JFFI. 2018; 5(2) 279-283 www.jurnal.farmasi.umi.ac.id/index.php/fitofarmakaindonesia

## UJI IN VITRO DAN IN SILICO SENYAWA 5,7,2’,5’-TETRAHYDROXY FLAVAN-3-OL TERHADAP ENZIM ALPHA GLUCOSIDASE
Frengki 1,2* , Deddi Prima 3 , Fatma Sri Wahyuni 3 , Daan Khambri 1 , Henny Vanda 2 , Noni Zakiah 4 , Jamilah Abbas 5 , Berna Elya 6
1 Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Andalas-Padang
2 FKH Universitas Syiah Kuala-Banda Aceh
3 Fakultas Farmasi Universitas Andalas
4 Akademi Farmasi-Aceh Besar
5 LIPI-Kimia Puspitek-Serpong
6 Fakultas Farmasi Universitas Indonesia
* farhanayyash@gmail.com , frengki_fkh@unsyiah.ac.id

## ABSTRACT
Several  of  Calophyllums  genus  have  been  searched  and  proven  as  medicinal  plants  and  Calophyllum macrophyllum is one of its genus. We have been isolated a compound from ethyl acetate fraction of the stem-bark. The  compound  was  flavan-3-ol  (5,7,2’,5’-tetrahydroxy  flavan-3-ol).  This  research  aimed  to  determine  inhibition antidiabetic activity and affinity of its compound on α-glycosidase enzyme. In vitro antidiabetic effect shown by IC 50 9.10 µg/ml and docking by Arguslab 4.01 shown by ΔG -10,24 kkal/mol as in silico test. The inhibition activity of flavan-3-ol  against  the  α-glucosidase  enzyme  that  is  very  strong  shows  its  promising  potential  as  a  candidate  for antidiabetic drugs.
Keywords: Flavan-3-ol, alpha glukosidase, in vitro, in silico

## I. PENDAHULUAN
Kepercayaan masyarakat terhadap manfaat dan  kegunaan  tumbuhan  dalam  pengobatan  dan pemeliharaan kesehatan semakin meningkat (Christine,1985). Salah satu genus tumbuhan tingkat tinggi  Indonesia  yang  mempunyai  potensi  sebagai sumber senyawa kimia bioaktif adalah Calophyllum dari suku Guttiferae/Clussiaceae. Beberapa wilayah seperti  Sumatera,  Jawa  Barat,  Jawa  Tengah, Kalimantan dan Papua merupakan tempat penyebarannya. Selain di Indonesia tumbuhan genus Calophyllum ini  juga  ditemukan  di  Vietnam, Kamboja,  Thailand,  Singapura,  Australia  bagian selatan, pulau Andaman, dan Srilangka dengan 200 jenis  telah  teridentifikasi  (Soerjanegara.  1994; Backer. 1963; Heyne. 1987).
Beberapa  jenis Calophyllum diantaranya adalah C.  macrophyllum Scheff, C.  teysmannii , C. inophyllum , C. apetalum , C. moonii , C. lankaensis , C. caledonicum , C. cordata-oblongum , C . verticillatum , C. calaba , C. brasiliense , C. blancoi , C.  australianum FvM, C.  enervosu,  C.  insularum dan C. gracilipes .
Kumarin,  santon,  flavonoid,  biflavonoid, triterpenoid,  asam-asam  organik  dan  senyawa benzofenon  merupakan  senyawa  aktif  yang  berhasil
diisolasi  dari  genus Callophyllum (Cao  S-G, et  al . 1998; Yimdjo, et al. 2004; Taher, et al. 2005; Kirk, et al. 1994).
Senyawa  santon  ((+)  kalanolida  A)  dari C. lanigerum mempunyai aktivitas sebagai antiplatelet, antibakteri, antikembung dan anti-HIV (Dharmaratne, et  al. 1999,  Linuma, et  al. 1996). Senyawa  kumarin  (brasimarin  A,  B,  dan  C,  4- fenilkumarin dari kulit batang C. brasiliense ) bersifat antitumor (Ito, T. 2003). Senyawa poliisoprenil keton (enervosanon)  dari  kulit  batang C.  enervosum dilaporkan aktif sebagai antibakteri terhadap bakteri B. subtilis (ATCC 6633), E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa dan S. aureus (ATCC 6538) (Taher, et al. 2005).  Senyawa  golongan  triterpena  friedelin  dan asam protokatekuat dan asam shikimat dari daun C. brasiliense aktif sebagai anti-HIV (Reyes-Chilpa, et al. 2004). Golongan flavonoid juga ditemukan dari C. calaba berupa  senyawa  biflavonoid  amentoflavon dan  merelloflavon,  dari C.  inophyllum ditemukan senyawa katekin (Linuma, et al. 1994).
Peneliti  juga  berhasil  mengisolasi  senyawa flavanal  (5,7,2’,5’-tetrahydroxy  flavan-3-ol)  dari kulit  batang  tumbuhan C.  macrophyllum Scheff. Senyawa  ini  memiliki  aktivitas  antioksidan  yang lebih  kuat  dibandingkan  dengan  katekin.  Diduga
gugus -OH posisi para pada cincin B senyawa flavan- 3 ol ini berperan meningkatkan aktivitas antioksidan lebih  kuat  dibanding  kuersetin  yang  memiliki  rantai samping gugus -OH posisi meta (Frengki, 2011)
Senyawa ini diduga juga aktif sebagai obat antidiabetes sebagaimana kuersetin sesama golongan  flavonoid  yang  memiliki  gugus  fenol. Sutedja et al, (2003) melaporkan semua bahan alam yang  mengandung  senyawa  dengan  gugus  fenol berkhasiat  sebagai  obat  antidiabetes.  Oleh  karena itulah  peneliti  tertarik  melakukan  uji  antidiabetes secara in vitro melalui mekanisme inhibisi enzim α- glucosidase.  Lebih  jauh  hasil  uji in  vitro ini  akan dikonfirmasi secara in silico melalui metode docking moleculer .

## II. METODE PENELITIAN

## A. Bahan dan Alat
Enzim  α-glukosidase  ( Saccharoyces  sp .,
Oriental  Yeast  Co.,  Ltd.,  Jepang),  bovine  serum albumin  (Wako  pure  Chemical  Industries,  Ltd, Jepang.),  koji,  paranitrofenil  α-D-glukopiranosa (PNP)  (Wako  pure  Chemical  Industries,  Ltd., Jepang), Na 2 CO 3 (Merck cat. 1.09940, Jerman).
Peralatan  uji in  vitro meliputi  pipet  mikro (Eppendrof),  lemari  pendingin,  wadah  inkubator, tube berbagai ukuran (pyrex) dan rak tabung reaksi. Sedangkan  perlengkapan  uji in  silico yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  perangkat keras  berupa  PC  dengan Random  Access  Memory sebesar  2  GB.  Perangkat  lunak  yang  digunakan berupa Pymol,  UCSF  Chimera,  Arguslab,  VegaZZ, dan Chemdraw 2006.

## B. Prosedur Penelitian
1. Uji  Antidiabetes  terhadap  enzim  α-glukosidase (Dewi et al , 2007)
Larutan  sampel  dalam  5  µL  DMSO ditambah dengan 495 µL dapar fosfat 0,1M dan 250 µL  0,02M  p-nitrofenil  α-D-glukopiranosa  (PNP), sampel diinkubasi  selama 5 menit pada suhu 37 o C. Kedalam sampel ditambahkan 250 µL larutan enzim α-glukosidase, diinkubasi lagi selama 15 menit pada suhu 37 o C. Setelah masa inkubasi selesai ditambahkan 1000 µL 0,2M Na 2 CO 3 . Sampel diukur absorbansinya  dengan  spektrofotometer  UV-Vis pada  panjang  gelombang  400  nm.  Perlakuan  yang sama  juga  dilakukan  pada  standar  kuersetin, sedangkan blanko sampel tanpa penambahan larutan enzim  diganti  dengan  penambahan  250  µL  dapar fosfat  pH  7,  demikian  juga  blanko  (tanpa  sampel) hanya digunakan larutan DMSO.
Nilai  LC 50 ditentukan  melalui  persamaan regresi dengan bantuan program komputer sederhana Mic. Excel.
2. Uji in  silico terhadap  enzim  α-glukosidase (Ragno et al . 2009)
Struktur  3  dimensi  ligan  dibuat  melalui program Chemdraw 2006, struktur tersebut disimpan dalam format pdb. Kemudian dilakukan minimisasi energi sebanyak 1000x, dan  konformasi geometris, kedua  proses  tersebut  menggunakan  piranti  lunak Vega ZZ .  Hasil pencarian konformasi terbaik dipilih sebagai  struktur  yang  akan  ditambatkan  pada makromolekul.
Makromolekul  reseptor  diunduh  dari  situs penyedia PDB makromolekul
http://www.rscb.org/pdb. Struktur  makromolekul dibersihkan dari ligan menggunakan software UCSF Chimera. Kemudian molekul air dibuang, sebaliknya ditambahkan  atom  hidrogen  dan  muatan  parsial Gasteiger  Charges dan  diberi forcefield Autodock. Minimisasi  dan  pencarian  konformasi  dilakukan sebanyak 1000 langkah. Proses tersebut menggunakan  piranti  lunak Vega  ZZ. Data makromolekul disimpan dalam format pdb.
Penambatan molekul dilakukan menggunakan  program  Arguslab  4.01.  Struktur makromolekul  dan  ligan  yang  akan  ditambatkan telah dioptimasi secara terpisah disimpan dalam satu folder yang sama. Hasil penambatan disimpan dalam format pdb.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian Uji  Antidiabetes  dengan  Mekanisme  Inhibisi  α- Glukosidase secara in vitro
Uji aktivitas antidiabetes dengan mekanisme  inhibisi  α-glukosidase  terhadap  standar kuersetin  dan  senyawa  5,  7,  2’,  5’  tetrahidroksi flavan-3-ol  diperoleh  nilai  IC 50 masing-masingnya sebesar 17,5 µg/mL dan 9,10 µg/mL.
Tabel  1. Data  uji  aktifitas  antidiabetes  standar  dan isolat uji
Sampel Kons %Inh IC 50 (µg/mL) Blanko Kuersetin 25 72.46 17.5 12.5 58.0 6.25 37.29 3.125 25.24 Flavan-3- ol 25 83.37 9.10 12.5 59.43 6.25 30.52 3.125 21.26
Uji  Antidiabetes  dengan  Mekanisme  Inhibisi  α- Glukosidase secara in silico
Proses  uji in  silico diawali  proses  validasi metode, optimasi ligan dan reseptor dan terkhir baru dilakukan docking ligan-resepto r .  Ligan  dalam  hal ini  adalah  sukrosa,  kuersetin  dan  flavan-3-ol. Selengkapnya  validasi native ligan,  profil  struktur 2D dan 3D, serta hasil docking masing-masing ligan tersebut  ditunjukkan  pada tabel  2,  3 dan 4 serta gambar 1, 2 dan 3 dibawah ini.
Tabel 2. Validasi Native Ligand 1328 ACR (Substrat α-Glukosidase)
Parameter Validasi RSMD Calculate Size Grid Box 2,374 Å X 21,243720
0,4
Y 20,981007 Z 17,354000
Tabel 3. Struktur 2D dan 3D ligand (Sukrosa, Kuersetin dan Flavan-3-ol)
Tabel 4. Hasil docking (kkal/mol) dan ikatan hidrogen antara ligan dengan reseptor
Senyawa Uji Jumah Ikatan Hidrogen Jarak Ikatan (Å) Asam Amino Yang Berikatan Gugus Senyawa Uji yang Berikatan Sukrosa 2 2,63 Arg 404 OH 3,00 OH 2 2,98 His 478 OH 3,05 OH 1 2,51 Asp 420 OH 1 2,88 Asp 197 OH Kuersetin 1 2,90 Asp 236 OH Flavan-3-ol 2 2,00 Asp 420 OH 2,58 OH 1 2,75 Trp 417 OH 1 3,05 Arg 404 -O-
Gambar 1 . Hasil visualisasi PyMol hasil docking enzim alpha glucosidase dengan sucrose (Arg 404 memiliki 2 ikatan hydrogen dengan sukrosa, His 478
2 ikatan, sedangkan ASP 420 1 ikatan dan ASP 197 masing-masing dengan ikatan hydrogen)
Gambar 2 . Hasil visualisasi PyMol hasil docking enzim alpha glucosidase dengan kuersetin (ASP 236 memiliki 1 ikatan hydrogen dengan kuersetin)
Gambar  3 .  Hasil  visualisasi  PyMol  hasil docking enzim  alpha  glukosidase  dengan  Flavan-3-ol  (ASP 420  memiliki  2  ikatan  hydrogen,  ARG  404  1  ikatan hydrogen dan TRP 417 memiliki 1 ikatan hydrogen

## B. Pembahasan
Uji  Antidiabetes  dengan  Mekanisme  Inhibisi  α- Glukosidase secara in vitro
Uji  antidiabetes  dilakukan  secara in  vitro menggunakan p-nitrofenil- α - D -glukopironosa sebagai substrat. Enzim α-glukosidase  akan menghidrolisis substrat p-nitrofenil- α - D - glukopironosa menjadi p-nitrofenol yang  berwarna kuning.  Aktivitas  enzim  α-glukosidase  diukur berdasarkan  absorbansi p-nitrofenol (Basuki, et  al . 2002 & Dewi, et al . 2007). Senyawa  flavan-3-ol  memiliki  kemampuan menghambat aktivitas enzim α-glukosidase menghidrolisis substrat
p-nitrofenil- α - D - glukopironosa menjadi p-nitrofenol. Daya hambatnya malah lebih baik dibandingkan standar kuersetin. Hal ini  diduga  perbedaan  pola  hidroksilasi  pada  cincin benzena  (B)  dimana  flavan-3-ol  memiliki  ikatan hidroksi pada posisi para , sedangkan kuersetin posisi ortho. Hasil ini senada dengan laporan Frengki et al (2011).
Uji  Antidiabetes  dengan  Mekanisme  Inhibisi  α- Glukosidase secara in silico
Langkah  awal  dilakukan  berupa  validasi program  ArgusLab  untuk  mendapat  metode  yang reliabel. Validasi  dilakukan  dengan  menggunakan pilihan docking  engine ArgusDock  pada  rentang kalkulasi sumbu x 21.243720, sumbu y 20,981007 dan sumbu  z  17,354000.  Metode  ini  memberikan  nilai RMSD 2,374 Ǻ (≤ 2,5 Ǻ), sehingga metode ini dapat digunakan  untuk  melakukan  proses docking. Proses validasi  ini  dilakukan  terhadap  salah  satu  substrat reseptor  3POC  (α-glukosidase  pada  usus  manusia yang  berasal  dari  mikroorganisme Ruminococcus obeum )  yang  secara  eksperimen  telah  dikenali  dan diberi nama 1328 ACR.
Reseptor  diketahui  memiliki binding  site pada residu asam amino Arg 404, Asp 197, Asp 420 dan His 478 dengan kode A5ZY13
( www.uniprot.org ). Berat molekul reseptor ini adalah 156840.93 dengan  jumlah  asam  amino  penyusunnya 666. Reseptor ini telah mengalami mutasi pada residu asam amino ke 307 dari Asp menjadi Ala.
Docking dilakukan  menggunakan  aplikasi ArgusLab  4.01.  Dari  empat  tempat  penambatan tersebut ternyata Arg 404 menunjukkan energi bebas Gibs ( – ΔG (kkal/mol)) yang paling rendah, sehingga Arg 404 juga menjadi target penambatan. Semua ligan menunjukkan nilai energi bebas Gibs negatif. Artinya ketiga  senyawa  tersebut  mampu  berikatan  dengan reseptor  dengan  melepaskan  sejumlah  energi. Masing-masing memberikan nilai energi bebas Gibs - 10,24 (flavan-3-ol), -7,02 (sukrosa) dan - 8,95(kuersetin) kkal/mol.
Semakin  negatif  nilai  energi  bebas  Gibs maka akan semakin stabil senyawa tersebut berikatan dengan  reseptornya.  Dalam  hal  ini  flavan-3-ol memiliki affinitas yang lebih baik dibanding sukrose. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  flavan-3-ol  mampu menghambat ikatan gula (sukrose) dengan reseptornya.  Demikian  juga  dengan  kuersetin  yang memiliki afinitas lebih kuat dibandingkan sukrosa.
Yang  menarik  dari  hasil in  slico ini  adalah flavan-3-ol bukan hanya memiliki afinitas lebih kuat dibandingkan  sukrosa,  juga  menunjukkan  kestabilan komplek  lebih  baik  dibandingkan  kuersetin  sebagai kontrol  yang  memang  telah  terbukti  aktif  sebagai inhibitor enzim α-Glukosidase.
Daya  hambat  flavan-3-ol  dan  kontrol kuersetin terhadap enzim α-glukosidase melalui uji in vitro berbanding  lurus  dengan  hasil in  silico. Kedua metode  ini  saling  melengkapi  dalam  rangka penelusuran  efek  suatu  senyawa  aktif  farmakologis yang telah dibuktikan melalui penelitian ini.

## IV. KESIMPULAN
Aktivitas inhibisi flavan-3-ol terhadap enzim α-glukosidase  yang  sangat  kuat  menunjukkan potensinya  yang  menjanjikan  sebagai  kandidat  obat antidiabetes.

## DAFTAR PUSTAKA
Backer and Bakhuizen Van den Brink. (1963). Flora of  Java,  Vol  1 ,  N.  V.  P.  Noordhoof  of- Goningen-The Nederlands Basuki,  T.,  et  al.  (2002). Evaluasi  aktivitas  daya hambat  enzim  α-glukosidase  dari  ekstrak kulit  batang,  daun,  bunga  dan  buah kemuning [ Murraya  Paniculata (L.)  Jack.] . Prosiding Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXI. Surabaya:  Fakultas Farmasi Universitas Surabaya Cao,  S-G., et  al .  (1998).  Minor  Coumarins  from Calophyllum  teysmannii var.    inophylloide and  Synthesis  of  Cytotoxic  Calanone Derivatives. Helv.  C.  Acta.  81 :  Issue  5-8. 1404-1415
Christine.  (1985). Penggunaan  Tanaman  Obat . Jakarta: Penerbit Buletin Farmakon
Dewi,  R.T.,  et  al.  (2007).  Inhibitory  effect  of  Koji
Aspergillus terreus on α-glucosidase activity and  postprandial  hyperglycemia. Pakistan Journal  of  Biological  Science ,  18,  3131- 3135.
Dharmaratne,  Wijesinghe,  Thevanasem.  (1999). Antimicrobial  activity  of  xanthones  from
Calophyllum  spesies ,  against  methicillin- resistant  S.  aureus  (MRSA). Journal  of Ethnopharmacology, 66 . 339-342 Frengki.  2011.  Isolasi  senyawa  aktif  dari  fraksi  etil asetat kulit batang tumbuhan C.
Macrophyllum Scheff.  Tesis.  Departemen Farmasi-UI. Depok Heyne.  (1987). Tumbuhan berguna  Indonesia ,  Jilid
III.  Jakarta:  Cetakan  ke  1,  Badan  Litbang Kehutanan  Jakarta.  Departemen  Kehutanan. Gatot Subroto. 1374-1380
Iinuma, et al . (1994). Two xanthones from root bark of Calophyllum inophyllum. Phytochemistry .
35 . 527-532. Iinuma,  M., et  al .  (1996).    Six  xanthones  from
Calophyllum austroindicum . Phytochemistry . 43 . 681-685 Ito,  T., et  al. (2003).  Chemical  constituents  of Calophyllum  brasiliense 2.  Structure  of Three New Coumarins and Cancer chemopreventive  Activity  of  4-Subtituted Coumarins. Journal of Natural Product, 66 . 368-371.
Kirk, et al. (1999). Calanone, a novel coumarin from
Calophyllum teysmannii.
Tetrahedron Letter . Vol 35 . No 32, 5821-5824 Ragno,  R., et  al .  (2009)  “ Molecular  Docking Tutorial” . http://www.mmvsl.farm.unipi.it Ratnayake, et  al. (1986).  Two  chemically  distinct groups  of Calophyllum species  from  Sri Langka. Phytochemistry. Vol 25 . 425-42 Rayes-Chilpa, et  al. (2004).    Cytotoxi  effect  of mammea type coumarins from Calophyllum brasillense. Life Science. Vol 75 . 1635-1647 Soerjanegara  and  Lemmens,  R.H.M.J.  (1994).  Plant
Resources  of  Sout-East  Asia  5. Prosea , Bogor: Pudoc. 114-138
Sutedja,  L,  2003.  Bioprospecting  Tumbuhan  Obat Indonesia  Sebagai  Sediaan  Fitofarmaka Antidiabetes.  Laporan  Kemajuan  Tahap  II Riset  Unggulan  Terpadu,  Pusat  Penelitian Kimia-LIPI.
Taher, et al. (2005).  A polyisoprenylated ketine from Calophyllum  enervosum.  Phytochemistry.
66 , 723-726
Yimdjo,  M.  C., et  al .  (2004).  Antimicrobial  and cytotoxic agents from Calophyllum inophyllum. Phytochemistry. 65 . 2789-2795