## ISOLASI DAN IDENTIFIKASI  BAKTERI YANG BERPOTENSI SEBAGAI PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA INDUSTRI PENYAMAKAN KULIT PT. ADHI SATRIA ABADI (ASA), YOGYAKARTA
Isolation and Identification of Bacteria that Has Potential as Producer of Protease Enzyme in the Tannery Industry, PT. Adi Satria Abadi (ASA), Yogyakarta

## M. I. Said dan J. C. Likadja
Laboratorium Teknologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin Jl.Perintis Kemerdekaan Km. 10 Makassar 90245 email : irfanmks@yahoo.com

## ABSTRACT
Bacteria are one of the microorganisms that have the potential as a producer of protease enzyme. Tannery industrial waste is one of the media predicted to contain a number of proteolytic bacteria because of the waste generated is composed largely of protein and fat which are good as growing medium for bacteria. This study aimed to isolate and identify bacteria that have the potential as a producer of protease enzyme. Research  conducted  at  the  waste  water  processing  installation  (WWPI),  tannery industry of PT.Adi Satria Abadi (ASA), Sitimulyo, Bantul, Yogyakarta and Laboratory of  Animal  Product  and  Food,  Faculty  of  Animal  Science,  Gadjah  Mada  University, Yogyakarta. Solid waste (SW), waste water (WW) and soil (S) around the industry are used  as  source  of  isolates.  Random  screening  methods  used  for  isolation  and identification. The results obtained by isolation and identification of 1264 colonies (621 colonies from the SW, 156  of the WW and 487 of S). Thirty one colonies (2.5%) were identified as potentially proteolytic bacteria by the presence of clear zone (halo) around the colony while the 1.233 colonies (97.5%) were not potential. The third colony isolates look like a white crust, firmly attached to the medium, round, white to resemble wool and convex. Bacterial isolates from the S and SW at pH 10 and 12 were potential as a source of proteases with Proteolytic Index (PI)≥3, while the one isolated from WW was less potential.
Keywords :  Bacteria, Protease  enzyme, Tannery  industry waste, Clear zone,  Proteolytic index

## ABSTRAK
Bakteri  merupakan  salah  satu  mikroorganisme  yang  berpotensi  sebagai penghasil  enzim  protease.  Limbah  industri  penyamakan  kulit  merupakan  salah  satu media  yang  diduga  mengandung  sejumlah  bakteri  proteolitik  karena  limbah  yang dihasilkan  sebagian  besar  terdiri  atas  protein  dan  lemak  yang  merupakan  media tumbuh  yang  baik  untuk  bakteri.    Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  dan mengidentifikasi bakteri yang berpotensi sebagai penghasil enzim protease.  Penelitian dilaksanakan di Instalasi Pengolah Air Limbah (IPAL), industri penyamakan kulit PT.
Adhi  Satria  Abadi  (ASA),  Sitimulyo,  Bantul,  Yogyakarta  dan  Lab.  Pangan  Hasil Ternak,  Fak.Peternakan  UGM.  Limbah  Padat  (LP),  Limbah  Cair  (LC)  dan  tanah  (T) sekitar  industri  digunakan  sebagai  sumber  isolat.  Proses  isolasi  dan  identifikasi menggunakan  metode screening random . Hasil  isolasi  dan  identifikasi  diperoleh  1.264 koloni  (621  koloni  dari  LP,  156  dari  LC  dan  487  dari  T).  Sebanyak  sekitar  31  koloni (2,5%) diidentifikasi berpotensi sebagai bakteri proteolitik yang ditandai adanya zona bening  (halo)  disekitar  koloni  dan  sisanya  1.233  koloni  (97,5%)  tidak  berpotensi. Koloni  ketiga  isolat  tampak  seperti  kerak  putih,  melekat  erat  pada  medium,  bulat, putih dengan tepian menyerupai wol serta cembung.  Isolat bakteri dari T dan LP pada pH  10  dan  12  berpotensi  sebagai  sumber  protease  dengan  Indeks  Proteolitik  (IP)≥3 sedangkan dari LC kurang berpotensi.
Kata Kunci : Bakteri, Enzim protease, Limbah industri penyamakan kulit, Zona bening, Indeks proteolitik

## PENDAHULUAN
PT.Adhi  Satria  Abadi  merupakan  salah  satu  industri  penyamakan  kulit    di Provinsi DI.Yogyakarta yang setiap harinya mengolah kulit mentah menjadi kulit jadi ( leather ).  Industri  penyamakan  kulit  dalam  prosesnya  melibatkan  sejumlah  aktivitas, baik fisik, kimiawi maupun biologis.  Adanya aktivitas biologis dalam hal ini cemaran mikroorganisme  tentunya  memiliki  pengaruh  yang  sangat  besar  baik  bagi  karyawan pada  industri  tersebut  maupun  terhadap  masyarakat  yang  ada  disekitarnya. Penelitian  menunjukkan  bahwa  kulit-kulit  yang  disimpan  maupun  diproses  pada industri  penyamakan  kulit  telah  banyak  yang  ditumbuhi  oleh  mikroorganisme  baik yang bersifat patogen maupun yang tidak (Said, 2000).
Salah  satu  aktivitas  biologis  pada  limbah  penyamakan  kulit  yang  memiliki pengaruh  terhadap  industri  maupun  lingkungannya  adalah  adanya  kemungkinan terjadinya  cemaran  mikroorganisme  khususnya  bakteri.  Mengingat  limbah penyamakan  kulit  sebagian  besar  terdiri  atas  protein,  lemak  dan  air,  maka  potensi untuk  menjadi  media  tumbuh  bakteri  sangatlah  besar.  Bakteri  yang  tumbuh  pada limbah  tersebut  tentunya  tidak  semuanya  memberikan  dampak  negatif,  namun  juga beberapa  diantaranya  memberikan  dampak  positif  yang  memungkinkan  dapat dimanfaatkan untuk kemaslahatan manusia.
Salah satu dampak positif dari bakteri adalah potensinya sebagai sumber enzim protease  (Suhartono,  2000).  Penggunaan  enzim  protease  dalam  berbagai  produk komersial  semakin  meluas  sejalan  dengan  kemajuan  dalam  bidang  bioteknologi. Enzim  protease  banyak  dimanfaatkan  dalam  bidang  industri  penyamakan  kulit, pengolahan pangan, industri deterjen, tekstil, makanan, hidrolisat protein, pengolahan susu,  farmasi,  makanan,  bir,  film  maupun  prosessing  limbah  (Moon  dan  Parulekar 1993).  Mikroorganisme  merupakan  salah  satu  sumber  enzim  yang  paling  potensial dibandingkan  tanaman  dan  hewan.  Penggunanan  mikroorganisme  lebih menguntungkan  karena  pertumbuhannya  cepat,  dapat  tumbuh  pada  substrat  yang murah, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi pertumbuhan dan  rekayasa  genetik,  serta  mampu  menghasilkan  enzim  yang  ekstrim.   Keberadaan mikroorganisme yang unggul merupakan faktor penting dalam proses produksi enzim
secara  massal,  sehingga  upaya  untuk  mencari  mikroorganisme  indigenous  sebagai penghasil protease sangat perlu dilakukan di Indonesia. Keragaman hayati yang tinggi memberikan peluang yang besar untuk mendapatkan mikroorganisme yang potensial untuk dikembangkan sebagai penghasil enzim (Akhdiya, 2003).
Penelitian-penelitian  yang  berkaitan  dengan  karakteristik  mikroorganisme khususnya  bakteri  yang  berpotensi  sebagai  penghasil    enzim  protease  dari  limbah penyamakan  kulit  belum  banyak  dipublikasikan  sehingga  hal  ini  sangat  menarik untuk dikaji secara lebih mendalam. Salah satu tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi  dan  mengidentifikasi  bakteri  yang  berpotensi  sebagai  penghasil  enzim protease  dari  limbah  industri  penyamakan  kulit  PT.Adhi  Satria  Abadi  (ASA), Yogyakarta.

## MATERI DAN METODE

## Lokasi penelitian
Penelitian  dilaksanakan  di  Unit  Instalasi  Pengolah  Air  Limbah  (IPAL)  Industri Penyamakan  Kulit  PT.  Adhi  Satria  Abadi  (ASA),  Sitimulyo,  Bantul,  Yogyakarta. Proses  isolasi  dan  identifikasi  bakteri  dilaksanakan  di  Laboratorium  Laboratorium Pangan Hasil Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

## Bahan dan alat
Materi  utama  penelitian  ini  adalah  limbah  proses  penyamakan  kulit  berupa Limbah Padat (LP), Limbah Cair (LC) yang diperoleh dari IPAL industri penyamakan kulit  PT.ASA  serta  Tanah  (T)  di  sekitar  industri    tersebut.    Bahan-bahan  lain  yang digunakan antara lain : yeast ekstrak ( oxoid ), nutrien agar (NA), susu skim, NaCl 9% ( oxoid ), buffer universal (pH 8, 10 dan 12),  larutan kasein 2,5% ( E.Merck ) dan alkohol 70%.
Peralatan dalam proses isolasi dan identifikasi bakteri proteolitik adalah autoklaf ( sterilizer  all  America ),  Laminar  Air  Flow  ( Telstar  B10-11A/P ),  oven  ( memmert ),  water bath ( Riko RS-12TE ), Vortex ( 16700 Mixer, Maxi-Mix ), sentrifuge ( Sorval Biofuge Stratos ), makro/mikropipet ( socorex ), pH meter ( Toa pH meter HM-5S ), timbangan ( Acculab VI- 200 ),  stirrer  ( Cimarec  3 ),  tabung  reaksi,  tabung  durham,  jarum  ose,  pipet  tetes, petridish,  mikroskop  ( Nikon  eclipse  E  600 ),  erlenmenyer,  kaca  preparat  dan  lampu bunsen.

## Pelaksanaan penelitian
Proses  isolasi  dan  identifikasi  mikroba  menggunakan  metode screening  random menurut  Malathi  dan  Chakraberty  (1991) . Sampel  LC  disaring  memakai  kertas whatman,  sedangkan  T  dan  LP  diencerkan  menggunakan  aquades  steril.    Inkubasi menggunakan suhu 37 o C selama 24 jam dalam inkubator bergoyang.
Isolasi  dilakukan  dengan  menggunakan  medium  nutrient  agar  (NA)  yang mengandung  kasein  dan  diperkaya  dengan skim  milk .    Kasein  yang  merupakan substrat  yang  baik  untuk  mengisolasi  bakteri  penghasil  enzim  protease  dan
menginduksi  sintesis  enzim  protease  alkalin  (Ward,  1983  ;  Fujiwara  dan  Yamamoto, 1987).
Medium dengan pH 8, 10 dan 12 yang telah dipersiapkan dituangkan ke dalam petridish  yang  telah  disterilisasi  sebanyak  10-15  ml  dan  dibiarkan  memadat. Pengenceran dilakukan sampai 10 -8 , kemudian dilakukan inokulasi pada medium yang telah disiapkan (Thangam et al ., 2001).  Tahap identifikasi bakteri meliputi pengamatan morfologi (zona bening dan diameter koloni) serta kemampuan tumbuh pada berbagai jenis tingkatan pH (Lay, 1989).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik isolat pada sumber dan pH berbeda
Hasil identifikasi terhadap jumlah isolat bakteri yang ditemukan pada berbagai jenis sumber dengan kondisi pH berbeda selengkapnya disajikan pada Gambar 1.
Berdasarkan Gambar 1 terlihat bahwa pada proses screening awal dengan sumber isolat  dan  kondisi  pH  media  tumbuh  berbeda  telah  diperoleh  1.264  koloni,    yang terdiri atas  621 koloni dari sumber isolat LP, 156 dari sumber LC dan 487 dari sumber T.    Berdasarkan  data  tersebut  menunjukkan  bahwa  koloni  bakteri  paling  banyak ditemukan  pada  LP.    Kondisi  pada  pH  12  menunjukkan  bahwa  jumlah  koloni  yang berasal dari sumber LP jumlahnya lebih besar dibanding yang berasal dari T.  Hal ini kemungkinan disebabkan karena LP pada dasarnya adalah limbah hasil proses dari LC yang  telah  melewati  perlakuan  biologi,  sehingga  memberi  kesempatan  kepada mikrobia  untuk  mengkonsumsi  padatan  terlarut  dan  koloid  agar  dapat  tumbuh  dan berkembang  biak  membentuk floks (Triatmojo,  2004).  Hal  tersebut  menyebabkan jumlah  bakteri  pada  LC  sudah  banyak  yang  mengalami  in-aktivasi  oleh  adanya perlakuan biologi tersebut sehingga populasinya menjadi lebih rendah.
Gambar 1 .  Karakteristik jumlah isolat (koloni) bakteri yang ditemukan dan mampu tumbuh pada berbagai sumber dengan kondisi pH berbeda 0 0 0 176 156 197 445 0 290 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Limbah Padat (LP) Limbah Cair (LC) Tanah (T) Jum la h (kol oni ) Sumber Isolat pH 8 pH 10
pH 12
Pengaturan media pertumbuhan bakteri pada berbagai jenis pH sangat penting untuk mengetahui pada kondisi pH berapa bakteri akan beraktivitas secara maksimal, karena  menurut  Lehninger  (2008)  bahwa  aktivitas  katalitik  enzim  di  dalam  sel dipengaruhi oleh perubahan pH medium lingkungan.

## Morfologi isolat bakteri penghasil protease
Morfologi  isolat  bakteri  proteolitik  yang  memiliki  potensi  sebagai  penghasil enzim protease secara jelas ditampilkan pada Gambar 2.
Berdasarkan  Gambar  2  terlihat  bahwa  secara  morfologi  isolat  bakteri  yang ditemukan  melekat  erat  pada  medium,  bentuknya  bulat,  berwarna  putih  dengan tepian menyerupai wol, berbentuk cembung seperti kerak putih.  Berdasarkan hasil uji katalase  dan  NO 3 ,  isolat  dari  ketiga  sumber  tersebut  menujukkan  reaksi  positif. Pembentukan zona bening  disekeliling isolat pada medium kasein merupakan salah satu  indikator  untuk  menentukan  adanya  aktivitas  proteolitik  dari  suatu  organisme bakteri.   Menurut Bower (1992) bahwa  kasein merupakan kelompok phosphoprotein yang  diketahui  secara  kolektif  jumlahnya  80%  dari  protein  skim.    Kasein  adalah protein yang mengalami presipitasi dari skim susu pada pH 4,6 dan suhu 20 o C (68 o F). Indikasi  hidrolisis  kasein  adalah  terbentuknya  zona  bening  (halo)  yang  mengelilingi koloni pada plat setelah proses inkubasi dilakukan.
Gambar 2 .    Morfologi isolat bakteri proteolitik yang berpotensi sebagai penghasil enzim protease
Dari  keseluruhan  isolat  bakteri  yang  ditemukan  setelah  dilakukan  identifikasi ternyata  tidak  semua  isolat  bakteri  berpotensi  sebagai  penghasil  enzim  protease. Gambaran  perbandingan  populasi  isolat  bakteri  yang  mampu  menghasilkan  enzim protease dengan isolat bakteri yang tidak mampu menghasilkan enzim protease secara lengkap disajikan pada Gambar 3.
Berdasarkan Gambar 3 terlihat  bahwa koloni yang memiliki zona bening dengan koloni yang tidak memiliki zona bening (halo) perbedaannya sangat signifikan.  Dari 1.264  koloni  isolat  bakteri  yang  teridentifikasi  awal,  hanya  sekitar  2,5%  (31  koloni)
2,5% 97,5% 0 20 40 60 80 100 120 Memiliki Zona Bening (halo) Tidak Memiliki Zona Bening (halo) ( % ) Keadaan Zona Bening (halo)
yang  memiliki  zona  bening  sedangkan  sisanya  97,5%  (1.233  koloni)  tidak  memiliki zona bening.  Hal ini berarti bahwa hanya sekitar 2,5% yang memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai bakteri proteolitik.
Gambar 3 .  Perbandingan jumlah isolat (koloni) bakteri yang memiliki dan tidak memiliki  zona  bening  pada  berbagai  sumber  isolat  dengan  kondisi pH berbeda

## Indeks proteolitik (IP) isolat bakteri penghasil protease
Indeks  Proteolitik  (IP)  merupakan  ukuran  yang  menunjukkan  nisbah  antara diameter zona bening terhadap diameter koloni (Durham et al ., 1987).  Nilai  IP yang semakin tinggi  (≥3)  pada isolat  menunjukkan bahwa isolat  tersebut memiliki potensi yang sangat besar dan maksimal sebagai sumber protease.  Karakteristik nilai IP isolat bakteri dari beberapa sumber dan pH berbeda selengkapnya disajikan pada Gambar 4.
Gambar 4 .  Nilai indeks proteolitik (IP) isolat bakteri dari sumber dan pH berbeda
0 2 4 6 8 10 pH 8  pH 10  pH 12  pH 8  pH 10  pH 12  pH 8  pH 10  pH 12 Limbah Padat (LP) Limbah Cair (LC) Tanah (T) 0 0 2 0 0 0 0 5 1 0 1 0 0 3 0 0 8 10 0 0 0 0 0 0 0 0 1
Jum la h (kol oni ) Sumber  Isolat IP≥3 3≤IP≤1
IP≤1
Berdasarkan Gambar 4 terlihat bahwa isolat yang memiliki nilai IP ≥3 ditemukan pada  sumber  isolat  LP  dan  T  yakni  masing-masing  2  dan  6  isolat  sedangkan  dari sumber  LC  potensinya  masih  sangat  rendah  (IP≤3).  Tingginya  IP  pada  isolat-isolat yang  ditemukan  pada  LP  dapat  disebabkan  karena,  pada  LP  komponen  senyawa protein  dan  lemak  masih  sangat  tinggi  sebagai  hasil  prosessing  dari  kulit.    Menurut Sarkar (1995), bahwa kulit secara struktural mengandung 33% protein dan 2-3% lemak yang  merupakan  media  tumbuh  yang  sangat  potensial  bagi  mikroorganisme khususnya bakteri.
Nilai  IP  yang  tinggi  pada  isolat  yang  bersumber  dari  T  (tanah)  disebabkan karena tanah masih mengandung banyak senyawa-senyawa protein yang merupakan hasil dekomposisi mahluk hidup untuk selanjutnya dimanfaatkan oleh bakteri sebagai sumber nutrient bagi kehidupannya.  Bakteri merupakan suatu katalisator biologi yang dapat  mengoksidasi  amoniak  ke nitrat.   Jika  material  nitrogen  dalam  bentuk  protein dari  limbah  maupun  pupuk  senantiasa  tersedia,  maka  aktivitas  katalisator  bakteri tersebut akan senantiasa meningkat (Nasahi, 2010).  Aktivitas proteolitik dipengaruhi oleh pH karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah dipengaruhi oleh pH. Perubahan nilai pH ataupun kondisi  pH yang tidak sesuai dengan lingkungannya akan  menyebabkan  daerah  katalitik  dan  konformasi  enzim  berubah.    Selain  itu terjadinya perubahan pH juga dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi enzim dan  pada  akhirnya  akan  mengakibatkan  hilangnya  aktivitas  dari  enzim  tersebut (Girindra, 1993).  Profil aktivitas pH dari suatu enzim menggambarkan pH pada saat gugus  pemberi  atau  penerima  proton  yang  penting  pada  sisi  katalitik  enzim  berada dalam tingkat ionisasi yang diinginkan (Baehaki dkk .,  2011).

## KESIMPULAN
Bakteri proteolitik telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari limbah industri penyamakan  kulit  (limbah  padat  dan  cair)  serta  tanah  disekitar  industri.    Sebanyak 2,5%  dari  jumlah  isolat  yang  diisolasi  telah  diidentifikasi  berpotensi  sebagai  bakteri proteolitik  dengan  potensi  yang  paling  maksimal  adalah  isolat  dari  tanah  (T)  dan limbah padat (LP) pada pH 10 dan12.

## DAFTAR PUSTAKA
Akhdiyah,  A.    2003.  Isolasi  Bakteri  Penghasil  Enzim  Protease  Alkalin  Termostabil.  Buletin Plasma Nutfah, 9(2): 38-44.
Baehaki, A., Rinto dan A. Budiman.  2011. Isolasi dan karakterisasi protease dari bakteri tanah rawa Indralaya, Sumatera Selatan. J. Teknol. dan Industri Pangan, 22(1): 37-42.
Bower, J. 1992.  Food Theory and Applications. 2nd New York, USA.
Durham,  D.  R.,  D.  B.  Stewart,  and  E.  J.  Stellwag.  1987.  Novel  alkaline  and  heat  stable  serine proteases from alkalaphilic Bacillus sp. strain GX6638. J. Bacterial., 169(6): 2762- 2768.
Fujiwara,  N.,  and  K.  Yamamoto.  1987.  Production  of  alkaline  protease  in  low  cost  medium  by alkalophilic Bacillus sp. and properties of the enzyme. J. Ferment. Technol., 65(3): 345-348.
Girindra, A. 1993. Biokimia I.  PT Gramedia Pustaka, Jakarta. p. 91-113
Lay, B.W.  1989.  Analisis Mikrobia di Laboratorium.  PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta.
Lehninger,  A.L.  2008.    Principles  of  Biochemistry.    Fifth  ed.  David  L.  Nelson  and  M.  M.  Cox. W.H. Freeman and Company, NY.
Malathi, S., dan R. Chakraberty.  1991.  Production of Alkaline Protease by a new Aspergillus flavus  isolat  under  solid  substrat  fermented  condition  for  used  as  a  depilation  agent. Applied and Enviromental Microbiology, 57: 712-716.
Moon,  S.H.  and  S.J.  Parulekar.  1993.  Some  observation  on  protease  producing  incontinuous suspention cultures of Bacillus firmus. Biotech. 41 ; 43-54.
Nasahi, C.,  2010.  Peran Mikroba dalam Pertanian  Organik.  Materi Ajar. Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan.  Fakultas Pertanian Universitas Padjadjaran, Bandung.
Said,  M.  I.    2000.  Isolasi  dan  Identifikasi  Kapang  pada  Kulit  Kambing  serta  Pengaruhnya Terhadap Sifat Fisik dan Struktur Jaringan Kulit Kambing Pickle serta Wet Blue dengan Perlakuan  Fungisida  selama  Penyimpanan.    Tesis.  Program  Studi  Ilmu  Peternakan, Sekolah Pascasarjana, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Sarkar,  K.  T.    1995.    Theory  and  Practice  of  Leather  Manufacture.    The  Author  4.  Second Avenue, Mahatma Gandhi Road, Madras.
Suhartono  M.  T,  2000.  Eksplorasi  protease  bakteri  asal  Indonesia  untuk  aplikasi  industri  dan riset  bioteknologi.  Prosiding  Seminar  Nasional    Industri  Enzim  dan  Bioteknologi    II. 125–133.
Thangam, E. Berla, T. Nagarajan, G. Suseela Rajmukar, N. K. Chandrababu.  2001.  Application of  alkaline  protease  isolated  from  Alkaligenes  faecalis  for  enzymatic  unhairing  in tanneries.  JALCA. 96 : 127-132.
Triatmojo, S. 2004.  Penanganan Limbah Peternakan.  Jurusan Teknologi Hasil Ternak.  Fakultas Peternakan Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Ward,  O.  P.  1983.  Proteinases. In Fogarty,  W.M.  ( Ed. ).  Microbial  Enzymes  and  Biotechnolgy. Applied Science Publishers, London. p. 251-290.