ISSN: 2085-3653
http://jurnal.unimed.ac.id/2012/index.php/jpk
Potensi Ekstrak Etanol Daun Lidah Buaya ( Aloe vera L.) Sebagai Antifertilitas Melalui Tampilan Imunohistokimia Caspase 3 Aktif Pada Testis Serta Penilaian Kuantitas dan Kualitas Spermatozoa Mencit ( Mus musculus L . )
Maria Lestari 1* ; M. Pandapotan Nasution 2 dan Sry Suryani 1
1 Bagian Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatera Utara 2 Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara * Korespondensi: sevenandmia@gmail.com/maria_cyutoo@yahoo.com
Abstract. Control of male fertility is one of the  goverment efforts to reduce the number of population. Several  researches  have  been  done  to  make  a  male  contraceptive,  one  of  them  is  using  herb  to  effect male reproductive system. Aloe vera (Aloe vera L.) has been widely cultivated by the people and used as materials  for  food  and  drugs.  One  of  the  benefits  of  this  plant  is  it’s  potential  antifertility.  For  this research aims to test the antifertility potential of ethanol extract in Aloe vera (Aloe vera L.) leaf. in male mice  (Mus  musculus  L.)  DDW  (Double  Ditch  Webster)  strain.  This  is  an    experimental  research  with complete  randomization.  Extract  administered  orally  once  a  day  for  four  weeks  to  of  24  male  mice which  divided  into  four  groups:  control  group  (0.5  ml/kgBW  Aqudest),  treatment  group  dosage 5mg/kgBW,  10mg/kgBW,  15mg/kgBW  extract.  We  observed  the  expression  of  active  caspase-3 microscopically  through  immunohistochemical  appearance,  quantity  (number  of  spermatozoa)  and quality  (viability  of  sperm,  sperm  morphology  and  motility).  The  results  were  statistically  analyzed using  one-way  ANOVA  followed  by  multiple  comparison  (post  hoc  -  Bonferroni  test).  The  results showed  between  ethanol  extract  of  Aloe  vera  leaf  with  the  first  dosage  (5mg/kgBW),  second  dosage (10mg/kgBW) and the third dosage (15mg/kgBW) a significant reduction of the quantity and quality of spermatozoa  (p  <0.05).  on  the  other  hand  activity  of  caspase  3  expression  active  has  increased significantly  (p<0.05)  in  spermatogonial  cells  of  seminiferous  tubules  during  the  administration  of ethanol  extract  of  Aloe  vera  (Aloe  vera  L.)  leaf.  This  shows  an  increase  in  the  incidence  of  apoptosis during  spermatogenesis.  From  these  results  it  can  be  concluded  that  the  ethanol  extract  of  Aloe  vera leaf  has  potency  to  be  an  antifertility  drug  that  can  later  be  developed  for  the  manufacture  of  male contraception.
Keywords: aloe vera extract, caspase-3, spermatozoa, quantity, quality

## PENDAHULUAN
Indonesia  merupakan  salah  satu  negara yang mengalami peningkatan jumlah penduduk  yang  cukup  pesat.  Berdasarkan hasil  sensus  tahun  2010  bahwa  jumlah penduduk  Indonesia  sebanyak  237.641.326 jiwa.  Dalam  periode  sepuluh  tahun  terakhir jumlah  penduduk  Indonesia  meningkat dengan  laju  pertumbuhan  per  tahun  sekitar 1,49  persen  sementara  itu  pada  periode sepuluh  tahun  sebelumnya  (1990-2000)  laju pertumbuhan  penduduk  per  tahun  sekitar 1,44 persen (Badan Pusat Statistik, 2013).
Salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi peningkatan  jumlah  penduduk  diatas  adalah penerapan keluarga berencana (KB). Program KB  telah  dikenal  sejak  lama  dengan menggunakan  berbagai  alat  kontrasepsi. Perkembangan  alat  kontrasepsi  selama  ini masih  terfokus  kepada  kaum  perempuan sedangkan  pendekatan  terhadap  konteks
pengendalian fertilitas laki - laki masih sangat kurang. Oleh karena itu banyak peneliti yang memperkenalkan  kontrasepsi  pria  non hormonal yang memiliki mekanisme berbeda dengan hormonal yaitu tanpa mempengaruhi jalur  hipotalamus  hipofisis  -  testis  untuk menghambat
spermatogenesis atau menghambat  motilitas  sperma  (Meriggiola  & Pelusi,  2006).  Kontrasepsi  non  hormonal tersebut  sering  dibuat  dalam  bentuk  pil kontrasepsi  yang  berbahan  dasar  dari berbagai  tanaman  yang  memiliki  potensi sebagai antifertilitas.
Indonesia  kaya  akan  tanaman  obat  yang baru sebagian kecil dimanfaatkan (Handayani,  2007).  Salah  satu  tumbuhan tradisional  yang  juga  banyak  dibudidayakan khususnya  di  Indonesia  yang  memiliki potensi sebagai antifertilitas adalah tumbuhan  Lidah  buaya  ( Aloe  vera )  (Sharma et  al .,  2013;  Phokharkar et  al .,  2010). Tumbuhan  Obat  Lidah  buaya (Aloe  vera)
dikenal  sebagai  tumbuhan  yang  memiliki banyak  khasiat.  Tumbuhan  ini  tergolong  ke dalam suku Liliaceae . Daun  lidah  buaya  mengandung  tanin, saponin dan flavonoid yang diduga mempengaruhi  proses  spermatogenesis  dan maturasi  sperma.  Dengan  adanya  tanin, saponin dan flavonoid maka diharapkan daun lidah  buaya  ini  mampu  berperan  sebagai salah  satu  alternatif  dalam  kontrasepsi  pria (Hidayat,  2009).  Oyeopo et  al .  (2011)  dalam hasil  penelitiannya  menyampaikan  bahwa pemberian  ekstrak  air  gel  Lidah  buaya  pada tikus  menurunkan  secara  signifikan  jumlah spermatozoa  dan    motilitasnya.  Selain  itu dilaporkan  juga  adanya  penurunan  berat testis setelah pemberian ekstrak air gel Lidah buaya.  Penelitian  Gupta et  al .  (2013) menyampaikan bahwa kandungan polisakarida  yang  terdapat  pada  daun  Lidah buaya memiliki potensi sebagai imunostimulan  yang  dapat  dijadikan  sebagai agen  antifertilitas  pada    sekelompok  tikus betina.  Hal  ini  dibuktikan  pada  kelompok tikus  betina  yang  diberikan  polisakarida  dari ekstrak daun Lidah buaya sebesar 4mg/kgBB memperlihatkan  tidak  adanya    implant  yang terbentuk pada saluran rahim. Sementara itu penelitian  tingkat  molekuler  menyebutkan bahwa infertilitas pria dilaporkan berhubungan  dengan  gangguan  pada  DNA mitokondria (mtDNA) dan apoptosis (Darmawan, 2007).
Selama  spermatogenesis  kematian  sel secara  terprogram  (apoptosis)  memainkan peran  penting  untuk  menghilangkan  sel  -  sel germinal  yang  cacat  atau  yang  membawa mutan  DNA.  Pada  proses  fisiologi  ini  dapat terjadi  disregulasi  sehingga  apoptosis  sel germinal dapat menyebabkan infertilitas pria. Apoptosis  sel  germinal  juga  biasa  dihasilkan dari  gangguan  eksternal  seperti  perubahan hormonal atau paparan bahan kimia beracun atau  radiasi  yang  dapat  menyebabkan penurunan  jumlah  sperma  (Hadi,  2011).  Zha et al . (2008) dalam penelitiannya menyampaikan bahwa obat antifertilitas pada pria  melalui  kontrasepsi  dapat  menekan proses  spermatogenesis.  Mekanisme  ini  juga berkorelasi  dengan  proses  apoptosis  sel  -  sel spermatogonia.  Sampai  saat  ini  caspase  3 (bentuk  aktif  dari  procaspase3)  merupakan jenis caspase mamalia yang paling dimengerti spesifisitas dan perannya pada apoptosis (Fan et  al .,  2005).  Pada  sel  yang  mengalami apoptosis  caspase  3  merupakan  eksekutor utama yang dapat diaktivasi oleh kedua jalur
baik  itu  jalur  ekstrinsik  maupun  intrinsik. Untuk  mendeteksi  dan  menilai  aktivitas apoptosis  pada  jaringan  caspase  3  jauh  lebih baik.  Hal  ini  didasari  melalui  metode pewarnaan  imunohistokimia  yang  mudah, sensitif,  dan  dapat  diandalkan  sehingga direkomendasikan  untuk  digunakan  pada deteksi  dan  penilaian  apoptosis  jaringan (Nurfaziyah et al ., 2011). Pencapaian keadaan apoptosis  diatas  merupakan  indikator  suatu pemberian  obat  antifertilitas  baik  modern maupun  tradisional  khususnya  pada  pria. Mengingat  resiko  dari  penggunaan  obat antifertilitas konvensional yang cukup membahayakan maka peneliti ingin menggunakan    yang  berbahan  dasar  dari salah  satu  jenis  tumbuhan  yang  terdapat dalam  jumlah  banyak  di  alam  serta pemanfaatannya yang cukup banyak terutama dalam bidang kesehatan.

## METODE
Penelitian  ini  merupakan  penelitian eksperimental  yang  didesain  mengikuti Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL).  Penelitian ini  terdiri dari  4  kelompok  perlakuan.  Setiap kelompok  terdiri  dari  6  ulangan  (n=6). Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Farmasi    Universitas  Sumatera  Utara  Medan dan  Laboratorium  Patologi  Anatomi  Rumah Sakit  Murni  Teguh  Medan.  Populasi  yang diigunakan  dalam  penelitian  ini  adalah mencit  ( Mus  musculus L.)  Strain  DDW ( Double Distch Webster ) yang  diperoleh dari animal house Fakultas Farmasi. Besar sampel yang  digunakan  dalam  penelitian  ini ditentukan  berdasarkan  rumus  Federer (Wahyuni, 2010) 14 dimana {(t-1) (n-1)}≥ 15. Kriteria  inklusi: Mus  musculus L.Strain DDW (Double Distch Webster) , jenis kelamin jantan,  sehat  dan  aktif,  umur  ±  12  minggu, mempunyai berat badan berkisar 25-30 g dan belum  pernah  digunakan  untuk  penelitian. Kriteria  eksklusi: mencit  dalam  keadaan sakit, bergerak  tidak  aktif  dan berat  badan  < 25g dan > 30 g. Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Lidah buaya yang  telah  diidentifikasi  di  Pusat  Penelitian Botani  Biologi  LIPI  Bogor.  Parameter  yang diamati  meliputi  ekspresi  caspase  3  aktif melalui  tampilan  imunohistokimia,  kuantitas (jumlah  spermatozoa)  kualitas  (viabilitas spermatozoa,  morfologi  spermatozoa  dan motilitas  spermatozoa)  yang  diamati  secara mikroskopik.  Hasil  pengamatan  selanjutnya dianalisis  secara  statistik  menggunakan  uji
ANOVA  satu  arah  dan  dilanjutkan  dengan multiple  comparison  (pos  hoc  -  bonferroni test).

## Diagram alir penelitian

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

## Profil data hasil perlakuan
Tabel 1 . Gambaran jumlah spermatozoa P3 (15mg/kgBB)
Kelompok Perlakuan n (Ulangan) Jumlah Spermatozoa (x±SD) P0 6 93.64 ±6.71 P1 6 30.11 ± 9.06 P2 6 31.28 ± 14.63 P3 6 24.67 ± 5.25
Gambar 1. Profil kelompok kontrol dan perlakuan
Tabel 2. Viabilitas  spermatozoa mencit ( Mus musculus L.) (%) Kelompok Perlakuan n (Ulangan) Viabilitas Spermatozoa (%±SD) P0 6 93.47 ±0.97 P1 6 43.22 ± 5.84 P2 6 40.78 ± 14.63 P3 6 32.48 ± 5.25

## Gambar 2. Profil viabilitas spermatozoa
Tabel 3. Morfologi  normal spermatozoa mencit ( Mus musculus L.) (%) Kelompok Perlakuan  n (Ulangan) Morfologi  Spermatozoa (%±SD) P0 6 93.42 ±0.91 P1 6 35.19± 9.22 P2 6 41.64± 6.60 P3 6 41.72± 27.80
Gambar 3. Profil morfologi normal kelompok kontrol dan  kelompok perlakuan
Tabel 4. motilitas spermatozoa mencit ( Mus musculus L.) (%) Kelompok Perlakuan n (Ulangan) Grade a Grade b Grade c Grade d P0 6 75.42±2.67 11.47±2.66 5.00±4.42 11.53±2.32 P1 6 10.14±1.23 32.03±9.30 22.50±3.18 21.94±6.07 P2 6 5.56±1.72 16.44±3.06 28.33±6.33 26.25±5.16 P3 6 8.33±1.83 39.78±4.58 44.17±4.61 40.28±3.06
b
Tabel 5. Aktivitas anti active caspase-3 antibody (%) Kelompok Perlakuan n (Ulangan) Ekpresi anti active caspase-3 antibody (%±SD) P0 6’ 6.75 ± 1.95 P1 6 7.13 ± 1.79 P2 6 8.71 ± 1.34 P3 6 8.42 ± 0.56
Gambar 5. Profil aktivitas anti active caspase-3 antibody kelompok kontrol dan perlakuan
Gambar 6. Hasil pengamatan jumlah spermatozoa
Gambar 7. Hasil pengamatan viabilitas spermatozoa
Gambar 8. Hasil pengamatan morfologi spermatozoa
Tampilan kuat pada kontrol positif anti active caspase-3 (perbesaran 400x)
Tampilan sedang pada kontrol positif anti active caspase-3 (perbesaran 400x)
B C A
Tampilan lemah pada kontrol positif anti active caspase-3 (perbesaran 400x)
Tampilan pada kontrol negatif (perbesaran 400x )
Tampilan positif kuat pada kelompok perlakuan (perbesaran 400x)
Tampilan positif sedang  pada kelompok perlakuan (perbesaran 400x)

## Tampilan positif lemah  pada kelompok perlakuan (perbesaran 400x)
Tampilan positif lemah  pada kelompok perlakuan (perbesaran 400x)
Gambar 9. Hasil pulasan imunohistokimia dengan anti active caspase-3 antibody

## PEMBAHASAN
Adanya  penurunan  konsentrasi  sperma kemungkinan karena terjadinya penghambatan pada spermatogenesis khususnya  pada  tahap  spermiogenesis  yaitu pada saat transformasi morfologik spermatid yang berdifferensiasi sepenuhnya membentuk spermatozoa.  Penghambatan  tersebut  dapat berupa  penghambatan  oleh  suplai  senyawa kimia  yang  berlebih  sehingga  menimbulkan toksisitas  yang  cukup  tinggi.  Demikian  pula Ogbuewu et  al .  (2011)  melaporkan  bahwa efek  spermisida  dari  tanaman  merupakan hasil  dari  kandungan  senyawa  fitokima.  Hal ini  didukung  juga  oleh  Hossain et  al .  (2013) yang  menyatakan  bahwa  bagian  daun  dari tanaman Aloe  vera L.  memiliki  pengaruh terhadap kondisi kesuburan pada tikus jantan dengan pemberian dosis 70-100mg/kgBB.
Pada  dasarnya  proses  spermatogenesis terjadi  di  tubulus  seminiferus  testis.  Dimana didalamnya
terdapat sel-sel induk spermatozoa atau spermatogonium, sel sertoli
yang  berfungsi  memberi  makan  spermatozoa juga  sel  leydig  yang  terdapat  pada  jaringan interstitial  yang  berfungsi  menghasilkan testosteron.  Adanya  gangguan  pada  organ reproduksi  ini  akibat  zat  kimia  tersebut secara  tidak  langsung  akan  mempengaruhi proses spermatogenesis (Guyton & Hall, 2001 dalam Heryani et al ., 2011). Zha et al . (2008) menyatakan  bahwa  mekanisme  kerja  obat antifertilitas  pada  jantan  berkaitan  dengan apoptosis  sel-sel  spermatogenik.  Selain  itu penurunan  jumlah  spermatid  akhir  dapat pula  disebabkan  oleh  penurunan  kadar testosteron.  Sewanirusike  &  Gundidza  (2011) melaporkan bahwa penurunan spermatogenesis berkaitan dengan kekurangan testosteron.
Susetyarini  (2009)  dalam  penelitiannya menyampaikan  bahwa  salah  satu  kandungan senyawa  fitokimia  seperti  flavonoid  dapat menghambat  kerja  enzim  aromatase  yang merupakan  enzim  yang  dapat  mengkatalis konversi  androgen  menjadi  estrogen  yang akan meningkatkan hormon testosteron yang
penting  untuk  meningkatkan  daya  hidup spermatozoa.  Sementara  itu  immobilitas sperma  yang  disebabkan  oleh  kandungan senyawa  pada  tanaman  dapat  berupa kematian sel (Lohiya et al ., 2000), kerusakan sel  membran  (Chakrabarti et  al .,  2003), penurunan  ATP  dan  kerusakan  kromatin (Hikim et  al .,  2000).  Hasil  penelitian  ini menunjukkan  kemungkinan  adanya  efek spermisid  dari  ekstrak  yang  berasal  dari kandungan  triterpen  dan  saponin  yang merusak sperma.
Spermatozoa tidak dapat hidup lebih dari 1-2  jam  tanpa  ada  glikolisis  yang  aktif. Metabolisme  spermatozoa  erat  hubungannya dengan  ATP  (Adenosin  Tri  Phospat)  karena energi yang terkandung dalam bahan tersebut dibutuhkan untuk motilitas dan mempertahankan  keseimbangan  osmotik. Seiring dengan hal tersebut perombakan ATP di  dalam  selubung  mitokondria  yang  berada pada bagian tengah ekor spermatozoa melalui reaksi penguraian menjadi Adenosin Diphospat (ADP) dan Adenosin Monophospat AMP) dimana jika ATP dan ADP habis maka spermatozoa  akan  berhenti  bergerak.  Selain itu  plasma  semen  yang  terganggu  akibat senyawa  kimia  juga  mempengaruhi  motilitas spermatozoa  tersebut.  Hal  ini  dikarenakan plasma  semen  merupakan  sarana  untuk berenang  sekaligus  sebagai  sumber  energi bagi  spermatozoa,  yang  dapat  dimanfaatkan untuk bergerak aktif (motil) (Hafez, 2000).
Apoptosis  atau  program  kematian  sel merupakan  proses  normal  yang  terjadi  pada proses spermatogenesis mamalia yang bertujuan  untuk  menjaga  homeostatis  dan mempertahankan  keseimbangan  antara  sel- sel  germinal  dan  sel  sertoli.  Komponen  yang menjadi  pusat  berjalannya  proses  apoptosis tersebut  melibatkan  kelompok  caspase  atau kelompok  enzim  protease  sistein  yang berperan  penting  dalam  mengatur  dan mengeksekusi  kematian  sel  secara  apoptosis (Reed, 2000). 24 Infertilitas pria menunjukkan korelasi  positif  dengan  jumlah  sperma  yang mengalami  apoptosis  (Wang et  al .,  2003). Kemungkinan  peningkatan  jumlah  apoptosis karena terikutnya sperma yang belum matang ketika ejakulasi (Cayli et al., 2004). Apoptosis  dan  kerusakan  DNA  dapat mencegah  proses  pemas  akan  sperma.
Akibatnya pasien mungkin menjadi azoospermia sebagai akibat dari ketidakseimbangan  dalam  jalur  ini  (Agarwal dan Said, 2005). Albadri et al ., (2013) dalam penelitiannya  menyampaikan  bahwa  mencit
yang  diberikan  perlakuan  alkohol  3g/kgBB secara  signifikan  mengalami  penurunan  baik dalam  jumlah  dan  motilitas  spermatozoanya dimana  akibat  dari  penurunan  ini  akan menyebabkan infertilitas.

## KESIMPULAN
Pemberian  ekstrak  etanol  daun  Lidah buaya  ( Aloe  vera )  dapat  menurunkan kuantitas  (Jumlah  Spermatozoa  mencit)  dan kualitas  (viabilitas,  morfologi,  motilitas) spermatozoa  mencit.  Hal  ini  diikuti  juga dengan adanya peningkatan  aktivitas caspase 3 aktif.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan  ucapan  terimakasih  kepada Dr. Pandapotan Nasution, MPS, Apt., dr. Sry Suryani,  M.  Kes,  dr.  M.Rusdah  SpOG  (K),
M.Ked,  dan  dr.  Feby  Yanti  Harahap,  M.Ked (PA).,  SpPA    yang  telah  banyak  memberikan bimbingan selama penelitian hingga penyelesaian penulisan artikel ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Badan Pusat Statistik. 2013. Laporan Bulanan Data Sosial Ekonomi. Edisi ke-43 Meriggiola, M. C. & Pelusi, G. 2006. Advances in  male  hormonal  contraception. Expert Opin Investig Drug , 15 ( 4 ):389-97 Handayani, L. 2007. Pil Kontrasepsi Laki-laki dengan Bahan Dasar Gandarusa ( Justicia  gendarussa  Burm . F). Maj Kedok Indon , 5 ( 7 ):281 Sharma, P., Sharma, S., Agarwal, M. & Joschi, S,C.  2013.  A  review  on  antifertility efficacy of plants in males. International Journal  of  Pharma  and  Bio  Sciences , 4 ( 4 ):413-428 Pokharkar,  R.D.,  Saraswat,  R.K.  &  Kotkar, S. 2010. Survey of plants having antifertility activity  from  western  ghat  area  of Maharashtra  state. Journal  of  Herbal Medicine and Toxicology , 4 ( 2 ):71-75 Hidayat,  L.  2009.  Efek  Pemberian  infusa daun  lidah  buaya  ( Aloe  vera )  terhadap jumlah spermatozoa mencit ( Mus musculus ). Penelitian kesehatan seri, 26 Oyeopo,  A,O.,  Oremosu,  A,  A.,  Akang,  E,  N., Noronha, C.C. & Okanlawon, A, O. 2011. Effects  of  Aloe  vera  (Aloe    barbadensis) aquaeous  leaf  extract  on  testicular weight, sperm count and motility of adult
male  Sprague-dawley  rats. Journal  of American Science , 7 ( 4 ):31-33
Gupta,  E.,  Pereira,  L.  Dugar,  F.  &  Rajesh,  L. 2013.  Polysaccharides  From  Aloe  Leaf Mucilage  As  Potential  Immunological- Based Anti-Fertility Agents. International  Pharmauceutical  Sience And Research , 4 ( 1 ):440-444
Darmawan, H. 2007. Production of ROS and its  effects  on  mitochondrial  and  nuclear DNA,  human  spermatozoa,  and  sperm function. Med J Indones , 16 ( 2 ):132-133
Hadi,  P.  2011.  Apoptosis  Pada  Sperma Sebagai  Petanda  Adanya  Gangguan Kesuburan. Majalah Kesehatan Pharmamedika , 3 ( 2 ):282-285
Zha, S.W., Sha, J. & Huang, Y.F. 2008. Male antifertility drugs and cell apoptosis. Nat J Andro , 14:75-78 Fan,  T.J.L.  H.,  Han,  R.  S.,  Cong,  J.  &  Liang. 2005.  Caspase  Family  Proteases  an Apoptosis. Acta  Biochim  Biophys  Sin ,
37 ( 11 ):719-727 Nurfaiziyah, A.,  novrial, D. & wijayana, K, A. 2011.  Efek  pemberian  ekstrak  tempe kedelai (glycine max) terhadap ekspresi caspase-3  mencit  galur  C3H  model karsinogenesis  payudara. Mandala  of Health , 5 ( 2 )
Wahyuni,  A.S.  2010.  Statistika  kedokteran disertai  aplikasi  SPSS,  bamboedoea communication. Jakarta Ogbuewu, I.P., Unamba-Oparah, I.C, Odoemenam,  V.U.,  Etuk,  I.F.  &  Okoli, I.C.  2011.  The  potentiality  of  medicinal plants as the source of new contraceptive principles in males. North Am J Med Sci , 3 :255-263
Hossain,  M.S.,  Rashid,  A.N.M.M.O.,  Md,  N.,
Towfique.  &  Sen,  M.K.  2013.  A  review on  ethnopharmacological  potential  of Aloe  vera  L. Journal  of  Intercultural Ethnopharmacology , 2 ( 2 ):113-120
Heryani, L., Susari, N. & Kardena, I.M. 2011.
Paparan  Formalin  Menghambat  Proses Spermatogenesis  pada  Mencit. Jurnal
Veteriner , 12 ( 3 ):214-220
Sewani-Rusike,  C.R.  &  Gundidza,  M.  2011.
Antifertility effects of oldenlandia affinis in  male  rats-a  preliminary  study .  Afr  J Tradit Compl Altern Med , 8 :425-428
Susetyarini,  R.,  E.  2009.  Efek  senyawa  aktif daun beluntas terhadap kadar testoteronTikus putih (ratus norwegicus)  jantan. GAMMA , 5 ( 1 ):  21- 27 Lohiya,  N.K.,  Kothari,  L.K.,  Manivannan,  B., Mishra, P.K. & Pathak, N. 2000. Human sperm  immobilization  effect  of  Carica papaya  seed  extracts:  an  in  vitro  study.
Asian J Androl , 2 :103-109 Chakrabarti, K., Pal, S. & Bhattacharyya, A.K. 2003.  Sperm  immobilization  activity  of Allium  sativum  L.  and  other  plant extracts. Asian J Androl , 5 :131-135 Hikim,  A.P.,  Lue,  Y.H.,  Wang,  C.,  Reutrakul, V.,  Sangsuwan,  R.  &  Swerdloff,  R.S. 2000.  Posttesticular  antifertility  action of triptolide in the male rat: evidence for severe  impairment  of  cauda  epididymal sperm  ultrastructure. J  Androl , 21 :431- 437 Hafez, B. & E.S.E. Hafez. 2000. Reproduction in Farm Animal 7th Edition . Lippincott William &Wilkins: Baltimore, USA
Reed  J.,  C.  2000.  Mechanisms  of  apoptosis. Am J Pathol , 157 :1415-1430
Wang, X., Sharma, R.K., Sikka, S.C., Thomas, A.J.,  Falcone,  T.  &  Agarwal,  A.  2003. Oxidative  stress  is  associated  with increased apoptosis leading to spermatozoa  DNA  damage  in  patiens with male factor infertility. Fertil Steril , 80 :531-535 Cayli,  S.,  Sakkas,  D.,  Vigue,  L.,  Demir,  R.  & Huszar,  G.  2004.  Celluler  maturity  and apoptosis  in  human  sperm:  creatine kinase,  caspase  3  and  Bcl-XL  levels  in mature and diminished maturity sperm.
Mol Hum Reprod , 10 : 365-372 Agarwal,  A.,  Prabakaran,  S.  &  Said,  T.  2005.
Prevention  of  oxidative  stress  injury  to sperm. J Androl, 26 :654-60 Albadri, C.T., Al, A.I.M. & Hiba, H.M.A. 2013.
Alcohol    consumption  and  its  effect  on testiscular  structure  and  on  sperma count  and  motility  in  parent  mice  and their  offsprings. IMJM              (The International Medical Journal Malaysia) , 12 ( 1 ): 45-46