Menara Perkebunan 2012 80(1), 32-40
Kloning parsial gen penyandi P5CS dari tebu ( Saccharum officinarum L.)
Cloning of P5CS-encoding gene fragment from sugarcane (Saccharum officinarum L. )
Hayati MINARSIH 1)*) , SUPRIYADI 2) , Soekarno Mismana PUTRA 1) & Asmini BUDIANI 1)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No. 1, Bogor 16151 Indonesia
2 Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Diponegoro, Semarang, Indonesia
Diterima tgl 19 Maret 2012/Disetujui tgl 28 Mei 2012

## Abstract
Abiotic  stress  such  as  drought  stress  is  one  of  the important  factors  that  affect  plant  growth.  Plants  have  an adaptation  mechanism  to  overcome  the  stress  condition  by accumulating  osmoprotectant  compounds.  Proline  is  a  well known  compatible  solute  and  can be  accumulated  to  a high concentration in plant cells under drought or osmotic stress. One  of  the  important  enzymes  in  proline  biosynthesis  is  ∆ 1 - pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) encoded by P5CS gene. This research is aimed to clone partial length of P5CS gene  from S.  officinarum ,  variety  PSJT  941.  The  amplifi- cation  of  P5CS  gene  fragment  was  done  by  Reverse Transcription-Polymerase  Chain  Reaction  (RT-PCR),  using specific primers. DNA fragment of 984 bp, 975 bp and 1725 bp were cloned into Escherichia coli XL1-Blue using pGEM- T Easy plasmid vector. Results from BLAST analysis showed that the P5CS sequences have high homology (99%) with the P5CS gene of S. officinarum in the GenBank database.
[ Key  words:  Pyrroline-5-carboxylate  synthetase,  proline, P5CS gene, sugarcane ]

## Abstrak
Cekaman  abiotik  seperti  kekeringan  merupakan  salah satu  faktor  penting  yang  mempengaruhi  pertumbuhan tanaman.  Tanaman  mempunyai  strategi  adaptasi  dalam mengatasi  cekaman  tersebut  dengan  mengakumulasi senyawa  osmoprotektan  yang  terakumulasi  dalam  kon- sentrasi  tinggi.  Prolin  merupakan  salah  satu  senyawa osmoprotektan yang dapat melindungi tanaman dari cekaman kekeringan maupun osmotik. Salah satu enzim yang berperan penting  dalam  biosintesis  prolin  adalah  ∆ 1 -pyrroline-5- carboxylate synthetase (P5CS) yang disandi oleh gen P5CS. Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengklon  fragmen  gen  P5CS dari S.  officinarum varietas  PSJT  941.  Amplifikasi  fragmen gen  P5CS  dilakukan  dengan  teknik Reverse  Transcription- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) menggunakan primer spesifik gen P5CS. Fragmen DNA hasil RT-PCR  berukuran 984  bp,  975  bp,  dan  1725  bp  diklon  ke  dalam Escherichia coli XL  1-Blue  menggunakan  vektor  plasmid  pGEM-T Easy. Hasil  analisis  BLAST  menunjukkan  bahwa  sekuen fragmen  gen  produk  RT-PCR  yang  berasal  dari S.  offici- narum PSJT  941  memiliki  homologi  yang  sangat  tinggi (99%) dengan gen P5CS pada S. officinarum yang ada dalam pusat data Genbank .
[Kata  kunci:  Pyrroline-5-carboxylate  synthetase,  prolin,  gen P5CS, tebu]

## Pendahuluan
Cekaman kekeringan merupakan salah satu faktor pembatas  pertumbuhan  tanaman,  antara  lain  melalui penghambatan  aktivitas  fotosintesis  dan  translokasi hasil fotosintesis (Mahajan & Tuteja, 2005). Pengaruh cekaman  kekeringan  tidak  hanya  terjadi  pada  fase vegetatif  tetapi  juga  pada  fase  generatif  (Toruan- Mathius et al ., 2004). Pada tebu, cekaman kekeringan dilaporkan  dapat  secara  langsung  mempengaruhi jumlah  anakan  dan  berat  batang  yang  berakibat  pada menurunnya  produksi  sukrosa  (Sugiharto,  2004). Penelitian  lain  menunjukkan  pula  bahwa  kondisi kekeringan  mempengaruhi  proses  biokimia  dan fisiologi  seperti  fotosintesis,  ukuran  sel  daun, transpirasi,  potensial  air,  laju  pertumbuhan  dan penutupan  stomata  pada  daun  (Reddy et  al .,  2004). Pada  tanaman  lain  misalnya  kelapa  sawit,  cekaman kekeringan  dapat  mengakibatkan  perubahan  pada  sex ratio,  gugurnya  bunga  dan  buah  muda,  serta  tandan buah  gagal  masak    yang  berakibat  pada  turunnya produksi  tandan  buah  segar  hingga  40  %  dan  CPO hingga 65% (Toruan-Mathius et al ., 2004).
Tanaman  memiliki  banyak  strategi  adaptasi dalam  merespon  cekaman  lingkungan  abiotik  seperti cekaman  kekeringan  dan  tekanan  osmotik  yang berlebihan. Mekanisme adaptasi tersebut dapat berupa perubahan  fisiologis  dan  proses  biokimia,  melalui penyesuaian  metabolik  yang  mendorong  terjadinya akumulasi  beberapa  senyawa  organik  seperti  gula, polyol,  betain,  dan  prolin  (Minarsih et  al .,  2001; Mohammadkhani  &  Heidari,  2008).  Beberapa  hasil penelitian menunjukkan bahwa tanaman yang tercekam  kekeringan  mengakumulasi  prolin  lebih tinggi  dibandingkan    tanaman  kontrolnya  (Kishor et  al. ,  2005;  Hien et  al .,  2003). Tinggi  rendahnya akumulasi  prolin di  bawah  kondisi  cekaman kekeringan berbeda antar spesies tanaman (Verbruggen & Hermans, 2008). Pada tanaman kelapa sawit  misalnya,  peningkatan  konsentrasi  prolin  dapat mencapai  600%  tergantung  berat  atau  lamanya cekaman  kekeringan  yang  terjadi  dan  genotipe tanaman  atau  tingkat  toleransi  tanaman  (Toruan- Mathius et  al .,  2004).  Sedangkan  kandungan  prolin pada   batang   tebu  yang   diberi  perlakuan  cekaman
Kloning parsial gen penyandi P5CS dari tebu……….. (Minarsih et al .)
kekeringan (tanpa penyiraman) selama 15 hari mening- kat hingga hampir 20 kali lipat (Iskandar et al ., 2011). Jalur utama sintesis prolin dipercaya dimulai dari glutamat,  yang  dikonversi  menjadi glutamic  semi- aldehyde (GSA)  oleh  enzim pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS).  GSA  kemudian  berubah  secara spontan  menjadi pyrroline-5-carboxylate (P5C)  dan P5C  kemudian  direduksi  menjadi  prolin  oleh  enzim P5C reductase (P5CR)  (Kishor et  al .,  2005).  Gen penyandi  P5CS  telah  diisolasi  dan  diteliti  lebih  lanjut dari  beberapa  komoditas  pertanian,  di  antaranya Phaseolus  vulgaris (Chen et  al .,  2009;  Chen et  al ., 2010), Sorghum bicolor (Su et al ., 2011), Oryza sativa (Hur et  al. ,  2004;  Su  &  Wu,  2004),  dan Triticum aestivum (Sawabel & Hasan., 2002).
Tanaman  transgenik  yang  mengoverekspresikan gen P5CS mengakumulasikan  prolin  lebih  tinggi  dan terbukti  lebih  toleran  terhadap  cekaman  kekeringan dibanding  tanaman  kontrolnya  (Yusniwati,  2008). Introduksi  gen P5CS asal Vigna  aconitifolia ke tanaman  tembakau  terbukti  meningkatkan  aktivitas enzim  P5CS  dan  produksi  prolin  10  sampai  18  kali lebih  tinggi  dibanding  tanaman  kontrolnya  (Kishor et al . , 2005). Aktivitas enzim P5CS pada tanaman padi transgenik  yang  ditransformasi  dengan  gen  P5CS meningkat  5,3  hingga  9,8  kali,  sedangkan  kandungan prolinnya meningkat 167% sampai 252%.  Di samping pening-katan  akumulasi  prolin,  tanaman  transgenik yang dihasilkan juga menunjukkan pertumbuhan yang lebih baik pada kondisi cekaman salinitas dan cekaman air  jika  dibandingkan  dengan  tanaman  kontrol  yang tidak  ditransformasi  dengan  gen  tersebut  (Hur et  al ., 2004).  Hasil  penelitian  Molinari et  al (2007) menunjukkan  bahwa  pada  tanaman  tebu,  akumulasi prolin  berkorelasi  positif  dengan  meningkatnya  level ekspresi  gen P5CS .  Penelitian  rekayasa  genetika  tebu untuk  toleransi  kekeringan  menggunakan  gen  P5CS menunjukkan  bahwa  pada  cekaman  salinitas  dan kekeringan,  ekspresi  gen P5CS yang  meningkat menyebabkan akumulasi prolin pada tanaman tersebut juga meningkat (Molinari et al ., 2007). Selain aktivitas P5CS  dan  kandungan  prolin  yang  meningkat,  pada kondisi  cekaman  kekeringan  biomassa  tanaman  trans- genik  hasil  transformasi  menggunakan  gen  penyandi P5CS juga dilaporkan meningkat, melalui peningkatan panjang akar, berat tajuk dan berat akar (Kishor et al ., 2005; Molinari et al ., 2007). Sebagai langkah awal dari upaya  rekayasa  genetika  tebu  toleran  kekeringan, penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengklon  fragmen  gen P5CS dari tanaman tebu.

## Bahan dan Metode
Bahan tanaman yang digunakan untuk isolasi gen P5CS   adalah  daun  tebu   varietas   PSJT   941  yang merupakan  salah  satu  varietas  bina  yang  direkomen- dasikan  oleh  P3GI,  Pasuruan,  yang  relatif  toleran terhadap cekaman kekeringan.

## Perancangan primer
Dua  pasang  primer  dirancang  menggunakan Program  Primer3  (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Sebagai  input  sekuen  digunakan  sekuen  DNA  gen penyandi  P5CS  (EU005373.2)  yang  terdeposit  pada GenBank .

## Isolasi RNA total dari daun tebu
RNA  total  diisolasi  dari  daun  tebu  menurut metode Chang et al (1993) dengan penambahan CTAB pada  bufer  ekstraksi.  Helai  daun  dipotong  kecil-kecil kemudian dibekukan dengan nitrogen cair dan digerus menggunakan  mortar  dan  pestel.  Hasil  gerusan  yang sudah  berbentuk  bubuk  kemudian  diekstraksi  dengan bufer  ekstraksi  (1  :  5)  yang  mengandung CTAB  pada suhu 65 o C dan kemudian divortex. Campuran selanjut- nya  diekstraksi  dua  kali  dengan  kloroform  :  isoamil- alkohol  (24  :  1)  dengan  volume  berimbang  dan disentrifus  dengan  kecepatan  14.000  rpm  selama 20 menit. Pelet atau endapan yang dihasilkan  dilarut- kan dalam bufer SSTE (1,0 M NaCl, 0,5% SDS, 10 m Tris-HCl pH 8,0 dan 1 mM EDTA), dan selanjutnya di ekstraksi  kembali  dengan  kloroform  :  isoamilalkohol. Ke dalam supernatan yang diperoleh ditambahkan dua kali volume ethanol 100% dan diinkubasi pada suhu - 70 o C selama 30 menit,  dilanjutkan dengan sentrifugasi selama  20  menit  untuk  mengendapkan  RNA.  Super- natan  dipisahkan  dan  endapan  yang  diperoleh  dicuci dengan  ethanol  70%  dingin,  kemudian  dilarutkan dalam 0,5 – 1,0 mL H 2 O steril. Kualitas dan kuantitas RNA  ditetapkan  dengan  elektroforesis  pada  gel agarose  dan  dengan  mengukur  absorbansinya  pada panjang  gelombang  (λ)  260,  280  dan  230  nm. Absorbansi  pada  λ 260 menunjukkan  kuantitas  RNA sedangkan  nisbah  A 260 / 280 menunjukkan  kemurnian RNA terhadap kontaminan protein, dan nisbah A 260 / 230 menunjukkan kemurnian RNA terhadap polisakarida.

## Amplifikasi fragmen DNA gen P5CS
Amplifikasi fragmen DNA gen P5CS parsial dilakukan menggunakan RT-PCR ( Reverse Trans-cryptase Polymerase  Chain  Reactioni ).  dengan  templat  RNA. Utas  pertama  cDNA  disintesis  menggunakan  kit Superscript  First  Strand  cDNA  Synthesis (Invitrogen) dengan templat RNA total hasil isolasi dari daun tebu. cDNA  utas  tunggal  yang  diperoleh  selanjutnya digunakan  sebagai  templat  untuk  amplifikasi  fragmen gen  P5CS  pada  mesin  PCR  menggunakan  primer spesifik  yang  telah  dirancang  sebelumnya.  Optimasi kondisi  PCR  dilakukan  untuk  menghasilkan  fragmen DNA  target,  yang   meliputi  suhu annealing , jumlah siklus  dan  konsentrasi  ion  Mg 2+ .  Produk  PCR  dicek pada gel agarosa, kemudian dimurnikan dari gel meng- gunakan kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen).

## Menara Perkebunan 2012 80(1), 32-40

## Kloning and analisis DNA produk PCR terklon
DNA  hasil  RT-PCR  diekstraksi  dan  dimurnikan dari  gel  agarose  menggunakan  kit PureLink TM Quick Gel  Extraction (Invitrogen),  kemudian  diligasikan  ke vektor  kloning  pGEM-T  Easy  (Promega).  Pemurnian DNA  dan  ligasinya  dilakukan  sesuai  prosedur  yang dikemukakan dalam buku manual yang tersedia dalam kit.  Konstruk  vektor  rekombinan  selanjutnya  diintro- duksikan  ke  dalam  sel E.  coli XL1-Blue  kompeten. Preparasi E.  coli kompeten  dilakukan  dengan  metode CaCl 2 ,  sedangkan  transformasinya  menggunakan vektor rekombinan pembawa fragmen produk RT-PCR dilakukan  dengan  metode heat  schock (Sambrook et al ., 2001). E. coli transforman diseleksi pada media LB  yang  mengandung  100  mg/L  ampisilin,  0,1  mM IPTG dan 40 mg/L X-Gal. Beberapa koloni putih yang tumbuh pada media seleksi kemudian dianalisis untuk mengkonfirmasi  adanya  fragmen  DNA  target  dengan PCR  menggunakan  primer  spesifik.  Selanjutnya plasmid  rekombinan  diisolasi  dari  koloni  yang  telah teruji  positif  menggunakan GeneJet TM Plasmid Miniprep kit  (Fermentas)  dengan  prosedur  sebagai- mana  yang  direkomendasikan  dalam  buku  manual yang  tersedia,  dilanjutkan  dengan  digesti  mengguna- kan enzim restriksi Eco RI, dan disekuen. Sekuen DNA yang  diperoleh  dianalisis  menggunakan    BLAST  dan dilakukan  penjajaran  dengan software Bioedit  v7.0.5 dan DNASTAR Lasergene.v7.1.

## Hasil dan Pembahasan

## Perancangan primer dan amplifikasi fragmen P5CS
Tabel  1  menyajikan  susunan  nukleotida  dua pasang  primer  yang  dirancang  menggunakan  input sekuen  gen  P5CS  dari  tebu  yang  terdeposit  pada GenBank ,  sedangkan  Gambar  1  menunjukkan  posisi keempat primer tersebut. Pasangan primer no 1 dengan no  2  (P5CS_5F/P5CS_5R)  dirancang  untuk  meng- amplifikasi  fragmen  gen  P5CS  dari  bagian  ujung  5’- coding  sequence  (cds),  sedangkan  pasangan  primer no  3  dengan  no  4  (P5CS_3F/P5CS_3R)  dirancang untuk mengamplifikasi fragmen gen P5CS dari bagian ujung  3’-coding  sequence  (cds),  masing-masing dengan ukuran sekitar 800 – 900 bp.

## Isolasi RNA dan amplifikasi fragmen gen P5CS
Gambar  2A  menyajikan  profil  elektroforesis RNA total yang diisolasi dari daun tebu. Dari Gambar tersebut nampak bahwa selain tidak terdegradasi, RNA yang diisolasi juga bebas dari kontaminan DNA. Hasil pengukuran  absorbansi  pada  λ260,  λ280  dan  λ230 menunjukkan bahwa RNA yang diperoleh mempunyai kemurnian  terhadap  protein  dan  polisakarida  yang cukup  memadai  untuk  reaksi  RT-PCR  (data  tidak disajikan).
RT-PCR  untuk  amplifikasi  fragmen  gen  P5CS dengan templat RNA yang telah diisolasi dari daun
Gambar 1. Posisi pasangan primer yang digunakan dalam penelitian ini relative terhadap sekuen full cds gen P5CS tebu dari Genbank (EU005373.2).
Figure 1.  The position of primer pairs used in this research relative to the full length cds of sugarcane P5CS gene from Genebank (EU005373.2).

## Tabel 1. Sekuen primer yang digunakan untuk amplifikasi fragmen gen P5CS.
Table 1. Primer sequences used to amplify P5CS gene fragment.
No Pasangan primer Primer Pairs Sekuen primer Primer sequences 1 P5CS_5F 5’GTTGGACAGAGTGGCCTCAT 2 P5CS_5R 5’AATCTGGACCAAGGCATGAG 3 P5CS_3F 5’GCAGCACAAGATGCTGGATA 4 P5CS_3R 5’TGTGCTTATGCCAACCTCAG
Kloning parsial gen penyandi P5CS dari tebu……….. (Minarsih et al .)
tebu  dilakukan  menggunakan  kedua  pasang  primer hasil  rancangan  sebagaimana  disajikan  pada  Tabel  1. Hasil  amplifikasi  menggunakan  pasangan  primer P5CS_5F/P5CS_5R  dan  P5CS_3F/P5CS_3R  dapat dilihat  pada  Gambar  2B  lajur  1  dan  lajur  2,  masing- masing menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 850 – 1000 bp, yang sesuai dengan ukuran target DNA (Gambar  1).  Selain  kedua  fragmen  DNA  tersebut, dalam  penelitian  ini  juga  dicoba  amplifikasi  meng- gunakan  kombinasi  primer  P5CS_5F/P5CS_3R  untuk menghasilkan  fragmen  DNA  yang  lebih  panjang, berukuran  mendekati cds P5CS  yang  utuh.  Hasil amplifikasi  berupa  fragmen  DNA  berukuran  sekitar 2000 bp ditunjukkan pada Gambar 2B lajur 3. Nampak bahwa  fragmen  yang  diperoleh  berukuran  mendekati panjang cds lengkapnya yaitu sekitar 2150 bp.
Konstruksi  vektor  rekombinan  dan  kloning  DNA produk amplifikasi
Koloni putih hasil transformasi dianalisis dengan PCR  koloni  menggunakan  primer  spesifik  gen  P5CS yang  sama  dengan  primer  yang  digunakan  dalam reaksi  RT-PCR  (Gambar  3.).  Hal  ini  dilakukan  untuk memastikan  ada  tidaknya  sisipan  fragmen  DNA  hasil RT-PCR  yang  terklon.  Gambar  3A  menyajikan elektroforesis hasil PCR dari koloni transforman yang membawa  fragmen  P5CS  3F  –  3R,  yaitu  koloni  hasil transformasi menggunakan produk amplifikasi dengan pasangan primer P5CS_3F/P5CS_3R.  Nampak bahwa tiga koloni  positif  mengandung fragmen DNA sisipan yang berukuran  sekitar 950 bp  (antara 850 bp –1000
bp).  Elektroforesis  hasil  PCR  dari  koloni  transforman yang membawa sisipan fragmen  P5CS 5F – 5R dapat dilihat pada Gambar 3B. Pada gambar tersebut nampak bahwa  koloni  yang  dianalisis  positif  mengandung sisipan  DNA  berukuran antara  850  -  1000  bp,  kurang lebih  sama  dengan  ukuran  produk  RT-PCRnya. Sedangkan  Gambar  3C  menunjukkan  hasil  PCR  dari koloni  transforman  yang  mengandung  fragmen  DNA hasil amplifikasi dengan pasangan primer  P5CS 5F – 3R.  Hasil  elektroforesis  tersebut  menunjukkan  bahwa ketiga fragmen produk RT-PCR telah diklon ke dalam E.  coli. Untuk  mengkonfirmasi  lebih  lanjut  bahwa fragmen  DNA  produk  RT-PCR  telah  terklon,  serta untuk  keperluan  analisis  sekuen  DNA  melalui sekuensing,  dilakukan  isolasi  plasmid  dari  koloni E.  coli rekombinan  yang  pada  uji  PCR  koloni  telah terbukti  positif  mengandung  sisipan  fragmen  DNA, dilanjutkan dengan digesti menggunakan enzim Eco RI. Hasil  isolasi  plasmid  dan  digestinya  dengan Eco RI dapat  dilihat  pada  Gambar  4.  Dari  gambar  tersebut nampak  bahwa  digesti  plasmid  dengan  enzim Eco RI menghasilkan dua pita yang masing-masing berukuran sekitar 3 kb dan 984 bp (pada lajur 1 dan 2), 3 kb dan 975  bp  (pada  lajur  3),  serta  sekitar  3  kb  dan  1725  bp (pada lajur 4 dan 5). Lajur 6 hanya menghasilkan satu pita  yang  berukuran  3  kb.  Hal  ini  disebabkan  karena pada  lajur  6,  plasmid  yang  dipotong  merupakan plasmid pGEM-T Easy tanpa sisipan (sebagai kontrol). Plasmid  pGEM-T Easy mempunyai  dua  situs pemotongan Eco RI  di  kanan  kiri  daerah  sisipan. Apabila  daerah  tersebut  tidak  tersisipi  oleh  fragmen DNA,  kemudian  dipotong  dengan Eco RI maka akan
A 1          2        3      M

## B
Gambar  2.  (A)  Profil  elektroforesis  RNA  total  hasil  isolasi  dari  daun  tebu.  (B)  Hasil amplifikasi  fragmen  gen  P5CS  dengan  beberapa  primer;  Lajur  1:  Hasil amplifikasi  fragmen  gen  P5CS  dengan  primer  P5CS_5F/  P5CS_5R;  Lajur  2: Hasil  amplifikasi  fragmen  P5CS  dengan  primer  P5CS_3F/P5CS_3R;  Lajur  3:
Hasil amplifikasi  fragmen P5CS dengan pasangan primer  P5CS_5F/P5CS_3R. Lajur M: marka DNA 1 Kb plus. Figure  2.  (A)  Electrophoretic  profile  of  total  RNA  isolated  from  sugarcane  leaf  (B)
Amplification  of  P5CS  gene  fragment  using  various  primer  pairs;  lane  1: amplification  of  P5CS  gene  fragment  using  P5CS_5F/  P5CS_5R  primer  pair, Lane 2: Amplification of P5CS gene fragment using P5CS_3F/P5CS_3R primer pair;  Lane  3:  Amplification  of  P5CS  gene  fragment using  P5CS_5F/P5CS_3R primer pair. Lane M: DNA marker 1 Kb plus.
Menara Perkebunan 2012 80(1), 32-40
memperlihatkan  satu  pita  ketika  dilakukan  elektro- foresis  gel  agarose.  Hasil  tersebut  memperkuat  hasil PCR  koloni  yang menunjukkan  kembali  bahwa fragmen gen P5CS telah terklon dalam E. coli.

## Sekuensing dan analisis DNA terklon
Konfirmasi  fragmen  gen P5CS hasil  RT-PCR dilakukan  dengan  sekuensing  fragmen  gen P5CS dan penjajarannya  dengan  fragmen  gen P5CS yang  ada  di Genbank .  Sampel  yang  digunakan  untuk  sekuensing pada  penelitian  ini  yaitu  fragmen  gen  hasil  RT-PCR (P5CS  3’F-3’R  dan  P5CS  5’F-3’R)  yang  telah diekstraksi  dan  dipurifikasi.  Fragmen  gen  P5CS  5’F-
5’R  tidak  disekuen.  Sekuensing  fragmen  gen  tersebut dilakukan dua arah yaitu dengan menggunakan primer P5CS Forward dan  P5CS Reverse .  Primer  yang digunakan  dalam  sekuensing  yaitu  pasangan  primer P5CS  3’F-3’R  dan  P5CS  5’F-3’R.  Hasil  sekuensing disajikan  pada  Gambar  5  &  6.  Sekuensing  DNA tersebut  menghasilkan  sekuen  DNA  yang  berukuran 854  bp  untuk  fragmen  gen  P5CS  3’F-3’R  sedangkan fragmen  gen  P5CS  5’F-3’R  menghasilkan  sekuen berukuran 1187 bp dengan tambahan gaps sekitar 295 bp.
Apabila  dicermati  lebih  lanjut,  berdasarkan  hasil sekuensing  dapat  diketahui  bahwa  ukuran  fragmen DNA  yang  didapatkan  mengalami  pengurangan.

## 1650
Gambar 3.  Profil elektroforesis hasil PCR dari (A) Koloni E. coli rekombinan yang membawa fragmen P5CS 3F - 3R; (B) Koloni E. coli rekombinan yang membawa fragmen P5CS 5F - 5R. (C)  Koloni E. coli rekombinan yang membawa fragmen P5CS 5F - 3R. M = marker 1 kb plus DNA Ladder.
Figure  3.    Electrophoretic  profile  of  PCR  from:  (A)  E.  coli  recombinant  colony  carrying  P5CS  3F  -  3R fragment;  (B) E.  coli recombinant  colony  carrying  P5CS  5F  -  5R  fragment;  (C) E.  coli recombinant colony carrying P5CS 5F - 3R fragment. M= 1 kb plus DNA ladder marker.
C M       1        2         3        4 5 M 1 2          2 B 1000 850 2000 M       1         2        3       4       5      6 A 12000 bp 2000 bp 1650 bp 1000 bp 850 bp A B C
Gambar  4.  Elektroforesis  plasmid  hasil  isolasi  dari E.  coli rekombinan  yang  membawa  fragmen  P5CS  3’F-3’R, P5CS  5’F-5’R,  dan  P5CS  5’F-3’R. (A)  Lajur  1-3=  pGEM-T Easy /P5CS  3’F-3’R, lajur  4=  pGEM-T Easy /P5CS 5’F-5’R; (B) lajur 1-2 = pGEM-T Easy /P5CS P5CS 5’F-3’R, lajur 3 = pGEM-T Easy ; (C) Elektroforesis  hasil  digesti  plasmid  rekombinan  menggunakan Eco RI.  lajur  1=  pGEM-T  Easy/P5CS 3’F-3R, lajur 2= pGEM-T Easy/P5CS 5’F-5’R, lajur 3= pGEM-T Easy/P5CS 5’F-3’R.M = marker 1 kb plus DNA Ladder .
Figure 4.  Electrophoretic of plasmid isolated from recombinant E. coli carrying fragments of P5CS 3’F-3’R, P5CS 5’F-5’R,  dan  P5CS  5’F-3’R.  (A)  Lane  1-3=  pGEM-T  Easy  /P5CS  3’F-3’R,  Lane  4=  pGEM-T  Easy /P5CS  5’F-5’R,  (B)  Lane  1-2=  pGEM-T  Easy  /P5CS  P5CS  5’F-3’R,  Lane  3=  pGEM-T  Easy,  (C) Electrophoretic of recombinant plasmid digested with EcoRI. Lane 1= pGEM-T Easy/P5CS 3’F-3R, lane 2=  pGEM-T  Easy/P5CS  5’F-5’R,  lane  3=  pGEM-T  Easy/P5CS  5’F-3’R.  M=  1  kb  plus  DNA  ladder marker.
Kloning parsial gen penyandi P5CS dari tebu……….. (Minarsih et al .)
Pembandingan  fragmen  gen  P5CS  3’F-3’R  hasil sekuensing  dengan  fragmen  gen  P5CS  3’F-3’R  hasil RT-PCR  yang  berukuran  984  bp  memperlihatkan pengurangan  basa  nukleotida  sebesar  130  bp.  Hal  ini disebabkan  ketika  sekuensing  menggunakan  primer P5CS  3’F  dan  P5CS  3’R  yang  menyebabkan nukleo- tida terbaca oleh alat sekuensing dimulai dari beberapa basa  nukleotida  primer  atau  beberapa  basa nukleotida setelah sekuen primer.
Begitu  pula  dengan  fragmen  P5CS  5’F-3’R  juga mengalami pengurangan panjang sekuen yang seharus- nya  1725  bp  hanya  dihasilkan  sekitar  1187  bp. Pengurangan  panjang  sekuen  fragmen  P5CS  5’F-3’R selain  disebabkan  oleh  penggunaan  primer  gen P5CS sewaktu  sekuensing  juga  disebabkan  oleh  adanya kesenjangan  ( gap) sekitar  295  bp.  Berdasarkan Gambar 6 dapat diketahui bahwa gap tersebut terdapat di  tengah-tengah  antara  hasil  sekuen  dengan  meng-
gunakan  primer  P5CS  5’F  dan  hasil  sekuen  dengan primer  P5CS  3’R.  Gaps  tersebut  ditunjukkan  dengan garis  putus-putus  (------)  dan  diduga  terjadi  terkait dengan  penggunaan  primer  dalam  proses  sekuensing yaitu  hanya  menggunakan  satu  pasang  primer  gen P5CS  dan  juga  terkait  dengan  kinerja  alat  sekuensing yang  hanya  mampu  membaca  nukleotida  dengan optimal sampai sekitar 600-800 bp.
Setelah dilakukan sekuensing, selanjutnya dilaku- kan  analisis  BLASTN  (Blast  nukleotida)  untuk  me- ngetahui  tingkat homologi  fragmen  DNA  produk  RT- PCR  dengan  sekuen  gen P5CS yang ada  di Genbank . Hasil  BLASTN  akan  menunjukkan  tingkat  homologi antara sekuen nukleotida fragmen DNA yang dianalisis dengan  sekuen  nukleotida  yang  terdapat  di  dalam Genbank. Data hasil analisis  BLASTN  disajikan  pada Tabel 2.
S.offic _P5CS 5’- TTGAAGCCAGGAAAGATAGCAAGCCTCGCAAAATCCATCCGCACTCTTGCACATATGGAA 1140 P5CS 3'F-3'R 5’- ---------- AGCAAGCCTCGCAAAATCCATCCGCACTCTTGCACATATGGAA 43
S.offic _P5CS GACCCAATCAACCAGATACTCAAAAGAACAGAGGTTGCTGAAGATTTGGTTCTTGAGAAA 1200
P5CS 3'F-3'R GACCCAATCAACCAGATACTCAAAAGAACAGAGGTTGCTGAAGATTTGGTTCTTGAGAAA 103
S.offic _P5CS ACATCTTGCCCATTAGGGGTGCTATTGATCGTTTTTGAGTCCAGGCCTGATGCCTTGGTC 1260
P5CS 3'F-3'R ACATCTTGCCCATTAGGGGTGCTATTGATCGTTTTTGAGTCCAGGCCTGATGCCTTGGTC 163
S.offic _P5CS CAGATTGCGTCGTTAGCAATTCGAAGTGGCAACGGTCTTCTCCTGAAAGGTGGAAAAGAA 1320
P5CS 3'F-3'R CAGATTGCATCGTTAGCAATTCGAAGTGGCAACGGTCTTCTCCTGAAAGGTGGAAAAGAA 223
S.offic _P5CS GCCATGAGATCAAACACAGTATTGCATAAGGTTATAACTGGTGCAATTCCTAGCAACGTG 1380
P5CS 3'F-3'R GCCATGAGATCAAACACAGTATTGCATAAGGTTATAACTGGTGCAATTCCTAGCAACGTG 283
S.offic _P5CS GGTGAAAAACTTATTGGACTTGTTACAAGTAGAGATGAAATCGCTGATTTACTAAAGCTT 1440
P5CS 3'F-3'R GGTGAAAAACTTATTGGACTTGTTACAAGTAGAGATGAAATCGCTGATTTACTAAAGCTT 343
S.offic _P5CS GATGATGTCATTGATCTTGTCATTCCAAGAGGCAGCAATAAGCTGGTTTCACAAATCAAG 1500
P5CS 3'F-3'R GATGATGTCATTGATCTTGTCATTCCAAGAGGCAGCAATAAGCTGGTTTCACAAATCAAG 403
S.offic _P5CS GCATCAACTAAGATCCCTGTCCTTGGTCATGCTGATGGTATTTGCCATGTATACATCGAC 1560
P5CS 3'F-3'R GCATCAACTAAGATCCCTGTCCTTGGTCATGCTGATGGTATTTGTCATGTATACATCGAC 463
S.offic _P5CS AAATCAGCTGACATGAATATGGCAAAACGAATAGTGATGGATGCTAAAATTGATTACCCA 1620
P5CS 3'F-3'R AAATCAGCTGACATGAATATGGCAAAACGAATAGTGATGGATGCTAAAATTGATTACCCA 523
S.offic _P5CS GCAGCCTGCAATGCTATGGAGACATTGCTTGTTCATAAAGATCTTATAAAGGCTCCAGGT 1680
P5CS 3'F-3'R GCAGCCTGCAATGCTATGGAGACATTGCTTGTTCATAAAGATCTTATAAAGGCTCCAGGT 583
S.offic _P5CS CTTGAGGACCTACTGCTATCTCTCAAAACAGAAGGAGTTATTCTTTATGGAGGGCCTGTT 1740
P5CS 3'F-3'R CTTGAGGACCTACTGCTATCTCTCAAAACAGAAGGAGTTACTCTTTATGGAGGGCCTGTT 643
S.offic _P5CS GCGCAGGAACTATTGTGCATTCCAAAAGCAGATTCATTCCATCATGAATATAGCTCTATG 1800
P5CS 3'F-3'R GCGCAGGAACTATTGTGCATTCCAAAAGCAGATTCATTCCATCATGAATATAGCTCTATG 703
S.offic _P5CS GCCCGCACAATTGAGTTCGTTGATGATGTACAGTCAGCAATTGACCATATACATCGCTAT 1860
P5CS 3'F-3'R GCCTGCACAATTGAGTTCGTTGATGATGTACAGTCAGCAATTGACCATATACATCGCTAT 763
S.offic _P5CS GGAAGTGGACATACAGATTGCATTGTTACTACAGATGATAAAGTAGCAGAAACTTTTCTG 1920
P5CS 3'F-3'R GGAAGTGGACATACAGATTGCATTGTTACTACAGATGATAAAGTAGCAGAAACTTTTCTG 823
S.offic _P5CS CGCCAAGTTGATAGTGCTGCTGTATTTTATAATGTGAGCACACGATTCTCTGATGGGGCT 1980 -3’
P5CS 3'F-3'R CGCCAAGTTGATAGTGCTGCTGTATTTTATA ----------------------------- 854  -3’
Gambar  5.  Hasil  sekuensing  fragmen  P5CS  3’F-3’R  dan  penjajarannya  dengan  gen P5CS dari S.  officinarum (EU005373.2). S.offic _P5CS  = S.  officinarum  delta-1-pyrroline-5-carboxylate  synthetase  (P5CS) mRNA,complete cds (EU005373.2), P5CS 3’F-3’R = fragmen hasil sekuensing.
Figure  5.  Sekuencing  of  P5CS  3’F-3’R  fragment  and  its  alignment  with  P5CS  gene  from S.  officinarum (EU005373.2).  S.offic_P5CS  = S.  officinarum delta-1-pyrroline-5-carboxylate  synthetase  (P5CS) mRNA,complete cds (EU005373.2), P5CS 3’F-3’R = sequenced fragment.
Menara Perkebunan 2012 80(1), 32-40
S.offic _P5CS 5’- GTCTTCCCAACTTCTTGTGACAGACAGTGATTTTGAGAATCCAAACTTCCGGGAGAGGCTCCGTGAAACT 420 P5CS 5'F-3'R 5’- ------------------------------------------ AAACTTCCGGGAGAGGCTCCGTGAAACT 28
S.offic _P5CS GTTGAGTCACTATTAGATCTTAAAGTTGTACCAATATTTAATGAAAATGATGCCATCAGCACTAGAAAGG 490 P5CS 5'F-3'R GTTGAGTCACTATTAGATCTTAAAGTTGTACCAATATTTAATGAAAATGATGCCATCAGCACTAGAAAGG 98 S.offic _P5CS CTCCATATGAGGATTCATCTGGTATATCCTGGGATAATGACAGTTTAGCCGGTCTTCTAGCTATAGAACT 560 P5CS 5'F-3'R CTCCATATGAGGATTCATCTGGTATATTTTGGGATAATGACAGTTTAGCCGGTCTTCTAGCTATAGAACT 168 S.offic _P5CS TAAAGCAGATCTCCTTGTTCTACTCAGTGACGTGGATGGCCTCTACAATGGTCCACCAAGTGAACCTCAA 630 P5CS 5'F-3'R TAAAGCAGATCTCCTTGTTCTACTCAGTGACGTGGATGGCCTCTACAATGGTCCACCAAGTGAACCTCAA 238 S.offic _P5CS TCAAAGATAATACATACCTACATCAAAGAGAAACATCACAATGAGATCACTTTTGGTGATAAGTCACGTG 700 P5CS 5'F-3'R TCAAAGATAATACATACCTACATCAAAGAGAAACATCACAATGAGATCACTTTTGGTGATAAGTCACGTG 308
S.offic _P5CS TTGGTAGAGGAGGAATGACAGCTAAAGTGAAGGCTGCTTTCGTGGCTTCAAACAGTGGCACGCCTGTTGT 770 P5CS 5'F-3'R TAGGTAGAGGAGGAATGACAGCTAAAGTGAAGGCTGCTTTCGTGGCTTCAAACAGTGGCACGCCTGTTGT 378 S.offic _P5CS TATTACAAGTGGATTTGCATCTCAGAGCATCCTTAGAGTTCTCCAAGGAGAGAAAATTGGCACTCTCTTT 840 P5CS 5'F-3'R TATTACAAGTGGATTTGCATCTCAGAGCATCCTTAGAGTTCTCCAAGGAGAGAAAATTGGCACTCTCTTT 448 S.offic _P5CS CATAAGGACGCAAGTCTGTGGGAACCATCCAAAGATGTTAGTGCTCGTGAGATGGCTGTCTCTGCAAGAG 910 P5CS 5'F-3'R CATAAGGACGCAAGTCTGTGGGAACCATCCAAAGATGTTAGTGCTCGTGAGATGGCTGTCTCTGCAAGAG 518 S.offic _P5CS AATGTTCAAGGTGTTTGCAGAATTTGTCATCGGATGAGCGCAAGAAAATATTGCTAGATGTTGCAGATGC 980 P5CS 5'F-3'R AATGTTCAAGGCGTTTGCAGAATTTGTCATCGGATGAGCGCAAGAAAATATTGCTA-------------- 574 S.offic _P5CS TTTGGAGGAGAATGAGGATTTGATTAAAACTGAGAATGAAGCTGATGTTGCTGCAGCACAAGATGCTGGA 1050 P5CS 5'F-3'R ---------------------------------------------------------------------- 574 S.offic _P5CS TATGAAAAATCTTTGATTGCTAGGTTGACTTTGAAGCCAGGAAAGATAGCAAGCCTCGCAAAATCCATCC 1120 P5CS 5'F-3'R ---------------------------------------------------------------------- 574 S.offic _P5CS GCACTCTTGCACATATGGAAGACCCAATCAACCAGATACTCAAAAGAACAGAGGTTGCTGAAGATTTGGT 1190 P5CS 5'F-3'R ---------------------------------------------------------------------- 574 S.offic _P5CS TCTTGAGAAAACATCTTGCCCATTAGGGGTGCTATTGATCGTTTTTGAGTCCAGGCCTGATGCCTTGGTC 1260 P5CS 5'F-3'R ---------------------------------------------------------------------- 574 S.offic _P5CS CAGATTGCGTCGTTAGCAATTCGAAGTGGCAACGGTCTTCTCCTGAAAGGTGGAAAAGAAGCCATGAGAT 1330 P5CS 5'F-3'R -AGATTGCATCGTTAGCAATTCGAAGTGGCAACGGTCTTCTCCTGAAAGGTGGAAAAGAAGCCATGAGAT 643 S.offic _P5CS CAAACACAGTATTGCATAAGGTTATAACTGGTGCAATTCCTAGCAACGTGGGTGAAAAACTTATTGGACT 1400 P5CS 5'F-3'R CAAACACAGTATTGCATAAGGTTATAACTGGTGCAATTCCTAGCAACGTGGGTGAAAAACTTATTGGACT 713 S.offic _P5CS TGTTACAAGTAGAGATGAAATCGCTGATTTACTAAAGCTTGATGATGTCATTGATCTTGTCATTCCAAGA 1470 P5CS 5'F-3'R TGTTACAAGTAGAGATGAAATCGCTGATTTACTAAAGCTTGATGATGTCATTGATCTTGTCATTCCAAGA 783 S.offic _P5CS GGCAGCAATAAGCTGGTTTCACAAATCAAGGCATCAACTAAGATCCCTGTCCTTGGTCATGCTGATGGTA 1540 P5CS 5'F-3'R GGCAGCAATAAGCTGGTTTCACAAATCAAGGCATCAACTAAGATCCCTGTCCTTGGTCATGCTGATGGTA 853 S.offic _P5CS TTTGCCATGTATACATCGACAAATCAGCTGACATGAATATGGCAAAACGAATAGTGATGGATGCTAAAAT 1610 P5CS 5'F-3'R TTTGTCATGTATACATCGACAAATCAGCTGACATGAATATGGCAAAACGAATAGTGATGGATGCTAAAAT 923 S.offic _P5CS TGATTACCCAGCAGCCTGCAATGCTATGGAGACATTGCTTGTTCATAAAGATCTTATAAAGGCTCCAGGT 1680 P5CS 5'F-3'R TGATTACCCAGCAGCCTGCAATGCTATGGAGACATTGCTTGTTCATAAAGATCTTATAAAGGCTCCAGGT 993 S.offic _P5CS CTTGAGGACCTACTGCTATCTCTCAAAACAGAAGGAGTTATTCTTTATGGAGGGCCTGTTGCGCAGGAAC 1750 P5CS 5'F-3'R CTTGAGGACCTACTGCTATCTCTCAAAACAGAAGGAGTTACTCTTTATGGAGGGCCTGTTGCGCAGGAAC 1063
S. offic _P5CS TATTGTGCATTCCAAAAGCAGATTCATTCCATCATGAATATAGCTCTATGGCCCGCACAATTGAGTTCGT 1820
P5CS 5'F-3'R TATTGTGCATTCCAAAAGCAGATTCATTCCATCATGAATATAGCTCTATGGCCTGCACAATTGAGTTCGT 1133
S.offic _P5CS TGATGATGTACAGTCAGCAATTGACCATATACATCGCTATGGAAGTGGACATACAGATTGCATTGTTACT 1890 -3’
P5CS 5'F-3'R TGATGATGTACAGTCAGCAATTGACCATATACATCGCTATGGAAGGGGACATAC ---------------- 1187 -3’
Gambar  6.  Hasil  sekuensing  fragmen  P5CS  5’F-3’R  dan  penjajarannya  dengan  gen P5CS dari S.  officinarum (EU005373.2). S.offic _P5CS  = S.  officinarum  delta-1-pyrroline-5-carboxylate  synthetase  (P5CS) mRNA, complete cds (EU005373.2), P5CS 5’F-3’R = fragmen hasil sekuensing.
Figure 6.    Sequencing result of P5CS 5’F-3’R fragment and its alignment with P5CS gene from S. officinarum (EU005373.2).  S.offic_P5CS  = S.  officinarum delta-1-pyrroline-5-carboxylate  synthetase  (P5CS) mRNA, complete cds (EU005373.2), P5CS 5’F-3’R= sequenced fragment.
Kloning parsial gen penyandi P5CS dari tebu……….. (Minarsih et al .)

## Tabel 2. Analisis BLASTN  fragmen P5CS 5’F-3’R
Table 2. BLASTN analysis of P5CS 5’F-3’R fragment
No. Aksesi Accession no Deskripsi ( Description ) Identitas ( Identity ) (%) EU005373.2 Saccharum officinarum delta-1-pyrroline-5-carboxy- late synthetase (P5CS) mRNA, complete cds 99 EU113257.1 EF155655.1 GO377720.2 Saccharum arundinaceum delta-1-pyrroline-5-
carboxylate synthetase mRNA, complete cds
Saccharum officinarum delta-1-pyrroline-5- carboxylate synthetase (P5CS) mRNA, complete cds
Sorghum bicolor delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase 2 (P5CS2), mRNA, complete cds 98 97 95
Berdasarkan nilai identitas dari analisis BLATSN (Tabel 2), dapat diketahui bahwa fragmen gen produk RT-PCR (P5CS 5’-3’) memiliki tingkat homologi yang sangat tinggi terhadap beberapa sekuen gen P5CS pada tebu  ( Saccharum sp.)  yang  terdapat  di  pusat  data Genbank .  Tingkat  homologi  tersebut  ditunjukkan dengan nilai identitas masing-masing sebesar 99 % dan 98%,  yaitu  terhadap  sekuen S.  officinarum  delta-1- pyrroline-5-carboxylate  synthetase  (P5CS)  mRNA, complete  cds (EU005373.2),  dan S.  arundinaceum delta-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase mRNA, complete  cds (EU113257.1).  Selain  itu,  dari  hasil BLAST  diketahui  pula  bahwa  fragmen  gen  P5CS tersebut memiliki homologi yang cukup tinggi dengan gen  P5CS  2  pada  tanaman  lain  yang  sekerabat  yaitu sorgum  ( Sorghum  bicolor ).  Data  tersebut  dapat digunakan  untuk  identifikasi  lanjutan  dari  gen  P5CS pada tanaman. Menurut Hur et al. (2004) tanaman padi mempunyai  dua  gen  yang  menyandi  P5CS  yaitu Os P5CS1  dan Os P5CS2.  Data  terkini  melaporkan bahwa  kedua  gen  family  P5CS  tersebut  (P5CS1  dan P5CS2)  pada Arabidopsis  thaliana menunjukkan peranan yang berbeda di dalam mengakumulasi prolin pada  kondisi  cekaman  kekeringan  (Szekely et  al., 2008).
Hasil penjajaran sekuen fragmen gen P5CS 3’F – 3’R menunjukkan adanya perbedaan nukleotida antara sekuen fragmen gen hasil  RT-PCR dengan sekuen gen P5CS dari S.officinarum (EU005373.2) dan S. arundi- naceum (EU113257.1).  Perbedaan  tersebut  terjadi karena  beberapa  nukleotida  pada  posisi  tertentu tersubtitusi  menjadi  nukleotida  lain  yaitu  basa  purin yang tersubtitusi menjadi basa purin maupun pirimidin lain,  dan  basa  pirimidin  menjadi  basa  pirimidin maupun purin lain (data tidak ditampilkan).
Selain  adanya  substitusi  basa  nukleotida,  juga terdapat  perbedaan  lain  yaitu  adanya  penambahan nukleotida  pada  posisi  tertentu.  Perbedaan  ini  terlihat pada  penjajaran  fragmen  gen  P5CS  5’F-3’R  dengan gen P5CS dari S.  officinarum (EU005373.2)  maupun
dengan gen P5CS dari S. arundinaceum (EU113257.1). Dari hasil penjajaran dengan S.  officinarum tersebut  diketahui  adanya  penambahan satu  basa  A  (Adenin)  pada  posisi  ke-575,  sedangkan pada  penjajaran  dengan S.  arundinaceum diketahui adanya  penambahan  satu  basa  C  (Sitosin)  pada  posisi ke-221 dan posisi ke-222, serta penambahan satu basa A  pada  posisi  ke-223  dan  posisi  ke-575  (data  tidak ditampilkan).
Fragmen  gen P5CS yang  telah  berhasil  diisolasi belum  merupakan  gen  lengkap.  Akan  tetapi  dengan diperolehnya  fragmen  gen P5CS dan  urutan  basanya dengan  ukuran  yang  hampir  mendekati  cds  lengkap- nya,  maka  peluang  untuk  mendapatkan  gen  lengkap P5CS semakin terbuka.

## Kesimpulan
Fragmen  gen P5CS berhasil  diisolasi  dari  daun tebu varietas PSJT 941, dengan homologi yang sangat tinggi  (99%)  dengan  gen P5CS dari Saccharum officinarum L.  dan  tanaman  sekerabat.  Fragmen  gen tersebut telah dikloning ke E. coli .

## Daftar Pustaka
Chen  J,  S  Wang,  R  Jing  &  X  Mao  (2009).  Cloning  The PvP5CS  Gene  from  Common  Bean  ( Phaseolus vulgaris )  and  its  Expression  Patterns  Under  abiotic stresses. J Plant Physiol 166, 12-19.
Chen  J,  X  Zhang,  R  Jing,  MW  Blair,  X  Mao  &  S  Wang (2010).  Cloning  and  Genetic  Diversity  Analysis  of New  P5CS  Gene  from  Common  Bean  ( Phaseolus vulgaris L.). Theor Appl Genet 120, 1393-1404.
Hien  DT,  M  Jacobs,  G  Angenon,  C  Hermans,  TT  Thu, LV  Son  &  NH  Roosens  (2003).  Proline  accumulation and  Δ 1 -pyrroline-5-carboxylate synthetase gene properties  in  three  rice  cultivars  differing  in  salinity and drought tolerance. Plant Sci 165, 1059-1068.
Menara Perkebunan 2012 80(1), 32-40
Hur  JH,  KH  Jung,  CH  Lee  &  GH  An  (2004).  Stress- inducible Os P5CS2 gene  is  essential  for  salt  and  cold tolerance in rice . Plant Sci 167, 417−426.
Iskandar  HM,  RE  Casu,  AT    Fletcher,  S  Schmidt,  J  Xu, DJ  Maclean,  JM  Manners  &  GD  Bonnett    (2011). Expression  of  abiotic  stress-response  genes  differ during  sucrose  accumulation  and  water  deficit  in sugarcane  culms. BioMed  Central  Biol 11,12 (doi:10.1186/1471-2229-11-12).
Kishor  PBK,  Z  Hong,  GH  Miao,  C-AA  Hu  &  Verma  DPS (2005).  Overexpression  of 1 -  pyrroline-5-carboxylate synthetase  increases  proline  production  and  confers osmotolerance  in  transgenic  plants. Plant  Physiol 108,1387-1394.
Mahajan  S  &  N  Tuteja    (2005).  Cold,  salinity  and  drought stresses, An overview. Arch Biochem Biophys 444(2), 139-158.
Minarsih  H,  D  Santosa  &  N  Fitrianty  (2001).  Identification of  P5CS  gene  on  sugarcane  by  PCR  using    hetero- logous primer. Menara Perkebunan 69 (1), 1-9.
Molinari  HBC,  CJ  Marur,  E  Daros,  MKF  de  Campos, JFRP  de  Carvalho,  JCB  Filho,  LFP  Pereira  & LGE  Viera  (2007).  Evaluation  of  the  stress-inducible production  of  proline  in  transgenic  sugarcane ( Saccharum spp),  osmotic  adjustment,  chlorophyll fluorescence  and  oxidative  stress. Physiol  Plant 130, 218-229.
Mohammadkhani  N  &  R  Heidari  (2008).  Drought-Induced Accumulation  of  Soluble  Sugars  and  Proline  in  Two Maize Varieties. Urnia University. Iran. Word Appl Sci J 3(3), 448-453.
Reddy  AR,  KV  Chaitanya  &  M  Vivekanandan  (2004) Drought-induced  responses  of  photosynthesis  and antioxidant  metabolism  in  higher  plants. J  Plant Physiol 161, 1189–1202.
Sambrook J & DW Russell (2001). Molecular Clonning : A Laboratory  Manual. 3 rd Edition. New  York,  Cold- Spring Harbor Laboratory Press.
Su J & R Wu (2004) Stress-inducible synthesis of proline in transgenic  rice  confers  faster  growth  under  stress conditions  than  that  with  constitutive  synthesis. Plant Sci 166, 941–948.
Su  M,  XF  Li,  XY  Ma,  XJ  Peng,  AG  Zhao,  LQ  Cheng, SY  Chen  &  GS  Liu  (2011).  Cloning  two  P5CS  genes from  bioenergy  sorghum  and  their  expression  profiles under  abiotic  stresses  and  MeJA  treatment. Plant  Sci 181, 652-659.
Sugiharto  B  (2004)  Biochemical  and  molecular  studies  on sucrose-phosphate  synthase  and  drought  inducible- protein  in  sugarcane  ( Saccharum  officinarum ). J  Ilmu Dasar 5, 62–67.
Szekely  G,  E  Abraham,  A  Cseplo,  G  Rigo,  L  Zsigmond,
J Csiszar, F Ayaydin, N Strizhov, J Jasik, E Schmelzer, C  Koncz  &  L  Szabados  (2008).  Duplicated  P5CS genes  of  Arabidopsis  play  distinct  roles  in  stress regulation  and  developmental  control  of  proline biosynthesis. Plant J 53, 11-28.
Toruan-Mathius  N,  M  Tony-Liwang,  Ibrahim-Danuwikarsa,
G  Suryatmana,  H  Djajasukanta,  D  Saodah  & IGP  Wenten  Astika  (2004).  Respons  biokimia beberapa  progeni  kelapa  sawit    ( Elaeis  guineensis Jacq.)  terhadap  cekaman  kekeringan  pada  kondisi lapang. Menara Perkebunan 72 (2), 38-56.
Verbruggen N & C Hermans (2008). Proline accumulation in plants: a review. Amino Acids 35, 753-759.
Yusniwati (2008). Galur cabai transgenik toleran kekeringan dengan  gen  P5CS  penyandi  enzim  kunci  biosintesis prolina:  Regenerasi  dan  karakterisasi    regeneran. Bogor, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Disertasi , 143 pp.