## Pengaruh Pemberian Imunisasi Intranasal Epitope Protein RrgB 255-270 Streptococcus pneumoniae Terhadap Kadar IL-4
Danang Tejamukti Widiatmaja 1 , Diana Chusna Mufida 1* , Zahrah Febianti 1
1 Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember, Kabupaten Jember, Jawa Timur, Indonesia E-mail : chusna.fk@unej.ac.id

## Abstrak
Streptococcus  pneumoniae atau  pneumokokus  merupakan  penyebab  penyakit community  acquired  pneumoniae (CAP). Penularan pneumokokus dapat dicegah oleh vaksin, seperti PPV dan PCV. Vaksin tersebut memiliki beberapa kelemahan  seperti  terbatas  pada  strain  tertentu  dan  pemberian  yang  masih  bersifat  invasif.  Pada  penelitian  ini dilakukan pengembangan vaksin dari epitope pneumokokus yang diberikan secara intranasal. Salah satu epitope yang dapat digunakan sebagai kandidat vaksin adalah epitope dari protein RrgB penyusun pili, seperti epitope protein RrgB 255-270 dari bakteri Streptococcus pneumoniae yang memiliki komponen antigenik tinggi. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pemberian imunisasi intranasal epitope protein RrgB 255-270 Streptococcus pneumoniae terhadap kadar IL-4. Kadar IL-4 diukur dengan metode ELISA dari bilasan hidung tikus wistar yang diimunisasi dengan epitope  protein  RrgB  255-270 S.  pneumoniae secara  intranasal.  Bilasan  hidung  yang  didapat  akan  diproses menggunakan metode ELISA untuk menghitung kadar IL-4. Nilai rata-rata kadar IL-4 pada K1 adalah 28,852± 18 ng/L, rata-rata kadar IL-4 pada K2 adalah 20,630 ± 9 ng/L dan rata-rata pada K3 adalah 18,519 ± 6 ng/L. Hasil uji ANOVA Welch menunjukkan nilai p sebesar 0,299. Dapat disimpulkan bahwa imunisasi intranasal epitope protein RrgB 255- 270 S. pneumoniae memberikan perbedaan yang tidak signifikan (dengan p > 0,05).
Kata kunci: Epitope, Pili, S. pneumoniae, IL-4

## Abstract
Effect  of  Intranasal  Immunization  Epitope  Protein  RrgB  255-270  Streptococcus  pneumoniae  to  IL-4  Level. Streptococcus pneumoniae or pneumococcus is the main cause of community acquired pneumoniae (CAP). Infection of  pneumococcal  can  be  prevented  by  vaccines,  like  PPV  and  PCV.  Those  vaccines  have  several  weaknesses,  like, limited  to  several  strain  of  bacteria  and  invasive.  Nowadays,  development  of  pneumococcal  vaccines  used  the antigenic component of which occur on the bacteria, like epitope. One of the epitopes that can be used as vaccine candidate is epitope from RrgB protein of bacteria’s pili. One of the RrgB protein’s epitope that has been identified having antigenic property is epitope protein RrgB 255-270 of Streptococcus pneumoniae bacteria’s pili. That epitope will stimulate immune system to produce antibody against the antigen supported by cytokine, like IL-4. This research aim is to knowing the effect of intranasal immunization epitope protein RrgB 255-270 Streptococcus pneumoniae to IL- 4 level. Wistar rat’s nasal rinse sample IL-4 levels measured by ELISA method. The mean of K1 is 28,852± 18 ng/L, K2 is 20.630 ± 9 ng/L and K3 is 18.519 ± 6 ng/L. Result of Welch ANOVA test shows that p-value of this research is 0.299. That can be concluded that the effect of intranasal immunization epitope protein RrgB 255-270 S. pneumoniae give non-significant difference (p-value > 0.05).
Keywords: Epitope, Pili, S. pneumoniae, IL-4
1. Pendahuluan Streptococcus
pneumoniae ( S. pneumoniae ) atau pneumokokus merupakan  salah  satu  bakteri  paling umum  penyebab Community  Acquired Pneumonia
(CAP). 1 Pneumokokus menyebabkan  berbagai  infeksi  seperti otitis  media,  CAP,  sepsis,  dan  meningitis. World  Health  Organization (WHO) menyatakan  bahwa  pada  tahun  2015 diperkirakan  terdapat  156  juta  kasus pneumonia  dan  sebanyak  2  juta  bayi meninggal  setiap  tahunnya. 2 Pneumonia merupakan  penyakit  penyebab  kematian bayi terbanyak di dunia pada tahun 2010.
Sebanyak 30-50% kasus tersebut disebabkan oleh S. pneumoniae . Streptococcus  pneumoni-ae merupakan bakteri  Gram  positif  yang  biasa berkolonisasi  di  permukaan  mukosa saluran pernapasan atas manusia. 3 Tahap  awal  infeksi  pneumokokus adalah  penempelan  bakteri  ke  sel host yang diperantarai oleh protein adhesi dan reseptor  sel host .  Pili  memegang  peran penting  dalam  penempelan  bakteri  pada sel host dan  didukung  oleh  protein- protein yang ada pada permukaan bakteri. Bakteri  Gram  positif  memiliki  pili  yang panjang,  tipis  dan  kuat  yang  telah dibuktikan juga bahwa pili tersebut dapat membantu kolonisasi bakteri dan pembentukan  biofilm. 3 Pili  pneumokokus tersusun dari protein yaitu RrgA, RrgB dan RrgC yang diikat oleh 3 enzim sortase. Pili S.  pneumoniae merupakan  salah  satu faktor virulensi bakteri dalam menyebabkan infeksi pada manusia. Salah satu protein pili yang memiliki komponen antigen  tinggi  yaitu  RrgB.  Secara  insilico, protein  RrgB  memiliki  5  epitope  dengan susunan  asam  amino  yang  memiliki panjang antara 13-23. Komponen tersebut menjadikan protein RrgB sebagai kandidat vaksin  yang  bisa  dikembangkan  untuk pencegahan infeksi pneumococcal. 3
Vaksin  yang  digunakan  untuk  infeksi S.  pneumonia saat  ini  adalah  PPV23  ( 23- Valent  Pneumococcal  Polyssacharide Vaccine ) dan PCV13 ( 13-Valent Pneumococcal Conjugate Vaccine ).
Kelemahan  vaksin  PPV  dan  PCV  yaitu keterbatasan strain bakteri pneumokokus yang  terdapat  dalam  kandungan  vaksin tersebut. Hanya terdapat 23 strain bakteri yang terkandung dalam PPV dan 13 strain bakteri  yang  terkandung  dalam  PCV. Kelemahan  lain  dari  vaksin  PPV  dan  PCV yaitu vaksin PPV dan PCV diberikan secara intramuskular  sehingga  bersifat  invasif. Pengembangan vaksin pneumokokus saat ini  menggunakan  faktor  virulensi  bakteri. Faktor virulensi bakteri terdiri dari kapsul, protein  fungsional,  protein  permukaan, dan pili. 3
Imunisasi  dengan  komponen  bakteri akan  mengaktivasi  sistem  imun.  Sistem imun  akan  mensekresikan  sitokin  yang berperan  dalam  proses  infeksi  akan disekresikan  oleh  tubuh.  Sitokin  ini  akan mengaktivasi  sel  T-helper  menjadi  Th2 yang  kemudian  mengakibatkan  produksi sitokin  lain  semakin  banyak  seperti  IL-4. 4 Interleukin  4  merupakan  biomarker penting  dalam  beberapa  penyakit  salah satunya  pneumonia. 5 Interleukin  4  akan merangsang  sel  imun  untuk  melawan infeksi  patogen  seperti  merangsang  sel  B limfosit untuk memproduksi antibodi atau merangsang  sel  T  limfosit  untuk berdiferensiasi  menjadi  sel  T-helper  atau sel T sitotoksik. 6 Interleukin 4 juga bekerja dengan  menekan  sitokin  proinflamasi yang timbul ketika terdapat infeksi seperti pada penderita pneumonia. Pada penderita  pneumonia,  peningkatan  kadar IL-4  lebih  dominan  daripada  sitokin antiinflamasi lain seperti, IL-17 atau IL-13. Peningkatan kadar IL-4 merupakan respon tubuh  untuk  menghambat  produksi sitokin  proinflamasi  dan  pembersihan patogen penyebab infeksi. 7
Adanya  kelemahan  dari  vaksin  PPV dan  PCV,  maka  perlu  dikembangkan vaksin pneumokokus menggunakan protein  yang  terdapat  pada  faktor virulensi  bakteri  ( protein-based  vaccine) dengan  mempertimbangkan  efektifitas dari  vaksin  tersebut.  Pemberian  secara intranasal juga sesuai dengan patogenesis infeksi  pneumonia  dan  tidak  bersifat invasif. Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan penelitian  untuk  mengetahui  pengaruh imunisasi  intranasal  epitope  protein  RrgB 255-270
Streptococcus pneumoniae terhadap IL-4.

## 2. Metode
Sebanyak 30 Tikus Wistar jantan, usia 12-16 minggu dibagi menjadi 3 kelompok. K1  diberikan  imunisasi Phospate  Buffer Saline (PBS)  dengan  volume  total  40  µL secara  intranasal.  K2  diberikan  imunisasi PBS  dengan  volume  40  µL  yang mengandung  ajuvan  saja  yaitu  2  µL  CTB ( Cholera  Toxin  B )  dan  K3  diberikan imunisasi dengan volume 40 µL PBS, 2 µL CTB dan 20 µL epitope protein RrgB 255- 270 Streptococcus  pneumoniae .  Bahan- bahan  terebut  diberikan  sebanyak  20  µL pada  setiap  lubang  hidung  tikus  secara intranasal. Semua tikus diimunisasi setiap minggu  sebanyak  3  kali.  Satu  minggu setelah imunisasi
terakhir, tikus diterminasi  dengan  menggunakan  eter dan dilakukan pembedahan dan pengambilan  saluran  pernapasan  tikus.
Isolasi  bilasan  hidung  dilakukan  dengan memasukkan  1-2  ml  larutan  saline  steril melalui  trakea  dan  tetesan  larutan  saline lewat hidung ditampung dengan Eppendorf  steril.  Setelah  isolasi  bilasan hidung,  kulit  kepala  tikus  dibersihkan, rahang  bawah  diambil  dan  dibuang kemudian dilakukan pengambilan jaringan nasofaring.
Kadar  IL-4  dari  bilasan  hidung  diukur menggunakan BioAssay ELISA kit untuk IL-
4  sesuai  dengan  prosedur.  Sampel sebanyak 40 µL dan standart sebanyak 50 µL  dimasukkan  kedalam  setiap well dimana  6  well  pertama  berisi  standart.
Kemudian 10 µL antibodi IL-4
ditambahkan  pada well yang  berisi sampel. Kemudian 50 µL HRP-Streptavidin ditambagkan  pada  semua well kecuali standart  0.  Inkubasi  selama  1  jam  pada suhu  37°C.  Semua well di  cuci menggunakan wash buffer sebanyak 5 kali dengan  setiap  kali  pencucian  dilakukan selama  30  detik  sampai  1  menit.  Setelah diinkubasi, 50 µL substrate solution A dan 50  µL substrate  solution  B ditambahkan pada  semua well dan  inkubasi  selama  10 menit pada suhu 37°C di tempat gelap. 50 µL stop solution ditambahkan pada setiap well untuk  menghentikan  reaksi  antigen antibodi.  Hasil  ELISA  dibaca  pada optical density (OD)  dengan  panjang  gelombang 450nm.
Analisis  statistik  dilakukan  untuk membandingkan kadar IL-4 bilasan hidung menggunakan ANOVA jika data terdistribusi normal dan bersifat homogen.
Batas signifikansi yang digunakan adalah 0,05 (p > 0,05). Jika data tidak  homogen,  maka  uji  statistik dilakukan  dengan  menggunakan  uji ANOVA Welch.

## 3. Hasil
Hasil  pengukuran  kadar  IL-4  dengan menggunakan metode ELISA dapat dilihat pada  Tabel  1.  Dan  Gambar.  1  dimana kadar IL-4 tertinggi terdapat pada K1 dan kadar IL-4 terendah terdapat pada K3.
Tabel 1. Kadar IL-4 Bilasan Hidung No Kelompok Kadar IL-4 (ng/L) 1 K1 28.852 ± 18 2 K2 20.630 ± 9 3 K3 18.519 ± 6

## Gambar 1. Grafik Kadar IL-4 Bilasan Hidung
K1  diberikan  imunisasi Phospate Buffer  Saline (PBS)  dengan  volume  total 40  µL  secara  intranasal.  K2  diberikan imunisasi PBS dengan volume 40 µL yang mengandung  ajuvan  saja  yaitu  2  µL  CTB ( Cholera  Toxin  B )  dan  K3  diberikan imunisasi dengan volume 40 µL PBS, 2 µL CTB dan 20 µL epitope protein RrgB 255- 270 S. pneumoniae . Uji  analisis  statistik  menggunakan  uji Welch ANOVA.  Hasil  uji Welch ANOVA didapatkan  nilai  p  sebesar  0,299.  Nilai  p yang  lebih  besar  dari  0,05  menunjukkan pengaruh  imunisasi  epitope  protein  RrgB Streptococcus  pneumoniae memberikan perbedaan  yang  tidak  signifikan  terhadap perubahan kadar IL-4.

## 4. Pembahasan
Pneumonia  merupakan  salah  satu infeksi saluran pernapasan yang diakibatkan  oleh  bakteri  pneumokokus yang  dapat  dicegah  penularan  dan persebarannya  dengan  menggunakan vaksin.  Vaksin  pneumokokus  yang berkembang  saat  ini  adalah  vaksin pneumokokus berbasis epitope.
Epitope  merupakan  salah  satu komponen  yang  terdapat  pada  molekul antigen.  Epitope  dipilih  sebagai  bahan dasar  vaksin  karena  epitope  dapat
mewakili zat antigenik patogen. Penelitian telah  dilakukan  oleh  Kulp  dan  Schief (2013)  dengan  mengisolasi  salah  satu epitope  dari  Bakteri Streptococcus Group B  yang  kemudian  diimunisasikan  ke hewan  coba  tikus.  Hasil  dari  penelitian tersebut  adalah  hewan  coba  tikus  yang diimunisasikan oleh epitope mensekresikan  antibodi  spesifik  terhadap strain  bakteri  yang  digunakan  untuk mengisolasi  epitope  tersebut.  Kelemahan penggunaan epitope dalam pengembangan vaksin yaitu mendapatkan satu  epitope  cukup  sulit,  untuk  satu epitope  setidaknya  dibutuhkan  2  atau lebih protein  backbones . 8 Hal  ini menunjukkan bahwa, respon imun dalam pembentukan  antibodi  yang  dirangsang oleh  epitope  relatif  sama  dengan  respon imun  yang  dirangsang  oleh  protein  utuh yang  bersifat  antigen  dari  suatu  bakteri.
Antigen  yang  masuk  ke  dalam  tubuh manusia  akan  dikenali  dan  tubuh  akan memproduksi  sitokin  sebagai  respon untuk  melawan  antigen.  Respon  imun muksoa  dalam  memproduksi  antibodi dibantu  oleh  jaringan  limfoid  yang  ada pada  mukosa,  pada  saluran  pernapasan dibantu  oleh  jaringan  limfoid  yang  ada pada mukosa nasofaring. Interleukin yang di-produksi  seperti  IL-4  akan  membantu diferensiasi  sel  B  limfosit  menjadi  sel plasma  dan  sel  T  limfosit  menjadi  sel  T helper  dan  sel  T  sitotoksik.  Sel  T  helper dalam merangsang germinal center untuk maturasi sel B limfosit dirangsang oleh IL- 4. Maturasi sel B limfosit dan rangsangan IL-4  dalam  diferensiasi  sel  B  limfosit  sel plasma,  mengakibatkan  terbentuknya antibodi spesifik dalam melawan antigen. Respon  imun  pada  mukosa  memiliki antibodi  spesifik  yang  disekresikan  oleh jaringan  limfoid  yang  ada  pada  mukosa saluran pernapasan yaitu IgA. 9
0 5 10 15 20 25 30 35 K1 K2 K3
Hasil  uji  analisis  data  menggunakan metode Welch ANOVA  dengan  data  yang didapat  dari  perhitungan  kadar  IL-4 dengan  ELISA  didapatkan  nilai  p  sebesar 0,689. Nilai tersebut lebih besar dari 0,05. Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  perbedaan yang diakibatkan oleh pemberian perlakuan  bersifat  tidak  siginifikan  dilihat dari  kadar  IL-4  pada  K1,  K2  dan  K3.  Dari data  yang  terdapat  pada  Tabel  1  di  atas, menunjukkan  bahwa  kadar  IL-4  pada  K1 relatif  lebih  tinggi  daripada  K2  dan  K3, namun  seperti  yang  kita  ketahui  K1 merupakan  kelompok  kontrol.  Hal  ini berlawanan  dengan  hipotesis  penelitian yang  mengharapkan  kadar  IL-4  pada  K1 lebih rendah daripada K2 dan K3.
Hasil  di  atas  dapat  dipengaruhi  oleh beberapa  hal,  seperti,  repson  imun  yang berbeda-beda,  respon  imun  yang  baik akan  lebih  cepat  mengeliminasi  antigen yang  ada  pada  tubuh,  dan  respon  imun yang buruk akan lebih lama mengeliminasi patogen dalam tubuh. Pada teorinya, IL-4 akan  merangsang  sel  B  berdiferensiasi menjadi sel plasma yang akan mensekresikan  antibodi  spesifik  terhadap antigen tertentu. 10 Terminasi hewan coba dilakukan  1  minggu  setelah  pemberian perlakuan  terakhir  pada  minggu  ke  3. Pemberian  perlakuan  dimulai  sejak minggu ke 1 setelah aklimatisasi, sehingga respon  imun  dalam  pembentukan antibodi terhadap antigen yang diimunisasikan kepada hewan coba sudah mulai bekerja setelah perlakuan pertama. Terdapat  kemungkinan  kadar  IL-4  pada minggu  ke  4  sebelum  terminasi  sudah mulai  rendah,  dikarenakan  produksi antibodi  IgA  oleh  respon  imun  mukosa sudah tinggi. Pada pembentukan antibodi dalam  melawan  antigen,  terdapat beberapa  komponen  yang  bekerja  secara bersamaan. Germinal center (GC) memiliki peran penting dalam regulasi immunoglobulin. Germinal center
memiliki  peran  untuk  maturasi  sel  B limfosit  dibantu  oleh  beberapa  sitokin seperti IL-2, IL-4, IL-6, dan IL-10. Peran IL-4 sebagai sitokin antiinflamasi mempengaruhi reaksi GC dalam mengaktivasi  sel  B  dan  merangsang diferensiasi  sel  B  limfosit  menjadi  sel plasma. Diferensiasi sel B limfosit menjadi sel  plasma  diperlukan  untuk  produksi antibodi  terhadapt  antigen. 9 Kadar  IL-4 yang  tinggi  menunjukkan  bahwa  tubuh sedang  melawan  suatu  antigen  tertentu yang  masuk  ke  dalam  tubuh.  Kadar  IL-4 yang  rendah  atau  relatif  normal menunjukkan  bahwa  tubuh  dalam keadaan baik-baik saja atau antibodi yang diproduksi oleh tubuh sudah cukup untuk melawan antigen yang ada dalam tubuh. 11
Interleukin
4 yang diproduksi membantu tubuh dalam mengaktivasi dan merangsang diferensiasi dari sel B limfosit dan sel T limfosit. Sel B limfosit yang telah berdiferensiasi  menjadi  sel  plasma  akan memproduksi  antibodi  spesifik  terhadap patogen.  Pada  lapisan  mukosa,  sebagian besar  antibodi  yang  diproduksi  adalah immunoglobulin A, yang dapat berinteraksi  dan  mengeliminasi  beberapa mikroorganisme atau antigen yang masuk ke  dalam  tubuh.  IgA  yang  disekresikan pada  lapisan  mukosa  biasa  disebut  sIgA. IgA  terus  diproduksi  oleh  sel  plasma selama  patogen  atau  antigen  yang  ada pada  tubuh  belum  berhasil  dieliminasi. 12 Produksi IgA secara terus menerus dalam melawan  penyebab  penyakit  membuat tubuh  juga  mensekresikan  IL-4  untuk membantu  diferensiasi  sel  B  limfosit menjadi  sel  plasma.  Hal  ini  dapat membuat  kadar  IL-4  dalam  tubuh  relatif lebih  tinggi  daripada  ketika  tubuh  dalam keadaan  sehat.  Pada  penelitian  ini,  kadar IL-4  yang  rendah  dapat  diakibatkan  oleh keadaan  dimana  kadar  IgA  yang diproduksi  oleh  sistem  imun  tikus  dalam melawan  antigen  yang  diimunisasikan
secara  intranasal  sudah  cukup  untuk mengeliminasi antigen tersebut. Kadar IgA yang  cukup  tinggi  akan  mempengaruhi keseimbangan kadar sitokin dalam tubuh. Hal  ini  membuat  tubuh  akan  melakukan down regulasi dalam produksi atau sekresi IL-4  sehingga  kadar  IL-4  dalam  tubuh kembali dalam keadaan normal.
Pada  tahun  2001,  Hodge et  al., melakukan  penelitian  yang  sama  untuk melihat  pengaruh  pemberian  imunisasi intranasal  dari  virus  influenza  dalam pembentukan  antibodi  spesifik  yaitu  IgA. Penelitian  tersebut  menggunakan  tikus betina  jenis  BALB/c  dan  bahan-bahan yang  digunakan  adalah  antigen  yang berasal dari influenza serta immunomodulator berupa cholera  toxin . Hasil  penelitian  Hodge et  al., (2001)
menunjukkan bahwa IgA yang diukur dari serum tikus setelah perlakuan menunjukkan peningkatan yang signifikan dibandingan dengan tikus kontrol produksi  IgA  tertinggi  terdapat  pada  hari ke  21  setelah  imunisasi  pertama  yang dilakukan. 13 Hal  tersebut  mungkin  juga terjadi  pada  penelitian  ini,  dimana,  tikus diterminasi  pada  minggu  ke  4.  Kadar  IgA pada tikus mulai tinggi sejak minggu ke 3 setelah imunisasi mengakibatkan produksi IL-4  dalam  hal  membantu  produksi  IgA mulai  diturunkan,  sehingga  kadar  IL-4 pada  minggu  ke  4  sudah  berada  pada kadar yang rendah.
Menurut  Parkitny et  al., (2013), pengukuran  kadar  IL-4  lebih  baik dilakukan dari sampel serum atau plasma, dikarenakan  kadar  IL-4  yang  terdapat dalam  serum  atau  plasma  relatif  stabil. 14 Pada penelitian ini, pengukuran kadar IL-4 menggunakan sampel bilasan hidung tikus Wistar  yang  telah  diimunisasikan  antigen berupa  epitope  protein  RrgB  255-270 S. pneumoniae . Pengambilan sampel dilakukan  dengan  mengalirkan  buffer saline melalui trakea tikus yang kemudian
buffer  saline  yang  keluar  dari  lubang hidung  tikus  tersebut  akan  ditampung pada  Eppendorf.  Terdapat  kemungkinan, metode pengambilan sampel ini tidak bisa melarutkan  seluruh  IL-4  yang  terdapat pada  saluran  pernapasan  karena  buffer saline  hanya  dialirkan  melalui  saluran pernapasan.  Hal  ini  dapat  berpengaruh terhadap hasil penelitian karena pengukuran  kadar  IL-4  yang  bagus dilakukan  pada  bilasan  hidung  pertama yang  diambil  dari  saluran  pernapasan hewan coba.

## 5. Kesimpulan
Pemberian imunisasi intranasal epitope protein RrgB 255-270 Streptococcus  pneumoniae memberikan perbedaan  yang  tidak  signifikan  terhadap kadar IL-4 tikus
Daftar Pustaka 1. Steel  HC,  Cockeran  R,  Anderson  R, Feldman C. Overview of community-acquired pneumonia and  the  role  of  inflammatory mechanisms in the immunopathogenesis  of  severe pneumococcal  disease.  Mediators Inflamm. 2013;2013. 2. Rudan  I,  Boschi-Pinto  C,  Biloglav  Z,
Mulholland K, Campbell H. Epidemiology  and  etiology  of childhood  pneumonia.  Bull  World Health Organ. 2008;86:408-416B. 3. Tanımlanması  P.  Identification  of hemagglutinin protein from Streptococcus pneumoniae pili as a vaccine  candidate  by  proteomic analysis. Turk J Immunol. 2018;6(1):8–15. 4. Hermawati  I,  Herman  H,  Agoes  R. Uji  Validasi  Kadar  Interleukin-4  (IL- 4)  Sebagai  Alternatif  Uji  Diagnosis Infeksi  Kecacingan.  Maj  Kedokt Bandung. 2016;48(4):211–5.
5. Wang R-S, Jin H-X, Shang S-Q, Liu X- Y, Chen S-J, Jin Z-B. Associations of IL-2  and  IL-4  expression  and polymorphisms  with  the  risks  of mycoplasma  pneumoniae  infection and  asthma  in  children.  Arch Bronconeumol (English Ed. 2015;51(11):571–8. 6. Junttila  IS.  Tuning  the  cytokine responses: an update on interleukin
(IL)-4 and IL-13 receptor complexes. Front Immunol. 2018;9:888.
7. Song  Z,  Zhang  J,  Zhang  X,  Li  D,
Wang  H,  Xu  X,  et  al.  Interleukin  4 deficiency reverses development of secondary Pseudomonas aeruginosa pneumonia during sepsis-associated immunosuppression.  J  Infect  Dis. 2015;211(10):1616–27. 8. Kulp  DW,  Schief  WR.  Advances  in structure-based  vaccine  design. Curr Opin Virol. 2013;3(3):322–31.
9. Boyaka PN. Inducing mucosal IgA: a challenge for vaccine adjuvants and delivery  systems.  J  Immunol. 2017;199(1):9–16.
10.   Abbas  AK,  Lichtman  AH,  Pillai  S.
Cellular and molecular immunology 8th  edition.  California:  Saunders;
2014. 11.   Jackson  DA,  Elsawa  SF.  Factors regulating immunoglobulin production  by  normal  and  disease- associated plasma cells. Biomolecules. 2015;5(1):20–40. 12.   Li  Y,  Jin  L,  Chen  T.  The  effects  of secretory  IgA  in  the  mucosal immune  system.  Biomed  Res  Int. 2020;2020:1–6.
13.   Hodge  LM,  Marinaro  M,  Jones  HP,
McGhee JR, Kiyono H, Simecka JW. Immunoglobulin  A  (IgA)  responses and  IgE-associated  inflammation along  the  respiratory  tract  after mucosal but not systemic immunization. Infect Immun. 2001;69(4):2328–38.
14.   Parkitny L, McAuley JH, Kelly PJ, Di Pietro  F,  Cameron  B,  Moseley  GL. Multiplex  cytokine  concentration measurement:  how  much  do  the medium  and  handling  matter? Mediators  Inflamm.  2013;2013:1– 13.