Tersedia online di: journal.gunabangsa.ac.id

## Journal of Health (JoH)
ISSN ( online ): 2407-6376 | ISSN (print): 2355-8857
1

## Chitosan Potential as Delivery Agent for S1 Gene from SARS-CoV-2 with pEGFP-N1 as its Vectors
Potensi Kitosan sebagai Sistem Penghantaran Gen S1 Virus SARS-CoV-2 dengan Vektor pEGFP-N1 Nabilah Adzra Fahlevi 1 , Rarastoeti Pratiwi 2 , Raudatul Jannah Nurina 3 , Tahta Afwi Maulina 4 , Asmarani Kusumawati 5 *
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 1,2,4,5 , STIKES Yarsi Mataram 3

## ABSTRACT
Coronavirus Disease-19 (COVID-19) is a disease caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS- CoV-2), this disease began to emerge at the end of 2019 and has become a pandemic to this day. Vaccination can play an important role to prevent the spread of the disease, so there are many vaccine developments, including DNA vaccines . DNA vaccines have the shortcomings of being unstable and easily degraded in vivo so it requires a delivery system such as nanoparticles. Chitosan nanoparticles are most widely used because they have the characteristics of biodegradability, low toxicity, and biocompatibility with tissues and cells. biodegradable, low toxicity, and biocompatibility with tissues and cells. The purpose of this study was to optimize and evaluate the pEGFP-N1-S1 formula with a chitosan delivery system as a DNA vaccine candidate. Recombinant plasmids were cloned in E. coli DH5α and extracted for further evaluation with restriction enzymes and sequencing. The EGFP-N1-S1 plasmid was then formulated with chitosan nanoparticles using the complex coacervation method with a mass ratio of plasmid DNA and chitosan of 1:0.1; 1:0.2; 1:0.3; 1:0.4; 1:0.5; 1:0.6 and 1:0.7. The isolated plasmid has a concentration of 2182.32 ng/L and a purity of 1.911 at absorbance ratio A260/A280 and 2.271 at A260/A230. Synthetic gene S1 (684 bp) was successfully inserted into plasmid pEGFP-N1 (4813 bp) based on the results of double digestion by BglII and EcoRI restriction enzymes and sequencing data alignment results. DNA: chitosan mass ratio of 1:0.6 is the optimal formulation for DNA to bind with chitosan perfectly.
Keywords: COVID-19, S1 Gene, Chitosan, SARS-CoV-2, DNA Vaccine

## INTISARI
Coronavirus Disease-19 (COVID-19) merupakan penyakit yang disebabkan oleh severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2) , penyakit ini mulai muncul pada akhir tahun 2019 dan menjadi pandemi hingga saat ini. Vaksinasi dapat berperan penting dalam prevensi penyebaran penyakit, sehingga banyak dilakukan pengembangan vaksin salah satunya ialah vaksin DNA. Vaksin  DNA  memiliki kekurangan yaitu tidak stabil dan  mudah terdegradasi secara in vivo sehingga diperlukan suatu sistem penghantaran seperti nanopartikel. Nanopartikel kitosan  paling banyak digunakan karena memiliki karakteristik biodegradable , toksisitas yang rendah, dan biokompatibilitas dengan jaringan dan sel.  Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengoptimasi dan mengevaluasi formula pEGFP-N1-S1 dengan sistem penghantaran kitosan sebagai kandidat vaksin DNA. Plasmid rekombinan dilakukan kloning pada E. coli  DH5α  dan  dilakukan  ekstraksi untuk evaluasi selanjutnya dengan enzim restriksi dan sekuensing. Plasmid EGFP-N1-S1 kemudian diformulasikan

## INFORMASI ARTIKEL
Diterima
Direvisi : : 26 September 2023 03 November 2023 Disetujui :  06 November 2023 Dipublikasi :  01 Julii 2024 KORESPONDENSI
Asmarani Kusumawati uma_vet@ugm.ac.id
Copyright © 2024 Author(s)
Di bawah lisensi Creative Commons Attribution 4.0 International License .
dengan nanopartikel kitosan menggunakan metode complex coacervation dengan rasio massa plasmid DNA dan kitosan sebesar 1:0,1; 1:0,2; 1:0,3; 1:0,4; 1:0,5; 1:0,6 dan 1:0,7. Sampel yang dilakukan isolasi plasmid memiliki konsentrasi 2182,32 ng/L dan kemurnian sebesar 1,911  pada rasio absorbansi A260/A280 dan 2,271  pada A260/A230.  Gen sintetik S1 (684 bp) berhasil diinsersi pada plasmid pEGFP-N1 (4813 bp) berdasarkan hasil double digestion oleh enzim restriksi BglII dan EcoRI serta hasil pensejajaran data sekuensing. Rasio massa DNA: kitosan sebesar 1:0,6 merupakan formulasi yang optimal untuk DNA berikatan dengan kitosan secara sempurna.
Kata kunci : COVID-19, Gen S1, Kitosan, SARS-CoV-2, Vaksin DNA

## PENDAHULUAN
Pendahuluan  Coronavirus Disease-19 (COVID-19) merupakan penyakit yang mulai muncul pada akhir tahun 2019 dan menjadi pandemi hingga saat ini. Penyakit ini diakibatkan oleh severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2)  (Singhal, 2020). Menurut data dari World Health Organization (2023), hingga tanggal 5 Juli 2023 tercatat sebanyak 769.774.646 kasus COVID-19 di seluruh dunia. Indonesia menempati peringkat ke-20 dengan kasus COVID-19 sebanyak 6.813.095  di seluruh dunia.
SARS-CoV-2 termasuk ke dalam subfamili coronavirinae dari famii coronaviridae dengan genus betacoronavirus. SARS-CoV-2 memiliki protein struktural yang  terdiri dari  Spike (S), Envelope (E), Membrane (M), Nucleocapsid (N), Hemagglutinin esterase (HE) dan Helicase (H). Protein Spike (S) merupakan  protein transmembran yang memiliki berat molekul 150 kDa. Protein S berada di permukaan luar virus yang jika berintegrasi dengan protein E memiliki aktivitas viroporin yang penting dalam siklus infeksi virus. Protein S memiliki 2 subunit yaitu S1 dan S2. Subunit S1 ini memiliki receptor-binding domain (RBD) yang berperan dalam pengikatan virus ke reseptor sel inang, sehingga subunit ini dapat dijadikan sebagai kandidat pengembangan vaksin (Peng dkk., 2021).
Penanganan COVID-19 hingga saat ini dilakukan dengan vaksinasi, terdapat berbagai macam jenis vaksin salah satunya ialah vaksin DNA. Vaksin DNA ialah vaksin berbasis vektor ekspresi rekombinan eukariotik  yang mampu mengaktivasi respon sistem imun humoral dan selular. Preparasi vaksin ini tidak membutuhkan handling partikel virus yang berbahaya. Keuntungan dari vaksin DNA ialah
memungkinkan pengkodean beberapa antigen dalam satu vaksin, biaya yang dikeluarkan lebih rendah, thermal stability , serta efisien dalam produksi skala besar karena menggunakan bakteri  (Peng  dkk., 2021; Tsang dkk., 2021) Vaksin ini memiliki kekurangan yaitu memiliki imunogenisitas yang rendah dan tidak stabil serta DNA dapat mudah terdegradasi  secara in vivo (Duan dkk ., 2020).  Salah satu metode penghantaran gen ialah menggunakan nanopartikel  (Vu dkk ., 2021). Nanopartikel ini dapat meningkatkan penghantaran dan melindungi vaksin dari degradasi secara in vivo . Jenis nanopartikel yang paling banyak digunakan ialah kitosan (Duan dkk. , 2020; Vu dkk ., 2021). Kitosan merupakan polimer biodegradable yang telah disetujui oleh FDA untuk penggunaannya sebagai sistem penghantaran. Kitosan digunakan dalam sistem penghantaran obat karena memiliki karakteristik antiviral, anti-fungal dan antibakteri Selain itu juga, kitosan memiliki pelepasan terkontrol dan berkelanjutan  serta  memiliki toksisitas rendah (El Hady dkk ., 2019) yang sangat berpotensi sebagai biopolymer yang digunakan untuk pembuatan vaksin SARS-CoV-2 (Mallakpour dkk ., 2021).
Plasmid  pEGFP-N1  digunakan  sebagai vektor  karena  membawa gen resisten terhadap antibiotik kanamisin (Clontech, 1999). Kanamisin ditambahkan pada medium dengan tujuan untuk menyeleksi hanya bakteri transforman yang dapat tumbuh dan juga bertujuan untuk mencegah pertumbuhan sel lain yang tidak memiliki resistensi terhadap kanamisin. Selain itu, pEGFP-N1 memiliki elemen poly (A) tail SV40 dan HSV TK.  Penambahan poly (A) tail (poliadenilasi) mempengaruhi stabilitas produk plasmid  DNA  yang rentan terhadap degradasi
endonuclease  (Wang dkk ., 2022)  .  Sehingga penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan vektor plasmid pEGFP-N1 sebagai vektor kloning gen S1 SARS-CoV-2  serta menemukan formulasi yang tepat dengan nanopartikel kitosan.

## METODE
Koloni bakteri dikulturkan ke media cair untuk diisolasi plasmidnya menggunakan Plasmid DNA Extraction Maxi Kit (Favorgen Biotech Corp) dan dilakukan sesuai dengan prosedur protokol kit yang diberikan. Kemurnian dan konsentrasi hasil isolasi kemudian diukur dengan NanoDrop Spektrofotometer. Hasil isolasi dilakukan double digestion dengan menambahkan  1 µL plasmid yang kemudian ditambahkan 1 µL enzim Bgl II (10 U/µL), 1 µl enzim EcoR I (20 U/µL), 2 µL buffer enzim restriksi dan 15 µL Nuclease Free Water (NFW). Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit. Kemudian plasmid dielektroforesis untuk memastikan bahwa restriksi berhasil.
Elektroforesis dilakukan menggunakan gel agarose 1% dengan cara melarutkan 0,5gram agarose dengan TAE buffer 1x sebanyak 50 mL. Larutan kemudian dipanaskan di dalam microwave hingga larut. Setelah itu, larutan ditambahkan 5 µL SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen). Kemudian larutan agarose dituangkan kedalam cetakan gel dan tunggu gel mengeras ± 20 menit. Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam electrophoresis chamber yang telah berisi oleh TAE buffer 1x. Loading sampel ke dalam sumuran gel dengan cara mencampurkan 5 µL  sampel isolasi plasmid dengan Gel Pilot DNA loading dye 5x (Qiagen) pada parafilm. Elektroforesis dilakukan menggunakan tegangan 100 V selama 60 menit. Kemudian, hasil divisualisasikan dengan UV Iluminator . Hasil isolasi juga dilakukan PCR  dengan PowerPol  2X PCR Mix with Dye dan primer sekuensing pEGFP-N1 yang dapat dilihat melalui website addgene  dengan urutan forward (5’-
TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG-3’) dan reverse (5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’). Master mix PowerPol 12,5 µL  ditambahkan dengan 10,5 µL ddH 2 O, primer forward 0,5 µL, primer reverse 0,5 µL dan hasil isolasi plasmid 2 µL. Running PCR dilakukan pada suhu annealing 56,2 °C. Hasil PCR kemudian dilakukan sekuensing dan data yang diperoleh dianalisis menggunakan BioEdit.
Langkah pertama dalam formulasi Plasmid DNA: Kitosan ialah preparasi larutan kitosan dengan cara melarutkan kitosan dalam larutan asam asetat 5 nM dengan pengadukan. Setelah itu, larutan diatur pHnya menjadi 4,0 menggunakan NaOH 1M. Larutan polimer kitosan yang telah terbentuk dan memiliki konsentrasi final 0,02% selanjutnya akan difilter steril menggunakan filter 0,2 μm.
Larutan kitosan dibuat konsentrasi 0,005 % (b/v) pada pH 4. Formulasi dilakukan dengan metode complex coacervation dengan beberapa modifikasi. DNA rekombinan 1 µg ditambahkan ke masing-masing tube dengan perbadingan massa DNA:kitosan sebesar 1:0,1; 1:0,2; 1:0,3; 1:0,4; 1:0,5; 1:0,6 dan 1:0,7. Tube kemudian dipanaskan dengan waterbath pada suhu 50°C selama 10 menit. Plasmid DNA dan larutan polimer kitosan dicampur dan divortex selama 20 detik kemudian campuran larutan diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang (Ishak dkk ., 2019; Martien dkk ., 2007; Unsunnidhal dkk ., 2019). Kompleks nanopartikel kemudian disimpan pada suhu ruang. Uji migrasi atau gel retardation assay pada kompleks nanopartikel DNA/kitosan dilakukan menggunakan gel agarose 0,8 % dengan tegangan 100 V selama 30 menit.
Penelitian ini memiliki Ethical Clearance dengan nomor: KE/FK/0929/EC/2022 yang dikeluarkan oleh Komisi Etik Penelitian Kedokteran dan Kesehatan, Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat dan Keperawatan, Universitas Gadjah Mada.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Plasmid pEGFP-N1-S1
Isolasi plasmid ialah suatu teknik yang digunakan untuk mengekstraksi plasmid DNA dari sel bakteri. Plasmid DNA dapat digunakan pada berbagai aplikasi di bidang molekuler seperti sekuensing, digestion dengan enzim restriksi, PCR, kloning maupun tranfeksi.  Terdapat beberapa metode yang sudah dikembangkan hingga kini untuk melakukan isolasi plasmid, salah satunya ialah menggunakan kit komersial  (Andreou, 2013). Isolasi plasmid dilakukan menggunakan Plasmid DNA Extraction Maxi Kit (Favorgen Biotech Corp) yang dilakukan berdasarkan manual prosedur kit yang diberikan. Hasil isolasi plasmid ini kemudian dihitung kemurnian dan konsentrasinya menggunakan nanodrop. Hasil isolasi plasmid ini juga dilakukan elektroforesis dengan gel agarose 0,8% selama 30 menit pada 100V. Secara topologi, plasmid DNA memiliki bentuk supercoil . Namun, ketika proses ekstraksi plasmid akan memiliki beberapa bentuk lain seperti open-circular / nicked-circular , linear , covalently bound dan circular single stranded (Balagurumoorthy dkk ., 2008; Roy dkk ., 2018). Visualisasi hasil isolasi plasmid uncut (Gambar 1.) juga menunjukkan beberapa band terbentuk pada sampel yang sama.
Gambar 1 . Visualisasi hasil isolasi plasmid pEGFP-N1- S1. Marker 1000 bp (M), hasil isolasi (P1), hasil isolasi dengan dilusi 5x (P2)
Sampel plasmid DNA sebelum digunakan untuk penelitian perlu dilakukan pengukuran kemurnian dan konsentrasinya. Konsentrasi DNA dapat diukur pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi sampel plasmid yang didapatkan ialah 2182,32 ng/µL.  Pengukuran dengan rasio absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (A260/A280) serta panjang gelombang 260 dan 230 nm (A260/A230) digunakan sebagai indikator kemurnian pada sampel asam nukleat. Pengukuran ini dilakukan dengan instrumen NanoDrop Spektrofotometer (MaestroGen). Sampel DNA dapat dikatakan murni jika memiliki rentang nilai antara 1,8-2,0 pada rasio absorbansi A260/A280  (Sambrook & Russell, 2001).  Rasio absorbansi A260/A230 akan memiliki rentang nilai 2,0-2,2 jika sampel yang terukur murni (Liu dkk ., 2009). Sampel yang diujikan memiliki nilai yang termasuk pada kedua rentang tersebut dengan nilai A260/A280  sebesar 1,911 dan A260/A230 sebesar 2,271.

## Analisis Konstruk pEGFP-N1-S1 dengan Enzim Restriksi dan Sekuensing
Restriksi dilakukan sebelum melakukan sekuensing pada sampel plasmid. Proses ini bertujuan untuk mengonfirmasi bahwa plasmid hasil isolasi merupakan plasmid rekombinan yang mengandung insert gen target (gen S1).  Plasmid dilakukan pemotongan menggunakan enzim Bgl II dan EcoR I.  Enzim EcoRI merupakan  enzim yang umum dipakai untuk melakukan restriksi. Enzim ini memiliki situs pengenalan palindromik dengan sekuens  komplemennya  yaitu  G↓AATTC  dan memiliki hasil pemotongan sticky ends dengan overhang pada 5’. Enzim BglII memiliki hasil pemotongan sticky ends dengan overhang pada 3’dan memiliki situs pengenalan pada A↓GATCT. Kedua enzim ini termasuk pada enzim restriksi endonuklease tipe II (Nevinsky, 2021; Pingoud & Jeltsch, 2001).
Gambar 2 . Visualisasi elektroforesis (a) restriksi isolat pEGFP-N1-S1 dan (b) hasil PCR. Marker 1000 bp (M1), uncut pEGFP-N1-S1 (U1), pEGFP-N1-S1 double digestion (C1), untemplate Control (UTC), hasil PCR (S1).
Hasil restriksi kemudian dilakukan visualisasi menggunakan gel agarose 1 % (Gambar 2). Plasmid rekombinan yang telah dilakukan double digestion atau restriksi akan membentuk dua band . Kedua band ini menunjukkan plasmid pEGFP-N1 dengan ukuran 4.713 bp dan sekuens S1 dengan ukuran 684 bp pada sampel C1. Isolat kemudian dilakukan amplifikasi dengan menggunakan primer pEGFP-N1. Hasil amplifikasi plasmid rekombinan menunjukkan band yang terbentuk pada marker antara 700 dan 1000 bp yang kemungkinan panjang amplikon tersebut 873 bp.  Produk PCR yang dihasilkan dalam penelitian ini spesifik dengan sekuens target serta menunjukkan band yang tebal. Band yang  tebal menunjukkan bahwa plasmid DNA memiliki konsentrasi yang tinggi. Sebaliknya, jika konsentrasi DNA rendah maka band yang dihasilkan akan tipis (Setiati dkk ., 2020). Menurut Sjafaraenan dkk .,  (2018),  keberhasilan dalam amplifikasi DNA menggunakan PCR meliputi berbagai faktor seperti kemurnian dan konsentrasi komponen dalam master mix PCR, primer yang digunakan, kemurnian dan jumlah sampel DNA serta kontaminan. Konsentrasi DNA dapat mempengaruhi jumlah amplikon yang dihasilkan pada proses PCR. Semakin tinngi
konsentrasi DNA maka semakin cepat proses annealing PCR berlangsung. Proses annealing yang cepat akan menghasilkan amplikon dalam jumlah yang banyak (Weaver, 2012).
Sekuensing DNA dalam laboratorium digunakan untuk menentukan urutan pasangan basa secara tepat pada suatu fragmen DNA. Sekuens DNA memiliki berbagai informasi penting bagi suatu organisme oleh karena itu, teknik sekuensing DNA ini bermanfaat dalam penelitian untuk mengetahui bagian dari suatu genom, kromosom atau gen dalam suatu organisme (Widłak,  2013) .  Metode  sekuensing yang digunakan ialah Sanger Sequencing .  Data yang didapatkan dari sekuensing dapat dianalisis dengan alignment . Alignment atau pensejajaran dilakukan untuk mengetahui kesamaan dan perbedaan antara beberapa sekuens (Bayat dkk ., 2019) sehingga dapat mendeteksi perubahan basa seperti delesi, insersi ataupun inversi (Lottspeich & Engels, 2018). Pairwise sequence alignment adalah tipe alignment yang dilakukan pada dua sekuens yang dapat dianalisis menggunakan algoritma global alignment atau local alignment . Global alignment adalah metode untuk menyejajarkan dua sekuens secara keseluruhan. Sedangkan local alignment hanya menyejajarkan pada wilayah sekuens tertentu yang memiliki kesamaan yang tinggi (Chao  dkk., 2022). Data sekuensing pada penelitian ini dianalisis menggunakan pairwise alignment dengan algoritma local alignment dari software Bioedit.
Gambar 3 . Analisis pairwise alignment hasil sekuensing dengan Bioedit
Data hasil sekuensing yang didapatkan dilakukan pensejajaran dan membentuk urutan basa nuklotida “consensus” yang diberikan label nama “ pEGFP-N1 Sequencing ”. Analisis pensejajaran  hasil sekuensing dengan reference gene S1 (Gambar 3.) menunjukkan bahwa sampel plasmid tidak menunjukkan adanya mutasi atau perubahan basa nukleotida. Gen S1 sebagai gen target juga berhasil diinsersi pada sekuens plasmid secara sempurna dengan tidak adanya perubahan pada basa nukleotida.
Uji  Migrasi  atau Gel Retardation Assay pada kompleks pEGFP-N1-S1/K
Kompleks nanopartikel pEGFP-C1-S1/K dan pEGFP-N1-S1/K dalam penelitian ini dipreparasi dengan metode koaservasi kompleks dengan memvariasikan rasio kitosan terhadap DNA menjadi beberapa variasi rasio DNA:Kitosan yaitu 1:0,1 sampai 1:0,7. Pembentukan kompleks kitosan-DNA diamati dengan gel retardation assay/uji migrasi kompleks pada gel agarosa (Gambar 4).
Dengan indikator yang diamati berupa DNA yang mampu terjerat sempurna dalam nanopartikel kitosan dengan harapan tidak ada DNA yang terlepas saat proses visualisasi.
Gambar 4 . Visualisasi retardation assay pada kompleks nanopartikel pEGFP-N1/K. Marker 1 Kb (M), pEGFP-C1-S1 tanpa kitosan (P), Rasio 1:0,1 (A), Rasio 1:0,2 (B), Rasio 1:0,3 (C), Rasio 1:0,4 (D), Rasio 1:0,5 (E), Rasio 1:0,6 (F), Rasio 1:0,7 (G)
Seiring peningkatan massa kitosan dalam pembuatan nanopartikel, DNA plasmid bebas yang mampu bermigrasi juga semakin berkurang. Hal ini terlihat dari adanya pendaran DNA plasmid bebas pada formulasi dengan rasio 1:0,1 sampai 1:0,5, namun tidak pada formulasi dengan rasio kitosan yang lebih tinggi. Semakin banyak kitosan yang ditambahkan dalam formulasi, semakin banyak DNA plasmid yang terenkapsulasi membentuk kompleks kitosan-DNA. Dari visualisasi di gel agarosa, perbandingan massa 1:0,6 merupakan perbandingan minimum kitosan yang paling efektif dalam mengenkasulapsi DNA plasmid baik pada pEGFP-C1-S1/K. Penelitian tentang pembuatan nanopartikel kitosan/DNA ini telah banyak dilakukan seperti penelitian dari Unsunnidhal dkk ., (2019) yang memformulasikan nanopartikel kitosan 0,02% dengan plasmid yang mengandung gen gag-CA  dari virus Jembrana. Penelitian ini menghasilkan formulasi yang memiliki rasio minimum 1:2 yang dapat memperangkap plasmid secara keseluruhan. Hasil yang serupa juga  didapatkan pada penelitian Ishak dkk ., (2019) yang memformulasikan kitosan dengan plasmid yang mengandung gen Env-TM
dari virus Jembrana dengan rasio minimum 1:2 juga.

## KESIMPULAN
Plasmid rekombinan yang digunakan dalam penelitian memiliki konsentrasi sebesar 2182,32 ng/µL  dengan memiliki kemurnian 1,911 dan 2,271. Gen target S1 berhasil di insert kan pada plasmid pEGFP-N1, yang terbukti dari hasil restriksi menunjukkan dua band berukuran 684 dan 4813 bp. Urutan nukleotida gen target pada plasmid rekombinan identik dengan gen reference , hal ini menandakan bahwa gen tidak mengalami perubahan nukleotida atau mutasi saat di insert kan pada plasmid. Rasio massa DNA: kitosan sebesar 1:0,6 terbukti sebagai  formulasi yang optimal untuk membentuk kompleks DNA- Kitosan dengan keseimbangan yang sempurna.
Penelitian ini dapat diteruskan dengan tahap uji karakterisasi fisikokimia pada kompleks nanopartikel DNA/kitosan. Tahapan selanjutnya juga bisa dilakukan transfeksi pada sel eukariot dengan menguji sitotoksisitas sel terhadap kompleks nanopartikel maupun melihat ekspresi protein dan RNA dari sel hasil transfeksi.

## APRESIASI
Penelitian ini dilakukan dengan hibah dana penelitian pada Program Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Tahun Anggaran 2023 yang diselenggarakan oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Riset dan Teknologi, Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset, dan Teknologi (Kemendikbudristek) dengan nomor kontrak
3211/UN1/DITLIT/Dit-
Lit/PT.01.03/2023.

## DAFTAR PUSTAKA
Andreou, L. (2013). Isolation of Plasmid DNA from Bacteria. In Laboratory Methods in Enzymology: DNA (1st ed., Vol. 529). Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-
418687-3.00010-0
Balagurumoorthy, P., Adelstein, S. J. A., & Kassis, A. I. (2008). Method to eliminate linear DNA
from mixture containing nickedcircular, supercoiled, and linear plasmid  DNA. Analytical Biochemistry , 381 (1), 172–174. https://doi.org/10.1016/j.ab.2008.06.037.
Bayat, A., Gaëta, B., Ignjatovic, A., & Parameswaran, S. (2019). Pairwise alignment of nucleotide sequences using maximal exact matches. BMC Bioinformatics , 20 (1), 1–15. https://doi.org/10.1186/s12859-019- 2827-0
Chao, J., Tang, F., & Xu, L. (2022). Developments in Algorithms for Sequence Alignment: A Review. Biomolecules , 12 (4), 1–13. https://doi.org/10.3390/biom12040546
Clontech. (1999). pEGFP-N1 Vector Information. Clontech Laboratories, Inc , 1–3.
Duan, Y., Wang, S., Zhang, Q., Gao, W., & Zhang, L. (2020). Since January 2020 Elsevier has created a COVID-19 resource centre with free information in English and Mandarin on the novel coronavirus COVID- 19 . The COVID-19 resource centre is hosted on Elsevier Connect , the company ’ s public news and information
. January .
El Hady, W. E. A., Mohamed, E. A., El-Aazeem Soliman, O. A., & El-Sabbagh, H. M. (2019). In vitro-in vivo evaluation of chitosan-PLGA nanoparticles for potentiated gastric retention and anti-ulcer activity of diosmin. International Journal of Nanomedicine , 14 , 7191–7213. https://doi.org/10.2147/IJN.S213836
Ishak, J., Unsunnidhal, L., Martien, R., & Kusumawati, A. (2019). In vitro evaluation of chitosan-DNA plasmid complex encoding Jembrana disease virus Env-TM protein as a vaccine candidate. Journal of Veterinary Research (Poland) ,
63 (1), 7–16. https://doi.org/10.2478/jvetres-2019- 0018
Liu, P., Avramova, L. V, & Park, C. (2009). Revisiting absorbance at 230 nm as a protein unfolding probe. Analytical Biochemistry ,
389 (2), 165–170.
https://doi.org/10.1016/j.ab.2009.03.028
Lottspeich, F., & Engels, J. W. (2018). Bioanalytics - Analytical Methods and Concepts in Biochemistry and Molecular Biology . Wiley- VCH.
Mallakpour, S., Azadi, E., & Mustansar, C. (2021).
Chitosan, alginate, hyaluronic acid, gums, and  β -glucan as potent adjuvants and vaccine delivery systems for viral threats including SARS-CoV-2: A review. International Journal of Biological Macromolecules , 182 (March), 1931–1940.
Martien, R., Loretz, B., Thaler, M., Majzoob, S., & Bernkop-Schnürch, A. (2007). Chitosan- thioglycolic acid conjugate: An alternative carrier for oral nonviral gene delivery? Journal of Biomedical Materials Research - Part A ,
82 (1), 1–9. https://doi.org/10.1002/jbm.a.31135
Nevinsky, G. A. (2021). How enzymes, proteins and antibodies recognize extended dnas; general regularities. International Journal of Molecular Sciences , 22 (3), 1–35. https://doi.org/10.3390/ijms22031369
Peng, X. L., Cheng, J. S. Y., Gong, H. L., Yuan, M. Di, Zhao, X. H., Li, Z., & Wei, D. X. (2021). Advances in the design and development of SARS-CoV-2 vaccines. Military Medical Research , 8 (1), 1–31. https://doi.org/10.1186/s40779-021- 00360-1
Pingoud, A.,  & Jeltsch, A. (2001). Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Research , 29 (18), 3705–3727. https://doi.org/10.1093/nar/29.18.3705
Roy, U., Mishra, A., Jana, P., Karmakar, S., & Sciences, F. (2018). A Comparative Study on Different Plasmid Isolation Procedures A Comparative Study on Different Plasmid Isolation Procedures . October . https://doi.org/10.18782/2320- 7051.6988
Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Editio). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Setiati, N., Partaya, & Hidayah, N. (2020). The use of two pairs primer for CO1 gene amplification on traded stingray at fish auction Tasik Agung Rembang The use of two pairs primer for CO1 gene amplification on traded stingray at fish auction Tasik Agung Rembang. Journal of Physics: Conference Series , 1567 . https://doi.org/10.1088/1742- 6596/1567/3/032056 Singhal, T. (2020). Review on COVID19 disease so far. The Indian Journal of Pediatrics ,
87 (April), 281–286.
Sjafaraenan, S., Lolodatu, H., Johannes, E., Agus, R.,
& Sabran, A. (2018). Profil Dna Gen Follicle Stimulating Hormone Reseptor (Fshr) Pada Wanita Akne Dengan Teknik Pcr Dan Sekuensing Dna. Bioma :  Jurnal  Biologi
Makassar , 3 (1), 1–11. https://doi.org/10.20956/bioma.v3i1.390
9
Tsang, H. F., Chan, L. W. C., Cho, W. C. S., Yu, A. C. S., Yim, A. K. Y., Chan, A. K. C., Ng, L. P. W., Wong, Y. K. E., Pei, X. M., Li, M. J. W., & Wong, S. C. C.
(2021). An update on COVID-19 pandemic: the epidemiology, pathogenesis, prevention and treatment strategies. Expert Review of Anti-Infective Therapy , 19 (7), 877–888. https://doi.org/10.1080/14787210.2021.1
863146
Unsunnidhal, L., Ishak, J., & Kusumawati, A. (2019). Expression of gag-CA gene of jembrana disease virus with cationic liposomes and chitosan nanoparticle delivery systems as dna vaccine candidates. Tropical Life Sciences Research , 30 (3), 15–
36. https://doi.org/10.21315/tlsr2019.30.3.2
Vu, M. N., Kelly, H. G., Kent, S. J., & Wheatley, A. K. (2021). Current and future  nanoparticle vaccines for COVID-19. EBioMedicine , 74 ,
103699.
https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2021.103 699
Wang, X. Y., Du, Q. J., Zhang, W. L., Xu, D. H., Zhang, X., Jia, Y. L., & Wang, T. Y. (2022). Enhanced Transgene Expression by Optimization of
Poly A in Transfected CHO Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology ,
10 (January), 1–9. https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.72272 2
Weaver, R. F. (2012). Molecular Biology, Fifth Edition . McGraw-Hill Companies, Inc.
Widłak, W. (2013). Molecular Biology Not Only for Bioinformaticians . Springer Heidelberg New York Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-3-642- 45361-8_9
World Health Organization (2023). WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. https://covid19.who.int/.  Diakses pada tanggal 20 Agustus 2023.