DETEKSI KOI HERPESVIRUS (KHV) PADA IKAN NILA ( Oreochromis niloticus ) YANG DIINFEKSI SECARA BUATAN
DETECTION OF KOI HERPESVIRUS (KHV) in Nile Tilapia ( Oreochromis niloticus ) WERE INFECTED BY ARTIFICIALLY INFECTION
Muhammad Sungging Pradana 1 , Suwarno 2 dan Hari Suprapto 3
1 Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga Kampus B Jl. Airlangga 4-6 - Surabaya, 60286 Telp. 031-5041566
2 Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo – Surabaya, 60115
3 Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo – Surabaya, 60115 Telp. 031-5033710

## Abstract
Koi  Herpesvirus  (KHV)  was  formerly  known  as  Cyprinid  herpesvirus-3  (CyHV-3)  and  carp nephritis interstitial and necrosis gill virus (CNGV) is a virus that infects common carp and koi ( Cyprinus carpio and C. carpio koi ) in farmed and wild population. KHV cause disease at a temperature of 18-25 °C with  mortality  rate  of  80-90  %  in  fry  and  adult  fish.  Currently  KHV  also  detected  in  tilapia  from  the results of monitoring in the field. The presence of KHV in tilapia can occur as a result of maintenance in cages adjacent to the infected carp.
KHV  diagnostic  method  currently  based  on  case  definition  and  PCR  (Polymerase  Chain Reaction) detection. The basic concept of PCR is one DNA molecule is used to produce two copies, then four, then eight and so forth through multiplication by polymerase. PCR results sometimes indicated the presence  of  a  faint  band  caused  a  low  amount  of  virus,  so  it  is  necessary  to  investigate  the  presence  of KHV DNA in tilapia using different doses of infection.
This  study  aimed  to  determine  the  KHV  infectivity  in  nile  tilapia  were  infected  by  artificially infection  and  determine  dose  KHV  infection  that  can  infect  nile  tilapia.  The  study  design  used  true experimental  with  with  the  presentation  of  descriptive  data.  Dose  of  viral  infection  are  1  ID 50 ,  10  ID 50 , 100 ID 50 and 1000 ID 50 .
The  results  showed  that  no  clinical  symptoms  of  KHV  infected  in  nile  tilapia.  The  results  of electrophoresis  of  PCR  products  showed  that  the  mucus  of  nile  tilapia  were  infected  with  a  1000  ID 50 immersion dose showed thin bands. The same results are also shown in the gill of nile tilapia infected by gill spray at 1000 ID 50 dose. Fish were infected by injection, KHV was not detected in mucus, gill, kidney and liver. The results above show nile tilapia cannot be infected by KHV on various treatment.
Keywords : KHV, nile tilapia, PCR

## Pendahuluan
Koi  Herpesvirus (KHV)  yang  juga dikenal sebagai Cyprinid herpesvirus -3 (CyHV- 3) atau carp nefritis interstitial and necrosis gill virus (CNGV)  (Minamoto et  al .,  2011) merupakan  virus  yang  menjadi  salah  satu ancaman  yang  paling  penting  untuk  ikan  mas dan ikan koi yang dibudidayakan (Bergmann et al .,  2010).  KHV  merupakan  patogen  ikan  yang dominan  menginfeksi  ikan  mas  dan  ikan  koi ( Cyprinus  carpio dan C.  carpio  koi )  dan  telah menyebabkan  penyakit  dan  kematian  massal populasi  spesies  ini  baik  dalam  budidaya maupun  alam  liar  (Garver et  al .,  2010).  KHV menyebabkan  penyakit  setiap  musim  semi  dan musim  gugur,  pada  saat  suhu  air  mencapai  18- 25°C (Lio-Po, 2011) dengan  angka kematian di
kolam yang terinfeksi yaitu 80-90% pada benih serta ikan dewasa (Perelberg et al ., 2003). Maka sejak  tahun  2007  KHV  masuk  untuk  daftar penyakit  yang dilaporkan Organisasi Kesehatan Hewan  Dunia  atau Office  International  des Epizooties (OIE) (Lio-Po, 2011).
Data  hasil  pemantauan  hama  dan penyakit ikan karantina (HPIK)  yang dilakukan Unit  Pelaksana  Teknis  (UPT)  karantina  di Indonesia selama 3 tahun terakhir menunjukkan KHV  juga  terdeteksi  pada  ikan  nila  (Rianto, 2014).  Di  Indonesia,  ikan  nila  dipelihara  dalam keramba yang berdekatan dengan keramba ikan mas  yang  terinfeksi  alami  dengan  KHV  (Lio- Po,  2011).  Pemeliharaan  semacam  itu  dapat menyebabkan  virus  menyerang  ikan  nila  dan
terdeteksi  pada  saat  pengujian  di  dalam laboratorium.
Metode  diagnosis  KHV  saat  ini didasarkan pada definisi kasus dan deteksi PCR ( Polymerase  Chain  Reaction ).  Konsep  dasar PCR  yaitu  satu  molekul  DNA  digunakan memproduksi dua  kopi DNA, kemudian empat, delapan  dan  seterusnya  melalui  penggandaan yang  dilakukan  enzim  polimerase.  Hasil  PCR terkadang ditunjukkan adanya band yang samar yang  diakibatkan  jumlah  virus  yang  rendah, sehingga  perlu  dilakukan  penelitian  untuk mengetahui  adanya  DNA  KHV  pada  ikan  nila menggunakan dosis infeksi yang berbeda.
Tujuan  penelitian  ini  yaitu  untuk mengetahui  infeksi  KHV  pada  ikan  nila  yang diinfeksi  secara  buatan  dan  mengetahui  dosis infeksi KHV yang dapat menginfeksi ikan nila.

## Materi dan Metode
Sampel Dalam  penelitian  ini  terdapat  3 perlakuan  inokulasi  dengan  masing-masing  5 perlakuan dosis yaitu 1 kontrol dan 4 perlakuan infeksi  virus  pada  ikan.  Jumlah  ikan  setiap perlakuan  dosis  5  ekor,  sehingga  jumlah  total ikan  65  ekor.  Teknik  pengambilan  sampel menggunakan simple  random  sampling yaitu teknik  pengambilan  sampel  yang  memberikan kesempatan  yang  sama  kepada  setiap  anggota yang  ada  dalam  suatu  populasi  untuk  dijadikan sampel (Siregar, 2011).
Pengambilan Filtrat Virus Isolasi virus dilakukan dengan mengambil organ dari ikan yang terinfeksi yang sebelumnya  dilakukan  pengujian  menggunakan PCR  dengan  membaca  pita  DNA  yang  positif pada  290  bp.  Isolasi  virus  dilakukan  dengan mengambil bagian insang, ginjal, limpa dan hati yang  kemudian  ditimbang  dan  ditumbuk menjadi  pasta  halus  dalam  mortar  steril  dingin, dihomogenisasi  sebanyak  9  kali  dari  berat sampel dengan phosphate-buffered saline (PBS) tanpa magnesium dan kalsium. Setelah itu organ dihomogenkan dengan  mixer. Organ  yang telah dihomogenkan  kemudian  disentrifugasi  pada 2500  rpm  selama  10  menit  pada  suhu  4°C,  dan supernatan disaring melalui membran filter 0,45 µm  (Lio-Po et.  al .,  2009).  Hasil  penyaringan kemudian  diencerkan  dengan  kelipatan  10 hingga 10 -6 .
Penyuntikan pada Ikan Koi
Hasil
pengenceran
selanjutnya
disuntikkan  ke  ikan  sebanyak  200  µl  secara intraperitoneal  (Sunarto et.  al .,  2005 b ).  Ikan yang  telah  disuntik  dipelihara  selama  14  hari
pada  suhu  23-25°C  dan  diamati  setiap  dua  kali sehari  untuk  tanda-tanda  klinis  penyakit  dan mortalitas.  Ikan  diberi  makan  sekali  sehari dengan  pakan  komersial  sebanyak  1%  berat badan  setiap  hari  (El-Matbouli and Soliman, 2011).
Penentuan Titer Virus Ikan  yang  telah  disuntik  selanjutnya dihitung  mortalitasnya  dan  dimasukkan  ke dalam rumus Reed-Muench (Lennette, 1969) :
(% kematian pada pengenceran di atas 50%) – (50%) PD = (%  kematian  pada  pengenceran  di  atas  50%)  –  (% kematian pada pengenceran di bawah 50%)
Keterangan: PD: Proportionate Distance atau selang proporsi Kemudian dilakukan penghitungan untuk mengetahui nilai ID50 yaitu konsentrasi dimana ikan terinfeksi sebanyak 50% dari populasi pada batas  waktu  tertentu.  Selanjutnya  menetukan dosis dari titer virus dengan cara pengenceran:
1 ID 50 : stok virus diencerkan 5000x
10 ID 50 : stok virus diencerkan 500x 100 ID 50 : stok virus diencerkan 50x 1000 ID 50 : stok virus diencerkan 5x
Inokulasi KHV pada Ikan Nila
Inokulasi virus pada ikan nila dilakukan  melalui  perendaman,  penyuntikan dan  semprot  insang  menggunakan  dosis  dari ID 50 yang berbeda sebanyak 1 ID 50 , 10 ID 50 , 100 ID 50 dan  1000  ID 50 /ml  serta  penyuntikan menggunakan  PBS  tanpa  virus  sebagai  kontrol. Perendaman  dilakukan  dengan  merendam  ikan dalam  2  liter  air  yang  telah  diberi  isolat  virus selama  2  jam.  Suhu  selama  perendaman dipertahankan  pada  22-24°C.  Setelah  itu  ikan dipindah  ke  dalam  akuarium  pemeliharaan  dan dipelihara selama 8 hari. Penyuntikan dilakukan dengan  menyuntik  isolate  virus  ke  ikan  secara intraperitoneal  sebanyak  0,2  ml/  ikan.  Semprot insang  dilakukan  dengan  menyemprot  insang ikan  dengan  isolat  virus  sebanyak  0,1  ml/  ikan. Selanjutnya  dilakukan  pengujian  menggunakan metode PCR pada organ insang, ginjal, hati dan lendir  pada  tiap  perlakuan  ikan  nila  untuk mengetahui adanya DNA KHV pada ikan nila.
Pengujian menggunakan Metode PCR Prosedur pelaksanaan PCR untuk KHV dilakukan  menurut  SNI:  2009  diawali  ekstraksi DNA  yaitu  mengambil  organ  sebanyak  25  mg- 50  mg  dan  ditambahkan  1000  µl  larutan DNAzol,  kemudian  hancurkan  menggunakan pellet  pestle dan  sentrifugasi  11.000  rpm  (r=7 cm) selama 10 menit. Supernatan sebanyak 500
µl  –  700  µl  dipindahkan  ke  dalam  mikrotube baru dan ditambahkan 100% alkohol 500 µl dan dicampurkan dengan cara dibolak-balik. Supernatan disimpan pada suhu 25-30°C selama 1-3  menit  kemudian  disentrifugasi  7.000  rpm (r= 7 cm) selama 1-2 menit.
Supernatan selanjutnya dibuang,
kemudian pellet dicuci  sebanyak  2  kali  dengan menambahkan 800-1000µl alkohol 75%, dicampur  dengan  cara  membolak-balikkan sebanyak  6  kali  dan  didiamkan  beberapa  saat hingga  DNA  terkumpul  di  dasar  mikrotube.
Setelah itu alcohol dibuang dengan menggunakan pipet (atau dengan mensetrifugasi pada  7.000  rpm  (r=7  cm)  selama  1-2  menit kemudian buang alkohol) kemudian dikeringkan selama  5-15  detik.  DNA  dilarutkan  segera setelah supernatan dibuang dengan menambahkan  200-300  µl  campuran  8  mM NaOH  (untuk  50  µl  8  mM  NaOH  ditambahkan 1,6 µl 0,1-1 mM HEPES) atau ddH 2 O.
Tahap  amplifikasi  dimulai  dengan menentukan  komposisi  pereaksi  hingga  25  µl yaitu  HotStarTaq_  Master  Mix  (QIAGEN) sebanyak  12,5  µl,  Primer  F290  (20  ρMol) sebanyak  0,5  µl,  Primer  R290  (20  ρMol)
sebanyak  0,5  µl, template DNA  sebanyak  2  µl, dan  DNase-free  water  sebanyak  9,5  µl.  Setelah itu  dilakukan  pengaturan  suhu  dan  siklus thermocycler ,  yaitu  tahap pre-denaturation (94°C) selama 30 detik sebanyak 1 siklus, tahap denaturation (94°C)  selama  30  detik  sebanyak 40  siklus,  tahap annealing (63°C)  selama  30 detik  sebanyak  40  siklus,  tahap extension (72°C) selama 30 detik sebanyak 40 siklus, dan tahap final  elongation (72°C)  selama  10  menit sebanyak  1  siklus.  Produk  hasil  amplifikasi selanjutnya  dianalisis  dengan  elektroforesis pada  gel  agarosa  1%  setelah  sebelumnya  diberi pewarnaan dengan 0,05% ethidium bromide .

## Hasil dan Pembahasan
Ikan  nila  tidak  menunjukkan  gejala klinis pada perlakuan perendaman, penyuntikan maupun semprot insang dengan dosis 1 ID 50 , 10 ID 50 , 100 ID 50 dan 1000 ID 50 . Ikan nila dari tiap perlakuan dosis selanjutnya dilakukan pemeriksaan menggunakan PCR untuk
mengetahui adanya DNA KHV. Hasil elektroforesis  produk  PCR  dapat  dilihat  pada Gambar 1, 2, 3 dan 4.
Gambar 1.   Hasil  elektroforesis  sampel  insang  dan  lendir  ikan  nila  pada  perlakuan  perendaman. Keterangan:  (A)  M-  marker  100  bp, 1-  kontrol  positif,  2-  kontrol  negatif,  3-  lendir  ikan kontrol,  4-  insang  ikan  kontrol,  5-  lendir  ikan  dosis  1000  ID 50 ,  6-  lendir  ikan  dosis  100 ID 50 , 7- lendir ikan dosis 10 ID 50 , 8- lendir ikan dosis 1 ID 50 . (B) M- marker 100 bp, 1- kontrol  positif,  2-  kontrol  negatif,  3-  insang  ikan  dosis  1000  ID 50 ,  4-  insang  ikan  dosis
100 ID 50 , 5- lendir ikan dosis 1000 ID 50 , 6- insang ikan dosis 10 ID 50 , 7- insang ikan dosis 1 ID 50 .
Gambar 2.   Hasil  elektroforesis  sampel  insang  dan  lendir  ikan  nila  pada  perlakuan  semprot  insang. Keterangan: M- marker 100 bp, 1- kontrol positif, 2- kontrol negatif, 3- insang ikan dosis 1 ID 50 , 4- insang ikan dosis 10 ID 50 , 5- insang ikan dosis 100 ID 50 , 6- insang ikan dosis 1000 ID 50 ,  7-  lendir  ikan  dosis  1  ID 50 ,  8-  lendir  ikan  dosis  10  ID 50 ,  9-  lendir  ikan  dosis 100 ID 50 , 10- lendir ikan dosis 1000 ID 50 , 11- kontrol positif.
Gambar 3.   Hasil  elektroforesis  sampel  insang  dan  lendir  ikan  nila  pada  perlakuan  penyuntikan. Keterangan: M- marker 100 bp, 1- kontrol positif, 2- kontrol negatif, 3- insang ikan dosis 1 ID 50 , 4- insang ikan dosis 10 ID 50 , 5- insang ikan dosis 100 ID 50 , 6- insang ikan dosis 1000 ID 50 ,  7-  lendir  ikan  dosis  1  ID 50 ,  8-  lendir  ikan  dosis  10  ID 50 ,  9-  lendir  ikan  dosis 100 ID 50 , 10- lendir ikan dosis 1000 ID 50 .
KHV tidak hanya menyerang ikan mas dan  ikan  koi,  tetapi  juga  ikan  air  tawar  lain seperti  ikan  nila.  Akan  tetapi  gejala  klinis  ikan yang  terserang  tidak  nampak  seperti  ikan  mas dan  ikan  koi.  Hal  itu  bisa  dilihat  dari  hasil penelitian ini yang menggunakan berbagai dosis yang  berbeda.  Tidak  adanya  gejala  klinis  pada ikan  nila  disebabkan  virus  ini  memiliki  kisaran inang  yang  sangat  sempit  (Perelberg et  al ., 2003).  Walaupun  ikan  nila  tidak  menunjukkan gejala klinis, akan tetapi hasil PCR pada sampel lendir  yang  diberi  dosis  perendaman  1000  ID 50 dan  sampel  insang  yang  diberi  dosis  semprot insang  1000  ID 50 menunjukkan  adanya  pita/ band yang  samar/  tipis  yang  terletak  sejajar dengan  kontrol  positif.  Hasil  ini  sama  dengan pemantauan  KHV  pada  ikan  nila  di  Tuban dimana secara eksternal ikan nila yang terserang KHV  tidak  menunjukkan  gejala  klinis,  akan tetapi  pada  pemeriksaan  laboratorium  terdapat pita/ band yang  sejajar  dengan  kontrol  positif (Suprapto dan Yulia, 2012).
Hasil PCR tipis/ samar juga menunjukkan  adanya  infeksi  laten  dari  virus. Salah  satu  karakteristik  unik  dari  semua  virus herpes  adalah  kemampuan  untuk  membentuk infeksi  laten,  yang  dapat  diaktifkan  dalam berbagai  kondisi  stress  (Xu et.  al .,  2013). Latensi  virus  disebabkan  banyak  virus  herpes menyandikan  gen  yang  dapat  memodulasi respon imun inang dan menghindari pertahanan kekebalan  inang.  Dua  gen  supresor  kekebalan tubuh  ikan,  TNFR  dan  IL-10,  dapat  dikodekan oleh  genom KHV. Hal ini  menunjukkan bahwa gen  modulasi  kekebalan  disimpan  dan  dapat memainkan  peran  penting  dalam  kemampuan
virus  untuk  menghindari  sistem  kekebalan tubuh inang (Xu et al ., 2013).
Hasil  PCR  pada  sampel  insang,  ginjal dan  hati  pada  berbagai  dosis  perlakuan perendaman  tidak  menunjukkan  adanya  KHV. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  virus  tidak menginfeksi  ikan  nila  walaupun  pada  ikan  koi dan  ikan  mas  KHV  dapat  masuk  melalui  kulit ikan.  Seperti  pendapat  Costes et  al .  (2009) bahwa  di  samping  virus  masuk,  kulit  bisa menjadi  jaringan  target  untuk  virus.  Hasil penelitian  Adamek et  al .  (2013)  bersama-sama dengan  hasil  sebelumnya  Costes et  al .  (2009), menunjukkan  bahwa  replikasi  KHV  pada  kulit akan  memudahkan  infeksi  ke  individu  lain melalui rute “kulit ke air ke kulit” atau “kulit ke kulit”.  KHV  menginfeksi  pada  kulit  ikan dengan  mengurangi  gen  yang  mengkode beberapa  komponen  mukosa  penghalang  dari lapisan  lendir  seperti  mucin  5B,  AMP,  beta defensin 1 dan 2, dan protein- claudin 23 dan 30 (Adamek et al ., 2013).
Ikan  nila  yang  diberi  perlakuan semprot  pada  insang  dengan  berbagai  dosis menunjukkan  hasil  yang  sama  yaitu  tidak terdeteksinya  KHV pada lendir, ginjal dan  hati. KHV  yang  menyerang  ikan  koi  dan  ikan  mas umumnya menginfeksi bagian insang. Kemungkinan  bahwa  virus  bereplikasi  pada insang  yang  sakit  dan  kemudian  masuk  ke dalam  air  adalah  sesuai  dengan  penyebaran cepat  dan  efisien  penyakit  menular  ini.  Hal  ini analog  dengan  virus  pernapasan  pada  mamalia yang menginfeksi epitel pernapasan, bereplikasi di sana, dan menyebar melalui tetesan udara dan aerosol.  Hal  ini  mungkin  juga  menjadi  cara
Gambar 4.   Hasil elektroforesis sampel ginjal dan hati ikan nila. Keterangan: (A) M- marker 100 bp, 1- kontrol positif, 2- kontrol negatif, 3- ginjal ikan kontrol, 4- hati ikan kontrol, 5- ginjal ikan dosis 1000 ID 50 , 6- ginjal ikan dosis 100 ID 50 , 7- ginjal ikan dosis 10 ID 50 , 8- ginjal ikan  dosis  1  ID 50 ,  9-  kontrol  negatif,  10-  hati  ikan  dosis  1000  ID 50 .  (B)  M-  marker,  1- kontrol positif, 2- kontrol negatif, 3- hati ikan dosis 100 ID 50 , 4- hati ikan dosis 10 ID 50 , 5- hati ikan dosis 1 ID 50 .
yang  paling  umum  penyebaran  virus  akuatik (Pikarsky et al ., 2004).
Ikan  nila  yang  diberi  perlakuan penyuntikan  intraperitoneal,  DNA  KHV  tidak terdeteksi  pada  lendir,  insang,  ginjal  dan  hati pada  berbagai  dosis  penyuntikan  (1  ID 50 -  1000 ID 50 ).  Hal  ini  sesuai  dengan  penelitian  yang dilakukan Rahmawati (2010) pada pemeriksaan ikan nila menggunakan metode PCR yang diberi perlakuan  penyuntikan  dengan  KHV  juga menunjukkan hasil yang negatif.
Pada penelitian ini dimana
menggunakan ikan nila sebagai subjek penelitian  menunjukkan  ikan  tidak  terinfeksi KHV  dan  tidak  menunjukkan  gejala  klinis.  Hal ini  disebabkan  ikan  nila  merupakan  spesies yang  mampu  untuk  mentolerir berbagai kondisi lingkungan  (Grammer et  al .,  2012).  Ikan  tetap dapat hidup pada suhu permisif KHV (18-25°C) dimana  virus  dapat  menginfeksi  ikan  mas  dan ikan  koi  dikarenakan  batas  bawah  suhu mematikan  bagi  ikan  nila  yaitu  11-12°C  (FAO, 2012).

## Kesimpulan
Kesimpulan yang didapat dari penelitian  ini  yaitu  ikan  nila  ( Oreochromis niloticus )  tidak  dapat  terinfeksi  oleh  KHV.  Hal ini  ditunjukkan  dengan  tidak  terdeteksinya KHV  pada  lendir,  insang,  ginjal  dan  hati melalui  metode  PCR  dengan  panjang  amplikon 290  bp  pada berbagai  perlakuan.  Ikan  nila  juga tidak  menunjukkan  gejala  klinis  terinfeksi KHV.  Pada  perlakuan  perendaman,  KHV  tidak terdeteksi  pada  lendir,  insang,  ginjal  dan  hati ikan  nila  ( Oreochromis  niloticus )  dengan  dosis 1000 ID 50 , 100 ID 50 , 10 ID 50 dan 1 ID 50 . Begitu pula  dengan  perlakuan  semprot  insang  dan penyuntikan  intraperitoneal.  Hasil  penelitian menggunakan  PCR  konvensional  menunjukkan KHV tidak terdeteksi pada lendir, insang, ginjal dan hati pada berbagai dosis perlakuan. Sebagai tambahan,  dapat  dicoba  dengan  jenis  PCR  lain seperti  nested  PCR  maupun  Real-Time  PCR, atau  dapat  menggunakan  metode  lain  untuk lebih memberikan hasil yang lebih optimal.

## Daftar Pustaka
Adamek,  M.,  H.  Syakuri,  S.  Harris,  K.  Ł. Rakus,  G.  Brogden,  M.  Matras,  I. Irnazarow, D. Steinhagen. 2013.
Cyprinid herpesvirus 3 Infection
Disrupts  The  Skin  Barrier  of  Common Carp  ( Cyprinus  carpio L.).  Veterinary Microbiology 162: 456-470. Bergmann, S. M., M. Riechardt, D. Fitchtner, P.
Lee and J. Kempter. 2010. Investigation on the diagnostic
sensitivity  of  molecular  tools  used  for detection of koi herpesvirus. Journal of
Virology Methods 163: 229-233.
Costes,  B.,  V.  S.  Raj,  B.  Michel,  G.  Fournier, M.  Thirion,  L.  Gillet,  J.  Mast,  F.
Lieffrig, M. Bremont and A.
Vanderplasschen.  2009.  The  Major Portal  Entry  of  Koi  Herpesvirus  in Cyprinus carpio Is the Skin. Journal of Virology: 2819-2830. El-Matbouli,  M. and H.  Soliman.  2011. Transmission  of Cyprinid  herpesvirus- 3 (CyHV-3)  from  goldfish  to  na ȉ ve common carp by cohabitation. Research  in  Veterinary  Science  90: 536-539. FAO. 2012. Cultured Aquatic Species Information  Programme. Oreochromis niloticus .  Cultured  Aquatic  Species Information  Programme.  Text  by Rakocy,  J.  E.  In:  FAO  Fisheries  and Aquaculture Department [online]. Rome. 12 pp.
Garver,  K.  A.,  L.  Al-Hussinee,  L.  M.  Hawley,
T.  Schroeder,  S.  Edes,  V.  LePage,  E. Contador, S. Russel, S. Lord, R. M. W. Stevenson, B. Souter, E. Wright and J. S.  Lumsden.  2010.  Mass  Mortality Associated  with  Koi  Herpesvirus  in Wild Common Carp in Canada. Journal of Wildlife Disease 46(4): 1242-1251.
Grammer,  G.  L.,  W.  T.  Slack,  M.  S.  Peterson, and M.  A.  Dugo.  2012.  Nile  Tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus,
1758)  Establishment  in  Temperate
Mississipi,  USA:  Multi-Year  Survival Confirned  by  Otolith  Ages.  Aquatic Invasions Vol. 7: 367-376.
Lennette,  E.  H.  1969.  General  Principles Underlying  Laboratory  Diagnosis  of
Viral and Rickettsial Infections.
Diagnostic  Procedurs  for  Viral  and Rickettsial  Infections.  Fourth  Edition.
American  Public  Health  Association,
Inc. New York. pp 47-49.
Lio-Po,  G.  D., et.  al .  2009.  Surveillance  of
Emerging  Fish  Viral  Pathogens  in Some  Southeast  Asian  Countries.  The Israeli Journal of Aquaculture- Bamidgeh 61(3): 208-214.
Lio-Po, G. D. 2011. Recent development in the study and surveillance of koi herpesvirus (KHV) in Asia. Diseases in Asian Aquaculture VII: 13-28.
Minamoto,  T.,  M.  N.  Honjo,  H.  Yamanaka,  N. Tanaka,  T.  Itayama and Z.  Kawabata.
2011. Detection of cyprinid
herpesvirus-3  DNA  in  lake  plankton.
Research  in  Veterinary  Science  90: 530-532.
Perelberg,  A.,  M.  Smirnov,  M.  Hutoran,  A. Diamant,  Y.  Bejerano and M.  Kotler. 2003.  Epidemiological  Description  of
A  New  Viral  Disease  Afflicting
Cultured Cyprinus carpio in Israel. The Israeli Journal of Aquaculture- Bamidgeh 55(1): 5-12.
Pikarsky, E., Ronen,A., Abramowitz, J., Levavi- Sinan,  B.,  Hutoran,  M.,  Shapira,  Y., Steinetz,  M.,  Perelberg,  A.,  Soffer,  D., and  Koller,  M.  2004.  Pathogenesis  of Acute Viral Diseaae Induced in Fish by Carp  Interstitial  Nephritis  and  Gill Necrosis  Virus.  Journal  of  Virology, 78: 9554-9551. Rahmawati W., T. 2010. Pencarian Inang KHV ( Koi  herpesvirus )  dari  Beberapa  Jenis Ikan:  Koi  ( Cyprinus  carpio ),  Koki ( Carassius auratus ), Komet ( Carassius auratus  auratus ),  Nila  ( Oreochromis niloticus ) dan Lele ( Clarias batrachus ). Fakultas  Perikanan  dan  Kelautan. Universitas Airlangga. 41 hal.
Rianto  W.,  B.  2014.  Analisis  Filogenetik  Gen Thymidin  Kinase  Koi  Herpesvirus (KHV)  Beberapa  Ikan  Air  Tawar  di Sentra  Budidaya  Provinsi  Jawa  Timur.
Tesis Program Pascasarjana. Universitas  Airlangga.  Surabaya.  61 pp. Siregar,  S.  2011.  Statistika  Deskriptif  untuk
Penelitian. Dilengkapi Perhitungan
Normal & Aplikasi SPSS versi 17. PT.
Raja  Grafindo  Persada.  Jakarta.  324 hal. Sunarto, A., Taukhid, A. Rukyani, I. Koesharyani,  H.  Supriyadi and L. Gardenia. 2005. Field Investigations on a Serious Disease Outbreak among Koi and  Common  Carp  ( Cyprinus  carpio ) in  Indonesia.  Diseases  in  Asian
Aquaculture V. hal. 125-135. Suprapto,  H.  dan  Yulia  K.  2012.  Pemantauan Virus dengan Metode
PCR ( Polymerase Chain Reaction ) di Pantai Utara  Jawa  Timur.  Jurnal  Ilmiah Perikanan dan Kelautan Vol. 4 (1): 65- 71.
Xu,  J.  R.,  J.  Bently,  L.  Beck,  A.  Reed,  T. Miller-Morgan,  J.  R.  Heidi,  M.  L. Kent,  D.  D.  Rockey and L.  Jin.  2013. Analysis  of  koi  herpesvirus  latency  in wild common carp and ornamental  koi in Oregon, USA. Journal of Virological Methods 187: 372-379.