## ANTIBACTERIAL ACTIVITY TEST SEA CUCUMBER EXTRACT (Holothuria scabra) SIDAYU COAST GRESIK USING DISK DIFFUSION METHOD
Haris Nursyah Arifin, Rachmawati Ningsih, Avin Ainur Fitrianingsih, Abdul Hakim
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim Malang Corresponding author : nastklenk69@gmail.com

## ABSTRACT
Sea cucumber ( Holothuria scabra ) is one kind of sea cucumbers that contains of bioactive compound that can  inhibit  bacteria  growth.  This  research  aim  to  know  the  effect  of  methanol  and n -hexane  extract  towards bacterium Staphylococcus  aureus,  Salmonella  typhi and Escherichia  coli bacterial  growth and to identification estimation active compound group.
Sea  cucumbers  active  compound extraction  using  maceration  method with  methanol  and n -hexane  as  a solvent. Methanol and n -hexane crude extract conducted antibacterial assay using disk diffusion method towards bacterium Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia coli and continued with reagent test to knowing active compound group.
The  result  of  this  research  indicated  that n -hexane  extracts  provide  the  best  inhibition  zone  toward bacterium Escherichia  coli at  concentration  2000  ppm  with  among  of  inhibition  zone  1,75  mm,  while  at bacterium Staphylococcus aureus and Salmonella typhi does not provide inhibition zone. Methanol extract does not  provide  inhibition  zone  towards  bacterium Staphylococcus  aureus,  Salmonella  typhi and Escherichia  coli . The result of reagent test indicated compound that detected in n -hexane extract is saponins.
Keywords : sea cucumbers ( Holothuria scabra ), disk diffusion, extraction, antibacterial, Staphylococcus aureus , Salmonella Typhi , and Escherichia coli .

## ABSTRAK
Teripang  pasir  ( Holothuria  scabra )  merupakan  salah  satu  jenis  teripang  yang  mengandung  senyawa bioaktif  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh ekstrak  metanol  dan  n-heksana  terhadap  pertumbuhan  bakteri Staphylococcus  aureus,  Salmonella  typhi dan Escherichia coli serta mengidentifikasi dugaan golongan senyawa aktif.
Ekstraksi  senyawa  aktif  teripang  pasir  menggunakan  metode  maserasi  dengan  pelarut  metanol  dan  n- heksana.  Ekstrak  kasar  metanol  dan  n-heksana  dilakukan  uji  antibakteri  menggunakan  metode  difusi  cakram terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus , Salmonella  typhi,  Escherichia  coli dan  dilanjutkan  dengan uji  reagen untuk mengetahui golongan senyawa aktif.
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak  n-heksana  memberikan  zona  bening  terbaik  pada konsentrasi 2000 ppm dengan rata-rata zona bening 1,75 mm terhadap bakteri Escherichia coli , sedangkan pada bakteri Staphylococcus  aureus dan Salmonella  typhi tidak  memberikan  zona  bening.  Ekstrak  metanol  tidak memberikan zona bening terhadap bakteri Staphylococcus aureus , Salmonella typhi dan Escherichia coli . Hasil uji fitokimia menunjukkan senyawa yang terdeteksi dalam ekstrak n-heksana adalah saponin.
Kata  Kunci: teripang  pasir  ( Holothuria  scabra ),  difusi  cakram,  ekstraksi,  antibakteri, Staphylococcus  aureus , Salmonella Typhi , dan Escherichia coli .

## I. PENDAHULUAN
Indonesia  adalah  salah  satu  negara kepulauan  yang  memiliki  garis  pantai terpanjang di dunia dengan panjang 81.000 km dengan luas perairan laut sekitar 5,8 juta km2  (75 %  dari  total  Wilayah  Indonesia) (Dewi et  al. ,  2010). Hasil  laut  yang mempunyai  nilai  penting  salah  satunya adalah teripang pasir.
Teripang  dapat  ditemukan  hampir  di seluruh  perairan  pantai,  mulai  daerah pasang surut yang dangkal sampai perairan yang  lebih  dalam.  Menurut  Martoyo et  al . (2000), teripang kering memiliki
kandungan protein  82  %,  lemak  1,7  %,  air 8,9  %,  abu  8,6  %,  dan  karbohidrat  4,8 %.
Bordbar et al .  (2011),  menjelaskan kandungan  senyawa  aktif  teripang  adalah
triterpen  glikosida  (saponin),  kondroitin sulfat,  glikosaminoglikan,  sterol,  sulfat triterpen  glukosa,  sulfat  polisakarida, peptida,  protein  (gelatin  dan  kalogen), hidrosalisilat, glikoprotein, lektin, fenol dan flavonoid. Senyawa yang terkandung dalam teripang pasir salah satunya adalah saponin yang dapat berpotensi sebagai antibakteri.
Farouk  (2007),  menjelaskan  ekstrak
teripang Holothuria atra dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia coli. Wawolumaya (2012), juga menjelaskan bahwa  ekstrak n- heksana teripang Stichopus  hermanii dan Stichopus sp.  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus . Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk  mengetahui  aktivitas  antibakteri ekstrak  teripang  pasir ( Holothuria  scabra ) dari  Pantai Sidayu  Gresik,  yang  diekstrak dengan dua jenis pelarut, yaitu metanol dan n -heksana  hasil  destilasi.  Hasil  dari penelitian  ini  nantinya  diaplikasikan sebagai sumber senyawa antibakteri.

## II. METODE PENELITIAN
Bahan Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  teripang  pasir ( Holothuria scabra )  yang  diperoleh  dari Pantai Sidayu Gresik.

## Analisis Kadar Air
Analisis  kadar  air  dilakukan  pada bagian  tubuh  teripang  pasir ( Holothuria scabra ).  Sebelumnya  cawan  dipanaskan dalam oven pada suhu 100 - 105 ˚C selama 15  menit  untuk  menghilangkan  kadar airnya,  kemudian  cawan  disimpan  dalam vacum desikator  sekitar  10  menit.  Cawan tersebut selanjutnya ditimbang dan dilakukan  perlakuan  yang  sama  sampai diperoleh  berat  cawan  yang  konstan. Sampel teripang pasir basah dimasukkan ke dalam  cawan  yang  telah  diketahui  berat konstannya.  Sampel  yang  sudah  dipotong kecil-kecil diambil 5 gram dan dikeringkan ke  dalam  oven  pada  suhu  100 - 105 ˚C
selama  15  menit  untuk  menghilangkan kadar  air  dalam  tubuh  teripang  pasir, kemudian  sampel  disimpan  dalam vacum desikator  selama 10  menit  dan  ditimbang. Sampel tersebut dipanaskan kembali dalam oven  15  menit,  didinginkan  dalam vacum desikator dan ditimbang kembali. Perlakuan ini diulangi sampai berat konstan.

## Uji Kadar Garam
Teripang  pasir  basah ditimbang sebanyak 10 gram. Diekstrak menggunakan aquades panas 100 mL, didiamkan selama ± 1  menit,  kemudian  disaring  dengan  kertas saring. Hasil  yang  diperoleh  diteteskan pada  prisma  pembaca  pada  salinometer ATAGO  PAL-06.  Garam  dalam  larutan tersebut diukur sebagai konsentrasi kepekatan ‰.

## Preparasi Sampel
Teripang  pasir diambil  seluruh bagian tubuh, di  buang  kotoran  dalam teripang kemudian dicuci, diiris kecil-kecil, selanjutnya diblender.

## Ekstraksi Sampel
Metode  ekstraksi  yang adalah metode  ekstraksi  maserasi.  Teripang ditimbang  200 gram  kemudian  direndam dalam  metanol dan n -heksana 400  mL selama  24  jam  dan  di shaker selama  5  jam dengan  kecepatan  150 rpm.  Ampas direndam  kembali  sampai  tiga  kali pengulangan  sampai  filtrat  yang  didapat bening,  sehingga  diperoleh  senyawa  aktif.
Filtrat disaring dari ampasnya
menggunakan vacum buchner , ketiga filtrat yang  diperoleh  digabungkan.  Pelarut metanol dan n -heksana diuapkan dengan rotary  evaporator pada  suhu  40 o C  untuk mendapatkan  ekstrak  kasar.  Ekstrak  kasar metanol  dan n -heksana dimasukkan  ke dalam vacum desikator untuk  memekatkan ekstrak. Selanjutnya ekstrak yang diperoleh dihitung rendemennya.
Ekstrak  pekat  metanol  dan n - heksana yang  diperoleh  diuji  aktivitas antibakterinya.
Uji  Aktivitas  Antibakteri  Menggunakan Metode Difusi Cakram
1. Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  untuk  uji aktivitas antibakteri disterilkan dengan cara memasukkan  ke dalam  autoklaf  selama  15 menit pada suhu 121 o C dan tekanan 15 psi
(per  square  inchi). Alat-alat  yang  tidak tahan  tehadap  panas  tinggi  disterilkan dengan menyiram alat dengan
menggunakan  etanol  70  %  (Volk  dan Wheeler, 1993).

## 2. Pembuatan Nutrient Agar
Pembuatan  media  dilakukan  dengan melarutkan  4,6  g  nutrien  agar  dalam  200 mL akuades pada  beaker  gelas.  Suspensi yang dihasilkan dipanaskan sampai mendidih,  kemudian  dimasukkan  dalam erlenmeyer  ditutup dengan  kapas dan wrap kemudian  disterilisasi. Proses  sterilisasi menggunakan autoklaf  pada  suhu  121 o C dengan  tekanan  15  psi  selama  15  menit (Volk dan Wheeler, 1993).

## 3. Pembuatan Media Agar Miring
Media  agar  miring  dibuat  dengan memasukkan media agar yang telah selesai dipanaskan  (tahap  3.5.5.3)  sebanyak  5  mL ke  dalam  tabung  reaksi  lalu  ditutup menggunakan  kapas  dan  plastik  wrap. Media  dalam  tabung  dimasukkan  dalam plastik  tahan  panas  dan  disterilisasi menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121 o C dengan  tekanan  15  psi  selama  15  menit. Proses sterilisasi selesai tabung diposisikan dalam keadaan miring.
4. Peremajaan Biakan Murni Bakteri
Biakan  murni  bakteri  diremajakan pada  media  padat  agar  miring  dengan  cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri Staphylococcus  aureus,  Salmonella typhi dan Escherichia  coli secara  aseptis yaitu  dengan  mendekatkan  mulut  tabung pada  nyala  api  saat  menggoreskan  jarum ose.  Tabung reaksi  ditutup kembali dengan kapas  dan  diinkubasi  selama  18-24  jam pada suhu 37 o C dalam inkubator.

## 5. Pembuatan Nutrient Bort
Pembuatan  media  dilakukan  dengan melarutkan  0,9  g  nutrien  bort  dalam  100 mL  akuades  pada  beaker  gelas.  Suspensi yang dihasilkan dipanaskan sampai mendidih,  kemudian  dimasukkan  dalam erlenmeyer  ditutup dengan kapas dan  wrap kemudian  disterilisasi.  Proses  sterilisasi menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121 o C dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.

## 6. Pembuatan Larutan Biakan Aktif
Satu  ose  bakteri  hasil  peremajaan biakan  murni  dibiakkan  dalam  10  mL media  agar  cair  steril  dan  dihomogenkan. Larutan ini berfungsi sebagai biakan aktif.

## 7. Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri menggunakan konsentrasi ekstrak metanol 500 ppm, 1000 ppm,  1500  ppm,  2000  ppm  dan  25.000 ppm,  50.000  ppm,  75.000  ppm,  100.000 ppm. Konsentrasi ekstrak n- heksana adalah 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, 2000 ppm. Konsentrasi  kontrol  positif  ampisilin  0,4 mg/mL dan streptomisin 6,25 mg/mL.
Langkah  pertama  yaitu  membuat variasi  konsentrasi  ekstrak  dan  kontrol sesuai  konsentrasi  di  atas.  Kertas  cakram (diameter  5  mm)  diresapkan  dalam  ekstrak metanol, n -heksana  dan  larutan  kontrol.
Proses  peresapan  dilakukan  dengan  cara merendamkan  kertas  cakram  pada  ekstrak metanol, n- heksana, kontrol positif antibiotik  dan  kontrol  negatif  pelarut selama 30-60 menit.
Langkah  kedua,  larutan  biakan  aktif bakteri  diambil  sebanyak  50  µL  dan dimasukkan  ke  dalam  cawan  petri  steril.
Media agar padat (tahap 3.5.5.2)
dipanaskan  sampai  mencair,  kemudian didinginkan  sampai  suhu  40 o C  dan dituangkan  ke  dalam  cawan  petri  yang berisi  larutan  biakan  aktif  bakteri.  Media agar  padat  dan  larutan  biakan  aktif  bakteri dihomogenkan  dan  dibiarkan  hingga memadat. Kertas cakram kemudian diletakkan di atas permukaan media bakteri menggunakan  pinset  dan  ditekan  sedikit. Selanjutnya,  diinkubasi  pada  suhu  37 o C
selama  ±24  jam.  Kemudian,  diukur  zona hambatannya dengan menggunakan penggaris.  Luas  zona  hambatan  ditentukan dengan cara mengurangi
diameter keseluruhan  (cakram  +  zona  hambatan) dengan diameter cakram dan diameter zona hambat  pelarut  (jika  pelarut  memberikan zona hambat).
Uji  aktivitas  antibakteri  bertujuan
untuk mengetahui pengaruh ekstrak metanol  dan n -heksana  terhadap  bakteri
Staphylococcus  aureus,  Salmonella  typhi dan Escherichia coli .
Uji  Kandungan  Senyawa  Aktif  dengan Uji Reagen
Uji Alkaloid Ekstrak  teripang  pasir dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambah 0,5 mL HCl 2 %  dan  larutan  dibagi  dalam  dua  tabung. Tabung  I  ditambahkan  2 - 3  tetes  reagen Dragendorff,  tabung  II  ditambahkan  2 - 3 tetes reagen Mayer. Jika tabung I terbentuk endapan jingga  dan  pada  tabung  II terbentuk  endapan  kekuning-kuningan, menunjukkan adanya alkaloid.

## Uji Flavonoid
Ekstrak  teripang  pasir dimasukkan dalam  tabung  reaksi  kemudian  dilarutkan dalam  1 - 2  mL  metanol  panas  50 %. Setelah  itu  ditambah  logam  Mg  dan  4 - 5 tetes  HCl  pekat.  Larutan  berwarna  merah atau  jingga  yang  terbentuk,  menunjukkan adanya flavonoid.

## Uji Saponin
Ekstrak  teripang  pasir dimasukkan dalam  tabung  reaksi  ditambah  air  (1:1) sambil  dikocok  selama  1  menit,  apabila menimbulkan  busa  ditambahkan  HCl  1  N, busa  yang terbentuk dapat  bertahan selama 10 menit dengan ketinggian 1 - 3 cm, maka ekstrak positif mengandung saponin.

## Uji Triterpenoid dan Steroid
Ekstrak  teripang  pasir dimasukkan dalam  tabung  reaksi,  dilarutkan  dalam  0,5 mL  kloroform  kemudian ditambah  dengan
0,5 mL asam asetat anhidrat. Campuran ini selanjutnya  ditambah  dengan  1 - 2  mL H 2 SO 4 pekat  melalui  dinding  tabung tersebut.  Jika  hasil  yang  diperoleh  berupa cincin  kecoklatan  atau  violet  pada perbatasan  dua  pelarut  menunjukkan adanya triterpenoid, sedangkan jika terbentuk warna hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN Preparasi Sampel
Sampel  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  teripang  pasir ( Holothuria  scabra )  Pantai  Sidayu  Gresik. Teripang  yang  digunakan  adalah  teripang basah yang masih segar dan tidak dilakukan pengeringan  untuk  menjaga  senyawa  aktif dalam teripang agar tidak rusak akibat suhu yang  terlalu  tinggi.  Bagian  luar  dan  dalam tubuh teripang dibersihkan dari kotoran dan organ  pencernaan  untuk  meminimalisir adanya  kontaminasi  yang  nantinya  akan berpengaruh  pada  hasil  pengujian.  Proses pemblenderan dilakukan untuk memperkecil ukuran sampel. Semakin kecil ukuran  sampel,  maka  luas  permukaan semakin  banyak  dan  proses  ekstraksi  akan berlangsung  lebih  efektif  karena  interaksi antara  pelarut  dengan  senyawa  dalam teripang semakin besar.

## Analisis Kadar Air
Analisis  kadar  air menurut  Winarno, 2002  dilakukan  dengan  metode  pemanasan menggunakan oven pada suhu 100 – 105 o C sampai  berat  sampel  konstan. Hasil  uji kadar  air  teripang  pasir  diperoleh  sebesar 77,83 %.
Kadar  air  yang  terlalu  tinggi memungkinkan  daya  simpan  sampel menjadi  rendah. Kadar  air  sampel  yang tinggi sebesar 77,83 % tidak memungkinkan  sampel  disimpan  terlalu lama  sehingga  harus  langsung  digunakan (preparasi) karena  dimungkinkan  sampel akan  rusak  karena  ditumbuhi  jamur  dan mikroba.

## Analisis Kadar Garam
Hasil  pengukuran  kadar  garam teripang pasir diperoleh sebesar 2 %. Kadar garam sampel sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri uji. Konsentrasi 10-15 % kadar  garam  umumnya  sudah  cukup untuk membunuh sebagian besar jenis-jenis bakteri  (Hudaya  dan  Darajat,  1980). Sehingga  kadar  garam  pada  sampel  tidak berpengaruh terhadap bakteri uji.

## Ekstraksi Sampel
Ekstraksi  yang  digunakan  pada penelitian  ini  untuk  mengekstrak  teripang pasir  menggunakan  ekstraksi  maserasi dengan pelarut methanol dan n- heksana. Rendemen  hasil  ekstraksi  pada penelitian  ini masing-masing yaitu metanol (3,983 %) dan n -heksana (0,089 %).

## Uji  Aktivitas  Antibakteri Menggunakan Metode Difusi Cakram
Variasi  konsentrasi ekstrak  metanol yang  digunakan  adalah  500  ppm,  1000 ppm,  1500  ppm,  2000  ppm  dan  25.000 ppm,  50.000  ppm,  75.000  ppm,  100.000 ppm. Variasi konsentrasi ekstrak n- heksana adalah  500  ppm,  1000  ppm,  1500  ppm, 2000 ppm.
Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap ekstrak metanol tidak memiliki zona bening terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus, Salmonella  typhi dan Escherichia  coli. Ekstrak n- heksana  memiliki  zona  bening disekitar  cakram  hanya  terhadap  pada bakteri Escherichia coli dan  tidak memberikan  zona  bening  pada  bakteri Staphylococcus  aureus dan Salmonella typhi .  Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak
n- heksana  teripang  pasir ditunjukkan  pada Tabel 4.1
Tabel  4.1  Hasil  uji  aktivitas  antibakteri ekstrak n- heksana teripang pasir.
Kon sentrasi Ekstrak (ppm) Kon sentrasi Bakteri (CFU/mL) Dia meter Zona Ham bat (mm) Nota si (BNT) 2000 1,03x10 9 1,75 b 1500 1,5 a 1000 - a
500 1,03x10 9 - a Kontrol - - Strepto misin 13 - Ekstrak n- heksana dapat menghasilkan zona bening karena mengandung senyawa aktif antibakteri yaitu saponin  (Hasil  uji  reagen). Saponin  dapat melarutkan lemak sehingga dapat
menurunkan  tegangan  permukaan  sel  yang dapat menghancurkan sel bakteri (Wawolumaya, 2012).
Uji Kandungan Senyawa Aktif Menggunakan Uji Reagen
Hasil uji reagen ekstrak teripang pasir ditunjukkan pada Tabel 4.2 berikut : Tabel  4.2 Hasil  uji reagen ekstrak  teripang pasir
Uji Reagen Fraksi metanol Fraksi n-heksana Saponin + + Triterpenoid - - Steroid - - Alkaloid : - R. Mayer - R. Dragendroff - + - - Flavonoid - -

## IV. KESIMPULAN
Hasil  penelitian  yang telah  dilakukan dapat disimpulkan bahwa sebagai berikut : 1. Ekstrak n- heksana  berpengaruh  sebagai antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia  coli pada  konsentrasi  2000 ppm  dengan  zona  bening  rata-rata  1,75 mm  dan  tidak  berpengaruh  terhadap bakteri Staphylococcus  aureus dan Salmonella  typhi .  Ekstrak  metanol  tidak berpengaruh sebagai antibakteri terhadap pertumbuhan  bakteri Escherichia  coli, Staphylococcus  aureus dan Salmonella typhi .
2. Dugaan  golongan  senyawa  aktif  ekstrak n- heksana  adalah  saponin  sedangkan ekstrak  metanol  adalah  saponin  dan alkaloid.
SARAN Penelitian ini agar mendekati
sempurna  saran  yang  perlu  diperbaiki  dari penelitian ini, diantaranya yaitu:
1. Perlu  dilakukan  penambahan  variasi pelarut  yang  lebih  banyak  mencakupi senyawa polar, semi polar, dan polar.
2. Perlu  dilakuakan  metode  pemisahan yang  lain  seperti  menggunakan  metode fraksinasi  untuk  memperoleh  rendemen yang lebih banyak.
3. Perlu  dilakukan  pengujian  lebih  lanjut dengan  KLTA  yang  dilanjutkan  dengan KLTP,  identifikasi  senyawa  dengan instrumen FTIR, dan H-NMR.

## V. DAFTAR PUSTAKA
Bordbar, S., Anwar, F., dan Saari, N. 2011.
High-Value Components and Bioactives  from  Sea  Cucumbers  for Functional Foods—A Review . Journal Marine Drugs: 1660-3397. Dewi,  H.,  Silsia,  D.,  dan  Susanti,  L.  2010.
Ekstraksi  Teripang  Pasir (Holothuria Scabra)  Sebagai  Sumber  Testosteron Pada  Berbagai  Kecepatan  dan  Lama
Pengadukan. Jurnal  Pengembangan Teknologi  Kimia  Untuk  Pengolahan Sumber Daya Alam Indonesia:  1693- 4393.
Farouk,  Ghouse  dan  Ridzwan.  2007. New Bacterial Species Isolated from Malaysian  Sea  Cucumbers  with Optimized Secreted Antibacterial Activity . American Journal of Biochemistry  and  Biotechnology:
1553-3468.
Hudaya,  S.  dan  Daradjat,  S.  1981. Dasar- Dasar  Pengawetan  I .  Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Jakarta. Martoyo  J.,  Aji  N.  dan  Winanto  T.  2000.
Budidaya  Teripang .  Jakarta:  Penebar Swadaya.
Volk,  W.A.,  dan  Wheeler,  M.F.,  1993,
Mikrobiologi  Dasar ,  Jilid  I,  Alih Bahasa: Markam, Erlangga, Jakarta. Wawolumaya,  2012. Potensi  Antibakteri Pada Beberapa Jenis Teripang (Stichopus  spp.)  Yang  Berasal  Dari
Perairan  Lampung  Selatan .  Jurnal Skripsi  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran.