## EKSTRAKSI DAN KARAKTERISASI INHIBITOR KATEPSIN DARI IKAN BANDENG

## Extraction and Characterization of Cathepsin Inhibitor from Milkfish
Tati Nurhayati*, Ruddy Suwandi, Syefri Rusyadi Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga, Jalan Agatis, Telepon. (0251) 8622909-8622906, Faks.
(0251) 8622907, Bogor-Jawa Barat 16680. *Korespondensi: nurhayati7870@yahoo.com Diterima 10 Februari 2015/Disetujui 13 April 2015

## Abstrak
Enzim proteolitik terdistribusi di semua jenis organisme termasuk ikan. Sistein protease merupakan kelompok  terbesar  dan  termasuk  katepsin  lisosom  yang  terbukti  dapat  menyebabkan  pelunakan  dan degradasi protein miofibrillar. Aktivitas protease diatur dengan inhibitor endogen. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan optimasi ekstraksi inhibitor katepsin dari kulit, otot, dan jeroan ikan bandeng, untuk memurnikan secara parsial inhibitor katepsin dari sumber yang dipilih, dan untuk mempelajari karakteristik inhibitor katepsin. Inhibitor katepsin dapat diekstrak dengan baik dari daging ikan bandeng dan dimurnikan secara  parsial  menggunakan  ammonium  sulfat  70%.  Karakteristik  inhibitor  katepsin  memiliki  suhu optimum 40°C dan pH optimum 8.  Ion-ion logam menurunkan aktivitas inihibitor protease kecuali ion logam Mn 2+ dan Na + 1 mM.
Kata kunci: Inhibitor protease, katepsin, karakterisasi, purifikasi parsial
Abstract
Proteolytic enzyme is distributed acros all organism including fish. Cysteine proteases are the largest group of proteolytic enzyme. Lysosomal cathepsin, one of cysteine protease enzyme, cause softening and degradation  of  myofibril  protein    and  it’s  activity  is  regulated  by  endogenous  inhibitors.  The  purposes of this study were to optimize the extraction cathepsin inhibitors from the skin, muscles, and viscera of fish, to partially purify the cathepsin inhibitors of selected sources, and to study the characteristics of the cathepsin inhibitor. The cathepsin inhibitor could be extracted from muscle fish and partially purified using ammonium sulfate of 70%. The purified cathepsin inhibitor had optimum temperature at 40°C and the optimum at pH 8. Metal ions decreased the activity of the protease inhibitor, except 1 mM of metal ion Mn 2+ and Na + .
Keywords: Cathepsin, characterization, partial purification, protease inhibitor

## PENDAHULUAN
Proses  penurunan  mutu  ikan  segar terutama diawali dengan proses perombakan oleh  aktivitas  enzim  yang  secara  alami terdapat  di  dalam  ikan.    Salah  satu  jenis enzim  yang  berperan  penting  dalam  proses kemunduran mutu ikan adalah enzim-enzim pengurai  protein  (enzim  proteolitik)  yang menguraikan protein menjadi pepton, peptida dan asam-asam amino. Hidrolisis protein oleh suatu protease misalnya katepsin, kalpain dan
kolagenase  dapat  menyebabkan  timbulnya akumulasi metabolit, perubahan citarasa, dan pelunakan  tekstur,  terbentuknya  komponen volatil serta peningkatan jumlah bakteri yang akhirnya menimbulkan kebusukan. Aktivitas proteolitik menyebabkan perubahan  fungsional  dan  sifat  organoleptik dari  daging  ikan.  Katepsin  merupakan kelompok  dari  sistein  protease  diantaranya katepsin  B  dan  L  yang  dapat  menyebabkan terjadinya  pelunakan  daging  ( softening )
pada  ikan  (Ladrat et  al. 2006).    Katepsin  L ditemukan  pada  sebagian  besar  proteinase termasuk  penyebab  degradasi  protein miofibril  pada  surimi  ikan pacific  whitening . Penambahan inhibitor protease seperti sistein pada  surimi  dapat  mengurangi  penurunan kekuatan  gel  melalui  penghambatan  sistein protease endogenous (Morrissey et al. 1995). Interaksi  antara  sistein  protease  dan inhibitornya  telah  menjadi  tujuan  beberapa penelitian  pada  dua  dekade  ini.  Inhibitor spesifik dari sistein protease sangat dibutuhkan untuk  mencegah  terjadinya  proteolitik  yang destruktif  dan  juga  dapat  dimanfaatkan pada  proses  terapi  dan  pada  berbagai  bahan penelitian.  Pengertian  yang  mendalam  pada interaksi  sistein  proteinase  dan  inhibitornya dapat  memberikan  informasi  penting untuk  mengkontrol  aktivitas  proteolitik (Hultman  2003).  Inhibitor  sistein  proteinase yang  secara  luas  tersebar  pada  jaringan hewan  dan  cairan  tubuh,  merupakan  suatu molekul protein yang terdiri dari 100 sampai 120  deret  asam  amino  dengan  adanya jembatan  disulfida  dan  residu  karbohidrat (Otto dan Schirmeister 1997).
Inhibitor protease pada ikan diperkirakan dapat  melakukan  perlindungan  dari mikrooganisme  dan  proses  embriogenesis pada  regulasi  pertumbuhan  awal  embrio. Inhibitor  seperti  sistein  juga  dapat  berperan sebagai  pertahanan  melawan  protease  virus yang  dibutuhkan  untuk  replikasi  virus (Ustadi et al. 2005). Inhibitor protease alami telah  berhasil  dipurifikasi  seperti  sistatin yang  dipurifikasi  dari  telur  ikan glassfish (Ustadi et al. 2005), cairan ovarian ikan nila, telur ikan salmon, kulit ikan atlantik salmon dan  ikan  cod  (Olonen  2004),  plasma  ikan chum salmon (Li et al. 2008), dan purifikasi inhibitor  tripsin  dari  telur  ikan  skipjack cakalang (Choi et al. 2002). Ikan  bandeng  ( Chanos  chanos ,  Forskal) seperti  halnya  mahluk  hidup  lainnya merupakan sumber enzim dan inhibitor alami yang dapat berada dalam sel (intraseluler) dan melekat pada membran atau berada di luar sel
(ekstraseluler). Permintaan yang kuat terhadap inhibitor protease alami yang dapat digunakan untuk  mencegah  proses  kemunduran  pada daging  ikan  dan  produk  berbasis  surimi (Ustadi et al. 2005). Beberapa inhibitor protease telah  dicoba  ditambahkan  ke  dalam  daging ikan untuk menjelaskan peranan enzim pada proses  pelunakan  daging  saat  post  mortem. Kubota et  al. (2001)  menyatakan  bahwa EDTA, pengkelat ion logam dan phenantroline (inhibitor  spesifik  metalloprotease)  dapat menekan  terjadinya  pelunakan  daging  ikan flounder.  Penelitian  ini  bertujuan  optimasi ekstraksi  PI  dari  kulit,  otot,  dan  jeroan  ikan bandeng,  untuk  memurnikan  secara  parsial inhibitor  katepsin  dari  sumber  yang  dipilih, dan untuk mempelajari karakteristik inhibitor katepsin.

## BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan pada  penelitian  adalah  ikan  bandeng ( Chanos  chanos ,  Forskal).  Ikan  bandeng dibawa dalam keadaan hidup ke laboratorium dan dipreparasi untuk diambil bagian daging, kulit,  dan  jeroan.  Bahan-bahan  kimia  yang digunakan  untuk  ekstraksi  dan  analisis adalah  tris  base  (Applichem),  asam  sitrat (Applichem), ammonium sulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ), sodium fosfat (Merck), sodium azida (Merck), 2-merkaptoetanol  (Sigma),  asam  trikloro asetat  (TCA)  (Merck),  tirosin  (Applichem), folin (Merck), hemoglobin (Sigma), commasive brilliant blue R-250 (Sigma), bovine serum  albumin  (BSA)  (Applichem).  Logam- logam  yang  digunakan  untuk  karakterisasi enzim  yaitu  CaCl 2 NaCl,  MnCl 2 dan  COCl 2 dari Merck. Inhibitor komersial, yaitu PMSF, EDTA dan pepstatin. Bahan untuk purifikasi digunakan  DEAE  sephadex  A-50  dan sephadex-G100 (pharmacia). Penentuan berat molekul digunakan SDS poliakrilamida (SDS- PAGE), prestained  protein  marker dengan berat  molekul  175-7  kDa  (NE  Biolabs)  yang terdiri  dari  MBP  (maltose-binding  protein) -β-galactosidase (175 kDa), MBP-paramyosin
(80 kDa), MBP-CBD ( chitin binding domain )
(58  kDa),  CBD-Mxe  Intein-2CBD  (46  kDa), CBD-Mxe Intein (30 kDa), CBD-BmFKBP13 (25  kDa), lysozyme (17  kDa),  aprotinin
(7  kDa).  Alat  utama  yang  digunakan  adalah spektrofotometer  uv-vis  (Yamato),  sentrifus dingin  (Sorvall),  inkubator  (thermoline), mikropipet (Axygen), dan elektroforesis.
METODE PENELITIAN Ekstraksi Inhibitor Katepsin (An et al. 1995 yang dimodifikasi)
Ekstraksi  inhibitor  katepsin  dilakukan pada  bagian  kulit,  jeroan,  dan  daging  ikan. Sampel  sebanyak  100  g  dihomogenasi dengan 100 mL akuades dingin (dibawah  4 o C),  selanjutnya  disentrifugasi dingin  pada  kecepatan  5.000  x  g  selama  30 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan buffer McIlvaine’s pH 5,5 (dibuat dari 0,2 M sodium fosfat dan 0,1 M asam sitrat) dengan volume yang sama dengan supernatan.
Campuran  diinkubasi  selama  10  menit pada  suhu  60,  70,  dan  80 o C,  selanjutnya disentrifugasi  kembali  pada  kecepatan 7.000x  g  selama  15  menit.  Supernatan  yang diperoleh merupakan ekstrak kasar inhibitor katepsin.  Aktivitas  inhibitor  katepsin  diukur menggunakan  katepsin  yang  diekstrak  dari daging ikan bandeng sebagai substrat. Enzim katepsin  diekstrak  menggunakan  metode Dinu et  al. (2002).  Konsentrasi  protein ditentukan dengan metode Bradford (1976).
Presipitasi Ekstrak Kasar Inhbitor Katepsin Menggunakan Ammonium Sulfat
(Ustadi et al . 2005)
Inhibitor  katepsin  ekstrak  kasar dipresipitasi  atau  diendapkan  menggunakan ammonium sulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) dengan tingkat kejenuhan  30%-80%  (w/v).  Pengendapan dilakukan  dengan  menambahkan  garam ammonium  sulfat  ke  dalam  supernatan (ekstrak  kasar  inhibitor  katepsin)  sedikit demi  sedikit.  Campuran  didiamkan  selama semalam  pada  suhu  sekitar  4 o C,  selanjutnya
disentrifugasi pada kecepatan 12.000xg selama 30 menit.  Hasil pengendapan, yaitu presipitat dilarutkan dalam buffer A (buffer McIlvaine’s pH 5,5 yang dibuat dari 0,2 M sodium fosfat dan 0,1 M asam sitrat).

## Karakterisasi Inhibitor Katepsin
Karakterisasi inhibitor katepsin dilakukan terhadap ekstrak kasar. Karakterisasi meliputi penentuan  suhu  optimum,  pH  optimum, stabilitas  panas  dan  pH,  serta  pengaruh  ion logam.

## Penentuan Suhu  dan pH Optimum Inhibitor Katepsin
Karakterisasi  ekstrak  inhibitor  atepsin dilakukan pada variasi suhu 10-70°C dengan interval  10 o C.  Karakterisasi  pH  dilakukan pada  berbagai  variasi  pH  yaitu  3-10  dengan pH  meter  merk  Thermo.  Aktivitas  inhibitor enzim  katepsin  kasar  diukur  berdasarkan metode Dinu et al. (2002).

## Stabilitas Suhu dan pH Inhibitor Katepsin
Stabilitas  suhu  ditentukan  dengan melakukan  preinkubasi  inhibitor  katepsin pada suhu 10-70°C selama 10 menit.  Stabilitas pH ditentukan dengan melakukan preinkubasi inhibitor  katepsin  pada  berbagai  pH  selama 10 menit pada suhu 37°C. Aktivitas inhibitor katepsin  kasar  diukur  berdasarkan  metode Dinu et al. (2002).
Pengaruh  Ion  Logam  terhadap  Inhibitor

## Katepsin
Pengaruh  ion  logam  terhadap  akvitas inhibitor  katepsin  ditentukan  dengan menambahkan  ion  logam  (Na + ,  Ca 2+ ,  Mn 2+ , Co 2+ ) ke dalam campuran reaksi untuk assay aktivitas  inhibitor  katepsin.  Konsentrasi inhibitor  katepsin  masing-masing  logam adalah  1  mM  and  5  mM.  Aktivitas  enzim katepsin  kasar  diukur  berdasarkan  metode Dinu et al. (2002).
Analisis  Aktivitas  Inhibitor  Katepsin (Dinu et al. 2002)
Uji  ini  ditentukan  dengan  mengukur
derajat  penghambatan  dari  aktivitas  enzim katepsin menggunakan substrat hemoglobin. Uji  ini  dimulai  dengan  mereaksikan  ekstrak inhibitor  0,1  mL  dengan  katepsin  0,1  mL selama  30  menit  pada  suhu  inkubasi  37°C. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL dari larutan substrat hemoglobin 2% (w/v) dan diinkubasi kembali pada 37°C selama 10 menit.  Reaksi dihentikan  dengan  penambahan  2  mL  TCA 5%  (w/v).  Campuran  disaring  dan  hasil reaksi    ditambah  dengan  1  mL  pereaksi folin,  kemudian  campuran  diukur  dengan spektrofotometer pada λ = 750 nm.
Pengukuran  ini  dilakukan  bersamaan dengan  pengukuran    larutan  blanko  dan larutan  standar  dengan  prosedur  yang  sama seperti  larutan  sampel  hanya  untuk  larutan blanko  larutan  campuran  enzim  digantikan dengan  enzim  digantikan  dengan  akuades dan untuk larutan standar larutan campuran enzim digantikan dengan tirosin. Bersamaan dengan  itu  juga  diperlukan    uji  aktivitas katepsin tanpa penambahan inhibitor dengan menggunakan  enzim  katepsin  sebanyak 0,1mL. Aktivitas inhibitor dihitung berdasarkan  perbedaan  aktivitas  enzim katepsin yang ditambah dengan inhibitor dan yang tanpa inhibitor.
Aktivitas  enzim  katepsin  dapat  dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan :

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi Proses Ekstraksi Inhibitor

## Katepsin
Optimasi  proses  ekstraksi  dilakukan untuk  mendapatkan  inhibitor  protease katepsin dengan aktivitas penghambatan yang tinggi. Tahap ini dilakukan ekstraksi inhibitor pada  tiga  bagian  ikan,  yaitu  pada  daging, kulit,  dan  jeroan  dengan  perlakuan  inkubasi ekstraksi  pada  suhu  60,  70,  dan  80 o C.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  aktivitas terbaik  diperoleh  pada  ekstrak  daging pada  waktu  suhu  inkubasi  ekstraksi  80 o C, sedangkan  untuk  ekstrak  dari  jeroan  tidak menunjukkan adanya aktivitas penghambatan protease  katepsin.  Hasil  penghambatan ekstrak inhibitor  ikan bandeng dapat dilihat pada Gambar 1.
Ekstrak inhibitor dari daging mempunyai aktivitas penghambatan tertinggi dibandingkan  dari  bagian  kulit  dan  jeroan, yaitu  87,84%.  Ekstrak  jeroan  menunjukkan aktivitas  inhibitor  yang  negatif,  hal  ini kemungkinan  besar  dalam  jeroan  masih banyak  mengandung  enzim  protease  lain yang aktif dan terekstrak sehingga kandungan inhibitor yang dihasilkan lebih sedikit bahkan tidak  mengandung  inhibitor,  atau  metode ekstraksi  ini  tidak  tepat  untuk  mengekstrak inhibitor katepsin dari jeroan ikan.
Ekstrak  inhibitor  dari  kulit  ikan  pada suhu  ekstraksi  80 o C  menunjukkan  aktivitas yang  cukup  tinggi,  yaitu  77,72%.  Hasil beberapa penelitian lain menunjukkan adanya inhibitor protease pada kulit, yaitu penelitian Ylonen et  al. (2002)  yang  melakukan pemurnian  inhibitor  dari  kulit  ikan  wolffish dan  atlantic  cod,  serta  penelitian  Olonen (2004), melakukan pemurnian inhibitor dari kulit ikan salmon. Kedua penelitian tersebut berhasil  memurnikan  inhibitor  protease berupa  kininogen  yang  termasuk  inhibitor sistein  protease.  Penelitian  Olonen et  al.
(2003),  juga  menemukan  inhibitor  sistein protease  tipe  baru  berupa  salarin  dari  ikan atlantic  salmon  ( Salmo  salar L.)  dan  ikan arctic charr ( Salvelimus alpinus ).
UA/mL = jumlah tirosin yang dihasilkan per ml enzim per menit
Persentase penghambatan =
P          = faktor pengenceran
T          = waktu inkubasi (10 menit) Satu unit inhibitor katepsin adalah jumlah inhibitor katepsin yang mampu menghambat aktivitas protease katepsin sebesar 50% pada kondisi pengujian.
Gambar  2  menunjukkan  bahwa  ekstrak inhibitor  dari  daging  mengandung  protein lebih  tinggi  dari  pada  ekstrak  inhibitor  dari kulit,  kecuali  pada  eksrak  inhibitor  jeroan ikan  bandeng.  Bandeng  merupakan  ikan herbivora  sehingga  jeroannya  masih  banyak pengotor  dari  sisa  makanan  yang  dapat terekstrak. Perlakuan inkubasi dari suhu 60 o C sampai  suhu  80 o C  selama  10  menit  dapat menurunkan konsentrasi protein. Sifat enzim dan protein yang mudah mengalami kerusakan (terdenaturasi) sehingga mengalami pengendapan.  Inhibitor  endogenous  dari kelas  inhibitor  protease  sistein  mempunyai sifat lebih tahan panas dibandingkan dengan enzim  dan  protein  lainnya,  sehingga  proses panas ini dapat memisahkan inhibitor dengan protein atau enzim lainnya.
Beberapa  inhibitor  protease  dapat stabil  setelah  perlakuan  panas  pada  suhu 95 o C  selama  15  menit,  contohnya  TIMPs
dan  sistatin  (Nagase  dan  Salvesen  2001). Inhibitor  sistein  proteinase  dari  hewan  dan mamalia  berupa  sistatin  dibagi  dalam  tiga kelompok yaitu stefin, sistatin dan kininogen, pada  umumnya  mempunyai  kestabilan  yang tinggi  terhadap  suhu  tinggi  (sampai  100 o C) (Otto dan Schirmeister 1997).
Hasil penelitian awal dari proses optimasi ekstraksi inhibitor terbaik digunakan sebagai acuan  untuk  tahap  penelitian  selanjutnya, yaitu  produksi  inhibitor  protease  katepsin dengan ekstraksi dari bagian daging ikan pada suhu ekstraksi 80 o C. Penelitian An et al. (1995) menemukan adanya inhibitor yang berikatan kompleks  dengan  katepsin  L  pada  daging ikan pacific whitening dan berhasil melakukan pemisahan katepsin dengan inhibitor melalui perlakuan  asam,  sedangkan  penelitian Ustadi et  al. (2005)  berhasil  melakukan pemurnian  inhibitor  dari  telur  ikan glassfish pada perlakuan suhu 80 o C pada saat ekstraksi.
Gambar  1  Persen (%) penghambatan aktivitas katepsin (A) dan konsentrasi protein  ekstrak (B) inhibitor ikan bandeng ( ) suhu 60 o C, ( ) suhu 70 o C, ( ) suhu 80 o C. (A) %P en gha m ba ta n Perlakuan suhu ekstraksi (B) Ko ns en tr as i p ro te in (m g/mL) Perlakuan suhu ekstraksi
Produksi dan Pemurnian  Parsial Inhibitor Katepsin
Proses  pemurnian  yang  dilakukan dalam  penelitian  ini  ada  beberapa  tahapan yang meliputi ekstraksi daging ikan bandeng sebagai  ekstrak  kasar  inhibitor,  presipitasi inhibitor protease menggunakan ammonium sulfat.

## Ekstraksi Inhibitor Katepsin
Inhibitor  katepsin  diekstrak  dari  daging ikan  bandeng  dengan  perlakuan  ekstraksi 80 o C.  Setelah  diperoleh  ekstrak  kasar kemudian  dilakukan  pengendapan  dengan ammonium  sulfat  dengan  persen  kejenuhan 30%  sampai  80%  pada  suhu  dibawah
4 o C.  Tujuannya  untuk  memisahkan  dan memurnikan inhibitor protease dari protein- protein lain yang terdapat pada ekstrak kasar inhibitor  sehingga  diharapkan  inhibitor tersebut akan mempunyai aktivitas yang lebih tinggi  dibandingkan  ekstrak  kasar.  Aktivitas penghambatan  inhibitor  dari  ekstrak  ikan bandeng  terhadap  protease  katepsin  dan konsentrasi  protein  setelah  mengalami pengendapan  dengan  ammonium  sulfat disajikan pada Gambar 2. Hasil pengendapan dengan  aktivitas  penghambatan  tertinggi digunakan untuk tahap dialisis.
Berdasarkan  Gambar  2  dapat  dilihat adanya  peningkatan  aktivitas  penghambatan
inhibitor hasil endapan (pelet) pada beberapa tingkat  konsentrasi  ammonium  sulfat. Aktivitas  persen  penghambatan  optimum terdapat  pada  hasil  endapan  dengan konsentrasi ammonium sulfat 70%.
Hasil  presipitasi  pada  kedua  ekstrak inhibitor  menyebabkan  penurunan  kadar protein  dalam  supernatan,  sedangkan  pada hasil  endapan  (pelet)  terjadi  peningkatan konsentrasi  protein.  Hasil  presipitasi  yang mempunyai  aktivitas  persen  penghambatan paling  tinggi  digunakan  untuk  pemurnian tahap selanjutnya.  Hasil pengendapan dengan konsentrasi  ammonium  sulfat  70%  bagian pelet  merupakan  ekstrak  terpilih  untuk dilakukan proses dialisis.
Berdasarkan  Gambar  2  dapat  dilihat adanya  peningkatan  aktivitas  penghambatan inhibitor hasil endapan (pelet) pada beberapa tingkat  konsentrasi  ammonium  sulfat. Aktivitas  persen  penghambatan  optimum terdapat  pada  hasil  endapan  dengan konsentrasi ammonium sulfat 70%.
Hasil  presipitasi  pada  kedua  ekstrak inhibitor  menyebabkan  penurunan  kadar protein  dalam  supernatan,  sedangkan  pada hasil  endapan  (pelet)  terjadi  peningkatan konsentrasi  protein.  Hasil  presipitasi  yang mempunyai  aktivitas  persen  penghambatan paling  tinggi  digunakan  untuk  pemurnian tahap selanjutnya.
Gambar  2  Persentase  (%)  aktivitas  penghambatan  inhibitor  katepsin  ikan  bandeng  setelah pengendapan ammonium sulfat —■— endapan, — ▲ — supernatan Ko ns en tr as i p ro te in (m g/mL)
Konsentrasi ammonium sulfat (%)

## Karakterisasi Inhibitor Katepsin
Faktor-faktor utama yang mempengaruhi aktivitas  enzim  adalah  konsentrasi  enzim, substrat,  produk,  senyawa  inhibitor  dan aktivator,  pH,  jenis  pelarut  yang  terdapat pada  lingkungan,  kekuatan  ion,  dan  suhu (Suhartono  1989).  Tujuan  karakterisasi inhibitor  katepsin  ini  untuk  mengetahui kondisi optimum dari kerja inhibitor enzim. Karakterisasi  dilakukan  pada  ekstrak  kasar inhibitor ikan bandeng. Karakterisasi meliputi penentuan  suhu  dan  pH  optimum,  stabilitas panas  dan  pH,  juga  karakterisasi  untuk mengetahui  pengaruh  beberapa  ion  logam terhadap ekstrak inhibitor katepsin.

## Suhu Optimum
Inhibitor  protease  katepsin  memiliki aktivitas  maksimum  pada  suhu  tertentu. Aktivitasnya akan meningkat seiring dengan peningkatan  suhu  sehingga  mencapai  suhu optimum.  Kenaikan  suhu  yang  lebih  lanjut akan  menyebabkan  aktivitas  menurun.  Suhu optimum  inhibitor  katepsin,  yaitu  40 o C (Gambar 3).
Ekstrak inhibitor protease katepsin masih mempunyai aktivitas yang cukup tinggi sampai suhu  70 o C.  Pada  saat  suhu  dinaikkan,  maka akan  menyebabkan  peningkatan  aktivitas inhibitor  hinggga  mencapai  maksimum dan  jika  dilanjutkan  terus  naik  maka  akan menyebabkan  penurunan  aktivitas  inhibitor dengan pola yang berbeda pada setiap bentuk inhibitor.  Inhibitor  proteinase  sistein  dapat
bersifat  termostabil  atau  stabil  pada  suhu tinggi karena adanya asam amino hidrofobik, jembatan  disulfida,  dan  intensitas  interaksi elektrostatik.  Rantai  samping  dari  asam amino yang bersifat elektrostatik (bermuatan) misalnya  asam  aspartat,  asam  glutamat,  dan arginin  menyebabkan  struktur  enzim  dan inhibitor protease lebih kaku sehingga sangat tahan  terhadap  perubahan  suhu  yang  cukup tinggi. Suhu mempengaruhi laju reaksi katalisis inhibitor  enzim  dengan  dua  cara.  Pertama, kenaikan  suhu  akan  meningkatkan  laju reaksi inhibitor enzim sampai batas tertentu. Peningkatan  suhu  yang  berlebih  akan berpengaruh terhadap perubahan konformasi substrat  (enzim)  sehingga  sisi  aktif  substrat (enzim)  mengalami  hambatan  untuk memasuki  sisi  aktif  inhibitor  enzim,  dan dapat menurunkan aktivitas inhibitor enzim. Kedua,  peningkatan  energi  termal  molekul yang    membentuk  struktur  protein  inhibitor enzim itu sendiri akan menyebabkan rusaknya interaksi nonkovalen seperti ikatan hidrogen, ikatan  van  der  walls,  ikatan  hidrofobik,  dan interaksi elektrostatik yang menjaga struktur tiga dimensi inhibitor enzim secara bersama- sama,  sehingga  inhibitor  enzim  mengalami denaturasi. Denaturasi protein menyebabkan struktur  lipatan  inhibitor  enzim  membuka pada  bagian  permukaannya  sehingga  sisi aktif  inhibitor  enzim  berubah  dan  sebagai akibatnya  akan  terjadi  penurunan  aktivitas inhibitor enzim (Hames dan Hoper 2000).
Suhu ( o C) % P en gha m ba ta n
Gambar 3  Persentase (%) penghambatan inhibitor protease ekstrak kasar ikan bandeng pada suhu 10-70 o C. ( □ ) inhibitor bandeng, ( ■ ) inhibitor patin

## pH Optimum
Semua reaksi enzim dipengaruhi oleh pH medium  tempat  reaksi  terjadi.  Setiap  enzim memiliki  pH  optimum  yang  khas,  yaitu  pH yang menyebabkan aktivitas maksimal. Profil aktivitas  pH  enzim  menggambarkan  pH pada saat pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada pada tingkat ionisasi yang diinginkan. Namun pada pH  tertentu  (ekstrim)  dapat  menyebabkan enzim  terdenaturasi  yang  menyebabkan enzim  kehilangan  aktivitas  biologisnya (Lehninger 1993).
Inhibitor  katepsin  yang  merupakan protein  mengikuti  sifat-sifat  protein  yang mempunyai  konstanta  disosiasi  pada  gugus asam  maupun  basa  terutama  pada  gugus residu  terminal  karboksil  dan  terminal aminonya.  Perubahan  aktivitas  inhibitor protease dapat terjadi akibat adanya perubahan ionisasi pada gugus ionik inhibitor pada sisi aktifnya  maupun  sisi  lain  yang  secara  tidak langsung  mempengaruhi  sisi  aktif.  Gugus ionik  berperan  dalam  menjaga  konformasi sisi  aktif  dalam  mengikat  substrat  (enzim) (Nurhayati  2006).  Gugus  fungsional  pada sisi  aktif  yang  dapat  terionisasi,  memegang peranan  penting  pada  suatu  reaksi  katalis enzim. Reaksi pengikatan dan pelepasan ion hidrogen pada gugus fugsional tersebut dapat dianggap sebagai reaksi antara enzim dengan suatu ligan secara umum (logam, asam, atau molekul lain) (Suhartono 1989).
Gambar  4  menunjukkan  bahwa  pH optimum  inhibitor  protease  katepsin  dalam bentuk  ekstrak  kasar  maupun  setelah pengendapan  dengan  ammonium  sulfat adalah 8. Ekstrak inhibitor dari ikan bandeng maupun  ikan  patin  juga  mempunyai  pH optimum  yang  sama,  berada  pada  kisaran pH 7-9.  Kisaran pH ini menunjukkan bahwa ekstrak inhibitor katepsin termasuk inhibitor protease alkalin atau bersifat basa. Penelitian yang lain menunjukkan bahwa inhibitor protease seperti sistatin mempunyai aktivitas  penghambatan  pada  kisaran  pH alkalin.  Ustadi et  al. (2005)  menunjukkan ekstrak  inhibitor  protease  dari  telur  ikan glassfish mempunyai  aktivitas  yang  tinggi pada kisaran pH 7-9 dan optimum pada pH 8.  Penelitian  oleh  Li et  al. (2008)  inhibitor sistein protease dari plasma ikan chum salmon menunjukkan aktivitas pada pH 6,0 -9,0 dan optimum pada pH 7,0.
Pengaruh  Ion  Logam  terhadap  Aktivitas Inhibitor
Aktivator  dan  inhibitor  secara  kimiawi tidak  dapat  dibedakan,  namun  dapat dibedakan  setelah  berinteraksi  dengan enzim.  Aktivator  berikatan  dengan  enzim dan  menyebabkan  kenaikan  kecepatan reaksi  enzim,  sedangkan  inhibitor  berikatan dengan enzim dan menyebabkan penurunan kecepatan reaksi (Suhartono 1989). Beberapa ion  logam  mempengaruhi  aktivitas  enzim
Gambar 4 Persentase (%) penghambatan inhibitor protease ikan bandeng pada pH 3-10
%P en gha m ba ta n pH
maupun  inhibitor  yang  merupakan  protein. Ion logam ini ada yang membantu pengikatan antara  enzim  dengan  substrat,  ada  yang berikatan  dengan  enzim  secara  langsung sehingga  konformasi  aktif  enzim  menjadi stabil,  dan  ada  yang  berikatan  dengan inhibitor  enzim  sehingga  mempengaruhi kerja  inhibitor  menghambat  enzim.  Gambar 5  memperlihatkan  pengaruh  ion  logam terhadap aktivitas inhibitor katepsin.
Ion  logam  Mn 2+ dengan  konsentrasi 1  mM  dan  5  mM  dapat  meningkatkan aktivitas  penghambatan  inhibitor,  ion  logam Na + 1  mM  sedikit  menaikkan  aktivitas penghambatan, namun menurunkan aktivitas pada  konsentrasi  5  mM,  sedangkan  Ca 2+ dan  Co 2+ sedikit  menurunkan  aktivitas inhibitor  baik  yang  konsentrasi  1  mM maupun  5  mM.  Berdasarkan  penelitian Choi et al. (2002), ion logam Ca 2+ menaikkan aktivitas  penghambatan  relatif  inhibitor tripsin  dari  ekstrak  telur  ikan  cakalang.  Ion logam  Ca 2+ dapat  menghubungkan  antara enzim  dan  inhibitor.  Kemungkinan  yang lain  yaitu  Ca 2+ membatasi  enzim  sehingga menyebabkan modifikasi struktur  yang dapat menaikkan  pembentukan  kompleks  enzim dengan inhibitor (Choi et al. 2002). Inhibitor  bandeng  terjadi  sebaliknya yaitu  Ca 2+ sedikit  menurunkan  aktivitas
inhibitor. Adanya perbedaan sisi aktif antara inhibitor  tripsin  dengan  inhibitor  katepsin yang termasuk jenis inhibitor sistein protease, sehingga  mekanisme  interaksi  ion  logam termasuk  Ca
2+ dengan  inhibitor  dan  enzim berbeda. Beberapa enzim dan inhibitor memerlukan  ion-ion  tertentu  untuk menjaga  kestabilan  aktivitasnya.  Ion-ion tersebut  dapat  bertindak  sebagai  inhibitor pada  konsentrasi  tertentu,  tetapi  dapat  juga menjadi  aktivator  pada  konsentrasi  yang berbeda. Ion logam dapat membentuk suatu kompleks  dengan  substrat  dan  sisi  aktif enzim  sehingga  menggabungkan  keduanya dalam bentuk aktif. Ion logam juga berfungsi sebagai  senyawa  penarik  kuat  elektron pada  tahap  tertentu  dalam  siklus  katalitik (Lehninger 1993).

## KESIMPULAN
Inhibitor  katepsin  bisa  diekstrak  dari daging dan kulit ikan bandeng dengan aktivitas tertinggi pada daging ikan.  Inhibitor katepsin dapat  dimurnikan  secara  parsial  dengan ammonium  sulfat  40%.    Inhibitor  katepsin tersebut  memiliki  suhu  dan  pH  optimum yaitu 40°C dan 8.  Ion-ion logam menurunkan aktivitas inihibitor protease kecuali ion logam Mn 2+ dan Na + 1 mM.
Gambar  5  Pengaruh  beberapa  jenis  logam  terhadap  aktivitas  penghambatan  ekstrak  ikan bandeng ( □ ) 1 mM, ( ) 5 mM.
Kontrol
Ca 2+ Mn 2+
Co 2+ N + %P en gha m ba ta n Ion logam

## DAFTAR PUSTAKA
Aehle W. 2004. Enzyme in Industry : Production and  Application.  Weinheim,  German  : WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. An H, Peters MY, Seymour TA, Morissey MT.
1995. Isolation and activation of chatepsin L-inhibitor  complex  from  pacific  whiting ( Merluccius productus ). Journal Agriculture Food Chemistry 43:327-330 Aoki T. Yamashita T. Ueno R. 2000. Distribution of  cathepsins  in  red  and  white  muscles among fish species. Journal Fisheries Science
66(4):776-782.
APB  [Amersham  Pharmacia  Biotech].  2001.
Affinity  Chromatography:  Principle  and methods.  Tokyo:  Amersham  Pharmacia Biotech AB.
Ashie  INA,  Smith  JP,  Simpson  BK.  1996.
Mechanisms  for  controlling  enzymatic reactions in foods. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition 36(1&2), 1-30.
Bradford  MM.  1967.  A  rapid  and  sensitive method  for  quantification  of  microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochemistry 72:234-254.
Cao  MJ,  Osatomi  K,  Matsuda  R,  Ohkubo M.  2000.  Purification  of  a  novel  serine proteinase  inhibitor  from  the  skeletal muscle  of  white  croaker  ( Argyrosomus argentatus ). Journal  Biochem  and  Biophys Res Com 272:485-489.
Carreno FLG, Cortes PH. 2000.  Use of protease inhibitors  in  seafood  products.    Dalam: Haard  NF,  Simpson  BK,  editor.    Seafood Enzymes  :  Utilization  and  Influence  on Postharvest  Seafood  Quality.    New  York: Marcel Dekker, Inc. hlm 531-547. Choi  JH,  Park  PJ,  Kim  SK.  2002.  Purification and characterization of a trypsin inhibitor from the egg of skipjack tuna Katsuwonus pelamis . Fisheries Science 68:1367-1373.
Creighton  T.  1997.  Proteins  :  Structures  and Molecular  Properties  2 nd Ed.  New  York:
WH Freeman and Co.
Davidson.  2001. SDS-PAGE Method.  Davidson
: Departement of Biology. http://www.bio. davidson.edu/COURSES/GENOMICS/ method/SDSPAGE/SDSPAGE.html [16 Juli 2008].
Dinu  D,  Dumitru  IF,  Nechifor  MT.  2002. Isolation  and  characterization  of  two chatepsin from muscle of Carassius auratus gibelio. Roum. Biotecnol. Lett 7(3):753 : 758. Dubey VK,  Pande  M, Singh BK, Jagannadham MV. 2007. Papain-like proteases: Applications  of  their  inhibitors. African
Journal of Biotechnology 9(6):1077-1086.
Haard NF. 2000.  Seafood enzymes: the role of adaptation  and  aother  intraspesific  factor. Dalam:  Haard  NF,  Simpson  BK,  editor. Seafood Enzymes : Utilization and Influence on Postharvest Seafood Quality.  New York: Marcel Dekker, Inc. hlm 531-547.
Hames  BD,  Hooper  NM.  2000.  Biochemistry: The  Instant  Notes.  2nd  editioin. Hongkong:Spinger-Verlag.
Han Y, Yu H, Yang X, Rees HH, Liu J, Lai R. 2008.
A serine proteinase inhibitor from frog eggs with  bacteriostatic  activity. Journal  Comp Biochem and Physi , Part B 149:58–62. Hultmann  L.  2003.  Endogenous  proteolitic enzymes:  Studies  of  their  impact  on  fish muscle  protein  and  texture.  [thesis]. Faculty of Natural science and Technology. Norwegia.
Ismail A, Poernomo A, Sunyoto P, Wedjatmiko, Dharmadi,  Budiman RAI. 1994. Pedoman Teknis  Usaha  Pembesaran  Ikan  Bandeng di  Indonesia.  Seri  Pengembangan  Hasil Penelitian  No.  26/1993 .  Jakarta:  Badan Litbang Pertanian.
Kolodziejska I,  Sikorski ZE. 1996. Neutral and alkaline  muscle  proteases  of  marine  fish and invertebrates - A review. Journal of Food Biochemistry 20:349-363.
Kubota M, Kinoshita M, Kubota S, Yamashita M, Toyohara  H,  Sakaguchi  M.  2001.  Possible implication  of  metalloproteinases  in  post- mortem  tenderization  of  fish  muscle. Fisheries Science 67(5):965-968. Ladrat  DC,  Cheret  R,  Taylor  R,  Bagnis  VV.
2006.  Trends  in  postmortem  aging  in fish:  understanding  of  proteolysis  and disorganization  of  the  myofibrillar structure. Critical  Review  in  Food  Science and Nutrition 46(5):409-421.
Lehninger AL.  1993.
Dasar-Dasar Biokimia . Jilid
1.  M. Thenawidjaja, penerjemah.  Jakarta: Erlangga.  Terjemahan  dari:  Principle  of Biochemistry.
Li  DK,  Lin  H,  Kim  SM.  2008.  Purification and  Characterization  of  a  Inhibitor sistein  protease  from  Chum  Salmon ( Oncorhynchus  keta )  Plasma. Journal
Agriculture Food Chemistry 56:106–111.
Morrissey  MT,  Hartley  PS,  An  H.  1995. Proteolysis  in  pacific  whiting  and  effect of  surimi  processing. Journal  Aquaculture
Food Product Technology 4(4):5-18. Muchtadi  D,  Palupi  NS,  Astawan  M.  1992.
Enzim dalam Industri Pangan . Bogor : PAU Bioteknologi, IPB.
Mudjiman  A.  1991. Budidaya  Bandeng  di Tambak .  Jakarta: Penebar Swadaya. Nagase  H,  Salvesen  GS.  2001.  Finding, purification and characterization of natural protease inhibitor. Dalam Beynon R, Bond JS, editor. Proteolitic Enzymes : A Practical Approach.  Ed  ke-2.  New  York:    Oxford university press. hlm 131-147.
Nurhayati T. 2006. Pemilahan dan karakterisasi inhibitor  protease  dari  bakteri  yang berasosiasi  dengan  spons  asal  perairan pulau  panggang,  kepulauan  seribu [disertasi].  Bogor  :  Sekolah  Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor. Oliviera  AS,  Xavier-Filho.  Sales  MP.  2003. Cysteine proteinase and sistatins. An Inter. Journal  Brazilian  Archieve  of  Biology  and Technology 46(1):91-104.
Olonen A.  2004.  High molecular weight sistein proteinase  inhibitors  in  Atlantic  Salmon and  other  fish  species  [dissertation].
Helsinki:  Protein  Chemistry  Laboratory and  Department  of  Biological  and Environmental  Sciences.    Faculty  of Biosciences.  University of Helsinki. Olonen A. Kalkinen N. Paulin L. 2003. A new
type  of  cysteine  proteinase  inhibitor  : the  salarin  gene  from  Atlantic  salmon ( Salmo  salar L.)  and  Arctic  charr
( Salvelimus  alpinus ). Biochimistry 85:677-
681.
Otto HH, Schirmeister T. 1997. Sistein proteases and  their  inhibitors. Chemistry Rev. 97(1):133-172 Rachmansyah, Tonnek S, Usman. 1997.  Produksi ikan  bandeng  super  dalam  karamba jaring apung di laut. Dipresentasikan pada Seminar  Regional  Hasil-Hasil  Penelitian
Berbasis  Perikanan,  Peternakan  dan Sistem-Sistem  Usaha  Tani  Di  Kawasan Timur Indonesia, Naibonat-Kupang, 28−30 Juli 1997.  hlm 22. Rao MB, Tanksale AM, Ghatgate MS, Deshpande VV. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microb. Mol.
Biol Revw. 62 : 1092-2172. Rosenberg  IM.  1996.  Protein  analysis  and
Purification : Benchtop technique. Boston: Birkhauser.
Salvesen  GS,  Nagase  H.  2001.  Inhibition  of proteolytic  enzymes.  Dalam  Beynon  R, Bond  JS,  editor.  Proteolitic  Enzymes:  A Practical  Approach.  Ed  ke-2.  New  York: Oxford university press. hlm 105-129.
Shahidi  F.    1994.    Seafoods  proteins  and preparation  of  protein  concentrates. Dalam: Shahidi F, Botta RJ, editor.  Seafoods: Chemistry,  Processing  Technology  and
Quality.    London:  Blackie  Academic  &
Professional.
Soeseno  S.    1988. Budidaya  Ikan  dan  Udang dalam  Tambak .    Edisi  kedua.    Jakarta:
Gramedia. Suhartono  MT.  1989. Enzim  dan  Bioteknologi . Bogor : PAU Bioteknologi IPB.
Suhartono  MT.  1992. Protease .  Bogor  :  PAU
Bioteknologi IPB.
Ustadi, Kim KY, Kim SM. 2005. Purification and Identification of a Protease Inhibitor from Glassfish ( Liparis  tanakai )  Eggs. Journal Agriculture Food Chemistry 53 : 7667-7672. Westermeier  R.  2005.  Electrophoresis  in Practice, Fourth edition. Freiburg : WILEY-
VCH Verlag GmbH & Co.KGaA Wijaya  R.  2005.  Karakteristik  Enzim  serupa Tripsin dari Cacing Tanah. [Tesis]. Bogor : Sekolah Pascasarjana, IPB. Ylonen A, Helin J, Bogwald J, Jaakola J. Rinne A,  Kalkinen  N.  2002.  Purification  and characterization  of  novel  kininogen  from spotted  wolfish  and  atlantic  cod. Europe Journal Biochemistry 269:2639-2646.