## KETERKAITAN JUMLAH DAERAH TERMUTASI PADA GEN β-GLOBIN DENGAN INDEKS KORPUSKULAR PEMBAWA SIFAT β-THALASSEMIA
RELATIONSHIP BETWEEN THE NUMBER OF MUTATED REGION ON β- GLOBIN GENE WITH CORPUSCULAR INDEX ON β- THALASSEMIA CARRIER
Priyambodo 1
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung
* priyambodo@fmipa.unila.ac.id

## Abstrak
Thalassemia merupakan kelainan genetik yang disebabkan karena mutasi titik pada gen penyandi rantai  globin  yang  mengakibatkan  menurunan  indeks  korpuskular  pada  penderita  thalassemia, termasuk pada pembawa sifat thalassemia. Tiga hingga llima persen dari total penduduk Indonesia merupakan  pembawa  sifat  thalassemia,  dengan  kasus  tertinggi  adalah β-thalassemia.  Penelitian ini  bertujuan  untuk  mengetahui  hubungan  antara  jumlah  daerah  termutasi  pada  gen β-globin dengan  penurunan  indeks  korpuskular  pada  pembawa  sifat β-thalassemia.  Data  diambil  pada tahun  2012-2013  di  Yogyakarta.  Analisis  indeks  korpuskular  meliputi mean  corpuscular  volume (MCV), mean corpuscular haemoglobin (MCH), and mean corpuscular haemoglobin concentration (MCHC) dilakukan  di  laboratorium  Prodia.  Analisis  molekuler  dengan  metode polymerase  chain reaction-single stand conformation polymorphism (PCR-SSCP) dilakukan di Laboratorium Genetika dan Laboratorium Falitma, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada. Dari total 96 individu yang melakukan  skrining, terdapat  9  individu  terduga  pembawa  sifat  β-thalassemia  dengan  1  daerah termutasi  pada  gen  β-globin  menunjukkan  rerata  MCV  63,1  fl,  MCH  19,76  pg  dan  MCHC  32,34 g/dl.  Tujuh  terduga  pembawa  sifat  β-thalassemia  dengan  2  daerah  termutasi  pada  gen  β-globin menunjukkan  rerata  MCV  61,16  fl,  MCH  19,74  pg,  and  MCHC  32,3  g/gl.  Satu  individu  terduga pembawa  sifat  β-thalassemia  dengan  3  daerah  termutasi  pada  gen  β-globin  menunjukkan  rerata MCV 64,2 fl, MCH 19,5 pg, and MCHC 30,4 g/dl. Jumlah daerah termutasi bukan merupakan faktor untama penurunan indeks korpuskular pada pembawa sifat β-thalassemia.
Kata kunci: daerah termutasi, indeks korpuskular, pembawa sifat β-thalassemia

## Abstract
Thalassemia is a genetic dissorder caused by point mutation on the globin gene that decreasing the corpuscular index on thalassemian, included the carrier of thalassemia. Three to five percents of Indonesian is thalassemia carrier, β-thalassemia is the most common type. This research aimed to  identify  the  relationship  between  t he  number  of  mutated  region  on  β-globin  gene  and  the decreasing of corpuscular index on β-thalassemia carrier. The data was collected during 2012 to 2013  in  Yogyakarta.  Hematological  analysis  was  performed  by  corpuscular  index  included  mean corpuscular  volume  (MCV),  mean  corpuscular  haemoglobin  (MCH),  and  mean  corpuscular haemoglobin  concentration  (MCHC)  in  Prodia  Laboratory.  Molecular  analysis  was  performed  by the  polymerase  chain  reaction-single  stand  conformation  polymorphism  (PCR-SSCP)  method  in Laboratory of Genetics and Laboratory of Falitma, Biology Faculty, University of Gadjah Mada. Of a  total  of  96  individual  screeaned,  there  were  9  suspects  β-thalassemia  carrier  with  1  β-globin gene mutated region showed the average of MCV 63,1 fl, MCH 19,76 pg and MCHC 32,34 g/dl. Seven suspects β-thalassemia carrier with 2 β-globin gene mutated regions showed the average of MCV 61,16 fl, MCH 19,74 pg, and MCHC 3 2,3 g/gl. One suspect β-thalassemia carrier with 3 β- globin gene mutated regions showed the average of MCV 64,2 fl, MCH 19,5 pg, and MCHC 30,4 g/dl.  The  number  of  β-globin  gene  mutated  region  was  not  the  main  factor  of  decreasing  the corpuscular index on β-thalassemia carrier.
Keywords: mutated region, corpuscular index, β-thalassemia carrier

## Jurnal Biologi Eksperimen dan Keanekaragaman Hayati

## PENDAHULUAN
Darah merupakan jaringan pada hewan yang tersusun atas plasma dan sel darah (eritrosit, leukosit, dan trombosit) [1]. Salah satu fungsi darah  adalah  mengangkut  oksigen  dan karbondioksida  dari  dan  ke  jaringan,  fungsi ini dilakukan oleh hemoglobin [2][3]. Kemampuan  hemoglobin  untuk  mengikat oksigen  dikarenakan  adanya  struktur  empat molekul heme yang terikat pada rantai globin [4].    Pada  orang  dewasa,  dapat  dijumpai empat macam rantai globin , yaitu α, β, δ, dan γ.  Kombinasi  keempat  macam  rantai  globin tersebut  menyebabkan  adanya  tiga  tipe hemoglobin,  yaitu  HbA  (α 2 β 2 ),  HbA 2 (α 2 δ 2 ), dan HbF (α 2 γ 2 ) [3][5].
Apabila  terjadi  mutasi  pada  gen  pengkode rantai  globin,  maka  akan  timbul  kelainan fungsi  hemoglobin  atau  bahkan  kegagalan produksi hemoglobin. Kelainan yang disebabkan oleh mutasi gen pengkode rantai globin antara lain thalassemia dan Hb varian [6]. Thalassemia merupakan kelainan genetik dengan  pola  penurunan  autosomal  resesif yang  banyak  terjadi  di  daerah  Afrika, Mediterania, Timur Tengah, Asia Selatan dan
Asia
Tenggara [7][8].
Thalassemia
disebabkan  oleh  mutasi  gen  HBA  atau  HBB dan  berdampak  pada  penurunan  atau  tidak adanya  produksi  rantai    α-globin  atau  β- globin, sehingga dapat menyebabkan hemolisis dan gangguan eritropoiesis [3][9].
World  Health  Organization pada  tahun  1994 menyatakan bahwa setidaknya terdapat 27 × 10 7 pembawa sifat thalassemia di dunia [10], sedangkan  di  Indonesia  jumlah  pembawa sifat  thalassemia  berkisar  antara  3-5%  dari total  penduduk  bahkan  mencapai  10%  pada daerah  tertentu  [11].  Kasus  HbE  dan  β- thalassemia  merupakan  kasus  tertinggi  di Indonesia  [12]  termasuk  di  Palembang  [13], Sumba  Timur  [12],  Medan  [14],  dan Yogyakarta [15][16].
Upaya  preventif  dilakukan  untuk  mencegah pertambahan jumlah
penyandang thalassemia adalah pemetaan jumlah pembawa sifat pada populasi melalui skrining [17]. Skrining dapat dilakukan secara massal di  seluruh  populasi  atau  secara  parsial  pada waktu  tertentu,  misalnya  premarital  atau prenatal.  Beberapa  metode  dikembangkan untuk  pelaksanaan  skrining,  antara  lain, metode  NESTROFT  berdasarkan  tingkat kerapuhan  membran  eritrosit  [18],  metode hematologis yang mengamati seluruh parameter  eritrosit  [8]  hingga  berbagai metode  molekular yang dikembangkan  untuk
menyempurnakan berbagai metode sebelumnya [19].
Yayasan Thalassemia Indonesia/Perhim- punan  Orangtua  Penderita  Thalassemia Indonesia  (YTI/POPTI)  cabang  Yogyakarta secara  rutin  melakukan  skrining  sejak  tahun 2012.    Skrining  dilakukan  dengan  metode hematologis  dan  molekular.  Salah  satu parameter  yang  diamati  dalam  skrining hematologis  adalah  indeks  korpuskular  yang memberikan  deskripsi  kondisi  rerata  tiap eritrosit.  Indeks  korpuskular  diukur  melalui tiga  hal,  yaitu  rerata  volume  eritrosit,  rerata kandungan hemoglobit tiap satu eritrosit, dan rerata  konsentrasi  hemoglobin  tiap  satu eritrosit.
Analisis  molekular  dilakukan  dengan  metode Polymerase  Chain  Reaction-Single  Strand Conformation  Polymorphism (PCR-SSCP) yang  telah  divalidasi  dengan  sekuensing DNA.  Analisis  PCR-SSCP  dilakukan  pada empat  daerah  yang  paling  sering  dijumpai adanya mutasi di dalamnya [20]. Berdasarkan  analisis  tersebut,  ditemukan  17 individu pembawa sifat β-thalassemia dengan variasi jumlah daerah termutasi, yaitu satu  hingga  tiga  daerah  dari  total  empat daerah  yang  diamati[15].  Penelitian  ini bertujuan  mencari  keterkaitan  antara  jumlah daerah  termutasi  pada  gen  pengkode  β- globin  dengan  indeks  korpuskular  individu pembawa sifat β-thalassemia.

## METODE PENELITIAN
Pengambilan Sampel Sampel  darah  diperoleh  dari  96  peserta skrining  pembawa  sifat  thalassemia  yang diselenggarakan  oleh  YTI/POPTI  cabang Yogyakarta bekerja sama dengan laboratorium  Prodia  dan  Fakultas  Biologi Universitas  Gadjah  Mada  tahun  2012-2013. Sebanyak 6 ml sampel darah masing-masing individu  diambil  dan  disimpan  dalam  dua tabung  vacutainer  EDTA  3  ml.  Satu  tabung digunakan untuk analisis hematologi, sedangkan  satu  tabung  digunakan  untuk analisis molekular. Dalam proses penyimpanan  dalam  jangka  waktu  lama sampel  darah  dimasukkan  dalam freezer  -
20 o C.
Pengukuran Indeks Korpuskular Pengukuran  indeks  korpuskular  dilakukan  di laboratorium Prodia Yogyakarta untuk mengukur  parameter mean  corpuscular volume (MCV),
mean corpuscular
haemoglobin (MCH),  dan mean  corpuscular haemoglobin concentration (MCHC).

## Isolasi DNA
Isolasi  DNA  dilakukan  berdasarkan  manual kit isolasi GeneAid Genomic DNA Mini Kit for Frozen  Blood  Protocol dengan  modifikasi, yang meliputi tahap lisis sel, pengikatan DNA pada  kolom silica  gel ,  pencucian,  dan  elusi DNA. Hasil isolasi DNA diuji kualitatif dengan elektroforesis  gel  agarosa  0,8  %  dalam  TBE 1×  100  volt  selama  30  menit.  Hasil elektroforesis  direndam  dalam ethidium bromide 30  menit  dan  dilihat  dengan  UV transiluminator.
Amplifikasi Gen β-Globin Amplifikasi  gen  β-globin  dilakukan  pada empat  daerah  [20]  pada  mesin thermocycler ( Eppendorf  Mastercycler  Personal )  dengan menggunakan PCR  kit  KAPA  2GTM  Fast Ready Mix .  Amplifikasi  gen  β-globin dilakukan  dengan  campuran  12,5  µl  PCR master  mix ,  3  µl  DNA template ,  1,25  µl forward  primer , 1,25 µl reverse primer dan  7 µl  ddH2O  steril.  Campuran  diinkubasi  dalam mesin thermocycler dengan kondisi suhu pre- denaturation 95 o C  selama  3  menit,  35  siklus ( denaturation 95 o C selama 15 detik, annealing sesuai melting  temperature dari primer selama  30  detik, elongation 72 o C selama  45  detik), post-elongation 72 o C selama  5  menit  dan colling 4 o C  selama  5 menit.    Hasil  amplifikasi  gen  β-globin  diuji kualitatif  dengan  elektroforesis  gel  agarosa 1%  dalam  TBE  1×  50  volt  45  menit.  Hasil elektroforesis  direndam  dalam ethidium bromide 30  menit  dan  dilihat  dengan  UV transiluminator.
Analisis molekular Analisis  molekular  dilakukan  dengan  metode PCR-SSCP  dan  sekuensing  DNA  untuk  uji validasi.  PCR-SSCP  dilakukan  berdasarkan metode  Fitriani  dengan  modifikasi  [21]. Sebanyak  10  µl  produk  PCR  ditambah dengan  15  µl loading  buffer (campuran bromo  phenol  blue,  formamide ,  EDTA, gliserol)  diinkubasi  dalam waterbath 95 o C selama  10  menit,  kemudian  secepatnya dimasukkan  dalam freezer -20 o C  selama  10 menit.  Sebanyak  25  µl  campuran  produk PCR  dan loading  buffer dimasukkan  dalam well gel  poliakrilamid  ( acrylamide:bis- acrylamide 29:1).  Elektroforesis  dilakukan pada  100  volt,  50  mA  selama  100  menit dalam  TBE  0,5×.  Visualisasi  hasil  PCR- SSCP dilakukan dengan pewarnaan ethidium bromide yang diamati dengan UV
transiluminator.
Sekuensing DNA dilakukan dengan mengirimkan sampel ke perusahaan 1 st Base Singapura.  Sampel  yang  dikirimkan  berupa 30  µl  produk  PCR,  20  µl primer dengan konsentrasi
10 µM, masing-masing
komponen  dimasukkan  ke  dalam  tabung PCR  berbeda.  Setiap  tabung  PCR  disegel dengan parafilm dan  dimasukkan  ke  dalam wadah  tertutup  untuk  dikirim  ke  Singapura melalui PT Genetika Science Jakarta.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebanyak  96  individu  peserta  skrining thalassemia  YTI/POPTI  Yogyakarta  diambil sampel  darahnya  untuk  dilakukan  uji  panel thalassemia.  Pengujian  dilakukan  dengan melihat  aspek  hematologis  dan  aspek molekular.  Tujuh  belas  individu  dapat dideteksi  memiliki  paling  tidak  satu  daerah term utasi  pada  gen  pengkode  β-globin  dari total empat daerah yang diuji dengan metode PCR-SSCP yang divalidasi dengan sekuensing  DNA.  Enam  dari  17  individu tersebut berjenis kelamin laki-laki, sedangkan sisanya perempuan.
Teknik  PCR-SSCP  merupakan  teknik  PCR- based yang  dikembangkan  agar  mampu mengenali  mutasi  dan  polimorfisme  DNA. PCR-SSCP dapat mendeteksi adanya perubahan sekuens basa tunggal pada untai DNA melalui pengamatan di gel poliakrilamid. PCR-SSCP  dimulai  dengan  memisahkan rantai  ganda  DNA  menjadi  rantai  tunggal yang  selanjutnya  akan  membentuk  pola konformasi
tertentu yang akan
mempengaruhi  pola  migrasi  di  dalam  gel poliakrilamid.  Interpretasi  data  PCR-SSCP dilakukan  dengan  membandingkan  pola migrasi individu pembawa sifat β-thalassemia dengan individu normal homozigot. Kebenaran  hasil  PCR-SSCP  selanjutnya divalidasi dengan sekuensing DNA.
Tabel  1  menunjukkan  perbandingan  jumlah daerah  termutasi  pada  gen  pengkode  β- globin  dengan  rerata  indeks  korpuskular individu.  Sembilan individu  pembawa  sifat β- thalassemia  dengan  satu  daerah  termutasi memiliki  rerata  MCV  63,1fl,  rerata  MCH 19,76 pg, dan rerata MCHC 32,34 g/dl. Tujuh individu pembawa sifat β-thalassemia dengan dua daerah termutasi memiliki rerata MCV  61,16  fl,  rerata  MCH  19,74  pg,  dan rerata  MCHC  32,3  g/dl;  sedangkan  satu individu pembawa sifat β-thalassemia dengan tiga daerah termutasi memiliki rerata MCV 64,2 fl, rerata MCH 19,5 pg, dan rerata MCHC 30,4 g/dl.
Tabel 1. Perbandingan kondisi antara jumlah daerah termutasi pada gen pengkode β-globin dan rerata indeks korpuskular pembawa sifat β- thalaessemia JDT \ RIK JI MCV (fL) MCH (pg) MCHC (g/dL) 1 9 63,1 19,76 32,34 2 7 61,16 19,74 32,3 3 1 64,2 19,5 30,4 Keterangan: JDT  : Jumlah daerah termutasi JI : Jumlah individu
RIK  : Rerata Indeks korpuskular MCV  : mean corpuscular volume MCH  : mean corpuscular haemoglobin MCHC  : mean  corpuscular  haemoglobin concentration
Rantai  β-globin  dikode  oleh  gen  HBB  yang terdapat  dalam  kromosom  nomor  11.  Rantai β-globin disintesis tubuh sejak fase embrional, namun berdeda proporsi produksinya tiap fase perkembangan. Sintesis rantai β-globin akan meningkat saat usia  kandungan  melewati  masa  36  minggu dan  akan  semakin  meningkat  saat  kelahiran dan akan mulai konstan saat usia 30 minggu. Peningkatan  sintesis  β-globin  ini  diikuti  oleh penurunan  sintesis  rantai  δ-globin,  sehingga dalam kondisi normal, persentase hemoglobin  tipe  HbA  (α 2 β 2 )  pada  orang dewasa  jauh  lebih  tinggi  daripada  tipe hemoglobin yang lain.
Mutasi  gen  HBB  dapat  menyebabkan penurunan atau tidak  adanya produksi rantai β-globin  yang  dapat  berdampak  pada kelainan  atau  bahkan  kegagalan  fungsi hemoglobin  untuk  mengikat  oksigen,  serta dapat berdampak pada perubahan struktur β- globin  dan  berkurangnya  umur  eritrosit. Secara  fenotip,  mutasi  gen  HBB  dapat berakibat pada penurunan indeks kropuskular  seseorang.  Indeks  korpuskular merupakan  kondisi  rerata  setiap  eritrosit. Indeks  korpuskular  diukur  pada  tiga  macam parameter,  yaitu  volume  rerata  tiap  eritrosit (MCV),  rerata  kandungan  hemoglobin  dalam satu  eritrosit  (MCH)  dan  rerata  konsentrasi hemoglobin  dalam  satu  eritrosit  (MCHC). Nilai  ketiga  macam  parameter  ini  bersifat konstan  dan  tidak  terpengaruh  atas  jenis nutrisi yang dikonsumsi seseorang, sehingga dapat  dijadikan  salah  satu  indikator  yang valid  untuk  mengetahui  status  seseorang atas kelainan thalassemia.
Pengukuran  parameter mean  corpuscular volume (MCV)  memberikan  informasi  terkait volume  rata-rata  eritrosit.  Secara  manual, MCV dapat dihitung dengan membandingkan nilai  hematokrit  dengan  jumlah  eritrosit. Rentang  MCV  normal  untuk  anak-anak adalah  69-93  fl,  sedangkan  untuk  orang dewasa adalah 80-100 fL. Secara mikroskopis,  hasil  pengukuran  MCV  dapat dibandingkan dengan kondisi ukuran eritrosit pada  gambaran  darah  tepi.  Dalam  kondisi normal,  eritrosit  seukuran  dengan  limfosit, sehingga  jika  dijumpai  adanya  eritrosit  yang berukuran lebih  kecil  daripada limfosit,  maka disebut  dengan  kondisi  mikrositik,  kondisi sebaliknya adalah makrositik.
Thalassemia  terjadi  akibat  adanya  mutasi yang  menyebabkan  adanya  penurunan  atau kegagalan  produksi  rantai  globin,  sehingga dari  adanya  penurunan  parameter  MCV. Tabel  1  menunjukkan  bahwa  seluruh  rerata MCV  berada  di  bawah  batas  nilai  MCV normal, bahkan di bawah batas normal pada kondisi  normal  anak-anak.  Hasil  pada  MCV tidak  menunjukkan  adanya  kecenderungan makin  banyak  jumlah  daerah  termutasi  akan makin menurunkan rerata MCV.
Parameter  pengukuran  kedua  adalah  MCH yang menunjukkan rerata kandungan hemoglobin dalam setiap eritrosit. Parameter MCH berbeda dengan parameter hemoglobin pada  kategori  hitung  darah  rutin  ( cell  blood count ).  Hasil  pengukuran  terhadap  MCH akan  konstan,  sedangkan  hasil  pengukuran terhadap hemoglobin seseorang akan fluktuatif berdasarkan kondisi fisiologis orang tersebut.  Secara  manual,  parameter  MCH dapat  dihitung  dengan  membandingkan konsentrasi  hemoglobin  dengan  jumlah eritrosit.  MCH  orang  dewasa  normal  berada di  kisaran  26 –  34  pg,  sedangkan  untuk anak-anak  berada  pada  kisaran  23 – 31  pg. Pada  pengamatan  mikroskopis,  jika  nilai MCH  rendah,  dapat  teramati  pada  kondisi warna  eritrosit  yang  pudar/pucat.  Kondisi  ini disebut  hipokromik  yang  merupakan  salah satu  indikator  thalassemia,  baik  mayor, intermedia, maupun minor.
Tabel 1 menunjukkan adanya kecen- derungan  antara  peningkatan  jumlah  daerah termutasi  pada  gen  pengkode    β-globin menyebabkan  penurunan  rerata  nilai  MCH. Kecenderungan  yang  sama  juga  teramati pada  parameter  MCHC.  Parameter  MCHC mengukur  rerata  konsentrasi  hemoglobin pada  setiap  eritrosit.  Nilai  MCHC  dapat dihitung secara manual dengan
membandingkan konsentrasi hemoglobin dengan  nilai  hematokrit.  MCHC  bukan merupakan indikator mutlak dalam penentuan status seseorang terkait
thalassemia,  namun  dapat  dijadikan  sebagai pelengkap pertimbangan. Kisaran nilai MCHC  normal  adalah  32 – 36 g/dL. Tabel 1 menunjukkan  bahwa  peningkatan  jumlah daerah  termutasi  pada  gen  pengkode  β- globin  diiringi  dengan  penurunan  rerata  nilai MCHC.  Pada  individu  dengan  satu  dan  dua daerah  termutasi  pada  gen pengkode  β- globin,  rerata  nilai  MCHC  masih  dalam kisaran  normal,  sedangkan  individu  dengan tiga daerah termutasi pada gen pengkode β- globin  menunjukkan  rerata  nilai  MCHC  di bawah kisaran normal.
Di  Asia  Tenggara  telah  ditemukan  lebih  dari 66  jenis  mutasi penyebab  β-thalassemia. Berbagai macam
mutasi ini tidak memberikan dampak yang seragam.
Sebagian  dari  jenis  mutasi  merupakan silent mutation
yang tidak menyebabkan
perubahan  protein  yang  dihasilkan  dari proses ekspresi gen, sehingga tidak menimbulkan  dampak  yang  parah  bagi penderita.  Beberapa  jenis  mutasi  yang  lain merupakan missense mutation yang menyebabkan  perubahan  jenis  protein  yang dihasilkan,  bahkan  sebagian  jenis  mutasi berupa delesi dapat mengakibatkan pergeseran  rangka  baca  pada  saat  ekspresi gen.  Keberagaman  jenis  mutasi  yang  ada lebih  diyakini  mempunyai  keterkaitan  yang lebih erat dengan penurunan indeks korpuskular,  baik  MCV,  MCH  maupun MCHC.
Silent  mutation gen  HBB  pengkode β-globin sangat  beragam.  Gen  sepanjang  1,6kb  ini memiliki 3 exon dan 2 intervening sequence . Mutasi  gen  HBB  tidak  hanya  terjadi  pada daerah exon yang  akan  diekspresikan menjadi  protein,  namun  dapat  terjadi  pula pada promoter , untranslated  region (UTR), dan intervening  sequence yang  merupakan tidak menyebabkan perubahan protein. Mutasi  -92  C>T  pada  CACC box meupakan contoh silent mutation pada daerah promoter . Pada  daerah  UTR  juga  terdapat  beberapa contoh silent  mutation ,  misalnya  mutasi  +1 A>C  dan  +6  C>G.  Keberagaman silent mutation ini  makin  memperkuat  asumsi bahwa  jumlah  daerah  termutasi  bukan merupakan  penyebab  utama  penurunan indeks korpuskular.
Indikator  jumlah  daerah  termutasi  pada  gen pengkode  β-globin  bersifat  komplementer
dengan jenis mutasi yang terjadi di dalamnya.  Makin  banyak  jenis  mutasi  yang terjadi  tidak  akan  memberikan  dampak signifikan  jika  jenis  mutasi  yang  terjadi adalah silent  mutation .  Namun,  jumlah daerah  termutasi  juga  memberikan  andil dalam  penurunan  nilai  indeks  korpuskular. Dua  daerah  termutasi  berjenis missense mutation akan  memberikan  dampak  yang lebih  parah  daripada  kondisi  satu  daerah termutasi berjenis missense mutation .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  penulis  ucapkan  kepada  Dr.
Niken Satuti Nurhandayani, M.Sc., Laboratorium  Genetika  Fakultas  Biologi
Universitas  Gadjh  Mada  atas  dukungan finansial,  moral  dan  bimbingan  intensif  atas penelitian ini.

## SIMPULAN
Jumlah daerah termutasi pada gen pengkode rantai  β-globin  bukan  merupakan  faktor utama  penurunan  indeks  korpuskular  pada individu pembawa sifat β-thalassemia.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Silbernagl, S. & Despopoulos, A. 2009.
Color  Atlas  of  Physiology .  6 th ed. Thieme, Stuttgart, Germany, pp: 88-90.
[2] Favero,  M.E.  &  Costa,  F.F.  2011. Alpha-haemoglobin-stabilizing  Protein: an  Erythroid  Molecular  Chaperone.
Biochem. Int. 2011: 1-7. [3] Tangvarasittichai, S. 2011. Thalassemia  Syndrome,  Advances  in the Study of Genetic Disorders . InTech (versi online). (http://www.intechopen.com/books/adv ances-in-the-study-of-genetic- disorders/thalassemia-syndrome) [4] Clarke,  G.M.  &  Higgins,  T.N.  2000. Laboratory Investigation of Haemoglobinopathies and Thalassaemias:  Review  and  Update. Clin. Chem. 46 (8B): 1284-1290
[5] Mosca,  A.,  Paleari,  R.,  Ivaldi,  G., Galanello,  R.,  &  Giordano,  P.C.  2009. The  Role  of  Haemoglobin  A  Testing in the  Diagnosis  of  Thalassaemias  and Related  Haemoglobinopathies. J.  Clin.
Pathol. 62: 13-17.
[6] Rogers,  K.  2011. Blood:  Physiology and  Circulation ,  1 st ed.  Britannica Educational Publishing, New York.
[7] Hoffbrand,  A.V.,  Pettit,  J.E.,  Moss,
P.A.H.  2006. Essential  Haematology Fifth Edition . Massachusetts: Blackwell Science, Inc.
[8] Cao,  A.  &  Galanello,  R.  2010.  Beta- thalassemia. GeneTest Review . Genetics in Medicine 12:2.
[9] Galanello,  R.  2012.  Recent  Advances in  the  Molecular  Understanding  of NonTransfusion-Dependent Thalassemia. Blood Rev. 26S: S7-S11.
[10]  Weatherall,  D.J.  &  Clegg,  J.B.  2001. Inherited  Haemoglobin  Disorders:  An Increasing  Global  Health  Problem. Public  Health  Reviews. Bulletin  of  the World  Health  Organization 79:  704- 712.
[11]  Anonymous . 2010.
Pencegahan Thalassemia  (Hasil  Kajian  HTA  Tahun
2009) .Dirjen  Bina  Pelayanan  Medik, Kementerian Kesehatan Republik
Indonesia,Jakarta.
[12]  Lanni, F. 2002. Heterogenitas Molekular  Gena  Globin-ß di  Indonesia: Kaitannya  dengan  Pola  Penyebaran Thalassemia-ß  serta  Afinitas  Genetik antar  Populasi  di  Indonesia. Disertasi , tidak diterbitkan. UGM. Yogyakarta.
[13]  Sofro,  A.S.M.,  Clegg,  J.B.,  Lanni,  F., Sianipar,  O.,  Himawan,  &  Liliani,  R.V. 1996. Application of ARMS Primers for the  Molecular  Characterization  of  ß- Thalassemia  Carrier  in  Palembang, South Sumatra. I. J. Biotech. 12: 5965.
[14]  Ganie,  R.A.  2008.  Distribusi  Pembawa Sifat  Thalassemia  (a  &  ß)  dan Hemoglobin-E pada Penduduk Medan. Majalah  Kedokteran  Nusantara 41  (2): 117-122.
[15]  Priyambodo.  2014.  Deteksi  Molekular Pembawa  Sifat  β-thalassemia  di Daerah  Istimewa  Yogyakarta. Tesis , tidak diterbitkan. UGM. Yogyakarta
[16]  Magfirahtul Jannah. 2014. Profil
Hematologis  dan  Deteksi  Molekular Pembawa  Sifat  Hemoglobin  E  di Yogyakarta. Tesis ,  tidak  diterbitkan.
UGM. Yogyakarta
[17]  Modell, B. & Darlison, M. 2008. Global Epidemiology of Haemoglobin Disorders and Derived Service
Indicators. Bulletin  of  the World  Health Organization 86 (6): 417-496.
[18]  Mangiani,  M.,  Lokeshwar,  M.R.,  Vani, VG.,  Bhatia,  N.  &  Mhaskar,  V.  1997. NESTROFT,  an  Effective  Screening Test for Beta Thalassemia Trait. Indian Pediatrics 34: 702-707.
[19]  Calzolari,  Roberta,  McMorrow,  Tara, Yannoutsos,  Nikos,  Langeveld,  An, Grosveld,  Frank.  1999.  Deletion  of  a Region  that  is  a  Candidate  for  the Difference between the Deletion Forms of  Hereditary  Persistence  of  Fetal Hemoglobin and δβ-thalassemia Affets β- bbut not γ-Globin Gene Expression.
European Molecular Biology Organization . 18: 4 pp 949 – 958.
[20]  Gupta,  A.  &  Agarwal,  S.  2003. Efficiency  and  Cost  Effectiveness: PAGE-SSCP  versus  MDE  and  Phast gels  for  Identification  of  Unknown  ß- Thalassaemia  Mutations. Journal  of Clinical Pathology , 56: 237-239.
[21]  Fitriani,  I.  2009.  Deteksi  Mutasi  Gen MATP pada Penderita Oculocutaneous Albinism  (OCA)  di  DIY  dan Wonosobo (Jawa Tengah). Tesis . tidak diterbitkan. UGM. Yogyakarta.