Reaksi Silang Antara Antibodi Adho36 Salmonella typhi dengan Outer Membrane Protein Vibrio cholerae Menggunakan Metode Western Blotting
Nyoman Artha Megayasa*, Sri Winarsih**, Sanarto Santoso**

## ABSTRAK
Pada penelitian terdahulu dilaporkan bahwa Salmonella typhi memiliki antibodi AdhO36 yang memberikan protektivitas yang bermakna dalam menghambat perlekatan Salmonella typhi pada usus mencit. Vibrio cholerae adalah agen penyebab infeksi usus akut yang dikenal sebagai kolera. Vibrio cholerae dilaporkan memiliki outer membrane  protein (OMP)  dengan  berat  molekul  yang  mirip  dengan  protein  AdhO36.  Penelitian  ini  bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya reaksi silang antara antibodi AdhO36 Salmonella typhi dengan OMP Vibrio cholerae .  Penelitian  ini  menggunakan  studi  eksploratif  laboratorium  dengan  cara western  blotting .  Hasil  yang diperoleh menunjukkan terdapat 3 pita protein dengan berat molekul sekitar 107 kDa, 74 kDa dan 38 kDa dari OMP Vibrio cholerae yang bereaksi dengan antibodi AdhO36.  Penelitian inimenyimpulkan bahwa  OMP Vibrio cholerae telah terbukti  merespon antibodi AdhO36 Salmonella typhi . Berdasarkan hasil penelitian ini, disarankan agar dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek imunisasi protein Adho36 Salmonella typhi terhadap perlekatan bakteri Vibrio cholerae di organ intestinal mencit.
Kata kunci: AdhO36, O uter membrane protein (OMP), Salmonella typhi , Vibrio cholerae , Western blotting.
Cross Reaction between AdhO36 Antibody of Salmonella typhi with Outer Membrane Protein of Vibrio cholerae Using Western Blotting Method

## ABSTRACT
In  previous  studies,  it  is  reported  that Salmonella typhi has  AdhO36  antibody  that  provide  significant protectivity  in  preventing  the  adherence  of Salmonella typhi in  mice  intestine. Vibrio  cholerae is  the  causative agent of acute intestinal infection known as cholera. Vibrio cholerae is reported to have outer membrane protein (OMP)  with  a  molecular  weight  similar  to  AdhO36  protein.  This  study  aimed  to  determine  the  presence  or absence of cross reaction between AdhO36 antibody Salmonella typhi with Vibrio cholerae’s OMP. Explorative laboratory study is used  with western blotting method. The results showed that there are three bands of protein with a molecular weight around 107 kDa, 74 kDa and 38 kDa of Vibrio cholerae ’s OMP that reacts with AdhO36 antibody.  The  conclusion  of  this  study  is  that Vibrio  cholerae ’s  OMP  has  shown  to  respond  towards  AdhO36 antibody  of Salmonella typhi. Based  on  these  results,  it  is  suggested  that  further  research  should  be  done  to determine  the  immunization  effects  of  AdhO36  protein  against  the  adherence  of  bacterium Vibrio  cholerae in mice intestine.
Keywords: AdhO36, Outer membrane protein (OMP), Salmonella typhi, Vibrio cholerae , Western-blotting.
*  Program Studi Pendidikan Dokter, FKUB
** Lab Mikrobiologi, FKUB

## PENDAHULUAN
Salmonella typhi merupakan  bakteri Gram-negatif yang terdapat di dalam saluran pencernaan  manusia  dan  termasuk  dalam keluarga  Enterobacteriaceae.  Bakteri  ini bersifat motil dan juga anaerob fakultatif, hal ini  menyebabkan  bakteri  tersebut  mudah terpengaruhi oleh antibiotik. Sampai saat ini, 107 strain bakteri ini telah di isolasi, banyak diantaranya yang memiliki karakter metabolis yang berbeda-beda, tingkat virulensinya, dan juga  resistensi  terhadap  banyak  obat  yang menyebabkan  penelitian  terus  berkembang. Cara  identifikasi  bakteri  dapat  dilakukan dengan  menumbuhkan  bakteri  pada  media bismuth sulfite agar (BSA). 1 Selain  itu, Salmonella typhi merupakan patogen  yang  memiliki  sifat  fakultatif intraseluler serta memiliki mekanisme adaptif sehingga dapat hidup di dalam makrofag. Hal ini  dapat  menyebabkan  bakteri  menyebar dan kemudian menyebabkan infeksi sistemik yang dikenal dengan nama demam tifoid. 2 Demam  tifoid  merupakan  salah  satu penyakit  infeksi  endemik  di  Asia,  Afrika, Amerika  Latin,  Karibia,  dan  Oceania, termasuk  negara-negara  yang  sedang berkembang  seperti  Indonesia.  Penyakit infeksi yang ditularkan melalui makanan dan minuman  ini,  disebabkan  oleh  kuman S. typhi .  Insiden  demam  tifoid  di  seluruh  dunia menurut  data World  Health  Organization (WHO)  pada  tahun  2003  sekitar  17  juta  per tahun,  dengan  insidensi  600.000  kasus kematian  tiap  tahun. 1 Pada  tahun  2000, diperkirakan  terdapat  lebih  dari  2,16  juta kasus  demam  tifoid  terjadi  di  seluruh  dunia, yang  mengakibatkan  216.000  kematian, dimana  lebih  dari  90  %  dari  morbiditas  dan kematian  terjadi  di  Asia. 2 Profil  kesehatan Indonesia  tahun  2008  menunjukkan  angka 600 ribu sampai 1,5 juta kasus demam tifoid setiap  tahun.  Penyakit  ini  menempati  urutan ke-15 dari penyakit mematikan di Indonesia. Dalam  usaha  melakukan  pencegahan terhadap  demam  tifoid,  maka  dibuatlah vaksin  untuk  pencegahan  penyakit  ini.  Saat ini  terdapat  3  jenis  vaksin  yang  telah disediakan  yaitu  Ty21a,  ViCPS  ( Vi  capsular pollyssacharide )  dan inactivated  typhoid vaccine ,  yang  telah  diuji  secara  luas  dan masing-masing  menunjukkan  keuntungan
dan  kerugian. 3 Pengembangan  vaksin  saat ini  telah  maju  dengan  pesat,  kemungkinan permukaan  bakteri  yang  disebut  dengan adhesin sebagai target dalam
pengembangan  vaksin  tengah  diteliti. Sebagai  contoh  vaksin  adhesin  yang  sudah digunakan  di  klinik  adalah  vaksin  terhadap penyakit pertusis. 4 Keuntungan yang didapat dari  vaksin  mukosal  berbasis  protein adhesin,  yaitu  pemberiannya  mudah  (oral), dan  imunogenik  tetapi  tidak  toksik  karena imunogennya bukan toksin atau materi toksik dari bakteri. 5
Pada  penelitian  sebelumnya  telah dilaporkan  bahwa Salmonella  typhi memiliki protein  adhesin  yang  berasal  dari  OMP dengan  berat  molekul  sekitar  36  kDa  dan diberi  nama  AdhO36.  Pada  penelitian tersebut  dilaporkan  juga  bahwa  imunisasi protein  AdhO36  melalui  oral  memberikan protektivitas yang bermakna dalam menghambat  perlekatan Salmonella  typhi pada  usus  mencit. 6 Dari  hasil  penelitian tersebut, protein AdhO36 dikatakan potensial untuk diteliti lebih lanjut untuk pengembangan vaksin demam tifoid.
Mekanisme vaksin oral berbasis adhesin ini  adalah  ketika  antigen  masuk  ke  dalam tubuh maka tubuh akan membentuk mucosal immunity . Mucosal  immunity yaitu  suatu bentuk  imunitas  yang  bekerja  di  permukaan mukosa untuk mencegah terbentuknya koloni bakteri  dengan  melibatkan  antibody  IgA sebagai  komponen  utama.  IgA  akan mengikat  patogen  sehingga  patogen  tidak bisa  menempel  pada  reseptor  yang  ada  di permukaan sel epitel pada mukosa usus. 7 Vibrio  cholerae adalah  bakteri  Gram- negatif  yang  berbentuk  batang,  berasal  dari keluarga  gammaproteobacteria  dan  agen penyebab  infeksi  usus  akut  yang  dikenal sebagai kolera. 8 Vibrio cholerae menyebabkan  kolera  pada  manusia  melalui kolonisasi  usus  dan  elaborasi  dari enterotoksin yang kuat dikenal sebagai toksin kolera.  Meskipun  imunitas  antitoksin memainkan peranan penting dalam perlindungan  terhadap  kolera,  imunitas antibakteri  tampaknya  lebih  penting.  Kelas IgA  sekretori  antibodi  dipercaya  untuk bertindak  melalui  penghambatan  lampiran usus dan kolonisasi Vibrio cholerae . Namun,
identifikasi  gugus  permukaan  sel  dari Vibrio cholerae yang  bertanggung  jawab  atas perlekatan  organisme  terhadap  epitel  usus tetap sukar dipahami sejauh ini. 9
Metode western  blotting adalah  metode yang  mereaksikan  antibodi  spesifik  dengan antigen, dan metode ini telah rutin digunakan untuk  analisis  protein. Blotting berarti memindahkan  sampel  dari  gel  elektroforesis ke  membran  nitroselulosa  dan  dilakukan dengan antibodi pada permukaan membran. Pada  penelitian  ini  juga  ingin  diketahui apakah ada reaksi silang antara OMP Vibrio cholerae dengan protein AdhO36 Salmonella typhi ,  yang  berarti  ingin  mendeteksi  reaksi antigen antibodi.
Pada  bakteri  patogen  Gram-negatif, lapisan  luar  membran  memainkan  sebuah peran  penting  pada  infeksi  dan  tingkat patogenisitasnya  kepada  inang.  Lapisan membran  luar  bakteri  pada  dasarnya tersusun atas protein, lemak, dan gula  yang dapat dengan mudah dikenali sebagai unsur zat  asing  pada  sistem  pertahanan  tubuh inang.  Diantara  komponen  ini,  protein membran  memiliki  peranan  rumit  pada banyak  proses  sel  dan  fisiologi,  dimana sangat menarik digunakan untuk dikembangkan sebagai kandidat vaksin. 10
Berdasarkan laporan sebelumnya, Vibrio cholerae memiliki outer  membrane  protein (OMP)  dengan  massa  molekul  subunit  dari 48 ke 50, 40-43, 35-36, 27 hingga 28, dan 20 kDa. 9 Hal  ini  menyimpulkan  bahwa  terdapat sedikitnya  3  persamaan  antara  bakteri Salmonella typhi dengan Vibrio  cholerae yaitu  merupakan  bakteri  Gram-negatif, berbentuk  batang  dan  juga  memiliki  protein adhesin yang berasal dari OMP dengan berat molekul sekitar 36 kDa. Oleh karena itu ingin diteliti  apakah  ada  reaksi  silang  antara antibodi  AdhO36 Salmonella  typhi dengan
OMP Vibrio cholerae . Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  ada  atau  tidaknya  reaksi  silang antara  antibodi  AdhO36 Salmonella  typhi
dengan OMP Vibrio cholerae .

## BAHAN DAN METODE
Desain  penelitian  yang  digunakan adalah    eksploratif  laboratorium.  Reaksi silang  dilakukan  secara in  vitro dengan
menggunakan  metode western  blotting . Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium Mikrobiologi dan Biomedik Fakultas Kedokteran  Universitas  Brawijaya  Malang pada  bulan  Desember  2010  hingga September 2011.
Antibodi  AdhO36 Salmonella  typhi diperoleh dari penelitian terdahulu yang telah dilakukan  oleh  Winarsih  (2010). 6 Bakteri Vibrio  cholerae diperoleh  dari  Laboratorium Mikrobiologi  Fakultas  Kedokteran  Brawijaya, Malang.
Prosedur  penelitian  yang  pertama  kali dilakukan adalah isolasi Vibrio cholerae, yaitu dengan menambahkan bahan ke air dengan pH  8,5  dalam  larutan  NaOH  3N,  kemudian didistribusikan  dan  di autoclave pada  suhu 121  °C  selama  15  menit.  Media  disimpan pada  suhu  4  °C  selama  6  jam  dalam keadaan  tertutup  rapat  untuk  mencegah terjadinya  penguapan  atau  penurunan  pH. Ketika  diinokulasikan  ke  dalam  APW, Vibrio cholerae akan  menunjukkan  pertumbuhan yang baik pada 6 sampai 8 jam.
Kultur  V ibrio  cholerae dibuat  dengan cara  media  harus  dihangatkan  sampai  suhu kamar  sebelum  diinokulasi,  lalu  spesimen diinokulasi langsung ke agar TCBS sehingga dapat diperoleh koloni yang terisolasi. Bakteri diinkubasi  aerobik  pada  suhu  35  °C  selama 18-24 jam. Vibrio cholerae akan menunjukkan  pertumbuhan  yang  baik dengan koloni berwarna kekuningan. Setelah itu  dilakukan  pengecatan  Gram  untuk identifikasi ulang bakteri Gram negatif.
Tahap  selanjutnya  adalah  isolasi  Omp Vibrio cholerae, dengan cara biakan cair dari tempat  perkembangbiakan Vibrio  cholerae , ditambahkan  TCA  dengan  konsentrasi  3  % untuk  mengendapkan  suspensi  bakteri.  Lalu dirotator  selama  1  jam,  dengan  diberi kocokan setiap 10 menit. Media cair tersebut lalu  dituang  pada  tabung mini  mixer lalu disentrifugasi  pada  4  °C  6.000  rpm  selama 15 menit. Supernatan dibuang, diambil pelet saja  lalu  cuci  dengan  larutan  PBS  dan dihomogenkan  dengan  cara  diaduk  dan dipipet. Kemudian disentrifugasi dan diulangi hingga  supernatan  menjadi  bening.  Cairan supernatan  kemudian  ditambahkan  deterjen CHAPS  dengan  konsentrasi    5  % perbandingan  1:1.  Campuran  divorteks
selama  5  menit  untuk  mereaksikan  CHAPS dengan pelet. Kemudian dilakukan sentrifugasi  pada  suhu  4  °C  12.000  rpm selama  15  menit.  Supernatan  yang merupakan  OMP  dipindahkan  ke  dalam tabung  sentrifus,  lalu  disimpan  di  -20 o C. Berikutnya  adalah  tahap  SDS-PAGE  yang diawali  dengan  pembuatan    gel. Separating gel 12,5  %.  dibuat  dengan  cara mencampurkan:
Acrylamida 30% 2063 µL Tris-CL 1,5M pH 8,8 1250 µL dd H2O 1635 µL SDS 10% 50 µL APS 10% 50 µL TEMED 10 µL Campuran segera dituang kedalam plate
pembentuk  gel  menggunakan  mikro  pipet  1 ml  (dijaga  jangan  sampai  terbentuk gelembung  udara)  sampai  batas  yang terdapat  pada plate .  Perlahan  tambahkan aquades diatas larutan gel dalam plate agar permukaan  gel  tidak  bergelombang.  Biarkan gel  memadat  selama  kurang  lebih  30  menit (ditandai dengan terbentuknya garis
transparan  diantara  batas  air  dan  gel  yang terbentuk)  setelah  itu,  air  yang  menutup separating  gel dibuang.  Setelah separating gel memadat, stacking  gel 3  %  disiapkan dengan  cara  yang  sama  pada  prosedur diatas dengan volume larutan:
Acrylamida 30% 257,5 µL Tris-CL 1,5M pH 6,8 312,5 µL dd H2O 662,5 µL SDS 10% 12,5 µL APS 10% 3,75 µL TEMED 2,5  µL Kemudian  tuang stacking  gel. Pasang  sisir tempat  penyuntikan  sampel,  kemudian biarkan beberapa lama hingga gel memadat, setelah  itu  lepas  sisir.  Gel  dalam plate dipasang  pada  alat  elektroporesis.  Tuang running buffer.
Tahap kedua adalah injeksi sampel dan r unning, yaitu s ampel  diambil  dengan  pipet sebanyak  15  µl  kemudian  dimasukan kedalam  eppendorf,  kemudian  ditambahkan dengan  15  µl  RSB  dan  dipanaskan  pada suhu  100  ºC  selama  5  menit.  Lalu
didinginkan  pada  suhu  kamar. Sampel disuntikan  sebanyak  10-20  µl  kedalam sumuran secara hati-hati dengan menggunakan pipet. Untuk memulai running , hubungkan perangkat elektroforesis dengan power  supply  dengan  arus  pada  20  mA tegangan 120 V selama 90 menit.
Tahap ketiga yaitu pewarnaan gel. Untuk tahap  ini  diperlukan  larutan  pewarna  untuk mewarnai  protein  pada  gel  dan  larutan destaining untuk pencucian atau menghilangkan  warna  pada  gel  dan memperjelas  pita  protein.  Gel  direndam  di dalam  20  ml  larutan comassie  blue sambil digoyang  selama  20  menit.  Kemudian  gel direndam  dalam  larutan destaining sambil digoyang selama 20 menit.
Tahap  terakhir  adalah western  blotting ,
dengan cara merendam membran nitrocellulose  dan  gel  elektroforesis  SDS- PAGE  masing-masing  dalam  transfer  buffer selama 30 menit dengan digojog pelan. Alat Trans  –  Blot  Semi  Dry  “Bio  Rad”  diset,  lalu kertas  saring,  membran  nitrocellulose,  Gel SDS-PAGE,  kertas  saring  disusun  sandwich (urutan dari bawah ke atas). Proses transfer dilakukan pada 300 mA, 20 Volt selama 120 menit.  Setelah  itu  NC  dicuci  dengan aquades,  direndam  dalam  ponceau  kurang lebih  1  menit  dan  dibilas  aquades  untuk konfirmasi  keberhasilan  transfer.  Lalu membran di blocking dengan TBS – skim milk 5  %,  diinkubasi  semalam  pada  suhu  4  °C. Keesokan  harinya, membran dibiarkan  pada suhu ruang dengan digojog. Membran dicuci dengan  TBS  -  Tween  0,05  %,  3X5  menit, digojog  pelan.  Inkubasi  dengan  Ab  primer (AdhO36) yang dilarutkan dalam TBS – skim milk  0,5  %  selama  120  menit  pada  suhu ruang. Membran dicuci kembali dengan TBS –  tween  0,05  %  selama  3x5  menit,  digojog pelan.  Membran  diinkubasi  dengan  Ab sekunder yang dilarutkan dalam TBS selama 60 menit pada suhu ruang. Cuci NC dengan TBS  –  tween  0,05  %  selama  3x5  menit, digojog  pelan.  Inkubasi  dengan  SAHRP  – tween  selama  40  menit  pada  suhu  ruang. Membran  dicuci  kembali  dengan  TBS  – tween  0,05  %  selama  3x5  menit,  digojog pelan.  Membran  diinkubasi  dengan  substrat TMB  sampai  muncul  pita  protein  lalu  distop
dengan  penambahan    ddH 2 O.  Membran dikering anginkan, kemudian dipindai.

## HASIL
Bakteri Vibrio  cholerae ditumbuhkan secara  konvensional  menggunakan  media TCBS  yang  ditunjukkan  dengan  munculnya koloni  yang  datar  berwarna  kuning  sebagai Vibrio  cholerae .  Sampel  bakteri  telah dikonfirmasikan  sebagai  bakteri Vibrio cholerae dengan memperlihatkan koloni yang berwarna  kuning  (sukrosa  positif)  dan memperlihatkan  morfologi  sebagai  bakteri gram negatif, berbentuk batang.
Elektroforesis  dan  perhitungan  BM dilakukan dengan tujuan untuk mengidentifikasi  berat  molekul  bakteri Vibrio cholerae dengan  menggunakan  metode elektroforesis. Berdasarkan hasil elektroforesis dengan pewarnaan commassie blue ,  diperoleh  gambaran band (pita)  dalam satuan berat molekul kDa (Gambar 1). Berat molekul  (BM)  pita  rotein  sampel  ditentukan dengan membandingkan antara BM  marker dengan Rf. Selanjutnya dibuat kurva standar
dengan  nilai  Rf  sebagai  sumbu  Y  dan  nilai logaritma  berat  molekul  sebagai  sumbu  X. Berdasarkan  perhitungan  antara  BM  dan  Rf dengan  menggunakan  regresi  linear, diperoleh  persamaan  :  Y  =  -0,4199x  + 1,3217,  yang  digunakan  untuk  menentukan nilai BM sampel. Penghitungan berat molekul masing-masing  sampel  didapat  dari  anti-log X  yang  sebelumnya  nilai  Rf  sampel dikonversikan  ke  dalam  persamaan  regresi linear.  Hasil  analisis  di  atas  dapat disimpulkan  setiap  perubahan  x  sebesar satuan,  maka  y  akan  mengalami  kenaikan satu satuan. Misal x = 1, akan mempengaruhi perubahan  y  sebesar  1,3217-0,4199. Koefisien  determinasi  (R 2 )  untuk  melihat apakah suatu model regresi yang dicocokkan sudah  memadai  dan  dapat  mengukur proporsi  dari  jumlah  variasi  yang  dapat diterangkan  dengan  model  regresi.  R 2 bernilai 99.3 % menunjukkan bahwa 99,3 % proporsi  keragaman  nilai  peubah  Y  (Rf) dapat  dijelaskan  oleh  nilai  peubah  X  (Log BM)  melalui  hubungan  linier  sedangkan sisanya 0,7 % dijelaskan oleh hal yang lain.
Gambar 1. Hasil elektroforesis Vibrio cholerae
Keterangan: sumur A = whole cell , sumur B =  OMP, sumur C = Pellet , sumur D = Marker
Analisis  korelasi  adalah  analisis terhadap kekuatan hubungan antara variabel X  dengan  variabel  Y.  Analisis  korelasi  akan menunjukkan  apakah  peningkatan  X  akan menyebabkan  turunnya  Y,  atau  peningkatan X tidak mempengaruhi besarnya Y. Kekuatan hubungan antara X dan Y untuk selanjutnya akan ditunjukkan dengan satu bilangan yang disebut  dengan  koefisien  korelasi  (R).  R merupakan  suatu  ukuran  hubungan  antara
dua  variabel  dimana  bila  R  mendekati  1, hubungan  antara  kedua  variabel  kuat,  dan dikatakan terdapat korelasi yang tinggi antara keduanya.  Bila  R  mendekati  nol,  hubungan linier  antara  X  dan  Y  sangat  lemah.  Pada hasil  penelitian,  didapatkan  R  =  0,996 dengan  menggunakan  rumus  akar  kuadrat dari R 2 . Sehingga dapat di simpulkan bahwa hubungan linier antara Log BM dan Rf sangat kuat.
Pada  hasil  penelitian  berdasarkan penghitungan persamaan regresi dari marker protein  untuk  menentukan  berat  molekul protein Vibrio  cholerae diketahui  15  fraksi protein  yaitu:  BM  847,  469-510,  335,  283, 185, 132, 103, 87, 73, 48-52, 34-37, 23, 16, 12-13, 8-9 (kDa)
Pada  hasil  penelitian  berdasarkan penghitungan persamaan regresi dari marker protein  untuk  menentukan  berat  molekul OMP Vibrio  cholerae diketahui  9  fraksi protein  yaitu:  BM  469-510,  364-396,  283, 185-202, 132-144, 102-112, 73, 48-52, 34-37 (kDa).
Western  blotting dan  perhitungan  BM dilakukan dengan tujuan untuk mengidentifikasi ada atau tidaknya reaksi
silang  antara  protein  AdhO36 Salmonella typhi dengan  OMP Vibrio  cholerae . Berdasarkan hasil western blotting , diperoleh gambaran  band  (pita)  dalam  satuan  berat molekul kDa (Gambar 2).
Penentuan  molekul  relatif  dilakukan dengan bantuan protein marker. Menentukan molekul  relatif  protein  dilakukan  dengan menghitung  nilai retardation  factor (Rf)  dari masing-masing pita dengan rumus :
Rf
= Jarak pergerakan protein dari tempat awal

## Jarak pergerakan pelarut dari tempat awal
Penentuan  BM  pita  protein  hasil western blotting sama dengan penentuan BM hasil SDS-PAGE.
Gambar 2. Deteksi reaksi silang antara protein AdhO36 Salmonella typhi dengan OMP Vibrio cholerae dengan western  blotting. Keterangan:  Sumur  A  =  OMP Vibrio  cholerae yang  bereaksi  dengan  antibodi  AdhO36 Salmonella typhi , Sumur  B = Protein Marker.
Berdasarkan perhitungan antara BM dan Rf  dengan  menggunakan  regresi  linear diperoleh  persamaan  :  Y  =  -0,6279x  + 1,4847.  Hasil  analisis  di  atas  dapat disimpulkan  setiap  perubahan  x  sebesar satuan,  maka  y  akan  mengalami  kenaikan satu satuan. Misal x = 1, akan mempengaruhi perubahan  y  sebesar  1,4847-0,6279.  R 2 bernilai  99.6%  menunjukkan  bahwa  99,6% proporsi  keragaman  nilai  peubah  Y  (Rf) dapat  dijelaskan  oleh  nilai  peubah  X  (Log BM)  melalui  hubungan  linier  sedangkan sisanya 0,4% dijelaskan oleh hal-hal yang
lain.  Pada  hasil  penelitian,  didapatkan  R= 0,998  dengan  menggunakan  rumus  akar kuadrat dari R 2 . Sehingga dapat disimpulkan bahwa hubungan linier antara Log BM dan Rf sangat kuat.
Pada  hasil  penelitian  berdasarkan penghitungan persamaan regresi dari marker protein  untuk  menentukan  berat  molekul protein Vibrio cholerae yang bereaksi dengan antigen AdhO36 Salmonella typhi diketahui 3 fraksi protein yaitu: 100 kDa, 74 kDa dan 38 kDa.
10 7k D a 74 k D a 38 k D a B A

## PEMBAHASAN
Bakteri Vibrio cholerae mempunyai outer membrane  protein dengan  reseptor  yang mempunyai  fungsi  dalam  mekanisme pertahanan  hidup.  Dengan  metode western blotting didapatkan  tiga  OMP  pada  bakteri Vibrio  cholerae yang  terbukti  merespon antibodi AdhO36. Setelah dihitung menggunakan  persamaan  regresi  dari marker  protein,  didapatkan  berat  molekul yang berbeda; 100 kDa, 74 kDa, dan 38 kDa. Protein  dengan  berat  molekul  100  kDa atau disebut juga protein subunit translokase SecA  adalah  bagian  dari  kompleks  protein translokase  Sec  yang  berinteraksi  dengan saluran  preprotein  SecYEG.  Protein  ini memiliki  peran  sentral  dalam  kopling hidrolisis ATP untuk transfer protein ke dalam dan  melintasi  membran  sel,  baik  sebagai reseptor  untuk  kompleks  preprotein-SecB dan  sebagai  motor  molekul  ATP-driven translokasi bertahap dari rantai polipeptida di membran.
Protein  subunit  translokase  SecA memiliki  peran  sentral  dalam  kopling hidrolisis ATP untuk transfer protein ke dalam dan  melintasi  membran  sel  yang  berguna bagi asupan nutrisi Vibrio cholerae . Ini berarti bahwa  apabila  protein  ini  berikatan  dengan antibodi  AdhO36,  maka  bakteri Vibrio cholerae akan kehilangan kemampuan untuk menghidrolisis  ATP  dan  mentransfer  protein ke  dalam  dan  melintasi  membrane  sel. Tanpa  adanya  protein  untuk  nutrisi,  maka Vibrio  cholerae tidak  akan  dapat  bertahan hidup.
Vibrio  cholerae mempunyai  mekanisme untuk memperoleh zat besi pada lingkungan rendah zat besi. Mekanisme tersebut adalah memproduksi  vibriobactin  yang  berguna dalam mengikat zat besi secara ekstraseluler dan  mentransportasikannya  ke  dalam  sel melalui  reseptor  yang  spesifik.  Protein dengan  berat  74  kDa  merupakan  reseptor vibriobactin yang diperlukan untuk transportasi  vibriobactin  dan  berfungsi sebagai reseptor ferric vibriobactin complexes. 11 Untuk  menunjang  kehidupan Vibrio cholerae dalam  lingkungan  rendah  zat  besi, vibriobactin  perlu  bereaksi  dengan  reseptor vibriobactin.  Namun,  antibodi  AdhO36
menghambat  proses  tersebut  dengan  cara berikatan  dengan  reseptor  vibriobactin. Tanpa  adanya  reseptor  vibriobactin  yang diperlukan  oleh  vibriobactin  sebagai  alat transportasi,  maka Vibrio  cholerae akan kehilangan  kemampuannya  untuk  hidup dalam lingkungan rendah zat besi.
Protein  dengan  berat  molekul  38  kDa atau  dapat  disebut  juga  Porin  OmpU, mempunyai  peran  dalam  pengangkutan  zat terlarut  hidrofilik  dalam  tes  pembengkakan liposom  dan  dianggap general  diffusion porins yang memungkinkan hanya setiap zat terlarut  dengan  ukuran  tertentu  untuk menyeberangi  membran.  Karena  porin adalah  protein  membran  luar  yang  utama, mereka juga berfungsi sebagai situs reseptor untuk mengikat fages dan bakteriosin. 12 Porin  OmpU  memiliki  peran  sebagai situs  reseptor  untuk  mengikat  fages  dan bakteriosin.  Hal  ini  berarti  apabila  antibodi AdhO36  bereaksi  dengan  OmpU,  maka fages dan bakteriosin yang berfungsi sebagai pembunuh  bakteri  akan  kehilangan  target reseptor  untuk  diserang.  Mengakibatkan Vibrio  cholerae kebal  terhadap  serangan fages  dan  bakteriosin.  Namun,  porin  OmpU memiliki  peran  dalam  asupan  nutrisi Vibrio cholerae .  Dengan  berikatannya  antibodi AdhO36  pada  porin  OmpU  maka Vibrio cholerae akan  kehilangan  asupan  nutrisinya yang  berguna  bagi  kelangsungan  hidup Vibrio  cholerae. Ini  berarti,  walaupun Vibrio cholerae tidak dapat diserang oleh fages dan bakteriosin, Vibrio  cholerae tetap  tidak  akan dapat  bertahan  hidup  tanpa  adanya  nutrisi yang berguna untuk kelangsungan hidupnya . Dari  beberapa  pita  protein  OMP Vibrio cholerae, yang  jelas  menunjukkan  reaksi silang  dengan  antibodi  AdhO36  adalah  pita protein  dengan  berat  molekul  sekitar  100 kDa,  74  kDa,  dan  38  kDa.  Protein  dengan berat  molekul  100  kDa  dan  74  kDa  tampak sebagai gabungan dari protein dengan berat molekul 38 kDa. Sehingga ada kemungkinan OMP dengan berat molekul 100 kDa dan 74 kDa  memiliki  antigen  yang  sama  dengan OMP dengan berat molekul 38 kDa.
Antibodi  AdhO36 Salmonella typhi merespon  tiga  OMP  dari  bakteri Vibrio cholerae yang  mempunyai  berat  molekul sekitar 100 kDa, 74 kDa, dan 38 kDa. Namun
penelitian  ini  belum  memberikan  informasi mengenai  hambatan  perlekatan  bakteri  di mukosa  mengingat  bahwa  antibodi  AdhO36
Salmonella typhi ini  memicu  terbentuknya imunitas  mukosa.  Sehingga  belum  diketahui efek antibodi AdhO36 sebagai vaksin demam tifoid dan vaksin kolera.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dengan metode western  blotting menggunakan antibodi  Adho36 Salmonella typhi dengan
OMP Vibrio  cholerae, diperoleh  kesimpulan yaitu  ada  reaksi  silang  antara  antibodi
AdhO36 Salmonella typhi dengan  OMP Vibrio  cholerae, dan  berat  molekul  OMP Vibrio  cholerae yang  merespon  antibodi AdhO36 yaitu sekitar: 100 kDa, 74 KDa, dan 38  KDa.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut untuk  mengetahui  efek  imunisasi  Protein AdhO36 Salmonella typhi terhadap perlekatan  bakteri Vibrio  cholerae di  organ intestinal mencit.

## DAFTAR PUSTAKA
1. [WHO]  World  Health  Organization. Background  Document:  the  Diagnosis,
Treatment  and  Prevention  Of  Typhoid Fever. Geneva: World Health Organization. 2003. 2. Crump  JA,  Luby  SP,  Mintz  ED.  The Global Burden of Typhoid Fever. Bulletin of  World  Health  Organization.  2004; 82(5).
3. Wirahardja  RS.  Vaccination  as  a  Public Health Tool of Typhoid Fever Prevention and  Control. Jurnal  Kedokteran  YARSI .
2003; 11(1):67-76.
4. Wizemann TM, Adamou JE, Langermann S.  Adhesins  as  Targets  for  Vaccine Development. Emerging Infectious Diseases . 1999; 5(3):395-403.
5. Santoso  S.  Protein  Adhesin Salmonella typhi sebagai Faktor Virulensi Berpotensi
Imunogenik pada Produksi S-IgA Protektif
:  Penelitian  Eksperimental  Laboratoris. ADLN Digital Collections. 2008.
6. Winarsih  S,  Santoso  S,  Sumarno. Adhesin  AdhO36 Salmonella  typhi as  a Potential  Candidate  Oral  Vaccine  for Typhoid  Fever.  Bandung:  Pertemuan Ilmiah Tahunan PAMKI. 2010.
7. Noor  R.  Mukosa  Imun  System.  2010. (online).  http://id.shvoong.com/medicine- and-health/imuunology/2066419-mukosa- imun-sistem/. Diakses 3 April 2011
8. Lowden  MJ,  Skorupski  K,  Pellegrini  M, Chiorazzoa  MG,  Taylor  RK,  Kull  FJ. Structure of Vibrio cholerae ToxT Reveals a Mechanism for Fatty Acid Regulation of Virulence  Genes. PNAS  (Proceedings  of the National Academy of Sciences of the United  States  of  America), Early  Edition. 2010; 107(7): 2860-2865.
9. Sengupta  DK,  Sengupta  TK,  Ghose  AC. Major Outer Membrane Proteins of Vibrio cholerae and  Their  Role  in  Induction  of Protective Immunity Through Inhibition of
Intestinal  Colonization. Infection  and Immunity . 1992; 60(11):4848-4855. 10. Pizza  M,  Scarlato  V,  Masignani  V,  Arico B,  Comanducci  M,  Giuliani,  MM. Identification  of  Vaccine  Candidates Against  Serogroup  B  Meningococcus  by Whole-Genome  Sequencing. Science Magazine. 2004; 287:1816-1820. 11. Stoebner  JA,  Butterton  JR,  Calderwood SB    Payne  SM.  Identification  of  the Vibriobactin  Receptor  of Vibrio  cholerae , J. of bacteriol . 1992; 174(10):3270-3274. 12. Simonet V, Basle A, Klose K, Delcour A. The Vibrio  cholerae Porins  OmpU  and OmpT  Have  Distinct  Channel. J  of  Biol Chem. 2003; 278:17539-17545.