## Pengaruh Pemberian Vitamin C
terhadap Aktifitas Fagositosis Makrofag dan Kadar Vitamin C dalam Cairan Intraperitoneal Mencit Balb/C dengan Sepsis
Hendra Widjaja*, Ign Riwanto*, Edi Dharmana**
Latar  belakang  : Sepsis  masih  menjadi  permasalahan  dalam praktek  klinis  karena  angka  mortalitas  masih  tinggi.  Penelitian bertujuan mengetahui pengaruh dosis bertingkat  vitamin C yang dibutuhkan  untuk  mencapai  aktivitas  fagositosis  optimal makrofag mencit sepsis.
Metode : Penelitian ini merupakan uji laboratoris  mencit Balb/C dengan   pendekatan the post test only controlled group design , 20 ekor mencit sepsis dibagi   4 kelompok: kelompok kontrol (K); kelompok  perlakuan  mendapat  vitamin  C  0 , 52  mg/hari  (P1); vitamin C 1 , 04 mg/hari (P2); vitamin C 2 , 6 mg /hari (P3) selama 3 hari, kemudian diperiksa kemampuan fagositosis makrofag dan kadar  vitamin  C  intraperitoneal.  Tingkat  aktivitas  fagositosis makrofag dan  kadar vitamin C intraperitoneal dianalisis dengan ANOVA dilanjutkan dengan Bonferroni test , dan korelasi keduanya diuji dengan uji korelasi Spearman . Hasil  : Terdapat  perbedaan  bermakna  pada  kemampuan fagositosis  makrofag  dalam  kelompok  ( p <0,05).  Uji  antar kelompok  menunjukkan:  K–P1  ( p <0,001),  K–P2  ( p <0,001),  K–P3 ( p <0,001),  P1–P2  ( p <0,001),  P1–P3  ( p <0,001),  tetapi  tidak didapatkan  perbedaan  yang  bermakna  antara  P2-P3  ( p =0,48). Terdapat  perbedaan  bermakna  kadar  vitamin  C  intraperitoneal K–P2  ( p <0,001),  K–P3  ( p <0,001),  P1–P2  ( p =0,003),  P1–P3 ( p <0,001),  P2-P3  ( p <0,001),  kecuali  pada  kelompok  K–P1 ( p =0,131).  Didapatkan  korelasi  positif  antara  kadar  vitamin  C intraperitoneal dengan fagositosis makrofag ( r =0,58 ; p <0,001). Simpulan  : Terdapat  peningkatan  signifikan  pada  fagositosis makrofag dan kadar vitamin C intraperitoneal pada mencit Balb/C dengan sepsis yang diberi vitamin C.  Dosis ideal vitamin C adalah 1,04  mg/hari,  dan  kadarnya  meningkat  sesuai  dosis  yang diberikan.
Kata  kunci: Sepsis,  vitamin  C,  fagositosis  makrofag,  vitamin  C intraperitoneal.
*Bagian/SMF Bedah, **Bagian Parasitologi dan Imonologi Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro/RSUP Dr. Kariadi Semarang

## Abstrak
Background : Sepsis in the hospitalized patients remains to be a major concern due to its high mortality. The aim of the study was to determine the effect of various level vitamin C doses needed to achieve optimum phagocytic activity of macrophages from  septic mice .
Methods : This was animal experimental study with randomized post test only  controlled  group  design.  Samples  were  20  septic Balb/C mice  divided  into  4  groups:  control (K);  and  treatment group  administered  0.52  mg  intravenous  vitamin  C/day  (P1); 1.04  mg  vitamin  C  (P2);  2.6  mg  vitamin  C  (P3).  All  groups  were treated for 3 days, phagocytosis ability of macrophages and   the level of   intraperitoneal vitamin C were measured. ANOVA with Bonferroni Test was used to analyzed. Spearman's Correlation test was performed to analyze  the correlation.
Results  : Within  group  test  showed  significant  difference  in macrophage phagocytosis ability ( p <0.001). Between group test showed: K–P1 ( p <0.001), K–P2 ( p <0.001), K–P3 ( p <0.001), P1–P2 ( p <0.001),  P1–P3  ( p <0.01).  There  were  no  significant  difference between the P2–P3 ( p =0.48). Intraperitoneal vitamin C levels were significantly  different  between  K–P2( p <0.001),  K–P3( p <0.001), P1–P2( p =0.003),  P1–P3( p <0.001),  P2–P3( p <0.001),  but  there were no significant different between the K–P1( p =0.131). There was positive correlation between levels of intraperitoneal vitamin C and macrophage phagocytosis ( r =0.58 ; p <0.001). Conclusion : There was a significant   increased on macrophages phagocytosis and intraperitoneal vitamin C level on Balb/C mice with  septic  given  vitamin  C.  The  ideal  dose  of  vitamin  C  was 1.04 mg/day and its increased in related with dose given.
Keywords  : Sepsis,  vitamin  C,  macrophage  phagocytosis, intraperitoneal vitamin C .

## Abstract
The Effect of Vitamin C Treatment to Intraperitoneal Macrophages Phagocitic Activity and Vitamin C Level on Septic Balb/C Mice

## Original Article
Med Hosp 2012; vol 1 (2) : 123-126

## Medica Hospitalia

## PENDAHULUAN
Sepsis merupakan suatu kondisi kerusakan sistem imun akibat  infeksi.  Hal  ini  masih  menjadi  masalah  dalam praktek  klinis  karena  patogenesisnya  yang  sangat kompleks  dan  pengobatannya  yang  sulit  serta  angka mortalitas  yang  tinggi  meskipun  selalu  terjadi perkembangan  antibiotik  yang  baru.  Sepsis  terjadi  di beberapa negara dengan angka kejadian yang tinggi dan kejadiannya  masih  terus  meningkat.  Berdasarkan  data epidemiologi di Amerika Utara bahwa sepsis terjadi pada 3  kasus  dari  1000  populasi  yang  diartikan 1 750.000  penderita  per  tahun.   Angka  mortalitas  sepsis mencapai  30%  dan  bertambah  pada  usia  tua  40%  dan
1 penderita sepsis dengan syok mencapai 50%.  Meskipun selalu  terjadi  perkembangan  antibiotik  dan  terapi perawatan intensif, sepsis menimbulkan angka kematian yang  tinggi  di  hampir  semua  ruang Intensive  Care  Unit (ICU).  Sindrom  sepsis  mulai  dari Sistemic  Inflammatory Response  Syndrome (SIRS)  sampai  sepsis  yang  berat (disfungsi organ yang akut) dan syok sepsis (sepsis yang berat  ditambah  dengan  hipotensi  yang  tak  membaik 2,3 dengan resusitasi cairan).
Mediator-mediator  inflamasi  atau  sitokin diproduksi pada keadaan sepsis. Makrofag merupakan salah  satu  mediator  seluler,  makrofag  memegang peranan  penting  dalam  patogenesis  syok  septik. Penelitian  terakhir  menunjukkan  bahwa  LPS  dapat menurunkan kemampuan   IFN-gamma atau LPS untuk memacu Inducible nitric oxide synthase (iNOS) pada kultur 4-7 makrofag sehingga NO mengalami penurunan.  Selain
itu pada sepsis juga didapatkan kadar vitamin C dalam plasma  yang  menurun.  Pemberian  vitamin  C  akan meningkatkan  konsentrasi  dalam  plasma  dan  jaringan 8-9 sehingga  menurunkan  morbiditas.   Penelitian  ini menguji  aktifitas  fagositosis  makrofag  setelah  diberi suntikan  vitamin  C,  kadar  vitamin  C  dalam  cairan intraperitoneal  dan  kaitannya  dengan  fagositosis makrofag tersebut.

## METODE
Penelitian  ini  merupakan  uji  laboratoris  dengan menggunakan mencit Balb/C dan pendekatan the post test only controlled group design . Dua puluh ekor mencit sepsis dibagi  4  kelompok:  kelompok  kontrol  (K);  kelompok perlakuan  mendapat  vitamin  C  0 , 52  mg/hari  (P1); vitamin C 1 , 04 mg/hari (P2); vitamin C 2 , 6 mg /hari(P3). Dilakukan perlakuan selama 3 hari, kemudian diperiksa kemampuan  fagositosis  makrofag  dan  pengukuran kadar  vitamin  C  intraperitoneal.  Aktivitas  fagositosis makrofag  dinyatakan  dengan  jumlah  makrofag  yang memfagosit partikel latex dalam 200 makrofag yang diperiksa dengan mikroskop cahaya. Perhitungan kadar vitamin  C  intraperitoneal  digunakan  cairan intraperitoneal dan diukur dengan alat HPLC.
Analisis  statistik  tingkat  aktivitas  fagositosis makrofag  dan  kadar  vitamin  C  intraperitoneal  dengan menggunakan  ANOVA  dilanjutkan  dengan  Bonferroni test. Uji korelasi antara kadar vitamin C intraperitoneal dan  tingkat  aktifitas  fagositosis  makrofag  dengan menggunakan uji korelasi Spearman .
P3 (5 ekor) Vitamin C 2.6 mg/hari
3 hari
Jumlah fagositosis makrofag rata-rata : 21.00 Tingkat kadar vitamin C intraperitoneal rata-rata : 0.74 μmol/lt
P2 (5 ekor) Vitamin C 1.04 mg/hari
3 hari
Jumlah fagositosis makrofag rata-rata : 20.80
Tingkat kadar vitamin C intraperitoneal rata-rata : 0.30 μmol/lt
P1 (5 ekor) Vitamin C 0.52 mg/hari
3 hari
Jumlah fagositosis makrofag rata-rata : 14.40
Tingkat kadar vitamin C intraperitoneal rata-rata : 0.09 μmol/lt
K (5 ekor) Jumlah fagositosis makrofag rata-rata : 2.80 3 hari Tingkat kadar vitamin C intraperitoneal rata-rata : 0.00 μmol/lt
24 ekor mencit Balb/C
Adaptasi 7 hari LPS 0,04 IU, 2 cc intraperitoneal Dievaluasi dalam 1 hari 20 ekor mencit Balb/C Drop out : 4 Berhasil Gagal
Randomisasi
Gambar 1. Alur dan ringkasan penelitian
Gambar 2. Box plot fagositosis makrofag mencit: ANOVA,
p <0,001. Perbedaan antar kelompok *P3 dibanding K, p <0,001, **P3 dibanding P1, p <0,001, ***P3 dibanding P2, p =0,48, #P2 dibanding K, p <0,001, ##P2 dibanding P1, p <0,001, @P1 dibanding K, p <0,001
Gambar 3. Makrofag yang tidak memfagositosis Latex
(Pembesaran 1000x)
Gambar 4. Makrofag yang memfagositosis Latex
(Pembesaran 1000x) Gambar 5. Scatterplot korelasi antara fagositosis makrofag dan kadar vitamin C intraperitoneal (r=0.58 ; p<0.001)

## HASIL
Penelitian ini menggunakan 24 ekor mencit Balb/C dari keturunan murni berumur 8–10 minggu dan berat badan 20–40  gram  yang  telah  diadaptasi  selama  7  hari kemudian, lalu disuntikan LPS agar sepsis dan dipantau selama 1 hari. Setelah 1 hari terdapat 4 ekor mencit yang tidak  menjadi  sepsis  dan  masuk  ke  kriteria  eksklusi. K e m u d i a n   d i l a k u k a n   r a n d o m i s a s i   d a l a m 4 kelompok yaitu kelompok kontrol (K) yang  terdiri dari 5  ekor  mencit  yang  diberikan  perlakuan  LPS  E.Coli 0,04  IU  sebanyak  2  cc  intraperitoneal,  3  kelompok perlakuan, P1, P2 dan P3 diberikan LPS E.Coli sebanyak 2  cc  intraperitoneal  dan  masing-masing  diberikan vitamin C intravena 0,52 mg/hari, 1,04 mg/hari dan 2,6  mg/hari  selama  3  hari.  Setelah  itu  mencit  dibunuh dan  diambil  cairan  peritonealnya  lalu  dihitung  jumlah fagositosis makrofag dan kadar vitamin C intraperitoneal pada tiap kelompok percobaan. Alur penelitian dan hasil secara lengkap dapat dilihat pada gambar 1.
Terdapat  perbedaan  bermakna  antara  aktivitas fagositosis  makrofag  pada  kelompok  K  (2,80±0,37) dibandingkan  dengan  masing-masing  kelompok perlakuan  P1  (14,40±0,68),  P2  (20,80±0,66)  dan P3 (21,00±0,58) dengan nilai p <0,05. Uji antar kelompok pada  gambar  2  menunjukkan:  K-P1  ( p <0,001),  K-P2 ( p <0,001),  K-P3  (p<0,001),  P1-P2  ( p <0,001),  P1-P3 ( p <0,001),  tetapi  tidak  didapatkan  perbedaan  yang bermakna antara P2-P3 ( p =0,48). Oleh karena itu dapat diartikan bahwa pemberian vitamin C secara bertingkat dengan  dosis  0,52 mg/hari  (P1)  dan  1,04 mg/hari  (P2) meningkatkan  fagositosis  makrofag  yang  cukup bermakna,  tetapi  bila  dosis  dinaikkan  lagi  menjadi 2,6 mg/hari (P3) menghasilkan peningkatan yang tidak bermakna  dibandingkan  P2  yang  mendapat  dosis 1,4 mg/hari ( p =0,48). Jadi meskipun secara keseluruhan peningkatan  dosis  vitamin  C  menghasilkan  kenaikkan fagositosis makrofag yang bermakna, tetapi pada batas dosis  tertentu  laju  kenaikan  fagositosis  makrofag  akan melambat.
Rata-rata tingkat kadar vitamin C intraperitoneal pada kelompok kontrol (K) adalah 0,00±0,00 ,kelompok perlakuan  1  (P1)  0,09±045  ,  kelompok  perlakuan  2  (P2) 0,30±0,11,  dan  kelompok  perlakuan  3  (P3)  0,74±0,14. Terdapat  perbedaan  bermakna  kadar  vitamin  C intraperitoneal  K-P2  ( p <0,001),  K-P3  ( p <0,001),  P1-P2 ( p =0,003), P1-P3 ( p <0,001), P2-P3 ( p <0,001), kecuali pada kelompok K-P1 ( p =0,131).
Didapatkan korelasi positif antara kadar vitamin C intraperitoneal dengan fagositosis makrofag ( r =0,58 ; p <0,001).

## DISKUSI
Secara  keseluruhan  peningkatan  dosis  vitamin  C menghasilkan  kenaikan  fagositosis  makrofag  yang bermakna, tetapi pada batas dosis tertentu laju kenaikan fagositosis makrofag akan melambat. Berbagai penelitian melaporkan  vitamin C  mampu  meningkatkan  respon imun  tubuh.  Sitokin  aktifator  makrofag  yang  poten adalah  IFN-γ.  Proses killing terhadap  bakteri menyangkut  proses  fagositosis  dan  pembentukan Reactive Oxygen Species (ROS). Sitokin seperti IFN-γ akan meningkatkan baik endositosis maupun fagositosis oleh monosit.  Fagositosis  terhadap  partikel  bakteri  dapat ditingkatkan  dengan  molekul  IgG  atau  komplemen. Setelah  bakteri  masuk  ke  dalam  fagolisosom  sel  maka makrofag  akan  membunuh  dengan  pembentukan Reactive  Oxygen  Species (ROS)  melalui  jalur Reactive Oxygen  Intermediates (ROI).  Proses killing terhadap bakteri  dibedakan  menjadi  2  yaitu  untuk  bakteri ektraseluler dan intraseluler. Pada bakteri ekstraseluler, setelah  dicerna  didalam  fagolisosom  dengan menggunakan  ROS  termasuk  NO,  maka  makrofag  ini akan  memproses  antigen  bakteri  tersebut  dan mengekspresikannya  ke  permukaan  sel  makrofag bersama dengan MHC II, yang selanjutnya akan dikenali oleh sel T-Helper CD4 yang akan mensekresikan IFN-γ, IFN-γ  ini  akan  mengaktifasi  proses  pencernaan  dalam fagolisosom  makrofag.  Sedangkan  pada  bakteri intraseluler, setelah masuk ke dalam fagolisosom bakteri ini  akan  masuk  ke  sitoplasma  makrofag  dan survive didalam APC tersebut. Bakteri akan mempengaruhi sel host  untuk  mensintesa  protein-protein  tertentu,  yang merupakan  antigen  yang  akan  dipresentasikan  ke permukaan makrofag bersama MHC I, MHC I ini akan dikenali  oleh  CD8  yang  selanjutnya  akan  dilakukan 5 proses killing .
Penurunan  kadar  vitamin  C  dalam  cairan intraperitoneal  dibandingkan  dengan  pemberian intravena  akan  terjadi  pada  kondisi  sepsis.  Hal  ini
dibuktikan  dengan  menurunnya  kadar  vitamin  C intraperitoneal  setelah  diberikan  dosis  vitamin  C bertingkat.  Asam  askorbat  diangkut  ke  dalam  sel  oleh Specific sodium-dependent Vitamin C Transporter 1 (SVCT1) dan Specific  sodium-dependent  Vitamin  C  Transporter  2 (SVCT2)  yang  merupakan  pengangkut  vitamin  C  yang tergantung  natrium.  SVCT1  dan  SVCT2  ditemukan hampir  disemua  jaringan  termasuk  intraperitoneal. Asam  dehidroaskorbat  diangkut  oleh  pengangkut glukosa Glucose  Transporters (GLUT1),  GLUT3,  dan  di dalam  jaringan  yang  sensitif  terhadap  insulin  oleh 9 GLUT4.
Pemberian  dosis  vitamin  C  dengan  dosis bertingkat akan menyebabkan kenaikan kadar vitamin C intraperitoneal. Tingkat kadar vitamin C intraperitoneal memiliki  korelasi  positif  terhadap  tingkat  aktifitas fagositosis makrofag.

## SIMPULAN
Terdapat  peningkatan  signifikan  pada  fagositosis makrofag  mencit Balb/C dengan  sepsis  yang  diberi vitamin  C,  dosis  ideal  adalah  1,04  mg/hari  dan peningkatan  yang  signifikan  tingkat  kadar  vitamin  C intraperitoneal  sesuai  dengan  dosis  yang  diberikan. Kadar vitamin C intraperitoneal memiliki korelasi positif dengan aktifitas fagositosis makrofag.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Cohen  J.  The  immunopathogenesis  of  sepsis.  Brighton, England. Nature Publishing Group, 2002:885-892
2. Marshall JS.Sepsis: rethinking the approach to clinical research. PubMed:18171697, J. Leukoc.Biol. 2008;83:471-482
3. Dellinger  RP,  Levy  MM,  Carlet  JM,  Bion  J.  International surviving sepsis campaign guidliness committee: international guidelines  for  management  of  severe  sepsis  and  shock. Intensive Care Med. 2008;36:296-327
th
4. Abbas  AK.  Cellular  and  molecular  immunology.  5   ed. Philadelphia:  Elsevier  Saunders  Companies,  2007;6:23,65- 103,175-185,258-259.
5. Paterson  RL,  Webster  NR.  Sepsis  and  the  systemic inflammatory  response  syndrome.  Aberdeen,  U.K. Educational Review. 2000:178-82.
6. Hotchkiss SR, Karl EI. The pathophysiology and treatment of sepsis. Pierre Benite. Advances in Sepsis. 2003:338-50.
7. Wright G, Singh IS, Hasday JD, Farrancel IK, Hal1 G, Cross AS and Rogers TB. Endotoxin stress-responsse in cardiomyocytes: NF-B activation and tumor necrosis factor- expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002;282:872-879
8. Adam  S.  The  antioxidant  vitamins.  Available  from:  : http:www.i2k.-suzanne/vitaminandc.htm#c.  Accessed January 26, 2010
9. Karl IE. Pathogenesis of sepsis and multiorgan dysfunction. J
Cell Biochem, 1992;267:1931-1944