## ALCHEMY Journal of Chemistry

## Artikel Penelitian
Preparasi dan Karakterisasi Nanobiokatalis Mikroreaktor dengan Polimer Monolitik Nanopori Enzim Termobilisasi
Baiq Octaviana D. Anggraeny 1 , Septi F. Raeni 1 , Elvina D. Iftitah 1,2 , Akhmad Sabarudin 1,2*
1 Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
2 Kelompok Penelitian Advanced System and Material Technology, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
INFO ARTIKEL ABSTRAK Sejarah artikel: Revisi 27 Februari 2017 Diterima 20 Maret 2017 Tersedia online 03 Mei 2017 Nanobiocatalyst  microreactor  column  of  an  immobilized  trypsin  onto nanoporous monolithic polymer has been developed. In this work, a poly (glycidyl  methacrylate-co-ethylene  glycol  dimethacrylate)  (poly(GMA-co- EDMA)) monolih with total monomer %T 40 and cross-linker %C 25 was prepared as a nanoporous polymeric-support by in-situ copolymerization inside  the  microbore  silicosteel  tubing  (1.0  mm  i.d  x  100  mm).  This nanoporous  monolithic-support  was  chemically  modified  with  trypsin through  the  ring-opening  reaction  of  epoxide  group  to  form  a nanobiocatalyst  microreactor.  In  order  to  obtain  reliable  microreactor, some  parameters  such  as  immobilization  time  (amount  of  trypsin),  and effect  of  glutaraldehyde  activation  on  the  trypsin-immobilized  monolithic column  were  optimized.  The  pore  size  distribution,  morphology  and elemental  composition  of  the  monolith  were  studied  by  inverse  size exclusion  chromatography  (ISEC)  and  scanning  electron  microscopy (SEM-EDX),  respectively.  While  permeability  of  the  monolith  was obtained through  measurement  of  its  back  pressure  using  HPLC  pump. The monolith was predominated by mesoporous content (65.85%) while the flow-through pore was 28.20%. From SEM-EDX, it was found that the highest nitrogen content (12.40%), which indicates the amount of trypsin chemically  attached  on  the  monolitic  support,  was  found  in  the nanobiocatalyst  microreactor  with  immobilization  time  4h  without glutaraldehyde  as  activation  agent.  The  optimized  nanobiocatalyst microreactor  column  was  successfully  applied  to  a  rapid  and  efficient digestion of protein samples in the range of second to minute.
Keywords:  nanoporous  monolit,  immobilized  enzyme,  nanobiocatalyst microreactor, protein digestion
Pada  penelitian  ini  telah  dilakukan  pengembangan  pembuatan  kolom nanobiokatalis  mikroreaktor  yang  terimobilisasi  oleh  enzim  tripsin  pada polimer  monolitik  nanopori.  Polimer  monolitik  nanopori  dibuat  secara in- situ kopolimerisasi   dalam  kolom silicosteel (1.0 mm  i.d  x  100  mm)  dari monomer  GMA  dan  EDMA  sebagai crosslinker serta  penambahan porogen  dengan  komposisi  1-propanol/1,4-butanediol/air  (7:4:1)  dan inisiator  radikal  AIBN  1%.  Proses  polimerisasi  berlangsung  selama  12 jam  pada  suhu  60°C  dengan  persentase  total  monomer  %T  40  dan persentase crosslinker %C  25.  Monolit  dimodifikasi  secara  kimia menggunakan metode imobilisasi enzim melalui reaksi pembukaan cincin
*Penulis korespondensi Email: sabarjpn@ub.ac.id
epoksida  dari  polimer  monolit  terhadap  tripsin.  Beberapa  parameter  uji dilakukan  untuk  menghasilkan  mikroreaktor  pada  kondisi  optimum  yaitu variasi waktu imobilisasi dan pengaruh penambahan glutaraldehida pada kolom  tripsin  monolit.  Karakterisasi  yang  dilakukan  meliputi  uji  ISEC untuk  mengetahui  ukuran  dan  distribusi  pori  monolit,  SEM-EDX  untuk mengetahui  struktur morfologi  kolom mikroreaktor,  dan  uji  permeabilitas kolom  mikroreaktor.  Berdasarkan  hasil  ISEC  proporsi  mesopori  dan makropori ( flow-through pore ) seimbang yaitu 65,85% dan 28,20%.  Hasil SEM-EDX  menunjukkan  kandungan  nitrogen  tertinggi  yang  mewakili jumlah  tripsin  yang  terimobilisasi  dalam  monolit  sebesar  12,40% dihasilkan  dari  tripsin  monolit  dengan  waktu  imobilisasi  4  jam  tanpa penambahan  glutaraldehida.  Nanobiokatalis  mikroreaktor  pada  kondisi optimum dapat digunakan untuk proses digestion sampel protein secara cepat dan efisien.
Kata  kunci:  monolit  nanopori,  imobilisasi  enzim,  nanobiokatalis mikroreaktor, protein digestion

## 1. Pendahuluan
Di  bidang  proteomik,  mikroreaktor  merupakan alat yang digunakan untuk pemetaan peptida. Pada proses  ini  protein  diidentifikasi  melalui  identifikasi fragmen  peptida  yang  dihasilkan  setelah mengalami  proteolisis  (Stigter,  de  Jong  &  van Bennekom, 2007). Pembuatan mikroreaktor  masih perlu dikembangkan berkaitan dengan peningkatan kinerja mikroreaktor tersebut yaitu dengan adanya material  pendukung  ( solid  support  material ). Beberapa  jenis  material  pendukung  yang  dapat digunakan  adalah  membran, fiber , microchip , nanopartikel, silika, dan monolit. Beberapa peneliti telah  mengembangkan  material  pendukung berbasis  monolit  yang  disebut  monolitik mikroreaktor.  Penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh Tasfiyati,  Iftitah,  Sakti  &  Sabaruddin  (2016), membuat  monolit  mikroreaktor  dari  poli(GMA-co- EDMA) melalui modifikasi gugus aktif menggunakan  dietilamin  diaplikasikan  sebagai kolom  penukar  anion  lemah  untuk  pemisahan sampel DNA termetilasi.
Mikroreaktor nanobiokatalis merupakan mikroreaktor  yang  modifikasi  gugus  aktif  material pendukungnya  dilakukan  dengan  menambahkan senyawa  biomolekul  seperti  enzim.  Mikroreaktor nanobiokatalis  dapat  dibuat  melalui  beberapa metode  yang  diperlukan  untuk  meningkatkan kinerjanya. Salah satu metodenya yaitu  imobilisasi enzim  (Kim,  Kim,  Lopez-Ferrer,  Petritis,  &  Smith, 2010).  Metode  ini  dapat  berlangsung  secara adsorpsi, entrapment , ikatan  kovalen (covalent bonding) dan pengikat-silang (crosslinking) (Safdar, Sprob,  &  Janis,  2014).  Penggabungan  antara
kedua  jenis  pendekatan  yaitu  ikatan  kovalen dan pengikat-silang  disebut  dengan  pelapisan  enzim (enzyme  coating) .  Pendekatan  secara  pelapisan enzim  diharapkan  mampu  meningkatkan  jumlah enzim  dari  satu  lapisan (monolayer) menjadi beberapa  lapisan (multilayer) .  Keunggulan penggunaan  metode  ini  dapat  meningkatkan stabilitas  enzim,  meningkatkan  volume  spesifik enzim  yang  terikat  pada  material  pendukung (enzyme loading), dan bersifat reusable atau dapat digunakan kembali (Chen et al., 2011; Shangguan et  al.,  2015).  Imobilisasi  enzim  pada  suatu mikroreaktor  juga  memiliki  efisiensi  pemecahan (digestion) tinggi  dan  dapat  dengan  mudah dihubungkan  dengan  sistem  pemisahan  dan deteksi secara otomatis (Liang et al., 2011).
Protein  digestion merupakan  suatu  proses pemecahan  protein  menjadi  peptida-peptidanya. Proses  pemecahan  disebut  dengan  analisis proteomik.  Studi  mengenai  proteomik  berfokus pada  karakterisasi  biomolekul  yang  berbeda. Selain  itu,  studi  ini  juga  berkaitan  dengan  proses identifikasi  keseluruhan  protein  dalam  sel,  dan jaringan  (Liang  et  al.,  2011).  Pada  awal pengembangannya,  studi  mengenai protein digestion dilakukan  menggunakan  metode konvensional (offline) .  Pemisahan  berlangsung  di dalam suatu larutan campuran protein ( batch wise method )  yang  diinkubasi  dalam  waktu  24  jam. Pada  dasarnya,  metode  pemisahan  dalam  larutan masih  belum  efisien  terutama  dalam  aplikasinya untuk  penggunaan  rutin.  Seiring  dengan berkembangnya  ilmu  pengetahuan  metode tersebut  mulai  ditinggalkan  karena  dinilai  memiliki
kelemahan yaitu waktu digestion lama, autodigestion pada  enzim  tidak  dapat  dihindari, reproduksibilitas  rendah  dan  berlangsung  secara offline sehingga  distribusi  enzim  dalam  larutan tidak merata (Liang et al., 2011; Safdar et al., 2014). Hal  tersebut  sangat  berbanding  terbalik  dengan metode online  digestion ,  dimana  pada  metode tersebut  semua  prosesnya  berlangsung  secara online menggunakan  sistem  HPLC  dalam  sebuah kolom  mikroreaktor  sehingga  efisiensi  waktu pemisahan  meningkat  karena  hanya  berlangsung dalam hitungan menit.
Dalam penelitian ini akan dilakukan pembuatan mikroreaktor  nanobiokatalis  dengan  menggunakan polimer  monolitik  nanopori  (poly-(GMA-co-EDMA)) dalam kolom silicosteel secara in-situ kopolimerisasi antara monomer glycidyl methacrylate (GMA)  dan ethylene  glycol dimethacrylate (EDMA).  Inisiator  radikal  (AIBN) digunakan  dalam  proses  tersebut  dengan  adanya porogen 1-propanol/1,4-butanadiol/air. Selanjutnya, tripsin  diimobilisasi  ke  dalam  monolit.  Proses tersebut akan menghasilkan mikroreaktor nanobiokatalis  yang  dalam  penelitian  ini  disebut dengan trypsin  immobilized  monolit  microreactor (TIMM).  Sebagai  pembanding,  dilakukan  pula pembuatan mikroreaktor nanobiokatalis yang sama dan diaktivasi dengan penambahan  glutaraldehida sebagai  agen  pengikat-silang sehingga  disebut sebagai trypsin  immobilized  monolit  microreactor- glutaraldehyde (TIMM-G) .

## 2. Bahan dan metode

## 2.1. Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  glisidil metakrilat  (GMA)  97%,  etilen  dimetakrilat  (EDMA) 98%,  3-(Trimetoksisilil)propil  metakrilat  (MAPS) 98%,  1-propanol,  1,4-butanadiol  99%,  α,α’- azoisobutironitril (AIBN), tripsin, glutaraldehida 25%, dan  benzamidin  hidroklorida  >96%.  Bahan  lain yang  digunakan  yaitu  natrium  hidrogen  karbonat >99%,  natrium  karbonat,  amonium  bikarbonat >99%,  β-kasein,  sitokrom  C,  asetonitril  (ACN), etanol,  piridin,  NaOH,  HCl  dan  asam  trifloroasetat (TFA).  Adapun  kolom  yang  digunakan  adalah kolom silicosteel (panjang  10  cm,  diameter  luar 1/16 inci dan diameter dalam 1,0 mm).

## 2.2. Pembuatan TIMM dan TIMM-G
Tahap  pertama  dilakukan  pembuatan  monolit poli(GMA-co-EDMA)  dengan  %T  40  dan  %C    25
(Tasfiyati et al., 2016). Modifikasi monolit dilakukan dengan mengalirkan 10 mg/mL tripsin ditambahkan 0,005 M benzamidin hidroklorida dalam 0,1 M bufer karbonat  (pH  10,5)  pada  monolit  tersebut.  Variasi waktu imobilisasi dilakukan selama 2, 4 dan 6 jam. Tahap  kedua,  tripsin-monolit  (nanobiokatalis mikroreaktor) dicuci dengan mengalirkan 1 M NaCl dalam  0,1  M  bufer  karbonat  (pH  10,5).  Tahap selanjutnya,  dicuci  kembali  dengan  mengalirkan benzamidin  hidroklorida  dalam  0,1  M  bufer karbonat  (pH  10,5).  Kedua  tahapan  pencucian tersebut dilakukan selama 20 menit dengan laju alir 0,05  mL/menit  pada  suhu  ruang  dan  dilakukan penyimpanan pada suhu 4 ° C sebelum digunakan. Pembuatan  TIMM-G  dilakukan  dengan mengalirkan  gluteraldehida  5%  dalam  0,1  M ammonium  bikarbonat  (pH  8)  pada  suhu  ruang selama  2  jam.  Kemudian,  nanobiokatalis mikrorekator  dicuci  dengan  mengalirkan  etanol selama 1 jam dengan laju alir 0,05 mL/menit pada suhu ruang dan dilakukan penyimpanan pada 4°C sebelum digunakan.

## 2.4. Uji distribusi pori menggunakan metode ISEC
Penentuan distribusi pori monolit poli(GMA-co- EDMA)  dilakukan  dengan  metode  ISEC menggunakan  senyawa  toluen  dan  polistiren standar dengan berat molekul 5x10 2 – 2x10 6 g/mol. Fasa  gerak  yang  digunakan  adalah  THF  dengan panjang  gelombang  deteksi  254  nm.  Masing- masing  standar  diinjeksi  dengan  volum  2  µL,  laju alir  0,05  mL/menit  pada  suhu  ruang.  Analisis proporsi flow-through  pores,  mesopores ,  dan micropores dihitung  berdasarkan  metode  pada Persamaan  1  (Al-Bokari,  Cherrak,  &  Guiochon, 2002).
M w = 2,25 Ø n 1,7 (1)
Dimana M w adalah berat  molekul,  Ø  adalah diameter  pori  (Angstrom),  dan  n  adalah  bilangan bulat yang menyatakan  urutan ukuran pori (Ø n+1 > Ø n ) Volume yang berkorelasi dengan diameter pori dihitung  berdasarkan  selisih  dari  volume  retensi  2 berat  molekul  yang  berurutan,  sesuai  dengan Persamaan 2.
∆V n+1,n = V Rn+1 - V Rn (2)
V n menyatakan  fraksi  volume  dari  pori  yang mempunyai ukuran setara atau lebih besar dari Ø n . Distribusi  pori  dinyatakan  dalam  grafik  hubungan antara fraksi volume dan logaritma diameter pori.

## 2.5. Uji permeabilitas
Permeabilitas  monolit  diketahui  berdasarkan data  tekanan  balik  yang  terukur  ketika  fasa  gerak dialirkan dan dihitung menggunakan Persamaan 3 yaitu  persamaan  Darcy  dengan  konversi  satuan  1 Darcy = 9,9 x 10 -13 m 2 .
u ∆ p m ∆ p (3)
K  = Permeabilitas (m 2 )
= Viskositas fasa gerak (Pa.s)
L = Panjang kolom (cm)
∆P  = Tekanan balik (Pa) u = Laju linier fasa gerak (m/s)
F m = Laju alir fasa gerak (m 3 /s)
r = Jari-jari kolom (m)

## 2.6. Scanning electron microscopy (SEM-EDX)
Karakterisasi  morfologi  TIMM  dan  TIMM-G dilakukan  dengan  SEM  yang  dilengkapi  dengan EDX ( Energy Dispersive X-Ray Analysis ).

## 3. Hasil dan pembahasan
3.1. Pembuatan TIMM dan TIMM-G
Pada  penelitian  ini  monolit  poly-(GMA-co- EDMA)  dibuat  dalam  kolom silicosteel tersilanasi.
Proses  silanasi  dalam  kolom silicosteel dilakukan dengan  cara  menghidrolisis  kolom  menggunakan larutan yang bersifat asam (HCl) dan basa (NaOH). Penambahan MAPS bertujuan untuk memudahkan terbentuknya  ikatan  kovalen  antara  permukaan dinding bagian dalam dari kolom silicosteel dengan polimer.  Reaksi  silanasi  pada  permukaan  dinding dalam  kolom silicosteel yang  berlangsung  antara gugus silanol dengan gugus metoksi dari senyawa MAPS ditunjukkan pada Gambar 1 (Bystrom, 2009).
Gambar 1. Reaksi silanasi kolom silicosteel menggunakan MAPS
Monolit  polimer  dibuat  secara in  situ polimerisasi  dalam  kolom silicosteel melalui campuran monomer GMA, agen ikat silang EDMA, campuran  porogen  (1-propanol,  1,4-butanadiol, dan  air),  dan  inisiator  radikal  AIBN.  Dalam penelitian  ini,  rasio  %T  dan  %C  yang  digunakan yaitu 40% dan 25%.
Pemilihan  komposisi  monomer  dan  agen pengikat-silang  didasarkan  pada  penelitian  yang telah  dilakukan  oleh  Tasfiyati  et  al.  (2016) menggunakan  kondisi  optimum  poli(GMA-co- EDMA)  yang  diperoleh  pada  komposisi  tersebut. Polimerisasi berlangsung secara adisi polimerisasi ( chain  growth reaction ) antara dua monomer  yang berbeda  membentuk  rangkaian  kopolimer  yang acak.  Penggunaan  inisiator  dalam  proses kopolimerisasi  sangat  mempengaruhi  porositas monolit.  Inisiator  AIBN  akan  membentuk  radikal pada  suhu  40-80°C.  Pada  penelitian  ini polimerisasi  berlangsung  selama  12  jam  dengan suhu polimerisasi 60°C.
Modifikasi  terhadap  monolit  poli(GMA-co- EDMA) dilakukan dengan melalui reaksi imobilisasi dengan  enzim  tripsin  yang  ditambahkan  dengan benzamidin  hidroklorida.  Senyawa  tersebut digunakan untuk mengkondisikan tripsin agar tidak mengalami  denaturasi  dalam  kondisi  bebas  (suhu ruang).  Dalam  penelitian  ini,  dilakukan  3  variasi waktu imobilisasi tripsin terhadap monolit yaitu 2, 4, dan  6  jam.  Variasi  waktu  imobilisasi  dilakukan untuk mengetahui kolom tripsin monolit yang paling optimum  berdasarkan  pendekatan  terhadap banyaknya  tripsin  yang  terikat  pada  monolit. Selama  reaksi  imobilisasi  berlangsung  laju  alir yang  digunakan  adalah  0,05  mL/menit  dengan konsentrasi  tripsin  1000  ppm.  Pencucian  kolom menggunakan  larutan  NaCl  dalam  bufer  karbonat untuk menghilangkan sisa tripsin yang tidak terikat, dan  dibilas  menggunakan  larutan  benzamidin hidroklorida  dalam  bufer  karbonat  untuk  memblok residu epoksida (Monzo, Rejtar, & Guttman, 2009). Reaksi imobilisasi tripsin terjadi melalui pembukaan cincin epoksida dari monomer GMA.
Modifikasi  lain  dilakukan  dengan  penambahan glutaraldehida  5%  dengan  cara  mengalirkannya pada  laju  alir  0,05  mL/menit  selama  2  jam. Penambahan  glutaraldehida  akan  mempengaruhi pembentukan  lapisan  dari monolayer menjadi multilayer dari  tripsin  yang  terikat  secara  kovalen dengan  gugus  epoksida  pada  permukaan  monolit. Gambar  2  menunjukkan  ilustrasi  keseluruhan reaksi  selama  proses  polimerisasi  berlangsung
hingga  proses  aktivasi  dengan  glutaraldehida. Pencucian  dilakukan  dengan  mengalirkan  etanol untuk  menghilangkan  residu  glutaraldehida  yang tidak terikat.

## 3.2. Pengukuran distribusi pori dengan ISEC
( Inverse Size Exlusion Chromatography )
Pengukuran  distribusi  ukuran  pori  pada  fasa diam (kolom monolit) menggunakan  beberapa seri polimer  standar  atau probe  molecules dengan ukuran  hidrodinamik  molekular  yang  berbeda. Beberapa seri polimer standar tersebut diinjeksikan secara  cepat  ke  dalam  larutan  pengelusi. Perbedaan  waktu  elusi  akan  tercatat  dan  dapat dihitung  sebagai  fungsi  ukuran  pori  dan  volume pori (Berthold and Salmen, 1997).
Seri polimer yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  satu  set  polistiren  standar  dan  toluen. Pengujian  dengan  ISEC  dilakukan  dengan menginjeksikan  seri  polimer  tersebut  secara terpisah  dalam  kolom  dengan  menggunakan  fasa gerak  THF  pada  laju  alir  0,05  mL/menit.  Toluen sebagai  molekul  terkecil  yang  mampu  menembus keseluruhan  pori  monolit  akan  memberikan  waktu retensi  yang  paling  lama.  Waktu  retensi  akan semakin  kecil  seiring  dengan  semakin  besarnya berat  molekul  polistiren  standar  yang  diinjeksikan. Adapun volume retensi toluen diasumsikan sebagai volume  pori  total  kolom  monolit.  Total  porositas monolit  (e t )  diperoleh  0,65.  Nilai  tersebut  sesuai dengan fraksi porogen ( pore forming agent ) monolit poli(GMA-co-EDMA)  yang  telah  dihasilkan sebelumnya  yaitu  0,6.  Porositas  eksternal
diperoleh 0,24 dan porositas internal (e i ) diperoleh 0,41.  Berdasarkan  hasil  tersebut,  monolit  memiliki porositas  internal  yang  lebih  besar  dibandingkan dengan  porositas  eksternal  sehingga  karakter mesopori lebih dominan dimiliki oleh fasa diam.

## Tabel 1.
Data  distribusi  ukuran  pori  kolom  monolit  poli- (GMA-co-EDMA)
Tipe Pori Pori (%) Mikropori (< 2 nm) 5,950 Mesopori (2-50 nm) 65,85 Makropori (> 50 nm) 28,20
Berdasarkan  Tabel  1,  hampir  66%  pori  yang terbentuk  pada  monolit  merupakan  tipe  mesopori. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  luas  permukaan monolit yang besar sehingga interaksi antara fasa diam dengan analit berlangsung baik. Monolit yang didominasi  oleh  tipe  mesopori  akan  mampu memisahkan molekul dengan ukuran besar seperti senyawa-senyawa biomolekul. Dalam penelitian ini, tipe mesopori sangat diharapkan karena berfungsi untuk mengikat aktif molekul (enzim tripsin) dalam jumlah  yang  lebih  banyak.  Tipe  makropori  ( flow through  pores )  yang  berfungsi  untuk  terjadinya transfer  massa  secara  konvektif  memiliki  proporsi sebesar  28,20%.  Tipe  makropori  ini  hanya  dapat memisahkan  molekul  kecil  dengan  jumlah  yang memadai sedangkan tipe mikropori yang terbentuk sebanyak  5,950%.  Proporsi  ini  diharapkan keberadaannya  dengan  persentase  yang  sangat kecil  untuk  menekan  terjadinya  pelebaran  puncak
Gambar 2. Ilustrasi reaksi pembuatan TIMM dan TIMM-G
yang disebabkan oleh adanya absorpsi irreversible sehingga mengurangi efisiensi pemisahan.

## 3.3. Permeabilitas kolom
Permeabilitas  kolom  didefinisikan  sebagai tingkat  kemampuan  kolom  dalam  meloloskan sejumlah  partikel  (aliran  fasa  gerak)  yang menenembus  atau  melaluinya.  Fasa  gerak  yang digunakan dalam pengukuran permeabilitas kolom monolit  yaitu  etanol.  Fasa  gerak  tersebut  akan memberikan  nilai  tekanan  balik  yang  berbanding terbalik  dengan  permeabilitas  ketika  dialirkan melewati  kolom.  Permeabilitas  akan  meningkat seiring  dengan  penambahan  tingkat  porositas polimer monolit, dan tekanan balik yang dihasilkan rendah.  Hal  tersebut  menunjukkan  tingkat kemudahan  fasa  gerak  dalam  melewati  kolom monolit.
Permeabilitas kolom tripsin monolit poly-(GMA- co-EDMA)  diuji  pada  laju  alir  0,01-0,1  mL/menit hingga  diperoleh  nilai  peningkatan  tekanan  balik yang  konstan.  Data  nilai  tekanan  balik  tersebut dipilih  pada  laju  alir  0,05  mL/menit  disajikan  pada Tabel 2. Secara keseluruhan kolom tripsin monolit memberikan  nilai  tekanan  balik  rendah  yang menunjukkan  bahwa  permeabilitas  kolom  yang tinggi.
Kolom mikroreaktor yang diujikan menggunakan  laju  alir  0,01-0,1  mL/menit menunjukkan  kenaikan  tekanan  balik  secara  linier dengan  nilai  koefisien  korelasi  mendekati  1.  Nilai tersebut  menunjukkan  tingkat  kestabilan  mekanis kolom  mikroreaktor  yang  tinggi.  Meskipun  terjadi perubahan laju alir dari rendah ke tinggi, TIMM dan TIMM-G  tidak  mengalami  kompresi  yang  diikuti dengan peningkatan tekanan balik.

## Tabel 2.
Permeabilitas kolom TIMM dan TIMM-G
Kolom
Mikro- reaktor Waktu Imobilisasi (jam) Tekanan Balik (MPa) Permeabilitas (darcy) TIMM 2 0,5 0,235 4 0,7 0,168 6 0,6 0,196 TIMM-G 2 1,4 0,084 4 0,8 0,147 6 0,8 0,147
Berdasarkan  Tabel  2  dapat  diketahui  bahwa dengan  membandingkan  antara  TIMM  dengan TIMM-G pada variasi waktu imobilisasi 2, 4, dan 6
jam menunjukkan terjadinya penurunan permeabilitas  kolom.  Penurunan  permeabilitas akibat  penambahan  glutaraldehida  terjadi  karena pengaruh  perubahan  struktur  kerapatan  pada monolit.  Pori  pada  monolit  semakin  sedikit  karena tertutupi  oleh  molekul  glutaraldehida  sehingga semakin  rapat  monolit  yang  dihasilkan  dan porositas monolit menurun.

## 3.4. Scanning electron microscopy (SEM-EDX)
Morfologi  permukaan  dan  perkiraan  ukuran globul  polimer  monolit  poli(GMA-co-EDMA),  TIMM dan  TIMM-G  diamati  menggunakan  SEM. Berdasarkan  hasil  pengamatan  dengan  SEM terlihat  bahwa  tidak  keseluruhan  dari  morfologi permukaan monolit membentuk globul dengan pori yang  saling  berhubungan  ( flow-through  pore ) (Gambar  3).  Hal  ini  terjadi  pada  polimer  TIMM-G dikeseluruhan variasi waktu imobilisasi sedangkan pada  monolit  poli(GMA-co-EDMA)  dan  polimer TIMM  keseluruhan  permukaan  membentuk  globul dengan adanya pembentukan pori yang terhubung secara kontinyu.
Struktur  morfologi  poli(GMA-co-EDMA)  %T  40 dan %C 25 pada Gambar  3 menunjukkan  adanya globul-globul berukuran lebih kecil jika dibandingkan  dengan  monolit  yang  telah dimodifikasi.  Hal  ini  terjadi  karena  pengaruh modifikasi struktur pada monolit yaitu penambahan enzim  tripsin.  Secara  garis  besar,  morfologi permukaan  dari  TIMM-G  lebih  rigid  dibandingkan dengan permukaan TIMM.

## Tabel 3.
Data  EDX  poly-(GMA-co-EDMA),  TIMM,  dan TIMM-G
Kolom Mikro- reaktor Waktu Imobilisasi Persen Komposisi Unsur (Wt%) C O N TIMM 2 38,17 55,29 6,540 4 50,80 36,80 12,40 6 47,10 42,11 10,79 TIMM-G 2 53,79 38,57 7,640 4 50,28 24,49 25,23 6 48,21 32,92 18,87 Poli-(GMA-co-EDMA) 62,67 37,33 -
Rigidnya  struktur  TIMM-G  disebabkan  oleh pengaruh  penambahan  glutaraldehida  5%  dimana molekulnya  menutupi  keseluruhan  pori  yang terbentuk diantara globul-globul pada TIMM. Hal ini sesuai  dengan  data  hasil  uji  permeabilitas  kolom
(Tabel 2). Penambahan glutaraldehida dalam suatu material  pendukung  yang  telah  diimobilisasi menggunakan  enzim  disebut  pelapisan  enzim (enzyme  coating) .  Teknik  ini  akan  menghasilkan lapisan multilayer dan  mencegah  terjadinya ketidakstabilan pada enzim (Kim et al., 2011). Hal tersebut  terjadi  karena  jumlah  N  yang  mewakili enzim tripsin pada TIMM-G mengalami peningkatan  dibandingkan  dengan  TIMM  secara keseluruhan  (Tabel  3).  Namun,  hasil  pengamatan SEM menunjukkan bahwa penambahan glutaraldehida  pada  teknik enzyme  coating mengakibatkan  tertutupnya  keseluruhan flow- through pore yang terbentuk diantara globul-globul sehingga terjadi peningkatan kerapatan monolit.
Pada  permukaan  TIMM-G  juga  mengalami cracking yang  disebabkan  oleh  tingkat  akomodasi stres  yang  muncul  dari  TIMM  akibat  pengaruh penambahan  glutaraldehida.  Stres  dapat  muncul dikarenakan  adanya  perubahan  struktur  morfologi dimana  ketidakteraturan  struktur  morfologi  dari TIMM  berubah  menjadi  struktur  morfologi  yang lebih  rapat,  padat  dan  teratur.  Selain  itu,  terjadi perubahan  ikatan  kimia  pada  monolit  sehingga dimungkinkan  globul-globul  yang  terbentuk  pada
TIMM terlarut dalam glutaraldehida mengakibatkan terbentuknya permukaan yang lebih rata. Cracking inilah  yang  menyebabkan  permeabilitas  kolom  ini cukup  tinggi  karena  dimungkinkan  fasa  geraknya masih  bisa  melewati  bagian  monolit  yang mengalami cracking .  Selain  itu,  distribusi glutaraldehida  pada  kolom  tidak  merata  sehingga masih ada globul dan flow-through pore yang tidak tertutupi.
Perbandingan  profil  SEM  pada  kondisi penambahan  komposisi  glutaraldehida  yang  sama tetapi  dengan  waktu  imobilisasi  enzim  yang berbeda. Gambar 3 (g-l) menunjukkan bahwa lama waktu  imobilisasi  enzim,  tidak  berpengaruh signifikan terhadap morfologi permukaan TIMM-G.
Hal  tersebut  ditunjukkan  dengan  morfologi permukaannya  karena  hampir  keseluruhan permukaan  terlihat  sangat  rigid.  Adapun perbandingan  profil  SEM  TIMM  pada  berbagai variasi waktu imobilisasi menunjukkan terbentuknya  globul  dan  diantara  globul  tersebut terdapat flow-through  pore .  Apabila  dilihat  dari struktur  morfologi  antar  masing-masing  variasi waktu imobilisasi hampir tidak ada perbedaan yang cukup  signifikan  (Gambar  3  (a-f)).  Namun,
Gambar  3 . Hasil SEM poli(GMA-co-EDMA)  %T  40  dan  %C  25,  TIMM  dan  TIMM-G. TIMM  2  jam  150x  (a), 10000x (b); TIMM 4 jam 150x (c), 10000x (d); TIMM 6 jam 150x (e), 10000x (f); TIMM-G 2 jam 150x (g), 10000x (h); TIMM-G 4 jam 150x (i), 10000x (j); TIMM-G 6 jam 150x (k), 10000x (l)
perbedaan  antar  variasi  waktu  imobilisasi  dapat terlihat  pada  EDX  yang  menunjukkan  persen komposisi atom  N, dimana pendekatan menggunakan atom N ini mewakili  jumlah N pada enzim  tripsin.  Pada  Tabel  3  menunjukkan  bahwa TIMM  dengan  waktu  imobilisasi  2  jam menghasilkan  persen  berat  N  lebih  sedikit dibandingkan dengan waktu imobilisasi 4 dan 6 jam yaitu  6,54;  12,40;  dan  10,79%,  secara  berturut- turut.
Hal ini dimungkinkan jumlah enzim tripsin yang bereaksi  dengan  gugus  epoksida  dari  monolit belum  mencapai  optimum  sehingga  berpengaruh pada jumlah atom N. Imobilisasi optimum diketahui terdapat  pada  waktu  imobilisasi  4  jam  dengan jumlah  persen  komposisi  atom  N  tertinggi.  Waktu imobilisasi  6  jam  mengalami  penurunan  jumlah  N dimungkinkan enzim tripsin mengalami ketidakstabilan  reaksi  ketika  berikatan  dengan gugus  epoksida  dari  monolit  sehingga  enzim terdegradasi/mengalami  autolisis  yaitu  penurunan aktivitas  katalitik  di  waktu  imobilisasi  yang  lebih lama.  Berdasarkan  struktur  morfologi  pada  hasil SEM  (Gambar  3)  dan  persen  komposisi  atom  N pada  EDX  kolom  TIMM  4  jam  mempunyai kemampuan digunakan sebagai mikroreaktor untuk proses digestion protein. Pada TIMM-G dilihat dari struktur  morfologi  permukaannya,  tidak  dapat dikatakan  baik  digunakan  sebagai  mikroreaktor untuk  proses digestion sampel  protein  karena strukturnya  yang  sangat  rigid  dan  teratur  hampir tidak  terbentuk  globul  dan flow-through .  Oleh karena  itu,  TIMM  dengan  waktu  imobilisasi  4  jam dipilih  untuk  diaplikasikan  sebagai  kolom mikroreaktor  dalam  proses  digestion  sampel protein.

## 4. Kesimpulan
Kolom monolit poly-(GMA-co-EDMA) dengan  %T  40  dan  %C  25  memiliki  proporsi micropores , flow-through  pore dan mesopores yang  seimbang  berdasarkan  hasil  ISEC  yaitu  5,9; 65,8  dan  28,20%.  Kolom  monolit  poly-(GMA-co- EDMA) terimobilisasi enzim tripsin (TIMM) dengan waktu  imobilisasi  4  jam  merupakan  mikroreaktor yang  paling  baik  karena  mempunyai  kestabilan mekanis  dan  permeabilitas  yang  baik,  dengan jumlah  persen  komposisi  unsur  N  tripsin  paling tinggi yaitu 12,40%.

## Ucapan terima kasih
Penelitian  ini  sebagian  didanai  oleh  Hibah Unggulan  Universitas  Tahun  2015-2016  dari Direktorat Jenderal Pendidikan  Tinggi, Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan, Indonesia.

## Daftar pustaka
Al-Bokari, M., Cherrak, D., & Guiochon, G., (2002). Determination  of  the  porosities  of monolithic  columns  by  inverse  size- exclusion chromatography, J. Chromatogr. A , 975: 275–284. Berthold,  J.,  &  Salmen,  L.,  (1997).  Inverse  Size Exclusion  Chromatography  (ISEC)  for Determining  the  Relative  Pore  Size Distribution  of  Wood  Pulps, STFI  Stockh. Swed., 51: 361–368. Bystrom, E. (2009) Porous polymeric Materials for Chromatography: Synthesis,
Functionalization,  and  Characterization, Umea University, Sweden. Chen, Y., Wu, M., Wang, K., Chen, B., Yao, S., Zou,
H.,  &  Nie,  L.,  (2011).  Vinyl  functionalized silica hybrid monolit-based trypsin microreactor  for  on  line  digestion  and separation  via  thiol-ene  “click”  st ategy, J. Chromatogr. A , 1218: 7982–7988. Strigter,  E.C.A.,  de  Jong,  G.J.,  &  van  Bennekom, W.P.  (2007).  Development  of  an  open- tubular trypsin reactor for on-line digestion of  proteins. Anal  Bioanal  Chem ,  389: 1967–1977.
Kim, J., Kim, B.C., Lopez-Ferrer, D., Petritis, K., & Smith,  R.D.,  (2010).  Nanobiocatalysis  for protein  digestion  in  proteomic  analysis, proteomics, 10: 687–699.
Liang, Y., Tao, D., Ma, J., Sun, L., Liang, Z., Zhang, L.,  &  Zhang,  Y.,  (2011).  Hydrophilic monolith  based  immobilized  enzyme reactors  in  capillary  and  on  microchip  for high-throughput  proteomic  analysis, J. Chromatogr. A , 1218: 2898–2905.
Monzo,  A.,  Rejtar,  T.,  &  Guttman,  A.,  (2009).
Optimization of poli(GMA-co-EDMA) Monolitic  Support  for  Trypsin  Nanoreactor Fabrication, J.  Chromatogr.  Sci. ,  47:  467– 472.
Safdar,  M.,  Sprob,  J.,  &  Janis,  J.,  (2014).
Microscale immobilized enzyme reactors in proteomics: Latest developments, 1324: 1–
10.
Shangguan,  L.,  Zhang,  L.,  Xiong,  Z.,  Ren,  J., Zhang,  R.,  Gao,  F.,  &  Zhang,  W.,  (2015). Investigation of bi-enzymatic reactor based on  hybrid  monolit  withnanoparticles embedded and its proteolytic characteristics,
J. Chromatogr. A , 1388: 158–166.
Tasfiyati,  A.N., Iftitah,  E.D.,  Sakti,  S.P.,  &  Sabarudin, A., (2016). Evaluation of glycidyl methacrylate- based  monolit  functionalized  with  weak  anion exchange moiety inside 0.5 mm i.d. column for liquid  chromatographic  separation  of  DNA, Anal. Chem. Res, 7:9–16.