Isolasi  Fungi  Tanah  Muara  Desa  Pasir  Putih  Kabupaten Situbondo  serta  Penapisan Aktivitas Antibakteri  terhadap

## Staphylococcus aureus
(Isolation of Soil Fungi from Pasir Putih Estuary in Situbondo Regency  and  Screening  of Antibacterial Activity  against Staphylococcus aureus )
ZIYAN NIHLATUL MILLAH 1 , BAWON TRIATMOKO 1 , ARI SATIA NUGRAHA 1*
1 Drug Utilisation and Discovery Research Group , Fakultas Farmasi, Universitas Jember, Jember, Jawa Timur, 68121, Indonesia
Diterima 27 April 2021, Disetujui 4 Juli 2022
JURNAL ILMU KEFARMASIAN  INDONESIA, Oktober 2022,  hlm. ISSN 1693-1831
Abstract: Healthcare-Associated  Infections  (HAIs)  is  a  bacterial  infections  in  Indonesia  caused  by Staphylococcus aureus . According to the World Health Organization (WHO), the prevalence of HAIs in developing countries varies between 5.7% and 19.1% with a combined prevalence of 10.1%. The prev- alence of HAIs in Indonesia is 7.1%. Infections caused by bacteria are a life-threatening disease, which needs to be treated immediately by administering antibacterial agents. One of the natural products with potential as new antibacterial agents, such as soil fungi. This research aims to discover the Antibacterial activity of fungi on estuary land at Pasir Putih village, Situbondo, East Java. This research was initiated by growing the soil on the PDA media to isolate six fungi which were labeled as IS-B1-A1, IS-B1-A2, IS-B1-T1, IS-B1-T2, IS-B1-B1, and IS-B1-B2. All the isolated fungi were separately fermented for 14 d and extracted using ethyl acetate before the microdilution test. The result of antibacterial testing showed all extracts from isolated fungi with code IS-B1-A1, IS-B1-A2, IS-B1-T1, IS-B1-T2, IS-B1-B1, and IS-B1-B2 possessed antibacterial activity against Staphylococcus aureus with percentage inhibition of 51.1±2.6%; 84.6±3.1%; 72.7±7.9%; 82.9±7.6%; 65.6±0.8%; 88.2±2.8% at a concentration of 100 μg/mL.
Keywords: Antibacterial activity, microdilution, soil fungi, Staphylococcus aureus
Abstrak : Infeksi nosokomial merupakan infeksi bakteri yang sering terjadi di Indonesia dan disebabkan oleh  bakteri Staphylococcus  aureus .  Menurut  data World  Health  Organization (WHO)  prevalensi infeksi  nosokomial  di  negara  berkembang  berkisar  antara  5,7%  hingga  19,1%  dengan  prevalensi gabungan  sebesar  10,1%  dan  prevalensi  infeksi  nosokomial  di  Indonesia  sebesar  7,1%.  Infeksi merupakan penyakit yang mengancam jiwa, sehingga perlu penanganan cepat dengan pemberian  agen antibakteri. Salah satu sumber bahan alam yang berpotensi sebagai agen antibakteri baru yaitu fungi tanah. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri fungi tanah  yang diisolasi dari muara  di  Desa  Pasir  Putih,  Situbondo,  Jawa  Timur.  Penelitian  ini  dilakukan  dengan  menumbuhkan sampel  tanah    pada  media  PDA  hingga  didapat  enam  isolat  yang  diberi  label  IS-B1-A1,  IS-B1-A2, IS-B1-T1,  IS-B1-T2,  IS-B1-B1,  dan  IS-B1-B2. Semua  isolat  kemudian  difermentasi  selama  14  hari dan diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat sebelum dilakukan uji mikrodilusi. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus menunjukkan bahwa semua ekstrak dari isolat fungi kode IS-B1-A1,  IS-B1-A2,  IS-B1-T1,  IS-B1-T2,  IS-B1-B1,  dan  IS-B1-B2  memiliki  aktivitas  antibakteri terhadap Staphylococcus  aureus dengan  nilai  persen  penghambatan  sebesar  51,1±2,6%;  84,6±3,1%; 72,7±7,9%; 82,9±7,6%; 65,6±0,8%; dan 88,2±2,8% pada konsentrasi 100 µg/mL.
Kata kunci : Aktivitas antibakteri, fungi tanah, mikrodilusi, Staphylococcus aureus
MILLAH ET AL.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
151
Meskipun  memiliki  potensi  yang  cukup  besar, namun penelitian fungi tanah sangatlah terbatas. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi fungi dari  tanah muara dalam  menghambat pertumbuhan bakteri. Tanah muara diambil dari Desa Pasir  Putih,  Kabupaten  Situbondo  karena  memiliki ekosistem  bakau  yang  baik  serta  dekat  dengan lokasi  penelitian.  Bakteri  uji  yang  digunakan  yaitu Staphylococcus aureus dengan metode mikrodilusi. Metode  ini  digunakan  untuk  mengetahui  persen penghambatan pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus yang  diamati  dengan  tingkat  kekeruhan koloni bakteri setelah pemberian ekstrak fungi single concentration.

## BAHAN DAN METODE
BAHAN. Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian ini  yaitu  sampel  tanah muara  sungai  Desa  Pasir Putih  Kecamatan  Bungatan  Kabupaten  Situbondo, air  demineralisata  (Hydrobatt), Potato  Dextrose Agar (PDA, Himedia), Potato Dextrose Broth (PDB, Himedia), Mueller  Hinton  Agar (MHA,  Merck), Mueller  Hinton  Broth (MHB,  Himedia),  bakteri Staphylococcus aureus ATCC 6538, akuades steril, air laut, etil asetat, gentamisin sulfat i.m/i.v (Indofarma), dimetil sulfoksida (DMSO), etanol 70%, CaCl 2 , BaCl 2 , dan H 2 SO 4 . Alat. Alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu neraca  analitik  (OHAUS), hotplate (HEIDOLPH), vortex  (HEIDOLPH),  sentrifus,  mikropipet (SOCOREX), autoklaf (B-ONE YX-18LM), Laminar Air Flow (THERMO SCIENTIFIC 1300 SERIES A2), spektrofotometer  UV-Vis  (GENESYS),  inkubator, shaker  incubator (B-ONE), microplate  ﬂ at  bottom 96  wells (IWAKI),  dan microplate  reader (Corona SH-1000).
METODE.  Pengambilan  Sampel  Tanah Muara. Sampel tanah diambil pada tanggal 30 Juli 2019 menggunakan pipa paralon ukuran 40 x 2,8 cm. Hasil sampling dibagi menjadi 3 bagian yaitu tanah bagian atas (5 cm di bagian atas pipa), tanah bagian tengah, dan tanah bagian bawah (5 cm bagian bawah pipa). Sampel tanah disimpan dalam freezer dengan suhu -4˚C.
Penanaman dan Isolasi Fungi Tanah. Sampel tanah disuspensikan dalam akuades steril, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 100 rpm selama 15 menit.  Supernatan  diratakan  pada  media  PDA  dan diinkubasi pada suhu ± 25 ˚C.  Pada hari ke tujuh, fungi dalam cawan petri diisolasi di media PDA yang baru.
Skrining aktivitas antibakteri. Skrining aktivitas antibakteri  dilakukan  menggunakan  uji  antagonis

## PENDAHULUAN
INFEKSI  menjadi  sepuluh  penyakit  penyebab kematian  tertinggi  di  dunia (1) .  Hingga  tahun  2019 angka kematian akibat infeksi bakteri mencapai 1,2 juta orang pertahun dan diperkirakan  pada tahun 2050 kematian akibat infeksi bakteri terus meningkat hingga mencapai 10 juta orang pertahun (2) . Hal inilah yang menjadikan kasus infeksi menjadi salah satu ancaman terbesar di dunia kesehatan (3) . Salah satu kasus infeksi yang terjadi di Indonesia adalah infeksi nosokomial yang  disebabkan  oleh  bakteri Staphylococcus aureus .  Berdasarkan  survei  yang  dilakukan  di Rumah  Sakit  di Amerika  Serikat  dari  9,000  pasien dilaporkan  meninggal  karena  mengalami  infeksi nosokomial (4) . Selain itu dari data WHO prevalensi infeksi nosokomial pada negara berkembang cukup tinggi berkisar 15,74% dimana jauh lebih tinggi dari negara  maju  dengan  kasus  berkisar  4,8%  sampai 15,5% (5) . Infeksi tersebut merupakan penyakit yang bersifat life-threatening sehingga  membutuhkan penanganan  cepat,  salah  satunya  yaitu  pemberian antibakteri.
Antibakteri  merupakan  terapi  utama  yang digunakan untuk pengobatan infeksi yang disebabkan oleh  bakteri. Berdasarkan  sejarah  antibakteri golongan penisilin ditemukan pada tahun 1928 oleh Alexander  Fleming  dari  fungi Penicillium  notatum (6) .  Penelitian oleh Corral tahun 2018 menyebutkan bahwa Aspergillus  protuberus yang  diisolasi  dari tanah sedimen laut mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus  aureus dengan Minimum Inhibitory  Concentration (MIC)  sebesar  30  μg/ mL (7) .  Penelitian  sebelumnya  tentang  isolasi  dan antibakteria dari fungi dari tanah muara di Kabupaten Situbondo menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas  aeruginosa (8) .  Dari  hasil  penelitian tersebut,  dilakukan  penelusuran  fungi  tanah  muara di  daerah  Desa  Pasir  Putih,  Kecamatan  Bungatan, Kabupaten  Situbondo  sebagai  sumber  potensi antibakteri  baru. Pada  penelitian  ini  digunakan sampel tanah muara yang diambil di dekat perakaran bakau,  karena  pohon  bakau  pada  ekosistem  muara menjadi  sumber  karbon  dan  nitrogen  yang  baik bagi  tanah  muara.  Ketersediaan  bahan  organik  ini memberikan nutrisi yang baik untuk fungi, sehingga banyak  ditemukan  spesies  fungi  di  tanah  muara (9) . Selain  itu,  pada  muara  sungai  terdapat  perbedaan konsentrasi garam yang menciptakan kondisi ekstrim untuk fungi, sehingga fungi dapat beradaptasi dengan memproduksi metabolit sekunder untuk pertahanan diri (10) .  Hal  inilah  yang  menjadikan  tanah  muara sebagai sumber potensi alam yang dapat digunakan sebagai antibakteri baru.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia ` 152 antara bakteri Staphylococcus aureus dan isolat fungi dalam  media  MHA.  Media  diinkubasi  pada  suhu 35±2˚C selama 18-24 jam.
Fermentasi dan Ekstraksi. Sebanyak 5 potong fungi dengan diameter 0,9x0,9 cm difermentasi dalam 200  mL  media  PDB.  Fermentasi  dilakukan  dalam shaker  inkubator selama  14  hari.  Hasil  fermentasi kemudian  disaring  dan  ditambah  etil  asetat  dengan perbandingan 1:1. Pengadukan dilakukan selama 15 menit dengan magnetic stirer , lalu dituangkan dalam corong  pisah.  Proses  ekstraksi  dilakukan  3-4  kali partisi.
Uji Aktivitas Antibakteri Metode Mikrodilusi. Pembuatan  media Cation  Adjusted  Mueller-Hinton Broth (CAMHB)  dilakukan  dengan  menambahkan larutan CaCl 2 dan MgCl 2 pada media MHB hingga didapatkan  konsentrasi Ca 2+ dalam media sejumlah 20-25  mg/L  dan  Mg 2+ sejumlah  10-12,5  mg/L (11) .
Pembuatan  larutan  kontrol  positif  dibuat  dengan mengencerkan sediaan injeksi gentamisin sulfat 40 mg/mL (Indofarma) menggunakan media CAMHB sehingga didapatkan konsentrasi 1µg/mL, sedangkan kontrol negatif dibuat dengan melarutkan 1mL DMSO 1% dalam 100 mL media CAMHB. Pembuatan larutan uji dilakukan dengan melarutkan 1 mg ekstrak fungi dengan  100 µL DMSO 100% dan diencerkan dalam media  CAMHB  hingga  didapatkan  konsentrasi  uji sebesar 100 µg/mL.
Mikrodilusi. Bakteri  diremajakan  dan  dibuat biakan aktifnya untuk disuspensikan dalam CAMHB, kemudian  dibandingkan  dengan  pembanding  0,5 McFarland agar didapatkan konsentrasi sebesar 1x10 8 CFU/mL (12) . Suspensi selanjutnya diencerkan dalam CAMHB  menjadi  100  kalinya  hingga  didapatkan konsentrasi bakteri 1x10 6 CFU/mL. Setiap sumuran ditambahkan 50 µL suspensi bakteri dan ditambahkan 50 µL kontrol positif, kontrol negatif dan larutan uji. Pada tiap sumuran konsentrasi akhir bakteri sebesar 5 x 10 4 CFU.  Desain mikroplate ditunjukkan  pada Gambar 1.

## Keterangan:
Ekstrak etil asetat fermentasi fungi tanah dalam DMSO 1% 50 µL + bakteri dalam CAMHB 50 µL (sampel uji)
Ekstrak etil asetat fermentasi fungi tanah dalam DMSO 1% 50 µL + media CAMHB 50 µL (kon- trol ekstrak)
Gentamisin 50 µL + media CAMHB 50 µL (kon- trol gentamisin)
Gentamisin 50 µL + bakteri dalam CAMHB 50 µL (kontrol positif)
DMSO 1% dalam media CAMHB 50 µL + media CAMHB 50 µL (kontrol DMSO 1%)
DMSO 1% dalam CAMHB 50 µL + bakteri dalam CAMHB 50 µL (kontrol negatif ekstrak)
Media CAMHB 100 µL (kontrol media)
Gambar  1.  Desain  mikroplate  ekstrak  etil  asetat  dengan metode mikrodilusi.
Gambar  2.  Hasil  penanaman  fungi  pada  hari  ke-7  dalam media PDA (A) tanah atas; (B) tanah tengah; dan (C) tanah bawah.
Analisis  Data .  Nilai  persen  penghambatan  di- hitung berdasarkan rumus persamaan sebagai berikut. Persentase penghambatan pertumbuhan bakteri=
( 1 - (Abs Y - Abs Z) ) X 100% (Abs W- Abs X)
Keterangan: W : kontrol negatif ekstrak atau gentamisin X : kontrol DMSO 1% atau media CAMHB Y : larutan uji ekstrak atau gentamisin Z : kontrol ekstrak atau gentamisin Abs : absorbansi
Data  yang  didapat  dianalisis  menggunakan independent samples t-test .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penanaman  dan  Isolasi  Fungi Tanah. Hasil penanaman  dan  isolasi  fungi  dapat  dilihat  pada Gambar 2 dan Gambar 3.
Gambar 2A merupakan hasil  penanaman fungi dari tanah atas.  Terdapat dua koloni yang berbeda. Koloni pertama menyebar hampir ke seluruh bagian cawan  petri,  berwarna  kecoklatan,  serta  memiliki permukaan  yang  halus,  sedangkan  koloni  kedua membentuk  bulatan  kecil,  hanya  terdapat  pada beberapa  titik,  berwarna  coklat  lebih  gelap  dengan permukaan yang lebih kasar dan tebal. Gambar 2B merupakan hasil penanaman fungi dari tanah tengah. Terdapat dua koloni berbeda, koloni pertama berwarna
MILLAH ET AL.
153
putih dan menyebar di seluruh permukaan cawan petri, sedangkan koloni kedua berwarna putih susu dengan koloni membentuk bulatan kecil dan hanya pada satu bagian tertentu di sebelah kiri cawan petri. Gambar 2C merupakan hasil penanaman fungi dari tanah bawah. Terdapat dua koloni yang berbeda, yang pertama yaitu koloni berwarna putih susu yang membentuk satu titik kecil di bagian kiri cawan petri. Koloni yang kedua berwarna putih kekuningan dengan permukaan halus dan menyebar di seluruh bagian cawan petri. Masing- masing  dari  koloni  di  tiap  bagian  tanah  kemudian diisolasi tepat pada hari ke tujuh, sehingga didapatkan 6 isolat fungi yang dapat dilihat pada Gambar 3 dan Tabel 1.
4. Ditemukan sel berbentuk bulat ( uniseluler ) serta tidak  ditemukan  bagian  seperti  hifa  dan  miselium, sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa  fungi  termasuk dalam jenis khamir.
Skrining  Awal  Aktivitas  Antibakteri. Adanya  aktivitas  antibakteri  dapat  diamati  dengan terbentuknya  zona  bening  di  sekitar  fungi  yang menandakan  penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus seperti pada Gambar 5 dan 6. Diameter hambat tertera pada Tabel 2.
Uji  antagonis  menganut  prinsip  metode  difusi. Metabolit sekunder dari fungi akan berdifusi pada me- dia yang berisi biakan bakteri. Dari hasil uji antagonis fungi IS-B1-A1 memiliki zona hambat paling besar dilanjutkan dengan IS-B1-T2, IS-B1-B1, IS-B1-T1, dan IS-B1-B2, sedangkan fungi IS-B1-A2 tidak ter- dapat  zona  bening  yang  menandakan  tidak  adanya aktivitas antibakteri.
Fermentasi  dan  Ekstraksi. Volume  hasil fermentasi  fungi  tanah  secara batch  process dapat dilihat pada Tabel 3.
Gambar 3. Hasil isolasi fungi (A) IS-B1-A1; (B) IS-B1-A2; (C) IS-B1-T1; (D) IS-B1-T2; (E) IS-B1-B1; dan (F) IS-B1-B2.
Bagian Tanah Nama Isolat Ciri-ciri Morfologi Atas IS-B1- A1 Warna  putih  kekuningan, warna dominan kuning, bertekstur,  tidak  berhifa,  dan terdapat bintik-bintik berwarna coklat Atas IS-B1- A2 Warna  putih  kekuningan dengan  permukaan  yang halus dan tidak berhifa Tengah IS-B1- T1 Warna  putih  kekuningan  dan bertekstur,  pada  bagian  yang tidak  bertekstur  berwarna kekuningan,  sedangkan  pada bagian yang bertekstur berwarna  putih,  dan  tidak berhifa Tengah IS-B1- T2 Warna  kekuningan  dengan permukaan  yang  halus  dan tidak berhifa Bawah IS-B1- B1 Warna  putih  kekuningan, tidak berhifa, dan bertekstur Bawah IS-B1- B2 Warna putih kekuningan dengan permukaan yang halus dan tidak berhifa Tabel 1. Nama isolat fungi dan ciri-ciri morfologinya.
Beberapa  mikroorganisme  yang  dapat  ditemui di  tanah  yaitu  bakteri, Actinomycetes,  dan  fungi. Secara makroskopis koloni Actinomycetes berbentuk kasar,  berpigmen,  berfilamen,  dan  berbau  seperti tanah  basah.  Koloni  bakteri  memiliki  permukaan halus,  berwarna  putih,  putih  kekuningan,  kuning, menggerombol,  bentuk  bundar  berpasangan,  dan mengkilap (13) . Dari pengamatan makroskopis tersebut, koloni yang tumbuh dipastikan bukan Actinomycetes maupun  bakteri  dikarenakan  koloni  tidak  memiliki ciri-ciri keduanya.
Berdasarkan  perbedaan  morfologi  terdapat dua  jenis  fungi,  yaitu  kapang  ( mold )  dan  khamir ( yeast ).  Kapang  merupakan  fungi  yang  memiliki miselium, spora, serta koloni dengan permukaan kasar, berﬁ lamen, bagian tepi berwarna pudar dibandingkan bagian pusat koloni, dan berwarna gelap. Sedangkan khamir  merupakan  fungi  dalam  bentuk  sel  tunggal ( uniseluler ) yang memiliki koloni dengan permukaan halus,  tidak  berfilamen,  tidak  mengkilap,  warna cenderung  mendekati  putih  dan  putih  kekuningan seperti koloni bakteri (14) . Isolat fungi yang didapatkan pada  penelitian  ini  merupakan  fungi  jenis  khamir dibuktikan dengan  hasil pengamatan mikroskopis menggunakan perbesaran 400x seperti  pada Gambar
Tabel 3. Hasil fermentasi dan ekstraksi.
Nama Fungi Hasil Fermentasi (mL) Bobot Ekstrak (g) Rendemen Ekstrak (% g/mL) IS-B1-A1 174 0,102 0,059 IS-B1-A2 184 0,092 0,050 IS-B1-T1 186 0,107 0,057 IS-B1-T2 186 0,056 0,030 IS-B1-B1 171 0,096 0,056 IS-B1-B2 181 0,190 0,105
Volume hasil fermentasi paling besar didapatkan oleh fungi IS-B1-T1 dan IS-B1-T2. Hal ini dikarenakan saat penyaringan menggunakan corong buchner kedua isolat tidak terbentuk busa, sedangkan saat penyaringan hasil fermentasi isolat fungi IS-B1-A1 dan IS-B1-B1 terbentuk  banyak  busa  dan  mengakibatkan  volume yang didapat lebih sedikit dibandingkan isolat fungi yang lain.
Fermentasi  pada penelitian  ini  digunakan  jenis batch process dikarenakan proses dan kontrol media yang  lebih  sederhana,  biaya  lebih  sedikit,  serta
Gambar 4. Hasil mikroskopik fungi (A) IS-B1-A1; (B) IS-B1-A2; (C) IS-B1-T1; (D) IS-B1-T2; (E) IS-B1-B1;(F) IS-B1-B2 dengan perbesaran 400x.
Gambar 5. Tanah Atas (A) dan (B) IS-B1-A1; (C) IS-B1-A2.
A B C D
Gambar 6. Tanah  tengah  (A) IS-B1-T1; (B) IS-B1-T2; dan tanah bawah (C) IS-B1-B1; (D) IS-B1-B2.
Tabel 2. Hasil uji antagonis. Nama Fungi Hasil uji Zona Hambat (mm) IS-B1-A1 + 13,5 IS-B1-A2 - Tidak ada IS-B1-T1 + 9,8 IS-B1-T2 + 12,0 IS-B1-B1 + 11,8 IS-B1-B2 + 9,7
Tabel 3. Hasil fermentasi dan ekstraksi.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia ` 155 dapat meminimalisir  adanya  kontaminasi (15) . Proses fermentasi dilakukan selama 14 hari agar didapatkan metabolit sekunder dengan jumlah yang maksimal (16) .
Hasil fermentasi yang diekstraksi dengan metode partisi cair-cair menggunakan pelarut etil asetat dapat dilihat pada Tabel 3. Rendemen ekstrak paling besar didapatkan oleh fungi IS-B1-B2 dengan %rendemen sebesar 0,105% g/mL.
Pelarut etil asetat dipilih karena dapat menarik metabolit  sekunder  fungi  yang  bersifat  polar  dan nonpolar, serta lebih aman digunakan dibandingkan dengan  pelarut  lainnya  seperti  diklorometana  dan klorofom (17) . Proses ekstraksi dilakukan dalam corong pisah. Hasil campuran antara cairan fermentasi dan etil asetat membentuk dua fase yang tidak saling campur, yaitu fase air dan fase organik. Hal ini menandakan sebagian  komponen  larut  pada  fase  pertama  dan sebagian komponen yang lain larut pada fase kedua sesuai dengan tingkat kepolarannya (18) .
Uji Aktivitas Antibakteri. Hasil  uji  aktivitas antibakteri  dengan  metode  mikrodilusi  didapatkan aktivitas penghambatan terbesar dimiliki oleh fungi IS-B1-B2, dilanjutkan dengan IS-B1-A2, IS-B1-T2, IS-B1-T1, IS-B1-B1 dan IS-B1-A1 sebagaimana yang ditunjukkan pada Gambar 7.
Penelitian ini menggunakan gentamisin sebagai kontrol  positif.  Berdasarkan  CLSI,  konsentrasi gentamisin yang digunakan pada pengujian terhadap bakteri Staphylococcus aureus dalam media CAMHB yaitu  sebesar  0,12-1  µg/mL,  sedangkan  persen penghambatan  yang  dipersyaratkan  sebesar  ≥80%. Hasil rerata persen penghambatan gentamisin terhadap bakteri Staphylococcus  aureus pada  penelitian  ini sebesar 98,8% dan telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan  dalam  CLSI,  sehingga  secara  teoritis metode  yang  digunakan  telah  sesuai. Apabila  hasil
persen penghambatan kontrol positif  <80% (19) , maka terdapat kesalahan dalam pembuatan media CAMHB dan  perlu  dilakukan  penyesuaian  kadar  Ca 2+ serta Mg 2+ dalam media. Ion divalen pada Ca 2+ dan Mg 2+ dapat mempengaruhi stabilitas membran sel bakteri, oleh karena itu kadar Ca 2+ dan Mg 2+ harus berada pada rentang yang telah dipersyaratkan (20) .
Sampel ekstrak etil asetat fungi tanah digunakan sebagai  kelompok  perlakuan.  Ekstrak  dilarutkan menggunakan bantuan kosolven DMSO. Etanol dan metanol  tidak  disarankan  sebagai  kosolven  ekstrak dalam  pengujian  antibakteri,  dikarenakan  kedua kosolven  tersebut  memiliki  aktivitas  bakterisidal terhadap Staphylococcus aureus (21) . Pada konsentrasi tinggi  DMSO  memiliki  aktivitas  bakteriostatik, sedangkan pada konsentrasi rendah DMSO tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri, sehingga dipilih konsentrasi DMSO sebesar 1%.
Berdasarkan  hasil  pengujian  ekstrak  etil  asetat fungi tanah terhadap bakteri Staphylococcus aureus , dinyatakan  bahwa  aktivitas  penghambatan  terbesar dimiliki oleh ekstrak fungi IS-B1-B2 dengan rerata persen  penghambatan  sebesar  88,2%  ±  2,8%, namun  hasil  ini  berbanding  terbalik  dengan  hasil uji  antagonis.  Pada  uji  antagonis  fungi  IS-B1-B2 memiliki  zona  hambat  paling  kecil  dibandingkan dengan  isolat  yang  lain,  yaitu  9,7  mm.  Fungi  IS- B1-A2 memiliki rerata persen penghambatan sebesar 84,6%,  sedangkan  pada  hasil  uji  antagonis  tidak terdapat zona hambat yang terbentuk. Kedua hal ini dikarenakan adanya perbedaan media yang digunakan pada  saat  uji  antagonis  dan  mikrodilusi.  Saat  uji antagonis  digunakan  media  MHA  dengan  pelarut air  sehingga  senyawa  yang  berdifusi  pada  media cenderung bersifat polar. Sedangkan pada mikrodilusi sampel sudah dalam bentuk ekstrak dimana ekstraksi dilakukan  dengan  menggunakan  pelarut  etil  asetat yang merupakan pelarut semipolar, sehingga senyawa yang bersifat polar dan nonpolar akan ikut terekstrak. Hal  ini  menyebabkan  ekstrak  etil  asetat  fermentasi fungi tanah lebih poten dibandingkan dengan fungi sebelum diekstrak. Selain itu uji antagonis dilakukan ketika fungi berusia 7 hari, sedangkan saat ekstraksi fungi  berusia  14  hari.  Adanya  perbedaan  usia tumbuh fungi dapat mempengaruhi jumlah metabolit sekundernya (22) .
Senyawa  yang  berperan  dalam  aktivitas antibakteri ekstrak fungi tanah belum diketahui secara pasti, sehingga perlu dilakukan skrining ﬁ tokimia serta isolasi dan karakterisasi senyawa aktif fungi. Beberapa metabolit  sekunder  fungi  yang  memiliki  aktivitas antibakteri antara lain alkaloid dan terpenoid (23) .
Gambar 7. Diagram batang persen penghambatan gentamis- in  dan  ekstrak  etil  asetat  fungi  tanah  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus ,  hasil  analisis  menggunakan independent  samples  t-test dengan  (a,b,c)  huruf  yang  sama menunjukkan  tidak  ada  perbedaan  signifikan  (p>0,05) antar kelompok uji.
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
156
11.  Reller  LB,  Weinstein  M,  Jorgensen  JH,  Ferraro MJ. Antimicrobial  susceptibility  testing:  a  review of  general  principles  and  contemporary  practices. Clinical Infectious Diseases. 2009;49(11):1749-55. 12.  Humphries R, Bobenchik AM, Hindler JA, Schuetz AN.  Overview  of  changes  to  the  clinical  and laboratory standards institute performance standards for antimicrobial susceptibility testing, M100. Journal of clinical microbiology. 2021;59(12):e00213-21.
13.  Jeanson  S,  Floury  J,  Gagnaire  V,  Lortal  S, Thierry A.  Bacterial  colonies  in  solid  media  and  foods:  a review  on  their  growth  and  interactions  with  the micro-environment.  Frontiers  in  Microbiology. 2015;6(1284):1-20.
14.  Murray, Patrick R, Rosenthal, Ken S, Pfaller, Michael A.  Fungal  classiﬁ cation, structure, and replication. Medical Microbiology. 2021;57:572-77.
15.  Yang Y,  Sha  MA.  Beginner’s  guide  to  bioprocess modes–batch, fed-batch, and continuous fermentation. Enﬁ eld, CT: Eppendorf Inc. 2019:408:1-16.
16.  Li HT, Zhou H, Duan RT., et al. Inducing secondary metabolite production by co-culture of the endophytic fungus Phoma sp. and the symbiotic fungus Armillaria sp. J ournal of natural products.  2019;82(4):1009-13. 17.  Joshi  DR, Adhikari  N. An  overview  on  common organic solvents and their toxicity. J. Pharm. Res. Int. 2019:28(3):1-18.
18.  Zhuang B, Ramanauskaite G, Koa ZY, Wang ZG. Like dissolves like: A ﬁ rst-principles theory for predicting liquid  miscibility  and  mixture  dielectric  constant. Science Advances. 2021;7(7):7275.
19.  Wayne  Performance  Standards  for Antimicrobial. Edisi 27. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2017. p. 56-63.
20.  Wang T, Flint S, Palmer J. Magnesium and calcium ions:  roles  in  bacterial  cell  attachment  and  bioﬁ lm structure maturation. Biofouling. 2019;35(9): 959-74.
21.  Elzain AM, Elsanousi SM, Ibrahim MEA. Eﬀ ectiveness of ethanol and methanol alcohols on diﬀ erent isolates of Staphylococcus  species .  J.  Bacteriol.  Mycol. 2019;7:71-3.
22.  Keller NP. Fungal secondary metabolism: regulation, function  and  drug  discovery.  Nature  Reviews Microbiology. 2019;17:167–80.
23.  Devi,  Rubee,  et  al.  Fungal  secondary  metabolites and  their  biotechnological  applications  for  human health.  In:  New  and  Future  Developments  in Microbial  Biotechnology  and  Bioengineering. Elsevier. 2020:147-61.

## SIMPULAN
Hasil  uji  aktivitas  antibakteri  didapatkan  bahwa semua  ekstrak  etil  asetat  fungi  memiliki  aktivitas penghambatan  terhadap Staphylococcus  aureus dengan rerata persen penghambatan ekstrak terbesar berturut-turut  yaitu  IS-B1-B2  sebesar  88,2±2,8%; IS-B1-A2  sebesar  84,6±3,1%;  IS-B1-T2  sebesar 82,9±7,6%;  IS  IS-B1-T1  sebesar  72,7±7,9%;  IS- B1-B1 sebesar 65,6±0,8%; dan IS-B1-A1 sebesar 51,1 ± 2,6 %. Dari hasil penelitian ini membuktikan bahwa fungi  yang  diisolasi  dari  tanah  muara  Desa  Pasir Putih, Kabupaten Situbondo dapat digunakan sebagai sumber  agen  antibakteri  dalam  penanganan  kasus infeksi yang disebabkan oleh bakteri Staphylococcus aureus .

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Vos  T,  Lim  SS, Afshin A.  Global  burden  of  369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990–2019: a systematic analysis for the global burden of disease study 2019. The lancet. 2020;396:1204-22.
2.   Murray  CJL,  Ikuta  KS,  Sharara  F,  et  al.  Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. The Lancet. 2022; 399:629–55
3.   Bloom DE, Cadarette D.  Infectious disease threats in the twenty-ﬁ rst century: strengthening the global response. Frontiers in Immunology. 2019;10(549):1- 12.
4.   Sartelli  M,  Mckimm  J,  Bakar  MA.  Health  care- associated infections an overview. 2018:11:2321-33.
5.   Sazkiah  ER,  Ismah,  Zata.  The  epidemiological determination  of  nosocomial  infection  in  inpatients at Adam Malik General Hospital, Meda. Placentum. 2022;10(2):99-111.
6.   Hess K.  Fleming vs ﬂ orey: It all comes down to the mold. The Histories. 2019;2(1):1-18.
7.   Corral P, Esposito FP, Tedesco P. et al. Identiﬁ cation of a Sorbicillinoid-producing Aspergillus strain with antimicrobial activity against Staphylococcus aureus : a new polyextremophilic marine fungus from Barents Sea. Mar Biotechnol. 2018; 20:502–11.
8.  Pamungkas  FB,  Triatmoko  B,  Nugraha  AS. Penelusuran  dan  isolasi  fungi  tanah  Kabupaten Situbondo serta skrining aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas  aeruginosa .  Jurnal  Kefarmasian Indonesia. 2021;19(1): 73-9.
9.  Jansa J, Forczek ST, Rozmoš M, Püschel D, Bukovská P,  Hršelová  H.  Arbuscular  mycorrhiza  and  soil organic nitrogen: network of players and interactions. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2019;6(1): 1-10.
10.  Velez,  Patricia.  Impact  of  salinity  stress  on  growth and development of aquatic fungi. In: Microorganisms in  Saline  Environments:  Strategies  and  Functions.
Springer. Cham. 2019:155-68.