Jurnal Penelitian dan Pengkajian Ilmu Pendidikan: e-Saintika
https://journal-center.litpam.com/index.php/e-Saintika/index

## Desain dan Optimasi Primer Gen Pengkode MRPA Trypanosoma evansi dan Penerapan pada Pembelajaran Biologi Molekuler
1* Moh. Mirza Nuryady, 1 H. Husamah, 1 Fuad Jaya Miharja, 1 Iin Hindun,
2 P. Patmawati
1 Prodi Pendidikan Biologi, FKIP, Universitas Muhammadiyah Malang, Jl. Raya Tlogomas No. 246, Malang, Jawa Timur, 65144, Indonesia
2 Prodi Magister Pendidikan Biologi, Program Pascasarjana, Universitas Muhammadiyah Malang, Jl. Raya Tlogomas No. 246, Malang, Jawa Timur, 65144, Indonesia
*Corresponding Author e-mail: mirzanuryady@umm.ac.id Received: June 2020; Revised: June 2020; Published: July 2020

## Abstrak
Penelitian  molekuler  untuk  menemukan  gen  pengkode  resistensi  Multidrug  Resistance  Prtotein  A (MRPA)  T.  evansi  dan  perbanyakan  gen  secara  Polimeration  Chain  Reaction  (PCR)  masih  sedikit dilakukan dan sangat penting untuk dipahami oleh mahasiswa calon guru biologi. Kajian ini bertujuan untuk menganalisis proses desain dan optimasi primer untuk gen target MRPA T. evansi yang dapat digunakan sebagai sumber belajar mahasiswa pendidikan biologi. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif  mengenai  tahapan  mendesain  primer  secara  online,  optimasi  primer  secara  laboratorium serta  kajian  mengenai  pentingnya  penerapan  hasil  studi  ini  dalam  pembelajaran.  Hasil  penelitian menunjukkan terdapat tiga desain primer yang memenuhi syarat, selanjutnya dari tiga primer tersebut hasil optimasi di laboratorium menunjukkan hanya terdapat dua primer yang menunjukkan hasil yang baik dan dapat digunakan untuk penelitian amplifikasi gen MRPA T. evansi, yaitu primer pertama (F1’, R1’)  dan  primer  kedua (F2’,  R2’). Hasil  kajian  desain  dan  optimasi  primer  ini  menunjukkan  bahwa mahasiswa pendidikan biologi sangatlah penting untuk memahami konsep terkait dengan pekerjaan molekuler  seperti  mendesain  dan  optimasi  primer,  dikarenakan  mereka  memiliki  tuntutan  untuk menjadi seorang calon pendidik atau sebagai calon peneliti di masa depan . Kata Kunci: Gen MRPA, Primer, Sumber belajar, Trypanosoma evansi

## Design and Optimization of Trypanosoma evansi MRPA Primer Coding Genes and Application to Molecular Biology Learning

## Abstract
Molecular  research  to  find  Multidrug  Resistance  Prtotein  A  (MRPA)  resistance  coding  genes  and  gene propagation by Polimeration Chain Reaction (PCR) is still little done and is very important to be understood by prospective biology teacher students. This study aims to analyze the design and primary optimization process for the T. evansi MRPA target gene that can be used as a learning resource for biology education students. This research was a descriptive study to described the step of primer design and optimization due to the importance of this steps to be applied as learning source. The results showed that there were 3 primer designs that qualified, then after the optimizing step there were only two primers that showed a good result, the first primer (F1, R1) and second  primer  (F2',  R2).  The  results  of  this  study  showed  the  importance  of  biology  education  students  to understand the concepts related to molecular work because in the future they are not only become prospective educators, they also have demands as prospective researchers.
Keywords: Gen MRPA, Learning resource, Primer, Trypanosoma evansi
How to Cite: Nuryady, M., M., Husamah, H., Miharja, F., J., Hindun, I., & Patmawati, P. (2020). Desain dan Optimasi Primer Gen Pengkode MRPA Trypanosoma evansi dan Penerapan pada Pembelajaran Biologi  Molekuler.  Jurnal  Penelitian  dan  Pengkajian  Ilmu  Pendidikan:  e-Saintika,  4(2),  223-233. doi: https://doi.org/10.36312/e-saintika.v4i2.217
https://doi.org/10.36312/e-saintika.v4i2.217
Copyright© 2020, Nuryady et al This is an open-access article under the CC-BY-SA License.

## PENDAHULUAN
Cabang ilmu Parasitologi dan Biomolekuler dalam keilmuan Biologi sangatlah berhubungan erat (Bass, Stentiford, Littlewood, & Hartikainen, 2015; Kochin, Bull, & Antia,  2010),  hal  ini  di dasarkan  pada  salah  satu  teknik  diagnosis  atau  identifikasi parasit yaitu dengan teknik molekuler (Dewi, Wardhana, Ekawasti, & Sawitri, 2020). Trypanosoma evansi (T. evansi) merupakan salah satu parasit yang menginfeksi hewan atau  dikenal  dengan  penyakit  surra  (Wardhana,  Merlina,  &  Subekti,  2014). Meningkatnya kasus infeksi T. evansi ini mengakibatkan seringnya penggunaan obat trypanosidal yang berakibat pada munculnya kasus resistensi T. evansi terhadap obat tertentu. Menurut Delespaux, Geysen, Majiwa, dan Geerts (2005), salah satu gen yang bertanggung  jawab  terhadap  kasus  resistensi  adalah  gen  pengkode  Multidrug Resistance Protein A (MRPA). Metode molekuler yang digunakan untuk mengisolasi gen tersebut adalah dengan prinsip Polimerase Chain Reaction (PCR).
Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik sintesis dan amplifikasi rantai  Dioxyribonucleic  Acid  (DNA)  dalam  jumlah  banyak  dalam  waktu  singkat (McPherson  &  Møller,  2007).  Teknik  PCR  dilakukan  secara  in  vitro  menggunakan reaksi  enzimatis  pada  potongan  DNA  yang  pendek  sebagai  cetakan.  Prinsip terjadinya reaksi dalam PCR adalah dengan adanya sifat komplementer antara rantai DNA  target  melalui  bantuan  enzim  polimerase,  deoksiribonukleotida  trifosfat (dNTP),  buffer  PCR,  magnesium  klorida  dan  oligonukleotida  sebagai  primer  yang ketika semua dicampurkan reaksinya akan dipicu dengan perubahan suhu di dalam mesin thermocycler (Handoyo & Rudiretna, 2000). Bagian sekuen DNA target yang akan  diamplifikasi  harus  diketahui  terlebih  dahulu  sebelum  dilakukan  amplifikasi dengan mendesain primer forward (F’) dan primer reverse (R’) yang sesuai. salah satu faktor  penting  dalam  keberhasilan  PCR  adalah  pemilihan  primer  yang  memiliki sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi.
Primer berperan penting dalam penempelan pada daerah spesifik cetakan DNA dan  juga  mengawali  sintesis  rantai  DNA  selanjutnya.  Primer  merupakan  urutan sekuen  basa  oligonukleotida  pendek,  umumnya  berukuran  18-25  basa  nukleotida. Ukuran primer yang terlalu pendek krang dari 18 basa akan menurunkan spesifitas karena primer akan menempel di sembarang tempat (misspriming). Primer forward akan  menempel  pada  ujung  DNA  5’-fosfat  yang  komplemen  dengan  bagian  dari cetakan DNA. Primer reverse akan menempel pada ujung rantai DNA antisense 3’- OH dan hasil sintesis rantai ini akan membentuk rantai okazaki karena arah sintesis rantai baru oleh enzim polimerase berjalan dari ujung 5’ menuju ujung 3’ (Sambrook &  Russel,  2001;  Yuwono,  2006).  Desain  primer  dilakukan  berdasarkan  data  DNA target yang bisa dilihat di Gene Bank, namun apabila belum diketahui primer dapat didesain  dengan  menggunakan  urutan  basa  DNA  spesies  yang  berkerabat  dekat dengan  spesies  target.  Proses  selanjutnya  setelah  melakukan  desain  primer  adalah optimasi  primer  dengan  melakukan  uji  trial  and  eror  (Dewi  et  al.,  2020),  hal  ini bertujuan  untuk  mendapatkan  primer  terbaik  yang  akan  digunakan  dalam melakukan isolasi DNA dalam prinsip molekuler.
Pembelajaran  untuk  calon  guru  biologi  di  jenjang  SMP  da  SMA  harus mengembangkan  minat  dan  antusiasme  mereka  terhadap  biologi  dalam  berbagai konteks yang merangsang keingintahuan, relevan, dan menyenangkan. Hal ini juga memungkinkan fleksibilitas dan personalisasi dengan menawarkan pilihan konteks untuk dipelajari. Keahlian penyelidikan dan investigasi ilmiah perlu dikembangkan sepanjang  perkuliahan.  Ini  akan  memungkinkan  para  mahasiswa  untuk  menjadi warga negara yang melek secara ilmiah (scientifically-literate citizens). Perkuliahan ini
memungkinkan  para  mahasiswa  untuk  mengembangkan  pemahaman  yang  lebih dalam  tentang  tema-tema  biologi  yang  mendasarinya.  Skala  topik  berkisar  dari molekuler  hingga  keseluruhan  organisme  dan  seterusnya  (Scottish  Qualifications Authority,  2019).  Mahasiswa  perlu  memiliki  literasi  genetic,  berupa  tiga  model terintegrasi, yaitu model genetik (pola pewarisan genetik), model meiosis, dan model molekuler (mekanisme menghubungkan genotipe dengan fenotipe)  (Maryuningsih, Hidayat,  Riandi,  &  Rustaman,  2020).  Beberapa  materi  yang  dapat  dipelajari  yaitu keadaan  materi  dan  ikatan  dalam  kaitannya  dengan  perilaku  dan  energi  molekul; genetika molekuler dan penurunan sifat serta mekanisme modifikasi genetik; dasar molekuler untuk teori dan klasifikasi evolusi; struktur dasar atom dan molekul; teori orbital  molekul,  aromatik,  struktur  logam  dan  ion,  dan  korelasi  dengan  sifat-sifat materi; reaktivitas kimia dan struktur molekul termasuk efek elektronik dan sterik; gerak kinetik-molekul dan model atom (National Science Teachers Association, 2003).
Penerapan  pembelajaran  molekuler  sangat  penting  diberikan  kepada mahasiswa  program  studi  pendidikan  biologi  (Boulay,  Parisky,  &  Campbell,  2010; Keskin & Özay Köse, 2017; Olander & Olander, 2013), dikarenakan selama ini prinsip- prinisp  kerja  molekuler  dirasa  sangat  susah  dipahami  oleh  mahasiswa  (Suryanti, Fitriani, Redjeki, & Riandi, 2019). Nurlaila, Sriyati, dan Riandi (2017) menunjukkan hasil  bahwa  sebagian  besar  mahasiswa  pendidikan  biologi  masih  mengalami miskonsepsi pada konsep-konsep genetika molekuler seperti DNA, gen, kromosom dan sintesis protein. Hal yang sama juga ditunjukkan pada penelitian oleh (Boulay et al., 2010) menemukan bahwa para guru tidak percaya diri dalam mengajarkan teknik – teknik biologi molekuler tertentu di kelas. Teknik seperti sentrifugasi, pemipetan, elektroforesis DNA, ligasi DNA, purifikasi DNA/plasmid, purifikasi protein, enzim restriksi,  transformasi  bakteri,  PCR  dan  desain  primer.  Hal  ini  tentu  menjadi pertimbangan  untuk  menjadikan  teknik-teknik  molekuler  tersebut  yang  salah satunya  adalah  desain  dan  optimasi  primer  dapat  diterapkan  dalam  pembelajaran mahasiswa pendidikan biologi.
Kajian  ini  bertujuan  untuk  menganalisis  proses  desain  dan  optimasi  primer untuk  gen  target  MRPA  T.  evansi  yang  dapat  digunakan  sebagai  sumber  belajar mahasiswa pendidikan biologi. Kajian ini berkontribusi pada pengembangan diskusi dan  penggambaran  alternatif  fokus  penelitian  terkait  dengan  optimasi  primer  dan bagaimana  kaitanya  dengan  pengembangan  kompetensi  calon  guru  biologi.  Bila nantinya  apabila  kajian  ini  dilanjutkan  menjadi  penelitian  maka  penelitian  ini merupakan penelitian pertama yang akan menjelaskan tentang desain dan optimasi primer yang dikaitkan dengan penerapan sumber belajar biologi. Kedepannya, hasil dari  penelitian  ini  akan  dapat  membantu  mahasiswa  program  studi  pendidikan biologi  dalam  melakukan  desain  dan  optimasi  primer  untuk  penelitian  molekuler lainnya.

## METODE Persetujuan Etik
Protokol  eksperimental  yang  dilakukan  telah  sesuai  dengan  prinsip-prinsip perawatan  hewan  laboratorium,  mendapatkan  persetujuan  dan  pengawasan  yang ketat oleh Komite Etik FKH-UGM dengan No. 0024/ EC-FKH/Int./2018.

## Metode Koleksi sampel T. evansi
Mencit jantan dewasa (Mus musculus Balb-C) dengan berat antara 20-30 gram digunakan  dalam  percobaan  ini.  Selanjutnya,  diinjeksikan  Trypanosoma  evansi
sebanyak  10 5 yang  dilarutkan  dalam  0.3  cc  Natrium  sitrat  3%  menggunakan  spuit melalui intraperitoneal. Pengecekan derajat parasitemia dilakukan setiap hari dengan cara  pengambilan  darah  melalui  ekor  mencit  dan  diamati  di  bawah  mikroskop dengan perbesaran 1000x. Apabila ditemukan >10 T. evansi dalam satu luas bidang pandang menandakan derajat parasitemianya tinggi dan dilakukan koleksi T. evansi dengan mengambil darah tikus secara intracardial setelah mencit dieutanasi.

## Metode Isolasi Genom T. evansi
Sampel darah mencit ditambahkan PBS sampai volume akhir menjadi 200 µl dan dicampur,  kemudian  dipindahkan  pada  tube  microsentrifus  1,5  ml  ,  selanjutnya ditambahkan sebanyak 20 µl proteinase K dan di vortex, kemudian diinkubasi pada suhu  60˚C  selama  5  menit,  setiap  2  menit  tube  dibalik  selama  inkubasi.  Larutan ditambahkan 200 µl alkohol absolut kemudian divortex selama 10 detik. Kolom filter diletakkan pada tabung koleksi ukuran 2ml, kemudian semua campuran pada kolom filter  dipindahkan  dan  disentrifugasi  pada  14-16000  x  g  selama  1  menit.  Selama dilakukan sentrifugasi, jika campuran tidak mengalir ke membran kolom filter waktu sentrifugasi  ditambah  sampai  campuran  mengaliri  membran  dalam  kolom  filter tabung koleksi yang terisi dibuka, kemudian kolom filter dipindahkan pada tabung koleksi  yang  baru.  Sebanyak  400  µl  W1  buffer  ditambahkan  pada  kolom  filter, disentrifugasi  pada  14-16.000  x  g  selama  30  detik  kemudian  dibuang.  Kolom  filter diletakkan kembali pada tabung koleksi. Pada kolom filter ditambahkan 600 µl wash buffer kemudian disentrifugasi pada 14-16.000 x g selama 3 menit dan dibuang. Kolom filter diletakkan kembali pada tabung koleksi, standar volume adalah 100 µl (prosedur DNAeasy Kit Extraction, Qiagen).

## Metode Desain Primer online
Tahapan awal desain primer yaitu dengan menentukan gen target di Gene Bank National  Center  For  Biotechnology  Information (NCBI),  yaitu  gen  pengkode  Multidrug Resistance  Protein  A  (MRPA).  Peneltian  tentang  MRPA  T.  evansi  beum  pernah dilakukan  sehingga  digunakan  gen  pengkode  MRP  dari  Trypanosoma  brucei (AJ318885.1) yang berkerabat dekat dengan Trypanosoma evansi. Ditentukan area yang akan  dijadikan  sebagai  target  isolasi  PCR  pada  gen  tersebut,  pada  penelitian  ini ditetapkan  panjang  maksimal  gen  target  adalah  >1000  basepair  (bp).  Potongan  gen target di proses dengan software onliePrimer3 web(version 4.1.0), gen target di paste pada kotak dialog (pada Gambar 1).
Gambar 1. Tampilan website primer3web
Tahapan  selanjutnya  sebelum  diproses  disarankan  untuk  mengatur  ukuran produk amplifikasi gen target, ukuran panjang primer (minimal >18 bp dan maksimal <30 bp), Primer Time Melting (Tm) yang disarankan berkisar 50-65˚C dan jumlah GC primer berkisar 45-60% (Gambar 2.), selanjutnya klik tombol pick primer. Primer yang sudah sesuai dengan  persyaratan selanjutnya di cek menggunakan primer-BLAST. Isikan  primer  reverse  dan  primer  forward  pada  sub  judul  “primer  parameters”  lalu pastikan pada sub judul “primer pair specificity checking parameters” kolom “database” telah  diubah  menjadi  nr  dan  pada  kolom  “organism”  dikosongkan  kemudian  klik tombol “get primers”.

## Gambar 2. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam desain primer online

## Metode Optimasi Primer secara laboratorium
Campuran reaksi PCR dimasukkan dalam tabung mikrotub, yang terdiri atas 25 µl 2x Go Taq Green polimerase Master Mix, 10 µl template DNA, primer (F:1 µl) dan distilled water 16-19 µl sehingga total volume 50 µl campuran reaksi PCR dicampur sampai homogen menggunakan vortex, tabung mikrotub selanjutnya dimasukkan ke dalam  mesin  PCR.  Optimasi  dilakukan  menggunakan  PCR  dengan  setting  suhu predenaturasi  94ºC  selama  5  menit,  suhu  denaturasi  94  ºC  selama  30  detik  ,  suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm– 5) ˚C sampai  dengan (Tm + 5) ˚C, suhu elongasi 72 ºC selama 1 menit dan post elongasi 72 ºC selama 5 menit, dilakukan sebanyak 35 siklus (Njiru et al., 2005).
Hasil  amplifikasi  PCR  yang  telah  dilakukan  kemudian  dikonfirmasi  dengan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) menggunakan alat elektroforesis. Komposisi gel agarosa  dibuat  dengan  melarutkan  0,3  gr  agarosa  dalam  30  ml  buffer  TBE  1  x ditambahkan cyber save flourescen 1,5 µl. Larutan tersebut kemudian didihkan hingga semua agarosa larut sempurna, kemudian didinginkan hingga suhu larutan menjadi 60˚C.  Setelah  larutan  dingin  dituangkan  ke  dalam  cetakan  gel  yang  memiliki  sisir sebagai cetakan sumuran. Pada sumuran gel dimasukkan 5 µl marker DNA yang telah dicampurkan  dengan  1  µl  loading  dye  dan  7  µl  sampel  hasil  PCR  yang  telah  di campurkan  dengan  1  µl  loading  dye.  Proses  elektroforesis  dilakukan  dalam  TBE  1x sebagai  media  penghantar  arus  listrik  tegangan  100V  selama  45  menit.  Hasil elektroforesis  kemudian  divisualisasi  dengan  lampu  UV  dan  dianalisis  dengan  di foto. Sampel dinyatakan berhasil apabila didapatkan pita DNA pada 1000 base pair (bp).

## Analisis hasil penelitian dihubungkan dengan penerapan sumber belajar
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  deksriptif  untuk  mendapatkan  primer terbaik dalam amplifikasi gen MRPA dari T. evansi, selanjutnya dihubungkan dengan penerapannya  sebagai  sumber  belajar  biologi.  Berbagai  referensi  diperoleh  dengan
cara  telusur  Google  terkait  dengan  topik  kajian.  Sebagian  besar  referensi  adalah referensi primer berupa jurnal dan prosiding terindeks Scopus, jurnal terakreditasi SINTA, dan beberapa dokumen internasional lainnya yang mendukung kajian ini.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  desain  primer  secara  online  didapatkan  setidaknya  empat desain  primer  gen  MRPA  dari  T.  brucei  yang  sesuai  dengan  syarat  primer.  Syarat- syarat  primer  tersebut  adalah  panjang  primer  berkisar  antara  18-  30  bp,  primer mengandung 45-60% basa guanine (G) dan sitosin (C) dikarenakan ikatan antara G-C memiliki  ikatan  yang  lebih  kuat  dibandingkan  A-T.  Primer  juga  harus memperhatikan  Melting  Temperature  (Tm)  antara  kedua  primer  Forward  dan Reverse  tidak  terlalu  jauh  perbedaannya.  Perhitungan  Tm  pada  masing-masing primer  dapat  dihitung  menggunakan  rumus  2(A+T)  +  4(C+G)  sehingga  akan menghasilkan  suhu  untuk  Tm.  Di  sisi  lain  urutan  basa  dalam  primer  juga  harus diperhatikan agar terhindar dari interaksi antar primer sendiri yang sering disebut dengan self homology, cross homology, dan primer dimer (Handoyo & Rudiretna, 2000). Keempat  primer  hasil  desain  online  kemudian  dilakukan  Primer-BLAST  hal  ini bertujuan  untuk  mengetahui  primer  yang  sudah  di  desain  secara  online  dapat berikatan dengan gen target yang berada pada gene bank (Bedwell & Goldberg, 2020; Ye et al., 2012). Hasil desain primer dari keempat primer hanya terdapat tiga primer yang  merupakan  hasil  dari  analisis  primer  Blast.  Hal  ini  dikarenakan  hanya  tiga primer saja yang berikatan spesifik pada gen target yaitu MRPA T. brucei dan tidak berikatan dengan gen pada organisme lainnya.
Primer pertama memiliki panjang 21bp dengan GC% 47.62 dan Tm left primer 60.00 ºC, Tm right primer 59.98 ºC, F1’ primer akan menempel pada sequence ke 1814 di  rantai  sense  sedangkan  R1’  primer  akan  menempel  pada  sekuens  ke  2826  pada rantai antisense. Hasil primer Blast  menunjukkan primer  ini akan menempel pada spesies  yang  spesifik  yaitu  gen  MRPA  T.  brucei  (Nomor  Akses  NCBI  AJ318885.1, XM_841956.1,  AC091701.3)  dengan  panjang  produk  gen  yang  akan  diamplifikasi sebesar  1013bp.  Hasil  desain  primer  kedua  memiliki  panjang  21  bp,  GC%  sebesar 42.86,  Tm  56.97  ºC  untuk  left  primer  dan  Tm  right  primer  sebesar  57.06  ºC.  Hasil analisis primer BLAST untuk primer kedua menunjukkan primer ini spesifik terhadap gen  MRPA  pada  T.  brucei  (XM_841956.1,  AC091701.3,  AJ318885.1) dengan panjang produk gen yang akan teramplifikasi sebesar 1216bp. Desain primer ketiga memiliki panjang 20 bp, Tm left 56.97 ºC , Tm right 57.06 ºC dan GC% 42.86 dengan panjang produk amplifikasi sebesar 1133. Hasil primer BLAST menunjukkan primer ini cukup spesifik  yaitu  hanya  mengenali  gen  MRPA  T.  brucei  (XM_841956.1,  AC091701.3, AC091701.3). Semua primer yang dinyatakan memenuhi persyaratan ukuran, Tm dan persentase GC (Tabel 1) selanjutnya dilakukan optimasi secara laboratorium. Tabel 1. Hasil desain primer online dan analisis primer BLAST
No Oligo Start Panjang Tm GC% Sekuen 1 Left Primer 1814 21 bp 60.00 ºC  47.62 CCTCACTTTGTGGCCGTATAA Right Primer  2826 21 bp 59.98 ºC  47.62 ATCCACAGCCTCCGTATTCTT 2 Left Primer 1691 21 bp 56.97 ºC  42.86 TACTGAACTTCTTGCCACACA Right Primer  2904 21 bp 57.06 ºC  42.86 ACATGCACCAACATACCTCTT 3 Left Primer 1689 20 bp 56.97 ºC  42.86 CTGAACTTCTTGCCACACAG Right Primer  2902 20 bp 57.06ºC  42.86 CACAGCCTCCGTATTCTTCT
Optimasi  dilakukan  menggunakan  PCR  dengan  pengaturan  suhu  annealing yang digunakan dihitung berdasarkan (Tm– 5) ºC sampai dengan (Tm + 5) ºC. Hasil optimasi  ketiga  primer  menunjukkan  primer  pertama  optimal  pada  suhu  59.5  ºC, primer kedua optimal pada suhu 58 ºC, primer ketiga tidak dapat ditemukan suhu optimalnya. Gambar 3 menunjukan hasil optimasi primer menggunakan PCR, pada primer  pertama  dan  kedua  menunjukkan  adanya  pita  DNA  yang  jelas,  sedangkan pada primer ketiga tidak tampak adanya pita DNA. Proses optimasi annealing masing- masing primer dilakukan beberapa kali untuk mendapatkan hasil yang standard atau sama  setiap  pengulangan.  Pada  primer  pertama  dapat  dimungkinkan  lebih  stabil dikarenakan  memiliki  GC  persentase  yang  paling  tinggi  yaitu  47.62%  sehingga menunjukkan pita DNA yang jelas, hal ini dikarenakan nilai GC menunjukkan ikatan yang lebih kuat antara primer dan DNA template  (Dewi et al., 2020; McPherson & Møller, 2007; Suryanti et al., 2019; Ye et al., 2012).
Gambar  3.  Hasil  optimasi  annealing  ketiga  primer,  (M)  Marker  1  kb,  (1)  hasil amplifikasi primer pertama, (2) hasil amplifikasi primer kedua, (3) hasil amplifikasi primer ketiga
Pada  primer  kedua  juga  menunjukkan  hasil  yang  sama  dengan  pita  yang terlihat,  namun  pada  primer  ketiga  hasil  yang  didapatkan  tidak  konsisten  bahkan tidak  terlihat  pita  DNA.  Hal  ini  dimungkinkan  karena  rendahnya  nilai  GC dibandingkan  kedua  primer  lainnya  dan  juga  perbedaan  area  pengenalan  primer yang mungkin tidak dapat mengenali DNA template (Handoyo & Rudiretna, 2000; McPherson & Møller, 2007) dari gen MRPA T. evansi mengingat desain primer diambil dari gen MRPA T. brucei sehingga tidak semua susunan gennya sama (Lun, Li, Chen, Lu, & Zhu, 2004). Sekuen gen MRPA T. brucei dijadikan template awal desain primer dikarenakan  T.  brucei  memiliki  kekerabatan  yang  sangat  dekat  dengan  T.  evansi (Nuryady, Widayanti, Nurcahyo, Fadjrinatha, & Ahmad Fahrurrozi, 2019).
Hasil optimasi primer pada penelitian ini dapat dijadikan kajian sebagai sumber belajar, dikarenakan umumnya  guru-guru kurang  begitu percaya diri atau bahkan kesulitan dalam menjelaskan materi terkait dengan bahasan molekuler (Boulay et al., 2010). Untuk kebanyakan guru biologi, biokimia dan biologi molekuler sangat sulit. Buku  teks  yang  mereka  miliki  dan  pelajari  tidak  dapat  memberikan  informasi mutakhir,  sementara  akses  ke  jurnal  penelitian  cukup  mahal  serta  relatif  minim pengalaman. Hal ini menjadi tantangan bagi guru, dan walau bagaimanapun guru
harus terus mengembangkan kompetensi mereka  (Dolan & Collins, 2015; Knight & Wood,  2005;  Veselinovska,  Gudeva,  &  Djokic,  2011;  Wood,  1984).  Guru-termasuk guru  IPA/Biologi-memainkan  peran  penting  dalam  pembelajaran  (Angin,  2020; Cahyono,  2020;  Pantiwati  &  Nyono,  2020;  Zalsalina,  Palupi,  &  Riyaningsih,  2020), termasuk pembelajaran biologi molekuler yang kaya teknologi saat ini yang secara signifikan mempengaruhi pembelajaran siswa. Untuk alasan inilah saatnya bagi siswa sekolah menengah, untuk menyadari bahwa tanggung jawab mereka terhadap subjek telah berubah, karena adanya tren terbaru dalam informasi dan komunikasi (Sarkar & Sarkar, 2016).
Hal  ini  sangat  penting  menjadi  bahan  kajian  dikarenakan  pada  pembahasan Biologi molekuler seorang guru juga harus menjelaskan terkait hal-hal yang berkaitan dengan PCR misalkan pembahasan apa itu primer, dan bagaimana cara mendesain primer  (Wardoyo,  Sabrina,  &  Suryani,  2020).  Sebagai  upaya  mengembangkan keterampilan  praktis  guru  sekolah  menengah,  guru  juga  perlu  membahas  materi teknologi DNA, integrate DNA science and technology (Miller, Sass, Wong, & Nienhuis, 2004),  teori  tentang  isolasi  DNA,  reaksi  berantai  polimerase,  dan  elektroforesis dilakukan  di  ruang  kelas.  Sementara  itu  di  laboratorium,  penggunaan  peralatan biologi molekuler, elektroforesis, hasil interpretasi pita DNA elektroforesis, dan NCBI dilakukan oleh para guru yang dibantu oleh asisten laboratorium (Aryani, Nugroho, Manurung, & Prahastika, 2018). Pemodelan molekul juga dipilih sebagai pusat atau inti  pembelajaran  karena  melibatkan  semua  disiplin  ilmu  (Taly,  Nitti,  Baaden,  & Pasquali,  2019).  Siswa  juga  dapat  memperoleh  pengalaman  langsung  dengan program grafis untuk menjelajahi aspek struktural sistem makromolekul (Canning & Cox, 2001).
Hal  ini  menjadi  penting  untuk  diaplikasikan  menjadi  sumber  belajar dikarenakan pada beberapa profil lulusan LPTK khususnya pendidikan biologi salah satu profil lulusan yang harus dicapai selain menjadi guru adalah menjadi wirausaha dan peneliti (National Research Council, 2003). Aspek peneliti dalam profil lulusan perguruan  tinggi  menjadi  hal  yang  sangat  mandatory  agar  para  mahasiswa pendidikan  biologi  lebih  memahami  proses-proses  dalam  pekerjaan  molekuler. Pekerjaan  bidang  molekuler  saat  ini  merupakan  bidang  yang  paling  berkembang (Nurhayati  &  Darmawati,  2019),  sehingga  apabila  mahasiswa  diharapkan  menjadi peneliti maka penerapan pembelajaran molekuler seperti desain dan optimasi primer harus  diaplikasikan  sebagai  sumber  belajar.  Oleh  karena  itu,  mahasiswa  dapat mengaplikasikan  cara  mendesain  dan  optimasi  PCR  untuk  berbagai  pekerjaan molekuler yang berhubungan dengan PCR di masa yang akan datang.

## KESIMPULAN
Desain primer onlie didapatkan tiga primer yang sesuai dengan persyaratan dan juga  hasil  primer  BLAST  menunjukkan  ketiga  primer  tersebut  spesifik  berikatan dengan gen MRPA T. brucei, namun hasil optimasi menunjukkan primer pertama dan kedua  merupakan  primer  yang  dapat  digunakan  untuk  penelitian  amplifikasi  gen MRPA T. evansi dengan suhu annealing masing-masing yaitu 59.5ºC dan 58ºC. Hasil penelitian ini sangat penting untuk diaplikasikan sebagai sumber belajar mahasiswa pendidikan biologi, agar mahasiswa pendidikan biologi lebih memahami pekerjaan molekuler  seperti  desain  dan  optimasi  PCR  agar  menjadi  lulusan  sesuai  cita-cita program studi salah satunya yaitu menjadi peneliti.

## SARAN
Kajian  ini  merupakan  titik  awal  rekomendasi  fokus  penelitian  terkait  dengan optimasi primer dan bagaimana kaitanya dengan pengembangan kompetensi calon guru  biologi.  Kajian  ini  perlu  dilajutkan  dalam  bentuk  model-model  pembelajaran atau  pengembangan  sumber  belajar  berbasis  desain  dan  optimasi  primer  dalam biologi.  Mahasiswa  dan  peneliti  lain  dapat  mengembangkan  desain  dan  optimasi primer  untuk  penelitian  molekuler  lainnya  dengan  bahan  atau  sampel  yang  lebih spesifik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kami  sampaikan  kepada  Dekan  Fakultas  Keguruan  dan  Ilmu Pendidikan serta Rektor Universitas Muhammadiyah Malang yang terus mendorong pengembangan  kajian  dan  diskusi  terkait  dengan  bioteknologi,  biologi  molekuler, dan implementasinya dalam pembelajaran sehingga memperkaya bahan yang dapat ditranfer kepada para mahasiswa calon guru biologi.

## DAFTAR PUSTAKA
Angin, R. Z. P. (2020). Penerapan STEM Pada Pembelajaran IPA Materi Bioteknologi. Prosiding  Seminar  Nasional  V  2019,  300–307.  Malang,  Indonesia:  Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Malang.
Aryani, R., Nugroho, R. A., Manurung, H., & Prahastika, W. (2018). Enhancing biology molecular  laboratory  practice  for  senior  high  school  of  biology  teachers  from Samarinda and Tenggarong city. Pelita Eksakta, 1(2), 75–81. https://doi.org/10.24036/pelitaeksakta/vol1-iss2/29
Bass,  D.,  Stentiford,  G.  D.,  Littlewood,  D.  T.  J.,  &  Hartikainen,  H.  (2015).  Diverse applications  of  environmental  DNA  methods  in  parasitology.  Trends  in Parasitology, 31(10), 499–513. https://doi.org/10.1016/j.pt.2015.06.013
Bedwell,  M.  E.,  &  Goldberg,  C.  S.  (2020).  Spatial  and  temporal  patterns  of environmental DNA detection to inform sampling protocols in lentic and lotic systems.
Ecology and Evolution,
10(3), 1602–1612.
https://doi.org/10.1002/ece3.6014
Boulay, R., Parisky, A., & Campbell, C. (2010). Developing teachers’ understanding of molecular  biology:  Building  a  foundation  for  students.  ASCILITE  2010  -  The Australasian Society for Computers in Learning in Tertiary Education, 119–128.
Cahyono, E. (2020). Kajian kompetensi guru tentang laboratorium IPA di SMP dan SMA.  Prosiding  Seminar  Nasional  V  2019,  362–367.  Malang:  Pendidikan  Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Malang.
Canning,  D.  R.,  &  Cox,  J.  R.  (2001).  Teaching  the  structural  nature  of  biological molecules: Molecular visualization in the classroom and in the hands of students. Chemistry  Education:  Research  and  Practice  in  Europe,  2(2),  109–122. https://doi.org/10.1039/b1rp90013g
Delespaux, V., Geysen, D., Majiwa, P. A. O., & Geerts, S. (2005). Identification of a genetic marker for isometamidium chloride resistance in Trypanosoma congolense. 35, 235–243. https://doi.org/10.1016/j.ijpara.2004.11.009
Dewi,  D.,  Wardhana,  A.,  Ekawasti,  F.,  &  Sawitri,  D.  (2020).  Perbandingan  lima  set primer  untuk  mendeteksi  Trypanosoma  evansi  pada  mencit  dengan  teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Medpub.Litbang.Pertanian.Go.Id, 178–188.
Dolan, E. L., & Collins, J. P. (2015). We must teach more effectively: Here are four ways to  get  started.  Molecular  Biology  of  the  Cell,  26(12),  2151–2155.
https://doi.org/10.1091/mbc.E13-11-0675
Handoyo,  D.,  &  Rudiretna,  A.  (2000).  Prinsip  umum  dan  pelaksanaan  polymerase chain reaction (PCR)[general principles and implementation of polymerase chain reaction]. Unitas, 9(1), 17–29.
Keskin, B., & Özay Köse, E. (2017). Misconceptions of prospective biology teachers about theory of evolution. Balikesirnef, 11(2), 212–242. https://doi.org/10.17522/balikesirnef.373344
Knight,  J.  K.,  &  Wood,  W.  B.  (2005).  Teaching  more  by  lecturing  less.  Cell  Biology Education, 4, 298–310. https://doi.org/10.1187/05
Kochin, B. F., Bull, J. J., & Antia, R. (2010). Parasite evolution and life history theory. PLoS Biology, 8(10), 10–13. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1000524
Lun, Z.-R., Li, A.-X., Chen, X.-G., Lu, L.-X., & Zhu, X.-Q. (2004). Molecular profiles of Trypanosoma brucei, T. evansi and T. equiperdum stocks revealed by the random amplified polymorphic DNA method. Parasitology Research, 92(4), 335–340.
Maryuningsih,  Y.,  Hidayat,  T.,  Riandi,  R.,  &  Rustaman,  N.  Y.  (2020).  The  critical thinking skills of biology teacher candidates toward the ethical issues. JPBI (Jurnal Pendidikan Biologi Indonesia), 6(1), 65–74.
McPherson, M., & Møller, S. (2007). Polimerase Chain Reaction (PCR). Taylor & Francis. Miller,  J.  S.,  Sass,  M.  E.,  Wong,  S.  J.,  &  Nienhuis,  J.  (2004).  Micropipetting:  An important  laboratory  skill  for  molecular  biology.  The  American  Biology  Teacher, 66(4), 291–296. https://doi.org/10.2307/4451672
National Research Council. (2003). BIO2010: Transforming undergraduate education for future research biologists. Washington, D.C: National Academies Press.
National Science Teachers Association. (2003). Standards for science teacher preparation. Retrieved
from https://digitalcommons.unl.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1085&context=te achlearnfacpub
Njiru, Z. K., Constantine, C. C., Guya, S., Crowther, J., Kiragu, J. M., Thompson, R. C. A., & Dávila, A. M. R. (2005). The use of ITS1 rDNA PCR in detecting pathogenic African trypanosomes. Parasitology Research, 95(3), 186–192.
Nurhayati,  B.,  &  Darmawati,  S.  (2019).  Biologi  sel  dan  molekuler:  Bahan  ajar teknologi labotarium medis. Jakarta: Indo. Kemkes. BPPSDM.
Nurlaila,  L.,  Sriyati,  S.,  &  Riandi.  (2017).  Analizing  student  biology  education misconception  and  scientific  argumentation  ability  using  diagnostic  question clusters (Dqcs) of molecular genetic concept. Journal of Physics: Conference Series, 812, 012112. https://doi.org/10.1088/1742-6596/812/1/012112
Nuryady,  M.  M.,  Widayanti,  R.,  Nurcahyo,  R.  W.,  Fadjrinatha,  B.,  &  Ahmad Fahrurrozi, Z. S. (2019). Characterization and phylogenetic analysis of multidrug- resistant protein-encoding genes in Trypanosoma evansi isolated from buffaloes in  Ngawi  district,  Indonesia.  Veterinary  World,  12(10),  1573–1577. https://doi.org/10.14202/vetworld.2019.1573-1577
Olander, C., & Olander, M. H. (2013). Professional development through the use of learning  study:  Contributions  to  pedagogical  content  knowledge  in  biology. Procedia -Social and Behavioral Sciences, 89, 205–212.
Pantiwati,  Y.,  &  Nyono,  N.  (2020).  Asesmen  Autentik  dalam  Kegiatan  Praktik Pembelajaran sains. Prosiding Seminar Nasional Pendidikan Biologi V 2019, 385–392. Malang: Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Malang.
Sambrook, J., R. D. . (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3th editio). New York: Cold Spring Harbor Laboratory press.
Sarkar, S., & Sarkar,  S. (2016). A new approach to teach molecular biology in high school  using  Python.  2016  IEEE  Region  10  Humanitarian  Technology  Conference (R10-HTC), 1–5. Retrieved from 10.1109/R10-HTC.2016.7906784
Scottish  Qualifications  Authority.  (2019).  Higher  biology.  Retrieved  from https://www.sqa.org.uk/files_ccc/HigherCourseSpecBiology.pdf
Suryanti,  E.,  Fitriani,  A.,  Redjeki,  S.,  &  Riandi,  R.  (2019).  Identifikasi  kesulitan mahasiswa  dalam  pembelajaran  biologi  molekuler  berstrategi  modified  free inquiry. Perspektif Pendidikan Dan Keguruan, 10(2), 37–47.
Taly, A., Nitti, F., Baaden, M., & Pasquali, S. (2019). Molecular modelling as the spark for  active  learning  approaches  for  interdisciplinary  biology  teaching.  Interface Focus, 9(3). https://doi.org/10.1098/rsfs.2018.0065
Veselinovska,  S.  S.,  Gudeva,  L.  K.,  &  Djokic,  M.  (2011).  Applying  appropriates methods for teaching cell biology. Procedia - Social and Behavioral Sciences, 15, 2837– 2842. https://doi.org/10.1016/j.sbspro.2011.04.199
Wardhana,  A.  H.,  Merlina,  Y.,  &  Subekti,  D.  T.  (2014).  Aktivitas  Antitrypanosoma Ekstrak Air Daun Tithonia diversifolia A. Gray dan Artemisia annua L. terhadap Trypanosoma evansi secara in vitro. JITV, 19(2).
Wardoyo,  E.  H.,  Sabrina,  Y.,  &  Suryani,  D.  (2020).  Pengenalan  teknik  molekuler polymerase chain reaction ( PCR ) pada guru biologi SMA di Kota Mataram. 1(2), 139– 143.
Wood, E.  J.  (1984).  Biochemistry  is  a difficult  subject  for  both  student  and  teacher.
Biochemical Education, 18(4), 170–172.
Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., & Madden, T. L. (2012). Primer-BLAST:  A  tool  to  design  target-specific  primers  for  polymerase  chain reaction. BMC Bioinformatics, 13(1), 134.
Yuwono,  T.  (2006).  Teori  dan  Aplikasi  Polymerase  Chain  Reaction;  panduan eksperimen PCR untuk memecahkan masalah biologi terkini. Yogyakarta: Penerbit Andi, 89.
Zalsalina, R., Palupi, G., & Riyaningsih, D. (2020). Penilaian keterampilan abad ke-21. Prosiding  Seminar  Nasional  V  2019,  340–346.  Malang:  Pendidikan  Biologi  FKIP Universitas Muhammadiyah Malang.