PENGARUH EKSTRAK ETANOL DAUN KELOR ( Moringa oleifera Lam . )

## TERHADAP JUMLAH SEL MAST PADA MENCIT( Mus musculus )

## MODEL ENDOMETRIOSIS
Dina Novarita Kusuma Wardani 1 , Hendy Hendarto 2 , Widjiati 3
1 Mahasiswa Ilmu Kesehatan Reproduksi Jenjang Magister, Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya
2 Departemen Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, RSUD Dr. Soetomo
3 Departemen Embriologi Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga e-mail : dinanovarita@gmail.com

## ABSTRAK
Sel  mast  memainkan  peran  penting  dalam  respon  imun  bawaan  dan  secara  signifikan meningkat  pada  endometriosis.  Protease  yang  disekresi  oleh  sel  mast    memainkan peran penting dalam fibrogenesis. CRH dan akumulasi estrogen dapat mengaktifkan sel mast untuk melepaskan tryptase, mengaktifkan PAR-2, yang menyebabkan peningkatan sekresi VEGF, IL-8, dan IL-6 dan proliferasi jaringan ektopik. Daun kelor mengandung 46  antioksidan  dan  36  antiinflamasi.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk membuktikan  pengaruh  daun  kelor  terhadap  penurunan  jumlah  sel  mast  pada  mencit (Mus  musculus)  model  endometriosis.  Jenis  penelitian  ini  adalah  eksperimental laboratoris.  Pembuatan  model  endometriosis  dengan  diinduksi  oleh  siklosporin  A, jaringan  endometrium,  dan  etinil  estradiol  dan  dilakukan  pada  24  ekor  mencit  betina umur 2-3 bulan dengan berat 20-30 gram. Subjek penelitian dibagi menjadi 2 kelompok yaitu  kontrol  dan  perlakuan.  Kedua  kelompok  menjadi  model  endometriosis  pada  hari ke-14. Selanjutnya pada  hari ke-15, kelompok kontrol diberi NaCMC 0,5%, sedangkan kelompok perlakuan diberikan terapi ekstrak etanol daun kelor dengan dosis 0,35 mg/g BB/ hari. Hari ke-29 mencit diterminasi dengan dislokasio os cervikalis dan melakuakn pemeriksaan  jumlah  sel  mast  dengan  pewarnaan  Hematoxillin  Eosin.  Hasil  penelitian menunjukkan  rerata  jumlah  sel  mast  pada  kelompok  kontrol  adalah 8.13  +  2.97 kelompok perlakuan adalah 1.90  +  1.88 . Pada  uji Mann  Whitney  didapatkan  nilai p  = 0,00.  Kesimpulan  dari  penelitian  ini  adalah  pemberian  ekstrak  etanol  daun  kelor (Moringa oleifera Lam.) terbukti dapat menurunkan jumlah sel mast pada mencit  (Mus musculus) model endometriosis.
Kata Kunci : sel mast, endometriosis, daun kelor, mencit

## ABSTRACT
Mast  cells  play  an  important  role  in  the  innate  immune  response  and  they  are significantly  elevated  in  endometriosis.  Proteases  secreted  by  mast  cells  play  an important role in fibrogenesis. CRH and estrogen accumulation can activate mast cells to release tryptase, activating PAR-2, which causes increased secretion of VEGF, IL-8, and IL-6  and  ectopic tissue proliferation.  Moringa leaves  contain 46 antioxidants and 36  anti-inflammatory. This  research  aimed  to  demonstrate  the  effect  of  ethanolic Moringa oleifera leaf extract on mast cell count in endometriosis mice model. This was an animal laboratory experimental study. Endometriosis was induced by administration of  cyclosporine  A,  human  endometrium  tissue  and  ethynil  estradiol  in  24  female  mice which  2-3  month  ages  with  20-30  g  average  of  body  weight  were  used.  Study  subject was divided into 2 groups consisting of control group and treatment group. Both groups became  models  of  endometriosis  on  day  14.  Then  on  the  15th  day, positive  control group  is  given  solution  Na-CMC  0,5%,  while  treatment  group  given  dose  0,35  mg/g BW/day. On  the  29th  day  termination  with  dislocatio  os  cervicalis  and  then  take  the peritoneal  tissue.  the  number  of  mast  cells  was  examination  with  Hematoxillin  Eosin staining. The results showed the average number of mast cells in the control group was 8.13 + 2.97 and the treatment group was 1.90 + 1.88. In Mann Whitney test obtained p value  =  0.00.  The  conclusion  of  this  research  is  giving  the  Moringa  leaf  ethanolic extract  (Moringa  oleifera  Lam.)  proven  to  decrease  the  number  of  mast  cells  in endometriosis mice model.
Keywords : mast cells, endometriosis, moringa leaf, mice

## 1.      PENDAHULUAN
Endometriosis            didefinisikan sebagai adanya jaringan seperti
endometrium  di  luar  rahim,  yang menginduksi  reaksi  inflamasi  kronis (Hendarto et  al .,  2014).  Endometriosis merupakan  suatu  kelainan  ginekologik yang  sering  diderita  perempuan  usia reproduksi.  Struktur  panggul  paling sering  terkena,  tapi  endometriosis  bisa melibatkan organ ekstrauterin  yang jauh seperti  paru-paru  (Azizad  dan  Clarke, 2014).    Diperkirakan    5-10%    dari populasi wanita secara umum
dipengaruhi  oleh  endometriosis,  dengan prevalensi  yang  lebih  tinggi  (20-30%) di  kalangan  wanita  infertil,  sehingga mendukung  hubungan  kausal  antara endometriosis  dan  infertilitas  (Giudice et al ., 2010). Penelitian lain menunjukkan  25%  sampai  50%  wanita inferil    menderita    endometriosis    dan 30%  sampai  50%  dari  wanita  dengan endometriosis     itu     infertil     (ASRM, 2012).
Proses angiogenesis atau pembentukan  pembuluh  darah  baru mempunyai pengaruh  besar  dalam perkembangan progresivitas lesi endometriosis  yang  ditandai  dengan peningkatan luas implan
lesi endometriosis.  Sekresi  VEGF  oleh aktivasi sel mast pada jaringan endometriosis  dapat  dihambat  dengan mencegah  aktivasi Nuclear  Factor
KappaB (NF-κB). Penelitian yang dilakukan Zhang et al . (2015)
membuktikan  bahwa  quercetin  dapat menginduksi  apoptosis  sel  kanker  colon manusia  melalui  inhibisi  NF-κB.  Kelor mengandung flavonoid, sedangkan kandungan   flavonoid   tertinggi   pada kelor  ( Moringa  oleifera Lam.)  adalah Quercetin  dan  Kaempferol.  Penelitian Nieman  (2007)  menunjukkan  bahwa ekstrak  air  daun  kelor  memberikan aktivitas   antiinflamasi   secara   invitro
dengan  mekanisme  penghambatan  NF- κB.
NF-κB dapat menyebabkan peningkatan sitokin proinflamasi,
sedangkan  sitokin  proinflamasi  juga berkontribusi  terhadap  pertumbuhan  sel mast (Min et  al., 2007).  Sel mast berperan  penting  pada  awal  dan  akhir fase  inflamasi  sebagai  respon  terhadap imunoglobulin    E    (Ig    E)    dalam pelepasan histamine, protease, prostaglandin,  dan  beberapa  sitokin inflamasi (Galli et al., 2005).
Berdasarkan    penelitian   Min et   al. (2007)  menunjukkan  bahwa  quercetin dapat  menghambat  ekspresi  sitokin  pro inflamasi  pada  sel mast .  Quercetin melakukan  block  terhadap  aktivasi  p38 mitogen-activated protein kinase
(MAPK)  dan  NF-κB,  oleh  karena  itu sitokin  pro  inflamasi  melemah  (Min et al., 2007).
Saat  ini  penelitian  dan  uji  klinis tentang  fungsi  kelor  sebagai  obat  mulai berkembang  meskipun  manfaat  dan khasiatnya  belum  banyak  diketahui  oleh masyarakat.  Penemuan  terbaru  adalah fungsi  daun  kelor  sebagai  farmakologis, yaitu  antimikroba,              antijamur, antihipertensi, antihiperglikemik, antitumor,  antikanker,  pro-implantasi (Toma  dan    Deyno,    2014).  Belum banyak penelitian tentang efek penggunaan  ektrak  daun  kelor  terhadap kesehatan  reproduksi  wanita,  sehingga penelitian ini bertujuan untuk Membuktikan pengaruh pemberian
ekstrak  etanol  daun  kelor  ( Moringa oleifera Lam.)  terhadap  penurunan jumlah  sel mast pada  mencit  ( Mus musculus ) model endometriosis.
2.         MATERI DAN METODE Jenis  penelitian  yang  digunakan adalah true experimental dengan menggunakan  rancangan  acak  lengkap randomized post  test only control group design. Populasi   dalam   penelitian   ini
© (2017) Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
adalah  mencit  ( Mus  musculus )  galur Balb/c  betina,  dengan  jumlah  sampel yang   digunakan   sebanyak   24    ekor mencit yang dibagi menjadi 2 kelompok dan  setiap  kelompok  memenuhi  kriteria inklusi  antara  lain  :  berumur  2-3  bulan, sehat   dan   anatomi   tampak   normal, sudah  pernah  beranak  1  kali,  bobot minimal      20-30    gram,     serta   belum pernah digunakan sebagai obyek penelitian sebelumnya. Bahan  yang  digunakan  untuk penelitian  ini  yaitu  lesi  pada  jaringan peritoneum mencit model endometriosis, ekstrak etanol daun kelor yang  didapatkan  dari  UPT  Materia Medica  Batu  Malang,  siklosporin  A ( sandimmun ), ethynil    estradiol , penicllin  200  IU/ml,  streptomisin  200 μgr/ml., water  fluid  injection ,  jaringan endometrium dari pasien post
histerektomi  dengan  tumor  pada  uterus,
Na CMC 0,5%, pewarnaan Hematoxylin Eosin , phosphate buffered saline (PBS), air PDAM untuk minum.
Pembuatan mencit model endometriosis diawali dengan melakukan  aklimatisasi  pada  mencit selama   7   hari.   Selanjutnya   mencit dibagi menjadi 2 kelompok secara acak. Pembuatan    model    endometriosis dimulai dengan pemberian injeksi siklosporin  A  10  mg/kg  BB  dan ditambah  injeksi  jaringan  endometrium wanita dengan tumor jinak uterus secara membuta  sebanyak  0,1  ml  selama  60 detik    kemudian    diinjeksi ethinyl estradiol 20.000  IU  0,1  ml/mencit/hari diberikan  secara  IM  di  femur  pada  hari 1  dan  5.  Jaringan  endometrium  diambil dari  bahan  uterus  tumor  jinak,  yang disimpan  di  PBS  (phosphate  buffered saline).   Dilakukan  washing 2 x  dengan alat  sentrifugal  dengan  putaran  2500 rpm.  Supernatan  dibuang  kemudian ditambahkan  PBS,  penicillin  200  IU/ml dan  streptomisin  200  μgr/ml.  diambil dengan   syringe   3   ml   jaringan   basah
endometrium.  Pada  hari  ke-14  menjadi mencit model endometriosis.
Proses  ekstraksi  daun  kelor dilakukan  dengan  metode  maserasi dengan pelarut alkohol 96%. Daun kelor diambil  dari  daerah  yang  sama,  dan kebun    yang    sama,    usia    pohon    sama yaitu  usia  3  tahun,  pada  urutan  ranting yang  sama,  dan  di  jam  yang  sama. Ekstrak  etanol  daun  kelor  ( Moringa oleifera Lam . ) yang digunakan merupakan hasil ekstraksi di
Laboratorium  Materia  Medica,  Batu,
Malang.  Ekstrak  daun  kelor  dibuat dengan    maserasi    daun    kelor    segar selama  2  hari  dengan  suhu  30-35 o C kemudian  dihancurkan  menggunakan blender,  dan  didapatkan  serbuk  daun kelor.  Serbuk  daun  kelor  sebanyak  100 g  ditambahkan  pelarut  etanol  96% sebanyak  100  ml,  dimasukkan  ke  dalam toples  dan ditambahkan  etanol 96%  lagi sebanyak  1  L,  kemudian  ditutup  dan dibiarkan selama 48 jam terlindung dari sinar  matahari.  Campuran  itu  disaring sehingga     didapat     maserat.     Ampas dimaserasi       dengan       etanol       96% menggunakan  prosedur  yang  sama. Maserasi  dilakukan  sampai  didapat maserat   yang   jernih   dengan   shaker digital  kecepatan  50  rpm.  Hasil  ekstrak cair  diuapkan  dengan rotary  evaporator selama 2 jam (Husin , 2017).
Perhitungan  dosis  ekstrak  etanol daun  kelor  yang  akan  diberikan  ke mencit berdasarkan
penelitian sebelumnya pada tikus yaitu 250 mg /kg BB  yang  dikonversi  berdasarkan  tabel konversi  Lauren  (2008).  Dosis  estrak etanol  daun  kelor  setelah  dihitung  dan dikonversi maka didapatkan dosis sebesar 0,35 mg/g BB. Pemberian terapi untuk  kelompok  perlakuan  diberikan secara  peroral  menggunakan  sonde lambung  dan  sebelumnya  disuspensi dengan  menggunakan  larutan  Na  CMC 0,5%.  Pemberian  Na  CMC  dapat membantu   ekstrak   etanol   daun   kelor
untuk   larut   dengan   air.   pemberian ekstrak  etanol  kelor  selama  14  hari. Setelah    itu    mengorbankan    mencit dengan  cara dislokasi  os  cervikalis dan seketika  darah  akan  berhenti  mengalir. Mencit  yang telah mati ditandai dengan :  mata  redup,  reflek  pupil  negatif,  dan denyut jantung negatif.
Penelitian  dilakukan  pada  bulan Maret   2018   sampai   Mei   2018   di kandang  hewan  coba  dan  Laboratorium Patologi  Veteriner  Fakultas  Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.

## 3.   HASIL DAN DISKUSI
Hasil Gambar   2    Jumlah   sel mast pada jaringan endometriosis mencit ( Mus musculus ) model  endometriosis  pada kelompok  yang  diberikan ekstrak  etanol  daun  kelor Pemeriksaan         sel mast menggunakan metode pewarnaan hematoxylin eosin . Data jumlah sel mast diperoleh  dari  data  skoring  menurut Klopfleisch    (2013).    Skor    jumlah    sel mast diperoleh  dengan  cara  menghitung sel mast pada  5  lapang  pandang dengan menggunakan pembesaran 400x, kemudian  dijumlah  dan  dikelompokkan menurut  skor Klopfleisch .  Pemeriksaan jumlah    sel    mast    menggunakan mikroskop  cahaya  merk  nikon  H600L dan    disambungkan    dengan    kamera digital  DS  Fi2  300  megapixel  dan software pengolahan  gambar Nikon Image System.
Gambar   1   Jumlah   sel mast pada jaringan endometriosis
mencit  ( Mus  musculus )
model  endometriosis  pada kelompok kontrol
Tabel  1.  Rerata  dan  simpangan  baku jumlah sel mast
Kelompok         Jumlah sel mast
Rerata + SD
X1         Kontrol              8.13 + 2.97
X2         Perlakuan           1.90 + 1.88
Tabel  1  menunjukkan  rerata  dan simpangan  baku  jumlah  sel mast pada mencit ( Mus musculus ) model endometriosis  antara  kelompok  kontrol dengan  kelompok  yang  mendapat  terapi ekstrak  daun  kelor  ( Moringa  oleifera Lam.).    Tabel    distribusi    frekuensi tersebut menunjukkan adanya penurunan  jumlah  sel mast pada kelompok perlakuan. Analisis  normalitas  distribusi data  menggunakan  uji Shapiro  wilk karena sampel dalam penelitian berjumlah    kurang    dari    50.    Distribusi data  normal  apabila  nilai  p  >  0,05.
Berdasarkan hasil uji normalitas menunjukkan  bahwa  jumlah  sel mast pada jaringan endometriosis mempunyai  distribusi  data  tidak  normal
dengan  nilai  p  =  0,000.  Selanjutnya dilakukan    uji    homogenitas    varian dengan  menggunakan  uji  Lavene  dan didapatkan nilai signifikansi kurang dari 0,05  sehingga  asumsi  homogen  tidak terpenuhi.     Data   variabel   jumlah   sel mast setelah uji normalitas dan homogenitas selanjutnya dianalisis dengan menggunakan uji Mann Whitney untuk membandingkan nilai dua kelompok.  Hasil  uji Mann  Whitney didapatkan   perbedaan   bermakna   (p   < 0,05)  antara  kelompok  kontrol  dengan kelompok  perlakuan  dengan  nilai  p  = 0.000.  Sehingga  kesimpulan  yang  dapat diambil adalah  terdapat perbedaan
jumlah  sel mast yang  signifikan  antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.
4.   Diskusi dan pembahasan
Sel mast merupakan     sel penting  dari  sistem  imun  dan  berasal dari hematopoietic  lineage atau myeloid lineage. Sel mast berasal  dari  sel progenitor    pluripotent dari bone marrow ,  dan  matur  dibawah  pengaruh c-kit  ligand dan stem  cell  factor. Sel mast dapat ditemukan di sel mukosa dan epitel pada seluruh tubuh (Krystel et al ., 2016).  Sel mast secara  signifikan meningkat    pada    endometriosis. Protease yang  disekresi  oleh  sel mast memainkan peran penting dalam
fibrogenesis (Kempuraj et al., 2004) . sel mast akan  mengeluarkan  enzym,  seperti tryptase yang akan menstimulasi
protease-activated receptor (PAR-2).
Penelitian  yang  dilakukan  oleh Kempuraj et  al. (2004)  menunjukkan peningkatan   jumlah   sel mast pada
pasien endometriosis dibandingkan dengan pasien-pasien tanpa endometriosis    atau    sebagai    kontrol
(17.6  +  9.4  sel  mast/mm),  cara mendeteksi  peningkatan  sel mast yaitu dengan  mendeteksi  peningkatan  enzim triptase  yang  dihasilkan  oleh  sel mast yang   mengindikasikan   adanya   reaksi
alergi  yang  mendasari  terjadinya  reaksi peradangan pada endometriosis.
Penelitian ini menggunakan mencit   betina   sebagai   hewan   coba model  endometriosis  karena  memiliki anatomi yang homolog dengan manusia. Pembuatan model hewan coba endometriosis  membutuhkan  waktu  14 hari    dan    selanjutnya    salah    satu kelompok    diberikan    terapi    ekstrak etanol  daun  kelor  dengan  dosis  0,35 mg/g  BB/hari  selama  14  hari.  Ekstrak etanol    daun    kelor    mengandung    salah satu senyawa anti-inflamasi yaitu quercetin yang    diduga    dapat menurunkan  aktivitas  sel mast melalui jalur  NFkB.  Penelitian  yang  dilakukan oleh Masyhur dkk. (2011) menunjukkan bahwa  quercetin  dapat  menurunkan ekspresi  protein  proinflamasi  penyebab aterosklerosis  melalui  penghambatan aktivasi NFkB.
Mencit    dikorbankan    pada    hari ke-29  dan  melakukan  pemeriksaan jumlah  sel mast menggunakan  metode histologi dengan pewarnaan hematoxylin  eosin. Berdasarkan  hasil analisa statistik Mann Whitney
menunjukkan  perbedaan  bermakna  dan terdapat   penurunan   jumlah   sel mast pada  kelompok  yang  diberikan  terapi ekstrak  etanol  daun  kelor  dibandingkan kelompok kontrol dengan nilai p < 0,05.
Flavonoid  memiliki  kandungan fitokimia yang berfungsi sebagai antioksidan  dan  antiinflamasi  terhadap sel  dengan  stres  oksidatif.  Mekanisme antiinflamasi pada flavonoid yaitu dengan  menurunkan  stimulus  inflamasi sehingga    IKK    kompleks    yang    terdiri dari  IKKα,  IKKβ,  dan  IKKγ  tidak melepaskan  salah  satu  komponennya yaitu  IKKα.  Tidak  lepasnya  IKKα  dari struktur  IKK  kompleks  mengakibatkan menurunyya  fosforilasi  IKKα  menjadi IkB.    Adanya    penurunan    fosforilasi IKKα       menyebabkan       IkB       tidak
mengalami  degradasi  proteosomal  dan menurunnya aktivasi NFkB untuk
melakukan transkripsi di nukleus
(Yilmaz et al., 2011).

## 5.      SIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dan
pengolahan data statistik maka
disimpulkan  bahwa  Pemberian  ekstrak etanol  daun  kelor  ( Moringa  oleifera Lam.)    dapat    menurunkan    jumlah    sel mast pada   mencit   ( Mus   musculus ) model endometriosis.
Berdasarkan  penelitian  yang  telah dilakukan maka dapat disarankan bahwa perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut tentang  tingkat  fertilitas  mencit  setelah diberikan    terapi    ekstrak    etanol    daun kelor ( Moringa oleifera Lam.).

## DAFTAR PUSTAKA
Azizad,    P.    and    Clarke,    D.    2014.
‘Thoracic endometriosis syndrome:  case  report  and review  of  the  literature’. Permanente J . 18:61 – 65.
Giudice, L. C. 2010. ‘Endometriosis’. N Engl J Med. 362:2389-2398.
Giudice,  L.  C.,  Swiersz,  LM.,  Burney, RO.   2010. ‘Endometriosis. In:  Jameson  JL,  De  Groot  LJ (eds).  Endocrinology’. New York: Elsevier, , 2356– 2370.
Healy,         D.L., Rogers,         P.A., Hii, L., Wingfield,      M.      1998.
‘Angiogenesis:  a  new  theory
for endometriosis’. Hum Reprod Update. 4(5):736-40.
Hendarto, H. 2012. ‘ Pathomechanism of Infertility  in    Endometriosis’.
In    Endometriosis    basic concept  and  current  research trends. Intech : 343-353.
Hendarto,    H.    2015.    ‘ Endometriosis    : dari  aspek     teori     sampai penanganan  klinis’ .  Surabaya
:  Airlangga  University  Press (AUP)
Nieman,    D.    2007.    ‘Quercetin’s Influence    on    Exercise- Induced  Changes  in  Plasma Cytokines  and  Muscle  and Leukocyte  Cytokine  mRNA’ . Journal of Applied Pysiology. 103(5):1728-1735.
Zhang , X.,  Zhang,  S.,      Yin , Q.,  and Zhang,   J.   2015 .   ‘Quercetin induces  human  colon  cancer cells  apoptosis  by  inhibiting the  nuclear  factor-kappa  B Pathway’. Pharmacognozy M . 11(42): 404-409.
Galli, SJ., Kalesnikoff, J., Grimbaldeston, MA., Piliponsky,  AM.,  Williams, CM.,   and   Tsai,   M.   2005. ‘Mast  cells  as  “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent   advances’. Annu   Rev
Immunol . 23: 749–86.
Min,  Y.D.,  Choi.  C.H.,  Bark,  H.,  Son, Y.H.,  Park,  H.H.,  Lee,  S., Park,  J.W.,  Park,.  E.K.,  Shin, H.I.,   and   Kim,   S.H.   2007. ‘Quercetin  inhibits  expression of  inflammatory  cytokines through  attenuation  of  NF-kB and  p38  MAPK  in  HMC-1 human mast cell line’. Inflamm. res. 56(5):210–215.
Kempuraj,    Castellani,    M.L.,    Petrarca, C.,  Frydas,  S.,  Conti,  P., Theoharides,  T.C.  J.,  and Vecchiet.  2006.  ‘Inhibitory effect of quercetin on  tryptase and  interleukin-6  release,  and
histidine decarboxylase mRNA    transcription    by human  mast  cell-1  cell  line’. Clin Exp Med. 6:150–156.
Kempuraj, D., Papadopoulou, N., Stanford,  E.J.,  Chritodoulou, S.,   Madhappan,     B.,     Sant,
G.R.,  Solage,  K.,  Adams,  T.,
and  Theoharides,  T.C.  2004. ‘Increased Number of Activated Mast Cells in Endometriosis Lesions Positive  for  Corticotropin- Releasing Hormone and Urocortin’. American  Journal of  Reproductive  Immunology . 52: 267-275