ISSN 1979-0309 (Online) 2614-7920 (Print)
Jurnal Teknologi Hasil Pertanian . 16(1), 41-64
URL: https://jurnal.uns.ac.id/ilmupangan/article/view/72623
DOI: https://doi.org/10.20961/jthp.v16i1.72623
Kajian Enzim Fibrinolitik pada Mikroorganisme Asal Pangan Fermentasi Asia: Review
Study of Fibrinolytic Enzymes on Microorganisms of Fermented Food From Asia: Review
Fathma Syahbanu 1) dan Setyaning Pawestri 2)
1) Program Studi Gizi, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Singaperbangsa Karawang
2) Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pangan dan Agroindustri, Universitas Mataram
email: fathma.syahbanu@fikes.unsika.ac.id
Diserahkan [03 April 2023]; Diterima [17 Mei 2023]; Dipublikasi [08 Juni 2023]

## ABSTRACT
Data collected by WHO in 2019 shows an estimated 17.9 million (equivalent to 32% of global death). The total  number  is  due  to  cardiovascular  disease,  85%  were  due  to  heart  attacks  and  strokes.  One  of  the  basic pathophysiologies of stroke is atero-thromboembolic (thrombosis). The accumulation of clots formed by fibrin in blood vessels can inhibit several processes in the body system, such as blood flow, oxygen transportation, and transportation  of  nutritional and  non-nutritional  compounds  needed.  Fibrinolytic  enzymes  from  food  microbes have attracted attention for further research as thrombolytic agents. The Bacillus genus from fermented foods can produce  strong  fibrinolytic  enzymes,  such  as  Bacillus  natto  from  natto  (Japan),  Bacillus  subtilis  KCK-7  from Chungkook-jang (Korea), Bacillus weihenstephanensis from shrimp paste (Vietnam), Bacillus amyloliquefaciens MH18B1 from Hawaijar (India), Rhizopus chinensis 12 from Chinese wine (China), and Bacillus pumillus and Bacillus  subtilis  K2  from  fermented  soybean  food  products  such  as  tempe  gembus,  red  oncom,  and  moromi (Indonesia).  The  high  protein  content  in  soybeans  can  be  used  as  a  medium  for  the  growth  of  proteolytic  and fibrinolytic microorganisms. Studies in Asia regarding fibrinolytic enzymes from fermented foods are still limited, even though the Asian region comprises many countries rich in fermented foods. This review is relevant to healthy food ingredients from local fermented foods. Recently, microbial fibrinolytic enzymes from fermented foods have received tremendous interest in the medical field. Many local fermented foods are a potential source of fibrin- degrading enzymes, which can be further developed to treat diseases like stroke and heart attack. This article aims to  review  microbial  fibrinolytic  enzymes  from  various  fermented  foods  and  their  impact  on  health,  especially thrombosis.  This  manuscript  review  uses  the  narrative  review  method.  From  the  overall  discussion,  it  can  be concluded that fermented foods have properties as fibrinolytic agents.

## Keywords: Bacillus sp.; fibrinolytics; fermented food; thrombosis

## ABSTRAK
Data WHO pada 2019 menunjukkan  sekitar 17,9 juta orang meninggal (setara dengan 32% angka kematian di  dunia).  Jumlah  dari  keseluruhan  tersebut  dikarenakan  penyakit  kardiovaskular,  yakni  85%  kematian  akibat serangan jantung dan stroke. Salah satu dasar patofisiologi dari stroke adalah atero-tromboembolik (trombosis). Adanya  akumulasi  bekuan  yang  dibentuk  fibrin  pada  pembuluh  darah  dapat  mengakibatkan  terjadinya penghambatan aliran darah, proses transportasi oksigen, serta senyawa gizi dan non gizi yang dibutuhkan oleh tubuh.  Enzim  fibrinolitik  dari  mikroba  pangan  telah  menarik  perhatian  untuk  diteliti  lebih  jauh  sebagai  agen trombolitik.  Genus Bacillus dari  pangan  fermentasi  dapat  menghasilkan  enzim  fibrinolitik  yang  kuat,  seperti Bacillus  natto dari  natto  (Jepang), Bacillus  subtilis KCK-7  dari  Chungkook-jang  (Korea), Bacillus weihenstephanensis dari  terasi  udang  (Vietnam), Bacillus  amyloliquefaciens MH18B1  dari  Hawaijar  (India), Rhizopus chinensis 12 dari arak China (China), serta Bacillus pumillus dan Bacillus subtilis K2 dari produk pangan fermentasi kedelai seperti tempe gembus, oncom merah, dan moromi (Indonesia). Kandungan protein yang tinggi pada kedelai berpotensi digunakan sebagai media pertumbuhan mikroorganisme proteolitik dan fibrinolitik. Kajian di Asia mengenai enzim fibrinolitik dari pangan fermentasi masih terbatas, padahal wilayah Asia tersusun dari banyak negara yang kaya akan pangan fermentasi. Studi ini relevan dengan bahan baku pangan sehat yang berasal dari pangan fermentasi. Belakangan ini, enzim-enzim fibrinolitik mikroba dari pangan fermentasi sangat diminati oleh bidang medis. Banyak pangan fermentasi dianggap sebagai sumber potensial enzim pendegradasi fibrin, yang
dapat  dikembangkan  lebih  lanjut  untuk  mengatasi  penyakit  seperti  stroke  dan  serangan  jantung.  Artikel  ini bertujuan untuk mengulas enzim fibrinolitik mikroba dari berbagai pangan fermentasi serta dampaknya terhadap kesehatan,  terutama  trombosis.  Ulasan  naskah  ini  menggunakan  metode narrative  review .  Dari  pembahasan keseluruhan dapat ditarik kesimpulan bahwa pangan fermentasi memiliki sifat sebagai agen fibrinolitik.
Kata Kunci : Bacillus sp.; fibrinolitik; pangan fermentasi; thrombosis
Saran sitasi : Syahbanu, F. dan Pawestri, S. 2023. Kajian Enzim Fibrinolitik pada Mikroorganisme Asal Pangan Fermentasi Asia Review. Jurnal Teknologi Hasil Pertanian, 16(1), 41-64. https://doi.org/10.20961/jthp.v16i1.72623

## PENDAHULUAN
Penyakit
kardiovaskuler seperti
penyakit stroke dan jantung adalah salah satu penyebab kematian utama di dunia, termasuk di Indonesia. Penyakit kardiovaskular merupakan  penyakit  tidak  menular  yang paling  umum  di  dunia,  serta  bertanggung jawab  terhadap  17.9  juta  kematian,  dimana lebih dari tiga perempatnya berada di negara berpenghasilan rendah dan menengah (Kaptoge et al. , 2019; WHO, 2021). Penyakit kardiovaskular  dapat  disebabkan  oleh  dua faktor,  yaitu  aterosklerosis  dan  trombosis. Aterosklerosis adalah pengerasan dan penyempitan  arteri  secara  progresif  akibat timbunan  lemak  dengan  disertai  peradangan, sementara trombosis merupakan suatu keadaan dimana bekuan-bekuan darah melekat dan beragregasi pada pembuluh darah yang terluka sehingga menyebabkan penyumbatan aliran darah. Adanya akumulasi bekuan  darah  yang  dibentuk  fibrin  pada pembuluh darah dapat mengakibatkan terjadinya penghambatan aliran darah, proses transportasi  oksigen  serta  senyawa  gizi  dan non gizi yang dibutuhkan oleh tubuh.
Salah satu dasar patofisiologi dari stroke adalah atero-tromboembolik. Menurut Ismail et  al. (2002)  sekitar  20%  –  30%  kasus kardiovaskular  disebabkan  oleh  trombosis. Trombosis  dapat  menyebabkan  terjadinya stroke  iskemia  dan  trombosis  vena  dalam emboli  paru.  Pada  tahun  2015,  ketua Perhimpunan Trombosis Hemostasis Indonesia (PTHI) melaporkan bahwa penyebab kematian utama di Indonesia, yaitu stroke  (11.8%)  dan  urutan  ketiga  adalah jantung  (8.7%).  Dari  jumlah  tersebut, sebanyak  80%  –  85%  stroke  adalah  stroke iskemia yang disebabkan oleh trombosis serta sebanyak  70%  penyakit  jantung  juga  terjadi akibat trombosis (Atmakusuma et al., 2015).
Wong et  al .,  (2021)  juga  melaporkan  bahwa sebagian  besar  negara  di  Asia  mengalami risiko penyakit jantung koroner (PJK), dengan angka  kematian  bervariasi  dari  103  hingga 366 per 100.000 populasi orang dewasa. Jenis kelamin  pria,  orang  dewasa  yang  lebih  tua, serta  mereka  yang  memiliki  dislipidemia, hipertensi, dan diabetes adalah individu yang berisiko  tinggi.  Selama  dekade  terakhir, terjadi  tren  peningkatan  trombosis  yang signifikan,  terutama  di  Asia  Timur,  di  mana terjadi  peningkatan  yang  mengkhawatirkan, yaitu  117,2  dan  115,3%  dari  total  kematian dan disabilitas yang disesuaikan dengan usia harapan  hidup.  Dengan  demikian  trombosis menjadi salah satu penyebab utama kematian di Asia, termasuk Indonesia. Pemicu terjadinya  trombosis  adalah  perlambatan aliran darah atau stasis, kekentalan darah, dan pembuluh  darah  yang  rusak.  Menurut  Kotb (2014) pada tahun 2020 penyakit kardiovaskular dapat menyebabkan sekitar 25 juta  kematian  per  tahun,  sehingga  terapi antitrombotik  menjadi  kajian  yang  sangat menarik.
Berdasarkan mekanisme kerjanya, agen trombolitik  diklasifikasikan  menjadi  tiga jenis. Pertama adalah aktivator plasminogen, seperti aktivator plasminogen jaringan (t-PA) (Collen  dan  Lijnen,  2004)  dan  urokinase (Duffy, 2002), yang mengaktifkan plasminogen  menjadi  plasmin  aktif  untuk mendegradasi  fibrin.  Jenis  lainnya  adalah plasmin-like  protein  (enzim  pendegradasi fibrin) yang bekerja secara langsung mendegradasi fibrin dalam pembekuan darah, sehingga  dapat  melarutkan  trombus  dengan cepat  dan  sempurna,  serta  antitrombin  yang bekerja  menghambat  kerja  trombin  dalam memotong rantai fibrinogen, sehingga pembentukan  rantai  fibrin  dapat  dihambat. Lumbrokinase dari cacing tanah dan fibrolase dari  bisa  ular  dikenal  sebagai  plasmin-like
protein  (Chen et  al., 1991;  Mihara et  al ., 1991). Meskipun, tissue Plasminogen Activator (t-PA), urokinase, serta streptokinase masih banyak digunakan dalam terapi trombolitik, harganya yang mahal (100 mg  t-PA  adalah  $2.750)  dan  adanya  efek samping yang tidak diinginkan pada penggunaan  streptokinase,  seperti  risiko pendarahan  dalam  usus  ketika  dikonsumsi secara  oral  (Yogesh  dan  Halami,  2017), mendorong berbagai penelitian untuk mencari sumber  agen  trombolitik  yang  lebih  murah dan  lebih  aman  untuk  digunakan  dalam aplikasi medis.
Enzim  fibrinolitik  asal  mikroba  yang diisolasi  dari  pangan  fermentasi  memiliki potensi  yang  signifikan  sebagai  fortifikan makanan dan aplikasi nutraseutikal, sehingga penggunaannya secara efektif dapat mencegah penyakit kardiovaskular. Penelitian mengenai  enzim  dari  mikroba  pangan  telah dilakukan  di  Jepang  pada  produk  tofuyo, skipjack,  dan  natto;  Korea  pada  produk chungkook-jang,  jeot-gal,  dan  doen-jang ; China  pada  produk douchi ,  serta  Indonesia pada  produk  jambal  roti,  ikan  fermentasi, moromi,  oncom  merah  dan  tempe  gembus. Enzim fibrinolitik Nattokinase yang diperoleh dari Bacillus sp. (hasil isolasi dari natto) serta enzim-enzim  yang  serupa  dari  pangan fermentasi lainnya telah dilaporkan memiliki potensi aktivitas fibrinolitik serta bermanfaat bagi kesehatan (Kim et al ., 1997a).
Penelitian  mengenai  enzim  fibrinolitik asal  mikroorganisme  yang  diisolasi  dari pangan  fermentasi  Indonesia  seperti  oncom merah, tempe gembus, moromi, tuak, jambal roti, terasi, serta tempe telah dilakukan secara in  vitro,  in  vivo ,  dan in  silico .  Dari  hasil penelitian  yang  dilakukan,  baik  secara in vitro, in vivo , maupun in silico menunjukkan adanya  bakteri  penghasil  enzim  fibrinolitik pada  pangan  fermentasi  tersebut  yang memiliki  aktivitas  protease  fibrinolitik  yang kuat, antiplatelet, antikoagulan, dan pendegradasi  trombus;  dapat  mendegradasi rantai  fibrinogen;  serta  bekerja  secara langsung  sebagai  enzim  pendegradasi  fibrin maupun  tidak  langsung  sebagai  aktivator plasminogen sehingga semakin efektif dalam melarutkan  trombus.  Meskipun  demikian, kajian  riset  di  Indonesia  mengenai  enzim
fibrinolitik  dari  pangan  fermentasi  masih terbatas, padahal Indonesia memiliki kekayaan  produk  pangan  fermentasi  yang beragam  seperti  tempoyak,  rusip,  pakasam, dadih,  tauco  dan  kefir.  Berbagai  penelitian menyebutkan  beberapa  bakteri Bacillus sp., seperti Bacillus subtilis dan Bacillus coagulans ditemukan secara luas pada produk pangan terfermentasi dan secara historik teruji aman  dikonsumsi  manusia.  Artikel  ini bertujuan  untuk  mengulas  enzim  fibrinolitik mikroba dari berbagai pangan fermentasi Asia serta dampaknya terhadap kesehatan, terutama trombosis.

## METODE
Penelitian  ini  dilakukan  menggunakan metode literature  review  narrative .  Langkah awal  yang  dilakukan  adalah  melakukan pencarian  literatur  ilmiah  yang  diterbitkan antara  tahun  2005  –  2022  yang  terindeks  di dalam  database  jurnal  ilmiah  seperti  Scopus, Pubmed, Google Scholar dan Sinta. Langkah selanjutnya  adalah  melakukan  identifikasi kata  kunci.  Kata  kunci  yang  digunakan berkaitan  dengan  enzim  fibrinolitik,  pangan fermentasi Asia, trombosis, Bacillus sp.,  dan sistem  fibrinolisis.  Langkah  ketiga  adalah melakukan  ulasan  atau  review  pada  abstrak dan  isi  artikel  masing-masing  literatur, dimana pada langkah ini artikel yang memiliki kata  kunci  yang  sesuai  tetapi  abstrak  dan  isi artikel  tidak  sesuai  dengan  tujuan  penelitian akan  dikeluarkan  (exclude).  Pada  langkah terakhir,  dilakukan  sintesis  temuan  dari  isi artikel  dan  diintegrasikan  ke  dalam  naskah publikasi.

## Mekanisme Pembekuan Darah dan Sistem Fibrinolisis
Pembekuan  darah  terjadi  ketika  sel darah  bertemu  dengan  sel-sel  endotelial  atau jika  terjadi  kerusakan  pada  jaringan  kulit. Mekanisme  pembekuan  darah  dapat  dilihat pada  Gambar  1.  Pembekuan  darah  atau prokoagulasi terjadi ketika sel darah bertemu dengan  sel-sel  endotelial  atau  jika  terjadi kerusakan  pada  jaringan  kulit.  Sel-sel endotelial  bersifat  antikoagulan  dan  inert terhadap  faktor-faktor  pembekuan  darah (Escobar  2002).  Namun,  adanya  luka  dapat
mengubah sifat sel endotelial menjadi sangat prokoagulan.
Sifat prokoagulan  sel endotelium menyebabkan  penempelan  trombosit  atau keping  darah  pada  dinding  pembuluh  darah (Katzung, 2018).
Maktriks-matriks subendotel yang bersifat prokoagulan, diantaranya  kolagen,  faktor  von  Willebrand (vWF),  fibrinogen  (FBG),  laminin,  dan fibronektin,  akan  terekspos  dan  matriks protein  subendotelium  akan  terikat  pada reseptor  glikoprotein  (GP)  di  trombosit (Repetto dan De Re, 2017). Gaya gesek pada lokasi  terjadinya  luka  akan  menyebabkan faktor  vWF  terurai  menjadi  konfigurasi berbentuk benang dan mengekspos titik ikatan dari  platelet  GPIbα  dan  memfasilitasi  ikatan antara trombosit dengan vWF (Thielemans et al. 2019). Faktor vWF akan berperan sebagai jembatan  antara  kolagen  endotelium  dengan reseptor  GPIb  di  permukaan  trombosit  dan mendorong  terjadinya  adhesi  (pelekatan) trombosit.  Penempelan  trombosit  ini  diikuti oleh  perubahan  bentuk  trombosit  dan pelepasan adenosin difosfat (ADP).
Pelepasan adenosin difosfat menyebabkan  pecahnya  trombosit-trombosit lain  dan  mulai  menyumbat  lubang  pada pembuluh  darah.  Trombosit  yang  telah  aktif akan  menyediakan  permukaan  fosfolipida yang bertindak sebagai perantara kedua yang akan  mengaktifkan  faktor-faktor  koagulasi darah,  baik  pada  sistem  intrinsik  maupun ekstrinsik. Seiring dengan terjadinya kerusakan pembuluh darah, sistem hemostasis juga  akan  mengalirkan  darah  melalui pembuluh darah lain di sekitar pembuluh yang rusak untuk mempercepat proses pembekuan darah (Escobar 2002). Bekuan darah merupakan  trombosit  yang  saling  terangkai melalui  sejumlah  reaksi  biokimia  dan membentuk  agregat  trombosit  (Escobar 2002). Asam arakidonat dalam trombosit akan diubah menjadi tromboksan A2 (TXA2) yang berfungsi  sebagai  pengaktif  trombosit  dan vasokonstriktor  bersama  ADP  dan  serotonin (5-HT)  (Olson  dan  Bjork,  1994;  Escobar, 2002).
Pengaktifan trombosit mengubah konformasi  pada  reseptor  αIIbβIII  integrin (glikoprotein Iib/IIIa) sehingga mudah mengikat  fibrinogen  dan  membentuk  ikatan silang  antarmolekul  trombosit  sehingga terbentuk agregat trombosit. Agregat trombosit  terdiri  dari  fibrin,  trombosit,  dan sisa-sisa  eritrosit  yang  tidak  larut.  Agregat yang pembentukannya tidak terkendali dapat menyumbat  pembuluh  darah,  serta  dapat menyebabkan  iskemia  jaringan  (Olson  dan Bjork,  1994;  Katzung,  2018).  Serangkaian proses ini disebut hemostasis primer (Tortora dan  Derrickson,  2014).  Hemostasis  primer terdiri  dari  pelekatan  trombosit,  aktivasi trombosit, dan pembentukan sumbatan trombosit (Tortora dan Derrickson, 2014).
Hemostasis  sekunder  didasarkan  pada reaksi  berantai  ( cascade )  koagulasi  melalui faktor  koagulasi  yang  mendorong  terjadinya pembentukan  bekuan  fibrin  sehingga  dapat memperkuat  trombus.  Hemostasis  sekunder terjadi melalui dua jalur yaitu jalur ekstrinsik dan  jalur  intrinsik,  yang  keduanya  akan mengaktifkan  jalur  umum  (Escobar,  2002; Tortora  dan  Derrickson,  2014).  Kedua  jalur tersebut  bertujuan  untuk  membentuk  ikatan silang  fibrin  yang  tidak  larut  dengan mengaktifkan berbagai faktor terutama trombin.  Jalur  pembentukan  bekuan  yang paling  singkat  dimulai  dengan  pengaktifan jalur  ekstrinsik.  Jalur  ekstrinsik  adalah  jalur yang melalui aktivasi faktor pembekuan darah yang dipicu oleh kerusakan dinding endotelial pembuluh  darah  serta  melepaskan  faktor jaringan III (tromboplastin). Selanjutnya, jalur ini  diaktivasi  oleh  faktor  jaringan  VII  dari faktor  jaringan  subendothelial III (TF  III) pada  fibroblas  dan  sel  otot  halus  yang terekspos  oleh  luka  pada  saluran  darah sehingga disebut juga jalur TF. Faktor III dan ion  Ca 2+ mengaktifkan  faktor  VII  menjadi VIIa.  Faktor  VIIa  bersama  dengan  faktor  III dan  ion  Ca 2+ dapat  memproduksi  trombin dalam jumlah kecil dengan sangat cepat yang bertujuan untuk mempercepat pembentukan
Gambar 1. Diagram caescade penggumpalan darah.
Keterangan:  Tanda menunjukkan  pengaktivasian  suatu  komponen;  tanda menunjukkan penghambatan  suatu  komponen.  Keterangan:  XII  (faktor  Hageman,  protease  serin),  XI (tromboplastin plasma), IX (faktor Christmas, protease serin), VII (faktor stabil, protease serin), XIII (faktor  penstabil  fibrin,  enzim  transglutaminase),  PL  (fosfolipid  membran  platelet),  Ca 2+ (ion kalsium), a (komponen dalam bentuk aktif) (Sumber : (Kotb, 2014))
fibrin  melalui  pelepasan  trombosit.  Faktor VIIa ini juga akan mengaktifkan faktor XI dan IX  pada  jalur  intrinsik  (Escobar,  2002).Palta et al. (2014) melaporkan bahwa jalur intrinsik diaktivasi karena adanya kontak dengan dinding sel  endotelium  yang  terluka  dan  tereksposnya kolagen sehingga jalur intrinsik ini juga disebut dengan  jalur  aktivasi  kontak. Jalur  intrinsik diinisiasi  dengan  adanya  pelepasan  senyawa asing yang bermuatan negatif seperti kolagen, dinding  subendotelial,  atau  fosfolipida  yang disekresikan oleh trombosit sehingga mengaktifkan faktor XII menjadi XIIa. Faktor XIIa bersama dengan  faktor Fitzgerald  ( high molecular  weight  kininogen (HMWK))  dan faktor Fletcher (prekallikrein) akan mengaktifkan  faktor  XI  menjadi  Xia. Selanjutnya,  faktor  Xia  dan  ion  Ca 2+ akan mengaktifkan  faktor  IX  menjadi  Ixa.  Ion kalsium juga berperan dalam tahap selanjutnya  pada  jalur  intrinsik  ini,  yaitu ketika  bersama  faktor  Ixa,  VIIa,  dan fosfolipida  faktor  keping  darah  3  ( platelet
factor 3  (PF3))  mengaktifkan  jalur  umum (faktor X menjadi faktor Xa) (Escobar 2002).
Pertemuan jalur intrinsik dan ekstrinsik adalah pembentukan faktor Xa (jalur umum). Faktor koagulasi ini mengkatalisis perubahan protrombin menjadi trombin (faktor Iia) pada jalur  akhir  dengan  bantuan  faktor  Va,  PF3, dan  ion  Ca 2+ (Escobar,  2002).  Trombin mengaktifkan faktor XIII menjadi XIIIa serta memotong  fibrinopeptida  dari  fibrinogen yang  larut  air  menjadi  monomer  fibrin  yang masih  larut  air.  Selanjutnya,  faktor  XIIIa membentuk  ikatan  silang  polimer  fibrin sehingga  menjadi  polimer  fibrin  yang  tidak larut air. Inisiasi reaksi berantai pembentukan bekuan fibrin ini dipengaruhi oleh pengaktifan  faktor-faktor  pembekuan  darah yang  prosesnya  berbentuk  reaksi  berantai (Olson  dan  Bjork  1994;  Katzung  2018). Setiap  reaksi  merupakan  akibat  dari  reaksi sebelumnya.  Jika  satu  di  antara  faktor-faktor tersebut  tidak  dapat  diaktifkan,  maka  akan mengakibatkan pembekuan darah semakin
Gambar 2. Diagram sederhana sistem fibrinolisis.
Keterangan: Tanda
menunjukkan pengaktivasian suatu komponen, tanda
menunjukkan penghambatan suatu komponen (Cesarman-Maus dan Hajjar, 2005) .
lama  atau  terjadi  pendarahan  secara  terus- menerus.
Pada sistem hemostasis normal, setelah pembentukan  sumbatan  trombosit  terdapat regulasi  untuk  mencegah  pembekuan  darah yang  berlebih.  Mekanisme  pengontrolan tersebut  meliputi  aliran  darah  yang  berperan untuk menghilangkan faktor-faktor pembekuan  darah  yang  telah  teraktivasi, pembentukan  prostasiklin  oleh  endotelium yang  berperan  untuk  menghambat  aktivitas trombus, aktivasi fibrinolisis untuk menghancurkan  bekuan  darah,  dan  adanya faktor  penghambat  bekuan  darah.  Sistem hemostasis  yang  tidak  normal  menyebabkan pendarahan yang berlebih atau dapat menyebabkan terjadinya trombosis.
Fibrinolisis  merupakan  proses  dimana bekuan fibrin dipecah menjadi produk-produk yang  bersifat  larut  (Cesarman-Maus  dan Hajjar, 2005). Enzim utama yang bertanggung jawab  terhadap  fibrinolisis  adalah  plasmin yang  memotong mesh /benang-benang  fibrin (bersifat tidak larut) sehingga menjadi produk degradasi fibrin (bersifat larut) yang selanjutnya  dimetabolisme  oleh  hati  dan ginjal.  Pada  kondisi  fisiologis  yang  normal, baik  sistem  koagulasi  maupun  fibrinolisis diatur  secara  tepat  oleh  keberadaan  substrat, aktivator,  kofaktor,  dan  reseptor.  Sistem fibrinolisis tersusun dari proenzim (plasminogen), aktivator plasminogen jaringan  (t-PA)  dan  urokinase  (enzim  yang
secara proteolitik mengaktifkan plasminogen menjadi  plasmin  (enzim  yang  aktif)),  serta beberapa  inhibitor  yang  meregulasi  aktivasi plasminogen, aktivitas plasmin, dan degradasi bertahap dari fibrin (Lijnen, 2001). Mekanisme  aktivasi  dan  penghambatan komponen  utama  dalam  sistem  fibrinolitik ditunjukkan pada Gambar 2.
Proses degradasi pada trombus dibutuhkan agar aliran darah kembali normal. Proses  degradasi  trombus  hanya  terjadi setelah pembuluh darah yang luka mengalami regenerasi.  Dalam  waktu  yang  bersamaan, aktivator  plasminogen  jaringan  (t-PA)  akan disekresikan  oleh  endotelium  dalam  bentuk aktif. Hal ini memicu terjadinya pembentukan plasmin  dari  plasminogen  yang  diaktivasi oleh  aktivator  plasminogen  seperti  aktivator plasminogen jaringan (t-PA), aktivator plasminogen  urokinase  (u-PA),  aktivator plasminogen vaskular, aktivator plasminogen darah,  serta  faktor  Hageman  (Mine et  al., 2005;  Yau et  al,. 2015).  Plasmin  akan memotong  bekuan  fibrin  atau  trombus menjadi  produk  degradasi  fibrin  yang selanjutnya akan dimetabolisme oleh hati dan ginjal  (Gambar  2).  Kelompok  protein  yang diketahui sebagai thrombin activated fibrinolysis inhibitor (TAFI) juga
menghambat kerja plasmin melalui pemotongan  residu  lisin  pada  fibrin  yang dibutuhkan  plasmin  sebagai  sisi  mediasi untuk  fibrinolisis  (Wolberg,  2007).  Selain
TAFI,  pendegradasian  fibrin  juga  diregulasi oleh penghambat dari aktivator plasminogen, seperti  penghambat  aktivator  plasminogen-1
(PAI-1) yang menghambat t-PA dan urokinase,

## Tabel 1. Pangan fermentasi beserta mikroorganisme GRAS penghasil enzim fibrinolitik di wilayah Asia
Mikroorganisme Pangan Enzim Referensi Bacillus subtilis var natto Vegetable cheese, Natto, Jepang Nattokinase (Sumi et al., 1987) Bacillus natto, NK Natto , Jepang Nattokinase (Fujita et al., 1993) Bacillus sp . DJ-4 Doen-jang, Korea Subtilisin DJ-4 (Kim dan Choi, 2000) Bacillus subtilis IMR-NK1 Natto, Jepang Nattokinase (Chang et al., 2012) Bacillus sp. KDO-13 Soybeanpaste , Korea - (Lee et al., 2001) Enterococcus faecalis Tempe , Indonesia E. faecalis BRCA-5 (Yoon et al., 2002) B. amyloliquefaciens DC-4 Fermented soybean, Douchi, China Subtilisin DFE (Peng et al., 2003) Bacillus subtilis KCK-7 Chungkook-jang , Korea Serine protease KCK-7 (Paik et al., 2004) Bacillus sp. DJ- Doen-jang, Korea bpDJ-2 (Choi et al., 2005) Rhizopus chinensis 12 Arak China, China - (Xiao-lan et al., 2005) Bacillus subtilis TP-6 Tempe Tpase (Kim et al., 2006) Bacillus subtilis DC 33 Babao Douchi , China Subtilisin DC33 (Wang et al., 2006) Bacillus vallismortis Ace02 Chungkook-jang , Korea Ace02 (Kim et al., 2007) Fusarium sp. BLB Tempe , Indonesia - (Sugimoto et al., 2007) B. amyloliquefaciens CH51 Fermented soy, Cheonggukjang, Korea AprE51 (Kim et al., 2009) Staphylococcus sp. AJ Fermented Anchovy-jeot , Korea AJ (Choi et al., 2009) B. amyloliquefaciens CH86- 1 Fermented soy, Cheonggukjang, Korea BacillopeptidaseF AprE86-1 (Lee et al., 2010; Kwon et al., 2011) B. amyloliquefaciens Fermented chickpeas , China - (Wei et al., 2011) B. amyloliquefaciens MJ5-41 Fermented soy, Meju, Korea - (Jo et al., 2011) Bacillus subtilis LD-8547 Fermented soybean, Douchi, China Subtilisin DFE (Wang et al., 2008; Yuan et al., 2012) Bacillus pumillus Gembus, Indonesia - (Afifah et al ., 2014a) Bacillus licheniformis Soy flour (Gad et al., 2014)
Bacillus subtilis MH12B1, B. subtilis MH12B3, B. subtilis MH10B5, dan Bacillus amyloliquefaciens MH18B1 Fermented soybean, Hawaijar , India - (Singh et al., 2014) B. amyloliquefaciens FCF-11 Tepung jagung fermentasi FCF-11 (Kotb, 2014) Bacillus subtilis ZA400 Kimchi, Korea BsfA (Ahn et al., 2015) Bacillus weihenstephanensis Vietnamese fermented shrimp paste, Vietnam - (Anh et al., 2015) Bacillus cereus 13 BN Fermented  shrimp  paste , Belacan, Malaysia - (Zakaria et al., 2015) Bacillus subtilis HK176 Fermented soybean, Cheonggukjang, Korea AprE176 (Jeong et al., 2015) B. amyloliquefaciens Vetnamese fermented soybean  paste ,  miso  dan cabai hijau - (Huy et al., 2016) Bacillus megaterium KSK-07 Kishk - (Kotb, 2015) Bacillus subtilis K2 Moromi Indonesia - (Syahbanu et al . , 2020a, Syahbanu et al., 2020b, Syahbanu et al ., 2022)
penghambat aktivator plasminogen-2 (PAI-2) hanya  bekerja  menghambat  urokinase,  serta α 2-  penghambat  plasmin  ( α 2-PI)  yang bekerja  menghambat  plasmin  (Cesarman- Maus dan Hajjar, 2005).

## Enzim Fibrinolitik
Enzim fibrinolitik merupakan kelompok  protease  serin  yang  mampu menghancurkan  bekuan  darah  (fibrin)  dalam berbagai penyakit trombosis. Dalam keadaan normal,  secara  seimbang  tubuh  mengalami pembentukan  bekuan  darah  dan  fibrinolisis dengan menghasilkan plasmin untuk menghidrolisis  fibrin.  Selain  dihasilkan langsung  oleh  tubuh  manusia  (urokinase, aktivator  plasminogen  jaringan),  enzim fibrinolitik  juga  telah  berhasil  diperoleh  dari berbagai  sumber,  yaitu  dari  hewan  (cacing tanah (lumbrokinase) (Nakajima et al. , 1993; Cho et al., 2004; Wu et al., 2007), venom ular (fibrolase)  (Randolph et  al. ,  1992)),  pangan fermentasi ( natto (Nattokinase) (Fujita et al., 1993) dan skipjack ( katsuwokinase ) (Sumi et al., 1995)),  dan  mikroorganisme,  seperti Actinomycetes (Uesugi et  al., 2011),  bakteri (Chang et  al., 2012).  Enzim-enzim  tersebut telah  diproduksi  secara  komersial  untuk pengobatan  yang  dapat  menghancurkan bekuan darah pada trombosis pembuluh darah serta  infark  miokardium  maupun  embolisme paru.  Pengobatan  oleh  enzim  ini  biasanya melalui  intravena  yang  diberikan  segera setelah serangan jantung untuk menghancurkan bekuan darah dalam arteri.
Enzim fibrinolitik yang bersumber dari bahan  pangan  diharapkan  dapat  digunakan sebagai fortifikan makanan dan nutraseutikal yang mencegah terjadinya pengentalan maupun pembekuan darah sehingga mencegah terjadinya penyakit kardiovaskuler (Kotb,  2012).  Protease  fibrinolitik  yang diperoleh  dari  mikroorganisme  mempunyai kelebihan,  yaitu  dapat  diproduksi  dalam jumlah besar, produktifitasnya mudah ditingkatkan  dan  mutunya  lebih  seragam, serta harganya lebih murah (Rao et al. 1998; Stanbury et  al. 2003).  Hal  ini  menyebabkan meluasnya penggunaan mikroorganisme sebagai penghasil enzim.
Aktivitas Enzim Fibrinolitik pada Pangan Fermentasi
Produk  pangan  fermentasi  dihasilkan dengan  melibatkan  aktivitas  mikroba  dalam produksinya. Kandungan senyawa aktif dalam berbagai  pangan  fermentasi  diduga  dapat mempengaruhi  sirkulasi  darah  adalah  enzim protease yang mempunyai aktivitas fibrinolitik.  Data  mengenai  penelitian  yang melaporkan adanya aktivitas fibrinolitik pada berbagai pangan fermentasi Asia ditunjukkan pada Tabel 1.

## Pemanfaatan Enzim Fibrinolitik
Enzim  fibrinolitik  Nattokinase  dari natto memiliki banyak kelebihan diantaranya aman  dikonsumsi  secara  oral,  stabil  dalam gastrointestinal,  memiliki  kemampuan  untuk melewati sistem intestinal, efek sistemik yang berkepanjangan,  serta  peningkatan  produksi endogen  plasmin  dan  agen  penghancur bekuan  darah  lainnya  (Fujita et  al., 1995a). Konsumsi Nattokinase baik secara oral (Sumi et al., 1990; Yamashita et al., 2003) maupun aplikasi  melalui  intravena  (Kamiya et  al., 2010) terbukti meningkatkan aktivitas fibrinolitik  plasma  pada  model  tikus  tanpa menyebabkan terjadinya reaksi alergi, mengaktifkan  produksi tissue-plasminogen activator (tPA)  (Fujita et  al., 1995b),  serta dapat  menghambat plasminogen  activator inhibitor I  (PAI-1)  (Urano et  al., 2001). Suplemen  pangan  fermentasi  kedelai  juga dapat membantu pencegahan kondisi pembekuan  darah  dalam  sistem  sirkulasi (Suzuki et  al. ,  2003;  Kamiya et  al., 2010). Pangan  fermentasi  biasanya  dikaitkan  atau diasosiasikan  dengan  bakteri  asam  laktat, khamir, Bacillus spp.,  dan  kapang,  tetapi jarang  diasosiasikan  dengan Actinomycetes . Sebagian  besar  enzim-enzim  fibrinolitik (yang  telah  dilaporkan  dari  berbagai  studi) dihasilkan  dari  berbagai  strain Bacillus spp. dari beragam jenis produk pangan fermentasi kedelai maupun ikan (Tabel 1).
Kondisi  saat  ini  agen  trombolitik  yang digunakan dalam mengatasi penyakit trombosis  adalah  streptokinase  yang  berasal dari  bakteri Streptococcus  hemolyticus dan Stafilokinase  dari Staphylococcus  aureus . Dua  agen  trombolitik  tersebut  yang  lebih dahulu diketahui efektif untuk terapi trombolitik  (Collen  dan  Lijnen,  2004). Mikroba  penghasil  enzim  fibrinolitik  yang
tergolong kategori GRAS ( Generally Recognized  As  Safe )  telah  menarik  banyak perhatian karena memiliki efek samping yang lebih  sedikit.  Respon  imun  yang  tidak diinginkan seperti reaksi alergi yang disebabkan  oleh  mikroba  penghasil  enzim fibrinolitik  dapat  diatasi  dengan  memilih mikroba  asal  pangan  fermentasi.  Pada umumnya, mikroba yang berasal dari pangan fermentasi  tergolong  GRAS  serta  terbukti aman  digunakan  sebagai  agen  trombolitik (Yoon et  al., 2002;  Mine et  al., 2005; Simkhada et  al., 2010;  Afifah et  al., 2014a; Kurnia et al., 2017; Stephani et al., 2017) Mikroba  khususnya  bakteri  merupakan salah satu sumber enzim fibrinolitik. Bacillus spp.  merupakan  salah  satu  kelompok mikroorganisme yang terkenal dapat memproduksi  enzim  fibrinolitik.  Penemuan Nattokinase  dari  produk  natto,  pangan fermentasi  dari  Jepang  (Sumi et  al. ,  1987; Fujita et al., 1993) yang memiliki efek positif bagi  kesehatan  menyebabkan  para  peneliti melakukan  eksplorasi,  baik  pada  enzim fibrinolitik maupun spesies Bacillus penghasil enzim  fibrinolitik  dari  berbagai  pangan fermentasi.  Sebagian  besar  dari  enzim fibrinolitik  telah  dilaporkan  berasal  dari berbagai Bacillus spp.  dari  beragam  sumber (termasuk  dari  sumber  perairan  tertentu (Mahajan et al., 2010)), seperti B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. cereus, B. firmus, B. sphaericus (Fujita et al., 1993; Kim et al., 1996; Peng et al., 2003; Seo dan  Lee,  2004).  Enzim-enzim  fibrinolitik umumnya  tersebut  tergolong  ke  dalam kelompok  protease  subtilisin  (Peng et  al. 2005).  Enzim  fibrinolitik  yang  berhasil
diisolasi  dari  spesies Bacillus tersebut memiliki  bobot  molekuler  yang  beragam (Tabel  2).  Berdasarkan  pada  Tabel  2,  bobot molekul  enzim  fibrinolitik  yang  diproduksi oleh  genus Bacillus memiliki  kisaran  14-63 kDa.
Enzim dari Bacillus umumnya mendegradasi  fibrin  secara  langsung  karena bersifat sebagai plasmin-like protein . Banyak Bacillus probiotik yang tersedia komersial di pasaran  serta  memiliki  kemampuan  dalam menghasilkan enzim fibrinolitik yang merupakan  suatu  nilai  tambah  fungsional untuk  bakteri  probiotik.  Hal  ini  disebabkan, beberapa  genus  dari Bacillus spp.  yang bersifat food grade yang memiliki kemampuan  untuk  menghasilkan  enzim fibrinolitik  tersebut  dapat  digunakan  dalam formulasi pangan fungsional. Oleh karena itu, strain Bacillus probiotik  perlu  dipilah  untuk kemampuan  dalam  menghasilkan  enzim fibrinolitik  sebagai  nilai  tambah  yang menguntungkan (Duc et al. 2004; Yogesh dan Halami 2017). Enzim fibrinolitik mendegradasi fibrin melalui proses enzimatik dan biokimia. Ada berbagai enzim yang saat ini  digunakan  sebagai  pengobatan  untuk CVD,  seperti  streptokinase,  nattokinase, staphylokinase, dan urokinase. Selain sebagai agen anti-trombosis, berdasarkan hasil in vitro dari  beberapa  peneliti  juga  menunjukkan bahwa  enzim  fibrinolitik  seperti  nattokinase berpotensi  sebagai  anti-hipertensi,  anti- aterosklerosis,  antiplatelet,  dan  pelindung saraf (Chen et al ., 2018), anti-alzheimer (Fadl et al ., 2013), anti-diabetes (Araki et al ., 2020), dan antioksidan (Amin et al ., 2020).
Tabel  2. Spesies Bacillus dengan  enzim  fibrinolitik  beserta  metode  produksi  enzim,  bobot molekuler, nilai pI dan pH optimum, serta suhu optimum
Bacillus sp. Enzim Fibrinolitik Metode Produksi Enzim Fibrinolitik Bobot Molekul, pI, pH, dan Suhu Optimum Referensi Bacillus subtilis Nattokinase Media  produksi :  Tryptic  Soy broth Lama fermentasi : 48 jam pada shaking incubator 150 rpm Suhu fermentasi : 370C 27.7 kDa, pI 8.6 (Sumi et al. 1987)
Bacillus sp. Enzim Fibrinolitik Metode Produksi Enzim Fibrinolitik Bobot Molekul, pI, pH, dan Suhu Optimum Referensi Bacillus subtilis 168 Vpr dan Wpr Media produksi : Luria Bertani broth Lama fermentasi : 12 jam pada shaking incubator 120 rpm
Suhu fermentasi : 37
0 C 63 kDa dan 52 kDa (Park et al. 2002) Bacillus subtilis QK-02 QK1 dan QK2 Media produksi : Luria Bertani broth
Lama fermentasi : 12 jam pada shaking incubator 120 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 42 kDa dan 28 kDa, pH 8.5, 55 °C (Ko et al. 2004) Bacillus subtilis A26 Subtilisin BSF1 Media  produksi :  ST  medium (5  g  Bacto-tryptone,  5  g  NaCl
and  5  g  Na  HPO  per  liter  of soybean  extract  solution,  pH
7.5) Lama  fermentasi :  24-48  jam pada rotary shaker 120 rpm Suhu fermentasi : 37 0 C pH 9.0, 60 °C (Agrebi et al. 2009a;
Agrebi et al. 2009b) Bacillus subtilis KCK-7 KCK-7 Media produksi : culture broth (5%  soluble  starch,  0.5%
cellobiose,  0,3%  beef  extract, 0.5% pepton, 0.02% Na 2 HPO 4 , 2% raw soybean meal )
Lama fermentasi : 48 jam pada
rotary shaker 150 rpm Suhu fermentasi : 37 0 C 45 kDa, pH 7.0, 60 °C (Paik et al. 2004) Bacillus subtilis TP-6 TPase Media produksi : nutrient  broth (pH  7.0)  terdiri
dari  5  soytone,  5  beef  extract, dan 20 g xylose Lama fermentasi : 48 jam pada fermentor 1,000  rpm,  laju
aerasi 1 vol/vol/menit Suhu fermentasi : 37 0 C 27.5 kDa (Kim et al. 2006) Bacillus subtilis DC33 Media produksi : 14 g/l tryptone,  2  g/l  galactose,  1  g/l
KH 2 PO 4 , 2 g/l Na 2 HPO 4 , 0.2 g/l MgSO 4 ,  3  g/l  CaCO 3 ,  0.01  g/l FeCl 3 ,  dan  0.01  g/l  LiSO 4 ;  pH 7.2
Lama fermentasi : 72 jam pada shaking incubator 140 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C pI 8.7, pH 8.0, 55 °C (Wang et al. 2006) Bacillus subtilis LD-8547 LD8547 Media  produksi : rice  powder 5%, soybean  powder 4%,
NH 4 NO 3 0.5%,  CaC1 2 0.01%, MgSO4  0.7%,  K 2 HPO 4 0.4%, KH 2 PO 4 0.2%; pH 7.0 Lama fermentasi : 72 jam pada shaking incubator 400 rpm
Suhu fermentasi : 35 0 C
pH 8.0, 50 °C
(Wang et al. 2008)
Bacillus sp. Enzim Fibrinolitik Metode Produksi Enzim Fibrinolitik Bobot Molekul, pI, pH, dan Suhu Optimum Referensi Bacillus subtilis K42 Co 2+ Metalloprotease K42 Media produksi : 1% galactose,  0.5%  NaCl,  0.5%
CaCO3,  0.5%  tryptone,  0.3% soybean,  0.15%  MgSO 4 .7H 2 O,
0.08% KH 2 PO 4 , 0.02% K 2 HPO 4 ,  0.005%  CuSO 4 dan 0.001% FeSO 4 ; pH 6
Lama fermentasi : 54 jam pada rotatory shaker 200 rpm Suhu fermentasi : 37 0 C 20.5 kDa, pH 9.4, 40-65 °C (Hassanein et al. 2011)
Bacillus subtilis A1 Bacillokinase II
Media produksi : Luria Bertani broth Lama fermentasi : 24 jam pada shaking incubator 120 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 31.4 kDa (Jeong et al. 2004) Bacillus subtilis BR21 Multiple proteases Media produksi : Luria Bertani broth
Lama fermentasi : 24 jam pada shaking incubator 100 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 14, 21, 35, dan 46 kDa (Yogesh dan Halami 2015) Bacillus subtilis YJ1 Nattokinase Media produksi: 1%  skim  milk,  1%  rice  husk, 0.5% NaCl, and 0.25% glucose Lama fermentasi : 96 jam pada shaking incubator 150 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 27.5 kDa (Yin et al . 2010) B. amyloliquefaciens CH51 AprE51 Media  produksi :  Tryptic  Soy broth Lama fermentasi : 48 jam pada shaking incubator 150 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 27 kDa (Kim et al. 2009) B. amyloliquefaciens MJ5-41 AprE5-41 Media produksi : Luria Bertani broth
Lama fermentasi : 24 jam pada shaking incubator 120 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 27 kDa, pH 7.0, 45 °C (Jo et al. 2011a)
B. amyloliquefaciens
LSSE-62 Subtilisin DJ-4 Media  produksi :  10  g/L maltose, 8.28 g/L soy peptone, 0.74 g/L yeast extract, 0.64 g/L
CaCl 2. 2H 2 O,  1  g/L  K 2 HPO 4 . 3H 2 O,  dan  0.5  g/L  MgSO 4 . 7H 2 O; pH 7.2
Lama fermentasi : 48 jam pada shaking incubator 180 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 29 kDa (Wei et al. 2011)
B. amyloliquefaciens
DC-4 Subtilisin DFE Media produksi : 2%  fibrin,  0.5%  peptone,  2% dextrin,  0.15%  yeast  extract, 0.4% K 2 HPO 4 , 0.04%
NaH 2 PO 4 ,  0.3%  CaCO3;  pH 7.2 Lama fermentasi : 72 jam pada
shaking incubator 210 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 28 kDa, pI 8, pH 10, 48 °C (Peng et al. 2003)
Bacillus sp. Enzim Fibrinolitik Metode Produksi Enzim Fibrinolitik Bobot Molekul, pI, pH, dan Suhu Optimum Referensi B.amyloliquefaciens FCF-11 FCF-11 Media produksi : 2 % corn husk, 0.1 % MgSO 4 . 7H 2 O,  0.08  %  KH 2 PO 4 ,  dan 0.02 % K 2 HPO 4 ; pH 6.5 Lama fermentasi : 72 jam pada shaking incubator 120 rpm
Suhu fermentasi : 40 0 C 18.2 kDa, pH 8, 40 °C (Kotb 2014) B. licheniformis KJ- 31 bpKJ 31 Media produksi : Luria Bertani broth Lama fermentasi : 24 jam pada shaking incubator 120 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 37 kDa (Hwang et al. 2007) B. licheniformis CH3-17 AprE3-17 Media  produksi :  Tryptic  Soy broth
Lama  fermentasi :  48  jam pada jar  fermenter laju  alir udara sebesar 1 vol/vol/menit
Suhu fermentasi : 37 0 C 27 kDa, pH 6.0 (Jo et al. 2011b) Bacillus sp. DJ-4 Subtilisin DJ-4 Media produksi : Luria-Bertani  (MLB)  medium (1% Bacto trypton, 0.5% Bacto yeast  extract,  5%  NaCl  and 2.5% glucose Lama  fermentasi :  12  jam pada bioreactor Suhu fermentasi : 37 0 C 29 kDa, pH 10, 40 °C (Kim dan Choi 2000) Bacillus sp. KA 38 Enzim Jeot gal Media produksi : Luria Bertani broth Lama fermentasi : 24 jam pada shaking incubator 120 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 41 kDa, pH 7, 40 °C (Kim et al. 1997) B. vallismortis Ace02 Ace02 Media produksi : 20 g dextrin, 20  g  soybean  meal,  5  g  yeast extract,  0.2  g  MgSO 4 .  7H 2 O, 0.2  g  CaCl 2 ,  2  g  K 2 HPO 4 ,  dan 0.2 g Na 2 HPO 4 ; pH 7.0 Lama  fermentasi :  48  jam pada jar  fermenter laju  alir udara  sebesar  1  vol/vol/menit ,
30% air saturation
Suhu fermentasi : 37 0 C 28 kDa (Kim et al. 2007) Bacillus sp. AS- S20-I Bafibrinase Media  produksi :  Tryptic  Soy broth Lama fermentasi : 48 jam pada shaking incubator 150 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 32.3 kDa, pH 7.4, 37 °C (Mukherjee et al. 2012) Bacillus spharicus Thrombinase Media produksi : nutrient  yeast  salt  medium (NYSM)
Lama  fermentasi : 7  jam  pada shaking incubator 200 rpm
Suhu fermentasi : 30 0 C 18.6 kDa (Balaraman dan Prabakaran 2007) Bacillus sp. CK-11 CK Media  produksi :  media  basal yang mengandung 0.3% ekstrak  daging  sapi,  0.5% pepton,  1%  soya,  dan  1% kasein  susu;  pH  disesuaikan 28.2 kDa; pH 10, 70 °C (Kim et al. 1996)
Bacillus sp. Enzim Fibrinolitik Metode Produksi Enzim Fibrinolitik Bobot Molekul, pI, pH, dan Suhu Optimum Referensi menjadi  7.0  dengan  1  M  HCl atau 1 M NaOH. Lama fermentasi : 16 jam pada jar  fermenter laju  alir  udara sebesar 1 vol/vol/menit Suhu fermentasi : 40 0 C Bacillus sp. DJ-2 bpDJ-2 Media  produksi :  Tryptic  Soy broth Lama fermentasi : 48 jam pada shaking incubator 150 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 42 kDa, pI 3.5–3.7, pH 9, 60 °C (Choi et al. 2005) Bacillus pumilus Protease serin kelompok subtilisin Media produksi : Luria Bertani broth
Lama fermentasi : 24 jam pada shaking incubator 120 rpm
Suhu fermentasi : 37 0 C 20 kDa, pH 7, 50 °C (Afifah et al. 2014b) Bacillus subtilis K2 Protease serin kelompok subtilisin Media produksi : Luria Bertani broth
Lama fermentasi : 24 jam pada shaking incubator 120 rpm Suhu fermentasi : 37 0 C 26 kDa, pH 7 (Syahbanu et al . 2020a, Syahbanu et al. 2020b)

## KESIMPULAN
Fibrin  adalah  komponen  protein  utama dari  bekuan  darah  dan  terbentuk  dari fibrinogen  oleh  trombin.  Kondisi  saat hemostasis  yang  terganggu,  akumulasi  fibrin dalam  pembuluh  darah  dapat  meningkatkan peluang  terjadinya  trombosis  menyebabkan infark  miokard  dan  penyakit  kardiovaskular. Bekuan  fibrin  dilisis  dengan  plasmin,  yang diaktifkan  dari  plasminogen  oleh  aktivator plasminogen jaringan (tPA). Agen trombolitik yang umum digunakan untuk tujuan therapeutic  yaitu  urokinase  dan  aktivator plasminogen jaringan (tPA). Kedua aktivator ini  berasal  dari  manusia  dan  aman  untuk digunakan,  tetapi  harganya  mahal.  Enzim fibrinolitik  dari Bacillus sp.  lebih  dipilih sebagai  agen  trombolitik  karena  bekerja efisien  dalam  proses  fibrinolitik  termasuk dapat  bekerja  untuk  mengaktifkan  plasmin. Subtilisin dari Bacillus sp. telah diidentifikasi memiliki  aktivitas  protease  yang  spesifik. Para  peneliti  telah  mengidentifikasi  enzim fibrinolitik  dari Bacillus sp.  strain  CK  11-4,
yang  diisolasi  dari  pangan  fermentasi  kecap kedelai  fermentasi  Korea.  Enzim  fibrinolitik juga  dimurnikan  dan  dikarakterisasi  dari Bacillus sp.  KA  38,  yang  berasal  dari  ikan fermentasi, serta dari Indonesia berupa enzim fibrinolitik asal Bacillus subtilis yang berhasil diisolasi  dari  tempe  gembus  dan  moromi. Studi  ini  relevan  dengan  bahan  baku  pangan sehat  yang  berasal  dari  pangan  fermentasi. Pangan  fermentasi  tradisional  Asia  ini  dapat menjadi  sumber  enzim  fibrinolitik  yang dimanfaatkan untuk terapi trombolitik. Potensinya  dalam  melarutkan  bekuan  fibrin membuka peluang pangan fermentasi sebagai sumber  enzim  fibrinolitik  alternatif  yang digunakan dalam penanganan penyakit kardiovaskular.  Enzim  ini  memiliki  potensi signifikan  untuk  fortifikasi  makanan  dan aplikasi nutraceutical, sehingga penggunaannya  dapat  mencegah  penyakit kardiovaskular  akan  lebih  efektif.  Enzim fibrinolitik  untuk  keperluan  medis  sangat mahal,  menilik  potensi  pangan  fermentasi maka dimungkinkan produksi enzim
fibrinolitik  dalam jumlah besar dengan bahan yang lebih mudah ditemukan dan efisien.

## DAFTAR PUSTAKA
[WHO]  World  Health  Organization.  (2021). Cardiovascular  diseases  (CVDs),  2022. https://www.who.int/news-room/fact- sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds). [11 Januari 2023].
Abusham,  R.A.K.,  Masomian,  M.,  Salleh,  A.B., Leow,  A.T.C.,  Abd  Rahman,  R.N.Z.R. (2019). An in-Silico Approach to Understanding  the  Structure-Function:  A Molecular  Dynamics  Simulation  Study  of Rand  Serine  Protease  Properties  from Bacillus  subtilis in  Aqueous  Solvents. Adv.
Biotechnol. Microbiol. 12(1):009–
0017.doi:10.19080/aibm.2019.12.555834.
Afifah,  D.N.,  Sulchan,  M.,  Syah,  D.,  Yanti, Suhartono,  M.T.  (2014).  Isolation  and identification  of  fibrinolytic  protease- producing microorganisms from Red Oncom and Gembus, Indonesian fermented soybean cakes. Malays.  J.  Microbiol. 10(4):273– 279.doi:10.21161/mjm.61914.
Afifah,  D.N.,  Sulchan,  M.,  Syah,  D.,  Yanti, Suhartono, M.T., Kim, J.H.  (2014). Purification  and  characterization  of  a fibrinolytic  enzyme  from  Bacillus  pumilus 2.g  isolated  from  gembus,  an  Indonesian fermented  food. Prev.  Nutr.  Food  Sci.
19(3):213– 219.doi:10.3746/pnf.2014.19.3.213.
Agrebi,  R.,  Haddar,  A.,  Hajji,  M.,  Frikha,  F., Manni,  L.,  Nasri,  M.  (2009).  Fibrinolytic enzymes  from  a  newly  isolated  marine bacterium Bacillus subtilis A26 :
characterization and statistical media optimization. Can.  J.  Microbiol. 55:1049– 1061.doi:10.1139/W09-057.
Agrebi,  R.,  Haddar,  A.,  Hmidet,  N.,  Jellouli,  K.,
Manni,  L.,  Nasri,  M.  (2009).  BSF1 fibrinolytic enzyme from a marine bacterium Bacillus subtilis A26: Purification, biochemical and molecular characterization. Process Biochem. 44(11):1252– 1259.doi:10.1016/j.procbio.2009.06.024.
Ahn,  M.,  Ku,  H.,  Lee,  S.,  Lee,  J.  (2015). Characterization  of  a  novel  fibrinolytic enzyme, bsfa, from Bacillus subtilis ZA 400 in  kimchi  reveals  its  pertinence  to thrombosis treatment. J. Microbiol. Biotechnol. 25(12):2090–
2099.doi:10.4014/jmb.1509.09048.
Amin, K., Zeng, X., You, Y., Hu, Y., Sun, H., Lyu,
B.,  Piao,  C.  and  Yu,  H.,  2020.  Enhanced thermostability  and  antioxidant  activity  of Nattokinase  by  biogenic  enrichment  of selenium. Journal of Food Measurement and Characterization, 14(4): 2145-2154.
Anh,  D.B.Q.,  Mi,  N.T.T.,  Huy,  D.N.A.,  Hung, P.Van. (2015). Isolation and Optimization of Growth  Condition  of Bacillus sp  .  from Fermented Shrimp Paste for High Fibrinolytic  Enzyme  Production. Arab.  J. Sci.  Eng. 40:23–28.doi:10.1007/s13369- 014-1506-8.
Arai, K., Mimuro, J., Madoiwa, S., Matsuda, M., Sako,  T.,  Sakata,  Y.  (1995).  Effect  of staphylokinase
concentration of plasminogen  activation. Biochim.  Biophys.
Acta . 1245:69–75.doi:10.1016/0304- 4165(95)00064-i.
Araki,  R.,  Fujie,  K.,  Yuine,  N.,  Watabe,  Y., Maruo,  K.,  Suzuki,  H.  and  Hashimoto,  K., 2020.  The  possibility  of  suppression  of increased  postprandial  blood  glucose levels by  gamma-polyglutamic  acid-rich  natto  in the  early  phase  after  eating:  a  randomized crossover pilot study. Nutrients, 12(4): 915.
Ariëns, R.A.S. (2013). Fibrinogen) and thrombotic  disease. J.  Thromb.  Haemost. 11(SUPPL.1):294–
305.doi:10.1111/jth.12229.
Astrup,  T., Miillertz,  S.  (1952).  The  Fibrin  Plate
Method for Estimating Fibrinolytic Activity. Arch. Biochem. Biophys. 40:346– 351.doi:10.1016/0003-9861(52)90121-5.
Atmakusuma, T.D., Tambunan, K.L., Sukrisman, L., Effendi, S., Rachman, A., Setiawati, A., Rinaldi,  I.,  Mulansari,  N.A.,  Rajabto,  W., Nasution,
S.A,
et al. (2015).
Underutilization of anticoagulant for venous thromboembolism  prophylaxis  in  three hospitals  in  Jakarta. Acta  Med.  Indones.
47(2):136–145.
Balaraman, K., Prabakaran, G. (2007). Production
&  purification  of  a  fibrinolytic  enzyme (thrombinase  )  from Bacillus  sphaericus . Indian J. Med. Res. 126:459–464.
Bornikova, L., Peyvandi, F., Allen, G., Bernstein, J., Manco-Johnson, M.J. (2011). Fibrinogen replacement therapy for congenital fibrinogen deficiency. J. Thromb. Haemost. 9(9):1687–1704.doi:10.1111/j.1538-
7836.2011.04424.x.
Cesarman-Maus,  G.,  Hajjar,  K.A.  (2005). Molecular mechanisms of fibrinolysis. Br. J. Haematol. 129(3):307–
321.doi:10.1111/j.1365-2141.2005.05444.x. Chakraborty,  N.,  Besra,  A.,  Basak,  J.  (2020). Molecular  Cloning  of  an  Amino  Acid Permease Gene and Structural
Characterization  of  the  Protein  in  Common Bean  ( Phaseolus  vulgaris L  .). Mol. Biotechnol. (0123456789).doi:10.1007/s120
33-020-00240-4.
Chang,  C.,  Fan,  M.,  Kuo,  F.,  Sung,  H.  (2000). Potent  Fibrinolytic  Enzyme  from  a  Mutant of Bacillus  subtilis IMR-NK1. J.  Agric. Food Chem. 48(8):3210– 3216.doi:10.1021/jf000020k.
Chang,  C.T.,  Wang,  P.M.,  Hung,  Y.F.,  Chung, Y.C.  (2012).  Purification  and  biochemical properties  of  a  fibrinolytic  enzyme  from Bacillus  subtilis -fermented  red  bean. Food Chem.
133(4):1611–
1617.doi:10.1016/j.foodchem.2012.02.061.
Chen, H.M., Guan, A.L, Marklands, F.S. (1991).
Immunological properties of the fibrinolytic enzyme (fibrolase) from southern copperhead (Agkistrodon contortrix
contortrix)  venom  and  its  purification  by immunoaffinity  chromatography. Toxicon . 29(6):683–694.doi:10.1016/0041- 0101(91)90060-5.
Chen,  H.,  McGowan,  E.M.,  Ren,  N.,  Lal,  S., Nassif, N., Shad-Kaneez, F., Qu, X. and Lin, Y., 2018. Nattokinase: a promising alternative  in  prevention  and  treatment  of cardiovascular diseases. Biomarker insights,
13, p.1177271918785130.
Cho, I.H., Choi, E.S., Lee, H.H. (2004). Molecular cloning,  sequencing,  and  expression  of  a fibrinolytic  serine-protease  gene  from  the earthworm Lumbricus rubellus . J. Biochem. Mol. Biol. 37(5):574– 581.doi:10.5483/bmbrep.2004.37.5.574.
Cho,  I.H.,  Choi,  E.S.,  Lim,  H.G.,  Lee,  H.H. (2004). Purification and Characterization of Six  Fibrinolytic  Serine-Proteases  from Earthworm Lumbricus rubellus. J. Biochem. Mol. Biol. 37(2):199– 205.doi:10.5483/bmbrep.2004.37.2.199. Choi, N.S., Ki-Hyun, Y., Hahm, J.H., Yoon, K.S., Chang,  K.T.,  Hyun,  B.H.,  Pil,  J.M.,  Kim S,H. (2005). Purification
and characterization  of  a  new  peptidase, bacillopeptidase  DJ-2,  having  fibrinolytic
activity: produced by Bacillus sp. DJ 2 from Doen-Jang. J. Microbiol. Biotechnol. 15(1):72–79.
Choi,  N.S.,  Song,  J.J.,  Chung,  D.M.,  Kim,  Y.J.,
Maeng, P.J., Kim, S.H. (2009). Purification and characterization of a novel thermoacid- stable fibrinolytic enzyme from Staphylococcus sp.  strain  AJ  isolated  from Korean salt-fermented Anchovy-joet. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 36(3):417–
426.doi:10.1007/s10295-008-0512-9.
Collen,  D.,  Lijnen,  H.R.  (2004).  Tissue-type plasminogen activator : a historical perspective  and  personal  account. J. Thromb. Haemost. 2(4):541– 546.doi:10.1111/j.1538-7933.2004.00645.x.
La  Corte,  A.L.C.,  Philippou,  H.,  Arins,  R.A.S.
(2011). Role of fibrin structure in thrombosis and  vascular  disease .  Ed  ke-1  Volume  ke- 83. Elsevier Inc.
Dabbagh,  F.,  Negahdaripour,  M.,  Berenjian,  A.,
Behfar,  A.,  Mohammadi,  F.,  Zamani,  M., Irajie, C., Ghasemi, Y. (2014). Nattokinase: production and application. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98(22):9199– 9206.doi:10.1007/s00253-014-6135-3.
Delange,  R.J.,  Smith,  E.L.  (1968).  Subtilisin Carlsberg :  Amino  acid  composition, isolation, and composition of peptides from the  tryptic  hydrolysate. J.  Biol.  Chem.
243(9):2134–2143.
DeLano  WL.  2002.  Pymol:  An  open-source molecular  graphics  tool. CCP4  Newsl. Protein Crystallogr. 40:82–92.
Duc, L.H., Hong, H.A., Barbosa, T.M., Adriano, O., Cutting, S.M. (2004). Characterization of Bacillus  Probiotics  Available  for  Human Use. Appl. Environ. Microbiol. 70(4):2161– 2171.doi:10.1128/AEM.70.4.2161.
Duffy,  M.J.  (2002).  Urokinase  Plasminogen Activator  and  Its  Inhibitor,  PAI-1,  as Prognostic Markers in Breast Cancer : From Pilot  to  Level  1  Evidence  Studies. Clin. Chem. 48(8):1194–1197.
Escobar, C. (2002). Ioteknologi & iosains. Dalam Harmening  DM  (ed). Clinical  Hematology and  Fundamentals  of  Hemostasis .  Ed  ke-4. FA Davis, Philadelphia (US).
Fadl, N.N., Ahmed, H.H., Booles, H.F. and Sayed, A.H.,  2013.  Serrapeptase  and  nattokinase intervention  for  relieving  Alzheimer’s disease  pathophysiology  in  rat  model.
Human  &  experimental  toxicology,  32(7): 721-735.
Fan, Q., Wu, C., Li, L., Fan, R., Wu, C., Hou, Q., He,  R.  (2001).  Some  features  of  intestinal absorption of intact fibrinolytic enzyme III- 1  from Lumbricus  rubellus. Biochim. Biophys.  Acta  -  Gen.  Subj. 1526(3):286– 292.doi:10.1016/S0304-4165(01)00140-4.
Fujita,  M.,  Hong,  K.,  Ito,  Y.,  Misawa,  S., Takeuchi,  N.,  Kariya,  K.,  Nishimuro,  S. (1995).  Transport  of  nattokinase  across  the rat  intestinal  tract. Biol.  Pharm.  Bull.
18(9):1194–1196.doi:10.1248/bpb.18.1194.
Fujita,  M.,  Ito,  Y.,  Hong,  K.,  Nishimuro,  S. (1995).  Characterization  of  nattokinase- degraded products from human fibrinogen or cross-linked fibrin. Fibrinolysis and Proteolysis . 9(3):157– 164.doi:10.1016/S0268-9499(95)80005-0.
Fujita, M., Nomura, K., Hong, K., Ito, Y., Asada, A.,  Nishimuro,  S.  (1993).  Purification  and characterization  of  a  strong  fibrinolytic enzyme  (Nattokinase)  in  the  vegetable cheese  Natto,  a  popular  soybean  fermented food  in  Japan. Biochem.  Biophys.  Res. Commun. 197(3):1340– 1347.doi:10.1006/bbrc.1993.2624.
Fuka,  M.M.,  Engel,  M.,  Haesler,  F.,  Welzl,  G., Munch, J.C., Schloter, M. (2008). Diversity of  proteolytic  community  encoding  for subtilisin  in  an  arable  field:  Spatial  and temporal  variability. Biol.  Fertil.  Soils . 45(2):185–191.doi:10.1007/s00374-008- 0319-x.
Furlan,  M.  (1988).  Structure  of  fibrinogen  and fibrin.  Dalam  J.  L.  Francis  (ed.)  in Fibrinogen, Fibrin Stabilization, and Fibrinolysis:  Clinical,  Biochemical  and Laboratory  Aspects .  Ed  ke-4  hlm.  17–64. Ellis Horwood, Ltd., New York, USA.
Gad,  R.G.  (2014).  Fibrinolytic  enzyme  from Bacillus  amyloliquefaciens:  optimisation and scale up studies. Int. J. Pharm. Pharm. Sci. 6(10):370–378.
Gardner, M.L.G. (1988). Gastrointestinal absorption  of  intact  proteins. Annu.  Rev.
Nutr. 8:329– 350.doi:10.1146/annurev.nu.08.070188.001 553.
Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M.R., Appel, R.D., Bairoch, A. (2005).  Protein  Identification  and  Analysis Tools  on  the  ExPASy  Server.  Dalam  Walk
JM  (ed.)  in The  Proteomics  Protocols Handbook .  hlm.  571–608.  Humana  Press Inc., Totowa, NJ.
Geer, L.Y., Domrachev, M., Lipman, D.J., Bryant, S.H. (2002). CDART: Protein homology by domain architecture. Genome Res.
12(10):1619–1623.doi:10.1101/gr.278202.
Gholami,  A.,  Shahin,  S.,  Mohkam,  M.,  Nezafat,
N., Ghasemi, Y. (2015). Cloning, Characterization and Bioinformatics
Analysis of Novel Cytosine Deaminase from Escherichia  coli  AGH09. Int.  J.  Pept.  Res. Ther. 21(3):365–374.doi:10.1007/s10989- 015-9465-9.
Głowacka,  A.E.,  Podstawka,  E.,  Szczȩsna- Antczak, M.H., Kalinowska, H., Antczak, T. (2005). Kinetic and molecular properties of Bacillus  subtilis  IBTC-3  subtilisin. Comp.
Biochem.  Physiol.  -  B  Biochem.  Mol.  Biol. 140(2):321–
331.doi:10.1016/j.cbpc.2004.10.015.
Hassanein, W., Kotb, E., Awny, N., El-Zawahry, Y.  (2011).  Fibrinolysis  and  anticoagulant potential of a metallo protease produced by Bacillus  subtilis K42. J.  Biosci. 36:773– 779.doi:10.1007/s12038-011-9151-9.
Hill,  M.,  Dolan,  G.  (2008).  Diagnosis,  clinical features  and  molecular  assessment  of  the dysfibrinogenaemias. Haemophilia . 14(5):889–897.doi:10.1111/j.1365- 2516.2008.01795.x.
Huy, D., Hao, P., Hung, P. (2016). Screening and identification  of  Bacillus  sp.  isolated  from traditional  Vietnamese  soybean-fermented products  for  high  fibrinolytic  enzyme production. 23(1):326–331.
Hwang,  K.J.,  Choi,  K.H.,  Kim,  M.J.,  Park,  C.S.,
Cha, J. (2007). Purification and characterization  of  a  new  fibrinolytic enzyme  of Bacillus  licheniformis KJ-31, isolated from Korean traditional Jeot-gal. J.
Microbiol. Biotechnol. 17(9):1469–1476.
Ismail,  D.,  Harun,  S.,  Alwi,  I.,  Tambunan,  K.L., Effendy,  S.  (2002).  Anti-thrombin  III, Protein C, and Protein S deficiency in acute coronary  syndrome. Med.  J.  Indones. 11(2):87–92.doi:10.13181/mji.v11i2.54.
Jain, S.C., Shinde, U., Li, Y., Inouye, M., Berman, H.M.  (1998).  The  crystal  structure  of  an autoprocessed Ser221Cys-subtilisin E-
propeptide  complex  at  2.0  Å  resolution. J. Mol. Biol. 284(1):137– 144.doi:10.1006/jmbi.1998.2161.
Jang,  J.S.,  Kang,  D.O.,  Chun,  M.J.,  Byun,  S.M.
(1992).  Molecular  cloning  of  a  subtilisin  J gene  from  Bacillus  stearothermophilus  and its expression in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 184(1):277– 282.doi:10.1016/0006-291X(92)91189-W.
Jeong, S.J., Kwon, G.H., Chun, J., Kim, J.S., Park, C.,  Kwon,  D.A.E.Y.,  Kim,  J.H.  (2007). Cloning of Fibrinolytic Enzyme Gene from Isolated from and Its Expression in Protease- deficient  Strains. J.  Microbiol.  Biotechnol.
17(6):1018–1023.
Jeong, S., Heo, K., Park, J., Lee, K., Park, J., Joo, S.,  Kim,  J.  (2015).  Characterization  of
AprE176,  a  Fibrinolytic  Enzyme  from
Bacillus  subtilis  HK176. J.  Microbiol.
Biotechnol. 25(1):89– 97.doi:dx.doi.org/10.4014/jmb.1409.09087.
Jeong,  Y.K.,  Kim,  J.H.,  Gal,  S.W.,  Kim,  J.E., Park,  S.S.,  Chung,  K.T.,  Kim,  Y.H.,  Kim, B.W., Joo, W.H. (2004). Molecular cloning and characterization of the gene encoding a fibrinolytic  enzyme  from  Bacillus  subtilis Strain  A1. World  J.  Microbiol.  Biotechnol. 20(7):711–717.doi:10.1007/s11274-003- 4514-5.
Jo, H.D., Lee, H.A., Jeong, S., Kim, J.H. (2011).
Purification and Characterization of a Major Fibrinolytic Enzyme from Bacillus amyloliquefaciens  MJ5-41  Isolated  from Meju. J. Microbiol. Biotechnol. 21(11):1166–
1173.doi:10.4014/jmb.1106.06008.
Jo,  H.D.,  Kwon,  G.H.,  Park,  J.Y.,  Cha,  J.,  Song, Y.S.,  Kim,  J.H.  (2011).  Cloning  and overexpression  of  aprE3-17  encoding  the major  fibrinolytic  protease  of  Bacillus licheniformis CH 3-17. Biotechnol. Bioprocess Eng. 16(2):352– 359.doi:10.1007/s12257-010-0328-0.
Juan,  M.,  Chou,  C.  (2010).  Enhancement  of antioxidant  activity  ,  total  phenolic  and flavonoid content of black soybeans by solid state  fermentation  with  Bacillus  subtilis BCRC  14715. Food  Microbiol. 27(5):586– 591.doi:10.1016/j.fm.2009.11.002.
Kamiya,  S.,  Hagimori,  M.,  Ogasawara,  M., Arakawa,  M.  (2010). In  vivo evaluation method  of  the  effect  of  nattokinase  on carrageenan-induced tail thrombosis in a rat model. Acta Haematol. 124(4):218– 224.doi:10.1159/000321518.
Kaptoge,  S.,  Pennells,  L.,  De  Bacquer,  D.,
Cooney,  M.T.,  Kavousi,  M.,  Stevens,  G., Riley, L.M., Savin, S., Khan, T., Altay, S., et al. (2019).  World  Health  Organization cardiovascular  disease  risk  charts:  revised models to estimate risk in 21 global regions. Lancet Glob. Heal. 7(10):e1332– e1345.doi:10.1016/S2214-109X(19)30318- 3.
Katzung,  B.G.  (2018). Basic  &  Clinical Pharmacology,  Fourteenth  Edition .  Ed  ke- 14 Katzung BG, editor. New York (US): Mc Graw Hill Education.
Kaur,  I.,  Kocher,  G.S.,  Gupta,  V.K.  (2012).
Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of  the  Gene  for  an  Alkaline  Protease  from Bacillus  circulans  MTCC  7906. Indian  J.
Microbiol.
52(4):630– 637.doi:10.1007/s12088-012-0297-4.
Killer,  M.,  Ladurner,  G.,  Kunz,  A.B.,  Kraus,  J.
(2010).  Current  endovascular  treatment  of acute  stroke  and  future  aspects. Drug
Discov. Today . 15(15):640–
647.doi:10.1016/j.drudis.2010.04.007.
Kim,  G.M.,  Lee,  A.R.,  Lee,  K.W.,  Park,  J.Y.,
Chun,  J.,  Cha,  J.,  Song,  Y.S.,  Kim,  J.H. (2009).  Characterization  of  a  27  kDa fibrinolytic enzyme from Bacillus amyloliquefaciens  CH51  isolated  from Cheonggukjang. J.  Microbiol.  Biotechnol.
19(9):997–1004.doi:10.4014/jmb.0811.600.
Kim,  H.K.,  Kim,  G.T.,  Kim,  D.K.,  Choi,  W.A.,
Park,  S.H.,  Jeong,  Y.K.,  Kong,  I.S.  (1997). Purification and Characterization of a Novel Fibrinolytic Enzyme from Bacillus sp. KA38 Originated from Fermented Fish. J. Ferment. Bioeng. 84(4):307–312.doi:10.1016/S0922- 338X(97)89249-5.
Kim, J.B., Jung, W.H., Ryu, J.M., Lee, Y.J., Jung, J.K.,  Jang,  H.W.,  Kim,  S.W.  (2007). Identification  of  a  fibrinolytic  enzyme  by Bacillus  vallismortis  and  its  potential  as  a bacteriolytic  enzyme  against  Streptococcus mutans. Biotechnol. Lett. 29(4):605– 610.doi:10.1007/s10529-006-9284-3.
Kim,  S.,  Choi,  N.S.  (2000).  Purification  and characterization  of  subtilisin  DJ-4  secreted by  Bacillus  sp  strain  DJ-4  screened  from Doen-Jang. Biosci.  Biotechnol.  Biochem.
64(8):1722–1725.doi:10.1271/bbb.64.1722.
Kim, S., Chun, H., Han, M.H., Park, N., Suk, K. (1997). A Novel Variant Of Staphylokinasegene  From  Staphylococcus Alirez . Is Atcc 29213. 87(l):387–395.
Kim,  S.B.,  Lee,  D.W.,  Cheigh,  C.I.,  Choe,  E.A., Lee, S.J., Hong, Y.H., Choi, H.J., Pyun, Y.R. (2006). Purification and characterization of a fibrinolytic subtilisin-like protease of Bacillus  subtilis  TP-6  from  an  Indonesian fermented  soybean,  Tempeh. J.  Ind. Microbiol. Biotechnol. 33(6):436– 444.doi:10.1007/s10295-006-0085-4.
Kim,  W.,  Choi,  K.,  Kim,  Y.,  Park,  H.,  Choi,  J., Lee,  Y.,  Oh,  H.,  Kwon,  I.,  Kim,  W.,  Choi, K., et  al. (1996).  Purification  and characterization  of  a  fibrinolytic  enzyme produced from Bacillus sp . strain CK 11-4 screened  from  Chungkook-Jang  .  These include : Purification and Characterization of a  Fibrinolytic  Enzyme  Produced  from Bacillus sp . strain CK 11-4 Scre.
Kim,  W.,  Choi,  K.,  Kim,  Y.,  Park,  H.,  Choi,  J., Lee,  Y.,  Oh,  H.,  Kwon,  I.,  Lee,  S.  (1996). Purification  and  Characterization  of  a Fibrinolytic Enzyme Produced from Bacillus sp  .  strain  CK  11-4  Screened  from Chungkook-Jang. Appl. Environ. Microbiol. 62(7):2482–2488.
Ko,  J.H.,  Yan,  J.P.,  Zhu,  L.,  Qi,  Y.P.  (2004). Identification  of  two  novel  fibrinolytic enzymes  from  Bacillus. Comp.  Biochem. Physiol. Part C . 137:65–
74.doi:10.1016/j.cca.2003.11.008.
Kotb,  E.  (2012). Fibrinolytic  Bacterial  Enzymes with Thrombolytic Activity . Ed ke-1. Berlin: Springer Heidelberg Dordrecht London New York.
Kotb,  E.  (2014).  Purification  and  partial characterization  of  a  chymotrypsin-like serine  fibrinolytic  enzyme  from  Bacillus amyloliquefaciens  FCF-11  using  corn  husk as  a  novel  substrate. World  J.  Microbiol.
Biotechnol.
30:2071–
2080.doi:10.1007/s11274-014-1632-1.
Kotb,  E.  (2015).  Purification  and  partial characterization of serine fibrinolytic enzyme from Bacillus megaterium KSK-07 isolated  from  kishk,  a  traditional  Egyptian fermented  food. Appl.  Biochem.  Microbiol.
51(1):34–
43.doi:10.1134/S000368381501007X.
Kovalevsky,  A.Y.,  Liu,  F.,  Leshchenko,  S., Ghosh,  A.K.,  Louis,  J.M.,  Harrison,  R.W., Weber,  I.T.  (2006).  Ultra-high  Resolution Crystal Structure of HIV-1 Protease Mutant Reveals  Two  Binding  Sites  for  Clinical Inhibitor TMC114. J. Mol. Biol. 363(1):161– 173.doi:10.1016/j.jmb.2006.08.007.
Kuhn, P., Knapp, M., Soltis, S.M., Ganshaw, G.,
Thoene,  M.,  Bott,  R.  (1998).  The  0.78  Å structure of a serine protease: Bacillus lentus subtilisin. Biochemistry . 37(39):13446– 13452.doi:10.1021/bi9813983.
Kumar, S., Tsai, C., Nussinov, R. (2000). Factors enhancing protein thermostability.
13(3):179–
191.doi:10.1093/protein/13.3.179.
Kurnia,  F.,  Tjandrawinata,  R.R.,  Yulandi,  A., Suhartono,  M.T.  (2017).  Protease  of Stenotrophomonas  sp.  from  Indonesian fermented  food:  gene  cloning  and  analysis.
J. Biol. Res. 90(2):70–
76.doi:10.4081/jbr.2017.6428.
Kurosawa, Y., Nirengi, S., Homma, T., Esaki, K., Ohta, M., Clark, J.F., Hamaoka, T. (2015). A single-dose  of  oral  nattokinase  potentiates thrombolysis  and  anti-coagulation  profiles. Sci. Rep. 5:1–7.doi:10.1038/srep11601.
Kwon, G.H., Park. J.Y., Kim, J.S., Lim, J., Park, C.S., Kwon, D.Y., Kim, J.H. (2011). Cloning and  expression  of  a  bpr  gene  encoding bacillopeptidase F from Bacillus amyloliquefaciens  CH86-1. J.  Microbiol.
Biotechnol.
21(5):515– 518.doi:10.4014/jmb.1010.10061.
Kyte, J., Doolittle, R.F. (1982). A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157(1):105– 132.doi:10.1016/0022-2836(82)90515-0.
Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S., Thornton,  J.M.  (1993).  PROCHECK:  a program to check the stereochemical quality of  protein  structures. J.  Appl.  Crystallogr. 26(2):283–
291.doi:10.1107/s0021889892009944.
Lee,  A.R.,  Kim,  G.M.,  Kwon,  G.H.,  Lee,  K.W., Park,  J.Y.,  Chun,  J.,  Cha,  J.,  Song,  Y.S., Kim, J.H. (2010). Cloning of aprE86-1 gene encoding  a  27-kDa  mature  fibrinolytic enzyme  from Bacillus  amyloliquefaciens CH86-1. J. Microbiol. Biotechnol.
20(2):370–
374.doi:10.4014/jmb.0906.06029.
Lee, I.H., Hung, Y.H., Chou, C.C. (2008). Solid- state fermentation with fungi to enhance the antioxidative  activity,  total  phenolic  and anthocyanin  contents  of  black  bean. Int.  J.
Food Microbiol. 121(2):150– 156.doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.09.008.
Lee, S.K., Bae, D., Kwon, T., Lee, S.B., Lee, H., Park,  J.,  Heo,  S.,  Johnson,  M.  (2001).
Purification  and  characterization  of  a fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KDO- 13 isolated from soybean paste. J. Microbiol. Biotechnol. 11(5):845–852.
Lijnen,  H.  (2001).  Elements  of  the  Fibrinolytic System. Ann.  N.  Y.  Acad.  Sci. 936(1):226– 236.doi:10.1111/j.1749-
6632.2001.tb03511.x.
Lijnen, H.R., Van Hoef, B., De Cock, F., Okada, K.,  Ueshima,  S.,  Matsuo,  O.,  Collen,  D. (1991). On the mechanism of fibrin-specific plasminogen activation by staphylokinase. J. Biol. Chem. 266(18):11826–11832.
Lovell,  S.C.,  Davis,  I.W.,  Adrendall,  W.B.,  de Bakker,  P.I.W.,  Word,  J.M.,  Prisant,  M.G., Richardson,  J.S.,  Richardson,  D.C.  (2003). Structure  validation  by  C  alpha  geometry :
Phi,  Psi  and  C  beta  Deviation. Proteins Struct. Funct. Genet. 50:437– 450.doi:10.1002/prot.10286.
Mahajan, P.M., Gokhale, S.V., Lele, S.S. (2010). Production  of  Nattokinase  Using  Bacillus natto NRRL 3666: Media optimization, scale Up,  and  kinetic  modeling. Food  Sci.
Biotechnol. 19(6):1593– 1603.doi:10.1007/s10068-010-0226-4.
Maiti,  R.,  Van  Domselaar,  G.H.,  Zhang,  H., Wishart,  D.S.  (2004).  SuperPose:  A  simple server for sophisticated structural superposition. Nucleic  Acids  Res. 32(WEB SERVER ISS.):590–
594.doi:10.1093/nar/gkh477.
Marrone,  T.J.,  Briggs,  J.M.,  McCammon,  J.A.
(1997). Structure-based drug design:
Computational advances. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:71–90.
Medved,  L.V.,  Solovjov,  D.A.,  Ingham,  K.C. (1996).  Domain  structure,  stability  and interactions  in  streptokinase. Eur.  J. Biochem. 239(2):333– 339.doi:10.1111/j.1432-1033.1996.0333u.x.
Mihara, H., Sumi, H., Yoneta, T., Mizumoto, H., Ikeda, R., Seiki, M., Maruyama, M. (1991).
A novel fibrinolytic enzyme extracted from the  earthworm,  Lumbricus  rubellus. Jpn.  J. Physiol.
41(3):461– 472.doi:10.2170/jjphysiol.41.461.
Mine,  Y.,  Kwan  Wong,  A.H.,  Jiang,  B.  (2005). Fibrinolytic  enzymes  in  Asian  traditional fermented  foods.  Dalam Food  Research International . Vol. 38. hlm. 243–250.
De  Moerloose,  P.,  Boehlen,  F.,  Neerman-Arbez,
M.  (2010).  Fibrinogen  and  the  risk  of thrombosis. Semin. Thromb. Hemost. 36(1):7–17.doi:10.1055/s-0030-1248720.
Mohanasrinivasan,  V.,  Mohanapriya,  A.,  Potdar, S.,  Chatterji,  S.,  Konne,  S.,  Kumari,  S., Keziah, S.M., Subathra, D.C. (2017). In vitro and  in  silico  studies  on  fibrinolytic  activity of  nattokinase:  A  clot  buster  from Bacillus sp. Front.  Biol.  (Beijing). 12(3):219– 225.doi:10.1007/s11515-017-1453-3.
Moreira,  I.S.,  Koukos,  P.I.,  Melo,  R.,  Almeida, J.G.,  Antonio,  J.P.,  Schaarschmidt,  J., Trellet,  M.,  Gümüş,  Z.H.,  Costa,  J., Alexandre, M, et al. (2017). SpotOn : High
Accuracy  Identification  of  Protein-Protein Interface Hot-Spots. (July):1– 11.doi:10.1038/s41598-017-08321-2.
Morya,  V.K.,  Yadav,  S.,  Kim,  E.K.,  Yadav,  D.
(2012). In silico characterization of alkaline proteases from different species of aspergillus. Appl.  Biochem.  Biotechnol.
166(1):243–257.doi:10.1007/s12010-011- 9420-y.
Mukherjee,  A.K.,  Rai,  S.K.,  Thakur,  R., Chattopadhyay,  P.,  Kar,  S.K.  (2012). Bafibrinase: A non-toxic, non-hemorrhagic, direct-acting  fibrinolytic  serine  protease from Bacillus sp. strain AS-S20-I exhibits in vivo anticoagulant activity and thrombolytic potency. Biochimie . 94(6):1300– 1308.doi:10.1016/j.biochi.2012.02.027.
Nailufar,  F.,  Tjandrawinata,  R.R.,  Suhartono, M.T.  (2016).  Thrombus  Degradation  by Fibrinolytic  Enzyme  of Stenotrophomonas sp.  Originated  from  Indonesian  Soybean- Based Fermented Food on Wistar Rats. Adv.
Pharmacol. Sci. 2016:1– 9.doi:10.1155/2016/4206908.
Nakajima, N., Mihara, H., Sumi, H., Mihara, H.,
Sumi, H. (1993). Characterization of Potent Fibrinolytic Enzymes in Earthworm, Lumbricus  rubellus. Biosci.  Biotechnol. Biochem. 57(10):1726– 1730.doi:10.1271/bbb.57.1726.
Nakamura,  T.,  Yamagata,  Y.,  Ichishima,  E.
(1992).  Nucleotide  Sequence  of  the Subtilisin  NAT  Gene,  aprN,  of Bacillus subtilis (natto). Biosci. Biotechnol. Biochem. 56(11):1869–
1871.doi:10.1271/bbb.56.1869.
Noh,  K.,  Kim,  D.,  Choi,  N.,  Kim,  S.  (1999). Isolation  of  fibrinolytic  enzyme  producing strains  from  kimchi. Korean  J.  Food  Sci.
Technol. 31(1):219–223. Ogbadu, L.J., Okagbue, R.N. (1988). Fermentation of African locust bean (Parkia biglobosa)  seeds:  involvement  of  different species  of  Bacillus. Food  Microbiol. 5(4):195–199.doi:10.1016/0740- 0020(88)90018-4.
Olson,  S.T.,  Bjork,  I.  (1994).  Regulation  of thrombin  activity  by  antithrombin  and heparin. Semin. Thromb. Hemost. 20(4):373–409.doi:10.1055/s-2007- 1001928.
Ouoba, L.I.I., Cantor, M.D., Diawara, B., Traoré, A.S.,  Jakobsen,  M.  (2003).  Degradation  of African  locust  bean  oil  by  Bacillus  subtilis and Bacillus pumilus isolated from soumbala,  a  fermented  African  locust  bean condiment. J.  Appl.  Microbiol. 95(4):868– 873.doi:10.1046/j.1365-2672.2003.02063.x.
Paik, H., Lee, S., Heo, S., Kim, S., Lee, H., Kwon, T.  (2004).  Purification  and  characterization of  the  fibrinolytic  enzyme  produced  by Bacillus subtilis KCK-7 from
Chungkookjang. J.  Microbiol.  Biotechnol. 14:829–835.
Palta, S., Saroa, R., Palta, A. (2014). Overview of the  coagulation  system. Indian  J.  Anaesth. 58(5):515–523.doi:10.4103/0019-
5049.144643.
Park, S.G., Kho, C.W., Cho, S., Lee, D.H., Kim, S.H.,  Park,  B.C.  (2002).  A  functional proteomic  analysis  of  secreted  fibrinolytic enzymes  from  Bacillus subtilis  168  using a combined  method  of  two-dimensional  gel electrophoresis
and zymography. Proteomics . 2(2):206–
211.doi:10.1002/1615-
9861(200202)2:2<206::AID-
PROT206>3.0.CO;2-5.
Peng, Y., Huang, Q., Zhang, R., Zhang, Y. (2003). Purification  and  characterization  of  a fibrinolytic  enzyme  produced  by Bacillus amyloliquefaciens DC-4  screened  from douchi , a traditional Chinese soybean food. Comp.  Biochem.  Physiol.  Part  B .  134:45– 52.doi:10.1016/s1096-4959(02)00183-5.
Peng, Y., Yang, X., Zhang, Y. (2005). Microbial fibrinolytic  enzymes:  An  overview  of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo. Appl. Microbiol. Biotechnol.
69(2):126– 132.doi:10.1007/s00253-005-0159-7.
Peng,  Y.,  Yang,  X.J.,  Xiao,  L.,  Zhang,  Y.Z.
(2004).  Cloning  and  expression  of  a fibrinolytic  enzyme  (subtilisin  DFE)  gene from  Bacillus  amyloliquefaciens  DC-4  in
Bacillus subtilis. Res. Microbiol.
155(3):167– 173.doi:10.1016/j.resmic.2003.10.004. Peng,  Y.,  Zhang,  Y.  (2002).  Optimation  of fermentation conditions of douchi fibrinolytic  enzyme  produced  by  Bacillus amyloliquefaciens  DC-4. Chinese  J.  Appl.
Environ. Biol. 8:285–289.
Pennica, D., Holmes, W.E., Kohr, W.J., Harkins, R.N.,  Vehar,  G.A.,  Ward,  C.A.,  Bennett, W.F., Yelverton, E.,  Seeburg, P.H., Heyneker,  H.L., et  al. (1983).  Cloning  and expression of human tissue-type plasminogen  activator  cDNA  in E.  coli .
Nature . 301(5897):214– 221.doi:10.1038/301214a0.
Pirooznia, M., Gong, P., Guan, X., Inouye, L.S., Yang,  K.,  Perkins,  E.J.,  Deng,  Y.  (2007). Cloning, analysis and functional annotation of  expressed  sequence  tags  from  the Earthworm
Eisenia fetida. BMC Bioinformatics . 8(SUPPL. 7):1– 16.doi:10.1186/1471-2105-8-S7-S7.
Pranaw,  K.,  Singh,  S.,  Dutta,  D.,  Chaudhuri,  S.,
Ganguly,  S.,  Nain,  L.  (2014).  Statistical
Optimization  of  Media  Components  for Production of Fibrinolytic Alkaline Metalloproteases  from  Xenorhabdus  indica KB-3. Biotechnol.  Res.  Int. 2014:1– 11.doi:10.1155/2014/293434.
Prihanto,  A.A.,  Firdaus,  M.,  Prihanto,  A.A.
(2013). Proteolytic And Fibrinolytic Activities  Of  Halophilic  Lactic  Acid Bacteria  From  Two  Indonesian  Fermented Foods. J.  Microbiol.  Biotechnol.  Food  Sci. 2(5):2291–2293.
Randolph,  A.,  Chamberlain,  S.H.,  Chu,  H.C.,
Retzios, A.D., Markland, F.S., Masiarz, F.R. (1992). Amino acid sequence of fibrolase, a direct-acting  fibrinolytic  enzyme  from Agkistrodon  contortrix  contortrix  venom. Protein Sci. 1:590– 600.doi:10.1002/pro.5560010505.
Rao,  M.B.,  Tanksale,  A.M.,  Ghatge,  M.S., Deshpande,  V.V.  (1998).  Molecular  and Biotechnological  Aspects  of  Microbial Proteases. Microbiol.  Mol.  Biol.  Rev.
62(3):597–635.doi:10.1016/S0168-
6445(99)00006-6.
Repetto,  O.,  De  Re,  V.  (2017).  Coagulation  and
fibrinolysis  in  gastric  cancer. Ann.  N.  Y. Acad. Sci. 1404(1):27– 48.doi:10.1111/nyas.13454.
Sambrook,  J.,  Fritsch,  E.F.,  Maniatis,  T.  (1989). Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual . Ed  ke-2.  New  York,  USA:  Cold  Spring Harbor Laboratory Press.
Sanderson, I.R., Walker, W.A. (1993). Uptake and transport of macromolecules by the intestine: Possible  role  in  clinical  disorders  (an update). Gastroenterology .  104(2):622– 639.doi:10.1016/0016-5085(93)90436-G.
Sanger, F., Coulson, A. (1976). A Rapid Method for  Determining  Sequences  in  DNA  by Primed Synthesis with DNA Polymerase. J. Mol.  Biol. 94:441–448.doi:10.1016/0022- 2836(75)90213-2.
Santiveri,  C.M.,  Santoro,  J.,  Rico,  M.,  Énez, M.A.J.I.M.  (2004).  Factors  involved  in  the stability  of  isolated  Beta  sheets :  Turn sequence  ,  Beta  sheet  twisting,  and hydrophobic  surface  burial. Protein  Sci. 13:1134–
1147.doi:10.1110/ps.03520704.also.
Sasaki, K., Moriyama, S., Tanaka, Y. (1985). The transport  of  125I-labeled  human  high molecular  weight  urokinase  across  the intestinal  tract  in  a  dog  model  with stimulation  of  synthesis  and/or  release  of plasminogen  activators. Blood .  66(1):69– 75.doi:10.1182/blood.v66.1.69.69.
Seo, J., Lee, S. (2004). Production of Fibrinolytic Enzyme  from  Soybean  Grits  Fermented  by Bacillus  firmus  NA-1. J.  Med.  Food . 7(4):442–449.doi:10.1089/jmf.2004.7.442.
Seo,  M.,  Park,  J.,  Kim,  E.,  Hohng,  S.,  Kim,  H. (2014).  Protein  conformational  dynamics dictate the binding affinity for a ligand. Nat. Commun. :1–7.doi:10.1038/ncomms4724.
Sigrist,  C.J.A.,  Cerutti,  L.,  De  Castro,  E., Langendijk-Genevaux,  P.S.,  Bulliard,  V., Bairoch,  A.,  Hulo,  N.  (2010).  PROSITE,  a protein  domain  database  for  functional characterization  and  annotation. Nucleic Acids Res. 38(SUPPL.1):161– 166.doi:10.1093/nar/gkp885.
Simkhada,  J.R.,  Mander,  P.,  Cho,  S.S.,  Yoo  JC. 2010.  A  novel  fibrinolytic  protease  from Streptomyces sp . CS684. Process Biochem.
J. 45:88–
93.doi:10.1016/j.procbio.2009.08.010.
Singh, T.A., Devi, K.R., Ahmed, G., Jeyaram, K.
(2014). Microbial and endogenous origin of fi brinolytic activity in traditional fermented foods  of  Northeast  India. Food  Res.  Int. 55:356– 362.doi:10.1016/j.foodres.2013.11.028.
Stanbury,  P.F,  Whitaker,  A.,  Hall,  S.J.  (2003).
Principles  of  Fermentation  Technology .  Ed ke-2.  United  Kingdom:  MPG  Books  Ltd, Bodmin, Cornwall.
Stephani, L., Tjandrawinata, R.R., Nur, D., Lim, Y., Ismaya, W.T., Suhartono, M.T. (2017a). Food  Origin  Fibrinolytic  Enzyme  With Multiple  Actions  Food  Origin  Fibrinolytic Enzyme With Multiple Actions. HAYATI J. Biosci. 24(3):124–
130.doi:10.1016/j.hjb.2017.09.003.
Stephani,  L.,  Tjandrawinata  RR,  Nur  D,  Lim  Y, Ismaya WT,  Suhartono  MT.  (2017b).  Food Origin  Fibrinolytic  Enzyme  With  Multiple Actions. HAYATI  J.  Biosci. 24:124– 130.doi:10.1016/j.hjb.2017.09.003.
Sugimoto,  M.,  Nakajima,  N.  (2001).  Molecular cloning,  sequencing,  and  expression  of cDNA  encoding  serine  protease  with fibrinolytic activity from earthworm. Biosci.
Biotechnol. Biochem. 65(7):1575– 1580.doi:10.1271/bbb.65.1575.
Sugimoto, S., Fujii, T., Morimiya, T., Johdo, O., Nakamura,  T.  (2007).  The  Fibrinolytic Activity of a Novel Protease Derived from a Tempeh  Producing  Fungus,  Fusarium  sp.
BLB. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(9):2184–2189.doi:10.1271/bbb.70153.
Sumi, H., Hamada, H., Nakanishi, K., Hiratani, H.
(1990).  Enhancement  of  the  fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta Haematol. 84:139– 143.doi:10.1159/000205051.
Sumi, H., Hamada, H., Tsushima, H., Mihara, H.,
Muraki,  H.  (1987).  A  novel  fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experentia . 43(10):1110– 1111.doi:10.1007/bf01956052.
Sumi,  H.,  Nakajima,  N.,  Yatagai,  C.  (1995).  A unique strong fibrinolytic enzyme
( katsuwokinase ) in skipjack “ Shiokara ,” a Japanese  traditional  fermented  food  *.
Comp. Biochem. Physiol. I(3):543– 547.doi:10.1016/0305-0491(95)00100-x.
Sumi,  H.,  Yanagisawa,  Y.,  Yatagai,  C.,  Saito,  J.
(2004). Natto bacillus as an oral fibrinolytic agent: Nattokinase activity and the ingestion
effect  of  bacillus  subtilis  natto. Food  Sci. Technol. Res. 10(1):17– 20.doi:10.3136/fstr.10.17.
Sung,  J.H.,  Ahn,  S.J.,  Kim,  N.Y.,  Jeong,  S.K., Kim,  J.K.,  Chung,  J.K.,  Lee,  H.H.  (2010).
Purification, molecular cloning, and biochemical  characterization  of  subtilisin JB1  from  a  newly  isolated  Bacillus  subtilis JB1. Appl. Biochem. Biotechnol. 162(3):900–911.doi:10.1007/s12010-009-
8830-6.
Suwanmanon, K., Hsieh, P.C. (2014). Effect of γ- aminobutyric acid and nattokinase-enriched fermented  beans  on  the  blood  pressure  of spontaneously hypertensive
and normotensive  Wistar-Kyoto  rats. J.  Food Drug Anal. 22(4):485– 491.doi:10.1016/j.jfda.2014.03.005.
Suzuki,  Y.,  Kondo,  K.,  Matsumoto,  Y.,  Zhao, B.Q., Otsuguro, K., Maeda, T., Tsukamoto, Y., Urano, T., Umemura, K. (2003). Dietary supplementation  of  fermented  soybean, natto,  suppresses  intimal  thickening  and modulates  the  lysis  of  mural  thrombi  after endothelial injury in rat femoral artery. Life Sci. 73(10):1289–1298.doi:10.1016/S0024- 3205(03)00426-0.
Syahbanu,  F.,  Kezia,  E,.  Puera,  N.,  Giriwono, P.E.,  Tjandrawinata,  R.R., Suhartono, M.T. (2020a). Fibrinolytic bacteria of Indonesian fermented  soybean:  preliminary  study  on enzyme  activity  and  protein  profile. Food Sci.  Technol. Vol.  40  (No.  Suppl  2):  458- 465. doi: 10.1590/fst.23919
Syahbanu,  F.,  Giriwono,  P.E.,  Tjandrawinata, R.R.,  Suhartono,  M.T.  (2020b).  Molecular analysis  of  fibrin-degrading  enzyme  from Bacillus subtilis K2 isolated from Indonesian fermented  soybean. Mol  Biol  Rep. Vol 47(11):  8553-8563.  doi:10.1007/s11033- 020-05898-2
Syahbanu,  F.,  Giriwono,  P.E.,  Tjandrawinata, R.R.,  Suhartono,  M.T.  (2022).  Molecular docking of Subtilisin K2, a fibrin-degrading enzyme  from  Indonesian  moromi,  with  its substrates. Food  Sci.  Technol. Vol  42:  1-8. doi: 10.1590/fst.61820
Thielemans,  L.,  Hanif,  M.,  Crawley,  J.  (2019). The Coagulation Cascade and its Therapeutic Modulation.  Dalam Guymer S, Terracino C (ed.) in Heart of the Matter Key: Key concepts in cardiovascular science . Vol. 206. Ed ke-1 hlm. 193–206. Springer Nature Switzerland AG, Switzerland, CH.
Tjandrawinata,  R.R.,  Trisina,  J.,  Rahayu,  P., Prasetya,  L.A.,  Hanafiah,  A.,  Rachmawati, H.  (2014).  Bioactive  protein  fraction DLBS1033 containing lumbrokinase isolated  from  Lumbricus rubellus:  Ex  vivo, in vivo, and pharmaceutic studies. Drug Des. Devel. Ther. 8:1585– 1593.doi:10.2147/DDDT.S66007. Tortora, G.J., Derrickson, B. (2014). Principles of Anatomy  and  Physiology .  John  Willey  & Sons, New York (US).
Trisina,  J.,  Sunardi,  F.,  Suhartono,  M.T., Tjandrawinata,  R.R.  (2011).  DLBS1033,  a protein  extract  from  lumbricus  rubellus, possesses  antithrombotic  and  thrombolytic activities. J.  Biomed.  Biotechnol. 2011:1– 7.doi:10.1155/2011/519652.
Tseng, G.N., Sonawane, K.D., Korolkova, Y V.,
Zhang  M,  Liu  J,  Grishin  E  V.,  Guy  HR. 2007.  Probing  the  outer  mouth  structure  of the  hERG  channel  with  peptide  toxin footprinting and molecular modeling. Biophys. J. 92(10):3524–
3540.doi:10.1529/biophysj.106.097360.
Tsurupa, G., Hantgan, R.R., Burton, R.A., Pechik,
I., Tjandra, N., Medved, L. (2009). Structure, stability, and interaction of the fibrin(ogen) αC-domains. Biochemistry .  48(51):12191– 12201.doi:10.1021/bi901640e.
Uesugi, Y., Usuki, H., Iwabuchi, M., Hatanaka, T.
(2011).  Highly  potent  fibrinolytic  serine protease from Streptomyces. Enzyme Microb. Technol. 48(1):7– 12.doi:10.1016/j.enzmictec.2010.08.003.
Urano,  T.,  Ihara,  H.,  Umemura,  K.,  Suzuki,  Y.,
Oike, M., Akita, S., Tsukamoto, Y., Suzuki, I.,  Takada,  A.  (2001).  The  Profibrinolytic Enzyme  Subtilisin  NAT  Purified  from Bacillus  subtilis  Cleaves  and  Inactivates Plasminogen  Activator  Inhibitor  Type  1. J. Biol. Chem. 276(27):24690– 24696.doi:10.1074/jbc.M101751200.
Vangone, A., Bonvin, A.M.J.J. *2015). Contacts- based  prediction  of  binding  affinity  in protein–protein complexes. Elife . 4 (JULY2015):1–
15.doi:10.7554/eLife.07454.
Vasantha,  N.,  Thompson,  L.D.,  Rhodes,  C., Banner,  C.,  Nagle,  J.,  Filpula,  D.  (1984). Genes  for  alkaline  protease  and  neutral protease  from  Bacillus  amyloliquefaciens contain a large open reading frame between the  regions  coding  for  signal  sequence  and
mature  protein. J.  Bacteriol. 159(3):811– 819.doi:10.1128/jb.159.3.811-819.1984.
Vijayaraghavan,  P.,  Raj,  S.R.F.,  Gnana,  S., Vincent,  P.  (2015).  Purification  and Characterization  of  Fibrinolytic  Enzyme from Pseudoalteromonas sp ., IND11 and its in vitro Activity on Blood Clot. Int. J. Biol. Chem.
9(1):11–
20.doi:10.3923/ijbc.2015.11.20.
Voet,  D.,  Voet,  J.G.  (1997). Biochemistry . Second.  New  York,  USA:  John  Wiley  & Sons, Incorporated.
Wang, C.T., Ji, B.P., Li, B., Nout, R., Li, P.L., Ji, H.,  Chen,  L.F.  (2006).  Purification  and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus  subtilis  DC33,  isolated  from
Chinese traditional Douchi. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol.
33(9):750– 758.doi:10.1007/s10295-006-0111-6.
Wang, S.H., Zhang, C., Yang, Y.L., Diao, M., Bai, M.F. (2008). Screening of a high fibrinolytic enzyme producing strain and characterization  of  the  fibrinolytic  enzyme produced  from  Bacillus  subtilis  LD-8547.
World J. Microbiol. Biotechnol. 24(4):475– 482.doi:10.1007/s11274-007-9496-2.
Wei, Q., Wang, H., Chen, Z. (2013). Profiling of dynamic changes in the microbial community during the soy sauce fermentation  process. Appl.  Microb.  CELL Physiol. 97:9111–9119.doi:10.1007/s00253- 013-5146-9.
Wei,  X.,  Luo,  M.,  Xu,  L.,  Zhang,  Y.,  Lin,  X., Kong,  P.,  Liu,  H.  (2011).  Production  of
Fibrinolytic Enzyme from Bacillus
amyloliquefaciens by  Fermentation  of Chickpeas  ,  with  the  Evaluation  of  the Anticoagulant and Antioxidant Properties of Chickpeas. J.  Agric.  Food Chem. 59:3957– 3963.doi:10.1021/jf1049535.
Wells J., Cunningham BC, Graycar T., Estell DA.
1986. Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin. Philos.  Trans.  R.  Soc.  London . 317(1540):415– 423.doi:10.1098/rsta.1986.0051.
Weng, Y., Yao, J., Sparks, S., Wang, K.Y. (2017). Nattokinase:  An  oral  antithrombotic  agent for the prevention of cardiovascular disease.
Int. J. Mol. Sci. 18(3):1–
13.doi:10.3390/ijms18030523.
Wolberg,  A.S.  (2007).  Thrombin  generation  and fibrin  clot  structure. Blood  Rev. 21(3):131–
142.doi:10.1016/j.blre.2006.11.001.
Wong,  S.L.,  Price,  C.W.,  Goldfarb,  D.S.,  Doi, R.H.  (1984).  The  subtilisin  E  gene  of Bacillus  subtilis  is  transcribed  from  a  σ37 promoter in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81(4 I):1184– 1188.doi:10.1073/pnas.81.4.1184. Wong, M.Y.Z., Yap, J., Huang, W., Tan, S.Y. and Yeo, K.K., (2021). Impact of age and sex on subclinical  coronary  atherosclerosis  in  a healthy Asian population. JACC: Asia, 1(1): 93-102.
Wu,  D.J.,  Lin,  C.S.,  Lee,  M.Y.  (2009).  Lipid- lowering  effect  of  nattokinase  in  patients with  primary  hypercholesterolemia. Acta Cardiol. Sin. 25(1):26–30.
Wu,  J.,  Gullo,  M.,  Chen,  F.,  Giudici,  P.  (2010).
Diversity of acetobacter pasteurianus strains isolated  from  solid-state  fermentation  of cereal vinegars. Curr. Microbiol. 60(4):280– 286.doi:10.1007/s00284-009-9538-0.
Wu,  J.X.,  Zhao,  X.Y.,  Pan,  R.,  He,  R.Q.  (2007).
Glycosylated  trypsin-like  proteases  from earthworm  Eisenia  fetida. Int.  J.  Biol.
Macromol.
40:399– 406.doi:10.1016/j.ijbiomac.2006.10.001.
Wun,  D.,  Voet,  J.G.  (1982).  Isolation  and characterization  of  urokinase  from  human plasma. J.  Biol.  Chem. 257(10):3276– 3283.doi:10.1021/ja01106a534.
Xiao-lan, L., Lian-xiang, D., Fu-ping, L., Xi-qun, Z.,  Jing,  X.  (2005).  Purification  and characterization  of  a  novel  fibrinolytic enzyme  from  Rhizopus  chinensis  12. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 67(2):209–
214.doi:10.1007/s00253-004-1846-5.
Xu,  Z.,  Yang,  Y.,  Gui,  Q.,  Zhang,  L.,  Hu  L.
(2010). Expression, purification, and characterization of
recombinant
lumbrokinase  PI239  in Escherichia  coli . Protein Expr. Purif. 69(2):198–
203.doi:10.1016/j.pep.2009.08.013.
Yamashita, T., Oda, E., Giddings, J., Yamamoto,
J.  (2003).  The  Effect  of  Dietary  Bacillus Natto  Productive  Protein  on  in  vivo Endogenous  Thrombolysis. Pathophysiol. Haemost. Thromb. 33:138–
143.doi:10.1159/000077822.
Yan, F., Yan, J., Sun, W., Yao, L., Wang, J., Qi, Y. (2009). Thrombolytic effect of Subtilisin QK  on  carrageenan  induced  thrombosis model  in  mice. J.  Thrombolysis .  28:444–
448.doi:10.1007/s11239-009-0333-3.
Yan, X.M., Kim, C.H., Lee, C.K., Shin, J.S., Cho,
I.H., Sohn, U.D. (2010). Intestinal absorption  of  fibrinolytic  and  proteolytic lumbrokinase  extracted  from  earthworm, Eisenia andrei. Korean J. Physiol. Pharmacol. 14(2):71– 75.doi:10.4196/kjpp.2010.14.2.71.
Yang, Y., Jiang, L., Yang, S., Zhu, L., Wu, Y., Li,
Z.  (2000).  A  mutant  subtilisin  E  with enhanced thermostability. World J. Microbiol. Biotechnol. 16(3):249– 251.doi:10.1023/A:1008959825832.
Yatagai, C., Maruyama, M., Kawahara, T., Sumi, H.  (2008).  Nattokinase-promoted  tissue plasminogen  activator  release  from  human cells. Pathophysiol.  Haemost.  Thromb.
36(5):227–232.doi:10.1159/000252817.
Yau,  J.W.,  Teoh,  H.,  Verma,  S.  (2015). Endothelial cell control of thrombosis. BMC
Cardiovasc. Disord.
15(1):1– 11.doi:10.1186/s12872-015-0124-z.
Yin,  L.J.,  Lin,  H.H.  and  Jiang,  S.T.,  2010. Bioproperties  of  potent  nattokinase  from Bacillus subtilis YJ1. Journal of agricultural and food chemistry, 58(9): 5737-5742.
Yogesh,  D.,  Halami,  P.M.  (2015).  A  fibrin degrading serine metallo protease of Bacillus circulans with α -chain speci fi city. 11:72– 78.doi:10.1016/j.fbio.2015.04.007.
Yogesh,  D.,  Halami,  P.M.  (2015).  Evidence  that multiple  proteases  of Bacillus  subtilis can degrade fibrin and fibrinogen. Int. Food Res. J. 22(4):1662–1667.
Yogesh,  D.,  Halami,  P.M.  (2017).  Fibrinolytic enzymes of Bacillus spp .: an overview. Int. Food Res. J. 24(1):35–47.
Yoon,  S.J.,  Yu,  M.A.,  Sim,  G.S.,  Kwon,  S.T.,
Hwang,  J.K.,  Shin,  J.K.,  Yeo,  I.H.,  Pyun, Y.R. (2002). Screening and characterization of microorganisms with fibrinolytic activity from  fermented  foods. J.  Microbiol. Biotechnol. 12(4):649–656.
Yoshimoto, T., Oyama, H., Honda, T., Tone, H., Takeshita, T. (1988). Cloning and Expression of Subtilisin Amylosacchariticus Gene. J. Biochem. 103:1060– 1065.doi:10.1093/oxfordjournals.jbchem.a1 22380.
Yu,  Q.,  Li,  P.,  Yang,  Q.  (2010).  Improving  the absorption of earthworm fibrinolytic enzymes  with  mucosal  enhancers. Pharm.
Biol.
48(7):816– 821.doi:10.3109/13880200903283681.
Yuan, J., Yang, J., Zhuang, Z., Yang, Y., Lin, L., Wang,  S.  (2012).  Thrombolytic  effects  of Douchi  Fibrinolytic  enzyme  from  Bacillus subtilis LD-8547 in vitro and in vivo.
Zakaria,  Z.,  Madihah,  M.S.,  Rashid,  N.A.A.
(2015).  Screening  and  identification  of fibrinolytic bacteria from malaysian fermented seafood products. J. Appl. Pharm.
Sci. 5(10):22–
31.doi:10.7324/JAPS.2015.501005.
Zhang,  L.,  Zhou,  R.,  Cui,  R.,  Huang,  J.,  Wu,  C.
(2016).  Characterizing  Soy  Sauce  Moromi Manufactured by High-Salt Dilute-State and Low-Salt  Solid-State  Fermentation  Using Multiphase  Analyzing  Methods.  00(0):1– 8.doi:10.1111/1750-3841.13516.
Zhang, R.H., Xiao, L., Peng, Y., Wang, H.Y., Bai, F.,  Zhang,  Y.  (2005).  Gene  expression  and characteristics of a novel fibrinolytic enzyme (subtilisin  DFE)  in  Escherichia  coli. Lett. Appl. Microbiol. 41(2):190– 195.doi:10.1111/j.1472- 765X.2005.01715.x.