Efek Paparan Sinar-X Terhadap Frekuensi Mikronukleus Sel Limfosit Dan Pemanfaatannya

## Untuk Pengembangan Dosimeter Biologi
Triesha Retno Astari 1) , Agung Pramana 2) , Mukh Syaifudin 3) 1),2) Laboratorium Biologi Sel dan Molekuler, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya Malang
3) Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional, Jl. Lebakbulus Raya No. 49 Jakarta
Email : 1) triesharetno_astari@yahoo.com . 2) junstone21@yahoo.com

## ABSTRAK
Pemanfaatan  teknologi  nuklir  pada  berbagai  bidang  memerlukan  dikembangkannya  suatu metode  yang  mudah  dan  cepat  untuk  mengetahui  risiko seseorang  yang  terkena paparan radiasi. Mikronuklei  (MN)  adalah  salah  satu  indikasi  kerusakan  struktural kromosom  akibat  paparan  radiasi yang dapat diamati pada sel dengan dua inti (binukleat, BNC), dengan cara memblok proses pembelahan menggunakan  sitokhalasin-B.  Tujuan  penelitian ini  adalah  mengetahui  frekuensi  MN  yang  terbentuk setelah paparan radiasi sinar-X berbasis gender dan umur responden (donor). Sampel darah dari 6 laki- laki  dan perempuan  sehat  berumur  25-51  tahun  diiradiasi dosis  0  dan  2  Gy,  kemudian  dilakukan pengkulturan,  pemanenan  dan  pengamatan MN  dengan  prosedur  baku.  Hasil menunjukkan  bahwa frekuensi  MN berbeda  baik  untuk  perbedaan  umur  maupun  gender  responden  (donor)  yang  diiradiasi pada dosis  0 Gy (kontrol) dan  2 Gy ( α=5% ). Frekuensi MN untuk dosis radiasi 2 Gy secara nyata lebih tinggi  daripada  0  Gy.  Akan  tetapi  pada  masing-masing  kelompok  umur  yaitu  28-30  tahun,  42-43  tahun dan  50-51  tahun  tidak nyata  secara  signifikan.  Hal  ini kemungkinan disebabkan  karena  perbedaan kondisi  laboratorium  dan  faktor  lain  seperti  banyaknya  dan  kondisi  sampel  yang  digunakan  dengan variasi  umur  >60  th.  M etode  uji  MN dari limfosit  darah  perifer akibat  radiasi memungkinkan  untuk digunakan dalam mempelajari efek iradiasi secara in vitro pada kromosom dan dapat digunakan sebagai dosimeter biologi.
Kata kunci : Biodosimetri, Cytokinesis Block (CB), dosis, mikronuklei, radiasi pengion

## ABSTRACT
Use of nuclear technology in various fields requires a development of a simple and quick method to determine the risks of person after exposed to radiation. Micronucleus (MN) is one of the indication of structural defect  on  chromosome  as  a  result  of  radiation  exposure  which  can  be  observed  in  a  cell  with two nuclei (binucleic cells, BNC), by blocking the cleavage process using cytochalacine-B. The purpose of this  study was  to  determine  the frequency of MN  that formed  after  radiation  exposure  based  on  gender and age of respondences (donor). Blood samples from six healthy person with age of about 25-51 years old were irradiated with X-ray at doses of 0 and 2 Gy, then MN culturing and its harvesting were done with standard  procedures.  The  results  showed that MN  frequency was  different  with differences  in  age  and gender of the respondents ( donors ) that were irradiated at doses of 0 Gy (control) and 2 Gy ( α = 5 % ). It was  found  that  the MN  frequency  induced  by dose  of 2  Gy  was significantly  higher  than that  of 0  Gy  . However, MN in  each  age  group of 28-30  years,  42-43  years  and  50-51 years were  not significantly different .  It  is may  be caused  by  the  difference  of  laboratory  condition  and  other  factors  such  as  the amount  and  sample  condition  that  used  with  variety  of  ages  >60  years  old.  The  MN  test  methods of peripheral blood lymphocytes due to radiation enable to be used to learn the irradiation effect in in vitro on the chromosome and can be used as a biological dosimeter.
Keyword : Biodosimetri, cytokinesis Block ( CB ), dose, micronuclei, ionizing radiation .

## PENDAHULUAN
Pemanfaatan  sumber  daya alam  maupun buatan di berbagai bidang kehidupan masyarakat telah  maju  secara  cepat.  Pemanfaatan  sumber daya  buatan  pada  pemanfaatan  teknologi  nuklir terutama  pada  bidang  penelitian,  kedokteran, industri, dan energi telah berkembang saat ini [1].
Seiring dengan meningkatnya penggunaan radiasi pengion diberbagai bidang dan kesadaran akan efek yang ditimbulkannya, maka dosimeter biologi  merupakan  hal  yang  sangat  penting sebagai  pendukung  dosimeter  fisik  terutama dalam kasus kedaruratan nuklir [2]. Keselamatan dan kesehatan kerja merupakan suatu usaha yang dilaksanakan secara berkesinambungan sehingga,
studi  intensif  yang  dilakukan  para  ahli  biologi radiasi (radiobiology) mengenai prinsip dosimetri  biologi  yaitu  pengujian  parameter biologi yang  bertujuan  untuk  memperkirakan dosis serap terhadap radiasi pengion berdasarkan kerusakan yang terjadi pada sistem biologi [3].
Aberasi  kromosom  telah  dikenal  secara luas  sebagai  dosimeter  yang  menggambarkan tingkat  kerusakan  kromosom  pada  seseorang yang  terpapar  radiasi  pengion.  Mikronuklei merupakan salah satu indikator kelainan kromosom akibat penyerapan dosis yang banyak menarik  perhatian  peneliti  karena  memiliki korelasi  positif  dengan  dosis  [4].  Teknik pengamatan  mikronuklei  pada  limfosit  yang telah  dikultur  selama  72  jam  dapat  dijadikan metoda alternatif sebagai  indikator  penyerapan dosis  untuk  memantau  kerusakan  kromosom. Mikronuklei terbentuk dari fragmen asentris atau patahan  kromosom  yang  diduga  bahwa  semakin banyak  aberasi  kromosom  yang  timbul  maka semakin banyak pula mikronuklei yang didapatkan [5]. Kriteria  mikronuklei  yang diamati  yaitu  diameter  kurang  dari  1/3  diameter nukleus,  lokasinya  didalam  sitoplasma tetapi diluar nukleus, tidak ada kontak dengan nukleus serta intensitas dan  penyerapan  warna sama dengan nukleus.
Keunggulan
metoda
mikronuklei  yaitu bentuk  yang  sederhana sehingga  mudah  dikenali  dan  dapat  dihitung dengan  cepat  dalam  jumlah  yang  banyak serta mikronuklei  terbentuk  pada  waktu  pembelahan sel  dan  tetap  ada  selama  interfase,  sehingga pengamatannya  lebih  leluasa  dan  kemungkinan terbentuknya  artefak  (kesalahan  teknis)  kecil, biodosimeter  pajanan  akut  dan  kronik  setelah radiasi in  vivo,  membedakan  antara  sel  sedang membelah  dan  tidak serta membedakan  antara pajanan  radiasi  pengion  dengan  non  radiasi dengan pelabelan kromosom [4,5].
Sitokhalasin  B  pada  kultur limfosit sebagai  analisa  mikronuklei  berguna  untuk memblokir  proses  sitokinesis  pada  awal  kultur selama  44  jam  yang  kemudian  dilanjutkan kembali  hingga  pemanenan  pada  kultur  72  jam. Sensitifitas  dari  metode  pengeblokan  diuji dengan mempelajari efek dosis rendah mikronuklei  yang  diinduksi  sinar-X  paparan tunggal in  vitro yang  menunjukkan respon-dosis sehingga  pada  sel yang  telah mengalami  pem-
Gambar 1. Sel binukleat dengan satu mikronuklei [5]. blokan sitokinesis, sel yang mempunyai mikronuklei  akan  lebih mudah  teramati  dengan kenampakan  sel  dengan  dua  inti  (binukleat) dalam  satu  sitoplasma yang  sama [6]. Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui respon dosis  pembentukan  Mikronuklei  akibat  paparan sinar  radiasi  sinar-X  dan  mengetahui  keandalan uji mikronuklei respon gender dan umur sebagai dasar penerapan pada dosimeter biologis.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan Desember 2014 – Februari 2015 di Laboratorium Sitogenetik,  bidang  TNKBR,  Pusat  Teknologi Keselamatan  dan  Metrologi  Radiasi  (PTKMR)- Badan  Tenaga  Nuklir  Nasional  (BATAN) Jakarta Selatan.

## Pembiakan
Darah  perifer sebanyak  0,5 ml dalam tabung  ber-heparin  dimasukkan  kedalam  4,5  ml RPMI-1640  yang  telah  dilengkapi 25  mM L- Glutamin dan  HEPES,  0,8 ml Fetal  Bovine Serum (FBS), 0,1  penstrep  (Gibco)  dan  0,1  ml
Phytohaemaglutinin (PHA). Selanjutnya
diinkubasi  pada inkubator suhu 37 o C dan CO 2 5% selama 72  jam, pada 44 jam pertama kultur ditambahkan  10  µl  sitokalasin  B  (Sigma)  dan diinkubasi kembali hingga 72 jam.

## Pemanenan
Kultur  darah  dipindahkan  ke dalam tabung  sentrifuse  dan  diputar  pada  800  rpm selama  10  menit. Supernatan  dibuang kemudian ditambahkan  5 ml cold  hypotonic  solution (KCl 0,56%)  4 o C, disentrifus  kembali selama  8  menit pada 800 rpm. Supernatan dibuang lalu ke dalam tabung  berisi endapan dimasukkan  5  ml  larutan fiksatif Carnoy  ringers  (metanol :  asam  asetat  = 10:1), disentrifus  kembali  8  menit  800  rpm  dan diulangi 2-3  kali  hingga  diperoleh endapan  sel limfosit  yang  putih. Selanjutnya  endapan  dibuat preparat  dalam  objek glass,  diwarnai  dengan pewarna Giemsa  4%  dan  diamati  di bawah

## Mikronuklei
mikroskop  dengan  perbesaran  1000  kali  lalu dilakukan analisis SPSS 16.00 for windows.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  penelitian  yang  dilakukan  pada  6 sampel/responden ini dibagi  menjadi  dua kelompok yaitu 3 pria dan 3 wanita sehat dengan kelompok usia  25-51 tahun, pertama dilakukan perhitungan pada jumlah  sel  mononukleat,  sel binukleat,  sel  trinukleat  dan  sel  tetranukleat untuk menghitung Nuclear Division Index (NDI). NDI akan  memberikan  ukuran  status  proliferatif dari  fraksi  sel  hidup  setelah  paparan  radiasi dan evaluasi  BNC  dalam  deteksi  MN  dalam  sel limfosit serta sebagai  ukuran  respon  mitogenik yang  berguna  untuk  biomarker  dari  fungsi kekebalan tubuh [6].
Pada 6  responden  dosis  0  Gy  dan  2  Gy berdasarkan  distribusi  nukleat, diperoleh  nilai BNC  terbanyak, menandakan sitokalasin-B  pada kultur limfosit berhasil mengeblok sel pada tahap metafase. NDI dosis 0 Gy diperoleh nilai 1,73 –
1,86 sedangkan dosis 2 Gy didapatkan nilai 1,71- 2,03. )  NDI  dikatakan  rendah  jika  memiliki  nilai 1,00.  Nilai  ini  diartikan  sebagai  sel  yang belum membelah dan  masih  berada  dalam  fase  G0 tahap  istirahat pada  siklus  sel  sehingga seluruh sel masih dalam bentuk mononukleat, akan tetapi jika keseluruhan sel mononukleat membelah dan telah  memasuki  siklus  sel lengkap maka sel menjadi  sel  binukleat dan NDI lebih  tinggi mencapai 2,00 (Tabel 1) [7].
Peluang penyerapan  radiasi  terhadap pembentukan mikronuklei dilakukan  analisis distribusi  Poisson  dan  indeks dispersi  [8]. Kisaran  nilai  pada  distribusi  Poisson  adalah - 1,96- 1,96. Nilai 1,96 analisis dinormal bakukan pada  tabel  Z,  maksud dinormal  bakukan  ini adalah  data  yang  ditransformasikan  ke  dalam bentuk Z-score dan diasumsikan normal sehingga distribusi menunjukan signifikan overdispersed apabila >1,96  dan distribusi signifikan underdispersed <1,96 (Tabel 2) [4,8]. Mikronuklei merupakan salah satu kelainan  kromosom  akibat  paparan  radiasi pengion atau senyawa kimia, sehingga frekuensi mikronuklei  yang  diinduksi  radiasi  menunjukan ketergantungan  pada  dosis  dan  kualitas  radiasi. Kriteria  MN  dalam  BNC  pada uji  mikronukleus harus  memenuhi ketentuan  seperti sel  harus dalam bentuk binukleat (terdiri dari dua nukleus),
Tabel  1. Hasil  pengamatan  sel  mononukleat, binukleat,  trinukleat,  tetranukleat  dan nilai NDI
Tabel 2. Distribusi poisson dan indeks disperse
kedua  nuklei  dalam  sel  binukleat  harus  dalam kondisi  membran  inti  berada  dalam  satu sitoplasma  yang  sama,  kedua  nuklei  dalam  sel binukleat  harus  memiliki  ukuran,  penyerapan warna  dan  intensitas  pewarnaan  yang  sama, apabila  dalam  kondisi  nuklei  yang overlapping dapat  dihitung  apabila  inti  dari  inti  yang  lain dapat  dibedakan  dan  lingkaran  sitoplasma  atau membran  dari  sel  binukleat  harus  berinteraksi dan  secara  jelas  dapat  dibedakan  dari  lingkaran sitoplasma dengan sel sekitarnya (Gambar 2) [9].
Berdasarkan kriteria pengamatan uji MN menyebutkan, mikronuklei baik dijadikan sebagai dasar dosimeter biologi terhadap proteksi radiasi karena memenuhi kriteria seperti efeknya harus  permanen,  jika  tidak  permanen  harus diketahui ketergantungannya pada waktu, efeknya  sangat  spesifik  untuk  radiasi  pengion, hasilnya harus bermanfaat segera setelah pajanan radiasi  untuk  suatu  kasus  kecelakaan,  metode harus  dapat  digunakan untuk  pajanan  kronis maupun  terfraksionasi,  bahan  biologik  yang menunjukkan  efek  harus  mudah  diperoleh  tanpa metode  invasif  yang  ekstensif  serta  evaluasi harus mudah, cepat dan dapat ditransfer ke suatu mesin [4].
Pengamatan 6 Responden dosis 0 Gy dan 2  Gy  terlihat  adanya  perbedaan  total  MN  untuk kelompok kontrol (0 Gy) adalah 4-24 MN (Tabel 3), hal ini sesuai dengan bahwa background MN
Gambar 2. Sel BNC dengan 1 MN (1), 2 MN (2), 3  MN  (3),  dan  4  MN  (4) perbesaran 1000.
Tabel  3.  Distribusi mikronuklei  dalam  sel binukleat
untuk  kontrol  (0  Gy)  yang  baik  tidak  lebih  dari 30 MN [4]. Berdasarkan frekuensi MN/BNC dari 500 sel/1000 sel yang teramati pada kedua dosis terlihat bahwa pada dosis 0 Gy kisaran nilai yang didapat  0,004-0,015.  Nilai  frekuensi  dosis  0  Gy tidak  melebihi  0,5  frekuensi  MN/BNC  yang teramati,  sehingga  frekuensi  ini  dapat  dikatakan baik, sesuai dan tidak melebihi nilai background dosis kontrol. Dosis 2 Gy  memiliki kisaran nilai 0,25-0,55.  Nilai  frekuensi  MN/BNC  dosis  2  Gy pada ke-6 responden seiring meningkat berdasarkan  kelompok  umur  dan  gender.  Nilai frekuensi  yang  didapat  pada  dosis  2  Gy mendekati  dosis  ambang  pengamatan  sel  yang teramati  berdasarkan  frekuensi  MN/BNC yaitu 0,5 sehingga pada dosis 2 Gy ini dapat dikatakan sebagai  dosis  yang  dapat  membuat  kerusakan dan kelainan pada kromosom.
Hubungan  dosis-respon terbentuknya MN dalam  sel limfosit menunjukkan dosis 2 Gy sangat  efektif  menyebabkan  kerusakan  sel  yang ditunjukkan  oleh meningkat frekuensi  MN  yang terbentuk  dibandingkan  dosis  0  Gy [10] . Penambahan jumlah MN dimulai pada paparan
Tabel 4. Perbandingan hasil penelitian ini dengan beberapa  literatur  yang  sudah  terbit pada  frekuensi  MN  akibat  paparan radiasi sinar-X dosis 2 Gy. Sumber Jumlah BNC Jumlah MN Frekuensi Penelitian ini 2.024 932 0,445 Pajic, 2014 2.800 700 0,25 Funda, 2008 2.006 551 0,22 Solomon, 1997 801 200 0,25
dosis  serendah  0,05  Gy  pada  limfosit  manusia, sehingga  pada  dosis  rendah 0,05  Gy untuk kerusakan  sitogenetik sudah  dapat terlihat penyimpangan  MN  yang  terbentuk,  sehingga untuk  dosis  lebih  tinggi  1,0  Gy  dan dosis  2  Gy akan  terlihat  jauh  lebih  banyak  jumlah  dan frekuensi  MN  yang  terjadi. MN  ini  juga  tidak spesifik  akibat  paparan  radiasi  dan  tidak  dapat dibedakan  antara  paparan  parsial  dan  seluruh tubuh,  dimana  paparan  dosis  tinggi  dapat mengganggu  pembelahan  sel.  Karena  frekuensi baseline nya  yang  tinggi  dan  ketergantungannya pada  umur  maka  reabilitas  uji  MN  masih  perlu diteliti lebih lanjut [11].
Keunggulan  uji  MN  terhadap evaluasi yang  lebih rinci  terhadap  dampak  gender  dan umur  pada  frekuensi  MN  akibat  radiasi dilakukan dengan memperkirakan rasio frekuensi untuk laki-laki dan perempuan. Sedangkan untuk umur dibedakan dengan rentang umur yang akan mulai banyak  terbentuk  MN  pada  kisaran  umur >60  tahun. Hubungan  dosis-respon  terhadap gender dan umur sebagai pengetahuan tambahan terhadap  peningkatan  jumlah  mutasi  atau penyimpangan  kromosom  pada  terbentuknya MN  ini  dapat  disebabkan  akibat  ketidakstabilan genomik yang dipahami sebagai studi sitogenetik yang  dapat  dideteksi  sebagai  peningkatan frekuensi  jumlah  atau  perubahan  struktur kromosom serta pembentukan mikronukleus [11]. Ketidakstabilan  genom  dapat  berfungsi  sebagai penanda penuaan karena mencerminkan penurunan  kemampuan  sel  untuk  memperbaiki kerusakan DNA. Perbandingan
jumlah penyimpangan sitogenetik dari donor sehat yang berbeda  usia  memberikan  wawasan  penting  ke dalam dinamika perubahan ketidakstabilan dalam makhluk hidup. sehingga, peningkatan usia pada tingkat  penyimpangan  kromosom  pada donor sehat dapat diketahui secara jelas [12].
1 3 2 4
KESIMPULAN Radiasi pengion sangat efektif menyebabkan  kerusakan  kromosom  terutama terbentuknya  mikronuklei  sebagai  konsekuensi dari patahan ganda DNA yang dapat dimanfaatkan  untuk  menentukan  besarnya  dosis radiasi sebagai dasar dosimeter biologi. Frekuensi MN pada perbedaan umur dan gender responden  (donor) yang  diiradiasi  pada  dosis  0 Gy (kontrol) dan 2 Gy menunjukan dosis radiasi sinar  X  pada  2  Gy  nyata  berbeda  lebih  tinggi daripada 0 Gy. Akan tetapi pada masing-masing kelompok  umur yaitu  28-30  tahun,  42-43  tahun dan 50-51 tahun tidak signifikan nyata.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan puji syukur kepada  Allah  SWT    sehingga penelitian  dan penulisan karya  ilmiah  ini    dapat    diselesaikan. Penulis  juga mengucapkan  banyak terima  kasih kepada Tim penelitian Laboratorium Sitogenetik, Bidang  TNKBR,  Pusat  Teknologi  Keselamatan dan  Metrologi  Radiasi  (PTKMR) – Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN) Pasar Jum’at, Jakarta Selatan, Dr. Agung Pramana W.M, M.Si dan  Dr.  Mukh  Syaifudin sebagai  dosen pembimbing  yang  telah  membimbing  dan memberikan  nasehat baik  dalam  penulisan maupun selama penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Riyanto,  Agus.  2014.  Risiko  Pajanan Radiasi  Sinar-X  terhadap  Pekerja  Radiasi di  bagian  Radiologi  Rumah  Sakit  Umum Pusat  Nasional  Cipto  Mangunkusumo Jakarta Tahun 2014. Proposal Tesis. FKM. UI
[2] Yanti dkk. 2007. Penerapan Efek Interaksi
Radiasi  Dengan  Sistem  Biologi  Sebagai Dosimeter Biologi. PTKMR-BATAN. Jakarta
[3] Rao, B.S. and Natarajan. A.T.
2001.Retrospective  Biological  Dosimetry Of Absorbed Radiation. Radiation Protection Dosimetry. 95, 17-23 .
[4] International atomic energy agency,
Biological Dosimetry Chromosomal Aberration Analysis for Dose Assessments.  2001.  Technical  Reports Series No. 260, IAEA, Viena, 25-31
[5] Countryman,p.i., Heddle, j.a.1979.The
Production of Micronuclei from
Chromosome  Aberration  in  Irradiated
Culture  of  Human  Lymfocytes,  mutation research, 41, 321-331 [6] Fenech,  M  And  Marley,  A.A.  1985. Measurement Of Micronuclei in Limphocytes. Mutation  Research  Vol  147 hal 29-36 [7] Hogsted. 1984. Micronuclei in Limphocytes with Preserved Cytoplasm, A Method  For  Assesment  Of  Cytogenetic Damage  in Man.  Mutation  Research  Vol
130 hal 62-72
[8] Ronald,E.,  Walpole.  1995. Pengantar Statistika. Gramedia. Jakarta
[9] Mill,  Aj.  ,  Well,  J,  Hall,C.S.  And  Butler, A.1996. Mikronucleus Induction in Human Lymphocytes Comparative Effects Of  X  Rays,  Alpha  Particles,  Betha Perticles  And  Neutrons  and  Implications For Biological Dosimetry. Mutation Research No. 145 p 575-576
[10] Fenech  M.  2007.  Protocol  Cytokinesis Block  Mikronukleus  Cytome  Assay. Nature Protocols Vol.2 No. 5 p 1084-1104
[11] Fenech  M.  and  Morley  A.A.  2001. Cytokinesis block micronucleus method in human  lymphocytes:  Effect  of  in  vivo ageing  and  low  dose  x-irradiation.  Mutat. Res. 161, 193-198. 5.
[12] Sieber  OM,  Heinimann  K,  Tomlinson  IP. 2003.  Genomic  Instability  the  engine  of tumorigenesis. Nat Rev Cancer
[13] Solomon  F.  D.  Paul,  P.  Venkatachalam and  R.K.  Jeevanram.  1997.  Analysis  of Radiation  Dose-Response  Curve  Obtained with  Cytokinesis  Block  Micronucleus Assay.  Nuclear  Medicine  and  Biology.
Elsevier Science Inc.
[14] Funda  S.  Pala1  ,  Fadime  ALKAYA2  , Kıymet TABAKÇIOĞLU1 , Füsun TOKATLI2  ,  Cem  UZAL3  .  2008.  The Effects  of  Micronuclei  with  Whole Chromosome on Biological Dose
Estimation. Turk J Biol. Turkey
[15] J.  Pajic,  B.  Rakic,  D.  Jovicic,  A. Milovanocic.  2014.  Construction  of  dose response  calibration  curves  for  disentrics and  micronuclei  for  X  radiation  in  a Serbian population. Mutation Research