## ALCHEMY : JOURNAL OF CHEMISTRY

## Artikel Penelitian
Aktivitas Antioksidan Isolat Steroid Hasil Kromatografi Lapis Tipis dari Fraksi n-Heksana

## Hydrilla verticillata
Ahmad Ghanaim Fasya 1* , Bagas Purwantoro 1 , Lulu’atul Hamidatu Ulya 1 , Mujahidin Ahmad 2
1 Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, Indonesia, 65144
2 Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, Indonesia, 65144
INFO ARTIKEL ABSTRAK Riwayat Artikel Diterima 3 Juni 2020 Direvisi 23 Juni 2020 Tersedia online 14 Juli 2020
* Email penulis korespondensi: fasya.organik@kim.uin-malang.ac.id
Hydrilla verticillata is one of Allah SWT creations that potential as an antioxidant. This study’s objectives were to determine antioxidant activity and identify steroid isolates  of  n-hexane  fraction  of H.  verticillata .  The  steroid  compounds  were extracted using methanol solvent. The methanol extract was hydrolyzed with HCl 2  N  and  partitioned  using  n-hexane.  The  n-hexane  fraction  was  tested phytochemically  and  separated  using  thin-layer  chromatography  (TLC).  The steroids compounds were identified using UV-Vis spectrophotometer, FTIR, and LC-MS/MS. The result showed that maceration extraction produced 5.14% yield, whereas  n-hexane  fraction  produce  47.95%  yield.  Steroid  separation  through analytical TLC revealed that n-hexane: ethyl acetate (4:1) as the best eluant with 12 spots, while separation using preparative TLC yielded 19 spots. Steroid isolate from TLC preparative has antioxidant activity with EC 50 of 5.109 ppm. Identification of steroid compounds using UV-Vis produced maximum wavelengths at 203.9 and 276 nm, while using FTIR indicated the presence of O-H group, geminal dimethyl, C=O,  C=C,  secondary  C-OH,  and  =C-H  (alkene)  which  might  contain  steroid compounds. The result of LC-MS/MS showed the presence of β -sitosterol.
Keywords: Hydrilla  verticillata ,  steroid  compounds,  thin-layer  chromatography, antioxidant assay, UV-Vis, FTIR, LC-MS/MS
Hydrilla verticillata merupakan salah satu ciptaan Allah SWT yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Penelitian ini bertujuan mengetahui aktivitas antioksidan dan mengidentifikasi senyawa steroid pada isolat hasil pemisahan fraksi n-heksana H. verticillata . Senyawa steroid diekstraksi menggunakan  pelarut metanol. Ekstrak pekat metanol dihidrolisis dengan HCl 2 N dan dipartisi dengan n-heksana. Fraksi n-heksana hasil partisi diuji fitokimia dan dipisahkan senyawanya menggunakan KLT (Kromatografi Lapis Tipis). Identifikasi dilakukan menggunakan UV-Vis, FTIR, dan LC-MS/MS. Hasil penelitian menunjukkan ekstraksi maserasi menghasilkan rendemen  5,14%,  sedangkan  rendemen  partisi  n-heksana  sebesar  47,95%. Pemisahan steroid menggunakan KLT analitik menunjukkan bahwa variasi eluen terbaik adalah n-heksana: etil asetat (4:1) dengan 12 noda, sedangkan pemisahan KLT preparatif menghasilkan 19 noda. Isolat steroid hasil KLT preparatif memiliki aktivitas  antioksidan  dengan  EC 50 5,109  ppm.  Identifikasi  senyawa  steroid menggunakan  UV-Vis  menunjukkan  bahwa  panjang  gelombang  maksimum sebesar  203,9  dan  276  nm,  sedangkan  untuk  identifikasi  isolat  steroid menggunakan FTIR menunjukkan gugus fungsi O-H, geminal dimetil, C=O, C=C, C-OH  sekunder  dan  =C-H  (alkena)  yang  diduga  merupakan  senyawa  steroid. Hasil LC-MS/MS menunjukkan adanya senyawa steroid β -sitosterol.
Kata kunci: Hydrilla verticillata , steroid, kromatografi lapis tipis, uji antioksidan, UV- Vis, FTIR, LC-MS/MS

## 1. Pendahuluan
Keanekaragaman sumberdaya alam di Indonesia baik hayati maupun nonhayati perlu dieksplorasi, salah satunya sebagai sumber senyawa aktif yang berpotensi untuk bahan obat. Hal ini didukung wilayah Indonesia yang berada di daerah tropis dan sebagian besar (75 %) terdiri dari perairan, baik air laut ataupun air tawar. Selain itu, jumlah danau yang ada di Indonesia  sangat  banyak  yaitu  526  danau.  Namun,  hanya  sedikit  danau  yang  potensi  alamnya  telah  dikaji  dan dimanfaatkan secara mendalam [1]. Seperti halnya Danau Ranu yang terletak di Kabupaten Pasuruan, danau ini memiliki keanekaragaman hayati yang tinggi salah satunya adalah Hydrilla ( Hydrilla verticillata (L.f) Royle) atau lebih dikenal oleh masyarakat setempat sebagai “ganggeng”.
Tumbuhan hydrilla masih belum banyak dimanfaatkan karena kurangnya pengetahuan dari masyarakat. Di Indonesia, pemanfaatan hydrilla masih terbatas sebagai tanaman hias untuk akuarium. Hydrilla sering dianggap sebagai ancaman bagi  ekosistem  danau  dan  sungai  karena  pertumbuhannya  yang  cepat  [1]. H.  verticillata dapat  dimanfaatkan  dalam fitoremediasi pada pengolahan limbah [2] dan diproduksi sebagai suplemen. Tumbuhan ini juga dimanfaatkan di bidang kesehatan antara lain sebagai obat antitumor, antibakteri [3, 4], antimikroba [5], antimalaria [6], dan antioksidan [7, 8] serta sebagai adsorben terbaik untuk beberapa logam berat [9].
H. verticillata mengandung berbagai metabolit sekunder. Kensa dan Neelamegam [10] menyebutkan hasil skrining H. verticillata mengandung metabolit sekunder yaitu flavonoid, alkaloid, dan steroid. Penelitian lain menyebutkan hasil skrining H. verticillata mengandung fenol, glikosida, alkaloid, dan steroid [11]. Penelitian yang dilakukan oleh Amalia dkk. [12] dan Fasya dkk. [8] menyatakan bahwa fraksi petroleum eter hasil hidrolisis ekstrak etanol H. verticillata mengandung steroid. Kandungan senyawa aktif H. verticillata dapat diperoleh dengan ekstraksi maserasi. Metode maserasi sering dipilih karena aman digunakan dan dapat mengantisipasi senyawa yang tidak tahan panas. Proses ini sangat menguntungkan dalam proses isolasi bahan alam karena mampu memecah dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan di dalam dan di luar sel sehingga senyawa metabolit sekunder akan larut dalam pelarut organik. Mardiyah [13] menyatakan bahwa senyawa metabolit sekunder di alam berada dalam bentuk glikosida sehingga ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut yang bersifat polar.
Menurut Lenny [14], pelarut yang sering digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam adalah pelarut golongan alkohol, salah satunya metanol. Metanol dapat melarutkan senyawa metabolit sekunder dan memiliki titik didih yang  rendah  sehingga  mudah  diuapkan  [15].  Hafiz  [16]  telah  melakukan  ekstraksi  maserasi H.  verticillata dengan menggunakan variasi pelarut antara lain metanol (polar), kloroform (semi polar), dan n-heksana (non polar). Rendemen yang didapat dengan pelarut metanol sebesar 12,72%. Adapun ekstraksi dengan pelarut kloroform dan n-heksana didapat rendemen yang lebih kecil yaitu masing-masing sebesar 4,96 dan 3,80%. Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan pelarut metanol untuk ekstraksi maserasi.
Pemisahan yang lebih spesifik dapat dilakukan dengan cara hidrolisis untuk memutuskan ikatan antara glikon dan steroid [17]. Senyawa sterol yang merupakan salah satu jenis steroid ditemukan pada tumbuhan dalam keadaan berikatan dengan  glikosida  [18].  Pemutusan  ikatan  glikosida  menjadi  steroid  dan  glikon  dapat  dilakukan  dengan  hidrolisis menggunakan  larutan  HCl  2  N  [19].  Partisi  dilakukan  untuk  mengambil  metabolit  sekunder  yang  diinginkan  yang mempunyai kesamaan kepolaran dengan pelarut [20]. Tonius dkk. [21] menyatakan bahwa fraksi n-heksana daun buas- buas ( Premna serratifolia L.) diduga mengandung cholestane yang termasuk dalam salah satu golongon steroid. Fraksi yang diperoleh dari hasil partisi biasanya masih berupa senyawa campuran sehingga perlu dilakukan isolasi lebih lanjut.
Isolasi  senyawa  steroid  dapat  dilakukan  dengan  metode  kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  [22,  23].  Mardaneni  [24] menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (17 : 3) pada fraksi etil asetat alga merah menghasilkan 6 noda. Baderos [25] menyatakan bahwa identifikasi golongan steroid dari fraksi petroleum eter alga merah menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (17 : 3) menunjukkan 11 noda di bawah sinar UV 366 nm.  Noda yang menunjukkan adanya steroid adalah noda ke- 5, 6, 7, 9, 10 dan 11. Penelitian Azah [26] menyatakan bahwa identifikasi golongan steroid pada H. verticillata dengan fase gerak n-heksana: etil asetat (3,75:1,25) diperoleh 13 noda dan 2 noda merupakan senyawa steroid.
Pengujian  aktivitas  antioksidan  dari  senyawa  steroid  dilakukan  dengan  metode  1,1-difenil-2-pikrilhidrazil  (DPPH). Hasil  uji  antioksidan  pada  tumbuhan H.  verticillata dengan  menggunakan  pelarut  metanol,  kloroform,  dan  n-heksana diperoleh nilai EC 50 masing-masing 256,6; 457,6 dan 2763 ppm [27]. Laili [28] melakukan uji antioksidan terhadap fraksi petroleum alga merah menunjukkan bahwa nilai EC 50 yaitu 248,1 ppm. Fasya dkk . [29] melakukan uji aktivitas antioksidan isolat KLT preparatif fraksi petroleum eter mikroalga Chlorella sp. dan diperoleh nilai EC 50 sebesar 73,83 ppm. Adapun nilai EC 50 isolat steroid hasil kromatografi kolom dari fraksi petroleum eter hasil hidrolisis ekstrak etanol H. verticillata sebesar 23,00 ppm [8].
Pada  penelitian  ini  dilakukan  pengujian  aktivitas  antioksidan  isolat  hasil  KLT  preparatif  fraksi  n-heksana  dari H. verticillata dengan metode DPPH dan mengidentifikasi senyawa steroid dalam fraksi n-heksana dengan menggunakan instrumentasi  UV-Vis  (Ultraviolet-visible),  FTIR  (Fourier-Transform  Infrared)  dan  LC-MS/MS  (Liquid  Chromatorgraphy- Mass Spectrometry). Hasil dari penelitian ini akan diaplikasikan sebagai sumber senyawa antioksidan alami.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1. Bahan
Bahan  sampel  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah H.  verticillata yang  berasal  dari  Danau  Ranu  Grati, Pasuruan. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah metanol 96% (p.a), kloroform 96% (p.a), n-heksana 96% (p.a), kertas saring, plat KLT GF 254 , aluminium foil, larutan DPPH 0,2 mM, etanol 95%, HCl 37%, HCl 2 M, natrium bikarbonat, dan reagen Lieberman-Burchard (asam asetat anhidrat, H 2 SO 4 pekat, dan etanol absolut).

## 2.2. Preparasi Sampel
Pengambilan sampel di Danau Ranu dilakukan di permukaan air dimana jarak antara permukaan dengan dasar air ± 2 m. Sampel diambil sebanyak 10 kg dan dicuci dengan air. Selanjutnya, dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung sampai kering. Setelah itu, sampel kering dihaluskan dengan ukuran 90 mesh dan dikeringkan pada suhu 38ºC selama 24 jam di Materia Medika, Kota Batu.

## 2.3. Penentuan Kadar Air
Cawan porselen disiapkan terlebih dahulu, lalu dipanaskan dalam oven pada suhu 100-105°C sekitar 15 menit untuk menghilangkan  kadar  air.  Selanjutnya,  cawan  disimpan  dalam  desikator  sekitar  10  menit,  ditimbang  dan  dilakukan perlakuan yang sama sampai diperoleh berat cawan yang konstan. Setelah itu, sebanyak 5 g sampel dimasukkan dalam cawan porselen, kemudian dimasukkan dalam oven dan dikeringkan pada suhu 100-105°C sekitar ±15 menit. Sampel kemudian disimpan dalam desikator sekitar ±10 menit dan ditimbang. Sampel tersebut dipanaskan kembali dalam oven ±15 menit, didinginkan dalam desikator sekitar ±10 menit dan ditimbang kembali. Perlakuan ini diulangi hingga tercapai berat konstan. Kadar air dalam serbuk H. verticillata dihitung menggunakan Persamaan (1).
Kadar air = (b - c) (b- a) x 100%
Dimana, a adalah bobot cawan kosong, b adalah bobot sampel ditambah cawan sebelum dikeringkan, dan c adalah bobot cawan ditambah sampel setelah dikeringkan.

## 2.4. Ekstraksi Sampel
Ekstraksi komponen aktif dilakukan dengan cara ekstraksi maserasi. Sampel H. verticillata yang telah dihaluskan kemudian  ditimbang  sebanyak  50  g  dan  diekstraksi  secara  maserasi  menggunakan  pelarut  metanol  96%  dengan perbandingan 5:1 (b/v) sebanyak 3 kali dan dilakukan pengocokan menggunakan shaker selama 3 jam dengan kecepatan 120  rpm.  Setelah  itu,  dilakukan  penyaringan  menggunakan  corong Buchner .  Ekstrak  pekat  ditimbang  lalu  dihitung rendemennya dengan Persamaan 2.
Rendemen (%) = berat ekstrak berat sampel x 100%

## 2.5. Hidrolisis dan Partisi
Hidrolisis ekstrak metanol H. verticillata dilakukan dengan cara penambahan HCl 2 M. Selanjutnya, ditambahkan natrium bikarbonat sampai pH 7 (netral). Ekstrak pekat metanol H. verticillata yang diperoleh pada proses sebelumnya dipindahkan ke dalam corong pisah dan dipartisi dengan pelarut n-heksana. Pelarut n-heksana ditambahkan sebanyak 25 mL kemudian dikocok dan didiamkan hingga terbentuk dua lapisan yaitu lapisan organik dan lapisan air. Masing-masing lapisan yang terbentuk kemudian dipisahkan, lapisan air yang ada di bagian bawah ditampung dan dimasukkan lagi ke corong pisah. Proses partisi dilakukan hingga diperoleh fasa air bening. Lapisan organik dimasukkan ke dalam gelas kimia kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator vacuum lalu dialiri dengan gas N 2 . Ekstrak pekat yang diperoleh selanjutnya ditimbang dan dihitung rendemennya [30].

## 2.6. Uji Fitokimia Senyawa Steroid
Uji fitokimia dilakukan dengan melarutkan fraksi n-heksana dalam 0,5 mL kloroform, kemudian ditambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrida dan 1-2 mL asam sulfat pekat (melalui dinding tabung). Apabila terbentuk warna hijau kebiruan menunjukkan adanya golongan senyawa steroid.
(1) (2)

## 2.7. Pemisahan Senyawa Steroid dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

## 2.7.1. Pemisahan dengan KLT Analitik
Pemisahan  senyawa  steroid  dengan  KLT  analitik  menggunakan  metode  modifikasi  Sriwahyuni  [31].  Identifikasi dengan KLT menggunakan plat silika gel GF 254 yang diaktivasi terlebih dahulu dalam oven pada suhu 100°C selama 30 menit  untuk menghilangkan air yang terdapat pada plat. Selanjutnya, masing-masing plat diberi ukuran 1x10 cm.
Ekstrak H. verticillata diperoleh dengan melarutkan ekstrak kasar sebanyak 10 mg dengan 1 mL pelarut n-heksana. Ekstrak H. verticillata kemudian ditotolkan pada jarak ±1 cm dari tepi bawah plat dengan pipa kapiler dan dalam 1 plat KLT diberi  1  totolan  dimana  dalam  1  tempat  totolan  diberikan  3-5  kali  penotolan.  Plat  yang  sudah  berisi  totolan  tersebut, kemudian dikeringkan dan dielusi dengan masing-masing fase gerak (eluen).
Eluen untuk pengembangan ini dilakukan penjenuhan terlebih dahulu dalam suatu bejana tertutup selama 20-30 menit. Penjenuhan ini dilakukan untuk menyamakan tekanan uap pada seluruh bagian bejana. Setelah gerakan fase gerak sampai pada garis batas, elusi dihentikan. Noda-noda pada permukaan plat diperiksa di bawah sinar UV pada panjang gelombang 366 nm, diamati pemisahan noda dan dihitung nilai Rf-nya. Pada penelitian ini digunakan 5 macam variasi eluen ( Tabel 1 ).
Tabel 1 . Variasi Eluen Campuran n-Heksana dan Etil Asetat Eluen Perbandingan n-Heksana : Etil Asetat Referensi 1 4,75  :  0,25 [32] 2 4,50  :  0,50 [33] 3 4,25  :  0,75 [34] 4 4,00  :  1,00 [35] 5 3,75  :  1,25 [36]

## 2.7.2. Pemisahan KLT Preparatif
Pemisahan  dengan  KLT preparatif  digunakan  plat  silika  gel  GF 254 dengan ukuran  10x20  cm.  Ekstrak pekat  hasil ekstraksi ditotolkan sepanjang plat pada jarak 1 cm dari garis bawah dan 1 cm dari garis tepi. Selanjutnya, dielusi dengan menggunakan eluen yang memberikan pemisahan terbaik pada KLT analitik. Noda-noda pada permukaan plat diperiksa di bawah sinar UV pada panjang gelombang 366 nm, kemudian diamati pada masing-masing hasil nodanya. Noda yang diduga merupakan senyawa steroid dikerok dan dilarutkan dalam 5 mL pelarut n-heksana,  selanjutnya disentrifugasi untuk mengendapkan silika.

## 2.8. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

## 2.8.1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH
Etanol 95% dipipet sebanyak 4,5 mL kemudian ditambahkan larutan DPPH 0,2 mM sebanyak 1,5 mL dan dimasukkan ke dalam kuvet. Selanjutnya, ditentukan dan dicatat hasil pengukuran λ max DPPH untuk digunakan pada tahap selanjutnya [37].

## 2.8.2. Pengukuran Aktivitas Antioksidan pada Sampel
Masing-masing isolat dilarutkan dalam etanol 95% dengan konsentrasi 50 ppm dan diuji aktivitas antioksidannya. Ekstrak untuk uji aktivitas antioksidan divariasikan konsentrasi menjadi 1, 2, 3, 4, dan 5 ppm. Ekstrak pada masing-masing konsentrasi dipipet 4,5 mL dan ditambahkan 1,5 mL DPPH 0,2 mM kemudian diinkubasi dengan suhu 37°C selama 90 menit,  dan  diukur  absorbansinya  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  pada  λ max yang  telah  didapatkan.  Data absorbansinya yang diperoleh digunakan untuk menghitung persen (%) aktivitas antioksidan menggunakan Persamaan (3) dan ditentukan pula nilai EC 50 nya [27].
Aktivitas antioksidan (%) = ( Absorbansi sampel - Absorbansi kontrol ) Absorbansi kontrol x 100 %

## 2.9. Identifikasi Senyawa Steroid

## 2.9.1. Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Vis
Isolat  yang  diperoleh  dari  hasil  KLT  preparatif  yang  diduga  senyawa  steroid  dianalisis  dengan  menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Isolat dimasukkan dalam kuvet dan dianalisis pada rentang panjang gelombang 200–800 nm. Blanko yang digunakan adalah pelarut n-heksana yang dianalisis rentang panjang gelombang yang sama dengan isolat. Spektra yang terbentuk diamati, dicatat panjang gelombang dan absorbansinya pada puncak yang terbentuk.
(3)

## 2.9.2. Identifikasi dengan FTIR
Hasil isolat steroid n-heksana dan petroleum eter yang menunjukkan nilai aktivitas antioksidan terbaik diidentifikasi menggunakan FTIR. Ekstrak kasar tersebut dicampur dengan pelet KBr lalu digerus bersamaan dengan mortar agate. Campuran pelet KBr dan sampel yang telah halus ditekan dengan tekanan 80 torr (8 – 20 Torr per satuan waktu) selama 10 menit. Selanjutnya, pelet yang telah ditekan dianalisis menggunakan FTIR.

## 2.9.3. Identifikasi dengan LC-MS/MS
Isolat senyawa steroid yang memiliki kemampuan antioksidan yang paling baik dianalisis menggunakan LC-MS/MS. Kolom yang digunakan dengan spesifikasi hypersil gold (50 mm x 2,1 mm x 1,9 µm). UHPLC merk ACCELLA type 1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri dari degasser vakum, pompa quartener, autosampler. Thermostatic yang dikendalikan oleh komputer melalui program x-calibur 2.1. Fase gerak yang digunakan adalah 0,1% asam format dalam air (fase A) dan 0,1% asam format dalam asetonitril (fase B). Pengaturan eluen secara gradien linier 100% (A) : 0% (B) sampai 0% (A) : 100% (B) yang diatur selama 5 menit dengan laju alir 500 µL/menit. Volume yang diinjeksikan sebanyak 2 µL. Kolom dikontrol pada suhu 30ºC, dan kompartemen autosampler ditetapkan untuk 10ºC.
MS yang digunakan adalah MS/MS triple Q (Quadrupole) spektrometer massa TSQ QUANTUM ACCESS MAX dari Thermo Finnigan dengan sumber ionisasi APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) dikendalikan oleh software TSQ Tune yang dikendalikan dengan mode positif. Kondisi ion APCL 41 adalah sebagai berikut: arus yang digunakan 4 µA, suhu penguapan 250ºC, suhu kapiler 300ºC, sheath gas pressure 45 arbitrary units , dan aux gas pressure 15 arbitary units .

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Preparasi Sampel
Preparasi sampel meliputi pencucian untuk menghilangkan pengotor yang terdapat pada sampel dan pengeringan untuk mengurangi kandungan air. Proses pengeringan dilakukan tanpa pemanasan sinar matahari langsung. Pengeringan tanpa menggunakan pemanasan matahari ini dilakukan agar senyawa aktif yang diinginkan tidak mengalami kerusakan akibat suhu yang tinggi. Penghalusan bertujuan untuk memperluas permukaan dari sampel sehingga mempermudah pada tahap ekstraksi. Menurut Voight [38], semakin kecil bentuk sampel maka luas permukaannya akan semakin besar sehingga kontak yang terjadi antara sampel dengan pelarut akan semakin besar. Sampel yang telah dihaluskan dan diayak dengan ukuran ±90 mesh. Sampel kering sebanyak 1,1 kg menghasilkan serbuk kering sebanyak 950 g.

## 3.2. Penentuan Kadar Air secara Termogravimetri
Kandungan air dalam sampel memiliki pengaruh besar terhadap proses ekstraksi. Menurut Khoiriyah dkk. [39], kadar air yang rendah dapat mempermudah proses penarikan zat aktif dalam sampel karena pelarut mudah menembus dinding sel sampel tanpa adanya gangguan dari molekul air. Hasil penentuan kadar air pada sampel kering H. verticillata sebesar 6,5%. Nilai tersebut sesuai dengan Setyaningsih dkk. [40] menyatakan bahwa kadar air maksimum yang diisyaratkan untuk berlangsungnya ekstraksi secara maksimal yaitu sebesar 11 %. Artinya kadar air sampel kering H. verticillata tidak melebihi ambang batas maksimum kadar air yang disyaratkan untuk proses ekstraksi. Hal ini bertujuan agar sampel yang telah berbentuk ekstrak tidak ditumbuhi jamur saat disimpan [41].

## 3.3. Ekstraksi Sampel
Senyawa metabolit sekunder yang berada di alam berikatan dengan glikosida sehingga bersifat polar. Oleh karena itu, pada penelitian ini proses ekstraksi maserasi dilakukan dengan pelarut metanol yang bersifat polar. Proses maserasi dihentikan ketika warna filtrat dari sampel sudah berubah dari hijau pekat menjadi hijau yang lebih bening yang dapat diasumsikan bahwa senyawa dalam sampel telah terekstrak. Filtrat dari hasil proses maserasi menggunakan metanol yang telah diperoleh dijadikan satu dan diuapkan menggunakan rotary evaporator untuk memperoleh ekstrak pekat metanol. Rendemen ekstrak pekat yang didapat dari pada penelitian ini yaitu 5,14%.

## 3.4. Hidrolisis dan Partisi
Senyawa organik yang terdapat pada tumbuhan dalam bentuk ikatan glikosida yaitu gabugan dua bagian senyawa antara gugus gula dan gugus bukan gula. Proses hidrolisis akan memutuskan ikatan glikosida menjadi glikon dan aglikon dengan  bantuan  katalis  asam.  Hidrolisat  yang  diperoleh  kemudian  dipartisi  (ekstraksi  cair-cair)  dengan  menggunakan pelarut  n-heksana.  Pelarut  ini  bersifat  nonpolar  sehingga  dapat  melarutkan  senyawa  yang  bersifat  nonpolar  seperti senyawa steroid. Proses partisi menghasilkan dua fasa cairan di mana fasa air dan fasa organik pada lapisan atas. Proses ekstraksi dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan untuk diambil fase organik yang mengandung senyawa steroid hingga
terjadi perubahan dari hijau kehitaman berubah warnanya menjadi bening. Dari 10 gram ekstrak kasar yang dihidrolisis didapatkan fraksi pekat n-heksana sebanyak 4,7 g dengan randemen 47,95%.

## 3.5. Uji Fitokimia
Uji fitokimia bertujuan untuk mengetahui senyawa steroid yang terdapat dalam sampel. Terbentuknya warna hijau kebiruan  menunjukkan  fraksi  n-heksana H.  verticillata mengandung  golongan  senyawa  steroid  sebagaimana  yang ditunjukkan pada Gambar 1(a) .

## 3.6. Pemisahan Senyawa Steroid dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

## 3.6.1. Pemisahan dengan KLT Analitik
Hasil ilustrasi pola pemisahan variasi eluen pada KLT analitik saat diamati di bawah lampu UV 366 nm tergambar pada Gambar 1(b) . Pola pemisahan pada eluen 5 (3,75:1,25) dan 4 (4:1) menghasilkan jumlah noda yang sama dan terbanyak daripada variasi eluen lainnya. Meskipun demikian, variasi eluen 4 memiliki pola pemisahan noda yang terduga steroid lebih bagus dibandingkan dengan variasi eluen 5 karena adanya jarak yang jelas antara senyawa terduga steroid dengan senyawa terduga triterpenoid.

## (a)                                                        (b)
Gambar 1. (a) Uji fitokimia fraksi n-heksana H. verticillata , dan (b) Penampakan noda KLT analitik pada 366 nm.
Tabel 2. Jumlah Noda yang Terbentuk pada KLT Analitik Eluen Jumlah Noda Rf Warna Dugaan Senyawa Rf Warna Dugaan Senyawa 1 (4,75:0,25) 4 0,0375 Merah Triterpenoid 0,1625 Hijau Steroid 0,1 Merah Triterpenoid 0,1875 Merah Triterpenoid 2 (4,50: 0,50) 4 0,05 Merah Triterpenoid 0,2125 Hijau Steroid 0,0875 Merah Triterpenoid 0,25 Merah Triterpenoid 3 (4,25: 0,75) 9 0,075 Merah Triterpenoid 0,35 Merah Triterpenoid 0,15 Merah Triterpenoid 0,425 Merah Triterpenoid 0,2 Merah Triterpenoid 0,6 Hijau Steroid 0,25 Merah Triterpenoid 0,7625 Merah Triterpenoid 0,2875 Merah Triterpenoid 4 (4,00:1,00) 12 0,1125 Merah Triterpenoid 0,5625 Merah Triterpenoid 0,2 Merah Triterpenoid 0,625 Merah Triterpenoid 0,25 Merah Triterpenoid 0,675 Merah Triterpenoid 0,3625 Merah Triterpenoid 0,725 Hijau Steroid 0,4 Merah Triterpenoid 0,7875 Merah Triterpenoid 0,475 Merah Triterpenoid 0,8625 Merah Triterpenoid 5 (3,75 : 1,25) 12 0,1625 Merah Triterpenoid 0,6375 Merah Triterpenoid 0,25 Merah Triterpenoid 0,7 Merah Triterpenoid 0,325 Merah Triterpenoid 0,7375 Merah Triterpenoid 0,4875 Merah Triterpenoid 0,775 Hijau Steroid 0,5625 Merah Triterpenoid 0,8125 Merah Triterpenoid 0,5875 Merah Triterpenoid 0,8625 Merah Triterpenoid
Adapun variasi eluen 1 (4,75:0,25) dan 2 (4,50:0,50) menghasilkan jumlah noda yang sedikit ( Gambar 1(b) ). Pada variasi eluen 1 memiliki jumlah noda sebanyak 9, namun noda yang diduga steroid mengalami overlap dengan noda yang diduga senyawa triterpenoid. Berdasarkan hasil tersebut, variasi eluen 4 dengan perbandingan n-heksana : etil asetat yaitu 4:1 digunakan untuk analisis lebih lanjut pada pemisahan KLT preparatif.
Berdasarkan Tabel 2 , dari kelima variasi eluen yang digunakan, variasi eluen 4 dan 5 menghasilkan jumlah noda terbanyak dengan jumlah yang sama yaitu 12, sedangkan pada variasi eluen 3 (4,25:0,75) hanya menghasilkan 9 noda. Adapun pada variasi eluen 1 dan 2 masing-masing menghasilkan 4 noda.

## 3.6.2. Pemisahan dengan KLT Preparatif
Pemisahan senyawa steroid dengan KLT preparatif dilakukan untuk mendapatkan isolat steroid. Hasil pemisahan menggunakan KLT preparatif terbentuk 19 noda yang ditunjukkan pada Tabel 3 . Berdasarkan Tabel 3 , dapat diketahui terdapat 1 steroid dan 18 triterpenoid. Jumlah noda yang dihasilkan pada KLT preparatif tidak sama dengan KLT analitik. Hal  ini  dikarenakan  jarak  elusi  yang  berbeda  sehingga  pada  KLT  preparatif  senyawa  yang  awalnya  masih  berhimpit akhirnya terpisah.
Tabel 3. Hasil Pemisahan Senyawa Steroid dengan KLT Preparatif No. Rf Warna Dugaan Senyawa No. Rf Warna Dugaan Senyawa 1 0,067 Merah Triterpenoid 11 0,4 Merah Triterpenoid 2 0,094 Merah Triterpenoid 12 0,461 Merah Triterpenoid 3 0,12 Merah Triterpenoid 13 0,51 Merah Triterpenoid 4 0,183 Merah Triterpenoid 14 0,55 Merah Triterpenoid 5 0,21 Merah Triterpenoid 15 0,66 Merah Triterpenoid 6 0,239 Merah Triterpenoid 16 0,75 Hijau Steroid 7 0,283 Merah Triterpenoid 17 0,8 Merah Triterpenoid 8 0,31 Merah Triterpenoid 18 0,856 Merah Triterpenoid 9 0,36 Merah Triterpenoid 19 0,917 Merah Triterpenoid 10 0,383 Merah Triterpenoid
Gambar 2. Hasil pemisahan senyawa steroid dengan KLT preparatif.
Ilustrasi hasil pemisahan KLTP ditunjukkan pada Gambar 2 . Pemisahan dengan KLT preparatif menghasilkan 1 noda positif steroid pada noda 16. Noda tersebut dikerok, dilarutkan dalam pelarutnya, dipisahkan menggunakan sentrifuge dan diuapkan pelarutnya. Isolat tersebut kemudian diuji antioksidannya menggunakan metode DPPH.

## 3.7. Uji Aktivitas Antioksidan dengan metode DPPH

## 3.7.1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH
Penentuan  panjang  gelombang  maksimum  bertujuan  untuk  mengetahui  panjang  gelombang  yang  mempunyai serapan tertinggi. Pengukuran sampel dilakukan panjang gelombang maksimum untuk mengoptimalkan kepekaan DPPH dan meminimalkan kesalahan [42]. Panjang gelombang maksimum DPPH yang diperoleh sebesar 515 nm sebagaimana yang ditunjukkan pada Gambar 3 . Panjang gelombang ini akan digunakan untuk menentukan aktivitas antioksidan pada isolat senyawa steroid hasil KLT fraksi n-heksana dari H. verticillata.
Gambar 3. Spektra panjang gelombang maksimum larutan DPPH.

## 3.7.2. Pengukuran Aktivitas Antioksidan pada Sampel
Persen aktivitas antioksidan pada isolat senyawa steroid hasil KLT preparatif dengan variasi konsentrasi 1, 2, 3, 4 dan 5 ppm ditunjukkan pada Tabel 4 . Pembuatan larutan DPPH dibuat dalam keadaan baru untuk menghindari terjadinya perubahan nilai yang signifikan. Berdasarkan data pada Tabel 4, dapat diketahui nilai EC 50 sampel yaitu sebesar 5,109 ppm. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat apabila memiliki nilai EC 50 kurang dari 50 ppm [43].
Tabel 4. Hasil Pengukuran Persen Aktivitas Antioksidan pada Sampel
Konsentrasi Absorbansi Kontrol Absorbansi Sampel Aktivitas Antioksidan (%) 1 ppm 0,1167 0,1125 3,59 2 ppm 0,4052 0,3849 5,009 3 ppm 0,1173 0,0973 17,05 4 ppm 0,7741 0,5601 27,6 5 ppm 0,7774 0,3875 50,154 3.8. Identifikasi Senyawa Steroid

## 3.8.1. Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Vis
Berdasarkan Gambar 4 , isolat steroid menghasilkan serapan maksimum pada panjang gelombang 203,9 dan 276 nm. Panjang gelombang 203 nm terdapat ikatan C=C tidak terkonjugasi dengan transisi π- π*. Sesuai dengan penelitian Aprelia dan Suyatno [44] yang melakukan identifikasi senyawa metabolit sekunder pada tumbuhan paku terdapat adanya serapan maksimum pada 203 nm yang menunjukkan adanya senyawa β -sitosterol, sedangkan panjang gelombang 276 nm menunjukkan bahwa hasil isolasi ini memiliki ikatan rangkap terkonjugasi.
Panjang Gelombang (nm)
Panjang Gelombang (nm)
A bso rb an si A bso rb an si

## 3.8.2. Identifikasi dengan FTIR
FTIR merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi suatu senyawa dimana terjadi interaksi  antara  energi dengan  molekul  yang  menyebabkan  terjadinya  transisi  akibat adanya vibrasi  molekul sehingga setiap gugus fungsi mempunyai tipe ikatan yang berbeda dan serapan IR yang khas. Spektra FTIR dari isolate steroid H. verticillata dapat dilihat pada Gambar 5 .
Gambar 5. Spektra FTIR isolat steroid hasil KLT preparatif.
Hasil analisis pola serapan FTIR yang dihasilkan dari isolat steroid H. verticillata menunjukkan adanya pita serapan pada  daerah  3460,150  cm -1 yang  melebar  menunjukkan  adanya  gugus  O–H  pada  isolat.  Pita  serapan  2958,771  cm -1 menunjukkan CH 3 stretching , –CH 2 – asiklik (2927 dan 2840 cm -1 ) dan ikatan C=C (1650 cm -1 ). Gugus fungsi penting lainnya yaitu gugus karbonil C=O untuk ester (1731 cm -1 ) yang didukung dengan serapan C–O ester (1286 cm -1 ) dan serapan C– O–C  (1076 cm -1 ).  Serapan  C–O  untuk  alkohol sekunder  muncul  1123,154 cm -1 .  Gugus geminal dimetil  pada  bilangan gelombang 1460 cm -1 dan 1383,5 cm -1 . Serapan gugus geminal dimetil ini adalah serapan khas dari senyawa steroid dan triterpenoid [45].

## 3.8.3. Identifikasi dengan LC-MS/MS
Identifikasi dilakukan pada isolat steroid yang didapat dari pemisahan menggunakan KLT. LC-MS/MS merupakan salah  satu  instrumen  yang  dapat  memisahkan  senyawa  berdasarkan  berat  dan  struktur  molekul,  serta  distribusi kepolarannya  terhadap  fasa  diam  dan  fasa  gerak  yang  digunakan.  Dugaan  jenis  steroid  hasil  identifikasi  LC-MS/MS berdasarkan waktu retensi dan nilai m/z yang terdapat pada Tabel 5 . Berdasarkan Tabel 5 , diketahui bahwa isolat hasil KLT preparatif fraksi n-heksana hasil hidrolisis ekstrak metanol H. verticillata menghasilkan spektra massa dengan m/z ion prekursor sebesar 397 dan m/z ion produk sebesar 161. Nilai ini sesuai dengan ion prekursor dan ion produk senyawa steroid β -sitosterol. Struktur ion prekursor, ion produk dan β -sitosterol ditunjukkan pada Gambar 6 .
(a)                                                                                 (b)
Gambar 6. (a) Struktur ion prekursor dan ion produk [18], dan (b) struktur β -sitosterol.
Bilangan Gelombang (cm -1 ) % T ra ns mit an m/z 397 [M-H 2 O+H] +
Ion prekursor β -sitosterol
161 Ion Produk
Tabel 5. Hasil Identifikasi LC-MS/MS Isolat Steroid H. verticillata

## .

## 4. Kesimpulan
Pemisahan steroid fraksi n-heksana pada H. verticillata menggunakan KLT dengan variasi eluen n-heksana dan etil asetat. Pemisahan terbaik untuk memisahkan steroid dengan KLT analitik menggunakan eluen 4 (4:1) dengan 12 noda. Pemisahan steroid menggunakan KLT preparatif menghasilkan 19 noda dimana 1 noda yang diduga steroid. Aktivitas antioksidan isolat steroid hasil KLT preparatif menghasilkan nilai EC 50 sebesar 5,109 ppm yang menunjukkan aktivitas antioksidan  yang  sangat  kuat.  Hasil  identifikasi  dengan  spektrofotometer  UV-Vis,  FTIR  dan  LC-MS/MS  menunjukkan bahwa isolat hasil KLT preparatif fraksi n-heksana hasil hidrolisis ekstrak metanol H. verticillata mengandung senyawa steroid β -sitosterol.

## Daftar Pustaka
[1] F.  Goltenboth,  K.  H.  Timotius,  P.  P.  Milan,  &  J.  Margraf, Ekologi  Asia  Tenggara  Kepulauan  Indonesia .  Jakarta: Salemba Teknika, 2012.
[2] A. Artiyani, "Penurunan Kadar N-Total dan P-Total pada Limbah Cair Tahu dengan Metode Fitoremediasi Aliran Batch dan Kontinyu Menggunakan Tanaman Hydrilla verticillata ," Spectra , vol. 9, no. 18, pp. 9–14, 2011.
[3] H. Araki, M. Inoue, & T. Katoh, ”Total synthesis and Absolute Configuration of Otteliones A and B, Novel and Potent Antitumor Agents from a Freshwater Plant," Organic Letters, vol. 5, no. 21, pp. 3903-3906, 2003.
[4] B. Das, D. Pal, & A. Haldar, "Pharmacognostical and Physiochemical Study of the Aquatic Weed Hydrilla verticillata (L.f.) Royle Known as Nutrient Power House," International Journal of Research in Pharmacy and Science, vol. 5, no. 1, pp. 1–6, 2015.
[5] P.  Prabha  &  J.  Rajkumar,  "Phytochemical  Screening  and  Bioactive  Potential  of Hydrilla  verticillata ," Journal  of Chemical and Pharmaceutical Research , vol. 7, no. 3, pp. 1809-1815, 2015.
[6] S.  W.  Annie,  R.  Raveen,  M.  G.  Paulraj,  T.  Samuel,  &  S.  Arivoli,  "Screening  of Hydrilla  verticillata (L.  F.)  Royle (Hydrocharitaceae) Crude Leaf Extracts for Larvicidal Efficacy against the Filarial Vector Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae)," International Journal of Entomology Research , vol. 1, no. 3, pp. 43-48, 2016.
[7] D. K. Pal & S. B. Nimse, "Little Known Uses of Common Aquatic Plant, Hydrilla verticillata (Linn. f.) Royle," Natural Product Radiance, vol. 5, no. 2, pp. 108-111, 2006.
[8] A. G. Fasya, S. Amalia, D. S. Megawati, F. Salima, V. A. Kusuma, & B. Purwantoro, "Isolation, Identification, and Bioactivity of Steroids Isolates from Hydrilla verticillata Petroleum Ether Fraction," in IOP Conference Series: Earth and Environmental Science on the 10 th International Conference on Green Technology, vol. 456, no. 012009, 2020.
[9] Z.  J.  Yi,  J.  Yao,  M.  J.  Zhu, H.  L.  Chen,  F.  Wang,  &  X.  Liu,  "Uranium  Biosorption from  Aqueous  Solution  by  the Submerged Aquatic Plant Hydrilla verticillata ," Water Science and Technology , vol. 75, no. 5-6, pp. 1332-1341, 2017.
[10] V. M. Kensa & R. Neelamegam, "Preliminary Phytochemical Analysis of Hydrilla verticillata (L.F.) Royle . Collected from Polluted and Unpolluted Water Sources," International Journal of Informative & Futuristic Research , vol. 3, no. 3, pp. 1125-1128, 2015.
[11] K. Roma, S. Kiran, & D. Sahoo, "Extraction and Screening of Bioactive Compounds of Some Common Hydrophyticand Wetland Plants from East Singbhum, Jharkhand, India," IOSR Journal of Pharmacy , vol. 7 no. 11, pp. 23-29, 2017.
[12] S. Amalia, A. G. Fasya, F. Hasanah, & D. Yuliani, "Pemisahan Senyawa Aktif Fraksi Petroleum Eter dan Etil Asetat Hasil Hidrolisis Ekstrak Etanol Hydrilla verticillata Pasuruan dari Ranu Grati, ALCHEMY: Journal of Chemistry, vol. 6, no. 2, pp. 50-56, 2018.
[13] U. Mardiyah, "Uji Aktivitas Antioksidan terhadap 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Alga Merah Eucheuma spinosum dari Perairan Banyuwangi," Skripsi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2012.
[14] S. Lenny, "Senyawa Flavonoida, Fenil Propanoida dan Alkaloida," USU Repository, 2006.
[15] S. Atun, "Metode Isolasi dan Identifikasi Struktur Senyawa Organik Bahan Alam," Jurnal Konservasi Cagar Budaya Borobudur, vol. 8, no. 2, pp. 53-61, 2014.
[16] M. N. Hafiz, "Uji Toksisitas Ekstrak Metanol, Kloroform dan n-Heksana Hydrilla verticillata (L.f) Royle dari Danau Ranu Kab. Pasuruan terhadap Larva Udang Artemia salina Leach," Skripsi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2017.
Jenis Steroid Waktu Retensi (Menit) Massa ( m/z) M M-H 2 O Ion Prekursor Ion Produk Kelimpahan β -sitosterol 2,26 414 396 397 160,5 – 161,5 1326
[17] A. G. Fasya, A. Baderos, A. D. R. Madjid, S. Amalia, & D. S. Megawati, "Isolation, Identification, and bioactivity of Steroids Compounds from Red Algae Eucheuma cottonii Petroleum Ether Fraction," in AIP Conference Proceedings, vol. 2120, no.1, 2019 .
[18] I. Khalaf, A. Corciovia, L. Vlase, B. Ivanescu, & D. Lazar, "LC/MS Analysis of Sterolic Compounds from Glycyrrhiza glabra ," Studia UBB Chemia , vol. 3, no. 1, pp. 97-102, 2011.
[19] D. S. P. Handoko, "Kinetika Hidrolisis Maltosa pada Variasi Suhu dan Jenis Asam sebagai Katalis," SIGMA: Jurnal Sains dan Teknologi , vol. 9, no. 1, 2006.
[20] A. G. Fasya, A. R. Dinasti, M. Shofiyah, L. M. Rahmawati, N. Millati, D. A. Safitri, S. Handoko, A. Hanapi, & R. Ningsih, "Ekstraksi, Hidrolisis dan Partisi Metabolit Sekunder dari mikroalga Chorella sp.," ALCHEMY: Journal of Chemistry , vol. 5, no. 1, pp. 5-9, 2016.
[21] J. Tonius, M. A. Wibowo, & N. Idiawati, "Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Steroid Fraksi n-Heksana Daun Buas- Buas ( Premna serratifolia L.)," Jurnal Kimia Khatulistiwa , vol. 5, no. 1, pp. 1-7, 2016.
[22] A. Mohammad, S. A. Bhawani, & S. Sharma, "Analysis of Herbal Products by Thin-Layer Chromatography: A Review," International Journal of Pharma and Bio Sciences , vol. 1, no. 2, pp. PS16, 2010.
[23] D. S. Megawati, A. G. Fasya, R. A. Pratiwi, & N. Maghfiroh, "Pharmacology Potency of Thin Layer Chromatography Steroid Isolates of Chlorella sp. Chloroform Fraction," IOP Conference Series Earth and Environmental Science, vol. 456, no. 012012, 2020.
[24] I. Mardaneni, "Pemisahan Senyawa Steroid Fraksi Etil Asetat Alga Merah Eucheuma cottonii Perairan Wongsorejo Banyuwangi  Menggunakan  Metode  KLT  dan  LC-MS,"  Skripsi,  Universitas  Islam  Negeri  Maulana  Malik  Ibrahim, Malang, 2017.
[25] A. Baderos, "Pemisahan Senyawa Steroid Fraksi Petroleum Eter Alga Merah ( Eucheuma cottonii) dengan Metode Kromatografi  Lapis  Tipis  dan Identifikasi  Menggunakan  LC-MS,"  Skripsi,  Universitas  Islam  Negeri  Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2017 .
[26] S. N. Azah, "Uji Toksisitas dan Identifikasi Isolat Steroid Hasil KLTP Ekstrak n-Heksana dan Petroleum Eter Hydrilla verticillata Menggunakan UV-Vis dan LC-MS/MS," Skripsi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2019 .
[27] S. Ikfi, "Uji Antioksidan Ekstrak Metanol, Kloroform dan n-Heksana Hydrilla verticillata (L.f) Royle dari Danau Ranu Kab.  Pasuruan  Menggunakan  Metode  DPPH  ( 1,1–diphenyl-2-picrylhydrazyl ),"  Skripsi, Universitas  Islam  Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2017.
[28] R. Laili, "Uji Aktioksidan dan Identifikasi Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis Senyawa Steroid Fraksi Petroleum Eter Hasil Hidrolisis Ekstrak Metanol Alga Merah," Skripsi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2016.
[29] A. G. Fasya, N. Millati, L. M. Rahmawati, R. Iyani, A. Hanapi, R. Ningsih, D. Yuliani, & D. S. Megawati, "Isolation and Bioactivity of Steroids Isolates from Petroleum Ether Fraction of Chlorella sp.," in AIP Conference Proceedings, vol. 2243, no. 1, 2020.
[30] N. Imamah, "Pemisahan Senyawa Steroid Fraksi Etil Asetat Hasil Hidrolisis Ekstrak Metanol Mikroalga Chlorella sp . Menggunakan  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT)  dan  Identifikasinya  Menggunakan  Spektrofotometer  FTIR,"  Skripsi , Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2015.
[31] I. Sriwahyuni, "Uji Fitokimia Ekstrak Tanaman Anting-Anting (Acalypha indica Linn ) dengan Variasi Pelarut dan Uji Toksisitas  Menggunakan  Brine  Shrimp (Artemia  salina Leach ) ,"  Skripsi,  Universitas  Islam  Negeri  Maulana  Malik Ibrahim, Malang, 2010.
[32] Muharram,  "Isolasi  dan  Uji  Bioaktivitas  Senyawa  Metabolit  Sekunder  Ekstrak N -Heksan  Daun  Pare  ( Momordica charantia L.)," Bionature, vol. 11, no. 2, pp. 70-78, 2010.
[33] U. Zahra, Muharram, & A. Ilyas, "Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak n-Heksan dari Umbi Lobak ( Raphanus sativus Lamk)," Al-Kimia, vol. 1, no. 1, pp. 1-9, 2013.
[34] L. N. Azizah, "Uji Toksisitas Isolat Steroid Hasil KLTP Fraksi Petroleum Eter Hasil Hidrolisis Ekstrak Metanol Alga Merah," Skripsi, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, 2016.
[35] E. K. Hayati, A. Jannah, & R. Ningsih, "Identifikasi Senyawa dan Aktivitas Antimalaria In Vivo Ekstrak Etil Asetat Tanaman Anting-Anting (Acalypha indica L . )," Molekul , vol. 7. no. 1. pp. 20-32, 2012.
[36] I. Dukomalamo, M. S. Sangi, & J. A. Rorong, "Analisis Senyawa Toksik Tepung Pelepah Batang Aren ( Arenga pinnata ) dengan Spektroskopi UV-Vis dan Inframerah," Jurnal MIPA, vol. 5, no. 1. pp. 54-59, 2016.
[37] E. Hanani, A. Mun'im, & R. Sekarini, "Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Spons Callyspongia sp. dari Kepulauan Seribu," Majalah Ilmu Kefarmasian, vol. 2, no. 3, pp. 127-133, 2005.
[38] R. Voigt, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi Edisi 5 . Yogyakarta: Gadjah Mada University Press, 1995.
[39] S.  Khoiriyah,  A.  Hanapi,  &  A.  G.  Fasya,  "Uji  Fitokimia  dan  Aktivitas  Antibakteri Fraksi  Etil  Asetat,  Kloroform dan Petroleum  Eter  Ekstrak  Metanol  Alga  Coklat Sargassum  vulgare dari  Pantai  Kapong  Pamekasan  Madura," ALCHEMY , vol. 3, no. 2, pp. 133-144, 2014.
[40] D. Setyaningsih, O. Y. Nurmillah, & S. Windawati, "Kajian Aktivitas Antioksidan dan Antimikroba Ekstrak Biji, Kulit Buah, Batang dan Daun Tanaman Jarak Pagar ( Jatropha curcas L.)," Jurnal Teknologi Pangan , vol. 4, no. 2, pp. 1-7, 2010.
[41] R. D. Ratnani, I. Hartati, Y. Anas, D. E. Puspaningrum, & D. D. D. Khilyati, "Standarisasi Spesifik dan Non Spesifik Ekstraksi  Hidrotropi  Andrographolid  dari  Sambiloto,"  dalam  Prosiding  Seminar  Nasional  Peluang  Herbal  sebagai Alternatif Medicine, 2015, pp. 147-155.
[42] A. Rohman, Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar, 2007.
[43] B. Hidajat, "Penggunaan Antioksidan pada Anak," Continuing Education XXXV. Hot Topics in Pediatric , pp. 3-4, 2005.
[44] F. Aprelia & Suyatno, "Senyawa Metabolit Sekunder dari Ekstrak Etil Asetat Tumbuhan Paku Christella arida dan Uji Pendahuluan Sebagai Antikanker," UNESA Journal of Chemistry , vol. 2, no. 3, pp. 93-99, 2013.
[45] M.  D.  Astuti,  A.  Maulana,  &  E.  M.  Kuntowati,  "Isolasi  Steroid  dari  Fraksi  n-Heksana  Batang  Bajakah  Tampala ( Spatholobus littoralis Hassk.)," dalam Prosiding Seminar Nasional Kimia Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 2014, pp. B-9 - B-12  .