ISOLASI KHAMIR INULINOLITIK PADA BUAH KERSEN ( Muntingia Calabura L.) SEBAGAI PENGHASIL ENZIM INULINASE
Wijanarka 1) dan Sarsa, A.N. 1)
1 Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto, Tembalang, Semarang.
Email: wijanarka1810@gmail.com
INULINOLITIC ISOLATION OF YEAST IN KERSEN FRUIT ( Muntingia Calabura L.) AS A PRODUCTION OF INULINASE ENZYMES

## ABSTRACT
Inulin is a polysaccharides and accumulates in the organs of plants. Besides being found in dahlia bulbs, inulin can also accumulate in the Kersen  fruit ( Muntingia  calabura  L.). Inulinase  (E.C.3.2.1.7.)  Is  a  hydrolytic  enzyme that catalyzes the hydrolysis reaction of inulin polysaccharides into fructose and  or  fructooligosaccharides.  Isolation  of  inulinase  enzymes  in  large quantities  from  plants  is  quite  difficult  to  do,  therefore  it  is  necessary  to isolate  enzymes  using  microbes.  One  of  the  microbes  that  can  hydrolyze inulin  is  yeast.  This  study  aims  to  obtain  inulinolytic  yeast  isolates  as  a producer  of  the  enzyme  inulinase  from  cherry  fruits  ( Muntingia  calabura L .), and determine the growth rate and inulinase production of the isolates obtained.The  study  was  conducted  by  isolating  yeast  from  cherries  using ISM (Inulin Selecting Medium) media.Yeast isolation using the streak plate method to obtain pure isolates. The obtained  yulin inulinolytic isolate was given the name Yke yeast isolate which was then measured for growth and inulinase activity test. Yeast culture in inulinase production media lasts for 24  hours  and  is  measured  every  6  hours.The  measurements  include  yeast growth and inulinase activity.The measurement of Yke yeast isolate growth was done by calculating absorbance through its transmitter value, while the measurement of inulinase activity was done by calculating reducing sugars using the DNS method.The results of measurement of optimal cell growth at  T12  which  is  a  logarithmic  phase  with  a  growth  value  of  0.7959,  while the results of the highest inulinase activity test at T12 with an activity value of 0.3977 U / ml.
Keywords :  inulinase,  inulinase activity,  kersen ( Muntingia calabura L.), Yke  isolate

## ABSTRAK
Inulin  merupakan  polisakarida  dan  terakumulasi  pada  bagian  organ tanaman.  Selain  ditemukan  di  umbi  dahlia,  inulin  juga  dapat  terakumulasi pada buah Kersen ( Muntingia calabura L.). Inulinase (E.C.3.2.1.7.) adalah enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis inulin menjadi fruktosa dan atau fruktooligosakarida.  Isolasi  enzim  inulinase  dalam  jumlah  banyak  dari tumbuhan  cukup  sulit  untuk  dilakukan,  oleh  sebab  itu  perlu  dilakukan isolasi  enzim  menggunakan  mikroba.  Salah  satu  mikroba  yang  dapat menghidrolisis  inulin  yaitu  khamir.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk memperoleh  isolat  khamir  inulinolitik  sebagai  penghasil  enzim  inulinase dari  buah  kersen  (Muntingia  calabura  L.),  dan  mengetahui  tingkat pertumbuhan serta produksi inulinase dari isolat yang diperoleh.  Penelitian dilakukan  dengan  mengisolasi  khamir  dari  buah  kersen  menggunakan media  ISM  (Inulin  Selecting  Medium).  Isolasi  khamir  menggunakan metode  streak  plate  sampai  didapatkan  isolat  murni.  Isolat  khamir inulinolitik  yang  didapat  diberi  nama  isolat  khamir  Yke  yang  kemudian dilakukan  pengukuran  pertumbuhan  serta  uji  aktivitas  inulinase. Pengkulturan khamir pada media produksi inulinase berlangsung selama 24 jam  dan  dilakukan  pengukuran  tiap  6  jam  sekali.  Pengukuran  tersebut meliputi  pertumbuhan  khamir  dan  aktivitas  inulinase.  Pengukuran pertumbuhan  isolat  khamir  Yke  dilakukan  dengan  cara  menghitung absorbansi  melalui  nilai  transmitternya,  sedangkan  pengukuran  aktivitas inulinase dilakukan dengan menghitung gula reduksi menggunakan metode DNS. Hasil pengukuran pertumbuhan sel optimal pada T 12 yang merupakan fase  logaritmik  dengan  nilai  pertumbuhan  0.7959,  sedangkan  hasil  uji aktivitas inulinase tertinggi pada T 12 dengan nilai aktivitas 0.3977 U/ml
Kata Kunci : inulinase, aktivitas inulinase,  Kersen ( Muntingia calabura L .),  isolat    Yke,

## PENDAHULUAN
Indonesia  merupakan  salah  satu  negara  tropis  yang  terkenal  dengan keanekaragaman  tanamannya.  Indonesia  juga  dikenal  sebagai  negara  pertanian  yang menghasilkan  banyak  tanaman  dari  golongan  karbohidrat.  Tanaman  golongan karbohidrat  umumnya  menghasilkan  rasa  yang  manis  karena  mengandung  karbohidrat di  dalamnya.  Menurut  Nakamura at  al. (1995),  inulin  merupakan  suatu  polisakarida yang  dibangun  oleh  unit-unit  monosakarida  fruktosa  melalui  ikatan  β-2-1 fruktofuransida  yang  diawali  oleh  suatu  molekul  glukosa.  Karbohidrat  ini  dihasilkan oleh  tanaman  jenis  Compositae  seperti  dahlia, chicory ,  dan Jerrusalem  artichoke .
Enzim  yang  mampu  memecah  polisakarida  inulin  menjadi  unit-unit  yang  lebih  kecil (fruktosa) disebut enzim inulinase.
Tanaman  kersen  ( Muntingia  calabura L.)  merupakan  salah  satu  tanaman  dari golongan karbohidrat. Tanaman tersebut dapat dengan mudah ditemukan di Indonesia. Kersen  adalah  pohon  yang  selalu  hijau  ( evergreen ),  tumbuh  dan  berbuah  sepanjang tahun. Saat ini, pohon kersen hanya dimanfaatkan sebagai tanaman peneduh di pinggir jalan karena daunnya yang rindang. Lebih dari itu, bagian lain dari tanaman kersen yang mempunyai  segudang  manfaat  adalah  bagian  buahnya.  Menurut  Ogata  (1995),  buah kersen memiliki diameter hingga 1,5 cm berbentuk seperti ceri, jika matang maka akan berwarna  merah  dan  terasa  manis.  Sedangkan  bijinya  berbentuk  bulat,  kecil,  putih kekuningan,  tiap  buah  mengandung  ratusan  biji,  dan  pada  akarnya  tunggang.  Rasa manis  dari  buah  kersen  tersebut  dikarenakan  adanya  kandungan  karbohidrat.  Inulin merupakan  polimer  pemanis  alami  yang  terdapat  pada  suatu  bagian  tanaman  yang menyebabkan timbulnya rasa manis. Untuk memecah inulin mejadi unit-unit yang lebih kecil dibutuhkan suatu enzim yang disebut enzim inulinase.
Salah satu enzim yang jumlahnya sangat melimpah di alam yaitu enzim inulinase. Menurut Franck (2003), inulin merupakan senyawa yang melimpah di alam setelah pati. Inulinase (E.C.3.2.1.7.) adalah enzim yang menghidrolisis inulin menjadi fruktosa atau frukto-oligosakarida. Isolasi enzim inulinase dalam jumlah banyak dari tumbuhan cukup sulit  untuk  dilakukan,  oleh  sebab  itu  inulinase  mikrobial  merupakan  obyek  penelitian yang sangat menarik bagi peneliti. Penelitian Saryono at al. (2016), menyatakan bahwa aktivitas inulinase banyak ditemukan pada berbagai spesies jamur, termasuk khamir.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memperoleh  isolat  khamir  inulinolitik  sebagai penghasil  enzim  inulinase  dari  buah  kersen  ( Muntingia  calabura L.),  dan  mengetahui tingkat  pertumbuhan  serta  produksi  inulinase  dari  isolat  yang  diperoleh.  Sedangkan manfaat  dari  penelitian  ini  adalah  memberikan  informasi  ilmiah  tentang  khamir penghasil  inulinase.  Enzim  ini  selanjutnya  dapat  digunakan  untuk  produksi High Fructoce Syrup (HFS).

## MATERIAL DAN METODE

## Subjek Penelitian
Khamir inulinolitik dalam buah kersen ( Muntingia calabura L.), merupakan salah satu jenis khamir yang mampu menghasilkan enzim inulinase (E.C.3.2.1.7.)

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah tabung reaksi, autoklaf, timbangan digital, gelas ukur,    Erlenmeyer, corong.  Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah buah kersen ( Muntingia calabura L.), media ISM ( Inulin Selecting Medium ), media produksi inulinase, media PDA ( Potatoe Dextrose Agar ), reagen DNS, buffer sodium asetat pH 5 0.1 M.

## Prosedur Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  Juli  hingga  September  2018  di Laboratorium Bioteknologi Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro. Langkah-langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut:
Pembuatan Media ISM ( Inulinase Selecting Medium ):
Pembuatan  Media  ISM    dilakukan  dengan  cara  menyiapkan  bahan  diantaranya  adalah inulin 1.2gr, agar 1.2gr, dan yeast extract 0.6gr. Semua bahan tersebut dilarutkan dalam 60 ml akuades, lalu dihomogenkan. Kemudian di tuang di tabung reaksi sebagai media miring, lalu disterilisasi dengan autoklaf.
Pembuatan Medium Produksi Inulinase (g/L) (Ertan et al., 2003):
Pembuatan Media produksi inulinase dilakukan dengan cara sebagai berikut ini, setiap 100ml  media  produksi  terdiri  dari  tepung  dahlia  3%,  NH 4 NO 3 0.23%,  (NH 4 ) 2 HPO 4 0.37%, K 2 HPO 4 0.1%, MgSO 4 .7H 2 O 0.05%, yeast ekstract 0.15%, pH 5. Tepung dahlia dilarutkan  kedalam  air  sebanyak  100ml  kemudian  dipanaskan  hingga  mendidih  dan warnanya  menjadi  bening.  Erlenmeyer,  corong  dan  kertas  saring  disiapkan.  Tepung dahlia  yang  telah  mendidih  disaring  kemudian  diukur  sebanyak  100ml  dengan menggunakan  gelas  ukur.  Bahan  yang  telah  ditimbang  dimasukkan  kedalam  larutan tepung  dahlia  dan  diaduk  hingga  homogen.  pH  diukur  dengan  menggunakan  pH  strip, ditambahkan HCl sedikit demi sedikit hingga pH mencapai 5.
Isolasi Yeast dari Buah Kersen ( Muntingia calabura L.):
Isolasi yeast pada  buah  kersen  ( Muntingia  calabura L.)  menggunakan  media  ISM ( Inulinase  Selecting  Medium ).  Sebelumnya,  buah  kersen  dibiarkan  membusuk  pada suhu  kamar  selama  lima  hari  sampai  terlihat  tanda-tanda  kerusakan  biologis. Selanjutnya,  satu  buah  kersen  busuk  tersebut  dimasukkan  secara  aseptik  ke  dalam tabung  reaksi  yang  berisi  akuades  steril,  lalu  diinokulasikan  ke  media  ISM  dengan metode  streak.  Metode  isolasi  lainnya  dilakukan  dengan  inokulasi  secara  langsung dengan  cara  menempelkan  buah  kersen  busuk  ke  media  ISM.  Kemudian  diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu kamar.
Setiap  khamir  yang  tumbuh  diinokulasikan  kembali  dengan  cara  di  pindahkan  pada media  PDA  ( Potatoe  Dextrose  Agar )  melalui  metode streak .  Kemudian  diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu kamar. Hasilnya ditemukan satu isolat khamir yang tumbuh. Biakan  murni  sebagai  isolat  dipindahkan  ke  media  ISM  miring  sebagai satu-satunya sumber  karbon,  untuk  disimpan  dan  dipelihara  sebagai  kultur  stok.  Isolat  tersebut dinamakan  isolat  Yke.  Koloni  isolat  Yke  diamati  bentuk  dan  ukurannya  secara makroskopis dan mikroskopis serta dilakukan foto mikroskop.

## Pembuatan Starter Khamir Inulinolitik:
Biakan murni isolat Yke pada media ISM diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasikan ke 10ml  medium  produksi  inulinase  cair  dengan  pH  5  di  dalam  tabung  reaksi  dan diinkubasi pada rotary shaker dengan kecepatan agitasi 120 rpm dalam suhu ruang (27- 28 o C) selama ± 22 jam, hingga diperoleh kultur dengan kepadatan 10 7 - 10 8 sel/ml (fase logaritmik akhir).
Pengukuran Pertumbuhan Sel:
Setelah 22 jam, starter dimasukkan ke dalam 40ml media produksi inulinase. Kemudian T 0 dihitung tingkat pertumbuhannya. Pengukuran pertumbuhan dihitung dengan selisih waktu  setiap  6  jam  sekali  dengan  pengambilan  sampel  sebanyak  lima  kali.  Jadi  akan didapatkan  hasil T 0 ,  T 6 ,  T 12 ,  T 18 ,  dan  T 24 .  Pengukuran  pertumbuhan  dilakukan  dengan cara  sampel  diambil  sebanyak  5  ml  dan  dimasukkan  ke  dalam  botol  film,  kemudian diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 520 nm.
Pengujian Aktivitas Enzim:
Setelah  sampel  diambil  dalam  wadah  sampel  sebanyak  5ml  dan  telah  dilakukan pengukuran pertumbuhan, selanjutnya sampel diambil 1ml diletakkan dalam microtube kemudian  di  sentrifuge  selama  10  menit  dengan  kecepatan  3000  rpm.  Hasil  dari sentrfiugasi  yang  digunakan  untuk  mengukur  aktivitas  inulinase  adalah  cairan  yang berada  dibagian  atas  (super  natan),  diambil  sesuai  volume  yang  ditentukan  dengan menggunakan  mikropipet.  Pengukuran  gula  reduksi  dilakukan  dengan  cara  mengukur ES,  S  dan  E  menggunakan  spektofotometer.  ES  disusun  dengan  komposisi  0.5ml Substrat inulin murni 1%; 0.4ml buffer sodium asetat  pH 5; dan enzim ( crude ) 0.1ml. S disusun dengan komposisi 5ml substrat inulin murni 1%; 0.4 mL buffer sodium astean pH 5; dan akuades 0.1ml. E disusun dengan komposisi buffer sosium asetat pH 5 0.4ml; enzim ( crude ) 0.1 ml; dan aquades 0.5ml. Blanko terbuat dari buffer sodium asetat pH 5 0.4ml; dan aquades 0.6ml. ES, S dan E yang sudah disusun kemudian di inkubasi 50 ˚ C selama 30 menit, kemudian reaksi dimatikan dengan air mendidih 1-2 menit, ditambah 1ml DNS dan dipanaskan lagi 1-2 menit, kemudian didinginkan dan ditambah akuades 5ml, kemudian diukur absorbansi dengan panjang gelombang 570nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  pengukuran  pertumbuhan  dan aktivitas  inulinase  (U/ml)  isolat  khamir  Yke tertera  pada  Tabel  1,  selanjutnya  akan  diuraikan  hasil  dan  pembahasan  pertumbuhan isolat khamir Yke. Demikian pula tentang aktivitas  inulinase (U/ml) isolat khamir Yke. Tabel 1. Data Hasil Perhitungan Pengukuran Pertumbuhan dan Aktivitas Inulinase (U/Ml) Isolat Khamir Yke.

## Pertumbuhan Isolat Khamir Yke
Pertumbuhan  dapat  diartikan  sebagai  bertambahnya  komponen  kimia  dalam  diri makhluk  hidup  yang  dapat  dihitung  secara  kuantitas.  Hal  tersebut  juga  terjadi  pada mikroorganisme. Pertumbuhan mikroba ditandai dengan bertambahnya jumlah sel yang dapat  dilihat  dengan  menggunakan  mikroskop.  Wijanarka  (2014)  menyatakan  bahwa pertumbuhan  mikroorganisme  biasanya  ditunjukkan  dengan  adanya  pertambahan jumlah  sel atau  massa  sel  yang  sedang  tumbuh.  Pertambahan  massa  sel  khamir terjadi karena  khamir  memperoleh  nutrisi  dari  media  kultur  dan  mampu  memanfaatkannya untuk  tumbuh  dan  berkembang.  Hasil  penelitian  Dinarvand  (2013),  komposisi  media kultur  adalah  faktor  yang  paling  penting  yang  berngaruh  terhadap  produksi  enzim, pertumbuhan, dan fisiologi dari sel, dan meningkatkan pembentukan bioproduk.
Salah  satu  parameter pengukuran  pertumbuhan  adalah  kecepatan  pertumbuhan spesifik.  Kecepatan pertumbuhan  spesifik  diartikan  sebagai  pertambahan  biomassa  sel per  satuan  waktu  pada  fase  pertumbuhannya.  Pertumbuhan  isolat  khamir  Yke    pada medium  produksi  dihitung  berdasarkan  nilai  densitas  optik  dari  kultur  produksi, Pengukuran  pertumbuhan  dilakukan  dengan  cara  menghitung  absorbansi  melalui  nilai transmitternya setiap 6 jam sekali, selama 24 jam pada panjang gelombang 520nm yang kemudian  dikonservasikan  menjadi  nilai  absorbansi  dengan  rumus  Abs  =  2  –  (log  T). Hubungan  antara  nilai optical  density dan  waktu  inkubasi  dinyatakan  dalam  kurva pertumbuhan (Gambar 1).
Gambar 1. Grafik Pertumbuhan Isolat Khamir Yke pada Medium Produksi Inulinase dan Waktu Inkubasi
Wijanarka  dan A.N., Sarsa,  Isolasi Khamir Inulinolitik pada Buah Kersen
Gambar  1  menunjukkan  bahwa  kurva  tersebut  merupakan  kurva  sigmoid  tanpa adanya  fase  lag  atau  fase  adaptasi.  Fase  lag  tidak  muncul  dalam  hasil  dikarenakan adanya penambahan starter sebanyak 10% yang merupakan tempat berlangsungnya fase lag.  Fase  log  atau  fase  eksponensial  berlangsung  sejak  pertama  kali  dilakukan pengukuran  yakni  pada  T 0 sampai  T 12 dan  tidak  diikuti  oleh  fase  adaptasi.  Fase Stationer berlangsung setelah fase log dan relative konstan, yaitu pada T 18 sampai T 24 . Fase  lag  dalam  kurva  tersebut  tidak  muncul  dikarenakan  adanya  penambahan  starter yang  sudah  memasuki  fase  log.  Hal  tersebut  didukung  oleh  pernyataan  Alexander (1990),  bahwa  starter  yang  ditambahkan  dalam  media  pertumbuhan  mempengaruhi keberadaan  fase  lag  dan  pertumbuhan  yang  dihitung  akan  langsung  menunjukkan adanya fase log. Wijanarka (2014), juga menyatakan bahwa fase log yang terjadi yang demikian  singkat  diakibatkan  adanya  pemberian  starter.  Adanya  starter  ini mengakibatkan  fase  lag  (fase  adaptasi)  hilang  atau  diperpendek  sehingga mengakibatkan lebih cepat memasuki fase logaritmik.
Kultur  memasuki  fase  stasioner  pada  T 18 sampai  T 24 ,  pada  saat  ini  kecepatan pembelahan  menurun  karena  menipisnya  ketersediaan  nutrien  di  dalam  medium  dan terjadi  akumulasi  produk  metabolit  beracun  yang  menghambat  pertumbuhan  khamir. Sebagian  populasi  sel  mulai  mengalami  kematian  setelah  inkubasi  24  jam  karena nutrien  di  dalam  medium  dan energi  cadangan  di  dalam  sel telah  habis.  Hal  ini  sesuai dengan  pernyataan  Gandjar et  al. (2006),  bahwa  fase  lag  terjadi  pada  waktu  inkubasi antara  0-6  jam  yang  merupakan  fase  penyesuaian  sel  dengan  lingkungan  (medium). Fase stasioner terjadi pada waktu inkubasi antara 24-30 jam yang menunjukkan adanya penurunan  jumlah  sel  akibat  berkurangnya  nutrien  dalam  medium.  Hal  ini  didukung oleh pernyataan Dinarvand (2013), bahwa sumber karbon yang digunakan dalam media dapat meningkatkan atau menghambat sintesis enzim, sehingga  mengakibatkan adanya penurunan jumlah sel.
Pada  kurva  pertumbuhan  tersebut,  kultur  khamir  belum  menunjukkan  fase kematian,  karena  hingga  waktu  inkubasi  24  jam,  kurva  pertumbuhan  masih memperlihatkan  kenaikan  sel  khamir,  jadi  yang  terlihat  hanya  fase  log  dan  fase stasioner, sedangkan fase kematian didapatkan setelah inkubasi 24 jam.

## Aktivitas Inulinase Isolat Khamir Yke
Uji  aktivitas  inulinase  merupakan  suatu  uji  yang  digunakan  untuk  mengetahui kadar  inulinase  yang  dihasilkan  oleh  khamir  pada  fase  pertumbuhannya.  Hal  ini didukung  oleh  pernyataan  Sadikin  (2002),  bahwa  jumlah  inulinase  yang  diproduksi dapat ditentukan melalui uji aktivitas inulinase. Dalam penentuan kadar enzim, sumber karbon  merupakan  faktor  penting  yang  mempengaruhi  jumlah  enzim  yang  akan disekresikan.  Hal  tersebut  sesuai  dengan  pernyataan  Gao at  al. (2012),  bahwa  sumber karbon  yang  digunakan  merupakan  faktor  signifikan  dalam  produksi  inulinase, dikarenakan  aktivitas  inulinase  tertinggi  (optimal)  jika  menggunakan  inulin  sebagai satu-satunya sumber karbon.
Prangviset et  al. (2018),  menyatakan  bahwa  satu  unit  aktivitas  inulinase didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang  mampu  membebaskan  1  µmol  fruktosa  per menit.  Wijanarka et  al. (2007),  menambahkan  bahwa  inulinase  adalah  enzim ekstraseluler  yang  disekresikan  keluar  dari  sel,  sehingga  perlu  dilakukan  pemisahan melalui proses sentrifugasi antara supernatan ( crude enzyme ) dan biomassa.
Uji  ini  dilakukan  dengan  cara  menghitung  nilai  transmitter  dari  enzim  (E), substrat (S) serta enzim dan subtrat (ES) pada interval waktu 6 jam sekali dimulai sejak titik  awal  diinokulasikan.  selanjutnya  dilakukan  penghitungan  lebih  lanjut  dengan menggunakan  rumus  tertentu.  Berdasarkan  penelitian  Sari  (2005),  rumus  yang digunakan  untuk  menentukan  aktivitas  enzim  adalah  p(y-x)/BM  x  W,  dengan  satuan Unit/ml. Berdasarkan perhitungan dari rumus tersebut, maka didapatkan kurva aktivitas enzim inulinase seperti pada (Gambar 2).
Gambar 2. Grafik Aktivitas Inulinase Isolat Khamir Yke.
Gambar  2  menunjukkan  bahwa  hasil  yang  diperoleh  pada  uji  aktivitas  inulinase isolat  khamir  Yke  adalah  pada  saat  T 0 dan  T 6 belum  menunjukkan  produksi  inulinase, pada T 12 dan T 18 hasilnya meningkat dibandingkan T 0 dan T 6 yakni sebesar 0.3977 U/ml dan 0.3634 U/ml. T 12 menuju T 18 terjadi penurunan sebesar 0.03634 U/ml yang berarti penurunan  tersebut  tidak  signifikan  dan masih  tergolong  stabil  pada  kisaran  0.3. Hasil produksi  inulinase  tertinggi  dan  optimal  terdapat  pada T 12 yakni  sebesar  0.3977  U/ml, mengalami penurunan pada T 18 dan T 24 seiring dengan menurunnya pertumbuhan isolat Yke yakni 0.3634 U/ml dan 0.3205 U/ml.
Penurunan  akitvitas  enzim  dikarenakan  berkurangnya  sumber  nutrisi  di  dalam medium yang digunakan oleh sel khamir. Selain itu, komposisi medium  merupakan hal yang  sangat crusial .  Hal  tersebut  didukung  oleh  penelitian  Dinarvand  (2013),  yang menyatakan  bahwa  komposisi  media  kultur  adalah  faktor  yang  paling  penting  yang berngaruh  terhadap  produksi  enzim,  pertumbuhan,  dan  fisiologi  dari  sel,  dan meningkatkan  pembentukan  bioproduk.  Sumber  karbon  digunakan  dalam  media  dapat meningkatkan  atau  menghambat  sintesis  enzim.  Selanjutnya,  sumber  nitrogen  yang kompleks  ( yeast  ekstrak dan  NaNO 3 )  pada  konsentrasi  yang  lebih  tinggi  mungkin memiliki efek toksik pada produksi enzim.
Kurva  aktivitas  enzim  di  atas  memperlihatkan  aktivitas  inulinase  tertinggi  yaitu pada  waktu  T 12 dengan  nilai  sebesar  0.3977  U/ml.  Hal  ini  disebabkan  karena  pada waktu  inkubasi  antara  T 6 dan  T 12 merupakan  fase  logaritmik  dari  sel  khamir,  dimana pada  fase  tersebut  inulinase  disekresi  dalam  jumlah  yang  tinggi.  Sesuai  dengan pernyataan  Brock et  al. (1994),  bahwa  enzim  inulinase  digolongkan  sebagai  metabolit primer  yang  biasanya  dibentuk  pada  fase  pertumbuhan  logaritmik,  sehingga  aktivitas enzim  yang  tinggi  dihasilkan  pada  fase  log.  Cazetta et  al. (2010),  menyatakan  bahwa sintesis  inulinase  dimulai  bersamaan  dengan  pertumbuhan  sel  dan  semakin  meningkat setelah inkubasi 6 sampai 8 jam. Aktivitas enzimatik rendah pada fase lag, mengalami peningkatan pada fase logaritmik, dan mulai mengalami penurunan pada fase stasioner.
Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Pessoa et al. (1999), bahwa biosintesis  inulinase  terjadi  dan  distimulasi  pada  fase  log  dimana  pada  fase  tersebut terjadi  pertumbuhan  sel  yang  cepat  ( mycelia  growth ),  dimulai  pada  waktu  inkubasi  24 jam, dan produksi enzim optimal berlangsung pada waktu antara 48 sampai 60 jam dari
proses  fermentasi.  Dinarvand  (2013)  menambahkan  bahwa  intra  dan  ekstraseluler inulinase  serta  aktivitas  invertase  diproduksi  pada  fase  pertumbuhan,  yaitu  fase eksponensial. Produksi maksimum enzim inulinase terjadi pada akhir fase eksponensial.
Aktivitas  enzim  akan  menurun  setelah  pertumbuhan  sel  yang  cepat berakhir  dan  kecepatan  pertumbuhan  melambat  kembali.  Hal  tersebut  didukung  oleh penyataan Dinarvand (2013), bahwa sumber karbon yang digunakan dalam media dapat meningkatkan  atau  menghambat  sintesis  enzim.  Selanjutnya,  sumber  nitrogen  yang kompleks  ( yeast  ekstrak dan  NaNO 3 )  pada  konsentrasi  yang  lebih  tinggi  mungkin memiliki  efek  toksik  pada  produksi  enzim.  Menurut  Hartiko  (2005),  semakin  lama waktu inkubasi, maka semakin besar jumlah gula reduksi sebagai hasil hidrolisis inulin, gula  reduksi  ini  merupakan  katabolit  yang  menghambat  aktivitas  inulinase  jika  dalam jumlah yang besar.
Goutara  dan  Widjandi  (1975)  menyatakan  bahwa  struktur  molekul  fruktosa mengandung  gugus  keton  sehingga  termasuk  dalam  golongan  gula  pereduksi,  oleh karena itu analisis kadar fruktosa dilakukan dengan metode DNS secara spektroskopi (λ 570  nm).  Penentuan  kadar  fruktosa  dihitung  berdasarkan  persamaan  kurva  standar fruktosa,  yaitu  :  Y  =  –  0,0288  +  0,5398  X. Keterangan  :  Y  =  nilai  absorbansi  pada sampel  media,  X  =  kadar  fruktosa  dalam  media  (mg/mL).  Pengukuran  kadar  fruktosa diperlukan  untuk  mengetahui  banyaknya  poli-fruktosa  inulin  yang  telah  dikonversi menjadi monomer fruktosa.
Menurut  Yuliana et  al. (2014),  lama  waktu  inkubasi  media  kultur  khamir berpengaruh  terhadap  nilai  kadar  fruktosa  dan  total  gula  dalam  media.  Semakin  lama waktu  inkubasi,  nilai  kadar  fruktosa  semakin  tinggi  karena  semakin  lama  suatu  bahan dihidrolisis  maka  pemutusan  rantai  yang  terjadi  akan  semakin  banyak  pula,  hampir sebagian  besar  bahan  telah  dihidrolisis  menjadi  monomer.  Sebaliknya,  semakin  lama waktu  inkubasi,  nilai  kadar  total  gula  semakin  turun,  karena  banyaknya  polisakarida semakin  berkurang  terpotong-potong  menjadi  molekul  yang    lebih  sederhana,  seperti oligosakarida, disakarida dan monosakarida.

## KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilaksanakan, kesimpulan yang dapat  diambil  adalah  telah  ditemukan  satu  isolat  khamir  potensial  penghasil  enzim inulinase  yang  diisolasi  dari  Tanaman  Kersen  ( Muntingia calabura L.).  Isolat  tersebut dinamakan isolat khamir Yke. Pertumbuhan isolat khamir Yke tidak mengalami fase lag dengan  hasil  optimal  pada  T 12 yang  merupakan  fase  logaritmik  dengan  nilai pertumbuhan  sebesar  0.7959.  (fase  adaptasi).  Aktivitas  Inulinase  pada  isolat  tersebut paling  optimal  pada  T 12 dengan  nilai  sebesar  0.3977  U/ml  dan  merupakan  fase logaritmik dari sel khamir, dimana pada fase tersebut inulinase disekresi dalam jumlah yang tinggi.

## DAFTAR PUSTAKA
Alexander,  M.A.,  and  Jeffries,  T.W.  1990.  "Respiratory  Efficiency  and  Metabolize Partitioning  as  Regulatory  Phenomena  in  Yeast,  Enzyme  Microbe." Technol :  2- 29.
Brock,  T.  D.,  Madigan.  M.T.,  Martinko.  J.M.,  and  Parker,  J.  1994. Biology  of Microorganism. 5th  Edition.  PrenticeHall,  Inc.,  Englewood  Cliffs  New  Jersey, USA.
Cazetta,  M.  L.,  Rubens  M  dan  Jonas  C.  2010.  Effects  of  Culture  Conditions  on  the Production  of  Inulinase  by Kluyveromyces  marxianus . Brazilian  Archives  of Biology and Technology. Vol.53 pp. 701-705.
Dinarvand,  M.,  Malahat  R.,  Malihe  M.,  Seyed  D.J.,  Mohsen  Z.,  Sahar  A.,  dan Arbakariya  B.  A.  2013.  “Effect  of  C/N  Ratio  and  Media  Optimization  through Response  Surface  Methodology  on  Simultaneous  Productions  of  Intraand Extracellular Inulinase
and Invertase from Aspergillus niger ATCC 20611”. BioMed Research International. Vol 2013. ID 508968 pages 13.
Ertan  F.,  Kaboglu.  T.  A.C,  Ekinci  F,  and.  Bakar.  E.  2003.  Determination  of  Optimum Cultivation  Conditions  on  the  Production  of  Inulinase  from  Rhizoctonia  solani. Pakistan Journal of Biological Science. 6(16): 1386- 1388
Franck,  A.  &  Leenheer  Leen  De.  2003.  “Inulin”.  Email:  ann.franck@orafti.com. Diakses 27 Agustus 2013.
Gao,  Jiaoqi.,  Lijie  Chen.,  and  Wenjie  Yuan.  2012.  “Effects  of  Carbon  Sources,
Oxygenation,  and  Ethanol  on  the  Production  of  Inulinase  by Kluyveromyces
marxianus YX01”. Journal  Bioscience  and  Biotechnology .  Vol  1  (2)  :  155-161. ISSN : 1314-6246.
Gandjar,  I.,  Sjamsuridzal  W.,  dan  Oetari  A.  2006.  Mikologi  Dasar  dan  Terapan. Yayasan Obor Indonesia. Jakarta. 178 hlm.
Nakamura,  T.,  Ogata,  Y.,  Shitasa,.,  Nakamura,  A.  &  Ohta,  K.  1995.  Continuous Production  of  Fructose  Syrup  from  Inulin  by  Immobilized  Inulinase  from Aspergillus niger Mutan 817. Journal of Fermentation and Bioeng , hal : 164-169.
Ogata,  Y.,  (Comite  Members)  1995. Medicinal  Herb  Index  in  Indonesia  (Second Edition) . PT. Eisai Indonesia. Jakarta. Hal 75.
Pessoa,  A.,  M.  Vitolo.  1999.  Inulinase  from Kluyveromyces  marxianus :  Culture Medium  Composition  and  Enzyme  Extraction. Brazilian  Journal  of  Chemical Engineering . ISSN 1678-4383.
Prangvingset,  Kotchakorn.,  Molnapat  Songpim.,  Natthawut  Yodsuwan.,  Siwaporn Wannawilai.,  Monchai  Dejsungkranont,  Prapas  Changlek.,  dan  Sarote Sirisansaneeyakul.  2018.  “Fructose  Production  fom  Jerusalem  arthicoke  Using Mixed Inulinases”. Agriculture and Natural Resources . 53 : 132-139.
Sari,  Siti  Lusi  Arum.,  Hartiko,  Hari.  2005.  "Aktivitas  Inulinase  Jamur  yang Diisolasi  dari  Tanah  Sekitar  Umbi  Dahlia  (Dahlia  ponnata  cav)." BioSmart Vol 7 No 1 , hal: 1-5.
Saryono,  Fitriani,  R.  Ukun  M.  S.  Soedjanaatmadja.  2016.  Beberapa  Mikroorganisme yang  Menghasilkan  Enzim  Inulinase,  Isolasi  dan  Karakterisasi  Enzim  dari Aspergillus  flavus  Gmn11.2 Galur  Lokal.  Chimica  et  Naura  Acta Vol.  4  No..3  : 165-174.
Wijanarka,  M.  G.  Isworo  Rukmi,  Lynda  Sutrisna.  2007.  Pengaruh  Pepton  dan  Waktu Inkubasi terhadap Produksi Inulinase oleh Pichia alni DUCC-W4 Berbahan Dasar Tepung Umbi Dahlia ( Dahlia variabilis Willd.). BIOMA Vol 9 No. 2 Hal. 52-57
Wijanarka,  Endang,  Sutariningsih  S.,  Kumala,  Dewi.,  Ari,  Indriyanto.  2014. "Kemampuan  Fusan  F1  dalam  Memproduksi  Inulinase." BIOMA  vol  16 ,  114  - 118.