## Jurnal Ilmu Farmasi dan Farmasi Klinik (JIFFK)
Vol. 16, No. 1, JUNI 2019, Hal. 43 – 50 ISSN: 1693 -7899

## AKTIVITAS INHIBISI ASETILKOLINESTERASE EMPAT JENIS SAYURAN SECARA IN VITRO
Maulita Cut Nuria *1,3) , Elin Yulinah Sukandar 2) , Asep Gana Suganda 1) , Muhamad Insanu 1)
1) Kelompok Keilmuan Biologi Farmasi, Sekolah Farmasi, Institut Teknologi Bandung, Jl. Ganesha 10, Bandung
2) Kelompok Keilmuan Farmakologi, Sekolah Farmasi, Institut Teknologi Bandung, Jl. Ganesha 10,
Bandung
3) Bagian  Biologi  Farmasi,  Fakultas  Farmasi,  Universitas  Wahid  Hasyim,  Jl.  Menoreh  Tengah X/22, Semarang Email: cut.nuria@yahoo.com ; Nomor telepon: 0811250380

## INTISARI
Asetilkolin  merupakan  senyawa  penghantar  rangsang  saraf  (neurotransmitter),  sedangkan asetilkolinesterase  adalah  enzim  yang  dapat  menghidrolisis  neurotransmiter  asetilkolin  menjadi kolin  dan  asam  asetat.  Reaksi  ini  diperlukan  supaya  saraf  bisa  kembali  beristirahat  setelah  proses aktivasi,  tetapi  hal  tersebut  dapat  menyebabkan  kerusakan  pada  sel-sel  di  otak  apabila  terjadi berlebihan.  Kasus  yang  paling  umum  terjadi  adalah  kepikunan  yang  ditandai  dengan  penurunan daya ingat. Prevalensi penyakit  ini  lebih  rendah di negara Cina dan beberapa  negara  Asia  lainnya dibandingkan dengan Amerika Serikat. Hal ini diduga karena jenis makanan yang biasa dikonsumsi oleh orang Asia adalah sayuran  yang berasal dari bahan  sayuran berpotensi menghambat aktivitas enzim  asetilkolinesterase  yang  terkait  dengan  kandungan  kimia  tumbuhan  tersebut.  Tujuan penelitian  ini  adalah  menentukan  aktivitas  inhibisi  enzim  asetilkolinesterase  (AChE)  dari  4  jenis sayuran yakni kecambah kedelai ( bean sprout of Glycine max (L.) Merr.), kecambah kacang hijau ( bean  sprout  of Vigna  radiata ),  umbi  wortel  ( Daucus  carota L.),  dan  kecipir  ( Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.) secara in vitro dengan metode Ellman. Kadar fenolik dan flavonoid total dari  keempat  jenis  ekstrak  tersebut  juga  ditentukan.  Ekstrak  kecipir  memiliki  kadar  fenolik  dan flavonoid  total  paling  kecil,  tetapi  aktivitas  inhibisinya  terhadap  AChE  paling  besar.  Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai IC 50 ekstrak kecipir sebesar 893,86 µg/ml, ekstrak umbi wortel di  atas  1500  µg/ml  sedangkan  ekstrak  lainnya  tidak  memiliki  aktivitas.  Ekstrak  kecipir  potensial untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai inhibitor AChE.
Kata kunci : inhibitor asetilkolinesterase, IC 50 , sayuran.

## ABSTRACT
Acetylcholine  is  a  conducting  compound  of  nerve  excitatory  (neurotransmitter),  while acetylcholinesterase is an enzyme that can hydrolyze the acetylcholine into choline and acetic acid. This reaction is needed so that the nerves can return to take a rest after the activation process, but it can cause damage to the cells in the brain. The most common case is dementia characterized by memory  loss.  The  prevalence  of  this  disease  is  lower  in  China  and  some  other  Asian  countries compared to the United States. It supposed because food consumption commonly by Asians contain vegetables. Extracts derived from vegetables potentially inhibit the activity of acetylcholinesterase (AChE) enzyme which related to chemical contents of the plant. This research aims  to investigate the  inhibitory  activity  of  acetylcholinesterase  enzyme  from  4  types  of  vegetables  namely  soybean sprouts  (bean  sprout  of  Glycine  max  (L.)  Merr.),  green  bean  sprouts  (bean  sprout  of  Vigna radiata), carrot (Daucus carota L.), and winged beans (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.) by
in  vitro  with  the  Ellman  method.  Total  phenolic  and  flavonoids  contents  from  fourth  types  of extracts  were  also  determined.  The  winged  beans  extract  had  the  smallest  total  phenolic  and flavonoid  contents,  but  the  inhibitory  activity  against  AChE  was  the  biggest.  The  results  showed that  IC 50 extract  of  winged  beans  was  893.86  μg/ml,  IC 50 carrot  extract  higher  than  1500  μg/ml while the other extracts had no activity. The winged beans extract potential to be further developed as an inhibitor AChE.
Keywords : inhibitor of acetylcholinesterase, IC 50 , vegetables
*Corresponding author: Maulita Cut Nuria Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Wahid Hasyim Jl. Menoreh Tengah X/22, Semarang Email: cut.nuria@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Asetilkolin merupakan senyawa penghantar rangsang saraf (neurotransmitter) yang disintesis di dalam ujung serabut saraf motorik melalui proses asetilasi kolin ekstrasel dan asetil koenzim A dengan  bantuan  enzim  kolinasetil  transferase. Setelah  pelepasannya  ke  celah  sinap,  asetilkolin dihidrolisis  oleh  enzim  asetilkolinesterase  endogen  menjadi  kolin  dan  asetat  (Perry  dkk.,  1999). Reaksi  ini  diperlukan  supaya  saraf  bisa  kembali  beristirahat  setelah  proses  aktivasi,  tetapi  hal tersebut  dapat  menyebabkan  kerusakan  pada  sel-sel  di  otak.  Kasus  yang  paling  umum  terjadi adalah kepikunan yang ditandai dengan penurunan daya ingat.
Umumnya  penderita  kepikunan  adalah  dari  kelompok  manusia  lanjut  usia  (lansia). Prevalensi  penyakit  ini  lebih  rendah  di  Cina  dan  beberapa  negara  Asia  lainnya  dibandingkan dengan  Amerika  Serikat.  Hal  ini  diduga  kuat  karena  jenis  makanan  yang  biasa  dikonsumsi  oleh orang  Asia  umumnya  mengandung  sayuran  salah  satunya  adalah  kecambah  (Kausler  dkk.,  2007), namun hal ini masih perlu  dibuktikan melalui penelitian ilmiah.
Selama berabad-abad, tumbuhan telah digunakan sebagai sumber makanan dan juga sebagai obat  tradisional  untuk  meningkatkan  daya  ingat  akibat  usia  lanjut  (Mukherjee  dan  Houghton, 2009).  Beberapa  jenis  sayuran  menunjukkan  aktivitas  inhibisi  asetilkolinesterase  sehingga berpotensi  meningkatkan  memori.  Sayuran  tersebut  diantaranya  herba  seledri,  daun  peterseli (Szwajgier dan Borowiec, 2012), daun kubis ungu (Boga dkk., 2011), daun kubis putih,  daun  ubi jalar (Septiningsih dan Suganda, 2013) dan daun kangkung (Dhanasekaran dkk., 2015).
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  membuktikan  adanya  aktivitas  inhibisi  enzim asetilkolinesterase dari 4 jenis sayuran, yakni kecambah  kedelai  (bean sprout of Glycine  max (L.) Merr.),  kecambah  kacang  hijau  (bean  sprout  of Vigna  radiata ),  umbi  wortel  ( Daucus  carota L.), dan kecipir ( Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.) secara in vitro dengan metode Ellman.

## METODE PENELITIAN Bahan tanaman
Bahan  tanaman  diperoleh  dari  daerah  di  Jawa  Barat  dan  Jawa  Tengah,  Indonesia.  Umbi wortel dan kecipir dipanen dari sumber budidaya di daerah Jawa Barat, yakni umbi wortel berasal dari  Lembang  sedangkan  kecipir  berasal  dari  Bogor.  Kecambah  kacang  hijau  dan  kecambah kedelai  diperoleh  dari  Semarang,  Jawa  Tengah.  Bahan-bahan  tersebut  dilakukan  determinasi  di Herbarium  Institut  Teknologi  Bandung.  Berdasarkan  penelusuran  pustaka,  kandungan  kimia  yang terdapat dalam keempat jenis sayuran tersebut tersaji pada Tabel I.

## Alat penelitian
Alat yang digunakan meliputi: alat-alat gelas yang umum digunakan di laboratorium, almari pengering, neraca analitik (Mettler), bejana maserasi, rotary evaporator (Buchi Interface I-300 dan Heidolph), spektrofotometer UV-Vis, dan Elisa reader (Tecan Infinite 200 pro).
Jalannya Penelitian

## 1. Ekstraksi bahan tanaman
Bahan  tanaman  dikeringkan  pada  temperatur  40-50 ° C  dan  diserbuk.  Bahan  kering  tersebut diekstraksi secara maserasi dengan pelarut etanol 95%. Proses tersebut dilakukan selama 3 hari dan tiap  harinya  dilakukan  remaserasi  menggunakan  pelarut  baru.  Maserat  yang  dihasilkan  kemudian diuapkan pelarutnya menggunakan rotary evaporator sehingga membentuk ekstrak kental. Ekstrak kental disimpan dalam desikator sebelum digunakan.
Tabel I. Daftar tanaman, bagian tanaman yang digunakan serta kandungan kimianya Nama botani Nama Indonesia Bagian tanaman yang digunakan Kandungan kimia Daucus carota L. Wortel Umbi Flavonoid (Miean dan Mohamed, 2001) Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC. Kecipir Polong Asam kafeat dan asam p -kumarat (Wongsa dkk. 2012). Bean sprout Vigna radiate Kecambah kacang hijau Kecambah Flavon, isoflavon, flavonoid, (Prokudina dkk. 2012; Wang dkk. 2008), asam fenolat dan asam organik (Tang dkk. 2014) Bean sprout Glycine max (L.) Merr. Kecambah kedelai Kecambah Isoflavon (Sakakibara dkk. 2003); sterol, phytic acid (Lee dkk. 2013); α-tokoferol (Ching dan
Mohamed, 2001)

## 2. Pembuatan larutan induk ekstrak
Ekstrak  ditimbang  0,5  gram  kemudian  ditambah  5  mL  etanol  p.a.  Larutan  ekstrak  diaduk menggunakan magnetic  stirer pada  kecepatan  500  rpm,  disaring  dan  filtrat  yang  diperoleh ditambah etanol ad 25 ml. Konsentrasi larutan induk ekstrak adalah 20.000 μg/mL.
3. Pengukuran panjang gelombang maksimum
Pengukuran  panjang  gelombang  maksimum  untuk  flavonoid  dilakukan  dengan  membuat larutan  standar  kuersetin  pada  konsentrasi  6  μg/mL.  Larutan  kompleks  kuersetin-AlCl 3 diukur menggunakan  spektrofotometer  visibel  pada  panjang  gelombang  390-550  nm,  dengan  nilai absorbansi  larutan  antara  0,2-0,8.  Panjang  gelombang  maksimum  yang  diperoleh  untuk  senyawa kompleks kuersetin-AlCl 3 adalah 422,9 nm.
Pengukuran  panjang  gelombang  maksimum  untuk  fenolik  dilakukan  dengan  membuat larutan  standar  asam  galat  pada  konsentrasi  50  μg/mL  kemudian  diambil  200  µL  ditambahkan 0,4 mL reagen Folin Ciocalteu, dikocok dan dibiarkan 8 menit. Larutan tersebut ditambahkan 4 mL larutan Na 2 CO 3 7%, dikocok hingga homogen, diukur menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang  gelombang  550-800  nm.  Panjang  gelombang  maksimum  yang  diperoleh  untuk  senyawa kompleks molibdenum-tungsten adalah 763,0 nm.

## 4. Penentuan operating time
Penentuan operating time atau waktu operasional untuk flavonoid dilakukan terhadap larutan kompleks  kuersetin-AlCl 3 konsentrasi  6  μg/mL.  Larutan  tersebut  diukur  menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 422,9 nm dengan waktu pengukuran pada menit ke 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, dan 60.
Penentuan operating  time untuk  fenolik  dilakukan  terhadap  larutan  asam  galat  konsentrasi 50  μg/mL  kemudian  diambil  200  µL,  ditambahkan  0,4  mL  reagen  Folin  Ciocalteu,  dikocok  dan dibiarkan  8  menit,  ditambahkan  4  mL  larutan  Na 2 CO 3 7%,  dikocok  hingga  homogen.  Senyawa kompleks  molibdenum-tungsten  tersebut  diukur  menggunakan  spektrofotometer  visibel  pada panjang gelombang 763,0 nm dengan waktu pengukuran pada menit ke 0, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90,  105,  120,  135,  150,  165  dan  180.  Penentuan operating  time ditentukan  dengan  melihat  nilai absorbansi yang stabil pada hasil pengukuran.

## 5. Pembuatan kurva baku
Pembuatan  kurva  baku  kuersetin  dilakukan  dengan  membuat  larutan  kuersetin  pada  seri konsentrasi  2,  4,  6,  8,  10  dan  12  μg/mL.  Pembuatan  kurva  baku  asam  galat  dilakukan  dengan membuat larutan asam galat pada seri konsentrasi 50, 100, 150, 200, 250 dan 300 μg/mL. Senyawa kompleks berwarna  yang dihasilkan dari masing-masing  larutan tersebut kemudian diukur dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum.
6. Pengukuran kadar flavonoid total
Analisis  kuantitatif  kadar  flavonoid  total  dari  keempat  jenis  ekstrak  dilakukan  dengan metode  kolorimetri  menggunakan  pereaksi  AlCl 3 (Chang  dkk.,  2002).  Larutan  uji  masing-masing ekstrak diambil sebanyak 1000 µL, kemudian ditambahkan 1,5 mL etanol p.a,  200 µL AlCl 3 10%, dan  200  µL  Kalium  asetat  1  M. Operating  time selama  30  menit  dan  absorbansi  diukur  pada panjang gelombang 422,9 nm. Kadar flavonoid total dinyatakan sebagai jumlah mg kuersetin (QE) yang ekuivalen pada tiap gram ekstrak.
7. Pengukuran kadar fenolik total
Analisis kuantitatif kadar fenolik total pada keempat jenis ekstrak dilakukan dengan metode Folin Ciocalteu (Ahmad dkk., 2015). Larutan uji masing-masing ekstrak diambil sebanyak 200 µL ditambahkan  0,4  mL  reagen  Folin-Ciocalteu,  dikocok  dan  dibiarkan  8  menit,  ditambahkan  4  mL larutan Na 2 CO 3 7%, dikocok hingga homogen. Operating time selama 2 jam dan absorbansi diukur pada panjang gelombang 763,0 nm. Kadar fenolik total dinyatakan  sebagai jumlah  mg asam galat (GAE) yang ekuivalen pada tiap gram ekstrak.
8. Penentuan aktivitas inhibisi enzim asetilkolinesterase secara in vitro
Aktivitas  enzim  diukur  menggunakan microplate  96-well dan  uji  tersebut  telah  dijabarkan oleh  Mathew  dan  Subramanian  (2014)  dengan  sedikit  modifikasi  berdasarkan  metode  Ellman. Enzim  asetilkolinesterase  (AChE)  akan  menghidrolisis  substrat  asetiltiokolin  (ATCI)  yang menghasilkan  produk  tiokolin.  Tiokolin  yang  terbentuk  direaksikan  dengan  5-5’-dithiobis-2- nitrobenzoic  acid  (DTNB)  dan  menghasilkan  5-thio-2-nitrobenzoic  acid  (TNB)  yang  berwarna kuning dan intensitasnya diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 412 nm.
Larutan  Tris-HCl  50  mM  pH  8,0  digunakan  sebagai  bufer  selama  proses  eksperimen berlangsung,  kecuali  dinyatakan  lain  dalam  penelitian  ini.  Enzim  asetilkolinesterase  yang digunakan  untuk  uji  diperoleh  dari  Electric  eel  (product  number  C3389,  500  U/mg  solid,  Sigma- Aldrich).  Enzim  yang  telah  dilarutkan  dalam  bufer  harus  disimpan  pada  suhu  -20°C  untuk kepentingan  penelitian  ini.  DTNB  dilarutkan  dalam  bufer  yang  mengandung  0,1  M  NaCl  dan 0,02 M MgCl 2 . ATCI dilarutkan dalam aqua deion.
Sebanyak 100 µl DTNB 3 mM, 20 µl AChE 0,26 U/ml, dan 60 µl dari setiap ekstrak pada beberapa  konsentrasi  (500,  750,  1000,  1250  and  1500  µg/ml)  dilarutkan  dalam  bufer  yang mengandung  tidak  lebih  dari  10%  metanol,  ditambahkan  pada  masing-masing  sumuran.  Setelah proses pencampuran, microplate 96-well tersebut diinkubasi pada suhu 25°C selama 15 menit dan serapannya  diukur  pada  412  nm.  Hasil  pembacaan  tersebut  digunakan  sebagai  blanko.  Reaksi enzimatik diinisiasi dengan penambahan 20 μL ATCI 15 mM (Sigma-Aldrich) sehingga senyawa TNB  yang  dihasilkan  dapat  diukur  dengan  membaca  serapan  setiap  5  menit  selama  30  menit. Pyridostigmin digunakan sebagai baku pembanding dalam penelitian ini. Masing-masing bahan uji dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Nilai persen inhibisi dihitung sebagai berikut:
Persen Inhibisi (%) = [(A-E)/A] × 100
keterangan:  A  adalah  aktivitas  enzim  tanpa  penambahan  ekstrak  dan  E  adalah  aktivitas  enzim dengan penambahan ekstrak.

## ANALISIS DATA
Data  absorbansi  dari  seri  konsentrasi  kuersetin  dan  asam  galat  kemudian  dibuat  persamaan kurva  baku.  Persamaan  kurva  baku  adalah  y=bx+a  dengan  y=absorbansi,  x=kadar  kuersetin  atau asam  galat  dalam  μg/mL.  Nilai  absorbansi  dari  keempat  jenis  ekstrak  tersebut  dimasukkan  ke
dalam persamaan  kurva baku kuersetin dan  asam galat, sehingga didapatkan  kadar flavonoid atau fenolik (μg/mL).
Kadar flavonoid dan fenolik total dihitung sebagai berikut:
Keterangan: F   = Kadar Flavonoid, Fenolik (mg/gram ekstrak) c   = Kesetaraan Kuersetin atau asam galat (μg/mL) V  = Volume Total Ekstrak (mL)
f    = Faktor Pengenceran
m  = Berat Sampel (gram)
Aktivitas inhibisi enzim asetilkolinesterase (AChE) dinyatakan dengan IC 50 . Nilai IC 50 dapat dihitung  dari  nilai  persen  inhibisi  beberapa  seri  konsentrasi  ekstrak  pada  masing-masing  ekstrak uji. Nilai IC 50 dihitung menggunakan regresi linear dengan bantuan piranti lunak Microsoft Excel.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tahap awal penelitian adalah penyiapan simplisia dan pembuatan ekstrak etanol dari masing- masing jenis sayuran yang digunakan. Proses pengeringan dilakukan pada suhu 40-50°C dan proses ekstraksi juga menggunakan metode dingin (maserasi) untuk meminimalkan kerusakan bahan aktif yang  tidak  tahan  panas  atau  mudah  menguap.  Tabel  II  menunjukkan  rendemen  simplisia  dan rendemen ekstrak dari masing-masing jenis sayuran.

## Tabel II. Jenis sayuran, nilai rendemen simplisia dan ekstraknya
Jenis sayuran Rendemen simplisia (%) Rendemen ekstrak (%) Wortel 8,14 30,18 Kecipir 5,56 11,76 Kecambah kacang hijau 9,88 13,54 Kecambah kedelai 20,85 4,12
Nilai  rendemen  simplisia  menyatakan  perolehan  kembali  bahan  tanaman  setelah  proses pengeringan. Bila rendemen simplisia kecil maka bahan tanaman tersebut banyak mengandung air, sehingga  dibutuhkan  lebih  banyak  bahan  segar  untuk  mendapatkan  ekstrak  dalam  jumlah  yang cukup untuk proses pengujian. Tabel  II menunjukkan bahwa  kecipir memiliki rendemen simplisia paling kecil sedangkan kecambah kedelai memiliki rendemen simplisia paling besar.
Rendemen  ekstrak  menyatakan  perolehan  kembali  bahan  simplisia  setelah  proses  ekstraksi. Nilai rendemen ekstrak yang besar menunjukkan bahwa senyawa-senyawa kimia yang terkandung dalam simplisia lebih banyak tersari dalam pelarut yang digunakan. Rendemen ekstrak yang paling besar  adalah  wortel  sedangkan  yang  paling  kecil  adalah  kecambah  kedelai.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  kecambah  kedelai  memiliki  rendemen  simplisia  terbesar  namun  rendemen ekstraknya  terkecil.  Hal  ini  berarti  bahwa  meskipun  kecambah  kedelai  tidak  terlalu  banyak mengandung  air  dibandingkan  bahan  lainnya,  namun  ternyata  senyawa-senyawa  kimia  yang terkandung didalamnya tidak banyak yang tersari dalam pelarut etanol 95%. Menurut Astawan dan Hazmi  (2016),  kecambah  kedelai  mengandung  lemak,  protein,  mineral,  dan  karbohidrat  dalam jumlah  yang  cukup besar. Hal inilah  yang  kemungkinan menyebabkan  kandungan senyawa kimia dalam kecambah kedelai relatif sedikit, sehingga tidak banyak yang tersari dalam etanol 95%.
Penelitian  ini  juga  menentukan  karakteristik  kimia  dari  keempat  jenis  ekstrak  yaitu  kadar fenolik  total  dan  kadar  flavonoid  total  (Tabel  III).  Berdasarkan  hasil  penentuan  kurva  baku kuersetin  diperoleh  persamaan  regresi  linear  y=  0,04942x  +  0,14529  (x=kadar  flavonoid  total dalam  µg/mL,  y=absorbansi)  dengan  nilai  koefesien  korelasi  r=0,99828,  sedangkan  persamaan kurva  baku  asam  galat  diperoleh  y=  0,00207  x  +  0,13513  (x=kadar  fenolik  total  dalam  µg/mL, y=absorbansi) dengan nilai koefesien korelasi r=0,99879.
Tabel  III  memperlihatkan  bahwa  ekstrak  kecipir  memiliki  kadar  fenolik  total  dan  kadar flavonoid total paling kecil, sedangkan ekstrak kecambah kacang hijau memiliki kadar fenolik total terbesar dan ekstrak wortel memiliki kadar flavonoid total terbesar. Perbedaan karakteristik ekstrak secara  kimia  sangat  dipengaruhi  oleh  kandungan  kimia  dari  tanaman.  Senyawa  golongan  fenolik lebih banyak ditemukan pada ekstrak kecambah kacang hijau. Asam fenolat merupakan komponen yang  ada  dalam  kecambah  kacang  hijau  (Tang  dkk.,  2014).  Chatatikun  dan  Chiabchalard  (2013) melaporkan bahwa ekstrak etanol umbi wortel memiliki kadar flavonoid total sebesar 20,4±2,8  mg kuersetin  (QE)  yang  ekuivalen  pada  tiap  gram  bahan  kering.  Hasil  tersebut  hampir  sama  seperti hasil yang didapatkan pada penelitian ini.
Tabel III. Jenis ekstrak serta kadar fenolik total dan flavonoid total
Jenis ekstrak Kadar fenolik total tiap gram ekstrak (mg/gram ekstrak) Kadar flavonoid total tiap gram ekstrak (mg/gram ekstrak) Wortel 12,67±0,67 22,77±0,55 Kecipir 5,25±0,081 0,10±0,004 Kecambah kacang hijau 597,67±4,83 13,14±0,05 Kecambah kedelai 7,69±0,22 0,21±0,003
Ekstrak etanol dari 4 jenis sayuran telah diuji aktivitas inhibisi AChE menggunakan metode Ellman. Hasilnya disajikan pada Tabel IV yang menunjukkan nilai persen inhibisi pada konsentrasi ekstrak  1000  µg/ml  dan  1500  µg/ml.  Ekstrak  kecambah  kacang  hijau  dan  kecambah  kedelai ternyata  tidak  memiliki  aktivitas  sebagai  inhibitor  AChE.  Pada  saat  percobaan,  nilai  kecepatan reaksinya  cenderung  meningkat  seiring  waktu  pengamatan  bila  dibandingkan  dengan  perlakuan enzim tanpa ekstrak. Oleh karena itu kedua ekstrak tersebut tidak bersifat menginhibisi, melainkan bersifat menginduksi enzim AChE. Ekstrak umbi wortel memiliki nilai persen inhibisi yang relatif kecil pada konsentrasi yang cukup besar, yaitu sekitar 11-20% pada konsentrasi 1000-1500 µg/ml. Adapun  ekstrak  kecipir  menghasilkan  nilai  persen  inhibisi  sebesar  52-75%  pada  konsentrasi 1000-1500  µg/ml.  Berdasarkan  penelusuran  pustaka  yang  telah  dilakukan,  biasanya  suatu  bahan alam  dikatakan  berpotensi  sebagai  inhibitor  AChE  jika  memiliki  nilai  IC 50 lebih  kecil  daripada 1000  µg/ml.  Oleh  karena  itu  penentuan  nilai  IC 50 hanya  dilakukan  pada  ekstrak  kecipir  saja, sedangkan ekstrak umbi wortel nilai IC 50 dinyatakan lebih besar daripada 1500 µg/ml.

## Tabel IV. Nilai persen inhibisi dari masing-masing ekstrak
Jenis ekstrak Inhibisi AChE pada konsentrasi ekstrak 1000 µg/ml   (%) Inhibisi AChE pada konsentrasi ekstrak 1500 µg/ml   (%) Wortel 11,93 21,68 Kecipir 52,32 75,70 Kecambah kacang hijau - - Kecambah kedelai - -
Pyridostigmin  digunakan  sebagai  baku  pembanding  inhibitor  AChE  pada  penelitian  ini. Penggunaan  baku  pembanding  bertujuan  untuk  validasi  metode  yang  digunakan  pada  penelitian. Nilai  IC 50 pyridostigmin  adalah  0,373  ±  0,005  µg/ml  sedangkan  IC 50 ekstrak    kecipir  sebesar 921,90  ±  48,50  µg/ml.  Kecipir  mengandung  senyawa  fenolik  diantaranya  asam  kafeat  dan  asam p -kumarat,  serta  mempunyai  aktivitas  antioksidan  (Wongsa  dkk.,  2012).  Salah  satu  terapi kepikunan  adalah  menggunakan  senyawa  antioksidan  yang  diketahui  memiliki  aktivitas  sebagai neuroprotektif.  Sebagian  besar  obat  yang  telah  digunakan  untuk  kepikunan  merupakan  inhibitor AChE  dengan  cara  menurunkan  degradasi  asetilkolin.  Obat-obat  ini  memberikan  banyak  manfaat untuk  perbaikan  kualitas  hidup  pasien,  sehingga  beberapa  peneliti  menggabungkan  molekul  obat ini  dengan  senyawa  antioksidan  dengan  harapan  dapat  meningkatkan  keberhasilan  terapi  (Rosini dkk., 2014). Jika aktivitas inhibisi AChE ekstrak dikaitkan dengan kadar fenolik maupun flavonoid
total, maka hal tersebut juga tidak signifikan korelasinya. Tabel  III memperlihatkan bahwa ekstrak kecipir  memiliki  kadar  fenolik  dan  flavonoid  total  paling  kecil,  namun  ternyata  aktivitas inhibisinya paling besar di antara keempat ekstrak uji. Hal ini berarti bahwa ada senyawa lain yang lebih berperan sebagai inhibitor AChE di dalam ekstrak kecipir tersebut.
Bila  dibandingkan  nilai  IC 50 ekstrak  kecipir  dengan  pyridostigmin,  maka  aktivitas  ekstrak masih  sangat  kecil.  Hal  ini  dikarenakan  ekstrak  masih  mengandung  banyak  senyawa-senyawa kimia  sehingga  aktivitasnya  merupakan  resultan  dari  interaksi  semua  senyawa-senyawa  kimia tersebut.  Interaksinya  bisa  bersifat  saling  memperkuat  atau  saling  meniadakan,  sehingga  masih diperlukan tahapan lainnya dalam rangka memperbesar aktivitas inhibisi AChE dari ekstrak. Salah satu  upaya  yang  dapat  dilakukan  adalah  menyederhanakan  kandungan  kimia  ekstrak  dengan  cara fraksinasi.  Proses  fraksinasi  dapat  memilah-milah  kandungan  kimia  berdasarkan  polaritasnya, misalnya  dengan  membuat  fraksi  non  polar,  semi  polar  dan  polar.  Harapannya  adalah  aktivitas inhibisinya dapat meningkat seiring dengan kandungan kimia yang lebih spesifik.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  nilai  IC 50 asetilkolinesterase  ekstrak    kecipir  sebesar 893,86  µg/ml,  ekstrak  umbi  wortel  diatas  1500  µg/ml  sedangkan  ekstrak  lainnya  tidak  memiliki aktivitas.  Dalam  rangka  meningkatkan  aktivitas  inhibisi  asetilkolinesterase  ekstrak  kecipir  dapat dilakukan  proses  fraksinasi  agar  kandungan  kimia  ekstrak  lebih  sederhana  sehingga  aktivitasnya dapat meningkat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Direktorat  Riset  dan  Pengabdian  kepada Masyarakat,  Direktorat  Jenderal  Penguatan  Riset  dan  Pengembangan,  Kementerian  Riset, Teknologi  dan  Pendidikan  Tinggi  yang  telah  membiayai  sebagian  dana  penelitian  ini  melalui skema “Penelitian Disertasi Doktor” 2017 atas nama Maulita Cut Nuria.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad,  A.R.,  Juwita,  Ratulangi,  S.A.D.  dan  Malik,  A.,  2015,  Penetapan  Kadar  Fenolik  dan Flavonoid  Total  Ekstrak  Metanol  Buah  dan  Daun  Patikala  ( Etlingera  elatior (Jack) R.M.SM), Pharm Sci Res, 2 , 1-10.
Astawan,  M.  dan  Hazmi,  K.,  2016,  Karakteristik  fisikokimia  tepung  kecambah  kedelai, Pangan , 25(2): 105-112.
Boga,  M.,  Hacibekiroglu,  I.,  Kolak,  U.,  2011,  Antioxidant  and  anticholinesterase  activities  of eleven edible plants, Pharmaceutical Biology , 49(3): 290–295.
Chang, C., Yang, M., Wen, H., Chern, J., 2002, Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods, J Food Drug Anal ., 10, 178-182.
Chatatikun, M. dan Chiabchalard, A., 2013, Phytochemical  screening  and free radical scavenging activities of orange baby carrot and carrot ( Daucus carota Linn.) root crude extracts, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research , 5(4):97-102.
Dhanasekaran,  S.,  Perumal,  P.,  and  Palayan,  M.,  2015,  In-vitro  screening  for  acetylcholinesterase enzyme inhibition potential  and antioxidant  activity of extracts of Ipomoea aquatica Forsk: therapeutic lead for alzheimer’s disease, Journal of Applied Pharmaceutical Science , 5(02): 012–016.
Kausler, D.H., Kausler, B.C., and Krupsaw, J.A., 2007, The essential guide to aging in the twenty – first century: Mind, body and behavior , Columbia and London: University of Missouri Press, P31–37.
Mathew, M. dan Subramanian, S., 2014, In vitro screening for anti-cholinesterase and antioxidant activity  of  methanolic  extracts  of  Ayurvedic  medicinal  plants  used  for  cognitive  disorders, PLOS one , 9(1): 1–7.
Mukherjee, P.K. dan Houghton, P.J., 2009, The worldwide phenomenon of increased use of herbal products:  opportunities  and  threats,  Di  dalam Mukherjee,  P.K.  dan  Houghton,  P.J.  (eds.), Evaluation  of  herbal  medicinal  products  –  perspectives  of  quality,  safety  and  efficacy , London: Pharmaceutical Press, P3–12.
Perry,  E.,  Walker,  M.,  Grace,  J.,  and  Perry,  R.,  1999,  Acetylcholine  in  mind:  a  neurotransmitter correlate of consciousness?, TINS , 22(6): 273-280
Rosini,  M.,  Simoni,  E.,  Milelli,  A.,  Minarini,  A.,  and  Melchiorre,  C.,  2014,  Oxidative  stress  in Alzheimer’s disease: Are we connecting the dots?, J Med Chem , 57: 2821–2831. Septiningsih,  E.  dan  Suganda,  A.G.,  2013,  Penghambatan  aktivitas  enzim  asetilkolinesterase ekstrak metanol empat belas jenis tumbuhan, Jurnal Bahan Alam Indonesia , 8 (4): 248–252. Szwajgier, D. dan Borowiec, K., 2012, Screening for cholinesterase inhibitors in selected fruits and vegetables, EJPAU , 15(2): #06.
Tang,  D.,  Dong,  Y.,  Ren,  H.,  Li,  L.,  and  He,  C.,  2014,  A  review  of  phytochemistry,  metabolite changes, and medicinal uses of the common food mung bean and its sprouts ( Vigna radiata ), Chemistry Central Journal , 8(4): 1-9.
Wongsa,  P.,  Chaiwarit,  J.,  and  Zamaludien,  A.,  2012, In  vitro screening  of  phenolic  compounds, potential inhibition against α -amylase and α -glucosidase of culinary herbs in Thailand, Food Chemistry , 131: 964 – 971.