## ISOLASI, IDENTIFIKASI SECARA MOLEKULER MENGGUNAKAN GEN 16S rRNA DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI BAKTERI SIMBION ENDOFIT ALGA Padina sp.
Maretsha C.H Sihombing 1) , Herny E. I. Simbala 1) , Adithya Yudistira 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Algae  Padina  sp.  is  a  type  of  algae  from  the  class  of  Phaeophyta  (brown  algae)  which  are scattered in large area of sea in North Sulawesi, and has potential as antibacterial agent. Endophytic symbionts  microbial  are  microbes  that  reside  in  the  plant  body  for  most  of  their  life  cycle  without adversely  affecting  the  host  plant.,  including  bacteria  and  fungi  (Kandel  et  al.,  2017).  Endophytic bacteria  has  great  potential  in  the  search  for  new  drug  sources  (Tan  and  Zou,  2001).  Bacterial identification can be done with a molecular-based method using 16S rRNA gene (Kattar et al., 2000). The  purpose  of  this  research  is  to  know  the  antibacterial  activity  of  endophytic  symbiont  bacteria isolated from algae Padina sp. against Staphylococcus aureus and Escherichia coli and to know the endophytic  symbiont  bacterial  species  of  algae  Padina  sp.  Which  has  the  greatest  antibacterial activity. Samples were smashed and dissolved up to 10 -7 , has been planted, isolation and inoculation on Nutrient Agar (NA) medium then incubated for 1 x 24 hours. Three different isolates of endophytic bacteria  were  obtained  and  the  antibacterial  activity  was  tested  by  the  well-diffusion  method,  the diameter was measured and the results are MB.1 (6,58 mm), MB.2 (7,66 mm), MB.3 (00.00) against Staphylococcus  aureus  bacteria,  whereas  against  Escherichia  coli  bacteria  are  MB.1  (7,22  mm), MB.2  (8,58  mm),  MB.3  (9,61  mm).    The  isolate  which  has  the  greatest  antibacterial  power  against both bacteria is the isolate MB.2. The molecular identification results indicate that the MB.2 isolate has 100% similarity with Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis.
Keywords : Algae Padina sp., Endophytic symbiont bacteria, antibacterial activity, molecular identification, 16S rRNA gene

## ABSTRAK
Alga Padina sp. merupakan jenis alga yang berasal dari kelas Phaeophyta (alga coklat) yang tersebar dalam jumlah yang banyak di perairan Sulawesi Utara, memiliki potensi sebagai  antibakteri. Mikroba simbion endofit adalah mikroba yang berada di dalam tubuh tanaman untuk sebagian besar siklus  hidup  mereka  tanpa  ada  dampak  yang  merugikan  bagi  tanaman  inang,  meliputi  bakteri  dan jamur (Kandel et al ., 2017). Bakteri endofit memiliki potensi besar dalam pencarian sumber-sumber obat baru (Tan and Zou, 2001). Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan sebuah metode berbasis molekuler  dengan  gen  16S  Rrna  (Kattar et  al .,  2000).  Tujuan  dari  penelitian  ini  yaitu  untuk mengetahui  aktivitas  antibakteri  dari  bakteri  simbion  endofit  isolat  dari  alga Padina sp.  terhadap bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli dan  mengetahui spesies  bakteri  simbion  endofit dari alga Padina sp. yang  memiliki aktivitas antibakteri terbesar. Sampel alga yang halus diencerkan sampai  10 -7 ,  dilakukan  penanaman,  isolasi  dan  inokulasi  pada  media Nutrient  Agar (NA),  inkubasi selama 1 x 24 jam. Diperoleh 3 isolat bakteri endofit yang berbeda dan dilakukan pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi sumuran, dan diameter diukur sehingga diperoleh hasil isolat bakteri simbion  endofit  MB.1  (6,58  mm),  MB.2  (7,66  mm),  MB.3  (00.00)  pada  bakteri Staphylococcus aureus ,  sedangkan pada bakteri Escherichia coli hasil isolat bakteri endofit MB.1 (7.22 mm), MB.2 (8,58 mm), MB.3 (3,80 mm). Daya antibakteri terbesar terhadap kedua bakteri uji yaitu isolat bakteri simbion endofit MB.2. Hasil identifikasi molekuler menunjukkan bahwa isolat bakteri MB.2 memiliki kesamaan 100% dengan Bacillus cereus dan Bacillus thuringiensis.
Kata kunci : Alga Padina sp., Bakteri simbion endofit, aktivitas antibakteri, identifikasi molekuler, Gen 16S rRNA.

## PENDAHULUAN
Indonesia merupakan
negara kepulauan terbesar di dunia yang memiliki wilayah  laut  yang  sangat  luas  dengan sumberdaya hayati yang kaya dan beranekaragam.  Untuk  itu  potensi  biota laut  dapat  dimanfaatkan.  Kebanyakan senyawa aktif yang terkandung dalam alga menunjukkan  aktivitas  antibakteri  (Varier et al ., 2013).
Padina sp.,  merupakan  alga  yang berasal dari kelas Phaeophyta (alga coklat) yang  tersebar  dalam  jumlah  yang  banyak di  perairan  Sulawesi  Utara.  Alga  Padina tersebar  di  perairan  Indonesia  sekitar  134 jenis (Winarno, 1996). Berdasarkan beberapa  penelitan  alga Padina sp.,  dapat digunakan sebagai sumber bahan pembuatan obat, namun mengalami kendala karena penelitian mengenai eksplorasi  dan  pengolahannya  belum berkembang  sehingga  pemanfaatannya sampai saat ini masih terbatas.
Mikroba  simbion  endofit  adalah mikroba  yang  berada  di  dalam  tubuh tanaman untuk sebagian besar siklus hidup mereka tanpa ada dampak yang merugikan bagi  tanaman  inang,  meliputi  bakteri  dan jamur. Karakteristik umum mkroba endofit meliputi  kemampuan  untuk  mensintesis hormon  tanaman  seperti  asam  indole-3- asetat, fosfat pelarut, mensekresikan siderophores, dan memberi toleransi tanaman  terhadap  tekanan  biotik  dan abiotik. Selain itu, beberapa bakteri endofit membawa  gen  yang  diperlukan  untuk fiksasi nitrogen biologis (BNF), berpotensi memungkinkan  mereka  untuk  mengubah gas  dinitrogen  (N2)  menjadi  bentuk nitrogen  yang  dapat  digunakan  seperti amonium  dan nitrat  dalam  tanaman inang. (Kandel et  al .,  2017).  Bakteri  endofit memiliki  potensi  besar  dalam  pencarian sumber-sumber obat baru. Hal ini
disebabkan  karena  bakteri  cukup  mudah untuk  dikembangbiakkan,  memiliki  siklus hidup yang pendek serta mampu menghasilkan  senyawa  bioaktif  dalam jumlah  yang  besar  dalam  waktu  yang singkat  (Tan  and  Zou,  2001).  Keuntungan lain  yang  diperoleh  dari  pengembangan bakteri  endofit  penghasil  antibakteri  dapat menjaga  kelestarian  tumbuhan,  terutama jenis  tumbuhan  yang  langka  agar  tidak dieksploitasi  secara  terus  menerus  yang akhirnya  akan  mengakibatkan  kepunahan (Prihatiningtias, 2006).
Dengan berkembangnya identifikasi mikroorganisme, maka saat ini identifikasi bakteri endofit dapat dilakukan dengan  sebuah  metode  berbasis  molekuler menggunakan  gen  16S  rRNA.  Identifikasi dengan analisis sekuensing gen 16S rRNA dinilai  memberikan  hasil  yang  akurat,  dan menunjukan  hasil  yang  dapat  digolongkan pada genus atau spesies tertentu  (Kattar et al ., 2000).

## METODOLOGI PENELITIAN
Bentuk penelitian ini adalah Rancangan  Acak  Lengkap  yang  dilakukan secara eksperimental di laboratorium  yang akan  menguji  aktivitas  antibakteri  dan identifikasi secara molekuler bakteri simbion endofit dari alga Padina sp.
Penelitian dilakukan pada bulan Desember 2017  sampai  dengan  Maret  2018  di Laboratorium Mikrobiologi Program Studi Farmasi  dan  Laboratorium  Mikrobiologi dan  Genetika  Jurusan  Biologi  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam Universitas Sam Ratulangi.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu masker, sarung tangan, snorkel,  fins,  Erlenmeyer    100,  250  ,  500 mL (Iwaki  ST Pyrex) gelas ukur  500 mL (Iwaki  ST  Pyrex),  tabung  reaksi,  rak
tabung  reaksi,  pipet  tetes,  timbangan analitik (ADAM), batang pengaduk, lumpang  dan  alu,  magnetic  stirer,  cawan petri,  jarum  ose,  pinset, rotary  shaker incubator (Infors  HT),  bunsen,  lemari pendingin,  pencadang  baja,  inkubator (Incucell), laminar  air  flow (Biotek), autoklaf  (ALP),  mikropipet  (Ecopipette), L-Glass,  mistar  berskala,  kertas  label, plastik  wrap,  aluminium  foil,  kapas,  kasa, seperangkat  alat  PCR  (Biometra  T- Personal)  dan  elektroforesis  (Biometra  T- Personal), aluminium foil, kamera.
Sampel  alga Padina sp.,  bakteri  uji Escerichia  coli ATCC  25922  dan
Staphylococcus  aureus ATCC  25923, aquades, etanol 70%, antibiotik ciprofloxacin.  Kit  isolasi  DNA  bakteri (Geneaid),  primer  set  (untuk  bakteri), 1xMaster  Mix  untuk  amplifikasi  DNA (Bioline),  ddH2O,  gel  agarosa,  TBE buffer, loading  dye dan  etidium  bromida (EtBr).

## Pengambilan Sampel
Sampel  alga Padina sp.,  diambil  dari perairan  pantai  Malalayang  menggunakan alat  bantu  (masker,  snorkel  dan  fins). Sampel  difoto  dan  di  ambil,  lalu dimasukkan ke dalam kantong zipper bag , kemudian langsung dibawa ke
Laboratorium Mikrobiologi Program Studi
Farmasi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sam Ratulangi.

## Sterilisasi Alat
Alat-alat  yang digunakan dalam penelitian aktivitas antibakteri ini disterilkan terlebih dahulu.  Alat-alat  gelas  disterilkan  dengan autoklaf  pada  suhu  121˚C  selama  15 menit,  pinset,  jarum  ose  dan L-Glass
dibakar  dengan  pembakaran  diatas  api langsung.

## Pembuatan Media
a. Media Padat Nutrient Agar
Ditimbang Nutrient  Agar (NA)  sebanyak 12,6  g,  dilarutkan  dalam  450  mL  aquades (28  g/1.000  mL)  menggunakan  erlemeyer. Kemudian dihomogenkan dengan magnetic  stirrer  di  atas hot  plate sampai mendidih, kemudian disterilkan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121ºC selama  15  menit,  dan  dibiarkan  sampai media  cukup  dingin.  Selanjutnya  media Nutrient  Agar dituang  ke  dalam  cawan petri  sebanyak  20  mL,  dan  ke  dalam tabung  reaksi  (sebagai  Agar  miring) sebanyak  10  mL,  didiamkan  sampai memadat.  Media  ini    digunakan  untuk kultur  awal,  kultur  stok,  isolasi  dan inokulasi bakteri endofit.
b. Media Cair Nutrient Broth
Ditimbang Nutrient  broth (NB)  sebanyak 0,24  g,  lalu  dilarutkan  dalam  30  mL aquades  (8  g/1.000  mL)  menggunakan erlenmeyer. Kemudian dihomogenkan dengan  magnetic  stirrer  di  atas hot  plate sampai  mendidih.  Media  yang  telah homogen kemudian disterilkan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121ºC selama  15  menit.  Media  dituang  sebanyak 10  mL  ke  dalam  3  erlenmeyer.  Media  ini digunakan sebagai inokulasi bakteri simbion  endofit  dari  alga Padina sp.,  dan untuk pengujian aktivitas antibakteri.
c. Media Padat Pengujian Antibakteri
Media dasar dibuat dengan cara ditimbang Nutrient  Agar (NA)  sebanyak  3,36  g,  lalu dilarutkan  dalam  120  mL  aquades  (28 g/1.000  mL)  menggunakan  erlenmeyer.
Sedangkan  media  pembenihan  dibuat dengan  cara  ditimbang  3,36  g Nutrient Agar (NA),  lalu  dilarutkan  dalam  120  mL aquades  (28  g/1.000  mL)  menggunakan erlenmeyer.  Setelah  itu,  masing-masing media  dihomogenkan  dengan magnetic stirer diatas hot  plate sampai  mendidih.
Media  yang  telah  homogen  ini  disterilkan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121ºC selama  15  menit.  Untuk  lapisan  dasar dituang  sebanyak  20  mL  NA  dari  Media dasar  ke  dalam  cawan  petri,  lalu didiamkan sampai memadat. Pada permukaan  lapisan  dasar  diletakkan  6 pencadang  baja.  Kemudian,  suspensi bakteri  dicampurkan  ke  dalam  media pembenihan,  dituangkan  20  mL  campuran suspensi  dan  media  pembenihan  tersebut ke  dalam  tiap  cawan  petri  lapisan  dasar. Selanjutnya  pencadang  diangkat  dari cawan petri (Mpila, 2012).

## Sterilisasi Permukaan
Sterilisasi  permukaan  mengacu  pada metode  Achlich  dan  Sieber  (1996)  yang dimodifikasi.  Sterilisasi  permukaan  alga Padina sp.,  dengan  cara  merendamnya dengan  alkohol  70%  selama  1  menit, dilanjutkan  dengan  merendam  di  dalam larutan sodium hipoklorida (NaOCI) 5,2 % selama  4  menit,  kemudian  direndam kembali  dengan  alkohol  selama  30  detik, terakhir dibilas dengan akuades.

## Kultur Bakteri Endofit
Penanaman  bakteri  endofit  yang bersimbiosis dengan alga dilakukan dengan  metode  sebaran  (Madigan et  al .,
2005).  Sebanyak  1  g  sampel  alga Padina sp.,  yang  telah  disterilisasi  permukaannya dihaluskan,  kemudian  dimasukkan  ke dalam  9  mL  aquades  sehingga  diperoleh pengencerann  sampel  sebesar  10 -1 sampai 10 -7 . Diambil 100 μL dari masing-masing
seri, disebarkan ke dalam cawan petri yang berisi  media  NA  dan  dinkubasi  pada  suhu 27ºC -29ºC selama 1x24 jam. Berdasarkan pengamatan perbedaan karakteristik morfologinya,  koloni-koloni  bakteri  (3 koloni)  dipisahkan  menggunakan  jarum ose  pada  cawan  petri  yang  berisi  media, dan  diinkubasi  selama  1x24  jam.  Isolat bakteri  endofit  yang  murni  dipindahkan pada media miring untuk disimpan sebagai stok.

## Pengujian Aktivitas Antibakteri
a. Pembuatan Larutan Mac Farland 0,5 Larutan  H 2 SO4  1%  sebanyak  9,95  mL dicampurkan dengan
larutan BaCl 2 2H 2 O  1,175%  sebanyak  0,05  mL dalam  erlenmeyer.  Kemudian  dikocok sampai  terbentuk  larutan  yang  keruh. Kekeruhan  ini  dipakai  sebagai  standar kekeruhan suspensi bakteri uji (Whitman et al. , 2010).
b. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Bakteri  uji  yaitu Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus yang  telah diinokulasi  diambil  ±  1  ose    kemudian disuspensikan  ke  dalam  tabung  yang berisi  5  mL  larutan  NaCL  0,9% sehingga  diperoleh  kekeruhan  yang sama dengan standar kekeruhan larutan Mac  farland 0,5.  Suspensi  bakteri tersebut  dipipet  sebanyak  200  μL  dan dituangkan ke media pembenihan.
c. Pembuatan  Larutan  Kontrol  Positif  dan Kontrol Negatif
Larutan  Kontrol  positif    ciprofloxacin 5μg/50μL.  Larutan  ini  digunakan sebagai kontrol positif pada pengujian . Larutan  kontrol  negatif  digunakan aquades steril.
d. Penyiapan Bakteri Simbion Endofit 3  isolat  bakteri  endofit  diambil  dengan jarum  ose  kemudian  masing-masing diinokulasikan  ke  dalam  5  mL  media
cair Nutrient Broth (NB) dan diinkubasi selama  24  jam  dalam rotary  shaker incubator pada  suhu  27  C  –  29  C (Infors HT).
e. Pengujian Aktivitas Antibakteri Isolat  bakteri  endofit  (3  isolat)  yang  telah diinokulasi  dalam  media  cair,  kontrol positif dan kontrol negatif, dipipet sebanyak  50μL  dan  diteteskan  di  lubang sumuran  yang  berbeda  pada  masing- masing  cawan  petri  yang  berisi  media pengujian. Kemudian diinkubasi pada suhu 37  C selama 1 x 24 jam.
f. Pengamatan  dan  Pengukuran  Zona Hambat
Pengamatan  dilakukan  setelah  1  x  24 jam  masa  inkubasi.  Zona  bening  yang terbentuk  di  sekitar  lubang  sumuran diamati.  Diameter  zona  hambat  ini kemudian  diukur  dengan  menggunakan mistar  berskala  dengan  cara  diameter keseluruhan dikurangi diameter sumuran 7 mm  (Vandepitte el  al., 2005).  Diameter zona  hambat  yang  terukur  dikategorikan kekuatan  daya  antibakterinya  berdasarkan penggolongan Davis and Stout, 1971.

## Identifikasi  Bakteri  Endofit  Secara Molekuler
a. Isolasi DNA
Sampel bakteri endofit di media miring diambil  mengunakan  mikro  pipet  dan dimasukkan  ke  dalam  tabung  eppendorf yang telah berisi buffer GP1 sebanyak 400 μL,  kemudian  dikocok.  Selanjutnya sampel dalam tabung eppendorf dimasukkan  ke  dalam thermoblock pada suhu  60  C  selama  15  menit.  Tabung kemudian disentrifugasi (ultrasentrifugasi). Sampel kemudian dimasukkan  buffer GP2 sebanyak  100  μL,  dan  didinginkan  dalam freezer  selama  1  menit,  disentrifugasi selama  2  menit  dengan  kecepatan  10.000
rpm.  Supernatan  dipindahkan  ke  dalam tabung spin  column .,  dan  ditambahkan buffer  GP3  sebanyak  750  µL.  Sebagian dari supernatan dipindahkan pada colection  tube beserta  spin  column  lalu disentrifugasi  dengan  kecepatan  10.000 rpm  selama    1  menit.  Ditambahkan  sisa supernatan  yang  ada  dengan    buffer  GP3. Selanjutnya  disentrifugasi  10.000  rpm selama 1 menit, filtrat dibuang. Ditambahkan buffer W1 sebanyak 400 µL ke dalam tabung spin column disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm selama  1 menit. Setelah itu filtrat dibuang lalu  dilakukan  pencucian  kedua  dengan mencampurkan wash  buffer sebanyak  600 µL  sentrifugasi  kecepatan  15.000  rpm selama  1  menit.  Sementara  itu elution buffer dipanaskan  pada  thermoblock  pada suhu  60 ℃ .  Setelah  sentrifugasi  selesai, membran  dengan  DNA  dipindahkan  ke dalam  tabung  eppendorf    baru  dan dikering-anginkan selama 2 menit. Membran  ditambahkan elution  buffer sebanyak  100  µL  ke  dalam  tabung collection tube dan spin column .
Selanjutnya  sentrifugasi  dilakukan  dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit.
b. Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase  Chain  Reaction (PCR) dilakukan menggunakan mesin PCR combi block (whatman biometra Germany).  Prosesnya  meliputi  3  tahap yaitu  denaturasi,  annealing  dan  ekstensi (elongasi).  Proses  ini  dikerjakan  pada sampel  DNA  genomik  bakteri  yang  telah diisolasi.  Primer  yang  digunakan  untuk proses  PCR  yaitu  rancangan  primer forward BKXF (5’- GCY TAA YAC ATG CAA  GTCG-3’)  dan    primer reverse BKYR  (5’-TTG  ACG  TCA  TCC  CCA CCT  TCC-3’)  (Kolondam, in  press )  . Amplifikasi dengan teknik PCR dilakukan dengan  variasi  komposisi  reagen  dan
kondisi reaksi PCR yang telah dimodifikasi.
c. Elektroforesis dan Visualisasi
Bubuk  agarose  ditimbang,  dilarutkan dalam  TBE  buffer,  kemudian  dicampur dan dididihkan sampai larut hinga berwarna  jernih.  Diamkan  larutan  agarose mendingin  (~60ºC)  lalu  tuangkan  dalam cetakan Casting  tray beserta  sisirnya (Mayangsari, 2012).
Peralatan  Elektroforesis    yaitu tangki  gel,  penutup  tangki,  casting  tray, sisir,  power  supply.  Campur  sample  DNA dengan    bufer  ( loading  bufer )  untuk memudahkan  sampel  masuk  kedalam sumuran. Sampel sebanyak 5 μl dimasukkan  ke  dalam  sumur  gel  dalam chamber elektroforesis.  Power  supply dinyalakan  selama  60  menit,  100  volt. Visualisasi  dilakukan  dengan  sinar  UV pada  UV-transiluminator.  Hasil  deteksi didokumentasikan (Mayangsari, 2012).
d. Sekuensing gen 16S rRNA
Proses  sekuensing  dilakukan  dengan mengirim  data  ke  1st  BASE  Malaysia. Hasil sekuensing DNA dianalisis menggunakan  metode  BLAST  secara online pada website (http//www.ncbi.nlm.nig.gov) untuk dicocokkan  dengan  data  spesies  pada  Gen Bank  untuk  mencari  kesamaan  urutan nukleotida gen 16S rRNA dalam menentukan  spesies  isolat  bakteri  endofit dari  alga Padina sp.,  yang  memiliki  daya antibakteri terbesar

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Bakteri Endofit
Isolasi  bakteri  endofit  dari  alga Padina sp.,  dilakukan  pada  setiap  hasil pengenceran bertingkat sampai 10 -7 . Setiap pengenceran pada proses sterilisasi permukaan  sampel    dilakukan  penanaman awal  pada  cawan  petri  yang  berisi  media NA  untuk  menumbuhkan  bakteri  endofit.
Air  bilasan  terakhir  pada  proses  sterilisasi permukaan  juga  dimasukkan  ke  dalam cawan  petri  berisi  media  NA.Kemudian diinkubasi selama 1 x 24 jam, cawan petri yang  berisi  bilasan  terakhir  tidak  tumbuh bakteri,  dan  pada  cawan  petri  yang  berisi hasil  pengenceran  sampel  tumbuh  koloni- koloni  bakteri  di  setiap  cawan  petri.  Hasil isolasi  memperlihatkan  banyaknya  koloni yang  bertumbuh  dan  dipilih  3  koloni bakteri  yang  berbeda  sesuai  dengan pengamatan  morfologi  yaitu  dari  hasil pengenceran  10 -3 ,  10 -4 ,  dan  10 -5 .  Isolat bakteri  endofit  yang  berbeda  dimurnikan dengan  teknik  isolasi  bakteri  metode cawan  gores  kuadran  dan  diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 27  C – 29  C. Isolasi dilakukan berulang sebanyak 4 kali untuk 3 isolat bakteri endofit. Setelah itu, 3 koloni  bakteri  endofit  yang  telah  murni diinokulasikan  ke  dalam  medium  NA miring sebagai stok bakteri endofit.

## Pengamatan Morfologi
Tabel 1. Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri Endofit dari Alga Padina sp.
NO Kode Isolat Ukuran Bentuk Elevasi Tepian Warna 1 B2 (10 -3 )  Sedang Bulat Timbul Datar Sedikit berombak Putih 2 B3 (10 -4 )  Sedang Bulat Timbul cembung Utuh Putih kekuningan. 3 B4 (10 -5 ) Kecil Tak beraturan Timbul datar Berombak Putih
Dari  hasil  pengamatan  morfologi  koloni, diketahui  bahwa  bakteri  endofit  alga Padina sp.,  memiliki  ukuran,  bentuk, elevasi,  tepian,  dan  warna  yang  berbeda disetiap isolat bakteri endofit.

## Pewarnaan Gram Isolat Bakteri Endofit
Hasil pewarnaan Gram dari 3 isolat bakteri endofit, 2 isolat bakteri dengan kode isolat MB.1  dan  MB.2  memiliki  bentuk bacil dengan  Gram  positif  dan  berbeda  dengan kode isolat MB.3 memiliki  bentuk coccus dengan  Gram  negatif.  Dikatakan  negatif karena  masih  terdapat  sisa Safranin yang mewarnai  sel  bakteri  maka  terjadi  warna merah,  sedangkan  Gram  positif  masih mempertahankan warna dari kristal violet.
Uji  Aktivitas  Antibakteri  dari  Bakteri Simbion Endofit Isolat Alga Padina sp. Pengujian  aktivitas  antibakteri  dari
3 isolat  bakteri  endofit dengan kode isolat MB.1,  MB.2,  dan  MB.3    pada  bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia coli menggunakan metode difusi sumuran.
Metode  ini  menjadi  metode  yang  dipilih dalam  uji  aktivitas  karena  memiliki keuntungan yaitu prosedurnya yang sederhana  (mudah  dan  praktis)  untuk dilakukan  dan  dapat  memberikan  hasil yang  lebih  dibandingkan  dengan  metode cakram  kertas Kirby  bauer (Prayoga, 2013).
Tabel 2. Rata-rata Diameter Zona Hambat  Bakteri Simbion Endofit isolat Alga Padina sp. terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
Zona  hambat  di  sekeliling  sumur  uji dilakukan  dengan  cara  mengukur  jarak dari tepi sumur uji ke batas lingkaran zona hambat  menggunakan  jangka  sorong (ketelitian  0.01  mm)  pada  beberapa  sisi sumur uji, lalu dirata-ratakan. Pengulangan dilakukan  sebanyak  3  kali  pada  masing- masing bakteri simbion endofit.
Pengulangan dilakukan untuk memperoleh hasil  yang  akurat.  Berdasarkan  kriteria Davis  and  Stout  (1971)  kategori  lemah kurang dari 5 mm, kategori sedang 5 mm - 10  mm,  kategori  kuat  10  mm  -  20  mm, kategori  sangat  kuat  lebih  dari  20  mm. Dari pengukuran rata-rata diameter zona
hambatnya,  maka  daya  antibakteri  dari simbion endofit pada bakteri Staphylococcus  aureus dengan  MB.1
(6,58  mm)  termasuk  kategori  sedang  , MB.2  (6,66  mm)  termasuk    kategori sedang, dan MB.3 (00.00) dengan kategori lemah  atau  tidak  dapat  menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus karena  tidak  terdapat  zona  bening disekitar lubang sumuran. Sedangkan daya antibakteri  dari  simbion  endofit  pada bakteri Escherichia  coli dengan  MB.1 (7,22  mm)  termasuk  kategori  sedang, MB.2  (8,58  mm)  termasuk  kategori sedang,  MB.3  (3,80  mm)  termasuk kategori  lemah.  Dengan  demikian  dapat
Rata-rata Diameter Zona Bening dari bakteri Simbion Endofit  (mm)
Staphylococcus aureus Escherichia coli Rata-rata Rata-rata 1 MB.1 6,58 7,22 2 MB.2 7,66 8,58 3 MB.3 0,00 3,80 4 Kontrol positif 14,68 14,13 5 Kontrol negatif 00.00 00.00
No Kode Isolat
diketahui  bahwa  bakteri  simbion  endofit dari  alga Padina sp.,  memiliki  daya
antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia coli.
Dari  hasil  perhitungan  rata-rata diameter  zona  hambat  yang  dihasilkan isolat bakteri endofit lebih besar menghambat  pertumbuhan  bakteri  Gram negatif Escherichia coli .
Menurut  Radji  (2005),  hal  ini  disebabkan adanya  perbedaan  struktur  dinding  sel kedua  jenis  bakteri  tersebut.  Dinding  sel bakteri  Gram  positif  terdiri  atas  beberapa lapisan  peptidoglikan  yang  membentuk struktur  yang  tebal  dan  kaku  serta mengandung  substansi  dinding  sel  yang disebut  asam  teikoat,  sedangkan  dinding sel  bakteri  Gram  negatif  terdiri  atas  satu atau lebih lapisan peptidoglikan  yang tipis dan  membran  di  bagian  luar  lapisan peptidoglikan.  Karena  hanya  mengandung sedikit  lapisan  peptidoglikan  dan  tidak mengandung  asam  teikoat,  maka  dinding sel  bakteri  Gram  negatif  lebih  rentan terhadap guncangan fisik, seperti pemberian antibiotik atau bahan antibakteri  lainnya.  Selain  itu,  perbedaan struktur dinding sel inilah yang menyebabkan  kedua  jenis  bakteri  tersebut memberikan  respon  terhadap  pewarnaan
Gram menunjukkan bakteri simbion endofit  MB.2  memiliki  nilai  perhitungan rata-rata  diameter  zona  hambat  yang  lebih besar  dibanding  isolat  bakteri  endofit MB.1 dan MB.3 terhadap bakeri Staphylococcus aureus maupun Escherichia  coli .  Sehingga  isolat  bakteri endofit MB.2 dilanjutkan untuk identifikasi
molekuler dengan
menggunakan  gen  16S  rRNA,  untuk mengetahui jenis bakteri tersebut.

## Identifikasi  Bakteri  Endofit  Secara Molekuler
Identifikasi  molekuler  dilakukan  pada isolat  bakteri  alga Padina sp  MB.2.  Hasil elektroforesis  dari  isolat  MB.2  tersebut diketahui  terdapat  pita  terespirasi  dan sejajar dengan marker sekitar 1.200 pasang basa  ( base  pairs )  (Gambar  1).  Kemudian isolat bakteri simbion endofit dideterminasi dengan menggunakan sekuen  gen  16S  rRNA,  dianalisis  di  1 st base Malaysia. Kromatogram yang diperoleh  dari  hasil  sekuensing  disunting menggunakan  software  Geneious  v5.6. Hasil sekuensing DNA dianalisis menggunakan  program  BLAST  melalui media  Online  NCBI  ( National  Center  for Biotechnologhy  Information )  (Kolondam et al ., 2012).
Gambar 1. Hasil Elektroforesis dari Produk Amplifikasi Gen 16S rRNA .
Dari hasil eletroforesis dikirm ke 1 st BASE Malaysia  dan  diperoleh  data  berupa Kromatogram  yang  akan  disunting  pada aplikasi  Geneious.  Hasil  suntingan  akan
menjadi urutan basa nukleotida (gambar 2) dianalisis  pada  program  BLAST  melalui media online NCBI
.
Gambar 2. Urutan Basa Nukleotida Isolat Bakteri Endofit MB.2 Hasil Sekuensing
Gambar 3. Hasil Analisis BLAST dari Isolat Bakteri Endofit MB.2
Dari  hasil  analisis  program  BLAST, diperoleh  bakteri Bacillus  cereus dan Bacillus  thuringiensis yang  artinya  bahwa isolat  bakteri  simbion  endofit  dari  alga Padina sp. yang telah dilakukan sekuensing  dianggap  sebagai  spesies  yang sama  dengan Bacillus  cereus dan Bacillus thuringiensis .  Hal  ini  disebabkan  karena persentasi  dari  panjang  nukleotida  yang dibandingkan  urutan  nukleotidanya  pada program  BLAST  100%    menunjukkan kesamaan dengan nukleotida bakteri Bacillus cereus dan Bacillus thuringiensis .
Dari  hasil  penelitian Giffel  et  al (1997),  meskipun idenifikasi berbasis 16S rRNA  dan  primer  PCR  berbasis  gyrB
untuk  diskriminasi Bacillus  cereus dan Bacillus  thuringiensis, ketika  sejumlah besar  strain  Bacillus  diuji,  hasilnya menunjukkan  bahwa  diskriminasi  antara Bacillus  cereus dan Bacillus  thuringiensis adalah sulit untuk dibedakan.
Dari  hasil  penetian  Chen  (2002),
perbedaan urutan di wilayah variabel (V1) 16S  rRNA  dan  gen  gyrB  antara Bacillus cereus dan Bacillus thuringiensis , dirancang  PCR  primer  khusus  untuk Bacillus.  Ketika  primer  ini  digunakan untuk  membedakan Bacillus cereus dan Bacillus thuringiensis ,  6  dari  82  strain Bacillus  cereus diidentifikasi  sebagai Bacillus thuringiensis ,  sementara  67  dari
73  Bacillus  strain Bacillus thuringiensis adalah  diidentifikasi  sebagai Bacillus cereus . Analisis urutan dari situs annealing primer  menunjukkan  bahwa tidak  ada  perbedaan  yang  jelas  di  wilayah V1  16S  rRNA,  dan  di  gen  gyrB  antara Bacillus cereus dan Bacillus thuringiensis . Dari beberapa
hasil penelitian  tersebut  menunjukkan  masih sulit  untuk  membedakan  spesies  dari Genus Bacillus sp, terutama spesies bakteri Bacillus  cereus dan Bacillus  thuringiensis yang memiliki hubungan kekerabatan yaitu dalam  satu  kelompok  yang  sama,  dan dapat  menghasilkan  gen  Cry.  Jumlah nukleotida  yang  dianalisis  pada  program BLAST  sebanyak  1.067  basa  nukleotida yang  jumlahnya  masih  kurang  panjang untuk  mencakup  area  variatif  yang membedakan  antar    spesies  dari  Genus Bacillus sp.  menjadi  faktor  yang  dapat menyebabkan  hasil  identifikasi  Molekuler sama.

## KESIMPULAN
1. Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan  dapat  disimpulkan  bahwa, terdapat  bakteri  endofit  yang  berasosiasi dengan  alga Padina sp.,  dan  memiliki aktivitas antibakteri terhadap
Staphylococcus  aureus dan Escherichia coli yaitu  diameter  zona  hambat  pada bakteri Staphylococcus aureus yaitu MB.1
(6,58  mm)  termasuk  kategori  sedang,
MB.2  (6,66  mm)  termasuk    kategori sedang, dan MB.3 (00.00) dengan kategori lemah.  Sedangkan  daya  antibakteri  dari simbion  endofit  pada  bakteri Escherichia coli dengan  MB.1  (7,22  mm)  termasuk kategori sedang, MB.2 (8,58 mm) termasuk  kategori  sedang,  MB.3  (3,80 mm) termasuk kategori lemah.
2. Setelah dilakukan identifikasi secara molekuler  menggunakan  Gen  16S rRNA terhadap isolat bakteri simbion  endofit  MB.2  dengan memiliki  kesamaan  100%  dengan bakteri Bacillus cereus dan Bacillus thuringiensis.

## SARAN
Berdasarkan hasil dan pembahasan isolasi, uji  aktivitas  antibakteri  bakteri  simbion endofit yang diisolasi dari alga Padina sp., maka dapat diberikan saran yaitu :
1. Melakukan  Pelacakan  filogeni  dengan teknik Molecular  phylogenetics untuk menentukan  hubungan  antar  spesies bakteri  sehingga  dapat  diperoleh  1 spesies bakteri yang diduga adalah jenis bakteri simbion endofit.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut uji aktivitas antibakteri pada jenis bakteri lain misalnya Klebsiella pneumoniae , Enterobacter aerogenes ,
Micrococcus luteus , Enterococcus faecalis , Pseudomonas aeruginosa , Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis

## DAFTAR PUSTAKA
Achlich,  K.,  Sieber,  T.N.  1996.  The profusion of Dark Septate Endophytic Fungi in non-Ectomycorrhizal  Fine  Roots  of Forest  Trees  and  Shrubs. New
Phytol . 105 : 259-270.
Chen,  M.L.,  and  Tsen,  H.Y.  2002. Discrimination  of Bacillus  cereus and Bacillus thuringiensis with 16S  rRNA  and  gyrB  Gene  based PCR Primers and Sequencing of  Their  Annealing  sites. Journal  of applied microbiology . 92 ( 5 ): 9-12. Davis,  W.W.,  and  Stout,  T.R.  1971. Disc Plate Methods of Microbiological  Antibiotic  Assay. Journal  Microbiology . 22 ( 4 ):  659
– 665.
Giffel,  M.C.I.,    Beumer,  R.R.,  Klijn,  N.,
Wagendorp,  A.,  Rombouts,  F.M. 1997 Discrimination between Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis using specific
DNA  probes  based  on  variable regions  of  16S  rRNA. Journal  of Applied Microbiology. 146
( 1 ): 47-51.
Kandel,  S.L.,  Joubert,  P.M.,  Doty,  S,L. 2017. Bacterial Endophyte Colonization and Distribution within Plants. Microorganisms .
5( 4 ):77.
Kattar,  M.M.,  Chavez,  J.F.,  Limaye,  A.P., Rassoulian-Barrett,  S.L.,  Carlson,
L.C. 2000.   Application  of  16S
rRNA  gene  sequencing  to  identify Bordetella hinzii as the
Causative Agent of Fatal
Septicemia. Journal  of  Clinical Microbiol . 38 : 789-794.
Kolondam,  B.J.  Primer forward BKXF dan  primer reverse BKYR (siap terbit).
Kolondam,  B.J.,  Lengkong,  E.,  Mandang, J.P.,  Runtunuwu,  S.,  Pinaria,  A.
Barcode  DNA Anthurium Gelombang Cinta ( Anthurium plowmanii ) berdasarkan gen RBCL   dan matK. Jurnal Bioslogos . 3 ( 1 ): 17 – 25
Madigan  M.  T.,  Martinko  J.M.,  Brock,
T.D.  2005. Brock Biology  of Microorgnisms. 11th   Edition. Pearson Prentice Hall, New Jersey.
Mayangsari,  Y.  2012. Electrophoresis . Department of Food and Agricultural Products Processing Technology  Faculty  of  Agricultural Technology Gadjah Mada University,Yogyakarta. Mpila,  D.  A.  2012. Uji  Aktivitas Antibakteri  Ekstrak  Etanol  Daun Mayana (Coleus
atropurpureus  benth)  Terhadap Staphylococcus  aureus,  Escherichia coli dan Pseudomas aeruginosa  Secara  Invitro [skripsi]. Program  Studi  Farmasi  FMIPA Universitas Sam Ratulangi, Manado. Prayoga,  E.  2013. Perbandingan  Efek Ekstrak Daun Sirih Hijau Piper betle L. dengan Metode Difusi  Disk dan Sumuran terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus [Laporan Penelitian]. Fakultas Kedokteran  dan  Ilmu  Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatulla, Jakarta Prihatiningtias, W.,  dan Wahyuningsi, M. S. H. 2006. Prospek Mikroba Endofit sebagai Sumber Senyawa Bioaktif .  Universitas  Gadjah  Mada, Yogyakarta.
Radji,  M.  2005. Penuntun  Praktikum
Mikrobiologi  Farmasi  Edisi  Kedua . Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia, Depok. Tan,  R.  X.,  and  Zou  W.  X.  2001. Endophytes:  A  Rich  Source  of Functional Metabolites. Natural  Product  Rep ost. 18 :  448- 459.
Vandepitte, J., Varhaegen, J., Engbaek, K.,
Rohner,  P.,  Piot,  P.,  Heock,  C.G.
2010. Prosedur untuk Laboratorium Dasar untuk Bakteriologi Klinis, Edisi 2.
Diterjemahkan  oleh  dr.  Lyana Setiawan.  Buku  Kedokteran  RGC, Jakarta.
Varier,  K.M.,  Milton,  M.C.,  Arulvasu,  C.,
Gajendran,  B.  2013.  Evaluation  of Antibacterial   Properties of Selected Red Seaweeds from
Rameshwaram   Tamil   Nadu  India. Journal  of  Acamedia  and  Industrial Research. 1 ( 1 ): 667-670.
Whitman,  K.A  and  MacNair,  N.G.  2010. Finfish  and  Shellfish  Bacteriology Manual:  Techniques and Procedures. (Online). http://books.google.co.id/books?id =hlk04vjlam0C&printsec=frontcoer &dg=Finfish+a nd+Shellfish+Bacteriology+Manua l:+Techniques+and+Procedures&hl= id&ei=5_zsT YvpK4_2tgP4ulngDQ&sa=X&oi=
book_result&ct=result&resnum=1& ved=0CCcQ6
AEwAA#v=onepage&q&f=false. [Diakses  18  Maret  2018.  Pukul
09.01 WITA]
Winarno, F.G. 1996. Teknologi
Pengolahan  Rumput  Laut  .  Pustaka
Sinar Harapan,   Jakarta.