J. Islamic Pharm. [ISSN: 2527-6123]
Analisis in Silico Senyawa Fitokimia dari Fraksi n -Heksana Daun Semanggi ( Marsilea crenata Presl.) sebagai Agen Neuroprotektif
Burhan Ma’arif 1* , Ricky Arie Jatmiko 1 , Dewi Sinta Megawati 1 , Rahmi Annisa 1 , Hajar Sugihantoro 1 , M. Artabah Muchlisin 2 , Hening Laswati 3 , Mangestuti Agil 4
1 Jurusan Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang, Malang, Indonesia
2 Jurusan Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Malang, Malang, Indonesia
3 Departemen Kedokteran Fisik dan Rehabilitasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
4 Departemen Farmakognosi dan Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia *E-mail: burhan.maarif@farmasi.uin-malang.ac.id

## ABSTRACT
Estrogen  deficiency  causes  various  health  problems  in  postmenopausal  women,  including  neurodegenerative  disease. Phytoestrogens  emerged  as  a  group  of  compounds  that  can  replace  the  estrogen  function  in  the  body,  and  prevent  the neurodegenerative disease to occur. Semanggi (Marsilea crenata Presl.) is a typical plant in Surabaya, Indonesia, that contain phytoestrogens. The aim of this research was to determine the metabolite profile of n-hexane fraction of Semanggi leaves using UPLC-QToF-MS/MS,  and  then  to  predict  the  neuroprotective  activity  of  compounds  with  in  silico  study  using  PyRX  0.8 software. The 100 ppm of n-hexane fraction of Semanggi leaves in DCM and methanol were injected 5 µl each into the UPLC- QToF-MS/MS,  and  then  analyzed  by  Masslynx  4.1  software  to  determine  the  compounds.  The  compounds  from  metabolite profiling then prepared with SwissADME webtool and Avogadro 1.90.0 software, molecular docking was done using Autodock Vina and Biovia Discovery Studio Visualizer 2016 to 3OLS protein. Metabolite profiling process shows a total of 34 predictable compounds  and  28  unknown  compounds.  From  in  silico  study, it  shows  a  total  of  7  compounds  that  are  predicted  to  have activities similar to estrogen. This result indicate that n-hexane fraction of Semanggi leaves has potential as a neuroprotective agent for treatment for postmenopausal women who experience estrogen deficiency.
Keywords: Marsilea crenata Presl., phytoestrogens, metabolite profiling, in silico, neuroprotective

## ABSTRAK
Defisiensi  estrogen  menyebabkan  berbagai  masalah  kesehatan  pada  perempuan  pascamenopause,  salah  satunya  adalah neurodegeneratif.  Fitoestrogen  merupakan  golongan  senyawa  yang  dapat  menggantikan  fungsi  estrogen  dalam  tubuh  dan mencegah terjadinya neurodegeneratif. Semanggi ( Marsilea crenata Presl.) yang termasuk sebagai tanaman khas di Surabaya, Indonesia,  diketahui  mengandung  fitoestrogen.  Penelitian  ini  bertujuan  menentukan  profil  metabolit  fraksi n -heksana  daun Semanggi menggunakan UPLC-QToF-MS/MS, dan memprediksi aktivitas neuroprotektif senyawa hasil metabolite profiling dengan studi in  silico menggunakan perangkat lunak PyRX 0.8. Sejumlah 100 ppm  fraksi n -heksana daun Semanggi dalam DCM dan metanol disuntikkan masing-masing 5 μl ke dalam UPLC-QToF-MS/MS, dan kemudian dianalisis dengan perangkat lunak  Masslynx  4.1  untuk  menentukan  jenis  senyawa  yang  terkandung.  Senyawa  hasil metabolite  profiling kemudian  di preparasi  dan  di  seleksi  menggunakan webtool SwissADME  dan  perangkat  lunak  Avogadro  1.90.0,  sedangkan molecular docking dilakukan menggunakan Autodock Vina dan Biovia Discovery Studio Visualizer 2016 terhadap protein 3OLS. Hasil metabolite  profiling menunjukkan  sejumlah  34 predictable  compounds dan  28 unknown  compounds .  Studi in  silico menunjukkan 7 senyawa yang diprediksi memiliki aktivitas yang mirip dengan estrogen. Hasil tersebut menunjukkan bahwa fraksi n -heksana  daun  Semanggi  berpotensi  sebagai  agen  neuroprotektif  sebagai  terapi  bagi  wanita  pascamenopause  yang mengalami defisiensi estrogen.
Kata kunci: Marsilea crenata Presl., fitoestrogen, metabolite profiling , in silico , neuroprotektif

## 1. Pendahuluan
Pascamenopause merupakan tahapan biologis yang terjadi sebagai  bagian  dari  proses  penuaan  pada  wanita  dan berdampak pada terjadinya defisiensi estrogen [1]. Perempuan pascamenopause  seringkali  mengalami  berbagai  masalah kesehatan  akibat  defisiensi  estrogen,  salah  satunya  adalah penurunan fungsi kognitif akibat neurodegeneratif [2,3].
Fitoestrogen  merupakan  sumber  pengobatan  alternatif untuk  defisiensi  estrogen.  Fitoestrogen  dapat  menggantikan fungsi estrogen didalam tubuh  baik dalam  ikatannya dengan reseptor  estrogen  ( ER-dependent )  maupun  tidak  ( ER- independent ), sehingga merupakan alternatif pengobatan bagi neuroodegeneratif  pada  wanita  pascamenopause  yang potensial [4-6].
Semanggi  ( Marsilea  crenata Presl.)  yang  terkenal  di Surabaya  Jawa  Timur  sebagai  makanan  khas  diketahui memiliki  kandungan  fitoestrogen.  Aktivitas  ekstrak  etanol 96% dan fraksi n -heksana daun Semanggi akibat kandungan fitoestrogen  didalamnya  telah  dibuktikan  dari  berbagai penelitian  [7-12].  Meskipun  memiliki  potensi  besar  sebagai tanaman  obat,  kandungan  senyawa  dalam  daun  Semanggi belum sepenuhnya diketahui.
Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengidentifikasi  profil metabolit dari fraksi n -heksana daun Semanggi menggunakan metode metabolite profiling dengan ultra performance liquid chromatography  –  quadropole  time  of  flight  –  mass spectrometry (UPLC-QToF-MS/MS),  dan  memprediksi aktivitas neuroprotektif dari senyawa yang terkandung secara in silico terhadap reseptor estrogen-β (ERβ). ERβ digunakan sebagai  objek molecular  docking karena  efek  neuroprotektif yang  diamati  adalah  melalui  mekanisme  antineuroinflamasi, dimana sel mikroglia yang bertanggungjawab terhadap proses tersebut  regulasinya  sangat  dipengaruhi  oleh  ikatan  antara estrogen dan ERβ [13,14].
UPLC-QToF-MS/MS merupakan teknik yang sangat baik dalam identifikasi profil metabolit dengan resolusi kromatografi  yang  tinggi,  lebih  cepat,  lebih  sensitif, menghemat  waktu,  dan  juga  lebih  hemat  pelarut  [15]. Sedangkan  melalui  pendekatan in  silico ,  prediksi  sederhana terkait aktivitas senyawa dapat dibuat dengan mengkorelasikan struktur dan sifat fisikokimia menggunakan analisis perangkat lunak terhadap reseptor yang dituju [16,17].
Penelitian  Semanggi  secara  berkelanjutan  bermanfaat dalam dunia kefarmasian terutama pengembangan fitofarmaka  neuroprotektif,  juga  bermanfaat  dalam  upaya pelestarian  kekayaan etno-cultural masyarakat  Surabaya, dimana saat ini Semanggi sangat jarang ditemukan.

## 2. Bahan dan Metode Penelitian

## 2.1 Bahan

## Bahan Tanaman
Daun Semanggi didapatkan dari daerah Benowo, Surabaya, Indonesia pada Mei 2019, dan kemudian diidentifikasi di UPT Materia  Medika,  Batu,  Indonesia  pada  Juni  2019  dengan nomor  spesimen  1a-17b-18a-1.  Daun  Semanggi  dipreparasi sehingga didapatkan serbuk daun berwarna hijau.

## Bahan Kimia
Pelarut etanol 96% (Merck), n -heksana (Merck), acetonitril (Merck), asam formiat (Merck), asam sulfat (Merck), dan plat HPTLC silika gel 60 F254 (CAMAG).

## 2.2 Metode

## Ekstraksi dan fraksinasi
Serbuk  daun  Semanggi  ditimbang  sebanyak  440  g  lalu dicampur  dengan  etanol  96%  dalam  erlenmeyer,  untuk kemudian  diekstraksi  metode ultrasonik  assisted  extraction (UAE).  Ekstrak  etanol  96%  daun  Semanggi  kemudian disuspensikan dengan aquadestilata dengan perbandingan 1:1. Suspensi  kemudian  di  fraksinasi  dengan  pelarut n -heksana metode ekstraksi cair-cair menggunakan corong pisah. Fase n - heksana  kemudian  dipisahkan  dan  diuapkan  menggunakan rotary  evaporator  Heidolph  Hei-VAP  ML/G3  untuk mendapatkan fraksi n -heksana.

## Metabolite profiling
Proses  identifikasi  senyawa  dilakukan  di  Laboratorium Forensik  Pusat  Badan  Reserse  Kriminal  Kepolisian  Negara Republik  Indonesia.  Fraksi n- heksana  daun  Semanggi  100 ppm sebanyak 5 μl disuntikan  kedalam  ACQUITY UPLC® H-Class  System  (Waters,  USA)  dengan  detektor  MS  Xevo G2-S  QToF  (Waters,  USA).  Sampel  dipisahkan  pada  kolom ACQUITY BEH C18 (1.7 μm 2.1x50 mm) dengan fase gerak asetonitril  +  0,05%  asam  formiat  dan  air  +  0,05%  asam, dengan  flowrate 0,2  ml /  menit. Hasil analisis UPLC-QToF- MS/MS diproses menggunakan software Masslynx Versi 4.1 untuk mendapatkan data kromatogram dan spektrum m/z dari setiap peak yang  terdeteksi.  Senyawa  yang  terdeteksi, kemudian di cek pada ChemSpider database .

## Molecular docking
Struktur reseptor ERβ yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh  dari Protein  Data  Bank (http://www.rcsb.org) dengan  kode  3OLS  [16].  Persiapan  awal  dilakukan  untuk memisahkan ligan internal (17β-estradiol) dari protein 3OLS menggunakan  Biovia  Discovery  Studio  Visualizer  2016.
Senyawa  hasil metabolite  profiling fraksi n -heksana  daun Semanggi  dipreparasi  dengan  Alat  Web  SwissADME  untuk memprediksi  sifat  fisikokimia  [18].  Senyawa  tersebut kemudian di seleksi dengan menggunakan metode BOILED- Egg, apabila memenuhi kriteria dapat menembus blood brain barrier (BBB)  maka  akan  digunakan  sebagai  senyawa  uji molecular  docking [19].  Ligan  internal  dan  senyawa  uji kemudian disiapkan dengan Avogrado 1.90.0 untuk optimasi energi. Molecular docking dilakukan menggunakan Pyrx 0.8 dengan  Autodock  Vina  untuk  simulasi  proses docking [20]. Visualisasi  kompleks  reseptor-ligan  diamati  menggunakan Biovia Discovery Studio Visualizer 2016.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1 Metabolite profiling
Sejumlah  70  g  ekstrak  etanol  96%  daun  Semanggi didapatkan dari proses ekstraksi dengan metode UAE. Ekstrak ini  kemudian  di  fraksinasi  lebih  lanjut  untuk  mendapatkan fraksi n -heksana sebanyak 11,9032 g. Fraksi n -heksana dipilih karena  pada  penelitian  sebelumnya,  fraksi n -heksana diketahui  memiliki  khasiat  dikarenakan  adanya  kandungan fitoestrogennya  [11,12].  Hasil metabolite  profiling fraksi n - heksana  daun  Semanggi  dengan  UPLC-QToF-MS/MS  pada pelarut  metanol  dan  DCM  yang  berupa total  ion chromatogram (TIC) dapat dilihat pada Gambar 1, sedangkan nilai retention  time (Rt),  %  area,  m/z,  rumus  molekul,  dan nama senyawa dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2.
Gambar 1 . Total ion chromatogram (TIC) fraksi n -heksana daun semanggi pada pelarut: (A) Metanol, dan (B) DCM.

## Tabel 1
Prediksi senyawa yang terkandung dalam fraksi n -heksana daun semanggi dengan pelarut metanol
No Rt (menit) % Area m/z Rumus Molekul Nama Senyawa 1 1.192 0.6870 103.0992 C 5 H 13 NO Valinol 2 1.571 0.0054 235.1423 C 10 H 21 NO 5 [({[1-(5-Methyl-1,3-oxazolidin-3-yl)-2- propanyl]oxy}methoxy)methoxy]methanol 3 2.150 0.0083 191.1915 Unknown Unknown 4 1.750 0.7642 302.1247 C 15 H 27 OBr 3-[(Z)-2-Bromovinyl]-2-tridecanone 5 4.332 0.4643 286.1336 C 15 H 23 O 3 Cl 6-Chloro-9,10-dimethyl-12- oxatricyclo[5.3.2.01,6]dodec-4-yl acetate 6 4.869 0.0287 268.1206 C 8 H 20 N 4 O 4 S 1-[2-(Carbamimidoylammonio)ethyl]piperidinium sulfate 7 5.628 0.8188 196.1100 C 11 H 16 O 3 2-Methyl-2-(3-oxobutyl)-1,3-cyclohexanedione 8 7.344 0.6447 264.0880 C 10 H 17 N 2 O 4 Cl N-(Chloroacetyl)leucylglycine 9 9.135 0.9524 180.1127 C 7 H 12 N 6 5-(2-Cyclohexylidenehydrazino)-2H-tetrazole 10 9.347 0.2919 827.4181 C 39 H 57 N 9 O 11 (2S,11E,15S,18S,21S,24S)-15-(2-Amino-2-
oxoethyl)-2-benzyl-24-carbamoyl-18-cyclohexyl-21- isopropyl-25-methyl-4,7,10,13,16,19,22-heptaoxo-
3,6,9,14,17,20,23-heptaazahexacos-11-en-1-oic acid
A B
11 9.610 0.0841 552.2933 C 29 H 44 O 10 (1R,2S,3R,4aR,5S,6R,8S,8aR)-8-Acetoxy-8a- (acetoxymethyl)-5-[(2S,3aR,6aS)- hexahydrofuro[2,3-b]furan-2-yl]-3-hydroxy-5,6- dimethyloctahydro-2H-spiro[naphthalene-1,2'- oxiran]-2-yl (2S)-2-methylbutanoate 12 9.852 0.9812 670.3174 C 29 H 46 N 6 O 12 N-Acetyl-L-α-aspartyl-L-α-aspartyl-L-isoleucyl-L- valyl-L-prolyl-L-alanine 13 10.010 0.3244 489.2860 C 12 H 31 N 19 O 3 Unknown 14 10.389 1.0747 285.1365 C 17 H 19 NO 3 Hydromorphone 15 10.568 0.2946 595.3035 C 28 H 45 N 5 O 7 S (2R)-N1-[(2S)-3-Cyclohexyl-1-({[(4- morpholinylsulfonyl)amino]methyl}amino)-1-oxo-2- propanyl]-N4-hydroxy-2-[3-(4- methylphenyl)propyl]succinamide 16 10.663 0.3210 508.2675 C 27 H 40 O 9 Ajugamarin E2 17 10.78 0.4605 467.3263 C 27 H 41 N 5 O 2 N-[3-(Diethylamino)propyl]-N'-[4-methyl-2-(4- methyl-1-piperidinyl)-6-quinolinyl]succinamide 18 10.905 2.1329 503.3061 C 3 H 29 N 29 O 2 Unknown 19 11.063 4.7056 693.3891 C 41 H 51 N 5 O 5 N-[(2S)-1-{[(2S,3R)-3-Hydroxy-4-{(2S,4R)-2-[(2- methyl-2-propanyl)carbamoyl]-4-phenoxy-1- piperidinyl}-1-phenyl-2-butanyl]amino}-3-methyl-1- oxo-2-butanyl]-2- 20 11.222 3.7288 517.3152 C 28 H 43 N 3 O 6 N-[(trans-4-{[(N-{[(2-Methyl-2- propanyl)oxy]carbonyl}-L- alloisoleucyl)amino]methyl}cyclohexyl)carbonyl]-L- phenylalanine 21 11.496 0.1386 508.2781 C 26 H 40 N 2 O 8 Dibutyl 4,19-dioxo-5,18-dioxa-3,20-diazadocosa- 10,12-diyne-1,22-dioate 22 11.696 1.9931 573.3256 C 17 H 39 N 19 O 2 S Unknown 23 11.801 0.6565 495.3602 C 18 H 45 N 11 O 5 Unknown 24 12.054 6.6303 495.3583 C 14 H 41 N 17 O 3 Unknown 25 12.233 3.1292 531.3408 C 27 H 49 NO 9 (3R,4S,6S,9R,11R,12R,13S,14R)-6-
{[(2S,3R,4S,6S)-4-(Dimethylamino)-3-hydroxy-6- methyltetrahydro-2H-pyran-2-yl]oxy}-14-ethyl- 4,12,13-trihydroxy-3,9,11,13- tetramethyloxacyclotetradecane-2,10-dione 26 12.338 3.3329 671.4105 C 32 H 57 N 5 O 10 Unknown 27 12.538 10.5293 495.3336 C 5 H 37 N 25 OS Unknown 28 12.950 5.1347 497.3729 C 29 H 47 N 5 O 2 2-Oxo-2-(1-piperazinyl)-N-(2- sulfamoylethyl)acetamide 29 13.034 3.0219 521.3493 C 28 H 48 N 5 O 2 Cl 1-(Diethylamino)-3-(4-{6-[(6-methoxy-4-methyl-8- quinolinyl)amino]hexyl}-1-piperazinyl)-2-propanol hydrochloride 30 13.255 2.3686 473.3722 C 26 H 51 NO 6 acetic acid;2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethyl (E)- octadec-9-enoate 31 13.613 17.0694 473.3728 C 27 H 47 N 5 O 2 (4S)-4-{[4-(Diethylamino)benzyl]amino}-N-(2- methoxyethyl)-1-(1-propyl-4-piperidinyl)-L- prolinamide 32 14.045 7.5191 499.3872 C 28 H 53 NO 6 Ethyl (3R)-3-(6-methoxy-2,2- dimethyltetrahydrofuro[2,3-d][1,3]dioxol-5-yl)-3- (pentadecylamino)propanoate 33 14.329 0.4782 523.3642 C 14 H 41 N 19 O 3 Unknown 34 14.562 0.5406 341.3278 Unknown Unknown 35 14.899 0.3358 304.2408 C 20 H 32 O 2 Methandriol 36 15.225 0.0889 698.5868 C 46 H 74 N 4 O Unknown 37 15.299 0.0221 698.5876 C 34 H 78 N 6 O 8 Unknown
38 15.499 0.2364 698.588 C 42 H 82 O 5 S Unknown 39 15.899 0.9784 698.5873 C 31 H 70 N 16 O 2 Unknown 40 16.099 0.4329 608.2669 C 24 H 36 N 10 O 9 [(3S,6S,12S,15S,19S,22S)-12-{3- [(Diaminomethylene)amino]propyl}-15-methyl- 5,8,11,14,17,21,23-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,20- heptaazatricyclo[17.3.1.13,22]tetracos-6-yl]acetic acid 41 16.278 0.1085 698.5894 C 43 H 78 N 4 OS Unknown 42 16.532 0.8647 608.2615 C 39 H 36 N 4 OS N-(1-{5-[(3-Methylbenzyl)sulfanyl]-4-(4- methylphenyl)-4H-1,2,4-triazol-3-yl}-2- phenylethyl)-2,2-diphenylacetamide 43 16.953 7.8715 592.2667 C 18 H 40 N 8 O 14 Unknown 44 17.09 0.8036 1087.627 8 C 52 H 85 N 11 O 14 L-Phenylalanyl-L-leucyl-L-lysyl-L-α-glutamyl-L- prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-α-glutamyl-L-valine 45 17.227 0.2080 698.5887 C 42 H 82 O 5 S Unknown 46 17.374 2.5841 592.2709 C 23 H 40 N 6 O 12 L-Threonyl-L-threonyl-L-leucyl-L-seryl-L-α- aspartylglycine 47 17.69 0.0186 698.5911 C 36 H 70 N 14 Unknown 48 17.827 3.5815 925.5775 C 50 H 79 N 5 O 11 Unknown 49 18.344 0.4206 1115.662 4 C 49 H 81 N 25 O 4 S Unknown 50 20.419 0.1283 191.155 Unknown Unknown

## Tabel 2
Prediksi senyawa yang terkandung dalam fraksi n -heksana daun semanggi dengan pelarut DCM
No Rt (menit) % Area m/z Rumus Molekul Nama Senyawa 1 1.078 0.2747 191.1621 Unknown Unknown 2 1.508 0.1622 123.0915 Unknown Unknown 3 8.693 0.3384 274.1654 C 13 H 24 NO 5 4-Methyl 3-(2-methyl-2-propanyl) (4R,5R)-2,2,5- trimethyl-1,3-oxazolidine-3,4-dicarboxylate 4 10.684 2.3712 287.2824 C 17 H 37 NO 2 2,2'-(Tridecylimino)diethanol 5 10.801 1.1165 241.2773 C 16 H 35 N Dioctylamine 6 12.001 0.2202 315.3144 Unknown Unknown 7 12.233 0.6880 315.3133 C 19 H 41 NO 2 2-Amino-3-(hexadecyloxy)-1-propanol 8 12.833 0.2309 436.254 C 19 H 40 N 4 O 3 S 2 Unknown 9 15.815 9.0406 387.3343 C 22 H 43 NO Erucamide 10 16.532 20.7510 735.6029 C 45 H 77 N 5 O 3 Unknown 11 17.290 64.7549 1097.7563 C 56 H 103 N 7 O 14 Unknown 12 22.347 0.0512 191.1554 Unknown Unknown Hasil metabolite  profiling menunjukkan  total  34 predictable  compounds dan  28 unknown  compounds ,  baik pada  pelarut  metanol  maupun  DCM.  Penggunaan  kedua pelarut ini bertujuan untuk mengelusi fraksi n -heksana secara optimal pada kolom UPLC-QToF-MS/MS. Tidak semua peak pada  TIC  yang  dapat  diidentifikasi  pada  proses metabolite profiling ,  hal  ini  dapat  terlihat  dengan  adanya unknown compounds sejumlah  28  buah. Unknown  compounds merupakan  senyawa  yang  tidak  dapat  teridentifikasi  oleh database , dapat berupa senyawa pengotor atau degradan yang masih terdeteksi oleh instrumen, atau mungkin senyawa baru yang  belum  ada  dalam database ,  terutama unknown compounds yang memiliki kadar tinggi [21].

## 3.2 Molecular docking
Molecular  docking menjadi  pendekatan  populer  untuk memprediksi  aktivitas  suatu  senyawa  dengan  biaya  murah serta  waktu  yang  relatif  cepat  [18].  Prediksi  aktivitas neuroprotektif  diawali  dengan  melakukan  skrining  awal terhadap senyawa hasil metabolite profiling fraksi n -heksana daun  Semanggi.  Syarat  yang  harus  dimiliki  oleh  senyawa untuk  memiliki  efek  neuroprotektif  adalah  mampu  melewati BBB  [22],  sehingga  skrining  awal  perlu  dilakukan  dengan pengamatan nilai topological polar surface area (TPSA) tiap senyawa, dimana senyawa yang memiliki nilai TPSA <70 Å 2 akan mampu menembus dan berefek pada BBB [23,24]. Salah
satu metode skrining tersebut dapat  dilakukan  menggunakan open source webtool SwissADME [23] (Gambar 2).
Senyawa  yang  telah  melewati  tahapan  skrining  serta memiliki  nilai  TPSA  <70  Å 2 dilanjutkan  dengan  optimasi geometri  struktur  untuk  menemukan  struktur  paling  stabil, yaitu  dengan  metode  MMFF  94  dalam  aplikasi  Avogadro
[24]. Molecular  docking kemudian  dilakukan  terhadap senyawa yang lolos seleksi menggunakan program PyRx 0.8 dan  AutoDock  Vina  sebagai docking  simulator .  Dari  hasil analisis  dengan  Biovia  Discovery  Studio  Visualizer  2016, ditemukan  bahwa  ada  7  senyawa  yang  diprediksi  sebagai agonis ERβ, seperti yang tercantum dalam Tabel 3 [25,26].
Gambar 2 . Analisis salah satu senyawa fraksi n -heksana daun Semanggi menggunakan Biovia Discovery Studio Visualizer 2016.

## Tabel 3
Senyawa dalam fraksi n -heksana daun semanggi yang agonis terhadap 17β-estradiol
No. Kodifikasi Senyawa Nama Senyawa Binding Affinity TPSA Asam Amino 1 MTL 12 Hydromorphone -8.8 49,77 His 475; Glu 305 2 MTL 15 N-[3-(Diethylamino)propyl]-N'-[4- methyl-2-(4-methyl-1-piperidinyl)-6- quinolinyl]succinamide -0.7 62,75 His 475; Glu 305 3 MTL 20 2-Ethyl-N-{[5-(4-ethyl-1-piperazinyl)-3- methyl-1-phenyl-1H-pyrazol-4- yl]methyl}-N-(3- methoxypropyl)hexanamide 7.5 53,84 His 475; Arg 346 4 MTL 25 17a-Methyl-5-androstene-3B,17B-diol. -5.9 40,46 His 475; Glu 305 5 DCM 2 2,2'-(Tridecylimino)diethanol -6.0 43,70 His 475; Glu 305 6 DCM 3 Dioctylamine -5.6 12,03 His 475; Glu 305; Arg 346 7 DCM 4 2-Amino-3-(hexadecyloxy)-1-propanol -5.8 55,48 His 475; Glu 305; Arg 346 Kontrol - 17β-estradiol -10,5 - His 475; Glu 305; Arg 346
ERβ hadir dalam beberapa jenis sel di otak, salah satunya adalah  sel  mikroglia.  Sel  mikroglia  bertanggung  jawab  atas proses  neuroinflamasi  yang  merupakan  salah  satu  penyebab
utama  neurodegeneratif.  Dalam  neuroinflamasi,  penurunan jumlah ikatan estrogen dan ERβ memicu peningkatan jumlah sel  mikroglia  yang  teraktivasi  dalam  jalur  M1 polarity ,  dan
menyebabkan peningkatan sitokin inflamasi seperti interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6),  tumor necrosis factor-α (TNF-α), dan nitric oxide (NO) di otak. Kejadian ini akan  mengurangi  fungsi  sinaptik  dan  plastisitas  neuron, sehingga  memicu  terjadinya  neurodegeneratif  [14].  Oleh karena  itu,  penambahan  fitoestrogen  sebagai  substituen estrogen akan memiliki efek neuroprotektif, dengan merubah aktivasi  sel  mikroglia  dari  M1 polarity yang  bersifat proinflamasi menjadi M2 polarity yang bersifat antiinflamasi [27].
Senyawa  dikatakan  sebagai  golongan  fitoestrogen  atau agonis  estrogen  (17β-estradiol)  apabila  senyawa  tersebut berikatan dengan  minimal dua asam amino His 475 dan Glu 305 dari tiga asam amino yang diikat oleh gugus farmakofor 17β-estradiol  pada  ERβ.  Nilai binding  affinity juga menunjukkan  kestabilan  senyawa  dalam  berikatan  dengan ERβ, semakin kecil nilai binding affinity , maka semakin stabil senyawa tersebut [26]. Dari Tabel 3, diketahui senyawa yang termasuk  dalam  fitoestrogen  dari  fraksi n -heksana  daun Semanggi  antara  lain  :  2,2'-(Tridecylimino)  diethanol; Dioctylamine; 2-Amino-3-(hexadecyloxy)-1-propanol; Hydromorphone;  N-[3-(Diethylamino)propyl]-N'-[4-methyl- 2-(4-methyl-1-piperidinyl)-6-quinolinyl]succinamide;
2-
Ethyl-N-{[5-(4-ethyl-1-piperazinyl)-3-methyl-1-phenyl-1H- pyrazol-4-yl]methyl}-N-(3-methoxypropyl)hexanamide; 17a- Methyl-5-androstene-3B,17B-diol.

## 4. Kesimpulan
Proses metabolite  profiling menunjukkan  sejumlah  34 predictable  compounds dan  28 unknown  compounds , sedangkan  studi in  silico menunjukkan  7  senyawa  yang diprediksi  memiliki  aktivitas  yang  mirip  dengan  estrogen. Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa  fraksi n -heksana  daun Semanggi  berpotensi  sebagai  agen  neuroprotektif  sebagai terapi  bagi  wanita  pascamenopause  yang  mengalami defisiensi estrogen.

## Penghargaan
Penelitian ini didanai oleh Bantuan Operasional Perguruan Tinggi  Negeri  (BOPTN)  Universitas  Islam  Negeri  Maulana Malik Ibrahim Malang.

## Daftar Pustaka
[1] Lee WL, Tsui KH, Seow KM, Cheng MH, Su WH, Chen CP, Wang  PH.  2013.  Hormone  Therapy  for  Postmenopausal Women-An  Unanswered  Issue. Gynecology  and  Minimally Invasive Therapy . 2(1): 13-17.
[2] Klempin  F,  dan  Kempermann  G.  2007.  Adult  Hippocampal Neurogenesis and Aging. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience . 257(5): 271-280.
[3] Dipiro  JT,  Robert  LT,  Gary  CY.  2008.  Pharmacotherapy  (A Pathophysiologic  Approach),  7th  Edition.  United  States: McGraw-Hill Companies Inc.
[4] Villiers  T.  2009.  Bone  Health  and  Osteoporosis  in Postmenopausal Women. Best Practice and Research: Clinical Obstetrics and Gynaecology . 23(1): 73-85.
[5] Yang TS, Wang SY, Yang YC, Su CH, Lee FK, Chen SC, Tseng CY,  Jou  HJ,  Huang  JP,  Huang  KE.  2012.  Effects  of Standardized  Phytoestrogen  on  Taiwanese  Menopausal Women. Taiwanese  Journal  of  Obstetrics  and  Gynecology . 51(2): 229-235.
[6] Cui  J,  Shen  Y,  Li  R.  2013.  Estrogen  Synthesis  and  Signaling Pathways  During  Aging:  from  Periphery  to  Brain. Trends  in Molecular Medicine . 19(3): 197-209.
[7] Laswati  H.  2011.  Green  Clover  Potentiates  Delaying  the Increment  of  Imbalance  Bone  Remodeling  Process  in Postmenopausal  Women. Folia  Medica  Indonesiana .  47(2): 112-117.
[8] Nurjanah,  Azka  A,  Abdullah  A.  2012.  Aktivitas  Antioksidan dan  Komponen  Bioaktif  Semanggi  Air  ( Marsilea  crenata ).
Jurnal Inovasi dan Kewirausahaan . 1(3): 152-158.
[9] Ma’arif  B,  Agil  M,  Laswati  H.  2016.  Phytochemical Assessment  on  n-Hexane  Extract  and  Fractions  of Marsilea crenata Presl.  Leaves  Through  GC-MS. Traditional  Medicine Journal . 21(2): 77-85.
[10] Ma’arif B, Agil M, Laswati H. 2020. The Enhancement of Arg1 and Activated ERβ Expression in Microglia HMC3 by Induction of  96%  Ethanol  Extract  of Marsilea  crenata Presl.  Leaves. Journal of  Basic and  Clinical  Physiology  and  Pharmacology . 30(6): 1-7.
[11] Ma’arif  B,  Agil  M,  Laswati  H.  2018.  Alkaline  Phosphatase Activity  of Marsilea  crenata Presl.  Extract  and  Fractions  as Marker of MC3T3-E1 Osteoblast Cell Differentiation. Journal of Applied Pharmaceutical Science . 8(3): 55-59.
[12] Agil M, Ma’arif B, Aemi NY. 2018. Aktivitas Antiosteoporosis Fraksi n -Heksana  Daun Marsilea  crenata Presl.  dalam Meningkatkan  Kepadatan  Tulang  Trabekular  Vertebra  Mencit Betina. Jurnal Tumbuhan Obat Indonesia . 11(2): 1-7.
[13] Au  A,  Feher  A,  McPhee  L,  Jessa  A,  Oh  S,  Einstein  G.  2016. Estrogens,  Inflammation  and  Cognition. Frontiers  in Neuroendocrinology . 40: 87-100.
[14] Engler-Chiurazzi EB, Brown CM, Povroznik JM, Simpkins JW. 2017. Estrogens as Neuroprotectants: Estrogenic Actions in the Context  of  Cognitive  Aging  and  Brain  Injury. Progress  in Neurobiology . 157: 188-211.
[15] Patil  VP,  Tathe  RD,  Devdhe  SJ,  Angadi  SS,  Kale  SH.  2011. Ultra  Performance  Liquid  Chromatography :  A  Review. International Research Journal of Pharmacy . 2(6): 39-44.
[16] Hardjono  S.  2013.  Sintesis  dan  Uji  Aktivitas  Antikanker
Senyawa 1-(2-Klorobenzoiloksi)urea dan 1-(4- Klorobenzoiloksi)urea. Berkala  Ilmiah  Kimia  Farmasi .  2(1): 16-21.
[17] Novikov  FN,  dan  Chilov  GG.  2009.  Molecular  Docking: Theoretical Background, Practical Applications and Perspectives. Mendeleev Communications . 19(5): 237-242.
[18] Muchtaridi  M,  Dermawan  D,  Yusuf  M.  2018.  Molecular Docking,  3D  Structure-Based  Pharmacophore  Modeling,  and ADME  Prediction  of  Alpha  Mangostin  and  Its  Derivatives against  Estrogen  Receptor  Alpha. Journal  of  Young Pharmacists . 10(3): 252-259.
[19] Sliwoski  GR,  Meiler  J,  Lowe  EW.  2014.  Computational Methods in Drug Discovery Prediction of Protein Structure and
Ensembles  from  Limited  Experimental  Data  View  Project Antibody  Modeling,  Antibody  Design  and  Antigen-Antibody Interactions  View  Project. Computational  Methods  in  Drug Discovery . 66(1): 334-395.
[20] Martin YC. 2005. A Bioavailability Score. Journal of Medicinal Chemistry . 48(9): 3164-3170.
[21] Ma'arif B, Mirza DM, Suryadinata A, Muchlisin MA, Agil M.
2019.  Metabolite  Profiling  of  96%  Ethanol  Extract  from Marsilea  crenata Presl.  Leaves  Using  UPLC-QToF-MS/MS and  Anti-Neuroinflammatory  Predicition  Activity  with Molecular  Docking. Journal  of  Tropical  Pharmacy  and Chemistry . 4(6): 261-270.
[22] Kelder  J,  Grootenhuis  DJP,  Bayada  DM,  Delbressine  PCL, Ploemen  JP.  1999.  Molecular  Surface  as  a  Dominating Determinant  for  Oral  Absorption  and  Brain  Penetration  of
Drugs. Pharmaceutical Research . 16(10): 1514-1519.
[23] Daina  A,  Michielin  O,  Zoete  V.  2017.  SwissADME:  A  Free Web  Tool  to  Evaluate  Pharmacokinetics,  Drug-Likeness  and Medicinal  Chemistry  Friendliness  of  Small  Molecules. Scientific Reports . 7: 1-13.
[24] Hanwell MD, Curtis DE, Lonie DC, Vandermeerschd T, Zurek E,  Hutchison  GR.  2012.  Avogadro:  An  Advanced  Semantic Chemical Editor, Visualization, and Analysis Platform. Journal of Cheminformatics . 4(1): 1-17.
[25] Trott  O,  dan  Olson  AJ.  2010.  Autodock  Vina:  Improving  the Speed and Accuracy of Docking with a New Scoring Function, Efficient  Optimization  and  Multithreading. J  Comput  Chem . 31(2): 455-461.
[26] Siswandono,  dan  Soekardjo  B.  1995.  Kimia  Medisinal. Surabaya: Airlangga University Press.
[27] Cui  L,  Zahedi  P,  Saraceno  J,  Bristow  R,  Jaffray  D,  Allen  C. 2013.  Neoplastic  Cell  Response  to  Tiopronin-Coated  Gold Nanoparticles. Nanomedicine:  Nanotechnology,  Biology,  and Medicine . 9(2): 264-273.