Jurnal Biologi Edukasi Edisi 30, Volume 15 Nomor 1, Juni 2023, hal 37-47

## Skrining dan Identifikasi Molekuler Gen Penyandi 16S rRNA Bakteri Penghasil Enzim Tanase
dari Hutan Lawu Utara
Screening and Molecular Identification of 16S rRNA Encoding Genes of Tanase Enzyme Producing Bacteria from North Lawu Forest
Muh. Nahrowi B
Sekolah Menengah Atas Negeri 2 Ngawi, Jl. Ahmad Yani Klitik, Ngawi, Jawa Timur, Tromol Pos 7 Email: muhnahrowi70@gmail.com

## Abstrak
Tanin  merupakan  senyawa  fenolik  bersifat  rekalsitran  dan  toksik  bagi  sebagian  besar mikroorganisme.  Degradasi  tanin  oleh  tanase  fungi  telah  banyak  dilaporkan,  namun  laporan  yang berkaitan  dengan  kemampuan  bakteri  untuk  mendegradasi  tanin  masih  sedikit.  Dalam  aplikasinya, tanase banyak digunakan sebagai biokatalisator dalam berbagai industri. Sebagian besar biomassa di dasar hutan Lawu Utara berupa tumpukan daun pinus dengan kandungan tanin cukup tinggi, diduga memiliki  potensi  cukup  melimpah  populasi  bakteri  penghasil  tanase.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui apakah di hutan Lawu Utara terdapat bakteri penghasil tanase aktivitas tinggi dan berapa besar  tingkat  aktivitas  tanase  serta  bagaimana  hubungan  filogenetiknya.  Uji  kualitatif  dengan mengukur indek degradasi asam tanat. Uji kuantitatif digunakan spektrofotometer UV- Vis, λ 310 nm. Identifikasi  takson  berdasarkan  sekuen  gen  penyandi  16S  rRNA.  Terdapat  6  isolat  memiliki  tanase aktivitas  tinggi.  Aktivitas  tertinggi  44,72  U/ml  terdapat  pada  isolat  B03  teridentifikasi  memiliki similaritas sebesar 98% dengan genus Pseudomonas.
Kata kunci : Gen penyandi 16S rRNA, Hutan Lawu Utara, tanase

## Abstract
Tannins  are  phenolic  compounds  that  are  recalcitrant  and  toxic  to  most  microorganisms. Degradation of tannins by tannase fungi has been widely reported, but reports relating to the ability of bacteria to degrade tannins are still few. In its application, tannase is widely used as a biocatalyst in various industries. Most of the biomass at the bottom of the North Lawu forest is in the form of piles of pine  needles  with  a  fairly  high  tannin  content,  thought  to  have  the  potential  for  quite  an  abundant population  of  tannase-producing  bacteria.  This  study  aims  to  determine  whether  there  are  high- activity  tannase-producing  bacteria  in  the  North  Lawu  Forest  forest,  what  is  the  level  of  tannase activity,  and  how  is  the  phylogenetic  relationship — qualitative  test  by  measuring  the  tannic  acid degradation index. The quantitative test used a UV- Vis spectrophotometer, λ 310 nm— identification of the taxon based on the 16S rRNA encoding gene sequence. Six isolates had high tannase activity. The highest activity of 44.72 U/ml was found in isolate B03, which was identified as a bacterium that has a similarity of 98% to the genus Pseudomonas.
Keywords : : 16S rRNA coding gene, North Lawu Forest, tannase

## Pendahuluan
Tanin  merupakan  metabolit  sekunder yang  tergolong  kedalam  senyawa  fenolik dengan  berat  molekul  berkisar  antara  500 – 3000  Dalton  (Biswas  et  al.,  2022;  Farha et  al., 2020).  Senyawa  ini  banyak  terdapat  pada angiospermae, gymnospermae dan pteridophyte,  banyak  ditemukan  di  bagian tumbuhan  seperti,  daun,  akar,  kulit  batang  dan buah  (Lekshmi  et  al.,  2021a).  Tanin diklasifikasikan  menjadi  tanin  terhidrolisis  dan terkondensasi. Gambar 1 menunjukkan klasifikasi  dasar  tanin.  Tanin  terhidrolisis menghasilkan  campuran  asam  galat,  asam ellagat,  dan  asam  digalat,  senyawa  tersebut terdiri  dari  ikatan  ester  yang  terbentuk  dari asam  benzoat  dan  gula.  Selain  itu,  tanin  juga memiliki  nukleofilisitas  lebih  rendah  dengan kandungan senyawa fenolat yang lebih rendah. Polimerisasi  tanin  terkondensasi  menghasilkan phlobaphene  yang  tidak  larut  dalam  air (Dhawale et al., 2022a).
Gambar 1. Jenis Tanin (Tanin Terhidrolisis dan
Terkondensasi) dan
Struktur Kimianya (Dhawale et al., 2022b)
Bar- Ya’akov  et  al.  (2019)  melaporkan, ekstrak  Punica  granatum  L  dan  Quercus  suber mengandung  tanin  yang  dapat  dihidrolisis. Sedangkan tanin terkondensasi terdiri oligomer atau  polimer  flavan-3-ol  yang  digabungkan dengan  ikatan  C-C,  yang  biasanya  dibentuk oleh ikatan C – 4 dari katekin ke C – 8 berikutnya, meskipun terkadang C – 4 ke C – 6 (Khanbabaee &  Van  Ree,  2001)  senyawa  ini  banyak ditemukan  di  beberapa  kulit  kayu  termasuk Pinus merkusii (Sianto et al., 2022). Kehadiran gugus  hidroksil  bebas,  tanin  memiliki  potensi untuk  dilakukan  modifikasi  secara  kimiawi sehingga  menjadi  bahan  yang  lebih  fungsional
(Dhawale  et  al.,  2022c).  Sebagian  besar  reaksi biokatalitik  dan  biotransformasi  telah  secara signifikan memanfaatkan berbagai enzim untuk membuat produk yang berharga bagi kesejahteraan  manusia  (Alcántara  et  al.,  2022) Enzim  mikroba  memiliki  nilai  ekonomi  sangat tinggi  di  beberapa  tahun  terakhir  karena kegunaannya  yang  luas  dalam  kebanyakan aplikasi  industry.  Enzim  mikroba  merupakan bagian utama dari enzim industri karena enzim mikroba  memiliki  karakteristik  aktivitas  lebih baik  dibandingkan  dengan  yang  diperoleh  dari sumber lain (Thapa et al., 2019)
Tannin acyl hydrolase (E.C.3.1.1.20) atau tanase  adalah  kelompok  enzim  esterase  yang bekerja  secara  spesifik  mengkatalisis  hidrolisis tanin  menjadi  asam  galat,  glukosa  dan  galoil ester  (saeed  et  al.,  2021).  Tanase  memiliki aplikasi  luas  dalam  berbagai  bidang  industri, seperti  industri  pembuatan  asam  galat, pirogalol,  pemrosesan  makanan  dan  minuman, pengelolaan  limbah  penyamakan  kulit  dan  air limbah  (Biswas  et  al.,  2022).  Indonesia  yang kaya akan  biodiversitas  memiliki  potensi  besar untuk  produksi  berbagai  biokatalis  dari ekplorasi  mikroba  terutama  enzim  tanase. Tanase  merupakan  salah  satu  molekul  penting dalam industri dan terapeutik yang permintaannya lebih dari 10.000 ton per tahun, enzim  ini  juga  dapat  digunakan  secara  efektif untuk  menurunkan  kandungan  tanin  dalam limbah  beracun  penyamakan  kulit  sehingga memberikan  peluang  untuk  meminimalkan biaya  operasional.  Selama  tiga  dekade  terakhir tannase  dari  sumber  mikroba  telah  diusulkan untuk  degradasi  tanin  alami.  Ketersediaan berbagai  residu  agroindustri  membuka  jalan untuk  pemanfaatan  produksi  tannase  secara maksimal (Lekshmi et al., 2021b). Tanase juga dapat  digunakan  sebagai  probe  analitik  untuk menentukan  struktur  ester  asam  galat,  untuk mendeteksi  sel  kanker,  pengurai  limbah  cair industri  penggilingan  zaitun  dan  kulit  yang mengandung  tanin  (Belmares  et  al.,  2004; Mohapatra  et  al.,  2009;  Noguchi  et  al.,  2007). Biaya produksi tannase dapat dikurangi melalui eksplorasi  penggunaan  mikroorganisme  yang berpotensi  aktif  menghasilkan  enzim  tersebut (Aharwar  &  Parihar,  2018).  Beberapa  mikroba yang  dilaporkan  menghasilkan  enzim  tanase antar lain; Bacillus Gottheilii M2S2, Lachnospiracea  bacterium,  Aspergillus  niger (Borah  et  al.,  2023;  Guan  et  al.,  2023; Omeroglu  et  al.,  2023).  Asam  tanat  adalah adalah  polifenol  alami  yang  mengandung
Jurnal Biologi Edukasi Edisi 30, Volume 15 Nomor 1, Juni 2023, hal 37-47
glukosa dan asam galat, senyawa ini merupakan standar yang paling umum digunakan untuk uji
kuantisasi tannin (Makkar & Becker, 1993).
Gambar 2. Jalur Hidrolisis Asam tanat oleh Enzim Tanase (Natarajan K. et al., 2008)
Metode Penelitian

## Jenis Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  pendekatan kualitatif diskriptif.

## Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan tanggal 12 Januari – 13 Juni 2022 di laboratorium Biologi SMAN 2 Ngawi dan Laboratorium Mikrobiologi Universitas Sebelas Maret.

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian ini  atara  lain;  sampel  tanah  yang  diambil  dari lantai  hutan  dari  kawasan  lereng  Lawu  bagian Utara,  medium  nutrien  agar  (NA  agar),  asam tanat  0,25%,  akuades,  buffer  sitrat  0,05M  (pH 5,5),  ddH2O,  forward  primer  63f,  reverse primer 1387r.

## Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: cool box, botol sampel, kertas label, pensil,  digital  camera,  tabung  reaksi,  cawan petri,  gelas  beker,  erlenmeyer,  neraca  analitik, hot  plate,  shaker,  laminar  air  flow,  autoclave, lampu  bunsen,  batang  pengaduk,  gelas  ukur, jarum  ose,  batang  L,  magnetic  stirrer,  kapas, alumunium  foil,  pipet,  freezer,  tip,  tabung eppendrof,  biophotometer,  alat  plolymerase chain  reaction  (PCR),  seperangkat  alat elektroforesis, ultraviolet transilumminator (gel doc). Spektrofotometri UV-Vis.

## Pengambilan Sampel
Sampel diambil dari tiga lokasi yaitu; a). Lantai  hutan  di  bawah  campuran  pohon  kopi dan  pinus,  b).  Lantai  hutan  di  bawah  pohon pinus  saja,  dan  c).  Lantai  hutan  di  bawah
campuran  pohon  cengkeh  dan  kopi.  Sampel tanah  diambil  dari  bawah  serasah  yang  sudah mulai lapuk kurang lebih 50 gram.

## Skrining bakteri penghasil enzim tanase
Skrining dilakukan dengan memodifikasi protokol  (Kumar  et  al.,  2010)  cara  1  gram sampel tanah diencerkan ke dalam 9 ml akuades steril  sehingga  dihasilkan  konsentrasi  10 -1 . Hasil seri pengenceran 10 -3 sampai 10 -5 diambil sebanyak  0,1  ml  kemudian  ditebarkan (spread plate method) dan diratakan di atas permukaan medium  nutrien  agar  (NA)  30.0  g/L  (pH  6.5) yang  diperkaya  asam  tanat  5g/L, beef  extract 2.0  g/L,  NaCl  4.0  g/L,  pepton  4.0  g/L dan diinkubasi  pada  suhu  37 O C  selama  7x24  jam. Setelah inkubasi  selesai,  larutan  FeCl3  0,01 M (dalam HCl 0,01 N) digenangkan di plate agar media  tumbuh  bakteri  dan  disimpan  selama  5 menit.  Kemudian  5 mL  larutan  FeCl3 (0,01  M FeCl3  dalam  HCl  0,01  N)  dikeluarkan  dari plate dan diperiksa pembentukan zona hidrolisis di sekitar koloni bakteri. Koloni yang memiliki morfologi  dan  menunjukkan  aktivitas  tanase ditandai  terbentuknya  area  coklat  bening disekitar  koloni  selanjutnya  dilakukan  proses isolasi  dengan  metode  gores (spread  plate method).

## Uji aktivitas kualitatif enzim tanase
Uji  aktivitas  tanase  secara  kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan diameter zona hidrolisis dengan diameter koloni bakteri  (Florencio  et  al.,  2012).  Rumus  indek enzimatik:  a/b,  a  =  diameter  zona  hidrolisis asam  tanat,  b=  diameter  koloni.  Penentuan kriteria  kualitatif  indek  enzimatik  berdasarkan asumsi  jika  kurang  dari  1,5  diberi  kriteria rendah, sama dengan 1,5 diberi kriteria sedang dan di atas 1,5 diberi kriteria tinggi.

## B: Skrining dan identifikasi molekuler gen
Produksi crude extract enzim tanase
Inokulum bakteri 2% yang dinkubasi satu malam  diinokulasi  ke  dalam  25  mL  media nutrient  broth  (NB)  dalam  labu  150  mL  yang mengandung  asam  tanat  10  g/L,  KH2PO4  0,5 g/L,  MgSO4.7H2O  0,5  g/L,  NH4Cl  1,0  g/L, CaCl2  0,1  g/L  dan  glukosa  5,0  g/L  (6,5  pH). Kemudian  dinkubasi  ked  ala  labu  suhu  37°C dan digoyang dengan shaker 120 rpm selama 48 jam. Setelah inkubasi selesai, kultur diambil 10 ml  dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm suhu 4 o C  selama  10  menit.  Supernatan  yang diperoleh  digunakan  sebagai crude  extract enzim  dan  disimpan  pada  suhu  4°C  untuk digunakan  lebih  lanjut.  (Aharwar  &  Parihar, 2018a).

## Uji kuantitatif aktivitas tanase
Uji  kuantatif  menurut  protokol  (Iibuchi, S., Minoda, Y., & Yamada, K. (1968). 0,5 mL crude  extract  enzyme,  2 mL  asam  tanat  0,35% (b/v),  20  µL  larutan  buffer  sitrat  0,05M  (pH 5,5)  dimasukkan  ke  dalam  kuvet  dan  ditambal etanol  hingga  larutan  menjadi  15  ml,  dengan waktu  inkubasi  selama  10  menit  pada  suhu ruang dan diukur dengan spektrofotometer UV- Vis pada  λ 310  nm.  Saat  setelah  penambahan etanol  dicatat  sebagai  t1  dan  setelah  10  menit inkubasi  dicatat  sebagai  t2.  Satu  unit  aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghidrolisis  1  µmol  ester  tiap  menit. Aktivitas  Enzim  (U/mL)  dihitung  dengan
rumus:  (Δ0 - Δt)  106.  (ε  R  T) - 1.    Δt =Arbsorbansi  pada  menit  ke- t,  Δ0  = Arbsorbansi  pada  menit  ke- 0,  ε  =  ko efisien absorpsivitas molar ester 270,000 cm-1M-1), T =  Waktu  (menit),  R  =  Volume  supernatan enzim (ml).

## Identifikasi molekuler bakteri penghasil tanase aktivitas tinggi
Isolasi  DNA  genom  bakteri  penghasil tanase  menggunakan  PrestoTM  mini  gDNA Bacteria Kit (Geneaid Biotech Ltd.). Amplifikasi  gen penyandi  16S  rRNA menggunkanan  MyTaq  HS  Red  Master  Mix (Bioline),  volume  total  reaksi  25  µl,  forward primer 63f (5’ - CAGGCCTAACACATGCAAGTC- 3’) dan reverse pri mer 1387r (5’ -
GGGCGGWGTGTACAAGGC- 3’)
mengamplifikasi DNA template dengan panjang  amplikon  sekitar  1300  bp.  Program PCR; denaturasi awal 95OC selama 1 menit, 30 siklus,  denaturasi  95OC  selama  15  detik, anealing 54OC-60OC selama 15 detik, ekstensi 72OC  selama  10 detik.  Verifikasi  produk  PCR dengan elektroforesis gel agarosa 1,5%.

## Hasil Penelitian dan Pembahasan

## Hutan Lereng Lawu Utara
Terdapat  tiga  macam  kelompok  tegakan yang  mendominasi  hutan  lereng  Lawu  Utara yaitu;  campuran  pohon  pinus  dan  kopi,  pohon pinus  saja  dan  campuran  pohon  kopi  dan cengkeh (Gambar 1).
Gambar 3. Pohon Dominan di Hutan Lawu Utara. Campuran pohon pinus dan kopi (lokasi  A),  pohon  pinus  saja  (lokasi  B)  dan  campuran  pohon  cengkeh dan kopi (lokasi C)
Tanaman hortikultura kebanyakan berupa tanaman  kopi  ditanam  di  bawah  pohon  Pinus, dan  sebagian  berupa  tanaman  cengkeh  yang ditanam  di  luar  area  pohon  pinus,  sedangkan pohon  pinus  di  dominasi  oleh  spesies  Pinus merkusii.  Komposisi  serasah  di  lantai  hutan
lereng  Lawu  Utara  didominasi  oleh  biomassa daun pinus (Gambar 3), hal tersebut disebabkan oleh  adanya  dominasi  pohon  pinus  dan ditunjang  oleh  sifat  daunnya  yang  memiliki kandungan  tanin  cukup  tinggi  dan  bersifat rekalsitran sehingga terjadi akumulasi biomassa
Jurnal Biologi Edukasi Edisi 30, Volume 15 Nomor 1, Juni 2023, hal 37-47
daun  pinus  cukup  tinggi  di  lantai  hutan.  Tanin sebagai  senyawa  proteksi  terhadap  herbivora, senyawa  tersebut  merupakan  subtrat  dan
sekaligus sumber karbon yang baik bagi bakteri pendegradasi tanin.
Gambar 4. Penumpukan biomassa daun pinus mendominasi dasar hutan lereng Lawu Utara
Dari  skrining  menunjukkan  bakteri penghasil  tanase  terdapat  di  seluruh  lokasi pengambilan sampel, terutama pada lokasi yang paling  banyak  mengandung  biomassa  daun pinus.
Koloni bakteri penghasil enzim tanase
Koloni  bakteri  penghasil  tanase  ditandai dengan  terbentuknya  zona  coklat  terang disekitar koloni, zona tersebut merupakan asam tanat  yang  terhidrolisis  oleh  aktivitas  enzim tanase  (Ajayi  &  Kwokoms,  2022)  Terdapat  7 macam  karakter  morfologi  koloni  dari keseluruhan sampel (Tabel 1).
Tabel 1. Karakte morfologi koloni bakteri penghasil enzim tanase dari seluruh sampel
No Morfologi Koloni Kode Koloni () = diamater koloni (mm) ∑ Bentuk Warna Tepian 1 Bulat Putih Berombak  A04 (7) 1 2 Bulat Kuning Berombak  A01  (4), A02 (5),  A03 (4), B01 (10), B02 (7), B05 (9), 6 3 Bulat Kuning pucat Berombak  B04(7). 1 4 Tdk beraturan Kuning pucat kusam  Berombak  B03 (6) 1 5 Bulat Putih Halus A05 (10). 1 7 Bulat Kuning Halus C01 (5), C02 (7), C03 (11), C04 (10) 4 Total 14 Koloni bermorfologi bulat-kuning-
berombak memiliki jumlah terbanyak.
Aktivitas  isolat  bakteri  penghasil  enzim tanase
Dari  uji  kualitatif  menunjukkan  terdapat variasi aktivitas enzim tanase isolat bakteri dari
seluruh  sampel.  Perbedaan  aktivitas  tersebut ditunjukkan  oleh  perbedaan  diameter  zona degradasi  (zona  hidrolisis)  yang  mengelilingi koloni  bakteri  pendegradasi  asam  tanat  pada medium  NA  yang  diperkaya  asam  tanat (Gambar 5).
Gambar  5.  Zona  hidrolisis  asam  tanat oleh  beberapa isolat bakteri
Keterangan:
Kode angka warna putih adalah kelompok isolat berindek enzimatik tinggi, kode angka warna hitam isolat bakteri non degrasasi asam tanat (ND)
Isolat  bakteri  penghasil  enzim  tanase memiliki kemampuan hidrolisis tinggi terhadap asam tanat terdapat di seluruh sampel, terutama
di  lokasi  b  terdapat  3  isolat  aktivitas  tinggi (B03, B04 dan B05) (Tabel 2)
Tabel  2.  Daftar  indek  enzimatik  isolat  bakteri  penghasil  enzim  tanase  dari  seluruh  sampel.  indek degradasi tertinggi 2,7 terdapat di isolat B03 No Kode isolat Diameter (mm) Indek degradasi Kriteria Koloni Zona bening 1 A01 4 6 1,5 Sedang 2 A02 5 5 1,25 Rendah 3 A03 4 9 1,3 Rendah 4 A04 7 17 2,4 Tinggi 5 A05 10 12 1,2 Rendah 6 B01 10 15 1,5 Sedang 7 B02 7 10 1,4 Rendah 8 B03 6 18 2,7 Tinggi 9 B04 7 11 1,6 Tinggi 10 B05 9 18 2,0 Tinggi 11 C01 5 6 1,2 Rendah 12 C02 7 9 1,3 Rendah 13 C03 11 19,5 1,8 Tinggi 14 C04 10 21 2,2 Tinggi Dari  keseluruhan  sampel  diperoleh  6
isolat  berindek  enzimatik  tinggi  dengan  urutan dari rendah ke tinggi sebagai berikut; B04, C03,
B05, C04, A04 dan B03.
Uji kuantitatif aktivitas tanase
menggunakan  spektrofotometri  UV-Vs,  diukur berdasarkan kecepatan perubahan nilai absorbansi per menit
Jurnal Biologi Edukasi Edisi 30, Volume 15 Nomor 1, Juni 2023, hal 37-47
Gambar 6. Grafik aktivitas tinggi enzim tanase dalam  reaksi  hidrolisis  asam  tanat oleh  6  isolat  bakteri.  isolat  B03 menunjukkan  memiliki  aktivitas paling tinggi 44,72 U/ml
Dari  gambar  6  diperoleh  urutan  tingkat aktivitas  enzim  tanase  dalam  menghidrolisis asam  tanat  dari  rendah  ke  tinggi  (U/ml)  yaitu; B04,  C03,  B05,  C03,  A04,  B03.  Aktivitas tertinggi  terdapat  pada  isolat  B03,  aktivitas tersebut  lebih  rendah    dari  Bacillus  subtilis (211.97±0.08 U/ml) (Shakir et al., 2022) tetapi lebih  tinggi  dari  Bacillus  haynesii  SSRY4 MN031245 (16.80 U/ml) (Dhiman et al., 2022)
Identifikasi  molekulker  gen  penyandi  16S rRNA  isolat  bakteri  penghasil  enzim  tanase aktivitas tinggi
Verifikasi amplikon produk PCR menggunakan  elektrofoersis  gel  agarosa  1,5% (Gambar 7), hasil amplifikasi gen penyandi 16S rRNA  memiliki  panjang  fragmen  sekitar  1300 bp.
Gambar  7.  Elektroforegram  produk  PCR  Gen  16S  rRNA  6  isolat bakteri penghasil tanase aktivitas tinggi
Analisis sekuen nukleotida menggunakan program  BLAST  untuk  dibandingkan  dengan sekuen nukleotida bakteri di database GenBank NCBI.  Menurut  Drancourt  et  al.  (2000)  jika persentase  similaritas  sebesar  ≥  99%  maka isolat  yang  dibandingkan  dapat  dinyatakan sebagai  spesies  yang  sama,  persentase  97-99% dapat dinyatakan sebagai genus yang sama dan persentase  similaritas  <  97%  dapat  dinyatakan bahwa isolat tersebut belum dapat teridentifikasi  taksonnya.  Penentuan  takson berdasarkan berdasarkan sekuen gen 16S rRNA tidak  cukup  untuk  menggambarkan  spesies yang  identik,  sekuen  nukleotida  yang menunjukkan  kemiripan  rendah  belum  dapat ditentukan  diskripsi  taksonnya  secara  lengkap (Stackebrandt  &  Goebel,  1994).  Dalam
beberapa  kasus  bakteri  dapat  dikelompokkan menjadi  spesies  baru  walaupun  homologi  16S rRNA di atas 99%, hal tersebut terjadi jika nilai homologi hibridisasi DNA-DNA rendah, atau < 70% (Jauh‐Hsun et al., 1999; Patel et al., 2004). Dari  hasil  analisis  sekuen  diperoleh  data  isolat A04  memiliki  similaritas  sebesar  99%  dengan Staphylococcus  saprophyticus .  B03,  B04,  B05 dan  C04  ketiganya  teridentifikasi  memiliki similaritas  sebesar  98%  genus  Pseudomonas sedangkan  isolat  C03  memiliki  similaritas sebesar 95% dengan Pseudomonas aeruginosa .
Hubungan  kekerabatan  bakteri  penghasil tanase
Untuk  memvalidasi  terhadap  hasil analisis BLAST, dilakukan analisis filogenetik,

## B: Skrining dan identifikasi molekuler gen
analisis  ini  digunakan  untuk  merekontruksi pohon  filogenetik  (phylogenetic  tree)  dan mempelajari  hubungan  kekerabatan  antara
isolat  bakteri  penghasil  tanase  hasil  penelitian dengan bakteri tanase yang telah teridentifikasi pada penelitian sebelumnya.
Gambar  8.  Pohon  filogenetik  bakteri  penghasil  tanase  hasil  penelitian  dengan  beberapa  bakteri penghasil  tanase  yang  telah  ditemukan  sebelumnya  menggunakan test  neighbor-joining tree dengan bootstrap 500 replikasi
6 isolat bakteri penghasil tanase aktivitas tinggi  terdikotomi  dalam  2  kelompok  besar (Gambar  7),  yaitu;  Kelompok  bakteri  gram negatif;  isolat  B03,  B04,  B05,  C03  dan  C04 berada  dalam  satu  sub-kelompok  dengan Pseudomonas aeruginosa , sedangkan Ochrobatrum  sp .  sebagai  outgroup,  Kelompok
bakteri  gram  positif;  isolat  A04  satu  sub- kelompok  dengan Bacillus  sp .  sedangkan Leucobacter  sp .  sebagai  outgroup.  Semakin dekat  jarak  genetik  suatu  isolat  bakteri  dengan isolat  lain  berarti  semakin  dekat  tingkat kekerabatannya,  sebaiknya  semakin  jauh  jarak genetik berarti semakin jauh kekerabatannya
Tabel  3.  Uji Pairwise  Distance  Calculation hubungan  genetik  antara  isolat  bakteri penghasil  tanase  aktivitas  tinggi  dan  bakteri  yang  pernah  ditemukan sebelumnya
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1. isolat_A04 2. isolat_B03 0.3 3. isolat_B04 0.3  0.0 4. Isolat_B05 0.3  0.0  0.0 5. Bacillus sp. (DSM 8724) 0.1  0.3  0.3  0.3 6. isolat_C03 0.3  0.0  0.0  0.0  0.3 7. isolat_C04 0.3  0.0  0.0  0.0  0.3  0.0 8. Leucobacter_sp. Dsoy17 0.3  0.3  0.3  0.3  0.3  0.3  0.3 9. Ochrobactrum_sp. 0.3  0.3  0.3  0.3  0.3  0.3  0.3  0.3 10. Pseudomonas aeruginosa. 0.3  0.0  0.0  0.0  0.3  0.0  0.0  0.3  0.3
Dari  uji Pairwise  Distance  Calculation (Tabel  3)  diperoleh  jarak  genetik  terdekat adalah 0,0 terdapat pada jarak antar isolat B03, B04,  B05,  C03,  C04  dan Pseudomonas
aeruginosa .  Jarak  genetik  terdekat  ke  dua adalah 0,1 terdapat pada jarak antar isolat A04 dengan Bacillus  sp .  Jarak  genetik  terjauh  0,3 terdapat pada jarak antara isolat A04, B03, B04,
Jurnal Biologi Edukasi Edisi 30, Volume 15 Nomor 1, Juni 2023, hal 37-47
B05, C03, C04, Leucobacter_sp, Ochrobactrum_sp dan Pseudomonas
aeruginosa .

## Simpulan dan Saran

## Simpulan
Lantai hutan BKPH Lawu Utara terdapat 6 isolat bakteri memiliki aktivitas tanase tinggi. Isolat  A04  teridentifikasi  memiliki  similaritas yang tinggi dengan Staphylococcus saprophyticus ,  Isolat  B03,  B04,  B05  dan  C04 ketiganya  teridentifikasi  memiliki  similaritas yang  tinggi  dengan  genus  Pseudomonas  dan isolat  C03  teridentifikasi  similaritas  tinggi dengan Pseudomonas aeruginosa. B03 merupakan  isolat  dengan  aktivitas  tanase tertinggi,  dengan  kemampuan  hidrolisis  ester sebesar 44,72 U/L).

## Saran
Penelitian  ini menggunakan  primer  yang mengasilkan  sekuen  parsial  gen  penyandi  16S rRNA dengan panjang 1300 bp sehingga belum bisa  digunakan  untuk  mendeterminasi  spesies dari  isolate  yang  ada,  untuk  hasil  determinasi spesies  lebih  valid  maka  disarankan  untuk peneliti  berikutnya  bisa  menggunakan  primer yang  menghasilkan  sekuen  total  gen  penyandi 16S rRNA (1500 bp).

## Daftar Pustaka
Aharwar,  A.,  &  Parihar,  D.  K.  (2018a).
Tannases:  production,  properties, applications. Biocatalysis and Agricultural  Biotechnology,  15,  322 –
334.
Aharwar,  A.,  &  Parihar,  D.  K.  (2018b). Tannases:  Production,  properties, applications.  In  Biocatalysis  and Agricultural  Biotechnology  (Vol.  15,
pp. 322 – 334). Elsevier Ltd. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2018.07 .005 Ajayi,  A.  A.,  &  Kwokoms,  U.  (2022). Characterization of tannase-producing bacteria in cowpea (Vigna unguiculata L. Walp). MICROBIOLOGY
RESEARCH.
Alcántara,  A.  R.,  Dominguez  de  Maria,  P., Littlechild,  J.  A.,  Schürmann,  M., Sheldon,  R.  A.,  &  Wohlgemuth,  R. (2022).  Biocatalysis  as  key  to sustainable industrial chemistry. ChemSusChem, 15(9), e202102709.
Bar- Ya’akov, I., Tian, L., Amir, R., & Holland,
D.  (2019).  Primary  metabolites, anthocyanins, and hydrolyzable tannins  in  the  pomegranate  fruit. Frontiers in Plant Science, 10, 620. Belmares,  R.,  Contreras-Esquivel,  J.  C., Rodr ı́ guez-Herrera,  R.,  Coronel,  A. R., & Aguilar, C. N. (2004). Microbial production  of  tannase:  an  enzyme with  potential  use  in  food  industry. LWT-Food  Science  and  Technology, 37(8), 857 – 864.
Biswas, I., Mitra, D., & Mohapatra, P. K. Das. (2022).  Structural  and  catalytic advancement  of  fungal  tannase:  A proteomic  contribution  in  industrial applicability. Bioresource Technology Reports, 101103.
Borah, A., Selvaraj, S., & Murty, V. R. (2023). Production  of  Gallic  Acid  from Swietenia macrophylla Using Tannase from  Bacillus  Gottheilii  M2S2  in Semi-Solid State Fermentation. Waste and Biomass Valorization, 1 – 19. Condren,  A.  R.,  Kahl,  L.  J.,  Boelter,  G., Kritikos, G., Banzhaf, M., Dietrich, L. E.  P.,  &  Sanchez,  L.  M.  (2019). Biofilm inhibitor taurolithocholic acid alters colony morphology, specialized metabolism, and virulence of
Pseudomonas aeruginosa. ACS
Infectious Diseases, 6(4), 603 – 612. Dhawale, P. V, Vineeth, S. K., Gadhave, R. V, MJ, J. F., Supekar, M. V., Thakur, V. K.,  &  Raghavan,  P.  (2022a).  Tannin as  a  renewable  raw  material  for adhesive  applications:  a  review. Materials Advances.
Dhawale, P. V, Vineeth, S. K., Gadhave, R. V, MJ, J. F., Supekar, M. V., Thakur, V. K.,  &  Raghavan,  P.  (2022b).  Tannin as  a  renewable  raw  material  for adhesive  applications:  a  review. Materials Advances.
Dhawale, P. V, Vineeth, S. K., Gadhave, R. V, MJ, J. F., Supekar, M. V., Thakur, V. K.,  &  Raghavan,  P.  (2022c).  Tannin as  a  renewable  raw  material  for adhesive  applications:  a  review. Materials Advances.
Dhiman,  S.,  Mukherjee,  G.,  Kumar,  A.,  & Majumdar,  R.  S. (2022).  Purification, Characterization and Application Study  of  Bacterial  Tannase  for Optimization of Gallic acid Synthesis
from Fruit Waste. Journal of Scientific &  Industrial  Research,  81(10),  1029 – 1036.
Drancourt, M., Bollet, C., Carlioz, A., Martelin, R., Gayral, J.-P., & Raoult, D. (2000).
16S ribosomal DNA sequence analysis  of  a  large  collection  of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. Journal  of  Clinical  Microbiology, 38(10), 3623 – 3630.
Farha, A. K., Yang, Q.-Q., Kim, G., Li, H.-B., Zhu,  F.,  Liu,  H.-Y.,  Gan,  R.-Y.,  & Corke,  H.  (2020).  Tannins  as  an alternative  to  antibiotics.  Food Bioscience, 38, 100751.
Florencio,  C.,  Couri,  S.,  &  Farinas,  C.  S. (2012). Correlation between agar plate screening and solid-state fermentation for  the  prediction  of  cellulase production  by  Trichoderma  strains. Enzyme Research, 2012.
Guan, L., Wang, K., Gao, Y., Li, J., Yan, S., Ji, N., Ren, C., Wang, J., Zhou, Y., & Li, B. (2023). Biochemical and Structural Characterization  of  a  Novel  Bacterial Tannase  From.  Biocatalysis  and Biotransformation  Guided  by  Protein Engineering, 16648714. Jana, A., Halder, S. K., Banerjee, A., Paul, T., Pati,  B.  R.,  Mondal,  K.  C.,  & Mohapatra,  P.  K.  Das.  (2014). Biosynthesis,  structural  architecture and  biotechnological  potential  of bacterial tannase: a molecular advancement. Bioresource
Technology, 157, 327 – 340.
Khanbabaee,  K.,  &  Van  Ree,  T.  (2001). Tannins:  classification  and  definition. Natural  Product  Reports,  18(6),  641 – 649.
Kumar, R., Kumar, A., Nagpal, R., Sharma, J., &  Kumari,  A.  (2010).  A  novel  and sensitive  plate  assay  for  screening  of tannase-producing bacteria. Annals of Microbiology, 60(1), 177 – 179. Lekshmi,  R.,  Nisha,  S.  A.,  Vasan,  P.  T.,  & Kaleeswaran,
B. (2021a). A
comprehensive  review  on  tannase: Microbes  associated  production  of tannase  exploiting  tannin  rich  agro- industrial wastes with special reference to its potential environmental and industrial
applications. Environmental Research,
201, 111625. Lekshmi,  R.,  Nisha,  S.  A.,  Vasan,  P.  T.,  & Kaleeswaran,
B. (2021b). A
comprehensive  review  on  tannase: Microbes  associated  production  of tannase  exploiting  tannin  rich  agro- industrial wastes with special reference to its potential environmental and industrial
applications. Environmental Research, 201, 111625.
Makkar,  H.  P.  S.,  &  Becker,  K.  (1993). Behaviour of tannic acid from various commercial  sources  towards  redox, metal complexing and protein precipitation  assays  of  tannins.
Journal  of  the  Science  of  Food  and Agriculture, 62(3), 295 – 299. https://doi.org/10.1002/jsfa.27406203
14
Mohapatra,  P.  K.  Das,  Maity,  C.,  Rao,  R.  S., Pati,  B.  R.,  &  Mondal,  K.  C.  (2009). Tannase  production  by  Bacillus licheniformis  KBR6:  Optimization  of submerged  culture  conditions  by Taguchi  DOE  methodology.  Food Research  International,  42(4),  430 – 435.
Natarajan  K  .,  Rajendran  A,  &  Thangavelu  V. (2008).  Tannase  enzyme:  The  most Promising  Biocatalist  for  Food Processing  Industries.  Bioseciences, Biotechnology  Research  Asia,  5(1) 221-228 (2008), 1 – 8. https://www.biotech-asia.org/?p=6611 Noguchi,  N.,  Ohashi,  T.,  Shiratori,  T.,  Narui,
K.,  Hagiwara,  T.,  Ko,  M.,  Watanabe, K.,  Miyahara,  T.,  Taira,  S.,  & Moriyasu,  F.  (2007).  Association  of tannase-producing Staphylococcus lugdunensis  with  colon  cancer  and characterization  of  a  novel  tannase gene. Journal of Gastroenterology, 42, 346 – 351.
Omeroglu,  M.  A.,  Albayrak,  S.,  Arslan,  N.  P., Ozkan,  H.,  Adiguzel,  A.,  &  Taskin, M. (2023). Evaluation of wool protein hydrolysate as peptone for production of  microbial  enzymes.  3  Biotech, 13(1), 31.
Patel, J. B., Wallace Jr, R. J., Brown-Elliott, B. A.,  Taylor,  T.,  Imperatrice,  C., Leonard,  D.  G.  B.,  Wilson,  R.  W., Mann,  L.,  Jost,  K.  C.,  & Nachamkin,
Jurnal Biologi Edukasi Edisi 30, Volume 15 Nomor 1, Juni 2023, hal 37-47
I. (2004). Sequence-based identification of aerobic actinomycetes.  Journal  of  Clinical Microbiology, 42(6), 2530 – 2540.
Shakir,  H.  A.,  Khan,  M.,  Irfan,  M.,  Ali,  S., Yousaf, M. A., Javed, I., Qazi, J. I., & Bukhari,  S.  S.  I.  (2022).  Production and  characterization  of  tannase  by Bacillus  subtilis  in  solid  state fermentation of corn leaves. Journal of Applied  Biotechnology  Reports,  9(1), 516 – 530.
Sianto,  B.  V.,  Rollando,  R.,  &  Tambun,  S.  H. (2022).  Uji  Aktivitas  Antikolesterol Kombinasi  Ekstrak  Daun  Afrika Vernonia amygdalina dan Daun Pinus Pinus  merkusii  Secara  In  Vitro. Sainsbertek  Jurnal  Ilmiah  Sains  & Teknologi, 3(1), 322 – 333.
Silva, I. S., Menezes, C. R. de, Franciscon, E., Santos, E. da C. dos, & Durrant, L. R.
(2010).  Degradation  of  lignosulfonic and  tannic  acids  by  ligninolytic  soil fungi  cultivated  under  icroaerobic conditions.  Brazilian  Archives  of Biology  and  Technology,  53,  693 – 699.
Stackebrandt,  E.,  &  Goebel,  B.  M.  (1994). Taxonomic  note:  a  place  for  DNA- DNA  reassociation  and  16S  rRNA sequence  analysis  in  the  present species  definition  in  bacteriology. International  Journal  of  Systematic and Evolutionary Microbiology, 44(4), 846 – 849.
Thapa, S., Li, H., OHair, J., Bhatti, S., Chen, F.- C., Nasr, K. Al, Johnson, T., & Zhou, S. (2019). Biochemical characteristics of  microbial  enzymes  and  their significance from industrial perspectives. Molecular Biotechnology, 61, 579 – 601.