KAJIAN  KARAKTER  MORFOLOGI MIKROSPORA TEMBAKAU VIRGINIA YANG MENGALAMI CEKAMAN PELAPARAN DAN SUHU TINGGI SECARA IN VITRO

## Baiq Farhatul Wahidah
Dosen Pada Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Alauddin Makassar
Abstract : The  effect  of  treatment  combination  by  heat  shock  (34 o C)
and  starvation  medium  on  embryogenesis  induction  in  microspore culture of selected genotype of Nicotiana tabacum L.cv. Virginia  was examined.
The  microspores  which  were  isolated  aseptically  by  maceration  and centrifugation,  were  cultured  on  starvation  medium  (B  medium) without  sugar  and  nitrogen  during  6  days  at  34 o C.    The  culture contained  relatively  homogeneous  population  of  developed  stage microspore (late uninucleate stage). The viability and development of microspore was obsevered. DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) was used to stain the nucleus. Stained microspores were examined under a fluorescence microscope.
The result showed that during stress treatment by starvation and heat shock  (34 o C)  the  structure  of  microspore  change  into  3  types  of embryogenic microspore. Type 1 was identical to the late uninucleate microspore stage; in type 2 the vacuole of microspore was fragmented and peripheral cytoplamic pocket contain the nucleus; and type 3 the nucleus  was  positioned  in  cytoplamic  pocket  in  the  centre  of  the microspore.
Key words : Nicotiana tabacum L.cv. Virginia, Starvation, heat shock .

## I. PENDAHULUAN
ikrospora  merupakan  stadium  muda  dalam  tahap  perkembangan pollen.  Secara  normal,  perkembangan  mikrospora  selanjutnya  akan berdiferensiasi menjadi pollen yang berperan sebagai  alat reproduksi jantan  pada  tumbuhan.  Dengan  kata  lain  bila  tidak  ada  persatuan  antara  alat reproduksi  jantan  dan  alat  reproduksi  betina  tidak  akan  terjadi  individu  baru sehingga  mikrospora  /pollen  ini  akan  terbuang  secara  percuma,  padahal    dalam setiap  pohon  tembakau  mengandung  ribuan  mikrospora.  Dengan  kultur mikrospora,  pollen  dalam  stadium  muda  ini  bisa  diinduksi  menjadi  embrio.  Jika jumlah  mikrospora  dalam  satu  kuncup  bunga  adalah  ribuan  (satu  antera  paling
M
218 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Juli  2014 , hlm. 217 – 226
tidak  mengandung  300  mikrospora)  maka  dapat  diprediksikan  jumlah planlet/individu baru yang dihasilkan dari kultur mikrospora tembakau ini. Selain itu  keuntungan  dari  kultur  mikrospora  adalah  dapat  diketahui  sifat-sifat  resesif yang  muncul  ketika  dikulturkan  yang  tidak  mudah  ditemukan  pada    metode pemuliaan  tanaman  yang  lain.  Dengan  adanya  kelebihan  ini  maka  proses pemuliaan  tanaman  dapat  dilakukan  dengan  mudah  dan  cepat.  Sehubungan dengan  kebutuhan  manusia  akan  tembakau  berkualitas  tinggi  pada  tahun-tahun mendatang  diharapkan  dapat  diatasi  dengan  kayanya  sumber  plasma  nuftah  dari kultur mikrospora ini.
Prinsip dasar dari kultur mikrospora adalah menginduksi mikrospora yang bersifat  embriogenik  dengan  cara  membelokkan  arah  perkembangan  gametofitik ke  arah  sporofitik  sehingga  menghasilkan  embrio  yang  bersifat  haploid. Fenomena ini dikenal dengan nama androgenesis atau embriogenesis mikrospora . Pada  embrio  yang  bersifat  haploid,    proses  penggandaan  kromosom  lebih  lanjut dapat  dilakukan  sehingga  dihasilkan  tanaman  yang  bersifat doble  haploid (homozigot)  sifat ini sangat penting dalam pemulian tanaman.
Seperti  dikemukaan  di  atas  prinsip  dasar  dari  kultur  mikrospora  adalah menginduksi  mikrospora  yang  bersifat  embriogenik  dengan  cara  membelokkan arah  perkembangan  gametofitik  kearah  sporofitik,  perubahan  jalur  gametofitik kearah  sporofitik  dapat  diinduksi  dengan  mengaplikasikan  beberapa  perlakuan misalnya  berupa  stres  pelaparan,  stres  temperatur  (dengan  temperatur  tinggi  dan rendah  )  (Touraev et  al. ,  1997).  Stres  berupa  temperatur  tinggi  (30-35 o C  )  telah terbukti meningkatkan respon androgenesis   pada Brassica , Zea mays L, Triticum aestivum serta O ryza sativa L (Li et al., 1988;. Reddy et al., 1985). Gandum akan menunjukkan  respon  androgenesis  pada  temperatur  optimal  32 o C  selama  6  hari (Li et al. , 1988) dan pada suhu 33 o C yang dikombinasi pelaparan (Touraev et al , 1996).  Metode  yang  sama  sebelumnya  diterapkan  pada Oryza  sativa (Ogawa et al. , 1994) Sedangkan Brassica campestris menunjukkan respon androgenesis pada temperatur 35 o C selama 3 hari.
Disamping perlakuan stres temperatur tinggi, perlakuan berupa temperatur rendah  pada  kuncup  bunga  sebelum  dilakukan  isolasi  antera  atau  mikrospora dilaporkan dapat meningkatkan respon androgenesis pada sereal seperti Hordeum vulgare L, Oryza sativa ,  dan  Z ea  mays L.  Perlakuan  temperatur  rendah  berkisar antara 2-15 o C dalam waktu 2-28 hari (Kiviharju dan Pehu , 1998).
Tanaman  yang  akan  dipergunakan  dalam  penelitian  ini  adalah Nicotiana tabacum L cv.  vortenlanden.  Varietas  tembakau  ini  merupakan  bahan  dasar pembuatan  sigaret,  dan  sangat  diminati  di  pasar  eropa.  Selain  itu  varietas
tembakau  ini  merupakan  varietas  unggulan  di  Daerah  NTB  khususnya  Lombok Timur,  Lombok  tengah  dan  juga  Lombok  Utara  (54%  produksi  tembakau Nicotiana  tabacum L.  cv.  Virginia  di  Indonesia  dihasilkan  NTB).  Besarnya antusias pasar eropa terhadap varietas tembakau ini menyebabkan Indonesia harus meningkatkan produksi tembakau  tidak hanya secara  kuantitas  tetapi  juga  secara kualitas.  Secara  konkrit  permasalahan  ini  digambarkan  Kuswanto  (2005)  adalah bagaimana meningkatkan tembakau virginia  lombok bisa  meningkat dari 35.000 ton  menjadi  75.000  ton  tetap  kompetitif,  bagaimana  bisnis  tembakau  Virginia meningkat  dari  500milyar  menjadi  1  triliyun,  bahkan  bagaimana  bila  sektor pertanian ini menjadi pilihan profesi  bagi generasi muda.
Meskipun  seharusnya  tujuan  akhir  dari  penelitian  adalah  menghasilkan tanaman  tembakau  yang  berkualitas  tinggi,  tetapi  penelitian  ini  lebih  ditujukan untuk  melihat  tahapan  perubahan  karakter  morfologi  pada  mikrospora  tembakau yang diinduksi secara invitro.

## Tujuan Penelitian
Tujuan  penelitian  ini  dijabarkan  sebagai  berikut:  Untuk  mengetahui bagaimana  perubahan  karakter  morfologi  mikrospora  tembakau  Nicotiana tabacum  L.  cv.  Virginia  setelah  diberi  perlakuan  cekaman  pelaparan  dan  suhu tinggi.

## II. METODE PENELITIAN
A. Alat dan Bahan Penelitian
1. Bahan  Habis pakai  berupa:  Kuncup Nicotiana  tabacum L  cv.  Virginia ukuran mahkota bunga kuncup 7-11 mm, Medium B (starvasi), Deterjen, NaCLO 5,25%  /  Sunclin/HgCL 2 0,05%,  Asam  Asetat  Glacial,  Pewarna  DAPI  (4,6- Diamidino 2-phenylidole), Alkohol 70%, gliserin.
2. Alat-alat berupa  :Laminar  air  flow,  sentrifugasi,  timbangan  analitik, inkubator yang distel pada suhu 34 o C, cawan petri, kertas payung, aluminium foil, autoclave, scalpel, pinset, batang penggerus, flakon, tabung sentrifus, mikropipet dan  mikrotip,  gelas  benda  dan  gelas  penutup,  mikroskop  fluorescen,  label  dan pensil.

## Cara kerja
a. Pengadaan  eksplan :  Dimulai  dengan  persiapan  media  tanam  yaitu menyediakan  tanah  kering  yang  kemudian  dicampur  dengan  pupuk  kandang dengan  perbandingan  1:1.  lalu  dibiarkan  selama  10  hari.  Campuran  tanah tersebut  dimasukkan  ke  dalam  polybag.  Pada  saat  bibit  akan  ditanam  terlebih
220 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Juli  2014 , hlm. 217 – 226
dahulu diberi pupuk fosfat. Pemupukan selanjutnya adalah dengan  pupuk yang mengandung nitrogen yaitu pada  hari ke 7 dan hari ke 28 masa tanam. Bagian tanaman yang akan dijadikan eksplan adalah kuncup bunganya, yang umumnya akan didapatkan setelah 3 bulan masa tanam.
b. Penentuan stadium Perkembangan Mikrospora : Mikrospora diisolasi dari antera,  kemudian  diamati  di  bawah  mikroskop.  Penentuan  stadium perkembangan  mikrospora  dilakukan  pada  beberapa  ukuran  mahkota  kuncup bunga yaitu 7-11mm yang dibagi menjadi 4 kelompok yaitu : 7-8mm, 8-9mm, 9-10mm,10-11 mm. stadium yang diperlukan adalah stadium Late uninucleate yang ditentukan atas dasar letak inti, jumlah inti dan vakuolisasi yang terjadi.
c. Isolasi  mikrospora  dan  kultur  : Perlakuan  stres  diberikan  pada  mikrospora yang  sudah  diisolasi  secara  aseptik.  Perlakuan  berupa  kombinasi  stres pelaparan  (medium  B  yang  mengandung:  KCl  1490mg/l,  CaCl 2 147mg/l, MgSO 4 7H2O 250 mg/L, Manitol 54700mg/l, KH 2 PO 4 140mg/l pH 7) dan suhu 34 o C  selama  6  hari.  Untuk  melihat  perkembangan  inti  dilakukan  pewarnaan DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole).
d. Pengecatan  DAPI  : Pengecatan  DAPI  bertujuan  untuk  melihat  perkembagan inti sel mikrospora dengan prosedur sebagai berikut :
1) Mikrospora  difiksasi  alkohol  70%  dan  asam  asetat  glacial  dengan perbandingan 1:3 selama 15 menit. Kemudian dicuci alcohol 70% sebanyak 2 kali
2) Larutan  DAPI  dituangkan  dan  dibiarkan  selama  20  menit  lalu  ditetesi gliserin
3) Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop fluorescen.
Pengecatan  ini  bisa  dilakukan  pada  saat  :  mikrospora  masih  segar  dan setelah perlakukan cekaman pelaparan dan suhu tinggi.

## B. Parameter penelitian:
Parameter penelitian meliputi hal-hal berikut :
1. Stadium  perkembangan  mikrospora    meliputi  mikrospora  uninukleat  awal- tengah, uninukleat akhir,  binukleat;
2. Perkembangan  inti  dilakukan  setelah  perlakuan  stres.  Dihitung  mikrospora uninukleat, binukleat asimetris, binukleat simetris;
3. Viabilitas  mikrospora  sebelum  dan  sesudah  perlakuan  stres.  Viabilitas ditandai dengan mikrospora berbentuk bulat, dan tidak terplasmolisis;
4. Prosentase mikrospora embriogenik setelah perlakuan;

## C. Teknik Pengumpulan dan Analisis data :
Pengumpulan data dilakukan secara deskripsi dengan menghitung rata-rata dan  standar  deviasi  dari  masing-masing  parameter.  Selain  itu  akan  dilakukan dokumentasi  berupa  pemotretan  obyek  penelitian  baik  pada  preparat  segar, preparat  mikrospora  yang  sudah  diberikan  perlakuan  stres  pelaparan  dan  suhu 34 o C  selama  6  hari.  Pengamatan  dilakukan  dibawah  mikroskop  cahaya  dan fluorescen.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Penetapan Stadium Perkembangan Mikrospora
Stadium  perkembnagan  sangat  penting  dalam  menentukan  keberhasilan induksi  embryogenesis  mikrospora  karena  embrio  yangterbentuk  dalam  jumlah banyak  didapat  dari  stadium  yang  responsive  yaitu  antera  yang  mengandung mikrospora  pada  stadum  uninukleat  akhir  dan  sebelum  mitosis  (Dunwell,  1996). Dalam penelitian ini terdapat korelasi antara ukuran panjangkuncup bunga dengan stadium perkembangan mikrospora.
Penelitian dilakukan pada 4  kelompok bunga berdasarkan ukuran  kuncup masing-masing:  7-8mm,  9-10mm,  11-12mm,  12-13mm.  berdasar  hasil pengamatan    dari  keempat  kelompok  tersebut  terlihat  semakin  panjang  ukuran kuncup maka  stadium mikrospora  semakin dewasa. Stadium perkembangan pada penelitian  ini  ada  3  kelompok  yaitu  uninukleat  awal-tengah,  uninuklaeat    akhir dan  binukleat.  Uninukleat  awal-tengah  memiliki  ciri  mikrospora  berbentuk  bulat dengan  vakuola  kecil-kecil.  Dengan  pengecatan  DAPI  kedudukan  inti  terletak ditengah.  Pada  stadium  selanjutnya  /uninukleat  akhir  kedudukan  inti  makin kepinggir  dan  ukuran  vakuola  senakin  besar  bahkan  menempati  sebagian  besar volume  sel.  Sedangkan  untuk  stadium  binukleat  dicirikan  dengan  adanya  2  inti dalam mikrospora tersebut.
Hasil  pengamatn  menunjukkan  ada  beberapa  perbedaan  persentase stadium  perkembangan  mikrospora  pada  keempat  kelompok  ukuran  kuncup tersebut dengan perincian sebagai berikut:
222 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Juli  2014 , hlm. 217 – 226
Tabel 1. Stadium perkembangan mikrospora  L. cv. Virginia (5kali ulangan)
Ukuran kuncup (mm) Rata-rata stadium perkembangan uninukleat awal- tengah uninuklaeat  akhir binukleat. 7-8 77,58 ±1,23 21,42 ± 1,72 - 9-10 54,13 ± 1,47 45,17 ± 1,97 0,67 ± 0,92 11-12 27,96 ± 1,01 69,48 ± 1,52 2,55 ± 0,73 12-13 17,74 ± 2,67 38,56 ± 1,96 44,73 ± 3,76
Dari table di atas persentase tertinggi mikrospora stadium uninukleat akhir adalah  pada  ukuran  kuncup  11-12mm.  menurut  Dunwell  (1996)  ukuran  ini merupakan  ukuran  terbaik  sebagai  eksplan  untuk  induksi  embryogenesis mikrospora.  Touraev et.al (1995)  pada  Nicotiana  tabacum  cv  petit  Havana  SR1 menyebutkan  stadium  uninukleat  awal  berada  pada  fase  G1  sedangkan  stadium uninukleat akhir berada pada fase G2 dalam  siklus  sel. Tetapi menurut  Indrianto et al (2001) mikrospora padavstadium uninukleat akhir merupakan transisi antara Fase  G1  dan  S.  Fase  G1  merupakan  periode  presintesis  DNA  sedangkan  fase  S merupakan  masa  berlangsungnya  sintesis  DNA.  Pada  mikrospora  yang  diberi perlakuan  cekaman  ketika  memasuki  check  point  G1  yang  berada  di  antara  fase G1  dan  S  akan  menghasilkan  proses  seluler  yang  berbeda  dari  proses  alaminya. Dalam hal ini terjadi proses pembelokan  arah perkembangan gametofitik  kearah sporofitik.
B. Perkembangan Mikrospora  Setelah  Perlakuan  Cekaman  Pelaparan  dan Suhu Tinggi
Mikrospora  yang  diisolasi  dan  diberi  perlakuan  cekaman  pelaparan  dan panas 34 o C  akan  mengalami perubahan baik  viabilitas  maupun perubahan  secara morfologi  dan  sitologi.  Viabilitas  setelah  perlakuan  cekaman  akan  mengalami penurunan. Pada table 2 menunjukkan korelasi  antara lama strss (6 hari ) dengan viabilitas mikrospora. Hal ini disebabkan karena sebagian mikrospora tidak dapat bertahan  hidup  pada  kondisi  yang  tidak  normal  yaitu  suhu  tinggi  dan  medium pelaparan.
Baiq Farhatul W , Kajian Karakter Morfologi Mikrospora Tembakau Virginia …_ 223
Table 2.Mikrospora Embriogenik Nicotiana Tabacum L. cv. Virginia Setelah
Perlakuan Cekaman  Pelaparan Dan Suhu 34 o c Perlakuan Viabilitas Mikrospora Embriogenik Tipe 1 Tipe 2 Tipe3 Segar 74,99 ± 1,33 - - - Cekaman 6 hari 50,93 ± 0,59 12,88 ± 1,11 16,22 ± 0,73 21,79 ± 0,68
Selain  berkurangnya  viabilitas,  mikrospora  mengalami  perubahan morfologi  dan  sitologi.  Tujuan  dari  pemberian  cekaman  adalah  untuk menginduksi  mikrospora  yang  bersifat  embriogenik.  Dari  hasil  pengamatan morfologi  mikrospora  embriogenik  dibagi  menjadi  3  tipe  (Indrianto,et  al.  2001) yaitu tipe 1, tipe 2, tipe 3, mikrospora  tipe 1 memiliki cirri  yang  identik  dengan mikrospora  fase  uninukleat  akhir  dengan  vakuola  berukuran  besar  hampir memeuhi  seluruh  ruang  sel,  inti  masih  di  tepi  dekat  dengan  dinding  sel.selama proses  cekaman  tipe  ini  akan  mengalami  perubahan  yaitu  ukuran  sel  akan bertambah  besar.  Secara  sitologi  pada  mikrospora  embriogenik  terjadi  juga perubahan    pada  organel-organel  yang  lain  yaitu  terdapat  granula  amilum/secara morfologi  tampak  lebih  jernih,  ukuran  dan  jumlah  plastid  berkurang,demikian juga  mitokondria  dan  ribosom.  Perkembangan  selanjutnya  adalah  vakuola  mulai terfragmentasi karena terbentuknya strand sitoplasmik yang melewati vakuola dan menghubungkan sitoplasma perinuklear dengan sitoplasma subcortical, inti masih ada  dekat  dinding  sel  mikrospora.  Mikrospora  yang  berada  dalam  keadaan  ini dikelompokkan  dalam  tipe  2  fragmentasi  vakuola  yaitu  terbentuknya  vakuola kecil  dimaksudkan  untuk  mencegah  pecahnya  dinding  mikrospora  akibat bertambahnya  ukuran  vakuola  selama  cekaman  berlangsung.  Inti  kemudian bergerak  ke  pusat  sel  sehingga  membentuk  struktur  seperti  bintang  ( star  like ). Mikrospora  ini  dikelompokkan  ke  dalam  tipe  3.  Selama  proses  induksi  dan sebelum  pembelahan  sel  terjadi  reorganisasi  pada  sistem  skeleton  mikrospora. Tubulin-tubulin terakit  menjadi filamen  mikrotubul. Mikrotubul  kemudian membentuk  preprofase  band  (PPB).  Diprediksikan  PPB  ini  merupakan  tempat terbentuknya dinding baru pada sel anakan hasil dari mitosis (Simmons, 1999).
224 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Juli  2014 , hlm. 217 – 226
Gambar 1.  Perubahan Karakter Morfologi Sel Mikrospora Setelah Mengalami Cekaman Pelaparan Dan Suhu Tinggi Keterangan:
Populasi  Mikrospora  Segar;  B-D  mikrospora  yang  telah  mengalami cekaman (B) Tipe 1, (C) tipe 2, (D) tipe 3 terlihat struktur star like ;  E. Sel mikrospora yang berkecambah (tidak mengalami cekaman)

## IV. KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan  yang  telah  diuraikan  di  atas,  maka dapat diambil kesimpulan :
1. Setelah  perlakuan  cekaman  mikrospora  mengalami  perubahan  morfologi menjadi 3 tipe  mikrospora embriogenik yaitu tipe 1, tipe 2, dan tipe 3.
2. Mikrospora  yang  tidak  diberi  perlakuan  cekaman  akan  berkembang membentuk buluh serbuk sari (berkecambah )

## DAFTAR RUJUKAN
Bhojwani,  SS  and  Bhatnaga,  S.P.  1999 .The  Embriology  Of  Angiosperm .  New Delhi. Vicas Publishing Hause PVT LTD.
Cahyono,  B.  1998. Tembakau  Budidaya  dan  Analisis  Usaha  Tani .  Yogyakarta. Penerbit  Kanisius
Dunwell  J.M.  1996. Microspore  Culture .  In  Jain  S.M;  S.K.  Sopory  and  R.E Veilleux  (Eds). In  Vitro  Haploid  Production  in  Higher  Plants vol  I Fundamental  aspect  in  Method.  Nederlands.  K luwer  Academics Publishers. p:205-216
Ferrie,  A.M.P.  and  Keller,  W.A.  1995. Microspore  Culture  For  Haploid  Plant Production in  : Gamborg O.L. and Philips. G.C. (eds) Plant Cell, tissue and  Organ  Culture  Fundamental  Methods .  Heidelberg  German.  Springer verlag Berlin.
Indrianto,A;    Barinova,  I;  Touraev,A  and    Heberle–Bors,E.  2001. Tracking Individual  Wheat  Microspores  In  vitro:  Indentifikation  of  Embriogenic Microspores and Body Axis Formation in Embryo. Planta 212 : 163-174
Karp,  G.  1999. Cell  and  Molecular  Biology. Concepts  and  Experiments  2 nd ed. Canada. Jhon Wiley and Sons.,Inc.. Pp.606-613
Kiviharju,  E  and  Pehu,E.  1998. The  Effect  of  Cold  and  Heat  Pretreatment  on Anther  Culture  Response  of Avena  sativa and  Avena sterili s .  Plant  cell tissue and organ culture 54: 97-104
Kuswanto,  2005. Kerjasama  kemitraan  antara  swasta  dan  Perguruan  Tinggi dalam  Penelitian  untuk  Meningkatkan  daya  Saing  Daerah  (Virginia lombok  Espektasi  dan  Revitalisasi).  PT  Sadana  Arif  Nusa. Makalah disampaikan pada PENLOK Nasional METOPEN. 29-30 september 2005
(tidak dipublikasikan)
Li  H.K;  Javed,  A.Q;  and  Kutty,  K.K.  1988. The  Influence  of  Different Temperature  Treatments  on  Anthere  Culture  Response  of  Spring  Wheat (Triticum aestivum L.) Plant sci. 57: 55-61
Ogawa,  T.F;  Hiroyuki  and  Ohkawa,  Y.  1994. Introduction  of  Cell  Division  of Isolated Pollen Grains by Sugar Starvation in Rice . Breeding Science Vol. 44 : 75-77 No.1
Palmer  C.E.  and  Keller,  W.A.  1997. Pollen  Embryos .  In  Sivana  K.R.  and  V.K. Sawhney (eds) Pollen Biotecnology for Crop Production and Inprovement Cambridge University Press.
Raghavan, V. 1997. Molecular Embriology . Plant Molecular Biology. Cambridge University Press. New York.
Reddy VS; Leelavanti,S and Sen, S.K . 1985. Influence of Genotipe and Culture Medium in Microspore Callus Induction  and Green Plant Regeneration in Anthera of Oryza sativa . Physiol. Plant 63: 309-314
Reynolds,  T.L.  and  Raghavan,  V.  1982. An  Auto  Radiographic  Study  of  RNA Synthesis  During  Maturation  and  Germination  of  Pollen  Grains  of Hyosciamus niger . Protoplasma.
Suryowinoto,  1996. Kultur  Jaringan  Tumbuhan .  Yogyakarta.  Gadjah  Mada University Press.
226 _ Jurnal Teknosains, Volume 8 Nomor 1, Juli  2014 , hlm. 217 – 226
Tjitrosoepomo,  1996. Taksonomi  Tumbuhan  (Spermatophyta) Cet.  Ke-5. Yogyakarta. Gadjah Mada University Press
Toonen.  M.A.J.and  S.C.  De  Vries.  1996. Initiation  of  Somatic  Embryo  from Single  Cells  in :  T.L.  Wangand  cuming  (eds)  Embryogenesis  :  The Generation of Plant. Bios Scientific Publishers. Pp. 173-189
Touraev, A;   Indrianto, A; Wratschko, I; Vincente,O and Heberle-Bors, E. 1996. Eficient  Microspore  Embriogenesis  in  Wheat  (Triticum  aestivum  L) Induced by Starvation at High Temperature . Sex Plant reprod 9: 209-215
Touraev,  A;  Vincente,  O.  and  Heberle  Bors,  E.  1997. Initiation  of  Microspore Embriogenesis by Cekaman . Trends Plant Sci 2: 285-303.
Yu, S.M. 1999. Update on Signal Tranduction Celluler and Benetic Responses of
Plant to Sugar Starvation. Plant physiology. 121: 687-693
Zarsky,V; Garrido, D; Rihova, L; Tupy, J; Vicente,O and Heberle-Bors, E.
1992. Depression of the Cell Cycle  by Starvation is Involved in The Induction of Tobacco Pollen Embryogenesis . Sexual plant Reproduction 5. 189-194