BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 2, Nomor 2 (2020): 181 - 185 E-ISSN: 2714-8564

## Deteksi Molekuler Virus Dengue dan Chikungunya pada Nyamuk Aedes spp. di  Kecamatan Cilongok

## Dwi Iva Fitriana*, Endang Srimurni Kusmintarsih, Trisnowati Budi Ambarningrum
Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Jalan dr Suparno 63 Purwokerto 53122 Email: dwiivafitriana@gmail.com
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 29/08/2019 Disetujui  : 29/05/2020

## Abstract
Cilongok sub-district is one of the dengue and chikungunya endemic area in Banyumas regency. Virus detection in mosquitoes before infecting humans is an early warning to prevent outbreaks in endemic areas.  The purposes of this study  ware to determine  dengue and chikungunya  virus infections  in  Aedes  spp  from  Cilongok  sub-district.  This  study  was  conducted  in  four  villages (Cilongok,  Pernasidi,  Kalisari,  and  Jatisaba)  in  Cilongok  sub-district.  The  research  design  was purposive random sampling study. Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technique was carried out to detect dengue and chikungunya viruses in mosquitoes. The positive result analyzed descriptively to estimate potential of virus transmissions. The result showed that Aedes spp. mosquitoes in this study was negative in both dengue and chikungunya virus. Keywords : Aedes spp. , chikungunya virus, dengue virus, RT-PCR technique

## Abstrak
Kecamatan  Cilongok  merupakan  salah  kecamatan  endemis  DBD  dan  pernah  mengalami  KLB chikungunya.  Deteksi  virus  pada  nyamuk  sebelum  menginfeksi  manusia  penting  sebagai peringatan dini dalam upaya pencegahan wabah di daerah endemis. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui  infeksi  virus  Dengue  dan  Chikungunya  pada  nyamuk Aedes spp.  asal  kecamatan Cilongok.  Penelitian  ini  dilakukan  di  empat  desa  di  Kecamatan  Cilongok  yang  meliputi  Desa Cilongok, Pernasidi, Kalisari, dan Jatisaba. Desain penelitian ini adalah  studi purposive random sampling . Deteksi virus Dengue dan Chikungunya pada nyamuk dilakukan menggunakan teknik Reverse-Transcriptase  Polymerase  Chain  Reaction (RT-PCR).  Hasil  positif  virus  dianalisis secara  deskriptif  untuk  menggambarkan  potensi  transmisi  virus.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa nyamuk Aedes spp. yang tertangkap tidak mengandung virus Dengue dan Chikungunya. Kata kunci : Aedes spp. , chikungunya virus, dengue virus, teknik RT-PCR

## PENDAHULUAN
Demam  berdarah  dengue  (DBD)  merupakan penyakit tropik yang disebabkan oleh virus Dengue (DENV). Virus ini terdiri dari empat serotipe, yaitu DENV1,  DENV2,  DENV  dan  DENV4.  Penyakit DBD  ini  ditularkan  melalui  gigitan  nyamuk Aedes aegypti ( Ae.  aegypti )  dan Aedes  albopictus ( Ae. albopictus ) (Pusat Data Surveilans dan Epidemiologi  Kementerian  Kesehatan  RI,  2010). Kedua  nyamuk  ini  juga  menjadi  vektor  penyakit menular  chikungunya  yang  disebabkan  virus Chikungunya  (CHIKV).  CHIKV  termasuk re- emerging  virus  disease dan  sering  menyebabkan kejadian  luar  biasa  (KLB)  di  berbagai  negara  di kawasan  Asia,  termasuk  Indonesia  (Maha  & Subangkit, 2014). Kecamatan Cilongok merupakan salah  satu  kecamatan  yang  dilaporkan  endemis DBD  di  Kabupaten  Banyumas  (Widiati  & Lasmiati,  2015).    Pada  tahun  2009  terjadi  KLB chikungunya  dengan  jumlah  penderita  rata-rata  50 orang  setiap  desa  (BNC,  2009).  Kecamatan Cilongok  memiliki  cuaca  tidak  stabil  dan  curah hujan  yang  cukup  tinggi  pada  musim  penghujan, sehingga  berpotensi  untuk  perkembangbiakan
nyamuk Aedes spp.  (Dinas  Kesehatan  Kabupaten Banyumas, 2015).
Belum  adanya  vaksin  DBD  dan  pengobatan spesifik demam chikungunya menyebabkan pengendalian  vektor  nyamuk Ae.  aegypti dan Ae. albopictus merupakan  cara  yang  tepat  untuk mencegah  persebaran  kedua  wabah  penyakit tersebut (Suriptiastuti, 2016; Mahmud et al. , 2018). Informasi  keberadaan  virus  DENV  dan  CHIKV pada  vektor  juga  diperlukan  sebagai  upaya  dini pencegahan  wabah.  Informasi  ini  dapat  memberi gambaran  risiko  penularan  virus  pada  nyamuk sebelum  menginfeksi  manusia.  Keberadaan  virus DENV  dan  CHIKV  pada  vektor  dapat  dideteksi dengan  teknik Reverse  Transcriptase-Polymerase Chain  Reaction (RT-PCR)  (Macedo et  al. ,  2013). Teknik  RT-PCR  juga  dapat  digunakan  untuk mendeteksi serotipe virus DENV dan CHIKV yang sedang  bersirkulasi  di  suatu  wilayah.  Informasi  ini dibutuhkan dalam mengontrol dan mencegah DBD serta  Sindrom  Syok  Dengue  (SSD)  yang  terjadi akibat  infeksi  oleh  salah  satu  serotipe  yang kemudian  diinfeksi  oleh  serotipe  lain  (Nurfadly, 2009).  Dengan  demikian,  penelitian  ini  bertujuan
untuk mengetahui infeksi DENV dan CHIKV pada vektor nyamuk Aedes s pp.yang ditangkap.

## MATERI DAN METODE
Desain  penelitian  ini  merupakan  studi purposive  random  sampling. Sampel  nyamuk Aedes spp.  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini diambil  secara purposive di  empat  desa  endemis DBD di Kecamatan Cilongok, Kabupaten Banyumas  yang  meliputi  Desa  Pernasidi,  Kalisari, Jatisaba,  dan  Cilongok.  Deteksi  virus  Dengue (DENV) dan virus Chikungunya (CHIKV) dilakukan di Laboratorium Genetika dan Molekuler Fakultas  Biologi  dan  Laboratorium  Riset  Unsoed. Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  Maret hingga Juli 2019.

## Isolasi genom RNA virus
RNA  virus  diisolasi  dari  nyamuk Aedes spp. menggunakan  PureLink TM Viral  RNA/DNA  Mini Kit  (Invitrogen,  Cat.  No.12280050)  sesuai  dengan protokol kit (Mboera et al. , 2016). Prosedur isolasi diawali  dengan  pembuatan  larutan  sampel,  yaitu nyamuk Ae des  spp.  dimasukkan  ke  dalam microtube (Eppendorf) 1,5 mL, kemudian ditambahkan  200  µL  DEPC  water  dan  digerus menggunakan grinder .  Selanjutnya,  pembuatan lysate nyamuk  dibuat  dengan  20  µL  proteinase  K, 200  µL  sampel,  dan  200  µL lysis  buffer (mengandung 5,6 µg carrier RNA) dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube 1,5 mL dan di vortex 15 detik.  Setelah  homogen,  larutan  diinkubasi  selama 15 menit pada temperatur 56  °C dan disentrifugasi dengan  kecepatan  rendah. Lysate ditambahkan dengan 250 µL etanol absolut dan di- vortex selama 15  detik. Lysate tersebut  kemudian  diinkubasi selama 5 menit pada temperatur ruang (25  °C) dan disentrifugasi  dengan  kecepatan  rendah. Lysate dimasukkan  ke  dalam viral  spin  column bersama collection tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 6.800  ×g  selama  satu  menit  pada  temperature ruang.  Tahapan  selanjutnya  adalah  pencucian  I dilakukan  dengan  cara collection  tube dilepas  dan viral  spin  column dipasangkan  pada wash  tube baru,  kemudian  500  µL wash  buffer ditambahkan ke dalam viral spin column bersama wash tube baru tersebut dan disentrifugasi dengan kecepatan 6.800 ×g selama 1 menit pada temperatur ruang. Larutan dalam wash  tube dibuang.  Tahap  pencucian  I diulang sekali dan larutan dalam wash tube dibuang dan viral  spin  column dipasang  pada wash  tube baru  dan  disentrifugasi  dengan  kecepatan  13.000 ×g selama 1 menit pada temperatur ruang. Larutan sisa wash buffer pada wash tube dibuang, kemudian viral  spin  column dipasangkan  pada recovery  tube 1,5 mL dan 50 µL RNAse free-water ditambahkan pada viral  spin  column bersama recovery  tube tersebut  dan  diinkubasi  selama  1  menit  pada temperatur  ruang. Setelah  inkubasi,  larutan disentrifugasi  dengan  kecepatan  13.000  ×g  selama
1  menit  pada  temperatur  ruang.  Kemudian sebanyak  25  µL  RNAse free-water ditambahkan pada recovery tube , viral spin column dibuang dan diperoleh larutan RNA viral pada recovery tube 1,5 mL.  Larutan  RNA  yang  diperoleh  disimpan  pada suhu  -20 °C jangka waktu satu minggu atau -80 °C untuk waktu lama.

## Sintesis cDNA
Sintesis  cDNA  dilakukan  menggunakan Superscript ® III  First-Strand  Synthesis  System  for RT-PCR  (Invitrogen)  sesuai  dengan  protokol  kit (Sriprapun et  al. ,  2015).  Tahapan  sintesis  cDNA yaitu  10  µL mix sampel  dibuat  dengan  komposisi yang  terdiri  dari  1  µL  primer  oligo(dT),  1  µL  10 mM dNTP mix , dan 8 µL sampel RNA. Mix sampel tersebut diinkubasi pada temperatur 65 °C selama 5 menit  dan  langsung  didinginkan  dalam  es  (0°C) selama  1  menit.  Tahapan  berikutnya  adalah mix sintesis  cDNA  dibuat  dengan  komposisi  yang terdiri  dari  2  µL  10×  RT  buffer,  4  µL  25  mM MgCl 2 ,  2  µL  0,1  M  DTT,  1 µL  RNaseOUT TM (40 U/ µL), dan 1 µL Superscript ® III RT (200 U/ µL).
Sebanyak  10  µL mix sintesis  cDNA  ditambahkan ke  dalam mix sampel  dan  diinkubasi  pada temperatur  50  °C  selama  50  menit.  Reaksi dihentikan  dengan  melanjutkan  inkubasi  pada temperatur  85  °C  selama  5  menit,  kemudian didinginkan  dalam  es.  Sebanyak  1  µL  RNase  H ditambahkan  ke  dalam tube  mix dan  kemudian diinkubasi pada temperatur 37 °C selama 20 menit. Sebanyak  20  10  µ  larutan  cDNA  yang  diperoleh disimpan pada temperatur -20 °C.
Deteksi  DENV  (1-4)  dengan  teknik Nested RT - PCR Nested PCR  cDNA  DENV  menggunakan MyTaq™  HS  Red  Mix  (Bioline,  Cat.  No.BIO- 25047)  sesuai  dengan  protokol  kit.  Primer  yang digunakan  yaitu  primer  universal  Dengue:  D1 (5'-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG -3')  dan  D2  (5'–TTGCACCAACAGTCAATGT CTTCAGGTTC-3') yang akan menghasilkan amplikon  cDNA  berukuran  511  bp  (Sari et  al ., 2012).  Komposis  PCR  dibuat  dengan  volume  25 µL  yang terdiri dari : 12,5 µL 2X MyTaq HS Red Mix,  1  µL  primer forward D1  [0,4  µM/µL],  1  µL primer reverse D2  1  [0,4  µM/µL],  9,5  µL  ddH 2 O, dan 1 µL template cDNA [sampel 1: 48,72 ng/µL; sampel 2: 48 ng/µL]. PCR dijalankan pada kondisi : (i) predenaturasi (95° C; 1 menit), (ii) amplifikasi 35  siklus  yang  terdiri  dari  denaturasi  (95°  C;  15 detik), annealing (65°C;  15  detik),  dan  ekstensi (72°  C;  10  detik),  (iv)  post  ekstensi  (72°  C;  5 menit); dan (v) hold (4° C). Deteksi serotipe DENV menggunakan  primer forward D1  dengan  primer reverse spesifik  serotipe  virus  Dengue  yang  terdiri dari TS1 untuk serotipe DEN-l (5’– CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3')  menghasilkan amplikon  cDNA  berukuran  482  bp,  TS2  untuk serotipe  DEN-2    (5’–CGCCACAAGGGCCATGA
ACAG-3') menghasilkan amplikon DNA berukuran 119  bp,  TS3  untuk  serotipe  DEN-3  (5’–TAA CATCATCATGAGACAGAGC-3')  menghasilkan amplikon  DNA  berukuran  290  bp,  dan  TS4  untuk serotipe  DEN-4  (5'–CTCTGTTGTCTTAAACAA GAGA-3') menghasilkan amplikon DNA berukuran 392 bp. PCR mix dibuat sesuai jumlah sampel yang akan diperiksa. Komposisi mix PCR dibuat dengan volume  25  µL  yang  terdiri  dari  :  12,5  µL  2  × MyTaq HS Red Mix, 1 µL primer forward D1 [0,4 µM/µL], primer reverse (masing-masing dari TS1- TS4) 1 µL [0,4 µM /µL], ddH 2 O 9,5 µL, dan 1 µL [sampel  1:  48,72  ng/µL;  sampel  2:  48  ng/µL] template dari  amplikon  cDNA  tahap  1.  PCR dijalankan pada kondisi yaitu (i) predenaturasi (95° C;  1  menit;  (ii)  amplifikasi  35  siklus  yang  terdiri dari  denaturasi  (95°  C;  15  detik), annealing (D1/TS1-TS4 55° C; 15 detik), dan ekstensi (72° C;
10  detik);  (iv)  post  ekstensi  (72°  C;  5  menit);  dan
(v) hold (4° C). Sebanyak 10 µL produk nested RT- PCR dielektrofresis pada  gel  agarose 1,5%  dengan tegangan 80 V, 200 mA selama 47 menit.

## Deteksi CHIKV dengan RT-PCR
PCR cDNA virus Chikungunya menggunakan MyTaq™  HS  Red  Mix  (Bioline,  Cat.  No.BIO- 25047)  sesuai  dengan  protokol.  Primer  yang digunakan yaitu primer CHICK-1 (5’- ACCGGCGTCTACCCATTCATG T-3’) dan CHIK-2(5’GGGCGGGTAGTCCATGTTGTAGA- 3’) menghasilkan amplikon DNA berukuran 330 bp
(Sari et  al. ,  2012).  Komposis  PCR  dibuat  dengan volume 25 µL yang terdiri dari 12,5 µL 2X MyTaq HS  Red  Mix,  1  µL  primer forward (CHIK1)  [0,4 µM/µL],  1  µL  primer reverse (CHIK2)  [0,4  µM/ µL],  9,5  µL  ddH 2 O,  dan  1  µL  template  cDNA [sampel 1: 48,72 ng/µL; sampel 2: 48 ng/µL]. PCR dijalankan pada kondisi yaitu yaitu (i) predenaturasi  (95°  C;  1  menit;  (ii)  amplifikasi  35 siklus yang terdiri dari denaturasi (95° C; 15 detik), annealing (60°C; 15 detik), dan ekstensi (72° C; 10 detik);  (iv)  post  ekstensi  (72°  C;  5  menit);  dan  (v) hold (4°  C).  Sebanyak  10  µL  produk  RT-PCR dielektrofresis  pada  gel  agarose  1,5%  dengan tegangan 80 V, 200 mA selama 47 menit.

## Analisis Data
Data hasil deteksi virus Chikungunya (CHIKV)  dan  serotipe  virus  Dengue  (DENV) dianalisis  secara  deskriptif  untuk  mengetahui persentase  jumlah  positif  serta  jenis  serotipe  virus yang ditemukan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  deteksi  serotipe  DENV  baik  dari nyamuk  dewasa  hasil  tangkapan  maupun  nyamuk yang di- rearing untuk mengetahui adanya transmisi transovarial dari Kecamatan Cilongok dapat dilihat pada  Gambar  1.  Deteksi  serotipe  DENV  dengan metode nested PCR negatif.
Gambar  1. Hasil  deteksi  serotipe  Dengue  pada nyamuk Aedes spp.  dengan  metode nestedtwo  step RT-PCR.Sumuran  (M)  Marker  DNA100-bp;  (1) Sampel  nyamuk  Kecamatan  Cilongok  1;  (2) Sampel nyamuk Kecamatan Cilongok 2.
Virus  Dengue  (DENV)  pada  nyamuk  tidak terdeteksi, karena virus tidak berada di dalam tubuh nyamuk.  Disamping  itu,  konsentrasi  RNA  virus dalam  tubuh  nyamuk  terlalu  kecil,  sehingga  tidak terdeteksi saat  uji PCR (Ansori et al ., 2015). Hasil negatif  juga  dapat  diakibatkan  RNA  virus terdegradasi selama proses penyimpanan. Degradasi  menyebabkan  RNA  DENV  pada nyamuk Aedes tidak terdeteksi. Ketahanan virus ini dalam  tubuh  nyamuk  dipengaruhi  beberapa  faktor dan  salah  satu  yang  penting  adalah  rendah  atau tingginya  temperatur  yang  dapat  menggangu ketahanan  virus  dalam  tubuh  nyamuk.  Degradasi RNA  menyebabkan  amplifikasi  cDNA  tidak terjadi,  sehingga  serotipe  virus  tidak  dapat dideteksi. Degradasi RNA menyebabkan amplifikasi  tidak  terjadi  sehingga  serotipe  virus tidak dapat dideteksi. Selain degradasi RNA, waktu penangkapan  nyamuk  juga  dapat  mempengaruhi keberhasilan  deteksi  virus.  Penangkapan  nyamuk yang  baru  mengalami  eklosi  dari  pupa  (belum menghisap  darah)  memungkinkan  diperolehnya nyamuk  yang  tidak  mengandung  virus  (Fadilla et al. ,  2015).  Penangkapan  nyamuk  ketika  tidak terjadi  wabah  juga  dapat  menyebabkan  hasil deteksi  virus  Dengue  negatif  (Ansori et  al. ,  2015).
Faktor  lain  yang  dapat  menyebabkan  hasil  negatif deteksi  virus  Dengue  adalah  metode  yang digunakan.  Penelitian  transmisi transovarial virus Dengue  di  Banyumas  yang  dilakukan  oleh Wijayanti et  al. (2017)  menggunakan  dua  metode yang  berbeda,  yaitu immunohistochemistry  assay (IHC)  dan one  step RT-PCR  menunjukkan  hasil yang  berbeda.  Hasil  sampel Ae.  aegypti yang dilakukan  dengan  deteksi  IHC  positif  namun setelah  diuji  Kembali  dengan  RT-PCR  karena  RT- PCR hasilnya negatif.
Deteksi  virus  pada  nyamuk  dapat  digunakan untuk  mengetahui  adanya  transmisi transovarial virus  (Purnama et  al. ,  2017),  digunakan  sebagai peringatan  dini  pencegahan  wabah  DBD  dan
chikungunya di suatu daerah  (Macedo et al. , 2013; Morrison,  2014).  Deteksi  virus  pada  nyamuk  juga dapat  menduga  potensi  penularan  virus  tersebut pada  manusia  (Rohani et  al. ,  2005),  serta  deteksi serotipe DENV secara rutin di suatu wilayah dapat digunakan untuk memprediksi kemungkinan adanya  persebaran  wabah  (Agustiningtyas  & Lusiyana,  2017).  Deteksi  serotipe  virus  penting karena  dapat  terjadi  infeksi  sekunder  yang disebabkan  oleh  serotipe  berbeda  dan  dapat menimbulkan  SSD.  Demikian  pula  infeksi  yang disebabkan  oleh  dua  serotipe  atau  lebih  pada  satu individu  (infeksi  ganda)  dan  dapat  menyebabkan infeksi  yang  semakin  parah  (Ansori et  al. ,  2015). Berdasarkan  hasil  penelitian  sebelumnya,  serotipe yang  paling  dominan  yang  sering  menjadi penyebab  DBD  di  Provinsi  Jawa  Tengah  adalah DENV-3
(Prasetyowati & Nusa, 2012;
Kusmintarsih et al. , 2018).
Gambar  2. Hasil  deteksi  CHIKV  pada  nyamuk Aedes spp.  dengan  metode two  step RT-PCR  pada gel  agarose  1,5%.  Sumuran  (M)  Marker  DNA100- bp; (1) Sampel nyamuk Kecamatan Cilongok 1; (2) Sampel nyamuk Kecamatan Cilongok 2.
Hasil  deteksi  virus  Chikungunya  (CHIKV) pada  2  lungkang  ( pool )  nyamuk  dari  empat  desa negatif  (Gambar  2).  Berdasarkan  hasil  PCR tersebut,  CHIKV diduga tidak ditemukan di dalam tubuh  nyamuk dari lokasi penelitian (Ansori et al ., 2015).  Hasil  yang  berbeda  diperoleh  oleh Farraudière et  al. (2017),  deteksi  CHIKV  dengan metode qRT-PCR pada nyamuk Ae. aegypti betina di  Martinique  selama  terjadi  wabah  2013-2014 menunjukkan  hasil  positif  serta  hasil  negatif  pada nyamuk  betina  yang  di- rearing dari  pupa.  Hasil positif  CHIKV  pada  nyamuk Ae.  aegypti juga diperoleh  oleh  Zayed et  al. (2012)  pada  masa wabah  di  Al  Hodaya  Yemen  tahun  2011.  Deteksi CHIKV  dari  nyamuk Ae.  aegypti dan Ae. albopictus jantan  di  Thailand  ketika  wabah  tahun 2008-2009 juga positif (Thavara et al. , 2009). Hasil yang  berbeda  dapat  disebabkan  oleh  pengambilan sampel  nyamuk  pada  waktu  yang  berbeda,  hasil positif  CHIKV  pada  penelitian  Thavara et  al.
(2009),  Zayed et  al. (2012),  dan  Farraudière et  al.
(2017)  diperoleh  ketika  sampel  nyamuk  diambil pada waktu terjadinya wabah, sementara pengambilan  sampel  nyamuk  dalam  penelitian  ini tidak pada waktu terjadinya wabah. Selain itu RNA CHIKV  diduga  tidak  ditemukan  dalam  tubuh nyamuk  (Ansori et  al. ,  2015).  untuk  memberikan gambaran yang lebih komprehensip perlu ditambahkan  sampel  nyamuk  yang  lebih  banyak dari kecamatan Cilongok, sehingga potensi nyamuk terdeteksi DENV dan CHIKV semakin tinggi serta perlu  dilakukan  deteksi  virus  dengan  metode  yang lebih sensitif seperti realtime RT-PCR.

## SIMPULAN
Berdasarkan  deteksi  molekuler  menggunakan metode  RT-PCR,  nyamuk Aedes spp.  yang ditangkap di Kecamatan Cilongok tidak mengandung virus Dengue dan Chikungunya.

## DAFTAR  REFERENSI
Agustiningtyas,  I.  &  Lusiyana,  N.  2017.  Ovitrap Survey  and  Serotype  Identification  of Dengue  Virus  on Aedes sp  Mosquito  in Potorono,  Banguntapan,  Bantul,  Indonesia. International Journal of Mosquito Research , 4(5), pp. 32-37.
Ansori,  A.,  Sucipto,  T.,  Deka,  P.,  Ahwanah,  N., Churrotin,  S.,  Kotaki,  T.  and  Soegijanto,  S. 2015. Differences of Universal and Multiplex  Primer  for  Detection  of  Dengue Virus  from  Patients  Suspected  Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) in
Surabaya. Indonesian  Journal  of  Tropical and Infectious Disease , 5 (6), pp.147-151.
Banyumas News.Com (BNC). 2009. Ribuan Warga Cilongok  Terjangkit  Chikungunya,  Satu
Meninggal. [online]
Available at: https://banyumasnews.com/7972/ribuan- warga-cilongok-terjangkit-chikungunya- satu-meninggal/[Accessed 10 August 2019].
Dinas  Kesehatan  Kabupaten  Banyumas.  2015.
Profil  kesehatan  kabupaten  Banyumas . Banyumas:  Dinas  Kesehatan  Kabupaten Banyumas.
Fadilla,  Z.,  Hadi,  U.K.  &  Setiyaningsih,  S.  2015.
Bioekologi Vektor Demam Berdarah Dengue (DBD) Serta Deteksi Virus Dengue pada Aedes  aegypti (Linnaeus)  dan Ae. albopictus (Skuse)  (Diptera:  Culicidae)  di Kelurahan  Endemik  DBD  Bantarjati,  Kota Bogor. Jurnal Entomologi Indonesia , 12(1), p. 31.
Farraudière,  L.,  Sonor,  F.,  Crico,  S.,  Étienne,  M., Mousson,  L.,  Hamel,  R.,  Missé,  D., Failloux,  A.B.,  Simard,  F.  &  Yébakima,  A. 2017.  First  Detection  of  Dengue  and Chikungunya viruses in Natural Populations of Aedes  aegypti in  Martinique  during  the
2013–2015  Concomitant  Outbreak. Revista Panamericana de Salud Pública , 41, p. 63.
Kusmintarsih,  E.S.,  Hayati,  R.F.,  Turnip,  O.N., Yohan,  B.,  Suryaningsih,  S.,  Pratiknyo,  H., Denis, D. & Sasmono, R.T. 2018. Molecular
Characterization of Dengue Viruses Isolated from Patients
in Central Java, Indonesia. Journal  of  Infection  and  Public Health , 11 (5), pp. 617-625.
Macedo,  G.A.,  de  Araújo,  J.M.G.,  Schatzmayr, H.G.,  Costa,  F.A.C.,  de  Filippis,  A.M.B., Santos,  F.B.D.  &  Nogueira,  R.M.R.  2013. Virological  Surveillance  for  Early  Warning of Dengue Epidemics in The State of Rio de Janeiro,  Brazil. Transactions  of  the  Royal Society  of  Tropical  Medicine  and  Hygiene , 107(3), pp. 141-146.
Maha, M.S. & Subangkit. 2014. Manifestasi Klinis Infeksi  Virus  Chikungunya  pada  Kejadian Luar  Biasa  di  Indonesia. Jurnal  Biotek Medisiana Indonesia , 3(1), pp. 11-16.
Mahmud,  M.A.F.,  Mutalip,  M.H.,  Lodz,  N.A.  & Shahar,  H.  2018.  Study  on  key Aedes spp Breeding  Containers  in  Dengue  Outbreak Localities in Cheras District, Kuala Lumpur.
International Journal of Mosquito Research , 5(2), pp. 23-30.
Mboera, L.E., Mweya, C.N., Rumisha, S.F., Tungu, P.K.,  Makange,  M.R.,  Misinzo,  G.,  De Nardo,  P.,  Vairo,  F.  &  Oriyo,  N.M.  2016. The  Risk  of  Dengue  Virus  Transmission  in Dar  Es  Salaam,  Tanzania  during  An Epidemic  Period  of  2014. PLoS  Neglected Tropical Diseases , 10(1), p.e0004313.
Morrison, T.E. 2014. Re-emergence of Chikungunya  Virus. Journal  of  virology , 88 (20), pp. 11644-11647.
Nurfadly,  2009.  Deteksi  dan  Penentuan  Serotipe Virus  Dengue  Tipe  1  dari  Nyamuk  Aedes aegypti  dengan  Menggunakan  Reverse Transcriptase  Polymerase  Chain  Reaction (RT-PCR)  di  Kota  Medan. Tesis .  Sekolah Pascasarjana  Universitas  Sumatera  Utara, Medan.
Prasetyowati,  P.  &  Nusa,  R.  2012.  DHF  Cases dominated by DEN-3 Serotype in The West Java  Province. Health  Science  Journal  of Indonesia , 3 (1 Jun), pp. 23-26.
Purnama,  S.G.,  Kardiwinata,  P.  &  Baskoro,  T. 2017. USDI (Unit Sumber Daya Informasi). [Online] Available at:
https://simdos.unud.ac.id/uploads/file_penel itian_1_dir/b3ef1c0e0703aa249103eeec774c
07f3.pdf [Accessed 10 Januari 2019].
Pusat Data Surveilans dan Epidemiologi Kementerian  Kesehatan  RI.  2010.  Demam Berdarah Dengue di Indonesia Tahun 1968-
2009. Buletin  Jendela  Epidemiologi ,  2,  pp.
1-14.
Rohani, A., Zamree, I., Lee, H.L. and Mustafakamal, I., Norjaiza, M.J., Kamila, D. 2005.  Detection  of  Transovarian  Dengue Virus  for  Field  Caught Aedes  aegypti And Aedes  albopictus Mosquito  Using  C6/36 Cell  Line  and  RT-PCR. Trop  Biomed , 22 , pp. 149-54.
Sari,  T.  F.,  Joharina,  A.  S.  &  Anggraeni,  Y.  M. 2012. Identifikasi  Serotipe  Virus  Dengue Pada  Nyamuk  Aedes  aegypti  Dan  Aedes albopictus Di Kota Salatiga Dengan Metode RT-PCR .  Salatiga:  Balai  Besar  Penelitian dan  Pengembangan  Vektor  dan  Reservoir Penyakit Salatiga.
Sriprapun, M., Laosakul, C., Krajiw, S., Arunyingmongkol,  K.,  Siriyasatien,  P.  & Kulwichit,  W.  2015.  Time  Course  of Concurrent  Infection  with  Dengue  Virus Serotypes  2  and  4  Detected  in  Urine. Asian Biomedicine , 9(2), pp. 197-202.
Suriptiastuti,  2016.  Re-emergensi  Chikungunya: Epidemiologi  dan  Peran  Vektor  pada Penyebaran  Penyakit. Universa  Medicina , 26(2), pp. 101-110.
Thavara,  U.,  Tawatsin,  A.,  Pengsakul,  T.,
Bhakdeenuan, P., Chanama, S., Anantapreecha, S., Molito, C., Chompoosri, J.,  Thammapalo,  S.,  Sawanpanyalert,  P.  & Siriyasatien, P. 2009. Outbreak of Chikungunya  Fever  In  Thailand  and  Virus Detection  In  Field  Population  of  Vector Mosquitoes, Aedes  aegypti (L.)  and Aedes albopictus Skuse  (Diptera:  Culicidae).
Southeast  Asian  JTrop  Med  Public  Health , 40(5), pp. 951-962.
Widiati  &  Lasmiati.  2015.  Beberapa  Aspek
Entomologi Pendukung Meningkatnya
Kasus. Jurnal Ekologi Kesehatan , 14(4), pp. 309-317.
Wijayanti,  S.P.M.,  Anandari,  D.  &  Maqhfiroch, F.A. 2017. Vertical Transmission of Dengue Virus  on  Field  Mosquitoes  in  Banyumas
Regency, Central Java, Indonesia. International  Journal  of  Public  Health  and Clinical Sciences , 4(3), pp. 109-119.
Zayed,  A.,  Awash,  A.A.,  Esmail,  M.A.,  Al- Mohamad,  H.A.,  Al-Salwa,  M,  Al-Jasari, A.,  Medhat,  I.,  Morales-Betoulle,  M.  dan Mnzava, A. 2012. Detection of Chikungunya Virus in Aedes aegypti during 2011 Outbreak in Al Hodayda, Yemen. Acta Tropica, 123, pp. 62– 66.