Menara Perkebunan , 2008, 76(1), 1-10

## Perkembangan kalus embriogenik sagu
( Metroxylon sagu Rottb.) pada tiga sistem kultur in vitro
Development of embryogenic callus of sago (Metroxylon sagu Rottb .) on three systems of in vitro culture
Pauline D. KASI & SUMARYONO
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia

## Summary
Embryogenic  callus  of  sago (Metroxylon sagu Rottb.)  has  been  grown  on  three  systems of in  vitro culture  i.e.  agar-solidified  medium, liquid  medium,  and  temporary  immersion system  (TIS)  medium  to  observe  and  compare the  development  of  embryogenic  callus  over one  passage  of  six  weeks.    A-half  gram  of embryogenic callus was cultured on a modified MS  medium  containing  10  mg/L      2,4-D  and 0.1  mg/L  kinetin.  For  histological  studies, embryogenic  callus  was  fixed  in  FAA  and embedded  in  paraplast  wax.  Serial  sections were  stained  with  safranin  1%  and  observed microscopically.  By  the  end  of  culture  period, the  development  of  embryogenic  callus  in  TIS medium was  relatively better than those of  the other  two  media.    Fresh  weight  of  callus  in liquid  medium  and  TIS  increased  by  6.5-fold, while  on  agar-solidified  medium  increased  by 5.4-fold  in  six  weeks.    About  40%  of  callus  in liquid  medium  and  TIS  and  20%  of  callus  on agar  solidified  medium  have  changed  into somatic  embryos  at  globular  stage.  Histology structure  of  embryogenic  callus  of  the  three systems  of in  vitro culture  shows  different pattern. On agar-solidified medium, secondary callus  and  friable  embryogenic  callus  that consist  of  meristematic  cells  were  formed.  In contrast,  more  embryogenic  cells  were  formed in  liquid  medium  and  TIS  to  support maturation  process  to  somatic  embryos. Therefore,  temporary  immersion  system  and liquid medium are recommended for maturation  of  embryogenic  callus,  whereas
agar-solidified  medium  is  for  proliferation  of embryogenic callus of sago .
[ Key  words :  Sago  palm, Metroxylon  sagu , embryogenic  callus,  agar-solidified medium, liquid medium, temporary - immersion system]

## Ringkasan
Kalus embriogenik sagu ( Metroxylon sagu Rottb.)  telah  ditumbuhkan  pada  tiga  sistem kultur in  vitro yaitu  medium  padat,  medium cair,  dan  medium  dengan  sistem  perendaman sesaat  (SPS)  untuk  mempelajari  dan  mem- bandingkan  perkembangan  dari  kalus  embrio- genik  selama  periode  enam  minggu.  Setengah gram  kalus  embriogenik  dikulturkan  pada medium  MS  modifikasi  yang  mengandung 2,4-D  10  mg/L  dan  kinetin  0,1  mg/L.    Untuk studi  histologi,  kalus  embriogenik  difiksasi dengan  FAA  dan embedding menggunakan lilin paraplast.  Irisan  diwarnai  dengan  safranin 1%  dan  diamati  menggunakan  mikroskop. Pada  akhir  periode  kultur,  pertumbuhan  kalus pada  medium  dengan  SPS  lebih  baik dibandingkan  dengan  medium  cair  dan  padat. Bobot basah kalus pada  medium cair dan SPS meningkat  6,5  kali  sedangkan  pada  medium padat  meningkat  5,4  kali  dalam  waktu  enam minggu.  Sebanyak  40%  kalus  pada  medium cair  dan  SPS  serta  20%  kalus  pada  medium padat  berubah  menjadi  embrio  somatik  fase globuler.  Struktur  histologi  kalus  embriogenik pada  ketiga  jenis  sistem  kultur in  vitro

## Kasi & Sumaryono
menunjukkan pola yang berbeda. Pada medium padat  terjadi  pembentukan  kalus  sekunder  dan kalus embriogenik remah yang terdiri atas sel- sel meristematik. Sebaliknya pada medium cair dan  SPS  pembentukan  sel  embriogenik  lebih banyak  yang  menunjang  proses  pendewasaan menjadi  embrio  somatik.  Oleh  karena  itu, medium cair dan SPS direkomendasikan untuk pendewasaan  kalus  embriogenik,  sedangkan medium padat untuk proliferasi kalus embriogenik sagu.

## Pendahuluan
Tanaman  sagu  ( Metroxylon  sagu
Rottb.)  merupakan  tanaman  palma  yang tumbuh  di  sekitar  rawa  dan  lahan  ter- genang  air  di daerah tropis.  Sebagai salah satu  tanaman  penghasil  pati  paling produktif  (15-25  ton  pati  kering/hektar/ tahun),  sagu  dapat  dimanfaatkan  dalam bidang industri antara lain untuk bioetanol,  sirup  berkadar  fruktosa  tinggi, plastik  terurai-hayati,  dan  bahan  perekat (Flach,  1997).  Perbanyakan  tanaman  sagu umumnya  dilakukan  secara  vegetatif, dengan  anakan  ( sucker )  yang  tumbuh  di sekitar batang utama (induk). Perbanyakan dengan  anakan  menghasilkan  tanaman yang relatif seragam, tetapi jumlah anakan yang  dihasilkan  sangat  terbatas.  Hal  ini merupakan  salah  satu  hambatan  utama dalam  pengembangan  budidaya  tanaman sagu secara komersial (Jong, 1995).
Kultur  jaringan  tanaman  sagu  dilaku- kan  melalui  induksi  embrio  zigotik (Hisajima et  al. ,  1991)  maupun  embrio somatik  (Tahardi et  al., 2002 ) .  Embrio- genesis  somatik  merupakan  salah  satu aplikasi penting dalam propagasi  tanaman secara  vegetatif  dalam  skala  besar  (van Arnold et al. , 2002). Tahardi et al. (2002) telah berhasil menginduksi embrio somatik  tanaman  sagu  dengan  mengguna- kan  eksplan  berupa  jaringan  muda  dari
tunas apikal anakan. Embriogenesis somatik  sagu  serupa  dengan  embrio- genesis  somatik  tanaman  palma  lainnya yang  diawali  dengan  pembentukan  kalus embriogenik,  yang  kemudian  pada  fase selanjutnya  membentuk  embrio  somatik globuler.  Tahapan  selanjutnya  adalah  per- ubahan  menjadi  fase bentuk hati, torpedo, kotiledon,  dan  kecambah.  Kecambah  ber- kembang membentuk planlet yang selanjutnya akan menjadi bibit.
Kultur  jaringan  tanaman  sagu  umum- nya  dilakukan  pada  medium  padat  untuk semua  fase  perkembangan  dimulai  dari induksi  kalus  hingga  ke  proses  maturasi embrio.  Pada  beberapa  jenis  tanaman palma  lainnya  seperti  kelapa  sawit, penggunaan  medium  padat  dalam  pro- sedur  propagasi in  vitro mempunyai beberapa  kekurangan  diantaranya  pertum- buhan  embrio  yang  tidak  seragam  dan multiplikasi  kalus  yang  rendah.  Hal  ini dapat  menjadi  hambatan  untuk  produksi skala  besar,  di  samping  biaya  produksi yang mahal (Duval et al., 1993). Alternatif lainnya  adalah  penggunaan  medium  cair sebagai medium tumbuh.  Kultur cair telah berhasil dilakukan pada beberapa tanaman perkebunan,  diantaranya  kelapa  sawit (Sumaryono et  al .,  1994).  Sistem  ini memberikan  hasil  yang  menjanjikan karena dapat memproduksi embrio somatik  dalam  skala  besar  dengan  meng- gunakan  bioreaktor.  Akan  tetapi  pada medium  cair,  eksplan  cenderung  meng- alami  kekurangan  oksigen  sehingga  dapat menghambat  pertumbuhan  (Sumaryono et al. , 1994).
Selain  prosedur  konvensional  seperti kultur  pada  medium  padat  dan  cair, terdapat  prosedur  kultur  lainnya  yaitu sistem  perendaman  sesaat  ( temporary immersion system ). Sistem
ini memungkinkan  terjadinya  perendaman periodik  dalam  jangka waktu  pendek,  dan
Perkembangan kalus embriogenik sagu...
selebihnya  kalus  atau  embrio  terpapar  ke udara.  Kondisi  ini,  menurut  Teisson et  al (1999)  memungkinkan  terjadinya  transfer oksigen  yang  cukup,  pencampuran  antara propagul  dan  medium  memadai,  per- gantian  medium  berurutan  dan  otomatis, kontaminasi  berkurang,  serta  biaya  relatif rendah.  Sistem  perendaman  sesaat  (SPS) telah  diaplikasikan  untuk  perbanyakan in vitro secara  masal  pada  berbagai  jenis tanaman,  antara  lain  pada  karet  (Etienne et al. , 1997), kopi (Berthouly et al. , 1995), teh (Tahardi et al. , 2003), dan kelapa sawit (Tahardi, 1998). Dalam rangka produksi bibit tanaman sagu  melalui  kultur  jaringan,  perlu dilakukan perbanyakan kalus embriogenik sebagai  sumber  bahan  pembentuk  embrio somatik.  Perkembangan  kalus  embrio- genik  sagu  yang  baik  dan  cepat  merupa- kan tahap awal untuk mendapatkan embrio somatik  yang  seragam  dalam  skala  besar. Melalui  penelitian  ini,  dipelajari  dan dibandingkan
perkembangan
kalus embriogenik  sagu  pada  tiga  sistem  kultur in  vitro ,  yaitu  medium  padat,  cair,  dan SPS.

## Bahan dan Metode

## Bahan tanaman
Penelitian  dilakukan  di  laboratorium Biak  Sel  dan  Mikropropagasi  Tanaman, Balai  Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan Indonesia,  Bogor.  Dalam  penelitian  ini, digunakan  kalus  embriogenik  sagu  yang merupakan  kalus  embriogenik  sekunder yang  berasal  dari  kultur  embrio  somatik pada  medium  padat.    Kalus  embriogenik diinduksi  dari  eksplan  jaringan  pucuk meristem  anakan  sagu  asal  Kalimantan Selatan   dengan   menggunakan   medium padat  modifikasi  MS  (medium  MMS)
seperti yang dilaporkan oleh Tahardi et al. (2002).

## Medium dan kondisi kultur
Sebanyak  0,5  g  kalus  embriogenik dikulturkan  pada  tiga  jenis  medium tumbuh yang berbeda, yaitu medium padat di  cawan  Petri,  cair  di  labu  Erlenmeyer dan medium cair dengan sistem perendaman  sesaat  (SPS).  Komposisi dasar  ketiga  media  adalah    MMS  dengan penambahan  zat  pengatur  tumbuh  2,4-D 10  mg/L;  kinetin  0,1  mg/L;  sukrosa 30  g/L;  dan  arang  aktif  1  g/L.    Khusus untuk  medium  padat  ditambahkan  gelrite 2  g/L.  Sebanyak  50  mL  medium  masing- masing  ditempatkan  pada  cawan  Petri berdiameter  10  cm  untuk  medium  padat dan  pada  labu  Erlenmeyer  250  mL  untuk medium cair. Untuk kultur cair, dilakukan penggoyangan  dengan  meletakkan  labu Erlenmeyer pada shaker dengan kecepatan 100 rpm.
Pada  kultur  SPS,  kalus  dikulturkan pada  bejana  yang  terdiri  dari  dua  wadah dengan  propagul  (kalus  atau  embrio somatik)  terletak  di  bagian  atas  dan medium  di  bagian  bawah  (Gambar  1). Sebanyak  50  mL  medium  cair  dapat  naik menggenangi  propagul  selama  jangka waktu dan interval yang telah diatur sesuai program dengan alat autonic double timer . Dalam  penelitian  ini  jangka  waktu perendaman  selama  tiga  menit  dengan interval setiap enam jam.
Untuk  ketiga  jenis  medium,  pH medium  disesuaikan  pada  skala  5,7 sebelum  medium  diautoklaf  pada  suhu 121°C  dan  tekanan  1  kg/cm 2 selama  20 menit. Kultur ditempatkan di ruang kultur pada  suhu  26°C  dengan  intensitas  cahaya 30  µmol  foton/m 2 /detik  dan  periode pencahayaan 14 jam.
Kasi & Sumaryono
Gambar 1. Kultur kalus embriogenik sagu pada medium cair  dengan  sistem  peren- daman sesaat (SPS).
Figure 1.  Culture of embryogenic calli of sago in a liquid medium using temporary immersion system (TIS).

## Pengamatan kalus embriogenik
Pertumbuhan kalus embriogenik diamati  selama  enam  minggu,  mengguna- kan  metode  destruktif  dengan  memanen lima cawan Petri (medium padat) dan lima labu  Erlenmeyer  (medium  cair)  yang dipilih secara acak setiap minggu. Khusus untuk  medium  SPS,  dipanen  tiga  bejana yang  dipilih  secara  acak.  Pertumbuhan diamati  dengan  menimbang  bobot  basah kalus.  Dari  data  bobot  basah  tersebut dibuat  kurva  pertumbuhan  kalus  embrio- genik  sagu.  Pada  akhir  periode  kultur (minggu  keenam)  diamati  pula  komposisi kalus  embriogenik  dan  embrio  somatik berdasarkan  bobot  basah  pada  masing- masing medium tumbuh.

## Histologi
Preparat  histologi  dibuat  dari  kalus embriogenik  remah  dan  noduler  yang diperoleh  dari  masing-masing  perlakuan. Material  (kalus  remah  dan  kalus  noduler)
difiksasi  dengan  FAA  (Formalin  Acetic acid  Alcohol)  dengan  komposisi  70%  etil alkohol  (80  mL),  asam  asetat  glasial (10  ml),  dan  10  mL  formalin  (37,5% formaldehid).  Material  yang akan dibuat preparat  dimasukkan  ke  dalam  botol flakon yang berisi larutan FAA selama 18 jam. Kemudian dilakukan proses dehidrasi menggunakan  seri  larutan  butanol  (40%, 55%,  70%,  85%,  dan  100%)  masing- masing  selama  satu  jam.    Selanjutnya cairan  dehidran  diganti  dengan  larutan butanol:paraplast (1:1) sebelum memasuki proses
embedding.
Spesimen di-
embedding dengan  menggunakan  lilin Paraplast (Sigma) . Cetakan hasil
embedding yang  berisi  material  tadi disimpan  pada  suhu  ruangan.    Pengirisan dilakukan  dengan  alat  mikrotom  putar dengan  ketebalan  irisan  10  µm  dan pewarnaan  menggunakan  safranin  1% dalam  akuades.  Preparat  histologi  diamati di  bawah  mikroskop  cahaya  dan  dipotret menggunakan kamera Nikon.

## Hasil dan Pembahasan

## Pertumbuhan kalus embriogenik
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa bobot basah total kultur kalus embriogenik sagu  pada  tiga  sistem  kultur in  vitro meningkat  terus  hingga  akhir  masa  kultur (minggu  keenam).    Pada  akhir  masa kultur,  bobot  basah  total  kalus  embrio- genik sagu pada medium padat sekitar 5,4 kali,  pada  medium  cair  dan  medium  SPS sekitar 6,5 kali lipat dari bobot basah kalus di  awal  kultur.    Peningkatan  terbesar terjadi  pada  kultur  kalus  embriogenik  di medium  cair,  namun  pada  akhir  periode kultur  bobot  basah  kalus  embriogenik pada  medium  cair  sama  dengan  pada medium SPS (Gambar 2).
Perkembangan kalus embriogenik sagu... 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 6 Periode kultur (minggu) Culture period (week) B o b o t b as ah k al u s em b ri o g en ik s ag u ( g ) F re sh w ei g h t o f sa g o e m b ry o g en ic c a ll i (g ) Padat Cair SPS ( Agar-solidified ) ( Liquid )
( TIS )
Gambar 2.  Kurva pertumbuhan kalus  embriogenik  sagu  pada  tiga sistem  kultur in vitro selama enam minggu.
Figure 2.   Growth curve  of sago embryogenic calli on three different systems of in vitro culture  over a six-week period.
Peningkatan bobot kalus embriogenik sagu  pada  medium  cair  lebih  baik dibandingkan  dengan  medium  padat. Pada  kultur  kalus  embriogenik  kelapa sawit  juga  menunjukkan  hal  yang  serupa, dimana  pertumbuhan  kalus  pada  medium cair lebih baik dibandingkan pada medium padat  (Sumaryono et  al., 1994).    Pada medium  padat,  hanya  sebagian  dari  kalus embriogenik  yang  bersinggungan  dengan permukaan  medium,  sementara  pada medium  cair  dan  SPS  seluruh  kalus embriogenik  terpapar  pada  medium.    Hal ini  berpengaruh  terhadap  penyerapan medium oleh kalus yang digunakan untuk tumbuh.
Pemaparan  kalus  embriogenik  ter- hadap medium secara terus-menerus dapat menyebabkan kalus mengalami ke- kurangan  oksigen  yang  juga  menghalangi pertumbuhan  kalus.    Pada  medium  SPS, dengan perendaman medium secara berkala,  seluruh  permukaan  kalus  dapat berhubungan  (kontak)  langsung  dengan medium  pada  saat  medium  menggenangi
kalus,  sehingga  penyerapan  nutrisi  terjadi di  seluruh  bagian  kalus,  tidak  hanya  di bagian  bawah  saja  seperti  pada  medium padat. Dibandingkan dengan medium cair, pada medium SPS terjadi transfer oksigen yang cukup. Oleh karena itu, pertumbuhan kalus  menjadi  lebih  baik  karena  nutrisi dapat  diserap  secara  bersamaan  dalam proporsi seimbang.
Pada medium SPS dan medium padat, hingga  akhir  masa  kultur  (minggu keenam)  pertumbuhan  kalus  embriogenik sagu  tetap  menunjukkan  peningkatan, sehingga periode kultur kalus embriogenik sagu  pada  kedua  jenis  medium  tersebut mungkin  dapat  diperpanjang.  Sementara pada medium cair, pertumbuhan menunjukkan  peningkatan  hingga  minggu kelima  dan  relatif  sama  hingga  minggu keenam  ( levelling  off ).    Oleh  karena  itu periode  kultur  kalus  embriogenik  sagu pada  medium  cair  sebaiknya  dilakukan selama lima minggu.  Setelah lima minggu medium harus diperbaharui dengan melakukan subkultur dan interval  transfer

## Kasi & Sumaryono
kalus  embriogenik  sagu  setiap  5-6 minggu.  Interval  ini  lebih  lama  jika dibandingkan  dengan  tanaman  kelapa sawit,  dimana  proliferasi  kalus  embrio- genik  paling  optimal  diperoleh  dengan interval  transfer  setiap  empat  minggu  di medium SPS (Sumaryono et al., 2007).

## Perkembangan kalus dan embrio somatik
Pada  akhir  masa  kultur,  dilakukan pengamatan terhadap perkembangan kalus embriogenik di tiga jenis medium tumbuh. Pada  awal  kultur,  semua  kalus  berupa embriogenik  yang  remah  (Gambar  3A). Hasil  pengamatan  menunjukkan  sebagian kalus  mengalami  diferensiasi  menjadi embrio  somatik  fase  perkembangan  awal yaitu  fase  globuler.    Berdasarkan  bobot basah  sebanyak    19,7  %  kalus  berubah menjadi  embrio  somatik  pada  medium padat,  40,5  %  pada  medium  cair  dan 38,4  %  pada  medium  SPS  (Tabel  1). Perubahan  ini  dapat  mempengaruhi  per- tambahan  bobot  total  kalus  embriogenik pada  tiga  sistem  kultur in  vitro (Gambar 2). Pembentukan  embrio  somatik  pada medium    proliferasi  kalus    embriogenik
dapat  disebabkan  oleh  zat  pengatur tumbuh  2,4-D  yang  terdapat  di  dalam medium. Zat pengatur tumbuh jenis auksin dalam konsentrasi rendah digunakan untuk menginisiasi pembentukan embrio
somatik pada tanaman kelapa (Chan et al ., 1999;  Fernando  &  Gamage,  2000)  dan kurma  (Huong et  al. ,  1999).  Pada penelitian sebelumnya Riyadi et al. (2005) menemukan  bahwa  penggunaan  2,4-D sebesar  10  mg/L  yang  dikombinasikan dengan  kinetin  0,1  mg/L  pada  medium padat  dapat  menginisasi  pembentukan embrio  somatik  sagu  sebesar  45%. Sehingga  dengan  menggunakan  medium proliferasi,  dapat  dilakukan  dua  tahapan sekaligus yaitu proliferasi dan diferensiasi kalus embriogenik menjadi embrio somatik.
Kondisi  medium  tumbuh,  khususnya luas dan lama kontak antara kalus dengan medium,  mempengaruhi  perubahan  kalus embriogenik.   Hal ini menyebabkan pada medium  padat  sebagian  besar  kalus  tetap remah  (Gambar  3B),  sedangkan  pada medium  cair  kalus  mengalami  pertum- buhan  yang  lebih  baik,  dan  memungkin- kan  sebagian  berubah  menjadi  embrio somatik (Gambar 3C).
Tabel 1. Perubahan komposisi kalus embriogenik sagu pada tiga sistem kultur in vitro setelah enam minggu dikulturkan, berdasarkan bobot basah total kalus.
Table 1. Composition changes of sago embryogenic calli on three different systems of in vitro culture over a six-week culture period, based on total fresh weight of calli.
Persentase komposisi kultur (%) Percentage of culture composition (%)
Sistem kultur Culture system Kalus embriogenik Embyogenic calli Embrio somatik Somatic embryo Medium padat Agar-solidified medium 80,3 19,7 Medium cair Liquid medium 59,5 40,5 SPS TIS 61,6 38,4
Perkembangan kalus embriogenik sagu...
Gambar 3.  Kalus  embriogenik  sagu:  kalus awal (A)  setelah  enam  minggu dikulturkan pada  medium padat (B), pada medium cair (C), dan pada sistem perendaman sesaat (D).
Figure  3.  Embryogenic  calli  of sagu:  initial calli (A) after  six-weeks   cultured  on    agar-solidified medium (B), in liquid medium (C), and in temporary immersion system ( D).
Pada medium cair, seluruh permukaan kalus  berhubungan  langsung  dengan medium,  sementara  pada  medium  padat hanya  sebagian  yang  mengalami  kontak dengan  medium.    Demikian  pula  dengan penggunaan  medium  SPS  dapat  meng- hasilkan  embrio  somatik  lebih  tinggi (Gambar  3D)  dibandingkan  medium padat.    Hal  ini  sesuai  dengan  hasil penelitian  pada  kelapa  sawit  (Tahardi, 1998) yang menunjukkan bahwa frekuensi pembentukan  embrio  somatik  dari  kalus nodular  pada  medium  SPS  sangat  tinggi. Penggunaan  medium  SPS  dapat  mening- katkan  keseragaman  embrio  smatik  dan meningkatkan skala produksi.
Pada  penelitian  ini  lama  perendaman diatur  tiga  menit  setiap  enam  jam. Pengaturan  ini  didasarkan  pada  penelitian tanaman  kelapa  sawit  (Sumaryono et  al.,
2007).  Pada  tanaman  tahunan,  rentang lama  perendaman  1  sampai  15  menit dengan  frekuensi  perendaman  2  sampai 12  jam  (Etienne  &  Berthouly,  2002). Untuk  mendapatkan  hasil  yang  lebih  baik maka  perlu  dilakukan  penelitian  tentang lama dan frekuensi  perendaman  pada fase pertumbuhan  kalus  dan  embrio  somatik sagu.

## Histologi
Pengamatan anatomi dari kalus embriogenik  sagu  menunjukkan  bahwa kalus  embriogenik  remah  terdiri  atas  sel- sel  yang  bersifat  meristematik  (yang ditandai  dengan  ruang  antar  sel  lebih rapat,  mempunyai  inti  yang  jelas,  me- nyerap  warna  kuat,  sitoplasma  padat  dan aktivitas  pembelahan  sel  yang  tinggi).
A B C D

## Kasi & Sumaryono
Pada  kalus  embriogenik  remah  di medium  padat  dan  SPS  sel-sel  meristem tersebut membentuk  kluster-kluster   yang dilindungi  lapisan  polisakarida  (Gambar 4A dan 4E), dimana setiap kluster tersebut nantinya akan menjadi satu individu kalus yang  terpisah.    Sementara  pada  medium cair  sel-sel  meristem  membentuk  daerah
meristematik  di bagian tepi (Gambar 4C). Hal  serupa  juga  dijumpai  pada  kalus embriogenik  tanaman  kurma  (Sané et  al., 2006).    Pada  ketiga  jenis  medium,  kalus embriogenik  noduler  terdiri  atas  sel-sel meristematik  dan  sel-sel  embriogenik (Gambar 4B, 4D, dan 4F).
Gambar  4. Penampang  lintang  kalus  embriogenik  remah  dan  noduler  pada  tiga  sistem  kultur  yang berbeda.  Kalus embriogenik remah pada medium padat (A).  Kalus embriogenik noduler pada  medium  padat  (B).    Kalus  embriogenik  remah  di  medium  cair  (C).    Kalus embriogenik  noduler  di  medium  cair  (D).    Kalus  embriogenik  remah  di  SPS  (E).    Kalus embriogenik  noduler  di  SPS  (F ). SM=  sel  meristem,  SE=  sel  embriogenik,  KS=  kalus sekunder. Bar = 125 µm.
Figure  4.  Transversal  section  of  friable  and  nodular  embryogenic  calli  on  different  systems  of culture.  Friable  embryogenic  calli  on  solid  medium  (A).  Nodular  embryogenic  calli  on solid medium (B). Friable embryogenic calli in liquid medium (C). Nodular embryogenic calli in liquid medium (D). Friable embryogenic calli in temporary immersion system (E). Nodular  embryogenic  calli  in  temporary  immersion  system  (F).  SM  =  meristematic  cell, SE = embryogenic cell, KS = secondary callus . Bar = 125 µm.
Perkembangan kalus embriogenik sagu...
Sel  meristematik  pada  umumnya terdapat  di  bagian  tengah  sedangkan  sel embriogenik  terdapat  di  bagian  tepi.    Sel embriogenik  mempunyai  ruang  antar  sel yang  tidak  dijumpai  pada  sel  meristem, sehingga  sel-sel  meristem  lebih  rapat.    Di antara  kedua  jaringan  tersebut  terdapat sekelompok  sel  yang  mempunyai  vakuola yang  besar  dan  bersifat  paren-kimatis (yang  nantinya  akan  membentuk  jaringan parenkim). Pada kalus embriogenik noduler  di  medium  padat  terdapat  ben- tukan  kalus  sekunder  pada  bagian  tepi yang  juga  terdiri  atas  sel-sel  meristem (Gambar  4B).  Struktur  histologi  kalus embriogenik  pada  ketiga  jenis  kultur in vitro menunjukkan  pola  yang  berbeda. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  penggunaan jenis  medium  akan  mempengaruhi  tipe kalus embriogenik yang terbentuk.
Medium padat dapat digunakan untuk proliferasi  kalus  karena  mempercepat pembentukan  kalus  sekunder  dan  pem- bentukan  kalus  embriogenik  remah  yang lebih  banyak.    Sementara  pada  SPS  dan medium  cair,  pembentukan  kalus  embrio- genik  remah  relatif  sedikit,  sehingga terbentuk  lebih  banyak  sel  embriogenik yang  menunjang  proses  pendewasaan menjadi embrio somatik.  Oleh karena itu, penggunaan  medium  cair  dan  medium SPS  dapat  direkomendasikan  sebagai medium tumbuh untuk pendewasaan kalus embriogenik  menjadi  embrio  somatik. Sedangkan untuk proliferasi kalus embrio- genik  sagu  sebaiknya  tetap  menggunakan medium padat.

## Kesimpulan
Pertumbuhan  kalus  embriogenik  sagu pada  medium  cair  dan  SPS  lebih  baik dibandingkan  pada  medium  padat.  Akan tetapi  pertumbuhan  ini  diikuti  dengan perkembangan kalus embriogenik menjadi
embrio somatik fase globuler. Penggunaan media  cair  dan  SPS  untuk  tahapan  pen- dewasaan  kalus  embriogenik  menjadi embrio somatik, sedangkan medium padat untuk  tahapan  proliferasi  kalus  embrio- genik sagu.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian ini didanai melalui Program  Insentif  Riset  Terapan  dengan nomor kontrak 78/RT/Insentif/PPK/I/2007 tanggal 15 Januari 2007, dari Kementerian Negara  Riset  dan  Teknologi,  Republik Indonesia.

## Daftar Pustaka
Berthouly,  M.,  M.  Dufour,  D.  Alvard, C.  Carasco,  L.  Alemanno  &  C.  Teisson (1995). Coffee micropropagation in liquid medium  using  temporary  immersion technique ,  ASIC,  Kyoto,  Vol  II,  514-
519C.
Chan, J.L., L. Saenz, C. Talavera, R. Hornung, M.  Robert  &  C.  Oropeza  (1998).
Regeneration  of  coconut  ( Cocos  nucifera L.)  from  plumule  explants  through somatic  embryogenesis. Plant  Cell  Rep. ,
17 , 515-521.
Duval,  Y.,  F.  Aberlenc  &  B.  de  Touchet
(1993).  Use  of  embryogenic  suspensions for oil palm micropropagation. In V. Rao,
I.E. Henson & N. Rajanaidu (Eds.) Recent Development  in  Oil  Palm  Tissue  Culture and  Biotechnology .  Palm  Oil  Research
Institute of  Malaysia, p. 38-47.
Etienne,  H.,  M.  Lartaud,  N.  Michaux-Ferrière,
M.P.  Carron,  M.  Berthouly  &  C.  Teisson (1997). Improvement of somatic embryogenesis  in Hevea  brasiliensis Müll. Arg. using the temporary immersion technique. In  Vitro  Cell.  Dev.  Biol. , 33 ,
81-87.

## Kasi & Sumaryono
Etienne, H. & M. Berthouly (2002). Temporary immersion systems in plant micropropagation. Plant  Cell  Tiss.  Org. Cult. , 69 , 215-231.
Fernanado,  S.  C.  &  C.  K.  A  Gamage  (2000).
Absisic acid induced somatic embryogenesis  in  immature  embryo explants  of  coconut  ( Cocos  nucifera L.). Plant Sci. , 151 , 193-198. Flach, M. (1997). Sago palm Metroxylon sagu
Rottb.  Promoting  the  conservation  and use  of  underutilized  and  neglected crops .13. Rome, International Plant Genetic Resources Institute. 76p.
Hisajima  S.,  F.  S.  Jong,  Y.  Arai  &  E.  S.  Sim (1991).  Propagation and breeding of sago palm  ( Metroxylon  sagu Rottb.)  plant  in vitro : 1. Embryo culture and induction of multiple  shoots  from  sago  embryo  in vitro. J. Trop. Agric., 35 (4), 259-267
Jong,  F.  S.  (1995). Research  for  the Development  of  Sago  Palm  ( Metroxylon sagu Rottb.)  Cultivation  in  Sarawak, Malaysia .  Malaysia,  Sadong  Press  Sdn. Bhd. 139p.
Riyadi, I. , J. S. Tahardi & Sumaryono (2005). The  development  of  somatic  embryos  of sago  palm  ( Metroxylon  sagu Rottb.)  on solid  media. Menara  Perkebunan , 73 (2), 35-43.
Sané, D., F. Aberlenc-Bertossi, Y.K. Gassama- Dia,  M.  Sagna,  M.  F.  Trouslot,  Y.  Duval &  A.  Borgel  (2006).  Histocytological analysis  of  callogenesis  and  somatic embryogenesis  from  cell  suspension  of date  palm  ( Phoenix  dactylifera ). Ann. Bot. , 98 , 301-308.
Sumaryono,  N.  Mardiana  &  J.  S.  Tahardi (1994).  Embryogenic  suspension  culture
of  oil  palm. Menara  Perkebunan , 62 (3),
41-46.
Sumaryono, I. Riyadi, P. D. Kasi & G. Ginting
(2007).  Pertumbuhan  dan  perkembangan kalus  embriogenik  dan  embrio  somatik kelapa  sawit  ( Elaeis  guineensis Jacq.) pada  sistem  perendaman  sesaat. Menara Perkebunan , 75 (1), 32-42.
Tahardi, J. S. (1998). Improvement of oil palm somatic embryogenesis by periodic immersion  in  liquid  medium. In Proc.
International  Oil  Palm  Conf. Nusa  Dua, Bali, 23-25 September 1998.
Tahardi,  J.  S.,  N.  F.  Sianipar  &  I.  Riyadi (2002).  Somatic  embryogenesis  in  sago palm  ( Metroxylon  sagu Rottb.). In K. Kaimuna,  M.  Okazaki,  Y.Toyoda,  &  J.E. Cecil  (Eds.) New  Frontiers  of  Sago  Palm Studies . Tokyo, Universal Academy Press,
p. 75-81.
Tahardi, J. S., I. Riyadi & W. A. Dodd (2003). Enhancement of somatic embryo
development  and  plant  recovery  in Camellia  sinensis by  temporary  liquid immersion. Jurnal Biotek. Pertanian , 8 (1),
1-7.
Teisson, C., D. Alvard, M. Lartaud, H. Etienne,
M. Berthouly, M. Escalona & J. C. Lorenzo (1999). Temporary immersion  for  plant  tissue  culture. In Proc.  IXth  International  Conggres  of Plant Tissue and Cell Culture , Jerusalem,
p. 629-632.
van  Arnold  S.,  I.  Sabala,  P.  Bozhkov,
J.  Dyachok  &  L.  Filonova  (2002). Development pathways of somatic embryogenesis. Plant  Cell  Tiss.  Org. Cult. , 69 , 233-249.