PRODUKSI MISELIUM Grifola frondosa (Dickson: Fries) Gray ISOLAT CIANJUR DAN BOBOT EKSTRAKNYA PADA MEDIUM MYPB DENGAN PENAMBAHAN BIJI BUNGA MATAHARI
Helianthus annuus L.

## R IZKI M AULIDA , N UNIEK I NA R ATNANINGTYAS , S LAMET P RIYANTO
Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, Jalan dr. Suparno 63 Purwokerto 53122
A B S T R A C T
Grifola frondosa or maitake, not only can be used as a food ingredient but also as medicine. Other than nutrients, fruit body and mycelium of G. frondosa also contains bioactive compounds, such as terpenoids, alkaloids, flavonoids, and beta glucans extracellular polysaccharides (β - 1,3  glucans  and  β -1,6 glucans). Extracellular polysaccharide harvested more often in mycelium form which is cultivated in liquid medium. Liquid medium which is commonly used for the growth of mycelium is MYPB ( Malt Yeast Peptone Broth ). Mycelium production on MYPB as a medium can be increased by adding additional ingredients, one of which is sunflower ( Helianthus annuus L.). The treatment was the addition of sunflower seeds on medium MYPB. The main parameters were mycelium’s dry weight and the weight of raw extract of G. frondosa . Supporting parameters were final pH medium, extracellular polysaccharides (qualitatively), terpenoid, alkaloid, and flavonoid compounds in the raw extract of G. frondosa . The addition of 250 g/l sunflower seeds in the medium MYPB was the optimum treatment that can produce 1,379 g/100ml of mycelium and 0,299 g/100ml G. frondosa extracts. K EY W ORDS : extracellular polysaccharides, Grifola frondosa , sunflower seeds
Penulis korespondensi: R IZKI M AULIDA | email: rizukimauri@gmail.com

## P E N D A H U L U A N
Jamur maitake atau G. frondosa berasal dari negara Jepang, dan saat ini jamur tersebut telah menyebar di benua  Asia, Amerika Utara, dan Eropa, termasuk di Indonesia (Mizuno dan Zhang, 1995). Pemanfaatan G. frondosa sebagai bahan makanan banyak dilakukan karena kandungan zat gizinya, selain itu dapat dimanfaatkan sebagai obat antikanker, antitumor, menurunkan kolesterol, diabetes, bahkan antiHIV, oleh karena itulah G. frondosa dikenal sebagai medicinal mushroom .  Ohno et al ., (1984) dalam Kim (2003) menyatakan bahan obat antikanker yang disebut polisakarida dapat dihasilkan baik oleh dinding sel miselium dan tubuh buah G. frondosa . Menurut Lee et al ., (2003); Bae et al ., (2005); dan Lin (2010) senyawa bioaktif yang terkandung di dalam G. frondosa adalah polisakarida ekstraseluler fraksi D dan grifolan.
Hsieh et al ., (2006) dan Wasser (2002) menyatakan bahwa polisakarida G. frondosa pada fraksi D diidentifikasi sebagai β - glukan (β -1,6 glukan dan  β -1,3 glukan) merupakan gugus aktif yang berperan sebagai antitumor. Kandungan senyawa polisakarida ekstraseluler dalam G. frondosa sangat tergantung pada pertumbuhan miselium jamur tersebut yang dipengaruhi oleh nutrien di dalam medium pertumbuhan.  Medium pertumbuhan yang digunakan adalah MYPB ( Malt Yeast Peptone Broth) .Produksi miselium G. frondosa dan polisakarida ekstraseluler pada MYPB meskipun sudah tinggi, namun kemungkinan masih dapat ditingkatkan lagi dengan cara menambahkan bahan yang mampu menstimulir pertumbuhan miselium dan polisakarida ekstraseluler. Salah satu bahan yang dapat
ditambahkan ke dalam medium pertumbuhan G. frondosa adalah biji bunga matahari. Biji bunga matahari ( Helianthus annuus L.) digunakan  sebagai bahan tambahan pada medium MYPB ( Malt Yeast Peptone Broth) karena selain kandungan nutriennya cukup tinggi, juga mengandung senyawa yang diduga mampu menstimulir pertumbuhan miselium G. frondosa , salah satu di antaranya adalah asam glutamat.  Menurut Griffin (1994) asam glutamat dapat mempersingkat fase lag sehingga dapat meningkatkan produksi miselium dan polisakarida ekstraseluler.
Berdasarkan uraian latar belakang, maka muncul permasalahan sebagai berikut; apakah penambahan biji bunga matahari pada medium MYPB dapat meningkatkan produksi miselium dan bobot ekstrak G. frondosa , dan pada penambahan biji bunga matahari berapa gram dalam 1 liter medium MYPB, untuk mendapatkan produksi miselium dan bobot ekstrak G. frondosa optimum.  Berdasarkan permasalahan yang muncul maka dilakukan penelitian dengan tujuan untuk mengetahui:
1. Peningkatan produksi miselium dan bobot ekstrak G. frondosa pada medium MYPB yang ditambah biji bunga matahari.
2. Banyaknya biji bunga matahari (gram) yang ditambahkan pada 1 liter medium MYPB untuk mendapatkan produksi miselium dan bobot ekstrak G. frondosa optimum. Herlina (2005), telah melakukan penelitian tentang pengaruh penambahan biji bunga matahari pada medium GMC dengan konsentrasi dan waktu inkubasi berbeda terhadap pertumbuhan miselium dan produksi polisakarida Ganoderma lucidum . Hasil penelitian menunjukkan penambahan biji bunga
matahari sebanyak 60 g/l dengan inkubasi selama 7 hari dapat meningkatkan bobot kering miselium sebesar 60,79%.
Berdasarkan hasil penelitian terdahulu maka hipotesis yang dapat diajukan adalah sebagai berikut: 1. Penambahan biji bunga matahari pada medium MYPB dapat meningkatkan produksi miselium dan bobot ekstrak G. frondosa
2. Produksi miselium dan bobot ekstrak G. frondosa optimum terdapat pada medium MYPB dengan penambahan biji bunga matahari sebanyak 250 g/l.

## M E T O D E
Penelitian dilakukan menggunakan metode eksperimental dengan rancangan acak lengkap (RAL). Adapun perlakuan yang dicobakan adalah:
P0 = penambahan biji bunga matahari 0 g/l P1 = penambahan biji bunga matahari 100 g/l P2 = penambahan biji bunga matahari 150 g/l P3 = penambahan biji bunga matahari 200 g/l P4 = penambahan biji bunga matahari 250 g/l P5 = penambahan biji bunga matahari 300 g/l Perlakuan diulang sebanyak 4 kali, sehingga terdapat 24 unit percobaan.
Parameter utama yang  diamati berupa bobot kering miselium dan bobot  ekstrak kasar G. frondosa . Parameter pendukung berupa pH akhir medium, polisakarida ekstraseluler (secara kualitatif), senyawa terpenoid, alkaloid, dan flavonoid dalam ekstrak kasar G. frondosa . Cara kerja penelitan ini adalah sebagai berikut:
1. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian disterilisasi dengan autoklaf. Sterilisasi jarum ose dengan cara disemprot dengan alkohol 70% kemudian dibakar langsung di atas api bunsen sebelum digunakan (Ratnaningtyas et al., 2012).
2. Pembuatan  medium Potato Dextrose Agar (PDA) (Fardiaz,1993), dengan bahan :
Kentang  .................................................................................. 200 g Agar  ............................................................................................. 15 g Dextrose  .................................................................................... 20 g Akuades add  .................................................................... 1000 ml Medium PDA selanjutnya dituang ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 ml dan ditutup dengan kapas kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C tekanan 2 atm selama 20 menit.
3. Peremajaan Isolat G. frondosa (Lomberh et al. , 2002). Satu ose biakan murni G. frondosa diinokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi medium PDA kemudian ditutup dan dirapatkan dengan wrap . Pekerjaan dilakukan secara aseptis. Cawan petri yang telah diinokulasi dengan isolat G. frondosa diinkubasi pada suhu kamar (±28°C) selama 30 hari hingga miselium memenuhi cawan.
4. Pembuatan Serbuk Biji Bunga Matahari (Curvetto et al., 2002).   Biji  bunga  matahari  dihaluskan  dengan blender.  Setelah dihaluskan, biji bunga matahari kemudian ditimbang sesuai dengan perlakuan (100; 150; 200; 250 dan 300) gram.
5. Pembuatan Medium Malt Yeast Peptone Broth (MYPB) dengan  Penambahan Biji Bunga Matahari (Stamets, 2000 dan Curvetto et al., 2002), dengan bahan:
Malt extract ...............................................................................  20 g Yeast extract ................................................................................ 2 g Peptone .........................................................................................  1 g
Serbuk biji bunga matahari  ...................... sesuai perlakuan Akuades add  ..................................................................... 1000 ml
Volume akhir dibuat hingga mencapai 1000 ml dengan menambahkan akuades, untuk pembuatan medium uji yang lain cara pembuatannya sama hanya berbeda dalam bobot biji bunga matahari yang ditambahkan. Derajat keasaman (pH) medium MYPB yang telah diberi ekstrak biji bunga matahari diukur menggunakan pH meter. Medium MYPB tersebut dituang ke dalam labu Erlenmeyer volume 250 ml sebanyak 100 ml, kemudian ditutup dengan sumbat (kapas dibalut kain kassa) dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C tekanan 2 atm selama 20 menit.
6. Kultivasi Miselium G. frondosa pada Medium MYPB yang  telah Ditambah Biji Bunga Matahari (Lee et al., 2003).  Medium MYPB yang telah dipersiapkan diinokulasi dengan 4 potong koloni isolat G. frondosa. Medium yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 30 hari menggunakan orbital shaker.
7. Pemanenan dan Penimbangan Bobot Kering Miselium G. frondosa (Uyanoglu et al., 2010). Kultur miselium G. frondosa yang telah berumur 30 hari dipanen  dan disaring menggunakan kertas saring Whatman No. 41. Miselium yang telah tersaring ditimbang bobot selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 60°C sampai diperoleh bobot kering yang konstan.
8. Pembuatan  Ekstrak  Kasar  Miselium G. frondosa yang Diperoleh  dari  Masing-masing  Perlakuan  dengan Etanol  (Harborne, 1984).  Ektraksi esktrak kasar miselium G. frondosa dilakukan dengan metode maserasi. Miselium yang telah ditimbang bobot keringnya diblender hingga halus kemudian ditambah etanol 96% dengan perbandingan  miselium berbanding etanol 96% 1:9 dan diinkubasi selama 1x24 jam. Ekstrak yang diperoleh kemudian diuapkan untuk menghilangkan etanolnya, selanjutnya diuji secara kualitatif untuk mengetahui ada tidaknya senyawa polisakarida ekstraseluler.
9. Uji Kualitatif  Polisakarida Ekstraseluler Ekstrak Miselium G. frondosa (Dubois et al., 1956).
Uji kualitatif polisakarida ekstraseluler dilakukan dengan uji warna untuk mengetahui ada tidaknya senyawa tersebut. Ekstrak kental miselium G. frondosa sebanyak 10 mg dilarutkan dengan pereaksi fenol- asam sulfat sebanyak 1 ml. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning hingga orange.
10. Pengukuran pH Akhir Medium (Hadioetomo, 1993). Filtrat medium dipisahkan dari miselium, kemudian diukur pH akhir mediumnya menggunakan pH meter.
11. Deteksi Senyawa Terpenoid, Alkaloid, dan Flavonoid Ekstrak  Miselium G. frondosa Secara Kualitatif (Harborne, 1984) Deteksi senyawa aktif ekstrak miselium G. frondosa dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk mengetahui ada tidaknya senyawa golongan terpenoid, alkaloid, dan flavonoid. Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254, dan fase gerak heksana-etil asetat (4:1) v/v. Bobot kering miselium G. frondosa yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis varian (ANOVA) uji F dengan tingkat kesalahan 5% dan 1% untuk mengetahui kemampuan biji bunga matahari yang ditambahkan pada medium MYPB dalam meningkatan produksi miselium. Hasil uji F  yang  berpengaruh nyata, dilanjutkan dengan uji BNT untuk mengetahui pengaruh antar perlakuan.

## H A S I L D A N P E M B A H A S A N
Hasil pengamatan pertumbuhan miselium G. frondosa pada medium MYPB dengan penambahan biji bunga matahari dapat diketahui bahwa pertumbuhan optimum terdapat pada medium MYPB dengan penambahan biji bunga matahari sebanyak 250g/l dengan bobot kering miselium rata-rata 1,379g/100ml. Hasil terendah bobot kering miselium rata-rata adalah 0,207 g/100ml pada medium MYPB tanpa penambahan biji bunga matahari (kontrol). Berdasarkan hasil analisis ragam dengan uji F dapat diketahui bahwa penambahan biji bunga matahari berbeda sangat nyata (Fhitung>Ftabel 0,01 dan 0,05). Hal tersebut berarti penambahan biji bunga matahari sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan miselium G. frondosa . Berdasarkan pengukuran berat kering rata-rata miselium, penambahan biji bunga matahari mampu meningkatkan pertumbuhan miselium G. frondosa pada medium MYPB. Pertumbuhan miselium G. frondosa pada medium MYPB yang ditambahkan dengan biji bunga matahari lebih cepat dan lebih baik karena biji bunga matahari mengandung nutrien yang dapat dibutuhkan untuk pertumbuhan miselium jamur tersebut. Menurut Besler et al., (2001), nutrien yang terkandung dalam biji bunga matahari per 100 g antara lain protein 22,5 g, lemak 49 g, karbohidrat 12,3 g, vitamin B1 1900 µm, vitamin B2 140 µm, dan berbagai asam amino.
G. frondosa mampu memanfaatkan nutrien yang ada pada medium pertumbuhan karena jamur tersebut dapat menghasilkan enzim pemecah nutrien komplek menjadi sederhana yang siap digunakan. Glukosa dimanfaatkan oleh G. frondosa sebagai
sumber karbon dan energi untuk pembentukan senyawa  polisakarida  ekstraseluler  (β -glukan). Polisakarida yang terbentuk, selanjutnya digunakan sebagai penyusun dinding sel miselium. Asam amino- asam amino yang ada digunakan sebagai sumber N dan asam lemak sebagai sumber energi untuk mensintesis senyawa-senyawa penyusun miselium G. frondosa , oleh karena itu dengan penambahan biji bunga matahari ke dalam medium pertumbuhan memberikan efek meningkatkan pembentukan miselium.
Asam amino dalam medium pertumbuhan selain digunakan sebagai sumber N, juga dapat memperpendek fase adaptasi (fase lag). Menurut Venkatesh dan Prakash (1993), biji bunga matahari yang dipanaskan pada suhu 121°C akan terjadi peningkatan jumlah kandungan beberapa jenis asam amino seperti  asam glutamat, histidin, serin, prolin, glisin, alanin dan leusin. Griffin (1994), menyatakan bahwa asam glutamat memiliki peran dalam meningkatkan pertumbuhan jamur dengan memperpendek durasi fase lag.
Nutrien yang terdapat pada biji bunga matahari selain digunakan untuk meningkatkan produksi miselium juga digunakan untuk membentuk metabolit sekunder pada akhir fase log. Berdasarkan hasil uji kualitatif dengan metode reaksi warna dan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diketahui bahwa pada ekstrak miselium G. frondosa yang didapat dari tiap perlakuan percobaan mengandung metabolit sekunder seperti terpenoid, alkaloid dan flavonoid.
Gambar 1. Histogram bobot kering miselium rata-rata dan bobot ekstrak miselium rata-rata G. frondosa pada medium MYPB dengan penambahan biji bunga matahari
Data hasil analisa BNT menunjukkan bahwa perlakuan P4 (penambahan biji bunga matahari 250 g/l)  dan P5 (penambahan biji bunga matahari 300 g/l) berbeda tidak nyata. Perlakuan P4 dan P5 mampu meningkatan produksi miselium, namun secara statistik besarnya peningkatan tidak berbeda (sama). Hal tersebut kemungkinan diakibatkan salah satunya
oleh konsentrasi biji bunga matahari yang ditambahkan terlalu tinggi, sehingga  komponen penyusun dalam medium pertumbuhan tidak berperan secara maksimal. Postemsky et al., (2006) menyatakan bahwa penambahan biji bunga matahari dengan konsentrasi yang tinggi pada medium cair tidak berpengaruh secara signifikan dalam
0,207 0,616 0,766 0,954 1,379 1,399 0,189 0,255
0,276 0,277 0,299 0,311
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 P0 P1 P2 P3 P4 P5 Bob oot ke ring d an e ks tr ak m is eliu m G. fr ond osa (g/ 10 0m l) Penambahan biji bunga matahari (g/l) Bobot kering miselium Bobot ekstrak
meningkatkan produksi miselium, karena beberapa komponen medium basal berkurang saat pemanasan dan proses sterilisasi ( autoclaving ). Mengingat bahwa bobot kering miselium yang diperoleh dari penelitian ini sangat kecil, maka ekstraksi miselium G. frondosa dilakukan dengan cara akumulatif per ulangan. Hasil yang diperoleh tidak dianalisa menggunakan ANOVA, tetapi dibuat grafik bobot kering rata-rata miselium dan bobot rata-rata ekstraknya  seperti terlihat pada Gambar 1. Berdasarkan histogram (Gambar 1) dapat diketahui bobot  kering miselium rata-rata dan bobot ekstrak rata-rata G. frondosa serta bobot optimum. Bobot ekstrak miselium rata-rata lebih rendah dibandingkan dengan bobot kering miselium rata-rata G. frondosa , karena ekstrak miselium diperoleh dari bobot kering miselium. Bobot ekstrak miselium rata-rata optimum (0,299 g/100ml) diperoleh pada medium MYPB dengan penambahan biji bunga matahari sebanyak 250 g/l. Hal tersebut menunjukkan adanya keterkaitan antara bobot kering miselium dan bobot ekstraknya.

## K E S I M P U L A N
Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat diambil kesimpulan sebagai berikut:
1. Penambahan biji bunga matahari pada medium MYPB dapat meningkatkan produksi miselium dan bobot ekstrak G. frondosa .
2. Produksi miselium dan bobot ekstrak G. frondosa optimum terdapat pada medium MYPB dengan penambahan biji bunga matahari sebanyak 250 g/l yaitu sebesar 1,379 g/100ml dan 0,299 g/100ml.

## D A F T A R R E F E R E N S I
Bae  JT,  Sim  GS,  Lee  DH,  Lee  BC,  Pyo  HB,  Choe  TB,  Yun  JW.  2005. Production of exopolysaccharide from mycelia culture of Grifola frondosa and its inhibitory effect on matrix metalloproteinase-1 expression in uv-irradiated human dermal fibroblast. FEMS Microbiology Letters. 251: 347-354.
Besler M, Hefle SL, Jensen-Jarolim E. 2001. Allergen data collection : sunsflower seed ( Helianthus annuus ). Internet Symposium on Food Allergens. 3(2): 103-114.
Curvetto  N,  González-Matute  R,  Figlas  D,  Delmastro  S.  2002.
Sunflower seed-based medium for growth of Ganoderma spp. Mushroom Biology and Mushroom Products. ISBN 968-878-
105-3 : 205-211. Dubois M, Gilles  KA,  Hamilton  JK,  Rebers  PA,  Smith  F. 1956. Colorimetric method for determinationof sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28(3): 3550-3560.
Fardiaz S. 1993. Fisiologi Fermentasi. PAU Pangan dan Gizi Bogor: IPB.
Griffin DH. 1994. Fungal Physiology 2 nd Edition . New York : Willey- Liss, Inc.
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek : Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Jakarta: Gramedia.
Harborne  JB. 1984. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisi Tumbuhan. Bandung: ITB.
Herlina M. 2005. Pengaruh penambahan biji bunga matahari pada media GMC dengan konsentrasi dan waktu inkubasi berbeda terhadap pertumbuhan muselium dan produksi polisakarida Ganoderma lucidum [skripsi]. Universitas Jenderal Soedirman- Purwokerto.
Lee BC, Bae JT, Pyo HB, Choe TB, Kim SW, Hwang HJ, Yun JW. 2003.
Biological activities of the polysaccharides produced from submerged culture of the edible basidiomycetes Grifola frondosa. Enzyme and Microbial Technology. 32: 6574-6581. Lin  ES.  2010. Production of exopolysaccharides by submerged mycelial culture of Grifola frondosa TFRI1073 and their antioxidant and antiproliferative activities. World Journal Microbiology Biotechnology. 27(3): 555-561.
Postemsky  P,  González-Matute  R,  Figlas  D,  Curvetto  N. 2006. Optimizing Grifola sordulenta and Grifola gargal in agar and liquid nutrient media. Micologia Aplicada International.18(1):7- 12.