IDENTIFIKASI FRAGMEN DNA MITOKONDRIA PADA SATU GARIS KETURUNAN IBU DARI SEL EPITEL RONGGA MULUT DAN SEL FOLIKEL AKAR RAMBUT
Rina Budi Satiyarti 1 , Nurmilah 2 , Tina Dewi Rosahdi 2
1 UIN Raden Intan Lampung Jalan Letkol H. Endro Suratmin Bandar Lampung
2 UIN Sunan Gunung Jati Bandung Jalan A.H. Nasution No. 105 Kota Bandung Email  : rinabudi07@gmail.com
Diterima: 22 Mei 2017. Disetujui : 19 Juni 2017. Dipublikasikan: 29 Juni 2017
Abstrak: DNA  mitokondria  (mtDNA)  manusia  memiliki  sejumlah  sifat  genetik  khas  yang membedakannya  dari  genom  inti  yang  dimanfaatkan  dalam  identifikasi  penurunan  hubungan kekerabatan, studi evolusi dan migrasi global manusia modern, bidang forensik dan identifikasi penyakit  genetik.  DNA  mitokondria  (mtDNA)  manusia  memiliki  laju  mutasi  yang  lebih  cepat dibandingkan  dengan  DNA  inti  sehingga  dapat  dimanfaatkan  untuk  pemeriksaan  sampel  yang terbatas seperti untuk kepentingan visum. Penelitian ini bertujuan untuk megidentifikasi fragmen DNA mitokondria dari lisis sel epitel rongga mulut menggunakan primer M1dan HV2R, dan sel folikel  akar  rambut  mengunakan  primer  M1  dan  M2  dengan  teknik  PCR  dan  elektroforesis agarosa.Sampel  sel  epitel  mulut  dan  akar  rambut  yang  diambil  dari  satu  garis  keturunan  dilisis terlebih  dahulu  dan  dilakukan  ekstraksi  sel  secara  kimiawi  dan  enzimatik  sehingga  DNA  total dapat  keluar  dari  inti  sel  dan  mitokondria.  Setelah  itu  dilakukan  amplifikasi  fragmen  D-loop mtDNA  secara  in  vitro  dengan  dua  jenis  primer  yang  berbeda  menggunakan  teknik  PCR  dan proses  terakhir  yaitu  dilakukan  analisis  hasil  PCR  menggunakan  teknik  elektroforesis  gel agarosa.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  amplifikasi  fragmen  DNA  mitokondria menggunakan  primer  M1  dan  HV2R  dari  sel  epitel  rongga  mulut  menghasilkan  fragmen berukuran  1  kb.  Pada  hasil  amplifikasi  fragmen  DNA  mitokondria  dari  sel  folikel  akar  rambut menggunakan  primer  M1  dan  M2,  fragmen  yang  didapatkan  berukuran  0,4-0,5  kb.  Dengan demikian,  fragmen  DNA  mitokondria  dapat  diamplifikasi  menggunakan  dua  primer  balik  M2 dan HV2R yang dirancang pada ujung daerah D-LOOP mitokondria.
Kata Kunci : mtDNA, PCR, epitel, folikel, fragmen, primer. .

## PENDAHULUAN
DNA  mitokondria  (mtDNA)  manusia  memiliki  sejumlah  sifat  genetik  khas  yang membedakannya  dari  genom  inti.  Pada  mamalia,  DNA  mitokondria  hanya  diturunkan  melalui jaluribu  tanpa  rekombinasi.  mtDNA  pada  sel  anak  seluruhnya  disumbangkan  oleh  ibu  dan sperma  sama  sekali  tidak  berkontribusi. [1] Keunikansistem  penurunan  yang  menarik  ini  telah dimanfaatkan dalam berbagai  bidang  yaitu  penurunan hubungan kekerabatan, studi evolusi  dan migrasi global manusia modern, bidang forensik dan identifikasi penyakit genetik. [2]
Keunikan  lain  dari  mtDNA  yaitu  memiliki  laju  mutasi  yang  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  DNA  inti  yaitu  laju  mutasi  menetap  gen-gen  mtDNA  10-17  kali  lebih  cepat  daripada yang  terlibat  dalam  fosforilasi  oksidatif  yang  dikode  oleh  DNA  inti. [2] mtDNA  berbeda  dengan DNA  inti  pada  lokasi,  urutan,  kuantitas  dalam  sel,  dan  cara  pewarisannya  (dari  orang  tua  ke anak). Sel hanya memiliki satu inti sel yang mengandung 2 set kromosom, yaitu satu set paternal
dan  satu  set  maternal,  masing-masing  set  terdiri  dari  23  kromosom.  Akan  tetapi  sel  dapat mengandung  ratusan  hingga  ribuan  mitokondria  dan  masing-masing  mitokondria  dapat mengandung  beberapa  kopi  mtDNA.DNA  inti  memiliki  jumlah  basa  yang  lebih  banyak dibandingkan  mtDNA,  tetapi  molekul  mtDNA  terdapat  dalam  jumlah  kopi  yang  jauh  lebih banyak daripada molekul DNA inti. Karakteristik mtDNA ini sangat berguna pada situasi ketika jumlah  DNA  dalam  sampel  sangat  terbatas,  seperti  sampel-sampel  yang  diambil  dari  kasus kriminal yaitu rambut, tulang, gigi, cairan tubuh (air liur, air mani, darah). [3]
Metode Polymerase  chain  reaction (PCR)  digunakan  untuk  membuat  jutaan  kopi  DNA dari sampel biologis. Amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR hanya membutuhkan sedikit sampel  dan  dapat  diperoleh  dari  sampel  yang  halus  seperti  rambut.  Kemampuan  PCR  untuk mengamplifikasi  sejumlah  kecil  DNA  memungkinkan  untuk  menganalisis  sampel  yang  sudah terdegradasi  sekalipun.  Namun,  tetap  saja  harus  dicegah    kontaminasi  dengan  materi  biologis yang  lain  selama  melakukan  identifikasi,  dan  menyiapkan  sampelnya. [4] Tes  DNA  dilakukan dengan cara mengambil DNA dari kromosom sel tubuh (autosom) yang mengandung area STR (short tandem repeats), suatu area ini tidak memberi kode untuk melakukan sesuatu. STR inilah yang bersifat unik karena berbeda pada setiap orang. Perbedaannya terletak pada urutan pasang basa yang dihasilkan dan urutan pengulangan STR. Pola STR ini diwariskan dari orang tua.
Metode  elektroforesis  gel  didasarkan  pada  pergerakan  molekul  bermuatan  dalam  media penyanggah matriks stabil dibawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA  yang  berukuran  lebih  besar  dari  100  bp  dan  dijalankan  secara  horizontal,  sedangkan elektroforesis  akrilamid  dapat  memisahkan  1  bp  dan  dijalankan  secara  vertikal.  Manfaat elektroforesis gel yaitu untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR.
Penelitian  ini  merupakan  bagian  dari  upaya  mendapatkan  ukuran  fragmen  mtDNA manusia pada satu  garis  keturunan ibu  menggunakkan  2 jenis primer, dimana sampel sel  epitel rongga  mulut  menggunakan  primer  M1  dan  HV2R  dan  sampel  sel  folikel  akar  rambut menggunakan  primer  M1dan  M2.Penelitian  ini  secara  khusus  bertujuan  untuk  melakukan amplifikasi ukuran fragmen 0,4 kb (443pb) pada sampel akar rambut  pada satu garis keturunan ibu dan amplifikasi ukuran fragmen 1 kb (1000pb) pada sampel sel epitel rongga mulut pada satu garis keturunan ibu.
Tubuh  manusia  tersusun  atas  sel  yang  membentuk  jaringan,  organ,  hingga  sistem organ.Sel  mengandung  materi  genetik  yang  terdiri  dari  DNA  dan  RNA.  Molekul  DNA merupakan  rantai  polinukleotida  berbentuk  heliks  ganda  yang  mempunyai  beberapa  jenis  basa purin dan pirimidin . [6]

## Sel
Sel merupakan unit struktural dan fungsional organisme hidup. Organisme terkecilterdiri dari sel tunggal,  sebaliknya  tubuh  manusia  mengandung  sedikit  10 14 sel.  Terdapat  berbagai  jenis  sel, yang  amat  bervariasi  dalam  ukuran,  bentuk  dan  fungsi  khususnya.  Tiap  sel  dikelilingi  oleh membran tipis yang membuatnya terpisah dan mencukupi diri sendiri. Membran sel disebut juga membran  plasma  atau  membran  sitoplasma  yang  bersifat  permeable.  Didalam  tiap  sel  terdapat sitoplasma, tempat berlangsungnya hampir semua reaksi enzimatis dari metabolisme sel. Dalam sitoplasma,  energi  kimia  digunakan  oleh  sel  untuk  membangun  dan  mempertahankan strukturnya. Didalam sitoplasma sel juga terdapat ribosom, suatu granula kecil yang berdiameter 18 sampai 22 nm, yang berfungi mensintesis protein. Dan semua sel hidup dilengkapi dengan inti
sel  dimana  tempat  terjadinya  replikasi  senyawa  genetik  dan  penyimpanan  dalam  bentuk  asam deoksiribonukleat (DNA). [7]
Organisme  yang  hidup  saat  ini  dibagi  dalam  dua  kelompok  besar,  yaitu prokariot dan eukariot. Sel prokariot merupakan  sel  terkecil  yang  paling  sederhana.  Berikut  gambar  sel prokariot dapat dilihat pada Gambar 1 .
Gambar 1. Sel prokariot. [8]
Sel prokariot kira-kira terdiri dari 3000 spesies bakteri, termasuk organisme yang disebut ganggang  hijau-biru.  Sel prokariot memiliki  struktur  yang  sederhana,  pertumbuhan  sel  nya sangat  cepat,  mekanisme  sederhana  dan  transmisi  informasi  genetik.Sedangkan  sel eukariot berukuran  lebih  besar  dibandingkan  dengan  sel prokariot. Sel eukariot dapat  dilihar  pada Gambar 2.
Gambar 2. Sel eukariot. [9]
Sel eukariot dapat  membelah  diri  secara  aseksual,  proses  pembelah  dirinya  secara mitosis.  Sel  benih  organisme eukariot dapat  juga  melangsungkan  konjugasi  seksual  yang kompleks. Berikut perbandingan antara sel prokariot dan eukariot dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. perbedaan antara sel prokariot dan eukariot Karakteristik Sel prokariot Sel eukariot Bentuk organisasi Bersel satu Bersel satu atau banyak Organel, sitoskelet, alat pembelahan sel Ada Ada namun rumit DNA Mudah, didalam sitoplasma Rumit, dalam inti sel Protein, sintesis dan pematangan Sederhana, terangkai dengan sintesis RNA Rumit, dalam sitoplasma dan retikulum endoplasma berbintil Metabolisme Anaerobik atau aerobik, sangat mampu menyesuaikan diri Kebanyakan aerobik
http://ejournal.radenintan.ac.id/index.php/biosfer/index
Endositisis dan eksositosis Tidak
Ya

## Mitokondria
Mitokondria merupakan organel sel yang diselimuti oleh membran dan ditemukan dalam semua  sel  eukariot.  Berdasarkan  hipotesis,  endosimbiosis  mitokondria  berasal  dari  sel  eukariot yang bersimbiosis dengan prokariot (bakteri) sehingga membentuk organel sel. [10] Adanya DNA pada mitokondria menunjukkan bahwa dahulu mitokondria merupakan entitas yang terpisah dari sel  inangnya  dan  hipotesis  ini  ditunjang  oleh  beberapa  kemiripan  mitokondria  dengan bakteri.Mitokondria ini menyerupai bakteri mulai dari bereproduksi dengan cara membelah diri menjadi dua; memiliki sistem genetik sendiri; dan memiliki ribosom. Ribosom mitokondria lebih mirip  dengan  bakteri  dibandingkan  dengan  ribosom  yang  dikode  oleh  inti  sel  eukariot. [11] Strukturmitokondria  ditunjukkan pada Gambar3.
Gambar 3 struktur mitokondria [12]
Gambar  3 adalah  struktur  mitokondria  yang  merupakan  organel  sel  penting  dalam  sel eukariot, berbentuk elips, dan memiliki empat bagian penting yaitu: (1) membran luar, (2) ruang antar-membran,  (3)  membran  dalam,  dan  (4)  matriks.  Membran  luar  bersifat  permeable;  ruang antar  membran  tempatdihasilkannya  nukleotida  kinase;  membran  dalam  yang  berlekuk-lekuk. Mitokondria pada eukariot berjumlah sangat banyak dan esensial karena tanpa mitokondria maka sel-sel akan mengandalkan proses anaerob untuk menghasilkan ATP.
Mitokondria memiliki berbagai sifat yang unik dibandingkan dengan organel sel lainnya, salah  satunya  adalah  jumlahnya  yang  berbeda-beda  disetiap  jaringan. [13] Semakin  tinggi kebutuhan jaringan akan energi,  maka jumlah mitokondria  yang dapat  ditemukan juga semakin tinggi.  Selain  itu,  mitokondria  juga  ditemukan  dalam  jumlah  banyak  pada  bagian  ekor  sperma, sel otot jantung, dan sel-sel yang aktif membelah seperti sel epitel, sel folikel akar rambut dan sel epidermis.  Hal  ini  erat  kaitannya  dengan  proses  oksidasi  zat-zat  makanan  yang  menghasilkan energi dalam bentuk adenosin triposfat (ATP) yang merupakan sumber energi kimia sel. [6]

## DNA Struktur dan Sifat Kimia DNA
DNA dan RNA merupakan polimer linear (polinukleotida) yang tersusun dari subunit dan monomer nukleotida. Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula
pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa nitrogen  yang  terdapat  pada  nukleotida  adalah  basa  purin  (adenin=A,  gunanin=  G)  dan  basa pirimidin (cytosin= C, timin= T, urasil= U). Timin terutama terdapat pada DNA sedangkan urasil hanya terdapat pada RNA. Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3’, gugus fosfat pada posisi karbon 5’ dan basa pada posisi karbon 1’ molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5’ fosfat dengan 3’ hidroksil. [14] Berikut struktur basa nitrogen purin dan pirimidin dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Sruktur DNA, basa nitrogen purin dan  pirimidin. [15]

## Fungsi DNA
DNA adalah dasar kimiawi hereditas dan penyusun gen  yang menjadi unit fundamental informasi genetik. Informasi genetik yang disimpan dalam nukleotida berfungsi untuk memenuhi dua tujuan, yaitu sumber informasi bagi sintesis semua molekul protein pada sel serta organisme dan memberikan informasi yang diwariskan kepada anak atau generasi berikutnya. [18]

## DNA Mitokondria
DNA  mitokondria  (mtDNA)  manusia  terletak  di  dalam  matriks  mitokondria.  mtDNA manusia  berupa  untai  ganda  berbentuk  sirkuler  yang  memiliki  urutan  lengkap  nukleotida sepanjang 16.569 pasang basa (pb). Molekul mtDNA terdiri dari untai heavy (H) dan untai light (L). [4] UntaiH  ini  memiliki  basa  G  lebih  banyak  dan  untai  L  yang  memiliki  basa  C  lebih banyak. [2] DNA mitokondria manusia ( Gambar5 ) tidak memiliki intron dan semua gen pengode terletak  berdampingan. [4] Urutan  lengkapnya  pertama  kali  ditentukan  pada  tahun  1981  oleh Aderson et al. dan dikenal dengan sebutan Cambriage Reference Sequence (CRS).
DNA  mitokondria  pada  CSR  mengandung  16.569  pasang  basa  dengan  37  gen  pengode ( coding redion ) yaitu 13 protein, 22 tRNA, 2rRNA dan daerah yang tidak mengode ( non coding region )  atau  daerah  pengontrol  yang  mengandung  D-loop.  D-loop  ini  terdiri  atas  dua  daerah dengan  variasi  tinggi,  yaitu hypervariablesegmentI (HVSI)  dan hypervariable  segment  II (HVSII). [4] Gambar struktur DNA mitokondria dapat dilihat pada Gambar5.
http://ejournal.radenintan.ac.id/index.php/biosfer/index
Gambar 5. Struktur DNA mitokondria [21]
Secara umum, mtDNA terdiri atas daerah pengode dan daerah non-pengode. Daerah non- pengode memiliki ukuran sepanjang 1122 pb. Daerah non-pengode ini mengandung bagian yang memiliki  variasi  tinggi  pada  tiap  individu  yang  disebut  dengan displacement  loop (D-loop) sehingga  seringkali  digunakan  untuk  keperluan  filogenetik.  D-loop  merupakan  daerah  beruntai tiga  ( triple  stranded ),  dan  untai  ketiga  ini  lebih  dikenal  dengan  nama  7S  DNA.  Terlihat  pada Gambar  5 bahwa  D-loop  ini  memiliki  dua  daerah  yaitu  HVSI  pada  posisi  16024-16265  dan HVSII  pada  posisi  57-732.  Selain  D-loop  juga  terdapat  daerah  pengontrol non-coding  region yang mengandung origin of replication (ORI) untuk untai (O H ) dan promotor untuk untai H dan L  (P L dan  P H ).  Selain  mengandung  daerah  dengan  variasi  tinggi,  daerah non  coding juga memiliki tiga daerah  yang lestari,  yang disebut  dengan Conserved  Sequence Block (CSB)  I,  II, III. Daerah yang lestari ini diduga memegang peranan penting dalam replikasi DNA.
Berbeda halnya dengan DNA inti, DNA mitokondria diwariskan melalui garis keturunan ibu. [22] Hal  ini  terjadi  karena  hampir  tidak  adanya  rekombinasi  DNA  mitokondria  dari  ayah  dan  DNA mitokondria dari ibu saat pembuahan sel telur oleh sperma. Saat terjadi pembuahan, bagian ekor sperma dilepaskan sehingga hampir tidak ada DNA mitokondria dari ayah yang masuk ke dalam sel telur. Selain itu, jumlah kopi mtDNA sel sperma sangat rendah (100-500) sedangkan sel telur memiliki  jumlah  kopi  mtDNA  yang  tinggi  (≥100000). [23] Oleh  karena  itu,  mtDNA  bersifat haploid yaitu karena diturunkan dari ibu ke seluruh keturunannya.

## 2.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR merupakan teknik in vitro untuk DNA yang dibatasi oleh sepasang primer (oligonukleotida pendek)  menggunakan  enzim  17  DNA  polimerase  dan  dNTP  sebagai  monomermya. [25] Pada umumnya  proses  PCR  berlangsung  dalam  tiga  tahap  yaitu:  (1).  Denaturasi,  yaitu  pemisahan DNA untai ganda menjadi untai tunggal karena terjadi pemutusan ikatan hidrogen basa-basanya pada suhu tinggi (94-96 o C). (2). Annealing, yaitu tahap penempelan primer pada template DNA. Suhu annealing dapat dihitung berdasarkan nilai melting temperature ™ dari primer-primer yang digunakan.  (3). Extension ,  yaitu  tahap  reaksipolimerisasi  oleh  enzim  DNA  polimerase menggunakan  dNTP  sebagai  monomernya  dan  dimulai  dari  ujung  3’  primer  sepanjang    DNA tampletnya hingga berbentuk untai DNA baru. Tahap ini  berlangsung pada temperatur saat DNA polimerase  bekerja  optimal.  Waktu  yang  dibutuhkan  pada  tahap  ekstensi  tergantung  pada
Juli 2017
panjang  fragmen  yang  diamplifikasi  dan  kecepatan  reaksi (processity) dari  enzim  DNA polimerase  yang  digunakan.Ketiga  tahap  tersebut  merupakan  siklus  yang  berlangsung  secara terus menerus.Untuk menghasilkan produk yang banyak dibutuhkan sekitar 25-30 siklus. Secara teori jumlah fragmen DNA yang dihasilkan selama n siklus PCR dirumuskan dengan (2 n – 2n)x, dimana n = jumlah siklus,  dan x = jumlah templat  DNA. [24] Bahan-bahan  yang dibutuhkan agar reaksi amplifikasi dapat berjalan adalah: DNA templat, diperoleh dari sampel yang mengandung fragmen  DNA  yang  diinginkan  untuk  diperbanyak  atau  diamplifikasi, Taq  buffer  (buffer  PCR), sebagai  penyedia  dan  penjaga  suasana  kimia  dalam  larutan  agar  enzim  polimerase  dapat berfungsi  dengan  baik,  Primer,  yang  digunakan  terdiri  dari  primer forward (maju)  dan reverse (balik)  yang  urutannya  merupakan  komplemen  dari  masing-masing  untai  DNA,  dan  dNTP, sebagai sumber nukleotida untuk memperpanjang rantai DNA primer yang menjadi daerah awal berjalannya proses perbanyakan.

## Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis  adalahteknik  pemisahan  komponen  atau  molekul  bermuatan  berdasarkan perbedaan  tingkat  migrasinya  dalam  sebuah  medan  listrik.  Kecepatan  molekul  yang  bergerak pada  medan  listrik  bergantung  pada  muatan,  bentuk  dan  ukuran  molekul.  Elektroforesis  gel biasanya  digunakan  untuk  tujuan  analisis,  namun  dapat  pula  digunakan  untuk  separasi makromolekul dan juga sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode lain seperti sekuensing, posisi  molekul  yang terseparasi  pada gel  dapat  dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. [27]

## METODE PENELITIAN
Metode yang akan dilakukan dalam penelitian ini terdiri dari pengumpulan sampel; lisis dari  sampel  mtDNA  yang  diperoleh;  amplifikasi  daerah  D-loop  mtDNA  sampel  dengan menggunakan  teknik  PCR  ( Polymerase  Chain  Reaction );  pendeteksian  hasil  PCR  dengan elektroforesis  gel  agarosa;  sekuensing hasil PCR dengan metode dideoksi  sanger; serta analisis urutan nukleotida menggunakan program SeqMan TM versi 4.00 DNASTAR.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik sampel epitel rongga mulut
Tahapan  awal dalam penelitian ini adalah pengambilan sampel dari satu garis keturunan ibu di daerah Sukabumi. Karakteristik dari masing-masing sampel secara rinci ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Data Sampel mtDNA Manusia Kode Sampel Jenis Kelamin K Perempuan KK Perempuan
Sampel  yang  diperoleh  dengan  cara  berkumur  merupakan  campuran  yang  sangat kompleks,  karena  selain  sel  epitel  dan  senyawa-senyawa  yang  telah  disebutkan  di  atas,  di dalamnya terdapat pula debris sel. Karena ukurannya yang relatif jauh lebih besar dari sel, debris
Juli 2017
dengan  mudah  dapat  dipisahkan  dari  campuran.  Sementara  zat-zat  organik,  anorganik,  dan makromolekul  terlarut  hasil  sekresi  kelenjar  saliva  tidak  dapat  dipisahkan  dari  campuran. Keberadaan  zat-zat  tersebut  dalam  sampel  tidak  mengganggu  reaksi  PCR,  terbukti  dengan berhasilnya amplifikasi yang dilakukan pada penelitian ini.
Banyaknya sel epitel yang dapat terambil dengan cara berkumur tergantung pada jumlah air  kumur  dan  waktu  kumur.  Makin  lama  waktu  kumur  akan  makin  banyak  sel  yang  terambil. Waktu  kumur  1  menit  merupakan  waktu  yang  ideal  untuk  berkumur  menggunakan  15  μL aquades  steril.  Makin  banyak  jumlah  air  yang  digunakan  untuk  berkumur  akan  makin  encer suspensi yang dihasilkan. [30]

## Karakteristik sampel folikel akar rambut
Sampel  yang  diambil  dari  satu  garis  keturunan  ibu  ini  juga  diambil  dari  akar  rambut. Hal  ini  dikarenakan  akar  rambut  dikelilingi  folikel.  Folikel  merupakan  pusat  tumbuh  rambut yang mengandung keratin yang berasal dari invaginasi epitel epidermis, sehingga terdapat lebih banyak mtDNA dibandingkan dengan bagian pangkalnya. [31] Beberapa alasan yang menyebabkan rambut  digunakan  sebagai  sumber  mtDNA  pada  penelitian  ini  adalah:  rambut  mengalami pertumbuhan  yang  relatif  cepat,  proses  pengambilan  sampel  rambut  lebih  mudah  dibandingkan sel-sel sumber mtDNA lainnya seperti darah, dan penyimpanannya lebih mudah.

## Hasil Lisis Sampel
Pada  proses  lisis  sampel  diperoleh  fragmen  mtDNA  yang  digunakan  sebagai  template. Prinsip  metode  lisis  adalah  perusakan  membran  sel  tanpa  harus  merusak  DNAyang diinginkan. [32] Templat ini merupakan hasil lisis dari sel epitel rongga mulut dan hasil lisis dari akar rambut yang ditambahkan buffer lisis, proteinase K dan ddH 2 O. Buffer lisis yang digunakan merupakan  campuran  dari  Tris-HCl  500μL  pH  8;  EDTA  20μL  pH  8;  dan  Tween-20  5%.  Tris- HCl berfungsi untuk menjaga pH optimum  pada aktivasi enzim proteinase K. Pada buffer lisis, larutan  EDTA (Ethylendiamine  tetraacetic  acid) berfungsi  sebagai  pembentuk  kompleks  kelat dengan  ion  logam,  seperti  Mg 2+ yang  merupakan  kofaktor  DNA  polimerase  III.  Pembentuk kompleks ini menyebabkan DNA polymerase III menjadi tidak aktif sehingga DNA polymerase III  tidak  memecah  molekul  DNA. [31] Tween-20  berperan  sebagai  detergen  atau  pengemulsi. Proteinase-K  yang  ditambahkan  dalam  larutan  lisis  berfungsi  untuk  menghancurkan  atau mendegrasdasi protein penyusun komponen sel.
Dalam  tahap  lisis  dilakukan  inkubasi  pada  suhu  50  ˚C  selama  60  menit.  Inkubasi  ini berperan  untuk  mengoptimalkan  kerja  enzim  proteinase-K  dalam  mendegradasi  protein  serta mengoptimalkan  reaksi  lisis  membran  sel  oleh  Tris-HCl,  EDTA,  dan  Twen  20.  Proteinase  K dalam  mtDNA  dideaktifasi  dengan  pemanasan  pada  suhu  95˚C  agar  tidak  merusak    molekul- molekul  proteinnya.  Dengan  demikian  diperoleh  templat  mtDNA  hasil  lisis  yang  terlarut  pada supernatannya dan sudah terpisah dari debrisnya. Templat mtDNA yang diperoleh disimpan pada suhu -20 ˚C untuk menjaga kondisi fisiologis mtDNA.
Primer-primer  dirancang  menggunakan  program seqman DNA  star.  Rancangan  primer dibuat  dengan  memasukan  urutan  D-loop  mtDNA  yang  diperoleh  dari  NCBI. Database yang diperoleh  dari  NCBI  dimasukkan  kedalam  program  seqman  DNA  star  kemudian  primer  yang digunakan dimasukkan kedalam program seqman DNA star. Perancang  primer yang baik harus mempertimbangkan  beberapa  peraturan,  yakni  memeperlihatkan  besarnya  amplikon,  panjang
http://ejournal.radenintan.ac.id/index.php/biosfer/index
Juli 2017
primer, titik leleh, dan tidak membentuk struktur sekunder. Berikut Gambar 6 rancangan primer majuM1 menggunakan program seqman DNA star. [29]
Gambar 6 Primer majuM1menggunakan program seqman DNA star
Primer  yang  didapatkan  dengan  menggunakan  program  seqman  DNA  star  merupakan primer  universal  untuk  mengidentifikan  daerah  D-loop  mtDNA.  Primer  maju  dimulai  dari 15.978-15997  pb.  Panjang  primer  maju20pb  hal  ini  sesuai  dengan  persyaratan  panjang  primer yang  baik  adalah  18-22pb.  Suhu annealing untuk  primer  ini  adalah  50˚C  hal  ini  sesuai  dengan persyaratan primer yang baik yaitu sekitar 50-58˚C.Berikut Gambar 7 rancangan primer balikM2 menggunakan program seqman DNA star. [29]
Gambar 7 PrimerbalikM2 menggunakan program seqman DNA star .
Primerbalik dimulai pada panjang basa 16.401-16.419pb. panjang primer balik 19pb, hal ini  sesuai  dengan  persyaratan  panjang  primer  yang  baik  yaitu  18-22pb.  Suhu annealing untuk primer  ini  adalah  50˚C  hal  ini  sesuai  dengan  persyaratan  primer  yang  baik  50-58˚C.Berikut Gambar 8 rancangan primer balikHV2R menggunakan program seqman DNA star. [29] Primerbalik  dimulai  pada  panjang  basa  409-429pb.  panjang  primer  balik  21pb,  hal  ini sesuai dengan persyaratan panjang primer yang baik yaitu 18-22pb. Suhu annealing untukprimer ini adalah 50˚C hal ini sesuai dengan persyaratan primer yang baik 50-58˚C. [22]

## Analisis Hasil PCR
Hasil  PCR  kemudian  dianalisis  menggunakan  metode  elektroforesis  gel  agarosa  dan visualisasi dapat dilihat di bawah sinar UV . Metode ini mampu memperlihatkan ukuran fragmen hasil  PCR  yang  diperoleh  dalam  penelitian.  Untuk  menentukan  ukuran  hasil  PCR  digunakan penanda  ( marker )  DNA  ladder  KAPA  Universal,  dan  1  kb  ladder  (fermentas)  dengan  ukuran
Juli 2017
pasang basa tertentu. Keberhasilan amplifikasi diidentifikasi dengan cara membandingkan posisi fragmen sampel  dengan marker DNA  yang sudah diketahui  ukurannya dan meyakinkan bahwa mtDNA yang diamplifikasi merupakan mtDNA targen bukan asing.
Gambar 8. Primer balikHV2R menggunakan program seqman DNA star
Pada proses elektroforesis gel agarosa digunakan DNA ladder KAPA Universal dan 1 kb ladder  fermentas  sebagai marker .  DNA  ladder  KAPA  Universal  menghasilkan  delapan  belas fragmen  dan  1  kb  ladder  fermentas  menghasilkan  empat  belas  fragmen.  Hasil  deteksi  produk PCR  dengan  teknik  elektroforesis  gel  agarosa  1%  pada  sampel  sel  epitel  rongga  mulut menggunakan  primer  M1  dan  HV2R  dapat  dilihat  pada Gambar  9,  Gambar  10 ,  dan  pada sampel sel folikel akar rambut menggunakan primer M1 dan M2 dapat dilihat pada Gambar 12 .
Hasil produk PCR sampel sel epitel  rongga mulut pada Gambar 9 menunjukkan adanya pita  fragmen  yang  sejajar  dengan  sampel  positif  K  terletak  pada  ukuran  1000  pb,  primer  yang digunakan  adalah  primer  M1  dan  HV2R.  Hasil  PCR  tersebut  merupakan  fragmen  D-loop mtDNA  manusia  yang  dimulai  dari  nukleotida  15.978  hingga  nukleotida  16.420. [11] dan  pita marker  yang  dihasilkan  cukup  sempurna  karena  pada  saat  penyimpanan marker suhu  ruang cukup lama sekitar 3-4 jam.
Gambar  9. Hasil  deteksi  produk  PCR  sampel  sel  epitel  rongga  mulut  dengan  elektroforesis  gel agarosa.  Lajur  1  menunjukkan  marker  DNA  ladder  KAPA  Universal;  lajur  2 menunjukkankontrol negatif ; lajur 3  sampel positif K dan 4 sampel KK
10000 pb 8000 pb 6000 pb 5000 pb 4000 pb 3000 pb 2000 pb 1600 pb 1200 pb 1000 pb 800 pb 600 pb 500 pb 400 pb 1000 pb 1 2 3 4
Amplifikasi PCR berhasil diamati dengan bantuan gel agarosa sebagai pita tunggal DNA yang  diperkirakan  berukuran  1000  pb  ( Gambar  10) .  proses  PCR  dikontrol  oleh  kontrol  positif yang  mengandung  templat  DNA  yang  telah  pernah  berhasil  diamplifikasi.  Seperti  terlihat  pada lajur  2,  kontrol  positif  menghasilkan  satu  pita  fragmen  berukuran  1000  pb.  Hasil  ini menunjukkan bahwa proses PCR yang dilakukan berhasil.
Gambar10. lajur  1  menunjukkan  marker  1  kb  ladder  fermantas;  lajur  2  menunjukkan  kontrol positif ; lajur 3  sampel positif K dan 4 sampel KK.
Ukuran  fragmen  PCR  dapat  dihitung  berdasarkan  selisih  total  pasang  basa  dalam mtDNA  (16569)  dengan  posisi  awal  primer  M1  (L15978)  dan  posisi  akhir  HV2R  (H409)  +  1. Berdasarkan perhitungan tersebut diperoleh ukuran fragmen hasil PCR adalah 1002 pasang basa. Posisi  ukuran  fragmen  tersebut  berada  di  daerah  D-Loop  yang  digambarkan  dalam  bentuk diagram dapat dilihat pada Gambar 11. Gambar tersebutmenunjukan pada posisi ukuran fragmen hasil  PCR  pada  daerah  D-loop,  fragmen  592  menunjukkan  selisih  total  pasangan  basa  dalam mtDNA (16569pb) dengan posisi awal primer M1 (L15978), fragmen 409 pb merupakan posisi akhir  HV2R  (H409).  Fragmen  1002  pb  menunjukkan  ukuran  fragmen  hasil  PCR.  Primer  M1 ditunjukan  dengan  warna  biru,  primer  HV2R  ditunjukkan  dengan  warna  merah.  Daerah  HV1 ditunjukkan  dengan  warna  hijau,  daerah  HV2  ditunjukkan  dengan    warna  ungu.  Warna  orange menunjukkan daerah antara HV1 dan HV2.
100 00 pb 800 0 pb 600 0 pb 500 0 pb 400 0 pb 350 0 pb 300 0 pb 250 0 pb 200 0 pb 150 0 pb 100 0 pb 750 pb 1000 pb 1  2 3 4 0 200 400 600
800 1000
HVI HV2 nt 372 nt 57 nt 16383 nt 16024 nt 15978 592 pb 409 pb nt 16569 nt 409 M 1
HV2R
1002p b
Gambar 11 . posisi ukuran fragmen hasil PCR pada daerah D-Loop Hasil  PCR  dari  dua  sampel  (k,  kk)  dipeoleh  fragmen  mtDNA  berukuran  sekitar  400  pb (0,4 kb), ditunjukkan oleh pita yang berada pada laju 3 dan 6 pada marker DNA ladder KAPA universal,  seperti  terlihat  pada Gambar  12. Hasil  ini  sesuai  prediksi,  yaitu  fragmen  442  pb daerah D-loop mtDNA pada posisi 15.978-16419. [11]
Ukuran fragmen PCR dapat dihitung berdasarkan selisih total pasang basa dalam mtDNA (16569)  dengan  posisi  awal  primer  M1  (L15978)  dan  posisi  akhir  M2  (H16419).  Berdasarkan perhitungan tersebut diperoleh ukuran fragmen hasil PCR adalah 442 pasang basa. Posisi ukuran fragmen  tersebut  berada  di  daerah  D-Loop  yang  digambarkan  dalam  bentuk  diagram  dapat dilihat pada Gambar 12.
Gambar  12. Hasil  deteksi  produk  PCR  dengan  elektroforesis  gel  agarosa  sampel  produk  PCR folikel  akar  rambut  dengan  primer  M1  M2.  Lajur  1  menunjukkan  marker  DNA ladder KAPA Universal; lajur 2 menunjukkan kontrol negatif; lajur 3 menunjukkan sampel positif  K; lajur 6 menunjukkan sampel KK .
Pada Gambar  12 posisi  ukuran  fragmen  hasil  PCR  pada  daerah  D-loop,  fragmen  442 menunjukkan selisih total pasanan basa dalam mtDNA (16569pb) dengan posisi awal primer M1 (L15978),  fragmen  16219  pb  merupakan  posisi  akhir  M2  (H16419).  Fragmen  442  pb menunjukkan ukuran fragmen hasil PCR. Primer M1 ditunjukan dengan warna biru, primer M2 ditunjukkan dengan warna oranye.
400 pb 1 3 6
Gambar 13 . posisi ukuran fragmen hasil PCR pada daerah D-Loop

## Hasil Sekuensing
Setelah berhasil dilakukan amplifikasi atau perbanyakan sampel satu garis keturunan ibu dan  divisualisasika  melalui  elektroforesis  gel  agarosa  yang  mengindikasi  bahwa  sampel  hasil PCR berhasil mengamplifikasi fragmen DNA pada sel  epitel  rongga mulut  berukuran 1 kb dan pada  sel  folikel  akar  rambut  berukuran  0,4kb,  maka  hasil  sampel  PCR  tersebut  kemudian diproses  dengan  sekuensing.  Proses  sekuensing  ini  bertujuan  untuk  menganalisis  urutan nukleotida  sampel  satu  garis  keturunan  ibu.  Berikut  gambar  hasilsekuensingsampel  satu  garis keturunan ibu dapat dilihat pada Gambar 14 .
Gambar 14. Tampilan sekuensing sampel satu garis keturunan ibu

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  tersebut  dapat  disimpulkan  bahwa  amplifikasi  fragmen  DNA mitokondria  menggunakan  primer  M1  dan  HV2R  dari  sel  epirel  rongga  mulut  menghasilkan fragmen berukuran 1 kb. Pada hasil amplifikasi fragmen DNA mitokondria dari sel folikel akar rambut  menggunakan  primer  M1  dan  M2,  fragmen  yang  didapatkan  berukuran  0,4-0,5  kb. Dengan  demikian,  fragmen  DNA  mitokondria  dapat  diamplifikasi  menggunakan  dua  primer balik M2 dan HV2R yang dirancang pada ujung daerah D-LOOP mitokondria.
Akan  tetapi  hasil  sekuensing  yang  dilakukan  tidak  dianalisis  urutan  nukleotida  nya  karena hasil  sekuensing  yang  didapat  tidak  sempurna  sehingga  tidak  bisa  menentukan  terjadi  mutasi atau tidak terjadinya mutasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Cambell, dkk., 2002. Biologi (Edisi Kelima). Jakarta: Erlangga. Wallace, D.C., 1997: Miochondrial DNA in Again Disease. Scientific American. 22-29
Moore,  J.M.,  Insenberg,  A.R.,  1999, Mitochondrial  DNA  Analysis  at  the  FBI  Laboratory , Forensic Science Communicatioj, vol. I, Number 2.
Marks, D.B., Marks, A.D, Smith,C.M. 1996. Basic Medical Biochemistry. Williams & Wilkins. Baltimore.
Poedjiadi,  Anna  dan  Supriyanti  F.M.T.  2006. Dasar-dasar  Biokimia .  Jakarta:  Universitas Indonesia Press).
Marguillis, L., 1981. Symbiosis In Cell Evolution. New  New ork:W.H. Freman . Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga. Andrey.2004. Biopsikologi.[Online]. Tersedia:https://Andreyagheanayaa.blogspot.co.id/2004/10/b iopsokologi.html.[05 Maret 2016]
Perpustakaan.2012. StrukturSelEukariot.[Online] Tersedia:https://Perpustakaancyber.blogspot.co. id/2012/11/struktur-sel-eukariot-fungsi.html. [05 Maret 2016]
Lynn,  Stephen,  et  al.  2002.  Defining  the  Importance  of  mitochondrial  Gene  Defects  in Maternally Inherited diabetes by sequencing the Entire Mitochondrial Genome. Diabetes 5, 2317-2320.
Anderson,  S.,  et  al,  1981, Sequence  and  Organization  of  the  human  mitochondrial  genome, Nature , 290,457-465. Fabio,fuady.2008. [Online]GenomMitokondria. Tersedia:https://fuadyfabiounsode.wordpres.com/ 2008/09/genom-mitokondria-manusia.html. [22 Desember 2015]
Brown, W.M., E.M. Prager, A Wang, and A.c. Wilson. 1982. Mitochondrial DNA Sequences of Primates : Tempo and Mode of Evolution.J. mol. Vol (18:225-239). Gaffar,  Shabrani,  M.Si.  2007. Buku  Ajar  Bioteknologi  Molekul. Bandung:  FMIPA  Universitas Padjajaran.
Biotechimylife.2011. [Online] Tersedia:https://biotechismylife.blogspot.co.id/2011/09/struktur.D NA.html. [05 Maret 2016].
Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetik Edisi Keda. Bogor : IPB Press.
Watson, James D., John tooze, & David T. Kurtz, 1988. DNA Rekombinan, alih bahasa: Wisnu Gunarno. Jakarta : Penerbit Erlangga.
Granner,  D.K. Biokimia  Harper  edisi  ke-24  : alih  bahasa,  Andry  Hartono;  editor.  Alexander  H. Santoso. Jakarta: EGC Penerbit Buku Kedokteran.
http://ejournal.radenintan.ac.id/index.php/biosfer/index
Saiyed. Z.M., C.N. Ramchand. 2007 Extrzction of Genomic DNA Using Magnetic Nanoparticle (Fe 3 O 4 ) as Solid-Phase Support. American Journal of Infectious Disease 3 (4): 225-229, 2007.
Promega.  2007. Technical  Manual  Maxwell  16  DNA  Purification  Kits. Tersedia: http://www.roche-applied-science.com.
Chen et al , 2004. Maternally Inherited Diabetes and Deafness (MIDD) Syndrome:a Clinical and Molecular Genetikc Study of a Taiwanse Family. Chang Gung Med Journal 27,(1), 66-72. Wallace, D.C., 1992: Diseases of the mitochondrial DNA, Annu Rev Biochem, 61, 1175-1212. Faatih, M. 2009: Isolasi dan Digesti DNA Kromosomal. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi, 10(1): 61-67.
Sundaland.2012. [Online]. Tersedia:https://Sundaland.gunungtoba.blogspot.co.id/2015/05/mengu pas pewarisan tes DNA.html. [22 Desember 2015].
Sutikno. 2009. Elektroforesis. http://sutikno.blog.uns.ac.id/2009/06/19/elektroforesis/. [13 Januari 2014].
Gumilar, G., Supriyanti, F. M. T., Siti, H. H. 2008. Bioteknologi . Bandung: Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI.
A.  Saifuddin  Noer  dan  Marisa  Gustiananda.,  1997. PCR  Tanpa  Isolasi  DNA  dari  Sel  Epitel Rongga Mulut . Bandung: Jurusan Kimia FMIPA ITB. Vol 2 No. 1, hal, 35-48. Purnomo,  Sudjiono,  T.  Joko,  dan  S.  Hadisusanto.  2009. Biologi  Kelas  XI  untuk  SMA  dan  MA. Jakarta : Pusat Perbukuan, Departemen Pendidikan Nasional.
Purnamasari,  Yunita.,  2013. Varian  Genetika  Daerah  Hipervariabel  I  (HVI)  DNA  Mitokondria pada  4  Generasi  DEngan  Riwayat  Diabetes  Melitus  Tipe  2. Bandung:  Universitas Pendidikan Indonesia.
Qiagen. 2006. Genomic DNA Purification. [Online]. Tersedia. http://www.qiagen.com/literature /brochurs/index. [24 September 2015].
Aris. T. W,. 2000. Inverse Polumerase Chain Reaction. Jurnal Hayati. Vol 7 (4): 121-123. Innis.  M.A., Gelfand D H, Srinsky. J.J, White. T. J. 1990. PCR Protocols A Guide to  Methods and Applications . Academic Press Inc. Madej,  R.  1991. Polymerase  Chain  Reaction  :Application  to  The  Clinical  Laboratory. Laboratory Roche Diagnostic Research, p. 23-32, 45-49. Sambrook,  J.  Russel  DW.  2001. Molecular  Cloning: A  Laboratoty  Manual  3rd  edition.  New York (USA): Cold Spring Harbor.