## EKSPLORASI BAKTERIOSIN DARI BAKTERI ASAM LAKTAT ASAL RUSIP BANGKA DAN KALIMANTAN
Exploration of Bacteriocin from Lactic Acid Bacteria Origin from Bangkanese and Kalimantanese Rusip
Arifah Kusmarwati 1* , Fadila Rachman Arief 2 , dan Sakinah Haryati 2
1 Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Pengolahan  Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan  dan  Perikanan, Jl. K.S. Tubun  Petamburan  VI,  Jakarta Pusat, Indonesia
2 Universtias  Sultan Ageng  Tirtayasa,  Indonesia *  Korespondensi  Penulis:  akusmarwati@gmail.com
Diterima: 11 Maret 2014;  Disetujui: 3 Juni 2014

## ABSTRAK
Penelitian  ini  dilakukan  untuk  memproduksi  dan  mengkarakterisasi  bakteriosin  yang  dihasilkan oleh  bakteri  asam  laktat  yang  diisolasi  dari  rusip.  Rusip  merupakan    produk  ikan  fermentasi tradisional  Bangka.  Penelitian  ini  menggunakan  sampel  rusip  yang  berasal  dari  Bangka  dan Kalimantan.  Sampel  diisolasi  hingga  diperoleh  isolat  murni  yang  selanjutnya  dilakukan  skrining untuk  memperoleh  isolat  yang  mampu  menghasilkan  aktivitas  antibakteri    tertinggi.  Isolat  terpilih selanjutnya  diidentifikasi  dan  digunakan  untuk  memproduksi  bakteriosin  kasar.  Bakteriosin  kasar diuji  sensitifitasnya  terhadap  enzim  proteolitik  dan  dikarakterisasi  melalui  pengujian  stabilitas terhadap  suhu  tinggi,  pH,  surfaktan,  serta  stabilitasnya  selama  penyimpanan.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  isolat  RK4  menghasilkan  bakteriosin  yang  bersifat  sensitif  terhadap  enzim proteolitik  seperti  proteinase-K  dan  papain.  Bakteriosin  tersebut  stabil  terhadap  suhu  tinggi  dan pH  2–8  serta  menghasilkan  aktivitas  antibakteri  yang  tertinggi  terhadap  Staphylococcus  aureus. Hasil  identifikasi  memperlihatkan  bahwa  isolat  RK4  termasuk   dalam  j enis  Pedioc oc cus pentosaceus  I.  Bakteriosin  dari  Pediococcus  pentosaceus  I  tersebut  aktivitasnya  distimulasi  oleh EDTA,  sodium  dodecyl  sulphate  (SDS)  dan  lauryl  sarcosine.  Namun  sebaliknya,  bioaktivitasnya tidak  dipengaruhi  oleh Triton  X-100, Tween  20, Tween  80  dan  urea.  Bakteriosin  kasar  RK4  stabil pada  penyimpanan  suhu  37  °C  selama  4  minggu  dan  pada  suhu  dingin  selama  2  minggu.
KATA KUNCI: bakteriosin, rusip, Pediococcus pentosaceus I, suhu tinggi

## ABSTRACT
Research  was  conducted  to  produce  and  characterize  bacteriocin  produced  by  lactic  acid bacteria  (LAB)  isolated  from  rusip,  a  traditional  Bangkanese  fermented  fish  product.  Research used rusip samples from Bangka and Kalimantan. Experiments were started  by isolation of lactic acid bacteria from rusip, followed by screening to obtain the best isolate in producing high bacterial inhibition activity. The selected isolate was then identified and used to produce crude bacteriocin. The crude bacteriocin was observed sensitivity to proteolytic enzymes, and characterized, in term of its stability to high temperature, pH, surfactants, and stability during storage. The result showed that RK4 isolate was sensitive to proteolityc enzyme, i.e proteinase-K and papain. The bacteriocin was heat stable, stable at pH 2–8, and produced the highest inhibition  activity to Staphylococcus aureus. Identification result showed that RK4 isolate was Pediococcus pentosaceus I. Bacteriocin which  was  identified  as  Pediococcus  pentosaceus  was  stimulated  by  EDTA,  sodium  dodecyl sulphate (SDS) and lauryl sarcosine. On the contrary, bioactivity of bacteriocin was not affected by Triton X-100, Tween 20, Tween 80 and urea. Meanwhile, crude bacteriocin RK4 was also stable at storage temperature of 37 °C for 4 weeks and cold temperature for 2 weeks.
KEYWORDS: bacteriocin, rusip, Pediococcus pentosaceus I, high temperature

## PENDAHULUAN
Bakteriosin  didefinisikan  sebagai  senyawa antimikrobia yang disintesis oleh berbagai spesies
bakteri termasuk kelompok bakteri asam laktat (BAL) di dalam ribosom. Bakteriosin merupakan senyawa protein  yang  mempelihatkan  aktivitas  antibakteri (bakterisida ataupun bakteriostatik) terhadap spesies
bakteri yang bersifat sensitif. Protein ini seringkali aktif melawan  spesies  lain  yang  memiliki  hubungan kekerabatan  yang  dekat  dengan  mikroorganisme penghasil (Klaenhammer, 1988; Kaiser et al., 1993 dalam  Galv ez   et  al.,  2007) .  Beberapa  BAL m em produksi  bakteriosi n  dengan  spekt rum penghambatan  luas.  Beberapa  bakteriosin  juga berpotensi sebagai pengawet pangan. Penggunaan bakteriosin pada industri pangan dapat membantu mengurangi penggunaan bahan pengawet kimiawi ataupun perlakuan panas yang intensif. Dalam hal ini penggunaan  bakteri osin  secara  al am i  akan memberikan nutrisi dan sifat  organoleptik yang lebih baik (Galvez et al., 2007). Selain itu bakteriosin yang berasal  dari  bakteri  asam  laktat  dikatakan  sangat menarik disebabkan ia merupakan bahan tambahan pangan yang aman dan tidak toksis untuk pengawet pangan dan mampu mencegah kerusakan pangan oleh  bakteri  patogen  yang  berifat  Gram  Positif (Morisset et al., 2004 dalam Hata et al., 2010). Melalui penelitian yang sangat intensif, nisin terbukti sebagai satu-satunya bakteriosin  yang dapat diaplikasikan pada industri pangan dan telah dipasarkan hingga lebih dari 48 negara (De Arauz et al., 2009). Hingga saat ini nisin telah digunakan sebagai pengawet alami pada produk keju dan makanan kaleng di berbagai negara antara lain Argentina, Australia, Brazil, Italia, Belanda, AS dan Inggris. Dosis nisin yang dipergunakan mulai dari 100 Ul/ml hingga tidak terhingga (Cleveland et al., 2001 dalam De Arauz et al., 2009).
Beberapa bakteriosin diproduksi dari bakteri asam laktat  yang  berasosiasi  dengan  produk-produk fermentasi. Beberapa bakteriosin terbaru dari produk fermentasi antara lain : bakteriosin yang diisolasi dari produk daging terfermentasi asal Turki (Con & GoÈ kalp, 2000), bakteriosin asal Brazilia (De Martinis & Freitas, 2003), bakteriosin dari produk fermentasi asal Burkina Faso (Omar et al., 2006), bakteriosin yang diisolasi  dari produk  daging fermentasi  tradisional China (Liu et al., 2008), bakteriosin dari sosis kering (Castro et al., 2011), bakteriosin dari produk daging kering fermentasi asal Brasil (Biscola et al., 2013) dan bakteriosin yang diisolasi dari pasta udang asal Thailand (Kaewkloma et al., 2013). Bakteriosin lain juga  dihasilkan  oleh  strain  Lactococcus  lactis, Pediococcus acidilactici 13, Lactobacillus plantarum A-1,  Lactobacillus  curvatus  MBSa2,  Bacillus licheniformis P40, Lactobacillus plantarum 17.2b, dan Lactobacillus pentosus B96 (Cladera-Olivera et al., 2004;  Delgado  et  al.,  2007;  Alegria  et  al.,  2010; Altuntas et al., 2010; Hata et al., 2010; Hurtado et al.,  2011; Biscola et  al.,  2013; dan  Barbosa et  al., 2015).
Pada penelitian ini beberapa strain bakteri asam laktat  telah  diseleksi  dengan  m aksud  untuk
memperoleh bakteriosin  baru.  Sebuah  isolat yang mampu menghasilkan bakteriosin (isolat RK4) telah berhasil diisolasi dari rusip. Rusip merupakan salah satu  produk  fermentasi  ikan  yang  berasal  dari Indonesia. Rusip terbuat dari ikan, garam, gula aren, dan  beras,  namun  terkadang  tanpa  beras,  yang selanjutnya difermentasi secara anaerob selama 7 – 14 hari (Yuliana, 2007). Rusip terutama diproduksi di Propinsi Kepulauan Bangka Belitung yang secara luas digunakan sebagai campuran sambal dan dikonsumsi bersama  nasi  dan  lalapan.  Pada  umumnya  rusip mengandung bakteri asam laktat seperti Lactobacillus, Streptococcus,  Leuconostoc,  Pediococcus,  dan Enterococcus  (Dessi,  1999  dalam  Yuliana,  2007; Wijaya, 2007 dalam Sakti (2009)).
Meskipun beberapa penelitian  bakteriosin yang dihasilkan oleh produk pangan dari Indonesia pernah dilaporkan,  namun  eksplorasi  bakteriosin  yang dihasilkan dari produk fermentasi asli Indonesia masih sangat terbatas. Diantaranya telah dilaporkan adanya bakteriosin  yang  berasal  dari  produk  daging  yang dikemas vakum dan susu yang berasosiasi dengan bakteri asam laktat (Rahayu et al., 1999; Kusmiati & Malik,  2002;  Nugroho &  Rahayu,  2003; Usmiati  & Mar wati ,  2007;  S yahni ar,  2009) .  Penelit ian ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  bakteri  asam laktat  dari  rusip,  selanjutnya  memproduksi  dan mengkarakterisasi bakteriosin dari isolat terpilih yang aktivitasnya stabil pada suhu tinggi.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rusip  komersial  yang  diperoleh  dari  Bangka  dan Kalimantan pada tahun 2013. Sampel rusip Bangka berasal dari pasar tradisional kota Pangkalpinang dan pengolah rusip asal kota Mentok, sementara sampel rusip Kalimantan berasal dari pengolah rusip asal kota Mempawah (Kalimantan Barat). Keseluruhan sampel telah diproduksi dalam jangka waktu yang berbeda- beda.
Bakteri  indikator  untuk  uji  aktivitas  bakteriosin yaitu  Lactococcus  lactis,  Salmonella  sp.,  E.  colli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, dan Vibrio sp. Media man rogosa and sharpe (MRS)  broth dan agar, CM sukrose (Sukrose 1%, yeast exstract 1%,  pepton  0,45%,  KH 2 PO 4 2,84%,  NaCl  0,2%, MgSO 4 0,02%,  MnSO 4 0,005%)  dan  brain  heart infussion (BHI) digunakan sebagai media pertumbuhan Bakteri  Asam  Laktat  (BAL)  penghasil  bakteriosin, sedangkan media muller hinton agar (MHA) digunakan sebagai media untuk pengujian aktivitas bakteriosin.

## Isolasi Bakteri Asam Laktat (BAL)

## Pertumbuhan awal BAL
Bakteri asam laktat (BAL) ditumbuhkan dengan cara memasukkan sampel rusip sebanyak 10 gr ke dalam media MRS broth yang selanjutnya diinkubasi pada suhu 35 °C selama 24 – 48 jam.

## Isolasi BAL
Bakteri asam laktat  diisolasi langsung dari rusip komersial yang terlebih dahulu ditumbuhkan selama 24 – 48  jam  pada  media  MRS  broth.  Metode  yang digunakan  adalah  metode  pengenceran  yang dilanjutkan dengan plating secara pour plate (Rahayu & Margino, 1997). Media yang digunakan untuk isolasi BAL adalah MRS agar  ditambah 1% CaCO 3 dengan pH 5. Inkubasi BAL dilakukan pada suhu 35 °C  selama 48 jam. Pemilihan isolat yang diduga sebagai BAL didasarkan pada  pembentukan zona bening di sekitar koloni.  Koloni  yang  membentuk  zona  bening selanjutnya digores (distreak) untuk menghasilkan koloni tunggal. Koloni tunggal digores 2 – 3 kali pada MRS agar hingga diperoleh isolat murni/tunggal. Isolat tunggal yang dihasilkan diidentifikasi secara kualitatif dengan  pewarnaan  Gram,  uji  katalase  dan  uji oksidase.  Isolat  murni  yang  bersifat  Gram  (+), katalase (-) dan oksidase (-) merupakan isolat BAL.
Penyimpanan  isolat dilakukan pada pada suhu 4 °C dalam media  CM sukrose agar miring. Isolat terpilih yang disimpan pada suhu 4 °C disegarkan kembali (direfresh) dengan media cair CM sukrose ketika akan dipergunakan. Isolat yang tumbuh pada m edia  t ersebut  selanj utnya  diseleksi  untuk memperoleh  BAL  yang  menghasilkan  senyawa antimikroba.
Skrining BAL Penghasil Senyawa Antimikroba
Seleksi isolat BAL penghasil senyawa antimikroba dilakukan  menggunakan  metode  spot  agar  (agar spotted on the lawn method) (Abrams et al., 2011) secara  aerobik.  Bakteri  indikator  yang  digunakan adalah  Staphylococcus  aureus  ATCC  25923  dari Remel ® (UK), Lactococcus lactis, Salmonella sp., E. coli, Listeria monocytogenes dan Vibrio sp.  Cawan agar diinokulasi dengan  100 µl strain indikator yang terlebih dahulu ditumbuhkan pada media nutrient broth. Aktivitas daya hambat melawan strain indikator diuji menggunakan Muller Hinton Agar (MHA). Muller Hinton Agar yang mengandung strain indikator dispot/ditetesi dengan 10 µl kultur BAL. Dengan cara demikian, maka satu cawan dapat digunakan untuk menguji sekaligus 8–10  isolat  BAL.  Selanjutnya  dilakukan  inkubasi semalam  pada  suhu  37  °C.  Isolat  yang  memiliki
kemampuan  untuk  menghambat  bakteri  indikator akan memberikan zona jernih di sekitar spot.

## Produksi Bakteriosin Kasar
Produksi  bakteriosin  kasar  mengacu  pada Ogunbanwo et al. (2003). Isolat yang telah diseleksi dan menunjukkan aktivitas antimikroba ditumbuhkan pada CM sukrose pada suhu 35 °C selama 48 jam. Kultur sel yang terbentuk disentrifugasi (8.000 rpm, suhu  4  °C  selama  15  menit)  untuk  mendapatkan supernatannya. Supernatan bebas sel diatur pHnya (pH 6) dengan menambahkan 1 M NaOH (dengan maksud  untuk  menghilangkan  pengaruh  asam organik), lalu difiltrasi dengan filter asetat selulose 0,2  µm .  Selanjutny a  supernatan  bebas  sel dipanaskan pada suhu 80 °C selama 10 menit untuk menghilangkan  aktivitas  proteolitik  dan  hidrogen peroksida.  Supernatan  bebas  sel  merupakan bakteriosin kasar.

## Pengujian Bakteriosin
Uji aktivitas bakteriosin dilakukan menggunakan metode difusi sumur agar (Ogunbanwo et al., 2003; Udhayashree et al., 2012). Sebanyak 100 µl bakteri indikator  diinokulasi  pada  media  MHA,  kemudian dibuat sumuran berdiameter 6 mm pada agar yang telah memadat. Pada setiap sumuran dimasukkan sebanyak  10  µl  bakteriosin  kasar.  Cawan  MHA kemudian diinkubasi pada suhu 35 °C selama 24 jam. Aktivitas bakteriosin ditunjukkan dengan adanya zona bening/halo yang tegas di sekitar sumuran. Aktivitas bakteriosin dinyatakan sebagai Arbitrari Unit (AU) per ml. Satu AU dinyatakan sebagai luas zona hambat per satuan volume sampel bakteriosin yang diuji (mm 2 / ml) (Usmiati & Marwati, 2007).
Aktivitas bakteriosin (mm 2 /ml) = AU/ml
Keterangan/Note: Lz = luas zona bening (mm 2 ) Ls = luas sumuran (mm 2 ) V  = volume sampel (mL)

## Konfirmasi BAL Penghasil Bakteriosin
Untuk  mengkonfirmasi  supernatan  BAL  yang merupakan bakteriosin dilakukan pengujian aktivitas supernatan  tersebut  terhadap  enzim  proteolitik. Supernatan  yang  kehilangan  aktiv itas  setelah direaksikan  dengan  enzim  proteolitik  merupakan bakteriosin  sesungguhnya.  Enzim  proteolitik  yang digunakan adalah papain dan proteinase K. Pengujian pengaruh enzim dilakukan sebagai berikut : Sebanyak
Lz - Ls =
V
200 µl supernatan bakteriosin dilarutkan dalam 20 µl larutan  enzim  (larutan  enzim  dibuat  dengan  cara melarutkan enzim dalam NaOH atau fosfat buffer pH 7), lalu diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam. Supernatan BAL yang sensitif terhadap proteinase-K dan papain dipertimbangkan sebagai bakteriosin yang sesungguhnya dan dipilih untuk pengujian berikutnya. Supernatan yang sensitif terhadap enzim proteolitik adalah supernatan tanpa zona bening/halo yang tegas di  sekitar  sumuran,  dan  dinyatakan  sebagai bakteriosin.

## Karakterisasi Bakteriosin

## Pengaruh pH
Sebanyak  5  ml  larutan  bakteriosin  kasar  pada tabung yang berbeda, masing-masing diatur pH nya pada pH 2, 4, 6, 8, dan 10 menggunakan larutan NaOH atau HCl. Setelah diinkubasi selama 4 jam pada suhu kamar,  selanjutnya  aktiv itas  bakteriosin  diuji menggunakan metode difusi sumuran agar. Aktivitas bakteriosin  dinyatakan  dalam  AU/ml  (Usmiati  & Marwati, 2007).

## Pengaruh surfaktan
Surfaktan yang digunakan antara lain : triton x- 100, Tween 20, tween 80, sodium dodecyl sulfat/SDS, EDTA,  Urea  dan  N-Laurylsarcosine.  Surfaktan ditambahkan  ke  dalam  masing-masing  larutan bakteriosin kasar pada konsentrasi 0,1 ml atau 0,01 g surfaktan per ml bakteriosin. Larutan bakteriosin kasar  tanpa  surfaktan  digunakan  sebagai  kontrol. Sampel maupun kontrol diinkubasi pada suhu 37 ºC selama  60  menit.  Kemudian  dilakukan  pengujian aktivitas  bakteriosin  menggunakan  metode  difusi sumuran agar. Aktivitas bakteriosin dinyatakan dalam AU/ml.

## Spektrum aktivitas antibakteri bakteriosin
Aktivitas  antibakteri  bakteriosin  diuji  terhadap beberapa  bakteri  indikator  (L.  plantarum,  L. monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium dan E. coli) menggunakan metode difusi sumuran  agar.  MHA  diinokulasi  dengan  100  µl  L. plantarum yang terlebih dahulu ditumbuhkan pada MRS  cair,  sedangkan  L.  monocy togenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium dan E. coli ditumbuhkan pada nutrient broth pada suhu 37 °C selama 24 jam. Sumuran berdiameter 6 mm pada  MHA  plate  disiapkan  dan  sebanyak  10  µl bakteriosin  kasar  ditambahkan  ke  dalam  masing- masing sumuran. Cawan MHA kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Aktivitas antimikroba dinyatakan positif jika terbentuk zona bening/halo yang
tegas  di  sekitar  sumuran.  Aktivitas  bakteriosin dinyatakan dalam AU/ml.

## Uji ketahanan terhadap suhu
Bakteriosin  diambil  200  µl  kemudian  di  uji ketahanannya terhadap  suhu 50 o C selama 20 menit, 100 o C selama 20 menit dan 121 o C selama 15 menit (Osmanagaoglu et al., 1998; Mandal et al., 2008).

## Stabilitas bakteriosin selama penyimpanan
Uji stabilitas dilakukan dengan cara menyimpan bakteriosin pada suhu  -20, 4, dan 37 °C selama 2 bulan.  Selanjutnya  dilakukan  uji  aktivitas  dengan metode diffuse agar (Nugroho & Rahayu, 2003).
Identifikasi
Isolat terpilih penghasil bakteriosin  diidentifikasi menggunakan  API  50  CH  strip  dan  API  50  CHL medium (API systems, Biomerieux Sa, Franch).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri Asam Laktat (BAL)
Skrining/penapisan bakteri asam laktat dilakukan terhadap 18 isolat bakteri yang berhasil diisolasi dari rusip  (Tabel  1).  Berdasarkan  penapisan  tersebut dihasilkan 12 isolat bakteri asam laktat. Berdasarkan hasil analisis pengecatan Gram kedua belas  bakteri tersebut  merupakan  bakteri  Gram  positif,  serta menunjukkan hasil uji katalase dan oksidase negatif.
Axelsson (2004) menerangkan bahwa bakteri asam laktat tipikal  merupakan bakteri yang bersifat Gram positif, tidak membentuk spora, katalase negatif, tidak memiliki sitokrom, habitat non aerobik namun bersifat aerotolerant, acid tolerant, dan sangat fermentatif, asam  laktat  merupakan  produk  akhir  yang  utama selama fermentasi gula.

## Skrining BAL penghasil senyawa antimikroba
Tahap berikutnya adalah melakukan skrining BAL penghasil senyawa antimikroba terhadap 12 isolat BAL. Dari 12 isolat BAL yang diskrining terdapat 4 isolat yang memiliki aktivitas antimikroba, yaitu RK1, RK2,  RK4,  dan  RAI  (Tabel  2).  Seleksi  BAL  yang mampu menghasilkan senyawa antimikroba  dilakukan dengan metode spot agar (agar spotted on the lawn method) pada media Muller Hinton Agar (MHA). Pada seleksi  tersebut  digunakan  bakteri  uji  Vibrio  sp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, E. coli, Salmonella sp., dan Lactococcus  lactis.  Hasil

## Tabel 1. Data isolat bakteri asam laktat (BAL) dari rusip
Table 1. Data of lactic acid bacteria isolate (LAB) from rusip
No. Asal Isolat/ Origin of Isolate Isolat/Isolate Uji Katalase/ Catalase Test Uji Oksidase/ Oxidase Test Pewarnaan Gram/ Gram Staining 1. Bangka RTB1. 1 Positif (+) Negatif (-) Gram positif (+) 2. Bangka RTB1. 2 Positif (+) Negatif (-) Gram positif (+) 3. Bangka RTB1. 3 Positif (+) Negatif (-) Gram positif (+) 4. Bangka RTB2. 1 Positif (+) Negatif (-) Gram positif (+) 5. Bangka RTB2. 2 Positif (+) Negatif (-) Gram positif (+) 6. Bangka RTB2. 3 Positif (+) Negatif (-) Gram positif (+) 7. Bangka RAI. 1 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 8. Bangka RAI. 2 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 9. Kalimantan RK1. 1 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 10. Kalimantan RK1. 2 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 11. Kalimantan RK1. 3 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 12. Kalimantan RK2. 1 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 13. Kalimantan RK2. 2 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 14. Kalimantan RK2. 3 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 15. Kalimantan RK2. 4 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 16. Kalimantan RK4. 1(RK4) Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 17. Kalimantan RK4. 2 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+) 18. Kalimantan RK4. 3 Negatif (-) Negatif (-) Gram positif (+)
aktivitas antimikroba bakteri asam laktat dapat dilihat pada Tabel 2.
Keempat  isolat  m em perlihatkan  spektrum penghambatan  yang  sempit,  yaitu  hanya  mampu menghambat  Staphylococcus aureus dari kelompok bakteri Gram positif. Hasil ini serupa dengan Mathieu et  al.  (1993)  dan  Hechard  et  al.  (1992)  dalam  De Martins  &  Freitas  (2003)  yang  melaporkan  bahwa bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat tidak efektif dalam mengambat bakteri Gram negatif.

## Tabel 2. Aktivitas antimikroba BAL
Table 2. Antimicrobe activity of LAB
Vibrio  sp. S. aureus L. monocytogenes E. coli Salmonella sp. L. lactis 1. RK1 0 2.0 mm 0 0 0 0 2. RK2 0 5.0 mm 0 0 0 0 3. RK4 0 5.0 mm 0 0 0 0 4. RAI 0 5.0 mm 0 0 0 0 No. Kode/ Code Zona Hambat Isolat (mm)/ Inhibition Zone of Isolate (mm)
Hal ini kemungkinan berhubungan dengan adanya lapisan lipopolisakarida (LPS) dari dinding sel bakteri Gram negatif yang  melindungi membran sel, sebagai lokasi target bakteriosin (Stevens et al., 1991 dalam De Martins & Freitas, 2003). Selain itu daya hambat yang dihasilkan oleh keempat isolat kemungkinan juga disebabkan  oleh  adanya  kompetisi  nutrisi,  asam laktat, diasetil, dan hidrogen peroksida (Klaenhammer, 1988 dalam Liu et al.,  2008; Abrams et  al.,  2011). Berdasarkan  hal  tersebut,  maka  untuk  pengujian
selanjutnya hanya digunakan Staphylococcus aureus sebagai bakteri uji. Selanjutnya terhadap keempat isolat  BAL  yang  memiliki  aktivitas  antimikroba dilakukan pengujian aktivitas supernatannya terhadap enzim proteolitik. Uji tersebut dilakukan  untuk tujuan konfirmasi yang membuktikan bahwa supernatan yang dihasilkan  oleh  isolat  BAL  merupakan  bakteriosin yang sesungguhnya.

## Konfirmasi BAL penghasil bakteriosin
Bakteriosin  adalah  substrat  dengan  sifat  alami protein  sehingga  sensitif terhadap aktivitas enzim proteolitik,  diantaranya  papain  dan  proteinase-K. Keem pat  isolat  BAL  yang  m emiliki  aktiv itas antimikroba selanjutnya dikonfirmasi kemampuannya sebagai penghasil bakteriosin melalui uji sensitifitas BAL  tersebut  terhadap  aktivitas  enzim  proteolitik. Hasil  uji  sensitifitas  bakteriosin  terhadap  enzim proteolitik dapat dilihat pada Tabel 3.
Aktivitas antibakteri dari supernatan RK2 masih ada  setelah  ditambahkan  dengan  enzim  papain. Mekanisme penghambatan strain ini kemungkinan disebabkan oleh kompetisi substrat atau pengasaman media (Osmanagaoglu et al., 1998). Penambahan enzim proteinase-K menyebabkan hilangnya aktivitas antimikroba pada RK1, RK2, dan RK4. Sementara RAI masih menunjukkan adanya aktivitas.
Supernatan  yang  dihasilkan  oleh  RK4  (Rusip Kalimantan) masih menunjukkan aktivitas sebelum diberi perlakuan enzim proteolitik, namun aktivitas supernatan menjadi hilang ketika diberi perlakuan enzim Proteinase-K dan papain. Papain merupakan enzim  hidrolase  sistein  protease  yang  ada  pada pepaya. Enzim proteinase-K dan papain keduanya merupakan  enzim  proteolitik  (enzim  pemecah protein).  Karena  pada  dasarnya  bakteriosin merupakan senyawa protein, maka keberadaan kedua enzim  proteolitik  tersebut  di  dalam sistem  larutan enzim bakteriosin menyebabkan hilangnya aktivitas
bakteriosin. Hal ini mengindikasikan bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan RK4 (Rusip Kalimantan) memiliki karakteristik yang sama seperti bakteriosin. Hasil uji sensitivitas keempat bakteri tersebut (RK1, RK2,  RK4,  dan  RAI)  terhadap  aktivitas  enzim proteolitik  (Tabel  3)  memperlihatkan  bahwa  RK4 memiliki karakteristik yang terbaik sebagai penghasil bakteriosin. Selanjutnya terhadap supernatan isolat RK4 dilakukan pengujian karakterisasi  bakteriosin. Bakteriosin dinyatakan sebagai protein atau senyawa protein yang memiliki sifat antagonis  terhadap bakteri (De Vuyst &  Vandamme,  1994). Sebagai senyawa antibakteri, bakteriosin bersifat sensitif terhadap enzim proteolitik,  mengalami  inaktivasi  sempurna  atau tereduksi  secara signifikan  setelah diberi perlakuan enzim proteinase-K, pronase dan tripsin (Todorov & Dicks, 2005; Biscola et al., 2013). Proteinase-K dan pepsin sangat kuat menghambat produksi bakteriosin, sementara  -amilase, DNase, RNase dan lipase tidak menghambat produksi bakteriosin (Rajaram et  al., 2010).

## Karakterisasi bakteriosin

## Pengaruh pH
Produksi bakteriosin tergantung pada kondisi pH, dengan kata lain pH sangat berperan dalam produksi bakteriosin (Lejeune et al. dalam De Vyust & Leroy, 2007; Delgado et al. dalam Altuntas et al., 2010). Hasil uji sensitifitas bakteriosin terhadap pH disajikan pada Gambar 1.
Hasil  penelitian  ini  sedikit  berbeda  dengan bakteriosin yang dihasilkan oleh Lactobacillus sakei R1333  yang  masih  stabil  aktiv itasnya  setelah diinkubasi pada pH 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; dan 12,0, namun  hasilnya  serupa  dengan  bakteriosin  yang dihasilkan oleh L. brevis OG1 yang masih stabil pada pH  2–8  (Ogunbanwo  et  al.,  2003;  Todorov  et  al., 2011a).  Pada  penelitian  ini,  hilangnya  aktivitas
RK1
RK2 RK4 RAI Kontrol - + + + + Papain 0.1 - + - - Proteinase-K 0.1 - - - + Perlakuan Enzim/ Enzyme Treatments Konsentrasi (mg/ml)/ Concentration  (mg/ml) Aktivitas Bakteriosin/Bacteriocin Activity
Tabel 3. Pengaruh enzim proteolitik terhadap aktivitas bakteriosin Table 3. Effect of proteolytic enzyme on bacteriocin activity
Keterangan/Note: Kontrol  adalah  larutan  bakteriosin  tanpa  diberi  perlakuan  enzim/
Control  was  bacteriocin  solution  without  enzyme  treatment
bakteriosin  pada  pH  10  kemungkinan  disebabkan terdegradasi oleh enzim proteolitik, agregasi protein, diserap oleh sel penghasil dan regulasi umpan balik (Parente et al., 1994 dalam Todorov & Dicks, 2006). Degradasi  bakteriosin  terjadi  seiring  dengan  fase kematian sel penghasil. Awalnya sel mengalami lisis kemudian  diikuti  dengan  akumulasi  protease intraseluler yang menyebabkan rusaknya bakteriosin (Avonts et al., 2004).

## Stabilitas terhadap panas
Bakteriosin  RK4  (Rusip  Kalimantan)  memiliki stabilitas panas yang kuat bahkan setelah disterilisasi pada  suhu 121  °C  selama  15  menit.  Berdasarkan karakter ini maka bakteriosin tersebut dapat digunakan sebagai pengawet makanan yang diolah dengan suhu tinggi,  di samping berperan penting untuk  aplikasi pengolahan dan konservasi pangan (Gao et al., 2010). Hasil serupa telah dilaporkan pada bakteriosin yang dihasilkan oleh L. plantarum F1 dan L. brevis OG1 yang masih menunjukkan aktivitas pada pemanasan suhu 100 ºC selama 10–30 menit dan pemanasan pada suhu 121 ºC selama 10–60 menit. Penelitian lain  menyebutkan bahwa  bakteriosin ST16Pa masih stabil  setelah  dipanaskan  pada  suhu  25–100  °C selama 2 jam dan tidak terjadi pengurangan aktivitas setelah diberi perlakuan suhu 121 °C selama 20 menit pada pH 6,0 (Ogunbanwo et al., 2003; Todorov & Dicks, 2006; Todorov et al., 2011b).
Bakteriosin  yang  dihasilkan  oleh  RK4  masih menunjukkan aktivitas ketika diberi perlakuan panas pada suhu 50, 100, dan 121 °C (Tabel 4) sehingga sementara diduga bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan  oleh  RK4  (Rusip  Kalimantan)  adalah
bakteriosin. Masih adanya aktivitas antibakteri oleh bakteriosin  ketika  diberi  perlakuan  panas  diduga karena bakteriosin merupakan peptida pendek yang stabil terhadap panas. Selain itu karena adanya asam amino tertentu pada bakteriosin tersebut yang mampu mempertahankan struktur bakteriosin dari pengaruh panas (Ray, 1992; Rahayu et al., 2004).

## Pengaruh surfaktan
Penambahan  surfaktan  dapat  mempengaruhi aktivitas bakteriosin. Dalam hal ini, surfaktan EDTA, SDS,  dan  laurylsarcosine  dapat  meningkatkan aktivitas  bakteriosin.  Dilaporkan  telah  terjadi  laju adsorpsi bakteriosin yang tinggi dengan keberadaan senyawa  kimiawi  seperti  NaCl,  gliserol  dan  SDS. Adsorpsi  bakteriosin  terhadap  sel  target  sangat penting karena sebagai perantara terjadinya insersi bakteriosin  ke  dalam  membran  sel  dan  dalam membentuk  pori  yang  menjadi  sebab  terjadinya kematian sel  (Todorov, 2009  dalam  Biscola  et  al., 2013). Sebaliknya, bioaktivitas bakteriosin RK4 tidak dipengaruhi oleh triton x-100, tween 20, tween 80, dan  urea.  Pengaruh  surfaktan  terhadap  aktivitas bakteriosin disajikan pada Gambar 2. EDTA diketahui memiliki  aktivitas  antimikroba  terutama  terhadap bakteri  Gram  negatif.  Dalam  hal  ini,  EDTA  dapat mengganggu struktur membran luar dan memberi akses  bagi  molekul  hidrofobik  masuk  ke  dalam membran sitoplasma (Vaara, 1992 dalam Kusmarwati et al., 2012). Sementara itu, surfaktan non ionik triton x- 100, tween 80  dan tween 20 tidak berpengaruh terhadap aktivitas bakteriosin (meskipun penelitian lain melaporkan bahwa penambahkan deterjen non ionik untuk berbagai makanan dapat menginduksi produksi bakteriosin).
Gambar 1.  Pengaruh pH terhadap aktivitas bakteriosin.
Figure 1.  Effect of pH on bacteriocin activity.
Akti v itas Bakterios in (AU/ m l) Bacteri oci n Activity (AU/ml) pH pH 2 pH 4 pH 6 pH 8 pH 10
Tween  diperlakukan  juga  untuk  meningkatkan aktivitas supernatan. Namun, efeknya bergantung jenis bakterinya (Reese & Maguire, 1969 dalam Castro, 2011). Peningkatan ini mungkin disebabkan karena pengaruh surfaktan terhadap permeabilitas membran sel (Ogunbanwo et al. 2003).

## Stabilitas bakteriosin selama penyimpanan
Uji  stabilitas  bakteriosin  dilakukan  melalui penyimpanan bakteriosin pada suhu -20, 4, dan 37 °C  selama  4  minggu  (Tabel  5).  Bakteriosin  yang dihasilkan  oleh  RK4  bersifat  lebih  stabil  setelah penyimpanan selama 4 minggu pada suhu 37°C dan 4 °C, namun tidak terdeteksi setelah penyimpanan pada  suhu  -20°C.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa penyimpanan bakteriosin tersebut hingga suhu 4ºC mungkin merupakan teknik preservatif yang sesuai. Aktivitas serupa ditunjukkan oleh pentocin 31-1 yang dihasilkan oleh produk daging asal china Xuan-Wei
Gambar 2.  Pengaruh surfaktan terhadap aktivitas bakteriosin. Figure 2.   Effect of surfactant on bacteriocin activity.
Ham (Liu et al., 2008). Selain itu berdasarkan aktivitas anti Stahylococcus yang ditunjukkan oleh bakteriosin RK4 dan sifatnya yang relatif lebih stabil pada suhu ruang  dan  suhu  dingin,  m enunjukkan  bahwa bakteriosin  tersebut  potensial  digunakan  sebagai pengawet pangan, khususnya pada produk pangan yang  rentan  terkontam i nasi  oleh  bakt eri Staphylococcus aureus.
Oleh  karena  itu,  masih  diperlukan  riset  yang berkaitan dengan aplikasi bakteriosin tersebut pada produk pangan terutama yang disimpan pada suhu ruang dan suhu dingin.

## Identifikasi isolat RK4
Metode untuk mengidentifikasi mikroorganisme manual ke tingkat spesies dapat menggunakan produk identifikasi  bioMérieux  API  yaitu  test  kit  untuk identifikasi bakteri Gram positif, Gram negatif, dan ragi.
Tabel 4. Pengaruh suhu terhadap aktivitas bakteriosin Table 4. Effect of temperature on bacteriocin activity
Perlakuan/Treatment Aktivitas Bakteriosin/Bacteriocin Activity Kontrol/Control + 50 °C selama 20 menit/50 °C for 20 minutes + 100 °C selama 20 menit/100 °C for 20 minutes + 121 °C selama 15 menit/121 °C for 15 minutes + Keterangan/Note: Kontrol  adalah  larutan  bakteriosin  tanpa  diberi  perlakuan/
Control  was  bacteriocin  solution  without  treatment
Akti v itas Bakterios in (AU/ m l) Bacteri oci n Activity (AU/ml) 1 Surfaktan/Surfactant EDTA Triton  x-100 SDS Tween  80 Laurylasarcosine
Tween  20
Urea Kontrol/Control

## Eksplorasi Bakteriosin  dari Bakteri  Asam  Laktat Asal  Rusip  Bangka  dan  Kalimantan         (Arifah Kusmarwati  et al.)

## Tabel 5. Stabilitas bakteriosin
Table 5. Stability of bacteriocin
Minggu ke-1/ 1st week Minggu ke-2/ 2nd week Minggu ke-3/ 3rd week Minggu ke-4/ 4th week 37 °C + + + + 4 °C + + - - -20 °C - - - - Suhu Penyimpanan/ Storage Temperature Aktivitas Bakteriosin/Bacteriocin Activity
Berdasarkan karakteristik fisiologis dan biokimia dengan menggunakan test kit API 50 CH dan API 50 CHL medium versi 5.1 (biomerieoux) yang dilanjutkan dengan  pengolahan  dan  analisis  menggunakan software  APIWEB,  maka  strain  bakteriosin  yang diisolasi dari isolat BAL tersebut teridentifikasi sebagai Pediococcus pentosaceus 1 dengan kategori indikasi baik (99,7%). Strain RK4 merupakan Gram positif, berbentuk  coccus,  katalase  negatif  dan  oksidase negatif.  Strain  RK4  mampu  memfermentasi  gula seperti ribosa, galaktosa, glukosa, fruktosa, manosa, selobiosa, maltosa, laktosa, sakarosa, trehalosa dan gentobiose. Karakteristik fisiologi dan biokimia isolat RK4 dapat dilihat pada Tabel 6.
Hasil tes kit API 50 CHL dapat dilihat pada Gambar 3. Hasil positif (+) ditandai dengan perubahan warna dari biru menjadi kuning setelah diinkubasi selama 48 jam, sedangkan yang memiliki hasil negatif (-) tidak mengalami perubahan warna (tetap berwarna biru).

## KESIMPULAN DAN SARAN
Dari sampel rusip yang berasal  dari Bangka dan Kalimantan telah diperoleh 12 isolat BAL. Selanjutnya dari kedua belas isolat BAL tersebut diperoleh 1 isolat BAL  (RK4)  asal  Kal im ant an  yang  m am pu m enghasi lkan  bakteriosi n.  Isolat  RK4  y ang teridentifikasi sebagai  Pediococcus  pentosaceus  I

## Tabel 6. Karakteristik fisiologis dan biokimia isolat RK4
Table 6.   Physiological and biochemical characteristics of isolate RK4
Karakteristik Fisiologi dan Biokimia/ Physiological and Biochemical Characteristics Hasil/Results Morfologi koloni/Colony morphology Putih,koloni bulat halus/ White, smooth round colonies Pewarnaan Gram/Gram staining Gram positif, coccus/Gram positive, coccus Pertumbuhan di MRS broth/Growth in MRS broth Keruh/Turbid Fermentasi positif/ Fermentation positive to L-Arabinosa, Ribosa, Galaktosa, D-Glukosa, D- Fruktosa, D-Mannosa, N-Asetilglukosamin,
Amigdalin, Arbutin, Salisin, Selobiosa, Maltosa,
Trehalosa, D-Tagatosa/ L-Arabinose, Ribose, Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, N-Acetylglucosamine, Amygdalin, Arbutin, Salicin, Cellobiose, Maltose, Trehalose, D- Tagatose Uji katalase/Catalase test Negatif/Negative Uji oksidase/Oxidase test Negatif/Negative Identifikasi/Identification Pediococcus pentosaceus 1 % ID 99.7%
menghasilkan  bakteriosin  yang  bersifat  sensitif terhadap enzim proteolitik proteinase-K dan papain. Bakteriosin  yang  dihasilkan  bersifat  stabil  hingga mencapai  suhu 121 °C, stabil pada pH 2-8, memiliki spektrum  penghambatan  sempit  hanya  terhadap Staphylococcus aureus dan aktivitasnya  distimulasi oleh  surfaktan  SDS,  laurylsarcosine  dan  EDTA. Sebaliknya Tween 20, Tween 80, Triton X-100 dan urea justru menghambat aktivitasnya. Bakteriosin kasar RK4 stabil pada penyimpanan suhu 37 °C selama 4 minggu dan pada suhu dingin selama 2 minggu.

## DAFTAR PUSTAKA
Abrams, D., Barbosa, J., Albano, H., Silva, J., Gibbs, P., &
Teixeira,  P.  (2011).  Characterization  of  bacPPK34  a bacteriocin  produced  by  Pediococcus  pentosaceus strain  K34  isolated  from  “Alheira”.  Food  Control.  22: 940–946.
Alegría, A., Delgado, S., Roces, C., López, B., & Mayo, B.
(2010).  Bacteriocins  produced  by  wild  Lactococcus lactis  strains  isolated  from  traditional,  starter-free cheeses  made  of  raw  milk.  International  Jounal  of Food  Microbiology.  143(1–2):  6–61.
Altuntas,  E.G.,  Cosansu,  S.,  & Ayhan,  K.  (2010).  Some growth  parameters  and  antimicrobial  activity  of  a bacteriocin-producing  strain  Pediococcus  acidilactici 13.  International  Journal  of  Food  Microbiology.  141: 28–31.
Avonts, L., Van Uytven, E., & De Vuyst, L. 2004. Cell growth and  bacteriocin  production  of  probiotic  Lactobacillus strains  in different  media.  International  Dairy  Journal 14:  947–955.
Axelsson,  L.  (2004).  Lactic  acid  bacteria  :  Classification and  Physiology.  In  Salminen,  S.,  Wright,  A.V.,  and Ouwehand. (eds). Lac tic Ac id Bac teria. Microbiological and Fungtional Aspects Third Edition. Revised  and  Expanded  :  1–66.
Biscola, V., Todorov, S.D., Capuano, V.S.C., Abriouel, H.,
Galvez, A.,  &  Franco,  B.D.G.M. (2013). Isolation  and characterization  of  a  nisin-like  bacteriocin  produced by  a  Lactococcus  lactis  strain  isolated  from  charqui, a Brazilian fermented, salted and dried  meat product. Meat Science. 93: 607–613.
Barbosa, M.S., Todorov, S.D., & Jurkiewicz, C.H. (2015).
Bacteriocin  production  by  Lactobacillus  curvatus MBSa2 entrapped  in calcium alginate  during ripening of salami for control of Listeria monocytogenes. Food Control.  47:  147–153.
Con,  A.H.  &  GoÈ  k alp,  H.Y.  (2000).  Production  of bacteriocin-like  metabolites  by  lactic  acid  cultures isolated  from sucuk samples. Meat  Science. 55: 89– 96.
Castro, M.P., Palavecino, N.Z., Herman, C., Garro, O.A., & Campos,  C.A.  (2011).  Lactic  acid  bacteria  isolated from  artisanal  dry  sausages:  Characterization  of antibacterial  compounds  and  study  of  the  factors affecting  bacteriocin  production.  Meat  Science.  87: 321–329.
Cladera-Olivera,  F.,  Caron,  G.R.,  &  Brandelli, A.  (2004). Bacteriocin  production by  Bacillus licheniformis strain P40  in  cheese  whey  using  response  surfac e methodology.  Biochemical  Engineering  Journal.  21 (1):  53–58.
De Arauz, L.J., Jozala, A.F., Mazolla, P.G., & Penna, T.C.V. (2009).  Nisin  biotec hnologic al  production  and application:  a  review.  Trend  in  Food  Sc ienc e  & Technology. 20: 146–154.
De  Martinis,  E.C.P., &  Freitas,  F.Z. (2003).  Screening  of lactic   ac id  bac teria  from  Brazilian  meats  for bacteriocin formation. Food  Control. 14(3):  197–200. De  Vuyst,  L.  &  Vandamme,  E.J.  (1994).  Bacteriocins  of Lactic  Acid  Bacteria:  Microbiology,  Genetics  and Applications.  Blackie  Academic  and  Professional, London.
De  Vyust,  L.  &  Leroy,  F.  (2007).  Bacteriocins  from  lactic acid  bacteria  :  production,  purification,  and  food
Gambar 3. Hasil identifikasi isolat RK4 setelah 48 jam pasca inokulasi pada Tes Kit API 50 CHL. Reaksi positif ditunjukkan warna kuning.
Figure 3. Identification result of isolat RK4 after inoculation for 48h using API 50 CHL. Positive reaction was shown by yellow colour.
applications.  J.  Mol  Microbiol  Biotechnol.  13:  194– 199.
Delgado, A., Francisco No´e Arroyo L´opez, F. N.A., Brito, D., Peres, C., Fevereiro, P., & Garrido-Fern´andez, A. (2007).  Optimum  bac terioc in  produc tion  by Lactobacillus  plantarum  17.2b  requires  absence  of NaCl  and  apparently  follows  a  mixed  metabolite kinetics.  Journal  of  Biotechnology.130:  193–201. Galvez, A., Abriouel, H., Lopez, R.L. & Omar, N.B. (2007).
Bacteriocin-based  strategies  for  food  preservation.
International Journal of Food Microbiology. 120: 51– 70.
Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., & Zhilei. (2010). A novel bacteriocin with    broad  inhibitory  spec trum  produc ed  by Lactobacillus  sake  C2,  isolated  from  traditional Chinese  fermented  cabbage.  Food  Control.  21:  76– 81.
Hata, T., Tanaka, R., & Ohmomo, A. (2010). Isolation and characterization of plantaricin ASM1: A new bacteriocin produc ed  by  Lactobac illus   plantarum  A-1. International Journal  of Food Microbiology. 137: 94– 99.
Hurtado, A., Reguant, C., Bordons, A., & Rozès, N. (2011).
Expression  of    Lactobac illus    pentosus  B96 bacteriocin  genes  under  saline  stress.  Food Microbiology.  28(8):  1514–8.
Kaewkloma,  S.,  Lumlert,  S.,  Kraikul,  W., & Aunpada,  R.
(2013).  Control  of  Listeria  monocytogenes  on  sliced bologna  sausage  using  a  novel  bacteriocin,  amysin, produced  by  Bacillus amyloliquefaciens isolated  from Thai  shrimp  paste  (Kapi).  Food  Control.  32:  552– 557.
Klaenhammer,  T.R.  (1988).  Bacteriocins  of  lactic  acid bacteria.  Biochimie.  70:  337–349.
Kusmarwati A.  &  Indriati,  N. (2012).  Karakteristik  bakteri asam laktat  asal rusip  sebagai agen  probiotik. Jurnal Pasc a  Panen  dan  Biotek nologi  Kelautan  dan Perikanan.  7(2):  159–170.
Kusmiati  &  Malik,  A.  (2002).  Bacterioc in  activity  of Leuc onostoc  mesenteroides  Pbac1  bacteria  on several  media.  Makara,  Health.  6(1):  1–7.
Liu, G., Lv, Y., Li, P., Zhou, K. & Zhang, J. (2008). Pentocin 31-1,  an  anti-Lis teria  bac terioc in  produc ed  by Lactobacillus pentosus 31-1  isolated  from Xuan-W ei Ham,  a  traditional  China  fermented  meat  product. Food  Control. 19:  353–359.
Mandal, V.,  Sen, S.K. & Mandal, N.C. (2008).  Optimized cultured  conditions  for  bacteriocin  production  by Pediococcus acidilactici LAB and its characterization. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics. 45: 106– 110.
Nugroho,  D.A.  &  Rahayu,  E.S.  (2003).  Extraction  and c harac terization  of  bac terioc in  produc ed  by Leuconostoc  mesenteroides  SM  22.  J.  Technol  and Food Industry. 14(3).
Omar, N. B., Abriouel, H., Lucas, R., Martinez-Canamero, M.,  Guyot,  J .  &  Galvez,  A.  (2006).  Isolation  of bacteriocinogenic  Lactobacillus  plantarum  strains from  ben  saalga,  a  traditional  fermented  gruel  from
Burk ina  Faso.  International  J ournal  of  Food Microbiology.  112:  44–50.
Ogunbanwo,  S.T.,  Sanni,  A.I.  &  Onilude,  A.A.  (2003).
Charac terization  of  bac terioc in  produc ed  by Lactobacillus plantarum  F1 and  Lactobacillus  brevis OG1. African Journal of Biotechnology. 2(8): 219–227.
Osmanagaoglu,  O.,  Gunduz,  U.,  Beyatli,  Y.,  &  Cokmus, C.  (1998).  Purific ation  and  c harac terization  of Pediocin  F.A  bacteriocin  produced  by  Pediococcus acidilactici F. Tr. J. of Biology. 22: 217–228.
Rahayu, E.S. & Margino, S. (1997). Bakteri Asam Laktat: Is olas i  dan  Identifikas i.  Materi  W orkshop,  PAU Pangan  dan  Gizi  Universitas  Gadjah  Mada.
Rahayu, E.S., Ekasari, A., Wardhani, A.K., & Margino, S. (1999). Screening of  Lactic  Acid Bacteria  from Meat and  Meat  Produc t  as   Bacterioc in  Producer. Proc eeding  of  Food  National  Conferenc e, Yogyakarta.
Rahayu, E.S., Wardani, A.K., & Margino, S. (2004). Skrining bakteri  asam  laktat  penghasil  bakteriosin  dari  daging dan  produk  olahannya.  Agritech.  24(2):  74–81.
Raj aram,  G.,  Manivasagan,  P.,  Thilagavathi,  B.,  & Saravanak umar,  A.  (2010).  Purific ation  and c harac terization  of  a  bac terioc in  produc ed  by Lactobacillus  lac tis   isolated from  marine environment. Advance Journal  of  Food Science and Technology.  2(2):  138–144.
Ray,  B.  (1992).  Fundamental  Food  Microbiology.  CRC Press.  London.  516  p.
Sakti,  T.P.J.  (2009).  Analysis  Probiotic  of  Lactic  Acid Bacteria  from  Rus ip.  Schript.  Departement  of Agriculture  Sriwijaya  University.  35  pp.
Syahniar,  T.M.  (2009).  Production  and  Characterization of Bacteriosin from Lactobacillus plantarum 1A5 and Antimicrobial Activity  to  Pathogen  Bacteria.  Schript. IPB Bogor. 61 pp.
Todorov,  S.D. &  Dicks. (2005). Effect of growth  medium on bacteriocin production by Lactobacillus plantarum ST194BZ, a strain isolated from Boza. Food Technol Biotechnol.  43:  165–173.
Todorov,  S.D.  &  Dicks,  L.M.T.  (2006).  Screening  for bacteriocin-producing  lactic  acid  bacteria  from  boza, a  traditional  c ereal  beverage  from  Bulgaria Comparison  of  the  bacterioc ins.  Proc es s Biochemistry.  41:  11–19.
Todorov,  S.D.,  Prevost,  H.,  Lebois,  M.,  Dousset,  X., LeBlanc ,  J .G.,  &  Franc o,  B.DGM.  (2011a). Bacteriocinogenic  Lactobacillus  plantarum  ST16Pa isolated  from  papaya  (Carica  papaya)-from  isolation to application: Characterization of a bacteriocin. Food Research  International.  44:  1351–1363.
Todorov, SD., Rachman, C., Fourrier, A., Dicks, Leon MT., Van  Reenen.,  Pre’vost,  H.,  &  Dousset,  X.  (2011b). Charac terization  of  a  bac terioc in  produc ed  by Lactobacillus  sakei  R1333  isolated  from  smoked salmon.  Anaerobe.  17:  23–31.
Udhayashree,  N.,  Senbagam,  D.,  &  Senthilkumar,  B.
(2012). Production of bacteriocin and their application in  food  products.  Asian  Pacific  Journal  of  Tropical Biomedicine.  S406–S410.
Usmiati,  S.  &  Marwati,  T.  (2007).  Selec tion and  optimation  of  proc ess  of  bac terioc in production      from  Lactobacillus  sp.  J.  Post  Harvest. 4(1):  27–37.
Yuliana,  N.  (2007).  Profile  of  rusip  fermentation  made from anchovies (Stolephorus sp). Agritech. 27(1): 12– 17.