## DIAGNOSIS PENYEBAB PENYAKIT BARU GUGUR DAUN KARET
Diagnosis of Causal Agent of New Rubber Leaf Fall Disease (Hevea brasiliensis Muell. Arg)
1*
2 2 Alchemi Putri Juliantika KUSDIANA , Meity Suradji SINAGA , dan Efi Toding TONDOK ( Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
Jalan Kamper, Babakan, Dramaga, Bogor, Jawa Barat 16680
1 Mahasiswa Fitopatologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
2 Staf Pengajar Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jalan Kamper, Babakan, Dramaga, Bogor, Jawa Barat 16680
Diterima: 22 Oktober 2020 / Disetujui : 24 November 2020
*Email: alchemiputri@gmail.com Abstrak
Keywords:  Koch  postulate;  ITS  r-DNA; Pestalotiopsis microspora

## Abstract
One  of  the  causal  of  the  low  rubber production is the presence of plant diseases. Leaf fall disease in rubber plants is the major disease,  after  white  root  disease.  Currently, there  is  an  incidence  of  new  rubber  leaf  fall disease  with  different  symptoms  from  the diseases  previously  reported  in  rubber plantations.  This  disease  is  widespread  in Sumatra, Bangka Belitung, Kalimantan, and Southeast  Asia.  There  are  many  suspicions about  the  causal  agent,  but  there  is  no accurate  diagnosis  of  the  causal  agent. Therefore,  this  research  was  carried  out  to determine  the  causal  agents  of  leaf  fall disease  with  symptoms  of  round  leaf  spots that  can  cause  leaf  fall.  The  diagnosis  was carried out using Koch's postulate by isolating the  pathogen  from  several  rubber  clones, inoculating  the  pathogen  to  healthy  rubber plants,  re-isolating  from  inoculated  plants, and  confirming  pathogenic  species  through m o r p h o l o g i c a l l y   a n d   m o l e c u l a r l y identification  with  the  rDNA-ITS  sequence. Based on the results of Koch's postulates and morphological  and  molecular  identification, the causal agent of leaf fall disease in rubber plants is the fungus Pestalotiopsis microspora (Speg.) G. C. Zhao & N. Li. Furthermore, a new rubber leaf fall disease is called Pestalotiopsis leaf fall disease.
Salah  satu  penyebab  rendahnya produksi  karet  yaitu  adanya  gangguan penyakit  tanaman.  Penyakit  gugur  daun pada  tanaman  karet  merupakan  kendala utama,  setelah  penyakit  jamur  akar  putih. Saat  ini,  terdapat  kejadian  penyakit  gugur daun karet baru dengan gejala yang berbeda d e n g a n   p e n y a k i t   y a n g   s e b e l u m n y a ditemukan di perkebunan karet. Penyakit ini menyebar  di  wilayah  Sumatera,  Bangka Belitung,  Kalimantan,  dan  Asia  Tenggara. Banyak dugaan penyebab penyakit, namun sampai  saat  ini  belum  terdapat  diagnosis yang akurat mengenai patogen gugur daun karet.  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini dilakukan untuk mendeterminasi penyebab penyakit  gugur  daun  baru  dengan  gejala bercak  berbentuk  bulat  dan  dapat mengakibatkan  gugur  daun.  Diagnosis dilakukan  dengan  postulat  Koch  yaitu dengan  cara  isolasi  patogen  dari  beberapa klon karet, inokulasi patogen pada tanaman karet  sehat,  re-isolasi  dari  tanaman  yang diinokulasi  patogen,  serta  konfirmasi spesies  patogen  melalui  identifikasi morfologi  dan  molekuler  dengan  sekuen rDNA-ITS. Berdasarkan hasil postulat Koch serta  identifikasi  secara  morfologi  dan molekuler, penyebab gugur daun baru pada t a n a m a n   k a r e t   y a i t u   c e n d a w a n Pestalotiopsis microspora (Speg.) G. C. Zhao &  N.  Li.  Selanjutnya,  penyakit  gugur  daun karet  yang  baru  disebut  penyakit  gugur daun Pestalotiopsis.
Jurnal Penelitian Karet, 2020, 38 (2) : 165 - 178 Indonesian  J.  Nat. Rubb. Res. 2020, 38 (2) : 165 - 178 Doi : https://doi.org/10.22302/ppk.jpk.v2i38.728
Banyak dugaan jenis patogen gugur daun  ini,  seperti  disebabkan  oleh Fusicoccum sp.  (Febbiyanti et  al., 2018), Colletotrichum spp. (Philip et  al., 2019;
Kata  kunci: Pestalotiopsis  microspora ; postulat Koch; rDNA-ITS
Produksi tanaman karet dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti jenis klon, cara budidaya,  lingkungan,  dan  gangguan  dari berbagai  penyakit.  Penyakit  pada  tanaman karet  terdapat  pada  semua  stadia pertumbuhan karet, seperti tanaman entres, tanaman  pembibitan,  tanaman  belum menghasilkan, dan tanaman menghasilkan. Sebagian  besar  penyakit  penting  pada tanaman  karet  memiliki  gejala  tajuk meranggas,  seperti  penyakit  jamur  akar putih, kanker batang, serta gugur daun.

## PENDAHULUAN
Penyakit  gugur  daun  karet  yang umumnya terdapat di Indonesia disebabkan o l e h   c e n d a w a n C o l l e t o t r i c h u m gloeosporioides (Penz.) Sacc., Oidium heveae B.A.  Steinm.,  dan Corynespora  cassiicola ( B e r k   &   C u r t )   W e i .   G u g u r   d a u n Colletotrichum  pertama  kali  dilaporkan  di Indonesia  pada  tahun  1918.  Gejala  pada daun  muda  adalah  daun  mengeriput, menggulung,  ujung  daun  mati,  dan  gugur. Gejala pada daun tua terdapat bercak kecil berwarna  hitam,  berlubang,  dan  bagian ujung  mati.  Serangan  berat  menyebabkan gugur daun dan tajuk meranggas (Shufen et al., 1999). Gugur daun Oidium pertama kali dilaporkan  di  Indonesia  pada  tahun  1938. Pada  permukaan  daun  terdapat  lapisan putih seperti tepung yang merupakan massa konidia  cendawan.  Daun  yang  terserang terlihat  pucat,  mengering,  dan  serangan b e r a t   m e n g a k i b a t k a n   d a u n   g u g u r ( Suryaningtyas,  2012).  Gugur  daun Corynespora  pertama  kali  dilaporkan  di Indonesia  pada  tahun  1980.  Gejala  pada daun karet terdapat bercak seperti sirip ikan dan  warna  daun  menjadi  kuning  atau cokelat kemudian gugur (Situmorang et al., 2004).
Sejak akhir tahun 2017, ditemukan gejala  penyakit  baru  yang  menyebabkan gugur  daun  di  perkebunan  karet  wilayah
Sumatera dengan keparahan penyakit yang tinggi.  Penyakit  tersebut  memiliki  gejala yang berbeda dengan penyakit gugur daun yang  sebelumnya  telah  dilaporkan. Pengamatan  awal  menunjukkan  gejala berupa  bercak  daun  berbentuk  bulat berwarna  cokelat  muda  dan  cokelat  tua. Pada setiap helai daun terdapat satu bercak atau  lebih.  Gejala  bercak  terdapat  pada daun  berwarna  hijau  sampai  hijau  tua berumur  lebih  dari  1  bulan.  Daun  yang terserang  patogen  dapat  mengalami perubahan  warna  menjadi  kuning  atau oranye.  Patogen  dapat  menyerang  semua jenis  klon  dan  infeksi  berat  dapat menyebabkan  daun  karet  menjadi  gugur lebih  dari  90%  (Febbiyanti  &  Fairuzah, 2020).
Berdasarkan press release Direktorat Jenderal  Perkebunan,  penyakit  ini  telah menyebar  ke  beberapa  wilayah  Indonesia, seperti Bangka Belitung, Kalimantan Barat, Kalimantan  Tengah,  dan  Kalimantan Selatan  dengan  luasan  yang  terserang sebesar 381,9 ribu hektar. Pada tahun yang sama, gejala penyakit ini juga ditemukan di beberapa  sentra  karet  di  Johor,  Malaysia (Zambri et al., 2018). Setelah itu, beberapa negara  penghasil  karet  di  kawasan  Asia Tenggara  seperti  India,  Sri  Lanka,  dan Thailand  juga  melaporkan  gejala  penyakit yang sama.
Adanya  kejadian  penyakit  gugur daun  di  wilayah  Sumatera  tersebut  dapat menurunkan  produksi  lateks  hingga  45% (Febbiyanti  &  Fairuzah,  2020).  Pada umumnya  penurunan  produksi  lateks akibat penyakit gugur daun dapat mencapai 7% sampai 45% tergantung dari keparahan p e n y a k i t   ( P a w i r o s o e m a r d j o ,   2 0 0 4 ) . Penurunan  produksi  tersebut  dapat menurunkan  juga  capaian  produktivitas nasional  serta  pendapatan  petani  dan pelaku usaha karet.

## Kusdiana, Sinaga, dan Tondok
Rodesuchit,  2020),  dan Pestalotiopsis sp. (Zambri et al., 2018; Febbiyanti & Fairuzah, 2020),  namun  sampai  saat  ini  belum  ada diagnosis  yang  tepat  sebagai  penyebab penyakit  yang  ditunjukkan  dengan keberhasilan  postulat  Koch.  Aturan  untuk mengkonfirmasi  bahwa  suatu  organisme merupakan  penyebab  suatu  penyakit dikenal  dengan  postulat  Koch.  Adapun pernyataan  Koch  adalah  patogen  yang diduga  harus  selalu  berasosiasi  pada tanaman yang sakit. Patogen tersebut harus dapat  diisolasi  dan  ditumbuhkan  sebagai biakan  murni  yang  apabila  diinokulasikan ke tanaman sehat menghasilkan gejala dan tanda  penyakit  yang  sama.  Apabila penyebab penyakit dilakukan reisolasi akan menghasilkan  biakan  murni  yang  sama dengan biakan murni awal  (Grimes, 2006). Apabila salah satu dari pernyataan tersebut tidak  ditemukan maka diagnosis dikatakan belum tepat. Selain itu, konfirmasi hasil dari postulat Koch dilakukan analisis molekuler. Diagnosis  penyakit  tanaman  yang  akurat s a n g a t   p e n t i n g   d i l a k u k a n   u n t u k pengelolaan penyakit tanaman yang efisien dan ekonomis. Diagnosis yang tidak akurat dapat  menyebabkan  kegagalan  dalam strategi  pengendalian  penyakit  yang  dapat menyebabkan  kehilangan  hasil  dan kerugian  secara  ekonomi  (Balodi et  al., 2017) .  Oleh  karena  itu,  penelitian  ini dilakukan  untuk  mendeterminasi  patogen baru gugur daun pada tanaman karet.
Isolasi  spora  tunggal  dilakukan menggunakan metode Maharachchikumbura et al. (2012) yang dimodifikasi. Konidiomata cendawan  patogen  direndam  dalam  5  mL aquades  steril  dan  dibiarkan  beberapa menit.  Sebanyak  100  µL  suspensi  konidia dimasukkan  ke  dalam  cawan  petri  berisi media water agar (WA) dan diinkubasi pada suhu 25°C selama 18-24 jam sampai konidia berkecambah.  Apabila  konidia  telah berkecambah, dilakukan pemindahan pada media  PDA  dengan  menggunakan  jarum
Isolasi Spora Tunggal Cendawan Patogen
Isolasi  cendawan  patogen  dari tanaman sakit dilakukan dengan memotong
2 daun  dengan  ukuran  ±  0,5  cm   di  antara bagian jaringan yang sakit dan jaringan yang sehat.  Setelah  itu,  dilakukan  sterilisasi permukaan  dengan  menggunakan  NaOCl 1% selama 30 detik, alkohol 70% selama 30 detik,  dan  dibilas  dengan  menggunakan akuades  steril  sebanyak  3  kali,  kemudian dilanjutkan  dengan  penanaman  jaringan pada  media potato  dextrose  agar (PDA). Cendawan  yang  tumbuh  dibiakkan  dan dimurnikan pada media yang sama sampai diperoleh biakan murni.
Pengambilan Sampel Tanaman Sakit
D i a g n o s i s   g u g u r   d a u n   k a r e t dilakukan  dengan  postulat  Koch  dan konfirmasi  spesies  patogen  dilakukan dengan identifikasi morfologi dan molekuler. Adapun rangkaian kegiatan sebagai berikut:
Sampel tanaman sakit diambil dari 4 klon  karet  di  Kebun  Percobaan  Pusat Penelitian  Karet,  Sumatera  Selatan. Penentuan  sampel  klon  karet  berdasarkan hasil  pengamatan  di  lapangan  yaitu  klon yang resisten (RRIC 100), klon moderat (PB 260), serta klon rentan (BPM 24 dan GT 1). Sampel tanaman yang diambil berupa daun yang memiliki gejala bercak bulat berwarna cokelat muda atau cokelat tua.
Isolasi  Cendawan  Patogen  dari  Tanaman Sakit

## BAHAN METODE
Penelitian  dilaksanakan  dari  bulan September 2019 sampai Juni 2020. Kegiatan isolasi dan identifikasi patogen berdasarkan k a r a k t e r   m o r f o l o g i   d i l a k u k a n   d i L a b o r a t o r i u m   M i k o l o g i   T u m b u h a n , Departemen  Proteksi  Tanaman,  IPB. Kegiatan  ekstraksi  DNA  dan  amplifikasi fragmen DNA dengan teknik PCR dilakukan di  Laboratorium  Fisiologi  Pusat  Penelitian Karet. Kegiatan inokulasi patogen pada bibit karet  dilakukan  di  rumah  kaca  Pusat Penelitian Karet, Sumatera Selatan.

## Diagnosis Penyebab Penyakit Baru Gugur Daun Karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
steril  untuk  mengambil  bagian  agar  yang mengandung konidia. Media PDA yang telah diberi  spora  diinkubasi  pada  suhu  25°C selama 7-10 hari sampai koloni tumbuh.

## Inokulasi  Cendawan  Patogen  pada Tanaman Karet
P e n e l i t i a n   y a n g   d i l a k u k a n menggunakan  rancangan  acak  lengkap (RAL)  dengan  perlakuan  inokulasi  patogen menggunakan  beberapa  jenis  klon  karet yaitu RRIC 100, PB 260, BPM 24, dan GT 1. Sumber  inokulum  yang  digunakan  pada postulat  Koch  berupa  potongan  miselia
2 biakan  murni  ukuran  5  mm .  Setiap  jenis
klon  karet  diinokulasi  dengan  miselium cendawan yang berasal dari klon yang sama. Sebagai  kontrol  dilakukan  inokulasi  media PDA.  Inokulasi  patogen  dilakukan  dengan cara menempelkan potongan biakan miselia pada bagian bawah daun yang sebelumnya telah  dilukai.  Setelah  itu,  miselia  ditutup dengan  kapas  steril  lembap  (Gambar  1). Daun  yang  digunakan  merupakan  daun hijau muda berumur 4 minggu. Pengamatan dilakukan setiap hari sampai gejala bercak muncul.  Pengamatan  yang  dilakukan berupa  insidensi  penyakit  serta  keparahan penyakit  dengan  kriteria  skoring  disajikan pada Tabel 1.
Figure 1.   Stages of inoculation of pathogenic fungi. a) leaf injury, b) penetrating pathogenic mycelium, c) giving moist sterile cotton, and d) observing disease symptoms
Gambar 1. Tahapan inokulasi cendawan patogen. a) pelukaan daun, b) penempelen miselium patogen, c) pemberian kapas steril lembab, dan d) pengamatan gejala penyakit a b c d Skor Score
Deskripsi gejala Description of symptoms
0 Tanaman tidak bergejala
1 Muncul titik bercak tapi tidak berkembang
2 Bercak berdiameter 1 mm sampai 3 mm
3 Bercak berdiameter 3,1 mm sampai 5 mm
4 Bercak berdiameter 5,1 mm sampai 7 mm
5 Bercak berdiameter > 7,1 mm atau daun mulai berubah warna menjadi oranye
6 Daun berubah warna menjadi oranye
7 Daun gugur
Table 1. Scoring of leaf fall disease severity Tabel 1. Skoring keparahan penyakit gugur daun karet

## Kusdiana, Sinaga, dan Tondok
Adapun  rumus  untuk  menghitung insidensi penyakit sebagai berikut:
N =   jumlah tanaman yang diamati V =  jumlah kategori serangan tertinggi Identifikasi Cendawan Patogen n =  jumlah  tanaman  yang  terserang  pada kategori i
n =   jumlah tanaman yang terserang
Data  hasil  perhitungan  keparahan dan  insidensi  penyakit  selanjutnya dianalisis  menggunakan  sidik  ragam  pada taraf  5%.  Apabila  terdapat  pengaruh  nyata dilakukan uji lanjut menggunakan uji jarak b e r g a n d a   D u n c a n   p a d a   t a r a f   5 % menggunakan  program Statistical  Analysis System (SAS) 9.
I d e n t i f i k a s i   M o r f o l o g i   d a n Mikroskopis. Identifikasi cendawan patogen dilakukan  dengan  mengamati  karakter morfologi yang muncul pada sampel bagian tanaman sakit dari lapangan maupun hasil isolasi dan re-isolasi. Identifikasi dilakukan berdasarkan  morfologi  koloni  (laju pertumbuhan,  bentuk  koloni,  dan  warna koloni)  dengan  pengamatan  langsung  dan bantuan  penggaris,  serta  morfologi  tanda patogen  (bentuk  konidia,  ukuran  konidia, jumlah  sel,  dan  jumlah  setula)  dengan menggunakan  mikroskop  compound Olympus  BX41  dan  aplikasi image-pro express .  Identifikasi  dilakukan dengan menggunakan  kunci  identifikasi  menurut Maharachchikumbura et al. (2011).
N =  jumlah tanaman yang diamati
R e - i s o l a s i   c e n d a w a n   y a n g menimbulkan gejala bercak daun dari hasil uji postulat Koch dilakukan dengan metode yang sama seperti isolasi cendawan patogen di  awal  yaitu  dengan  memotong  daun
2 berukuran  ±  0,5  cm   di  antara  bagian jaringan yang sakit dan jaringan yang sehat. Setelah itu, dilakukan sterilisasi permukaan dengan menggunakan NaOCl 1% selama 30 detik,  alkohol  70%  selama  30  detik,  dan dibilas dengan menggunakan akuades steril sebanyak  3  kali,  kemudian  dilanjutkan dengan  penanaman  jaringan  pada  media PDA.  Cendawan  yang  tumbuh  dibiakkan
dan  dimurnikan  pada  medium  yang  sama sampai diperoleh biakan murni.
Identifikasi  Molekuler. Ekstraksi DNA dari isolat cendawan patogen dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada 100 mL medium potato  dextrose  broth (PDB)  dalam tabung  erlenmeyer,  kemudian  digoyang dengan  kecepatan  1.500  rpm  pada  suhu 25°C  selama  7  hari.  Miselia  yang  tumbuh digerus  dan  digunakan  untuk  ekstraksi DNA.  Ekstraksi  DNA  menggunakan prosedur yang dikembangkan oleh Doyle & Doyle  (1990)  berbasis  cetyl  trimethyl ammonium  bromide  (CTAB).  Miselia  hasil penggerusan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan ditambahkan buffer ekstraksi (2%  b/v  CTAB,  100  mM  Tris-HCl  pH  8,  20 mM EDTA pH 8, 1,4 M NaCl), lalu diinkubasi pada  suhu  65°C  selama  10  menit  dengan sesekali  dilakukan  pengocokan,  kemudian diikuti  dengan  menambahkan  fenol: kloroform:  isoamyl  alkohol  dengan perbandingan  volume  25:24:1.  Sampel disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm selama  10  menit.  Supernatan  hasil sentrifugasi  dipindahkan  ke  tabung  yang baru.  DNA  kemudian  diendapkan  dengan menambahkan  1  kali  volume  isopropanol dingin  dan  perlahan  tabung  diputar  lalu diinkubasi pada suhu -20°C selama 1 jam. Setelah itu, dilakukan sentrifugasi kembali
Dimana ( remaks ):
Dimana ( remaks ): v =  kategori kerusakan ke-i
Re-isolasi Cendawan Patogen
Berdasarkan  hasil  dari  penilaian skor  penyakit,  dilakukan  perhitungan keparahan penyakit dengan rumus Towsend dan  Heuberger  (1974) dalam Sinaga  (2006) sebagai berikut:
.....(1)
.....(2)
Diagnosis Penyebab Penyakit Baru Gugur Daun Karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
Pengamatan urutan sekuen fragmen DNA dilakukan dengan sekuensing melalui First  Base  International  Ltd.,  Malaysia. Susunan nukleotida dari setiap isolat yang diperoleh  diidentifikasi  dengan  program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) yaitu  membandingkan  dengan  database yang  terdapat  pada Genbank dalam  situs National Centre for Biotechnology Information (NCBI)  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /blast/Blast.cgi).  Setelah  itu,  hasil sekuensing  di  alignment  dengan  sekuen DNA  cendawan  yang  tersedia  di  GenBank ( Pestalotiopsis  microspora asal  Thailand (KX020561),  Malaysia  (MK801280),  Korea (DQ456865),  Jepang  (GU908473),  Cina (KT965676,  MK333971,  dan  MT322831), serta P.  theae (AY681481), P.  chamaeropis (LC412070), P.  camelliae (NR120188),  dan Corynespora  cassiicola (KP759967)  sebagai out  grup ).  Analisis  filogenetik  dari  sekuen DNA  cendawan  tersebut  dilakukan  dengan
metode neighbour  joining  tree dalam bootstrap  1000  ulangan  menggunakan program Mega X 10.1.
Berdasarkan hasil isolasi daun dari 4 klon  karet  serta  identifikasi  isolat  secara morfologi  dan  mikroskopis  menunjukkan bahwa  cendawan  yang  tumbuh  adalah Pestalotiopsis sp.  Cendawan  tersebut dilakukan  inokulasi  pada  tanaman  karet s t a d i a   d a u n   h i j a u   d e n g a n   m e t o d e p e n e m p e l a n   m i s e l i u m   c e n d a w a n menggunakan  pelukaan.  Metode  tersebut dipilih  karena Pestalotiopsis sp.  dianggap sebagai  patogen  lemah (Maharachchi- kumbura et al., 2011) yang menembus inang melalui  lubang  alami  seperti  stomata, lentisel, dan hidatoda (Agrios, 2005).
Setiap  klon  menunjukkan  respon gejala berupa bercak berbentuk bulat tidak beraturan  berwarna  cokelat  muda  dengan pinggiran bercak berwarna lebih gelap. Pada permukaan  bercak  juga  berkembang aservuli  berwarna  hitam  (Gambar  2a-e). Gejala  bercak  terlihat  pada  3  hari  setelah inokulasi (hsi). Pada klon RRIC 100 dan GT 1 terjadi  perubahan  warna  menjadi  kuning pada  hari  ketiga  setelah  inokulasi  dan
Amplifikasi  DNA  untuk  melihat keragaman sekuen ITS rDNA menggunakan pasangan primer universal cendawan primer ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') dan ITS4  (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'). Komponen dan komposisi bahan PCR terdiri atas  15,3  μL  ddH2O,  2,5  μL  buffer  10x  + Mg2+,  2,5  μL  sucrose  cresol  10x,  0,5  μL dNTP  10  mM,  masing-masing  1  μL  primer forward dan reverse, 0,2 μL enzim Taq DNA polimerase  rekombinan  5  U/μL,  dan  2  μL DNA  sampel,  sehingga  volume  campuran reaksi  menjadi  25  μL.  Program  amplifikasi terdiri atas denaturasi awal (94°C, 90 detik), diikuti  40  siklus  pemanasan  denaturasi (95°C,  35  detik),  anealing  (55°C,  55  detik), dan ekstensi (72°C, 60 detik). Ekstensi akhir dilakukan pada suhu 72°C selama 10 menit (Jasalavich et  al., 2000).  Amplikon  DNA dielektroforesis  pada  gel  agarosa  1%  pada tegangan  55  V  selama  50  menit.  Pita  DNA divisualisasi pada transiluminator UV.
dengan  kecepatan  16.000  rpm  selama  10 menit  pada  suhu  4°C.  Supernatan  dicuci dengan  menggunakan  etanol  70%  dan dikeringkan-anginkan  pada  suhu  kamar. Supernatan DNA dilarutkan dalam 50 mL air suling steril dan disimpan pada suhu -20°C.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penyakit  gugur  daun  karet  di lapangan  menunjukkan  gejala  yang  khas yaitu  bercak  berbentuk  bulat  tidak beraturan  berwarna  cokelat  muda  sampai cokelat tua dengan pinggiran berwarna lebih gelap. Pada permukaan bercak berkembang aservuli  berwarna  hitam.  Pada  setiap  helai daun  terdapat  lebih  dari  satu  bercak (Gambar  2a).  Gejala  terlihat  pada  daun berwarna hijau sampai hijau gelap berumur lebih  dari  1  bulan.  Selain  itu,  daun  juga mengalami  perubahan  warna  menjadi kuning  kemerahan.  Serangan  lanjut  dapat mengakibatkan  terjadinya  gugur  daun. Gugur  daun  dapat  terjadi  pada  daun  yang mengalami perubahan warna maupun daun yang  masih  berwarna  hijau  tua.  Tidak terdapat  perbedaan  gejala  yang  signifikan antar jenis klon karet.

## Kusdiana, Sinaga, dan Tondok
mengalami  gugur  daun  pada  hari  kelima setelah  inokulasi.  Hasil  pengamatan  di lapangan  juga  menunjukkan  terdapat perubahan  warna  menjadi  kuning  atau oranye  pada  daun  yang  terserang  patogen. Hal  tersebut  dapat  disebabkan  adanya pengaruh  toksin yang  membantu  serangan patogen. Beberapa cendawan patogen dapat memproduksi  fitotoksin  yang  dapat mengganggu  fungsi  sel  inang  atau membunuh sel sebelum atau selama proses infeksi  patogen  (Agrios,  2005).  Beberapa s p e s i e s P e s t a l o t i o p s i s d i l a p o r k a n menghasilkan  metabolit  sekunder  bioaktif yang membantu hubungan antara inang dan patogen,  seperti P.  longiseta dan P.  theae penyebab  penyakit  hawar  daun  kelabu  teh menghasilkan 3 fitotoksin yaitu oxysporone, epiepoxydon,  dan  PT-toxin  (Nagata et  al., 1992); P.  guepinii penyebab  hawar  cabang kacang  hazel  menghasilkan  pestalopyrone (Turkkan et  al., 2011);  dan P.  oenotherae penyebab  bercak  daun  pada Oenothera l a c i n i a t a m e n g h a s i l k a n   o x y s p o r o n e (Venkatasubbaiah, Dyke, & Chilton, 1991).
Perubahan  warna  daun  menjadi kuning  dan  absisi  daun  juga  dapat disebabkan  oleh  produksi  hormon  pada tanaman  seperti  etilen  dan  asam  absisat (ABA).  Selain  dihasilkan  secara  alami  oleh tumbuhan,  hormon  juga  dihasilkan  oleh cendawan.  Patogen  dapat  mengganggu pertumbuhan  inang  dengan  memproduksi hormon  penyebab  respon  abnormal  dari inang  dan  memproduksi  senyawa  yang menstimulasi  tumbuhan  inang  untuk memproduksi hormon tumbuh lebih banyak atau lebih sedikit. Hormon etilen merupakan fitohormon  multifungsi  yang  mengatur pertumbuhan  dan  penuaan  daun.  Proses penuaan  daun  dapat  menjadi  respon pertahanan  terhadap  infeksi  patogen  yang terlihat  dengan  nekrosis  sel  daun  atau perubahan  warna  akibat  degradasi  klorofil dan  diikuti  dengan  kematian  sel  daun (Ferrante  &  Francini,  2006).  Hormon  ABA tidak  berperan  secara  langsung  dalam proses  pengguguran  daun,  namun  hormon ini  berperan  dalam  menyebabkan  penuaan pada sel-sel daun sebelum daun gugur dan
a b c d e f
Gambar  2.  Gejala  bercak  daun  dari  lapangan  berbentuk  bulat  tidak  beraturan  berwarna cokelat dengan pinggiran bercak berwarna lebih gelap (a), gejala pada daun yang diinokulasi Pestalotiopsis sp. pada klon RRIC 100 (b), PB 260 (c), BPM 24 (d), GT 1 (e), dan daun pada perlakuan kontrol (f)
Figure 2.   Symptoms of leaf spot from the field are round irregularly shaped brown with darker colored fringes (a), symptoms on leaves inoculated with Pestalotiopsis sp. on clones RRIC 100 (b), PB 260 (c), BPM 24 (d), GT 1 (e), and control treatment (f)
Diagnosis Penyebab Penyakit Baru Gugur Daun Karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
Gejala  bercak  dengan  aservuli berwarna hitam menyebar pada daun karet h a s i l   p o s t u l a t   K o c h   m e n u n j u k k a n persamaan dengan gejala awal yang diamati di  lapangan  (Gambar  3).  Selain  itu,  hasil inokulasi  cendawan Pestalotiopsis sp.  pada b e b e r a p a   k l o n   k a r e t   m e n u n j u k k a n persentase  keparahan  penyakit  yang  tinggi yaitu  lebih  dari  50,00%  dengan  kejadian penyakit  lebih  dari  83,33%.  Hasil  analisis statistika  menunjukkan  bahwa  klon  RRIC 100 dan GT 1 memiliki nilai keparahan dan insidensi penyakit lebih tinggi dibandingkan klon lainnya, walaupun keparahan penyakit pada  klon  RRIC  100  tidak  berbeda  nyata dengan  semua  klon  (Tabel  2).  Diameter bercak  pada  daun  hasil  inokulasi  memiliki nilai yang bervariasi yaitu berkisar antara 2 mm  sampai  14  mm.  Hasil  pengukuran diameter bercak dari beberapa klon karet di
lapangan  juga  menunjukkan  hasil  yang hampir  sama  yaitu  berkisar  antara  3  mm sampai  16  mm  dengan  rata-rata  diameter bercak  sebesar  8,10  mm.  Hal  tersebut disampaikan  juga  oleh  Chen et  al. (2018) bahwa  spesies Pestalotiopsis penyebab penyakit hawar daun kelabu pada tanaman teh  berhasil  diinokulasi  melalui  metode pelukaan  dengan  kejadian  penyakit  antara 41,70%  sampai  76,70%  dan  diameter  lesi sebesar  3,30  mm  sampai  10,80  mm, sedangkan  pada  daun  yang  diinokulasi tanpa pelukaan tidak menghasilkan gejala.
Karakter  makroskopis Pestalotiopsis sp. pada media PDA berupa koloni berwarna putih,  bertekstur  halus,  berbentuk  seperti bunga atau membentuk pola lingkaran, dan terdapat konidiomata berwarna hitam yang mulai tumbuh pada hari ke 4 hingga hari ke 13 setelah isolasi (Gambar 4). Konidiomata Pestalotiopsis sp.  dapat  tumbuh  secara
Karakter Koloni Cendawan Patogen
hal tersebut dapat menyebabkan terjadinya peningkatan  produksi  etilen  (Asra, et  al. 2020).
Figure 3.   Spots on the adaxial of the leaves from field (I) and spots on the adaxial of the leaves inoculated with Pestalotiopsis sp. (II), on the RRIC 100 (a), PB 260 (b), BPM 24 (c), and GT 1 (d) clones
Gambar 3. Bercak pada permukaan atas daun dari lapangan (I) dan bercak pada permukaan atas daun yang diinokulasi Pestalotiopsis sp. (II), pada klon RRIC 100 (a), PB 260 (b), BPM 24 (c), dan GT 1 (d)
a b c b d I II a c b d

## Kusdiana, Sinaga, dan Tondok
Perlakuan Treatment Keparahan penyakit Disease severity (%) Insidensi penyakit Disease incidence (%) Klon RRIC 100 - Inokulasi Pestalotiopsis sp. 65,61 ab 94,44 a Klon PB 260 - Inokulasi Pestalotiopsis sp. 50,00 b 83,33 b Klon BPM 24 - Inokulasi Pestalotiopsis sp. 53,70 b 83,33 b Klon GT 1 - Inokulasi Pestalotiopsis sp. 79,89 a 100,00 a Kontrol 0,00 c 0,00 c

## Tabel 2. Keparahan dan insidensi penyakit gugur daun pada 7 hari setelah inokulasi (hsi)
Table 2. Severity and incidence of leaf fall disease at 7 days after inoculation (dai)
Keterangan  :  Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukan berbeda nyata berdasarkan uji berganda Duncan dengan taraf uji 5%)
Remarks : Number followed with different letter at the same coloum showed significantly different based on Duncan at 5% level.
a b c d
I II I II I II I
II
Figure 4.   The character of Pestalotiopsis sp. from several rubber clones with circular patterns on isolates from RRIC 100 (a) and flower-like patterns in isolates from PB 260 (b), BPM 24 (c), and GT 1 (d). (I: the upper surface of the colony and II: the lower surface of the petri dish)
Gambar 4. Karakter koloni cendawan Pestalotiopsis sp. asal beberapa klon karet dengan pola melingkar pada isolat asal RRIC 100 (a) serta pola seperti bunga pada isolat asal PB 260 (b), BPM 24 (c), dan GT 1 (d). (I: permukaan atas koloni dan II: permukaan bawah cawan petri)
radial, menyebar tidak teratur, dan berpusat pada bagian tengah koloni  (Espinoza et al., 2008).  Cendawan  mencapai  diameter  8  cm setelah 7 hari pada suhu 25°C.
Berdasarkan  bentuk  konidianya, Steyaert  (1949) dalam (Maharachchi- kumbura et  al., 2014)  membagi  Pestalotia m e n j a d i   3   g e n u s   y a i t u P e s t a l o t i a , Pestalotiopsis ,  dan Truncatella . Truncatella untuk  spesies  dengan  konidia  bersel  4, Pestalotiopsis untuk  konidia  bersel  5,  dan Pestalotia untuk  konidia  bersel  6.
Selanjutnya Pestalotiopsis dibagi  menjadi beberapa bagian berdasarkan jumlah setula yaitu  monosetula,  bisetula,  trisetula,  dan multisetula.  Selain  itu, Pestalotiopsis juga dikelompokkan  berdasarkan  warna  pada pigmen  sel  median  konidianya  yaitu berwarna  seragam  dan  tidak  seragam (Jeewon et al., 2004).
Berdasarkan  hasil  pengamatan mikroskopis,  konidia  yang  diperoleh berbentuk  fusiform  hingga  oval  dengan ukuran berkisar antara 13,21 µm – 16,15 µm

## Diagnosis Penyebab Penyakit Baru Gugur Daun Karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
x 2,36 µm - 4,70 µm (Tabel 3). Konidia terdiri atas  5  sel  dengan  4  septa  yang  berwarna lebih  gelap  dibandingkan  sel  median.  Sel median  berjumlah  3  dan  berwarna  cokelat muda  sampai  cokelat  tua.  Sel  basal  dan apikal  berwarna  hialin  dan  berbentuk seperti  kerucut.  Pada  setiap  konidia memiliki  setula  yang  muncul  pada  ujung apikal  berjumlah  2-4  buah  dengan  ukuran panjang 10,81 µm - 15,95 µm dan berwarna hialin,  sedangkan  pada  setiap  ujung  sel basal muncul pedisel berbentuk tabung dan berwarna hialin (Gambar 5).
Maharachchikumbura et  al., (2011) melaporkan  karakteristik  konidia  tersebut mirip dengan P. microspora (Speg.) G.C. Zhao &  N.  Li.  Selain  itu,  Han et  al. (2019) melaporkan konidiomata dari P. microspora berbentuk  bundar,  berwarna  hitam, berlendir  dan  berkilau,  serta  memiliki diameter 120 μm hingga 410 μm. Sel konidia P.  microspora berbentuk  fusiform  sampai oval, hialin, pendek, dan berdinding tipis. Sel basal dan sel apikal berbentuk segitiga dan hialin.  Zhang,  Wu,  Tsukiboshi,  &  Okabe
Gambar 5. Konidiomata (I) dan konidia (II) Pestalotiopsis sp. asal klon karet RRIC 100 (a), PB 260 (b), BPM 24 (c), dan GT 1 (d) pada perbesaran 1000x (scale bars = 2 µm) Figure 5.   Conidiomata (I) and conidia (II) Pestalotiopsis sp. from rubber clones RRIC 100 (a), PB 260 (b), BPM 24 (C), and GT 1 (d) at 1000x magnification (scale bars = 2 µm)
I I II II I I II II a c b d from P. microspora Asal Klon P. microspora
clones Ukuran Konidia Conidia Size Panjang x Lebar Length x Width (µm) Setula Appendages Jumlah Amount Panjang Length (µm) RRIC 100 14,71 ± 0,80 x 4,01 ± 0,31 2-4 13,01 ± 1,32 PB 260 13,54 ± 0,21 x 3,74 ± 0,44 2-4 13,20 ± 1,20 BPM 24 14,03 ± 0,40 x 3,61 ± 0,52 2-4 13,01 ± 0,55 GT 1 14,17 ± 0,85 x 3,56 ± 0,59 2-4 13,42 ± 0,82
Table 3. Characteristics of P. microspora conidia from several clones Tabel 3. Karakteristik konidia P. microspora asal beberapa klon

## Kusdiana, Sinaga, dan Tondok

## Identifikasi Molekuler Cendawan Patogen
K o n f i r m a s i   h a s i l   i d e n t i f i k a s i morfologi  dan  mikroskopis  dari  4  isolat P.  microspora asal  karet  dilakukan  dengan identifikasi  molekuler.  Hasil  BLAST  pada GenBank menunjukkan bahwa sekuens ITS dari  4  isolat  asal  klon  karet  memiliki
k e m i r i p a n   l e b i h   d a r i   9 9 %   d e n g a n P. microspora (Tabel 4).
Berdasarkan  pohon  filogeni  dari  4 isolat P.  microspora asal  karet  (Gambar  6) menunjukkan  isolat  inang  karet  asal Indonesia berada pada kelompok yang sama dengan  isolat-isolat P.  microspora yang merupakan  patogen  pada  beberapa  inang dan  berasal  dari  negara  yang  berbeda, sedangkan  dengan  isolat  Pestalotiopsis spesies  lain  berada  dalam  kelompok  yang berbeda.  Hal  ini  menunjukkan  isolat P. microspora asal karet Indonesia memiliki
(2010)  menyebutkan  ukuran  konidia P.  microspora asal Hypericum  patulum berkisar antara 17 µm - 21 µm × 5 µm - 8 μm dengan ukuran setula berkisar antara 10 µm - 21 μm.
Gambar 6.  Pohon  filogenetik  sekuen  nukleotida P.  microspora dengan  metode neighbour joining tree
Figure 6.   Phylogenetic tree of P. microspora nucleotide sequences using a neighboring joining tree method
Isolat Asal Klon Clone Origin Isolates Homologi Homology (%) Nomor Aksesi GenBank GenBank Accession Number Asal Negara Country of Origin RRIC 100 99,63 MH707063.1 Cina PB 260 99,81 MH707065.1 Cina BPM 24 99,82 MH707065.1 Cina GT 1 99,63 MH707065.1 Cina
Tabel 4. Homologi nukleotida isolat cendawan asal klon karet dengan P.  microspora yang tersedia di GenBank dengan program BLAST Table  4.  Nucleotide  homology  of  fungal  isolates  from  rubber  clones  with  P.  microspora  at GenBank with the BLAST program
Diagnosis Penyebab Penyakit Baru Gugur Daun Karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
hubungan  kekerabatan  yang  dekat  dengan isolat P.  microspora dari  negara  lain berdasarkan sekuen DNA.
B e r d a s a r k a n   h a s i l   p e n u l a r a n cendawan Pestalotiopsis sp.  pada  kegiatan postulat  Koch  menunjukan  gejala  bercak yang  sama  dengan  bercak  yang  terdapat pada  daun  di  lapangan  yaitu  bercak berbentuk  tidak  beraturan,  berwarna cokelat  muda  dengan  pinggiran  bercak berwarna lebih gelap, serta terdapat aservuli berwarna  hitam  yang  menyebar  pada permukaan  bercak.  Selain  itu,  hasil  re- isolasi  daun  sakit  asal  postulat  Koch menunjukkan  miselium,  konidiomata,  dan konidia yang sama dengan hasil isolasi daun sakit  yang  diambil  dari  lapangan.  Hasil konfirmasi  spesies  dengan  molekuler menunjukkan jenis spesies yang sama. Hal ini  menandakan  bahwa  patogen  penyebab gugur  daun  karet  yaitu Pestalotiopsis microspora .
Espinoza, J. G., Briceño, E. X., Keith, L. M., & Latorre, B. A. (2008). Canker and twig dieback  of  blueberry  caused  by Pestalotiopsis spp. and a Truncatella sp.  in  Chile. Plant  Disease ,  92(10),
1 4 0 7 – 1 4 1 4 .   h t t p s : / / d o i . o r g /10.1094/PDIS-92-10-1407
Chen, Y., Zeng, L., Shu, N., Jiang, M., Wang, H.,  Huang,  Y.,  &  Tong,  H.  (2018). Pestalotiopsis-like  species  causing gray  blight  disease  on Camellia sinensis in  China. Plant  Disease , 102(1),  98–106.  https://doi.org /10.1094/PDIS-05-17-0642-RE
Febbiyanti,  T.  R.,  &  Fairuzah,  Z.  (2020). Identifikasi Penyebab Kejadian Luar Biasa Penyakit Gugur Daun Karet di Indonesia. Jurnal  Penelitian  Karet , 37(2),  193–206.  https://doi.org /10.22302/ppk.jpk.v37i2.616
Balodi, R., Bisht, S., Ghatak, A., & Rao, K. H.
(2017).  Plant  disease  diagnosis: Technological  advancements  and challenges. Indian  Phytopathology,
70(3),  275–281.  https://doi.org /10.24838/ip.2017.v70.i3.72487
Doyle, J J, & Doyle, J. L. (1990). Isolation of plant  DNA  from  fresh  tissue. Focus , 12, 13–15.
Berdasarkan  hasil  identifikasi  secara morfologi  dan  molekuler,  penyebab  gugur daun  baru  pada  tanaman  karet  dengan gejala  bercak  berbentuk  bulat  tidak beraturan  berwarna  cokelat  dengan pinggiran  berwarna  lebih  gelap  yaitu cendawan Pestalotiopsis  microspora (Speg.) G.C.  Zhao  &  N.  Li.  Selanjutnya,  penyakit gugur  daun  ini  disebut  dengan  penyakit gugur  daun  Pestalotiopsis.  Hasil  penelitian ini memberikan informasi mengenai spesies penyebab  penyakit  gugur  daun  baru  pada tanaman karet. Hal tersebut menjadi dasar bagi  para  peneliti  untuk  mengembangkan penelitian  lanjutan  terkait  karakter bioekologi  patogen  atau  pengembangan strategi pengendalian penyakit.
KESIMPULAN

## DAFTAR PUSTAKA
Febbiyanti,  T.  R.,  Kusdiana,  A.  P.  J, Fairuzah, Z, & Herlinawati, E. (2018). The  outbreak  of  Fusicoccum  leaf disease  in  Indonesia  and  the potential  yield  loss. International Plant Protection Workshop 2018 .
Asra,  R.,  Samarlina,  R.  A.,  &  Silalahi,  M. (2020). Hormon Tumbuhan . Jakarta: UKI Press
Agrios,  G.  (2004).  Plant  pathology:  Fifth edition.  In Plant  Pathology :  Fifth E d i t i o n   ( V o l .   9 7 8 0 0 8 0 4 7 3 ) . https://doi.org/10.1016/C2009-0-
02037-6
Ferrante,  A.,  Francini,  A.  (2006).  Ethylene and  leaf  senescence.  In  N.  A.  Khan (Ed.), Ethylene  Action  in  Plants (pp. 51–67).  Springer.  https://doi.org /10.1007/978-3-540-32846-9

## Kusdiana, Sinaga, dan Tondok
Suryaningtyas,  H.  (2012).  Pengendalian penyakit.  In  M.  Lasminingsih  (Ed.), Sapta  Bina  Usahatani  Karet  Rakyat (pp.  67–80).  Balai  Penelitian Sembawa, Pusat Penelitian Karet.
Shufen,  F.,  Gang,  G.,  &  Fucong,  Z.  (1999). General  situation  of  anthracnose  of rubber  trees  and  its  researches  in China. Proceedings  of  IRRDB Symposium 1999, 288–297.
Philip, S., Prem, E., & Vineeth, V. K. (2019). New  leaf  spot  disease  of  rubber. IRRDB Plant Breeder’s Meeting .

## Rodesuchit, A. (2020). Current situation on
the new leaf fall disease in Thailand. Meeting  of  Expert  on  Pestalotiopsis Leaf Disease .
Situmorang,  A.,  Sinaga,  M.  S.,  Suseno,  R., H i d a y a t ,   S .   H . ,   S i s w a n t o , Darussamin,  A.  (2004).  Status  dan manajemen  pengendalian  penyakit g u g u r   d a u n   C o r y n e s p o r a   d i p e r k e b u n a n   k a r e t . P r o s i d i n g Pertemuan Teknis, 97–118.
Turkkan,  M.,  Andolfi,  A.,  Zonno,  M.  C., Erper,  I.,  Perrone,  C.,  Cimmino,  A., Vurro,  M.,  &  Evidente,  A.  (2011). P h y t o t o x i n s   p r o d u c e d   b y Pestalotiopsis  guepinii ,  the  causal agent  of  hazelnut  twig  blight. Phytopathologia  Mediterranea ,  50,
154–158.
Han, S., Wang, Y., Wang, M., Li, S., Ruan, R., Qiao, T., & Zhu, T. (2019). First report of Pestalotiopsis  microspora causing leaf blight disease of Machilus nanmu i n   C h i n a . T h e   A m e r i c a n P h y t o p a t h o l o g i c a l   S o c i e t y . https://doi.org/10.1094/PDIS-05- 19-0937-PDN
Jasalavich, C. A., Ostrofsky, A., & Jellison, J. (2000).  Detection  and  identification of  decay  fungi  in  spruce  wood  by r e s t r i c t i o n   f r a g m e n t   l e n g t h polymorphism  analysis  of  amplified genes  encoding  rRNA. Applied  and Environmental  Microbiology ,  66(11),
4 7 2 5 – 4 7 3 4 .   h t t p s : / / d o i . o r g / 1 0 . 1 1 2 8 / A E M . 6 6 . 1 1 . 4 7 2 5 - 4734.2000
Jeewon,  R.,  Liew,  E.  C.  Y.,  &  Hyde,  K.  D.
(2004).  Phylogenetic  evaluation  of s p e c i e s   n o m e n c l a t u r e   o f Pestalotiopsis in  relation  to  host association. Fungal Diversity , 17(May 2014), 39–55.
Maharachchikumbura, S. S.N., Hyde, K. D., Groenewald, J. Z., Xu, J., & Crous, P. W.  (2014). Pestalotiopsis revisited. Studies in Mycology , 79(1), 121–186. https://doi.org/10.1016/j.simyco.2 014.09.005
Maharachchikumbura,  Sajeewa  S.N.,  Guo, L. D., Cai, L., Chukeatirote, E., Wu, W. P., Sun, X., Crous, P. W., Bhat, D. J., McKenzie, E. H. C., Bahkali, A. H.,
&  Hyde,  K.  D.  (2012).  A  multi-locus backbone tree for Pestalotiopsis, with a  polyphasic  characterization  of  14 new species. Fungal Diversity, 56(1), 9 5 – 1 2 9 .   h t t p s : / / d o i . o r g /10.1007/s13225-012-0198-1
Maharachchikumbura,  Sajeewa  S.N.,  Guo,
L.  D.,  Chukeatirote,  E.,  Bahkali,  A. H . ,   &   H y d e ,   K .   D .   ( 2 0 1 1 ) . P e s t a l o t i o p s i s - m o r p h o l o g y , p h y l o g e n y ,   b i o c h e m i s t r y   a n d d i v e r s i t y . F u n g a l   D i v e r s i t y , 5 0 ( J a n u a r y ) ,   1 6 7 – 1 8 7 . https://doi.org/10.1007/s13225- 011-0125-x
G r i m e s ,   D .   J .   ( 2 0 0 6 ) . K o c h ’ s Postulates—Then  and  Now .  1(5), 223–228.
Pawirosoemardjo,  S.  (2004).  Manajemen pengendalian  penyakit  penting dalam  upaya  mengamankan  target produksi karet nasional tahun 2020. Prosiding Pertemuan Teknis , 21–45.
Nagata,  T.,  Ando,  Y.,  &  Hirota,  A.  (1992). Phytotoxins  from  Tea  Gray  Blight Fungi, Pestalotiopsis  longiseta and Pestalotiopsis  theae.  Bioscience, Biotechnology  and  Biochemistry, 56(5),  810–811.  https://doi.org /10.1271/bbb.56.810
Diagnosis Penyebab Penyakit Baru Gugur Daun Karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
Venkatasubbaiah,  P.,  &  Van  Dyke,  C.  G.
(1991).  Phytotoxins  produced  by Pestalotiopsis oenotherae , a pathogen of evening primrose. Phytochemistry , 30(5),  1471–1474.  https://doi.org /10.1016/0031-9422(91)84189-Y
Zambri, A. M. A., Mahyudin, M. M., & Noran, A. S. (2018). Re-Emergence of Hevea leaf  spot  caused  by Pestolotia sp.  in Malaysia. Proceeding  International Plant Protection Workshop 2018 .
Zhang,  M.,  Wu,  H.  Y.,  Tsukiboshi,  T.,  & Okabe,  I.  (2010).  First  report  of Pestalotiopsis microspora causing leaf spot  of  hidcote (Hypericum  patulum) in Japan. Plant Disease , 94(8), 1064. https://doi.org  /10.1094/PDIS-94- 8-1064B.

## Kusdiana, Sinaga, dan Tondok