## ISSN: 0215-7950
*Alamat penulis korespondensi: Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680. Tel: 0251-8629364, Faks: 0251-8629362, Surel: giyanto@apps.ipb.ac.id
Volume 16, Nomor 4, Juli 2020 Halaman 166–176
DOI: 10.14692/jfi.16.4. 166–176
Keefektifan Bakteri Endofit dan Fungi Mikoriza Arbuskula dalam Menekan Ralstonia solanacearum pada Tanaman Eucalyptus pellita
Effectiveness of Endophytic Bacteria and Arbuscular Mycorrhizal Fungi in Suppressing Ralstonia solanacearum in Eucalyptus pellita Plants
Yuliana Susanti 1 , Giyanto 1 *, Meity Suradji Sinaga 1 , Kikin Hamzah Mutaqin 1 , Budi Tjahjono 2
1 Institut Pertanian Bogor, Bogor 16680, Indonesia.
2 PT. Arara Abadi Sinarmas Forestry, Riau 28772, Indonesia.

## ABSTRAK
Penyakit  layu  bakteri  yang  disebabkan  oleh Ralstonia solanacearum merupakan  salah  satu penyakit penting pada tanaman eukaliptus ( Eucalyptus pellita )  di  Indonesia.  Salah  satu pendekatan teknik pengendalian adalah melalui pemanfaatan bakteri endofit dan fungi mikoriza arbuskula (FMA). Penelitian  ini  ditujukan  untuk  mengevaluasi  keefektifan  bakteri  endofit  dan  FMA  dalam  menekan perkembangan penyakit layu bakteri. Terdapat sepuluh kombinasi bakteri endofit dan FMA yang di- ujikan pada bibit eukaliptus berumur satu bulan. Inokulasi R. solanacearum secara buatan dilakukan tiga bulan setelah introduksi bakteri endofit dan FMA. Percobaan dilakukan di ruang growth chamber . Peubah pengamatan meliputi periode inkubasi, insidensi penyakit, laju penyakit, agresivitas kolonisasi bakteri dengan mengamati cairan bakteri (ooze) R. solanacearum pada bibit eukaliptus , pengukuran aktivitas phenylalanine ammonia lyase (PAL), dan total fenol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan B5F1 ( Paenibacillus polymyxa dan Glomus mosseae ) memiliki kemampuan penekanan tertinggi terhadap  perkembangan  penyakit  layu  bakteri  pada  bibit  eukaliptus,  yaitu  sebesar  100% . Perlakuan B5F1 menunjukkan periode inkubasi R. solanacearum lebih lama, persentase insidensi penyakit paling rendah, laju infeksi penyakit rendah, dan penghambatan agresivitas kolonisasi R. solanacearum pada eukaliptus. Sementara perlakuan B4F1 ( Serratia marcescens dan G. mosseae ) mampu meningkatkan aktivitas PAL dan total fenol tertinggi dibandingkan perlakuan lainnya. Berdasarkan hasil penelitian ini, perlakuan B5F1 dan B4F1 berpotensi mengendalikan penyakit layu bakteri pada tanaman eukaliptus.
Kata kunci: agresivitas, insidensi penyakit, laju infeksi, layu bakteri, periode inkubasi

## ABSTRACT
Bacterial wilt disease (BWD) caused by Ralstonia solanacearum is one of the important diseases of eucalyptus ( Eucalyptus pellita ) plants in Indonesia. One of the control technique approaches is the use of endophytic bacteria and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF). This study was aimed to evaluate the  effectiveness  of  endophytic  bacteria  and AMF  in  suppressing  the  development  of  bacterial  wilt disease. There were ten combinations of endophytic bacteria and AMF that were tested on one month
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Susanti et al. old  eucalyptus  seeds. Artificial  inoculation  of R. solanacearum was  carried  out  three  months  after introduction of endophytic bacteria and AMF. Experiments were carried out in the growth chamber. The observation variables included incubation period, disease incidence, disease rate, aggressiveness of bacterial colonization by R. solanacearum , measurement of phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity, and total phenol. The results showed that the combination of B5F1 ( Paenibacillus polymyxa and Glomus mosseae )  showed  the  highest  suppression  ability  of  the  development  of  bacterial  wilt disease in eucalyptus seedlings up to 100%. B5F1 treatment showed a longer incubation period of R. solanacearum , the lowest incidence of disease, low infection rates, and inhibited the agresiveness of R. solanacearum . Meanwhile B4F1 ( Serratia marcescens and G. mosseae ) was able to increase PAL activity and the highest total phenol compared to other treatments. Based on the results of this study, the threatment of B5F1 and B4F1 has the potential to control bacterial wilt disease in eucalyptus plants.
Keywords: aggressiveness, bacterial wilt, disease incidence, incubation period, infection rate

## PENDAHULUAN
Penyakit  layu  bakteri  merupakan  salah satu penyakit penting pada pertanaman hutan tanaman industri (HTI) di Indonesia dan di  negara-negara  penghasil  utama  tanaman eukaliptus (Ran et al . 2005). Penyakit layu bakteri pada tanaman eukaliptus disebabkan oleh Ralstonia solanacearum . Penyakit layu bakteri dilaporkan sebagai pembatas dalam produktivitas  eukaliptus  pada  HTI  dan menyebabkan kerugian yang sangat besar. Di Riau pada  tahun  2010–2011  penyakit  layu bakteri menyebabkan kerusakan di pembibitan dan di lapangan dengan kerugian ditaksir mencapai  16  milyar  rupiah  (Siregar et al . 2012).  Gejala  yang  ditimbulkan  ialah  layu, daun menguning, dan terdapatnya ooze bakteri pada  bagian  batang  tanaman  yang  terinfeksi (Coutinho dan Wingfield 2017).
Beberapa metode pengendalian penyakit layu bakteri telah dilakukan di antaranya adalah eradikasi,  penggunaan  bahan  kimia  sintetik, seleksi tanaman eukaliptus yang resisten, pe- nanaman eukaliptus secara multiklon, dan deteksi penyakit layu bakteri secara molekuler pada bibit eukaliptus untuk memastikan bibit yang akan ditanam bebas bakteri patogen. Namun demikian upaya tersebut masih belum mendapatkan  pengendalian  yang  efektif. Pengembangan pengendalian terhadap penyakit layu bakteri terus berlanjut hingga sekarang, salah  satunya  adalah  teknik  pengendalian hayati dengan penggunaan bakteri endofit dan FMA  (fungi  mikoriza  arbuskula).  Kombinasi bakteri endofit dan FMA dilaporkan memiliki
potensi untuk digunakan sebagai agens hayati pada beberapa kasus penyakit tanaman (Bagy et al . 2019; Rashad et al . 2020). Pengendalian penyakit layu bakteri pada eukaliptus dengan menggabungkan bakteri endofit  dan  FMA belum pernah dilakukan sebelumnya. Sampai saat ini pengendalian penyakit dilakukan dengan  mengaplikasikan  bakteri  endofit  dan FMA  secara  tunggal  dalam  pengendalian penyakit tanaman eukaliptus (Mafia et al . 2009; Santiago et al .  2015;  Hashem et al . 2016; Agustini et al . 2020). Bakteri endofit dapat mengolonisasi bagian internal  jaringan  tanaman  tanpa  efek yang merugikan pada tanaman inangnya (Upreti dan Thomas 2015). Bakteri endofit dapat mengurangi dan  mencegah  efek  negatif  dari  patogen tertentu melalui berbagai mekanisme seperti antibiosis,  pemacu  pertumbuhan  tanaman, induced systemic resistance (ISR), parasitisme, kompetisi, dan gangguan sinyal quorum sensing (QS)  patogen  (Amer  dan  Utkhede 2000; Collins dan Jacobsen 2003; Jataraf et al . 2005; Jorjani et al . 2012; Mansoori et al . 2013). Bakteri endofit sebagai agens biokontrol sering menunjukkan kombinasi beberapa mekanisme dalam menekan penyakit (Ongena et al . 2007). FMA dapat berperan dalam pengendalian penyakit  tanaman.  Mekanisme  yang  terlibat dapat terjadi melalui peningkatan unsur hara tanaman,  kompetisi  untuk  nutrisi,  perubahan morfologi  dan  jaringan  akar,  perubahan komponen kimia jaringan tanaman, pengurang- an tekanan abiotik, dan perubahan komposisi kelompok mikrob pada mikoriza (Linderman 2000).  Selain  itu  FMA  dapat  menginduksi
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Susanti et al. ketahanan tanaman. FMA mengaktifkan enzim pertahanan seperti fitoaleksin, fenilpropanoid, kitinase,  β-1,3-glukanase, peroksidase, protein yang terkait dengan patogenesis (PR), callose, dan  fenolik.  Enzim-enzim  ini  meningkat jumlah  dan  aktivitasnya  selama  kolonisasi awal  akar  tanaman  oleh  FMA  (Siddiqui et al .  2008).  Berdasarkan  permasalahan  yang terjadi pada HTI eukaliptus, maka penelitian ini ditujukan untuk mengevaluasi keefektifan bakteri  endofit  dan  FMA  dalam  menekan perkembangan penyakit layu bakteri pada tanaman eukaliptus.

## BAHAN DAN METODE
Penyiapan Isolat Patogen, Agens Hayati dan Bibit Eukaliptus Isolat Patogen .  Isolat R. solanacearum diperoleh  dari  isolasi  sampel  tanaman eukaliptus  yang  terinfeksi  penyakit  layu bakteri. Pengambilan sampel dilakukan di area penanaman eukaliptus PT. Arara Abadi pada lima klon eukaliptus. Selanjutnya sampel tanaman  dibawa  ke  laboratorium  sebagai bahan  untuk  isolasi  bakteri  patogen.  Isolat R. solanacearum yang  berhasil  diisolasi dimurnikan pada medium NAPSA (3 g beef extract , 2.5 g glukosa, 5 g pepton, 20 g sukrosa, 100 g ekstrak kentang, dan 20 g agar dalam 1000 mL akuades, serta 4 mL TZC diberikan setelah  medium  steril)  yang  merupakan kombinasi dari medium nutrient agar (NA) dengan potato sucrose agar (PSA)  hasil modifikasi  R&D  PT.  Arara  Abadi.  Isolat R. solanacearum dimurnikan dengan meng- gores koloni tunggal pada medium NAPSA. Isolat R. solanacearum dikarakterisasi secara morfologi  dan  fisiologi  meliputi  morfologi koloni, uji Gram, uji oksidasi dan fermentasi, levan, potato soft rot , dan hypersensitive response (HR). Isolat R. solanacearum setelah dikarakterisasi selanjutnya diidentifikasi secara molekuler  menggunakan  primer  spesifik Oli-1/Y2  dan  primer  universal  16S  rRNA. Selanjutnya kelima isolat R. solanacearum dilakukan  uji  virulensi  untuk  mengetahui kemampuan infeksi dari masing-masing isolat. Hasil  pengujian  virulensi R. solanacearum
pada  bibit  eukaliptus  menunjukkan  bahwa galur kode Rs 18 memiliki virulensi tertinggi. Berdasarkan uji virulensi galur Rs 18 terpilih sebagai patogen uji dalam penelitian ini. Penyiapan galur Rs 18 dilakukan dengan menggoreskan koloni bakteri pada medium NAPSA dan diinkubasi selama 48 jam. Selanjutnya bakteri disuspensikan pada akuades steril dengan kepadatan populasi mencapai 10 8 cfu mL -1 . Bakteri Endofit . Bakteri endofit diperoleh dari isolasi sampel akar sehat eukaliptus yang terdiri dari 6 klon tanaman (5 klon rentan dan  1  klon  komersial  perusahaan).  Bakteri endofit  yang  berhasil  diisolasi  dimurnikan pada medium NA.  Bakteri  endofit  dilakukan penapisan  yang  meliputi  uji  HR,  hemolisis, patogenesitas,  dan  pertumbuhan  pada  bibit eukaliptus.  Bakteri  endofit  hasil  penapisan terpilih  selanjutnya  dikarakterisasi  meliputi kemampuan antibiosis, produksi enzim protease dan AHL laktonase, hormon indole asetic acid (IAA), penambat nitrogen, dan pelarut fosfat. Setelah bakteri endofit dikarakterisasi dilakukan pemilihan  bakteri  endofit  potensial  dengan menggunakan metode analytical hierarchy process (AHP).  Berdasarkan  perhitungan metode  AHP  dipilih  sepuluh  bakteri  endofit yang  memiliki  hasil  nilai  tertinggi.  Sepuluh bakteri  endofit  tersebut  diidentifikasi  secara molekuler  menggunakan  primer  universal 16S  rRNA.  Hasil  identifikasi  bakteri  endofit berdasarkan sikuen gen 16S rRNA menunjuk- kan  spesies  bakteri  endofit  potensial  sebagai agens biokontrol adalah Bacillus cereus (B1), Stenotrophomonas maltophilia (B2), Serratia marcescens (B4), Paenibacillus polymyxa (B5), Brevundimonas olei (B6), B. megaterium (B7),
S. marcescens (B8), P. polymyxa (B9) dan B. velezensis (B10).  Sepuluh  bakteri  endofit terpilih  digunakan  dalam  penelitian  ini. Penyiapan  bakteri  endofit  dilakukan  dengan meremajakan  isolat  bakteri  endofit  pada medium NA dan inkubasi selama 48 jam. Selanjutnya  bakteri  endofit  dikulturkan  pada medium nutrient broth (NB) dengan kepadatan populasi mencapai 10 8 cfu mL -1 . Fungi Mikoriza Arbuskula (FMA) . FMA yang digunakan dalam penelitian merupakan
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Susanti et al.
koleksi  R&D PT. Arara Abadi, yaitu Glomus mosseae (F1), G. clarum (F2), dan G. intraradices (F3).  Ketiga  jenis  isolat  FMA  sebelumnya telah  diperbanyak  pada  tanaman  sorgum menggunakan medium tumbuh zeolit selama 3 bulan di screen house . Sebelum digunakan sebagai  inokulan,  dilakukan  penghitungan spora. Pemanenan sorgum dilakukan dengan mengambil potongan akar sorgum dan zeolit, dimasukkan  ke  wadah  plastik  dan  diberi label.  Kepadatan  spora  dihitung  dengan teknik penyaringan basah berdasarkan metode Brundrett et al. (1996).  Sampel  zeolit  yang telah  dihitung  jumlah  sporanya  disimpan  di dalam lemari pendingin dan siap digunakan sebagai inokulan FMA.
Bibit Tanaman Eukaliptus . Stek pucuk dari  pohon  induk  eukaliptus  disterilisasi  per- mukaan dengan dicelupkan pada kloroks 0.5%, dibilas dengan akuades steril. Stek pucuk ditanam pada medium kokopit steril, dipelihara di rumah kaca. Bibit berumur 1 bulan  sebagai fase awal perakaran tanaman muncul diguna- kan sebagai tanaman uji.
Uji Keefektifan Bakteri Endofit dan FMA Pengujian menggunakan 10 kombinasi bakteri  endofit  dan  FMA  (berdasarkan  nilai tertinggi pada olah data statistik dari peubah pengamatan  kolonisasi  akar,  jumlah  spora, tinggi tanaman, dan diameter batang eukaliptus), kontrol positif/KP (inokulasi R. solanacearum ), dan  kontrol  negatif/KN  (tanpa  inokulasi R. solanacearum , bakteri endofit, dan FMA). Kombinasi  bakteri  endofit  dan  FMA  yang terpilih  adalah  B5F1,  B7F1,  B2F3,  B6F3,
B1F1, B4F1, B8F1, B8F2, B10F1, dan B10F2 (Tabel 1). Setiap perlakuan yang diuji di- lakukan pengulangan sebanyak 10 tanaman.
Aplikasi  Bakteri  Endofit  dan  FMA. Aplikasi  bakteri  endofit  dilakukan  dengan cara:  seluruh  bagian  pangkal  batang  bibit eukaliptus direndam selama 1 jam dalam suspensi  bakteri  endofit  dengan  kepadatan populasi 10 8 cfu mL -1 . Aplikasi FMA sebanyak 2 g zeolit (±200 spora) per tanaman dilakukan satu  bulan  setelah  aplikasi  bakteri  endofit, dengan  cara  memberikan  inokulum  FMA ke  dalam  medium  tanam  yang  bersentuhan dengan akar bibit eukaliptus.
Aklimatisasi Bibit Eukaliptus di Ruang Growth Chamber . Bibit eukaliptus yang telah diaplikasikan dengan bakteri endofit dan FMA dipelihara  di screen house selama 3 bulan. Selanjutnya,  bibit  eukaliptus  dipindahkan  ke dalam ruangan growth chamber dengan suhu ±28 ºC, kelembapan udara ˃ 80%, fotoperiode 12 jam dan intensitas cahaya 40 µmol s -1 m -2. , dan diaklimatisasi selama 2 minggu (Fonseca et al. 2015).  Bibit  eukaliptus  yang  telah diaklimatisasi, diinokulasi dengan bakteri R. solanacearum . Inokulasi Ralstonia solanacearum . Inokulasi R. solanacearum dilakukan secara buatan, mengacu pada metode Fonseca et al. (2015), yaitu bibit eukaliptus dikeluarkan dari tabung, kemudian akar dilukai menggunakan gunting steril dan dicelupkan ke dalam suspensi R. solanacearum (10 8 cfu  mL -1 ) selama 5 menit per tanaman. Bibit eukaliptus dimasukkan kembali ke dalam tabung yang berisi medium tanam.
Tabel 1  Kombinasi perlakuan bakteri endofit dan FMA No Kode Perlakuan Spesies bakteri endofit dan FMA 1 B1F1 Bacillus cereus dan Glomus mosseae 2 B4F1 Serratia marcescens dan Glomus mosseae 3 B8F1 Serratia marcescens dan Glomus mosseae
4 B8F2
Serratia marcescens dan Glomus clarum
5 B10F1
Bacillus velezensis dan Glomus mosseae
6 B10F2
Bacillus velezensis dan Glomus clarum
7 B5F1
Paenibacillus polymyxa dan Glomus mosseae 8 B7F1 Bacillus megaterium dan Glomus mosseae 9 B2F3 Stenotrophomonas maltophilia dan Glomus intraradices 10 B6F3 Brevundimonas olei dan Glomus intraradices
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Susanti et al.

## Pengamatan
Perkembangan Gejala Penyakit, Periode Inkubasi, Insidensi dan Penekanan Penyakit pada Bibit Eukaliptus. Gejala penyakit dan periode  inkubasi  diamati  setiap  hari  setelah inokulasi sampai munculnya gejala awal layu bakteri. Insidensi  penyakit  dihitung  meng- gunakan rumus:
IP = n N × 100%, d engan n, jumlah tanaman yang menunjukkan gejala layu dan N, jumlah tanaman yang diamati. Penyakit  layu  bakteri  adalah  penyakit dengan tipe monosiklik sehingga laju infeksi dihitung dengan rumus Van der Plank (1963):
r = 1 , dengan e t × log [ log 1 1 – Xt 1 – Xo – ] e,  bilangan  hasil  konversi  (2714);  t,  selang waktu  pengamatan;  Xt,  insidensi  penyakit pada  waktu  tertentu;  dan  Xo,  insidensi penyakit pada waktu sebelumnya.
Persentase  penekanan  penyakit  dihitung dengan rumus Aliye et al. (2008):
PR = Pc – Pt Pc × 100%, d engan Pc,  insidensi  penyakit  pada  kontrol  positif; Pt, insidensi penyakit pada masing-masing perlakuan.
Tingkat Agresivitas Kolonisasi Ralstonia solanacearum . Bibit eukaliptus uji dievaluasi perkembangan gejala penyakit layu setiap hari dengan mengamati ooze bakteri R. solanacearum pada jaringan tanaman. Pengamatan dilakukan secara kualitatif dengan melihat ada atau tidak adanya  ooze  pada  sayatan jaringan batang tanaman. Apabila jaringan tanaman terdapat ooze  bakteri,  maka  hal  tersebut menandakan terjadinya  kolonisasi  (positif)  dan  sebaliknya jaringan tanpa adanya ooze maka tidak terjadi kolonisasi  (negatif).  Tanaman  yang  layu langsung diamati dengan cara menyayat batang tanaman, yang terdiri atas tiga bagian sayatan, yaitu  bawah  (pangkal  batang),  tengah (3 cm dari  bawah),  atas  (6  cm  dari  bawah)  disayat menggunakan  pisau  bedah  dan  diletakkan  di atas gelas objek yang diberi setetes air. Potongan sayatan  batang  diamati  di  bawah  mikroskop cahaya dengan pembesaran 40–100x.
Pengamatan  seluruh  peubah  dilakukan selama  dua  minggu,  dimulai  sejak  awal inokulasi R. solanacearum .
Analisis Metabolit Sekunder Penginduksi Ketahanan Analisis metabolit sekunder sebagai penginduksi  ketahanan  tanaman  terhadap R. solanacearum dengan mengukur  aktivitas phenylalanine ammonia lyase (PAL) dan total fenol  pada  tanaman  uji.  Data  yang  disajikan merupakan  peningkatan  persentase  aktivitas PAL  dan  fenol,  yaitu  pengurangan  aktivitas PAL dan senyawa fenol sebelum dan setelah inokulasi bakteri R. solanacearum . Sampel daun bibit eukaliptus dianalisis pada umur 12 minggu sebelum inokulasi dan umur 14 minggu setelah inokulasi R. solanacearum . Sampel dianalisis pada masing-masing perlakuan sebanyak 3 tanaman secara komposit.
Analisis Total Fenol . Analisis kuantitatif total  fenol  dilakukan  menggunakan  metode Konappa et al .  (2016).  Perubahan  warna biru diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer  pada  λ  =  725  nm  dengan katekol  sebagai  standar.  Jumlah  fenolat  di- nyatakan sebagai mikrogram katekol -1 mg -1 protein. Aktivitas PAL. Aktivitas PAL ditentukan berdasarkan metode Chmielowska et al . (2008). Konsentrasi asam trans-sinamat diukur dengan spektrofotometri pada λ = 290 nm dan aktivitas enzim  dinyatakan  sebagai A 290 mg cinnamic acid menit -1 mg -1 protein. Sampel daun bibit eukaliptus yang digunakan untuk analisis aktivitas  PAL  sama  dengan  sampel  untuk analisis total fenol.

## HASIL
Perkembangan Gejala Penyakit Layu Bakteri Perkembangan gejala penyakit layu bakteri diawali dengan munculnya layu pada bagian pucuk daun dan cabang-cabang tanaman yang muda. Gejala berlanjut dengan mengeringnya daun bagian bawah hingga berlanjut ke daun bagian atas. Layu akan semakin parah dengan
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Susanti et al.
bertambahnya  hari  sejak  munculnya  gejala. Perkembangan  penyakit  lebih  lanjut  me- nyebabkan  tanaman  layu  keseluruhan  dan terjadi  perubahan  warna  kehitaman  pada batang tanaman (Gambar 1). Tanaman kontrol positif  menunjukkan  gejala  awal  tiga  hari setelah inokulasi R. solanacearum sedangkan pada  perlakuan  aplikasi  bakteri  endofit  dan FMA  gejala  awal  muncul  lima  hari  setelah inokulasi R. solanacearum .
Periode dan Insidensi Penyakit Layu Bakteri Hasil  pengamatan  menunjukkan  bahwa periode inkubasi penyakit pada tanaman uji dengan perlakuan B10F2, B5F1, B7F1, B2F3, dan  B6F3  terlihat  lebih  lama  (>  8  hari)  di- bandingkan dengan kontrol positif. Perlakuan B5F1 dan B6F3 menunjukkan periode inkubasi  lebih  lama  dari  kontrol  dengan insidensi penyakit yang rendah. Aplikasi B5F1 merupakan perlakuan terbaik dalam menekan insidensi penyakit. Pada perlakuan kontrol negatif,  seluruh  tanaman  uji  tidak  terdapat gejala (Tabel 2).
Laju Infeksi Penyakit Layu Bakteri Hasil  pengukuran  laju  infeksi  setelah munculnya  gejala  awal  menunjukkan  bahwa perlakuan B7F1, B2F3, B6F3, B1F1, B4F1, B8F2, B10F1, B10F1, dan B5F1 memiliki laju infeksi lebih rendah dari kontrol positif.
Tanaman uji dengan perlakuan B5F1 me- nunjukkan  laju  infeksi  paling  rendah.  Pada tanaman  uji  kontrol  negatif,  tidak  terjadi perkembangan gejala layu (Gambar 2).
Tingkat Agresivitas Kolonisasi Ralstonia solanacearum pada Bagian Batang Bibit Eukaliptus Jaringan tanaman uji yang diintroduksi dengan bakteri endofit dan FMA pada seluruh kombinasi perlakuan menunjukkan persentase ooze  bakteri R. solanacearum lebih  rendah dibandingkan dengan kontrol positif. Perlakuan B5F1 menjadi perlakuan terbaik karena tidak ditemukan ooze bakteri pada jaringan batang tanaman uji yang diamati (persentase 0). Tanaman kontrol negatif tidak ditemukan ooze (Gambar 3). Kolonisasi R. solanacearum pada bagian bawah sayatan batang (pangkal batang) mendominasi lokasi ooze terbanyak dari semua perlakuan,  sedangkan  bagian  tengah  sayatan batang  (3  cm  dari  bawah  pangkal  batang) terdapat ooze bakteri lebih sedikit, demikian halnya dengan bagian atas sayatan batang (6 cm dari bawah pangkal batang).
Jaringan tanaman yang diamati mengguna- kan  mikroskop  cahaya  menunjukkan  setiap bagian sayatan ada terdapat ooze (positif) dan ada yang tidak terdapat ooze (negatif) (Gambar 4). Ooze  bakteri  yang  terdapat  pada  jaringan tanaman menandakan terjadinya kolonisasi
Gambar 1  Perkembangan gejala penyakit layu bakteri pada bibit tanaman eukaliptus: a, tanaman sehat sebagai kontrol negatif; b, gejala awal; c, gejala lanjut; dan d, tanaman mati.
a b c
d
Jurnal Fitopatologi Indonesia
bakteri R. solanacearum . Hampir keseluruhan bagian sayatan bawah batang ditemukan ooze bakteri. Hal ini diduga disebabkan teknik inokulasi  yang  digunakan  adalah  pelukaan akar tanaman.

## Aktivitas PAL dan Total Fenol pada Bibit
Eukaliptus yang diaplikasikan dengan Bakteri Endofit dan FMA Perlakuan B1F1, B4F1, dan B10F1 me- nyebabkan  terjadinya  peningkatan  aktivitas PAL yang tinggi dibandingkan dengan kontrol positif dan negatif, sedangkan peningkatan total fenol  lebih  tinggi  dari  kontrol  terdapat  pada perlakuan B1F1, B4F1, B10F1, B5F1, B2F3, dan B6F3. Peningkatan aktivitas PAL dan total fenol  tertinggi  ditemukan  pada  tanaman  uji dengan perlakuan B4F1 (Tabel 3). Tanaman pada perlakuan B8F1 dan B8F2 tidak dapat dianalisis  karena  tanaman  telah  mati  setelah diinokulasi dengan R. solanacearum .

## PEMBAHASAN
Penyakit  layu  bakteri  merupakan  salah satu penyakit penting pada tanaman E. pelllita yang  disebabkan  oleh R. solanacearum . Patogen ini menular melalui tanah dan infeksi ke tanaman umumnya terjadi melalui akar (Hayward 1991). Pengendalian penyakit layu bakteri sulit karena variabilitas patogen yang tinggi,  pilihan  pestisida  kimia  yang  terbatas, tingkat  kelangsungan  hidup  patogen  yang tinggi di berbagai lingkungan dan kisaran inang yang luas.
a b
Gambar 4  Jaringan batang tanaman eukaliptus: a,  tanpa  ooze  bakteri R. solanacearum ; dan b, ada ooze bakteri R. solanacearum.
Gambar 3  Persentase kolonisasi bakteri R. solanacearum pada bibit eukaliptus dengan berbagai macam perlakuan bakteri endofit dan FMA. , pangkal batang;  , batang bagian tengah; dan , batang bagian atas.
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ooze bakteri (%) Perlakuan 0.00 0.31 0.00 0.23 0.10 0.08 0.28 0.22 0.40 0.28 0.33 0.17 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 KN KP B5F1 B7F1 B2F3 B6F3 B1F1 B4F1 B8F1 B8F2 B10F1 B10F2 La ju inf eks i Perlakuan
Gambar 2  Rata-rata laju infeksi R. solanacearum pada bibit eukaliptus dengan berbagai macam perlakuan bakteri endofit dan FMA.
Perlakuan Laju infeksi
Tabel 2  Penekanan periode inkubasi dan insidensi penyakit layu bakteri pada perlakuan bakteri endofit dan FMA
Perlakuan Periode inkubasi (hari) Insidensi penyakit (%) Penekanan penyakit (%) KN Tt Tt Tt KP 7.89 90 0 B1F1 7.50 80 11 B4F1 7.25 80 11 B8F1 7.22 90 0 B8F2 7.00 70 22 B10F1 7.00 80 11 B10F2 8.14 70 22 B5F1 Tt Tt 100 B7F1 8.25 80 11 B2F3 9.33 60 33 B6F3 9.40 50 44 Tt = Tidak terdeteksi (tidak terdapat gejala)
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Pengendalian  penyakit  layu  bakteri  telah dilakukan dengan berbagai upaya, namun belum mampu mengatasi perkembangan penyakit layu bakteri pada perkebunan eukaliptus. Untuk itu diperlukan teknik pengendalian yang  ramah  lingkungan,  biaya  rendah  dan efesien  dalam  skala  luas.  Pendekatan  yang dapat  dilakukan  adalah  pengendalian  hayati. Penggunaan agens biokontrol seperti bakteri endofit  dan  FMA  dapat  menekan  atau  me- nurunkan kepadatan populasi patogen tanaman (Afzal et al . 2019; Pozo et al . 2013). Keuntungan dari  pengendalian  hayati  adalah  dapat  di- terapkan pada target yang luas atau sempit tergantung pada organisme biokontrol, kurang spesifik dan kurang rentan terhadap akumulasi ketahanan, hemat biaya dan dapat diintegrasi- kan dengan strategi pengendalian lainnya (Whipps dan Lumsden 2001). Tanaman  yang  terinfeksi  menunjukkan gejala layu pada daun, umumnya dimulai bagian pucuk dan selanjutnya daun mengering. Infeksi lanjut akan menyebabkan keseluruhan bibit eukaliptus layu dan akhirnya mengalami kematian. Aplikasi B5F1, B7F1, B2F3, dan B6F3 pada bibit eukaliptus dapat memper- panjang periode inkubasi dan menurunkan insidensi penyakit. Hasil ini sesuai dengan
penelitian sebelumnya bahwa bakteri endofit yang diintroduksi pada tanaman cabai dapat memperpanjang masa inkubasi penyakit layu bakteri, menurunkan insidensi dan keparahan penyakit  (Habazar et al. 2020) dan aplikasi Paenibacillus polymyxa dapat menekan per- kembangan R. solanacearum sebesar  80% pada tanaman kentang (Soliman 2020). Demikian halnya dengan inokulasi FMA pada tomat dapat mencegah infeksi R. solanacearum (Tahat et al. 2012). Seluruh kombinasi aplikasi bakteri endofit dan  FMA  pada  bibit  eukaliptus  mampu menurunkan laju infeksi penyakit layu bakteri. Namun pada perlakuan B8F1 dan B10F1 laju infeksi lebih cepat dibandingkan dengan tanaman  kontrol.  Hal  tersebut  berarti  bahwa perkembangan penyakit layu bakteri tidak mampu ditekan oleh bakteri endofit dan FMA yang diintroduksikan ke tanaman. Tingkat kolonisasi R. solanacearum pada bibit eukaliptus memiliki persentase ooze lebih rendah  dengan  aplikasi  perlakuan  bakteri endofit dan FMA. Ooze bakteri R. solanacearum yang diinokulasikan pada bibit eukaliptus dengan  teknik  pelukaan  akar  lebih  sedikit untuk berkembang sampai ke bagian atas batang tanaman, hal ini diduga karena adanya bakteri endofit dan FMA yang mengkolonisasi perakaran tanaman. Agens biokontrol dapat menghambat perkembangan penyakit dengan beberapa  mekanisme.  Bakteri  endofit  secara tidak langsung dapat menghambat perkembang- an patogen melalui berbagai mekanisme seperti antibiotik, siderofor, enzim hidrolitik, dan senyawa volatil (Afzal et al . 2019). FMA telah terbukti bersaing secara langsung dengan patogen untuk mendapatkan ruang dan nutrisi, mengubah morfologi akar yang dapat meng- ubah  dinamika  infeksi  patogen  (Pozo et al . 2013). Peningkatan aktivitas PAL dan total fenol pada  beberapa  perlakuan  bakteri  endofit  dan FMA menunjukkan terjadinya induksi ketah - anan tanaman. Perlakuan B4F1 merupakan Perlakuan B4F1 merupakan kombinasi perlakuan yang menunjukkan in- kombinasi perlakuan yang menunjukkan in- duksi  ketahanan  tanaman  terbaik  diban duksi  ketahanan  tanaman  terbaik  diban ding- kan dengan perlakuan lain. Kemampuan dari
Tabel 3 Peningkatan aktivitas PAL dan total fenol pada bibit eukaliptus terinfeksi R. solanacearum
Perlakuan Peningkatan (%) Aktivitas PAL Total fenol KN b 2.536 0.421 KP a 3.426 0.697 B1F1 13.085 199.552 B4F1 97.377 229.885 B8F1 Td Td B8F2 Td Td B10F1 -32.677 46.703 B10F2 167.422 -41.121 B5F1 -45.151 16.571 B7F1 -48.786 -10.744 B2F3 -27.635 64.1150 B6F3 -1.931 76.836 a Tanaman dengan inokulasi R. solanacearum b Tanaman tanpa inokulasi R.solanacearum , bakteri endofit dan FMA Td = Tidak dianalisis
Jurnal Fitopatologi Indonesia
jenis bakteri endofit dan FMA dapat melibat - kan satu mekanisme atau lebih dalam pengen - dalian penyakit tanaman. Peningkatan akti- vitas PAL dan fenol dikarenakan agens hayati menghasilkan elisitor yang dapat menginduksi respons pertahanan tanaman. Banyak elisitor yang dihasilkan oleh agens biokontrol dalam menginduksi ketahanan tanaman, seperti elisi - tor PeBA1 dari B. amyloliquefaciens dan B. subtilis BU412 dapat menginduksi respons pertahanan tanaman tembakau dengan menin - gkatkan enzim-enzim pertahanan (Wang et al . 2016; Shen et al . 2019). FMA memiliki mole - kul permukaan seperti kitin dan glukan, dan oligomernya yang dapat menginduksi respons pertahanan tanaman inang (Song et al . 2011). Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa S. marcescens dan G. mosseae mampu meningkatkan metabolit sekunder, yaitu PAL dan fenol pada tanaman Camellia sinensis dan beberapa  tanaman  obat  (Chakraborty et al . 2010;  Pedone-Bonfim et al . 2015). Produksi senyawa fenol dipicu sebagai respons terhadap berbagai  rangsangan  oleh  ekspresi  gen  PAL dan aktivitas protein (Mandal et al . 2010). Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa aplikasi  bakteri  endofit  dan  FMA,  yaitu kombinasi bakteri P. polymyxa dan  fungi G. mosseae (B5F1), serta S. marcescens dan G. mosseae (B4F1)  berpotensi  menghambat perkembangan penyakit layu bakteri dan menginduksi  ketahanan  tanaman  eukaliptus. Dalam aplikasi selanjutnya pada skala luas, masih  diperlukan  evaluasi  frekuensi  aplikasi bakteri endofit dan FMA, metode aplikasi di ruang growth chamber , dan kajian aplikasi bakteri endofit dan FMA secara tunggal sebagai pembanding  hasil  perlakuan  kombinasi aplikasi dari kedua agens hayati tersebut yang telah diperoleh dalam penelitian ini.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dirjen DIKTI yang membantu dana penelitian melalui Beasiswa BPPDN dan Hibah Penelitian Disertasi Doktor, dan Departemen Riset and Development  PT.  Arara  Abadi  Sinarmas Forestry, Perawang-Riau.

## DAFTAR PUSTAKA
Afzal I, Shinwari ZK, Sikandar S, Shahzad S.
2019. Plant beneficial endophytic bacteria: Mechanisms,  diversity,  host  range  and genetic  determinants.  Microbiol  Res. 221:36–49. DOI: https://doi.org/10.1016/j. micres.2019.02.001.
Agustini L, Irianto RSB, Indrayadi H, Tanna RD, Fahrizawati, Faulina SA, Hidayat A, Tjahjono B, Priatna D, Turjaman M. 2020. The  effects  of  arbuscular  mycorrhizal inoculation to growth and survivability of micropropagated Eucalyptus pellita and Acacia crassicarpa in  nursery.  IOP  Conf Ser: Earth Environ Sci. 533(1):1–11. DOI: https://doi.org/10.1088/1755-1315/533/1/ 012028.
Aliye N, Fininsa C, Hiskias Y. 2008. Evaluation  of  rhizosphere  bacterial antagonists for their potential to bioprotect potato ( Solanum tuberosum ) against bacterial  wilt  ( Ralstonia solanacearum ). Biol Control. 47(3):282–288. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.biocon trol.2008.09.003.
Amer  GA,  Utkhede  RS.  2000.  Development of  formulations  of  biological  agents  for management  of  root  rot  of  lettuce  and cucumber.  Can  J  Microbiol.  46(9):809– 816. DOI: https://doi.org/10.1139/cjm-46- 9-809.
Bagy  HMMK,  Hassan  EA,  Nafady  NA, Dawood MFA. 2019. Efficacy of arbuscular mycorrhizal  fungi  and  endophytic  strain Epicoccum nigrum ASU11 as biocontrol agents  against  blackleg  disease  of  potato caused by bacterial strain Pectobacterium carotovora subsp. atrosepticum PHY7. Biol  Control.  134:103–113.  DOI:  https:// doi.org/10.1016/j.biocontrol.2019.03.005.
Brundrett  M,  Bougher  N,  Dell  B,  Grove  T, Malajczuk N. 1996. Examining mycorrhizal associations.  Di  dalam:  Lynch  P,  editor. Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture . Canberra (AU): Australian Centre for  International  Agriculture Research.
Chakraborty U, Chakraborty BN, Chakraborty AP. 2010. Influence of Serratia marcescens
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Susanti et al.
TRS-1 on growth promotion and induction of resistance in Camellia sinensis against Fomes lamaoensis . J Plant Interact. 5(4): 261–272. DOI: https://doi.org/10.1080/174 29140903551738.
Chmielowska  J,  Deckert  J,  Diaz  J.  2008. Activity of peroxidases and phenylalanine ammonia-lyase in lupine and soybean seedlings  treated  with  copper  and  an ethylene inhibitor. Biol Lett. 45:59–67.
Collins  DP,  Jacobsen  BJ.  2003.  Optimizing
a Bacillus subtilis isolate  for  biological control of sugar beet cercospora leaf spot. Biol Control. 26(2):153–161. DOI: https:// doi.org/10.1016/S1049-9644(02)00132-9. Coutinho TA, Wingfield MJ. 2017. Ralstonia solanacearum and R. Pseudosolanacearum on eucalyptus: Opportunists or primary pathogens?  Front  Plant  Sci.  8(761):1–7. DOI:  https://doi.org/10.3389/fpls.2017.00 761.
Fonseca NR, Oliveira LSS, Guimaraes LMS, Teixeira  RU,  Lopes  CA,  Alfenas  AC. 2015.  An  efficient  inoculation  method of Ralstonia solanacearum to  test  wilt resistance in Eucalyptus spp. Trop Plant Pathol. 41(1):42–47. DOI: https://doi.org/ 10.1007/s40858-015-0056-2.
Habazar T, Yanti Y, Daulay NR. 2020. In planta screening of chili roots endophyte bacteria to control bacterial wilt disease. IOP Conf Ser:  Earth  Environ  Sci.  583:1–12.  DOI: https://doi.org/10.1088/1755-1315/583/1/ 012021.
Hashem A, Abd-Allah EF, Alqarawi AA, Al- Huqail  AA,  Wirth  S,  Egamberdieva  D. 2016. The interaction between arbuscular mycorrhizal fungi and endophytic bacteria enhances plant growth of Acacia gerrardii under salt stress. Front Microbiol. 7:1–15. DOI:  https://doi.org/10.3389/fmicb.2016. 01089.
Hayward AC. 1991. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum .  Annu  Rev  Phytopathol. 29:65–87.  DOI:  https://doi.org/10.1146/ annurev.py.29.090191.000433.
Jataraf  J,  Radhakrim  NV,  Hannk  P,  Sakoof R.  2005.  Biocontrol  of  tomato  damping-
off  caused  by Pythium aphanidermatum . Biocontrol  Sci  Technol.  15:55–65.  DOI: https://doi.org/10.1080/095831504000159
20.
Jorjani  M,  Heydari  A,  Zamanizadeh  HR. 2012.  Controlling  Sugar  Beet  Mortality Disease. J Plant Prot Res. 52(3):303–307. DOI: https://doi.org/10.2478/v10045-012- 0049-9.
Konappa NM, Maria M, Uzma F, Krishnamurthy S, Nayaka SC, Niranjana SR, Chowdappa S. 2016. Lactic acid bacteria mediated induction of defense enzymes to enhance the resistance in tomato against Ralstonia solanacearum causing  bacterial  wilt.  Sci Hortic. 207:183–192. DOI: https://doi.org/ 10.1016/j.scienta.2016.05.029.
Linderman RG. 2000. Effects of Mycorrhizas on Plant Tolerance to Diseases. Di dalam: Arbuscular Mycorrhizas: Physiology and Function . Norwell (MA): Kluwer Academic Publisher. hlm 345–365. DOI: https://doi. org/10.1007/978-94-017-0776-3_15.
Mafia  RG, Alfenas AC,  Maffia  LA,  Ferreira EM, Binoti DHB, Mafia GMV. 2009. Plant growth promoting rhizobacteria as agents in the biocontrol of eucalyptus mini-cutting rot. Trop Plant Pathol. 34(1):10–17. DOI: https://doi.org/10.1590/s1982-567620090 00100002.
Mandal  SM,  Chakraborty  D,  Dey  S.  2010. Phenolic acids act as signaling molecules in plant-microbe symbioses. Plant Signal Behav. 5(4):359–368. DOI: https://doi.org/ 10.4161/psb.5.4.10871.
Mansoori  M,  Heydari  A,  Hassanzadeh  N, Rezaee  S,  Naraghi  L.  2013.  Evaluation of  Pseudomonas  and  Bacillus  bacterial antagonists for biological control of cotton Verticillium wilt disease. J Plant Prot Res. 53(2):154–157.  DOI:  https://doi.org/10. 2478/jppr-2013-0023.
Ongena  M,  Jourdan  E, Adam A,  Paquot  M, Brans A, Joris B, Arpigny JL, Thonart P. 2007. Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic  resistance  in  plants.  Environ Microbiol.  9(4):1084–1090.  DOI:  https:// doi.org/10.1111/j.1462-2920.2006.01202.x.
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Pedone-Bonfim  MVL,  da  Silva  FSB,  Maia LC.  2015.  Production  of  secondary metabolites  by  mycorrhizal  plants  with medicinal or nutritional potential. Acta Physiol  Plant.  37(27):1–12.  DOI:  https:// doi.org/10.1007/s11738-015-1781-3.
Pozo  MJ,  Jung  SC,  Martınez-Medina  A,
Lopez-Raez  JA,  Azcon-Aguilar  C, Barea  JM.  2013.  Root Allies: Arbuscular Mycorrhizal  Fungi  Help  Plants  to  Cope with Biotic Stresses. Di dalam: Aroca R, editor. Soil Biology . Heidelberg (DE): Springer. hlm. 289–306. DOI: https://doi. org/10.1007/978-3-642-39317-4. Ran  L,  Liu  C,  Wu  G,  VanLoon  L,  Bakker P.  2005.  Suppression  of  bacterial  wilt in Eucalyptus urophylla by  fluorescent Pseudomonas spp.  in  China.  Biol Control.  32(1):111–120.  DOI:  https://doi. org/10.1016/j.biocontrol.2004.08.007. Rashad YM, Abbas MA, Soliman HM, Abdel- Fattah  GG,  Abdel-Fattah  GM.  2020. Synergy  between  endophytic  Bacillus amyloliquefaciens  GGA  and  arbuscular mycorrhizal  fungi  induces  plant  defense responses  against  white  rot  of  garlic  and improves  host  plant  growth.  Phytopathol Mediterr. 59(1):169–186. DOI: https://doi. org/10.36253/phyto-11019.
Santiago  TR,  Grabowski  C,  Rossato  M,
Romeiro  RS,  Mizubuti  ESG.  2015. Biological control of eucalyptus bacterial wilt  with  rhizobacteria.  Biol  Control. 80:14–22.  DOI:  https://doi.org/10.1016/j. biocontrol.2014.09.007.
Shen Y, Li J, Xiang J, Wang J, Yin K, Liu Q.
2019. Isolation and identification of a novel protein  elicitor  from  a Bacillus subtilis strain  BU412.  AMB  Express.  9(1):1–9 DOI:  https://doi.org/10.1186/s13568-019- 0822-5.
Siddiqui  ZA,  Pichtel  J.  2008.  Mycorrhizae: an  overview.  Di  dalam:  Siddiqui  ZA, Akhtar MS, Futai K, editor. Mycorrhizae: Sustainable Agriculture and Forestry . Dordrecht  (DE):  Springer.  hlm.  1:1–35. DOI:  https://doi.org/10.1007/978-1-4020- 8770-7.
Siregar  BA,  Indrayadi  H,  Mardai  2012. Ancaman  Penyakit  layu  bakteri  terhadap produktivitas Eucalyptus pellita di dataran rendah  tropis.  Laporan  Tahunan  R&D. Perawang  (ID):  R&D  PT.  Arara  Abadi. hlm. 1– 15. Soliman  MA.  2020. Paenibacillus polymyxa and Bacillus aryabhattai as Biocontrol Agents against Ralstonia solanacearum In Vitro and In Planta. JPPP. 11(3):197–203. DOI:  https://doi.org/10.21608/jppp.2020. 87024.
Song F, Song G, Dong A, Kong X. 2011. Regulatory  mechanisms  of  host  plant defense responses to arbuscular mycorrhiza. Acta Ecol Sin. 31(6):322–327. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.chnaes.2011.09.001.
Tahat  MM,  Sijam  K,  Othman  R.  2012.  The potential  of  endomycorrhizal  fungi  in controlling tomato bacterial wilt Ralstonia solanacearum under glasshouse condition. Afr  J  Biotechnol.  11(67):13085–13094. DOI: https://doi.org/10.5897/ajb11.3629. Upreti  R,  Thomas  P.  2015.  Root-associated bacterial  endophytes  from Ralstonia solanacearum resistant and susceptible tomato  cultivars  and  their  pathogen antagonistic  effects.  Front  Microbiol. 6(255):1–12. DOI: https://doi.org/10.3389/ fmicb.2015.00255. Van der Plank JE. 1963. Plant Diseases: Epidemics and Control . New York (NY): Academic Press. Wang N, Liu M, Guo L, Yang X, Qiu D. 2016. A  novel  protein  elicitor  (PeBA1)  from Bacillus amyloliquefaciens NC6 induces systemic resistance in Tobacco. Int J Biol Sci.  12(6):757–767.  DOI:  https://doi.org/ 10.7150/ijbs.14333.
Whipps JM, Lumsden RD.  2001. Commercial use  of  fungi  as  plant  diseases  biological control agents: status and prospects.  Di dalam: Butt, TM, Magan N, editor. Fungi as Biocontrol Agents: Progress, Problems and Potential .  Wallingford  (GB):  CABI Publishing.  hlm. 9-22.