## STABILITAS pH DAN SUHU DAN BERAT MOLEKUL PEKTIN HIDROLASE EKSTRASELULER BAKTERI PEKTINOLITIK  DALAM KLARIFIKASI JUS JERUK

## pH STABILITY AND THERMOSTABILITY AND MOLECULAR WEIGHT OF EXTRACELLULAR PECTIN HYDROLASE OF PECTINOLYTIC BACTERIA ON CITRUS JUICE CLARIFICATION
Esti Widowati 1) Harijono 2) Aji Sutrisno 2)
1) Staf Pengajar Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret
2) Staf Pengajar Jurusan Teknologi Hasil Pertanian Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya
Email : esti_widowati@yahoo.com

## ABSTRACT
The aim of this research were to determine extracellular  pectin hydrolase enzyme  characters in citrus juice clarification (pH stability,thermostability and molecular weight) from pectinolytic bacteria. Isolate 15 was the isolate from dari citrus peel with incubation temperature at 37°C and isolate 19 and 21 from mix of citrus peel and soil with incubation temperature partially 50°C and 55°C. Extracellular pectin hydrolase from isolate 15  stable  at  pH  3,0-4,0  and  at  pH  3,0-5,0  of  isolate  19  and  21.  These  isolates  inactive  at  pH  9,0  at  50 C. Extracellular pectin hydrolase from isolate 15, 19 and 21 stable at 50 C at pH 7,0 and inactive at 90 C at pH 7,0. Each enzyme from isolate 15, 19 and 21 had molecular weight partially 35,5 kDa, 34,5 kDa and 37,5 kDa.
Key  words:  Citrus  juice  clarification,  Extracellular  pectin  hydrolase,  Molecular  weight,  Pectinolytic  bacteria, pH stability, Thermostability

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan karakter enzim pektin hidrolase ekstraseluler dalam klarifikasi jus jeruk dari isolat bakteri pektinolitik yaitu kestabilan enzim terhadap pH dan suhu dan berat molekul enzim. Isolat  15  diperoleh  dari  kulit  jeruk  yang  dibusukkan  dengan  suhu  inkubasi  37°C  sedangkan  isolat  19  dan  21 diperoleh  dari  kulit  jeruk  ditambah  tanah  kebun  dengan  suhu  inkubasi  masing-masing  50°C  dan  55°C.  Enzim pektin  hidrolase  ekstraseluler  isolat  15  stabil  pada  pH  3,0-4,0  sedangkan  enzim  pektin  hidrolase  ekstraseluler isolat  19  dan  21  stabil  pada  pH  3,0-5,0.  Ketiga  enzim  inaktif  pada  pH  9,0  pada  suhu  inkubasi  50 C.  Enzim pektin  hidrolase  ekstraseluler  isolat  15,  19  dan  21  stabil  pada  suhu  30-50 C  kemudian  inaktif  pada  suhu  90 C pada pH 7,0. Enzim pektin  hidrolase ekstraseluler isolat 15, 19 dan 21 masing-masing  memiliki berat  molekul sebesar 35,5 kDa; 34,5 kDa dan 37,5 kDa.
Kata Kunci :  Bakteri pektinolitik,  Berat  molekul, Kestabilan pH,  Kestabilan suhu, Klarifikasi jus jeruk, Pektin hidrolase ekstraseluler

## PENDAHULUAN
Jus  jeruk  merupakan  suspensi  koloid dari  pektin,  gula,  protein  dan  mineral. Molekul-molekul tersebut menyebabkan kekeruhan  dan  viskositas  yang  tinggi  pada jus  jeruk  (Benitez  and  Lozano,  2006  dalam Widowati dkk, 2012). Pektin dalam jus jeruk dapat  mempengaruhi  warna  dan  citarasa (Croak and Corredig, 2006).
Klarifikasi  jus  jeruk  dapat  dilakukan dengan  filtrasi  atau  sentrifugasi  untuk mengendapkan  pulp.  Pektin  larut  air  dalam jus jeruk masih menyebabkan kekeruhan dan dapat  menyumbat  pori  membran  filter sehingga  menghambat  proses  klarifikasi (Pilnik  and  Voragen,  1993  dalam  Widowati
dkk,  2012).  Oleh  karena  itu  diperlukan enzim pektinase.
Mekanisme  klarifikasi  jus  jeruk dengan keterlibatan enzim dilakukan dengan memperkecil molekul pektin menjadi senyawa  pektat  yang  larut  air  sehingga viskositas jus menurun (Pilnik and Voragen, 1993; Koutchma, 2005), melalui mekanisme pengendapan  agregat  (de  Man,  1997)  dan mencegah  pembentukan  gel  (Hidayat  dkk, 2006).
Menurut  deCarvalho et  al .,(2006), proses  klarifikasi  jus  jeruk  yang  melibatkan enzim  biasanya  berlangsung  pada  suhu 40 C-65 C  pada  pH  3,5-5,5  selama  15-120 menit.  Oleh  karena  itu  dalam  penelitian  ini dilakukan  eksplorasi  dan  karakterisasi  isolat termofolik dan enzim termostabil.
Enzim pektinase untuk klarifikasi jus dapat  diperoleh  dari  bakteri  yang  memiliki laju pertumbuhan sel  yang cepat dan mudah dibiakkan pada kondisi nutrisi, suhu dan pH yang  bervariasi.  Isolat  termostabil  saat  ini belum  banyak  dieksplorasi  terutama  dalam aplikasi  industri  yang  menggunakan  suhu tinggi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi  enzim  pektin  hidrolase ekstraseluler  dalam  klarifikasi  jus  jeruk  dari isolat  bakteri  pektinolitik  yaitu  kestabilan enzim  terhadap  pH  dan  suhu  dan  berat molekul enzim.

## METODE PENELITIAN

## Penelitian Tahap I
Produksi, Ekstraksi dan Pemurnian Enzim  Pektin  Hidrolase  Ekstraseluler (Salvador et  al. ,  2002;  Rolinek,  2003 dalam Widowati dkk, 2012)
Produksi  enzim  ditentukan  pada  fase logaritma isolat.
Penentuan kurva pertumbuhan  bakteri  dilakukan  dengan penentuan  panjang  gelombang  maksimum dan kurva standar isolat dalam media pektin cair.  Kurva  pertumbuhan  dilakukan  pada media  pektin  cair  dengan  agitasi  144  rpm sesuai  dengan  suhu  masing-masing  isolat. Aktivitas  enzim  kasar  diuji  dengan  metode DNS  pada  setiap  titik  pengambilan  sampel kurva  pertumbuhan.  Kurva  pertumbuhan isolat  dan  kurva  aktivitas  enzim  kemudian digabungkan  untuk  penentuan  hubungan antara  jumlah  sel  dan  fase  pertumbuhan  sel dengan aktivitas enzim.
Isolat  bakteri  yang  telah  mencapai fase  logaritma  kemudian  diekstraksi  dengan sentrifugasi  pada  kecepatan  6000  rpm  4 C selama  15  menit.  Supernatan  dipresipitasi dengan fraksinasi ammonium sulfat 10-90%. Sentrifugasi dilakukan  pada kecepatan 12000  rpm  selama  10  menit  4 C.  Pellet ditambah  dengan  buffer  asetat  0,05  M  pH 5,2  (1:1).  Uji  aktivitas  enzim  kemudian dilakukan  dengan  metode  DNS  pada  fase supernatan dan pellet.
Fase dengan aktivitas enzim tertinggi dimasukkan dalam kantung membran selophan  untuk  prosedur  dialisis.  Membran
tersebut  direndam  selama  24  jam  pada  suhu 4 C dalam gelas beaker 600 ml berisi 300 ml buffer asetat 0,05 M pH 5,2 yang dilengkapi magnetic stirer.

## Penelitian Tahap II
Karakterisasi  Enzim  Pektin  Hidrolase (Laemmli,  1970;  Van  Rijssel et  al. ,  1993; Munoz  and  Ros,  1996;  Wilson  and Walker, 2004)
Penentuan  Kestabilan  pH  dan  Suhu Enzim Pektin Hidrolase Ekstraseluler
Kestabilan  pH  enzim  dilakukan dengan  0,1  ml  enzim  diinkubasi  dalam  0,1 ml  buffer  sodium  asetat  0,025  M  pH 3,4,5,6,7,8,9  dan  10  selama  30  menit  pada suhu 50 C.
Kestabilan  suhu  enzim  dilakukan dengan  0,1  ml  diinkubasi  dalam  0,1  ml buffer sodium asetat 0,025 M pH 7,0 selama 30  menit  pada  suhu  30,40,50,60,70,80  dan 90 C.
Uji  aktivitas  enzim  pektin  hirolase ekstraseluler  didasarkan  pada  pengukuran gula  reduksi  yang  dilepaskan.  Penentuan gula reduksi dilakukan dengan metode DNS dengan asam D-galakturonat sebagai standar. Enzim sebanyak 0,1 ml dicampur dengan 0,9 ml  media  pereaksi  (0,7%  pektin  citrus ditambah  buffer  sodium  asetat  0,025  M  pH 4,8)  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 C  selama 30  menit.  Sampel  ditambah  1  ml  DNS kemudian  dipanaskan  selama  10  menit dalam  air  mendidih  bersuhu  90 C.  Seluruh tabung  reaksi  didinginkan.  Larutan  K-Na- Tartrat  40%  ditambahkan  sebanyak  0,5  ml dan  dihomogenkan.  Masing-masing  sampel ditera  pada  panjang  gelombang  540  nm. Aktivitas enzim ditentukan dengan mengkonversikan  nilai  absorbansi  asam  D- galakturonat dengan persamaan regresi linier kurva standar asam D-galakturonat 100 ppm.
Satu  unit  aktivitas  enzim  pektin hidrolase  dinyatakan  sebagai  1  mol  gugus reduksi yang mampu dihidrolisis oleh enzim per  menit  pada  kondisi  yang  sesuai  atau banyaknya  enzim  yang  melepaskan  1  mol gugus gula reduksi per menit pada suhu dan pH tertentu.

## Elektroforesis SDS-PAGE
Metode ini dilakukan untuk mengetahui  berat  molekul  protein  enzim. Elektroforesis  dilakukan  dengan  sistem discontinous dengan separating  gel 12,5% dan stacking  gel 4%. Running dilakukan pada  10  mA  CC  selama  3-4  jam  dan menggunakan molekul standar protein (Fermentas).
Gel kemudian dipotong dan
direndam  dalam  larutan staining (coomassie brilliant  blue  (R-250)  selama  +30  menit kemudian  dibilas  dengan  larutan destaining sampai pita protein terlihat jelas.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Seleksi  isolat  uji  berdasarkan  jumlah sel/ml.  diameter  zona  jernih  (mm),  aktivitas enzim (U/ml), kemampuan dalam klarifikasi jus  jeruk  dan  depolimerisasi  pektin  cair  1% maka  diperoleh  isolat  15,  19  dan  21.  Isolat 15  diisolasi  dari  sampel  kulit  jeruk  pada suhu  inkubasi  37 C.  Isolat  19  dan  21 diisolasi  dari  sampel  kulit  jeruk  dicampur tanah  kebun  dengan  suhu  inkubasi  masing- masing 50 C dan 55 C (Widowati, 2012).
Kestabilan  enzim  berperan  dalam preservasi  enzim  atau  dalam  aplikasi klarifikasi  dan  fermentasi  produk  pangan. Enzim  pektik  dapat  memiliki  karakter  yang stabil pada kondisi asam atau basa dan pada suhu tertentu sebelum enzim menjadi inaktif. Oleh  karena  itu,  uji  ini  penting  dilakukan supaya  enzim  bekerja  optimal  dalam mengkatalis reaksi.
Isolat  15  stabil  pada  pH  3,0-4,0  dan menjadi inaktif pada pH 9,0 pada suhu 50 C. Isolat  19  dan  21  stabil  pada  pH  3,0-5,0  dan inaktif  pada  pH  9,0  pada  suhu  50 C ( Gambar 1 ).
Isolat 15, 19 dan 21 stabil pada suhu 30-50 C  kemudian  mengalami  penurunan aktivitas    pada  suhu  60 C  dan  inaktif  pada suhu 90 C pada pH 7,0 ( Gambar 2 ).
(a) (b)
(c)
Gambar 1. Kestabilan pH Enzim Isolat 15 (a), 19 (b) dan 21 (c) pada suhu 50 C
(a) (b) (c)
Gambar  2.  Kestabilan  Suhu  Enzim  Isolat 15 (a), 19 (b) dan 21 (c) pada pH 7,0
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 0.500 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 pH 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 pH 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0.900 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Suhu (C) 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Suhu (C) 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Suhu (C)
Karakterisasi  enzim  melalui  analisis elektroforesis  SDS-PAGE  diperoleh  pita protein  pada  setiap  sampel  enzim  dari  isolat 15,19  dan  21.  Enzim  isolat  15,  19  dan  21 masing-masing memiliki berat molekul 35,5; 34,5 dan 37,5 kDa.
Ketiga sampel diatas dapat dikatakan sebagai enzim yang berbeda karena memiliki profil  pita  yang  berbeda,  kondisi  pH optimum  dan  kestabilan  pH  enzim  yang berbeda. Enzim pektin
hidrolase ekstraseluler diduga merupakan  enzim poligalakturonase  karena  memiliki  aktivitas enzim pada pH 4,0-5,0.
Aktivitas  enzim  endopektinase  dapat diketahui  dari  penurunan  viskositas  larutan pektin dengan viscometer Ostwald. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai banyaknya enzim  yang mereduksi viskositas spesifik  dalam  larutan  (20%  atau  50%) selama  waktu  dan  suhu  tertentu.  Aktivitas enzim eksopektinase dapat diketahui berdasarkan  pengukuran  gula  reduksi.  Satu unit  aktivitas  enzim  dinyatakan  sebagai  1 mol gugus reduksi yang mampu dihidrolisis  oleh  enzim  per  menit  pada kondisi  yang  sesuai  atau  banyaknya  enzim yang melepaskan 1  mol gugus gula reduksi per  menit  pada  suhu  dan  pH  tertentu  (Patil and Dayanand,
2006).
Berdasarkan pernyataan  tersebut  maka  aktivitas  enzim dalam  penelitian  ini  merupakan    enzim eksopektinase.

## KESIMPULAN
Kesimpulan dari penelitian ini adalah Enzim  pektin  hidrolase  ekstraseluler  isolat 15  stabil  pada  pH  3,0-4,0  sedangkan  enzim pektin  hidrolase  ekstraseluler  isolat  19  dan 21  stabil  pada  pH  3,0-5,0.  Ketiga  enzim inaktif  pada  pH  9,0  pada  suhu  inkubasi 50 C.  Enzim  pektin  hidrolase  ekstraseluler isolat  15,  19  dan  21  stabil  pada  suhu  30- 50 C kemudian inaktif pada suhu 90 C pada pH 7,0. Enzim  isolat 15, 19 dan 21 masing- masing  memiliki  berat  molekul  35,5;  34,5 dan 37,5 kDa.

## Saran
Penelitian  ini  memerlukan  eksplorasi lebih  lanjut  mengenai  uji  kestabilan  enzim
dengan interval untuk pH atau suhu terutama dalam  aplikasi  klarifikasi  di  skala  industri. Selain  itu  perlu  dilakukan  eksplorasi  lebih lanjut mengenai isolat termostabil.

## DAFTAR PUSTAKA
Benitez,  E.I  and  J.E.  Lozano.  2006. Influence  of  The  Soluble  Solids  on Zeta Potential of a Cloudy Apple Juice, Lat.Am.Appl.Res.  Scielo . 36 (3)  dalam Widowati,  E.,  Harijono  dan  A.
Sutrisno. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Pektin Hidrolase Ektraseluler Bakteri Pektinolitik dalam
Klarifikasi Jus Jeruk. Jurnal Teknologi Hasil  Pertanian .  Volume  V  No.  2 Agustus 2012 : 82-88
Croak,  S  and  M.  Corredig.  2006.  The  Role of Pectin in Orange Juice Stabilization : Effect of Pectin Methyl Esterase  and Pectinase  Activity  on  The  Size  of Cloud Particles. J. Food
Hydrocolloids . 20 (7) : 961-965
deCarvalho, L.M.j., R. Borcheta., E.M.M. da
Silva., C.W.P. Carvalho., R.M.
Miranda  and  C.A.B.  da  Silva.  2006. Effect  of  Enzymatic  Hydrolysis  on Particle  Size  Reduction  in  Lemon Juice  ( Citrus  limon ,  L.),  cv.  Tahiti. Braz.J.Food Technol . 9 (4) : 277-282
deMan,  J.M.  1997.  Kimia  Makanan,  Edisi Kedua.  K. Padmawinata (Penerjemah). Penerbit  ITB.  Bandung.  p.  201-205, 438-446, 457-461, 472
Hidayat,  N.,  M.C.  Padaga  dan  S.  Suhartini. 2006. Mikrobiologi  Industri ,  Penerbit Andi. Yogyakarta. p. 10, 35-40, 43-56
Koutchma,  T.  2005.  Effect  of  CO 2 and Pressure  Processing  on  Microbial  and Enzyme  inactivation  in  Food  and Beverages. Food Tech International
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of Structural Proteins  during  The  Assembly  of  The Head  of  A  Bacteriophage  T4. J.
Nature . 227 :680-685
Munoz,  R  and  A.B.  Ros.  1996.  Enzymes  in M.L.  Leo  (Ed.). Handbook  of  Food Analysis , Volume I. Physical
Characterization
and
Nutrient
Analysis, Marcel  Dekker.  New  York.
10 p
Patil,  S.R  and  A.  Dayanand.  2006. Production of Pectinase from Deseeded
Sunflower  Heed  by Aspergillus  niger
in Submerged and Solid-State Conditions. Biosource  Technology . 97
: 2054-2058
Pilnik,  W  and  A.G.J.  Voragen.  1993. Pectic
Enzymes in Fruit and Vegetable. Juice Manufacture. Enzymes in Food Processing .  Academic  Press  Limited.
London.  Third  Edition.  p.  363-392 dalam  Widowati,  E.,  Harijono  dan  A.
Sutrisno. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Pektin Hidrolase Ektraseluler Bakteri Pektinolitik dalam Klarifikasi Jus Jeruk. Jurnal Teknologi
Hasil  Pertanian .  Volume  V  No.  2 Agustus 2012 : 82-88
Rolinek,  R.  2003.  Separation  of  Three
Isoforms  of  Polygalacturonase  from Fermentation Supernatant of Sclerotium  rolfsii with  Pro  Team  FFE Compared to Chromatography. http://www.tecan.com/com-pdf.  April, 04, 2008 dalam Widowati, E., Harijono dan  A.  Sutrisno.  2012.  Isolasi  dan Karakterisasi Pektin Hidrolase Ektraseluler Bakteri Pektinolitik dalam Klarifikasi Jus Jeruk. Jurnal Teknologi Hasil  Pertanian .  Volume  V  No.  2 Agustus 2012 : 82-88
Salvador, L.D., T. Singanuma., K. Kitahara., Y.  Fukusage  and  H.  Tanoue.  2002. Degradation  of  Cell  Wall  Materials from Sweet Potato, Cassava and Potato
by  A  Bacterial  Protopectinase  and Terminal  Sugar  Analysis  of  The Resulting Solubilized Products, Journal of Bioscience and Bioengineering . 93 (1)  :  64-72  dalam
Widowati,  E.,  Harijono  dan  A.
Sutrisno. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Pektin Hidrolase Ektraseluler Bakteri Pektinolitik dalam Klarifikasi Jus Jeruk. Jurnal Teknologi
Hasil  Pertanian .  Volume  V  No.  2 Agustus 2012 : 82-88
Van  Rijssel,  M.,  G.J.  Gerwig  and  T.A.
Hansen. 1993. Isolation and
Characterization  of  an  Extracellular Glycosylated  Protein  Complex  from Clostridium thermosaccharolyticum with  Polygalacturonase  and  Pectin Methyl Esterase Hydrolase Activity, J . Applied and Enviromental Microbiology. 59 (3) : 828-836
Widowati,  E.,  Harijono  dan  A.  Sutrisno.
2012.  Isolasi  dan  Karakterisasi  Pektin Hidrolase Ektraseluler Bakteri Pektinolitik  dalam  Klarifikasi  Jus Jeruk. Jurnal Teknologi Hasil
Pertanian .  Volume  V  No.  2  Agustus 2012 : 82-88
Wilson,  K  and  J.  Walker.  2004.  Principles and Techniques of Practical Biochemistry. Fourth Edition. Cambridge University Press. Cambridge. 15 p