## PENGARUH PEMBERIAN KOMBINASI METFORMIN DAN OKSIGEN HIPERBARIK TERHADAP JUMLAH FIBROBLAS DAN  KETEBALAN KOLAGEN  DALAM  PENYEMBUHAN  LUKA  PADA  TIKUS  PUTIH HIPERGLIKEMIA

## Wahyu  Dewi  Tamayanti1*,  Bernadette  Dian  Novita  Dewi2,  Imelda  Theodora2

## ABSTRACT
Metformin is used inpatients with type 2 DMwho had a chronic hyperglycemia caused by insulin resistance. DMpatients  also suferedfiom hypoxia condtion of lacking oxygen in the tissues. This study was aimed to identza the eflect of combination therapy of metformin and hyperbaric oxygen  to  increase  the  number  of fibroblasts  and  collagen  thickness  in  thePseudomonas aeruginosa-infected tissue in male  mstar  rats with hyperglycemia. This shrdy  used alloxan 8% (w/v) that was injected intramuscular, anaerobic bacteria Pseudomonas aeruginosa in the injured area, metformin of 45mgkgBB dose, and hyperbaric oxygen therapy at 2.4 ATA given 3 times 30 minutes respectively with 5 minutes interval for  5 consecutive days. Male  Wistar rats  (Rattus norvegicus) were divided into five  groups:KN-  was the group of normal  mstar rats;XDM- was  the group with alloxan induction;KI -was the group  with alloxan induction and  infected by Pseudomonas aeruginosawithout treatment;KUl - was the group  induced by alloxan, infected by Pseudomonas aeruginosa, and treated by metformin; and KU2 - was the group that induced by alloxan, infected by Pseudomonas aeruginosaand treated by combination therapy ojhetformin and  hyperbaric oxygen.  Skin  tissue was  taken on the termination and HE stained  to analysed the number offibroblast  and sized  the collagen. Data  obtained was statistically analysed by One way anava with a signiJicant level of 5%. The result confirmed that combination therapy of metformin and hyperbaric oxygen increases the number offibroblasts and  collagen  thickness  in  the wound  of male hyperglycemic  Wistar rats  that Pseudomonas aeruginosa-infected
Key words: metformin, hyperbaric oxygen, fibroblasts,

## ABSTRAK
Metformin telah banyak digunakan sebagai terapi pada  penderita  diabetes melitus tipe 2 yang mengalami hiperglikemia menahun karena  resisten insulin.Penderita DM kronis juga  rentan mengalami hipoksia - kekurangan oksigen pada jaringan.Pene1itian  ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahuipengaruh dari terapi kombinasi metformin dan oksigen hiperbarik terhadap peningkatan  jumlah  sel  fibroblas  dan  ketebalan  kolagen  di  jaringan  kulit  yang  terinfeksi Pseudomonasaeruginosa pada tikus yang mengalami hiperglikemia.Pene1itian ini rnenggunakan aloksan 8%  (b/v) secara  intramuscular,bakteri patogen  Pseudomonas aeruginosadiinfeksikan pada  daerah  luka,metformin 45mgkgBB,  dan  terapi  oksigen  hiperbarik  sebesar  2,4  ATA diberikan 3 kali  masing-masing  selama 30  menit  dengan  interval  waktu  5  menit  selama  5 hari. Pada  penelitian  ini digunakan tikus putih jantan  (Rattus norvegicus) galur  Wistar yang dibagi  menjadi  4  ke1ompok:KN- merupakan  kelompok  tikus  normal, KDM - merupakan kelompok tikus diabetes dengan induksi aloksan, KI - merupakan kelompok dengan induksi aloksan dan  infeksi oleh Pseudomonas  aeruginosa, tanpa terapi, KU1 - kelompok  dengan induksi aloksan, infeksi bakteri Pseudomonas aeruginosa, dengan terapi metformin; dan KU2
I - kelompok  dengan  induksi  aloksan, infeksi  Pseudomonas  aeruginosa,  dan  terapi  dengan kombinasi  metformin  dan  oksigen hiperbarik.  Pengambilan jaringan  kulit  dilakukan  setelah tikus diterminasi pada hari ke-5, lalu dipreparasi secara histology dengan pengecatan HE.Data yang diperoleh dianalisa statistik dengan anava satu arah dengan tingkat signifikansi S%.Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  terapi  kombinasi  metformin  dan  oksigen hiperbarik  dapat meningkatkan jumlah fibroblas dan ketebalan kolagen pada luka tikus putih hiperglikemia yang terinfeksi Pseudomonas aeruginosa.
Kata-kata kunci:  metformin,  oksigen  hiperbarik,  fibroblas,  kolagen,  hiperglikemia,
Pseudomonas aeruginosa
- ' Fakultas Farmasi, Universitas Katolik Widya Mandala Surabaya, Surabaya, Indonesia. Fakultas Kedokteran, Universitas Katolik Widya Mandala Suabaya, Surabaya, Indonesia 'korespondensi: dewffua@grnail.com

## PENDAHULUAN
Gaya hidup masyarakat modern membawa  dampak  terhadap  pola  makan  di masyarakat.Masyarakat  cenderung  memilih makanan  siap  saji  dibandingkan  dengan makanan yang diolah secara tradisional.Pada sisi lain,kehidupan modern juga  menurunkan intensitas olahraga, sehinggakedua gaya hidup modern  tersebut  dapat  memicu  timbulnya salah satu sindroma metabolik yang  dikenal sebagai  diabetes  mellitus  (DM).  Diabetic

## Federation memperkirakan jumlah penderita
DM  di Indonesia pada  1995 sebesar 4,5 juta akan meningkat menjadi 12,4 juta pada 2020 dan  pada  2030  akan  mencapai  21,3  juta. WHO  melaporkan  bahwa  jumlah  penderita DMdi Indonesia pada 2000 menempati urutan ke-4 dengan prevalensi  8,4 juta jiwa.  Urutan diatasnya adalah India (3 1,7 juta jiwa), China (20,8 juta  jiwa),  dan Amerika  Serikat  (17,7 juta jiwa) (Darmono, 2007).
Penderita  DM  beresiko  mengalami kornplikasi apabila terjadi hiperglikemi dalam jangka  waktu  yang  1ama.Gangguan  pada beberapa organ dalam tubuh seperti gangguan kardiovaskuler,  gangguan  penglihatan,  dan
kerusakan  ginjal  adalah  resiko  komplikasi DM  (Corwin,  2007).Penderita  DM  yang mengalami  hiperglikemi  kronis  rentan mengalami  ulkus  diabetika  yaitu  luka terbuka pada permukaan kulit karena adanya mikroangiopati.Mikroangiopatimenyebabkan daerah  luka  mengalami  hipoksia  sehingga mempercepat  terjadinya  gangren.Gangren mudah  berkembang  menjadi  infeksi  karena masuknya bakteri.Gula darah yang tinggi dan tidak terkontrol menjadi tempat yang strategis untuk perturnbuhan  bakteridan karena rendahnyapasokan oksigen (hipoksia) di area luka maka  dapat mempercepat pertumbuhan bakteri  anareob.Saat  fungsi  dari  komponen penyembuhan  luka  menurun  maka  infeksi akansemakin  sukar  terkendali  (Misnadiarly, 2006).Penderita  DM  lima  kali  lebih  mudah mengalami  gangrenkarenabeberapa  faktor yaitu,  neuropati,  infeksi,  dan  kelainan vaskular,  tekanan  darah,  kontrol  glukosa darah,  umur,  tingkat  kegiatan  jasmani (Tjokroprawiro, 2006).
Oral Antidiabetic  Drug  (0AD)dipakai dalam menangani DM (Tjokroprawiro, 2006). Salah  satu  OAD  adalah  metforrnin,  obat
DMtipe  2  yang  termasuk  dalam  golongan biguanid  (Wiernsperger,  2007).Metformin memiliki sisi positif sebab dapat menurunkan terjadinya  kelainan  mikrovaskuler  seperti dilaporkan dalam UnitedKingdom Prospective Diabetes  Shrdy(Katzung,  20 12).  Penelitian lain  juga  melaporkan  bahwa  metformin mampu  mencegah  kematian  jaringan  dan melindungi dari efek komplikasi vaskuler pada penderita  DM  dengan  disfungsi  pembuluh darah  (Wiernsperger, 2007).  Namun,  akhir- akhir  ini  banyak  terjadi  kegagalan  dalam penggunaan  tunggal  metformin.  Sensus di  Inggris  menyatakan  bahwa dari 4360 subjek secara random,  mengalami kegagalan sebanyak 907 subjek (Kahn, et al, 2006). Oleh karenanya, masih perlu dilakukan upaya lain untuk meningkatkan penggunaan  metformin sebagai terapi tunggal.
Dalam  upaya  penyembuhan  pasien DM  dengan  gangren telah  digunakan terapi tambahan  yaitu  terapi  oksigen  hiperbarik (OHB) untuk meningkatkan  penyembuhan luka (Wang, 2003).Terapi ini juga mengurangi kerusakan sel beta pankreas pada DM tipe 2. Terapi OHB dilakukan menggunakan oksigen 100 % murni  dengan  tekanan  2 - 2,5 ATA selama 2 - 3 jam pada tekanan atmosfir absolut (Wang,  2009;  Tibbles, et al, 2008).  Terapi OHB diberikan 3x30 menit  dengan  interval waktu  5 menit  selama  10 hari  berturut-turut untuk mensuplai  kebutuhan  oksigen  pada penderita  peradangan  kronis  DM  tipe  2. Berdasarkan  mekanisme  kerja  metformin dan OHB maka penelitian untuk mengetahui pengaruh terapi kombinasi antara metformin dan OHBmenarik untuk dilakukan.Penelitian ini  melaporkan  percepatan  penyembuhan
luka pada tikus Wistar hiperglikemia dengan luka  gangren yang  telah  memperoleh terapi kombinasi  metformin  dan  0HB.Sebagai parameter  penyembuhan  luka  digunakan jumlah  fibroblas dan ketebalan kolagen yang diamati pada histologi kulit hewan coba.

## METODE PENELITIAN
Hewan  coba  yang  digunakan  adalah tikus  putih  jantan  galur  wistar  (Rattus nowegicus)  yang  berusia  2-3  bulan  dengan berat  sekitar  150-200  gram,  sebanyak  25 ekor, sehat, dan mempunyai aktivitas normal. Sebelum  digunakan  dalam  penelitian,  tikus tersebut  diadaptasikan  selama  dua  minggu. Tikus yang telah dipuasakan  selama  12 jam dan tetap diberi minum, diukur kadar glukosa darah  (KGD)  awal  dengan Advantagemeter: Setelah  rerata  KGD  mencapai  80-95  mgl dl  maka  tikus  diberi  aloksan  monohidrat 8%  blv,  dosis  350  mg/kg BB dengan volume  pemberian  0,875  mV200g  secara intramuskular  (im). Setelah  48  jam  paska induksi aloksan, dilakukan pengukuran KGD, hanya  tikus  dengan KGD 200-400  mgldl yang  dipakai  untuk  penelitian  selanjutnya. Selanjutnya  tikus  coba  dibagi  menjadi6 kelompok secara random, yaitu: KN (kontrol negatif - induksi NaCl & aquadest per oral), KDM(kontro1  diabetes  melitus - induksi aloksan  im - aquadest),  KI(kontro1  infeksi - induksi  aloksan  im - bakteri - aquadest), KU1  (induksi aloksan  im - bakteri - terapi metformin), dan KU2 (induksi aloksan im - bakteri - terapi kombinasi metformin & OHB).
Tikus  berdasarkan  kelompok  lalu  diinduksi bakteri  Pseudomonas  aeruginosa  setelah dilukai  pada  bagian  kulit  punggungnya. Lalu tikus diberi terapi sesuai kelompoknya,
metforminHC1 0,225% blv,  dosis 45 mgl kg BB, volume pemberian 4 m1/200g & OHB 2,4 ATA,  3x30  menit,  interval  waktu  5  menit,5 hari  berturut-turut  (Guritno,  2010).Setelah  5 hari perlakuan, tikus dikorbankan dan diambil bagian  kulit  yang  telah  terinfeksi.  Potongan kulit  dicat  menggunakan  Hematocylin- Eosin(HE)  dan  diamati  dengan  mikroskop LED  (perbesaran  400  kali)  yang  telah terpasang  gratikule,  untuk  dihitung  jumlah fibroblas  yang  terpotong  secara  membujur dandiamati ukuran  kolagen  yang  dihasilkan. Data  dianalisa  menggunakan  one way anova
untuk  mengetahui  perbedaan sign8cant antar rerata kelompok data (Santoso, 201 1).

## HASIL PENELITIAN
Pengamatan  Mikroskopis  Fibroblas dan Kolagen
Jaringan  kulit  terinfeksi  yang  sudah diawetkan  dengan  buffer  formalin  dan sudah  dipreparasi  secara  histologi  dengan pengecatan  Hematocylin  Eosinselanjutnya diamatidengan  mikroskop  LED  perbesaran 400  kali.  Pengamatan  mikroskopis  dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Pengecatan HE pengamatan fibroblas dan kolagen
KN:  kontrol negatif, KDM: kontrol diabetes mellitus, KI: kontrol infeksi, KU2:  kelompok uji dengan terapi kombinasi  metformin - OHB,(l)  Sel  fibroblas,(2)

## Serat kolagen,(3) Luka
Pada  gambar  1 .luka  ditandai  dengan adanya  ruang  kosong  pada  jaringan  kulit tikus  coba.  Pada KN terlihat inti  sel  (ungu) menunjukkan  potongan  jaringan  kulit  tikus keadaan  normal.Pada KDM tampak  terjadi luka,  ditunjukkan  dengan  ruang  kosong pada  potongan  jaringan  kulit  tikus  (nomor 3).Pembekakan  disekitar  kulit  juga  tampak pada KDM akibat induksi aloksan yang telah merubah keseimbangan kadar glukosa darah. Pada KI juga tampak adanya luka yang cukup parah,  terlihat  sebagai ruang  kosong  yang
luas pada potongan jaringan kulit tikus. Luka tersebut terjadi oleh paparan bakteri patogen ditambah dengan kerusakan  sel-sel pankreas akibat induksi aloksan. Pada KU2tampak luka yang ukurannya relatif lebih sempit dibanding pada gambar lainnya. Didugapenurunan lebar luka karena  adanya perbaikan jaringan  yang ditandai dengan adanya pertambahan inti sel yang  menghasilkan  serat  kolagen  pengaruh dari terapi kombinasi metformin dan OHB.

## Hasil pengukuran jumlah fibroblast
Pengukuran  jumlah  fibroblast  dilakukan 6 area  dekat  luka  secara  mikroskopis,  lalu dihitung  rerata  tiap  kelompok  dengan  hasil sebagai berikut:
Tabel  1.  Rerata  jumlah  fibroblast  tiap kelompok
, KUl NO.
Menurut data diatas menunjukkan bahwa adanya  peningkatan  jurnlah  fibroblas  pada kelompok perlakuan KU 1 dan KU2 mendekati KN,  jika  hasilnya  dibandingkanterhadap kelompok KDM dan KI yaitu tikus coba yang mengalami hiperglikemia dan infeksi namun memperoleh terapi aquadest.

## Hasil Pengukuran Ketebalan Kolagen

## KelOmpOk
Sampel
Rata-rata  ketebalan  kolagen  diamati pada mikroskopdan diukur sehingga hasilnya dapat ditarnpilkan pada tabel 2.
Tabel 2. Rerata jumlah kolagen tiap kelompok
Rerata Pcrkelompok (Sell
Kelompok Rerata Standar I NO. I Sampel I Perkelompok I Deviasi I

## Standar
Deviasi
Hasil  uji  statistik  menyatakan  bahwa perhitungan jumlah fibroblast maupun ukuran kolagen berbeda bermakna antar kelompok.

## DISKUSI
Induksi  aloksandilakukan  pada  semua kelompok  tikus  coba  kecuali  KN untuk merusak  pankreas  sehingga  tikus  putih
mengalarni  hiperglikemia  karena  resisten insulin (Merentek,  2006).  Selama penelitian dilakukan  pengukuran  kadar  glukosa  darah (KGD)  dan  peningkatan  KGD  terjadi setelah  induksi  aloksan.  Setelah  induksi aloksan  menghasilkan  peningkatan KGD maka  dilakukaninokulasi  bakteri  anaerob
Pseudomonas aeruginosa padakelompok uji KU1  dan KU2  di  daerah  luka dengantujuan menginfeksi lukasehingga mengalami peradangan.  Induksi  aloksan  yang  memsak pankreas akan  menyebabkankeadaan  tubuh tikus coba melemah karena imunitas menurun ditambah adanya infeksi bakteri anaerob pada 1uka.Kondisi  ini  dibuat  sedemikian  rupa untuk  rnembuat  tikus  kesulitan  membentuk komponen penyembuhan 1uka.Setelah infeksi bakteri  anaerob  dilakukan,  lalu  diberikan terapi sesuai kelompok masing-masing yang dilanjutkan  dengan  terminasi  hewan  coba pada  hari  ke-5 untuk mengambil  jaringan kulit  yang  terinfeksidan mengamati  jurnlah fibroblas clan  ukuran  kolagen  yang  terjadi seiring  berjalannya  waktu  terapi.  Jaringan kulit yang sudah terambil  dipreparasi secara histologi dengan pengecatanHE (Hematocylin Eosin).
Pengamatan  secara  mikroskopis  KI mengalami  luka dan  pembekakan  disekitar luka  yang  cukup  besar.  Hal  ini  disebabkan oleh  induksi  aloksan  pada  tikus  sehingga mengalami  p e n m a n   pada  kadar  glukosa darah akibat sel-sel pankreas rusak terutama sel p yang  dapat memicu kenaikan molekul radikal  bebas  dalam  tubuh  (Lenzen,  2008) danmemperlambat  proses penyembuhan luka  pada  kelornpok  tersebut.Ha1  ini  juga membuktikan bahwa hambatan penyembuhan
luka  terjadi  karena  kematian  sel  pada  kulit ketebalan  kolagen  maka  dimana  hasil  ini yang  kekurangan  oksigen  yang  disebut mendukung hipotesis penelitian ini.
dengan hipoksia  (Convin, 2009).Kondisi  ini dapat  diperbaiki  dengan  terapi  kombinasi metformin  dan  oksigen  hiperbarikseperti yang ditampilkan pada gambar 1 .Pada gambar tersebut  terlihat  adanya  perbaikan  jaringan kulit  yang  ditandai  dengan  bertambahnya intisel dan serat kolagen.
Perbandingan  jumlah  sel  fibroblast (tabel  1)menunjukkan  adanya  peningkatan jumlah  fibroblas  pada  kelompok  uji  KUl dan KU2 mendekati KN (kontrol  negatif), jika  dibandingkanterhadap  kelompok KDM dan KI  yaitu  tikus  coba  yang  mengalami hiperglikemia dan infeksi.Tikus coba dalam kelompok KU2  yang  diterapi dengan kombinasi  metformin - OHB  menghasilkan jumlah  sel  fibroblast  lebih  tinggi  dari  tikus kondisi normal (KN) didugakarena terjadinya proses  optimasi  dalam  tubuh  tikus untuk mempertahankan  diri  dari  kerusakan  sel- sel  pankreas  terutama  terpapar  oleh  bateri patogen  sehingga fibroblas yang  dihasilkan lebih banyak.
Data  pada  tabel  2.  menunjukkan adanya peningkatan  ketebalan  kolagen  pada KU2  dibandingkan  terhadap KDM dan Kl. Pada  KU2,  rerata  ketebalan  kolagen  juga menunjukkan nilai lebih tinggi dari KN.Dapat dikatakan  bahwa  tikus  yang  diterapi  dapat menghasilkan ketebalanmelebihi tikus normal dan  tikus  yang  hiperglikemia.Ini  berarti terapi  kombinasi  metformin - OHB  dapat meningkatkan  ketebalan  ukuran  kolagen mendekati tikus kondisi normal (KN).Hal ini menunjukkan bahwa dengan terapi kombinasi metformin - OHB  dapat  meningkatkan
Metformin dapat meningkatkan kondisi tikus yang  hiperglikemia dengan melakukan penurunan glukoneogenesis, hambatan penyerapan  glukosa  yang  dilakukan  oleh eritrosit,  dengan  adanya  pemicu  tersebut terjadi glikolisis pada jaringan, meningkatkan pembersihan  glukosa  dalam  darah,  dan menurunkan  kadar  glukosa  dalam  plasma. Pemberian  metformin  dapat  menstimulasi sekresi  insulin  sehingga  insulin  pada plasma  dapat  berikatan  dengan  reseptor sehingga  meminimalkan  terjadinya  resisten insulin  sehingga  dapat  menurunkan  kondisi hiperglikemia  pada  tikus.  Pada  kondisi kadar  glukosa  darah  menurun  dapat  terjadi percepatan  penyembuhan  luka  yang  terdiri dari  penurunan  molekul  radikal  bebas  dan kenaikan FGF  (Fibroblast  Growth  Factor) sehingga  komponen  penyembuhan  luka berupa  sel fibroblas dan  serat kolagen  dapat disentesis dengan baik.
Oksigen  hiperbarik  dengan  prinsip memberikan oksigen dengan kadar tinggi yaitu 100% dengan tekanan 2,4 ATA akan menekan daerah luka, maka akan terjadi penyembuhan luka pada jaringan yang rusak lalu menaikkan kandungan oksigen pada jaringan  yang  luka sehingga  fibroblas  dan  kolagen  meningkat. Fibroblas mengalir ke daerah luka terbentuk serat kolagen pada proses penyembuhan luka pada keadaan hiperglikemia. Selain itu dengan pemberian  oksigen  yang  cukup tinggi  dapat merangsang  pembunuhan  bakteri  patogen. Dapat  dikatakan  terapi  oksigen  hiperbarik dapat  memperbaiki  jaringan  yang  rusak karena  hipoksia  pada  kondisi DM. Namun,
terkadang  ada  efek  samping  yang  perlu Lenzen, S., 2008, Alloxan and Streptozotocin diwaspadai yaitu, barotraumas telinga, sinus Diabetes, Vol.  1 15, Acta Endocrinology. paranasalis, int~ksikasi htoksigen, penyakit Merent&,  E., 2006, Resistensi Insulin Pads dekompresi  yang  disertaibarotraumas paru Diabetes  Melitus  Tipe 2, No. 150,  Cermin (Wang,  2 0 0 9 ) . ~ ~ 1 ini rnembuman Dunia  Kedokteran,  Poliklinik  Endokrin Metabolik,  Bagian  Penyakit  Dalam,  RSU penelitian lebih lanjut. Gowa, Makasar, 3 8-4 1. Pemberian terapi kombinasi metformin dan oksigen hiperbarik meningkatkan jumlah sel  fibroblas  dan  ketebalan  kolagen  di jaringan  kulit yang terinfeksi bakteri anaerob (Pseudomonas  sp.)  pada  tikus  putih  yang mengalami hiperglikemia.
I UCAPAN TERIMA KASIH 1 Penghargaan yang tinggi kami 1 sampaikan  kepada  LPPM  Unika  Widya Mandala  Surabaya  yang  telah  mendanai I penelitian ini  dan  Giovani  Anggasta 1 Januariska,  Sisilia Indah, serta  pihak-pihak yang terlibat dalam pelaksanaan penelitian ini yang tidak dapat kami sebutkan satu-persatu.
I

## DAFTAR PUSTAKA
I
Convin, E. J., 2009, Buku Saku Patofisiologi,
I edisi 3, EGC, Jakarta, 6 18-630.
I
Darrnono, 2007, Pola Hidup Sehat Penderita
Diabetes  Melitus : Naskah  Lengkap Diabetes  Melitus  Ditinjau  dari  Aspek Penyakit Dalam, Badan Penerbit Universitas Diponegoro,  Semarang.
Katzung,  B.G.,  2012,  Basic  and  Clinical
Pharmacology,  12& Edition, Mc.Graw  Hill I Lange, Singapore, 704-7 12
Misnadiarly, 2006, Diabetes Melitus Gangren, Ulcer, Infeksi, Mengenali Gejala,  Menanggulangi,  dan  Mencegah Komplikasi,  Pustaka Obor Populer,  Jakarta,
38.
Tandra,  H.,  2007,  Segala  Sesuatu  yang Harus  Anda  Ketahui  Tentang  Diabetes : Penduan  Lengkap  Mengenal  dan Mengatasi  Diabetes  dengan  Cepat  dan Mudah,  Grarnedia  Pustaka  Utama,  Jakarta, 2-4.
Tjokroprawiro,  A,,  2006,  Hidup  Sehat dan  Bahagia  Bersama  Diabetes  Mellitus, Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, 1-25.
Wang,  C.,  Swaitberg  S.,  Berliner E., Zarin DA.,  Lau J.,  2003, Hyperbaric  Oxygen for Treating  Wounds:  A  Systematic  Review of  The  Literature,  Vol.  138,  Archieve  of Surgical,  hal. 272-279
Wiernsperger, N. F., 2007, 50 Years Later : Is Metformin A Vascular Drug With Antidiabetic Properties ?, Vol. 7,  The  British Journal of
Diabetes and Vascular Disease,  204-209.
World Health Organization, 2006, Definition and  Diagnosis  of  Diabetes  Mellitus  and Intermediate  Hyperglycemia : Report of A WHO/ IDP  Consultation,  Geneva,
Switzerland, 3-5.