ANALISIS POTENSI DAUN TORBANGUN ( Plectranthus amboinicus ) SEBAGAI ANTIBAKTERI TERHADAP Klebsiella pneumoniae SECARA IN SILIC O
Nabila Nur Nafiati 1 , Rini Madyastuti Purwono 2* , Nurhidayat 3 , Laksmi Ambarsari 4
1 Program Sarjana Sekolah Kedokteran Hewan dan Biomedis, Institut Pertanian Bogor 2 Sub-divisi  Farmasi  Veteriner,  Departemen  Klinik,  Reproduksi,  dan  Patologi,  Sekolah Kedokteran Hewan dan Biomedis, Institut Pertanian Bogor 3 Divisi  Anatomi,  Histologi,  dan  Embriologi,  Departemen  Anatomi,  Fisiologi,  dan Farmakologi, Sekolah Kedokteran Hewan dan Biomedis, Institut Pertanian Bogor 4 Departemen  Biokimia,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Institut Pertanian Bogor *Penulis Korespondensi: rinipurwono@gmail.com

## ABSTRAK
Resisten  antibiotik  adalah  masalah  global. Klebsiella  pneumoniae memiliki  prioritas  tinggi untuk  dicari  antibiotiknya  karena  memiliki  enzim  extended-spectrum  beta-lactamase  (ESBL) yang  membuat  bakteri  mudah  kebal  terhadap  antibiotik.  Kajian  fitokimia  pada  tumbuhan  obat merupakan  salah  satu  upaya  untuk  menemukan  antibiotik.  Indrulizia  merupakan  salah  satu tanaman obat empiris yang mengandung flavonoid yang digunakan untuk mengobati penyakit. Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  menganalisis  potensi  borage  sebagai  antibakteri  terhadap Klebsiella  pneumoniae  in  silico.  Metode  docking  pada  penelitian  ini  menggunakan  AutoDock Vina. Ini adalah aplikasi untuk docking enzim ESBL dari K. pneumoniae , disebut sebagai SHV (variabel sulfhidril), dan metabolit kedua dari tumbuhan. Parameter yang dianalisa adalah energi bebas ikatan, konstanta inhibisi dan visualisasi 3D dan 2D. Energi bebas ikatan dan konstanta inhibisi  ligan  asli  adalah  -6,7  kkal/mol  dan  12,118  μM.  Nilai  energi  bebas  ikatan  apigenin  7- glucuronide  dan  asam  rosmarinic  menunjukkan  potensi  yang  lebih  tinggi  daripada  ligan  asli SHV-1 (1,4-thiazepine).
Kata Kunci: Resistensi Antibiotik, AutoDock Vina, Indian borage, Klebsiella pneumoniae

## ABSTRACT
Antibiotic-resistant  is  a  global  issue. Klebsiella  pneumoniae has  high  priority  to  find  its antibiotic  because  it  has  extended-spectrum  beta-lactamase  (ESBL)  enzyme  that  makes  the bacteria easy to resist the antibiotic. The study of phytochemicals in medicinal plants is one of the  efforts  to  find  antibiotics.  Indrulizia  is  one  of  the  empirical  medicinal  plants  containing flavonoids used to treat disease. The aim of this study was to analyze the potential of borage as an  antibacterial  agent  against  Klebsiella  pneumoniae  in  silico.  Docking  is  the  method  for  this study  using  AutoDock  Vina.  This  is  an  application  for  docking  the  enzyme  ESBL  from K. pneumoniae ,  referred to  as  SHV  (sulfhydryl  variable),  and  the  metabolite  second  from  plants. The  parameters  analyzed  were  binding  free  energies,  inhibition  constants  and  visualization  in 3D and 2D. The free energy of binding and the inhibition constant of the native ligand are -6.7 kcal/mol  and  12.118  μM.  The  binding  free  energy  values  of  apigenin  7-glucuronide  and rosmarinic acid show higher potencies than the native ligand of SHV-1 (1,4-thiazepine).
Keywords : Antibiotic resistant, docking, Indian borage, Klebsiella pneumoniae

## PENDAHULUAN
Saat ini masalah resistensi antibiotik  menjadi  masalah  global. World  Health  Organization (WHO) memberikan  daftar  bakteri  prioritas untuk ditemukan antibiotiknya dengan 3 kelas  prioritas.  Bakteri  yang  termasuk di dalam prioritas 1 adalah Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, dan  beberapa  bakteri  dalam famili Enterobacteriaceae seperti Klebsiella, E. coli, Serratia , dan Proteus (Tacconelli et  al., 2018).  Resistensi antibiotik dapat terjadi karena penggunaan antibiotik yang kurang bijak dalam pengobatan  seperti  kurang  patuhnya  pasien untuk menghabiskan antibiotik yang diberikan,  konsentrasi antibiotik yang diberikan dibawah dari yang dibutuhkan, dan kegagalan  dalam  pengobatan  (Kitagawa et al., 2018).
Klebsiella  pneumonia merupakan bakteri  gram-negatif  yang  mudah sekali mengalami  resistensi  karena  adanya enzim extended spectrum beta- lactamase (ESBL)  (Nirwati et  al.,
2019).  Salah  satu  varian  ESBL  yang banyak ditemukan pada bakteri Klebsiella  pneumoniae adalah  SHV ( Sulfhydryl  Variable )  (Rajasekharan et al., 2017).  SHV  terletak  pada  plasmid bakteri, sehingga memudahkan penyebaran  gen  beta-laktamase  yang
telah  bermutasi  ke  bakteri  lain  (Chaves et al., 2001).
Berbagai  penelitian  telah  banyak dilakukan dalam upaya mencari senyawa  antibiotik  baru,  salah  satu upaya yang dilakukan adalah melakukan  pengujian berbagai senyawa metabolit  sekunder  yang  berasal  dari tanaman  dengan  menggunakan  teknik komputasi (Setzer et al., 2016). Penggunaan senyawa tanaman berkhasiat  obat  banyak  digunakan  oleh masyarakat  dengan  keuntungan  antara lain efek samping yang minimal, mudah didapat, dan praktis (Pane et al., 2021). Walaupun  begitu,  Indonesia  memiliki banyak tanaman obat yang masih belum dimanfaatkan  secara  optimal.  Ada sekitar  9000  spesies  tanaman  yang diperkirakan  memiliki  kandungan  obat dan  baru  10%  dari  tanaman  obat  yang sudah  dimanfaatkan  sebagai  bahan fitofarmaka (Munadi, 2017).
Penelitian  terkait  tanaman  obat yang memiliki potensi sebagai antibakteri K. pneumoniae telah banyak dilakukan.  Salah  satu  tanaman  yang memiliki  potensi  tersebut  adalah  daun torbangun  ( Plectranthus  amboinicus ).
Daun  torbangun  memiliki  aroma  yang cukup  kuat,  tanaman  aromatik  seperti ini sering digunakan sebagai obat herbal
karena manfaatnya yang dapat
membunuh bakteri patogen (Nasution et al., 2017; Gafur et al., 2020). Penelitian yang telah dilakukan oleh Sivaranjani et al., (2019)  menunujukkan  hasil  bahwa daun  torbangun  memiliki  hasil  zona inhibisi  bakteri K.  pneumoniae sebesar 31  mm  pada  konsentrasi  ekstrak metanol  50  mg/mL,  sedangkan  pada dosis  100  mg/mL  menunjukkan  zona inhibisi  yang  lebih  besar,  yaitu 35  mm. Saat  ini  belum  ada  informasi  mengenai analisis daun torbangun  secara in  silico , sehingga  mekanisme  penghambatan terhadap           bakteri  belum  diketahui dengan jelas. Harapannya dengan dilakukan penelitian ini akan
melengkapi  data  mekanisme  daun torbangun  dalam  berperan  sebagai antibakteri sehingga pemanfaatan tanaman dalam upaya menjaga kesehatan  bisa  berlandaskan  kepada scientific base medicine.

## METODE PENELITIAN

## Preparasi Protein Reseptor
Struktur  kimia  beta-laktamase yang digunakan sebagai reseptor dengan kode  protein  SHV-1  diunduh  pada laman https://www.rcsb.org .  Reseptor yang telah diunduh dibuka
menggunakan aplikasi Discovery Studio
Visualizer untuk  memisahkan  ligan alami  dan  menghilangkan  molekul  air. Hasil  setelah  ini  protein    disimpan dengan format *.pdb. Data ini kemudian dibuka dengan aplikasi AutoDock Tools untuk                 ditambahkan  hidrogen  polar, kemudian  data  ini  disimpan  dengan format *.pdbqt.\

## Preparasi Ligan
Struktur  kimia  dari  tanaman  daun torbangun (ligan uji) yaitu apigenin  7 – glucuronid, asam rosmarinat, dan karvakrol diunduh pada laman https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov dalam bentuk  2D  dengan  format  *.sdf.  Ligan yang  telah  diunduh  diubah  strukturnya menjadi  3D  menggunakan Discovery Studio  Visualizer dan  disimpan  dalam format *.pdb. Ligan yang telah memiliki  format  *.pdb  dimasukkan pada laman http://www.scfbio- iitd.res.in/software/drugdesign/lipinski.j sp untuk  diketahui  bioavailabilitasnya.
Selanjutnya semua ligan dibuka kembali  pada  aplikasi AutoDock  Tools dan  disimpan  lagi  dengan  format *.pdbqt.
Validasi Metode Penambatan Molekuler Ligan  alami  yang  sebelumnya didapatkan  dari  pemisahan  ligan  pada
protein  SHV-1  disimpan  dalam file
tersendiri dengan format *.pdb.
Selanjutnya ligan alami, format penyimpanannya diubah menjadi *.pdbqt menggunakan aplikasi AutoDock  Tools .  Struktur  reseptor  dan ligan  yang  telah  dipreparasi  dibuka menggunakan  aplikasi AutoDock  Tools untuk membuat gridbox dengan menentukan titik koordinat yang disebut dengan center point serta ukuran dimensi (x,  y,  dan  z).  Penambatan  molekuler dilakukan  menggunakan  ligan  alami dan  diulang  sebanyak  20  kali  hingga mendapatkan rata-rata root mean standard deviation (RMSD) kurang dari 3 Å.

## Penambatan Molekuler
Reseptor  dan  ligan  yang  telah dipreparasi  dipindahkan  ke dalam folde r yang  sama  dengan  aplikasi Autodock Vina yang  berada  di Drive C,  folder diberi nama Vina. Dokumen konfigurasi dibuat  menggunakan  aplikasi notepad dengan  memasukkan  data  berupa  nama reseptor  dan  ligan  yang  digunakan, nama dokumen hasil penambatan molekuler  ( output ),  dan center  point
serta  dimensi  yang  sebelumnya  sudah didapatkan melalui grid box .
Penambatan molekuler dilakukan
menggunakan program command prompt ,  dengan  perintah  pemrograman yaitu “C:\vina --config (nama konfigurasi).txt  --log  (nama  log).txt” kemudian tekan enter . Hasil penambatan molekuler didapatkan dokumen output dengan  format *.pdbqt dan  log  dengan  format  *.txt.  Dokumen output dibuka  menggunakan  aplikasi Discovery  Studio  Visualizer .  Dokumen log  berisi data nilai energi  bebas ikatan ( binding affinity) dan RMSD.

## Analisis Energi Bebas Ikatan dan Konstanta Inhibisi
Hasil penambatan molekuler yang berupa  nilai  energi  bebas  ikatan ditabulasikan  dan  hasilnya  digunakan untuk  mencari  nilai  konstanta  inhibisi (Ki) berdasarkan persamaan berikut:
∆ 𝐺 = 𝑅𝑇 𝑙𝑛 𝑙𝑛 𝐾𝑖
Keterangan:
ΔG  :  Energi  afinitas  atau  perubahan energy bebas Gibbs
R :  Konstanta  ideal  gas  (1,986 kal/molK)
T : Suhu (298 K)
Ki : Konstanta inhibisi

## Visualisasi Ligan Hasil Penambatan Molekuler
Hasil yang diperoleh akan dilakukan visualisasi menggunakan
aplikasi Discovery  Studio  Visualizer untuk  dilihat  kompleks  ligan  uji- reseptor  yang  memiliki  model  interaksi paling  mendekati  reseptor  dengan  ligan alami.  Model  tersebut  digabungkan dengan  cara  menyalin  model  terpilih pada layar tab “ ligand ” dan ditempelkan pada  layar  tab  “ macromolecule ”.  Ligan ditarik  ke  reseptor  sehingga  struktur keduanya menyatu.
Hasil
penggabungan  disimpan  dengan  format *.pdb.  Analisis  dapat  dilakukan  dengan visualisasi 3D menggunakan PyMol .

## Analisis Data
Data  bioavabilitas, Root  Mean Standard Deviation , energi bebas ikatan, konstanta inhibisi, dan presentase Binding Site Similarity ditabulasikan dengan aplikasi Microsoft excel dan  dianalisis  dengan  metode deskriptif. Visualisasi
3D dapat diperoleh  dari  aplikasi PyMol serta  2D dapat diperoleh  dari  aplikasi Ligplot+ version  v.2.2.5 dan  dianalisis  dengan metode deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada  penelitian  ini  dilakukan beberapa  persiapan  untuk  melakukan penambatan  molekul  atau molecular docking antara  ligan  uji  dengan  enzim
atau protein target. Ligan uji merupakan kandidat obat yang akan dikaji umumnya  metabolit  sekunder  dari tanaman.  Pada  studi  ini  menggunakan ligan  uji  Apigenin  7  –  glucuronide, asam rosmarinate, dan karvakrol. Setiap ligan uji yang akan digunakan umumnya  dilakukan  uji  stabilitas  dan biovaibilitas dengan menggunakan prinsip aturan Lipinski (Tabel 1). Aturan /prinsip  Lipinski  harus  memenuhi  5 aturannya  yaitu berat molekul di bawah 500  Dalton,  log  P≤5,  donor  ikatan hidrogen  ≤  5,  akseptor  ikatan  hidrogen ≤  10,  dan  refraktivitas  molar  di  antara 40-130  (Lipinski,  2004).  Aturan  dari Lipinski dapat menentukan sifat fisikokimia  suatu  ligan  yang  dapat menentukan  karakter  hidrofobik  atau hidrofilik suatu senyawa melalui membran sel oleh difusi pasif (Lipinski 2001).
Analisis  Lipinski  terhadap  ligan uji menunjukkan hasil, asam rosmarinat dan  karvakrol  memenuhi  lima  aturan lipinski. Sementara ligan uji apigenin 7- glucuronide memiliki  nilai  donor  dan akseptor  ikatan  hidrogen  yang  lebih besar,  sehingga  tidak  memenuhi  aturan Lipinski sebanyak 2 buah. Dua ligan uji yang memenuhi aturan Lipinski menunjukkan senyawa apabila
dijadikan  obat  dalam  bentuk  per  oral maka proses absorpsinya cukup baik.
Setelah  persiapan  ligan  uji  dan protein  maka  dilanjutkan  dengan  tahap selanjutnya yaitu penambatan
molekuler. Pada penelitian ini, penambatan  molekul  pada  daerah  atau yang  biasa  disebut  dengan grid  box
memiliki  ukuran  dimensi  x=10,  y=12, z=14 serta center point (pusat) x=8,022; y=39,967;  z=2,569.  Sebelum grid  box dapat digunakan sebagai pedoman untuk penambatan  molekuler  terhadap  ligan uji,  perlu  dilakukan  validasi  dengan melakukan  penambatan  ulang  terhadap ligan alami.
Tabel 1. Bioavailabilitas Ligan Uji Menggunakan 5 Aturan Lipinski Ligan Berat Molekul (Dalton) Donor ikatan hidrogen Akseptor ikatan hidrogen Log P Refraktivitas Molar Apigenin 7 – glucuronide 446 6 11 1,287 95,497 Asam Rosmarinat 360 5 8 1,534 81,959 Karvakrol 150 1 1 2,162 48,492 Validasi Grid  box dapat  dilihat melalui  nilai Root  Mean  Square Deviation (RMSD)  dengan  melakukan pengulangan proses
penambatan molekuler pada ligan alami sebanyak 20 kali.  Rata-rata  nilai  RMSD  yang didapatkan dari penambatan ulang ligan alami  dari  enzim  SHV-1  adalah  2,309 Å.  Nilai  RMSD  yang  baik  adalah kurang dari 3Å, lebih dari nilai ini akan banyak  terjadi  ligan  uji  yang  tidak menempel  di  situs  yang  diinginkan (situs  katalitik)  (Grosdidier et  al., 2007).
Energi  bebas  ikatan adalah energi yang  dibutuhkan  oleh  ligan  dan  protein
target  untuk  saling  berikatan,  semakin negatif  energi  bebas  ikatan  tersebut maka  ikatan  hidrogen  semakin  kuat (Nusantoro dan Fadlan, 2020). Konstanta inhibisi merupakan
konsentrasi  yang  dibutuhkan  inhibitor untuk  dapat  menginaktifkan  enzim (McWhirter, 2021).
Nilai  konstanta  inhibisi  akan selaras dengan nilai energi bebas ikatan (Tabel 2). Ligan uji dengan nilai energi bebas  ikatan  dan  konstanta  inhibisi terkecil  adalah  asam  rosmarinat  yaitu  - 8,1  kkal/mol  dan  1,138  µM.  Karvakrol merupakan ligan uji yang memiliki nilai energi  bebas  ikatan  dan  konstanta
inhibisi  lebih  tinggi  daripada  ligan alami.  Menurut  Vargas et  al., (2018), semakin  kecil  nilai  dari  energi  bebas
ikatan  dan  konstanta  inhibisi,  maka afinitas  ligan  dengan  protein  target semakin tinggi.
Tabel  2. Energi  Bebas  Ikatan  dan  Konstanta  Inhibisi  Ligan Alami,  Ligan Kontrol,  dan Ligan Uji Terhadap SHV-1

## Visualisasi  Penambatan  Molekuler
Ligan
Hasil  dari  penambatan  molekuler yang  dilakukan  terhadap  kelima  ligan uji  berada  di  situs  katalitik  yang divisualisasikan  secara  3D  dapat  dilihat pada  Gambar  1.  Daerah  merah  (situs katalitik)  merupakan daerah yang berperan  aktif  dalam  proses  enzimatis SHV-1.  Situs  katalitik  terletak  pada Ser70, Lys73, Ser130, Glu166, Asn170, dan Lys234 (Kuzin et al., 1999). Hal ini menunjukkan  bahwa  seluruh  ligan  uji
memiliki  peran  dalam  proses  tersebut dengan  berikatan  pada   situs  katalitik. Namun,  hal  tersebut  dapat  dilihat  lebih jelas  menggunakan  visualisasi  2D  yang memperlihatkan  ikatan  yang  terbentuk pada ligan uji dengan SHV-1. Visualisasi  2D  menunjukkan  ikatan hidrogen  dan  interaksi  hidrofobik  pada ligan  uji  dengan  SHV-1  (Gambar  1). Hampir semua ligan uji memiliki ikatan dengan  salah  satu  asam  amino  penting dalam SHV-1 kecuali karvakrol .
Gambar  1. Visualisasi  3D  interaksi  ligan  dengan  SHV-1.  Ligan  alami  (paling  kiri), apigenin  7-glucuronide (kiri  kedua),  asam  rosmarinat  (kanan  kedua),  dan  karvakrol (paling  kanan).  Keterangan:  Hijau  =  SHV-1;  merah  =  situs  katalitik;  merah  muda  = CYMAL-6; kuning = ligan.
Ligan Energi bebas ikatan (ΔG) (Kcal/mol) Konstatanta Inhibisi (Ki)(µM) Ligan alami -6,7 12,118 Apigenin 7-glucoronide -7,3 4,397 Asam rosmarinat -8,1 1,138 Karvakrol -6,6 14,348
Visualisasi  2D  antara  ligan  uji dengan  enzim  SHV-1  dapat  dilakukan dengan  menggunakan  perangkat  lunak LigPlot+2.2 dapat dilihat pada (Gambar 2).  Hasil  visualisasi  2D  ini  dapat dianalisis  bagaimana  interaksi  antara ligan  uji  dengan  sisi  katalitiknya  bisa berupa  interaksi  hidrofobik  atau  ikatan hidrogen. Adanya ikatan hidrogen yang cukup banyak dengan jarak yang cukup dekat  menunjukkan  kekuatan  ikatan antara  ligan  uji  dengan  asam  amino pada  sisi  katalitik.  Ligan  uji  Apigenin 7-glucoronide memiliki 4 ikatan hidrogen  dengan  asam  amino  Asp  104, Asn  170,  dan  Ser  70  pada  sisi katalitiknya.  Ikatan  hidrogen  terjadi antara  ligan  uji  rosmarinate  dengan asam  amino  Ala  237,  Ser  70,  dan  Gly 238 pada enzim target. Sementara ligan alami  (native  ligan)  hanya  membentuk dua  ikatan  hidrogen  pada  asam  amino Ala  237  dan  Asn  170  dan  untuk karvakrol  menunjukkan  4  interaksi ikatan  hidrogen  pada asam  amino   Asn 132,  Ser70,  Asn17,  dan  Ala  237  pada
sisi katalitik enzim.
Analisis  interaksi  antara  ligan  uji dan  enzim  pada  sisi  katalitiknya ditunjukkan  dengan  presentase Binding
Site Similarity (BSS) (Tabel 3).
Walaupun struktur molekul dapat sangat berbeda,  jika  terikat  di  bagian  yang sama, maka ligan uji berpeluang menjadi kandidat obat (Kellenberger et al., 2008). Nilai  ini  melihat  jumlah  ikatan  yang sama  antara  ligan  uji  dengan  ligan alami. Nilai  BSS tertinggi  dimiliki  oleh apigenin  7-  glucuronide dengan  nilai 87,5%  dan  nilai  BSS  terendah  dimiliki oleh karvakrol dengan nilai 25%. Empat dari  lima  ligan  uji  memiliki  presentase BSS lebih dari 50%  yang menunjukkan bahwa empat ligan uji tersebut diperkirakan  memiliki  efek  yang  sama dengan  ligan  alami.  Ligan  alami  yang digunakan  adalah  1,4-thiazepine.  1,4- thiazepine  merupakan  obat  golongan penem yang mekanisme kerjanya menghambat  proses  hidrolisis  cincin beta  laktam  (Nukaga et  al., 2003).
Gambar  2. Visualisasi 2D interaksi ligan dengan SHV-1. Ligan alami (A), apigenin  7- glucuronide (B),  asam  rosmarinat  (C),  dan  karvakrol  (D).  Keterangan:  bulu  mata berwarma  merah  menunjukkan  interaksi  hidrofobik  dan  garis  putus-putus  hijau menunjukkan ikatan hidrogen.
Tabel 3. Ikatan Hidrogen dan Interaksi Hidrofobik Ligan Alami dan Ligan Uji  dan Persentase Binding Site Similarity Ligan Uji Terhadap Ligan Alami Ligan Ikatan hidrogen Interaksi hidrofobik %BSS Ligan alami Asn170*, Ala237 Ser70*,  Tyr105, Ser130*, Asn132, Glu166*, Gly238 100% Apigenin 7- glucuronide Ser70* #
Asp104,
Asn170* # Tyr105 # ,Ser130* # Asn132 # ,Glu166
* # Glu171, Val216, Gly238, Glu240 87,5% Asam rosmarinat Ser70* # Asn132 # Ala237 #
Gly238 #
Asp104, Tyr105 # , Gly236, Glu240 62,5% Karvakrol Asn132 Asp104, Tyr105 # , Val216 25%
Keterangan:* =Asam amino pada situs katalitik; # =Asam amino yang sama dengan ligan alami
A
B
C D
Berdasarkan analisa interaksi antara ligan uji yang berasal dari ekstrak torbangun  dan  protein  maka  ligan  uji yang  memiliki  potensi  paling  kuat sebagai antibakteri adalah asam rosmarinate  dengan  energi  bebas  ikatan paling  besar  dibandingkan  ligan  alami atau ligan uji lainnya. Asam rosmarinate memiliki interaksi ikatan hidrogen yang cukup  dengan  dekat  residu  asam  amino Ser 70 dengan jarak ikatan sebesar 2,77 Å.

## KESIMPULAN
Tanaman daun torbangun
diduga memiliki potensi sebagai antibakteri  berdasarkan  nilai  energi bebas ikatan dan konstanta inhibisi yang lebih  lebih  kecil  daripada  ligan  alami yang  diperoleh  melalui  pendekatan in silico .

## DAFTAR PUSTAKA
Chaves,  J.,  Ladona,  M.G.,  Segura,  C., Coira, A., Reig, R., and mp rdan s,  C.  SHV-1  β- Lactamase is Mainly a Chromosomally Encoded Species- Specific  Enzyme  in Klebsiella pneumoniae . Antimicrob.  Agents Chemother. 2001, 45(10):  2856-
2861.
Gafur,  A.,  Sukamdani,  G.Y.,  Kristi,  N., Maruf, A., Xu, J., Chen, X., et al.
From  bulk  to  nano-delivery  of essential  phytochemicals:  recent progress and strategies for antibacterial  resistance. J.  Mater.
Chem. B . 2020, 8(43): 9825-9835.
Grosdidier, A., Zoete, V., and Michielin,  O.  EADock:  Docking of  small  molecules  into  protein active  sites  with  a  multiobjective evolutionary optimization. Proteins Struct. Funct. Bioinforma .  2007, 67(4):  1010-
1025. Kellenberger,  E.,  Schalon,  C.,  and Rognan,  D.  How  to  measure  the similarity  between  protein  ligand- binding  site? Curr.  Comput.
Aided.  Drug  Des. 2008,  4(3):  1-
12.
Kitagawa, K., Shigemura, K., Yamamichi,  F.,  Alimsardjono,  L., Rahardjo, D., Kuntaman, K., et al. International comparison of causative bacteria and antimicrobial  susceptibilities  of urinary  tract  infections  between Kobe, Japan, and Surabaya, Indonesia. Jpn.  J.  Infect.  Dis . 2018, 71(1): 8- 13.
Kuzin,  A.P.,  Nukaga,  M.,  Nukaga,  Y., Hujer,  A.M.,  Bonomo,  R.A.,  and Knox, J.R. Structure of the SHV-1 β-lactamase. Biochem . 1999, 38(18): 5720-5727.
Lipinski,  C.A.  Lead-  and  drug-like compounds: the rule-of-five revolution. Drug  Discov.  Today Technol . 2004, 1(4):337-341.
Lipinski,  C.A.,  Lombardo,  F.,  Dominy,
B.W.,  Feeney,  P.J.  Experimental and  computational  approaches  to estimate solubility and
permeability  in  drug  discovery and development q settings. Advanced Drug Delivery Reviews . 2001, 46(1-3): 3-26.
McWhirter,  C.  2021.  Chapter  One  - Kinetic  mechanisms  of  covalent inhibition.  Di  dalam:  Ward,  R.A., Grimster NPBT-AR in MC,
editor. The  Design  of  Covalent- Based Inhibitors . Vol. 56. Academic Press. Halaman. 1-31.
Munadi, E. 2017. Tanaman obat, sebuah tinjauan singkat. Di dalam: Salim, Z.,  Munadi,  E.,  editor. Info Komoditi  Tanaman Obat .  Jakarta: Badan Pengkajian dan Pengembangan Perdagangan. Halaman. 1-7. Nasution,  N.,  Siregar,  L.A.,  Bayu,  E.S. Karakteristik pertumbuhan vegetatif  dari  beberapa  aksesi tanaman Bangun-bangun ( Plectranthus  amboinicus (Lour.) Spreng). J.  Agroekoteknologi  FP USU . 2017, 5(1): 26-32.
Nirwati,  H.,  Sinanjung,  K.,  Fahrunissa,
F.,  Wijaya,  F.,  Napitupulu,  S.,
Hati  VP,  et  al.  Biofilm  formation and antibiotic resistance of Klebsiella  pneumoniae isolated
from clinical samples in  a tertiary care  hospital,  Klaten,  Indonesia.
BMC Proc . 2019, 13(S11): 1-8.
Nukaga,  M.,  Abe,  T.,  Venkatesan,
A.M.,  Mansour,  T.S,  Bonomo
R.A,  and  Knox,  J.R.  Inhibition  of class  A  and  class  C  β-lactamases by penems: Crystallographic structures of a novel 1,4- thiazepine  intermediate. Biochem .
2003, 42(45): 13152-13159. Nusantoro,  Y.R.,  dan  Fadlan,  A. Analisis  sifat  mirip  obat,  prediksi ADMET, dan penambatan molekular isatinil-2- aminobenzoilhidrazon dan kompleks  logam  transisi  Co(II), Ni(II),  Cu(II),  Zn(II)  Terhadap
BCL2-XL. Akta  Kim.  Indones . 2020, 5(2): 114-126.
Rajasekharan, S.K., Ramesh,  S., Satish, A.S.,  and  Lee,  J.  Antibiofilm  and anti-β-  lactamase  activities  of Burdock root extract and chlorogenic acid against Klebsiella pneumoniae . J. Microbiol. Biotechnol .  2017,
27(3): 542-551.
Setzer, M.S., Sharifi-Rad, J., and Setzer, W. The search for herbal antibiotics: An in-silico investigation of antibacterial phytochemicals. Antibiotics . 2016, 5(3): 1-113. Sivaranjani, D., Saranraj, P., Manigandan,  M.,  and  Amala,  K. Antimicrobial activity of Plectranthus  amboinicus solvent extracts against human pathogenic  bacteria  and  fungi. J.
Drug Deliv. Ther .  2019, 9(3):  36- 39.
Tacconelli,  E.,  Carrara,  E.,  Savoldi,  A., Harbarth,  S.,  Mendelson,  M., Monnet,  D.L.,  et  al.  Discovery, research, and development of new antibiotics:  the  WHO  priority  list of  antibiotic-  resistant  bacteria and  tuberculosis. Lancet  Infect. Dis . 2018, 18(3): 318-327.
Vargas,  J.A.R.,  Lopez,  A.G.,  Piñol, M.C.,  and  Froeyen,  M. Molecular docking  study  on the  interaction between  2-substituted-4,5-difuryl
imidazoles  with  different  protein target  for  antileishmanial  activity. J.  Appl.  Pharm.  Sci .  2018, 8(3):14-22.