HISTOLOGI TESTIS MENCIT ( Mus musculus L.) MUDA DAN TUA YANG DIBERI EKSTRAK LADA HITAM ( Piper nigrum L.)
TESTICULAR HISTOLOGY OF YOUNG AND OLD MOUSE ( Mus musculus L.) THAT WERE GIVEN BLACK PEPPER ( Piper nigrum L.) EXTRACT
Septiya Reni 1 , M. Kanedi 1 , Nuning Nurcahyani 1 , Sutyarso 1
1 Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung e-mail : septiya01@yahoo.co.id
Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Lampung Jl. Prof.Dr. SoemantriBrojonegoro No. 1, Bandarlampung, Lampung, Indonesia, 35145

## ABSTRAK
Lada  hitam  ( Piper  nigrum L.)  dipercaya  oleh  masyarakat  memiliki  banyak  khasiat.  Selain  membuat penggunanya  tetap  sehat,  lada  hitam  juga  diduga  memiliki  kandungan  antioksidan  yang  mampu menangkap  radikal  bebas  sebagai  salah  satu  faktor  pemacu  penuaan.Telah  dilakukan  percobaan menggunakan  hewan  mencit  dengan  tujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  lada  hitam  terhadap perubahan  histologi  testis  dan  jumlah  spermatozoa  mencit  muda  dan  mencit  tua.Penelitian  ini menggunakan 20 ekor mencit berumur 4 bulan dan 20 ekor mencit berumur 6 bulan. Masing-masing kelompok usia mencit tersebut dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan. Kelompok 1, tidak diberi ekstrak lada  hitam,  kelompok  2,  diberi  ekstrak  air  lada  hitam  0,3  ppt,  Kelompok  3  diberi  ekstrak  ethanol sebanyak  0,3  ppt,  dan  Kelompok  4,  diberi  campuran  ekstrak  air  dan  ethanol  0,3  ppt.  Data  yang didapat  dianalisis  dengan  Analisis  Ragam  (ANARA)  2  jalur  (dengan  α  =  5%).  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  pemberian  ekstrak  lada  hitam  pada  mencit  usia  tua  mampu  meningkatkan jumlah spermatogonia dengan nilai rata-rata perlakuan mencapai 81,6 sel dan jumlah spermatogonia mencit  yang  tidak  diberi  perlakuan  berjumlah  47,0  sel  dalam  1  sayatan  tubulus  seminiferus. Sementara itu, jumlah spermatozoa antar setiap perlakuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata.
Kata kunci : mencit (Mus musculus L.), lada hitam (Piper nigrum L.), spermatogonium, spermatozoa.

## ABSTRACT
Black  pepper  ( Piper  nigrum L.)  is  traditionally  believed  to  have  some  benefits.  In  addition  to  keep healthy  for  the  users,  black  pepper  is  also  known  to  have  some  antioxidant  properties  by  capturing free  radicals  contribute  to  aging  process.  The  experiment  was  conducted  using mice  with the  aim  to determine the effect of black pepper on histological changes of testis and the number of spermatozoa between  old  and  young  mice  group.  The  experiments  used  20  male  mice  aged  of  4  months  and  20 mice  aged  of  6  months.  Each  of  the  age  group  were  divided  into  4  treatment  groups.  Group  1  as control  group,  without  any  black  pepper  extract,  Group  2,  were  given  water  extract  of  black  pepper with concentration of 0.3 ppt , Group 3 were given ethanol extract of black pepper with concentration 0.3  ppt,  and  Group  4  were  given  mixture  of  black  pepper  extract  either  with  water  and  ethanol  with concentration of 0.3 ppt. Data  were analyzed  with Two-way  Analysis  of Variance (ANOVA) (with α = 5%). The results showed that the extract of black pepper treated on old mice increase the amount of spermatogonia with an average of 81.6 spermatogonial cells compared with the untreated group (with cell number of 47,0)  in one incision  of seminiferous tubules. While the number  of spermatozoa  were not significantly different among groups.
Keywords : mouse (Mus musculus L ), black pepper (Piper nigrum L.), spermatogonia, spermatozoa .

## PENDAHULUAN
Lada  hitam  dimanfaatkan  oleh  masyarakat  se- bagai  bahan  rempah-rempah  karena  memiliki aroma  dan  rasa  yang  khas.  Aroma  pada  lada hitam  disebabkan  oleh  adanya  minyak  atsiri yang terdiri dari beberapa jenis minyak terpene (Rismunandar, 1992).
Selain  digunakan  sebagai  rempah-rempah,  da- lam tradisi pengobatan Ayurveda lada hitam di- yakini memiliki banyak khasiat, yaitu dapat me- nyembuhkan  beragam  penyakit,  membuat penggunanya  tetap  sehat  dan  panjang  umur (Majeed and Prakash, 2000).
Kajian  terhadap  kandungan  kimia  lada  hitam menunjukkan  bahwa  tanaman  ini  mengandung bahan aktif seperti phenolic amides , phenolic a- cids ,  dan flavonoid yang  bersifat  antioksidan sangat  kuat  (Meghwal  and  Goswami,  2012). Antioksidan  merupakan  senyawa  yang  mampu mencegah  kerusakan  oksidatif  secara  bermak- na  yang  disebabkan  oleh  radikal  bebas (Halliwell and Whiteman, 2004).
Radikal bebas merupakan salah satu faktor pe- macu proses penuaan. Penuaan (aging) adalah proses akumulasi berbagai perubahan pada sel dan jaringan sebagai akibat pertambahan umur. Proses  akumulasi  tersebut  berakibat  pada peningkatan  risiko munculnya  penyakit  dan  ke- matian.  Selain  itu,  penuaan  juga  mengakibat- kan  kemunduran  sistem  imun  dan  penurunan kemampuan  organisme  dalam  beradaptasi  ter- hadap lingkungannya  (Troen, 2003).
Proses penuaan yang terjadi pada pria ditandai dengan  menurunnya  fungsi  organ  reproduksi dan  terjadinya  kerusakan  sel-sel  spermatoge- nik.  Menurut  Wibisono  (2001),  cekaman  panas pada testis dapat menyebabkan fragmentasi to- tal dan berakibat pada kerusakan jaringan testis yang  menyebabkan  kegagalan  proses  sperma- togenesis,  sedangkan  fragmentasi  parsial  ber- pengaruh  terhadap  spermatozoa  yang  diha- silkan.
Kerusakan  sel-sel  spermatogenik  oleh  faktor radikal bebas dapat  dicegah dengan mengkon- sumsi makanan  yang mengandung antioksidan (Droge,  2002).  Salah  satu  bahan  pangan  yang mengandung  antioksidan  adalah  lada  hitam ( Piper  nigrum L.).  Untuk  menguji  kandungan antioksidan  yang  terkandung  di  dalam  lada  hi- tam,  maka  dilakukan  penelitian  dengan  meng- gunakan  hewan  uji  mencit  ( Mus  musculus L.) jantan  yang  diberi  ekstrak  lada  hitam  dengan parameter yang diamati berupa jumlah sperma- tozoa dan spermatogonia mencit tersebut.

## BAHAN dan METODE

## Pembuatan ekstrak lada hitam dan peracikan pakan
Lada  yang  digunakan  merupakan  lada  hitam yang  diperoleh  langsung  dari  petani  buah  lada di  provinsi  Lampung.  Lada  dipilih  yang  bernas lalu  dikeringkan  kemudian  diekstraksi  dengan metode  maserasi  menggunakan  dua  macam pelarut, yaitu ethanol dan air.
Masing-masing  ekstrak  kemudian  ditambahkan pada  pa-kan  mencit  dengan  komposisi  0,3  g dalam  setiap  1  kg  pakan  lalu  dicetak  kembali. Pakan  dicetak  membentuk  batangan  dengan panjang  4-5  cm  dan  diameter  0,5-1  cm,
kemudian  dikeringkan.  Pakan  inilah  yang  dibe- rikan pada mencit hewan uji selama 3 bulan.

## Pemeliharaan dan perlakuan ekstrak
Mencit  yang  digunakan  sebagai  hewan  uji adalah  20  ekor  mencit  jantan  yang  berumur  4 bulan dan 20 ekor mencit jantan  yang  berumur 6  bulan.  Pada  tiap  umur  mencit  dibagi  menjadi 4 kelompok.
a.  Kelompok kontrol tanpa penambahan ekstrak lada hitam
b.  Kelompok dengan perlakuan ekstrak air lada hitam dengan dosis 0,3ppt (PA)
c.  Kelompok dengan perlakuan ekstrak ethanol lada hitam dengan dosis 0,3 ppt (PE)
d.  Kelompok dengan perlakuan ekstrak air dan ethanol  lada  hitam  dengan  dosis  0,3  ppt (PC)
Masing-masing  kelompok  terdiri  dari  5  ekor mencit  yang  dipelihara  dalam  1  kandang  yang terbuat  dari  plastik  berukuran  40x20x15  cm. Mencit  uji  dipelihara  selama  3  bulan  sehingga pada akhir penelitian usia mencit tepat 7 dan 9 bulan.  Dalam  penelitian  ini mencit  usia  7  bulan dianggap sebagai mencit usia muda dan mencit usia 9 bulan dianggap sebagai mencit usia tua

## Pembuatan preparat testis
Testis difiksasi dengan menggunakan HCl 0,01 %,  selanjutnya  dilakukan  tahapan  pembuatan preparat  dengan  metode  parafin  dan  pewarna- an Hematoxylin & Eosin (H&E).

## Perhitungan jumlah spermatogonia
Histologi  testis  diamati  di  bawah  mikroskop  bi- nokuler dengan  perbesaran 400 kali, kemudian difoto  untuk  dihitung  jumlah  spermatogonianya pada  satu tubulus  seminiferus.  Pemilihan  tubu- lus seminiferus dilakukan secara acak pada se- tiap preparat.

## Perhitungan jumlah spermatozoa
Perhitungan  jumlah  spermatozoa  pada  epidi- dimis  dilakukan  menurut  Soehadi  dan  Arsyad (1983)  yaitu  dengan  cara  meletakkan  organ epididimis sebelah kiri diambil pada cawan petri yang  berisi eosin ,  kemudian  bagian  proximal cauda  dipotong  sedikit  dengan  gunting  lalu ditekan  dengan  perlahan  hingga  sekresi  cairan epididimis  keluar  dan  tersuspensi  dengan eo- sin .  Suspensi  dihomogenkan  kemudian  diambil sebanyak 10µl dan diamati dengan mengguna- kan  hemositometer.  Jumlah  spermatozoa  per kotak  dihitung  pada  bidang  a,  b,  c,  d,  dan  e (Gambar  1).  Hasil  perhitungan  dimasukkan  ke dalam  rumus  perhitungan  jumlah  sperma/ml dengan rumus:
Jumlah sperma =  N / 2 x 10 5 sperma/ml
Gambar 1. Kamar Hitung pada Haemositometer (Sumber: Zaneveld dan Polakosski, 1986)

## Analisis data
Data  yang  diperoleh  dari  perhitungan  berupa jumlah  spermatogonium  dan  jumlah  spermato- zoa  dianalisis  menggunakan  ANOVA  ( analysis of variance ),  dilanjutkan  dengan  uji  BNT  (Beda Nyata Terkecil) dengan taraf signifikasi 5%.

## HASIL dan PEMBAHASAN

## 1. Jumlah spermatogonia
Hasil  perhitungan  perbandingan  jumlah  sper- matogonia,  antara  mencit  usia  muda  dan  me- ncit usia tua disajikan dalam Tabel 1.
Tabel  1.  Perbandingan  jumlah  spermatogonia mencit muda dan tua setelah diberi perlakuan ekstrak lada hitam.
Perlakuan Rata-rata total jumlah spermatogonia (sel) ±SD Usia muda Usia tua K* 77,80 ± 4,20 47,00 ± 5,24 PA 68,20 ± 11,21 78,20 ± 10,32 PE 79.60  ± 9,18 88,80 ± 7,98 PC 70,60  ± 7,66 77,80 ± 4,43
Keterangan  :  Tanda  bintang  (*)  pada  perlakuan  menunjuk- kan  adanya  beda  nyata  pada  taraf  signifikansi  0,05  antara kelompok mencit muda dan mencit tua.
K  : Kelompok kontrol ,tidak diberi ekstrak lada hitam PA  : Diberi ekstrak air PE  : Diberi ekstrak ethanol PC  : Diberi ekstrak air dan ethanol
Pada perbandingan antara kelompok usia tidak terdapat  beda  nyata  antara  jumlah  sperma- togonia  mencit  kelompok  usia  muda  dengan mencit  kelompok  usia  tua  yang  telah  diberi perlakuan  ekstrak  lada  hitam,  tetapi  pada kelompok  kontrol  terlihat  sekali  adanya  beda nyata.  Hal  ini  menunjukka  bahwa  pemberian ekstrak  lada  hitam  mampu  mengurangi  pe- nurunan  jumlah  spermatogonia  mencit  usia  tua dari jumlah spermatogonia mencit usia muda.
Perbandingan  jumlah  spermagonia  mencit  usia muda antara kelompok perlakuan tidak menun- jukkan adanya beda nyata, namun pada kelom- pok mencit usia tua terlihat adanya beda nyata antara  jumlah  spermatogonia  kelompok  kontrol dengan kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak  lada  hitam.  Peningkatan  jumlah  sper- matogonia  mencit  usia  tua  pada  kelompok perlakuan  ekstrak  lada  hitam  diduga  meru- pakan  efek  dari  senyawa  antioksidan  yang terdapat  pada  ekstrak  lada  hitam.  Senyawa- senyawa  antioksidan  dari  ekstrak  lada  hitam yaitu  senyawa  flavonoid  ,  asam  fenolat  dan  a- mida  fenolat.  Gulcin  (2005)  melaporkan  bahwa ekstrak air dan ethanol dari lada hitam memiliki aktivitas antoksidan yang kuat

## 2. Jumlah spermatozoa
Hasil  perhitungan  perbandingan  jumlah  total spermatozoa  mencit,  antara  mencit  usia  muda dan mencit usia tua disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Perbandingan jumlah spermatozoa an- tara  mencit  muda  dan  tua  pada kelompok kontrol dan kelompok yang diberi ekstrak lada hitam
Perlakuan Rata-rata total jumlah spermatozoa (juta/ml) ±SD Usia muda Usia tua K 20.96 ± 5.49 13.92 ± 4.79 PA 17.53 ± 9.48 19.60 ± 6.33 PE 16.35 ± 4.28 21.48 ± 21.22 PC 17.20 ± 2,82 21.20 ± 2.52 Keterangan :
K  : Kelompok kontrol ,tidak diberi ekstrak lada hitam PA  : Diberi ekstrak air lada hitam PE  : Diberi ekstrak ethanol lada hitam PC  : Diberi ekstrak air dan ethanol lada hitam
Perbandingan  rata-rata  total  jumlah  sperma- tozoa mencitusia muda antara kelompok kontrol dengan  kelompok  perlakuan  dapat  dilihat  pada Tabel 2.
Dari  hasil  uji  statistik  dengan  menggunakan ANOVA,  tidak  terlihat  adanya  beda  nyata  an- tara  jumlah  spermatozoa  mencit  tua  dengan spermatozoa mencit muda. Hasil  uji statistik ini juga menunjukkan bahwa tidak ada beda nyata antara  jumlah  spermatozoa  mencit  kelompok kontrol  (K)  dengan  spermatozoa  mencit  kelom- pok perlakuan dengan penambahan ekstrak la- da hitam (PA, PE dan PC). Hal ini menunjukkan bahwa  pemberian  ekstrak  lada  hitam  dengan dosis  0,3  ppt  belum  mempengaruhi  jumlah spermatozoa  mencit  sebagai  hewan  uji.  Me- ningkatnya  usia  maka  jumlah  radikal  bebas  di dalam  tubuh  akan  meningkat  (Pangkahila. 2007).  Pada  pria  radikal  bebas  dapat  meng- ganggu proses spermatogenesis salah satunya menyebabkan  kerusakan  membran  spermato-
zoa  akibat  terbentuknya  lipid  peroksida  pada membran  tersebut  dan  lama  kelamaan  sper- matozoa  akan  mati  yang  nantinya  akan  menu- runkan  jumlah  spermatozoa.  Hasil  penelitian yang  dilakukan  oleh  Agarwal et  al .  (2005)  me- nunjukkan  bahwa  pemberian  senyawa  antio- ksidan  berupa  vitamin  C  mampu  menetralisir radikal  hidroksil,  superoksid  dan  hidrogen  pe- roksida  dan  mencegah  aglutinasi  sperma,  se- lain  itu  antioksidan  juga  mampu  meningkatkan jumlah sperma in vivo pada laki-laki infertil.

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa: 1.  Perbedaan  umur  mencit  jantan  (muda  dan tua),memperlihatkan beda nyatapada jumlah spermatogonia,namun  tidak  terdapat  beda nyata pada jumlah spermatozoa.
2.  Ekstrak lada hitam mampu menghambat pe- nurunan    jumlah  spermatogonia,  namun  ti- dak mempengaruhi jumlah spermatozoa  pa- da mencit
3.  Jumlah  spermatogonia  mencit  jantan  usia tua yang diberi ekstrak lada hitam meningkat secara nyata jika dibandingkan dengan yang tidak diberi ekstrak lada hitam.

## DAFTAR PUSTAKA
Agarwal,  A.,  Prabakaran  S.,  and  Said  T.  2005. Prevention  of  Oxidative  Stress  Injury  to Sperm. Journalof Andrology . 26(6):54-60. Droge,  W.  2002.  Free  Radicals  in  The Physiological  Control  of  Cell  Function. Journal of Physiology.Review. 82. :47-95. Gulcin,  I.  2005.  The  Antioxidant  and  Radical Scavenging  Activities  of  Black  Pepper ( Piper nigrum L.)Seeds. International Journal
of Food Sciences and Nutrition . Vol. 56, No. 7:491-499. Halliwell  B,  Whiteman  M.  Measuring.  2004. Reactive
Species
and
Oxidative DamageIn Vivo and Cell Cultu- re. International  Journal  of  Pharmaceu- tical  Sciences  and  Research;  Vol. 142:231-55. Majeed  and  Prakash  L.    2000.  The  Medicinal Uses  of  Pepper. International  Pepper News.Vol.25, No. 1:23-31. Meghwal,  M.  and  Goswami  K.  2012.Nutritional Constituent  of  Black  Pepper  as  Medi- cinal  Molecules. ArticleReview  1:  129. doi:10.4172/scientificreports.12. Pangkahila, W. 2007. Memperlambat Penuaan, Meningkatkan Kualitas Hidup .  Anti Aging Medicine.Cetakan  ke-1 .  Buku  Kompas. Jakarta.
Rismunandar.    1992. Rempah-rempah  Komo- diti  Ekspor  Indonesia .  Sinar  Baru. Bandung. Soehadi, K., Arsyad K. 1983. Analisis Sperma. Airlangga University Press. Surabaya. Troen  B.  2003.  The  biology  of  aging. Mount Sinai. Journal Medica. Vol 70:3-22.
Wibisono,  M.  2001.  Pemanfaatan  Vitamin  C untuk  Meningkatkan  Jumlah  Spermato- zoa  pada Mus  musculus yang  Dipapar Gelombang Ultrasonik. Jurnal Media Me- dika,  Fakultas  Kedokteran .  Juli-Septem- ber  2002.Universitas  Brawijaya  No.3 (20).
Zaneveld  dan  Polakosski.  1977.  Techniques  of Human  Andrology.  Dalam  Zaneveld. 1986.  Short  Course; Male  Reproduction/ Andrology  and  Non-Hormonal  Contra- ception:19. Chicago.