## KARAKTERISTIK BAKTERI ASAM LAKTAT  (Lactobacillus sp) BIJI KAKAO
(Theobroma cacao L) YANG TELAH DIFERMENTASI
1) Andi Fatmawati
1) Akademi Analis Kesehatan Muhammadiyah Makassar Alamat Korespondensi: fatmawati.moe@gmail.com

## Abstrak
Telah dilakukan penelitian tentang Isolasi Dan Identifikasi bakteri asam laktat (Lactobacillus sp) Dari Biji Kakao (Theobroma cacao L) Yang Telah Difermentasi. Tujuan  penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengidentifikasi  bakteri asam laktat Lactobacillus sp dari biji kakao yang telah difermentasi. Metode penelitian meliputi sampel biji kakao yang di encerkan dengan pengenceran 10 -1 sampai dengan 10 -5 dengan menggunakan medium MRS Broth, lalu di inkubasikan pada suhu 37 o C selama 1 x 24 jam, kemudian di ambil 1 ml dari masing-masing pengenceran dan dilakukan penanaman pada  medium MRS Agar (De Man Rogosa and Sharpe Agar) dan di inkubasi pada suhu 37 o C selama 2 x 24 jam. Dari hasil penelitian, sampel 10 -1 di dapatkan koloni bakteri yang memiliki bentuk koloni yaitu bundar, bentuk tepian yang licin, bentuk elevasinya timbul dan memiliki warna koloni bakteri yaitu krem. Pada pengecatan gram, sampel 10 -1 bersifat gram positif yang memiliki bentuk sel batang dengan warna keunguan.
Kata Kunci: Fermentasi Biji Kakao, Lactobacillus sp.

## PENDAHULUAN
Tanaman   kakao  yang  memiliki nama  latin Theobroma  cacao merupakan tumbuhan  tahunan  (perennial)  berbentuk pohon. Tanaman kakao termasuk tanaman tahunan  yang  tergolong  dalam  kelompok tanaman  caulofloris,  yaitu  tanaman  yang dapat  berbunga  dan  berbuah  pada  batang dan  cabang.  Tanaman  ini  pada  garis besarnya  dapat  dibagi  atas  dua  bagian, yaitu bagian vegetatif yang meliputi akar, batang  serta  daun  dan  bagian  generatif yang  meliputi  bunga  dan  buah.  Tanaman ini merupakan tanaman perkebunan untuk rakyat  karena  sepanjang  tahun  dapat berbunga  dan  berbuah  (Kristanto.  A, 2008).
Sekitar  28,26%  produksi  kakao nasional dihasilkan dari Sulawesi Selatan. Produksi  kakao  di  Sulawesi    Selatan memberikan  sumbangsih  yang  cukup besar pada produksi kakao nasional, sebab lahan  Sulawesi  Selatan  yang  mendukung untuk  pertumbuhan  tanaman  kakao  ini. Namun  produksi  kakao  yang  besar  di Sulawesi Selatan, tidak diimbangi dengan mutu  kakao  yang  baik  pula.  (Deperinda, 2007).
Fermentasi merupakan proses
produksi  suatu  produk  dengan  mikroba
sebagai  organisme  pemroses.  Fermentasi biji kakao merupakan fermentasi tradisional yang melibatkan mikroorganisme  indigen  dan  aktivitas enzim  endogen.  Fermentasi  biji  kakao tidak  memerlukan  penambahan  kultur starter  (biang),  karena pulp /daging  kakao yang mengandung banyak glukosa, fruktosa,  sukrosa  dan  asam  sitrat  sudah dapat mengundang
terbentuknya pertumbuhan  mikroorganisme  sehingga terjadi fermentasi. (Bahri, 2002).
Selama  fermentasi,  di  dalam  biji kakao  akan  terjadi  penguraian  senyawa polifenol,  protein  dan  gula  oleh  adanya enzim  yang  akan  menghasilkan  senyawa calon  aroma,  perbaikan  cita  rasa  dan perubahan  warna.  (Widyotomo,  dkk, 2001).
Bakteri asam laktat (BAL) digunakan untuk fermentasi yang
menghasilkan  berbagai  produk  pangan yang  bertujuan  selain  mengawetkan,  juga mempunyai efek terapeutik. Bakteri asam laktat  (BAL)  sering  digunakan  sebagai kultur  probiotik  dalam  produk-produk fermentasi  susu  atau  produk  olahannya, fermentasi  daging  dan  fermentasi  buah seperti  kakao  atau  sayuran.  Beberapa genera bakteri dan yeast diusulkan sebagai
probiotik namun kebanyakan hanya
Lactobacillus dan Bifidobacterium yang sejauh  ini  diterima  untuk  makanan manusia.  Oleh  karena  itu,  upaya  seleksi dimulai  dengan  menskrinning  kedua bakteri  ini  dari  sumber  probiotik  dan seleksi terhadap isolat untuk mendapatkan isolat  paling  sesuai  dengan  lingkungan dalam  usus.  Isolat  bakteri  asam  laktat ternyata  dapat  mengambat  pertumbuhan Salmonella  typhi, melalui  pengaruh  pH untuk  menekan  bakteri Salmonella  typhi secara invitro (Soeharsono 2010).
Penelitian  oleh  Hermina  (tahun 2007), dari 198 koloni bakteri asam laktat ( probiotik) dari kakao yang difermentasi, lima  bakteri  yang  daya  tantangnya  cukup kuat  menghambat  pertumbuhan  bakteri patogen  (bakteri  jahat).  Lima  bakteri probiotik tersebut dikaji dan diidentifikasi karakternya.  Bakteri  itu  diuji  dengan bakteri-bakteri patogen seperti bakteri coli (penyebab  diare),  bakteri  kolera,  typus, dan  lain-lain.  Dari  Lima  bakteri  tersebut ternyata  satu  bakteri  daya  tantangnya cukup  kuat  menghambat  bakteri  patogen. Satu bakteri itu adalah bakteri Pediococcus pentosaceus ATCC  25745.  (Urnemi.E, 2013).
Berdasarkan  uraian  di  atas,  maka rumusan  masalah  dalam  penelitian  ini adalah    apakah  buah  kakao  yang  telah difermentasi,  mengandung  bakteri  asam laktat Lactobacillus sp . Sedangkan tujuan penelitian  ini  adalah  untuk  mengisolasi dan  mengidentifikasi  bakteri  asam  laktat Lactobacillus sp dari biji kakao yang telah difermentasi.

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat yang digunakan autoklaf, botol steril, cawan petri, deck glass, gelas kimia, gelas  ukur,  inkubator,  mikroskop,  jarum ose,  kantong  plastik,  kapas,  mikroskop, oven,  objek  glass,  pipet  tetes,  tabung reaksi.
Bahan  yang  digunakan  air  suling, alkohol  96%,  biji  kakao  yang  telah difermentasi, kristal  violet, larutan lugol,
medium MRSB (de Man, Ragosa, Sharpe Broth)  merk  A5810,  medium  MRSA  (de Man, Ragosa, Sharpe Agar) merk 7543, oil imersi, safranin.

## Sampel
Sampel  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  biji  kakao  yang  di ambil dari perkebunan Bantaeng.

## Prosedur Penelitian Sterilisasi Alat
Beberapa alat yang digunakan harus melalui  tahap  sterilisasi  yang  bertujuan untuk mematikan semua bentuk kehidupan mikroorganisme  yang  ada  pada  alat.  Alat lebih  dahulu  dicuci  dengan  deterjen  lalu dibilas dengan air suling. Alat-alat berupa gelas  disterilisasi  dalam  oven  pada  suhu 180 0 C selama 2 jam.
Pembuatan  Medium  MRSA  (de  Man, Ragosa, Sharpe Agar) 200 ml
Ditimbang media MRS agar sebanyak  13  gram,  lalu  ditambahkan aquadest  sebanyak  200  ml,  dipanaskan sampai  mendidih  sambil  diaduk  hingga larut,  kemudian  di  sterilkan  di  dalam autoklaf  dengan  suhu  121 o C  selama  15 menit.
Perlakuan Sampel

## Fermentasi Biji Kakao
Buah kakao dipilih yang tua dengan ciri-ciri berwarna kuning, lalu dipecahkan (dibelah) menggunakan batang kayu untuk memisahkan antara kulit dan biji. Biji yang masih  terbungkus  pulp  (daging  buah)  ini kemudian  difermentasi  dengan  cara  di bungkus dalam kantong plastik yang telah dilubangi  selama seminggu, kemudian biji akan  terlepas  dari  pulpnya,  setelah  itu keringkan di bawah sinar matahari, lalu di haluskan  dengan  menggunakan  blender atau lumpang.

## Pembuatan Larutan Sampel
Biji  kakao  yang  telah di  hancurkan tadi,  di timbang  sebanyak  1  gram,  lalu  di masukkan ke dalam gelas kimia, kemudian dilarutkan  dengan  aquadest  sebanyak  10 ml, kemudian di homogenkan.

## Penanaman pada Media MRS Broth
Di siapkan lima tabung reaksi yang telah berisi 9 ml medium MRS broth lalu pada  tabung  pertama  dimasukkan  1  ml sampel  biji  kakao  (10 -1 ),  lalu  dari  tabung pertama, dipipet 1 ml ke tabung kedua (10 - 2 ), dari tabung kedua dipipet lagi 1 ml ke tabung  yang  ketiga  (10 -3 ),  sampai  tabung ke lima (10 -5 ) lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 1 x 24 jam. Penanaman pada Media MRS Agar Di  siapkan  lima  cawan  petri  diberi etiket dan label masing-masing 10 -1 sampai 10 -5 , lalu dimasukkan 9 ml medium MRS Agar,  dari  medium  MRS  broth  dipipet masing-masing  1  ml  dan  di  tanam  pada medium MRS Agar dengan metode tuang (pour plate) lalu diinkubasi pada suhu 37 o

## C selama 2 x 24 jam. Pengamatan Morfologi Koloni
Setelah  di  inkubasi  selama  48  jam, dilakukan pengamatan morfologi terhadap koloni  yang  tumbuh.  Pengamatan  ini meliputi bentuk, tepian, elevasi dan warna koloni  bakteri.  sedangkan  pengamatan morfologi  sel  meliputi  uji  pewarnaan Gram, dan bentuk sel.
Pengamatan Morfologi sel Disiapkan  reagen  larutan  kristal violet  (ungu),  larutan  lugol-mordan, larutan  alkohol-larutan  pemucat  (tidak berwarna),  larutan  safranin  (merah).
Dilakukan  pengecata  Gram.  Kaca  objek dibersihkan dengan menggunakan alkohol 96%, untuk membebas lemakkan. Diambil 1 ose NaCl 0,9% sehingga merata. Preparat kemudian di biarkan mengering. Fiksasi di atas  api  spiritus.  Preparat  yang  telah difiksasi  dan  telah  dingin  dicat  dengan larutan  kristal  violet,  di  biarkan  selama  1 menit (cat A). Dicuci  dengan air mengalir kemudian  dikering-anginkan.  Diberikan larutan lugol, biarkan selama 1 menit (cat B).  sediaan  dicuci  dengan  Alkohol  asam (Cat    C),  kemudian  dicuci  dengan  air mengalir  lalu  dikering-anginkan.  Dicat dengan larutan safranin, biarkan selama 15 detik  (Cat  D).dicuci  dengan  air  mengalir, kemudian dikering-anginkan. Diberikan 1 tetes oil imersi, lalu diamati bentuk selnya secara  mikroskopik  menggunakan  lensa objekti 100x pada kaca preparat sehingga dapat diketahui bentuknya (kokus, batang atau  spiral).  Bakteri  gram  positif  ditandai dengan  warna  ungu  yang  menunjukkan bahwa  bakteri  tersebut  mampu  mengikat warna kristal violet.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari  hasil  pengamatan  koloni bakteri sampel biji kakao yang ditanamkan media  MRS  Agar,  di  dapatkan  morfologi bentuk koloni sebagai berikut :
Tabel 1. Hasil Pengamatan Morfologi Bakteri pada Sampel Biji Kakao
Pada penelitian yang telah dilakukan  dengan  menggunakan  sampel biji  kakao  yang  telah  di  encerkan  dengan menggunakan medium MRS Broth dengan pengenceran  10 -1 ,  10 -2 ,10 -3 ,10 -4 ,  dan  10 -5 dan kemudian di inkubasi pada suhu 37 o C
selama 1 x 24 jam, dengan tujuan supaya bakteri  dapat  tumbuh  baik  dalam  suatu media. Setelah dilakukan pananaman pada media MRS Broth di ambil masing-masing 1 ml dari media MRS Broth kemudian di tanam  menggunakan  media  MRS  Agar,
Pengenceran Bentuk koloni Tepian Elevasi Warna koloni Pewarnaan gram Bentuk sel Jenis bakteri 10 -1 Bundar Licin Timbul krem Positif batang warna keunguan Lactobacillus sp 10 -2 - - - - - - - 10 -3 - - - - - - - 10 -4 - - - - - - - 10 -5 - - - - - - -
kemudian  di  inkubasi  pada  suhu  37 o C selama  2  x  24  jam  lalu  dari  koloni  yang timbul  di  ambil  1  ose  dilakukan pengecatan  dan  pengamatan  di  bawah mikroskop dengan pembesaran 60x.
Dari  hasil  penelitian  di  dapatkan koloni  bakteri  pada  pengenceran  10 -1 . Sedangkan pada pengenceran 10 -2 10 -3 , 10- 4 dan  10 -5 tidak  di  temukan  koloni  karena semakin  tinggi  pengencerannya,  semakin sedikit  jumlah  sampel  yang  ada  sehingga tidak  ditemukan  koloninya.  Morfologi koloni  yang  diamati  pada  isolat  bakteri meliputi bentuk, tepian, elevasi dan warna koloni. Keseluruhan morfologi koloni dari bakteri Lactobacillus memiliki  bentuk koloni bundar, tepian yang licin elevasinya timbul dan memiliki warna koloni bakteri yaitu  krem.  Bentuk  koloni  dari  suatu bakteri  dipengaruhi  oleh  umur  dan  syarat pertumbuhan  tertentu.  Variasi  bentuk bakteri yang terjadi juga dipengaruhi oleh lingkungan  (faktor  biotik  dan  abiotik). Faktor  makanan  (medium  tumbuh)  dan suhu (minimum, optimum dan maksimum)
(Ilyas, 2001).
Warna koloni yang tampak menunjukkan  adanya  pigmen.  bahwa pigmen  yang  terdapat  pada  bakteri dintaranya  adalah  pigmen  karotenoid, antosianin,  melanin,  Tripirilmethene  dan
Phenazin. (Savitri, 2006).
Pada pengecatan gram, dari pengenceran  10 -1 didapatkan  sel  yang berbentuk batang dengan warna keunguan, hal  ini  mengindikasikan  bahwa  bakteri tersebut  termasuk  gram  positif.  Bakteri gram positif terlihat berwarna ungu karena asam-asam  ribonukleat  pada  sitoplasma sel-sel  gram  positif  membentuk  ikatan yang  lebih  kuat  dengan  kompleks  ungu kristal  violet,  sehingga  ikatan  kimiawi tersebut  tidak  mudah  dipecahkan  oleh pemucat  warna  (Hadioetomo,  1993). Reaksi tersebut didasarkan atas perbedaan komposisi  kimiawi  dinding  sel.  Sel  gram positif mempunyai dinding dengan lapisan peptidoglikan yang tebal (Sunatmo, 2007).
KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian,  maka dapat disimpulkan bahwa pada biji kakao yang telah difermentasi, ditemukan adanya bakteri Lactobacillus sp , pada pengenceran 10 -1 , memiliki bentuk koloni bundar, tepian yang licin, bentuk elevasinya  timbul  dan  memiliki  warna koloni  bakteri  yaitu  krem.  Bentuk  sel bakteri  yang  didapatkan  dari  hasil pengecatan  gram  10 -1 adalah  berbentuk batang warna keunguan, termasuk bakteri gram positif.

## DAFTAR PUSTAKA
Anggraeni,  P  ,  2001. Probiotik  untuk Kesehatan Optimum (ejornal.unri.ac,id).  Diakses  19 April. Bahri, Syamsul., 2002. Bercocok Tanaman Perkebunan  Tahunan .  Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Buckle,  K.,  A.,  Edwards, Fleet,  Wootton. 1985. Ilmu  Pangan. Universitas Indonesia Jakarta hal 94, 95, 273,
274, 275, dan 276. Departemen  perindustrian,  2007. Kakao . Penerbit Pusat Data dan Informasi. Jakarta Hadioetomo,  R.  S.  1993. Mikrobiologi
Dasar Dalam praktek Teknik dan
Prosedur  Dasar  Laboratorium . Penerbit Gramedia, Jakarta. Holtj,G.,Kreign.R, moreSneath.p.H.A. 1994. Bergeys Manual Determinative Bacteriology , baltimore.  William  dan  wilkins baltimore Ilyas, S. 2001. Mikrobiologi Dasar Diklat Kompilasi 28 . Universitas Sumatera Utara Press, Medan Irianto,  K.  2006. Mikrobiologi  Menguak Dunia Mikrobiologi. Bandung,hal 61 dan 62 Kristanto  A.  S.  P,  2008. Panduan Budidaya Kakao . Penerbit Pustaka Baru Press, Yogyakarta. Hal 110. Pelczar.  M.J.,  dan  Chan,  E.  S.  1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi .
Universitas Indonesia Press. Jakarta. Purwanti,  S.,  2008. Bakteri  Laktat, Pengawet  Sayuran  Penghambat
Kolesterol.
http://suaramerdeka.com/v1/ind ex.php/read/cetak/2008/03/13/4 6
Bakteri.Laktat..Pengawet.Sayur an.Penghambat.Kolesterol (diakses pada 9 April 2012) Savitri,  S.  D.  N.  2006. Isolasi  dan Karakterisasi Bakteri Halotoleran Pada Ikan Kembung (Rastrelliger sp. ). Skripsi. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Susanto,  F.X.,  2001. Tanaman  Kakao Budidaya dan Pengolahan Hasil. Penerbit Kanisius, Yogyakarta. Tjahjadi  P,  2007. Fisiologi  Mikroba .
Penerbit    Bumi  Aksara,  jakarta.
Hal 194-205 Wahyudi,  T,  Pangabean  dan  Pujiyanto. 2008. Panduan  Lengkap  Kakao Penebar swadaya. Jakarta. Waluyo, Lud,Drs.M.Kes, 2004. Mikrobiologi Umum . Universitas Muhammadiyah. Press: Malang
.