## OPTIMASI EKSTRAKSI DNA KOI HERPESVIRUS DARI AIR BUDIDAYA
(Optimum Koi Herpesvirus DNA Extraction from the Aquaculture Water)
Ishaaq Saputra 1* dan Khumaira Puspasari 1
1 Balai Besar KIPM Jakata I Gd. Karantina Hewan, Ikan dan Tumbuhan Bandara Int’l Soekarno Hatta, 19210 Tangerang – Banten Corresponding author: isaputra.6m2@gmail.com
Diterima : 25 September 2021 / Disetujui : 25 Maret 2022

## ABSTRAK
Koi Herpesvirus (KHV) merupakan salah satu jenis penyakit yang menjadi kendala dalam kegiatan  budidaya  ikan  mas.  Pengujian  KHV  dilakukan  dengan  metode Polymerase Chain Reaction (PCR) namun ekstraksi DNA virus dari sampel lingkungan menghadapi dua  masalah  yaitu:  inhibitasi  pada  proses  ekstraksi  dan  amplifikasi  serta  jumlah  virus yang  sangat  kecil.  Kandungan  virus  yang  sangat  kecil  dalam  air  memerlukan  proses konsentrasi  sebelum  dilakukan  analisis  molekuler.  Penelitian  ini  memdibandingkan sensitifitas  tiga  metode  ekstraksi  dan  permurnian  materi  genetik  virus  dari  air  yaitu presipitasi dengan PEG, filtrasi-elusi, dan flokulasi dengan antibodi untuk deteksi KHV dari air dengan metode PCR. Flokulasi organik tidak dapat dilakukan karena antibodi anti KHV tidak dapat diproduksi yang disebabkan oleh rendahnya jumlah virus dalam sampel yang dijadikan vaksin. Metode presipitasi dengan PEG tidak dapat menghasilkan DNA hasil ekstraksi yang jumlah dan kemurniannya cukup baik untuk diamplifikasi. Metode filtrasi-elusi dengan atau tanpa proses rekonsentrasi, menghasilkan pita DNA yang jelas setelah amplifikasi. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dari beberapa metode yang dilakukan, metode filtrasi-elusi merupakan metode yang lebih baik dalam memperoleh DNA KHV yang diambil dari sampel air.
Kata kunci : ekstraksi, filtrasi-elusi, KHV

## ABSTRACT
Koi Herpesvirus (KHV) is one of the viral fish disease in the common carp aquaculture. At  present,  KHV  diagnoses  is  performed  using  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR) method. However, the effort to extract DNA viruses from environmental samples depend on two fundamental problems: inhibition of the extraction and amplification processes and a very small number of viruses. The small amount of virus load in the water requires a concentration process before further molecular analysis. In this study, the sensitivity of three  methods  of  extraction  and  purification  of  viral  genetic  material  from  the  water, namely deposition with PEG, filtration-elution, and flocculation with antibodies for the detection of KHV from the water with the PCR method was performed. Water samples were  collected  from  Cirata  reservoir,  West  Java  which  is  a  site  location  for  carp aquaculture. The organic flocculation cannot be carried out in the present study because anti-KHV  antibodies  cannot  be  produced.  This  is  because  the  amount  of  virus  in  the sampel used by the vaccine is low. Meanwhile, the precipitation method with PEG cannot produce DNAextract’s although quantity and purity are good enough to be amplified. For the filtration-elution method, both with and without the reconcentration process, a clear band of  DNA can be produced after amplification.  In conclusion, the filtration-elution
method is considered as the most suitable method in obtaining KHV DNA’s taken from the water samples.
Keywords : extraction, methods, KHV

## PENDAHULUAN
Koi Virus Herpes (KHV) pada ikan mas ( Cyprinus carpio ) merupakan salah satu penyebab  penyakit  ikan  yang  sulit  ditanggulangi,  cepat  menyebar  di  lingkungan,  serta menyebabkan  kerugian  ekonomi  dan  sosial  yang  sangat  besar  (Sunarto et  al. ,  2005). Penykit  KHV  tidak  hanya  mengancam  budidaya  perikanan  tetapi  juga  kelestarian sumberdaya alam (Aoki et al. , 2007). Sampai saat ini, Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik yang diakui cepat, akurat, dan sensitif dalam mendeteksi keberadaan KHV dalam suatu sampel (Matsui et al. , 2008).
Deteksi KHV dengan PCR sering kali mengalami dua kendala yang berhubungan dengan sampel uji. Kendala pertama adalah sulitnya memperoleh sampel uji pada ikan yang nilai estetika  tinggi seperti koi. Hal tersebut terutama terjadi di pintu-pintu keluar masuk karantina ikan Indonesia misalnya bandara atau pelabuhan. Kendala kedua adalah sulitnya memperoleh sampel jika populasi ikan yang diperiksa sangat besar, misalnya saat pemantauan.  Hal  ini  dikarekanan  dalam  kegiatan  pemantauan  sampel  diambil  dari beberapa  lokasi  budidaya  dengan  jumlah  titik  lokasi  yang  banyak.  Berdasarkan  hal tersebut,  perlu dicari sumber sampel uji  alternatif tanpa menyentuh  ikan serta mampu mewakili jumlah sampel dalam jumlah besar.  Pada skala laboratorium, diketahui KHV dapat bertahan hidup di air hingga empat jam setelah keluar dari tubuh inang (Perelberg et  al. ,  2003).  Selain  itu  telah  diketahui  pula  bahwa  KHV  dapat  menular  melalui  air (Sunarto et.al 2005).  Kedua  penelitian  tersebut  menjadi  dasar  bahwa  air  pemeliharaan atau media transportasi berpotensi menjadi sampel dalam deteksi KHV dengan metode PCR.
Air  pemeliharaan  atau  media  transportasi  yang  dijadikan  sampel  uji  memiliki kendala  antara  lain  mengandung  inhibitor  berupa  senyawa-senyawa  fenolik  (phenolic compound),  asam  humus  (humic  acid),  logam  berat,  protein  atau  karbohidrat.  Bahan- bahan tersebut berikatan dengan nukleotida atau ion magnesium sehingga menghalangi ikatan nukleotida dan ion megnesium dengan enzim polimerase DNA seperti Taq atau reverse  transcriptase ,  urea,  dan  haemoglobin  yang  memiliki  kelarutan  sama  dengan DNA.  Inhibitor tersebut  juga tidak dapat  dihilangkan dengan metode-metode ekstraksi biasa, seperti dengan detergen, protease maupun fenol-kloroform, dan tetap ada bersama DNA setelah ekstraksi selesai (Moreira, 1998; Queiroz et al. , 2001; Schwab et al. , 1996). Selain masalah inhibitor, kandungan virus dalam air juga sangat kecil (Gilad et al. , 2004). Virus  dalam  sampel  lingkungan  dapat  dikonsentrasikan  dengan  metode Presipitasi Polyethylene Glycol (PEG). Metode PEG merupakan teknik yang efektif dan dapat  meningkatkan  kesempatan  mendeteksi  virus  dari  berbagai  sampel  lingkungan (Lewis  &  Metcalf,  1988;  Schwab et.al 1996).  Proses  konsentrasi  virus  dapat  juga dilakukan  dengan  metode  flokulasi  dengan  antibodi  poliklonal  anti  KHV.  Pada  proses flokulasi, virus KHV dalam air akan dikenali dan diikat oleh antibodi anti KHV sehingga membentuk  padatan.  Padatan  tersebut  dapat  dipisahkan  dengan  sentrifugasi.    Metode- metode presipitasi, konsentrasi, dan flokulasi terhadap sampel lingkungan awalnya dibuat untuk mendeteksi virus-virus enterik atau dalam aktifitas mikrobiologi kelautan (Matsui et.al 2008). Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan efektifitas 3 metode ekstraksi dan permurnian materi genetik virus dari air yaitu presipitasi dengan PEG, adsorbsi-elusi,
dan  flokulasi  dengan  antibodi  untuk  deteksi  KHV  dari  air  dengan  metoda  PCR. Keberhasilan aplikasi salah satu  metode  untuk  mendeteksi KHV dari  air  pemeliharaan atau  media  transportasi  akan  dapat  digunakan  sebagai  dasar  pengembangan  metode deteksi virus KHV dalam jumlah kecil dari media air.  Sehingga dapat diperoleh DNA sebagai  bahan  uji  PCR  untuk  digunakan  sebagai  alat  untuk  mendeteksi  dan mengendalikan KHV secara tepat dan akurat.

## METODE PENELITIAN Waktu dan tempat penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Juni-September tahun 2017. Air sampel berasal dari  Waduk  Cirata,  Jawa  Barat.  Pengujian  sampel  dilakukan  di  Balai  Uji  Standar Karantina Ikan, Cilangkap – Jakarta Timur.

## Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam uji coba adalah: akuarium dan aerator, mortar dan pestle, pasir steril, syringe ukuran 1; 5; 10; dan 20 cc, mikropipet ukuran 10; 20; 100; dan 1000 µL;  alat  bedah, hot  plate  with  stirrer ,  timbangan  digital,  erlenmeyer  1000  mL,  tabung bijou, refrigerator (suhu 4°C), peralatan untuk peralatan ekstraksi dan PCR DNA KHV, GeneQuantTM.
Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah: organ sampel berupa ginjal ikan  mas  positif  KHV,  ikan  mas  sampel  sebanyak  24  ekor,  akuades  bebas  pyrogen, syringe 1 cc, akuades, ethanol PA, Agarosa, TE buffer 50×, SYBR Safe, PEG, Phospat- Buffered  Saline (PBS),  NaCl,  NaOH,  HCl,  KCl, Beef  Extract (BE),  Glycine  (G), mikrotube 0,2; 0,5 dan 1,5 mL mikrotips 10; 200; 1000 µL tabung sentrifugasi 150 mL , object  glass,  alkhohol  teknis,  formaldehyde, Freund’s  Adjuvant  Complete,  Freund’s Adjuvant  Incomplete, DNAzol,  glycogen,  bahan-bahan  ekstraksi  dan  PCR  DNA  KHV IQ2000,  glucose  powder,  HEPES  buffer  solution,  Penicillin-streptomycin,  gentamicin reagen solution, MEM with Earle’s salt, distiled dan deionized water, fetal bovine serum, L-glutamin,  DMSO,    filter  membran  0,45  µm,  pakan  ikan  dan  pakan  kelinci,  sarung tangan, masker, primasept, label dan alat tulis.

## Prosedur penelitian
Penelitian  dilakukan  dengan  menggunakan  ikan  mas  yang  positif  KHV  yang diperoleh dari Waduk Cirata. Homogenat organ dari ikan tersebut diinjeksikan pada ikan- ikan  sehat  yang  dipelihara  di  laboratorium.  Air  pemeliharaan  ikan  di  laboratorium tersebut  menjadi  subjek  penelitian  dengan  metode  presipitasi,  adsorbsi-elusi,  dan flokulasi organik (
Gambar 1 ).
Infeksi Buatan Terhadap Sampel Ikan
Sumber  virus  yang  digunakan  dalam  infeksi  buatan  KHV  berasal  dari  Waduk Cirata.  Ikan  mas  yang  tidak  menunjukkan  gejala  dikumpulkan  lalu  dinekropsi, selanjutnya diambil jaringan insang, limpa, dan ginjal. Sampel jaringan selanjutnyalalu dibawa  ke  laboratorium  dalam  kondisi  beku.  Saat  nekropsi,  sebagian  jaringan  insang difiksasi di dalam alkhohol 95 p.a. % untuk pemeriksaan apakah terinfeksi KHV dengan PCR menggunakan primer KHV Thymidine Kinase (KHV-TK) (Bercovier et al. , 2005). Pembuatan homogenat organ yang akan dinjeksikan ke ikan mas dilakukan berdasarkan percobaan yang dilakukan (Sunarto et.al 2005). Organ dari ikan yang positif KHV digerus menggunakan mortar steril dingin, diencerkan 10× menggunakan PBS, lalu disentrifugasi pada 3.000 rpm selama 10 menit. Supernatan  difilter menggunakan membran filter 0,45 µm,  lalu  digunakan  untuk  infeksi  ikan  sampel.  Setiap  satu  ekor  ikan  berukuran  200  g diinjeksi pada bagian intramuskular dengan dosis 0,1 cc.
Ikan dipelihara dalam akuarium  yang diisi  air sebanyak 10  L dan diberi  aerasi. Kepadatan  ikan  dalam  satu  akuarium  adalah  20  ekor.  Pemeliharaan  dilakukan  sampai ikan menunjukkan gejala khas KHV yaitu (nekrosis di jaringan insang) atau sampai mati. Insang  ikan  selanjutnya  diperiksa  dengan  PCR  menggunakan  primer  KHV-TK  untuk determinasi serangan serangan KHV.

## Gambar 1 Proses kegiatan penelitian pengujian KHV dengan berbagai metode

## Presipitasi Virus dari Air Pemeliharaan Menggunakan PEG
Air  pemeliharaan  dicampurkan  dengan  64,6  gr  PEG/L  hasil  elusi,  dan  17,53  g NaCl/L hasil elusi lalu pH segera disesuaikan menjadi 7,2. Campuran kemudian diaduk menggunakan stirer sampai homogen lalu diinkubasi pada 4 o C selama 12 jam. Campuran kemudian  disentrifugasi  13.500  rpm  selama  20  menit.  Pelet  diekstraksi  DNAnya, diperiksa  jumlah  dan  kemurniannya  menggunakan  GeneQuant TM dan  diamplifikasi dengan Primer KHV-TK.
Adsorbsi-Elusi Virus dari Air
Sampel positif KHV
(PCR/primer KHV-TK)
Homogenat organ sebagai bahan infeksi buatan Infeksi terhadap ikan dengan cara injeksi intramuskular Pemeriksaan terhadap ikan sakit/mati Amplifikasi dengan KHV-TK Primers Kuantifikasi DNA dengan GeneQuant TM Presipitasi dengan PEG Ekstraksi DNA KHV Produksi antibodi poliklonal Titrasi Ab Flokulasi virus dengan Ab anti KHV Re-elusi Adsorbsi-elusi air pemeliharaan Pengenceran homogenat (10×, 100×, 1000×) Penambahan karbon aktif
Sebanyak  1  L  air  pemeliharaan  (dari  akuarium  yang  sama)  ditambahkan  AlCl 3 sampai konsentrasi AlCl 3 menjadi 0,0015N, lalu disesuaikan pH-nya sampai 3,5. Larutan tersebut  kemudian  difilter  dengan  kertas  filter  no  40  (Whatman)  untuk  menjernihkan. Filtrat kemudian difilter  menggunakan membrane filter 0,45 µm. Setelah selesai, filter dicuci  dengan  NaCl  0,14N  lalu  dielusi  dengan  cara  direndam  dalam  28  ml  0,05M Glycine-NaoH  (pH  11,5)  sambil  di  aduk  menggunakan  stirer  perlahan  pada  suhu  4 o C selama  15  menit  dalam  buffer  tersebut.  Membran  filter  kemudian  dikeluarkan  dari Glycine buffer. Sebagian buffer hasil elusi tersebut direkonsentrasi dengan cara dielusi ulang dengan cara menambahkan 0,28 ml AlCl 3 0,15N lalu disesuaikan pH-nya menjadi 3,5  kemudian  langsung  disentrifugasi  pada  13.500  rpm.  Supernatan  hasil  sentrifugasi dibuang dan peletnya diekstraksi.
Sebagian buffer hasil elusi kemudian direkonsentrasi kandungan virusnya dengan menambahkan 64,6 gr PEG/L hasil elusi, dan 17,53 g NaCl/L hasil elusi lalu pH segera disesuaikan menjadi 7,2. Campuran kemudian distirer sampai homogen lalu diinkubasi pada 4 o C selama 12 jam. Setelah inkubasi akan terbentuk dua fasa, dan pada fasa bawah ditambahkan NaCl sampai 1 M sambil dihomogenkan, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.500 rpm selama 20 menit. Pelet kemudian diekstraksi DNAnya dan DNA hasil  ekstraksi  tersebut  kemudian  diperiksa  jumlah  dan  kemurniannya  menggunakan GeneQuant TM dan diamplifikasi dengan Primer KHV TK.

## Flokulasi Virus dari Air Menggunakan Antibodi Poliklonal Anti KHV
Homogenat  organ  yang  berasal  dari  infeksi  buatan  ditambahkan  formaldehyde (0,4%)  lalu  di  stirer  pada  4 o C  selama  24  jam.  Homogenat  dicampur  dengan Freund’s Adjuvant  Complete (1:1)  kemudian  disuntikkan  subkutan  pada  kelinci.  Setelah  tiga minggu  kelinci  kembali  disuntik  dengan  vaksin  yang  dicampur  dengan Freund’s Adjuvant  Incomplete (1:1),  dan  injeksi  diulang  seminggu  sekali  selama  3  minggu. Seminggu setelah injeksi terakhir serum di panen dari kelinci. Titrasi antibodi dilakukan menggunakan Agar Gel Precipitation Test (AGPT), dengan homogenat organ berisi virus aktif  sebagai  antigen  KHV.  Jumlah  antibodi  yang  optimal  berikatan  dengan  antigen kemudian  digunakan  dalam  proses  flokulasi.  Sebanyak  1.000  mL  air  pemeliharaan dijernihkan dengan sentrifugasi. Flokulasi dilakukan dengan mengaduk air pemeliharaan yang  sudah  dijernihkan  tersebut  pada  4 o C  dengan  stirer.  Pada  air  tersebut  diteteskan antibodi anti KHV perlahan-lahan sampai air menjadi keruh dan terbentuk butiran yang sangat  kecil.  Setelah  flokulasi,  padatan  yang  terbentuk  dipisahkan  dari  air  dengan disentrifugasi pada 7.000 rpm selama 30 menit pada 4 o C. Pelet yang terbentuk diekstraksi DNA KHV. DNA hasil ekstraksi lalu diperiksa jumlah dan kemurniannya menggunakan GeneQuant TM dan diamplifikasi dengan Primer KHV-TK.

## Kontrol Positif Pengujian
Kontrol  positif  pengujian  menggunakan  homogenate  organ  yang  diencerkan bertingkat  10x,  100x  ,  dan  1.000x  menggunakan  air  kolam  steril.  Campuran  tersebut kemudian ditambahkan 64,6 g PEG/L hasil elusi, dan 17,53 g NaCl/L hasil elusi lalu pH segera disesuaikan menjadi 7,2. Campuran kemudian diaduk menggunakan stirer sampai homogen  lalu  diinkubasi  pada  4 o C  selama  satu  malam.  Campuran  kemudian disentrifugasi 13.500 rpm selama 20 menit. Pelet diekstraksi DNAnya, diperiksa jumlah dan kemurniannya menggunakan GeneQuant TM dan diamplifikasi dengan Primer KHV- TK.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  ini  menunjukan  bahwa  DNA  KHV  dapat  diekstraksi  langsung dari air pemeliharaan. Penelitian ini menggunakan tiga metode utama,  yaitu presipitasi menggunakan  PEG,  flokulasi  organik,  dan  adsorbsi-elusi.  Metode  adsorbsi-elusi dilakukan  dengan  tiga  variasi  perlakuan  berbeda,  yaitu pre-treatment dengan  karbon aktif, rekonsentrasi dengan presipitasi PEG dan rekonsentrasi dengan re-elusi. Dari dua metode  yang  dapat  dilaksanakan,  presipitasi  menggunakan  PEG  dan  adsorbsi-elusi, metode  yang  berhasil  memurnikan  DNA  KHV  dari  air  adalah  metode  adsorbsi-elusi. Virus  KHV  hasil  dari  adsorbsi-elusi  direkonsentrasi  dengan  dua  cara,  yang  pertama dengan re-elusi dan  yang kedua dengan menggunakan PEG (Bagan 1).  Kedua langkah lanjutan  tersebut  memberikan  hasil  yang  sama  berupa  pita  DNA  KHV  sebesar  409  bp pada amplifikasi menggunakan primer KHV-TK. Perbedaan pita DNA dari kedua metode rekonsentrasi tersebut adalah hasil amplifikasi DNA virus yang direkonsentrasi dengan re-elusi  tampak  lebih  tipis  dibandingkan  hasil  rekonsentrasi  dengan  presipitasi menggunakan PEG (Gambar 4).
Mekanisme  deteksi  KHV  dari  sampel  jaringan  ikan  sudah  sangat  berkembang; mulai  dari PCR  (Bercovier et.al 2005; Dishon et  al. , 2005; Gray et  al. , 2002), ELISA (Adkison et al. , 2005), LAMP (Gunimaladevi et al. , 2004; Soliman & El-Matbouli, 2005) dan  Real-time  PCR  (Gilad et.al 2004).  Meskipun  demikian,  mekanisme  deteksi keberadaan  KHV  dari  sampel  lingkungan  belum  berkembang  dengan  baik.  Hal  ini disebabkan kurang berkembangnya metode yang stabil untuk deteksi KHV dari sampel lingkungan (Matsui et.al 2008).  Metode isolasi dan deteksi virus dari air pada awalnya berkembang untuk deteksi virus-virus enterik yang patogen bagi kesehatan manusia (Hill et  al. ,  1976).  Metode  adsorbsi-elusi  berhasil  diaplikasikan  untuk  deteksi  KHV  dari  air sungai di Jepang untuk deteksi dengan Real-time PCR (Haramoto et al. , 2007). Penelitian saat  ini  berhasil  mendeteksi  KHV  dari  air  dengan  teknik  PCR  yang  lebih  sederhana, dengan  cara  menambahkan  metode  rekonsentrasi  untuk  memperbesar  kesempatan menangkap partikel virus. Selain itu, hasil penelitian saat ini menunjukkan bahwa teknik isolasi  yang  dikembangkan  untuk  jenis  virus  yang  tidak  memiliki  selubung  ( non- enveloped viruses ) termasuk KHV.
Tabel 1 Pengukuran DNA Hasil Ekstraksi dengan GeneQuant TM
Sampel Hasil Pengukuran λ 260/280 λ 260/230 (µg/mL)
Pemurnian air Waduk Cirata ( rekonsentrasi PEG ). 0,418 0 a 68,3 Pemurnian air Waduk Cirata ( rekonsentrasi PEG ). 1,077 0,621 18,2 Pemurnian air media transportasi ( rekonsentrasi PEG ). 1,714 0,673 4,2 Pemurnian air media transportasi ( rekonsentrasi PEG ). 0,936 5,193 5,66
Pemurnian air Waduk Cirata ( pre-treatment karbon aktif/rekonsentrasi PEG ). 1,827 0,325 6,85 Pemurnian air media transportasi ( rekonsentrasi re- elusi ). 1.383 0,683 13,55 Pemurnian air pemeliharaan ( rekonsentrasi re-elusi ). 1,165 1,066 51,59
Pemurnian air Waduk Cirata ( pre-treatment karbon aktif/ rekonsentrasi re-elusi ). 0 a 0 a 0 a Pemurnian air Waduk Cirata ( rekonsentrasi PEG ). 1,714 0 a 88,1
Pemurnian air pemeliharaan dengan dengan PEG 0 a 0 a 0 a Kontrol positif (10 -1 ), pengenceran 2×. 1,163 1,09 35,1 Kontrol positif (10 -1 ),  pengenceran 4×. 1,345 0,478 11,3 Kontrol positif (10 -1 ),  pengenceran 6×. 1,194 1,00 3,7 Sampel positif KHV 1,321 0 a 105
Keterangan: a tidak terbaca oleh GeneQuant TM
Berdasarkan pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA dengan GeneQuant TM , tebal atau tipisnya pita DNA hasil amplifikasi dapat berhubungan dengan kemurnian dan konsentrasi  DNA  hasil  ekstraksi  (Tabel  1).  Kemurnian  dan  jumlah  DNA  KHV  hasil rekonsentrasi dengan PEG lebih baik daripada yang direkonsentrasi dengan re-elusi. Hal tersebut  disebabkan  pada  proses  rekonsentrasi  dengan  re-elusi  terlalu  banyak  partikel virus  yang  bebas  dalam  buffer,  sehingga  sentrifugasi  yang  hanya  13.500  rpm  tidak mampu mengendapkan partikel virus tersebut. Sementara pada proses adsorbsi-elusi yang diikuti  rekonsentrasi  menggunakan  PEG  partikel-partikel  virus  yang  bebas  diikat  oleh PEG dan menghasilkan partikel yang berukuran lebih besar dan sanggup diendapkan oleh kecepatan  sentrifugasi  13.500  rpm.    Metoda  adsorbsi-elusi  mampu  mengurangi  atau menghilangkan  inhibitor  proses  amplifikasi  sehingga  DNA  hasil  ekstraksi  dapat diamplifikasi dan menghasilkan pita yang jelas. Hal tersebut terjadi karena filter membran yang bermuatan negatif secara selektif berikatan dengan virus dalam kondisi reaksi kaya Al3+ dan lingkungan yang asam (Haramoto et.al 2007), sehingga saat filter dielusi tidak ada inhibitor yang terikut dalam proses tersebut.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  sebanyak  5  sampel  dari  24  sampel  yang dikumpulkan di Cirata menderita infeksi sangat ringan, 1 sampel menderita infeksi berat, dan sisanya negatif KHV. Satu minggu setelah infeksi, ikan mas percobaan disampling masing-masing  dua  ekor  dari  1  akuarium  percobaan  dan  diperiksa  menggunakan  PCR IQ2000 KHV dan KHV-TK (Bercovier et.al 2005).  Semua ikan yang diperiksa positif KHV  dengan  tingkat  infeksi  sangat  ringan  menurut  IQ2000  KHV  dan  negatif    KHV menurut primer  KHV-TK ( Gambar 2 ).
Gambar 2  KHV-infected DNA documentation. (Line 1  : Marka DNA 100 bp Ladder, 2 : Kontrol positif 10 3 , 3  : Kontrol positif 10 2 , 4  : Kontrol positif 10 1 , 5  : Kontrol negatif, 6  : Sampel positif, 7-12 : Ikan hasil infeksi)

## Presipitasi Virus dari Air Pemeliharaan Menggunakan PEG
Hasil  DNA  yang  dimurnikan  dari  air  pemeliharaan  menggunakan  PEG  tidak teramplifikasi. Konsentrasi DNA memang tinggi tetapi kandungan pengotor juga sangat tinggi sehingga nilai kemurnian DNA tidak dapat terbaca oleh GeneQuant TM ( Tabel 1 ). Metode ekstraksi DNA dari air langsung menggunakan PEG tidak berhasil memberikan DNA  yang  kualitasnya  baik  untuk  diamplifikasi.  Meskipun  pada  pengukuran
menggunakan  GeneQuant TM konsentrasi  DNA  hasil  ekstraksinya  sangat  tinggi (123,5µg/mL),  bahkan  lebih  tinggi  dibandingkan  konsentrasi  DNA  pada  sampel  yang positif KHV (105 µg/mL), tetapi kemurnian DNA hasil ekstraksi tersebut sangat buruk (dibawah kemampuan membaca GeneQuant TM ).
Gambar 3. DNA hasil Presipitasi air dengan PEG (Lane 1: Marka DNA 100 bp Ladder, 2: Kontrol negatif (ddH 2 O), 3: Sampel positif KHV, 4: DNA dari metode adsorbsi-elusi, 5 & 6: DNA dari metode presipitasi dengan PEG).
PEG merupakan polimer yang dapat berikatan dengan protein dan biasanya dapat mempresipitasi  virus  dalam  medium  kultur.  Tetapi  medium  kultur  jauh  lebih  bersih dibandingkan air pemeliharaan. Ketika presipitasi dengan PEG diaplikasikan terhadap air pemeliharaan yang memiliki pengotor sangat besar, terlalu banyak protein non-virus yang ikut terikat. Hal tersebut menyebabkan kuantitas dan kualitas DNA hasil ekstraksi sangat buruk  dan  pada  akhirnya  menyebabkan  gagalnya  proses  amplifikasi.  Gagalnya  proses amplifikasi terhadap DNA hasil  presipitasi langsung juga dapat disebabkan masih adanya inhibitor setelah proses ekstraksi.

## Adsorbsi-Elusi
DNA  hasil  ekstraksi  dari  pemurnian  air  pemeliharaan  menghasilkan  pita  DNA pada  posisi  yang  sama  dengan  sampel  positif  KHV  ketika  dielektroforesis  tanpa diamplifikasi sebelumnya (Gambar 3). Selain terhadap air pemeliharaan, adsorbsi-elusi juga dilakukan terhadap air yang diambil dari Waduk Cirata dan menghasilkan pita DNA berukuran 409 bp (Gambar 4). Pada sebagian air yang diambil dari Cirata dilakukan pre- treatment yaitu  dengan  penambahan  karbon  aktif  untuk  mengikat  inhibitor  yang  biasa ditemukan dalam sampel-sampel lingkungan. Tidak ada pita DNA yang dihasilkan dari amplifikasi  terhadap  sampel  yang  di pre-treatment tersebut  (Gambar  4).  Sebagian  air yang  difiltrasi-elusi  direkonsentrasi  dengan  re-elusi  sementara  sisanya  menggunakan PEG.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pita  DNA  hasil  rekonsentrasi  dengan  PEG lebih jelas dibandingkan yang direkonsentrasi dengan re-elusi (Gambar 4).
Gambar 3. Elektroforesis DNA hasil ekstraksi (tanpa amplifikasi) (1   : Marka DNA 100 bp Ladder, 2   : Sampel positif KHV, 3   : Hasil ekstraksi dari pemurnian air pemeliharaan, 4 & 5   : Hasil ekstraksi dari pemurnian air pemeliharaan)
Gambar 4. DNA Hasil adsorbsi-elusi (Primer KHV-TK). Keterangan gambar : 1  :  Marka DNA 100 bp Ladder, 2 & 3 :  Pemurnian air Waduk Cirata (rekonsentrasi PEG), 4 & 5 : Pemurnian air media transportasi (rekonsentrasi PEG), 6  :  Pemurnian air Waduk Cirata (pre-treatment karbon aktif/rekonsentrasi PEG), 7 & 8  :  Pemurnian air media transportasi (rekonsentrasi  re-elusi),  9    :    Pemurnian  air  pemeliharaan  (rekonsentrasi  re-elusi),  10: Pemurnian  air  Waduk  Cirata  (pre-treatment  karbon  aktif/  rekonsentrasi  re-elusi),  11: Pemurnian air Waduk Cirata (rekonsentrasi re-elusi), 12:  Kontrol positif penelitian (10 - 1 ), 13:  Kontrol positif penelitian (10 -2 )., 14:  Kontrol negatif PCR (reagen), 15:  Kontrol negatif PCR (ddH 2 O), 16:  Sampel positif KHV.

## Flokulasi Virus dari Air Menggunakan Antibodi Poliklonal Anti KHV
Pembuatan  antibodi  anti-KHV  yang  dilakukan  dengan  menyuntikkan  vaksin KHV  yang  dibuat  dari  homogenat  yang  sama  untuk  infeksi  buatan  pada  ikan  tidak berhasil  menghasilkan  antibodi  anti  KHV.  Setelah  masa  inkubasi  dalam  tubuh  kelinci selama satu bulan, serum yang dihasilkan dari tubuh kelinci sama sekali tidak bereaksi terhadap  antigen    KHV  yang  digunakan  dalam  Agar-gel  Presipitation  Test  (AGPT). Booster terhadap kelinci juga tidak dapat menghasilkan antibodi anti KHV.  Oleh karena tidak  ada  ikatan  antigen-antibodi  dari  serum  kelinci,  maka  flokulasi  organik menggunakan antibodi anti KHV tidak dapat dilakukan.

## Kontrol Positif Penelitian
Pada  amplifikasi  menggunakan  primer  KHV-TK  IQ2000  KHV,  hanya pengenceran  10×  yang  menghasilkan smear tebal  (Gambar  4).  Hasil  amplifikasi menggunakan IQ2000 menghasilkan pita yang cukup jelas. Pada pengenceran yang lebih besar, DNA inang terlihat jelas, tetapi DNA virus hilang (Gambar 5).
Gambar 5. DNA Hasil amplifikasi kontrol positif (1   : Marka DNA 100 bp Ladder, 2   : Kontrol positif 10 3 , 3   : Kontrol positif 10 2 , 4   : Kontrol positif 10 1 , 5   : Kontrol negatif, 6   : Pengenceran 2×, 7   : Pengenceran 4×, 8   : Pengenceran 6×, 9   : Pengenceran 10×, 10 : Pengenceran 100× , 11 : Sampel positif)
Amplifikasi lalu diulang terhadap DNA hasil ekstraksi yang diencerkan 2X, 6X dan  10X  menggunakan  primer  Gray  untuk  memastikan  ada  tidaknya  DNA  virus. Amplifikasi meggunakan primer Gray menghasilkan pita berukuran 290 bp (Gambar 6) dan sesuai dengan beberapa penelitian sebelumnya (Gray et al., 2002).
Gambar 6. DNA hasil amplifikasi kontrol positif penelitian  menggunakan primer Gray (Gray et  al. ,  2002).  Keterangan  gambar  1    :    Marka  DNA  100  bp  Ladder,  2  &  3  : Pemurnian air media tranportasi, 4  :  Pemurnian air pemeliharaan, 5 & 6  :  Pemurnian air Waduk Cirata, 7  :  Kontrol positif penelitian (10 -1 , diencerkan 2×), 8  :  Kontrol positif penelitian (10 -1 , diencerkan 4×), 9  :  Kontrol positif penelitian (10 -1 , diencerkan 6×), 10: Pemurnian air pemeliharaan, 11:  Pemurnian air pemeliharaan, 12 & 13 :  Pemurnian air media tranportasi, 14:  Kontrol negatif PCR (reagen), 15:  Kontrol negatif PCR (ddH 2 O), 16:  Sampel positif KHV.

## KESIMPULAN
Koi Herpesvirus yang ada di air dapat diekstraksi untuk dideteksi dengan metode PCR. Metode  adsorbsi-elusi  adalah  yang  paling  efektif  dalam  mengkonsentrasikan  dan memurnikan  DNA  KHV  sehingga  dapat  di  amplifikasi.  Penggunaan  metode  tersebut dapat  menghilangkan  inhibitor  dalam  sampel  sehingga  tidak  menghambat  proses ekstraksi  dan  amplifikasi.  Metode  presipitasi  dengan  PEG  tidak  dapat  diaplikasikan langsung terhadap air karena tidak mampu menghilangkan inhibitor.

## DAFTAR PUSTAKA

## 1     2    3    4    5    6     7     8    9   10   11  12  13  14  15
Adkison, M., Gilad, O., & Hedrick, R. (2005). An Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for Detection of Antibodies to the Koi Herpesvirus (KHV) in the Serum of Koi Cyprinus carpio. Fish Pathology, 40 , 53-62. doi: 10.3147/jsfp.40.53 Aoki,  T.,  Hirono,  I.,  Kurokawa,  K.,  Fukuda,  H.,  Nahary,  R.,  Eldar,  A.,  Davison,  A., Waltzek, T., Bercovier, H., & Hedrick, R. (2007). Genome Sequences of Three Koi  Herpesvirus  Isolates  Representing  the  Expanding  Distribution  of  an Emerging  Disease  Threatening  Koi  and  Common  Carp  Worldwide. Journal  of Virology, 81 , 5058-5065. doi: 10.1128/JVI.00146-07
Bercovier,  H.,  Fishman,  Y.,  Nahary,  R.,  Sinai,  S.,  Zlotkin,  A.,  Eyngor,  M.,  Gilad,  O., Eldar,  A.,  &  Hedrick,  R.  (2005).  Cloning  of  the  Koi  Herpesvirus  (KHV)  gene encoding thymidine kinase and its use for a highly sensitive PCR based diagnosis. BMC Microbiology, 5 , 13. doi: 10.1186/1471-2180-5-13
Dishon,  A.,  Perelberg,  A.,  Bishara-Shieban,  J.,  Ilouze,  M.,  Davidovich-Cohen,  M., Werker, S., & Kotler, M. (2005). Detection of Carp Interstitial Nephritis and Gill Necrosis Virus in Fish Droppings. Applied and Environmental Microbiology, 71 , 7285-7291. doi: 10.1128/AEM.71.11.7285-7291.2005
Gilad, O., Yun, S., Zagmutt, F., Leutenegger, C., Bercovier, H., & Hedrick, R. (2004). Concentration of a Koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Diseases of Aquatic Organisms, 60 , 179-187. doi: 10.3354/dao060179
Gray,  W.,  Mullis,  L.,  LaPatra,  S.,  Groff,  J.,  &  Goodwin,  A.  (2002).  Detection  of  Koi herpesvirus DNA in tissues of infected fish. Journal of Fish Diseases, 25 , 171- 178. doi: 10.1046/j.1365-2761.2002.00355.x
Gunimaladevi,  I.,  Kono,  T.,  Venugopal,  M.,  &  Sakai,  M.  (2004).  Detection  of  koi herpesvirus  in  common  carp,  Cyprinus  carpio  L.,  by  loop-mediated  isothermal amplification. Journal  of  Fish  Diseases,  27 ,  583-589.  doi:  10.1111/j.1365- 2761.2004.00578.x
Haramoto,  E.,  Kitajima,  M.,  Katayama,  H.,  &  Ohgaki,  S.  (2007).  Detection  of  koi herpesvirus  DNA  in  river  water  in  Japan. Journal  of  Fish  Diseases,  30 ,  59-61. doi: 10.1111/j.1365-2761.2007.00778.x
Hill, W., Jakubowski,  W., Akin, E., &  Clarke, N. (1976). Detection of virus in  water: sensitivity  of  the  tentative  standard  method  for  drinking  water. Applied  and Environmental  Microbiology,  31 ,  254-261.  doi:  10.1128/AEM.31.2.254- 261.1976
Lewis,  G.,  &  Metcalf,  T.  (1988).  Polyethylene  glycol  precipitation  for  recovery  of pathogenic viruses, including hepatitis A virus and human rotavirus, from oyster, water,  and  sediment  samples. Applied  and  Environmental  Microbiology,  54 , 1983-1988. doi: 10.1128/AEM.54.8.1983-1988.1988
Matsui, K., Honjo, M. I. E., Kohmatsu, Y., Uchii, K., Yonekura, R., & Kawabata, Z. I.
(2008).  Detection  and  significance  of  koi  herpesvirus  (KHV)  in  freshwater environments. Freshwater Biology, 53 (6), 1262-1272. doi:
https://doi.org/10.1111/j.1365-2427.2007.01874.x
Moreira, D. (1998). Efficient removal of PCR inhibitors using agarose-embedded DNA preparations. Nucleic Acids Research, 26 (13), 3309-3310. doi: 10.1093/nar/26.13.3309
Perelberg, A., Smirnov, R., Hutorian, M., Diamant, A., Bejerano, Y., & Kotler, M. (2003). Epidemiological  description  of  a  new  viral  disease  afflicting  cultured  Cyprinus Carpio in Israel. The Israeli journal of aquaculture = Bamidgeh, 55 , 5-12.
Queiroz,  A.  P.  S.,  Santos,  F.  M.,  Sassaroli,  A.,  Hársi,  C.,  Monezi,  T.,  &  Mehnert,  D.
(2001). Electropositive Filter Membrane as an Alternative for the Elimination of PCR  Inhibitors  from  Sewage  and  Water  Samples. Applied  and  Environmental Microbiology, 67 , 4614-4618. doi: 10.1128/AEM.67.10.4614-4618.2001 Schwab,  K.,  Leon,  R.,  &  Sobsey,  M.  (1996).  Immunoaffinity  concentration  and purification  of  waterborne  enteric  virus  for  detection  by  reverse  transcriptase PCR. Applied  and  Environmental  Microbiology,  62 ,  2086-2094.  doi: 10.1128/AEM.62.6.2086-2094.1996
Soliman, H., & El-Matbouli, M. (2005). An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi  Herpesvirus  (KHV)  infection  by  loop-mediated  isothermal  amplification. Virology Journal, 2 (1), 83. doi: 10.1186/1743-422X-2-83
Sunarto, A., Rukyani, A., & Itami, T. (2005). Indonesian Experience on the Outbreak of Koi Herpesvirus in Koi and Carp (Cyprinus carpio). Bull Fish Res Agency Suppl, 2 .