## Skrining Bakteri Asam Laktat asal Susu Kambing Peranakan Etawa sebagai Penghasil Bakteriosin
Indah Nur Fitria 1) , Tri Ardyati 2)
1),2) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
1) indahnfitria@gmail.com dan 2) tri_ardyati@yahoo.com

## ABSTRAK
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan mikroorganisme yang  tergolong GRAS (Generally Recognized as  Safe).  Sebagian  besar    BAL  memiliki  potensi  sebagai  penghasil  bakteriosin.  Bakteriosin  merupakan senyawa  protein  yang  disintesis  oleh  ribosom  dan  mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri  lainnya. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memperoleh  BAL  penghasil  bakteriosin  dan  mempelajari  daya  hambat bakteriosin  terhadap  Staphylococcus  aureus  dan  Salmonella  thypimurium.  Penelitian  ini  menggunakan Rancangan  Acak  Kelompok  (RAK)  dengan  tiga  kali  ulangan.  Tahapan  dilakukan  dengan  isolasi  BAL  asal susu  kambing  Peranakan  Etawa  (PE)  pada  media  MRS  ditambah  dengan  CaCO 3 1%,  karakterisasi  isolat BAL, deteksi p enghambatan  kultur BAL terhadap bakteri uji , uji aktivitas penghambatan bakteriosin (CFS)  terhadap  bakteri  uji,  uji  sensitivitas  bakteriosin  terhadap  enzim  proteolitik,  serta  identifikasi  BAL dengan  menggunakan  API  50  CHL  test  kit.  Dua  belas  isolat  diperoleh  dari  isolasi,  namun  hanya  6  isolat (SKE5, SKE7, SKE8, SKE9, SKE10, dan SKE11) diduga mampu menghasilkan bakteriosin. Bakteriosin yang diproduksi oleh keenam isolat tersebut  dapat terdegradasi  oleh enzim  Proteinase K (1  mg/ml).  Isolat  SKE9 teridentifikasi sebagai Lactobacillus curvatus merupakan  kandidat isolat  BAL terbaik  karena menghasilkan bakteriosin  dan  menghambat  pertumbuhan  Staphylococcus  aureus  dan  Salmonella  thypimurium dengan indeks penghambatan masing-masing sebesar 2,94 ± 0,59 dan 2,89 ± 0,89.
Kata kunci : Bakteri asam laktat, Bakteriosin, Susu kambing Peranakan Etawa

## ABSTRACT
Lactic acid bacteria (LAB) are microorganisms include in group of generally recognized as safe. Most of LAB have potency as bacteriocin producers. Bacteriocin is ribosomally synthesized protein able to inhibit the  growth  of  other  bacteria.  The  aim  of  this  research  were  to  obtain  lactic  acid  bacteria  isolated  from crossbreed  Etawa  (PE)  goat’s  milk  able to  produce  bacteriocin  and  to  study  the  effect  of  bacteriocins  from LAB against Staphylococcus aureus and Salmonella thypimurium. The steps of the research were isolation of LAB using MRS medium containing 1% of CaCO 3 , characterization of LAB, detection the inhibition activity of  culture  against  pathogenic  bacteria,  assay  of  bacteriocin  (CFS)  against  Staphylococcus  aureus  and Salmonella  thypimurium,  assay  of  bacteriocin  sensitivity  to  proteolytic  enzyme,  and  identification  of  isolate using  API  50  CHL  test  kit.  Total  of  twelve  isolates  were  obtained,  however  only  6  isolates  (SKE5,  SKE7, SKE8, SKE9, SKE10, SKE11) were able to produce bacteriocin. All of bacteriocin produced were degraded by proteolytic enzymes, proteinase K (1mg/ml). Isolate SKE9 was identified as Lactobacillus curvatus, the best candidate of bacteriocin producer against Staphylococcus aureus and Salmonella thypimurium with inhibition index of 2.94 ± 0.59 dan 2.89 ± 0.89, respectively.
Keyword: Bacteriocin, Crossbreed Etawa goat’s milk, Lactic acid bacteria

## PENDAHULUAN
Susu  kambing  PE  merupakan  jenis  susu yang  mengandung  nutrisi  lengkap  sehingga merupakan media pertumbuhan yang ideal untuk
mikroorganisme  [1].    Salah  satu  kelompok utama  bakteri  yang  tumbuh  pada  susu  adalah bakteri  asam  laktat  (BAL).  Bakteri  asam  laktat merupakan  mikroorganisme  yang  tergolong sebagai  Generally  Recognized  as  Safe  (GRAS)
yang  menghasilkan  senyawa  antimikroba  antara lain  asam  organik,  diasetil  dan  bakteriosin. Senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh BAL dapat menghambat pertumbuhan bakteri pembusuk  makanan  dan  bakteri  patogen  [2]. Oleh karena itu, bakteri asam laktat telah banyak digunakan  untuk  memperpanjang  umur  simpan (shelf  life)  suatu  produk  atau  dijadikan  sebagai alternatif pengawetan makanan [3].
Oleh karena itu bakteriosin sangat penting bagi  pengembangan  industri  pangan.  Sehingga diperlukan  eksplorasi  bakteri  asam  laktat  yang mampu menghasilkan bakteriosin.

## METODE PENELITIAN

## Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam
Laktat  asal  susu  kambing  PE.  Susu  kambing PE diperoleh dari Balai Besar Inseminasi Buatan (BBIB)  –  Singosari.  Sebanyak  25  ml  sampel susu  kambing  PE  dimasukkan  ke  dalam  225  ml NaCl 0,85 % untuk memperoleh seri pengenceran 10 -1 . Pengenceran bertingkat dilakukan  hingga  10 -6 .  Bakteri  asam  laktat diisolasi  menggunakan  media  de  Man,  Rogosa and  Sharpe  agar  (MRS)  yang  mengandung  1% CaCO 3 dengan  metode  pour  plate.  Isolat  BAL yang tumbuh dicirikan oleh adanya zona bening dan dimurnikan hingga diperoleh koloni tunggal dan  ditumbuhkan  pada  media  MRS  agar  miring sebagai  stok  [4].  Isolat  BAL  dikarakterisasi dengan  pengamatan  morfologi  koloni,  uji katalase dan pewarnaan Gram.
Deteksi  Penghambatan  Kultur  BAL terhadap Staphylococcus aureus dan Salmonella  thypimurium.  Satu  ose  isolat  BAL yang  berumur  24  jam  diinokulasikan  dalam  10 ml  media  MRS  broth  diinkubasi  pada  suhu  37 °C  selama  24  jam.  Bakteri  Staphylococcus aureus dan Salmonella thypimurium dikulturkan pada  20  ml  media  NB  (Nutrient  Broth)  dan diinkubasi  pada  suhu  37  °C  hingga  mencapai densitas  sel  10 6 CFU/ml.  Pengujian  dilakukan dengan menggunakan metode agar well diffusion.    Masing-masing  kultur  bakteri  uji diinokulasikan secara spread plate sebanyak 100 µl  ke  dalam  cawan  petri  yang  mengandung media  NA  yang  telah  memadat  dan  dibiarkan hingga  mengering. Kultur isolat BAL kemudian
diinokulasikan ke dalam masing-masing sumuran  sebanyak  40  µl  [5].  Selanjutnya dilakukan  inkubasi  pada  suhu  37  ºC  selama  24 jam.
Pengujian Penghambatan (CFS) Bakteriosin  terhadap  Staphylococcus  aureus dan  Salmonella  thypimurium.  Persiapan  cell free  supernatant  (CFS)  dilakukan  dengan menumbuhkan  isolat  terpilih  dalam 10  ml MRS broth    dan  diinkubasi  pada  suhu  37  °C  selama 24 jam.  Sebanyak 5 ml dari hasil kultur tersebut diinokulasikan  ke  dalam  45  ml  MRS  broth  dan diinkubasi  pada  suhu  37  °C  selama  24  jam. Kultur  bakteri  yang  telah  berumur  48  jam disentrifugasi pada suhu  4 °C dengan kecepatan 10.000  rpm,  selama  15  menit.  Supernatan diambil dan diatur pHnya  dengan menggunakan NaOH  (1,0  M)  menjadi  pH  6,5.  Supernatan difiltrasi  dengan  menggunakan  membrane  filter steril yang berukuran 0,22 µm.
Sebanyak  100  µl  bakteri  uji  dengan densitas  10 6 CFU/ml  diinokulasikan  secara spread  plate  ke  dalam  media  NA  yang  telah memadat. Setelah hasil spread plate mengering, kultur  isolat  BAL  kemudian  diinokulasikan  ke dalam  masing-masing  sumuran  sebanyak  50  µl [5].  Biakan  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37 ºC selama 24 jam.
Sensitivitas Bakteriosin terhadap Enzim Proteolitik. Larutan Proteinase K dalam 20  mM  Tris  HCl  pH  7  konsentrasi  1  mg/ml digunakan sebagai enzim proteolitik. Supernatan bebas  sel  yang  telah  dinetralkan  dan  difiltrasi kemudian  dicampur dengan  enzim Proteinase K dengan  perbandingan  1:1  (v/v).  Campuran diinkubasi pada 37 °C selama 1 jam. Selanjutnya dilakukan  pemanasan  pada  suhu  100  ºC  selama 5  menit.  Pengujian  dilakukan  dengan  metode agar-well diffusion terhadap bakteri uji. Kontrol berupa  supernatan  bebas  sel  yang  tidak dilakukan penambahan enzim proteolitik [6].
Identifikasi  isolat  BAL  dengan  API  50 CHL test kit. Sebanyak dua ose isolat BAL yang telah berumur 84 jam diinokulasikan ke dalam 5 ml  aquades steril.  Selanjutnya suspense tersebut diinokulasikan  sebanyak  2  ml  ke  dalam  5  ml aquades  steril  hingga  kekeruhan  mencapai  2 McFarland.  Sebanyak  4  ml  larutan  pada
kekeruhan 2 McFarland diinokulasikan ke dalam ampul  yang  berisi  medium  API  50  CHL  dan dihomogenasi.
Isolat  BAL  yang  terdapat  pada  medium API  50  CHL  diambil  dengan  mikropipet  steril dan  diinokulasikan  ke  dalam  strip  yang  telah berisi  media  karbohidrat  kemudian  ditutup dengan  mineral  oil  sebanyak  dua  tetes  pada masing-masing  strip.  Selanjutnya  strip  media API  50  CHL  tersebut  diinkubasi  pada  37ºC selama  48  jam.  Pengamatan  dilakukan  dengan mencatat hasil uji positif atau negatif pada setiap strip.  Hasil  positif  ditandai  dengan  berubahnya warna  reagen  menjadi  berwarna  kuning  dan khusus  untuk  strip  nomor  25  berwarna  hitam. Hasil  negatif  ditandai  dengan  tidak  adanya perubahan  warna  pada  strip  (warna  biru keunguan).  Hasil  pengujian  dianalisis  dengan menggunakan API Web Software [7].

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebanyak  dua  belas  isolat  BAL  yaitu SKE1,  SKE2,  SKE3,  SKE4,  SKE5,  SKE6, SKE7,  SKE8,  SKE9,  SKE10,  SKE11,  dan SKE12  diperoleh  dari  hasil  isolasi.  Isolat tersebut  membentuk  zona  bening  pada  media MRS  agar  yang  mengandung  CaCO 3 1  %.
Semua  isolat  BAL  yang  diperoleh  merupakan Gram  positif  dan  katalase  negatif.  Isolat  SKE5 memiliki  kemiripan  dengan  Genus  Pediococcus karena  memiliki  bentuk  sel  tetrad  dan  memiliki koloni bewarna putih [8].
Gambar 1. Penghambatan kultur BAL asal susu
kambing PE terhadap Staphylococcus aureus dan Salmonella thypimurium
Tujuh isolat BAL memiliki penghambatan terhadap  Staphylococcus  aureus  dan  delapan isolat dapat menhambat pertumbuhan
Salmonella  thypimurium.  Nilai  penghambatan kultur  BAL  terhadap  bakteri  uji  tersebut  tidak berbeda  nyata  satu  sama  lain.  Kemampuan antimikroba  isolat  BAL  terhadap  bakteri  uji berbeda-beda, dikarenakan masing-masing isolat BAL  menghasilkan  metabolit  yang  berbeda- beda.      Perbedaan  metabolit  yang  dihasilkan dipengaruhi  oleh  tipe  metabolisme  BAL  [9]. Enam  isolat,  yaitu  SKE5,  SKE7,  SKE8,  SKE9, SKE10,  SKE11,  dan  SKE12  merupakan  isolat terpilih  karena  kultur  BAL  tersebut  mampu menghambat kedua bakteri uji (Gambar 1).
Nilai diameter zona bening pada penghambatan  bakteriosin  (CFS)  tidak  berbeda nyata, namun penghambatan tertinggi oleh isolat SKE5  (14,  34  ±  2,18  mm)  diikuti  oleh  isolat SKE9  dengan  diameter  sebesar  13,55  ±  4,09 mm.  Penghambatan  bakteriosin  (CFS)  terhadap Salmonella  thypimurium  terjadi  hanya  pada empat  isolat  yaitu  SKE7,  SKE8,  SKE9,  dan SKE10.  Diameter  tertinggi  oleh  SKE8  (15,44  ± 1,85 mm) tidak berbeda nyata dengan SKE9 dan SKE7 secara berturut-turut sebesar 11.66 ± 1.88 mm dan  12.77 ± 0.40 mm (Gambar 3).
Gambar  2.  Penghambatan  bakteriosin  (CFS)
isolat BAL
terhadap Staphylococcus  aureus  (a  dan  b) dan  Salmonella  thypimurium  (c dan d)
Nilai  indeks  penghambatan  bakteriosin
(CFS) terhadap Salmonella thypimurium
tertinggi  adalah  oleh  SKE8  sebesar  3,21  ±  0,26
B A A A A A A A B a b a a a a a a a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 SKE1 SKE2 SKE5 SKE7 SKE8 SKE9 SKE10 SKE11 SKE12 d ia m et e r zo n a b en in g ( m m ) jenis isolat S. aureus S. thypimurium c . d . a. b
dan  tidak  berbeda  secara  signifikan  terhadap SKE7  dan  SKE9.  Nilai  indeks  penghambatan terhadap Staphylococcus aureus oleh SKE5  dan SKE9  berturut-turut  adalah  sebesar  3,05  ±  0,31 dan  2,94  ±  0,59.  Indeks  penghambatan  BAL terhadap  Salmonella  thypimurium  tertinggi adalah oleh isolat SKE8 dan diikuti isolat SKE9 masing-masing  sebesar  3,21  ±  0,26  dan  2,89  ± 0,89.  Sebagian  besar  bakteriosin  tidak  mampu menghambat  bakteri  Gram  negatif.  Hal  ini dikarenakan  membran  sel  bagian  luar  dari bakteri Gram negatif bertindak sebagai penghalang (barrier) mekanisme aksi bakteriosin  yang  terjadi  pada  bagian  membran sitoplasma [10]. Beberapa mekanisme
bakteriosin  membunuh  bakteri  target  yaitu dengan  merusak  dinding  sel  mikroba  target, destabilisasi  membran  sitoplasma,  mengubah struktur asam nukleat, menghambat kerja enzim, penghambatan sintesis asam nukleat [11].

## Gambar  3.  Penghambatan  bakteriosin  (CFS)
isolat BAL asal susu Kambing PE terhadap  Staphylococcus  aureus dan Salmonella thypimurium Pemberian  Proteinase  K  pada  CFS  yang telah dinetralkan mengakibatkan tidak terbentuknya  zona  bening  disekitar  sumuran. Hal  ini  dikarenakan  CFS  mampu  terdegradasi oleh enzim Proteinase K (1 mg/ml). Bakteriosin merupakan  protein  yang  mampu  terdegradasi oleh  keberadaan  enzim  proteolitik  [12].  Dapat diduga  bahwa  semua  isolat  terpilih  mampu menghasilkan bakteriosin.
Berdasarkan  API  50  CHL  test  kit,  isolat SKE9  teridentifikasi  sebagai  Lactobacillus curvatus spp cuvatus dengan % ID sebesar 99,8 %. Lactobacillus curvatus merupakan BAL yang
mampu menghasilkan bakteriosin yaitu curvaticin. Curvaticin diketahui memiliki spektrum  antimikroba  terhadap  beberapa  strain bakteri  antara  lain  Listeria  monocytogenes, Staphylococcus aureus, dan Enterococcus faecalis  [13].  Berdasarkan  penelitian  ini,  dapat diketahui bahwa curvaticin yang dihasilkan oleh Lactobacillus  curvatus  mampu  menghambat pertumbuhan bakteri patogen yaitu Staphylococcus aureus dan Salmonella thypimurium.

## KESIMPULAN
Terdapat  enam  isolat  BAL  asal  susu kambing  PE  yaitu  SKE5,  SKE7,  SKE8,  SKE9, SKE10, SKE11 yang diduga mampu memproduksi  bakteriosin.  Isolat-isolat  tersebut mampu menghambat pertumbuhan
Staphylococcus aureus dan Salmonella thypimurium,  tetapi  isolat  SKE5  dan  SKE11 hanya mampu menghambat pertumbuhan Staphylococcus  aureus.  Kandidat  isolat  terbaik berdasarkan  indeks  penghambatan  penghasil bakteriosin adalah SKE9 dan SKE8. Isolat SKE9 telah teridentifikasi sebagai Lactobacillus curvatus. Bakteri tersebut mampu menghasilkan bakteriosin  yang  menghambat  pertumbuhan Staphylococcus aureus dan Salmonella thypimurium  dengan  indeks  penghambatan cukup  tinggi  masing-masing sebesar  2,94  ±  0,59 dan 2,89 ± 0,89.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  disampaikan  kepada  Ibu Dra. Tri Ardyati, M.Agr., Ph.D., Dr. Suharjono, M.Si.  dan  Dr.  Ir.  Nur  Hidayat,  MP  yang  telah banyak  membantu  dalam  proses  penyelesaian penelitian ini

## DAFTAR PUSTAKA
[1]   Haenlein,  G.  2004.  Goat  Milk  In  Human Nutrition. Small Ruminant Res 51(2):155– 163.
[2]   Gonzales,  B.,  Arca  P.,  Mayo  B.,  dan Saurez,  J.  1996.  Detection,  purification, and partial characterization of plantaricin C, a bacteriocin produced by a Lactobacillus  plantarumm  strain  of  diary origin. Applied and Environmental Microbiology. 6:2158-2163.
A A A A A A c ab a ab b c 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 SKE5 SKE7 SKE8 SKE9 SKE10 SKE11 d ia m e te r zo n a b en in g (m m ) jenis isolat S. aureus S. thypimurium
[3]   Navaro,  L.,  Zaraxaga  M.,  Saenz  J.,  Ruiz- Larrea F. dan Torres C. 2000. Bacteriocin
Production  by  Lactic  Acid  Bacteria Isolated From Rioja Red Wines. Journal of Applied Microbiology. 88:44-51.
[4]   Sujaya  I.  N.,  Amachi  S.,  Yokota  A., Asona  A.,  dan  Tomita  F.  2000.  Isolation and  characterization  of  lactic  acid bacteria  in  ragi  tape.  World  Journal  of Microbiology  Biotechnology.  17:  349- 357.
[5]   Yang,  E.,  Lihua  F., Yueming  J.,  Craig  D. dan Sherry F. 2012. Antimicrobial activity of bacteriocin-producing lactic acid bacteria  isolated  from  cheeses  and yogurts. AMB Express.
[6]   El-Shouny,  W.A.  2006.    Characterization of  bacteriocin  from    Pseudomonas aeruginosa. El -Minia Science bull. 17(2): 279-304.
[7]    Cappuccino, J. G. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison-Wesley: USA.
[8]   Axelsson,  L.  2004.    Lactic  acid Bacteria: Classification  and  physiology.      In: Salminen, S.,    Wright,   A.V.,  Ouwehand, A.,  editors.    Lactic  Acid  Bacteria.  Marcel Dekker, Inc. New York.
[9]   Charlier, C., Cretenet M., Even S., Le Loir Y. 2009. Interactions between
Staphylococcus  aureus  and  lactic  acid bacteria:  An old story with new perspectives. International Journal of Food
Microbiology 131:30–39
[10]   Raetz,  C.R.H.  dan  Whitfield  C.  2002. Lipopolysaccharide  endotoxins.  Annual Review of Biochemistry 71: 635–700.
[11]   Luders  T.,  Birkemo  G.A.,  Fimland  G., Nissen-Meyer  J.,  Nes  I.F.  2002.  Strong synergy between a eukaryotic antimicrobial  peptide  and  bacteriocins from  lactic  acid  bacteria.  Applied  and
Environmental  Microbiology  69:  1797- 1799
[12]  Tatsadjieu, N.L., Njintang N.Y., Kemgang S.  T.,  Daoudou  B.,  dan  Mbofung  C.M.F. 2009.  Characterization  of  lactic  acid bacteria  producing  bacteriocins  against chicken Salmonella enterica and
Escherichia  coli.  African  Journal  of Microbiology Research. 3(5): 220-227.
[13]   Bouttefroy,  A.,  Linder  M.    dan  MillieÁre J.B.  2000.  Predictive  models  of  the combined  effects  of  curvaticin  13,  NaCl and  pH  on  the  behaviour  of  Listeria monocytogenes  ATCC  15313  in  broth  . Journal of Applied Microbiology. 88:919- 929.