Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip https://doi.org/10.6066/jtip.2023.34.2.127 Hasil Penelitian
Copyright © 2023 by Authors, published by Journal of Food Technology and Industry This is an open-access article distributed under the CC BY-SA 4.0 License https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

## Deteksi dan Identifikasi Molekuler Kapang Berpotensi sebagai Penghasil
Patulin pada Buah Tropis
[Detection and Molecular Identification of Potentially Patulin-Producing Mold in Tropical Fruits]
Ratih Paramastuti 1,2) , Winiati Pudji Rahayu 1,3) *, dan Siti Nurjanah 1,3)
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB University, Bogor, Indonesia
2) Program Studi Teknologi Pangan, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Nasional Karang Turi, Semarang, Indonesia
3) South-East Asia Food & Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center-LPPM, IPB University, Bogor, Indonesia
Diterima 17 Maret 2023 / Disetujui 25 Juni 2023

## ABSTRACT
Production and export of tropical fruits in Indonesia have an increasing trend every year. The important factor in the production and export of fruits is food safety.  One of the contaminants that may be found in fruits is mycotoxin, especially patulin. Patulin mainly found in fruits such as apple, orange, grape, and pear. This  study  aimed  to  detect  molds  from  tropical  fruits  and  to  identify  potentially  patulin-producing  molds. Detection  of  potentially  patulin-producing  molds  obtained  from  tropical  fruits  was  carried  out  using  the isoepoxydon  dehydrogenase (idh)  gene.  Species  identification  was  carried  out  using  internal  transcribed spacer ( ITS) region. The mold isolate sequences of ITS rDNA region were analyzed for their homology using both BLAST search and phylogenetic tree. A total of 26 molds were isolated from four types of fruit (malang apple, ambon banana, medan orange, and avocado) obtained from five different places in Bogor including fruit stalls, traditional markets, and supermarkets. The positive results of idh gene were mold isolates that have an amplicon at 620 bp. The  result showed that 5 of 26 (19.2%) isolates were positive for idh gene, namely  A11,  A34,  A43,  A51  and  B23.  The  positive  isolates  for  idh  gene  were  identified  as  Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Cladosporium anthropophilum, Cladosporium tenuissimum, and  Talaromyces verruculosus .
Keywords: molecular identification, patulin, toxigenic mold, tropical fruits

## ABSTRAK 1
Produksi dan ekspor buah-buahan tropis Indonesia mengalami tren peningkatan dari tahun ke tahun. Salah satu faktor penting yang harus diperhatikan dalam produksi maupun ekspor buah adalah keamanan pangan.  Salah  satu  cemaran  yang  dapat  ditemukan  pada  buah  adalah  mikotoksin,  khususnya  patulin. Patulin sering ditemukan pada buah-buahan seperti buah apel, jeruk, anggur, dan pir. Penelitian ini bertu- juan  untuk  memperoleh  isolat  kapang  yang  tumbuh  dari  empat  jenis  buah-buahan  tropis  dan  identitas kapang  yang  berpotensi  sebagai  penghasil  patulin.  Kapang  yang  berpotensi  sebagai  penghasil  patulin dideteksi menggunakan gen idh . Identifikasi molekuler spesies kapang dilakukan menggunakan daerah ITS. Sekuens ITS dari rDNA kapang dianalisis homologinya dengan BLAST dan pohon filogenetik. Total kapang yang  diisolasi sebanyak  26  isolat dari  4 jenis  buah  tropis  (apel  malang,  pisang ambon,  jeruk medan  dan alpukat).  Kapang  tersebut  didapat  dari  5  tempat  yang  berbeda  di  Bogor  yaitu  kios  buah,  pasar,  dan supermarket. Isolat yang positif gen idh mempunyai amplikon pada 620 bp. Kapang yang positif mengan- dung gen idh berjumlah 5 dari 26 (19,2%) isolat yaitu A11, A34, A43, A51, dan B23. Isolat tersebut teridenti- fikasi  sebagai Aspergillus  aculeatus , Aspergillus  niger , Cladosporium  anthropophilum , Cladosporium tenuissimum , dan Talaromyces verruculosus .
Kata kunci: buah tropis, identifikasi molekuler, kapang toksigenik, patulin

## PENDAHULUAN
Produksi  buah-buahan  tahunan  di  Indonesia selama lima tahun terakhir (2014-2018) secara umum mengalami  peningkatan  (Kementan,  2019).  Produk buah-buahan  digunakan  untuk  konsumsi  nasional dan ekspor. Peningkatan produksi buah-buahan juga diiringi  dengan  meningkatnya  konsumsi  nasional (Kementan,  2018).  Penanganan  produk  buah- buahan yang baik perlu dilakukan untuk menghindari kerusakan secara mikrobiologi, salah satunya adalah pertumbuhan  kapang.  Keberadaan  kapang  dikha- watirkan karena dapat menghasilkan mikotoksin.
Mikotoksin  adalah  komponen  kimia  bersifat toksik  yang  merupakan  produk  metabolit  sekunder dari  kapang  (Tola  dan  Kebede,  2016).  Mikotoksin yang telah diidentifikasi dan dilaporkan sebanyak 300 jenis,  namun  yang  kerap  ditemukan  dalam  pangan antara  lain  aflatoksin, okratoksin, fumonisin, patulin, zearalenone , dan trichothecenes (Alshannaq dan Yu, 2017). Menurut Food Agriculture Organization (FAO), diperkirakan 25% dari hasil pertanian dunia per tahun terkontaminasi oleh mikotoksin. Namun, berdasarkan penelitian terkini nilai perkiraan tersebut masih terlalu rendah.  Kontaminasi  mikotoksin  diperkirakan  men- capai  60-80%,  nilai  yang  tinggi  ini  merupakan  hasil dari  peningkatan  sensitivitas  metode  analitis  dan perubahan iklim (Eskola et al ., 2020).
Mikotoksin  yang  sering  ditemukan  pada  buah- buahan  adalah  patulin.  Patulin  dapat  menyebabkan masalah kesehatan akut seperti mual, muntah, ulse- rasi,  perdarahan  usus,  lesi  pada  duodenum,  peru- bahan fungsi penghalang usus, dan kerusakan ginjal (Vidal et al ., 2019). Patulin merupakan hasil metabo- lit  sekunder  kapang  dari  genus Penicillium , Asper- gillus , Paecylomyces ,  dan Xylaria (Frisvad,  2018). Faktor  yang  memengaruhi  produksi  patulin  pada buah  antara  lain  jenis  buah,  varietas,  lokasi  geo- grafis,  kondisi  iklim,  tahun  produksi,  perlakukan  pra dan  pasca  panen,  metode  pemanenan,  cacat  pada permukaan  buah,  penggunaan  pestisida,  dan  kon- disi penyimpanan (Oteiza et al., 2017). Buah-buahan yang lebih berisiko untuk mengalami migrasi patulin ke daging adalah buah dengan kulit yang tipis seperti buah pisang, jeruk, apel, dan alpukat. Keempat buah tersebut  juga  termasuk  11  besar  produksi  tertinggi tanaman buah-buahan tahunan di Indonesia.
Patulin  merupakan  senyawa  yang  stabil  se- hingga tidak dapat dihilangkan dengan proses peng- olahan  pada  bahan  pangan.  Metode  pengolahan seperti  filtrasi,  perlakuan  panas,  dan  fermentasi hanya  dapat  mengurangi  namun  tidak  dapat  meng- hilangkan kandungan patulin secara keseluruhan (Ioi et al., 2017). Deteksi patulin dapat  dilakukan meng- gunakan beberapa metode seperti metode referensi, metode cepat, maupun metode analitik baru. Contoh dari metode referensi antara lain thin-layer chromato- graphy (TLC), gas chromatography (GC), mass spec-
trometry (MS), dan high-performance liquid chroma- tography (HPLC).  Metode  cepat  contohnya enzyme immunoassay test , dipstick , dan lateral flow . Metode analitik  baru  contohnya near-infrared  spectroscopy , fluorescence ,  elektroforesis  kapiler,  dan  biosensor (Notardonato et  al., 2021).  Metode-metode  tersebut dapat  mendeteksi  patulin  setelah  terbentuk.  Pence- gahan  dari  keberadaan  patulin  dapat  dilakukan  de- ngan  mencegah  pertumbuhan  kapang  yang  berpo- tensi sebagai penghasil patulin.
Keberadaan kapang penghasil patulin harus di- cegah dengan deteksi dini pada rantai pangan sebe- lum menghasilkan toksin yang melampaui batas yang ditentukan. Deteksi menggunakan metode mikrobio- logi  konvensional  membutuhkan  waktu  yang  lama dan  tidak  dapat  mendeteksi  kapang  yang  mati sehingga  tidak  mampu  mengindikasikan  kontami- nasi sebelumnya pada suatu produk. Oleh karena itu, dibutuhkan  metode  lain  untuk  mendeteksi  kebe- radaan  kapang  penghasil  patulin  secara  cepat  dan spesifik  seperti  metode  molekuler  menggunakan polymerase  chain  reaction (PCR).  PCR  merupakan metode alternatif dari metode kimia dan mikrobiologi untuk  mendeteksi  dan  mengindentifikasi  kapang toksigenik  pada  pangan  (Paterson,  2007).  Protokol PCR  yang  dirancang  menggunakan  gen  target iso- epoxydon  dehydrogenase ( idh )  sebagai  gen  target penghasil patulin dan gen target internal transcribed spacer (ITS)  untuk  identifikasi  isolat  kapang (Paterson, 2004; Cunha et al., 2014). Gen idh telah digunakan  secara  umum  untuk  mendeteksi  kapang yang  memproduksi  patulin,  gen idh berperan  dalam biosintesis  patulin  untuk  mengonversi isoepoxydon menjadi phyllostine (Paramastuti et  al., 2021). Beberapa  penelitian  yang  menggunakan  gen idh sebagai  gen  target  untuk  mendeteksi  kapang  yang memproduksi patulin telah dilakukan baik mengguna- kan  metode  PCR  konvensional  maupun  PCR real- time (Paterson, 2004; Luque et al., 2011; Rodríguez et al., 2011; De Clercq et al., 2016). Perkembangan deteksi mikotoksin menggunakan beberapa gen tar- get memungkinkan deteksi beberapa mikotoksin da- lam pangan pada waktu yang bersamaan (Rodríguez et al., 2012; Luque et al., 2013). Identifikasi kapang yang  berpotensi  sebagai  penghasil  patulin  dapat dilakukan  menggunakan  primer  universal  yaitu daerah  ITS.  Daerah  ITS  merupakan  penanda  DNA barcoding universal  untuk  identifikasi  pada  tingkat spesies pada kapang atau jamur (Raja et al., 2017). Penelitian tentang kontaminasi patulin pada apel dan  produk  olahannya  sudah  banyak  dilakukan, namun  data  mengenai  kontaminasi  patulin  pada buah-buahan  tropis  masih  terbatas.  Kebijakan  di Indonesia  tentang  batasan  maksimum  cemaran patulin hanya pada jenis pangan produk olahan apel (50 ppb), minuman beralkohol berbasis apel (50 ppb), serta puree apel  untuk  bayi  dan  anak  (10  ppb) (BPOM,  2018).  Namun,  belum  ada  regulasi  yang
J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 34(2): 127-141 Th. 2023
mengatur batasan maksimum cemaran patulin pada produk  lainnya.  Data  hasil  deteksi  dan  identifikasi kapang  penghasil  patulin  pada  buah-buahan  tropis dapat  digunakan  sebagai  dasar  ilmiah  bagi  kebijak- an keamanan pangan serta pengembangan metode deteksi kapang penghasil patulin dalam pangan. Oleh karena  itu,  metode  berperan  penting  untuk  deteksi dan identifikasi kapang penghasil patulin pada buah- buahan  tropis.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mem- peroleh isolat kapang yang tumbuh pada buah tropis dan  mengidentifikasi  kapang  yang  berpotensi  seba- gai penghasil patulin.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  buah-buahan  tropis  berupa  pisang  ambon, jeruk  medan,  apel  malang,  dan  alpukat,  masing- masing  diperoleh  dari  lima  tempat  yang  berbeda  di Bogor  antara  lain  kios  buah,  pasar  tradisional,  dan supermarket.  Strain Colletotrichum  musae PA01 yang  telah  teridentifikasi  sebagai  strain  toksigenik penghasil  patulin  dari  penelitian  sebelumnya  digu- nakan sebagai kontrol positif. Media yang digunakan untuk  pertumbuhan  adalah buffer  peptone  water / BPW  (Oxoid,  Inggris), potato  dextrose  agar /PDA (Oxoid,  Inggris)  dan potato  dextrose  broth /PDB (Himedia, India).

## Isolasi kapang
Metode  untuk  isolasi  kapang  mengacu  pada Cunha et  al. (2014)  dengan  modifikasi.  Modifikasi yang  dilakukan  adalah  mengganti  media sabouraud dextrose  agar (SDA)  dengan potato  dextrose  agar (PDA)  untuk  memindahkan  koloni  spesifik.  Sampel yang  telah  dihomogenisasi  dari  buah  utuh  ( puree buah)  sebanyak  50  g  diencerkan  10 -2 dan  diinoku- lasikan  dengan  metode  sebar  pada  media potato dextrose agar (PDA) yang diberi kloramfenikol 0,01% secara  duplo.  Inkubasi  dilakukan  pada  suhu  ruang (28°C)  selama  5  hari  dalam  kondisi  gelap.  Koloni yang  spesifik  ditumbuhkan  menggunakan  metode gores kuadran pada media PDA dan inkubasi dilaku- kan  pada  suhu  ruang  (28°C)  selama  5  hari.  Koloni yang terpisah kemudian ditumbuhkan dengan meto- de  gores  kuadran  pada  media  PDA  dan  diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang (28°C). Perlakuan ini diulangi  sampai  didapatkan  isolat  murni.  Isolat kapang yang didapat ditumbuhkan pada PDA miring untuk pengujian selanjutnya.

## Ekstraksi DNA
Metode  untuk  isolasi  kapang  mengacu  pada Tannous et al. (2015)  dengan modifikasi. Modifikasi yang  dilakukan  adalah  mengganti  media yeasts  ex- tract  sucrose (YES)  menjadi potato  dextrose  broth
(PDB). Isolat kapang ditumbuhkan pada media PDA dengan  metode  titik  lalu  diinkubasi  selama  5  hari pada  suhu  ruang  (28°C).  Miselium  yang  tumbuh  di- potong  sebesar  diameter  6  mm  sebanyak  2  keping. Inokulum tersebut ditumbuhkan kembali pada media PDB  dan  diinkubasi  pada incubator  shaker dengan agitasi  konstan  selama  3  hari  pada  suhu  ruang. Miselia  yang  tumbuh  pada  media  PDB  kemudian disaring  dan  dibilas  dengan  akuades  steril.  Miselia yang  didapat  digerus  dengan  mortar  dan  lumpang dengan penambahan nitrogen cair, hingga diperoleh serbuk  miselia  yang  halus.  DNA  diekstrak  dengan menggunakan GenElute  Plant  Genomic  DNA Miniprep Kit (Sigma, Jerman) sesuai protokol kit. .

## Kuantifikasi DNA
Hasil  ekstraksi  DNA  selanjutnya  dikuantifikasi untuk  mengetahui  konsentrasi  DNA  menggunakan NanoDrop  UV-Vis  Spektrofotometer  2000  (Thermo Scientific, Amerika Serikat). Konsentrasi DNA didapat dalam satuan ng/ µ L dan absorbansinya diukur pada panjang  gelombang  260  dan  280  nm.  Kemurnian DNA dapat dilihat dari rasio absorban pada 260 nm/ 280  nm,  DNA  dikatakan  murni  jika  memiliki  rasio ~1,8. Jika rasionya lebih rendah (≤1,6), maka menun- jukkan  adanya  protein,  fenol,  atau  kontaminan  lain (Lucena-Aguilar et al., 2016).

## Deteksi PCR gen idh
Deteksi gen idh  dilakukan  menggunakan  meto- de  Paterson  (2007)  yang  dimodifikasi.  Amplifikasi dilakukan  menggunakan  primer  IDH1F  ( 5’-CAATGT GTCGTACTGTGCCC- 3’)/IDH2R  (5’-ACCTTCAGTC GCTGTTCCTC- 3’)  yang  disintesis  dari Integrated DNA Technologies (IDT) Singapura. Modifikasi yang dilakukan  adalah  mengubah  kondisi  dan  komposisi reaksi  PCR  sesuai  hasil  optimasi.  Reaksi  dilakukan dengan  total  volume  25 μ L  yang  mengandung  12,5 μ L MyTaq Red Mix (Bioline, UK), 0,2 mM dari masing- masing  primer,  DNA  genom  (100  ng)  dan nuclease free water /NFW (1 st Base, Singapura) sampai 25 µ L. PCR  2720  Thermal  Cycler  (Applied  Biosystem, Thermo Scientific, Amerika Serikat) diatur pada kon- disi amplifikasi sebagai berikut: tahap pra denaturasi pada suhu 94°C selama 4 menit, 30 siklus pada suhu melting 94°C selama 1 menit, tahap annealing pada suhu 54°C selama 1 menit, tahap ekstensi pada suhu 72°C  selama  1  menit.  Tahap  ekstensi  akhir  pada suhu 72°C selama 5 menit. Hasil amplifikasi dianalisis pada  1,5%  (b/v)  gel  Omnipur  agarosa  (Merck, Jerman)  menggunakan buffer 1XTAE  pada  80  V selama  1  jam. Buffer TAE  dibuat  dengan  komposisi Trizma base (Sigma, Jerman), EDTA dan asam ase- tat  (Merck,  Jerman).  Gel  diwarnai  dengan ethidium bromide , DNA divisualisasikan oleh transiluminasi UV pada GelDoc (Bio-rad, Bio-Rad Laboratories Pte. Ltd, Singapura) dengan target amplikon 620 bp.

## Identifikasi molekuler
Amplifikasi  DNA  dilakukan  pada  daerah  target ITS  mengacu  pada  metode  Hammami et  al. (2017) yang  dimodifikasi.  Modifikasi  yang  dilakukan  adalah mengubah kondisi dan komposisi reaksi PCR sesuai hasil optimasi. Primer yang digunakan adalah ITS1F ( 5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)/ITS4R  (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3’)  yang  disintesis dari Integrated  DNA  Technologies (IDT)  Singapura. Amplifikasi  dilakukan  pada  total  volume  reaksi  se- besar 30 μ L yang mengandung 15 μ L GoTaq Master Mix (Promega, Amerika Serikat), 0,2 mM dari masing- masing  primer,  DNA  genom  (100  ng),  dan  NFW. Program yang dipakai untuk daerah ITS: pra denatu- rasi  pada  suhu  94°C  selama  5  menit,  amplifikasi sebanyak  35  siklus  (denaturasi  pada  suhu  94°C selama 30 detik, annealing pada suhu 54°C selama 30  detik,  dan  ekstensi  pada  suhu  72°C  selama  30 detik), dan ekstensi akhir pada suhu 72°C selama 5 menit. Hasil amplifikasi dianalisis pada 1,5% (b/v) gel agarosa  menggunakan buffer 1XTAE  pada  80  V selama  1  jam.  Gel  diwarnai  dengan ethidium bromide , DNA divisualisasikan oleh transiluminasi UV pada GelDoc (Bio-rad, Bio-Rad Laboratories Pte. Ltd, Singapura) dengan target amplikon 600 bp.

## Purifikasi produk PCR dan analisis hasil sekuen- sing
Purifikasi produk PCR dilakukan oleh PT Gene- tika Science Indonesia yang dilanjutkan dengan cycle sequencing dan  pengumpulan  data  sekuen  oleh  1 st BASE DNA Sequencing Services Singapura ( https:// base-asia.com/dna-sequencing-services ) menggu- nakan  metode  Raja et  al. (2017).  Sekuens  tersebut dicari  homologinya  dengan  BLAST  pada National Center  for  Biotechnology  Information (NCBI).  Pada sekuens rDNA ITS dilakukan analisis lanjutan dengan pohon filogenetik yang disusun menggunakan meto- de Maximum  Likelihood dengan  model  yang  paling sesuai  dan  bootstrap  1000x  pada  perangkat  lunak MEGA X.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolat kapang dari buah-buahan tropis
Kapang yang diperoleh sebanyak 26 isolat  dari empat jenis buah-buahan tropis, dengan rincian tiga belas  isolat  dari  apel  malang  (A11,  A21,  A22,  A23, A31, A32, A34, A41, A42, A43, A44, A51, dan A52), sembilan  isolat  dari  pisang  ambon  (B11,  B22,  B23, B24,  B51,  B52,  B53,  B54,  dan  B55),  dua  isolat  dari jeruk  medan  (O11  dan  O13),  dan  dua  isolat  dari alpukat (V22 dan V41). Gambar buah, isolat kapang, dan  karakteristik  koloninya  dapat  dilihat  pada  Tabel 1.
Gen  idh  dalam  isolat  yang  berpotensi  sebagai penghasil patulin
Deteksi  gen  penghasil  patulin  (gen idh )  dila- kukan pada 26 isolat yang didapat dari 4 jenis buah tropis  yaitu  13  isolat  dari  apel  malang  (kode  A),  9 isolat dari pisang ambon (kode B), 2 isolat dari jeruk medan (kode O), dan 2 isolat dari alpukat (kode  V). Gen idh mempunyai  amplikon  sebesar  620  bp,  dan berdasarkan  hasil  visualisasi  pada  Gambar  1  a  dan b, terdapat 5  dari  26 (19,2%) isolat yang positif gen idh yaitu  A11,  A34,  A43,  A51,  dan  B23.  Dua  puluh satu  isolat  lainnya  tidak  mempunyai  amplikon  pada 620 bp, sehingga dapat disimpulkan bahwa tidak me- ngandung atau negatif gen idh . Namun, hasil negatif yang  didapat  mungkin  juga  disebabkan  oleh  bahan yang mengandung DNA target tidak mencukupi atau terdapat penghambatan (Paterson, 2004).
Produk  PCR  pada  Gambar  1  a  dan  b  masih terlihat  menghasilkan multiple  band ,  hasil  tersebut sejalan  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh Paterson  (2007).  Hasil  yang multiple  band menun- jukkan  bahwa primer  IDH1/IDH2  tidak  spesifik  pada amplikon  620  bp.  Deteksi  gen idh menghasilkan amplikon tunggal (620  bp)  hanya pada  17% dari 93 isolat  yang  didominasi  oleh Penicillium  simplices- simum , Penicillium  expansum , Penicillium  brevi- compactum , dan Penicillium hirsutum . Strain lainnya dari  genus Penicillium , Aspergillus , Byssochlamys , dan Paecilomyces menghasilkan  2-8  amplikon. Spesies lain menghasilkan amplikon yang tidak spe- sifik namun dapat digunakan untuk menggambarkan profil  DNA  dalam  mengidentifikasi  dan  mengklasifi- kasikan kapang. Sebagai contoh amplikon pada 400 dan/atau 500 bp berkaitan dengan kapang yang tidak menghasilkan  patulin,  sedangkan  amplikon  450  bp berhubungan  dengan  beberapa  strain Aspergillus dan Bysshochlamys nivea . Kapang yang positif mem- punyai gen idh menghasilkan amplikon pada 620 bp, baik  itu  amplikon  tunggal  maupun  multi  amplikon (Paterson, 2007).
Gen yang telah diidentifikasi dan dikarakterisasi secara  molekuler  dalam  biosintesis  patulin  dari Penicillium  griseofulvum, B.  nivea ,  atau Aspergillus clavatus antara lain patK, patG, patH, patI, dan patN yang  masing-masing  mengkode  6- methylsalicylic acid  synthase / 6MSAS ,  6- methylsalicylic  acid  decar- boxylase , m-cresol  hydroxylase , m-hydroxy-benzyl alcohol  hydroxylase , dan isoepoxydon  dehydro- genase ( idh ) (Snini et al., 2014). Gen idh pertama kali disekuens dari Penicillium urticae yang telah berganti nama  menjadi P.  griseofulvum . Gen idh merupakan enzim  ketujuh  pada  jalur  biosintesis  patulin  yang mengonversi isoepoxydon menjadi phyllostine dan mempunyai  spesifisitas  absolut  untuk  NADP + (Dombrink-Kurtzman, 2006).

## Tabel 1. Gambar buah, isolat kapang dan karakteristik koloninya
Table 1. Picture of fruits, mold isolates, and colony characteristics
Origin Sample Sample Picture Isolate Code Isolate Colony Characteristics Malang apples A1 A11 Colonies are round, the surface color is blackish white, the reverse color is yellowish white A2 A21 Colonies are round, surface color is white, reverse color is yellowish white A22 Colonies are round, surface color is green, reverse color is green A23 Colonies are round, surface color is white, reverse color is yellowish white A3 A31 Colonies are round, surface color is brown, reverse color is brown A32 Colonies are round, surface color is white, reverse color is yellowish white
https://doi.org/10.6066/jtip.2023.34.2.127 2
Origin Sample Sample Picture Isolate Code Isolate Colony Characteristics A34 Colonies are round, the surface color is greenish white, the reverse color is white A4 A41 Colonies are irregular in shape, surface color is white, reverse color is white A42 Colonies are round, surface color is white, reverse color is yellowish white A43 Colonies are round, surface color is green, reverse color is green A44 Colonies are round, surface color is white, reverse color is yellowish white A5 A51 Colonies are round, surface color is green, reverse color is green A52 Colonies are irregular in shape, surface color is white, reverse color is yellowish white
https://doi.org/10.6066/jtip.2023.34.2.127 2
Origin Sample Sample Picture Isolate Code Isolate Colony Characteristics Ambon bananas B1 B11 Colonies are round, the surface color is yellowish green, the reverse color is yellowish green B2 B22 Colonies are round, surface color is red, reverse color is red B23 Colonies are irregular in shape, surface color is white, reverse color is yellowish white B24 Colonies are irregular in shape, surface color is white, reverse color is white B5 B51 Colonies are irregular in shape, surface color is white, reverse color is yellow B52 Colonies are round, surface color is white, reverse color is yellowish white
https://doi.org/10.6066/jtip.2023.34.2.127 2
Origin Sample Sample Picture Isolate Code Isolate Colony Characteristics B53 Colonies are round, the surface color is yellowish white, the reverse color is yellowish white B54 Colonies are round, the surface color is yellowish white, the reverse color is yellowish white B55 Colonies are round, the surface color is yellowish white, the reverse color is yellowish white Medan oranges O1 O11 Colonies are round, surface color is white, reverse color is yellowish white O13 Colonies are round, the surface color is greenish white, the reverse color is yellowish white Avocados V2 V22 Colonies are round, the surface color is greenish white, the reverse color is yellowish white V4 V41 Colonies are round, surface color is white, reverse color is yellowish white
(a)  (b)
Gambar 1.  (A) Hasil visualisasi PCR isolat (M) DNA ladder marker 100bp, (1) kontrol positif, (2) A11, (3) A21,
(4) A22, (5) A23, (6) A31, (7) A32, (8) A34, (9) A41, (10) A42, (11) A43, (12) A44, (13) A51, (14)
A52, (B) Hasil visualisasi PCR isolat (M) DNA ladder marker 100bp, (1) kontrol positif, (2) B11, (3) B22, (4) B23, (5) B24, (6) B51, (7) B52, (8) B53, (9) B54, (10) B55, (11) O11, (12) O13, (13) V22
(14) V41
Figure 1.   (A) PCR product visualization result of isolate (M) DNA ladder marker 100 bp, (1) positive control,
(2) A11, (3) A21, (4) A22, (5) A23, (6) A31, (7) A32, (8) A34, (9) A41, (10) A42, (11) A43, (12) A44,
(13) A51, (14) A52, (B) PCR product visualization result of isolate (M) DNA ladder marker 100 bp,
(1) positive control, (2) B11, (3) B22, (4) B23, (5) B24, (6) B51, (7) B52, (8) B53, (9) B54, (10) B55,
(11) O11, (12) O13, (13) V22, (14) V41
Sekuens nukleotida dan asam amino pada gen idh dari P.  griseofulvum dan P.  expansum mempunyai perbedaan antara lain posisi asam amino tertentu,  penambahan  panjang  intron  1  pada P. expansum ,  dan  substitusi  asam  amino  lisin  menjadi treonin  dalam  area  pengikatan  koenzim  pada P. expansum . Perbedaan inilah yang memengaruhi pro- duksi  patulin  dan  aktivitas  enzim  (Dombrink- Kurtzman, 2006).
Gen idh tidak  selalu  mengindikasikan  ada/ tidaknya  produksi  patulin.  Berdasarkan  hasil  pene- litian  Rharmitt  (2016),  isolat  yang  positif  gen idh belum  tentu  dapat  memproduksi  patulin,  sebaliknya ada beberapa isolat yang negatif gen idh tapi mampu memproduksi  patulin.  Hal  ini  mungkin  disebabkan karena  jalur  biosintesis  patulin  belum  dipahami sepenuhnya. Ada kemungkinan bahwa gen idh bukan merupakan gen yang berperan utama dalam produksi patulin.  Gen idh bekerja  mengubah iso-epoxydon menjadi  filostin  yang  kemudian  secara  berurutan diubah  menjadi  neopatulin,  askladiol,  dan  akhirnya menjadi  patulin.  Namun,  ada  kemungkinan  bahwa filostin, yang merupakan prekursor patulin, diproduksi melalui gentisil alkohol dengan melewati reaksi yang melibatkan gen idh .

## Identitas isolat positif gen idh
Sekuens  produk  hasil  amplifikasi  PCR  diana- lisis  dan  pohon  filogenetik  disusun  berdasarkan analisis  sekuens  ITS  dari  kelima  isolat  yang  positif terdeteksi idh . Berdasarkan hasil BLAST yang dapat dilihat di Tabel 2, kelima isolat (A11, A34, A43, A51, dan B23) tersebut teridentifikasi sebagai Aspergillus aculeatus KUASN  14, A.  niger AHBR17, Cladospo- rium  anthropophilum ID53, Cladosporium  tennuis- simum SAAS-17,  dan Talaromyces  verruculosus 5A3.  Pohon  filogenetik  dari  masing-masing  isolat dibuat  berdasarkan  genusnya  sehingga  terdapat  3 pohon filogenetik yang disusun. Berdasarkan analisis filogenetik  dari  ITS,  kelima  isolat  (A11,  A34,  A43, A51,  dan  B23)  mempunyai  homologi  yang  tinggi dengan A. aculeatus , A. niger , C. anthropophilum , C. tennuissimum , dan Talaromyces verruculosus . Pohon filogenetik dari kelima isolat dapat dilihat pada Gambar 2-4, dan dari gambar tersebut dapat terlihat bahwa  isolat  tidak  dapat  diidentifikasi  dengan  baik. Hal ini terlihat dari letak isolat dalam satu clade yang mengandung lebih dari satu spesies. Masing-masing isolat tidak terpisah secara tepat menjadi satu clade tertentu.
M  1   2   3  4   5  6  7  8  9 10 11 12 13 14 M  1   2   3  4   5  6  7  8  9 10 11 12 13 14 620 bp 620 bp

## Tabel 2. Hasil identifikasi molekuler
Table 2. Molecular identification result
Kode Isolat ( Isolate code ) Persentase identitas (%) ( Percent Identity (%) ) Query Cover (%) E value Identitas ( Identity ) A11 100 99 0.0 Aspergillus aculeatus KUASN 14 A34 99.67 99 0.0 Aspergillus niger AHBR17 A43 99.82 100 0.0 Cladosporium anthropophilum ID53 A51 100 100 0.0 Cladosporium tenuissimum SAAS-17 B23 100 100 0.0 Talaromyces verruculosus 5A3
Gambar 2.  Pohon filogenetik dari isolat A11 dan A34 menggunakan metode Maximum Likelihood berdasarkan analisis ITS
Figure 2.   The phylogenetic tree of A11 and A34 strains by Maximum Likelihood method based on analysis of ITS
Identifikasi dengan menggunakan area ITS tidak berjalan maksimal pada beberapa genus yang sangat spesifik seperti Aspergillus , Cladosporium , Fusarium , Penicillium ,  dan Trichoderma karena taxa tersebut memiliki  celah  yang  sangat  sempit  atau  tidak  ada celah  sama  sekali  pada  area  ITS-nya.  Penanda sekunder  digunakan  untuk  memperoleh  identitas
yang  lebih  akurat  pada  tingkat  spesies.  Penanda sekunder  yang  dapat  digunakan  untuk  identifikasi kapang  antara  lain  RPB1,  RPB2,  tub2/BenA,  dan calmodulin (CaM) untuk genus Aspergillus dan Peni- cillium . Barcode DNA yang direkomendasikan untuk Penicillium adalah tub2/BenA, sedangkan untuk ana- lisis filogenetik adalah RPB2 atau CaM karena hasil-
nya  lebih  mudah  disejajarkan. Barcode DNA  yang direkomendasikan untuk Aspergillus adalah CaM dan tub2/BenA (Raja et al., 2017).
A.  aculeatus termasuk  ke  dalam  kapang Aspergillus section Nigri atau  aspergili  hitam,  meru- pakan  kapang  kontaminan  yang  sering  ditemukan pada  pangan  dan  pakan  (Nielsen et  al., 2009). A. aculeatus tergolong  dalam clade uniseriate  black aspergilli , kapang dalam clade tersebut dapat mem- produksi metabolit sekunder berupa poliketida, turu- nan  peptida  non  ribosomal,  maupun  campuran. A. aculeatus merupakan kapang yang umum ditemukan pada  buah,  biji,  maupun  kacang  yang  mengalami pembusukan (Petersen et al., 2014).
A.  aculeatus terbukti  telah  menghasilkan  bebe- rapa metabolit sekunder seperti okratoksin A, aculin A,  fumonisin, secalonic  acid , nominine , okaramine , dan calbistrin (Petersen et al., 2014; Petersen et al., 2015;  Lamboni et  al., 2016;  Zhang et  al., 2016). Belum  ada  penelitian  yang  menyebutkan  bahwa A. aculeatus dapat  memproduksi  patulin.  Kapang  ter- sebut telah terdeteksi mempunyai gen 6MSAS yang merupakan  prekursor  patulin  dan  aculin  A.  Jalur biosintesis  antara  aculin  A  dan  patulin  mempunyai kesamaan  pada  empat  tahap  awal,  terdapat  bebe- rapa  kesamaan  juga  pada  gen  yang  terlibat  yaitu AcuC  dan  AcuD  merupakan  homolog  dari  PatI  dan PatH (Petersen et al., 2015).
Gambar 3.  Pohon filogenetik dari isolat A43 dan A51 menggunakan metode Maximum Likelihood berdasarkan analisis ITS
Figure 3.   The phylogenetic tree of A43 and A51 strains by Maximum Likelihood method based on analysis of ITS
Gambar 4.  Pohon filogenetik dari isolat B23 menggunakan metode Maximum Likelihood berdasarkan analisis ITS
Figure 4. The phylogenetic tree of B23 strain by Maximum Likelihood method based on analysis of ITS
A. niger menyebabkan gejala yang paling parah pada  penyakit  pascapanen  utama  pada  apel  yaitu busuk Aspergillus (Zhang et  al .,  2018). A.  niger menghasilkan  beberapa  mikotoksin  seperti  okra- toksin A, okratoksin B, citrinin, dan gliotoxin (Navale et  al., 2021). Belum  ada  penelitian  yang  menye- butkan bahwa A. niger dapat memproduksi patulin. A. niger telah terdeteksi mempunyai gen 6MSAS, yang merupakan  penyandi  6MSA,  yang  dikenal  juga sebagai  prekursor  patulin.  Senyawa  6MSA  ini  juga merupakan  prekursor  dari  yanuthone  D.  Terdapat persamaan  antara  biosintesis  yanuthone  D  dan patulin  yaitu  YanC  merupakan  homolog  dari  PatI (Holm et  al., 2014).  Kluster  gen  biosintetik  pada P. expansum berbagi 5 dari 10 gen dengan kluster gen biosintetik  yanuthone  D  pada A.  niger .  Kluster  gen biosintetik  yanuthone  D  menunjukkan  homologi
setidaknya  9  dari  10  gen  dibandingkan  kluster  gen biosintetik patulin (Nielsen et al., 2017). Cladosporium sp.  merupakan  kapang  yang sering  ditemukan  pada  apel,  tomat,  raspberi,  dan stroberi (Cunha et al., 2014; Nam et al., 2015; Farwell et al., 2023). Cladosporium sp . dilaporkan menghasil- kan  mikotoksin  berupa  turunan  citrinin  (Salvatore et al., 2021).  Mikotoksin  utama  yang  dihasilkan  oleh Cladosporium sp.  adalah cladosporin , isocladospo- rium , emodin , epicladosporic  acid , fagicladosporic acid ,  dan  ergot  alkaloid  (Alwatban et  al., 2014). C. anthropophilum dan C. tennuissimum belum pernah dilaporkan dapat menghasilkan patulin.
Penicillium  verruculosum atau  yang  sekarang disebut T.  verruculosus merupakan  kapang  penye- bab penyakit busuk hitam yang ditemukan pada buah mangga dan storage rot pada kacang tanah (Chadni et al ., 2017; Ortega ‐ Acosta et al. , 2018). Talaromyces
sp. dapat menghasilkan 221 jenis metabolit sekunder yang terdiri dari 43 alkaloid dan peptida, 88 ester, 31 poliketida, 19 quinone, 15 steroid dan terpenoid, dan 25 senyawa struktur lainnya. T. verruculosus meng- hasilkan metabolit sekunder berupa (E)-3-(2,5-dioxo- 3-(propan-2-ylidene) pyrrolidin-1-yl) yang merupakan golongan alkaloid dan peptida serta turunan isokuma- rin  yang  merupakan  golongan  ester  (Zhai et  al ., 2016). Namun, belum ada penelitian yang menyebut- kan  bahwa T.  verruculosus dapat  memproduksi patulin.

## KESIMPULAN
Isolat  yang  diperoleh  sebanyak  26  isolat  yang didapat  dari  4  jenis  buah  tropis  yaitu  13  isolat  dari apel malang, 9 isolat dari pisang ambon, 2 isolat dari jeruk  medan,  dan  2  isolat  dari  alpukat.  Deteksi kapang  penghasil  patulin  dengan  gen idh dilakukan terhadap  26  isolat,  dan  terdapat  5  dari  26  (19,2%) isolat yang positif gen idh yaitu A11, A34, A43, A51, dan  B23.  Isolat  tersebut  teridentifikasi  sebagai Aspergillus  aculeatus , Aspergillus  niger , Clados- porium  antropophilum , Cladosporium  tenuissimum , dan Talaromyces  verruculosus. Belum  ada  literatur yang  mendukung  bahwa  kapang-kapang  tersebut dapat  memproduksi  patulin.  Gen idh tidak  selalu mengindikasikan  ada/tidaknya  produksi  patulin. Ada kemungkinan bahwa gen idh bukan merupakan gen yang berperan utama dalam produksi patulin. Hal ini dikarenakan jalur biosintesis patulin belum dipahami sepenuhnya.  Deteksi  kapang  penghasil  patulin secara  molekuler  membutuhkan  konfirmasi  dengan penggunaan  primer  atau  gen  target  lain.  Identifikasi molekuler kapang  membutuhkan penanda sekunder untuk mendapatkan hasil yang lebih akurat di tingkat spesies. Produksi patulin dari kapang yang terdeteksi mempunyai  gen idh perlu  dikonfirmasi  dengan metode kimia atau biosensor.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada Kementerian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi Republik  Indonesia  yang  telah  memberikan  dana penelitian  dalam  skema  hibah  Penelitian  Dasar Unggulan  Perguruan  Tinggi  (PDUPT)  atas  nama Prof.  Dr.  Winiati  P.  Rahayu  yang  berjudul “Buah- Buahan  Tropis  Indonesia  Bebas  Kapang  Toksigen dan Patulin”. Penghargaan penulis sampaikan kepa- da  Laboratorium  Departemen  Ilmu  dan  Teknologi Pangan  IPB,  Laboratorium  South-East  Asia  Food  & Agricultural  Science  and  Technology  (SEAFAST) Center,  dan  Laboratorium  Biotechnology  Research Indonesia-Netherlands Pusat Penelitian Sumberdaya
Hayati  &  Bioteknologi  (BIORIN  PPSHB)  IPB  yang telah menyediakan fasilitas untuk penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Alshannaq A, Yu JH. 2017. Occurrence, toxicity, and analysis  of  major  mycotoxins  in  food.  Int  J Environ Res Public Health 14: 632. https://doi.org/10.3390/ijerph14060632
Alwatban MA, Hadi S, Moslem MA. 2014. Mycotoxin production  in Cladosporium species  influenced by  temperature  regimes.  J  Pure  Appl  Microbiol 8: 4061 –4069.
[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2018.
Peraturan Badan Pengawas Obat dan Makanan Nomor 8 Tahun 2018 Tentang Batas Maksimum Cemaran  Kimia  dalam  Pangan  Olahan.  Badan Pengawas Obat dan Makanan, Jakarta.
Chadni Z, Rahaman MH, Jerin I, Hoque KMF, Reza MA.  2017.  Extraction  and  optimisation  of  red pigment  production  as  secondary  metabolites from Talaromyces verruculosus and its potential use  in  textile  industries.  Mycology  8:  48 –57. https://doi.org/10.1080/21501203.2017.130201 3
De  Clercq  N,  Vlaemynck  G,  Van  Pamel  E,  Van Weyenberg  S,  Herman  L,  Devlieghere  F,  De Meulenaer B, Van Coillie E. 2016. Isoepoxydon dehydrogenase ( idh ) gene expression in relation to  patulin  production  by Penicillium  expansum under different temperature and atmosphere. Int J Food Microbiol 220: 50 –57. https://doi.org/10. 1016/j.ijfoodmicro.2016.01.004
Cunha SC, Faria MA, Pereira VL, Oliveira TM, Lima AC, Pinto E. 2014. Patulin assessment and fungi identification  in  organic  and  conventional  fruits and  derived  products.  Food  Control  44:  185 – 190. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.03. 043
Dombrink-Kurtzman  MA.  2006.  The  isoepoxydon dehydrogenase  gene  of  the  patulin  metabolic pathway differs for Penicillium griseofulvum and Penicillium  expansum .  Antonie  van  Leeuwen- hoek  89:  1 –8. https://doi.org/10.1007/s1048200 5-9002-5
Eskola  M,  Kos  G,  Elliott  CT, Hajšlová  J,  Mayar  S, Krska  R.  2020.  Worldwide  contamination  of food-crops  with  mycotoxins:  Validity  of  the widely  cited  “FAO  estimate”  of  25%.  Crit  Rev Food  Sci  Nutr  60:  2773 –2789. https://doi.org/ 10.1080/10408398.2019.1658570
Farwell LH, Deakin G, Harris AL, Fagg G, Passey T, Verheecke-Vaessen  C,  Magan  N,  Xu  X.  2023. Cladosporium species:  The  predominant  spe- cies  present  on  raspberries  from  the  UK  and
Spain  and  their  ability  to  cause  skin  and  stig- mata infections. Horticulturae 9: 128. https://doi. org/10.3390/horticulturae9020128
Frisvad  JC.  2018.  A  critical  review  of  producers  of small lactone mycotoxins: Patulin, penicillic acid and moniliformin. World Mycotoxin J 11: 73 –100. https://doi.org/10.3920/WMJ2017.2294
Hammami W, Al-Thani R, Fiori S, Al-Meer S, Atia FA, Rabah D, Migheli Q, Jaoua S. 2017. Patulin and patulin producing Penicillium spp. Occurrence in apples and apple-based products including baby food. J Infect Dev Ctries 11: 343 –349. https://doi. org/10.3855/jidc.9043
Holm  DK,  Petersen  LM,  Klitgaard  A,  Knudsen  PB, Jarczynska  ZD,  Nielsen  KF,  Gotfredsen  CH, Larsen TO, Mortensen UH. 2014. Molecular and chemical characterization of the biosynthesis of the 6-MSA-derived meroterpenoid yanuthone D in Aspergillus  niger .  Chem  Biol  21:  519 –529. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.201 4.01.013
Ioi  JD,  Zhou  T,  Tsao  R,  Marcone  MF.  2017.  Mitiga- tion of patulin in fresh and processed foods and beverages.  Toxins  9:  157. https://doi.org/10.33 90/toxins9050157
[Kementan]  Kementerian  Pertanian.  2018.  Statistik Konsumsi  Pangan  Tahun  2018.  Kementerian Pertanian, Jakarta.
[Kementan]  Kementerian  Pertanian.  2019.  Produksi Buah-Buahan  di  Indonesia  Tahun  2014-2018. Kementerian Pertanian, Jakarta.
Lamboni Y, Nielsen KF, Linnemann AR, Gezgin YK, Hell K, Nout MJR, Smid EJ, Tamo M, van Boekel MAJS,  Hoof  JB,  Frisvad  JC . 2016.  Diversity  in secondary  metabolites  including  mycotoxins from strains of Aspergillus section nigri isolated from raw cashew nuts from Benin, West Africa. PLoS One 11: e0164310. https://doi.org/10.137 1/journal.pone.0164310
Lucena-Aguilar  G,  Sánchez-López  AM,  Barberán- Aceituno  C,  Carrillo-Ávila  JA,  López-Guerrero JA,  Aguilar-Quesada  R.  2016.  DNA  source selection for downstream applications based on DNA quality indicators analysis. Biopreserv Bio- bank  14:  264 –270. https://doi.org/10.1089/bio. 2015.0064
Luque  MI,  Andrade  MJ,  Rodríguez  A,  Bermúdez  E, Córdoba  JJ.  2013.  Development  of  a  multiplex PCR method for the detection of patulin-, ochra- toxin A- and aflatoxin-producing moulds in foods. Food  Anal  Methods  6:  1113 –1121. https://doi. org/10.1007/s12161-012-9516-1
Luque  MI,  Rodríguez  A,  Andrade  MJ,  Gordillo  R, Rodríguez  M,  Córdoba  JJ.  2011.  Development of  a  PCR  protocol  to  detect  patulin  producing moulds in food products. Food Control 22: 1831 –
1838. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2011.0
4.020
Nam MH, Park MS, Kim HS, Kim TI, Kim HG. 2015. Cladosporium  cladosporioides and C.  tenuissi- mum cause  blossom  blight  in  strawberry  in Korea. Mycobiology 43: 354 –359. https://doi.org/ 10.5941/MYCO.2015.43.3.354
Navale V, Vamkudoth KR, Ajmera S, Dhuri V. 2021. Aspergillus derived  mycotoxins  in  food  and  the environment:  Prevalence,  detection,  and  toxi- city.  Toxicol  Rep  8:  1008 –1030. https://doi.org/ 10.1016/j.toxrep.2021.04.013
Nielsen  JC,  Grijseels  S,  Prigent  S,  Ji  B,  Dainat  J, Nielsen KF, Frisvad JC, Workman M, Nielsen J. 2017. Global analysis of biosynthetic gene clus- ters reveals vast potential of secondary metabo- lite production in Penicillium species. Nat Micro- biol 2: 17044. https://doi.org/10.1038/nmicrobiol. 2017.44
Nielsen KF, Mogensen JM, Johansen M, Larsen TO, Frisvad  JC.  2009.  Review  of  secondary  meta- bolites  and  mycotoxins  from  the Aspergillus niger group.  Anal  Bioanal  Chem  395:  1225 – 1242. https://doi.org/10.1007/s00216-009-3081- 5
Notardonato I, Gianfagna S, Castoria R, Ianiri G, De Curtis  F,  Russo  MV,  Avino  P.  2021.  Critical review of the analytical methods for determining the mycotoxin patulin in food matrices. Rev Anal Chem  40:  144 –160. https://doi.org/10.1515/re vac-2021-0131
Ortega-Acosta SA. Reyes-García G, Vargas-Álvarez D,  Gámez-Vázquez  AJ,  Ávila-Perches  MA, Espinosa-Trujillo  E,  Bello-Martínez  J,  Damián- Nava A, Palemón-Alberto F. 2018. First report of Talaromyces verruculosus causing storage rot of groundnut  in  Mexico.  New  Dis  Rep  38:  27. https://doi.org/10.5197/j.2044-0588.2018.038.0 27
Oteiza  JM,  Khaneghah  AM,  Campagnollo  FB, Granato  D,  Mahmoudi  MR,  Sant’Ana  AS, Gianuzzi L. 2017. Influence of production on the presence  of  patulin  and  ochratoxin  A  in  fruit juices  and  wines  of  Argentina.  LWT –Food  Sci Technol  80:  200 –207. https://doi.org/10.1016/j. lwt.2017.02.025
Paterson  RRM.  2004.  The  isoepoxydon  dehydroge- nase gene of patulin biosynthesis in cultures and secondary  metabolites  as  candidate  PCR  inhi- bitors.  Mycol  Res  108:  1431 –1437. https://doi. org/10.1017/S095375620400142X
Paterson  RRM.  2007.  The  isoepoxydon  dehydroge- nase  gene  PCR  profile  is  useful  in  fungal taxonomy. Rev Iberoam Micol 24: 289 –293.
Petersen LM, Hoeck C, Frisvad JC, Gotfredsen CH, Larsen  TO.  2014.  Dereplication  guided  disco- very of secondary metabolites of mixed biosyn- thetic  origin  from Aspergillus  aculeatus .  Mole- cules 19: 10898 –10921. https://doi.org/10.3390/ molecules190810898
Petersen  LM,  Holm  DK,  Gotfredsen  CH,  Mortensen UH, Larsen TO. 2015. Investigation of a 6-MSA synthase  gene  cluster  in Aspergillus  aculeatus reveals 6-MSA-derived aculinic acid, aculins  A- B and epi-aculin A. Chem Bio Chem 16: 2200 – 2204. https://doi.org/10.1002/cbic.201500210 Paramastuti  R,  Rahayu  WP,  Nurjanah  S.  2021. Patulin-producing  mold,  toxicological,  biosyn- thesis,  and  molecular  detection  of  patulin.  Adv Food Sci Sustain Agric Agroind Eng 4: 93 –109. https://doi.org/10.21776/ub.afssaae.2021.004.0
2.3
Raja  HA,  Miller  AN,  Pearce  CJ,  Oberlies  NH.  2017. Fungal  identification  using  molecular  tools:  a primer for the natural products research commu- nity. J Nat Prod 80: 756 –770. https://doi.org/10. 1021/acs.jnatprod.6b01085
Rharmitt S, Hafidi M, Hajjaj H, Scordino F, Giosa D, Giuffre L, Barreca D, Criseo G, Romeo O. 2016. Molecular  characterization  of  patulin  producing and non-producing Penicillium species in apples from  Morocco.  Int  J  Food  Microbiol  217:  137- 140. http://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.1
0.019
Rodríguez  A,  Isabel  Luque  M,  Andrade  MJ, Rodríguez  M,  Asensio  MA,  Córdoba  JJ.  2011. Development of real-time PCR methods to quan- tify  patulin-producing  molds  in  food  products. Food  Microbiol  28:  1190 –1199. https://doi.org/ 10.1016/j.fm.2011.04.004
Rodríguez A, Rodríguez M, Andrade MJ, Córdoba JJ. 2012. Development of a multiplex real-time PCR to  quantify  aflatoxin,  ochratoxin  A  and  patulin producing  molds  in  foods.  Int  J  Food  Microbiol 155:  10 –18. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmic ro.2012.01.007
Salvatore MM, Andolfi A, Nicoletti R. 2021. The genus cladosporium:  A  rich  source  of  diverse  and bioactive  natural  compounds.  Molecules  26:  1- 45. https://doi.org/10.3390/molecules2613 3959
Snini SP, Tadrist S, Laffitte J, Jamin EL, Oswald IP, Puel  O.  2014.  The  gene  PatG  involved  in  the biosynthesis  pathway  of  patulin,  a  food-borne mycotoxin,  encodes  a  6-methylsalicylic  acid decarboxylase. Int J Food Microbiol 171: 77 –83. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.11.02 0
Tannous J, Atoui A, El Khoury A, Kantar S, Chdid N, Oswald IP, Puel O, Lteif R. 2015. Development of a real-time PCR assay for Penicillium expan- sum quantification  and  patulin  estimation  in apples.  Food  Microbiol  50:  28 –37. https://doi. org/10.1016/j.fm.2015.03.001
Tola  M,  Kebede  B.  2016.  Occurrence,  importance and  control  of  mycotoxins:  A  review.  Cogent Food Agric 2: 1-12. https://doi.org/10.1080/2331
1932.2016.1191103
Vidal  A,  Ouhibi  S,  Ghali  R,  Hedhili  A,  Saeger  SD, Boevre  MD.  2019.  The  mycotoxin  patulin:  An updated short review on occurrence, toxicity and analytical  challenges.  Food  Chem  Toxicol  129: 249 –256. https://doi.org/10.1016/j.fct.2019.04.0 48
Zhai MM, Li J, Jiang CX, Shi YP, Di DL, Crews P, Wu QX. 2016. The bioactive secondary metabolites from Talaromyces species.  Nat  Prod  Biopros pect 6: 1 –24. https://doi.org/10.1007/s13659-01 5-0081-3
Zhang X, Li Y, Wang H, Gu X, Zheng X, Wang Y, Diao J, Peng Y, Zhang H. 2016. Screening and identi- fication  of  novel  ochratoxin  A-producing  fungi from grapes. Toxins (Basel) 8: 1-14. https://doi. org/10.3390/toxins8110333
Zhang M, Tang J, Huang Z, Hu K, Li Y, Han Z, Chen X,  Hu  L,  Yao  G,  Zhang  H.  2018.  Deletion  of catalase  gene  cpeB  reduces Aspergillus  niger virulence in apple fruits. J Agric Food Chem 66: 5401 –5409. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.8b0 1841