## OPTIMASI JENIS DAN KADAR SUMBER NITROGEN SERTA pH MEDIUM UNTUK PRODUKSI PROTEASE
DARI ISOLAT HTcUM 6.2.2 DARI TAUCO SURABAYA
Monika Rahayu dan * Evi Susanti
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Malang
* email: evi.susanti.fmipa@um.ac.id
Received 26 Oktober 2017
Accepted 28 Nopember 2017

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui sumber nitrogen, kadar sumber nitrogen dan pH optimum  untuk  produksi  protease  isolat  HTcUM 6.2.2. Penelitian  ini  merupakan  penelitian eksperimental  laboratoris  menggunakan  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  satu  faktorial masing-masing  yaitu  jenis,  kadar  sumber  nitrogen,  serta  pH  medium  dengan  tahap penelitian terdiri dari peremajaan, validasi kemurnian isolat HTcUM 6.2.2 , produksi ekstrak kasar  protease  isolat  HTcUM 6.2.2 ,    uji  aktivitas  protease.  Hasil  penelitian  menunjukkan sumber nitrogen optimum untuk menghasilkan protease dari isolat HTcUM 6.2.2 adalah susu skim dan limbah cair tahu. Kadar limbah cair tahu optimum untuk produksi protease dari isolat HTcUM 6.2.2 sebesar 10 %. Produksi protease cukup tinggi dan  relatif konstan antara pH 6 sampai 8.  Aktivitas protease tertinggi sebesar 0,817 U/ml dicapai dengan penggunaan 10 % (v/v) limbah cair tahu pada medium produksi, pH = 7 selama 3 hari.
Katakunci: protease, tauco, isolat, nitrogen, limbah cair tahu

## Abstract
This study aims to determine the  optimum of the  nitrogen source, percentage of  nitrogen source and pH for the production of protease from isolate  HTcUM 6.2.2. This research is a laboratory experimental with a research stage comprising inoculation and validation of the purity  of  the  isolates  HTcUM 6.2.2 ,  production  of  crude  extract  of  protease  to  determine source  of  nitrogen,  percentage  of  nitrogen  source  and  pH  optimum,  determination  of protease  activity.  The  results  showed  that  the  optimum  source  of  nitrogen  to  produce proteases from the HTcUM 6.2.2 isolate was skim milk and tofu wastewater. Percentage of nitrogen  source  optimum  to  produce  protease  of    HTcUM 6.2.2 isolate  was  10  %  of  tofu wastewater. Protease production is relatively high and constantance at pH 6 to 8. The highest protease  activity  was  achieved  by  the  use  of  10  %  (v/v)  tofu  wastewater  at  production medium, pH = 7 for 3 days was 0,817 U/mL.
The keywords: protease, tauco, isolate, nitrogen, tofu wastewater

## Pendahuluan
Protease  merupakan  salah  satu  enzim yang  banyak  diproduksi  secara  komersial pada berbagai industri, antara lain industri makanan, farmasi, deterjen, dan diagnostik. Porcine pepsin atau pepsin dari
lambung  babi  adalah  protease  yang digunakan untuk proses produksi kolagen (Yang & Shu, 2014), khususnya di negara- negara produsen kolagen seperti Amerika Utara,  Eropa,  dan  Asia  Pasifik.  Padahal Indonesia  mengimpor  kolagen  sekitar
2.715.782 kg per tahun dari negara-negara tersebut (BPS, 2016). Hal ini menyebabkan  timbulnya  keraguan  akan kehalalan kolagen tersebut. Mengatasi hal ini  Ramadhan  (2016)  telah  mengisolasi dan  menyeleksi  isolat  bakteri  potensial sebagai  sumber  protease  dari  pangan fermentasi  tauco  yang  diharapkan  dapat digunakan untuk isolasi kolagen dari sisik ikan  bandeng  sebagai  pengganti porcine pepsin yaitu  HTcUM 2 , HTcUM 6.2.1 , HTcUM 6.2.2, dan HTcUM 10 .
Satu  dari  keempat  isolat  tersebut (HTcUM 10 ) menunjukkan aktivitas protease  yang  rendah  yaitu  sebesar  0,11 U/mL  dalam  medium  produksi  yang mengandung  sumber  nitrogen  pepton. Padahal  isolat  tersebut  memiliki  indeks proteolitik yang cukup tinggi dalam media Susu  Skim  Agar  (SSA).  Sumber  nitrogen pepton  yang  digunakan  dalam  medium produksi  tersebut  diduga  tidak  dapat menginduksi  produksi  protease  isolat tersebut.  Beberapa  penelitian  melaporkan bahwa bakteri spesies yang sama menghasilkan  aktivitas  protease  yang berbeda-beda dalam sumber nitrogen yang berbeda.  Chu  (2007)  melaporkan  bahwa Basillus  subtilis menghasilkan  protease optimum  pada  medium  produksi  yang mengandung  sumber  nitrogen  berupa pepton  (836,3  U/mL),  sedangkan  Ahmed et  al. (2010)  melaporkan  bahwa Basillus subtillis menghasilkan  protease  lebih tinggi  pada  medium  produksi  yang mengandung sumber nitrogen berupa susu skim  (154.05±1.21  U/mL)  dibandingkan dengan kasein (149.85±1.11 U/mL) . Senyawa  yang  digunakan  sebagai sumber  nitrogen  dapat  berupa  garam- garam  anorganik  seperti  kalium  nitrat, amonium  sulfat,  dan  amonium  nitrat maupun  senyawa-senyawa  organik  dari bahan  yang  mengandung  protein  seperti pepton,  ekstrak  khamir,  tripton,  dan  urea. (Pelczar & Chan, 2010: 132-137). Masing- masing sumber nitrogen organik memiliki kadar  dan  kandungan  protein  yang  khas. Kacang-kacangan pada proses perkecambahan  memiliki  kadar  protein
sekitar  20-25  %  berat  kering.  Tiyono (2011) juga menyatakan bahwa dalam biji kacang hijau mengandung protein sebesar 22,8%, sedangkan biji kedelai sebesar 40% (Suhaidi,  2003).  Limbah  cair  tahu mengandung  protein  sebesar  45%  (Ounis et  al .,  2008).  Kandungan  protein  utama dalam  susu  skim  adalah  kasein  mencapai 3,7%  (Buckle et  al. 1987).  Pepton merupakan  hasil  hidrolisis  dari  suatu bahan  yang  mengandung  protein  melalui proses  enzimatik.  Bahan  tersebut  dapat berasal  dari  daging,  ikan,  kasein,  gelatin, keratin,  tepung  kedelai,  khamir  dan  lain- lain (Nurhayati et al ., 2015).
Produksi protease tidak hanya dipengaruhi  oleh  sumber  nutrien  yang terkandung  pada  media  produksi,  tetapi juga dipengaruhi oleh kondisi pertumbuhan seperti pH medium. Masing- masing bakteri memiliki pH optimum yang berbeda-beda tergantung jenis bakterinya. Jika  bakteri  ditumbuhakan  diluar  pH optimumnya,  maka  akan  menurunkan pertumbuhan bakteri.
Penurunan
pertumbuhan bakteri menyebabkan produksi  metabolit  termasuk  protease menurun.  Isolat  HTcUM 6.2.2 memiliki indeks  proteolitik  yang  tinggi,  diduga dapat  menghasilkan  aktivitas  yang  tinggi pada  media  produksi  dengan  sumber nitrogen  dan  kondisi  pertumbuhan  yang optimum

## Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Penelitian  ini  menggunakan  alat-alat berupa  peralatan  gelas  dan  peralatan khusus  yaitu magnetic stirrer , kawat ose ujung lingkaran, autoklaf, oven, Eyela soft incubator SLI-600ND, waterbath
inkubator Memmert ,  Eyela Uni  Termo Shaker NTS  1300,  neraca  analitik  ACIS, vortex , enkas, centrifuge kokusan, Thermo Scientific  Heraus  Pico  17  Centrifuge, Thermo  Scientific  Hot  Plate  Stirrer,  dan Bio Rad Smartspec Plus Spectrofotometer . Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam penelitian ini berderajat p.a. (pro analisis) yaitu:  Natrium  Klorida  (NaCl),  Natrium
Hidroksida  (NaOH),  Natrium  Karbonat (Na 2 CO 3 ),  Folin  Ciocalteu, Buffer fosfat pH  7  50  mM,  BSA  ( Bovine  Serum
Albumin )  ,  glukosa,  pepton  oxoid, magnesium sulfat
heksahidrat
(MgSO 4 .7H 2 O),  kalium  dihidrogen  fosfat (KH 2 PO 4 ),  besi  (II)  sulfat  heksahidrat (FeSO 4 .7H 2 O), tembaga (II) sulfat pentahidrat  (CuSO 4 .5H 2 O),  natrium  sitrat dihidrat  (Na 3 C 6 H 5 O 7 .2H 2 O),  tirosin,  TCA (Asam trikloroasetat), kasein, dan baktoagar.  Bahan-bahan  berderajat  teknis antara  lain  susu  skim,  bubuk  kedelai, rebusan  kecambah,  limbah  cair  tahu, akuades, alkohol dan spiritus.
Peremajaan isolat HTcUM 6.2.2
Peremajaan isolat
HTcUM 6.2.2
dilakukan  dengan  mengambil  satu  koloni tunggal  dari  isolat  induk  HTcUM 6.2.2 dan distreak  empat  kuadran  pada  media  Susu Skim Agar (SSA).
Optimasi  jenis  sumber  nitrogen  untuk produksi ekstrak kasar protease
Metode isolasi protease dengan optimasi
jenis sumber nitrogen
menggunakan  jenis  sumber  nitrogen berupa  pepton  oxoid,  susu  skim,  kasein, bubuk  kedelai,  rebusan  kecambah,  dan limbah  cair  tahu.  Isolasi  protease  dan pengukuran  aktivitas  mengacu  pada penelitian Alnahdi (2012) dengan modifikasi. Sebanyak 1 ose koloni tunggal bakteri  dari  isolat  HTcUM 6.2.2 yang  telah murni  diinokulasikan  ke  dalam  100  mL medium  produksi  yang  mengandung (g/mL) 0,5 MgSO 4 .7H 2 O; 0,5
FeSO 4 .7H 2 O;  dan  0,5  KH 2 PO 4 ;  0,5 glukosa;  untuk  sumber  nitrogen  pepton, susu skim, kasein, dan bubuk kedelai 0,75; sedangkan  untuk  sumber  nitrogen  air rebusan  kecambah  dan  limbah  cair  tahu 10% v/v pada pH 7. Inokulum diinkubasi pada  suhu  37 o C  dengan  agitasi  100  rpm selama  72  jam.  Setelah  itu  inokulum diambil  ±10  mL  dan  disentrifugasi  pada 3000  rpm  selama  30  menit.  Supernatan yang  diperoleh  merupakan  ekstrak  kasar
enzim  protease  yang  diuji  aktivitas  dan kadar proteinnya.

## Optimasi  kadar  sumber  nitrogen  untuk produksi ekstrak kasar protease
Metode  isolasi  protease  pada  optimasi kadar  sumber  nitrogen  dengan  variasi kadar limbah cair tahu (v/v) 1%, 5%, 10%, dan 15%. Isolasi protease dan pengukuran aktivitas mengacu pada penelitian Alnahdi (2012) dengan modifikasi. Sebanyak 1 ose koloni tunggal bakteri dari isolat HTcUM 6.2.2 yang telah murni
diinokulasikan ke dalam 100 mL medium produksi  yang  mengandung  (g/mL)  0,5
MgSO 4 .7H 2 O;  0,5  FeSO 4 .7H 2 O;  0,5 KH 2 PO 4 ; 0,5 glukosa; dan sumber nitrogen menggunakan  limbah  cair  tahu  dengan variasi kadar (v/v) 1%, 5%, 10%, dan 15% pada pH 7. Inokulum diinkubasi pada suhu 37 o C  dengan  agitasi  100  rpm  selama  72 jam. Setelah itu inokulum diambil ±10 mL dan  disentrifugasi  pada  3000  rpm  selama 30  menit.  Supernatan  yang  diperoleh merupakan  ekstrak  kasar  enzim  protease yang diuji aktivitas dan kadar proteinnya.
Optimasi  pH  medium  untuk  produksi ekstrak kasar protease
Metode isolasi protease dengan optimasi pH medium pada pH 4, 5, 6, dan 7.  Isolasi  protease  dan  pengukuran aktivitas mengacu pada penelitian Alnahdi (2012) dengan modifikasi. Sebanyak 1 ose koloni tunggal bakteri dari isolat
HTcUM 6.2.2
yang telah murni diinokulasikan ke dalam 100 mL medium produksi  yang  mengandung  (g/mL)  0,5 MgSO 4 .7H 2 O;  0,5  FeSO 4 .7H 2 O;  dan  0,5 KH 2 PO 4 ; 0,5 glukosa; dan sumber nitrogen menggunakan  limbah  cair  tahu  10%  v/v dengan  variasi  pH  4,  5,  6,  dan  7  dan  8. Inokulum  diinkubasi  pada  suhu  37 o C dengan  agitasi  100  rpm  selama  72  jam. Setelah itu inokulum diambil ±10 mL dan disentrifugasi  pada  3000  rpm  selama  30 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan  ekstrak  kasar  enzim  protease yang diuji aktivitas dan kadar proteinnya.
Pembuatan  kurva  standar  tirosin  dengan metode anson
Sebanyak  2  mL  larutan  standar  yang mengandung 0 (blanko), 10, 30, 50, dan 70 μg/mL  tirosin  ditambahkan  5  mL  larutan 0,5  M  Na 2 CO 3 dan  1  mL  reagen  Folin Ciocalteu. Larutan dihomogenkan dengan vortex  kemudian  diinkubasi  pada  37 o C selama 30 menit. Kompleks berwarna biru yang terbentuk diukur absorbansinya pada panjang  gelombang  660  nm.  Data konsentrasi  tirosin  dan  absorbansinya digunakan  untuk  membuat  kurva  standar tirosin.

## Uji aktivitas protease
Uji  aktivitas  protease  merujuk  pada penelitian  Alnahdi  (2012).  Pengukuran aktivitas  protease  dilakukan  dengan  cara 0,5 mL substrat kasein (1% b/v) dalam 50 mM buffer fosfat pH 7 dimasukkan dalam tabung reaksi dan dicampur dengan 0,2 mL ekstrak  kasar  enzim,  diinkubasi  pada penangas  air  pada  suhu  40  °C  selama  20 menit, ditambahkan 1 mL TCA (10% b/v), campuran  dihomogenkan  dengan  vortex dan  dijaga  pada  suhu  ruang  selama  15 menit.  Campuran  disentrifugasi  pada 10.000  rpm  selama  10  menit.  Supernatan yang  dihasilkan  dicampur  dengan  2,5  ml Na 2 CO 3 0,4  M  dan  ditambahkan  1  mL reagen
Folin Cioceltau. Larutan dihomogenkan dengan vortex dan
diinukbasi  pada  suhu  kamar  dalam  ruang gelap selama 30 menit. Setelah itu, larutan hasil  diukur  absorbansi  pada  660  nm dengan  blanko  menggunakan  larutan tirosin  standar.  Kontrol  mengikuti  cara yang sama tetapi penambahan larutan TCA (10%  b/v)  sebelum  penambahan  substrat kasein (1% b/v) dalam 50 mM buffer fosfat pH 7.
Aktivitas enzim dinyatakan dalam Unit (U), satu unit aktivitas enzim sama dengan banyaknya  enzim  yang  dibutuhkan  untuk menghasilkan  1  mikrogram  tirosin  setiap mililiter  larutan  per  menit  pada  kondisi percobaan.Penentuan kadar tirosin ditentukan  dengan  cara  hasil  absorbansi sampel  pada  panjang  gelombang  660  nm
diinterpolasikan  pada  persamaan  regresi kurva  standar  tirosin.  Konsentrasi  tirosin yang telah diketahui kemudian dimasukkan  dalam  persamaan  untuk menghitung  aktivitas  enzim..  Berikut  ini adalah persamaan yang digunakan:
enzim (U/mL) es e C V Aktivitas t V    (1)
dengan, C (konsentrasi  tirosin  (μg/mL)), Ves (volume  total  pengujian  enzim- substrat (mL) = 0,7 mL), t (waktu inkubasi enzim-substrat  (menit))  dan Ve (volume enzim (mL) = 0,2 mL)

## Pembuatan  kurva  standar  protein  dan pengukuran kadar protein dengan metode Lowry
Sebanyak  0,5  larutan  protein  standar yang  mengandung 0 (blanko), 20, 40, 60, 80, 100 µg BSA ( Bovine Serum Albumin ), ditambah  2,5  mL  pereaksi  biuret,  diaduk hingga  homogen.  Campuran  diinkubasi pada suhu  kamar  tepat 10 menit. Setelah itu campuran ditambahkan 0,25 mL Folin Ciocalteu,  dihomogenkan  dengan  vortex, dan  diinkubasi  pada  suhu  kamar  tepat  30 menit.  Nilai  absorbansi  larutan  diukur pada  panjang  gelombang  750  nm.  Data konsentrasi  BSA  dan  absorbansinya digunakan  untuk  membuat  kurva  standar protein.

## Penentuan aktivitas spesifik protease
Aktivitas  spesifik  dapat  diukur  dengan membandingan  nilai  aktivitas  enzim  per miligram protein ekstrak kasar selulernya. Jumlah  protein  dapat  dihitung  jika diketahui  kadar  atau  konsentrasi  protein dalam  larutan  enzim.  Untuk  penentuan kadar  protein,  hasil  absorbansi  sampel pada panjang gelombang 750 nm diinterpolasikan  pada  persamaan  regresi kurva standar protein. Kadar atau konsentrasi  protein  yang  telah  diketahui kemudian  dimasukkan  dalam  persamaan untuk menghitung aktivitas spesifik enzim.

## Hasil dan Pembahasan
Peremajaan isolat HTcUM 6.2.2 Peremajaan isolat HTcUM 6.2.2 dilakukan  dengan  mengambil  satu  koloni dari isolat induk HTcUM 6.2.2 dan distreak empat  kuadran  pada  media  SSA  (Susu Skim Agar). Pertumbuhan bakteri protease pada  media  SSA  dapat  diamati  dari terbentuknya zona bening disekitar koloni. Hal  ini  disebabkan  bakteri  tersebut menghidrolisis  kasein  susu  yang  awalnya berwarna  putih  keruh  menjadi  peptida- peptida  dan  asam-asam  amino  yang ditandai  dengan  adanya  zona  bening disekitar  koloni  (Pakpahan,  2009).  Hasil
dari  peremajaan  isolat  HTcUM 6.2.2 dapat dilihat pada Gambar 1
Hasil  peremajaan  isolat  HTcUM 6.2.2 menghasilkan zona bening dengan diameter 1,12 cm dan diameter bakterinya sebesar  0,43  cm  dengan  waktu  inkubasi pertumbuhan selama tiga hari. Berdasarkan perolehan data tersebut, isolat HTcUM 6.2.2 mampu  menghasilkan  indeks proteolitik sebesar 2,60. Indeks proteolitik merupakan  perbandingan  diameter  zona bening dengan diameter bakteri.
Pengukuran indeks proteolitik diilustrasikan pada Gambar 2.
Gambar 1. Isolat induk HTcUM 6.2.2 (A) dan hasil peremajaan isolat HTcUM 6.2.2 (B)
Gambar 2. Pengukuran Diameter Zona Bening dan Bakteri Hasil Hidrolisis Kasein Susu oleh Bakteri
Optimasi Jenis Sumber Nitrogen untuk Produksi Protease dari Isolat HTcUM 6.2.2 Bakteri  memerlukan  sumber  nutrisi untuk  proses  metabolismenya.  Sumber nutrisi  tersebut  berasal  dari  senyawa nitrogen,  karbon,  dan  senyawa  lain.  Pada penelitian  ini  digunakan  sumber  nitrogen berupa  senyawa-senyawa  organik  murni
seperti  kasein  dan  pepton  juga  sumber nitrogen  yang  berasal  dari  bahan  alamiah seperti  susu  skim,  bubuk  kedelai,  air rebusan  kecambah  dan  limbah  cair  tahu. Pemilihan sumber nitrogen tersebut karena isolat  HTcUM 10 yang  diisolasi  dari  tauco menghasilkan  aktivitas  protease  yang rendah  dalam  medium  produksi  yang
A B Diameter Zona Bening Diameter Bakteri
mengandung  sumber  nitrogen  pepton (Ramadhan,
2016), maka pepton digunakan sebagai variabel pembanding.
Pertumbuhan  bakteri  dapat  diamati berdasarkan perubahan jumlah sel maupun produksi  metabolit  primernya  seperti protein. Naiola (2002) melaporkan bahwa aktivitas protease bakteri penghasil
protease  mulai  meningkat  setelah  hari  ke tiga dan stabil pada hari ke 4-6. Aktivitas protease  isolat  HTcUM 6.2.2 ditunjukkan pada  Gambar  3.  Aktivitas  protease  isolat HTcUM 6.2.2 tertinggi  pada  hari  ketiga dalam  semua  jenis  sumber  nitrogen  yang digunakan dan menurun secara signifikan pada hari keempat.
Gambar 3. Aktivitas protease Isolat HTcUM 6.2. pada hari ke-3,4,5 dan 6 dalam media produksi dengan sumber nitrogen yaitu: air rebusan kecambah, bubuk kedelai, kasein, pepton, susu skim, limbah cair tahu.
Jenis  sumber  nitrogen  dalam  masing- masing  media  produksi  mempengaruhi jumlah  protein  terlarut  (Tabel  1).  Bubuk kedelai,  susu  skim,  kasein  dan  pepton memiliki  kadar  protein  terlarut  rendah. Protein dalam bubuk kedelai yang berupa tepung, kasein  dan  pepton diduga mengandung  protein  yang  kurang  larut dalam  air.  Air  rebusan  kecambah  dan limbah  cair  tahu  memiliki  kadar  protein terlarut  yang  paling  tinggi.  Hal  tersebut
diduga  karena  pada  proses  perebusan kecambah melarutkan protein yang terkandung  didalam  kecambah.  Limbah cair tahu merupakan filtrat hasil penyaringan koagulan dari fermentasi susu kedelai sehingga diduga banyak mengandung  protein  berupa  polipeptida pendek  yang  lebih  larut  di  dalam  air dibandingkan  protein  berukuran  besar seperti pepton maupun kasein
.
Tabel 1 . Kadar protein terlarut dalam bubuk kedelai, susu skim, kasein, pepton, limbah cair   tahu, dan air rebusan kecambah Jenis Sumber Nitrogen Kadar Protein Terlarut (mg/mL) Bubuk Kedelai 1,835 Susu Skim 2,356 Kasein 2,388 Pepton 2,833 Limbah Cair Tahu 3,245 Air Rebusan Kecambah 3,532
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3 4 5 6 A kt iv it as E n zi m ( U/m l) Hari Ke- Air Rebusan Kecambah Bubuk Kedelai Kasein Pepton Susu Skim
Hasil  penelitian  menunjukkan  jenis sumber  nitrogen  sangat  mempengaruhi aktivitas  spesifik  protease  relatif  yang dihasilkan dari isolat HTcUM 6.2.2 (Gambar 4).  Aktivitas  spesifik  protease  relatif merupakan aktivitas enzim dibagi dengan kadar protein terlarutnya. Aktivitas protease  relatif  isolat  HTcUM 6.2.2 dengan sumber  nitrogen  air  rebusan  kecambah paling  rendah  hanya  sebesar  0,130  U/mg padahal  air  rebusan  kecambah  memiliki kadar protein terlarut tertinggi. Air rebusan
kecambah  diperoleh  dengan  merebus kecambah  dalam  air  mendidih  selama  10 menit,  diduga  protein  yang  terlarut  dari proses  ini  masih  merupakan  protein komplek  dengan  rantai  polipeptida  yang panjang  sehingga  bakteri  membutuhkan waktu  yang  lebih  lama  dalam  mencerna protein-protein  yang  masih  kompleks tersebut  sebagai  sumber  nutrien  untuk proses  pertumbuhan  termasuk  produksi proteasenya.
Gambar 4. Aktivitas protease spesifik relatif isolat HTcUM 6.2.2 dalam berbagai jenis sumber nitrogen
Aktivitas  protease  spesifik  relatif  yang dihasilkan dalam medium produksi dengan sumber nitrogen bubuk kedelai, kasein dan pepton memiliki aktivitas protease dengan kategori sedang. Aktivitas protease spesifik  relatif  dengan  sumber  nitrogen pepton memiliki aktivitas yang lebih tinggi (0,529 U/mg) dibandingkan kasein (0,428 U/mg)  dan  bubuk  kedelai  (0,410  U/mg). Hal ini disebabkan pepton merupakan hasil hidrolisis protein hewani, sehingga panjang rantai polipeptidanya lebih bendek  daripada  kasein  maupun  protein yang  terdapat  dalam  bubuk  kedelai. Aktivitas  spesifik  protease  yang  tertinggi dihasilkan  dalam  medium  produksi  yang mengandung sumber nitrogen berupa susu skim  (0,855  U/mg)  dan  limbah  cair  tahu (0,734).  Susu  skim  dan  limbah  cair  tahu merupakan sumber nitrogen alamiah yang lebih  kaya  nutrisi  dibandingkan  sumber
nitrogen  lainnya.  Susu  skim  selain mengandung protein utama berupa kasein juga  mengandung  beberapa  protein  lain, laktosa, dan beberapa asam lemak. Limbah cair  tahu  merupakan  filtrat  penyaringan koagulan  hasil  fermentasi  susu  kedelai diduga  mengandung  berbagai  nutrisi  lain yang lebih mudah dicerna seperti oligosakarida  dan  polipeptida  pendek. Isolat  HTcUM 6.2.2 mampu  menghasilkan protease  tertinggi  dalam  media  produksi mengandung  susu  skim,  tetapi  untuk pengembangan  ke  skala  industri  maka penggunaan  susu  skim    kurang  efisien secara  ekonomis  karena  harga  media produksi  menjadi  sangat  mahal.  Limbah cair tahu lebih potensial digunakan sebagai sumber nitrogen karena ditinjau dari nilai ekonomis. Protease yang dihasilkan dalam media  produksi  cukup  sebanding  dengan protease  yang  dihasilkan  dalam  medium
0,130 0,410 0.428 0.529 0.855 0.734 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Air Rebusan
Kecambah Bubuk Kedelai Kasein Pepton Susu Skim Limbah Cair Tahu A kt iv it as S pe si fi k E n zi m R el at if (U/m g) Jenis Sumber Nitrogen
mengandung  susu  skim.  Jumlah  limbah cair  tahu  melimpah  karena    banyaknya industri  tahu  yang  ada  di  Kota  Malang sehingga  mudah  didapatkan  dan  tidak termanfaatkan.
Optimasi  Kadar  Sumber  Nitrogen  untuk Produksi Protease dari Isolat HTcUM 6.2.2 Optimasi  produksi  protease  dari  isolat HTcUM 6.2.2 pada  tahap  ini  dilakukan
dengan  memvariasikan  kadar  sumber nitrogen  yang  terdapat  dalam  medium produksi. Aktivitas protease hasil optimasi kadar  sumber  nitrogen  disajikan  pada Tabel 2.  Peningkatan jumlah limbah cair tahu  dalam  medium  produksi  sebanding dengan peningkatan kadar proteinnya. Hal ini  menunjukkan  bahwa  dengan  kadar sumber nitrogen yang semakin tinggi maka pertumbuhan bakteri juga semakin tinggi.
Tabel 2. Aktivitas Protease Hasil Optimasi Kadar Sumber Nitrogen Medium Produksi Enzim Kadar Limbah Cair Tahu (%) Kadar Protein Terlarut (mg) Aktivitas Enzim (U/mL) Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik Enzim (U/mg) 1 0,325 0,051 ± 0,000     0,022 ± 0,004 2,381 ± 0,397 5 1,623 0,154 ± 0,073 0,047 ± 0,000 3,279 ± 1,555 10 3,245 0,817 ± 0,118 0,070 ± 0,006 11,65 ± 1,834 15 4,868 0,071 ± 0,064 0,104 ± 0,004 0,664 ± 0,576
Namun  hubungan  tersebut  tidak  linier pada aktivitas enzim. Peningkatan jumlah limbah  cair  tahun  meningkatkan  aktivitas protease yang dihsilkan hingga penggunaan  10%,  tetapi  pada  kadar diatasnya  yaitu  15%  aktivitas  protease menurun  drastis.  Hal  ini  kemungkinan pada  kondisi  tersebut  terdapat  senyawa yang  dapat  menghambat  ekpresi  gen protease,  sehingga  walaupun  jumlah protein  ekstrak  selular  meningkat  tetapi aktivitas protease yang dihasilkan menurun.    Hal  ini  dikuatkan  oleh  nilai aktivitas  spesifik  protease  yang  juga menurun drastis pada penggunaan limbah cair tahu sebesar 15%. Maka penggunaan 10% limbah cair tahu mampu menghasilkan protease optimum dari isolat HTcUM 6.2.2 dengan  nilai  aktivitas  enzim sebesar 0,817 ± 0,118 U/mL dan aktivitas spesifik  enzim  sebesar  11,65    ±  1,834 U/mg.
Optimasi  pH  Medium  untuk  Produksi Protease dari Isolat HTcUM 6.2.2
Secara umum, pH medium
mempengaruhi pertumbuhan bakteri.
Pertumbuhan  bakteri  sejalan  dengan aktivitas  yang  dihasilkan.  Setiap  enzim memiliki  pH  medium  optimum  yang bervariasi. Pada pH medium optimumnya, aktivitas  enzim  yang  dihasilkan  lebih tinggi  dari  pH  lainnya.  Produksi  protease dari  isolat  HTcUM 6.2.2 dilakukan  dengan variasi pH medium pada pH 4, 5, 6, 7, dan 8 untuk mengetahui pH optimum aktivitasnya  seperti  yang  ditunjukkan Gambar 5.
Isolat HTcUM 6.2.2 menghasilkan aktivitas protease yang relatif rendah pada pH 4 dan 5, dan relatif tinggi pada pH 6, 7, dan 8. Bahkan pada pH 6,7 dan 8, besarnya aktivitas  protease  yang  dihasilkan  tidak berbeda  secara  signifikan.  Berdasarkan hasil  ini  diduga  isolat  HTcUM 6.2.2 merupakan bakteri proteolitik netral. Sifat ini membawa keuntungan bahwa penjagaan  kondisi  pH  untuk  produksi protease  isolat  HTcUM 6.2.2 tidak  terlalu ketat  pada  suatu  pH  tertentu  tetapi  ada dalam  suatu  rentang  yang  cukup  lebar yaitu 6 hingga 8
Gambar 5. Aktivitas protease isolat HTcUM 6.2.2 pada berbagai variasi pH

## Kesimpulan
Jenis  sumber  nitrogen  terbaik  untuk produksi  protease  dari  isolat  HTcUM 6.2.2 adalah  susu  skim  dan  limbah  cair  tahu, tetapi  limbah  cair  tahu  lebih  potensial digunakan sebagai sumber nitrogen karena lebih  murah  dan  mudah  diperoleh.  Kadar
limbah cair tahu optimum untuk produksi protease dari isolat HTcUM 6.2.2 yaitu 10%. Aktivitas  protease  tertinggi  sebesar  0,817 U/ml  dicapai  dengan  penggunaan  10% limbah  cair  tahu  pada  medium  produksi, pH = 7 selama 3 hari.

## Daftar Pustaka
Ahmed, I., Irfan M., Nadeem, M., Zia M.
A.,  Ahmad  B.  A.  &  Iqbal  H.  M.  N.
2010.  Optimization  of  Media  and Environmental Conditions for Alkaline  Protease  Production  Using Bacillus Subtilis in Submerged Fermentation  Process. Journal  of IJAVMS , 4 (4) :105-113.
Alnahdi,  H.  S.  2012.  Isolation  and screening  of  extracellular  proteases produced by new isolated Bacillus sp environmental  samples  and  screened their capability of protease. Journal of Applied  Pharmaceutical  Science, 2 (9): 71–74.
Badan Pusat Statistik Kabupaten Sidoarjo. 2016. Statistik  Daerah  Kabupaten Sidoarjo ,
(Online), (https://www.scribd.com/document/3 27540037/Statistik-Daerah-Kabupa ten-Sidoarjo-2016), diakses 12  Maret 2017.
Buckle, K.A., Edward, R.A., Fleet, G.H. & Wooton,  M.  1987. Ilmu  Pangan. Diterjemahkan  oleh  H.  Purnomo  & Adiono.  Jakarta:  Penerbit  Univesitas Indonesia.
Chu, W. 2007. Optimization of extracellular alkaline protease production  from  species  of Bacillus. Journal  of    J  Ind  Microbiol Biotechnol , 34 : 241–245.
Naiola, E. & Widhyastuti, N. 2002. Isolasi, seleksi dan optimasi produksi protease dari  beberapa  isolat  bakteri. Jurnal Berita Biologi , 6 (3): 467-473.
Nurhayati,  T.,  Ibrahim,  B.,  Suptijah,  P., Salamah, E., Fitra, R. N., Astuti, E. R. W.  2015.  Karakterisasi  Pepton  Ikan Hasil  Tangkap  Sampingan  Tidak Layak  Konsumsi  sebagai  Sumber
Nutrien Pertumbuhan Mikroorganisme.  Jurnal  Teknologi Industri Pertanian, 25 (1) : 68-77.
0.154 0.206 0.425 0.367 0.412 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 4 5 6 7 8 Ak tivi tas E n zim ( U/m L ) pH Medium Produksi
Ounis,  W.  B.,  Champagne,  C.  P., Makhlouf,  J.  &  Bazinet,  L.  2008. Utilization of tofu whey pre-treated by electromembrane process as a growth medium  for Lactobacillus  plantarum LB17. Journal of Desalination, 229 : 192–203.
Pakpahan, R. 2009. Isolasi Bakteri dan Uji
Aktivitas  Protease  Termofilik  dari Sumber Air Panas Sipoholon Tapanuli  Utara  Sumatera  Utara. Tesis  tidak  diterbitkan.  Medan  :
Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara.
Pelczar,  M.  J.  Jr.,  &  Chan,  E.  C.  S.,  2010.
Dasar-dasar  mikrobiologi .  Jakarta:  UI- Press
Ramadhan,  H.R.  2016. Isolasi  Bakteri Penghasil  Protease  dari  Pangan Fermentasi  Tauco  sebagai  Sumber Protease  Untuk  Isolasi  Kolagen secara  Enzimatis  dari  Sisik  Ikan Bandeng .  Skripsi  tidak  diterbitkan.
Malang: S1 Kimia Universitas Negeri
Malang.
Suhaidi,
I. 2003. Pengaruh Lama Perendaman  Kedelai  dan  Jenis  Zat Penggumpal  Terhadap  Mutu  Tahu. Sumatra  Utara  :  Universitas  Sumatra Utara.
Tiyono,  A.  2010.  Mempelajari  Pengaruh Penambahan  Beberapa  Asam  pada
Proses Isolasi Protein terhadap Tepung  Protein  Isolat  Kacang  Hijau ( Phaseolus  radiatus  L. ).  Seminar Rekayasa  Kimia  dan  Proses,  4-5 Agustus 2010.
Yang,  H. & Shu, Z. 2014. The extraction of  collagen  protein  from  pigskin.
Journal of Chemical and
Pharmaceutical Research , 6 (2): 683– 687.