## Respons Ayam Broiler  yang  Diberi Ransum dengan Suplementasi  Fitase, Zn dan Cu
(Broiler Response Feed upon Phytase, Zn, and Cu

## Suplementation)
Hendi  Setiyatwan 1) , dan Wiranda G Piliang 2)
1. Fakultas Peternakan, Universitas Padjadjaran Bandung
2. Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
Email: setiyatwan@yahoo.co.id

## Abstrak
Seng  dan  tembaga  bersifat  antagonis  di  dalam  media intestinal  metallothionein.    Zn mempunyai  afinitas  yang  lebih  tinggi  untuk  berikatan  dengan histidin dan sistein, sedangkan  Cu  hanya  berafinitas  tinggi  dengan histidin.    Penelitian  ini  bertujuan  untuk mendapatkan  interaksi antara  mineral seng,  tembaga,  dan  aktivitas alkalin  fosfatase pada ayam  broiler    yang    diberi  ransum  dengan  suplementasi    fitase,  Zn  dan  Cu.    Dua  ratus delapan  puluh  delapan  ekor  DOC (Unsexed) yang  dipelihara  selama  42  hari,  dialokasikan ke dalam rancangan acak lengkap dengan sembilan ransum perlakuan dan diulang sebanyak empat  kali.    Kombinasi  ransum  penelitian  terdiri  atas:  R1  (Ransum  kontrol  positif),  R2 (Ransum kontrol negatif), R3 (R2 + 132,70 ppm ZnO), R4 (R2 + 286,16 ppm CuSO 4 ), R5 (R2 + 132,70 ppm ZnO + 286,16 ppm CuSO 4 ), R6 (R2 + fitase 1000 FTU/kg), R7 (R2 + fitase  1000  FTU/kg  +  132,70  ppm  ZnO),  R8  (R2  +  fitase  1000  FTU/kg  +  286,16  ppm CuSO 4 ),  R9  (R2  +  fitase  1000  FTU/kg  +  132,70  ppm  ZnO  +  286,16  ppm  CuSO 4 ).    Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa suplementasi kombinasi fitase 1000 FTU/kg, ZnO 132,70  ppm,  dan  CuSO 4 286,16  ppm  dalam  ransum  memberikan  interaksi  sinergis  yang ditandai dengan peningkatan kandungan Zn dalam serum dan aktivitas alkalin fosfatase. Kata kunci : seng, tembaga, aktivitas alkalin fosfatase, ayam broiler

## Abstract
Zn  and  Cu  are  antagonist  in  the  intestinal  metallothionein.  Zn  has  a  higher  affinity  for chelate with Histidine and sistein, although Cu just has a high affinity with histidine. This research is aimed to get an interaction between Zn, Cu, and the alkaline fosfate activity in broiler chicken that feed with fitase suplemantation, Zn, and Cu.  Two hundred eighty eight Day  Old  Chicks  unsexed  were  allocated  into  nine    treatment  diets  with  four  replications (eight chicks in each replicate).   The birds were raised up to 42 days old.  Combination of the treatment diets were: R1 (positive control), R2 (negative control), R3 (R2 + 132.70 ppm ZnO), R4 (R2 + 286.16 ppm CuSO 4 ), R5 (R2 + 132.70 ppm  ZnO + 286.16 ppm CuSO 4 ), R6 (R2 + phytase 1000 FTU/kg), R7 (R2 + phytase 1000 FTU/kg + 132.70 ppm ZnO), R8 (R2  +  phytase  1000  FTU/kg  +  286.16  ppm  CuSO 4 ),  R9  (R2  +  phytase  1000  FTU/kg  + 132.70  ppm  ZnO  +  286.16  ppm  CuSO 4 ).    The  results  of  this  research  indicated  that    the combination  between  fitase  1000  FTU/kg,  ZnO  132,70  ppm,  dan  CuSO 4 286,16  ppm  in feed  give  a  synergic  interaction  that  showed  with  the  increase  of  Zn  in  feed  and  alkaline fosfatase activity.
Keywords : zinc, copper, alkaline fosfate activity, broiler

## Pendahuluan
Mineral Zn dan Cu bekerja pada enzim-enzim yang  terlibat  dalam  pertumbuhan  dan sistem kekebalan tubuh, akan tetapi ketersediaan hayatinya bagi  tubuh  ternak  dipengaruhi  oleh  kehadiran  asam fitat  dalam  ransum  (Piliang  2000).    Fitat  pada  pH netral  membentuk  kompleks  dengan  mineral-
mineral  bervalensi  dua,  yaitu    Cu 2+ ,  Zn 2+ ,  CO 2+ , Mn 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ , dan Ca 2+ . Ikatan fitat-Zn dan fitat- Cu merupakan  ikatan  yang  stabil  dan  tidak  larut sehingga  absorpsinya  di  dalam  saluran  pencernaan menurun (Piliang 2000).
Mineral Zn dalam sistem biologis merupakan komponen metaloenzym, seperti polimerase  DNA,
peptidase karboksi A dan B, dan alkalins fosfatase. Enzim  tersebut  berperan  dalam proliferasi  DNA yang  selanjutnya  berpengaruh  pada  sintesis  protein, proses  pencernaan  protein,  dan  absorpsi  asam amino, serta metabolisme energi  (Larvor 1983).
Mineral Cu berperan pada sintesis hemoglobin yang normal dan merupakan komponen seruloplasmin, dismutase superoksida (SOD), oksidase lysil, dan oksidase sitokrom.
Seruloplasmin berperan  dalam  penyerapan  dan transpor  Fe  yang  dibutuhkan  untuk  sintesis hemoglobin dan dapat berfungsi sebagai antioksidan  serta  agen  pertahanan  (Harmon  dan Torre 1997).
Fitase adalah enzim yang mampu melepaskan ikatan fitat dengan Ca, Zn, Cu, dan Mn, serta  meningkatkan  relaksasi  usus,  dan  absorpsi nutrien  (Traylor et  al. 2001).    Mineral  Zn  dan  Cu bersifat  antagonis  di  dalam  media intestinal metallothionein.    Tembaga  selalu  kalah  bersaing dalam  berikatan  dengan  protein.    Hal  ini  terjadi karena  Zn  mempunyai  afinitas  lebih  tinggi  untuk berikatan dengan histidin dan sistein, sedangkan Cu hanya  berafinitas  tinggi  dengan  histidin  (Berdanier 1998).    Kandungan  Cu  yang  tinggi  dalam  ransum akan  menurunkan  absorpsi  Zn  (Piliang  2000) sehingga  keseimbangan  Zn  dan  Cu  dalam  ransum perlu diperhatikan.
Penelitian  ini  mengkaji  interaksi antara mineral seng,  tembaga,  dan  aktivitas  alkalin fosfatase  pada ayam  broiler    yang    diberi  ransum berbahan  dasar  dedak  dengan  suplementasi    fitase, Zn dan Cu

## Metode
Ayam broiler umur sehari (DOC) strain Cobb sebanyak  288  ekor (unsexed) dengan  berat  badan rata-rata  48,72  g  dan  koefisien  variasi  7,96% digunakan  dalam  penelitian  ini.  Anak  ayam
ditempatkan  secara  acak  ke  dalam  36  unit  kandang yang terbuat dari bahan besi dan kawat, dan masing- masing  unit  berukuran  0,75  x  0,50  x  0,40  meter. Setiap  unit  kandang  diisi  dengan  8  ekor  DOC. Pemanasan  kandang  dilakukan  selama  2  minggu menggunakan lampu pijar berkekuatan 60 watt yang dipasang  pada  tiap  petak  kandang.    Setelah  periode tersebut  dua  lampu  pijar  digunakan  sebagai  alat penerangan malam hari di kandang utama.  Susunan ransum kontrol penelitian dicantumkan dalam Tabel 1 dan komposisi nutrien dalam Tabel 2.
Ransum  penelitian  terdiri  atas:  R1  (Kontrol positif), R2 (Kontrol negatif), R3 (R2 + 132,70 ppm ZnO),  R4  (R2  +  286,16  ppm  CuSO 4 ),  R5  (R2 + 132,70  ppm  ZnO  +  286,16  ppm  CuSO 4 ),  R6  (R2  + fitase 1000 FTU/kg), R7 (R2 + fitase 1000 FTU/kg + 132,70 ppm ZnO), R8 (R2 + fitase 1000 FTU/kg + 286,16  ppm  CuSO 4 ),  dan  R9  (R2  +  fitase  1000 FTU/kg + 132,70 ppm ZnO + 286,16 ppm CuSO 4 ). Ransum  kontrol  terdiri  atas  kontrol  positif  dan kontrol  negatif  sesuai  dengan  rekomendasi  BASF (2002). Tiap perlakuan diulang sebanyak empat kali. Ransum  diberikan  dalam  bentuk mash dan  air minum diberikan ad libitum.
Peubah  yang  diukur  adalah:    kadar  Zn  dan  Cu serum,  kadar  Zn  dan  Cu  dalam  feses,  dan  aktivitas alkalin  fosfatase dalam  serum.    Kandungan  Zn  dan Cu dianalisis dengan menggunakan atomic absorption  spechtrophotometer (AAS).    Analisis dilakukan di Laboratorium Kimia, Departemen Ilmu Nutrisi  dan  Teknologi  Pakan,  Fakultas  Peternakan IPB  Bogor. Pengukuran  aktivitas alkalin  fosfatase (ALP)  dilakukan  berdasarkan    IFCC  (International Federation  of  Clinical  Chemistry)  (Stauffer  1989) yang dilakukan di Laboratorium Prodia.  Data yang diperoleh  dianalisis  dengan  sidik  ragam kemudian dilanjutkan  dengan  uji  Duncan  dan  uji  korelasi (Steel dan Torrie 1980).
Tabel  1   Bahan pakan penyusun ransum penelitian No Bahan Pakan Kontrol Positif (%) Kontrol Negatif  (%) No Bahan Pakan Kontrol Positif (%) Kontrol Negatif (%) 1 2 3 4 Dedak Padi Tepung Ikan Jagung Bungkil Kedelai 50 15,14 15 13 50 15,14 15 13 5 6 7 8 Minyak CPO Premiks CaCO 3 Garam 5,5 0,3 0,96 0,1 4,2 0,3 2,26 0,1
Tabel  2   Komposisi nutrien ransum kontrol penelitian berdasarkan perhitungan No Nutrien* Kontrol Positif Kontrol Negatif No Nutrien Kontrol Positif Kontrol Negatif 1 2 3 4 5 6 7 8 9 EM (Kkal/kg) PK  (%) SK  (%) Ca  (%) P total  (%) P tersedia  (%) Na  (%) Cl  (%) Lisin  (%) 3100 21,60 7,60 1,23 1,31 0,16 1,27 0,14 1,18 3000 21,60 7,60 1,75 1,31 0,16 1,27 0,14 1,18 10 11 12 13 14 15 16 17 Metionin (%) Met + Sist (%) Cu  (mg/kg) Fe  (mg/kg) Mn  (mg/kg) Zn  (mg/kg) Asam Fitat  (%) Molar rasio  AF : Zn 0,39 1,19 11,62 17,80 14,03 45,50 3,80 83 0,39 1,19 11,62 17,80 14,03 45,50 3,80 91,39
Keterangan :
- Ransum kontrol positif disusun berdasarkan rekomendasi Cobb Guide - Ransum kontrol negatif disusun berdasarkan rekomendasi BASF
* Analisis proksimat bahan pakan dilakukan di  Lab. Ilmu dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan IPB (2003).

## Hasil dan Pembahasan

## Kandungan Mineral Feses
Kadar  Zn  dalam  feses  ada  yang  diberi  rasa disuplementasi  hanya  ZnO;  kombinasi  ZnO  dan CuSO 4 ; dan fitase dan ZnO nyata (P<0,05) daripada perlakuan  lainnya.    Demikian  pula  kadar  Cu  dalam feses  terus  ada  yang  diberi  rasa  disuplementasi hanya CuSO 4 , kombinasi ZnO dan CuSO 4 ; fitase dan CuSO 4 ;  dan  fitase,  ZnO  dan  CuSO 4 lebih  tinggi (P<0,05)  dari  perlakuan  lainnya  (Tabel  4). Tingginya  ekskresi  Zn  pada  suplementasi  ZnO  dan peningkatan Cu pada suplementasi CuSO 4 disebabkan  karena  penyerapan  Zn  dalam  bentuk ZnO  menurun  dengan  meningkatnya  ketersediaan
Zn  dalam  saluran  pencernaan,  demikian  halnya  Cu dalam bentuk CuSO 4 Kedua bentuk mineral tersebut memiliki daya larut tinggi ?, penurunan ketersediaan kedua  mineral  tersebut  menggambarkan  bahwa kebutuhan  ayam  akan  mineral  Zn  dan  Cu  sudah terpenuhi  pada  tingkat suplementasi  132,70  ppm ZnO  dan  286,16  ppm CuSO 4 .    Hal  tersebut  juga menggambarkan  adanya  kemampuan  maksimum absorpsi  dinding  saluran  pencernaan  terhadap  Zn dan  Cu.    Ekskresi  Zn  dan  Cu  melalui  feses meningkat  secara  linier  sejalan  dengan  peningkatan taraf  Zn  dan  Cu  ransum  (Kim  dan  Patterson  2004). Hal ini berarti bahwa suplementasi 132,70 ppm ZnO dan 286,16 ppm CuSO 4 telah melebihi kebutuhan.
Tabel 4   Rataan kandungan mineral Zn dan Cu dalam feses ayam broiler yang dipelihara dari umur 1-42 hari
Mineral Ransum Perlakuan R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 ppm Zn 4,57 b (0,84) 4,61 b (1,32) 7,27 a (0,61) 4,42 b (0,91) 7,17 a (0,79) 3,94 b (0,17) 6,29 a (1,65) 4,28 b (0,23) 4,65 b (0,34)
Cu 1,21 b (0,10) 1,18 b (0,05) 1,36 b (0,15) 2,75 a (0,16) 2,60 a (0,36) 1,07 b (0,09) 1,13 b (0,12) 2,59 a (0,34) 2,87 a
(0,40)
Keterangan  :  Angka di dalam kurung adalah standar deviasi.  Huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan  sangat nyata (P<0,05) R1 (Kontrol positif), R2 (Kontrol negatif), R3 (R2 + 132,7 ppm ZnO), R4 (R2 + 286,16 ppm CuSO 4 ), R5 (R2 + 132,7 ppm ZnO + 286,16 ppm CuSO 4 ), R6 (R2 + fitase 1000 FTU/kg), R7 (R2 + fitase 1000 FTU/kg + 132,7 ppm  ZnO), R8 (R2 + fitase 1000 FTU/kg + 286,16 ppm CuSO 4 ), R9 (R2 + fitase 1000 FTU/kg + 132,7 ppm ZnO + 286,16 ppm CuSO 4 )
Tabel 5  Rataan kandungan mineral Zn, Cu, dan aktivitas Alkalin fosfatase dalam serum ayam broiler yang dipelihara dari umur 1-42 hari
Mineral Ransum Perlakuan R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 Zn (μg/dl) 79,39 f (0,18) 79,14 f (0,57) 47,67 h (0,31) 100,6 c (0,14) 81,5 e (0,28) 103,4 b (0,33) 65,45 g (0,26) 90,52 d
(0,30) 106,6 a (0,36) Cu (μg/dl) 91,50 g (0,09) 76,52 i (0,07) 84,51 h (0,06) 98,63 f (0,25) 113,5 e (0,08) 128,5 c (0,06) 136,5 b
(0,07) 143,5 a
(0,20) 121,5 d (0,07) Alp (U/L) 206,4 f (0,41) 204,3 g (0,28) 184,4 i (0,45) 230,1 d (0,65) 210,4 e (0,47) 240,6 c (0,23) 189,3 h (0,23) 256,7 b
(0,12) 270,2 a
(0,14)
Keterangan    :  Angka  di  dalam  kurung  adalah standar  deviasi. Huruf  yang  berbeda  pada  baris  yang sama    menunjukkan  perbedaan  nyata  (P<0,05). R1 (Kontrol  positif), R2 (Kontrol  negatif), R3 (R2  + 132,7 ppm ZnO), R4 (R2 + 286,16 ppm CuSO 4 ), R5 (R2 + 132,7 ppm ZnO + 286,16 ppm CuSO 4 ), R6 (R2  +  fitase  1000  FTU/kg), R7 (R2  +  fitase  1000  FTU/kg  +  132,7  ppm  ZnO), R8 (R2  +  fitase  1000 FTU/kg + 286,16 ppm CuSO 4 ), R9 (R2 + fitase 1000 FTU/kg + 132,7 ppm ZnO + 286,16 ppm CuSO 4 )
Tabel 6   Korelasi antara mineral dalam ransum dan mineral dalam feses, serum, dan aktivitas enzim alkalin fosfatase Korelasi
Zn  ransum  x  Cu feses
Zn  ransum  x  Zn feses
Zn  ransum  x  Zn  serum Zn  ransum  x  Enzim alkalin fosfatase Cu  ransum  x  Cu  feses Cu ransum  x Cu serum 0,12 0,69 -0,43 -0,27 0,95 0,36
Ekskresi  Cu  meningkat  pada  suplementasi kombinasi fitase,  ZnO,  dan  CuSO 4.. Hal  ini menggambarkan  adanya  interaksi  antagonis  antara Zn  dan  Cu  di  dalam  saluran  pencernaan  akibat suplementasi  fitase.    Fitase  mampu  melepaskan ikatan  fitat  dengan  mineral,  energi,  dan  asam-asam amino.  Mineral Zn dan Cu diserap melalui dinding usus atas bantuan ligand chelate.  Zat pengikat yang membantu  proses  absorpsi  adalah  asam  amino (Groff dan Gropper 2000).
Persaingan  antara  Zn  dan  Cu  untuk  berikatan dengan asam amino terjadi di dalam media intestinal metallothionein. Cu  selalu  kalah  bersaing  untuk berikatan  dengan  protein  sehingga  ekskresi  Cu meningkat  (Berdanier  1998).    Hal  ini  memberi gambaran  bahwa  suplementasi  fitase  1000  FTU/kg
ke  dalam  ransum  yang  mengandung    ZnO  dan CuSO 4 meningkatkan absorpsi Zn.
Kandungan Zn,  Cu,  dan  Aktivitas  Alkalin Fosfatase  dalam Serum
Suplementasi  kombinasi  fitase,  ZnO,  dan CuSO 4 nyata meningkatkan (P<0,05) kandungan Zn dan  aktivitas alkalin  fosfatase di  dalam  serum. Suplementasi  kombinasi  fitase  dan  CuSO 4 nyata meningkatkan (P<0,05) kandungan Cu dalam serum (Tabel  5)Peningkatan  kandungan  Zn  serum  dan aktivitas alkalin  fosfatase akibat  suplementasi kombinasi  fitase,  ZnO,  dan  CuSO 4 memberi gambaran  adanya  keserasian  kerja  antara  fitase  dan Zn.  Fitase meningkatkan absorpsi Zn, kehadiran Zn dan  Cu  asal  ransum  tidak  menghambat  aktivitas fitase.    Fitase  memberikan  aksi  pada  pelepasan ikatan myoinositol 1,2,3,4,5,6 - hexakis  dihydrogen fosfate sehingga  ikatan  fitat  dengan  fosfor,  mineral bervalensi  dua,  dan  asam-asam  amino  terlepas (Bagainama  hubungan  P  dengan  Zn  ?).    Zn  dan  Cu bersaing  untuk  menempati  posisi  pada  protein,  Zn memiliki  afinitas  lebih  tinggi dibandingkan dengan Cu  sehingga    lebih  banyak  Zn  yang  bisa  diserap. Hal  ini  menggambarkan  bahwa  terjadi  interaksi antagonis  antara  Zn  dan  Cu  untuk  diabsorpsi  akibat suplementasi  fitase . Peningkatan  kandungan  Zn serum meningkatkan aktivitas Alkalin fosfatase. Hal ini menggambarkan bahwa aktivitas alkalin fosfatase dipengaruhi kandungan Zn di dalam serum. Penelitian  terdahulu  menyatakan  bahwa alkalin fosfatase membutuhkan  Zn  untuk  strukturnya  serta
memerlukan  Zn 2+ dan  Mg 2+ untuk  aktivitasnya (Metzler  1977).    Hal  ini  memberi  gambaran  bahwa suplementasi  kombinasi  fitase  1000  FTU/kg,  ZnO 132,70 ppm, dan CuSO 4 286,16 ppm  meningkatkan kandungan  Zn  dalam  serum  yang  diikuti  dengan peningkatan aktivitas alkalin fosfatase.
Korelasi  antara  Mineral  Ransum  dan  Mineral Feses, Serum, dan Aktivitas Alkalin Fosfatase
Dugaan  korelasi  antara  mineral  dalam ransum,  feses,  serum,  dan  aktivitas  enzim alkalin fosfatase disajikan  pada  Tabel  6.    Uji  korelasi membuktikan  bahwa  suplementasi  hanya  ZnO menurunkan  ketersediaan  Zn  dan  aktivitas alkalin fosfatase.  Suplementasi hanya CuSO 4 meningkatkan ekskresi feses.  Hal ini memberi gambaran bahwa Zn atau Cu tidak efektif diberikan masing-masing tanpa kombinasi.

## Kesimpulan
Suplementasi  enzim  fitase  sebanyak  1000 FTU/kg, ZnO 132,70 ppm, dan CuSO4 286,16 ppm ke  dalam  ransum  menghasilkan interaksi  sinergis. Pada  perlakuan  ini  terjadi  peningkatan  absorbsi  Zn. Sebagian besar Zn yang diabsorbsi digunakan untuk meningkatkan  aktivitas alkalin  fosfatase. Uji korelasi  membuktikan  bahwa  suplementasi  hanya ZnO  menurunkan  ketersediaan  Zn  dan  aktivitas alkalin  fosfatase.    Suplementasi  hanya  CuSO 4 meningkatkan  ekskresi  feses.    Hal  ini  memberi gambaran bahwa Zn atau Cu tidak efektif diberikan masing-masing tanpa kombinasi.

## Daftar Pustaka
BASF  and  DSM.  2002. The  Natural  Key  to  Higher Yields.  BASF, Lugwigshafen, Germany.
Berdanier  CD.  1998. Advanced  Nutrition  Microelement.
Boca  Raton,  Boston,  London,  New  York, Washington DC : CRC Press:143-150 ; 194-207. Biehl  RR,  Baker  DH.  1997.  Microbial  phytase  improves amino  acid  utilization  in  young  chicks  fed  diets based  on  soybean  meal  but  not  diets  based  on peanut meal. Poult  Sci 76:355-360.
Groff  JL,  Gropper  SS.  2000. Advanced  Nutrition  and Human  Metabolism.  Ed ke-3.  U.S.A  :  Wadsworth Thomson Learning.
Harmon  RJ,  Torre  PM.  1997.  Economic  Implication  of Copper  and  Zinc  Proteinates  :  Role  in  Mastitis Control.  Di dalam: Lyon TP, Jacques KA, Editor. Biotechnology  in  The  Feed  Industry.    Nottingham University Pr. hlm.  419-430.
Kim  WK,  Patterson  PH.  2004.    Effects  of  dietary  zinc suplementation  on  broiler  performance    and nitrogen loss from manure. Poult Sci 83:34-38.
Kornegay  ET,  Denbow  DM,  Yi  Z,  Ravindran  V.  1998.
Response of Broiler to Graded Levels of Natuphos Phytase added to Corn-Soybean Meal- Based Diets Containing  Three  Levels  of  Non  Phytate Phosphorus. Brit J Nutr 75:839-852.
Larvor P. 1983. The Pools of Celluler Nutrients: Mineral.
Di dalam: Riss PM, editor. Dynamic Biochemistry of Animal Production. Elsevier: Amsterdam.
Metzler  DE.    1977. Biochemistry  :  The  chemical reactions of living cells. London : Academic Press, Inc.
Piliang  WG.  2000. Nutrisi  Mineral.  Edisi  ke  3.  Bogor: PAU Ilmu Hayat IPB .
Rutherfurd SM, Chung TK, Morel PCH, Moughan. 2004.
Effect  of  Microbial  Phytase  on  Ileal  Digestibility of  Phytate  Phosphorus,  Total  Phosphorus,  and Amino  Acids  in  a  Low-Phosphorus  Diet  for Broiler. Brit. Poult. Sci 43 (4): 598-606.
Stauffer.  1989. Metode  pengukuran  aktivitas  alkalin fosfatase.    Petunjuk  laboratorium.  Laboratorium klinik Prodia. Jakarta.
Steel RDG, Torrie JH. 1980. Principles and Procedures of Statistics, A Biometrical Approach. International Student Ed.  McGraw-Hill.  Kokusha Limited, Tokyo.
Sumiati,  Piliang  WG.  2005.    Increasing  Laying Performances  and  Egg  Vitamin  A  Content Through  Zinc  Oxide  and  Phytase  Enzyme Suplementation. Med Pet 28(3) :130-135.
Traylor SL, Cromwell GL,  Lindermann MD, Kuabe DA. 2001.  Effects of Levels of Suplemental Phytase on Ileal  Digestibility  of  Amino  Acid,  Calcium  and Phosphorus  in  Dehulled  Soybean  Meal  for Growing Pigs. J Anim Sci 79:2634-2642.