN
Tempe  merupakan  salah  satu makanan  favorit  di  Indonesia.  Secara nasional,  konsumsi  kedelai  total  yang terdapat  pada  makanan  jadi  seperti  tahu, tempe,  dan  kecap  mengalami  peningkatan selama  tahun  2015-2019,  dengan  rata-rata pertumbuhan  sebesar  0,72%  (Sabarella et al. ,  2020).      Peningkatan  konsumsi  tempe dipengaruhi oleh harga tempe yang murah
tetapi  kualitas  gizinya  baik.  Proses fermentasi  menyebabkan  tempe  memiliki beberapa keunggulan dibandingkan kacang  kedelai.  Tempe  memiliki  enzim fitase  yang  berperan  mendegradasi  asam fitat  pada  kedelai  karena  peran  kapang (Perdani  &  Utama,  2020).  Selain  itu, kapang  yang  tumbuh  pada  tempe  mampu menghasilkan enzim protease untuk
menguraikan  protein  menjadi  peptida  dan asam amino bebas (Astawan, 2008).
Selain tempe segar, masyarakat  juga gemar mengonsumsi tempe yang difermentasi  melebihi  waktu  biasa  yang sering  disebut  tempe  busuk.  Tempe terfermentasi lanjut dikenal oleh masyarakat  dengan  nama  tempe  busuk. Tempe  busuk  ( over  fermented )  juga diketahui memiliki manfaat untuk kesehatan  karena  memiliki  kandungan isoflavon  yang  tinggi.    Soetjipto et  al . (2018)  melakukan  penelitian  dengan mengisolasi  gistein  yang  merupakan  salah satu  bagian  dari  isoflavon  dari  sumber tempe  busuk  menghasilkan  kandungan gistein  dalam  serat  kasar  dan  dalam  isolat berturut-turut  4737,50  dan  31,36  g/g ekstrak.
Tempe busuk diminati karena memiliki rasa dan aroma spesifik “semangit”. Rasa unik “semangit” ini bagi sebagian  orang  menjadikan  cita  rasa makanan  menjadi  lebih  lezat.  Tempe busuk  banyak  digunakan  untuk  berbagai masakan  seperti  sayur  lodeh,  sayur tumpang,  gudeg,  bothok,  dan  sambal (Rachmawati et al. , 2019).
Tempe  busuk  diperoleh  dengan  cara menyimpan  tempe  lebih  lama  agar  proses fermentasi  tetap  berjalan.  Lemak  pada tempe  mengalami  peningkatan  derajat ketidakjenuhan  karena  adanya  proses fermentasi.  Terjadi  peningkatan  asam lemak  tidak  jenuh  majemuk  pada  tempe sehingga  hal  tersebut  memberikan  efek baik  untuk  kesehatan  karena  dapat menurunkan  kandungan  kolesterol  serum dan  menetralkan  efek  negatif  sterol  dalam tubuh  (BSN,  2012).  Menurut  Deliani (2008),  lama  fermentasi  tempe  yang semakin meningkat juga akan meningkatkan  jenis  asam  lemak  yang
dihasilkan dari proses pertumbuhan bakteri asam laktat (BAL) selama proses fermentasi. Akan tetapi fermentasi berkepanjangan  juga  akan  memberikan efek negatif. Tempe segar hanya memiliki umur  simpan  selama  2  hari  dalam  suhu ruang, meskipun pada penyimpanan 3 dan 4  hari  masih  memenuhi  standar  SNI 3144:2015 tetapi  setelah  melewati  2  ×  24 jam kapang akan mati sehingga yang akan tumbuh  adalah  bakteri  perombak  protein. Oleh karena itu, maka tempe akan menjadi mudah  busuk.  Tempe  busuk  masih  bisa dikonsumsi, akan tetapi  nilai gizinya telah banyak  berkurang.  Batas  waktu  aman untuk  mengonsumsi  tempe  busuk  belum diketahui sehingga perlu dilakukan penelitian terkait apa saja perubahan kimia dan mikrobiologi tempe selama fermentasi hingga fermentasi berlebih. Tujuan penelitian  adalah  mengetahui  perubahan kimia  dan  perubahan  mikrobiologi  tempe busuk  selama  proses  fermentasi  berlanjut. Informasi  yang  diperoleh  akan  dapat digunakan  untuk  menentukan  batasan waktu  tempe  aman  dikonsumsi  dan  masih memiliki  nilai  gizi.  Selain  itu,  penelitian juga bertujuan untuk mendapatkan perlakuan  kemasan  dan  lama  fermentasi terbaik.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk penelitian terdiri dari alat untuk pembuatan  tempe  dan  untuk  analisis.  Alat untuk pembuatan tempe antara lain ember, panci  pengukus,  tampah,  dan  pengaduk. Peralatan  untuk  penyimpanan  berupa inkubator  (Memmert).  Alat  analisis  terdiri atas  oven  (Memmert),  desikator  (Duran),
labu  soxhlet  (Iwaki),  krus  porselen, sedok/spatula,  waterbath,  gelas  beker  100 mL,  erlenmeyer  100  mL,  tabung  reaksi, pipet  ukur  1  mL,  pipet  ukur  10  mL, mortar, kuvet, spektrofotometer (Shimadzu), timbangan analitik (Shimadzu AUX320),  labu  takar  100  mL,  kertas saring,  cawan  petri,  jarum  ose,  dan  alat moisture analyzer (Shimadzu MOC6-3U).
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini terdiri dari bahan pembuatan tempe  dan  bahan  untuk  analisis.  Bahan untuk pembuatan tempe meliputi ragi tape (merk  Raprima),  kedelai,  daun  jati,  daun pisang.  Bahan-bahan  yang  digunakan untuk  analisis  yaitu  NaOH  (Merck), larutan  Nelson,  arsenomolibdat,  akuades, pelarut  eter,  indikator  PP,  alkohol  netral, media nutrien agar (Merck), larutan garam fisiologis, dan NaCl (Merck).

## Tahapan Penelitian
Penelitian
dimulai dengan pembuatan  tempe  yang  dikemas  dengan tiga  jenis  kemasan  yaitu  daun  jati,  daun pisang, dan plastik. Pengamatan dilakukan saat proses fermentasi hari ke-0, hari ke-1, hari ke-3, hari ke-5, dan hari ke-7.
Proses  Pembuatan  Tempe  Tradisional (Alvina & Hamdani, 2019 dengan

## Modifikasi)
Kedelai dibersihkan dari benda asing seperti batu dan kotoran lainnya kemudian dicuci  dengan  air  mengalir.    Selanjutnya menuangkan air mendidih sehingga semua biji  kedelai  terendam  (selama  12  jam). Kedelai  dicuci  dengan  air  dingin  dan dilakukan  penghilangan  kulit  ari  sampai bersih. Kedelai yang sudah bersih dikukus selama  30  menit.  Kemudian  diangkat, ditiriskan,  dan  ditebarkan  dalam  tampah yang  bersih  dan  kering.  Kedelai  tersebut
lalu  dikipasi  sampai  suhu  kedelai  dingin (sekitar 30 o C). Tahapan selanjutnya adalah menaburkan ragi tape ( Rhizopus oligosporus )  sesuai  kebutuhan  yaitu  10 g/kg  kedelai.  Kedelai  yang  sudah  diberi ragi  kemudian  ditimbang  sebanyak  39  g lalu  dikemas  dengan  pembukus  daun  jati, daun pisang,  dan plastik. Tempe disimpan hingga  hari  ke-9,  pengamatan  dilakukan setiap 2 hari sekali.

## Rancangan Percobaan
Penelitian  menggunakan  rancangan acak  lengkap  (RAL)  faktorial,  faktor pertama  adalah  jenis  kemasan  tempe  dan faktor kedua adalah lama waktu fermentasi ( Tabel  1 ).  Penelitian  dilakukan  dengan menyimpan  tempe  dari  tiga  macam kemasan  (daun  pisang,  daun  jati,  dan plastik).  Ketiga  tempe  diinkubasi  pada suhu  ruang  selama  9  hari.  Tempe  diamati pada hari ke-1, 3, 5, 7, dan 9.
Tabel 1 .  Rancangan percobaan
Perlakuan penyimpanan Hari ke- Kemasan daun jati (A1) Kemasan daun pisang (A2) Kemasan plastik (A3) 1 (B1) A1B1 A2B1 A3B1 3 (B2) A1B2 A2B2 A3B2 5 (B3) A1B3 A2B3 A3B3 7 (B4) A1B4 A2B4 A3B4 9 (B5) A1B5 A2B5 A3B5

## Metode Analisis
Pengujian kimiawi dan
mikrobiologi  dilakukan  pada  tempe busuk  selama  penyimpanan.  Pengujian kimia meliputi kadar air metode thermogravimetri (AOAC, 1995),
pengujian  pH  menggunakan  pH  meter, protein  terlarut  (AOAC,  1995),  dan pengujian  angka  asam  (BSN,  1998).  Uji

## Perubahan Kimia dan Mikrobiologi Tempe Busuk ….. Jurnal Agroteknologi Vol. 15 No. 02 (2021)
mikrobiologi  pada  tempe over  fermented (busuk)  yaitu  uji  total  bakteri  metode (BSN,  2008;  Cempaka et  al., 2020 dengan modifikasi).

## Uji Protein Terlarut  (AOAC, 1995)
Sampel  tempe  ditimbang  sebanyak 0,5  g  kemudian  dilarutkan  menggunakan akuades  hingga  100  mL.  Selanjutnya suspensi  disaring  menggunakan  kertas saring.  Filtrat  diambil  1  mL  dan direaksikan  dengan  1  mL  larutan Lowry D yaitu Lowry A:B:C (20:1:1). Kemudian dihomogenisasi.  Setelah  itu,  larutan diinkubasi  selama  15  menit  pada  suhu ruang. Setelah dilakukan inkubasi, larutan direaksikan  dengan  3  mL  larutan  Folin Ciau-Calteau  2  N  ( Lowry E)  dan dihomogenisasi. Kemudian larutan tersebut  didiamkan  selama  45  menit. Selanjutnya,  larutan  campuran  ditera menggunakan  spektrofotometer  dengan panjang  gelombang  750  nm.  Kadar protein  terlarut  diketahui  dari  nilai absorbansi  yang  diplotting  pada  kurva standar.
Kurva standar dibuat menggunakan protein standar BSA ( bovine serum albumin ) dengan konsentrasi 0 μm/mL hingga 300 μm/mL dan  ditera  dengan  panjang  gelombang 750  nm.  Hasil  kurva  standar  kemudian diplot  hingga  mendapat  persamaan  garis lurus  y=  ax  +  b,  sehingga  diperoleh  nilai x (kadar protein) melalui rumus:
𝑋 = 𝑦−𝑏 𝑎 Keterangan:
x
= kadar protein y
= hasil pembacaan spektrofotometer UV-Vis
a dan b  = konstanta yang diperoleh dari persamaan garis lurus kurva standar
Uji  Angka  Asam  (BSN,  1998  dengan Modifikasi)
Tempe  busuk  ( over  fermented ) ditimbang  sebanyak  28,2±0,2  g  dan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 250 mL. 50 mL alkohol netral panas dan 2 mL indikator  fenolftalein  (PP)  dimasukkan  ke dalam  sampel,  lalu  dititrasi  menggunakan NaOH  0,100  N  sampai  terjadi  perubahan warna  dari  tidak  berwarna  menjadi  merah jambu  (tidak  hilang  selama  30  detik). Asam  lemak  bebas  dinyatakan  dalam persen.    Perhitungan    angka  asam  adalah sebagai berikut:
Angka asam (%) =
V NaOH (mL)× N NAOH × BM As Lemak
Bobot sampel (g) ×  100% Keterangan: V = volume N = normalitas
BM = berat molekul

## Pengujian Total Bakteri
Pengujian  total  bakteri  dimulai dengan  pembuatan  media  NA.  NA ( nutrient agar ) sebanyak 39 g dicampurkan  dalam  1000  mL  akuades kemudian  dihomogenkan  menggunakan magnetic  stirrer hingga  mendidih.  Media tersebut  disterilisasi  dengan  menggunakan autoklaf  pada  suhu  121 o C  selama  15 menit.
Pada  pengujian  total  bakteri  (angka lempeng  total),  25  g  sampel  dimasukkan dalam  225  mL  larutan  garam  fisiologis sehingga  diperoleh  pengenceran  10 -1 .  1 mL  suspensi  dipipet  dan  dimasukkan

## Perubahan Kimia dan Mikrobiologi Tempe Busuk ….. Jurnal Agroteknologi Vol. 15 No. 02 (2021)
dalam  9  mL  larutan  garam  fisiologis sehingga  diperoleh  pengenceran  10 -2 .  Hal ini  dilakukan  sampai  pengenceran  10 -5 . Seri pengenceran yang di- plating yaitu 10 - 2 ,  10 -3 ,  10 -4 ,  dan  10 -5 .  Masing-masing pengenceran  tersebut  dipipet  sebanyak  1 mL  ke  dalam  cawan  petri  yang  telah disterilkan.  Selanjutnya,  NA  dituangkan sebanyak  15-20  mL.  Cawan  petri  yang telah berisi medium dan sampel, dihomogenkan
dengan cara menggoyangkan cawan petri secara perlahan  membentuk  angka  delapan,  ke atas-bawah,  dan  ke  samping  kiri-kanan. Selanjutnya  ditunggu  hingga  memadat. Media NA + sampel diinkubasi pada suhu 30 o C  selama  48  jam  dengan  posisi terbalik.  Setelah  24  jam,  masing-masing cawan  petri  diamati  dan  dihitung  seluruh mikroba yang tumbuh. Perhitungan jumlah bakteri  sesuai  dengan  SNI  2897:2008 (BSN,  2008)  dengan  modifikasi.  Jumlah bakteri  yang  dihasilkan  dalam  satuan CFU/g  kemudian  disajikan  dalam  bentuk log 10 CFU/g.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar  Air  Tempe  Busuk  Selama Penyimpanan
Kadar  air  merupakan  salah  satu parameter  yang  dapat  digunakan  untuk mengetahui  kualitas  bahan  pangan.  (BSN, 2015) mensyaratkan tempe memiliki kadar air maksimal 65% (SNI 3144:2015). Tabel
2 menunjukkan hasil pengamatan kadar air tempe  yang  dibungkus  dengan  3  kemasan berbeda,  dan  waktu  fermentasi  yang berbeda.  Kadar  air  paling  tinggi  diperoleh pada  tempe  yang  disimpan  dihari  ke-9 dengan  kemasan  plastik.  Pada  hari  ke-9 tempe yang dikemas menggunakan kemasan  plastik    memiliki  kadar  air  yang
paling  tinggi  diantara  2  kemasan  yang lainnya.  Kadar  air  dalam  suatu  bahan pengemas  makanan  berkaitan  dengan  laju transmisi uap air. Hal tersebut dikarenakan kemasan  plastik  lebih  kedap  udara meskipun  sudah  dilubangi  tapi  jika dibandingkan  kemasan  daun  pisang  dan kemasan  daun  jati,  daun  memiliki  pori- pori  yang  lebih  banyak  di  sepanjang bagian.
Tabel  2 menunjukkan  kadar  air cenderung meningkat dari hari ke-1 hingga hari  ke-9,  akan  tetapi  di  hari  ke-7 mengalami  penurunan  pada perlakuan kemasan  daun  jati.  Hari  ke-1  kadar  air kemasan daun jati  mencapai  44,80±0,28% kemudian mengalami kenaikan dan kembali  menurun  pada  hari  ke-7  yaitu 49,01±1,44%, lalu kembali naik di hari ke- 9  mencapai  67,13±0,06%.  Kemasan  daun jati  memiliki  kadar  air  yang  fluktuatif dibandingkan dengan kedua kemasan yang lainnya  (plastik  dan  daun  pisang).  Setelah hari  ke-7  kadar  air  mengalami  kenaikan dan  mencapai  nilai  tertinggi  di  hari  ke-9. Hari  ke-9  kadar  air  tempe  sudah  melebihi dari  nilai  SNI  3144:2015  (BSN,  2015) yaitu  maksimal  65%  yaitu  67,13±0,06
(perlakuan kemasan daun jati),
67,81±0,01%  (kemasan  plastik),  dan 66,73±0,07%  (kemasan  daun  pisang).
Kadar  air  memiliki  hubungan  erat  dengan proses  pembusukan,  kadar  air  yang  tinggi akan  mempercepat  proses  pembusukan dan memungkinkan adanya bakteri patogen. Kadar air dalam tempe dipengaruhi  oleh  jenis  kemasan  tempe yang  digunakan.  Pada  kadar  air  tertentu pertumbuhan  kapang  terhenti  dan  terjadi perubahan flavor karena  degradasi  protein lanjut sehingga terbentuk ammonia (Suhartanti, 2010).

## Perubahan Kimia dan Mikrobiologi Tempe Busuk ….. Jurnal Agroteknologi Vol. 15 No. 02 (2021)
Kadar  Protein  Terlarut  dan  Nilai  pH Tempe Busuk Selama Penyimpanan
Protein terlarut
merupakan banyaknya asam-asam  amino  yang mudah diserap  oleh  sistem  pencernaan sehingga menjadi  parameter  kualitas  tempe.  Tempe memiliki  kelebihan  dibandingkan  bahan pangan  lain  karena  mengandung  protein yang mudah dicerna karena adanya proses fermentasi.  Aktivitas  enzimatis  dalam proses fermentasi pada tempe menyebabkan terjadinya  protein  kompleks dipecah  menjadi  protein  yang  lebih sederhana dengan cara memutuskan ikatan-ikatan peptida dalam protein.
Pemutusan  tersebut  menyebabkan  protein bersifat  mudah  larut  sehingga  kadar protein terlarutnya meningkat.
Tabel  2 menunjukkan  nilai  protein terlarut  terhadap  tempe  yang  dikemas dengan 3 perlakuan kemasan dan disimpan
pada lama waktu fermentasi yang berbeda. Tempe  yang  memiliki  kadar  protein tertinggi  adalah  tempe  yang  disimpan  di hari  ke-3  yaitu  0,60  mg/L dengan pengemas  daun  jati.  Sementara  itu,  kadar protein  terendah  pada  hari  ke-9  dengan pengemas plastik. Protein terlarut mengalami  kenaikan  kemudian  kembali menurun  seiring  proses  pembusukan. Razie & Widawati (2018) telah melakukan penelitian  untuk  memperpanjang  kemasan tempe dengan menggunakan plastik vakum  kemasan  sekunder  plastik  PP  0,06 mm maksimal bertahan 4 hari. Setelah hari ke-4,  tempe  mengalami  kerusakan  dan penurunan kadar protein yang signifikan.
Protein  terlarut  meningkat  hingga hari  ke-3  kemudian  menurun  mulai  hari kelima. Protein terlarut pada penyimpanan hari  pertama  tertinggi  adalah  kemasan daun  jati    yaitu  sebesar  0,51±0,01  mg/L,
Tabel  2 .  Kadar  air,  protein  terlarut,  asam  lemak  bebas,  dan  log  ALT  (angka  lempeng  total)  tempe  yang dikemas dalam berbagai kemasan dan berbagai waktu penyimpanan Hari ke- Kemasan Kadar air (%) Protein terlarut (mg/L) Asam lemak bebas (mgNaOH/g) Log total bakteri (log 10 CFU/g) 1 Plastik 48,95 ± 0,24 d 0,45 ± 0,06 e 1,21 ± 0,04 a 2,43 ± 0,04 h Pisang 45,98 ± 0,29 c 0,38 ± 0,02 d 1,58 ± 0,01 b 1,76 ± 0,03 bc Jati 44,80 ± 0,28 b 0,51 ± 0,01 f 2,12 ± 0,12 d 1,68 ± 0,02 a 3 Plastik 55,02 ± 0,01 e 0,35 ± 0,01 d 6,25 ± 0,02 k 2,48 ± 0,001 i Pisang 56,24 ± 0,37 f 0,46 ± 0,02 e 5,02 ± 0,01 j 2,21 ± 0,03 g Jati 39,99 ± 0,02 a 0,60 ± 0,03 g 3,86 ± 0,04 h 1,84 ± 0,01 d 5 Plastik 63,09 ± 0,1 ij 0,22 ± 0,00 bc 3,96 ± 0,03 hi 2,44 ± 0,03 hi Pisang 62,68 ± 0,71 hi 0,61 ± 0,00 g 3,98 ± 0,04 i 1,93± 0,01 e Jati 64,00 ± 0,01 j 0,18 ± 0,00 ab 4,41 ± 0,02 j 1,78 ± 0,01 c 7 Plastik 62,03 ± 0,35 h 0,22 ± 0,00 bc 4,01 ± 0,1 i 3,23 ± 0,01 j Pisang 60,51 ± 0,32 g 0,61 ± 0,01 g 3,99 ± 0,06 i 2,79 ± 0,01 l Jati 49,01 ±  1,44 c 0,18 ± 0,00 ab 4,39 ±  0,02 i 1,73 ± 0,02 b 9 Plastik 67,81 ± 0,08 m 0,17 ± 0,00 a 2,00 ± 0,04 c 3,23 ± 0,01 l Pisang 66,73 ±  0,07 k 0,18 ± 0,00 ab 2,36 ± 0,02 e 2,83 ± 0,01 k Jati 67,13 ± 0,06 kl 0,25 ± 0,00 c 2,96 ± 0,01 f 2,15 ± 0,01 f
Keterangan: Huruf berbeda menunjukkan adanya beda nyata pada tingkat kepercayaan 95%

## Perubahan Kimia dan Mikrobiologi Tempe Busuk ….. Jurnal Agroteknologi Vol. 15 No. 02 (2021)
dan  terendah  adalah  kemasan  daun  pisang yaitu  0,38±0,02  mg/L.  Protein  terus meningkat  hingga  hari  ke-3  dan  mulai menurun  dari  ke-5  kecuali  pada  kemasan daun  pisang  yang  tetap  tinggi  sampai  hari ke-7  yaitu  0,61±0,01  mg/L.  Hari  ke-9 semua perlakuan kemasan menurun drastis dengan  nilai  terendah  adalah  kemasan plastik  yaitu  0,17±0,00  mg/L.  Kadar protein  terlarut  pada  tempe  dipengaruhi oleh  aktivitas  enzimatis,  semakin  tinggi aktivitas enzimatis yang terjadi, maka akan semakin  tinggi  kadar  protein  terlarut. Aktivitas  enzimatis  dipengaruhi  oleh beberapa  faktor,  antara  lain  adalah  suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, inhibitor, dan aktivator (Risnawati,  2013).  pH  merupakan  salah satu  faktor  yang  memengaruhi  kecepatan enzim  dalam  mengkatalisis  reaksi.  Lama fermentasi bioetanol memberikan pengaruh  signifikan  terhadap  nilai  pH. Lama  fermentasi  menyebabkan  produksi gas CO 2 juga semakin bertambah meskipun hasilnya tidak signifikan.
Peningkatan  produksi  gas  ternyata  juga diikuti dengan penurunan nilai pH (Azizah et  al. ,  2012).  Gas  CO 2 sering  disebut  gas asam  ( acid  whey )  karena  gas  CO 2 memiliki  sifat  asam.  Oleh  karena  itu  gas CO 2 juga  berkontribusi  terhadap  nilai  pH (Kartohardjono et al ., 2007).
Enzim  protease  optimal  pada  pH yang  cenderung  asam  yaitu  pH  4-7 (Fathimah  &  Wardani,  2014).  Hasil penelitian menunjukkan kisaran pH tempe 5-8.  pH  tempe  tidak  berpengaruh  secara signifikan  terhadap  kadar  protein  terlarut karena  cenderung  asam-netral.  Nilai  pH tertinggi mencapai 8 terjadi pada kemasan pisang pada hari ke-7 ( Gambar 1 ).
Gambar  1 .  Nilai  pH  tempe  yang  dikemas  dalam berbagai  kemasan:  plastik  ( ), pisang  ( ),  jati  ( )    dan berbagai waktu penyimpanan
Asam  Lemak  Bebas  Tempe Over Fermented Selama Penyimpanan Asam  lemak  bebas atau free  fatty acid (FFA)  adalah   asam  lemak   yang berada  sebagai   asam  bebas   tidak  terikat sebagai  trigliserida.  Asam  lemak  bebas dihasilkan  oleh  proses  hidrolisis  dan oksidasi. Terjadinya kenaikan kadar asam lemak bebas juga disebabkan oleh lamanya
penyimpanan. Selama
penyimpanan, minyak dan lemak mengalami  perubahan  fisiko-kimia  yang dapat  disebabkan  oleh  proses  hidrolisis maupun  oksidasi.  Pada  pembuatan  tempe, peningkatan asam lemak bebas disebabkan adanya  enzim  lipolitik  yang  dihasilkan oleh kapang Rhizopus sp. (Darawati et al ., 2016). Asam lemak bebas mulai meningkat  dari  hari  pertama  menuju  hari ke-3.  Hal  tersebut  menandakan  tahap pertumbuhan  cepat  sudah  dimulai.  Tempe menjadi  hangat  kerena  kenaikan  suhu, kemudian  miselia  sudah  mulai  tumbuh,
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 hari 1 Hari 3 Hari 5 Hari 7 Hari 9 pH Waktu penyimpanan

## Perubahan Kimia dan Mikrobiologi Tempe Busuk ….. Jurnal Agroteknologi Vol. 15 No. 02 (2021)
lebat,  dan  kompak  dihari  ke-3.  Akan tetapi, asam lemak bebas mulai turun pada hari  ke-5  yang  menandakan  bahwa  telah terjadi  fermentasi  lanjut  dan  sudah memasuki proses pembusukan (Sulistyowati et  al., 2004).  Kapang  sudah tidak  tumbuh  dan  kadar  air  semakin meningkat.  Asam  lemak  bebas  terus mengalami  proses  penurunan  hingga  hari ke-9  yang  menunjukkan  sudah  terjadinya proses  pembusukan.  Nilai  asam  lemak bebas  paling  tinggi  pada  perlakuan kemasan  plastik  hari  ke-3  yang  mencapai 6,2  mgNaOH/g,  sementara  tempe  yang dikemas  daun  jati  di  hari  ketiga  masih menunjukkan  nilai  rendah  yaitu  3,83 mgNaOH/g.  Zulfa  &  Kumalaningsih (2014) menyatakan bahwa ekstrak jaun jati memiliki antioksidan jenis karotenoid. Hal tersebut  menyebabkan  daun  jati  dapat menghambat  terbentuknya  asam  lemak bebas pada tempe, meskipun pada hari ke- 5  dan  ke-9  nilai  asam  lemak  bebas  pada kemasan  daun  jati  menjadi  tinggi  karena adanya proses pembusukan ( Tabel 2 ).
Setelah  melewati  hari  ke-3  menuju hari  ke-5  asam  lemak  bebas  mengalami penurunan.    Penurunan  asam  lemak  bebas kemungkinan  disebabkan  oleh  proses hidrolisis  yang  sudah  optimal.  Jika hidrolisis  dilanjutkan  lagi,  maka  asam lemak bebas akan diurai lebih lanjut dalam siklus  katabolisme  lemak  menghasilkan suatu  heksosa  sehingga  jumlah  asam lemak  bebas  akan  berkurang  (Su’i et  al. , 2010).
Total  Bakteri  Tempe Over  Fermented

## Selama Penyimpanan
Total  bakteri  menentukan  jumlah bakteri  dalam  suatu  sampel.  Dalam pengujian tersebut diketahui perkembangan  banyaknya  bakteri  dapat
dikontrol dengan mengatur jumlah sampel, dimana  total  bakteri  tergantung  atas formasi  bakteri  di  dalam  media  tempat tumbuhnya  dan  masing-masing  bakteri yang  dihasilkan  akan  membentuk  koloni yang  tunggal.  Perhitungan  total  bakteri dapat  dipergunakan  sebagai  indikator proses  higienis  sanitasi  produk,  analisis mikroba  lingkungan  pada  produk  jadi, indikator proses pengawasan, dan digunakan  sebagai  dasar  kecurigaan  dapat atau  tidak  diterimanya  suatu  produk berdasarkan kualitas mikrobiologinya.
Angka  total  bakteri  menunjukkan tren  yang  semakin  meningkat  dari  hari pertama  hingga  hari  ke-9,  nilai  total bakteri tertinggi pada hari ke-9.
Pemeriksaan total bakteri  dilakukan untuk menentukan  jumlah  bakteri  dalam  suatu sampel. Semakin tinggi angka total bakteri mengindikasikan adanya proses pembusukan. Tempe yang dikemas dengan plastik  memiliki  nilai  total  bakteri  paling tinggi  dibandingkan  dua  kemasan  yang lainnya,  sementara  kemasan  daun  jati memiliki  nilai  total  bakteri  paling  rendah.
Menurut    Alfiyah et  al. (2017),  daun  jati memiliki  ciri  berdaun  besar,  bulat  telur terbalik, berhadapan, dengan tangkai  yang sangat  pendek,  dan  memiliki  kandungan fitokimia  yang  sangat  tinggi  (Thoha  & Diana, 2010).
Berdasarkan  hasil  uji  fitokimia dalam  daun  jati  terdapat  flavonoid, alkaloid, tanin, napthaquinones, dan antrakuinon  yang  dapat  menghambat pertumbuhan bakteri atau sebagai antibakteri  (Purushotham et  al. ,  2010). Senyawa  aktif  dalam  daun  jati  ini  dapat digunakan untuk mengawetkan daging.
Kenaikan  total  bakteri  pesat  terjadi dari  hari  ke-1  menuju  hari  ke-3  pada semua  jenis  kemasan,  kemudian  menurun

## Perubahan Kimia dan Mikrobiologi Tempe Busuk ….. Jurnal Agroteknologi Vol. 15 No. 02 (2021)
di hari ke-7 pada kemasan daun pisang dan plastik ( Tabel 2 ). Hari ke-9 kembali naik dan  mencapai  nilai  total  bakteri  paling tinggi  salama  masa  fermentasi.  Pada  hari pertama menuju hari ke-3 terjadi kenaikan jumlah total bakteri. Hal tersebut dikarenakan  adanya  proses  fermentasi, proses fermentasi akan memberikan sumbangan  bakteri  dalam  perhitungan total  bakteri.  Kemudian,  nilai  total  bakteri menurun  di  hari  ke-5  saat  proses fermentasi sudah selesai  dan kembali  naik karena  adanya  proses  pembusukan.  Nilai total  bakteri  terus  naik  hingga  hari penyimpanan  ke-9.  Nilai  populasi  bakteri terendah  adalah  kemasan  daun  jati  pada penyimpanan  hari  ke-1  yaitu  1,68±0,02 log 10 CFU/g dan tertinggi kemasan plastik 3,23±0,01  log 10 CFU/g    pada  hari  ke-7.
Kemasan daun jati memiliki nilai populasi bakteri  paling  rendah  dibanding  dua kemasan  yang  lainnya  pada  penyimpanan hari  ke-9  yaitu  sebesar  2,15±0,01  log 10 CFU/g.

## KESIMPULAN
Tempe  busuk  ( over  fermented ) masih layak dikonsumsi hingga penyimpanan  hari  ke-5  dilihat  dari parameter  protein  terlarut,  jumlah  total bakteri  dan  nilai  asam  lemak  bebas. Perlakuan  terbaik  adalah  kemasan  daun jati yang masih baik dikonsumsi pada hari ke-5.  Tempe  busuk  ( over  fermented ) perlakuan  kemasan  daun  jati  dengan  lama penyimpanan hari ke-5  memiliki kadar air sebesar 64%, kadar protein terlarut sebesar 0,18%,  kadar  asam  lemak  bebas  sebesar
4,41  mgNaOH/g,  dan  log  total  bakteri sebesar 1,68 log 10 CFU/g.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  kami  ucapkan kepada  LPPM  Universitas  Slamet  Riyadi Surakarta yang telah memberikan dukungan  secara  moril  dan  material  pada Hibah  Penelitian  Universitas  tahun  2021 No: 037/S9/AK/2021.

## DAFTAR PUSTAKA
Alfiyah,  M.F.,  Budiretnani,  D.A.,  &  Solikin,
N.  (2017).  Uji  ekstrak  etanol  daun  jati ( Tectona grandis ) sebagai bahan pengawet  alami  daging  sapi. Prosiding Semnas Hayati IV , 94–102.
Alvina,  A.,  &  Hamdani,  D.  (2019).  Proses pembuatan  tempe  tradisional. Jurnal Pangan Halal , 1 (1), 1-4.
AOAC.  (1995). Offician  Methode  of  Analysis of The Association of Official Analytical Chemist .
Azizah,  N.,  Al-Baarri,  A.,  &  Mulyani,  S. (2012).  Pengaruh  lama  fermentasi terhadap  kadar  alkohol,  pH,  dan produksi  gas  pada  proses  fermentasi bioetanol  dari  whey  dengan  substitusi kulit  nanas. Jurnal  Aplikasi  Teknologi Pangan , 1 (2), 72–77.
BSN  (Badan  Standarisasi  Nasional).  (2015).
SNI 3144:2015 . Tempe Kedelai , 1–26.
BSN  (Badan  Standardisasi  Nasional).  (2008).
SNI  2897:2008.  Metode  pengujian cemaran  mikroba  dalam  daging,  telur dan  susu,  serta  hasil  olahannya. Badan Standardisasi Nasional , 1–32.
Cempaka, L., Widyana, M.A., & Astuti, R.M. (2020). Karakteristik sensori dan analisis  mikroba  tempe  segar  beraneka rasa. Jurnal  Ilmu  Pangan  dan  Hasil Pertanian , 4 (1), 43–59.
Darawati,  M.,  Riyadi,  H.,  Damayanthi,  E.,  & Kustiyah,  L.  (2016).  Pengembangan pangan fungsional berbasis pangan lokal sebagai  produk  sarapan  untuk  remaja

## Perubahan Kimia dan Mikrobiologi Tempe Busuk …..
Jurnal Agroteknologi Vol. 15 No. 02 (2021)
gemuk. Jurnal  Gizi  dan  Pangan , 11 (1),
43–50.
Fathimah,  A.N.,  &  Wardani,  A.K.  (2014). Ekstraksi dan karakterisasi enzim protease  dari  daun  kelor  ( Moringa oliefera Lamk.). Jurnal  Teknologi Pertanian , 15 (3), 191–200.
Kartohardjono,  S.,  Anggara,  Subihi,  & Yuliusman. (2007). Kontaktor membran serat  berongga  menggunakan  pelarut air. Makara Teknologi , 11 (2), 97–102.
Perdani,  A.W.,  &  Utama,  Z.  (2020).  Korelasi kadar  asam  fitat  dan  protein  terlarut tepung  tempe  kedelai  lokal  kuning ( Glycine max ) dan hitam ( Glycine soja ) selama fermentasi. Prosiding
Pendidikan  Teknik  Boga  Busana  FT
UNY , 15 .
Purushotham,  K.G.,  Arun,  P.,  Jayarani,  J.J., Vasnthakumari,  R.,  Sankar,  L.,  & Reddy, B.R. (2010). Synergistic in vitro antibacterial  activity  of Tectona grandis leaves with tetracycline.
International  Journal  of  PharmTech Research , 2 (1), 519–523.
Rachmawati, M.H., Soetjipto, H., &
Kristijanto, A.I.G.N. (2019). Profil asam lemak  minyak  tempe  busuk. Jurnal Kimia , 13 (1), 82–87.
Razie,  F.,  &  Widawati,  L.  (2018).  Kombinasi pengemasan  vakum  dan  ketebalan kemasan  untuk  memperpanjang  umur simpan  tempe. Agritepa:  Jurnal  Ilmu dan Teknologi Pertanian , 5 (1), 94-107.
Reddy,  N.R.  (2019).  Tempe. Legume-Based Fermented Foods , 95–40.
Risnawati,  M.  (2013).  Pengaruh  penambahan ion logam Ca 2+ terhadap aktivitas enzim papain (The addition effect of the metal ions  Ca 2+ on  the  papain  activities). UNESA Journal of Chemistry , 2 (1), 76- 83.
Sabarella, Komalasari, W.B., Seran, K., Saida, M.D.N.,  Manurung,  M.,  Sehusman, Rinawati,  &  Yani  Supriyati.  (2020). Buletin  Konsumsi  Pangan . Buletin Komsumsi , Volume 11 , 48. (http://epublikasi.setjen.pertanian.go.id/
epublikasi/buletin/konsumsi/2020/Buleti n_Konsumsi_Vol_11_No_I_2020/files/ assets/basic-html/page1.html).  [Diakses tanggal 16 September 2021].
Soetjipto,  H.,  Martono,  Y.,  &  Yuniarti,  Z.
(2018).  Isolasi  dan  analisis  genistein dari tempe busuk menggunakan metode kromatografi kolom.
Jurnal
Bioteknologi  &  Biosains  Indonesia (JBBI) , 5 (1), 88.
Su’i,  M.,  Harijono,  Yunianta,  &  Aulani’am.
(2010).  Hidrolysis  activity  of  lipase enzyme  from  coconut  houstorium  for coconut oil. Agritech , 30 (3), 164–167.
Suhartanti,  P.D.  (2010).  "Karakteristik  Fisik Biji Beberapa Varietas Kedelai ( Glycine max )  dan  Pengaruh  Lama  Fermentation Terhadap  Karakteristik  Kimia  Tempe".
Program Studi Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas  Sebelas  Maret  Surakarta, Surakarta.
Sulistyowati, E., Arianingrum, R., &
Salirawati,  D.  (2004).  "Studi  Pengaruh Lama Fermentasi Tempe Kedelai Terhadap  Aktivitas  Tripsin."  Laporan Penelitian.  Fakultas  Matematika  dan Ilmu  Pengetahuan  Alam  Universitas Negeri Yogyakarta, Yogyakarta.
Suroso,  A.S.  (2013).  Kualitas  minyak  goreng habis  pakai  ditinjau  dari  bilangan peroksida, bilangan asam, dan kadar air. Jurnal  Kefarmasian  Indonesia , 3 (2),
77–88.
Zulfa,  L.,  &  Kumalaningsih,  S.  (2014).
Ekstraksi  pewarna  alami  dari  daun  jati ( Tectona  grandis )  (kajian  konsentrasi asam  sitrat  dan  lama  ekstraksi)  dan analisa tekno-ekonomi
skala
laboratorium. Industria: Jurnal Teknologi dan Manajemen Agroindustri, 3 (1), 62-72.