Juni 2022, Vol. 9 No. 1: 72 – 84
pISSN : 2355-9942, eISSN:2656-792X
Terakreditasi Nasional, Dirjen Pendidikan Tinggi, Riset, dan Teknologi
Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset dan Teknologi RI
S.K. No. 105/E/KPT/2022 Received: 5 November 2021, Accepted: 11 Juni 2022 Published online: 30 Juni 2022
Doi: https://doi.org/10.35508/nukleus.v9i1.5491 https://ejurnal.undana.ac.id/index.php/nukleus/article/view/5491

## KUALITAS SEMEN BEKU BABI DUROC DALAM PENGENCER TRIS MODIFIKASI DENGAN WAKTU EKUILIBRASI YANG BERBEDA
(The frozen sperm quality of duroc pig in modified tris diluent with different equilibration time)
Selsiana Dongkot * , Aloysius Marawali, Thomas M. Hine, Wilmientje M. Nalley Program Studi Peternakan, Fakultas Peternakan, Kelautan, dan Perikanan, Universitas Nusa Cendana Jln. Adisucipto, Penfui, Kupang, Nusa Tenggara Timur, Indonesia 850001
* Correspondent author, email : selsidongkot01@gmail.com

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk menguji kualitas semen beku babi duroc dalam pengencer Tris modifikasi dengan waktu  ekuilibrasi  yang  berbeda.  Semen  dikoleksi  dari  dua  ekor  pejantan  duroc  dan  dievaluasi  secara makroskopis dan mikroskopis. Semen dengan motilitas ≥ 75%, konsentrasi ≥ 200 x 106sel/ml dan abnormalitas ≤  20%  diencerkan  dalam  pengencer  Tris  modifikasi,  selanjutnya  di  holding  time  selama  dua  jam  pada  suhu ruang (27-28ºC). Semen yang telah di holding time kemudian disentrifuge dengan kecepatan 2000 rpm selama 15  menit.  Pellet  hasil  sentrifuge  diencerkan  kembali  dengan  pengencer  Tris  modifikasi  +  gliserol  3%.  Semen yang  telah  diencerkan  dikemas  dalam  mini  straw  0,5  ml  dan  diekuilibrasi  sesuai  dengan  waktu  ekuilibrasi perlakuan,  yaitu  P1:  waktu  ekuilibrasi  1  jam,  P2:  waktu  ekuilibrasi  2  jam  dan  P3:  waktu  ekuilibrasi  3  jam. Setelah diekuilibrasi dibekukan di atas uap nitrogen cair (-110ºC) pada jarak 5 cm selama 10 menit, kemudian disimpan dalam nitrogen cair (-196oC) dan dibiarkan selama 24 jam. Kemudian di thawing dengan air bersuhu 37ºC selama 30 detik dalam water bath. Hasil penelitian menunjukkan bahwa motilitas, viabilitas, abnormalitas, MPU dan recovery rate nyata lebih tinggi (P<0,05) pada ekuilibrasi 2 jam, yakni secara berturut-turut 23,12%, 45,44%, 4,65%, 50,15%, 33,03% dibandingkan dengan ekuilibrasi 1 dan 3 jam, yakni secara berturut-turut 20%, 42,17%, 8,19%, 42,67%, 28,57% dan 16,87%, 36,39%, 7,64%, 37,73%, 24,99%. Penelitian ini menyimpulkan bahwa  lama  waktu  ekuilibrasi  2  jam  menghasilkan  kualitas  semen  beku  babi  duroc  yang  lebih  tinggi dibandingkan 1 dan 3 jam.
Kata-kata kunci: ekuilibrasi, tris modifikasi , babi duroc, semen beku

## ABSTRACT
This study aimed to examine the quality of frozen sperm of duroc boar in modified Tris diluent with different equilibration  time.  Semen  was  collected  from  two  duroc  males  and  evaluated  macroscopically  and microscopically. Semen with motility 75%, concentration 200x106 cell/mL and abnormality <20% was diluted in Tris modified diluent, then held for two hours at room temperature (27-28ºC). The semen that has been in the holding time is then centrifuged at 2000 rpm for 15 minutes. The pellet from centrifuge were diluted again with modified  Tris  diluent  +  3%  glycerol.  The  diluted  semen  was  packed  in  0,50  mL  mini  straws  and  equilibrated according  to  the  treatment  equilibration  time,  namely  P1:  1  hour  equilibration  time,  P2:  2  hour  equilibration time, P3: 3 hour equilibration time. After equilibration , it was frozen over liquid nitrogen vapor (-110ºC) at a distance  of    5  cm  for  10  minutes,  then  stored  in  liquid  nitrogen  (-196ºC)  and  left  for  24  hours.  Then  thawing with warm water at 37ºC for 30 seconds in a water bath. The result showed that motility, viability, abnormality, intact plasma membrane and recovery rate were significantly  higher (P<0,05) at two hour equilibration , namely 23.12%,  45.44%,  4.65%,  50,15%,  33.03%  respectively  compared    to  one  and  two  hour  equilibration  time, namely 20%, 42.17%, 8.19%, 42.67%, 28.57% and 16,87%, 36.39%, 7.64%, 37.73%, 24.99% respectively. This study conclude that the equilibration time of two hours resulted in higher quality of frozen sperm  of duroc boar than one and three hours.
Keywords: equilibration, modified tris, duroc boar, frozen semen

## PENDAHULUAN
Salah  satu  teknologi  reproduksi  yang cukup  efektif  dan  efisien  untuk  percepatan peningkatan populasi babi duroc adalah teknologi  IB  menggunakan  semen  cair  maupun semen  beku.  Teknologi  IB  disamping  mampu meningkatkan populasi dan mutu genetik ternak juga diharapkan dapat mempercepat penyebaran bibit  ke  wilayah  produksi  ternak  yang  masih terbelakang.  Keberhasilan  dari  IB  pada  ternak dipengaruhi beberapa faktor, diantaranya adalah kualitas  semen  cair  maupun  semen  beku  yang digunakan (Yusuf et al ., 2006). Namun aplikasi IB  pada  ternak  babi  masih  menemukan  banyak kendala, terutama terbatasnya penyediaan semen beku  babi  karena  sulit  didapatkan,  biayanya cukup  mahal  dan  masih  minimnya  informasi tentang  metode  kriopreservasi  yang  tepat  dalam mempertahankan  motilitas  spermatozoa  setelah pembekuan.
Masalah  utama  yang  sering  terjadi  dalam kriopreservasi  semen  adalah  pengaruh  cold shock terhadap sel spermatozoa yang dibekukan dan  perubahan-perubahan  intraseluler  akibat pengeluaran  air  yang  berlebihan,  berhubungan dengan  pembentukan  kristal-kristal  es  dan penumpukan  elektrolit  di  dalam  larutan  atau  di dalam sel. Konsentrasi elektrolit yang berlebihan akan  melarutkan  selubung  lipoprotein  dinding sel  spermatozoa  dan  pada  waktu  thawing, permeabilitas  membran  sel  akan  berubah  dan menyebabkan kematian sel spermatozoa (Toelihere,  1993).  Disisi  lain,  penyimpanan semen  dalam  kondisi  beku  memungkinkan penggunaan  semen  dalam  jangka  waktu  lama, tetapi  pembekuan  dapat  mengakibatkan  stres pada  sel  yang  sering  menghasilkan  kerusakan membran serta penurunan motilitas dan viabilitas spermatozoa (Barrios et al ., 2000) Permasalahan  cold  shock  dan  perubahan intraseluler  tersebut  dapat  disiasati  dengan menggunakan zat-zat pelindung (senyawa krioprotektan) dalam media pengencer, menurut Aboagla  &  Terada  (2004)  untuk  menghasilkan kualitas  semen  beku  yang  berkualitas  perlu
diperhatikan jenis dan konsentrasi krioprotektan yang  digunakan  dan  teknik  atau  metode  yang tepat dalam pembekuan semen. Salah satu bahan pengenceran  semen  adalah  Tris  kuning  telur yang  berfungsi  sebagai  penyangga  atau  buffer, yang berguna dalam menstabilkan pH, mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit, melindungi spermatozoa  dari  kejutan  dingin  (cold  shock) (Hoesni,  1997).  Krioprotektan  yang  paling umum  digunakan  pada  mamalia  adalah  gliserol (Kusumaningrum, 2002). Gliserol akan berdifusi, menembus dan memasuki spermatozoa dan akan digunakan untuk aktivitas metabolisme  oksidatif,  menggantikan  sebagian air  yang  bebas  dan  menurunkan  konsentrasi elektrolit  intraseluler  dan  mengurangi  daya merusaknya  terhadap  spermatozoa  dengan  jalan memodifikasi  pembentukan  kristal-kristal  es (Tambing et al ., 2000).
Efisien  penggunaan  zat  pelindung  selama pembekuan  sangat  dipengaruhi  oleh  waktu ekuilibrasi (Arifiantini, 2005). Waktu ekuilibrasi merupakan periode yang diperlukan spermatozoa sebelum pembekuan untuk menyesuaikan  diri  dengan  pengencer  supaya sewaktu pembekuan kematian spermatozoa yang berlebihan  dapat  dicegah.  Penelitian  mengenai pengaruh  waktu  ekuilibrasi  terhadap  kualitas semen telah banyak dilaporkan pada semen sapi FH (Arifiantini et al ., 2005) 4 jam, Arruda et al . (2002)  pada  semen  kuda  selama  2  jam  dalam krioprotektan  gliserol  dan  etilen  glikol  5%, Pasarelli et  al .  (2020)  pada  semen  babi  hibrida selama  2  jam  dan  Yi et  al .  (2002)  pada  semen babi hutan selama 2 atau 3 jam.
Mengetahui  pentingnya  waktu  ekuilibrasi pada  proses  pembekuan  semen  dan  penelitian tentang waktu ekuilibrasi pada ternak babi masih sangat  kurang.  Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan penelitian  tentang  kualitas  semen  beku  babi duroc  dalam  pengencer  tris  modifikasi  dengan waktu ekuilibrasi yang berbeda.

## METODE PENELITIAN

## Materi Penelitian
Ternak  yang  digunakan  sebagai  sumber semen  adalah  dua  ekor  pejantan  duroc  berumur 2-3 tahun yang telah terlatih dalam penampungan  semen  dan  memiliki  organ
reproduksi  yang  sehat.  Pengambilan  semen dilakukan  pada  pagi  hari  dengan  periode  dua kali  seminggu.  Semen  hasil  koleksi  ditampung dalam  tabung  penampung  yang  dilengkapi
dengan kain kasa pada bagain atas tabung untuk menyaring fraksi gelatin.

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  metode eksperimen  dengan  rancangan  percobaan  yang dipakai  adalah  rancangan  acak  lengkap  (RAL), terdiri  atas  3  perlakuan  dan  4  ulangan,  Ketiga perlakuan  tersebut  adalah:  waktu  ekuilibrasi  1 jam,  waktu  ekuilibrasi  2  jam  dan  waktu ekuilibrasi 3 jam.

## Pembuatan Pengencer Semen
Tris (Hiydroxymethil) aminomethane ditimbang sebanyak 3,63 gram, asam sitrat 1,99 gram  dan  0,50  gram  fruktosa  dilarutkan  dalam 100  ml  aquabidest.  Kemudian  20  mL  kuning telur  dilarutkan  kembali  dalam  80  mL  larutan Tris,  selanjutnya  ditambahkan  penicillin  1000 IU/mL dan streptomycin 1000 µg/mL. Penambahan  kedua  antibiotic  ini  disesuaikan dengan  rumus  pengenceran  serta  banyaknya semen yang akan diencerkan, kemudian tambahkan  minyak  zaitun  sebanyak  12%. Kemudian  dihomogenkan  pada  suhu  37ºC. Untuk  pengencer  perlakuan  sebanyak  96  mL Tris-kuning telur disiapkan kemudian tambahkan sukrosa 2 gram, gliserol 3%.

## Penampungan dan Evaluasi Semen
Penampungan  semen  babi  dilakukan dengan  cara  manual  glove  and  hand  method menggunakan  dummy  sow.  Semen  segar  hasil koleksi  segera  dilakukan  evaluasi  secara makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi makroskopis  meliputi  volume,  warna,  pH, konsentrasi  dan  evaluasi  secara  mikroskopis meliputi  motilitas,  viabilitas,  abnormalitas  dan membran plasma utuh.

## Pengenceran Semen
Semen  yang  telah  dievaluasi  diencerkan dalam  4  tabung  yang  berisi  pengencer  dasar
dengan  perbandingan  1:1,  dilakukan  secara perlahan-lahan melewati dinding tabung, kemudian tabung diputar secara perlahan sampai larutan  tersebut  homogen.  Selanjutnya  holding time  selama  2  jam  pada  suhu  ruang  (27-28ºC). Semen  yang  telah  mengalami  holding  time disentrifuge dengan kecepatan 2000 rpm selama 15  menit,  pellet  yang  dihasilkan  diencerkan kembali  menggunakan  pengencer  dasar  dengan perbandingan  1:1.  Kemudian  diencerkan  dalam pengencer perlakuan dengan konsentrasi 500x106 sel/mL.

## Pre Freezing, Freezing, dan Thawing
Semen  yang  telah  diencerkan  dalam pengencer  perlakuan  dikemas  dalam  mini  straw 0,50  mL  dan  diberi  kode  atau  label.  Kemudian diekuilibrasi  pada  suhu  3-5ºC  sesuai  dengan waktu ekuilibrasi perlakuan. Setelah diekuilibrasi  dibekukan  diatas  uap  N2  cair bersuhu  -110ºC  pada  jarak  5  cm  selama  10 menit.  Kemudian  meletakkan  straw  di  dalam container  N2 cair dan  dibiarkan  selama  24 jam. Untuk mengetahui kualitas semen belu dilakukan  pencairan  kembali  semen  beku (thawing)  menggunakan  air  bersuhu  37ºC selama 30 detik dalam water bath.

## Variabel Penelitian
Variabel yang diukur dalam penelitian ini adalah:  (1)  motilitas,  (2)  viabilitas,  (3) abnormalitas,  (4)  membrane  plasma  utuh,  (5) recovery rate.

## Analisis Data
Keseluruhan data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis Of Variance (ANOVA)  dan  perlakuan  yang  berpengaruh nyata  diuji  lebih  lanjut  dengan  menggunakan Duncan  Multiple  Range  Test  dengan  program software SPSS 20.0 for windows.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik Semen Segar
Evaluasi semen segar dilakukan bertujuan untuk  mengetahui  kelayakannya  untuk  diproses lebih  lanjut,  karakteristik  semen  segar  babi duroc dapat dilihat pada Table 1.
Dari  Tabel  1  dapat  dilihat  rataan  volume semen  segar  yang  diperoleh  selama  penelitian adalah  164,75±24,11  ml.  Hasil  ini  berbeda dengan  penelitian  Robert  (2006)  dan  Ax et  al .
(2000)  yang  menyatakan  volume  semen  babi tanpa  gelatin  berkisar  200-250  ml.  Hal  ini disebabkan  oleh  volume  semen  tergantung spesies  ternak,  bangsa,  bobot  badan,  umur,  dan frekuensi  penampungan  (Kartasudjana,  2001), tingkat  rangsangan,  frekuensi  ejakulasi  dan kualitas  pakan  (Johnson et  al .,  2000),  fraksi semen yang ditampung (Robert, 2006), perbedaan  ras,  lingkungan  serta  perbedaan buffer (Evans dan Maxwel, 1987).

## Tabel 1. Karakteristik semen segar babi duroc
Karakteristik Semen Nilai Rataan Volume semen (mL) 164,75±24,11 Warna semen Putih susu pH semen 6,55±17 Bau semen Khas Motilitas sperma (%) 70±00 Viabilitas sperma (%) 86,3475±5,12 Konsentrasi x 10 6 sel sperma/mL 370,25±85,89 Abnormalitas sperma (%) 3,4275±0,51 Membran plasma utuh (MPU) sperma (%) 87,3±5,15
Warna  semen  yang  didapatkan  selama penelitian  dari  4  kali  penampungan  dari  seekor babi  duroc  adalah  putih  susu.  Hal  ini  sesuai dengan  pendapat  Robert  (2006)  dan  Ax et  al . (2000)  yang  menyatakan  bahwa  karakteristik warna semen babi adalah putih krem. Sumardani (2007)  menjelaskan  bahwa  warna  semen berkaitan erat dengan konsentrasi dan kekentalan. Disamping itu warna dan konsistensi semen  babi  tergantung  dari  fraksi  yang ditampung,  yaitu  fraksi  pra  spermatozoa  dan fraksi kaya spermatozoa. Menurut Johnson et al . (2000)  beberapa  faktor  yang  mempengaruhi warna  semen  adalah  tingkat  rangsangan, frekuensi ejakulasi, kualitas pakan.
Derajat  keasaman  (pH)  semen  yang didapatkan  selama  penelitian  ini  adalah  pH 6,5±17. Hasil penelitian pH semen masih berada pada  kisaran  pH  semen  hasil  penelitian  Garner dan  Hafez  (2000)  yaitu  6,4-7,8  tetapi  lebih rendah  dari  hasil  penelitian  Sumardani  (2007) yaitu  7,78.  Faktor-faktor  yang  mempengaruhi perubahan  pH  tersebut  terjadi  karena  umur, tingkat rangsangan, frekuensi ejakulasi, lingkungan  dan  kualitas  pakan  (Feradis,  2010). Semakin  rendah  atau  semakin  tinggi  dari  pH normal, dapat membuat spermatozoa lebih cepat mati (Sumardani, 2007).
Motilitas  spermatozoa  dinilai  segera sesudah  penampungan.  Dari  hasil  pengamatan semen  segar  secara  mikroskopik  diperoleh rataan  motilitas  spermatozoa  70±00%.  Hasil penelitian ini tergolong rendah bila dibandingkan  dengan  penelitian  Feka et  al . (2016)  yang  mendapatkan  motilitas  mencapai 89,00%  dan  Yusuf et  al .  (2017)  memperoleh motilitas  sebesar  76,31%.  Meskipun  demikian hasil  ini  masih  dalam  kategori  normal,  hal  ini sesuai  menurut  Garner  dan  Hafez  (2000)  yang menyatakan  standar  minimum  kualitas  semen yang  dipakai  untuk  inseminasi  buatan  memiliki
motilitas 50-80%. Faktor-faktor yang memengaruhi  motilitas  spermatozoa  adalah perbedaan  bangsa,  inidividu,  umur  ternak  yang digunakan (Johnson et al ., 2000).
Viabilitas  yang  diperoleh  dari  hasil evaluasi  semen  dengan  rata-rata  86,3475.  Hasil penelitian  ini  kategori  tinggi  bila  dibandingkan dengan penelitian Kaka (2020) yang mendapatkan viabilitas 71,67±5,85%. Penilaian konsentrasi semen sangat esensil karena faktor inilah yang menggambarkan  jumlah  spermatozoa  yang terkandung  dalam  satu  ejakulasi.  Rataan konsentrasi  spermatozoa  yang  diperoleh  yaitu 370,25±85,89  sel/mL,  hasil  ini  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  penelitian  Feka et  al . (2016)  yang  hanya  memperoleh  konsentrasi 280,20 x 106 sel/mL. Namun demikian hasil ini masuk  kategori  normal  sesuai  dengan  hasil penelitian  Garner  dan  Hafez  (2000),  yakni karakteristik  semen  babi  salah  satunya  adalah memiliki  kisaran  konsentrasi  130-300  x  106 se/mL.
Dari  penelitian  yang  dilakukan  terhadap semen  segar  babi  duroc  yang  dievaluasi  secara mikroskopik didapatkan persentasi abnormalitas spermatozoa  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini tergolong  rendah  dan  masih  memenuhi  kriteria untuk  diolah  menjadi  semen  beku  yaitu  dengan persyaratan  sperma  abnormal  <  20%  (Hafez, 2000).  Bentuk  abnormal  spermatozoa  pada penelitian  ini  kebanyakan  abnormalitas  skunder seperti  ekor  bergulung,  leher  patah,  kepala  dan leher  putus.  Abnormalitas  skunder  disebabkan perlakuan  ketika  pembuatan  preparat  ulas (Solihati et al ., 2008).
Hasil  perhitungan  rataan  nilai  MPU  pada semen  segar  babi  duroc  adalah  87,3±5,15%. Hasil  penelitian  ini  tergolong  tinggi  bila dibandingkan  dengan  penelitian  Sangma et  al . (2020)  yang  memperoleh  persentase  MPU  pada
babi hampshire sebesar 81,74±0,45%. Perbedaan  nilai  MPU  spermatozoa  antar  ternak dapat  dipengaruhi  oleh  perbedaan  individu ternak,  pola  pemeliharaan,  dan  kandungan pengencer  (Lubis et  al .,  2013).  Keutuhan membran  plasma  dapat  memengaruhi  kondisi tudung  akrosom,  pengamatan  MPU  sangat penting  karena  dapat  menentukan  kualitas  dan kemampuan  fertilitas  spermatozoa  (Sutama et al ., 2000).
Berdasarkan  hal  tersebut,  karakteristik semen segar babi duroc yang diperoleh memiliki kualitas  yang  baik.  Hal  ini  dapat  disimpulkan
bahwa  semen  layak  diproses  lebih  lanjut  baik dalam bentuk semen cair maupun semen beku.

## Pengaruh  Perlakuan  Terhadap  Motilitas Spermatozoa
Widiastuti  (2001)  mengatakan  bahwa motilitas atau daya gerak spermatozoa digunakan sebagai penilaian kemampuan spermatozoa  untuk  membuahi  sel  telur,  oleh karena  itu  motilitas  mempunyai  peranan  yang penting  dalam  proses  fertilisasi.  Motilitas spermatozoa ditampilkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Pengaruh waktu ekuilibrasi terhadap motilitas spermatozoa
Variabel Waktu ekuilibrasi (Jam) 1 2 3 Pasca pengenceran 70±00 a 70±00 a 70±00 a Pasca ekuilibrasi 64,37±3,75 a 63,12±3,14 a 63,12±3,14 a Pasca thawing 20±1,53 ab 23,12±2,39 b 16,87±3,75 a
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang tidak nyata antar perlakuan (P>0,05)
Berdasarkan hasil analisis statistik, perlakuan  tidak  memberikan  pengaruh  nyata  (P >  0,05)  terhadap  kualitas  spermatozoa  pasca pengenceran dan pasca ekuilibrasi.
Nilai  motilitas  pasca  pengenceran  pada semua  perlakuan  adalah  70±00%,  setelah ekuilibrasi  terjadi  penurunan  nilai  motilitas spermatozoa  sebesar  5,625%  pada  P1,  6,875% pada  P2  dan  P3.  Sugiarti et  al .  (2004) menyatakan  bahwa  proses  pendinginan  pada suhu  5ºC  akan  menyebabkan  penurunan motilitas spermatozoa akibat adanya asam laktat sisa metabolisme spermatozoa yang menyebabkan kondisi medium menjadi semakin asam  karena  penurunan  pH.  Kondisi  tersebut menyebabkan  perubahan  kondisi  asam  yang bersifat  toksik  bagi  spermatozoa.  Meskipun demikian  penurunan  motilitas  ini  masih  dalam kisaran  normal  motillitas  yakni  50-80%.  Hasil ini  sesuai  yang  dilaporkan  Aminasari  (2009) yang meyatakan bahwa nilai motilitas spermatozoa  yang  sudah  didinginkan  pada  suhu 5°C tidak boleh berada dibawah 50%.
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa waktu ekuilibrasi memberikan perbedaan nyata (P < 0,05) terhadap motilitas spermatozoa babi duroc setelah pembekuan. Waktu ekuilibrasi 2 jam  menunjukkan perbedaan nyata (P<0,05)  antara  waktu  ekuilibrasi  3  jam  dan  1 jam.
Setiap  peningkatan  waktu  dan  penurunan suhu penyimpanan, dari suhu ekuilibrasi ke suhu
pembekuan  (5ºC  ke  -190ºC)  terlihat  bahwa motilitas  spermatozoa  semakin  menurun.  Pada P1 terjadi penurunan motilitas sebesar 44,375%, P2  40%,  dan  P3  sebesar  46,25%.  Dari  ketiga penurunan  angka  motilitas  tersebut,  terlihat bahwa  penurunan  persentase  motilitas  terendah teramati pada perlakuan ekuilibrasi 2 jam.
Persentase  penurunan  terendah  pada perlakuan  ekuilibrasi  2  jam  mengindikasikan bahwa  pada  waktu  tersebut  gliserol  telah mencapai  keseimbangan  yang  optimal  dengan spermatozoa  babi  duroc  untuk  menyesuaikan dengan  pengencer  Tris  kuning  telur-modifikasi, spermatozoa memberi kesempatan yang optimal terhadap gliserol untuk masuk kedalam membran  plasma  spermatozoa.  Hasil  penelitian ini tidak jauh berbeda yang dilaporkan oleh Yi et al . (2002) yang menyatakan waktu ekuilibrasi 2 atau  3 jam  merupakan  waktu  yang  cocok  untuk pembekuan  spermatozoa  babi  dan  Passarelli et al .  (2020)  melaporkan  bahwa  ekuilibrasi  2  jam dengan nilai motilitas sebesar 26,16% pada babi hibrida komersil.
Sedangkan  penurunan  pada  perlakuan ekuilibrasi  1  jam  mengindikasikan  bahwa gliserol  belum  dapat  dimanfaatkan  sebagai krioprotektan sel karena waktu pemaparan yang kurang  optimum  dan  penurunan  pada perlakuan ekuilibrasi  3  jam  diduga  terjadi  karena pemaparan  gliserol  yang  terlalu  lama  dengan spermatozoa  sehingga  menimbulkan  efek  yang merugikan  bagi  spermatozoa.  Hal  ini  sesuai
yang  dilaporkan  Umar  dan  Maharani  (2005) yang menyatakan bahwa ekuilibrasi yang terlalu lama  akan  menyebabkan  toksik  terhadap  sel spermatozoa.  Hal  yang  sama  juga  dilaporkan oleh  Toelihere  (1993)  pemaparan  gliserol  yang terlalu lama dapat bersifat toksik sehingga akan menyebabkan  gangguan  motilitas.  Sebaliknya, efek  toksik  gliserol  dapat  diminimalisir  dengan mempersingkat  waktu  pemaparan.  Namun,  efek pemaparan gliserol yang singkat tidak memberikan  kesempatan  kepada  gliserol  untuk berdifusi kedalam sel spermatozoa.
Penurunan  persentase  motilitas  ini  juga terjadi menurut Sugiarti et al . (2004) disebabkan penyimpanan spermatozoa dalam rentang waktu yang  lama  akan  mengakibatkan  penurunan motilitas  akibat  adanya  asam  laktat  sisa  dari metabolisme  sel  yang  menyebabkan  kondisi medium menurun menjadi asam akibat penurunan pH.
Penurunan  persentase  motilitas  pada waktu  ekuilibrasi  menurut  Salisbury  dan  Van Denmark (1985) bahwa tenaga yang dibutuhkan spermatozoa  berasal  dari  perombakan  ATP (Adenosin Trisphosphate) yang berada di dalam selubung  mitokondria  teraktifkan  oleh  enzim tertentu sehingga ikatan fosfat yang mengandung banyak energi terurai dan melepaskan  energi,  akan  tetapi  penyimpanan spermatozoa  pada  suhu  dingin  dan  terlalu  lama membuat  membran  spermatozoa  rusak  dan menyebabkan  enzim  untuk  merombak  ATP
hilang  sehingga  mengakibatkan  motilitas  yang rendah  pada  spermatozoa.  Hal  serupa  juga dilaporkan  oleh  Colenbrander et  al .  (1992) menyatakan  bahwa  kerusakan  membran  plasma menyebabkan terlepasnya enzim aminotransferase  (AspaT)  kedalam  plasma semen,  sehingga  produksi  ATP  akan  terhenti dan  menyebabkan  spermatozoa  tidak  dapat bergerak.
Selain itu, penurunan persentase motilitas juga  terjadi  karena  pada  suhu  ruang  terjadi proses  peroksidasi  yaitu  reaksi  oksidatif  yang berasal dari adanya deaminasi asam amino oleh enzim  aromatic  amino  acid  aminase  (AAAO). Enzim ini akan meningkat seiring meningkatnya suhu  penyimpanan  (Vishwanath  and  Shannon, 2000).  Enzim  AAAO  ini  tidak  aktif  pada spermatozoa yang masih hidup, tetapi aktif pada spermatozoa  yang  mati,  sehingga  semakin banyak  spermatozoa  yang  mati  meningkatkan produksi  enzim  AAAO  dan  bersifat  toksik  bagi spermatozoa hidup.

## Pengaruh  Perlakuan  Terhadap  Viabilitas Spermatozoa
Toelihere  (1993)  pada  waktu  semen dicampur dengan zat warna, sel-sel spermatozoa yang  hidup  tidak  atau  sedikit  sekali  menghisap zat  warna  sedangkan  sel-sel  yang  mati  akan mengambil  warna  karena  permeabilitas  dinding sel meninggi waktu mati. Viabilitas spermatozoa ditampilkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Pengaruh perlakuan terhadap viabilitas spermatozoa post thawing
Variabel Waktu ekuilibrasi (Jam) 1 2 3 Pasca pengenceran 86,20±5,30 a 86,20±5.30 a 86,20±5,30 a Pasca ekuilibrasi 85,15±7,13 a 79,97±6.78 a 80,13±2,35 a Pasca thawing 42,17±0,35 ab 45,44±3.29 b 36,79±7,41 a
Superskrip yang sama pada baris  yang sama menunjukan perbedaan yang tidak nyata antar perlakuan (P>0,05)
Berdasarkan hasil analisis statistik menunjukkan  perlakuan  tidak  memberikan pengaruh nyata (P > 0,05) terhadap spermatozoa pasca pengenceran dan pasca ekuilibrasi.
Nilai viabilitas sperma pasca pengenceran untuk waktu ekuilibrasi 1, 2, 3 jam adalah sebesar 86,20±5,30%. Setelah ekuilibrasi terjadi penurunan viabilitas spermatozoa sebesar 1,05%  pada  P1,  6,235%  P2,  dan  6,067%  P3. Penurunan persentase viabilitas ini masih dalam kisaran  normal  yaitu  >80%  (Ax et  al .,  2000). Kemudian  Kostaman  dan  Sutama  (2006) menyatakan bahwa persentase viabilitas
spermatozoa  lebih  tinggi  dari  pada  motilitas spermatozoa  karena  dari  jumlah  spermatozoa yang hidup belum tentu semua motil progresif.
Berdasarkan hasil analisis statistik menunjukkan  bahwa  waktu  ekuilibrasi  tidak berpengaruh nyata (P > 0,05) terhadap viabilitas spermatozoa babi duroc pasca thawing. Namun, pada  uji  lanjut  Duncan  menunjukan  bahwa waktu ekuilibrasi 2 jam berbeda nyata (P < 0,05) dengan waktu ekuilibrasi 3 jam dan 1 jam.
Hasil  dari  penelitian  ini  menunjukan bahwa viabilitas spermatozoa tertinggi 45,44±3,29% terdapat pada perlakuan
ekuilibrasi 2 jam. Hasil ini tergolong rendah bila dibandingkan  dengan  hasil  penelitian  Dapawole et  al .  (2017)  yang  memperoleh  persentasi viabilitas sebesar 69,17±3,62%. Waktu ekuilibrasi 2 jam gliserol sudah dapat dimanfaatkan  sebagai  krioprotektan  sel.  Efek perlindungannya  adalah  menjaga  keseimbangan elektrolit  intraseluler  dan  ekstraseluler  sehingga proses  biokimia  yang  terjadi  di  dalam  sel spermatozoa  tetap  berlangsung  dan  mengurangi kematian  sel  spermatozoa  yang  berlebihan. Gliserol akan berdifusi, menembus dan memasuki  spermatozoa  dan  akan  dipakai  oleh spermatozoa  untuk  metabolisme  oksidatif- elektrolit  intraseluler  serta  mengurangi  daya merusaknya terhadap sel spermatozoa (Toelihere, 1993).
Selain  itu,  gliserol  akan  menurunkan konsentrasi natrium di dalam  medium diluar sel sehingga kematian spermatozoa akibat solution- effect  dapat  dihindarkan  dan  pembentukan kristal  es  di  dalam  sel  dapat  dikurangi. Mekanisme  kerjanya  adalah  dengan  jalan mengubah  bentuk  dan  ukuran  kristal  es  yang terbentuk sehingga mengurangi tekanan mekanik  dan  menurunkan  titik  beku  medium sehingga  kristal-kristal  es  tidak  terbentuk. Solution-effect  ini  akan  timbul  bila  terjadi perubahan  yang  drastis  dari  larutan  dalam  sel yang  dibekukan  sebagai  akibat  terbentuknya kristal  es  di  luar  dan  dalam  sel,  perubahan  air menjadi  es  dan  adanya  peningkatan  konsentrasi larutan  di  dalam  dan  di  luar  sel.  Membran plasma  pada  kondisi  seperti  ini  menunjukan kestabilan  fungsi  yang  baik  sehingga  tidak mudah  ditembus  oleh  zat  warna  pada  saat  uji viabilitas spermatozoa (Anggarsari, 2015)
Disisi  lain,  nutrisi  yang  terdapat  dalam pengencer  Tris-kuning  telur  dan  antioksidan yang  terkandung  dalam  minyak  zaitun  dapat meningkatkan  ketahanan  membran  plasma spermatozoa, sehingga membran plasma berfungsi  secara  maksimal  untuk  melindungi organel-organel  sel  dan  mengatur  tekanan osmosis selama proses metabolisme berlangsung.  Kandungan  antioksidan  pada minyak  zaitun  yang  ditambahkan  ke  dalam pengencer  dapat  mempertahankan  viabilitas spermatozoa.
Penambahan  antioksidan  minyak  zaitun dalam pengencer dapat melindungi spermatozoa dari kerusakan oksidatif, dan akhirnya berpengaruh pada kelangsungan hidup spermatozoa. Hal ini diperkuat oleh Mittal et al .
(2010)  dimana  kematian  sel  spermatozoa  atau yang  disebut  apoptosis  dapat  terjadi  apabila tidak  ada  perlindungan  antioksidan.  Menurut Zhenganddan Wang (2009) mekanisme hambatan dari antioksidan biasanya terjadi pada saat  reaksi-reaksi  inisiasi  atau  propagasi  pada reaksi  oksidasi  lemak  atau  molekul  lainnya  di dalam  tubuh  dengan  cara  menyerap  dan menetralisir  radikal  bebas.  Kemudian  Al-Daraji (2012) menyatakan bahwa suplementasi minyak zaitun  menghasilkan  viabilitas  lebih  baik dibandingkan tanpa minyak zaitun.
Hasil  penelitian  ini  yang  menunjukkan bahwa  nilai  viabilitas  spermatozoa  terendah 36,79±7,41% terdapat pada perlakuan ekuilibrasi  3.  Waktu  ekuilibrasi  yang  lama kemungkinan  membuat  gliserol  menjadi  toksik sehingga  membuat  kerusakan  pada  membran plasma spermatozoa dan menyebabkan viabilitas spermatozoa  rendah  (Apriyanti,  2012).  Gliserol akan  menarik  air  secara  berlebihan  dari  dalam sel  spermatozoa  yang  menyebabkan  dehidrasi dan selanjutnya terjadi kerusakan sel spermatozoa (Best , 2006).
Penurunan persentase viabilitas spermatozoa  mungkin  disebabkan  oleh  kondisi membran plasma spermatozoa yang telah rusak. Membran plasma spermatozoa berfungsi sebagai penjaga  organel  sel  dan  pengatur  keseimbangan elektrolit  dalam  metabolisme  (Salmah,  2014). Apabila membran plasma mengalami kerusakan membuat  metabolisme  spermatozoa  terganggu dan spermatozoa kehilangan kemampuan fertilitasnya dikarenakan komponen seluler lepas dan  kehilangan  daya  inaktivasi  komponen protein  enzim  penting  di  dalam  akrosom. kejadian  ini  membuat  spermatozoa  mengalami kematian  dan  akan  berdampak  pada  viabilitas spermatozoa (Yulnawati dan Agus, 2005).

## Pengaruh Perlakuan Terhadap Abnormalitas Spermatozoa
Ada dua macam abnormalitas sperrmatozoa  menurut  Partodihardjo  (1992) yaitu  abnormalitas  primer  yang  meliputi kelainan  seperti  kepala  terlalu  kecil,  kepala terlalu  besar,  kepala  kerucut,  kepala  miring, kepala dua, kepala salah bentuk, berleher besar, sedangkan  abnormalitas  sekunder  meliputi kepala  terpisah  dari  leher,  leher  patah,  ekor kusut, ekor patah dan ekor tergulung. Abnormalitas    spermatozoa  ditampilkan  pada Tabel 4.

## Tabel 4. Pengaruh waktu ekuilibrasi terhadap abnormalitas spermatozoa
Variabel Waktu ekuilibrasi (Jam) 1 2 3 Pasca pengenceran 3,67±0,49 a 3,67±0,49 a 3,67±0,49 a Pasca ekuilibrasi 4,11±0,52 a 3,84±0,36 a 3,88±0,33 a Pasca thawing 8,19±0,38 a 4,65±0,36 b 7,64±0,84 a
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang tidak nyata antar perlakuan (P>0,05)
Berdasarkan hasil analisis statistik menunjukan perlakuan tidak memberikan pengaruh  (P  >  0,05)  nyata  terhadap  kualitas spermatozoa  pasca  pengenceran  dan  pasca ekuilibrasi,  dimana  memiliki  nilai  sebesar 3,67±0,49%.  Setelah  ekuilibrasi  terlihat  adanya peningkatan  abnormalitas  spermatozoa  sebesar 0,4375%  pada  ekuilibrasi  1  jam,  0,1675%  pada ekuilibrasi 2 jam dan 2,075% pada ekuilibrasi 3 jam.  Persentase  abnormalitas  spermatozoa  yang semakin meningkat pada setiap tahapan perlakuan  dipengaruhi  oleh  perlakuan  pada  saat pencampuran semen, pembuatan preparat (Wiratri et  al .,  2014).  Namun  demikian, peningkatan  abnormalitas  ini  masih  dalam kisaran  normal  karena  menurut  Johnson et  al . (2000) abnormalitas spermatozoa tidak melebihi 20%.
Hasil  analisis  statistik  yang  telah dilakukan,  menunjukan  bahwa  P2  memberikan perbedaan  nyata  (P  <  0,05)  pada  P3  dan  P1 terhadap  abnormalitas  spermatozoa  babi  duroc pasca thawing.
Peningkatan  abnormalitas  spermatozoa terendah  pasca  thawing  dari  pasca  ekuilibrasi didapati pada perlakuan ekuilibrasi selama 2 jam dengan  penurunan  persentase  sebesar  0,81% dibandingkan pada perlakuan ekuilibrasi selama 1 jam dan 3 jam yang  memperoleh peningkatan abnormalitas  sebesar  4,0775%  dan  3,755%. Persentasi  abnormalitas  yang  diperoleh  dalam penelitian ini jauh lebih rendah bila dibandingkan  dengan  penelitian  Bebas et  al . (2020) memperoleh persentasi viabilitas sebesar 27,60±1,14%.
Perbedaan persentase abnormalitas spermatozoa  pada  setiap  perlakuan  dikarenakan dalam larutan pengencer keseimbangan intraseluler dan ekstraseluler dengan spermatozoa tidak stabil karena adanya penurunan  suhu  pada  saat  ekuilibrasi  (Tuhu et
al .,  2013).  Hal  ini  diperkuat  oleh  Herdiawan (2004) perbedaan konsentrasi cairan intarseluler dengan ekstraseluler akan menimbulkan perubahan tekanan osmotik sel selama pembekuan, sehingga akan menyebabkan selubung  lipoprotein  pecah  dan  membran  sel mengalami kerusakan, kondisi inilah yang dapat menyebabkan spermatozoa abnormal.
Perbedaan laju pembekuan spermatozoa pada  media  berbeda  akan  berpengaruh  pada tingkat abnormalitas spermatozoa sebagai akibat terjadinya perubahan fisik media hidupnya, baik perubahan tekanan osmotik, maupun pembentukan  kristal-kristal  es  intraseluler.  Hal tersebut dapat membuat struktur pada spermatozoa berubah seperti bentuk spermatozoa ekor tergulung atau kepala terlepas (Siregar,  2018).  Abnormalitas  spermatozoa terjadi  karena  adanya  suhu  dingin  dan  tekanan osmotik  yang tidak seimbang akibat dari proses metabolik  yang  terus  berlangsung  selama  masa penyimpanan  pada  suhu  5ºC.  Hal  ini  diperkuat oleh Solihati dan Kune (2009) yang menyatakan bahwa meningkatnya abnormalitas pada spermatozoa  dipengaruhi  oleh  lamanya  waktu penyimpanan. Kemudian ditambahkan Arifiantini et  al .  (2006)  peraparasi,  cold  shock, genetik,  stres,  suhu  lingkungan,  penyakit  dan bahkan  perlakuan  pada  saat  pembekuan  semen dapat mempengaruhi tingkat abnormalitas spermatozoa.
Pengaruh  Perlakuan  Terhadap  Membran Plasma Utuh (MPU) Spermatozoa
Fungsi keutuhan membran plasma spermatozoa adalah sebuah faktor penting dalam metabolisme  spermatozoa,  kapasitasi,  reaksi akrosom,  dan  pengikatan  spermatozoa  pada permukaan  sel  telur  (Baqir et  al .,  2009).  MPU spermatozoa ditampilkan pada Tabel 5.

## Tabel 5. Pengaruh waktu ekuilibrasi terhadap MPU spermatozoa
Variabel Waktu ekuilibrasi (Jam) 1 2 3 Pasca pengenceran 86,92±5,18 a 86,92±5,18 a 86,92±5,18 a Pasca ekuilibrasi 86,25±6,83 a 81,06±7,926 a 81,09±2,57 a Pasca thawing 42,67±0,43 ab 50,15±4,82 b 37,73±7,27 a
Superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang tidak nyata antar perlakuan (P>0,05)
Berdasarkan hasil analisis statistik menunjukkan bahwa perlakuan tidak memberikan pengaruh nyata (P > 0,05) terhadap kualitas  spermatozoa  pasca  pengenceran  dan pasca ekuilibrasi.
Hasil  pemeriksaan  MPU  spermatozoa pasca pengenceran untuk waktu ekuilibrasi 1, 2, dan 3 jam menunjukkan nilai sebesar 86,92±5,18%. Terlihat adanya penurunan persentase  MPU  setelah  ekuilibrasi  sebesar 0,6675%  pada  P1,  5,8625%  pada  P2,  dan 5,825%  pada  P3.  Penurunan  MPU  terendah terdapat  pada  P1,  kemudian  diikuti  P3  dan  P2. Kondisi  ini  menggambarkan  bahwa  semakin lama  waktu  penyimpanan  menyebabkan  MPU spermatozoa semakin menurun. Hal ini berkaitan  dengan  spermatozoa  babi  sangat sensitiv  terhadap  temperatur  dingin  yang  biasa disebut cold shock (Holt, 2000; Watson, 2000).
Hasil analisis statistik menunjukan bahwa waktu  ekuilibrasi  memberikan  perbedaan  nyata (P < 0,05) terhadap P2 dan P3 membran plasma utuh spermatozoa babi duroc pasca thawing.
Nilai  MPU  tertinggi  pasca  thawing terdapat  pada  perlakuan  ekuilibrasi  2  jam  yaitu 50,15±4,82%  dengan  penurunan  nilai  MPU terendah sebesar 30,9025%, kemudian diikuti P3 dan  P1  dengan  besar  angka  penurunan  masing- masing 43,3629% dan 43,585%. Perolehan nilai MPU  dalam  penelitian  ini  tidak  berbeda  jauh dengan hasil penelitian Bebas et al . (2020) yang memperoleh persentasi MPU sebesar 53,80±3,36%. Persentasi MPU tertinggi pada P2 dalam  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa gliserol  dalam  pengencer  Tris-modifikasi  sudah dapat beradaptasi dengan membran sel spermatozoa,  sehingga  dapat  dimanfaatkan sebagai  agen  protektif,  sumber  energi  dan kandungan  antioksidan  dalam  minyak  zaitun mampu  memutuskan  rantai  reactive  oxygen species  (ROS)  selama  penyimpanan  pada  suhu dingin.
Penggunaan pengencer Tris (Hydroxymethyl)  aminomethane  sebagai  buffer berperan untuk memertahankan tekanan osmosis
dan  keseimbangan  elektrolit  (Siswanto,  2006) dan  dikenal  sebagai  penyangga  yang  baik (Steinbach  and  Foote,  1992).  Kuning  telur mempunyai  komponen  berupa  lipoprotein  dan lesitin  yang  mempertahankan  dan  melindungi spermatozoa  dari  cekaman  dingin.  Umumnya kuning  telur  ditambahan  ke  dalam  pengencer semen  sebagai  sumber  energi,  agen  protektif, dan  dapat  memberikan  efek  sebagai  penyangga terhadap  sperma  (Watson  and  Martin,  1975). Kuning telur juga mengandung glukosa, vitamin yang  larut  dalam  air  dan  larut  dalam  lemak sehingga menguntungkan spermatozoa (Salisbury dan Van Denmark, 1985). Disisi lain, kandungan  lesitin  (phosphatidil  choline)  pada kuning  telur  mampu  melindungi  dan  menjaga keutuhan  membran  sel  spermatozoa  (Moussa et al ., 2002).
Penurunan  nilai  MPU  pasca  thawing dengan  waktu  ekuilibrasi  selama  1  jam disebabkan  gliserol  dan  bahan  pengencer  yang digunakan  belum  optimal  digunakan  sebagai krioprotektan dan sumber nutrisi bagi spermatozoa.  Sedangkan  penurunan  persentasi MPU  pada  waktu  ekuilibrasi  3  jam  disebabkan oleh  efek  racun  dari  krioprotektan  gliserol  dan energi telah habis terpakai.
Menurut  Umar  dan  Maharani  (2005) ekuilibrasi yang terlalu lama akan menyebabkan kontak  gliserol  dengan  spermatozoa  berlebihan sehingga bersifat toksik terhadap sel spermatozoa. Kemudian ditambahkan Mc Laughin et  al .  (1992)  mengemukakan  bahwa efek toksisitas dari gliserol adalah memodifikiasi  struktur  membran  plasma  dan pada konsentrasi yang tinggi dapat menghambat metabolisme energi.
Faktor  yang  memengaruhi  penurunan nilai MPU juga disebabkan tingginya metabolisme  seluler  yang  menggunakan  banyak energi di dalam plasma semen babi duroc untuk mempertahankan  kondisi  intraseluler  terhadap perubahan suhu, dimana lama berada pada suhu ruang  mengakibatkan  terjadinya  kerusakan membran plasma. Perubahan suhu dapat memicu
stress  pada  spermatozoa  yang  berdampak  pada terjadinya  perubahan  konfigurasi  fosfolipid membran plasma, adanya disfungsi dan permeabilitas membran sel.
Pengaruh  Perlakuan  Terhadap  Recovery Rate Spermatozoa
Recovery rate adalah kemampuan pemulihan  spermatozoa  setelah  pembekuan dengan cara membandingkan motilitas spermatozoa  setelah  thawing  dengan  dengan motilitas  spermatozoa  segar  (Hafez,  2000). Recovery  rate    spermatozoa  ditampilkan  pada Gambar 1.
Gambar  1.  Pengaruh  perlakuan  terhadap  recovery rate spermatozoa
Hasil  analisis  statistik  menunjukkan bahwa perlakuan tidak meberikan pengaruh (P > 0,05)  terhadap  recovery  rate  spermatozoa  pasca thawing, namun pada uji lanjut waktu ekuilibrasi 2  jam  berbeda  nyata  (P  <  0,05)  dengan  waktu ekuilibrasi 1 jam dan 3 jam.
Adanya  perbedaan  nilai  recovery  rate yang  nyata  pada  P2  dengan  perlakuan  lainnya menunjukan  bahwa  waktu  ekuilibrasi  2  jam merupakan waktu yang optimum bagi spermatozoa untuk beradaptasi dengan pengencer  pembekuan  semen  sehingga  pada tahap  pembekuan  dan  thawing,  spermatozoa masih  terjaga.  Tingkat  kerusakan  spermatozoa yang  teramati  dalam  penelitian  ini  berbeda dengan  yang  dilaporkan  Hafez  (2000)  bahwa spermatozoa  yang  dibekukan  akan  mengalami kerusakan sekitar 40%.
Menurut  Alvarez  and  Strorey  (1982) kerusakan  sel  selama  proses  pembekuan  dan thawing disebabkan karena terjadinya
peroksidasi  lipid  pada  spermatozoa  sehingga menurunkan  daya  hidup.  Dilanjutkan  Park  and Graham  (19932)  kerusakan  pertama  pada membran  sel  spermatozoa  terjadi  pada  proses pembekuan  dan  thawing    antara  suhu    -15ºC sampai  -60ºC  tetapi  tidak  terjadi  selama penyimpanan  di  nitrogen  cair.  Pendinginan  dan pemanasan  kembali  akan  merusak  lipoprotein yang ada pada membran plasma sperma.
Campbell et  al .  (2003)  melaporkan persentase sperma motil pasca thawing minimal 30%  untuk  dapat  diinseminasikan.  Berdasarkan teori ini semen beku babi duroc yang dihasilkan pada  penelitian  ini  tidak  layak  digunakan  untuk IB.  Hal  ini  diduga  disebabkan  susbstansi  yang terdapat  dalam  kuning  telur  dapat  menghambat respirasi  dan  mengurangi  persentase  sperma motil  (Moussa et  al .,  2002).  Substansi  yang dibutuhkan  sperma  dari  kuning  telur  dalam kriopreservasi  adalah  Low  Density  Lipoprotein (LDL). Low Density Lipoprotein ini didapatkan melalui  ultrasentrifugasi.  Namun  kuning  telur yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah seluruh  komponen  lipoprotein  (LDL  dan  high density lipoprotein (HDL) yang dapat menghambat respirasi dan motilitas
spermatozoa.
Arifiantini et  al .  (2005)  melaporkan bahwa  nilai  RR  semen  beku  pada  tiga  jenis pengencer  TF,  Tris-kuning  telur  dan  pengencer paten Andromed masing-masing sebesar 59,40%,  63%,  48%,  dan  69,96%.  Sedangkan Komariah et  al .  (2013)  melaporkan  nilai  RR semen  beku  pada  tiga  bangsa  sapi  Limousin, Simental,  dan  FH  masing-masing  sebesar 58,87%, 56,27% dan 58,87%.
Perbedaan  nilai  RR  yang  diperoleh  dan penurunan nilai RR yang melebihi batas normal ini  kemungkinan  disebabkan  karena  ternak  babi mempunyai  lipid  penyusun  membran  plasma yang  rasionya  lebih  rendah  dari  membran plasma sperma sapi. Hal ini yang  menyebabkan sperma  babi  lebih  rentan  terhadap  cold  shock selama penyimpanan pada suhu rendah dan lebih peka  terhadap  serangan  reactive  oxygen  spesies (ROS).

## SIMPULAN
Penelitian  ini  menyimpulkan  bahwa waktu ekuilibrasi dua jam dalam pengencer Tris-
modifikasi  menghasilkan  kualitas  semen  beku babi duroc yang lebih baik.

## DAFTAR PUSTAKA
Aboagla  EME,  Terada  T.  2004.  Effects  of  egg yolk  during  the  freezing  step  of cryopreservation  on  the  viability  of  goat spermatozoa. Agroland 16 (2): 172-179.
Al-Daraji  HJ.  2012.  Adding  olive  oil  to  rooster semen  diluents  for  improving  semen quality  and  storage  ability  during  liuid storage. Baltic journal of comparative and clinical system biology. 6 (10): 3–11.
Alvarez JG, Storey BT. 1982. Spontaneous lipid
peroxidation
rabbit epididymal spermatozoa:  It’s  effect  on  sperm motility. Biol. Reprod 27 (5): 1102–1108. Aminasari  PD.  2009.  Pengaruh  umur  terhadap kualitas  semen  beku  sapi  limousin. Skripsi .  Fakultas  Peternakan  Universitas Brawijaya Malang.
Anggarsari LY. 2015. Pengaruh waktu ekuilibrasi terhadap motilitas dan viabilitas  kambing  boer  after  thawing dalam  pengencer  yang  mengandung lesitin nabati. Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.
Apriyanti  C.  2012.  pengaruh  waktu  ekuilibrasi terhadap  kualitas  semen  beku  sapi  pesisir pre  dan  post  thawing. Thesis. Program Studi Ilmu Ternak Universitas Andalas. Arifiantini RI. 2005. Penentuan waktu ekuilibrasi  pada  pembekuan  semen  kuda menggunakan  bahan  pengencer  susu skim. J. Anim. Prod. 9(3): 145-152.
Arifiantini  RI,  Yusuf  TL.  2006.  Keberhasilan penggunaan  tiga  pengencer  dalam  dua jenis  kemasan  pada  proses  pembekuan semen sapi FH. Majalah Ilmiah
Peternakan 9(3): 89-93.
Arruda SP, Ball BA, Gravance CG, Gracia AR,
Liu  IKM.  2002.  Effects  of  extenders  and cryoprotectants  on  stallion  sperm  head morphometry. Theriogenology 58(4): 253-256.
Ax  RL,  Dally  M,  Didion  BA,  Lenz  RW,  Love CC,  Varner  DD,  Hafez  B,  Bellin  ME. 2000. Semen evaluation. In: ESE Hafez & B  Hafez  (Eds).  Reproduction  in  Farm Animals.7th  Ed.  Williams  &  Wilkins, USA.
Barrios BR, Perez-Pe, Gallego M, Tato A, Muin,
Osada  J,  Muino-Blanco  T,  Cebrian  Perez A..  2000.  Seminal  plasma  proteins  revert the  cold-shock  damage  on  ram  sperm
membrane. Biology  reproduction 63(5): 1531-1537.
Bebas  W,  Gorda  W.  2020.  Kadar  krioprotektan gliserol  dan  dymethilsulfoxide  terbaik pada  pengencer  astaxanthin  fosfat  kuning telur  bebek  terhadap  kualitas  semen  beku babi. Jurnal Veteriner 2(1): 115-123.
Best  B.  2006.  Viability,  cryoprotectant  toxicity and  chilling  injury  in  cryonics.  Animal Reproduction Science 60: 41-51.
Baqir  M,  Fakhrildin  MR,  Kouty  BK.  2009. Outcomes of sperm parameters, hyposmotic swelling test and intra-uterine insemination  for  varicoccelic  and  non  – varicocelic infertile patients. Jurnal Dohuk University 12(1): 301-305.
Campbell JR, Campbell KL, Kenealy MD. 2003. Artificial  insemination.  In:  Anim  Sci.  4th Ed New York (US): Mc Graw Hill. Page. 219-224.
Colenbrander  B,  Fazeli  AR,  Van  Buiten  A,
Parlevliet J, Gadella MB. 1992.
Assesment  of  sperm  cell  membrane integrity  in  the  horse. Act.  Vet.  Scand. Supl. 88: 49-58.
Dapawole RR, Arifiantini RI, Nalley WM. 2017. Kualitas  Semen  Beku  Babi  dalam Pengencer Komersial yang
Disuplementasi  dengan  Trehalosa.  Jurnal veteriner  Indonesia. Jurnal  Veteriner 18 (1): 69-75.
Evans  G,  Maxwel  WMC.  1987.  Salamon’s Artificial  Insemination  Of  Sheep  And Goat. Butterworths, Sydney.
Feradis.  2010.  Bioteknologi  Reproduksi  pada Ternak. Alfabeta. Bandung.
Feka  WV,  Dethan  AA,  Beyleto  VY.  2016.
Pengaruh  lama  penyimpanan  terhadap viabilitas  dan  ph  semen  babi  landrace yang  diencerkan  menggunakan  bahan pengencer  sitrat  kuning  telur. Journal  of Animal Science 1(3): 34-35.
Garner DL, Hafez ESE. 2000. Spermatozoa and Seminal  Plasma.  In:  ESE  Hafez  &  B Hafez  (Eds).  Reproduction  in  Farm Animals.7th  Ed.  Williams  &  Wilkins, USA.
Hafez  B,  Hafez  ESE.  2000.  Reproduction  in farm  animals.  Edisi  Ke-7.  Lippincot. Williams  and  Wilkins.  USA.  Hlm.  140– 141.

## Herdiawan.  2004.  Pengaruh  Laju  Penurunan
Suhu  dan  Jenis  Pengencer  terhadap Kualitas  Semen  Beku  Domba  Periangan. Jurnal  Ilmu  Ternak  dan  Veteriner 9(2): 98-107.
Hoesni  F.  1997.  Pengaruh  kadar  kuning  telur dalam berbagai pengencer terhadap
kualitas semen spermatozoa pasca pembekuan. Tesis. Program Pasca Sarjana. Universitas Padjajaran. Bandung.
Holt  WV.  2000.  Basic  aspect  of  frozen  storage of semen. Anim. Reprod. Sci. 62(3): 3-22. Johnson  LA,  Weitze  KF,  Fiser  P,  Maxwel
WMC.  2000.  Storage  of  boar  semen. Anim . Reprod . Sci. 62(3): 143-172.
Kaka  A.  2020.  Karakteristik  dan  daya  fertilitas spermatozoa  babi  peranakan  landrace. Jurnal  Peternakan  Indonesia 22(3):  277- 283.
Kartasudjana  R.  2001.  Teknik  inseminasi buatan. Departemen Pendidikan Nasional. Jakarta.
Komariah,  Arifiantini  RI,  Nugraha  FW.  2013.
Kaji  banding  kualitas  spermatozoa  sapi simmental,  limousin  dan  friesian  holstein terhadap  proses  pembekuan. Buletin Peternakan 37(3): 143-147.
Kostaman  T,  Sutama  IK.  2006.  Studi  motilitas dan  daya  hidup  spermatozoa  kambing boer dalam pengencer Tris sitrat fruktosa.
J. Sain Vet. 24(1): 58-64.
Kusumaningrum  DA,  Situmorang  P,  Setioko AR, Sugiarti T, Triwulangningsih, Sianturi  RG.  2002.  Pengaruh  jenis  dan aras  krioprotektan  terhadap  daya  hidup spermatozoa  entog.  Balai  Penelitian Ternak. Bogor.
Lubis  TM,  Dasrul  CNT,  Akbar  T.  2013.
Efektivitas  penambahan  vitamin  c  dalam pengencer  susu  skim  kuning  telur terhadap  kualitas  spermatozoa  kambing boer  setelah  penyimpanan  dingin. Jurnal S. Pertania. 3(1): 347-361.
Mc  Laughin  EA,  Ford  WCL,  Hull MGR.  1992. Motility  characteristics  and  membran integrity of cryopreserved human spermatozoa. Reprod. 95(5): 527-534. Mittal P, Gupta V, Kaur G, Garg AK, Singh A. 2010. Phytiocimistry and pharmacological activities  of  psidium  guajava.  A  review. IJPSR. 1(9): 9-19.
Moussa M, Martinet V, Trimeche A. 2002. Low density  lipoproteins  extracted  from  hen egg yolk by  an  easy  method : cryoprotective  effect  on  frozen  thawed
bull semen. Theriogenology 57 (6): 1695- 1706.
Park JE, Graham K. 1992. Flavanoid composition and effect of cryopreservation  procedures  on  sperm membranes. Theriogenology 38(2):  209- 222.
Passarelli  MDS,  Pinoti  Pavaneli  AP,  Mouro Ravagnani  G,  Pasini  Martins  M,  Pedrosa AC, Maria Massami Kitamura Martins S, Rocha  NRDA,  Bittarigo  VH,  Yasui  G, Yeste M, de Andrade AFC. 2020. Effects of  different  equilibration  times  at  5°C  on boar sperm cryotolerance. Animal reproduction science 219(1): 106-547.
Robert VK. 2006. Semen Processing, Extending And  Storage  For  Artificial  Insemination In  Swine.  Dep.  of  animal  science University of Illinois. Hlm. 1–7.
Partodihardjo F. 1992. Ilmu Reproduksi Hewan. Penerbit Mutiara, Cet. Ke-3. Jakarta.
Salisbury  GW,  Van  Denmark.  1985.  Fisiologi Reproduksi  Dan  Inseminasi  Buatan  Pada Ternak  Sapi  (Terjemahan  RD  Januar). Gaja Mada Universitas Press. Yogyakarta.
Salmah  N.  2014.  Motilitas,  persentase  hidup, dan  abnormalitas  spermatozoa  semen beku  sapi  bali  pada  pengencer  andromed dan  Tris  kuning  telur. Skripsi. Fakultas
Peternakan Universitas Hasanudin Makasar. Sangma TFM, Ahmed K, Choudhury M, Zaman GU, Ahmed N, Das, A. 2020. Characteristics of fresh crossbreed hampshire boar semen. Haryana veteriner 59 (1): 98-101.
Siswanto.  2006.Kualitas  Semen  di  dalam pengencer  tris  dan  natrium  sitrat  dengan berbagai  sumber  karbohidrat  dan  level gliserol  pada  proses  krioprservasi  semen rusa  timor  (Cervus  timorensis). Tesis. Sekolah  Pascasarjana  Institut  Pertanian Bogor. Bogor.
Siregar  FK.  2018.  Pengaruh  waktu  ekuilibrasi terhadap  kualitas    semen  sapi  pesisir sebelum  proses  pembekuan.  Skripsi. Fakultas Peternakan Andalas Padang.
Solihati Idi NR, Rasad SD, Rizal M, Fitriani M. 2008. Kualitas spermatozoa cauda epididimis  sapi  peranakan  ongol  (PO) dalam  pengencer  susu,  Tris  dan  sitrat kuning  telur  pada  penyimpnanan  4-5°C.
Jurnal Animal Production 10(1): 22-29.
Solihati  Idi  NR,  Kune  P.  2009.  Pengaruh  jenis pengencer  terhadap  motilitas  dan  daya
tahan  hidup  spermatozoa  semen  cair  sapi simental. Makalah seminar nasional.
Steinbach  J,  Foote  RH.  1992.  Osmotic  pressure and  pH  effects  on  survival  of  frozen bovine  spermatozoa. Journal  of  Dairy Science 50 (2): 205–213.
Sugiarti  T,  Triwulangningsih  E,  Situmorang  P, Dianturi  RG,  Kusumaningrum  DA.  2004.
Penggunaan  katalase  dalam  produksi semen  dingin  sapi.  Prosiding  seminar nasional teknologi peternakan dan veteriner. Hlm. 215–220.
Sumardani  NLG.  2007.  Viabilitas  dan  fertilitas spermatozoa dalam pengenceran BTS dan Zorlesco  dengan  penyimpanan  berbeda dalam  rangkaian  inseminasi  buatan  pada babi. Tesis. Sekolah  Pasca  Sarjana.
Institut Pertanian Bogor.
Sutama  IK,  Setiadi  B,  Situmorang  P,  Adiati  U, Budiarsana  IGM,  Kostaman  T,  Maulana, Mulyawan,  Riad  S.  2000.  Uji  kualitas semen  beku  kambing  peranakan  etawah dan  kambing  boer.  Laporan  Bagian Proyek  Rekayasa  Teknologi  Peternakan ARMP II. Balai Penelitian Ternak. Bogor. Tambing SN, Toelihere MR, Yusuf TL, Sutama IK.  2000.  Pengaruh  gliserol  dalam pengencer  tris  terhadap  kualitas  semen beku  kambing  peranakan  etawah. JITV 5(2): 84-99.
Toelihere MR. 1993. Fisiologi Reproduksi Pada Ternak. Angkasa. Bandung. Hlm. 22. Tuhu  AD,  Ondho  YS,  Samsudewa  D.  2013. Pengaruh  perbedaan  waktu  pelepasan water  jacket  dalam  proses  ekuilibrasi terhadap  kualitas  semen  beku  sapi  jawa pada  tahap  before  freezing  dan  post thawing. Jurnal Animal Agricultural 2(1): 473.
Umar  S,  Maharani M.  2005.  Pengaruh  berbagai waktu  ekuilibrasi  terhadap  daya  tahan sperma sapi limousin dan uji kebuntingan.
Jurnal agribisnis peternakan 1(1): 17-21.
Vishwanath  R,  Shannon  P.  2000.  Storage  of bovine  semen  in  liquid  and  frozen  state.
Animal  reproduction  science 62(1):  23- 53.
Watson  PF,  Martin  CA.  1975. The  Influence  of some  Fractions  of  Egg  Yolk  on  the Survival  of  Ram  Spermatozoa  at    5ºC. Australian  journal  of  biological  sciences 28 (2): 145-152.
Wiratri VDB, Susilawati T dan Wahyuningsih S. 2014. Kualitas semen sapi Limousin pada pengencer yang berbeda selama pendinginan. Jurnal  Ternak  Tropika . 15(1): 13-20
Widiastuti  E.  2001.  Kualitas  semen  beku  sapi FH  dengan  penambahan  antioksidan vitamin  C  dan  E. Skripsi. Fakultas Peternakan  Institut  Pertanian  Bogor.
Bogor.
Yi  YJ,  Cheon  YM,  P.  C.  2002.  Effects  of  N- acetyl-D-glucosamine and glyserol concentration  and  equilibration  time  on acrosome  morphology  and  motility  of frozen  thawed  boar  sperm. Animal Reproductuon 69(2): 91-97.
Yulnawati,  Agus  SM.  2005.  Motilitas  dan keutuhan  membran  plasma  spermatozoa epididimis  kucing  selama  penyimpanan pada suhu 4ºC. Media Kedokteran Hewan 21(3): 100-104.
Yusuf  TL,  Arifiantini  RI,  Mulyadi  Y.  2006. Efektivitas  Waktu  Pemaparan  Gliserol terhadap  motilitas  spermatozoa  pada pembekuan semen domba lokal menggunakan  pengencer  Tris  kuning telur. Animal production 8(3): 168-173. Yusuf  TL,  Arifiantini  R,  Dapawole  R,  Nalley WM.  2017.  Kualitas  semen  beku  babi dalam pengencer komersial yang disuplementasi  dengan  trehalosa. Jurnal Veteriner 18(1): 69-75.
Zheng W, Wang SY. 2009. Antioxidant activity and  phenolycs  compound  in  selected herbs. Jurnal Agric. Food. Chem . 49(11): 5165-5170.