## PENGEMBANGAN SISTEM PEMBAWA ALBUMIN NANOPARTIKEL UNTUK SILIMARIN DAN KAJIAN SIFAT FISIK SERTA PROFIL PELEPASANNYA SECARA IN VITRO
Rini Ambarwati 1 , Heni Rachmawati 2
1 Universitas Pakuan, Bogor
2 Program Studi Magister Farmasetika, ITB, Bandung

## ABSTRAK
Silimarin  merupakan senyawa  flavonolignan yang  berasal dari tumbuhan Silybum marianum (Asteraceae).  Silimarin  memiliki  efek  farmakologi  sebagai  antikanker  dan hepatoprotektor,  tetapi  senyawa  ini  memiliki  kelarutan  yang  rendah  dalam  air.  Tujuan penelitian  ini adalah  mengembangkan  formulasi  silimarin dalam sistem pembawa  nano dengan teknik desolvasi. Pembawa yang digunakan adalah serum albumin (bovine serum albumin/BSA). Kombinasi silimarin dalam BSA diharapkan dapat meningkatkan efikasi silimarin sebagai anti kanker karena permeabilitas BSA yang lebih baik pada sel kanker. Evaluasi  standar  terhadap  nanopartikel  silimarin-BSA  meliputi  ukuran  dan  distribusi ukuran  partikel,  zeta  potensial,  morfologi  nanopartikel,  kristalinitas,  sifat  termal, spektroskopi  inframerah,  efisiensi  penjeratan  serta  profil  pelepasan  silimarin  dari  BSA nanopartikel  pada  2  media   berbeda  (HCl  0,1  N  &  PBS  pH  7,4).  Nanopartikel  BSA- silimarin memiliki ukuran partikel 174,23 ± 13,94 nm; distribusi ukuran partikel 0,185 ± 0,052; efisiensi penjeratan 90,54 ± 0,098 %; loading capacity 30,18 ± 0,036 % dan zeta potensial -1,62 mV. Hasil analisis menggunakan DSC ( differential scanning calorimetry ), XRD  ( X-ray  diffraction )  dan  spektroskopi  inframerah  menunjukan  bahwa  nanopartikel silimarin berhasil terenkapsulasi di dalam nanopartikel BSA, dan BSA-silimarin memiliki bentuk amorf. Setelah 1 jam uji pelepasan, terdapat  sebanyak 21,89% silimarin terlepas dalam  HCl  0,1  N  dan  54,84%  silimarin  terlepas  dalam  PBS  pH  7,4  sehingga  dapat disimpulkan bahwa silimarin-BSA memiliki kelarutan yang baik dalam air. Oleh karena itu,  perlu  dilakukan  pengujian  lebih  lanjut  untuk  mengkaji  akt ivitas  serta  perilaku silimarin-BSA in vivo untuk mengkonfirmasi data in vitro .
Kata kunci : Nanopartikel, Silimarin, BSA, Desolvasi, Albumin, Desolvating agent

## DEVELOPMENT OF SILIMARIN NANOPARTICLES CARRYING SYSTEM AND THE STUDY OF ITS PHYSICAL AND RELEASE PROFILE IN VITRO

## ABSTRACT
Silimarin  is  a  flavonolignan  compound  derived  from Silybum  marianum (Asteraceae)  plant.  Silimarin  has  a  pharmacological  effects  as  an  anticancer  and hepatoprotector substance, but the solubility of this compound is very low in the water. The purpose of this study was to develop a silimarin formulation in bovine serum albumin (BSA)  nano-carrying  system  using  desolvation  technique.  Since  the  BSA  was  more permeable  in  the  cancer  cell,  the  combination  of  silimarin  in  BSA  was  expected  to increase  the  efficacy  of  silimarin  as  an  anti-cancer.      Standard  evaluations  of  BSA- silimarin nanoparticles include particle size and distribution, potential zeta, morphology of nanoparticles, crystallinity, thermal properties, infrared spectroscopy and efficiency of trapping and silimarin release profiles of BSA nanoparticles on 2 different media (HCl 0.1 N & PBS pH 7.4). BSA-silimarin nanoparticles have a particle size of 174.23 ± 13.94
nm; particle size distribution 0.185 ± 0.052; efficiency of snares 90.54 ± 0.098%; loading capacity  30.18  ±  0.036%  and  zeta  potential  -1.62  mV.  Results  of  analysis  using  DSC (differential  scanning  calorimetry),  XRD  (X-ray  diffraction)  and  infrared  spectroscopy showed that silimarin nanoparticles was successfully encapsulated in BSA nanoparticles whereas the BSA-silimarin have an amorphous form.  After  1 hour of release test, there were 21.89% of silymarin released in 0.1 N HCl and 54.84% of silymarin were released in  PBS  pH  7.4.    It  can  be  concluded  that  silimarin-BSA  has  good  solubility  in  water. Therefore, further study is recommended to assess activity and in vivo behavior to confirm in vitro data.
Keywords: Nanoparticle, Silimarin, BSA, Desolvation, Albumine, Desolvating agent

## PENDAHULUAN
Silimarin       merupakan       senyawa flavonolignan  yang  berasal  dari  tumbuhan
Silybum  marianum (Asteraceae)  yang memiliki efek farmakologi sebagai antikanker,  dan  hepatoprotektor.  Namun silimarin  memiliki  kelarutan  yang  rendah dalam air sekitar 0,04 mg/mL (Snima dkk., 2014).  Berbagai  upaya  telah  dilakukan untuk  mengatasi masalah silimarin  sebagai obat. Pada penelitian ini  perbaikan ketersediaan  hayati  silimarin  dilakukan dengan pendekatan sistem pembawa berbasis teknologi nano untuk
mengenkapsulasi silimarin.
Berbagai   sistem  pembawa   tersedia untuk  proses  enkapsulasi  suatu  obat  yang bermasalah  baik  dalam  formulasi  maupun penghantarannya.  Pada  penelitian  ini, dipilih protein,  yaitu serum albumin.  Dasar pertimbangan  pemilihan  albumin  sebagai sistem pembawa
adalah: inert, biokompatibel,  relatif  murah,  mempunyai kemampuan membentuk nanopartikel dengan  berbagai  teknik, serta  yang terpenting  adalah  kemampuan  terpenetrasi lebih  baik  dan  lebih  banyak  ke  sel  kanker dibandingkan sel normal. Sehingga,
pemilihan albumin    sebagai sistem
pembawa silimarin diharapkan dapat meningkatkan    efek    antikanker    dari silimarin   ( active   targeting ) (Yuan   dkk., 2013).
Banyak      terapi      kanker      secara konvensional          masih          menghadapi
permasalahan  yaitu  akumulasi non spesifik dalam jaringan sel  kanker. Dengan demikian, BSA sebagai pembawa diharapkan  akan  meningkatkan  akumulasi silimarin  ke  sel  kanker  dan  menekan distribusinya   ke   sel   normal.   Beberapa teknik  pembuatan  albumin  nanopartikel, diantaranya teknik desolvasi dan emulsifikasi.  Kekurangan  dari  metode emulsifikasi  adalah  penggunaan  pelarut organik  dan  surfaktan  sebagai  penstabil sistem  emulsi.  Keduanya  sangat  sulit dihilangkan  pada  saat  proses  preparasi nanopartikel  albumin  (Langer,        2003). Maka dipilih menggunakan teknik desolvasi.    Teknik    desolvasi    pada prinsipnya adalah mengubah kelarutan dari albumin di dalam air, dengan menambahkan faktor
pendesolvasi.
Kemudian  ditambakan cross-link untuk meningkatkan  rigiditas  dari  nanopartikel yang terbentuk.
Pada        penelitian        ini,        akan dikembangkan sistem pembawa nanopartikel berbasis albumin untuk silimarin, dengan teknik desolvasi.
Karakterisasi  kemudian  dilakukan  pada nanopartikel yang dibuat.

## METODE PENELITIAN Bahan
Silimarin   (Sigma   Aldrich),   BSA (Sigma Aldrich), NaOH, Aseton, Glutaraldehid  (Merck),  HCl,  dapar  fosfat
pH 7,4 (komponen penyusun dapar : KCl, NaH 2 PO 4 , NaCl, dan Na 2 HPO 4 ) analisis     termal     dengan     DSC,     dan difraktometri sinar-X. Alat
Neraca  Analitik  (Mettler  Toledo ®
Evaluasi     Pelepasan     Silimarin     dari Nanopartikel  BSA-Silimarin  secara  In
XS205),   pengaduk   magnetic  , stirrer, vitro
sonikator  tipe bath (Krisbow  ultrasonic
Uji pelepasan silimarin dari Cleaner),  alat  analisis  ukuran partikel dan zeta  potensial  (Delsa TM Nano  C  Particle Analyzer,  Beckman  Coulter),  pH  meter (Mettler Toledo ® S20), Scanning Electron
Microscope , Difraktometer sinar-X (Bruker, 8D Advance),  jarum suntik 1  mL (Terumo),    Spektrometer    inframerah (FTIR-Shimadzu  8501),  Spektrofotometer UV  (Beckman  DU  7500i),  Vortex  Mixer (IKA ® MS 3 digital), alat mikrosentrifuga (Hsiang   Tai),   tabung    mikrosentrifuga, kuvet disposable ,  dan  alat  gelas  lain  yang umum digunakan di laboratorium.
Pembuatan         Nanopartikel         BSA mengandung Silimarin
Formula  optimum  pada  pembuatan nanopartikel BSA digunakan untuk membuat nanopartikel BSA yang
mengandung  silimarin.  Berbagai  jumLah silimarin (7,5; 15; dan 30 mg) ditambahkan ke  larutan  BSA,  selanjutnya  dilakukan proses yang sama dengan proses pembentukan    nanopartikel    albumin blanko.

## Karakterisasi Nanopartikel
Karakterisasi     fisika     nanopartikel meliputi ukuran partikel, indeks polidispersitas,  zeta  potensial,  morfologi nanopartikel,      spetroskopi     inframerah,
nanopartikel     BSA-silimarin     dilakukan pada  dua  medium  yang  berbeda  PBS  pH 7,4 (simulasi cairan darah)  dan HCl 0,1 N (simulasi cairan lambung) pada suhu 37°C, kecepatan  pengadukan  100  rpm,  selama  1 jam.  Pada  interval  waktu  yang  ditentukan (15;  30;  45;60  menit)  diambil  cuplikan sampel  sebanyak  4  mL,  dan  ditambahkan medium  kembali  sebanyak  4  mL  agar volume  mediumnya  tetap.  Kadar  silimarin ditentukan dengan menggunakan Spektrofotometer UV pada panjang gelombang 288 nm.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ukuran,   Indeks   Polidispersitas,   Zeta Potensial,    Efisiensi    Penjeratan,    dan Loading Capacity
Pada  tahapan  optimasi  pemuatan silimarin  ke  dalam  nanopartikel  albumin, semakin  banyak  jumLah  silimarin  yang ditambahkan menghasilkan ukuran nanopartikel  yang  lebih  besar.  Silimarin yang  ditambahkan  sebanyak  7,5  ;15  ;dan 30  mg  memberikan  efisiensi  penjeratan berturut-turut   90,39   ±   0,157;   90,54   ± 0,098;   dan   89,75   ±   1,317   %. Loading
Capacity nya  secara  berturut-turut  adalah 18,076 ± 0,030; 30,18 ± 0,036; dan 44,88 ± 0,666 %.

## Tabel 1. Pengaruh JumLah Silimarin terhadap Karakteristik Nanopartikel BSA- silimarin
JumLah Zat Aktif (mg) Ukuran Nanopartikel (nm) Indeks Polidispersitas Zeta potensial (mV) Efisiensi Penjeratan (%) Loading Capacity (%) - 114,27± 11,24 0,269 ± 0,118 -0,10 - - 7,5 121,47 ± 1,167 0,177 ± 0,069 -0,65 90,39 ± 0,157 18,076 ± 0,030 15 174,23 ± 13,94 0,185 ± 0,052 -1,62 90,54 ± 0,098 30,18 ± 0,036
30 313,77 ± 13,36 0,297 ± 0,036 -2,11 89,75 ± 1,317 44,88 ± 0,666 Scanning Electron Microscopy
Gambar 1. Pengamatan SEM  nanopartikel BSA-silimarin perbesaran 80.000x (C)Fotomikrograf SEM di atas menunjukkan bahwa nanopartikel BSA- silimarin memiliki bentuk morfologi berupa partikel sferis, walaupun terlihat kohesif karena sifat adesif dari BSA.

## Spektroskopi Inframerah
Prosedur         pengujian         analisis spektroskopi inframerah untuk
nanopartikel  BSA,  nanopartikel  BSA- Silimarin,  BSA  dan  silimarin  tidak dilakukan  penggerusan,  hal  ini  bertujuan untuk menjaga keutuhan sistem.  Dari hasil overlay menunjukkan  bahwa  pita-pita spektrum     antara     Nanopartikel     BSA-
Silimarin mirip dari nanopartikel BSA, dan tidak  terlihat  lagi  puncak  dari  silimarin.
Hal  ini  menunjukkan  bahwa  silimarin berada  dalam  nanopartikel  sehingga  tidak terdeteksi. Untuk memastikan hasil tersebut,  maka  dilakukan  karakteristik selanjutnya  yaitu  Difraktometri  Sinar-X,
dan Analisis Termal DSC.
Gambar 2. Spektrum Inframerah Nanopartikel BSA, Nanopartikel BSA-Silimarin, BSA, & Silimarin

## Difraktrometri Sinar-X
Difraktogram  dari  Silimarin  terlihat puncak  puncak  difraksi  yang  tajam  dan kuat,  dan  juga  terdapat  puncak-puncak dengan intensitas yang rendah. Difraktogram  nanopartikel  BSA-silimarin
terlihat puncak difraksi sinar-X yang lebar, ini    menunjukkan    bahwa    nanopartikel BSA-silimarin  bersifat  amorf  (77,3%). Difraktogram  nanopartikel  BSA-silimarin menunjukkan  adanya  peningkatan  puncak difraksi pada  θ  yang  ke  10,  dibandingkan
dari  difraktogram  nanopartikel  BSA.  Dari hasil overlay ,  difraktogram  nanopartikel BSA-silimarin  menunjukkan  pola  yang sama  dengan  difraktogram  dari  BSA  dan nanopartikel          BSA          dibandingkan
difraktogram  dari  silimarin, hal  ini menunjukkan  bahwa  silimarin  berada  di dalam    sistem    nanopartikel    BSA    (Ding dkk., 2013).
Gambar 3. X-ray difaktrogram Nanopartikel BSA, Nanopartikel BSA-Silimarin, BSA,
& Silimarin

## Analisis termal (DSC)
Pada    nanopartikel    BSA-silimarin terdeteksi   adanya   Tg   pada   temperatur 28,25°C,      puncak      endotermik      pada 62,32°C.  Sedangkan  pada  BSA  terdeteksi adanya  Tg  pada  temperatur  34,51°C  dan puncak      endoterm      pada      temperatur 71,86°C.  Menurut  Lai  dkk.  (2000),    Tg pada  suhu  sekitar  30°C  adalah  sub  Tg sedangkan  pada  temperatur  yang  lebih tinggi  disebut  Tg.  Nilai  sub  Tg  dapat berhubungan  dengan  kandungan  lembab dari  sampel  yang  dianalisis        dimana penurunan    nilai    tersebut    berhubungan
dengan  peningkatan  aktivitas  air  pada sampel.  Terjadi  penurunan  Tg  pada nanopartikel  BSA  dan  Nanopartikel  BSA- silimarin  dibandingkan  dengan  Tg  BSA nya. Hal ini menunjukkan kelembaban dari Nanopartikel  yang  terbentuk  lebih  tinggi karena pada pembuatan nanopartikel dengan  teknik  desolvasi  menggunakan  air sebagai pelarut dari BSA. Puncak endotermik  dari  Silimarin  tertutupi  oleh BSA  dalam  Nanopartikel  BSA-Silimarin, hal  ini  mengindikasikan  bahwa  Silimarin terenkapsulasi oleh BSA.
Gambar 4. Profil DSC dari Nanopartikel BSA, Nanopartikel BSA-Silimarin, BSA,

## & Silimarin
Evaluasi Pelepasan Zat Aktif Secara In

## Vitro
Pada  umumnya,  kecepatan  pelepasan obat  bergantung  pada  kelarutan,  desorpsi permukaan, difusi melalui matriks polimer dan degradasi matriks nanopartikel (Mahapatro  dan  Singh,            2011).  Dari Gambar  5  dapat  dilihat  jumLah  Silimarin yang terlepas pada medium HCl (mensimulasikan cairan lambung)  pada 15 menit  pertama  terlepas  sebesar  5,40%; kemudian berlanjut  30 menit  10,  96%; 45
menit  terlepas 16,63%; dan pada menit  ke 60  terlepas  sebesar  21,89  %.  Diharapkan silimarin  tidak  terlepas  dalam  cairan lambung.  Hasil  uji  menunjukkan  bahwa silimarin terlepas, meskipun <25% setelah 1 jam.  Sistem nanopartikel BSA-silimarin diharapkan  terabsorpsi  secara  utuh.  Akan tetapi  jika  diperhatikan  dari  ukurannya (>100 nm), sulit sistem ini bisa terabsorpsi melalui jalur paraseluler, sehingga pemberian oral perlu dipertimbangkan.
Gambar 5. Profil pelepasan in vitro dari Nanopartikel BSA-Silimarin
Tabel 2. Hasil Uji Pelepasan Silimarin
Waktu (menit) JumLah Silimarin  yang terlepas (%) PBS pH 7,4 HCl 0,1 N 15 13,54 ± 1,326 5,4 ± 3,239 30 27,55 ± 2,39 10,96 ± 6,838 45 41,59 ± 4,427 16,93 ± 8,052 60 54,84 ± 5,916 21,89 ± 10,722
Alternatifnya  adalah  melalui  rute intramuskular.  Oleh  karena  itu,  dilakukan juga  uji  pelepasan  dalam  medium  PBS pH7,4  (simulasi  dalam  darah).  Pada medium  PBS  pH  7,4  jumLah  Silimarin yang  terlepas  pada  menit  ke  15  pertama adalah  sebesar  13,54%;  30  menit  sebesar 27,55%; pada menit ke 45 terlepas sebesar 41,59%;  dan  pada  menit  ke  60  terlepas sebesar 54,84 %. Setelah 1 jam pemberian, Silimarin  yang  lepas  sebesar  54,84%, jumLah  yang  cukup  besar  jika  sistem nanopartikel    BSA-silimarin    diinginkan
untuk  tujuan  bertarget  ke  sel  kanker.  Jika waktu distribusi nanopartikel BSA- silimarin menuju ke sasaran kurang dari 30 menit,  maka  tujuan  akumulasi  sistem  ini akan  tercapai  dan  diharapkan  setelah mencapai sel kanker, sistem akan mengalami  endositosis  diperantarai  oleh reseptor  spesifik  BSA  dan  melepaskan silimarin  intraseluler.  Untuk  membuktikan dugaan  ini,  perlu  dilakukan  kajian  yang lebih mendalam.

## SIMPULAN
Nanopartikel  BSA  dengan  teknik desolvasi  menggunakan  aseton  berhasil mengenkapsulasi  silimarin.  Karakteristik sistem ini adalah memiliki ukuran partikel 174,23 ± 13,94 nm;  indeks polidispersitas 0,185 ± 0,052; efisiensi penjeratan 90,54 ± 0,098 %; loading capacity 30,18 ± 0,036 % dan zeta potensial -1,62 mV. Hasil analisis menggunakan DSC,  Difraktometri sinar-x, dan  spektroskopi  inframerah  menunjukan bahwa  silimarin  berada  di  dalam  sistem nanopartikel BSA.

## DAFTAR PUSTAKA
Ding, D., X. Tang, X. Cao, J. Wu, A. Yuan
Q.   Qiao, J. Pan, J. Hu. 2014. Novel Self-assembly endows  human serum albumin nanoparticles with an enhanced antitumor efficacy. American Association of Pharmaceutical Scientists. 5(1): 213-
22.
Lai,  Y.C.,  P.H.  Sung  dan  J.T.  Chen,  J.T.
2000.  Evaluation  of  compability  of rice   strach   and   pectins   by   glass transition and sub-tg endotherms and the   effect   of   compability   on   gel
viscosity   and   water   loss. Cereal Chem. 77(5): 544-550.
Langer,   K.,   S.  Balthasar,  V.  Vogel,  N. Dinauer,  H.  Von  Briesen  dan Schubert,  D.  2003.  Optimization  of the  preparation  process  for  human serum albumin  (HSA)  nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics. 257.  169–180.
Mahapatro,   A.   dan   D.K.   Singh.   2011. Biodegradable     nanoparticles     are excellent  vehicle  for site directed in- vitro  delivery of drugs  and  vaccines.
Journal      of      Nanobiotechnology . 9(55): 1-11.
Snima, K.S., P. Arunkumar, R. Jayakumar, V.K.  Lakshmanan.  2014. Silymarin encapsulated poly ( D , L - lactic - co - glycolic              acid ) nanoparticles : a prospective  candidate for prostate cancer  therapy. J.  Biomed. Nanotechnol. 10: 559-570.
Yuan,  A.,  J.  Wu,  C.  Song,  X.  Tang,  Q. Qiao,  L.  Zhao,  G.  Gong dan Y.  Hu. 2013.     A     Novel     Self-Assembly Albumin  Nanocarrier  for  Reducing Doxorubicin-Mediated Cardiotoxicity. Journal of Pharmaceutical  Sciences. 102 ( 5 ):
1626-1635.