Profil Fitokomponen dan Aktivitas Ekstrak Metanol Daun Intaran Bali ( Azadiractha Indica Juss.) Terhadap Candida albicans ATCC-10231
Meylana Ayu Melinda * , Agung Nova Mahendra **
* Program Studi Farmasi, FMIPA, Universitas Udayana, Denpasar-Bali, Indonesia
** Departemen Farmakologi dan Terapi, Fakultas Kedokteran , Universitas Udayana, Denpasar-Bali, Indonesia

## ABSTRACT
Background: Candidiasis,  usually  caused  by Candida  albicans is  commonly  found  in  clinical settings. Resistance of C. albicans against antifungals is an emerging issue. This study was aimed to determine  the  selected  quantitative  phytocomponent  profile  and  evaluate  the  effectiveness  of intaran ( Azadiractha indica A. Juss) leaf extract from Bali in inhibiting the growth of C. albicans . Methods: This  experimental  research  was  conducted  at  the  Center  for  Marine  Aquaculture Research  and  Development  (Buleleng,  Bali),  Laboratory  Service  Unit,  Faculty  of  Agricultural Technology, Udayana University, and Microbiology Laboratory, Department of Biology, Faculty of Mathematics  and  Natural  Sciences,  Udayana  University,  Denpasar,  Bali.  Our  study  included  the preparation  of  the  methanol  extract  of intaran leaves  using  maceration  method,  phytochemical analysis, and testing the antifungal activity of the extract using the diffusion disk assay  against C. albicans ATCC-10231.
Results: Phytochemical  components  in  the  methanol  extract  of intaran Bali  leaves  were chlorophyll  (18434.47  mg/L),  total  antioxidants  (4818.07  mg/L  GAEAC),  phenol  (4391.16 mg/100gr  GAE)  and  flavonoids  (785.32  mg/100gr  QE).  The  extract  exhibited  dose-dependent effect,  with  greatest  inhibition  against C.  albicans ATCC-10231  growth  was  obtained  at  the concentration of 50%.
Conclusion: Methanol  extract  of  Balinese intaran leaves  contained  significant  amount  of chlorophyll,  total  antioxidants,  phenol,  and  flavonoids.  The  extract  showed  antifungal  activity against C.  albicans ATCC-10231.  This  anticandidal  effect  is  assumed  to  be  related  to  the phytocomponents of the extract.
Keywords: Azadiractha indica A. Juss; leaf extract; phytocomponents; antifungal activity; Candida albicans ATCC-10231

## JEKK KKK

## Pendahuluan
Berbagai  penyakit  yang  diakibatkan  oleh infeksi jamur tidak jarang ditemukan di setting klinis.  Penyakit  ini  perlu  mendapat  perhatian yang  lebih  serius  karena  seringkali  mematikan dan  menyebabkan  kematian  hingga  lebih  dari 1,5  juta  jiwa  setahun  dan  jumlah  kasus  yang lebih  dari  1  triliun  setahun. 1 Kasus-kasus infeksi  jamur  yang  berat  seringkali  muncul karena  berbagai  kondisi  yang  menyebabkan imunosupresi. 2 Salah  satu  penyakit  yang diakibatkan oleh jamur yang sering dihadapi di ranah  klinis  yaitu  kandidiasis  yang  umumnya disebabkan  oleh Candida  albicans .  Resistensi C.  albicans terhadap  berbagai  golongan  obat antijamur  merupakan  salah  satu  isu  yang bersifat  emerging  di  bidang  kesehatan,  dengan berbagai  mekanisme  yang  telah  dikaji  secara komprehensif  oleh. 3 Oleh  karena  itu,  perlu dilakukan  pengkajian  terhadap  bahan-bahan alternatif  yang  bersumber  dari  alam  sebagai sumber  obat  antijamur  yang  baru  untuk membantu mengatasi hal ini.
Flavonoid  merupakan  salah  satu  kelompok senyawa  alami  yang  berpotensi  dikembangkan sebagai antijamur. Flavonoid dapat menghambat germinasi spora jamur fitopatogen  tanaman,  oleh  karena  itu  maka bahan  alam  yang  kaya  flavonoid  diduga memiliki potensi untuk dikembangkan terhadap jamur  patogen  pada  manusia. 4 Indonesia sebagai  negara  dengan  mega-biodiversitas merupakan  “ladang emas” sumber  bahan alam kaya  flavonoid,  terutama  yang  bersumber  dari tumbuhan.    Masyarakat    setempat    umumnya mengambil    manfaat    dari  tumbuhan    untuk menggantikan    obat    modern    dalam    menjaga kesehatan dan mengobati penyakit berdasarkan  pengetahuan  empiris. 5
Salah  satu  tanaman  yang  kaya  flavonoid dan  bernilai  terapeutik  yang  banyak  digali manfaatnya  di  dunia  yaitu Azadirachta  indica A.  Juss.  Tanaman  ini  tercatat  sebagai  tanaman pertama  yang  disebut  dalam Siddha ( Siddha medicine ). Siddha adalah suatu sistem pengobatan berusia ribuan tahun yang bersumber dari India Selatan, yang sampai saat ini  masih  diterapkan  di  India,  Sri  Lanka  dan beberapa  negara  di  Asia  Tenggara. 6 Berbagai khasiat Azadirachta  indica A.  Juss.  yang
tumbuh  di  berbagai  negara  atau  area  di  luar Bali telah diteliti, dan telah dibuktikan berbagai aktivitas  farmakologiknya,  baik  secara in  vivo maupun  secara  klinis.  Sejauh  ini,  penelitian terhadap  kandungan  fitokimia  dan  khasiat  dari daun intaran yang  bersumber  dari  Bali terhadap  jamur  dari  genus Candida belum pernah dikaji. Berdasarkan latar belakang yang telah  ditunjukkan,  penting  dilakukan  kajian terhadap  profil  fitokomponen  dan  efek  daun intaran Bali  sebagai  antijamur,  khususnya terhadap C.  albicans .  Sebagai  langkah  awal, maka dilakukan profiling terhadap fitokomponen  ekstrak  daun intaran Bali, kemudian  dilakukan  pengujian  efek  inhibisi ekstrak  terhadap C.  albicans isolat  non-klinis, yaitu C. albicans ATCC-10231.

## Metode
Daun intaran diambil  dari  pohon intaran yang  tumbuh  di  areal  Universitas  Udayana, Bukit  Jimbaran,  Kabupaten  Badung,  Bali. Berat  daun  yang  diambil  adalah  300  gram. Daun  ini  selanjutnya  dicuci  dengan  air  lalu dianginkan.  Kemudian  dilakukan  pengeringan menggunakan  metode freeze  drying di  Balai Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Budidaya Laut,  Desa  Gondol,  Kecamatan  Grokgak, Buleleng.  Berat  daun  yang  diperoleh  setelah pengeringan  adalah  146  gram.  Daun  kering selanjutnya  diblender  hingga  menjadi  serbuk. Berat serbuk yang digunakan adalah 100 gram.
Sebanyak  100  gram  serbuk  daun intaran dimaserasi  dalam  1000  mL  metanol.  Maserasi dilakukan  selama  24  jam.  Hasil  maserasi selama  24  jam  tersebut  dikeringkan  dengan cara  penyaringan  untuk  memperoleh  filtrat daun intaran .  Selanjutnya  dilakukan  evaporasi terhadap larutan metanol  daun intaran . Evaporasi  dilakukan  dengan  menggunakan rotary  evaporator selama  8  jam.  Hasil  yang didapat  yaitu  ekstrak  metanol  daun intaran sebanyak 10 gram.
Ekstrak  daun intaran yang  diperoleh  dari evaporasi selanjutnya diuji untuk didapat profil kuantitatif  dari  beberapa  senyawa  aktifnya. Analisis  komponen  bioaktif  dilakukan  di Laboratorium Farmakologi dan Terapi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana .
Ekstrak  daun intaran yang  diperoleh selanjutnya  diujikan  pada C.  albicans ATCC- 10231  menggunakan  media  SDA.  Ekstrak diteteskan  pada  media  SDA  yang  sudah  diberi C.  albicans dengan  konsentrasi  25%,  50%, 75%,  95%  dalam  satu disk dan  diamati pertumbuhannya.

## Hasil
Tabel  1.  Profil  Kuantitatif  Senyawa  Terpilih Ekstrak  Metanol  Daun Intaran ( Azadiractha indica A. Juss).
Sam- pel Flavono- id (mg/100gr QE) Fenol (mg/100gr GAE) Antioksi -dan (mg/L GAEAC) Total Klorofil (mg/L) Daun Intaran 785,32 4391,16 4818,07 18434,47
Analisis  fitokimia  terhadap  ekstrak  metanol daun intaran kemudian  dilanjutkan  dengan  uji inhibisi  terhadap  pertumbuhan  C.  albicans secara in  vitro .    Hasil  uji  inhibisi  ini  dapat dilihat pada gambar 1 dan 2, serta tabel 2.
Gambar 1. Diameter zona hambat ekstrak daun intaran terhadap C. albicans .
Gambar 2. Diameter zona hambat ekstrak daun intaran terhadap C. albicans .
Tabel 2. Hasil pengukuran zona hambat ekstrak daun intaran terhadap C. albicans .
Konsentrasi (%) Diameter Zone Hambatan (mm) Candida albicans 0 0 10 11 20 13 30 15 40 17 50 18

## Pembahasan
Penelitian ini dilakukan untuk menginvestigasi  dua  hal  utama,  yaitu  kadar fitokomponen  terpilih  serta  aktivitas  inhibisi ekstrak  metanol  daun intaran Bali  terhadap C. albicans .  Dari  penelitian  yang  telah  dilakukan diperoleh  hasil  berupa  senyawa  aktif  yaitu klorofil, antioksidan total, fenol, dan flavonoid. Klorofil menunjukkan aktivitas antijamur, baik terhadap C. albicans (isolat klinis dan ATCC), maupun  spesies non-albicans dari  isolat  klinis yang  dapat  menyebabkan  mukositis  berat. Klorofil  yang  bersumber  dari  ekstrak  air Spirullina  platensis ,  pada  dosis  yang  efektif terhadap berbagai galur Candida spp., ditemukan  memiliki  profil  toksisitas in  vitro yang baik. Hal ini dapat diketahui dari efeknya yang  tidak  mempengaruhi  kontraktilitas  sel otot  polos  miometrium,  bersifat  kompatibel terhadap  mikroflora  normal  dari  vagina  dan tidak  bersifat  sitotoksik. 7 Kandungan  klorofil yang  banyak  terkandung  pada  ekstrak  metanol daun intaran sebagai  fitokomponen  membawa implikasi bahwa ekstrak ini berpotensi dikembangkan  menjadi  agen  antijamur  yang efektif  dan  toksisitas  yang  minimal.  Ada beberapa  strategi  yang  kami  ajukan  dalam menjawab  tantangan  ini  di  masa  mendatang. Pertama, kami menekankan perlunya dilakukan kajian  terhadap  efek  samping  dari  ekstrak metanol  daun intaran Bali,  khususnya  efek miotoksik  dan  sitotoksik.  Kedua,  mengingat pentingnya preservasi faktor protektif antikandidiasis  yang  alami,  maka  penting  pula dilakukan  studi  terhadap  efek  disruptif  esktrak metanol  daun intaran terhadap  pertumbuhan Lactobacillus spp.
Ekstrak  metanol  daun intaran Bali  pada penelitian  ini  juga  ditemukan  mengandung  2 kelompok  senyawa  lain  yaitu  fenol  dan flavonoid.  Dua  kelompok  senyawa  ini  dikenal sebagai  antioksidan  alami. 8 Pernyataan  ini didukung juga dengan temuan berupa kemampuan fenol total dalam ekstrak Lumbricus  rubellus dari  lahan  pertanian organik  di  Bali  yang  menunjukkan  aktivitas antioksidan in  vitro . 9 Senyawa  fenolik  sebagai antioksidan  sangat  bergantung  pada  jenis pelarut,  karena  senyawa  antioksidan  memiliki karakteristik kimia dan polaritas yang beragam. Penggunaan  pelarut  dalam  ekstraksi  sangat berpengaruh  terhadap  hasil  yang  diperoleh. 10 Dalam  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Dieu- Hien Truong et al . (2019) 11 terhadap Severinia buxifolia ditemukan  bahwa  pelarut  metanol merupakan pelarut terbaik yang dapat digunakan  dalam  ekstraksi  senyawa  aktif  dan diketahui  bahwa  ekstrak  metanol  sangat menjanjikan  dikembangkan sebagai  agen antioksidan  dan  anti-inflamasi  untuk  industri farmasi.  Ekstrak  metanol  dari  daun  tumbuhan Cassia fistula dapat dijadikan sebagai pembanding  tambahan  yang  memperkuat temuan dalam studi terhadap daun intaran Bali ini.  Pada  penelitian  yang  dilakukan  oleh Kadhim et  al .  (2016) 12 ,  ekstrak  metanol  daun Cassia fistula diketahui bahwa ekstrak mengandung  fenol  dan  flavonoid,  serta menunjukkan aktivitas anti- Candida . Konsentrasi  senyawa  fenolik  dan  flavonoid yang  tinggi  dari  suatu  ekstrak  metanol berkontribusi penting terhadap aktivitas antioksidan dan anti inflamasi ekstrak tersebut. Berdasarkan kajian literatur, flavonoid diketahui  memiliki  sejumlah  mekanisme  kerja sebagai antijamur, yaitu: (1) memicu disintegrasi  membran  sel  jamur,  (2)  inhibisi sintesis β-glucans dan chitin , (3) inhibisi rantai transport elektron, (4) inhibisi pembelahan  sel, (5)  inhibisi  aktivitas  pompa efflux ,  (6)  inhibisi sintesis  asam  nukleat  dan  protein.  Berbagai efek  ini  telah  diteliti  pada C.  albicans ,  spesies non-albicans maupun terhadap jamur patogenik dari genera Aspergillus dan Trichophyton . 13
Daya  hambat  yang  ditunjukkan  oleh ekstrak  methanol  daun intaran Bali  dalam penelitian ini bersifat dose-dependent .
Berdasarkan  temuan  analisis  fitokimia  yang didapat,  efek  antijamur  yang  ditimbulkan  oleh paparan  terhadap  ekstrak  metanol  ini  diduga terkait  dengan  adanya  klorofil,  serta  fenol  dan flavonoid. Ekstrak metanol daun A. indica dari wilayah  semi-arid  di  Nigeria,  dibandingkan dengan  ekstrak  etil  asetat  dan  ekstrak  heksan, menunjukkan  aktivitas in  vitro yang  moderat terhadap C.  albicans .  Secara  kualitatif  ekstrak daun A.  indica dari  Nigeria,  ditemukan mengandung alkaloid (fitokomponen terbanyak;  +++)  dan  fenol  (++),  namun  tidak ditemukan  adanya  flavonoid. 14 Dibandingkan dengan  studi  yang  dilakukan  oleh  Benisheikh et al . (2019) 14 ini, dari studi yang kami lakukan ditemukan  adanya  flavonoid  dalam  ekstrak metanol  daun intaran Bali.  Hal  ini  merupakan kelebihan  yang  potensial  untuk  dikaji  lebih lanjut,  mengingat  flavonoid  merupakan  salah satu kelompok senyawa yang dikenal memiliki aktivitas  antijamur  berspektrum  luas  dan multitarget. Cara kerja flavonoid yang multitarget  ini  berpotensi  mencegah  timbulnya resistensi,  sehingga  penting  untuk  kelak dibandingkan  resistensi C.  albicans terhadap komponen  bioaktif  dari  daun intaran versus obat  antijamur,  seperti  misalnya  obat  dari golongan azol.
Temuan studi in vitro ini menjadi langkah awal  bagi pengembangan ekstrak daun intaran Bali  sebagai  agen  baru  yang  berbasis  bahan alam  untuk  penatalaksanaan  kandidiasis.  Data profil  fitokomponen dari ekstrak metanol daun intaran di  Bali  dan  adanya  efek  inhibisi terhadap  pertumbuhan C.  albicans in  vitro menunjukkan  jika  bahan  alam  ini  memiliki potensi yang menjanjikan untuk dikembangkan sebagai  antikandidiasis.  Kajian  farmakologis dan  tosikologis  lanjutan  perlu  dilakukan  agar ekstrak  metanol  daun intaran Bali  sebagai salah  satu  plasma  nutfah  bangsa  Indonesia dapat  dimanfaatkan  sebagai  agen  antijamur baru,  setidaknya  sebagai  agen  terapeutik terhadap  kandidiasis  yang  disebabkan  oleh C. albicans .

## Kesimpulan
Fitokomponen  yang  terkandung  dalam ekstrak  metanol  daun intaran Bali  yaitu klorofil,  flavonoid,  fenol,  dan  antioksidan,
yang  diduga  berkontribusi  bagi  inhibisi pertumbuhan C.  albicans ATCC-10231 in vitro .  Efek  inhibisi  bersifat dose-dependent , dengan  daya  hambat  terbesar  diperoleh  pada konsentrasi 50%.

## Ucapan Terimakasih
Terimakasih  kami  sampaikan  kepada  Ida Ayu Kade  Ratna Sukmadewi, S.Si., yang telah membantu pelaksanaan disk-diffusion assay .

## Daftar Pustaka
1. Bongomin,  F.,  Gago,  S.,  Oladele,  R., Denning,  D.  2017  Global  and  Multi- National  Prevalence  of  Fungal  Diseases— Estimate Precision. J. Fungi . 3: 57.
2. Lu,  M.;  Li,  T.;Wan,  J.;  Li,  X.;  Yuan,  L.; Sun,  S.  2017.  Antifungal  effects  of phytocompounds on  Candida species alone and in combination with fluconazole. Int. J.
Antimicrobial. Agents . 49: 125–136.
3. Costa-de-Oliveira,  S.,  Rodrigues,  A.G. 2020. Candida albicans Antifungal Resistance  and  Tolerance  in  Bloodstream Infections: The Triad Yeast-Host-
Antifungal. Microorganisms . 8 (154): 1-19.
4. Jin,  YS.  2019.  Recent  advances  in  natural antifungal  flavonoids  and  their  derivatives. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters . 29 (19): 1-13.
5. Hamzah,  H.,  Hertiani,  T.,  Pratiwi,  S.U.T., dan  Nuryastuti,  T.,  2020.  Inhibitory Activity  and  Degradation  of  Curcumin  as Anti-Biofilm  Polymicrobial  on  Catheters .
International  Journal  of  Research  in Pharmaceutical Sciences . 11: 830–835.
6. Kumar,  V.S.,  Navaratnam  V.  2013.  Neem (Azadirachta indica):
Prehistory to contemporary  uses  to  humankind. Asian Pac J Trop Biomed . 3 (7): 505-514
7. Marangoni,  A.,  Foschi,  C.,  Micucci,  M., Palomino,  R.A.N.,  Toschi,  T.G.,  Vitali,  B.
et  al.  2017. In  vitro activity  of Spirulina platensis water  extract  against  different Candida species  isolated  from  vulvo- vaginal  candidiasis  cases. PLOS  ONE .  12 (11): 1-17.
8. Huyut  Z,  Beydemir  S,  Gülçin  E.  2017.
Antioxidant  and  Antiradical  Properties  of Selected Flavonoids and Phenolic
Compounds. Biochem Res. Int .  17: 1-10.
9. Sucindra  Dewi, Agung  Nova,  Widi Kencana,  Made  Jawi,  Made  Sukrama,  dan Ni  Luh  Kartini.  2017.  Ethanolic  extract  of the  powder  of  red  earthworm  (Lumbricus rubellus)  obtained  from  several  organic farmlands  in  Bali,  Indonesia:  Analysis  of total  phenolic  content  and  antioxidant capacity. Bali  Medical  Journal .  3  (3):  80- 83.
10. Salim,  E.,  Afritunando,  Y.,  Febriana,  A., dan  Mai  Efdi.  2019.  Studi  Optimasi Ekstraksi  Kandungan  Senyawa  Fenolik Total  dan  Uji  Aktivitas  Antioksidan  dari Daun  Manggis  ( Garcinia  mangostana Linn.). Jurnal Riset Kimia . 10 (1): 36-43.
11. Truong,  D.H.,  Nguyen,  D.H.,  Ta,  N.T.A.,
Bui,  A.V.,  Do,  T.H.,  Nguyen  H.C.  2019. Evaluation of the Use of Different Solvents for Phytochemical Constituents, Antioxidants, and In vitro Anti- Inflammatory Activities of Severinia buxifolia . Journal of Food Quality .1-9.
12. Mohanad  Jawad  Kadhim,  Ghaidaa  Jihadi Mohammed and Imad Hadi Hameed. 2016. In  vitro Antibacterial,  Antifungal  and Phytochemical  Analysis  of  Metanolic Extract  of  Fruit Cassia  fistula . Oriental Journal Of Chemistry . 32 (3): 1329-1346.
13. Al  Aboody,  M.S.,  Mickymarray,  S.  2020. Anti-Fungal  Efficacy  and  Mechanisms  of Flavonoids. Antibiotics . 9 (45): 1-42.
14. Benisheikh  AAG, Muhammad  FM,  Kelluri H,  Aliyu  ZM,  Mallam  UB,  Jibrin  MW.
2019. Phytochemical Extraction and
Antimicrobial  Studies  on  Crude  Leaf
Extract  of Azadirachta  indica ( Neem )  in Semi-Arid Region of Borno State, Nigeria.
International  Journal  of  Research  and Review . 6 (12): 516-522.