J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 27(1): 87-94 Th. 2016 ISSN: 1979-7788 Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012

## PURIFIKASI  DAN  PROFIL  PROTEIN OVOTRANSFERRIN DARI EGGSHELL MEMBRANE TELUR  AYAM  RAS  DAN  BURAS

## [Purification and Protein Analysis of Ovotransferrin  from  Eggshell Membrane of Local Indonesia and Leghorn Hens]
Risa Fazriyati Siregar 1) , Ahmad Ni’matullah Al–Baarri 2) *, Antonius Hintono 2) , Yoyok  Budi Pramono 2) , dan Setya Budi Muhammad Abduh 2)
1) Program Studi Magister Ilmu Ternak, Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro, Semarang
2) Program Studi Teknologi Pangan, Fakultas Peternakan dan Pertanian Universitas Diponegoro, Semarang
Diterima 14 Maret 2016 / Disetujui 19 Juni 2016

## ABSTRACT
Eggs consumption in Indonesia increases every year resulting in egg shell waste. In addition, the functional components including ovotransferrin existing in this waste has not b een yet studied well. This research has b een done to explore ovotransferrin in egg shell membrane from local Indonesia and leghorn hens.  The  ion  exchange  chromatography  using  SP-Sepharose  Fast  Flow  was  used  to  purify  the ovotransferrin  from  egg  shell  memb rane.  The  fractions  from  salt  elution  were  analyzed  for  protein concentration and protein profile using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS - PAGE). The result showed that the b est concentration of salt elution to ob tain ovotransferrin was 0.1 mM NaCl since the single b and was detected among other fractions. The ovotransferrin concentration (%) per single egg was also calculated as much as 0.75 ±0.017 and 0.16±0.005 for leghorn dan local Indonesia hen, respectively. This result may provide the b eneficial information to purify ovotransferrin from egg shell memb rane which conceivab ly as a food preservative agent.
Keywords: eggshell memb rane, layer, native Indonesia hen, ovotransferrin, protein profile

## ABSTRAK
Konsumsi  telur  di  Indonesia  mengalami  peningkatan  setiap  tahunnya  yang  mengakibatkan banyaknya limbah kerabang telur yang dihasilkan.  Bagian dalam membran cangkang telur merupakan komponen yang belum banyak dimanfaatkan untuk kepentingan pangan padahal di dalamnya terkandung protein  fungsional ovotransferrin .  Tujuan  penelitian  ini  adalah  memurnikan  (purifikasi)  komponen ovotransferrin dari membran cangkang telur ayam ras dan buras serta menganalisisnya. Ovotransferrin dipurifikasi melalui metode ion exchange chromatography dengan resin SP Sepharose Fast Flow . Profil protein dari fraksi-fraksi hasil elusi yang sudah didapat dianalisis dengan SDS - PAGE. Hasil elusi yang terbaik untuk purifikasi ovotransferrin ini adalah dengan menggunakan elusi dengan larutan  0,1 mM NaCl karena  terbukti  telah  berhasil  mengeliminasi  protein  lain.  Berdasarkan  perhitungan  jumlah  protein didapatkan hasil bahwa membran cangkang telur ayam ras dan buras mengandung ovotransferrin masing- masing  sebesar  0,75±0,017  dan  0,16±0,005%.  Kebe rhasilan  purifikasi ovotransferrin dari  membran cangkang  kulit  telur diharapkan  dapat  membuka  peluang pemanfaatan ovotransferrin untuk berbagai keperluan, misalnya sebagai senyawa antibakteri yang aman untuk pangan.
Kata kunci: buras, membran cangkang kulit telur, ovotransferrin , profil protein, ras

## PENDAHULUAN
1
Telur  merupakan  salah  satu  bahan  pangan yang  selain  berfungsi  sebagai  sumber  protein,  juga telah  dikenal  sifat  fungsionalnya  sebagai  agen  untuk daya  buih  pengemulsi,  serta  pembuat  gel  (Ayadi et
*Penulis Korespondensi: E-mail:  albari@undip.ac.id
al., 2008).  Telur  buras  dan  ras  merupakan  telur  yang dominan  dikonsumsi  oleh  masyarakat.  Tidak  ter- dapat  perbedaan  yang  mencolok  antara  nutrisi  telur ayam  buras  dan  ras  namun  demikian  telur  ayam  ras lebih  banyak  dijumpai  di pasar.
Kandungan  protein  yang  terdapat  pada  telur, selain  memberikan  nilai  nutrisi  yang  tinggi,  juga memiliki  sifat  fungsional  sebagai  antimikroba  yang dapat  diaplikasikan  pada  makanan  dan  obat-obatan,
seperti imunoglobulin  avidin , ovotransferrin ,  dan lisozim  (Stadelman,  2000;  Charter  dan  Lagarde, 2014).  Kandungan  perotein  tersebut,  tidak  hanya terdapat  pada  albumin  dan  kuning  telur  namun  juga terdapat  pada  membran  telur  yang  merupakan lapisan  bagian  dalam  dari  cangkang  telur  dan merupakan  bagian  terkecil  dari  struktur  telur  utuh yaitu  sekitar  10%  dari  berat  telur  (Kamkum et  al., 2015).  Oleh  karena  kerabang  telur  kaya  akan mineral  seperti  kalsium  karbonat,  kalsium  fosfat, magnesium  karbonat  (Kamkum et  al., 2015), kerabang  telur  banyak  diaplikasikan  untuk  industri pupuk  dan  pakan  ternak,  pengisi  dalam  polimer, agen  untuk  menyerap  logam  berat  seperti  Cu,  Cr, dan  Cd  (Kamkum et  al., 2015).  Namun  demikian, pemanfaatan  membran  bagian  dalam  cangkang telur, belum  tereksporasi  dengan  baik.
Membran  kerabang  telur,  merupakan  bagian terkecil  dari  kerabang  telur  yang  memiliki  berat sekitar  5%  dari  berat  kerabang  dan  tersusun  dari kalsium  karbonat  dan  matriks  organik  (sekitar  3,5%) yang  terdiri  dari  glikoprotein,  proteoglikan  (Soekarto, 2013)  glikosaminoglikan  seperti  dermatan  sulfat  dan kondroitin  sulfat,  glikoprotein  sulfat  termasuk hexo- samines (Ruff et  al., 2009).  Membran  kerabang  telur mengandung  beberapa  protein  yaitu  lisozim, ovo- transferrin ,  desmozine,  ovalbumin,  ovocalyxin –36, dan  isodesmozine.  Protein ovotransferrin dan  liso- zim  memiliki  fungsi  sebagai  agen  antibakteri  (Wu dan  Alexandra,  2012;  Balaz,  2014).  Selain  sebagai antibakteri ovotransferrin juga merupakan pe- ngangkut  ( transporter )  besi  untuk  embrio  yang sedang  berkembang  (Wu  dan  Alexandra,  2012). Ovotransferrin termasuk  dalam  golongan  protein utama  dalam  putih  telur  (12%  dari  putih  telur)  dan memiliki  berat  molekul  sebesar  78  kDa  (Hinckea et al., 2008),  serta  banyak  dijumpai  dalam  membran kerabang  telur  yang  memiliki  fungsi  utama  sebagai agen  antibakteri  (Ko et  al., 2008). Ovotransferrin sebagai  antibakteri  masih  belum  banyak  dimanfaat - kan  dalam  bidang  pangan  tetapi  sudah  terbukti dapat  membunuh  bakteri  seperti Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus (Varon et al., 2013). Mekanisme ovotransferrin sebagai  antibakteri adalah  keberadaan  komponen  glikoprotein  yang  me- ngikat  Fe  dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri sehingga membatasi ketersediaan Fe melalui khelasi  dengan  membentuk ovotransferrin Fe  jenuh (holo ovotransferrin )  (Varon et  al., 2013). Ovotrans- ferrin berperan  sebagai  agen  antimikroba  terhadap Escherichia  coli , Staphylococcus  aureus (Varon et al., 2013;  Ibrahim,  2000) Pseudomonas  sp  dan Salmonella  mutans (Wu dan  Alexandra,  2012). Kadar ovotransferrin tinggi  ketika  terjadi  ovulasi pada  unggas.  Ovulasi  merupakan  pelepasan  telur dari  ovarium.  Pada  tahap  ini ovotransferrin berfugsi
untuk  melindungi  kuning  telur  yang  merupakan bakal  embrio  dari  serangan  mikroorganisme.  Pada unggas ovotransferin terdapat  pada  bagian  saluran telur,  setelah  telur  lepas  dari  ovarium  maka ovo- transferrin disimpan pada albumin telur dan berfungsi  sebagai  agen  anti  bakterisida.  Kandungan ovotransferrin pada  putih  telur  sebanyak  13%  (Wu dan  Alexandra,  2012).  Faktor  utama  yang  mem- pengaruhi ovotransferrin adalah pakan yang memenuhi  kebutuhan  nutrisi  ayam.  Kecukupan kebutuhan  nutrisi  mendukung  kesehatan  ayam, sehingga  berdampak  pada  produksi ovotransferrin yang  tinggi  sebagai  salah  satu  bagian  proses pembentukan  telur.  Pakan  sangat  berpengaruh terhadap  produktivitas  telur,  tingkat  kontaminasi mikroba  patogen  yang  rendah,  serta  membentuk kandungan  protein  dan  β  karoten  (Urip et  al., 2008). membran  cangkang  telur mempunyai  potensi  untuk dikembangkan sebagai Generally  Recognized  As Safe (GRAS)  (Ko et  al., 2008),  terutama  dalam pengawetan  pangan.  Hingga  saat  ini  belum  banyak langkah  aplikatif  untuk  memurnikan ovotransferrin dari  membran  cangkang  telur.  Penelitian  ini  ber- tujuan  untuk  melakukan  upaya  purifikasi ovotrans- ferrin dari membran  cangkang  telur menggunakan metode ion  exchange  chromatography. Penelitian  ini sangat  bermanfaat  dalam  memberikan  informasi tentang  cara  purifikasi ovotransferrin dari  membran cangkang  telur  yang  kelak  dapat  digunakan  secara luas di bidang  pengawetan  pangan.

## BAHAN  DAN METODE

## Bahan
Telur  sebagai  sampel  penelitian  didapat  dari peternakan  ayam  ras  dan  ayam  buras  di  Kelurahan Mijen,  Semarang.  Penelitian  ini  dilakukan  mulai bulan  Februari –September  2015  dan  dilakukan  di Laboratorium  Kimia  dan  Gizi  Pangan,  Program  Studi Teknologi  Pangan,  Fakultas  Peternakan  dan  Perta- nian  Universitas  Diponegoro  serta  Laboratorium Terpadu,  Universitas  Diponegoro.  Telur  yang  di- gunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  telur  ayam  ras dan  ayam  buras  segar  yang  didapatkan  pada  pagi hari  dengan  berat  masing-masing  sebesar  60±4,3 dan  45±6,7  g.  Telur  ayam  ras  dan  buras  yang digunakan  masing –masing  sebanyak  2 kg terdiri dari 40  butir  telur  ayam  ras  dan  50  butir  telur  ayam buras.  Membran  cangkang  telur  langsung  segera dipisahkan  dari  telur  dan  dikumpulkan  menjadi  satu, disimpan  dalam  refrigerator  bersuhu  4±2°C  mak- simal  24  jam.  Proses  pemisahan  membran  dari kerabang  telur  dilakukan  secara  manual  tanpa adanya  penambahan  bahan  kimia.
Pemurnian ovotransferrin dari  membran kera- bang
Protein ovotransferrin dari dimurnikan  meng- gunakan  modifikasi  metode  dari  penelitian  Naknu- kool et  al. (2009).  Hal  yang  dimodifikasi  adalah penambahan  0,01  mM  HCl  untuk  menurunkan  pH membrane dan  penggunaan  larutan  pencuci  resin. Membrane yang  sudah  didapat  dari  2  kg  telur, kemudian  dipotong  menjadi  bagian  kecil  dengan ukuran  mendekati  0,5  x  0,5  cm 2 dengan  mengguna- kan  alat  berupa  gunting,  yang  selanjutnya  direndam di  dalam  0,05  mM sodium-phosphate  buffer (PB)  pH 7,5  dibuat  dari  NaH 2 PO 4 .H 2 O  dan  NaHPO 4 (Hime- dia,  India).  Campuran  tersebut  kemudian  diaduk dengan Ultra  Turax  Homogenizer (IKA ® T25)  yang berkecepatan  6000  x  g    Nilai  pH  campuran  diturun- kan  menjadi  6,0  dengan  penambahan  0,01  mM  HCl (Panreuc  Quimica  SAU,  Barcelona)  secara  ber- tahap.  Campuran  disentrifugasi  (HETTICH  EBA  20, Germany)  pada  kecepatan  6000  x  g    selama  15 menit.  Selanjutnya  supernatan  dialirkan  melalui kolom  vertikal  terbuka  dengan  diameter  5  cm  yang telah  diisi  10  g  resin SP-Sepharose  Fast  Flow (GE Healthcare  Bio-Science  AB,  Sweeden,  Lot number 10081054).  Resin  ini  terlebih  dahulu  dibersihkan  dari sisa  komponen  yang  tidak  diinginkan  dengan  cara dialiri  10  mM  PB  pH  7,0  sebanyak  300  mL.  Setelah campuran  membran dalam  PB  dimasukkan  ke dalam  kolom  secara  perlahan,  lalu  secara  berurutan, kolom  dialiri  dengan  10  mM  PB  pH  7,0 yang masing- masing  mengandung  0,1;  0,3;  dan  0,5  mM  NaCl (Merck,  Germany).  Volume  setiap  konsentrasi  yang dialirkan  adalah  sebanyak  30  mL  dan  hasil  elusi kemudian  ditampung  ke  dalam  tabung  ultrasentrifus (Biologix,  China)  berukuran  15  mL  (sebanyak  10  mL per  tabung).  Larutan  yang  telah  ditampung  kemu- dian  disimpan  di  dalam refrigerator dengan  suhu 6°C  dan  langsung  digunakan  untuk  penelitian  tahap selanjutnya.

## Analisis  kualitatif kadar protein
Analisis kualitatif kadar protein dilakukan dengan  menggunakan  spektrofotometer  (UV  Mini Shimadzu,  China)  pada  panjang  gelombang  280 nm.  Analisis  kadar  protein  dengan  spektrofotometri pada  panjang  gelombang  280  nm  ini  dilakukan dengan  menuangkan  3  mL  fraksi  hasil  elusi  dari kromatografi  kolom  terbuka  ke  dalam cuvette dan langsung diukur absorbannya segera setelah cuvette dimasukkan  ke  dalam  spektrofotometer (Touch et  al. ,  2004).  Kadar  protein  sampel  dalam  %, diprediksi  menggunakan  rumus:
rotein
Keterangan: A280 :  Absorbansi pada panjang gelombang 280 nm
1,5
: Faktor koreksi protein

## Analisis  profil protein
Analisis  protein  menggunakan  elektroforesis (GE  Healthcare  Bio-Science  AB,  Sweeden).  Profil protein membran  kerabang  dianalisis  dengan  meng- gunakan sodium  dodecyl  sulfate  poly-acry-lamide gel  electrophoresis (SDS-PAGE).  Sampel  sebanyak 15  µL  dari  masing-masing  fraksi  dicampur  dengan SDS sample  buffer sebanyak  15  µL  dan mercap- toetanol (BioChemica,  Inggris)  sebanyak  3  µl  lalu sampel  dimasukkan  ke  dalam  air  mendidih  selama  2 menit.  Sampel  dimasukkan  ke  dalam  sumuran  gel sebanyak  15  µL  untuk  setiap  sumur  dan  perangkat elektroforesis dihubungkan dengan arus listrik bertegangan  60  V  12  mA  selama  6  jam.  Gel  dilepas dan  diwarnai  dengan  pewarna Coo-masie  Brilliant Blue (CBB)  selama  60  menit  lalu  dicuci  dengan larutan staining  CBB yang  terdiri  dari  asam  asetat (Merck,  Germany)  dan  alkohol  (MKR  Chemicals, Indonesia)  untuk mendapatkan band pada  gel.

## Analisis  kuantitatif kadar protein
Analisis kadar protein secara kuantitatif dilakukan berdasarkan metode Bradford . Pe- ngukuran  kadar  protein  dengan  metode Bradford terdiri  atas  dua  tahap.  Tahap  pertama  pembuatan larutan  kit  (kit Bradford )  yang  terdiri  dari  campuran 10  mg Brilliant  Blue (MKR  Chemicals,  Indonesia) dan  50  mL  ethanol  (Merck,  Germany).  Selanjutnya campuran  ini  dilarutkan  ke  dalam  100  Selanjutnya campuran  ini  dilarutkan  ke  dalam  100  mL  asam fosfat  (MKR  Chemical,  Indonesia).  Larutan  kit  ini kemudian  diencerkan  dengan  aquades  dengan perbandingan    1:2.  Tahap  kedua  adalah  meng- analisis  kadar  protein  sampel  dengan  cara  melarut- kan  100  µL  campuran  final  dengan  3  mL Kit Bradford .  Setelah  dibiarkan  selama  2  menit,  selisih absorbansi  dibaca  pada  spektrofotometer  (UV  Mini Shimadzu,  Japan)  pada  panjang  gelombang  465  nm (Bradford,  1976).  Kadar  protein  ditetapkan  meng- gunakan  kurva  standar  ovalbumin  murni  dengan kadar  0,5 –5,0%.

## Analisis  data
Penelitian ini menggunakan analisis data deskriptif  kuantitatif  dan  kualitatif  yaitu  dengan  cara membandingkan nilai hasil pengamatan pada masing-masing  tahapan  untuk  menentukan  hasil yang  terbaik  (Fahardian et  al., 2012).  Fenomena yang  tampak  pada  data  yang  diperoleh  diklarifikasi dan  dideskripsikan  dengan  menghubungkan  se- jumlah variabel lain yang berkaitan dengan parameter  yang  diteliti.  Data  kuantitatif  berupa  nilai absorbansi  pada  panjang  gelombang  280  nm  dan persentase  kadar  protein.  Data  kualitatif  yang diambil  adalah  profil  SDS-PAGE.  Deskripsi  diguna- kan  dalam  menggabungkan  antar  parameter  dan antar  jenis  sampel  telur  ayam  ras  dan  buras.  Hasil yang  diperoleh  tersebut  diakumulasikan  secara
bersama-sama  untuk  menarik  kesimpulan  dan  saran yang  tepat  untuk  melaksanakan  penelitian  sejenis dengan  baik.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Proses  purifikasi ovotransferrin Purifikasi  menggunakan  resin SP –Sepharose Fast  Flow untuk  mengimobilisasi  protein ovotrans- ferrin dari  membran  kerabang  telur  bertujuan  agar ovotransferrin dapat  digunakan  secara  berulang – ulang.  Hal  ini  dikarenakan  penggunaan ovotrans- ferrin yang  sangat  sedikit  dalam    pengaplikasian  dan proses  yang  sulit  untuk  memperoleh ovotransferrin . Penggunaan  resin SP –Sepharose  Fast  Flow dinilai cukup  tepat,  hal  ini  dikarenakan SP –Sepharose Fast Flow memiliki  senyawa  yang  bermuatan  negatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa proses pemisahan ovotransferrin dari  membran  kerabang telur  ayam  buras  dan  ras  dinilai  tidak  berbeda  yang mencolok.  Kedua  jenis  membran  kerabang  telur  ini keduanya  tergolong  sulit  dilepaskan  dari  kerabang telur,  hal  ini  dikarenakan  membran  kerabang  telur yang  sangat tipis.
Proses pengaliran campuran membran kerabang  telur dalam  PB  berlangsung  agak  lambat dengan  kecepatan  alir  rata-rata  mencapai  0,6±0,05 mL/menit  (Tabel  1).  Hal  ini  dimungkinkan  karena jumlah  padatan  yang  masih  tersisa  tinggi  sehingga memperlambat  laju  alir  di  dalam  kolom.  Padatan yang  tersisa  berupa  partikel –partikel  halus  membran kerabang  telur yang  lolos  selama  penyaringan. Untuk  mengoptimalkan  hasil  pemisahan  protein yang  ada  pada  kolom, maka dialirkan  larutan  garam.
Tabel  1.  Parameter  visual  setiap  hasil  elusi ion exchange  chromatography
Parameter Membran Kerabang Telur Ras Buras Kecepatan alir (mL/menit) 0,65 0,60 Jumlah tabung penampung berisi fraksi berwarna kuning emas 3 4 Jumlah tabung penampung berisi fraksi yang agak berwarna kuning 4 3 Jumlah tabung penampung berisi fraksi yang jernih 3 3 Kejernihan pradilusi ke dalam kolom Agak jernih Agak jernih Bau eluent Tidak berbau Tidak berbau
Secara  visual,  fraksi-fraksi  ini  mempunyai tingkat  penampakan  agak  keruh  dengan  warna kekuning-kuningan.  Namun  beberapa  fraksi  terlihat berwarna  jernih,  tidak  ada  penampakan  warna
kuning  didalamnya  (Tabel  1).  Tidak  ada  perbedaan warna  yang  mencolok  antara  fraksi  kelompok sampel  ayam  ras  dan  buras.  Hal  ini  dimungkinkan karena  tidak  ada  perbedaan  yang  mencolok  pada jumlah  protein  kedua  jenis  telur  ini.  Berdasarkan pada  hasil  pengamatan  sebagaimana  yang  ter- cantum  dalam  Tabel  1,  kedua  jenis  telur  meng- hasilkan  fraksi  dengan  warna  kuning  keemasan, dimana  pada  terlur  ayam  ras  terdapat  3  frasi  yaitu frasi  1  hingga  fraksi  3  dan  pada  telur  ayam  buras terdapat  4  fraksi  yaitu  fraksi  1  hingga  fraksi  4. Perbedaan  warna  pada  fraksi –fraksi  ini  menandakan seberapa besar ovotransferrin mengikat besi, semakin  besar ovotransferrin mengikat  besi  maka warna  fraksi  akan  berwarna  kekuningan  (keruh)  dan semakin  sedikit ovotransferrin mengingat  besi  maka warna  fraksi  akan  terlihat  jernih.  Hal  ini  karena  ovo- transferrin  termasuk  dalam  golongan  glikoprotein yang  dapat  mengikat  besi.  Fenomena  ini  juga diduga  adanya  komponen  protein  dengan  persen- tase  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  fraksi- fraksi  lain.  Semakin  kuning  (keruh)  warna  fraksi maka  semakin  tinggi  kandungan  proteinnya  dan sebaliknya,  semakin  jernih  warna  fraksi  maka kandungan  proteinnya  semakin rendah.

## Kadar protein kualitatif
Pada  Tabel  2  dapat  dicermati  bahwa  nilai absorbansi  tertinggi,  terdapat  pada  fraksi  1  dengan nilai  absorbansi  mencapai  0,535  (atau  dengan prediksi kandungan protein sebesar 0,356%), artinya  bahwa  fraksi  1  ini  mempunyai  konsentrasi protein  yang  tertinggi  diantara  fraksi-fraksi  lain.  Nilai absorbansi  yang  tertinggi  ini  belum  tentu  memiliki tingkat  kemurnian  protein  yang  tinggi  oleh  karena itu,  pada  tahap  penelitian  berikutnya  dilakukan analisis  profil  protein  dengan  SDS-PAGE  untuk  me- ngetahui  kemurnian  protein.
Beberapa  peneliti  enzim,  pada  umumnya  men- dapatkan  hasil  absorbansi  fraksi  yang  kurang  dari 1,00  (Naknukool et  al., 2009;  Al-Baarri et  al., 2010). Hasil  absorbansi  yang  menunjukkan  angka  kurang dari  1,00  tergolong  angka  yang  sensitif  dan  dapat mengetahui  pola  perubahan  absorbansi  masing- masing  fraksi.  Hasil  absorbansi  pada  penelitian  ini berkisar  0,121-0,535  yang  artinya  masih  dalam angka  di  bawah  1,00.  Sensitifivas  nilai  absorbansi sangat  bervariasi  ditunjukkan  pada  Tabel  2.
Purifikasi  protein  yang  dilakukan  oleh  Naknu- kool et  al. (2009),  menggunakan  larutan  penda- huluan  berupa acetate  buffer molaritas  rendah  (10 mM),  yang  berguna  untuk  memisahkan  senyawa pengganggu  termasuk  sisa  lemak  dan  mineral. Namun  dalam  penelitian  ini,  tidak  digunakan buffer tersebut  karena  hasil  elusi  fraksi  pertama  dinilai sudah  jernih  dan  tidak keruh.
Tabel  2.  Nilai  absorbansi  (280  nm)  dan  prediksi total protein  yang  terkandung  dalam  fraksi
Nama Fraksi Fraksi Telur Ayam Ras Fraksi Telur Ayam Buras Nilai Absorbansi Prediksi Kadar Protein (%)* Nilai Absorbansi Prediksi Kadar Protein (%)* Fraksi 1 0,535 0,357 0,472 0,315 Fraksi 2 0,233 0,155 0,341 0,227 Fraksi 3 0,193 0,129 0,250 0,167 Fraksi 4 0,183 0,122 0,295 0,197 Fraksi 5 0,173 0,115 0,250 0,167 Fraksi 6 0,220 0,147 0,187 0,125 Fraksi 7 0,121 0,081 0,177 0,118 Fraksi 8 0,145 0,001 0,159 0,106 Fraksi 9 0,268 0,178 0,146 0,100
Keterangan:  Fraksi  1 –3:  elusi  dengan  0,1 mM NaCl, fraksi 4–6: elusi  dengan  0,3 mM NaCl, fraksi 7 –9: elusi dengan 0,5 mM NaCl.  *Dihitung dengan membagi nilai absorbansi dengan 1,5
Puncak  nilai  absorbansi,  fraksi  yang  tertinggi pada  penelitian  Naknukool et  al. (2009),  ditunjukkan pada  fraksi  yang  dielusikan  dengan  0,5  mM  NaCl dengan  nilai  absorbansi  sekitar  2,50  sedangkan pada  penelitian  ini,  absorbansi  yang  tertinggi  dicapai pada  fraksi  1  yang  merupakan  hasil  elusi  dari  0,1 mM  NaCl.  Nilai  absorbansi  sangat  bergantung  pada zat  yang  dipurifikasi.  Semakin  tinggi  kandungan protein,  maka  semakin  tinggi  nilai  puncak  absor- bansi.  Naknukool et  al. (2009)  menggunakan  putih telur  yang  mempunyai  kandungan  protein  sebesar 88,63%  (Ayadi et  al., 2008)  sedangkan  pada penelitian  ini,  digunakan  membran  telur  yang  hanya mempunyai  kandungan  protein  berkisar  3,5 –4,0%, sehingga  terjadi  perbedaan  yang  cukup  menc olok pada  nilai  absorbansi  titik tertingginya.

## Profil protein
Profil  protein membran  kerabang  telur dianalisis dengan  menggunakan  SDS-PAGE.  Uji  SDS –PAGE ditampilkan  pada  Gambar  1  yang  menunjukkan profil  protein  membran  kerabang  telur ayam  ras sebelum  purifikasi  ( lane A)  dan  setelah  purifikasi ( lane B –H).
Lane B  sampai  dengan  H  (Gambar  1)  adalah tampilan  protein  hasil  dari  fraksi  yang  telah  me- ngalami  tahapan  purifikasi.  Setelah  melalui  tahapan ini,  tampak  terdapat  pengurangan  jumlah band, dari dua band menjadi  hanya  satu band ,  yaitu band dengan berat molekul  sekitar  78  kDa  yang merupakan ovotransferrin .  Hasil  profil  SDS-PAGE  ini dapat  digunakan  untuk  menarik  kesimpulan  bahwa proses  purifikasi  dapat  berhasil  dengan  baik  dan hanya  menyisakan  satu  protein  saja,  yaitu ovo- transferrin dalam  fraksi  yang  diperoleh  pasca purifikasi.  Intensitas band dapat  diartikan  sebagai indikator  banyak  tidaknya  kadungan  protein  dalam sampel  (Mahasri et  al., 2010).  Gambar  2  menunjuk- kan  profil  protein  membran  kerabang  telur ayam
buras  sebelum  purifikasi  ( lane A)  dan  setelah  puri- fikasi ( lane B).
Gambar  1.  Profil  protein  membran  kerabang  telur ayam  ras. Lane A:  membran  kerabang telur dalam  larutan buffer , Lane B-D: fraksi  dari  elusi  dengan  0,1  mM  NaCl; Lane E-G:  fraksi  elusi  0,3  mM  NaCl; Lane H  fraksi dari  elusi 0,5  mM NaCl
Gambar  2.  Profil  protein  membran  kerabang  telur ayam  buras. Lane A:  sebelum  puri- fikasi; Lane B:  hasil  purifikasi  dielusi dengan  0,1 mM NaCl
Band yang  terdapat  pada lane B  pada  Gambar 2  adalah band yang  didapat  dari  fraksi  yang mengandung ovotransferrin .  Penentuan  o votrans- ferrin pada  SDS –PAGE  didukung  juga  dengan senyawa  standar  yang  telah  dilakukan  pada  Gambar 1.  Senyawa  standar  tidak  memiliki band lain  di antara  berat  molekul  66-97  kDa  sehingga band yang muncul  pada  rentang  66-97  kDa  adalah  protein
A B C D E F  G H 200 116 97 66 55 45
36 29 14,2 A B
dominan pada membran  kerabang  telur , yaitu ovotransferrin yang memiliki berat 78 kDa. Ovotransferrin memiliki  berat  molekul  78  kDa dengan  686  asam  amino  dan  titik  isoelektrik  6,1  dan termasuk  dalam  protein  dominan  pada membran kerabang  telur (Ko  dan  Ahn  2008;  Abeyrathne et  al., 2014). Band tunggal  yang  muncul  pada  SDS  PAGE menunjukkan  bahwa ovotransferrin murni,  yaitu terletak  pada lane C,  D,  E.  Fraksi-fraksi  ini  adalah fraksi  yang didapat  dari  hasil elusi 0,1 mM NaCl.
Lane  A  baik  pada  Gambar  1  dan  2,  menunjuk- kan  terdapatnya  ovalbumin  dan ovotransferrin yang terdeteksi  dengan  berat  molekul  masing –masing  45 dan  78  kDa  (penentuan  berat  molekul  ini,  berdasar- kan  pada  tampilan  protein  marker  yang  digunakan  di lane  paling  kanan  Gambar  1).  Hal  ini  dapat  dipasti- kan  bahwa  komponen  tersebut  adalah  ovalbumin dan ovotransferrin karena  komponen  mayor  protein pada eggshell  membrane hanyalah  ovalbumin  dan ovotransferrin yang  hanya  dapat  dipisahkan  melalui strong  cation  exchanger (Naknukool et  al., 2009;  Wu dan  Alexandra,  2012).  Kandungan  ovalbumin  dalam putih  telur  cukup  besar  yaitu  54%  (Mann  dan  Mann 2011;  Deleu et  al., 2015),  sehingga  kandungan ovalbumin  di eggshell  membrane juga  besar. Kandungan ovotransferrin pada  putih  telur  sebanyak 13%  (Wu  dan  Alexandra,  2012).  Kandungan  protein lain  yang  terdapat  pada eggshell  membrane me- rupakan  protein  minor  yaitu  lisozim,  ovocalyxin –36 dan  demozine  (Balaz,  2014)  sehingga  tidak  dapat muncul  dalam  profil  protein  dengan  menggunakan SDS –PAGE.  Berdasarkan  Gambar  1  dan  2,  maka hanya  fraksi  yang  didapat  dari  elusi  0,1  mM  NaCl yang  digunakan  untuk penelitian  lebih  lanjut.

## Kadar protein kuantitatif
Tabel  3.  menunjukkan  kadar  protein  yang terlarut.  Fraksi  1  sampai  dengan  4  dipilih  untuk dianalisis  kadar  protein  secara  kuantitatif  karena hasil  nilai  absorbansi  pada  panjang  gelombang  280 nm  untuk  fraksi  1 –4  menunjukkan  nilai  absorbansi yang  berada  pada  kisaran  0,2 –0,5  pada peak pertama  dan  hasil  analisis  profil  protein  yang menunjukkan  adanya band pada  78  kDa  dan  tidak terdapat band yang  jelas  pada  fraksi –fraksi  setelah fraksi  ketiga.  Fraksi  keempat  dan  kelima  diikut - sertakan  dalam  analisis  kadar  protein  ini  dimaksud- kan  untuk  melakukan  pemeriksaan  apakah  masih terdapat  protein  dalam  sampel.
Berdasarkan  Tabel  3  didapat  hasil  bahwa  kadar protein  dapat  terdektesi  pada  fraksi  1 –3  pada kedua jenis  sampel,  namun  untuk  sampel  telur  ayam buras,  masih  terdeteksi  ada  protein  pada  fraksi nomer  4.  Protein  pada  fraksi  nomer  4  ini  diduga adalah  protein  bukan ovotransferrin karena  fraksi nomer  4  ini band tidak  muncul  sama  sekali  setelah
dilakukan  analisis  profil  protein  dengan  mengguna- kan SDS –PAGE.
Tabel  3.  Kadar  protein  kuantitatif  (%)  fraksi  1 sampai  4  hasil  elusi  sampel  dari  telur ayam  ras  dan  buras  yang  ditentukan dengan  metode Bradford Nomor Fraksi Jenis Telur Ras Buras Fraksi 1 7,8±0,16 1,2±0,09 Fraksi 2 4,4±0,10 1,0±0,03 Fraksi 3 2,8±0,07 1,8±0,05 Fraksi 4 0 1,6±0,06 Fraksi 5 0 0
Keterangan: Fraksi 1-3 dipilih karena mempunyai tingkat kemurnian  protein  yang  tinggi.  Fraksi  4 dipilih untuk sampling  fraksi  yang  tidak  menghasilkan b and ber- dasarkan  analisis  SDS-PAGE  yang  telah  dilakukan pada tahapan sebelumnya
Penjumlahan  seluruh  fraksi  dari  1-3  pada  telur ayam  ras  memberikan  hasil  sebesar  15±0,33%  yang menunjukkan  bahwa  dari  seluruh  larutan  membran kerabang  telur  (200  g membran  kerabang  telur dalam  300  mL buffer )  terdapat ovotransferrin sebanyak  15±0,33%  dari  total  protein  dalam  mem- bran  kerabang  telur.  Guna  mendapatkan  200  g membran  kerabang  telur,  diperlukan  40  butir  telur ayam  ras,  sehingga  dapat  dihitung  bahwa  setiap telur  terkandung  0,75±0,017% ovotransferrin .  Pola perhitungan  ini  jika  diaplikasikan  pada  telur  ayam buras,  maka  didapat  hasil  sebesar  4%  (dari  hasil penjumlahan  kadar  protein  pada  fraksi  1 –3),  sehing- ga  dari  200  g  membran  kerabang  telur (untuk  men- dapatkannya,  diperlukan  50  butir  telur  ayam  buras), terdapat ovotransferrin sebanyak  8±0,23%  dan dalam  satu  butir  telur  0,16±0,005% ovotransferrin pada  membran  kerabang  telur.
Berdasarkan perhitungan tersebut, jumlah ovotransferrin pada  membran  kerabang  telur ayam ras  adalah  4,6  kali  lipat  lebih  besar  daripada ovotransferrin telur  ayam  buras.  Hal  ini  dimungkin- kan  karena  terkontrolnya  konsumsi  protein  yang pada  ayam  ras  dibandingkan  pada  ayam  buras. Berdasarkan  penelitian  Ketaren  (2010),  kebutuhan protein  ayam  petelur  adalah  berkisar  15-17%  dan bergantung  pada  masa  pertumbuhannya.  Jika  dilihat dari  pola  pemberian  pakan  ayam  ras,  peternak selalu  menjaga  kualitas  pakan  (terutama  kadar protein)  guna  memenuhi  kebutuhan  protein.  Sebalik - nya,  kebutuhan  protein  ayam  buras  cenderung  tidak terjaga  karena  didapat  dari  pola  pemberian  pakan yang  tidak  terpola  sehingga  dapat  menyebabkan asupan  protein  yang  kurang.  Faktor  inilah  yang menyebabkan kadar ovotransferrin pada  ayam buras  lebih  rendah  dibandingkan  ayam  ras.

## KESIMPULAN
Pemurnian
ovotransferrin dari membran kerabang  telur  ayam  ras  dan  ayam  buras  telah berhasil  dilakukan  dengan  menggunakan  metode ion  exchange  chromatography. Hasil  elusi  yang terbaik  untuk  mengambil ovotransferrin ini  adalah dengan  menggunakan  elusi  0,1  mM  NaCl.  Hasil elusi  ini  telah  berhasil  untuk  menghilangkan  protein lain  selain ovotransferrin .  Berdasarkan  perhitungan jumlah  protein,  maka  didapatkan  hasil  bahwa  sebutir ayam  ras  dengan  berat  60  gram/butir  dan  buras dengan  berat  45  gram/butir,  terkandung ovotrans- ferrin dalam  membran  kerabang  telur masing- masing  sebesar  0,75±0,11  dan  0,16±0,05%.  Keber- hasilan purifikasi ovotransferrin dari membran kerabang  telur  diharapkan  dapat  membuka  peluang pemanfaatan ovotransferrin membran kerabang telur untuk  berbagai  keperluan,  misalnya  sebagai senyawa  antibakteri  yang aman  untuk  pangan.

## DAFTAR PUSTAKA
Abeyrathne  ED,  Lee  HY  Ahn  DU.  2014.  Separation of  ovotransferrin  and  ovomucoid  from  chicken egg  white.  Poultry  Sci  93:  1010-1017.  DOI: 10.3382/ps.2013-03649.
Al –Baarri  AN,  Ogawa  M,  Hayakawa  S. 2010. Scale- up  studies  on  immobilization  of  lactoperoxidase using  milk  whey  for  producing  antimicrobial agent.  J  Indonesian  Trop  Anim  Agric  35:  185- 191.  DOI:  10.14710/jitaa.35.3.  185-191.
Ayadi  MA,  Khemakhem  M,  Belgith  H,  Attia  H.  2008.
Effect  of  moderate  spray  drying  conditions  on functionality  of  dried  egg  white  and  whole  egg. J  Food  Sci  73:  E281 –E287.  DOI:  10.1111/j. 1750-3841.2008.00811.x.
Balaz  M.  2014.  Eggshell  membrane  biomaterial  as   a platform  for  applications  materials  science. Acta  Biomater  10:  3827 –3843.  DOI:  10.1016/j. actbio.2014.03.020.
Bradford  MM.  1976.  A  rapid  and  sensitive  method for  the  quantitation  of  microgram  quantities  of protein  utilizing  the  principle  of  protein-dye binding.  Anal  Biochem 7: 248 –254.
Charter  EA,  Lagarde  G.  2014.  Natural  antimicrobial systems:  lysozyme  and  other  protein  in  egg. Dalam:  Batt  Carl  A  and  Tortorello  Mary  Lou (ed).  Encyclopedia  of  Food  Microbiology  (2 nd
Edition).  936 –940.  Academic  Press  is  an Imprint  of  Elsevier,  United  Kingdom.
Fahardian  A,  Jinap  S,  Faridah  A,  Zaidul  ISM.  2012.
Effects  of  marinating  on  the  formating  of polycyclic  aromatic  hydrocarbons  (benzoal[a]- pvrene  benzo[b]fluorathene  dan  fluranthene)  in grilled  beef  meat.  Food  Control  28:  420 –425. DOI:  10.1016/j.foodcont.2012.04.034.
Hinckea  MT,  Gautronb  J,  Panheleux  M,  Garcia- Ruizc  M,  McKee  MD,  Nys  Y.  2000.  Identifi- cation  and  localization  of  lysozyme  as  a  com- ponent  of  eggshell  membranes  and  eggshell matrix.  Matrix  Biology  19:  443 –453.  DOI:  10. 1016/S0945-053X(00)00095-0.
Ibrahim  HR.  2000.  Ovotransferrin.  Dalam  Naidu  AS.
Ed,  Natural  Food  Antimicrobial  Systems.  211 – 226.  CRC  Press, Inc, New  York.
Kamkum  P,  Atiwongsangthong  N,  Muanghlua  R,
Vittayakorn  N.  2015.  Application  of  chicken eggshell  waste  as  a  starting  material  for synthesizing calcium niobate (Ca 4 Nb 2 O 9 ) powder.  Ceram  Int  41:  69 –75.  DOI:  10.1016/j. ceramint.2015.03.189.
Ketaren  PP.  2010.  Kebutuhan  gizi  ternak  unggas  di Indonesia.  Wartazoa  20: 172-180.
Ko  KY,  Mendonca  AF,  Ahn  DU.  2008.  Effect  of ethylenediaminetetraacetate  and  lysozyme  on the antimicrobial activity of ovotransferrin against Listeria  monocytogenes .  Poultry  Sci  87: 1649-1658.  DOI:  10.3382/ps.2007-00521.
Ko  KY,  Ahn  DU.  2008.  An  economic  and  simple purification  procedure  for  the  large  scale production  of  ovotransferrin  from  egg  white. Poultry  Sci  87:  1441-1450.  DOI:  10.3382/ps200 7-00434.
Mahasri  G,  Fajriah  U,  Subekti  S.  2010.  Karakterisasi protein Lernaea  cyprinacea dengan  metode elektroforesis  SDS-PAGE.  J  Ilmiah  Perikanan dan  Kelautan  2: 61-66.
Naknukool  S,  Hayakawa  S,  Uno  T,  Ogawa  M.  2009. Antimicrobial  Activity  of  Duck  Egg  Lysozyme Against Salmonella  enteritidis .  Dalam:  Canovas GB,  Mortimer  A,  Lineback D, Spiess, W, Buckle K,  Colonna  P.  Global  Issues  in  Food  Science and  Technology.  293 –307.  Academic  Press  is an  imprint  of  Elsevier,  United  Kingdom.  DOI: 10.1051/IUFoST:200060308.
Ruff  KJ,  DeVore  DP,  Leu  MD,  Robinson  MA.  2009. Eggshell  membrane:  a  possible  new  natural therapeutic for joint andconnective tissue disorders.  Results  from  two  open-label  human clinical  studies.  Clin  Intervention  Aging  4:  235- 240.
Stadelman  WJ.  2000.  Eggs  and  Egg  Products. Dalam:  Wiley  J,  Sons,  Francis  FJ.  (Ed.), Encyclopedia  of  Food  Science  and  Technology (2 nd Edition).  36 –54. New York.
Soekarto  S.  2013.  Teknologi  Penanganan  dan  Pe- ngolahan  Telur.  136 –138.  Alfabeta, Bandung.
Urip  S.  2007.  Pengaruh  penambahan  ekstrak  dan katuk  terhadap  kualitas  telur  dan  berat  organ dalam.  J Sain  Peternakan  Indonesia  2: 5 –10.
Touch  V,  Hayakawa  S,  Yamada  S,  Kaneko  S.  2004. Effects of a lactoperoxidase –thiocyanate– hydrogen peroxide  system  on  Salmonella enteritidis  in  animal  or  vegetable  foods.  Int  J
Food  Microbiol  93:  175 –183.  DOI  10.1016/j. ijfoodmicro.2003.11.004.
Varon  O,  Allen  KJ,  Bennett  DC,  Mesak  LR,  Scaman CH.  2013.  Purification  and  characterization  of tinamou  egg  white  ovotransferrin  as  an  anti- microbial  agent  against  foodborne  pathogenic bacteria.  Food  Res  Int  54:  1836-1842.  DOI: 10.1016/j.foodres.2013. 02.041.
Wu  J,  Acero-Lopez  A.  2012.  Ovotransferrin:  struc- ture,  bioactivities,  and  preparation.  Food  Res Int 46: 480 –487.  DOI:  10.1016/j.foodres. 2011.07.012.