CURRENT BIOCHEMISTRY ISSN: 2355-7877 e-ISSN: 2355-7931 Journal homepage: http://journal.ipb.ac.id/index.php/cbj Journal E-mail: current.biochemistry@apps.ipb.ac.id

## In Silico Analysis of Active Compounds of Avocado Fruit (Persea americana Mill.) as Tyrosinase Enzyme Inhibitors
(Analisis In Silico Senyawa Aktif pada Alpukat ( Persea americana Mill.) sebagai Inhibitor Enzim Tirosinase)
Puspa Julistia Puspita 1* , Ni Putu Peggy Liliyani 1 , Laksmi Ambarsari 1
1 Department of Biochemistry, IPB University, Bogor, 16680, Indonesia
Received: 15 June 2022 ; Accepted: 13 November 2022
Corresponding author : Puspa Julistia Puspita, Departemen Biokimia FMIPA IPB; e-mail: puspajulistia@gmail.com

## ABSTRACT
Avocado  is  a  plant  in  which  almost  all  the  pieces  have  the  potential  as  herbs.  The  high phenolic  and  flavonoid  content  on  the  leaves,  seeds  and  skin  of  avocado  has  the  potential  as  a tyrosinase-related protein-1 inhibitor. This enzyme is involved in the formation of melanin related to the  pigmentation  process  in  the  skin.  This  study  attempts  to  analyze  the  potential  of  the  active compounds from leaves, seeds, and skin of avocado that play a role in inhibiting tyrosinase activity. The  research  methods  employed  include  is  virtual  screening,  bioavailability  and  toxicity  test, molecular docking by YASARA structure and 3D visualization by Discovery Studio Visualizer. The results showed that out of 68, 11 active compounds of avocado leaves, seeds, and skins had a binding affinity for  tyrosinase-related  protein-1, namely  quercetin,  epicatechin,  apigenin, 3-hdroxytyrosol, scopoletin, abscisic acid, citric acid, coumaric acid, quinic acid, vanillin, and caffeic acid. Coumaric acid was ligan with the best potential inhibition found in leaves and bark of avocado with an energy affinity of -2,545 kcal/mole. Abscisic acid was ligan with the best potential inhibition of TYRP1, which was found in seeds of avocado with an energy affinity of  -2.645 kcal/mole interacts with 17 amino acid residues.
Keywords: Avocado, Inhibitor, Melanin, Molecular Docking, Tyrosinase.

## ABSTRAK
Alpukat  adalah  tanaman  yang  hampir  semua  bagiannya  memiliki  potensi  sebagai  herbal. Kandungan fenolik dan flavonoid yang tinggi pada daun, biji dan kulit buah alpukat memiliki potensi sebagai inhibitor tyrosinase related protein-1. Enzim ini berperan dalam pembentukan melanin yang berkaitan dengan proses pigmentasi pada kulit. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis potensi senyawa  aktif  dari  daun,  biji,  dan kulit  buah  alpukat  yang  berperan  dalam  menghambat  aktivitas enzim  tirosinase.  Metode  penelitian  ini  yaitu  penapisan  virtual,  uji  bioavaibilitas  dan  toksisitas, penambatan molekul dengan YASARA Structure, dan visualisasi 3D menggunakan Discovery Studio. Hasil penelitian menunjukkan dari 68 senyawa aktif daun, biji, dan kulit buah alpukat terdapat 11
senyawa  aktif  yang  memiliki  afinitas  pengikatan  yang  baik  terhadap  tyrosinase  related  protein-1 yaitu kuersetin, epikatekin, apigenin, 3-Hydroxytyrosol, scopoletin, asam absisat, asam sitrat, asam koumarat,  asam  kuinik,  vanillin,  dan  asam  kafeik.  Asam  koumarat  merupakan  ligan  uji  dengan potensi  inhibisi  terbaik  yang  terdapat  pada  daun  dan  kulit  buah  alpukat  dengan  energi  afinitas sebesar -2,545 kkal/mol, dan asam absisat merupakan ligan dengan potensi inhibisi TYRP1 terbaik yang terdapat pada biji alpukat sebesar -2.645 kkal/mol yang berinteraksi dengan 17 residu asam amino.
Kata kunci: Alpukat, Inhibitor, Melanin, Penambatan Molekuler, Tirosinase

## 1. PENDAHULUAN
Alpukat ( Persea americana Mill.) merupakan  tanaman  berbentuk  pohon  yang berasal  dari  Amerika  Tengah  dan  Meksiko. Tanaman  ini  dapat  tumbuh  di  wilayah  tropis dan  subtropis  (Achmad  dan  Sugiarto,  2020). Biji, kulit, dan daun alpukat merupakan bagian tanaman  alpukat  yang  tidak  dapat  dikonsumsi sehingga  jarang  dimanfaatkan  dan  berakhir sebagai  limbah.  Menurut  Malangngi et  al . (2012)  biji  alpukat  memiliki  kandungan senyawa polifenol, flavonoid, triterpen, kuinon, tanin, monoterpenoid dan seskuiterpenoid yang dapat  menjadi  sumber  antioksidan  penangkal radikal  bebas.  Daun  alpukat  juga  memiliki kandungan senyawa aktif yang tinggi, menurut Irawati (2015) bahwa daun alpukat mengandung senyawa flavonoid, tanin katekat, kuinon,  saponin,  steroid/  triterpenoid,  alkaloid dan  fenol.  Kulit  buah  alpukat    memiliki kandungan  senyawa  aktif  yang  tak  kalah melimpah  dari  biji  dan  daunnya.  Kulit  buah alpukat  mengandung  senyawa  flavonoid, karotenoid,  vitamin  C,  dan  Vitamin  E  yang tinggi (Vinha et al . 2013).
Kandungan senyawa flavonoid yang cukup tinggi  pada  biji,  daun,  dan  kulit  buah  alpukat dapat  digunakan  sebagai  bahan  aktif  yang mampu  mencerahkan  kulit.  Kulit  yang  sering terpapar  sinar  matahari  dapat  membuat  kulit menjadi  kusam  dan  lebih  gelap  dikarenakan terbentuknya melanin. Bahkan paparan berulang  dari  sinar  UV  dapat  mengaktifkan sintesis  melanin  di  kulit  manusia.  Sinar  UV
menginduksi  terbentuknya Reactive  Oxygen Species (ROS)  yang  dapat  membuat  tubuh menghasilkan  hormon  α-melanosit  (α-MSH), selanjutnya  α-MSH  menginduksi  peningkatan regulasi  enzim  pembatas  ( rate  limitating enzyme )  untuk  sintesis  melanin  di  melanosit (Chatatikun et al . 2020).
Tirosinase  merupakan  metaloenzim  dari golongan  polifenol  oksidase,  secara  genetik berlokasi  di  dalam  kromosom  nomor  11. Tirosinase  terdapat  pada  berbagai  organisme dan memiliki fungsi spesifik dalam melanogenesis  (Da  Silva et  al .  2017). Melanogenesis merupakan proses sintesis atau pembentukan  melanin  pada  kulit.  Produksi melanin dalam melanosit dipicu oleh berbagai faktor fisiologis, seperti enzim melanosom dan pengatur  melanogenik.  Produksi  pigmen  pada sel  melanoma  murine  umumnya  diatur  oleh komponen  enzimatis  melanosom,  seperti tirosinase, tyrosinase  related  protein-1 ,  dan tautomerase  dopachrom.  Faktor  lingkungan seperti  pajanan  sinar  matahari  meningkatkan aktivitas enzim tirosinase sehingga meningkatkan  produksi  melanin  yang  dapat mempengaruhi pigmentasi kulit dan penimbunannya di dalam keratinosit menyebabkan kulit mencoklat ( tanning ) (Kurniasari et  al .  2018).  Sehingga  produk kosmetik  yang  sering  digunakan  adalah  yang mampu melindungi kulit dari paparan sinar UV dan meningkatkan kecerahan kulit  (Randhawa et al . 2015).
Kosmetika yang beredar dipasaran saat ini masih  banyak  yang  mengandung  bahan-bahan kimia berbahaya yang dapat menimbulkan efek samping,  seperti  mengelupas,  tipis,  iritasi  dan timbul  rasa  terbakar  atau  gangguan  kesehatan bagi  penggunanya  (Dominika  dan  Hasyim 2019;  Herlina  dan  Vestabilivy  2019).  Oleh karena  itu  diperlukan  senyawa  aktif  yang mampu menjadi inhibitor tirosinase yang aman dan  efektif  dalam  mengurangi  produksi melanin pada kulit sehingga dapat mencerahkan  warna  kulit.  Pengujian  potensi senyawa  aktif  dari  alpukat  terhadap  tirosinase dilakukan melalui simulasi penambatan molekular.  Menurut  Giantari et  al .,  (2019) melalui simulasi penambatan molekul, katekin dapat  dengan  baik  menghambat  aktivitas tirosinase.  Adnyani et  al .,  (2019)  juga melakukan  simulasi  penambatan  molekul senyawa  kuersetin    terhadap  tirosinase  dan menyatakan bahwa kuersetin dapat dengan baik menghambat  enzim  tirosinase.  Sehingga, penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui potensi setiap senyawa bioaktif dari biji, daun, dan  kulit  buah  alpukat  dengan  menganalisis interaksi  molekuler  senyawa  dengan  enzim tirosinase

## 2. METODOLOGI
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan  perangkat  lunak  YASARA Structure Ver.19.9.17, Ligplot+ 4.3.5,
Discovery Studio Visualizer dan PyMOL untuk visualisasi  interaksi  antara  ligan  dengan reseptor.  Bahan-bahan  yang  digunakan  yaitu struktur tiga dimensi enzim tirosinase manusia yang  diperoleh  dari  basis  data RCSB  Protein Data  Bank dengan  kode  PDB  ( Protein  Data Bank )  5M8M.  Struktur  ini  memiliki  resolusi 2.65 Å dan telah terdapat struktur kristalografinya.  Ligan  uji  yang  digunakan yaitu  struktur  tiga  dimensi  68  senyawa  aktif dari daun, biji, dan kulit buah alpukat ( Persea americana Mill.)  dengan  format  .sdf,  yang diperoleh dari basis data PubChem . Ligan alami
yang  digunakan  merupakan  ligan  yang tertambat human tyrosinase 5M8M yaitu asam kojat.

## Preparasi Reseptor  (Mulatsari et al. 2019)
Struktur  tirosinase  5M8M  diunduh  pada situs  basis  data RSCB Protein  Data  Bank www.rcsb.org/pdb  dipilih  tirosianase  yang memiliki  resolusi  kristalogi  kurang  atau  sama dengan 2.5 Å dan stabil dalam bentuk struktur 3D. Reseptor 5M8M.pdb kemudian di load dari file  pdb  ke  YASARA.  Struktur  3D  tirosinase 5M8M kemudian dibersihkan dari molekul air. Hapus ligan asli dan hapus bagian dari struktur yang  tidak  terlibat  dalam docking sehingga hanya  tersisa  protein  target  dengan  sisi  aktif ( pocket )  untuk  berikatan  dengan  senyawa  uji. Kemudian  dilakukan  penambahan  hidrogen dengan  cara  ( Edit>Add>Hydrogen  to  :  all ). Struktur tersebut disimpan dalam bentuk format PDB.

## Preparasi  Struktur  Ligan  dan  Analisis Stabilitas Ligan (Modifikasi Farhan 2019)
Preparasi  struktur  ligan  uji  dilakukan menggunakan  perangkat  lunak  YASARA Structure . Seluruh ligan diunduh dalam struktur tiga  dimensi  dengan  format  .sdf  melalui database PubChem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ kemudian disimpan dalam bentuk format PDB menggunakan  perangkat  lunak  YASARA
Structure .
Hasil preparasi tersebut kemudian dioptimasi  geometri  ligan  dengan  membuat simCELL kemudian ditambahkan molekul air. Setelah itu, pilih menu Option kemudian pilih Macro  &  Movie lalu  pilih Play  Macro dan browse ‘ em_runclean.mcr ’  lalu  pilih  OK  dan tunggu  hingga  proses  optimasi  geometri selesai. File ligan kemudian disimpan ke dalam format PDB.
Validasi  Metode  Penambatan  Molekuler (Modifikasi  Aswad  et  al.  2020  dan  Farhan 2019)
Ligan  alami  asam  kojat  (KOJ  514)  yang menempel  pada  struktur tyrosinase  related protein -1  dipisahkan  terlebih  dahulu  dan dipreparasi.  Setelah  itu  dilakukan  penambatan molekuler  terarah  dengan  aturan  ukuran gridbox 90°  dan  koordinat  x,y,dan  z  masing- masing 3.8 Å dengan spasi 1.0 Å. Selanjutnya, dilakukan running  docking untuk  validasi gridbox dan  kemudian  dilakukan  perhitungan RMSD  ( Root  Mean  Square  Deviation ) menggunakan perangkatlunak YASARA Structure.
Penapisan  Virtual  dan  Uji  bioavaibilitas (Dallakyan dan Olson 2015)
Semua  ligan  yang  telah  dipreparasi disimpan  dalam  format  (.PDB).  Selanjutnya ligan  uji  dan  pembanding  dianalisis  afinitas ikatannya menggunakan aplikasi PyRx- Virtual Screeening  Tool .  Hasil  prediksi  selanjutnya dipilih  berdasarkan  besarnya  nilai  energi afinitas (∆G).
Ligan-ligan tersebut kemudian diuji bioavaibilitas  untuk  melihat  laju  absorpsi  zat aktif dalam tubuh berdasarkan aturan Lipinski meliputi  lima  parameter  yaitu  massa  molekul, lipofilisitas,  donor  ikatan  hidrogen,  akseptor ikatan  hidrogen,  dan  refraksi  molar  melalui laman http://www.scfbiiitd.res.in/software/drugdesig n/lipinski.jsp
Prediksi  Toksisitas  Ligan  (Ochieng  et  al. 2017)
Prediksi  toksisitas  ligan  uji  dilakukan menggunakan perangkat lunak online Admetstar  1.0.  Ligan  yang  akan  digunakan
diunduh  pada  laman  PubChem  dalam  format SMILES.
Prediksi dilakukan dengan mengunggah struktur ligan pada
http://lmmd.ecust.edu.cn/admetstar1/ , kemudian  dioperasikan  dengan  memilih  opsi ‘ Predict’ .  Hasil  prediksi  kemudian  akan ditampilkan setelah beberapa saat.
Analisis  Energi  Afinitas  dan  Konstanta Inhibisi (Modifikasi Farhan 2019)
Ligan  dan  tirosinase  reseptor  yang  telah dipreparasi  dalam  format  .pdb  kemudian disimpan dalam format .scene lalu dimasukkan ke  dalam  folder  kerja.  Setelah  itu,  pilih  menu option kemudian  pilih Macro  &  Movie lalu pilih Play Macro
dan browse
‘dock_runlocal.mcr’  lalu  pilih  OK.  Nilai binding  energy yang  negatif  menunjukan bahwa  proses  penambatan  molekuler  perlu diulang  kembali  dengan  ukuran gridbox yang berbeda  sampai  didapatkan binding  energy positif. Hasil penambatan molekuler menghasilkan  nilai  Energi  afinitas  ( binding affinity / ∆G ) dan Konstanta disosiasi (Kd). Nilai energi  afinitas  kemudian  digunakan  untuk menghitung Konstanta Inhibisi (Ki).
Visualisasi 3D kompleks ligan uji-reseptor dalam  analisis  penambatan  molekuler  ligan- reseptor  ini  ditentukan  yang  paling  mendekati model interaksi ligan kontrol-reseptor menggunakan  perangkat  lunak  YASARA Structure .  Hasil  penggabungan  disimpan  ke dalam bentuk format PDB kemudian dianalisis ikatan  hidrogen,  dan  interaksi  hidrofobik menggunakan perangkat lunak Ligplot+ 4.3.5., serta interaksi lainnya dengan Discovery Studio Visualizer.

## 3. HASIL
Struktur Ligan dan Kestabilan Reseptor
Ligan yang digunakan dalam penelitian
ini  merupakan  ligan  uji  yang  berasal  dari senyawa  aktif  biji,  daun,  dan  kulit  buah alpukat  yaitu  sebanyak  68  senyawa  aktif. Ligan  uji  diunduh  dalam  bentuk  3D  dari laman PubChem dengan format .sdf. Ligan dipreparasi
menggunakan gridbox berukuran 5Å. Selanjutnya ligan diminimisasi energinya dengan menambahkan  molekul  air.  Minimisasi energi  ligan  dilakukan  sebanyak  tiga  kali pengulangan  agar  mendapatkan  kondisi ligan yang paling stabil.
Struktur  tiga  dimensi  reseptor human tyrosinase diunduh  melalui  basis  data The Research  Collaboratory  for  Structural Bioinformatics
Protein Data Bank https://www.rcsb.org/structure/5M8M , merupakan basis data yang menyimpan dan menyediakan  akses  data  protein.  Reseptor human  tyrosinase dengan  kode  PDB  ID 5M8M,  memiliki  resolusi  2.65  Å  dan dengan panjang sekuens yaitu 446. Struktur tersebut  merupakan  struktur  tersier  dari enzim  tirosinase  pada  manusia.  Enzim human  tyrosinase (Gambar  1)  terdiri  dari empat  subunit  yang  sama  (tetradimer). Struktur  protein  ini  memiliki  ligan  yang tertambat secara alami yaitu asam kojat, dan dua atom logam Zn yang terdapat pada sisi aktif  enzim.  TYRP1  ( Tyrosinase  Related Protein-1 ) memiliki 4 domain yaitu domain peptida  sinyal,  domain  intramelanosomal (atau  luminal),  domain  trans-membran  α- heliks  dan  domain  sitoplasma  (Lai et  al .
2017).  Residu  asam  amino  pada  sisi  aktif TYRP1  yaitu  Arg  374,  His  377,  His  381,
His 404, Ser 394, His 224, His 215, His 192, Thr  391,  dan  Tyr  362  yang  berinteraksi langsung  dengan  substrat  yaitu  L-tyrosine (Lai et al . 2017).
Gambar 1 Struktur Reseptor 5M8M
Analisis kestabilan reseptor pada laman PROCHECK menghasilkan plot Ramachandran (Gambar 2) dengan persentase  jumlah  residu  pada  kuadran  I ( most  favoured  regions )  sebesar  85.7% dengan 1209 residu, kuadran II ( additional allowed regions ) sebesar 13.5% dengan 204 residu,  kuadran  III  ( generously  allowed regions )  sebesar  0.7%  dengan  11  residu, dan  kuadran  IV  ( disallowed  regions ) sebesar  0.1%  dengan  2  residu.  Sebagian besar  residu  berada  pada  kuadran  I  yang merupakan daerah yang disukai. Hasil plot Ramachandran  juga  menunjukan  terdapat residu lain seperti residu ujung sebanyak 8 residu,  glisin  sebanyak  124  residu,  dan prolin sebanyak 136 residu.

## Penapisan  Virtual,  Bioavaibilitas  dan Toksisitas
Penapisan  virtual  merupakan  tahap awal  yang  dilakukan  untuk  menyeleksi calon ligan uji (senyawa aktif) yang berasal dari biji, daun dan kulit buah alpukat dalam jumlah besar sesuai dengan parameter yang telah ditentukan. Penapisan virtual dilakukan  menggunakan software PyRx dengan  cara  penentuan afinitas  pengikatan ligan  alami  dan  ligan  uji  pada  reseptor. Pemilihan  ligan  uji  yang  berpotensi didasarkan  pada  kedekatan  nilai  energi afinitas  dengan  ligan  alami.  Ligan  alami merupakan  ligan  (inhibitor)  yang  sudah tertambat langsung pada reseptor. Penapisan  virtual  dilakukan  terhadap  68 ligan  uji  dari  hasil  studi  pustaka  dan ligan alami terhadap reseptor 5M8M. Ligan dari penapisan  virtual  kemudian  dilakukan  uji Bioavaibilitas dengan tujuan untuk mengetahui  potensi  ligan  untuk  dapat diserap oleh sel. Parameter yang digunakan ada  5  berdasarkan  pada  aturan  Lipinski, yaitu  berat  molekul  kurang  dari  500  Da,
Log  P  tidak  melebihi  5,  jumlah  donor hidrogen  kurang  dari  5,  jumlah  akseptor hidrogen  kurang  dari  10,  dan  refraktivitas molar  40-130.  Ligan  hasil  penapisan, bioavaibilitas  kemudian  digunakan  untuk uji  toksisitas.  Uji  ini  dimaksudkan  untuk mengetahui  ligan-ligan  yang  berpotensi toksik  apabila  dikonsumsi  sebagai  herbal ataupun obat oral.
Hasil penapisan diperoleh  energi afinitas  ligan  alami  yaitu  -5.8  kkal/mol.
Sehingga  dipilih  ligan  uji  yang  memiliki nilai  energi  afinitas  yang  berada  pada rentang -5.6 kkal/mol - 8.9 kkal/mol. Ligan uji  yang  memenuhi  kriteria  tersebut sebanyak  49  ligan  uji.  Ligan  uji  dengan energi  afinitas  terendah  yaitu persin , tricaprylin ,  dan persenone  A sebesar  -5.6 kkal/mol,  dan  ligan  uji  dengan  afinitas tertinggi  yaitu  rutin  sebesar  -8.9  kkal/mol
(Data tidak ditampilkan). Uji bioavaibilitas mengeliminasi 5 ligan Hesperidin, Procyanidin_B1 , Procyanidin_B2,
Proanthocyanidin ,dan Rutin .  Asam  kojat sebagai  ligan  alami  sekaligus  ligan pembanding dalam penelitian ini memenuhi seluruh aturan Lipinski, hal ini menunjukkan  bahwa  asam  kojat  memiliki bioavabilitas yang baik.
Ligan-ligan  yang  telah  memenuhi aturan Lipinski kemudian dianalisis toksisitasnya  menggunakan  laman  analisis onlie Admetsar  1.0.  Parameter  yang digunakan  dalam  uji  toksisitas  ada  tiga yaitu  inhibisi Human  Ether-A-Go-Go Related Gene (herG), karsinogenisitas, dan toksisitas oral akut (Data tidak ditampilkan). Hasil analisis herG menunjukkan  bahwa  seluruh  ligan  uji merupakan  golongan  inhibitor  lemah dengan Phorbol 12,13-dibutyrate memiliki nilai  tertinggi  sebesar  0.9933  dan  Vitamin K dengan nilai terendah sebesar 0.5675.
Berdasarkan  hasil  uji  karsinogenitas, terdapat 3 ligan yang tergolong karsinogen yaitu Tricaprylin dengan nilai 0.5000 yang merupakan  nilai  terendah, Palmityl  oleate dengan  nilai  0.5589,  dan 3-methylbuty dengan nilai 0.779. Nilai tertinggi terdapat pada ligan Phloridzin sebesar 0.9695. Hasil analisis toksisitas oral menunjukkan bahwa terdapat  dua  ligan  yang  termasuk  dalam golongan II yaitu kaemferol dan kuersetin. Sebagian  besar  ligan  didominasi  oleh golongan  III  dan  IV,  yaitu  sebanyak  26 ligan  pada  golongan  III  dan  9  ligan  pada golongan  IV.  Nilai  Toksisitas  Oral  Akut tertinggi yaitu pada Palmityl oleate sebesar 0.8627,  dan  terendah  pada  ligan Epi- dihydrophaseic_acid dengan  nilai  sebesar 0.3849.
Validasi Gridbox dan Penambatan Molekuler Validasi
penambatan molekuler merupakan  tahapan  yang  penting  dalam penentuan  ukuran gridbox pada  reseptor 5M8M.  Penelitian  ini  menggunakan  sisi aktif reseptor 5M8M sebagai situs penambatan  ligan  untuk  menghambat aktifitas  dari  enzim tyrosinase  related protein-1 .  Reseptor  5M8M  memiliki  tiga buah ligan alami yaitu asam kojat, Zn, dan 2-acetamido-2-deoxy-beta-D-
glucopyranose .  Asam  kojat  merupakan ligan  (inhibitor)  yang  mengikat  sisi  aktif reseptor.  Pembuatan gridbox didasarkan pada situs pengikatan asam kojat, Penentuan gridbox terbaik  dibuat  dari rentang  1Å  -  5Å  dengan  beda  0.1Å  pada setiap  gridbox.  Tabel  4  menunjukkan percobaan  penentuan  ukuran gridbox terbaik  berdasarkan  parameter  energi afinitas  dan  RMSD.  Validasi  dilakukan dengan pengulangan 999 kali dan
menghasilkan gridbox terbaik yaitu berukuran 4.0 Å dengan nilai energi afinitas sebesar  3.972  dan  nilai  RMSD  sebesar
0.0884  Å.  Selanjutnya  ukuran gridbox ini digunakan  dalam  penambatan  molekuler dengan software YASARA Structure .
Reseptor  yang  telah  dipreparasi  dan telah  ditentukan  situs  penambatannya  siap untuk  dilakukan  penambatan  molekuler dengan  ligan  uji.  Hasil  analisis  berupa file log  yang  berisi  informasi  tentang  nilai energi  afinitas,  konstanta  disosiasi,  dan residu  asam  amino  pada  reseptor  yang berinteraksi  dengan  ligan.  Ligan  dengan nilai  energi  afinitas  yang  rendah  (bernilai negatif)  kemudian  dilakukan  analisis  jenis ikatan. Hasil penambatan molekuler kemudian  dianalisis  jenis  interaksinya secara 2D menggunakan software Ligplot+ dan  secara  3D  menggunakan software Discovery Studio Visualizer. Visualisasi 2D menggunakan Ligplot+ dapat menampilkan
jenis ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik. Visualisasi 3D menampilkan interaksi ligan dengan  residu  asam  amino  dan  ketepatan penambatan ligan pada sisi aktif reseptor.
Berdasarkan  hasil  penelitian  terdapat sebelas  ligan  dengan  nilai  energi  afinitas negatif yaitu Apigenin, Asam Kafeat, Asam Koumarat,  Kuercetin,  Vanilin,  Asam Kuinat, Epikatekin, Asam Absisat,
Scopoletin ,  dan 3-Hydroxytyrosol-3-O- glucoside .  Asam  kojat  sebagai  ligan  alami memiliki ikatan hidrogen pada asam amino His215  dengan  jarak  3.01  Å  dan  asam amino  Gly389  dengan  jarak  2.58  Å (Gambar  3).  Apigenin  memiliki  ikatan hidrogen pada asam amino Tyr362 dengan jarak 3.31 Å pada atom O2 dan 2.81 Å pada atom O1.
Gambar 3 Interaksi Asam Kojat
Asam Kafeat memiliki ikatan hidrogen pada dua asam amino yaitu Gly388 dengan jarak 2.93 Å dan Gly389 dengan jarak 2.49 Å.  Asam  Sitrat  memiliki  ikatan  hidrogen pada asam amino Thr391 dengan jarak 3.03 Å.  Asam  Koumarat  memiliki  ikatan hidrogen  pada  tiga  asam  amino  His377 dengan jarak 3.23  Å, His381 dengan jarak 2.97 Å, dan His215 dengan jarak 3.34 Å.
Ligan  uji  Kuersetin  memiliki  ikatan hidrogen  pada  dua  asam  amino  yaitu
Arg321 dengan jarak 3.26 Å pada atom O1, 3.27 Å pada atom O3, dan 3.15 Å pada atom O3, dan asam amino Arg374 dengan jarak 2.42  Å.  Vanilin  memiliki  ikatan  hidrogen pada asam amino Tyr362 dengan jarak 2.48 Å. Asam Kuinik memiliki ikatan hidrogen pada asam amino Thr391 dengan jarak 2.90 Å pada atom O4 dan 2.99 Å pada atom O6 dan asam amino Tyr362 dengan jarak 2.52 Å.
Epikatekin  memiliki  ikatan  hidrogen pada asam amino Arg321 dengan jarak 2.89 Å. Asam Absisat memiliki ikatan hidrogen pada asam amino Arg374 dengan jarak 2.28 Å, asam amino Thr391 dengan jarak 2.09 Å, atom Zn513 dengan jarak 2.50 Å dan atom Zn512 dengan jarak 2.31 Å (Gambar 4) dan pada Gambar 5 Asam absisat memiliki situs tambat  yang  tepat  pada  sisi  aktif  enzim.
Scopoletin memiliki  dua  ikatan  hidrogen pada asam amino Tyr362 dengan jarak 2.90 Å pada atom O2 dan 2.10 Å pada atom O2 . 3-Hydroxytyrosol_3-O-glucoside memiliki ikatan  hidrogen  pada  asam  amino  Arg374 dengan  jarak  2.87  Å. Proanthocyanidin memiliki  interaksi  hidrofobik  dengan sepuluh  asam  amino  pada  sisi  aktif  dan berikatan hidrogen dengan salah satu residu katalitik yaitu His 215.

## Energi Afinitas dan Konstanta Inhibisi
Energi  afinitas  merupakan  parameter penting untuk mengetahui ketepatan penambatan  molekuler  ligan  terhadap reseptor.  Energi  afinitas  adalah  nilai  yang menggambarkan  kemampuan  suatu  ligan untuk  menempel  pada  reseptor  (energi ikatan).  Terdapat  11  ligan  dengan  nilai energi afinitas yang baik yaitu dengan nilai paling negatif, seperti Kuersetin,
Epikatekin  Apigenin, 3-Hydroxytyrosol_3- O-glucoside , Scopoletin, Asam  Absisat,
Asam sitrat, Asam Koumarat, Asam Kuinat Vanillin,  dan  Asam  Kafeat  Kuersetin merupakan ligan uji dengan energi afinitas paling negatif dengan nilai -4.974 Kkal/mol sedangkan  Asam  kafeik  memiliki  energi afinitas paling positif yaitu -0.299
Kkal/mol.
Nilai  energi  afinitas  diperlukan  untuk menghitung  konstanta  inhibisi  (Ki)  ligan uji.  Konstanta  inhibisi  diartikan  sebagai kemampuan  penghambatan  suatu  ligan terhadap aktivitas reseptor. Nilai konstanta inhibisi  berbanding  lurus  dengan  energi afinitas.  Semakin  kecil  nilai  konstanta inhibisi (Ki) maka semakin kecil konsentrasi  ligan  yang  diperlukan  untuk dapat menghambat aktivitas enzim/reseptor.  Hal  ini  juga  berarti  bahwa semakin  kecil  nilai  Ki  maka  semakin  kuat ikatan  yang  terbentuk  antara  ligan  dan reseptor.  Ligan  yang  memiliki  energi afinitas  yang  lebih  kecil  dari  ligan  alami, kemudian  dilanjutkan  untuk  dianalisis (Data tidak ditampilkan).
Kuersetin  memiliki  konstanta  inhibisi paling  kecil  yaitu    2.2387  x  10 -4 µM  dan Proanthocyanidin memiliki nilai konstanta inhibisi  paling  besar  yaitu  3.8552  x  10 104
µM.  Asam  Kafeat  dan  Asam  Absisat memiliki  konstanta  inhibisi  yang  cukup baik, namun nilainya lebih besar dari ligan alami asam kojat yaitu berturut-turut 6.0337 x 10 -1 µM dan 1.1456  x 10 -2 µM.

## Gambar 5 Penambatan molekuler Asam Absisat

## 4. PEMBAHASAN
Senyawa aktif yang melimpah pada biji, daun, dan kulit buah alpukat seperti fenolik dan  flavonoid  memiliki  potensi  untuk menginhibisi  aktivitas  enzim tyrosinase related protein 1 sehingga dapat mengurangi pembentukan  melanin  berlebih  pada  kulit (Şöhretoğlu et  al. 2018).  Potensi  senyawa aktif  lainnya  terhadap  aktivitas  enzim tirosinase  yang  terdapat  pada  bagian tanaman Alpukat belum diketahui. Berdasarkan  penelitian  ini,  sebanyak  69 ligan dari alpukat dilakukan proses penapisan  virtual,  biovaibilitas,  toksisitas hingga  didapat  12  ligan  yang  berpotensi sebagai  inhibitor  tirosinase.  Semua  struktur tiga  dimensi  ligan  diunduh  pada  laman https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ kemudian dipreparasi dengan menggunakan perangkat lunak  YASARA Structure ,  dan  dilakukan minimisasi  energi  pada  ligan  sehingga interaksi  yang  dihasilkan  oleh  ligan  akan lebih stabil (Land dan Humble 2018).
Reseptor yang digunakan pada penelitian ini  adalah  kristal  protein human  tyrosinase related protein 1 yang memiliki dua atom Zn pada  sisi  aktifnya  dengan  kode  PDB  ID 5M8M. Reseptor 5M8M merupakan struktur tersier  dari  enzim  tirosinase  yang  telah dikristalkan.  Reseptor  juga  merupakan
protein tetramer dengan empat subunit yaitu subunit A, B, C, D dengan fungsi yang sama.
Penelitian  ini hanya menggunakan salah satu  subunit  yaitu  subunit  A  dengan  ligan alami  yang  tertambat  pada  reseptor  yaitu asam  kojat  dengan  resolusi  struktur  kristal 5M8M yaitu 2.65 Å. Resolusi reseptor yang digunakan  pada  penelitian  ini  sudah memenuhi  ketentuan.    Reseptor human tyrosinase (5M8M) yang digunakan berdasarkan hasil Ramachandran
menunjukkan  jumlah  residu  asam  amino pada  kuadran  I  (85.7  %),    kuadran  II  (13.5 %),    kuadran  III  (0.7%),  dan  kuadran  IV (0.1%),  ini  menandakan  bahwa  struktur model  memiliki  kualitas  yang  stabil  karena memiliki  residu  non  glisin  pada disallowed regions berada    dibawah  15%  yaitu  0.1%. Kualitas struktur protein dikatakan baik jika residu  non-glisin  pada  daerah outlier lebih kecil  dari  15%.  Protein  dengan  kualitas struktur  yang  baik  memiliki  persentase residu  yang  berada  pada  daerah  yang diinginkan  ( favored  region )  >50%  dan persentase  residu  berada  pada  daerah  yang dihindari ( outlier region ) <15% (Mannige et al . 2016).
Berdasarkan  hasil  penapisan  virtual terdapat 49 ligan yang memiliki nilai afinitas yang  mendekati  afinitas  asam  kojat.  Ligan uji tersebut terdiri dari 25 ligan yang berasal
dari biji alpukat, 13 ligan yang berasal dari daun  alpukat,  dan  11  ligan  dari  kulit  buah alpukat.  Asam  kojat  yang  merupakan  ligan alami  digunakan  pula  sebagai  pembanding dikarenakan  asam  kojat  telah  terbukti memiliki aktivitas sebagai inhibitor tirosinase  (Hashemi  dan  Emami  2015). Asam  kojat  juga  telah  banyak  digunakan pada produk komersil sebagai agen pencerah kulit seperti dalam krim kulit, lotion , sabun, dan  produk  perawatan  gigi  (Saeedi et  al . 2019).  Analisis  bioavabilitas  ligan  uji  pada penelitian ini menggunakan aturan Lipinski ( Lipinski’s  Rule  of  Five ).  Lipinski et  al. (2001)  mengatakan  bahwa  suatu  obat memiliki  penyerapan  atau  transport  yang buruk  ketika  obat  tersebut  memiliki  lebih dari  5  donor  ikatan  hidrogen,  lebih  dari  10 akseptor  ikatan  hidrogen,  berat  molekul (MWT) lebih besar dari 500 g/mol dan nilai Log  P  (CLogP)  lebih  besar  dari  5  (atau MlogP.  4.15).  Sebanyak  49  ligan  uji  yang telah  melalui  proses  penapisan  virtual, dilanjutkan  dengan  analisis  bioavabilitas ligan.
Berdasarkan hasil penelitian terdapat 44 jenis ligan uji yang lolos analisis bioavabilitas  dan  dapat  dilanjutkan  untuk analisis  toksisitas  ligan. Proanthocyanidin tereliminasi  karena  melanggar  lebih  dari  2 aturan Lipinski, namun penambatan molekuler  tetap  dilakukan  pada  ligan  ini dikarenakan proanthocyanidin merupakan senyawa  aktif  (ligan)  dengan  kemampuan sebagai  antioksidan  yang  jumlahnya  cukup banyak  dalam  biji  dan  kulit  buah  alpukat (Ramos-jerz et  al .  2013).  Zolghadri et  al. (2019)  dalam  penelitiannya  mengatakan bahwa proanthocyanidin dan  turunannya procyanidin yang merupakan golongan tanin memiliki  kemampuan  sebagai  inhibitor tirosinase.
Penelitian lainnya juga membuktikan bahwa senyawa proanthocyanidin daun teh kulktivar
Huangjingui dan Qilan memiliki kemampuan  yang  kuat  sebagai  inhinitor tirosinase (Song et al . 2017).
Analisis  toksisitas  ligan  merupakan analisis lanjutan untuk menentukan kandidiat obat yang aman tanpa menimbulkan  efek  kimia  merugikan  bagi tubuh.  Analisis  toksisitas  ligan  umumnya dilakukan untuk mengetahui tingkat karsinogenitas  suatu  ligan  (Prasetiawati et al. 2019). Penyerapan, Distribusi, Metabolisme,  Ekskresi,  dan  Toksisitas (ADMET) memainkan peran penting dalam penemuan  obat  dan  penilaian  bahaya lingkungan.  Analisis  ini  menggunakan server  online yang  memberikan  informasi mengenai  toksisitas  dan  karsinogenisitas ligan (Moon et al. 2017).
Hasil analisis menunjukkan bahwa Ligan yang digunakan pada penelitian ini seluruhnya  merupakan  inhibitor  lemah sehingga ligan-ligan tersebut tidak menyebabkan  aritmia  jantung.  Selain  itu, hasil  analisis  menunjukkan  bahwa  semua ligan uji tidak bersifat karsinogen kecuali 3 ligan yaitu Tricaprylin Palmityl oleate , dan 3-methylbuty .
Toksisitas  oral  akut  diklasifikasikan menjadi  4  kategori  yaitu  kategori  I  dengan LD 50 ≤  50  mg/kg,  kategori  II  50  mg/kg  < LD 50 ≤ 500 mg/kg, kategori III 500 mg/kg < LD 50  5000  mg/kg,  dan  kategori  IV  yaitu LD 50 >  5000  mg/kg  (Paris et  al. 2015). Berdasarkan  hasil  analisis  terdapat  2  ligan yang dengan toksisitas akut orat kategori II yaitu kaemferol dan kuersetin, hal ini berarti bahwa  senyawa  ini  dapat  memberikan dampak  negatif  pada  tubuh  dengan  dosis pemberian yang cukup rendah.
Ligan  yang  mengalami  seleksi  secara bertahap  kemudian  terpilih  11  yang dilanjutkan  untuk  penambatan  molekuler untuk  melihat  interaksi  yang  terbentuk berdasarkan  energi  afinitas,  Ki  dan  jenis
ikatan  yang  terbentuk.  Hasil  penambatan molekuler  menunjukan  bahwa  adanya perbedaan  interaksi  residu  asam  amino antara reseptor dan ligan uji dengan reseptor dan ligan pembanding/ligan alami. Lai et al.
(2017)  telah  meneliti  bahwa  asam  kojat sebagai  ligan  alami  reseptor human tyrosinase  related  protein  1 (5M8M) berinteraksi  pada  residu  His  192,  His  215, His 224, Thr 391, Tyr 362, Arg 374, His 377, His  381,  His  404,  dan  Ser  394.  Menurut penelitian  yang  dilakukan  oleh  Noh et  al. (2020),  residu  histidin  yang  terdapat  pada sisi  aktif human  tyrosinase memiliki  peran yang  penting  dalam  proses  katalitik  enzim. Residu  histidin  yang  tetap  (dilestarikan)  di sekitar  ion  tembaga  mungkin  memainkan peran berbeda dalam stabilitas, fleksibilitas, dan  struktur  konformasi  tambahan  untuk aktivitas  katalitik  tirosinase.  Penelitian tersebut mengkonfirmasi, bahwa tiga residu histidin,  H180,  H202  dan  H211,  dari tirosinase  manusia  di  sekitar  situs  CuA sangat penting untuk aktivitas enzim. Asam kojat  sebagai  ligan  alami  pada human tyrosinase menginhibisi  memiliki  potensi untuk  menghambat  aktivitas  tirosinase  dan pembentukan  melanin  secara  in  vivo  pada sel  melanoma  tikus  B16F10  (Mann et  al. 2018)
Hasil visualisasi 2D menunjukan bahwa terdapat dua jenis interaksi antara ligan dan reseptor, yaitu interaksi ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik. Ikatan hidrogen memainkan  peranan  penting  di  alam  yaitu dalam  pelipatan  protein,  interaksi  protein- ligan, dan reaksi katalisis (Chen et al. 2016). Menurut Rachmania (2019), ikatan hidrogen dapat menstabilkan interaksi antara ligan dan reseptor, serta dapat mempengaruhi nilai ΔG atau energi afinitas. Interaksi hidrofobik juga memegang peranan penting dalam interaksi ligan  reseptor.  Interaksi  hidrofobik  dapat menstabilkan  pengikatan  ligan  pada  situs
target,  dan  membantu  mengubah  afinitas pengikatan dan efektivitas obat. Peningkatan jumlah  atom  hidrofobik  di  permukaan  sisi aktif  dapat  lebih  meningkatkan  aktivitas biologis obat (Varma et al. 2010).
Ligan  uji  Asam  Absisat  dan  Asam Koumarat merupakan dua ligan yang paling banyak  berinteraksi  dengan  residu  asam amino penting pada sisi aktif reseptor. Asam Absisat  memiliki  2  ikatan  hidrogen  yaitu pada  residu  Arg  374,  Thr  391  dan  15 interaksi  hidrofobik  yaitu  pada  residu  His 192, His 215, Glu 216, Phe 220, His 224, Glu 360,  Tyr  362,  His  377,  Asn  378,  His  381, Leu  382,  Gly  389,  Gln  390,  Ser  394,  Phe 400.  Asam  Koumarat  berikatan  hidrogen pada 3 residu asam amino His 215, His 377, dan  His 381 dan 9 Interaksi hidrofobik pada residu His 192, Glu 216, Phe 220, Tyr 362, Arg  374,  Asn  378,  Thr  391,  Ser  394,  Phe 400.  Kedua  jenis  ligan  ini  memiliki kesamaan yaitu sama-sama berikatan hidrogen dengan logam Zn 512 dan Zn 513. Hal  ini  memiliki  kesamaan  dengan  asam kojat  (KOJ514)  sebagai  ligan  alami  yang sama-sama  membentuk  ikatan  hidrogen dengan  logam  Zn  512  dan  Zn  513.  Asam Absisat  dan  Asam  Koumarat  juga  masih memiliki  interaksi  dengan  asam  amino penting pada sisi aktif tyrosinase yaitu pada residu Ser 394, His 215, dan Thr 391.
Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa terdapat  11  ligan  menghasilkan  energi afinitas negatif yang berarti bahwa semakin negatif  nilai  energi  afinitas,  maka  interaksi yang terbentuk semakin kuat dan stabil. Nilai energi afinitas ligan alami Asam Kojat yaitu -3.972 Kkal/mol. Ligan dengan afinitas yang lebih  kuat  dari  afinitas  Asam  Kojat  yaitu Kuersetin  dan  Epikatekin.  Ligan  uji Kuersetin  dan  Epikatekin  memiliki  energi afinitas paling negatif yaitu -4.974 Kkal/mol dan  -4.875  Kkal/mol,  sedangkan  ligan  uji lainnya memiliki nilai yang lebih positif dari
ligan alami. Hal ini meandakan bahwa dalam konteks  energi  ikatan  Kuersetin  dan epikatekin  memiliki  kemampuan  interaksi yang  kuat  dengan  reseptor.  Namun,  baik Kuersetin  dan  Epikatekin  sama-sama  tidak berinteraksi atau berikatan hidrogen dengan residu penting pada sisi aktif yaitu Ser 394. Hal  yang  berbeda  terjadi  pada  Asam Koumarat dan Asam Absisat, dengan energi ikatan  yang  lebih  tinggi  dari  ligan  alami yaitu -2.545 Kkal/mol  dan -2.645 Kkal/mol, namun  memiliki  banyak  interaksi  dengan residu  asam  amino  pada  sisi  aktif,  dan berinteraksi  dengan  residu-residu  penting (residu  katalitik)  sesuai  yang  disebutkan dalam literatur yaitu Arg 374, His 215, dan Ser 394 (Lai et al. 2017).
Kemampuan  suatu  ligan  menginhibisi aktivitas  suatu  reseptor  dapat  dianalisis melalui  konstanta  inhibisi  (Ki)  ligan. Konstanta  inhibisi  erat  kaitannya  dengan energi  afinitas.  Semakin  kecil  konstanta inhibisi  (Ki)  maka,  semakin  kuat  afinitas pengikatan dan semakin sedikit jumlah obat yang dibutuhkan untuk menghambat aktivitas enzim tersebut. Semakin kecil nilai Ki  maka  semakin  kuat  pengikatan  ligan terhadap protein (Klebe 2013).
Berdasarkan  hasil  penelitian  seluruh ligan  uji  belum  termasuk  golongan  ligan potensial berdasarkan nilai konstanta inhibisinya, namun Kuersetin dan Epikatekin memiliki nilai Ki yang mendekati 100  µM.  Analisis  kelayakan  ligan  uji berpotensi  sebagai  inhibitor  dapat  juga dianalisis melalui interaksi ligan uji dengan residu  sisi  aktif  reseptor.  Ligan  uji  Asam Absisat  dan  Asam  Koumarat  banyak berinteraksi pada residu asam amino penting pada  reseptor  membentuk  ikatan  hidrogen dan  ikatan  hidrofobik.  Asam  Absisat berinteraksi  dengan  residu  penting  pada reseptor  yaitu  His  215  dan  Ser  394. Penelitian  sebelumnya  melaporkan  bahwa
ABA  ( Abscisic  acid )  diketahui  memiliki banyak  manfaat  bagi  kesehatan  manusia diantaranya  memainkan  peran  kunci  dalam metabolisme  glukosa,  peradangan,  memori dan menghambat pertumbuhan tumor (Balino et al . 2019). Menurut hasil penelitian dari  Zolghadri et  al. (2019)  senyawa  asam fenolik  seperti  asam  koumarat  dan  asam vanilik  telah  teruji  memiliki  kemampuan sebagai inhibitor tirosinase. Zolghadri et al. (2019) juga menyebutkan turunan glukosida kombinasi struktural resorsinol dan glukosa, signifikan untuk menginduksi efek penghambatan  tirosinase.  Oleh  karena  itu, Asam Absisat dan Asam Koumarat memiliki potensi  sebagai  inhibitor  enzim  human tirosinase  karena  berinteraksi  langsung dengan residu penting pada sisi aktif reseptor (memiliki  situs  pengikatan  yang  hampir sama  dengan  substrat),  sehingga  dapat menghambat pembentukan melanin.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  penulis  ucapkan  kepada Departemen  Biokimia  yang  memberikan akses terhadap YASARA structure sehingga penelitian ini dapat berhasil.

## DAFTAR PUSTAKA
Achmad  Z,  Sugiarto  B.  2020.  Ekstraksi
antosianin  dari  biji  alpukat  sebagai pewarna alami. J Teknol
Technoscientia . 12(2):134-`143.
Adnyani  KD,  Lestari  LWE,  Prabowo  H, Siaka PAIA, Laksmiani NPL. 2019. Aktivitas dari kuersetin sebagai agen pencerah  kulit  secara  in  silico. J
Kim . 13(2):207–212. doi:10.24843/jchem.2019.v13.i02.p 14. Aswad  M,  Christine  L,  Hardianti  B.  2020. Studi penambatan molekul senyawa-senyawa bioaktif dari kulit akar  murbei  ( Morus  sp .  ). Maj
Farm dan Farmakol . 23(3):85–100. doi:10.20956/mff.v23i3.9399.
Balino P, Cadenas AG, Malo DL, Romero FJ, Muriach M. 2019. Is there a role for  abscisic  acid,  a  proven  anti- inflamatory  agent,  in  the  treatment of ischemic retinopathies.
Antioxidants . 8(104) : 1-11.
Chatatikun  M,  Supjaroen  P,  Promlat  P, Chantarangkul  C,  Waranuntakul  S, Nawarat J, Tangpong J, Chiabchalard  A.  2020.  Antioxidant and  tyrosinase  inhibitory  properties of  an  aqueous  extract  of Garcinia atroviridis Griff.  ex.  T.  Anderson fruit  pericarps. Pharmacogn  J . 12(1):71–78.
Chen D, Oezguen N, Urvil P, Ferguson C,
Dann  SM,  Savidge  TC.  2016.
Regulation of protein-ligand binding affinity  by  hydrogen  bond  pairing. Sci Adv . 2(3). doi:10.1126/sciadv.1501240. Dallakyan, Sargis; Olson A. 2015. Participation  in  global  governance: Coordinating  “the  voices  of  those most  affected  by  food  insecurity.”
Glob  Food  Secur  Gov .  1263:243– 250.
Da Silva AP, De Silva NF, Andrade EHA,
Gratieri  T,  Setzer  WN,  Maia  JGS,
Da  Silva  JKR.  2017.  Tyrosinase inhibitory activity, molecular
docking  studies  and  antioxidant potential  of  chemotypes  of Lippia origanoides (Verbenaceae) essential oils. PLoS One . 12(5):1–17.
Dominika N, Hasyim H. 2019. Perlindungan hukum terhadap konsumen  atas  penjualan  kosmetik berbahaya  di  Indonesia:  suatu pendekatan kepustakaan. Niagawan . 8(1):60–67.
Farhan  M.  2019.  Penambatan  molekuler
senyawa  aktif  okra  ( Abelmoschus esculentus L.)  pada  enzim  α- glukosidase  sebagai  kandidat  obat antidiabetes  melitus.[skripsi].Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor.
Giantari  NKM,  Prayoga  IWI,  Laksmiani NPL. 2019. Aktivitas agen pencerah kulit  dari  katekin  secara  in  silico. J Kim . 13(2):196–200.
Hashemi  SM,  Emami  S.  2015.  Kojic  acid- derived tyrosinase inhibitors: synthesis  and  bioactivity. Pharm Biomed Res . 1(1):1–17.
Herlina,  Vestabilivy  E.  2019.  Pengaruh pengetahuan dan penggunaan kosmetik  pemutih  terhadap  kulit wajah  pada  mahasiswi  STIKes Persada Husada Indonesia. 6(20):30–40.
Irawati  NAV.  2015.  Antihypertensive effects  of  avocado  leaf  extract ( Persea  americana Mill). Majority . 4(1):44–48.
Kurniasari  A,  Anwar  E,  Djajadisastra  J. 2018.  Potensi  ekstrak  biji  coklat ( Theobroma  cacao Linn)  sebagai inhibitor  tirosinase  untuk  produk pencerah  kulit. J  Kefarmasian Indones . 8(1):34–43.
Klebe G. 2013. Drug design: methodology, concepts, and mode-of-action. Drug Des  Methodol  Concepts,  Mode-of- Action .:61–87.  doi:10.1007/978-3- 642-17907-5.
Lai X, Wichers HJ, Soler-Lopez M, Dijkstra BW.  2017.  Structure  of  human tyrosinase related protein 1 reveals a binuclear  zinc  active  site  important for melanogenesis. Angew Chemie - Int Ed . 56:9812–9815.
Land  H,  Humble  MS.  2018. YASARA:  A tool to obtain structural guidance in biocatalytic  investigations .  Volume ke-4.
Lipinski  CA,  Lombardo  F,  Dominy  BW,
Feeney  PJ.  2001.  Experimental  and computational approaches to estimate solubility and permeability in  drug  discovery  and  development settings. Adv Drug Deliv Rev . 46:3–
26. doi:10.1016/j.addr.2012.09.019.
Malangngi L,  Sangi  M,  Paendong  J.  2012. Penentuan  kandungan  tanin  dan  uji aktivitas  antioksidan  ekstrak  biji buah  alpukat  ( Persea  americana Mill.). J MIPA . 1(1):5–10.
Tobias  M,  Wolfram  G,  Jan  B,  Kerstin  E,
Cathrin  S,  Horst  W,  Franz  S, Vincent J. H, Klaus-HR, Ludger K.
2018. Inhibition of Human Tyrosinase Requires Molecular Motifs  Distinctively  Different  from
Mushroom  Tyrosinase.  Journal  of
Investigative  Dermatology.  138(7):
1601-1608.
Mannige RV, Kundu J, Whitelam S. 2016.
The  Ramachandran  Number:  An Order Parameter for Protein Geometry. Plos One . 1-14.
Moon  A,  Khan  D,  Gajbhiye  P,  Jariya  M. 2017. Insilico prediction of toxicity of  ligands  utilizing  admetsar. Int  J Pharma  Bio  Sci .  8(3):674–677. doi:10.22376/ijpbs.2017.8.3.b674- 677.
Mulatsari  E,  Mumpuni  E,  Sandy  K.  2019.
Penapisan  virtual  senyawa  dalam tanaman familia annonaceae
sebagai ligan pada reseptor estrogen alfa  (ER-α). J  Sains  dan  Edukasi Sains . 2(2):70–76.
Noh H, Lee SJ, Jo HJ, Choi HW, Hong S,
Kong  KH.  2020.  Histidine  residues at the copper-binding site in human tyrosinase  are  essential  for  its catalytic  activities. J  Enzyme  Inhib Med Chem . 35(1):726–732. doi:10.1080/14756366.2020.17406 91. Ochieng  PJ,  Sumaryada  T,  Okun  D.  2017. Molecular docking and
pharmacokinetic prediction of herbal  derivatives  as  maltase- glucoamylase  inhibitor. Asian  J Pharm Clin Res . 10(9):392–398. Paris  M,  Strickland  J,  Allen  D,  Casey  W. 2015. Using acute oral toxicity data to  estimate  acute  dermal  hazard classification and labeling of pesticide  actives. NICEATM  SOT 2015 Poster .:1–17.
Ramos-Jerz  M,  Villanueva  S,  Jerz  G,
Winterhalter  P,  Deters  AM.  2013. Persea  americana Mill.  seed:
fractionation,  characterization,  and effects  on  human  keratinocytes  and fibroblasts. Evidance-Based Complementary  and  Alternative Medicine . 2013. 1-12.
Randhawa M, Seo I, Liebel F, Southall MD,
Kollias  N,  Ruvolo  E.  2015.  Visible light  induces  melanogenesis  in human skin through a photoadaptive response. Plos One .1-14.
Saeedi  M,  Eslamifar  M,  Khezri  K.  2019.
Kojic  acid  applications  in  cosmetic and  pharmaceutical  preparations. Biomedicine  &  Pharmacotherapy .
110(2019) : 582-593.
Şöhretoğlu  D,  Sari  S,  Barut  B,  Özel  A.
2018. Tyrosinase inhibition by some flavonoids: Inhibitory activity, mechanism by in vitro and in silico studies. Bioorg Chem . 81:168–174.
Song W, Zhu X, Ding XD, Yang HB, Qin ST,  Chen  H,  Wei  SD.  2017. Structural  features,  antioxidant  and tyrosinase  inhibitory  activities  of proanthocyanidins  in  leaves  of  two tea  cultivars. International  Journal of  Food  Properties .    20(6)  :  1348– 1358.
Varma  AK,  Patil  R,  Das  S,  Stanley  A,
Yadav  L,  Sudhakar  A.  2010. Optimized hydrophobic interactions and hydrogen bonding at the target- ligand  interface  leads  the  pathways of Drug-Designing. PLoS One . 5(8). doi:10.1371/journal.pone.0012029. Vinha  AF,  Moreira  J,  Barreira  SVP.  2013.
Physicochemical
parameters,
phytochemical  composition  and antioxidant activity of the algarvian avocado ( Persea americana Mill.). J
Agric Sci . 5(12):100–109.
Zolghadri S, Bahrami A, Khan H, Tareq M, Munoz-Munoz  J,  Garcia-Molina  F, Garcia-Canovas  F,  Saboury  AA. 2019.  A  comprehensive  review  on tyrosinase  inhibitors. J  Enzyme
Inhib  Med  Chem .  34(1):279–309. doi:10.1080/14756366.2018.15457 67.