## PENGARUH  DIAMMONIUM HIDROGEN FOSFAT
(NH 4 ) 2 H 2 PO 4 PADA EKSPLORASI KHAMIR INDEGENOUS NIRA AREN, KELAPA, NIPAH, DAN SIWALAN TERHADAP PRODUKSI BIOETANOL
Effects of Diammonium Hydrogen Phosphate (NH 4 ) 2H 2 PO 4 in Exploration Indegenous yeast of Aren, Coconut, Nipah, and Siwalan Nira for Bioetanol Production
Trianik Widyaningrum 1 )* , Listiatie Budi Utami 2
1) Program Studi Pendidikan Biologi Universitas Ahmad Dahlan
2) Program Studi Biologi Universitas Ahmad
DOI: http://dx.doi.org/10.21111/agrotech.v4i2.1938
Terima  19 Juli 2017                    Revisi 17 Maret 2018                               Terbit  12 Desember 2018
Abstrak: Sumber energi utama pada umumnya berasal dari energi fosil yang semakin lama  semakin  langka  ketersediaanya.  Berdasarkan  fakta  tersebut  perlu  dikembangkan berbagai  energi  alternatif  yang  dapat  diperbaharui, ramah  lingkungan,  dan  berkelanjutan salah  satunya  adalah  bioetanol.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh penambahan (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 pada eksplorasi khamir indegenous   nira aren, kelapa, nipah, dan siwalan yang potensial untuk produksi etanol. Penelitian ini diawali dengan sampling nira aren dan kelapa serta nira nipah dan nira siwalan. Langkah berikutnya adalah skrining khamir penghasil etanol dengan penambahan (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 pada Nira meliputi pH, kadar gula reduksi dengan menggunakan metode DNS, waktu fermentasi (0, 2, 4, 6) hari, dan jumlah sel. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh kondisi awal nira, yaitu pH nira aren 4,9 kelapa  3,7,  nipah  4,3,  dan  siwalan  4,7,  kemudian  gula  reduksi  nira  aren  13,41  mg/ml, kelapa 17,09 mg/ml, nipah 33,38 mg/ml, dan siwalan 43,35 mg/ml, kadar etanol nira aren 1,53%, kelapa 4,4 %, nipah 0,3%, dan siwalan 0,23%. Berdasar data tersebut terlihat kadar etanol tertinggi pada nira kelapa, sehingga skrining berikutnya dengan menggunakan nira kelapa  dengan  penambahan  (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 .  Berdasar  isolasi  khamir  dari  keempat  Nira diperoleh 48 isolat s. Berdasar skrining yang dilakukan dengan penambahan (NH 4 ) 2 H 2 PO 4
* Korespondensi email: trianik.widyaningrum@pbio.uad.ac.id Alamat : Universitas Ahmad Dahlan Kampus 4, Jl.Ringroad Selatan, Kragilan, Tamanan, Banguntapan Bantul, Daerah Istimewa Yogyakarta, 55191
dan memperhatikan pH nira, waktu fermentasi, gula reduksi, dan jumlah sel diperoleh isolat yang unggul untuk produksi etanol sejumlah 18 isolat  dengan waktu fermentasi 4 dan 6 hari.
Kata Kunci : Eksplorasi, Nira, isolat  bioetanol.
Abstract: The main source of energy comes from fossil fuels that are becoming increasingly  rare.  Based  on  that  fact  are  needed  to  develop  a  variety  of alternative energy that can be updated, environmental  friendly, and  sustainable one  of  them  is  bioethanol.  This  study  aims  to  determine  the  effect  of  addition (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 on the exploration of indegenous yeast palm, coconut, nipah, and siwalan  potential  for  ethanol  production.  This  research  starting  with  sampling palm  juice  and  coconut  as  well  as  palm  and  siwalan  nira.  The  next  step  is  the screening of ethanol-producing yeast with the addition of (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 to Nira including pH, reducing sugar content by DNS method, fermentation duration (0, 2,4,6)  days,  and  cell  count.  The  results  showed  the  initial  condition  of  palm juice,  namely  pH  palm  sugar  palm  4.9,  3.7,  palm  4.3,  and  siwalan  4.7,  then sugar  palm  sugar  reduction  13.41  mg/ml,  coconut  17.09  mg/ml  ,  nipah  33.38 mg/ml,  and  siwalan  43.35  mg/ml,  ethanol  level  of  palm  sugar  palm  1.53%, coconut  4.4%,  nipah  0.3%,  and  siwalan  0.23%.  The  highest  ethanol  content  in coconut  palm,  so  the  next  screening  using  coconut  juice  with  the  addition  of (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 .  The  isolation  of  yeasts  from  the  four  NIRA  were  obtained  48 isolates.  The  screening  performed  by  addition  (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 and  taking  into account the pH of nira, fermentation time, reducing sugar, and cell number were obtained  superior  isolates  for  ethanol  production  of  18  isolates  with fermentation on 4 and 6 days.
Keywords : Exploration, nira,  isolates bioethanol

## 1. Pendahuluan
Bahan bakar fosil, terutama minyak bumi, batu bara, dan gas alam, merupakan sumber energi utama bagi sebagian besar industri dan  masih  merupakan  bahan  baku  yang  paling  penting  untuk menghasilkan  energi  di  dunia.  Saat  ini,  nilai  pasar  energi  dunia sekitar  1,5  triliun  dolar  didominasi  oleh  bahan  bakar  fosil (Goldemberg,  2006).  Namun,  sumber-sumber  ini  tidak  lagi dianggap  berkelanjutan,  dan  ketersediaannya  jauh  lebih  sedikit.
Shafiee  dan  Topal  (2009)  meramalkan  bahwa  minyak,  batubara, dan gas hanya akan tersisa secara berurutan sekitar 35, 107, dan 37 tahun.  Selain  itu  bahan  bakar  tersebut  menimbulkan  dampak lingkungan seperti pemanasan global akibat emisi gas rumah kaca (Naik  dkk ., 2010).  Oleh  karena  itu,  diperlukan  sumber  energi terbarukan,  berkelanjutan,  dan  ramah  lingkungan  antara  lain bioetanol.
Penelitian  produksi  bioetanol  melalui  fermentasi  telah banyak  dipublikasi  di  luar  negeri  dengan  menggunakan  berbagai strain  mikroorganisme,  seperti  bakteri,  khamir,  dan  jamur  dengan sumber  karbon  yang  berbeda  ( Dien  dkk ., 2003;  Desai  dkk ., 2004;
Demain  dkk ., 2005; Chinn dkk .,  2006;  Stephanopoulos  2007;
Riyanti dan Rogers, 2009). Bioetanol umumnya diproduksi dengan bantuan mikroorganisme jenis khamir dengan sumber karbon gula sederhana  dari  tetes  tebu  (molase),  jagung  atau  tebu  (Riyanti, 2011).
Penelitian  tentang  produksi  etanol  dengan  berbagai macam  bahan  baku  (molase,  nira  kelapa,  nira  nipah,  mikro  dan makroalgae, Sargassum )  sudah  dilakukan  (Sebayang,  2006;
Wardani dan Pertiwi, 2013; Wijaya dan Arthawan, 2012); Chairul dan  Yenti,  2013;  Hadi  dkk.,  2013).  Selain  tetes  tebu  (molase), bahan  baku  lain  yang  dapat  dimanfaatkan  sebagai  sumber  etanol adalah Nira. Nira merupakan cairan manis mengandung gula pada konsentrasi  7,5  sampai  20,0  %  yang  terdapat  di  dalam  bunga
tanaman aren, kelapa, dan lontar  yang pucuknya belum membuka dan  diperoleh  dengan  cara  penyadapan  (Dyanti,  2002).  Nira  aren mengandung  air  87,66  %,  gula  12,04  %,  protein  0,36  %,  serta lemak  dan  abu  masing-masing  0,36  %  dan  0,21  %  (Hasbullah, 2001).
Berdasarkan penelitian-penelitian yang sudah dilakukan berkaitan dengan nira, molase, dan algae sebagai bahan pembuatan etanol  dengan  memanfaatkan Saccharomyces  cerevisiae .Tujuan dari  penelitian  ini  adalah  mengeksplorasi  khamir  indegenous  dari nira  aren,  kelapa,  nipah,  dan  siwalan  dengan  penambahan (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 yang potensial dalam memproduksi bioetanol.

## 2. Bahan dan Metode
Penelitian ini diawali dengan sampling nira aren dan kelapa  yang diperoleh dari Desa Pagerharjo Samigaluh Kabupaten Kulon Progo yang dilakukan pada  20 Desember 2016 serta nira nipah dari Desa Ujung  Manik    Kecamatan  Kawungan    Cilacap  yang  dilakukan pada  25  Desember  2016  ,  dan  nira  siwalan  yang  diperoleh  dari Desa Landoh, Rembang yang dilakukan pada 27 Desember 2017 . Selanjutnya  dilakukan  isolasi  khamir  dari  keempat  sumber  nira tersebut  berdasarkan  Heard  dan  Armada,  (1986)    dalam  Blanco dkk.,  (2012).  Langkah  berikutnya  adalah  skrining  khamir penghasil  etanol  dengan  penambahan  (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 pada  Nira meliputi  pH,  kadar  gula  reduksi  dengan  menggunakan  metode
DNS, waktu fermentasi (0, 2,4,6) hari, dan jumlah selspektrofotometer pada panjang  gelombang 600 nm.  Rancangan percobaan menggunakan Rancangan acak kelompok.Data dianalisis dengan Anava dan DMRT.

## 3. Hasil dan Pembahasan
Berdasar sampling nira aren, kelapa, nipah, dan siwalan dihasilkan kondisi awal Nira tersebut seperti pada Gambar 1,2, dan 3 berikut
Gambar 1. Derajat Keasaman Nira
Gambar 2. Kadar gula reduksi nira
Gambar 3. Kadar Bioetanol nira
Berdasar hasil pengujian awal nira terlihat kadar bioetanol tertinggi  pada  nira  kelapa,  kemudian  langkah  selanjutnya dilakukan skrining untuk mendapatkan isolat yang produktif dalam produksi  bioetanol  dengan  menggunakan  nira  kelapa  dan penambahan  (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 dengan  tujuan  untuk  menambah kandungan  N  sebagai  sumber  hara  bagi  pertumbuhan  khamir. Berdasar  skrining  tersebut  diperoleh  data  seperti  pada  Tabel  2 berikut.
Gontor AGROTECH Science Journal                                                79
Tabel  2.  Hubungan  jenis  isolat  dan  waktu  fermentasi  terhadap  rata-rata  kadar  gula  reduksi,  pH  kadar bioetanol, dan jumlah sel.
Keterangan:  A: isolat dari nira Aren,  K: isolat dari nira kelapa,  N: isolat dari nira Nipah,  S: isolat dari nira siwalan, 1, 2 A, B, C, D: kode isolat.
Setelah  dilakukan  uji  statistik  menunjukkan  bahwa  berdasar perlakuan  lama  fermentasi  yang  menghasilkan  kadar  bioetanol tertinggi adalah waktu fermentasi 6 hari, sedangkan berdasar kadar bioetanol hasil fermentasi pada hari ke 6 menunjukkan ke 18 isolat menghasilkan  kadar  bioetanol  berkisar  9,27  -  13,02  %,  dan berdasarkan  uji  statistik  menunjukkan  tidak  ada  perbedaan  yang nyata  antara  jenis  isolat  terhadap  kadar  bioetanol,  meskipun berdasarkan pengukuran kadar bioetanol menunjukkan isolat K2C menghasilkan kadar bioetanol tertinggi yaitu 13,02 (isolat dari nira kelapa).
Berdasar  Tabel  2  terlihat  pada  hari  ke  6  kadar  bioetanol didapatkan  semakin  meningkat.  Hal  tersebut  disebabkan  karena pada hari ke 6  merupakan fase eksponensial  yaitu mikrobia akan tumbuh  dengan  laju  pertumbuhan  yang  sangat  tinggi  sehingga peningkatan jumlah sel terjadi secara eksponensial atau logaritmik (Yuwono,  2005).  Berdasarkan  Tabel    2  tersebut  terlihat  bahwa kadar  bioetanol  tertinggi  terdapat  pada  Isolat  K2C    yaitu  sebesar 13,02  %, fase ini masih pada fase eksponensial dikarenakan kadar bioetanol  masih  mengalami  kenaikan,  hal  ini  sesuai  dengan  teori yang  dikemukakan  oleh  Desrosier  (2008)  bahwa  untuk menghasilkan  kadar  bioetanol  yang  optimal  melalui  fermentasi, waktu yang dibutuhkan adalah 3-6 hari.
Berdasar  Tabel  2  setelah  dilakukan  proses  fermentasi kondisi  pH  mulai  menurun.  Pada  fermentasi  hari  ke  6 menunjukkan  pH  mengalami  penurunan,  meskipun  tidak signifikan  hal  ini  sesuai  dengan  pendapat  Azizah  (2012),  bahwa pertumbuhan mikroba optimal pada kondisi pH kisaran antara 3,5- 6,5  sedangkan  pada  kondisi  basa  tidak  akan  tumbuh.  Lingkungan yang terlalu asam  atau basa membuat mikroorganisme sulit untuk beradaptasi.Selama  fermentasi  perubahan  pH  dapat  disebabkan oleh  hasil  fermentasi  yang  merupakan  asam  atau  basa  yang dihasilkan  selama  pertumbuhan  mikroorganisme  dan  komponen organik  dalam  medium  (Keenan  dkk,  (1990)  dalam  (Rahmawati, 2010)).Kecenderungan media fermentasi semakin asam disebabkan  amonia  yang  digunakan  sel  khamir  sebagai  sumber nitrogen diubah menjadi NH 4 + . Molekul
NH 4 + akan menggabungkan  diri  ke  dalam  sel  sebagai  R-NH3.  Dalam  proses ini  H + ditinggalkan  dalam  media,  sehingga  semakin  lama  waktu fermentasi  semakin  rendah  pH  media  (Judoamidjojo  dkk , (1989) dalam (Rahmawati, 2010)).
Waktu fermentasi yang semakin lama menunjukkan kadar gula  reduksi  yang  menurun  tetapi  kadar  bioetanolnya  semakin meningkat (Tabel 2), hal tersebut disebabkan karena gula tersebut diubah menjadi bioetanol oleh khamir. Berdasar jumlah sel terlihat semakin lama waktu fermentasi jumlah sel semakin meningkat, hal tersebut  menunjukkan  bahwa  sel  khamir  dapat  tumbuh  dengan
baik  pada  kondisi  pH  berkisar  4  (asam)  dan  dengan  panambahan (NH 4 ) 2 H 2 PO 4 terlihat  khamir  dapat  mengalami  pertumbuhan dengan baik akibat tersedianya unsur N dalam media nira kelapa

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan  terlihat  bahwa  nira aren,  kelapa,  nipah  dan  siwalan  terdapat  khamir  indegenous  yang dapat  memproduksi  bioetanol.  Isolat  yang  unggul  untuk  produksi etanol  sejumlah  10  isolat,  yaitu  A11E,  A3A  (dari  Aren),  K1C1, K2C, K1A (dari Kelapa),N3D, N3E, N1A (dari Nipah), dan S1A, S2D (dari Siwalan). dengan waktu fermentasi 4 dan 6 hari.
Saran  yang  dapat  disampaikan  berdasar  hasil  penelitian yaitu  perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk  mengetahui jenis khamir indegenous dari nira aren, kelapa, nipah, dan siwalan yang  selanjutkan  dapat  diketahui  hubungan  kekerabatan  dari isolat-isolat  tersebut  untuk  selanjutnya  digunakan  dalam  produksi bioetanol.
5. Referensi
Azizah.N,  Dkk.  2012.  “Pengaruh  Lama  FermentasiTerhadap
Kadar  Alkohol,  Ph,    Dan  Produksi    Gas  Pada  Proses Fermentasi  Bioetanol  Dari  Whey  Dengan  Substansi  Kulit Nanas”.  Semarang:  UNDIP. Jurnal  Penelitian  Aplikasi
Teknologi Pangan . Vol. 1, No. 2, 2012: 72-73
Blanco,  J.M.  M.  Avalos  and  I.  Orriols.  2012.  Effect  of  must characteristics  on  the  diversity  of  Saccharomyces  strains and their prevalence in spontaneous Fermentations. Journal of Applied Microbiology 112 (1): 936–944
Chairul  dan  S.R.  Yenti.2013.  Pembuatan  Bioetanol  dari  Nira
Nipah  Menggunakan Sacharomyces  cereviceae.Jurnal
Teknobiologi , IV(2): 105 – 108.
Chinn,  M.S.,  E.E.  Nokes,  and  H.J.  Strobel.  2006.  Screening  of thermophilic  anaerobic  bacteria  for  solid  substrate cultivation  on  lignocellulosic  substrates .  Biotechnol .Prog.
22 (1): 5359.
Dien,  B.S.,  M.A.  Cotta,  and  T.W.  Jeffries.  2003.  Bacteria engineered  for  fuel  ethanol  production:  current  status.
Appl. Microbiol.Biotechnol . 63 (1): 258−266.
Demain,  A.L.,  M.  Newcomb,  and  J.H.D.  Wu.  2005.  Cellulase, clostridia,  and  ethanol. Microbiol.  Mol.  Biol .  Rev.  69(1):
124154.
Desai,  S.G.,  M.L.  Guerinot,  and  L.R.  Lynd.  2004.  Cloning  of  L-
lactate  dehydrogenase  and  elimination  of  lactic  acid production via gene knockout in Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum JW/SL-YS485.
Appl. Microbiol. Biotechnol .
Desrosier,NormanW,2008. TeknologiPengawetanPangan .Jakarta:U
niversitas
Indonesia Press.
Dyanti, 2002. Studi Komparatif Gula Merah Kelapa dan Gula Merah Aren. Jurusan Teknologi  Pangan dan Gizi,
Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor,
Bogor . 2 (1): 26-40
Goldemberg, J. 2006. The promise of clean energy. Energy Policy .
34 (1): 2185–2190.
Hadi, Thamrin., Moersidik, S.S., Bahry, S. 2013. Karakteristik dan
Potensi  Bioetanol  dari  Nira  Nipah  ( Nypa  fruticans )  untuk
Penerapan  Skala  Teknologi  Tepat  Guna. Jurnal  Ilmu
Lingkungan . 2 (1): 291-293.
Hasbullah.  2001. Teknologi  Tepat  Guna  Agroindustri  Kecil Sumatera  Barat .  Padang.  Dewan  IlmuPengetahuan,
Teknologi dan Industri Sumatera Barat.
Naik,  S.N.,  Goud,  V.V.,  Rout,  P.K.  &  Dalai,  A.K.  2010.
Production  of  first  and  second  generation  biofuels:  A comprehensive  review. Renewable  and  Sustainable
EnergyReviews . 14 (1): 578–597.
Rahmawati,  A.  2010.  “Pemanfaatan  Limbah  Kulit  Ubi  Kayu
( Manihotutilissima Pohl.)  dan  Kulit  Nanas  ( Ananas comosus L.)Pada  Produksi  Bioetanol  Menggunakan
Aspergillus  niger ”. Skripsi  Fakultas  Matematika  Dan  Ilmu
Pengetahuan Alam. UNS
Riyanti,  E.I.  2011.Beberapa  Gen  Pada  Bakteri  yang  Bertanggung Jawab  Terhadap  Produksi  Bioetanol. Jurnal  Litbang
Pertanian, 30(2): 23-25.
Riyanti,  E.I.  and  P.L.  Rogers.  2009.  Kinetic  evaluation  of
bioethanol-tolerant
thermophile
Geobacillus
thermoglucosidasius M10EXG  for  ethanol  production.
Indones. J. Agric. Sci. 10(1): 3441.
Saputra,  Ali  Ridlo,  I.  Widowati.  2012.  Kajian  Rumput  Laut
Sargassum  duplicatum J.  G.  Agardh  sebagai  Penghasil
Bioetanol dengan Proses Hidrolisis Asam dan
Fermentasi. Journal Of Marine Research . 1 (2): 145-151
Sebayang. 2006. Pembuatan Etanol dari Molase secara Fermentasi
menggunakan Sel Saccharomyces cerevisiae yang
Terimobilisasi  pada  Kalsium  Alginat .  Jurnal  Teknologi Proses 5 (2):75-80.
Shafiee, S. and Topal, E. 2009. When will fossil fuel reserves be
diminished Energy Policy . 37 (1): 181–189.
Stephanopoulos, G. 2007. Challenges  in engineering microbes for biofuels production. Science 315 (1): 801804.
Wardani  dan  F.  N.E.  Pertiwi.  2013.  Produksi  Etanol  Dari  Tetes Tebu  Oleh Saccharomyces  cerevisiae Pembentuk  Flok (Nrrl – Y 265). Agritech, 33(2): 131-139
Wijaya  dan  I  G.  K.  A.  Arthawan.2012.Potensi  Nira  Kelapa Sebagai Bahan Baku Bioetanol. Jurnal Bumi Lestari, 12(1):
85 – 92.
Yuwono,  Triwibowo,  2006. Fisiologi  Mikrobia .  Yogyakarta  :
Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada