## PERIODE BUKAAN MULUT DAN LAJU SERAPAN KUNING TELUR KAITANNYA DENGAN AKTIVITAS ENZIM PENCERNAAN PADA STADIA
AWAL KERAPU BEBEK HASIL PEMBENIHAN INDUK TURUNAN KE 2

## PERIODS OF MOUTH OPENING AND YOLK ABSORPTION RELATED TO THE ACTIVITY OF DIGESTIVE ENZYMES IN THE EARLY STADIA FROM THE SECOND GENERATION OF HUMPBACK GROUPER BROODSTOCK

## Wawan Andriyanto dan Muhammad Marzuqi
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Budidaya Laut, BalitbangKP-KKP, Gondol E-mail: wa2n.rimgdl@gmail.com

## ABSTRACT
The  experiment  was  carried  out  to  determine  the  exposure  time  of the  first  mouth  opening  on humpback grouper larval from F2 broodstock on hatchery until 10 DAH (days after hatching) because this phase is a critical phase of larval adaptation from food endogenous (from yolk sac) to  the  ability  of  absorbing  nutrients  from  external  (exogenous).  The  eggs  used  were  collected from natural spawning of second generation of humpback grouper reared in the tank size of 150 litre.  The  mouth  opening  was  observed  at  90  and  45  degrees  under  computerize  integrated microscope and processed by a specific software. The rate of yolk absorption was observed in larvae  from  the  beginning  to  the  end  of  breeding,  while  the  activities  of  digestive  enzymes (trypsin and chymotripsin) were analyzed by enzyme assay techniques. The results showed that the  period  of  mouth  opening  of  larvae  of  humpback  grouper  occurred  at  3  DAH  with  mouth openings of 45° as large as  0.103 mm and of 90° as large as 0.156 mm. In the early stadia, the diameter of yolk was 0.1875 mm, while the oil globule was 0.0537 mm. At 4 days after hatching, the yolk and oil  globule had been absorbed, while the enzymes trypsin and chymotripsin were detected  in  the  early  stadia.  The  results  also  showed  that  the  larvae  was  started  to  use  foods from outside after the age of 4 DAH. Up to the age of 10 days, the mouth opening increased and the activity of trypsin and chymotripsin were still detected.
Keywords: progeny larvae of humpback grouper F2, mouth opening, yolk sac, enzyme

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  waktu  bukaan  mulut  pertama  stadia  larva  kerapu bebek  hasil  pembenihan  F2  sampai  dengan  umur  10  HSM  (hari  setelah  menetas)  karena  pada fase ini merupakan fase kritis adaptasi larva dari input makanan endogen (dari yolk sac) sampai dengan kemampuan menyerap makanan dari luar (eksogen). Telur yang digunakan berasal dari pemijahan  alami  induk  ikan  kerapu  generasi  ke  2  (F2)  yang  dipelihara  pada  bak  ukuran  150 liter.  Bukaan  mulut  diamati  di  bawah  mikroskop  yg  terintegrasi  dengan  komputer,  data  yang didapatkan diolah dengan software dan diukur bukaan mulut 90° dan 45°. Laju serapan kuning telur  diamati  dari  larva  mulai  menetas  sampai  dengan  habis.  Sedangkan  aktivitas  enzim pencernaan  (trypsin  dan  chymotripsin)  dianalisa  dengan  teknik  enzim  assay.  Hasil  penelitian menunjukkan bahwa bukaan mulut larva kerapu bebek hasil pembenihan F2 terjadi pada umur 3 HSM  dengan  bukaan  45° sebesar  0.103  mm  dan  90° sebesar  0.156  mm.  Awal  stadia  diameter kuning telur adalah 0.1875 mm dan gelembung minyak 0.0537 mm. Pada umur 4 HSM kuning telur  dan  gelembung  minyak  telah  terserap  habis,  sedangkan  enzim  trypsin  dan  chymotripsin telah  pula  terdeteksi  pada  awal  stadia  (1  HSM).  Dari  hasil  tersebut  disimpulkan  bahwa  larva mulai  dapat  memanfaatkan  makanan  dari  luar  setelah  umur  4  HSM.  Sampai  dengan  umur  10 HSM, bukaan mulut semakin lebar dan aktivitas trypsin dan chymotripsin masih terdeteksi.
Kata kunci : larva kerapu bebek, pembenihan F2, bukaan mulut, kuning telur, enzim

## I. PENDAHULUAN
Benih  kerapu  bebek  turunan  F0 dan  F1  selama  ini  telah  berkembang dalam  budidaya  di  tingkat  pembudidaya laut.  Penelitian  tentang  faktor  biologi, nutrisi,  lingkungan,  penyakit  dan  pakan telah  banyak  dilakukan  untuk  benih  F0 dan F1. Namun untuk turunan F3 nya dari induk  F2  masih  belum  banyak  diamati. Studi  perkembangan  pencernaan  larva kerapu  bebek  sebelumnya  telah  diketahui bahwa  pencernaan  larva  kerapu  bebek mulai  fungsional  sekitar  umur  25  HSM (Munafi et  al. ,  2011).  Stadia  larva merupakan  salah  satu  faktor  kritis  dalam perbenihan kerapu bebek, sehingga sampai  saat  inipun  banyak  kendala  dalam peningkatan survival rate dan pertumbuhannya. Fase kritis adalah sebagian  besar  pada  usia  1  hari  setelah menetas  sampai  40  hari. Angka  kematian tinggi  pada  tahap  ini  sebagian  besar disebabkan  oleh  faktor  makanan  dan penyakit. Larva  kerapu  sangat  sensitif bahkan  untuk  gangguan  mekanis  yang minimal khususnya selama metamorfosis. Pada tahap penetasan, larva kerapu  kecil  dan  rapuh  dengan  cadangan makanan  dari  yolk  sac  (Ordonio-Aguilar et  al., 1995).  Kombinasi  faktor  ini dianggap menjadi penyebab mendasar dari kematian  yang  tinggi  dan  pertumbuhan yang  lambat  selama  pemeliharaan  larva (Kohno et  al., 1997).  Struktur  morfologi pada  saluran  pencernaan  larva  ikan  lebih kompleks  karena  disertai  oleh  adanya aktivitas  enzim  (Timeyko  dan  Novikov, 1987). Spesies ikan yang berbeda memiliki  pencernaan  yang  berbeda  serta kemampuan  mencerna  yang  berbeda karena  perbedaan  dalam  struktur  saluran pencernaan  mereka  dan  dalam  cara mereka makan (Eusebio et al., 2004).
Aktivitas  enzim  pencernaan  telah digunakan untuk mengevaluasi
kemampuan larva ikan pencernaan selama pertumbuhan  (Segner et  al., 1993,  1994; Zambonino-Infante  dan  Cahu,  1994),  dan aktivitas enzim pencernaan dapat
menunjukkan  kebutuhan  nutrisi  yang berbeda  (Buddington,  1985). Pada  tahap awal  kehidupan,  enzim  pankreas  seperti tripsin, amilase dan lipase, sangat  penting untuk  pencernaan  ikan  larva,  karena  pada tahap ini saluran pencernaan masih belum fungsional  dalam  beberapa  spesies  ikan (Zambonino-Infante  &  Cahu,  2001). Enzim proteolitik yang digunakan sebagai indikator kondisi gizi, dan terutama tripsin telah terbukti menjadi indikator penyerapan makanan yang tepat (Pedersen dan Hjelmeland, 1988; Ueberschär,
1995). Kematian  yang  tinggi  yang  terjadi pada  stadia  awal  larva  berhubungan dengan  faktor  makanan  setelah  habis persediaan makanan dari yolk sac (Kohno et al. , 1997). Larva E. coioides menunjukkan  aktivitas  enzim  pencernaan rendah  selama  10  hari  setelah  menetas (Eusebio et  al. ,  2004;  McBride,  2004). Tripsin,  sebuah  endoproteinase  telah dipilih  sebagai  enzim  indikator,  karena terhubung  langsung  ke  metabolisme protein dan terdapat pada stadia awal larva ikan. Studi enzimatik, merupakan langkah  awal  untuk  identifikasi  serta sumber  informasi  yang  penting  untuk menentukan waktu ketika sistem pencernaan  larva  secara  fungsional  siap untuk  mencerna dan mengasimilasi  pakan buatan  (Segner et  al. ,  1993;  Sarasquete et al., 1995).
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk  mengetahui  waktu  awal  mulut terbuka  larva  ikan  kerapu  bebek  hasil pembenihan induk F2 dan aktivitas enzim pencernaan  yang  berupa  trypsin  dan chymotripsin.

## II.  METODE PENELITIAN

## 2.1. Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilakukan  di  lokasi hatchery  di  Gondol  Bali  selama  40  hari dan  analisa  dilakukan  di  laboratorium biologi dan kimia.

## 2.2.  Bahan dan Alat

## 2.1.1. Telur dan Wadah Inkubasi
Telur berasal dari pemijahan induk generasi  turunan  ke  2  (F2)  dengan menggunakan  kolektor  telur  ukuran  400 (μm). Telur kemudian dipindahkan ke bak fiber  ukuran  100  liter  untuk  diinkubasi. Telur yang tidak terbuahi dibuang dengan cara  disipon.  Telur  yang  dibuahi  ditebar ke dalam bak ukuran 1000 liter dan diberi aerasi.

## 2.1.2. Larva dan Wadah Pemeliharaan
Proses penebaran dan pemeliharaan  larva  (pemberian  pakan alami sampai pakan buatan dan manajemen pergantian air) mengikuti SOP (Standar Operasional Prosedur) perbenihan  kerapu  yang  telah  ada  di BBPPBL Gondol. Hal yang tidak dilakukan  adalah  pengkayaan  pakan alami/buatan  agar  larva  yang  hidup dikondisikan  normal.  Larva  dipelihara dari  menetas  sampai  dengan  40  hari setelah menetas (HSM), karena diasumsikan  pada  umur  40  HSM  larva telah mencapai stadia juvenil.

## 2.1.3. Pengumpulan Data
Untuk mendapatkan data
pengukuran  panjang  digunakan  panjang total dari larva ikan menggunakan metode pengambilan  gambar  dengan  mikroskop khusus  dengan  perbesaran  menyesuaikan kondisi  larva.  Sebelum  diamati  dalam mikroskop, larva diberikan obat bius MS- 222.  Setelah  didapatkan  data  berupa  foto mikroskop  dari  larva,  kemudian  data diolah  menggunakan  software  MOTIC image  plus  2.0  untuk  mendapatkan  data
panjang  dari  panjang  rahang  atas  dan bawah.  Pengukuran  bukaan  mulut  larva ikan  menggunakan  formula  seperti  dalam Shirota  1970  yaitu :  MH  (90 0 ) = UJ x √2 dan MH (45 0 ) = UJ x 2 sin (45/2); dimana: UJ:  Upper  Jaw  (rahang  atas)  and  MH:
Mouth  Height  (tinggi  mulut).  Sedangkan penghitungan  volume  dan  penyusutan kuning telur dilakukan berdasarkan metode Hemming dan Buddington (1988): V=0.1667 LH 2 dan  penyusutan  kuning telur dengan rumus: {(Vn-Vo)/Vo} x 100%, dimana: V;
volume,  L;  sumbu  terpanjang  panjang kuning  telur,  H;  sumbu  pendek  terlebar kuning  telur,  Vo;  volume  kuning  telur awal, Vn; volume kuning telur hari ke n.
Untuk  pengamatan  enzim,  sediaan sampel  diawetkan  menggunakan  nitrogen cair  selama  30  detik  dan  kemudian disimpan  dalam  penyejuk  dengan  suhu  - 80 0 C.  Larva  kemudian  dihomogenisasi dalam  Tris-HCL  dingin  menggunakan
“hand held glass homogenizer”. Homogenat kemudian di sentrifugasi pada 4 0 C  di  10  000  rpm  selama  15  menit. Endapan  dan  supernatant  dipisahkan, kemudian supernatant disimpan pada suhu -20 0 C  sebelum  dianalisis.  Aktivitas tripsin  dan  cimotripsin  diukur  dengan menggunakan  N-α-benzoyl-DL-Arginine- p-nitroanilide (BAPNA) dan Suc-Ala-Ala-
Pro-Phe-p-nitroanalidine (SAPNA)
sebagai  substrat  masing  masing  enzim.
Perubahan  absorbansi  dilihat  dalam  mode kinetik  selama  3  menit  pada  410  nm (Erlanger et  al. ,  1961).  Aktivitas  enzim dihitung dengan persamaan:
Activity units =
[(Abs410nm/min)  x  1000  x  Volume  of reaction mixture]/8800 X mg
 8800:  koefisien  molar  dari  para- nitroanilide
 mg:  berat  jaringan  dalam  larutan enzim
Aktivitas enzim dinyatakan dalam (mU/mg protein).

## 2.3.  Analisa Data
Data yang diperoleh ditabulasi dan dianalisis  secara  deskriptif  untuk  masing masing variabel.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1.  Bukaan Mulut Larva Kerapu Bebek Hasil Pembenihan F2
Stadia  awal  perkembangan  larva kerapu  bebek  hasil  pembenihan  F2  dapat diamati  menggunakan  mikroskop  dengan perbesaran 20x dengan menggunakan obat bius  dosis  rendah.  Larva  habis  menetas tampak  transparan  dan  belum  memiliki pigmen  dan  mulut  masih  terlihat  tertutup serta  organ  pencernaan  yang  belum tampak  seperti  pada  stadia  benih.  Pada umur 3 hari setelah menetas, mulut  mulai terbuka  dengan  panjang  2.5  ±  0.4  mm  – 2.6  ±  0.4  mm.  Pada  umur  ini,  ukuran bukaan  mulut  sekitar  0.103  mm  pada
bukaan  45° dan  0.156  mm pada  bukaan 90° (Gambar 1). Selain itu dari pengamatan  mikroskopis juga  dapat dilihat saluran pencernaan mulai terbentuk dan berkembang pada umur 4 hari setelah menetas. Ukuran  bukaan  mulut  semakin lebar  pada  umur  6  hari  dan  berkembang sangat cepat sampai dengan larva mencapai  umur  10  hari.  Ukuran  bukaan mulut  pada  umur  10  hari  setelah  menetas adalah  0.471  mm  pada  bukaan  45° dan 0.801  mm  pada  bukaan  90°.  Secara umum, perkembangan bukaan mulut larva sampai dengan umur 10 hari dapat  dilihat pada  grafik  1.  Pola  pertumbuhan  bukaan mulut  larva  pada  bukaan  45°  dan  90° mengikuti  persamaan  logaritmik  dengan persamaan masing masing y = 0.1962ln(x)
-  0.0743  dengan  R²  =  0.8935.  dan  y  = 0.3555ln(x) - 0.1609 dengan R² = 0.8861.
Gambar 1. Grafik perkembangan bukaan mulut stadia larva ikan kerapu bebek hasil pembenihan F2 (kanan) dan pengukuran bukaan mulut larva (kiri) Ket: UJ: upper jaw, LJ: lower jaw dan MH: mouth high.
3.2.  Laju  Penyerapan  Kuning  Telur dan Butiran Minyak Kerapu Bebek Hasil Pembenihan F2 Sehari  setelah  menetas  kuning telur dan butiran minyak terlihat  dominan pada larva kerapu bebek hasil pembenihan F2.  Proporsi  butiran  minyak  dan  kuning telur yang berukuran besar pada stadia ini juga  membantu  larva  dalam  mengapung dan  berenang  mengikuti  arus.  Ukuran butiran  kuning  telur  pada  1  hari  setelah menetas  sekitar  0.188  mm  sedangkan ukuran  butiran  minyak  sekitar  0.054  mm. Secara  mikroskopis  kuning  telur  dan butiran minyak terlihat habis terserap pada umur  4  hari  setelah  menetas.  Prosentase ekspresi  laju  serapan  kuning  telur  dan butiran minyak (Gambar 2).
Laju  penyerapan  kuning  telur  dan butiran  minyak  mengikuti  persamaan
eksponensial  dengan  persamaan  masing masing  y  =  0.3804e -0.081x dengan  R²  = 0.9352 dan y = 0.4054e -0.179x dengan R² = 0.9025  seperti  tersaji  pada  Gambar  3. Volume  kuning  telur  dan  butiran  minyak mengalami  laju  penyerapan  yang  cepat pada  sekitar  30  jam  setelah  menetas masing  masing  hingga  20%  dan  14%  dan menurun  drastis  60  jam  setelah  menetas atau kira kira umur larva mencapai 3 hari. Kuning  telur  dan  butiran  minyak  habis terserap  ketika  larva  memasuki  umur  4 hari  atau  sekitar  84  jam.  Pada  usia  ini tampak organ pencernaan berupa hati dan pancreas yang memenuhi kolom abdomen yang  sebelumnya  penuh  terisi  dengan kuning  telur  dan  butiran  minyak.  Pada saat  bersamaan  sirip  sirip  perut  dan  dada mulai tampak dan pigmentasi pada bagian abdomen juga terlihat secara mikroskopis.
Gambar 2. Persentase laju penyerapan kuning telur  dan  gelembung minyak pada larva kerapu bebek hasil pembenihan F2.

## 3.3.  Aktivitas  Enzim  Pencernaan  pada
Stadia  Larva  Kerapu  Bebek  Hasil Pembenihan Induk F2
Pada  stadia  larva  dari  penetasan sampai  dengan  sepuluh  hari,  aktivitas enzim  pencernaan  baik  trypsin  dan chymotripsin  telah  terdeteksi.  Aktivitas enzim trypsin dan chymotripsin pada larva kerapu bebek hasil pembenihan F2 seperti tampak  pada  Gambar  4.  Aktivitas  trypsin telah  terdeteksi  pada  1  hari  setelah menetas sebelum kuning telur dan butiran
minyak  terserap    habis  dengan  jumlah 0,0835  U/mg  protein  sedangkan  aktivitas chymotripsin  telah  pula  terdeteksi  dengan jumlah  aktivitas  yang  lebih  tinggi  yaitu 0,3326  U/mg.  Kedua  aktivitas  enzim tersebut  cenderung  stabil  dan  sedikit mengalami  fluktuasi  pada  sekitar  umur  6 hari  setelah  menetas  dengan  jumlah masing  masing  trypsin  dan  chymotripsin adalah  0.1253  U/mg  dan  0.4455  U/mg kemudian stabil lagi  sampai dengan umur 10 hari.
Gambar 3. Hubungan antara umur dan laju penyerapan kuning telur dan butiran minyak stadia larva kerapu bebek hasil pembenihan F2.
Gambar  4.  Kombinasi  aktivitas  enzim  trypsin  dan  chymotripsin  stadia  larva  kerapu bebek hasil pembenihan induk F2.
3.4.  Pembahasan Banyak penelitian yang menganalisa  hubungan  antara  bukaan mulut  dan  aktivitas  enzim  pencernaan.
Pada Sparid  fish ( S.aurata )  enzim  trypsin dan  chymotrypsin  terdeteksi  pada  umur  3 hari setelah menetas saat mulut juga mulai terbuka (Moyano et al., 1996), sedangkan pada  ikan  lain  yaitu  Senegal  sole  ( S. senegalensis ) (Martinez et al., 1999) pada 2  hari  setelah  menetas,  kemudian  pada Red  drum  ( S.  ocellatus )  (Lazo et  al., 2000)  pada  3  hari  setelah  menetas,  dan pada D. labrax terdeteksi saat umur 5 hari setelah  menetas  (Zambonino  dan  Cahu, 1994). Sedangkan Fujii (2007) mengatakan bahwa aktivitas tripsin dalam jumlah  yang  rendah  juga  terdeteksi  pada umur  1  hari  setelah  menetas  sebelum terjadinya proses eksogenous dan
aktivitasnya  mulai  meningkat  setelah umur 2 hari saat mulut mulai terbuka.
Pada penelitian
sebelumnya tentang  penyerapan  kuning  telur  dan butiran  minyak  hampir  sebagian  besar larva  kerapu  pada  umur  3  hari  cadangan kuning telur dan butiran minyaknya habis. Seperti  dalam  Tridjoko et  al., 1996  pada kerapu  bebek  ( Cromileptes  altivelis ) turunan  pertama  dan  Anindiastuti et  al.,
1999 pada kerapu macan ( E. fuscoguttatus ).  Laju  penyerapan  kuning telur  dan  butiran  minyak  yang  sangat cepat  tersebut  erat  kaitannya  dengan pertumbuhan
morfologi maupun pencernaan  makanannya.  Pada  umur  3 sampai 4 hari mulut sudah terbuka dengan bukaan mulut yang cukup untuk memanfaatkan  makanan  dari  luar.  Selain itu  perkembangan  saluran  pencernaan pada umur stadia 3-4 hari juga berkembang  pesat  mulai  dari  mulut, kerongkongan,  perut,  usus  dan  anus. Selain  itu  organ  hati  dan  pancreas  mulai terbentuk  sehingga  proses  enzimatik  dan penyimpanan  energy  sudah  dimulai  pada tahap ini.
Secara  umum  aktivitas  enzim trypsin  dalam  penelitian  ini  lebih  rendah dari  aktivitas  chymotripsin,  dan  kedua aktivitas  enzim  tersebut  telah  terdeteksi saat fase  endogenous. Tripsin  dan cimotripsin  memainkan  peranan  penting dalam  proses  penyerapan  makanan  pada stadia  larva.  Pada  penelitian  sebelumnya pada ikan sea bass ( D. labrax ) tripsin dan cimotripsin juga terdeteksi sebelum terjadinya  proses  pemanfaatan  makanan dari  luar  (Zambonino  dan  Cahu,  1994). Kedua enzim tersebut juga terdeteksi pada proses  embriogenensis  ikan  Atlantic  cod sebelum  menetas.  Hal  ini  dimungkinkan untuk  menjaga  agar  dapat  meningkatkan nilai  kelulushidupan  larva  saat  awal pemanfaatan  makanan  dari  luar  sehingga menstimulasi aktivitas kedua enzim tersebut.  (Sveinsdóttir,  2006).  Seperti yang  dikemukanan  oleh  Chen  (2006), fluktuasi  aktivitas  enzim  menjelaskan adanya  diferensiasi  pada  fase  larva,  masa perubahan morfologi dalam organ pencernaan  dan  organ  yang  terkait. Sebelum  lambung  dan  kelenjar  lambung terdiferensiasi,  secara  umum  larva  yang bersifat  planktonik  mencerna  makanan dengan  menggunakan  organ  pancreas  dan enzim usus  (Kurokawa dan Suzuki,  1996, 1998; Anand et  al., 2002),  dan  dengan penyerapan  secara  intrasel  pada  bagian depan  usus  ( Tanaka,  1972; Watanabe, 1981, 1982).

## IV. KESIMPULAN
Dari  pengamatan  pada  fase  awal stadia  tersebut  dapat  disimpulkan  bahwa bukaan  mulut  larva  kerapu  bebek  hasil pembenihan  F2  mulai  berkembang  pada umur  3  hari  –  4  hari  dan  dari  bukaan maksimal  nya  dapat  menangkap  makanan alami  berupa  rotifer  dengan  ukuran  yang kecil.  Selain  itu  laju  serapan  kuning  telur dan  butiran  minyak  habis  terserap  pada umur 4 hari namun aktivitas enzim typsin dan  chymotripsin  sebagai  indikator  telah
terjadi proses pemanfaatan makanan telah terdeteksi dan aktivitasnya tidak menurun. Hal  ini  sejalan  dengan  terjadinya  proses metamormofis  perubahan  organ  organ pencernaan  untuk  dapat  berfungsi  nya saluran pencernaan.

## DAFTAR PUSTAKA
Anand,  S.,  T.  Kurokawa,  and  T.  Suzuki., 2002.    mRNA  expression  of pancreatic  enzyme  precursors  and estimation  of  protein  digestibility in  first  feeding  larvae  of  Japanese flounder, Paralichthys  olivaceus .
Comparative  Biochemistry and
Physiology . Part A. 13:629-635. Anindiastuti,  N. Rausin,  Mustamin,  and E.  Sutrisno.    1999.    Paket  usaha budidaya kerapu macan, EpinepheIus  fuscoguttatus .  Depar- temen Pertanian, Dirjen. Perikanan,  Balai  Budidaya  Laut Lampung. 35Hlm. Buddington,  R.K.    1985.    Digestive secretions of lake sturgeon, Acipenser  fulvescens ,  during  early development. J.  of  Fish  Biology , 26:715-723.
Chen,  B.N.,  J.G.  Qin,  M.S.  Kumar,  W. Hutchinson,  S.  Clarke.    2006. Ontogenetic  development  of  the digestive  system  in  yellowtail kingfish Seriola  lalandi larvae. Aquaculture, 256:489–501.
Erlanger,  B.F.,  N.  Kokowski,  W.  Cohen.
1961. The preparation and properties of two new chromogenic  substrates  of  trypsin.
Archives  of  Biochemistry  and Biophysics , 95:271–278.
Eusebio,  P.S.,  J.D.  Toledo,  R.E.P. Mamauag,  M.J.G.  Bernas.  2004. Digestive  enzyme  activity  in developing  grouper  ( Epinephelus coioides ) larvae. In : M.A. Rimmer, S.  McBride,  K.C.  Williams  (eds.), Advances  in  grouper  aquaculture:
Australian Center for  International Agriculture  Research,  Canberra,
35–40pp.
Fujii,  A.,  Y.  Kurokawa,  S.  Kawai,  K.
Yoseda,  S.  Dan,  A.  Kai,  and  M. Tanaka.    2007.  Diurnal  variation of  tryptic  activity  in  larval  stage and  development  of  proteolytic enzyme  activities  of  malabar grouper  ( Epinephelus  malabari- cus )  after  hatching. Aquaculture , 270:68–76.
Heming,  T.A.,  and  R.K.  Buddington,
1988. Yolk absorption in embryonic  and  larval  fishes. In : Randall,  D.J.  and  W.S.  Hoar (Eds.). Fish physiology. Academic Press. New York.
Kohno,  H.,  R.S.  Ordonio-Aguilar,  A. Ohno, and Y. Taki.  1997.  Why is grouper larval rearing difficult? an approach from the development of the  feeding  apparatus  in  early stage  larvae  of  the  grouper, Epinephelus  coioides . Ichthyo- logical Research , 44:267–274. Kurokawa,  T.  and  T.  Suzuki.    1996. Formation  of  the  diffuse  pancreas and  the  development  of  digestive enzyme  synthesis  in  larvae  of  the Japanese  flounder Paralichthys olivaceus . Aquaculture ,  141:267– 276.
Lazo,  J.P.,  M.T.  Dinis,  G.J.  Holt,  C. Faulk,  and  C.R.  Arnold.    2000. Co-feeding  microparticulate  diets with  algae:  toward  eliminating  the need  of  zooplankton  at  first feeding in larval red drum ( Sciaenops  ocellatus ). Aquacul- ture , 188:339–351.
McBride,  S.,  2004.  The  activity  of
digestive enzymes in larval grouper  and  live  food. In :  M.A.
Rimmer, S. McBride,
K.C. Williams,  (eds.),  Advances  in grouper  aquaculture:  Australian
Center  for  International  Agricul- ture Research, Canberra, 41–46pp. Martinez-Lagos,  R.  and  V.  Gracia-Lopez. 2009.  Morphological development and growth patterns of the leopard grouper Mycteroperca  rosacea during larval development. Aquaculture  Research ,  41:120- 128. Moyano,  F.J.,  M.  Diaz,  F.J.  Alarcon,  and M.C. Sarasquete. 1996. Characterization of digestive enzyme  activity  during  larval development  of  gilthead  seabream ( Sparus  aurata ). Fish  Physiology and Biochemistry , 15:121–130.
Munafi,  A.B.,  W.  Andriyanto,  S.  Ismi, A.Y.  Nirmala,  I.  Mastuti,  A. Muzaki,  and  A.W.M.  Effendy.
2011.    The  ontogeny  of  the digestive  tract  and  associated organs  of  Humpback  Grouper ( Cromileptes altivelis ) larvae. Asian  Fisheries  Science, 24:379- 386.
Ordonio-Aguilar,  R.    1995.    Survival mechanisms of tropical marine fish larvae  during  changeover  from endogenous  to  exogenous  feeding. PhD  Thesis.  Tokyo  University  of Fisheries, Tokyo, Japan. 322p. Pedersen, B.H. and K. Hjelmeland.  1988. Fate  of  trypsin  and  assimilation efficiency in larval herring ( Clupea harengus ) following digestion  of  copepods, Marine Biology , 97:467–476.
Sarasquete,  A.,  Polo,  and  M.  Yufera,
1995.    Histology  and  histoche- mistry  of  the  development  of  the digestive  system  of  larval  gilthead seabream, Sparus aurata L., Aquaculture , 130:79–92.
Segner, H., R. Roesch, J. Verreth, U. Witt.
1993.    Larval  nutritional  physio- logy: studies with Clarias gariepinus, Coregonus  lavaretus and Scophthalmus  maximus . J.
World Aquaculture Society , 24:121–134. Segner,  H.,  V.  Storch,  M.  Reinecke,  W.
Kloas,  W.  Hanke.    1994.    The development    of    functional digestive  and  metabolic  organs  in turbot, Scophthalmus  maximus .
Marine Biology , 119:471–486.
Shirota,  A.    1970.    Studies  on  the  mouth size  of  fish  larvae. Bulletin  of  the Japanese  Society  of  Scientific Fisheries, 36:353-368 (in Japanese). Sveinsdóttir,  H.,  H.  Thorarensen,  A. Gudmundsdóttir.    2006.  Involve- ment  of  trypsin  and  chymotrypsin activities  in  Atlantic  cod  ( Gadus morhua )  embryogenesis. Aquacul- ture , 260:307–314.
Tanaka,  M.    1972.    Studies  on  the structure  and  function  of  the digestive  system  in  teleost  larvae- IV  epithelial  change  in  the posterior-gut and protein ingestion. Japanesse J. of Ichthyology , 19:172-180  (in  Japanese  with English summary).
Timeyko, V.N. and G.G. Novikov.  1987. Proteolytic activity in the digestive tract  of  Atlantic  salmon, Salmo salar ,  during  larval  development.
J. of Ichthyology , 27:27–33.
Tridjoko,  B.    Slamet,  D.  Makatutu    dan K.    Sugama.    1996.    Pengamatan pemijahan  dan    perkembangan telur ikan kerapu bebek,
Cromileptes  altivelis ,  pada  bak secara    terkontrol. J.  Penelitian Perikanan  Indonesia , 2(2):55-62.
Ueberschär,  B.    1995.  The  use  of  tryptic enzyme  activity  measurement  as  a nutritional condition
index: laboratory  calibration  data  and field  application. ICES  Marine Science Symposium , 201:119–129. Watanabe,  Y.    1981.    Ingestion  of horseradish  peroxidase  by  the intestinal  cells  in  larvae  or
juveniles of some teleosts. Bulletin
of the Japanese Society of
Scientific Fisheries, 47:1299-1307.
Watanabe,  Y.    1982.    Intracellular
digestion of horseradish peroxidase  by  the  intestinal  cells of  teleost  larvae  and  juvenile.
Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries , 48:37-42. Zambonino-Infante  J.L.,  and  C.  Cahu. 1994.    Development  and  response to  a diet change of some digestive enzymes  in  sea  bass  ( Dicentrar- chus labrax ) larvae. Fish Physiology and Biochemistry ,
12:399-408. Zambonino-  Infante,  J.L.,  and  C.L.  Cahu. 2001.    Ontogeny  of  the  gastro- intestinal  tract  of  marine  fish larvae. Comprehensive  Biochemis- try and Physiology , 130C:477-487.