## Nematoda Puru Akar pada Seledri (Apium graveolens L.) dan Pengendaliannya Menggunakan Bakteri
Endofit Secara In Vitro
Rootknot Nematodes in Celery (Apium graveolens L.) and Its in Vitro Control Using Endophytic Bacteria
Fitrianingrum Kurniawati 1* , Neng Tipa Nursipa 1 , Abdul Munif 1
1 Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jl. Kamper, Kampus IPB Dramaga, Bogor, 16680 *Email korespondensi: fitrianingrum@apps.ipb.ac.id
Diterima: 07 Januari 2020 / Disetujui: 18 Maret 2020.

## ABSTRACT
Root  knot  nematodes  can  cause  disease  on  celery.  Endophytic  bacteria  as  biocontrol  agents  is  an  alternative  for controlling nematodes. This research aimed to identify plant-parasitic nematodes that associated with celery in  Cikole Village, Cihideung, and Ciputri and control these nematodes using endophytic bacteria. Nematodes were extracted from soil and root samples  by  flotation-centrifugation  and  mist  chamber  techniques.  Root  knot  nematodes  were  identified  based  on  their morphological  characters  and  were  characterized  by  the  female  perineal  pattern.  Endophytic  bacteria  were  isolated  from ‘kenikir’ on TSA 20%. Bacteria obtained were subsequent hypersensitive test, hemolysis test and in vitro test. Four species of root  knot  nematodes,  which  were  M.  incognita,  M.  arenaria,  M.  javanica,  and  M.  hapla  were  identified.  Eleven  bacteria isolates showed negative reaction on hipersensitive test and hemolysis test. Isolates with code EB45, EB48, EB28, EB13, EB49 caused nematodes mortality with the highest percentage of 53.74%, 51.41%, 49.45%, 47.71%, and 47.69% at 12 hours after in vitro treatment.

## Keywords:  celery, endophytic bacteria, Meloidogyne, root knot nematodes

## ABSTRAK
Nematoda puru akar (Meloidogyne spp.) merupakan salah satu patogen penyebab penyakit pada seledri. Pengendalian nematoda puru akar menggunakan bakteri endofit merupakan salah satu alternatif pengendalian yang dapat dipertimbangkan. Tujuan  dari  penelitian  ini  mengidentifikasi  nematoda  puru  akar  yang  berasosiasi  dengan  tanaman  seledri  di  Desa  Cikole, Cihideung,  dan  Ciputri  serta  pengendaliannya  menggunakan  bakteri  endofit.  Ekstraksi  nematoda  menggunakan  metode flotasi-sentrifugasi  dan  pengabutan.  Identifikasi  nematoda  berdasarkan  karakteristik  morfologi,  dan  karakter  pola  perineal nematoda  betina.  Bakteri  endofit  diisolasi  dari  tanaman  kenikir.  Bakteri  endofit  yang  didapatkan  selanjutnya  di  uji hipersensitif, uji aktivitas hemolisis dan uji in vitro. Empat spesies nematoda puru akar, yaitu M. incognita, M. arenaria, M. javanica dan M. hapla teridentifikasi berdasarkan karakter pola perineal. Sebanyak 11 isolat menunjukkan reaksi negatif uji hipersensitif dan uji aktivitas hemolisis. Isolat dengan kode EB45, EB48, EB28, EB13, EB49 merupakan isolat dengan jumlah mortalitas nematoda terbanyak dengan persentase berturut-turut 53,74%, 51,41%, 49,45%, 47,71%, dan 47,69% pada 12 jam setelah perlakuan pada uji in vitro.
Kata kunci: bakteri endofit, Meloidogyne, nematoda puru akar, seledri

## PENDAHULUAN
Tanaman  seledri  ( Apium  graveolens L.)  merupakan komoditas  sayuran  bernilai  ekonomi  yang  sering digunakan sebagai  penyedap  makanan,  bumbu  masakan  dan  penghias hidangan  (Kasahara  dan  Hemmi  1995).  Salah  satu  kendala dalam  budi  daya  tanaman  seledri  ialah  gangguan  nematoda parasit  akar  yang  dapat  menyebabkan  penyakit  yang  serius dan  menimbulkan  kehilangan  hasil  mencapai  70%  di Michigan Amerika Serikat (Melakeberhan dan Wang 2012).
Beberapa jenis nematoda dilaporkan dapat menyebabkan  penyakit  pada  tanaman  seledri.    Penelitian
Rosya  dan  Winarto  (2013)  melaporkan  bahwa  di  Sumatera Barat  nematoda  yang  menyerang  tanaman  seledri  yaitu Helicotylenchus , Trichodorus , Longidorus , Xiphinema dan nematoda  puru  akar  (NPA) Meloidogyne spp . . Luc et  al. (2001) menyatakan bahwa tanaman seledri merupakan inang dari M.  incognita,  M.  javanica ,  dan M.  thamesi .  Spesies Meloidogyne yang  telah  dilaporkan  berasosiasi  dengan seledri di Indonesia adalah M. incognita , M. arenaria, dan M. javanica (Kurniawati et al . 2017). Meloidogyne spp.  merupakan  nematoda  yang berkembang sangat  cepat  dan mempunyai daya tekan tinggi terhadap  pertumbuhan  tanaman  dengan  gejala  khas  terlihat
DOI: https://doi.org/10.21107/agrovigor.v13i1.6304
pada  akar,  yaitu  berupa  bintil-bintil  yang  disebut  dengan puru akar (Whitehead 1998). Selain terbentuknya puru akar, akar  lebih  sedikit,  daun  mengalami  klorosis,  layu,  banyak yang  gugur,  dan  tanaman  kerdil,  dan  serangan  yang  berat menyebabkan  tanaman  mati  (Prasasti  2012).  Pengendalian nematoda  parasit  tanaman  yang  biasa  dilakukan  yaitu dengan  menggunakan  nematisida,  agens  antagonis,  dan pergiliran  tanaman  (Luc  e t  al. 2001).  Penggunaan  pestisida sintetik dinilai dapat mencemari lingkungan dan menganggu keseimbangan  ekosistem  apabila  penggunaannya  tidak terkontrol.  Alternatif  pengendalian  hama  dan  penyakit tanaman  yang  ramah  lingkungan  untuk  mendukung kehidupan  yang  lebih  sehat  perlu  terus  dikembangkan.  Hal ini  sejalan  dengan  salah  satu  konsep  pengendalian  hama terpadu (PHT), yaitu pengendalian hayati dengan memanfaatkan  komponen  biologi.  Konsep  ini    merupakan salah  satu  pilihan  teknologi  pengendalian  yang  perlu dikembangkan  karena  rendahnya  dampak  negatif  terhadap lingkungan,  murah  dan  berkelanjutan  ( sustainable )  (Barker dan Koening  1998). Salah satu  alternatif pengendalian yang dapat digunakan yaitu penggunaan bakteri endofit.
Bakteri  endofit  merupakan  bakteri  saprofit  yang hidup  dan  berasosiasi  dengan  jaringan  tanaman  yang  sehat tanpa  menimbulkan  gejala  penyakit.  Keberadaan  bakteri- bakteri  endofit  di  dalam  jaringan  tanaman  berperan  dalam perbaikan  pertumbuhan  tanaman  ( plant  growth  promotion ) karena kemampuannya dalam mensintesis dan memobilisasi fosfat, hormon pertumbuhan dan enzim serta berperan dalam ketahanan  tanaman  sebagai  agens  hayati.  Bakteri  endofit diduga  mampu  memproduksi  antibiotik  dan  senyawa antimikroba lainnya yang sangat berperan dalam menginduksi ketahanan tanaman terhadap serangan penyakit dan hama. Bakteri endofit dapat ditemukan di berbagai jenis tanaman  seperti  tanaman  hortikultura,  perkebunan,  pangan, dan kehutanan (Munif et al., 2012). Munif dan Harni (2011) berhasil  mengisolasi  bakteri  endofit  dari  tanaman  lada  dan beberapa diantaranya terbukti efektif dalam menekan jumlah puru pada akar dan populasi  juvenil  nematoda M. incognita di dalam tanah hingga mencapai 90%.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi  NPA yang  berasosiasi  dengan  tanaman  seledri  di  Desa  Cikole Kecamatan Lembang, Desa Cihideung Kecamatan
Parongpong  Bandung  Barat  dan  Desa  Ciputri  Kecamatan Pacet  Cianjur  dan  mengetahui  potensi  bakteri  endofit  asal tanaman kenikir dalam mengendalikan NPA.

## BAHAN DAN METODE

## Pengambilan Sampel dan Pengamatan Gejala
Pengambilan  sampel  dilakukan  dengan  metode purposif  di  lahan  seledri  milik  petani  di  Desa  Cikole,  Desa Cihideung  dan  Desa  Ciputri.  Sampel  yang  diambil  berupa tanah  dan  akar  tanaman  seledri.  Pengambilan  sampel  tanah dilakukan  dengan  menggunakan  bor  tanah  (diameter  5  cm) pada  kedalaman  15  cm  dengan  jarak  10  cm  dari  batang tanaman.  Sampel  tanah  kemudian  dimasukkan  ke  dalam kantong  plastik  dan  amplop  berwarna  coklat  yang  telah diberi  label  dan  dibawa  ke  laboratorium.  Pengambilan
sampel  akar  dilakukan  dengan  mencabut  akar  tanaman seledri  sampai  bagian  pangkal.  Sampel  akar  kemudian dimasukan  dalam  kantong  plastik  dan  amplop  berwarna coklat  yang  telah  diberi  label  dan  dibawa  ke  laboratorium. Selain  itu,  dilakukan  pendataan  untuk  mendapatkan informasi  awal  mengenai  tipe  gejala  tanaman  yang disebabkan oleh nematoda Meloidogyne spp.

## Ekstraksi Nematoda dari Sampel Tanah
Sampel tanah dipisahkan dari gumpalan. Tanah yang halus  diambil  sebanyak  100  ml  dan  dicampurkan  dengan 800 ml air dalam ember A, lalu diendapkan selama 1 menit. Air  dari  ember  A  disarig  ke  dalam  ember  B  dengan menggunakan  saringan  kasar.  Air  dalam  ember  B  disaring diatas  saringan  bertumpuk  dengan  posisi  miring  30º,  yaitu berturut-turut  saringan  20  mesh,  50  mesh  dan  400  mesh. Substrat tanah dan nematoda yang tertinggal di saringan 400 mesh  dituang  ke  dalam  tabung  sentrifuse.  Substrat  di sentrifugasi  selama ± 5 menit dengan kecepatan 1 500 rpm, kemudian  supernatan  dibuang.  Endapan  ditambahkan dengan  larutan  gula  40%  dan  diaduk  sampai  merata. Selanjutnya  disentrifugasi  selama  ±  1  menit  dengan kecepatan  1  700  rpm.  Supernatan  yang  terbentuk  disaring dengan  saringan  500  mesh  dan  dibilas  dengan  air  yang mengalir  sehingga  diperoleh  suspensi  nematoda,  lalu dimasukkan  dalam  botol  koleksi  untuk  diamati  dan diidentifikasi (Caveness & Jensen 1955).

## Ekstraksi Nematoda dari Sampel Akar
Nematoda  diekstraksi  dari  sampel  akar  dengan menggunakan  metode  pengabutan  ( mist  chamber ).  Akar seledri  terlebih  dahulu  dibersihkan  kemudian  di  potong- potong sepanjang ± 1 cm dan ditimbang sebanyak 5 g. Akar yang telah di potong-potong disimpan diatas saringan kasar, lalu  diletakkan  diatas  corong  yang  dibawahnya  terdapat gelas  plastik  untuk  penampung  nematoda,  kemudian disimpan di ruang pengabutan dan dibiarkan selama 48 jam. Setelah  itu  gelas  plastik  yang  berisi  nematoda  disaring dengan  menggunakan  saringan  400  mesh  dengan  posisi saringan  agak  miring.  Nematoda  yang  bertahan  dalam saringan dipindahkan dan disimpan dalam botol koleksi lalu dimasukkan  dalam  kulkas  untuk  pengamatan  selanjutnya (Hutagalung 1988).

## Pembuatan Preparat Nematoda Semipermanen
Preparat  semi  permanen  dibuat  berdasarkan  metode Goodey  (1937)  yang  telah  dimodifikasi.  Lingkaran  parafin dibuat  diatas  gelas  objek  dengan  menggunakan  bor  gabus ( cork  borer )  dengan  ketebalan  yang  sama,  kemudian diteteskan  laktofenol  pada  tengah-tengah  lingkaran  parafin. Sebanyak  3-5  ekor  nematoda  diletakkan  pada  larutan laktofenol  dengan  posisi  yang  sama  sejajar,  selanjutnya ditutup  dengan  cover  glass.  Preparat  kemudian  dipanasi sampai  cincin  parafin  meleleh  kembali  dan cover  glass merekat  bersama  parafin.  Pinggir cover  glass direkatkan dengan kuteks transparan.

## Identifikasi Morfologi
Pengamatan  secara  morfologi  dilakukan  dengan melihat ciri dari tiap fase perkembangan nematoda tersebut. Pengamatan  dilakukan  dengan  menggunakan  kamera. Identifikasi  dilakukan  dengan  mengacu  pada  buku identifikasi  nematoda  yaitu  Plant  Parasitic  Nematodes  :  a Pictorial  Key  to  Genera  (May  &  Lyon  1996)  dan Nematology  Laboratory  Investigations  Morphology  And Taxonomy (Eisenback 2003)

## Penghitungan Nematoda
Penghitungan  jumlah  nematoda  dari  sampel  tanah dan  akar  dilakukan  di  bawah  mikroskop  stereo  dengan perbesaran 40x. Jumlah sampel  tiap penghitungan sebanyak 1 ml dan dilakukan sebanyak 5x ulangan.

## Isolasi Bakteri Endofit
Isolasi  bakteri  endofit  dari  akar  dan  batang  tanaman kenikir  dilakukan  dengan  menggunakan  metode  yang dilakukan  oleh  Hallmann  et  al. (1997)  dengan  modifikasi. Masing-masing  sampel  akar  dan  batang  dicuci  dengan  air mengalir  sampai  bersih,  kemudian  dikeringkan  dengan kertas  tissu  dan  ditimbang  sebanyak  2  g,  selanjutnya  akar disterilisasi  permukaan  dengan  menggunakan  NaOCl  3% yang telah diberi 0.01% Tween 20 selama 3 menit kemudian akar  dibilas  dengan  air  steril  sebanyak  4  kali.  Untuk mengetahui apakah sterilisasi permukaan berhasil atau tidak, diuji  dengan  meletakkan  akar  dan  batang  yang  sudah disterilkan  ke  dalam  cawan  petri  yang  sudah  diisi  media Tryptic Soy Agar (TSA) 20%, dan diinkubasi selama 48 jam. Akar maupun batang yang masih ditemukan mikroorganisme yang tumbuh pada permukaan akar, berarti sterilisasi  gagal  dan  bakteri  yang  diperoleh  tidak  dapat digunakan.  Perlakuan  ini  bertujuan  agar  bakteri  yang diperoleh  betul-betul  berasal  dari  jaringan  akar  dan  bukan dari  permukaan  akar  (kontaminan).  Akar  yang  sudah  steril dihancurkan dengan mortar steril sampai halus. Ekstrak akar disuspensikan  dengan  9  ml  air  steril  dalam  tabung  reaksi. Suspensi dikocok dengan menggunakan vorteks, selanjutnya dipindahkan sebanyak 1 ml suspensi ke dalam 9 ml air steril pada  tabung  reaksi.  Dengan  demikian  diperoleh  tingkat pengenceran  10 -2 dan  selanjutnya  dilakukan  pengenceran dengan  cara  yang  sama  dan  diperoleh  suspensi  10 -3 . Selanjutnya  dari  pengenceran  10 -3 diambil  0.1  ml  suspensi untuk ditumbukan pada media TSA 20%, diinkubasi selama 48  jam  pada  suhu  kamar.  Koloni  bakteri  yang  tumbuh dimurnikan  pada  media  TSA  100%.  Bakteri  yang  sudah murni  disimpan  di  dalam ependorf yang  telah  berisi  media air steril kemudian disimpan pada suhu -80 º C.
Uji Hipersensitif
Uji  hipersensitif dilakukan untuk mengetahui potensi patogenesitas  bakteri  endofit.  Tanaman  yang  digunakan dalam  uji  ini  adalah  tanaman  tembakau  sehat  berumur  3-4 bulan. Isolat  bakteri endofit yang akan diuji dibiakkan pada media TSA 100% dan diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu, sebanyak  20  ml  akuades  steril  dituangkan  pada  biakan  dan bakteri  dipanen  dengan  cara  meluruhkannya  menggunakan jarum  inokulasi.  Bakteri  endofit  yang  telah  diencerkan tersebut  kemudian  disuntikkan  dengan  menggunakan  jarum suntik  pada  daun  tembakau  dan  diinkubasi  selama  24  jam. Bakteri  yang  bereaksi  positif  akan  menunjukkan  gejala nekrosis pada daun tembakau. Bakteri yang bereaksi negatif tidak  menunjukkan  gejala  kerusakan  pada  daun  tembakau dan digunakan untuk pengujian selanjutnya.

## Uji Akivitas Hemolisis
Isolat  bakteri  endofit  ditumbuhkan  pada  media  agar darah  yang  diperoleh  dari  Lab  Bakteriologi  Tumbuhan Departemen Proteksi  Tanaman Institut Pertanian Bogor dan selanjutnya  diinkubasi  selama  24  jam.  Adanya  aktivitas hemolisis  ditandai  dengan  adanya  zona  hemolisis  pada  plat agar darah.

## Uji  Bakteri  Endofit  terhadap  Nematoda  Parasit  secara In Vitro
Uji  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  aktivitas antibiosis  bakteri  endofit  yang  diisolasi  terhadap  juvenil  2 (j2)  nematoda  parasit.  Uji  ini  dilakukan  dengan  cara memasukkan 1 ml suspensi nematoda yang berisi ±100 ekor larva  nematoda  ke  dalam  5  ml  suspensi  bakteri  endofit. Suspensi bakteri endofit dibuat dengan cara sebanyak 20 ml akuades  steril  dituangkan  pada  biakan  isolat  bakteri  endofit yang  berumur  48  jam  dan  dipanen  dengan  cara meluruhkannya menggunakan jarum inokulasi. Perlakuan ini dilakukan  sebanyak  3  kali  ulangan  untuk  setiap  perlakuan. Perhitungan jumlah mortalitas nematoda dilakukan 2, 6, dan 12 jam setelah perlakuan.

## Analisis Data
Rancangan  percobaan  yang  dilakukan  pada  uji in vitro adalah  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL).  Data  yang diperoleh  dianalisis  secara  statistika  dengan  menggunakan uji  Duncan  pada  program  SAS  9.1.3  dengan  selang kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kondisi Lokasi Pengambilan Sampel dan Gejala yang Ditemukan
Suhu pada pengambilan sampel di lokasi pengambilan sampel  berturut-turut berkisar 19-24 ºC,  18-22 ºC,  18-26  ºC.  Jenis  tanah  pada  ketiga  lokasi  memiliki  tipe yang sama, yaitu tipe andosol. Varietas seledri yang banyak dibudidayakan oleh petani yaitu varietas lokal.
Gejala  sekunder  terlihat  di  atas  permukaan  tanah, yaitu  pertumbuhan  tanaman  lambat,  gejala  defisiensi  hara seperti  kerdil,  daun  menguning  (klorosis),  dan  layu  pada cuaca  panas  (Dropkin  1991).  Gejala  sekunder  di  lahan terdapat daun berwarna kuning atau klorosis (Gambar 2a dan 2b)  dan  pada  saat  tanaman  dicabut  terdapat  puru  yang banyak  dengan  rambut  akar  pada  akar  seledri  tersebut (Gambar 2c).
Terbentuknya  puru  pada  akar  disebabkan  oleh Meloidogyne spp.  yang  dapat  menghasilkan  sekresi  protase sehingga  mengubah  protein  di  dalam  jaringan  akar  menjadi asam  amino.  Salah  satu  asam  amino  yang  dihasilkan  yaitu triptofan  yang  diduga  dapat  bertindak  sebagai  perangsang terjadinya  hormon  IAA.  Zat  tumbuh  tersebut  merangsang terjadinya  hiperplasia  (pertambahan  banyak  sel  yang  tidak normal)  dan  hipertropi  (pertambahan  besar  sel  yang  tidak normal) (Mulyadi 2009).
Meloidogyne  spp.  yang  Ditemukan  pada  Sampel  Tanah dan Akar
Rata-rata  jumlah  populasi  nematoda  parasit  di  Desa Cikole yaitu 444 ekor Meloidogyne spp., di Desa Cihideung lahan monokultur yaitu 330 ekor Meloidogyne spp, dan pada lahan  tumpang  sari  rata-rata  jumlah  populasi  nematoda parasit  yaitu  410  ekor Meloidogyne spp . Rata-rata  jumlah populasi nematoda parasit di Desa Ciputri lahan monokultur yaitu  200  ekor Meloidogyne spp.,  pada  lahan  tumpangsari dengan  bawang  daun  rata-rata  jumlah  populasi  nematoda parasit  yaitu  410  ekor Meloidogyne spp , serta rata-rata jumlah  populasi  nematoda Meloidogyne spp . dari  sampel akar  Desa  Cihideung  lahan  monokultur  yaitu  508  ekor, tumpang sari 2 068 ekor Meloidogyne spp. Rata-rata jumlah populasi nematoda parasit di Desa Ciputri lahan monokultur yaitu  400  ekor Meloidogyne spp,  dan  tumpang  sari  1290 ekor.
Menurut  Jayasinghe  (2002),  juvenil  stadia  2  (J2) Meloidogyne merupakan  stadia  paling  infektif  untuk melakukan  penetrasi  ke  dalam  perakaran. Setelah  J2  masuk
kedalam akar, J2 bergerak di antara sel-sel sampai di tempat dekat  silinder  pusat.  Di  tempat  tersebut  nematoda  menetap dan  menyebabkan  perubahan  sel-sel  yang  menjadi makanannya  (Dropkin  1991).  Panjang  tubuh  J2  yang ditemukan yaitu 100,911µm, stilet tipe stomatostilet dengan panjang  9,87  µm,  basal  knob offset ,  tubuh Meloidogyne bervariasi tergantung dari spesies. Fase istirahat Meloidogyne juvenil  2  memperlihatkan  bentuk  tubuh  yang relatif  lurus,  tipe  bibir  tidak  set-off  atau  tidak  memiliki lengkungan  bibir,  anulasi  halus,  dan  ujung  ekor  terlihat bergerigi (Gambar 2).
Karakter  yang  paling  sering  digunakan  untuk identifikasi  morfologi  spesies Meloidogyne spp . betina adalah  menggunakan  pola  perineal.  Pola  perineal  tersebut terletak  di  bagian  posterior  nematoda  betina  dewasa.  Hasil identifikasi  pola  perineal  menunjukkan  adanya  empat spesies Meloidogyne spp.  di  kelima  lokasi  pengambilan sampel.  Keempat  spesies  tersebut  adalah M.  incognita , M. javanica , M. arenaria , dan M. hapla . Masing-masing spesies nematoda  betina  tersebut  dapat  dikenali  berdasarkan  ciri khas  dari  pola  perineal  yang  dimiliki.  Perbedaan  pola perineal dari keempat spesies dapat dilihat pada Gambar 3.
M.  incognita mempunyai  ciri  khas  lengkung  dorsal yang  tinggi  dan  menyempit,  sedangkan  bagian  paling  luar sedikit  melebar  dan  agak  mendatar.  Pola  striasi  kasar, bergelombang  kadang  zig-zag,  tidak  memiliki  garis  lateral dan  bagian  stria  terlihat  jelas  (Gambar  3a  dan  3e). M. javanica mempunyai  ciri  khas  berupa  garis  lateral  yang terputus dan seperti memisahkan bagian lengkung dorsal dan ventral.  Striasi  kasar,  halus  sampai  sedikit  bergelombang (Gambar  3b  dan  3f). M.  arenaria mempunyai  ciri  khusus berupa  lengkung  dorsal  yang  rendah  dan  membulat,  tidak terdapat garis pada bidang lateral. Striasi kasar, halus hingga sedikit  bergelombang. Bagian lengkung striasi  bercabang di dekat  garis  lateral  dengan  bagisan  striasi  lebih  mendatar (Gambar  3c  dan  3g). M.  hapla memiliki  ciri  khas  terdapat tonjolan-tonjolan seperti duri pada zona ujung ekor (Gambar 3d dan 3h).
a
b c
Gambar 1  Gejala tanaman seledri yang terserang nematoda parasit. a) Gejala seledri di lapangan, b) Gejala sekunder, c) Gejala primer
a b c
Gambar  2.    Morfologi Meloidogyne juvenil.  a)  Seluruh  tubuh  (perbesaran  20x10),  b)  bagian  tubuh  anterior  (Perbesaran 40x10), dan c) bagian tubuh posterior (Perbesaran 40x10).
Gambar 3.  Pola perineal Meloidogyne betina dewasa. a) M. incognita , b) M.arenaria , c) M. javanica , d) M. hapla (Eisenback et al . 1981). Hasil identifikasi berdasarkan morfologi pola perineal e) M. incognita , f) M. javanica , g) M. arenaria ,
h) M. hapla
b c a stilet Ekor Anus a e f g F G H

## Isolasi Bakteri Endofit
Bakteri yang berhasil diisolasi sebanyak 101 isolat yang terdiri dari 51 isolat berasal dari akar, dan 50 isolat dari batang. Isolat tersebut di murnikan pada media TSA 100% dan disimpan di dalam lemari es pada suhu -40C (Gambar 4).

## Uji Reaksi Hipersensitif
Sebanyak  101  isolat  bakteri  endofit  selanjutnya dilakukan  pengujian  hipersensitif  pada  tanaman  tembakau. Hasil  pengujian  menunjukkan  29  isolat  tidak  menunjukan gejala  nekrosis  pada  daun  tembakau  (reaksi  negatif), sedangkan  72  isolat  menunjukkan  gejala  (reaksi  positif) (Tabel  3).  Reaksi  ini    adalah  respon  tanaman  terhadap munculnya  patogen  di  dalam  jaringan  tanaman  yang merupakan usaha untuk menghambat pertumbuhan patogen. Reaksi  hipersensitif  dipengaruhi  oleh  gen hrp yang  umum terdapat  pada bakteri gram  negatif patogen tanaman, seperti kelompok Xanthomonas sp. (Zhu et al. 2000). Bakteri yang tidak  menunjukkan  gejala  nekrosis  pada  daun  tembakau (reaksi  nematif)  digunakan  untuk  pengujian  selanjutnya (Gambar 5).
Lelliott  dan  Stead  (1987)  menyebutkan  bahwa kebanyakan  bakteri  patogen  tanaman  dapat  menginduksi respon  hipersensitif  jika  diinjeksikan  ke  dalam  jaringan tanaman  inang  yang  tidak  rentan  dalam  waktu  24-72  jam setelah inokulasi.  Menurut  Yang He (1996) uji hipersensitif merupakan  salah  satu  metode  yang  dapat  digunakan  untuk mendeteksi dengan cepat potensi patogenisitas suatu bakteri terhadap  tanaman.  Reaksi  uji  hipersensitif  terjadi  dalam waktu  24-48  jam  dan  terlokalisasi.  Membran  seluler  pada
daun  tanaman  tembakau  yang  mengalami  kontak  dengan bakteri  patogen akan hancur dan  nekrosis. Respons tersebut menunjukkan  bahwa  bakteri  yang  kontak  dengan  daun tanaman  tembakau  berpotensi  sebagai  patogen  tumbuhan (Zhu et  al .  2000).  Berdasarkan  uji  yang  telah  dilakukan, isolat  yang  negatif  hipersensitif  berasal  dari  bagian  akar berjumlah  15  isolat.  Isolat  yang  berasal  dari  bagian  batang yang negatif uji hipersensitif berjumlah 14 isolat (Tabel 3).

## Uji Aktivitas Hemolisis
Bakteri  yang  tidak  menunjukkan  gejala  nekrotik pada  uji  hipersensitif  digunakan  untuk  uji  agar  darah  untuk melihat keamanannya terhadap kesehatan mamalia. Terdapat 29  isolat  bakteri  endofit  yang  diuji  dengan  metode  ini. Berdasarkan  hasil  uji  diketahui  terdapat  18  isolat  bakteri endofit yang menunjukkan reaksi positif (Gambar 6) dan 11 isolat  menunjukkan  reaksi  negatif.  Prinsip  pengujian hemolisis  adalah  melihat  perubahan  warna  media  ketika bakteri ditumbuhkan di atas medium padat darah segar (Das et  al . 2008). Munculnya perubahan warna dari  merah darah menjadi  warna  gelap  (transparan  tidak  berwarna)  telah tampak disekitar koloni bakteri tumbuh. Hal ini menunjukkan  aktivitas  bakteri  mampu  melisiskan  sel-sel darah merah selama 48 jam waktu inkubasi.
Bakteri  yang  menghasilkan  toksin  hemolisin  tidak digunakan pada pengujian selanjutnya karena telah diketahui supernatan  dari  α  hemolisin  bersifat  sangat cytotoxic terhadap  granulocytes,  monocytes,  dan  lymphocytes manusia (Lopes et  al. 2010). Serratia marcescens diketahui mampu meyebabkan hemolisis pada eritosit manusia (Hertle et al. 1999).
a                             b                               c                               d Gambar 4.  Hasil isolasi dari akar dan batang kenikir pada media TSA. a) kontrol, b) isolat akar, c) isolat batang, d) bakteri yang di remajakan pada media TSA 100% c a b c
d
a b c d
A
B
Gambar  5   Hasil uji reaksi  hipersensitif.  A) Isolat  bakteri  yang tidak menunjukkan gejala nekrosis  (reaksi  negatif), B) Isolat bakteri  endofit  yang  menunjukkan  gejala  nekrosis  (reaksi  positif)  pada  uji  hipersensitif  menggunakan  daun tembakau
Tabel 3. Isolat bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman kenikir dan hasil uji hipersensitif pada tanaman tembakau
Kode isolat Uji hipersensitif EA1 Positif EA2 Positif EA3 Positif EA4 Positif EA5 Positif EA6 Positif EA7 Positif EA8 Positif EA9 Positif EA10 Positif EA11 Positif EA12 Positif EA13 Positif EA14 Positif EA15 Positif EA16 Positif EA17 Positif EA18 Positif EA19 Positif EA20 Positif EA21 Positif EA22 Positif EA23 Positif EA24 Positif EA25 Positif EA26 Positif EA27 Positif EA28 Positif EA29 Positif EA30 Positif
EA31 Negatif EA32 Negatif EA33 Positif EA34 Positif EA35 Negatif EA36 Negatif EA37 Negatif EA38 Negatif EA39 Positif EA40 Negatif EA41 Positif EA42 Positif EA43 Negatif EA44 Positif EA45 Positif EA46 Negatif EA47 Positif EA48 Negatif EA49 Positif EA50 Positif EA51 Positif EB1 Positif EB2 Positif EB3 Negatif EB4 Negatif EB5 Positif EB6 Positif EB7 Negatif EB8 Negatif EB9 Positif EB10 Negatif EB11 Positif EB12 Negatif EB13 Negatif EB14 Negatif EB15 Positif EB16 Positif EB17 Positif EB18 Positif EB19 Positif EB20 Positif EB21 Negatif EB22 Negatif EB23 Positif EB24 Positif
EB25 Positif EB26 Positif EB27 Negatif EB28 Negatif EB29 Negatif EB30 Negatif EB31 Positif EB32 Positif EB33 Positif EB34 Positif EB35 Positif EB36 Negatif EB37 Positif EB38 Positif EB39 Negatif EB40 Positif EB41 Positif EB42 Positif EB43 Positif EB44 Positif EB45 Negatif EB46 Positif EB47 Positif EB48 Negatif EB49 Negatif
EB50
Positif
Gambar 6.  Hasil uji aktivitas hemolisis. a) isolat bakteri yang diuji agar darah, b) isolat yang menunjukkan hemolisis, c) isolat yang tidak menghasilkan hemolisis
a b c
Tabel 4  Isolat bakteri endofit hasil uji aktivitas hemolisis Kode isolat Uji agar darah Kode isolat Uji agar darah EA3 Positif EB12 Positif EA3 Negatif EB13 Negatif EA3 Positif EB14 Positif EA3 Positif EB21 Positif EA3 Positif EB22 Positif EA3 Positif EB27 Positif EA4 Negatif EB28 Negatif EA4 Positif EB29 Positif EA4 Positif EB30 Negatif EA4 Positif EB36 Negatif EB3 Negatif EB39 Positif EB4 Negatif EB45 Negatif EB7 Positif EB48 Negatif EB8 Positif EB49 Negatif EB1 Positif
Tabel 5  Pengaruh perlakuan bakteri endofit terhadap jumlah mortalitas nematoda parasit secara in vitro No Nama isolat Mortalitas 2 jam 6 jam 12 jam 1 Kontrol 2.34   d 2.34   g 2.34   g 2 EA32 13.19 bc 21.91 de 33.29 e 3 EA40 12.04 bcd 28.70 cd 39.33 cde 4 EB3 6.40   cd 13.55 ef 21.24 f 5 EB4 8.89   bcd 32.26 bc 37.03 de 6 EB13 14.75 bc 41.30 a 47.71 abc 7 EB28 8.98   bcd 22.25 de 49.45 ab 8 EB30 7.59   bcd 12.17 f 25.06 f 9 EB36 10.55 bcd 29.46 cd 44.17 bcd 10 EB45 25.54 a 39.55 ab 53.74 a 11 EB48 12.07 bcd 19.12 ef 51.41 ab 12 EB49 17.06 ab 28.59 cd 47.69 abc
Uji  Bakteri  Endofit  terhadap  Mortalitas  Nematoda Parasit secara In Vitro
Uji in  vitro dilakukan  untuk  mengetahui  pengaruh langsung  bakteri  terhadap  nematoda  parasit.  Isolat  yang digunakan  dalam  uji  ini  merupakan  isolat  dari  hasil  uji sebelumnya  yaitu  EA32,  EA40,  EB3,  EB4,  EB13,  EB28, EB30,  EB36,  EB45,  EB48,  EB49.  Tabel  5  menunjukkan bahwa  perlakuan  dengan  isolat  bakteri  endofit  memberikan pengaruh  terhadap  peningkatan  jumlah  nematoda  parasit yang  mengalami  kematian  dibandingkan  dengan  kontrol. Kecuali  pada  perlakuan  2  jam  isolat  dengan  kode  EA40, EB3, EB28, EB30, EB36, EB48 tidak berbeda nyata dengan kontrol.
Perlakuan  bakteri  endofit  terhadap  nematoda  parasit menyebabkan nematoda mengalami kematian pada pengamatan  2  jam  setelah  perlakuan  dan  terus  meningkat  6 dan  12  jam  setelah  perlakuan.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa
perlakuan dengan isolat bakteri endofit dengan penambahan waktu memberikan pengaruh terhadap peningkatan mortalitas  nematoda  dibandingkan  dengan  kontrol.  Pada perlakuan  2  jam  isolat  dengan  kode  EB45  dan  EB49 memiliki  mortalitas  tertinggi  sebesar  25.54%  dan  17.06%, sedangkan  pada  perlakuan  6  jam  isolat  dengan  kode  EB13, dan EB45 merupakan isolat yang memiliki tingkat kematian nematoda  parasit  paling  tinggi  dengan  jumlah  41.31%  dan 39.55%,  dan  pada  perlakuan  12  jam  isolat  dengan  kode EB13,  EB28,  EB45,  EB48  dan  EB49  merupakan  isolat dengan  jumlah  nematoda  yang  mengalami  mortalitas terbanyak dengan persentase berturut-turut 47.71%, 49.45%, 53.74%, 51.41% dan 47.69%.
Juvenil  nematoda  yang  mengalami  inaktif  diduga terjadi  karena  adanya  pengaruh  senyawa  metabolit  yang dihasilkan  oleh  bakteri  dan  bersifat  toksik  terhadap nematoda  parasit.  Senyawa  metabolit  yang  dihasilkan  oleh bakteri  endofit  diantaranya  yaitu  pelarut  fosfat  dan  enzim
penghidrolisa seperti kitinase, protease,  selulase, lipase, dan pektinase  (Berg  dan  Hallmann  2006).  Hartini  (2004) melaporkan  bahwa  perlakuan  kultur  fitrat  bakteri  endofit yang  diisolasi  dari  tanaman  tomat  mampu  meningkatkan jumlah  larva Meloidogyne spp.  yang  mengalami  inaktif hingga  100%.  Selain  itu,  perlakuan  filtrat  isolat  bakteri endofit  yang  diisolasi  dari  akar  tanaman  lada  ada  yang berpengaruh  terhadap  mortalitas  larva  nematoda  hingga 86.3% (Munif dan Harni 2011).

## KESIMPULAN
Empat  spesies Meloidogyne yang  teridentifikasi berdasarkan  karakter  pola  perineal  yaitu M.  incognita,  M. arenaria , M.  javanica, dan M.  hapla. Sebanyak  11  isolat dengan  kode  isolat  EA32,  EA40,  EB3,  EB4,  EB13,  EB28, EB30,  EB36,  EB45,  EB48,  EB49  berhasil  diisolasi  dari tanaman  kenikir  yang  digunakan  untuk  pengujian in  vitro , 11  isolat  ini  merupakan  isolat  yang  negatif  uji  hipersensitif dan uji aktivitas hemolisis. Isolat dengan kode EB13, EB28, EB45,  EB48  dan  EB49  merupakan  isolat  dengan  jumlah mortalitas  nematoda  terbanyak  dengan  persentase  berturut- turut 47.71%, 49.45%, 53.74%, 51.41% dan 47.69% pada 12 jam setelah perlakuan.

## DAFTAR PUSTAKA
Barker,  K.  R.  &  Koenning,  S.  R  (1998).  Developing sustainable systems for nematode management. Annu Rev Phytopathol , 36, 165-205.
Berg, G. & Hallmann, J. (2006). Control of plant pathogenic fungi  with  bacterial  endophytes.  Di  dalam:  Schulz BJE,  Boyle  CJC,  Sieber  TN,  editor. Microbial  Root Endophytes . Verlag Berlin Heidelberg (DE): Springer. hlm 53-66.
Caveness, F. E., & Jensen, H. J. (1955). Modification of the centrifugal-flotation  technique  for  the  isolation  and concentration  of  nematodes  and  their  eggs  from  soil and plant tissue. Proc Helminthol  Soc Wash , 25, 87- 89.
Das,  P.,  Mukherjee,  S.,  &  Sen,  R.  (2008).  Antimicrobial potential  of  a  lipopeptide  biosurfactant  derived  from a  marine Bacillus  circulans . J  Appl  Microbiol ,  104, 1675-1684.
Dropkin,  V.  H.  (1991). Pengantar  Nematologi  Tumbuhan .
Ed  ke-2.  Supratoyo,  penerjemah.  Yogyakarta  (ID): Gajah  Mada  University  Press.  Terjemahan  dari: Introduction to Plant Nematology .
Eisenback,    J.  D.,    Hirschman,    H.,    Sassser,    J.  N.,  & Triantaphyllou,  A.  C.  (1981).  A  Guide  to  The  Four Most   common  Species  of  Root-Knot  Nematodes (Meloidogyne      species)      With      a    Pictorial    Key. Washington  DC  (US):  Cooperative    Publication
Departement of  Plant  Pathology  and  U.S  Agency International Development.
Goodey,  T.  (1973). Two methods for staining  nematodes in plant tissue. J Helminthol .15: 137-144.
Hallmann, J., Hallmann, A.Q., Mahaffee, W. F., & Kloepper, J.  W.  (1997).  Bacterial  endophytes  in  agricultural crops. Can J Microbiol , 43, 895-914.
Hartini,  A.  (2004).  Isolasi  bakteri  endofit  dan  pengujian potensinya untuk mengendalikan nematoda
Meloidogyne sp.  pada  tanaman  tomat  ( Lycopersicon esculentum Mill.)  [skripsi].  Bogor  (ID):  Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Hertle,  R.,  Hilger,  M.,  Weingardt-Kocher,  S.,  &  Walev,  I.
(1999).  Cytotoxic  action  of Serratia  marcescens hemolysin  on  human  epithelial  cells. Infection  and Immunity, 67(2),817-825.
Hutagalung,  L.  (1988).  Teknik  Ekstraksi  dan  Membuat Preparat  Nematoda  Parasit  Tumbuhan.  Jakarta  (ID): Rajawali Press.
Jawetz,  E.,  Melnick,  J.  L.,  &  Adelberg,  E.A.  (1982). Microbiology  for  Medicine.  14th  ed.  Los  Altos. California : Lange Medical Publications.
Jayasinghe,  U.  (2002).  Potato  seed  in  Indonesia:  a  baseline survey.  Di  dalam:  Fuglie  KO,  editor. Progress  in Potato and Sweetpotato research inIndonesia.Proccedings of the CIP-Indonesia Research  Review  Workshop .  Bogor:  International Potato Center.
Joklik, W. K., Willett, H. P., Amos, D. B., & Wilfert, C. M.
(1992).  Zinsser  Microbiology.  20th  ed.  California  : Appleton and Lange.
Kasahara, S. & Hemmi, S. (1995). Medicinal Herb Index in Indonesia , Ed ke-2. Jakarta (ID): Eisai Indonesia.
Kurniawati, F., Supramana, & Adnan, M. A. (2017). Spesies Meloidogyne Penyebab  Puru  Akar  pada  Seledri  di Pacet,  Cianjur,  Jawa  Barat. Jurnal  Fitopatologi Indonesia. 13(1),  26-30.  DOI:  10.14692/jfi.13.1.26– 30.
Lelliot, R. & Stead, E. (1987). Methods for the Diagnosis of Bacterial  Disease  ofPlants .  British:  British  Society for  Plant  Pathology  by  Blackwell  Scientific  Publ. Oxford london edinburgh
Luc,  M.,  Sikora,  R.  A.,  &  Bridge,  J.  (2001). Nematoda Parasit Tumbuhan di Pertanian Subtropik dan Tropik . Ed  ke-2.  Supraptoyo,  penerjemah.  Yogyakarta  (ID): Gadjah  Mada  University  Press.  Terjemahan  dari:
Plant  Parasitic  Nematodes  in  Subtropical  and Tropical Agriculture .
May, W.  F. & Lyon,  H.  H.  (1996). Pictorial  key to  Genera of  Plant Parasitic Nematodes . Edisi  ke-5. New York (US): Cornel University.
Melakeberhan,  H.,  Wang,  &  Wei.  (2012).    Suitability  of celery  cultivars  to  infection  by  populations  of Meloidogyne hapla . J. Nematol , 14(5), 623-629.
Mulyadi.  (2009). Nematologi  Pertanian .  Yogyakarta  (ID):
Jurusan  Hama  dan  Penyakit  Fakultas  Pertanian Universitas Gadjah Mada.
Munif,  A.  &  Harni,  R.  (2011).  Keefektifan  bakteri  endofit untuk  mengendalikan  nematoda  parasit Meloidogyne incognita pada  tanaman  lada. Buletin  Ristri ,  2(3), 279-419.
Munif,  A.,  Wiyono,  S.,  &  Suwarno.  (2012).  Isolasi  Bakteri endofit  asal  tanaman  padi  gogo  dan  potensinya sebagai  agens  biokontrol  dan  pemacu  pertumbuhan tanaman. J Fitopatol Indones , 8(3), 57-64.
Park PW, Foster TJ, Nishi E, Duncan SJ, Klagsbrun M, and
Chen Y. (2004). Activation of Syndecan-1 ectodomain  shedding  by Staphylococcus  aureus α- toxin and β-toxin. J. Biol. Chem ., 279(1), 251-258.
Prasasti,  W.  D.  (2012). Strategi  Pengendalian  Penyakit Nematoda  Puru  Akar  (Meloidogyne  spp.)  pada Tanaman Tomat (Solanun lycopersicum L.). yogyakarta (ID): UGM Press.
Rosya,  A.  &  Winarto.  (2013).  Keragaman  Komunitas Fitonematoda  pada  Sayuran  Lahan  Monokultur  dan Polikultur  di  Sumatera  Barat. JFI .  9(3),  71-76.  doi: 10.14692/jfi.9.3.7.1.
Whitehead, A. G. (1998). Plant Nematode Control . London: CAB International.
Yang  He,  S.  (1996).  Elicitation  of  plant  hypersensitive response by bacteria. Plant Physiol . 112, 865-869.
Zhu,  W.,  MaGbanua,  M.  M.,  &  White,  F.  F.  (2000). Identification  of  two  novelhrp-associated  genes  in the  hrp  gene  cluster  of Xanthomonas  oryzae pv. oryzae . Journal of Bacteriology. 182(7):1844-1853. doi: 10.1128/JB.182.7.1844-1853.2000