PENAMBAHAN EKSTENDER MADU DALAM PROSES PENYIMPANAN SPERMA BEKU TERHADAP MOTILITAS DAN VIABILITAS SPERMATOZOA IKAN KOMET ( Carassius auratus auratus )
ADDITIONS EXTENDER HONEY IN FROZEN SPERM STORAGE PROCESS AGAINST SPERM MOTILITY AND VIABILITY COMET FISH (Carassius auratus auratus).
Boedi Setya Rahardja, A. Shofy Mubarak dan Permana Sulistyo Rini
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451

## Abstract
The development of fish culture is strongly influenced by hatchery technology, especially in the stock  of  fish  seed.  Often,  the  problem  arises  in  the  stock  of  seeds,  due  to  the  maturation  of  gametes, broadstock  fish  sometimes  do  not  happen  simultaneously,  one  of  alternative  solution  to  the  problem through  the  application  of  reproductive  biotechnology,  is  preservation  of  sperm  (Dirjennak,  2007). Preservation  sperm  is to optimize the  male  broadstock (Dirjennak, 2007). This  storage process requires diluent and cryoprotectant material that could sustain sperm motility (Zaenab, 2007). Diluent material is used  to  reduce  the  activity  of  spermatozoa  that  inhibit  energy  usage  and  prolong  the  life  of  sperm (Rustidja, 2000). The use of honey as a diluent material is expected to support the vitality of spermatozoa. Material  of  honey  there  are  various  combinations  of  materials  a  simple  sugar  and  salt  ions.  With  the combination of basic ingredients and simple sugar salt ions spermatozoa can produce an energy source so it can defend itself and can fertilize an egg cell after Cryoperservation process.
The purpose of this research is to know the effect of adding extender honey in enhancing sperm motility and viability of fish comet after the freezing process and to determine the best dose of honey in the process of freezing sperm comet fish (Carassius auratus auratus). This research was conducted at the Laboratory Center for Artificial Insemination Singosari. The design use Completely Randomized Design (CRD) followed by Duncan's multiple range test.
Test materials in this research is sperm comet fish are packed in mini straw and stored in liquid nitrogen  container  with  9  treatments  and  3  replications.  Media  diluent  used  was  physiological  NaCl  is added to honey, glucose, fructose, and Tris Aminomethane. Honey dosages of the experiments were 0.3% (A);  0.4%  (B),  0.5%  (C),  0.6%  (D)  and  0.7%  (E)  and  0.05%  glucose  (KG);  fructose  0.05%  (KF),  Tris Aminomethane  (KT)  and  without  the  addition  of  physiological  NaCl  (KN).  The  main  parameters  of observed  percentage  of  live  sperm  and  duration  of  motion.  The  supporting  parameters  measured  were fresh  sperm  concentration,  percentage  of  live  sperm  fresh,  long  fresh  sperm,  pH,  volume  and  color  of sperm.
The  results  of  the  research  shows  that the  addition  of  honey  with  different  dosage  at    diluents material physiological NaCl gived significant effect (P <0.05) against the percentage of sperm motion and long  life.  Average  percentage  of  long  life  and  highest  sperm  obtained  by  treatment  of  the  addition  of honey 0.6% (D), ie 63.89% and 101.33 seconds. Average lowest percentage of life gained by treatment of honey  0.3%  (C)  that  were  39.67  second  while  the  lowest  was  in  motion  treatment  control  without  the addition of (KN) that were 28.33 seconds.
Keywords : Carassius auratus auratus, sperm, honey, cryopreservation

## Pendahuluan Latar Belakang
Perkembangan  budidaya  ikan  sangat dipengaruhi oleh teknologi pembenihan, terutama  dalam  pengadaan  benih  ikan.  Sering kali  timbul  masalah  dalam  pengadaan  benih yang  dikarenakan  masa  pematangan  gamet induk  ikan  jantan  dan  betina  terkadang  tidak terjadi  secara  bersamaan,  salah  satu  cara  untuk memberikan alternatif pemecahan dalam
masalah
tersebut melalui penerapan
bioteknologi  reproduksi  yaitu  pengawetan sperma  (Dirjennak,2007).  Pengawetan  sperma bertujuan  dalam  mengoptimalkan  induk  jantan yang  unggul  dalam  membuahi  sel  telur  betina yang  sejenis  sehingga  pengawetan  sperma mempunyai  peran  yang  sangat  besar  dalam penyediaan benih ikan unggul (Dirjennak,2007).
Ikan  komet  memiliki  pemasaran  dan permintaan  yang  relatif  stabil  dikarenakan  ikan
komet  memiliki  bentuk  tubuh  yang  menarik, kombinasi  warna  yang  indah  dan  selalu bermunculan  jenis  atau  strain  yang  beragaam. Selain  itu  ikan  ini  memiliki  ketahanan  tubuh yang  lebih  baik  bila  dibandingkan  dengan  ikan hias tawar lainnya sehingga cara pemeliharaanya relatif mudah.
Pengawetan sperma membutuhkan sperma  yang  baik  kualitas  dan  kuantitasnya, sedangkan  kriteria  kualitas  sperma  yang  baik untuk  proses  penyimpanan  menurut  Toelihere (1981) yaitu sperma dengan motilitas lebih  dari 70%  dan  lama  gerak  menurut  Fujaya  (2002) yaitu  lebih  dari  dua  menit.  Bentuk  teknologi pembekuan semen ini disebut dengan kriopreservasi sperma (Partodiharjo,1992).
Kriopreservasi sperma merupakan suatu  teknik  penyimpanan  semen  dan  oosit dalam  keadaan  beku,  sedangkan  keuntungan dari  kriopreservasi  sperma  ialah  sperma  dapat disimpan  dalam  waktu  yang  tidak  terbatas  dan dapat  digunakan  kapan  saja  bila  diperlukan (Toelihere,1981).  Proses  ini  membutuhkan bahan  pengencer  dan  krioprotektan  yang  dapat mempertahankan motilitas spermatozoa.
(Zaenab,2007). Keberhasilan teknik pengawetan spermatozoa  ditentukan  oleh  temperature, pengaturan pertukaran gas, pencegahan pertumbuhan  bakteri  dan  pencegahan  terhadap aktifitas gamet (Billard, et al ., 1995).
Pemakaian ekstender dimaksudkan untuk mengurangi aktifitas spermatozoa sehingga  menghambat  pemakaian  energi  dan memperpanjang hidup
spermatozoa (Rustidja,2000).  Penggunaan  madu  sebagai bahan  pengencer  diharapkan  dapat  mendukung daya  hidup  spermatozoa.  Hal  ini  dikarenakan pada  madu  terdapat  berbagai  kombinasi  bahan dasar  gula  sederhana  dan  ion-ion  garam. Dengan  adanya  kombinasi  bahan  dasar  gula sederhana dan ion-ion garam spermatozoa dapat menghasilkan  sumber  energi  sehingga  dapat mempertahankan  diri  dan  dapat  membuahi  sel telur setelah proses Cryoperservation . Penambahan ekstender madu dapat memberikan pengaruh  terhadap  motilitas  dan  viabilitas spermatozoa ikan komet setelah proses pembekuan.

## Perumusan Masalah
Berdasarkan  latar  belakang  di  atas  dapat dirumuskan suatu masalah :
1) Bagaimana pengaruh penambahan ekstender  madu  dalam  meningkatkan motilitas  dan  viabilitas  spermatozoa  ikan komet setelah proses pembekuan?
2) Berapakah  konsentrasi  ekstender  madu yang  tepat  dalam  proses  pembekuan spermatozoa ikan komet?
Tujuan  dilakukan  penelitian  ini  adalah untuk  mengetahui  pengaruh  madu  terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ikan komet pada  proses  pembekuan  dan  untuk  mengetahui konsentrasi  madu  yang  tepat  pada  media ekstender agar  dapat  memberikan  daya  simpan yang terbaik.
Penelitian  ini  diharapkan  memberikan informasi bermanfaat sebagai bahan pertimbangan  tentang  pengaruh  penambahan ekstender madu  dalam  meningkatkan  motilitas dan  viabilitas  spermatozoa  ikan  komet  setelah proses pembekuan serta menentukan konsentarsi  madu  secara  tepat  pada  proses penyimpanan spermatozoa beku ikan.

## Metodologi Penelitian Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan April  2010  di  Laboratorium  Balai  Besar Inseminasi Buatan Singosari, Malang.

## Meteri Penelitian
Materi  penelitian  yang  akan  digunakan terdiri  atas  bahan  dan  alat  penelitian.  alat  yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop,  tabung  Eppendorf,  tabung  reaksi, gelas ukur, mini straw , obyek glass, cover glass, thermometer,  Erlenmeyer, timbangan  analitik, alumuniun  foil , counter , cool  top  cabinet, container  nitrogen  cair, lap  halus,  kertas  pH, pipet, spuit, haemocytometer, lemari pendingin. Bahan  penelitian  yang  akan  digunakan  adalah Sperma ikan komet ( Carasius auratus auratus ), alkohol  70%,  madu,  NaCl  fisiologis,  Natrium sitrat,  glukosa,  fruktosa, Tris  Amonethane , Nitrogen  cair, Penicillin , Streptomicin , gliserol dan larutan eosin negrosin dan aquadest.

## Metode Penelitian
Rancangan  penelitian  yang  digunakan dalam  penelitian  adalah  Rancangan  Acak Lengkap  (RAL),  sebab  dalam  penelitian  ini semua  dikondisikan  sama  kecuali  perlakuan yaitu  konsentrasi  madu, Tris  Aminomethane,
NaCl,  glukosa  dan  fruktosa  sebagai  kontrol (Kusriningrum, 2008). Penelitian ini menggunakan  media  pengencer  NaCl  fisiologis yang  ditambahkan  dengan  dosis  madu  0,3% (A);  0,4%  (B);  0,5%  (C);  0,6%  (D);  0,7%  (E); Tris Aminomethane (KT) , glukosa 0,05% (KG); fruktosa  0,05%  (KF)  dan  tanpa  penambahan (KN).

## Prosedur Kerja
A. Persiapan penelitian
Persiapan penelitian ini meliputi persiapan  peralatan  dan  bahan-bahan  yang diperlukan  serta  menyiapkan  induk  ikan  komet matang gonad yang akan di stripping.
Sterilisasi  alat-alat  yang  digunakan selama  penelitian  dilakukan  dengan  cara. Peralatan  yang  akan  digunakan  dicuci  sampai bersih  kemudian  dibilas  air  tawar  dan dikeringkan.  Peralatan  yang  terbuat  dari  kaca tahan  panas  seperti  pipet  dan  gelas  ukur  harus dicuci  bersih  lalu  dimasukan  ke  dalam  panci berisi  air  panas  atau  direbus  dan  tiriskan, melakukan pasteurisasi di  dalam  oven  atau inkubator  pada  suhu  55-60 o C  selama  3-12  jam (Zenichori,dkk. 2007).
B. Pelaksanaan Penelitian a. Persiapan dan Pembuatan Larutan
Pengencer.
Membuat larutan pengencer yang akan digunakan  dalam  proses  pembekuan  sebagai berikut:  langkah  awal  adalah  persiapan  bahan dan  alat  yang  dibutuhkan  dalam  proses pembuatan  larutan  pengencer.  Bahan  dan  alat yang  dibutuhkan  antara  lain  madu,  NaCl fisiologis,
Natrium
sitrat, penicillin , streptomicin, glyserol, fuktosa, glukosa dan Tris Aminomethane .
b. Pengambilan Sperma ( stripping ). Ikan matang gonad diambil dari kolam pemeliharaan  induk  secara  hati-hati  kemudian dipegang  menggunakan  kain  dengan  lubang genital  menghadap  ke  atas.  Ikan  kemudian  di stripping dan  sperma  yang  keluar  dihisap dengan spuit plastik  1  ml  kemudian  dilakukan pemeriksaan sperma segar
c. Pemeriksaan  Sperma  Segar  Sebelum Proses Pembekuan. Penentuan  kualitas  sperma  segar  yang diperoleh  dapat  dilakukan  pemeriksaan  secara makrokopis  dan  mikrokopis.  Pengamatan  yang dilakukan  sebagai  berikut  warna,  volume  dan pH-nya, serta dihitung konsentrasi spermatozoa, motilitas, lama gerak serta viabilitas dari semen segar.
1 Pemeriksaan Makrokopis
a) Pemeriksaan Fisik
Sperma  ikan  yang  tertampung  dapat diamati  secara  seksama  mulai  dari  warna, volume, bau dan kekentalan.
b) Pemeriksa Kimia
Pemeriksaan sperma secara kimia meliputi
derajat keasaman. Menentukan derajat
keasaman  pada  sperma  segar  menggunakan  pH paper (Rustidja, 2000). 2 Pemeriksaan Mikrokopis a) Penghitungan Konsentrasi Sperma Dengan Metode Thoma Penentuan  konsentrasi  spermatozoa dapat  dilakukan  dengan  cara  thoma  dan dinyatakan dalam angka (Salisbury dan VanDemark,  1985).  Cara  ini  menggunakan pengencer berupa larutan eosin dalam NaCl 3%. NaCl 3% berfungsi untuk mematikan spermatozoa,  sedangkan eosin 2%  berfungsi untuk  memberikan  warna  pada  sperma  yang mati  sehingga  dapat  menghitung  spermatozoa dengan mudah. b) Viabilitas Penentuan nilai viabilitas dapat dilakukan  dengan  metode  pembuatan  preparat ulas dengan pewarnaan eosin negrosin. Penghitungan menggunakan konsentrasi sperma dapat  dihitung  dengan  menggunakan  rumus (Evans dan Maxwell, 1987 dalam Hidayaturrahmah, 2007):
Konsentrasi sperma (%) = ∑sperma hidup x 100% ∑ total sperma
Sperma  yang  mati  akan  menyerap  zat warna  merah  karena  permeabilitas  dinding selnya telah melemah, sehingga zat warna eosin negrosin akan  dapat  masuk  ke  dalam  sel sehingga  menyebabkan  warna  merah  sampai kedalam  sel terutama pada  bagian ujung kepala dan yang hidup akan tetap berwarna putih pada bagian dalam selnya.
c) Lama Gerak
Pelaksanaan  pemeriksaan  lama  gerak dilakukan setelah sperma yang sudah di teteskan pada objek  glass ditambahkan  aquades,  secara alami akan terjadi pergerakan sperma.
Penghitungan  waktu  lama  gerak  sperma dilakukan sesaat setelah penambahan air,dengan mengamati  beberapa  sel  sperma  mulai  dari bergerak sampai berhenti dan tidak ada gerakan lagi. Pemeriksaan ini dilakukan pada mikroskop dengan  perbesaran  400x  (Nuryadi  dan  Sidiq, 2002).
d) Motilitas Meneteskan sperma ikan komet sebanyak  2-3  tetes  diatas objek  glass kemudian  tambahkan  aguades  dan  amati pergerakan  sperma  di  bawah  mikroskop dengan perbesaran 400x.
d. Pencampuran Sperma Dengan Ekstender Ekstender  madu  dibagi  menjadi  3
bagian:  A1,  A2  dan  B1,  sedangkan  A1  dan  A2 berisi ekstender madu dan  (B1) berisi ekstender madu dan gliserol. Pencampuran sperma dengan ekstender  A1  diberikan  pada  suhu  kamar  20-
23 0 C  dengan  perbandingan  1:1.  Pencampuran sperma  dan  ekstender  pada  suhu  kamar dimaksudkan  agar  suhu  antara  ekstender  dan kondisi  normal  ikan  tidak  berbeda  jauh.  Tahap pencampuran ekstender A2 dilakukan pada cool top  cabinet dengan  suhu  12 0 C  hingga  volume sperma, ekstender A1 dan A2 mencapai volume 1  ml  dilakukan  selama  30  menit.  Tahap pencampuran  selanjutnya  ekstender  B1  dengan suhu cool  top  cabinet 3 0 C  dan  dengan  volume B1 sebanyak 1 ml. (Zenichori dkk, 2007).
e. Evaluasi Sperma Setelah Proses Pencampuran Semen  yang  sudah  mengalami  proses pencampuran dilakukan evaluasi terlebih dahulu sebelum  dibekukan.  Evaluasi  sperma  ini meliputi  pemeriksaan  secara  mikrokopis  (lama gerak  dan  motilitas)  adapun  cara  kerja  dapat dilihat  pada  pemeriksaan  awal  (Zenichori  dkk, 2007).
f. Pengisian  Sperma  Yang  Sudah  Dievaluasi Ke Dalam Straw
Mini  straw yang  akan  digunakan disterilisasi  terlebih  dahulu  dalam UV  Ray sterilizer selama  15  menit.  Sperma  yang  sudah mengalami proses pencampuran dimasukkan ke dalam mini  straw dengan  menggunakan spuit dalam cool  top  cabinet .  Kemudian  salah  satu ujung mini  straw ditutup  dengan  kapas  steril dan sperma yang sudah diencerkan dimasukkan pada  ujung mini  straw lainnya  kemudian  tekan dengan  pinset  yang  telah  dipanaskan  pada bunsen (Puspitasari, 2006).
g. Proses Adaptasi ( Equalibrasi)
Proses  adaptasi  dilakukan  setelah  proses pencampuran  dan  pengemasan  dalam straw selesai,  kemudian  dibiarkan  dalam  rak cool  top cabinet bersuhu  3 o C  selama  1  jam  (Zenichori dkk, 2007).
h. Pra Freezing dan Freezing Proses pembekuan
menggunakan nitrogen  cair.  Teknik  pembekuan  terdiri  dari  2 tahapan:  tahap  pertama  pra  pembekuan  yaitu sperma  dibekukan  pada  suhu  -140 o C  dengan jalan  memindahkan  rak  yang  berisi mini  straw dari cool top cabinet ke dalam uap di atas cairan nitrogen  di  dalam container dan  dibiarkan selama  9  menit.  Tahap  kedua  pembekuan  yaitu dengan  cara  memindahkan mini  straw dari  uap nitrogen  cair  ke  dalam  nitrogen  cair  bersuhu  - 196 o C dalam container (Zenichori dkk, 2007).
i. Thawing
Mengambil  sperma  beku  yang  sudah dikemas dalam bentuk mini straw dari container satu  per  satu  menggunakan  pinset  kemudian segera direndam ke dalam air yang bersuhu 37- 38 o C selama 10 detik, selanjutnya mengeringkan straw dengan tissue. Memotong
straw hendaknya  di  bagian  tengah-tengah  lalu meneteskan di objek glass yang telah dihangatkan  dan  kemudian  diperiksa  di  bawah mikroskop (Zenichori dkk, 2007). j. Pemeriksaan  Kualitas  Sperma  Setelah Pembekuan Pemeriksaan ini bertujuan untuk
mengetahui  bagaimana  kondisi  spermatozoa. Pemeriksaan ini dilakukan dengan cara thawing spermatozoa dengan waktu thawing 15-30 detik. Pemeriksaan ini meliputi pemeriksaan makrokopis dan mikrokopis. Pengamatan dilakukan  selama  tiga  hari  dengan  interval pengamatan satu hari atau 24 jam sekali.

## Parameter Pengamatan
Parameter  utama  dalam  penelitian  ini adalah  viabilitas  (%),  dan  motilitas  (detik). Parameter  pendukung  yang  juga  diamati  dalam penelitian ini adalah warna, volume, kekentalan dan derajat keasaman (pH).

## Analisis data
Analisis  data  penelitian  secara  statistik dengan menggunakan Analisis Ragam
(ANOVA)  sesuai  dengan  rancangan  yang digunakan  yaitu  Rancangan  Acak  Lengkap (RAL)  dan  untuk  mendapatkan  perlakuan terbaik  dilakukan  Uji  Jarak  Berganda  Duncan taraf signifikansi 5% (Kusriningrum, 2008).

## Hasil dan Pembahasan
Hasil  pemeriksaan  makrokopis  dan mikrokopis  sperma segar ikan komet ( Carasius auratus  auratus )  dapat  dilihat  pada  tabel  1  di bawah ini:
Tabel 1.   Pemeriksaan makrokopis dan mikrokopis sperma segar. No Pengamatan Keterangan 1 Volume 1 ml 2 Warna Putih susu 3 Ph 7,4 4 Kekentalan Kental 5 Konsentrasi 163,4 x10 6 6 Motilitas (gerakan) 60 % 7 Viabilitas (%) 89 % 8 Lama gerak (menit ) 3 menit 48 detik
Berdasarkan  Tabel  1,  pemeriksaan motilitas, viabilitas dan lama gerak sperma ikan komet  ( Carasius  auratus  auratus )  tersebut layak digunakan untuk proses pembekuan.

## Viabilitas Sperma
Penentuan  viabilitas  sperma  dilakukan dengan metode pembuatan preparat ulas dengan
pewarnaan eosin  negrosin .  Sperma  yang  mati, akan menyerap zat warna sedangkan yang hidup tidak  menyerap  zat  warna,  adapun  rumus penghitungan  dapat  dilihat  pada  halaman  26. Rata-rata  viabilitas  sperma  ikan  komet  pada pengamatan jam ke 72 dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 2.  Rata-rata viabilitas Sperma Ikan Komet Pengamatan Pada Jam Ke 72 Perlakuan Rata-rata viabilitas A 59,6 b B 48,8 cd C 39,4 e D 63,89 b E 48,34 cd KN 44,76 e KF 44,07 e KG 53,08 c KT 70,18 a
Keterangan  :    Superskrip  berbeda  dalam  satu kolom  menunjukkan  perbedaan  yang  nyata  (p< 0,05).
Hasil  Uji  Jarak  Berganda  Duncan menunjukkan  perlakuan  madu  0,6%  (D)  nilai rata-rata  viabilitasnya  tertinggi  dibandingkan dengan  perlakuan  lainnya.  Perlakuan  D  tidak berbeda nyata dengan perlakuan madu 0,3% (A) tetapi  berbeda  nyata  dengan  kontrol Tris Aminomethane (KT),  perlakuan  B,C,E  dan kontrol  KG,KF,KN.  Rata-rata  viabilitas  sperma terendah didapat pada perlakuan madu 0,5% (C) yang  tidak  berbeda  nyata  dengan  kontrol  NaCl dan kontrol NaCl + fruktosa (KF) tetapi berbeda nyata dengan semua perlakuan.

## Lama Gerak
Hasil  pengamatan  penelitian  lama gerak  spermatozoa  diperoleh  dari  pengamatan berapa  lama  (detik)  sperma  dapat  bergerak (motil). Rata-rata lama gerak sperma pengamatan  pada  jam  ke  72  disajikan  pada Tabel  3  dan  Tabel  lama  gerak  disajikan  pada gambar 8.
Tabel  3.  Rata-rata  Lama  Gerak  Sperma  Ikan Komet Pengamatan Pada Jam Ke 72 Perlakuan Rata-rata lama gerak A 65,33 de B 87,33 ab C 59,67 de D 101,33 a E 49,66 e KN 28,33 e KF 79,67 bc KG 72 cd KT 79 a
Keterangan  :    Superskrip  berbeda  dalam  satu kolom  menunjukkan  perbedaan  yang  nyata  (p< 0,05).
Hasil  Uji  Jarak  Berganda  Duncan menunjukkan  bahwa  rata-rata  lama  gerak tertinggi  pada  perlakuan  madu  terlihat  pada perlakuan  madu  dengan  dosis  0,6%  (D). Perlakuan  D  tidak  berbeda  nyata  dengan perlakuan  madu  0,4%  (B)  tetapi  berbeda  nyata semua  kontrol  (KN,  KF,  KG  dan  KT)  dan perlakuan  madu  0,3  %,  0,5%,  0,7%  (A,  C,  E). Rata-rata  lama  gerak  sperma  terendah  didapat pada kontrol NaCl fisiologis tanpa penambahan (KN)  yang  tidak  berbeda  nyata  dengan perlakuan  madu  0,7%  (E)  tetapi  berbeda  nyata dengan perlakuan lainnya.
Berdasarkan  hasil  pemeriksaan  secara mikroskopis  semen  segar  ikan  komet  memiliki nilai  viabilitas  sperma  yang  cukup  baik  yaitu 89%,  dengan  viabilitas  yang  hidup  tersebut dapat dikatakan bahwa sperma yang tertampung cukup  baik  dan  dapat  dilakukan  ke  proses pembekuan  selanjutnya.  Hal  ini  sesuai  dengan yang  dipersyaratkan  oleh  Stoss  (1982) dalam Rustidja (2000) bahwa sperma  segar  yang akan digunakan  untuk  penyimpanan  dan  pembekuan harus  mempunyai  nilai  viabilitas  minimal 70%. Konsentrasi  sperma  sangat  penting  untuk diketahui  karena  merupakan  salah  satu  kriteria dalam  penentuan  kualitas  sperma.  Konsentrasi yang  didapat  pada  saat  penelitian  163,4  x  10 6 sel/ml.
Motilitas adalah daya gerak sel sperma yang dinilai segera setelah proses penampungan selesai,  yang  merupakan  kriteria  utama  dalam penilaian kualitas sperma untuk proses selanjutnya.  Nilai  motilitas  individu  yang didapat  adalah  60%  sedangkan  nilai  motilitas massa didapat nilai +++ diamana pergerakannya terlihat  bergelombang  besar,banyak  dan  aktif. Hal  ini  juga  diperkuat  oleh  Toeliher  (1981) yang  menyatakan  syarat  sperma  yang  baik  dan dapat  dilanjutkan  ke  proses  pembekuan  adalah sperma yang memiliki nilai motilitas individu di atas  50%  dan  bergerak  progresif.  Pengamatan lama gerak dilakukan seiringan dengan pengamatan  motilitas  sperma  (gerakan  massa dan individu). Dari pengamatan yang dilakukan lama  gerak  sperma  segar  adalah  3  menit  48 detik.  Lama  gerak  tersebut  dapat  dikatakan bahwa  sperma  tersebut  layak  untuk  dilakukan pembekuan.  Fujaya  (2002)  menyatakan  bahwa sebagian  besar  sperma  ikan  air  tawar  dapat bergerak  selama  2-3  menit  setelah  bersentuhan dengan air.
Hasil  evaluasi  pengamatan  semen segar  menunjukan  bahwa  semen  segar  tersebut
layak  untuk  proses  pembekuan  selanjutnya. Pemeriksaan  yang  akan  dilakukan  setelah proses pembekuan meliputi:  viabilitas dan lama gerak.  Viabilitas  spermatozoa  adalah  salah  satu penilaian  untuk  menentukan  kualitas  sperma dalam  proses  penyimpanan  untuk  fertilisasi buatan  (Toelihere,  1981).  Jumlah  spermatozoa yang  hidup  dapat  digunakan  sebagai  indikator dalam  menentukan  kualitas  semen.  Rata-rata viabilitas sperma terbaik didapat pada perlakuan D.  Namun  perlakuan  D  tidak  berbeda  nyata dengan konrol Tris Aminomethane dan perlakuan  A,  tetapi  berbeda  nyata  dengan perlakuan  lainnya.  Hal  ini  berarti  bahwa  madu dapat menggantikan pengencer Tris Aminomethane . Dikarenakan madu mengandung  glukosa  dan  fruktosa  yang  setara dengan pengencer Tris Aminomethane sehingga dapat  sebagai  sumber  energi. Hidayaturrahmah
(2007)  menyatakan  bahan  utama  yang  dipakai spermatozoa  sebagai  sumber  energi  pada  saat diluar  testis  adalah  fruktosa.  Fruktosa  diubah menjadi  asam  laktat  dengan  bantuan  enzim fruktolisin  dalam  proses  glikolisis  untuk menghasilkan ATP dan ADP bagi spermatozoa, sedangkan Tris  Aminomethane mengandung banyak  sumber  energi  yang  berasal  dari  asam sitrat, laktosa, raffinosa dan kuning telur.
Rata-rata  viabilitas  sperma  terendah didapat  pada  perlakuan  C  yang  tidak  berbeda nyata dengan Kontrol NaCl dan kontrol NaCl + fruktosa  (KN,KF).  Kontrol  NaCl  menunjukan nilai rendah karena dalam perlakuan ini sperma kekurangan  sumber  energi  yang  berasal  dari bahan  pengencer  sehingga  viabilitas  sperma rendah.
Sperma ikan motil pada saat tercampur dengan  media  air  yang  hipotonis,  pengamatan lama  gerak  dimulai  dari  bergeraknya  sperma pada  media  air  hingga  sperma  berhenti bergerak.  Perlakuan  D  menunjukan  hasil tertinggi  diantara  perlakuan  madu  lainnya namun perlakuan D tidak berbeda nyata dengan kontrol Tris  Aminomethae. Hal  ini  berarti bahwa ekstender madu dapat menggantikan atau setara  dengan  pengencer Tris  Aminomethane . Adapun  perlakuan  madu  dapat  mengganti pengencer Tris dikarenakan  didalam Tris terdapat kandungan kuning telur yang berfungsi mencegah  dari  cold  shock,  sedangkan  pada madu  terdapat  kandungan    glyserol  yang berfungsi  sebagai  zat  anti  beku  atau  zat pelindung dari cold shock .
Rata-rata  lama  gerak  sperma  terendah didapat  pada  perlakuan  kontrol  NaCl  fisiologis tanpa  penambahan  (KN)  disebabkan  pada kontrol  KN  tidak  banyak  mengandung  sumber energi  sehingga  sperma tidak dapat hidup  lebih
lama  dan  apabila  dapat  hidup  sperma  akan bergerak  dalam  waktu  yang  singkat.    Menurut Suquest  (1994) dalam Hidayaturrahmah  (2007) menyatakan  bahwa  durasi  motilitas  terjadi dalam periode yang sangat pendek pada ikan air tawar,  Pergerakan  aktif  spermatozoa  ikan sekitar  1-2  menit  dan  tak  ada  lagi  pergerakan setelah 5 menit.

## Kesimpulan
Penambahan ekstender madu  dapat meningkatkan motilitas dan daya hidup spermatozoa  ikan  komet  ( Carassius  auratus auratus ) selama proses pembekuan. Penambahan ekstender madu dengan dosis 0,6% merupakan dosis yang terbaik dalam meningkatkan motilitas dan daya hidup spermatozoa  ikan  komet  ( Carassius  auratus auratus ).
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut untuk  mengetahui  kemampuan  spermatozoa dalam proses fertilisasi setelah proses penyimpanan. Perlu dilakukan penelitian dengan menggunakan ekstender yang lain.

## Daftar Pustaka
Billard  R.,  J.  Cosson,  G.  Perchec  and.  O.
Linhart.  1995.  Biology  of  Sperm  and Artificial Reproduction in Carp. Aquaculture vol. 129 : 95-112. Direktorat  Jenderal  Peternakan.  2007.  Petunjuk Teknis  Produksi  dan  Distribusi  Semen Beku.  Departeman  Pertanian  Direktorat Jendral Perternakan. Jakarta. hal 531-536.
Evans.  G,  Maxwell  WMC.1987.  Salamon’s Artificial  Insemination  of  Sheep  and Goats. London: Butterworths. pp 85-141.
Fujaya,  Y.  2002.  Fisiologi  Ikan.  Proyek Peningkatan  Penelitian  Pendidikan  Tinggi Direktorat  Jendral  Pendidikan  Tinggi. Departemen  Pendidikan  Nasional.  Jakarta. Hal. 160-163.
Handayani,S.  2004.Penggunaan  DMSO  dan Glyserol  5,10,15  %  terhadap  Kualitas Sperma  Pada  Kriopreservasi  Semen  Ikan Batak  (Tor  Soro).  Fakultas  Perikanan  dan Ilmu  Kelautan.  Institusi  Pertanian  Bogor. hal 14-16.
Harper,  H.  A.,  P.  A.  Mayes,  D.  K.  Graner,  V. W.  Rodwell  and  D.  W.  Martin.  1984. Review of physiology Chemistry, 19 th . Ed.
Diterjemahkan  oleh  Darmawan.  Buku
Kedokteran, ECG. Jakarta. hal. 164-175. Hidayaturrahmah.  2007.  Waktu  Motilitas  dan Viabilitas Spermatozoa Ikan Mas
( Cyprinus  carpio  L )  Pada  Beberapa
Konsentrasi  Fruktosa.  Jurnal  Bioscientiae. hal 9-18.
Kilawati,  Y.  2004.  Kualitas  Sperma  Ikan  Mas ( Cyprinus  carpio )  pada  Umur  Ikan  Yang Berbeda.  Artikel  Ilmiah  Tesis.  Program
Pasca  Sarjana.  Universitas  Brawijaya. Malang. hal 5. Kusriningrum,R.S. 2008.
Perancangan
Percobaan.  Airlangga  University  Press. Surabaya. hal 43-87. Nuryadi  dan  Siddiq,  2002. Teknik  Inseminasi Buatan. Balai Inseminasi Buatan Singosari. Malang. Hal 10-16. Partodiharjo,S.1992.  Ilmu  Reproduksi  Hewan.
Jurusan  Reproduksi.  Fakultas  Kedokteran Hewan  Institut  Pertanian  Bogor.  Penerbit
Mutiara  Sumber  Widya.  Jakarta.hal  519-
571. Puspitasari,  R.  2006.  Pengaruh  Penambahan Glukosa  pada  Media  Ekstender  dalam Proses Penyimpanan Sperma Beku
Terhadap  Kualitas  Sperma  Ikan  Patin ( Pangasius  suchi ).  Fakultas  Perikanan. Universitas Brawijaya. Malang. hal 16-25. Rustidja.  2000.  Prospek  Pembekuan  Ikan. Fakultas Perikanan Brawijaya. Malang. hal 46-52.
Salisbury,  G.  W.  and  N.L.  Van  Demark.  1985.
Fisiologi  dan  Inseminasi  Buatan  pada Sapi.  Fakultas  Peternakan  Universitas Jendral  Sudirman.  Gajahmada  University Press. Hal 124-189. Shiantiningsih, Dini. 2005. Pengaruh Penambahan Glukosa Pada Proses Penyimpanan  Terhadap  Motilitas  dan Lama  Hidup  Spermatozoa  Ikan  Mas. Skripsi.  Fakultas  Kedokteran  Hewan Universitas  Airlangga  Surabaya.  Tidak
Diterbitkan. hal 46.
Stoss,  J.  and  Donaldson.  1982.  Preservation  of Fish Gametes. Proceeding of The International  Symposium  on  Reproductive Physiology of Fish, Centre for Agricultural Publishing and Documentation. Wagenigen, Netherland. pp 114-122. Toelihere,  M.S.  1981.  Inseminasi  Buatan  pada Ternak, Angkasa. Bandung. hal 43-98.
Wulandari, W. 2004. Lama Hidup Spermatozoa
Kambing Peranakan Ettawa pada Beberapa Kadar  Glukosa  dalam  Pengencer  Larutan
Ringer  –  Kuning  Telur  Yang  Disimpan pada Suhu 5 o C. Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Airlangga.
Surabaya. hal 50. Zaenab,  S.  2007.  Motilitas  Spermatozoa  dalam Berbagai  Pengencer  dan  Krioprotektan pada Proses Kriopreservasi. Thesis. Universitas Airlangga. Surabaya. hal 72. Zenichori,  K.Herliantien.,  dan  Sarastina.  2007.
Teknologi  Prosesing  Semen  Beku  Pada Sapi.  Balai  Besar  Inseminasi  Buatan Singosari. Malang. 2007. hal 19-55.