KLT-Bioautografi Ekstrak Etil Asetat Supernatan Hasil Fermentasi Streptomyces G Isolat Tanah Rumah Kompos Bratang Surabaya
Ifah Yulistyani 1 , Achmad Toto Poernomo 2 , Isnaeni 2 * 1 Program Studi Magister Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
2 Departemen Ilmu Kefarmasian, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Corresponding author: isnaeni@ff.unair.ac.id
Submitted: 16 Februari 2020 Accepted: 23 December 2020 Published: 27 April 2021

## Abstract
Background:  The  rapid  development  of  microorganisms  behavior  through  various  mechanisms  reflected  in various resistant strains, tolerant and persistent characters, such as Multi Drug Resistant (MDR), Extended Strain Beta  Lactamase,  MDR-Tuberculosis  and  Methicillin  Resistant  Staphylococcus  Aureus.  Efforts  to  explore  new antibiotics from various natural sources have been done to overcome problems related to the need for antibiotics that  are  responsible  for  handling  infectious  diseases.  Objectives:  This  research  focuses  on  the  isolation  of Streptomyces sp. from compost waste land in the Bratang area of Surabaya that were able to produce anti-bacterial compounds. Methods: The Streptomyces sp. was successfully isolated and identified as Streptomyces G by which fermentation  process  was  performed  in  the  International  Streptomyces  Project-4  media.  Thin  Layer Chromatography-Bioautography method was used to evaluate the antibacterial activity of ethyl acetat extract of cell  free  fermentation  broth  (CFFB)  against  Escherichia  coli  ATCC  7890  and  Staphylococcus  aureus  ATCC 23456. Results: The CFFB supernatant exhibited ability to inhibit the tested bacteria growth. The active compound was successfully extracted from the supernatant by ethyl acetate. The TLC-bioautogram using eluent of butanol : acetic acid : water (3: 2: 6, v/v) showed that two spots were good separately, one of those (Rf = 0.56) inhibited the  tested  bacteria  with  a  weak  potential  category.  Conclusion:  Ethyl  acetate  extract  of  CFFB  supernatant  of Streptomyces  G  in  ISP-4  media  contained  two  different  compounds  and  one  of  them  showed  growth  inhibitory activity  against  Staphylococcus  aureus  ATCC  6538  and  Escherichia  coli  ATCC  8739  based  on  the  TLC- bioautogram.

## Keywords: Streptomyces sp-G, compost, waste-soil, TLC-bioautography

## Abstrak
Pendahuluan : Meningkatnya penggunaan antibiotika yang tidak rasional menyebabkan berkembangnya masalah resistensi  obat  anti  infeksi.  Perkembangan  perilaku  mikroorganisme  yang  luar  biasa  pesatnya  melalui  berbagai mekanisme telah melahirkan berbagai strain yang resisten, toleran dan persisten, antara lain, Multi Drug Resistant (MDR), Extended  Strain  Betalactamase ,  MDR-Tuberkulosis  dan Methicillin  Resistant Staphylococcus  aureus . Upaya untuk  mengeksplor antibiotika baru dari  berbagai  sumber alam telah banyak dilakukan untuk  mengatasi permasalahn terkait kebutuhan antibiotika yang handal dalam mengatasi penyakit infeksi. Tujuan : Penelitian ini berfokus pada isolasi Streptomyces s p.yang mampu menghasilkan senyawa anti bakteri dari tanah kompos buangan sampah di daerah Bratang Surabaya. Metode : Streptomyces sp . telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi sebagai Streptomyces G  dan  dilakukan  proses  dalam  media  ISP-4.  Metode  KLT-bioautografi  digunakan  untuk mengevaluasi aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat supernatan kaldu fermentasi terhadap Escherichia coli ATCC 7890 dan Staphylococcus aureus ATCC 23456. Hasil : Supernatan menunjukkan kemampuan untuk menghambat pertumbuhan  bakteri  uji.  Senyawa  aktif  berhasil  diekstraksi  dari  supernatan  dengan  etil  asetat  dan  KLT- bioautogram  menggunakan  eluen  butanol-asam  asetat-air  (3:2:6,  v/v)  menunjukkan  bahwa  ada  dua  noda  yang terpisah secara baik, salah satu dari noda dengan Rf 0,56 mampu menghambat bakteri uji dengan kategori potensi lemah. Kesimpulan :  Ekstrak  etil  asetat  supernatan  kaldu  fermentasi Streptomyces G  dalam  media  ISP-4
mengandung  dua  senyawa  yang  berbeda  dan  satu  diantaranya  menunjukkan  aktivitas  penghambatan  terhadap pertumbuhan Staphylococcus  aureus ATCC  6538  dan Escherichia  coli ATCC  8739  berdasarkan  data  KLT- bioautogram.
Kata kunci : Streptomyces sp-G, tanah kompos, aktivitas antibakteri

## PENDAHULUAN
Actinomycetes termasuk bakteri berfilamen golongan  Gram  positif,  saprofitik  yang  mampu  hidup bebas  di  berbagai  habitat,  dan  dikenal  sebagai  sumber berbagai  antibiotik  (Valli  dkk.,  2012;  Al-Dhabi  dkk., 2019)  yang  sebagian  besar  sudah  digunakan  di  klinik. Actinomycetes ditemukan  di  laut,  lingkungan  muara, tanah  dan  air tawar  (Gebreyohannes  dkk.,  2013), serta memiliki  sifat  antara  bakteri  dan  jamur  (Pandey  dkk., 2004). A ctinomycetes tercatat sebagai salah satu bakteri penghasil antibiotik selain fungi dan beberapa mikroba lainnya.  Dari  sekitar  11.900  jenis  antibiotik  yang ditemukan,  kurang  lebih  66%  dihasilkan  oleh actinomycetes dan  hampir  80%  dari  jumlah  tersebut ditemukan  dalam Streptomyces spp.,  22%  dihasilkan oleh  jamur,  12%  dihasilkan  oleh  bakteri  selain actinomycetes.
Streptomyces sp.  dikenal  sebagai  produsen antibiotik  penting,  menghasilkan  tiga  perempat  dari semua  antibiotik  yang  tersedia  secara  komersial.  Pada penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa Streptomyces sp.  memproduksi  bermacam-macam antibiotik  antara  lain  streptomisin,  kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin, bleomisin, kanamisin, dan masih banyak  lagi  antibiotik  lainnya  (Hopwood,  2007). Perbedaan  geografis  lokasi  menyebabkan  variasi  jenis tanah dan antibiotik yang dihasilkan oleh Streptomyces (Nampoothiri dkk., 2002).
Dalam Actinomycetes , Streptomyces termasuk genus yang terpenting dan lebih dari 1000 species telah ditemukan  (Al-Ansari  dkk.,  2019).  Penelitian  ini bertujuan  mengisolasi  dan melakukan penapisan  daya antibakteri Streptomyces sp. dari tanah Rumah Kompos Bratang  Surabaya  (RKBS),  salah  satu  tempat pengolahan  sampah  yang  terletak  di  bagian  selatan Kebun Bibit Bratang, Surabaya. Penelitian terkait isolasi actinomycetes khususnya Streptomyces telah  banyak dilaporkan, antara Cuesta dkk. (2012) telah mengisolasi 49 actinomycetes dari  kompos  dan  12  di  antaranya termasuk  spesies Streptomyces .  Identifikasi  senyawa aktif  dengan  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT)- bioautografi  juga  dilaporkan.  Choma  (2005)  telah menyampaikan  konsep  teknik  pemisahan,  identifikasi
dan  uji  aktivitas  senyawa  aktif  hasil  isolasi  dari  bahan alam (Isnaeni dkk., 2017).
Telah  melaporkan  aktivitas  antibakteri  supernatan hasil fermentasi Streptomyces sp dan hasil ekstraksinya dengan  butanol  yang  diisolasi  dari  tanah  kebun  sayur terhadap  bakteri  Gram  positif,  Gram  negatif  termasuk Mycobacterium tuberculosis (Isnaeni dkk., 2016).

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Streptomyces G  isolat  tanah  RKBS  diperoleh  dari Departemen Kimia Farmasi Fakultas Farmasi
Universitas  Airlangga. Escherichia  coli ATCC  8739 dan Staphylococcus aureus ATCC  6538 diperoleh dari Unit  Layanan  Pengujian  Fakultas  Farmasi  Universitas Airlangga. Media International  Streptomyces  project (ISP-4)  cair  dan  padat  (Lampiran  1),  media Nutrient Broth (Difco)  (Lampiran  2),  agar  AA,  streptomisin sulfat  (Meiji),  eritromisin  stearat  (Aditamaraya Farmindo), tetrasiklin hidroklorida (Interbat), NaCl p.a (Merck),  air  suling,  metanol  p.a.(Merck),  etil  asetat teknis (Merck), n-butanol p.a. (Merck), asam asetat p.a. (Merck),  toluen  p.a.  (Merck),  etanol  p.a.  (Merck), kalium permanganat (Merck), asam sulfat p.a. (Merck), anisaldehid (Merck), dapar fosfat (Millipore).

## Alat
Timbangan  analitik  (Sartorius),  otoklaf  ( Pressure Stem  Sterilizer 0,14  Mpa),  pH  meter  (Schott), termometer, Laminar  Air  Flow  cabinet (type  pvc-750 APG seisa KHUSO LTD), inkubator (Memmert), cawan petri,  jarum  penanam  (Öse),  mikropipet  (Socorex), jangka sorong (Tricle Brand), hot plate , Spectrophotometer UV-Vis (Lovibond Spectro PC 22), Thermoshaker (Gerhardt  Laboshake), rotavapour , bejana  kromatografi, vortex ,  lempeng  kromatografi lapis tipis Silica Gel F 254 (Merck, Germany), pipa kapiler 2 µL.
Metode

## Penyiapan starter Streptomyces G
Sebanyak  satu  Öse  koloni Streptomyces G digesekkan dalam 8 mL kultur media ISP-4 agar miring, diinkubasi  pada  suhu  28 o C  selama  48  jam.  Suspensi bakteri  disiapkan  dengan  cara  menanamkan  satu  Öse koloni Streptomyces G  dalam  media  ISP-4  cair  dan
diinkubasi  pada  suhu  28 o C  selama  48  jam,  dikocok 150 rpm pada Termoshaker . Jumlah bakteri dalam kaldu fermentasi Streptomyces G  dihitung  dengan  Angka lempeng Total (ALT). Sebanyak 1 mL kaldu fermentasi dimasukkan  tabung  reaksi  berisi  9  mL  larutan  steril 0,9%  NaCl,  suspensi  divortex  hingga  homogen. Selanjutnya  dilakukan  pengenceran  dari  10 -1 sampai 10 -15 .  Dari  masing-masing  enceran  diambil  1  mL menggunakan  mikropipet,  dicampur  dengan  10  mL media ISP-4 Agar yang telah dicairkan suhu 45 - 50 o C, divortex hingga homogen, kemudian dituang ke dalam cawan  Petri  dan  diinkubasi  pada  suhu  28 o C  selama 48 jam, percobaan dilakukan duplo. Cawan Petri yang mengandung  koloni  30  -  300  digunakan  sebagai  dasar perhitungan  ALT.  Kaldu  fermentasi Streptomyces G juga  diukur  transmitansnya  dengan  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis.  Transmitans  yang  diperoleh akan digunakan sebagai dasar pemanenan biomassa atau starter pada proses fermentasi selanjutnya (Isnaeni dkk., 2016).

## Fermentasi Streptomyces G
Sebanyak  25  mL  suspensi Streptomyces G dipindahkan  dari  starter  ke  250  mL  media  ISP-4  cair, kemudian dikocok pada Thermoshake dengan kecepatan 150  rpm  pada  suhu  28 o C  selama  48  jam.  Fermentasi dilakukan selama 10 hari. Pengambilan sampel selama fermentasi  dilakukan  setiap  24  jam,  miselium  bakteri dipisahkan  dari  kaldu  hasil  fermentasi  dengan  cara sentrifugasi  5000  rpm  selama  10  menit  (Awad  dkk., 2009).  Parameter  yang  diamati  adalah  aktivitas antibakteri, pH, dan berat sel  kering (Yücel  & Yamaç, 2010). Untuk  menentukan  berat  sel  kering,  miselium isolat Streptomyces G  dikeringkan  pada  105 o C  selama 18  -  24  jam  sampai  diperoleh  berat  konstan  (Yücel  & Yamaç, 2010).

## Isolasi metabolit antibakteri
Supernatan  dari  kaldu  fermentasi  yang  diperoleh diekstraksi dengan etil asetat 1:1 (v/v), dikocok selama 1 jam untuk menyempurnakan ekstraksi. Fase etil asetat dipisahkan  dari  fase  air  dan  diuapkan  sampai  kering menggunakan rotavapour pada  suhu  37 o C  dan  residu yang  diperoleh  ditimbang.  Ekstrak  yang  diperoleh digunakan  untuk  menentukan  aktivitas  antibakteri, Konsentrasi  Hambat  Minimum  (KHM)  dan  untuk identifikasi dengan KLT-bioautografi (Singh & Pandey, 2009; Kharat dkk., 2009).
Penentuan aktivitas antibakteri Penyiapan bakteri uji
Sebanyak satu  Öse  koloni Escherichia coli ATCC 8739 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538 masing-
masing  dibiakkan  dalam  8  mL  kultur  media Nutrient Agar miring,  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37 o C selama 24 jam.

## Penyiapan inokulum bakteri uji
Mikroba  uji  pada  agar  miring  24  jam  ditambah dengan  10  mL  larutan  steril  0,9%  NaCl,  kemudian dikocok sampai koloni di permukaan Agar terlepas dan tersuspensi dalam larutan 0,9% NaCl. Inokulum tersebut selanjutnya  diukur  transmitannya  pada  panjang gelombang 580 nm dengan spektrofotometer. Transmitan  suspensi  diatur  sampai  25%  (Isnaeni  dkk., 2017).

## Penyiapan media uji
Disiapkan  Petri  yang  diisi  dengan  media Nutrient Agar 12  mL  sebagai base  layer .  Selanjutnya  diambil masing-masing 8 µL inokulum Escherichia coli ATCC 8739 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538 (T 25%) dimasukkan  ke  dalam  8  mL  media Nutrient  Agar sebagai sheed layer (Warsito dkk., 2017). Agar dicetak dengan  perforator  untuk  membuat  sumur  pencadang dengan diameter 0,7 cm dan kedalaman 1 cm.

## Uji potensi antibakteri
Aktivitas  antibakteri  ditentukan  dengan  metode difusi  agar.  Ekstrak  kering  etil  asetat  supernatan  hasil fermentasi Streptomyces G dilarutkan dalam 1 mL dapar fosfat  0,2  M  (pH  7.0).  Dipipet  100  μL  larutan  ekstrak dimasukkan  ke  dalam  sumur  agar,  setelah  seluruh pencadang terisi larutan uji, selanjutnya petri diinkubasi pada 37°C selama 24 jam. Diameter zona hambat yang terbentuk  di  sekitar  pencadang  diukur  diamati  dan diukur menggunakan jangka sorong (Nampoothiri dkk., 2002).

## Optimasi fase gerak KLT
Dibuat  beberapa  macam  sistem  eluen  dengan berbagai perbandingan. Sebanyak 10 μL larutan sampel dan  antibiotik  standar  200  ppm  ditotolkan  pada  pelat KLT silica gel F 254 , kemudian dieluasi dengan masing- masing  eluen.  Pelat  KLT  hasil  eluasi  dikeringkan  dan noda  yang  terbentuk  diamati  di  bawah  lampu  UV dengan atau tanpa penampak noda. Noda yang tampak diberi tanda dan nilai Rf dihitung (Warsito dkk., 2017).

## Penapisan daya antibakteri fase gerak
Ditotolkan  sebanyak  10  µL  fase  gerak,  antibiotik standar, dan etil asetat sebagai blanko pada pelat KLT. Selanjutnya  pelat  KLT  diletakkan  di  atas  permukaan media Nutrient  Agar yang  telah  ditanami  bakteri  uji, kemudian disimpan di dalam lemari es selama dua jam. Cawan  petri  dikeluarkan  dari  lemari  es.  Selanjutnya pelat  KLT  diangkat  dari  permukaan  agar,  kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Zona jernih
yang  terbentuk  pada  posisi  noda  diamati  dan  diukur diameternya  dengan  jangka  sorong  (Warsito  dkk., 2017).

## Kromatografi  lapis tipis
Sebanyak 10 µL ekstrak etil asetat hasil fermentasi Streptomyces G  dan  antibiotik  standar  200  ppm ditotolkan  pada  pelat  KLT  silica  gel  F 254 .  Pelat  KLT dibuat  dua  bagian,  bagian  pertama  digunakan  untuk bioautografi  dan  bagian  lainnya  untuk  menentukan profil  kromatogram  KLT.  Pelat  dieluasi  dengan  fase gerak  hasil  optimasi.  Pelat  KLT  yang  telah  dieluasi dikeringkan dan noda yang terbentuk diamati di bawah lampu UV 365 nm  dengan atau tanpa penampak noda. Noda yang tampak diberi tanda dan nilai Rf dihitung.

## KLT-Bioautografi
Bioautogram  dibuat  dengan  cara  meletakkan  hasil KLT  di  atas  permukaan  media Nutrient  Agar yang mengandung  bakteri  uji,  kemudian  disimpan  di  dalam lemari  es  (4 o C)  selama  dua  jam  supaya  proses  difusi antibiotik  dalam noda kromatogram ke media Nutrient Agar sempurna. Cawan petri dikeluarkan dari lemari es, pelat  KLT  diangkat  dari  permukaan  agar,  kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Zona jernih yang  terbentuk  pada  posisi  noda  diamati  dan  diukur diameternya dengan jangka sorong.

## Uji  stabilitas terhadap panas
Larutan  ekstrak  diuji  stabilitasnya  terhadap  panas dengan meletakkan pelat KLT yang telah berisi ekstrak etil  asetat pada suhu 60 o C selama 30 menit  dan 100 o C selama 5 menit. Selanjutnya pelat KLT digunakan untuk uji bioautografi. Zona jernih yang diperoleh dibandingkan  dengan  larutan  tanpa  perlakuan  panas (Yucel & Yamac, 2009).

## Penentuan KHM
Ekstrak kering etil asetat dilarutkan dalam metanol 10%  (persentase  ini  diperoleh  dari  hasil  penelitian pendahuluan  dan  pada  konsentrasi  ini  pelarut  tidak memberikan  daya  hambat  terhadap  bakteri  uji). Penetuan  KHM  ini  dilakukan  menggunakan 96  –  well plate steril.  Pada  penentuan  KHM  dilakukan  seri pengenceran  yaitu  dari  konsentrasi  5000  ppm  sampai 10  ppm.  Larutan  hasil  pengenceran  disaring  dengan membran  filter  steril  Millipore  0,45  µm  (Yucel  & Yamac,  2009).  Kemudian  sebanyak  100  µL  masing- masing  filtrat  ke  dalam well yang  telah  diisi  20  µL
suspensi  bakteri  uji.  Selanjutnya plate diinkubasi  pada suhu 37˚C selama 24 jam.
Sebanyak  10  µL  resazurin  ditambahkan  ke  dalam masing-masing well ,  kemudian  diinkubasi  dilanjutkan pada  suhu  37˚C  selama  3  jam.  Perubahan  warna yang terjadi dinilai secara visual. Setiap perubahan warna dari ungu ke merah muda dicatat sebagai hasil positif (Yucel &  Yamac,  2009).  Konsentrasi  terendah  yang menyebabkan  terjadinya  perubahan  warna  dicatat sebagai  nilai  KHM,  yaitu  konsentrasi  minimum  yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme uji.

## HASIL DAN DISKUSI Penetapan ALT starter Streptomyces G
Seri  pengenceran  suspensi Streptomyces G  dari 10 -1 sampai  10 -15 dilakukan  untuk  menentukan  jumlah Streptomyces G  yang  digunakan  selama  proses fermentasi. Dari hasil perhitungan angka lempeng total diperoleh jumlah koloni dalam suspensi Streptomyces G yang digunakan adalah 50x10 15 cfu/mL dan menghasilkan transmitan 3,5% pada 530 nm. Tahap ini dilakukan  untuk  mendapatkan  jumlah  biomassa  yang cukup untuk proses fermentasi dan untuk mendapatkan kondisi  yang  reprodusibel,  fermentasi  dilakukan  pada fase pertumbuhan atau logaritmik.

## Fermentasi isolat Streptomyces G
Pertumbuhan dan aktivitas Streptomyces G diamati setiap 24 jam selama 10 hari. Puncak aktivitas tercapai pada  hari  ke-5  (Tabel  1,  Gambar  1).  Berdasarkan diameter  zona  yang  diperoleh  (10  -  15  cm),  senyawa aktif dikategorikan lemah). Selanjutnya proses fermentasi  dihentikan  untuk  produksi  metabolit  aktif. Aktivitas  ini  spesifik  tergantung  spesies Streptomyces. Hasil ini sesuai dengan hasil yang dilaporkan oleh Singh &  Pandey  (2009)  yang  melakukan  fermentasi Streptomyces sp.  selama  3  -  5  hari  pada  pH  6,9  -  7,0. Pada  penelitian  ini  pH  fermentasi  berkisar  6,0  -  8,2. Zothanpuia dkk. (2018) melakukan fermentasi Streptomyces spp . dari  sedimen dalam media LB yang dimodifikasi  untuk  isolasi  senyawa  antimikroba  dan penapisan  aktivitas,  dilakukan  selama  7  -  15  hari. Kondisi  fermentasi  untuk  memperoleh  senyawa  aktif penting dioptimasi baik media, pH, suhu dan kecepatan agitasi.
Tabel 1. Profil pertumbuhan dan aktivitas antibakteri supernatan hasil fermentasi Streptomyces sp. G dalam media ISP-
4 cair Hari ke- Diameter zona hambat (mm) pH Berat sel kering (x 10 -3 g/10 mL)
S. aureus ATCC 6538 E. coli ATCC 8739 0 9,30 9,35 7,16 18,10 1 11,75 12,24 5,99 8,00 2 12,26 13,21 5,96 12,60 3 11,70 13,14 6,04 8,60 4 11,83 12,06 6,55 20,50 5 14,39 13,73 7,25 33,80 6 10,29 11,93 7,61 30,00 7 11,21 13,15 7,95 23,70 8 10,88 13,18 8,01 14,40 9 9,73 10,21 8,16 20,00 10 10,23 9,75 8,16 22,40
Gambar 1. Aktivitas antibakteri supernatan hasil fermentasi Streptomyces G terhadap Escherichia coli ATCC 8739 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538 pada hari ke-1 sampai dengan ke-10 inkubasi

## Isolasi metabolit antimikroba
Sebanyak  1  L  kaldu  fermentasi Streptomyces G diekstraksi dengan 1 L etil asetat (1:1) dan dikeringkan dengan rotavapor ,  sehingga  didapatkan  ekstrak  kering seberat  830,4  mg.  Etil  asetat  digunakan  dengan  tujuan mengisolasi  seyawa  aktif.  Solvent  yang  digunakan untuk  ekstraksi  tergantung  pada  karakteristik  senyawa aktif  yang  diisolasi.  Singh  &  Pandey  (2009) menggunakan  metanol:kloroform  untuk  melakukan gradient elusi menggunakan kromatografi kolom.

## Optimasi fase gerak KLT
Hasil optimasi fase gerak diperoleh toluen : etanol (8 : 2) sebagai eluen terpilih,  karena menghasilkan nilai Rf  0,2  -  0,8  (Tabel  2  dan  Tabel  3)  dan  diperoleh  dua noda  yang  terpisah.  Harga  Resolusi  (Rs)  kedua  noda dapat dioptimasi untuk kesempurnaan pemisahan. Nilai Rs  ini  penting  dipertimbangkan  untuk  analisis  lanjut, terutama  dengan  KLT-bioautografi,  karena  ada  faktor difusi senyawa aktif pada media uji.
Tabel 2. Hasil optimasi fase gerak KLT ekstrak etil asetat supernatan hasil fermentasi Streptomyces G
No. Sistem Fase Gerak R f noda Noda 1 Noda 2 I Metanol : air : etanol (75:20:5) 0 0,93 II Toluen : etanol : asam asetat (50:40:10) 0,92 - III n-butanol : asam asetat (80:20) 0,87 - IV Toluen : etanol (8 : 2) 0,48 0,58
Tabel 3. Hasil Pengamatan Rf pada kromatogram KLT menggunakan eluen toluen:etanol (8:2) Nama Sampel Nilai R f Noda 1 Noda 2 Streptomisin * - - Eritromisin 0,15 - Tetrasiklin 0 - Ekstak etil asetat Streptomyces G 0,56 0,67 *) noda tidak nampak sehingga R f tidak dapat dihitung

## Kromatografi lapis tipis
Uji  aktivitas  antibakteri  fase  gerak  terpilih dilakukan  untuk  mengetahui  pengaruh  fase  gerak terhadap  pertumbuhan  bakteri  uji.  Hasil  pengamatan (Gambar  2)  menunjukkan  bahwa  fase  gerak  yang terpilih  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap  bakteri
uji.  Selanjutnya,  perlu  dilakukan  pemanasan  untuk menghilangkan sisa fase gerak dari pelat KLT sebelum dilakukan  uji bioautografi. Hasil uji stabilitas  terhadap panas  menunjukkan  bahwa  noda  stabil  terhadap perlakuan panas.
Gambar 2. Penapisan daya hambat ekstrak etil asetat supernatan hasil fermentasi Streptomyces G dalam dapar fosfat 0,2 M pH 7,0 terhadap Escherichia coli ATCC 8739 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538; M = ekstrak etil asetat Streptomyces G dalam buffer fosfat 0,2 M pH 7,0; EA = etil asetat; Buf = dapar fosfat 0,2 M; KF = kaldu fermentasi (sebelum diekstraksi); St = antibiotik standar (streptomisin 200 ppm)
Berdasarkan  data  kromatogram  dapat  dinyatakan bahwa  senyawa  dalam  ekstrak  etil  asetat  hasil fermentasi Streptomyces G tidak sama dengan antibiotik standar yang digunakan (Gambar  3). Selanjutnya noda yang  dihasilkan  ekstrak  etil  asetat  yang  diamati  di
bawah  lampu  UV  pada  panjang  gelombang  yang berbeda menunjukkan bahwa pada λ 254 hanya terdeteksi satu  noda,  sedangkan  pada  λ 365 teramati  dua  noda (Gambar 4).
Gambar 3. Kromatogram KLT di bawah sinar UV 365 dan dengan penampak noda larutan anisaldehid 1 =  ekstrak etil asetat hasil fermentasi Streptomyces G; 2 =  streptomisin; 3 = tetrasiklin; 4 = eritromisin
Gambar 4. Kromatogram KLT ekstrak etil asetat supernatan hasil fermentasi Streptomyces G menggunakan fase gerak toluen:etanol (8:2) di bawah sinar UV 365 nm

## KLT-bioautografi
Pada uji bioautografi noda yang memiliki aktivitas antibakteri  terhadap  bakteri  uji  hanya  noda  dengan  R f 0,56. Aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan terbentuknya  zona  jernih  pada  bioautogram    (Gambar 5).  Bioautogram  ekstrak  etil  asetat  setelah  perlakuan panas  menunjukkan  daya  hambat,  yang  menunjukkan stabilitas  senyawa  aktif  dalam  ekstrak  (Gambar  6). Teknik  analisis  yang  banyak  dibahas  oleh  Choma (2005)  ini  sangat  menguntungkan,  terutama  untuk memisahkan  campuran  antibiotika,  karena  minimal diperoleh  tiga  informasi  dari  teknik  ini,  (1)  jumlah senayawa,  (2)  aktivitas  senyawa  secara  kualitatif,  dan (3)  potensi  aktivitasnya.  KLT-densitometri  dapat digunakan  untuk  mendeteksi  campuran  analit  dalam
kromatogram,  tetapi  tidak  mampu  memberikan informasi aktivitasnya. Sebagai contoh gentamisin yang terdiri  dari  tiga  komponen  yang  dapat  dipisahkan dengan KLT dan diamati dengan densitometer (Isnaeni dkk., 2016), namun tidak dapat diketahui perbandingan aktivitas antibakteri ketiga komponen tersebut. Validasi metode  KLT-bioautografi  untuk  penentuan  kadar streptomisin sulfat telah dilakukan Warsito dkk. (2017) dan  memberikan  hasil  yang  memenuhi  parameter validasi.  Bakteri  uji  perlu  diperbanyak  untuk representasi  aktivitas  antimikroba  senyawa  yang terdeteksi pada kromatogram. Senyawa yang tidak aktif dengan mikroba uji yang digunakan pada penelitian ini dapat diujikan dengan galur atau spesies mikroba uji lain baik bakteri maupun jamur patogen.
Gambar 5. Profil KLT-bioautogram ekstrak etil asetat Streptomyces G terhadap Escherichia coli ATCC 8739 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538 (tanda panah menunjukkan noda yang aktif menghambat bakteri uji)
Gambar 6. Profil KLT-bioautogram ekstrak etil asetat supernatan hasil fermentasi Streptomyces G setelah perlakuan panas. EA = etil asetat; KLT = pelat KLT, St = standar tetrasiklin; 0 = Sampel tanpa perlakuan panas; 60 = Sampel setelah dipanaskan 60 o C selama 30 menit; 100 = Sampel setelah dipanaskan 100 o C selama 5 menit

## Penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM)
Pada penentuan KHM menggunakan uji modifikasi resazurin, aktivitas antibakteri ditandai dengan terbentuknya perubahan warna dari ungu menjadi merah muda (Gambar 7). Warna ungu atau biru menggambarkan adanya aktivitas antibakteri,  sehingga bakteri  uji  tidak  dapat  tumbuh.  Warna  merah  muda
mengindikasikan  adanya  pertumbuhan  bakteri  uji. Berdasarkan data yang diperoleh ekstrak etil asetat hasil fermentasi Streptomyces G  memiliki  nilai  KHM 128,75  ppm  dan  2575  ppm  masing-masing  terhadap Escherichia  coli ATCC  8739  dan Staphylococcus aureus ATCC 6538 (Gambar 7).
Gambar 7. Konsentrasi hambat minimum ekstrak metanol 10% supernatan hasil fermentasi Streptomyces G terhadap Escherichia coli ATCC 8739 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538 menggunakan resazurin sebagai indikator. B = blanko (media Nutrient Broth ); - =  kontrol negatif (metanol 10%); + =  streptomisin 202 ppm (kontrol positif); 1= ekstrak dalam metanol 10% (5150 ppm); 2 = ekstrak dalam metanol 10% (2575 ppm); 3 = ekstrak dalam metanol 10% (1030 ppm); 4 = ekstrak dalam metanol 10% (772,5 ppm); 5 = ekstrak dalam metanol 10% (515 ppm); 6 = ekstrak dalam metanol 10% (257,5 ppm); 7 = ekstrak dalam metanol 10% (206 ppm); 8 = ekstrak dalam metanol 10%
(128,75 ppm); 9 = ekstrak dalam metanol 10% (103 ppm); 10 = ekstrak dalam metanol 10% (77,25 ppm); 11 = ekstrak dalam metanol 10% (51,5 ppm); 12 = ekstrak dalam metanol 10% (25,75 ppm); 13 = ekstrak dalam metanol 10%
(10,3 ppm)

## KESIMPULAN
Ekstrak Streptomyces G  mengandung  2  senyawa yang berbeda dan hanya ada satu senyawa (R f 0,53) yang memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap Staphylococcus aureus ATCC 6538 serta Escherichia coli ATCC 8739.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  Research  Group  Isolasi senyawa aktif dari Streptomyces sp., outbound Students program yang  telah  memfasilitasi  penelitian  ini bekerjasama dengan UITM.

## DAFTAR PUSTAKA
Al-Ansari,  M.,  Alkubaisi,  N.,  Vijayaragavan,  P.  &
Murugan,  K.  (2019).  Antimicrobial  Potential  of Streptomyces Sp. to the Gram Positive and Gram Negative  Pathogens. Journal  of  Infection  and Public Health; 12; 861–866.
Al-Dhabi,  N. A.,  Ghilan,  A. M.,  Esmail,  G. A.,  Arasu,
A.  V.,  Duraipandiyan,  V.  &  Ponmurugan,  K.
(2019).  Bioactivity  Assessment  of  the  Saudi Arabian  Marine Streptomyces Sp.  Al-Dhabi-90, Metabolic  Profiling  and  Its  in  Vitro  Inhibitory Property  against  Multidrug  Resistant  and Extended-Spectrum  Beta-Lactamase  Clinical Bacterial  Pathogens. Journal  of  Infection  and Public Health; 12; 549–56.
Awad,  H.  M.,  El-Sahed,  K.  &  El-Nakkadi,  A.  (2009).
Isolation, Screening and Identification of Newly Isolated  Soil Streptomyces ( Streptomyces Sp. NRC-35)  for  b-Lactamase  Inhibitor  Production.
World Applied Sciences Journal; J7; 637–646.
Choma, I. (2005). The Use of Thinl-Layer Chromatography  with  Direct  Bioautography  for Antimicrobial Analysis. Chromatography Online; 18; 482-488.
Cuesta,  G.,  García-de-la-Fuente,  G.,  Abad,  M.  &
Fornes, F. (2012). Isolation and Identification of
Actinomycetes  from  a  Compost-Amended  Soil with  Potential  as  Biocontrol  Agents. Journal  of Environmental Management; 95; S280–S284. Gebreyohannes,  G.,  Moges,  F.,  Sahile,  S.  &  Raja,  N.
(2013).  Isolation  and  Characterization  of Potential  Antibiotic  Producing  Actinomycetes from  Water  and  Sediments  of  Lake  Tana, Ethiopia. Asian  Pacific  Journal  of  Tropical Biomedicine; 3; 426–435.
Hopwood,  D.  A.  (2007).  Streptomyces  in  Nature  and
Medicine:  The  Antibiotic  Makers.  Oxford; University Press.
Isnaeni, Astuti, A. & Yuwono, M. (2017). Validation of
Thin-Layer Chromatography-Bioautographic
Method  for  Determination  of  Streptomycin.
Jurnal Farmasi dan Ilmu Kefarmasian
Indonesia; 4; 34–38.
Isnaeni, Kusumawati, I., Warsito, M. F., Darmawati, A.
&  Mertaniasih,  N.  M.  (2016).  Antimicrobial Activity  of Streptomyces Sp.  Isolates  from Vegetable  Plantation  Soil. Berkala  Penelitian Hayati; 21; 69–74.
Kharat  K.  R.,  Kharat  A.  &  Hardikar,  B.  P.    (2009).
Antimicrobial  and  Cytotoxic  Activity  of Streptomyces  sp.  from  Lonar  Lake. African Journal of Biotechnology; 8; 6645-6648.
Nampoothiri,  K.  M.,  Ramachandran,  S., Soccol,  C.  R. Pandey,  A.  (2002).  Advances  in  Fermentation Technology. International  Sugar  Journal;  104; 493–499.
Pandey,  B.,  Prakash,  G.  &  Vishwanath,  P.  A.  (2004).
Studies  on  the  Antibacterial  Activity  of  the Actinomycetes  Isolated  from  the  Khumbu Region of Nepal. Journal of Applied Microbiology ;12; 421–423.
Singh, P. N. N. & Pandey, A. (2009). Biotechnology for Agro-Industrial Residues Utilisation. Dordrecht: Springer.
Valli,  S.,  Suvathi,  S.  S,  Aysha,  O.  S.,  Nirmala,  P., Kumar, P. V. & Reena, A. (2012). Antimicrobial Potential of Actinomycetes Species Isolated from Marine  Environment. Asian  Pacific  Journal  of Tropical Biomedicine; 2; 469–473.
Warsito,  M.  F.,  Nasution,  N. E.,  Merthaniasih,  N.  M., Poernomo,  A.  T.,  Fairuz,  D.  &  Hanifah,  A. (2017). Antibacterial Activity of Butanol Extract from Cell Free Fermentation Broth of Streptomyces Sp.  Isolated  from  Vegetable Plantation Soil. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences; 8; 1921–1927.
Yücel, S. & Yamaç, M. 2010. Selection of Streptomyces Isolates  from  Turkish  Karstic  Caves  against Antibiotic  Resistant  Microorganisms. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences; 23; 1–6. Zothanpuia,  A.,  Passari,  K.,  Preeti,  C.,  Vineet,  K.,
Mishra, B. K. & Bhim, P. S. (2018). Production of Potent Antimicrobial Compounds from Streptomyces cyaneofuscatus Associated with Fresh Water Sediment. Frontier Microbiology; 10; 1681 .