Jurnal Farmasi, Sains, dan Kesehatan ISSN 2442-9791
Isolasi  dan  Karakterisasi  Enzim  Selulase  dari  Keong  Sawah Pila ampullaceal Menggunakan Substrat Serbuk Gergaji Kayu
Hasty Hamzah *

## Program Studi DIII Farmasi Politeknik Bau-bau, Sulawesi Tenggara 93724

## Abstrak
Enzim selulase adalah enzim yang berperan dalam katalisis reaksi hidrolisis selulosa menjadi glukosa. Enzim ini dapat diisolasi dari  keong  sawah Pila  ampullacea menggunakan  substrat  selulosa  alami  dari  serbuk  gergaji  kayu.Tujuan  penelitian  ini  adalah mengisolasi  dan  menentukan  kondisi  optimum  selulase  dari  keong  sawah.  Penelitian  diawali  dengan  persiapan  substrat  serbuk gergaji  dengan  cara  delignifikasi  menggunakan  NaOH  2%.  Selanjutnya  mengisolasi  enzim  selulase  dari  hepatopankreas  keong sawah  melalui  teknik  destruksi,  homogenisasi  dan  sentrifugasi.  Penelitian  dilanjutkan  untuk  memurnikan  selulase  melalui pengendapan protein selulase menggunakan amonium sulfat (NH 4 ) 2 SO 4 pada berbagai tingkat kejenuhan 10%, 20%, 30%, 40%, 60%,  80%.  Pemurnian  tahap  berikutnya  dilakukan  dengan  cara  dialisis  menggunakan  membran  selofan.  Aktivitas  selulase diperoleh dengan menghitung kadar glukosa sebagai produk hidrolisis dari substrat selulosa (serbuk gergaji) menggunakan metode Nelson-Somogy, sedangkan kadar protein ditentukan dengan metode Lowry dengan menggunakan bovine serum albumin (BSA) sebagai  standar.  Enzim  selulase  dari  keong  sawah  mencapai  aktivitas  maksimum  pada  kondisi  optimum:  konsentrasi  substrat (serbuk gergaji) 2% (b/v), pH 5,8, suhu 40 ᵒ C, konsentrasi enzim 7,2 mg/mL.
Kata Kunci: Selulase, keong sawah, Pila ampullacea , serbuk gergaji, isolasi, karakterisasi

## 1. Pendahuluan
Kemajuan bioteknologi telah meningkatkan pendayagunaan  enzim  selulase,  baik  dari  diversifikasi pemanfaatannya  maupun  dalam  skala  penggunaannya. Selulase  adalah  kompleks  enzim  yang  menghidrolisis secara  sinergis  selulosa  menjadi  selobiosa  (disakarida), kemudian dihidrolisis lebih lanjut oleh enzim  selobiase menghasilkan glukosa [1]. Selulase memainkan peranan penting dalam proses biodegradasi biomassa lignoselulosa, dimana selulosa dapat dikonversi menjadi glukosa  [2],  dan  jika  difermentasi  lebih  lanjut  akan menghasilkan  etanol,  butanol,  serta  aseton.  Produk fermentasi  tersebut  dapat  dimanfaatkan  sebagai biofuel (bahan bakar renewable ) , untuk mengurangi penggunaan bahan bakar fosil dan mengurangi polusi lingkungan [3]. Enzim  tersebut  juga  telah  digunakan  dalam  bidang produksi  pangan,  tekstil,  asam-asam  organik,  etanol, kertas, penanganan limbah, dan analisis biokimia [4]. Di sisi  lain,  enzim  selulase  memiliki  nilai  ekonomi  yang tinggi  dan  prospek  penjualan  yang  cukup  besar  pada pasar  global  [5].  Besarnya  potensi  enzim  selulase menjadikan  permintaan  terhadap  enzim  ini  meningkat pesat.  Oleh  karena  itu,  para  ilmuwan  terus  melakukan
* Email: hastyhamzah@gmail.com
riset untuk memperoleh sumber selulase baru serta terus melakukan inovasi teknologi enzimatisnya . Berdasarkan peran enzim selulase dalam mengkatalisis reaksi hidrolisis selulosa, maka enzim ini dapat dimanfaatkan untuk menghidrolisis selulosa yang terkandung  dalam  serbuk  gergaji  kayu  ( saw  dust ). Serbuk  gergaji  sebagai  hasil  industri  pengolahan  kayu merupakan limbah lignoselulosa yang mengandung 42- 45%  selulosa  dan  27-30%  hemiselulosa  [6].  Tingginya kadar  selulosa  pada  serbuk  gergaji  dapat  dimanfaatkan sebagai  salah  satu  sumber  selulosa  alamiah.  Serbuk gergaji  ini  sangat  berpotensi  maksimal  untuk  produksi selulase secara komersial bagi semua organsime [7, 8]. Enzim selulase sekaligus berperan sebagai biokonvertor limbah selulosa (khususnya serbuk gergaji) yang cukup melimpah untuk mengatasi masalah lingkungan [9].
Enzim selulase dapat disolasi dari mikroorganisme, hewan,  tumbuhan.  Telah  banyak  dilaporkan  bahwa selulase dapat diisolasi dari hewan tingkat rendah seperti moluska,  antara  lain  keong Mudalia  dilatata [10], (Farrisdkk.,  1994),  keong  mas Pomacea  canaliculata [11],  bekicot Achatina  fulica [12,  13],  siput  air  tawar
17 |
Hamzah: Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Keong Sawah Pila ampullaceal
Menggunakan Substrat Serbuk Gergaji Kayu
Ampullaria  crossean [14],  dan  keong  afrika Archatina marginata [15].
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi selulase dari  salah  satu  jenis  keong  lain  yakni  keong  sawah. Genus Pila merupakan  keong  pemakan  tumbuhan utamanya berupa daun tumbuhan air yang mengandung selulosa  dan  dimanfaatkan  sebagai  sumber  energinya [16].  Proses  pencernaan  selulosa  dalam  sistem  digestif (pencernaan) hewan invertebrata termasuk keong sawah merepresentasikan  adanya  simbiosis  enzim  selulase dengan  bakteri  atau  mikroorganisme  lain  [17]. Mikroorganisme selulolitik memproduksi enzim selulase (secara intraseluler) untuk mencerna makanan (selulosa) yang  sebagian  besar  disimpan  dalam  hepatopankreas yang  bermuara  ke  saluran  pencernaan.  Hal  tersebut menunjukkan bahwa enzim selulase dapat diisolasi dari keong sawah Pila ampullacea .
Selain  mengisolasi  enzim  selulase,  penelitian  ini juga  bertujuan  untuk  menentukan  kondisi  optimum enzim  selulase  (konsentrasi  substrat,  pH,  suhu  dan konsentrasi  enzim).  Kondisi  optimum  selulase  perlu diketahui  agar  aktivitas  enzim  dapat  dicapai  maksimal dalam  menghidrolisis  substrat  serbuk  gergaji  menjadi glukosa

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1 Persiapan bahan baku dan delignifikasi
Serbuk  gergaji  kayu  dicuci  dengan  air  kemudian dijemur  sampai  kering  selanjutnya  dihaluskan  dengan blender  kemudian  diayak  dengan  ayakan  ukuran  100 mesh. Proses delignifikasi dilakukan dengan mencampur serbuk  gergaji  kayu  100  mesh  dengan  larutan  natrium hidroksida (NaOH) untuk meningkatkan hasil hidrolisis [18]. Campuran serbuk gergaji dan larutan NaOH 2% b/v dimasukkan ke dalam  wadah tertutup, dipanaskan pada suhu  121 ᵒ C  dan  dibiarkan  selama  30  menit    sambil sesekali  diaduk  lalu  disaring  dengan  kain  penyaring. Residu  dicuci  dengan  akuades  hingga  lignin  yang berwarna  coklat  kehitaman  keluar.  Proses  pencucian dihentikan  setelah cairan pencuci sudah jernih dan pH netral,  kemudian  sampel  dikeringkan  dalam  oven  pada suhu  45 ᵒ C    hingga  kering  [10,  19].  Kadar  selulosa sebelum  dan  setelah  delignifikasi  ditentukan  dengan metode Chesson [20].

## 2.2 Isolasi dan Pemurnian Enzim Selulase
Sebanyak  75  g  hepatopankreas  keong  sawah dihomogenisasi  dengan  500  mL  NaCl  1%  (pH  =  7) dingin dalam blender selama 3 menit. Homogenat yang diperoleh  disaring  dengan  kain  steril.  Kemudian  residu dibuang  sedangkan  filtratnya  disentrifugasi  selama  30 menit pada suhu 2-4 o C dengan kecepatan 6000 rotation
per minute (rpm), supernatan yang dihasilkan merupakan enzim  selulase  kasar  (ekstrak  enzim).  Ekstrak  kasar selulase selanjutnya dimurnikan dengan teknik fraksinasi melalui  presipitasi  (pengendapan)  protein  enzim menggunakan  garam  amonium  sulfat  (NH 4 ) 2 SO 4 pada berbagai tingkat kejenuhan 10%, 20%, 30%, 40%, 60% hingga  80%.  Fraksi  dengan  aktivitas  selulase  tertinggi dimurnikan lebih lanjut, dan sisa garam amonium sulfat dihilangkan  melalui  teknik  dialisis  menggunakan membran  selofan  dalam  buffer  sitrat  fosfat.  Selulase murni digunakan untuk karakterisasi selanjutnya.

## 2.3 Uji Aktivitas Enzim dan Penentuan Kadar Protein
Penentuan  aktivitas  enzim  ditentukan  berdasarkan jumlah  glukosa  yang  dihasilkan  selama  60  menit inkubasi  dengan  konsentrasi  substrat  serbuk  kayu  2%, pH  5,6  dan  suhu  37°C.  Jumlah  glukosa  bebas  yang dihasilkan ditentukan dengan menggunakan spektrofotometer  berdasarkan  metode  Nelson-Somogy. Kadar protein ditentukan dengan metode Lowry, dimana larutan diukur dengan spektrofotometer spektronik 20D pada  panjang  gelombang  maksimum,  dan  kadar proteinnya ditentukan berdasarkan kurva standar bovine serum albumin (BSA).

## 2.4 Karakterisasi enzim selulase
Karakterisasi dilakukan untuk menentukan kondisi optimum  enzim  selulase  sehingga  diperoleh  aktivitas maksimum.  Kondisi  optimum  meliputi  penentuan konsentrasi substrat (serbuk gergaji hasil delignifikasi), pH,  suhu  dan  konsentrasi  enzim.  Pada  penentuan konsentrasi  substrat,  substrat  divariasikan  0,5%;  1%; 1,5%; 2%; 2,5% dan 3%, sedangkan suhu bervariasi pada suhu  30 ᵒ C;  35 ᵒ C;40 ᵒ C;45 ᵒ C  dan50 ᵒ C.  Pengaruh  pH terhadap  aktivitas  selulase  menggunakan  buffer  sitrat fosfat  pada  rentan  pH  5,2;  5,4;  5,6;  5,8;  6,0;  6,2  dan penentuan konsentrasi enzim dilakukan pada variasi 1,8 mg/mL; 3,6 mg/mL;5,4 mg/mL;6,0 mg/mL;7,2 mg/mL; 9,0 mg/mL; 10,8 mg/mL.

## 3. Hasil

## 3.1 Penentuan  Kadar  Selulosa  Sebelum  dan  Setelah Delignifikasi
Analisis  kadar  selulosa  menggunakan  metode Chesson  menunjukan  bahwa  dalam  substrat  serbuk gergaji sebelum delignifikasi adalah 16,69% sedangkan setelah  delignifikasi  meningkat  sebesar  26,97%  (Tabel 1).
Hamzah: Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Keong Sawah Pila ampullaceal
Menggunakan Substrat Serbuk Gergaji Kayu
Tabel 1. Penentuan kadar selulosa serbuk gergaji sebelum dan setelah proses delignifikasi Serbuk gergaji Berat sampel (a) (g) Berat residu (c) (g) Berat residu (d) (g) Kadar selulosa (%) A 1,0017 0,7447 0,5788 16,6882 B 1,0014 0,9616 0,6928 26,9769 A: Tidak terlignifikasi B: Terlignifikasi

## 3.2 Isolasi dan pemurnian enzim
Isolasi  enzim  yang  dilakukan  melalui  destruksi, homogenisasi dan sentrifugasi sel hepatopankreas keong sawah  menghasilkan  ekstrak  selulase  ( crude )  dengan aktivitas  rendah.  Oleh  karena  itu  dilakukan  pemurnian dengan  cara  presipitasi  protein  enzim  menggunakan amonium  sulfat.  Untuk  mengetahui  tingkat  kejenuhan optimum protein enzim dilakukan fraksinasi mulai 10%, 20%, 30%, 40%, 60% dan 80%.
Tabel 2. Aktivitas tiap tingkat kejenuhan amonium sulfat
Fraksi (%) [Glukosa] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Kadar Protein (mg/mL) 0-10 0,3073 0,0285 18,5662 0-20 0,1779 0,0165 23,1252 20-30 0,0226 0,0021 6,37595 20-40 0,0449 0,0042 21,3413 40-60 0,0166 0,0015 17,7073 60-80 0,0101 0,0001 15,7251
Tabel  2  menunjukkan  aktivitas  dan  kadar  protein setiap  fraksi. Enzim  selulase pada fraksi 10% memiliki aktivitas  tertinggi  0,0285  U/mL  dan  kadar  protein 18,5662 mg/mL. Enzim pada fraksi ini, dimurnikan lebih lanjut  dengan  cara  dialisis.  Dalam  setiap  tahap pemurnian selulase dilakukan pengukuran kadar protein dan aktivitas spesifik selulase, sehingga dapat diketahui tingkat  kemurnian  pada  setiap  tahap  pemurnian. Perbandingan aktivitas crude selulase, ditunjukkan oleh Tabel 3, dimana selulase hasil pemurnian menggunakan amonium sulfat 10% dan dialisis.
Tabel 3 menunjukkan peningkatan aktivitas enzim dan  penurunan  kadar  protein.  Aktivitas  enzim  ekstrak kasar adalah 0,0069 U/mL dengan kadar protein 49,6861 mg/mL, aktivitas enzim meningkat pada fraksi amonium sulfat  10%  adalah  0,0229  U/mL  dengan  kadar  protein 18,5662  mg/mL,  dan  semakin  meningkat  untuk  enzim hasil  dialisis  dengan  aktivitas  0,0448  U/mL  dan  kadar protein semakin menurun hingga 17,5090 mg/mL.

## 3.3 Konsentrasi substrat optimum
Tabel  4  memperlihatkan  pengaruh  peningkatan konsentrasi substrat  terhadap  aktivitas  enzim.  Aktivitas meningkat sebesar  0,0709 U/mL untuk konsentrasi 0,5% hingga  0,1424  U/mL  pada  konsentrasi  2%.  Pada konsentrasi  2,5%,  aktivitas  enzim  selulase  cenderung tetap  yakni  0,1413  U/mL.  Dapat  dikatakan  bahwa aktivitas  maksimum  dicapai  pada  saat  konsentrasi substrat 2%.

## 3.4 pH Optimum
Nilai  pH optimum enzim selulase ditetapkan pada berbagai  pH  buffer  sitrat  fosfat  yakni  mulai  pH  5,2 hingga  pH  6,2.  Hasil  penelitian  yang  ditunjukan  pada Tabel  5,  terlihat  bahwa  aktivitas  meningkat  dengan meningkatnya pH dari pH 5,2 hingga pH 5,6. Aktivitas selulase  maksimum  pada  pH  5,8  yaitu  sebesar  0,0436 U/mL.  Pada  nilai  pH  yang  lebih  tinggi  6,0  dan  pH  6,2 aktivitas menurun tajam berturut-turut 0,0172 U/mL dan 0,0053 U/mL. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa pH  optimum  enzim  selulase  dari  keong  sawah  pada substrat serbuk gergaji kayu adalah 5,8.
Tabel 4. Aktivitas tiap tingkat kejenuhan amonium sulfat
[Substrat] %, b/v Absorbansi Kadar glukosa (mg/mL) * Aktivitas (U/mL) 0,5 0,404 0,7668 0,0709 1,0 0,612 1,1777 0,1091 1,5 0,676 1,3043 0,1208 2,0 0,794 1,5380 0,1424 2,5 0,788 1,5257 0,1413 3,0 0,754 1,4585 0,1350 Ket: *) Pengenceran 20x
Tabel 3. Aktivitas dan kadar protein setiap tahap pemurnian
Fraksi Enzim Kadar Glukosa (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg) Tingkat Kemurnian Ekstrak kasar 0,0751 0,0069 49,6861 0,00014 1 Fraksinasi 0-10% 0,2470 0,0229 18,5662 0,00123 8,803 Dialisis 0,4842 0,0448 17,5090 0,00256 18,296
19 |
Hamzah: Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Keong Sawah Pila ampullaceal
Menggunakan Substrat Serbuk Gergaji Kayu
Tabel 5. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim pH Absorbansi Kadar glukosa (mg/mL) * Aktivitas (U/mL) 5,2 0,246 0,1136 0,0105 5,4 0,440 0,2095 0,0194 5,6 0,542 0,2599 0,0240 5,8 0,970 0,4713 0,0436 6,0 0,392 0,1858 0,0172 6,2 0,131 0,0568 0,0053 Ket: *) Pengenceran 5x

## 3.5 Suhu Optimum
Tabel 6 menggambarkan bahwa suhu berpengaruh secara  signifikan  terhadap  aktivitas  enzim  selulase. Diketahui  terjadi  peningkatan  aktivitas  enzim  selulase dari suhu dari 30 °C hingga suhu 40 °C. Pada suhu 30 ᵒ C aktivitas  enzim  selulase  adalah  sebesar  0,02  U/mL  dan meningkat  hingga  0,0472  U/mL  pada  suhu  40 ᵒ C  dan kemudian  menurun  hingga  0,0269  U/mL  pada  suhu  50 °C.  Dari  data  tersebut  menunjukan  bahwa  aktivitas optimum enzim dicapai pada suhu 40 ᵒ C dengan aktivitas 0,0472 U/mL (0,0472 µmol glukosa/ mL per menit).
Tabel 5. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim
Suhu (°C) Absorbansi Kadar Glukosa (mg/mL) * Aktivitas (U/mL) 30 0,235 0,2164 0,02 35 0,27 0,2509 0,0232 40 0,532 0,5098 0,0472 45 0,376 0,3557 0,0329 50 0,311 0,2915 0,0269 Ket: *) Pengenceran 5x

## 3.6 Konsentrasi Enzim Optimum
Tabel  7  menunjukan  pengaruh  konsentrasi  enzim terhadap  aktivitas  selulase.  Terlihat  bahwa  aktivitas enzim mulai konsentrasi 1,8 mg/mL masih cukup rendah sebesar  0,0033  U/mL.  Aktivitas  enzim  semakin meningkat pada konsentrasi 3,6 mg/mL dengan aktivitas sebesar  0,0154  U/mL  hingga  0,0608  U/mL  pada konsentrasi 6 mg/mL. Pada kondisi ini konsentrasi enzim makin  tinggi,  sisi  aktif  enzim  makin  banyak  mengikat substrat. Selanjutnya kenaikan konsentrasi enzim sampai 7,2  mg/mL  menyebabkan  aktivitas  enzim  meningkat menjadi  0,0977  U/mL.  Penambahan  enzim  di  atas konsentrasi  tersebut  tidak  merubah  aktivitas  enzim secara  signifikan  walaupun  terjadi  sedikit  penurunan maupun peningkatan aktivitas pada konsentrasi enzim 9 mg/mL  dan  10,8  mg/mL.  Hal  ini  mengindikasikan bahwa  pada  konsentrasi  enzim  7,2  mg/mL  aktivitas mencapai maksimum.
Tabel 7. Aktivitas Enzim terhadap variasi konsentrasi enzim
Konsentrasi (mg/mL) Absorbansi Kadar Glukosa (mg/mL) Aktivitas (U/mL) 1,8 0,088 0,0356 * 0,0033 3,6 0,100 0,1660 ** 0,0154 5,4 0,336 0,6324 ** 0,0586 6,0 0,348 0,6561 ** 0,0608 7,2 0,55 1,0435 ** 0,0977 9,0 0,54 1,0356 ** 0,0959 10,8 0,543 1,0553 ** 0,0966 Ket:   *) Pengenceran 5x
**) Pengenceran 20x

## 4. Pembahasan
Bahan  lignoselulosa  sangat  besar  peranannya sebagai  substrat  enzim  selulase  dalam  biokonversi selulosa  menghasilkan  glukosa.  Serbuk  gergaji  kayu merupakan bahan lignoselulosa yang memiliki kandungan  selulosa  dan  lignin  yang  besar.  Untuk meningkatkan  proses  hidrolisis  secara  enzimatik  maka perlu  dilakukan  perlakuan  awal  yang  disebut  proses delignifikasi  dengan  menggunakan  bantuan  senyawa katalis, salah satu caranya adalah dengan menggunakan katalis  kimia  berupa  senyawa  NaOH  [21,  22]. Berdasarkan Tabel 1, serbuk gergaji yang telah melalui proses  delignifikasi  dengan  NaOH  memiliki  kadar selulosa  yang  lebih  tinggi.  Hal  ini  terjadi  karena banyaknya  lignin  yang  hilang  akibat  terdegradasi  oleh NaOH  yang  menyebabkan  pula  terjadinya  safonifikasi ikatan ester dari residu lignin dan hemiselulosa menjadi lebih  terbuka  sehingga  struktur  selulosa  lebih  mudah untuk dihidrolisis oleh enzim dan menghasilkan glukosa yang maksimal.
Enzim  selulase  merupakan  enzim  ekstraselular yang  diproduksi  di  dalam  sel  mikroba  selulolitik  dan kemudian  dikeluarkan  dari  sel  masuk  ke  dalam  sistem pencernaan  untuk  mencerna  selulosa.  Proses  isolasi selulase dari hepatopankreas melalui tahapan dekstruksi sel  yaitu  pelepasan  enzim  dari  matriks  sel.  Enzim selulase dipisahkan dari matriks sel dengan cara merusak membran  sel  melalui  pengaturan  tekanan  osmosis larutan diluar sel dengan menggunakan larutan NaCl dan homogenisasi dengan menggunakan blender. Selanjutnya  homogenat  disentrifugasi  menghasilkan endapan  dan  supernatan.  Endapan  yang  diperoleh dilarutkan dalam buffer sitrat fosfat pH 5,6. Hasil isolasi ini  merupakan  selulase  kasar  dengan  aktivitas  0,0069 U/mL.
Pemurnian  melalui  fraksinasi  dengan  (NH 4 ) 2 SO 4 dilakukan  untuk  meningkatkan  aktivitas  enzim  pada tingkat kejenuhan 0-10%, 0-20%, 20-30%, 20-40%, 40- 60%, dan 60-80% (Tabel 2). Penambahan garam netral (NH4) 2 SO 4 ke  dalam  larutan  enzim  pada  tingkat
Hamzah: Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Keong Sawah Pila ampullaceal Menggunakan Substrat Serbuk Gergaji Kayu
kejenuhan  yang  optimum  akan  meningkatkan  muatan listrik  di  sekitar  protein  enzim,  yang  akan  menarik mantel air dari  molekul protein. Interaksi  hidrofobik di antara sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi akan  menurunkan  kelarutan  protein,  sehingga  protein enzim  mengendap.  Enzim  selulase  yang  diperoleh  dari hasil  presipitasi  dengan  (NH 4 ) 2 SO 4 10%  masih  belum murni  karena  mengandung  sisa-sisa  garam  (NH 4 ) 2 SO 4 sehingga  perlu  dilakukan  cara  dialisis.  Batas  akhir dialisis  ditandai  dengan  tidak  adanya  endapan  BaSO 4 ketika  larutan  buffer  ditambahkan  garam  BaCl 2 . Lamanya  waktu  dialisis  yang  diperlukan  adalah  9  jam. Setiap  tahap  pemurnian  enzim  selulase  dilakukan pengukuran  kadar  protein  dan  aktivitas  spesifik, sehingga dapat diketahui tingkat kemurnian pada setiap tahap pemurnian.
Tabel  3  menunjukkan  bahwa  pemurnian  dengan (NH 4 ) 2 SO 4 10% menghasilkan aktivitas spesifik selulase 0.00123 U/mg dengan tingkat kemurnian 8,803. Nilai ini meningkat dibandingkan aktivitas spesifik selulase kasar (0,00014  U/mg).  Teknik  dialisis  dapat  memisahkan molekul  yang  berukuran  kecil  (garam  amonium  sulfat) dari molekul yang berukuran besar yakni molekul enzim selulase  melalui  membran  selofan.  Hal  ini  ditandai dengan  meningkatnya  aktivitas  spesifik  selulase  yaitu 0,00256 U/mg dengan tingkat kemurnian 18,296.
Aktivitas  enzim  meningkat  sebesar  0,0709  U/mL untuk  konsentrasi  0,5%  hingga  0,1424  U/mL  untuk konsentrasi  2%  pada  uji  atau  penentuan  konsentrasi substrat (Tabel 4). Aktivitas enzim cenderung tetap pada konsentrasi  2,5%  yakni  0,1413  U/mL.  Hal  ini disebabkan terjadinya kejenuhan dimana sisi aktif enzim selulase  telah  dipenuhi  oleh  substrat.  Tingginya konsentrasi  substrat  tidak  menyebabkan  bertambahnya konsentrasi kompleks enzim substrat, bahkan penambahan  konsentrasi  substrat  lebih  lanjut  justru menghambat kerja enzim karena substrat yang semakin banyak akan berdesakan satu sama lain berikatan dengan sisi  aktif  enzim.  Akibatnya,  stabilitas  kompleks  enzim substrat akan terganggu.
Enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang  dapat  menghasilkan  aktivitas  maksimum  dalam mengkatalisis  suatu  reaksi.  Perubahan  pH  berpengaruh terhadap aktivitas enzim melalui perubahan struktur atau muatan  residu  asam  amino  yang  berfungsi  dalam pengikatan  substrat.  pH  yang  bervariasi  juga  dapat menyebabkan  perubahan  konformasi  enzim.  Hal  ini terjadi karena gugus bermuatan yakni -NH 3 + atau –COO - yang jauh dari daerah terikatnya susbtrat yang mungkin diperlukan untuk mempertahankan struktur tersier akan mengalami  perubahan  muatan  pada  pH  yang  berbeda. Hal  ini  menyebabkan  terganggunya  ikatan  ionik  dan terputusnya  ikatan  enzim  dengan  substrat  ( folding ) sehingga  konformasi  enzim  berubah.  Perubahan  inilah
yang  menyebabkan  aktivitas  enzim  menurun.  pH optimum  selulase  dalam  penelitian  ini  berada  pada kisaran  pH optimum  dari  beberapa  penelitian sebelumnya.  Li et  al (2009)  meneliti  selulase  dari lambung  siput Ampullariacrossean pada  pH  optimum berkisar 5,5 – 6,5 [14].
Perubahan suhu terhadap aktivitas enzim memberikan  pengaruh  signifikan.  Reaksi  enzimatis berlangsung  paling  cepat  pada  suhu  optimum  karena aktivitas  enzim  titik  maksimum. Peningkatan suhu dari 30 ᵒ C  hingga  35 ᵒ C  menyebabkan  aktivitas  enzim meningkat.  Kenaikan  suhu  optimum  pada  suhu  40 ᵒ C menyebabkan  peningkatan  energi  kinetik  sehingga menambah  intensitas  tumbukan  antara  substrat  dengan enzim  dan  produk  yang  terbentuk  lebih  maksimal.  Di atas  suhu  optimum,  enzim  akan  mengalami  denaturasi dan  kehilangan  aktivitas  katalitiknya  (inaktivasi), ditunjukan dengan menurunnya aktivitas pada suhu 45 ᵒ C dan 50 ᵒ C. Proses inaktivasi enzim pada temperatur yang sangat tinggi berlangsung melalui 2 tahap yaitu diawali dengan pembukaan parsial struktur sekunder, tersier, dan kuartener  molekul  enzim  akibat  putusnya  ikatan-ikatan kovalen  maupun  ikatan  hidrofobik  dan  selanjutnya terjadi  perubahan  struktur  primer  enzim  karena  adanya kerusakan asam-asam amino tertentu akibat pemanasan. Suhu  optimum  ini  sesuai  dengan  penelitian  mengenai enzim  selulase  yang  diisolasi  dari  udang Cherax quadrinatus dan  kumbang  merah Tribolium  castaneum [3].  Di  sisi  lain,  penelitian  lainnya  menunjukkan  hasil bahwa  selulase  (Hgcel)  dari Hirondellea  gigas secara efisien  dapat  memproduksi  glukosa  dari  substrat  kayu kering pada suhu 35 ᵒ C [23].
Kecepatan  suatu  reaksi  yang  menggunakan  enzim tergantung  pada  konsentrasi  enzim  tersebut.  Pada konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim. Tetapi setelah mencapai  aktivitas  maksimumnya,  maka  penambahan konsentrasi enzim tidak akan mengubah aktivitas enzim. Terlihat    bahwa  aktivitas  enzim  mulai  konsentrasi  1,8 mg/mL  masih  cukup  rendah  sebesar  0,0033  U/mL. Aktivitas enzim semakin meningkat pada konsentrasi 3,6 mg/mL  dengan  aktivitas  sebesar  0,0154  U/mL  hingga 0,0608  U/mL  pada  konsentrasi  6  mg/mL.  Selanjutnya kenaikan  konsentrasi  enzim  sampai  7,2  mg/mL menyebabkan aktivitas enzim meningkat menjadi 0,0977 U/mL.  Penambahan  enzim  di  atas  konsentrasi  tersebut tidak  merubah  aktivitas  enzim  secara  signifikan walaupun terjadi sedikit penurunan maupun peningkatan aktivitas  pada  konsentrasi  enzim  9  mg/mL  dan  10,8 mg/mL.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  pada konsentrasi  enzim  7,2  mg/mL  aktivitas  mencapai maksimum.  Pada  konsentrasi  enzim  optimum  ini, seluruh  bagian active  site dari  enzim  berikatan  dengan substrat membentuk kompleks enzim substrat.
Menggunakan Substrat Serbuk Gergaji Kayu
Konsentrasi  enzim  optimum  yang  diperoleh  pada peneitian  ini  tidak  jauh  berbeda  dengan  konsentrasi enzim  optimum  pada  penelitian  sebelumnya,  yakni 5,0076 mg/mL [24].

## 5. Kesimpulan
Keong  sawah  memiliki  potensi  menghasilkan enzim  selulase,  melalui  isolasi  hepatopankreas  dengan teknik  destruksi,  homogenisasi  dan  sentrifugasi. Aktivitas enzim selulase yang diperoleh meningkat pada kondisi optimum yakni pada konsentrasi substrat serbuk gergaji  2%  (b/v),  pH  5,8,  suhu  40 ᵒ C,  dan  konsentrasi enzim 7,2 mg/mL.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis  menyampaikan  terimakasih  kepada  Prof. Abd. Rauf Patong dan ibu Dr. Seniwati Dali, MSi yang telah  memberikan  pengarahan  dan  petunjuk  dalam menyelesaikan  jurnal  ilmiah  ini,  serta  kepada  Dirjen DIKTI atas bantuan beasiswa selama penelitian ini.

## Daftar Pustaka
1. Jyotsna KP, Vijayalakhsmi K, Prasanna ND, Shaheen SK. Isolation,  Characterization  of  Cellulase  Producing Lysinibacillus  sphaericus  MTCC  No.  9468  from  Gut  of Eisenia foetida. The Bioscan , 2010, 6 ; 325-327.
2. Barman D, Saud ZA, Habib MR, Islam MF, Hossain K, Yeasmin T. Isolation of Cellulolytic Bacterial Strain from Effective and Efficient Bioconversion of Solid Stete. Life Sci. and Med. Res., 2011, 25 .
3. Rehman  FU.  Isolation  of  Cellulolytic  Activities  from Tribolium  castaneum (Red  Flour  Beetle), African  J.  of Biotech., 2009, 8 ; 6710 - 6715.
4. Peciulyte  D.  Isolation  of  Cellulolytic  Fungi  from  Waste Paper Gradual  Recycling Materials, Ekologia , 2007, 53 ;
11-18.
5. Ain QU, Baig S, Saleem M. Production andCharacterization of Cellulases Of Aspergillus niger by Using Rice Husk and Saw Dust as Substrates. Pak. J. Bot , 2012, 44 ; 377-382.
6. Iranmahboob J, Nadim JF, Monemi S. Optimizing Acid- hydrolysis: a Critical Step for Production of Ethanol from Mixed Wood Chips. Biomass and Bioenergy , 2002, 22(5) ; 401-404
7. Ojumu TV, Solomon BO, Betiku E, Layokun SK, Amigun B.  Cellulase  Production  by Aspergillus  Flavus Linn Isolate  NSPR  101  Fermented  in  Sawdust,  Bagasse  and Corncob. African J. of Biotech. , 2003, 2(6) ; 150-152.
8. Giorgio EM, Fonseca MI, Tejerina MR, Ramos-Hryb AB, Sanabria N, Zapata PD, Villalba LD. Chips and Sawdust Substrates  Aplication  for  Lignocellulolytic  Enzymes Production  by  Solid  State  Fermentation. Int.  Res.  J.  of Biotech. , 2012, 3(7) ; 120–127.
9. Chinedu  NS,    Nwinyi  OC,  Okochi  VI.  Growth  and Cellulase  Activity  of  Wild-Type Aspergillus  Niger
ANL301 in Different Carbon Sources. Canadian J. Pure and Appl. Sci. , 2008, 2(2) ; 357-362.
10. Farris JL, Grudzein SE, Belanger DS, Cherrry J, Cairns Jr. J.  Molluscan  Cellulolytis  Activity  Responses  to  Zinc Exposure  in  Laboratory  and  Field  Stream  Comparisons. Hydrobiologia , 1994, 287 ; 161-178.
11. Siregar SH. Isolasi Enzim Selulase dari Pankreas Keong Mas. Jurnal Photon, 2009, 1(2) .
12. Maisaroh.  Hidrolisis  Selulosa  Bagas  dengan  Enzim Selulase  dari  Bekicot Achatina  fulica untuk  Produksi Etanol  dengan Zymonas  mobilis A3. Tesis .  Surabaya: Institut Teknologi Sepuluh November, 2009.
13. Masfufatun. Hidrolisis Selulosa Carboxy Methil Cellulose dengan Enzim Selulase dari Bekicot Achatina fulica untuk Produksi Etanol dengan Zymonas mobilis Tesis . Surabaya: Institut Teknologi Sepuluh November, 2010.
14. Li  Y.,  Min  Q.,  Ding M.&  Zhao,  F.  (2009). Purification, Characterization and Molecular Cloning of a Novel Endo- β-1,4-glucanase AC-EG65 from the Mollusc
Ampullariacrossean . Comp.  Biochem.  Physiol.  B. Biochem.  Mol.  Biol ., 2009 153(2) ;  149-56.  doi: 10.1016/j.cbpb.2009.02.011.
15. Fagbohunka BS, Agboola FK, Afolayan A.
Characterization of Cellulase from the haemolymph of the giant African snail ( Archactina marginata ). African J. of Biotech., 2012, 11(38) ;  9254-64,  10  May,  2012  DOI: 10.5897/AJB10.2071
16. Koswara W. Penyebaran dan Kelimpahan Beberapa Jenis Keong  Gondang ( Pila spp.)  di  Perairan  Rawa  Pening, Jawa  Tengah. Karya  Ilmiah .  Bogor:  Fakultas  Perikanan Institut Pertanian Bogor, 1985.
17. Watanabe  H,  Tokuda  G.  Review:  Animal  cellulases, CMLS Cell . Mol Life Sci, 2001, 58 ; 1167-78.
18. Gunam IBW, Wartini WM, Anggraeni AMD, Suparyana PM. Delignifikasi Ampas Tebu dengan Larutan Natrium Hidroksida Sebelum Proses Sakarifikasi secara Enzimatis Menggunakan  Enzim  Selulase  Kasar  dari Aspergillus niger FNU 6018. Teknologi Indonesia LIPI , 2011, 34 .
19. Raghavendra  B,  Havannavar  GSG.  Pre-treatment  of Agroresidues  for  Release  of  Maximum  Reducing  Sugar. Karnataka J. Agric. Sci , 2007, 20(4) ;  771-772.
20. Datta R. Acidogenic Fermentation of Lignocellulose-acid yield and Conversion of Components . Biotechnology and Bioengineering, 1981, 23 ; 2167-70.
21. Irfan M. Effect of NaOH and H 2 O 2 on Degradation of Saw Dust. Wulfenia Journal , 2013, 1 .
22. Kim  B,  Gulati  I,  Park  J,  Shin  JS.  Pretreatment  of Cellulosic  Waste  Sawdust  into  Reducing  Sugars  Using Mercerization  and  Etherification. BioResources ,  2012, 7(4) ; 5152-66.
23. Kobayashi  H,  Hatada  Y,  Tsubouchi  T,  Nagahama  T, Takami  H.  The  Hadal  Amphipod Hirondellea  gigas Possessing  a  Unique  Cellulase  for  Digesting  Wooden Debris Buried in the Deepest Seafloor. PLoS One ., 2012, 7(8) . doi: 10.1371/journal.pone.0042727.
24. Maryani  D.  Optimalisasi  Konversi  Selulosa  Menjadi Glukosa pada Limbah serbuk Kayu Agatis Menggunakan Aktivator  Ca 2+ terhdap  Enzim  selulase  pada  Usus  Sapi Skripsi . Makassar: Universitas Hasanuddin, 2006.