## Pemodelan  Farmakofor  untuk  Identifikasi  Inhibitor  Heat  Shock  Proteins- 90 (HSP-90)
Pharmacophore Modeling to Identify Heat Shock Proteins-9 (HSP-90) Inhibitors
Muhammad Arba 1* , Arfan 1 , Ayu Trisnawati 2 , Desi Kurniawati 2
1* Fakultas Farmasi, Universitas Halu Oleo, Kendari, Indonesia, 93232
2 Jurusan Kimia, Universitas Halu Oleo, Kendari, Indonesia. E-mail: muh.arba@uho.ac.id
Article Info: Received: 19 Maret 2020 in revised form: 10 Mei 2020 Accepted: 14 Agustus 2020
Available  Online:  30  September 2020

## ABSTRACT
Heat shock proteins-90 (HSP-90) is a protein that plays an important role in the  life  cycle  of  normal  and  cancer  cells  for  their  self  protection  from thermal  stress,  oxidative  damage,  and  cell  hypoxia.  Inhibition  of  HSP90  is one way to suppress the growth of cancer cells. In this study, pharmacophore modeling and molecular docking were conducted to identify hit compounds as  inhibitors  of  HSP-90.  The  pharmacophore  feature  consists  of  three hydrogen  bond  acceptors,  one  hydrogen  bond  donor  and  one  hydrophobic feature  with  Area  Under  Curve  of  Receiver  Operating  Characteristics (AUCROC) is 0.5 and the Goodness of Hit (GH) value is 0.752. Screening in the ZINC database generated 1,500 hit compounds, were subjected to molecular docking to  determine  their  binding  energy  and  interactions  with HSP-90. The range of binding energy (E) of all hit compounds is  -5.68 to - 12.24 kcal/mol  and  there  are  four  best  hit  compounds  namely  lig_543, lig_527, lig_1337 and lig_337, when compared to native ligands (PU2, E=- 8.25 kkal/mol) based on the binding energy and orientation, which indicate their potential as new HSP-90 inhibitors.
Keywords : Pharmacophore
Heat Shock Protein -90 Molecular Docking Virtual Screening

## Corresponding Author:
Muhammad Arba Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo Kendari
93232 Indonesia email: muh.arba@uho.ac.id
Copyright © 2019 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.
How to cite (APA 6 th Style):
Arba,  M.,  Arfan,  Trisnawati,  A.,  Kurniawati,  D.  (2020).  Pemodelan  Farmakofor  untuk  Identifikasi  Inhibitor Heat  Shock Proteins -90  (HSP-90). Jurnal  Farmasi  Galenika:(Galenika  Journal  of  Pharmacy  (e-Journal), 6 (2),  229-236. doi:10.22487/j24428744.2020.v6.i2.15036
Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy) (e-Journal) 2020; 6(2): 229 – 236 ISSN : 2442-8744 (electronic); 2442-7284 (printed) Journal Homepage: https://bestjournal.untad.ac.id/index.php/Galenika DOI: 10.22487/j24428744.2020.v6.i2.15036

## ABSTRAK
Heat shock proteins-90 (HSP-90) merupakan protein yang berperan penting dalam siklus kehidupan sel normal dan  sel  kanker  yang  berfungsi  sebagai  pelindung  diri  dari  stres  termal,  kerusakan  oksidatif,  dan  hipoksia  sel. Penghambatan  HSP-90  menjadi  salah  satu  cara  untuk  menghambat  perkembangan  sel  kanker.  Pada  penelitian ini, pemodelan farmakofor dan penambatan molekuler telah dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa hit yang berpotensi  menghambat  HSP-90.  Fitur  farmakofor  terdiri  dari  tiga  akseptor  ikatan  hidrogen  dan  satu  donor ikatan  hidrogen  dan  satu  fitur  hidrofobik  dengan Area  Under  Curve dari Receiver  Operating  Characteristic (AUC-ROC)  sebesar  0,5  dan  nilai Goodness  of  Hit ( GH)  sebesar  0,752.  Skrining  terhadap database ZINC menghasilkan sebanyak 1.500 senyawa hit yang kemudian dilakukan penambatan molekuler untuk  mengetahui energi ikatan dan interaksi mereka terhadap HSP-90. Energi ikatan (E) dari semua senyawa hit  berkisar  antara - 5,68  sampai  -12,24  kkal/mol  dan  terdapat  empat  senyawa  hit  terbaik  yaitu    lig_543,  lig_527,  lig_1337  dan lig_337,  bila  dibandingkan  dengan  ligan  alami  (PU2,  E=-8,25  kkal/mol)  berdasarkan  energi  ikatan  dan orientasinya yang mengindikasikan potensi senyawa hit tersebut sebagai penghambat HSP-90 yang baru.
Kata kunci: Farmakofor, Heat Shock Protein-90, Penambatan Molekuler, Skrining Virtual.

## PENDAHULUAN
HSP merupakan sekelompok protein yang terdapat dalam semua bagian perkembangan makhluk hidup serta memainkan peranan penting dalam etiologi dari banyak penyakit. Pada kanker, HSP juga terlibat dalam diferensiasi dan proliferasi, invasi serta metastasis sel kanker. Adanya rangsangan seperti stress oksidatif  dan  termal,  perubahan  kadar  glukosa  dan  pH,  adanya  inflamasi  serta  hambatan  oksigenasi dalam sel menyebabkan HSP menjadi aktif (Juliati et al., 2015).
HSP-90 adalah salah satu tipe HSP yang bertindak untuk melindungi sel ketika mengalami stres akibat adanya kenaikan suhu yang jumlahnya akan meningkat hingga 6% dari total protein seluler. Selain itu, HSP-90  juga  melindungi  protein  yang  kurang  stabil  yang  dihasilkan  oleh  mutasi  DNA  (Chen et  al., 2005).  Penghambatan  HSP-90  dapat  menginduksi  terjadinya  apoptosis  sel-sel  yang  abnormal  dan dapat menghambat metastasis sel kanker.
Penghambat  HSP-90  yang  terkenal  dan  ampuh  adalah  deldanamisin  (GA),  namun  perkembangan evaluasi klinis GA belum dilanjutkan karena sifat hepaktoksisitas dan kelarutan dalam air yang buruk (Kim et  al., 2011).  Turunan  GA  yang  telah  dilaporkan  yang  memiliki  kemampuan  yang  baik  dalam menghambat  HSP-90  sebagai  faktor  antiangiogenik  dalam  sel  tumor  yakni  17-allylamino  17- demethoxygeldanamycin (17-DMAG) (Kaur et al., 2004). 17-DMAG merupakan senyawa stabil yang larut  dalam  air,  namun  efek  terapeutiknya  telah  dihentikan  karena  masih  memiliki  efek  samping terhadap organ lain (Egorin et al., 2002). Oleh karena itu, dengan penggunaan metode skrining virtual untuk mengidentifikasi senyawa yang dapat menghambat HSP-90 dapat menjadi salah satu solusinya.
Skrining virtual merupakan salah satu metode yang terdapat dalam desain obat berbantukan komputer yang  berperan  dalam  penemuan  senyawa  hit  baru  (Kumalo  &  Soliman,  2015;  Arba et  al., 2018). Desain obat berbantukan komputer terdiri atas desain obat berbasis struktur dan berbasis ligan (Arba, 2019).  Pada  penelitian  ini,  dilakukan  pemodelan  farmakofor  yang  merupakan  desain  obat  berbasis ligan untuk mengembangkan model farmakofor yang dapat digunakaan untuk menyeleksi senyawa hit baru terhadap basis data yang mengandung sejumlah besar senyawa serta dilakukan studi penambatan molekuler untuk mengetahui orientasi pengikatan senyawa hit tersebut terhadap protein HSP-90.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian yaitu perangkat keras ( hardware ) berupa Note book Acer Aspire ES 11 dengan spesifikasi Intel ® Celeron ® Processor N3350, intel ® HD Graphics , 2 gigabyte DDR3 L memory ,  500 gigabyte .  Perangkat  lunak  ( software )  berupa  AutoDockTools  1.5.6 , LigandScout Advance  4.3,  iDock,  Discovery  Studio  Visualizer  dan website Pharmit  ( http://pharmit.csb.pitt.edu ). Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  yaitu  struktur  3D  HSP-90  diunduh  dari Protein  Data  Bank ( http://www.rcsb.org/pdb/ )  dengan  PDB  ID  1UYG  serta  125  senyawa  aktif  dan  4940 decoy yang diperoleh  dari Directory  of  Useful  Decoys:  Enhanched (DUD-E)  ( http://www.dude.docking.org/ ) (Mysinger et al., 2012).

## Metode
Farmakofor  dibangun  dari  struktur  PU2  yang  merupakan  ligan  alami  dari  HSP-90  menggunakan LigandScout Advanced 4.3 (Wolber & Langer, 2005). Farmakofor merupakan fitur struktur dari suatu senyawa  dan  posisinya  dalam  ruang  tiga  dimensi  yang  berperan  dalam  pengiktan  senyawa  yang optimal secara spesifik pada target protein (Dror et al., 2009). Model farmakofor kemudian divalidasi terhadap 125 senyawa aktif dan 4940 decoy yang diperoleh dari DUD-E, kemudian dilakukan skrining virtual terhadap database ZINC pada website Pharmit ( http://pharmit.csb.pitt.edu ) (Irwin et al., 2012).
Penambatan molekuler dilakukan menggunakan iDock software (Li et al., 2012) . Protein dipreparasi dengan  menghilangkan molekul air  dan  dilakukan  penambahan  muatan  Kollman  menggunakan AutoDockTools 1.5.6 software (Morris et al. , 2009; Arba et al. , 2019).
Sisi aktif dari protein diatur dengan mencontoh posisi ligan alami dengan koordinat center x = 3,65, center y  =  13,51  dan center z  =  24,274.  Ukuran grid  box yang  digunakan  sebesar  40  x  40  x  40  Å dengan point  spacing 0,375  Å. Grid  box merupakan  ukuran  ruang  tiga  dimensi  dari  suatu  target protein  yang  menjadi  tempat  dilakukannya  penambatan  molekul.  Hasil  dari  penambatan  molekul kemudian divisualisasi menggunakan Discovery Studio Visualizer.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Fitur farmakofor dari PU2 terdiri dari 11 fitur yaitu 1 cincin aromatik, 5 akseptor ikatan hidrogen, 3 donor ikatan hidrogen, dan 1 fitur hidrofobik. Lebih lanjut, model farmakofor dikembangkan dengan menggunakan  kombi  nasi  fitur-fitur  tersebut  dan  Tabel  1  menampilkan  model  farmakofor  yang dihasilkan beserta nilai Area Under Curve dari Receiver Operating Characteristic (AUC-ROC).
Model farmakofor yang baik harus memiliki nilai AUC-ROC yang lebih besar dari 0,5 serta nilai GH yang  lebih  dari  0,7  (Arba,  2019).  Model  farmakofor  PU2-3  memiliki  nilai  AUC100%  sebesar  0,9, namun  nilai  GH  0,21  tidak  memunhi  syarat  validasi. Dengan  demikian  dipilih model  PU2-1  dengan AUC100% sebesar 0,5 dan nilai GH sebesar 0,752. Nilai AUC-ROC yang mendekati 1 menunjukkan bahwa model farmakofor semakin baik dan mampu membedakan antara senyawa aktif dengan decoy (senyawa  yang  tidak  aktif/pengecoh).  Nilai  GH  diperoleh  dari  penggabungan  sensitivitas  (Se), spesifitas  (Sp)  dan yield  of  actives (YA) . Sensitivitas  menggambarkan  kemampuan  suatu  model farmakofor  untuk  mengenali  senyawa  aktif.  Spesifitas  menggambarkan  kemampuan  dari  model farmakofor  untuk  mengenali  senyawa  tidak  aktif  sebagai  senyawa  tidak  aktif. Yield  of  actives menunjukkan  kemampuan  model  farmakofor  untuk mengenali senyawa  aktif  dalam  jumlah  senyawa hit yang diperoleh dari database . Berikut rumus penentuan nilai GH (Arba, 2019):
GH = ……………………………………………... (1)
Tabel 1. Model Farmakofor ligan alami (PU2) dari protein HSP-90
Selanjutnya, skrining virtual dilakukan dengan menggunakan model farmakofor yang telah divalidasi menggunakan website Pharmit  menghasilkan  sebanyak  1500  senyawa  hit.  Penambatan  molekuler bertujuan  untuk  memprediksikan  modus  pengikatan  atau  interaksi  antara  ligan  dan  protein  beserta energi  ikatan  mereka  (Zhao et  al., 2020).  Validasi  proses  penambatan  molekuler  dilakukan  dengan penambatan  ulang  ligan  alami  PU2  dan  protein  yang  diperoleh  dari  protein  data  bank.  Validasi  ini bertujuan  untuk  menilai  kemampuan  proses  penambatan  molekul  dalam  menghasilkan  konformasi ligan  yang  mirip  dengan  hasil  eksperimen.  Proses  penambatan  molekul  yang  valid  dapat  dinilai parameter Root  Mean  Square  Deviation (RMSD)  atom-atom  berat  antara  konformasi  penambatan molekul dengan hasil eksperimen (kristalografi) maksimal 2 Å (Ravindranath et al. , 2015; Musoev et al. ,  2019).  Penambatan  molekuler  dilakukan  untuk  semua  ligan  termasuk  ligan  alami  (PU2). Penambatan  ulang  PU2  menghasilkan  energi  pengikatan  sebesar  -8,25  kkal/mol dengan nilai  RMSD sebesar 0,6316 Å (Gambar 1). Pose /konformasi hasil penambatan dari PU2 menunjukkan tiga ikatan hidrogen  dengan  Asp93,  Gly97  dan  Thr184  serta  memiliki  enam  interaksi  hidrofobik  dengan  Ser52, Ile96, Leu103, Ala111, Val136 dan Val150.
Gambar 1. Superposisi antara konformasi x-ray (merah) dengan hasil docking (biru) dengan garis putus-putus berwarna hijau menunjukkan ikatan hidrogen.
Penambatan molekuler 1500 senyawa hit menghasilkan konformasi dengan energi ikatan antara -5,68 sampai  -12,24  kkal/mol.  Empat  senyawa  hit  terbaik  dalam  hal  konformasi  dan  energi  ikatan  adalah lig_543  (E  =  -12,24  kkal/mol),  lig_527  (E  =  −11,31  kcal/mol),  lig_1337  (E  =  -11,31  kcal/mol),  dan lig_337  (E  =  -11,26  kkal/mol).  Keempat  senyawa  hit  tersebut  memiliki  energi  ikatan  yang  lebih rendah bila dibandingkan dengan PU2. Energi ikatan menggambarkan afinitas atau kemampuan suatu senyawa untuk berikatan/berinteraksi dengan target protein. Nilai energi ikatan yang semakin rendah menunjukkan afinitas  yang  semakin  kuat.  Gambar  2 menampilkan struktur senyawa  hit terbaik  hasil skrining :

## Gambar 2. Struktur senyawa hit terbaik
Interaksi  molekul-molekul  hit  terjadi  di  sisi  aktif  dari  HSP-90  melalui  ikatan  hidrogen  dan  interaksi hidrofobik  (Gambar  3).  Ikatan  hidrogen  dengan  Gly97  dan  Thr184  yang  diamati  pada  struktur kristalografi PU2, juga terdapat pada pengikatan Lig_1337. Selain itu, ikatan hidrogen dengan Asn51 juga diamati dalam pengikatan Lig_527. Lig_1337 dan Lig_337 berinteraksi melalui ikatan hidrogen dengan  Tyr139.  Interaksi  hidrofobik  dengan  residu  Leu103  pada  struktur  kristalografi  ligan  alami (PU2),  teramati  pula  pada lig_543  dan  lig_337.  Selain  itu,  residu  Val130  dan  Val150 juga memiliki interaksi  dengan lig_1337 dan  lig_337.  Gambar  4 menunjukkan interaksi  lig_543,  lig_527,  lig_1337 dan Lig_337 terhadap HSP-90.
Gambar 3. Interaksi dari Lig_543, Lig_527, Lig_1337 dan Lig_337 terhadap HSP-90 dengan garis putus-putus berwarna hijau menunjukkan ikatan hidrogen.
Berdasarkan konformasi dan nilai energi ikatan dari 4 senyawa hitu tersebut mengindikasikan bahawa keempat senyawa tersebut berpotensi sebagai inhibitor HSP90 deengan modus pengikatan yang serupa dengan ligan alami PU2.

## KESIMPULAN
Dalam  penelitian  ini,  pemodelan  farmakofor  dilakukan  untuk  mengidentifikasi  senyawa  hit  yang berpotensi  menghambat  HSP-90.  Model  farmakofor  yang  dibangun  kemudian  digunakan  untuk menskrining senyawa hit baru pada database ZINC yang berisi lebih dari 13 juta senyawa. Ditemukan empat senyawa hit (Lig_543, Lig_527, Lig_1337 dan Lig_337) yang memiliki afinitas lebih kuat bila dibandingkan  dengan  ligan  alami  (PU2).  Dengan  demikian  keempat  senyawa  tersebut  diusulkan diverifikasi sebagai inhibitor HSP90 yang potensial melalui studi eksperimen in vitro dan in vivo .

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terima  kasih  kepada  Universitas  Halu  Oleo  atas  dukungan  dalam  penelitian  ini  melalui Penelitian Dasar Unggulan Perguruan Tinggi.

## DAFTAR PUSTAKA
Arba, M. (2019). Buku Ajar Farmasi Komputasi. Yogyakarta: Deepublish.
Arba,  M.,  Azali,  H.,  Ombe,  S.,  Armid,  A.,  &  Usman,  I.  (2019).  3D-QSAR,  Molecular  Docking  and Dynamics  Simulation  of  Difluorophenol  Pyridine  Derivatives  as  RSK2  Inhibitor. J.  Appl. Pharm. Sci., 9 (6), 001-009.
Arba,  M.,  Nur-Hidayat,  A.,  Surantaadmaja,  S.  I.,  &  Tjahjono,  D.  H.  (2018).  Pharmacophore-based Virtual  Screening  for  Identifying  β5  Subunit  Inhibitor  of  20S  Proteasome. Computational Biology and Chemistry, 77 , 64-71.
Chen, B., Piel, W. H., Gui, L., Bruford, E., & Monteiro, A. (2005). The HSP90 Gen Family in Human Genom: Their Different Wawasan and Evolution. Genomics, 86 (6).
Dror,  O.,  Schneudman-Duhovny,  D.,  Inbar,  Y.,  Nussinov,  R.,  &  Wolfson,  H.  J.  (2009).  Novel Approach for Efficient Pharmacophore-Based Virtual Screening: Method and Applications. J.
Chem. Inf. Model, 49 , 2333-2343.
Egorin, M. J., Lagattuta, T. F., & Hamburger, D. R. (2002). Pharmacokinetics, Tissue Distribution and Metabolism  of  17-(Dimethylaminoethylamino)-17-Demethoxygeldanamycin  (NSC  707545) in CD2F1 Mice and Fischer 344 Rats. Cancer Chemother Pharmacol, 49 , 7-19.
Irwin, J. J., Sterling, T., Mysinger, M. M., Bolstad , E. S., & Coleman, R. G. (2012). ZINC: A Free Tool to Discovery Chemistry for Biology. J. Chem. Inf. Model, 52 (7), 1757-1768.
Juliati,  F.,  Brahmana,  A.,  &  Dyah,  F.  (2015).  Hubungan  antara  Ekspresi  Hsp27  dan  Hsp70  dengan Derajat  Diferensiasi  dan  Angka  Ketahanan  Hidup  Dua  Tahun  pada  Penderita  Kanker Endometrium  Tipe  I  Pasca-Pembedahan  di  RSUD  Dr.  Soetomo. Indonesian  Journal  of Cancer, 9 (2).
Kaur,  G.,  Belotti,  D.,  Burger,  A.  M.,  Fisher-Nielson,  K.,  Borsotti,  P.,  Riccardi,  F.,  .  .  .  Giayazzi,  R.
(2004).
Antiangiogenic
Properties of 17-(Dimethylaminoethylamino)-17-
Demethoxygeldanamycin:  An  Orally  Bioavailable  Heat  Shock  Protein  90  Modulator. Clin Cancer Res, 10 , 4813-4821.
Kim,  H.  Y.,  J.Park,  K.  H.,  Lee,  D.  U.,  Kwak,  Y.  S.,  &  Kim,  S.  M.  (2011).  The  Future  of Thoracoscopic Lobectomy in Lung Cancer. Asian Cardiovasc Thorac Ann, 28 (2).
Kumalo,  H.  M.,  &  Soliman,  M.  E.  (2015).  Per-Residue  Energy  Footprints-Based  Pharmacophore Modeling  as  an  Enhanced  in  Silico  Approach  in  Drug  Discovery:  A  Case  Study  on  the Identification of Novel b-Secretase 1 (BACE1) Inhibitors as AntiAlzheimer Agents. Cell. Mol. Bioeng., 9 (1), 175-189.
Li,  H.,  Leung,  K., &  Wong,  M.  (2012).  Idock:  A  Multithreaded  Virtual  Screening  Tool for  Flexible Ligand Docking. 2012 IEEE Symposium on Computational Intelligence in Bioinformatics and Computational Biology (CIBCB).
Morris , G. M., Huey, R., Lindstorm, W., Sanner , M. F., Belew, R. K., Goodsell, D. S., & Olson, A. J. (2009).  AutoDock4  and  AutoDock  Tools4:  Automated  Docking  with  Selective  Receptor Flexibility. J. Comput. Chem., 30 (16), 2785-2791.
Mussev, A., Sodik, N., Zhuhong Y., & Hongwei G. (2019).  Discovery of Novel DPP-IV Inhibitors as Potential  Candidates for the  Treatment  of  Type  2  Diabetes  Mellitus  Predicted  by  3D  QSAR Pharmacophore  Models,  Molecular  Docking  and  De  Novo  Evolution. Molecules , 24 (16), 2870.
Mysinger,  M.  M.,  Charcia,  M.,  Irwin,  J.  J.,  &  Shoichet  ,  B.  K.  (2012).  Directory  of  Useful  Decoys, Enhanced  (DUD-E):  Better  Ligands  and  Decoys  for  Better  Benchmarking. J.  Med.  Chem, 55 (14), 6582-6594.
Ravindranath,  P.  A.,  Forli,  S.,  Goodsell,  D.  S.,  Olson,  A.  J.,  &  Sanner,  M.  F. (2015).  AutoDockFR:
Advances in Protein-Ligand Docking with Explicitly Specified Binding Site Flexibility. PLOS Computational Biology , 11 (12), e1004586.
Wolber,  G.,  &  Langer,  T.  (2005).  LigandScout:  3-D  Pharmacophores  Derived  from  Protein-Bound Ligands and Their Use as Virtual Screening Filters. J. Chem. Inf. Model, 45 (1), 160-169.
Zhao,  J.,  Cao,  Y.,  &  Zhang,  L.  (2020).  Exploring  the  Computational  Methods  for  Protein-  Ligand Binding Site Prediction. Computational and Structural Biotechnology Journal. 8, 417-426.