Identifikasi Isolat Ekstrak Etanol Kulit Batang Rhizophora apiculata Blume dan Rhizophora mucronata Lam Serta Sitotoksisitasnya Terhadap Sel MCF-7 dan T47D
Identification of Ethanol Extract Isolate of Rhizophora apiculata Blume and Rhizophora mucronata Lam Stem Bark and Their Cytotoxicity on MCF-7 and T47D Cells
Joko Kristianto 1 , Haryoto Haryoto 1,2 , Peni Indrayudha 1,2*
1 Program Studi Magister Farmasi, Sekolah Pasca Sarjana, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Jl. A. Yani Tromol Pos I Pabelan Sukoharjo 57162, Indonesia
2 Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Jl. A. Yani Tromol Pos I, Pabelan Kartasura, Sukoharjo 57162, Indonesia *E-mail: peni.indrayudha@ums.ac.id
Received: 06 Juni 2020; Accepted: 17 Juni 2021; Published: 30 Juni 2021

## Abstrak
Tanaman mangrove sebagai obat tradisional telah lama digunakan oleh masyarakat untuk terapi penyakit antikanker.  Tumbuhan  mangrove  belum  banyak  diteliti  potensinya  sebagai  antikanker.  Ekstrak  metanol kulit  batang R.  mucronata diketahui  memiliki  aktivitas  sitotoksik  pada  sel  Myeloma.  Penelitian  ini bertujuan untuk menentukan isolat dari fraksi Etil asetat ekstrak metanol kulit batang R. mucronata dan R. apiculata dan mengkaji potensi aktivitas sitotoksik terhadap sel MCF-7 dan T47D. Serbuk kulit batang R. mucronata dan R. apiculata diekstraksi dengan metanol dengan cara maserasi kemudian ekstrak metanol difraksinansi  berturut-turut  dengan  n-heksana,  etil  asetat,  dan  metanol.  Fraksi  etil  asetat  kemudian dipurifikasi dengan Kromatografi Kolom Tekan (KKT) dengan diameter 2 cm dan tinggi 30 cm dengan fase diam berupa Silica Gel 60 (0,063-0,2 mm) Merck 7734 dan eluen n-heksana:etil asetat (6:4, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1) dan n-heksana:metanol (9,5:0,5) masing-masing 10 ml.  Eluat yang menghasilkan jumlah dan pola  noda  yang  sama  digabungkan  menjadi  satu  isolat.  Selanjutnya  eluat  diuapkan  pada  suhu  kamar. Kemudian hasil purifikasi dari ekstrak R, mucronata diisolasi menggunakan KLT preparatif dengan fase diam silika gel GF254 0,25 mm dan fase gerak n-heksan:etil asetat (6:4), sedangkan ekstrak R. apiculata dengan fase gerak n-heksan:etil asetat (5:5). Hasil pemisahan noda senyawa dikerok dan dipisahkan dari fase diam menggunakan pelarut. Senyawa isolat dicek kemurnian menggunakan KLT fase diam silika gel GF254  0,25  mm.  Hasil  uji  kualitatif  fraksi  etil  asetat  kulit  batang R.  apiculata tersebut  dengan spektrofotometer  NMR  terdapat  senyawa cis -3-(3,5-dihidroksifenil)  akrilik  acid,  sedangkan  fraksi  Etil asetat kulit batang R.mucronata terdapat senyawa n-heksan-3-ol. Uji sitotoksisitas ekstrak etanol, fraksi n- heksana,  fraksi  etil  asetat  dan  ekstrak  etanol  dilakukan  terhadap  sel  MCF-7  dan  T47D  dengan  metode MTT.  Hasil  penelitian  bahwa  ekstrak  etanol,  fraksi  n-heksana,  fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  etanol  dari ekstrak etanol kulit batang R. mucronata dan R. apiculata berdasar aktifitas sitotoksik tidak aktif terhadap sel MCF-7 dan T47D.
Kata Kunci :  Isolat aktif , R. mucronata , R. apiculata , sitotoksik, sel MCF-7 dan T47D

## Abstract
Mangrove plants as traditional medicine have long been used by the society for the therapy of anticancer diseases.  So  far,  the  potency  of  mangrove  plants  as  anticancer  has  not  been  studied  intensively.  The methanol extract of R. mucronata stem bark has cytotoxic activity on myeloma cells. This study aims to determine the isolates of the ethyl acetate fraction of the methanol extract of the stem bark of R. mucronata and R. apiculata, and to examine the potency of cytotoxic activity against MCF-7 and T47D cells. The powder of the stem bark of R. mucronata and R. apiculata were extracted with methanol by maceration, and then the methanol extract was fractionated consecutively using n-hexane, ethyl acetate, and methanol. Ethyl acetate fraction was then purified by column chromatography with a diameter of 2 cm and a height of  30  cm  with  a  static  phase  in  the  form  of  silica  gel  60  (0.063-0.2  mm)  Merck  7734  and  eluent  n- hexane:ethyl acetate (6: 4, 5: 5, 6: 4, 7: 3, 8: 2, 9: 1) and n-hexane: methanol (9,5: 0,5) 10 ml each. The
eluates that produce the same number and pattern of stains were combined into one isolate. Then the eluate was  evaporated  at  room  temperature.  Then  the  purification  results  of  the  extract  R.  mucronata  were isolated using preparative TLC with 0.25 mm GF254 silica gel as static phase and n-hexane mobile phase: ethyl acetate (6: 4), while the apiculata extract with n-hexane mobile phase: ethyl acetate (5: 5). The results of  the  stain  separation  of  the  compound  were  scraped  off  and  separated  from  the  static  phase  using  a solvent. The purity of isolates compound was examined using TLC in the static phase of silica gel GF254 0.25 mm. The qualitative test results of the ethyl acetate fraction of R. apiculata stem bark with an NMR spectrophotometer  showed  a  composition  of  cis-3-  (3,5-dihydroxyphenyl)  acrylic  acid,  while  the  ethyl acetate  fraction  of R.  mucronata  stem  bark  contained  n-hexan-3-ol  compounds.  The  cytotoxicity  test  of ethanol extract, n-hexane fraction, ethyl acetate fraction and ethanol extract was carried out on MCF-7 and T47D cells using the MTT method. The results proved that the ethanol extract, n-hexane fraction, ethyl acetate fraction and ethanol fraction from the ethanol extract of R. mucronata and R. apiculata stem bark, based on cytotoxic activity, were inactive against MCF-7 and T47D cells.
Keywords : Active isolate, R. mucronata, R. apiculata, cytotoxic, MCF-7 and T47D cells

## PENDAHULUAN
Angka  kejadian  penyakit  kanker  di Indonesia (136,2/ 100.000 penduduk) berada pada urutan 8 di Asia Tenggara, sedangkan di Asia  urutan  ke  23.  Angka  kejadian  untuk perempuan  yang  tertinggi  adalah  kanker payudara  yaitu  sebesar  42,1  per  100.000 penduduk  dengan  rata-rata  kematian  17  per 100.000 penduduk (Kemenkes RI, 2019).
Pembedahan dan radiasi dilakukan untuk mengobati  penyakit  kanker,  namun  terbatas pada  kanker  lokal  stadium  awal  dan  tidak efektif pada kanker stadium lanjut yang telah mengalami  metastasis.  Pengobatan  kanker dengan obat (kemoterapi) hanya efektif untuk beberapa periode dan belum mampu memberikan  hasil  yang  memuaskan.  Oleh karena  itu,  pemilihan  alternatif  terapi  yang aman,  efektif  dan  selektif  pada  penyakit kanker  sangat  penting  seperti  penggunaan obat tradisional (Ma’at, 2003), terutama dari tumbuhan contohnya mangrove.
Tumbuhan  mangrove  sangat  banyak tumbuh  di  daerah  pesisir  pantai.  Sebagian besar dari tumbuhan mangrove belum banyak digunakan  sebagai  bahan  obat.  Namun ekstrak  dan  bahan  mentah  dari  tumbuhan mangrove  telah  digunakan  oleh  masyarakat pesisir untuk keperluan pengobatan tradisional. Hutan mangrove di pantai Cilacap mencapai  15.145  hektar,  dengan  17  jenis tumbuhan mangrove (Hadiyati, 2000) diantaranya Rhizophora sp.
Tumbuhan mangrove merupakan sumber bahan obat tradisional yang dapat digunakan sebagai sumber senyawa bioaktif di antaranya golongan  tanin,  saponin,  terpenoid,  alkaloid dan  steroid  sebagai  antimikroba,  antifungi, antivirus, antitumor, insektisida dan antileukemia.  Bagian  tumbuhan  yang  dapat digunakan  sebagai  antikanker  adalah  kulit batang, akar, daun, bunga dan buah. Senyawa metabolit sekunder sebagai senyawa komponen  bioaktif  yang  ditemukan  belum memberikan  informasi  mengenai  senyawa yang  paling  berperan  sebagai  senyawa metabolit sekunder utama (Soetarno, 2000).
Hasil penelitian Harwoko (2010) menunjukkan bahwa fraksi n-heksana: kloroform  dari  ekstrak  metanol  kulit  batang Rhizophora  mucronata bersifat  sitotoksik pada  sel  myeloma  dengan  nilai  IC 50 sebesar 15  µg/mL  dan  hasil  uji  kualitatif  fraksi tersebut mengandung senyawa flavonoid dan terpenoid.
Hasil uji fotokimia ekstrak metanol pada kulit  batang  bakau  positif  mengandung alkaloid, flavonoid dan tanin. Tanin merupakan  senyawa  utama  dari  tumbuhan bakau Rhizophora  apiculata yang  diketahui dapat  menangkal  efek  stres  oksidatif  yang disebabkan  oleh  radikal  bebas  (Berawi  dan Marini, 2018)
Penelitian  terhadap  tanaman  mangrove famili  Rhizophora,  di  antaranya  spesies R. apicullata dan R.  mucronata belum  banyak dilaporkan, terutama kajian senyawa
kimianya yang berpotensi sebagai antikanker. Berdasarkan  latar  belakang  tersebut  di  atas maka  perlu  dilakukan  penelitian  untuk melakukan  penentuan  isolat  aktif  dan aktivitas  sitotoksisitas  ekstrak  etanol  kulit batang R.  apicullata dan R.  mucronata sebagai  antikanker  melalui  uji  sitostoksik terhadap sel MCF-7 dan T47D.

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat  uji  yang  digunakan  timbangan analitik (Ohaus), mikropipet (Socorex), stirrer (Big  Squid  IKA  Werke),  oven, autoclave, homocytometer, rotary evaporator , inkubator CO 2 (Binder),  tangki  nitrogen  cair, Laminar Air  Flow ,  96- well  plate ,  ELISA reader (Biotex  ELx800),  UV  254  nm  dan  UV  366 nm, Spektroskopi NMR (Agilent 500 Mhz).
Bahan uji adalah serbuk kulit batang R. apiculata dan R.  mucronata yang  diperoleh dari  Cilacap,  etanol  96%,  n-heksana,  etil asetat, sel T47D dan MCF7, RPMI ( Rosewell Park  Memorial  Institue )  1640,  DMEM, NaHCO 3 , DMSO 100%, alkohol 80%, tripsin 0,025%,  FBS  10%,  PBS  ( Phosphat  Buffer Saline ), larutan MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2- il) difenil tetrazolium bromida) 0,5%, larutan SDS (Sodium Dodesil Sulfat) 10%, alumunium foil.

## Jalannya Penelitian
Sampel  kulit  batang  mangrove  berasal dari  Kawasan  Konservasi  Hutan  Mangrove Kabupaten  Cilacap.  Kulit  batang  mangrove Rhizophora sebanyak  3  kg  berat  kering dihaluskan  menggunakan  blender,  hingga diperoleh serbuk kulit batang mangrove.

## Ekstraksi
Simplisia  sebanyak  500  g  diekstraksi secara  maserasi  menggunakan  2,5  L  etanol 96%  selama  24  jam.  Maserat  kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat dan residu. Residu  diremaserasi  dan  diberi  perlakuan yang  sama  selama  24  jam  hari  berikutnya sampai  hari  ketiga  dan  diperoleh  filtrat berwarna  bening.  Filtrat  ditampung  dan
dipekatkan  menggunakan rotary  evaporator suhu 50 o C dengan kecepatan 250 rpm.

## Fraksinasi Ekstrak
Fraksinasi  dilakukan  dengan  partisi  cair- cair.  Sebanyak  50  gram  ekstrak  etanol  kulit batang  mangrove  dilarutkan  dalam  50  ml etanol  kemudian  dipartisi  dengan  pelarut dimulai  dari  n-heksana  50  ml  dan  etil  asetat 50  ml.  Fraksi  yang  didapatkan  kemudian dipekatkan di atas cawan porselin.
Isolasi  Fraksi  Etil  asetat  ekstrak  kulit batang R. mucronata
Fraksi  Etil  asetat  ekstrak  kulit  batang R. mucronata dipurifikasi menggunakan kromatografi  kolom  tekan  (KKT)  dengan diameter 2 cm dan tinggi 30 cm dengan fase diam  berupa  silica  gel  60  (0,063-0,2  mm) Merck  7734  dan  eluen  n-heksana:etil  asetat (6:4,  5:5,  6:4,  7:3,  8:2,  9:1)  dan  n-heksana: metanol  (9,5:0,5)  masing-masing  10  mL dengan  sistem  elusi  isokratik.  Pemisahan dilakukan  dengan  mengamati  pemisahan warna  pada  kolom  dan  menampung  setiap pemisahan pada wadah dengan volume 10 ml. Hasil purifikasi dicek profil KLT dan dilihat pada  UV  254  nm  dan  365  nm.  Eluat  yang sama  digabungkan  menjadi  satu  isolat. Selanjutnya  isolate  diuapkan  pada  suhu kamar.
Isolasi  dilakukan  dengan  menggunakan KLT  preparatif  dengan  fase  diam  silika  gel GF254  0,25  mm  dan  fase  gerak  hasil optimasi.  Hasil  pemisahan  noda  senyawa dikerok  dan  dipisahkan  dari  fase  diam menggunakan  pelarut  n-heksana:etil  asetat (6:4).  Senyawa  isolat  dicek  kemurnian menggunakan  KLT  fase  normal  silika  gel GF254 0,25 mm.
Isolasi  Fraksi  Etil  asetat  ekstrak  kulit batang R. apiculata
Fraksi  etil  asetat  ekstrak  kulit  batang R. apiculata dipurifikasi menggunakan kromatografi  kolom  tekan  (KKT)  dengan diameter 2 cm dan tinggi 30 cm dengan fase diam  berupa  silica  gel  60  (0,063-0,2  mm)
Merck  7734  dan  eluen  n-heksana:etil  asetat (6:4,  5:5,  6:4,  7:3,  8:2,  9:1)  dan  n-heksana  : metanol  (9,5:0,5) dengan  sistem  elusi isokratik.  Pemisahan  dilakukan  dengan mengamati pemisahan warna pada kolom dan menampung  setiap  pemisahan  pada  wadah dengan volume 10 mL. Hasil sub fraksi dicek profil KLT dan dilihat pada UV 254 nm dan 365  nm.  Eluat  yang  sama  digabungkan menjadi  satu  isolat.  Selanjutnya  isolat diuapkan pada suhu kamar.
Isolasi  dilakukan  dengan  menggunakan KLT  preparatif  dengan  fase  diam  silika  gel GF254  0,25  mm  dan  fase  gerak  hasil optimasi.  Hasil  pemisahan  noda  senyawa dikerok  dan  dipisahkan  dari  fase  diam menggunakan  pelarut  n-heksana:etil  asetat (5:5).  Senyawa  isolat  dicek  kemurnian menggunakan  KLT  fase  normal  silika  gel GF254 0,25 mm.

## Identifikasi Isolat
Indentifikasi  dari  hasil  Isolasi  fraksi etil  asetat  dianalisa  menggunakan  instrumen spektrofotometer
Nuclear
Magnetic Resonance (NMR)  =  Agilent  500  MHz dengan  sistem  konsol  DD2,  yang  beroperasi pada frekuensi 500 MHz (1H) dan 125 MHz (13C)  di  Laboratorium  Kimia,  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Institut Teknologi Bandung.
Spektrum 1 H-NMR  dan 13 C-NMR hasil pengukuran dianalisis dengan mendeteksi  lingkungan  kimia,  multiplikasi, rasio  jumlah  dan  jarak  antar  inti  atom berdasarkan momen magnetnya untuk memprediksi senyawa kimia pada sampel uji. Struktur  ini  dianalisa  prediksi  menggunakan software  nmrdb.org  sehingga  diperoleh spektrum sesuai prediksi software .

## Penyiapan Kultur Sel MCF7 dan T47D
Panen  sel  MCF7  dan  T47D  dilakukan jika  sel  sudah  80%  konfluen.  Sel  dibuang medianya  kemudian  sel  dicuci  dengan  PBS sebanyak 2 kali, dengan jumlah PBS yaitu ½ dari volume media awal. Kemudian ditambahkan Tripsin-EDTA (Tripsin  0,25%)
secara merata dan diinkubasi selama 3 menit. Selanjutnya media ± 5 mL ditambahkan untuk menghilangkan tripsin. Sel diamati di bawah mikroskop,  untuk  kemudian  sel  yang  telah terpisah dimasukkan dalam conical steril baru (CCRC,2009).

## Uji Sitotoksik
Suspensi  sel  MCF7  dalam  medium DMEM dan sel  T47D dalam medium  RPMI masing-masing  sebanyak  100  µL  dengan kepadatan  5x10 4 sel  dimasukkan  ke  dalam plate 96 dan diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO 2 5%. Setelah kultur sel MCF-7 dan  T47D  diinkubasi  selama  24  jam medianya  dibuang,  kemudian  dilanjutkan dengan perlakuan sampel.
Kemudian  100  µL  sampel  ditambahkan dalam medium pada tiap sumuran dengan seri konsentrasi ekstrak 15,625; 31,25; 62,5; 125; 250  µg/mL  dan  seri  konsentrasi  fraksi  7,81; 15,625;  31,25;  62,5;  125  µg/mL.  Plate diinkubasi  dalam  inkubator  CO 2 5%  selama 24 jam pada suhu 37 0 C. kontrol positif yang digunakan adalah doksorubisin.
Sebanyak 15 µL MTT 0,5% ditambahkan ke dalam PBS, kemudian diinkubasi selama 4 jam dalam inkubator CO 2 pada suhu 37°C. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk formazan  tidak  larut  yang  berwarna  ungu. Selanjutnya  larutan  stopper  SDS  dalam  HCl 10%  ditambahkan  dan  diinkubasi  selama  2 jam  jam  pada  suhu  ruang.  Serapan  dari formazan dibaca dengan ELISA reader pada panjang  gelombang  550  nm.  Persentase  sel hidup  dihitung  dari  data  absorbansi.  Kurva hubungan  log  konsentrasi versus log konsentrasi  dibuat  untuk  menghitung  nilai IC 50 nya (CCRC, 2013).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi  Isolat  Fraksi  Etil  Asetat  dari Ekstrak Etanol Kulit Batang R. apiculata Senyawa hasil isolasi  yang terdapat pada fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit batang R. apiculata telah dilakukan penelusuran strukturnya  menggunakan  spektrofometer NMR  dengan  hasil  spektrum 1 H-NMR
senyawa  1  dapat  dilihat  pada  Gambar  1, sedangkan  lingkungan  kimia,  multiplikasi, rasio  jumlah  dan  jarak  antar  inti  atom berdasarkan momen magnetnya dapat dilihat pada Tabel 1 . S inyal a merupakan proton pada cincin aromatik benzena yang muncul sebagai singlet  ( s )  menandakan  proton  ini  tidak mempunyai  proton  tetangga  non-ekivalen. Geseran  kimianya  (d)  nya  berada  di  daerah yang relatif upfield (6.18 ppm) untuk rentang proton  aromatik  (6-8  ppm).  Proton a ini kemungkinan  sangat  dekat  dengan  gugus pendonor elektron ( electron donating group / EDG)  seperti  OH  yang  mendonorkan elektronnya  kepada  proton  a  tersebut, sehingga  lebih  terlindungi  terhadap  medan
magnet  luar.  Sinyal b sedikit  banyak karakternya  mirip  dengan  sinyal a ,  yaitu singlet  dan  berada  di  daerah  yang  relatif upfield untuk  rentang  proton  aromatik. Namun,  dibandingkan  dengan  proton a , proton b ini  sedikit  lebih downfield (6.40 ppm).  Hal  ini  kemungkinan  karena  selain dekat dengan EDG seperti OH, proton ini juga dekat  dengan  gugus  penarik  elektron ( electron  withdrawing  group /  EWG)  seperti ikatan rangkap maupun gugus COOH. EWG akan  menarik  elektron  dari  proton  tersebut dan membuatnya menjadi kurang terlindungi terhadap  medan  magnet  luar  (McMurry, 2010).
Gambar 1 . Spektrum 1 H-NMR senyawa 1 berdasar eksperimen
Tabel 1. Profil 1 H-NMR dari senyawa 1 Sinyal d (ppm) Jumlah proton Multiplikasi J-J coupling constant (Hz) a 6.18 1 s - b 6.40 1 s - c 6.88 1 d 8.5 d 7.54 1 d 8.6 e 7.67 1 s - f 12.49 1 s -
Sinyal c muncul pada d yang lebih downfield (6.88  ppm)  dibandingkan  sinyal a dan b , kemungkinan  proton  ini  berada  di  daerah yang  lebih  dekat  dengan  EWG  yang  kuat seperti  ikatan  rangkap  vinilik,  benzena  atau COOH (Pavia et al., 2008). Sinyal c muncul sebagai puncak kembar (doublet/ d ) mengindikasikan keberadaan 1 proton tetangga  non-ekivalen.  Sinyal d sepertinya merupakan pasangan dengan sinyal c . Sinyal d juga muncul sebagai doublet mengindikasikan  adanya  1  proton  tetangga non-ekivalen,  namun  d-nya  lebih downfield (7,54  ppm)  dibandingkan  sinyal c .  Hal  ini kemungkinan  proton d lebih  dekat  dengan EWG  kuat  dibandingkan  proton c .  Rasio proton c dan d adalah  1:1  mengindikasikan kedua  proton  punya  jumlah  yang  sama. Berdasarkan J-J coupling constant , kedua proton ( c dan d )  merupakan  proton  vinilik  yang mempunyai konfigurasi cis karena mempunyai  J-J coupling  constant sebesar  8,5  dan 8,6  Hz.  Proton  vinilik  yang  mempunyai  J- J coupling constant pada  rentang  5-14  Hz mempunyai  konfigurasi cis ,  sedangkan  jika rentangnya 11-19 Hz mempunyai konfigurasi trans (Koyama et al., 1989). Sinyal e merupakan  proton  aromatik yang paling downfield (7.67 ppm), mengindikasikan  keberadaannya  yang  dekat dengan EWG. Proton ini mempunyai jumlah proton sebanyak 1 dan berbentuk singlet yang
mengindikasikan  ketiadaan  proton  tetangga non-ekivalen.  Sinyal f merupakan  proton yang paling downfield , tidak terlindungi dari medan  magnet  luar  sehingga  bergeser  ke  d 12.49  ppm.  Proton  di  daerah  ini  biasanya merupakan proton OH pada gugus karboksilat (COOH).  Proton  ini  berjumlah  satu  dan berbentuk  singlet  karena  tidak  mempunyai proton tetangga non-ekivalen.
Hasil analisa berdasar spektrum 1 H-NMR dan lingkungan kimia diperoleh hasil struktur senyawa  1  adalah cis -3-(3,5-dihidroksifenil) akrilik  acid  ditunjukkan  pada  gambar  2. Lingkungan  kimia  senyawa  1  ( cis -3-(3,5- dihidroksifenil) akrilik acid memiliki kesesuaian dengan spektrum analisis prediksi setelah  dianalisa  menggunakan  software (www.nmrdb.org)  seperti  pada  Gambar  3 yang  menunjukkan  adanya  gugus-gugus  dan lingkungan kimia yang sama dengan senyawa 1.
Gambar  2.  Struktur  molekul  senyawa  ( cis -3- (3,5-dihidroksifenil) akrilik acid
Gambar 3. 1 H-NMR Senyawa 1 berdasarkan software prediksi
( https://www.nmrdb.org/new_predictor/index.shtml?v=v2.115.0 )
Identifikasi  Isolat    Fraksi  Etil  Asetat  dari Ekstrak Etanol Kulit Batang R.mucronata Spektrum 1 H-NMR  untuk  senyawa  2 terlihat  cukup  kompleks  dengan  banyaknya multiplikasi  sinyal  yang  saling  bertumpang tindih  hal  ini  cukup  mempersulit  dalam menganalisisnya.  Sehingga,  untuk  analisis struktur  senyawa  ini  memungkinkan  untuk dimulai  menggunakan  spektrum 13 C-NMR terlebih dahulu. Spektrum 13 C-NMR senyawa 2  dapat  dilihat  pada  Gambar  4,  sedangkan lingkungan  kimia,  inti  atom  berdasarkan momen magnetnya dapat dilihat pada Tabel 2 . Proton  pada  gugus  fenol  biasanya  tidak muncul karena mudah mengalami polimerasi. Proton  ini  hanya  muncul  pada  konsentrasi sampel  yang  sangat  tinggi  namun  hanya berupa  puncak  tipis  dan  melebar  pada  d  3-7
ppm (Nerantzaki et al. , 2011). Sinyal pada 2.5 ppm  merupakan  kontaminasi  proton  pada pelarut DMSO-D 6 yang digunakan, sedangkan sinyal pada 3.4 ppm adalah proton H 2 O yang juga merupakan kontaminasi pada pelarut  deuterated  yang  bersifat  sangat higroskopis (Jones et al ., 2005).
Tabel 2. Profil lingkungan kimia 13 C-NMR dari senyawa 2 Sinyal d (ppm) a 6,7 b 22,4 c 24,2 d 29,3 e 36,1 f 61,9 Gambar 4. Spektrum 13 C-NMR senyawa 2 hasil eksperimen
Informasi  yang  didapat  dari  spektrum 13 C-NMR  biasanya  hanya  berupa  geseran kimia (d) mengingat 13 C kelimpahan di alam sangat kecil yaitu hanya 1,1% dan selebihnya adalah 12 C.  Sayangnya  hanya 13 C  yang mempunyai momen magnet dengan 12 C tidak mempunyai momen magnet. Hal ini menyebabkan 13 C tidak mengalami multiplikasi dan area serapannya tidak dapat
dihitung  rasio  jumlah  karbonnya  (Ward, 1999).
Spektrum 13 C-NMR pada Gambar 4 dan lingkungan  kimia,  multiplikasi,  rasio  jumlah dan jarak antar inti atom berdasarkan momen magnetnya pada Tabel 2 menunjukan sinyal a merupakan  karbon  yang  paling upfield menyerap  di  6.7  ppm  diikuti  sinyal b (22.4 ppm), c (24.2 ppm), d (29.3 ppm) dan e (36.1
ppm). Karbon-karbon ini biasanya merupakan karbon rantai alkil yang mengalami  pergeseran  kimia  seiring  dengan kedekatannya dengan gugus yang elektronegatif seperti OH. Sinyal f merupakan karbon  yang  paling downfield (61.9  ppm) mengindikasikan  karbon  ini  paling  dekat dengan atom yang elektronegatif seperti OH.
Data  spektrum 1 H-NMR  senyawa  2  dan lingkungan  kimia,  multiplikasi,  rasio  jumlah dan jarak antar inti atom berdasarkan momen magnetnya dapat dilihat pada pada gambar 5
dan tabel 3, sinyal a dan b pada 1 H-NMR mengindikasikan  2  tipe  proton  alkil  yang mempunyai  2  proton  tetangga  non-ekivalen, karena  muncul  sebagai  puncak  triplet  (t). Proton  ini  cukup  terlindungi  ( upfield ) sehingga  menyerap  radiasi  elektromagnetik pada berturut-turut 0.89 dan 0.96 ppm. Total jumlah  proton  keduanya  adalan  6  yang ditunjukkan  bilangan  integrasi  1.3  dan  5.4 pada  geseran  kimia  tersebut  yang  saling bertumpang  tindih  karena  dekatnya  geseran kimianya.
Gambar 5. Spektrum 1 H-NMR senyawa 2 eksperimen
Tabel 3. Profil 1 H-NMR dari senyawa 2 Sinyal d (ppm) Jumlah proton Multiplikasi a 0,89 3 t b 0,96 3 t c 1,30 2 m d 2,17 2 m e 2,36 2 m f 4,12 1 m g 5,34 1 s
Sinyal c juga masih bertipe proton alifatik namun lebih dekat dengan atom elektronegatif daripada proton a dan b karena sedikit  bergeser  ke downfield (1,30  ppm). Proton ini mempunyai 5 proton tetangga non- ekivalen  sehingga  muncul  sebagai  multiplet. Sinyal d dan e mempunyai  karakter  yang kurang  lebih  sama  namun  lebih downfield
(berturut-turut 2,17 dan 2,36 ppm) dibandingkan  proton c .  Proton  inipun  lebih menyerupai  multiplet  yang  agak  sulit dispesifikasi meskipun secara teori, proton d seharusnya berbentuk kuartet karena mempunyai  3  proton  tetangga  non-ekivalen sedangkan  proton e seharusnya  berbentuk kuintet karena mempunyai 4 proton tetangga
non-ekivalen. Untuk rasio jumlah proton pada proton c , d dan e tidak  bisa  dikuantifkasi dengan jelas karena saling bertumpang tindih, terutama dengan sinyal proton dari kontaminasi air pada pelarut CDCl 3 .
Sinyal f merupakan  proton  alkil  yang paling  dekat  dengan  atom  elekronegatif sehingga  bergeser  cukup downfield (4.12 ppm).  Proton  ini  mempunyai  4  proton tetangga  non-ekivalen  sehingga  muncul sebagai  multiplet.  Jumlah  proton  ini  tepat sesuai  prediksi  yaitu  sebanyak  1.  Sinyal g merupakan proton OH alkohol yang menyerupai  puncak  melebar  terserap  pada radiasi 5.34 ppm karena inti H berada dalam keadaan tidak terlindungi oleh medan magnet luar. Proton ini muncul sebagai puncak singlet
karena tidak mempunyai proton tetangga non- ekivalen.  Proton  yang  mengkontaminasi pelarut  deutarated  CDCl 3 muncul  pada  7.2 ppm.
Berdasarkan  hasil  analisis  kombinasi antara 1 H-NMR dan 13 C-NMR pada senyawa 2,  maka  struktur  molekul  tersebut  adalah n - heksan-3-ol  seperti  yang  diperlihatkan  pada Gambar 6.
Lingkungan kimia senyawa 2 ( n -heksan- 3-ol)  memiliki  kesesuaian  dengan  spektrum 13 C-NMR prediksi setelah dianalisa menggunakan  software  nmrdb.org  seperti pada Gambar 7, spektrum 1 H-NMR Senyawa 2  seperti pada  Gambar 8  yang menunjukkan adanya  gugus-gugus  dan  lingkungan  kimia yang sama .
Gambar 6. Struktur molekul senyawa 2 ( n -heksan-3-ol)
Gambar 7. Spektrum 13 C-NMR Senyawa 2 berdasarkan prediksi ( https://www.nmrdb.org/new_predictor/index.shtml?v=v2.115.0)
Gambar 8. Spektrum 1 H-NMR Senyawa 2 berdasarkan prediksi ( https://www.nmrdb.org/new_predictor/index.shtml?v=v2.115.0 )

## Uji Aktivitas Sitotoksik terhadap sel MCF- 7 dengan Metode MTT
Pengujian  aktivitas  sitotoksik  dalam penelitian  ini  menggunakan  metode  MTT assay  (mikrokultur  tetrazolium).  Metode  ini secara  prinsip  yaitu  mengukur  aktivitas dehidrogenase mitokondria pada sel-sel hidup
yang memiliki kemampuan untuk mengkonversi MTT menjadi formazan.
Hasil  aktivitas  antikanker  ekstrak  kulit batang R. apiculata dan R. mucronata , fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi etanol secara in  vitro pada sel  MCF-7 dapat  dilihat di Gambar 9.
Gambar 9. Grafik persentase sel MCF-7 hidup
Sitotoksisitas  sel  juga  dapat  dilakukan secara kualitatif dengan pengamatan morfologi sel. Kenampakan sel MCF-7 pada kontrol  negatif,  pemberian  sampel  dan kontrol  positif  (doksorubisin)  dapat  dilihat pada gambar 10, menunjukkan morfologi sel
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 50 100 150 200 250 300 Pers en ta se s el MCF -7 h id u p Konsentrasi (ppm) Fraksi EtOH R.apiculata Fraksi etil tasetat R.apiculata Doxorubicin Fraksi n-Heksana R.apiculata
Ekstrak Etanol R.apiculata Fraksi EtOH R.mucronata Fraksi etil tasetat R.mucronata
Fraksi n-Heksana R.mucronata
Ekstrak Etanol R.mucronata
MCF-7,  sel  hidup  ditandai  dengan  bentuk epitel  dan  berwarna  terang,  sedangkan  sel mati  ditandai  dengan  bentuk  bulat  dan berwarna gelap (tidak bercahaya). Morfologi sel  hidup  tampak  bersinar  cemerlang  dan
batas  membran  dengan  media  akan  terlihat jelas, sedangkan sel mati tampak bulat, gelap, tidak bercahaya dan membran selnya terlihat pecah atau agak samar.
.
( a )                                        ( b )                                        ( c )
Gambar 10. Morfologi sel MCF-7 (a) tanpa perlakuan (kontrol negatif), (b) perlakuan dengan doksorubisin (kontrol positif) dan (c) perlakuan dengan sampel fraksi non polar R. apiculata Sel MCF-7 hidup,         Sel MCF-7 mati
Hasil  uji  aktivitas  sitotoksik  sampel  uji dari  ekstrak,  fraksi  n-heksana,  fraksi  etil asetat  dan  fraksi  etanol R  apiculata dan R. mucronata terhadap  sel  MCF-7 ditunjukkan dengan  nilai  IC 50 sesuai  tabel  4.  Kontrol positif  doxorubicin  memiliki  kemampuan
menginhibisi  sel  MCF-7  dengan  nilai  IC 50 4,12x10 -2 μg/mL. menurut National  Cancer Institute bahwa  nilai  IC 50 <30  μg/mL menunjukkan  bahwa  doksorubisin  memiliki aktivitas  sitotoksik  yang  aktif  terhadap  sel MCF-7.
Tabel 4. Nilai IC 50 sampel uji terhadap sel MCF-7 Bahan Uji IC 50 (µg/mL) Keterangan NCI R. apiculata Blume: Ekstrak Fraksi n-Heksana Fraksi Etil asetat Fraksi Etanol >250 >125 >125 >125 Tidak aktif Tidak aktif Tidak aktif Tidak aktif R. mucronata Lam: Ekstrak Fraksi n-Heksana Fraksi Etil asetat Fraksi Etanol >250 >125 >125 >125 Tidak aktif Tidak aktif Tidak aktif Tidak aktif Doksorubicin 4,12 X 10 -2 Aktif Keterangan: * Potensi  antikanker  berdasarkan National  Cancer  Institute (NCI)  Amerika,  Aktif  (IC 50 <30 μg/mL), moderat aktif (30 μg/m ≤ C 50 < 100 μg/mL), tidak aktif (IC 50 ≥100 μg/mL)
Ekstrak,  fraksi  n-heksana,  fraksi  etil asetat,  dan  fraksi  etanol  kulit  batang R. apiculata dan R.  mucronata tidak  memiliki kemampuan menginhibisi sel MCF-7 dengan nilai  IC 50 >125  μg/mL,  menurut  NCI  bahwa nilai  IC50≥100  μg/mL  menunjukkan  bahwa semua  sampel  uji  tidak  aktif  terhadap  sel MCF-7
Uji Aktivitas Sitotoksik terhadap sel T47D dengan  Metode  MTT Hasil  aktivitas antikanker  ekstrak  kulit  batang R.  apiculata dan R. mucronata , fraksi n-heksana, etil asetat dan  metanol  secara in  vitro pada  sel  T47D dapat  dilihat  di  gambar  11.  Kenampakan morfologi  sel  T47D  pada  kontrol  negatif, pemberian  sampel  dan  kontrol  positif
(doksorubisin)  menunjukkan  morfologi  sel T47D sel hidup ditandai dengan bentuk epitel dan  berwarna  terang,  sedangkan  sel  mati ditandai  dengan  bentuk  epitel  tipis  dan
berwarna  gelap  (tidak  bercahaya),  membran selnya  terlihat  pecah  atau  agak  samar (Gambar 12) .
( a )                                        ( b )                                       ( c )
Gambar 12. Morfologi sel T47D (a) tanpa perlakuan (kontrol negatif), (b) perlakuan dengan doksorubisin (kontrol positif) dan (c) perlakuan dengan sampel fraksi non polar R. mucronata Sel T47D hidup,         Sel T47D mati
Tabel 5. Nilai IC 50 sampel uji terhadap sel T47D Bahan Uji IC 50 (µg/mL) Keterangan NCI R. apiculata Blume: Ekstrak Fraksi n-Heksana Fraksi Etil asetat Fraksi Etanol >250 >125 >125 >125 Tidak aktif Tidak aktif Tidak aktif Tidak aktif
R. mucronata Lam:
Ekstrak Fraksi n-Heksana Fraksi Etil asetat Fraksi Etanol >250 >125 >125 >125 Tidak aktif Tidak aktif Tidak aktif Tidak aktif Doksorubicin 7,50 X 10 -1 Aktif Keterangan: * Potensi antikanker berdasarkan National Cancer Institute (NCI) Amerika, Aktif (IC 50 <30 μg/mL), moderat aktif (30 μg/m ≤ C 50 < 100 μg/mL), tidak aktif (IC 50 ≥100 μg/mL)
Hasil  uji  aktivitas  sitotoksik  sampel  uji dari  ekstrak,  fraksi  n-heksana,  fraksi  etil asetat  dan  fraksi  etanol R  apiculata dan R. mucronata terhadap  sel  T47D ditunjukan dengan  nilai  IC 50 sesuai  Tabel  5.  Kontrol positif  doxorubicin  memiliki  kemampuan menginhibisi  sel  T47D  dengan  nilai  IC 50 7,50x10 -1 μg/mL.  Menurut National  Cancer
Institute
bahwa nilai IC 50
<30 μg/menunjukkan  doksorubisin  memiliki aktivitas  sitotoksik  yang  aktif  terhadap  sel T47D. Fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi etanol kulit batang R. apiculata dan R. mucronata tidak  memiliki  kemampuan menginhibisi  sel  T47D  (nilai  IC 50 >125 μg/mL),  sedangkan  ekstrak  memiliki  nilai
IC 50 >250 μg/mL. Menurut NCI bahwa nilai IC50≥100  μg/mL  menunjukkan  bahwa sampel uji tidak aktif terhadap sel T47D.
Nilai IC 50 ekstrak, fraksi n-heksana, fraksi etil  asetat,  dan  fraksi  etanol  kulit  batang R. apiculata dan R.  mucronata sesuai  dengan standar National Cancer  Institute (NCI) Amerika  yang  menyatakan  bahwa  standar efektivitas komponen bioaktif untuk melawan sel kanker harus lebih rendah dari 30 μg/mL. Dengan  nilai  IC 50 yang  sangat  tinggi,  maka ekstrak,  fraksi  n-heksana,  fraksi  etil  asetat, dan fraksi etanol kulit batang R. apiculata dan R.  mucronata tidak  memiliki  potensi  untuk dikembangkan  lebih  lanjut  sebagai  agen antikanker sel MCF-7 dan T47D.

## KESIMPULAN
Hasil isolasi dari fraksi etil asetat ekstrak etanol  kulit  batang R.  mucronata diperoleh senyawa n -heksan-3-ol.
Ekstrak  etanol  kulit  batang R.  apiculata yang  difraksinasi  dengan  etil  asetat  dan diisolasi  dengan  n-heksana:etil  asetat  (5:5)
diperoleh senyawa cis -3-(3,5-dihidroksifenil) akrilik acid.
Ekstrak  etanol,  fraksi  n-heksana,  fraksi etil  asetat  dan  fraksi  etanol  kulit  batang R. mucronata dan R.  apiculata berdasarkan aktivitas  sitotoksik  tidak  aktif  terhadap  sel T47D dan sel MCF-7
.

## Daftar Pustaka
Atun, S. 2014.  Metode isolasi  dan identifikasi  struktur senyawa organik  bahan  alam, Jurnal Konservasi Cagar Budaya Borobudur, Volume 8, Nomor 2, Desember 2014, Hal 53-61 Backer,  C.A.,  &  Van  DenBrink,  B.R.C.1963.  Flora  of  Java  (Spermatophytes  Only)  Vol  I, N.V.P. Noordhoff, Groningen
Bandaranayake,  M.  2002.  Bioactivities,  bioactive  compounds  and  chemical  constituents  of mangrove plants, Wetlands Ecology and Management 10 (6): 421-452
Berawi,  K.N.,  dan  Marini,  D.  2018.  Efektivitas  kulit  batang  bakau  minyak  ( Rhizopora apiculata ) sebagai antioksidan, Agromedicine, Volume 5, Nomor 1, Juni 2018 CCRC.  2009.  Prosedur  tetap  uji  sitotoksik  metode  MTT,  Cancer  chemoprevention  research center Farmasi UGM Yogyakarta, 6–9.
CCRC. 2014. Sel MCF-7, Terdapat di:http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/?page_id=1234 [Diakses pada 24 Januari 2020].
CCRC.  2014.  Sel  T47D,  Terdapat  di:http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/?page_id=1239  [Diakses pada 24 Januari 2020].
Diastuti,  H.,  Warsinah,  dan  Purwati.  2008.  Uji  aktivitas  antikanker  ekstrak  etanol  daun Rhizopora mucronata terhadap sel myeloma, Molekul, Vol. 3. No. 2. Nov, 2008: 63-70 Gerothanassis, I. P., Troganis, A., Exarchou, V., & Barbarossou, K. 2002. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy: basic principles and phenomena, and their applications to  chemistry, biology  and medicine. Chemistry Education Research and Practice, 3(2), 229-252.
Hadiyati,  T.  2000.  Zonasi  mangrove  pada  daerah  akresi  dan  non  akresi  di  Segara  Anakan Cilacap, Biosfera, A Scientific Journal. Vol 17
Harwoko  dan  Utami,  D.E.  2010,  Aktivitas  sitotoksik  fraksi  n-heksanaloroform  dari  ekstrak metanol  kulit  batang  mangrove  ( Rhizopora  mucronata )  pada  sel  kanker  myeloma, Majalah Obat Tradisional, 15(2), 51 – 55 https://www.kemkes.go.id/article/view/19020100003/hari-kanker-sedunia-2019.html https://www.nmrdb.org/new_predictor/index.shtml?v=v2.115.0
Jones, I. C., Sharman, G. J., & Pidgeon, J. 2005. 1H and 13C NMR data to aid the identification and  quantification  of  residual  solvents  by  NMR  spectroscopy. Magnetic  Resonance  in Chemistry, 43(6), 497-509.
Koyama, Y., Hosomi, M., Hashimoto, H., & Shimamura, T. 1989. 1H NMR spectra of the all- trans, 7-cis, 9-cis, 13-cis and 15-cis isomers of β-carotene: elongation of the double bond and shortening of the single bond toward the center of the conjugated chain as revealed by vicinal coupling constants. Journal of Molecular Structure, 193 , 185-201.
Ma’at, S. 2003. Tanaman obat untuk pengobatan kanker, Jurnal Bahan Alam Indonesia
Machana,  S,  Weerapreeyakul,  N.,  Barusrux,  S.,  Nonpunya,  A.,  Sripanidkulchai,  B., Thitimetharoch, T. 2011. Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal plants against the human hepatocarcinoma (HepG2) cell line. Chinese Medical Journal. 6(39): 1-8.
McMurry, J. E. 2010. Fundamentals of organic chemistry. Cengage Learning. Mingzhe Gao and Hongbin Xiao 2012, Activity-Guided isolation of antioxidant compounds from Rhizophora  apiculata,  17 ,  10675-10682;  doi:10.3390/molecules  170910675 www.mdpi.com/journal/molecules, Article, Molecules
Nerantzaki, A. A., Tsiafoulis, C. G., Charisiadis, P., Kontogianni, V. G., & Gerothanassis, I. P. 2011. Novel determination of the total phenolic content in crude plant extracts by the use of 1H NMR of the–OH spectral region. Analytica chimica acta, 688 (1), 54-60. Noor,  R.Y.,  Khazali,  M.,  dan  Suryadiputra,  I.N.N.  2006.  Panduan  pengenalan  mangrove  di Indonesia. PHKA/WI-IP, Bogor.
Pavia,  D.  L.,  Lampman,  G.  M.,  Kriz,  G.  S.,  &  Vyvyan,  J.  A.  (2008).  Introduction  to spectroscopy. Cengage Learning.
Rahim, A.A., Rocca, E., Steinmetz, J., Kassim, M.J. 2008. Antioxidant activities of mangrove Rhizophora apiculata bark extracts, Food chemistry, 200-27, American Cancer Society,
2017
Rajendra B Kakde, 2011, Cancer therapeutics opportunities, challenges and advances in drug delivery, Journal of Applied Pharmaceutical Science I (9): 1-10
Sastrohamidjojo, H. 2005. Kromatografi. Yogyakarta: Penerbit Liberty Sastrohamidjojo, H. 2007. Spektroskopi. Yogyakarta: Penerbit Liberty Soetarno, S. 2000. Potensi dan manfaat tumbuhan mangrove sebagai sumber bahan bioaktif,
ActaPharmaceutica Indones ia , 12 (4): 84- 103.
Sudjarwo, G.W., Mahmiah, Hukmiyah, M, 2017, Kandungan senyawa metabolit sekunder dari fraksi etil asetat kulit batang Rhizopora muronata L., Seminar Nasional Kelautan XII Ward, R. L. 1999. A complete introduction to modern NMR spectroscopy. Macomber, Rodger S.