Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau, 7(2) Oktober 2022, PP. 115-124 Publisher by : Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Batanghari Jambi
Print ISSN 2503-4766 | Online ISSN 2597-8837 | DOI 10.33087/akuakultur.v7i2.142
Studi Komunitas Bakteri Hidrolitik Saluran Pencernaan Ikan Nilem ( Osteochilus vittatus ) yang Dibudidayakan di Kabupaten Banyumas

## Community Study of Digestive Tract Hydrolytic Bacteria of Nilem Fish (Osteochilus vittatus) Cultivated in Banyumas Regency
*E. Listiowati, A. Ekasanti, D. Nugrayani, H. Syakuri, D. Wisudyanti, M. Nurhafid, dan Y. Evander Program studi Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Jenderal Soedirman, Jln. Dr. Soeparno Komplek GOR Soesilo Sudarman, Karangwangkal, Purwokerto 53122 *e-mail korespondensi : emyliana.listiowati@unsoed.ac.id
Abstract. Hydrolytic bacteria are bacteria that play an important role in helping the digestive process of fish. This study aims to determine the hydrolytic activity of bacteria in the digestive tract of Nilem fish seen from amylolytic, proteolytic, lipolytic and cellulitic indices. The method used is exploratory and data analysis using parametric and non-parametric to explain the research data. Exploration carried out in this study included the total number of bacteria, proportion of hydrolytic bacteria, activity index of hydrolytic bacteria and molecular identification of bacteria with the best activity index. Fish were taken at random from fish farming ponds in Beji and Singasari with three fish each. The number of bacteria found an increasing pattern to the posterior intestine of fish from Beji and a pattern that varied between parts of the intestine of fish from Singasari. Hydrolytic bacteria were isolated from each part of the intestine from both locations which showed a decreasing pattern in each type of hydrolytic and intestinal tracts of fish from Singasari and varied patterns in the intestines of fish from Beji. The hydrolytic activity index showed a stable average value in each part of the intestine and the sampling location. Based on the best activity index, seven isolates were identified from three different genera, namely 1) Bacillus subtilis, 2) Enterobacter mori, Enterobacter cloacae, and 3) Aeromonas hydrophila (3), Aeromonas veronii. The bacteria obtained are classified as non-pathogenic bacteria that have potential in the field of aquaculture and normal pathogenic bacteria in the fish intestine Keywords : Hydrolitic bacteria, identification, part of gut, Osteochilus vittatus
Abstrak. Bakteri  hidrolitik  merupakan  bakteri  yang  berperan  penting  dalam  membantu  proses  pencernaan  ikan.  Penelitian  ini bertujuan mengetahui aktivitas hidrolitik bakteri saluran pencernaan ikan Nilem dilihat dari indek amilolitik, proteolitik, lipolitik dan  selulitik.  Metode  yang  digunakan  yaitu  eksploratif  dan  analisis  data  menggunakan  parametrik  dan  non-parametrik  untuk menjelaskan data hasil penelitian. Eksplorasi  yang dilakukan pada penelitian ini  meliputi jumlah total bakteri, proporsi bakteri hidrolitik,  indeks  aktivitas  bakteri  hidrolitik  serta  identifikasi  molekuler  bakteri  dengan  indeks  aktivitas  terbaik.  Ikan  diambil secara  acak  dari  kolam  pembudidaya  ikan  di  Beji  dan  Singasari  dengan  jumlah  masing-masing  tiga  ekor.    Jumlah  bakteri mendapatkan pola yang meningkat ke bagian posterior usus ikan dari Beji dan pola yang bervariasi antar bagian usus ikan dari Singasari. Bakteri hidrolitik berhasil diisolasi dari setiap bagian usus dari kedua lokasi yang menunjukan pola menurun di setiap jenis hidrolitik dan bagian usus ikan dari Singasari dan pola bervariasi pada bagian usus ikan dari Beji. Indeks aktivitas hidrolitik menunjukan nilai rata-rata yang stabil pada setiap bagian usus dan lokasi sampling. Berdasarkan indeks aktivitas terbaik didapatkan sebanyak tujuh isolate yang teridentifikasi dari tiga Genus berbeda yaitu 1) Bacillus subtilis , 2) Enterobacter mori , Enterobacter cloacae, dan 3) Aeromonas hydrophila (3), Aeromonas veronii. Bakteri yang didapatkan tergolong dalam bakteri non-patogen yang berpotensi dibidang akuakultur dan bakteri patogen yang normal di dalam usus ikan Kata Kunci : bakteri hidrolitik, identifikasi, bagian usus, Osteochilus vittatus

## PENDAHULUAN
Ikan Nilem merupakan ikan dari famili Cyprinidae yang tersebar di perairan Sumatera, Jawa dan Kalimantan. Ikan ini adalah salah satu komoditas budidaya ikan air tawar yang terkonsentrasi di Pulau Jawa (Rahmia et al ., 2015). Ikan Nilem sudah dapat dibudidayakan dengan baik dan memiliki potensi dikembangkan menjadi komoditas unggulan di  Banyumas,  Purbalingga  dan  Banjarnegara  karena  banyak  diminati  oleh  konsumen.  Ikan  Nilem  termasuk  dalam golongan herbivora (Rahmia et al ., 2015). Ikan Nilem dalam kegiatan budidaya dapat mengkonsumsi pakan buatan dengan baik. Jenis pakan yang dikonsumsi akan mempengaruhi kondisi sistem pencernaan dan absorbsi nutrient yang dimiliki oleh suatu jenis ikan (Anggani et al., 2021)
Sistem pencernaan pada ikan Nilem di mulai di usus bagian depan bukan di rongga mulut, sebab tidak memiliki kelenjar air liur yang dapat menghasilkan saliva. Selain enzim, proses pencernaan dibantu oleh aktivitas bakteri dalam saluran pencernaan.  Menurut Khasani, (2010; Kurniasih et al., (2013) beberapa jenis bakteri memiliki peranan penting dalam meningkatkan pemanfaatan pakan, kesehatan ikan, perbaikan mutu lingkungan dan daya cerna pakan. Peranan bakteri  yang  menguntungkan  dalam  saluran  pencernaan  yang  memiliki  potensi  menghasilkan  enzim  pencernaan eksogen telah banyak diteliti.  Hasil riset Deepika et al., (2019) menyatakan bahwa salah satu jenis bakteri pada saluran pencernaan  ikan  Gurami  adalah Bacillus sp.  yang  dapat  menghasilkan  enzim  hidrolitik  seperti  protease,  amylase, selulase dam lipase.  Pada ikan lele ditemukan aktivitas bakteri amilolitik, proteolitik dan lipolitik.  Diantara bakteri yang ditemukan bakteri genus Staphylococcus sp. memiliki ketiga aktivitas tersebut (Kurniasih et al., 2013).
Kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim hidrolitik ekstraselluler dapat dideteksi dengan menggunakan medium pengujian yaitu medium yang diperkaya dengan substrat enzimnya (Yusra & Hatta, 2019) Aktivitasnya akan ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekitar koloni. Dengan keberadaan bakteri yang memiliki aktivitas hidrolitik  akan  meningkatkan  kemampuan  ikan  dalam  mencerna  nutrisi  dan  lebih  lanjut  dapat  digunakan  sebagai kandidat probiotik. Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui aktivitas hidrolitik bakteri saluran pencernaan ikan Nilem dilihat dari indek amilolitik, proteolitik, lipolitik dan selulitik.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  menggunakan  metode  eksploratif  dan  hasilnya  dianalisis  secara  statistika  parametrik  dan  non parametrik untuk menjelaskan hasil pengamatan.  Penelitian ini diawali dengan mengambil sampel pada dua tempat budidaya yang berbeda yaitu tempat budidaya ikan Nilem yang sesuai dengan SNI dalam hal ini akan diwakilkan oleh BBI  Singasari  dan  Pembudidaya  ikan  Nilem  (Beji).    Sampel  ikan  dibawa  ke  laboratorium  untuk  pengamatan mikrobiologis. Pengamatan meliputi jumlah total bakteri dan pengujian aktifitas bakteri amilolitik, proteolitik, lipolitik dan selulolitik serta identifikasi bakteri dengan indeks hidrolitik terbaik.

## Pengambilan Sampel Saluran Pencernaan
Sampel ikan Nilem diambil dari BBI Singasari dan Pembudidaya ikan di desa Beji.  Banyaknya sampel yang diambil adalah masing-masing tiga (3) ekor ikan dengan ukuran 10 – 15 cm.  Sampel ikan Nilem yang diambil adalah dari  strain  yang  sama.    Ikan  diambil  dan  dibawa  ke  Laboratorium  riset  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan Purwokerto dalam kondisi hidup dengan transportasi basah. Sampel ikan dimatikan dengan memotong pangkal tulang belakang, diukur panjangnya, dan ditimbang beratnya dan selanjutnya dibedah untuk diambil saluran pencernaanya (usus). Saluran pencernaaan diukur panjangnya dan dibedakan menjadi tiga bagian yaitu anterior, middle dan posterior.

## Isolasi Mikroba
Jumlah total bakteri dihitung berdasarkan metode total plate count (TPC) dengan pour plating (Nurhafid et al ., 2021) . Sampel usus ikan Nilem sepanjang 0,5 cm ditimbang, dimasukkan tabung 1,5 ml,  dan dihaluskan dengan pellet pastel .  Sampel dihomogenkan dengan larutan NaCl 0,9% steril sebanyak 1 ml.   Pengenceran bertingkat dilakukan pada 10 -1 sampai 10 -5 .  Tabung reaksi diisi dengan larutan NaCl 0,9 % steril sebanyak 4,5 ml/tabung dan sampel usus dimasukkan  sebanyak  0,5  ml  pada  tabung  reaksi  pertama  sebagai  pengenceran  10 -1 selanjutnya  divortex  supaya homogen  dan  diambil  0,5  ml  untuk  diencerkan  kembali  pada  tabung  reaksi  kedua  sebangai  pengenceran  10 -2 dan divortex  supaya  homogen.    Proses  dilanjutkan  dengan  prosedur  yang  sama  sampai  dengan  pengenceran  10 -5 . Selanjutnya dari setiap pengenceran 10 -2 sampai 10 -4 diambil 0,5 ml untuk dikultur pada media TSA dengan metode Pour Plate.  Selanjutnya diinkubasikan pada suhu ruang selama 18-24 jam.  Kemudian koloni yang ada dihitung untuk menentukan jumlah total bakteri. Perhitungan jumlah bakteri menggunakan metode TPC (Total Plate Count) denga rumus sbb :
Total bakteri = ∑koloni x 1 pengenceran x 1 volume bakteri (mL) x 1
berat sampel (g) (CFU/g)

## Pengamatan Aktivitas Bakteri Proteolitik
Preparasi media proteolitik dilakukan dengan cara disiapkan 4 gr bubuk TSA dan ditambahkan sebanyak 2% skim milk powder dan simasukan ke dalam erlenmeyer yang telah diisi 100 mL akuades. Larutan media dipanaskan menggunakan microwave dan diaduk hingga homogen. Kemudian media disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121 ° C selama 15 menit. Kemudian media yang steril dipindahkan pada waterbath hingga digunakan . Jika terjadi proses  hidrolisis  kasein  yang  ada  pada  skim  milk  powder,  akan  terlihat  zona  bening  di  sekeliling  koloni  mikroba, sebaliknya bila tidak terjadi hidrolisis maka daerah di sekitar koloni tetap berwarna keruh.  Berdasarkan data tersebut diperoleh  dapat  ditentukan  nilai  rasio  protease  dengan  rumus  yang  digunakan  dalam  riset  (Ginting  et  al.,  2020; Subagiyo & Djunaedi, 2012).
Indeks hidrolisis protein = diameter zona bening bakteri/diameter koloni bakteri.

## Pengukuran Aktivitas Bakteri Amilolitik
Preparasi media Amilolitik dilakukan dengan cara disiapkan 4 gr bubuk TSA dan ditambahkan sebanyak 1% tepung  singkong (Tapioka)  dan simasukan ke dalam erlenmeyer yang telah  diisi 100 mL akuades. Larutan media dipanaskan  menggunakan microwave dan  diaduk  hingga  homogen.  Kemudian  media  disterilkan  menggunakan autoklaf  dengan  suhu  121 0 C  selama  15  menit.  Kemudian  media  yang  steril  dipindahkan  pada waterbath hingga digunakan. Pengamatan aktivitas amilolitik menggunakan larutan Iodine untuk melihat aktivitas positif dengan cara
menuangkan  larutan  Iodine  pada  permukaan  cawan  untuk  menunjukan  adanya  zona  hidrolisis  (Ginting  et  al., 2021).Cara menghitung indeks hidrolisis amilum yaitu :
Indeks hidrolisis amilum = diameter zona bening bakteri/diameter koloni bakteri.

## Pengukuran Aktivitas Bakteri Lipolitik
Preparasi media lipolitik dilakukan dengan cara disiapkan 100ml akuades, lalu tambahkan 1% minyak zaitun, 1% Gum arabic , 0,5% CaCl2 lalau diaduk pada suhu 100 0 C menggunakan magnetic dan Hot plate stirer selama 15 menit. Tambahkan bubuk TSA sebanyak 4 gr. Larutan media dipanaskan menggunakan microwave dan diaduk hingga homogen. Kemudian media disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121 0 C selama 15 menit. Kemudian media yang steril dipindahkan pada waterbath hingga digunakan (Simamora & Sukmawati, 2020) yang dimodifikasi. Cara menghitung indeks hidrolisis lemak yaitu (Rizky et al., 2017)
Indeks hidrolisis lemak  = diameter zona bening bakteri/diameter koloni bakteri.

## Pengukuran Aktivitas Bakteri Selulitik
Preparasi media selulolitik dilakukan dengan cara disiapkan 4 gr bubuk TSA dan ditambahkan sebanyak 1% Carboxy  Methil  Cellulose (CMC).  Lalu  ditambahkan  sebanyak  100mL  akuades  dan  aduk  menggunakan magnetic stirer dan panasakan dengan suhu 100 0 C selama 15 menit. Kemudian media disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121 0 C selama 15 menit. Kemudian media yang steril dipindahkan pada waterbath hingga digunakan. Pengamatan aktivitas  selulolitik  dilakukan  dengan  menambahkan Congored 0,1%  pada  seluruh  permukaan  media  CMC  untuk menunjukan adanya zona hidrolisis.  Pengukuran aktivitas bakteri selulitik dengan rumus (Nursyirwani et al., 2020).
Indeks hidrolisis selulose = diameter zona bening bakteri/diameter koloni bakteri.

## Identifikasi Bakteri
Identifikasi  bakteri  hidrolitik  dilakukan  pada  bakteri  yang  memiliki  aktivitas  tergolong  tinggi.  Tahapan identifikasi  diawali  dengan  isolasi  DNA  bakteri.  Isolasi  DNA  bakteri  dilakukan  menggunakan  kit  genomic  tissue (Geneaid) dengan prosedur yang sesuai dengan petunjuk penggunaan. Bakteri dikultur pada media Tryptone Soy Broth (TSB)  dan  diinkubasi  selama  24  jam.  Hasil  kultur  bakteri  dari  TSB  diambil  sebanyak  1  mL  dipindahkan  kedalam microtube 1,5 mL. Bakteri dicuci dari media dengan cara bakteri yang telah di pindah pada tube divortex dan spindown kemudian supernatan diganti menggunakan akuades. Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali. Selanjutnya pelet bakteri dihomogenkan dengan 200 μL GT Buffer dan 20 μL Proteinase K. Sampel diinkubasi pada suhu 60ºC selama 30 menit dengan menggunakan waterbath. Selama inkubasi, sampel dihomogenkan setiap 5 menit. Tahapan selanjutnya adalah sel  lisis.  Larutan GBT  Buffer dimasukan  pada  ampel  sebanyak  200  μL  lalu  di-vortex  selama  10  detik.  Sampel diinkubasi kembali pada suhu 60ºC selama 20 menit. Tahapan selanjutnya adalah binding dan washing DNA. E thanol absolut ditambahkan ke dalam sampel, vortex dan spindown masing-masing selama 10 detik. Selanjutnya GS column dipasangkan pada 2 ml collection tube . Sampel dipindahkan ke dalam GS column dan disetrifugasi pada 6.000 rpm selama 2 menit. GS column dipindahkan ke 2 mL collection tube yang baru. Sebanyak 400 μL W1 Buffer ditambahkan ke dalam GS column lalu disentrifugasi pada 6.000 rpm selama 30 detik. Sebanyak 600 μL wash buffer ditambahkan ke GS column lalu disentrifugasi pada 6.000 rpm selama 30 detik. Kemudian GS column disentrifugasi selama 3 menit pada 6.000 rpm untuk mengeringkan matriks column . Tahapan selanjutnya adalah elusi DNA. GS-column yang telah kering dipindahkan ke 1,5 microtube baru lalu ditambahkan 100 µL Elution buffer yang telah dihangatkan ke bagian tengah  matriks column .  Sampel  didiamkan  selama  5  menit  untuk  memastikan Elution  buffer sepenuhnya  terserap. Selanjutnya sampel disentrifugasi pada 6.000 rpm selama 30 detik. Sampel DNA disimpan pada suhu  -20°C untuk dilakukan analisis pada tahap selanjutnya.
Amplifikasi dilakukan menggunakan Primus 25 Thermocycler PCR ( Peqlab ). Sepasang primer yang digunakan mengikuti penelitian Marchesi, et al. (1998) 63f (5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) dengan hasil amplifikasi berukuran 1500 bp. Mastermix PCR berisi sepasang primer, nuclease free water dan my taq HS Redmix 2x (DNA polymerase , Buffer MgCl 2, dan dNTP) dengan volume masing- masing sesuai protokol My Taq HS Redmicx. Program PCR yang digunakan untuk amplifikasi adalah predenaturasi 94ºC selama 2 menit; diikuti 35 siklus: denaturasi 94ºC selama 20 detik, anneling pada suhu 53ºC selama 30 detik dan extention pada suhu 72ºC selama 20 detik dan final extention pada suhu 72ºC selama 5 menit serta suhu akhir 25ºC. Hasil PCR dilihat dengan visualisassi gel elektroforesis dengan panjang pita 1500bp. Selanjutnya, dari hasil PCR yang berhasil kemudian dilakukan sekuensing untuk mendapatkan informasi urutan basa nukleutida. Data yang didapatkan berupa sekuen fasta yang kemudian di analisis BLAST untuk melihat homologi sekuen sampel dengan database NCBI.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil
Kelimpahan bakteri di dalam saluran pencernaan dapat dihitung berdasarkan metode Total Plate Count (TPC) (Nurhafid et al., 2021).  Metode Total Plate Count (TPC) memiliki prinsip yaitu menentukan besarnya populasi bakteri yang terdapat pada saluran pencernaan ikan. Pengenceran yang digunakan dalam metode Total Plate Count (TPC) adalah  10 -2 sampai  10 -4 dan  hasil  perhitungan  kelimpahan  bakteri  dengan  satuan Colony  Form  Unit (CFU)/gram. Koloni bakteri yang tumbuh dalam TSA dihitung pada rentang 30–300 koloni.  Sampel ikan Nilem diambil dari dua tempat yang memiliki perbedaan sistem pemeliharaan dan lokasi.  Sampel berasal dari Balai Benih Ikan Singasari dan pembudidaya ikan di desa Beji. Hasil perhitungan ditampilkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Kelimpahan  bakteri  saluran  pencernaan  ikan  Nilem  per  bagian  ( anterior,  middle,  posterior )  yang dibudidayakan di Kabupaten Banyumas.
Berdasarkan Gambar 1. Tiga bagian pencernaan cenderung mengalami peningkatan pada bagian posterior untuk sampel yang berasal dari desa beji namun kelimpahan bervariasi untuk sampel dari desa singasari. Kelimpahan bakteri pada penelitian ini, kelimpahan bakteri saluran pencernaan ikan dari Beji menunjukan kelimpahan meningkat kearah bagian posterior, berturut-turut 8,4x10 6 CFU/g, 13,2x10 6 CFU/g dan 23,5x10 6 CFU/g. Sedangkan kelimpahan bakteri saluran  pencernaan  ikan  dari  Singasari  bagian  anterior  sebanyak  9,5x10 6 CFU/g,  bagian middle 0,5x10 6 CFU/g  dan bagian posterior 1,8x10 6 CFU/g.
Gambar 1. Proporsi  Isolat  Bakteri  Proteolitik,  Amilolitik,  Lipolitik,  atau  Selulolitik  dari  Usus  Bagian  Anterior, Middle, dan Posterior Ikan Nilem (Osteochilus vittatus) yang Dibudidayakan di Kabupaten Banyumas.
8,4 13,2 23,5 9,5 0,5 1,8 0 5 10 15 20 25 Anterior Middle Posterior K elim pa ha n B a k ter i Sa lura n
Pencerna a n ( x 1 0 6 CFU/g )

## Bagian Saluran Pencernaan
Beji Singasari 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 An ter io r
Mid d le Po st er io r An ter io r Mid d le Po st er io r An ter io r
Mid d le Po st er io r An ter io r
Mid d le
Po st er io r Amilolitik Proteolitik Lipolitik Selulolitik P ro po rsi I so la t B a k ter i H idro litik ( %) Singasari Beji
Isolat bakteri hidrolitik berhasil diisolasi dari setiap bagian usus ikan nilem dari Singasari dan Beji. Berdasarkan lokasi pengambilan sampel, proporsi bakteri hidrolitik secara  umum menunjukan pola menurun ke bagian posterior usus ikan dari Singasari. Sedangkan proporsi bakteri hidrolitik lokasi Beji menunjukan pola bervariasi di setiap bagian usus  ikan.  Meski  demikian,  berdasarkan  gambar  2  keberadaan  bakteri  hidrolitik  tertentu  dapat  diketahui  lebih mendasar.  Misalnya  keberadaan  bakteri  selulolitik  dari  kedua  lokasi  menunjukan  keberadaan  relative  tinggi dibandingkan dengan keberadaan bakteri hidrolitik lainnya. Namun hasil penelitian ini menunjukan bahwa keberadaan bakteri  lipolitik  dari  lokasi  Singasari  didapatkan  proporsi  yang  rendah  dibandingkan  keberadaan  dari  lokasi  Beji. Kemudian bakteri amilolitik dan proteolitik secara umum menunjukan proporsi relative tinggi di setiap bagian usus ikan namun relative bervariasi berdasarkan pengambilan dari lokasi Beji.
Gambar  2. Nilai  rata-rata  indeks  aktivitas  hidrolitik  bakteri  usus  ikan  Nilem  (Osteochilus  vittatus)  yang Dibudidayakan di Kabupaten Banyumas
Berdasarkan  Gambar  3,  nilai  rata-rata  indeks  aktivitas  bakteri  hidrolitik  bagian  usus  ikan  menunjukan  nilai relative seragam. Hal tersebut dapat dilihat dari bakteri amilolitik, proteolitik dan selulolitik, berbeda dengan lipolitik yang menunjukan indeks tinggi pada bagian posterior lokasi Singasari didapatkan nilai rata-rata indeks aktivitas yang sangat tinggi dibandingkan bagian anterian.  Bakteri hidrolitik diseleksi berdasarkan aktivitas proteolitik, amilolitik, lipolitik dan selulolitik didapatkan sebanyak tujuh isolat dengan aktivitas tinggi. Bakteri hidrolitik terpilih di tampilkan pada Tabel 1.
Tabel 1 .  Isolat bakteri penghasil enzim ekstraselluler dan indeks hidrolisis tertinggi
Isolat Indeks Hidrolitik Proteolitik Amilolitik Lipolitik Selulolitik BA26P 4,4 - - 2,5 BA31N - 4,0 2,8 BA13N 4,0 - 4,6 1,8 SP31N - 3,0 - 2,0 BA27N - 2,2 1,4 3,3 SP22N - 2,1 - 3,0 BA21N - - 1,8 3,8
Keterangan: Pengukuran indeks hidrolisis diukur dengan satuan sentimeter (cm)
Hasil seleksi berdasarkan indeks hidrolitik, sebanyak tujuh isolat memiliki indeks tergolong tinggi. Sebagian besar bakteri yang menunjukan hidrolitik tinggi berasal dari usus bagian anterior. Hidrolitik tertinggi didapatkan dari bakteri  proteolitik  sedangkan  hidrolitik  terendah  didapatkan  dari  bakteri  lipolitik.  Kemudian  tujuh  isolate  bakteri terpilih menunjukan aktivitas selulolitik kemudian diikuti bakteri lipolitik sebanyak empat isolate, bakteri amilolitik tiga isolate dan bakteri proteolitik dua isolate.
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 An teri o r Mid d le Po sterior An teri o r Mid d le Po sterior An teri o r Mid d le Po sterior An teri o r Mid d le Po sterior
Amilolitik Proteolitik Lipolitik
Selulolitik
N ilai r ata -r ata In d e ks H id ro litik Singasari Beji
Identifikasi bakteri hidrolitik dilakukan pada bakteri terpilih berdasarkan indeks hidrolisis tinggi.  Identifikasi bakteri hidrolitik berdasarkan analisis blast sekuen gen 16s rDNA sampel dengan sekuen di GenBank untuk melihat similaritas. Hasil identifikasi ditampilkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Identifikasi bakteri hidrolitik saluran pencernaan ikan nilem No Isolat Similaritas (%) Species Nomor Akses 1 BA26P 100 Bacillus subtilis MT641205.1 2 BA31N 100 Enterobacter cloacae MG557804 3 BA27N 99.80 Aeromonas hydrophila MN442055.1 4 BA13N 99.47 Aeromonas veronii MT345040 5 BA21N 100 Aeromonas hydrophila MT384379.1 6 SP22N 100 Enterobacter mori MT613362.1 7 SP31N 100 Aeromonas hydrophila MT384379
Gambar  3. Pohon  filogenetik  bakteri  bakteri  hidrolitik  berdasarkan  sekuen  16s  rDNA.  Nomor    akses  NCBI ditampilkan  dalam  tanda  kurung.  Strain  bakteri  yang  tidak  memiliki  nomor  akses  merupakan  isolat sampel. Percabangan pada Halobacterium salinarum sebagai out-group.
Hasil alignment bakteri hidrolitik menunjukan nilai similaritas yang sangat tinggi dengan spesies di GenBank yaitu  99,47-100%.  Hasil  identifikasi  bakteri  hidrolitik  identik  pada  empat  spesies  berbeda,  yaitu Bacillus  subtilis , Enterobacter  cloacae,  Enterobacter  mori,  Aeromonas  hydrophila dan Aeromonas  veronii. Bakteri  hidrolitik  yang didapatkan  diketahui  memiliki  sifat  patogen  dan  nonpatogen  pada  ikan.  Hasil  konstruksi  menunjukan  bahwa percabangan pohon terdiri dari tiga cabang besar yaitu Bacillus sp., Enterobacter sp., dan Aeromonas sp. Percabangan yang terbentuk menunjukan percabangan yang stabil dengan nilai bootstrap tinggi yaitu 68-99%.

## Pembahasan
Kelimpahan  bakteri  pada  penelitian  ini  meningkat  kearah  bagian  posterior  pada  pencernaan  ikan  dari  Beji, namun didapatkan kelimpahan yang bervariasi pada bagian pencernaan ikan dari Singasari.  Hasil penelitian Debasis et al., (2012) mendapatkan kelimpahan bakteri saluran pencernaan meningkat kearah bagian posterior, namun pada ikan  lainnya  didapatkan  kelimpahan  bakteri  saluran  pencernaan  menurun  kearah  posterior.  Salah  satu  faktor  yang mempengaruhi kelimpahan bakteri yaitu bahan organik atau sumber nutrisi dalam lingkungan. Menurut Marwan, et al. (2015), hubungan antara jumlah total bakteri dan jumlah organik total pada lingkungan perairan memiliki korelasi sebesar  92%  dimana  semakin  tinggi  jumlah  bahan  organik  maka  akan  semakin  tinggi  jumlah  bakteri.  Hal  ini menunjukan  bahwa  kelimpahan  bakteri  disuatu  lingkungan  berhubungan  sumber  nutrisi  bakteri. Kelimpahan  yang bervariasi antar bagian pencernaan diduga karena distribusi nutrisi yang bervariasi sehingga didapatkan kelimpahan
yang bervariasi. Secara keseluruhan, kelimpahan bakteri saluran pencernaan ikan nilem tergolong normal. Kelimpahan bakteri saluran pencernaan ikan nila ditemukan kelimpahan sebanyak 3,4x10 8 CFU/g dan kelimpahan bakteri saluran pencernaan ikan bandeng sebanyak 4,7x10 6 CFU/g (Al-Harbi dan Uddin, 2004; Debasis et al., 2012). Penelitian Bairagi et al., (2002) jumlah total bakteri dalam saluran pencernaan ikan mas mendapatkan kelimpahan 0,6x10 6 CFU/g. Bakteri  hidrolitik  pada  penelitian  ini  ditemukan  disetiap  bagian  pencernaan  dengan  proporsi  yang  berbeda. Bakteri selulolitik didapatkan persentase relative tinggi disetiap bagian pencernaan. Hal ini karena ikan nilem memiliki kebiasaan makan herbivora dimana dalam penelitian ini diketahui bahwa ikan nilem  yang dibudidaya diberi pakan tambahan  berupa  tumbuhan  sente  sehingga  kandungan  serat  dalam  pencernaan  tinggi.  Menurut  Liu et  al., (2016) keberadaan bakteri selulolitik signifikan lebih tinggi pada ikan dengan kebiasaan makan tumbuhan (herbivora), namun sebaliknya, bakteri proteolitik signifikan lebih tinggi pada ikan dengan kebiasaan makan hewani (karnivora). Selain itu, kebiasaan makan ikan nilem yang herbivora akan mencari sumber pakan alami sebagai pakan tambahan berupa fitoplankton. Muryanto dan Sumarno, (2013) berdasarkan penelitiannya mengenai pengamatan kebiasaaan makan ikan nilem hasil tangkapan di danau Talaga Sulawesi Tengah didapatkan bahwa jenis pakan ikan nilem berupa fitoplankton dan  tumbuhan.  Keberadaan  bakteri  lipolitik  menunjukan  persentase  terendah  pada  setiap  bagian  pencernaan. Berdasarkan penelitian Debasis et al., (2012) kelimpahan bakteri lipolitik menunjukan nilai kelimpahan terendah dari bakteri  proteolitik,  amilolitik  dan  selulolitik.  Keberadaan  bakteri  proteolitik  dan  amilolitik  pada  penelitian  ini menunjukan bervariasi pada setiap bagian pencernaan. Keberadaan bakteri hidrolitik secara umum tersebar disetiap bagian pencernaan.
Berdasarkan hasil seleksi didapatkan tujuh isolat bakteri dengan indeks hidrolitik yang tinggi. Menurut Dar et al., (2015) indeks hidrolisis bakteri dikategorikan tinggi jika mencapai rasio ≥3, kategori sedang ≥1-2,9 dan kategori rendah  0-0,9.  Seleksi  bakteri  hidrolitik  bertujuan  untuk  mengetahui  kemampuan  dalam  menghasilkan  enzim ekstraselluler yang berpotensi sebagai kandidat probiotik. Menurut Yukgehnaish et al., (2020) bakteri yang memiliki kemampuan  dalam  menghasilkan  enzim  ektraselluler  yang  menguntungkan  dapat  dikembangkan  sebagai  bakteri probiotik. Bakteri probibiotik akuakultur memiliki kriteria, yaitu  memiliki efek menguntungkan inang, antagonisme terhadap patogen dan stimulus kekebalan, mampu hidup dalam pencernaan, non-patogen, tidak resisten terhadap obat dan menghasilkan enzim ekstraselluler (Chauhan dan Singh, 2019).
Hasil identifikasi berdasarkan gen 16s rDNA dan konstruksi pohon filogenetik didapatkan tiga genus dari lima spesies  berbeda  yaitu Bacillus  subtilis , Aeromonas  hydrophila (3), Aeromonas  veronii , Enterobacter  cloacae , Enterobacter mori . Menurut Hagström et al., (2000) identifikasi bakteri menggunakan urutan gen 16s rDNA dengan nilai  similaritas  lebih  dari  97%  maka  menunjukan  bakteri  dengan  spesies  yang  sama.  Hasil  konstruksi  pohon filogenetik  menunjukan  percabangan  yang  tabil  yaitu  76%-99%  kecuali  percabangan  dari Aeromonas  veronii menunjukan  percabangan  mendekati  stabil  yaitu  68%.  Menurut  Fajriani et  al., (2018)  percabangan  dalam  pohon filogenetik dikatakan stabil jika lebih dari 75%. Bootstrap merupakan metode untuk menguji tingkat kepercayaan set data model percabangan.
Tiga  genus  yang  didapatkan  dari  penelitian  ini  diketahui  bersifat  patogen  dan  nonpatogen. Bacillus  subtilis merupakan  bakteri  Gram  positif  berbentu  batang  yang  banyak  ditemukan  diperairan  sebagai  bakteri  non-patogen (Darafsh et al., 2020; Nayak, 2021). B. subtilis diketahui memiliki potensi yang banyak dimanfaatkan sebagai agen probiotik  akuakultur. B.  subtilis diketahui  memiliki  potensi  menghambat  pertumbuhan  patogen  dengan  metabolit sekunder yang dihasilkan berupa senyawa antibakteri. Studi penelitian menunjukan terkait efek menguntungkan dari B. subtilis yaitu meningkatkan kesehatan ikan, menghasilkan enzim hidrolitik yang dapat membantu pencernaan inang. Probiotik B. subtilis banyak digunakan untuk meningkatkan produktifitas kegiatan akuakultur (Olmos, 2014). Enterobacter sp  merupakan  bakteri  Gram  negatif  yang  ditemukan  mendominasi  di  perairan.  Efek  dari keberadaan dan karakteristik Enterobacter sp. di perairan belum banyak di pelajari. Namun telah dilakukan penelitian oleh Zakaria et al., (2019) Enterobacter sp. memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen Vibrio  harveyi. Probiotik Enterobacter sp . diuji  skala  in  vivo  pada  larva  ikan  kakap  menunjukan  penurunan  pada jumlah vibrio harveyi. Penelitian Abdel-Latif et al., (2017) menemukan bahwa hasil isolasi bakteri dari organ dalam ikan nila sakit ditemukan bakteri Enterobacter, hasil uji menunjukan Enterobacter menimbulkan kerusakan pada organ dalam ikan nila. Kajian mengenai karakteristik bakteri Enterobacter sp. perlu dipelajari lebih lanjut terkait peranan dan karakteritik dilingkungan perairan. Aeromonas sp. merupakan salah satu kelompok bakteri patogen oportunistik perairan  tawar  yang  dapat  menyababkan  kematian  ikan  hingga  100%. Aeromonas  hydrophila dapat  menimbulkan gejala luka dan warna kemerahan pada ikan. Baru-baru ini, patogen A. hydrophila terdeteksi menyerang empat kolam budidaya ikan nila di Kabupaten Minahasa Utara (Sinubu et al., 2022). Selain lain, strain Aeromonas veronii memiliki virulen yang terdeteksi menyebabkan epizootic ulcerative syndrome (EUS) pada ikan di Bangladesh (Rahman et al., 2002).
Berdasarkan  bakteri  yang  didapatkan  dari  tiga  genus  yaitu Bacillus sp. Enterobacter sp.  dan Aeromonas sp. merupakan bakteri yang umum menghuni usus ikan (Nurhafid et al., 2021). Bakteri kelompok Bacillus sp. telah banyak dilakukan studi mengenai potensi yang sangat menguntungkan bagi ikan seperti B. subtilis (Darafsh et al., 2020), B.
licheniformis (Das et al., 2014) B. amyloliquefaciens (Lee et al., 2015). Bakteri kelompok Enterobacter sp. diketahui sebagian studi menunjukan sifat patogen bagi ikan dalam kondisi tertentu, namun beberapa studi juga menunjukan kelompok bakteri ini dapat dijadikan sebagai agen biokontrol terhadap bakteri patogen (Al-Harbi & Uddin, 2004; Arief et al., 2010). Sedangkan kelompok Aeromonas sp. banyak dipelajari terkait infeksi terhadap ikan karena kelompok bakteri ini tergolong dalam bakteri patogen seperti A. hydrophila dan A. veronii (D. Zhang et al., 2020; D. X. Zhang et al., 2019). Meskipun demikian, kelompok bakteri yang ditemukan dalam penelitian ini diketahui berada dalam usus ikan sebagai penghuni usus ikan sehingga dapat berinteraksi dan selama keseimbangan populasi tetap seimbang akan menguntungkan bagi ikan.

## KESIMPULAN
Bakteri  hidrolitik  ditemukan  disetiap  bagian  pencernaan  ikan  nilem  dengan  proporsi  dari  keberadaan  yang berbeda. Bakteri selulolitik ditemukan dengan keberadaan tertinggi disetiap bagian pencernaan, bakteri proteolitik dan amilolitik  ditemukan  bervariasi,  dan  bakteri  lipolitik  ditemukan  dengan  keberadaan  terendah  disetiap  bagian pencernaan. Tujuh isolat bakteri hidrolitik yang ditemukan memiliki indeks hidrolitik tinggi teridentifikasi sebagai Bacillus subtilis , Aeromonas hydrophila (3), Aeromonas veronii , Enterobacter cloacae , Enterobacter mori. Bakteri hidrolitik yang didapat diketahui bersifat patogen dan nonpatogen dan diketahui sebagai bakteri normal dalam usus ikan

## DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Latif, H. M., Khalifa Sedeek, E., & Hany Abdel-Latif, C. M. (2017). Diversity of enterobacteriaceae retrieved from  diseased  cultured  Oreochromis  niloticus. International  Journal  of  Fisheries  and  Aquatic  Studies , 29 (January 2017), 29–34. www.fisheriesjournal.com Al-Harbi,  A.  H.,  &  Uddin,  M.  N.  (2004).  Seasonal  variation  in  the  intestinal  bacterial  flora  of  hybrid  tilapia (Oreochromis niloticus x Oreochromis aureus) cultured in earthen ponds in Saudi Arabia. Aquaculture , 229 (1– 4), 37–44. https://doi.org/10.1016/S0044-8486(03)00388-0
Anggani, D., Rusliadi, R., & Putra, I. (2021). Penambahan Enzim Phytase pada Pakan Terhadap Pertumbuhan dan Kelulushidupan Ikan Nilem (Osteochilus hasselti) dengan Sistem Resirkulasi. Ilmu Perairan (Aquatic … , 9 (3), 207–214. https://jipas.ejournal.unri.ac.id/index.php/JIPAS/article/view/4685%0Ahttps://jipas.ejournal.unri.ac.id/index.p hp/JIPAS/article/download/4685/1702
Arief,  M.,  Sulmartiwi,  L., Prayogo,  &  Saputri,  H.  M.  (2010).  Isolasi  Bakteri  Indigen  Sebagai  Pendegradasi  Bahan Organik  Pada  Media  Pembenihan  Ikan  Lele  Dumbo  (Clarias  sp.)  Sistem  Sirkulasi  Tertutup. Jurnal  Ilmiah Perikanan Dan Kelautan , 2 (2), 117–122.
Bairagi,  A.,  Ghosh,  K.  S.,  Sen,  S.  K.,  &  Ray,  A.  K.  (2002).  Enzyme  producing  bacterial  flora  isolated  from  fish digestive tracts. Aquaculture International , 10 (2), 109–121. https://doi.org/10.1023/A:1021355406412 Chauhan, A., & Singh, R. (2019). Probiotics in aquaculture: a promising emerging alternative approach. Symbiosis , 77 (2), 99–113. https://doi.org/10.1007/s13199-018-0580-1
Dar,  M.  A.,  Pawar,  K.  D.,  Jadhav,  J.  P.,  &  Pandit,  R.  S.  (2015).  Isolation  of  cellulolytic  bacteria  from  the  gastro- intestinal tract of Achatina fulica (Gastropoda: Pulmonata) and their evaluation for cellulose biodegradation. International Biodeterioration and Biodegradation , 98 , 73–80. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2014.11.016 Darafsh, F., Soltani, M., Abdolhay, H. A., & Shamsaei Mehrejan, M. (2020). Improvement of growth performance, digestive  enzymes  and  body  composition  of  Persian  sturgeon  (Acipenser  persicus)  following  feeding  on probiotics: Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae. Aquaculture Research , 51 (3), 957–964. https://doi.org/10.1111/are.14440
Das, P., Mandal, S., Khan, A., Manna, S. K., & Ghosh, K. (2014). Distribution of extracellular enzyme-producing bacteria  in  the  digestive  tracts  of  4  brackish  water  fish  species. Turkish  Journal  of  Zoology , 38 (1),  79–88. https://doi.org/10.3906/zoo-1205-3
Debasis, D., Ghoshal, T. K., & Raja, R. A. (2012). Short Comunication Characterization of enzyme-producing bacteria isolated from the gut of Asian seabass , Lates calcarifer and milkfish , Chanos chanos and their application for nutrient enrichment of feed ingredients . 1–8. https://doi.org/10.1111/are.12099 Deepika, G., Sivakumar, P., & Rajan, M. R. (2019). Isolation and Characterization of Bacteria from the Gut of Blue Gourami ( Trichogaster tricopters ) and its Role on Growth . 13 (December), 2479–2487.
Fajriani,  B.,  Budiharjo,  A.,  &  Pujiyanto,  S.  (2018).  Isolasi  dan  Identifikasi  Molekuler  Bakteri  Antagonis Terhadap Vibrio  Parahaemolyticus  Patogen  Pada  Udang  Litopenaeus  Vannamei  dari  Produk  Probiotik  dan  Sedimen Mangrove di Rembang. Jurnal Biologi , 7 (1), 52–63.
Ginting, E. L., Kemer, K., Wullur, S., & Uria, A. R. (2020). Identification of Proteolytic Thermophiles from Moinit Coastal Hot-Spring, North Sulawesi, Indonesia. Geomicrobiology Journal , 37 (1), 50–58.
https://doi.org/10.1080/01490451.2019.1662524
Ginting,  E.  L.,  Wantania,  L.  L.,  Moko,  E.  M.,  Tumbol,  R.  A.,  Siby,  M.  S.,  &  Wullur,  S.  (2021).  Isolation  and identification  of  thermophilic  amylolytic  bacteria  from  likupang  marine  hydrothermal,  North  Sulawesi, Indonesia. Biodiversitas , 22 (6), 3326–3332. https://doi.org/10.13057/biodiv/d220638 Hagström,  Å.,  Pinhassi,  J.,  &  Li  Zweifel,  U.  (2000).  Biogeographical  diversity  among  marine  bacterioplankton.
Aquatic Microbial Ecology , 21 (3), 231–244. https://doi.org/10.3354/ame021231 Khasani, I. (2010). Pemanfaatan Bioteknologi Berbasis Mikroorganisme Guna Mendukung Peningkatan Produktivitas Perikanan Nasional. Media Akuakultur , 5 (1), 22. https://doi.org/10.15578/ma.5.1.2010.22-31 Kurniasih, T., Lusiastuti, A. M., Azwar, Z. I., & Melati, I. (2013). SEBAGAI UPAYA MENDAPATKAN KANDIDAT PROBIOTIK . 99–109.
Lee, Y., Lin, C., Lee, Y., Lin, C., Liu, F., & Huang, T. (2015). Degradation of histamine by Bacillus polymyxa isolated from salted fish products ScienceDirect Degradation of histamine by Bacillus polymyxa isolated from salted fish products. Journal of Food and Drug Analysis , 23 (4), 836–844. https://doi.org/10.1016/j.jfda.2015.02.003 Liu, H., Guo, X., Gooneratne, R., Lai, R., Zeng, C., Zhan, F., & Wang, W. (2016). The gut microbiome and degradation enzyme activity of wild freshwater fishes influenced by their trophic levels. Scientific Reports , 6 (April), 1–12. https://doi.org/10.1038/srep24340
Marwan, A. H., Widyorini, N., & Nitisupardjo, M. (2015). Hubungan total bakteri dengan kandungan bahan organik total di muara sungai Babon, Semarang. Diponegoro Journal of Maquares , 4 (3), 170–179.
Muryanto,  T.,  &  Sumarno,  D.  D.  (2013).  Pengamatan  Kebiasaan  Makan  Ikan  Nilem  (Osteochilus  Vittatus)  Hasil Tangkapan Jaring Insang Di Danau Talaga Kabupaten Donggala Provinsi Sulawesi Tengah. Btl , 11 (1), 51–54. Nayak, S. K. (2021). Multifaceted applications of probiotic Bacillus species in aquaculture with special reference to Bacillus subtilis. Reviews in Aquaculture , 13 (2), 862–906. https://doi.org/10.1111/raq.12503 Nurhafid, M., Syakuri, H., Oedjijono, O., Listiowati, E., Ekasanti, A., Nugrayani, D., & Pramono, H. (2021). Isolasi dan Identifikasi Molekuler Bakteri Proteolitik dari Saluran Pencernaan Ikan Nila (Oreochromis niloticus) yang Dibudidayakan  di  Kabupaten  Banyumas. Jurnal  Perikanan  Universitas  Gadjah  Mada , 23 (2),  95. https://doi.org/10.22146/jfs.64072
Nursyirwani,  N.,  Feliatra, F., Tanjung,  A.,  &  Harjuni,  F. (2020).  Isolation  of  Cellulolytic  Bacteria  from  Mangrove Sediment  in  Dumai  Marine  Station  Riau  and  the  Antibacterial  Activity  against  Pathogens. IOP  Conference Series: Earth and Environmental Science , 430 (1). https://doi.org/10.1088/1755-1315/430/1/012012 Olmos, J. (2014). Bacillus subtilis A Potential Probiotic Bacterium to Formulate Functional Feeds for Aquaculture.
Journal of Microbial & Biochemical Technology , 06 (07), 361–365. https://doi.org/10.4172/1948-5948.1000169 Rahman,  M.,  Colque-Navarro,  P.,  Kühn,  I.,  Huys,  G.,  Swings,  J.,  &  Möllby,  R.  (2002).  Identification  and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh. Applied and Environmental Microbiology , 68 (2), 650–655.
https://doi.org/10.1128/AEM.68.2.650-655.2002 Rahmia, M., Putri, A., & Sugianti, Y. (2015). Beberapa aspek Biologi Ikan Nilem (Osteochillus Vittatus) Di Danau Talaga , Sulawesi Tengah . 7 (2), 111–120.
Rizky, M. Y., Fitri, R. D., Hastuti, U. S., & Prabaningtyas, S. (2017). Identifikasi Uji Kemampuan Hidrolisis Lemak Dan Penentuan Indeks Zona Bening Asam Laktat Pada Bakteri Dalam Wadi Makanan Traditional Kalimantan Tengah. Jurnal Bionature , 18 (2), 87–98.
Simamora, C. J. K., & Sukmawati, S. (2020). Identifikasi dan Karakterisasi Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Lipase Isolat Bakteri Lipolitik Lptk19 Asal Biji Karet. Jurnal Ilmu Eksakta , 12 (1), 28–37.
Sinubu, W. V, Tumbol, R. A., Undap, S. L., Manoppo, H., & Kreckhoff, R. L. (2022). Identifikasi bakteri patogen Aeromonas sp. pada ikan Nila (Oreochromis niloticus) di Desa Matungkas, Kecamatan Dimembe, Kabupaten Minahasa Utara. Budidaya Perairan , 10 (2), 109–120.
Subagiyo,  S.,  &  Djunaedi,  A.  (2012).  Skrining  Kandidat  Bakteri  Probiotik  dari  Saluran  Pencernaan  Ikan  Kerapu Berdasarkan  Aktivitas  Antibakteri  dan  Produksi  Enzim  Proteolitik  Ekstraseluler. ILMU  KELAUTAN: Indonesian Journal of Marine Sciences , 16 (1), 41–48.
https://ejournal.undip.ac.id/index.php/ijms/article/view/1844 Yukgehnaish,  K.,  Kumar,  P.,  Sivachandran,  P.,  &  Marimuthu,  K.  (2020). Gut  microbiota  metagenomics  in aquaculture :  factors  influencing  gut  microbiome  and  its  physiological  role  in  fish .  1–25. https://doi.org/10.1111/raq.12416 Yusra, Y., & Hatta, U. B. (2019). SKRINING KANDIDAT BAKTERI PROBIOTIK DARI SALURAN PENCERNAAN IKAN NILA ( Tilapia nilotica ) BERDASARKAN AKTIFITAS PRODUKSI ENZIM . November 2014 .
Zakaria, Z. H., Yaminudin, N. J. M., Yasin, I. S. M.,  Ikhsan, N. F. M., & Karim, M. M. A. (2019). Evaluation of enterobacter sp. strain G87 as potential probiont against vibrio harveyi infection in artemia nauplii and asian seabass (lates calcarifer) larvae. Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science , 42 (4), 1251–1262.
Zhang, D. X., Kang, Y. H., Song, M. F., Shu, H. P., Guo, S. N., Jia, J. P., Tao, L. T., Zhao, Z. L., Zhang, L., Wang, C. F., Wang, G. Q., Qian, A. D., & Shan, X. F. (2019). Identity and virulence properties of Aeromonas isolates from healthy Northern snakehead (Channa argus) in China. Letters in Applied Microbiology , 69 (2), 100–109. https://doi.org/10.1111/lam.13172
Zhang, D., Xu, D. H., Shoemaker, C. A., & Beck, B. H. (2020). The severity of motile Aeromonas septicemia caused by  virulent  Aeromonas  hydrophila  in  channel  catfish  is  influenced  by  nutrients  and  microbes  in  water. Aquaculture , 519 (December 2019), 734898. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2019.734898