# Korespondensi:  Program  Studi  Akuakultur,  Fakultas  Pertanian dan  Peternakan,  Universitas  Muhammadiyah,  Malang.
Jl.  Raya  Tlogomas  No.  246,  Tlogomas,  Lowokwaru,  Tegalgondo, Kota  Malang,  Jawa  Timur  65144,  Indonesia E-mail:  aniszubaidah@umm.ac.id
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## AKTIVITAS  PROTEOLITIK  BAKTERI  KANDIDAT  PROBIOTIK DARI SALURAN PENCERNAAN UDANG JERBUNG, Penaeus merguiensis
Diki  Mulianto,  Widyowati,  Hendra  Raharja,  dan  Anis  Zubaidah #
Program Studi Akuakultur, Fakultas Pertanian dan Peternakan, Universitas Muhammadiyah, Malang Jl. Raya Tlogomas No. 246, Tlogomas, Lowokwaru, Tegalgondo, Kota  Malang, Jawa Timur 65144
(Naskah diterima: 18 Oktober 2021; Revisi final: 1 April 2022; Disetujui publikasi: 4 April 2022)

## ABSTRAK
Upaya untuk meningkatkan pemanfaatan protein dalam pakan dapat dilakukan dengan penambahan bakteri proteolitik.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  skrining  bakteri  proteolitik  pada  saluran  pencernaan  udang Jerbung (Penaeus merguiensis) sebagai kandidat probotik. Skrining bakteri dilakukan dengan mengisolasi bakteri dari saluran pencernaan udang yang diperoleh dari tangkapan nelayan di pesisir pantai Pasuruan, Jawa Timur. Dari hasil isolasi diperoleh lebih dari 30 koloni yang tumbuh pada media, selanjutnya dipilih lima isolat yang dengan karakteristik morfologi yang berbeda. Lima isolat terpilih selanjutnya diuji aktivitas proteolitiknya pada media skim milk agar (SMA). Hasil penelitian menunjukkan aktivitas proteolitik terbesar pada isolat UD-1 dengan nilai aktivitas proteolitik sebesar 2,49 ± 0,9 cm; UD-2 sebesar 2,33± 0,24 cm; UD- 3 sebesar 1,85 ± 0,07 cm; UD-4 sebesar 1,11 ± 0,43 cm; dan UD-5 sebesar 1,36 ± 0,07 cm. Tiga isolat dengan nilai aktivitas proteolitik tertinggi kemudian diuji pewarnaan gram, uji ketahanan terhadap kondisi asam (pH 3), uji penempelan bakteri, uji antagonistik terhadap bakteri Vibrio harveyi, uji patogenitas dan pengamatan pertumbuhan bakteri. Hasil uji pewarnaan gram dengan hasil gram positif pada ketiga isolat. Ketiga isolat mampu bertahan hidup pada kondisi asam (pH 3) selama delapan jam dengan nilai kepadatan (OD ë 620 nm) pada isolat tertinggi UD-1 (0,875). Uji antagonistic menunjukkan isolat UD-1, UD-2, dan UD- 3 mampu menghambat pertumbuhan bakteri Vibrio harveyi dengan membentuk zona hambat di sekeliling isolat.  Nilai  antagonistik  tertinggi  pada  isolat  UD-1  sebesar  12,3  mm.  Uji  patogenitas  yang  dilakukan menunjukkan  bahwa  isolat  tidak  bersifat  patogen  pada  udang  budidaya.  Berdasarkan  hasil  penelitian dapat  disimpulkan  bahwa  isolat  (UD-1,  UD-2,  dan  UD3)  yang  diisolasi  dari  saluran  pencernaan  udang termasuk bakteri proteolitik dan memenuhi syarat sebagai bakteri kandidat probiotik.
KATA KUNCI: bakteri proteolitik; uji antagonistik; uji patogenisitas; uji perwarnaan gram; Vibrio harveyi
ABSTRACT: Proteolytic activity of probiotic candidate bacteria from the digestive tract of the Banana shrimp (Penaeus merguiensis). By: Diki Mulianto, Widyowati, Hendra Raharja, and Anis Zubaidah
Efforts to increase the utilization of protein in feed can be made by adding proteolytic bacteria. This study aimed to screen proteolytic bacteria in the digestive tract of Banana shrimp (Penaeus merguiensis) as probiotic candidates. The bacterial screening was carried out by isolating bacteria from the digestive tract of shrimp obtained from fishermen’s catch on the coast of Pasuruan, East Java. From the isolation results, more than 30 colonies grew on the media, then five isolates were selected with different morphological characteristics. The five selected isolates were then tested for their proteolytic activity on Skim Milk Agar (SMA) media. The results showed the most excellent proteolytic activity in isolate UD-1 with a proteolytic activity value of 2.49 ± 0.9 cm; UD-2 is 2.33 ± 0.24 cm; UD-3 is 1.85 ± 0.07 cm; UD-4 is 1.11 ± 0.43 cm; and UD-5 is 1.36 ± 0.07 cm. The three isolates with the highest proteolytic activity values were tested for gram-positive staining, acid resistance test (pH 3), bacterial attachment test, antagonistic test against Vibrio harveyi bacteria, pathogenicity test, and bacterial growth observation. Gram stain test results with gram- positive results on the three isolates. The three isolates were able to survive in acidic conditions (pH 3) for eight hours with the highest density (OD ë 620 nm) value of UD-1 (0.875). The antagonistic test showed that isolates UD-1, UD-
2, and UD-3 could inhibit the growth of Vibrio harveyi bacteria by forming an inhibitory zone around the isolates. The highest antagonistic value in the UD-1 isolate was 12.3 mm. The pathogenicity test carried out showed that the isolates were not pathogenic in cultured shrimp. Based on the study results, it can be concluded that the isolates (UD- 1, UD-2,  and UD-3) isolated  from the  shrimp’s digestive tract  are proteolytic bacteria  and qualify  as probiotic candidate bacteria.
KEYWORDS: proteolytic bacteria; Vibrio harveyi; antagonistic test; pathogenicity test; gram stain test
tein  menjadi  senyawa  sederhana,  sehingga  akan mudah terserap oleh tubuh dan akan meningkatkan laju  pertumbuhan  (Rohyati,  2015).  Upaya  untuk meningkatkan  pertumbuhan  pada  udang  dengan memanfaatkan  bakteri  proteolitik  penghasil  enzim protease yang dapat diperoleh dari saluran pencernaan.
Isolasi bakteri yang kandidat probiotik dari saluran pencernaan  udang  vaname  telah  dilakukan  oleh Sarastiti et al. (2020) dan hasilnya memiliki kemiripan 99,93% dengan Bacillus flexus. Saat ini penelitian isolasi bakteri dari udang jerbung belum banyak dilakukan. Oleh  sebab  itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk memperoleh  kandidat  probiotik  yang  diisolasi  dari udang jerbung (Penaeus marguiensis) hasil tangkapan alam di perairan Pasuruan. Kandidat bakteri probiotik diharapkan  memenuhi  syarat  sebagai  probiotik dengan  nilai aktivitas  proteolitik  yang tinggi,  tahan terhadap  kondisi  asam,  serta  mampu  menekan pertumbuhan bakteri patogen.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan pada bulan Mei-Juli tahun 2021 di  Laboratorium  Perikanan  dan  Laboratorium Mikrobiologi  Universitas  Muhammadiyah  Malang (UMM). Analisis data dilakukan dengan metode analisis deskriptif. Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah  udang  putih  (Penaeus  marguensis)  yang diperoleh dari hasil tangkapan nelayan di pesisir pantai Pasuruan.  Lima  ekor  sampel  udang  (bobot  ±  25  g) diambil  ususnya  untuk  dihancurkan  dan  dilakukan pengenceran untuk ditebar pada media pertumbuhan dengan menggunakan teknik cawan sebar.
Semua  alat  yang  digunakan  disterilisasi  pada autoklaf (Hirayama HVE-50) untuk membunuh mikroba yang hidup. Sampel diisolasi dari saluran pencernaan udang  pada  media  nutrien  agar  (NA).  Hasil  isolasi diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C kemudian dilakukan  pengamatan  morfologi  meliputi  bentuk, warna, elevasi, dan karakter optik (Sousa et al., 2015). Lima  isolat  yang  paling  mendominasi  (berdasarkan karakteristik  morfologi  bakteri)  selanjutnya  diuji proteolitik. Tiga isolat yang memiliki nilai proteolitik tertinggi selanjutnya diuji lanjut.
Pengujian aktivitas proteolitik dilakukan  dengan cara menumbuhkan isolat pada media skim milk agar

## PENDAHULUAN
Udang vaname (Litopenaeus vannamei) merupakan salah  satu  komoditas  budidaya  perikanan  yang memiliki nilai ekonomis tinggi. Udang vaname di In- donesia  mulai  dibudidayakan  sejak  tahun  2001 sehingga  sekarang  menjadi  primadona  perikanan nasional. Namun hingga kini masih banyak tantangan pembudidaya  untuk  menghasilkan  produksi  yang maksimal  (Lunes  et  al.,  2021).  Pada  tahun  2017 produksi  udang  vaname  mengalami  penurunan mencapai 20%  menjadi  555,14 ton  dari tahun  2016 dengan jumlah produksi 698,14 ton (Suriawan et al., 2019).  Selain  ancaman  penyakit  yang  masih  tinggi penurunan  produksi  dapat  pula  diakibatkan  oleh pengelolaan kualitas air yang kurang baik dan kurangnya tingkat  pemanfaatan  pakan  (Liu  et  al.,  2021).  Pada tambak intensif yang mengandalkan pakan buatan yang berlebih dan kualitas yang kurang baik sehingga dapat menyebabkan pencemaran media budidaya. Salah satu upaya untuk menjaga kualitas air budidaya yaitu dengan menggunakan  probiotik  yang  dapat  dicampurkan dengan  pakan  dan  diaplikasikan  langsung  pada  air budidaya  (Ringø  et  al.,  2020).  Menurut  Ding  et  al. (2020), probiotik merupakan nutrisi tambahan yang terdiri atas mikroba hidup yang menguntungkan bagi hewan inangnya. Probiotik dapat meningkatkan nafsu makan,  meningkatkan  metabolisme,  menghambat bakteri patogen, meningkatkan aktivitas kerja enzim, dan meningkatkan pertumbuhan (Newaj-Fizul & Aus- tin, 2015; Falcinelli et al., 2018; Van Doan et al., 2019). Penggunaan probiotik dapat memberikan efek yang baik  apabila  sesuai  dengan  beberapa  kriteria  di antaranya  spesies  probiotik  yang  dimanfaatkan, metode yang digunakan, dosis pemberian, dan waktu pemberian (Ringø et al., 2020).
Lebih  dari  90%  probiotik  digunakan  oleh  para petambak  udang  untuk  meningkatkan  hasil budidayanya  (Rico  et  al.,  2013).  Probiotik  dapat berperan dalam meningkatkan nilai kecernaan dengan menghasilkan  enzim  yang  membantu  proses pencernaan  seperti  amilase,  lipase,  dan  protease. Keberadaan  bakteri  proteolitik  penghasil  protease pada  saluran  pencernaan  udang  bertujuan  untuk mencerna substansi kompleks berupa protein dalam waktu  yang  sangat  singkat  (Kurniasih  et  al.,  2013). Enzim protease berfungsi untuk menghidrolisis pro-
(SMA) menggunakan cotton bud, adanya zona bening yang  terbentuk  di  sekeliling  koloni  menggunakan jangka sorong menandakan adanya aktivitas proteolitik (Suo et al., 2021).
Uji  ketahanan  terhadap  kondisi  asam  dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat pada media TSB yang telah  diberi  larutan  pH  buffer  dengan  pH  3  dan  7, selanjutnya disimpan pada shaker dengan suhu ruang selama 24 jam. Pertumbuhan bakteri diamati dengan menggunakan  metode  pengukuran  nilai  optical  den- sity  (OD  620  nm)  pada  spektrofotometer  UV-Vis (Ayyash et al., 2021).
Uji pertumbuhan bakteri dilakukan selama 14 jam dengan  pengamatan  nilai  OD  setiap  dua  jam  sekali menggunakan media TSB yang dimodifikasi dari jurnal (Meyers et al., 2018). Uji aktivitas antagonistik dengan mengamati zona hambat yang terbentuk di sekeliling koloni yang terdapat pada kertas cakram menggunakan bakteri patogen Vibrio harveyi yang dimodifikasi dari metode (Moussaid et al., 2019).
Uji  penempelan  menggunakan  media  triptic  soy broth (TSB), NaCl, dan substrat lempeng baja dengan melakukan  pengukuran  nilai  OD  yang  telah dimodifikasi  dari  penelitian  (Jankoviæ  et  al.,  2012). Lempeng baja yang digunakan disterilisasi dengan cara direndam pada larutan desinfektan selama 24 jam dan kemudian disterillisasi dengan  autoclave pada  suhu 121° dan tekanan 1 atm selama 15 menit. Sterilisasi tersebut  dilakukan  untuk  mencegah  adanya kontaminasi dari mikroorganisme lain yang menempel pada substrat tersebut. Lempeng baja dimasukkan pada masing-masing tabung reaksi yang berisikan 9 mL TSB dan telah terisi dengan masing-masing isolat dengan kepadatan  10 6 cfu/mL.  Proses  selanjutnya  yakni melakukan inkubasi (suhu 37°C) dan di-shaker selama 24 jam. Memasukkan setiap lempeng baja pada pelarut NaCl fisiologis dan dilakukan pengukuran nilai OD pada spektrofotometer.  Nilai  OD  menunjukkan  jumlah banyak  sedikitnya  bakteri  yang  menempel  pada substrat lempeng baja.
Uji pewarnaan gram dengan mengacu pada metode (Ako  et  al.,  2020).  Uji  patogenitas  dilakukan  pada udang vaname yang dibudidaya pada akuarium dengan volume air sebanyak 36 L dengan kepadata 15 ekor/ akuarium.  Pemeliharaan  dilakukan  selama  12  hari dengan  pemberian  pakan  sehari  sebanyak  dua  kali. Setiap  akuarium  diberi  10 10 cfu/mL  masing-masing isolat dan satu akuaium kontrol tanpa pemberian isolat (Pahlawi et al., 2019).

## HASIL DAN BAHASAN
Isolasi dilakukan untuk memisahkan bakteri satu dengan  yang  lainnya  berdasarkan  karakteristiknya
(Sousa et al., 2015). Hasil dari isolasi pada media NA diperoleh lebih dari 30 koloni yang tumbuh, sehingga dipilih  lima  isolat  yang  memiliki  karakteristik  yang berbeda. Pemilihan isolat dapat dilihat pada Tabel 1.
Dari hasil inokulasi didapatkan lima isolat bakteri dengan  karakteristik  morfologi  yang  berbeda,  hasil pengamatan tersebut ditunjukkan pada Tabel 1. Kelima isolat tersebut selanjutnya dimurnikan dengan metode gores empat kuadran sebagai stok isolat murni. Isolat bakteri  yang  tumbuh  pada  media  NA  kemudian diinokulasi  pada  media  SMA  untuk  dilakukan  uji aktivitas  proteolitik.
Hasil  dari  uji  aktivitas  proteolitik  menunjukkan bahwa kelima isolat dapat tumbuh pada media SMA dan  menghasilkan  zona  bening  (memiliki  aktivitas proteolitik).  Hasil  tersebut  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Dari  kelima  isolat  selanjutnya  dipilih  tiga  isolat yang memiliki nilai aktivitas proteolitik yang tinggi. Isolat  tersebut  di  antaranya  yaitu  UD-1,  UD-2,  dan UD-3. Nilai aktivitas yang tertinggi yaitu pada isolat UD-1  sebesar  2,49  ±  0,9  cm.  Berdasarkan  hasil inokulasi diperoleh bahwa isolat yang tumbuh pada media  SMA  mampu  membentuk  zona  bening  yang menandakan  isolat  tersebut  mampu  mendegradasi protein.  Zona  bening  yang  terbentuk  di  sekeliling isolat  menandakan  adanya  aktivitas  protease ekstraseluler (Suo et al., 2021). Diameter zona bening setiap  isolat  berbeda-beda  tergantung  dari kemampuan  setiap  isolat  menghasilkan  protease ekstraseluler untuk menghidrolisis protein di luar sel. Menurut Colantuono et al. (2020), semakin besar zona bening  yang  terbentuk  di  sekeliling  isolat  maka kemampuan  isolat  dalam  menghasilkan  enzim  pro- tease semakin baik. Dari hasil pengukuran  aktivitas proteolitik (Gambar 1) didapatkan lima isolat dengan nilai aktivitas proteolitik tertinggi yaitu isolat UD-1, UD-2,  dan  UD-3.  Selanjutnya  ketiga  isolat  tersebut dilakukan  uji  lanjut  sebagai  syarat  bakteri  kandidat probiotik.
Hasil dari uji ketahanan asam (pH 3) dan kontrol (pH 7) pada isolat UD-1, UD-2, dan UD-3 yang dilakukan pengukuran nilai OD dengan panjang gelombang 620 nm dapat dilihat pada Gambar 3.
Saluran pencernaan udang pada umumnya memiliki pH asam (Kim et al., 2021), untuk itu, isolat kandidat probiotik dilakukan uji menggunakan pH asam (pH 3) dan (pH 7) (Ayyash et al., 2021). Menurut Kim et al. (2021), saluran pencernaan udang memiliki suasana pH asam yaitu pada kisaran pH 2-3. Pada Gambar 3 dapat diketahui dari ketiga isolat tersebut memiliki nilai  OD  tinggi,  yang  menandakan  bakteri  dapat tumbuh pada kondisi asam. Menurut Mohamad et al.
Tabel 1. Morfologi koloni bakteri hasil isolasi dari usus udang Table 1. The morphology of bacterial colonies isolated from shrimp intestines Isolat Isolates Warna Color Bentuk Shape Elevasi Elevation Tepian Edge Karakteristik optik Optical characteristics UD-1 Putih White Tidak teratur Irregular Cembung Convex Seluruh Entire Tembus cahaya Translucent UD-2 Krem Beige Bundar Circular Naik Raised Bergelombang Undulate Tembus cahaya Translucent UD-3 Krem Beige Tidak teratur Irregular Naik Raised Seluruh Entire Tidak tembus cahaya Not  translucent UD-4 Krem Beige Bundar Circular Datar Flat Seluruh Entire Tidak tembus cahaya Not  translucent UD-5 Putih White Tidak teratur Irregular Datar Flat
Filamen
Tembus cahaya Translucent
Gambar 1. Aktivitas proteolitik isolat pada media SMA (skala 4:5). Figure 1. Proteolytic activity of isolates on skim milk agar media.
2.49 ± 0.9 2.33 ± 0.24 1.85 ± 0.07 1.11 ± 0,43 1.36 ± 0.7 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 UD 1 UD 2 UD 3 UD 4
UD 5
N ila i ak ti vi ta s Pr o te o lit ik Pr ot eo lyt ic a ct iv it y va lu es (c m ) Perlakuan (Treatments)
Gambar 2. Nilai  aktivitas  proteolitik. Figure 2. Proteolytic activity values.
(2012),  kriteria  bakteri  sebagai  kandidat  probiotik salah satunya harus dapat hidup pada kondisi asam.
Hasil dari uji pertumbuhan bakteri yang dilakukan selama 14 jam dengan pengukuran nilai OD dua jam sekali dapat dilihat pada Gambar 4.
Uji pertumbuhan dilakukan pada ketiga isolat UD- 1, UD-2, dan UD-3. Uji pertumbuhan dilakukan untuk mengetahui waktu yang tepat pertumbuhan optimal dari setiap isolat. Pengamatan pertumbuhan bakteri dilakukan  di  setiap  dua  jam  sekali  selama  20  jam dengan melakukan pengukuran nilai OD (620 nm) untuk mengetahui  fase  pertumbuhan  dari  masing-masing isolat.  Setelah  mengetahui  nilai  OD  setiap  isolat,
selanjutnya  nilai  tersebut  dimasukkan  dalam persamaan kurva standar. Penggunaan kurva standar dilakukan  karena  dengan  metode  ini  maka  dapat mengetahui jumlah sel bakteri secara tidak langsung. Kurva  standar  tersebut  diperoleh  dengan meregresikan  antara  nilai  OD  dengan  jumlah  TPC. Berdasarkan  analisis  nilai  regresi  dapat  diketahui bahwa nilai OD dengan jumlah TPC memiliki pola yang linier. Pola tersebut terbentuk berdasarkan persamaan yaituo pada:
Gambar 3. Grafik pengukuran OD pada media pH 3 dan pH 7.
Figure 3. Graph of optical density measurement on pH 3 and pH 7. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 2 4 6 8 2 4 6 8 pH 3 pH 7 K ep ad at an b ak te ri
O pt ic al d en si ty ( λ 6 2 0 n m ) Pengamatan (jam) / Observation (hours) UD 1 UD 2 UD 3
Gambar 4. Grafik pertumbuhan bakteri. Figure 4.
Bacterial growth graph. 0 5 10 15 20 2 4 6 8 10 12 14 K ep ad at an b ak te ri A bu nd an ce o f ba ct er ia (C FU /m L) Pengamatan (jam) Observation (hours) UD1 UD2 UD3 1) ..... 1,2795 11,883x Y UD3 Isolat 5,3473 16,883x Y UD2 Isolat 3,579 13,525x Y UD1 Isolat
     
Pengamatan (jam) Observation (hours)
Berdasarkan persamaan tersebut maka akan lebih mudah dalam penghitungan jumlah sel bakteri terhadap nilai OD. Berdasarkan grafik pertumbuhan (Gambar 4) ketiga  isolat  mengalami  fase  penyesuaian  pada lingkungan baru sangat cepat. Ketiga isolat tersebut mengalami fase eksponensial di mulai dari jam ke-2 hingga  jam  ke-8.  Isolat  UD-1  dan  UD-2  mengalami fase stasioner di antara jam ke-8 dan ke-9. Isolat UD- 3 fase stasioner terjadi di antara jam ke-9 dan ke-10. Kemudian kurva ketiga isolat tersebut menunjukkan penurunan yang berarti fase kematian. Pertumbuhan bakteri  dapat  dipengaruhi  oleh  beberapa  faktor  di antaranya yaitu pH, nutrisi, dan  suhu (Setyati et  al., 2015). Menurut Rolfe et al. (2012), kurva pertumbuhan menunjukkan adanya aktivitas pertumbuhan ataupun pembelahan sel  suatu mikroorganisme yang diawali dengan fase pertumbuhan  dan diakhiri dengan  fase kematian.
Bakteri yang digunakan pada uji antagonisitas yaitu bakteri Vibrio harveyi. Bakteri ini merupakan bakteri patogen yang umum menyerang pada budidaya udang vaname.  Infeksi  bakteri  vibrio  akan  menyebabkan udang stres dan bahkan mengalami kematian massal. Uji terhadap bakteri patogen ini dimaksudkan untuk mengetahui  kemampuan  dari  setiap  isolat  unuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Aktivitas menghambat yang ditunjukkan oleh bakteri kandidat probiotik ditandai dengan terbentuknya zona hambat di  sekeliling  isolat  (Moussaid  et  al.,  2019).  Dari pengukuran zona hambat yang terbentuk di sekeliling koloni  isolat  bakteri  diperoleh  zona  hambat  pada isolat  UD-1  sebesar  12,3  mm;  isolat  UD-2  sebesar 9,9  mm  dan  isolat  UD-3  sebesar  5,5  mm.  Hasil tersebut berdasarkan pemilihan zona hambat terbesar di  masing-  masing  isolat.  Semakin  luas  area  zona hambat  yang  terbentuk  hal  tersebut  menunjukkan bahwa  isolat  tersebut  menghambat  pertumbuhan bakteri patogen dengan baik (Nopitawati, 2010). Zona
hambat yang terbentuk dapat dilihat pada Gambar 5. Bakteri  kandidat  probiotik  mampu  menghambat pertumbuhan bakteri patogen dengan memproduksi antibotik, asam organik tertentu, membentuk produk bakteriosin,  dan  dapat  menekan  jumlah  populasi bakteri lain (Wijayanto, 2015). Nilai zona hambat dari ketiga isolat yang memiliki nilai tertinggi yaitu isolat UD-1  sebesar  12,3  mm  Davis  &  Stout  (1971).  Zona hambat  dengan  diameter  >  20  mm  dikategorikan sangat  kuat,  diameter  10-20  mm  kategori  kuat,  di- ameter 5-10 mm dikategorikan sedang, dan diameter < 5 dikategorikan daya hambatnya lemah.
Uji  penempelan  bakteri  dilakukan  untuk mengetahui  kemampuan  setiap  isolat  untuk menempel pada epitel usus udang dan bersaing dengan bakteri  lainnya  ataupun  malah  terbuang  bersamaan dengan sisa makanan (Mohamad et al., 2012). Uji ini dilakukan dengan menggunakan substrat lempeng baja. Pemilihan  substrat  tersebut  berdasarkan  dari komposisi penyusun yang merupakan bahan yang tidak mudah korosif sehingga tidak akan memengaruhi hasil dari uji penempelan ini.
Berdasarkan  dari  uji  tersebut  dapat  diketahui kemampuan dari setiap isolat untuk menempel pada substrat yang ditunjukkan pada nilai OD yang berbeda- beda. Dari Tabel 2, dapat diketahui dari ketiga isolat tersebut terdapat satu isolat yang memiliki nilai OD tertinggi  yaitu  isolat  UD-1  dengan  nilai  absorbansi 0,971  yang  berarti  isolat  tersebut  memiliki kemampuan  menempel  paling  baik  dibandingkan dengan  yang  lainnya.  Ada  dua  sifat  bakteri  untuk menempel  yaitu  autoagregasi  (membentuk  koloni dengan  strain  yang  sejenis)  dan  koagregasi (membentuk  agregat  dengan  strain  bakteri  yang berbeda),  sifat  autoagregat  sangat  penting  untuk probiotik  dapat  berkolonisasi  dan  bertahan  pada saluran pencernaan (Jankovi et al., 2012).
Gambar 5. Zona hambat terhadap bakteri patogen. Figure 5. Zone of inhibition against pathogenic bacteria.
Uji pewarnaan gram dilakukan pada setiap isolat untuk mengetahui bakteri kandidat probiotik tersebut termasuk  gram  positif  ataupun  negatif.  Hasil  uji pewarnaan gram dapat dilihat pada Tabel 3.
Uji  pewarnaan  gram  yang  dilakukan  pada  setiap masing-masing  isolat  menunjukkan  bahwa  ketiga isolat tersebut termasuk bakteri gram positif (Tabel 3). Hasil tersebut menunjukkan  bahwa setiap isolat merupakan bakteri gram positif karena menunjukkan warna ungu (Rahmiati & Mumpuni, 2017). Bakteri gram positif berwarna ungu karena bakteri tersebut mampu mempertahankan  warna  dari  kristal  violet  yang menandakan  bakteri  tersebut  memiliki  lapisan peptidoglikan yang tebal.
Hasil  uji  patogenitas  tidak  menunjukkan  gejala klinis  yang  buruk,  pengamatan  gejala  klinis  dapat dilihat pada Tabel 4.
Uji  patogenitas  dilakukan  untuk  mengetahui masing-masing isolat bersifat patogen terhadap inang sehingga dapat menyebabkan sakit ataupun kematian (Pahlawi et al., 2019). Hasil pengamatan menunjukkan bahwa udang dalam kondisi sehat, hal ini dapat dilihat dari nafsu makan udang yang baik, pergerakan lincah, tidak terdapat luka di badan dan tidak ada kematian
udang.  Hasil  ini  juga  membuktikan  bahwa  bakteri kandidat  probiotik  yang  diisolasi  dari  usus  udang jerbung tidak bersifat patogen dan telah memenuhi persyaratan  sebagai  kandidat  probiotik  (Verschuere et al., 2000).

## KESIMPULAN
Screening  bakteri  dari  saluran  pencernaan  udang yang dapat menghasilkan enzim protease didapatkan lima isolat yaitu: UD-1, UD-2, UD-3, UD-4, dan UD-5. Berdasarkan uji yang dilakukan didapatkan tiga isolat (UD-1, UD-2, dan UD-3) yang telah memenuhi syarat sebagai kandidat probiotik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  diucapkan  pada  Dirjen  Dikti Kemendikbud Ristek yang telah mendanai penelitian ini melalui Program Kreatifitas Mahasiswa (PKM-RE).

## KONTRIBUSI PENULIS
Penulis Satu menyiapkan naskah (manuskrip) dan persiapan; Penulis Dua melakukan percobaan; Penulis Tiga melakukan percobaan dan analisis data 3; Penulis Empat melakukan arahan riset, desain percobaan, dan penyelesaian naskah.
Tabel 2. Nilai OD dan TPC uji penempelan
Table 2. OD and TPC values of attachment test Isolat Isolates Absorbansi (Absorbance ) (620 nm) Kemampuan penempelan Attachment ability (CFU/mL) UD-1 0.971 15.3 x 10 2 UD-2 0.131 8.4 x 10 2 UD-3 0.872 12.9 x 10 2
Tabel 3. Pewarnaan gram pada setiap isolat Table 3. Gram stain on each isolate
Isolat Isolates UD-1 UD-2 UD-3 Gram
(+)
Gram positif Positive gram
(+)
Gram positif Positive gram
(+)
Gram positif Positive gram
Gambar
Figure

## DAFTAR  ACUAN
Ako, S.E., Akum, E.A., Nkenfou, C.N., Pokam, T.B., & Assob, J.C.N. (2020). Fecal gram stain morphotype and their distribution patterns in a Cameroonian cohort with and without HIV infection. Scientific African,
8, e00376, DOI:10.1016/ j.sciaf.2020.e00376.
Ayyash,  M.M.,  Abdalla,  A.K.,  AlKalbani,  N.S.,  Baig, M.A., Turner, M.S., Liu, S-Q., & Shah, N.P. (2021). Invited review: Characterization of new probiotics from  dairy  and  nondairy  products-Insights  into acid tolerance, bile metabolism and tolerance, and adhesion capability. Journal of Dairy Science, 104(8), 8363-8379. DOI: 10.3168/jds.2021-20398.
Budiardi,  T.,  Muzaki  A.,  &  Utomo,  N.B.P.  (2013). Produksi  udang  vaname  (Litopenaeus  vaname)  di tambak biocrete dengan padat penebaran berbeda. Jurnal Akuakultur Indonesia, 4(2), 109-113.
Colantuono,  A.,  D’Incecco,  P.,  Fortina,  M.G.,  Rosi, V.,  Ricci,  G.,  &  Pellegrino,  L.  (2020).  Milk  sub- strates influence proteolytic activity of Pseudomo- nas fluorescens strains. Food Control, 111, 107063.
Davis, W.W. & Stout, T.R. (1971). Disc plate methods of  microbiological  antibiotic  assay.  Microbiology 22  (4):  659-665  doi:  10.1128/am.22.4.659- 665.1971.
Ding,  S.,  Yan,  W.,  Ma,  Y.,  &  Fang,  J.  (2020).  The  im- pact of probiotics on gut health via alternation of immune status of monogastric animals. Animal Nu- trition, 7(1). DOI: 10.1016/j.aninu.2020.11.004.
Falcinelli,  S.,  Rodiles,  A.,  Hatef,  A.,  Picchietti,  S., Cossignani, L., & Merrifield, D.L. (2018). Influence of  probiotic  administration  on  gut  microbiota core. A review on the effect on appetite control,
glucose  and  lipid  metabolism.  Journal  of  Clinical Gastroenterology, 52, S50-S56.
Jankoviæ, T., Frece, J., Abram, M., & Gobin, I. (2012).
Ag-gregation ability of potential probiotic Lactoba- cillus plantarumstrains. Int. J. Sanitary Eng, Res., 6, 19-24.
Kim, S., Jeon, H., Han, H., & Hur, J.W. (2021). Evaluasi Bacillus  albus  SMG-1  dan  B.  safensis  SMG-2  yang diisolasi  dari  Danau  Saemangeum  sebagai probiotik  untuk  budidaya  udang  vaname (Litopenaeus  vannamei).  Laporan  Budidaya,  20, 100743.
Kurniasih, T., Widanarni, Mulyasari, Melati, I., Azwar, Z.I., & Lusiastuti, A.M. (2013). Isolasi, seleksi, dan identifikasi bakteri dari saluran  pencernaan ikan lele  sebagai  kandidat  probiotik.  Jurnal  Riset Akuakultur, 8(2), 277-286.
Liu, X., He, X., Huang, G., Zhou, Y., & Lai, J. (2021). Bioremediation by the mullet Mugil cephalus feed- ing  on  organic  deposits  produced  by  intensive shrimp mariculture. Aquaculture, 541, 736674.
Lunes,  R.S.,  Branco,  P.C.,  Pressinotti,  L.N.,  de Carvalho, R.A.D.L., & da Silva, J.R.M. (2021). Does the  heterotrophic  system  influence  the  cellular immune response of Litopenaeus vannamei shrimp? In vitro phagocytosis indices and superoxide an- ion production comparisons. Fish and Shellfish Im- munology Reports, 2, 100009.
Meyers,  A.,  Furtmann,  C.,  &  Jose,  J.  (2018).  Direct optical density determination of bacterial cultures in microplates for high-throughput screening ap- plications. Enzyme and Microbial Technology, 118, 1-5.
Tabel 4. Pengamatan gejala klinis udang yang dipelihara pada media yang mengandung bakteri kandidat probiotik
Table 4. Observation of clinical symptoms of shrimp reared in media containing candidate probiotic bacteria
Keterangan (Note): - : tidak ada (not) + : sedikit/cukup (fairly) ++ : baik (good) +++ : sangat baik (very good)
Parameter Parameters UD-1 UD-2 UD-3 Pergerakan (Movement ) +++ +++ ++ Nafsu makan (Apetite ) +++ +++ ++ Luka di badan (Body wounds ) - - - Kematian (Mortality ) - - -
Mohamad, N., Manan, H., Sallehhuddin, M., Musa, N.,
& Ikhwanuddin, M. (2020). Screening of lactic acid bacteria  isolate  from  giant  freshwater  prawn (Macrobrachium rosenbergii) as potential probiotics. Aquaculture Reports, 18, 100523.
Moussaid, F., Barnossi, A.E., Chahmi, N., & Housseini, A.I.  (2019).  Screening  and  selection  of  new  mi- crobial anti-Candida. Materials Today: Proceedings, 13, 1049-1054.
Newaj-Fyzul,  A.  &  Austin,  B.  (2015).  Probiotics, immunostimulants,  plant  products  andoral  vac- cines, and their role as feed supplements in the control  of  bacterial  fishdiseases.  Journal  of  Fish Diseases, 38, 937-955.
Nopitawati,  T.  (2010).  Seleksi  bakteri  probiotik  dari saluran  pencernaan  untuk  meningkatkan  kinerja pertumbuhan  udang  vaname  (Litopenaeus vannamei).  Tesis.  Insitut  Pertanian  Bogor.
Pahlawi,  I.M.H.  &  Satyantini,  W.H.  (2019).  Pathoge- nicity  test  of  Pseudomonas  sp.  in  white  shrimp (Litopanaeus vannamei) as a probioitic candidate. Journal of Aquaculture and Fish Health, 8(2), 92-98.
Rahmiati, R. & Mumpuni, M. (2017). Eksplorasi bakteri asam  laktat  kandidat  probiotik  dan  potensinya dalam  menghambat  bakteri  patogen.  Elkawnie: Journal of Islamic Science and Technology, 3(2), 141- 150.
Rico, A., Satapornvanit, K., Min, J., Shahabuddin, A.M., Henriksson,  P.J.G.,  Murray,  F.J.,  Little,  D.C., Dalsgaard, A., & Van den Brink, P.J. (2013). Use of veterinar y  medicines,  feed  additives  and probiotics  in  four  major  internationally  traded aquaculture species farmed in Asia. Aquaculture, 412-413, 231-243. DOI: 10.1016/ j.aquaculture.2013.07.028.
Ringo,  E.,  Van  Doan,  H.,  Lee,  S.H.,  Soltani,  M., Hoseinifar,  S.H.,  Harikrishnan,  R.,  &    Song,  S.K. (2020). Probiotics, lactic acid bacteria and bacilli: Interesting supplementation for aquaculture. Jour- nal of Applied Microbiology, 129, 116-136. https:// doi.org/10.1111/jam.14628.
Rohyati, I.S. (2015). Improved of growth rate of aba- lone Haliotis asinine fed pudding probiotic-enriched protein. Procedia Environmental Sciences, 23, 315- 322.
Rolfe,  M.D.,  Rice,  C.J.,  Lucchini,  S.,  Pin,  C.,  Thomp- son, A., Cameron, A.D., Alston, M., ....., & Baranyi,
J. (2012). Lag phase is a distinct growt phase that prepares  bacteria  for  exonential  growth  and  in- volves  transient  metal  accumullation.  Journal  of Bacteriology, 194(3), 686-701.
Setyati,  W.A.,  Martani,  E.,  &  Zainuddin,  M.  (2015). Kinetika pertumbuhan dan aktivitas protease isolat 36k  dari  sedimen  ekosistem  mangrove, Karimunjawa,  Jepara.  Indonesian.  Journal  of  Ma- rine Sciences/Ilmu Kelautan, 20(3), 163-169.
Sarastiti,  S.,  Suminto,  &  Sarjito.  (2020).  Molecular identfication  bacteria  as  probiotik  candidate isolatd  from  intestinal  tract  of  vaname  shrimp (Litopenaeus  vannamei).  Jurnal  Pasir  Laut,  4(1),  9- 15.
Sousa,  A.M.,  Pereira,  M.O.,  &  Lourenço,  A.  (2015). MorphoCol: An ontology- based knowledgebase for  the  characterisation  of  clinically  significant bacterial colony morphologies. Journal of Biomedi- cal Informatics, 55, 55-63.
Suo,  X.,  Huang,  S.,  Wang,  J.,  Fu,  N.,  Jeantet,  R.,  & Chen, X.D. (2021). Effect of culturing lactic acid bacteria with varying skim milk concentration on bacteria survival during heat treatment. Journal of Food  Engineering,  https://doi.org/10.1016/ j.jfoodeng.2020.110396.
Suriawan,  A.,  Efendi,  S.,  Asmoro,  S.,  &  Wiyana,  J. (2019). Sistem budidaya udang vaname (Litopenaeus vannamei) pada tambak HDPE dengan sumber air bawah  tanah  salinitas  tinggi  di  Kabupaten Pasuruan. Jurnal Perekayasaan Budidaya Air Payau dan Laut, 1(14), 6-14.
Van  Doan,  H.,  Hoseinifar,  S.H.,  Ringø,  E.,  Esteban, M.Á., Dadar, M., & Dawood, M.A.O. (2019). Host- associated probiotics: A key factor in sustainable aquaculture.  Reviews  in  Fisheries  Science  & Aquaculture.
Verschuere,  L.,  Rombaut,  G.,  Sorgeloos,  P.,  & Verstraete,  W.  (2000).  Probiotic  bacteria  as  bio- logical control agents in aquaculture. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(4), 655-671.
Wijayanto, N., Feliatra, F., & Nedi, S. (2015). Antago- nism test of probiotics bacteria isolate from black tiger shrimp (Penaeus monodon) against patogens (Aeromonas  hydrophila,  Pseudomonas  sp.,  and Vibrio  alginolyticus)  .  Disertasi.  Universitas  Riau. Jambi.