## INTERESTERIFIKASI ENZIMATIS MINYAK IKAN DENGAN ASAM LAURAT UNTUK SINTESIS LIPID TERSTRUKTUR
[Enzymatic Interesterification of Fish Oil with Lauric Acid for the Synthesis of Structured Lipid]
Edy Subroto 1) , Chusnul Hidayat 2) ,  dan  Supriyadi 2)
1) Program Pascasarjana UGM, Yogyakarta 55281
2) Jurusan Teknologi Pangan dan Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian UGM, Yogyakarta 55281
Diterima  25 Agustus   2008 / Disetujui   17 Desember   2008

## ABSTRACT
Structured  lipid  (SL)  containing  of  medium  chain  fatty  acid  (MCFA)  at  outer  position  and  polyunsaturated  fatty  acid  (PUFA)  at  sn-2 position has superior dietary and absorption characteristics. The most methods for the enzymatic synthesis of SL were through two steps process, so that it was inefficient. Caprilic acid was usually used as a source of MCFA. In this research, SL was synthesized by enzymatic interesterification between fish oil and lauric acid. The specific lipase from Mucor miehei was used as catalyzed. Factors, such as the incubation time, substrate mole ratio, and reaction temperature were evaluated. The incorporation and the position of lauric acid on glycerol backbone and glyceride profile were determined.
The results showed that SL containing of lauric acid at the outer position and PUFA at sn-2 was successfully synthesized, and it was done through one step process. From regiospecific determination, it showed that the position of lauric acid incorporation was only at the sn-1 and sn-3. Only 0.87% of lauric acid was incorporated at the sn-2. The optimum time and temperature of the reaction, and the substrate mole ratio were 12 h, 50  C and 1:10, respectively, in which the incorporation of lauric acid was 62.8% (mol). Glyceride profile was affected by incubation time, substrate mole ratio and reaction temperature. Triglyceride concentration decreased with an increase in the incubation time (> 12 h). In contrast, the diglyceride concentration increased at longer incubation time (> 12 h). Beside, triglyceride concentration increased with an increase in substrate mole ratio to 1:10, but it decreased when mole ratio of substrate was 1:15. At higher temperature (50  C), triglyceride decreased with an increase in the reaction temperature. In summary, the SL was successfully synthesized by the interesterification of fish oil and lauric acid using specific lipase of Mucor miehei.
Key words : Interesterification, fish oil, lauric acid, structured lipids, lipase

## PENDAHULUAN
Sintesis lipid terstruktur (SL) dengan memodifikasi susunan asam lemak pada backbone lipid telah berkembang pesat  dalam  satu  dekade  ini.  Hal  ini  dilakukan  terutama untuk meningkatkan sifat fungsional dan nutrisi suatu lemak atau minyak. SL dengan asam lemak rantai medium (C 6 -C 12 ) pada posisi luar dan polyunsaturated fatty acid (PUFA) pada posisi sn-2 memiliki nilai gizi dan absorbsi yang sangat baik (Irimescu et  al. 2001b).  Residu  MCFA  dengan  mudah terhidrolisis  di  dalam  saluran  pencernaan  menghasilkan asam  lemak  yang  diabsorbsi  dengan  cepat  dan  digunakan sebagai  sumber  energi  yang  tinggi  di  dalam  tubuh.  PUFA terabsorbsi  sebagai  2-mono  gliserida  (2-MG)  yang  paling siap diabsorbsi diantara senyawa turunan PUFA. SL dengan residu  jenuh  pada  posisi  luar  dan  PUFA  pada  posisi  sn-2 juga lebih tahan terhadap oksidasi (Endo et al. 1997).
SL  dapat  disintesis  dengan  interesterifikasi  lipid baik secara ezimatis maupun kimia, tetapi metode enzimatis lebih diutamakan karena enzim memiliki aktivitas biokatalitik yang tinggi dan spesifik. Penggunaan enzim sebagai katalis juga  lebih  ramah  lingkungan  dibandingkan  secara  kimiawi karena  limbah  dari  bahan  kimia  umumnya  berbahaya  bagi lingkungan (Akoh, 2002).
Berbagai  metode  sintesis  lipid  terstruktur  spesifik secara  enzimatik  telah  dilakukan  diantaranya  melalui pembentukan  triasilgliserol  (TAG)  dari  gliserol  dan  asam lemak (antara lain PUFA) yang dilanjutkan asidolisis dengan asam lemak tertentu, antara lain MCFA menggunakan lipase spesifik-1,3 (Kawashima et al. 2001). Sintesis lipid terstruktur spesifik juga telah diteliti dengan melakukan etanolisis pada minyak  ikan  untuk  memperoleh  2-MG  yang  dilanjutkan dengan  esterifikasi  dengan  asam  kaprilat  secara  enzimatis sehingga diperoleh SL dengan asam kaprilat pada posisi luar dan  PUFA  pada  posisi  sn-2  (Irimescu et  al. 2001b),  tetapi proses  tersebut  kurang  ekonomis  dan  perlu  pengendalian proses yang lebih intensif.
Selama  ini  sintesis  SL  yang  mengandung  PUFA dan  MCFA  umumnya  menggunakan  asam  kaprilat  sebagai sumber  MCFA  dan  dilakukan  dengan  dua  tahap.  Pada penelitian  ini,  sintesis  SL  dilakukan  dengan  metode interesterifikasi (asidolisis) antara minyak ikan dengan asam laurat  yang  dikatalisis  lipase Mucor  miehei yang  bersifat spesifik  1,3  dalam  satu  tahap  reaksi.  Diharapkan  bahwa asam laurat hanya akan menempati posisi 1,3 dari kerangka gliserol  minyak  ikan  sedangkan  PUFA  tetap  tertinggal  dan berada pada posisi sn-2. Asam laurat dipilih karena banyak terdapat di Indonesia, khususnya dari minyak kelapa.
Pengkajian dilakukan terhadap waktu reaksi, rasio substrat  (minyak  ikan  :  asam  laurat)  dan  suhu  reaksi sehingga  diperoleh  waktu  reaksi  dan  kondisi  proses  yang optimal  untuk  sintesis  SL  secara  enzimatis  dengan  lipase Mucor  miehei .  Keberhasilan  sintesis  SL  ditentukan  oleh banyaknya  inkorporasi  asam  laurat  pada  minyak  ikan  dan dalam hal ini diharapkan inkorporasi laurat terjadi pada posisi sn-1 dan sn-3 dari kerangka gliserol.

## METODOLOGI
Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah minyak ikan komersial  (Prince  Gold @ Alaska  Deep  Sea  Fish  Oil)  dan asam  laurat  dari  Sigma  Chemical  (St.  Louis,  MO,  USA). Enzim  yang  digunakan  adalah  lipase  teramobil  dari Mucor miehei (Lipozyme ® )  dan  lipase Candida  antartica teramobil (Lipozyme)  dari  Novo  Nordisk  Denmark.  Pelarut  organik yang  digunakan  antara  lain  heksana,  aseton,  etanol, petroleum eter, dietil eter, dan asam asetat  yang dibeli dari Merck KGaA (Darmstadt, German). Sedangkan bahan kimia yang digunakan antara lain KOH dan Na 2 SO 4 anhidrat, baik pelarut  maupun  bahan  kimia  memiliki  spesifikasi analytical grade yang  diperoleh  dari  Sigma  Chemical  (St.  Louis,  MO, USA).

## Interesterifikasi  enzimatis  minyak  ikan  dengan asam laurat pada berbagai waktu reaksi
Interesterifikasi  minyak  ikan  dengan  asam  laurat dilakukan mengacu pada metode Yankah dan Akoh (2000), serta  Haman  dan  Shahidi  (2005)  yang  dimodifikasi. Sebanyak  1.43  g  minyak  ikan  dan  4  g  asam  laurat  dengan rasio  molar  minyak  ikan  :  asam  laurat  1:10  dimasukkan kedalam  erlenmeyer,  lalu  ditambahkan  0.54  g  lipozyme ® (10  %  dari  substrat)  dan  8.1  ml  heksana.  Campuran diinkubasi dalam waterbath shaker dengan kecepatan    120 rpm pada suhu 40  C sesuai dengan waktu yang ditetapkan (2,  4,  6,  12,  24,  dan  48  jam).  Larutan  hasil  reaksi  disaring dengan  kertas  saring  untuk  memisahkan  lipase  teramobil. Filtrat ditambah 20 ml campuran etanol dan aseton dengan rasio 1:1 (v/v). Selanjutnya, larutan tersebut dititrasi dengan 0.5  M  larutan  KOH  dengan  indikator phenolphathalein (PP) sampai  warna  larutan  menjadi  merah  jambu.  Heksana (35  ml)  ditambahkan  ke  dalam  larutan  untuk  mengekstrak asilgliserol. Na 2 SO 4 anhidrat ditambahkan   ke dalam lapisan fraksi heksana untuk menghilangkan sisa air dan selanjutnya dievaporasi untuk menguapkan heksana, etanol, dan aseton sehingga  diperoleh  komponen  asilgliserol  (SL)  yang digunakan untuk keperluan analisis.

## Interesterifikasi  enzimatis  minyak  ikan  dengan asam laurat pada berbagai rasio substrat
Interesterifikasi  dilakukan  pada  berbagai  rasio molar minyak : asam laurat (1:2; 1:5; 1:10; dan 1:15) untuk mengetahui pengaruh rasio molar substrat terhadap efisiensi inkorporasi  dan  profil  gliserida  yang  diperoleh.  Reaksi
dilakukan  dalam  erlenmeyer  tertutup  yang  diinkubasikan dalam waterbath  shaker dengan  kecepatan  120  rpm  pada suhu 40  C selama 12 jam. Larutan hasil reaksi selanjutnya diperlakukan seperti pada prosedur interesterifikasi enzimatis pada  berbagai  waktu  reaksi.  Pengukuran  pH  dengan pH-meter  dilakukan  untuk  mengetahui  tingkat  keasaman substrat.

## Interesterifikasi  enzimatis  minyak  ikan  dengan asam laurat pada berbagai suhu reaksi
Rasio  molar  substrat  yang  optimal  kemudian digunakan  untuk  mengkaji  pengaruh  suhu  reaksi  dengan variasi suhu 30, 40, 50, 60, dan 70  C. Minyak ikan (1.43 g) ditambahkan  ke  dalam  4  gram  asam  laurat  (rasio  molar minyak  ikan  :  asam  laurat  1:10)  di  dalam  erlenmeyer. Sebanyak 0.54 g lipozyme ® (10 % dari substrat) dan 8.1 ml heksana  (1.5  kali  berat  substrat)  ditambahkan  ke  dalam substrat,  kemudian  diinkubasi  dalam waterbath  shake pada berbagai  suhu  dengan  kecepatan  120  rpm  selama  12  jam. Larutan  hasil  reaksi  selanjutnya  diperlakukan  seperti  pada prosedur  interesterifikasi  enzimatis  pada  berbagai  waktu reaksi.

## Analisis  profil  gliserida  dengan  kromatografi  lapis tipis (TLC)
TLC Plate  Silica  Gel GF  254  diaktifkan  terlebih dahulu  sebelum  digunakan.  Sebagai  larutan  pengembang digunakan  campuran  petroleum  eter  :  dietil  eter  :  asam asetat  (60:40:1).  Analisis  kuantitatif  dilakukan  dengan menggunakan  TLC Scanner CAMAG  II  pada  panjang gelombang 350 nm.
Preparasi Fatty  Acid  Methyl  Ester ( FAME)  dan  analisis penentuan inkorporasi asam laurat
Preparasi FAME dilakukan sesuai dengan metode Park  dan  Goins  (1994).  Sebanyak  200  µl  lipid  terstruktur dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 50 µl (konsentrasi 0.1 g/ml) internal standar asam heptadekanoat, 100 µl metilen klorida dan 1 ml NaOH 0.5 N dalam metanol. Gas nitrogen diberikan ke dalam tabung sebelum dipanaskan pada suhu 90  C selama 10 menit. Setelah dingin ditambah 1  ml  BF 3 14  %  dalam  metanol,  kemudian  dipanaskan  lagi selama 10 menit. Setelah dingin ditambahkan 1 ml aquades dan  200-500  µl  heksana  dan  dicampur  menggunakan vorteks  untuk  mengekstrak  metil  ester  asam  lemak.  Fraksi heksana merupakan FAME dan siap untuk dianalisis dengan kromatografi gas (GC).
GC yang digunakan dilengkapi dengan kolom HP 5 (5  %  Phenyl  Methil  Siloxone)  panjang  30  m.  Temperatur kolom  mula-mula  180 o C  ditahan  selama  2  menit  kemudian dinaikkan  10  C/menit  sampai  suhu  mencapai  280  C. Temperatur  injektor  280  C  dan  detektor  yang  digunakan adalah  FID  dengan  suhu  300  C.  Gas  helium  digunakan sebagai gas pembawa dengan aliran 10 ml/menit.
Hasil Penelitian                                                                        J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XIX No. 2 Th. 2008
Analisis distribusi posisi asam lemak dengan Etanolisis Lipase Candida antartica Distribusi  posisi  asam  lemak  pada  SL  dilakukan sesuai  dengan  metode  Irimescu et  al. (2001b;  2002). Sebanyak 0.5 g minyak ikan atau lipid terstruktur dilarutkan dalam  2  g  etanol  dan  ditambah  0.2  g  lipase Candida antartica , kemudian  diinkubasi  pada  30  C  selama  3  jam. Larutan hasil reaksi dianalisa menggunakan TLC plate silica gel GF 254. Campuran kloroform : aseton (98:2) digunakan sebagai  larutan  pengembang  dan  visualisasi  dilakukan dengan penyinaran pada panjang gelombang 254 nm. Spot yang  sesuai  untuk  2-MG  diambil  dan  dilarutkan  dalam heksana.  Fraksi  heksana  digunakan  untuk  derivatisasi menjadi asam lemak metil ester untuk selanjutnya dianalisis dengan GC.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakterisasi minyak ikan
Pada Tabel 1 dapat dilihat bahwa kadar air minyak ikan  sangat  rendah  (0.05  %)  dan  angka  peroksida  juga cukup rendah dibandingkan dengan standar FAO/WHO/CAC/RS  19-1981  rev.  1  (1989)  yaitu  0.2  %  dan 10  meq/kg  minyak.  Kadar  air  yang  tinggi  dapat  memacu terjadinya reaksi hidrolisis menghasilkan asam lemak bebas. Angka  asam  minyak  ikan  yang  digunakan  lebih  tinggi  dari yang  dipersyaratkan  FAO/WHO/CAC/RS  19-1981  rev.1 (1989) yaitu untuk refined oil angka asamnya maksimum 0.6. Gliserida  minyak  ikan  yang  digunakan  ternyata tidak  semuanya  berupa  trigliserida  (hanya  70.40  %) sedangkan  sisanya  berupa  monogliserida  dan  digliserida. Hal  ini  sebenarnya  kurang  dikehendaki  untuk  keperluan reaksi asidolisis  karena pada kerangka gliserol minyak ikan terkandung  beberapa  gugus  –OH  dan  gugus  ini  dapat mengalami  reaksi  esterifikasi  dengan  asam  laurat  bebas yang  menghasilkan  air,  selanjutnya  air  tersebut  dapat mempengaruhi  keseimbangan  air  dalam  sistem  untuk terjadinya  reaksi  hidrolisis  lagi.  Namun  komposisi  gliserida di  atas  menunjukkan  jumlah  mono-  dan  digliserida  yang relatif  kecil  dibandingkan  dengan  trigliserida  (Tabel  1)  dan perlu  diketahui  bahwa  reaksi  asidolisis  enzimatik  juga memerlukan  air  untuk  membentuk  interface  dalam  jumlah sedikit  sehingga  kemungkinan  kondisi  di  atas  justru menguntungkan.
Pada  asidolisis  tristearin  dengan  asam  oleat  dan stearat,  inkorporasi  justru  mencapai  optimal  ketika ditambahkan air masing-masing 10 % dan 8 % dari substrat (Yankah dan Akoh, 2000). Komponen gliserida ini juga akan mempengaruhi  berat  molekul  rata-rata  dari  minyak  ikan, karena  penghitungan  berat  molekul  didasarkan  pada asam-asam lemak penyusunnya dan komponen gliseridanya. Semakin  besar  komponen  trigliserida  maka  berat  molekul minyak  ikan  akan  relatif  lebih  besar.  Pada  penelitian  ini diketahui bahwa berat molekul minyak ikan rata-rata adalah 715.47 g/mol. Berat molekul ini selanjutnya akan digunakan sebagai  dasar  untuk  penghitungan  rasio  molar  minyak  ikan
dengan asam laurat yang digunakan sebagai substrat pada penelitian ini.
Tabel 1 Karakterisasi minyak ikan Parameter Nilai Kadar air (%) Angka asam Asam lemak bebas (%)
Angka penyabunan Angka peroksida Komposisi gliserida -monogliserida (%)
-digliserida (%) -trigliserida (%) Berat molekul (g/mol) 0.05 1.06 0.55 204.18 5.34 14.50 15.10 70.40 715.47
Asam  lemak  yang  terkandung  dalam  minyak  ikan pada penelitian ini terutama didominasi oleh asam lemak tak jenuh  rantai  panjang  termasuk  EPA  (20.38  %)  dan  DHA (11.71  %).  Asam  lemak  tak  jenuh  seperti  EPA  dan  DHA sering dikenal sebagai asam lemak ω-3 yang memiliki fungsi penting untuk kesehatan. Secara teori asam lemak tak jenuh ini  memiliki  kecenderungan  menempati  posisi  sn-2  dari kerangka  gliserol  sehingga  diharapkan  jika  diasidolisis dengan asam laurat menggunakan lipase spesifik 1,3 maka asam lemak tak jenuh tersebut tetap tertinggal di posisi sn-2 sedangkan  posisi  sn-1  dan  sn-3  terinkorporasi  oleh  asam laurat.  Minyak  ikan  sendiri  memiliki  kandungan  asam  laurat tetapi sangat kecil yaitu hanya 0.17  %.

## Pengaruh waktu reaksi terhadap inkorporasi asam laurat ke dalam minyak ikan
Reaksi enzimatis berlangsung seiring dengan lama reaksi  pada  kondisi  suhu  tertentu.  Pengaruh  lama  reaksi terhadap  interesterifikasi  minyak  ikan  dengan  asam  laurat ditunjukkan  dengan  banyaknya  asam  laurat  yang  terikat pada  kerangka  gliserol  dari  minyak  ikan  atau  yang  sering disebut sebagai tingkat inkorporasi asam laurat pada minyak ikan.  Inkorporasi  asam  laurat  sebagai  fungsi  dari  waktu reaksi disajikan seperti pada Gambar 1.
Reaksi  interesterfikasi  berjalan  cepat  pada  awal reaksi  (sampai  12  jam).  Peningkatan  lama  reaksi mengakibatkan  penurunan  inkorporasi  asam  laurat  dari 44.27  %  menjadi  38.28  %  (24  jam).  Inkorporasi  kembali meningkat setelah 24 jam. Dengan demikian, tampak bahwa reaksi sudah mencapai equilibrium pada waktu 12 jam. Hasil penelitian  Yankah  dan  Akoh  (2000)  pada  inkorporasi  asam kaprilat pada tristearin menunjukkan hasil yang sama. Hal ini kemungkinan  disebabkan  kondisi  dalam  reaktor  mengalami beberapa  perubahan.  Substrat  yang  digunakan  pada penelitian ini berupa minyak ikan yang mengandung mono-, di-,  dan  tri-gliserida.  Adanya  mono-,  dan  di-gliserida memungkinkan  terjadinya  reaksi  esterifikasi  gugus  –OH bebas dari gliserol dengan asam laurat bebas menghasilkan molekul  air  yang  dapat  memacu  terjadinya  reaksi  hidrolisis kembali  sehingga  dengan  penambahan  waktu  reaksi  justru memberikan  kesempatan  terjadinya  reaksi  hirolisis  atau reaksi  akan  bergeser  ke  kiri.  Namun  hidrolisis  parsial menyebabkan  jumlah  air  menjadi  berkurang  dan  reaksi
kembali bergeser ke kanan sehingga sistem relatif setimbang atau mencapai keseimbangan reaksi.

## Profil  gliserida  lipid  terstruktur  akibat  pengaruh waktu reaksi
Pada  awal  reaksi  (sampai  6  jam)  komponen  TG meningkat  22.80  %  yang  dikuti  dengan  penurunan  DG  dan MG  (Gambar  1).  Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  reaksi tidak seluruhnya berjalan secara asidolisis, tetapi juga terjadi esterifikasi  gugus  –OH  pada  MG  dan  DG  minyak  ikan dengan  asam  laurat  sehingga  komponen  MG  dan  DG berkurang  sedangkan  trigliserida  meningkat.  Setelah  reaksi lebih  dari  6  jam,  komponen  TG  cenderung  menurun  yang diikuti  dengan  kenaikan  DG  dan  menuju  ke  kondisi setimbang. Hal ini menunjukkan bahwa dengan penambahan waktu  reaksi  maka  reaksi  didominasi  oleh  reaksi  hidrolisis parsial  trigliserida  menjadi  digliserida  dan  reaksi  esterifikasi monogliserida  menjadi  digliserida.  Menurut  Wilis  dan Marangoni  (2002),  triasilgliserol  lebih  mudah  dihidrolisis daripada  diasilgliserol  dan  diasilgliserol  dihidrolisis  lebih cepat daripada monoasilgliserol. Namun adanya asam lemak bebas yang berlebih di dalam larutan dapat mengakibatkan terbentuknya  DG  dari  reaksi  antara  MG  dan  asam  lemak bebas.  Dengan  demikian  dapat  dikatakan  bahwa triasilgliserol  lebih  mudah  terhidrolisis  sedangkan monoasilgliserol  lebih  mudah  teresterifikasi  sehingga  reaksi mengarah  pada  pembentukan  DG  baik  melalui  hidrolisis parsial pada TG maupun esterifikasi parsial pada MG.

## Pengaruh rasio substrat terhadap inkorporasi asam laurat ke dalam minyak ikan
Gambar  2  menunjukkan  bahwa  inkorporasi  asam laurat  pada  lipid  terstruktur  (42  %)  meningkat  sampai  rasio mol  substrat  1:10.  Peningkatan  rasio  mol  substrat  sampai 1:15 mengakibatkan penurunan sebesar 30 %. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa hal antara lain (i) kompetisi asam laurat  dengan  asam  lemak  bebas  yang  lain,  (ii)  penurunan pH  larutan  dengan  penambahan  asam  laurat,  (iii)  substrat inhibitor dan (iv) desorbsi air pada interfase.
Pada prinsipnya reaksi interesterifikasi minyak ikan dengan  asam  laurat  menggunakan  lipase  spesifik  1,3 membutuhkan  2  mol  asam  laurat  dalam  setiap  mol trigliserida  dari  minyak  ikan.  Namun  demikian,  reaksi interesterifikasi  berjalan  secara  kompetitif  sehingga  asam lemak yang dibebaskan dari minyak ikan akan berkompetisi dengan  asam  laurat  untuk  teresterifikasi  kembali  ke  dalam kerangka  gliserol  minyak  ikan.  Oleh  sebab  itu  agar  reaksi inkorporasi asam laurat ke dalam minyak ikan berjalan baik diperlukan asam laurat dalam jumlah berlebih. Penambahan substrat  akan  meningkatkan  produk  selama load atau  sisi katalitik  enzim  tersedia,  tetapi  ketika  jumlah  substrat  telah melebihi load enzim yang ada maka kelebihan substrat tidak akan dikatalisis lagi sehingga tidak akan berpengaruh pada jumlah  produk.  Bahkan  kelebihan  substrat  justru  dapat menghambat  aktivitas  lipase  yang  disebut  dengan substrat inhibition (Wilis  dan  Marangoni,  2002).  Tingkat  kejenuhan reaksi  interesterifikasi  pada  tiap-tiap  bahan  berbeda-beda. Pada  asidolisis  tristearin  dengan  asam  oleat  pada  rasio molar  1:1  sampai  1:8  inkorporasi  masih  terus  meningkat tetapi asidolisis dengan asam kaprilat setelah rasio molar 1:6 inkorporasi tidak meningkat bahkan justru menurun (Yankah dan Akoh, 2000).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 waktu reaksi (jam) gl is e r ida ( % ) )) )) MG DG TG
Gambar 1 Pengaruh waktu reaksi terhadap profil gliserida lipid terstruktur. MG: monogliserida, DG: digliserida, TG:trigliserida
0 10 20 30 40 50 0 2 4 6
8 10 12 14 16 rasio mol substrat ink orpo r a s i la ura t (m ol % ) ) )) )) 0 1 2 3 4 5 6 7 pH . inkorporasi pH
Gambar 2 Pengaruh rasio molar substrat terhadap inkorporasi asam laurat pada minyak ikan. Jumlah minyak ikan tetap, sedangkan yang diubah jumlah asam laurat (misal: 2 artinya rasio mol m. ikan : as. laurat adalah 1:2). Reaksi dilakukan pada suhu 40  C selama 12 jam dalam pelarut heksana. Enzim yang ditambahkan 10 % dari berat substrat.
Selain itu, perubahan kondisi lingkungan akibat penambahan asam  lemak  bebas  yang  terlalu  tinggi  menyebabkan lingkungan  menjadi  terlalu  asam.  Hasil  pengukuran  pH menunjukkan  untuk  rasio  1:15  pH  sistem  sebesar  4.0 sedangkan  pH  aktivitas  lipase Mucor  miehei amobil  antara 3-11  (Yamane,  1987).  Rendahnya  pH  tersebut  mungkin sudah  menyebabkan  terjadinya  denaturasi  parsial  pada enzim  sehingga  aktivitasnya  akan  berkurang  meskipun  pH 4.00 masih dalam pH aktivitasnya,.
Aktivitas  lipase  juga  akan  berkurang  ketika konsentrasi asam lemak bebas terlalu tinggi (Wilis  dan  Marangoni,  2002).  Tingginya  asam  lemak  bebas akan  menghasilkan  gugus  asam  karboksilat  bebas  atau terionisasi yang akan meningkatkan keasaman mikroaqueus di  sekitar  enzim  atau  menyebabkan  desorbsi  air  dari interface. Short  chain  fatty  acid (SCFA)  dan medium  chain fatty acid (MCFA) dapat mengambil bagian interface lapisan air  di  sekitar  enzim  dan  meningkatkan  kelarutannya  dalam air,  hal  ini  juga  akan  membatasi  masuknya  substrat  pada interface.  Kuo  dan  Parkin  (1993)  mendapatkan penghambatan lebih besar ketika menggunakan asam lemak rantai  pendek  (C5:0  –  C9:0)  daripada  menggunakan  asam lemak rantai yang lebih panjang (C13:0 – C17:0).
Profil  gliserida  lipid  terstruktur  akibat  pengaruh  rasio substrat
Pengaruh  rasio  substrat  terhadap  profil  gliserida lipid  terstruktur  ditunjukkan  pada  Gambar  3.  Komponen  TG meningkat seiring dengan meningkatnya jumlah asam laurat bebas  sampai  pada  rasio  1  :  10  yang  diikuti  dengan penurunan DG. Hal ini disebabkan lipase dari Mucor miehei sangat  spesifik  untuk  asam  laurat  (Weete,  2002;  Wilis  &
Marangoni,  2002)  dan  memiliki  aktivitas  yang  relatif  rendah terhadap PUFA terutama DHA (Irimescu et al. 2000). Ketika jumlah  asam  laurat  relatif  rendah  maka  kecenderungan reaksi  berjalan  ke  kanan  cukup  lemah  dan  kemampuan asam  laurat  berkompetisi  untuk  teresterifikasi  juga  relatif kecil  sehingga  dengan  peningkatan  jumlah  asam  laurat di  dalam  larutan  maka  reaksi  cenderung  ke  arah pembentukan  TG.  Komponen  trigliserida  justru  menurun pada rasio substrat lebih besar dari 1 : 10. Hal ini mungkin berkaitan  dengan  aktivitas  lipase  yang  menurun  dengan semakin banyaknya asam lemak bebas. Asam lemak bebas menyebabkan  desorbsi  air  dari  interface  kemudian mengambil  bagian  interface  lapisan  air  disekitar  enzim  dan meningkatkan  kelarutannya  dalam  air  sehingga  akan membatasi  masuknya  substrat  pada  interface.  Penurunan aktivitas  lipase  tersebut  menyebabkan  terbentuknya  produk intermediet dan reaksi interesterifikasi tak sempurna.
Pengaruh suhu reaksi terhadap inkorporasi asam laurat ke dalam minyak ikan
Pada suhu di bawah 40  C inkorporasi laurat tidak berubah  (42  %).  Pada  suhu  50  C  inkorporasi  meningkat tajam  dan  relatif  tidak  berubah  hingga  suhu  60  C  (65  %). Hal  tersebut  menunjukkan  kisaran  suhu  untuk  reaksi interesterifikasi  adalah  pada  suhu  50  C  –  60  C.  Kisaran suhu  ini  hampir  sama  dibandingkan  dengan  reaksi interesterifikasi dari penelitian lain yang menggunakan lipase Mucor  miehei amobil.  Yankah  dan  Akoh  (2000) mengasidolisis  tristearin  dengan  asam  oleat  dan  asam kaprilat  menggunakan  lipase Rhizomucor  miehei masing- masing  suhu  optimum  reaksinya  dicapai  pada  suhu  45  C dan  55  C.  Rao et  al .  (2002)  melakukan  asidolisis  minyak
kelapa  dengan  dengan  asam  lemak  ω-3  dalam  pelarut heksana,  diperoleh  bahwa  inkorporasi  ω-3  maksimal diperoleh  pada  suhu  54.1  C  dan  waktu  reaksi  34  jam. Namun inkorporasi ω-6 maksimal diperoleh pada suhu 39  C dan  waktu  reaksi  48.5  jam.  Menurut  Malcata et  al .  (1992), suhu optimal untuk kebanyakan lipase amobil adalah antara 30  –  62  C,  tetapi  lipase  amobil  secara  umum  tahan terhadap pengaruh  suhu terhadap terjadinya unfolding dan denaturasi daripada enzim bebas.
Secara  umum,  semakin  tinggi  suhu  reaksi  akan menurunkan  viskositas  sistem  campuran  reaksi  dan  hal  ini tentu  akan  membantu  molekul  substrat  lebih  mudah melakukan  mobilisasi.  Suhu  reaksi  juga  membantu  sistem reaksi  mencapai  energi  aktivasinya.  Namun  pada interesterifikasi  ini  ditambahkan  pelarut  organik  berupa heksana  yang  dapat  membantu  menurunkan  titik  leleh substrat  sehingga  pada  suhu  rendah  pun  sebenarnya viskositas  substrat  sudah  rendah.  Penggunaan  pelarut organik  untuk  sintesis  enzimatis  berfungsi  dalam  pelarutan substrat  hidrofobik  dan  mengeliminasi  penggunaan  suhu tinggi (Yankah dan Akoh, 2000). Pelarut organik juga  dapat memperbaiki  stereoselektifitas  lipase.  Pelarut  yang  sangat baik untuk stereoselektifitas yang optimal adalah n-heksana (Chandler et al . 1998).
Kestabilan lipase juga dapat dipengaruhi oleh suhu reaksi,  tetapi  penggunaan  pelarut  heksana  juga  dapat berfungsi menjaga kestabilan lipase terhadap suhu, diketahui bahwa  lipase  lebih  thermostabil  dalam  pelarut  organik daripada  dalam  air  (Yang et  al .  dalam  Yankah  dan  Akoh,
2000). Hal ini juga tampak pada Gambar 3 yaitu sampai suhu 70 o C inkorporasi laurat masih tetap tinggi. Yankah dan Akoh (2000)  mengasidolisis  tristearin  dengan  asam  oleat  sampai suhu 70 o C  menunjukkan inkorporasi masih tetap tinggi.
Profil  gliserida  lipid  terstruktur  akibat  pengaruh  suhu reaksi
Gambar  3  secara  umum  menunjukkan  pada  suhu di  atas  40  C  komponen  trigliserida  menurun  dengan peningkatan  suhu  reaksi.  Penurunan  tersebut  menandakan terjadinya hidrolisis parsial komponen trigliserida menghasilkan ‘produk antara’ digliserida dan monogliserida. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh terjadinya migrasi asil yang  menyebabkan  reaksi  interesterifikasi  tidak  sempurna (Xu,  2000).  Migrasi  asil  merupakan  berpindahnya  asil  dari trigliserida  dari  posisi  sn-2  ke  posisi  sn-1  atau  sn-3. Berpindahnya  asil  tersebut  dapat  menyebabkan  posisi  sn-2 kosong sehingga terbentuk digliserida ataupun monogliserida. Migrasi asil dapat dipicu oleh tingginya suhu reaksi,  kadar  air,  dan  rasio  substrat.  Selanjutnya  juga diketahui  bahwa  suhu  reaksi  dan  waktu  reaksi  memacu terbentuknya  1,3-diasilgliserol  lebih  besar  daripada 1,2-diasilgliserol (Xu et al . 1999). Dengan terbentuknya    ,3- diasilgliserol maka lipase spesifik 1,3 dari Rhizomucor  miehei tentu  tidak  dapat  atau  sulit  untuk mengakatalisis  interesterifikasi  pada  posisi  sn-2.  Dengan demikian  hal  tersebut  dapat  menurunkan  komponen trigliserida  dan  justru  meningkatkan  digliserida  ataupun monogliserida.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 suhu reaksi (oC) gl i s e r i da ( % ) ) ) ) MG DG TG
Gambar 3 Pengaruh suhu reaksi terhadap profil gliserida lipid terstruktur

## Regiospesifisitas posisi asam lemak lipid terstruktur
Analisis  regiospesifitas  dilakukan  dengan  metode etanolisis  minyak  atau  trigliserida  secara  spesifik  1,3 menggunakan  lipase Candida  antartica sehingga  dihasilkan 2-monogliserida  dan  etil  ester.  Hasil  TLC  dan scanning dengan TLC Scanner CAMAG ditunjukkan pada Gambar 4. MG merupakan komponen yang dominan pada larutan hasil ethanolisis sedangkan DG kurang terlihat karena jumlahnya yang terlalu sedikit. Menurut Irimescu (2002a) lipase Candida antartica akan  bersifat  spesifik  1,3  ketika  berada  dalam pelarut  etanol  dalam  jumlah  besar,  sehingga  ketika digunakan untuk etanolisis maka yang terlepas hanya posisi sn-1  dan  sn-3  dengan  meninggalkan  2-monogliserida. Irimescu et  al .  (2001b)  juga  melakukan  etanolisis  minyak ikan  bonito  dengan  lipase Candida  antartica menghasilkan monogliserida dan  hasil analisis  TLC ternyata menunjukkan 100 % dari monogliserida berupa 2-monogliserida.
Hasil analisis GC menunjukkan bahwa asam laurat pada posisi sn-2 untuk minyak ikan hanya 0.90 % dari luas area, sedangkan untuk lipid terstruktur asam laurat yang ada pada posisi sn-2 hanya 0.87 % luas area sedangkan lainnya didominasi  oleh  asam  lemak  rantai  panjang  (PUFA). Interesterifikasi  asam  laurat  pada  minyak  ikan  diharapkan menghasilkan inkorporasi laurat hanya pada posisi sn-1 dan sn-3. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa sebagian besar  dari  asam  laurat  pada  lipid  terstruktur  hanya menempati  posisi  sn-1  dan  sn-3.  Dengan  demikian  berarti
bahwa  pada  reaksi  interesterifikasi  tidak  terjadi  migrasi  asil dan  lipid  terstruktur  yang  dihasilkan  sebagian  besar  posisi sn-1,3 ditempati laurat sedangkan posisi sn-2 ditempati oleh PUFA.

## KESIMPULAN
Kondisi  optimum  reaksi  inkorporasi  asam  laurat ke  dalam  minyak  ikan  pada  reaksi  interesterifikasi  dicapai pada  suhu  50  C,  rasio  mol  minyak  ikan  dan  asam  laurat 1:10  dengan  waktu  reaksi  12  jam.  Waktu  reaksi,  rasio substrat,  dan  suhu  reaksi  juga  berpengaruh  terhadap  profil gliserida  lipid  terstruktur.  Lipid  terstruktur  yang  dihasilkan diduga  sebagian  besar  posisi  sn-1,3  ditempati  oleh  asam laurat sedangkan pada posisi sn-2 didominasi oleh PUFA

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ditjen  dikti  atas  pemberian  dana  penelitian  hibah pasca  tahun  2007.  Almarhum  Prof.  Tranggono,  Ph.D,  atas ide  dasar  dan  inspirasi  penelitian  yang  sekarang  ini  telah dapat diwujudkan.
A B
Gambar 4 Hasil etanolisis lipid terstruktur pada TLC dibandingkan dengan senyawa standar. a & b= hasil etanolisis SL, c= asam oleat, d & e= metil ester.  (MG=  monogliserida,  DG=  digliserida,  TG=  trigliserida,  ALB=  asam  lemak  bebas).  A=  visualisasi  dengan  iodin,  B=  hasil  TLC scanner CAMAG, monogliserida (1), digliserida (2, 3) dan trigliserida (4)

## DAFTAR PUSTAKA
Akoh  CC.  2002.  Structured  lipids.  Di  dalam: Food  Lipids, Chemistry,  nutrition,  and  Biotechnology .  West Virginia: Marcel Dekker Inc.
AOCS. 1989. Official Methods and Recommended Practices of  the  American  Oil  Chemistry  Society. Ed  ke-4. Illinois: Broadmaker Drive.
Chandler  IC,  Quinlan  PT,    dan  McNeill  GP.  1998.  Lipase- catalyzed synthesis of chiral triglycerides . J Am Oil Chem Soc 75: 1513 – 1518.
Endo Y, Hoshizaki S, dan Fujimoto K. 1997. Autoxidation of synthetic  isomers  of  triacylglycerol  containing eicosapentaenoic  acid . J  Am  Oil  Chem  Soc 74: 543-548.
FAO/WHO/CAC/RS  19  1981  rev  1.  1989.  Di  dalam: Guidelines for Characterizing Food-Grade Fish Oil. Inform Vol 9 no 5: 473-481.
Irimescu R,  Yasui M, Iwasaki Y, Shimidzu N, dan Yamane T. 2000.  Enzymatic  Synthesis  of  1,3-Dicapryloyl-2- Eicosapentaenoylglycerol . J Am Oil Chem Soc 78: 743 – 748.
Irimescu R,  Furihata K, Hata K, Iwasaki Y, dan Yamane T.
2001a . Utilization    of    reaction        medium- dependent     regiospecifity   of Candida antartica lipase   (Novozyme 435)   for        the    synthesis of      1,3-dicapryloyl-2-docosahexaenoy  (or eicosapentaenoyl)  glycerol . J  Am  Oil  Chem  Soc 78: 285 – 289.
Irimescu R,  Furihata K, Hata K, Iwasaki Y, dan Yamane T.
2001b.  Two-step  enzymatic  synthesis  of docosahexaenoic
acid-rich symmetrically structured triacilglycerols via   2-monoacylglycerols. J Am Oil Chem Soc 78: 743 – 748.
Irimescu  R,  Iwasaki  Y,  dan  Hou  CT.  2002.  Study  of ethanolysis  to  2-MAG  by  immobilized Candida antartica lipase  and  synthesis  of  symmetrically structured TAG. J Am Oil Chem Soc 79: 879 – 883.
IUPAC. 1979. Standard Methods for the Analysis for Oil, Fats and Derivates. Oxford: Pergamon Press.
Kawashima A, Shimada Y, Yamamoto M, Sugihara A, Nagao T,  Komemushi  S,  dan  Tominaga  Y.  2001. Enzymatic synthesis of high-purity structured lipids with  caprylic  acid  at  1,3-positions  and polyunsaturated fatty acid at     2-position. J Am Oil
Chem Soc 78: 611 – 616.
Kuo  SJ,  dan  Parkin  KL.  1993.  Substrat  preference  lipase- mediated  acyl-exchange  reaction  with  buteroil  are concentration-dependent. J Am  Oil Chem Soc 70: 393 – 399.
Malcata  FX,  Reyes  HR,  Garcia  HS,  Hill  CG,  Amundson  Jr dan  CH.  1992.  Kinetics  and  mechanisms  of reaction catalized by immobilized lipases. Enzyme Microb Techno l 14: 426-446.
Martati  E.  1998.  Hidrolisis  Minyak  Hati  Ikan  Cod  dengan Lipase  Teramobil  dari Mucor  miehei [Tesis]. Yogyakarta:  Program  Pascasarjana  Universitas Gadjah Mada.
Park  PW  dan  Goins  RE.  1994.  In  situ  preparation  of  fatty acids  metil  ester  for  analysis  of  fatty  acids composition in food . J Food Sci 59: 1262 – 1266.
Rao  R,  Manohar  B,  Sambiah  K,  dan  Lokesh  BR.  2002.
Enzymatic  acidolysis  in  hexane  to  produce  n-3  or n-6 FA-enriched structured lipids from coconut oil: optimization  of  reactions  by  response  surface methodology . J Am Oil Chem Soc 70: 885 – 890.
Weete  JD.  2002.  Microbial  lipases.  Di  dalam: Food  Lipids, Chemistry,  Nutrition,  and  Biotechnology. West Virginia: Marcel Dekker Inc.
Wilis  WM,  dan  Marangoni  AG.  2002. Enzymatic Interesterification. In: Food  Lipids,  Chemistry, Nutrition, and Biotechnology. West Virginia: Marcel Dekker Inc.
Xu  X,  Mu  H,  Skands  ARH,  Hoy  CE,  dan  Nissen  JA.  1999. Parameters  affecting  diacylglycerol  formation during the production of specific-structured lipids by lipase-catalyzed interesterification . J Am Oil Chem Soc 76: 175-181.
Xu  X.  2000.  Enzymatic  production  of  structured  lipids: process  reaction  and  acyl  migration. Inform 11: 1121-1131.
Yamane T. 1987. Di dalam: Hidrolisis Minyak Hati Ikan Cod dengan  Lipase  Teramobil  dari Mucor  miehei . [Tesis].  Yogyakarta:  Program  Pascasarjana Universitas Gadjah Mada.
Yankah VV, dan Akoh C. 2000. Lipase-catalyzed acidolisis of tristearin  with  oleic  or  caprilic  acids  to  produce structured lipids. J Am Oil Chem Soc 77: 495-500.