## OPTIMASI KONDISI PURIFIKASI PARSIAL LIPASE Aspergillus niger 65I6 SOLID STATE FERMENTATION (SSF) PADA MEDIUM BUNGKIL JARAK SEBAGAI SUMBER BELAJAR PENGANTAR MIKROBIOLOGI

## MAULINA NURIKASARI
Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Metro E-ma
Abstract:  Extracellular lipase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis reaction of triglycerides into free fatty acids and glycerol and synthesis reaction of esters. Lipase can be produced by microbes include bacteria, fungi and yeasts. Lipase by Aspergillus niger 65I6 produced in the medium of Jatropha cake using solid-state fermentation has a different character of the lipase produced by other microorganisms. The aims of this research were to determine the optimum condition partially purified lipase by Aspergillus niger  65I6.  The methods of this research were conducted in 2  steps: (1) production of lipase, (2) partial purification using ion exchange chromatography, (3) SDS-PAGE.  The results of this research showed that partial purification lipase by Aspergillus  niger  65I6 using anion exchange chromatography esterification activity of 45.58 U/ml with specific activity of 421.97 U/mg adsorbed at pH 8 and 0.5 M NaCl elution. Partially purified lipase by Aspergillus niger 65I6 was 86.11% yield and purification factor 12,12 and a molecular mass of Lipase by Aspergillus niger  at 19 kDa estimated by SDS-PAGE.  Found of this research can be explained for the development study of microbiology concept and practical contribution about procedure research simple design. Students understand about technique and condition of partial purification.
Kata kunci: Lipase, Aspergillus niger , Solid-State Fermentation, Purifikasi, SDS- PAGE
Pengunaan enzim dalam bioteknologi modern semakin berkembang secara cepat. Banyak industri-industri yang telah memanfaatkan kerja enzim, meliputi industri pangan dan non pangan. Salah satu jenis enzim yang mempunyai  peran penting dalam bidang bioteknologi adalah lipase. Enzim ini memiliki sifat khusus dapat memecahkan ikatan ester antara asam lemak dan gliserol. Selain itu, lipase mempunyai kemampuan mengkatalis reaksi organik baik dalam media air maupun dalam media non air (Sumarsih, 2002).
Sampai saat ini pemenuhan kebutuhan lipase di Indonesia belum bisa terpenuhi dan harus impor dari produsen luar negeri dengan harga sekitar Rp. 25.000.000/kg (Kao Corporation). Karena
harga enzim yang cukup tinggi inilah maka perlu  dilakukan penelitian tentang produksi lipase dengan biaya murah ( low- cost ), dengan mengembangkan medium produksi yang murah dan efisien, serta menggunakan sumber mikrobia indigenous yang potensial menghasilkan lipase.
Lipase (EC 3.1.1.3: triasil gliserol hidrolase) merupakan enzim  yang sangat fleksibel, karena lipase tidak hanya dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis trigliserida menjadi asam lemak bebas dan gliserol tetapi juga dapat mengkatalisis reaksi transesterifikasi maupun esterifikasi (Winarno, 1989) . Beberapa reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase diantaranya adalah reaksi hidrolisis, alkoholisis, esterifikasi  dan interesterifikasi (Dosanjh
dan Kaur, 2002).  Sumber lipase berasal dari tanaman, hewan dan mikrobia. Lipase kapang, khususnya Aspergillus niger paling banyak digunakan karena untuk produksinya memerlukan waktu yang singkat dan aktivitasnya dapat ditingkatkan dengan kondisi pertumbuhan yang tepat serta tidak memerlukan lahan produksi yang luas. Purifikasi lipase merupakan bagian terpenting dalam rangka karakterisasi enzim. Tujuan dari purifikasi  yaitu:  1) memisahkan  enzim dari protein lainnya sehinggga dapat dianalisa karakternya, 2) mengisolasi enzim  dengan max possible yield yang berbanding lurus dengan aktivitas total ekstrak asli. (Palmer, 1991). Beberapa karakter protein kapang yang dijadikan sebagai dasar untuk purifikasi dengan kromatografi meliputi: muatan, hidrofobisitas, afinitas biologisnya terhadap molekul lain, stabilitasnya terhadap lingkungan dan berat molekulnya (Farabee, 2001).
Metode purifikasi yang digunakan yaitu kromatografi Ion Exchange menggunakan matrix penukar anion
Amberlite IRA-400 . Teknik pemurnian enzim dengan kromatrografi pertukaran ion ditunjukkan dalam Gambar 1. Purifikasi menggunakan kromatografi Ion exchange memiliki beberapa kelebihan antara lain kecepatan pemisahan/pendeteksian, bisa dilakukan pemisahan menggunakan kolom kation atau anion yang sesuai dengan sample, kolom pemisah bisa bertahan pada perubahan yang terjadi pada sampel, tidak akan mempengaruhi kestabilan material penyusun kolom Nelson dan Cox (2008). Purifikasi menggunakan kromatografi Ion Exchange dapat memisahkan molekul protein lipase dari molekul lainnya. Hasil penelitian ini nantinya dapat digunakan sebagai acuan dalam karakterisasi enzim untuk menentukan standart prosedur dalam pemanfaatan enzim lipase untuk kepentingan aplikasi.
Gambar 1.  Pemurnian enzim dengan kromatrografi pertukaran ion. (Nelson dan Cox, 2008)
Sumber belajar dapat dirumuskan sebagai segala sesuatu yang dapat memberikan kemudahan kepada peserta didik dalam memperoleh sejumlah informasi, pengetahuan, pengalaman, dan keterampilan dalam proses belajar mengajar (Enco Mulyasa, 2005: 177). Salah satu  alternatif sumber belajar yang dapat dipakai untuk memperkaya informasi adalah hasil penelitian.

## METODE
1. Produksi Crude Lipase Ekstraseluller Menggunakan SSF
a. Fermentasi Solid State
( Darmasiwi, 2010) Fermentasi SSF berdasarkan Darmasiwi (2010) yang telah di modifikasi,  50 g bungkil jarak yang telah di- defatting dalam erlenmeyer 1000 mL ditambahkan dengan olive oil 2% (v/w) , NaN0 3 1% (v/w) dan air 50%. Medium diaduk kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC  selama 60 menit. Medium diinokulasi dengan 10  mL suspensi spora fungi (10 7 spora/mL), lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari. Aktivitas lipase dianalisis aktivitas esterifikasinya.
b. Ekstraksi Crude Lipase (Darmasiwi, 2010)
Sampel dari hasil fermentasi ditambah dengan 0,1 M buffer asetat pH 6,0 dan fosfat pH 7,0; 8,0; 9,0 (3 mL/g medium). Campuran diaduk menggunakan waterbath shaker 100 rpm selama 20 menit pada suhu ruang. Campuran kemudian disaring. Filtrat/supernatan disentrifuge  (3000 rpm)  suhu 4°C,
selama  20  menit  untuk memisahkan padatan. Supernatan yang diperoleh merupakan crude enzyme disimpan pada suhu -16ºC  sampai dilakukan analisis aktivitas esterifikasi dan protein terlarut.
2. Purifikasi Lipase Menggunakan Kromatogafi Ion Exchange
Purifikasi lipase dilakukan menggunakan metode Kromatografi Ion Exchange , berdasarkan Scopes (1997) yang dimodifikasi. Sebanyak 2 g resin ( Anion Exchanger Amberlite IR 400 Cl) dicuci dengan 0,1M buffer asetat pH 6,0 dan phospat pH 7,0; 8,0; 9,0 (sebanyak 3x). Resin di equilibrasi dengan 0,1M buffer asetat pH 6,0 dan phospat pH 7,0; 8,0; 9,0. Sampel (1 ml) dimasukkan dalam kolom dan dilanjutkan dengan pencucian menggunakan buffer asetat pH 6,0 dan phospat pH 7,0; 8,0; 9,0. Sampel ditampung dalam ependorf. Elusi dilakukan dengan 0,1 M; 0,5 M; 1 M NaCl dalam 0,1 M buffer asetat pH 6,0 dan phospat pH 7,0; 8,0; 9,0 sebanyak 5 ml ke dalam kolom. Eluen ditampung dalam tabung ependorf. Eluent yang telah tertampung kemudian di uji protein terlarutnya dan aktivitas esterifikasinya.

## 3. Berat Molekul Lipase
Berat molekul enzim ditentukan berdasarkan kurva standar Rf (rasio
jarak migrasi protein standar dibagi jarak migrasi penanda) dengan log berat molekul protein standar. Protein standar yang digunakan adalah Wide Range  Sigma Marker (Sigma-Aldrich) dengan berat molekul 18-200 kDa yang terdiri atas Myosin (200 kDa), β - Galactosidase
(116 kDa), Phosphorylase b (97 kDa), Bovine Serum Albumin (66 kDa), Glutamic Dehydrogenase (55 kDa), Ovalbumin (45 kDa), Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (36 kDa) dan Tripsin Inhibitor (18 kDa).
4. Metode Analisis Kimia
a. Reaksi Esterifikasi
(Darmasiwi, 2010) Sebanyak  200  μl  enzim (pH 6,0; 7,0; 8,0 dan 9,0) ditambahkan pada 4 mL larutan yang mengandung 0,5 M asam oleat dan 0,5 M metanol dalam isooktan. Perbandingan antara asam oleat dan metanol adalah 1:1 mmol. Selanjutnya enzim diinkubasi dalam waterbath shaker pada suhu 40 ºC selama  30 menit dengan kecepatan 120  stroke/menit. Reaksi dihentikan dengan meletakkan erlenmeyer pada icebath selama 5 menit. Analisis dilanjutkan dengan mengambil 200 μl  lapisan  atas,  ditambahkan  ke dalam  campuran  600  μl  isooktan, kemudian mengambil 200 μl lapisan atas, ditambahkan ke dalam campuran 18 00 μl isooktan dan 400 μl  Cu -asetat piridin (CAP) pH 6,0. Larutan dicampur menggunakan vortex selama 5 detik dan didiamkan selama 10 menit. Larutan ditera absorbansinya pada 715 nm. Unit aktivitas esterifikasi didefinisikan sebagai  μmol  pengurangan  jumlah substrat asam lemak (asam oleat) dari reaksi esterifikasi per menit.
b. Kadar Protein Terlarut Lowry
(Cooper, 1977)
Dilakukan dengan metode Lowry menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar.

## HASIL

## Fermentasi
Produksi lipase dilakukan dengan kondisi optimal pertumbuhan Aspergillus niger 6516 yang merupakan hasil optimasi yang telah dilakukan peneliti lain. Lipase Aspergillus niger 6516 diproduksi melalui proses solid-state fermentation dengan komposisi medium setiap 3 gramnya sebagai berikut: tepung biji jarak 5 gram, kadar air 50% (4,713 ml), sumber karbonnya adalah olive oil (Sigma Aldrich) 2% (0,1 ml), sumber nitrogennya adalah NaNO 3
Tabel 1. Hasil Fermentasi crude lipase Aspergillus niger 6516 yang di ekstrak pada berbagai pH (6, 7, 8 dan 9) 1% (0,05 ml) dan di inkubasi selama 7 hari. Aktivitas crude lipase dan kadar  protein terlarut pada pH ekstraksi (6, 7, 8 dan 9) dapat dilihat pada Tabel 1.
pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 Aktivitas Lipase (U/g medium) 553,27  560,19  578,65  575,77 Protein terlarut (mg/ml) 5,54 5,51 5,58 5,56
Dari data pada Tabel  1.  hasil fermentasi crude lipase Aspergillus niger 65I6 menunjukkan aktivitas lipase tertinggi pada ekstraksi menggunakan buffer fosfat pH 8 sebesar 578,65 U/g medium, dengan protein terlarutnya sebesar 5,58 mg/ml. Aktivitas esterifikasi yang diperoleh lebih tinggi 1,83 kali dibandingkan dengan aktivitas lipase yang
dihasilkan oleh Darmasiwi (2010) sebesar 316,25 U/g medium. Aktivitas lipase yang lebih tinggi dipengaruhi oleh banyaknya volume ekstraksi. Ekstraksi lipase dengan buffer pada penelitian lebih rendah 1,67
kali dibanding Darmasiwi (2010). Hariyadi (1996) mengatakan konsentrasi yang lebih pekat pada substrat akan mendukung terjadinya rekasi esterifikasi dan menghasilkan akitivitas yang lebih tinggi. Crude lipase selanjutnya dipurifikasi menggunakan kromatografi penukar ion.

## Purifikasi Lipase Menggunakan  Ion

## Exchange Chromatography
Purifikasi lipase Aspergillus niger 6516 dalam penelitian ini
menggunakan kromatografi anion exchange (basa). Matrik anion exchange bermuatan positif. Proses equilibrasi dengan pH adsorsi akan menyebabkan matrik bermuatan positif mengikat ion bermuatan negatif. Lipase (bermuatan negatif) akan terikat pada matrik dan protein pengotor bermuatan positif akan lolos (unbound). Lipase yang terikat akan terelusi dengan adanya penambahan NaCl.
Fraksi 2 merupakan fraksi unbound (tidak terikat resin), fraksi 3 merupakan fraksi hasil elusi dengan konsentrasi NaCl 0,1M, fraksi 4 merupakan fraksi hasil elusi dengan konsentrasi NaCl 0,5M dan fraksi 5 merupakan fraksi hasil elusi dengan konsentrasi NaCl 1M (Gambar 2). Fraksi 2 pada pH 6 dan 7 memiliki total aktivitas 22 kali lebih tinggi dibandingkan pada pH 8 dan 9. Fraksi 4 pada pH 8 dan 9 memiliki total aktivitas 2,56 kali lebih tinggi dibandingkan  fraksi 3 dan 5. Berdasarkan data tersebut dapat diambil kesimpulan lipase Aspergillus niger 65I6 bermuatan negatif karena lolos pada pH adsorbsi 6 dan 7, tetapi terikat pada pH adsorbsi 8 dan 9.
Gambar 2. Total aktivitas fraksi yang didapat dari hasil kromatografi anion exchange .
Seleksi pH buffer adsorbsi dan elusi dilakukan untuk memilih pH buffer yang mempunyai kemampuan adsorbsi dan elusi tinggi sehingga dapat menghasilkan lipase dengan kemurnian yang tinggi. Buffer yang digunakan untuk adsorbsi adalah buffer fosfat pH 6, 7, 8, 9. Elusi dilakukan tiga tahap menggunakan NaCl dengan konsentrasi 0,1 M (elusi I), 0,5 M (elusi II) dan 1 M (elusi III) dalam buffer fosfat pH 6, 7, 8 dan 9. Pengaruh pH adsorbsi terhadap aktivitas lipase dan protein total dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3.  Pengaruh pH adsorbsi terhadap aktivitas dan total protein lipase
Aspergillus niger 6516.
Gambar 3. menunjukkan pH 6, 7, 8 dan 9 dapat mengadsorbsi lipase dan total protein masing-masing sebesar (70,62%, 71,19%; 87,44%, 73,32%; 99,11%, 29,93%; 98,40%, 29,86%). Dari data aktivitas lipase yang teradsorbsi terlihat bahwa pH 8 mampu mengikat lipase dari pada  pH 6, 7. Dari data total protein yang teradsorbsi terlihat bahwa pH 8 mampu mengikat protein yang lebih spesifik dari pada pH 6, 7 dan 9. pH adsorbsi  dari pI enzim yang dimurnikan agar dapat mengikat protein yang lebih spesifik, maka dapat disimpulkan pI lipase dari Aspergillus niger 6516 adalah 7. Hasil rekapitulasi dari Tabel  2. menunjukkan elusi II pada pH 8 memiliki aktivitas spesifik (286,97 U/mg) lebih besar 1,17 kali dibandingkan aktivitas spesifik elusi II pada pH 9 (246,32 U/mg), 12,34 kali dibandingkan elusi II pH 6 (23,26 U/mg) dan 12,46 kali dibandingkan elusi II pH 7 (23,03 U/mg). Elusi II pada pH 8 memiliki aktivitas spesifik lebih besar 3,02 kali dibandingkan elusi I pada pH 8 (94,75 U/mg) dan 4,16 kali dibandingkan dengan elusi III pada pH 8 (63,55 U/mg). Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa lipase yang teradsorbsi pada pH 8 lebih mudah dielusi menggunakan elusi II (0,5M NaCl) dibandingkan dengan elusi I (0,1M NaCl).
Semakin tinggi konsentrasi elusi semakin kuat melepaskan lipase yang terikat (Pujiraharti, dkk., 1997). Dengan data yang didapat maka kondisi optimum purifikasi lipase untuk karakterisasinya adalah menggunakan pH 8 untuk pH adsorbsi dengan konsentrasi elusi 0,5M NaCl dalam 0,1M buffer fosfat. Hasil dari purifikasi lipase Aspergillus niger 65I6 menggunakan kromatografi anion exchange dengan kondisi optimum yang sudah didapatkan terlihat pada Tabel 3.
Tabel 2.  Konsentrasi NaCl dalam masing-masing pH buffer untuk elusi pada proses purifikasi lipase menggunakan kromatografi anion exchange . pH Tahapan Akt. Lar. Fermentasi (U/mL) Total aktivitas (U) Total Protein (mg) Aktivitas spesifik (U/mg Protein) pH 6 • Crude • Elusi I (0,1M) • Elusi II (0,5M) • Elusi (1M) 184,42 3,65 1,92 0,96 184,42 14,62 7,69 3,85 5,45 1,18 1,18 1,19 33,81 12,37 6,50 3,24 pH 7 • Crude • Elusi I (0,1M) • Elusi II (0,5M) • Elusi (1M) 186,73 9,62 7,12 6,35 186,73 38,46 28,46 25,38 5,51 1,23 1,24 1,24 33,86 31,25 23,03 20,47 pH 8 • Crude • Elusi I (0,1M) • Elusi II (0,5M) • Elusi (1M) 192,88 10,96 28,08 7,31 192,88 43,85 112,31 29,23 5,58 0,46 0,39 0,46 34,56 94,75 286,97 63,55 pH 9 • Crude • Elusi I (0,1M) • Elusi II (0,5M) • Elusi (1M) 191,92 11,92 26,15 6,73 191,92 47,69 104,62 26,92 5,56 0,47 0,42 0,47 34,52 102,54 246,32 57,59
Tabel 3.  Hasil purifikasi parsial lipase Aspergillus niger 65I6 menggunakan kromatografi anion exchange Fraksi Aktivitas larutan fermentasi (U/mL) Total aktivitas (U) Total protein (mg) Aktivitas spesifik (U/mg Protein) Yield (%) Purifikasi faktor Crude 193,88 193,88 5,57 34,82 100 1 Lipase hasil purifikasi parsial 41,73 166,9 0,39 421,97 86,11 12,12 Tabel 3. menunjukkan bahwa hasil purifikasi parsial lipase Aspergillus niger 6516 menggunakan kromatografi anion exchange meningkatkan kemurnian lipase menjadi 12,12 kali, dengan Yield sebesar 86,11%.
Yield hasil purifikasi parsial lipase Aspergillus niger 65I6 ketika dibandingkan dengan lipase yang dihasilkan dari berbagai genus Aspergillus memiliki hasil sebagai berikut: lebih besar 1,6 kali dibanding yield lipase dari
Aspergillus niger NCIM 1207; 2,53 kali dibanding yield lipase dari Aspergillus niger F044; 3,06 kali dibanding yield lipase dari Aspergillus niger ; 7,83 kali dibandingkan yield lipase dari Aspergillus oryzae ; 8,16 kali dibanding yield lipase dari Aspergillus niger (Toida, dkk.,Zheng- Yu, dkk., 2007; 1998; Mhetras dkk., 2008; Malle dkk., 2008).
Purifikasi faktor Aspergillus niger yang dilaporkan Torossian dan Bell (1991) lebih tinggi 3,3 kali dibandingkan
dengan Aspergillus niger hasil dari penelitian. Purifikasi faktor yang diperoleh pada penelitian lebih besar 1,1 kali dibandingkan purifikasi faktor dari Aspergillus terreus (11,01) (Yadav dkk., 1998).
Berat Molekul
Gambar 4.  Profil protein Aspergillus niger 6516. M: Marker protein
(9-200 kDa), 1: Crude lipase Aspergillus niger 65I6., 2:
Lipase Aspergillus niger 65I6 hasil purifikasi parsial menggunaan kromatografi anion exchange .
Penentuan berat molekul dari lipase Aspergillus niger 65I6 dilakukan dengan menggunakan cara analisis SDS- PAGE (15%). Analisis dilakukan terhadap crude enzyme maupun enzim murni. Berdasarkan hasil analisis terhadap crude enzyme diketahui ada 6 pita protein. Hasil ini membuktikan bahwa crude enzyme mengandung campuran protein yang ukurannya berbeda sehingga menghasilkan lebih dari 1 pita. Hasil analisis terhadap parsial lipase menunjukkan adanya 1 pita protein dengan berat molekul 19 kDa (Gambar 4).
Berat molekul lipase parsial Aspergillus niger 6516 yang diperoleh
sama dengan Aspergilus niger yang diteliti oleh Hofelmann (1985) yang memiliki berat molekul sebesar 19 kDa. Lipase Aspergillus niger F044  dan Aspergillus carneus memiliki berat molekul lebih besar (35-40 dan 27 kDa) dibandingkan hasil penelitian (Zheng-Yu, dkk., 2007; Davidson, 1998). Berdasarkan Jaeger dan Reetz (1998) lipase memiliki berat molekul antara 19 –  60 kDa dan termasuk dalam protein monomer.

## Implikasi Hasil Penelitian Pada Bidang Pendidikan
Konsep hasil penelitian optimasi
kondisi purifikasi parsial lipase Aspergillus niger 65I6 SSF pada medium bungkil jarak dapat digunakan untuk acuan  sebagai salah satu sumber belajar pada mata kuliah pengantar mikrobiologi bab enzim. Konsep dan data yang didapat dari penelitian dapat digunakan untuk memperkaya materi yang disampaikan kepada peserta didik sehingga dapat meningkatkan pemahaman peserta didik terhadap materi yang disampaikan  karena memiliki alternatif sumber belajar yang beragam, tidak terbatas hanya informasi yang ada di buku pegangan yang digunakan.
Sesuai  dengan pendapat Enco Mulyasa (2005:183-184) bahwa
pendayagunaan  sumber belajar sangat penting selain berguna  untuk kepentingan akademik dan keterampilan umum dalam kehidupan sehari-hari, sumber belajar juga dapat meningkatkan aktivitas dan kreativitas belajar sehingga dapat mencapai hasil yang optimal melalui proses yang efektif dan efisien.
Semakin banyak jenis sumber belajar yang dimanfaatkan, makin lengkap dan makin sesuai dengan indikator pembelajaran maka pencapaian tujuan pembelajaran dan hasil belajar akan lebih baik (Arief Sadiman.1990:161).
Hasil penelitian ini juga memberikan sumbangan praktis tentang
teknik/proses purifikasi (pemurnian) enzim yang dihasilkan oleh fungi ( Aspergillus niger ) menggunakan fermentasi SSF ( Solid State Fermentation ) pada limbah bungkil jarak. Kajian tentang purifikasi sampai saat ini masih sangat kurang dilakukan oleh mahasiswa pendidikan biologi di Universitas Muhammadiyah Metro.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa purifikasi lipase Aspergillus niger 65I6 menggunakan kromatografi Anion Exchange menghasilkan aktivitas esterifikasi tertinggi 45,58 U/mL dengan aktivitas spesifik sebesar 421,97 U/mg pada pH 8 dan elusi NaCl 0,5 M. Purifikasi parsial lipase Aspergillus niger 65I6 menghasilkan yield sebesar 86,11 % dengan purifikasi faktor sebesar 12,12.
Hasil penelitian dapat  digunakan sebagai  sumber belajar mikrobiologi  dan dapat digunakan sebagai wacana untuk ide menyusun skripsi.

## Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang karakterisasi aktivitas esterifikasi yang ditunjukkan oleh lipase Aspergillus niger 65I6 untuk mengetahui karakter enzim lipase bekerja pada kondisi optimum.
Perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang  mobilisasi lipase Aspergillus niger 65I6 hasil purifikasi parsial untuk meningkatkan stabilitas enzim yang berpengaruh pada lama penyimpanan dan kestabilan enzim saat bekerja.
Perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang metode pembelajaran  yang sesuai dan implementasi lesson study pada pembelajaran pengantar mikrobiologi menggunakan hasil penelitian purifikasi enzim.

## DAFTAR RUJUKAN
Arief Sukadi Sadiman.  1990.  Beberapa Aspek Pengembangan Sumber
Belajar. Jakarta: Mediyatama Sarana
Perkasa
Bannon, Cecil D., Craske, John D., and Norman, Lynette M. 1988. Limitation Ambient Temperature Methods for the Methanolysis of
Triacylglycerols. J. Am. Oil. Chem. , Vol. 65 (2).
Cooper. 1977. The Tools of  Biochemistry .
Wiley, New York.
Darmasiwi, sari. 2010. Screening Isolat Lipolitik Indigenus dan Karakterisasi Lipase Yang Dihasilkan Pada Solid-State Fermentation . Program Studi Bioteknologi. Universitas Gajahmada, Yogyakarta.
Dosanjh, N.S., dan Kaur, J. 2002. Immobilization, Stability and esterification Studies of A Lipase
From Bacillus sp . Journal
Biotechnology and Applied
Biochemistry . Vol. 36. Hlm 7-12.
Punjab University. Chandigarh.
Enco Mulyasa. 2005. KurikulumBerbasis Kompetensi: Konsep, Karakteristik, dan  Implementasi.  Bandung: PT. Remaja Rosdakarya.
Farabee, M.J. 2001. Enzyme: Organic catalyst . W.H-Freeman  Co. USA.
Jaeger, K.E. dan M.T. Reetz. 1998. Microbial lipases form versatile tools for Biotechnology. Tibtech .
Vol. 16 :396-408.
Malle Dominggus, Garingan Gina, Peralta Milagros, Revilleza MJ. 2008. Rapid Purification and Partial Characterization of an Extracellular
Enantioselective Lipase from Aspergillus niger .
Annales
Bogorienses n.s. Vol. 12. No. 1.
Mhetras, N.D., K.B. Bastawde,  dan D.V. Gokhale. 2009. Purification and characterization of acidic lipase from Aspergillus niger NCIM 1207. Biores. Technol . (100).1486–1490.
Namboodiri, V. M. H dan Chattopadyaya,
R. 2000. Purification and Biochemical characterization of a novel thermostable lipase from Aspergillus niger . Lipids 35, 495- 502.
Nelson, D.L., Cox, M.M., 2008,
Lehninger Principles of Biochemistry , W.H. Freeman and Company, New York.
Palmer, T. 1991. Understanding enzyme . Springerlink. New York.
Saxena RK, Davidson WS, Sheoran A, dkk. 2003. Purification and characterization of an alkaline thermostable lipase from Aspergillus carneus . Process Biochemistry . 39: 239-247.
Scopes, R.K. 1997. Protein purification. 3rd edition. Springer-Verlag : New York.
Sugihara A, Shimada Y, Tominaga Y. 1988. Purification and characterization of Aspergillus niger lipase. Agricultural and Biological Chemistry . 52(6): 1591-1592.
Sumarsih, S. 2002. Uji Aktivitas Lipolitik Beberapa Bakteri Hasil Isolasi dari Pelabuhan Tanjung Perak dan Produksi Lipase dari Strain Terpilih . JIPTUNAIR. Surabaya.
Toida, J., Y. Arikawa, K. Kondou, M. Fukuzawa, dan J. Sekiguchi. 1998. Purification and characterization of triacylglycerol lipase from Aspergillus oryzae. Biosci. Biotechnol. Biochem .  62 (4): 759- 763.
Winarno, F.G. 1989. Enzim Pangan . Gramedia Press, Jakarta.
Yadav, RP., Saxena, RK., Gupta, R.,
Davidson, S., 1998. Purification and Characterization of a regiospesific lipase from Aspergillus terreus .
Biotechnol. Appl. Biochem . 28, 243-
249.
Yamada, H.; Adachi, O.; Watanabe, M. dan Sato, N., 1968, Studies on fungal tannase. Part I: Formation, purification and catalytic properties of tannase of Aspergillus flavus . Agricultural and Biological Chemistry , vol. 32, no. 9, p. 1070- 1078.
Zheng-Yu Shu, Jiang-Ke Yang, Yun-Jun
Yan. 2007. Purification and Characterization of a Lipase from Aspergillus niger F044. Chinese Journal Of Biotechnology , 23(1),
96-100.