INDUKSI KALUS KRISAN ( Chrysanthemum morifolium Ramat var. Tomohon Kuning) DENGAN 2,4- Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D) DAN 6- Benzylaminopurine (BAP) PADA KONDISI PENCAHAYAAN BERBEDA
Tia Setiawati 1*) , Annisa Nur Arofah 2) , Mohamad Nurzaman 3)
1,2,3) Departemen Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Padjadjaran * Corresponding author : tia.unpad@ac.id

## Abstract
This study aims to obtain the optimum concentration of 2,4-D and BAP plant growth regulators (PGRs) to induce Chrysanthemum callus in light and dark conditions. The method used is an experimental method in the laboratory using a Completely Randomized Design (CRD) with 4 treatment of 2,4-D + BAP concentration combinations. The culture  was  incubated  under different  lighting  conditions  for  45  days  after  planting.  The  parameters  observed included ctexture and color of callus, other responses produced by explants, size, fresh weight and dry weight of callus. Data were analyzed descriptively. The results showed that 4 ppm 2,4-D + 0.5 ppm BAP treatment was the best combination in inducing Chrysanthemum callus in both light and dark conditions. In bright conditions, most of the callus were dark green and dark brown with a compact texture, callus size of 1.36 cm, and the highest fresh weight and dry weight of callus were 0.62 gram and 0.17 gram respectively. Meanwhile, in the dark conditions most of the callus were light green and light brown with a compact texture, callus size 1.18 cm, and the highest fresh weight and dry weight of the callus produced were 0.51 grams and 0.15 grams, respectively.
Keywords: Callus, Chrysanthemum morifolium, 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 6-Benzylaminopurine (BAP )

## PENDAHULUAN
Tanaman  krisan  ( C.  morifolium ) merupakan jenis tanaman hias atau tanaman pot yang banyak digemari oleh masyarakat serta  memiliki  nilai  ekonomi  yang  tinggi (Kasli,  2009).  Selain  sebagai  flora  hias, krisan  juga  memiliki  potensi  untuk dimanfaatkan  sebagai  tumbuhan  obat tradisional  dan  penghasil  racun  serangga (Rukmana  &  Mulyana,  1997).  Pada perdagangan internasional, krisan merupakan tanaman bunga potong terpenting ketiga setelah mawar dan anyelir (Mani  &  Senthil,  2011).  Namun,  telah terjadi penurunan produksi tanaman krisan dari 397.651.571 tangkai/ha di  tahun 2012 menjadi 387.208.754 tangkai/ha pada tahun
2013  (Direktorat  Jenderal  Hortikultura, 2015).  Pengembangan  budidaya  tanaman krisan  juga  terkendala  oleh  teknologi pembibitan yang belum mampu menyediakan  bibit  bermutu  tinggi  dalam jumlah  banyak  dan  waktu  yang  relatif singkat (Kasli, 2009).
Permasalahan  tersebut  dapat  diatasi melalui upaya perbanyakan tanaman secara in vitro atau kultur jaringan. Kultur in vitro tanaman  berpotensi  besar  dalam  program pemuliaan tanaman serta penyediaan benih dan bibit  berkualitas. Perbanyakan in  vitro dapat  menghasilkan  bibit  dalam  jumlah banyak  dengan  kurun  waktu  yang  relatif singkat  serta  tidak  tergantung  pada  iklim dan  musim  (Yuwono,  2008).  Perbanyakan
tanaman  secara in  vitro dapat  dilakukan melalui proses organogenesis dan embriogenesis baik secara langsung maupun tidak langsung melalui pembentukan kalus yang akan beregenerasi menghasilkan tanaman utuh.  Induksi kalus merupakan tahap awal yang sangat penting dalam perbanyakan tanaman secara in vitro yang dilakukan melalui organogenesis dan embriogenesis  tidak langsung.  Kalus dihasilkan  melalui  proses  pembelahan  sel secara  terus  menerus  dari  eksplan  yang dikultur  pada  media  dengan  menggunakan zat  pengatur  tumbuh  (ZPT)  hingga terbentuk  massa  sel  yang  selanjutnya beregenerasi  membentuk  tanaman  yang lengkap  atau  utuh  (Bustami,  2011). Zulkarnain  (2009)  menyatakan  bahwa kultur  kalus  memiliki  beberapa  kelebihan yaitu  dapat  menghasilkan  tanaman  yang bebas  dari  virus,  senyawa  metabolit sekunder, serta regenerasi varian genetika.
Kondisi lingkungan merupakan salah satu  faktor  penentu  keberhasilan  induksi kalus secara in vitro (Putri, 2008). Menurut Afshari et al . (2011), cahaya memiliki efek yang  signifikan  terhadap  pertumbuhan kalus  dan  morfogenesis.  Forooghian  & Esfarayeni  (2013)  menyatakan  bahwa faktor cahaya seperti lama durasi pencahayaan, intensitas cahaya, dan komposisi  spektral  cahaya  merupakan faktor  yang  penting  pada  kultur in  vitro. Keberhasilan  pelaksanaan  kultur  jaringan
juga  ditentukan  oleh  faktor  lain,  seperti komposisi ZPT, sumber eksplan, dan jenis tanaman.  Dalam  kultur  jaringan,  terdapat dua kelompok ZPT yang sering digunakan, yaitu auksin dan sitokinin.
Penelitian  ini  menggunakan  auksin dengan  jenis  2,4 Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Menurut Kristina et al. (2008), pembentukan dan pertumbuhan kalus dapat terjadi dengan pemberian ZPT seperti 2,4-D dan  sering  pula  dikombinasikan  dengan sitokinin.  Mardini  (2015)  mengemukakan bahwa  2,4-D  memiliki  peran  yang  sangat signifikan  terhadap  proses  pembentukan kalus,  terkait  dengan  diferensiasi  maupun peningkatan kompetensi sel yang terbentuk. Demikian  juga  dengan  sitokinin  yang berperan  dalam  memicu  pembelahan  dan pemanjangan sel, sehingga dapat mempercepat pertumbuhan dan perkembangan kalus (Indah & Ermavitalini, 2013). Salah satu  jenis  ZPT dari  golongan sitokinin  yang  sering  digunakan  adalah  6- Benzylaminopurine (BAP),  yang  berfungsi dalam  pembelahan  sel  dan  diferensiasi tunas  adventif  dari  kalus  (Bhojwani  and Razdan  1996  dalam  Syahid  &  Kristina 2007).  Beberapa  penelitian  mengenai pemberian  variasi  konsentrasi  ZPT  2,4-D dan  BAP  untuk  menginduksi  kalus  telah dilakukan.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh Ariani et  al .  (2016)  menunjukkan  bahwa pada  tahap  diferensiasi,  konsentrasi  2,4-D dan BAP berpengaruh terhadap
Tia Setiawati et al. : Induksi Kalus Krisan ( Chrysanthemum morifolium ramat var. tomohon kuning) dengan 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-d) dan 6- benzylaminopurine (bap) pada Kondisi Pencahayaan Berbeda
peningkatan  persentase  kalus  yang  sehat. Ayuningrum et al. (2015) juga melaporkan bahwa  pemberian  2,4-D  dan  BAP  dapat memacu  pertumbuhan  subkultur  kalus kedelai ( Glycine max (L.) Merrill).
Berdasarkan  uraian  diatas,  pengaruh kombinasi konsentrasi ZPT 2,4-D dan BAP terhadap  pertumbuhan  kalus  dari  eksplan batang tanaman krisan ( C. morifolium ) yang didasarkan pada perbedaan kondisi pencahayaan  menarik  untuk  dikaji  lebih lanjut.  Informasi  ilmiah  yang  dihasilkan dari  penelitian  ini  merupakan  data  awal untuk penelitian selanjutnya dalam perbanyakan krisan secara in vitro.

## METODE PENELITIAN

## Bahan Penelitian
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  agar  bubuk,  akuades steril,  alkohol  70%,  gula,  media  MS ( Murashige and Skoog ) bubuk
( PhytoTechnologyLaboratories ®),  planlet
Chrysanthemum  morifolium Ramat  var. Tomohon Kuning yang diperoleh dari Balai Pengembangan  Benih  Hortikultura  dan Aneka Tanaman (BPBHAT) Pasir Banteng, spirtus, serta zat pengatur tumbuh golongan auksin  (2,4- Dichlorophenoxyacetic  acid ) dan sitokinin (6- Benzylaminopurine ).
Metode
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode eksperimental dengan  Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)
faktor tunggal berupa 4 kombinasi konsentrasi 2,4-D + BAP, yaitu  2 ppm 2,4- D  +  0,5  ppm  BAP;  2  ppm  2,4-D  +  1  ppm BAP; 4 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP; 4 ppm 2,4-D + 1 ppm BAP. Kultur diinkubasi pada kondisi  pencahayaan  yang  berbeda  yaitu terang dan gelap.Masing-masing perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak enam kali.

## Sterilisasi Alat
Peralatan yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu menggunakan detergen, lalu dibilas  dengan  air  bersih  dan  dikeringkan. Selanjutnya, peralatan disterilkan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121  C dan  tekanan  1  atm  selama  15  menit. Sebelum  digunakan, Laminar  Air  Flow Cabinet disterilkan  dengan  cara  menyapu
seluruh permukaan meja kerja menggunakan  kapas  yang  telah  dibasahi alkohol  70%.    Lampu  UV  dinyalakan selama  2  jam  guna  mematikan kontaminan.

## Pembuatan Media Perlakuan
Pembuatan media perlakuan dilakukan  dengan  cara  menimbang  bubuk media  MS  ( Murashige  and  Skoog ) sebanyak 4,43 g/L dan gula 30 g/L. Kedua bahan tersebut dimasukkan ke dalam gelas kimia dan dilarutkan dengan akuades steril secukupnya. Selanjutnya, ditambahkan kombinasi ZPT sesuai perlakuan yang telah ditentukan  dan  akuades  hingga  volume mencapai 1 L lalu dihomogenkan. Sebelum
ditambahkan bahan pemadat, derajat keasaman  (pH)  media  ditentukan  sekitar
5,6-5,8. Nilai pH diatur dengan menambahkan  beberapa  tetes  NaOH  1  N untuk  menaikkan  pH  atau  HCl  1  N  untuk menurunkan  pH.  Agar  bubuk  sebanyak  9 g/L dimasukkan ke dalam larutan kemudian diaduk  hingga  homogen  dan    dipanaskan hingga mendidih.  Media dimasukan dalam botol-botol kultur sebanyak  10 mL/botol lalu disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121  C dan tekanan 1 atm selama  15 menit.

## Penanaman Eksplan
Penanaman  eksplan  berupa  batang planlet  krisan  dilakukan  di  dalam  LAF ( Laminar Air Flow ) yang sebelumnya telah disterilkan. Planlet diambil dari dalam botol kultur,  kemudian  diletakkan  di  dalam cawan petri steril yang telah dilapisi dengan kertas  saring.  Batang  planlet  dipotong dengan  ukuran  1  cm,  kemudian  ditanam ke media perlakuan dengan posisi horizontal. Kultur diinkubasi selama 45 hari pada  temperatur  18-27  C  dan  intensitas cahaya 2000 Lux untuk kondisi terang dan ditutup  menggunakan  kain  hitam  untuk kondisi gelap.

## Pengamatan dan Analisis Data
Pengamatan  dilakukan  pada  hari  ke- 45  setelah  tanam.  Pengamatan  dilakukan terhadap  tekstur  dan  warna  kalus,  respon pertumbuhan  lainnya,  ukuran  (diameter),
berat  basah  dan  berat  kering  kalus.  Data pengamatan dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Morfologi Kalus C. morifolium (Tekstur dan Warna)
Indikator  pertumbuhan  eksplan  pada kultur in  vitro berupa  tekstur  dan  warna kalus  menggambarkan  penampilan  visual kalus  sehingga  dapat  diketahui  kalus dengan  sel  yang  masih  aktif  melakukan pembelahan  (meristematis)  atau  sel  yang telah  mengalami  kematian  (nekrosis). Morfologi kalus dapat menunjukkan variasi baik tekstur maupun warna tergantung dari perlakuan  jenis  dan  konsentrasi  ZPT  yang ditambahkan,  seperti  yang  dapat  dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 1 .
Berdasarkan Tabel 1 dan Gambar 1 , tekstur kalus  yang dihasilkan pada seluruh media  perlakuan  menunjukkan  hasil  yang seragam yakni bertekstur kompak. Penambahan kombinasi 2,4-D+BAP dalam media dengan kondisi pencahayaan berbeda berpengaruh  secara  signifikan  terhadap warna dan respon lain yang dihasilkan kalus. Sebagaimana  yang  diungkapkan  Budiarti (2017) bahwa jaringan kalus yang dihasilkan  dari  suatu  eksplan  biasanya memunculkan  warna  yang  berbeda-beda. Hasil  pengamatan  pada  awal  pertumbuhan kalus  menunjukkan  bahwa  sebagian  besar kalus  yang  terbentuk  menghasilkan  warna bening,  putih,  dan  hijau  muda.  Seiring
Tia Setiawati et al. : Induksi Kalus Krisan ( Chrysanthemum morifolium ramat var. tomohon kuning) dengan 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-d) dan 6- benzylaminopurine (bap) pada Kondisi Pencahayaan Berbeda
dengan pertumbuhan kalus, terjadi perubahan  warna  yang  didominasi  warna hijau  tua,  coklat  muda,  dan  coklat  tua. Seluruh kalus yang diinkubasi pada kondisi gelap menghasilkan warna yang lebih muda dan pucat dibandingkan pada kondisi terang. Respon pertumbuhan lain adalah terbentuknya akar dan tunas pada kalus.

## Tekstur Kalus
Berdasarkan hasil pengamatan secara visual,  kalus  yang  terbentuk  pada  seluruh perlakuan memiliki tekstur kompak, ikatan antar sel-nya juga tampak kuat. Kalus yang kompak  memiliki  tekstur  yang  sulit  untuk dipisahkan  dan  terlihat  padat.  Anniasari et al .  (2016)  mengemukakan  bahwa  selama masa  pertumbuhan,  kalus  mengalami lignifikasi sehingga terbentuk tekstur kalus
yang  keras,  kompak,  dan  padat.  Kalus dengan  tekstur  yang  kompak  umumnya memiliki  ukuran  sel  yang  kecil  dengan sitoplasma  yang  padat,  inti  sel  besar,  dan mengandung banyak pati (karbohidrat).
Tekstur kalus yang kompak disebabkan oleh adanya perbedaan kemampuan  jaringan  tanaman  dalam menyerap  unsur  hara  dan  zat  pengatur tumbuh dalam media inisiasi (Ibrahim et al. 2010).  Santoso  & Nursandi  (2004) menjelaskan  bahwa  kalus  yang  kompak dapat  disebabkan  oleh  beberapa  hal, diantaranya  karena  sel-sel  yang  semula aktif  membelah  mengalami  penurunan aktivitas proliferasi. Aktivitas ini dipengaruhi  oleh  auksin  alami  (endogen) yang terdapat pada eksplan.
Tabel 1. Morfologi Kalus Krisan ( C. morifolium ) pada Perlakuan ZPT 2,4-D + BAP
Kondisi Pencahayaan Perlakuan Warna kalus Tekstur kalus Respon pertumbuhan lain Terang 2 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP Coklat tua, hijau tua Kompak tunas 2 ppm 2,4-D + 1 ppm BAP Hijau muda, hijau tua, putih Kompak tunas 4 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP Coklat muda, coklat tua, hijau muda, putih Kompak akar 4 ppm 2,4-D + 1 ppm BAP Coklat muda, coklat tua, hijau tua Kompak akar Gelap 2 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP Coklat muda, coklat tua, hijau muda Kompak akar 2 ppm 2,4-D + 1 ppm BAP Coklat tua, hijau muda, putih Kompak - 4 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP Coklat muda, hijau muda Kompak - 4 ppm 2,4-D + 1 ppm BAP Coklat muda, coklat tua, hijau muda, putih Kompak tunas
Gambar 1. Kalus krisan ( C. morifolium ) pada 45 HST pada kondisi terang (kiri) dan gelap (kanan). Keterangan : A (2 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP); B (2 ppm 2,4-D + 1 ppm BAP), C (4 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP), D (4 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP)
Hasil pengamatan menunjukkan
bahwa  kalus  kompak  diperoleh  pada seluruh media perlakuan dengan konsentrasi  ZPT  2,4-D  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  konsentrasi  BAP ( Gambar  1 ).  Hal  ini  dapat  disebabkan karena tingginya konsentrasi auksin (2,4-D)
yang diberikan dapat memengaruhi peningkatan  konsentrasi  auksin  endogen pada  eksplan.  Selain  itu,  adanya  sitokinin (BAP) dalam konsentrasi rendah juga dapat memengaruhi  terbentuknya  kalus  kompak tersebut.  Tekstur  kalus  yang  kompak merupakan  efek  dari  penambahan  auksin
D A B C
Tia Setiawati et al. : Induksi Kalus Krisan ( Chrysanthemum morifolium ramat var. tomohon kuning) dengan 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-d) dan 6- benzylaminopurine (bap) pada Kondisi Pencahayaan Berbeda
dan  sitokinin  yang  memengaruhi  potensial air  dalam  sel.  Hal  ini  menyebabkan penyerapan  air  dari  medium  ke  dalam  sel meningkat sehingga sel menjadi lebih keras (padat) (Ariati, 2012).
Perbedaan kondisi pencahayaan yang diberikan pada masa inkubasi eksplan tidak memiliki pengaruh yang signifikan terhadap  tekstur  kalus.  Seluruh  kalus  yang diinkubasi  pada  kondisi  terang  maupun gelap  memiliki  tekstur  kompak  ( Tabel  1 dan Gambar  1 ).  Hal  ini  sejalan  dengan penelitian  Putri  (2008)  yang  melaporkan bahwa  kondisi  gelap  dan  terang  pada berbagai media perlakuan tidak berpengaruh  pada  tekstur  kalus  yang terbentuk.

## Warna Kalus
Berdasarkan hasil pengamatan, penambahan 2,4-D + BAP dalam beberapa konsentrasi menghasilkan warna kalus yang beragam pada kondisi pencahayaan berbeda ( Tabel 1 dan Gambar 1 ). Pada awal masa pertumbuhan,  kalus  yang  terbentuk  pada seluruh  media  perlakuan  menunjukkan dominansi warna bening dan putih. Hal ini sejalan  dengan  pernyataan  Puteri et  al. (2014) bahwa proses induksi kalus diawali dengan menggelembungnya atau melengkungnya eksplan, kemudian dilanjutkan  dengan  munculnya  tonjolan- tonjolan  berwarna  putih  pada  bagian  luka bekas potongan yang akan terus berkembang  menjadi  kalus.  Desriatin
(2011)  menambahkan  bahwa  warna  putih yang  terbentuk  pada  kalus  adalah  jaringan parenkim  yang  mengandung  butiran  pati dengan kadar  yang tinggi  serta merupakan tempat  penyimpanan  polisakarida  pada tumbuhan.
Pada Gambar  1 terlihat  adanya perbedaan  yang  cukup  signifikan  antara warna  kalus  yang  diinkubasi  pada  kondisi terang dan kondisi  gelap. Pada  akhir masa pengamatan (45 HST), kalus yang diinkubasi pada kondisi gelap menghasilkan  warna  lebih  muda  dan cenderung pucat dibandingkan pada kondisi terang.Kalus pada kondisi terang didominasi warna hijau tua dan coklat tua, sedangkan  kalus  pada  kondisi  gelap cenderung berwarna hijau muda dan coklat muda.  Kresnawati  (2006)  menyatakan bahwa  warna  kalus  yang  bervariasi diakibatkan oleh adanya pigmentasi cahaya. Pigmentasi  dapat  merata  ke  seluruh permukaan kalus atau hanya sebagian saja.
Rainiyati et  al. (2007)  menjelaskan bahwa perkembangan klorofil pada eksplan yang diinkubasi dalam terang terjadi karena adanya rangsangan cahaya dan dimulainya proses  fotosintesis.  Sintesis  klorofil  terjadi melalui fotoreduksi protoklorofilid menjadi klorofilid  a  dan  diikuti  dengan  esterifikasi fitol  untuk  membentuk  klorofil  a  yang dikatalisis enzim klorofilase (Rahayu et al. , 2003).
Pada  perlakuan  4  ppm  2,4-D  +  0,5 ppm BAP (kondisi terang) dan 4 ppm 2,4-D +  1  ppm  BAP  (kondisi  gelap)  kalus  yang terbentuk berwarna putih pada kalus ( Tabel 1 ). Leupin et al . (2000) menyatakan bahwa kalus yang berwarna putih akan tumbuh dan membentuk  butir-butir  klorofil  akibat paparan  cahaya  sehingga  kalus  menjadi hijau.  Semakin  hijau  warna  kalus  yang dihasilkan  maka  kandungan  klorofilnya semakin besar (Fatmawati, 2008). Andaryani  (2010)  menjelaskan  bahwa warna  putih  kehijauan  pada  kalus  karena adanya interaksi  antara 2,4-D (auksin) dan BAP  (sitokinin)  serta  faktor  cahaya  yang berperan  penting  dalam  pembentukan klorofil.
Hasil  pengamatan  menunjukkan  pula adanya  perubahan  warna  pada  sebagian permukaan kalus yakni dari warna hijau tua hingga  membentuk  warna  coklat  muda ataupun  coklat  tua  ( Gambar  1 ).  Hal  ini terjadi seiring meningkatnya laju pertumbuhan  kalus.  Sesuai  pernyataan Abdullah et al. (1998) bahwa sel-sel muda yang  sehat  menunjukkan  warna  kuning bening,  namun  akan  berubah  menjadi kecokelatan  seiring  dengan  bertambahnya laju  pertumbuhan  dan  umur  kalus  yang semakin  tua.  Lerch  (1998)  dalam  Hutami
(2008) mengemukakan bahwa pencokelatan jaringan ( browning ) disebabkan  oleh  senyawa  fenolik  yang
teroksidasi melalui aktivitas enzim polifenol oksidase.

## Pembentukan tunas dan akar pada kalus
Pengamatan  terhadap  kalus  dengan perlakuan 2,4-D+BAP dan kondisi pencahayaan berbeda menunjukkan adanya pembentukan  organ  akar  dan  tunas  pada beberapa perlakuan ( Tabel 1 dan Gambar 1 ).  Terbentuknya  tunas  dan  akar  dapat disebabkan  oleh  kalus  yang  memiliki tekstur  kompak  yang  memudahkan  tahap organogenesis  (Trigiano  dan  Gray,  2005). Pada penelitian ini, kemunculan akar terjadi pada perlakuan 2 ppm 2,4-D + 1 ppm BAP (kondisi  terang);  4  ppm  2,4-D  +  0,5  ppm BAP  (kondisi  terang);  dan  2  ppm  2,4-D  + 0,5  ppm  BAP  (kondisi  gelap).  Akar  yang tumbuh  pada  kalus  dapat  disebabkan  oleh penambahan  konsentrasi  2,4-D  yang  lebih tinggi dibandingkan BAP. Hendaryono dan Wijayani  (1994)  menyatakan  apabila konsentrasi auksin yang ditambahkan lebih besar  maka  akanmerangsang  pembentukan akar  pada  kalus  sedangkan  konsentrasi sitokinin  yang  tinggi  akan  mencegah pertumbuhan akar dan penghantaran respon auksin  dalam  inisiasi  akar  (George  & Sherrington, 1984).
Pembentukan  tunas  terjadi  pada perlakuan 2 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP dan 2  ppm  2,4-D  +  1  ppm  BAP  pada  kondisi terang,  serta  4  ppm  2,4-D  +  1  ppm  BAP pada  kondisi  gelap.  Hal  ini  dapat  terjadi disebabkan  peran  sitokinin  BAP.  Sesuai
Tia Setiawati et al. : Induksi Kalus Krisan ( Chrysanthemum morifolium ramat var. tomohon kuning) dengan 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-d) dan 6- benzylaminopurine (bap) pada Kondisi Pencahayaan Berbeda
pernyataan  George  &  Sherrington  (1984) bahwa ZPT golongan sitokinin seperti BAP
banyak digunakan dalam media perbanyakan secara in vitro untuk memacu pembentukan  tunas. Pada  perlakuan- perlakuan tersebut, tampak bahwa konsentrasi  auksin  (2,4-D)  lebih  tinggi daripada  sitokinin  (BAP),  namun  eksplan mampu membentuk tunas. Padahal menurut Hendaryono & Wijayani (1994) pemberian auksin  dengan  kadar  yang  relatif  tinggi daripada sitokinin menyebabkan pembentukan primodia akar sedangkan jika pemberian  sitokinin  dengan  kadar  lebih tinggi daripada auksin akan mengarah pada pembentukan  primodia  batang  atau  tunas. Hal  ini  dapat  terjadi  karena  adanya kontribusi  hormon  sitokinin  endogen sehingga kebutuhan eksplan akan sitokinin untuk  pembentukan  tunas  dapat  terpenuhi. Sebagaimana Gunawan (1988) menyatakan bahwa  arah  perkembangan  suatu  kultur merupakan hasil interaksi dan perimbangan antara  ZPT  yang  diberikan  dalam  media
(eksogen)  dengan  ZPT  yang  diproduksi oleh sel secara endogen.
Berat Basah, Berat Kering dan Ukuran Kalus
Hasil  pengukuran  terhadap  berat basah  kalus  krisan  ( C.  morifolium )  pada kondisi  terang  dan  kondisi  gelap  dapat dilihat pada Gambar 2 .
Gambar 2 menunjukkan bahwa kalus pada  kondisi  terang  memiliki  berat  basah lebih  tinggi  dibandingkan  pada  kondisi gelap.  Berat  basah  kalus  tertinggi  pada kondisi  terang  dan  gelap  berturut-turut 0,62dan 0,51 gram diperoleh pada perlakuan  4  ppm  2,4-D  +  0,5  ppm  BAP. Sementara  itu,  berat  basah  kalus  terendah pada kondisi terang dan gelap berturut-turut 0,44  dan  0,34  gram  diperoleh  pada perlakuan  4  ppm  2,4-D  +  1  ppm  BAP. Zakaria  (2010)  mengemukakan  bahwa keberadaan  2,4-D  dan  BAP  dalam  media dapat  memacu  proses  metabolisme  dalam sel eksplan sehingga meningkatkan pertumbuhan kalus.
Gambar 2. Rata-rata berat basah kalus krisan ( C. morifolium ) pada perlakuan 2,4-D + BAP
Keterangan : B1 = 0,5 ppm BAP; B2 = 1 ppm BAP; D1 = 2 ppm 2,4-D; D2 = 4 ppm 2,4-D
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 B1D1 B1D2 B2D1 B2D2 0.57 0.62 0.53 0.44 0.46 0.51 0.41 0.34 terang gelap kombinasi konsentrasi 2,4-D dan BAP
Berat  basah  yang  dihasilkan  sangat tergantung pada kecepatan sel-sel tanaman dalam melakukan pembelahan, perbanyakan,  dan  dilanjutkan  dengan membesarnya kalus (Rahayu et al . 2003).
Hasil  pengukuran  berat  kering  kalus krisan  ( C.  morifolium )  yang  diinkubasi selama  45  HST  pada  kondisi  terang  dan gelap dapat dilihat pada Gambar 3 .
Gambar 3 menunjukkan bahwa berat kering  kalus  tertinggi  pada  kondisi  terang maupun  gelap  diperoleh  pada  perlakuan yang  sama  yaitu  4  ppm  2,4-D  +  0,5  ppm BAP  berturut-turut  0,17  dan  0,15  gram. Menurut  Maftuchah et  al. (1998),  2,4-D diduga  memengaruhi  metabolisme  protein yang  terjadi  pada  saat  proses  transkripsi molekul  RNA.  Hal  tersebut  menyebabkan peningkatan aktivitas dan berat kering kalus. Kenaikan sintesis protein juga menyebabkan bertambahnya sumber tenaga untuk  pertumbuhan  kalus.  Rahayu et  al .
(2003) mengemukakan bahwa penggunaan 2,4-D dapat memacu pertumbuhan kalus.
Pertumbuhan berkaitan dengan pertambahan  volume  dan  jumlah  sel, pembentukan protoplasma baru, pertambahan  berat,  dan  selanjutnya  akan meningkatkan berat kering kalus.
Pemberian  2,4-D  dan  BAP  ke  dalam media  tanam  dapat  memacu  penambahan ukuran  kalus  krisan  ( C.  morifolium ). Lizawati (2012) menyatakan bahwa pemberian  ZPT  BAP,  TDZ,  dan  2,4-D dapat menyebabkan terjadinya penambahan ukuran  atau  diameter  kalus  eksplan  daun jarak  pagar  ( Jatropha  curcas L.).  Aplikasi 2,4-D yang dikombinasikan dengan sitokinin  (BA  atau  kinetin)  akan  lebih meningkatkan laju pertumbuhan kalus (Xie &  Hong  2001;  Thao et  al .2003).  Hasil pengamatan  terhadap  ukuran  kalus  pada kondisi  terang  dan  kondisi  gelap  disajikan pada Gambar 4 .
Gambar 3. Rata-rata berat kering kalus krisan ( C. morifolium ) pada perlakuan  2,4-D + BAP
Keterangan : B1 = 0,5 ppm BAP; B2 = 1 ppm BAP; D1 = 2 ppm 2,4-D; D2 = 4 ppm 2,4-D
0 0.05 0.1 0.15 0.2 B1D1 B1D2 B2D1 B2D2 0.16 0.17 0.11 0.13 0.14 0.15 0.12 0.08 terang gelap kombinasi konsentrasi 2,4-D dan BAP
Tia Setiawati et al. : Induksi Kalus Krisan ( Chrysanthemum morifolium ramat var. tomohon kuning) dengan 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-d) dan 6- benzylaminopurine (bap) pada Kondisi Pencahayaan Berbeda
Gambar 4. Rata-rata ukuran kalus krisan ( C. morifolium ) pada perlakuan  2,4-D + BAP Keterangan : B1 = 0,5 ppm BAP; B2 = 1 ppm BAP; D1 = 2 ppm 2,4-D; D2 = 4 ppm 2,4-D
Gambar 4 menunjukkan bahwa kalus yang  diinkubasi  pada  kondisi  terang memiliki  rata-rata  ukuran  lebih  besar dibandingkan pada kondisi gelap. Rata-rata ukuran  kalus  terbesar  pada  kondisi  terang dan  kondisi  gelap  berturut-turut  sebesar 1,36  cm  dan  1,18  cm  diperoleh  pada perlakuan  4  ppm  2,4-D  +  0,5  ppm  BAP. Sementara  itu,  rata-rata  ukuran  kalus terkecil  pada  kondisi  terang  dan  gelap berturut-turut sebesar 0,66 cm dan 0,53 cm diperoleh pada perlakuan 4 ppm 2,4-D + 1 ppm  BAP.  Kedua  kombinasi  konsentrasi ZPT  tersebut  merupakan  keseimbangan yang optimal antara 2,4-D (auksin) dengan BA (sitokinin) dalam memacu pembelahan sel.
Data  yang  disajikan  pada Gambar  2 dan Gambar  4 menunjukkan  bahwa penambahan  berat  basah  kalus  yang dihasilkan  pada  setiap  perlakuan  sejalan dengan  peningkatan  ukuran  kalus.  Berat basah  dan  ukuran  kalus  terbesar  pada
kondisi  terang  dan  gelap  diperoleh  pada perlakuan  yang sama  yaitu 4 ppm 2,4-D + 0,5  ppm  BAP.  Sementara  itu,  berat  basah dan  ukuran  kalus  terkecil  pada  kondisi terang  dan  gelap  juga  diperoleh  pada perlakuan yang sama, yaitu 4 ppm 2,4-D + 1  ppm  BAP.Putri  (2008)  menyatakan bahwa berat basah kalus yang besar diikuti dengan  ukuran  kalus  yang  juga  besar (korelasi  positif)  menunjukkan  bahwa  sel- sel  kalus  yang  terbentuk  akan  mudah mengalami diferensiasi. Sebaliknya, apabila  berat  basah  kalus  cukup  besar namun  diikuti  dengan  ukuran  kalus  yang lebih  kecil  (korelasi  negatif)  maka  sel-sel kalus  yang  terbentuk  padat  dan  pejal, sehingga  diperkirakan  akan  sulit  terjadi diferensiasi kalus membentuk organ tanaman.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian,  dapat disimpulkan sebagai berikut.
0 0.5 1 1.5 B1D1 B1D2 B2D1 B2D2 1.15 1.36 1.03 0.66 1.05 1.18 0.79 0.53 terang gelap kombinasi konsentrasi 2,4-D dan BAP
1. Perlakuan 4 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP
merupakan konsentrasi optimum dalam menginduksi kalus krisan ( C.
morifolium ) secara in vitro pada kondisi terang  yang  memiliki  tekstur  kompak, warna  kalus  hijau  tua  dan  coklat  tua, ukuran  1,36  cm,  serta  berat  basah  dan berat  kering  tertinggi  berturut-turut sebesar 0,62 dan 0,17 gram.
2. Perlakuan 4 ppm 2,4-D + 0,5 ppm BAP merupakan konsentrasi optimum dalam menginduksi kalus krisan ( C. morifolium ) secara in vitro pada kondisi gelap  yang  memiliki  tekstur  kompak, warna  kalus  hijau  muda  dan  coklat muda, ukuran 1,18 cm, serta berat basah dan berat kering tertinggi berturut-turut sebesar 0,51 dan 0,15 gram.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdullah MA, Ali M, Marziah NH & Arrif AB.  1998.  Establishment  of  cell suspension  cultures  of Morinda elliptica for  the  production  of anthraquinones. Plant Cell Tissue and Organ Culture , 54:173-182.
Afshari  RT,  Angoshtari  R  &  Kalantari  S.
2011.  Effects  of  light  and  different plant  growth  regulators  on  induction of callus growth in rapeseed ( Brassica napus L.) genotypes. Plant Omics J., 4 (2): 60-67.
Andaryani  S.  2010.  Kajian  penggunaan berbagai  konsentrasi  BAP  dan  2,4-D terhadap  induksi  kalus  jarak  pagar ( Jatrophacurcas L.)  secara in  vitro.
Skripsi .  Universitas  Sebelas  Maret.
Surakarta.
Anniasari TD, Putri RBA & Muliawati ES. 2016.  Penggunaan  BA  dan  NAA
untuk merangsang pembentukan tunas lengkeng dataran rendah ( Dimocarpus longan ) secara in vitro. Bioteknologi , 13(2):43-53.
Ariani  R,  Anggraito  YU  &  Rahayu  ES. 2016.  Respon  Pembentukan  Kalus Koro  Benguk  ( Mucuna  pruriens L.) pada Berbagai Konsentrasi 2,4-D dan BAP. Jurnal MIPA, 39(1):20-28.
Ariati  SN.  2012.  Induksi  kalus  tanaman Kakao  ( Theobroma  cacao L.)  pada media MS dengan penambahan 2,4-D, BAP,  dan  air  kelapa. Jurnal  Natural Science, 1(1):78-84.
Ayuningrum K, Budisantoso I & Kamsinah. 2015.  Pemberian  hormon  2,4-D  dan BAP terhadap pertumbuhan subkultur kalus  Kedelai  ( Glycine  max (L.) Merrill)  secara in  vitro. Biosfera, 32(1):59-65.
Badan  Pusat  Statistik  [BPS].  2013. Luas panen,  produksi,  dan  produktivitas tanaman  Krisan  2009-2013. Jakarta: BPS Pusat.
Budiarti  C.  2017.  Pengaruh  Teknik sterilisasi  dan  zat  pengatur  tumbuh 2,4-D  (2,4  Dikloro  Fenoksiasetat),
BAP  (Benzil  Amino  Purin)  terhadap induksi  kalus  Nilam  ( Pogostemon cablin Benth.) secara in vitro. Skripsi .
Universitas  Islam  Negeri  Sunan Gunung Djati. Bandung.
Bustami  MU.  2011.  Penggunaan  2,4-D untuk  induksi  kalus  Kacang  Tanah.
Media Litbang Sulteng, 4(2):137-141. Desriatin  NL.  2011.  Pengaruh  kombinasi zat pengatur tumbuh IAA dan kinetin terhadap morfogenesis pada kultur in vitro tanaman  Tembakau  ( Nicotiana tabacum L. var. Prancak-95). Skripsi.
Institut Teknologi Sepuluh Nopember. Surabaya.
Direktorat  Jenderal  Hortikultura.  2015.
Statistik Produksi Hortikultura Tahun 2014 .  Jakarta:  Direktorat  Jenderal Hortikultura, Kementerian Pertanian.
Fatmawati  A.  2008.  Kajian  konsentrasi BAP dan 2,4-D terhadap induksi kalus tanaman Artemisia annua L. secara in
Tia Setiawati et al. : Induksi Kalus Krisan ( Chrysanthemum morifolium ramat var. tomohon kuning) dengan 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-d) dan 6- benzylaminopurine (bap) pada Kondisi Pencahayaan Berbeda
vitro.  Skripsi. Universitas  Sebelas Maret. Surakarta.
Forooghian  S  &  Esfarayeni.  2013.  An evaluation  of  effects  of  plant  growth regulators  and  light  on  callus induction  for  varieties  of  potatoes. American-Eurasian J. Agric.  and Environ . Sci., 13 (8): 1129-1134.
George EF & Sherrington PD. 1984. Plant propagation by tissue culture . England: Easter Press.
Hendaryono  DPS  &  Wijayani  A.  1994.
Teknik  Kultur  Jaringan:  Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman secara Vegetatif Modern . Yogyakarta: Kanisius. Hutami S. 2008. Ulasan Masalah Pencokelatan  pada  Kultur  Jaringan. Jurnal AgroBiogen , 4(2):83-88.
Ibrahim MSD, Rostiana O & Khumaida N.
2010. Pengaruh umur eksplan terhadap  keberhasilan  pembentukan kalus embriogenik pada kultur meristem  Jahe  ( Zingiber  officinale Rosc.). Jurnal Littri , 16(1):37-42.
Indah PN & Ermavitalini D. 2013. Induksi kalus daun Nyamplung ( Calophyllum inophyllum Linn.)  pada  beberapa kombinasi konsentrasi 6- Benzylaminopurine(BAP)  dan  2,4- Dichlorophenoxyacetic  Acid(2,4-D).
Jurnal Sains dan Semi Pomits , 2(1):1-
6.
Kasli  K.  2009.  Upaya  Perbanyakan tanaman Krisan ( Chrysanthemum sp. ) secara in vitro . Jerami, 2(3):121-125.
Kresnawati E. 2006. Pengaruh zat pengatur tumbuh  NAA  dan  kinetin  terhadap induksi  kalus  dari  daun  Nilam ( Pogostemon  cablin Benth). Skripsi.
Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan. Universitas Muhammadiyah Surakarta. Leupin  RE,  Leupin  M,  Ehret  C,  Erismann KH  &  Bernard  W.  2000.  Compact callus induction and
plant
regeneration  of  a  non-flowering vitiver  from  java. Plant  Cell,  Tissue,
and Organ Culture , 62:115-123.
Lizawati  L.  2012.  Proliferasi  kalus  dan embriogenesis  somatik  Jarak  Pagar ( Jatropha curcas L.) dengan berbagai kombinasi  ZPT  dan  asam  amino.
Bioplantae, 1(4):256-265.
Maftuchah  M,  Ardiana  HK  &  Joko  BS.
1998. Induksi kalus artemisia ( Artemisia vulgaris L.) melalui kultur in vitro . Tropika, 6(2):135-141.
Mani  T  &  Senthil  K.  2011.  Multiplication of Chrysanthemum through  somatic embryogenesis. Asian Journal Pharma Technology , 1 (1): 13-16. Mardini U. 2015. Pengaruh kombinasi 2,4- D  dan  BAP  terhadap  induksi  kalus eksplan  daun  dan  batang  tanaman Binahong ( Anredera cordifolia (Ten.) Steenis)  secara in  vitro . Skripsi . Universitas
Muhammadiyah Surakarta. Surakarta. Puteri  RF,  Ratnasari  E  &  Isnawati.  2014. Pengaruh penambahan berbagai konsentrasi NAA (Napthalene Acetic Acid)  dan  BAP  (Benzyl  Amino Purine)  terhadap  induksi  kalus  daun Sirsak  ( Annona  muricata )  secara in vitro. LenteraBio , 3(3):154-159.
Putri NI. 2008. Kajian berbagai  komposisi media  serta  kondisi  gelap  dan  terang terhadap  induksi  kalus  tanaman  Jati Belanda ( Guazuma ulmifolia Lamk.). Skripsi .  Universitas  Sebelas  Maret.
Surakarta. Rahayu B, Solichatun S & Anggarwulan E. 2003. Pengaruh Asam 2,4- Diklorofenoksiasetat (2,4-D) terhadap pembentukan dan pertumbuhan kalus serta  kandungan  flavonoid  kultur kalus Acalypha indica L. Biofarmasi , 1(1):1-6.
Rainiyati DM, Gusniwati G & Jasminarni J. 2007.  Perkembangan  pisang  Raja Nangka  ( Musa sp.)  secara  kultur jaringan  dari  eksplan  anakan  dan meristem  bunga. Jurnal  Agronomi , 1(11):35-40.
Rukmana  R  &  Mulyana  A.  1997. Krisan.
Yogyakarta: Kanisius.
Santoso  U  &  Nursandi  F.  2004. Kultur jaringan tanaman . Malang:
Universitas Muhammadiyah Malang. Sitompul SM  &  Guritno B. 1995. Analisis Pertumbuhan Tanaman . Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Syahid  SF  &  Kristina  NN.  2007.  Induksi dan  regenerasi  kalus  Keladi  Tikus ( Typonium  flagelliforme Lodd.) secara in  vitro.  Jurnal  Littri , 13(4):142-146.
Thao  NTP,  Ozaki  Y  &  Okubo  H.  2003. Callus induction and planlet regeneration in ornamental Alocasia micholitziana.  Plant  Cell,  Tissue, and Organ Culture, 73:285-289.
Xie  D  &  Hong  Y.  2001. In  vitro regeneration of Acacia mangium via organogenesis. Plant  Cell,  Tissue, and Organ Culture, 66:167-173.
Zakaria  D.  2010.  Pengaruh  konsentrasi sukrosa  dan  BAP  (Benzil  Amino Purine)  dalam  Media  Murashige
Skoog  (MS)  terhadap  pertumbuhan dan  kandungan  reserpin  kalus  Pule Pandak ( Rauvolfia verticillata Lour.). Skripsi .  Universitas  Sebelas Maret. Surakarta.
Zulkarnain  H.  2009. Kultur  Jaringan Tanaman. Jakarta: Bumi Aksara.
.