Hasil Penelitian                                                                         J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XX No. 1 Th. 2009

## PENGARUH  BERBAGAI KONDISI PREPARASI DAN PENYIMPANAN SUSU FORMULA PADA PERTUMBUHAN  SPORA Bacillus cereus DAN Clostridium perfringens
[The growth of Bacillus cereus and Clostridium perfringens spores under a variety of preparation and storage condition]
Maya Purwanti 1) , Mirnawati Sudarwanto 2) , Winiati P. Rahayu 3) , dan A. Winny Sanjaya 2)
1) Jurusan Penyuluhan Peternakan, Sekolah Tinggi Penyuluhan Pertanian Bogor, 2) Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, dan 3) Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
Diterima 23 Juli 2008 / Disetujui  14 Juni 2009

## ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the ability of Bacillus cereus and Clostridium perfringens spores to survived in different preparation temperature  (25,  35,  and  70  C  for  B.  cereus  and  25,  45,  70ºC  for  C.  perfringens)  and  modified  storage  condition  (with  50  and  75%  humidity; opened,  closed  and  opened  twice  a  day  during  period  of  observation)  of  powdered  milk    formula.    The  spores  of  B.  cereus  ATCC  13061  and C. perfringens CP-1 artificially  contaminated to the milk formula. Results showed that B. cereus and C. perfringens spores were germinated and growth in reconstituted milk formula.  Bacteria population increased  ≥1 log within 3 hours at  room  temperature (28-29ºC).  The spores of both bacteria survived from dry condition of powdered milk formula, like when aw of the formulas increased cause of storage condition.
Key words :  Bacillus cereus, Clostridium perfingens, powdered milk formula, preparation temperature, storage condition.

## PENDAHULUAN
Air  susu  ibu  adalah  makanan  yang  terbaik  bagi bayi,  namun  karena  satu  dan  lain  hal,  ibu  tidak  mampu menyusui  bayinya,  sehingga  membutuhkan  bantuan  susu formula.  Susu  formula  yang  diperdagangkan  di  Indonesia umumnya dalam bentuk formula bubuk.
Bentuk bubuk tidak memerlukan cara penyimpanan yang  khusus,  setelah  kemasan  dibuka,  susu  formula  cukup disimpan  pada  tempat  yang  kering  dan  tertutup  rapat. Pelarutannya  kembali,  cukup  ditambahkan  air  matang dengan suhu minimal 70  C, maka susu formula sudah bisa dikonsumsi  (Codex  Alimentarius  Commission,  2007). Anjuran  tersebut  tidak  sepenuhnya  dipatuhi  oleh  para  ibu dalam  melarutkan  susu  formula.  Perlakuan  yang  tidak semestinya  pada  penyimpanan  dan  preparasi,  menjadikan susu  formula  sebagai  pangan  yang  berisiko  tinggi  karena kepekaan bayi terhadap bakteri enterik patogen dan respon yang berlebihan terhadap toksin.
Ada sejumlah penyakit yang dikaitkan dengan susu formula  bubuk  sebagai  wahana  infeksinya  (Louie,  1993; Gericke dan Thurn, 1994). Sebuah kejadian luar biasa akibat pangan  yang  diderita  35  neonatus  di  Chile,  diduga berhubungan dengan B. cereus dalam  susu  bubuk dengan level 50-200 spora/g (Cohen et al ., 1984).
Kepekaan  bayi  terhadap  jumlah  kecil  mikroba patogen  kemungkinan  berhubungan  dengan  sistem  imun yang belum berkembang (Anderton, 1993).   Keberadaan B. cereus enterogenik dalam makanan bayi yang didistribusikan
di  17  negara  telah  dilaporkan  oleh  Becker et  al .  (1994) dengan level antara 0.3-600 sel/g.  Efuntoye dan Adetosoye (2004)  melaporkan  bahwa  3%  kasus  diare  sporadik  pada balita Nigeria disebabkan oleh Clostridium spp., dimana 72% diantaranya adalah C. perfringens tipe A. B. cereus dan C. perfringens adalah bakteri Gram positif  bentuk  batang,  termasuk  kelompok  pembentuk endospora  yang  menjadi  penyebab  terjadinya  keracunan pangan  (Todar,  2005).    Penyakit  terjadi  seiring  dengan termakannya  sejumlah  besar  organisme  (>10 6 -10 7 sel) tumbuh di dalam usus halus, menghasilkan enterotoksin dan menyebabkan  diare  (Labbe,  1989;  Brynestad  dan  Granum, 2002).
B.  cereus adalah  bakteri  aerob,  mampu  tumbuh pada suhu 4-50  C, dengan suhu optimum 30-40  C (ICMSF, 1996).  Waktu generasi pada suhu 30  C adalah 26-57 menit, dan  pada  suhu  35  C  adalah  18-27  menit  (Kramer  dan Gilbert,  1989). C.  perfringens adalah  bakteri  anaerob, dengan  suhu  untuk  pertumbuhan  sel  vegetatif  serta germinasi spora dan tumbuh kembali bervariasi antara     10- 52  C,  dengan  suhu  optimum  sekitar  45  C.  Pada  kondisi optimum,  multiplikasi  sel  dapat  sangat  cepat,  kira-kira  9 menit (Ray, 2001).
Sampai  sejauh  ini,  informasi  tentang  keberadaan B. cereus dan C. perfringens pada kasus keracunan pangan di Indonesia masih jarang dilaporkan.  Tujuan dilakukannya kajian  ini  adalah  untuk  melihat:  (1)  pengaruh  suhu  awal preparasi  dan  waktu  pengamatan  terhadap  kemampuan bertahan dan germinasi spora B. cereus dan C. perfringens
dalam susu formula, dan (2) pengaruh kelembaban, cara dan waktu penyimpanan  terhadap  kemampuan bertahan spora B. cereus dan C. perfringens dalam susu formula bubuk.

## METODOLOGI
Produksi  spora B.  cereus dan C.  perfringens (Rhodehamel dan Harmon, 1998a+b) Sel vegetatif B. cereus (ATCC 13061, koleksi Balai Besar Penelitian Veteriner) diinokulasi ke dalam brain hearth infusion (Difco)  medium  dan  diinkubasi  pada  suhu  30  C selama  24  jam.    Sebanyak  0.1  ml  suspensi  kemudian digoreskan  diatas  nutrient  agar  yang  mengandung MnSO 4 .7H 2 O  (50  µg/ml).  Spora  dipanen  setelah  diinkubasi pada  suhu  30  C  selama  72-76  jam  dengan  cara menggenangi  permukaan  setiap  cawan  dengan  5  ml  air deion steril,  permukaan media digosok dengan batang kaca steril  untuk  melepaskan  spora  dan  sel  yang  tidak bersporulasi.    Suspensi  kemudian  disaring  dengan glass wool dan disentrifus (2600 x g , 20 menit, 21  C).  Pencucian dilakukan  berulang  sampai  semua  spora  terlepas  dari  sel vegetatifnya  (Rhodehamel  dan  Harmon,  1998a).    Suspensi (50-100  ml)  disimpan  pada  suhu  4  C  sampai  digunakan untuk kajian pengaruh suhu preparasi susu formula.
Isolat vegetatif C. perfringens (CP 1, koleksi Dept. Mikrobiologi FKH-UGM) sebanyak 6 ml diinokulasi ke dalam fluid  thyoglicollate  medium (Oxoid),  diinkubasi  pada  suhu 37  C  selama  24  jam  secara  anaerob.    Kemudian  0.2  ml kultur diinokulasi ke dalam 10 ml Duncan-Strong sporulation medium (Oxoid,  1998),  diinkubasi  pada  suhu  37  C  selama 24  jam  (anaerob).  Adanya  spora  dalam  kultur  dikonfirmasi dengan  mikroskop  (Rhodehamel  dan  Harmon,  1998b). Suspensi disimpan pada suhu 4  C sampai digunakan untuk kajian pengaruh suhu preparasi susu formula (SF).
Untuk  keperluan  kajian  penyimpanan  dalam  SF bubuk,  spora B.  cereus dan C.  perfringens masing-masing disimpan  dalam  vial  10  ml,  dibekukan  pada  suhu  -82  C selama  24  jam,  kemudian  dikering  bekukan  dengan menggunakan freezer  dryer (Kinetics).  Setelah  kering, disimpan pada suhu -82  C sampai digunakan.

## Kajian pengaruh suhu preparasi susu formula
Sebanyak  masing-masing  20  gram  susu  formula (SF)  dilarutkan  dengan  180  ml  aquadestilata  steril  dengan suhu pelarutan 70, 35, dan 25  C untuk susu formula A (SF- A),  serta  70,  45,  dan  25  C  untuk  susu  formula  B  (SF-B). Perlakuan ketiga suhu tersebut dipilih dengan pertimbangan suhu  70  C  adalah  suhu  pelarutan  minimal  yang  disarankan oleh EFSA (2004), suhu 35 dan 45  C adalah rata-rata suhu optimal  untuk  pertumbuhan B.  cereus dan C.  perfringens (Jay,  2000),  dan  suhu  25  C  adalah  rata-rata  suhu  ruang  di negara tropis.
Ke  dalam  larutan  SF-A  ditambahkan  rata-rata  10 3 spora  bakteri B.  cereus /ml  dan    larutan  SF-B  ditambahkan
rata-rata 10 3 spora C. perfringens /ml.  Dibuat pula larutan SF tanpa dikontaminasi, sebagai kontrol.  Larutan SF-A dan SF- B  diberi heat  shock dalam  penangas  air  (70  C,  15  menit) dengan  tujuan  untuk  merangsang  spora  melakukan germinasi dan mematikan sel vegetatif yang ada di dalam SF bubuk,  kemudian  dibuat  pengenceran  seri.    Pemeriksaan mikrobiologik dilakukan dengan menginokulasi 0.1 ml larutan SF-A  dari  pengenceran  seri  pada  agar mannitol  yolk polymyxin (Oxoid)  dan  diinkubasi  pada  suhu  35  C  selama 20-24  jam.  Koloni  dengan  zona  presipitasi  warna  eosin merah  jambu-lavender  dihitung.    Sebanyak  0.1  ml  larutan SF-B  dari  pengenceran  seri  diinokulasi  pada  agar tryptose sulfite  cycloserine (Oxoid)  yang  diberi  emulsi  kuning  telur (50%),  diinkubasi  secara  anaerob  pada  suhu  35  C  selama 20-24 jam. Dihitung lempeng yang mengandung koloni hitam dengan zona presipitasi.
Larutan  SF-A  dan  SF-B  selanjutnya  disimpan dalam  suhu  ruangan.    Pemeriksaan  dilakukan  setiap  1  jam sekali selama 4 jam berturut-turut.  Waktu 4 jam adalah hang time yang  direkomendasikan  oleh  EFSA  (2004)  untuk  susu formula.    Setiap  perlakuan  diulang  3  kali,  dan  dianalisis secara duplo.

## Kajian pengaruh penyimpanan susu formula bubuk
Sebanyak  rata-rata  10 3 spora  kering  beku B. cereus dan  rata-rata  10 4 spora  kering  beku C.  perfringens ditambahkan  masing-masing  ke  dalam  700  g  SF  bubuk, selanjutnya  diaduk  dengan  spatula  steril  sampai  spora  dan SF tercampur rata.  SF yang sudah dikontaminasi, disimpan dalam  stoples  dengan  16  cm.    Untuk  kontrol,  100  g  SF yang  sudah  dikontaminasi  dikemas  dalam  kantong  plastik dan  ditutup  rapat.  SF  bubuk  selanjutnya  mendapat perlakuan: (1) wadah dibuka, (2) wadah dibuka 2 kali sehari selama 2 menit, dan (3) wadah tertutup (kontrol).  Seluruh SF kemudian  disimpan  dalam  inkubator  dengan  suhu  ±27  C dengan tingkat kelembaban nisbi <50% (A) dan >70% (B).
Kelembaban  <50%  merupakan  gambaran  kondisi ruangan  yang  kering,  dan  kelembaban  >70%  merupakan gambaran kondisi ruangan yang lembab.  Untuk menciptakan ruangan  dengan  kelembaban  <50%  digunakan  pendingin ruangan  yang  dihidupkan  selama  24  jam,  dan  untuk menciptakan  ruangan  berkelembaban  >70%  digunakan  air yang diletakkan di dasar inkubator.  Setiap hari dicatat suhu dan kelembaban yang terbentuk dalam inkubator, dilakukan 2 kali yaitu pagi dan sore.  Setiap perlakuan diulang 3 kali, dan dianalisis secara duplo.
Pemeriksaan  mikrobiologik  dilakukan  setiap  hari sampai hari ke-5 dengan cara dan media yang sama seperti pada kajian preparasi.  Lama penyimpanan ditentukan 5 hari sesuai  dengan  masa  konsumsi  susu  formula  dengan  berat 400 g yang sudah dibuka.
Sebanyak  masing-masing  75  g  SF  bubuk  dari masing-masing  perlakuan  diukur  nilai  aktivitas  air  ( a w ) dengan  menggunakan a w - meter.  Dicatat  skala a w dan suhunya.  Nilai a w yang  didapat  dikonversi  ke  nilai a w pada suhu 25  C.

## Analisis statistik
Untuk  kajian  preparasi  SF,  data  yang  diperoleh dianalisis  dengan  rancangan  acak  lengkap  faktorial  dengan dua faktor. Faktor pertama adalah suhu awal yang digunakan dalam  preparasi  SF  dan  faktor  kedua  adalah  waktu pengamatan.    Untuk  kajian  penyimpanan  SF  bubuk,  data yang  diperoleh  dianalisis  dengan  rancangan  acak  lengkap faktorial  dengan  tiga  faktor.    Faktor  pertama  adalah  cara penyimpanan,  faktor  kedua  adalah  kelembaban  dan  faktor ketiga adalah waktu penyimpanan.
Untuk  melihat  kecepatan  pertambahan  jumlah bakteri  dalam  preparasi  SF,  dihitung  waktu  generasinya. Data  dan  tampilan  grafik  diolah  dengan  menggunakan Microsoft Office Excel 2007 dan SPSS 15.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh  suhu  awal  preparasi  dan  lama penyimpanan pada pertumbuhan spora B. cereus dan C. perfringens dalam larutan susu formula Pelarutan  susu  formula  dengan  menggunakan suhu  70  C,  jika  disimpan  pada  suhu  ruang  (27-30  C)  dan wadah tertutup akan menjadi dingin (28-29  C) dalam waktu 2 jam.  Jika pelarutan menggunakan suhu yang lebih rendah, kesesuaian  suhu  susu  formula  dengan  suhu  ruang  akan dicapai dalam waktu yang lebih cepat (Gambar 1).
Gambar  1  Perubahan suhu larutan susu formula yang  disimpan selama 4 jam pada suhu ruangan
Dari  hasil  analisis  diketahui  bahwa  suhu  awal preparasi  dan  waktu  penyimpanan  di  suhu  ruang berpengaruh sangat nyata ( p <0.01) pada pertumbuhan spora B.  cereus, sedangkan  pada pertumbuhan  spora C. perfringens yang  berpengaruh  nyata  ( p <0.05)  adalah  waktu penyimpanan di suhu ruang.   Suhu awal preparasi ternyata berhubungan sangat lemah terhadap pertumbuhan spora B. cereus (r=0.12, p>0.01) dan C. perfringens (r=0.07, p>0.01), sedangkan  lama  penyimpanan  di  suhu  ruang  ternyata berhubungan  sangat  kuat  pada  pertumbuhan  spora B. cereus (r=0.74, p<0.01) dan C. perfringens (r=0.50, p<0.01) di  dalam  larutan  susu  formula.    Penelitian  Rowan et  al .,
(1997)  pada  100  merek  susu  bayi  yang  dipreparasi  pada berbagai  suhu  juga  menunjukkan  hasil  yang  serupa. Gambaran pertumbuhan spora B. cereus dan C. perfringens masing-masing tersaji pada Gambar 2 dan 3.
Gambar  2  Pertumbuhan spora dan sel vegetatif B. cereus pada susu formula yang dipreparasi pada berbagai suhu yang disimpan selama 4 jam pada suhu  ruang
Gambar  3  Pertumbuhan  spora  dan  sel  vegetative C.perfringens pada  susu  formula  yang  dipreparasi  pada  berbagai suhu yang disimpan selama 4 jam pada suhu ruang
Pada  satu  jam  pertama,  pertumbuhan  spora B. cereus pada suhu 25  C dan 70  C  serta spora C. perfringens pada  suhu  25  C  cenderung  menurun  (Gambar  2  dan  3), tetapi  tidak  ada  perbedaan  diantara  perlakuan  ( p >0.05). Pada  kondisi  ini,  bakteri  melakukan  penyesuaian  dengan kondisi lingkungan, dan selanjutnya melakukan pertumbuhan cepat.  Dari  ke-3  suhu  preparasi  pada  Gambar  2,  ternyata suhu awal 35  C merupakan suhu yang lebih disenangi oleh B.  cereus dibandingkan  suhu  25  C  maupun  70  C.    Pada suhu  tersebut  spora  tumbuh  lebih  cepat  karena  tidak  perlu terlalu  lama  beradaptasi  untuk  menyesuaikan  diri. Sedangkan  spora C.  perfringens nampak  lebih  cepat melakukan  germinasi  pada  susu  formula  yang  dipreparasi pada suhu 70  C. Suhu tersebut merupakan heat shock untuk
Keterangan:  = 25  C  = 35  C  = 70  C
C. perfringens Keterangan:
 = 25  C  = 35  C  = 70  C Keterangan:  = suhu ruang  = 25  C  = 35  C  = 45  C  = 70  C
Hasil Penelitian                                                                         J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XX No. 1 Th. 2009
spora C.  perfringens ,  sehingga  spora  terangsang  untuk berubah  menjadi  sel  vegetatif  dan  melakukan  multiplikasi. Keadaan  tersebut  tercermin  pada  rata-rata  waktu  generasi yang lebih singkat yaitu 11 menit (Tabel 1).
Tabel 1 Rata-rata waktu generasi B. cereus dan C. perfringens dalam susu formula yang  dipreparasi   dalam berbagai suhu
Suhu Preparasi (  C) B. cereus (menit) C. prefringens (menit) 25 42 56 35 24 - 47 - 21 70 37 11
Berdasarkan  analisis multiple  comparison  Games- Howell pada  beda  rata-rata  jumlah B.  cereus dalam  susu formula  terlarut  yang  disimpan  dalam  suhu  ruang,  ternyata perbedaan  peningkatan  jumlah  bakteri  dengan  sangat signifikan  ( p <0.01)  terjadi  setelah  jam  ketiga  penyimpanan, tetapi  tidak  untuk C.  perfringens ( p >0.01).    Pertumbuhan spora B.  cereus sampai  dengan  1  log  terjadi  setelah disimpan selama 3 jam yaitu dari jumlah rata-rata awal 2.7 x 10 3 CFU/ml  (suhu  preparasi  35  C)  dan  2.5  x  10 3 CFU/ml (suhu preparasi 70  C) menjadi masing-masing adalah 5.4 x 10 4 CFU/ml dan 1.3 x 10 4 CFU/ml (Gambar 2).  Becker et al., (1994)  merekonstitusi  susu  formula  dan  menambahkan kurang  lebih  1.0  x  10 2 CFU/ml B.  cereus, diinkubasi  pada suhu 27  C, level 10 5 CFU/ml dicapai setelah 7-9 jam.  Suhu awal  preparasi  ternyata  berpengaruh  pada  kecepatan multiplikasi,  dimana  pada  suhu  42  C  kecepatan  multiplikasi bervariasi antara 11-34 menit (Borge et al ., 2001).  Dufrene et  al., (1995)  melihat  bahwa  preinkubasi  pada  suhu  37  C akan meningkatkan durasi lag phase secara drastis.
Dari  Gambar  3  terlihat  bahwa  pertumbuhan  spora C. perfringens sampai 1 log terjadi setelah 2 jam untuk susu yang  dipreparasi  pada  suhu  45  dan  70  C.  Susu  yang mengandung spora C. perfringens yang dilarutkan pada suhu 25  dan  70  C  mulai  menurun  pertumbuhannya  setelah  jam ke-3,  kecuali  untuk  yang  dipreparasi  pada  suhu  45  C. Pelarutan  dengan  menggunakan  suhu  25  C  dalam  2  jam mampu meningkatkan jumlah   spora C. perfringens dari rata- rata 1.8 x 10 2 CFU/ml menjadi 1.9 x 10 3 CFU/ml sedangkan suhu  70  C  mampu  meningkatkan  dari  rata-rata  3.0  x  10 2 CFU/ml menjadi   4.5 x 10 3 CFU/ml dan menurun setelah jam ke-3.  Penurunan  pada  pola  pertumbuhan  tersebut  menurut Smith et  al., (2004)  antara  lain  dipengaruhi  oleh  oksigen lingkungan.  Pada  suhu  45  C  dalam  3  jam  mampu meningkatkan dari rata-rata 1.1 x 10 2 CFU/ml menjadi 6.9 x 10 3 CFU/ml,  dan  masih  mampu  bertahan  untuk  satu  jam berikutnya.  Pada  suhu  37-45  C  waktu  generasi  untuk C.perfringens dapat terjadi dalam 7.4 menit (Willardsen et al ., 1975).
Dengan  demikian  preparasi  susu  dengan  air matang yang didinginkan sampai suhu 25  C tetap aman dari
segi  risiko B.  cereus dan C.  perfringens ,  asal  air  yang digunakan dididihkan dengan benar yaitu selama minimal 2 menit, melakukan cuci tangan dengan sabun dan air bersih sebelum  preparasi,  dan  mencuci  tempat  minum  dengan sabun  dan  air  bersih  serta  merebusnya  dalam  air  sampai mendidih  (FAO/WHO,  2006).  Setelah  dipreparasi,  susu sebaiknya  tidak  disimpan  terlalu  lama  pada  suhu  ruang karena  akan  menggandakan  jumlah  mikroba  didalamnya. Untuk  meminimalkan  risiko,  disarankan  untuk  sesegera mungkin  mengkonsumsi  susu  formula  yang  telah  dilarutkan dan memperpendek waktu konsumsi ( feeding time ) menjadi hanya  dua  jam,  dan  susu  yang  tidak  habis  diminum  harus dibuang  (Codex  Alimentarius  Commision,  2007). Feeding time yang  disarankan  Codex  Alimentarius  Commision tersebut  dilandasi  oleh  penelitian  yang  dilakukan  pada E. sakazakii dan Salmonella pada  susu  formula  bubuk (FAO/WHO, 2006).
Pengaruh kelembaban udara
dan lama penyimpanan  pada  spora B.  cereus dan C. perfringens dalam susu formula bubuk Kelembaban  udara,  baik  tinggi  (>70%)  maupun rendah  (<50%)  secara  nyata  (p<0.05)  mempengaruhi a w susu formula bubuk yang disimpan selama lima hari (Gambar 4 dan 5).  Susu formula bubuk yang disimpan dalam wadah terbuka,  akan  menyerap  lebih  banyak  uap  air  dari lingkungan,  dibandingkan  dengan  yang  hanya  dibuka  dua kali  dalam  sehari  (Gambar  6),  sehingga  bubuknya  terlihat menggumpal.  Keadaan  ini  memperlihatkan  bahwa  setelah kemasan susu formula dibuka, maka kemasan harus ditutup dengan rapat, agar kekeringan produk tetap terjaga.
Spora B. cereus dapat bertahan pada susu formula bubuk yang memiliki a w 0.44-0.60  (Gambar 4) dan spora C. perfringens pada a w 0.44-0.74 (Gambar 5).  Kedaan ini mirip dengan E.  sakazakii yang  diinokulasikan  ke  dalam  susu formula  berbahan  dasar  susu  dan  tepung  kedelai,  ternyata mampu  bertahan  pada  rentang a w 0.43-0.86  (Gurtier  dan Beuchat, 2007).
Berdasarkan  hasil  analisis multiple  comparison Games-Howell pada  susu  formula  yang  dikontaminasi dengan B.  cereus ,  beda  rata-rata  jumlah B.  cereus secara nyata  ( p <0.05)  terjadi  setelah  dua  hari  penyimpanan (Gambar  7  dan  8).  Suhu  udara  lingkungan  (25-30  C) nampaknya  memegang  peranan  yang  cukup  penting  dalam germinasi  spora B.  cereus ,  ini  terlihat  dari  bertambahnya bakteri pada susu formula yang disimpan dalam tempat yang tertutup  dan  yang  dibuka  2  kali  sehari  walaupun  nilai a w cenderung tidak berubah dari hari ke hari (Gambar 4 dan 5). B. cereus mulai menurun jumlahnya pada susu formula yang disimpan  dalam  tempat  tertutup  maupun  yang  terbuka (disimpan  dalam  tingkat  kelembaban  >70%)  dan  memiliki nilai a w minimal 0.5  sejak  hari  ke-4.  Jaquette  dan  Beuchat (1998)  melihat  bahwa  kematian  spora B.  cereus yang diinokulasikan  ke  dalam  bubur  bayi  beras  cereal  yang disimpan selama 48 minggu dan disimpan pada suhu 45  C, dipertinggi oleh nilai a w 0.78.
Gambar 4 Perubahan nilai a w susu formula pada berbagai cara penyimpanan di ruang berkelembaban <50% selama 5 hari
Gambar 5 Perubahan nilai a w susu formula pada berbagai cara penyimpanan di ruang berkelembaban >70% selama 5 hari
Gambar 6 Perubahan partikel susu formula bubuk setelah 5 hari penyimpanan
Keterangan:
 = wadah terbuka
 = wadah dibuka 2x sehari
 = wadah tertutup Keterangan:  = wadah terbuka  = wadah dibuka 2x sehari
 = wadah tertutup 1 2 Keterangan: A. Susu formula yang disimpan dalam kelembaban <50%
B. Susu formula yang disimpan dalam kelembaban >70%
1. Susu formula dikontaminasi dengan perlakuan dibuka 2 kali sehari
2. Susu formula dikontaminasi dengan perlakuan terbuka
1 2 A B
Hasil Penelitian                                                                         J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XX No. 1 Th. 2009
Gambar  7  Pertumbuhan spora dan sel vegetatif B. cereus dalam susu formula bubuk yang ditempatkan dalam berbagai tipe wadah dan disimpan pada ruang berkelembaban <50% selama 5 hari
Gambar   8  Pertumbuhan  spora  dan  sel  vegetatif B.  cereus dalam  susu  formula  bubuk  yang  ditempatkan  dalam  berbagai  tipe  wadah  dan disimpan pada ruang berkelembaban >70% selama 5 hari
Kemampuan germinasi spora C. perfringens dalam 24  jam  pertama  mencapai  2  log  untuk  perlakuan  wadah tertutup  dan  terbuka,  yaitu  dari  rata-rata  8.1  x  10 2 CFU/g menjadi 2.1 x 10 4 CFU/g dan dari rata-rata 3.5 x 10 2 CFU/g menjadi 1.3 x 10 4 CFU/g, sedangkan pada yang dibuka 2 kali sehari  hanya  mencapai  1  log  yaitu  dari  rata-rata  8.3  x  10 2 CFU/g  menjadi  9.5  x  10 3 CFU/g  (Gambar  9  dan  10). Kalinowski et  al. (2003)  melihat  spora C.  perfringens yang diinokulasikan pada daging dada kalkun yang disimpan pada suhu  26.7  dan  32.2  C,  dalam  6  jam  akan  meningkat jumlahnya 1 dan 3 log CFU/g.  Juneja et al . (1994) melihat bahwa  pola  pertumbuhan C.  perfringens pada  daging  yang dimasak  akan  naik  2  log  setelah  12  jam  pada  suhu penyimpanan  28  C  pada  kondisi  aerob.  Pada  kondisi anaerob,  pada  suhu  yang  sama  kenaikkannya  dapat mencapai  4  log,  yaitu  dari  rata-rata  10 3 CFU/g  menjadi  10 7 CFU/g.  Berdasarkan  hasil  analisa multiple  comparison Games-Howell pada  beda  rata-rata  kemampuan  bertahan
spora C.  perfringens dalam  susu  formula  bubuk  secara signifikan berbeda sejak hari pertama (p<0.05).
Pada  hari  ke-2,  jumlah  spora C.  perfringens yang germinasi menurun dengan tajam pada susu yang disimpan pada  kondisi  kelembaban  lebih  rendah  (<50%),  setelah  itu pertumbuhan  meningkat  sampai  hari  ke-3  dan  menurun kembali  pada  hari  ke-4.    Penurunan  tersebut  kemungkinan karena C. perfringens semakin kontak dengan oksigen yang ada  di  udara.  Aktivitas  air  juga  sangat  mempengaruhi pertumbuhan  spora C.  perfringens ,  nilai a w 0.65  atau  lebih (p<0.05)  perlu  diwaspadai.    Decaudin  dan  Tholozan  (1995) melihat  bahwa  kondisi  dan  strain  yang  berbeda  sangat mempengaruhi  pola  pertumbuhan  dan  sporulasi C. perfringens .
Keterangan:
 = wadah terbuka
 = wadah dibuka 2x sehari  = wadah tertutup
Keterangan:
 = wadah terbuka
 = wadah dibuka 2x sehari
 = wadah tertutup
Hasil Penelitian                                                                         J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XX No. 1 Th. 2009
Gambar   9  Kemampuan bertahan spora C. perfringens dalam susu formula bubuk yang tempatkan dalam berbagai tipe wadah dan disimpan pada ruang berkelembaban <50% selama 5 hari
Gambar  10  Kemampuan bertahan spora C. perfringens dalam susu formula bubuk yang tempatkan dalam berbagai tipe wadah dan disimpan pada ruang berkelembaban >70% selama 5 hari

## KESIMPULAN DAN SARAN
Pertumbuhan  spora B.  cereus dan C.  perfringens pada  susu  formula  yang  dipreparasi  tidak  bergantung  pada suhu awal preparasi tetapi oleh lama waktu penyimpanan di suhu ruang (28-29  C).  Spora B. cereus dan C. perfringens mampu  bertahan  dalam  bubuk  susu  formula,  kemampuan tersebut  dipengaruhi  oleh  cara  penyimpanan,  dimana semakin  terbuka  bubuk  susu  formula  disimpan  semakin meningkat  potensi  spora  untuk  bertahan  dan  melakukan germinasi.
Dengan  demikian,  jika  susu  formula  sudah dilarutkan sebaiknya segera dikonsumsi, dan tidak disimpan terlalu  lama  di  suhu  ruang.  Kemasan  susu  formula  yang sudah  dibuka  sebaiknya  disimpan  serapat  mungkin,  karena setelah terbuka, kondisi lingkungan akan meningkatkan nilai a w bubuk susu, dan merangsang spora kedua bakteri untuk tumbuh dan melakukan multiplikasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Anderton A, 1993. Bacterial contaminant of enteral foods and feeding system. Clin. Nutr. 12:97-113.
Becker  H,  Schaller  G,  Wise  Von  W,  dan  Teplan  G.  1994. Bacillus  cereus in  infant  food  and  dried  milk  products. Int. J. Food Microbiol . 23(1):1-15.
Borge GIA., Skeie M, Sørhaug T, Langsrud T, dan Granum PE.  2001.  Growth  and  toxin  profiles  of Bacillus  cereus isolated  from  different  food  sources. Int.  J.  Food Microbiol . 69:237-246.
Brynestad S, dan Granum PE. 2002. Clostridium perfringens and foodborne infections. Int. J. Food. Microbiol . 74:195- 202.
Codex Alimentarius Commission. 2007. Proposed Draft Code of  Hygienic  Practice  for  Powdered  Formulae  for  Infants and Young Children at Step 3 .  CX/FH 07/39/4.
Keterangan:  = wadah terbuka
 = wadah dibuka 2x sehari
 = wadah tertutup
Keterangan:
 = wadah terbuka
 = wadah dibuka 2x sehari
 = wadah tertutup
Hasil Penelitian                                                                         J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XX No. 1 Th. 2009
Cohen  J,  Marambio  E,  Lynch  B,  dan  Moreno  AM.  1984.
Infecciön  por Bacillus  cereus en  recién  nacidos [Abstract]. Rev. Chil. de Pediatr. . 55:20-25.
Decaudin M, dan Tholozan J. 1995. A comparative study on the conditions of growth and sporulation of three strains of Clostridium  perfringens type  A. Can.  J.  Microbiol. 42:298-304.
Dufrene  J,  Bijwaard  M,  Giffel  te  M,  Beumer  R,  dan Notermans  S.1995.    Characteristics  of  some psychrotropic Bacillus  cereus isolates. Int.  J.  Food Microbiol . 27:175-183.
[EFSA]  European  Food  Safety  Authority,  2004. Microbiological  risks  in  infant  formulae  and  follow-on formulae. The EFSA Journal 113:1-35.
Efuntoye  MO,  dan  Adetosoye  AI.  2004.  Sporadic  diarrhoea due to Clostridium perfringens in children aged five year or below . Afr. J. Biotech. 3:366-369.
[FAO/WHO] Food and Agriculture Organization/World Health Organization.  2006. Enterobacter  sakazakii and Salmonella in  powdered  infant  formula:  meeting  report, Microbiological Risk Assessment Series 10 .
Gericke B, dan Thurn V.1994. Identification of infant food as a vehicle in nosocomial outbreak of Citrobacter freundii : epidemiological subtyping by allozyme whole cell protein and antibiotic resistance. J. Appl. Bacteriol . 76:553-558.
Gurtier  JB,  dan  Beuchat  LR.2007.  Survival  of Enterobacter sakazakii in  powdered  infant  formula  as  affected  by composition,  water  activity,  and  temperature .                    J. Food Prot. 70:1579-1586.
 ICMSF  International  Commision  on  Microbiological Spesification for Foods, 1996. Microorganism in Food. 5 Characteristic of Microbial Pathogens . Blackie Academic and Professional, London.
Jaquette CB, dan Beuchat LR. 1998. Survival and growth of psychotropic Bacillus  cereus in  dry  and  reconstituted infant rice cereal. J. Food Prot . 61:1629-1635.
Jay  JM.  2000. Modern  Food  Microbiology .  Ed.  ke-6.  Aspen Publishers, Inc. Gaithersburg, Maryland.
Juneja  VK,  Marmer  BS,  dan  Miller  AJ.  1994.  Growth  and sporulation potential of Clostridium perfringens in aerobic
and  vacuum-packaged  cooked  beef. J.  Food  Prot. 57:393-398.
Kramer JM, dan Gilbert RJ.1989. Bacillus cereus and Other Bacillus Spesies.  Di  dalam    M.P.  Doyle,  editor. Foodborne  Bacterial  Pathogens .  Marcel  Dekker,  Inc.
New York.
Labbe  R.  1989. Clostridium  perfringens .  Di  dalam  M.P. Doyle,  editor. Foodborne  Bacterial  Pathogens .    Marcel Decker, Inc., New York.
Louie  KK.  1993. Salmonella serotype  Tennessee  in powdered  milk  product  and  infant  formula-Canada  and United States. J. Am. Med. Asoc. 270:432.
Oxoid 1998. The Oxoid Manual . E.Y. Bridson, editor. Ed. ke- 8. Oxoid Limited, Hampshire.
Ray  B.  2001. Fundamental  Food  Microbiology .    Ed.  ke-2.
CRC Press, Boca Raton.
Rhodehamel EJ., dan SM. Harmon, 1998a. Bacillus cereus . Di dalam Bacteriological Analytical Manual. Ed. ke-8 rev. Food and Drug Administration, Washington.
Rhodehamel  EJ,  dan  Harmon  SM.1998b. Clostridium perfringens .  Di  dalam Bacteriological  Analytical  Manual. Ed.  ke-8  rev.    Food  and  Drug  Administration, Washington.
Rowan  NJ,  Anderson  JG,  dan  Anderton  AA.  1997. Bacteriological  quality  of  infant  milk  formulae  examined under a variety of preparation and storage conditions. J. Food Prot. 60:1089-1094.
Smith  S,  Juneja  V,  dan  Schaffner  DW.  2004.  Influence  of several  methodological  factors  on  the  growth  of Clostridium perfringens in cooling rate challenge studies.
J. Food Prot. 67:1128-1132.
Todar K.2005. The Genus Bacillus . Di dalam Todar’s Online Textbook  of  Bacteriology .  University  of  Wisconsin- Madison[terhubung  berkala],  htpp://www.textbookof bacteriology.net [4 November 2006].
Willardsen  RR,  Busta  FF,  dan  Allen  CE.  1975.  Growth  of Clostridium perfringens in three different beef media and fluid thyoglycollate medium at static and constanly rising temperatures. J.Food Prot . 42:144-148.