## Fraksinasi Flavonoid
Spirulina platensis dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis dan Aktivitas Inhibisi Enzim α -Glukosidase
Hartoyo Notonegoro 1 *, Heder Djamaludin 2 , Iriani Setyaningsih 3 , Kustiariyah Tarman 3
1 Jurusan Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Pertanian, Perikanan dan Biologi, Universitas Bangka Belitung Desa Balunijuk, Merawang, Bangka Belitung, Indonesia
2 Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya Jl. Veteran No. 1, Kota Malang, Indonesia
3 Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor Jl. Agatis Kampus IPB Dramaga, Bogor, Indonesia Email: hartoyonotonegoro@ubb.ac.id

## Abstract

## Fractionation of Spirulina platensis Flavonoids by Thin Layer Chromatography Method and a- Glucosidase Enzyme Inhibition Activity
Spirulina  platensis  is  a  type  of  Cyanobacterium  microalgae  that  forms  multicellular  helicoidal  filaments.  Spirulina  platensis contains primary and secondary metabolites. The type and amount of the active compound Spirulina platensis depends on the  method  of  extraction,  fractionation,  and  isolation.  So  far,  there  are  not  much  research  data  related  to  the  active compound of Spirulina platensis extract cultured on Walne. The purpose of this study was to use of thin layer chromatography (TLC) method to separate flavonoids from Spirulina platensis biomass extract cultured on Walne media and the activity of a- glucosidase enzyme inhibition using biomass, crude extract, active fraction of flavonoids and phycocyanins from Spirulina platensis. This research method is descriptive experimental, which the Spirulina platensis is cultured on 80 g/L NaNO 3 modified Walne media, extracted by maceration, fractionated by TLC and isolated the active compound by Preparative TLC (PTLC). The analysis included fraction and isolation of flavonoids from Spirulina platensis. The results showed that the TLC could be used  to  identify  the  active  compound  of  Spirulina  platensis  extract  cultured  on  Walne.  Fractionation  of  Spirulina  platensis extract using stationary phase silica gel Si 60 GF 254 and the best mobile phase with a combination of chloroform:ethyl acetate (6:4) and an Rf 1 value of 0.58; Rf 2 0.71; and Rf 3 0.83, as well as yellow-orange spots. Isolation of the active compound of Spirulina platensis  extract  using  PLTC  stationary  phase  silica  gel  Si  60  PF 254 and  the  best  mobile  phase  combination  eluent chloroform:ethyl acetate (9:1). RF value of Rf 2 0.57; Rf 3 0.86; and Rf 4 0.93 with dark yellow-brown spots. The color of the spots from the PLTC results shows that the active compounds of Spirulina platensis extract are flavonoid compounds. Biomass, crude extract, ph ycocyanine extract and flavonoids from Spirulina do not have inhibitory activity against α -glucosidase enzyme.
Keywords: Walne , PTLC, Spirulina platensis , Inhibition, α -Glucosidase, Flavonoid, Extraction

## Abstrak
Spirulina  platensis  merupakan  jenis  mikroalga  Cyanobacterium  yang  membentuk  filamen  helicoidal  multiseluler.  Spirulina platensis mengandung senyawa metabolit primer dan sekunder. Jenis dan jumlah senyawa aktif Spirulina platensis tergantung pada  metode  ekstraksi,  fraksinasi  dan  isolasi.  Sejauh  ini  belum  banyak  data  hasil  penelitian  terkait  senyawa  aktif  ekstrak biomassa Spirulina platensis yang dikultur pada media Walne. Tujuan penelitian ini yaitu penggunaan metode kromatografi lapis tipis (KLT) untuk memisahkan flavonoid ekstrak biomassa Spirulina platensis yang dikultur pada media Walne serta aktivitas inhibisi enzim α -glukosidase menggunakan biomassa, ekstrak kasar, fraksi aktif flavonoid dan fikosianin dari Spirulina platensis. Metode  penelitian  ini  adalah  eksprimental  deksriptif  dimana  mikroalga  Spirulina  platensis  dikultur  pada  media  Walne modifikasi  80  g/L  NaNO 3 ,  diekstraksi  dengan  maserasi,  difraksinasi  dengan  KLT  dan  diisolasi  senyawa  aktif  dengan  KLT Preparatif (KLTP). Analisis yang dilakukan meliputi analisis fraksi dan isolasi flavonoid dari Spirulina platensis. Hasil penelitian menunjukkan  metode  KLT  dapat  digunakan  untuk  mengindetifikasi  senyawa  aktif  ekstrak  Spirulina  platensis  yang  dikultur pada  media  Walne.  Fraksinasi  ekstrak  Spirulina  platensis  menggunakan  fase  diam  silika  gel  Si  60  GF 254 dan  fase  gerak kombinasi eluen terbaik kloroform:etil asetat (6:4) dan nilai Rf 1 0,58; Rf 2 0,71; dan Rf 3 0,83, serta bercak berwarna kuning-oranye. Isolasi senyawa aktif ekstrak Spirulina platensis menggunakan KLTP fase diam silika gel Si 60 PF 254 dan fase gerak kombinasi eluen terbaik kloroform:etil asetat (9:1). Nilai Rf 2 0,57; Rf 3 0,86; dan Rf 4 0,93 dengan bercak berwarna kuning-cokelat gelap. Warna  bercak  hasil  KLTP  menunjukkan  komponen  senyawa  aktif  ekstrak  Spirulina  platensis  berupa  senyawa  golongan flavonoid.  Biomassa,  ekstrak  kasar,  ekstrak  fikosianin  dan  flavonoid  dari  Spirulina  tidak  memiliki  aktivitas  penghambatan terhadap enzim α -glukosidase.
Kata Kunci : Walne , KLTP, Spirulina platensis , Inhibisi, α -Glukosidase, Flavonoid, Ekstraksi

## PENDAHULUAN
Spirulina platensis merupakan jenis mikroalga biru-hijau (Cyanobacterium) yang membentuk filamen helicoidal (spiral) multiseluler dengan panjang 200- 300 μm dan lebar 5- 10 μm (Benelhadj et al ., 2016). Biomassa dari Spirulina platensis mengandung berbagai komponen senyawa metabolit primer  dan  sekunder.  Djamaludin  dan  Chamidah  (2021a)  melaporkan  bahwa  ekstrak  minyak Spirulina sp. memiliki kandungan asam lemak tertinggi yaitu asam palmitat sebagai Saturated Fatty Acid (53,30-56,57%),  asam  oleat  sebagai Mono-Unsaturated  Fatty  Acid (4,34-4,50%),  dan  asam linoleat sebagai Poly-Unsaturated Fatty Acid (18,39-18,88%). Spirulina platensis berdasar hasil skrining fitokimia  menunjukkan  adanya  kandungan  senyawa  metabolit  sekunder  berupa  golongan flavonoid, steroid, fenol, dan saponin (Notonegoro et al ., 2018). Ekstrak mikroalga Spirulina sp. juga mengandung  vitamin  di  antaranya  asam  nikotinat,  riboflavin,  thiamin,  sianokobalamin,  mineral, asam amino dan senyawa aktif lainnya seperti karotenoid, pigmen klorofil (Suharyanto et al ., 2014) dan juga fikosianin yang berpotensi sebagai senyawa antioksidan alami (Ridlo et al ., 2016), serta berpotensi sebagai bahan pewarna alami (Sedjati et al ., 2016).
Jenis dan jumlah komposisi komponen senyawa aktif yang terkandung pada ekstrak mikroalga Spirulina sp. tergantung pada metode ekstraksi yang digunakan. Djamaludin dan Chamidah (2021a) melaporkan  metode Ultrasonic-Assisted  Extraction (UAE)  menghasilkan  jumlah  komponen  asam lemak pada ekstrak Spirulina sp. lebih tinggi daripada metode Microwave-Assisted Extraction (MAE). Djamaludin  dan  Chamidah  (2021b)  juga  melaporkan  bahwa  hasil  dari  metode  UAE  memiliki rendemen ekstrak Spirulina sp. yang lebih tinggi daripada metode MAE. Hal penting lain yang juga memengaruhi jenis dan jumlah komponen aktif Spirulina sp. selain metode ekstraksi yakni metode pemisahan dan pemurnian senyawa aktif.
Salah satu metode praktis yang dapat digunakan untuk pemisahan dan pemurnian senyawa aktif  yakni  kromatografi  lapis  tipis  (KLT)/ thin  layer  chromatography (TLC).  Cai  (2018)  menyatakan bahwa KLT merupakan sebuah teknik cepat, sensitif, dan murah yang digunakan untuk menentukan jumlah komponen dalam campuran, memverifikasi identitas dan kemurnian senyawa, memantau kemajuan reaksi, menentukan komposisi pelarut untuk pemisahan preparatif dan menganalisis fraksi yang  diperoleh  dari  kromatografi  kolom.  Kartini et  al .  (2021)  juga  menambahkan  bahwa kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu teknik analisis yang telah umum digunakan baik untuk  analisis  secara  kualitatif  maupun  kuantitatif,  bahkan  untuk  pengujian  aktivitas  biologis  bila dikombinasikan dengan bioautografi.
Berbagai upaya telah dilakukan sebagai bentuk optimasi metode ekstraksi, pemisahan dan pemurnian  komponen  senyawa  aktif Spirulina platensis untuk  memperoleh  rendemen  dan mengetahui aktivitas farmakologis dari komponen senyawa aktif. Sejauh ini belum banyak data hasil penelitian terkait analisis dengan metode KLT terhadap komponen senyawa aktif ekstrak biomassa Spirulina platensis yang dikultur  dengan  media  Walne.  Berdasarkan  uraian  tersebut,  maka  tujuan penelitian  adalah  untuk  mendapatkan  kombinasi  eluen  terbaik  dalam  pemisahan  komponen senyawa aktif golongan flavonoid dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis/ thin layer chromatography dan  lebih  lanjut  analisis  aktivitas  farmakologis  yakni  inhibisi  terhadap  enzim α - glukosidase.

## MATERI DAN METODE

## Kultivasi dan Pemanenan
Kultivasi Spirulina  platensis dilakukan  di  dalam  toples  kapasitas  10  L  menggunakan  media Walne modifikasi 80 g/L NaNO 3 yang mengacu pada Dinata et al. (2017) , pada suhu 25 o C, intensitas cahaya 3250 lux (40 W) dengan lama pencahayaan 24 jam terang, salinitas air laut 15 ppt dan bibit yang  digunakan  20%  dari  volume  kultur.  Menurut  Dinata et  al. (2017)  natrium  nitrat  (NaNO 3 ) merupakan  sumber  nitrogen  yang  diketahui  sebagai  parameter  yang  sangat  berpengaruh terhadap  pertumbuhan  dan  kandungan  senyawa  pada  mikroalga. Spirulina  platensis dipanen
pada  hari  ke  11  dengan  OD  ≥  0 ,5.  Pemanenan Spirulina  platensis dilakukan  dengan  cara penyaringan menggunakan nylonmesh ukuran 20 μm untuk memisahkan biomassa dan filtratnya. Biomassa dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 40 o C selama 24 jam.
Ekstraksi Komponen Aktif Biomassa Spirulina platensis
Biomassa Spirulina platensis hasil kultur ditimbang sebanyak 10 g dan dimasukkan ke dalam tabung  Erlenmeyer  yang  berisi  pelarut  etanol  (C 2 H 5 OH)  sebanyak  200  mL  dengan  rasio sampel:pelarut  1:20  (b/v).  Sampel  diekstraksi  menggunakan  metode  ekstraksi  cara  dingin  yakni maserasi selama 3x24 jam dan setiap 24 jam dilakukan penyaringan.  Selanjutnya filtrat diuapkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 48 o C.
Fraksinasi Komponen Senyawa Aktif Spirulina platensis Metode KLT Fraksinasi  atau  pemisahan  komponen  aktif  dari  ekstrak  kasar Spirulina  platensis dilakukan dengan  teknik  mencari  rasio  eluen  terbaik  menggunakan  kromatografi  lapis  tipis  (KLT)/ Thin-Layer Chromatography (TLC) dan diamati dengan sinar UV pada panjang gelombang ( λ ) 254 dan 366 nm.  Kombinasi  eluen  yang  digunakan  pada  fraksinasi  ekstrak Spirulina  platensis yaitu:  A)  etil asetat:metanol:air  (10:1.35:1),  B)  kloroform:metanol:air  (7:3:0.4),  C)  Etil  asetat:metanol:air:asam asetat (6.5:1.5:1.5:1), dan D) kloroform:etil asetat (9:1).
Fraksinasi ekstrak Spirulina platensis dilakukan dengan menggunakan lempeng lapis tipis silika gel Si 60 GF 254 dengan ukuran panjang 10 cm dan lebar 1 cm diberi tanda garis dengan pensil pada jarak 1 cm dari salah satu ujung lempeng. Ekstrak aktif terpilih dilarutkan dalam pelarut asalnya. Eluen yang digunakan dimasukkan ke dalam tabung kemudian ditutup rapat agar jenuh. Larutan ekstrak sampel  diteteskan  menggunakan  pipa  kapiler  pada  lempeng  silika  gel.  Ujung  lempeng  yang terdekat  pada  tempat  penetesan  dicelupkan  ke  dalam  tabung  kromatografi  yang  telah  jenuh dengan  eluen.  Tabung  ditutup  rapat  dan  didiamkan  hingga  pelarut  elusi  sampai  batas  yang ditentukan  yaitu  1  cm  dari  batas  atas.  Setelah  elusi  pada  batas  tertentu,  lempeng  diangkat selanjutnya dikeringkan pada suhu ruang selama beberapa menit, kemudian diamati dengan UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, kemudian dihitung nilai Rf menggunakan rumus:

## 𝑅𝑓 = Jarak yang ditempuh oleh komponen Jarak total yang ditempuh oleh eluen
Isolasi komponen aktif pada ekstrak Spirulina platensis dilakukan menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) dengan pelat kaca berukuran 20x20 cm 2 dengan fase diam silika gel Si 60 PF 254 yang telah diaktifkan dengan cara pemanasan pelat kaca selama satu jam pada suhu 110 o C. Ekstrak  aktif  20  mg  ditotolkan  sepanjang  garis  pita  pada  pelat  kaca  dan  dielusi  dengan perbandingan eluen terpilih dari hasil KLT. Pelat kaca kemudian dikeringkan dan diamati dengan UV pada panjang gelombang 254 nm dan  366 nm  berdasarkan nilai Rf-nya. Pengambilan senyawa hasil KLTP dilakukan dengan cara dikerik dan hasilnya dilarutkan dengan pelarut awal ekstrak yaitu etanol, kemudian dikeringkan menggunakan vacuum dryer.
Uji Aktivitas Inhibisi Enzim α -Glukosidase
Preparasi  sampel  biomassa,  ekstrak  kasar,  fikosianin,  fraksi  terpilih  dan  senyawa  isolasi flavonoid    dari Spirulina dibuat    pada    konsentrasi  100,  250,  500,  750  dan  1000 μg/mL, kemudian  dipipet  sebanyak  0,1  mL  dan dicampurkan dengan 50 μL buffer fosfat 0,1 M (pH 7,0), 25  μL  p -nitrofenil- α -D-glukopiranosida  ( p -NPG)  10  mM,  kemudian  campuran  diaduk  hingga homogen. Setelah campuran homogen, sebanyak 25 μL larutan enzim α -glukosidase ditambahkan dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 100 μL Na 2 CO 3 200 mM. Selanjutnya absorbansi larutan diukur menggunakan spektrofotometer UV- Vis pada panjang gelombang 403 nm sebagai absorbansi sampel (As).
Larutan blanko sampel dibuat dengan cara mencampurkan 0,1 mL dan dicampurkan dengan
50 μL buffer fosfat 0,1 M (pH 7, 0), 25 μL p -nitrofenil- α -D-glukopiranosida ( p -NPG) 10 mM, kemudian campuran diaduk hingga homogen. Setelah campuran homogen, sebanyak 25 μL larutan enzim α - glukosidase  ditambahkan  dan  diinkubasi  selama  30  menit  dengan  suhu  37°C.  Reaksi  tersebut dihentikan dengan menambahkan 100 μL Na 2 CO 3 200 mM. Selanjutnya absorbansi larutan diukur dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang  403  nm  sebagai  absorbansi  blanko (Ab1).
Kontrol  negatif  dibuat  dengan  cara  mencampurkan  sebanyak  0,1  mL  dan  dicampurkan dengan  50  μL buffer fosfat  0,1  M  (pH  7, 0),  25  μL  p -nitrofenil- α -D-glukopiranosida  ( p -NPG)  10  mM, kemudian  campuran  diaduk  hingga  homogen.  Setelah  campuran  homogen,  sebanyak  25  μL larutan enzim α -glukosidase ditambahkan dan diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 37°C. Reaksi tersebut  dihentikan  dengan  menambahkan  100  μL  Na 2 CO 3 200  mM.  Absorbansi  larutan  diukur dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang  403  nm  sebagai  absorbansi  kontrol (Ac).
Larutan  blanko  kontrol  positif  dibuat  dengan  cara  mencampurkan  sebanyak  0,1  mL  dan dicampurkan dengan 50 μL buffer fosfat 0,1 M (pH 7,0), 25 μL p -nitrofenil- α -D-glukopiranosida ( p - NPG)  10  mM,  kemudian  campuran  diaduk  hingga  homogen.  Setelah  campuran  homogen, sebanyak 25 μL larutan enzim α -glukosidase ditambahkan dan diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 37°C. Reaksi tersebut dihentikan dengan menambahkan 100 μL Na 2 CO 3 200 mM. Absorbansi larutan  diukur  dengan  spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang  403  nm  sebagai absorbansi blanko (Ab2). Larutan akarbosa digunakan sebagai kontrol positif dengan sistem reaksi sama seperti sampel. Aktivitas inhibisi enzim α -glukosidase ditentukan dengan rumus:
𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖  = (𝐴𝑐 − 𝐴𝑏2) − (𝐴𝑠 − 𝐴𝑏1) (𝐴𝑐 − 𝐴𝑏2) × 100%
Keterangan: Ac = Absorbansi kontrol negatif; Ab1= Absorbansi blanko kontrol positif; As = Abosrbansi sampel; Ab2 = Absorbansi blanko sampel

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Fraksinasi  komponen  senyawa  aktif Spirulina  platensis dilakukan  menggunakan  metode kromatografi  lapis  tipis  (KLT)/ thin  layer  chromatography (TLC).  Kromatografi  lapis  tipis  merupakan metode pemisahan komponen senyawa aktif berdasarkan kecepatan migrasi atau rasio distribusi dari komponen campuran fase diam/ stationary phase dan fase gerak/ mobile phase (Hancu et al ., 2011).  Kromatografi  lapis  tipis  merupakan  metode  yang  relatif  sederhana,  cepat  dan  umum digunakan  untuk  mengidentifikasi  komponen  senyawa  aktif.  Pada  penelitian  ini  menggunakan empat jenis rasio eluen/pelarut sebagai fase gerak yaitu: A) etil asetat:metanol:aquades (10:1.35:1); B) kloroform:metanol:aquades (7:3:0.4); C) etil asetat:metanol:aquades:asam asetat (6.5:1.5:1.5:1); dan  D)  kloroform:etil  asetat  (6:4).  Tujuan  penggunaan  kombinasi  campuran  eluen/pelarut  yakni untuk  menentukan  kombinasi  pelarut  terbaik  dalam  memisahkan  komponen  senyawa  aktif yang terkandung dalam ekstrak biomassa Spirulina platensis . Berdasarkan perbedaan jenis eluen tersebut diperoleh sejumlah fraksi yang ditandai adanya bercak/noda dengan nilai retardation factor (Rf) yang bervariasi. Untuk masing-masing hasil pemisahan dengan KLT dapat dilihat pada Gambar 1.
Pemilihan kombinasi eluen tersebut dilakukan berdasarkan Stahl (2013). Gambar 1 merupakan kombinasi  eluen  C  yakni    pelarut  etil  asetat:metanol:aquades:asam  asetat  (6.5:1.5:1.5:1) menunjukkan  bahwa  komponen  aktif  yang  dapat  ditarik  oleh  eluen  cenderung  lebih  sedikit dibandingkan  dengan  fraksi  lain  karena  fase  gerak  (eluen/pelarut)  tidak  dapat  memisahkan senyawa  yang  terkandung  di  dalam  ekstrak  sehingga  tertahan  di  bagian  atas  dekat  garis start . Kombinasi  pelarut  B  dan  A  menunjukkan  pemisahan  komponen  aktif  yang  kurang  sempurna. Pemisahan  senyawa  terbaik  terdapat  pada  kombinasi  pelarut  D  yaitu  kloroform:etil  asetat  (6:4). Fraksi  dengan  rasio  eluen  tersebut  dapat  melarutkan  cukup  baik  dengan  menghasilkan  3  noda
komponen  senyawa  aktif  yang  terpisah  dengan  baik.  Kombinasi  eluen  kloroform:etil  asetat merupakan kombinasi eluen yang bersifat non polar dan semi-polar. Adanya kombinasi eluen/fase gerak  berdasarkan  perbedaan  polaritas  (polar:semi-polar:nonpolar)  dapat  memisahkan  dengan baik  masing-masing  komponen  senyawa  aktif    (Lade et  al .,  2014).  Hal  ini  juga  sesuai  dengan penelitian  oleh  Dermawan et  al .  (2019)  yang  melaporkan  bahwa  kombinasi  eluen/fase  gerak nonpolar:semi-polar  yakni  kloroform:aseton  mampu  memisahkan  dengan  baik  noda/bercak komponen senyawa aktif dengan metode KLT dari ekstrak Pycnoclavella diminuta .
Masing-masing jenis eluen menunjukkan noda/bercak dengan nilai Rf yang berbeda-beda. Selanjutnya  dilakukan  pemisahan  dengan  melakukan  modifikasi  perbandingan  eluen  terbaik kloroform:etil  asetat  (6:4)  yaitu  menggunakan  tiga  jenis  rasio  eluen  sebagai  fase  gerak  yakni kombinasi  E)  kloroform:etil  asetat  (7:3),  kombinasi  F)  kloroform:etil  asetat  (8:2),  dan  kombinasi  G) kloroform:etil asetat (7:3). Hasil rasio eluen ini dapat dilihat pada Gambar 2. Berdasarkan Gambar 2 maka diperoleh kombinasi eluen/pelarut terbaik yaitu kombinasi G kloroform:etil asetat (9:1) yang menghasilkan pemisahan sempurna antarnoda/bercak warna. Terjadinya perbedaan pemisahan komponen  senyawa  aktif  disebabkan  oleh  prinsip like-dissolve-like .  Senyawa  yang  bersifat  polar akan  larut  dalam  pelarut  yang  polar,  senyawa  yang  bersifat  nonpolar  akan  larut  dalam  sistem pelarut  yang  nonpolar  dan  sebagian  besar  senyawa  yang  bersifat  polar  dan  nonpolar  memiliki kemampuan untuk larut  dalam pelarut yang bersifat semi-polar seperti etil asetat (Pandey et al ., 2013).
Nilai Rf pada hasil KLT dari fraksi G yaitu kombinasi eluen kloroform:etil asetat (9:1) memiliki pemisahan komponen  aktif  yang  cukup  baik  bila  dibandingkan  dengan  kombinasi  eluen  lainnya.  Nilai Rf diperoleh  dari  perbandingan  jarak  tempuh  antara  senyawa  dengan  jarak  tempuh  fase  gerak (eluen).  Kombinasi  eluen  kloroform:etil  asetat  (9:1)  menghasilkan  4  fraksi  dengan  nilai  Rf  yang berbeda yaitu Rf 1 (0,53) , Rf 2 (0,57) , Rf 3 (0,86) dan Rf 4 (0,93). Hasil KLT dari fraksi G dengan nilai Rf 0,53; 0,57; 0,86; dan 0,93 diduga senyawa flavonoid yang ditunjukkan warna kuning-oranye. Hal ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh Mathew dan  Lakshmanan (2012) bahwa  senyawa flavonoid yang terkandung pada ekstrak Mangrove Rhizophora apiculata dan Acanthus illicifolius memiliki warna noda/bercak  kuning-oranye.  Fraksi  dideteksi  menggunakan  UV  kemudian  divisualisasi menggunakan reagen FeCl 3 untuk mendeteksi keberadaan komponen senyawa aktif flavonoid. Hal ini  sesuai  dengan  laporan  oleh  Cai  (2018)  bahwa  metode  visualisasi  hasil  KLT  untuk  senyawa golongan flavonoid dan fenol dapat menggunakan metode Ferric Chloride Spray . Reagen FeCl 3 digunakan untuk  mendeteksi  senyawa  flavonoid  yang  ditandai  dengan  adanya  spot/noda berwarna kuning-cokelat. Hasil visualisasi eluen tersebut dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 1. Hasil KLT ekstrak biomassa Spirulina platensis : (A) etil asetat:metanol:aquades (10:1.35:1), (B)  kloroform:metanol:aquades  (7:3:0.4),  (C)  etil  asetat:metanol:aquades:asam  asetat (6.5:1.5:1.5:1), dan (D) kloroform:etil asetat (6:4)
Rf 1 0,75 Rf 1 0,88 Rf 1 0,58 Rf 2 0,71 Rf 3 0,83 A B C D Rf 1 0,88 Rf 2 0,84 Rf 3 0,7
Gambar 1. Hasil KLT dengan rasio eluen terbaik ekstrak biomassa Spirulina platensis : (E) kloroform:etil asetat (7:3), (F) kloroform:etil asetat (8:2), dan (G) kloroform:etil asetat (9:1)
Gambar 2. Hasil  KLT  ekstrak  biomassa Spirulina  platensis visualisasi  dengan  reagen  FeCl 3 :  (H) kloroform:etil asetat (7:3), (I) kloroform:etil asetat (8:2), dan (J) kloroform:etil asetat (9:1)
Gambar  3  menunjukkan  bahwa  setiap  plat  KLT  yang  disemprotkan  dengan  reagen  FeCl 3 menghasilkan 3 hasil visualisasi yang berbeda yaitu Rf 2 (0,57) , Rf 3 (0,86) dan Rf 4 (0,93). Hal ini diduga karena  adanya  perbedaan  jenis  senyawa  golongan  flavonoid  yang  terkandung,  sehingga menghasilkan nilai Rf yang berbeda-beda. Pemilihan fraksi dengan pemisahan noda/bercak warna terbaik yaitu kloroform:etil asetat (9:1) fraksi 03 dengan Rf 0,86 yang diduga merupakan senyawa flavonoid dengan ditandai warna bercak/noda kuning-cokelat gelap. Hal ini sesuai dengan El-Baky et  al .  (2008)  yang  melaporkan  bahwa  noda/bercak  yang  menunjukkan  senyawa  flavonoid  dari ekstrak Spirulina maxima hasil visualisasi dengan reagen FeCl 3 berwarna dark-brown .
Komponen senyawa aktif ekstrak Spirulina sp. memiliki berbagai aktivitas farmakologis seperti antioksidan (Firdiyani et al ., 2015). Ekstrak dari bahan alam yang memiliki aktivitas antioksidan juga dapat  memiliki  potensi  aktivitas  farmakologis  lain  (Djamaludin et  al .,  2019).  Telah  dilaporkan  oleh Abdel-Moneim et  al. (2022)  bahwa  ekstrak Spirulina sp.  memliki  aktivitas  farmakologis  lain  yaitu antifungi.  Alshuniaber et  al .  (2021)  melaporkan  bahwa Spirulina  platensis yang  diekstrak  dengan kombinasi pelarut methanol-water-acetic acid (30:69:1 v/v/v) memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen penyebab food-borne diseases . Sirait et al . (2019) juga melaporkan bahwa ekstrak Spirulina memiliki  aktivitas  sebagai  antikanker  payudara  dengan  kemampuan  menginhibisi proliferasi  sel  kanker  payudara  MCF-7.  Hidayati et  al .  (2020)  menyatakan  ekstrak  aquades  dari Spirulina platensis mampu menghambat 46,12±2,03% radikal bebas, dengan kandungan total fenolik
Rf 1 0,56 Rf 2 0,67 Rf 3 0,90 Rf 4 0,92 Rf 1 0,50 Rf 2 0,56 Rf 3 0,80 Rf 4 0,84 Rf 1 0,53 Rf 2 0,57 Rf 3 0,86 Rf 4 0,93 E F G Rf 2 0,56 Rf 3 0,80 Rf 4 0,84 Rf 2 0,57 Rf 3 0,86 Rf 4 0,93 Rf 3 0,90 Rf 4 0,92 Rf 2 0,67 H I J
sebesar  26,64±0,16  mg  GAE/g  sampel  dan  didominasi  oleh  pigmen  fikosianin  0,301±0,09  mg/g. Ekstrak Spirulina sp.  juga menunjukkan  adanya  aktivitas  inhibisi  terhadap  enzim  α -amilase  (0,07 %/(min. μg )  (Scaglioni et  al .,  2018),  sehingga  dapat  dikembangkan  dalam  penelitian  terkait pengembangan anti-diabetes mellitus.
Uji aktivitas inhibisi  terhadap enzim α -glukosidase dilakukan untuk  mengetahui kemampuan ekstrak Spirulina platensis berpotensi  untuk  dikembangkan  sebagai  anti-hiperglikemik.  Pengujian dilakukan dengan menggunakan biomassa, ekstrak biomassa, fikosianin dan fraksi 03 yang diduga merupakan senyawa golongan flavonoid mengacu pada penelitian Notonegoro et al. (2018) dan konsentrasi  pengujian  masing-masing  sebesar  100,  250,  500,  750  dan  1000  ppm.  Pengujian  juga dilakukan menggunakan akarbose sebagai kontrol positif. Nilai aktivitas inhibisi terhadap enzim α - glukosidase oleh biomassa, ekstrak biomassa, fikosianin dan senyawa flavonoid dapat dilihat pada Tabel 1.
Hasil pengujian inhibisi enzim α -glukosidase menunjukkan bahwa biomassa, ekstrak biomassa, fikosianin diduga memiliki aktivitas yang lemah/rendah dalam penghambatan terhadap enzim α - glukosidase  pada  konsentrasi  100,  250,    500,    750    dan    1000  ppm.  Nilai  inhibisi  yang  dihasilkan menunjukan angka negatif pada setiap konsentrasinya.  Lemahnya  aktivitas  penghambatan terhadap  enzim α -glukosidase pada penelitian ini diduga karena bahan yang digunakan masih dalam bentuk ekstrak kasar/ crude extract . Hal ini sesuai dengan Daou et al . (2022) yang melaporkan bahwa  aktivitas  inhibisi  enzim α -glukosidase  oleh  komponen  ekstrak  kasar Tamarix  nilotica lebih lemah  dari  aktivitas  inhibisi  enzim α -glukosidase  oleh  komponen  hasil  fraksinasi,  di  mana  nilai  IC 50 komponen esktrak kasar 24, 8 μg/mL , sedangkan nilai IC 50 komponen fraksi mencapai 5, 21 μg/mL . Silva et al . (2020) juga melaporkan bahwa komponen fraksinasi dari Mouriri elliptica Martius memiliki aktivitas  penghambatan  (IC 50 )  enzim acetylcholinesterase dan α -amilase  yang  jauh  lebih  tinggi daripada  aktivitas  penghambataan  oleh  komponen  ekstrak  kasarnya.  Sehingga  perlu  dilakukan fraksinasi,  pemisahan  dan  pemurnian  senyawa  dari  ekstrak  biomassa Spirulina  platensis untuk mengetahui lebih jauh kemampuan penghambatan terhadap enzim α -glukosidase. Hal ini karena semakin murni komponen suatu senyawa, maka semakin tinggi aktivitas penghambatan atau nilai IC 50 (Bawazeer et al ., 2019).
Hasil  penelitian  AbouZid et al. (2014) menyatakan bahwa ekstrak biomassa Spirulina versicolor menggunakan etanol dengan dosis 50 mg/kg dapat menurunkan kadar glukosa dalam darah tikus sebesar 228,00±30,86 menjadi 49,94±7,70 pada konsentrasi glukosa puasa dan 274,02±27,90 menjadi 184,97±22,01  pada  konsentrasi  glukosa  2  jam.  Setyaningsih  (2015)  juga  menyatakan  bahwa biomassa  dan  fikosianin  yang  terkandung  dalam Spirulina  fusiformis sebesar  0,30  mg/g -1 dapat menurunkan  kadar  glukosa  dalam  darah  pada  tikus  sebesar  86,00±1,000  dan  84,8±1,000  pada konsentrasi glukosa 2 jam.
Senyawa  yang  terkandung  pada Spirulina  platensis yang  diduga  berperan  dalam penghambatan  terhadap aktivitas  enzim  α -glukosidase  adalah  senyawa  golongan  flavonoid. Senyawa golongan ini terkandung pada biomassa dan ekstrak kasar Spirulina . Hasil pengujian inhibisi terhadap enzim  α -glukosidase  menunjukkan  bahwa  fraksi  03  yang  diduga  merupakan  senyawa golongan  flavonoid  memiliki  kemampuan  yang  rendah untuk  menghambat  aktivitas  enzim  α - glukosidase dilihat berdasarkan  persen  nilai inhibisinya. Hal ini diduga karena senyawa golongan flavonoid yang diuji merupakan senyawa golongan flavonoid yang masih berbentuk umum yaitu masih terikat dengan gugus gula. Struktur flavonoid, posisi dan jumlah gugus OH merupakan faktor penentu untuk efek yang diinginkan seperti aktivitas penghambatan enzim a-glukosidase (Proença et al. 2017)
Proença et al. (2017) melaporkan bahwa flavonoid yang paling aktif adalah jenis quercetin dan  menunjukkan  IC 50 jauh  lebih  rendah  dibandingkan  penghambatan  a-glukosidase menggunakan acarbose. Hal ini sejalan dengan penelitian Mataputun (2013) yang menunjukkan
Tabel 1. Nilai % Inhibisi Enzim α -Glukosidase oleh Biomassa, Ekstrak Biomassa, Fikosianin dan Flavonoid
Konsentrasi (ppm) Biomassa Ekstrak Biomassa Flavonoid Fikosianin % Inhibisi 100 -0.483 -7.235 1.082 -2.664 250 -8.978 -6.546 -0.654 -10.752 500 -5.619 -6.213 0.424 -8.541 750 -4.360 -7.443 0.160 -7.989 1000 -6.747 -9.339 -1.819 -8.456
bahwa  ekstrak  kulit  batang  matoa  yang  mengandung  senyawa  golongan  flavonoid  berupa flavonol memiliki persen inhibisi terhadap enzim α -glukosidase sebesar   24,79%. Hasil uji IC 50 akarbose sebagai  standar  (kontrol  positif)  menunjukkan  nilai  IC 50 sebesar  0,246  ppm.  Akarbose  digunakan sebagai  standar  (kontrol  positif)  karena  termasuk  obat  golongan  penghambat  aktivitas  enzim α - glukosidase.

## KESIMPULAN
Hasil eluen terbaik untuk memisahkan senyawa komponen flavonoid pada Spirulina platensis menggunakan  metode  kromatografi  lapis  tipis  (KLT)/ thin  layer  chromatography (TLC)  adalah dengan kombinasi kloroform:etil asetat perbandingan 9:1 yang memiliki nilai Rf 2 0,57; Rf 3 0,86; dan Rf 4 0,93  dengan  bercak  berwarna  kuning-cokelat  gelap.  Biomassa  Spirulina,  ekstrak  biomassa, ekstrak fikosianin dan flavonoid tid ak dapat menghambat aktivitas inhibisi enzim α -glukosidase. Perlu dilakukan fraksinasi, pemisahan dan purifikasi untuk memperoleh isolat senyawa murni dari golongan flavonoid pada biomassa dan ekstrak Spirulina platensis untuk menguji lebih lanjut aktivitas inhibisi terhadap enzim α -glukosidase.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdel-Moneim, A.M.E.,  El-Saadony, M.T., Shehata, A.M., Saad, A.M., Aldhumri, S.A., Ouda, S.M., & Mesalam, N.M. (2022). Antioxidant and antimicrobial activities of Spirulina platensis extracts and biogenic selenium nanoparticles against selected pathogenic bacteria and fungi. Saudi Journal of Biological Sciences, 29(164), 1197 – 1209. doi: 10.1016/j.sjbs.2021.09.046.
AbouZid,  S.F.,  Ahmed,  O.M.,  Ahmed,  R.R.,  Mahmoud,  A.,  Abdella,  E.,  &  Ashour,  M.B.  (2014).
Antihyperglycemic  effect  of  crude  extracts  of  some  Egyptian  plants  and  algae. Journal  of Medicinal Food, 17(3), 400-406. doi: 10.1089/jmf.2013.0068
Alshuniaber, M.A., Krishnamoorthy, R., & AlQhtani, W.H. (2021). Antimicrobial activity of polyphenolic compounds from Spirulina against food-borne bacterial pathogens. Saudi Journal of Biological Sciences . 28(1), 459-464.
Bawazeer, S., Rauf, A., Shah, S.U.A., Ullah, N., Uddin, G., Khan, H., & Hadda, T.B. (2019). Antioxidant and  enzyme  inhibitory  activities  of  extracts  and  phytochemicals  isolated  from Pistacia integerrima . Journal of Medicinal and Spice Plants . 23  (2), 55-58.
Benelhadj,  S.,  Gharsallaoui,  A.,  Degraeve,  P.,  Attia,  H.,  &  Ghorbel,  D.  (2016).  Effect  of  pH  on  the functional properties of Arthrospira ( Spirulina ) platensis protein isolate. Food Chem. 194, 1056- 1063. doi: 10.1016/j.foodchem.2015.08.133.
Cai,  L.  (2018).  Thin  layer  chromatography. Curr.  Protoc.  Essent.  Lab.  Tech. 8,  6.3.1-6.3.18.  doi: 10.1002/9780470089941.et0603s08.
Daou, M., Elnaker N.A., Ochsenkühn, M.A., Amin, S.A., Yousef, A.F., & Yousef, L.F. (2022). In vitro α - glucosidase inhibitory activity of Tamarix nilotica shoot extracts and fractions. PLoS ONE . 17(3), e0264969. doi: 10.1371/journal.pone.0264969 Dermawan,  A.  M.,  Julianti,  E.,  Putra,  M.Y.,  &  Karim,  F.  (2019).  Identification  and  evaluation  of antibacterial  compounds  from  the Vibrio sp.  associated  with  the  ascidian Pycnoclavella diminuta . Pharmaceutical Sciences and Research, 6(3), 142-148.
Dinata Widnyana, B.K.D., Anggreni Dewi, A.A.M., & Antara, N.S. 2017. Pengaruh konsentrasi natrium nitrat dan natrium dehidrogen fosfat pada media Walne terhadap konsentrasi biomassa dan protein Nannocholorpsis oculata. Jurnal Rekayasa dan Manajemen Agroindustri, 5(1), 40-49. Djamaludin, H., & Chamidah, A. (2021a). Analisis komposisi asam lemak ekstrak  minyak mikroalga Spirulina sp. dengan metode ekstraksi yang berbeda. Journal of Fisheries and Marine Research. 5(2), 254 – 261. doi: 10.21776/ub.jfmr.2021.005.02.10 Djamaludin,  H.,  &  Chamidah,  A.  (2021b).  Kualitas  ekstrak  minyak  mikroalga Spirulina sp.  dengan metode ekstraksi yang berbeda. Prosiding Simposium Nasional VIII Kelautan dan Perikanan. 8, 215 – 224.
Djamaludin, H., Bintang, M., & Priosoeryanto, B. P. (2019). Cytotoxicity and antiproliferative effects of ethyl acetate fraction of Padina australis against MCM-B2 and K562 cell lines. Journal of Applied Biology and Biotechnology, 07(02), 25 – 29. doi: 10.7324/JABB.2019.70205.
El-Baky, H.H.A., El-Baz, F.K. & El-Baroty, G.S. (2008). Characterization of nutraceutical compounds in blue green alga Spirulina maxima . The Journal of Medicinal Plants Researc. 2(10), 292 – 300. Firdiyani, F., Agustini, T.W., & Ma’ruf, W. F. (2015). Ekstraksi senyawa bioaktif sebagai antioksidan alami Spirulina  platensis segar  dengan  pelarut  yang  berbeda. Jurnal  Pengolahan  Hasil  Perikanan Indonesia. 18(1), 28 – 37. doi: 10.17844/jphpi.2015.18.1.28.
Hancu, G., Fulop, E., Rusu, A., Mircia, E., & Gyeresi, A. (2011). Thin layer chromatographic separation of benzodizepine derivates. Ars. Docendi Publishing House. 20(02), 181-188.
Hidayati, J.R., Yudiati, E., Pringgenies, D., Oktaviyanti, D.T., & Kusuma, A.P. (2020). Comparative study on antioxidant activities, total phenolic compound and pigment contents of tropical Spirulina platensis , Gracilaria arcuata and Ulva lactuca extracted in different solvents polarity. E3S Web of Conferences . 147(03012), 1-9. doi: 10.1051/e3sconf/202014703012.
Kartini,  K.,  Wulandari,  W.A.,  Jayani,  N.I.E.,  &  Setiawan,  F.  (2021).  TLC-Based  fingerprinting  for Phyllanthus  niruri from  diverse  geographical  origins  in  East  and  Central  Java  Indonesia. IOP Conference  Series:  Earth  and  Environmental  Science, 948,  1 – 8.  doi:  10.1088/1755-1315/948/ 1/012003.
Lade, B.D., Patil, A.S., Paikrao, H.M., Kale, A.S. & Hire, K.K. (2014). A comprehensive working, principles and applications of thin layer chromatography, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences , 5(4), 486 – 503. Mataputun, S.P., Rorong, J.A., & Pontoh, J. (2013). Aktivitas inhibitor α -glukosidase ekstrak kulit batang matoa ( Pometia pinnata s pp.) sebagai agen antihiperglikemik. Jurnal MIPA , 2(2), 119-123. Mathew, A.K.K.S., & Lakshmanan, P.T. (2012). Flavonoids and phenolic compounds in two mangrove species and their antioxidant property. Indian Journal of Geo-Marine Sciences, 41(3), 259 – 264. Notonegoro, H., Setyaningsih, I., & Tarman, K. (2018). Kandungan senyawa aktif Spirulina platensis yang  ditumbuhkan  pada  media  walne  dengan  konsentrasi  NaNO 3 berbeda. Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, 13(2), 111 – 122.
Pandey, R., Shukla, S. S., Saraf, S., & Saraf, S. (2013). Standardization and validated high-performance thin-layer chromatographic fingerprint method for quantitative determination of plumbagin in a traditional  Indian  formulation. Journal  of  Planar  Chromatography, 26(5),  440 – 444.  doi: 10.1556/JPC.26.2013.5.9.
Proença  C, Freitas  M, Ribeiro  D, Oliveira  E.F.T, Sousa  J.L.C, Tomé  S.M, Ramos  M.J, Silva  A.M.S, Fernandes P.A., & Fernandes E. (2017). α -Glucosidase inhibition by flavonoids: an in vitro and in silico structure – activity relationship study. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 32(1), 1216-1228. doi: 10.1080/14756366.2017.1368503 Ridlo,  A.,  Sedjati,  S.,  &  Supriyantini,  E.  (2016).  Aktivitas  anti  oksidan  fikosianin  dari Spirulina sp. menggunakan  metode  transfer  elektron  dengan  DPPH  (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Jurnal Kelautan Tropis . 18(2), 58-63. doi: 10.14710/jkt.v18i2.515.
Scaglioni,  P.T.,  Quadros,  L.,  de  Paula,  M.,  Furlong,  V.B.,  Abreu,  P.C.,  &  Badiale-Furlong,  E.  (2018). Inhibition  of  enzymatic  and  oxidative  processes  by  phenolic  extracts  from Spirulina sp.  and Nannochloropsis sp. Food Technology and Biotechnology, 56(3), 344 – 353. doi: 10.17113/ftb.56. 03.18.5495
Sedjati,  S.,  Ridlo,  A.,  &  Supriyantini,  E.  (2016).  Efek  penambahan  gula  terhadap  kestabilan  warna ekstrak fikosianin Spirulina sp. Jurnal Kelautan Tropis . 18(1), 01-06. doi: 10.14710/jkt.v18i1.505.
Setyaningsih, I., Bintang, M., & Madina, N. (2015). Potentially antihyperglycemic from biomass and phycocyanin of Spirulina fusiformis voronikhin by in vivo test. Procedia Chemistry . 14, 211-215. doi: 10.1016/j.proche.2015.03.030.
Silva, L.S., Porfiro, C A., Silva, F.G., Rodrigues, A.R.S., & Pereira, P.S. (2020). Acetylcholinesterase and α -amylase inhibitors from Mouriri elliptica Martius leaf extract. Bioscience Journal, 36(2), 578-590. doi: 10.14393/BJ-v36n2a2020-42714
Sirait,  P. S.,  Setyaningsih,  I., & Tarman,  K. (2019).  Aktivitas antikanker ekstrak Spirulina yang dikultur pada media walne dan media organik. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia, 22(1), 50 – 59.
Stahl,  S.  M.  (2013). Stahl's  Essential  Psychopharmacology:  Neuroscientific  Basis  and  Practical Applications (4 th Edition). Cambridge University Press. Suharyanto,  Tri-Panji,  Permatasari,  S.,  &  Syamsu,  K.  (2014).  Produksi  S pirulina  platensis dalam fotobioreaktor  kontinyu  menggunakan  media  limbah  cair  pabrik  kelapa  sawit. Menara Perkebunan, 82(1), 1 – 9. doi: 10.22302/iribb.jur.mp.v82i1.25.