ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 12 (2) (2009) : 31 – 39
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Studi Filogeni dan Uji Potensi Bioremediasi serta Enzim Termostabil Ekstraseluler Isolat Geobacillus sp. dari Sumber Air Panas Gedong Songo
Maulida Indriyaning Ratri a , Purbowatiningrum Ria Sarjono a* , Agustina L.N. Aminin a a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: purbowatining@live.undip.ac.id A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords:
Thermophilic microorganisms, Geobacillus sp, bioremediation Thermophilic  microorganisms  are  microorganisms  that  are  resistant  to  high temperatures with optimum growth temperature reaching more than 60°C. Thermophilic microorganisms have many uses such as, for bioremediation and thermostable enzyme producer. This study aims were to explore the potential of Geobacillus sp. from the Gedong Songo  hot  spring  through  the  construction  of  phylogeny  trees  and  to  obtain  potential bioremediation data of Fe (III), Pb (II), H2O2 and extracellular enzymes from Geobacillus sp. The construction of phylogeny trees was performed using Phylip 3.68 ed program with parsimony method. Test the potential of Geobacillus sp. for bioremediation of Fe (III) and Pb  (II)  was  performed  by  inoculating  the  pellet Geobacillus  sp. on  BSM  (Basal  Saline Medium) containing Fe (III) and Pb (II) respectively. Analysis of Fe (III) and Pb (II) on the medium  was  performed  by  AAS.  Test  of  H2O2bioremediation  potential  was  conducted qualitatively by observing the presence of O2 bubbles produced by catalase activity from Geobacillus sp. Amylase enzyme activity test, β -galactosidase and extracellular protease were done qualitatively with addition of each starch, ONPG and gelatin as its substrate respectively. The study showed positive results on the bioremediation potential of Fe (III) and Pb (II) as well as for the test of enzyme amylase and extracellular protease. Test of bioremediation  potential  of  H2O2  and  extracellular β -galactosidase  enzyme  showed negative  result.  The  construction  of  phylogeny  trees  shows  that  the  eight  isolates  of Geobacillus  sp. has  the  closest  genetic  relation  to Geobacillus  sp. _TERI_NSM  and Geobacillus sp. Sbs3.

## A b s t r a k

## Kata kunci:
Mikroorganisme termofilik, Geobacillus sp, bioremediasi Mikroorganisme termofilik merupakan mikroorganisme yang tahan terhadap suhu tinggi dengan  suhu  optimum  pertumbuhan  mencapai  lebih  dari  60°C.  Mikroorganisme termofilik  mempunyai  banyak  kegunaan,  antara  lain  untuk  proses  bioremediasi  dan penghasil  enzim  termostabil.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menelusuri  potensi Geobacillus  sp. dari  sumber  air  panas  Gedong  Songo  melalui  konstruksi  pohon  filogeni serta  mendapatkan  data  potensi  bioremediasi  Fe(III),  Pb(II),  H 2 O 2 dan  enzim ekstraselular dari isolat Geobacillus sp. Konstruksi pohon filogeni dilakukan menggunakan program  Phylip  3.68  ed  dengan  metode parsimony .  Uji  potensi Geobacillus  sp. untuk bioremediasi Fe(III) dan Pb(II) dilakukan dengan menginokulasikan pellet Geobacillus sp. pada  media  BSM  (Basal  Salin  Medium)  yang  mengandung  masing-masing  Fe(III)  dan Pb(II).  Analisis  kadar  Fe(III)  dan  Pb(II)  pada  media  dilakukan  dengan  AAS.  Uji  potensi bioremediasi H 2 O 2 dilakukan secara kualitatif dengan melihat adanya gelembung O 2 yang dihasilkan  oleh  aktifitas  katalase  dari Geobacillus  sp. Uji  aktivitas  enzim  amilase, β - galaktosidase dan protease ekstraseluler dilakukan secara kualitatif dengan penambahan
masing-masing amilum, ONPG dan gelatin sebagai substratnya. Penelitian menunjukkan hasil positif pada uji potensi bioremediasi Fe(III) dan Pb(II) serta untuk uji enzim amilase dan  protease  ekstraseluler.  Uji  potensi  bioremediasi  H 2 O 2 dan  enzim β -galaktosidase ektraseluler menunjukkan hasil negatif. Konstruksi pohon filogeni menunjukkan bahwa kedelapan  isolat Geobacillus  sp. memiliki  kekerabatan  terdekat  dengan Geobacillus sp._TERI_NSM dan Geobacillus sp. sbs3 .

## 1. Pendahuluan
Mikroorganisme termofilik merupakan
mikroorganisme  yang  tahan  terhadap  suhu  tinggi dengan suhu optimum pertumbuhan mencapai lebih dari 60°C [1]. Mikroorganisme termofilik dapat diisolasi dari sumber  air  panas  seperti Thermococcus  kodakaraensis dengan  suhu  optimum  pertumbuhan  85°C  [2]  dan Geobacillus  thermoleovorans dari  sumber  air  panas Gedong Songo dengan suhu pertumbuhan 74°C [3].
Mikroorganisme  termofilik  mempunyai  banyak potensi,  antara  lain  untuk  proses  bioremediasi. Bioremediasi  adalah  proses  pengolahan  limbah  dengan memanfaatkan kemampuan terakumulasi dan terkonsentrasinya  zat  polusi  atau  logam  dari  suatu cairan/limbah oleh material biologi, selanjutnya melalui proses pengolahan lebih lanjut, cairan/limbah ini dapat dibuang  dan  ramah  terhadap  lingkungan  [3].  Kondisi limbah yang mengandung logam berat sering kali masih dalam keadaan panas dalam proses pengolahannya. Oleh karena itu dibutuhkan mikroorganisme pengikat logam yang  tahan  pada  suhu  tinggi  atau  mikroorganisme termofilik.  Contohnya  adalah  bakteri Geobacillus thermoleovorans dari  sumber  air  panas  Gedong  Songo yang mampu mengikat besi (III), sulfat dan nitrat dengan temperatur optimum 65°C [4].
Selain  untuk  proses  bioremediasi  material, mikroorganisme  termofilik  sangat  bermanfaat  karena dapat menghasilkan protein-protein enzim termostabil [5]. Misalnya Pyrococcus furiosus yang dapat menghasilkan  enzim  hidrolase  dan  glikosintase  pada suhu  80°C  [6],  alfa  amylase  dari Bacillus  licheniformis yang  dapat  menghidrolisis  pati,  protease  dari Bacillus stearothermophilus [7]  dan  laktase  dari Streptococcus thremophilus yang  dimanfaatkan  dalam  industri  yogurt [8].
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh [9] pada sumber air panas Gedong Songo telah diisolasi delapan  isolat Geobacillus, yaitu Geobacillus  sp. dYTae-1 , Geobacillus  sp. dYTae-3 ,  Geobacillus  sp. dYTae-5 , Geobacillus  sp. dYTae-13 ,  Geobacillus  sp. dYTae-14 , Geobacillus  sp. dNBae-1 ,  Geobacillus  sp. dNBae-3X , Geobacillus  sp. dGae-3.  Kedelapan  isolat  tersebut  telah ditentukan  urutan  nukleotidanya  dari  gen  16S  rRNA, namun belum diketahui potensinya.
Salah  satu  cara  untuk  menelusuri  potensi mikroorganisme  adalah  dengan  menggunakan  pohon filogeni. Pada penelitian ini dilakukan konstruksi pohon filogeni  terhadap  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. untuk mengetahui  tingkat  kekerabatan  dari  isolat-isolat Geobasillus  sp. tersebut  dengan  bakteri-bakteri  lain.
Bakteri  yang  mempunyai  hubungan  filogenetik  yang dekat,  diperkirakan  sifat-sifat  dari  mikroorganisme tersebut  relatif  sama,  sehingga  kemungkinan  memiliki potensi  biomolekuler  yang  sama  pula.  Berdasarkan informasi  potensi  bakteri  yang  memiliki  kekerabatan terdekat  dengan  kedelapan  isolat Geobacillus  sp., maka potensi biomolekuler dari kedelapan Geobacillus sp., dapat diperkirakan.
Delapan  isolat Geobacillus  sp. tersebut  berasal  dari sumber air panas Gedong Songo. Widarto dan Yudistira [10] dalam penelitiannya membuktikan bahwa kadar Fe pada sumber air panas Gedong Songo (GS 2) pada tahun 2003 mencapai 92,15 ppm, sehingga diperkirakan isolat Geobacillus  sp. dapat  menggunakan  Fe(III)  dalam pertumbuhannya sehingga berpotensi untuk digunakan dalam  bioremediasi  Fe(III).  Penelitian  [11]Hussein  dkk, 2004 Pseudomonas sp. menghasilkan  bahwa  bakteri tersebut dapat mengakumulasi beberapa logam berbeda sehingga  terdapat  kemungkinan  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. juga  mempunyai  potensi  bioremediasi untuk logam selain Fe.

## 2. Metode Penelitian

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  adalah  sentrifugator (Beckman  model  J2-21),  inkubator  (Memmert  model 300),  pH  meter,  kulkas  (Sanyo  dan  Polytron),  botol semprot,  alat-alat  kultur  sel,  Atomic  Absorption Spectroscopy  (Shimadzu),  autoklaf  (Clinical  Autoclave Prestige Medical series 2100), gelas beker, tabung reaksi, labu  ukur,  botol  vial,  corong  kaca,  mikropipet,  pipet tetes, kertas saring dan pengaduk.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah isolat  bakteri  termofilik Geobacillus  sp. ,  media  Basal Saline Medium (BSM), Yeast Tripton(YT), Nutrient Broth (NB), larutan FeCl 3 , PbSO 4 , H 2 O 2 , H 2 SO 4 , Spirtus, Alkohol 70 %, ONPG (o-nitrovenil- β -D-Galaktosidase), gelatin, laktosa, pati kanji (amilum), bakto agar dan akuades.

## Cara Kerja

## Konstruksi Pohon Filogeni
Konstruksi pohon filogeni terhadap isolat Geobacillus  sp. dilakukan  dengan  program  Phylip ( Phylogeny  Inference  Package )  3.68  ed.  Pada  paket program Phylip, dipilih program seqboot, DNApars dan consense.

## Peremajaan Bakteri
Media  Basal  Saline  Medium  (BSM)  tersusun  dari K 2 HPO 4 ;  KH 2 PO 4 ;  (NH 4 ) 2 SO 4 ;  MgSO 4 .7H 2 O;  FeCl 3 .6H 2 O; NaCl;  dan  CaCl 2 .2H 2 O  yang  dilarutkan  dalam  akuades. Media  BSM  tersebut  dibuat  dengan  pH  6.  Sebanyak 100mL  media  BSM  yang  ditambah  nutrisi  disterilisasi. Media  cair  ini  digunakan  untuk  peremajaan  isolat bakteri.  Isolat  Bakteri  murni  diambil  dengan menggunakan  mikropipet,  kemudian  diinokulasikan  ke dalam media BSM dan diinkubasi pada suhu 55°C selama 24 jam.

## Uji Potensi Bioremediasi logam Fe (III)
Masing-masing  isolat Geobacillus  sp. yang  telah diremajakan diambil dengan menggunakan mikro pipet, dan diinokulasikan ke dalam media BSM yang baru dan diinkubasi  pada  suhu  55°C.  Media  BSM  yang  telah ditumbuhi  isolat Geobacillus  sp. disentrifuge  pada  4000 rpm  selama  10  menit  untuk  mengendapkan  bakteri. Pellet  bakteri Geobacillus  sp. yang  didapatkan diinokulasikan  pada  media  BSM  yang  mengandung Fe(III)  34,5  ppm  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  55°C. Media  yang  telah  ditumbuhi Geobacillus  sp. disentrifuge pada 4000 rpm selama 10 menit hingga didapatkan filtrat dan diuji kadar Fe(III) yang masih tersisa dengan AAS.

## Uji Potensi Bioremediasi logam Pb (II)
Masing-masing  isolat Geobacillus  sp. yang  telah diremajakan  diambil  dengan  menggunakan  mikropipet kemudian diinokulasikan kedalam media BSM yang baru dan  diinkubasi  pada  suhu  55°C.  Media  BSM  yang  telah ditumbuhi  isolat Geobacillus  sp. disentrifuge  pada  4000 rpm  selama  10  menit  untuk  mengendapkan  bakteri. Pellet  bakteri Geobacillus  sp. yang  didapatkan diinokulasikan  pada  media  BSM  yang  mengandung  7,5 mg/L  larutan  Pb(II)  dan  diinkubasi  pada  suhu  55°C. Kemudian disentrifuge pada 4000 rpm selama 10 menit. Supernatant  yang  didapatkan  dianalisis  dengan  AAS ( Atomic Absorption Spectroscopy ) untuk mengetahui kadar Pb yang masih tersisa pada larutan.
Uji Potensi Bioremediasi H 2 O 2
Masing-masing  isolat Geobacillus  sp. yang  telah diremajakan diambil dengan menggunakan mikro pipet kemudian  diinokulasikan  ke  dalam  media  BSM  untuk mendapatkan  stater.  Media  tersebut  diinkubasi  pada 55°C  hingga  keruh  yang  menandakan  bakteri  telah tumbuh. Media yang telah ditumbuhi bakteri diteteskan pada  kaca  preparat  kemudian  ditetesi  H 2 O 2 aktivitas katalase  pada  mikroba  dapat  diketahui  dengan terbentuknya gelembung-gelembung gas O 2 .

## Uji Amilase Ekstraseluler
Uji  amilase  ekstraseluler  dilakukan  dengan membuat media BSM padat yang mengandung pati kanji. Sebanyak 30 mL media dituang ke dalam cawan Petri dan didiamkan  hingga  memadat.  Kemudian  isolat  bakteri diteteskan pada media,  lalu  diinkubasi  pada  suhu 30°C. Setelah 48 jam, cawan digenangi dengan larutan lugol (1 g  kristal  iodin,  2  g  KI,  300  ml  akuades)  dan  didiamkan sekitar  1  menit  agar  iodin  bereaksi.  Adanya  daerah  tak
berwarna di sekitar koloni menunjukkan aktivitas enzim amilase.
Uji β -Galaktosidase Ekstraseluler
Masing-masing isolat Geobacillus sp. diambil dengan menggunakan  mikro  pipet  kemudian  diinokulasikan  ke dalam media cair BSM yang mengandung 1 % laktosa dan diinkubasi  pada  suhu  55°C  selama  24  jam.  Kemudian inokulum ditambah dengan larutan ONPG (o-nitrovenil- β -D-Galaktosidase)  dan  diinkubasi  selama  3-5  jam. Adanya β -Galaktosidase  ekstraseluler  ditandai  dengan perubahan  warna  dari  kuning  pucat  menjadi  berwarna jingga/kuning tua.

## Uji Protease Ekstraseluler
Uji  protease  ekstraseluler  dilakukan  dengan menghidrolisis gelatin. Bakteri yang diuji diinokulasikan ke  dalam  media  BSM  yang  ditambah  dengan  gelatin kemudian  diinkubasi  pada  55°C  selama  24  jam  hingga media sedikit keruh yang menandakan telah ditumbuhi bakteri.  Setelah  itu  media  disimpan  di  dalam  lemari  es selama 15 menit. Apabila media tetap cair menunjukkan adanya  hidrolisis  gelatin  oleh  protease  yang  dihasilkan bakteri  sedangkan  bila  media  memadat  maka  tidak terjadi  hidrolisis  gelatin  oleh  protease  yang  dihasilkan bakteri.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Studi Filogeni
Studi  filogeni  dilakukan  untuk  mengetahui  tingkat kekerabatan  dari  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. khas Gedong  Songo.  Analisis  filogenetik  ini  didasarkan  pada sekuen  parsial  gen  16S  rRNA  yang  merupakan  penanda molekuler  dengan  fungsi  yang  identik  pada  seluruh organisme. Molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki  urutan basa  yang  relatif  konservatif dan beberapa daerah urutan basanya variatif [12].
Berdasarkan  hasil  analisis  Blast  N  dari  data Gene Bank dengan  urutan  DNA  gen  16S  rRNA,  terdapat  100 spesies  bakteri  yang  memiliki  kemiripan  97-99% dengan kedelapan isolat Geobacillus sp. Penjajaran urutan nukleotida gen 16S rRNA dari kedelapan isolat Geobacillus sp. dilakukan dengan program Clustal W dan dihasilkan data pada gambar 1:
Gambar 1. urutan nukleotida gen 16S rRNA dari kedelapan isolat Geobacillus sp.
Berdasarkan  data  tersebut  diketahui  bahwa  pada penjajaran  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  dari kedelapan Geobacillus  sp. terdapat  delesi  yang  tidak ditemukan  pada  urutan  nukleotida  gen  16S  rRNA  dari spesies bakteri yang lain. Delesi terjadi pada basa kelima
dan kesepuluh dari data penjajaran gen 16S rRNA. Delesi spesifik  tersebut  menunjukkan  bahwa  kedelapan Geobacillus  sp. mempunyai  perbedaan  dengan  spesies bakteri  lain  yang  menunjukkan  bahwa  bakteri  Gedong Songo adalah khas.
Konstruksi pohon filogeni dilakukan menggunakan program  Phylip  ( Phylogeny  Inference  Package )  3,68  ed dengan metode parsimony , dan dihasilkan pohon filogeni yang  menunjukkan  kekerabatan  dari  kedelapan  isolat Geobacillus sp. dengan 92 spesies bakteri lainnya.
Berdasarkan pohon filogeni dari 100 spesies bakteri tersebut, dipilih 17 spesies bakteri yang memiliki tingkat kekerabatan  terdekat  dengan Geobacillus  sp. Gedong Songo  untuk  dibandingkan  lebih  lanjut  dengan kedelapan  isolat Geobacillus  sp. ,  sehingga  dihasilkan pohon filogeni yang lebih spesifik dari 25 spesies bakteri yang disajikan pada gambar 2.
Gambar 2. Pohon filogeni dari 25 spesies bakteri
Berdasarkan  pohon  filogeni  tersebut,  dapat diketahui bahwa kedelapan isolat Geobacillus sp. Gedong Songo  berada  dalam  satu  kelompok  kekerabatan  yang dekat.  Kedekatan  kekerabatan  tersebut  menunjukkan kemiripan  sifat  pada  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. , dibuktikan  dengan  adanya  kemiripan  data  potensi bioremediasi  dan  enzim  ektraseluler  dari  kedelapan isolat Geobacillus  sp. yang  telah  didapatkan  pada penelitian ini.
Spesies lain yang memiliki tingkat kekerabatan yang dekat  dengan  dengan  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. adalah Geobacillus_sp._TERI_NSM yang  ditemukan  oleh Nitu  Sood  dan  Banwari  Lal  (NCBI. Accession Number EF199739,  2009)  serta Geobacillus  sp.  sbs3 yang ditemukan  oleh  Tayyab,M.,  Rasool,N.,  Jalal,A.  dan Rashid,N  (NCBI. Accession Number  AB306518 ,  2009). Berdasarkan  potensi  spesies  bakteri  yang  mempunyai kekerabatan  yang  dekat  dengan Geobacillus  sp. Gedong Songo , maka potensi dari Geobacillus sp. dapat ditelusuri. Bakteri  yang  mempunyai  hubungan  filogenetik  yang dekat,  diperkirakan  sifat-sifat  dari  mikroorganisme tersebut  relatif  sama,  sehingga  kemungkinan  memiliki potensi yang sama pula. Selain itu dapat pula diketahui mikroorganisme alternatif untuk masing-masing isolat dalam pemanfaatannya.
Potensi  molekuler  sebagian  besar  spesies  bakteri yang  memiliki  kekerabatan  terdekat  dengan  kedelapan isolat Geobacillus sp. belum dieksplorasi lebih lanjut. Pada penelitian  ini  akan  dieksplorasi  lebih  lanjut  potensi molekuler  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. sebagai  agen bioremediasi Fe(III), Pb(II) dan H 2 O 2 serta potensi enzim ekstraseluler  terhadap  amilase, β -Galaktosidase  dan protease.

## Uji Potensi Bioremediasi Fe (III)
Delapan  isolat Geobacillus  sp. tersebut  berasal  dari sumber  air  panas  Gedong  Songo  yang  mengandung Fe(III).  Widarto  dan  Yudistira  [10]  dalam  penelitiannya membuktikan  bahwa  kadar  Fe  pada  sumber  air  panas Gedong  Songo  (GS  2)  pada  tahun  2003  mencapai  92,15 ppm.  Dari  hasil  tersebut  diperkirakan  isolat Geobacillus sp. dapat  menggunakan  Fe(III)  dalam  pertumbuhannya sehingga berpotensi untuk digunakan dalam bioremediasi Fe(III).
Pellet  bakteri Geobacillus  sp. diinokulasikan  pada media  BSM  yang  mengandung  Fe(III)  34,5  ppm. Pengamatan  dilakukan  setiap  hari  untuk  mengetahui pertumbuhan  bakteri  yang  diindikasikan  dengan kekeruhan media. Pada hari ketiga, media sudah terlihat keruh. Hal ini menunjukkan bahwa Geobacillus sp. mampu tumbuh pada media BSM dengan Fe(III) 34,5 ppm.
Kultur Geobacillus sp. yang berusia 4 hari disentrifuge pada  4000  rpm  selama  10  menit  untuk  mengendapkan bakteri hingga didapatkan filtrat yang bebas bakteri yang selanjutnya  akan  diuji  kadar  Fe(III)  yang  masih  tersisa dengan  AAS  dengan  panjang  gelombang  248,3  nm. Berdasarkan  data  yang  dihasilkan  pada  gambar  3, diketahui  bahwa  kadar  Fe(III)  pada  media  telah berkurang  untuk  masing-masing  isolat Geobacillus  sp. Hal ini menunjukkan bahwa kedelapan isolat Geobacillus sp. mampu mengabsorpsi Fe(III).

## Gambar 3. Pengujian kadar Fe(III) oleh isolat Geobacillus sp
Secara umum proses bioremediasi logam berat oleh mikroorganisme  melalui  dua  mekanisme  yaitu ekstraseluler  dan  intraseluler  yang  terjadi  secara
bersamaan . Proses ekstraseluler biasa disebut biosorbsi. Proses  ini  terjadi  ketika  ion  logam  berat  terikat  pada dinding sel dengan dua cara. Pertama melalui pertukaran ion di mana ion-ion bermuatan positif pada dinding sel digantikan  oleh  ion-ion  logam  berat.  Kedua  adalah formasi  kompleks  antara  ion-ion  logam  berat  dengan biopolimer seperti polisakarida dan protein yang berada pada dinding sel mikroorganisme yang berperan penting dalam  mengikat  ion  logam. Geobacillus  sp. merupakan bakteri gram positif, dimana dinding selnya terdiri dari peptidoglikan  [9].  Peptidoglikan  adalah  polimer  dari  3 macam building  block, yaitu  N-acetyl  Glucosamine (NAG),  N-Acetyl  Muramic  Acid  (NAM),  Peptida  yang dibangun oleh 4 asam amino (tetrapeptida) yang terdiri dari  beberapa  D-asam  amino.  Ketiga  senyawa  tersebut sangat  efektif  sebagai  zat  penjerap  logam  [13].  Gugus fungsi seperti karbonil, amino, thiol, hidroksi, fosfat, dan hidroksi-karboksil  yang  berada  pada  dinding  sel merupakan gugus ligan yang berkoordinasi dalam atom pusat logam melalui pasangan elektron bebas [3].
Gambar 4. Struktur Peptidoglikan pada Dinding Sel

## Bakteri
Dinding  sel  pada  bakteri  gram  (+)  juga  memiliki polisakarida  yang  disebut  asam  teikoat.  Asam  teikoat yang  merupakan  polimer  gliserol  dan  ribitol  fosfat menempel pada peptidoglikan atau membran sitoplasma.  Salah  satu  fungsi  asam  teikoat  yang bermuatan negatif adalah untuk transport ion positif dari dan keluar sel.
Gambar 5. Struktur Asam Teikoat
Mekanisme  intraseluler  secara  simultan  terjadi sejalan dengan konsumsi ion logam untuk pertumbuhan mikroorganisme  atau  akumulasi  intraselular  ion  logam tersebut [3].
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kedelapan isolat Geobacillus  sp. mempunyai  potensi  untuk bioremediasi  Fe(III).  Pengurangan  konsentrasi  Fe(III) yang  besar  menunjukkan  bahwa  delapan  isolat Geobacillus  sp. cukup  efektif  untuk  proses  bioremediasi Fe(III). Dari kedelapan isolat Geobacillus sp., isolat dGae- 3  mampu  mengabsorpsi  Fe(III)  paling  tinggi,  hal  ini terbukti dari konsentrasi Fe (III) yang terakumulasi pada isolat  dGae-3  paling  tinggi,  yaitu  99,85  %,  sehingga dGae-3  paling  efektif  digunakan  untuk  bioremediasi Fe(III).

## Uji Potensi Bioremediasi Pb (II)
Penelitian  Hussein ,  dkk. [11]  pada  empat  spesies Pseudomonas sp. menghasilkan  bahwa  keempat  bakteri dapat  mengakumulasi  beberapa  logam  berbeda.  Oleh karena  itu,  terdapat  kemungkinan  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. mempunyai  potensi  bioremediasi  untuk logam selain Fe.
Pellet  bakteri Geobacillus  sp. yang  didapatkan diinokulasikan  pada  media  BSM  yang  mengandung Pb(II)  7,5  ppm.  Media  yang  telah  ditanami  bakteri tersebut diinkubasi selama 4 hari, hingga media terlihat keruh,  yang  menandakan  bahwa  bakteri  telah  tumbuh pada  media  BSM  tersebut.  Kultur Geobacillus  sp. disentrifuge  pada  4000  rpm  selama  10  menit  untuk mengendapkan bakteri  yang  telah  tumbuh.  Filtrat  yang didapatkan  selanjutnya  diuji  kadar  Pb(II)  yang  masih tersisa  pada  media  dengan  AAS  dengan  Panjang Gelombang  283,3  nm.  Konsentrasi  Pb(II)  yang terakumulasi pada masing-masing isolat Geobacillus sp. dapat dilihat pada gambar 6.
Gambar 6. Konsentrasi Pb(II) yang terakumulasi pada masing-masing isolat Geobacillus sp.
Berdasarkan  data  yang  dihasilkan  pada  grafik, diketahui bahwa kadar Pb(II) pada media telah berkurang untuk  masing-masing  isolat Geobacillus  sp. Bakteri Geobacillus  sp. dapat  beradaptasi  dengan  media  yang mengandung Pb(II) yang merupakan logam berat. Dalam metabolismenya,  logam  berat  Pb  terakumulasi  dalam membran  sel  (ekstraseluler)  dan  pada  sitoplasma (intraseluler).
Akumulasi  ekstraseluler  Pb(II)  terjadi  dengan mekanisme  yang sama dengan  ion Fe(III)  yaitu  dengan adanya  pengikatan  ion-ion  logam  oleh  polimer ekstraseluler  yang  dihasilkan  sel-sel  mikroba  dan komplekasi  antara  ion-ion  logam  bermuatan  positif
99,73 99,73 100 100 100 99,6 100 100 99,4 99,5 99,6 99,7 99,8 99,9 100 Kadar Pb yang terakumulasi (%) dYTae- 1 dYTae- 3 dYTae-
5 dYTae- 13 dYTae- 14 dN
Bae-1 dN Bae-x dGae-3 Isolat Geobacillus sp.
dengan  sisi  reaktif  permukaan  sel  yang  bermuatan negatif.
Uji Bioremediasi Hidrogen Peroksida (H 2 O 2 )
Uji  ini  dilakukan  dengan  cara  membuat  stater  dari delapan  isolat Geobacillus  sp. Gedong  Songo  yang  telah diremajakan.  Stater  yang  berumur  48  jam  diambil dengan menggunakan mikro pipet kemudian diteteskan pada kaca preparat, dan ditetesi H 2 O 2 .
Adanya  bioremediasi  H 2 O 2 pada  mikroba  dapat diketahui  dengan  terbentuknya  gelembung-gelembung gas O 2 . Hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) dapat terdekomposisi oleh  enzim  katalase  yang  dapat  dihasilkan  suatu mikroorganisme.
2H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2 [14]
Pada  mikroorganisme,  katalase  tersebut  berfungsi untuk  melindungi  sel  dari  efek  toksik  hydrogen peroksida  [15].  Kontrol  positif  yang  digunakan  adalah S.aureus yang  merupakan  katalase  positif. S.aureus diteteskan pada kaca preparat dan ditambah setetes H 2 O 2 . Gelembung-gelembung gas O 2 pada sel S.aureus tersebut timbul setelah 5 detik.
Hasil  penelitian  tidak  menunjukkan  adanya gelembung-gelembung  gas  pada  masing-masing  isolat Geobacillus sp. yang ditetesi H 2 O 2 dimana mengindikasikan  bahwa  H 2 O 2 yang  ditambahkan  tidak terurai menjadi gas O 2 oleh Geobacillus sp.
Kontrol

## hasil uji
Gambar 7. Uji gelembung gas pada masing-masing
isolat Geobacillus sp
Sebagian besar bakteri dari genus Geobacillus dapat menghasilkan  enzim  katalase  [16].  Pada  penelitian  ini,
kedelapan isolat Geobacillus sp. tidak dapat menghasilkan katalase,  kemungkinan  disebabkan  sifat  bakteri  yaitu mikroaerofil  dimana  isolat Geobacillus  sp. hanya membutuhkan  sedikit  O 2 untuk  pertumbuhannya  [9]. Sehingga  jika  H 2 O 2 terurai  menjadi  O 2 ,  maka  O 2 yang terbentuk tersebut malah akan menjadi racun bagi isolat Geobacillus  sp. Katalase  adalah  suatu  enzim  yang dihasilkan  oleh  sebagian  besar  mikroorganisme  aerofil yang  membutuhkan  O 2 untuk  pertumbuhannya  [15], namun pada penelitian ini, isolat dYTae-14 yang bersifat aerofil  juga  tidak  dapat  menghasilkan  katalase.  Dalam suatu  lingkungan  tertentu,  organisme  yang  tidak memproduksi katalase (katalase negatif) dilindungi oleh organisme lain yang mempunyai kemampuan memproduksi  enzim  katalase  (katalse  positif).  Bakteri katalase positif mendekomposisi H 2 O 2 dalam lingkunan tersebut,  sehingga  bakteri  katalase  negatif  terlindung dari efek toksik H 2 O 2 [15].
Berdasarkan  hasil  penelitian  tersebut,  dapat disimpulkan  bahwa  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. adalah  termasuk  bakteri  katalase  negatif  yaitu  bakteri yang tidak dapat menghasilkan enzim katalase sehingga tidak dapat digunakan untuk bioremediasi H 2 O 2 .

## Uji Kualitatif Enzim Amilase Ekstraseluler
Uji ini dilakukan dengan cara membuat media BSM padat  yang  mengandung  1%  pati  kanji  dan menumbuhkan  isolat bakteri Geobacillus sp. pada  media tersebut. Pati kanji yang ditambahkan pada media padat tersebut berperan sebagai substrat yang dapat diuraikan oleh enzim amylase [17].
Setelah  inkubasi  48  jam,  bagian  media  padat  yang ditanami  8  isolat Geobacillus  sp. terlihat  keruh.  Hal  ini menunjukkan bahwa 8 isolat Geobacillus sp. telah tumbuh pada masing-masing media padat yang mengandung 1% pati  kanji.  Untuk  membuktikan  apakah  8  isolat Geobacillus sp. menghasilkan enzim amilase ekstraseluler,  maka  kultur Geobacillus  sp. tersebut di tetesi iodin [18].
Hasil penelitian menunjukkan di sekeliling delapan isolat Geobacillus  sp. terdapat  zona  bening.  Hal  ini menunjukkan bahwa amilum yang terdapat pada media di sekitar isolat Geobacillus sp. telah terhidrolisis menjadi monosakaridanya, yaitu glukosa [19].
Gambar 8. Uji enzim amilase ekstraseluler
Hasil  ini  membuktikan  bahwa  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. dapat  menghasilkan  enzim  amilase  yang disekresikan  ke  dalam  medium  sehingga  amilum  (pati) yang  terdapat  pada  medium  dapat  terurai.  Enzim amilase, meliputi α -amilase, β -amilase dan glukoamilase [20]. Enzim α -amilase (E.C. 3.2.1.1) bekerja menghidrolisis ikatan α -1,4 secara acak di bagian dalam molekul antar unit glukosa di dalam rantai amilosa yang linier.  Hasil  hidrolisis α -amilase  mula-mula  akan menghasilkan  dekstrin,  dekstrin  tersebut  kemudian dipotong-potong lagi menjadi campuran antara glukosa dan  maltosa  [21].  Enzim β -amilase  memotong  pada ikatan α -1,4 pada unit maltosa dari rantai amilum yang belum  terputus  sempurna.  Enzim  glukoamilase  (E.C. 3.2.1.3) atau sering disebut amiloglukosidase atau α -1,4- glukano glukohidrolase merupakan enzim ekstraseluler yang  mampu  menghidrolisis  ikatan α -1,4  pada  rantai amilosa dan amilopektin. Enzim glukoamilase juga dapat menyerang  ikatan α -1,6  pada  titik  percabangan, walaupun dengan laju yang lebih rendah. Hal ini berarti bahwa  pati  dapat  diuraikan  secara  sempurna  menjadi glukosa [22].
Uji Kualitatif Enzim β -Galaktosidase Ekstraseluler
Uji  ini  dilakukan  dengan  cara  menumbuhkan delapan isolat Geobacillus sp. dalam media BSM cair yang mengandung  1%  laktosa.  Laktosa  yang  ditambahkan tersebut berfungsi sebagai induser [8]. Keberadaan dari enzim β -Galaktosidase  dapat  diketahui  dengan menggunakan  ONPG  (o-nitrovenil- β -D-Galaktosidase) sebagai  substrat.  Substrat  ONPG  ditambahkan  pada kultur Geobacillus sp. [23].
Uji  positif  adanya  aktivitas  enzim β -Galaktosidase pada  media Geobacillus  sp. ditunjukkan  oleh  terjadinya perubahan warna pada media menjadi kuning terang. Hal ini  disebabkan  ONPG  dihidrolisis  oleh  enzim β - Galaktosidase menjadi ONP (o-nitrofenol) dan galaktosa. ONPG  merupakan  senyawa  tak  berwarna,  tetapi  hasil hidrolisisnya  yaitu  ONP  (o-nitrofenol)  adalah  senyawa yang berwarna kuning [8].
Hasil uji kualitatif enzim β -Galaktosidase ekstraseluler  yang  telah  dilakukan  menunjukkan  tidak ada perubahan warna pada kedelapan media BSM. Hal ini disebabkan tidak adanya produk ONP (o-nitrofenol) hasil
reaksi  enzimatis  dan  membuktikan  bahwa  kedelapan isolat Geobacillus  sp. tidak  memiliki  enzim β - Galaktosidase ekstraseluler.
Gambar 9. Uji Enzim β -Galaktosidase Ekstraseluler

## Uji Kualitatif Enzim Protease Ekstraseluler
Uji  ini  dilakukan  dengan  cara  menumbuhkan delapan isolat Geobacillus sp. pada media BSM cair yang mengandung  gelatin.  Setelah  inkubasi  24  jam  media menjadi  sedikit  keruh.  Hal  ini  disebabkan  isolat Geobacillus sp. telah tumbuh pada media tersebut. Setelah itu  masing-masing  media  disimpan  di  dalam  lemari  es selama 15 menit [24].
Pada penelitian ini, kedelapan media menunjukkan hasil  positif.  Hal  ini  dibuktikan  dari  masing-masing media  BSM-gelatin  tetap  cair  setelah  pendinginan. Media  BSM-gelatin  yang  tidak  ditumbuhi  isolat Geobacillus sp. menjadi beku. Gelatin merupakan protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen yang secara alami terdapat pada tulang atau kulit binatang. Gelatin meleleh bila dipanaskan, namun akan segera menjadi  padat lagi apabila didinginkan. Bila bercampur dengan air, gelatin akan membentuk larutan dengan viskositas tinggi yang juga akan menjadi padat (gel) bila mendingin [25].
Gambar 9. Uji Kualitatif Enzim Protease Ekstraseluler
Dari  hasil  penelitian  ini,  dapat  diketahui  bahwa gelatin pada media BSM telah terhidrolisis menjadi asam amino  penyusunnya,  yaitu  asam  amino  non  esensial contohnya  glisin  dan  prolin  [25].  Oleh  sebab  itu  media yang  telah  ditumbuhi  isolat Geobacillus  sp. tidak membeku  setelah  pendinginan.  Hal  ini  membuktikan
bahwa  telah  terjadi  aktivitas  protease  yang  dihasilkan oleh kedelapan isolat Geobacillus sp. pada media tersebut.
Hasil penelitian ini menunjukkan adanya kesamaan potensi  enzim  protease  ekstraseluler  dengan  bakteri yang diisolasi oleh Susilawati [24]. Dalam penelitiannya, Susilawati  telah  berhasil  mengisolasi  bakteri  penghasil enzim  protease  termostabil  dari  sumber  air  panas Gedong  Songo.  Bakteri  tersebut  berbentuk  batang  dan termasuk  bakteri  gram  positif,  dimana  sifat  tersebut sama  dengan  kedelapan  isolat Geobacillus  sp. Adanya kesamaan sifat dan potensi dari bakteri-bakteri tersebut menunjukkan adanya kemungkinan bahwa bakteri yang ditemukan  Susilawati  tersebut  merupakan  salah  satu isolat Geobacillus  sp. atau  memiliki  kekerabatan  yang dekat dengan Geobacillus sp.

## 4. Kesimpulan
Dari  pohon  filogeni  diketahui  bahwa  kedelapan isolate Geobasillus sp. berada dalam tingkat kekerabatan yang dekat dan memiliki hubungan kekerabatan terdekat dengan Geobacillus sp._TERI_NSM dan Geobacillus sp. sbs3 . Kedelapan  isolat Geobasillus  sp .  mempunyai  potensi bioremediasi terhadap Fe(III) dan Pb(II) akan tetapi tidak mempunyai  potensi  bioremediasi  H 2 O 2 .  Hasil  uji  enzim termostabil ekstraseluler menunjukkan bahwa kedelapan  isolat Geobasillus sp. memiliki  amilase  dan protease termostabil ekstraseluler namun tidak memiliki β -Galaktosidase termostabil ektraseluler.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  W Deden Trismillah, Produksi Xilanase Sumaryanto, Pengaruh  Komposisi  Media  pada  Produksi  Xilan, Bacillus stearothermophillus DSM 22 Menggunakan Substrat  Kulit  Buah  Pisang,  Pustaka  IPTEK  J,  Sains dan Teknologi BPPT, VII. IIA, 1 (2005).
[2]  Wakao  Fukuda,  Yulia  Sari  Ismail,  Toshiaki  Fukui, Haruyuki Atomi, Tadayuki
Imanaka,
Characterization of an archaeal malic enzyme from the  hyperthermophilic  archaeon  Thermococcus kodakaraensis KOD1, Archaea, 1 (2005) 293-301.
[3]  Suhendrayatna,  Bioremoval  Logam  Berat  Dengan Menggunakan  Microorganisme:  Suatu  Kajian Kepustakaan (Heavy Metal Bioremoval by
Microorganisms:  A  Literature  Study  ),  in:    Seminar On-Air,  Bioteknologi  untuk  Indonesia  Abad  21, Sinergy Forum - PPI Tokyo Institute of Technology, Japan, 2001.
[4]  Tuty  Alawiyah,  Kultivasi  Anaerob  dan  Identifikasi Fragmen  396  pb  (550-945)  Gen  16S  rRNA  Bakteri Geobacillus  thermoleovorans  T4  Isolat  Sumber  Air Panas Gedong Songo, in, Jurusan Kimia Universitas Diponegoro, Semarang, 2007.
[5]  M.  S.  Friedman,  Thermophilic  Microorganism, Academic Press, Inc. New York 1992.
[6]  J Van  Lieshout,  M Faijes,  J Nieto,  J  Van  Der  Oost,  A Planas,  Hydrolase  and  glycosynthase  activity  of endo-1,  3- β -glucanase  from  the  thermophile Pyrococcus furiosus, Archaea, 1 (2004) 285-292.
[7]  S.  Marvin  Friedman, Protein Synthesis  in Cell-Free Extracts from a Thermoacidophilic Archaebacterium, Systematic and Applied Microbiology, 6 (1985) 1-6.
[8]  Sophie  Drouault,  Jamila  Anba,  Gérard  Corthier, Streptococcus thermophilus is able to produce a β - galactosidase active during its transit in the digestive tract of germ-free mice, Applied and environmental microbiology, 68 (2002) 938-941.
[9]  Agustina  L.  N.  Aminin,  F.  Madayanti,  P.  Aditiawati, Akhmaloka,  Isolation  of  Thermophiles  From Gedongsongo Hot Spring Using A Simple Enrichment Medium,  in:    International  Seminar  Advance  in Biological Science, 2007.
[10] Djedi  S  Widarto,  Tedi  Yudistira,  Karakterisasi Sumberdaya Panas Bumi Skala Kecil di Zona Depresi Volkanik Ungaran Jawa Tengah, (2004).
[11]  Hany Hussein, Soha Farag Ibrahim, Kamal Kandeel, Hassan Moawad, Biosorption of heavy metals from waste  water  using  Pseudomonas  sp,  Electronic Journal of Biotechnology, 7 (2004) 30-37.
[12] E Stackebrandt, BM Goebel, Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis  in  the  present  species  definition  in bacteriology,  International  Journal  of  Systematic and Evolutionary Microbiology, 44 (1994) 846-849.
[13] Adrian Nur, Immobilisasi Limbah Fermentasi Pabrik Alkohol  Terhadap  Adsorpsi  Logam  Berat  Kadmium (Cd), Ekuilibrium, 6 (2007) 27-31.
[14] Ventsislava  Yankova  Petrova,  Tanya  Vassileva Rasheva,  Anna  V  Kujumdzieva,  Catalase  enzyme  in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae, Electronic Journal of Biotechnology, 5 (2002) 11-12.
[15] L Luhova, A Lebeda, D Hedererová, P Pec, Activities of  amine  oxidase,  peroxidase  and  catalase  in seedlings of  Pisum  sativum  L.  under  different  light conditions,  Plant  soil  and  environment,  49  (2003) 151-157.
[16] DR Zeigler, Bacillus Genetic Stock Center Catalog of Strains, vol. 3, The Genus Geobacillus, in, 2001.
[17] R  Borris,  Biological  Role  of  Enzymes,  eds. Biotechnology ed., UCH, Germany, 1987.
[18] Elidar Naiola, Mikrobia Amilolitik pada Nira dan Laru dari  Pulau  Timor,  Nusa  Tenggara  Timur, Biodiversitas, 9 (2008).
[19] R.  Melliawati,  R.S.  Suherman,  B.  Subardjo, Pengkajian  Kapang  Endofit  dari  Taman  Nasional Gunung  Halimun  sebagai  Penghasil  Glukoamilase, Pusat Penelitian Bioteknolgi LIPI, 2006.
[20] LM Josson, LM Coronel, BB Mercado, ED De Leon, OG Mesina, AM Lozano, MB Bigol, Strain improvement of  aspergillus  oryzae  for  glucoamylase  production, Asean  Journal  on  Science  and  Technology  for Development, 9 (1992) 1-116.
[21] R  Melliawati,  E  Sukara,  Pengaruh  sumber  pati  dan nitrogen  terhadap  produksi  enzim  amilolitik  oleh khamir  Saccharomycopsis  sp.  TJ-1,  in:    Simposium Nasional  Bioteknologi  -  Dies  Natalis  ke-37  UNAIR, Universitas Airlangga, Surabaya, 1991.
[22] John  M  Deman,  Kimia  makanan,  Penerbit  ITB. Bandung, (1997).
[23] Joseph  Sambrook,  David  W  Russell,  Molecular cloning:  a  laboratory  manual  3rd  edition, Coldspring-Harbour Laboratory Press, UK, (2001).
[24] Tuti  Susilawati,  Isolasi  dan  karakterisasi  enzim protease  dari  isolat  bakteri  termofilik  sumber  air panas Gedong Songo Bawen, in, FMIPA UNDIP, 2004.
[25] Alan  Gordon  Ward,  Albert  Courts,  Science  and technology of gelatin, Academic Press, 1977.