e- Jurnal Rekayasa dan Teknologi Budidaya Perairan
Volume V No 1 Oktober 2016 ISSN: 2302-3600

## PRODUKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE
Burkholderia cepacia TERHADAP SUBSTRAT YANG BERBEDA
Melisha *† , Esti Harpeni ‡ , Supono ²

## ABSTRAK
Pati  atau  amilum  merupakan  bahan  utama  yang  dihasilkan  oleh tumbuhan untuk menyimpan  kelebihan  glukosa sebagai  produk fotosintesis. Burkholderia cepacia merupakan  bakteri  yang  mampu  menghidrolisis  pati,  karena  bakteri  tersebut memiliki  enzim  amilase.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh pemberian  substrat  yang  berbeda  terhadap  pertumbuhan,  indeks  amilolitik  dan aktivitas enzim amilase bakteri B. cepacia. Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan 3 perlakuan (substrat daun singkong, daun pepaya dan sente) dengan 3 ulangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri B. cepacia mampu hidup  dengan  baik  pada  substrat  daun  pepaya.  Pemberian  substrat  daun  sente memberikan pengaruh terhadap indeks amilolitik yang ditunjukkan dengan adanya zona  bening  sebesar  9,8  mm.  Aktivitas  enzim  amilase  pada  penelitan  ini  adalah 101,8 unit dan konsentrasi protein sebesar 0,094 mg/ml.
Kata kunci:  Burkholderia cepacia, Pati, Enzim, Amilase, Protein
Pendahuluan Ikan  gurame  mempunyai  sifat omnivora yang berkecenderungan herbivora sehingga pada pembudidayaannya  biasanya  diberikan asupan  makanan    bukan  hanya  dari pakan  pellet  tetapi  dari  dedaunan  hijau yang
mempunyai kandungan karbohidrat  tinggi  (Kusumah,  2010) seperti daun keladi, singkong dan daun pepaya  (Susanto,  2001).  Kemampuan ikan  untuk  memanfaatkan  karbohidrat bergantung pada kemampuannya untuk menghasilkan enzim amilase (Mujiman, 1991).  Karbohidrat  merupakan  salah satu  komponen  sumber  energi  dalam pakan.  Selain  itu  berperan  dalam menghemat penggunaan protein sebagai sumber energi (Afrianto dan Liviawaty, 2005). Enzim amilase merupakan enzim
* Mahasiswa Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung
† e-mail: melisha035@gmail.com
‡ Dosen Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung
yang menghidrolisis molekul pati untuk memberikan  produk  yang  bervariasi termasuk  dekstrin  dan  polimer-polimer kecil  yang  tersusun  dari  unit-unit glukosa (Windish dan Mhatre, 1965).
Salah  satu  mikroorganisme  yang dapat  menghasilkan  enzim  amilase adalah bakteri amilolitik. Bakteri amilolitik  merupakan  bakteri  yang memproduksi enzim amilase dan memecah  pati  (Frazier  dan  Westhoff, 1988). Burkholderia cepacia
merupakan  mikroorganisme  berupa bakteri  yang  dapat  menghidrolisis substrat  karbohidrat  yang  dibuktikan dengan  adanya  zona  bening  di  sekitar isolat. Hal ini dapat diasumsikan bahwa B. cepacia mengandung enzim amilase yang mempunyai kemampuan menghidrolisis  karbohidrat  menjadi
senyawa yang lebih sederhana (Alfin et al. ,  2014).  Tujuan  dari  penelitian  ini adalah  untuk  mengetahui  pengaruh pemberian substrat yang berbeda terhadap pertumbuhan, indeks amilolitik  dan  aktivitas  enzim  amilase B. cepacia .

## Metode
Preparasi substrat menjadi tepung yaitu dengan cara daun singkong, daun pepaya  dan  daun  sente  diambil  dan disortasi  untuk  memisahkan  kotoran dengan  cara  membuang  bagian-bagian pelepah  daun  dan  tangkai  daun. Kemudian  pencucian  dilakukan  untuk menghilangkan  kotoran  yang  masih melekat  dengan  menggunakan  air mengalir, selanjutnya pengeringan dilakukan dengan cara dikeringanginkan  atau  tidak  kena cahaya  matahari  langsung  atau  pada suhu  kamar  ±25 ⁰ C  sampai  kadar  air  ≤
10 %. Proses selanjutnya yaitu penggilingan/penepungan yang dilakukan  dengan  menggunakan  mesin penepung. Analisis  proksimat  substrat  daun singkong,  daun  pepaya  dan  daun  sente dilakukan  di  Laboratorium  Analisis Hasil  Pertanian,  Universitas  Lampung. Analisi  proksimat  substrat  mengacu pada Lestari et al. (2013) yang meliputi kadar air dengan metode thermogravimetri,  kadar  abu  dengan metode pengabuan tanur, kadar protein dengan  metode  kjedahl,  kadar  lemak dengan  metode  soxhlet,  kadar  serat kasar dan pati dengan cara by difference .
Isolat bakteri B. cepacia diperoleh dari usus ikan gurame yang dipreparasi oleh  Alfin et  al. (2014).  Inokulasi bakteri dilakukan dengan cara
menempatkan  1  ose  biakan  ke  dalam tabung reaksi miring berisi nutrien agar (NA) dan diinkubasi pada suhu 27-28 o C selama  24-48  jam.  Isolat  bakteri  siap untuk  produksi  enzim.  Ekstraksi  isolat bakteri  dilakukan  dengan  cara  kultur cair  bakteri  disentrifuge  selama  15 menit dengan kecepatan 8.000 rpm.
Metode  produksi B.  cepacia mengacu  pada  Chasanah et  al .(2011) dengan menggunakan MSM cair ( minimal  synthetic  medium )  yang ditambahkan  0,5%  sumber  karbon (daun singkong, daun pepaya dan daun sente).  Isolat  bakteri  diambil  dan diinokulasi pada media awal berupa 20 ml  MSM  cair,  kemudian  di shaker dengan kecepatan 100 rpm dengan suhu 27-28 o C  selama  24  jam.  Selanjutnya diambil  10%  hasil  kultur  dipindahkan pada  media  produksi  berupa  80  ml MSM  cair,  kemudian  di shaker dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 27-28 o C. Kepadatan  bakteri  dihitung  dengan mengukur  absorbansi  menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.
Indeks  amilolitik  diukur  dengan menggunakan  media  MSM  padat  yang ditambahkan  1%  substrat  karbohidrat (daun singkong, daun pepaya dan daun sente).  Potongan  kertas  cakram  steril direndam  pada  biakan  kultur  bakteri selama  1  jam,  kemudian  potongan kertas  cakram  diletakkan  di  atas permukaan media MSM  dan diinkubasi pada  suhu  27-28 o C  selama  66  jam. Setelah inkubasi, larutan lugol’s iodine dituang di atas kultur. Adanya aktivitas enzim  amilase  ditunjukkan  dengan terbentuknya  zona  bening  di  sekitar koloni. Indeks amilolitik diukur dengan menggunakan rumus (Agustien, 2010):
Indeks Amilolitik = x ̄ 𝑑𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟 𝑧𝑜𝑛𝑎 𝑏𝑒𝑛𝑖𝑛𝑔−x̄ 𝑑𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 x̄  𝑑𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 ………………………………….……….(1)
Pengujian  Aktifitas  Enzim  Amilase Kasar
Isolat bakteri dikultur pada MSM
cair    yang  telah  ditambahkan  0,5% substrat  daun  pepaya  selama  66  jam.
Kemudian kultur cair bakteri disentrifuse ( Hybrid Refrigerated Centrifuge CAX-370) dengan kecepatan  8000  rpm  selama  15  menit pada  suhu  4 o C.  Sentrifugasi  dilakukan di  Laboratorium  Biomass,  Universitas Lampung.  Supernatan  yang  dihasilkan kemudian diambil 3 ml dan dimasukkan
ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan  dengan  1  ml  larutan amilum  1%  dan  diinkubasi  selama  60 menit  pada  suhu  27-28 o C.  Reaksi dihentikan  dengan  menambahkan  2  ml reagen DNS. Kemudian tabung
dipanaskan  hingga  mendidih  selama  5 menit, didinginkan dengan air mengalir selama  15  menit  dan  ditambahkan akuades  sebanyak  20  ml.  Pada  larutan blanko ditambahkan larutan amilum 1% dan    diinkubasi  selama  60  menit  pada suhu  27-28 o C,  tanpa  penambahan supernatan.  Tiap  larutan  dideterminasi intensitas  warnanya    menggunakan spektrofotometer  ( Thermo  Scientific Genesys 20) dengan panjang gelombang
540 nm.
Penentuan kadar protein
dilakukan  dengan  cara  ditambahkan  2 ml  larutan  ekstrak  enzim  pada  tabung reaksi,  kemudian  ditambahkan  2,75 ml pereaksi  Lowry  B  dan  dihomogenkan, dibiarkan selama 15 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,25 ml pereaksi Lowry A dan  dihomogenkan,  lalu  dibiarkan selama  30  menit  agar  reaksi  berjalan sempurna.  Absorbansi  sampel  diukur
menggunakan spektrofotometer
( Thermo  Scientific  Genesys 20)  pada panjang  gelombang  750  nm.  Kadar protein enzim yang diperoleh dari kurva tersebut,  selanjutnya  digunakan  untuk menentukan  aktivitas  spesifik  enzim (Page, 1989) yaitu :
As  = 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 ……………….(2) Keterangan: As : aktivitas spesifik enzim dalam mg protein (U/mg) AE : aktifitas enzim (U/ml) Total protein   : mg protein (mg/ml) Hasil dan Pembahasan Pertumbuhan Bakteri Bakteri B. cepacia mulai melakukan  adaptasi  selama  ±  3  jam awal  pengamatan  pada  ketiga  substrat. Peningkatan jumlah sel tertinggi terdapat  pada  substrat  daun  sente sebesar  1,01554  x  10 9 CFU/ml  dan peningkatan jumlah sel terendah terdapat  pada  substrat  daun  singkong sebesar 5,4918 x 10 8 CFU/ml. Penurunan jumlah sel yang signifikan mulai terjadi setelah jam ke- 18  hingga  jam  ke-66  untuk  substrat daun pepaya, jam ke-12 hingga jam ke- 63 untuk substrat daun sente dan jam ke- 33  hingga  jam  ke-63  untuk  substrat daun singkong (Gambar 1). Oleh karena itu  dilakukan  isolasi  enzim  amilase dengan  substrat  daun  pepaya  pada  jam ke-66 sebagai akhir dari siklus pertumbuhan (fase stasioner).
Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Bakteri B. cepacia yang dilakukan setiap 3 jam
Fase stasioner adalah fase dimana laju  pertumbuhan  bakteri  sama  dengan laju  kematiannya,  sehingga  jumlah bakteri  keseluruhan  akan  tetap  karena adanya pengurangan derajat pembelahan sel. Hal ini disebabkan oleh kadar nutrisi yang berkurang dan terjadi akumulasi limbah metabolisme (Sugiri, 1992).  Pada  fase  ini  bakteri  banyak memproduksi zat-zat metabolit sekunder yang dibutuhkan untuk mempertahankan  kehidupannya,  salah satunya adalah enzim (Fardiaz, 1992). Kerapatan pertumbuhan sel menurun  setelah  jam  ke-69  untuk substrat  daun  pepaya,  jam  ke-66  untuk substrat  daun  sente  dan  daun  singkong sehingga pada fase ini bakteri memasuki fase kematian.
Hasil  pengamatan  menunjukkan bahwa  ketiga  kultur  bakteri  dengan masing-masing substrat yang digunakan membutuhkaan  waktu  yang  berbeda- beda  untuk  mencapai  tiap  fase. Perbedaan  waktu  untuk  mencapai jumlah  sel  tertentu  dipengaruh  oleh beberapa  faktor,  yaitu  sumber  energi, sumber  karbon,  pH,  suhu,  lingkungan, oksigen  dan  masa  inkubasi  atau  sifat mikroorganisme  tersebut  (Pelczar  dan
Chan,  1986).  Karena  kondisi  setiap isolat  bakteri  dibuat  sama,  maka perbedaan  waktu  untuk  mencapai  fase logaitmik dipengaruhi oleh sifat masing-masing substrat (sumber
karbohidrat) (Tabel3).

## Uji Kemampuan Amilolitik Isolat Bakteri
Isolat  bakteri  penghasil  enzim amilase  dapat  dilihat  aktivitasnya dengan mengukur diameter zona bening di sekitar isolat bakteri. Diameter zona bening  terbentuk  setelah  isolat  bakteri diinkubasi selama 66 jam pada suhu 27- 28 o C. Pada pengujian indeks amilolitik, diameter  koloni  bakteri  dibuat  dengan ukuran yang sama menggunakan potongan kertas cakram steril berukuran 6 mm. Berdasarkan data diatas, bakteri
B. cepacia memiliki kemampuan amilolitik  yang  berbeda-beda  pada ketiga  substrat  sumber  karbohidrat. Indeks  amilolitik  yang  diperoleh  dari ketiga  substrat  berturut-turut  dari  yang terbesar  hingga  terkecil  yaitu  0,63  mm untuk  substrat  daun  sente,  0,47  mm untuk  substrat  daun  pepaya  dan  0,12
mm  untuk  substrat  daun  singkong (Tabel 4).
Daya amilolitik bakteri B. cepacia terhadap ketiga substrat dapat dikatakan memiliki  potensi  yang  rendah,  hal  ini sesuai  dengan  pernyataan  Ochoa– Solano  dan  Olmos–Soto  (2006)  bahwa isolat bakteri yang menghasilkan diameter zona bening dua atau tiga kali diameter  koloni  merupakan  produsen enzim yang potensial.
Analisis  Anova  menunjukkan bahwa  hasil  indeks  amiloltik  memiliki nilai signfikan sebesar 0,048 pada taraf nyata 95% (α=0,05). Murdiyanto (2005) menyatakan  bahwa,  apabila  nilai  taraf nyata  (α=0,05)  lebih  kecil  dari  nilai signifikannya maka H 1 diterima, sehingga dapat dikatakan bahwa penambahan  substrat  yang  berbeda berpengaruh  nyata  terhadap  indeks amilolitik.  Hasil  uji  sidik  ragam memperlihatkan adanya perbedaan secara signifikan sehingga dilakukan uji lanjut BNT dengan tingkat kepercayaan 95%.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa perlakuan  substrat  daun  singkong  dan substrat daun pepaya tidak memberikan pengaruh pada indeks amilolitik, sedangkan  pemberian  substrat  daun sente  memberikan  pengaruh  pada indeks  amilolitik  secara  signifikan dibanding  substrat  daun  singkong  dan daun pepaya.
Alfin et  al. (2014)  menyatakan bahwa  bakteri B.  cepacia yang  berasal dari  usus  ikan  gurame  juga  diketahui dapat  menghidrolisis  karbohidrat  pada media  yang  ditambahkan  10%  tepung terigu  dengan  diameter  zona  bening yang  diperoleh  sebesar  4  mm.  Adanya perbedaan  zona  bening  pada  masing- masing  media  disebabkan  oleh  jumlah dan  aktivitas  enzim  dari  bakteri  yang disekresikan  pada  media  berbeda.
Aktivitas  enzim  tersebut  ditentukan oleh  konsentrasi  enzim,  konformasi enzim,  urutan  asam  amino  pembentuk enzim  dan  macam  asam  amino pembentuk enzim (Agustien, 2005).
Indeks  amilolitik  tertinggi  tidak selalu berbanding lurus dengan aktivitas enzim  yang  tinggi  karena  tidak  selalu ada  hubungan  antara  diameter  zona bening  pada  medium  agar-agar  dengan kemampuan mikroorganisme memproduksi  amilase  pada  kultur terendam (Ward, 1983). Hal ini karena nilai aktivitas enzim amilase ditunjukkan dengan semakin lebar zona bening  tetapi  besarnya  aktivitas  enzim amilase  yang  berperan  merombak  pati dalam  medium  padat  tidak  dapat diketahui. Indeks amilolitik merupakan seleksi  awal  secara  kualitatif  untuk menentukan  adanya  aktivitas  enzim amilase.  Hal  ini  sesuai  dengan  yang dinyatakan  oleh  Winarno  (1983)  yaitu pembentukan zona
bening menunjukkan bahwa pati yang terdapat di dalam media, dihidrolisis oleh enzim amilase.

## Pengujian  Aktivitas  Enzim  Amilase Kasar
Pengujian aktivitas enzim amilase kasar dilakukan dengan cara mengkultur  bakteri B.  cepacia pada mediam  MSM  cair  yang  ditambahkan 0,5%  substrat  daun  pepaya  sebagai sumber karbohidrat.
Persamaan regresi kurva kalibrasi yang  diperoleh  yaitu  y  =  0,0003x  – 0,081 (Gambar 2). Perhitungan aktivitas enzim dilakukan dengan mensubtitusikan absorbansi larutan yang diperoleh pada pengujian aktivitas enzim  ke  dalam  persamaan  regresi kurva  kalibrasi  larutan  standar  glukosa (Tabel 1). Aktivitas enzim dari ekstrak
kasar enzim yaitu 101,853 Unit dengan konsentrasi  glukosa  sebesar  6111,18 µmol.  Suarni  dan  Patong  (2007) menyatakan bahwa 1 unit enzim amilase sama  dengan  besarnya  aktivitas  enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan 1 µmol glukosa per menit per mL enzim.
Tabel  1.  Data  Pengukuran  Standar Glukosa Konsentrasi  (ppm) Absorbansi 250 0,0210 500 0,0870 750 0,1520 1250 0,3410 1500 0,4440 Penentuan Kadar Protein Enzim Amilase Pengukuran  kadar  protein  dalam enzim ditentukan dengan menggunakan metode Lowry dan larutan standar BSA (Bovine  Serum  Albumin)  dengan variasi konsentrasi standar yang diukur pada  panjang  gelombang  maksimum 750  nm  sehingga  diperoleh  kurva standar. Dari kurva standar ini kemudian dibuat persamaan garis lurus untuk menghitung kadar protein amilase.
Gambar  2.  Grafik  Absorbansi  Larutan
Kurva Standar Glukosa
Persamaan regresi kurva kalibrasi yang diperoleh yaitu y =  4,705x + 0,002 (Gambar  2).  Perhitungan  kadar  protein
enzim amilase dilakukan dengan mensubtitusikan absorbansi larutan yang  diperoleh  pada  penentuan  kadar protein  enzim  ke  dalam  persamaan regresi  kurva  kalibrasi  larutan  standar protein (Tabel 2). Kadar protein enzim yang  diperoleh  dari  kurva  tersebut, selanjutnya digunakan untuk menentukan  aktivitas  spesifik  enzim.
Ekstrak kasar enzim amilase B. cepacia memiliki  konsentrasi  protein  sebesar 0,0948 mg/ml dan aktivitas spesifiknya sebesar 537,199 U/mg.
Tabel  2.  Data  Pengukuran  Larutan Standar BSA dan Larutan Enzim
Konsentrasi BSA (mg/ml) Absorbansi 0,02 0,086 0,04 0,198 0,06 0,284 0,08 0,399 0,10 0,456 Sampel Enzim 0,448

## Uji Proksimat
Analisis proksimat dilakukan untuk mengetahui komponen utama dari suatu  bahan  seperti  air,  abu,  protein, karbohidrat, dan lemak yang terkandung pada  daun  tersebut.  Uji  proksimat dilakukan  pada  ketiga  substrat  yaitu daun  singkong,  daun  pepaya  dan  daun sente yang menjadi sumber karbohidrat bagi bakteri B. cepacia (Tabel 3) .
Gambar  3.  Kurva  Konsentrasi  Larutan Standar BSA

## Tabel 3.Uji Proksimat Substrat
Parameter Daun singkong  Daun pepaya  Daun sente Lemak (%) 2,6 2 0,3 Protein (%) 25,688 27,000 20,879 Abu (%) 7,125 10,686 11,940 Air (%) 7,934 7,427 8,078 Pati (%) 49,938 37,281 22,406 Serat kasar (%) 20,67 15,75 20,37 Tabel 4. Pengukuran indeks amilolitik B. cepacia berumur  66 jam Substrat Daun Diameter zona bening (mm) Rata-rata Indeks Amilolitik 1 2 3 Singkong 5,5 8 4,7 6,07 0,12 Pepaya 10,7 7 8,7 8,8 0,47 Sente 9,7 9,7 10 9,8 0,63 Berdasarkan hasil analisis proksimat  terlihat  bahwa  pada  ketiga substrat  memiliki  komponen  terbesar berupa  pati.  Kadar  pati  berturut-turut dari  nilai  yang  terbesar  hingga  terkecil yaitu  daun  singkong  49,938%,  daun pepaya  37,281%  dan  daun  sente 22,406%.  Komponen  terbesar  kedua adalah  protein.  Kadar  protein  pada substrat  tertinggi  yaitu  daun  pepaya 27%, daun singkong 25,688% dan daun sente  20,879%.  Protein  merupakan salah satu kelompok bahan
makronutrien.  Protein  berperan  lebih penting dalam pembentukan biomolekul daripada sumber energi. Namun apabila organisme  kekurangan  energi,  maka protein  ini  dapat  juga  di  pakai  sebagai sumber  energi  (Sudarmadji,  1989). Komponen terendah dari ketiga substrat adalah  lemak.  Kadar  lemak  pada  daun singkong  sebesar  2,6%,  daun  pepaya 2% dan daun sente 0,3%.

## Simpulan
Bakteri B.  cepacia mampu  hidup
pada ketiga substrat
dengan
pertumbuhan sel tertinggi terdapat pada substrat  daun  pepaya  dengan  waktu produksi  enzim  selama  66  jam.  Ketiga substrat secara keseluruhan menunjukkan  bahwa  bakteri  mampu menghidrolisis  masing-masing  sumber karbohidrat, namun indeks amilolitiknya berpotensi rendah.
Ekstrak  kasar  enzim  memiliki  nilai aktivitas  enzim  yang  tinggi  yaitu sebesar  101,853  unit  dan  konsentrasi protein sebesar 0,0948 mg/ml.

## Daftar Pustaka
Afrianto,  E.  dan  Liviawaty,  E.  2005.
Pakan Ikan . Kanisius. Yogyakarta. Agustien,  A.  2010. Protease  Bakteri Termofilik. Universitas  Padjajaran.
Bandung.
Alfin,  G.,  Harpeni,  E.,  Ali,  M.,  dan Putri,  B.  2014.  Penapisan  Bakteri
Penghasil  Enzim  Amilase  dari  Usus Ikan Gurame (Osphronemus gouramy). Di  dalam: Seminar Indonesia  Aquaculture ;  Jakarta,  26- 29 Agustus 2014.  218-225.
Chasanah, E., Patantis, G., Zilda, D.S., Ali,  M.,  dan  Risjani,  Y.  2011.
Purification  and  Characterization  of
Aeromonas  Media  KLU  11.16
Chitosanase  Isolated  from  Shrimp Waste. Journal of Coastal Development . 15 (1): 104-113. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I . Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Frazier,  W.  C.  dan  Westhoff.  1988. Food  Microbiology .  McGraw-Hill. New York.
Kusumah,  W.  2010. Metabolisme
Energi,  Karbohidrat  dan  Lipid . Skripsi. Institut Teknologi Bandung.
Lestari, L.A., Fatma, Z.N. dan Sudarmanto. 2013. Analisis Zat Gizi. Unveriversitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Mujiman,  A.  1991. Makanan  Ikan . Penebar Swadaya. Jakarta.
Murdiyanto,  B.  2005. Rancangan Percobaan. PT.  Raja  Grafindo Persada. Jakarta.
Ochoa-Solano,  J.  dan  Olmos-Soto,  J. 2006.  The  Functional  Property  of
Bacillus  for  Shrimp  Feeds. Food Microbiology . 23: 519–525. Page, D.S. 1989. Prinsip-Prinsip Biokimia  Edisi  Kedua .  Erlangga.
Jakarta.
Pelczar, M.J.Jr. dan Chan, E.C.S. 1986.
Dasar-Dasar  Mikrobiologi  Jilid  1 .:
Universitas Indonesia. Jakarta.
Suarni  dan  Patong,  R.  2007.  Potensi Kecambah  Kacang  Hijau  Sebagai Sumber  Enzim  α-Amilase. Indo.  J. Chem . 7 (3); 332-336. Sudarmadji,  S.  1989. Analisa  Bahan Makanan  dan  Pertanian. Liberty. Yogyakarta.
Sugiri, N. 1992. Biologi Sel. Depdikbud Direktorat  Jendral  Pendidikan  Pusat Antar  Universitas  Ilmu  Hayati. Institut Pertanian Bogor. Susanto,  H.  2001. Budidaya  Ikan  di Pekarangan . Penebar Swadaya. Jakarta. Ward,  O.P.  1983. Microbial  and Enzyme Technology . Applied Science Publishing 251- 305. Winarno,  F.G.  1983. Enzim  Pangan . Gramedia. Jakarta.
Windish, W.W. dan Mhatre, N.S. 1965. Microbial Amylases . Academic Press. New York.