## UJI AKTIVITAS IMUNOMODULATOR FERMENTASI TEH HITAM JAMUR KOMBUCHA TERHADAP ROLIFERASI SEL LIMFOSIT MENCIT GALUR BALB/C SECARA IN VITRO
Rahma Laila Qodriyan Sofiakmi 1* , Maria Ulfah 1 , Ediati Sasmito 2
1 Jurusan S1 Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Wahid Hasyim
2 Jurusan S1 Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada
* Email: rahmalalaqs@gmail.com

## ABSTRAK
Teh  kombucha  diperoleh  dari  hasil  fermentasi  larutan  teh,  gula  dan  koloni  kombucha. Fermentasi  teh  hitam  jamur  kombucha  (FTHJK)  secara  empiris,  terbukti  dapat meningkatkan  sistem  kekebalan  tubuh.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui aktivitas  imunomodulator  hasil  FTHJK  terhadap  proliferasi  sel  limfosit  mencit  galur Balb/C secara in vitro.
Kombucha  difermentasi  selama  5,  10,  dan  15  hari  dengan  menggunakan  seduhan  teh hitam  yang  telah  diberi  gula.  Hasil  fermentasi  teh  hitam  jamur  kombucha  (FTHJK) dibuat  beberapa  seri  konsentrasi  yakni  6,25;  12,5;  25;  50  dan  100  µg/ml  dan  sebagai kontrol  positif  Phytohemagglutinin  (PHA)  10  µg/ml  diuji  secara  in  vitro  terhadap proliferasi  sel  limfosit  mencit  galur  Balb/C  jantan  usia  2  bulan  dengan  menggunakan metode MTT Assay. Data absorbansi berupa nilai Optical Density (OD) dianalisis secara statistik dengan Friedman Test dilanjutkan Mann Whitney Test.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  FTHJK  memiliki  aktivitas  imunostimulator terhadap proliferasi sel limfosit pada konsentrasi 50 dan 100µg/mL fermentasi hari ke-5, dan  konsentrasi  100µg/mL  fermentasi  hari  ke-10  dan  15.  Aktivitas  imunostimulator tertinggi terjadi pada konsentrasi 100µg/mL dengan lama fermentasi hari ke-15.
kata  kunci: Teh  hitam  jamur  kombucha,  imunomodulator,  MTT  Assay,Optical  Density (OD).

## 1. PENDAHULUAN
Sel limfosit yang berperan dalam memberikan respon imun spesifik  akan  secara khas  mengenali  patogen  yang  pertama  kali  dihadapi  dan  jika  terjadi  paparan  berulang oleh patogen yang sama maka akan terjadi peningkatan respon imun spesifik. Sel limfosit yang  berinteraksi  dengan  patogen  akan  berproliferasi  dan  mengaktifkan  sel-sel  efektor untuk  menghancurkan  patogen  yang  masuk  dalam  tubuh.  Fungsi  dari  sel  limfosit  dalam melawan  mikroorganisme  patogen  dapat  ditingkatkan  dengan  pemberian  agen imunomodulator.  Agen  imunomodulator  dapat  berupa  imunomodulator  biologik  seperti bahan asal tanaman, jamur, dan bakteri (Baratawidjaya & Rengganis, 2012).
Teh  kombucha  merupakan  hasil  fermentasi  larutan  teh,  gula  oleh  kultur kombucha.  Penelitian  tentang  aktivitas  imunomodulator  teh  kombucha  telah  dilakukan oleh  Ulfah  (2005)  menggunakan  metode  ELISA  tidak  langsung.  Hasil  penelitiannya menyebutkan  bahwa  teh  kombucha  mampu  meningkatkan  sistem  imun.  Hal  ini  dilihat dengan  dihasilkannya  titer  antibodi  imunoglobulin  M  (IgM)  dan  meningkatnya  berat organ  limpa.  Berat  organ  limpa  menggambarkan  kemungkinan  terjadinya  proliferasi  sel limfosit  di  dalam  organ  limpa.  Ulfah  dan  Arifin  (2013),  juga  melakukan  penelitian tentang  aktivitas  imunomodulator  teh  hijau  jamur  kombucha  dengan  menggunakan metode  MTT  ( 3-(4,5-dimetylthiazol-2yl)-2,5  diphenyltetrazolium  bromide ) Assay .  Hasil penelitiannya  menyebutkan  bahwa  teh  hijau  jamur  kombucha  mempunyai  aktivitas
imunomodulator  tertinggi  terhdap  proliferasi  sel  limfosit  mencit  pada  konsentrasi  100 μg/mL fermentasi hari ke-10.
Seduhan  teh  hitam  dapat  meningkatkan  proliferasi  sel  limfosit  mencit  Balb/C yang  diinokulasi Salmonella  typhimarium (Arnas,  2009).  Kandungan  flavonoid  seperti quercetin dan epigallocatechin  3-gallate (EGCG)  dalam  teh  hitam  dapat  meningkatkan sistem  pertahanan  tubuh  melalui  mekanisme  peningkatan  Interleukin-6  (IL-6)  dan  IL-10 yang berpengaruh terhadap  aktivasi sel limfosit T dan B (Neiman et al ., 2009).
Menurut  Jayabalan et  al .  (2007),  jamur  kombucha  dapat  difermentasi  dalam seduhan teh hitam selama 18 hari. Proses fermentasi tidak menghilangkan senyawa kimia yang  ada  di  dalam  teh  yaitu  polifenol  dan  flavonoid  (Suprijono et  al .,  2012).  Hasil fermentasi  lainnya  berupa  asam  glukoronat,  asam  laktat,  asam  asetat  dan  asam  askorbat (Jayabalan et  al .,  2007).  Senyawa  asam  tersebut  dapat  memperkuat  sistem  kekebalan tubuh (Dufrense & Franworth, 2000).
Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  aktivitas  imunomodulator  fermentasi teh hitam jamur  kombucha (FTHJK) terhadap proliferasi sel limfosit mencit galur Balb/C secara in  vitro untuk  memberikan  tambahan  bukti  ilmiah  mengenai  manfaat  FTHJK terhadap sistem imun.
2. METODE PENELITIAN
2.a. Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah bibit jamur kombucha diperoleh dari pembibitan jamur kombucha Karanganyar, Jawa Tengah.Bahan untuk fermentasi adalah gula pasir, serbuk kering teh hitam (merk X) dan aquadest. Bahan untuk uji aktivitas imunomodulator antara lain: organ limpa dari mencit jantan galur Balb/C  berumur  2  bulan  ,  etanol  70%  (Merck),  Medium Rosewell  Park  Memorial Institude (RPMI) 1640 (Gibco), RPMI 1640 media komplit berisi FBS ( Fetal Bovine Serum ) 10% (v/v)  (Caisson), PBS  ( Phosfat Buffer Saline ) (Gibco). Vaksin  hepatitis B (Engerix ® ), PHA ( Phytohemaglutinin , Gibco), MTT ( 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium  bromide ,  Sigma), stopper 10%    SDS    ( sodium  dodecyl sulphate, Merck),  HCl    (Merck)  0.01  N,  penicillin-streptomicin  (Gibco), fungizon/amphoterisin B (Gibco).
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah seperangkat alat-alat gelas (Pyrex), stoples kaca, kompor listrik, thermometer, dan timbangan elektrik (Ohaus). Alat-alat  bedah  steril  (Smicss),  tabung  mikropipet  (Gibco), eppendorf  tube (Extragen),  sentrifugator  (Sorvall),  pipet  pastur  (Brand),  petri  dish  steril  50  mm (Costar),  spuit  injeksi  10  mL  (Terumo),  tabung  sentrifugasi  15  mL  (Nunc), vortex (Bio-Rad), laminar  air  flow (Nuaire). Hemocytometer (Neubaeur), inverted microscope (Olympus),  inkubator  CO 2 5%  (Heraeus ® ),  mikroplate  96  (Costar), ELISA reader (Bio-Rad),  mikropipet  (Gibson), eppendorf  tube (Extragen), vortex (Brandstead), laminar  air  flow (Nuaire), white  tip , yellow  tip dan blue  tip (Brand) dan timbangan elektrik (Mettler Toledo).
2.b. Jalannya penelitian
1. Fermentasi Teh Hitam Jamur Kombucha
Sebanyak 8 gram teh hitam dimasukkan ke dalam 1 L air mendidih (100ºC) dan teh dibiarkan mengembang selama 15 menit. Setelah suhu air turun menjadi 45- 50ºC,  kemudian  air  seduhan  teh  disaring.  Gula  pasir  sebanyak  100  gram ditambahkan  dalam  seduhan  teh  tersebut,  dan  diaduk  hingga  larut  sempurna. Seduhan  teh  tersebut  dimasukkan  dalam  stopless  kaca  dan  suhu  ditunggu  hingga sesuai dengan suhu ruang. Jamur kombucha ditambahkan dalam stopless yang telah berisi seduhan teh. Stopless ditutup dengan kain kasa bersih kemudian diikat dengan
karet  gelang.  Pembuatan  teh  hitam  jamur  kombucha  dilakukan  3  kali  dengan menggunakan  stopless  yang  berbeda,  ditandai  sesuai  lama  waktu  fermentasi  5,  10 dan  15  hari.  Air  seduhan  teh  yang  sudah  bercampur  dengan  jamur  kombucha disimpan  dalam  suhu  ruang  sesuai  dengan  lama  fermentasi  yang  sudah  ditentukan. Setelah fermentasi, jamur kombucha dipisahkan dari seduhan teh tersebut, kemudian disaring.  Filtrat  tersebut  diuji  aktivitas  imunomodulator  terhadap  proliferasi  sel limfosit mencit.
2.c. Uji Aktivitas Imunostimulator
a. Pembuatan Larutan Uji dan Kontrol Positif PHA
Larutan  uji  berupa  filtrat  yang  diperoleh  dari  hasil  fermentasi  teh  hitam jamur kombucha selama 5, 10, dan 15 hari yang telah disaring. Masing-masing filtrat  dibuat  menjadi  lima  seri  konsentrasi  yaitu  6,25;  12,5;  25;  50  dan 100µg/mL,  yang  selanjutnya  akan  dilakukan  uji  aktivitas  imunomodulator terhadap  proliferasi  sel  limfosit. Phytohemaglutinin (PHA)  sebagai  kontrol positif  dibuat  dari  stok  induk  1  mg/mL  yang  dilarutkan  dalam  larutan  buffer phosphat, kemudian dibuat pengenceran sehingga konsentrasi 10 µg/mL.
b. Isolasi Sel Limfosit
Isolasi sel limfosit diperoleh dari organ limpa mencit galur Balb/C. Tahap pertama,  mencit  dikorbankan  dengan  menggunakan  eter,  kemudian  mencit dibedah  dan  diambil  jaringan  limpanya.  Jaringan  limpa  tersebut  disolasi  secara aseptis  dan  diletakkan  dalam  petri dish berdiameter  50  mm  yang  berisi  10  mL medium RPMI. Jaringan limpa dilisiskan dengan cara media RPMI dipompakan ke  dalam  limpa  sehingga  limfosit  ikut  keluar  bersama  media.  Suspensi  sel dimasukkan dalam tabung sentrifugasi 10 mL dan disentrifus pada 3000 rpm 4 o C selama  5  menit.  Pellet  yang  didapat  disuspensikan  dalam  5  mL  buffer  tris ammonium klorida untuk melisiskan eritrosit. Sel dicampur hingga homogen dan didiamkan  pada  suhu  ruang  selama  15  menit  atau  sampai  warnanya  berubah menjadi  agak  kekuningan.  Kemudian  ditambahkan  RPMI  ad  10  mL, disentrifugasi pada 3000 rpm 4 o C selama 5 menit dan  supernatan dibuang. Pelet yang  didapat  dicuci  2  kali  dengan  RPMI.  Sel  dihitung  dengan hemocytometer . Selanjutnya sel limfosit siap untuk dikultur dalam inkubator CO 2 5% pada suhu 37°C dan siap untuk diuji aktivitasnya (Hay &Westwood, 2002).
c. Uji Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT Assay
Sel  limfosit  (1,5  x10 6 sel/mL)  sebanyak  100  µL  didistribusikan  ke  dalam sumuran microplate 96- wells dan  ditambahkan  vaksin  hepatitis  B  sebanyak  10 µL  tiap  sumuran,  kemudian  diinkubasi  selama  24  jam  dalam  inkubator  dengan aliran  5%  CO 2 pada  suhu  37 o C,  setelah  inkubasi  24  jam    ditambahkan  100  µL filtrat teh hitam jamur kombucha yang telah diinkubasi selama 5, 10 dan 15 hari dengan   konsentrasi 6,25; 12,5; 25; 50 dan 100µg/mL dan PHA  sebagai kontrol positif  dengan  konsentrasi  10  µg/mL  ditambahkan  sebanyak  100  µL.  Semua perlakuan  tersebut  diinkubasi  lagi  selama  48  jam.  Setelah  inkubasi  48  jam, masing-masing  sumuran  ditambahkan  larutan  10  µL  MTT  5  mg/mL,  kemudian diinkubasi  lagi  4  jam  pada  suhu  37 o C.  Sel  limfosit  yang  hidup  akan  bereaksi dengan  MTT  membentuk  warna  ungu.  Reaksi  dengan  MTT  dihentikan  dengan menambah  reagen  stopper  yaitu  larutan Sodium  Dodecyl  Sulphate (SDS)  10% dalam  asam  klorida  0,01N  sebanyak    100  µL  pada  tiap  sumuran  dan  didiamkan sampai  24  jam.  Selanjutnya  diukur  absorbansinya  dengan  ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm (Hay & Westwood, 2002)

## 2. Analisis Data
Data  yang  didapat  dari  hasil  pembacaan  senyawa  formazan  oleh  ELISA reader berupa  absorbansi  atau Optical  Density (OD).  Nilai  OD  yang  terbaca menggambarkan aktivitas proliferasil sel limfosit. Nilai OD yang diperoleh dianalisis dengan  program  SPSS 16  for  windows menggunakan  perhitungan  statistik  non parametrik Friedman Test dilanjutkan Mann-Whitney Test dengan taraf kepercayaan 95%.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.a.  Fermentasi Teh Hitam Jamur Kombucha
Pembuatan  teh  jamur  kombucha  menggunakan  metode  fermentasi.  Proses fermentasi  akan  berlangsung  oleh  adanya  simbiosis  antara  bakteri  dan yeast dalam seduhan  teh dan  gula. Seduhan  teh hitam berfungsi sebagai sumber mineral bagi bakteri dan yeast (Jayabalan et  al. ,  2014).  Nutrisi  sebagai  sumber  karbon  diperlukan  untuk kelangsungan  hidup  kombucha.  Nutrisi  tersebut  diperoleh  dari  gula  yang  ditambahkan sebanyak 10% (b/v). Selama fermentasi terjadi pemecahan glukosa menghasilkan alkohol dan senyawa asam seperti asam asetat dan asam laktat, secara terus menerus sampai gula yang  terdapat  dalam  larutan  habis.  Fermentasi  dilakukan  pada  suhu  kamar  dan  kondisi anaerob.
Lama  proses  fermentasi  berpengaruh  pada  pH  larutan  teh  kombucha,  total  asam dan ketebalan nata dari kombucha. Lama fermentasi yang dilakukan dalam penelitian ini yaitu  fermentasi  selama  5,  10  dan  15  hari.  Pemilihan  lamanya  hari  berdasarkan  proses pemasakan dan pematangan dari kombucha yaitu pada 8-18 hari (Jayabalan et al. , 2007). Tujuan  fermentasi  dilakukan  pada  hari  ke-5,  10  dan  15  untuk  dibandingkan  aktivitas imunomodulatornya dengan seri konsentrasinya yaitu, 6,25; 12,5; 25; 50 dan 100  µg/mL terhadap proliferasi sel limfosit mencit Balb/C.

## 3.b.  Uji Aktivitas Imunomodulator
Aktivitas  imunomodulator  diketahui  melalui  respon  imun  FTHJK  terhadap proliferasi  sel  limfosit  mencit  galur  Balb/C.  Proliferasi  merupakan  fungsi  biologis mendasar  limfosit  yaitu  proses  diferensiasi  dan  pembelahan  (mitosis)  sel.  Respon proliferasi  pada  kultur  limfosit  digunakan  untuk  menggambarkan  fungsi  limfosit  dan status  imun  tubuh  (Roitt  &  Delves,  2001).  Sel  limfosit  diisolasi  dari  jaringan  limpa mencit galur Balb/C. Mencit yang dipilih adalah mencit Balb/C karena responsif terhadap rangsangan eksogen. Limpa digunakan karena merupakan organ limfoid sekunder utama yang berisi sel T dan sel B (Abbas et al ., 2007).
Penentuan  aktivitas  imunomodulator  terhadap  proliferasi  sel  limfosit  dilakukan inkubasi  selama  48  jam.  Hal  tersebut  berkaitan  dengan  kandungan  nutrisi  dalam  media yang  menjadi  asupan  sel  limfosit    selama  roses  pengkulturan. Rosewell  Park  Memorial Institude (RPMI  1640)  merupakan  media  yang  baik  untuk  kultur  sel  limfosit  karena mengandung  garam-garam  organik,  asam  amino,  vitamin  dan  glukosa.  Penggunaan glukosa  yang  terbatas  pada  sel  limfosit  selama  lebih  dari  48  jam  mengakibatkan  sel limfosit tidak dapat berproliferasi secara optimal (Maclever et al ., 2008).
Pengujian  aktivitas  imunomodulator  sampel  uji  FTHJK  terhadap  proliferasi  sel limfosit  dilakukan  dengan  menggunakan  metode  MTT Assay .  Metode  ini  merupakan metode kolorimetri yang umum digunakan untuk mengamati proliferasi dan pertumbuhan sel.  Dimana  garam  tetrazolium  MTT  yang  berwarna  kuning  akan  direduksi  oleh  enzim suksinat  dehidrogenase  dalam  mitokondria  sel  limfosit  yang  hidup,  menjadi  kristal formazan  berwarna  ungu  (Mosmann,  1983).  Intensitas  warna  kristal  formazan  yang terbaca pada ELISA reader setara dengan jumlah sel limfosit yang mengalami proliferasi,
sehingga  pengukuran  aktivitas  proliferasi  sel  limfosit  dapat  diketahui  dari  nilai Optical Density (OD).
Nilai OD dari sampel uji FTHJK akan dibandingkan dengan  kontrol negatif dan kontrol  positif  ( Phytohemagglutinin (PHA)).  Kontrol  negatif  yang  digunakan  adalah  sel limfosit  ditambah  vaksin  hepatitis  B.  Penambahan  vaksin  hepatitis  B  ditujukan  untuk menginduksi  respon  imun  sebelum  diberikan  pelakuan  sampel  uji.  Suatu  agen imunomodulator  dapat  mengarah  ke  imunostimulator  jika  senyawa  tersebut  mampu meningkatkan  respon  imun,  berupa  peningkatan  aktivitas  proliferasi  sel  limfosit  akibat pemberian  vaksin.  Semakin  tinggi  aktivitas  proliferasi  sel  limfosit  akibat  pemberian mitogen maka nilai OD yang diperoleh akan semakin tinggi.
Hasil perhitungan uji Mann Whitney nilai OD  dari sampel uji FTHJK fermentasi hari  ke-5  tersaji  dalam  grafik  mean  ±  SD  nilai  OD  kontrol  negatif,  kontrol  positif  dan sampel uji FTHJK terdapat dalam Gambar 1.
Gambar 1. Grafik Mean ± SD Nilai OD Kontrol Negatif (Sel limfosit ditambah vaksin), Kontrol Positif (PHA), dan Sampel Uji FTHJK Fermentasi hari ke-5
Hasil  analisa  menunjukkan  terdapat  perbedaan  bermakna  kelompok  sampel  uji  FTHJK (hari  ke-5)  terhadap  kontrol  negatif    pada  konsentrasi  50  dan  100  µg/mL.  Konsentrasi  tersebut menunjukkan adanya aktivitas imunostimulator. Aktivitas imunostimulator yang ada pada sampel uji  FTHJK  (hari  ke-5)  karena  kadar  polifenol  dan  flavonoid  dalam  teh  masih  banyak  dan khasiatnya  sebagai  imunostimulator  ditingkatkan  dengan  mulai  dihasilkannya  senyawa  hasil fermentasi seperti asam asetat, asam glukoronat, asam laktat dan asam askorbat.
Grafik  mean  ±  SD  nilai  OD  kontrol  negatif,  kontrol  positif  dan  sampel  uji  FTHJK fermentasi hari ke-10 dan 15 terdapat dalam Gambar 2 dan 3.
Gambar 2. Grafik Mean ± SD Nilai OD Kontrol Negatif (Sel limfosit ditambah vaksin), Kontrol Positif (PHA), dan Sampel Uji FTHJK Fermentasi hari ke-
10 0.360 0.380 0.400 0.420 0.440 n ila i O D * = berbeda bermakna dengan kontrol negatif … 0.300 0.350 0.400 0.450 n ila i O D *= berbeda bermakna dengan kontrol negatif …
Gambar 3. Grafik Mean ± SD Nilai OD Kontrol Negatif (Sel limfosit ditambah vaksin), Kontrol Positif (PHA), dan Sampel Uji FTHJK Fermentasi hari ke- 15
Pada  Gambar  2,menunjukkan  ada  perbedaan  bermakna  dari  sampel  uji  dan kontrol  negatif  adalah  konsentrasi  100  µg/mL.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kelompok sampel  uji  FTHJK  fermentasi  hari  ke-10  yang  memiliki  aktivitas  imunostimulator  pada konsentrasi  100  µg/mL.  Sesuai  penelitian  Jayabalan et  al., (2007)  meskipun  terjadi penurunan kadar polifenol dan flavonoid dalam sampel uji FTHJK, tetapi hasil fermentasi berupa  asam-asam  organik  kadarnya  meningkat.  Adanya  aktivitas  imunostimulator  pada sampel  uji  FTHJK  hari  ke-10  lebih  banyak  berasal  dari  asam  asetat,  asam  glukoronat, asam laktat dan asam askorbat.
Hasil analisa pada Gambar 3, menunjukkan terdapat perbedaan bermakna terlihat pada  kontrol  positif  terhadap  kelompok  kontrol  negatif  (sel  limfosit  dengan  vaksin). Perbandingan  nilai  OD  antara  kelompok  sampel  uji  dan  kontrol  negatif,  yang memberikan  perbedaan  bermakna  pada  konsentrasi  100  µg/mL  dengan  nilai  OD  yang lebih  tinggi  dari  kontrol  negatif.  Hal  ini  menunjukkan  sampel  uji  FTHJK  memiliki aktivitas imunostimulator pada konsentrasi 100µg/mL.
Hasil  analisis  semua  kelompok  sampel  uji  FTHJK  dari  masing-masing  lama waktu fermentasi menunjukkan  aktivitas imunostimulator tertinggi pada konsentrasi 100 µg/mL  fermentasi  hari  ke-15,  namun  dalam  penelitian  ini  belum  didapatkan  konsentrasi optimal  dari  sampel  uji  FTHJK  yang  memberikan  aktivitas  proliferasi  sel  limfosit, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih  lanjut  terhadap sampel uji  FTHJK dengan  seri konsentrasi diatas 100 µg/mL pada fermentasi hari ke-15. Konsentrasi optimal pemberian imunostimulator  dapat  ditentukan  dengan  melihat  konsentrasi  dimana  sampel  uji memberikan  aktivitas  tertinggi  (batas  konsentrasi  tertentu),  yang  kemudian  pada pemberian beberapa  konsentrasi lebih tinggi terjadi penurunan  aktivitas imunostimulator terhadap proliferasi sel limfosit.
Besarnya  potensi  aktivitas  imunostimulator  sampel  uji  FTHJK  dibandingkan dengan  kontrol  positif.  Kontrol  positif  yang  digunakan  dalam  penelitian  adalah  PHA. Hasil analisa menunjukkan kontrol positif memiliki perbedaan bermakna terhadap kontrol negatif,  ini  berarti  PHA  merupakan  mitogen  yang  poten  dalam  menginduksi  proliferasi sel limfosit. Hal tersebut sesuai dengan penelitian Schroecksnadel et al . (2011).
Konsentrasi  sampel  uji  FTHJK  tertinggi  yaitu  konsentrasi  100  µg/mL  pada fermentasi hari ke-15 menunjukkan hasil perbedaan bermakna dengan nilai rata-rata OD lebih  rendah  dari  kontrol  positif.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  FTHJK  pada  konsentrasi tersebut  memiliki  efek  imunostimulator  yang  lebih  kecil  daripada  kontrol  positif  yang digunakan.
Lama  fermentasi  yang  mempengaruhi  aktivitas  imunostimulator  sampel  uji FTHJK,  terlihat pada grafik nilai OD berdasarkan lama fermentasi dalam Gambar 4.
0.300 0.350 0.400 0.450 n ila i O D *= berbeda bermakna dengan kontrol negatif …

## Gambar 4. Grafik Perbandingan  Nilai OD dari Sampel Uji FTHJK Berdasarkan LamaFermentasi
Berdasarkan  Gambar  4,  Semua  kelompok  konsentrasi  menunjukkan  penurunan  aktivitas imunostimulator pada fermentasi hari ke-10. Hal ini dapat dikarenakan adanya penurunan dari  kadar  senyawa  polifenol,  flavonoid  dan  asam  laktat,  terdapat  sedikit  asam  asetat, asam askorbat (vitamin C) dan zat besi dalam sampel uji FTHJK sesuai dengan penelitian Jayabalan et al ., (2007) dan Loncar et al ., (2002), senyawa yang digunakan sebagai agen imunostimulator  diperoleh  lebih  banyak  dari  asam  glukoronat  yang  dapat  memperbaiki sistem imun.
Peningkatan  aktivitas imunostimulator terjadi pada fermentasi hari ke-15, dengan konsentrasi  tertinggi  100  μg/mL.  Peningkatan  aktivitas  ini  kemungkinan  karena  kadar polifenol,  flavonoid,  asam  laktat,  asam  asetat  dan  asam  askorbat.  Peningkatan  senyawa asam  ini  dapat  menginduksi  sistem  imun  seluler,  diantaranya  adalah  asam  laktat  dapat meningkatkan  respon  sel  limfosit  T  (Scholttfeldt et  al .,  1995),  asam  asetat,  asam glukoronat dapat memperbaiki sistem imun (Loncar et al ., 2000), asam askorbat (vitamin C)  hasil  fermentasi  teh  hitam  oleh yeast dapat  meningkatkan  proliferasi  sel  limfosit (Pasha  &  Reddy,  2005).   Polifenol  dan  flavonoid  seperti  yang  terdapat  dalam  teh  hitam yang  tidak hilang oleh proses fermentasi ini,  mampu merangsang proliferasi sel  limfosit (Arnas, 2009).
Mekanisme  umum  terjadinya  proses  proliferasi  sel  limfosit  dikarenakan terikatnya  suatu  senyawa  aktif  (antigen)  pada  permukaan  sel  T  dan  sel  B.  Pengikatan antigen  pada  reseptor  permukaan  sel  T  bersama  interlukin  1  (IL-1)  dari  APC  ( Antigen Presenting Cell ) dapat mengaktivasi G-protein yang kemudian memproduksi fosfolipase C.  Enzim  ini  menghidrolisis  fosfatidil  inositol  bifosfat  (PIP2)  menjadi  produk  reaktif diasil  gliserol  (DAG)  dan  inositol  trifosfat  (IP3).  Reaksi  tersebut  berlangsung  dalam membran  plasma.  IP3  kemudian  menstimulasi  pelepasan  Ca 2+ ke  dalam  sitoplasma sehingga  konsentrasi  Ca 2+ meningkat.  Peningkatan  Ca 2+ ini  berperan  penting  dalam menstimulasi  kerja  enzim  protein  kinase  C  dan  5-lipooxygenase.  Protein  kinase  C menstimulasi produksi interlukin-2 (IL-2), IL-2 ini kemudian mengaktivasi sel B maupun sel T untuk berproliferasi (Roitt & Delves, 2001).
Pengujian secara in vitro pada penelitian ini menunjukkan bahwa perbedaan jenis teh  sebagai  media  fermentasi  dapat  mempengaruhi  hasil  aktivitas  proliferasi  sel  limfosit pada  variasi  konsentrasi  dan  lama  fermentasi.  Hasil  penelitian  ini  berbeda  dengan penelitian  Ulfah  dan  Arifin  (2013),  dimana  dengan  jenis  teh  hijau  dan  seri  konsentrasi yang sama ( 6,25; 12,5; 25; 50 dan 100 µg/mL) memilik aktivitas proliferasi sel limfosit tertinggi pada konsentrasi 100 µg/mL dan lama fermentasi hari ke-10.
Beberapa hasil fermentasi juga telah diteliti sebagai peningkat sistem imun tubuh, diantaranya  efek  imunomodulator  dari  fermentasi  teh  kombucha  yang  diteliti  secara in vivo dapat  memberikan  efek  titer  antibodi  IgM  pada  mencit  setelah  diimunisasi  vaksin hepatitis A (Ulfah, 2005). Antibodi tersebut  merupakan salah satu hasil dari diferensiasi dan proliferasi sel limfosit B. Hasil pengujian FTHJK secara in vitro ini diharapkan dapat
0.340 0.360 0.380 0.400 0.420 0.440 hari ke 5 hari ke 10 hari ke 15 ni la i OD 6,25  µg/mL 12,5  µg/mL 25  µg/mL 50  µg/mL
100  µg/mL
memberikan  gambaran  mengenai  potensi  teh  hitam  kombucha  sebagai  agen imunomodulator.
4. KESIMPULAN
1. Hasil  fermentasi  teh  hitam  jamur  kombucha  (FTHJK)  memiliki  aktivitas imunomodulator  terhadap  peningkatan  proliferasi  sel  limfosit  mencit  galur Balb/C  secara in  vitro pada  konsentrasi  50  dan  100µg/mL  fermentasi  hari  ke5 dan konsentrasi 100 µg/mL pada fermentasi hari ke-10 dan 15.
2. Fermentasi  teh  hitam  jamur  kombucha  mempunyai  aktivitas  imunomodulator yang tinggi pada konsentrasi 100 µg/mL pada fermentasi hari ke-15.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
Arnas,  Y.,  2009,  Pengaruh  Pemberian  Seduhan  Teh  Hitam  ( Camellia  sinensis )  Dengan Dosis  Bertingkat  TerhadapProliferasi  Limfosit  Mencit  Balb/c  yang  Diinokulasi Salmonella typhimurium , Skripsi , Universitas Diponegoro, Semarang.
Baratawidjaja, K.G., & Rengganis, I., 2012, Imunologi Dasar, edisi ke-10, Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta. 29-32, 39, 93-147.
Dufresne, C., & E. Farnworth, 2000, Tea Kombucha and Health: a Review. Food
Research International , 33 , 409-421.
Jayabalan, R., Marimthu, S., & Swaminathan, K., 2007,  Changes in Content of Organic Acid and Tea Polyphenols during Kombucha Tea Fermentation, Food Chemistry , 102 , 392-398.
Jayabalan,  R.,  Malbasa,  R.V,  Loncar,  E.S.,  Vitas,  J.S.,  &  Sathiskumar,  M.,  2014,  Review  on Kombucha  Tea-Microbiology,  Composition,  Fermentation,  Beneficial  Effects,  Toxicity, and Tea Fungus, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety , 13 , 538-550. Loncar,  E.S.,  Petrovic,  S.E.,  Malbasa  R.V.,  &  Verac,  R.M,  2000,  Biosynthesis  of Glucoronic Acid by Means of Tea Fungus, Nahrung , 44 , 138-139.
Maclever,  N.J.,  Jacobs,  S.R.,  Wieman,  Wofford,  J.A.,  Coloff,  J.L.,  and  Rathmell,  J.C., 2008,  Glucose  Metabolism  In  Lymphocytes  Is  A  Regulated  Process  With Significant Effects On Immune Cell Function And Survival, Journal of Leukocyte Biology, 84 , 949–957.
Mosmann,T., 1983, Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival, Journal of Immunilogical Method , 55-63.
Neiman, D.C., Henson, U.A., Maxwell, K.R., Williams, S.R.M., Mcanulty, S.R., Jin, F., Shanely,  R.A.,  &  Lines,  T.C.,  2009,  Effects  of  Quercetin  and  EGCG  on Mitochondrial  Biogenesis  and  Immunity, Medicine  &  Science  In  Sports  and Exercise , 9 , 1467-1475.
Pasha, C., & Reddy, G., 2005, Nutritional and Medicinal  Improvement of Black  Tea by Yeast Fermentation, Food Chemistry , 89 , 449-453. Roitt, I. M. & P. J. Delves. 2001. Essential Immunology . 10th edition. Blackwell Science Ltd. London, 17-25, 75-81.
Schlottfeldt,  J.,  Blazina,  L.R.,  Wannmacher,  M.D.,  &  Wajner,M.,  1995,  The  Effect  of Organic  Acid  On  Phytohaemagglutinin-Actived  Proliferation  of  Human Lymphocyte In Vitro, International Society for Immunopharmacolgy , 17 , 175 Schroecksnadel, S., Sucher, R., Kurz, K., Fucks, D., and Brandacher, G., 2011, Influence of  immunosuppresive  agents  on  trypthophan  degradation  and  neopterin production  in  human  peripheral  blood  mononuclear  cells, Transplant Immunology , 25 , 119-123.
Suprijono, A., Putri, G.K.P., & Susanti, E., 2012, Pengaruh Fermentasi Kultur Kombucha terhadap  Aktivitas  Antioksidan  Infus  Daun  Teh  Hitam Camellia  sinensis O.K. var.assamica  (mast))  dengan  metode  DPPH  (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Media Farmasi Indonesia , 6 , 2.
Ulfah,M.,  2005,  Pengaruh  Pemberian  Teh  Jamur  Kombucha  Terhadap  Titer  Antibodi Imunoglobulin  M  (IgM)  Pada  Mencit  Setelah  Divaksinasi  Hepatitis  A, Skripsi , Universitas Wahid Hasyim, Semarang.
Ulfah, M., & Arifin, I., 2013, Teh Jamur Kombucha  Sebagai  Imunomodulator Terhadap Proliferasi  Sel  Limfosit  Mencit  Galur  Balb/c  Secara In  Vitro , Prosiding ‘’Simposium  Nasional  Peluang  dan  Tantangan  Obat  Tradisional  dalam Pelayanan Kesehatan Formal, Yogyakarta, 95-1001.