## TRANSGLIKOSILASI ENZIMATIK SENYAWA ANTIOKSIDAN PINOCEMBRIN MENGGUNAKAN SELULASE TRICHODERMA RESEEI UNTUK PENINGKATAN BIOAVAILABILITASNYA
Nova Rianti Putri, Harni Sepriani, Hilwan Yuda Teruna, Titania Tjandrawati Nugroho
Pascasarjana Kimia, FMIPA, Universitas Riau, Pekanbaru 28293. Alamat koresponden: r.putrinova@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Flavonoid  merupakan  senyawa  polifenol  yang  paling  banyak  terdapat  di  alam.  Senyawa  ini  umumnya  ditemukan dalam  bentuk  tidak  terikat  dengan  gula  (flavonoid  aglikon).  Salah  satu  contohnya  adalah  flavonoid  aglikon pinocembrin.  Flavonoid  aglikon  pinocembrin  merupakan  senyawa  antioksidan,  dan  terbukti  memiliki  sifat  anti- angiogenesis,  anti-inflamasi  dan  anti-tumor.  Senyawa  ini  belum  digunakan  dalam  jumlah  banyak  dikarenakan kelarutannya dalam air rendah, tidak stabil terhadap pengaruh cahaya, mudah teroksidasi, dan penyerapan di dalam usus  rendah,  serta  memiliki  rasa  pahit.  Sifat  bioavailabilitas  flavonoid  aglikon  ini  dapat  ditingkatkan  dengan melakukan  reaksi  transglikosilasi.  Transglikosilasi  merupakan  reaksi  pemindahan  unit  gula  ke  akseptor  yang memiliki gugus  -OH. Flavonoid aglikon pinocembrin  dapat bersifat stabil dan  kelarutannya dalam air    meningkat apabila  diubah  menjadi  bentuk  glikosida  sebagai  flavonoid  glikosida  melalui  reaksi  transglikosilasi  secara enzimatik.  Dalam  penelitian  ini  transglikosilasi  enzimatik  pinocembrin  dilakukan  menggunakan  bantuan  enzim selulase Trichoderma reseei . Reaksi transglikosilasi dilakukan selama 30 jam pada suhu 40 o C, menggunakan buffer asetat 0,05M pH 5, dan kecepatan pengocokan 170 rpm. Substrat carboxymethylcellulose (CMC) digunakan sebagai donor  glikosil.  Flavonoid  glikosida  hasil  reaksi  transglikosilasi  dianalisis  menggunakan High Performance  Liquid Chromatography (HPLC).  Hasil  analisis  HPLC  menunjukkan  enzim T.  Reseei mampu  melakukan  reaksi transglikosilasi  terhadap  pinocembrin  yang  dapat  dilihat  dari  adanya  perubahan  nilai  waktu  retensi  dari  produk transglikosilasi dibandingkan sebelum reaksi.
Kata kunci : antioksidan, pinocembrin, selulase, transglikosilasi, Trichoderma reseei

## 1. PENDAHULUAN
Flavonoid  merupakan  senyawa  polifenol yang  banyak  terdapat  di  alam  dan  digunakan sebagai  obat  tradisional  (Wang, et  al .,  2010,
Winarsih,  2007).  Flavonoid  dapat  ditemukan pada  jenis  tanaman,  buah,  dan  sayur-sayuran (Wang et  al .,  2010).  Konsentrasi  paling  tinggi dari  flavonoid  terdapat  pada  bagian  daun  dan kulit kupasannya (Winarsih, 2007). Senyawa ini umumnya  ditemukan  dalam  bentuk  tidak  terikat dengan  gula  (flavonoid  aglikon).  Salah  satu contohnya adalah flavonoid aglikon
pinocembrin.  Flavonoid  aglikon  pinocembrin merupakan  senyawa  antioksidan,  dan  terbukti memiliki  sifat  anti-angiogenesis,  anti-inflamasi dan anti-tumor (Soeka et al ., 2007, Vila-Real et al ., 2011). Senyawa ini belum digunakan dalam jumlah  banyak  dikarenakan  kelarutannya  dalam air  rendah,  tidak  stabil  terhadap  pengaruh cahaya,  mudah  teroksidasi,  dan  penyerapan  di dalam  usus  rendah,  serta  memiliki  rasa  pahit. Apabila  teroksidasi,  struktur  senyawa  ini  akan berubah dan fungsinya sebagai bahan aktif akan berkurang  bahkan  hilang  (Soeka et  al .,  2007).
O
O OH HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6'
Gambar 1. Pinocembrin (Lindstedt, et al ., 1951)
Sifat  bioavailabilitas  (kemudahan  pelarutan dalam  senyawa  polar  dan  diserap  usus) flavonoid aglikon  ini  dapat  ditingkatkan  dengan melakukan reaksi transglikosilasi.
Transglikosilasi  merupakan  reaksi  pemindahan unit gula ke akseptor yang memiliki gugus -OH. Flavonoid berbagai aglikon, termasuk pinocembrin, dapat bersifat stabil dan kelarutannya  dalam  air  meningkat  apabila diubah  menjadi  bentuk  glikosida  sebagai flavonoid glikosida melalui reaksi transglikosilasi secara enzimatik (Noguchi et al., 2008).
Menurut  Chen et  al .,  (2011), Penicillium decumbens dan Trichoderma  reesei memiliki aktivitas  transglikosilasi.  Hal  ini  ditunjukkan oleh  hasil  reaksi  transglikosilasi  yang  memiliki kepolaran  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan flavonoid  aglikon  awal  pada  flavonoid  dari tanaman  Ginkgo  Biloba.  Oleh  Chen et  al .,
(2011) reaksi transglikosilasi enzimatik flavonoid  Ginkgo  Biloba  ditunjukkan  sangat bergantung  pada  sumber  selulase,  donor, akseptor,  dan  kondisi  reaksi  (pH,  suhu,  dan pelarut yang digunakan). Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kemampuan selulase Trichoderma  reesei untuk  mentrasglikosilasi flavonoid  aglikon  pinocembrin,  menjadi  suatu flavonoid glikon.

## 2. METODOLOGI PENELITIAN

## Bahan dan peralatan
Bahan  yang  digunakan  adalah  pinocembrin isolat    kulit  batang Goniothalamus  ridleyi ), selulase Trichoderma  reesei keluaran  SIGMA- Aldrich (Cat. No. C8546), CMC ( carboxymethyl cellulose )  keluaran  BDH  Chemical  Ltd.  Poole England  (Cat.  No.  279290,  dan  reagen  analisis lainnya pro-analisis, sesuai cara kerja.
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah autoklaf Electric Model No.25x (Winconsin  Aluminium  Foundry  Co.  Inc., Monitowoc),  spektrofotometer  UV-Vis  Thermo Scientific  Genesys  10S ,  shaking  incubator model LSI 3016R (Daihan Lab Tech Co..LTD) , mikrosentrifuga  berpendingin  Hitachi  CT15RE, vortex  mixer H-VM-300,  tabung  mikro,  HPLC
Shimadzu seri UFLC sistem dengan kolom Shim Pack C18 berukuran 150 mm x 4,6 mm.
Penentuan aktivitas enzim selulase Analisis  aktivitas  enzim  menggunakan substrat CMC ( Carboxymethyl Cellulose) . Tabung  uji  diisi  dengan  500  µL  substrat  CMC 2%  dan  diinkubasi  selama  5  menit  dalam waterbath pada temperatur 40 o C. Tanpa mengeluarkan  tabung  dari waterbath ,  500  µL larutan  enzim  dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi  dan  diaduk  perlahan.  Larutan  diinkubasi selama  30  menit  dalam waterbath .  Tabung dikeluarkan dari waterbath, lalu tambahkan 500 µL reagen Nelson-Somogyi. Tabung dipanaskan dalam  penangas  air  selama  20  menit  dengan mulut tabung ditutup menggunakan kelereng.
Tabung  kontrol  dibiarkan  kosong  dan diinkubasi  selama  5  menit  dalam waterbath temperatur  40 o C.  Lalu  ditambahkan  500  µL enzim tanpa mengeluarkan tabung dari waterbath, diaduk perlahan dan larutan diinkubasi  selama  30  menit  dalam waterbath temperatur  40 o C.  Tabung  dikeluarkan  dari waterbath, lalu  ditambahkan  500  µL  reagen Nelson-Somogyi dan 500 µL substrat CMC 2%. Tabung  dipanaskan  dalam  penangas  air  selama 20  menit  dengan  mulut  tabung  ditutup menggunakan kelereng.
Tabung  blanko  diisi  dengan  2  mL  larutan buffer asetat 0,05 M pH 5,5 dan ditambahkan 1 mL  reagen  Nelson-Somogyi  lalu  dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Tabung uji, kontrol  dan  blanko  didinginkan  hingga  suhu kamar  (boleh  dalam  air  dingin  di  beaker  gelas selama  5  menit).  Setelah  didinginkan,  pada tabung  blanko  ditambahkan  1  mL  reagen arsenomolibdat.  Untuk  tabung  uji  dan  kontrol, reagen arsenomolibdat yang ditambahkan sebanyak  500  µL . Semua  tabung  tersebut diinkubasi  selama  5  menit. Setelah  diinkubasi selama 5 menit, pada tabung blanko ditambahkan  6  mL  aquades,  sedangkan  pada tabung  uji  dan  kontrol  ditambahkan  aquades sebanyak  3  mL. Kemudian  tabung  tersebut (blanko,  uji,  dan  kontrol)  dihomogenkan menggunakan vortex hingga tercampur sempurna  dan  diinkubasi  selama  30  menit. Pengukuran  absorbansi  dilakukan  menggunakan
spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  540 nm.
Reaksi  transglikosilasi  flavonoid  aglikon oleh T. reseei
Reaksi  transglikosilasi  sampel  dilakukan dengan  menginkubasi  enzim  selulase  komersial T.  reseei ,  dengan  pinocembrin  dan  donor glikosil  CMC  selama  30  jam  mengikuti  metode yang  diuraikan  oleh  Chen et  al. (2011),  dengan kondisi  reaksi  pelarut  buffer-etanol  40%, temperatur  inkubasi  40 o C  dan  kecepatan  170 rpm  selama  30  jam.  Setelah  30  jam  waktu inkubasi reaksi dihentikan dengan TCA  hingga konsentrasi  akhir  1%  dan  larutan  divorteks selama  30  detik.  Setelah  itu  larutan  diinkubasi selama  10  menit  pada  suhu  ruang.  Larutan disentrifugasi  selama  10  menit  menggunakan mikrosentrifuga  dengan  kecepatan  13.000  rpm untuk  mengendapkan  protein.  Filtrat  yang diperoleh  didekantasi  ke  dalam  tabung  mikro yang  bersih.  Filtrat  tersebut  disimpan  di  lemari es  dan  dapat  digunakan  untuk  analisis  lanjutan. Sebagai  kontrol,  reaksi  yang  sama  dilakukan, dengan  menginkubasi  CMC  dan  pinocembrin pada  kondisi  reaksi  yang  sama  tanpa  enzim. Setelah  penambahan  TCA  hingga  konsentrasi akhir 1%, pada tabung kontrol baru ditambahkan enzim. Perlakuan selanjutnya adalah sama antara kontrol dan sampel.
Analisis High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Analisis menggunakan HPLC Shimadzu seri UFLC system dengan  Kolom  Shim  Pack  C18 berukuran 150 mm x 4,6 mm (Shimadzu, Kyoto, Japan).  Metode  yang    digunakan  adalah  HPLC fase  terbalik  dengan    gradien    fasa  gerak  air- asetonitril  (gradien  elusi)  selama  15  menit  dan kecepatan  alir  1  mL/menit.  Detektor  sinar  UV digunakan pada panjang gelombang 207 nm dan 288 nm.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Enzim selulase yang digunakan untuk reaksi transglikosilasi  adalah  enzim  selulase  komersial dari  jamur T.  reseei .  Hasil  uji  aktivitas  enzim selulase T.  reseei yang  digunakan  pada penelitian ini adalah (0,03655±0,0079) U/mL.
Berdasarkan  hasil  transglikosilasi T.  reseei pada  substrat  pinocembrin  yang  dilakukan selama  30 jam,  suhu  40 o C,  CMC  sebagai  donor glikosil, dan kecepatan rotasi 170 rpm, diperoleh perbedaan  waktu  retensi  dari  puncak  pada analisis  menggunakan  HPLC.  Hasil  analisis HPLC,  waktu  retensi  pada  sampel  kontrol  dan uji  adalah  9,558  dan  8,912  menit  ( Gambar  2 dan 3 ).  Adanya  perbedaan  waktu  retensi  antara sampel kontrol dan sampel uji, yaitu 0,646 menit menunjukkan  terjadinya  reaksi  transglikosilasi. Perbedaan  waktu  retensi  ini  membuktikan bahwa  pinocembrin  mampu  menjadi  akseptor pada  reaksi  transglikosilasi,  dan  menjadi senyawa  yang  lebih  polar  setelah  diglikosilasi. Dengan  demikian,  reaksi  transglikosilasi  secara enzimatis  (enzim  selulase T.  reseei )  dapat meningkatkan  bioavabilitas  dari  pinocembrin karena menghasilkan senyawa yang lebih polar.
Pinocembrin  mampu  menjadi  akseptor glikosil  karena  memiliki  hambatan  ruang  yang kecil,  yaitu  hanya  terdapat  gugus  akseptor  –OH pada  posisi  5  dan  7.  Selain  dipengaruhi  oleh hambatan ruang (konformasi), reaksi transglikosilasi  dipengaruhi  oleh  sifat  dari  asam amino  penyusun  enzim  pada  sisi  pengikatan ( binding site ). Sisi pengikatan enzim selulase T. reseei diperkirakan  mengandung  gugus  asam amino  hidrofob.  Hal  ini  dapat  dilihat  bahwa molekul  pinocembrin  yang  kurang  polar  dapat bereaksi membentuk flavonoid aglikon. Menurut penelitian  yang  dilakukan  Kwon et  al. (2002), adanya  pergantian  asam  amino  pada  sisi pengikatan enzim selulase
(CMCase/endoglukanase)  mempengaruhi  reaksi transglikosilasi.
Tidak  semua  jenis  selulase  yang  dapat melakukan  reaksi  transglikosilasi  akseptor. Reaksi  ini  dapat  terjadi  dengan  enzim  selulase yang  memiliki  mekanisme retaining (York  dan Hawkins,  2000,  Dinge  dan  Anton,  2010). Pada reaksi  transglikosilasi  ini,  nukleofil  menyerang intermediet glikosil-enzim pada karbon anomerik yang terjadi karena adanya molekul air atau  molekul  karbohidrat  lainnya  (Kwon et  al ., 2002). Berbagai faktor mempengaruhi
keberhasilan  reaksi  transglikosilasi.  Selain  jenis enzim  selulase,  faktor-faktor  yang  umum
mempengaruhi  reaksi  enzimatis  juga  harus diperhitungkan.  Faktor-faktor  ini  belum  diteliti untuk  transglikosilasi  pinocembrin  oleh  selulase
T.  reesei. Begitu  pula  struktur  pinocembrin glikon  akhir  yang  diperoleh  dari  reaksi transglikosilasi tersebut .
Gambar 2. Kromatogram pinocembrin kontrol
Gambar 3. Kromatogram pinocembrin reaksi transglikosilasi menggunakan selulase T. reseei

## 4. KESIMPULAN DAN SARAN
Dari  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan, dapat  disimpulkan  bahwa  enzim  selulase T. reseei mampu  melakukan  reaksi  transglikosilasi dengan  substrat  pinocembrin,  dan  donor  CMC. Waktu  retensi  pinocembrin  aglikon  adalah 9,558,  dan  pinocembirn  glikon  adalah  8,912 menit.  Perbedaan  waktu  retensi  menunjukkan adanya  reaksi  transglikosilasi  yang  terjadi. Dengan  demikian,  reaksi  transglikosilasi  secara enzimatis  (enzim  selulase T.  reseei )  dapat meningkatkan  bioavabilitas  dari  pinocembrin karena menghasilkan senyawa yang lebih polar.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
Chen, S., Xing, X. H., Huang, J. J. & Xu, M. S. 2011.  Enzyme-assisted  extraction  of flavonoids  from  Ginkgo  biloba  leaves:
improvement effect of flavonol
transglycosylation
catalyzed by
Penicillium  decumbens cellulase. Enzyme Microbial Technology, 48 , 100-5.
Dingee, J. W. & Anton, A. B. 2010. The kinetics
of
p-nitrophenyl- β -d-cellobioside hydrolysis  and  transglycosylation  by
Thermobifida
fusca
Cel5Acd. Carbohydrate  Research, 345 , 2507-
2515.
Kwon,  I.,  Ekino,  K.,  Oka,  T.,  Goto,  M., Furukawa, K. 2002. Effect of amino acid alteration  on  the  transglycosylation reaction  of  endoglucanase  I  from Trichoderma viride HK-75. Biotechnology , 66(1) , 110-116.
Lindstedt,  G.  1951.  Constituent  of  pine heartwood. Acta  Chemia  Scandinavica ,
5, 129-138.
Noguchi,  A.,  Inohara-Ochiai,  M.,  Ishibashi,  N., Fukami,  H.,  Nakayama,  T.,  Nakao,  M. (2008).  A  novel  glucosylation  enzyme:
Molecular  cloning,  expression,  and chaaracteriaztion  of  Trichoderma  viride JCM22452
alpha-amylase and
enzymatic  synthesis  of  some  flavonoid monoglucosides  and  oligoglucosides.  J. Agric. Food Chem. 56: 12016-12024.
Soeka,  Y.  S.,  Naiola,  E.  &  Sulistyo,  J.  2007.
Aktivitas antimikroba flavonoid- glikosida hasil sintesis secara transglikosilasi enzimatik. Berita Biologi , 8(6), 455-464.
Vila-Real,  H.,  Alfaia,  A.  J.,  Bronze,  M.  R., Calado,  A.  R.  &  Ribeiro,  M.  H.  2011. Enzymatic  Synthesis  of  the  Flavone Glucosides,  Prunin  and  Isoquercetin, and  the  Aglycones,  Naringenin  and Quercetin, with Selective  -L-
Rhamnosidase  and  -D-Glucosidase Activities of Naringinase. Enzyme research, 2011,692618.
Wang, A., Zhang, F., Huang, L., Yin, X., Li, H.,
Wang,  Q.,  Zeng,  Z.  &  Xie,  T.  2010. New  progress  in  biocatalysis  and biotransformation of flavonoids. Journal Medicine Plants Research, 4 , 847-856.
Wilcox,  L.J.,  Barradaile,  N.  M.,  Huff,  M.  W. 1999.  Antitherogenic  properties  of naringenin, a citrus flavonoid.
Cardiovascular  Drug  Reviews ,  17,  160- 178.
Winarsih,  H.  2007. Antioksidan  alami  dan radikal bebas . Penerbit Kanisius,
Yogyakarta.
York,  W.S.  Hawkins,  R.  2000.  Preparation  of oligomeric  β-glycosides  from  cellulose and  hemicellulosic  polysaccharides  via the  glycosil  transferase  activity  of  a Trichoderma reesei cellulase.
Glycobiology, 10 (2), 193-201.