## BIOTROPIKA Journal of Tropical Biology
https://biotropika.ub.ac.id/
Vol. 8  |  No. 1  |  2020  |  DOI : 10.21776/ub.biotropika.2020.008.01.05
KULTUR KALUS TANAMAN OBAT CIPLUKAN ( Physalis angulata L. )
CALLUS CULTURE OF MEDICINAL PLANTS CIPLUKAN ( Physalis angulata L. )
Retno Mastuti 1)* , Wahyu Widoretno 1) , Nunung Harijati 1)

## ABSTRAK
Ciplukan  ( Physalis  angulata L.)  merupakan  anggota  famili  Solanaceae  yang telah lama dimanfaatkan sebagai tanaman obat. Penyediaan tanaman obat yang umumnya  tumbuh  liar  dan  belum  banyak  dibudidayakan  ini  telah  diupayakan melalui  propagasi  tanaman  secara  in  vitro.  Kultur  kalus  banyak  dilaporkan berpotensi  sebagai  alternatif  sumber  metabolit  sekunder  termasuk  yang berkhasit  obat.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  optimasi  inisiasi  dan pemeliharaan  kultur  kalus  P.  angulata  menggunakan  eksplan  kotiledon  dan hipokotil  kecambah  in  vitro.  Kalus  diinduksi  pada  medium  MS  ditambah  Zat Pengatur  Tumbuh  (ZPT)  BAP  0,5  dan  2  mg/l  yang  masing-masing dikombinasikan dengan 2,4-D 1, 2, dan 4 mg/l dan IAA 0,05 , 0,5 dan 1,0 mg/l. Secara  umum  kedua  eksplan  kotiledon  maupun  hipokotil  menunjukkan  respon proliferasi yang baik terhadap kombinasi ZPT yang diujikan. Jenis eksplan tidak berpengaruh  nyata  pada  kemampuan  pembentukan  kalus  pada  semua  (100%) bagian  jaringan eksplan  dan berat  basah  (BB)  kalus  primer  maupun  sekunder. Berat  basah  kalus  primer  maupun  sekunder  lebih  dipengaruhi  oleh  kombinasi ZPT. Subkultur kalus primer pada medium pemeliharaan dengan kombinasi BAP (0,5  dan  1  mg/l)  +  IAA  /  2,4-D  0,2  mg/l  tidak  hanya  menghasilkan  kalus sekunder  tetapi  juga  menghasilkan  tunas  dan  akar.  Kombinasi  BAP  2  mg/l  + 2,4-D  (1,  2  dan  4  mg/l)  dapat  mempertahankan  pertumbuhan  kalus  sekunder tanpa mengalami organogenesis. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kultur kalus  dapat  dihasilkan  secara  optimal  baik  dengan  eksplan  hipokotil  maupun kotiledon in vitro pada medium induksi dan pemeliharaan yang sama yaitu MS + BAP 2 mg/l + 2,4-D (1, 2 dan 4 mg/l).
Kata Kunci: eksplan, friabel, hipokotil, in vitro , kotiledon

## ABSTRACT
Ciplukan  ( Physalis  angulata L.)  is  a  member  of  the  Solanaceae  family which  has  long  been  used  as  a  medicinal  plant.  Provision  of  medicinal  plants that generally grow wild and have not been widely cultivated has been attempted through  propagation  of  plants  in  vitro.  Callus  culture  has  been  reported  as  a potential  alternative  source  of  secondary  metabolites,  including  those  with medicinal properties. This study aims to optimize the initiation and maintenance of P. angulata callus culture using cotyledonary explants and hypocotyl sprouts in  vitro.  Callus  was  induced  on  MS  medium  supplemented  with  Plant  Growth Regulator (PGR), namely BAP 0.5 and 2 mg / l, each combined with 2,4-D 1, 2, and  4  mg  /  l  and  IAA  0.05,  0.5  and 1.0  mg  / l.  In  general,  both cotyledon  and hypocotyl  explants  showed  a  good  proliferation  response  to  the  ZPT combination tested. The type of explant had no significant effect on the ability of callus formation in all (100%) parts of explant tissue and fresh weight (FW) of primary and secondary callus. The primary and secondary callus FW was more influenced  by  the  combination  of  PGR.  Primary  callus  subculture  on maintenance medium with a combination of BAP (0.5 and 1 mg / l) + IAA / 2,4- D  0.2  mg / l not  only  produced  secondary  callus  but also produced  shoots  and roots. The combination of BAP 2 mg / l + 2,4-D (1, 2 and 4 mg / l) can maintain secondary callus  growth  without  undergoing organogenesis.  The  results  of  this study indicate that callus culture can be produced optimally both from hypocotyl
Diterima: 22 April 2020
Disetujui: 15 Mei 2020

## Afiliasi Penulis:
1) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan  Alam,  Universitas

## Brawijaya
Alamat Korespondensi:
* mastuti7@ub.ac.id

## Cara Sitasi:
Mastuti,  R.,  W.  Widoretno,  N. Harijati.  2020.  Kultur  kalus tanaman  obat  ciplukan  ( Physalis angulata L.). Biotropika: Journal of Tropical Biology 8 (1): 26-35.
and  cotyledons  explants  in  vitro  on  the  same  induction  and  maintenance medium, namely MS + BAP 2 mg / l + 2,4-D (1, 2 and 4 mg / l) .
Keywords: explan, friable, hypocotyl, in vitro, cotyledon

## PENDAHULUAN
Kalus  merupakan  sekumpulan  massa  sel yang  aktif  membelah,  tidak  terorganisir,  dan belum  terdiferensiasi.  Secara  alami  kalus terbentuk  sebagai  respon  perbaikan  terhadap kondisi  stress  seperti  pelukaan  dan  infeksi patogen  [1].  Pada  kondisi  artifisial in  vitro penambahan kombinasi hormon eksogen dapat memperpanjang  proses  pembelahan  sel  hingga menghasilkan  massa  kalus  yang  banyak. Apabila  massa  kalus  telah  mampu  dihasilkan dari  sepotong  kecil  jaringan  induknya  maka lingkungan tumbuh in vitro dapat dimodifikasi untuk meningkatkan akumulasi produk senyawa  metabolit  sekunder  yang  juga  akan bermanfaat  dalam  mengurangi  eksplorasi  dan resiko  kepunahan  suatu  spesies  tanaman  dari habitat  aslinya  [2,  3].  Teknik  kultur  jaringan, melalui  kultur  kalus  dan  kultur  suspensi  sel telah  banyak  digunakan  untuk  produksi senyawa  metabolit  sekunder  [4,  5,  6,  7]. Ketersediaan  kultur  sel  dan  jaringan  secara berkelanjutan  dapat  menjadi  solusi  senyawa sekunder  yang  hanya  diproduksi  pada  struktur dan jaringan yang spesifik dan fase pertumbuhan  tertentu  [8].  Manipulasi  kultur kalus dapat meningkatkan kandungan senyawa metabolit  sekunder  yang  bernilai  komersial baik  secara  kuantitatif  maupun  kualitatif  [9, 10].  Kultur  kalus  yang  dimodifikasi  secara genetik  dapat  digunakan  untuk  sintesis metabolit sekunder bioaktif dan untuk regenerasi  tanaman  dengan  daya  tahan  yang lebih  baik  terhadap  stres  garam,  angin, penyakit,  dan  hama  [11].  Pembentukan  kalus dipengaruhi  oleh  jenis  eksplan  dan  kombinasi Zat  Pengatur  Tumbuh  (ZPT)  pada  medium kultur.  Tipe  eksplan  yang  berbeda  akan memberikan  respon  yang  berbeda  terhadap kecepatan  pembentukan  dan  pertumbuhan serta  perkembangan  kalus  [12,  13].  Oleh karena  itu  untuk  pengembangan  kultur  kalus diperlukan  medium  kultur  yang  paling  sesuai untuk jenis eksplan tertentu.
Ciplukan ( Physalis angulata L.)
merupakan  tanaman  herba  tahunan  anggota famili Solanaceae yang telah lama dimanfaatkan sebagai obat tradisional.
Ciplukan banyak mengandung senyawa metabolit  sekunder  antara  lain withanolide , physalin , calystegine ,  dan  alkaloid  tropan nortropan  [14].  Hasil  penelitian in  vitro maupun in  vivo menunjukkan  bahwa  senyawa kimia yang terkandung pada tanaman ciplukan memiliki aktivitas antara lain sebagai, antibakteri  [15,  16],  antiinflamatori,  analgesik dan  antipiretik  [17].  Beberapa  senyawa  telah diisolasi  dari P. angulata dan  telah  dilakukan karakterisasi  secara  kimia.  Senyawa physalin dari  kelompok  steroid  ditemukan  pada  daun dan batang P. angulata [18].
Pada  genus Physalis induksi  kalus  telah diteliti  pada P. minima [19,  20,  21],  P. peruviana [22], P. angulata [23],  dan P. pubescens [24].  Pertumbuhan  kalus in  vitro terbaik  pada P.  pubescens diperoleh  dari eksplan in  vitro batang  dan  petiol  pada medium MS + NAA 0,5 mg/l + BAP 0,5 mg/l dan  MS  +  NAA  0,25  mg/l  +  0,5  mg/l  [24]. Kultur  kalus P. angulata telah  dilaporkan berhasil  diinduksi  dari  eksplan  hipokotil kecambah in  vitro pada  medium  MS  dengan penambahan  beberapa  kombinasi  sitokinin (BAP dan kinetin) dan auksin (2,4-D, IBA dan IAA) [23]. Penambahan 2,4-D mampu menginduksi pembentukan kalus pada potongan  eksplan  hipokotil  paling  banyak, yaitu  >80%    bagian.  Kalus  yang  dihasilkan pada  medium  dengan  penambahan  2,4-D memiliki  berat  basah  (BB)  paling  tinggi  tetapi sampai  minggu  keempat  setelah  kultur  hanya mencapai sekitar 0,5 g.  Oleh karena itu, upaya penyediaan  kalus P. angulata secara  optimal dan berkelanjutan masih perlu dilakukan untuk mendukung  perbanyakan  /  penyediaan  bibit berkualitas  secara  massal  maupun  untuk manipulasi produksi senyawa metabolit sekunder.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk optimasi  induksi  dan  produksi  kalus  dari eksplan  hipokotil  dan  kotiledon P. angulata in vitro pada  beberapa  kombinasi  ZPT  terutama BAP dengan 2,4-D atau IAA.

## METODE PENELITIAN
Persiapan  sumber eksplan .    Biji diperoleh  dari  buah  masak  tanaman  ciplukan
yang  tumbuh  liar  di  ladang  jagung  di  daerah Malang  Selatan.  Setelah  dikeringanginkan, kemudian  biji  disterilisasi  dengan  larutan kloroks  20%  selama  15  menit  dan  dibilas dengan  akuades  steril  selama  lima  menit sebanyak  tiga  kali.  Biji  yang  telah  disterilisasi dikecambahkan  pada  medium  agar  tanpa penambahan  komponen  makro  dan  mikro nutrien  maupun  ZPT.  Satu  minggu  setelah perkecambahan bagian hipokotil dan kotiledon kecambah  dapat  digunakan  untuk  eksplan induksi kalus.
Pengaruh  jenis  eksplan  dan  variasi kombinasi ZPT pada induksi kalus. Eksplan kotiledon  utuh  dan  hipokotil  sepanjang  0,5 cm yang  dipotong tepat di bawah percabangan kotiledon  kecambah in  vitro diinokulasi  pada medium  MS  +  kombinasi  auksin:sitokinin yang  ditambah  gula  pasir  3%,  dan  dipadatkan dengan  agar  komersial  10%.  Zat  pengatur tumbuh  yang  diujikan  adalah  BAP  0,5  dan  2 mg/l  yang  masing-masing  dikombinasikan dengan 2,4-D (1, 2, dan 4 mg/l) dan IAA (0,05, 0,5,  dan  1,0  mg/l).  Eksplan  kotiledon  utuh diinokulasikan  pada  medium  dengan  sisi abaksial  menghadap  ke  permukaaan  medium agar sedangkan eksplan hipokotil diletakkan di atas  medium  secara  horisontal.  Setiap  jenis eksplan  dikultur  dalam  10  botol  dan  setiap botol  kultur  diisi  tiga  buah  eksplan  untuk masing-masing jenis. Selanjutnya semua kultur diinkubasi pada suhu 24  2ºC dengan kelembaban  relatif  60-65%  dan  pencahayaan secara  terus-menerus  pada  intensitas  sekitar 600  lux  yang  diberikan  oleh  cahaya  fluoresen putih.  Kalus  primer  yang  memiliki  morfologi dan respon pertumbuhan yang baik disubkultur pada  medium  pemeliharaan  yaitu  a)  medium dengan  penambahan  BAP  0,5  dan  1,0  mg/l yang  masing-masing  dikombinasikan  dengan IAA  dan  2,4-D  0,2  mg/l,  dan  b)  medium  yang menghasilkan  respon  terbaik  untuk  induksi kalus.
Parameter  induksi  dan  pertumbuhan kalus. Kecepatan induksi kalus dan perubahan morfologi  dalam  proses  dediferensiasi  dan persentase  eksplan  yang  membentuk  kalus diamati  setiap  hari  sampai  umur  kultur  tiga minggu.  Friabilitas  dan  warna  kalus  juga diamati  seiring  dengan  perkembangan  massa kalus.  Berat  basah  kalus  primer  ditimbang pada umur kultur empat minggu sedangkan BB kalus  sekunder  ditimbang  setiap  minggu selama tiga minggu.
Analisis data . Respon pembentukan kalus dianalisis secara deskriptif. Analisis komparasi data  kuantitatif  dilakukan  dengan  One-way ANOVA  (P<0,05).  Uji  lanjutan  menggunakan Tukey  HSD  pada  taraf  5%  menggunakan software SPSS 24.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Induksi  kalus .  Eksplan  hipokotil  dan kotiledon  kecambah  ciplukan in  vitro umur satu minggu menunjukkan respon pembentukan  kalus  primer  yang  baik  pada semua  kombinasi  ZPT  yang  diujikan.  Kalus primer  adalah  kalus  yang  dihasilkan  pada jaringan  eksplan  [25].  Proliferasi  sel  secara aktif  ditandai  dengan  peningkatan  ukuran eksplan  kotiledon  maupun  hipokotil  yang mulai  tampak  pada  hari  ketiga  setelah  kultur. Potongan  eksplan  hipokotil  yang  awalnya berwarna  hijau  muda  keputihan  dengan  BB  < 0,01  g  dan  diameter  0,5  mm  mulai  tampak membengkak  dan  menebal  serta  berwarna putih keruh. Eksplan kotiledon yang berukuran 3-4  mm  mulai  tampak  memanjang,  melebar dan  menebal  dengan  warna  hijau  yang bervariasi,  yaitu  hijau  keputihan,  hijau  muda jernih dan hijau tua.
Satu  minggu  setelah  kultur,  indikasi terjadinya  proses  dediferensiasi  pada  kedua jenis  eksplan  semakin  jelas  yang  ditunjukkan dari  peningkatan  ukuran.  Eksplan  hipokotil mulai menunjukkan massa kalus yang terbentuk  pada  kedua  ujung  potongan  atau bahkan  pada  seluruh  potongan  hipokotil (Gambar  1A).  Sedangkan  dediferensiasi  dan proliferasi  pada  eksplan  kotiledon  juga ditunjukkan  dengan  peningkatan  ukuran  yang signifikan (Gambar 1B).
Gambar 1 .  Perubahan morfologi eksplan pada  tahap  induksi  kalus  satu minggu  setelah  kultur.  A  eksplan hipokotil,  B.  eksplan  kotiledon. Keterangan:  *:  jaringan  hipokotil atau kotiledon yang telah mengalami dediferensiasi dan proliferasi  sel,  :  eksplan  pada saat  awal  kultur  di  medium induksi kalus.
Pada  kultur  umur  dua  minggu  semua eksplan  hipokotil  tetap  mengalami  proliferasi aktif  yang  ditunjukkan  dengan  ukuran  yang semakin  bertambah  (Tabel  1).  Pada  medium BAP  2  mg/l  eksplan  hipokotil  mengalami pembengkakan  lebih  tebal  pada  dibanding pada  medium  BAP  0,5  mg/l.  Kombinasi  BAP 2  mg/l  +  IAA  menghasilkan  pembengkakan eksplan  lebih  tebal  dibanding  kombinasi  BAP + 2,4-D (Gambar 2A). Pembengkakan semakin tebal  seiring  dengan  peningkatan  konsentrasi IAA.  Respon  yang  sama  juga  ditunjukkan eksplan  kotiledon.  Secara  umum  tingkat proliferasi  sel  lebih  baik  pada  medium  BAP  2 mg/l  (Gambar  2B-C).  Jenis  auksin  IAA menginduksi  proliferasi  lebih  baik  dibanding 2,4-D (data tidak dipublikasikan).
Gambar 2 .  Inisiasi  kalus  dua  minggu  setelah kultur. A. Pembengkakan / penebalan seluruh jaringan eksplan hipokotil, B. Pembentukan  kalus  pada  bagian pangkal  eksplan  kotiledon  yang sudah membesar, C. Dediferensiasi pada seluruh jaringan eksplan kotiledon.
Kultur  kalus  dapat  diperoleh  melalui  dua tahap,  yaitu  induksi  dan  proliferasi.  Tahap induksi melibatkan dediferensiasi yang merupakan  proses  perubahan  sitologi  maupun morfologi sel dewasa menjadi sel yang bersifat meristematis  kembali.  Aktivitas  proliferasi secara aktif mengakibatkan peningkatan jumlah  sel  sehingga  jaringan  induk  terlihat menjadi  lebih  tebal  dan  membesar  atau membengkak.  Proliferasi  aktif  ini  umumnya terjadi sebagai respon cepat perbaikan terhadap pelukaan  pada  jaringan.  Ketersediaan  hormon eksogen  dan  endogen  yang  sesuai  akan memicu  pembelahan  secara  berkelanjutan  dan meregulasi  terbentuknya  massa  kalus  yang tidak terorganisasi (amorf) [26]. Jaringan kalus merupakan  sekumpulan  massa  sel  parenkim yang  berdinding  tipis  yang  dapat  tersusun renggang  (remah)  atau  rapat  (kompak)  satu sama  lain.  Kombinasi  auksin  dan  sitokinin pada  medium  dapat  mempengaruhi  kecepatan pembentukan  kalus.  Selain  itu  tipe  jaringan
eksplan  yang  berbeda  juga  berpengaruh  pada intensitas kalus yang terbentuk [27].
Pada umur kultur tiga minggu kedua jenis eksplan pada seluruh kombinasi ZPT menunjukkan  perbedaan  kisaran  persentase pembentukan  kalus.  Pembentukan  kalus  pada 100% eksplan hipokotil berkisar antara 66,67 - 100% sedangkan pada eksplan kotiledon antara 25 – 94,44%.  Medium  BAP 2 mg/l + 2,4-D 4 mg/l  menunjukkan  pembentukan  kalus  100% paling sedikit (66,67%) (Gambar 3A) sedangkan  BAP  0,5  mg/l  +  2,4-D  2  mg/L  dan BAP  2  mg/l  +  IAA  1,0  mg/l  menunjukkan pembentukan  kalus  100%  yang  lebih  banyak, masing-masing  sebanyak  93,33%  dan  100%. Sedangkan  eksplan  kotiledon  yang  telah menghasilkan kalus 100% berkisar antara 25 – 94,44%. Berdasarkan individu eksplan, jaringan  hipokotil  juga  relatif  lebih  responsif dalam  proses  dediferensiasi  sel  untuk  induksi kalus  dibanding  eksplan  kotiledon  (Gambar 3B).  Hasil  ini  ditunjukkan  dengan  bagian potongan eksplan hipokotil yang menghasilkan kalus berkisar antara 81,67  – 100% sedangkan pada  eksplan  kotiledon  berkisar  antara  56,7  – 97,2%.
Gambar 3 .   Respon  pembentukan  kalus  pada dua  jenis  eksplan P.  angulata pada umur kultur tiga minggu. A. Persentase  ulangan  eksplan  yang menghasilkan  kalus  dari  seluruh ulangan.  B.  Persentase  bagian individu eksplan yang mengalami dediferensiasi menghasilkan kalus. B= BAP, D= 2,4-D.
Tabel 1 .   Morfologi perkembangan  eksplan hipokotil dan kotiledon pada beberapa medium induksi kalus empat minggu setelah kultur
No Kombinasi ZPT (mg/L) Morfologi / tekstur kalus pada dua jenis eksplan BAP 2,4-D IAA kotiledon hipokotil kalus organogenesis tekstur kalus organogenesis tekstur 1
0,5 1 - + tunas & akar Hijau kompak ++ Tunas & akar hijau keputihan kompak / kekuningan friabel 2 2 - + akar +++ +++ tunas friabel kuning /  hijau kompak 3 4 - + akar sebagian menjadi coklat + tunas hijau kompak / friabel kuning bagian bawah kecoklatan;
4 2 1 - ++ -
hijau kompak +++ - hijau friabel / hijau keputihan kompak 5 2 - +++ - hijau kompak ++ nodul tunas hijau friabel dan kompak hijau keputihan 6 4 - ++ - kompak hijau agak kekuningan ++ - hijau friabel dan kompak hijau keputihan 7
0,5 0,05 + -
+ tunas hijau friabel 8 - 0,5 + tunas hijau kompak ++ tunas kompak, hijau keputihan bagian bawah kecoklatan 9 - 1,0 + - hijau kompak + tunas kompak, hijau keputihan bagian bawah kecoklatan 10 2 - 0,05 + tunas
hijau keputihan  kalus pada salah satu ujung hipokotil tunas kompak hijau keputihan 11 - 0,5 + tunas hijau keputihan, kompak + - friabel hijau kekuningan dan kompak 12 - 1,0 + - kebanyakan kompak, sebagian kecil friabel + - kompak /friabel hijau kekuningan
Empat  minggu  setelah  kultur  eksplan hipokotil dan kotiledon masing-masing mengalami  perkembangan  morfologi  yang bervariasi (Tabel 1). Kalus umumnya berwarna hijau,  kompak  maupun  remah  (friabel).  Dari semua  kombinasi  ZPT  hanya  medium  BAP  2 mg/l  +  2,4-D  yang  hanya  menghasilkan  kalus primer saja tanpa menghasilkan organogenesis. Perkembangan  ini  hanya  terjadi  pada  eksplan hipokotil.
Hasil  analisis  varian  menunjukkan  bahwa BB  kalus  dipengaruhi  oleh  interaksi  sitokinin (BA) dan auksin (2,4-D atau IAA) (Gambar 4). Berat  basah  kalus  tidak  dipengaruhi  oleh  jenis eksplan.  Pada  medium  kombinasi  BAP  +  2,4- D BB  kalus yang  dihasilkan  eksplan kotiledon tidak berbeda nyata. Eksplan hipokotil menghasilkan  BB  kalus  tertinggi  pada  media BAP  0,5  mg/l  +  2,4-D  1  mg/l  (0,9  0,3  g) yang  berbeda  nyata  dengan  BB  kalus  pada media  BAP  0,5  mg/l  +  2,4-D  4  mg/l  (0,4  0,16 g) dan BAP 2 mg/l + 2,4-D 2 mg/l (0,5 
0,12  g).  Berat  basah  kalus  paling  rendah cenderung dihasilkan  medium BAP 0,5 mg/l + IAA  0,05  mg/l  dan  BAP  0,5  mg/l  +  IAA  0,05 mg/l pada eksplan hipokotil maupun kotiledon. Berat  basah  kalus  yang  dihasilkan  eksplan
hipokotil  dan  kotiledon  pada  kedua  jenis medium tersebut, masing-masing hanya mencapai  0,19  0,05  mg/l  dan  0,21  0,05 mg/l.
Zat  pengatur  tumbuh  2,4-D  diketahui sebagai auksin sintetik utama yang berpengaruh  signifikan  pada  kalogenesis  [28]. Tetapi  untuk  menginduksi  pertumbuhan  kalus dari  tanaman  dikotil  sering  ditambahkan sitokinin.  IAA  adalah  salah  satu  hormon auksin  yang  banyak  digunakan  untuk  induksi pertumbuhan  akar in  vitro [29].  Kombinasi IAA  dengan  BAP  dapat  menghasilkan  induksi kalus in  vitro maksimum  pada  eksplan  batang Citrullus  colocynthis bila  ditambahkan  2,4-D [30].
Gambar 4 .   Berat  basah  jaringan  eksplan yang  mengalami  dediferensiasi empat  minggu  setelah  kultur. Keterangan:  B=  BAP,  D=2,4-D, I=IAA.  Huruf  yang  sama  pada jenis eksplan yang sama dan jenis auksin  yang  sama  menunjukkan tidak berbeda nyata (  =0,05).
Berdasarkan  hasil  pengamatan  deskriptif (Tabel  1)  dan  data  pertumbuhan  secara kuantitatif  (Gambar  4)  dapat  disimpulkan bahwa  eksplan  hipokotil  kecambah  in  vitro ciplukan berpotensi menghasilkan kalus primer tanpa  organogenesis  apabila  dikultur  pada medium  dengan  penambahan  kombinasi  BAP dan  2,4-D.  Berdasarkan  respon  perkembangan morfologi (Tabel 1) dan pertumbuhan (Gambar 4)  yang  dihasilkan  maka  kalus  primer  hasil induksi pada lima medium induksi kalus (BAP 2 mg/l + IAA 1 mg/l; BAP 0,5 mg/l + 2,4-D 1 mg/l;  dan  BAP  2  mg/l  +    2,4-D  1,  2,  dan  4 mg/l) selanjutnya disubkultur pada empat jenis medium  pemeliharaan  kalus,  yaitu  kombinasi BAP  0,5  dan  1,0  mg/l  yang  masing-masing
dikombinasikan  dengan  IAA  dan  2,4-D  0,2 mg/l.
Pemeliharaan  kalus .  Empat  minggu setelah  subkultur  umumnya  semua  medium pemeliharaan  menghasilkan  kalus  sekunder kompak  putih/kehijauan  (Tabel  2).  Kalus primer dari eksplan hipokotil mampu mempertahankan pertumbuhan kalusnya walaupun  organogenesis  baik  tunas  maupun akar  juga  muncul  pada  banyak  medium pemeliharaan  (Gambar  5A).  Kalus  primer  dari eksplan  hipokotil  pada  medium  BAP  2  mg/l  + 2,4-D 1 mg/l atau 2 mg/l setelah disubkultur ke medium pemeliharaan menghasilkan pertumbuhan  tunas  (Tabel  2;  Gambar  5A). Eksplan  kotiledon  tampak  lebih  dominan dalam  menghasilkan  kalus  sekunder  (Gambar 5B)  tetapi  organogenesis  juga  terjadi  pada beberapa medium pemeliharaan.
Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  empat medium  pemeliharaan  yang  diujikan  yaitu kombinasi  BAP  0,5  atau  1  mg/l  dengan  2,4-D 2  mg/l  atau  IAA  2  mg/l  kurang  mampu mempertahankan  pertumbuhan  kalus.  Oleh karena  itu,  kalus  primer  disubkultur  ke medium  pemeliharaan  dengan  komposisi  ZPT yang sama dengan medium induksi kalus, yaitu BAP  2  mg/l  dikombinasikan  dengan  2,4-D  1, 2, dan 4 mg/l.
Gambar  5 .  Morfologi  kalus  pada  medium  pemeliharaan  kalus.  A  eksplan  hipokotil,  B.  Eksplan kotiledon.  Keterangan:  lajur  paling  kiri  adalah  medium  induksi  kalus;  baris  paling  atas adalah medium pemeliharaan.
Tabel 2 .  Deskripsi  morfo-organogenesis  eksplan  kotiledon  dan  hipokotil pada medium pemeliharaan empat minggu setelah subkultur
HIPOKOTIL KOTILEDON No Mediu m asal BAP1 IAA 0,2 BAP1 2,4-D 0,2 BAP0,5 IAA 0,2 BAP0,5 2,4-D 0,2 BAP1 IAA 0,2 BAP1 2,4-D 0,2 BAP0,5 IAA 0,2 BAP0,5 2,4-D 0,2 1 BAP 2 IAA 1 kalus kompak kehijauan kalus kompak keputih an/keku ningan kalus kompak kehijauan kalus; muncul akar kalus kompak keputih an ; muncul akar* Kontami nasi kalus kompak keputih an/keku ningan kalus kompak kehijauan kalus kompak keputihan; muncul tunas* & akar* 2 BAP 0,5 2,4- D 1 kalus kompak hijau ; muncul akar* kalus kompak hijau ; muncul akar** kalus kompak hijau ; muncul akar * kalus kompak hijau; muncul akar** & tunas kalus kompak kehijauan kalus kompak kehijauan kalus kompak kehijauan kalus kompak kehijauan 3 BAP 2 2,4-D 4 kalus kompak kehijauan ; muncul tunas** kalus kompak putih kehijauan ; muncul tunas* kalus kompak kehijauan kalus kompak kehijauan ; muncul tunas** kalus hijau keputih an; muncul akar** & tunas kalus hijau keputih an; muncul akar** & tunas kalus hijau gelap akar** kalus hijau keputihan; muncul akar** 4 BAP 2 2,4-D 2 tunas + akar – pertum buhan tunas sangat dominan tunas + akar – pertum buhan planlet + akar akar – pertum buhan akar dominan tunas + akar – pertum buhan planlet + akar kalus kompak hijau kekuning an kalus hijau keputih an kompak , tunas kalus hijau keputih an kompak , tunas kalus kompak hijau kekuningan 5 BAP 2 2,4-D 1 tunas + akar – pertum buhan planlet tinggi tunas + akar - aplikasi tunas tunas + akar – pertum buhan planlet/tu nas daun melebar tunas + akar – pertum buhan planlet tinggi kalus hijau keputih an + tunas kalus hijau keputih an kalus hijau keputih an + akar* kalus hijau keputihan + akar* Dua  minggu  setelah  subkultur  umumnya kalus sekunder dapat mempertahankan pertumbuhan  kalus  hijau  kompak/friabel  pada ketiga medium (Gambar 6). Hasil analisis sidik ragam  menunjukkan  bahwa  penambahan  BB kalus  selama  tiga  minggu  dipengaruhi  secara nyata  oleh  jenis  medium  (Gambar  7).  Kalus primer dari eksplan hipokotil maupun kotiledon pada tiga jenis medium pemeliharaan mengalami  peningkatan  BB  selama  tiga minggu  kultur.  Berat  basah  kalus  sekunder pada  medium  dengan  penambahan  2,4-D  1,  2 dan  4  mg/l  meningkat  signifikan  sampai minggu  kedua  setelah  subkultur,  masing- masing  mencapai  0,67  0,21  ;  0,  55  0,20 dan  0,45  0,17  g.  Pada  minggu  selanjutnya BB  masih  cenderung  bertambah  tetapi  tidak signifikan (Gambar 7). Hal ini berbeda dengan hasil  kultur  kalus  sebelumnya  yang  sampai
pada  minggu  keempat  hanya  mencapai  BB  0,5 g [23].
Gambar  6 .  Morfologi  kalus  pada  umur  kultur tiga  minggu  di  medium  MS  + BAP  2  mg/l  kombinasi  dengan 2,4-D (1, 2, dan 4 mg/l).
Gambar 7 . Respon pertumbuhan kalus selama tiga  minggu  pada  medium  MS  + BAP  (2  mg/l)  +  2,4-D  (1,  2,  4 mg/l).  A.  eksplan  hipokotil,  B. eksplan  kotiledon.  Huruf  yang sama  pada  setiap  jenis  medium menunjukkan  tidak  berbeda  nyata (  =0,05).  B=  BAP,  D=  2,4-D.
tanda *: kultur mengalami kontaminasi.
Induksi  proses  dediferensiasi  dipengaruhi oleh  hormon  endogen  dan  ZPT  eksogen  pada medium  nutrisi.  Peran  penting  pada  induksi dediferensiasi  ditentukan  oleh  jenis  dan konsentrasi  ZPT  serta  interaksinya  [31]. Kombinasi  antara  auksin  dan  sitokinin  pada medium  induksi  maupun  pemeliharaan  kalus menentukan  intensitas  pembentukan  kalus [27].

## KESIMPULAN

## Eksplan hipokotil dan kotiledon kecambah
P. angulata  in  vitro mampu  menghasilkan kalus  dengan  intensitas  berbeda  pada  semua variasi  kombinasi  sitokinin  dan  auksin.
Eksplan  yang  diinduksi  pada  medium  dengan penambahan kombinasi ZPT BAP (2 mg/l) dan 2,4-D  (1, 2  dan  4  mg/l)  mampu  meningkatkan BB  kalus  sekunder  tanpa  diiringi  munculnya tunas maupun akar.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  dana  DIPA Universitas Brawijaya berdasarkan surat perjanjian No. 5/UN10.F09.01/PN/2018.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Ikeuchi M, Sugimoto K, Iwase A (2013) Plant  callus:  Mechanisms  of  induction and  repression.  Plant  Cell  25(9):  3159–
3173. doi: 10.1105/tpc.113.116053.
[2] Yue  W,  Ming  QL,  Lin  B,  Rahman  K,
Zheng  CJ,  Han  T,  Qin  LP  (2016) Medicinal plant cell suspension cultures:
Pharmaceutical  applications  and  high- yielding  strategies  for  the  desired secondary  metabolites.  Critical  Reviews in  Biotechnology  36:215-232.  doi: 10.3109/07388551.2014.923986. [3] Chandana  BC,  Kumari  NHC,  Heena MS,  Shashikala  S  K,  Lakshmana  D (2018)  Role  of  plant  tissue  culture  in micropropagation, secondary metabolites production, and
conservation of some endangered medicinal
crops. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry SP3:246-251.
[4] Murthy  HN,  Lee  EJ,  Paek  KY  (2014)
Production  of  secondary  metabolites from  cell  and  organ  cultures:  Strategies and approaches for biomass
improvement and metabolite accumulation.  Plant  Cell  Tissue  and Organ Culture 118:1-16. doi:
10.1007/s11240-014-0467-7. [5] Isah  T,  Umar  S,  Mujib  A,  Sharma  MP, Rajasekharan  PE,  Zafar  N,  Frukh  A (2018) Secondary metabolism of pharmaceuticals  in  the  plant  in  vitro cultures:  Strategies,  approaches,  and limitations  to  achieving  higher  yield. Plant  Cell  Tissue  and  Organ  Culture. 2018;132:239-265. doi:
10.1007/
s11240-017-1332-2.
[6] Cardoso  JC,  Oliveira  MEBS,  Cardoso FCI (2019) Advances and challenges  on the  in  vitro  production  of  secondary metabolites  from  medicinal  plants. Horticultura Brasileira 37: 124-132. doi: 10.1590/s 0102-053620190201.
[7] Janarthanam  B,  Gopalakrishnan  M, Sekar  T  (2010)  Secondary  metabolite production  in  callus  cultures  of  Stevia rebaudiana  Bertoni.  Bangladesh  Journal of  Scientific  and  Industrial  Research 45(3): 243-248. doi: 10.3329/bjsir.v45i3.6532. [8] Goncalves S, Romano A (2018)
Production of plant secondary metabolites  by  using  biotechnological tool. doi:10.5772/intechopen.76414
[9] Ashokhan  S,  Othman  R,  Rahim  MHA, Karsani SA, Yaacob JS (2020) Effect of plant  growth  regulators  on  coloured callus  formation  and  accumulation  of azadirachtin, an essential biopesticide  in
Azadirachta  indica.  Plants  9(352):  1-17.
doi: 10.3390/plants9030352.
[10] Benjamin  ED,  Ishaku  GA,  Peingurta FA,  Afolabi  (2019)  Callus  culture  for the production of therapeutic compounds.  American  Journal  of  Plant Biology 4(4): 76-84. doi: 10.11648/j.ajpb.20190404.14. [11] Efferth T (2019) Biotechnology applications  of  plant  callus  cultures. Engineering 5(1):50-59. doi: 10.1016/j.eng .2018.11.006
[12] Yan  MM,  Kim  CH,  Apho  BA,  Xu  C, Um  YC,  Guo  DP  (2009)  Effects  of explant  type,  culture  media  and  growth regulators  on  callus  induction  and  plant regeneration  of  Chinese  jiaotou  (Allium chinense). Scientia Horticulturae 123(1):124-128. doi: 10.1016/j.scienta.2009.07.021.
[13] Adil  M,  Ren  X,  Kang  DI,  Thi  LT, Jeong  BR  (2018)  Effect  of  explant  type and  plant  growth  regulators  on  callus induction, growth and secondary
metabolites  production  in  Cnidium officinale  Makino.  Molecular  Biology
Reports. 45(6):1919-1927. doi:
10.1007/s11033-018-4340-3.
[14] Agata  K,  Kusiak  J,  Stępień  B,  Bergier K,  Kuźniak  E  (2010)  Bioactive secondary  metabolites  produced  by plants  of  the  genus  Physalis.  Postepy Hig Med Dosw (Online), 64, 665-73.
[15] Januário  AH,  Filho  ER,  Pietro  RCLR, Kashima S, Sato DN, França SC (2000)
Antimycobacterial physalins from Physalis angulata L. (Solanaceae). Phytotherapy  Research,  16,  445  –  448. doi:/10.1002/ptr. 939
[16] Patel T, Shah K, Jiwan K, Shrivastava N (2011)  Study  on  the  antibacterial potential  of  Physalis  minima  Linn.
Indian Journal of Pharmaceutical Science, 73(1):111-115. doi: 10.4103/0250-474X.89770
[17] Khan  MA,  Khan  H,  Khan  S,  Mahmood T,  Khan  PM,  Jabar  A  (2009)  Anti- inflammatory,  analgesic  and  antipyretic activities  of  Physalis  minima  Linn.  J. Enzyme Inhibition Med. Chem. 24, 632- 7. doi: 10.1080/14756360802321120.
[18] Lin  YS,  Chiang  HC,  Kan  WS,  Hone  E, Shih SJ, Won MH (1992) Immunomodulatory  activity  of,  various fractions derived from Physalis angulata
L.  extract.  The  American  Journal  of
Chinese  Medicine.  20(3-4):233–243. doi: 10.1142/S0192415X92000242.
[19] Mungole  AJ,  Doifode  VD,  Kamble  RB, Chaturvedi  A,  Zanwar P  (2011)  In-vitro callus  induction  and  shoot  regeneration in  Physalis  minima  L.  Annals  of Biological Research, 2 (2) : 79-85.
[20] Sheeba E, Palanivel S, Parvathi S (2013) Effect  of  plant  growth  regulators  on callus  induction  in  Physalis  minima Linn. International Journal of Innovative Research  in  Science,  Engineering  and Technology, 2(9):4847 – 4851.
[21] Ramar,  K.  and  V.  Ayyadurai  (2016)  In vitro callus induction studies of Physalis minima  (L).  An  Important  Medicinal
Plant. International Journal of Pharmaceutical  Science  and  Research 1(1):01-03. [22] Lashin II, Elhaw MH (2016) Evaluation of  secondary  metabolites  in  callus  and tissues of Physalis peruviana.
International Journal of Modern Botany, 6(1):10-17. doi: 10.5923/j.ijmb.20160601.03
[23] Mastuti  R,  Munawarti  A,  Firdiana  ER (2017)  The  combination  effect  of  auxin and  cytokinin  on  in  vitro  callus formation  of  Physalis  angulata  L.  –  A medicinal plant. AIP Conference Proceeding 1908, 040007. doi:10.1063/1.5012721.
[24] Bertoncelli  MC,  dos  Passos  OAI,  Ariati AC,  Ortolan  AO,  Witt  EP  (2014) Establishment and content of sugars and phenols in Physalis callus obtained from different  explants  and  concentrations  of BAP  and  NAA.  Acta  Scientiarum. Biological  Sciences,  36(1):  27-33.  doi: 10.4025/actascibiolsci.v36i1.18074
[25] Bhatia  S  (2015)  Plant  tissue  culture.  In: Bathia  S  (ed)  Modern  applications  of plant  biotechnology  in  pharmaceutical sciences.  Academic  Press,  Oxford,  pp 31-107.
[26] Murashige  T  and  Skoog  F  (1962),  A revised  medium  for  rapid  growth  and bioassays  with  tobacco  tissue  culture. Plant Physiology. 15, 473-497.
[27] Makunga  NP,  Jager  AK,  van  Staden  J, (2005)  An  improved  system  for  the  in vitro  regeneration  of  Tapsia  garganica via  direct  organogenesis  –  inﬂuence  of auxins and cytokinins. Plant Cell, Tissue and  Organ  Culture.  82:  271–280.  doi: 10.1007/s11240-005-1372-x.
[28] George  EF,  Hall  MA,  De  Klerk  GJ
(2008)  Plant  growth  regulators  I:
Introduction; auxins, their analogues and inhibitors. Dalam: George EF, Hall MA, Klerk  GJ  (eds)  Plant  Propagation  by
Tissue  Culture  3rd  ed,  Springer,  The Netherlands, pp 175–204.
[29] Thangavelu  RM,  Gunasekaran  D,  Jesse MI,    Mohammed  Riyaz,  D  Sundarajan,
K  Krishnan  (2018)  Nanobiotechnology approach  using  plant  rooting  hormone synthesized silver nanoparticle as “nanobullets” for the dynamic applications in horticulture – An in vitro and  ex  vitro  study.  Arabian  Journal  of Chemistry. 11(1): 48-61.
doi:10.1016/j.arabjc.2016.09. 022
[30] K.  Satyavani,  T.  Ramanathan  and  S.
Gurudeeban  (2011)  Effect  of  plant growth  regulators  on  callus  induction and  plantlet  regeneration  of  bitter  apple
(Citrullus colocynthis) from stem explant. Asian Journal of Biotechnology 3(3): 246-253. doi:
10.3923/ajbkr.2011.246.253
[31] Khanam  N,  Khoo  C,  Khan  AG  (2000)
Eﬀects  of  cytokinin/auxin  combination on  organogenesis,  shoot  regeneration and  tropane  alkaloid  production  in
Duboisia  myoporoides.  Plant  Cell, Tissue  and  Organ  Culture.  62,  125–33. doi: 10.1023/A: 1026568712409.