## Bakteri Simbion Karang Lunak Sinularia sp. sebagai Agen Antibakteri

## Sekar Widyaningsih* dan Nor Sa’adah
Program Studi Oseanografi, Fakultas Teknik dan Ilmu Kelautan, Universitas Hang Tuah Jl. Arif Rahman Hakim 150 Surabaya 60111 Email : sekar.widyaningsih@hangtuah.ac.id

## Abstract

## Symbiotic bacteria of soft-coral Sinularia sp. as antibacterial agent
The disease caused by bacterial pathogen infection has become a major problem in the world  of  health.  Therefore,  it  needs  new  bioactive  compond  to  resolve  that  problem.  Symbiotic bacteria of softcoral are one promising source. This is because symbiotic bacteria of softcoral have the  same  bioactive  compounds  as  their  host.  Symbiotic  bacteria  were  isolated  from  softcoral Sinularia  sp.  that  collected  from  Tanjung  Gelam  Waters,  Karimunjawa  Jepara.  The  symbiotic bacteria  screened  for  antibacterial  activity  against  E.coli,  Proteus  sp.,  Enterobacter  sp.  and  S. aureus with diffution agar method. One of ten symbiotic bacteria was active against, SNTGA 5, with inhibition zone 9.067 ± 0.305 mm against E coli, 8.533 ± 0.416 mm against S. aureus, 9.067 ± 0.058 mm against  Enterobacter  sp.,  dan  9.1±  0.557  mm  against    Proteus  sp..  The  molecular  identification based on partial 16S DNA, that active isolate was closely related to Pseudomonas stutzeri.
Keywords: Antibacterial, Sinularia sp., symbiontic bacterial, PCR 16S DNA, Pseudomonas stutzeri

## Abstrak
Penyakit  akibat  infeksi  bakteri  patogen  telah  menjadi  masalah  utama  dalam  dunia kesehatan.  Oleh  karenanya,  diperlukan  bahan  aktif  baru  guna  mengatasi  masalah  tersebut. Bakteri  simbion  karang  lunak  merupakan  salah  satu  sumber  yang  menjanjikan.  Hal  ini  karena bakteri  simbion  karang  lunak  memiliki  senyawa  bioaktif  yang  sama  dengan  inangnya.  Bakteri simbion  diisolasi  dari  karang  lunak Sinularia sp.  yang  dikoleksi  dari  Perairan  Tanjung  Gelam Karimunjawa Jepara. Bakteri simbion diuji aktivitasnya terhadap E.coli , Proteus sp., Enterobacter sp. dan S. aureus dengan metode difusi agar. Satu dari 10 bakteri simbion memiliki aktivitas antibakteri, SNTGA5, dengan besar zona hambat 9.067 ± 0.305 mm terhadap E coli , 8.533 ± 0.416 mm terhadap S. aureus , 9.067 ± 0.058 mm terhadap Enterobacter sp., dan 9.1± 0.557 mm terhadap Proteus sp.. Identifikasi  molekuler  dilakukan  dengan  menggunakan  PCR  16S  DNA,  dimana  isolat  yang  aktif memiliki memiliki kekerabatan terdekat dengan Pseudomonas stutzeri .
Kata kunci : Antibakteri, Sinularia sp.,  PCR 16S DNA, Pseudomonas stutzeri

## PENDAHULUAN
Salah masalah kesehatan yang disebabkan  oleh  bakteri  patogen E.  coli , Proteus sp., Enterobacter sp.  dan S.  aureus adalah foodborne infections dan waterborne infections (Thielman  dan  Guerrant,  2004). Penggunaan  obat  yang  tidak  tepat  dan pengobatan  yang  tidak  tuntas  pada  suatu penyakit akan menyebabkan bakteri
patogen  menjadi  resisten  (Radjasa et  al ., 2007a).
Invertebrata  laut  seperti  karang  lunak, diketahui  memiliki  kandungan  metabolit sekunder  yang  melimpah,  sehingga  menjadi target  eksplorasi  sumber  senyawa  bioaktif alami (Radjasa, et al. , 2007b; Thiel dan Imhoff, 2003).  Untuk  dimanfaatkan  sebagai  obat diperlukan  jumlah  yang  besar,  dan  hal tersebut  menjadi  masalah  tersendiri  bagi
ketersediaan karang lunak di alam. Diperlukan alternatif lain, seperti pemanfaatan  bakteri  simbionnya.  Seperti yang diungkapkan oleh Burgess et al. , (2003), bahwa  mikroorganisme  simbion  mampu mensistesa metabolit sekunder seperti organisme inangnya. Oleh karenanya, bakteri yang bersimbiosis dengan Sinularia sp. dapat  memberi  kontribusi  sebagai  sumber alternatif baru, khususnya sebagai antibakteri. Seperti Paenibacillus  campinasensis yang diisolasi  dari  karang  lunak Lobophytum sp. yang memiliki aktivitas antibakteri E. coli dan S.  aureus (Murti  dan  Radjasa,  2012).  Maka dilakukanlah  penelitian  mengenai  aktivitas antibakteri  dari  bakteri  simbion  karang  lunak Sinularia sp. ini.

## MATERI DAN METODE
Materi yang digunakan dalam penelitian ini antara lain bakteri yang diisolasi dari Sinularia sp. dari Perairan Tanjung Gelam, Karimunjawa,  Jepara.  Kultur  bakteri  patogen E. coli, S.aureus, Enterobacter sp., dan Proteus sp. sebagai bakteri uji.

## Kultur dan Isolasi bakteri simbion
Kultur  dan  isolasi  bakteri  simbion  dari karang lunak Sinularia sp. yang diperoleh dari Perairan Tanjung Gelam Karimunjawa Jepara dilakukan menggunakan media Zobell 2216E, dengan  metode  streak,  dan  diinkubasi selama  2X24  jam  (Madigan et  al .  2000; Radjasa et al ., 2007a).

## Antibacterial test
Antibacterial  test dilakukan  dengan metode  difusi  agar . Kultur  setiap  bakteri  uji patogen  pada  fase  logaritma  di streak di permukaan  agar  rose  sebanyak  100µL  dan didiamkan selama 10-15 menit. Kultur bakteri simbion yang juga fase logaritma dimasukkan pada paperdisk dan  ditempelkan  di  atas agar  rose  berbakteri  patogen.  Hasil  uji diinkubasi  selama  1x24  jam,  dan  dilakukan pengukuran zona bening. Aktivitas antibakteri ditentukan  dengan  adanya  zona  bening  di sekitar koloni bakteri (Radjasa et al. , 2007a).

## Amplifikasi PCR dan Sequensing DNA
Amplifikasi  DNA  dilakukan  dengan menggunakan metode Radjasa et al . (2007b).
Genomik  DNA  bakteri  yang  memiliki  aktivitas antibateri diisolasi dari materi sel yang diambil dari  agar  di  cawan  petri.  Materi  tersebut dilarutkan  dalam  air  steril  dan  dibekukan pada suhu -80 O C dan dipanaskan pada suhu 95 O C  sebanyak  lima  kali  ulangan.  Amplifikasi PCR  16S  RNA  bakteri  simbion Sinularia sp., purifikasi  produk  PCR  dan  analisis  sekuensing dilakukan berdasarkan metode Radjasa et al . (2007c).  Hasil  data  sekuensing  dicocokkan dengan  data  homologi  dalam BLAST database .

## Screening PCR – NRPS
Amplifikasi  gen  Non-Ribosomal  Peptide Synthetases  (NRPS)  dengan  menggunakan primer A2gamF (5’ AAG GCN GGC GSB GCS TAY STG CC 3’) dan A3gamR (5’ TTG GGB IKB CCG GTS GIN CCS GAG GTG 3’) (Radjasa et. al. , 2007c). Amplifikasi DNA dilakukan dengan mesin DNA thermal cycler (MyCycler, BioRad) dengan metode Radjasa et al ., (2007b).

## Analisa Sekuensing DNA
Analisis  sekuen  DNA  isolat  bakteri terbaik  kemudian  dibandingkan  dengan sekuen  DNA  pada  basis  data  (database) DNA. Penelusuran dilakukan dengan menggunakan  internet  melalui  program pelacakan  database  Basic  Local  Alignment Search Tool (BLAST) pada National Center for Biotechnology  Information , National  Institute for  Health ,  USA  (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al ., 1997; Radjasa et al., 2008).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Terdapat  sepuluh  bakteri  simbion  dari karang lunak Sinularia sp, dimana hanya satu isolat  bakteri  saja  (SNTGA5)  yang  ditemukan mampu  menghambat  pertumbuhan  empat bakteri  patogen  (Tabel  1).  Identifikasi molekuler isolat bakteri simbion aktif dilakukan berdasarkan 16S rDNA, dan hasil menunjukkan  isolat  memiliki  kekerabatan dengan Pseudomonas stutzeri (Tabel 2). Hasil screening menunjukkan  isolat  bakteri  aktif mampu  mengamplifikasi  fragmen  gen  NRPS (Gambar 1).  Masalah bakteri patogen yang berubah resisten terhadap berbagai antibiotik menjadi salah satu masalah utama di  bidang  kesehatan.  Hal  tersebut  dapat menyebabkan meningkatnya mortalitas,
morbilitas  dan  biaya  kesehatan  (Cohen, 1994;  Wang,  2003).  Seperti  menurut  Thielman dan Guerrant (2004), infeksi diare disebabkan oleh foodborne  infections dan waterborne infections yang disebabkan bakteri Salmonella spp, Campylobacter  jejuni , Staphyilococcus  aureus , Bacillus  cereus , Clostridium
perfringens
dan Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC).
Organisme  laut  yang  berasal  sari ekosistem  terumbu  karang  menjadi  sumber yang  menarik  dan  penting  dalam  produksi natural  product .  Hal  tersebut  dikarenakan mereka  memproduksi  berbagai  senyawa bioaktif  guna  menunjang  aktivitas  mereka  di alam (Sulistiyani et al. , 2010). Invertebrata laut yang  juga  bagian  dari  ekosistem  terumbu karang  diketahui  kaya  akan  senyawa metabolit yang berpotensi untuk dikembangkan (Faulkner, 2001).
Pemanfaatan  produk  alam  secara langsung menjadi masalah lain. Hal tersebut, dikarenakan  suplai  yang  terbatas,  sehingga digantikan bakteri simbionnya. Seperti menurut  Perez  Matos et  al. (2007),  bakteri yang bersimbiosis mampu mensintesa senyawa  bioaktif  yang  mirip  dengan inangnya.  Pada beberapa penelitian bakteri simbion  invertebrata  laut,  khususnya  karang
lunak terbukti mampu memproduksi senyawa metabolit  sekunder  yang  mirip  dengan inangnya,  seperti  bakteri  simbion Sinularia polydactyla mempunyai  aktivitas  antibakteri terhadap
Streptococcus
equi subsp. Zooepidemicus (Radjasa et al ., 2007c).
Penelitian  bakteri  simbion Sinularia sp. menunjukkan  adanya  aktivitas  antibateri terhadap  empat  bakteri  patogen, E.  coli , Proteus sp., Enterobacter sp.  dan S.  aureus , dengan adanya zona hambat (Tabel 1).
Hasil  DNA  sekuensing  isolat  SNTGA5 yang mampu menghambat E. Coli, S. aureus, Proteus sp.,  dan Enterobacter sp.  memiliki kesamaan  homologi  sebesar  100%,  dan berkerabat  dengan Pseudomonas  stutzeri (Tabel  2).  Seperti  pada  Uzair et  al .  (2007), yang  mengisolasi  bakteri Pseudomonas stutzeri dari  saluran  usus  ikan  Ribbon ( Desmodema sp.)  mempu  menghambat bakteri  patogen S.  aureus .  Fragmen  gen NRPS berhasil diampliikasi dari bakteri SNTGA5 (Gambar  1).  Oleh  karenanya  isolat  SNTGA5 diduga  termasuk  kelompok  peptida  yang dihasilkan  melalui  jalur  nonribosomal.  Seperti bakteri  yang  berasosiasi  dengan  karang lunak Sinularia  polydactyla, TASC.16  yang menghambat Streptococcus  equi yang  juga ditemukan  berfragmen  NRPS  (Isrina,  2008).
Tabel 1. Aktivitas antibakteri bakteri simbion karang lunak Sinularia sp. terhadap pathogen
No.  Isolat bakteri simbion Diameter zona hambat (mm) E. coli S. aureus Enterobacter sp. Proteus sp. SNTGA5 9.067 ± 0.305  8.533 ± 0.416 9.067 ± 0.058 9.1± 0.557
Tabel 2. Identifikasi molekular isolate bakteri
No.  Kode bakteri  Panjang  Kekerabatan terdekat  Homologi  No. akses
1 SNTGA5 811 Pseudomonas stutzeri 100% JF727659.1
Marker SNTGA5
Peptida  nonribosomal  dapat  menghasilkan berbagai  macam  molekul  peptide  berantai asam lemak, asam amino non proteinogenik, asam  karboksil,  cincin  heterosiklik  dan  asam amino  yang  termodifikasi.  Strukturnya  juga dapat  bercabang  atau  siklik,  dan  masih dapat  teroksidasi  atau  tereduksi  (Marahiel and Finking, 2004).

## KESIMPULAN
Bakteri yang berasosiasi dengan karang lunak Sinularia sp.  yang  mempunyai  aktivitas antibakteri terhadap empat bakteri patogen E.  coli , Proteus sp., Enterobacter sp.  dan S. aureus .  adalah Pseudomonas  stutzeri. Selain itu,  bakteri  simbion  ini  juga  diduga  termasuk kelompok peptide
yang mampu mengaplifikasi fragmen
gen NRPS. Diharapkan penelitian ini digunakan sebagai solusi  awal  dalam  masalah  penanganan bakteri  patogen,  dan  masalah  suplai  ketika mencari bahan bioaktif dari alam.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih disampaikan kepada Prof. Ocky Karna Radjasa yang telah memberi dana untuk penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Altschul,  S.F.,  Madden,  T.L.,  Schäffer,  A.A.,
Zhang,  J.,  Zhang,  Z.,  Miller,  W.  &  Lipman, D.J.  1997.  Gapped  BLAST  and  PSI-BLAST: a  new  generation  of  protein  database search  programs. Nucleic  acids  Res . 25(17):3389-3402.
Burgess, J.G., Boyd, K.G., Armstrong, E., Jiang, Z.,  Yan,  L.,  Berggren,  M.  &  Adams,  D.R. 2003.  The  development  of  a  marine natural  product-based  antifouling  paint. Biofouling . 19(S1):197-205.
Cohen,  M.L.  1994.  Antimicrobial  Resistance: Prognosis
for Publichealth. Trends Microbiol . 2 : 422–425.
Faulkner,  D.J.  2001.  Marine  natural  products.
Nat. Prod. Rep. 18 (1):1R-49R.
Finking, R., & Marahiel, M.A. 2004. Biosynthesis of  Nonribosomal  Peptides. Annu.  Rev. Microbiol., 58:453-488.  DOI  :  10.1146/
annurev.micro.58.030603.123615
Isrina, S.O.S. & Lammler, C. 2008. Antibacterial
Property of Marine
Bacterium pseudomonas sp.  Associated  with  A  Soft
Coral  against  Pathogenic Streptococcus equi subsp. Zooepidemi-cus J.  Coast. Dev. 11(3):113-120.
Madigan,  M.T.,  Martinko,  J.M.  &  Parker,  J.
2000.  Brock  Biology  of  Microorganisms. Prentice Hall. New Jersey.
Murti, P.D.B. & Radjasa, O.K. 2012. Antibacterial Activity of Bacterial Symbiont  of  Soft  Coral Lobophytum sp. against  MDR  Bacteria Escherichia  coli and Staphyllococcus  aureus . J.  Coast. Dev . 15(3):297–302. Radjasa,  O.  K.,  Kencana,  D.  S.,  Sabdono,  A., Hutagalung,  R.  A.,  &  Lestari,  E.  S.  2007a. Antibacterial  activity  of  marine  bacteria associated  with  sponge  Aaptos  sp. against Multi Drugs Resistant (MDR) strains. J. Mat.  Sains . 12(4):147-152. Radjasa,  O.  K.,  Martens,  T.,  Grossart,  H.  P., Brinkhoff,  T.,  Sabdono,  A.,  &  Simon,  M. 2007b.  Antagonistic  Activity  of  a  Marine Bacterium
Pseudoalteromonas
luteoviolacea  TAB4.  2  Associated  with Coral  Acropora  sp. J.  Biol.  Sci. 7(2):239- 246. DOI : 10.3923/jbs.2007.239.246
Radjasa,  O.  K.,  Salasia,  S.  I.  O.,  Sabdono,  A., Wiese, J., Imhoff, J. F., Lämmler, C., & Risk, M.  J.  2007c.  Antibacterial  activity  of marine  bacterium Pseudomonas sp. associated  with  soft  coral Sinularia polydactyla against Streptococcus  equi subsp.  zooepidemicus . Int.  J.  Pharmacol. 3(2):170-174.
Radjasa, O.K., Sabdono A., Wiese, J. & Imhoff, J.F.  2008 . Coral  as  Source  Of  Bacteria With Antimicrobial Activity. J. Coast. Dev.,
11(3):121-130.
Sulistiyani,  Nugraheni,  S.A.,  Khoeri,  M.M., Sabdono,  A.  &  Radjasa,  O.K.  2010 .
Antibacterial Activity of Bacterial Symbionts  of  Softcoral Sinularia sp. against  Pathogenic  Resistant  Bacteria. J.
Coast. Dev., 13(2):113-118.
Thiel,  V.,  &  Imhoff,  J.F.  2003.  Phylogenic
Identification of Bacteria with
Antimicrobial  Activities  Isolated  from Mediterranean  Sponges. Biomol.  Eng . 20(4-6):421-423.
Thielman,  N.M,  &  Guerrant,  R.L.  2004 . Acute Infectious  Diarrhea. N.  Engl.  J.  Med .  350 (1):38-47.
Wang, T.K.F. & Ho, P.L.  2003. The Challenge of Antibiotic  Resistance  in  Asia:  Problems and Solutions. Med. Prog . 8:41-49.