Sterilisasi Permukaan untuk Mengisolasi Fungi Endofit Akar pada Meranti Tembaga ( Shorea leprosula Miq.) di Hutan Penelitian

## Dramaga
Surface Sterilization to Isolate Fungal Root Endophytes of Meranti Tembaga ( Shorea leprosula Miq.) in Dramaga Experimental Forest
Safinah S. Hakim 1 , Sri Wilarso Budi 1 , Maman Turjaman 2
1 Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB
2 Badan Litbang Kehutanan Gunung Batu, Bogor

## ABSTRACT
Root  fungal  endophyte  were  isolated  from  seedling  of  Meranti  Tembaga  (Shorea  leprosula  Miq.)  taken  from Dramaga  experimental  Forest,  Bogor  with  five  difference  surface  sterilization  methods.  Recommended  surface sterilization to isolate root fungal endophyte was  performed by following immersion process : 96%  ethanol for 1 min, 20%  H 2 O 2 for 3 min, 96% ethanol for 0.5 min, and rinse with sterile water for 5 min. Endophyte  frequency was low (6- 11%) and four morphological types of fungi were found during this research.
Keywords: root fungal endophyte, surface sterilization,  Shorea sp .

## PENDAHULUAN
Secara  alami,  hampir  90%  tanaman  berinteraksi dengan  mikroorganisme  tanah  (Das  dan  Varma,  2009). Berdasarkan  hasil  berbagai  penelitian,  interaksi  antara tanaman  dan  mikroorganisme  tanah  memberikan beberapa  keuntungan  pada  tanaman  antara  lain meningkatkan  kemampuan  penyerapan  unsur  hara tanaman, meningkatkan biomass tanaman, meningkatkan kemampuan tanaman di kondisi cekaman,  dan  lain-lain  (Hrynkiewicz  dan  Baum,  2011; Bonkowski et  al. ,  2000).  Pada  tanaman  kehutanan Indonesia,  penelitian  tentang  interaksi  tanaman  dan mikroorganisme tanah telah banyak dilakukan, terutama tentang  mikoriza  (Santoso et  al., 2006).Tidak  seperti mikoriza, interaksi antara fungi endofit  dengan tanaman kehutanan Indonesia belum banyak dieksplorasi.
Fungi  endofit  adalah  fungi  yang  hidup  di  dalam tanaman inang tanpa menimbulkan gejala penyakit serta memiliki  ikatan  yang  kuat  dengan  tanaman  dan menunjukkan  efek  terhadap  fungsional  tanaman  serta kemampuan  hidup  tanaman  (Bayman,  2007).  Fungi endofit  pada  akar  sangat  berlimpah  (Schulz  dan  Boyle, 2006)  dan  memberikan  berbagai  pengaruh  terhadap tanaman  antara  lain  menghasilkan  metabolit  sekunder yang  secara  in  vitro  berfungsi  sebagai  antibakteri,  bio- fungisida,  dan  kandungan  herbal  yang  bermanfaat  bagi kesehatan meningkatkan pertumbuhan tanaman, menekan  penyakit  pada  tanaman,  dan  meningkatkan toleransi tanaman inang terhadap toleransi kondisi stress lingkungan (Shulz, 2006).
Dipterocarpaceae  merupakan  salah  satu  jenis  pohon yang sangat terkenal di kawasan tropis. Dipterocarpaceae  memegang  peranan  penting  dalam perdagangan  kayu  dunia  dan  juga  memainkan  peran penting  dalam  perekonomian  beberapa  negara  di
kawasan Asia Tenggara (Appanah dan Turnbull, 1998) . Konstribusi  tinggi  jenis-jenis  pohon  Dipterocarpaceae ini  terhadap  perekonomian  berdampak  pada  kelestarian jenis ini di Alam. Permintaan yang tinggi akan jenis ini di  pasaran  perdagangan  kayu  dunia  menyebabkan eksploitasi berlebihan pada jenis ini (Lee, 2000).
Terancamnya  keberlangsungan  pohon  dari  family Dipterocarpaceae tidak hanya mengancam keberlangsungan  spesies  ini  sendiri,  tetapi  juga mengancam  seluruh  ekosistem  yang  terdapat  di  hutan tersebut  karena  pohon-pohon  jenis  Dipterocarpaceae berperan  sebagai  habitat  dan  sumber  pakan  bagi  satwa liar  yang  hidup  di  hutan.  Kondisi  jenis-jenis Dipterocarpaceae  yang  terdegradasi  mendorong  studi yang  berhubungan  dengan  upaya  penanaman  kembali dan  teknik  silvikulturnya  yang  juga  mendorong dilakukannya  studi  akan  hubungan  jenis  ini  dengan berbagai jenis fungi.
Studi  tentang  Fungi  Endofit  pada  pohon  jenis-jenis Dipterokarpa belum benyak dipelajari. Orachaipunlap et al,. (2009)  mempelajari  keanekaragaman  fungi  endofit yang  diisolasi  dari  daun  tiga  jenis  pohon  dipterokarpa. Dari studi tersebut, 40 morfotaksa berhasil diidentifikasi.  Studi  tentang  fungi  endofit  akar  sendiri masih  belum  ditemukan.  Oleh  karena  itu  penelitian  ini akan  menjadi    penelitian  dasar  tentang  fungi  endofit akar  pada  jenis  tanaman  dipterokarpa  khususnya  jenis Shorea sp.
Ada  empat  cara  yang  bisa  dilakukan  untuk mempelajari  fungi  endofit  akar  pada  tanaman  yakni  a) pengamatan  secara  mikroskopis  b)  isolasi  dengan sterilisasi  permukaan  di  kultur  murni  c)  metode molekular  d)  metode  biokimia  (Bayman,  2007).  Dari keempat  metode  tersebut,  metode  sterilisasi  permukaan merupakan metode yang paling sederhana, murah, serta diketahui  bisa  mendeteksi  berbagai  jenis  fungi.  Tujuan
Jurnal Silvikultur Tropika Vol. 05 No. 1 April 2014, Hal 49-53 ISSN: 2086-82
penelitian  adalah  untuk  mengetahui  bagaimana  metode sterilisasi  permukaan  yang  terbaik  dalam  mengisolasi fungi  endofit  akar  pada  Meranti  Tembaga  ( Shorea leprosula Miq.)  yang  terdapat  di  Hutan  Penelitian Dramaga, Bogor.

## BAHAN DAN METODE

## Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium  Mikrobiologi Hutan  Pusat  Penelitian  dan  Pengembangan  Hutan, Gunung  Batu,  Bogor.  Sampel  penelitian  diambil  di Hutan Penelitian Dramaga. Penelitian dilakukan selama 3 bulan, yakni pada September hingga November 2013.

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  adalah  akar  dari  anakan S.leprosula, sekop, air steril, etanol, hidrogen peroksida, plastic  wrap ,  kertas,  tisu,    kertas  label,  media  Malt Extract dan Agar. Alat yang digunakan terdiri dari petri dish, cutter, gelas  piala,  autoklaf,  timbangan  analitik, mikroskop, hand sprayer, Laminar Air Flow , dan timer.

## Metode Kerja

## Pengambilan Sampel Akar
Fungi endofit akar diisolasi dari akar anakan Shorea leprosula  yang  sehat    dengan  tinggi  anakan  sekitar  20- 50  cm.  Anakan  dengan  seksama  digali  dari  tanah, dibungkus  dengan  tisu  yang  telah  dibasahi,  dan
dimasukkan  ke  dalam  plastik  untuk  dilakukan  proses selanjutnya pada hari yang sama di laboratorium.

## Sterilisasi permukaan
Sterilisasi  permukaan  yang  mengacu  pada  metode Ahlich  dan  Sieber  (1996)  yang  dimodifikasi  untuk mengetahui  hasil  terbaik  untuk  mengisolasi  fungi endofit  akar  Shorea  leprosula.  Sebelum  dilakukan sterilisasi  permukaan,  akar  lateral  diambil,  dicuci dengan  air  mengalir  hingga  seluruh  tanah  yang menempel  pada  akar  bersih.  Jika  perlu  digunakan  sikat halus  untuk  membersihkan  permukaan  akar.  Proses selanjutnya  adalah  perendaman  ke  dalam  beberapa larutan  yang  diurai  pada  tabel  1  yang  dilakukan  di bawah Laminar Air Flow. Selanjutnya akar dikeringanginkan  dan  dipotong  menjadi  segmen berukuran 0.5-1 cm.

## Isolasi
Segmen akar dipindahkan ke  Malt  Extract Agar 1% (10  g/L  ME  dan  20  g/L  agar)  yang  merupakan  media yang  umum  digunakan  untuk  isolasi  fungi  endofit (Arnold,  2001). Inkubasi  dilakukan  pada  suhu  ruangan. Lama  inkubasi  bervariasi,  tergantung  pada  kecepatan pertumbuhan  fungi.  Jika  pada  masa  inkubasi  terdapat fungi  yang  muncul  pada  ujung  segmen  akar,  fungi tersebut dipindahakan ke MEA 1%.

## Pengamatan dan pengambilan data
Selama proses inkubasi, diamati pertumbuhan fungi, persentase  kemunculan  strain,  dan  banyaknya  segmen akar yang berkolonisasi dengan fungi endofit akar.
Tabel 1   Perlakuan sterlisasi permukaan
No Perendaman ke- Jenis perlakuan (% larutan ; menit) A B C D E 1 EtOH 96; 1 70; 1 96; 1 96;0.5 96; 1 2 H 2 O 2 35; 5 15; 4 25;3 25;4 20; 3 3 EtOH 96;0.5 70; 1 96;0.5 96;0.5 96; 1 4 H 2 O - ; 5 -; 5 -; 5 -; 5 -; 5 5 H 2 O -; 5 -; 5 - - -

## HASIL
Hasil pengamatan sterilisasi permukaan akar Shorea leprosula untuk mendapatkan fungi endofit akar dengan lima perlakuan perendaman yang berbeda menunjukkan frekuensi  asosiasi  fungi  endofit  pada  segmen  akar adalah  antara  6%  hingga  10%  (Gambar  2).  Adanya asosiasi  dapat  diamati  dengan  melihat  adanya  fungi yang  tumbuh  dari  irisan  segmen  yang  diletakkan  di MEA  1%  (Gambar  1).  Pada  tahap  sterilisasi  ini, dijumpai  juga  kontaminasi  dengan  persentase  0% hingga  54%.  Kontaminasi  terbanyak  dijumpai  pada perlakuan sterilisasi permukaan  D  yakni 54%.
Gambar 1.  Hifa Fungi Endofit yang muncul dari ujung segmen akar Meranti Tembaga
Pada  setiap  perlakuan,  diperolah  beberapa  jenis isolat  yang  diberi  kode  berdasarkan  jenis  perlakuan yang  disajikan  dalam  tabel  2.    Pada  perlakuan  A,  tidak diperoleh  fungi  yang  berasosiasi  dengan  segmen  akar yang  telah  disterilsasi.  Pada  perlakuan  sterilisasi permukaan  D,  diperolah  jumlah  asosiasi  paling  banyak dibandingkan  dengan  perlakuan  yang  lain.  Hasil pengamatan  pada  isolat  yang  telah  diisolasi  menunjuk- kan  bahwa  isolate-isolat  tersebut  beberapa  memiliki kemiripan,  yang  diklasifikasikan  menjadi  empat  jenis (Tabel  3).  Isolat  WF  dengan  ciri  morfologis  pertum- buhan koloni irregular , raised, dan curled paling banyak dijumpai.  Sedangkan  pada  jenis  perlakuan  sterilisasi permukaan  yang  berbeda  jenis  dengan  ciri  morfologi circular,  flat, dan filiform bisa  dilihat  muncul  dari segmen akar yang ditumbuhkan pada  media MEA 1%.
Gambar 2    Persentase  asosiasi  fungi  endofit  akar  dan kontaminasi pada segmen akar S. leprosula dengan lima metode sterilisasi permukaan
Tabel 2  Isolat yang diisolasi pada sterilisasi permukaan dengan lima perlakuan No Kode Perlakuan Kode Isolat 1 A NA 2 B B25,B35, B39 3 C C17,C26,C12 4 D D3,D4 5 E E40,E47,E3, E10, E25 Tabel 3  Pengelompokan  isolat  berdasarkan  kemiripan morfologi No Kode Isolat Asal Isolat Karakteristik 1 WF C12, B39, D4, B25, Circular, miselia putih, filiform 2 WT D3, C26, E47, E10, E3, E25 Irregular, raised, curled, miselia putih 3 BF C17 Circular, corvex, miselia coklat kehitaman 4 YF E40 Circular, miselia hijau kekuningan
Berdasarkan  hasil  di  atas,  diketahui  bahwa  metode sterilisasi A yang merupakan metode yang diambil dari Ahlich  dan  Sieber  (1996)  tidak  bisa  digunakan  untuk mengisolasi  endofit  pada  akar Shorea  sp. Hasil  terbaik adalah  metode  sterilisasi  C  dan  E  dengan  jumlah presentase  kolonisasi  masing-masing  sebesar  11%  dan 10%  serta  presentase  kontaminasi  sebesar  0%. Kontaminasi  yang  dijumpai  pada  umumnya  berupa Trichoderma  sp. yang  ditandai  dengan  spora  berwarna hijau dan pertumbuhan yang cepat.

## PEMBAHASAN
Meranti  merupakan  tanaman  kehutanan  yang diketahui  memiliki  interaksi  yang  tinggi  dengan mikoriza,  terutama  jenis  ektomikoriza  (Lee,  1998). Penelitian  ini  berhasil  menunjukkan,  bahwa  selain berinterkasi  dengan  ektomikoriza,  akar  meranti  juga dapat  berinterkasi  dengan  fungi  endofit  akar.    Hal  ini sesuai  dengan  teori  yang  menyatakan  bahwa  fungi endofit  jumlahnya  sangat  melimpah  di  alam  (Schulz  et al.,  2006).  Interaksi  antara  fungi  endofit  dengan  inang bersifat luas dan dapat  dijumpai pada berbagai jaringan tanaman  dan  menginfeksi  tanaman  melalui  stomata, dinding sel, ataupun luka pada jaringan taman (Bayman, 2007).
Adanya  endofit  yang  muncul  pada  tanaman  yang umumnya  berasosiasi  dengan  ektomikoriza  sudah banyak  diteliti.  Wagg  et  al  (2008)  pada  penelitiannya berhasil  menunjukkan  adanya  jenis-jenis  pinus  yang berasosiasi  dengan  ektomikoriza,  fungi  mikoriza arbuskula,  serta Dark  Septate  Endophyte (DSE).  Fungi Mikoriza  serta Dark  Septate  Endophyte berbagi  habitat yang  sama,  tetapi  bagaimana  mekanisme  bagaimana cara  mendapatkan  sumber  nutrisi  belum  banyak diketahui (Relnlnger dan Sieber, 2013).
Sterilisasi permukaan dengan metode perendaman di berbagai  larutan  merupakan  metode  yang  paling  umum dilakukan  serta  berhasil  mengisolasi  fungi  endofit  akar (Schulz  et    al.,  1993  ;  Bayman,  2007;  Silvani  et al.,2008).  Pada  penelitian  ini  digunakan  metode sterilisasi permukaan  yang digunakan oleh  Achlich dan Sieber  (1996).  Alkohol  berfungsi  sebagai  larutan  yang membahasahi  jaringan  tanaman  (Schulz  et    al.,  1993)  . Hidrogen  peroksida  (H 2 O 2 )  merupakan  larutan  yang berfungsi  untuk  mengoksidasi  permukaan  akar  serta membunuh jamur maupun bakteri yang ada. Selanjutnya digunakan lagi etanol dan air steril untuk menhilangkan sisa-sisa larutan yang ada pada permukaan akar.
Hidrogen  peroksida  dan  ethanol  merupakan  larutan yang  paling  umum  digunakan  dalam  sterilisasi permukaan.  Namun,  Selain  penggunaa  hydrogen peroksida,  terdapat  beberapa  larutan  yang  lain  yakni Sodium  Hyporchloride  (Schulz  et  al.,1993;  Silvani  et al., 2008) . Sterilisasi permukaan dengan  menggunakan metode  A  yang  merupakan  metode  yang  sama  dengan yang  digunakan  oleh    Achlich  dan  Sieber  (1996)  untuk mengisolasi  fungi  endofit  akar  pada  berbagai  jenis tanaman  berkayu  serta  semak,  tidak  bisa  digunakan untuk  mengisolasi  fungi  endofit  akar  pada  Meranti tembaga.  Kondisi  ini  diduga  karena  seluruh  organisme baik  yang  diinginkan  ataupun  tidak  diinginkan  mati
0% 6%
11% 8% 10%
0% 21% 0% 54% 0% 0% 20% 40% 60% A B C D
E
F re k u en si fu n gi en d of it ak ar (% ) Persentase asosiasi
Kontaminasi
akibat  konsentrasi  larutan  yang  terlalu  kuat.  Pada metode  B,  konsentrasi  etanol  (70%)  dan  hydrogen peroksida (15%)  terlalu rendah, diperkirakan masih ada mikroorganisme  yang  tidak  diharapkan  di  permukaan segmen  yang  memicu  munculnya  kontaminasi.  Pada metode  D,  waktu  perendaman  terlalu  singkat  sehingga masih memungkinkan adanya kontaminasi.
Metode  C  dan  E  menunjukkan  hasil  isolasi  tanpa kontaminasi  serta  persentase  kemunculan  fungi  endofit yang  lebih  besar  dibanding  dengan  metode  lain.  jika kedua  metode  ini  dibandingkan  maka  metode  E  lebih disarankan  dengan  alasan  efektivitas  penggunaan larutan  karena  pada  metode  E  konsentrasi  Hidrogen Peroksida  lebih  rendah.  Hasil  percobaan  dan  studi literatur  yang  telah  dilakukan  menunjukkan  bahwa keefektifan  metode  sterilisasi  baik  konsentrasi  larutan maupun  waktu  perendaman    akan  memberikan  hasil berbeda pada inang yang berbeda.
Persentase fungi endofit yang berhasil diisolasi pada penelitian  ini  berkisar  6%  hingga  11%  .  Jumlah  ini sangat  kecil  jika  dibandingkan  dengan  isolasi  yang dilakukan pada jenis-jenis pohon di wilayah subtropik , salah  satunya  oleh  Achlich  dan  Sieber  (1996)  yang menunjukkan  70-100%  segmen  akar  bebberapa  jenis pohon dan semak berasosiasi dengan fungi endofit akar. Isolasi  fungi  endofit  pada  daun  dan  batang  dari Betula platyphylla (Betulaceae)  , Quercus  liaotungensis (Fagaceae) , dan Ulmus  macrocarpa (Ulmaceae) menunjukkan  persentase  infeksi  sebesar  48.5-65.6% (Sun et al., 2012).
Pada  tanaman  kehutanan,  fungi  endofit  yang berasosiasi  merupakan  jenis  fungi Non-clavipitaceous yang  dicirikan  dengan  kisaran  inang  yang  luas, menginfeksi  akar  dan  tunas,  dan  menyebar  secara vertical  dan  horizontal  (Rodriguez et  al .,  2008).  Studi yang  lebih  spesifik,  menyebutkan  bahwa  komunitas fungi  endofit  pada  tanaman  angiospermae  umumnya didominasi oleh jenis Diaporthales dan pada Gymospermae didominasi oleh fungi Helotiales (Sieber, 2007).
Jumlah  spesies  yang  terdeteksi  dalam  studi  fungi endofit  sangat  dipengaruhi  oleh  beberapa  factor  antara lain  factor  biotik,  factor  abiotic,  inang,  fase  tanaman, edafis  dan  klimatis  (Sieber,  2007).  Di  tanaman  sendiri, jenis endofit serta frekuensi fungi endofit yang terdapat di  dalamnaya  dipengaruhi  oleh  zat-zat  metabolit  yang dikandung  inang  (Bayman,2007)  .Pada  penelitian  ini, rendahnya  persentase  asosiasi  pada  sampel  diduga dikarenakan  oleh  sifat  fungi  endofit  yang  berinteraksi dengan  akar  meranti  tembaga  ini  spesifik.  Kombinasi jenis  larutan  untuk  sterilisasi  permukaan  serta  media untuk inkubasi sangat diperlukan dalam skala penelitian yang  lebih  luas  agar  diperoleh  hasil  yang  lebih maksimal.

## KESIMPULAN
1. Terdapat fungi edofit  yang berasosiasi dengan akar meranti tembaga ( Shorea leprosula )
2. Sterilisasi permukaan dengan  mencelupkan segmen akar  pada    ethanol  96%  (1  menit),  hydrogen peroksida  20%  (3  menit),  ethanol  96%  (1  menit),
dan  air  steril  (5  menit)  merupakan  metode  yang dianjurkan  untuk  mendapatkan  fungi  endofit  akar pada Shorea leprosula
3. Persentase frekuensi kemunculan fungi endofit akar pada Shorea  leprosula rendah  yakni  berkisar  6% hingga 11%.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  terima  kasih  kepada  Pusat Penelitian  dan  Pengembangan  Hutan  dan  Konservasi Alam, Badan Litbang Kehutanan, Kementrian Kehutanan, Gunung Batu Bogor dan Tanoto Foundation atas  bantuan  alat,  bahan  serta  finansial  yang  digunakan selama  penelitian  serta  kepada  anggota  Kelompok Penelitian  Mikrobiologi  Hutan  yang  memberikan bantuan secara teknis serta saran terhadap penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Achlich  K  dan  Sieber  TN.1996.  The  profusion  of  dark septate endophytic fungi in non-ectomycorrhizal fine roots  of  forest  trees  and  shrubs.  New  Phytol  132  : 259-270.
Arnold  AE;  Maynar  Z;  Gilbert  GS.  2001.  Fungal endophytes  in  dicotyledonous  neotropical  trees  : patterns  of  abundance  and  diversity.  Mycol  105 (12): 1502-1507.
Bayman  P.  2007.  Fungal  endophytes.  Kubicek  CP  dan Druzhinina  IS,  editor.  Environmental  and  Microbial Relationship 2nd Edition. Verlag Berlin   Heidelberg : Springer.
Bonkowski M, Cheng W, Griffiths BS, Alphei J, Scheu S.  2000.  Microbial-fauna  interactions  in  the rhizosphere  and  effect  on  plant  growth.  European Journal of Soil Biology 36 : 135-147.
Das A dan Varma A. 2009. Symbiosis : the art of living. a  varma  dan  kharkwal  ac,  editor.  symbiotic  fungi. Verlag Berlin  Heidelberg : Springer.
Hrynkiewicz,  K  dan  Baum,  C.  2011.  The  potential  of rhizosphere  microorganisms  to  promote  the  plant growth  in  disturbed  soils.  A.  Malik,  E.  Grohmann (eds.),  environmental  protection  strategies  for sustainable development, strategies for sustainability. Verlag Berlin  Heidelberg : Springer.
Lee SS. 1998. Root symbiosis and nutrition. Appanah S and Turnbull JM (eds.).
1998.  A  Review  of
Dipterocarps:  Taxonomy,  ecology  and  Silviculture. Bogor : CIFOR.
Orachaipupnlap K; Roengsumran S; Sihanonth P. 2009. Diversity  of  endophytic  fungi  isolated  from  plant leaves  of  decidious  dipterocarp  forest  in  tak province. Kasetsart Jounal 43: 182-188.
Relnlnger  V  dan  Sieber  TN.  2013.  Mitigation  of antagonistic  effects  on  plant  growth  due  to  root  co- colonization  by  dark  septate  endophytes  and
Sterilisasi permukaan untuk mengisolasi fungi endofit 53 ectomycorrhiza. Environmental Microbiology Reports 5 (6) : 892-898.
Rodriguez  RJ,  White  Jr  JE,  Arnold  AE,  Redman  RS. 2008. Fungal endophytes : Diversity and Functional roles. New Phytologist 182: 314-330.
Santoso,  E;  Turjaman,  M;  Irianto  RSB.  2006.  Aplikasi mikoriza  untuk  meningkatkan  kegiatan  rehabilitasi hutan  dan  lahan  terdagradasi.  Proceeding  in: Ekspose hasil Penelitian Konservasi dan Rehabilitasi Sumberdaya Hutan. Forestry Research and Development Ministry of Forestry Indonesia.
Schulz,  B  dan  Boyle  C.  2006.  What  are  endophytes?. Schulz, B; Boyle C dan Sieber TN, editor. Microbial root endophytes. Verlag Berlin Heidelberg: Springer
Schulz  B;  Wanke  U;  Draeger  S;  Aust  HJ.  1993.
Endophytes  from  herbaceous  plant  and  shrubs:
effectiveness of surface sterilization methods. Mycol Res 97: 1447-1450
Sieber  TN. 2007.  Endophytic  fungi  in  forest  trees  :  are they mutualist ?. Fungal Biology Review 20 : 75-89.
Silvani  VA;  Fracchia  S;  Fernandez  L;  Pergola  M;
Godeas  A.  2008.  A  simple  method  to  obtain microorganism  from  fiels-collected  roots.  Soil Ecology and Biochemistry 40 : 1259-1263.
Sun X; Ding Q; Hyde KD; Guo LD. 2012. Community structure and preference of endophytic fungi of three woody plants in a  mixed forest. Fungal Ecology 5  : 624-632.
Wagg  C;  Pautler  M;  Massicotte  HB;  Peterson  L.  2008. The  co-occurance  of  Ectomycorrhizal,  arbuscular mycorrhizal,  and  dark  septate  fungi  in  seedling  of four members of the Pinaceae. Mycorrhiza 18: 103- 110.