## Identification Lactic Acid Bacteria Potentially as Probiotic at Joruk Maman

## Mulyani, S
Jurusan Gizi Politeknik Kesehatan Kemenkes Riau sri.mulyani@pkr.ac.id

## Abstract
Consumer trends for food have developed with increasing health awareness likes demand  for  probiotics  has  begun  to  increase.  Indonesian  food  potentially  as sources  of  lactic  acid  bacteria  that  functionas  probiotic.  Joruk  Maman  is  a fermented food of Riau Province. Joruk maman has been known to contain lactic acid  bacteria  (LAB).  The  functional  properties  of  LAB  as  probiotics  can  differ depending  on  the  strain.  The  research  objective  is  to  identify  and  characterize lactic  acid  bacteria  from  Joruk  Maman.  LAB  characteristics  include  gram properties, shape, motility, catalase properties and testing for resistance to gastric and  intestinal  pH  conditions  and  identification  with  API  Test  Kits.    The  results showed  that lactic acid bacterial isolates from Joruk  Maman were rod-shaped,
gram-positive, non-motile, catalase negative. LAB Joruk Maman potentially as a probiotic candidate that is 93.07% resistant to gastric conditions (pH 2.0) and 96.13% to intestinal conditions (pH 7.2) and identified as Weisella confuse
Keywords:
Joruk maman; probiotic; Weisella confusa

## Abstrak
Tren  konsumen  pangan telah  mengalami  perkembangan  dengan  meningkatnya kesadaran akan kesehatan, seperti permintaan probiotik yang mulai meningkat. Indonesia kaya akan sumber bakteri asam laktat yang berpotensi probiotik.  Joruk Maman merupakan makanan fermentasi khas Propinsi Riau.  Joruk maman telah diketahui mengandung bakteri asam laktat.  Sifat fungsional dari BAL probiotik dapat berbeda tergantung strainnya.  Tujuan penelitian adalah mengidentifikasi dan  karakterisasi  bakteri  asam  laktat  dari  Joruk  Maman.    Karakterisasi  BAL meliputi  sifat  gram,  bentuk,  motilitas,  sifat  katalase  dan  pengujian  ketahanan terhadap kondisi pH lambung dan usus serta identifikasi dengan API Kit Tes. Hasil  Penelitian  menunjukkan  isolat  bakteri  asam  laktat  dari  Joruk  Maman berbentuk batang, bakteri gram positif, bersifat katalase negatif dan non motil. BAL Joruk Maman berpotensi sebagai kandidat probiotik yaitu tahan terhadap pH lambung (2.0) dan usus (7.2) dengan ketahanan 93.07 % pada pH lambung dan 96.13 % pada pH usus serta teridentifikasi sebagai Weisella confusa. Kata Kunci
Joruk maman; probiotik; Weisella confusa

## PENDAHULUAN
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri yang bersifat gram positif yang dikenal juga sebagai  mikroorganisme  yang  aman  atau Generally Recognized as Safe (GRAS) yaitu mikroorganisme yang tidak beresiko terhadap kesehatan, bahkan beberapa jenis bakteri tersebut bermanfaat bagi kesehatan [1].    BAL  mampu  hidup  pada  berbagai habitat yang cukup luas di alam seperti pada tanaman,  pada  saluran  pencernaan  baik hewan maupun manusia, juga pada berbagai
produk  makanan  fermentasi  seperti:  yogurt, minuman  dan  makanan  fermentasi,  keju,  dll. Sifat terpenting dari BAL adalah kemampuannya  untuk  memfermentasi  gula menjadi  asam  laktat  [2]. Menurut  Candra  et al (2007) [3], BAL yang berkembang dalam produk  fermentasi  mampu  menghambat pertumbuhan  mikroorganisme  yang  bersifat patogen.    BAL  juga  memiliki  sifat  fungsional yaitu  sebagai  probiotik.    Collado  et  al. (2007) [4] melaporkan bahwa probiotik yang umumnya  digunakan  pada  produk    pangan

## Article Info
Article history Received date: 2019-12-04 Revised date: 2019-12-27 Accepted date: 2019-12-31
terutama  (BAL)    galur  Lactobacillus,
Bifidobacterium, dan beberapa dari Propionibacterium.    FAO/WHO  (2006)  [5] mendefinisikan probiotik sebagai mikroorganisme  hidup  yang  jika  dikonsumsi dalam  jumlah    cukup  dapat    memberikan manfaat    kesehatan  bagi    inangnya. Kesadaran konsumen akan pangan fungsional dan fakta probiotik yang dapat memberikan manfaat  terhadap  kesehatan  menyebabkan peningkatan  permintaan  konsumen  terhadap makanan  yang  mengandung  probiotik  di seluruh dunia [6][7].
Joruk  Maman  merupakan  makanan  khas  di Propinsi Riau, khususnya di Kecamatan Tanah Putih  Kabupaten  Rokan  Hilir.    Joruk  Maman dibuat dari daun dan batang muda tanaman Maman  (Cleome  gynandra  L)  yang difermentasi secara alami dengan menambahkan  garam,  nasi  putih  dan  air hangat,  kemudian  dibiarkan  sekama  2  –  3 hari sebelum dikonsumsi.  Fermentasi Maman atau  Joruk  Maman  ini  merupakan  produk makanan  yang  telah  diketahui  mengandung bakteri asam laktat yang berfungsi sebagai probiotik.    Muharni  et  al  (2016)  [8] melaporkan  kandungan  bakteri  asam  laktat pada  fermentasi  Maman  dengan  perlakuan penambahan  garam  5%  dan  nasi  10% memiliki  hasil  tertinggi  yaitu  2.40  x  108 cfu/g.
Seiring  dengan  semakin  meningkatnya permintaan  konsumen  terhadap  probiotik mendorong para peneliti melakukan perluasan sumber BAL.  Beberapa penelitian yang telah dilakukan terkait BAL adalah islasi dan  identifikasi  spesies  BAL  penghasil senyawa antimikroba asal kolon sapi bali [9], seleksi  dan  karakterisasi  BAL  asal  bekasam sebagai  probiotik  [10],  BAL  merupakan bakteri  yang  umum  digunakan  sebagai probiotik,  namun  tidak  semua  BAL  termasuk bakteri probiotik. Untuk dapat dikategorikan sebagai  probiotik,  salahsatunya  BAL  harus tahan  terhadap  kondisi  pencernaan  yang ekstrim. Bakteri probiotik memiliki kemampuan dan karakteristik yang berbeda- beda.  Berdasarkan  hal  tersebut  dalam penelitian  ini  dilakukan  pengujian  BAL  asal joruk  maman  terhadap  kondisi  pencernaan, serta  identifikasi  dan  karakterisasi  untuk
mengetahui genus bakteri probiotik asal joruk maman.

## METODE Bahan
Sampel dalam penelitian ini adalah isolat BAL yang  diisolasi  dari  hasil  fermentasi  joruk maman.    Joruk  Maman  diperoleh  dari  Desa Bunga Tanjung Kabupaten Rokan Hulu, Riau.

## Fermentasi Joruk Maman
Tanaman  Maman  (Cleome  gynandra  L) dipisahkan  dari  daun  dan  batangnya, ditimbang  daunnya  sebanyak  1  kg.  Daun dicuci  dan  ditiriskan  sebagai  bahan  baku dalam  pembuatan  produk  fermentasi  ini. Bahan lain yang digunakan adalah nasi putih sebanyak  10%,  garam  dapur  5%  dan  air steril  dengan  perbandingan  1:4  (semua persentase  dihitung  dari  volume  air  matang yang  digunakan)  terhadap  daun  Maman. Garam  dapur  sebanyak  5%  dilarutkan dengan  air  matang.  Daun  Maman  (Cleome gynandra L) direndam dengan larutan garam dan  ditaburi  dengan  nasi  putih  sebanyak 10%.  Fermentasi  dilakukan  di  dalam  toples kaca steril tertutup selama 1 hari pada suhu kamar.

## Isolasi Bakteri Asam Laktat
Sebanyak  10  mL  sampel  ditambahkan dengan  90  mL  NaCL  fisiologis  sehingga diperoleh pengenceran 10-1 dan selanjutnya dibuat  pengenceran  berseri  sampai  10-3. Dari pengenceran 10-3 tersebut, ditanam 10 µL  pada  media  MRS  agar  yang  telah ditambahkan indikator pH bromcresol purple, kemudian  diiinkubasi  pada  kondisi  anaerab suhu  37 o C  selama  48  jam.  Koloni  BAL  yang tumbuh  terlihat  berwarna  kuning  sebagai karakteristik dihasilkannya asam [11].
Ketahanan  hidup  isolat  BAL  pada  pH lambung (pH 2.0) dan pH usus (pH 7.2) [12] Satu mL kultur BAL umur 24 jam dicampurkan ke dalam 9 mL phosphate buffer saline (PBS) steril pH 2.0 dan pH 7.2 dan diinkubasi pada suhu  37°C  selama   tiga   jam.   Bakteri asam laktat  yang  tumbuh  dihitung  dengan pengenceran  pada  buffer  pepton  water (BPW)  dan  media  pemupukan  pada  media man  rogosa  sharpe  agar  (MRSA)  dalam kondisi anaerobik pada suhu 37°C selama 48 jam.  Populasi  awal  BAL  umur  24  jam  juga
dihitung.  Ketahanan  terhadap  pH  rendah dihitung berdasarkan perbandingan populasi BAL yang tumbuh pada pH perlakuan dengan populasi  awal.  Percobaan  ini  dilakukan dengan dua kali ulangan secara duplo. Karakterisasi  dan  identifikasi  isolat  BAL Karakterisasi  isolat  BAL  terpilih  meliputi morfologi  koloni  dan  morfologi  sel  yang terdiri  dari  bentuk    sel,    pewarnaan    Gram dan    spora,    pengamatan    sifat  fisiologis meliputi motilitas, katalase, uji tipe fermentasi, amilolitik dan lipolitik.
1). Pewarnaan Gram [13] Bakteri terlebih dahulu difiksasi dengan  cara sebagai    berikut:  1  ose    isolat  bakteri disebarkan  tipis  dan  merata  diatas  kaca objek dan dipanaskan pada api kecil secara tidak  langsung  (fiksasi)  kemudian  diangin- anginkan  di  udara  hingga  kering  dan membentuk  lapisan  kultur  yang  kering  dan merata. Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara  meneteskan  pewarna  kristal  violet secara merata di atas kultur pada kaca objek dan  didiamkan  selama  1  menit, membilas dengan  air  mengalir  kecil  secara  hati-hati. Sisa air diserap dengan menggunakan kertas hisap.  Larutan lugol diteteskan pada sampel dan  didiamkan  selama  1  menit  dan  dibilas dengan alkohol dan aquades lalu dikeringkan.    Sampel  diteteskan  larutan safranin dan didiamkan selama 10 detik dan dibilas  dengan  air  mengalir  dengan  cepat, kemudian dikeringkan dengan tisu. Pengamatan  dilakukan  dengan  mikroskop menggunakan lensa objektif (1000x).  Bakteri Gram-positif  berwarna  ungu  sedangkan bakteri Gram-negatif berwarna merah. 2). Pewarnaan spora [13] Bakteri  digoreskan  pada  gelas  objek  yang bersih  dan  difiksasi.    Sampel  diteteskan malachite  green  dan  dipanaskan  di  atas bunsen  tetapi  tidak  sampai  mendidih  atau mengering.    Setiap  kali  pewarna  menjadi kering  meneteskan  lagi  pewarna  baru  lalu dibilas  dengan  air  selama  beberapa  detik dan dikeringkan dengan menggunakan kertas tissue.  Sampel  diteteskan  larutan  safranin selama  30  detik  dan  dibilas  dengan  air mengalir/kran dengan cepat, lalu dikeringkan  dengan  kertas  tissue.  Hasil pewarnaan  diamati,  spora  bakteri  akan
terlihat  berwarna  hijau  sedangkan  sel vegetatif akan berwarna merah.
3) Uji motilitas [14] Bakteri  diinokulasikan  secara  vertikal  pada media  sulfide  indol  motility  (SIM)  dan  di inkubasi  selama  24  jam.  Moltilitas  bakteri ditunjukkan  dengan  adanya  pertumbuhan pada  permukaan  medium  dan  tidak  ada bekas pada tusukan. Bakteri non motil tumbuh sepanjang tusukan.
4) Uji katalase [15] Satu  ose  isolat  diambil  dari  media pertumbuhan  MRSA  dan  diletakkan  pada gelas obyek yang bersih.  Sampel diteteskan pereaksi H 2 O 2 3% serta dibiarkan beberapa saat.    Uji  positif  ditandai  dengan terbentuknya  gelembung.    Hasil  uji  negatif menunjukkan ciri bakteri probiotik.
5) Identifikasi isolat BAL dengan API 50 CHL Kultur  BAL  digores  pada  media  MRSA  dan diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  37 o C. Kultur BAL dipanen dan dimasukkan ke dalam media  API  50  CHL  dan  dihomogenkan dengan  vortex.  Penyiapan  kit  dilakukan dengan memasukkan air steril pada sumur kit dengan  menggunakan  mikropipet  untuk mengkondisikan  suasana  tetap  lembab. Memasukkan  strips  pada  kit  dengan  urutan strip biru diletakkan pada baris pertama dan kedua pada kit, strips hijau baris ketiga dan keempat  dan  strips  merah  diletakkan  pada baris terakhir pada kit.  Media API  50 CHL yang  telah  dihomogenkan  dengan  BAL dimasukkan  kedalam  sumuran  strips  dengan mikropipet,  menutup  sumuran  strips  dengan mineral  oil  untuk  memberikan  lingkungan anaerob dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu  37 o C. Parameter  uji  adalah  perubahan warna setelah diinkubasi selama 24 jam. Hasil pengamatan  diolah  menggunakan  software Apiweb TM.

## Analisis Data
Data  kuantitatif  yang  diperoleh  dari  hasil pengujian  disajikan  dalam  bentuk  rata-rata dan  standar  deviasi.    Data-data  kualitatif diolah  dengan  melihat  ada  atau  tidaknya suatu komponen dalam sampel.
Data yang telah diolah selanjutnya dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi  dan  Karakterisasi  Bakteri  Asam Laktat Isolasi Bakteri Asam Laktat (BAL) dilakukan dengan cara menumbuhkan hasil fermentasi joruk maman pada Media de Mann Rogosa Sharpe (MRS) Agar. Isolasi BAL ini bertujuan untuk  mendapatkan  isolat  terpilih  untuk  uji selanjutnya.  Isolat yang tumbuh membentuk koloni  yang  terlihat  berwarna  kuning (Gambar 1) sebagai karakteristik dihasilkannya asam.
Gambar 1. Isolasi Bakteri Asam Laktat
Karakterisasi  isolat  BAL  terpilih  meliputi morfologi  koloni  dan  morfologi  sel  yang terdiri  dari  bentuk  sel,  pewarnaan  Gram dan  spora,  pengamatan  sifat  fisiologis meliputi  motilitas  dan  uji  katalase.  Hasil Pengujian dapat dilihat pada Tabel .1.
Tabel 1. Hasil Karakterisasi BAL Joruk Maman
Variabel Hasil 1.gram dan bentuk sel Positif, batang 2.Spora Tidak ada 3.Katalase Negatif 4.Motilitas Non motil Sumber: Data primer
Hasil  karakterisasi  menunjukkan  isolat  BAL Joruk  Maman  berbentuk  batang  dan merupakan  bakteri  Gram-positif,  tidak membentuk  spora,  katalase  negatif  serta non  motil  (Tabel  1).  Hal  ini  sesuai  dengan yang  dilaporkan  Axelsson  (2004)  [16] bahwa  Bakteri  asam  laktat  merupakan kelompok  bakteri  Gram  positif,  berbentuk bulat atau batang, tidak membentuk spora, bersifat katalase negatif, mampu
memfermentasi karbohidrat dan merupakan kelompok  mikroaerofilik.  Savadago  et  al. (2006) [2] menambahkan bahwa selain dari kelompok  bakteri  Gram-positif,  tidak membentuk  spora  serta  berbentuk  batang dan  bulat,  BAL  juga  tidak  memiliki  alat gerak atau non motil.
Ketahanan  hidup  isolat  BAL  pada  pH lambung  (pH  2.0)  dan  pH  usus  (pH  7.2) [12] Sifat pertama yang harus dimiliki BAL pada saat  akan  melakukan  seleksi BAL  probiotik adalah  ketahan  isolat  BAL  tersebut terhadap  tingkat  keasaman  yang  tinggi. Isolat  probiotik  harus  dapat  melewati kondisi  ekstrim  dengan  keasaman  yang tinggi  [17].  Hasil pengujian  isolat  BAL  asal Joruk Maman dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Karakterisasi BAL Joruk Maman Populasi Awal (log cfu/ml) Populasi Akhir (log cfu/ml) Ketahanan Hidup (%) 6.78 pH 2.0 6.31 93.07 pH 7.2 6.52 96.13
Populasi  awal  merupakan  populasi  isolat BAL setelah ditumbuhkan pada media MRSB pada suhu 37°C selama 24 jam, yang juga digunakan  pada  pengujian  ketahanan terhadap  pH.  Pada  Tabel.1  dapat  dilihat populasi  awal  isolat  BAL  joruk  maman adalah  7.68  log  cfu/mL.    Kondisi  isolat pada  pH  2.0  dan  pH  7.2  mengalami penurunan  populasi  tidak  lebih  dari  2  log cfu/mL,  dengan  ketahanan  hidup  yang tinggi yaitu 93.07% dan 96.13%. Menurut Lin et al. (2006) [12], ketahanan hidup BAL pada kondisi pH 2.0 yang lebih besar atau sama dengan 50% dinyatakan mempunyai ketahanan hidup yang tinggi.
Faktor  utama  penentu  ketahanan  bakteri melewati  lambung  sampai  dengan  usus halus  adalah  pH  lambung.  Makanan  yang masuk  berperan  sebagai  bufer  dan merupakan  tekanan  awal  BAL  masuk  ke dalam  tubuh  manusia  adalah  terpapar asam  lambung,  dengan  tingkat  pH  yang sangat  rendah  yaitu  sekitar  2.0  pada
kondisi  lambung  kosong  dan  sekitar  3.0 pada kondisi lambung berisi [18]. Bakteri yang masuk ke dalam lambung akan mengalami  penurunan  populasi  karena terpapar  asam  lambung  (HCL)  dengan tingkat pH yang sangat rendah yaitu sekitar 2.0 dan adanya garam empedu pada usus halus bagian atas, sehingga jumlah populasi bakteri  probiotik  memiliki  standar  minimal 10 6 cfu/mL agar  ketika sampai  pada  usus halus  jumlah  populasi  bakteri  probiotik masih  mendominasi  dibanding  bakteri patogen.  Sanz dan Santacruz (2010) [19] juga melaporkan bahwa jumlah sel mikroba hidup  yang  harus  terdapat  pada  produk probiotik  bervariasi  tergantung  genusnya, namun pada umumnya minimal sebesar 10 6 -
10 8 cfu/mL. Shah (2007) [20] menambahkan bahwa jumlah minimal strain probiotik yang ada dalam produk makanan adalah sebesar 10 6 cfu/g atau jumlah strain probiotik yang harus dikonsumsi setiap hari sekitar  10 8 cfu/g,  dengan  tujuan  untuk mengimbangi kemungkinan penurunan jumlah bakteri probiotik pada saat berada dalam jalur pencernaan.
Identifikasi isolat BAL dengan API  50 CHL Identifikasi dilakukan untuk melihat kemiripan  atau  kekerabatan  bakteri  asam laktat  yang  diisolasi  dari  Joruk  Maman dengan  spesies  yang  telah  teridentifikasi. API  tes  kit  50  CHL  dapat  digunakan  untuk mengidentifikasi  genus  bakteri  hingga ketingkat spesies.  Pengujian dengan API Kit Test berdasarkan pada kemampuan bakteri asam  laktat  (BAL)  untuk  memfermentasi karbohidrat. Karbohidrat merupakan sumber  karbon  dan  sumber  energi  utama untuk  pertumbuhan  bakteri.  Namun  setiap spesies  bakteri  memiliki  kemampuan  yang tidak  sama  dalam  memfermentasi  jenis karbohidrat.  Oleh  karena  itu  pengujian kemampuan  memfermentasi  karbohidrat dapat digunakan sebagai dasar identifikasi bakteri  asam  laktat  (BAL).  Hasil  pengujian menunjukkan bahwa isolat BAL joruk maman mampu  mendegradasi  18  komponen  gula yaitu  komponen  gula no: 4,  6,  10, 11, 12, 13, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 31, 39, dan 47 (Gambar 2).
Gambar 2. Hasil identifikasi isolat BAL Joruk maman pada perangkat Kit API  50 CHL.
Dengan memperhatikan tabel pada produk kit  API  50  CHL,  isolat  BAL  Joruk  maman teridentifikasi  sebagai Weisella  confusa dengan  nilai  ID  99.6%  dan  nilai  T  (typical index)  sebesar  0.94,  kriteria  identifikasi adalah very  good  identification .  Nilai  T sebesar    1.0  menunjukkan  bahwa  semua pola  reaksi  fermentasi  isoIat  yang  diuji cocok  (sesuai)  dengan  profil  spesies  yang ada di database.

## SIMPULAN
Bakteri asam laktat yang diisolasi dari Joruk maman  memiliki  potensi  sebagai  kandidat probiotik  yaitu  memiliki  ketahanan  hidup yang  tinggi  pada  pH  lambung  (97.07%) dan pH usus (96.13%).  Karakteristik isolat BAL  Joruk  maman  yaitu  berbentuk  batang, bakteri  gram  positif,  tidak  membentuk spora, katalase negatif dan non motil serta teridentifikasi sebagai Weisella confusa .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih  disampaikan  pada  Poltekkes Kemenkes  Riau  yang  telah  mendanai penelitian  ini  melalui  program  penelitian calon dosen Pusat penelitian dan
Pengembangan Kesehatan.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] E. J. Smid and L. G. M. Gorris, Natural antimicrobials for food preservation in Gálvez et al. 2014. Food Biopreservation,  SpringerBriefs  in Food, Health, and Nutrition. 2007.
[2] S. Aly, O. C. A. T, B. I. H. N, and T. S. Alfred,  “Bacteriocins  and  lactic  acid bacteria  -  a  minireview,” African  J. Biotechnol. ,  vol.  5,  no.  9,  pp.  678– 683, 2006.
[3] J.  I.  Candra,  W.  Zahiruddin,  and Desniar,  “Isolasi  dan  karakterisasi bakteri  asam  laktat  dari  produk bekasam  ikan  bandeng  (,” Bul.
Teknol. Has. Perikan. , vol. X, no. 2, pp. 14–24, 2007.
[4] M.  C.  Collado,  J.  Meriluoto,  and  S. Salminen, “In vitroanalysis of probiotic strain combinations to inhibit pathogen adhesion to human intestinal  mucus.,” Food  Res.  Int. ,  vol. 40, no. 5, pp. 629–636, 2007.
[5] Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) and W. H.
O.  (WHO),  “Guidelines  for  the Evaluation  of  Probiotics  in  Food,” London Ontario, Canada, 2002. [6] D. Granato, G. F. Branco, F. Nazzaro, A.  F.  Faria,  and  A.  G.  Cruz,  “and Nondairy Probiotic Food Development :  Trends  ,  Concepts  , and Products,” Compr. Rev. Food Sci. Food  Saf. ,  vol.  9,  pp.  292–302, 2010.
[7] N.  Karthikeyan,  A.  Elango,  G. Kumaresan, T. R. Gopalakrishnamurty,  and  B.  V Raghunath, “Enhancement Of Probiotic  Viability  In  Ice  Cream  By Microencapsulation,” Int.  J.  Sci. Environ.  Technol. ,  vol.  3,  no.  1,  pp.
339–347, 2014.
[8] Muharni and L. Restusari, “Optimization of lactic acid bacteria content  in  maman  fermentation (Cleome Gynandra L).,” 2016. [9] S. A. Lindawati and I. W. Suardana,
“Isolation And Identification Of Lactic Acid Bacteria Species Producing Anti-
Microbial  Substance  Isolated  From Colon Of Bali Cattle,” Vet. J. , vol. 17, no. 4, pp. 576–581, 2016.
[10]  A. Nurnaafi, “Selection and characterization  of  lactic  acid bacteria from bekasam as probiotic.,” Bogor, 2016.
[11]  I.  W.  Suardana,  I.  K.  Suada,  I.  M. Sukada, and I. N. Suarsana, “Isolation and  identification  of  lactic  acid bacteria SR9 rumen origin of bovine cow as probiotic superior candidate,”
Med. Sci. journals Indones. , vol. 40, no.
2, pp. 100–103, 2009.
[12]  W. H.  Lin, C.  F. Hwang,  L.  W.  Chen, and  H.  Y.  Tsen,  “Viable  counts, characteristic evaluation for commercial  lactic  acid  bacteria product,” Food Microbiol. , vol. 23, no.
1, pp. 74–81, 2006.
[13]  L. Waluyo, Basic Method Techniques in Microbiology .  Malang  (ID):  UMM Press, 2010.
[14]  R.  P.  Tiwari,  G.  S.  Hoondal,  and  R. Tewari, Laboratory  techniques  in microbiology  &  biotechnology .  New Delhi  (IN):  Abhishek  Publication, 2009.
[15]  S.  Fardiaz,  “Guide  to  basic microbiology,” Bogor (ID), 1989.
[16]  L.  Axelsson,  “Lactic  Acid  Bacteria: Classification and Physiology,” pp. 1– 66, 2004.
[17]  E. Tuomola, R. Crittenden, M. Playne, E. Isolauri, and S. Salminen, “Quality assurance  criteria  for  probiotic bacteria 1 – 4,” Am. Soc. Clin. Nutr. , vol. 73, pp. 393–398, 2001.
[18]  E.  B.  Minelli et  al. ,  “Assessment  of novel  probiotic  Lactobacillus  casei strains for the production of functional dairy foods,” Int. Dairy J. , vol. 14, no.
8, pp. 723–736, 2004.
[19]  Y. Sanz, A. Santacruz, and P. Gauffin, “International
Immunonutrition
Workshop Session 8 : Probiotics in the defence  and  metabolic  balance  of the  organism  Gut  microbiota  in obesity  and  metabolic  disorders,” Proc. Nutr. Soc. , no. 69, pp. 434–441, 2010
[20] N.  P.  Shah,  “Functional  cultures  and health benefits,” Int. Dairy J. , vol. 17, no. 11,
pp. 1262–1277, 2007.