## PENGARUH pH DAN KATION TERHADAP AKTIFITAS ENZIM β-GLUKOSIDASE YANG DIHASILKAN DARI A. foetidus (Naka.)

## Trirakhma Sofihidayati
Program Studi Farmasi FMIPA Universitas Pakuan Bogor Email:  sofihidayati9@gmail.com

## ABSTRAK
Selulase  adalah  enzim  yang  terlibat  dalam  proses  degradasi  selulosa.  Enzim  ini merupakan  campuran  dari  enzim  endoglukanase,  eksoglukanase,  dan  -glukosidase. Limbah agro industri yang diolah menggunakan kapang Aspergillus foetidus diperkirakan dapat dimanfaatkan sebagai sumber enzim selulase untuk mendegradasi  limbah dengan biaya  yang  lebih  murah.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  pH  dan kation  terhadap  aktivitas  enzim  -glukosidase  yang  dihasilkan  dari  kapang A. foetidus (Naka.). Hasil penelitian menunjukan bahwa enzim  -glukosidase dari A. foetidus yang diinkubasi  pada  suhu  ruang  di  medium  yang  mengandung  3% polard selama  6  hari menghasilkan  aktivitas  sebesar  3.56  U/mL.  Aktivitas  optimum  enzim  α-glukosidase terjadi  pada kondisi medium dengan pH 5.0 dan suhu 60 ºC. Enzim α-glukosidase relatif stabil pada pH 4,2 – 5,0 dan suhu penyimpanan 28 dan 40 ºC, tetapi tidak stabil pada suhu 80  ºC.  Aktivitas  β-glukosidase  meningkat  dengan  adanya  penambahan  kation-kation Mg 2+ , Ba 2+ , dan Mn 2+ dengan konsentrasi akhir 1 mM dan 5 mM. Penambahan 1 mM ion Fe 2+ menurunkan  aktivitas  enzim,  tetapi  penambahan  5  mM  ion  Fe 2+ meningkatkan aktivitas enzim sebesar 39%.
Kata kunci: Enzim α-glukosidase, A. foetidus, degradasi selulosa

## THE EFFECT OF pH AND ADDITION OF CATIONS ON THE ACTIVITES OF β-GLUKOSIDASE PRODUCED FROM Aspergillus foetidus (Naka.)

## ABSTRACT
The α-glucosidase is the enzyme involved in the degradation process of cellulose. This  enzyme  was  expected  could  be  produced  from  the  fermentation  of  agro-industry waste  product  using A. foetidus (Naka.)  mold.  This  study  was  aimed  to  determine  the effect of  pH  and  additionof  cations    on the  activity  of    α-glucosidase  enzyme  from A. foetidus .  The  results  show that  the  highest  activity  of  -glukosidase  produced  from A. foetidus which  was  grown  on  the  medium    contained  3%  wheat  pollard  in  room temperature reached at days 6 of incubation period.   The activity was as much as 3.56 U/mL. The optimum activity  β-glucosidase was reached at pH 5.0  and  temperature 60º C. The stable condition of the β-glucosidase is observed in the pH ranged from 4.2 to 5.0. Addition of  Mg 2+ , Ba 2+ , and Mn 2+ c cations at concentration of 1 mM and 5 mM proved increasing the  activity of the enzyme  meanwhile  addition of 1  mM Fe 3+ decreased the activity  of  the  enzyme.  On  the  contrary,  the  addition  of    5  mM  increases  the  enzyme activity up to 39%.
Keywords : β-glucosidase, A. foetidus, cellulose degradation

## PENDAHULUAN
Selulase  adalah  enzim  yang  terlibat dalam  proses  degradasi  selulosa,  yaitu komponen  utama  yang  memiliki  polimer ikatan  antar molekul glukosa didalamnya. Enzim ini merupakan campuran  dari  enzim  endoglukanase, eksoglukanase,  dan  -glukosidase.  Enzim  -glukosidase memutuskan ikatan  (1  4) glikosida  antara  2  molekul  glukosa  atau molekul selobiosa dan  mengkatalis proses hidrolisis residu ujung non pereduksi pada  -D-glukosa  dengan  melepaskan  unit glukosa.  Enzim  selulase  dibutuhkan  oleh organisme  seperti  jamur,  bakteri,  rayap, maupun  hewan  ruminansia  untuk  bisa mengkonsumsi  senyawa  selulosa.  Saat enzim  endoglukanase  dan  eksoglukanase mendegradasi  selulosa,  akan  dihasilkan molekul  selobiosa  yang  pada  akhirnya akan  menghambat  aktivitas  kerja  enzim- enzim  tersebut.  Pada  fase  ini  dibutuhkan peranan  enzim  -glukosidase  untuk  dapat menghidrolisis selobiosa menjadi senyawa yang  lebih  sederhana  yaitu  glukosa. Beberapa  penelitian  melaporkan  bahwa limbah  agro  industri      dapat  menjadi substrat  yang  baik  untuk  memproduksi enzim  α-amilase  dan  β-glukosidase.
Penelitian-penelitian lain juga
menunjukkan  bahwa  beberapa  spesies kapang  juga  dapat  menghasilkan  enzim- enzim ini. Limbah agroindustri dan kapang jika digunakan secara bersamaan keduanya diperkirakan  dapat  digunakan  secara sinergis untuk meningkatkan daya degradasi limbah-limbah pertanian  dengan biaya yang lebih murah, karena penggunaan enzim komersial untuk proses degradasi  limbah  pertanian  dan  industri sangat tidak ekonomis (Rajasekar, 2013).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  pengaruh  pH  dan  kation terhadap  aktivitas  enzim  α-glukosidase yang dihasilkan dari kapang A. foetidus.

## METODE PENELITIAN
Bahan
Isolat  kapang A.  foetidus (Naka.) koleksi  Balai  Penelitian  Ternak  Ciawi. pollard (dedak  gandum  untuk  pakan ternak)  dari  PT.  Indofeed-Bogor, potato dextrose  agar (PDA),  medium  Manels, medium Dubos.

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  adalah pipet  mikro,  autoklaf,  alat  sentrifugal berpendingin, spektrofotometer, jarum ose, pH  meter, vorteks ,  neraca  analitik, rotary shaker , blender, dan peralatan gelas.

## CARA KERJA Pembuatan Polard NaOH
Kedalam 1 liter larutan NaOH 0.5% (b/v)  ditambahkan  sebanyak  50  gram polard kering.  Campuran  dididihkan selama  60  menit  dalam  penangas  air. Setelah  didinginkan  sampai  suhu  kamar, campuran  disaring  dengan  kain  tipis  dan dicuci  dengan  air  sampai  air  perasan mempunyai pH netral. Selanjutnya polard NaOH  dikeringkan  dengan blower pada suhu  40°  C. Polard yang  telah  kering kemudian digiling dengan blender .
Produksi Enzim ß-glukosidase Isolat A. foetidus untuk memproduksi enzim α-glukosidase
ditanam pada media agar miring PDA dan diinkubasi  selama  5  hari  (Haryati et  al . 1997).  Spora  yang  dihasilkan  kemudian disuspensikan ke dalam 5 mL larutan NaCl 0.85% menjadi larutan inokulum.
Sebanyak 2 mL larutan inokulum diinokulasikan pada 50 mL media Mandels yang mengandung 3% polard NaOH, 0.3% ekstrak khamir, dan 0.075% bacto pepton , selanjutnya  diinkubasi  pada  suhu  kamar dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan  150  rpm  selama  6  hari.  Untuk mengetahui  aktivitas  enzim,  dilakukan pengujian pada hari ke 5, 6 dan 7.

## Penentuan Aktivitas β-glukosidase
Aktivitas enzim β-glukosidase ditentukan dengan mengukur pelepasan p - nitrofenol  dari p -NPG  (Lin et  al .  1999). Filtrat enzim,  larutan buffer asetat pH 5.0 dan  substrat p -NPG 0.3% (b/v) diinkubasi selama  60  menit  pada  suhu  50  °C. Absorban diukur pada panjang gelombang 400 nm.

## Penentuan  pH  dan  Suhu  Optimum Enzim
Penentuan  pH  optimum  dilakukan dengan  menguji  aktivitas  enzim  pada kisaran  pH  4.2,  4.6,  5.0,  5.4,  5.8  dan  6.2. Sedangkan  penentuan  suhu  optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim pada  variasi  suhu  40,  50,  55,  60,  65,  dan 70º C.

## Penentuan pH Stabilitas enzim
Penentuan  pH  stabilitas  dilakukan dengan  menginkubasi enzim dalam  buffer asetat  (pH  4.2,  4.6,  5.0,  5.4,  5.8,  dan  6.2) pada  suhu  optimum  selama  30  menit. Setelah  inkubasi  berakhir,  aktivitas  enzim ditentukan  pada  kondisi  pH  optimum  dan suhu optimum.
Aktivitas enzim β-glukosidase ditentukan dengan mengukur pelepasan p - nitrofenol  dari p -NPG.  Absorbansi  diukur pada panjang gelombang 400 nm. Kadar p - nitrofenol  yang  dihasilkan  ditentukan berdasarkan  kurva  standar.  Aktivitas  β- glukosidase  dinyatakan  dalam  satuan Unit/mL  Satu  unit  aktivitas  enzim didefinisikan  sebagai  jumLah  enzim  yang dibutuhkan untuk mengkatalisis pembentukan satu mikromol (10 -6 mol) p - nitrofenol per-menit pada kondisi percobaan.

## Penetapan  Aktivitas  Enzim    Terhadap Pengaruh Kation
Pengaruh  ion  logam  ditentukan dengan  menambahkan  masing-masing, FeCl 3 ,  MgCl 2 ,  BaCl 2 ,  dan  MnCl 2 dengan konsentrasi  akhir  1  dan  5  mM  dalam campuran  reaksi.  Komposisi  campuran reaksi  terdiri  dari,  enzim,  substrat p -NPG 0.3%,  dan  bufer  asetat,  selanjutnya diinkubasi selama 1 jam pada kondisi suhu dan pH optimum.  Aktivitas β-glukosidase ditentukan dengan mengukur pelepasan p - nitrofenol dari p -NPG.
Aktivitas ß-glukosidase = [ nitrofenol ] sampel ( μg mL ⁄ ) - [ nitrofenol ] kontrol ( μg mL ) ⁄ Waktu inkubasi ( menit ) × BMnitrofenol (139  μg μmol) ⁄ × fp HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan  pH  dan  Suhu  Optimum Enzim Penetapan pH maupun suhu
optimum mutlak dilakukan sebagai prasyarat penetapan aktivitas enzim karena perubahan  suhu  maupun  pH  dapat mempengaruhi  stabilitas  enzim  ataupun afinitas  enzim  sebagai  aktivator  dan inhibitor.  Dengan  diketahuinya  pH  dan suhu  optimum,  aktifitas  selulolitik  yang mikroba dapat diaplikasikan secara
optimal    untuk  mendegradasi  selulosa secara maksimal
Hasil  uji  penetapan  aktivitas  enzim β-glukosidase  isolat  kapang A.  foetidus diperoleh  data  bahwa  aktifitas  optimum enzim  sebesar  2.76  U/mL  dicapai      pada hari inkubasi ke 6. Gambar 1 menampilkan aktivitas  enzim  β-glukosidase  pada  lama inkubasi yang berbeda.
Gambar 1 . Aktivitas β-glukosidase terhadap variasi waktu inkubasi
Pengujian aktivitas enzim α-
glukosidase  pada  berbagai  kondisi  pH ditampilkan    Gambar  2.  Pada  gambar terlihat  bahwa  β-glukosidase  mempunyai pH optimum 5.0, dengan aktivitas sebesar 2.13 U/mL. Pada pH 5.2, aktivitasnya turun sebesar 61% menjadi 0.81 U/mL, sedangkan  pada  pH  4.8,  β-glukosidase mempunyai  aktivitas  sebesar  1.15  U/mL.
Sebagian besar kapang umumnya mempunyai  pH  optimum  dibawah  7,  dan sebagian besar enzim umumnya mempunyai pH optimum antara 4-8. Pada penelitian sebelumnya, Setyaningsih
(2007)  menyatakan  bahwa  pH  optimum enzim  β-glukosidase  yang  dihasilkan A. niger adalah  4.5,  sedangkan  Oktavia (2014))  menemukan  aktivitas  optimum  β- glukosidase  pada isolat kapang EN (isolat dari Enhalus sp )  yang  dikulturkan  pada media yang mengandung limbah agar-agar terjadi  pada  pH  4.  Penelitian  lainnya  juga menunjukan  bahwa  pH  optimum  enzim selulase  dari  bakteri  yang  diisolasi  dari
limbah  rumput  laut  adalah  pada  pH  5.0 Dini (2017).
Selain pH, suhu medium juga dapat mempengaruhi  aktivitas  enzim.  Pada Gambar  3,  terlihat  bahwa  β-glukosidase mempunyai  suhu  optimum  60º  C,  dengan aktivitas sebesar 3.56 U/mL. Pada kondisi diatas  suhu  optimum,  aktivitas  β- glukosidase  menurun  68%,  menjadi  1.12 U/mL,  bahkan  pada  suhu  70º  C, aktivitasnya tinggal 13% atau sebesar 0.45 U/mL.  Namun  pada  kondisi  sedikit dibawah  dibawah  suhu  optimum,  yaitu pada  suhu  50º  C,  aktivitas  enzim  β- glukosidase relatif stabil, walaupun aktivitasnya  turun  sebesar    51%  menjadi 1.74  U/mL,  sedangkan  pada  suhu  40º  C aktivitasnya  hanya  0.95  U/mL.  Suhu optimum pada penelitian ini sesuai dengan hasil  penelitian  Setyaningsih  (2007)  yang menemukan  suhu  60º  C  sebagai  suhu optimum    aktivitas  enzim  β-glukosidase yang dihasilkan oleh A.niger . 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 5 6 7 A kt iv it sa s (U /m L) Waktu inkubasi (hari)
Gambar 2 . Aktivitas β-glukosidase terhadap variasi pH
Gambar 3. Aktivitas β-glukosidase terhadap variasi suhu
Gambar 4. Stabilitas β-glukosidase terhadap variasi pH
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 4,2 4,6 4,8 5 5,2 5,4 5,8 6,2 pH A k ti fi ta s (U /m l) 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,2 4,6 5 5,4 5,8 6 6,2 Stabilitas pH A k ti fi ta s (U /m l)
Gambar 5. Pengaruh kation terhadap aktivitas β-glukosidase
Peningkatan  aktivitas  enzim  yang tajam,  yaitu  46%  pada  pH  optimum berkaitan  dengan  perubahan  yang  terjadi pada  struktur  atau  muatan  gugus  ionik enzim yang terdapat pada sisi aktif enzim. Hal  ini  mengakibatkan  konformasi  sisi aktif  enzim  menjadi  lebih  efektif  dalam mengikat  substrat,  yang  selanjutnya  akan diubah  menjadi  produk.  Pada  pH  yang rendah enzim akan mengalami protonisasi sehingga  kehilangan  muatan  negatifnya, sedangkan  pada  pH  yang  tinggi  substrat akan  mengalami  ionisasi  dan  kehilangan muatan  positifnya.  Dengan  berubahnya muatan, maka  struktur  tersier  atau kuarterner akan berubah, akibatnya protein β-glukosidase akan terbuka dan kehilangan aktivitasnya.
Pengaruh  kation  terhadap  aktivitas  β- glukosidase
Pengaruh  kation terhadap aktivitas enzim  β-glukosidase  yang  dikarakterisasi menggunakan  senyawa-senyawa  FeCl 3 , MgCl 2 ,  BaCl 2 ,  dan  MnCl 2 ditampilkan pada Gambar 5. Penambahan 1 mM dan 5 mM  masing-masing  senyawa  MgCl 2 , BaCl 2 ,  dan  MnCl 2 dapat  meningkatkan aktivitas β-glukosidase, sedangkan
penambahan  1  mM  FeCl 3 menurunkan aktivitas  β-glukosidase  sebesar  2%. Namun penambahan 5 mM senyawa FeCl 3 ternyata mampu meningkatkan aktivitas β-
glukosidase hingga 60 %. Hasil penelitian ini  sejalan  dengan  hasil-hasil  penelitian sebelumnya  yang  menunjukan  bahwa aktivitas  enzim  selulase  yang  dihasilkan oleh  bakteri  yang  diisolasi  dari  limbah rumput laut juga dapat ditingkatkan dengan penambahan  10  mM  FeCl 3 ,  sedangkan penambahan  10  mM  kation  Zn 2+ justru menurunkan aktivitas enzim (Dini, 2017).
Sebagian  enzim  mengandung  ion logam  yang  terikat  erat  atau  memerlukan ion  logam  untuk  aktivitasnya.  Ion  logam dapat  meningkatkan  pengikatan  substrat dan  proses  katalisis  dengan  membentuk beberapa  jenis  komplek  jembatan  dari enzim, logam dan substrat. Tetapi kelebihan  ion  logam  dapat  menghambat aktivitas enzim karena senyawa nukleotida di-  dan  tri-fosfat  yang  membentuk kompleks  yang  stabil  dengan  kation tersebut.  Selain  ion  Fe 3+ dan  Mg 2+ yang berfungsi  dalam  protein  heme,  ion-ion logam  yang  paling  sering  terlibat  dalam katalisis  enimatik  adalah  Mn 2+ dan  Ca 2+ . Keempat kation tersebut bekerja mengaktifkan  enzim  selulase  dari  bakteri PMP-0126Y (Munifah, 2013).

## SIMPULAN
Aktivitas  β-glukosidase  maksimum dari A.  foetidus (Naka.)  dihasilkan  pada hari  ke  6  inkubasi  pada  media  Mandels dengan  penambahan  3% polard .  Nilai  pH
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 Mg Ba Mn Fe awal A kt ivi ta s Kation Pengaruh Kation Terhadap Aktivitas Bglukosidas 1 mM 5 mM
optimum  bagi  aktivitas  β-glukosidase A. foetidus (Naka.) berada pada  5.0 dan dan suhu  optimum  pada  60  ºC.  Beta- glukosidase relatif stabil pada pH 4.2 - 5.0 dan pada penyimpanan suhu 28 ºC dan 40 ºC,  tetapi  tidak  stabil  pada  suhu  80  ºC. Aktivitas β-glukosidase meningkat dengan adanya  penambahan  kation-kation  Mg 2+ , Ba 2+ ,  dan  Mn 2+ dengan  konsentrasi  akhir 1mM  dan  5mM,  sedangkan  penambahan 1mM ion Fe 2+ justru menurunkan aktivitas enzim  tetapi  penambahan  5  mM  ion  Fe 2+ meningkatkan  aktivitas sebesar 39%.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut untuk megetahui bagaimana memproduksi dan  mengisolasi enzim beta- glukosidase  dari A.  foetidus, kemudian mengaplikasikanny secara optimal sebagai enzim  selulase  yang  bermanfaat  untuk mendegradasi limbah-limbah agroindustri.

## DAFTAR PUSTAKA
Dini,  I.R.  dan  I.  Munifah.  2014.  Produksi dan  karaterisasi  enzim  selulase ekstrak  kasar  dari  bakteri  yang diisolasi  dari  limbah  rumput  laut.
Jurnal Teknologi dan Industri
Pertanian . 6(3).
Hermansyah,  H.  dan  R.  Rizky.  2014. Produksi enzim hidrolisis α-amylase
dan  β-glukosidase  dari Aspergillus niger dalam  substrat  sekam  padi, bagas  dan  tongkol  jagung  dengan metode  fermentasi  solid. Rekayasa
Bioproses . Program Studi Teknologi
Bioproses, Departemen Teknik Kimia, Fakultas  Teknik, Universitas
Indonesia. Oktavia, Y., A. Andhika, T. Nurhayati dan
T.  Kustiariyah.  2014.  Karakterisasi enzim kasar selulase kapang Endofit dari lamun. Jurnal  Ilmu  dan Teknologi  Kelautan  Tropis .    6  (1):
200-218. Rajasekar,  A.  2013. Production  and optimazation  of  amylases  using Aspergillus niger . International Journal of Scientific and Engineering Research . 4(7): 2497. Setyaningsih,  D.,  K. Tresnawati1),  M.  T. Soehartono  dan  A.  Apriyantono. 2007. Pengaruh aktivitas β- glukosidase  eksternal  dari  kapang terhadap  kadar  vanilin  buah  vanili.
Jurnal Teknologi Industri Pertanian . 16 (1): 28-35. Munifah, I. 2014. Produksi dan karakterisasi  enzim  selulase  dari limbah  pengelolaan  rumput  laut. Jurnal Teknologi Pengelolaan Limbah . 16 (3): 221-228.