## IDENTIFIKASI VIROID PENYEBAB PENYAKIT KERDIL PADA KRISAN MENGGUNAKAN RT-PCR
Identification of Viroid Causes of Dwarf Disease in Krisan Using RT-PCR
Ayu Nindita Nuraini 1 , Evan Purnama Ramdan 2 *, Erniawati Diningsih 3 1 Program studi Agroteknologi, Fakultas Teknologi Industri, Universitas Gunadarma (Gunadarma University). ayunindita3@gmail.com
2 Program studi Agroteknologi, Fakultas Teknologi Industri, Universitas Gunadarma (Gunadarma University). evan_ramdan@staff.gunadarma.ac.id.
3 Balai Penelitian Tanaman Hias, Segunung, Cianjur. diningsiherniawati@gmail.com *) Penulis korespondensi

## ABSTRAK
Bunga  krisan  merupakan  tanaman  hias  populer  di  Indonesia.  Saat  ini  telah dilaporkan  14  jenis  virus  yang  dapat  menginfeksi  tanaman  krisan,  sehingga  akan menurunkan hasil bunga krisan. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan diidentifikasi penyakit tanaman krisan  yang disebabkan oleh  virus dengan  menggunakan teknik RT- PCR.  Penelitian  diawali  dengan  pengamatan  gejala  penyakit  pada  daun  yang diindikasikan  terinfeksi  virus.  Sampel  daun  bergejala  kemudian  diambil  untuk diidentifikasi  dengan  teknik  RT-PCR  meliputi  proses  ekstrasi  total  DNA  dan ampilifikasi  nukleotida  dengan  menggunakan  pasangan  primer  berupa  primer forward (F)  (5’-CAACTGAAGCTTCAACGCCTT-3’)  dan  primer reverse (R)  (5’- AGGATTACTCCTGTCTCGCA-3’). Hasil penelitian menunjukkan bahwa gejala yang diamati  pada  daun  krisan  adalah  perubahan  warna  menjadi  dan  abnormaltas  tanaman menjadi  yang  diduga  adanya  infeksi  CSVd  ( Chrysantenum  Stunt  Viroid ).  Konfirmasi melalui  teknik  RT-PCR  teridentifikasi  bahwa  gejala  tersebut  disebabkan  oleh  CSVd dengan teramplifikasinya cDNA CSVd pada ukuran 250 bp.
Kata kunci : Chrysantenum Stunt Viroid, deteksi virus, teknik molekuler,

## ABSTRACT
Chrysanthemum is a popular ornamental plant in Indonesia. At present, 14 types of viruses have been reported that can infect chrysanthemum plants, which will reduce the  yield  of  chrysanthemum  flowers  Therefore,  this  study  will  identify  chrysanthemum plant  diseases  caused  by  viruses  using  the  RT-PCR  technique.  The  study  began  with observation of disease symptoms on the leaves that were indicated to be infected with a virus.  Symptomatic  leaf  samples  were  then  taken  to  be  identified  by  the  RT-PCR technique  including  the  process  of  total  DNA  extraction  and  nucleotide  ureaification using primer pairs in the form of a forward primer (F) (5'- CAACTGAAGCTTCAACGCCTT-3') and reverse primer (R) (5'-
AGGATTACTCCTGTCTCGCA -3 '). The results showed that the symptoms observed in chrysanthemum leaves  were yellow on the leaves and dwarf on chrysanthemum plants suspected  of  having  CSVd  (Chrysantenum  Stunt  Viroid)  infection.  Confirmation through the RT-PCR technique was identified that the symptoms were caused by CSVd with the amplification of cDNA CSVd at a size of 250 bp.
Keywords : Chrysantenum Stunt Viroid, molecular techniques, virus detection

## PENDAHULUAN
Krisan  menjadi  salah  satu  bunga favorit  bagi  masyarakat  Indonesia.  Oleh karena  itu,  bunga  krisan  memiliki  nilai ekonomi tinggi. Hal  ini dapat dilihat dari peningkatan  bunga  potong  krisan  yang mencapai  47,58  juta  tangkai  (10,99%) pada  tahun  2017.  Peningkatan  paling tinggi  dibandngkan  bunga  potong  lain (Badan  Pusat  Statistik,  2017).  Bunga krisan  mempunyai  prospek  pemasaran yang  menjanjikan sebab banyak dimanfa- atkan untuk memperindah ruangan seperti pelengkap  dekorasi  atau  hiasan.  Bunga krisan  dapat  dimanfaatkan  dalam  bentuk bunga  potong  maupun  bunga  dalam  pot ataupun  menjadi  bouket  bunga  tangan (Rukmana  &  Mulyana,1997).  Krisan diperkirakan  masuk  ke  Indonesia  pada tahun 1800-an. Kemudian mulai berkembang  secara  komersil  sejak  tahun 1940.  Sentra  penghasil  bunga  krisan  di Indonesia  terdapat  di  daerah  Bandung, Cipanas, Batu, Cisarua, Sukabumi, Lembang dan Brastagi di Sumatera Utara (Nuryanto, 2001) Saat ini tanaman krisan di  Indonesian  memiliki  lebih  dari  50 varietas  seperti  fiji,  marimar,  azzura, pasopati,  solinda,  bakardi  dan  puspita nusantara.  Beberapa  varietas  tersebut
merupakan varietas unggul, karena memiliki  warna  bunga  yang  warna-warni dan berukuran cukup besar serta memiliki pertumbuhan  tanaman  yang  seragam (Kaharuddin, 2015).
Menurut  Smith  (1978),  sedikitnya terdapat  14  jenis  virus  yang  menyerang tanaman krisan, diantaranya 1)
chrysanthemum vein mothe virus (CVMV)  yang  ditularkan  oleh  kutu  daun macro  siphoniella  sanborni (Semangun, 2005);  2) chrysanthemum  virus B  (CVB) dengan  gejala  motling  daun  atau vein- clearing (Hollings,  1957;  Hollings  & Stones,  1972;  Moran,  1987).  Penularan CVB  dapat  melalui  beberapa  cara  seperti luka  mekanis  pada  saat grafting atau ditularkan  oleh  kutu  daun  seperti Myzus persicae,
Macrosiphum euphorbiae, Aulacorthum solani, Coloradoa rufomaculata dan Macrosiphoniella sanborani (Suastika  et  al.1997;  Moran,, 1987;  Hollings  &  Stones,  1972);  3) cucumber  mosaic  virus (CMV)  yang memiliki  gejala  mosaic  pada  daun sehingga  mengakibatkan  ukuran  bunga menjadi  lebih  kecil  dibandingkan  bunga sehat (Semangun, 2005).
Sementara  itu,  salah  satu  jenis penyakit  dari  golongan  viroid  yang
banyak  dijumpai  di  Indonesia  yaitu Chrysanthemum  virus-B  (CVB) .  Gejala khas dari  infeksi CVB yaitu terbentuknya motling atau vein  clearing pada  daun yang  mengakibatkan  kualitas  bunga menurun (Hollings &
Srones. 1972;Verma  et  al.2003).  Sementara  itu, Verma et  al. (2003)  melaporkan  bahwa infeksi  CVB  pada  krisan  di  India menunjukkan  gejala  yang  lebih  beragam. Selain  gejala mottling dan vein  clearing , infeksi  CVB  menunjukkan  gejala vein banding dan mosaic pada krisan di India.
Pada infeksi berat, bunga krisan
menunjukkan  malformasi  atau  bentuk abnormal.  Selain  ditemukan  menginfeksi krisan,  Suastika et  al. (1997)  telah melaporkan  juga  bahwa  gejala  dari infeksi  CVB  juga  ditemukan  pada  daun dan bunga Gymnaster savatieri.
Pengendalian  virus  dapat  dilakukan melalui beberapa cara seperti penggunaan tanaman  resisten,  pengendalian  vektor, isolasi, dan proteksi silang atau imunisasi. Adapum  teknik  proteksi  silang  yang dikembangkan dengan menggunakan isolat  CMV  lemah  (Waterworth  et  al. 1979; Kaper 1984). Oleh karena itu, perlu dikembangkan metode pengendalian yang tepat. Namun, untuk memutuskan pengendalian  yang  tepat  terlebih  dahulu perlu  diketahui  penyebabnya  secara
akurat.  Saat  ini,  molekuler  telah  menjadi teknik  yang  cepat  dan  akurat  untuk mendeteksi keberadaan virus pada tanaman  baik  berbasis  DNA  dengan menggunakan PCR maupun RNA dengan menggunakan  RT-PCR.  Oleh  karena  itu, pada  penelitian  ini  akan  dilakukan identifikasi  penyakit  kerdil  tanaman krisan  yang  disebabkan  oleh  viroid melalui teknik reverse-transcripsion polymerase chain reaction (RT-PCR).

## BAHAN DAN METODE

## Waktu dan Tempat Penelitians
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Agustus  sampai  dengan  September  2019 di  Kebun  percobaan  dan  Laboratorium Virologi,  Balai Penelitian Tanaman Hias, Segunung, Cianjur.

## Pengamatan  Gejala  dan  Pengambilan Sampel
Sampel  krisan  yang  diuji  berasal dari  Rumah  Kaca,  Balai  Balai  Penelitian Tanaman  Hias,  Segunung,  Cianjur.  Daun yang  mengindikasikan  adanya  infeksi virus  diamati  dan  dideskripsikan  gejala yang  tampak.  Daun  tersebut  kemudian dipotong  menggunakan  gunting  dan dimasukkan  plastik  bening.  Selanjutnya
sampel  daun  dibawa  ke  laboratorium untuk pengujian selanjutnya.

## Identifikasi Viroid
a. Ekstraksi  RNA  Total  Dari  Daun Krisan Terinfeksi Viroid
Sampel  daun  tanaman  krisan  yang diduga terinfeksi viroid ditimbang sebanyak  100mg.  Sampel  kemudian digerus dalam mortar dingin hingga halus dan  ditambakan  ditambahkan  500  µl bufer  lisis  yang  mengandung  1%  2-β- merkaptoetanol.  Hasil  gerusan  kemudian dimasukkan  ke  dalam  tabung  mikro  1.5 mL  dan  diinkubasi  pada  penangas  air pada  suhu  56 o C  selama  3  menit.  Tabung selanjutnya  diangkat  dari  penangas  air untuk  disentrifugasi  selama  5  menit  pada kecepatan  14.000  rpm.  Supernatan  yang diperoleh  ditambahkan  etanol  96%  dan disentrifugasi  kembali  selama  1  menit pada kecepatan 13.000 rpm. Hasil berupa supernatan  dipindahkan  pada  tabung mikro baru dan ditambahkan 700 µl wash buffer  WBI.  Kemudian  disentrifugasi kembali  selama  1  menit  pada  kecepatan 10.000  rpm.  Supernatan  yang  diperoleh ditambahkan  500  µl  bufer  RPE  dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm sebanyak  dua  kali,  masing-masing  1  dan 2  menit  hingga  didapat  pelet  RNA.  Pelet RNA  ditambahkan  40  µl nuclease  free
water .  Selanjutnya  disentrifugasi  pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. b. Amplifikasi  Nukleotida  pada  mesin

## PCR
Amplifikasi  nukleotida  pada  mesin PCR  mengikuti  metode  Hosokawa et  al .
(2004) dengan teknik reverse transcriptase-polymerase chain  reaction (RT-PCR). Adapun pasangan primer yang digunakan yaitu 5’- CAACTGAAGCTTCAACGCCTT-3’ untuk primer forward dan 5’- AGGATTACTCCTGTC  TCGCA-3’  untuk primer reverse .  Pasangan  primer  ini dilaporkan  dapat  mengidentifikasi  amplikon pada  pita  dengan  ukuran  250  bp. Amplifikasi  dilakukan  pada  sebuah gene amp  PCR  system  9700 thermocycler . Reaksi  RT  yang  dipakai  sebanyak  25  µl dengan  reagent  yang  dipakai  seperti tertera  pada  Tabel  1.  Adapun  program PCR  yang  dijalanan:  25°C  selama  3 menit;  37°C  selama  90  menit;  inaktivasi 70°C selama 15 menit.
c. Separasi  hasil  PCR  pada  Gel Elektroforesis
1,5% agarose dengan running buffer TBE 1x (89 mM Tris-HCl, 89 mM boric acid , 2,5 M  EDTA,  pH  8,3)  dipanaskan  pada microwave  selama  1  menit.  Kemudian diaduk  rata  sampai  larut.  Selanjutnya
agarose  dimasukkan  ke  dalam  cetakan plat e dan dipasangkan sisir ( comb ).
Setelah  itu  dibiarkan  dingin  dan mengeras.  Kemudian  dilakukan loading produk  hasil  PCR  sebanyak  10  µl  ke dalam well  (lane). Selanjutnya  dielektro- foress  pada  voltase  75  volt  selama  90 menit.  Etidium  bromida  (EtBr)  1% digunakan  sebagai  pewarnaan  dengan konsentrasi  0,5  µl/10  ml  gel. Tridye 100 bp  digunakan  sebaga  DNA ladder atau marker pada penelitian ini.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Gejala Virus di Lapangan.
Pada  pengamatan  gejala  penyakit krisan  di  lapangan  ditemukan  gejala berupa  kerdil  disertai  dengan  adanya
penguningan pada daun seperti Gambar 1. Tanaman  krisan  sehat  mempunyai  tinggi kurang  lebih  100  cm  (Vina,  2016). Sementara  pada  pengamatan  di  lapangan tinggi menyusut 50%. Menurut Diningsih et  al.  (2013)  gejala  infeksi  viroid  dapat dikenali  dengan  perubahan  daun  menjadi kuning  dan  pertumbuhan  krisan  menjadi kerdil.  Viroid  yang  menyebabkan  gejala tersebut  dikenal  dengan Chrysantenum Stunt  Viroid (CSVd).    CSVd  dapat menyebabkan  kerdil  sebab  metabolisme tanaman  yang  terganggu  akibat  proses fotosintetis menjadi tidak optimal. Patogen  ini  juga  menyebabkan  daun menjadi  lebih tipis dari daun krisan sehat yang  mempunyai  panjang  7-13  cm,  lebar 3-6 dengan bunga majemuk juga berbentuk seperti cawan. Tabel 1.  Premix One-Step RT-PCR No Reagent Vol. (µl) 1 RNA template 5 2 dNTPs 10 mM 5
3 bufer RT 10x (1x = 150  mM NaCl, 50
mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,1 mM EDTA,
1  mM dithiothreitol ,  0,1%  NP-40,  dan 50% glycerol 2,5 4 enzim MmuLV 1 5 recombinant rnasin ribonuclease inhibitor 1 6 primer oligo d (T) 10 µM 1.5 7 dH2O. 9 Total Volume 25
Laporan  Diningsih  et  al.  (2003) menyebutkan  bahwa  selain  menginfeksi tanaman  krisan,  CSVd  juga  ditemukan menginfeksi  tanaman  Puspita  Kencana ( Dendranthremagrandiflora ). Infeksi
CSVd  menyebabkan  tanaman  puspita kencana kerdil dan menguning. Akibatnya,  tanaman  ini  hancur  dan  tidak lakukan  perbanyakan  lagi  di  Cipanas. (Diningsih et al, 2003).
d. Hasil  amplifikasi  fragmen  cDNA berdasarkan RT-PCR
Hasil  amplifikasi  cDNA  pada  daun krisan  menunjukkan  bahwa  amplikon berhasil  teramplifikasi  pada  band  ukuran
250  pb  (Gambar  2).  Hasil  ini  sesuai dengan  Diningsih  et  al.  (2013)  yang menguji  CSVd  pada  tanaman  krisan teknik  RT-PCR  dengan  pasangan  primer berupa pasangan primer
(5’CAACTGAAGCTTCAACGCC
TT-3’) dan (5’-AGG AT TACTCCTGTCTCGCA-3’) mampu
mengamplifikasi  amplikon  dari  cDNA CSVd pada ukuran basa 250 bp.
Selain itu, dengan gejala yang sama pada  laporan  Diningsih  et  al.  (2013) berupa  kerdil  dan  daun  menguning,  hasil amplikasi  menunjukkan  bahwa  viroid berhasil terbaca pada band ukuran 250 pb.
Gambar 1. Tanaman Krisan yang Terkena Terinfeksi Csvd
Gambar 2. Visualisasi Pita Cdna Hasil Amplifikasi dengan Primer F Dan R Pada Gel Agarosa 1.5%. M = Penanda DNA Ladder 100 Bp; 1: Sampel Daun Krisan Terinfeksi Csvd

## KESIMPULAN DAN SARAN
Jenis  penyakit  krisan  yang  berhasil ditemukan berdasarkan gejala pada tanaman  yaitu  penyakit  kerdil  ( stunting ) dan menguningnya daun yang disebabkan oleh  infeksi  CSVd.  Proses  identifikasi CSVd  pada  krisan  menggunakan  teknik molekuler dengan RT-PCR dengan primer berupa  primer forward (F)  dan  primer reverse ( R ) hasil berupa teramplifikasinya  cDNA  CSVd  pada ukuran  250  bp.  Penelitian  selanjutnya diperlukan banyak sampel tanaman krisan yang  diduga  terinfeksi  virus,  sehingga hasil identifikasi lebih beragam.

## DAFTAR PUSTAKA
Ammirato  PV,  Evans  DA,  Sharp  WR, Bajaj  YPS.  1990.  Handbook  of plant  cell  culture  (Ornamental species)  Volume  5.  Mc  Graw-Hill Publishing  Company.  New  York. USA. 833p.
Badan  Pusat  Statistik.  2017.  Statistik Tanaman  Hias  Indonesia.  Jakarta:
Badan Pusat Statistik
Diningsih  E,  Suastika  G,  Sulyo  Y,
Winarto  B.  2013. Deteksi  dan Identifikasi Chrysanthemum  Stunt
Viroid Pada Tanaman Krisan Menggunakan Teknik Reverse Transcriptase  Polymerase  Chain. Jurnal  Hortikultura 23(1):  1-8.
Douine,  L.,  Quiot,  J.B.,  Marchoux,
G. and P. Archange. 1979.
Recensement  des  especes  vegetale sensibles au virus de la mosaique du comcombre  (CMV). Ann.  Phy- topathol. 11:439-475
Hollings  M.  1957.  Investigation  of chrysanthemum  viruses. II. Virus B (mild  mosaic)  and  chrysanthemum latent  virus. Ann.  Appl.  Biol. 45:
589 – 602
Hollings
M, Stone OM. 1972. Chrysanthemum  virus  B.  CMI/AAB Description  of  Plant  Viruses  No. 110. Hosokawa  M,  Ueda  E,  Ohishi  K,  Otake A, Yazawa, S. 2004. Chrysanthemum stunt viroid disturbs  photoperiodic  response  for flowerinf  of  chrysanthemum  plant.
Planta., vol. 220, pp. 64-70.
Kaharuddin  I.  2015.  Perbanyakan  Enam Varietas  Krisan  Secara  In  Vitro
pada Berbagai Media Tanam.
[Skripsi]. Fakultas Pertanian,
Universitas  Hasanuddin  Makassar.
Makassar. 91 h.
Kaper  JM.  1984.  Plant  disease  regulation by  virus  dependent  satellite-like replicating  RNAs.  Pp:317-343. In : Kurstak,  E.  (Ed.). Control  of  virus diseases. Marcel  Dekker.  Inc.  New York and Basel.
Krisantini.  2006. Produksi  Krisan  Pot  : Budidaya  Bunga  dan  Tanaman
Hias. Departemen  Agronomi  dan Hortikultura,  Fakultas  Pertanian,
Institut Pertanian Bogor. 16 hal. Manaf  R.2014.  Analisis  Serangan  Virus Gemini Pada Cabai Merah (Capsicum  Annum  L.)  Berbasis
Visual  Dengan  Segmentasi  Bayes.
fakultas teknologi pertanian, institut pertanian bogor.bogor
Moran  JR.  1987.  Chrysanthemum  B carlavirus.  Cite  this  publication  as: Brunt,  A.A.,  K.  Crabtree,  M.J. Dallwitz,  L.  Watson,  and  E.J. Zurcher.  (eds)  (1996  onwards). ‘Plant  Viruses  Online  Descriptions and  Lists  from  the  VIDE  Database. Version: 20th August 1996’.
Mossop DW, Francki RIB, Hatta T. 1979.
Description of plant viruses no. 213. Cucumber mosaic virus . Commonw. Mycol. Inst. Kew Surrey, England. 4p.
Nuryanto  H.  2011.  Budidaya  Tanaman Krisan. Bekasi : Ganeca
Purwanto  AW,  Martini  T.  2009. Krisan Bunga Seribu Warna .Yogyakarta. Rukmana HR, Mulyana AE.1997. Krisan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Pp : 14 – 16 Semangun  H.  2005. Penyakit-penyakit Tanaman Hortikultura di Indonesia. Yogyakarta:Gajah  Mada  University Press.
Smith,  KM.  1978. A  textbook  of  plant virus diseases . 3 rd ed. Longman Ltd. London. 684p.
Suastika  GJ,  Kurihara  KT,  Natsuaki,
Tomaru  K.  1997.  A  strain  of Chrysanthemum B carlavirus causing  flower  colour  breaking  on Gymnaster savatieri (Makino) Kitamura. Ann.  Phytopathol.  Soc . Japan. 63:1 – 7. Vina. 2016. Pertumbuhan dan
pembungaan  krisan  pada  berbagai komposisi  media  tanam  [Skripsi]. Universitas Andalas : Padang.
Verma  N,  Sharma  A,  Ram  R,  Hallan  V,
Zaidi AA, Garg ID. 2003. Detection, identification and incidence  of  Chrysanthemum  B carlavirus  in  chrysanthemum  in India. Crop Protect . 22: 415 – 429.
Waterworth  HE,  Kaper  JM,  Tousignant ME.  1979.  CARNA  5, Small
Cucumber  Mosaic  Virus -Dependent Replicating RNA, Regulates Disease  Expression. SCI .  204:845-
847.