## ORIGINAL ARTICLE
Pengaruh ekstrak biji pala ( Myristica fragrans Houtt ) sebagai antibakteri terhadap pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa
Fiadwita Nia Ifriana 1 Widyasari Kumala 2

## ABSTRAK
LATAR BELAKANG Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri negatif-gram yang menjadi penyebab tersering infeksi di lingkungan Rumah Sakit yang dikenal dengan istilah infeksi nosokomial. Saat ini penggunaan antibakteri dari bahan alami mulai dikembangkan. Di seluruh dunia, ratusan tanaman dapat digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai pengobatan untuk infeksi bakteri. Biji buah pala ( Myristica fragrans Houtt ) mengandung minyak atsiri, saponin, terpenoid, flavonoid, yang diketahui berpotensi sebagai antibakteri. Maka dari itu penulis ingin mengetahui aktivitas antibakteri pada biji pala ( Myristica fragrans Houtt ) terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa .

## METODE
Desain penelitian ini adalah eksperimental sesungguhnya ( True Experimental ) laboratorium in vitro, menggunakan metode difusi cakram, dengan menggunakan sampel ekstrak biji pala ( Myristica fragrans Houtt ) dan bakteri Pseudomonas aeruginosa . Terdapat 4 kelompok perlakuan dan 2 kelompok kontrol. Zona hambat yang terbentuk akan diukur menggunakan penggaris. Analisis data dengan menggunakan SPSS versi 22.

## HASIL
Hasil penelitian menunjukkan ekstrak biji pala ( Myristica fragrans Houtt ) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa , hal ini dibuktikan dengan terbentuknya zona hambat pada kertas cakram. Zona hambat yang terbentuk bervariasi, semakin tinggi konsentrasi ekstrak maka semakin luas zona hambat yang terbentuk.

## KESIMPULAN
Ekstrak biji pala ( Myristica fragrans Houtt ) dapat menghambat pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa dengan kategori lemah.
Kata kunci : Pseudomonas aeruginosa , ekstrak biji pala, difusi cakram
1 Program Studi Kedokteran,
Fakultas Kedokteran,
Universitas Trisakti 2 Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Trisakti
Korespondensi:
Widyasari Kumala
Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Trisakti
Email: mecowid@trisakti.ac.id;
mecowid@yahoo.com
J Biomedika Kesehat 2018;1(3):172-
178 DOI: 10.18051/JBiomedKes.2018. v1.172-178
pISSN: 2621-539X / eISSN: 2621-5470 Artikel akses terbuka ( open access ) ini didistribusikan di bawah lisensi Creative Commons Attribution 4.0 International (CC-BY 4.0)
Effect of nutmeg ( Myristica fragrans Houtt ) extract as antibacterial substance on the growth of Pseudomonas aeruginosa
BACKGROUND Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative bacterium that is the most common cause of infection in the hospital or known as nosocomial infection. Currently the use of antibacterials from natural ingredients began to be developed. Around the world, hundreds of plants can be used in traditional medicine as a treatment for bacterial infections. The nutmeg seed ( Myristica fragrans Houtt ) contains essential oils, saponins, terpenoids, flavonoids, which are known to be potent as antibacterials. Therefore, the authors wanted to know the antibacterial activity in nutmeg seed ( Myristica fragrans Houtt ) on the growth of bacteria Pseudomonas aeruginosa .
METHODS The design of this study is a real experimental ( True Experimental ) laboratory study in vitro, using the disc diffusion method. The sample used is the extract of nutmeg seed ( Myristica fragrans Houtt ) and bacterium Pseudomonas aeruginosa . Divided into four groups of treatment and two control group. The inhibit zone formed will be measured using a ruler. Data analysis using SPSS version 22.
RESULT In this study obtained the results of nutmeg extract ( Myristica fragrans Houtt ) can inhibit the growth of bacteria Pseudomonas aeruginosa , this is evidenced by the formation of resistor zones on paper discs. Zone inhibition that formed varies, the higher the concentration of extracts the more the zone of inhibition is formed.
CONCLUSION The extract of nutmeg seed ( Myristica fragrans Houtt ) can inhibit the growth of Pseudomonas aeruginosa with the weak category.
Keywords : Myristica fragrans Houtt, Pseudomonas aeruginosa , nutmeg seed extract, disc diffusion

## ABSTRACT
PENDAHULUAN Penyakit infeksi adalah penyebab kematian terbanyak di seluruh dunia. (1) Di Negara berkembang, termasuk Indonesia, penyakit infeksi masih merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat. Tingginya angka kejadian penyakit infeksi di Indonesia menyebabkan terjadinya peningkatan yang berkaitan dengan pengobatannya. (2) Salah satu penyebab infeksi yang paling sering dijumpai adalah infeksi yang disebabkan oleh bakteri, sehingga pemberian antibiotik atau antibakteri masih merupakan pilihan utama untuk mengatasi penyakit infeksi saat ini. Berbagai studi menemukan bahwa sekitar 40–62% antibiotik digunakan secara tidak tepat antara lain untuk penyakit-penyakit yang sebenarnya tidak memerlukan antibiotik. (3) Penggunaan  antibiotik yang  berulang  pada  beberapa  strain  bakteri tertentu  dapat menyebabkan terjadinya resistensi, karena pada bakteri terjadi mekanisme pertahanan diri agar tetap survive di alam. (4) Munculnya resistensi terhadap berbagai antibiotik dipengaruhi oleh pemakaian antibiotik itu sendiri. Semakin lama seorang pasien mendapat terapi antibiotik, maka akan memudahkan timbulnya kolonisasi oleh mikroba yang resisten antibiotik. (5,6) Bila antibiotik diberikan berlebihan, tidak adekuat,
monoton (satu jenis terus menerus) maka akan mengurangi efektifitasnya sehingga menimbulkan resistensi terutama bakteri negatif-gram. (7,8) Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Nurmala dkk, dikatakan bahwa bakteri negatif- gram lebih banyak mengalami resistensi antibiotik dari pada bakteri positif-gram. Salah satu bakteri negatif-gram yang telah mengalami resistensi antibiotik adalah Pseudomonas aeruginosa . (9) Pseudomonas aeruginosa adalah kuman patogen oportunistik yang dapat menyebabkan keadaan yang invasif pada pasien dengan penyakit kritis maupun pasien yang memiliki tingkat imunitas yang sangat rendah. Umumnya kuman ini sering ditemukan sebagai penyebab infeksi nosokomial di rumah sakit khususnya di Intensive Care Unit (ICU). (10) Infeksi nosokomial banyak terjadi di seluruh dunia dengan kejadian terbanyak di Negara yang sedang berkembang karena penyakit- penyakit infeksi masih menjadi penyebab utamanya. Suatu penelitian yang dilakukan oleh WHO tahun 2006 menunjukkan bahwa sekitar 8,7% dari 55 rumah sakit dari 14 negara di Eropa, Timur  tengah,  dan  Asia  Tenggara  serta  Pasifik terdapat infeksi nosokomial, khususnya di Asia Tenggara sebanyak l0%. Di Indonesia yaitu di 10
RSU pendidikan, prevalensi infeksi nosokomial cukup tinggi yaitu 6-16% dengan rata-rata 9,8% pada tahun 2010. (11) Bangsa Indonesia telah lama mengenal dan menggunakan tanaman berkhasiat obat sebagai salah satu upaya dalam menanggulangi masalah kesehatan. Pengetahuan tentang tanaman berkhasiat obat berdasar pada pengalaman dan keterampilan yang secara turun temurun telah diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya. (12) Penggunaan obat tradisional secara umum dinilai lebih aman dari pada penggunaan obat modern. Hal ini disebabkan karena obat tradisional memiliki efek samping yang relatif lebih sedikit dari pada obat modern. (13) Biji buah pala (Myristica fragrans Houtt) mengandung minyak atsiri, saponin, terpenoid, flavonoid, yang diketahui berpotensi sebagai antibakteri. (14)
Saat ini penggunaan antibakteri dari bahan alami mulai dikembangkan. Di seluruh dunia, ratusan tanaman dapat digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai pengobatan untuk infeksi bakteri. Tingginya tingkat resistensi bakteri terutama negatif-gram membuat banyak peneliti berusaha mencari cara untuk mengatasi masalah infeksi bakteri. Dari penjelasan di atas, penulis ingin mengetahui serta menilai apakah ada daya hambat dari ekstrak biji pala (Myristica fragrans Houtt) dengan berbagai konsentrasi terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa .

## METODE
Desain penelitian ini ialah penelitian eksperimental sesungguhnya (True Experimental) laboratorium menggunakan metode difusi cakram dengan melakukan pengujian aktivitas antibakteri ekstrak biji pala (Myristica fragrans Houtt) dengan berbagai konsentrasi terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa. Dalam penelitian ini terdapat kelompok kontrol yang terbagi menjadi dua yaitu kontrol positif yaitu antibiotik Gentamicin dan kontrol negatif yaitu etanol 96%. Sedangkan kelompok perlakuan akan diberikan perlakuan berupa berbagai konsentrasi (20%, 40%, 60% dan 80%) dari ekstrak biji pala (Myristica fragrans Houtt).

## Populasi yang digunakan adalah bakteri
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 yang diperoleh dari isolat bakteri milik Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas
Trisakti. Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak biji buah pala (Myristica fragrans Houtt) dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BALITTRO) Bogor, Indonesia. Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain Isolat murni bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 , Ekstrak kental biji pala (Myristica fragrans Houtt) , Etanol 96%, Mueller Hinton Agar , Larutan McFarland 0,5, kertas cakram, Media BHI, antibiotik Gentamicin.

## Gambar 1 . Alur penelitian
Analisis data menggunakan metode data statistik One Way ANOVA (Analysis of Variance) kemudian dilanjutkan dengan uji Post Hoc Multiple Comparisons dengan metode Least  Significancy Difference (LSD). Jika pada data yang diuji ternyata tidak terdistribusi normal atau variannya tidak homogen maka analisis data menggunakan metode Kruskal-Wallis kemudian dilanjutkan dengan uji Post Hoc Multiple Comparisons dengan metode Mann-Whitney.

## HASIL
Setelah bakteri diberi perlakuan dan diinkubasi selama 24 jam, selanjutnya dilakukan
pengukuran zona hambat di sekitar kertas cakram menggunakan penggaris atau jangka sorong. Hasil pengukuran dapat dilihat pada Tabel 1. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak biji pala yang diperoleh dari proses maserasi mampu menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa .  Berdasarkan  klasifikasi  morales, zona hambat yang terbentuk pada masing- masing konsentrasi tergolong lemah. (15) Besarnya zona hambat yang terbentuk dipengaruhi oleh konsentrasi ekstrak, di mana semakin besar konsentrasi ekstrak maka semakin besar pula zona hambat yang terbentuk. Kadar Hambat Minimum (KHM) yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa secara kualitatif adalah pada konsentrasi 20%.
Data yang telah didapatkan terlebih dahulu diuji normalitas datanya. Uji normalitas dilakukan untuk menguji apakah data berdistribusi normal atau tidak, uji normalitas dilakukan dengan metode Kolmogrov-smirnov .
Tabel 2. Uji normalitas
Varians zona hambat bakteri Signifikansi Konsentrasi Ekstrak biji Pala 0,200 Dari hasil uji normalitas didapatkan nilai Asymp.Sig ialah 0,200 di mana nilai tersebut >0,05. Sehingga dapat disimpulkan bahwa data dalam penelitian ini berdistribusi normal. Setelah itu dilakukan uji homogenitas untuk mengetahui apakah varian dari perlakuan homogen atau tidak homogen dengan menggunakan uji Lavene. Berdasarkan uji Lavene didapatkan nilai p sebesar 0,000, karena nilai p <0,05 maka dapat dikatakan bahwa data tidak homogen. Salah
Tabel 1. Hasil pengukuran uji daya hambat ekstrak biji pala terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa
satu syarat dilakukannya uji one way ANOVA adalah uji homogenitas >0,05, sehingga syarat uji ANOVA tidak terpenuhi. Maka data dapat diuji menggunakan uji non parametric Kruskal-Wallis .
Tabel 3. Uji Kruskal-Wallis Varians zona hambat bakteri Signifikansi Konsentrasi Ekstrak biji Pala 0,200 Pada hasil uji Kruskal-Wallis , didapatkan nilai significancy sebesar 0,000. Dimana hasil uji Kruskal-Wallis tersebut menunjukkan nilai significancy <0,05 maka dapat dikatakan bahwa sampel tersebut memiliki perbedaan varians data yang bermakna. Uji selanjutnya adalah uji Post hocMann-whitney. Uji post hoc dilakukan untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan bermakna antara dua perlakuan dalam terbentuknya zona hambat. Dari hasil uji diketahui bahwa setiap konsentrasi (20%, 40%, 60%, 80%) yang digunakan pada penelitian ini memiliki perbedaan bermakna terhadap kontrol positif yaitu antibiotik Gentamicin dengan nilai significancy <0,05 dan terdapat juga perbedaan bermakna terhadap kontrol negatif dengan nilai significancy <0,05.

## PEMBAHASAN
Berdasarkan tabel hasil penelitian uji daya hambat ekstrak biji pala (Myristica fragrans Houtt) terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa menggunakan metode difusi cakram, dengan konsentrasi ekstrak biji pala yaitu 20%, 40%, 60% dan 80%, dengan masa inkubasi 24 jam didapatkan bahwa ekstrak biji pala (Myristica fragrans Houtt) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa secara in vitro.
Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat keruh di sekitar kertas cakram. Akan  tetapi  berdasarkan  klasifikasi  Morales, kemampuan daya hambat ekstrak biji pala terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa tergolong lemah. Penggunaan etanol sebagai kontrol negatif tidak memperlihatkan adanya zona hambat yang terbentuk di sekitar kertas cakram. Hal ini menunjukan bahwa etanol sebagai pelarut yang digunakan dalam pembuatan ekstrak biji pala tidak mempunyai pengaruh antibakteri.  Pada kontrol positif yaitu antibiotik Gentamicin yang masih efektif menghambat pertumbuhan bakteri terutama bakteri negatif-gram, salah satunya adalah bakteri Pseudomonas aeruginosa, tampak terlihat adanya zona hambat yang cukup luas di sekitar kertas cakram antibiotik Gentamicin.
Zona hambat sudah mulai terlihat pada ekstrak biji pala dengan konsentrasi 20%, dari hasil juga dapat dilihat bahwa semakin  bertambahnya konsentrasi maka semakin luas juga zona hambat yang terbentuk, menurut Harvey. (16) semakin tinggi zat antibakteri maka memungkinkan semakin banyak pula sel mikroorganisme yang perkembangbiakannya terhambat. Pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Praisia dkk.
(17) yang menggunakan ekstrak biji pala dengan metode sumuran dan konsentrasi 12,5%, 25%, 50% dan 100% didapatkan bahwa ekstrak biji pala memiliki daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Streptococcus pyogenes , kedua bakteri tersebut merupakan bakteri positif-gram, konsentrasi hambatan minimum pada penelitian tersebut ialah 12,5%, dalam penelitian tersebut  juga menggunakan kontrol positif yaitu antibiotik sefuroksim, zona hambat yang terbentuk pada antibiotik sefuroksim lebih luas, dalam penelitiannya juga dikatakan bahwa lama waktu inkubasi dan konsentrasi ekstrak mempengaruhi zona hambat yang terbentuk. Kesimpulan dari penelitian yang dilakukan oleh Praisia dkk ialah ekstrak biji pala dengan konsentrasi 12,5%, 25%, 50% dan 100% dapat menghambat pertumbuhan bakteri positif- gram. (18) Pada penelitian lain yang dilakukan oleh Arrizqiyani dkk menggunakan ekstrak biji pala dari proses maserasi dan konsentrasi 5%, 15%, 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% 85%, 95% dan 100% dengan metode difusi cakram didapatkan bahwa ekstrak biji pala dapat
menghambat pertumbuhan Escherichia coli , yang mana merupakan bakteri positif-gram dengan konsentrasi hambat minimum sebesar 25% . (19) Menurut Jawetz dkk. (18) aktivitas antibakteri dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain konsentrasi ekstrak, kandungan senyawa antibakteri, jenis dan jumlah bakteri yang dihambatDalam penelitian ini terlihat bahwa konsentrasi ekstrak biji pala tertinggi yaitu 80% menghasilkan zona hambat yang lebih luas dari konsentrasi yang lebih rendah. Biji pala mengandung senyawa aktif yang dapat memberikan  efek  antibakteri,  yaitu  flavonoid, saponin, dan minyak atsiri. Menurut Cushnie dan Lamb (20) ,  flavonoid  dapat  menghambat sintesis asam nukleat oleh karena cincin B pada flavonoid  dapat  mengganggu  proses  interkalasi atau pengikatan hidrogen pada komponen asam  nukleat,  selain  itu  flavonoid  juga  dapat menghambat metabolisme energi bakteri dengan menghambat konsumsi oksigen serta mengganggu rantai transpor elektron pada proses respirasi bakteri. Dalam penelitian ini zona hambat yang terbentuk tergolong lemah, hal ini disebabkan karena Pseudomonas aeruginosa merupakan patogen dengan faktor virulensi yang sangat kompleks sehingga memiliki sifat resisten yang tinggi, bakteri ini juga mampu bertahan pada suhu yang tinggi, selain itu struktur dinding dari bakteri negatif-gram seperti Pseudomonas aeruginosa cenderung lebih tebal karena memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya. Membran luarnya terdiri dari lipid, protein, dan lipopolisakarida. (21) Sifat patogen pada bakteri negatif-gram umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin). Kemungkinan lain penyebab zona hambat yang terbentuk dalam respon lemah adalah kandungan glukosa pada ekstrak yang bisa menjadi nutrisi bagi bakteri. Keterbatasan pada penelitian ini ialah zona hambat tidak diukur menggunakan jangka sorong, sehingga  ketepatan  pengukuran  kurang  spesifik, tidak  dilakukan  analisis  fitokimia  dari  biji  pala (Myristica fragrans Houtt) sehingga tidak dapat
diketahui senyawa antibakteri pada biji pala yang bekerja lebih dominan.

## KESIMPULAN
1.  Ekstrak biji pala (Myristica fragrans Houtt) dengan konsentrasi 20%, 40%, 60% dan 80% mempunyai pengaruh antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa secara in vitro . 2.  Kadar Hambat Minimum (KHM) Ekstrak biji pala (Myristica fragrans Houtt) terhadap Pseudomonas aeruginosa secara kualitatif adalah pada konsentrasi 20%.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih kepada Dr. Suriptiastuti DAP&E, MS selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti, dan Kepada Bagian Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti dan semua pihak yang telah membantu penelitian ini.

## DAFTAR REFERENSI
1.  Bisht, R., Bhattacharaya, S. Some Medical Plants Of Uttarakhand (India) With Antimicrobial Activity – A Review, Pharmacologyonline,2, 2011; 428- 39.
2.  Wahyono, H. Peran Mikrobiologi Klinik Pada Penanganan Penyakit Infeksi. Makalah Pidato Pengukuhan Guru Besar Dalam Ilmu Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. 2007;6.
3.  Kemenkes RI. Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 2406/Menkes/PER/ XII/2011 tentang Pedoman Umum Penggunaan Antibiotik, Jakarta: Menkes RI. 2011. Available at : http://www.binfar.depkes.go.id/dat/permenkes_ antibiotik.pdf. Accessed on may 14 2017.
4. Soleha  M.  Detection  Of Attaching And  Effacing Virulence Gene Of E. Coli. Center For Biomedical And Applied Health Technology, National Institute Of Health Research And Development, Ministry Of Health Republic Indonesia. 2013;1(4):42-6.
5.  Long SS, Dowell SF. Anti-infective therapy. Dalam: Long SS, Pickering LK, Prober CG. Penyunting Principles and Practice of Pediatric Infectious Diseases, 2 nd ed. Philadelphia: Churchill Livingstone,2007; 1422-32.
6.  Toltzis P, Dul M, O’Riordan MA, Melnick
D, Lo M, Blumer J. Meropenem use and colonization by antibiotic-resistant Gram- negative bacilli in a pediatric intensive care unit. Crit Care Med. 2009;10(1):49-54. doi: 10.1097/ PCC.0b013e318193691a
7.  Al-Lawati AM, Crouch ND, Elhag KM. Antibiotic consumption and the development of resistance among Gram-negative bacilli in intensive care units in Oman. Annals of Saudi medicine 2007;20(6):325-7.
8.  Niederman MS. Appropriate use of antimicrobial agents: Challenges and strategies for improvement. Crit Care Med 2003;31(2):608-16. DOI: 10.1097/01.CCM.0000050464.70382.D6
9.  Nurmala, IGN Virgiandhy, Andriani, Delima F. Liana. Resistensi dan Sensitivitas Bakteri terhadap Antibiotik di RSU dr. Soedarso Pontianak Tahun 2011-2013. April 2015;1(3):25-8. https://doi/ org/10.23886/ejki.3.4803.
10.  Nugraheni R, Suhartono, Winarni S. Infeksi
Nosokomial Di RSUD Setjonegoro Kabupaten Wonosobo. Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Diponegoro. Semarang, Jawa Tengah.
2012;1(11):95-7. DOI: https://doi.org/10.14710/ mkmi.11.1.94-100
11.  Sukandar E Y, Tren dan Paradigma Dunia Farmasi, Industri-KlinikTeknologi Kesehatan, disampaikan dalam orasi ilmiah Dies Natalis ITB, Available at  http://itb.ac.id/focus/  focus_file/orasi-ilmiah- dies-45.pdf, Accessed on Mei 2017.
12.  Oktora L. Pemanfaatan obat tradisional dengan pertimbangan manfaat dan keamanannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. Studi Farmasi Universitas Jember. Jember, Jawa Timur. 2006; 1(3):1-7
13.  Rachmi W, Zanuri A, Yuharmen. Perbandingan
Isolasi Minyak Atsiri Biji Pala Cara Hidrodistilasi dan konvensional serta uji akitivitas antibakteri dan antioksidan. JOM FMIPA. 2014;2(1):335-42
14.  Rismunandar. Budidaya dan Tataniaga pala. PT. Penebar Swadaya. Jakarta. Cetakan kedua. 1992:7- 8, 23, 81.
15.  Morales G, Sierra P, Mancilla A, Paredes A, Loyola LA, Golardo O. Secondary metabolites from four medicinal plants from northern chile : Antimicrobial activity and biotoxicity againts artemia salina. J Chil Chem Soc 2013; 2(48):30-5. http://dx.doi. org/10.4067/S0717-97072003000200002
16.  Harvey RA, Champe PC, Fisher BD. Microbiology. 2nd ed.Philadelpia: Lippincot Williams & Wilkins; 2007. 31-5.
17.  Rumopa P.M.E, Awaloei H, Mambo C. Uji daya hambat ekstrak biji pala (myristicae fragrans) terhadap pertumbuhan bakteri staphylococcus aureus dan streptococcus pyogenes di Laboratorium
Fitokimia dan Mikrobiologi Program studi Farmasi FMIPA Universitas Sam Ratulangi. Manado. Jurnal e-Biomedik (eBm). 2016;2(4):2-4.
18.  Arrizqiyani T, Sonjaya N, Asty A. Optimalisasi Potensi Tanaman Pala Sebagai Antibakteri Escherichia Coli Menggunakan Metode Ekstraksi. Prosiding Seminar Nasional Publikasi Hasil-Hasil Penelitian dan Pengabdian Masyarakat. 2017: 377-
81.
19.  Jawetz E,  Melnick J L, & Adelberg E A. Mikrobiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh Maulany R F, Edinugroho. Salemba Medika, Jakarta. 2005: 49,335,372
20.  T.P. Tim Cushnie, Andrew J. Lamb. Antimicrobial activity  of  flavonoids.  School  of  Pharmacy, The Robert Gordon University, Schoolhill,
Aberdeen AB10 1FR, UK. International Journal of Antimicrobial Agents. 2005; (26):343–56. doi:10.1016/j.ijantimicag.2005.09.002
21.  Cooper GM, Hausman RE. The Cell: A Molecular
Approach. 4th ed. Sunderland: Sinauer Associates, Inc. 2007;325-50