p-ISSN 2527-6751
Penggunaan Kinetin, Asam Naftalen Asetat, dan  Benzil Adenin  dalam  Induksi Kalus Kecubung ( Datura metel L.) Secara In Vitro
Use of Kinetin, Naphthalene Acetate Acid, and Benzyl Adenine in Induction of Amber Callus ( Datura metel L.) In Vitro
Yulita Nurchayati 1 *, Santosa 2 , Laurentius H. Nugroho 2 dan Ari Indrianto 2
1) Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro, Semarang
2) Fakultas  Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta * Email : yulita.yoko@gmail.com
Diterima 8 Januari 2018 / Disetujui 31 Januari 2018

## ABSTRAK
Kecubung  ( Datura  metel L.)  merupakan  tumbuhan  penghasil  hyosciamin  dan  skopolamin,  yang  berkasiat sebagai anticholergic dan spasmolytic .  Kedua  metabolit  dapat  ditingkatkan  produksinya  dari  kultur  kalus. Induksi    kalus  dari  daun  kecubung  dilakukan  dengan  menggunakan  aplikasi  zat  pengatur  tumbuh  (ZPT). Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mempelajari  respon  dan  perkembangan  daun  kecubung  terhadap beberapa  macam  hormon  dan  untuk  menseleksi  kalus  yang  terbentuk  secara in  vitro .  Penelitian  ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan 6 perlakuan ZPT dalam medium Murashige & Skoog (MS) yaitu tanpa hormon, Kinetin tunggal, NAA tunggal, kombinasi Kinetin dan NAA, BA tunggal serta kombinasi BA dan NAA.  Daun yang telah disterilkan ditumbuhkan dalam medium MS dengan penambahan sukrosa 3% dan beberapa ZPT perlakuan dan diberikan 5 ulangan.   Kalus yang terbentuk disubkultur dalam medium yang sama  formulasinya  untuk  mengoptimalkan  pertumbuhan.  Hasil  menunjukkan  bahwa  kalus  dapat  terbentuk pada  semua  medium  yang  diujikan.  Kalus  yang  remah  diperoleh  dari  medium  MS  dengan  ZPT  kombinasi kinetin 3x10 -5 M dan NAA 10 -5 M. Respon kalus yang berbeda diperoleh dari medium dengan penambahan BA tanpa NAA. Penambahan BA tunggal 6x10 -6 M dalam medium MS menginduksi kalus yang embrionik.
Kata kunci : induksi kalus, zat pengatur tumbuh, kalus remah, kalus embrionik

## ABSTRACT
Datura  metel L.  is  plant  produced  hyosciamine  and  scopolamine,  which  has anticholergic and spasmolytic activities. Both metabolites can be arised by callus culture. Callus induction from the leaves can be established by plant growth regulators (PGR) application. The aims of this experiments are to study leaves respon and the development in several PGR and to screen the callus properly in further stages. This research was conducted by Completely Randomized Design with 6 treatment PGR into Murashige & Skoog (MS) medium i.e. without hormone, single Kinetin, single  Naphtalene acetic acid (NAA), Kinetin combined with NAA, single Benzyl Adenin  (BA),  and  BA  combined  with  NAA.  The  sterile  leaves  were  initiated in  MS  medium  supplemented 3%  sucrose  and  several  combines  of    PGR  with  5  replicates.  Moreover,  callus  formatted  were  subcultured three times at the same medium to optimize growth. The result showed that callus could be formatted at all of medium composition. The friable  callus was gained at MS by adding with Kinetin 3x10 -5 M combined with NAA 10 -5 M.  Difference respon of leaves was obtained in MS supplemented  BA without NAA. This respons indicated that BA 6x10 -6 M  was suitable growth regulator for embrionic callus formation.
Keywords : callus induction, plant growth regulators, friable callus, embrionic callus

## PENDAHULUAN
Tumbuhan  menjadi  bahan  baku  yang penting  untuk  obat  herbal  karena  kandungan senyawa  kimianya  (Dechaux  and  Boitel-Conti,
2005). Salah satu tumbuhan dari famili Solanaceae yakni  kecubung  ( Datura  metel L.)  mengandung senyawa alkaloid kelompok tropan, yakni hyosciamin  dan  skopolamin,  yang  berkasiat sebagai anticholergic dan spasmolytic (Alexander
et al. , 2007; Facchini, 2001) dan memiliki aktivitas antibakteri    (Bruce,  1999).    Eksplorasi  kedua senyawa  ini  dari  tumbuhan  asalnya  memerlukan waktu  yang  lama,  karena  dormansi  biji  dan persentase  perkecambahan  yang  rendah.  Biji kecubung  tergolong  biji  yang  berkulit  keras, sehingga  sulit  dikecambahkan  secara in  vitro (Ajungla et  al. ,  2009).    Semua  bagian  dari tumbuhan  tersebut  dapat  menghasilkan  alkaloid ketika  diinduksi  menjadi  kalus.  Kalus  merupakan jaringan yang belum terdiferensiasi, yang diperoleh  dengan kultur jaringan. Kalus memiliki kemampuan  unuk  mensintesis  suatu  metabolit sekunder. Melalui metode ini, suatu potongan daun dapat mengalami dediferensiasi membentuk kalus. Kalus akan tumbuh di dalam medium buatan yang mengandung nutrisi dan menjalankan metabolisme umumnya  bahkan  metabolisme  sekunder  (Mantell &  Smith,  1986;  Chawla,  2002;  Dewick,  2000). Beberapa metabolit diproduksi dari kalus tumbuhan  anatara  lain  produksi  suatu  antioksidan dari Morinda  citrifolia (Kusdianti,  2007), karotenoid dan klorofil dari jenis Acalypha indica L. (Rahayu, 2002) nikotin dari Nicotiana tabacum L.  dan  asam  askorbat  dari  Hibiscus  sabdariffa (Nurchayati & Rahmah, 2010).
Induksi  kalus  menjadi  bagian  awal  yang harus  dilakukan  untuk  mendapatkan  kultur  kalus secara in  vitro maupun  untuk  pengujian  tahap perkembangan  selanjutnya.    Zat  pengatur  tumbuh (ZPT)    menjadi    salah    satu    unsur  penting  dalam kultur  jaringan  untuk    mendapat  kalus,  pucuk, maupun planlet (Trigiano & Gray, 2005; Hartman et al ., 2000). Kelompok zpt auksin sintetik seperti NAA,  2,4D  dan  sitokinin  berupa  benzil  adenin, kinetin,  dan  thidiazuron  merupan  beberapa  zpt yang  sering  digunakan  dalam    kultur in  vitro . Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengkaji  respon fisiologi daun kecubung terhadap beberapa macam zat pengatur tumbuh di dalam  medium Murashige dan  Skoog  (MS)  sehingga  diperoleh  kalus  yang menjadi jaringan penghasil metabolit sekunder.

## METODE PENELITIAN
Bahan tanaman yang digunakan adalah daun tumbuhan  induk  pada  urutan  ke  3  dari  pucuk tumbuhan  induk  yang  ditumbuhkan  di  dalam
rumah  kaca  dan  telah  berbunga.  Daun  yang  telah diisolasi kemudian dicuci dengan air mengalir dan deterjen,  dilanjutkan  sterilisasi  permukaan  di dalam  LAF  menggunakan  larutan  Natrium hipoklorit 10% selama 5 menit, selanjutnya dibilas dengan  akuades  steril.  Daun    steril  tersebut digunakan  sebagai  eksplan  dengan  ukuran    1  x  1 cm  ditanam  di  dalam  medium  perlakuan  yakni medium  MS  padat  yang  mengandung  beberapa macam ZPT.  Perlakuan ZPT dalam  induksi kalus kecubung terdiri dari : Kinetin (Kin) tunggal 3x10 - 5 M,  NAA  tunggal  10 -5 M,  BA  tunggal  6x10 -6 M, kombinasi  Kin-NAA,serta  kombinasi  BA-NAA dengan konsentrasi yang telah disebutkan. Analisis deskriptif dilakukan setelah subkultur ke 3 dengan parameter berupa morfologi eksplan dan atau kalus dan  tekstur  kalus.  Kultur  kalus  dinkubasi  pada kondisi terang di bawah pencahayaan lampu  1000 lux pada suhu 25ºC.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Induksi  kalus  merupakan  tahap  pertama yang  dilakukan  dalam  penelitian  ini  untuk menghasilkan  kalus  yang  remah.    Kalus  remah menjadi syarat penting sebagai bahan utama untuk beberapa  pengujian  atau bioassay. Kalus  yang remah  disusun  oleh  sel-sel  parenkim  yang berdinding tipis, terorganisir saling lepas, berwarna  kekuningan  (Gambar  16A).  Kalus demikian umumnya dikenal dengan kalus proliferatif  dan  mengandung  metabolit  sekunder (Veerpote & Memmelink, 2002; Chawla, 2002).
Daun dipilih sebagai eksplan dalam pembentukan kalus, karena selain sebagai penghasil  senyawa  alkaloid  kelompok  tropan (Dewick, 2002), daun kecubung memiliki morfologi  yang  tipis  dengan  trikoma  pada permukaan  adaksialnya.  Karakter  daun  tersebut memudahkan  kontak  dengan  permukaan  medium kultur  yang  padat,  sehingga  kalus  dapat  terbentuk dengan  cepat.  Hal  ini  mendukung  penyediaan bahan  utama  pada  pengujian  selanjutnya.  Respon daun kecubung sebagai eksplan yang ditumbuhkan pada  medium  Murashige&Skoog  (MS)  dengan penambahan berbagai macam zat pengatur tumbuh disajikan dalam Tabel 1.  Daun yang ditumbuhkan pada  medium  MS  dengan  beberapa  komposisi  zat
pengatur  tumbuh  menunjukkan  respon  yang berlainan.    Kalus  yang  remah  dihasilkan  dari medium  MS  dengan  penambahan  Kinetin  3x10 -5
M  dan  NAA  10 -5 M.    Kombinasi  zat  tumbuh Kinetin dan NAA tersebut sesuai untuk mendukung  proses  dediferensiasi  daun  kecubung secara in  vitro .  Hal  ini  menunjukkan  bahwa kombinasi  Kin  dan  NAA  merupakan  zpt  yang tepat  bagi  kalogenesis  daun  kecubung.  Kebutuhan
jenis  dan  konsentrasi  zpt  sngat  tergantung  oleh genetik  tumbuhan.  Daun  dari  spesies  lain  dalam satu  famili  Solanaceae  diduga  memerlukan  zpt yang  berbeda  jenis  dan  konsentrasi.    Penggunaan kedua  zat  pengatur  tumbuh  tersebut  dilakukan berdasarkan  pada  induksi  kalus D.  stramonium secara in  vitro yang  bertujuan    untuk  produksi alkaloid (Iranbakhsh et al ., 2007).
Tabel  1.  Respon  eksplan  daun Datura    metel L.  pada  berbagai  komposisi  zat  pengatur  tumbuh    dalam medium  MS
Zat tumbuh (M) Kalus Jaringan meristemoid Akar 0 (tanpa zpt) - - +++ Kinetin 3x10 -5 + - - NAA 10 -5 ++ - ++ Kin 3x10 -5 +NAA 10 -5 ++++ - - BA 6x10 -6 ++ +++ - BA 6x10 -6 +NAA 10 -5 +++
+ -
keterangan :
Kombinasi  sitokinin  lain,  Benzil  Adenin 6x10 -6 M dengan NAA 10 -5 M menghasilkan kalus kompak berwarna hijau dengan jaringan meristemoid  di  sebagian  permukaan.    Jaringan meristemoid ini berwarna hijau yang mengindikasikan kandungan klorofil.
Pembentukan  klorofil  ini  memerlukan  peran sitokinin,  karena  sitokinin  merupakan  kelompok hormon  yang  memiliki  peran  fisiologi  dalam pembelahan  sel  termasuk  kariokinesis    dan sitokinesis    (Davies, et  al. ,  1987;  Fosket,  1994).
Pembelahan  kloroplas  sebagai  organel  dalam sitoplasma    ikut  dipengaruhi  oleh  sitokinin. Karakter  kalus  kompak  yang  demikian  sangat mendukung untuk mikropropagasi yang menghasilkan planlet, maupun untuk pembentukan kultur  pucuk. Kalus  kompak  semacam  itu memiliki  susunan  jaringan  yang  rapat  dan  banyak mengandung  air  (Manuhara,  2001).    Komposisi MS yang hanya mengandung  Benzil Adenin (BA)
tanpa NAA menghasilkan respon morfologi  kalus yang  berbeda  dengan  komposisi  Kin-NAA maupun BA-NAA.  Kalus kompak berwarna hijau dengan jaringan meristemoid yang mendominasi di permukaannya  dihasilkan  dari  penggunaan  BA 6x10 -6 M,  merupakan  kalus  yang  mengandung jaringan meristemoid yang selanjutnya berkembang membentuk  tunas  dan  planlet (Gambar    1B).    Benzil  Adenin  berperan  dalam mengaktifkan  gen-gen  yang  ada  di  dalam  daun untuk  membentuk  tunas.  Sadik et  al. (2006)  dan (Victor et  al .,  1999),  menyatakan  bahwa  BA berperan    menstimulasi  pembelahan  sel  dan diferensiasi.  Benzil    Adenin    merupakan  sitokinin sintetik  turunan  adenin  yang  sangat  aktif  dalam mendorong  pertumbuhan  kalus  tembakau.  Bentuk isomer  1- bensil  adenine mempunyai  aktivitas kimia  yang  rendah,  sehingga  untuk  dapat  aktif harus  diubah  menjadi  6- bensil  adenine .  Sitokinin BA  berperan  penting  dalam  menginduksi  respon
-
:  tidak terbentuk + :  Terbentuk kurang dari 10% bagian ++
:  Terbentuk 25% bagian +++
:  Terbentuk hingga 50% bagian ++++ :  Terbentuk di seluruh permukaan eksplan
fisiologi seperti regulasi pembelahan sel, diferensiasi  jaringan  dan  organ  serta  biosintesis klorofil.
Respon  perkembangan  daun  dari  tiap spesies tanaman di dalam medium  kultur berbeda satu  sama  lain.  Pembentukan  kalus  dari  daun tanaman  rosela  memerlukan  zat  tumbuh  dengan kombinasi    NAA  2  mg/L  dan  BA  3  –  5  mg/L  di dalam  medium  MS.    Kalus  yang  remah  diperoleh
baik  dari  daun  maupun  kelopak  bunga  tanaman tersebut, serta mampu menghasilkan asam askorbat    (Nurchayati&Rahmah,  2010)  dan karotenoid    (Noviati et  al .,  2014).    Yuan et  al. (2004),    melaporkan  bahwa  kalus Alternanthera philoxeroides tumbuh  optimal  pada  medium 1/2MS,  yang  mengandung    BA  3  mg/L  dan  NAA 0.2 mg/L.
Gambar 1. Kalus dari medium MS dengan penambahan zpt A. Kinetin dan NAA;  B. BA dan NAA;  C. BA tunggal Skala: 1 cm
Penambahan  satu  macam  zat  tumbuh,  baik Kinetin  tunggal    maupun    NAA  tunggal,  kurang mendukung pembentukan kalus kecubung.  Hal ini ditandai eksplan hanya membentang dan menggulung  pada  10  hari  pertama,  diikuti pembentukan  kalus  pada  tepi-tepi  irisan  daun. Hingga  akhir  subkultur    ke-3  (42  HST)  sisa eksplan  masih  mendominasi.  Pemberian  BA tunggal  maupun  dikombinasi  dengan  NAA menghasilkan tipe kalus yang kompak dan banyak mengandung  meristemoid.    Menurut  Sadik et  al ., 2006;  Zhang et  al. ,  2005,  komposisi  Kin-NAA merupakan  kombinasi  ZPT  untuk  memperoleh kultur  kalus  yang  bertekstur  remah,  yang  dapat digunakan  dalam  produksi  metabolit  sekunder, maupun  untuk  mendapatkan  kultur  suspensi  sel. Kalus  suspensi  sel  sangat  tinggi  potensinya sebagai sarana produksi metabolit sekunder. Kalus yang  remah  sangat  tepat  digunakan  untuk mempelajari  respon  sel  tumbuhan  terhadap berbagai cekaman, antara lain cekaman
kekeringan,  salinitas  dan  cekaman  logam  berat secara in vitro (Chawla, 2002;  Endress, 1994).
Kalus  kompak  yang  dipenuhi  meristemoid sangat memudahkan tahap organogenesis membentuk  tunas  adventif    atau  kultur  pucuk. Kultur  pucuk  selanjutnya  akan  lebih  mudah diinduksi  membentuk  akar  tanpa  perlakuan  ZPT, sehingga dapat mendukung mikropropagasi tanaman.  Kalus  yang  kompak  umumnya  dapat membentuk  embrio  (Trigiano  &  Gray,  2005; Hartman, et  al .,  2000;  Victor et  al. ,  1999). Pembentukan embrio somatik juga sangat mendukung  mikropropagasi  pada  beberapa  biji tanaman  yang  sulit  berkecambah  atau  biji  yang non embrionik.
Induksi  kalus  secara in  vitro umumnya memerlukan  kombinasi  aksin  dan  sitokinin. Penggunaan salah satu ZPT atau tidak adanya ZPT yang ditambahkan dalam medium hara tidak dapat menginduksi kalus secara optimal. Pada penelitian ini  eksplan  yang  melengkung  dan  beberapa
eksplan lainnya muncul, akar pada perlakuan tanpa adanya penambahan ZPT dalam medium dasar.

## KESIMPULAN
Pemberian  kombinasi  Kinetin    3  x  10 -5 M dan  NAA  10 -5 M  dalam  media  MS  dapat menginduksi  kalus Datura  metel L.  yang  remah dan  mendukung  untuk  sarana    produksi  metabolit sekunder.  Penambahan  BA  tunggal  6x10 -6 M dalam  medium  MS  menginduksi  kalus  yang embrionik.

## DAFTAR PUSTAKA
Ajungla,  L.,  P.P.  Patil,  R.B.  Barmukh,  and    T.D.
Nikam. 2009. Influence of biotic and abiotic elicitors on accumulation of hyosciamin and scopolamine in root culture of Datura metel L.. Indian J. of Biotech. 8 : 317-322.
Alexander, J . Benford, D., Cockburn, A., Cravedi, JP.,  Dogliotti,  E.,  Di  Domenico,  A., Fernandez-Cruz,  M.  L.,  Furst,  P.,  Fink- Gremmels,  J.,  Galli,  C.  L.,  Grandjean,  P., Gzyl,  J.,  Heinemeyer,  G.,  Johansson,  N., Mutti,  A.,  Schlatter,  J.,  van  Leeuwen,  R., Peteghem,  C.  V.,  and  Verger,  P.  2008. Tropane  Alkaloids  (from Datura sp.)  as Undesirable  Substances  in  Animal  Feed. The  European  Food  Safety  Authority Journal 691: 1-55.
Bruce,N.C. 1999. Alkaloid. Cambridge,UK. www.wileyvch.de/books/pdf/v08a_alk.pdf Chawla, H.S. 2002. Plant Biotechnology
Laboratory Manual for Plant Biotechnology.
Oxford dan IBH Publishing. New Delhi.
Dewick, P.M. 2002. Medicinal Natural Products A Biosynthetic  Approach.  John  wiley  &  sons.
Ltd.
Endress,  R.  1994.  Plant  Cell  Biotechnology. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg.
Facchini, P.J. 2001. ALKALOID BIOSYNTHESIS IN PLANTS: Biochemistry, Cell Biology,Molecular
Regulation,  and  Metabolic  Engineering
Applications. Annu.  Rev.  Plant  Physiol. Plant Mol. Biol. 52:29–66.
Nurchayati, Y. dan F.A. Rahmah. 2010. Kandungan  asam  askorbat  pada  Kultur
Kalus  Rosela (Hibiscus  sabdariffa L.) dengan  variasi  Konsentrasi  Sukrosa  dalam Media  MS. Majalah  Obat  Tradisional,
15(2), 71 – 74.
Rahayu, S., R. R. Esyanti dan A.H. Siregar. 2006. Pengaruh Elisitasi dengan Verticillium dahliae Kleb dan Rhizoctonia Solan i Kuhn terhadap kandungan Gosipol  dalam kalus Gossypium hirsutum L. pada beberapa tingkat Subkultur. Biosfera 23 (1): 9-14.
Sadik,  K.,  P.  R.  Rubaihayo,  M.  J.  S.  Magambo, and  M.  Pillay.  2006.  Generation  of  cell suspensions  of  East  African  highland bananas  through  scalps. African  J.  of Biotechnology 6 (11) : 1352-1357.
Trigiano,  R.  N.  and  Gray,  D.  J.  2005.  Plant Development  and  Biotechnology.  CRC Press, Boca Raton.
Veerporte, R. and J. Memmelink 2002. Engineering secondary metabolite
production  in  plants. Current  Opinion  in Biotechnology. 13: 181-187.
Victor,  J.M.R.,  S.J.  Murch,  S.  Krishna  Raj,  and P.K. Saxena. 1999. Somatic Embryogenesis and  Organogenesis  in  Peanut:  The  Role  of Thidiazuron  and  N6-Benzylaminopurine  in The  Induction  of  Plant  Morphogenesis. Plant Growth Regulation 28: 9–15.
Zhang,  L.,  G.  Kai,  B.  Lu,  H.  Zhang,  K.  Tang,  J. Jiang,  and  W.  Chen.  2005.  Metabolic
Engineering of Tropane Alkaloid
Biosynthesis  in  Plants. J.  Integrative  Plant Biol . 47 (2):136-143.