## LEVELS OF MALONDIALDEHYDE AND CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE IN PULP INFLAMMATION DUE TO LPS INDUCTION DURATION
Arlina Nurhapsari*, Andina Rizkia Putri Kusuma*

## PENDAHULUAN
Inflamasi  pulpa  atau  pulpitis  merupakan  salah satu  penyakit  pulpa  yang  paling  banyak  diderita oleh masyarakat baik anak-anak maupun dewasa. Inflamasi  pulpa  merupakan  reaksi  pertahanan jaringan  pulpa  dalam  menghadapi  infeksi  dari bakteri (1) . Durasi paparan dari iritan mempengaruhi keadaan inflamasi pada jaringan pulpa. Gejala awal inflamasi  pulpa  adalah  rasa  nyeri  ringan  hingga berat pada penderitanya dan bila tidak dirawat akan menyebabkan nekrosis pulpa dan kerusakan yang bertambah pada struktur gigi yang tersisa (2,3) .
Pemberian
induksi
menggunakan
lipopolisakarida  (LPS)  telah  banyak  dilakukan (4,5) . Paparan  LPS  pada  pulpa  akan  memicu  respon
imun  bawaan  jaringan  pulpa  sebagai  tahap  awal inflamasi.  Selanjutnya,  saat  suasana  inflamasi terjadi akan memicu timbulnya stress oksidatif pada sel  karena  peningkatan  r eactive  oxygen  species (ROS)  yang  menghasilkan  radikal  bebas.  Radikal bebas ini mengakibatkan kondisi inflamasi bertambah  parah  dan  berakhir  menjadi  kerusakan pada  jaringan  pulpa (6) .  Ketika  radikal  bebas bereaksi  dengan  lipid,  maka  akan  membentuk senyawa
malondialdehyde (MDA)
(6,7) . Malondialdehyde lebih  sering  digunakan  dalam penelitian biomedis sebagai penanda stres oksidatif khususnya  pada  berbagai  keadaan  klinis  yang berkaitan dengan proses peroksidasi lipid (8) .
* Department of Conservative Dentistry, Sultan Agung Islamic University
Correspondence: arlina@unissula.ac.id

## ABSTRACT
Background: Administration  Lipopolysaccharide  (LPS)  to  pulp  tissue  might produce  inflammation.  Inflammation  occurs,  which  can  lead  to  oxidative  stress and  neuropeptides  release.  Malondialdehyde  (MDA)  is  an  oxidative  stress measure,  while calcitonin  gene-related  peptide (CGRP)  is  a  neuropeptide found  in  large  amounts  in  the  pulp.  This  study  attempted  to  analyze  levels  of CGRP and MDA in LPS inflamed rat pulp tissue Methode: Wistar rats' maxillary incisors were treated to LPS stimulation. A total of 30  mice  were  separated  into  six  groups,  each  with  five  animals.  The  groups were created by administering LPS to the pulp for 6, 12, 24, 48, and 72 hours. Rat without  pulpal  exposure  (0  hour)  served  as  controls.  Enzyme-linked Immunosorbent  Assay  (ELISA)  was  used  to  measure  the  levels  of  MDA  and CGRP in the pulp tissue.
Result  : MDA  and  CGRP  levels  were  found  to  be  significantly  different  in  all groups (p0.05 mohon diberi keterangan apakah </>/=). With LPS administration, MDA levels increased on average, whereas CGRP levels fluctuated.
Conclusion: The presence of inflammation in the pulp was shown by changes in MDA and CGRP  levels after 6 hours of LPS injection. The effect of rising MDA levels  on  inflamed  pulp  tissue  did  not  produce  effects  that  were  directly proportional to or vice versa with CGRP levels that showed fluctuated.
Keywords: Inflammation pulp,
Lipopolysaccharide ,Malondialdehyde, Calcitonin Gene-Related Peptide
Nyeri  yang  terjadi  pada  pulpitis,  dipengaruhi oleh  peningkatan  neuropeptida  c alcitonin  gene- related peptide (CGRP) yang dilepaskan oleh ujung syaraf  bebas  (f ree  nerve  Eending )  pada  pulpa (9) . CGRP merupakan  asam  amino  peptida  yang terletak  pada  serabut  saraf  C  dan  A  delta.  CGRP berfungsi  memediasi  fase  vasodilatasi  tahap  akhir dan lebih dominan pada inflamasi pulpa (10) . Tujuan penelitian  ini  untuk  mengetahui  pengaruh  durasi pemberian LPS pada jaringan pulpa tikus terhadap kadar CGRP dan MDA.

## METODE PENELITIAN
Penelitian
ini merupakan penelitian eksperimental  laboratorium  dengan post  test control  group  design .  Penelitian  ini  menggunakan 30  tikus  Wistar  jantan  umur  8-10  minggu  dengan berat  200-250  gram.  Tikus  dibagi  menjadi  6 kelompok  dengan  5  tikus  per  kelompoknya. Kelompok  dibagi  berdasarkan  durasi  pemberian LPS pada pulpa dengan durasi 0, 6, 12, 24, 48, dan 72 jam.
Pada kelompok durasi 6, 12, 24, 48, dan 72 jam tikus  dianastesi  menggunakan  Ketamin  75-100 mg/kg BB, ditambah xylazine 5-10 mg/kg BB secara intra  peritonal,  perlakuan  ini  sesuai  dengan penelitian Ohkura dkk (4) . Setelah tikus tidak sadar dilakukan preparasi pada gigi insisivus rahang atas dengan  memotong  bagian  mahkotanya  ±7mm hingga  margin  gingiva  menggunakan bur  disk straight. Selanjutnya dilakukan pengeburan dengan metal  bur  low  speed ukuran  10,  kemudian  akses menuju  ruang  pulpa  diperbesar  menggunakan K- file ukuran 15 – 45 hingga tampak perdarahan dari atap  pulpa  yang  terbuka.  Kavitas  dibersihkan dengan  larutan  salin,  hingga  terjadi  hemostasis. Paper  point dipotong  5  mm  pada  bagian  ujung, kemudian  direndam  di  LPS  20mg/ml  dan dimasukkan  ke  kavitas  untuk  berkontak  dengan pulpa.  Kavitas  ditutup  dengan  tumpatan Glass
ionomer  cement (GIC).  Tikus  dikorbankan  sesuai dengan durasi pemberian LPS yaitu 0, 6, 12, 24, 48, dan  72  jam,  kemudian  dilakukan  pengambilan sampel gigi insisivus rahang atas.
Jaringan  pulpa  diekstirpasi  menggunakan barbed  broach  #40  dari  apikal  dan  dibersihkan dengan  NaCl.  Jaringan  pulpa  dibilas  dalam  PBS (Phophate Buffer Saline) sedingin es (pH 7,4) untuk menghilangkan kelebihan darah secara menyeluruh  dan  timbang  sebelum  homogenisasi. Jaringan  digerus  dan  dihomogenkan  dalam  PBS (berat jaringan (g): PBS (mL) volume=1:9) dengan homogenizer  kaca  di  atas  es.  Sonikasi  suspensi dengan ultrasonic cell disrupter atau dengan freeze thaw-cycles untuk  memecah  sel  lebih  lanjut. Homogenkan  kemudian  disentrifugasi  selama  5 menit pada 5000xg untuk mendapatkan supernatan. Kadar CGRP dan MDA dari supernatan  yang  dihasilkan  ditentukan  dengan menggunakan kit immunoassay enzim (CGRP dan MDA ELISA Kit; Bioenzy). Kadar CGRP dinyatakan dengan nilai  pg/mL, sedangkan  MDA dengan  nilai nmol/mL. Data diolah dan dianalisis dengan uji One way  Anova menggunakan  SPSS  (SPSS  Inc, Chicago, IL), hasil p<0.05 menunjukkan perbedaan yang  signifikan.  Semua  data  disajikan  sebagai mean ± standar deviasi.

## HASIL PENELITIAN
Pada kelompok yang diberikan LPS menunjukkan  rerata  kadar  CGRP  dan  MDA
lebih rendah dibandingkan dengan kelompok yang tidak  diberi  LPS  (0  jam).  Tingkat  kadar  MDA menunjukkan  rerata  yang  meningkat  seiring dengan lamanya pemberian LPS, dengan rata-rata terendah 2 nmol/mL pada kelompok 6 jam dan rata- rata tertinggi 2,83 nmol/mL terdapat pada kelompok 72  jam.  Tingkat  kadar  CGRP  berfluktuasi  dengan rata-rata  kadar  terendah  42,17  pg/mL  terdapat pada kelompok 48 jam dan rata-rata tertinggi 51,12 pg/mL pada kelompok 12 jam.
Hasil uji One way Anova untuk kadar CGRP dan MDA  menunjukkan  perbedaan  yang  signifikan (p=0,000).  Uji Post  Hoc  LSD untuk  kadar  MDA, tampak perbedaan yang signifikan antara kelompok 6  jam  dengan  kelompok  24,  48  dan  72  jam, sedangkan untuk kelompok 6 jam dan 12 jam tidak terdapat  perbedaan  yang  signifikan  (Gambar  1). Pada  uji Post  Hoc  LSD untuk  kadar  CGRP kelompok  pemberian  LPS  6,  12,  24,  48,  72  jam, tidak  terdapat  perbedaan  yang  signifikan  antar masing-masing kelompok (Gambar 2).

## PEMBAHASAN
LPS adalah komponen dinding sel bakteri gram negatif,  yang  umumnya  berperan  dalam  infeksi endodontik dan banyak digunakan untuk menginduksi  reaksi  inflamasi  pada  jaringan  pulpa gigi  secara  in  vivo  dan  in  vitro (11,12) .  Selain penggunaan  LPS  untuk  induksi  inflamasi,  dapat menggunakan teknik dengan memapar pulpa pada rongga mulut agar terinfeksi bakteri. Namun, teknik paparan  pulpa  pada  rongga  mulut  mempunyai kelemahan  karena  induksi  dengan  bakteri  dapat menyebabkan perbedaan profil molekuler di antara subjek (13) .  Pada  penelitian  ini  induksi  pada  pulpa dengan  LPS  berhasil  dilakukan  karena  terjadi perubahan  yang  signifikan  pada  kadar  MDA  dan CGRP  kelompok  pemberian  LPS  dibandingkan dengan kelompok normal (0 jam).
Induksi LPS sebagai mediator yang mengawali proses  inflamasi  akan  menyebabkan  peningkatan sitokin  proinflamasi  seperti  TNF- α,  bila  inflamasi tidak  segera  ditangani  maka  akan  terjadi  suasana inflamasi  yang  berlebihan.  Suasana  inflamasi  ini mengakibatkan  akumulasi  jumlah  ROS    seperti (H 2 O 2 ,  O 2- dan  OH - )  dalam  jaringan,  bila  jumlah ROS lebih banyak dibandingkan jumlah antioksidan akan  menyebabkan  stres  oksidatif (14) .  Stres oksidatif  akan  mengakibatkan  kematian  sel  dan
Gambar 1. Tingkat kadar MDA sesuai dengan pemberian LPS. Terdapat perbedaan signifikan
antar kelompok (*p<0,05)
Gambar 2. Tingkat kadar CGRP sesuai dengan pemberian LPS. Terdapat perbedaan signifikan
antar kelompok (*p<0,05)
kerusakan  jaringan.  Stres  oksidatif  dalam  jaringan dapat  ditentukan  dengan  kadar  MDA (15) .  Pada penelitian ini, kadar MDA pada kelompok 6, 12, 24, 48,  72  jam  menunjukkan  peningkatan  seiring dengan  lamanya  pemberian  induksi  LPS.  Hal  ini menunjukkan bertambah lama paparan iritan pada pulpa akan menyebabkan  suasana  inflamasi yang bertambah  parah,  sehingga  stress  oksidatif  juga meningkat  yang  ditandai  dengan  kadar  MDA. Peningkatan kadar MDA berkaitan dengan tingkatan  keparahan  kerusakan  jaringan,  karena kadar MDA yang  meningkat  menyebabkan kerusakan  sel  dan  keadaan  patologis  yang bertambah parah
Stres  oksidatif  adalah  salah  satu  faktor  dan mekanisme penting yang mengatur fungsi fisiologis normal  sel  saraf  dan  dapat  menyebabkan perubahan  di  banyak  jalur  pensinyalan  molekuler.
Beberapa tahun ini, banyak bukti yang menunjukkan CGRP dapat melawan stres oksidatif
(16,17) . CGRP  adalah vasodilator yang sangat kuat, sehingga  pelepasan  peptida  ini  menghasilkan pembentukan  edema,  peningkatan  aliran  darah, dan perekrutan sel inflamasi ke area lokal (18) . Pada penelitian  ini  kadar  CGRP  pada  kelompok  normal (0  jam)  mempunyai  kadar  paling  tinggi,  karena CGRP  banyak  ditemukan  di  ujung  saraf  sensorik pada  dentin  terutama  dari  akson  bermielin  yaitu saraf  A-delta.  Tingkat  kadar  CGRP  yang  fluktuatif pada penelitian ini, berhubungan dengan keadaan patologis jaringan pulpa yang terjadi seiring dengan waktu  pemberian.  Walaupun  secara  uji Post  Hoc tidak  ada  perbedaan  yang  signifikan  antara kelompok  6,12,  24,  48,  72  jam,  tetapi  menariknya dari rerata tampak hasil yang naik turun.
Pada penelitian ini kadar CGRP yang fluktuatif pada kelompok LPS, menunjukkan hubungan yang masih  belum  jelas  mengenai  keterlibatan  CGRP dalam  stres  oksidatif.  Pada  satu  sisi  produksi CGRP  difasilitasi  oleh  ROS (19) ,  tetapi  disisi  lain
CGRP  berkaitan  dengan  peningkatan  ekspresi enzim  antioksidan (20,21) .  Oleh  karena  itu,  tingginya kadar  CGRP  pada  jaringan  pulpa  sehat  dan jaringan  pulpa  terinflamasi  menunjukkan  peran CGRP  dalam  inflamasi,  penyembuhan  dan regenerasi di dalam pulpa gigi (22) .

## KESIMPULAN
Perubahan kadar MDA dan CGRP setelah 6 jam pemberian  LPS,  menunjukkan  terjadinya  inflamasi pada  pulpa . Efek  peningkatan  kadar  MDA  pada jaringan pulpa yang terinflamasi, tidak menunjukkan  hasil  yang  berbanding  lurus  atau sebaliknya  dengan  kadar  CGRP  yang  cenderung fluktuatif.  Peranan  CGRP  terhadap  stres  oksidatif yang terjadi pada inflamasi pulpa masih memerlukan investigasi lebih lanjut.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Hargreaves  KM,  Berman  LH.  Cohen’s Pathways of the Pulp ed 11. 2016.
2. Zanini  M,  Meyer  E,  Simon  S.  Pulp Inflammation  Diagnosis  from  Clinical  to Inflammatory  Mediators:  A  Systematic Review.  Journ  al  Endod.  2017;43(7):1033 – 51.
3. Torabinejad  M,  Walton  RE,  Fouad  AF. Endodontics PRINCIPLES AND PRACTICE 5th edition. Elsevier. 2015.
4. Ohkura N, Shigetani Y, Yoshiba N, Yoshiba K,  Okiji  T.  Prostaglandin  transporting protein-mediated prostaglandin E2 transport in  lipopolysaccharide-inflamed  rat  dental pulp. J Endod [Internet]. 2014;40(8):1112 –7.
Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.joen.2013.12.024
5. Renard E, Gaudin A, Bienvenu G, Amiaud J, Farges JC, Cuturi MC,  et al.  Immune Cells and  Molecular  Networks  in  Experimentally Induced Pulpitis. J Dent Res. 2016;95(2):196 –205.
6. Gloire G, Legrand-Poels S, Piette J. NF- κB activation  by  reactive  oxygen  species: Fifteen  years  later.  Biochem  Pharmacol. 2006;72(11):1493 –505.
7. Soetojo  A,  Cahyadi  EK,  Prasetyo  EA. Malondialdehyde  expressions  on  pulp odontoblast  cells  after  application  of 2 ‑ hydroxyethyl  methacrylate  mixed  with water, ethanol, and acetone solvents. Saudi Endod J. 2019;9:96 –100.
8. Moselhy HF, Reid RG, Yousef S, Boyle SP. A specifi c, accurate, and sensitive measure of total plasma malondialdehyde by HPLC. J Lipid Res. 2013;54(3):852 –8.
9. Caviedes-Bucheli  J,  Muñoz  HR,  Azuero- Holguín  MM,  Ulate  E.  Neuropeptides  in Dental  Pulp:  The  Silent  Protagonists.  J Endod. 2008;34(7):773 –88.
10. Berggreen  E,  Heyeraas  KJ.  The  role  of sensory  neuropeptides  and  nitric  oxide  on pulpal blood flow and tissue pressure in the ferret. J Dent Res. 1999;78(9):1535 –43. 11. Ning T, Shao J, Zhang X, Luo X, Huang X, Wu H, et al. Ageing affects the proliferation and  mineralization  of  rat  dental  pulp  stem cells  under  inflammatory  conditions.  Int Endod J. 2020;53(1):72 –83.
12. Li M, Tian J, Xu Z, Zeng Q, Chen W, Lei S, et al. Histology-based profile of inflammatory mediators in experimentally induced pulpitis in  a  rat  model:  screening  for  possible biomarkers.  Int  Endod  J.  2021;54(8):1328 – 41.
13. Kim SA, Lim SS. T lymphocyte subpopulations and interleukin-2, interferon- γ,  and  interleukin-4  in  rat  pulpitis experimentally induced by specific bacteria.
Vol.  28,  Journal  of  Endodontics.  2002.  p. 202 –5.
14. Ayala  A,  Muñoz  MF,  Argüelles  S.  Lipid peroxidation:  Production,  metabolism,  and signaling  mechanisms  of  malondialdehyde and  4-hydroxy-2-nonenal.  Oxid  Med  Cell Longev. 2014;2014.
15. Wang  H,  Ding  X,  Li  S,  Zheng  H,  Zheng  X, Navin  S,  et  al.  Role  of  Oxidative  Stress  in Surgical  Cavernous  Nerve  Injury  in  a  Rat Model. 2015;00(October 2014):1 –8.
16. Ding L, Song T, Yi C, Huang Y, Yu W, Ling L,  et  al.  Transcutaneous  Electrical  Nerve
Stimulation  (TENS)  Improves  the  Diabetic Cytopathy  (DCP)  via  Up-Regulation  of CGRP and cAMP. PLoS One. 2013;8(2):1 –
7.
17. Umoh NA, Walker RK, Millis RM, Al-Rubaiee M,  R.  PG,  Haddad  GE.  Calcitonin  Gene- Related  Peptide  Regulates  Cardiomyocyte Survival  through  Regulation  of  Oxidative Stress  by  PI3K/Akt  and  MAPK  Signaling Pathways.  Ann  Clin  Exp  Hypertens. 2014;2(1):1007-.
18. Russell  FA,  King  R,  Smillie  SJ,  Kodji  X, Brain  SD.  Calcitonin  gene-related  peptide: physiology  and  pathophysiology.  Physiol Rev. 2014;94(4):1099 –142.
19. Luca  C  De,  Baldacci  F,  Mazzucchi  S, Lombardo  I,  Curto  L,  Ulivi  M,  et  al.  CGRP Inhibitors  and  Oxidative  Stress  Biomarkers in  Resistant  Migraine :  A  Real-Life  Study with  Erenumab  ,  Fremanezumab  ,  and Galcanezumab. 2021;
20. Dang H, Li J, Liu C, Fu Y. CGRP attenuates hyperoxia-induced  oxidative  stress-related injury  to  alveolar  epithelial  type  II  cells  via the  activation  of  the  Sonic  hedgehog pathway. 2017;(2):209 –16.
21. Liu Y, Zhang S, Xue J, Wei Z, Ao P, Shen B, et  al.  CGRP  Reduces  Apoptosis  of  DRG Cells  Induced  by  High-Glucose  Oxidative Stress Injury through PI3K/AKT Induction of Heme  Oxygenase-1  and  Nrf-2  Expression. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019.
22. Awawdeh  LA,  Lundy  FT,  Linden  GJ,  Shaw C,  Kennedy  JG,  Lamey  PJ.  Quantitative analysis  of  substance  P,  neurokinin  A  and calcitonin  gene-related  peptide  in  gingival crevicular  fluid  associated  with  painful human teeth. Eur J Oral Sci. 2002;110(3):185 –91.