## PENGARUH PENAMBAHAN LAKASE DARI JAMUR TIRAM PUTIH ( Pleurotus ostreatus ) TERHADAP AKTIVITAS ANTIOKSIDAN TEH HIJAU
[Effect of The Addition of Laccase from White Oyster Mushroom ( Pleurotus ostreatus ) Towards Antioxidant Activity of Green Tea]
Tagor M. Siregar 1) *, A. Herry Cahyana 2) , dan Natalia 1)
1) Jurusan Teknologi Pangan, Universitas Pelita Harapan, Tangerang
2) Departemen Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Indonesia, Jakarta
Diterima 09 April 2010 / Disetujui 12 Maret 2012

## ABSTRACT
Laccase is one of the enzymes that can be used in organic synthesis using aromatic compounds (polyphenols and aminofenol) as substrates. Polyphenol compound in green tea is flavan-3-ols or catechin which are susceptible to enzymatic reaction with laccase. In this research laccase isolated  from  white  oyster  mushroom  was  added  into  the  green  tea  extract.  Addition  of  laccase  is  expected  to  yield  products  with  a  higher antioxidant activity. Prior to it’s use, laccase activity was determined and had a specific activity of 0.54 Unit/mg. The green tea extract was prepared using  methanol  and  water  as  solvents.  The  antioxidant  activity  was  evaluated  using  2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl  (DPPH)  radical-scavenging activity  method  and  the  total  flavonoid  content  was  assayed  by  spectrophotometry.  Antioxidant  compounds  are  identified  by  using  UV-Vis spectrophotometry and GC-MS. Addition of laccase into green tea extract resulted in precipitates showing a significant increase in flavonoid content and antioxidant activity. Use of methanol as solvent resulted in extract with higher antioxidant activity and total flavonoid than that extracted with water.  Qualitative  analysis  with  spectrophotometer  UV-Vis  and  GC-MS  showed  that  the  new  components  in  the  precipitates  were  a  variety  of dimeric  products  with  increased  molecular  weight  and  antioxidant  activity.  Addition  of  laccase  into  green  tea  extract  has  yielded  products  with higher antioxidant activity.
Key words: antioxidant, catechin, green tea, laccase enzyme, white oyster mushroom (Pleurotus ostretus)

## 1 PENDAHULUAN
Antioksidan  merupakan  senyawa  kimia  yang  dapat  mem- perlambat  reaksi  oksidasi,  karena  kemampuannya  bereaksi dengan radikal bebas. Salah satu dampak buruk yang diakibat- kan  oleh  radikal  bebas  terhadap  kesehatan  adalah  timbulnya penyakit  kanker.  Manfaat  antioksidan  yang  baik  bagi  tubuh manusia  menyebabkan  berbagai  upaya  telah  dilakukan  untuk mengeksplorasi  sumber-sumber  antioksidan  dari  berbagai tanaman.  Salah  satu  upaya  yang  dilakukan  adalah  dengan melakukan sintesis organik terhadap senyawa antioksidan yang terkandung di dalam suatu bahan. Sintesis organik pada dasar- nya  merupakan  suatu  reaksi  kimia  organik  yang  terjadi  pada suatu substrat dengan melibatkan katalis. Produk yang dihasil- kan dari sintesis organik  ini diharapkan akan memiliki aktivitas antioksidan  yang  lebih  tinggi.  Enzim  sebagai  biokatalis  dapat digunakan dalam sintesis organik, karena kemampuannya yang spesifik.  Lakase  merupakan  salah  satu  enzim  yang  dapat  di- gunakan  dalam  sintesis  organik,  dengan  substrat  berasal  dari komponen aromatik (polifenol dan aminofenol). Sebagai enzim yang termasuk golongan oksidoreduktase, lakase dapat meng- oksidasi  komponen  aromatik  tersebut  dengan  mereduksi  satu molekul  oksigen  menjadi  dua  molekul  air  (Leite et  al .,  2003). Teh hijau diketahui memiliki aktivitas antioksidan, yang disebab- kan  oleh  kandungan  flavonoidnya.  Senyawa  polifenol  seperti flavonoid  merupakan  tipe  substrat  yang  dapat  digunakan  oleh lakase. Katekin merupakan senyawa flavonoid utama yang ter-
* Korespondensi Penulis : Email : tagor.siregar@uph.edu
dapat di dalam teh hijau. Berdasarkan strukturnya katekin ber- potensi  untuk  disintesis  menghasilkan  produk  baru  dengan kemampuan  antioksidan  yang  meningkat.  Penelitian  yang  di- lakukan Hosny dan Rosazza (2002) menunjukkan reaksi antara katekin dan lakase dapat membentuk variasi komponen produk polimer,  dimer,  dan  oligodimer.  Jamur  memiliki  kandungan mikronutrien  yang  lengkap,  yakni  vitamin  B1,  B2,  D,  niasin, serta  berbagai  unsur  mineral  yang  diperlukan  oleh  tubuh, seperti kalium, kalsium, natrium, dan magnesium sehingga baik untuk  dikonsumsi  (Henky,  2004).  Jamur  tiram  putih  ( Pleurotus ostreatus )  adalah  salah  satu  jamur  konsumsi  yang  mudah dikenali.  Hasil  penelitian  Henky  (2004),  Cahyana  (2005),  dan Leite et  al .  (2003)  menunjukkan  bahwa  jamur  tiram  putih mengandung lakase. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh  penambahan  lakase  dari  jamur  tiram  putih  terhadap aktivitas  antioksidan  teh  hijau.  Penambahan  lakase  yang  di- ekstrak  dari  jamur  tiram  putih  ke  dalam  substrat  (ekstrak  teh hijau)  diharapkan  akan  menghasilkan  produk  dengan  ke- mampuan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi. Selain itu, jenis pelarut  yang  digunakan  dalam  ekstraksi  teh  hijau  juga  akan dilihat  pengaruhnya  terhadap  karakteristik  dari  produk  baru yang dihasilkan.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  adalah jamur tiram putih segar ( Bionic Farm, Jakarta Raya), ekstrak teh hijau  bubuk  kering  (Nikken Foods  Company, St.  Louis,  USA),
akuades,  akuabides,  larutan  buffer  fosfat  0,2  M  (KH 2 PO 4 )  pH 6,0,  (NH 4 ) 2 SO 4 ,  pereaksi Folin  Ciocalteau p.a.,  metanol  teknis 80%, metanol p.a., larutan DPPH 0,2 mM, larutan Pyrocatechol 0,2  M,  AlCl 3 ,  CuSO 4 .5  H 2 O  0,5%, Bovine  Serum  Albumin , Na 2 CO 3 2%, NaOH 0,1 N, Na-K Tartarat p.a.
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  adalah  Hettich centrifuge EBA-20,  Turner  spektrofotometer  SP-830,  neraca analitik, Iishin freeze dryer , Hitachi Spektrofotometer UV-VIS U- 1800,  Knauer  HPLC, Agilent  Technologies 6890 Gas Chromatograph ,  5973 Mass  Selective Detector ,  dan Chem- station data system .
Isolasi  enzim  kasar  lakase  (modifikasi  Hernandez et al ., 2001)
Jamur  tiram  putih  segar  ditambahkan  0,2  M  larutan  buffer fosfat  pH  6,0  (1:2)  dalam  keadaan  dingin  (suhu  10°C), kemudian  dihancurkan  dengan  blender.  Homogenat  yang  di- peroleh  disaring  dengan  kertas  saring.  Filtrat  yang  diperoleh disentrifugasi  dengan  kecepatan  3500  rpm  selama  10  menit. Supernatan  yang  diperoleh  dipisahkan  dari  endapannya. Supernatan tersebut ditambahkan garam ammonium sulfat 50% (b/v) dan diaduk dengan stirrer selama 2 jam, kemudian larutan diendapkan  semalaman.  Endapan  yang  diperoleh  dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 20 menit pada  suhu  ruang  25°C.  Endapan  menyandang  enzim  lakase kemudian  disuspensikan  dalam  0,2  M  larutan  buffer  fosfat  pH 6,0.

## Penentuan aktivitas enzim lakase (Laela, 2005)
Aktivitas enzim lakase ditetapkan dengan mereaksikan hasil isolasi  enzim  kasar  lakase  dengan pyrocatechol .  Ke  dalam tabung reaksi ditambahkan 2 mL larutan buffer fosfat 0,2 M pH 6; 2,5 mL larutan pyrocatechol 0,2 M; 0,5 mL aquades, dan 0,5 mL  sampel  enzim.  Larutan  diinkubasi  selama  30  menit  pada suhu 30°C. Reaksi dihentikan dengan merendam tabung dalam air  mendidih  selama  3  menit.  Aktivitas  enzimatik  diukur  pada suhu  25°C  dengan  mengukur  absorbansinya  pada  panjang gelombang λ = 470 nm. Aktivitas spesifik enzim dapat dihitung berdasarkan Worthington Manual Enzym .
Aktivitas enzim (unit/mg) = A470 nm / menit 6,58 x mg / mL protein

## Persiapan substrat ekstrak teh hijau
Ekstrak  teh  hijau  dilarutkan  dalam  dua  jenis  pelarut,  yaitu metanol  80%  dan  air.  Substrat  yang  digunakan  untuk  pen- campuran  dengan  enzim  maupun  analisis,  dibuat  dalam  per- bandingan 1 gram ekstrak teh hijau: 100 mL pelarut.

## Penambahan enzim  lakase pada  substrat  ekstrak  teh hijau (modifikasi Hosny dan Rosazza, 2002)
Pencampuran  dengan  menambahkan  hasil  isolasi  enzim kasar  lakase  sebanyak  20  mL  pada  substrat  ekstrak  teh  hijau sebanyak  100  mL,  dilakukan  baik  dengan  pelarut  metanol maupun air. Pencampuran dalam suhu ruang 25°C dan dibiar- kan bereaksi selama 3 jam. Hasil yang diperoleh berupa filtrat dan  endapan,  dipisahkan  dengan  kertas  saring.  Filtrat  hasil pemisahan  langsung  dianalisis,  sedangkan  endapan  dikering-
kan  dahulu  dengan freeze  dryer .  Endapan  dari  substrat  teh hijau  baik  dengan  pelarut  metanol  maupun  air,  dilarutkan kembali dalam metanol 80% (1:100) untuk dianalisis.
Analisis total flavonoid (Huang et al ., 2005)
Ditimbang  2  gram  AlCl 3 lalu  dilarutkan  dalam  metanol  p.a. hingga volume mencapai 100 mL. Sebanyak 4 mL larutan AlCl 3 2% dimasukkan ke dalam kuvet dan ditambahkan 4 mL larutan sampel lalu dikocok. Pengukuran absorbansi dilakukan setelah inkubasi  selama  10  menit  pada  panjang  gelombang  367  nm. Blanko yang digunakan adalah 4 mL larutan AlCl 3 2% dengan 4 mL akuades.
Analisis free  radical  scavenging  activity (Amin  dan Lee, 2005) Larutan  sampel  sebanyak  0,2  mL  dicampur  dengan  1  mL larutan campuran 0,2 mM DPPH dengan metanol p.a. kemudian ditambahkan  metanol  6,8  mL.  Sampel  diaduk  dan  disimpan selama  30  menit,  setelah  itu  absorbansi  sampel  diukur  pada panjang  gelombang  λ  =  517  nm  dengan  larutan  kontrol  1  mL DPPH ditambahkan 7 mL metanol. Aktivitas radical scavenging dihitung  dengan  mengukur  perbedaan  absorbansi  dari  radikal DPPH menggunakan rumus:
Aktivitas radical scavenging (%) =
k s k A ) A - (A x 100 %
Keterangan : A s = absorbansi sampel; A k = absorbansi kontrol
Pengukuran absorbansi sampel dan kontrol dilakukan setiap 5 menit selama 30 menit.

## Analisis dengan spektrofotometer UV-VIS
Sampel  diencerkan  baik  dengan  pelarut  metanol  maupun air.  Sebanyak  3  ml  dimasukkan  ke  dalam  kuvet.  Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang antara 200-500 nm untuk melihat peak tertinggi.

## Analisis dengan GC-MS
Pengujian  dilakukan  menurut  metode  Balai  Penelitian Kesehatan  Daerah  DKI  Jakarta.  Sebanyak  5  μL  sampel  di- suntikan  ke  dalam  GC-MS.  Elektron  energi  sebesar  70eV, temperatur  suntikan  250°C,  temperatur  sumber  ion  230°C, temperatur interface 280°C, dan temperatur Quadrupole 140°C. Helium sebagai gas pembawa dengan aliran 0,9 μL/menit.

## Analisis data
Rancangan  percobaan  yang  digunakan  adalah  rancangan acak  lengkap  (RAL)  dua  faktor  dengan  perlakuan  2  x  3 sebanyak dua kali ulangan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Aktivitas enzim lakase
Hasil  perhitungan  berdasarkan Worthington  Manual Enzyme ,  maka  diperoleh  rata-rata  aktivitas  spesifik  enzim lakase dari hasil isolasi enzim kasar lakase adalah sebesar 0,54 unit/mg.

## Reaksi substrat ekstrak teh hijau dengan enzim lakase
Substrat  metanol  dan  substrat  air  adalah  substrat  ekstrak teh  hijau  dengan  dua  jenis  pelarut  yang  tanpa  penambahan enzim (awal). Substrat metanol berwarna hijau terang, sedang- kan  substrat  air  berwarna  hijau  gelap  cenderung  kecoklatan. Pencampuran  substrat  dari  dua  jenis  pelarut  dengan  enzim lakase  diperoleh  massa  atau  endapan  yang  berwarna  putih seperti  yang  tampak  pada  Gambar  1  dan  Gambar  2,  dimana endapan yang diperoleh merupakan hasil reaksi antara substrat dengan enzim lakase.
Gambar 1. Hasil reaksi substrat metanol dengan enzim lakase
Gambar 2. Hasil reaksi substrat air dengan enzim lakase
Hasil  pencampuran  antara  substrat  dengan  enzim  lakase seperti terlihat pada Gambar 1 dan 2 dipisahkan hingga meng- hasilkan filtrat dan endapan, kemudian dilakukan analisis kimia terhadap  kedua  produk  tersebut.  Substrat  ekstrak  teh  hijau pelarut  metanol  disebut  filtrat  metanol  dan  endapan  metanol, sedangkan substrat ekstrak teh hijau pelarut air disebut filtrat air dan endapan air. Pencampuran menghasilkan endapan metanol yang lebih putih dan lebih banyak untuk dianalisis, sedangkan endapan  air  lebih  coklat  dan  sangat  sedikit.  Dari  1  g  substrat ekstrak  teh  hijau  menghasilkan  sebanyak  0,4  g  endapan  hasil freeze  drying .  Endapan  tersebut  mempunyai  tingkat  kelarutan yang  rendah  terhadap  pelarut  semula  sehingga  campuran tersebut menjadi keruh.
Kekeruhan  pada  endapan  tersebut  terjadi  karena  enzim dapat  memanfaatkan  ekstrak  teh  hijau  sebagai  substrat. Menurut Riva (2006), enzim lakase dapat bereaksi dengan baik terhadap substrat yang mempunyai senyawa fenolik dan amina. Reaksi yang terjadi dengan substrat menyebabkan enzim mem- peroleh limpahan elektron dari kopling reaksi oksidasi yang ber- fungsi  mengembalikan  bentuk  semula  enzim  lakase  tersebut setelah  mereduksi  oksigen  menjadi  air.  Akibat  dari  limpahan elektron  tersebut,  substrat  yang  mempunyai  struktur  fenolik yaitu  katekin  akan  teroksidasi  dan  mengalami  resonansi  pada struktur  aromatik  yang  dimilikinya  dan  selanjutnya  akan  saling menstabilkan  diri  dengan  membentuk  ikatan  karbon-karbon yang akan menghasilkan senyawa baru dengan sifat fisik yang berbeda dari substrat awalnya.

## Total flavonoid
Pengukuran  total  flavonoid  sampel  didasarkan  bahwa senyawa  antioksidan  utama  dalam  teh  hijau  adalah  senyawa
katekin  yang  merupakan  senyawa  fenolik  dalam  bentuk flavonoid. Hasil pengukuran total flavonoid content dapat dilihat pada  Gambar  3.  Hasil  uji  statistik  menunjukkan  total  flavonoid dipengaruhi  oleh  jenis  pelarut  dan  ada  tidaknya  penambahan enzim  (p<0,05),  tetapi  tidak  ada  interaksi  antara  faktor  jenis pelarut  dan  faktor  ada  tidaknya  penambahan  enzim.  Pada sampel substrat dan endapan baik dengan pelarut metanol dan pelarut  air  tidak  ada  perbedaan  yang  signifikan,  sedangkan pada uji statistik antara sampel filtrat metanol dengan filtrat air berbeda  nyata.  Hal  ini  disebabkan  pada  dasarnya  flavonoid dapat  larut  dalam  pelarut  metanol  maupun  air  (Shahidi  dan Naczk,  1995),  tetapi  dalam  beberapa  hasil  penelitian  seperti Pourmorad et  al. (2006),  untuk  mengidentifikasi  total  flavonoid dengan  pelarut  metanol  mempunyai  nilai  yang  lebih  tinggi  di- bandingkan  dengan  pelarut  air.  Pelarut  metanol  (CH 3 )  yang memiliki atom karbon lebih mampu menarik senyawa flavonoid dengan  membentuk  lebih  banyak  ikatan  antar  karbon,  bila  di- bandingkan dengan pelarut air (H 2 O) yang tidak memiliki atom karbon.
Endapan  yang  diperoleh  sebagai  hasil  reaksi  antara substrat  ekstrak  teh  hijau  dengan  enzim  lakase  menunjukkan total  flavonoid  yang  lebih  besar  dari  filtrat  maupun  substrat awalnya. Hal ini berarti aktivitas enzim lakase dapat memanfaat- kan  substrat  sehingga  terjadi  polimerisasi  senyawa  flavonoid seperti dimer, oligodimer, polimer yang tidak larut air. Senyawa flavonoid dari substrat berpindah ke endapan dan menghasilkan total flavonoid yang lebih tinggi. Dengan demikian dapat dikata- kan  bahwa  penambahan  enzim  lakase  terhadap  substrat  teh hijau  dapat  meningkatkan  total  flavonoid  pada  endapan  dan menghasilkan  total  flavonoid  yang  lebih  tinggi  pada  pelarut metanol.
Keterangan:  Angka-angka  yang  diikuti  huruf  yang berbeda  menunjukkan berbeda nyata (p<0,05)
Gambar 3. Hasil analisa total flavonoid

## Aktivitas antioksidan
Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode radical  scavenging DPPH  (1,1- difenil -2- pikrilhidrazil ).  Semakin besar  konsentrasi  sampel  maka  semakin  berwarna  kuning  ke- emasan,  warna  yang  terbentuk  dianalisis  dengan  spektrofoto- meter pada panjang gelombang 517 nm. Kemampuan aktivitas antioksidan  selanjutnya  dihitung  sebagai  IC 50 yang  diperoleh dengan  cara  membandingkan  absorbansi  radikal  bebas sebelum dan setelah direaksikan dengan antioksidan yang ter- dapat dalam sampel untuk setiap konsentrasi.
0.35 Substrat Filtrat Endapan 0.17  c 0.20  c a 0.12 b 0.28  d 0.30  d 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Metanol Air Jenis Pelarut To ta l F la vo no id (%) 0.06 Endapan Hasil Raksi Endapan Hasil Raksi
Gambar  4.  menunjukkan    nilai  IC 50 setiap  sampel  uji.  Nilai IC 50 menunjukkan  konsentrasi  antioksidan  (mg/mL)  yang dibutuhkan  untuk  mampu  menghambat  50%  radikal  bebas. Semakin  rendah  nilai  IC 50 maka  konsentrasi  antioksidan  yang dibutuhkan  untuk  menghambat  50%  radikal  bebas  semakin rendah,  dengan  demikian  aktivitas  antioksidannya  semakin tinggi.

## Keterangan:  Angka-angka  yang  diikuti  huruf  berbeda  menunjukkan  berbeda nyata (p<0,05)
Gambar 4. Aktivitas antioksidan dari sampel uji
Berdasarkan uji statistik, jenis pelarut dan sampel sebelum maupun sesudah bereaksi dengan enzim berpengaruh terhadap nilai  IC 50 ini.  Interaksi  diantara  dua  faktor  tersebut  juga  ber- pengaruh, tetapi setelah dilakukan uji lanjutan dengan one way anova ,  nilai  IC 50 setiap  sampel  berbeda  secara  signifikan. Secara  umum  sampel  substrat  metanol  dan  hasil  reaksinya yaitu filtrat metanol dan endapan metanol mempunyai nilai IC 50 yang lebih rendah bila dibandingkan dengan sampel dari pelarut air.  Jika  dibandingkan  nilai  IC 50 substrat  metanol  dan  substrat air (tanpa penambahan enzim) dengan nilai IC 50 filtrat metanol dan filtrat air (hasil reaksi dengan enzim lakase), nilai IC 50 filtrat metanol dan filtrat air lebih besar. Hal ini menunjukkan  bahwa kemampuan  antioksidan  untuk  menangkap  radikal  bebas sampel tanpa penambahan enzim lebih tinggi secara keseluruh- an dibandingkan sampel filtrat. Dalam filtrat hasil reaksi dengan enzim  lakase  hanya  terdapat  sejumlah  kecil  senyawa  fenolik sehingga saat diuji aktivitas antioksidannya lebih rendah.
Pada reaksi substrat ekstrak teh hijau dengan enzim lakase, katekin  dari  teh  hijau  kemungkinan  mengalami  oksidasi,  dan radikal-radikal  fenolik  yang  terbentuk  saling  bergabung  dan menambah  berat  molekul  yang  mengakibatkan  timbulnya endapan. Senyawa-senyawa fenolik baru yang dihasilkan lebih banyak terdapat pada endapan  (Hernandez et al ., 2001). Nilai IC 50 untuk  endapan  mempunyai  nilai  paling  rendah  secara keseluruhan  bila  dibandingkan  dengan  filtrat  maupun  substrat awalnya. Hal ini menandakan bahwa aktivitas antioksidan pada endapan  metanol  maupun  endapan  air  jauh  lebih  tinggi  jika dibandingkan  dengan  substrat  ekstrak  teh  hijau  tanpa  penam- bahan  enzim  lakase,  terlebih  lagi  jika  dibandingkan  dengan filtratnya.

## Korelasi  antara  total  flavonoid  dan  aktivitas  anti- oksidan
Total  flavonoid  dan  aktivitas  antioksidan  mempunyai korelasi  yang  positif,  ditunjukkan  dengan  semakin  tinggi  kan-
dungan  flavonoid  maka  semakin  tinggi  pula  aktivitas  anti- oksidannya.  Gambar  5  menunjukkan  korelasi  positif  baik  pada pelarut  metanol  maupun  pelarut  air,  tetapi  substrat  dengan pelarut  metanol  mempunyai  nilai  yang  lebih  tinggi  bila  di- bandingkan  dengan  pelarut  air.  Dalam  grafik  korelasi  tersebut filtrat  mempunyai  total  flavonoid  dan  aktivitas  antioksidan  te- rendah  (titik  paling  kiri),  substrat  awal  pada  titik  tengah,  dan endapan  mempunyai  total  flavonoid  dan  aktivitas  antioksidan tertinggi (titik paling kanan).
Gambar 5. Korelasi antara total flavonoid dengan aktivitas antioksidan

## Spektrofotometer UV-Vis
Substrat  awal  metanol  sebelum  penambahan  enzim  mem- punyai tiga komponen yang terdeteksi pada panjang gelombang 401 nm, 273 nm, dan 207 nm dengan grafik yang dapat dilihat pada Gambar 6. Setelah dibandingkan dengan produknya, yaitu filtrat  metanol  pada  Gambar  7  dan  endapan  metanol  pada Gambar  8,  komponen  yang  terbentuk  menjadi  lebih  banyak dengan nilai panjang gelombang yang lebih tinggi dan berbeda- beda.  Filtrat  metanol  mempunyai  bentuk  grafik  lebih  rendah dengan komponen pada panjang gelombang 402 nm, 316 nm, 271  nm,  dan  209  nm,  sedangkan  komponen  yang  terdeteksi pada endapannya mempunyai bentuk grafik lebih tinggi dengan panjang gelombang 496 nm, 382 nm, 272,5 nm, dan 205 nm.
Gambar 6. Hasil spektrofotometer UV-Vis substrat methanol
70 75 80 85 90 95 100 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Total Flavonoid (%) Ak tiv ita s An tio ks id an (%) Pelarut Metanol Pelarut Air 2.53 c 3.57 d
3.97  e
5.71  f 1.55 a 1.81 b 0 1 2 3 4 5 6 Metanol Air Jenis Pelarut IC 5 0 (m g/ m L) Substrat Filtrat Endapan 500nm ABS 1 0 200 ABS 1 0 200 500nm
Secara  keseluruhan,  hasil  endapannya  mempunyai  bentuk grafik tertinggi bila dibandingkan dengan substrat awal maupun filtratnya,  demikian  halnya  dengan  nilai  panjang  gelombang yang  dicapai  oleh  komponen  yang  terkandung.  Hasil  antar endapan  dibandingkan  dan  dapat  dilihat  pada  Gambar  8  dan Gambar 9.
Gambar 8. Hasil spektrofotometer UV-Vis endapan metanol
Gambar 9. Hasil spektrofotometer UV-Vis endapan air
Pada  endapan,  grafik  yang  terbentuk  sedikit  lebih  tinggi daripada  endapan  metanol,  dan  terdeteksi  komponen  pada panjang  gelombang  467  nm,  273  nm,  dan  207  nm.  Dengan panjang  gelombang  diantara  keduanya  berbeda,  jenis komponen  yang  ada  dalam  endapan  mempunyai  kandungan kimia  yang  berbeda.  Hal  ini  berarti  perbedaan  jenis  pelarut antara metanol dan air berpengaruh terhadap kandungan kimia yang  terbentuk.  Senyawa  fenolik  pada  umumnya  mempunyai serapan  pada  panjang  gelombang  280  nm  (Cheong et  al., 2005). Keseluruhan hasil sampel dengan spektrofotometer UV- vis  ini  terdeteksi  komponen  dengan  panjang  gelombang  yang mendekati 280 nm, yang berarti mempunyai komponen fenolik. Hal  ini  sesuai  dengan  hasil  penelitian  bahwa  semua  sampel mempunyai  aktivitas  antioksidan  yang  diduga  dari  komponen fenolik.
Gas chromatography – mass spectrophotometric Pada  substrat  awal  difokuskan  komponen  dengan  berat molekul  284  pada  menit  ke  31,52,  karena  berat  molekul tersebut  yang  paling  mendekati  berat  molekul  katekin  dengan struktur epicatechin (EC)  yang  mempunyai  berat  molekul  290 (Hosny  dan  Rosazza,  2002).  Hasil  analisis  GC-MS  substrat awal  (metanol)  dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Umumnya  pada menit ke-23 hingga menit ke-40 terdeteksi berbagai komponen. Kafein  juga  terdeteksi  pada  menit  ke-23,12  dengan  berat molekul 194. Hasil analisis GC-MS substrat awal dibandingkan dengan  produk  hasil  penambahan  enzim  lakase,  yaitu  filtrat pada Tabel 2 dan endapan pada Tabel 3. Dengan melihat tinggi
rendahnya peak ,  terjadi  perubahan peak pada  filtrat  maupun endapan yang dilihat pada range menit ke-23 hingga menit ke- 40.  Filtrat  mempunyai peak yang  cenderung  menurun  dari substratnya,  sedangkan  endapan  berbanding  sebaliknya  yaitu mempunyai peak yang lebih banyak dan lebih tinggi.
Tabel 1. Hasil analisis GC-MS substrat metanol Waktu (menit) m/z Abundance (%) 23 – 30 109 24 137 2 194 40 30 – 40 213 6 255 7 284 55 Tabel 2. Hasil analisis GC-MS filtrat metanol Waktu (menit) m/z Abundance (%) 23 – 35 109 10 194 20 35 – 40 251 14 376 7 165 9 430 4 Tabel 3. Hasil analisis GC-MS endapan metanol Waktu (menit) m/z Abundance (%) 23 – 34 109 13 194 28 34 – 40 253 13 394 7 401 4 535 1 595 1
Berat  molekul  yang  diharapkan  bila  terjadi  dimerisasi katekin  yaitu  sebesar  580  atau  lebih.  Berdasarkan  hasil penelitian  Hosny  dan  Rosazza  (2002),  endapan  hasil  reaksi katekin  dengan  enzim  lakase  menghasilkan  struktur  molekul dengan  berat  molekul  sebesar  399,  sedangkan  dengan  enzim peroksidase  dapat  menghasilkan  berat  molekul  576  dan  611. Dengan  demikian  berat  molekul  hasil  filtrat  dan  endapan difokuskan  yang  mendekati  berat  molekul  tersebut.  Berat molekul  terbesar  dalam  komponen  di  filtrat  metanol  yaitu  376 dan 430, sedangkan berat molekul terbesar dalam komponen di endapan  metanol  yaitu  394,  401,  535,  dan  595. Nilai  berat molekul  376  dan  430  kurang  sesuai  bila  terjadi  dimerisasi katekin,  hal  ini  kemungkinan  memang  tidak  terjadi  dimerisasi pada filtrat melainkan terjadi pada endapannya.
Tabel 4. Hasil analisis GC-MS endapan air Waktu (menit) m/z Abundance (%) 23 – 35 109 9 194 17 35 – 40 251 10 394 7 396 1
408 1
ABS 1 0 200 500nm ABS 1 0 200 500nm
Berat  molekul  pada  endapan  paling  mendekati  teori,  yaitu katekin  dengan  berat  290  mengalami  perubahan  struktur sehingga  mempunyai  berat  molekul  sebesar  399  (Hosny  dan Rosazza, 2002). Hasil  penelitian yang telah dilakukan substrat awal  dengan  berat  molekul  284  menit  ke-31,52  mengalami perubahan  menjadi  394  pada  menit  ke-39,  diduga  terjadi perubahan struktur molekul seperti pada Gambar 10.
Gambar  10.      Perubahan  struktur  dari  reaksi  antara  katekin  dengan enzim lakase (Hosny dan Rosazza, 2002).
Pada  endapan  air  mempunyai  komponen  dengan  berat molekul 394 menit ke-35, 396 menit ke-36,44, dan 408. Dalam endapan metanol mempunyai berat molekul yang terbesar 595, sedangkan  dalam  endapan  air  hanya  mencapai  berat  molekul 408.  Hal  ini  berarti  endapan  metanol  mengalami  penambahan berat  molekul  lebih  banyak  daripada  endapan  air.  Namun komponen  dengan  berat  molekul  394  juga  dimiliki  kedua endapan, berarti dalam kedua endapan ini terjadi proses peng- gabungan senyawa sehingga terjadi perubahan struktur molekul dan menjadi produk dimer.

## KESIMPULAN
Jamur tiram putih ( Pleurotus ostreatus ) yang dimanfaatkan sebagai  sumber  enzim  kasar  lakase  mempunyai  aktivitas spesifik  sebesar  0,54  Unit/mg  protein.  Enzim  lakase  yang  di- ekstrak dari jamur tiram putih mampu bereaksi dengan substrat ekstrak  teh  hijau.  Bila  dibandingkan  dengan  substrat  awal (sebelum  ditambah  enzim  lakase),  hasil  analisis  terhadap endapan  menunjukkan  peningkatan  total  flavonoid,  aktivitas antioksidan  dan  berat  molekul.  Korelasi  positif  terjadi  antara total flavonoid dengan aktivitas antioksidan, semakin tinggi total flavonoid  maka  semakin  tinggi  pula  aktivitas  antioksidannya. Secara  keseluruhan  sampel  dengan  pelarut  metanol  mem- punyai nilai total flavonoid dan aktivitas antioksidan lebih besar daripada  seluruh  sampel  dengan  pelarut  air,  demikian  juga halnya  pada  korelasi  positif  antara  total  flavonoid  dengan aktivitas antioksidan menunjukkan pelarut metanol memiliki nilai
yang  lebih  tinggi  daripada  pelarut  air.  Berdasarkan  hasil  uji kualitatif  dengan  spektrofotometer  UV-vis,  dan  GC-MS  terlihat adanya komponen baru dalam endapan. Hasil analisis spektro- fotometer  UV-vis  menunjukan  bahwa  seluruh  sampel  mengan- dung  komponen  fenolik  yang  berasal  dari  katekin.  Dengan penambahan  enzim  terjadi  perubahan  berat  molekul  dari  284 menjadi 394. Komponen-komponen baru dengan berat molekul yang  besar  pada  endapan  menunjukkan  terjadinya  perubahan struktur katekin.

## DAFTAR PUSTAKA
Amin  I,  Lee  WY.  2005.  Effect  of  different  blanching  times  on antioxidant properties in  selected cruciferous vegetables.  J of The Sci of Food and Agric 85: 2314-2320.
Cahyana AH. 2005. Studi  awal  pemanfaatan jamur tiram putih ( Pleurotus  ostreatus )  sebagai  biokatalis  pembentukan senyawa antioksidan. J Ilmu dan Teknol Pangan 3: 1-8.
Cheong  WJ,  Park  MH,  Kang  GW,  Ko  JH,  Seo  YJ.  2005.
Determination  of  catechin  compounds  in  korean  green  tea infusions  under  various  extraction  conditions  by  high performance  liquid  chromatography.  J  Bull  Korean  Chem Soc 26: 747-754.
Henky  I.  2004.  Teknologi  bioproses  pembibitan  dan  produksi jamur  tiram  untuk  peningkatan  nilai  tambah.  Prosiding Seminar Nasional Untuk Negeri 2: 123-126.
Hernandez  MRT,  Munguia  AL,  Ramirez  RO.  2001.  Residual compost of agaricus bisporus a source of crude laccase for enzymatic  oxidation  of  phenolic  compounds.  J  Process Biochem 36: 635-639.
Hosny M, Rosazza JPN. 2002. Novel oxidations of (+)-catechin by horseradish peroxidase and laccase. J of Agric and Food Chem 50: 5539-5545.
Huang  D,  Ou  B,  Prior  RL.  2005.  The  chemistry  behind antioxidant capacity assays. J of Agric and Food Chem 53: 1841-1856.
Laela  N.  2005.  Produksi  Senyawa  Bioaktif  Fenolik  Meng- gunakan  Enzim  Lakase  Hasil  Isolasi  Media  Jamur  Tiram Putih  ( Pleurotus  ostreatus ).  Karya  Utama  Sarjana  Kimia. FMIPA-UI.
Leite OD, Orlando Fatibello F, Aneli de MB. 2003. Determination of  catecholamines  in  pharmaceutical  formulations  using  a biosensor  modified  with  a  crude  extract  of  fungi  laccase ( Pleurotus ostreatus ). J of The  Brazilian Chemical Soc 14: 1-12.
Pourmorad  F,  Hosseinimehr  SJ,  Shahabimajd  N.  2006. Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants. African J of Biotechnol 5: 1142-1145.
Riva  S.  2006.  Laccases:  blue  enzymes  for  green  chemistry. Review Trends in Biotechnol 24: 219-225.
Shahidi F, Naczk M. 1995. Food Phenolics Sources Chemistry Effects  Application.  Tenchnomic  Publishing  Co.  Inc., Lancaster.