## ALCHEMY: JOURNALOF CHEMISTRY

## Artikel Penelitian
POTENSI MADU DAN EKSTRAK AMPAS TEH SEBAGAI PENGHAMBAT TIROSINASE UNTUK BAHAN AKTIF KOSMETIKA PEMUTIH
La Ode Sumarlin 1* , Nur Ernita 2*, Hajar 3
1 Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidatullah Jakarta Ciputat, 15412,
2 Pusat Laboratorium Terpadu Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidatullah Jakarta Ciputat, 15412 3 Program Studi Peternakan Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Sulawesi Tenggara, Kendari, 93121
INFO ARTIKEL ABSTRAK Riwayat Artikel Diterima 11 Januari 2023 Diterima 30 September 2023
Tersedia online 03 Oktober 2023
*Penulis korespondensi: sumarlin@uinjkt.ac.id n ur. rnita@uinjkt.ac.id
Efforts to lighten skin color biochemically through the process of inhibiting melanin formation  can  be  done  by  inhibiting  tyrosinase.  Bleach  acts  as  an  inhibitor  of melanin  production  and  is  known  as  a  competitive  tyrosinase  inhibitor.  In  this research, the potency of teabag and honey dregs will be analyzed singly and in mixed  form.  The  method  used  is  the  anti-tyrosinase  test  using  L-DOPA  as  a substrate. The results of the analysis showed that almost all of the tea extract samples  tested  positive  (Flavonoids,  Alkaloids,  Tannins,  Saponins,  Steroids) except for Quinone and Triterpenoid compounds. Honey for positive samples only saponin compounds, while those for other compounds are negative. Tea extract has the potential to inhibit the tyrosinase enzyme, because it contains flavonoids, tannins and steroids. Tests for the inhibition of the tyrosinase enzyme in honey and tea and their mixtures had an IC value of >1000 μg/ml, so the inhibitory activity was very weak. However, research has shown that teabag and honey dregs have bioactive potential through phytochemical tests. However, its ability as a tyrosinase inhibitor needs to be further studied through a variety of extraction methods and appropriate solvents.

## Keywords: Antityrosinase; Honey; Tea dregs
Upaya pencerahan warna kulit secara biokimiawi melalui proses penghambatan pembentukan  melanin  dapat  dilakukan  dengan  cara  menghambat  tirosinase. Pemutih  bertindak  sebagai  penghambat  produksi  melanin  dan  dikenal  sebagai penghambat tirosinase yang bersifat kompetitif. Pada penelitian akan dianalisis potensi  ampas  teh  celup  dan  madu  secara  tunggal  dan  dalam  bentuk campurannya.  Metode yang digunakan adalah uji anti tyrosinase menggunakan L-DOPA sebagai substrat.  Hasil analisis menunjukkan bahwa sampel ekstrak teh hampir semua senyawa uji positif (Flavonoid, Alkaloid, Tanin, Saponin, Steroid) kecuali  senyawa  Quinon  dan  Triterpenoid.  Madu  untuk  sampel  positif  hanya senyawa saponin, sedang yang untuk senyawa lain negatif. Ekstrak teh berpotensi dalam menghambat enzim tirosinase, karena kandungan senyawa flavonoid, tanin dan steroid.  Pengujian penghambatan enzim tirosinase pada madu dan teh serta campuran keduanya memiliki nilai IC 50 >1000 μg/ml, maka aktivitas daya hambat sangat  lemah.  Namun  demikian  dalam  penelitian  telah  menunjukkan  bahwa ampas  teh  celup  dan  madu  potensi  bioaktif  melalui  uji  fitokimia.  Akan  tetapi kemampuannya sebagai penghambat tirosinase perlu dilakukan lagi kajian melalui berbagai variasi metode ekstraksi dan pelarut yang tepat.
Katakunci: Ampas teh, madu, penghambat tirosinase, pemutih

## 1. Pendahuluan
Indonesia terletak di daerah tropis, terkenal dengan suhu tinggi dan radiasi ultraviolet (UV) pada tingkat tertinggi. Paparan terhadap sinar UV dalam waktu yang cukup lama secara langsung dan lama dapat menyebabkan gangguan pada kulit, misalnya warna kulit yang memudar. Warna kulit yang coklat adalah hasil dari produksi melanin yang berlebihan [1]. Proses penyusunan senyawa melanin (melanogenesis) terjadi dengan bantuan biokatalis, khususnya katalis tirosinase [2].
Dengan  demikian,  keberdaan  melamin  akan  dipercepat  dengan  adanya  tirosinase.  Oleh  karena  itu  upaya  untuk memperlambat  atau  mengurangi  produksi  melanin  dapat  dilakukan melalui  penghambatan tirosinase.    Pada  akhirnya, ketika tirosinase terhambat maka produksi melamin akan berkurang dan pigmentasi coklat pada kulit juga kan berkurang.
Secara  umum,  penghambatan tirosinase  dapat  dilakukan  dengan  bahan  alam  dan  bahan  sintesis.    Penghambat tirosinase yang berbeda ditemukan dalam berbagai termasuk asam hialuronat, arbutin, asam kojat, merkuri dan hidrokuinon. Senyawa ini memiliki daya hambat yang besar, namun berbahaya karena dapat menyebabkan kanker [3]. Dengan demikian upaya untuk menemukan bahan-bahan alami yang aman bagi kesehatan manusia menjadi topik yang menarik untuk bahan penelitian
Madu  merupakan  bahan  alami  yang  manis  dan  harum,  memiliki  manfaat  nutrisi  yang  tinggi  dan  mempengaruhi kesehatan manusia seperti pelindung oksidasi, bakteriostatik, mitigasi, antimikroba, dan menyembuhkan luka [4].  Madu Euphorbia telah diteliti dan memiliki potensi besar sebagai antioksidan, anti-inflamasi dan sumber anti-tirosinase untuk aplikasi farmasi dan kosmetik (Boutoub et al., 2021) dan madu Astragalus menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap enzim AChE, BChE, urease, dan tirosinase [5].
Bahan alam lain sangat potensial dan jumlah banyak adalah ampas teh celup.  Hal ini beralasan karena Indonesia adalah produsen teh terbesar ke-5 di dunia setelah Sri Lanka, Kenya, India dan China, dengan tingkat produksi mencapai 154.598 ton/tahun [6].  Padahal, pada ekstrak daun teh hijau ( Camellia sinensis (L.) Kuntze) terdapat senyawa polifenol yang berpotensi menghambat tirosinase pada konsentrasi 0,5% [7] dan teh kombucha dari buah anggur berpotensi sebagai anti penuaan [8].
Kemampuan madu dan ampas teh sebagai penghambat tirosinase disebabkan oleh komponen utamanya khususnya senyawa flavonoid dan turunannya. Ektrak madu kelengkeng bubuk memiliki antioksidan tertinggi memiliki nilai kandungan total flavonoid tertinggi (0,079±0,001 mg QE/g) [9].  Meziant et al., [10] menyatakan bahwa ekstrak kaya flavonoid dari F. carica dapat dianggap sebagai bahan bioaktif multifungsi untuk digunakan dalam formulasi farmasi diantaranya sebagai pemutih kulit.  Fan et al., [11] juga menemukan bahwa modifikasi struktural flavonoid sebagai penghambat tirosinase yang efektif.
Klasifikasi kemometri dari madu kastanye oleh Kucukaydin et al., [12] menggunakan PCA dan HCA menunjukkan bahwa beberapa senyawa fenolik memberikan kontribusi yang signifikan.  Pemanfaatan ampas teh juga ditunjang oleh keberadaan polifenol, misalnya pada ekstrak etanol ampas teh hijau memiliki kandungan polifenol sebesar 46 % yang setara dengan 460 mg GAE/g sampel [13], tanin, fenol, dan steroid [14]. Aoki et al., [15] mengkaji ekstrak teh oolong secara in  vivo  efektif  dalam  memutihkan  melalui  efek  penghambatan  pada  melanogenesis  melalui  mekanisme  penurunan tirosinase  intraseluler  pada  tingkat  mRNA,  Lonicera  japonica  (bunga,  daun  dan  ranting)  sebagai  pemutih  yang  diduga melalui mekanisme penghambatan tirosinase [16].
Dengan  demikian,  baik  madu  maupun  ampas  teh  celup  memiliki  potensi  dimplementasikan  sebagai  bahan  aktif kosmetika yang bekerja melalui penghambatan tirosinase. Selain itu akan sangat berguna untuk pemanfaatan bahan yang tidak dipakai lagi (ampas teh) dalam bentuk sunscreen, cream, ataupun lotion yang selama ini belum banyak dieksplorasi.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu, Sampel madu (Apis dan Trigona) , Ampas produk kemasan merek teh (produksi di Indonesia) yang telah digunakan dalam sekali seduhan dengan air panas, Kertas Saring, Alumunium Foil , Etanol  96%  (Teknis),  Metanol  (Teknis),  Aquades.,Larutan  NH 3 ,  H 2 SO 4 2M  dan  pekat,  CHCl 3 ,  larutan Dragendorf, CH 3 COOH anhidrat, larutan HCl, amil alkohol, FeCl 3 10%, NaOH 1N, DMSO (dimetilsulfoksida), bufer kalium fosfat, asam kojat, 12 mM L-DOPA (difenolase), dan tirosinase (Sigma, 333 Unit mL -1 dalam buffer fosfat).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu, beberapa alat glassware ( Beacker glass, Erlenmeyer, pengaduk kaca , magnetic strirer, hot plate, rotary evaporator, terrmometer, spatula, reader plate multi-well .

## 2.2 Ekstraksi Madu dan Ampas Teh
Madu (Apis dan Trigona) dan ampas produk kemasan merek teh tertentu dikumpulkan, yang akan digunakan sebagai sampel penelitian.
Contoh madu 100 gram dilarutkan dalam 300 ml metanol. Campuran madu dengan pelarut metanol dicampur dengan pengaduk stirer selama  30 menit.  Setelah  didiamkan  selama  24  jam,  endapan  yang  terbentuk  sebagai  filtrat  diisolasi menggunakan kertas saring. Kemudian, dipekatkan menggunakan evaporator pada suhu 64 o C. Ini adalah konsentrat pekat sebagai konsentrat kasar ( crude ) dari contoh madu.
Sementara itu, residu teh dihilangkan dengan teknik ekstraksi dingin, khususnya dengan maserasi menggunakan pelarut etanol 96%.  Ampas teh dicelupkan ke dalam air menjadi ampas teh basah.  Ampas teh basah sebanyak 100 gram dilarutkan dalam 700 mL etanol 96% diamkan selama 5 x 24 jam sambil diaduk selama 15 menit/hari. Hasil maserasi (maserat) dipisahkan dengan kertas saring dan residu dilakukan maserasi kembali sampai pelarut menjadi bening. Lalu, maserat dipekatkan dengan evaporator pada temperatur ± 40 o C dan kecepatan ± 80 rpm, sehingga diperoleh konsentrat ampas  teh  pekat/kental.    Akhirnya,  baik  ekstrak  pekat  madu (1) maupun  ampas  teh (2) siap  dicampurkan  dengan perbandingan 1: 1 (b/b) untuk pengujian penghambatan tirosinase kombinasi sampel madu dan ampas teh (3).

## 2.3 Uji Skrining Fitokimia
Sebelum pengujian penghambatan tirosinase, ekstrak etanol teh dan ekstrak metanol madu dilakukan uji skrining fitokimia secara kualitatif dengan uji reagen. Skrining fitokimia pada ekstrak etanol teh dan ekstrak metanol madu meliputi flavonoid, tanin, saponin, kuinon, alkaloid dan steroid/triterpenoid, prosedurnya seperti berikut.

## 2.3.1 Alkaloid
Sebanyak 1 gram contoh ditambahkan beberapa tetes NH 3 , kemudian ditumbuk. Lalu, 5 mL CHCl 3 ditambahkan pada larutan NH 3 tersebut. Bahan-bahan yang tercampur tersebut, dipisahkan dan filtratnya ditambahkan H 2 SO 4 2 M. Lapisan asam dipisahkan menjadi 3 bagian. Lapisan pertama ditambahkan ke Dragendorf, menghasilkan endapan jingga; lapisan kedua ditambahkan ke larutan Mayer, menghasilkan endapan putih; dan lapisan ketiga ditambahkan ke larutan Wagner, menghasilkan endapan berwarna coklat. Semua proses ini berlangsung secara bersamaan.

## 2.3.2 Steroid/Triterpenoid
Sebanyak  1  gram  sampel  ditambahkan  beberapa  tetes  etanol  panas,  lalu  disaring.  Kemudian  filtrat  di  panaskan hingga kering. Campuran dihomogenkan dengan 1 mL dietil eter setelah itu. Setelah itu, tambahkan masing-masing satu tetes H 2 SO 4 pekat dan CH 3 COOH anhidrat. Jika warnanya hijau/biru, larutan sampel mengandung senyawa Steroid dan jika warnanya merah/ungu, larutan sampel mengandung senyawa Triterpenoid.

## 2.3.3 Flavonid, Tanin, Saponin dan Kuinon
Sebanyak 5 gram sampel dilarutkan dalam aquades, lalu di panaskan selama 5 menit, kemudian di saring. Filtrat yang  di  hasilkan  di  bagi  menjadi  4  perlakuan.  Perlakuan  pertama,  ke  dalam  filtrat  di  tambahkan  sedikit  serbuk  Mg, Campuran  larutan HCl  dan  Ethanol  (1:1),  dan  beberapa  tetes  Pelarut  Amil  Alkohol.  Ketika  pada  lapisan  Amil  Alkohol terbentuk  warna  jingga,  maka  larutan  sampel  mengandung  senyawa  Flavonoid.  Perlakuan  kedua,  ke  dalam  filtrat  di tambahkan larutan FeCl3 10% sebanyak 3 tetes. Jika terbentuk warna hitam kehijauan, maka larutan sampel mengandung senyawa Tanin. Perlakuan ketiga, filtrat di kocok kuat, ketika timbul buih yang stabil, maka sampel mengandung senyawa Saponin.  Perlakuan  keempat,  ke  dalam  filtrat  ditambahkan  larutan  NaOH  1  N  sebanyak  3  tetes,  jika  larutan  sampel berwarna merah, maka sampel mengandung senyawa Kuinon.

## 2.4 Pengujian Penghambatan Tirosinase (Ekstrak madu (1), ampas teh (2), campurannya (3))
Penghambatan  aktivitas  tirosinase  (monofenolase)  dan  auto-oksidasi  DOPA  (difenolase).  Pengujian  ini  dilakukan dengan  menggunakan metode  seperti  yang  dijelaskan sebelumnya [17], [18].  Ekstrak  dilarutkan  dalam  DMSO  (dimetil sulfoksida) hingga konsentrasi akhir 20 mg mL -1 . Larutan stok ekstrak ini kemudian diencerkan hingga 600 µg mL -1 dalam 50 mM bufer kalium fosfat (pH 6,5).
Ekstrak diuji pada konsentrasi mulai dari 7,8125 sampai 2000 µg mL -1 . Asam kojat yang digunakan sebagai kontrol positif juga diuji pada konsentrasi 7,8125 sampai 500 µg mL -1 . Dalam plate 96-sumur, 70 µL setiap pengenceran ekstrak dikombinasikan dengan 30 µL tirosinase (Sigma, 333 Unit mL -1 dalam buffer fosfat) dalam tiga kali ulangan.  Setelah itu diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit, 110 µL substrat (2 mM L-tirosin atau 12 mM L-DOPA) ditambahkan ke setiap sumur. Inkubasi  dimulai  selama  30 menit  pada suhu  kamar.  Optikal  densiti  sumur  kemudian ditentukan pada  510  nm dengan reader plate multi-well . Konsentrasi ekstrak tumbuhan merupakan setengah aktivitas tirosinase asli dihambat (IC 50 ), ditentukan untuk setiap ekstrak tumbuhan. Asam kojat (Sigma, Checz Republic) digunakan sebagai kontrol positif.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1 Metode ekstraksi sampel
Pada penelitian ini digunakan metode yang mudah dan sederhana yaitu maserasi (Gambar 1). Metanol merupakan pelarut yang paling cocok untuk maserasi pada suhu kamar [19].  Metanol direkomendasikan sebagai pelarut yang optimal untuk mendapatkan kandungan fitokimia yang tinggi serta antioksidan yang tinggi [20].  Hasil uji antioksidan menunjukkan maserasi segar metanol 95% menunjukkan hasil tertinggi dengan IC 50 25,22 dengan kategori aktivitas antioksidan kuat, kandungan fenol total 68,43 mg/g, kandungan flavonoid total 295,95 mg/g [21].
Metode tradisional, seperti maserasi, pengadukan, maserasi berbantuan, dan ekstraksi Soxhlet, adalah yang paling banyak digunakan di seluruh dunia [22], [23], [24]. Ekstraksi maserasi adalah berdasarkan pemisahan padat-cair, dengan pelarut organik atau air sebagai fase cair. Pelarut utama yang digunakan untuk ekstraksi senyawa fenolik adalah metanol, etanol, air, atau campuran dari pelarut ini [24], [25]. Hasil penelitian menyimpulkan bahwa jenis perlakuan pelarut dan waktu maserasi berpengaruh terhadap karakteristik ekstrak jeruk nipis [26].  Metanol pelarut adalah pelarut yang digunakan dalam uji flavonoid yang lebih polar dari kloroform dengan a tingkat polaritas sekitar 4,1 [27].
Metanol adalah pelarut ekstraksi terbaik, yang menunjukkan aktivitas antioksidan maksimum diikuti oleh kloroform dan terakhir n-heksana. Hasil penelitian kami mengungkapkan bahwa ekstrak metanol yang dibuat dengan teknik maserasi menunjukkan  aktivitas  antioksidan  yang  lebih  baik.  Disimpulkan  dari  penelitian  ini  bahwa  teknik  maserasi  lebih  efektif dibandingkan dengan teknik Soxhlets [28].
(a) (b)
Gambar 1. Sampel saat maserasi (a), Sampel setelah Rotary Evaporator (b)

## 3.2 Skrining Fitokimia
Skrining  fitokimia  merupakan  salah  satu  metode  analisis  kualitatif  keberadaan  senyawa  pada  tumbuhan  yang sederhana dalam penggunaannya.  Pada penelitian ini skrining yang dilakukan adalah uji flavonoid, tanin, saponin, kuinon, alkaloid dan steroid/triterpenoid. Setelah dilakukan uji skrining fitokimia dari ekstra teh dan madu (Tabel 1).
Hasil  skrining  fitokimia  dari  ekstra  teh  dan  madu  pada  Tabel  1  menunjukan  bahwa  ekstrak  teh  lebih  banyak mengandung senyawa metabolit sekunder golongan alakaloid, steroid, tannin, flavonoid, dan saponin.  Sementara itu, pada sampel penelitian ini, ekstrak madu hanya mengandung senyawa golongan saponin (Sp). Pada uji flavonoid hasil positif diperoleh dari ekstrak TSW, Ekstrak TSS dan ekstrak TWS (Tabel 1), sedangkan hasil negatif didapatkan pada madu TR BGR dan madu APLK. Hasil positif pada uji flavonoid ditandai adanya perubahan warna jingga setelah serbuk Mg dan HCl pekat ditambahkan pada larutan, dikarenakan terjadinya mereduksi ikatan glikosida dengan flavonoid [29].
Tabel 1 Data hasil skrining fitokimia sampel ekstrak ampas teh dan madu Sampel F T Sp Q Alkaloid ST Tp W M D Ekstrak TSW + + + - + + + + - Ekstrak TSS + + + - + + + + - Ekstrak TTJ + + + - + + + + - Madu TR BGR - - + - - - - - - Madu APLK - - + - - - - - -
Keterangan; F : Flavonoid; T : Tanin; Sp : Saponin; Q : Quinon; ST : Steroid; Tp: Triterpenoid ; W: Wagner; M: Mayer; D: Dragendorf TSW : Teh Sariwangi; TSS : Teh Sosro; TTJ : Teh Tong Djie.; TR BGR : Madu Trigona Bogor; APLK : Madu Apis Kelengkeng
Komponen bioaktif dalam teh diantaranya katekin (flavan-3-ol), suatu gugus flavonoid meliputi (-)-epikatekin (EC), (-)-epigallokatekin (EGC), (-)-epikatekin-3-galat (ECG), dan (-)-epigalokatekin-3-galat (EGCG) [30].
Flavonoid  yang  telah  dibuktikan  mengandung  penghambat  tirosinase,  misalnya  senyawa  flavonol  ( quercetin , kaempferol dan myricetin ), flavon (norartocarpetin), isoflavon ( kalicosine ), flavanol (dihydromorin dan taxifolin), flavanon (stepogenin), isoflavon (gliasperin C), glabridin) dan chalcone [31]. Ternyata, ciri-ciri struktur kimiawi teh polifenol terkait erat dengan potensi antioksidannya [32].  Polifenol teh adalah zat aktif penting dalam teh, dengan aktivitas antioksidan yang sangat baik, kemampuan anti-glikasi [33].
Pada uji tanin, diperoleh hasil positif pada ekstrak TSW, Ekstrak TSS dan ekstrak TWS. Pada madu TR BGR dan APLK tidak mengandung tannin ditandai dengan hasil negatif. Identifikasi adanya tannin ditendai dengan perubahan warna hijau  kehitaman  dikarenakan  terdeteksi  keberadaan  gugus  fenol  akibat  penambahan  FeCl 3 .  Senyawa  yang  diduga mengandung tanin yang mungkin dapat berperan sebagai penghambat tirosinase adalah asam galat [34].
Selanjutnya uji saponin, hasil yang didapatkan semua ekstrak teh dan madu mengandung saponin ditandai dengan adanya buih stinggi 1 cm yang stabil.  Hal ini terjadi karena senyawa saponin memiliki gugus hidrofilik yang berikatan dengan air dan gugus hidrofobik yang berikatan dengan oksigen di udara, gugus polar berada di luar misel dan gugus non polar berada di dalam misel, maka uji saponin mengungkapkan bahwa semua ekstrak teh dan madu yang mengandung saponin memiliki busa stabil setinggi 1 cm. Pedoman respon hidrolisis ini digambarkan dengan susunan foam atau buih [35]. Senyawa saponin mengalami hidrolisis menjadi aglikon dan glikon [36].
Pada uji quinon diketahui bahwa semua sampel ekstrak teh dan madu tidak mengandung senyawa golongan quinon karena memiliki hasil negatif. Hal ini dikarenakan, pada pecobaan tidak terbentuk endapan merah, sedangkan hasil positif pada uji kuinon ditunjukkan dengan terbentuknya red fast karena pemuaian NaOH yang mendeprotonasi gugus fenol pada kuinon  sehingga  terbentuk  partikel  enolat.    Partikel  enolat  akan  mengalami  resonasni  di  antara  elektron  dalam  ikatan rangkap 𝜋 yang dapat mempertahankan cahaya spesifik dan memantulkan warna [37].
Pada uji alkaloid diperoleh bahwa semua ekstra teh berupa ekstrak TSW, Ekstra TSS dan ekstrak TWS mengandung senyawa  golongan  alkaloid  ditandai  dengan  hasil  positif,  sedangkan  madu  TR  BGR  dan  madu  APLK  tidak  memiliki kandungan  alkaloid  karena  hasilnya  negatif.  Pada  uji  alkaloid,  HCl  2  N  yang  ditambahkan  ditujukan  untuk  pemisahan alkaloid  dari  simplisia.  Hal  ini  terjadi  karena  sifat  alkaloid  basa  yang  akan  berbentuk  garam  ketika  ditambahkan. Pemanasan dilakukan untuk memutuskan ikatan antara alkaloid yang tidak termasuk dalam susunan garam, kemudian dilakukan reaksi pengendapan menggunakan tiga reagen [38].
Uji alkaloid pada pereaksi Mayer mendapatkan hasil positif dengan terbentuknya warna putih atau kuning yang cepat, karena nitrogen dalam alkaloid bereaksi dengan partikel K + dari kalium tertiodomerkurat(II) membentuk kompleks kalium- alkaloid  yang  mengendap.    Dalam  reagen  Wagner,  hasil  positif  ditunjukkan  oleh  pembentukan  warna  coklat  yang mengendap  karena  logam  K + membentuk  ikatan kovalen koordinat  dengan  nitrogen. Dalam  alkaloid, kompleks  kalium- alkaloid  terbentuk,  sedangkan  dalam  reagen  Dragendroff,  pembentukan warna  jingga  menunjukkan  hasil  yang  positif, karena  adanya  nitrogen  menyebabkan  pembentukan  ikatan  kovalen  koordinat  dengan  K + (ion  logam)  dan  menghasil endapan [39].
Pada uji steroid/ triterpenoid diketahui bahwa ekstrak TSW, Ekstra TSS dan ekstrak TWS mengandung senyawa golongan  steroid  sedangkan  madu  TR  BGR  dan  madu  APLK  tidak  mengandung  senyawa  golongan  steroid  ataupun triterpenoid  dikarenakan  memiliki  hasil  negatif.  Hasil  tes  steroid  yang  positif  ditunjukkan  dengan  penyesuaian  warna hijau/biru, sedangkan triterpenoid positif ditunjukkan oleh perubahan warna merah/ungu sebagai akibat respons terhadap reagen Liebermann-Bouchard (H 2 SO 4 anhidrat).  Hal ini bergantung pada kemampuan campuran triterpenoid dan steroid untuk membentuk warna oleh H 2 SO 4 (dalam larutan asam asetat anhidrida). Perbedaan warna yang terlihat pada pengujian triterpenoid dan steroid adalah karena kedudukan pada atom C-4 [40]. Bahkan steroid dapat berperan menghambat katalis tirosinase [41].

## 3.3 Penghambatan Tirosinase
Mengevaluasi efikasi penghambat tirosinase untuk melihat apakah senyawa bioaktif dalam ekstrak teh dan madu serta kombinasi kedua ekstrak tersebut dihambat oleh enzim tirosinase. Dalam melanosit, enzim tirosinase terlibat dalam biosintesis melanin. Melanogenesis adalah proses dimana pigmen melanin diproduksi (Gambar 2).  Enzim penghambat alami dapat dimanfaatkan dalam industri kosmetik dan obat-obatan sebagai agen depigmentasi [7].
Menghambat aktivitas tirosinase adalah cara yang sangat efektif dan aman untuk mencegah pencoklatan enzimatik pada makanan dan melawan hama di bidang pertanian. Polifenol teh (TPs), dianggap sebagai aditif makanan yang aman dan tidak beracun, telah dilaporkan karena kemampuan penghambatan potensialnya terhadap tirosinase.
Gambar 2. Skema reaksi terbentuknya melanin [42]
Pada penelitian tersebut, spektroskopi fluoresensi, siklik voltametri (CV), oksimetri dan pendekatan simulasi molekuler digunakan untuk menjelaskan mekanisme penghambatan yang mendasari TPs dengan struktur yang berbeda termasuk (+)-katekin,()-epicatechin gallate (ECG) dan ( )-epigallocatechin gallate (EGCG ) terhadap tirosinase.
Spektrum fluoresensi menunjukkan bahwa ketiga TP mampu mengikat tirosinase dengan proporsi molar 1: 1. Analisis kurva CV dan pemanfaatan oksigen menunjukkan bahwa ketiga TP ini dapat dioksidasi oleh tirosinase, mengungkapkan bahwa ketiga TP ini adalah penghambat bunuh diri tirosinase.  Selanjutnya, EKG dan katekin membuat tirosinase menjadi tidak aktif secara ireversibel karena gugus katekolnya (cincin B) dikatalisis oleh tirosinase melalui jalur seperti kresolase, sementara EGCG menghambat aktivitas tirosinase dengan bersaing atau menunda oksidasi substrat. Simulasi molekuler selanjutnya mengkonfirmasi bahwa cincin B EKG dan katekin memberikan kontribusi yang signifikan terhadap aktivitas penghambatan  tirosinase,  dan  memiliki  interaksi  langsung  dengan  ion  tembaga  binuklir  berpasangan  dalam  orientasi optimal yang diperlukan oleh jalur seperti kresolase [43].
Asam 2-O- β -glukopiranosiloksi-4-metoksi- hidrosinamat (1) Dihidromelilotosida (2) Asam 2-O- β -glukosiloksi-4-metoksi trans-
sinamat (3)
Gambar 3. Struktur isolat ekstrak P. mahaleb sebagai penghambat tirosinase [44]
Dengan memeriksa kinetika enzim dari senyawa dengan turunan asam sinamat yang efektif, jenis penghambatan dan konstanta pengikatan enzim Ki dihitung. Senyawa 1, 2 dan 3 menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase nonkompetitif yang  tinggi  terhadap  substrat  L-tirosin,  dengan  nilai  IC 50 masing-masing  sebesar  0,22,  0,31  dan  0,37  mM.  Selain  itu, senyawa 1, 2 dan 3 (Gambar 3) menunjukkan efek penghambatan yang bergantung pada dosis pada kadar tirosinase dan melanin intraseluler dalam sel melanoma B16F10 yang diinduksi α -melanocyte- stimulating hormone (α -MSH) [44].
Pengujian  penghambatan  enzim  tirosinase  menggunakan  L-DOPA  sebagai  substrat  karena  substrat  dengan tirosinase  ini  akan  menghasilkan dopachrome  yang kemudian dapat  memproduksi melanin. Jika  terdapat  penghambat tirosinase maka pembentukan melanin dapat dihentikan. Artinya proses ini dapat menjadi parameter bahwa jika konsentrat tersebut mengandung senyawa penghambat tirosinase, maka kerja katalis tirosinase akan terhambat dalam menghasilkan melanin [45].
Dalam bahasan ini, munculnya senyawa dopachrome terlihat melalui pembentukan warna coklat yang dapat menekan respon  substrat-tirosinase.  Akibatnya,  terjadi  penurunan  produksi  dopachrome  yang  terlihat  melalui  parameter berkurangnya  kepekatan  warna  coklat  yang  ditimbulkan.  Sementara  itu,  ekstrak  yang  tidak  memiliki  aktivitas
penghambatan  dan  kontrol  (tanpa  ekstrak  tambahan)  berwarna  keunguan  dari  senyawaa  dopachrome.  Jika  jumlah dopakrom  yang  terbentuk  sangat  besar,  penghambatan  tirosinase  tidak  terjadi.  Untuk  melihat  pembentukan  senyawa dopakrom, dapt diukur pada frekuensi 490 nm. Besarnya aktivitas ekstrak dalam menghambat reaksi tirosinase-substrat ditentukan oleh daya serap yang diperoleh, atau absorbansi [31].
Kemampuan tirosinase ditunjukkan dengan nilai IC50 sebagai nilai konsentrasi senyawa penghambat  tirosinase yang dapat menekan setengah dari aksi tirosinase. Semakin rendah nilai IC 50 semakin besar aktivitas penghambat tirosinase. Senyawa pembanding dalam pengujian ini adalah asam kojat yang berfungsi sebagai kontrol karena mampu memberikan informasi perbedaan penghambatan dan memiliki keandalan yang tinggi dibandingkan dengan bahan-bahan lain.  Untuk menghitung persentase penghambatan tirosinase menggunakan perhitungan dengan 3 (tiga) kali pengulangan pengukuran. Untuk mencari IC 50 dibuat regresi persamaan linear yang didapat dari kurva hubungan antara % inhibisi dengan konsentrasi [46].
Pada Tabel 2 menunjukkan Persen (%) inhibisi bertambah seiring dengan meningkatnya konsentrasi. Persen inhibisi dalam  aktivitas  inhibitor  tirosinase  diartikan  sebagai  kemampuan  suatu  senyawa  bioaktif  di  dalam  sampel  dalam menghambat enzim tirosinase pada konsentrasi larutan uji tertentu. Sehingga semakin besar nilai inhibitor maka aktivitas sebagai penghambat enzim tirosinase semakin besar, sedangkan nilai IC 50 yang diperoleh semakin kecil. Pada sampel yang  diuji  dapat  terlihat  bahwa  nilai  %  inhibisi terendah didapatkan dari  madu  TR  BGR  yang  berarti  aktivitas  sebagai inhibitor  tirosinase  sangat  kecil.  Pada  ekstrak  TSW  memiliki  %  inhibisi  tertinggi  yang  membuat  aktivitas  dalam penghambatan enzim menjadi lebih besar dibandingkan dengan sampel uji lainnya [47].
Nilai IC 50 menunjukkan nilai konsentrasi suatu senyawa (bahan alam) yang memiliki kemampuan untuk menghambat aktivitas tirosinase sebear 50%.  Nilai ini akan memberikan petunjuk penting kemampuan suatu bahan dapat menghambat aktivitas  suatu  enzim.    Pada Tabel  2.  diketahui  bahwa  nilai  IC 50 pada  sampel  ekstrak  teh  dan  madu  serta  campuran keduanya memiliki nilai yang lebih besar dibandingkan dengan kontrol. Hal ini menyatakan bahwa sampel memiliki aktivitas penghambatan enzim tirosinase yang sangat lemah, dikarenakan semakin tinggi nilai IC 50 maka aktivitas inhibitor tirosinase menjadi kecil. Berdasarkan pembagian tersebut maka konsentrasi penghambatan sebesar 200- 1000 μg/m L, suatu bahan dikategorikan kurang aktif namun masih berpotensi sebagai penghambat tirosinase. Akan tetapi, nilai IC 50 > 1000 μg/ml maka dapat dikatakan sampel uji memiliki aktivitas penghambatan tirosinase yang sangat lemah. Pada kontrol asam kojat memiliki nilai IC 50 yang kecil sebesar 26,33 μg/ml yang mana nilai IC 50 < 50 μg/ml, maka kontrol asam koj ik mempunyai aktivitas penghambatan enzim tirosinase yang kuat.
Tabel 2. Data hasil perhitungan IC50 Sampel Konsentrasi (ppm) Ln Konsentrasi (ppm) % Inhibisi IC 50 (µg/mL) Ekstrak TSW 1000 6,90775 37,749 4.405,17 500 6,2146 24,893 100 4,60517 8,868 50 3,91202 0,926 25 3,2188 -0,142 Ekstrak TSS 1000 6,90775 15,135 5.980.899,48 500 6,2146 9,046 100 4,60517 0,855 50 3,91202 0,463 25 3,2188 -0,57 Ekstrak TTJ 1000 6,90775 24,786 43.163,72 500 6,2146 18,803 100 4,60517 8,761 50 3,91202 2,6 25 3,2188 -0,321 Madu TR BGR 1000 6,90775 2,208 3,0829 x 10 36 500 6,2146 1,175 100 4,60517 0,392 50 3,91202 0,036 25 3,2188 0,036 Madu APLK 1000 6,90775 2,279 3,2701 x 10 35 500 6,2146 1,104 100 4,60517 0,214 50 3,91202 0,142 25 3,2188 -0,356
Pada madu TR BGR dan madu APLK memiliki nilai IC 50 yang sangat besar dibandingkan sampel uji lainnya, sehingga madu sangat lemah sekali dalam melakukan penghambatan tirosinase. Sampel uji dari ekstrak TSW mempunyai nilai IC 50 yang  paling  rendah,  sehingga  esktrak  TSW  lebih  memiliki  potensi    dalam  aktivitas  penghambatan  enzim  tirosinase dibandingkan sampel uji lainnya walaupun kekuatan nilai IC 50 terbilang sangat lemah. Nilai IC 50 pada campuran ekstrak teh dan madu yang paling berpotensi dalam mengahmbat enzim tirosinase adalah campuran dari ekstrak TSW dan madu APLK. Nilai IC 50 bergantung pada metode ekstraksi dan bahan terlarut yang digunakan dalam ekstraksi serta pemilihan interval konsentrasi dan substrat digunakan dalam respon terhadap aksi penghambat tirosinase.  Oleh karena itu, dalam melihat respon enzimatik, penentuan substrat sangat penting karena dapat mempengaruhi hasil estimasi pengukuran [45].
Pada sampel teh dan madu serta campuran keduanya memiliki nilai IC 50 > 1000 µg/mL, sehingga aktivitas untuk menghambat enzim tirosinase masih terbilang sangat lemah sekali. Ekstrak teh mengandung senyawa flavonoid, tanin dan steroid  diperoleh  dari  hasil  positif  skrining  fitokimia.  Flavonoid  dapat  menghambat  aktivitas  tirosinase  sehingga  dapat menghambat proses pigmentasi kulit pada proses melanogenesis.
Tanin merupakan bagian dari senyawa polifenol yang berperan sebagai pelindung oksidasi sel dan dapat berperan dalam  aksi  penghambatan  tirosinase.  Senyawa  steroid  juga  dikenal  sebagai  penghambat  tirosinase  yang  efektif. Kemampuan ekstrak teh untuk melindungi kulit dari hiperpigmentasi dan kerusakan akibat radikal bebas disebabkan oleh kandungan fitokimianya, terutama senyawa flavonoid [48]. Pilihan asam kojat sebagai kontrol positif karena menunjukkan
Sampel Konsentrasi (ppm) Ln Konsentrasi (ppm) % Inhibisi IC 50 (µg/mL) Ekstrak TSW + Madu TR BGR 1000 6,90775 17,058 997.492,59 500 6,2146 12,322 100 4,60517 4,38 50 3,91202 0,783 25 3,2188 -0,819 Ekstrak TSW + Madu APLK 1000 6,90775 17,842 949.793,62 500 6,2146 11,538 100 4,60517 3,454 50 3,91202 0,285 25 3,2188 0,071 Ekstrak TSS + Madu TR BGR 1000 6,90775 8,013 949.914,41 500 6,2146 5,627 100 4,60517 0,285 50 3,91202 0,214 25 3,2188 -0,071 Ekstrak TSS + Madu APLK 1000 6,90775 7,443 1004,09 x 10 8 500 6,2146 5,413 100 4,60517 0,926 50 3,91202 0,499 25 3,2188 0,321 Ekstrak TTJ + Madu TR BGR 1000 6,90775 11,859 1390,92 x 10 9 500 6,2146 5,662 100 4,60517 1,852 50 3,91202 0,57 25 3,2188 0,142 Ekstrak TTJ + Madu APLK 1000 6,90775 11,254 1390,92 x 10 9 500 6,2146 4,523 100 4,60517 1,674 50 3,91202 0,285 25 3,2188 -0,071 Asam Kojat (Kontrol) 500 6,214608098 96,617 26,33 250 5,521460918 81,731 125 4,828313737 68,056 62.5 4,135166557 59,046 31.25 3,442019376 52,671 15.625 2,748872196 42,13 7.8125 2,055725015 35,969
adanya penghambatan yang serius pada aksi monofenolase dan dampak penghambatan campuran pada aksi difenolase dari katalis tirosinase sehingga reaksi pembentukan melanin akan terganggu [49].
Adanya  senyawa  fenolik  (fenol  dan  polifenol  sederhana)  dan  turunannya  serta  beberapa  senyawa  termasuk terpenoid, fenil, piridin, piperidin, piridinon dapat bertindak sebagai inhibitor tirosinase [50].  Senyawa flavonoid, fenol dan tanin  memiliki  potensi  dalam  menghambat  aktivitas  tirosinase  [51].    Bahkan  hasil  penelitian  terhadap  aktivitas penghambatan enzim tirosinase buah kersen lebih maksimum pada ekstrak etanol dibandingkan dengan ekstrak air dan kandungan  flavonoid  yang terkandung  dalam  buah  kersen merupakan senyawa  bioaktif yang  dapat  bertindak  sebagai penghambat tirosinase [52]. Senyawa lain yang juga menjadi penghambat tirosinase adalah flavonoid melalui pengkelatan Cu 2+ , gugus hidroksil pada cincin A dan B [53].
Senyawa polifenol umumnya ditemukan pada tanaman yang dapat dikonsumsi dan tidak dapat dikonsumsi dan telah dilaporkan memiliki beberapa efek biologis [54].  Fenolat dengan kemampuan mereduksi ion mengurangi kemungkinan jalur pembentukan radikal hidroksil dari radikal anion superoksida dan juga menghambat enzim karena kemampuannya untuk mengkhelat tembaga di situs aktif [55].  Polifenol ini telah menarik para peneliti untuk menggunakan aplikasi kulit topikal.    Senyawa-senyawa flavonoid seperti  isookanin,  luteolin, kaempferol, kaempferol  3-O-(6 ’’ -O-trans-p-coumaroyl)- glukosida (tiliroside), kuersetin, robinetin menunjukkan beberapa mekanisme yang mungkin terjadi [56]. Selain itu, hasil pengujian menunjukkan bahwa temperatur saat pemanfaatannya sangat mempengaruhi tanin (0,09%), waktu penyeduhan (3,98%), aroma (netral) dan pengaruh yang sangat besar pada variasi rasa (nonpartisan [57].

## 4. Kesimpulan
Dalam uji skrining fitokimia untuk sampel ekstrak teh hampir semua senyawa uji positif (Flavonoid, Alkaloid, Tanin, Saponin, Steroid) kecuali senyawa Quinon dan Triterpenoid. Madu untuk sampel positif hanya senyawa saponin, sedang yang untuk senyawa lain negatif. Ekstrak teh berpotensi dalam menghambat enzim tirosinase, karena kandungan senyawa flavonoid, tanin dan steroid.  Pengujian penghambatan enzim tirosinase pada madu dan teh serta campuran keduanya memiliki  nilai  IC 50 >1000  μg/mL,  maka  aktivitas  daya  hambat  sangat  lemah.  Namun  demikian  dalam  penelitian  telah menunjukkan bahwa ampas teh celup dan madu memiliki senyawa bioaktif melalui uji fitokimia. Akan tetapi kemampuannya sebagai penghambat tirosinase perlu dilakukan lagi kajian melalui berbagai variasi metode ekstraksi dan pelarut yang tepat.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat melalui Pusat Penelitian dan Penerbitan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah membiayai penelitian ini tahun Anggaran 2022. No. SK B-301/LP2M-PUSLITPEN/TL.03/2022.

## Daftar Pustaka
[1] Z. Sagala, R. W. Pratiwi, and N. U. Azmi, “Uji Aktivitas Inhibisi terhadap Enzim Tirosinase dari Ekstrak Etanol Daun Pepaya (Carica papaya L.) Secara In Vitro,” Jurnal Penelitian Farmasi Indonesia , vol. 7, no. 2, pp. 34 – 38, May 2019.
[2] A. Rauf, S. Ningsi, and H. Nurdin, “Potensi Penghambatan Tirosinase Ekstrak Etanol Daun Tomat (Lycopersicon esculentum Mill, var. Pyriforme Alef),” Proceeding Semantic Scholar, pp. 1 – 7, 2019.
[3] S. U. Noor, F. Faridah, and P. Magdalena, “In Vitro Enzyme Tyrosinase Inhibitory Activity Test on Liquorice Root Extract Cream (Glycyrrhiza glabra L.),” Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, vol. 16, no. 2, p. 150, Oct. 2018, doi: 10.35814/jifi.v16i2.566.
[4]  J. Alvarez- Suarez, F. Giampieri, and M. Battino, “Honey as a Source of Dietary Antioxidants: Structures, Bioavailability and Evidence of Protective Effects Against Human Chronic Diseases,” Curr Med Chem, vol. 20, no. 5, pp. 621 – 638, Jan. 2013, doi: 10.2174/092986713804999358.
[5] S. Küçükaydın et al. , “Characterization of Turkish Astragalus honeys according to their phenolic profiles and biological activities with a chemometric approach,” Food Biosci, vol. 53, p. 102507, Jun. 2023, doi: 10.1016/j.fbio.2023.102507.
[6] W. A. Angga, Y. Rizal, M. E. Mahata, A. Yuniza, and R. Mayerni, “Potential of Waste Tea Leaves (Camellia sinensis) in West Sumatra to Be Processed into Poultry Feed,” Pakistan Journal of Nutrition, vol. 17, no. 6, pp. 287 – 293, May 2018, doi: 10.3923/pjn.2018.287.293.
[7] H. Rahmi, S. Supandi, N. S. Radjab, and T. Julianti, “Tyrosinase Inhibition from Green Tea (Camellia sinensis (L.) Kuntze) gel,” Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology, vol. 8, no. 2, p. 59, Jun. 2021, doi: 10.24198/ijpst.v8i2.27145.
[8]  H. K. Permatasari et al. , “Kombucha tea from seagrapes (Caulerpa racemosa) potential as a functional anti -ageing food: in vitro and in vivo study,” Heliyon, vol. 7, no. 9, p. e07944, Sep. 2021, doi: 10.1016/j.heliyon.2021.e07944.
[9] L. O. Sumarlin, A. Tjachja, R. Octavia, and N. Ernita, “Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Madu Cair d an Madu Bubuk Lokal Indonesia,” Al-Kimia, vol. 6, no. 1, pp. 10 – 23, 2018. [10]  L. Meziant, M. Bachir-bey, C. Bensouici, F. Saci, M. Boutiche , and H. Louaileche, “Assessment of inhibitory properties of  flavonoid- rich  fig  (Ficus  carica  L.)  peel  extracts  against  tyrosinase,  α -glucosidase,  urease  and  cholinesterases enzymes,  and  relationship  with  antioxidant  activity,” Eur  J  Integr  Med,  vol.  43,  p.  101272,  Apr.  2021,  doi: 10.1016/j.eujim.2020.101272.
[11] M.  Fan,  H.  Ding,  G.  Zhang,  X.  Hu,  and  D.  Gong,  “Relationships  of  dietary  flavonoid  structure  with  its  tyrosinase inhibitory activity and affinity,” LWT, vol. 107, pp. 25 – 34, Jun. 2019, doi: 10.1016/j.lwt.2019.02.076.
[12] M. Taş - Küçükaydın et al. , “Chemometric classification of chestnut honeys from different regions in Turkey based on their  phenolic  compositions  and  biological  activities,” Food  Chem,  vol.  415,  p.  135727,  Jul.  2023,  doi: 10.1016/j.foodchem.2023.135727.
[13] P. D. N. Bayan and L. Syafnir, “Perbandingan Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Etanol Ampas Teh Hitam dan Teh Hijau (Camellia Sinensis (L.) Kuntze) dengan Metode DPPH Serta Penentuan Kadar Polifenol,” in Prosiding Farmasi, Bandung: Unisba, Aug. 2018, pp. 321 – 328.
[14] N. Nurjanah, B. E. Aprilia, A. Fransiskayana, M. Rahmawati, and T. Nurhayati, “Senyawa Bioaktif Rumput Laut Dan Ampas Teh Sebagai Antibakteri Dalam Formula Masker Wajah,” J Pengolah Has Perikan Indones, vol. 21, no. 2, pp. 305 – 316, Aug. 2018, doi: 10.17844/jphpi.v21i2.23086.
[15] Y. Aoki, T. Tanigawa, H. Abe, and Y. Fujiwara, “Melanogenesis Inhibition by an Oolong Tea Extract in B16 Mouse Melanoma Cells and UV- Induced Skin Pigmentation in Brownish Guinea Pigs,” Biosci Biotechnol Biochem, vol. 71, no. 8, pp. 1879 – 1885, Aug. 2007, doi: 10.1271/bbb.70099.
[16] N. T. Dung, V. K. Bajpai, A. Rahman, J. I. Yoon, and S. C. Kang, “Phenolic Contents, Antioxidant And Tyrosinase Inhibitory  Activities  Of  Lonicera Japonica  Thumb,” J  Food  Biochem, vol.  35,  no.  1,  pp.  148 – 160, Feb.  2011,  doi: 10.1111/j.1745-4514.2010.00461.x.
[17]  E. V Curto et al. , “Inhibitors of mammalian melanocyte tyrosinase: in vitro comparisons of alkyl esters of gentisic acid with  other  putative  inhibitors,” Biochem  Pharmacol,  vol.  57,  no.  6,  pp.  663 – 672,  Mar.  1999,  doi:  10.1016/S0006- 2952(98)00340-2.
[18]  O.  Nerya,  J.  Vaya,  R.  Musa,  S.  Izrael,  R.  Ben- Arie,  and  S.  Tamir,  “Glabrene  and  Isoliquiritigenin  as  Tyrosinase Inhibitors from Licorice Roots,” J Agric Food Chem, vol. 51, no. 5, pp. 1201 – 1207, Feb. 2003, doi: 10.1021/jf020935u. [19] T. Okselni, A. W. Septama, R. A. Pamungkas, E. P. Rahmi, M. Efdi, and M. Koketsu, “A systematic review and meta - analysis extraction techniques to reach the optimum asiaticoside con tent from the edible plant of Centella asiatica,”
South African Journal of Botany, vol. 155, pp. 261 – 273, Apr. 2023, doi: 10.1016/j.sajb.2023.02.019.
[20]  D.- H. Truong, D. H. Nguyen, N. T. A. Ta, A. V. Bui, T. H. Do, and H. C. Nguyen, “Evaluation of the Us e of Different Solvents for Phytochemical Constituents, Antioxidants, and In Vitro Anti-Inflammatory Activities of Severinia buxifolia ,” J Food Qual, vol. 2019, pp. 1 – 9, Feb. 2019, doi: 10.1155/2019/8178294.
[21] E. S. Savitri, K. Holil, R. S. Resmisari, U. Syarifah, and S. Munawaroh, “Effect of extraction solvent on total phenol, total flavonoid content and antioxidant activities of extract plants Punica granatum, Vitis vinifera L, Ficus carica L. and Olea europea ,” 2019, p. 030034. doi: 10.1063/1.5115638.
[22] O. R. Alara, N. H. Abdurahman, C. I. Ukaegbu, and N. H. Azhari, “Vernonia cinerea leaves as the source of phenolic compounds, antioxidants, and anti-diabetic activity using microwave-assisted extraction tech nique,” Ind Crops Prod, vol. 122, pp. 533 – 544, Oct. 2018, doi: 10.1016/j.indcrop.2018.06.034.
[23]  T. Belwal et al. , “A critical analysis of extraction techniques used for botanicals: Trends, priorities, industrial uses and optimization  strategies,” TrAC  Trends  in  Analytical  Chemistry,  vol.  100,  pp.  82 – 102,  Mar.  2018,  doi:
10.1016/j.trac.2017.12.018.
[24] N. Ćujić, K. Šavikin, T. Janković, D. Pljevljakušić, G. Zdunić, and S. Ibrić, “Optimization of polyphenols extraction from dried  chokeberry  using macerati on as  traditional  technique,” Food  Chem, vol.  194,  pp.  135 – 142, Mar.  2016,  doi: 10.1016/j.foodchem.2015.08.008.
[25]  U.- J.  Vajić et  al. ,  “Optimization  of  extraction  of  stinging  nettle  leaf  phenolic  compounds  using  response  surface methodology,” Ind Crops Prod, vol. 74, pp. 912 – 917, Nov. 2015, doi: 10.1016/j.indcrop.2015.06.032.
[26] P. J. N. Dewi, G. Putra, and L. Lutfi Suhendra, “Effect of Solvent Type and Maceration Time on Characteristics and Stability  of  Lime  Orange  Extract  (Citrus  amblycarpa)  as  Natura l  Antioxidants  in  Foods,” Media  Ilmiah  Teknologi Pangan, vol. 9, no. 1, pp. 1 – 14, Mar. 2022.
[27] H.  Parbuntari,  Y.  Prestica,  R.  Gunawan,  M.  N.  Nurman,  and  F.  Adella,  “Preliminary  Phytochemical  Screening (Qualitative Analysis) of Cacao Leaves (Theobroma ca cao L.),” EKSAKTA: Berkala Ilmiah Bidang MIPA, vol. 19, no.
2, pp. 40 – 45, Oct. 2018, doi: 10.24036/eksakta/vol19-iss2/142.
[28] O. A. O. Adam, R. S. M. Abadi, and S. M. H. Ayoub, “The Effect of Extraction method and Solvents on yield and Antioxidant Activi ty of Certain Sudanese Medicinal Plant Extracts,” The Journal of Phytopharmacology, vol. 8, no. 5, pp. 248 – 252, Oct. 2019, doi: 10.31254/phyto.2019.8507.
[29] Z. Azizah, Zulharmita, and S. W. Wati, “Skrining Fitokimia Dan Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak Etanol Daun Pare (Momordica charantia L.),” Jurnal Farmasi Higea, vol. 10, no. 2, pp. 163 – 172, 2018. [30]  T. Tounekti, E. Joubert, I. Hernández, and S. Munné- Bosch, “Improving the Polyphenol Content of Tea,” CRC Crit Rev Plant Sci, vol. 32, no. 3, pp. 192 – 215, May 2013, doi: 10.1080/07352689.2012.747384.
[31]  T.- S. Chang, “An Updated Review of Tyrosinase Inhibitors,” Int J Mol Sci, vol. 10, no. 6, pp. 2440 – 2475, May 2009, doi: 10.3390/ijms10062440.
[32]  V.-L. Truong and W.-S. Jeong, “Cellular Defensive Mechanisms of Tea Polyphenols: Structure - Activity Relationship,” Int J Mol Sci, vol. 22, no. 17, p. 9109, Aug. 2021, doi: 10.3390/ijms22179109.
[33]  S. Li, L. Zhang, X. Wan, J. Zhan, and C.- T. Ho, “Focusing on the recent progress of tea polyphenol chemistry and perspectives,” Food  Science  and  Human  Wellness,  vol.  11,  no.  3,  pp.  437 – 444,  May  2022,  doi: 10.1016/j.fshw.2021.12.033.
[34]  Ø. M. Andersen and K. R. Markham, FLAVONOIDS: Chemistry, Biochemistry and Applications. New York: CRC Press Taylor & Francis, 2006.
[35] A.  P.  Wardana  and  Tukiran,  “Skrining  Fitokimia  Dan  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Kloroform  Tumbuhan  Gowok (Syzygium  polycephalum),”  in Prosiding  Seminar  Nasional  Kimia  dan  Pembelajarannya,  Jurusan  Kimia  FMIPA Universitas Negeri Surabaya, Sep. 2016, pp. 1 – 6.
[36] P. D. Padmasari, K. W. Astuti, and N. K. Warditiani, “Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 70% Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.),” Jurnal Farmasi Udayana, vol. 2, no. 4, pp. 1 – 7, 2013.
[37]  W. F. Dewatisar i, L. Rumiyanti, and I. Rakhmawati, “Rendemen dan Skrining Fitokimia pada Ekstrak Daun Sanseviera sp.,” Jurnal Penelitian Pertanian Terapan, vol. 17, no. 3, p. 197, Jan. 2018, doi: 10.25181/jppt.v17i3.336.
[38]  R. Ikalinus, S. K. Widyastuti, and N. L. E. S etiasih, “Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Kulit Batang Kelor (Moringa oleifera),” Indonesia Medicus Veterinus , vol. 14, no. 1, pp. 71 – 79, 2015.
[39] R. N. Sani, F. C. Nisa, R. D. Andriani, and J. M. Maligan, “Yield Analysis and Phytochemical Screening E thanol Extract of Marine MicroalgaeTetraselmis chuii,” Jurnal Pangan dan Agroindustri, vol. 2, no. 4, pp. 121 – 126, Apr. 2014.
[40] E. Marliana and C. Saleh, “Uji Fitokimia dan Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Etanol, Fraksi heksana, Etil Asetat dan Meta nol dari Buah Labu Air (Lagenari siceraria (Moliana) Standl),” Jurnal Kimia Mulawarman , vol. 8, no. 2, pp. 63 – 69, May 2011.
[41] W.  S.  Putri,  N.  K.  Warditiani,  and  L.  P.  F.  Larasanty,  “Skrining  Fitokimia  Ekstrak  Etil  Asetat  Kulit  Buah  Manggis (Garcinia Ma ngostana L ),” Jurnal  Farmasi Udayana , vol. 2, no. 4, pp. 56 – 60, 2013.
[42]     Balsam, M.S. & Sagarin, E., 1972.Cosmetics Science and Technology, 2 nded, Vol. 3, John Wiley and Sons, New York.
[43]  C. Q. Tang et al. , “Identifying long -term stable refugi a for relict plant species in East Asia,” Nat Commun, vol. 9, no. 1, p. 4488, Oct. 2018, doi: 10.1038/s41467-018-06837-3.
[44] Z.  Bayrakçeken  Güven,  I.  Saracoglu,  A.  Nagatsu,  M.  A.  Yilmaz,  and  A.  A.  Basaran,  “Anti -tyrosinase  and antimelanogenic  effect  of  cinnamic  acid  derivatives  from  Prunus  mahaleb  L.:  Phenolic  composition,  isolation, identification and inhibitory activity,” J Ethnopharmacol, vol. 310, p. 116378, Jun. 2023, doi: 10.1016/j.jep.2023.116378.
[45] A. Levitzki and E. Mishani, “Tyrphostins and Other Tyrosine Kinase Inhibitors,” Annu Rev Biochem, vol. 75, no. 1, pp. 93 – 109, Jun. 2006, doi: 10.1146/annurev.biochem.75.103004.142657.
[46] Meiliana Charissa, Joshita Djajadisastra, and Berna Elya, “Uji Aktivitas Antioksidan dan Penghambatan Tirosinase serta Uji Manfaat Gel Ekstrak Kulit Batang Taya (Nauclea subdita) terhadap Kulit ,” Jurnal Kefarmasian Indonesia, vol. 6, no. 2, pp. 98 – 107, Aug. 2016.
[47] N. Rubinadzari, L. S. Saula, and M. R. Utami, “Perbandingan Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bi ji Hijau dan Sangrai Kopi  Robusta  (Coffea  canephora  L.)  Serta  Kombinasinya  Terhadap  Bakteri  Staphylococcus  aureus,” LUMBUNG FARMASI ; Jurnal Ilmu Kefarmasian, vol. 3, no. 2, Jul. 2022.
[48] M. Miyazawa and N. Tamura, “Inhibitory Compound of Tyrosinase Acti vity from the Sprout of Polygonum hydropiper L. (Benitade),” Biol Pharm Bull, vol. 30, no. 3, pp. 595 – 597, 2007, doi: 10.1248/bpb.30.595.
[49]  L. Saghaie, M. Pourfarzam, A. Fassihi, and B. Sartippour , “Synthesis and tyrosinase inhibitory properties of some novel derivatives of kojic acid.,” Res Pharm Sci, vol. 8, no. 4, pp. 233 – 42, Oct. 2013.
[50]  S. Zolghadri et al. , “A comprehensive review on tyrosinase inhibitors.,” J Enzyme Inhib Med Chem, vol. 34, no. 1, pp. 279 – 309, Dec. 2019, doi: 10.1080/14756366.2018.1545767.
[51] M. Gazali, “Aktivitas Inhibitor Tirosinase Rumput Laut Halimeda Spp dari Pesisir Aceh Barat,” Jurnal Perikanan Tropis, vol. 5, no. 2, p. 149, Oct. 2018, doi: 10.35308/jpt.v5i2.1034.
[52] K.  P.  Balakrishnan,  N.  Narayanaswamy,  and  A.  Duraisamy,  “Tyrosinase  inhibition  and  anti -oxidant  properties  of Muntingia calabura extracts: In vitro studies,” Int J Pharma Bio Sci, vol. 2, no. 1, pp. 294 – 303, Jan. 2011.
[53]  Z. Abidin, U. Khaeriah, Zuh rina, M. Pratama, and M. Baits, “Tyrosinase Inhibitor Activity Measurement of Crude and Purified  Extract  of  Moringa  Leaves  (Moringa  oleifera  L.),” Indonesian  Journal  of  Pharmaceutical  Science  and Technology, vol. 1, no. 1, pp. 52 – 58, 2019.
[54]  M. P. Kähkönen et al. , “Antioxidant Activity of Plant Extracts Containing Phenolic Compounds,” J Agric Food Chem, vol. 47, no. 10, pp. 3954 – 3962, Oct. 1999, doi: 10.1021/jf990146l.
[55]  Y.-H. Lin et al. , “Evaluation of a New Hepatitis B Virus Surface Antigen Rapid Test with Improved Sensitivity,” J Clin Microbiol, vol. 46, no. 10, pp. 3319 – 3324, Oct. 2008, doi: 10.1128/JCM.00498-08.
[56] K. Jakimiuk, S. Sari, R. Milewski, C. T. Supuran, D. Şöhretoğlu, and M. Tomczyk, “Flavonoids as tyrosinase inhibitors in silico and in vitro models: basic framework of SAR using a statistical modelling approach,” J Enzyme Inhib Med Chem, vol. 37, no. 1, pp. 427 – 436, Dec. 2022, doi: 10.1080/14756366.2021.2014832.
[57] N. Fikri, R. Rasdiansyah, and F. Zakaria, “Pengaruh Suhu Dan Lama Penyeduhan Terhadap Kualitas Minuman Teh Daun Kersen (Muntingia calabura L.),” Jurnal Ilmiah Mahasiswa Pertanian, vol. 6, no. 4, pp. 492 – 500, Nov. 2021, doi: 10.17969/jimfp.v6i4.18287.