## Borneo Journal Of Medical Laboratory Technology

## Potensi Dan Uji Stabilitas Ekstrak Lawsonia Inermis Sebagai Cat Penutup  Pada Gram
Staining Dengan Variasi Suhu
Potency and Stability Test of Lawsonia inermis Extract as Counterstain on Gram Staining with Temperature Variation
Nida Azki Asfiya 1*
Dhiah Novalina 2
Tri Dyah Astuti 3
*1 Universitas ‘Aisyiyah Yogyakarta, Yogyakarta, Indonesia
2 Universitas ‘Aisyiyah Yogyakarta, Yogyakarta, Indonesia
3 Universitas ‘Aisyiyah Yogyakarta,
Yogyakarta, Indonesia
*email: nidaazkiasfiya22@gmail.com

## Abstrak
Pewarnaan gram merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi bakteri. Safranin  merupakan  salah  satu  zat  pewarna  pada  pewarnaan  gram.  Toksisitas dan bahaya kesehatan yang ditimbulkan dari penggunaan pewarna safranin telah banyak  dilaporkan,  terutama  bahaya  pencemaran  zat  warna  yang  berasal  dari limbah zat warna sintetis. Penggunaan pewarna sintetis sangat berbahaya karena dapat  memicu  kanker,  kerusakan  ginjal  dan  hati.  Tanaman  yang  berpotensi dijadikan  sebagai    cat  penutup  pada  pewarnaan  gram  adalah  daun  pacar  kuku ( Lawsonia  inermis )  yang  mengandung  zat  warna  lawsone.  Namun,  zat  warna alami  rentan  terhadap  suhu.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui kemampuan  daun  pacar  kuku    dalam  mewarnai  bakteri    sebagai  pewarna penutup  pada pewarnaan  gram,  serta  mengetahui  stabilitas  suhu ekstrak  daun pacar kuku pada berbagai variasi suhu. Penelitian ini merupakan jenis penelitian deskriptif  kualitatif  dengan  desain  penelitian  eksperimen  yang  dilakukan  di Laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas  Ilmu  Kesehatan  Universitas  ‘Aisyiyah Yogyakarta. Hasil pewarnaan bakteri Gram negatif ( Escherichia coli )  pada suhu 40 ℃ dan  80 ℃ terlihat  tidak  kontras  dengan  latar  belakang,  sementara pewarnaan  Gram  positif  ( Staphylococcus  aureus )  terlihat  kontras  dengan  latar belakang.  Dapat  disimpulkan  bahwa  pewarnaan  gram  bakteri Escherichia  coli dengan  ekstrak Lawsonia  inermis pada  suhu  40 ℃ dan  80 ℃ ,  diperoleh  hasil pewarnaan  yang  tidak  kontras  antara  sel  bakteri  dengan  latar  belakang, sedangkan  pada  bakteri Staphylococcus  aureus diperoleh  hasil  pewarnaan  yang kontras antara sel bakteri dengan latar belakang. Uji stabilitas ekstrak Lawsonia inermis pada suhu 40 ℃ lebih stabil dibandingkan 80 ℃ .

## Kata Kunci:
Lawsonia inermis , Uji Stabilitas ,
Pewarnaan Gram,  Safranin
Keywords :
Lawsonia inermis , Stability Test, Gram Staining, Safranin

## Abstract
Gram staining is one of the methods used for bacterial identification. Safranin is one of  the  dye  substances  employed  in  Gram  staining.  The  toxicity  and  health  hazards associated with the use of safranin have been extensively reported, especially the risk of  contamination  from  synthetic  dye  waste.  The  use  of  synthetic  dyes  is  highly hazardous as it can lead to cancer, kidney, and liver damage. A potential alternative for  Gram  staining  is  the  use  of  henna  leaves  (Lawsonia  inermis),  which  contain  the dye  substance  lawsone.  However,  natural  dyes  are  susceptible  to  temperature changes.This research aims to determine the ability of henna leaves to stain bacteria as  a  counterstain  in  Gram  staining  and  to  assess  the  temperature  stability  of  the henna  leaf  extract  under  various  temperature  variations.  This  study  is  a  qualitative descriptive  research  with  an  experimental  design  conducted  in  the  Microbiology Laboratory of the Faculty of Health Sciences at 'Aisyiyah University Yogyakarta. The results of Gram staining for Gram-negative bacteria (Escherichia coli) at temperatures of  40°C  and  80°C  show  no  contrast  with  the  background,  while  Gram-positive staining for Staphylococcus aureus appears contrasting against the background. It can be  concluded  that  the  Gram  staining  of  Escherichia  coli  bacteria  with  Lawsonia inermis  extract  at  temperatures  of  40°C  and  80°C  yields  staining  results  that  lack contrast  between  bacterial  cells  and  the  background.  In  contrast,  Staphylococcus aureus  bacteria  exhibit  contrasting  staining  results  between  bacterial  cells  and  the background. The stability test of Lawsonia inermis extract indicates greater stability at 40°C compared to 80°C.

## PENDAHULUAN
Bakteri secara umum  tidak berwarna dan hampir tidak nampak.  Identifikasi  bakteri  dapat  dilakukan  dengan pewarnaan  bakteri.  Pewarnaan  Gram  merupakan teknik  pewarnaan  differential  yang  paling  penting  dan paling  luas  digunakan  dan  membagi  bakteri    menjadi dua  kelompok,  yaitu  Gram  positif  dan  Gram  negatif (Rini  &  Rohmah,  2020).  Bakteri  Gram    positif  (+) mempertahankan  zat  warna  Kristal  violet  sehingga  sel bakteri  tampak  berwarna  biru  atau  ungu  tua.  Bakteri Gram negatif  (-) kehilangan Kristal violet ketika di cuci dengan alkohol dan sewaktu diberi counterstain safranin sel  bakteri  tampak  berwarna  merah  (Gracia  dalam Miftahul, 2021).
Safranin  merupakan  salah  satu  zat  warna  yang  secara luas  digunakan  pada  bidang  industri,  tekstil,  histologi, sitologi  dan  bakteri.  Limbah  safranin  berdampak  bagi kesehatan,  diantaranya  dapat  mengakibatkan  iritasi pada  mulut,  tenggorokan,  pernafasan  dan  perut (Edyani, 2020).  Selain itu zat pewarna tersebut mahal, juga  mengandung  senyawa  kimia  yang  berbahaya  bagi kesehatan  pengguna.  Penggunaan  pewarna  sintesis sangat  berbahaya  karena  dapat  memicu  terjadinya kanker  serta  kerusakan  ginjal  dan  hati  (Reysa  dalam Pujilestari, 2015). Toksisitas dan bahaya kesehatan yang ditimbulkan  dari  penggunaan  pewarna  safranin  dan pewarnaan  sintetik  lain  telah  banyak  dilaporkan, terutama  bahaya  pencemaran  zat  warna  yang  berasal dari  limbah  cair  buangan  industri  (Nurmasari et  al ., 2018).
Adanya  keterbatasan  penggunaan  pewarna  sintetik, maka  dibutuhkan  pewarna  alternatif  yaitu  pewarna alami.  Pewarna  alami dapat dijadikan  sebagai  alternatif karena  selain  murah,  penggunaan  bahan  alami  lebih aman  dan  mudah  diperoleh.  Beberapa  penelitian terdahulu  telah  dilakukan  untuk  memanfaatkan  bahan alami  sebagai  pengganti  pewarnaan  gram  diantaranya yang  dilakukan  oleh  Niken  &  Yulia  (2023)  tentang pemanfaatan  daun  pacar  kuku  ( Lawsonia  inermis ) sebagai  pewarna  alternatif  untuk  mewarnai  bakteri
Escherichia  coli. Daun  pacar  kuku  ( Lawsonia  inermis ) mengandung zat warna lawsone . Lawsone (2-hidroksi, 1,4  naftokuinon)  merupakan  kandungan  pewarna utama  daun  pacar  kuku  dengan  konsentrasi  1,0-1,4%. Daun  pacar  kuku.  memiliki  substansi  zat  warna  yang bervariasi  mulai  dari  merah,  burgundy,  kuning  tua, coklat kemerahan sampai coklat (Setiana, 2015).
Pada penelitian Niken & Yulia (2023) belum dilakukan uji  stabilitas  dari  ekstrak  daun  pacar  kuku  yang digunakan  sebagai  pewarna  alternatif  pada  pewarnaan bakteri. Kestabilan zat warna lawsone dipengaruhi oleh beberapa  faktor  antara  lain  pH,  oksigen,  cahaya  dan suhu  yang  juga  dapat  merusak  warna  zat  warna lawsone  pada  saat  proses  maserasi  (Herwin  dalam Niken  &  Yulia,  2023).  Berdasarkan    latar    belakang tersebut,  maka  peneliti tertarik    untuk     meneliti potensi  ekstrak  daun  pacar  kuku  sebagai  alternatif pewarna  safranin  serta  stabilitas  suhu  dari  ekstarak tersebut.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui  apakah  daun  pacar  kuku  dapat  dijadikan sebagai pewarna alternatif safranin sebagai counterstain pada pewarnaan gram, serta mengetahui stabilitas suhu dari ekstrak daun pacar kuku.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  merupakan  jenis  penelitian  deskriptif kualitatif  dengan  desain  penelitian  eksperimen  yang dilakukan  di  Laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas  Ilmu Kesehatan Universitas ‘Aisyiyah Yogyakarta.

## PREPARASI SAMPEL
Daun pacar kuku disortir untuk memisahkan daun dari tangkai  dan  daun  yang  rusak.  Setelah  itu  daun  pacar kuku  dicuci  dan  ditiriskan.  Daun  yang  telah  tiris dikeringkan  dengan  oven  selama  4  hari  pada  suhu  50
℃ sampai kadar air daun <10 % dari berat basah. Daun pacar kuku yang telah kering diblender hingga menjadi bubuk.

## EKSTRAKSI
Ekstraksi  dilakukan  dengan  metode  maserasi menggunakan pelarut ethanol absolut 96%. Bubuk daun
pacar  kuku  direndam  dalam  pelarut  selama  tiga  hari dan  sesekali  diaduk.  Setelah  tiga  hari,  hasil maserasi disaring  menggunakan  kertas Whatman no.1 untuk  memisahkan  antara  filtrat  dan  residu.  Hasil maserat  di  uapkan    dengan  hotplate  sampai  ekstrak menjadi kental.

## UJI STABILITAS SUHU
Pengujian stabilitas suhu dilakukan dengan cara ekstrak daun  pacar  kuku    dibuat  menjadi  dua  larutan  yaitu larutan  pertama  2  ml  ekstrak  daun  pacar  kuku ditambahkan    dengan  50  ml  aquadest,  kemudian dihomogenkan  dan  dipanaskan  pada  hotplate  dengan suhu  40 ℃ selama  satu  jam.  Larutan  kedua  dibuat dengan  cara  2  ml  ekstrak  daun  pacar  kuku ditambahkan    dengan  50  ml  aquadest,  kemudian dihomogenkan  dan  dipanaskan  pada  hotplate  dengan suhu  80 ℃ selama  satu  jam.  Kemudian  dilakukan  uji stabilitas  dengan  cara  larutan  tersebut  di  ukur absorbansinya  menggunakan  spektrofotometer  UV-vis pada panjang gelombang 600-640 nm, kemudian dibuat grafik hubungan suhu dengan absorbansi zat warna.

## PEMBUATAN PREPARAT BAKTERI
Pembuatan preparat bakteri dilakukan dengan cara ose cincin di pijarkan di atas spritus kemudian biakan murni dari E.  coli dan Staphylococcus  aureus diambil  dan diletakkan  di kaca objek . Kemudian diteteskan larutan NaCl  dan  diratakan  sehingga  membentuk  oval. Preparat  dibiarkan  kering  setelah  itu  di  fiksasi  diatas spritus.

## PEWARNAAN GRAM
Preparat  bakteri  yang  telah  difiksasi  digenangi  dengan larutan  kristal  violet  selama  satu  menit,  kemudian dibilas  dengan  aquades.  Setelah  itu  preparat  digenangi dengan  larutan  lugol  selama  satu  menit  dan  dibilas dengan aquades. Kemudian preparat digenangi dengan larutan alkohol sampai warna luntur dan dibilas dengan aquades.  Kemudian  preparat digenangi  dengan  larutan safranin  selama  30  detik  sebagai  kontrol  ,  sedangkan sebagai percobaan maka safranin diganti dengan larutan pewarna  dari  ekstrak  daun  pacar  kuku  dengan  suhu 40 ℃ dan  80 ℃ .  Preparat  dikeringkan.  Setelah  kering maka  dilakukan  pengamatan  menggunakan  mikroskop perbesaran 100x.

## ANALISIS DATA
Pengolahan  dan  analisis  data  pada  penelitian  ini berdasarkan hasil pengamatan mikroskopis pewarnaan gram dengan ekstrak daun pacar kuku pada bakteri E. coli dan Staphylococcus  aureus .  Analisis  data  hasil pengujian stabilitas disajikan dalam bentuk grafik  suhu dan  absorbansi  zat  pewarna  dari  ekstrak  daun  pacar kuku pada panjang gelombang 600-640 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN HASIL
Hasil pewarnaan gram dengan ekstrak Lawsonia inermis pada bakteri Escherichia coli dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel I. Hasil Pewaarnaan Gram dengan Zat Warna dari Ekstrak Daun Pacar Kuku pada Escherichia coli Perlakuan Warna Hasil Pewarnaan Gram Keterangan Bentuk Gambar Safranin (kontrol) Merah Basil Penyerapan  zat  warna terlihat  kontras  dengan latar belakang
Daun  pacar  kuku (Suhu 40 ℃ ) Bening Basil Penyerapan  zat  warna terlihat  tidak  kontras dengan latar belakang Suhu 80 ℃ Bening Basil Penyerapan  zat  warna terlihat  tidak  kontras dengan latar belakang
Sebelum  bakteri Escherichia  coli  dan  staphylococcus aureus diwarnai  dengan  ekstrak Lawsonia  inermis dilakukan  perlakuan  kontrol  terlebih  dahulu,  yaitu Escherichia  coli dan  staphylococcus  aureus diwarnai dengan  safranin  untuk  melihat  perbedaan  hasil  antara menggunakan zat warna alami dan zat warna sintetis.
Pewarnaan  dengan  ekstrak Lawsonia  inermis juga dilakukan  dengan  variasi  suhu  40 ℃ dan  80 ℃ untuk melihat kestabilan zat warna tersebut. Hasil pewarnaan gram  dengan  ekstrak Lawsonia  inermis pada staphylococcus aureus disajikan pada Tabel II.
Tabel II. Hasil Pewaarnaan Gram dengan Zat Warna dari Ekstrak Daun Pacar Kuku pada Staphylococcus aureus
Perlakuan Warna Hasil Pewarnaan Gram Keterangan Bentuk Gambar Safranin (kontrol) Ungu Coccus Penyerapan zat warna terlihat kontras dengan latar belakang Daun  pacar  kuku (Suhu 40 ℃ ) Ungu Coccus Penyerapan zat warna terlihat kontras dengan latar belakang Suhu 80 ℃ Ungu Coccus Penyerapan  zat  warna terlihat  kontras  dengan latar belakang
Hasil pewarnaan gram dengan ekstrak Lawsonia inermis pada bakteri staphylococcus aureus  terlihat lebih jelas dan kontras dibandingkan dengan hasil pewarnaan pada bakteri Escherichia  coli ,  dikarenakan staphylococcus aureus merupakan  bakteri  gram  positif  yang  tidak menyerap cat warna penutup baik safranin maupun zat
warna  ekstrak Lawsonia  inermis. Variasi  suhu  pada pewarnaan gram  dilakukan  untuk  melihat  stabilitas suhu dari zat warna Lawsonia inermis . Hasil uji stabilitas ekstrak Lawsonia  inermis pada  suhu  40 ℃ dan  80 ℃ dapat dilihat pada grafik Gambar 1 .

## PEMBAHASAN
Pada penelitian ini safranin digantikan dengan zat warna dari  ekstrak Lawsonia  inermis .  Fungsi  dari  zat  warna ekstrak  daun  pacar  kuku  adalah  mewarnai  dinding  sel bakteri gram negatif yaitu Escherichia coli . Berdasarkan hasil  pada  Tabel  1  dengan  perlakuan  kontrol  yaitu pewarnaan Escherichia  coli menggunakan  safranin mempunyai  kualitas  hasil  pewarnaan  yang  baik  dan kontras    yaitu  terlihat  bakteri  berbentuk  basil berwarna merah. Bakteri gram negatif memiliki dinding sel  yang  lebih  tipis.  Setelah  pencucian  dengan  alkohol lapisan  lipopolisakarida  pada  bakteri  gram  negatif memberikan  permeabilitas  yang  lebih  besar,  sehingga pewarna  sebelumya  dapat  lebih  mudah  dikeluarkan dari  sel.  Akibatnya,  saat  proses  pewarnaan  dengan safranin, bakteri gram negatif akan menerima pewarna safranin dan tampak berwarna merah. Sedangkan hasil pewarnaan  gram Escherichia  coli dengan  ekstrak Lawsonia inermis pada suhu 40 ℃ dan 80 ℃ kualitas hasil pewarnaan  kurang  baik,  karena  hanya  terlihat  bakteri berbentuk  basil  jernih  tidak  berwarna  Hal  ini  tidak sejalan dengan penelitian Niken & Yulia (2023) yang
menyatakan bahwa  ekstrak  daun  pacar  kuku  ( Lawsonia  inermis ) efektif dan dapat digunakan sebagai pengganti pewarna penutup  pada  pewarnaan  gram,  pada  pewarnaan tersebut  tampak  bakteri  basil  berwarna  merah. Berdasarkan studi literatur yang dilakukan oleh Edyani (2020)  menyatakan  bahwa  zat  pewarna  alami  yang efektif  digunakan  sebagai  pewarna  alternatif  safranin dalam gram stainning adalah daun pacar kuku.
Pada  penelitian  ini Escherichia  coli tidak  terwarnai dengan  sempurna  menggunakan  ekstrak  daun  pacar kuku    karena  dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor diantaranya  perbandingan  konsentrasi  antara  ekstrak daun  pacar  kuku  dan  pelarut  masih  belum  sempurna, pencucian  dengan  alkohol  yang  terlalu  lama  dapat menyebabkan  semua  pewarna  keluar  dari  sel  bakteri, baik dari bakteri gram positif maupun gram negatif. Hal ini  dapat  menyebabkan  kesulitan  dalam  membedakan antara  kedua  jenis  bakteri.  Selain  itu  suhu  yang  tidak stabil atau waktu yang tidak sesuai, dapat memengaruhi hasil akhir. Suhu yang terlalu tinggi atau terlalu rendah dapat mempengaruhi interaksi antara bakteri, pewarna, dan  reagen.  Kontaminasi  zat  warna  dapat menyebabkan  gangguan  dalam  proses  pewarnaan  dan menghasilkan  hasil  yang  kurang  akurat.  Kesalahan
Gambar 1.  Grafik uji stabilitas ekstrak Lawsonia inermis pada suhu 40 ℃ dan 80 ℃ pada panjang gelombang 600-640 nm.
dalam  prosedur  pewarnaan  juga  dapat  mempengaruhi hasilnya.
Hasil  pewarnaan  bakteri Staphylococcus  aureus pada Tabel 2 dengan perlakuan kontrol  safranin, perlakuan suhu  40 ℃ dan  80 ℃ memperlihatkan  hasil  pewarnaan gram  yang  baik  dan  kontras    yaitu  terlihat  bakteri berbentuk  coccus  berwarna  ungu. Staphylococcus aureus merupakan  bakteri  gram  positif  yang  memiliki dinding  sel  yang  lebih  tebal  daripada  bakteri  gram negatif. Struktur ini memungkinkan bakteri gram positif mempertahankan  kristal  violet  selama  pencucian dengan alkohol.
Uji stabilitas suhu pada penelitian ini dilakukan dengan larutan  zat  warna  ekstrak  daun  pacar  kuku  dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Pada uji stabilitas ini terjadi penurunan absorbansi dari suhu  40 ℃ ke  80 ℃ pada  600-640  nm  dapat  dilihat pada grafik Gambar 1. Hal ini sejalan dengan Sharifi & Hassani,  (2012  dalam  Nasrullah  et  al.,  2020)  yang menyatakan  bahwa  salah  satu  faktor  penyebab penurunan  nilai  absorbansi  adalah  enzim.  Enzim menyebabkan  terjadinya  dekolorisasi  zat  warna, sehingga  warna  yang  diekstrak  akan  memudar.  Hal  ini diduga  dengan  semakin    tinggi  suhu  pemanasan  maka akan  mengakibatkan  pigmen  warna  mengalami dekomposisi  dan  nilai  asbsorbansinya  menurun. (Wijaya dalam  Yusuf et  al., 2023)  menyatakan  bahwa suhu  dan  lama  penyinaran  menyebabkan  terjadinya dekomposisi  dan  perubahan  struktur  pigmen  sehingga terjadi  pemucatan.  Penurunan  absorbansi  juga  dapat disebabkan  oleh denaturasi  protein,  banyak  zat warna alami yang memiliki struktur kompleks, seperti protein. Pemanasan  yang  tinggi  dapat  menyebabkan  denaturasi protein,  yang  mengakibatkan  perubahan  bentuk  dan struktur  molekuler.  Perubahan  ini  bisa  menyebabkan perubahan  dalam  absorbansi  spektrum  zat  warna. Pemanasan  ekstrak  zat  warna  dapat  menyebabkan perubahan kimia, seperti reaksi oksidasi atau degradasi. Perubahan  ini  bisa  merusak  struktur  molekuler  zat warna  dan  mengakibatkan  penurunan  absorbansi.
Selain  itu  pemanasan  dapat  mengakibatkan  penguapan pelarut.  Konsentrasi  zat  warna  dalam  larutan  dapat meningkat, dan hal ini dapat mempengaruhi absorbansi. Menurut Oktaviani (2016) warna yang dihasilkan daun pacar  kuku  lebih  pekat,  jika  tanaman  tumbuh  pada temperatur  antara  35°C  sampai  45°C.  Pada temperatur di bawah 11°C tanaman tidak berkembang dengan  baik,  dan  pada  temperatur  di  bawah  5°C tanaman  akan  mati. Lawsone sebagai  molekul  warna, terutama  banyak  terkandung  di  dalam  daunnya,  dan kandungan  warna  terpekat  terdapat  pada  tangkai daunnya. Maka stabilitas suhu ekstrak daun pacar kuku yang  digunakan  sebagai  zat  warna  stabil  pada temperatur  antara  35°C  sampai  45°C  dan  pada temperatur  tersebut  pigmen  warna  lebih  pekat  dan maksimal jika digunakan sebagai pewarna.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa pewarnaan gram bakteri Escherichia coli dengan  ekstrak Lawsonia  inermis pada  suhu  40 ℃ dan  80 ℃ , diperoleh  hasil  pewarnaan  yang  tidak kontras  antara  sel  bakteri  dengan  latar  belakang. Sedangkan hasil pewarnaan gram bakteri Staphylococcus aureus dengan ekstrak Lawsonia inermis diperoleh hasil pewarnaan yang kontras antara sel bakteri dengan latar belakang.  Hasil  uji  stabilitas  ekstrak Lawsonia  inermis pada  suhu  40 ℃ lebih  stabil  dibandingkan  80 ℃ , ditandai terjadinya  penurunan  absorbansi  pada  suhu 80 ℃ .

## SARAN
Penelitian  ini  diharapkan  dapat  dikembangkan  lebih lanjut. Bagi peneliti selanjutnya dapat dicari konsentrasi yang  paling  sesuai  antara  ekstrak  daun  pacar  kuku dengan  pelarut  untuk  dijadikan  pewarna  alternatif pengganti  safranin  pada  pewarnaan  gram,  serta  diteliti lebih lanjut mengenai stabilitas zat pewarna daun pacar kuku,  baik  dari  sisi  suhu,  lama  penyimpanan,  pH  dan lain sebagainya.

## DAFTAR PUSTAKA
Edyani,  J.  S.,  Widyantara,  A.  B.,  &  Novalina,  D.  2020. Systematic  Review:  Pemanfaatan  Bahan  Alami  Sebagai Pewarna Alternatif Pengganti Safranin pada Pewarnaan Gram. Disertasi . Universitas  ‘Aisyiyah  Yogyakarta , Yogayakarta.
Miftahul, K. 2021. Identifikasi Ekstrak Ubi Jalar (Ipomea
Batatas  Poiret) sebagai  Zat  Pewarna  Alternatif  pada
Pewarnaan Gram. Skripsi .  Universitas  Perintis Indonesia , Padang.
Niken,  N.,  &  Yulia,  I.  2023.  Innovation  of  extract ( Lawsonia  inermis  L )  as  alternative  dye  for  Escherichia
Coli  bacterial  staining. International  Journal  of Multidisciplinary Approach Research and Science , 1 (03):512-517.
Nasrullah, N., Husain, H., & Syahrir, M. 2020. Pengaruh suhu dan waktu pemanasan terhadap stabilitas pigmen antosianin  ekstrak  asam  sitrat  kulit  buah  naga  merah (Hylocereus polyrizus) dan aplikasi pada bahan pangan. Chemica , 21(2):150-162 .
Nurmasari,  R.,  Umaningrum,  D.,  &  Yuliyanti,  E.  2018. Kajian  Sorpsi  Zat  Warna  Safranin  O  Pada  Sorben Beads  Kitosan-Tripolifosfat. Sains  dan  Terapan  Kimia , 12(1):34 – 40.
Oktaviani,  I.  M.  2016.  Pengaruh  Rebusan  Daun  Pacar Kuku (Lawsonia inrmis Linn.) terhadap Penurunan Kadar Asam  Urat  Mencit  Jantan ( Mus  muculus  L. ). Skripsi . Univeritas Jember, Jember.
Pujilestari,  T.  2015.  Sumber  dan  pemanfaatan  zat warna  alam  untuk  keperluan  industry. Dinamika Kerajinan dan Batik , 32(2):93-106.
Rini, C. S., & Rohmah, J. 2020. Buku Ajar Mata Kuliah Bakteriologi Dasar. Umsida Press , 1-108.
Setiana,  Shella.  2015.  Pengaruh  Konsentrasi  Mordan Kapur Dengan Zat Warna Daun Pacar Kuku (Lawsonia inermis)  Kering  Terhadap  Pewarnaan  Kain  Knit Cotton Dengan Teknik Tie Dye. Jurnal S1 Tata Busana , 4(3):38-43.
Susanto, H. 2016. Pemeriksaan Protozoa, Helminthes. Depok, PPPPTK Bisnis dan Pariwisata.
Yusuf,  T.  M.,  Nurjanah,  A.,  &  Wapa,  A.  2023. Karakteristik Uji Stabilitas Pigmen dan Antioksida Hasil Ekstraksi  Pewarna  Alami  dari  Kulit  Buah  Naga Merah. SOKO  GURU:  Jurnal  Ilmu  Pendidikan , 3 (1):163- 176.