J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 32(2): 157-168 Th. 2021 ISSN: 1979-7788 Terakreditasi Ristekdikti: 51/E/KPT/2017

## ISOLASI PROTEIN KACANG MERAH DAN KACANG HIJAU MENGGUNAKAN METODE ASAM BASA DIKOMBINASIKAN DENGAN PROSES ENZIMATIS
[Isolation of Protein from Red Beans and Green Beans using Acid-Base Method Combined with Enzymatic Processes]
Slamet Hadi Kusumah 1) , Robi Andoyo 2) *, dan Tita Rialita 2)
1) Program Studi Teknologi Pangan, Fakultas Teknik, Universitas Islam Al-Ihya, Kuningan
2) Departemen Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Industri Pertanian, Universitas Padjadjaran, Bandung
Diterima 16 Januari 2021 / Disetujui 8 Desember 2021

## ABSTRACT
Red  beans  (Phaseolus  vulgaris  L.)  and  greens  beans  (Phaseolus  raditus  L.)  proteins  contain  high amount of essential amino acids lysine and leucine. The study aimed to determine the optimum conditions for protein isolation process from red beans and green beans flour to produce the highest protein content. Additionally, an enzymatic hydrolysis was aimed to produce isolates or protein concentrates of  red beans and  green  beans  with  good  digestibility.  The  research  method  used  was  the  Response  Surface Methodology (RSM) Box-Behnken Design with Design Expert 10. The variables used in this process were extraction  temperature  (30-50°C),  extraction  pH  (8.50-9.50),  and  time  extraction  (30-60  minutes).  The results showed  that  the  optimum  conditions  for  the  extraction  of  red  beans  protein  were extraction  pH  of 8.60,  temperature  of  30°C,  and  time  of  30.1  minutes,  with  the  resulting  protein  content  of  86.88±1.38% with and a validity value of 0.91. Meanwhile, the optimum conditions for the green beans protein extraction process  were  extraction  pH of  8.83,  extraction  temperature of  30°C,  extraction  time  of 30  minutes  which yielded  protein  content  of  88.27±1.08%  and  a  validity  value  of  0.97.  Enzymatic  hydrolysis    using  of  3% (w/w)  bromelain  enzyme  on  red  bean  and  mung  bean  protein  concentrate  powder  was  able  to  increase protein digestibility by 15.61 and 14.51%, respectively.
Keywords: concentrate protein, enzymatic hydrolysis, protein isolation

## ABSTRAK
1
Protein kacang merah ( Phaseolus vulgaris L. ) dan kacang hijau ( Phaseolus raditus L. ) memiliki asam amino  esensial  lisin  dan  leusin  yang  tinggi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  kondisi  optimum proses isolasi protein tepung kacang merah dan kacang hijau yang menghasilkan kadar protein tertinggi. Tahap modifikasi hidrolisis enzimatis bertujuan untuk menghasilkan isolat atau konsentrat protein kacang merah  dan  kacang  hijau  dengan  daya  cerna  protein  yang  baik.  Penelitain  ini  menggunakan  metode Response Surface Methodology (RSM) Box-Behnken Design melalui Software Desain Expert 10 . Variabel yang  digunakan  pada  proses  ini  adalah  suhu  ekstraksi  (30-50°C),  pH  ekstraksi  (8,50-9,50),  dan  lama ekstraksi  (30-60  menit).  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kondisi  optimum  proses  ekstraksi  protein kacang  merah  dilakukan  pada  pH  ekstraksi  8,60,  suhu  ekstraksi  30°C,  lama  ekstraksi  30,1  menit,  dan menghasilkan  kadar  protein  86,88±1,38%  dengan  nilai  validitas  0,91.  Kondisi  optimum  proses  ekstraksi protein kacang hijau dilakukan pada pH ekstraksi 8,83, suhu ekstraksi 30°C, lama ekstraksi 30 menit dan menghasilkan  kadar  protein  88,27±1,08%  dengan  nilai  validitas  0,97.  Hidrolisis  enzimatis  dengan penambahan  enzim  bromelin  3%  (b/b)  pada  bubuk  konsentrat  protein  kacang  merah  dan  kacang  hijau mampu meningkatkan daya cerna protein berturut-turut sebesar 15,61 dan 14,51%.
Kata kunci: hidrolisis enzimatis, isolasi protein, konsentrat protein

## PENDAHULUAN
Persentase  stunting  di  Jawa  Barat  saat  ini adalah  34,51%  yang  tersebar  di  beberapa  Kabu- paten  diantaranya  Sukabumi,  Cianjur,  Cirebon  dan Garut  (Yusuf et  al., 2018).  Stunting  didefinisikan sebagai  keadaan  dengan  tinggi  badan  di  bawah  2 simpang baku dari median pada kurva pertumbuhan tinggi  badan.  Penyebab  dan  faktor  risiko  stunting terjadi karena faktor internal seperti genetik ataupun eksternal  seperti  asupan  nutrisi  kurang  dan  infeksi kronis.  Anak  balita  stunting  lebih  rendah  mengon- sumsi  protein  dibandingkan  anak  balita  dengan status  gizi  baik  (Ernawati et  al., 2016).  Anak-anak dengan  status  gizi  baik  mempunyai  asam  amino esensial  seperti  lisin  dan  leusin  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  anak  stunting  (Semba et  al., 2016).
Komoditas  lokal  Jawa  Barat  yang  berpotensi sebagai sumber protein  nabati ( plant-based  protein ) adalah  kacang  merah  dan  kacang  hijau  dengan kadar  protein  masing-masing  sekitar  22  dan  20% (Kusumah et  al., 2020a).  Kandungan  asam  amino esensial  biji  kacang  merah  dan  kacang  hijau  cukup lengkap,  yakni  isoleusin,  leusin, lisin, metionin, feni- lalanin,  threonin,  dan  valin  (Almatsier,  2013).  Pada penelitian  sebelumnya  (Kusumah et  al., 2020a), telah dilakukan identifikasi asam amino pada tepung kacang  merah  dan  kacang  hijau.  Asam  amino esensial terbesar yang terdapat pada tepung kacang merah dan tepung kacang hijau adalah lisin sebesar 15.929,89 dan  14.916,14  mg/kg, kemudian terbesar kedua  adalah  leusin  sebesar  12.385,81  dan 12.694,86  mg/kg,  masing-masing  (Kusumah et  al., 2020a).  Hasil  tersebut  memberikan  penguatan  bah- wa  protein  kacang  merah  dan  kacang  hijau  berpo- tensi  untuk  menjadi  sumber  asam  amino  esensial pada berbagai macam produk high protein food . Protein  kacang  merah  dan  kacang  hijau  dapat diisolasi  dan  diolah  menjadi  bubuk  isolat  atau konsentrat protein (Gunarti et al., 2013; Wang et al., 2011;  Zhu et  al., 2018).  Isolat  atau  konsentrat  pro- tein  kacang  merah  dan  kacang  hijau  diperoleh  de- ngan  cara  mengendapkan  protein  pada  titik  iso- elektriknya.  Berdasarkan  penelitian  sebelumnya (Kusumah et  al., 2020a),  telah  diidentifikasi  titik isoelektrik  kacang  merah  dan  kacang  hijau  yaitu masing-masing pH 4,56 dan 4,81.
Isolasi  protein  kacang-kacangan  menggunakan metode asam basa dimulai dengan proses ekstraksi protein  pada  larutan  alkali.  Pada  kondisi  basa, proses  ekstraksi  menghasilkan  protein  yang  lebih banyak  karena  protein  yang  terlarut  mudah dipisahkan  dari  residu.  Kondisi  basa  juga  dapat merusak  asam  amino  yang  mengandung  sulfur diantaranya  triptofan,  treonin,  lisin,  dan  metionin (Kanetro, 2017). Penggunaan variasi suhu pemanasan  dan  lama  ekstraksi  dalam  teknik  isolasi
protein  kacang-kacang  juga  menentukan  rendemen isolat  atau  konsentrat  protein  yang  dihasilkan. Proses  ekstraksi  protein  kacang  merah  dan  kacang hijau  yang  dilakukan  pada  suhu suhu ruang selama 30  menit  dan  pH  ekstraksi  9,00  menghasilkan  ren- demen  protein  sebesar  81,87  dan  76,99%,  masing- masing  (Kusumah et  al., 2020b).  Kondisi  ekstraksi ini  perlu  dioptimasi  agar  bisa  menghasilkan  isolat atau konsentrat protein yang lebih banyak.
Tantangan dari penelitian ini adalah mendapat- kan konsentrat atau isolat protein kacang merah dan kacang hijau  dengan profil  yang baik seperti bentuk oligopeptida  (2-10  asam  amino)  sehingga  dapat memperbaiki daya cerna protein. Teknik yang dapat dilakukan  yaitu  melalui  proses  isolasi  protein kacang-kacangan yang dikombinasikan dengan pro- ses  hidrolisis  enzimatis  (Kusumah et  al., 2020b). Enzim protease dapat mengubah protein dari bentuk kompleks  menjadi  bentuk  sederhana  yang  diharap- kan  mampu  menghasilkan  daya  cerna  protein  yang lebih baik. Konsentrasi enzim alcalase optimal pada proses  isolasi  protein  kacang  adalah  4%  dengan dosis  3642  U/g  menghasilkan soy  bean  oligopep- tides (Cai et al., 2014). Proses isolasi kacang merah dengan  penambahan  enzim  protease  sebesar  3% menghasilkan  bubuk  konsentrat  protein  dengan kadar  protein  sebesar  73,34%  (Liu et  al. ,  2011). Isolasi  protein  kacang  kedelai  dengan  penambahan enzim Corolase PP (10 mg enzyme/g SPI) mengha- silkan soy  bean  oligopeptides yang  memiliki  sifat fungsional ACE inhibitor, peptide antithrombotic dan antioxidative (Coscueta et al. , 2019).
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan kondisi  optimum  isolasi  protein  tepung  kacang  me- rah dan kacang hijau yang menghasilkan kadar pro- tein  tertinggi.  Tahap  modifikasi  hidrolisis  enzimatis dengan  penambahan  enzim  bromelin  bertujuan untuk  menghasilkan  isolat  atau  konsentrat  protein kacang merah dan kacang hijau dengan daya cerna yang  baik.  Enzim  bromelin  memiliki  sifat  ka- rakteristik  yaitu  titik  isoelektrik  berada  pada  pH  9,5, suhu  optimum  berkisar  antara  50°C, aktivitas  spesi- fik  5-10  U/mg  protein  dan  berwarna  putih  sampai kekuning-kuningan  dengan  bau  khas.  Enzim  bro- melin  lebih  mudah  didapatkan  dan  memiliki  harga yang  lebih  murah  dibandingkan  dengan  enzim  pro- tease lainnya.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  proses  isolasi protein  adalah  kacang  merah  ( Phaseolus  vulgaris L. ) (Argapura, Kabupaten Majalengka), kacang hijau ( Phaseolus  raditus  L. )  (Ciwaringin,  Kabupaten  Cire- bon),  akuades,  asam  klorida  (HCl)  2N  (merck),
natrium hidroksida (NaOH) 0,5 N (merck), bromelain enzyme (focusherb, Cina).
Pembuatan  tepung  kacang  merah  dan  tepung kacang hijau (Pangastuti et al., 2013)
Persiapan  bahan  baku  yang  dilakukan  pada penelitian ini adalah proses penepungan biji kacang merah  dan  kacang  hijau.  Tahap  ini  diawali  dengan pencucian  dan  sortasi  kacang  merah  dan  kacang hijau  menggunakan  ari  bersih.  Tujuannya  adalah membersihkan dan memisahkan bagian kacang me- rah atau kacang hijau dari kontaminan. Selanjutnya, proses  perendaman  selama  11  jam  menggunakan akuades  untuk  menginaktifkan  asam  fitat  yang  ter- dapat  pada  bagian  kulit  ari  kacang  merah  dan kacang  hijau.  Kacang  merah  dan  kacang  hijau  di- keringkan menggunakan sinar matahari selama 1 –2 hari  sampai  kadar  air  <15%.  Kacang  merah  dan kacang hijau yang sudah kering kemudian dilakukan penggilingan menggunakan discmill (FFC-23, Cina). Pengayakan tepung kacang merah dan kacang hijau menggunakan saringan 80 mesh.
Optimasi  proses  ekstraksi  protein  (Wang et  al., 2011) Metode  penelitian Response  Surface  Metho- dology (RSM )  Box-Behnken  Design melalui Soft- ware  Desain  Expert 10  dipilih  untuk  mengoptimasi kondisi  proses  ekstraksi  protein  kacang  merah  dan kacang hijau. Variabel  yang digunakan pada proses ini  adalah  suhu  ekstraksi  (30-50°C),  pH  ekstraksi (8,50-9,50), dan lama ekstraksi (30-60 menit). Varia- bel bebas ditentukan berdasarkan trial and error dan kajian  penelitian  sebelumnya  (Kusumah et  al . , 2020b)  untuk  menentukan  batas  minimum  dan maksimum.  Berdasarkan  program Desain  Expert RSM  Box-Behnken  Design diperoleh  17  perlakuan dengan  berbagai  kombinasi  suhu  ekstraksi,  pH ekstraksi,  dan  lama  ekstraksi  (Tabel  1).  Respon
yang diukur dan dioptimasi adalah kadar protein per total solid (%) menggunakan metode kjeldahl (buchi, Swiss) (AOAC, 1990).
Isolasi  protein  kacang  merah  dan  kacang  hijau menggunakan  metode  asam  basa  yaitu  melalui proses  ekstraksi  dan  pengendapan  memodifikasi teknik  yang  dilakukan  oleh  Wang et  al .  (2011). Setiap  formula  dibuat  dari  40  g  tepung  kacang merah  atau  tepung  kacang  hijau.  Pencampuran bahan  dengan  rasio  tepung  kacang  merah:akuades adalah 1:10 (b/b). Kemudian diaduk selama 3 menit dan  dilakukan  pengecekan  pH  awal  menggunakan pH  meter  (lutron  pH208  portable).  Hal  yang  sama juga dilakukan pada sampel tepung kacang hijau.
Proses  selanjutnya  adalah  penyesuaian  pH dengan  menambahkan  NaOH  0,5  N  sampai  pH menunjukkan  nilai  pH  ekstraksi  sesuai  rancangan penelitian.  Proses  sentrifugasi  I  (Thermo  scientific ST16  benchtop  centrifuge,  Jerman)  dilakukan  sela- ma  15  menit  pada  kecepatan  4000-4500  rpm,  tu- juannya adalah untuk memisahkan residu  yang me- ngendap  dan  supernatan  (protein  yang  terlarut). Supernatan kemudian diambil untuk proses pengen- dapan. Supernatan ditambahkan HCl 2N sampai pH menunjukkan  pH  isoelektrik  (pI)  yaitu  pH  4,56  (ka- cang  merah)  dan  pH  4,81  (kacang  hijau)  (Kusumah et al . , 2020a). Proses pengendapan dilakukan pada suhu  30°C  selama  10  menit.  Proses  sentrifugasi  II dilakukan  selama  15  menit  pada  kecepatan  4000- 4500  rpm.  Endapan  protein  yang  dihasilkan  kemu- dian  dilakukan  uji  kadar  protein  dengan  metode Kjeldahl.
Analisis  respon  dilakukan  dengan  mengguna- kan  beberapa  pilihan  model analysis  of  variance (ANOVA)  yaitu linear , quadratic ,  dan cubic .  Pemi- lihan  model  ini  ditentukan  berdasarkan  model  yang memberikan nilai  terbesar, menghasilkan nilai signi- fikansi  ANOVA,  dan  non  signifikansi  pada lack  of fit (Apriliyanti et al . , 2020) .
Tabel 1.   Data formulasi kondisi proses ekstraksi dan data respon kadar protein (%)
Run Faktor A Suhu Ekstraksi (°C) Faktor B pH Ekstraksi Faktor C Lama Ekstraksi (Menit) Respon Kadar Protein per Total Solid (%) Kacang Merah Kacang Hijau 1 30 8,50 45 86,53±1,15 85,36±2,96 2 30 9,00 30 86,98±0,05 89,93±5,96 3 30 9,00 60 87,37±6,34 89,64±0,60 4 30 9,50 45 89,42±2,74 86,49±6,24 5 40 8,50 30 93,20±0,87 91,59±1,57 6 40 8,50 60 75,71±7,40 91,38±2,98 7 40 9,00 45 90,60±5,16 84,40±2,73 8 40 9,00 45 76,74±8,11 92,44±0,27 9 40 9,00 45 68,95±9,50 90,26±8,01 10 40 9,00 45 74,66±3,10 82,64±4,70 11 40 9,00 45 59,78±8,50 86,47±2,27 12 40 9,50 30 77,90±8,34 78,02±0,88 13 40 9,50 60 76,07±3,90 81,99±2,87 14 50 8,50 45 48,14±1,50 85,58±10,06 15 50 9,00 30 53,09±6,41 76,51±5,10 16 50 9,00 60 53,42±2,91 88,42±6,70 17 50 9,50 45 46,30±3,30 71,97±7,78
Program Desain  Expert 10 juga  memberikan fitur grafik contour plot yang menunjukkan kombinasi antar  komponen  yang  saling  memengaruhi  nilai respon  dengan  warna  biru  (nilai  respon  terendah) dan  warna  merah  (nilai  respon  tertinggi).  Bentuk permukaan dari hubungan interaksi antar komponen ini  dapat  dilihat  lebih  jelas  pada  grafik  tiga  dimensi (3-D)  (Braimah et  al . , 2016).  Formula  dengan  nilai desirability maksimum  dipilih  karena  menunjukkan kemampuan  Program Desain  Expert 10 untuk memberikan  nilai  yang  dikehendaki.  Solusi  yang dilakukan  jika  nilai desirability sama  adalah  memilih nilai respon yang paling tinggi (Maula et al . , 2019). Tahap verifikasi atau validasi dilakukan dengan cara  mengisolasi  protein  sesuai  dengan  kombinasi suhu  ekstraksi,  pH  ekstraksi,  dan  lama  ekstraksi terbaik  dan  menganalisis  kadar  protein  per  total solid  (%).  Verifikasi  dilakukan  dengan  dua  kali ulangan. Nilai  validitas diukur dengan membanding- kan  nilai  aktual  dan  nilai  prediksi  (Anihouvi et  al., 2011).  Apabila  terdapat  kesesuaian  antara  nilai aktual  dan  nilai  prediksi  maka  verifikasi  dinyatakan baik (Muhandri et al . , 2017).
Modifikasi  hidrolisis  enzimatis  (Liu et  al., 2011; Wang et al . , 2016)
Modifikasi  hidrolisis  enzimatis  bertujuan  untuk menghasilkan  konsentrat  dengan  bentuk  oligopep- tida sehingga memiliki daya cerna protein yang baik. Proses  ini  hanya  menggunakan  endapan  terbaik yang  dihasilkan  pada  tahap  sebelumnya.  Proses  ini memodifikasi teknik yang telah dilakukan oleh Liu et al . (2011) dan Wang et al . (2016).
Endapan  protein  kacang  merah  dan  kacang hijau  terbaik  dikeringkan  menggunakan  alat  pe- ngering freeze dryer (christ alpha 1-4 LD plus) pada suhu  kurang  lebih  -50°C  selama  24  jam.  Bubuk konsentrat  atau  isolat  yang  telah  kering  kemudian dicampurkan  dengan  akuades.  Rasio  bubuk  isolat atau  konsentrat  protein  kacang  merah:akuades adalah  1:5  (b/b).  Rasio  yang  sama  juga  dilakukan pada  bubuk  isolat  atau  konsentrat  protein  kacang hijau.
Proses  selanjutnya  adalah  penyesuaian  pH dengan menambahkan NaOH 0,5 N sampai pH me- nunjukkan  nilai  pH  8,00  dan  pemanasan  sampai suhu 50°C. Pemberian enzim bromelin dengan kon- sentrasi 3%  (b/b)  dari berat bubuk kosentrat protein yang  digunakan.  Tahap  selanjutnya  dilakukan  pro- ses  hidrolisis  selama  60  menit.  Kemudian  proses inaktivasi enzim dengan cara pemanasan selama 15 menit  pada  suhu  90°C.  Sentrifugasi  dilakukan  pada kecepatan  4000-4500  rpm  selama  15  menit. Endapan  yang  dihasilkan  kemudian  dikeringkan menggunakan freeze drayer pada suhu kurang lebih -50°C  selama  24  jam.  Kosentrat  protein  kacang merah  dan  kacang  hijau  terhidrolisis  enzimatis  ke- mudian dilakukan pengamatan yaitu kadar air meto-
de  gravimetri  (AOAC,  1990),  kadar  protein  metode kjeldhal  (AOAC,  1990),  dan  uji  daya  cerna  protein metode in vitro (Saunders et al . , 1973).
Pengujian daya cerna  metode in vitro (Saunders et al., 1973)
Penentuan  daya  cerna  protein  dilakukan  de- ngan  mengutip  metode  pengujian  daya  cerna protein secara in vitro yang dilakukan oleh Saunders et  al .  (1973).  Enzim  yang  digunakan  dalam  peneli- tian  ini  adalah  enzim  tripsin  (sigma),  kimotripsin (sigma),  dan  pankreatin  (sigma).  Pengujian  daya cerna  protein  secara in  vitro dimulai  dengan  pen- campuran  bahan  dengan  penambahan  buffer  fosfat pH  8,00  pada  sampel  konsentrat  protein  kacang merah dan kacang hijau agar menciptakan suasana basa. Setelah homogen, 10 mL larutan dicampurkan dengan  1,0  mL  larutan  multienzim  (1,6  mg  tripsin, 3,1  mg  kimotripsin,  dan  4  mg  pankreatin).  Proses inkubasi  larutan  sampel  dilakukan  pada  suhu  30°C selama  10  menit  untuk  agar  enzim  dapat  memecah protein.  Pengukuran  absorbansi  menggunakan spektrofotometer  UV-9200  (Rayleigh,  Cina)  pada panjang gelombang 578 nm dilakukan untuk menen- tukan  daya  cerna  protein.  Pengukuran  absorbansi dilakukan  dengan  menggunakan  indikator  yaitu pereaksi folin ciocalteau yang memberikan perbeda- an  intensitas  warna  pada  asam  amino  dan  peptida hasil  hidrolisis enzimatis dalam sampel. Daya cerna protein  per  kadar  protein  bubuk  konsentrat  protein kering  (DCP)  (%)  dapat  dihitung  menggunakan rumus:

## DC
(

## )

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar  protein  konsentrat  protein  kacang  merah dan kacang hijau
Isolasi  protein pada  prinsipnya  didasarkan atas dua  proses  utama  yaitu  ekstraksi  dengan  pelarut basa dan pengendapan dengan pelarut asam (Hatti- Kaul dan Mattiasson, 2011). Asam amino dapat ber- muatan positif pada pH rendah, sedangkan pada pH tinggi dapat bermuatan negatif. Pada pH isoelektrik, asam  amino  berada  pada  keadaan  dipolar  atau in zwitter (Salgin et  al., 2012).  Kelarutan  protein  ber- nilai  paling  kecil  pada  keadaan  tersebut  sehingga protein akan menggumpal dan mengendap (Kusumah et  al . , 2020a).  Perlakuan  kondisi  ekstraksi  protein kacang  merah  dan  kacang  hiijau  yang  bervariasi memberikan hasil nilai kadar protein yang berbeda.
Berdasarkan  Tabel  1,  dapat  dilihat  bahwa  ki- saran  nilai  kadar  protein  per  total  solid  endapan protein  kacang  merah  adalah  46,30±3,30  hingga 93,20±0,87%,  sedangkan  untuk  endapan  kacang hijau  adalah  71,97±7,78  hingga  92,44±0,27%.  Hasil ini menunjukkan bahwa kondisi ekstraksi protein ka- cang  merah  dan  kacang  hijau  memberikan  kadar protein  yang  berbeda-beda.  Menurut  Wang et  al . (2011),  endapan  protein  kacang  hijau  tertinggi dihasilkan  pada  suhu  ekstraksi  31,74°C,  pH  8,97, lama  ekstraksi  33,24  menit  dan  menghasilkan  ren- demen protein 77,60%. Penelitian lain menyebutkan bahwa  kondisi  ekstraksi  yang  optimal  untuk  eks- traksi  protein  kacang  hijau  adalah  pada  suhu  40°C, pH 9,10 dan menghasilkan rendemen protein 77,32% (Du et al., 2017).
Hasil analisis model optimasi (Tabel 2), menun- jukkan  bahwa  model  yang  terpilih  adalah  kuadratik, karena model ini yang memiliki R 2 mendekati 1 yaitu 0,8432  untuk  kacang  merah  dan  0,8354  untuk kacang  hijau.  Model  kuadratik  dipilih  karena  me- nunjukkan nilai yang signifikan ( P <0,05) yaitu 0,0363 (kacang  merah)  dan  0,0420  (kacang  hijau).  Nilai lack  of  fit endapan  protein  menunjukkan  tidak  signi- fikan  ( P >0,05)  yaitu  0,8411  (kacang  merah)  dan 0,7405 (kacang hijau).
Hasil  analisis  ragam  (ANOVA)  didapatkan  se- cara  otomatis  dengan  menggunakan  menu fit summary dalam  program Desain  Expert 10.  Model optimasi  pada  endapan  protein  kacang  merah  me- miliki  nilai P <0,05  yaitu  0,0363  artinya  siginifikan. Pada  variabel  A  (suhu  ekstraksi)  memiliki  nilai P <0,05  yaitu  0,0008  yang  berarti  siginifikan.  Berda- sarkan  hasil  tersebut  maka  variasi  perlakuan  suhu (30-50°C)  dalam  proses  ekstraksi  protein  kacang merah  dapat  berpengaruh  terhadap  respon  kadar protein  endapan  protein  kacang  merah.  Hal  ini  di-
sebabkan  karena  daya  ikat  air  menurun  seiring  de- ngan  proses  pemanasan  yang  membuat  protein menjadi  terdenaturasi  (Andoyo et  al . , 2015).  Pema- nasan  juga  dapat  memberikan  keuntungan  yaitu menginaktifkan  atau  menurunkan  protein  inhibitor. Pemanasan  juga  dapat  meniminalkan  alergenitas pada kacang (Palupi et al., 2015). Perlakuan pema- nasan  dapat  memengaruhi  sifat  gelasi  pada  protein (Morand et  al .,  2011).  Perlakuan  pH  ekstraksi  dan lama  ekstraksi  tidak  berpengaruh  terhadap  respon kadar protein endapan protein kacang merah. Varia- bel pH ekstraksi dan  lama ekstraksi memiliki nilai ti- dak signifikan ( P >0,05)  yaitu masing-masing 0,6168 dan 0,5058.
Pada  sampel  kacang  hijau,  model  optimasi pada  endapan  protein  kacang  hijau  memiliki  nilai P <0,05  yaitu  0,0420  artinya  siginifikan.  Pada  varia- bel  A (suhu  ekstraksi) dan  variabel B (pH ekstraksi) memiliki  hasil  yang  siginifikan.  Berdasarkan  hasil tersebut,  variasi  perlakuan  suhu  dan  pH  dalam  pro- ses  ekstraksi  protein  kacang  hijau  dapat  berpe- ngaruh terhadap respon kadar protein endapan pro- tein  kacang  hijau.  Jumlah  protein  lebih  banyak  di- hasilkan  pada  kondisi  basa  karena  protein  yang terlarut  lebih  mudah  dipisahkan  dari  residu.  Kondisi basa  juga  dapat  memberikan  efek  yang  merugikan yaitu merusak asam amino yang mengandung bele- rang  seperti  lisin,  metioni,  triptopan,  dan  treonin (Kanetro,  2017).  Variasi  pH  pada  proses  ekstraksi protein  kacang  memengaruhi  kadar  protein,  kadar air,  rendemen,  kecerahan,  daya  serap  air,  daya serap  minyak,  kapasitas  emulsi,  stabilitas  emulsi, kapasitas  buih,  serta  stabilitas  buih  konsentrat  pro- tein  kacang  (Pratiwi et  al., 2018).  Variabel  C  (lama ekstraksi) tidak berpengaruh terhadap respon kadar protein  endapan  protein  kacang  hijau  dengan  nilai P >0,05 yaitu 0,1681.
Tabel 2.   Analisis model optimasi
Sampel Model Signifikansi ( P <0,05) Lack of Fit R 2 Model Matematika Endapan protein kacang merah Kuadratik 0,0363 0,8411 0,8432 Y = 74,15 - 18,67A - 1,74B - 2,33C - 1,18AB - 0,017AC + 3,92BC -8,53A 2 + 1,98B 2 + 4,59C 2 Linear 0,0006 0,8275 0,7264 Y = 73,23 - 18,67A - 1,74 - 2,33C Kubik 0,2281 - 0,8700 Y = 74,15 - 16,96A - 3,74B - 4,83C - 1,18AB - 0,017AC + 3,92BC - 8,53A 2 + 1,98B 2 + 4,59C 2 + 4A 2 B + 5,01A 2 C -
3,42AB 2 Endapan protein kacang hijau Kuadratik 0,0420 0,7405 0,8354 Y = 87,24 - 3,62A -4,43B + 1,92C - 3,69AB + 3,05AC + 1,05BC - 2,26A2 - 2,64B2 + 1,14C2 Linear 0,0135 0,4735 0,5483 Y = 85,48 - 3,62A - 4,43B + 1,92C Kubik 0,2125 - 0,8758 Y = 87,24 - 3,66A - 5,74B + 0,94C - 3,69AB + 3,05AC + 1,05BC - 2,26A 2 -
2,64B 2 + 1,14C 2 + 2,62A 2 B + 1,97A 2 C Keterangan: Faktor A= suhu ekstraksi (°C); Faktor B= pH ekstraksi; Faktor C= lama ekstraksi (menit)
A
Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Protein per Total Solid (%) Design Points
93,2048
46,2961 X1 = A: Extraction Temperature X2 = B: Extraction pH Actual Factor C: Extraction Time = 45 30 35 40 45 50 8,5 8,7 8,9 9,1 9,3 9,5 Protein per Total Solid (%) A: Extraction Temperature (oC) B : E xtr a ct io n p H 50 60 70 80 5 9,5 9,3 9,1 8,9 8,7 8.5 30 35 40            45              50 A: Extraction Temperature (°C) B: Ex tra c ti o n pH B Design-Expert® Software Factor Coding: Actual Protein per Total Solid (%) Design Points
92,443 71,9703
X1 = A: Extraction Temperature X2 = B: Extraction pH
Actual Factor C: Extraction Time = 45
30 35 40 45 50 8,5 8,7 8,9 9,1 9,3 9,5 Protein per Total Solid (%) A: Extraction Temperature (oC) B : E x tr a ct io n p H 75 80 85 5 9,5 9,3 9,1 8,9 8,7 8.5
30 35 40            45              50 A: Extraction Temperature (°C) B: Ex tra c ti o n pH
Berdasarkan  grafik contour  plot pada  Gambar 1,  menunjukkan  bahwa  nilai  respon  kadar  protein endapan kacang merah dan kacang hijau ditentukan oleh  kombinasi  antar  variabel  suhu  ekstraksi,  pH ekstraksi,  dan  lama  ekstraksi  yang  saling  meme- ngaruhi.  Nilai  respon  terendah  ditunjukkan  dengan adanya  warna  biru  pada  grafik contour  plot ,  yaitu kadar  protein  46,30±3,30%  (kacang  merah)  dan 71,97±7,78%  (kacang  hijau).  Nilai  respon  tertinggi ditunjukkan  dengan  adanya  warna  merah  pada grafik contour  plot yaitu  kadar  protein  93,20±0,87% (kacang  merah)  dan  92,44±0,27%  (kacang  hijau). Program Desain  Expert 10  juga  dapat  memberikan bentuk  permukaan  dalam  tampilan  grafik  3D  agar
dapat  melihat  lebih  jelas  hubungan  interaksi  antar variabel  suhu  ekstraksi,  pH  ekstraksi,  dan  lama ekstraksi dengan nilai respon kadar protein (Gambar 2). Sama seperti grafik contour plot , warna biru pada grafik  menunjukkan  nilai  respon  yang  terendah,  se- dangkan warna merah menunjukkan nilai respon ter- tinggi.
Komponen  pertama  yang  dioptimalkan  adalah suhu ekstraksi dengan target minimal 30°C dan ting- kat  kepentingan  3+  (Tabel  3).  Penentuan  ini  dika- renakan  proses  pemanasan  dapat  memengaruhi karaktersitik protein kacang merah dan kacang hijau yaitu  dengan  terjadinya  denaturasi  protein  (Andoyo et al., 2014).
Gambar 1.   Grafik contour plot hasil uji respon kadar protein kacang merah (A) dan kacang hijau (B)
Gambar 2.   Grafik tiga dimensi hasil uji respon kadar protein kacang merah (A) dan kacang hijau (B) A: Extraction Temperature (°C) B: Extraction pH A: Extraction Temperature (°C) B: Extraction pH A B
Tabel 3. Komponen respon yang dioptimasi, target, batas, dan kepentingan pada tahapan optimasi formula
Sampel Komponen Respon Target/ Goal Batas Bawah/ Lower Limit Batas Atas/ Upper Limit Kepentingan/ Importance Endapan protein kacang merah Suhu ekstraksi (°C) Minimal/ Minimum 30 50 3+ pH ekstraksi kisaran/ Inrange 8,50 9,50 3+ Lama ekstraksi (menit) kisaran/ In range 30 60 3+ Protein per Total Solid (%) Maksimal/ Maximum 46,30 93,20 5+ Endapan protein kacang hijau Suhu ekstraksi (°C) Minimal/ Minimum 30 50 3+ pH ekstraksi kisaran/ In range 8,50 9,50 3+ Lama ekstraksi (menit) kisaran/ In range 30 60 3+ Protein per Total Solid (%) Maksimal/ Maximum 71,97 92,44 5+
pH ekstraksi merupakan komponen kedua yang dioptimalkan  dengan  target  kisaran  8,50-9,50  dan tingkat  kepentingan  3+.  Penentuan  ini  dikarenakan pada  kondisi  basa  dapat  memberikan  protein  yang lebih banyak tetapi dapat juga merusak asam amino yang  mengandung  belerang  (Kanetro,  2017).  Lama ekstraksi  merupakan  komponen  ketiga  yang  diopti- malkan dengan tingkat kepentingan 3+ dan memiliki kisaran  30-60  menit.  Penentuan  ini  dikarenakan ikatan  peptida  dapat  terhidrolisis  dan  menguraikan struktur  primer  protein  yang  dipengaruhi  oleh  lama protein  bereaksi  dengan  asam  maupun  basa (Lafarga et al., 2018).
Respon  yang  dioptimalkan  yaitu  kadar  protein dengan  tingkat  kepentngan  5+  dan  ditargetkan  me- miliki  nilai  maksimal.  Tingkat  kepentingan  dengan nilai 5 dipilih karena proses optimasi proses ekstrasi protein  harus  menghasilkan  kadar  protein  semaksi- mal  mungkin.  Konsentrat  protein  kacang-kacangan harus mengandung protein sedikitnya 70%, sedangkan  isolat  protein  harus  mengandung  lebih dari 90% protein dari bahan kering (Kanetro, 2017).
Optimasi  proses  ekstraksi  protein  kacang merah  dan  kacang  hijau  mendapatkan  nilai  respon kadar  protein  dengan  melihat  nilai desirability .  Ber- dasarkan  proses  optimasi,  program Desain  Expert 10 memberikan 10 (sepuluh) solusi formula optimum (Tabel  4).  Kondisi  proses  ekstraksi  protein  kacang merah  yang  direkomendasikan  sebagai  solusi  opti- mal  adalah  dengan  suhu  ekstraksi  30°C,  pH  eks- traksi  8,60  dan  lama  ekstraksi  30,1  menit.  Pada kondisi tersebut memiliki nilai desirability yang tinggi yaitu  sebesar  1,000  dan  diprediksi  menghasilkan kadar  protein  per  total  solid  tertinggi  yaitu  95,99%. Hasil  berbeda  ditunjukkan  pada  proses  ekstraksi protein  kacang  hijau,  solusi  formula  optimal  yang direkomendasikan  yaitu  kondisi  proses  ekstraksi protein  dengan  suhu  ekstraksi  30°C,  pH  ekstraksi 8,83 dan lama ekstraksi 30,0 menit. Kondisi tersebut menghasilkan  nilai desirability yang  tinggi  dengan nilai  0,961  dan  diprediksi  menghasilkan  kadar  pro- tein per total solid tertinggi yaitu 91,17%.
Verifikasi  atau  validasi  data  dilakukan  untuk memverifikasi tingkat kebenaran model yang direko-
mendasikan  oleh  program Desain  Expert 10 (Tabel 5).  Hasil  uji  laboratorium  (nilai  aktual)  menunjukkan kadar  protein  per  total  solid  pada  endapan  kacang merah  sebesar  86,88±1,38%  sedangkan  nilai  pre- diksi  adalah  95,39%.  Endapan  protein  kacang  hijau memiliki  kandungan  protein  sebesar  88,27±1,08%, sedangkan  prediksi Desain  Expert adalah  91,17%. Adapun nilai  validitas pada endapan protein kacang merah dan kacang hijau masing-masing adalah 0,91 dan 0,97. Optimasi proses isolasi kacang merah dan kacang  hijau  memiliki  nilai  validasi  mendekati  1. Berdasarkan  hasil  tersebut  maka  kondisi  proses optimum  yang  direkomendasikan  oleh  program Desain  Expert memiliki  tingkat  kebenaran  yang tinggi dan dapat dipercaya.
Endapan  protein  kacang  merah  dan  kacang hijau  terbaik  yang  dihasilkan  pada  kondisi  optimum kemudian  dikeringkan  menggunakan  teknik freeze drying agar  menghasilkan  bubuk  konsentrat  protein kering.  Pemilihan  metode freeze  drying dalam  pro- ses  pengeringan  bertujuan  untuk  menghindari  pro- tein  dari  kerusakan  akibat  suhu  tinggi  (Coscueta et al . , 2019; Du et al . , 2017).
Berat  bubuk  konsentrat  protein  kacang  merah yang  dihasilkan  dari  40  g  tepung  kacang  merah adalah 5,95 g, sehingga rendemen berat konsentrat protein  kacang  merah  ada-lah  14,88%.  Isolasi protein tepung kacang hijau menghasilkan rendemen  berat  sebesar  16,75%  dengan  berat bubuk  konsentrat  protein  kacang  hijau  yang dihasilkan sebesar 6,70 g.

## Kadar  air  konsentrat  protein  kacang  merah  dan kacang hijau terhidrolisis enzimatis
Proses  hidrolisis  enzimatis  pada  konsentrat protein  kacang merah  dan  kacang  hijau mengguna- kan  enzim  bromelin  yang  memiliki  aktivitas  enzim yaitu  1260  GDU  ( Gelation  Digestion  Unit )  atau  se- tara dengan 0,455 U/g. Berdasarkan Tabel 6, bubuk konsentrat  protein  kacang  merah  dan  kacang  hijau yang  terhidrolisis  enzimatis  memiliki  kadar  air berturut-turut 12,48±0,75 dan 11,17±0,17%. Mikroba dapat tumbuh pada bahan pangan dengan kadar air minimum sebesar 14-15%.

## Tabel 4.   Solusi formula optimum dan desirability
Sampel No Faktor A Suhu Ekstraksi (°C) Faktor B pH Ekstraksi Faktor C Lama Ekstraksi (menit) Respon Kadar Protein per Total Solid (%) Desirability Endapan protein kacang merah 1 30 8,63 30,1 95,3925 1,000 2 30 8,52 32,8 94,6425 1,000 3 30 8,52 33,3 94,2824 1,000 4 30 8,60 31,4 94,6581 1,000 5 30 8,80 30,0 93,2929 1,000 6 30 8,76 30,6 93,2676 1,000 7 30 8,56 32,9 94,0185 1,000 8 30 8,57 31,4 95,0558 1,000 9 30 8,60 30,1 95,9995 1,000 10 30 8,75 30,1 93,8866 1,000 Endapan protein kacang hijau 1 30 8,83 30,0 91,1737 0,961 2 30 8,83 30,0 91,1735 0,961 3 30 8,83 30,0 91,1735 0,961 4 30 8,82 30,0 91,1731 0,961 5 30 8,84 30,0 91,1729 0,961 6 30 8,81 30,0 91,1705 0,961 7 30 8,81 30,0 91,1694 0,961 8 30 8,85 30,0 91,1680 0,961 9 30 8,89 30,0 91,1379 0,960 10 30 8,81 30,1 91,1316 0,959 Tabel 5. Validasi solusi formula optimum Sampel Faktor A Suhu Ekstraksi (°C) Faktor B pH Ekstraksi Faktor C Lama Ekstraksi (menit) Respon Kadar Protein per Total Solid (%) Validitas Nilai Aktual Nilai Prediksi Endapan protein kacang merah 30 8,60 30,1 86,88±1,38 95,39 0,91 Endapan protein kacang hijau 30 8,83 30,0 88,27±1,08 91,17 0,97 Tabel 6.  Data  kadar  air  dan  kadar  protein  bubuk konsentrat protein terhidrolisis enzimatis Sampel Kadar Air (%) Kadar Protein (%) Bubuk konsentrat protein kacang merah terhidrolisis enzimatis 12,48±0,75 78,43±0,67 Bubuk konsentrat protein kacang hijau terhidrolisis enzimatis 11,17±0,17 88,77±0,20
Konsentrat  protein  kacang  merah  dan  kacang hijau  mengandung  protein  amfifatik  yaitu  adanya gugus  asam  amino  hidrofilik  (dapat  berikatan  de- ngan  air)  pada  bagian  luar  dan  gugus  hidrofobik pada  bagian  dalam  (Pangastuti et  al., 2013).  Kan- dungan  air  konsentrat  protein  dipengaruhi  oleh asam  amino  yang  bersifat polar  seperti  asam  gluta- mat,  asam  aspartat,  lisin,  arginin  dan  histidin  yang mampu  mengikat  air  (Pratiwi et  al., 2018).  Nilai activity  water (a w )  juga  memengaruhi  daya  tahan bahan  pangan  terhadap  serangan  mikroba.  a w ada- lah jumlah air bebas  yang  digunakan mikroba untuk melakukan  pertumbuhannya.  Semakin  kecil  nilai kadar  air  produk,  maka  semakin  kecil  pula  nilai a w
produk  tersebut  (Rizqiati et  al., 2020).  Berdasarkan hasil  tersebut  maka  bubuk  konsentrat  protein  ka- cang  merah  dan  kacang  hijau  dengan  modifikasi hidrolisis  enzimatis  memiliki  karakteristik  kadar  air yang baik.
Kadar  protein  konsentrat  protein  kacang  merah dan kacang hijau terhidrolisis enzimatis
Berdasarkan Tabel 6,  bubuk konsentrat protein kacang  merah  dan  kacang  hijau  terhidrolisis  enzi- matik  memiliki  kadar  protein  berturut-turut  yaitu 78,43±0,67  dan  88,77±0,20%.  Beberapa  penelitian lain  menghasilkan  bubuk  konsentrat  protein  kacang merah  terhidrolisis  enzimatis  dengan  kandungan protein sebesar 73,34% (Liu et al . , 2011) dan 80,8% (Al-Ruwaih et  al., 2018).  Kadar  protein  bubuk  kon- sentrat protein kacang merah dan kacang hijau lebih tinggi  dibandingkan  dengan  hasil  penelitian  lainnya. Hal  ini  bisa  disebabkan  karena  lama  hidrolisis  yang lebih pendek (60 menit) dibandingkan dengan pene- litian  lainnya  (3,5-4  jam).  Semakin  lama  protein  be- reaksi  dengan  asam  atau  basa  kemungkinan  besar ikatan  peptida  terhidrolisis  sehingga  struktur  primer protein terurai (Lafarga et al. , 2018).
4,36 4,45 19,97 18,96 0 5 10 15 20 25 a b c d % D ay a C ern a Prote in
Kandungan protein pada bubuk konsentrat pro- tein  kacang  merah  dan  kacang  hijau  terhidrolisis enzimatis  dapat  dimanfaatkan  untuk  memperbaiki kualitas  produk  pangan  atau  sebagai ingredient fungsional.  Jumlah  asam  amino  hidrofilik  dan  hidro- fobik  mengendalikan  sifat-sifat  kelarutan,  potensial pengikatan  air,  dan  sifat-sifat  permukaan  (Houde et al., 2018).  Perlakuan  hidrolisis  enzimatis  dapat  me- ningkatkan kapasitas pengemulsian protein, mening- katkan kelarutan protein, dan menurunkan kapasitas penyerapan air dan minyak (Kanetro, 2017).
Daya  cerna  protein  konsentrat  protein  kacang merah dan kacang hijau terhidrolisis enzimatis
Berdasarkan  Gambar  3,  bubuk  konsentrat  pro- tein  kacang  merah  dan  kacang  hijau  memiliki  daya cerna  protein  metode in  vitro yaitu  masing-masing 4,36±0,08  dan  4,45±0,20%.  Pengujian  daya  cerna protein  juga  dilakukan  pada  bubuk  konsentrat  pro- tein  kacang  merah  dan  kacang  hijau  terhidrolisis enzimatis  yang  menghasilkan  nilai  daya  cerna  pro- tein  jauh  lebih  tinggi  yaitu  masing-masing  19,97± 0,37 dan 18,96±0,14%.
Keterangan:  a= Bubuk konsentrat protein kacang merah, b=  Bubuk  konsentrat  protein  kacang  hijau,  c=  Bubuk konsentrat  protein  kacang  merah  terhidrolisis  enzima- tik,  dan  d=  Bubuk  konsentrat  protein  kacang  hijau terhidrolisis enzimatis
Gambar 3.  Daya cerna protein
Terjadi  peningkatan  daya  cerna  protein  pada konsentrat  protein  kacang  merah  dan  kacang  hijau terhidrolisis  enzimatis.  Hal  ini  mungkin  disebabkan karena  sebagian  besar  protein  konsentrat  tersebut sudah  dihidrolisis  oleh  enzim  bromelin  pada  proses hidrolisis  enzimatis.  Struktur  protein  dari  konsentrat protein  kacang merah  dan  kacang  hijau  terhidrolisis
enzimatis diduga sudah terurai menjadi oligopeptida, tripeptida,  dipeptida,  atau  asam  amino  (Cai et  al . , 2014).  Perlakuan  pemanasan  selama  proses  hidro- lisis  juga  dapat  meningkatkan  daya  cerna  protein kacang  (Ren et  al., 2018).  Hal  ini  menyebabkan enzim  tripsin  dan  kimotripsin  bekerja  lebih  cepat pada  bubuk  kosentrat  protein  terhidrolisis  enzimatis sehingga menghasilkan nilai daya cerna yang tinggi.
Daya  cerna  protein  bubuk  konsentrat  protein kacang  merah  dan  kacang  hijau  dapat  ditingkatkan dengan  cara  menghilangkan  lemak  atau  minyak pada bahan baku tepung kacang merah dan kacang hijau. Inhibitor berupa minyak ( fase lipid ) dapat meng- halangi  kontak  protein  dan  enzim  ( fase  aqueous ) yang  menyebabkan  afinitas  substrat  terhadap  sisi katalitik enzim menjadi rendah (Restiani, 2016).  Pe- ningkatan  konsentrasi  dan  aktivitas  enzim  bromelin dapat  dilakukan  untuk  menyempurnakan  proses hidrolisis  enzimatis  pada  bubuk  konsentrat  protein kacang  merah  dan  kacang  hijau  (Kahiro et  al., 2017).  Penggunaan  jenis  enzim  protease  yang  lain selama proses hidrolisis enzimatis juga dapat dicoba untuk  mengetahui  perbedaan  daya  cerna  protein konsentrat  protein  kacang  merah  dan  kacang  hijau. Beberapa  enzim  lain  yang  dapat  digunakan  adalah alcalase , flavourzyme ,  pepsin,  pankreatin,  kimotrip- sin, papain, tripsin, dan thermolisin (Luna-Vital et al ., 2014).
Peptida bioaktif memiliki peranan penting seba- gai bahan pangan fungsional diantaranya adalah se- bagai  antihipertensi,  antioksidan,  antimikroba,  anti- trombotik,  dan  lain  sebagainya  (Tamam et  al., 2018).  Budseekoad et  al .  (2018)  telah  menghidro- lisis  protein  kacang  hijau  dan  menghasilkan  oligo- peptida  dengan  sifat calcium and iron-binding yang tersusun atas sekuen asam amino Leu - Leu - Leu - Gly - Ile , Ala - Ile - Val - Ile - Leu , dan His - Ala - Asp - Ala - Asp . Oli- gopeptida  tersebut  mengandung  asam  amino  esen- sial dan memiliki sifat pengikat kalsium dan besi se- bagai penunjang pertumbuhan dan jaringan tubuh.
Pangan  tinggi  protein  yang  mengandung  ba- nyak asam amino esensial dibutuhkan untuk proses pertumbuhan  anak-anak.  Pertumbuhan  pada  anak- anak  tergantung  pada  lempeng  pertumbuhan  chon- dral  (Baron et  al., 2015).  Pertumbuhan  tulang  dan lempeng  chondral  diatur  oleh  mTORC1  dan  kese- diaan asam amino seperti leusin dan lisin (Efeyan et al. ,  2015).  Apabila  mTORC1  kekurangan  asam amino  maka  dapat  menekan  untuk  melakukan  sin- tesis protein dan lipid (Laplante dan Sabatini, 2013). Anak  yang  kekurangan  asupan  asam  amino  esen- sial  dapat  memiliki  risiko  tinggi  menjadi  anak  stun- ting.  Berdasarkan  hal  tersebut,  konsentrat  protein kacang  merah  dan  kacang  hijau  terhidrolisis  enzi- matik dapat direkomendasikan sebagai sumber pro- tein dan asam amino esensial yang dibutuhkan pen- derita stunting.

## KESIMPULAN
Kondisi  optimum  proses  ekstraksi  protein  ka- cang merah yaitu pada suhu 30°C dan pH 8,60 sela- ma  30,1  menit  yang  memiliki  kadar  protein  86,88± 1,38%  dengan  nilai  validitas  0,91.  Kondisi  optimum proses  ekstraksi  protein  kacang  hijau  yaitu  pada suhu  30°C  dan  pH  8,83  selama  30  menit  yang  me- miliki  kadar  protein  88,27±1,08%  dengan  nilai  vali- ditas  0,97.  Proses  modifikasi  hidrolisis  enzimatis menggunakan  enzim  bromelin  mampu  meningkat- kan  daya  cerna  protein  bubuk  konsentrat  protein kacang merah  dan  kacang  hijau  sebesar  15,61  dan 14,51%.

## DAFTAR PUSTAKA
Al-Ruwaih  N,  Ahmed  J,  Mulla  MF,  Arfat  YA.  2018. High-pressure assisted enzymatic proteolysis of kidney  beans  protein  isolates  and  characteri- zation  of  hyrolysates  by  functional,  structural, rheological,  and  antioxidant  properties.  LWT- Food Sci Technol 100: 231-236. DOI: 10.1016/j. lwt.2018.10.074.
Almatsier  S.  2013.  Prinsip  Dasar  Ilmu  Gizi.  77-104. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Andoyo  R ,  G y    c’h  F,  B      A,  F         M. 2015.  Spatial  arrangement  of  casein  micelles and whey protein aggregate in acid gels: Insight on  mechanisms.  Food  Hydrocoll  51:  118-128. DOI: 10.1016/j.foodhyd.2015.04.031.
A   y   R,  G y    c’h  F,  C   y  C,  F         M-H. 2014.  Model  mixtures  evidence  the  respective roles  of  whey  protein  particles  and  casein  mi- celles  during  acid  gelation.  Food  Hydrocoll  37: 203-212. DOI: 10.1016/j.foodhyd.2013.10.019.
Anihouvi  V,  Saalia  F,  Sakyi-Dawson  E,  Ayernor  G, Hounhouigan  J.  2011.  Response  surface  me- thodology  for  optimizing  the  fermentation  con- ditions  during  the  processing  of  cassava  fish ( Pseudoolithus sp) into Lanhouin. Int J Eng Sci Technol 3: 7085-7095.
[AOAC]  Association  of  Official  Analytical  Chemists. 1990.  Official  Methods  of  Analysis  (Volume  1). AOAC, Arlington, Virginia.
Apriliyanti  MW,  Suryanegara  MA,  Wahyono  A, Djamila  S.  2020.  Kondisi  optimum  perlakuan awal dan pengeringan kulit buah naga kering. J Teknol  Industri  Pangan  31:  155-163.  DOI:  10. 6066/jtip.2020.31.2.155.
Baron  J,  Sävendahl  L, de  Luca  F,  Dauber  A,  Phillip M,  Wit  JM,  Nilsson  O.  2015.  Short  and  tall stature:  A  new  paradigm  emerges.  Nat  Rev Endocrinol  11:  735-746.  DOI:  10.1038/nrendo. 2015.165.
Braimah  MN,  Anozie  AN,  Odejobi  OJ.  2016. Utilization  of  response  surface  methodology (RSM) in the optimization of crude oil refinery. J Multidiscip Eng Sci Technol 3: 4361-4369.
Budseekoad  S,  Yupanqui  CT,  Sirinupong  N,  Alashi AM,  Aluko  RE,  Youravong  W.  2018.  Structural and  functional  characterization  of  calcium  and iron-binding  peptides  from  mung  bean  protein hydrolysate.  J  Funct  Foods  49:  333-341.  DOI: 10.1016/j.jff.2018.07.041.
Cai  M-Y,  Gu  R-Z,  Li  C-Y,  Ma  Y,  Dong  Z,  Liu  W-Y, Jin  Z-T,  Lu  J,  Yi  W-X.  2012.  Pilot-scale  pro- duction  of  soybean  oligopeptides  and  antioxi- dant and antihypertensive effects in vitro and in vivo .  J  Food  Sci  Technol  51:  1866-1874.  DOI: 10.1007/s13197-012-0701-4.
Coscueta  ER,  Campos  DA,  Osório  H,  Nerli  BB,
Pintado M. 2019.  Enzymatic soy  protein  hydro- lysis:  A  tool  for  biofunctional  food  ingredient production.  Food  Chem  X  1:  100006.  DOI: 10.1016/j.fochx.2019.100006.
Du  M,  Xie  J,  Gong  B,  Xu  X,  Tang  W,  Li  X,  Li,  C. 2017.  Extraction,  physicochemical  characteris- tics and functional properties of mung bean pro- tein.  Food  Hydrocoll  76:  131-140.  DOI:  10.101 6/j.foodhyd.2017.01.003.
Efeyan  A,  Comb  WC,  Sabatini  DM.  2015.  Nutrient sensing  mechanisms  and  pathways.  Nature 517: 302-310. DOI: 10.1038/nature14190.
Ernawati  F,  Prihatini  M,  Yuriestia  A.  2016.  Gam- baran  konsumsi  protein  nabati  dan  hewani pada  anak  balita  stunting  dan  gizi  kurang  di Indonesia. Penelitian Gizi dan Makanan 39: 95- 102.
Gunarti  DR,  Rahmi  H,  Sadikin  M.  2013.  Isolation and purification of thiamine binding protein from mung  bean.  Hayati-J  Biosci  20:  1-6.  DOI:  10.4 308/hjb.20.1.1.
Hatti-Kaul  R,  Mattiasson  B.  2011.  Isolation  and Purification  of  Proteins.  In  Handbook  of Molecular  and  Cellular  Methods  in  Biology  and Medicine,  Third  Edition.  Lund  University  Lund, Swedia.
Houde  M,  Khodaei  N,  Benkerroum  N,  Karboune  S. 2018.  Barley  protein  concentrates:  Extraction, structural and functional properties. Food Chem 254:  367-376.  DOI:  10.1016/j.foodchem.2018. 01.156.
Kahiro SK, Kagira JM, Maina N, Karanja SM, Njonge FN.  2017.  Enzymatic  activity  of  bromelain  from crude  extracts  of  crown,  peels  and  stem  of pineapples from different agro-ecological zones of  thika  region,  Kenya.  Asian  J  Biotechnol Bioresour Technol 1: 1-6. DOI: 10.9734/AJB2T/ 2017/34314.
Kanetro  B.  2017.  Teknologi  Pengolahan  dan Pangan  Fungsional  Kacang-Kacangan.  71-76 Palantaxia, Yogyakarta.
Kusumah  SH,  Andoyo  R,  Rialita  T.  2020a.  Isolation and  characterization  of  red  bean  and  green bean  protein  using  the  extraction  method  and isoelectric  pH.  SciMed  J  2:  77-85.  DOI:  10. 28991/SciMedJ-2020-0202-5.
Kusumah  SH,  Andoyo,  R,  Rialita  T.  2020b.  Protein isolation  techniques  of  beans  using  different methods:  A  review.  IOP  Conference  Series: Earth  and  Environmental  Science  443,  Interna- tional  Conference  on  Food  and  Bio-Industry 2019,  29-30  July  2019,  Bandung,  Indonesia. DOI: 10.1088/1755-1315/443/1/012053.
Lafarga  T,  Álvarez  C,  Bobo  G,  Aguiló-Aguayo  I. 2018.  Characterization  of  functional  properties of  proteins  from  ganxet  beans  ( Phaseolus  vul- garis L.  var. Ganxet )  isolated  using  an  ultra- sound-assisted  methodology.  LWT-Food  Sci Technol  98:  106-112.  DOI:  10.1016/j.lwt.2018. 08.033.
Laplante  M,  Sabatini  DM.  2012.  mTOR  signaling  in growth control  and  disease.  Cell  149:  274-293. DOI: 10.1016/j.cell.2012.03.017.
Liu Q, Jiang L, Li Y, Wang S, Wang M. 2011. Study on  aqueous  enzymatic  extraction  of  red  bean protein.  Procedia  Eng  15:  5035-5045.  DOI: 10.1016/j.proeng.2011.08.936.
Luna-Vital  DA,  Mojica  L,  de  Mejia  EG,  Mendoza  S, Loarca-Pina  G.  2014.  Biological  potential  of protein  hydrolysates  and  peptides  from  com- mon  bean  ( Phaseolus  vulgaris L.):  A  review. Food Res Int 76: 39-50. DOI: 10.1016/j.foodres. 2014.11.024.
Maula  A,  Faridah  DN,  Muhandri  T.  2019.  Optimasi proses  mi  jagung  varietas  lokal  dengan  tekno- logi ekstrusi. J Teknol Industri Pangan 30: 110- 118. DOI: 10.6066/jtip.2019.30.2.110.
M       M,  G y    ch’h  F,  F         M-H.  2011. How  to  tailor  heat-induced  whey  protein/k- casein  complexes  as  a  means  to  investigated the  acid  gelation  of  milk-a  review.  Dairy  Sci Technol 91: 97-126. DOI: 10.1007/s13594-011- 0013-x.
Muhandri  T,  Subarna,  Koswara  S,  Nurtama  B, Ariefianto  DI,  Fatmala  D.  2017.  Optimasi  pem- buatan sohun ubi jalar menggunakan ekstruder pemasak-pencetak.  J  Teknol  Industri  Pangan 28: 36-45. DOI: 10.6066/jtip.2017.28.1.36.
Palupi  NS,  Sitorus  SR,  Kusnandar  F.  2015. Perubahan  alergenitas  protein  kacang  kedelai dan  kacang  bogor  akibat  pengolahan  dengan panas.  J  Teknol  Industri  Pangan  26:  222-231. DOI: 10.6066/jtip.2015.26.2.222.
Pangastuti  HA,  Affandi  DR,  Ishartani  D.  2013. Karakteristik sifat fisik dan kimia tepung kacang merah  ( Phaseolus  vulgaris L.)  dengan  bebe- rapa  perlakuan  pendahuluan.  J  Teknosains Pangan 2: 20-29.
Pratiwi  H,  Yusasrini  NLA,  Putra  INK.  2018.  Penga- ruh  pH  ekstraksi  terhadap  rendemen,  sifat fisiko-kimia  dan  fungsional  konsentrat  protein kacang guide. J ITEPA 7: 1-11. DOI: 10.24843/ itepa.2018.v07.i01.p01.
Ren C, Xiong W, Peng D,  He  Y, Zhou P, Li J, Li B. 2018.  Effect  of  thermal  sterilization  on  soy protein  isolate/polyphenol  complexes:  Aspects of structure, in  vitro digestibility and antioxidant activity.  Food  Res  Int  112:  284-290.  DOI:  10. 1016/j.foodres.2018.06.034.
Restiani R. 2016. Hidrolisis secara enzimatis protein bungkil biji  nyamplung ( Calophyllum  inophyllum ) menggunakan  bromelain.  Biota  1:  103-110. DOI: 10.24002/biota.v1i3.1226.
Rizqiati  H,  Nurwantoro,  Febrisiantosa  A,  Shauma CA, Khasanah R. 2020. Pengaruh isolat protein kedelai  terhadap  karakteristik  fisik  dan  kimia kefir  bubuk.  J  Pangan  Argoindustri  8:  111-121. DOI: 10.21776/ub.jpa.2020.008.03.1
Salgin S, Salgin U, Bahadir S. 2012. Zeta potentials and  isoelectric  points  of  biomolecules:  The effect  of  ion  types  and  ionic  strengths.  Int  J Electrochem Sci 7: 12404-12414.
Saunders RM, Connor MA, Booth AN. 1973. Measu- rement  of  digestibility  of  alfalfa  protein  concen- trates  by in  vivo and in  vitro Methods.  J  Nutr 130: 530-535. DOI: 10.1093/jn/103.4.530.
Semba  RD,  Shardell  M,  Ashour  FAS,  Moaddel  R, Trehan  I,  Maleta  KM,  Ordiz  MI,  Kraemer  K, Khadeer  MA,  Ferrucci  L,  Manary  MJ.  2016. Child stunting is  associated  with low circulating essential  amino  acids.  EBioMed  6:  246-252. DOI: 10.1016/j.ebiom.2016.02.030.
Tamam  B,  Syah  D,  Lioe  HN,  Suhartono  MT, Kusuma  WA.  2018.  Beberapa  penciri  berbasis sekuens  untuk  mengenali  sifat  fungsional  pep- tida  bioaktif:  Studi  eksplorasi.  J  Teknol  Industri Pangan 29: 1-9. DOI: 10.6066/jtip.2018.29.1.1.
Wang  M,  Jiang  L,  Li  Y,  Wang  S,  Sui  X.  2011. Optimization  of  extraction  process  of  protein isolate  from  mung  bean.  Procedia  Eng  15: 5250-5258. DOI: 10.1016/j.proeng.2011.08.973.
Wang Q, Shi A, Liu H, Liu L, Zhang Y, Li N, Gong K, Yu  M,  Zheng  L.  2016.  Chapter  5-Peanut  by- products  utilization  technology.  211-236.  Aca- demic  Press.  DOI:  10.1016/B978-0-12-809595- 9.00005-3.
Yusuf  AA,  Komarulzaman  A,  Alisjahbana  AS,  Anna Z,  Ghina  AA,  Setiawan  A,  Megananda.  2018. Seri  Menyomgsong  SDGs:  Kesiapan  Kabupa- ten/Kota  di  Provinsi  Jawa  Barat.  Unpad  Press, Bandung.
Zhu  Y-S,  Shuai  S,  FitzGerald  R.  2018.  Mung  bean proteins  and  peptides:  Nutritional,  functional and  bioactive  properties.  Food  Nutr  Res  62:  1- 11. DOI: 10.29219/fnr.v62.1290.