## DETEKSI POLYMORPHISME DENGAN SUBSTITUSI NUKLEOTIDA TUNGGAL PADA
Streptococcus agalactiae ISOLAT LOKAL INDONESIA
Angela Mariana Lusiastuti *) , Helga Seeger **) , Desy Sugiani *) , Tatik Mufidah *) , dan Hessy Novita *)
*) Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar
Jl. Raya Sempur No. 1, Bogor 16154 E-mail: lusiastuti_61@yahoo.co.id
**) Hessian State Laboratory Schubert Straße 60, H 13, 35396 Gießen, Germany

## ABSTRAK
Kasus penyakit pada budidaya ikan nila di wilayah di Jawa Barat, Jawa Tengah, Jawa Timur, Sulawesi Utara dan Papua Barat, disebabkan Streptococcus yang menyebabkan penyakit Streptococcosis di mana 80% disebabkan oleh grup B S. agalactiae . Tujuan penelitian ini adalah melakukan deteksi pada nukleotida isolat S. agalactiae untuk mengetahui sampai sejauh mana terjadinya nukleotida polimorfisme tunggal (SNP) pada isolat tersebut. Identifikasi menggunakan PCR dilakukan terhadap 16S rDNA  dan primer spesifik spesies terhadap S. agalactiae yaitu agal I 5’-ATAAGAGTAATTAACACATGTTAG-3’ ( forward ) dan agal II 5’-ACTTCGGGTGTTACAAAC-3’( reverse ) dengan target 1250 bp. Produk PCR diamplifikasi terlebih dahulu menggunakan tujuh pasangan primer oligonukleotida yang berbeda  yang didesain dari sekuens genom NEM316 GBS. Sekuens yang diperoleh dibandingkan dengan sekuens di Gene Bank database menggunakan National Center for Biotechnology Information Blast search tool . Hasil yang diperoleh ternyata ada dua basa yang berubah yaitu pada basa 24 dan basa 167. Pada basa 24 jelas terjadi subtitusi basa baru yaitu G, yang seharusnya tidak ada basa tersebut pada gen adhP-54 dan adhP-49 standar. Sedangkan pada basa 167 terjadi perbedaan basa dari seharusnya A pada standar menjadi G pada isolat 2.
KATA KUNCI: polimorfisme, Streptococcus agalactiae , PCR
ABSTRACT: The single strand conformational polymorphism to detect a nucleotide substitution in Streptococcus agalactiae isolate from Indonesia. By: Angela Mariana Lusiastuti, Helga Seeger, Desy Sugiani, Tatik Mufidah, and Hessy Novita
Cases  of  the  disease  in  tilapia  farming  in  West  Java,  Central  Java,  East  Java,  North  Sulawesi  and  West  Papua,  is  caused  by Streptococcus species that cause disease Streptococcosis where 80% are caused by group B S.agalactiae . The purpose of this study was to detect the nucleotide S.agalactiae to determine the occurrence of single nucleotide polymorphisms (SNPs). Identification using 16S rDNA and species-specific primers of S.agalactiae were agal I 5’-ATAAGAGTAATTAACACATGTTAG-3 (forward) and agal II 5’-ACTTCGGGTGTTACAAAC -3’ (reverse) with a target of 1250 bp. PCR products amplified  using 7 different oligonucleotide primer pairs were designed from the genome sequences of GBS NEM316. Sequences obtained were compared with sequences in the Gene Bank database using the National Center for Biotechnology Information Blast search tool. The results showed there were two bases change on base 24 and base 167. At base 24 occured G base substitution, which there should be no such bases in the gene and adhP-54 and adhP-49 standard. While there was a difference in base 167 should be a standard A to G in isolate 2.
KEYWORDS: polymorfism, Streptococcus agalactiae , PCR

## PENDAHULUAN
Streptococcus sp.  merupakan  agen  penyebab penyakit Streptococcosis pada ikan budidaya Bakteri ini mampu  menginfeksi  langsung  ke  dalam  tubuh  inang apabila terjadi kontak (Evans et al ., 2006). Clark et al. (2000)  menyatakan  bahwa Streptococcosis di  Filipina menyebabkan  kematian  ikan  nila  sekitar  50%  sejak bulan  pertama  dan  meningkat  menjadi  80%  sampai pada akhir masa pemeliharaan dalam karamba.
Infeksi Streptococcus grup  B  dikaitkan  dengan morbiditas dan kematian yang signifikan pada spesies
ikan  air  tawar,  estuaria  dan  laut.  Patogenesis  pada ikan  menimbulkan  septikemia  dan  kolonisasi  pada berbagai  organ,  seperti  mata,  otak,  ginjal  dan  usus; Tanda-tanda  klinis  muncul  segera  setelah  infeksi termasuk  depresi  atau  aksitabiliti,  anoreksia,  bentuk tubuh  seperti  huruf  C,  berenang  dan  berputar-putar tak  menentu,  dan  kematian  pada  ikan  (Evans et  al ., 2002). Histopatologi menunjukkan septikemia dengan kerusakan mononuklear pada meninges, epikardium dan mata.  Di  mana  peradangan  terjadi  pada  hari  ke-3  dan ke-7 setelah infeksi (Filho et al ., 2009). Evans et al . (2006)
Deteksi polymorphisme dengan substitusi nukleotida tunggal pada Streptococcus agalactiae ..... ( Angela Mariana )
menyatakan gejala klinis lain dari Streptococcosis adalah perut bengkak, lambung dan usus terisi dengan cairan gelatinous atau kekuning-kuningan dan pada beberapa ikan  terjadi  hemoragik  kecil  di  mata,  eksoptalmia  dan kornea mata buram (opasiti), selain itu hati membesar, kongesti ginjal dan limpa, dan adanya cairan di rongga peritoneal. Ikan nila yang sakit menjadi lesu, berenang tak menentu dan menunjukkan kekakuan dorsal.
Berdasarkan hasil penelitian Lusiastuti et al . (2012), tipe S.  agalactiae isolat  lokal  Indonesia  adalah  non- hemolitik  dengan  uji    cAMPnegatif  dan  masuk  dalam Lancefield grup B. Dari 6 isolat yang positif S. agalactiae , hanya  isolat  1,  3,  4  dan  6  saja  yang  mempunyai kesamaan 100% sekuens gen 16S rDNA menggunakan BLASTN 2.2.1 S. agalactiae dari NCBI. Sedangkan isolat 2  dan  5  tidak  100%  kesamaannya  karena  mengalami polimorfisme nukleotida tunggal.
Polimorfisme adalah variasi urutan DNA yang terjadi ketika  satu  nukleotida  (A,  T,  C,  atau  G)  dalam  urutan genom  berubah.  Istilah  yang  sering  juga  digunakan adalah  nukleotida  polimorfisme  tunggal  (single nucleotide polymorphisms, SNP). Hal ini disebut juga mutasi. Mutasi titik merupakan perubahan pada basa N dari DNA atau RNA. Mutasi titik relatif sering terjadi namun  efeknya  dapat  dikurangi  oleh  mekanisme pemulihan  gen.  Mutasi  titik  dapat  berakibat berubahnya  urutan  asam  amino  pada  protein,  dan dapat  mengakibatkan  berkurangnya,  berubahnya atau  hilangnya  fungsi  enzim.  Teknologi  saat  ini menggunakan  mutasi  titik  sebagai  marker  (disebut SNP) untuk mengkaji perubahan yang terjadi pada gen dan dikaitkan dengan perubahan fenotipe yang terjadi.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  melakukan  deteksi pada nukleotida isolat S. agalactiae untuk mengetahui sampai sejauh mana terjadinya polimorfismenukleotida tunggal (SNP) pada isolat tersebut.

## BAHAN DAN METODE
Sampel  berasal  dari  ikan  nila Oreochromis  niloticus yang  terinfeksi  dengan  gejala  klinis  berenang  tidak beraturan (whirling), eksopthalmia (pop eye) , warna tubuh kehitaman  dan  adanya  hemoragi  eksternal  pada  anus dan  di  beberapa  tempat  pada  tubuh.  Isolat  diperoleh dari  otak,  ginjal  anterior,  mata  dan  hati  yang  dikultur pada 5% Columbia sheep blood agar (Oxoid, Wernigerode, Germany) pada suhu 32°C (Evans et al ., 2002).
Semua isolat yang diduga isolat S. agalactiae Grup B (GBS) diuji biokimiawi dengan metode hemolisis dan uji cAMP (MacFaddin, 2000). Hasil dari Voges Proskauer dan  fermentasi  sorbitol,  trehalose,  ribose,  inulin, mannose,  xylose  dan  lactose  dianalisis  lebih  lanjut dengan menggunakan API 20 Strep System (bioMerieux, France).  Tipe  B  antisera  (Oxoid)  dikelompokkan berdasarkan grup Lancefield.
Identifikasi menggunakan PCR dilakukan terhadap 16S rDNA  dan primer spesifik spesies terhadap S. agalactiae
yaitu  agal  I  5’-ATAAGAGTAATTAACACATGTTAG-3’ (forward) dan  agal  II  5’-ACTTCGGGTGTTACAAAC-3’ (reverse) dengan  target  1250  bp.  Kondisi cycling yang digunakan adalah 95°C selama 5 menit, diikuti denaturasi 35 siklus pada 94°C selama satu menit, annealing pada 50°C  satu  menit  dan extension pada  72°C  selama  7 menit, diikuti final extension pada 72°C selama 7 menit. Produk PCR kemudian dielektroforesis menggunakan 12 μL  amplicon  dalam  2%  agarose  gel  (Biozym,  Hessisch- Oldendorf,  Germany)  pada  120  Volt  dalam  1x  Tris- acetate-electrophoresis  buffer  (TAE)  [(0,04  mol/L  Tris, 0,001  mol/L  EDTA;  pH  7.8)].  Marker  yang  digunakan adalah GeneRuler 100 bp DNA ladder (MBI Fermentas).
Produk PCR dari sampel positif hasil identifikasi PCR di atas kemudian diuji berdasarkan skema Multi Locus Sequence  Typing (MLST)  terhadap  7  loci  yaitu:  alcohol dehydrogenase  gbs0054  ( adhP ),  phenylalanyl  tRNA synthetase  ( pheS ),  amino  acid  transporter  gbs0538 ( atr ),  glutamine  synthetase  ( glnA ),  serine  dehydratase gbs2105  ( sdhA ),  glucose  kinase  gbs0518  ( glcK ),  dan transketolase  gbs2105  ( tkt ).  Produk  PCR  diamplifikasi terlebih  dahulu  menggunakan  tujuh  pasangan  primer oligonukleotida  yang  berbeda  seperti  tersebut  di atas yang didesain dari sekuens genom NEM316 GBS. Adapun amplifikasi PCR adalah sebagai berikut: 50 μL campuran  dari  5  μL  sampel  DNA,  20  pmol/μL  primer PCR  (TIB  MOLBIOL  Syntheselabor,  Berlin,  Germany), 1x  PCR  buffer  1,5  mM  MgCl2  (Qiagen,  Hilden, Germany),  0.5  μL  Taq  DNA  polymerase  (Qiagen),  dan 1,6  mM  deoxynucleoside  triphosphate  mix  (dNTPs, ABgene, Epsom, United Kingdom). Kondisi cycling yang digunakan  adalah  denaturasi  awal  pada  94°C  selama satu  menit,  primer annealing pada  55°C  selama  45 detik, dan extension pada 72°C selama satu menit untuk 35 cycles. Produk PCR dielektroforesis dan dimurnikan menggunakan Microelute Cycle Pure Kit (Omega Bio-tek) dan disekuens di Gottingen Laboratories. Sekuens yang diperoleh dibandingkan dengan sekuens di Gene Bank database menggunakan National Center for Biotechnology Information Blast search tool .

## HASIL DAN BAHASAN
Berdasarkan hasil pengujian dengan menggunakan uji cAMP, hemolisis dan API 20 STREP System maka ada dua isolat yaitu isolat 2 dan isolat 5 yang mempunyai tingkat  kemiripan  dengan S.  agalactiae sebesar  79,3% dan 89,8% Taxa yang signifikan berdekatan dengan S. agalactiae dengan  kemiripan  79,3%  dan  89,8%  adalah Streptococcus acidominimus . Sedangkan isolat yang lain yaitu isolat 1, 3, 4, dan 6 mempunyai tingkat kemiripan dengan S. agalactiae sebesar 99,8% sampai 100%.
Berdasarkan  data  sekuens  gene  dari  NCBI  Blast, maka  untuk  isolat  1,  3,  4,  dan  6  diperoleh query coverage sebesar  97%  dan  maksimum  identifikasi  98% dideskripsikan sebagai S. agalactiae NEM316 (accession number  gi123094426AL766843.1)  dan  merupakan genom yang lengkap. Isolat 2 dan 5 memperoleh query
coverage yang  rendah  yaitu  76%  tetapi  maksimum identifikasinya sebesar 99% dan dideskripsikan sebagai S.  agalactiae strain  GBS267 alcohol  dehydrogenase (adhP)  pseudogene,  sekuens  parsial  (accession numbergi1224925311 FJ719775.1).
Untuk  mengetahui  lebih  lanjut  mengapa  pada isolat 2 dan 5 mempunyai query coverage yang rendah tetapi  tetap  teridentifikasi  sebagai S.  agalactiae maka dilanjutkan dengan melihat internal fragmennya isolat 2. Internal fragmen dari isolat 2 dibandingkan dengan internal fragmen standard dari gen adh P-54 dan adhP- 49  yang  dilakukan  melalui multiple  sequence  alignment menggunakan program Clustal W2. Hasil yang diperoleh ternyata ada dua basa yang berubah yaitu pada basa 24 dan basa 167. Pada basa 24 jelas terjadi subtitusi basa baru yaitu G, yang seharusnya tidak ada basa tersebut pada  gen  adhP-54  dan  adhP-49  standar.  Sedangkan pada basa 167 terjadi perbedaan basa dari seharusnya A pada standar menjadi G pada isolat 2. Pada Tabel 1 menunjukkan contoh kelainan penyakit pada manusia jika  terjadi  mutasi  DNA,  dan  jika  hal  ini  terjadi  pada S.  agalactiae maka  kemungkinannya  adalah  timbulnya gejala klinis yang berbeda dari S. agalactiae yang sejati. Menurut pendapat Shehaan et al. (2009), bahwa terdapat S. agalactiae biotipe 1 dan biotipe 2. Kemungkinan lain adalah S. agalactiae dengan tipe sekuens yang sama atau serumpun dengan S. agalactiae pada sapi dan manusia. Tetapi hal ini memerlukan penelitian yang lebih lanjut.
Menurut  Clancy  (2008),  polimorfisme  biasanya terjadi akibat subtitusi nukleotida tunggal atau disebut juga single nucleotide polymorphism (SNP) yang merupakan variasi sekuens DNA yang terjadi ketika ada nukletioda tunggal  atau  satu  nukleotida  A,  T,  C  atau  G  di  dalam genom  yang  berbeda  dengan    suatu  spesies  biologis dalam  hal  ini  adalah  bakteri S.  agalactiae. Menurut Clancy (2008), penyakit sickle-cell anemia pada manusia disebabkan  perubahan  genetik  yang  relatif  kecil  yang terjadi akibat kerusakan pada nukleotida tunggal pada rantai  beta  dari  protein  hemoglobin.  Sehingga  hal  ini menyebabkan  gen  dari  hemoglobin  normal  berubah menjadi gen hemoglobin sickle-cell. Adanya perubahan yang terjadi hanya pada satu nukleotida saja tetapi dapat memberikan dampak yang buruk. Beta hemoglobin (beta globin) adalah rantai tunggal dengan 147 asam amino. Sickle-cell anemia disebabkan oleh gen beta globin yang bermutasi  yaitu  hanya  mutasi  satu  basa  saja  sehingga harusnya  asam  amino  keenam  adalah  asam  glutamik menjadi  asam  amino  valin  menyebabkan  sel  darah berbentuk  seperti  sickle  (batang)  yang  saling  melekat satu  sama  lain,  sehingga  tidak  dapat  mengangkut oksigen dengan baik yang berakibat suplai oksigen tidak lancar  sehingga  menyebabkan  serangan  jantung  atau stroke (Clancy, 2008).
Menurut  Twyman  (2003),  mutasi  didefinisikan sebagai  adanya  perubahan  pada  sekuens  DNA,  yang disebut juga istilah single nucleotide polymorphism (SNP) untuk menjelaskan adanya perubahan satu pasang basa
pada suatu populasi. Polimorfisme dapat terjadi pada setiap lokasi genetik dan sedikitnya dapat ditemukan pada dua sekuens yang berbeda, yaitu setiap sekuens yang muncul pada sedikitnya satu persen dari populasi. Lebih jauh, cut off prevalensi minimal 1% diklasifikasikan sebagai polimorfisme dan jika frekuensinya lebih kecil dari 1% maka alel dianggap mengalami mutasi (Twyman, 2003).
Menurut International Human Genome Sequencing Consortium (2001), SNP biasanya sebagai marker untuk menentukan  populasi  organisme  yang  mengalami perubahan  genetik  sehingga  menjadikan  individu membawa  sifat  tertentu  termasuk  menderita  suatu penyakit.  DNA  terganggu  akibat  terpapar  faktor lingkungan seperti bahan kimia dan radiasi ultraviolet pada  waktu  proses  replikasi.  Tabel  1  menyajikan contoh tipe mutasi DNA yang mengakibatkan kelainan penyakit pada manusia.
Mutasi dapat dihasilkan dari kejadian yang disebut sebagai crossing-over selama  proses  meiosis.  Hal  ini dapat  terjadi  pada  beberapa  area  dari  genom  yang sering  disebut  sebagai hot  pots di  mana  sekuens mengalami  pengulangan  berkali-kali.  Sebagai  contoh, sekuens pengulangan trinukleotida pada saat replikasi DNA  karena  polymerase  dapat  mengalami  “slip” disassosiasi dan  reassosiasi dengan untai DNA (Viguera et al. , 2001).
Pada kasus yang lain, mutasi dapat terjadi dengan cara  karena  adanya  insersi  atau  terhapusnya  satu basa.  Hal  ini  disebut frameshift  mutations ,  di  mana keseluruhan  protein  akan  berubah  sebagai  akibat terjadi penghapusan atau insersi. Hal ini terjadi karena nukleotida  dibaca  oleh  ribosom  dalam  bentuk  grup tiga basa yang disebut kodon. Jadi, jika basa terhapus atau diinsersi dari gen yang tidak terdiri dari tiga basa, maka reading frame yang tersisa dari protein tersebut akan dibuang.
Faktor-faktor  yang  dapat  menyebabkan  mutasi antara  lain  adalah  terpapar  ultraviolet  (UV)  dari cahaya matahari. Salah satu akibat terpapar UV adalah hidrolisis  basa  sitosin  menjadi  bentuk  hidrat  yang menyebabkan basa tersebut salah berpasangan dengan adenin dan pada replikasi berikutnya posisinya diganti oleh  timin (Viguera et al. , 2001). Penyebab lain adalah terpapar  bahan  kimia  seperti Oxidizing  agents yang umum  disebut  sebagai  radikal  bebas  di  mana  bahan ini  dapat  memodifikasi  nukleotida  sehingga  merubah pasangan  basa.  Mutasi  juga  dapat  terjadi  secara spontan, misalnya depurinasi di mana basa purin hilang dari  nukleotida  melalui  proses  hidrolisis.  Deaminasi atau hilangnya grup amin dari basa juga dapat terjadi.
Adanya perbedaan dalam sekuens S. agalactiae isolat lokal  Indonesia  ditunjang  dengan  penelitian  Sheehan et al. (2009) yang melaporkan bahwa isolat S. agalactiae dari  ikan  nila, Oreochromis  niloticus menunjukkan  dua karakter  kluster  yang  berbeda  berdasarkan  variasi  di
Tabel 1. Tipe mutasi DNA dan akibat yang ditimbulk an Table 1. DNA mutation type and the impact
dalam  propertis  biokimiawi  dan  fenotipiknya  sebagai contoh karakteristik hemolitik. Lebih lanjut Sheehan et al .  (2009)  menyatakan  bahwa  perbedaan  kluster  atau biotipe itu dibagi menjadi S. agalactiae beta-hemolitik atau klasik atau S. agalactiae biotipe 1 dan S. agalactiae non-beta-hemolitik  atau S.  agalactiae biotipe  2. S. agalactiae biotipe  1  menginfeksi  keseluruhan  siklus produksi dari benih sampai pembesaran, sedangkan S. agalactiae menginfeksi pada ikan konsumsi. Sheehan et al. (2009) juga melaporkan bahwa S. agalactiae biotipe 2 lebih umum dijumpai di Asia (Cina, Indonesia, Vietnam, dan Filipina).

## KESIMPULAN
Isolat 1, 3, 4 dan 6 diperoleh query coverage sebesar 97%  dan  maximum  identifikasi  98%  dideskripsikan sebagai S.  agalactiae NEM316  (accession  number gi123094426AL766843.1)  dan  merupakan  genom  yang lengkap. Isolat 2 dan 5 memperoleh query coverage yang rendah yaitu 76% tetapi maksimum identifikasinya sebesar 99% dan dideskripsikan sebagai S. agalactiae strain GBS267 alcohol  dehydrogenase  (adhP)  pseudogene,  sekuens parsial  (accession  number  gi1224925311  FJ719775.1). Ada dua basa yang berubah yaitu pada basa 24 dan basa 167.  Basa  24  terjadi  subtitusi  basa  baru  yaitu  G,  yang seharusnya tidak ada basa tersebut pada gen adhP-54 dan adhP-49  standar.  Basa  167  terjadi  perbedaan  basa  dari seharusnya A pada standar menjadi G pada isolat 2.

## DAFTAR ACUAN
Clancy, S. (2008). Genetic mutation. Nature Education,
1(1).
Clark,  J.S.,  Paller,  B.,  &  Smith,  P.D.  (2000).  Prevention of Streptococcus in  tilapia  by  Vaccination.  The Philippine Experience. Camrose1@hotmail.com.
Evans, J.J., Klesius, P.H., Gilbert, P.M., Shoemaker, C.A., Al-Sarawi,  M.A.,  Landsberg,  J.,  Duremdez,  R.,  Al- Marzouk, A., & Al-Zenki, S. (2002). Characterization
of ß-haemolytic group B Streptococcus agalactiae in cultured  seabream, Sparus  auratus (L.,),  and  wild mullet, Liza  klunzingeri (Day),  in  Kuwait. Journal  of Fish Disease , 25, 505-513.
Evans,  J.J.,  Pasnik,  D.J.,  Klesius,  P.H.,  &  Al-Ablani,  S.
(2006).  First  report  of Streptococcus  agalactiae and Lactococcus garviae from a wild bottlenose dolphin ( Tursiops  truncates ). Journal  of  Wildlife  Disease ,  42, 561-569.
Filho,  C.I.,  Muller,  E.E.,  Pretto-Giordano,  L.G.,  Paula, A., & Bracarense, F.R.L. (2009). Histological findings of  experimental Streptococcus  agalactiae infection in  nile  tilapias  ( Oreochromis  niloticus ). Braz.  J.  Vet. Pathol ., 2(1), 12-15.
International Human Genome Sequencing Consortium. (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature , 409, 860-921.
Lusiastuti,  A.M.,  Seeger,  H.,  &  Zschoeck,  M.  (2012). Penyiapan  isolat Streptococcus  agalactiae untuk deteksi multilocus sequence typing system. Seminar Bioteknologi  Universitas  Diponegoro .  Semarang,  6 Oktober 2012.
MacFaddin, J.F. (2000). Biochemical tests for identification of medical bacteria, 3 rd eds. Phildelphia, PA. Lippincot Williams and Wilkins.
Sheehan,  B.,  Lee,  Y.S.,  Wong,  F.S.,  Chan,  J.,  Labrie, L.,  Komar,  C.,  Wendover,  N.,  &  Grisez,  L.  (2009). Streptococcosis in tilapia: A more complex problem than expected. World Aquaculture Meeting 2009 . Twyman,  R.  (2003).  Mutation  or  polymorphism? Wellcome  Trust  website,  http://genome.wellcome. ac.uk/doc_WTD020780.html (2003).
Viguera,  E.,  Cancell,  D.,  &  Ehrlich,  S.D.  (2001).
Replication  slippage  involves  DNA  polymerase pausing and dissociation. EMBO Journal , 20, 2587– 2595.