## SKRINING AKTIVITAS KLOROFILASE PADA DAUN KATUK
( Sauropus androgynus )
CHLOROPHYLLASE ACTIVITY OF KATUK ( Sauropus androgynus )

## LEAVES

## Rehmadanta Sitepu1*), Heryanto2
Info Artikel Abstrak Sejarah Artikel : Latar  Belakang: Klorofilase  ( Chlase )  merupakan  salah  satu  enzim  yang terlibat  dalam  degradasi  klorofil.  Enzim  ini  berfungsi  dalam  mendegradasi klorofil  menjadi  fitol  dan  klorofilid.  Beberapa  literatur  menunjukkan  aktivitas klorofilase yang tinggi ada pada tanaman-tanaman herba. Tujuan: Penelitian ini bertujuan  untuk  mencari  kandidat  enzim  klorofilase  dari  beberapa  tanaman herba  di  Indonesia,  khususnya  herbal.  Kandidat  klorofilase  tesebut  nantinya dapat digunakan pada Photodynamic Therapy (PDT). PDT sangat efektif dalam membunuh  sel  kanker  dengan  mengubah  oksigen  dilingkungan  sel  kanker mejadi  oksigen  radikal  sehingga  efektif  membunuh  sel  kanker. Metode: Skrining  aktivitas  klorofilase  diamati  pada  daun  Kumis  Kucing  ( Orthosiphon aristatus ),  daun  Katuk  ( Saoropus  androgynus ),  dan  daun  Pecut  Kuda ( Stachytarpheta  jamaicensis ). Hasil: Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa dengan menggunakan metode skrining awal aktivitas klorofilase dan pengujian menggunakan  ekstrak  klorofil  daun  Bayan  sebagai  substrat,  maka  dapat disimpulkan  daun  Katuk  memiliki  aktivitas  klorofilase  yang  baik. Simpulan dan saran: isolat aseton daun Katu memiliki aktivitas klorofilase dan sebaiknya dapat dilakukan karakterisasi profil protein klorofilase tersebut.
Diterima 1 Maret 2018 Disetujui 1 Juni 2018
Dipublikasikan 16 Juni
2018

## Kata Kunci:
Klorofilase, Kumis Kucing, Katuk, dan daun Pecut Kuda
Keywords: Chlorophylase,
Orthosiphon aristatus, Saoropus  androgynous, Stachytarpheta jamaicensis.

## Abstract
Background: Chlorophylase (Chlase) is one of the enzymes involved in chlorophyll degradation.  This  enzyme  functions  in  degrading  chlorophyll  to  phytol  and chlorophyllid.  Some  literature  shows  high  activity  of  chlorophylase  exists  in herbaceous  plants. Objectives : This  study  aims  to  find  chlorophylase  enzyme candidates  from  some  herbaceous  plants  in  Indonesia,  especially  herbs.  The chlorophyllase candidate can then be used in Photodynamic Therapy (PDT). PDT is very  effective  in  killing  cancer  cells  by  converting  oxygen  in  the  environment  of cancer cells into radical oxygen so effectively kill cancer cells. Methods: Screening of  chlorophyllase  activity  observed  on  leaves  of  Kumis  Kucing  ( Orthosiphon aristatus ),  leaves  of  Katuk  ( Saoropus  androgynus ),  and  leaves  of  Pecut  Kuda ( Stachytarpheta jamaicensis ). Results: The results of this study indicate that by using the initial screening method of chlorophylase activity and testing using Chlorophyll extract  of  Spinach  as  substrate,  it  can  be  concluded  leaves  of  Katuk  has  good chlorophylase activity. Conclusions and suggestions: Katu leaf acetone isolate has chlorophylase  activity  and  it  is  preferable  to  characterize  the  protein  profile  of  the chlorophylase.

## PENDAHULUAN
Photodynamic Therapy (PDT) merupakan suatu pengobatan terhadap penyakit, khususnya kanker, melalui suatu pemberian photosensitizer (PS) yang kemudian akan diaktivasi oleh suatu gelombang  cahaya  tertentu.  Oksigen  yang  berada  disekitar  PS  yang  sudah  teraktivasi  akan diubah  menjadi  oksigen  singlet  yang  memicu  apoptosis  dan  nekrosis  sel  kanker.  Ada  juga mekanisme dimana PS bereaksi dengan lingkungan mikro di sekitar sel kanker yang selanjutnya mentransfer elektron ke oksigen sehingga menghasilkan spesies oksigen yang reaktif yang akan membunuh sel kanker.
Pada  umumnya  PS  merupakan  turunan    klorofil.  Fungsi  klorofil  yang  dapat  menyerap cahaya  menjadi  energi  merupakan  implementasi  dari  struktur  klorofil  yang  khas.  Stuktur  ini disusun oleh porfirin sebagai sturktur utama. Salah satu produk PDT yang telah disetujui FDA pada  tahun  1990-an  adalah  Photofrin®.  Produk  ini  digunakan  untuk  perlakuan  terhadap  sel kanker organ dan penyakit kulit. Obat ini merupakan turunan forfirinoid. Turunan klorofil yang sedang banyak dikembangkan sebagai PDT adalah feoforbid, struktur dimana logam Mg hilang dari struktur klorofil.  Feoforbid ini merupakan senyawa kromofor yang memiliki serapan pada panjang  gelombang  antara  650  nm  dan  670  nm.  Pada  penelitian  Valentina  dkk.  Telah  dibuat suatu konjugasi feoforbid a dengan molekul monometoksi-polietilen glikol untuk meningkatkan solubilisasinya di dalam darah (Limantara, 2006).
Penelitian  ini  memang  bukan  penelitian  yang  akan  langsung  dapat  menuntun  kita  untuk dapat langsung menemukan kandidat PDT berikutnya. Namun, penelitian ini adalah awal untuk dapat  membuat  turunan  klorofil  sehingga  kita  dapat  menyediakan  kandidat  PDT.  Klorofilase adalah suatu enzim yang mampu memutuskan klorofil secara enzimatik sehingga terbentuk fitol dan  klorofilid.  Dari  beberapa  literatur,  belum  ditemukan  mekanisme  lain  baik  secara  fisik maupun kimiawi untuk dapat memutus rantai panjang ekor klorofil ini.
Untuk  itulah  skrining  aktivitas  klorofilase  ini  akan  menjadi  sangat  penting  untuk menemukan  kandidat  klorofilase  baru  dari  alam  Indonesia  yang  dapat  digunakan  dalam pembuatan turunan klorofil sebagai dasar kita untuk mengarahkan penelitian ini ke suatu proyek yang besar, penemuan kandidat PDT baru

## METODE PENELITIAN

## Alat
Timbangan Sartorius BT2245, blender laboratorium Waring Commercial,), spektrofotometer  Labtech,  mikropipet  soccorex  1000  µl,  sentrifugator  Hettich,  oven  Binder, Kulkas untuk menyimpan sampel.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Kumis Kucing, daun Katuk, daun Pecut  Kuda,  Bayam,  pelarut  seperti  aseton,  n-heksan,  etanol,  akuades,  dan  buffer  40  mM KH2PO4-Na2HPO4 pH 7,0

## Prosedur Rinci

## Skrining Awal Identifikasi Klorofilase
Masing-masing  sampel  dipreparasi  dengan  cara  dihaluskan,  kemudian  perasan  air sampel sayuran ditampung. 0,5 ml filtrat air sampel ditambahkan 0,5 ml aseton dan 1 ml buffer 40 mM KH 2 PO4-Na 2 HPO4 pH 7,0. Pembuatan preparat ini dilakukan dua perlakuan yang sama (Sampel  1  dan  2).  Sampel  1  diinkubasi  pada  suhu  ruang  dan  sampel  2  diinkubasi  pada  suhu 35 o C.  Inkubasi  ini  dilakukan  selama  10 menit.  Selanjutnya  tambahkan  2  ml  heksan:aseton  2:1 ke  dalam  preparat,  kemudian  di  vorteks  kurang  lebih  5  menit.  Sampel  disentrifugasi  selama  5 menit dengan kecepatan 14.000 rpm.  Fase aseton yang diperoleh dari hasil sentrifugasi diukur pada panjang gelombang 750 nm, 663 nm, dan 645 nm.

## Isolasi Klorofil dari Daun Bayam
5 g daun  Bayam dilarutkan dengan 30 mL  aseton dengan cara digerus di dalam mortir hingga ekstrak klorofil dapat ditarik semua ke dalam aseton. Isolat disaring dengan kasa untuk memperoleh ekstrak klorofil.

## Penentuan Aktivitas Klorofilase Ekstrak Aseton Daun Bayam
Sampel yang memiliki selanjutnya diuji dengan pigmen klorofil standar. Sejumlah filtrat tanaman  seperti  disebutkan  di  atas  dihomogenisasi  dengan  air  diambil  dan  diekstraksi  dengan aseton  untuk  menghilangkan  klorofil  yang  tersisa.  Selanjutnya  residu  dikeringkan  dari pelarutnya.  Residu  yang  telah  kering  dihomogenisasi  dengan  buffer  fosfat  pH  7.  Untuk menentukan aktivitas klorofilase, 0,15 ml residu ditambahakan dengan 1 ml dapar fosfat, 0,5 ml pigmen standar klorofil a dan 0,35 ml H 2 O. Campuran ini diinkubasi pada sushu 35 o C  selama 10 menit. Kemudian tambahkan 2 ml aseton dan 4 ml n-Heksan. Campuran divorteks selama 5 menit.  Hasilnya  disentrifugasi  14.000  rpm  selama  5  menit.  Fase  n-heksan  dan  fase  aseton diambil secara terpisah dan diukur pada panjang gelombang 750 nm, 663 nm, dan 645 nm.

## Penentuan Konsentrasi Klorofil a
Penentuan  konsentrasi  klorofil  a  yang  digunakan  pada  kedua  metode  di  atas  dihitung dengan menggunakan rumus :

## Analisis Statistik
Semua prosedur analitis dilakukan tiga ulangan secara independen (n = 3) dan hasilnya dinyatakan  sebagai  rata-rata  ±  S.D.  (standar  deviasi).  Signifikansi  perbedaan  antara  nilai  rata- rata parameter Chlase dilakukan analisis statistik satu varian (ANOVA). Nilai p ≤ 0,01 dianggap menjadi asumsi signifikansi secara statistik.

## HASIL PENELITIAN
Daun Kumis  Kucing, daun Katuk, dan daun Pecut Kuda   adalah tanaman yang digunakan dalam  skrining  awal  aktivitas  klorofilase  dengan  menggunakan  klorofil  yang  berasal  dari tanaman  itu  sendiri.  Penambahan  larutaan  penyangga  fosfat  pH  7,4  digunakan  untuk mengaktivasi  protein  klorofilase.  Pelarut  yang  digunakan  adalah  aseton  dan  n-heksan.  Sampel diinkubasi  pada  suhu  35 o C  selama  10  menit.  Kemudian  fase  aseton  diukur  untuk  menentukan konsentrasi  klorofil.  Kontrol  yang  digunakan  adalah  isolat  yang  diinkubasi  pada  suhu  ruang. Hasil  menunjukkan  bahwa  tanaman  yang  memiliki  aktivitas  klorofilase  pada  skrining  awal aktivitas  klorofilase  ini  adalah  daun  Katuk  seperti    pada  Gambar  1.  Gambar  1  menunjukkan bahwa konsentrasi klorofil sampel daun Katuk  yang diinkubasi 35 o C menunjukkan penurunan sekitar 30% dibandingkan dengan kontrol pada suhu kamar.
Untuk  menguji  aktivitas  klorofilase,  isolat  tanaman  sejumlah  klorofil  yang  diperoleh  dari ekstrak  daun  bayam  dengan  konsentrasi  yang  sama,  dan  diinkubasi  di  dalam  oven  selama  10 menit pada suhu 35 o C. Metode dilakukan hampir sama dengan metode yang pertama, hanya saja perlu  dilakukan  pencucian  klorofil  tanaman    sampel  dengan  aseton  dan  ditambahkan  dengan ekstrak klorofil bayam dengan konsentrasi yang sama untuk tiap-tiap tanaman. Kemudian untuk memperoleh  protein,  sampel  disentrifugasi  dan  endapannya  diambil  dan  ditambahkan  dengan aseton untuk dilarutkan kembali. Pada metode ini, fase aseton diisolasi dan diukur pada λ 645 nm, 663 nm, dan 750 nm.
Gambar 1 Konsentrasi klorofil daun Katuk pada pengujian skrining awal aktivitas klorofilase
Dari hasil yang ditunjukkan oleh Gambar 2 menunjukkan bahwa isolat yang diperoleh dari daun  Katuk  menunjukkan  penurunan  konsentrasi  klorofil  bila  dibandingkan  dengan  kontrol yang mengindikasikan adanya aktivitas klorofilase pada tanaman tersebut.

## PEMBAHASAN
Dari  skrining  awal  tiga  spesies  tanaman  yang  berbeda,  yaitu  daun  Kumis  Kucing,  daun Katuk,  dan  daun  Pecut  kuda,    dari  hasil  isolasi  klorofil  yang  diperoleh  dari  fase  aseton,  maka dapat terlihat hanya pada daun Katuk yang memiliki aktivitas klorofilase. Isolat yang diperoleh dari fase aseton dari daun Kumis  Kucing dan daun Pecut  Kuda tidak menunjukkan perubahan konsentrasi  klorofil  yang  signifikan  sehingga  dari  hal  ini  disimpulkan  tidak  terdapat  aktivitas klorofilase  pada  kedua  tanaman  ini.  Namun  demikian,  prosedur  yang  dilakukan  dalam identifikasi awal ini memiliki banyak kelemahan, seperti jumlah klorofil yang digunakan tidak seragam karena bergantung dari sampel dan bagian tanaman. Namun melalui skrining awal ini dapat  digunakan  sebagai  dasar  dalam  uji  aktivitas  lanjutan  dengan  menggunakan  ekstrak klorofil  yang  diperoleh  dari  daun  Bayam.  Gambar  1  menunjukkan  bagian  tanaman  yang memiliki aktivitas klorofilase pada daun Katuk.
Untuk  mengevaluasi  hasil  skrining  awal,  maka  dilakukanlah  pengujian  isolat  aseton masing-masing  bagian  tanaman  tersebut  dengan  menggunakan  ekstrak  klorofil  daun  Bayam. Prosedur  yang  digunakan  hampir  sama  dengan  skrining  awal,  hanya  saja  tidak  menggunakan klorofil  yang  berasal  dari  tanaman  tersebut,  tetapi  menggantinya  dengan  ekstrak  klorofil  dari daun  bayam.  Dengan  menggunakan  ekstrak  klorofil  daun  Bayam,  maka  konsentrasi  klorofil yang diberikan sama sehingga dapat membandingkan aktivitas klorofilase antara tanaman yang satu dengan yang lainnya.
Dari hasil ini menunjukkan adanya aktivitas klorofilase hanya pada daun Katuk. Gambar 2 menunjukkan tingkat penurunan konsentrasi ekstrak klorofil dari daun Bayam pada isolat daun Katuk  dibandingkan  dengan  kontrol.    Hal  ini  mengkonfirmasi  kembali  terhadap  aktivitas klorofilase yang diperoleh dari   metode skrining awal untuk aktivitas klorofilase ini.
Rehmadanta Sitepu | Skrining Aktivitas Klorofilase Pada…..
Jurnal Wiyata, Vol. 5 No. 1 Tahun 2018
Gambar 2 Penurunan konsentrasi klorofil daun Bayam pada perlakuan isolate  daun Katuk dibandingkan dengan kontrol.
Rehmadanta Sitepu | Skrining Aktivitas Klorofilase Pada….. Jurnal Wiyata, Vol. 5 No. 1 Tahun 2018
Nilai klorofil a total dari kontrol diperoleh dengan rata-rata 4,12 ± 0,49 sedangkan untuk nilai konsentrasi klorofil dari isolat daun Katu diperoleh dengan rata-rata 4,01 ± 1,20. Meskipun nilai penurunannya tidak bergitu banyak, tetapi hasil ini dapat dijadikan acuan untuk melakukan penelitian lanjut terhadap klorofilase yang ada pada daun Katu.

## SIMPULAN
Dari  hasil  ini  dapat  diperoleh  kesimpulan  bahwa  aktivitas  klorofilase  dapat teridentifikasi  pada  bagian  tanaman  daun  Katu.    Adanya  aktivitas  klorofilase  ini  perlu dilakukan penelitian lebih lanjut seperti  isolasi klorofilase, optimasi pH dan suhu, serta sekuensing    untuk  menentukan  urutan  asam  amino  protein  ini.  Namun  hal  ini membutuhkan  waktu  dan  biaya  yang  cukup  tinggi.  Penelitian  selanjutnya  akan dilakukan  ke  arah  isolasi  dan  optimasi  klorofilase  untuk  dapat  dilakukan  penentuan urutan asam amino enzim tersebut.

## SARAN
Penentuan aktivitas klorofilase pada daun Katu ini perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mulai dari karakterisasi enzim, pemurnian enzim, hingga penentuan urutan asam amino dari enzim klorofilase yang ada pada daun Katu ini.

## REFERENSI
Abrahamse,  H.,  Hamblin,  M.,  Abrahamse,  H.,  &  Hamblin,  M.  R.  (2016).  New
photosensitizers for
photodynamic therapy,
(February).
doi:10.1042/BJ20150942
Care, B. (2015). Photodynamic therapy in colorectal cancer treatment : The state of the art in clinical trials Photodynamic therapy in colorectal cancer treatment : The state of the art in clinical, (April). doi:10.1016/j.pdpdt.2015.04.004
Drazkiewicz,  M.,  &  Krupa,  Z.  (1991).  The  participation  of  chlorophyllase  in chlorophyll metabolism. Acta Societatis Botanicorum Poloniae.
Gupta,  S.,  Gupta,  S.  M.,  &  Kumar,  N.  (2011).  Role  of  chlorophyllase  in  chlorophyll homeostasis  and  post-harvest  breakdown  in  Piper  betle  L  .  leaf, 48(October), 353–360.
H,  DMínguez-mosquera,  M.  I.  (2001).  Properties  of  Chlorophyllase  from  Capsicum annuum L. Fruits. Z. Naturforsch, 56c, 1015–1021.
Ion,  R.-M.,  Sorescu,  A.-A.,  &  Nuta,  A.  (2014).  NEW  METALLO-SENSITIZERS  IN PHOTODYNAMIC THERAPY. Advanced Research in Scientific Areas,
(5), 223–228.
Łabuz,  J.,  Sztatelman,  O.,  &  Gabrys,  H.  (2011).  Expression  of  Enzymes  Involved  in Chlorophyll  Catabolism  in  Arabidopsis  Is  Light  Controlled  1  [  W  ], 157(November), 1497–1504. doi:10.1104/pp.111.185504
Limantara,  L.,  Koehler,  P.,  Wilhelm,  B.,  Porra,  Robert,  J.,  &  Scheer,  H.  (2006).
Photostability  of  Bacteriochlorophyll  a  and  Derivatives:  Potential Sensitizers  for  Photodynamic  Tumor  Therapy.  Photochemistry  and Photobiology.
Marise, L., Calito, G. M. F., Chorilli, M., Giusti, J. S. M., Bagnato, V. S., Soukos, N. S., …  Fontana, C. R. (2016). Polymeric Nanoparticle-Based Photodynamic Therapy  for  Chronic  Periodontitis  in  Vivo.  International  Journal  of Molecular Science, 17(765). doi:10.3390/ijms17050769
Oa, I. L., Shemer, T. A., Harpaz-saad, S., Belausov, E., Lovat, N., Krokhin, O., … Eyal, Y.  (2008).  Citrus  Chlorophyllase  Dynamics  at  Ethylene-Induced  Fruit Color-Break :  A  Study  of  Chlorophyllase  Expression  ,  Posttranslational Processing  Kinetics  ,  and  in  Situ,  148(September),  108–118. doi:10.1104/pp.108.124933
Ocakoglu, K., Er, O., Kiyak, G., Lambrecht, F. Y., Gunduz, C., & Kayabasi, C. (2015). 131I-Zn-Chlorophyll  Derivative  Photosensitizer  for  Tumor  Imaging  and Photodynamic  Therapy.  International  Journal  of  Pharmaceutics, 493(July), 96–101. doi:10.1016/j.ijpharm.2015.07.047
Pellosi, D. S., Tessaro, A.  L., Moret,  F.,  Gaio, E., Reddi, E., Caetano, W., … Noboru Hioka.  (2016).  Pluronic  ®  mixed  micelles  as  efficient  nanocarriers  for benzoporphyrin  derivatives  applied  to  photodynamic  therapy  in  cancer cells.  Journal  of  Photochemistry  &  Photobiology,  A :  Chemistry, 314(August), 143–154.doi:10.1016/j.jphotochem.2015.08.024
Ramos, U. D., Ayub, L. G., Reino, D. M., Grisi, M. F. M., Jr., M. T., Souza, S. L. S., …
Rehmadanta Sitepu | Skrining Aktivitas Klorofilase Pada….. Jurnal Wiyata, Vol. 5 No. 1 Tahun 2018
Novaes,  A.  B.  (2015).  Antimicrobial  Photodynamic  Therapy  as  an alternative  to  Systemic  Antibiotics:  Results  from  a  Double-Blind, Randomized,  Placebo-  Controlled,  Clinical  Study  on  type  2  Diabetics. Journal of Clinical Periodontology, (June 2016). doi:10.1111/jcpe.12498
Robertson,  C.  A.,  Evans,  D.  H.,  &  Abrahamse,  H.  (2009).  Journal  of  Photochemistry and  Photobiology  B :  Biology  Photodynamic  therapy  (  PDT  ):  A  short review on cellular mechanisms and cancer research applications for PDT. Journal  of  Photochemistry  &  Photobiology,  B:  Biology,  96(1),  1–8. doi:10.1016/j.jphotobiol.2009.04.001
Sytykiewicz,  H.,  Sprawka,  I.,  Czerniewicz,  P.,  &  Sempruch,  C.  (2013).  Biochemical characterisation of chlorophyllase from leaves of selected Prunus species — A comparative study, 60.
Xu,  J.,  Gao,  J.,  &  Wei,  Q.  (2016).  Combination  of  Photodynamic  Therapy  with Radiotherapy for Cancer Treatment. Jounal of Nanomaterials, 2016, 1–7.