## KRISTALISASI PELARUT SUHU RENDAH PADA PEMBUATAN FRAKSI KAYA VITAMIN E MENGANDUNG TOKOTRIENOL DARI DISTILAT ASAM LEMAK MINYAK SAWIT
[Low Temperature Solvent Crystallizationin Tocotrienol Containing Vitamin E Rich Fraction Preparation from Palm Fatty Acid Distillate]
Kgs Ahmadi 1) *, dan Teti Estiasih 2)
1) Program Studi Teknologi Industri Pertanian – Universitas Tribhuwana Tunggadewi Jl. Telaga Warna – Tlogomas - Malang
2) Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan – Universitas Brawijaya Jl. Veteran – Malang
Diterima 05 November 2010 / Disetujui 10 Oktober 2011

## ABSTRACT
Palm Fatty Acid Distillate (PFAD) is a by-product of physical refining of CPO (Crude Palm Oil) in deodorization process. PFAD is a potential source  of  natural  vitamin  E,  that  besides  tocopherol,  also  contains  tocotrienol.  Both  have  functions  as  antioxidant  and  vitamin.  This  research studied a method for obtaining vitamin E rich fraction that contained tocotrienol by low temperature hexane solvent crystallization. The elucidation factors  were  ratio  of  solvent  to  unsaponifiable  fraction  of  PFAD(5:1,  6:1,  and  7:1)  and  crystallization  temperature  (-20,  -10,  and  0°C).  The experiment was conducted in factorial completely randomized design. The research showed that PFAD contains high tocotrienol. Low temperature solvent crystallization of unsaponifiable fraction  gave 33.88% increase ofvitamin E concentration  compared to control. Temperature and ratio of solvent to unsaponifiable fraction affected enrichment of vitamin E in PFAD. Later, saponification increased  vitamin E content in unsaponifiable fraction  of  PFAD.  Enrichment  of  tocopherol  was  higher  than  that  of  tocotrienol,  supposed  as  a  result  of  improper  separation  process  in crystallization stage. Modulation of Vitamin E concentration during saponification of PFAD increased antioxidant activity compared to unsaponifiable fraction. The best result was achieved at ratio of solvent to unsaponifiable fraction of 6:1 and crystallization temperature of -10°C.
Key words: low temperature, solvent crystallization, vitamin E, tocotrienol, palm fatty acid distillate

## 1 PENDAHULUAN
Distilat asam lemak minyak sawit (DALMS) merupakan hasil samping  pengolahan  minyak  sawit  dan  dihasilkan  pada  tahap deodorisasi.  Jumlah  DALMS  yang  dihasilkan  pada  proses pengolahan sawit di Indonesia mencapai 4,14 juta ton (Ekonomi dan  Bisnis,  2007).  Menurut  Lewis  (2001)  DALMS  merupakan salah  satu  sumber  vitamin  E  alami.  Musalmah et  al .  (2005) menyatakan keunggulan DALMS adalah sebagian besar vitamin E dalam bentuk tokotrienol (70%) dan sisanya adalah tokoferol (30%).  Tokotrienol  mempunyai  efek  fisiologis  yang  lebih  baik dari  tokoferol  (Ng et  al .,  2004;  Nesaretnam et  al .,  2004; Musalmah et al ., 2005; Wali dan Sylvester, 2007).
Ahmadi  (1997)  telah  mengembangkan  proses  pemisahan fraksi  kaya  tokoferol  dari  DALMS  dengan  teknik  saponifikasi dan  adsorpsi.  Komponen  yang  terdapat  dalam  fraksi  tidak  ter- sabunkan adalah vitamin E dan sterol (Watanabe et al ., 2004). Fraksi ini mengandung 86% tokoferol yang ada dalam DALMS, tetapi  kadar  tokoferol  pada  fraksi  ini  masih  rendah  yaitu 27,909,23  g/g  (Pitoyo,  1991).  Pemurnian  tokoferol  dengan teknik  adsorpsi  menggunakan  zeolit  menunjukkan  kemurnian tokoferol masih rendah (Ahmadi, 1997). Penelitian ini mengem- bangkan  teknik  lain  untuk  meningkatkan  kadar  vitamin  Edari fraksi  tidak  tersabunkan  DALMS.  Teknik  tersebut  juga  harus mampu  memisahkan  tokoferol  dari  tokotrienol  sehingga  di- peroleh fraksi kaya vitamin E yang mengandung tokotrienol.
*Korespondensi Penulis : Email : kgs.ahmadi@yahoo.com
Teknik  yang  telah  dicoba  pada  proses  pembuatan konsentrat vitamin E dari minyak nabati meliputi metilasi kimia, distilasi  molekuler,  dan  fraksinasi  etanol  (Nagao et  al .,  2004), adsorpsi  dengan  adsorben  (Ahmadi,  1997;  Chu et  al .,  2004; Chu et  al., 2005;  Wan et  al. ,  2008),  ekstraksi  dengan  cairan superkritis  (Ibanez et  al .,  2002),  enzimatis  dan  distilasi molekuler  (Watanabe et  al., 2004),  serta  kombinasi  distilasi, saponifikasi,  dan  winterisasi  (Lewis,  2001).  Teknik-teknik  ter- sebut  rumit  dan  umumnya  melibatkan  suhu  tinggi.  Isomer vitamin  E  sangat  peka  terhadap  suhu,  cahaya,  dan  oksigen (Park et al ., 2007).
Fitosterol dari fraksi tidak tersabunkan DALMS seperti sterol dan hidrokarbon pada suhu tertentu mengkristal sehingga dapat dipisahkan  dengan  vitamin  E.  Menurut  Gapoor et  al .  (2002) fitosterol dapat dipisahkan dari fraksi lain dalam DALMS melalui teknik  kristalisasi.  Teknik  ini  dapat  digunakan  untuk  memisah- kan vitamin E dengan fitosterol.
Tokotrienol dengan tokoferol dapat dipisahkan dengan cara manipulasi  suhu  kristalisasi  karena  keduanya  mempunyai perbedaan titik beku. Tokoferol mempunyai titik beku 2,5-3,5°C (Anonymous,  2007)  dan  tokotrienol  karena  bersifat  lebih  tidak jenuh  diduga  mempunyai  titik  beku  yang  lebih  rendah.  Kedua jenis vitamin E tersebut mempunyai sedikit perbedaan polaritas akibat  perbedaan  kejenuhan  pada  rantai  samping  struktur molekulnya.
Keunggulan  kristalisasi  pelarut  adalah  penggunaan  suhu rendah dan mudah diaplikasikan dengan peralatan sederhana. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengkaji  suhu  kristalisasi  dan
nisbah fraksi tidak tersabunkan DALMS pada pembuatan fraksi kaya vitamin E mengandung tokotrienol.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  DALMS yang diperoleh dari industri pengolahan CPO PT Salim Ivomas Pratama  Surabaya.  Standar  vitamin  E  ( -tokoferol  dan  -,  -, -tokotrienol)  dan  DPPH  ( 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) dari Sigma  Co.,  methanol,  KOH,  etanol,  kloroform,  asam  asetat, natrium  tiosulfat,  pati,  KI,  gas  nitrogen,  asam  askorbat,  HCl, heksana,  BaCl 2 ,  Na 2 SO 4 (p.  a.  dari  Merck),  heksana  (teknis), kertas  saring  kasar,  dan  kertas  saring  Whatman  No.  1. Peralatan  yang  digunakan  meliputi  perangkat  HPLC  Beckman dengan  kolom  C18, freezer ,  inkubator, rotary  evaporator (Buchii), spektrofotometer (Spectronic), termometer digital, dan penangas air. Penelitian ini meliputi tahap saponifikasi DLAMS dan  kristalisasi  pelarut  suhu  rendah  fraksi  tidak  tersabunkan DALMS.

## Saponifikasi DALMS
Saponifikasi  dilakukan  pada  DALMS  untuk  memisahkan asam  lemak  bebas  dengan  fraksi  tidak  tersabunkan. Saponifikasi dilakukan dengan metode Ahmadi (1997). Sebelum digunakan  DALMS  dan  fraksi  tidak  tersabunkan  DALMS dianalisis  untuk  mengetahui  kadar  dan  jenis-jenis  vitamin  E, aktivitas  antioksidan,  bilangan  peroksida,  kadar  asam  lemak bebas, dan rendemen.

## Kristalisasi pelarut suhu rendah
Sebanyak  5  g  fraksi  tidak  tersabunkan  DALMS  dilarutkan dalam heksana dengan nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan 5:1,  6:1,  7:1  v/b)  dan  suhu  kristalisasi  (–20,  -10,  atau  0°C). Setelah 24  jam, fase kristal dipisahkan dari filtrat dengan cara penyaringan.  Pelarut  dalam  filtrat  diuapkan  dengan  rotavapor sampai  semua  pelarut  menguap.  Filtrat  tanpa  pelarut  yang diperoleh adalah fraksi kaya vitamin E.
Fraksi  kaya  vitamin  E  yang  diperoleh  dianalisis  meliputi kadar  dan  jenis-jenis  vitamin  E,  aktivitas  antioksidan,  bilangan peroksida,  kadar  asam  lemak  bebas,  dan  rendemen  ber- dasarkan fraksi tidak tersabunkan.

## Metode analisis
Metode  yang  digunakan  untuk  menganalisis  parameter yang  dikaji  meliputi:  kadar  -tokoferol  dan  -, -,  -tokotrienol dengan  HPLC  (Nielsen  dan  Hansen , 2008),  aktivitas antioksidan  metode  DPPH  dan  bilangan  peroksida  metode feriklorida (Kim, 2005), kadar asam lemak bebas (AOCS, 1989), rendemen.

## Rancangan percobaan
Rancangan  percobaan  yang  digunakan  adalah  rancangan acak  lengkap  dua  faktor  dalam  pola  faktorial  dengan  2  kali ulangan.  Faktor  pertama  suhu  kristalisasi  (–20,  -10,  atau  0°C) dan faktor kedua adalah nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan (5:1, 6:1, 7:1 v:b). Analisis ragam dilakukan terhadap data yang
diperoleh dilanjutkan uji lanjut dengan DMRT jika perlakuan me- nunjukkan pengaruh yang signifikan ( =0,05).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik  DALMS  dan  fraksi  tidak  tersabunkan DALMS
Karakteristik  DALMS  yang  digunakan  pada  penelitian  ini dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Komponen  utama  dalam  DALMS adalah  asam  lemak  bebas,  dan  DALMS  mengandung komponen  minor  yang  menguap  pada  proses  deodorisasi. Menurut Hui (1996), 80 – 90% kandungan DALMS adalah asam lemak  bebas.  DALMS  ini  merupakan  sumber  vitamin  E  dan senyawa bioaktif yang lain seperti fitosterol. Menurut Hoed et al. (2006),  proses  pemurnian  secara  fisik  menyebabkan  fitosterol dan  tokotrienol  teruapkan  dan  terkonsentrasi  dalam  distilat deodorizer .
Tabel 1. Karakteristik DALMS, Fraksi Tidak Tersabunkan DALMS, dan Fraksi Kaya Vitamin E
Karakteristik DALMS Fraksi Tidak Tersabunkan DALMS Fraksi Kaya Vitamin E Kadar asam lemak bebas (%) 95,75 7,99 0,43 Bilangan peroksida (mek/kg) 0,27 0,22 0,43 Aktivitas antioksidan (%) t. a. 81,51 93,00 Kadar vitamin E (%) 0,45 12,09 33,88 -tokoferol 0,15 4,05 -tokotrienol 0,08 2,12 -tokotrienol 0,13 3,51 -tokotrienol 0,09 2,40 Total tokotrienol 0,30 8,04 Rendemen t. a. 3,75* 50,25** Keterangan : t. a. = tidak dianalisis
*basis DALMS ** basis fraksi tidak tersabunkan
DALMS mengandung vitamin E yang cukup tinggi yaitu 0,45 g/100  g  atau  4500  ppm.  Nilai  ini  sangat  tinggi  dibandingkan sumber vitamin E yang lain seperti bekatul (300 ppm) (Xu et al., 2001),  biji-bijian  dan berry dengan  kisaran  84-318  dan  56-140 ppm  (Kallio et  al., 2002),  dan  minyak  zaitun  (100-270  ppm) (Cunha et  al., 2006).  Goh et  al .  (1985)  menyatakan  bahwa kandungan  vitamin  E  pada  DALMS  berkisar  antara  150–8,500 ppm.
Komposisi  vitamin  E  dari  DALMS  adalah  -tokoferol 33,48%,  -tokotrienol  17,57%,  -tokotrienol  29,06%,  dan  - tokotrienol  19,89%.  Penelitian  sebelumnya  (Ahmadi,  1997) menunjukkan  bahwa  kadar  tokoferol  dalam  DALMS  adalah  1. 509,91  mg/100  g  setara  dengan  hasil  penelitian  ini  yaitu  0,15 g/100  g  atau  1,500  mg/kg.  Tokotrienol  merupakan  komponen terbesar vitamin E DALMS yang jumlahnya mencapai 66,52%, dan  sisanya  adalah  tokoferol  dalam  bentuk -tokoferol sebanyak 33,48%. Hal ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yaitu  Musalmah et  al .  (2005)  yang  menyatakan  bahwa keunggulan  DALMS  adalah  sebagian  besar  vitamin  E  dalam bentuk tokotrienol (70%) dan sisanya adalah tokoferol (30%).
Menurut  Puah et  al. (2007),  komposisi  vitamin  E  minyak sawit selama proses pemurnian adalah  -tokoferol (14–17%), α tokotrienol  (22–24%),  -tokotrienol  (49–53%),  -tokotrienol  (6– 7%) dan  -tokomonoenol (3%). Total tokotrienol dalam DALMS pada  penelitian  ini  lebih  rendah  dari  minyak  sawit.  Diduga proses pemanasan suhu tinggi pada deodorisasi menyebabkan tokotrienol mengalami kerusakan yang lebih intensif dibanding- kan tokoferol. Dilihat dari struktur molekulnya, tokotrienol mem- punyai  ikatan  rangkap  pada  rantai  isoprenoid  yang  diduga menyebabkan tokotrienol lebih labil terhadap panas dibanding- kan  tokoferol.  Jumlah  asam  lemak  bebas  dan  peroksida  pada DALMS tinggi karena DALMS merupakan hasil samping proses pemurnian minyak sawit pada tahapan deodorisasi.
Ahmadi  (1997)  mendapatkan  bahwa  bilangan  peroksida 15,98  mek/kg  dengan  -tokoferol  1,509,91  mg/kg.  Bilangan peroksida  yang  rendah  pada  DALMS  yang  digunakan  pada penelitian  ini  diduga  disebabkan  bahwa  DALMS  yang  diguna- kan  masih  segar,  walaupun  sebagian  produk  hasil  oksidasi menguap  pada  proses  deodorisasi.  Bilangan  peroksida  yang rendah menunjukkan bahwa tingkat oksidasi DALMS yang juga rendah.
Menurut  Hui  (1996),  produk  oksidasi  selama  proses  peng- olahan  CPO  hilang  pada  saat  deodorisasi  dan  DALMS merupakan  hasil  samping  deodorisasi.  Produk  oksidasi  tidak terakumulasi  dalam  DALMS  karena  bersifat  volatil  sehingga tidak  terekoveri  pada  saat  distilasi  menjadi  DALMS.  Distilat asam  lemak  minyak  sawit  yang  akan  digunakan  pada kristalisasi  pelarut  suhu  terlebih  dahulu  dilakukan  saponifikasi. Fraksi  tidak  tersabunkan  DALMS  selanjutnya  diambil  untuk digunakan pada tahapan kristalisasi pelarut suhu rendah. Hasil analisis karakteristik fraksi tidak tersabunkan dapat dilihat pada Tabel 1.
Bila dibandingkan DALMS dengan fraksi tidak tersabunkan dari DALMS, kadar asam lemak bebas yang menurun signifikan yaitu  dari  95,75%  menjadi  7,99%.  Reaksi  KOH  dengan  asam lemak bebas menghasilkan sabun sehingga mudah dipisahkan dari fraksi tidak tersabunkan. Hal ini menyebabkan jumlah asam lemak  bebas  pada  fraksi  tidak  tersabunkan  menjadi  sangat menurun.  Dibandingkan  DALMS,  kadar  vitamin  E  fraksi  tidak tersabunkan  jauh  lebih  tinggi  (Tabel  1).  Proses  saponifikasi menghasilkan fraksi tidak tersabunkan.
Menurut  Mitei et  al .  (2009),  komponen  terbesar  dari  fraksi tidak  tersabunkan  adalah  fitosterol  dan  vitamin  E.  Komposisi vitamin  E  fraksi  tidak  tersabunkan  dan  DALMS  adalah  sama. Tokotrienol  mempunyai  kadar  yang  lebih  tinggi  dibandingkan tokoferol. Peningkatan kadar vitamin E fraksi tidak tersabunkan dari  DALMS  adalah  26,87  kali,  yaitu  dari  0,45  g/100  g  pada DALMS  menjadi  12,87  g/100  g  pada  fraksi  tidak  tersabunkan DALMS.  Komponen  lain  yang  ada  dalam  fraksi  tidak  ter- sabunkan  DALMS  selain  asam  lemak  bebas  adalah  fitosterol, hidrokarbon,  dan  lilin  (Hui,  1996).  Aktivitas  antioksidan  fraksi tidak tersabunkan cukup tinggi yaitu 81,51%.
Hal  ini  menunjukkan  fraksi  tidak  tersabunkan  dari  DALMS mengandung  antioksidan  yang  cukup  tinggi.  Rendemen  fraksi tidak  tersabun-kan  dari  DALMS  sebesar  3,75%.  Angka  ini sudah tinggi karena menurut Hui (1996) kandungan fraksi tidak tersabunkan  dari  DALMS  berkisar  antara  1,6-3,7%.  Hal  Ini menunjukkan  bahwa  saponifikasi  yang  dilakukan  sudah
optimum  karena  dapat  menghasilkan  rendemen  yang  mak- simum akan tetapi kadar asam lemak bebas masih cukup tinggi.

## Kadar vitamin E pada fraksi kaya vitamin E
Nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  dan  suhu  merupa- kan  faktor  penting  yang  diduga  mempengaruhi  kristalsisasi pelarut.  Pelarut  yang  digunakan  adalah  heksana.  Menurut Hartel  (2001),  faktor-faktor  yang  mempengaruhi  kristalisasi adalah  suhu  kristalisasi,  laju  pendinginan,  agitasi,  nisbah pelarut:minyak,  waktu  kristalisasi,  dan  jenis  pelarut.  Kadar vitamin  E  pada  fraksi  kaya  vitamin  E  merupakan  parameter utama  yang  menentukan  keberhasilan  pengayaan  fraksi  tidak tersabunkan  DALMS  dengan  vitamin  terutama  tokotrienol. Tokotrienol  merupakan  komponen  yang  ingin  ditingkatkan sehingga pemilihan suhu mempertimbangkan tingkat pengaya- an  tokotrienol.  Menurut  Anonymous  (2007),  tokoferol  mem- punyai titik leleh 2,5-3,5°C. Diduga titik leleh tokotrienol karena bersifat tidak jenuh pada rantai isoprenoid (tiga ikatan rangkap) atau  farnesil  dan  mempunyai  titik  leleh  yang  lebih  rendah  dari vitamin  E.  Oleh  karena  itu  taraf  faktor  suhu  yang  dikaji  pada penelitian ini adalah -20, -10, dan 0°C.
Nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  merupakan parameter  yang  mempengaruhi  viskositas  larutan.  Viskositas larutan  pada  proses  kristalisasi pelarut  mempengaruhi  transfer massa dan transfer panas. Menurut Hartel (2001), pertumbuhan kristal  dipengaruhi  oleh  pindah  massa  dan  pindah  panas. Pertumbuhan  kristal  berkaitan  dengan  viskositas  cairan  induk. Viskositas  cairan  dipengaruhi  oleh  nisbah  pelarut:fraksi  tidak tersabunkan.  Jika  viskositas  tinggi,  pindah  massa  dari  cairan induk  ke  inti  kristal,  dan  pindah  panas  dari  kristal  ke  sistem pendingin  akan  terhambat.  Akibatnya  ukuran  kristal  yang terbentuk  tidak  optimum  sehingga  proses  separasi  menjadi tidak sempurna.
Larutan  yang  encer  akan  mudah  mentransfer  massa  dan panas/energi  yang  diambil  dari  bahan.  Akan  tetapi,  jika viskositas terlalu encer akan menyulitkan proses rekoveri fraksi yang  tidak  mengkristal.  Faktor  yang  mempengaruhi  kadar vitamin E akibat perubahan nisbah pelarut:fraksi tidak tersabun- kan yang berbeda adalah viskositas sistem. Krishnamurthy dan Kellens  (1995)  menyatakan  bahwa  kemampuan  sistem  untuk memulai  pembentukan  inti  kristal  berbanding  terbalik  dengan besarnya  viskositas.  Pada  nisbah  yang  lebih  kecil  yaitu  5:1 diduga  viskositas  masih  terlalu  tinggi  sehingga  ruang  gerak molekul terbatas yang menyebabkan proses pindah panas dan pindah  massa  akan  terhambat.  Akibatnya  proses  kristalisasi komponen-komponen  non  vitamin  E  tidak  dapat  berlangsung dengan  baik.  Peningkatan  kadar  vitamin  E  sampai  nisbah pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  6:1  diduga  disebabkan  oleh semakin  rendahnya  viskositas  sistem.  Nisbah  pelarut:fraksi tidak  tersabunkan  5:1  mempunyai  viskositas  tertinggi.  Pada kondisi  ini  viskositas  terlalu  tinggi  sehingga  menghambat pembentukan  inti  kristal  dan  pertumbuhan  kristal.  Peningkatan nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  6:1  mengakibatkan viskositas  sistem  menurun.  Proses  pindah  panas  dan  pindah massa  dapat  berjalan  lebih  baik.  Selain  itu  pembentukan  inti kristal menjadi efisien untuk menyeleksi jenis asam lemak yang akan  dipisahkan.  Proses  kristalisasi  komponen-komponen  non
vitamin  E  dapat  berlangsung  lebih  sempurna  sehingga  kadar vitamin E dalam fraksi kaya vitamin E meningkat.
Dari  Gambar  1  diketahui  bahwa  kadar  vitamin  E  paling tinggi  dihasilkan  pada  nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan 6:1. Peningkatan kadar vitamin E sampai nisbah pelarut:minyak 6:1 berkaitan erat dengan viskositas sistem. Krishnamurthy dan Kellens  (1995)  menyatakan  bahwa  kemampuan  sistem  untuk memulai  pembentukan  inti  kristal  berbanding  terbalik  dengan besarnya viskositas. Ada kecenderungan bahwa semakin tinggi nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan,  kadar  vitamin  E mengalami  peningkatan.  Peningkatan  terjadi  sampai  nisbah pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  6:1,  peningkatan  nisbah  lebih lanjut  mengakibatkan  penurunan  kadar  vitamin  E.  Fenomena yang  sama  pernah  dilaporkan  oleh  Ahmadi  (2006)  bahwa hubungan  antara  kadar  asam  lemak  -3  dengan  nisbah pelarut:minyak bersifat kuadratik. Artinya, kadar asam lemak  - 3  meningkat  sampai  nisbah  pelarut:minyak  5,94:1  dan  pe- ningkatan  nisbah  pelarut  minyak  tidak  menyebabkan  pe- ningkatan kadar asam lemak  -3.
Penggunaan  teknik  kristalisasi  pelarut  suhu  rendah  pada pembuatan  fraksi  kaya  vitamin  E  didasarkan  pada  perbedaan titik beku antara masing-masing fraksi tidak tersabunkan dalam DALMS.  Menurut  Pan et  al .  (2005)  fitosterol  dalam  distilat deodorizer minyak jarak dapat dipisahkan dari vitamin E dengan kristalisasi  pada  suhu  -8°C.  Tokoferol  dan  tokotrienol  dapat dipisahkan  dengan  perlakuan  suhu  karena  keduanya  mem- punyai perbedaan kejenuhan. Menurut Heinemann et al. (2008), rantai  samping  tokoferol  bersifat  jenuh  sedangkan  tokotrienol bersifat  tidak  jenuh.  Perbedaan  ketidakjenuhan  tersebut  ber- dampak pada perbedaan titik beku.
Suhu  kristalisasi  sangat  menentukan  keberhasilan  pem- bentukan  kristal.  Laju  pendinginan  berkaitan  dengan  pem- bentukan inti kristal dan pertumbuhan kristal. Pendinginan yang cepat  menyebabkan  inti  kristal  banyak  terbentuk  dan  laju  per- tumbuhan  kristal  lebih  cepat.  Laju  pendinginan  yang  tinggi karena  suhu  yang  rendah  menyebabkan  pindah  panas  cepat sehingga kristal cepat tumbuh.
Gambar 1. Pengaruh nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan dan suhu
kristalisasi terhadap kadar vitamin E (a), -tokotrienol (b),
-tokotrienol  (c),  -tokotrienol  (d),  dan  -tokoferol  (e) fraksi kaya vitamin E dari DALM
Hartel  (2001)  menyatakan  bahwa  suhu  yang  terlalu  tinggi menyebabkan proses transfer panas dari sistem ke lingkungan tidak maksimum. Akibatnya inti kristal yang terbentuk terbatas, dan  transfer  massa  pada  inti  kristal  yang  terbentuk  menjadi terbatas  pula  akibat  transfer  energi  yang  belum  maksimum. Kristal  yang  terbentuk  menjadi  belum  maksimum  sehingga senyawa-senyawa bukan vitamin E seperti sterol masih banyak yang  terlarut  didalam  pelarut.  Sebaliknya  suhu  yang  terlalu rendah menyebabkan pembentukan inti Kristal yang banyak. Inti kristal yang banyak pada proses pertumbuhannya memerlukan massa dari sistem. Transfer massa pada inti kristal menyebab- kan pertumbuhan kristal.
Selama  pertumbuhan  kristal,  senyawa-senyawa  dengan kelarutan  rendah  akibat  berada  dibawah  titik  lelehnya  akan bermigrasi  pada  inti  kristal  dan  mengkristal.  Akibatnya  pada suhu -20°C, sebagian vitamin E ikut mengkristal karena diduga berada  dibawah  titik  lelehnya  yang  mengakibatkan  kadar vitamin E pada suhu -20°C untuk nisbah pelarut:fraksi tidak ter- sabunkan 5:1 dan 6:1 mengalami penurunan.
Fenomena  berbeda  terjadi  pada  nisbah  pelarut:fraksi  tidak tersabunkan  7:1.  Pada  kondisi  ini,  sistem  sangat  encer sehingga  inti  kristal  sangat  banyak.  Komponen-komponen  non
15 18 21 24 27 30 33 36 -20 -15 -10 -5
0 Ka da r V ita m in E (g
/1 00 g ) Suhu Kristalisasi (ºC) Rasio 5:1 Rasio 6:1 Rasio 7:1 2 3 4 5 6 7 8 -30 -20 -10 0
10 Ka da r T ok ot rie no l ( g/ 10 0 g) Suhu Kristalisasi (ºC) Rasio 5:1 Rasio 6:1 Rasio 7:1
4 5 6 7 8 9 10 -25 -20 -15 -10 -5 0 5
Ka da r T ok ot rie no l ( g/ 10 0 g) Suhu Kristalisasi (ºC) Rasio 5:1 Rasio 6:1 Rasio 7:1 1 2 3 4 5 -30 -20 -10 0 Ka da r T ok ot rie no l ( g/ 10 0 g) Suhu Kristalisasi (ºC) Rasio 5:1 Rasio 6:1 Rasio 7:1 5 7 9 11 13 15 -30 -20 -10 0 10 Ka da r T ok of er ol (g /1 00 g ) Suhu Kristalisasi ( C) Rasio 5:1 Rasio 6:1 Rasio 7:1 (a) (b)
(c) (d) (e)
vitamin  banyak  yang  mengkristal  sehingga  kadar  vitamin  E masih mengalami peningkatan. Hasil analisis parameter vitamin E menunjukkan bahwa  kadar vitamin E terbaik diperoleh pada kombinasi  perlakuan  nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan DALMS (6:1) dengan suhu kristalisasi -10 ° C. Kadar masing-masing jenis isomer vitamin E berbeda-beda bergantung  pada  komposisinya  pada  fraksi  tidak  tersabunkan (Tabel 1). Pengaruh nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan dan suhu kristalisasi mengakibatkan pola perubahan kadar masing- masing  jenis  isomer  vitamin  E  berbeda-beda.  Tokoferol  dan tokotrienol mempunyai struktur pada rantai samping, yaitu rantai samping  fitil  bersifat  jenuh  pada  tokoferol  dan  rantai  farnesil yang tidak jenuh pada tokotrienol.
Masing-masing  isomer  tokotrienol  mempunyai  perbedaan struktur  pada  cincin  kromanol  (Gambar  1).  Kemungkinan  per- bedaan gugus R yang terikat pada cincin kromanol (gugus metil atau  atom  hidrogen)  mempengaruh  titik  lelehnya.  Ada  kecen- derungan  kadar  tokotrienol  mengalami  penurunan  dengan menurunnya  suhu.  Sebaliknya  dengan  kadar  tokoferol  yang cenderung meningkat dengan peningkatan suhu.

## Komposisi vitamin E pada fraksi kaya vitamin E
Jenis-jenis  isomer  vitamin  E  yang  terdeteksi  dalam  fraksi kaya vitamin E dari DALMS adalah  -tokoferol serta  -,  -, dan -tokotrienol. Pada DALMS, fraksi tidak tersabunkan, dan fraksi kaya vitamin E tidak ditemukan  -,  -, dan  -tokoferol, serta  - tokotrienol.  Tabel  2  menunjukkan  bahwa  komposisi  komponen penyusun  vitamin  E  dalam  fraksi  kaya  vitamin  E  dipengaruhi oleh  suhu  kristalisasi  dan  nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabun- kan. Kadar tokotrienol dalam fraksi kaya vitamin E yang dihasil- kan  lebih  tinggi  dibandingkan  tokoferol.  Persentase  tokotrienol lebih  dari  50%,  kecuali  untuk  perlakuan  suhu  kristalisasi  0 C dan  nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  5:1.  Kadar tokotrienol  dalam  fraksi  tidak  tersabunkan  adalah  66,50% sedangkan  dalam  DALMS  adalah  66,67%.  Kadar  tokotrienol dalam fraksi kaya vitamin E berkisar 48-62% (Tabel 2).
Kadar total tokotrienol ( -,  -, dan  -tokotrienol) mengalami peningkatan dengan semakin meningkatnya nisbah pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  (Tabel  2).  Peningkatan  nisbah pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  menyebabkan  sistem  mem- punyai viskositas yang semakin rendah. Hal ini mengakibatkan transfer  energi  dari  sistem  ke  lingkungan  semakin  efisien. Akibatnya,  energi  kinetik  molekul-molekul  yang  ada  dalam sistem menjadi berkurang dan cenderung bermigrasi menuju inti kristal  yang  terbentuk.  Demikian  pula  transfer  massa  akan semakin efisien sehingga kristal dapat tumbuh dengan baik.
Akibatnya  sebagian  komponen  non  vitamin  E  yang mempunyai titik leleh yang lebih tinggi mengkristal. Hal ini yang menyebabkan peningkatan kadar vitamin E dengan meningkat- nya  nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan.  Akan  tetapi, peningkatan kadar vitamin E dalam fraksi kaya vitamin E tidak menyebabkan  peningkatan  proporsi  tokotrienol.  Proporsi tokotrienol  dalam  fraksi  kaya  vitamin  E  (48-62%)  mengalami penurunan jika dibandingkan fraksi tidak tersabunkan (66,50%). Kemungkinan, suhu dan nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan yang  digunakan  pada  penelitian  ini  mengakibatkan  tokoferol masih  ada  dalam  filtrat  dan  belum  dapat  dipisahkan  dengan baik dengan tokotrienol.
Tabel 2. Komposisi vitamin E pada fraksi kaya vitamin E pada berbagai suhu dan nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan Perlakuan Jenis Vitamer E (%) Suhu Nisbah Pelarut:FTT δ-T3 α-T3 γ-T3 α-T Total T3 -20 C 5:1 27,93 17,68 10,36 44,04 55,97 6:1 25,78 20,06 10,80 43,37 56,64 7:1 32,81 21,51 7,28 38,40 61,60 -10 C 5:1 27,68 20,07 10,10 42,15 57,85 6:1 26,99 17,91 10,83 44,27 55,73 7:1 24,43 16,43 12,35 46,79 53,22 0 C 5:1 25,51 14,37 8,90 51,21 48,79 6:1 24,41 18,31 11,98 45,31 54,69 7:1 26,45 19,63 8,66 45,26 54,74
Keterangan:
FTT = Fraksi Tidak Tersabunkan, T3=tokotrienol, T= tokoferol

## Aktivitas antioksidan fraksi kaya vitamin E
Aktivitas biologi tokol atau vitamin E berkaitan erat dengan kemampuannya  untuk  menghambat  peroksidasi  dalam  mem- brane  biologis  (Qureshi et  al .,  2000).  Tokoferol  merupakan antioksidan  alami  yang  paling  banyak  digunakan.  Senyawa  ini berperan  menghambat  proses  propagasi  pada  tahap  auto- oksidasi  radikal  bebas  dengan  cara  bereaksi  dengan  berbagai senyawa  radikal  bebas  (Bandarra et  al .,  1999).  Aktivitas antioksidan  -tokoferol  telah  banyak  diteliti,  akan  tetapi  pene- litian tentang kemampuan tokotrienol sebagai antioksidan masih terbatas (Qureshi et al ., 2000; Abidi, 2003).
Aktivitas  antioksidan  fraksi  kaya  vitamin  E  pada  penelitian ini ditentukan dengan metode DPPH. Metode DPPH merupakan metode  yang  mengukur  kemampuan  suatu  senyawa  anti- oksidan  untuk  menstabilkan  radikal  bebas  dengan  cara  men- donorkan  atom  hidrogen  pada  radikal  bebas  DPPH.  Dengan demikian,  metode  DPPH  merupakan  metode  untuk  mengukur aktivitas  antioksidan  primer.  Vitamin  E  merupakan  senyawa fenolik yang termasuk ke dalam antioksidan primer (Pokorny et al., 2001)  dan  merupakan  antioksidan  yang  larut  dalam  lemak (Abidi, 2003).
Vitamin E berperan sebagai antioksidan primer dengan cara mendonorkan atom H dari cincin kromanol ke senyawa peroksi radikal.  Setelah  mendonorkan  atom  H,  tokoferol  berubah menjadi  tokoferil  radikal.  Hal  ini  yang  menyebabkan  beberapa senyawa,  seperti  fosfolipid,  bersifat  sinergis  dengan  vitamin  E karena mampu meregenerasi tokoferil radikal menjadi tokoferol (Pokorny et al ., 2001).
Peningkatan  nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan menyebabkan  penurunan  aktivitas  antioksidan  (Gambar  3a). Aktivitas  antioksidan  tertinggi  terdapat  pada  nisbah pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  6:1  dan  7:1,  serta  terendah pada  nisbah  5:1.  Jika  dihubungkan  dengan  kadar  vitamin  E, kadar vitamin E pada nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan 7:1 adalah yang terendah. Akan tetapi, aktivitas antioksidan nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan 7:1 adalah yang tertinggi. Hal ini diduga berkaitan dengan sifat vitamin E yang berubah menjadi prooksi  dan  pada  konsentrasi  tinggi.  Semakin  tinggi  nisbah pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan,  kadar  vitamin  E  semakin meningkat  dan  pada  konsentrasi  yang  digunakan  pada  peng- ujian  menjadi  bersifat  prooksidan.  Hal  ini  yang  menyebabkan aktivitas  antioksidan  menurun.  Menurut  Frankel  (1998)  vitamin E  pada  konsentrasi  tinggi  bersifat  sebagai  prooksidan  karena meregenerasi radikal peroksil dengan reaksi kebalikan.
Aktivitas  antioksidan  meningkat  sampai  suhu  -10 C  di- bandingkan  0 C,  dan  penurunan  suhu  lebih  lanjut  menyebab- kan  aktivitas  antioksidan  menurun.  Fenomena  yang  sama terjadi  pada  kadar  vitamin  E  pada  fraksi  kaya  vitamin  E,  yaitu kadar vitamin E meningkat pada suhu -10 C dan menurun pada suhu -20 C. Perubahan aktivitas antioksidan sebagai pengaruh suhu  kristalisasi  berkaitan  erat  dengan  kadar  vitamin  E  dalam fraksi kaya vitamin E.
Masing-masing  jenis  tokotrienol  mempunyai  aktivitas antioksidan  yang  berbeda.  Menurut  Qureshi et  al .  (2000) kemampuan antioksidatif -tokotrienol> -tokotrienol> - tokotrienol.  Suzuki et  al .  (1993)  sebelumnya  menunjukkan bahwa  kemampuan  antioksidan  -tokotrienol  lebih  baik  di- bandingkan    tokotrienol.  Alfa  ( -)tokotrienol  mempunyai kemampuan  antioksidan  yang  sama  dengan -tokoferol (Schroeder et  al .,  2006).  Alfa  ( -)tokotrienol  dan  -tokoferol nerupakan  vitamin  E  yang  mempunyai  cincin  kromanol  yang sama  tetapi  mempunyai  perbedaan  pada  rantai  sampai hidrokarbon.  Akan  tetapi  menurut  Suzuki et  al .  (1993), tokotrienol  mempunyai  potensi  melindungi  terhadap  radikal bebas  yang  menginduksi  stress  oksidatif  lebih  baik  dibanding- kan  -tokoferol.

## Rendemen
Rendemen fraksi kaya vitamin E diukur sebagai persentase berat  fraksi  kaya  vitamin  E  dibandingkan  berat  fraksi  tidak tersabunkan  DALMS.  Rendemen  yang  dihasilkan  berkisar antara  41,33-50,87%  (Gambar  3b)  dengan  rendemen  fraksi tidak tersabunkan dibandingkan DALMS adalah 3,75%.
Rendemen  semakin  menurun  dengan  menurunnya  suhu kristalisasi.  Penurunan  suhu  menyebabkan  proses  kristalisasi semakin  efisien  karena  kecepatan  penurunan  suhu  yang meningkat.  Menurut  Hartel  (2001),  kecepatan  penurunan  suhu mempengaruhi  pembentukan  inti  kristal,  yaitu  semakin  rendah suhu kecepatan penurunan suhu semakin meningkat. Akibatnya inti  kristal  yang  terbentuk  semakin  banyak.  Inti  yang  banyak menfasilitasi  massa  dalam  fase  cair  untuk  bermigrasi  secara cepat pada inti kristal. Akibatnya sebagian besar massa dalam fase  cair  yang  mempunyai  kemampuan  untuk  mengkristal, mengalami proses kristalisasi. Akibatnya massa dalam fase cair mengalami  penurunan  sehingga  rendemen  yang  dihasilkan menurun.
Peningkatan nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan dari 5:1 menjadi  6:1  mengakibatkan  peningkatan  rendemen  yang dihasilkan. Peningkatan nisbah pelarut:fraksi tidak tersabunkan lebih  lanjut  menyebabkan  rendemen  menurun.  Peningkatan rendemen dari nisbah 5:1 menjadi 6:1 disebabkan peningkatan kadar  vitamin  E  dalam  fraksi  kaya  vitamin  E  yang  dihasilkan. Faktor  yang  mempengaruhi  kadar  vitamin  E  akibat  perubahan nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  yang  berbeda  adalah viskositas  sistem.  Krishnamurthy  dan  Kellens  (1995)  menyata- kan bahwa kemampuan sistem untuk memulai pembentukan inti kristal  berbanding  terbalik  dengan  besarnya  viskositas.  Pada nisbah yang lebih kecil yaitu 5:1 diduga viskositas masih terlalu tinggi  sehingga  ruang  gerak  molekul  terbatas  yang  me- nyebabkan  proses  pindah  panas  dan  pindah  massa  akan
terhambat.  Akibatnya  proses  kristalisasi  komponen-komponen non vitamin E tidak dapat berlangsung dengan baik.
Gambar 3. Grafik hubungan aktivitas antikosidan (a) dan rendemen (b) dengan  suhu  kristalisasi  dan  nisbah  pelarut:fraksi  tidak tersabunkan
Peningkatan  rendemen  sampai  nisbah  pelarut:fraksi  tidak tersabunkan  6:1  diduga  disebabkan  oleh  semakin  rendahnya viskositas  sistem.  Nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  5:1 mempunyai  viskositas  tertinggi.  Pada  kondisi  ini  viskositas terlalu  tinggi  sehingga  menghambat  pembentukan  inti  kristal dan  pertumbuhan  kristal.  Viskositas  yang  tinggi  menunjukkan terdapat banyak molekul di dalam sistem yang mengakibatkan pergerakan  molekul  dan  pindah  panas  terbatas.  Akibatnya penggabungan molekul untuk membentuk struktur kristalin yang teratur  menjadi  terhambat.  Peningkatan  nisbah  pelarut:fraksi tidak  tersabunkan  6:1  mengakibatkan  viskositas  sistem  me- nurun. Proses pindah panas dan pindah massa dapat ber-jalan lebih  baik.  Selain  itu  pembentukan  inti  kristal  menjadi  efisien untuk menyeleksi jenis asam lemak yang akan dipisah-kan.
Proses kristalisasi komponen-komponen dapat berlangsung lebih  sempurna  sehingga  rendemen  fraksi  kaya  vitamin  E meningkat.  Viskositas  sistem  yang  rendah  pada  nisbah pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  7:1  mengakibatkan  pindah panas  dan  pindah  massa  dari  minyak  cair  ke  kristal  menjadi lebih  tinggi  sehingga  inti  kristal  yang  terbentuk  dalam  sistem menjadi  lebih  banyak.  Fenomena  ini  diduga  menyebabkan sebagian  besar  massa  dalam  fase  cair  ikut  mengkristal sehingga rendemen fraksi kaya vitamin E menurun.
80 82 84 86 88 90 92 94 5:1 6:1 7:1 Ak tiv ita s an tio ks id an (% ) Rasio pelarut
Suhu -20 ⁰ Suhu -10 ⁰ C Suhu 0 ⁰ C 40 43 46 49 52 55 -30 -20 -10 0 10 R en de m en (%) Suhu Kristalisasi (ºC) Rasio 5:1 Rasio 6:1 Rasio 7:1
(3a)
(3b)

## KESIMPULAN
Distilat asam lemak minyak sawit merupakan sumber yang potensial untuk dikembangkan sebagai sumber vitamin E alami yang mengandung tokotrienol tinggi. Saponifikasi meningkatkan kadar  vitamin  E  dalam  fraksi  tidak  tersabunkan.  Kristalisasi pelarut suhu rendah fraksi tidak tersabunkan dapat meningkat- kan kadar vitamin E  sehingga dihasilkan fraksi kaya vitamin  E dengan  kadar  vitamin  E  tertinggi  dalam  fraksi  kaya  vitamin  E mencapai  33,88%  dari  berbagai  nisbah  pelarut:fraksi  tidak  ter- sabunkan  dan  suhu  kristalisasi  yang  dikaji.  Suhu  dan  nisbah pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  mempengaruhi  pengayaan vitamin  E  dalam  fraksi  kaya  vitamin  E.  Peningkatan  kadar vitamin  E  dalam  fraksi  kaya  vitamin  E  menyebabkan  aktivitas antioksidan  meningkat  jika  dibandingkan  fraksi  tidak  tersabun- kan.  Kristalisai  pelarut  suhu  rendah  menggunakan  heksana pada  nisbah  pelarut:fraksi  tidak  tersabunkan  6:1  dan  suhu  - 10 ° C memberikan hasil terbaik.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terimakasih  disampaikan  kepada  Direktorat Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat (DP2M) – Dikti– Kemendiknas  atas  dana  Penelitian  Hibah  Bersaing  (PHB) Tahun 2009.

## DAFTAR PUSTAKA
Abidi  SL.  2003.  Tocol-derived  minor  constituents  in  selected plant seed oils. J Amer Oil Chem 80(4): 327-333.
Ahmadi  K.  1997.  Aktivasi  Zeolit  Alam  dan  Penggunaannya untuk Pemurnian Tokoferol dari Distilat Asam Lemak Minyak Sawit. Thesis. Program Pascasarjana – UGM, Yogyakarta.
Ahmadi K. 2006. Optimasi kristalisasi pelarut suhu rendah pada pembuatan minyak kaya asam lemak  -3 dari hasil samping pengalengan  ikan  lemuru  ( Sardinellalongiceps ).  Agritek 14(3): 580-593.
Anonymous.  2007.  Tocotrienol.  http://en.wikipedia.org/-wiki/ Tocotrienol. [13 Januari 2007].
[AOCS] Assotiation of Official Analytical Chemist. 1989. Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemistry  Society.  4 th ed.  Broadmaker  Drive,  Champaign, Illinois.
Bandarra  NM,  Campos  RM,  Batista  I,  Nunes  ML,  Empis  JM. 1999.  Antioxidant  synergy  of  alpha-tocopherol  and phospholipids. J Amer Oil Chem Soc 76(8): 905-913.
Chu  BS,  Baharin  BS,  Man  YB,  Quek  SY.  2004.  Separation  of vitamin  E  from  palm  fatty  acid  distillate  using  silica:  I Equilibrium of batch adsorption. J Food Eng 62(1): 97-103.
Chu  BS,  Baharin  YB,  Man  C,  Quek  SY.  2005.  Comparison  of selected adsorbents for adsorption and desorption of vitamin E from palm fatty acid distillate. J of Food Lipids 12(1): 23.
Cunha  SC,  Amaral  JS,  Fernandez  JO,  Oliviera  MBPP.  2006. Quantification  of  tocopherol  and  tocotrienols  in  potugues
olive oils using HPLC with three different detection systems. J Agric Food Chem 54: 3351-3356.
Ekonomi dan Bisnis. 2007. Kenaikan pungutan ekspor CPO tak efektif. [31 Oktober 2007].
Frankel  EN.  1998.  Lipid  Oxidation.  The  Oily  Press.  Dundee- Scotland.
Gapoor  A,  Hassan  WHW,  Sulong  M.  2002.  Phytochemical  for nutraceutical from the by product of palm oil refining . Palm Oil Development 36: 13-19.
Goh  SH,  Gee  PT.  1985.  Noncarotenoids  hydrocarbon  in  palm oil and palm fatty acid distillate. J Amer Oil Chem Soc 63(2): 226-230.
Hartel  RW.  2001.  Crystallization  in  Foods.  A  Wolters  Kluwer Co., USA.
Heinemann RJB, Xu Z, Godber JS, Lanfer-Marquez UM. 2008. Tocopherols,  tocotrienols,  and    oryzanol  content  in Japonica and Indica subspecies of rice cultivated in  Brazil. Cereal Chem 85(2): 243-247.
Hoed  VV,  Depaemelaere  G,  Ayala  JV.  2006.  Inflence  of chemical refining on the major and minor components of rice bran oil. J Amer Oil Chem Soc 83(4):315-321.
Hui YH. 1996. Bailey’s Industrial Oil and Fat Products. Fifith ed.
(2) John Wiley & Son Inc., New York.
Ibanez  E,  Benavides  AMH,  Senorans  AFJ,  Reglaro  G.  2002. Concentration of sterols and tocopherols from olive oil with supercritical carbon dioxide. J Amer Oil Chem Soc 79:1255- 1260.
Kallio  H,  Yang  B,  Peippo  P,  Tahnoven  R,  Pan  R.  2002. Triacylglycerols,  glycerophospholipids,  tocopherol,  and tocotrienols  in  berries  and  seeds  of  two  subspecies (ssp. Sinensi  and  mongolica) of  sea  bucthorn (Hippopae 1rhamnoides) . J Agric Food Chem 50: 3004-3009.
Kim  OS.  2005.  Radical  scavenging  capacity  and  antioxidant activity  of  the  E  vitamer  fraction  in  rice  bran . J  Food  Sci 70(3): 208-213.
Krishnamurthy  R,  Kellens  M.  1995.  Fractionation  and Winterization. In Y-H. Hui (ed. ). Bailey’s Industrial Oil and Fat  Products.  Edible  Oil  and  Fat  Products:  Processing Technology. 5 th ed. (4)A John Wiley & Sons, Inc., New York. Lewis  J.  2001.  Process  for  the  production  of  tocotrienol.US Patent 6: 838,104.
Mitei  JC,  Ngila  SO,  Yeboah  L,  Schmidt  WJ.  2009.  Profiling  of phytosterol, tocopherol, and tocotrienol in selected seed oils from botswana by GC-MS and HPLC. J Amer Oil Chem Soc 86(7): 617-625.
Musalmah M, Nizam MY, Fairuz AH, Aini AHN, Azian AI, Gapor MT, Ngah WWZ. 2005. Comparative effects of palm vitamin E and   tocopherol on healing and wound tissue antioxidant enzyme levels in diabetic rats . Lipids 40: 575-580.
Nagao  T,  Hirota  Y,  Watanabe  Y,  Kobayashi  T,  Kishimoto  N, Fujita T, Kitano M, Shimada Y. 2004. Recovery of sterol as fatty acid steryl esters from waste material after purification of tocopherols. Lipids 39(8): 784-794.
Nesaretnam  K,  Ambra  R,  Selvaduray  KR,  Radhakhrishnan  A, Reimann  K,  Razak  G,  Virgali  F.  2004.  Tocotrienol-rich fraction  from  palm  oil  affects  gene  expression  in  tumor resulting from mcf-7 cell inoculation in athymic mice. Lipids 39: 459-467.
Ng  MH,  Chao  YM,  Ma  AH,  Choah  CH,  Hashim  MA.  2004. Separation  vitamin  E  (tocopherol,  tocotrienol,  and tocomonoenal) in palm oil. Lipids 39: 1031-1035.
Nielsen  MM,  Hansen  A.  2008.  Rapid  high-performance  liquid chromatography  determination  of  tocopherols  and tocotrienols in cereals. Cereal Chem 85(2): 248-251.
Pan  L,  Shao  P,  Jiang  S.  2005.  Separation  of  phytosterol  and synthesized  vitamin  E  succinate  from  rapeseed  oil deodorizer  distillate.  Agricultural  Engineering  International: the CIGR Ejournal 7. Manuscript FP 04 010.March, 2005.
Park  SR,  Kim  YH,  Park  HJ,  Lee  YS.  2007.  Stability  of tocopherols  and  tocotrienols  extracted  from  unsaponifiable fraction of rice bran under various temperature and oxygen cond ition .  http ://www.Cropscience.org.au/icsc2004/-poster/ 5/1/1/654park.htm. [ 8 Maret 2007].
Pitoyo.  1991.  Pemisahan  Tokoferol  dari  Distilat  Asam  Lemak Minyak  Sawit.  Thesis.  Program  Pascasarjana  –  UGM, Yogyakarta.
Pokorny J, Yanishlieva H, Gordon M. 2001. Antioxidant in Food: Practical  Application.  Woodhead  Publishing  Ltd., Cambridge, England.
Puah  CW,  Choo  YM,  Ma  AN,  Chuah  CH.  2007.  The  effect  of physical  refining  on  palm  vitamin  E  (tocopherol,  tocotrienol and tocomonoenol). American J of App Sci 4(6): 374-377.
Qureshi AA, Mo H, Packer L, Peterson DM. 2000. Isolation and identification  of  novel  tocotrienols  from  rice  bran  with hypocholesterolemic, antioxidant, and antitumor properties.J Agric Food Chem 48: 3130-3140.
Schroeder  MT,  Becker  EM,  Skibsted  LH.  2006.  Molecular mechanism  of  antioxidant  synergism  of  tocotrienols  and carotenoids in palm oil. J Agric Food Chem 54: 3445-3453.
Suzuki YJ, Tsuchiya M, Wassall SR, Choo YM, Govil G, Kagan VE,  Packer  L.  1993.  Structural  and  dynamic  membrane properties  of.  alpha.  -tocopherol  and.  alpha.  -tocotrienol: Implication to the molecular mechanism of their antioxidant potency. Biochem 32(40): 10693-10699.
Wali VB, Sylvester PW. 2007. Synergistic antiproliferativeeffects of    gamma  tocotrienol  and  statin  treatment  on  mammary tumor cell. Lipids 42(12): 1113-1123.
Wan  J,  Ziang  W,  Jiang  B.  2008.  Separation  of  individual tocopherol from soybean distillate by column chromatography . J Amer Oil Chem Soc 85: 331-338.
Watanabe  Y,  Nagao  T,  Hirota  Y,  Kitano  M,  Shimada  Y.  2004.
Purification  of  tocopherols  and  phytosterols  by  two-step  in situ  enzymatic  reaction.  J  Amer  Oil  ChemSoc  81(4):  339- 345.
XuZ,  Hua  N,  Godber  JS.  2001.  Antioxidant  activity  of tocopherols, tocotrienols, and oryzanol component from rice bran againts cholesterol oxidation accelerated by 2,2’-azobis (2-methylpropionamidine).  J  Agric  Food  Chem  49:  2077- 2081.