p-ISSN : 2442-6032 e-ISSN :  2598-9979
DOI : 10.35311/jmpi.v9i2.347
Aktivitas Anti-elastase dan Antioksidan dari Ekstrak Etanol Kayu Bangkal ( Nauclea subdita ) Korth. Steud. dengan Variasi Metode Ekstraksi
Sintiami Ramadhani, Berna Elya * , Roshamur Cahyan Forestrania Program Studi Magister Herbal, Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia, Depok 16424, Jawa Barat, Indonesia

## ABSTRAK
Kayu  Bangkal  ( Nauclea  subdita )  (Korth.)  Steud.  telah  digunakan  secara  tradisional  oleh penduduk asli Kalimantan Selatan, sebagai produk perawatan kulit berupa masker wajah, yang  diyakini  dapat  melindungi  kulit  dari  pengaruh  buruk  sinar  matahari.  Penelitian  ini bertujuan untuk membandingkan rendemen, aktivitas anti-elastase, efek proliferasi sel, total polifenol,  dan  total  flavonoid  dan  aktivitas  antioksidan  dari  berbagai  metode  ekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan metode UAE ( Ultrasound Assisted Extraction ), MAE ( Microwave Assisted  Extraction ),  dan  Soxhlet.  Aktivitas  anti-elastase  dilakukan  secara  enzimatis menggunakan Porcine  Pancreatic  Elastase (PPE).  Ekstrak  teraktif  dilanjutkan  dengan pengujian proliferasi sel menggunakan HDFa. Pengujian kadar total polifenol dan flavonoid dilakukan  dengan  metode  kolorimetri  dan  aktivitas  antioksidan  dengan  metode  DPPH, ABTS, dan  FRAP.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  rendemen metode  ekstraksi  UAE ( Ultrasound Assisted Extraction ) kayu bangkal menghasilkan rendemen tertinggi, dengan nilai 7,12% lebih tinggi dibandingkan metode MAE ( Microwave Assisted Extraction ) dan Soxhlet, aktivitas anti-elastase tertinggi diperoleh pada ekstrak metode UAE (361,22 μg/mL). Ekstrak teraktif  memiliki  efek  proliferasi  terhadap  sel  HDFa  dependent  dose,  total  fenol  dan flavonoid tertinggi pada metode MAE dengan kadar berturut-turut 124.96±0.42 mg EAG/g ekstrak dan 16.62±0.23 mg EK/g ekstrak. Pengujian antioksidan dari masing-masing ekstrak umumnya  menunjukkan  aktivitas  yang  kuat  dalam  meredam  radikal  ABTS,  DPPH  dan reduksi besi. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa metode ekstraksi UAE dalam menarik senyawa  aktif  N.  subdita  berpotensi  sebagai  anti  elastase,  antiaging,  dan  antioksidan dibandingkan  dengan  metode  ekstraksi  lainnya.  Penelitian  ini  diharapkan  dapat memberikan informasi kepada masyarakat untuk dapat dikembangkan pada penelitian lebih lanjut.
Kata Kunci : Anti-elastase, Antioksidan, Nauclea subdita , Ekstraksi

## ABSTRACT
Bangkal Wood ( Nauclea subdita ) (Korth.) Steud. has been used traditionally by the natives of South Kalimantan, as a skin care product in the form of a face mask, which is believed to protect the skin from the harmful effects of sunlight. This study aims to compare the yield, anti-elastase  activity,  cell  proliferation  effect,  total  polyphenols,  total  flavonoids  and antioxidant activity of various extraction methods. Extraction was carried out using the UAE (Ultrasound  Assisted  Extraction),  MAE  (Microwave  Assisted  Extraction),  and  Soxhlet methods.  Anti-elastase  activity  was  carried  out  enzymatically  using  porcine  pancreatic elastase (PPE). The most active extract was followed by cell proliferation testing using HDFa. Tests for total levels of polyphenols and flavonoids were carried out using the colorimetric method  and  antioxidant  activity  using  the  DPPH,  ABTS,  and  FRAP  methods.  The  results showed that The Ultrasound-Assisted Extraction (UAE) method of bangkal wood produced the  highest  yield,  with  a  value  of  7.12%  higher  than  the  Microwave  Assisted  Extraction (MAE)  and  Soxhlet  methods.  The  highest  anti-elastase  activity  was  obtained  in  the  UAE method extract (361.22 μg/mL). The most active extract has a dose-dependent proliferative effect on HDFa cells. The total phenols and flavonoids were highest in the MAE method with levels  of  124.96±0.42  mg  GAE/g  extract  and  16.62±0.23  mg  QE/g  extract,  respectively. Antioxidant  testing  of  each  extract  generally  showed  strong  activity  in  reducing  ABTS radicals, DPPH and iron reduction. The results of this study indicate that the UAE extraction method  in  extracting  the  active  compounds  of  N.  subdita  has  the  potential  to  act  as  anti- elastase, antiaging and antioxidant compared to other extraction methods. This research is expected to provide information to the public to be developed for further research.
Keywords : Anti-elastase, Antioxidant, Nauclea subdita , Extraction
Sitasi: Ramadhani, S., Elya, B., & Forestrania, R.C. (2023). Aktivitas Anti-elastase dan Antioksidan dari Ekstrak Etanol Kayu Bangkal ( Nauclea subdita ) Korth. Steud. dengan Variasi Metode Ekstraksi. Jurnal Mandala Pharmacon Indonesia, 9(2), 228-243. https://doi.org/10.35311/jmpi. v9i2.347
Submitted: 13 Juni 2023 Accepted: 19 November 2023 Published: 18 Desember 2023
*Penulis Korespondensi:
Berna Elya
Email:
berna.elya@farmasi.ui.ac.id
Jurnal Mandala Pharmacon Indonesia is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
Ramadhani, et al.

## PENDAHULUAN
Proses  penuaan  sangat  dipengaruhi oleh  paparan  stres  oksidatif  pada  kulit (Anggraini  et  al.,  2020).  Proses  biologis  dari penuaan sangat rumit sehingga menyebabkan perubahan morfologis dan fisiologis, terutama  pada  lapisan  kulit  yang  terpapar sinar matahari (Anggraini et al., 2021). Dalam respons photoaging ,  ROS  yang  diproduksi secara berlebih, akan merangsang peningkatan  ekspresi Matrix  metalloproteinase (MMP) dan elastase, sehingga dapat menyebabkan penurunan sintesis protokollagen dan elastin. Elastin merupakan protein  serat  elastis,  yang  dibentuk  oleh  sel fibroblas, dan bersama dengan kolagen, dapat mempengaruhi  sifat  mekanik  pada  jaringan ikat, yang bertanggung jawab dalam menjaga elastisitas  dan  ketahanan  kulit.  Sel  fibroblas akan mengalami penurunan populasi seiring bertambahnya  usia.  Penurunan  populasi  sel fibroblas menyebabkan penurunan biosintesis kolagen  pada  lapisan  dermis  yang  dapat menyebabkan  kerutan  pada  kulit  serta mengarah  pada  proses  penuaan  (Nur  et  al., 2021).
Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan  berbagai  upaya  untuk  mencegah terjadinya  penuaan  dini.  Saat  ini,  banyak bahan sintetis yang dipasarkan sebagai bahan kosmetik anti-penuaan, namun bahan tersebut  dapat  menimbulkan  efek  negatif seperti fotoalergi dan dermatitis kontak, yang dapat  mengiritasi  kulit  dan  menyebabkan alergi.  Akibatnya,  sumber  alami,  seperti ekstrak  herbal  sebagai  bahan  produk perawatan kulit, sangat penting untuk diteliti. Penelitian in  vitro telah  menunjukkan  sifat antioksidan  dan  anti-elastase  dari  ekstrak herbal  yang  mengandung  komponen  fenolik (Desmiaty et al., 2020).
Beberapa tumbuhan dari famili Rubiaceae  memiliki  aktivitas  anti-elastase yang  kuat,  seperti  daun Psychotria  capensis (Eckl.)  Vatke  (Rubiaceae)  yang  dapat menghambat  elastase  sebesar  80%  (92,84  ± 1,13%),  dan  ixorapeptide  II,  isolat  dari Ixora. coccinea L.  (Rubiaceae),  yang  mengurangi
pelepasan  elastase  dengan  nilai  IC50  5,6  µM (Ndlovu  et  al.,  2013)(Ahmad  et  al.,  2020) . Nauclea  subdita ,  (Korth.)  Steud.,  anggota  dari keluarga  Rubiaceae,  merupakan  salah  satu spesies  dalam  genus Nauclea .  Penduduk  asli
Kalimantan
Selatan secara empiris memanfaatkan  kayu  bangkal  ( N.  subdita) sebagai perawatan kulit berupa masker wajah untuk  melindungi  kulit  dari  sinar  matahari dan menghilangkan flek hitam (Rahmi et al., 2021).  Penggunaan  kayu  bangkal  mungkin terkait  dengan  aktivitas  anti-elastasenya, namun penelitian tentang pengaruh aktivitas anti-elastase pada kulit kayu bangkal sebagai produk perawatan kulit belum pernah diteliti secara  ilmiah.  Menurut  Jamaluddin,  ekstrak kasar  metanol  kayu  bangkal  mengandung fenolik, flavonoid, terpenoid, alkaloid, fitosterol,  dan  saponin  (Jamaluddin  et  al., 2012).  Alkaloid,  flavonoid,  dan  polifenol merupakan  zat  aktif  antioksidan.  Jumlah komponen flavonoid dalam ekstrak mempengaruhi potensi aktivitas anti-elastase (Ambarwati  et  al.,  2019).  Jika  dibandingkan dengan  metode  ekstraksi  lainnya  (perkolasi, maserasi,  dan  air  suling),  dan  jenis  pelarut (seperti  etanol  96%,  etanol  70%,  dan  etil asetat), sokletasi dengan etanol 96% memberikan konsentrasi fenolik total terbesar yaitu 81,121±1,66 mg EAG/g ekstrak (Rahmi et al.,  2021).  Selain  itu,  penelusuran  literatur sebelumnya,  metode  ekstraksi  konvensional berpengaruh pada hasil rendemen, maka dari itu  pada  penelitian  ini  digunakan  berbagai metode  ekstraksi  konvensional  dan  non konvensional  untuk  membandingkan  hasil rendemen pada kayu bangkal. Pada penelitian  ini  dilakukan  evaluasi  terkait optimasi ekstraksi dengan metode konvensional  yaitu  Soxhlet,  dan  metode  non konvensional yaitu Ultrasound Assisted Extraction (UAE)  dan Microwave Assisted Extraction (MAE)  menggunakan  pelarut etanol 96%. Keuntungan dari metode sokletasi adalah  lebih  banyak  minyak  yang  dapat diekstraksi,  dan  lebih  sedikit  pelarut  yang digunakan. UAE merupakan metode ekstraksi menggunakan gelombang
Ramadhani, et al.
ultrasonik, keuntungan dari metode ini yaitu efisiensi  lebih  besar,  suhu  ekstraksi  lebih rendah,  waktu  operasinya  lebih  singkat (Panja,  2018).  MAE  merupakan  metode ekstraksi  menggunakan  gelombang  mikro, keuntungan  dari  metode  ini  yaitu  waktu ekstraksi yang lebih pendek, selektivitas yang lebih  tinggi  dan  kualitas  ekstrak  target  yang lebih  baik  dibandingkan  dengan  metode ekstraksi  konvensional  (Chemat  &  Vian, 2014).
Menurut penelitian Charissa, aktivitas antioksidan  gel  ekstrak  kulit  batang  dengan menggunakan etanol 96% tergolong kuat dan memiliki IC50 sebesar 48,78 µg/mL (Charissa et al., 2017). Oleh karena itu dalam penelitian ini bertujuan untuk membandingkan rendemen  ekstrak  etanol  96%  dari  kayu
bangkal  dengan  menggunakan  metode konvensional (Soxhlet) dan non konvensional (UAE  dan  MAE),  membandingkan  aktivitas anti-elastase,  efek  proliferasi  terhadap  sel kulit, kadar polifenol dan flavonoid total, dan aktivitas  antioksidan  (DPPH,FRAP,  dan ABTS) dari berbagai metode ekstraksi.

## METODE PENELITIAN Bahan tanaman
Kayu bangkal ( Nauclea subdita ) (Korth.)  Steud.  (Famili  Rubiaceae)  dikoleksi pada  Juli  2022  dari  Tabalong,  Kalimantan Selatan.  Tumbuhan  tersebut  diidentifikasi oleh  Fakultas  MIPA  Universitas  Lambung Mangkurat. Kayu dibersihkan dan dikeringkan  pada  suhu  16 0 C  dan  digiling menjadi halus (Gambar 1).
Gambar 1. Kayu bangkal (Nauclea subdita) (Korth.) Steud. (Sumber Pribadi)

## Bahan Dan Reagen Kimia
Bahan-bahan  kimia  yang  digunakan pada  penelitian  ini  antara  lain  Trizma  Base (Sigma  Aldrich  No.T1503),  Porcine  pankreas elastase  (Sigma  Aldrich  SLBV  9311),  N- Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide  /  SANA (Sigma  Aldrich  SLBR  7591V),  asam  galat, quercetin  (Sigma  Aldrich,  India),  asam askorbat, HCl, aqua demineralisata (Brataco Chemika,  Indonesia),  natrium  asetat  (Merck, Jerman), 2,4,6- Tris(2-Pyridyl)-S-Triazine (TPTZ)  (Sigma  Aldrich,  USA)  ,  besi(III) klorida  heksahidrat  (Merck,  Jerman),  besi(II) sulfat  heptahidrat  (Merck,  Jerman),  DMSO (Merck,  Jerman),  DPPH  (Sigma  Aldrich, Jerman), ABTS (Sigma Aldrich, India), kalium persulfat , Trolox, pelarut pro-analitik (etanol
p.a, metanol p.a), etanol 96%, folin ciocalteau (F9252/F47641), natrium karbonat, aluminium klorida,  dan  air  suling  (Brataco  Chemika, Indonesia) sebagai pengencer.

## Proses Ekstraksi
Ekstrak  kayu  bangkal  dilakukan dengan sedikit memodifikasi ekstraksi metode Soxhlet, Microwave-Assisted Extraction (MAE)  dan Ultrasound-Assisted  Extraction (UAE). Sebanyak 100 gram sampel digunakan,  dan  etanol  96%  digunakan sebagai  pelarut,  dengan  rasio  sampel terhadap  pelarut  1:10  (Abbas  et  al.,  2021) (Indonesia, 2017). Rumus tersebut digunakan untuk  menentukan  persentase  rendemen ekstrak dari berat kering ekstrak (a) dan berat serbuk simplisia yang ekstraksi (b)
Ramadhani, et al.
(Sembiring  et  al.,  2018).  Hasil  ekstraksi dihitung  untuk  setiap  ekstrak  dengan menggunakan persamaaan berikut: Rendemen (%) = a/b  x 100%

## Skrining fitokimia
Skrining  fitokimia  secara  khusus dilakukan  untuk  semua  ekstrak  sesuai dengan  metode  standar  dengan  sedikit modifikasi.  Skrining  fitokimia  kualitatif bertujuan untuk mendeteksi senyawa kimia (fenol,  flavonoid,  tanin,  terpenoid,  steroid, alkaloid,  dan  saponin).  Pereaksi  yang digunakan adalah pereaksi besi (III) klorida, pereaksi Mayer, Dragendorff, dan Bouchardat (uji alkaloid), pereaksi Shinoda (uji  flavonoid),  gelatin,  uji  garam-gelatin (tanin),  uji  buih  (uji  saponin),  dan  uji Liebermann- Pereaksi Burchard (uji terpenoid/steroid) (Jamaluddin et al., 2012) (Sembiring et al., 2018).

## Penentuan kadar polifenol total
Metode  Folin-Ciocalteu  digunakan untuk penentuan fenolik total, dengan asam galat  digunakan  sebagai  standar,  dengan sedikit  modifikasi  (Nur  et  al.,  2021).  Pada pengujian  sampel,dan  standar  dilakukan pemipetan sebanyak 200 μL larutan uji yang sesuai  dan  masing-masing  seri  larutan standar  ke  dalam  wadah  yang  sesuai. Tambahkan 500 μL enceran Folin- Ciocalteu LP  (7,5%  dalam  air).  Diamkan  selama  8 menit, ditambahkan 1 mL NaCO 3 , ditambahkan  hingga  5  mL  H 2 O  inkubasi selama ± 1 jam dalam vial coklat pada suhu ruang. Ukur serapan masing-masing larutan  pada  panjang  gelombang  serapan maksimum  asam  galat  671  nm.  Lakukan pengukuran  blanko  dengan  cara  yang sama,  tanpa  penambahan  larutan  uji.  Buat kurva kalibrasi dan hitung kadar larutan uji (Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2017; Wiliantari et al., 2022).

## Penentuan kadar flavonoid total
Metode  kolorimetri  AlCl 3 yang digunakan dalam penentuan flavonoid total menggunakan quercetin digunakan sebagai standar dengan sedikit modifikasi
(Anggraini et al., 2020) (Chang Chia-Chi et al.,  2002).  Pada  pengujian  sampel  dan standar, dilakukan pemipetan 1 mL larutan uji dan masing-masing seri larutan standar ke  dalam  wadah  yang  sesuai.  Tambahkan pada  masing-masing,  0,1  mL  aluminium klorida  P  10%,  0,1  mL  natrium  asetat  1  M dan  ditambahkan  methanol  hingga  5  mL. Kocok dan diamkan selama ± 30 menit pada suhu ruang. Ukur absorbansi pada panjang gelombang  maksimum  kuersetin  441  nm. Buat  kurva  kalibrasi  dan  hitung  kadar larutan uji.

## Uji anti-elastase
Uji anti-elastase menggunakan porcine  pancreatic  elastase  (PPE)  dan substrat N-Succ-(Ala)-3-p-nitroanilide (SANA) (Ambarwati et al., 2019).
Pembuatan  buffer  Triz  HCl  0,1  M  pH  8, pembuatan  substrat  SANA  1,3  mM,  0,88 U/mL  (PPE).  Dalam  pengujian  blanko, 155μL buffer dimasukkan dalam microplate 96  well ,  15  μL  enzim  ditambahkan,  dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 25°C sebelum  ditambahkan  30  μL  substrat  dan diinkubasi  selama  50  menit.  Dalam  uji kontrol blanko, 170 μL buffer ditambahkan ke  sumuran  microplate  96  well  dan diinkubasi  selama  20  menit;  kemudian ditambahkan 30 μL substrat dan diinkubasi selama  50  menit.  Pengujian  ekstrak  dan quercetin  sebagai  kontrol  positif,  125  μL buffer dimasukkan ke dalam microplate 96 well, ditambahkan 15 μL enzim, ditambahkan 30 μL ekstrak atau  kuersetin, dan campuran diinkubasi selama 20 menit. Kemudian 30 μL substrat ditambahkan, dan campuran  diinkubasi  selama  20  menit. Kemudian, dengan menggunakan
microplate
reader, pada panjang gelombang  405  nm  digunakan  untuk menghitung absorbansi
(Glomax).
Pengujian  dilakukan  sebanyak  tiga  kali pengulangan.  Persentase  penghambatan dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut:
Penghambatan (%) = ((1- B))/((A)) x 100%
Ramadhani, et al.
di mana A  mewakili  aktivitas enzim tanpa adanya  inhibitor  dan  B  mewakili  aktivitas ketika ada inhibitor.

## Evaluasi proliferasi sel normal
Proliferasi  sel  normal  dievaluasi dengan  metode  MTT(González-Centeno  et al.,  2014).  MTT  merupakan  metode  yang dapat digunakan untuk mengukur persentase  usia  viabilitas  sel  berdasarkan aktivitas  mitokondria  sel  fibroblas  (Bernas &  Dobrucki,  2002).  Dalam  penelitian  ini, sampel yang digunakan adalah sampel ter- aktif  yaitu  sampel  dari  metode  ekstraksi UAE,fibroblas  dermal  manusia  dewasa (HDFa), yang berasal dari sel kulit dewasa normal  yang  memiliki  respons  seluler terhadap  penuaan  pada  kulit,  digunakan. Sel  HDFa  diperoleh  dari  Life  Technologies Corporation  (GIBCO,  California,  USA) dikultur  pada  media  DMEM  lengkap.  Sel yang  konfluen  sekitar  >80%  dianggap sebagai  sel  yang  dipanen.  Untuk  uji proliferasi  dengan  MTT  assay  digunakan dengan konsentrasi
2×10 4 sel/sumur.Suspensi  sel  sebanyak  100  µL (2×10 4 sel/well),  didistribusikan  ke  dalam 96-well plate,  kemudian diinkubasi selama 24  jam  agar  sel  menempel  pada  well,  dan dibuat berbagai seri konsentrasi (31,25–1000 µg/mL)pada  sampel  UAE.  Semua  sampel yang  diuji  dilarutkan  secara  individual dalam  DMSO  sebelum  ditambahkan  ke dalam  media  kultur.  Sumur  diinkubasi selama  24  jam  dalam  inkubator  CO 2 5% (Thermoscience  8000Dh  series,  Waltham, Massachusetts,  USA)  pada  suhu  37°C. Setelah masa inkubasi, media dibuang, dan sel  dicuci  dengan  100  μL  PBS.  Sel  hidup akan  bereaksi  dengan  MTT  membentuk garam  formazan  berwarna  ungu.  Reaksi MTT  dihentikan  dengan  reagen  stopper (SDS  10%  dalam  HCl  0,01  N),  kemudian diinkubasi  semalaman  pada  suhu  kamar dan  di  tempat  gelap.  Keesokan  harinya, serapan  dibaca  dengan  microplate  reader pada 595 nm (Nur et al., 2021).
Aktivitas Antioksidan

## 1. Aktivitas Antioksidan DPPH
Metode DPPH (2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl)  untuk  pengujian  aktivitas antioksidan dilakukan dengan asam askorbat  sebagai  kontrol  positif  yang mengacu pada penelitian Nur & Wiliantari dengan sedikit modifikasi (Nur et al., 2021) (Wiliantari et al., 2022). Persentase perubahan  warna  larutan  DPPH  dari  biru menjadi  kuning  yang  disebabkan  oleh kontrol digunakan untuk  menghitung efek penghambatan (larutan DPPH saja). Rumus perhitungan  nilai  IC50  menggunakan persentase  penghambatan  radikal  DPPH pada setiap seri konsentrasi larutan sampel:
Persen  penghambatan(%)  =  ((Abs.blanko- Abs.sample))/((Abs.blanko)) x 100%
dimana  Abs.  blanko  adalah  absorbansi larutan  yang  hanya  mengandung  larutan radikal  DPPH•,  dan  Abs.Sampel  adalah absorbansi  larutan  sampel  yang  akan  diuji dengan adanya DPPH•. Kemudian dihitung persentase penghambatan dengan menggunakan  persamaan  regresi  linier. Konsentrasi  sampel  yang  dapat  menekan radikal  DPPH  sebesar  50%  digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan. 2. Aktivitas Antioksidan ABTS Metode pengujian kapasitas antioksidan ABTS (2,2’-azino-bis-3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)
dilakukan  menggunakan  spektrofotometri UV-VIS  dengan  standar  asam  askorbat dengan sedikit modifikasi (Nur et al., 2021) (Apak et al., 2010). Larutan ABTS (7,0 mM) dan  2,73  mM  kalium  persulfat  (K 2 S 2 O 8 ) dalam  25  mL  air  suling  digunakan  untuk membuat  radikal  ABTS-+.  Campuran larutan  kation  radikal  ABTS  diinkubasi selama 12 sampai 16 jam  pada suhu  ruang dan disimpan di tempat gelap. Setelah masa inkubasi, ditambahkan etanol proanalisis ke dalam  campuran  dengan  perbandingan 1:15  (ABTS:  etanol  proanalisis)  untuk mengencerkannya. Pada penyiapan blanko atau  kontrol  negatif,  1  mL  larutan  ABTS-+ dipipet  ke  dalam  botol  vial,  kemudian
Ramadhani, et al.
diencerkan menjadi 5 mL dengan etanol pro analisis,  dan  absorbansi  dihitung  pada panjang  gelombang  752  nm  dengan Spektrofotometer  UV-Vis  (Shimadzu  UV- 1900, Perusahaan Shimadzu, Kyoto, Jepang).  Seri  konsentrasi  ekstrak  etanol metode  UAE  dan  MAE  mulai  dari  3–18 μg/mL, ekstrak etanol metode Soxhlet (4–24 μg/mL),  dan  asam  askorbat  (0,5–3  μg/mL) sebagai kontrol positif digunakan dalam uji sampel. Campuran diencerkan hingga 5 mL dengan etanol pro analisis,  dan didiamkan pada  suhu  ruang  selama  30  menit  dalam ruang gelap. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali.
Persentase  warna  larutan  blanko  (larutan ABTS+  saja)  yang  memudar  digunakan untuk  menghitung  persen  penghambatan dengan persamaan berikut:
Persen penghambatan (%) = ((A0-
A1))/((A0)) x 100%
di mana A1 adalah absorbansi sampel, dan A0 adalah absorbansi blanko (hanya larutan ABTS-+). Nilai IC50 suatu aktivitas antioksidan dihitung dengan menggunakan konsentrasi  sampel  yang  dapat  mereduksi radikal ABTS sebesar 50% dengan menggunakan grafik regresi linier.
3. Aktivitas Antioksidan Ferric Reduced Antioksidan Power (FRAP)
Metode Ferric  Reducing  Antioxidant Power (FRAP)  untuk  pengujian  aktivitas antioksidan dilakukan dengan asam askorbat  sebagai  kontrol  positif  yang mengacu  pada  penelitian  Nur;  Wiliantari dengan  sedikit  modifikasi  (Nur  et  al., 2019)(Wiliantari et al., 2022). Pertama-tama, disiapkan  reagen  yang  terdiri  dari  larutan besi  klorida  atau  FeCl 3 (20  mM)  dalam  air suling,  larutan  standar  besi  (II)  sulfat heptahidrat  (1  mM),  larutan  TPTZ  10  mM dalam  40  mM  asam  klorida,  dan  300  mM larutan  buffer  asetat  pH  3,6.  Pada pembuatan  kurva  kalibrasi,  larutan  kerja FRAP  I  dengan  komposisi  buffer  asetat: TPTZ:  aquabides  (dengan  perbandingan
10:1:1)  dipipet  ke  dalam  50  µL  larutan standar  besi(II)  sulfat  heptahidrat.  Larutan sampel  dipipet  sebanyak  50  μL,  asam askorbat  dipipet  sebanyak  5  μL  sebagai kontrol positif, dan reagen FRAP II dengan komposisi bufer asetat:TPTZ:FeCl 3 (dengan perbandingan 10:1:1) ditambahkan. Selanjutnya,  volume  campuran  sampel, asam  askorbat  dicukupkan  ke  dalam  5  mL akuades dan diinkubasi dalam ruang gelap selama  30  menit  pada  suhu  ruang. Pengujian  dilakukan  dengan  tiga  kali pengulangan. Setelah masa inkubasi, absorbansi dihitung pada panjang gelombang 596 nm dengan Spektrofotometer  UV-Vis  (Shimadzu  UV- 1900, Perusahaan Shimadzu, Kyoto, Jepang).  Kurva  kalibrasi  dibuat  dari  plot konsentrasi  (x)  dalam  mM  vs.  serapan bersih (y) larutan seri standar besi(II) sulfat heptahidrat untuk memperoleh persamaan regresi  linier  y  =  bx  +  a.  Penentuan  nilai FRAP dihitung dengan persamaan berikut:
Nilai  FRAP  (μmol/g  sampel)=  (C  x  V  x  Fp )/m
di mana C adalah konsentrasi larutan baku FeSO 4 .7H 2 O  yang  setara  dengan  sampel (μmol/mL), V adalah volume sampel (mL), Fp  adalah  faktor  pengenceran,  m  adalah berat  sampel  (g).  Menurut  persamaan berikut, aktivitas antioksidan sampel dihitung  dalam  gram  setara  FeSO 4 per  100 gram ekstrak:
Aktivitas  antioksidan  =  nilai  FRAP  x  10 -6 x Mr FeSO 4 .7H 2 O x 100
di  mana  aktivitas  antioksidan  sampel direpresentasikan sebagai g FeSO 4 ekuivalen per 100 g ekstrak, Mr adalah berat molekul FeSO 4 .7H 2 O (g/mol).

## Analisis statistik
Pengujian  bioaktivitas  pada  setiap sampel  dianalisis  menggunakan  Microsoft Excel  2019  yang  dihasilkan  dalam  bentuk rata-rata  ±  standar  deviasi  (SD).  Nilai signifikansi  pada  masing-masing  sampel dianalisis melalui uji T independen dan one
Ramadhani, et al.
way ANOVA yang diikuti dengan Tukey test menggunakan  SPSS  Versi  23  dengan perbedaan signifikan p<0,05.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi
Berdasarkan  hasil  penelitian,  metode ekstraksi  UAE  dari N.  subdita menghasilkan rendemen  tertinggi,  dengan  nilai  7,12%, seperti  ditunjukkan  pada  Tabel  1.  UAE merupakan metode ekstraksi yang efisien dan mudah dilakukan. Jika dibandingkan, dengan metode  konvensional  seperti  Soxhlet,  yang memerlukan periode ekstraksi selama 1-2 jam, UAE  secara  substansial  dapat  mengurangi waktu  ekstraksi.  Hal  ini  pernah  dilaporkan pada  famili  Rubiaceae,  dengan  metode ekstraksi  UAE  dapat  meningkatkan  hasil ekstraksi  pada  batang  dan  daun,  sekaligus mengurangi  durasi  dan  jumlah  pelarut  yang digunakan,  UAE  sangat  sesuai  untuk ekstraksi  senyawa  alami  bioaktif  yang  peka terhadap  bahan  kimia,  seperti  polifenol (Barrera  Vázquez  et  al.,  2014);(Marijan  et  al., 2023). Dalam hal mengekstraksi bahan kimia
bioaktif,  UAE  secara  signifikan  lebih  efisien daripada  dua  metode  lainnya  (Soxhlet  dan MAE).  Hal  ini  dapat  dijelaskan  karena gelombang  ultrasonik  berinteraksi  dengan dinding dan membran sel untuk memfasilitasi pelepasan kandungan senyawa kimia (Abbas et  al.,  2021).  Selain  itu,  reproduktifitas  yang tinggi,  konsumsi  pelarut  yang  rendah,  serta tingkat ekstraksi yang cepat.

## Skrining fitokimia
Skrining  fitokimia  bertujuan  untuk mengetahui kandungan senyawa kimia yang terdapat  pada sampel  uji.  Berdasarkan  Tabel 2,  hasil  uji  penapisan  fitokimia  dari  ketiga metode ekstraksi kayu bangkal (Soxhlet, UAE, dan  MAE)  mengandung  senyawa  fenolik, flavonoid, tanin, saponin, dan alkaloid. Hal ini sesuai  dengan  penelitian  sebelumnya,  yang menjelaskan bahwa senyawa fenolik, flavonoid, terpenoid, alkaloid, pitosterol, dan saponin  terdapat  pada  ekstrak  metanol N. subdita (Jamaluddin  et  al.,  2012).  Selain  itu, kayu  bangkal  mengandung  tanin  yang dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antibakteri (Rahmi et al., 2021).
Tabel 1: Rendemen ekstrak N. subdita No. Metode Ekstraksi Rendemen (%) 1 UAE 7.12 2 MAE 4.81 3 Soxhlet 6.87 Tabel 2: Skrining fitokimia ekstrak N. subdita No. Uji Reagen Soxhlet UAE MAE 1 Fenol FeCl 3 (+) (+) (+) 2 Flavonoid Uji Shinoda (+) (+) (+) 3 Tanin Uji Gelatin- Garam (+) (+) (+) FeCl 3 (+) (+) (+) 4 Terpenoid Liebermann- Burchard (-) (-) (-) 5 Saponin Uji Buih (+) (+) (+) 6 Alkaloid Dragendorff’s (+) (+) (+) Mayer’s (+) (+) (+) Kadar Polifenol dan Flavonoid Total Pengujian kadar polifenol dan flavonoid  pada  kayu  bangkal  dilakukan
untuk  mengukur  kadar  polifenol  dan flavonoid  yang  terdapat  pada  kayu  bangkal. Hal didukung dengan penelitian Avanti et al.,
Ramadhani, et al.
(2021)  ekstrak  kasar  metanol  kayu  bangkal mengandung senyawa fenolik, dan flavonoid. Pengujian  kadar  polifenol  didasarkan  pada reaksi oksidasi-reduksi menggunakan reagen Folin-Ciocalteau.  Berdasarkan  Gambar  2 menunjukkan  bahwa  metode  ekstraksi  MAE memiliki  kadar  polifenol  tertinggi  jika dibandingkan  dengan  metode  ekstraksi lainnya,  pada  konsentrasi  sampel  40  µg/mL memiliki kadar polifenol sebesar 124,96 ± 0,42 mg EAG/g ekstrak. Selain itu, hasil kadar total polifenol metode sokletasi adalah 113,32±1,30 mg EAG/g ekstrak, dan metode UAE memiliki
kadar polifenol terendah sebesar 101.40 ± 2.44 mg EAG/g ekstrak. Proses MAE yang efisien meningkatkan  total  hasil  fenol.  Selain  itu, MAE membutuhkan lebih sedikit pelarut dan membutuhkan  suhu  yang  lebih  rendah daripada  yang  dibutuhkan  dalam  ekstraksi Soxhlet.  Hasil  serupa  juga  dilaporkan  dalam membandingkan MAE dengan teknik ekstraksi  konvensional  dalam  mengekstraksi polifenol  dari  buah Gordonia  axillaris , Anoectochilus  roxburghii ,  dan  daun Pistacia lentiscus (Zhao et al., 2018).
Gambar 2. Kadar Fenol Total Ekstrak N. subdita Berdasarkan Gambar 3, metode ekstraksi  MAE  memiliki  kadar  flavonoid tertinggi  jika  dibandingkan  dengan  metode ekstraksi  lainnya,  pada  konsentrasi  sampel 200 µg/mL memiliki kadar flavonoid sebesar 16,62±0,23 mg EK/g ekstrak. Selain itu, metode sokletasi  menghasilkan  kadar  flavonoid  total 13,41±0,21 mg EK/g ekstrak, dan metode UAE memiliki  kadar  flavonoid  terendah  sebesar 12.86 ± 0.08 mg EK/g ekstrak.
Hasil  ini  serupa  dengan  beberapa penelitian sebelumnya, ekstrak etanol dengan MAE  (81,7181  ±  1,0404  mg  EK/g)  memiliki konsentrasi  flavonoid  total  (TFC)  yang  lebih tinggi  daripada  ekstrak  etanol  oleh  UAE (56,2038 ± 0,1058 mg EK/g) (Anuar et al., 2021). Di sisi lain, pengamatan yang sama dilakukan untuk kandungan flavonoid total dari ekstrak carob  yang  terungkap  sangat  dipengaruhi oleh proses ekstraksi. MAE ternyata menjadi metode  ekstraksi  yang  paling  tepat  untuk pemulihan  carob  flavonoid,  menghasilkan nilai tertinggi (10,53 mg EK/g DM) (Mansouri et  al.,  2022).  Di  sisi  lain,  pengamatan  yang
sama  dilakukan  untuk  kandungan  flavonoid total  dari  ekstrak  biji  carob  ( Ceratonia  siliqua L.) dari keluarga Fabaceae (kacang-kacangan), yang  terungkap  sangat  dipengaruhi  oleh proses  ekstraksi.  MAE  ternyata  menjadi metode  ekstraksi  yang  paling  tepat  untuk pengukuran  kadar  flavonoid,  menghasilkan nilai tertinggi (10,53 mg EK/g DM) (Mansouri et al., 2022).
Berdasarkan hasil ekstrak pada pengujian  total  fenol  dan  total  flavonoid, dapat dikaitkan dengan aktivitas antioksidan. Senyawa  fenolik  berupa  flavonoid  yaitu flavonol  dan  flavon  memiliki  peran  sebagai antioksidan.  Keterkaitan  antara  aktivitas flavonoid terhadap jumlah dan lokasi gugus – OH  dimana  dalam  hal  ini  berperan  dalam menetralkan radikal bebas. Flavonoid mampu menekan  radikal  bebas,  berkaitan  juga dengan kemampuannya mendonorkan elektron.  Hal  inilah  yang  menyebabkan hubungan  antara  kandungan  total  fenol dengan aktivitas antioksidan. Semakin tinggi
101,40 ± 2.44 124.96  ± 0.42 113.32 ± 1.30 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 UAE MAE SOXHLET Ka da r F enol Total ( mg EAG /g ) Ekstrak N. subdita
Ramadhani, et al.
nilai total fenol dan flavonoid maka semakin tinggi kemampuan antioksidan dalam mendonorkan elektronnya dalam hal menekan  perkembangan  radikal  bebas  (Nur
et  al.,  2019).  Jumlah  senyawa  fenolik  dan flavonoid  dalam  ekstrak N.  subdita terkait dengan seberapa kuat antioksidannya (Nur et al., 2021).
Gambar 3. Kadar Flavonoid Total Ektrak N. subdita

## Aktivitas anti-elastase
Hasil  pengujian  dapat  dilihat  pada Tabel 3, dimana hasil IC50 dari ketiga metode ekstraksi  menunjukkan  bahwa  nilai  IC50 ekstrak  metode  UAE  paling  rendah  diantara ekstrak  MAE  dan  Soxhlet  dengan  nilai  IC50 sebesar 361,22 µg/mL. Metode ekstraksi UAE menunjukkan  hasil  yang  berbeda  nyata dengan  metode  MAE  dan  Soxhlet.  Jika dibandingkan  dengan  nilai  IC50  kuersetin, sebagai kontrol positif yaitu 6,18 µg/mL, nilai IC50  kuersetin  lebih  kuat  dari  sampel  uji. Kuersetin dipilih dalam penelitian ini sebagai standar.  Kuersetin  adalah  senyawa  tunggal yang  secara  kimiawi  diklasifikasikan  sebagai flavonoid  dari  jenis  flavonol  yang  biasa digunakan  sebagai  standar  untuk  mengukur penghambatan  antioksidan  dan  elastase (Ambarwati et al., 2019). Aktivitas
penghambatan  enzim  elastase  lebih  tinggi pada metode UAE, hal ini karena kandungan polifenol  (flavonoid)  yang  berhasil  diekstrak semakin
meningkat akibat getaran/gelombang  ultrasonik  pada  dinding sel tanaman (Sulistyowati et al., 2023).
N.  subdita belum  pernah  terbukti memiliki  aktivitas  penghambatan  elastase. Meskipun  demikian,  aktivitas  anti-elastase
spesies  tanaman  dari  famili  yang  sama dengan  tanaman  yang  diperiksa  telah ditemukan. Ekstrak etil asetat daun P. capensis (Eckl.) Vatke (Rubiaceae) menghambat elastase sebesar 80% (92,84 1,13%), sedangkan ixorapeptide  II  (70)  dari I.  coccinea L. (Rubiaceae)  menghambat  pelepasan  elastase dengan IC50 nilai 5,6 µM (Ndlovu et al., 2013 dan Ahmad et al., 2020).
Selain  itu,  aktivitas  penghambatan elastase, juga terkait dengan kandungan total flavonoid  pada  ekstrak N.  subdita yang  lebih rendah  dari  kandungan  total  polifenol sehingga  aktivitas  penghambatan  elastase pada  ekstrak  memungkinkan  hasil  yang lemah.  Semakin  tinggi  kandungan  flavonoid total,  semakin  tinggi  aktivitas  anti-elastase. Menurut  Pientaweeratch  et  al.,  (2016),  fenol dan  flavonoid  seperti  kuersetin  secara signifikan  dapat  mempengaruhi  aktivitas enzim elastase. Penelitian sebelumnya menemukan  bahwa kandungan  flavonoid N. subdita secara  keseluruhan  sebesar  1,83%, yang cukup untuk  menjaga kekenyalan kulit atau  digunakan  sebagai  agen  anti-penuaan. Sayangnya,  kurang  ideal  bila  digunakan untuk menghilangkan kerutan (Charissa et al., 2016).
12,86 ± 0.08 16.62 ± 0.23 13,41 ± 0.21 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 UAE MAE SOXHLET Ka da r F lavonoid ex tra ct (mg KE/g ) Ekstrak N. subdita
Ramadhani, et al.
Tabel 3. Aktivitas anti-elastase ekstrak N. subdita No. Ekstrak Konsentrasi (μg/mL) IC 50 (μg/mL) 93.75 187.5 375 750 1500 1 UAE 13.52 ± 1.63 32.12 ± 2.39 52.81 ± 1.63 69.32 ± 1.81 87.22 ± 1.36 361.22* 2 MAE 5.35 ± 0.90 18.84 ± 1.13 34.20 ± 0.73 45.52 ± 1.20 65.67 ± 1.19 820.16 3 SOXHLET 2.16  ± 1.38 10.37 ± 1.83 29.90± 0.81 52.51±3.36 70.77 ±1. 79 738.39 4 Kontrol positif (kuersetin)
IC 50 = 6.18 (μg/mL)*
Keterangan: Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SD dengan rangkap tiga (n = 3);
*Hasil berbeda nyata pada p ≤ 0,05

## Evaluasi proliferasi sel normal
Proliferasi  sel  normal  dievaluasi dengan metode MTT (González et al., 2017). MTT  merupakan  metode  yang  dapat digunakan  untuk  mengukur  persentase usia  viabilitas  sel  berdasarkan  aktivitas mitokondria  sel  fibroblas  (Bernas  & Dobrucki,  2002).  Dalam  penelitian  ini, digunakan  HDFa  yang  berasal  dari  sel  kulit
dewasa normal yang memiliki respons seluler terhadap  penuaan  pada  kulit.  Berdasarkan Gambar  4  menunjukkan  bahwa,  semakin meningkatnya  konsentrasi  sampel  UAE, semakin meningkat pula persentase viabilitas sel hidup, yang dapat menyebabkan banyaknya  sel  yang  hidup  (Nur  et  al.,  2021). Hal  ini  menjelaskan  bahwa  ekstrak  UAE memiliki efek proliferasi terhadap sel kulit.
Gambar 4. Persentase viabilitas dan konsentrasi pada ekstrak N. subdita
Perubahan  morfologi  sel  merupakan tanda  aktivitas  viabilitas  dan  atau  sitotoksik yang  dihasilkan  dari  suatu  senyawa  setelah perlakuan terhadap sel dibandingkan dengan sel  kontrol.  Hasil  pengamatan  sel  HDFa menunjukkan perbedaan morfologi sel sebelum dan sesudah reagen MTT (Aisyah et al.,  2022).  Pada  Gambar  5C  kristal  formazan yang terbentuk lebih banyak, sedangkan pada Gambar  4B  kristal  formazan  yang  terbentuk
sangat  sedikit.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa semakin tinggi tingkat konsentrasi sampel uji, semakin  banyak  kristal  formazan  yang terbentuk,  yang  berarti  semakin  banyak  sel yang  hidup.  Sel  hidup  memiliki  enzim reduktase  mitokondria,  yang  dapat  bereaksi dengan  reagen  MTT  untuk  menunjukkan pembentukan garam formazan berwarna biru
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 0 200 400 600 800 1000 1200 Via bil it as (% )
Konsentrasi (µg/mL)
Ramadhani, et al.
keunguan (Aisyah et al., 2022).
A B

## C
Gambar 5.  Morfologi  sel  setelah  perlakuan  dengan  reagen  MTT  (A)  Sel  Kontrol,  (B)  Sel  setelah perlakuan  sampel  (konsentrasi  rendah  31,25  µg/mL)  (C)  Sel  setelah  perlakuan  sampel (konsentrasi tinggi 1000 µg/mL). (Nur et al., 2021)

## Aktivitas Antioksidan
1. DPPH
Pengujian  radikal  DPPH  didasarkan pada  perubahan  warna  molekul  radikal DPPH ungu tua akan menjadi kuning akibat transfer  atom  hidrogen  oleh  senyawa pereduksi  antioksidan  sehingga  radikal DPPH  menjadi  stabil  (Nur  et  al.,  2021). Berdasarkan,  Tabel  5,  aktivitas  antioksidan teknik  DPPH  yang  memiliki  aktivitas antioksidan sangat poten, yaitu pada metode MAE  yang  memiliki  IC50  sebesar  14,15±0,04 µg/mL,  UAE  yang  memiliki  19,75±0,06  µg /mL, dan Soxhlet, yang memiliki 36,26 ± 0,10 µg/mL. Perbedaan metode ekstraksi
menunjukkan  bahwa  aktivitas  antioksidan mempunyai  nilai  yang  berbeda  nyata  antara
UAE,  MAE,  dan  Soxhlet.  Metode  MAE memiliki nilai IC50 tertinggi, karena pengaruh energi  gelombang  mikro  ditransfer  secara efektif pada bahan tanaman melalui interaksi molekuler dengan adanya medan elektromagnetik dan memungkinkan transfer massa  yang  cepat  terhadap  pelarut  ekstraksi dan bahan tanaman sehingga memungkinkan komponen  senyawa-senyawa  polar  dapat meredam  radikal  DPPH  (Mansouri  et  al., 2022).  Hal  ini  berkorelasi  dengan  semakin tinggi  kandungan  total  polifenol,  maka semakin  tinggi  pula  aktivitas  antioksidan metode DPPH untuk metode ekstraksi MAE.
Nilai  IC50  dibagi  menjadi  empat kategori:  aktivitas  sangat  kuat  (IC50  < 50µg/mL),  aktivitas  kuat  (IC50  50  -
Ramadhani, et al.
100µg/mL),  aktivitas  sedang  (IC50  101  - 150µg/mL),  dan  aktivitas  lemah  (IC50  > 150µg/mL)  (Wijaya  et  al.,  2020).  Hal  ini menunjukkan bahwa ekstrak N. subdita pada metode  ekstraksi  MAE,  UAE,  dan  soxhlet memiliki  peluang  tinggi  untuk  menjadi
antioksidan  yang  sangat  kuat.  Namun  jika dibandingkan  dengan  kontrol  positif,  asam askorbat yang memiliki aktivitas antioksidan IC50 yang sangat tinggi yaitu 2,66±0,00 µg/mL daripada ketiga metode ekstraksi.
Tabel 5: Aktivitas Antioksidan Metode DPPH Ekstrak N. subdita No. Uji IC 50 DPPH (μg/mL ) 1 UAE 19.75 ± 0.06* 2 MAE 14.15± 0.04* 3 Soxhlet 36.26± 0.10* 4 Asam askorbat 2.66 ± 0.00*
Keterangan:   Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SD dengan rangkap tiga (n = 3).
*Hasil berbeda nyata pada p ≤ 0,05.

## 2. ABTS
Prinsip dasar metode spektrofotometri yang  telah  digunakan  untuk  menentukan aktivitas  antioksidan  ABTS  dari  larutan sampel  yaitu  pembentukan  kation  radikal ABTS  [2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic  acid)]  (Amalia  et  al.,  2023). Aktivitas  antioksidan  pada  metode  ABTS, tergolong  sangat  kuat  pada  metode  soxhlet dengan  nilai  IC50  13,84±0,55  µg/mL,  metode UAE dengan nilai IC50 15,14 ±0,03 µg/mL, dan MAE  dengan  nilai  IC50  15,95±0,04  µg/mL (Tabel  6).  Perbedaan  metode  ekstraksi menunjukkan  bahwa  aktivitas  antioksidan mempunyai  nilai  yang  berbeda  nyata  antara UAE, MAE, dan Soxhlet. Perbedaan aktivitas antioksidan pada ekstrak disebabkan oleh
perbedaan  kandungan  senyawa  seperti polifenol pada masing-masing metode ekstraksi  (Nur  et  al.,  2021).  Hal  ini menunjukkan  bahwa  ekstrak N.  subdita melalui  metode Soxhlet, UAE, MAE memiliki peluang  tinggi  untuk  menjadi  antioksidan yang sangat kuat. Penelitian ini memiliki nilai IC50  yang  lebih  kuat  dibandingkan  dengan penelitian  sebelumnya,  percobaan  ABTS mengungkapkan  bahwa  ekstrak  kulit  batang N. subdita menunjukkan aktivitas antioksidan dengan  nilai  IC50  sebesar  1183,13  µg/mL (Avanti  et  al.,  2021).  Asam  askorbat  yang memiliki  aktivitas  antioksidan  IC50  yang sangat kuat yaitu 1,92 µg/mL jika dibandingkan dengan ketiga metode ekstraksi.
Tabel 6.  Aktivitas Antioksidan Metode ABTS ekstrak N. subdita No. Uji IC 50 ABTS (μg/mL ) 1. UAE 15.14 ± 0.03* 2. MAE 15.95 ± 0.04* 3. Soxhlet 13.84 ± 0.02* 4. Asam askorbat 1.92 ± 0.00*
Keterangan:   Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SD dengan rangkap tiga (n = 3). *Hasil berbeda nyata pada p ≤ 0,05.
Ramadhani, et al.

## 3. FRAP
Berdasarkan  Tabel  7,  hasil  pengujian aktivitas  antioksidan  dengan  metode  FRAP menunjukkan  bahwa  ekstrak  MAE  memiliki aktivitas  antioksidan  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  metode  ekstraksi lainnya, dengan aktivitas antioksidan sebesar 53,57  ±  0,63  g  setara  FeSO 4 /100  g  ekstrak, seperti  terlihat  pada  Tabel  7  dengan konsentrasi  sampel  10  µg/mL.  Metode ekstraksi  UAE  menunjukkan  hasil  yang berbeda  nyata  dengan  metode  MAE  dan Soxhlet.  Aktivitas antioksidan asam askorbat sebagai  kontrol  positif,  pada  konsentrasi  1 µg/mL  sebesar  252,42  ±  0,39  g  FeSO 4 ekuivalen/100  g  ekstrak,  tergolong  sangat tinggi  daripada  ketiga  metode  ekstraksi. Perbedaan aktivitas antioksidan pada ekstrak disebabkan  oleh  perbedaan  kandungan senyawa  seperti  polifenol  pada  masing- masing metode ekstraksi. Kehadiran sejumlah besar  senyawa  polifenol  dapat  berpengaruh pada  kapasitas  antioksidan.  Kandungan senyawa    antioksidan  yang  besar  seperti
polifenol  yang  berperan  dalam  mekanisme pengkhelat  ion  logam    dalam  ekstrak  dan mengurangi kemungkinan terbentuknya radikal  hidroksil  yang  berasal  dari  radikal anion  superoksida  sehingga  menyebabkan tingginya  aktivitas  penangkapan  radikal bebas (Nur et al., 2021).
Bedasarkan hasil tersebut dapat dilihat bahwa,  semakin  tinggi  nilai  FRAP  sampel, semakin  besar  kapasitas  antioksidan  karena nilai  FRAP  yang  didasarkan  pada  prinsip reduksi ion besi (Fe 3+ ) menjadi ion besi (Fe 2+ ), yang merupakan senyawa antioksidan sebagai agen pereduksi (Nur et al., 2021). Pada metode FRAP, suatu sampel dapat berpotensi sebagai  antioksidan,  jika  sampel  tersebut mampu  mengirimkan  elektron  pada  reagen FRAP.  Aktivitas  antioksidan  dengan  metode ini  dapat  dikonfirmasi  dengan  mengukur pembentukan  warna  biru  pada  panjang gelombang  596  nm.  Peningkatan  absorbansi pada 596 nm menunjukkan bahwa ekstrak uji memiliki  daya  reduksi  yang  lebih  besar (Amalia et al., 2023).
Tabel 7. Aktivitas Antioksidan Metode FRAP Ekstrak N. subdita No. Uji FRAP (g FeSO 4 equivalent/ 100 g extract) ± SD 1 UAE 44.11 ± 1.37* 2 MAE 53.57 ± 0.63 3 Soxhlet 53.33 ± 0.34 4 Asam askorbat 252.42 ± 0.39 *
Keterangan:   Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SD dengan rangkap tiga (n = 3).
*Hasil berbeda nyata pada p ≤ 0,05

## KESIMPULAN
Metode ekstraksi UAE pada ekstrak N. subdita memiliki  rendemen  tertinggi  dan aktivitas  anti-elastase  tertinggi  yaitu  7,12% dan  361,22  μg/mL.  Metode  ekstraksi  MAE memiliki  kadar  total  polifenol  dan  flavonoid tertinggi yaitu 124,96 ± 0,42 mg EAG/g ekstrak dan  16,62  ±  0,23  mg  EK/g  ekstrak.  Metode
ekstraksi MAE memiliki aktivitas antioksidan tertinggi  dengan  nilai  IC50  DPPH  sebesar 14,15  ±  0,04  µg/mL  dan  FRAP  53,57  ±  0,63  g setara  dengan  FeSO4/100  g  ekstrak,  serta ekstrak  metode  Soxhlet  memperoleh  nilai IC50  ABTS  13.84  ±  0.02  μg/mL.  Ekstrak  ter- aktif  metode  UAE  memiliki  efek  proliferasi terhadap  sel  HDFa  dependent  dose.  Hasil
Ramadhani, et al.
penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  metode ekstraksi  UAE  dalam  menarik  senyawa  aktif N.  subdita  berpotensi  sebagai  anti  elastase, antiaging,  dan  antioksidan  dibandingkan dengan metode ekstraksi lainnya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  yayasan Daewoong.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas, M., Ahmed, D., Qamar, M. T., Ihsan, S.,
&  Noor,  Z.  I.  (2021).  Optimization  of ultrasound-assisted,  microwave-assisted and  Soxhlet  extraction  of  bioactive compounds  from  Lagenaria  siceraria:  A comparative analysis. Bioresource Technology Reports , 15 . https://doi.org/10.1016/j.biteb.2021.10074
6
Ahmad,  S.,  Saleem,  M.,  Riaz,  N.,  Lee,  Y.  S.,
Diri, R., Noor, A., Almasri, D., Bagalagel, A.,  &  Elsebai,  M.  F.  (2020).  The  Natural Polypeptides  as  Significant  Elastase Inhibitors. Frontiers  in  Pharmacology , 11 . https://doi.org/10.3389/fphar.2020.00688
Aisyah,  A.  N.,  Lukitaningsih,  E.,  Rumiyati,
Marwati, Sapra, A., Khairi, N., Fadri, A.,
& Nur, S. (2022). In vitro antioxidant and cytotoxic  evaluation  of  ethyl  acetate fraction  of  angiopteris  ferox  copel  tuber against  htb  lung  cancer  cell. Egyptian Journal  of  Chemistry , 65 (11),  41–48.
https://doi.org/10.21608/ejchem.2022.918 43.4364
Amalia, A., Nugraha, M. F. I., Sukenda, S., &
Elya, B. (2023). Tropical Journal of Natural Product Research . 7 (May), 2911–2918.
Ambarwati, N. S. S., Elya, B., & Desmiaty, Y.
(2019). Anti-elastase activity of methanolic and ethyl acetate extract from Garcinia latissima Miq. Journal of Physics: Conference Series , 1402 (5). https://doi.org/10.1088/1742- 6596/1402/5/055079
Anggraini,  N.  B.,  Elya,  B.,  &  Iskandarsyah.
(2020).  Anti-elastase,  antioxidant,  total phenolic  and  total  flavonoid  content  of macassar kernels (Rhus javanica L) from pananjung  pangandaran  nature  tourism park-  Indonesia. Journal  of  Natural
Remedies , 20 (1), 61–67. https://doi.org/10.18311/jnr/2020/24240
Anggraini, N. B., Elya, B., & Iskandarsyah, I.
(2021). Antielastase Activity of Macassar Kernels (Rhus javanica) Stem Extract and
Skin  Elasticity  Evaluation  of  Its  Topical Gel Formulation. Advances in Pharmacological and Pharmaceutical Sciences , 2021 .
https://doi.org/10.1155/2021/6690029
Anuar, A., Awang, M. A., & Tan, H. F. (2021).
Impact  of  solvent  selection  on  the extraction  of  total  phenolic  content  and total  flavonoid  content  from  kaffir  lime leaves:  Ultrasonic  assisted  extraction (UAE) and microwave assisted
extraction (MAE). AIP Conference Proceedings , 2347 .
https://doi.org/10.1063/5.0051934
Apak, R., Güçlü, K., Özyürek, M., Bektaşo ǧ lu, B.,  &  Bener,  M.  (2010).  Cupric  ion reducing  antioxidant  capacity  assay  for antioxidants  in  human  serum  and  for hydroxyl  radical  scavengers. Methods  in Molecular Biology , 594 , 215–239. https://doi.org/10.1007/978-1-60761-411-
1_15
Avanti,  C.,  Remanti,  E.,  Yuniarta,  T.  A., Azminah, A., Yunita, O., & Setiawan, F. (2021).  Antioxidant  activity  of  different parts of nauclea subdita. Tropical Journal of  Natural  Product  Research , 5 (8),  1365– 1370.
https://doi.org/10.26538/tjnpr/v5i8.7
Barrera Vázquez, M. F., Comini, L. R., Martini,
R. E., Núñez Montoya, S. C., Bottini, S., & Cabrera,  J.  L.  (2014).  Comparisons between conventional, ultrasound- assisted and microwave-assisted methods for extraction of
anthraquinones  from  Heterophyllaea
Ramadhani, et al.
pustulata Hook f. (Rubiaceae).
Ultrasonics Sonochemistry , 21 (2), 478–484.
https://doi.org/10.1016/j.ultsonch.2013.08
.023
Bernas, T., & Dobrucki, J. (2002). Mitochondrial  and  nonmitochondrial reduction  of  MTT:  Interaction  of  MTT with TMRE, JC-1, and NAO mitochondrial fluorescent probes. Cytometry , 47 (4), 236–242. https://doi.org/10.1002/cyto.10080 Chang Chia-Chi, Yang Ming-Hua, Wen Hwei- Mei,  &  Chern  Jiing-Chuang.  (2002). Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis byTwo Complementary Colorimetric Methods. Journal of Food and Drug Analysis , 10 (3), 178–182.
Charissa,  M.,  Djajadisastra,  J.,  &  Elya,  B. (2017).  Uji  Aktivitas  Antioksidan  dan Penghambatan  Tirosinase  serta  Uji Manfaat  Gel  Ekstrak  Kulit  Batang  Taya
(Nauclea  subdita)  terhadap  Kulit. Jurnal Kefarmasian Indonesia , 6 (2). https://doi.org/10.22435/jki.v6i2.6224.98-
107
Desmiaty,  Y.,  Saputri,  F.  C.,  Hanafi,  M.,
Prastiwi,  R.,  &  Elya,  B.  (2020).  Anti- elastase, anti-tyrosinase, and anti- oxidant  of  Rubus  fraxinifolius  stem methanolic extract. Pharmacognosy Journal , 12 (2), 271–275. https://doi.org/10.5530/pj.2020.12.42
González-Centeno,  M.  R.,  Knoerzer,  K., Sabarez,  H.,  Simal,  S.,  Rosselló,  C.,  & Femenia,  A.  (2014).  Effect  of  acoustic frequency  and  power  density  on  the aqueous ultrasonic-assisted extraction of grape  pomace  (Vitis  vinifera  L.)  -  A response  surface  approach. Ultrasonics
Sonochemistry , 21 (6), 2176–2184. https://doi.org/10.1016/j.ultsonch.2014.01 .021 Indonesia,  K.  K.  R.  (2017). Farmakope  Herbal Indonesia . Kemenkes RI.
Jamaluddin, F. R., Wahab, R., Daud, J. M., &
Rahman,  S.  (2012).  Total  phenolic contents  and  free-radical  scavenging activities  from  methanolic  extracts  of Nauclea subdita (Korth) Steud.
heartwood. Advances  in  Natural  and Applied Sciences , 6 (7), 1116–1124.
Mansouri, F. El, Silva, J. C. G. E., Cacciola, F., Asraoui, F., Tayeq, H., Ben Amar, Y. M., Lovillo, M. P., Chouaibi, N., & Brigui, J. (2022). Evaluation of Different Extraction Methods on the Phenolic Profile and the Antioxidant  Potential  of  Ceratonia siliqua L. Pods Extracts. Molecules , 27 (19). https://doi.org/10.3390/molecules271961 63
Marijan,  M.,  Tomić,  D.,  Strawa,  J.  W.,
Jakupović, L., Inić, S., Jug, M., Tomczyk, M.,  &  Zovko  Končić,  M.  (2023).
Optimization  of  Cyclodextrin-Assisted Extraction
of Phenolics from Helichrysum italicum for Preparation of Extracts  with  Anti-Elastase  and  Anti- Collagenase Properties. Metabolites , 13 (2). https://doi.org/10.3390/metabo13020257
Ndlovu,  G.,  Fouche,  G.,  Tselanyane,  M., Cordier,  W.,  &  Steenkamp,  V.  (2013).  In vitro  determination  of  the  anti-aging potential  of  four  southern  African medicinal  plants. BMC  Complementary and
Alternative Medicine , 13 .
https://doi.org/10.1186/1472-6882-13-304
Nur, S., Angelina, A. A., Aswad, M., Yulianty, R., Burhan, A., & Nursamsiar. (2021). In vitro  anti-aging  activity  of  Muntingia calabura L. fruit extract and its fractions. Journal  of  Pharmacy  and  Pharmacognosy
Research , 9 (4), 409–421. https://doi.org/10.56499/jppres20.979_9.4 .409
Nur, S., Mubarak, F., Jannah, C., Winarni, D. A., Rahman, D. A., Hamdayani, L. A., & Sami,  F.  J.  (2019).  Total  phenolic  and flavonoid  compounds,  antioxidant  and toxicity profile of extract and fractions of paku  atai  tuber  (Angiopteris  ferox Copel). Food  Research , 3 (6),  734–740.
Ramadhani, et al.
https://doi.org/10.26656/fr.2017.3(6).135
Rahmi, N., Salim, R., Miyono, M., & Rizki, M.
I.  (2021).  Pengaruh  Jenis  Pelarut  Dan Metode  Ekstraksi  Terhadap  Aktivitas Antibakteri  Dan  Penghambatan  Radikal Bebas  Ekstrak  Kulit  Kayu  Bangkal (Nauclea subdita). Jurnal Penelitian Hasil Hutan , 39 (1), 13–26. https://doi.org/10.20886/jphh.2021.39.1.1
3-26
Sembiring,  E.  N.,  Elya,  B.,  &  Sauriasari,  R.
(2018).  Phytochemical  screening,  total flavonoid and total phenolic content and antioxidant  activity  of  different  parts  of Caesalpinia bonduc (L.) Roxb. Pharmacognosy  Journal , 10 (1),  123–127. https://doi.org/10.5530/pj.2018.1.22
Wijaya,  L.,  Ehrich,  I.  N.,  Fachrial,  E.,  &
Girsang,  E.  (2020). Scavenge  ABTS  and
Inhibition of Elastase Enzyme Activity from
Ethanol  Extract  of  Pineapple  (  Annas cosmusus ( L .) Merr ) Core . 106–113.
Wiliantari, S., Iswandana, R., & Elya, B. (2022).
Total  Polyphenols,  Total  Flavonoids, Antioxidant  Activity  and  Inhibition  of Tyrosinase  Enzymes  from  Extract  and Fraction  of  Passiflora  ligularis  Juss. Pharmacognosy  Journal , 14 (3),  660–671. https://doi.org/10.5530/pj.2022.14.86
Zhao, C. N., Zhang, J. J., Li, Y., Meng, X., & Li, H.  Bin.  (2018).  Microwave-assisted extraction  of  phenolic  compounds  from melastoma sanguineum fruit: Optimization and identification. Molecules , 23 (10).
https://doi.org/10.3390/molecules231024
98