## CURRENT BIOCHEMISTRY
ISSN: 2355-7877 e-ISSN: 2355-7931 Journal homepage: http://journal.ipb.ac.id/index.php/cbj Journal E-mail: current.biochemistry@gmail.com
In Silico Analysis of Red Betel ( Piper crocatum ) Active Compounds as Xanthine Oxidase Inhibitors
(Analisis In Silico Senyawa Aktif Sirih Merah ( Piper crocatum ) sebagai Inhibitor Xantin Oksidase)
Mega Safithri 1* , Shafillah Miantika 1 , Laksmi Ambarsari 1
1 Department of Biochemistry, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia
Received: 24 November 2022 ; Accepted: 14 December 2022
*Corresponding author : Mega Safithri, Depatemen Biokimia IPB: e-mail: safithri@apps.ipb.ac.id

## ABSTRACT
Excess  uric  acid  causes  swelling,  pain  and  stiffness  in  the  joints.  One  alternative  is  to  inhibit  the activity of the  enzyme xanthine oxidase. This study aimed to identify the active compound of red betel that can  inhibit  the  activity  of  the  xanthine  oxidase  through  molecular  docking  (in  silico).  Receptor  and  ligans were obtained from data bases.  Molecular docking was carried out using the Autodock Vina Tools. The size of the center retardation were x= 26,7853; y= 9,9800; z= 113,3917 with dimension value x= 14; y= 14; z= 18.The results of molecular docking showed that protocatechin acid and 2-(3,4-dimethoxy phenyl)-6-ethoxy- 7-methoxy-1-naphthol were potential as xanthine oxidase inhibitors (∆G =  -7.6 kcal/mol and Ki = 2.679 ) which is better than the commercial drug Allopurinol (∆G = -7.4 kcal/mol and Ki = 3.764), and binds to the active site residues Arg880 and Thr1010 in the Mo domain which is the target site for competitive inhibitors such as Allopurinol and natural inhibitors (salicylic acid).
Keywords: gout, inhibition, molecular docking, red betel leaves

## ABSTRAK
Asam  urat  berlebih  mengakibatkan  pembengkakan,  rasa  nyeri  dan  kaku  dipersendian.  Salah  satu alternatif  adalah  dengan  menginhibisi  aktivitas  enzim  xantin  oksidase.  Penelitian  ini  bertujuan mengidentifikasi  senyawa  aktif  sirih  merah  sebagai  inhibitor  enzim  xantin  oksidase  melalui  penambatan molekuler  (in  silico)  terarah  (site  directed  docking).  Reseptor  dan  ligan  diperoleh  dari  basis  data. Penambatan  molekul  dilakukan  menggunakan  software  Autodock  Vina  Tools.  Ukuran  pusat  penambatan molekuler  sebesar    x=26,7853;  y=  9,9800;  z=  113,3917  dengan  nilai  dimensi  x=14  ;  y=14  ;  z=18.  Hasil penambatan  molekul  menunjukkan  bahwa  asam  protokatekuat  dan  2-(3,4-dimetoksi  fenil)-6-etoksi-7- metoksi-1-naftol  berpotensi  sebagai  inhibitor  xantin  oksidase  (∆G  =  -7,6  kkal/mol  dan    Ki  =  2,679)  yang lebih baik dibandingkan obat komersial Allopurinol (∆G = -7,4 kkal/mol dan  Ki = 3,764), serta mengikat sisi aktif residu Arg880 dan Thr1010 pada Mo domain yang menjadi sisi target inhibitor kompetitif seperti Allopurinol maupun inhibitor alami (asam salisilat).
Kata kunci : daun sirih merah, inhibisi, gout, penambatan molekuler

## 1. PENDAHULUAN
Hiperurisemia  adalah  jumlah  kadar asam urat di darah tinggi karena sintesis asam urat  yang berlebih dan ekskresinya berkurang, sehingga  terjadi  endapan  Na-urat  pada  sendi dan  organ  ginjal  (Ling  dan  Bochu  2014). Enzim  xantin  oksidase  berperan  dalam mengkatalisis  hidroksilasi  dari  hipoxantin menjadi  xantin,  kemudian  xantin  menjadi asam  urat  (jalur  degradasi  purin).  Dengan demikian,  xantin oksidase  adalah enzim kunci dalam  meningkatkan  kadar  asam  urat  dalam darah (Bustanji et al . 2011). Allopurinol (obat sintetik)  adalah  inhibitor  dari  enzim  xantin oksidase,  akan  tetapi  penggunaan  berlebih memiliki  efek  samping  pada  tubuh  seperti pencernaan  yang  terganggu,  kerusakan  organ hati,  nefropati,  alergi,  dan  berkurangnya  sel darah  putih  (Khanna et  al .,  2012),  sehingga dibutuhkan  terapi  alternatif  herbal  akibat adanya  efek  samping  allopurinol.  Salah  satu herbal  yang  potensi  sebagai  antihiperuresemia adalah sirih merah ( Piper crocatum ).
Ekstrak  etanol  daun  sirih  merah  ( P. corcatum )  terbukti  secara  pra  klinis  pada mencit jantan sebagai antihiperuresemia dengan  mereduksi  60.51%  kadar  asam  urat dengan  dosis  0,0041  g/kg  bb  (Laili et  al. 2019).  Namun  demikian,  penelitian  terkait senyawa  aktif  sirih  merah  yang  berperan sebagai inhibitor enzim xantin oksidase  secara in  silico belum  ada.  Penelitian  ini  bertujuan mengidentifikasi  senyawa  aktif  sirih  merah yang  dapat  menginhibisi  aktivitas  enzim xantin oksidase melalui penambatan molekuler ( in silico).

## 2. METODOLOGI
Analisis in silico penelitian ini memakai reseptor protein struktur tiga dimensi xantin oksidase (kode PDB:1FIQ) diambil dari database bank data protein pada https://www.rcsb.org/search .  Ligan  uji  (89 senyawa aktif sirih merah), (ligan alami) asam salisilat,  dan  ligan  pembanding  (allopurinol).
Ligan  didapat  dari  basis  data PubChem Compound dengan  format  SDF  ( Structure Data  File ).  Seluruh  ligan  dioptimasi  geometri menggunakan  perangkat  lunak Discovery Studio  Visualizer 2016 dan AutoDock  Tools 1.5.6 .  Ligan  optimal  kemudian  ditapis  secara virtual menggunakan PyRx (Modifikasi
Pratama et al. 2016).
Seleksi  ligan  terbaik  dilakukan  dengan menganalisis  kelarutan  Lipinski  pada  laman http://www.scfbio- iitd.res.in/software/drugdesign/lipinski.jsp
(Modifikasi  Nogara et  al. 2014).  Prediksi toksisitas  ligan  uji  dilakukan  menggunakan perangkat lunak online Admetstar 1.0 (Ochieng et al . 2017).  Penambatan molekuler menggunakan software  Autodock  Vina  Tools dilakukan  pada  grid  box  daerah  pusat  x= 26.7853; y= 9.9800; z= 113.3917 dengan nilai dimensi  x=14  ;  y=14  ;  z=18  spasi=  0.375. Hasil dianalisis berdasarkan energi ikatan yang dihasilkan  (modifikasi  Singh et  al. 2017). Analisis  interaksi  hidrofobik  dan  ikatan hidrogen  dilakukan  dengan  mengoperasikan software Ligplot+  1.4.5  dengan radius interaksi kurang dari 5Ᾰ (Pratama et al. 2016).

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penapisan  virtual  89  senyawa sirih  merah,  dilanjutkan  dengan  tahapan seleksi  terhadap  senyawa  penciri  sirih  merah berdasarkan
database pada
http://ijah.apps.cs.ipb.ac.id.
Hasil seleksi
menunjukkan  terdapat  50  senyawa  yang merupakan senyawa penciri sirih  merah dan 4 diantaranya  memiliki  nilai  energi  ikatan  sama atau lebih negatif dibandingkan asam salisilat. Asam  salisilat  memiliki  nilai  energi  ikatan sebesar  -7,7  kkal/mol.  Selain  itu,  terdapat  16 senyawa khas sirih  merah  yang memiliki nilai Energi ikatan diantara nilai energi ikatan asam salisilat  dan  allopurinol  yaitu  direntang  nilai Energi ikatan -7,7 kkal/mol dan -6,4 kkal/mol.
Hasil  penapisan  ligan  berdasarkan aturan  Lipinski  terutama  pada  nilai  bobot molekul, menunjukkan bahwa ligan [4-[(3,4,5- trietoksibenzoil)oksimetil]fenil]metil 3,4,5- trietoksibenzoat  memiliki  penyerapan  dan permeabilitas  yang  kurang  di  dalam  tubuh, karena  berat  molekulnya  >  500  Da  (Lipinski, 2004).  Berdasarkan  nilai  logP,  terdapat  6 senyawa yang memiliki nilai logP lebih dari 5. Nilai logP merupakan parameter yang berhubungan  dengan  polaritas  ligan  dalam pelarut  non  polar,  pelarut  minyak  maupun lemak.  Senyawa  aktif  dengan  nilai  log  P>5 akan  lebih  mudah  melewati  lapisan  lipid bilayer pada membran sel, sehingga terdistribusi  luas  di  dalam  tubuh.  Menurut Isnaeni et  al. (2016),  apabila  nilai  log  P semakin  negatif,  maka    senyawa  aktif  bersifat lebih  terdistribusi  pada  fase  polar,  yang menunjukkan senyawa aktif hanya larut dalam cairan  tubuh,  namun  sulit  untuk  melewati membran sel, akibatnya sulit berikatan dengan reseptor yang ada pada membran sel tersebut.
Hasil  penapisan  ligan  berdasarkan aturan  Lipinski  terutama  nilai  refraktivitas molar menunjukkan bahwa ligan isobenzofuran-4,7-dion,  Z-11-Tetradesen-1-ol- trifluoroasetate,  asam  protokatekuat  dan  4-(4- metoksifenilamino)-2,3-dihidro-1H-4a,9- diaza-siklopenta(b)fluorin-10-karbonitril memiliki refraktivitas molar lebih kecil dari 40 sedangkan
[4-[(3,4,5-
trietoksibenzoil)oksimetil]fenil]metil 3,4,5-
trietoksibenzoat  memiliki  refraktivitas  molar lebih besar dari 130. Refraktivitas molar dapat menjadi salah satu parameter yang membedakan sutau senyawa dapat diserap atau tidak. Senyawa yang dapat diserap mempunyai  nilai  refraktivitas  yang lebih  kecil dibandingkan  dengan  senyawa  yang  tidak dapat diserap oleh tubuh (Chedik et al. 2017).
Parameter lainnya pada aturan Lipinski yaitu  suatu  ligan  harus  memiliki  donor hidrogen  kurang  dari  5  dan  akseptor  hidrogen kurang  dari  10.  Jumlah  donor  dan  akseptor
hidrogen  berkaitan  dengan  kapasitas  ikatan hidrogen. Donor dan akseptor ikatan hidrogen dapat  menunjukkan  energi  yang  dibutuhkan senyawa  aktif  untuk  dapat  diabsorpsi  oleh tubuh.  Kapasitas  ikatan  hydrogen  yang semakin  tinggi  menunjukkan  bahwa  energi yang  dibutuhkan  dalam  proses  penyerapan dalam  tubuh  semakin  besar,  sehingga  ligan akan  sulit  diabsorbsi  (Syahputra et  al. 2014).
Senyawa [4-[(3,4,5- trietoksibenzoil)oksimetil]fenil]metil 3,4,5-
trietoksibenzoat termasuk  ke  dalam  ligan  uji yang  tidak  memenuhi  aturan    Lipinski  karena 4  dari  5  aturan  tidak  sesuai  dengan  aturan Lipinski  (Tabel 1). Berdasarkan hasil analisis aturan  Lipinski,  terdapat  19  senyawa  bioaktif sirih  merah  yang  lolos  untuk  dilakukan prediksi toksisitas ligan.
Hasil  pengujian  toksisitas  berdasarkan metode  klasifikasi  ADMET  dapat  digunakan dalam  menentukan  derajat  kerusakan  yang dapat disebabkan oleh suatu molekul obat dan menentukan  batas  pemberian  dosis.  Hasil prediksi  karsinogenik  menunjukkan  semua ligan  termasuk  ke  dalam  kategori  senyawa non-karsinogenik, kecuali trans-beta-
Farnesene dan Z-11-tetradesen-1-ol-
trifluoroasetat  yang  bersifat  karsinogenik (Tabel  2).  Toksisitas  akut  merujuk  pada pengaruh  toksik  yang  diamati  akibat  asupan dosis tunggal secara oral pada selang waktu 24 jam.  Hasil  analisis  toksisitas  menunjukkan bahwa  ligan  isobenzofuran-4,7-dion  dan  N- metiloktadesilamin termasuk ke dalam kategori  II  dengan  nilai  ≤300  mg/kg  sehingga bersifat  lebih  toksik.  Sofalkon  dan  asam  1,2- benzendikarboksilat termasuk ke dalam kategori  IV  (≤5000  mg/kg)  yang  berarti  tidak lebih  toksik  dibandingkan  isobenzofuran-4,7- dion dan N-metiloktadesilamin. Semakin kecil kategori  suatu  senyawa  maka  semakin berbahaya  senyawa  tersebut  (Safithri et  al. 2012).  Berdasarkan  prediksi  toksisitas  ligan, terdapat  14  senyawa  yang  lolos  untuk dilakukan uji penambatan molekular.
Penambatan  molekuler  dilakukan  pada 14  senyawa  penciri  sirih  merah  yang  telah lolos  pada  prediksi  toksisitas  ligan.  Hasil penambatan  molekuler  menunjukkan  bahwa terdapat  5  ligan  uji  yang  memiliki  energi ikatan yang  lebih negatif    dibanding allopurinol  (Tabel  3).  Nilai  energi  ikatan
menunjukkan  tingkat  kestabilan  ikatan  antara ligan  dan  reseptor,  jika  nilainya  semakin negatif  maka  tingkat  kestabilan  ikatan  ligan dan  reseptor  semakin  tinggi,  sehingga  ikatan yang  terbentuk  akan  semakin  kuat  dan  reaksi antara  ligan  dan  reseptor  berlangsung  secara spontan (Murray 2012).
Tabel 1 Kelarutan ligan sirih merah berdasarkan aturan Lipinski
No Senyawa Masa atom relatif (Da) Donor ikatan hidrogen Akseptor ikatan hidrogen LogP Refraktivitas Molar 1 Alilpirokatekol 134 1 1 2,1207 42,00779 2 Sofalkon 450 1 6 5,7361 129,23126 3 Metil 3-(4-hidroksi-2- okso-2H-kromen-3-il)-3- (4- (oktiloksi)fenil)propanoat 452 1 6 5,9609 126,31275 4 [4-[(3,4,5- Trietoksibenzoil)oksimetil ]fenill]metil 3,4,5- trietoksibenzoat 610 0 10 6,7928 164,57919 5 Isobenzofuran-4,7-dion 148 0 3 1,2148 36,50899 6 N-Metiloktadesilamin 283 1 1 6,4673 93,47266 7 Urapidil 387 1 8 1,1621 108,27865 8 N-[2-(7- Benzhidriloksinaftalen-1- il)etil]siklopropanakarbok samid 421 1 3 6,0769 128,74066 9 Trans-beta-Farnesen 204 0 0 5,2015 70,99298 10 2-Metoksi-4-vinilfenol 150 1 2 2,0438 44,74979 11 2,6-Dimetil-3- (metoksimetil)-p- benzokuinon 180 0 3 1,0474 48,34698 12 Asam 1,2- Benzenedikarboksoli 166 2 4 1,0830 40,36060
Lanjutan... No Senyawa Masa atom relatif (Da) Donor ikatan hidrogen Akseptor ikatan hidrogen LogP Refraktivitas Molar 13 Z-11-Tetradesen-1-ol- trifluoroasetat 114 2 3 1,1950 21,12610 14 5-isopropil-3- pirazolidin karbohidrazid 172 5 5 -1,133 45,63249 15 Asam protokatekuat 154 3 4 0,7960 36,73090 16 2-(3,4-dimetoksi fenil)-6- etoksi-7- metoksi-1-naftol 354 1 5 4,6369 101,87377 17 6XO32ZSP1D 210 1 4 1,7210 55,50278 18 N-1,N-9-Bis[€-(2- nitrofenil)metilen]nonane dihidraze 482 2 10 3,8341 129,98516 19 4-(4-metoksifenilamino)- 2,3-dihidro-1H-4a,9- diaza- siklopenta(b)fluorine-10- karbonitril 354 1 4 4,6001 4,60007 20 6-Amino-4-[3- (benziloksi)fenil]-3-tert- butil-2,4-dihidropirano[2,3- c]pirazol-5-karbonitril 400 3 5 4,6001 114,02008
Tabel 2 Prediksi toksisitas ligan
Nama Ligan hERG Karsinogenisitas Toksisitas oral akut Kategori Skor Kategori Skor Kategori Skor Asam salisilat Inhibitor lemah 0,946 Non- karsinogenik 0,849 III 0,828 Allopurinol Inhibitor lemah 0,940 Non- karsinogenik 0,912 III 0,574 Alilpirokatekol Inhibitor lemah 0,717 Non- karsinogenik 0,733 II 0,537 sofalkon Inhibitor lemah 0,958 Non- karsinogenik 0,831 IV 0,629 Metil 3-(4-hidroksi-2- okso-2H-kromen-3-il)-3- (4- (oktiloksi)fenil)propanoa t Inhibitor lemah 0,829 Non- karsinogenik 0,945 III 0,401 Isobenzofuran-4,7-dion Inhibitor lemah 0,907 Non- karsinogenik 0,934 II 0,426 N-Metiloktadesilamin Inhibitor lemah 0,691 Non- karsinogenik 0,607 II 0,678 Urapidil Inhibitor 0,516 Non- 0,765 III 0,771
lemah karsinogenik N-[2-(7- Benzhidriloksinaftalen- 1- il)etil]siklopropanakarbo ksamid Inhibitor lemah 0,898 Non- karsinogenik 0,919 III 0,648 Trans-beta-Farnesen Inhibitor lemah 0,769 Karsinogenik 0,569 III 0,908 2-Metoksi-4-vinilfenol Inhibitor lemah 0,895 Non- karsinogenik 0,852 III 0,860 2,6-Dimetil-3- (metoksimetil)-p- benzokuinon Inhibitor lemah 0,831 Non- karsinogenk 0,744 III 0,533 Asam 1,2- Benzendikarboksilat Inhibitor lemah 0,982 Non- karsinogenik 0,747 IV 0,728 Z-11-Tetradesen-1-ol- trifluoroasetate Inhibitor lemah 0,915 Karsinogenik 0,807 III 0,679 5-isopropil-3- pirazolidin karbohidrazid Inhibitor lemah 0,996 Non- karsinogenik 0,734 III 0,603 Asam protokatekuat Inhibitor lemah 0.982 Non- karsinogenik 0,915 III 0,506 2-(3,4-dimetoksi fenil)- 6-etoksi-7- metoksi-1- naftol Inhibitor lemah 0,968 Non- karsinogenik 0,815 III 0,644 6XO32ZSP1D Inhibitor lemah 0,949 Non- karsinogenik 0,940 III 0,767 N-1,N-9-Bis[€-(2- nitrofenil)metilen]nonan edihidraze Inhibitor lemah 0,821 Non- karsinogenik 0,756 III 0,610 4-(4- metoksifenilamino)-2,3- dihidro-1H-4a,9-diaza- siklopenta(b)fluorin-10- karbonitril Inhibitor lemah 0,683 Non- karsinogenik 0,972 III 0,589 6-Amino-4-[3- (benziloksi)fenil]-3-tert- butil-2,4- dihidropirano[2,3- c]pirazol-5-karbonitril Inhibitor lemah 0,983 Non- karsinogenik 0,832 III 0,580
Ligan  alami  memiliki  nilai  energi ikatan  sebesar  7.7  kkal/mol,  sedangkan allopurinol  memiliki  nilai  energi  bebas  Gibs sebesar  7.4  kkal/mol.  Hasil  penambatan molekuler  menunjukkan  bahawa  terdapat  2 senyawa  yang  memiliki  nilai  energi  ikatannya yang  lebih  negatif  dibandingkan  dengan Energi  ikatan  ligan  alami,  yaitu  N-[2-(7- benzhidriloksinaftalen-1- il)etil]siklopropanakarboksamid  sebesar  -11.8
kkal/ml
dan
N-1,N-9-bis[€-(2- nitrofenil)metilen]nonanedihidraze  sebesar  - 8.2  kkal/mol.  Sebanyak  4  ligan  uji  yang memiliki  nilai  energi  ikatan  diantara  nilai energi ikatan ligan alami dan allopurinol, yaitu sofalkon,  asam  1,2-benzendikarboksilat,  dan 2-(3,4-dimetoksi  fenil)-6-etoksi-7-  metoksi-1- naftol,  dan  asam  protokatekuat  (Tabel  3). Energi bebas Gibbs berdasarkan
termodinamika  menunjukkan  proses  adsorpsi
yang  spontan  jika  nilainya  kurang  dari  nol (ΔG<0)  dan  tidak  spontan  apabila  nilainya lebih  dari  nol  (ΔG>0)  (Du et  al .  2021).
Dengan  demikian,  semakin  kecil  nilai  energi bebas  Gibbs  maka  interaksi  antara  ligan  dan reseptor  semakin  spontan  dan  membutuhkan energi yang sedikit untuk melakukan penambatan  molekul.  Besar  kecilnya  energi bebas  Gibbs  (ΔG)  ditentukan  oleh  kontribusi ikatan  ionic,  ikatan  hidrogen,  interkasi hidrofobik,  dan  interaksi  Van  der  Waals  yang terjadi  pada  interaksi  reseptor  dengan  ligan, sehingga menghasilkan nilai afinitas pengikatan (Ashraf et al. 2021).
Parameter lain dalam melihat kekuatan interaksi antara ligan dan reseptor adalah nilai konstanta  inhibisi.  Nilai  konstanta  inhibisi dapat diperoleh dari persamaan
∆G= -RT In K
Berdasarkan hasil perhitungan semakin negatif nilai energi ikatan, maka akan semakin kecil  juga  nilai  konstanta  inhibisi  yang didapat.  Nilai  konstanta  inhibisi  tertinggi diperoleh  dari  ligan  sofalkon,  yaitu  sebesar 3,764,  sedangkan  nilai  konsanta  inhibisi terendah diperoleh dari ligan N-[2-(7- benzhidriloksinaftalen-1-
il)etil]siklopropanakarboksamid,  yaitu  sebesar 0,0022  µM  (Tabel  3).  Nilai  afinitas  (energi ikatan)  berbanding  lurus  dengan  nilai  Ki. Pengikatan  suatu  ligan  sebagai  inhibitor kompetitif  ditunjukkan  dengan  nilai  Ki  pada rentang nilai mikromolar yang rendah (Ramsay et al. 2017). Tambunan dan Alamudi (2010),  semakin  kecil  nilai  konstanta  inhibisi dan  semakin  negatif  nilai  energi  ikatan  dapat meningkatkan  energi  torsional,  sehingga ikatan yang terbentuk antara senyawa aktif dan enzim sangat kuat dan stabil.
Tabel 3 Penambatan molekuler senyawa sirih merah terhadap xantin oksidase
No Nama ligan Energi ikatan (kkal/mol) Konstanta inhibisi (µM) 1 Asam salisilat (ligan alami) -7,7 2,338 2 Allopurinol (obat komersil) -7,4 3,764 3 N-[2-(7-Benzhidriloksinaftalen-1- il)etil]siklopropanakarboksamid -11,8 0,0022 4 N-1,N-9-Bis[€-(2- nitrofenil)metilen]nonanedihidraze -8,2 0,976 5 Asam protokatekuat -7,6 2,679 6 2-(3,4-dimetoksi fenil)-6-etoksi-7- metoksi-1- naftol -7,6 2,679 7 asam 1,2-Benzendikarboksilat -7,5 3,176 8 Sofalkon -7,4 3,764 Hasil penambatan molekuler
membutuhkan visualisasi untuk melihat residu asam  amino  yang  berperan  membuat  iaktan antara  ligan  dan  reseptor.  Residu  yang membuat  ikatan  dengan  ligan  memiliki
interaksi yang dapat meningkatkan afinitas dan aktivitas  inhibisi  terhadap  enzim  xantin oksidase.  Interaksi  hidrofobik  dan  ikatan hidrogen  menentukan  stabilitas  ikatan  antara senyawa  aktif  dengan  proteinnya.  Bila  ikatan hidrogen  banyak  disertai  dengan  interaksi
hidrofobik,  maka  dapat  dikatakan  bahwa interaksi ligand dan reseptor tersebut merupakan interaksi  yang kuat  (Ummah et  al. 2020).
Hasil visualisasi penambatan
molekuler menunjukkan bahwa asam protokatekuat  memiliki  residu  asam  amino yang  berikatan  hidrogen  terbanyak  dibanding ligan  lainnya  yaitu  sebanyak  5  residu  (Tabel 4).  Asam  protokatekuat  memiliki  5  residu yang  berikatan  secara  hidrogen  berupa Thr1010,  Val1011,  Glu802,  Ala1079,  dan Arg880.  Ligan  asam  protokatekuat  lebih  kuat interaksinya terhadap reseptor jika dibandingkan  dengan  allopurinol,  karena
allopurinol  hanya  memliki  3  residu  asam amino  yang  berikatan  hydrogen.  Berbeda dengan  asam  protokatekuat,  ligan  N-1,N-9- bis[€-(2-nitrofenil)metilen]nonanedihidraze tidak  memiliki  residu  yang  berikatan  secara hidrogen.  Ligan  2-(3,4-dimetoksi  fenil)-6- etoksi-7-  metoksi-1-naftol  memiliki  jarak ikatan  terjauh  dibandingkan  ligan  lainnya, yaitu  pada  residu  Thr1010  sebesar  3.98  Å. Jarak  ikatan  terpendek  dimiliki  oleh  residu Glu1261  pada  ligan  sofalkon.  Ligan  N-1,N-9- bis[€-(2-nitrofenil)metilen]nonanedihidraze tidak  memiliki  jarak  ikatan  karena  tidak terdapat  residu  asam  amino  yang  berikatan hirdogen.

## Tabel 4 Interaksi residu asam amino pada sisi aktif xantin oksidase
No Nama ligan Berikatan hidrogen (jarak ikatan) Berikatan hidrofobik Mo domain 1 Asam salisilat Arg880 (3.08 Å), Thr1010 (2.85 Å), Val1011 (3.31 Å) (3) Ala1079, Phe1009 , Phe914 , Leu873, Glu802, Leu1014 (6) Arg880, Thr1010, Glu1261, Phe914, Phe1009 2 Allopurinol Arg880 (2.98 Å), Thr1010 (2.84 Å) Glu802 (3.21 Å) (3) Ala1079, Phe1009 , Phe914 , Leu873,  Ala1078 (5) Arg880, Thr1010, Glu1261, Phe914, Phe1009 3 Sofalkon Glu1261 (2.71 Å), Ala1079 (2.84 Å), Ser1008 (3.30 Å), Arg880 (2.81 Å) (4) Ser1080, Gly799, Phe798, Arg912, Ala1078, Val1011, Phe914 , Glu802,Leu648,
Pro1076, Phe1013, Lys771,
Leu1014, Leu873, Phe1009 , Ser876, Phe1005, Gly1006 (18) Arg880, Thr1010, Glu1261, Phe914, Phe1009 4 N-[2-(7- Benzhidriloksinafta len-1- il)etil]siklopropana karboksamid Glu802 (2.94 Å) (1) Glu1261 , Phe911, Gly799, Ala1078, Ala1079, Arg912, Gln767, Ala910, Phe914,
Arg880, Phe1009 , Leu873,
Leu1014, Phe649, Phe1013,
Lys771, Asn768, Ser876, Thr1010 , Val1011, Leu648 (21) Arg880, Thr1010, Glu1261, Phe914, Phe1009
Lanjutan... No  Nama ligan Berikatan hidrogen (jarak ikatan) Berikatan hidrofobik Mo domain 5 asam 1,2- Benzendikarboksilat Arg880 (2.80 Å), Ser1008 2.82 Å), Val1011 (3.01 Å) (3) Phe1009, Ser876, Leu1014, Glu802, Thr1010, Phe914, Ala1079 (7) Arg880, Thr1010, Glu1261, Phe914, Phe1009 6 Asam protokatekuat Thr1010 (2.84 Å ) Val1011 (3.33 Å ), Glu802 (2.68 Å), Ala1079 (3.17 Å), Arg880 (3.03 Å) (5) Phe1009, Phe914, Ala1078 (3) Arg880, Thr1010, Glu1261, Phe914, Phe1009 7 2-(3,4-dimetoksi fenil)-6-etoksi-7- metoksi-1-naftol Arg880 (3.03 Å) Thr1010 (3.98 Å ), Ser876 (3.78 Å) (3) Lys771, Val1011, Phe1013, Phe649, Leu873, Leu1014, Glu802, Leu648, Phe1009, Phe914, Glu1261, Ala1079 (12) Arg880, Thr1010, Glu1261, Phe914, Phe1009 8 N-1,N-9-bis[€-(2- nitrofenil)metilen]non anedihidraze - Phe798, Phe911, Gly799, Phe914, Ala1079, Glu1261, Ala910, Leu1014, Ala1078,
Thr1010, Val1011,
Ser876, Phe1013, Leu873, Leu648, Pro1076, Phe1009, Glu802, Arg912, Gln767, Thr1077, Met1038 (22) Arg880, Thr1010, Glu1261, Phe914, Phe1009
Keterangan: cetak tebal merupakan residu asam amino yang berikatan terhadap domain MO
Domain molibdopterin berfungsi sebagai  tempat  pengikatan  substrat  tempat terjadinya reaksi oksidasi. Hidroksilasi oksidatif  dari  substrat  purin  terjadi  di  pusat
molibdenum,  yang  menghasilkan  reduksi  dua elektron dari enzim. Salisilat sebelumnya telah terbukti  sebagai  penghambat  kompetitif  untuk substrat  yang  mengikat  di  situs  aktif  Mo
(Enroth et al . 2000; Pauff et al. 2008). Domain Mo  merupakan  situs  katalitik  yang  digunakan sebagai patokan dalam melihat interaksi residu asam  amino.  Residu  asam  amino  yang berinteraksi terhadap situs pengikatan aktif Mo yaitu  Arg880,  Thr1010,  Glu126,  Phe914,  dan Phe1009.  Berdasarkan  hasil  penelitian  (Tabel 4),  asam  salisilat  dan  allopurinol  berinteraksi terhadap residu asam amino Arg880, Thr1010, Phe914,  dan  Phe1009.  Ligan  2-(3,4-dimetoksi fenil)-6-etoksi-7-  metoksi-1-naftol  memiliki interaksi  residu  asam  amino  yang  sama terhadap  domain  Mo  secara  hidrofobik maupun hidrogen.
Berdasarkan  daerah  pengikatan  residu, ligan yang memiliki interaksi yang cukup kuat terhadap  xantin  oksidase  (1FIQ)  yaitu  asam protokatekuat, 2-(3,4-dimetoksi fenil)-6- etoksi-7-  metoksi-1-naftol,  dan  sofalkon.  Hal ini  dikarenakan  ligan  tersebut  memiliki  2 residu  ikatan  hidrogen  yang  sama  dengan residu pada Mo domain. Berdasarkan golongan  metabolit  sekunder,  ligan  sofalkon termasuk  ke  dalam  golongan  flavonoid  yang larut  dalam  pelarut  air  (Safithri et  al. 2016), sedangkan  ligan  2-(3,4-dimetoksi  fenil)-6- etoksi-7- metoksi-1-naftol dan asam protokatekuat  merupakan  senyawa  tanin  yang larut  dalam  pelarut  n-heksan  (Safithri et  al . 2022).
Olehkarena  itu,  penambatan  molekuler menghasilkan  5  senyawa  penciri  sirih  merah yang  memiliki    nilai  ∆G  lebih  negatif dibandingkan allopurinol. Ligan asam protokatekuat  dan  2-(3,4-dimetoksi  fenil)-6- etoksi-7-  metoksi-1-naftol  berpotensi  paling baik  dalam  menghambat  aktivitas  xantin oksidase karena memiliki nilai ∆G sebesar -7,6 kkal/mol,    nilai  Ki  sebesar  2,679  serta mengikat sisi aktif residu Arg880 dan Thr1010 pada  Mo  domain.  Sofalkon  juga  berpotensi baik  dalam  menginhibisi  xantin  oksidase karena memiliki nilai Ki dan ∆G sama  dengan allopurinol  juga  mengikat  sisi  aktif  residu Arg880 dan Glu1261 pada Mo domain.
Perlu  dilakukan  analisis  dinamika molekuler  untuk  melihat  stabilitas  kekuatan ikatan  tiap  ligan  uji  pada  penelitian in  silico ini.  Pengujian in  vitro dan in  vivo perlu dilakukan  untuk  mengetahui  daya  dan  jenis inhibisi  senyawa  sirih  merah  terhadap  xantin oksidase  yang  mengkatalisis  sintesis  asam urat.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih yang  tulus  kepada  Rini  Kurniasih,  S.Si,  M.Si karena  telah  berkontribusi  dalam  menelaah dan  memberikan  informasi  terkait  penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ashraf  SA,  Elkhalifa  AEO,  Mehmood  K, Adnan  M,  Khan  MA,  Eltoum  NE, Krishnan  A,  Baig  MS.  2021.  Multi- targeted molecular docking, pharmacokinetics,  and  drug-likeness evaluation  of  okra-derived  ligand abscisic acid targeting signaling proteins  involved  in  the  development of diabetes. Molecules. 26(5957): 1-23.
Bustanji  Y,  Hudaib  M,  tawaha  k,  Mohammad MK,  Almasri  I,  Hamed  S,  Oran  S. 2011.  In  vitro  xanthine  oxidase inhibition by selected jordanian medicinal  plants. Jourdan  Journal  of Pharmaceutical Sciences . 4(1): 49-56.
Chedik L, Mias-Lucquin D, Bruyere A, Fardel O.  2017.  In  silico  prediction  for intestinal absorption and brain penetration  of  chemical  pesticides  in human. International Journal of Enviromental  Research  and  Public Health . 14(6): 708-724.
Du X, Cheng Y, Liu Z, Yin H, Wu T, Huo L, Shu C. 2021. CO2 and CH4 adsorption on different rank coals: A thermodynamics  study  of  surface potential,  Gibbs  free  energy  change and entropy loss. Fuel. 283(118886):1- 11.
Enroth  C,  Eger  BT,  Okamoto  K,  Nishino  To,
Nishino  Ta,  Pai  EF.  2000.  Crystal structures  of  bovine  milk  xanthine dehydrogenase  and  xanthine  oxidase:
structure-based mechanism of conversion. PNAS .  97(20):  10723- 100728.
Isnaeni  L,  Kasmui,  Kusuma  SBW.  2016. Kajian  hubungan  kuantitatif  struktur dan aktivitas antioksida senyawa analog  kalkon. Indonesian  Journal  of Chemical Science . 5(2): 119-123.
Khanna  D,  Fitzgerald  JD,  Khanna  PP,  Bae  S,
Singh  MK,  Neogi  T,  et  al.  2012 American  College  of  Rheumatology Guidelines  for  Management  of  Gout  .
Part  1 :  Systematic  Nonpharmacologic and Pharmacologic Therapeutic Approaches to Hyperuricemia.
2012;64(10):1431–46.
Laili  NF,  Savitri  L,  Probosiwi  N.  2019.  Uji aktivitas  ekstrak  etanolik  daun  sirih merah ( Piper crocatum terhadap penurunan  kadar  asam  urat  darah mencit  jantan  putih. Jurnal  Inovasi Farmasi Indonesia . 1(1):1-10.
Ling  X,  Bochu  W  (2014)  A  Review  of phytotherapy  of  gout:  Perspective  of new pharmacological treatments.
Pharmazie . 69:243–256. doi: 10.1691/ph.2014.3642.
Lipinski,  C.  A.,  2004.  Lead-  and  drug-like compounds: the rule-of-five revolution.
Drug  Discovery  Today:  Technologies .
1(4): 337–341. doi: 10.1016/j.ddtec.2004.11.007. Murray  RK,  Bender  DA,  Botham  KM,
Kennely  PJ,  Rodwell  VW,  Weil  PA. 2012. Biokimia  Harper  Edisi  29 . Jakarta(ID): Penerbit EGC.
Nogara PA, Saraiva RDA, Bueno PC, Lissnerr
LJ, Corte CLD, Braga MM, Rosemberg  DB,  Rocha  JBT.  2014. Virtual screening of acetylcholinesterase inhibitor using the lipinski’s rule of five and zinc databank –  Review  article. Biomed  Research
International .
1-8. doi:10.1155/2015/870389. Ochieng  PJ,  Sumaryada  T,  Okun  D.  2017. Molecular docking and pharmacokinetic  of  herbal  derivates  as maltase-glucoamylase  inhibitor. Asian J Pham Cilin Res . 10(9): 392-398.
Pauff  JM,  Zhang  J,  Bell  CE,  Hille  R.  2008. Substrate orientation in xanthine oksidase  crystal  structur  of  enzyme  in reaction with 2-hydroxy-6- methylpurine. The Journal of
Biological  Chemistry .  283(8)  :  4818- 4824. DOI 10.1074/jbc.M707918200.
Pratama R, Ambarsari L, Sumaryada TI. 2016.
Molecular interaction analysis of COX- 2  against  curcuminoid  and  xanthorizol ligand  as  anti  breast  cancer  using molecular docking. Current
Biochemistry . 2(3): 139-149.
Ramadani F. 2018. Aktivitas antioksidan daun, total  tannin  ekstrak  dan  fraksi  daun sirih  merah  ( Piper  crocatum )  dan identifikasi  dengan  LC-MS  [skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Ramsay  RR,  Tipton  KF.  Assessment  of enzyme  inhibition:  a  review  with examples  from  the  development  of monoamine oxidase and cholinesterase inhibitory  drugs. Molecules .  2017; 22(7): 1-46.
Safithri  M,  Kurniawati  A,  Syaefudin.  2016.
Formula of
Piper crocatum , Cinnamomum  burmanii ,  and Zingiber offcinale extracts  as  a  functional beverage  for  diabetics. International Food  Research  Jounal .  23(3):1123- 1130.
Safithri  M,  Yasni  S,  Bintang  M,  Ranti  AS.
2012.  Toxicity  study  of  antidiabetics functional drink of Piper crocatum and Cinnamomum burmannii. HAYATI
Journal  of  Biosciences. 19(1):  31-16. doi: 10.4308/hjb.19.1.31.
Safithri M, Faridah DN, Ramadani F, Pratama R.  2022.  Antioxidant  activity  of ethanol  extract  and  fractions  of  Piper crocatum  with  Rancimat  and  cuprac
methods. Turk J Biochem 1-7.
https://doi.org/10.1515/tjb-2021-0300
Syahputra  G,  Ambarsari  L,  Sumaryada  T. 2014.  Simulasi  Docking  Senyawa Kurkumin  dan  Analognya  Sebagai
Inhibitor Enzim 12-Lipoksigenase.
Jurnal Biofisika . 10(1) : 55-67.
Tambunan, USF, Alamudi, S. 2010. Designing cyclic peptide inhibitor of dengue virus NS3-NS2B protease
by using molecular docking approach.
Bioinformation . 5(6):250-254.