## THE DEGRADATION OF ANTRACENE COMPOUND USING BACTERIA ISOLATED FROM PAOTERE PORT WATERWAYS
Degradasi Senyawa Antrasena Dengan Menggunakan Isolat Bakteri Yang Berasal Dari Perairan Pelabuhan Paotere
Mirnawati 1 , Nursiah La nafie 1 , Seniwati Dali 1
1 Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Hasanuddin University, Jl. Perintis Kemerdekaan 90245, Makassar-Indonesia

## Received:  Juni 2015 Published: July 2015

## ABSTRACT
The  objectives  of  this  study  are  (1)  Determine  the  content  of  antrasena  compound  in  the  waste  oil  at  the waterway of Paotere port (2) Determine the characteristics of antrasena degradation bacteria and  (3) Determine the percentage of antrasena degradation. In this research an analysis of antrasena compound was conducted with sea water that had been polluted with oil. The next steps were to isolate and characterize the degrading bacteria of antrasena and to analyze the results of antrasena degradation. The results showed that (1) Concentration of the antrasena  compound  in  the  waterway  of  paotere  port  is  4,8x10 -10 ppm.  (2)  The  bacteria  can  degraded  of  the antracene  is Bacillus  cereus (3)  There  was  evidence  that Bacillus  cereus was  able  to  degrade  antracenr compound, the highest degradation percentage is 98,11%, it was achieved on 12 day of incubation.
Keywords : Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) antracena, isolation of bacteria biodegradation. .

## PENDAHULUAN
Minyak bumi mengandung ribuan komponen  kimia  yang  berbeda  dan  lebih  dari separuh  (50-98%)  berupa  hidrokarbon.  Produk olahan  minyak  bumi  yang  paling  banyak digunakan  adalah  bahan  bakar  diesel  yaitu  solar dan bensin . Solar tersusun atas benzena, toluena, xylena,  dan  berbagai  alkil  pada  hidrokarbon poliaromatik  sedangkan  bensin  atau  mogas ( motor  gasoline )  tersusun  atas  campuran monomer heptana dan oktana. Senyawa-senyawa ini akan menimbulkan efek kronik pada mamalia seperti  gangguan  imunologis,  reproduktif,  serta timbulnya  efek  fetotoksik  dan  genotoksik (Herdiyanoro, 2005)
Salah  satu  pelabuhan  di  Makassar  adalah pelabuhan  paotere  diperuntungkan  bagi  kapal perintis  dan  kapal  pinisi.Limbah  kapal  tersebut menghasilkan  limbah  minyak  yang  berasal  dari bahan  bakar  solar  maupun  bensin  yang mengandung senyawa  hidrokarbon poliaromatik. Antrasena  merupakan  senyawa  hidrokarbon poliaromatik  yang  merupakan  senyawa  polusi yang  dapat  memberikan  efek  yang  negatif terhadap  suatu  perairan  dengan  kata  lain
mempengaruhi  kwalitas  air  suatu  perairan. Kegiatan  anjungan  minyak,  pembakaran  minyak bumi  yang  tidak  sempurna  akan  menghasilkan buangan yang mengandung senyawa HAP.
Banyak cara yang dilakukan untuk mengatasi pencemaran lingkungan akibat limbah minyak  bumi,  salah  satunya  adalah  dengan melibatkan agen biologis berupa mikroorganisme  yang  memiliki  kemampuan mendegradasi senyawa hidrokarbon yang terdapat di dalam minyak bumi menjadi mineral- mineral yang lebih sederhana (Goenadi, 2003).
Secara  alamiah  proses  pemulihan  oleh mikroorganisme  di  suatu  media  tercemar  sudah terjadi dengan sendirinya, namun proses pemulihan  tersebut  terjadi  sangat  lambat  karena pengaruh  fisik,  kimia  dan  biologis  di  lokasi pencemaran  yang  kurang  atau  tidak  mendukung aktivitas  mikroorganisme  dalam  mengurangi atau  menghilangkan  kadar  bahan  pencemar. Selain  itu,  jumlah  dari  bahan  pencemar  juga melebihi  kemampuan  mikroorganisme  tersebut sehingga terjadi akumulasi bahan pencemar.
Teknik  pemulihan  lahan  tercemar  oleh minyak bumi yang dilakukan dengan menggunakan kemampuan mikroorganisme dalam  mendegradasi  struktur  hidrokarbon  ini
dikenal dengan istilah bioremediasi. Bioremediasi banyak digunakan dalam pemulihan pencemaran lingkungan akibat minyak bumi karena lebih efektif dan berwawasan  lingkungan  dibandingkan  dengan metode  pemulihan  lingkungan  baik  secara  fisika maupun kimia (Nugroho 2006).
Kelompok bakteri yang dapat mendegradasi senyawa  HAP  adalah mycobacterium  sp, bacillus,  pseudomonas  sp. Tingkat  biodegradasi terhadap senyawa fenantren dari isolat Pseudomonas  sp  Kalp3b22  asal  Kumai  terbukti dapat  mendegradasi  Fenantren  sebesar  59,5  % selama  29  hari  kultivasi.  Model  molekul fenantren  terbukti  bahwa  bakteri  ini  mampu mendegradasi  pada  tahap  pembukaan  cincin aromatik (Murniasih, 2009).
Isolat  indigenus  bakteri Pseudomonas putida dan Pseudomonas  diminuta merupakan bakteri  gram  negatif,  bersifat  aerobik,  berbentuk batang dan dapat mendegradasi polutan terutama hidrokarbon  aromatik.  Kedua  isolat  ini  dapat digunakan untuk menentukan kenitika biodegradasi  baik  dalam  koloni  tunggal  maupun kultur tercampur (Kurniawan. 2012).
Mengingat  limbah  HAP  yang  terdapat  pada pelabuhan  paotere  berbahaya  bagi  ekosistem laut, maka perlu suatu metode untuk mendegradasi  senyawa  antrasena.  Penggunaan bakteri pendegradasi hidrokarbon pada lingkungan  yang  tercemar  minyak  akan  lebih efektif  apabila  bakteri  tersebut  berasal  dari sumbernya.  Berdasarkan  informasi  tersebut, maka perlu dilakukan penelitian ini.

## METODOLOGI
Bahan Sampel air laut, antrasena (merk), diklorometan  (merk),  Na 2 SO 4 anhidrat, alkohol, pepton, yeast    extract ,  glukosa,  agar,  air  laut steril, aquades, spiritus, gas nitrogen.

## Alat
Cawan petri, erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur,  jarum  ose,  bunsen,  spatula,  pipet  volum, kertas  saring, hot  plate , magnetic  stirrer , autoclave , oven, incubator, spektro UV-Vis, GC- MS  (Agilent  7890),  PCR-Real  time  Pocit- Generaach,  GPS,  pH  meter,  termometer, refraktometer, timbangan analitik, alat ultrasonik, mikroskop, hot plate, oven, pengaduk,  botol  vial,  plastik  wrab,  aluminium voil, tisu, botol semprot, kertas pH (merk), spoid, sarung tangan, lampu spiritus.

## Prosedur kerja
A. Pembuatan  larutan  Standar  (Salenda,
2011)

## 1. Pembuatan Larutan Induk antrasena 1000 mg/L
Larutan  induk  antrasena  1000  mg/L  dibuat dengan  melarutkan  0.025  gantrasena  dengan diklorometan.  Setelah  larut  dimasukkan  ke dalam  labu  ukur  25  mL  kemudian  diencerkan dengan  diklorometan  hingga  tanda  batas  dan dihomogenkan

## 2. Pembuatan Larutan Internal Standar antrasena 50 mg/L
Larutan  internal  standar  antrasena  50  mg/L dibuat  dari  larutan  induk  1000  mg/L.  Larutan induk  dipipet  sebanyak  0,5  mL  kedalam  labu ukur  10  mL  kemudian  diencerkan  dengan diklorometan hingga tanda batas dan dihomogenkan.

## B. Analisis antrasena dalam air laut (Salenda, 2011)
Air  laut  dipipet  sebanyak  5  mL  ke  dalam botol kaca, setelah itu ditambahkan 5 mL pelarut diklorometan.  Diekstraksi  menggunakan  alat ultrasonik selama 15 menit. Selanjutnya supernatan  dipindahkan  ke  dalam  erlenmeyer, residu  diekstraksi  kembali  dengan  cara  yang sama sebanyak 2 kali dengan 5 mL diklorometan menggunakan  ultrasonik  selama  15  menit.  Hasil ekstrak/supernatan  dikumpul  pada  erlenmeyer dan  pelarut  diuapkan  dengan  menggunakan  gas nitrogen  hingga  1  mL,  kemudian  ditambahkan natrium sulfat anhidrat, dipipet 0,5 mL ke dalam botol vial untuk diinjeksikan ke alat Kromatografi Gas Spektrofotometri massa.
C. Pengayaan
Bakteri pendegradasi

## (Nasikhin dan Maya,2013)
Pengayaan  bakteri  pendegradasi  dilakukan menggunakan  media    selektif  secara  aseptis. Media  selektif  dibuat  dari  pepton  0.4  g, yeast extract 0.2 g, dilarutkan dalam 1000 mL air laut steril.  Media  selektif  kemudian  dihomogenkan, disterilisasi  dan  ditambah  dengan  50  mg/L antrasena.Media  kemudian  dituang  ke  dalam erlenmeyer  500  mL  masing-masing  volumenya 25  mL.  Media  ini  digunakan  untuk  pengayaan bakteri  pendegradasi  antrasena  tahap  pertama, kedua dan ketiga.
Pengayaan  tahap pertama dilakukan dengan cara  menambahkan  25  mL  sampel  air  laut  yang diambil  dari  perairan  tercemar  diperairan
pelabuhan Paotere, dimasukan ke dalam erlenmeyer  berisi  media  selektif  dan  di shaker pada  suhu  ruang  selama  7  x  24  jam  dengan kecepatan  150  rpm.  Sebelum  dan  sesudah  masa inkubasi,  dilakukan  pengamatan  OD(optical density)  pada  panjang  gelombang  600  nm. Kontrol  pada  pengayaan  tahap  pertama  ini adalah media minimal tanpa penambahan sampel air laut.
Tahap  selanjutnya  adalah  pengayaan  tahap kedua.  Sumber  inokulum  adalah  pengayaan tahap  pertama  yang  berusia  tujuh  hari.Biakan bakteri  25  mL  dan  dibiakkan  ke  dalam erlenmeyer  yang  berisi  25  mL  media  minimal baru.  Pertumbuhan  bakteri  pada  tahap  ini  juga dideteksi  sebagaimana  tahap  pertama.  Tahap terakhir  adalah  pengayaan  tahap  ketiga.  Metode yang  digunakan  sama  dengan  pengayaan  kedua dan  sumber  inokulum  yang  digunakan  adalah pengayaantahap kedua yang berusia 7 hari.

## D. Isolasi  dan  Pemurnian  Bakteri  (Nasikhin dan Maya,2013)
Isolasi  bakteri  dilakukan  dengan  metode tuang  (pour  plate)  secara  aseptis.Sumber  isolat berasal dari pengayaan tahap ketiga. Media yang digunakan  adalah media PCA  (5.0 g pepton,  2.5 g yeast  extract ,  1.0  g  glukosa  dan  14.0  g  agar dalam  1000  ml  aquades  steril)  yang  sudah disterilisasi.  Cawan  Petri  berisi  isolat  bakteri kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 o C selama 2 x 24 jam.
Isolat  tunggal  yang  tumbuh  di  permukaan media dimurnikan ke media baru dengan metode gores  dan  diinkubasi  1  x  24  jam.  Pemurnian dilakukan  secara  bertahap  sampai  diperoleh isolat biakan murni melalui pengamatan mikroskopis.
E. Karakterisasi
Bakteri(Nasikhin dan Maya,2013)
Bakteri  diidentifikasi  berdasarkan  karakter biokimiawinya  secara  bertahap  (step  ways) sesuai  dengan  kunci  dikotomi Bergey’s  manual of  determinative  bacteriology .  Isolat  yang digunakan  untuk uji biokimia merupakan  biakan murni dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 x 24  jam.Selanjutnya  dilakukan  analisis  DNA menggunakan PCR.
F. Biodegradasi antrasena
1. Pertumbuhan bakteri pendegradasi antrasena (Nasikhin dan Shovitri, 2013).
Isolat  murni  yang  sudah  dikarakterisasi dibiakkan  kembali  dalam  media.  Sebelumnya, dibuat  terlebih  dahulu  starter  berusia  1x24  jam. Diambil  10  mL  starter  dimasukkan  dalam  100 mL  media  dan  diinkubasi  di  rotary  shaker  pada suhu  ruang  selama  7  x  24  jam.  Selama  masa inkubasi, pertumbuhan isolat diukur berdasarkan kerapatan optik pada panjang gelombang 600 nm setiap  24  jam.  Ada  dua  kontrol  pada  tahap  ini yaitu kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif merupakan isolat bakteri yang ditumbuhkan pada media selektif tanpa antrasena sedangkan  kontrol  negatif  merupakan  media minimal  dengan  antrasena,  namun  tanpa  isolat bakteri. Hasil pengukuran pertumbuhan dibandingkan  dengan  kontrol  positif  dan  negatif selanjutnya  digunakan  untuk  membuat  kurva pertumbuhan.
2. Perubahan konsentrasi antrasena
a. Pembuatan  prekultur  bakteri  (sarbini, 2012)
Erlenmeyer  yang  berisi  media  minimal  dan substrat  antrasena  50  mg/L  dihomogenkan dengan  menggunakan magnetic  stirrer. Media disterilkan selama 15 menit kemudian ditambahkan  bakteri  yang  telah  diinokulasi. Prekultur  bakteri  di  inkubasi  dalam shaker incubator selama 24 jam pada suhu 37 0 C dengan kecepatan 150 rpm.

## b. Pembuatan kultur bakteri
Erlenmeyer  yang  berisi  media  minimal  dan substrat  antrasena  50  mg/L  dihomogenkan dengan  menggunakan magnetic  stirrer. Media disterilkan selama 15 menit dan ditambahkan 10 mL  kultur  bakteri,  diinkubasi  pada  suhu  37 0 C dengan  kecepatan  150  rpm  dan  waktu  inkubasi selama ± 12 hari.
c. Pengukuran konsentrasi antrasena (Murniasih,dkk, 2009)
Sebanyak  5  mL  larutan  kultur  diekstrak dengan  diklorometan,  kemudian  diambil  fasa organiknya,  selanjutnya  untuk  menghilangkan kandungan  air  ditambahkan  natrium  sulfat.  Fase organik  dipekatkan  hingga  volume  akhir  1mL, kemudian dilakukan analisa dengan GC-MS.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Analisis Antrasena Dalam air laut
Dari  data  pada  tabel  1  dan  gambar  1  dapat dilihat  konsentrasi  antrasena  yang  diperoleh yaitu  4,8x10 -10 ppm    pada  titik  C.  Terdapatnya antrasena  C  di  sebabkan  karena  lokasi  sampling dekat dengan pelabuhan Pelni. Sumber pencemar dapat  berasal  dari  aktivitas  transport  laut  berupa buangan serta tumpahan minyak. Aktivitas pasar ikan di sekitarnya turut mempengaruhi keberadaan  pencemaran  karena  menghasilkan limbah organik.
Gambar 1.Kromatogram air laut pada titik C
Tabel 1 Data konsentrasi antrasena dalam sampel air laut Sampel Konsentrasi antrasena (ppm) Titik A - Titik B - Titik C 4,8x10 -10
Untuk titik A dan B tidak terdapat senyawa antrasena  di  sebabkan  karena  lokasi  sampling barada jauh dari pesisir pantai jadi kemungkinan untuk terkontaminasi oleh limbah minyak sangat kecil.

## B. Karakterisasi Bakteri
1. Analisis  Molekul  Gen  16S  rRNA  Isolat Bakteri Karakterisasi  molekul  gen  16S  rRNA
bakteri dilakukan dengan mengidentifikasi urutan  pasangan  molekul  gen  DNA  melalui metode Polimerase Chain Reaction (PCR). Hasil sekuensing  molekul  gen  DNA  diolah  dengan menggunakan  perangkat  software Bioedit versi 7.2.5,  sehingga  diperoleh  urutan  molekul  gen isolat  terhadap molekul DNA database yang  ada pada GenBank ,  dimana  molekul  gen  16S  rRNA bersifat  universal  pada  bakteri,  dari  hasil amplikasi isolat di atas dapat disimpulkan bahwa
bakteri  yang  dihasilkan  adalah  jenis  bacillus. Untuk  mengetahui  karekterisasi  bakteri  bacillus dapat  dapat  dibandingkan  dengan  urutan  RNA sampel (Alamri 2012 dalam Marzuki, 2015).
Hasil amplifikasi isolat Keterangan: S1 = sampel Ladder 100bp   = standar 996bp = area sampel

## Gambar 2 Indentifikasi PCR
Sekuen  DNA  gen  16S  rRNA  ini  dianalisis dengan program BLAST ( Basic Local Alignment Search  Tool )  dari  NCBI  ( National  Center  for Biotechnology  Information ).  Hasil  pensejajaran sekuen sampel dengan sekuen GenBank menunjukkan  kesamaan  deret  homolog  yang tinggi, yang ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool) bakteri Sampel Sekuen Sampel Sekuen GenBank Identitas (%) Spesies Isolat 1-542 542- 1498 942/960 (98%) Bacillus cereus B12 16S
Dari  hasil  BLAST  Analisis  urutan  sekuen DNA  sampel  isolat  memiliki  kesamaan  genus yang  tinggi  yaitu  98%  dimana  isolat  tersebut teridentifikasi jenis Bacillus cereus .
C. Biodegradasi Antrasena 1. Pertumbuhan Bakteri Dalam Kultur

## Biodegradasi
Berdasarkan  Gambar  3  di  atas  untuk  isolat dapat  dilihat,  bahwa  pada  hari  ke  0  sampai  hari ke  1  terjadi  fase  adaptasi  lingkungan,  fase  ini merupakan  penyesuaian  diri  bakteri  terhadap lingkungan.  Fase  eksponensial  terjadi  pada  hari ke  1  sampai  ke  4  dimana  terjadi  peningkatan
jumlah bakteri. Hal ini disebabkan karena bakteri telah  beradaptasi  dengan  lingkungannya  serta nutrisi  yang  tersedia  dalam  media  mencukupi untuk kelangsungan hidup dan perkembangbiakan bakteri.
Pertumbuhan  optimum    bakteri  terjadi  pada hari ke 5 dengan nilai OD yaitu 0.279 dan mulai menurun  pada  hari  ke  6,  sedangkan  kontrol  (+) pertumbuhan  optimum  terjadi  pada  harike  5 inkubasi.  Kecepatan  pertumbuhan  tergantung dari  kadar  substrat,  oleh  karena  itu  menurunnya kecepatan  pertumbuhan  sudah  terjadi  ketika kadar  substrat  berkurang  sebelum  substrat  habis terpakai.  Dengan  demikian  pengalihan  dari  fase eksponensial ke fase stasioner terjadi berangsung-angsur.  Faktor-faktor  lain  yang menyebabkan menurunnya kecepatan pertumbuhan  antara  lain  kepadatan  populasi yang  tinggi  dan  terjadinya  akumulasi  bahan toksik,  namun  pada  hari  ke  7  terlihat  bahwa masih  banyaknya  bakteri  yang  hidup.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  bakteri  tersebut  memiliki fase  pertumbuhan  yang  panjang.  Adanya pertumbuhan bakteri pada kontrol (-) disebabkan karena terjadinya kontaminasi selama pengerjaan.
Pada  Gambar  3  dapat  dinyatakan  isolat mampu  mendegradasi  antrasena.  Hal  ini  dapat dilihat  dari  perbandingan  nilai Optical  Density (OD)  antara  media  pertumbuhan  dengan  kontrol positiif  (+)  dan  kontrol  negatif  (-).  Pertumbuhan
bakteri  tumbuh  lebih  baik  dibandingkan  dengan kontrol  (+)  dan  kontrol  (-).  Hal  ini  berarti  isolat tersebut kemungkinan besar mampu memanfaatkan antrasena sebagai sumber karbon, sedangkan  pada  kontol  (+)  dengan  tidak  adanya penambahan antrasena menyebabkan berkurangnya  bakteri  yang  tumbuh  dimana bakteri  hanya  memanfaatkan  media  sebagai sumber nutrisinya.
Pada Tabel 3 di atas dari hari ke 0 sampai hari ke  12  terbentuk  senyawa  baru,  dimana  senyawa yang  terbentuk  lebih  sederhana  dan  memiliki tingkat  toksisitas  yang  rendah  dibandingkan antrasena.
Tabel 3 hasil pembentukan senyawa lain selama
proses degradasi Hari Waktu  Retensi (RT) Senyawa yang terbentuk 0 21.54 Antrasena 4 10.67 Morpholine-4- Carbaldehyde 8 18.85 Hexana 12 3.81 Asam aseat
Kecepatan  proses  biodegradasi  antrasena dipengaruhi  oleh  kelarutan  sumber  karbon antrasena  dalam  media  pertumbuhan.  Data perubahan  konsentrasi  antrasena  sebagai  sumber karbon  tunggal  pada  media  pertumbuhan  oleh Bacillus cereus ditunjukkan pada Tabel 4.
Tabel 4 Data perubahan konsentrasi antrasena dan % degradasi antrasena dari Bacillus cereus
Waktu Inkubasi (hari) Konsentrasi (ppm) % Degradasi 0 9,0x10 -9 - 4 2,1x10 -9 76,66 8 1,7x10 -9 81,11 12 1,7x10 -10
98,11
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 2 4 6 8 OD Waktu Inkubasi (Hari) Sampel A Control + Control- Gambar 3 Kurva Pertumbuhan Bakteri
pandegradasi antrasena
Konsentrasi antrasena dalam kultur biodegradasi selalu terjadi penurunan dari hari ke hari.  Hal  ini  disebabkan  karena  antrasena  telah terdegradasi  oleh  bakteri,  penurunan  konsentrasi antrasena  menyebabkan  persen  degradasinya meningkat.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  diperoleh maka dapat disimpulkan sebagai berikut: 1. Konsentrasi  antrasena  yang  diperoleh  dari ketiga  titik  sampling  adalah  titik  C  sebesar 4x10 -10 ppm,  sedangkan  titik  A  dan  B  tidak terkontaminasi antrasena.
2. Hasil  karakterisasi  molekul  gen  16S  rRNA isolat  bakteri  pendegradasi  antrasena  yaitu Bacillus  cereus .  Hasil  BLAST  untuk  isolat tersebut  mencapai  tingkat  kesamaan  genus tinggi yaitu mencapai 98%.
3. Degradasi  senyawa  antrasena  oleh Bacillus cereus pada  hari  ke  4    sebesar  76,6%,  pada hari  ke  8  sebesar  81,11%,  sedangkan  pada hari ke 12 sebesar 98,11%.

## DAFTAR PUSTAKA
Atlas, R. M., dan Bartha, R., 1981. Microbiology Ecology  Fundamentals  and  Applications . Addison Wesley Publishing Company, Inc.
Augustine,  D.,  2008. Akumulasi  Hidrokarbon Aromatik  Polisiklik  (PAH)  dalam  Kerang Hijau  (Perna  Viridis.L)  di  perairan  Kamal Muara,Teluk  Jakarta .  Fakultas  Perikanan dan Ilmu Kelautan.Institut Pertanian Bogor. Chapman, P.J., et.el., 1995. fossil fuel biodegradation ; laboratory study.
Environmental Health perspectives. 203.
Charlena-et.al.,  2009.  Degradasi  hidrokarbon pada  tanah  tercemar  minyak  bumi  dengan isolate  A  10  dan  D  8.  Jurnal  biosains.
Seminar Nasional Sain II. Bogor.
Darmadi Rifni, 2011. Eksplorasi spons (Porifera), spong atau (porifera) 830 spesies dengan kelas yaitu Calcerea, Demospongiae , dan Hexactinellidae, Bioremoval, Metode. Herdiyantoro, D., 2005. Biodegradasi
Hidrokarbon Minyak Bumi oleh Bacillus sp. Galur  ICBB  7859  dan  ICBB  7865  dari Ekosistem  Air  Hitam  Kalimantan  Tengah dengan  Penambahan  Surfaktan .Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor.
Freedman. B. 2009. Oil Pullution, environmental  ecology  the  impact  of pollution and other stresses on ecosystemstructure function . Academic
press. Inc USA.
Foght,  J.  M.,  dan  Westlake,  D.W.S.,  1987.
Bioremediation of hydrocarbons in freshwater. In:Vandermeulen& Hrudey (Ed). Oil in Freshwater : Chemistry, Biology,Countermeasure Technology. Pergamon Press, New York,213-217. Jaringan Advokassi Tambang 2004. Gali beritaP: Pantai Balikpapan tercemar, http://www.jatam.org, (5 januari 2013). Juhasz, A. L., dan Naidu,R., 2000.
Bioremediation  of  high  molecular  weight polycyclic  aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene . Int. Biodeterior. Biodegrad 45 : 57-88.
Johnson,  J.  S.,  Woolhouse  J.  K.,  Prommer,  H., Barry,  A.  D  dan  Christofi,  N.,  2003. Contribution of Anaerobic Microbial Activity  to  Natural  Attenuation  of  Benzene in Groundwater. Eng.Geol . 70 : 343-349. Killops,  S.  D.,  dan  Killops,  V.  J.,  1993. An introduction  to  Organic  Geochemistry .John Wiley and Sons, Inc. New York.
Kurniawan.  A.,  2012.  The  Isolation  and identification  of  petrofilic  bacteria  bacteria from  Total  Petroleum  Hydrocarbons  (TPH) residues  under  1%  (w/w)  of  bioremediation process result. ITS-ECO campur.
Mueller,  J.  G.,  Cerniglia.,  dan  Pritchard,  P.  H., 1998. Bioremidiation  of  Environments Contaminated  with  Polycyclic  Aromatic Hydrocarbon. In : Bioremidiation : Principles  and  Application. ed R.L.  Crawford & D.L.Crawford.
Cambridge University Press. Cambridge.
Mustaller, 1996. Natural resources and development .  Mungrave  forest,  institute  for scientific  cooperation,  maier,  Rottenberg, federal of journal Germany.
Murniasih,T.,  Yopi.,  dan  Budiawan.,  2009. Biodegradasi  Fenantren  oleh  Bakteri  Laut Pseudomonas  sp  KalP3b22  Asala  Kumai Kalimantan  Tengah .  Makara  Sains 13(1):
77-80.
Nasikhin.,  dan  Shovitri,  M.,  2013.  Isolasi  dan Karakterisasi  Bakteri  Pendegradasi  Solar dan  Bensin  dari  Perairan  Pelabuhan
Gresik . ITS. Jurnal  Sains  dan  Seni  Pomits 2(2): 2337-3520.
Nugroho,  S.  H.,  2003. Degradasi  Minyak  Bumi
Melalui Mikroorganisme . Situs Kimia.Akses tanggal 9 Oktober 2014.
Pagoray,  H.,  2003. Lingkungan  Pesisir  dan
Masalahnya sebagai dearah aliran buangan limbah.  http://www.yahoo.com (5  januari
2013). Pastra.  D.A.,  2011.  Penapisan  bakteri  yang bersimbosis dengan spons jenis Aplysina sp sebagai  penghasil  antibakteri  dari  perairan pulau Tegal Lampung, universitas
Sriwijaya.
Peraturan Pemerintah RI Nomor 18 Tahun 1999, Tentang Pengelolaan Bahan Berbahaya dan Beracun.
Pikoli.  M.R.P.,  Aditiawati,  &  D.I.  Astuti  2000.
Isolasi  bertahap  dani  dentifikasi  isolate bakteri  termofilik  pendegradasi  minyak bumi  dari  sumur  bangko.  Jurusan  Biologi, ITB, Bandung.