## ANALISIS BERBAGAI MACAM BIOMARKER AIR MATA DALAM DIAGNOSIS PENYAKIT MATA KERING
Muhammad Furqan, 1 Sukma Purnama Sidhi, 1 Lulu Chotim Amsari 1
1 Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatera Utara

## ABSTRAK
Pendahuluan: Diagnosis penyakit mata kering ( Dry Eye Disease / (DED) terutama pada tahap  awal  merupakan  hal  yang  penting,  tetapi  seringkali  sulit.  Hal  ini  dikarenakan kurangnya standar emas dan korelasi yang buruk antara perubahan biokimia air mata dan tanda-tanda  klinis.  Biomarker  air  mata  dinilai  dapat  digunakan  dalam  diagnosis  dan memantau  DED  karena  bersifat non  invasive ,  serta  memiliki  korelasi  yang  baik  dengan perubahan biokimia air mata dan perkembangan penyakit. Tujuan: Artikel  ini  akan  memaparkan  beberapa  biomarker  air  mata  yang  paling  penting untuk  DED  yaitu  marker  untuk  disfungsi  kelenjar  lakrimal,  inflamasi,  stres  oksidatif,  dan intoleransi lensa kontak, serta korelasinya dengan subtipe dan keparahan penyakit. Metode: Metode  yang  digunakan  adalah  studi  pustaka  dengan  menggunakan  jurnal  10 tahun terakhir yang diperoleh dari mesin pencarian seperti Sciencedirect, PubMed, Google Scholar dan ClinicalKey . Pembahasan: Biomarker  untuk  disfungsi  kelenjar  lakrimal  ditandai  dengan  perubahan kadar protein (laktoferin, lisozim, dll), neuromediator (NGF, CGRP, NPY, Serotonin), dan mucin  (MUC/  5AC);  sementara  respons  inflamasi  ditandai  dengan  perubahan  ekspresi sitokin, kemokin, MMP-9, dan albumin. Stres oksidatif ditandai dengan perubahan kadar lipid (HNE, MDA). Sementara itu intoleransi lensa kontak dihubungkan dengan perubahan secretoglobin 1D1, β2 microglobulin , lacritin , secretoglobin 1 A2 , albumin, LPRR4, LCN-1, dan PIP. Kesimpulan: MMP-9 dan kombinasi Mammaglobin B, lipophilin A, dan B2MG merupakan biomarker  dengan  sensitivitas  dan  spesifitas  tertinggi  dari  biomarker  lainnya.  Beberapa biomarker  tersebut  dapat  digunakan  untuk  mendiagnosis  DED,  membedakan  antara sindrom Sjögren DED dan sindrom non-Sjögren DED, ADDE dari EDE, serta menentukan tingkat keparahan penyakit.
Kata Kunci: Air mata, Biomarker, Penyakit mata kering

## ABSTRACT
Introduction:  The  diagnosis  of  dry  eye  disease  (DED)  especially  in  the  early  stages  is important,  but  difficult.  This  is  due  to  the  lack  of  a  gold  standard  and  a  poor  correlation between the biochemical changes in tears and clinical signs. Tear biomarkers can be used in  diagnosing  and  monitoring  DED  because  they  are  non-invasive,  and  have  a  good correlation with biochemical changes in tears and disease progression.
Purpose: This article will describe some of the most important tear biomarkers for DED, namely markers for lacrimal gland dysfunction, inflammation, oxidative stress, and contact lens intolerance, and its correlation with subtypes and disease severity.
Method: The method used is literature study using the last 10 years journals obtained from search engines such as Sciencedirect, PubMed, Google Scholar and ClinicalKey.

## Tinjauan Pustaka
Discussion:  Biomarkers  for  lacrimal  gland  dysfunction  are  characterized  by  changes  in protein levels (lactoferrin, lysozyme, etc.), neuromediators (NGF, CGRP, NPY, Serotonin), and mucin ((MUC)5AC); while the inflammatory response is characterized by changes in the  expression  of  cytokines,  chemokines,  MMP-9,  and  albumin.  Oxidative  stress  is characterized by changes in lipid levels (HNE, MDA). Meanwhile contact lens intolerance is associated with changes in 1D1- secretoglobin, β2-microglobulin, lacritin, secretoglobin 1A2, albumin, LPRR4, LCN-1, and PIP.
Conclusion: MMP-9 and  a combination of Mammaglobin-B, lipophilin-A, and  B2MG are biomarkers with the highest sensitivity and specificity of other biomarkers. Some of these biomarkers can be used to diagnose DED, differentiate between Sjögren DED syndrome and  non-Sjögren  DED  syndrome,  ADDE  from  EDE,  and  determine  the  severity  of  the disease.
Keywords: Biomarker, Dry eye disease, Tear

## 1.  PENDAHULUAN
Penyakit  mata  kering  ( Dry  Eye
Disease /  DED)  merupakan  penyakit multifaktorial  pada  permukaan  mata yang ditandai dengan hilangnya homeostasis  lapisan  air  mata  dan disertai dengan gejala-gejala pada mata. ketidakstabilan dan hiperosmolaritas lapisan air mata, inflamasi dan kerusakan permukaan mata serta kelainan neurosensorik memainkan peran dalam etiologi penyakit ini. [1]
Menurut studi epidemiologi secara global  oleh  DEWS  pada  tahun  2017, prevalensi penyakit mata kering berkisar antara  5-50%. [2] Sedangkan  menurut data National  Health  and  Wellness Survey tahun  2013 , sekitar  16,4  juta penduduk  dewasa  USA  menderita mata kering.  Prevalensi  ini  meningkat  seiring bertambahnya usia dan lebih tinggi pada wanita  (11,1  juta  kasus)  dibandingkan dengan pria (5,3 juta kasus). [3]
Berdasarkan etiopatologi, penyakit mata kering dapat diklasifikasikan menjadi dua yaitu Aqueous Deficient Dry Eye (ADDE)  dan Evaporative  Dry  Eye
(EDE).  Pada  ADDE,  terjadi  penurunan sekresi kelenjar lakrimal yang
menghasilkan cairan air mata.
Sedangkan pada
EDE, terjadi
penguapan yang berlebihan dari lapisan air  mata  yang  terpapar  sementara kelenjar lakrimal berfungsi normal. [1] Penyakit  mata  kering  merupakan kondisi  umum  pada  mata  yang  memiliki dampak  tinggi  pada  fungsi  penglihatan dan kualitas hidup seseorang. [4] Namun, DED  adalah  salah  satu  penyakit  yang sering salah didiagnosis karena keterlambatan  gejala  dan  tanda-tanda klinis  serta  kurangnya  satuan  kriteria
diagnosis. [5] Selain itu, perubahan biokimia pada lapisan air mata biasanya terjadi sebelum tanda-tanda klinis terdeteksi  sehingga  dapat  diketahui bahwa gejala subjektif dan tes diagnosis yang saat ini digunakan memiliki korelasi yang  buruk. [6] Tes  rutin  seperti  tes Schirmer , Tear  Film  Break-up  Time (TBUT), dan vital staining bersifat invasif, kurang  standarisasi,  dan  hanya  spesifik untuk kasus DED yang parah. [6,7]
Oleh  karena  itu,  identifikasi  tes baru  untuk  diagnosis  dan  manajemen DED  perlu  dilakukan.  Salah  satu  jenis biomarker  yang  menjanjikan  saat  ini adalah  biomarker  air  mata  yang bersifat non-invasive dan  mempunyai  korelasi yang signifikan antara perubahan biokimia  air  mata  dan  perkembangan penyakit.  Selain  itu,  biomarker  air  mata dapat  menilai  kasus  DED  yang  ringan dan sedang. [5]
Tinjauan pustaka ini akan memaparkan  beberapa  biomarker  air mata  yang  paling  penting  pada  DED (marker  protein  untuk  disfungsi  kelenjar lakrimal, intoleransi lensa kontak, inflamasi  dan  stress  oksidatif)  dan hubungannya dengan subtipe dan keparahan penyakit.

## 2.  PEMBAHASAN
2.1  Analisis Lapisan Air Mata pada

## Penyakit Mata Kering
Analisis  lapisan  air  mata  menjadi topik hangat dalam bidang diagnosis dan prognosis pada DED karena dua alasan, yaitu  pengambilan  sampelnya  yang non invasive dan banyaknya jenis biomolekul pada  air  mata.  Telah  terbukti  bahwa kadar abnormal pada berbagai biomolekul  di  dalam  lapisan  air  mata
berhubungan dengan disfungsi permukaan mata. [8,9]
Pada  umumnya,  lapisan  air  mata tersusun  atas  3  lapisan  yaitu  lapisan lemak, aqueous , dan musin. Namun, ada bukti  bahwa  dalam  struktur  tiga  lapisan film  air  mata  yang  disebutkan  di  atas, lapisan musin memiliki gradien konsentrasi  yang  menurun  dari  epitel menuju  lapisan aqueous .  Sehingga dapat dianggap bahwa lapisan aqueous , dan  musin  merupakan  lapisan  tunggal yang  disebut  lapisan muco-aqueous . Lapisan  lemak  yang  menutupi  lapisan muco-aqueous terdiri  dari  campuran protein,  lemak,  elektrolit,  dan  molekul metabolit kecil. [8-10] Lapisan lemak berasal  dari  kelenjar  meibomian  dan kelenjar  kelopak  mata  yang  berfungsi untuk mencegah penguapan dari lapisan dibawahnya  serta  membentuk  batasan antara mata dengan lingkungan.
Sementara itu, lapisan aqueous
mengandung protein,
elektrolit,
antioksidan,  dan growth  factor yang dihasilkan  oleh  kelenjar  lakrimal  dan permukaan  mata.  Fungsi  utamanya adalah  dalam  hal  nutrisi  dan  proteksi epitel,  perlindungan  permukaan  mata serta  pemeliharaan  stabilitas  lapisan  air mata.  Lapisan  musin  yang  terdiri  atas glikoprotein  dihasilkan  oleh  sel  goblet dan sedikit kelenjar lakrimal.  Lapisan  ini sebagian diserap oleh epitel kornea yang merubah sifat hidrofobik menjadi hidrofilik  sehingga  lapisan  aqueous menyebar merata di permukaan kornea. [8,9,11]
Gambar 1. Struktur Lapisan Air Mata
Protein yang terbagi atas constitutive (sig A), regulated (lysozyme, lactoferrin,  lipocalin)  dan serum-derived
(albumin), membentuk lapisan aqueous. [11] Proporsi protein yang berasal  dari  plasma  dan  konjungtiva berhubungan  dengan  rata-rata  aliran  air mata dan tingkatan stimulasi permukaan mata. [12] Banyak gelforming dan transmembrane mucins telah diidentifikasi  (seperti soluble MUC5AC dan transmembrane MUC1 dan MUC16) di  lapisan muco-aqueous ,  berperan utama  dalam  proteksi,  lubrikasi,  hidrasi, dan  pembentukan  lapisan  barrier. [8] Penurunan  kadar  mucin  air  mata  dan perubahan jalur glycosylation adalah hal yang umum terjadi pada DED. [13]

## 2.2  Metode Pengumpulan Air Mata
Metode pengumpulan air mata yang umum  digunakan  yaitu:  pengumpulan dengan Schirmer  strips ,  spons  atau corong  yang  diposisikan  di  meniskus konjungtiva  dan  pengumpulan  dengan gelas kapiler atau mikropipet. [8,9] Walaupun Schirmer strips nyaman digunakan  oleh  pasien  namun,  memiliki kekurangan dalam penyimpanan protein terutama serum  derived  (albumin) dan protein  dengan  berat  molekul  <40KDa ( lysozyme ). [8,9,11,17] Karena  pengaruh terhadap  profil  protein,  penggunaan gelas  kapiler  merupakan  metode  yang diunggulkan  untuk  analisis  protein. Sementara  itu,  penggunaan Schirmer strip hanya  direkomendasikan  pada analisis sitokin. [8,16] Analisis protein air mata menggunakan agarose gel electrophoresis diketahui tidak dipengaruhi oleh jenis air mata baik itu air mata  pada  mata  tertutup,  basal,  dan  air mata  dengan  refleks. [14] Air  mata  yang telah dikumpulkan akan dianalisa dengan berbagai teknologi yang tersedia sekarang yaitu agarose gel electrophoresis, enzyme-linked immunosorbent assay, mass- spectrometry  based  proteomic  analysis, dan the  innovative  multiplex  bead analysis. [8,14]
2.3  Biomarker Air Mata pada Penyakit Mata Kering
2.3.1  Biomarker Protein Terdapat dua biomarker tradisional yang telah diterima secara umum untuk DED yaitu:
a.  Laktoferin Laktoferin yang juga dikenal sebagai laktotransferin,  adalah  protein  pengikat zat  besi non  heme dari  keluarga transferrin.
Laktoferin merupakan glikoprotein  globular  dengan  massa molekul sekitar 80 kDa yang terdapat  di berbagai  cairan  sekretori,  seperti  ASI, saliva,  air  mata,  dan  sekresi  hidung. Laktoferin  adalah  salah  satu  komponen kekebalan  tubuh  sistem  tubuh  yang memiliki  aktivitas  antimikroba,  antivirus, antiparasit,  katalitik,  imunomodulator, dan antiinflamasi. [15] Laktoferin ditemukan  berkorelasi  negatif  dengan pewarnaan Rose Bengal, hal ini menunjukkan bahwa penurunan laktoferin  adalah  penanda  kerusakan permukaan  mata. [16] Namun, pada  mata kering  dengan  tipe evaporative dengan tidak  adanya  defek  pada  sel  epitel, laktoferin  pada  air  mata  juga  ditemukan berkurang. [17] Penggunaan  laktoferin  dalam  air mata  telah  dianjurkan  untuk  diagnosis sindrom Sjogren primer (SS), di mana tes ini memiliki spesifisitas 95% dan sensitivitas  72%. [16] nilai  ini  sedikit  lebih tinggi daripada hanya menggunakan tes schirmer  I  untuk  deteksi  penyakit  ini. [16] Para peneliti telah menyarankan nilai cut- off 1,1  mg  /  mL  untuk  diagnosis  DED dengan akurasi yang optimal [5,16] . Menggunakan  nilai cut-off tersebut,  tes ini  dapat  mendeteksi  DED  dengan sensitivitas 79,4% dan spesifisitas 78,3%. [5,16]
b.  Lisozim Lisozim merupakan protein yang juga dikenal  sebagai muramidase atau N- acetylmuramide glycanhydrolase .
Protein  ini  termasuk  enzim  golongan glikosida  hidrolase  yang  dapat  merusak dinding sel bakteri dengan mengkatalisis hidrolisis ikatan beta-1,4-glikosida antara residu  asam  N-asetillamatamat  dan  N- asetil-D glukosamin dalam peptidoglikan.
Lisozim  berlimpah  dalam  sejumlah sekresi, seperti air mata, saliva, ASI, dan mukus. [18]
Lisozim  mungkin  merupakan  protein air  mata  yang  paling  awal  dipelajari dalam hubungannya dengan mata kering, dan kadar lisozim dalam air mata diketahui  meningkat  sampai  usia  40 tahun dan menurun setelahnya. [16] Kadar lisozim ditemukan menurun pada pasien glaukoma  dengan  kondisi  mata  kering akibat  pengobatan  kronik. [5,16] selain  itu, kadar  lisozim  juga  ditemukan  menurun pada  pasien  mata  kering  idiopatik  dan SS. [16] Pada  penelitian  besar  dengan subjek  sebanyak  262  pasien  (78  pasien SS),  diketahui  nilai cut-off lisozim sebesar 0,9 mg/ml dengan nilai spesifitas 96,9%  dan  sensitivitas  25%  dalam diagnosis  DED. [16] Meskipun  beberapa penelitian  menunjukkan  bahwa  kadar lisozim  dalam  air  mata  tidak  berbeda antara  sindrom  Sjögren,  sindrom  DED dan kontrol. biomarker ini dapat berguna untuk memantau efek samping dari obat penghambat  reseptor  beta  adrenergik seperti  Practalol  atau  untuk  mendeteksi mata  kering  akibat  paparan  pada pekerjaan tertentu
seperti di pertambangan batu bara. [5,16,19]
Laktoferin dan lisozim adalah produk utama  kelenjar  lakrimal.  Penurunan kadar  kedua  protein  tersebut  dikaitkan dengan  disfungsi  kelenjar  lakrimal, kerusakan  permukaan  mata,  reaksi inflamasi,  kapasitas  antioksidan  yang rendah,  dan  aktivitas  antimikroba  yang rendah  (terutama  lisozim). [5] Penurunan kadar  kedua  protein  tersebut  pada pasien DED menunjukkan bahwa penentuan  kadar  laktoferin  dan  lisozim dapat  diusulkan  menjadi  salah  satu  tes objektif untuk diagnosis DED. [20]

## 2.3.2  Biomarker Protein Lainnya
Para  peneliti  telah  melakukan analisis  proteomik  air  mata  untuk menentukan protein yang secara spesifik terkait
DED.
Sebagai contoh, pendekatan proteomik untuk mendeteksi biomarker  DED  pada  cairan  air  mata dilakukan  oleh  Aluru et  al. melalui elektroforesis  2D  dan  diferensiasi  gel elektroforesis  (DIGE).  Pada  penelitian
tersebut  ditemukan Lacrimal  Proline- Rich Protein 4 (LPRR4) secara signifikan menurun  pada  beberapa  tipe  DED. [21] Berdasarkan  ekspresi  diferensial  dan korelasi  kadar  air  mata  LPRR4  dengan tingkat  keparahan  penyakit,  protein  ini telah diusulkan sebagai biomarker potensial  pada  DED.                Penelitian selanjutnya menemukan beberapa protein  yaitu calgranulin  A/1008,  α-1
antitrypsin yang  ditemukan  meningkat pada  air  mata  pasien  DED  dan  protein LPRR3, LPRR4 , nasopharyngeal carcinoma-associated PRP 4 dan antitrypsin α-1 yang ditemukan menurun
pada DED. protein ini memiliki sensitivitas  dan  spesifitas  90%  ketika digunakan bersama jaringan saraf buatan. [20] Zhou et al berhasil mengidentifikasi 6 protein  yang  mengalami  peningkatan pada pasien DED dengan menggunakan metode  proteomik  kuantitatif  iTRAQ, ditambah dengan 2D nano-LC-nano-ESI- MS  /  MS.  Protein  itu  terdiri  dari α- enolase,  α-1  asam  glikoprotein  1,  S100 A8/calgranulin  A,  S100  A9 / calgranulin B, S100 A4 dan S100 A11 (calgizzarin) ,
serta  4  protein  yang  menurun  yaitu Prolactin-Inducible Protein (PIP), lipocalin-1 (LCN-1), laktoferin dan lisozim. Dengan menggunakan 4
biomarker  protein  yaitu α-enolase, PIP, LCN-1 dan  S100  A9 / calgranulin  B , kelompok ini memperoleh akurasi diagnosis  untuk  DED  sebesar  96% (sensitivitas 91% dan spesifitas 90%). [22]
Selanjutnya  Tong et  al menemukan bahwa S100 A8 / calgranulin A dan S100 A9  /  calgranulin  B berkorelasi  dengan keparahan penyakit. [23] Pada tahun 2013, Boehm et  al .  menganalisis  pola  protein air mata pasien DED dengan memasukkan  berbagai  fenotipe  klinis, seperti aqueous-deficient dry eye , (DRYaq), lipid-deficient dry eye (DRYlip) dan  kombinasi  keduanya  (DRYaqlip), untuk  menguji  pengaruhnya  terhadap komposisi  protein  film  air  mata.  Dengan menggunakan surface-enhanced  laser desorption
/ionisation-time-of-flight
(SELDI-TOF)  / matrix-assisted  laser desorption/ ionisation-time-of-flight (MALDI-TOF) mass  spectrometry  (MS)- based strategy untuk mendeteksi
kandidat  biomarker,  diikuti  oleh  studi penemuan  (studi  1)  dan  studi  validasi (studi  2),  hasil  mereka  menunjukkan bahwa LPRR4 dalam air mata berkurang pada  pasien  DRYaq  dan  DRYaqlip, dibandingkan  dengan  subyek  sehat. Selain  itu,  prekursor mammaglobin  B, lipophilin  A , S100A8 / calgranulin dan beta-2  microglobulin (B2M)  meningkat pada subkelompok ini. Dengan menggunakan set enam protein biomarker  ini,  mereka  memperoleh sensitivitas dan spesifisitas hampir 100% untuk pasien DRYaq dan DRYaqlip (nilai AUC = 1). [24]
Soria et  al, menemukan  beberapa marker  yaitu  S100A6, annexin A1, annexin A11, cystatin  S (CST4)  dan protein  aktifasi fosfolipase A2  (PLAA), dengan  area  di  bawah  kurva  ROC ≥97,7% (sensitivitas ≥94,3%; spesifisitas ≥97,6%)  untuk  DED  dibandingkan kontrol.  Marker  ini  dapat  membedakan DED,  MGD,  dan kontrol dengan akurasi sebesar 73,2% antara semua kelompok. [25] Versura et  al, juga  telah mengusulkan  panel  marker  protein  lain untuk  diagnosis  DED  yaitu  dengan mengukur  transferin,  LCN-1  dan  protein total.  Panel  ini memiliki sensitivitas 96% dan spesifitas 98%. [26]
Jenis  protein  lain  juga  telah  diukur dalam  air  mata  pasien  DED.  Misalnya, kadar  protein  mucin  (MUC)  5AC  telah terbukti berkurang secara signifikan pada air  mata  pasien  dengan  SS.  Guo et  al . mengukur malat dehidrogenase (MDH) 2 pada  air  mata  pasien  DED  ringan. Mereka  menemukan  bahwa  aktivitas MDH2  dalam  kelompok  DED  meningkat secara  signifikan  dibandingkan  dengan kelompok  kontrol.  Kelompok  ini  juga ditemukan  berkorelasi  negatif  secara signifikan  dari  MDH2  air  mata  dengan parameter  klinis,  seperti  produksi  air mata  dan  nilai  kualitas  air  mata,  dan berkorelasi positif dengan gejala nyeri. [27] Baru-baru  ini,  sebuah  protein  baru  dari film  air  mata  milik  keluarga  protein surfaktan, palate  lung  nasal  clone (PLUNC),  telah  ditemukan  meningkat dalam air mata pasien DED. [28] Neuromediator, seperti zat P, calcitonin  generelated  peptide (CGRP), neuropeptide  Y (NPY), vasointestinal
peptide (VIP)  dan neural  growth  factor (NGF),  juga  telah  ditentukan  dalam  air mata  pasien  DED  dan  berkorelasi dengan temuan klinis. [29] Secara khusus, kadar  NGF  dalam  air  mata  ditemukan meningkat secara signifikan pada pasien DED,  sedangkan  CGRP  dan  NPY menurun secara signifikan, dibandingkan dengan  subjek  sehat.  Kadar  NGF berkorelasi langsung dengan keparahan DED  sedangkan  CGRP  dan  NPY berbanding  terbalik  dengan  keparahan DED. [29] Kemudian  dalam  penelitian terbaru  oleh  Chhadva et  al .  konsentrasi serotonin dalam air mata telah berkorelasi dengan aspek pada DED dan telah  ditemukan  secara  signifikan  lebih tinggi pada pasien DED yang menunjukkan gejala DED dengan aqueous  tear  deficiency ,  dibandingkan dengan pasien yang memiliki gejala DED tetapi produksi air mata normal. [30]

## 2.3.3  Biomarker Inflamasi
Identifikasi biomarker untuk memantau  reaksi  inflamasi  permukaan mata tidak hanya meningkatkan diagnosis  DED,  klasifikasi  keparahan penyakit  dan  hasil  terapi,  tetapi  juga memberikan arahan penting untuk mengembangkan perawatan
antiinflamasi  yang  efektif  untuk  pasien dengan DED. [31] Dalam  1-2  dekade  terakhir,  uji multiple bead assays telah memfasilitasi identifikasi berbagai sitokin, kemokin dan reseptor  kemokin  sebagai  biomarker  air mata pada DED. Peningkatan kadar IL-2, IL-4,  IL-5,  IL-6,  IL-8,  IL-10,  IL-12,  IL-13, IL-17,  IL-21, interferon (IFN)  - γ, tumor necrosis  factor (TNF)  - α,  CXCL9, CXCL10,  CXCL11,  IL-1Ra,  CCL5  / RANTES,  dan fractalkine /  CX3CL1 adalah  temuan  umum  pada  DED. [16,20]
Peningkatan level
ini terutama disebabkan  oleh  peningkatan  regulasi gen inflamasi pada epitel konjungtiva. [20]
Level  sitokin  /  kemokin  tampaknya berkorelasi dengan tipe DED dan tingkat keparahannya. Dengan demikian, IL-17, IL-22, IL-6, IL-10, IL-4, IFN- γ, dan TNF-α meningkat  pada  sindrom  Sjögren  DED dibandingkan  dengan  sindrom  non- Sjögren  DED. [16] Level  TNF- α, IL-6,  dan
IL- 1β yang lebih tinggi telah ditemukan di ADDE  dan  DED  campuran  daripada  di subtipe EDE. [24]
Ekspresi  MMP-9,  protease  yang terlibat dalam induksi kerusakan permukaan  mata  dan  sinyal  inflamasi juga ditemukan meningkat secara signifikan dalam air mata pasien dengan DED. [7,16] Namun,  peningkatan  aktivitas MMP-9  tidak  spesifik  untuk  DED, dilaporkan  juga  dalam  acanthamoeba  / keratitis  herpes  dan  rosacea  okular. [7] Dengan  demikian,  Ekspresi  MMP-9 dalam  air  mata  pasien  dengan  DED tampaknya  mewakili  kerusakan  jaringan okular  spesifik  atau  remodeling,  dan tidak  dapat  digunakan  sebagai  alat diagnostik  untuk  DED. [7] Level  MMP-9 telah terbukti berkorelasi dengan tingkat keparahan penyakit, dan oleh karena itu dapat digunakan sebagai alat pemantauan.  Ini  dibuktikan  dengan pengembangan  tes  diagnostik  rujukan cepat  untuk  MMP-9  pada  air  mata (InflammaDry®,  Quidel,  San  Diego,  CA, USA),  yang  telah  tersedia  secara komersial,  mampu  mendeteksi  kadar MMP-9> 40 ng / mL dengan sensitivitas dan spesifisitas yang ditunjukkan masing-masing 85% dan 94%. [8]

## 2.3.4  Biomarker Stres Oksidatif
Faktor lingkungan (polutan, radiasi ultraviolet  dan  ozon),  terapi  kronis dengan obat tetes mata yang diawetkan pada  glaukoma,  reaksi  inflamasi  dan penurunan protein antioksidan (laktoferin dan  lisozim)  merupakan  kontributor utama  terhadap  stres  oksidatif  pada permukaan  mata. [32] Level  tinggi  dari marker peroksidasi lipid akhir 4-hydroxy- 2-nonenal dan malondialdehyde telah dilaporkan dalam lapisan air mata pasien dengan  DED  sebagai  indikator  untuk kerusakan  oksidatif,  berkorelasi  dengan baik dengan parameter permukaan mata (TBUT, tes Schirmer , sensitivitas kornea). [33] Selain  itu,  laktoferin,  protein
S100A,
superoksida dismutase, peroksidase, katalase dan enzim oksidatif  mitokondria  dianggap  sebagai marker  pertahanan  antioksidan  yang paling  penting  dalam  DED.  Meskipun
biomarker  ini  dapat  digunakan  untuk diagnosis DED, sensitivitas untuk membedakan  antara  ADDE  dan  EDE rendah. [34]

## 2.3.5  Biomarker untuk Intoleransi Kontak
Mata  kering  terkait  lensa  kontak dan  intoleransi  lensa  kontak  adalah komplikasi  yang  paling  umum  di  antara pemakai lensa kontak. [11,12] Sebagai hasil dari  tindakan  gabungan  dari  lensa  dan faktor  lingkungan  (aliran  udara  tinggi atau  kelembaban  rendah),  lensa  kontak memiliki  kemungkinan besar  untuk mengubah struktur dan stabilitas film air mata,  yang  mengarah  ke  DED  oleh banyak mekanisme potensial (penguapan  air  mata  yang  meningkat dan  hiperosmolaritas,  dehidrasi  lensa, peradangan  atau  pengembunan  terkait dengan kurangnya biokompatibilitas permukaan lensa) . [35] Selanjutnya, DED yang  dihasilkan  atau  yang  sudah  ada sebelumnya dapat menyebabkan intoleransi lensa kontak. Walaupun  kestabilan  lapisan  air mata,  volume  air  mata,  dan  gejala lainnya  diakui  sebagai  variabel  terbaik untuk intoleransi lensa kontak,  beberapa biomarker air mata telah terbukti membedakan antara mereka yang toleran  dan  mereka  yang  tidak  toleran terhadap lensa kontak (kadar lipokalin air mata yang tinggi dan aktivasi fosfolipase A2) . [16,36] Biomarker air mata juga dapat digunakan  sebagai  alat  potensial  untuk diagnosis lensa mata kering terkait lensa kontak, seperti penurunan kadar secretoglobin 1D1 (sedikit  berkurang pada soft  contact  lenses dan  berkurang secara signifikan pada rigid gas permeable  lenses ),  β2 microglobulin , prolin  rich  protein 4 dan lacritin ,  serta peningkatan  kadar  protein  S100A8 dalam soft contact lenses , secretoglobin 1  A2 ,  albumin, nerve  growth factor ,  dan protein yang diinduksi prolactin. [6,16,20,35,36,37] Selain  itu,  telah dibuktikan  tidak  ada  korelasi  antara sitokin  dan  ketidaknyamanan  terkait lensa kontak. [38]

## 2.3.6  Biomarker Lainnya
Lacritin , faktor pertumbuhan spesifik yang saat dioleskan mendorong keluarnya  air  mata  basal,  kurang terdeteksi  pada  pasien  dengan  DED. [39]
Peningkatan  level  aquaporin  5  (protein integral yang terletak di kelenjar lakrimal dan epitel kornea) telah dilaporkan pada pasien  dengan  sindrom  Sjögren  DED. [5] Ini adalah hasil pelepasan aquaporin 5 ke dalam air mata ketika sel asinar kelenjar lakrimal  dirusak  oleh  infiltrasi  limfositik. Perubahan  neuromediator  air  mata  juga telah dilaporkan dalam
DED. [29]
Peningkatan  kadar nerve  growth  factor, transforming  growth  factor dan vascular endothelial growth factor, serta penurunan  kadar  peptida  terkait  gen kalsitonin,  neuropeptide  Y,  dan  EGF, semuanya  telah  disarankan.  sebagai biomarker potensial dalam DED. [16,29]
Sebuah  studi  cross-sectional  yang diterbitkan  pada  tahun  2015  oleh Chhadva et  al. melaporkan  tingkat serotonin  air  mata  yang  tinggi  pada pasien  dengan  gejala  DED  dan  ADDE, dibandingkan  dengan  mereka  yang memiliki  gejala  DED,  tetapi  produksi  air mata  normal  dan  mereka  yang  tidak memiliki gejala DED. [30]

## 3  SIMPULAN
Pada  studi  ini,  biomarker  air  mata yang penting dalam diagnosis DED telah diidentifikasi  seperti  biomarker  akibat disfungsi  kelenjar  lakrimal  yang  ditandai dengan perubahan kadar protein
(laktoferin,  lisozim,  dll),  neuromediator (NGF,  CGRP,  NPY,  Serotonin),  dan mucin ((MUC)5AC). Sementara biomarker akibat adanya reaksi inflamasi ditandai  dengan  perubahan  ekspresi sitokin,  kemokin,  MMP-9,  dan  albumin. Stres oksidatif ditandai dengan perubahan kadar lipid (HNE, MDA). Dan intoleransi lensa kontak ditandai dengan perubahan  kadar secretoglobin  1D1, β2 microglobulin , lacritin , secretoglobin  1 A2 , albumin, LPRR4, LCN-1, dan PIP. Beberapa biomarker tersebut dapat digunakan dalam diagnosis DED, namun tidak  semua  memiliki  nilai cut-off , sensitivitas  dan  spesifitas.  Biomarker tunggal  yang  memiliki  semua  hal tersebut adalah laktoferin, lisozim,
transferrin, LCN-1, albumin dan MMP-9. Tes  MMP-9  dapat  digunakan  dalam diagnosis  DED  dengan  nilai  sensitivitas dan spesifitas yang paling tinggi diantara biomarker  tunggal  lainnya  yaitu sebesar 85%  dan  94%  dengan  nilai cut-off sebesar  >40  ng/ml.  Sementara  itu, biomarker  gabungan  yang  terdiri  dari Mammaglobin B, lipophilin A, dan B2MG memiliki  nilai  sensitivitas  dan  spesifitas tertinggi yaitu mencapai hampir 100%.
Untuk diagnosis yang akurat, kadar biomarker  ini  perlu  dipertimbangkan bersama  dengan  riwayat  klinis  dan pemeriksaan  mata  lainnya.  Selain  itu, kurangnya  standarisasi,  kompleksitas prosedur  analitis,  dan  jumlah  kecil  air mata  yang  dapat  dikumpulkan  dapat membatasi  penggunaan  biomarker  ini dalam praktik klinis.

## 4  SARAN
Diperlukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai nilai cut-off
biomarker,
standarisasi pengumpulan dan
penyimpanan  air  mata,  serta  studi tentang  biomarker  lainnya  pada  lapisan air mata.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih kepada  kedua  orang  tua  penulis  dan teman-teman  SCORE  PEMA  FK  USU yang telah memberikan dukungan selama  penyusunan  manuskrip  tinjauan pustaka ini.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Craig  JP,  Nelson  JD,  Azar  DT, Belmonte  C,  Bron  AJ,  Chauhan SK, et al . "TFOS DEWS II Report Executive  Summary". Ocul  Surf . 2017;15(4):802 –12.
2. Stapleton F, Alves M, Bunya VY, Jalbert I, Lekhanont K, Malet F, et al ."TFOS  DEWS  II  Epidemiology Report". Ocul Surf . 2017;15(3):334 –65. 3. Farrand  KF, Fridman M, Stillman IÖ, Schaumberg DA. "Prevalence of Diagnosed Dry Eye Disease in the United  States  Among  Adults
Aged 18 Years and Older". Am J
Ophthalmol . 2017;182:90 –8.
4. Gayton JL. "Etiology, prevalence,
and treatment of dry eye disease". Clin Ophthalmol . 2009;3(1):405 –12. 5. Chiva A. "Tear Biomarkers in Dry
Eye  Disease". Eur  Ophthalmic Rev . 2019;13(1):21. 6. Chiva  A.  "Dry  Eye  and  Clinical Disease of Tear Film – Diagnosis and Management". Eur Ophthalmic Rev . 2014;08(01):8. 7. Bron  AJ,  Tomlinson  A,  Foulks GN,  Pepose  JS,  Baudouin  C, Geerling G, et al . "Rethinking dry eye  disease:  A  perspective  on clinical  implications". Ocul  Surf .
2014;12(3):231. 8. Willcox MDP, Argueso P, Georgiev GA, et al . "TFOS DEWS II  tearfilm  report". Ocul  Surf .
2017;15:366 –403. 9. Versura P, Campos EC. "Update on human tear proteome".
European  Ophthalmic  Review .
2013;7:36 –41.
10. Craig JP, Nelson JD, Azar DT, et al .  "TFOS  DEWS  II  report executive  summary". Ocul  Surf . 2017;15:802 –12.
11. Nichols  JJ,  Wilcox  MD,  Bron  AJ,
et  al .  "The  TFOS  international workshop on contact lens discomfort:  executive  summary". Invest Ophthalmol Vis Sci . 2013;54:TFOS7 –13. 12. Alipour F, Khaheshi S, Soleimanzadeh M, et al . "Contact lens-related complications: a review". J  Ophthalmic  Vis  Res . 2017;12:193 –204.
13. Stephens  DN,  McNamara  NA.
"Altered  mucin  and  glycoprotein expression  in  dry  eye  disease".
Ophtom Vis Sci . 2015;92:931 –8.
14. Chiva  A.  "Dry  eye  and  clinical disease of tear film, diagnosis and management". European
Ophthalmic  Review .  2014;8:8 –
12.
15. González-Chávez  SA,  Arévalo- Gallegos  S,  Rascón-Cruz  Q. "Lactoferrin:  structure,  function
and applications". Int J Antimicrob Agents . 2009;33(4):301.
16. D’Souza  S,  Tong  L.  "Practical issues  concerning  tear  protein assays  in  dry  eye". Eye  Vis . 2014;1(1):1 –12. 17. Versura  P, Nanni  P, Bavelloni A, Blalock WL, Piazzi M, Roda A, et al ."Tear proteomics in evaporative dry eye disease". Eye Vis . 2010;24(8):1396 –402.
18. Callewaert L, Michiels CW.
"Lysozymes in the animal kingdom". J Biosci . 2010;35(1):127 –60.
19. Sun Z, Hong J, Liu Z, Jin X, Gu C. "Coal dust contiguity-induced changes  in  the  concentration  of TNF- and NF- B p65 on the ocular surface". Ocul  Immunol  Inflamm . 2009;17(2):76 –82.
20. Hagan S, Martin  E,  Enríquez-de- Salamanca A. "Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive and personalised  medicine". EPMA  J
2016;7(1):1 –20.
21. Aluru  SV,  Agarwal  S,  Srinivasan B, Iyer GK, Rajappa SM, Tatu U, et  al .  "Lacrimal  Proline  Rich  4 (LPRR4) Protein in the Tear Fluid Is  a  Potential  Biomarker  of  Dry Eye  Syndrome". PLoS  One . 2012;7(12):1 –9.
22. Zhou  L,  Beuerman  RW,  Chan CM,  Zhao  SZ,  Li  XR,  Yang  H, Tong  L, Liu  S,  Stern  ME,  Tan D.
"Identification of tear fluid biomarkers  in  dry  eye  syndrome using iTRAQ quantitative proteomics". J  Proteome  Res . 2009;8:4889 –905.
23. Tong  L,  Zhou  L,  Beuerman  RW, Zhao  SZ,  Li  XR.  "Association  of tear  proteins  with  Meibomian gland  disease  and  dry  eye symptoms". Br  J  Ophthalmol . 2011;95:848 –52.
24. Boehm  N,  Funke  S,  Wiegand  M, Wehrwein N, Pfeiffer N, Grus FH. "Alterations  in  the  tear  proteome
of  dry  eye  patients —a  matter  of the  clinical  phenotype". Invest Ophthalmol Vis Sci . 2013;54:2385 –92. 25. Soria  J,  Durán  JA,  Etxebarria  J, Merayo  J,  González  N,  Reigada R,  García  I,  Acera  A,  Suárez  T.
"Tear  proteome  and  protein network  analyses  reveal  a  novel pentamarker  panel  for  tear  film characterization  in  dry  eye  and meibomian  gland  dysfunction". J Proteomics . 2013;78:94 –112. 26. Versura P, Bavelloni A, Grillini M, Fresina M, Campos EC. "Diagnostic performance of a tear protein  panel  in  early  dry  eye".
Mol Vis . 2013;19:1247 –57.
27. Guo Q, Huang H, Pi Y, Zhang H.
"Evaluation of tear malate dehydrogenase 2 in mild dry eye disease". Eye Sci . 2014;29(4):204 –8.
28. Schicht  M,  Rausch  F,  Beron  M, Jacobi  C,  Garreis  F,  Hartjen  N, Beileke  S,  Kruse  F,  Bräuer  L,
Paulsen  F.  "Palate  lung  nasal clone (PLUNC), a novel protein of the  tear  film:  three-dimensional structure, immune activation, and involvement  in  dry  eye  disease (DED)". Invest  Ophthalmol  Vis Sci. 2015; 56(12):7312 –23.
29. Lambiase  A,  Micera  A,  Sacchetti M, Cortes M, Mantelli F, Bonini S. "Alterations of tear neuromediators in dry eye disease". Arch Ophthalmol . 2011;129:981 –6.
30. Chhadva P, Lee T, Sarantopoulos CD,  Hackam  AS,  McClellan  AL,
Felix  ER,  Levitt  RC,  Galor  A. "Human  tear  serotonin  levels correlate  with  symptoms  and signs of dry eye. Ophthalmology".
2015;122(8):1675 –80.
31. Wei  Y,  Asbell  PA.  "The  core mechanism  of  dry  eye  disease (DED)  is  inflammation". Eye
Contact Lens . 2014;40:248 –56.
32.
Seens  S,  Tong  L. “Dry  eye disease  and  oxidative  stress ”.
Acta Ophthalmol . 2018;96:e412 –
20.
33. Choi  W,  Lian  C,  Ying  L, et  al . “Expression  of lipid  peroxidation markers  in  tear  film  and  ocular surface  of  patients  with  non- Sjogren syndrome: potential biomarkers for dry eye disease ”. Curr Eye Res . 2016;41:1143 –9. 34. Labbe  A,  Brignole-Baudouin  F, Baudouin  C. “Ocular  surface investigation  in  dry  eye ”. J  Fr Ophthalmol . 2007;30:76 –97. 35. Chiva A. “Electrophoresis of tear proteins as a new diagnostic tool for  two  high  risk  groups  for  dry eye: computer users and contact lens  wearers ”. J  Med  Life . 2011;4:228 –33.
36. Kramann N,Boehm N, Lorenz K,
et  al . “Effects  of  contact  lenses on the protein composition in tear film: a ProteinChip study ”. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol . 2011;249:233 –43.
37. Glasson  MJ,  Stapleton  F,  Keay L, et  al . “Differences  in  clinical parameters  and  tear  film  of tolerant  and  intolerant  contact lens wearers ”. Invest Opt Vis Sci .
2003;44:5116 –24.
38. Wilcox  MD. “Is  there  a  role  for inflammation  in  contact  lens discomfort? ”. Eye  Contact  Lens . 2017;43:5 –16.
39. Still  KM,  Soyars  CL,  Velez  F, et al . “Development  of  quantitative sandwich ELISAs for lacritin and
the  lacritin-c  splice  variant  in human  tears ”. Invest  Ophthalmol
Vis Sci . 2012;53:4233. 40. Massingale ML, Li X, Vallabhajosyula M, Chen D, Wei
Y,  Asbell  PA. “Analysis  of inflammatory  cytokines  in  the tears  of  dry  eye  patients ”. Cornea . 2009; 28(9):1023 –7.
41. Yoon KC, Park CS, You IC, Choi
HJ,  Lee  KH,  Im  SK,  Park  HY, Pflugfelder  SC. “Expression  of CXCL9, −10, −11, and CXCR3 in the tear film and ocular surface of patients with dry eye syndrome ”.
Invest Ophthalmol Vis Sci .
2010;51(2):643 –50 . 42. Sambursky R, Davitt WF,
Latkany  R,  Tauber  S,  Starr  C, Friedberg  M,  et  al. “Sensitivity and  specificity  of a  point-of-care matrix metalloproteinase 9 immunoassay  for  diagnosing inflammation related to dry eye ”. Arch Ophthalmol . 2013;131(1):24 –8.
Tabel 1. Rangkuman Biomarker Cairan Air Mata dalam Diagnosis Penyakit Mata Kering
Tipe molekul Biomarker air mata Metode Jumlah subjek Nilai cut-off Sensitivita s Spesifitas Sensitivitas gabungan Spesifitas gabungan p- value Ref. Protein Lactoferrin Electrophores is 250 1,1 mg/ml 79,4% 78,3% NA NA <0,01 [16] SDS-PAGE 262 1,1 mg/ml 28,6% 90,6% <0,00 01 [20] Lysozyme SDS-PAGE 262 0,9 mg/ml 25,0% 96,9% NA NA <0,00 01 [20] LPRR3, LPRR4, nasopharyngea l carcinoma- associated PRP 4, α-1 antitrypsin, calgranulin A SELDI-TOF- MS Protein chip arrays 159 NA NA NA 90% 90% <0,01 [5,20] α-enolase, PIP, LCN-1, calgranulin B iTRAQ, ditambah dengan 2D nano-LC- nano-ESI-MS / MS 56 1,2 (DE:C) 0,8 (DE:C) , NA, NA 77%, 71,7%, NA, NA 88,5%, 87,1%, NA, NA 91% 90% <0,01 [22,23 ] Mammaglobin B, lipophilin A, B2MG SELDI-TOF- MS/MALDI- TOF-MS 169 NA NA NA ~100% ~100% < 3.0E- 05 [24] S100A6, annexin A1, annexin A11, CST4, PLAA 2D Gel Electrophores is 144 NA 93,8%, 92%, 84%, 90,2%, 94,2% 84,8%, 85,6%, 61,6%, 27,2%, 88% 94,3% 97,6% NA [25] Transferrin protein 230 kit 160 ≤0,3 mg / ml 70,8% 96,7% 98% 96% NA [26] LCN-1 ≤1,1 mg / ml 65,5% 94,9% MMP-9 InflammaDry 206 > 40 ng/ml 85% 94% NA NA < 0,001 [42] MDH 2 Electrophores is 15 NA NA NA NA NA <0.01 [27] PLUNC ELISA 39 NA NA NA NA NA <0.00 5 [28] Albumin protein 230 kit 205 > 10% vs TP 42,5% 90,9% NA NA <0.00 01 [26] neuromediato r
NGF
ELISA 19
NA
NA
NA
NA NA
0,02
[29] CGRP 0,001 NPY 0,01 Serotonin 62 0,01 Mucins (MUC)5AC ELISA 28 NA NA NA NA NA 0,02 [20] Lipid HNE, MDA ELISA 77 NA NA NA NA NA <0,01 [33]
Cytokines IL-6, IL-2, IL-5, IFN- γ, IL-5, IL- 10, IL-8 Immunologica l Assay 14 NA NA NA NA NA 0.001 [40] IL- 1β, TNF-α, IL-4 NA NA 0.01 [40] Chemokines CXCL-9, CXCL-10, CXCL-11, CXCR-3 ELISA 33 NA NA NA NA NA 0.01 [41]
Tabel 2. Potensi Biomarker pada Penyakit Mata Kering dan Kemampuannya untuk Membedakan antara Penyakit Mata Kering Sindrom Sjögren / Sindrom Non-Sjögren  dan Subtipe Penyakit.
Tipe molekul Biomarker air mata Perubahan pada DED perbedaan antara SS dan non SS DED Perbedaan antara subtipe DED Intoleransi Lensa Kontak Ref. Disfungsi kelenjar lakrimal Protein Lactoferrin ↓ ↓ pada SS-DED ↓ pada ADDE, MGD [16, 20] Lysozyme ↓ ↓ pada SS-DED ↓ pada ADDE [20] LPRR3 ↓ tidak tidak [5,2 0] LPRR4, lacritin ↓ ↓ pada SS-DED ↓ pada ADDE, MGD ↓ nasopharyngeal carcinoma- associated PRP 4 ↓ tidak tidak α-1 antitrypsin ↑ tidak tidak calgranulin A ↑ ↑ pada SS-DED ↑ pada ADDE, MGD α-enolase ↑ tidak ↑ pada ADDE, MGD [22, 23] PIP ↓ ↓ pada SS-DED ↓ pada ADDE ↑ LCN-1 ↑/↓ ↓ pada SS-DED ↑/↓ pada ADDE, menurun pada MGD ↑ calgranulin B ↑ ↑ pada SS-DED ↑ pada ADDE, MGD Mammaglobin B, lipophilin A, B2M ↑ tidak ↑/↓ pada ADDE ↓ [24] S100A6 ↑ ↑ pada SS-DED ↑ pada ADDE [25]
annexin A1
↑ ↑ pada SS-DED ↑ pada ADDE annexin A11 ↑ ↑ pada SS-DED ↑ pada ADDE CST4 ↓ ↓ pada SS-DED ↓ pada ADDE, MGD PLAA ↑ tidak ↑ pada ADDE Transferrin ↓ ↑ pada SS-DED ↑/↓ pada ADDE, meningkat pada MGD [26] Secretoglobin family 1D member 1 ↑/↓ tidak ↑/↓ pada ADDE ↓ [5,3 8] Secretoglobin family 2A member 2 ↓ tidak ↓ pada ADDE ↑ MDH 2 ↑ tidak tidak [27] PLUNC ↑ tidak tidak [28] Neuromedia tor
NGF
↑ tidak
↑ pada ADDE
[29] CGRP ↓ ↓ pada non SS-DED ↓ pada ADDE NPY ↓ ↓ pada SS-DED ↑ pada EDE Serotonin ↑ tidak ↓ pada ADDE [30]
Mucins (MUC)5AC ↓ ↑/↓ pada SS-DED ↓ pada ADDE [20] Stres oksidatif Lipid HNE,MDA ↑ tidak tidak [33] Inflamasi Cytokines ↑ IL-4, 6, 10, 17, 22, IFN- γ, TNF-α IL- 1β, 2, 4, 5, 6, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 22, IFN- γ, TNF-α [40] ↓ IL-4, 12, 17A, IFN- γ Chemokines ↑ CCL-3, 4, 5, 9, 10, 11 CCL-2, 3, 4, 5, 11, 15, CXCL-1, 5, 8, 11 [41] MMP-9 ↑ ↑ pada SS-DED ↑ pada ADDE [42] Albumin ↑ tidak ↑ pada ADDE ↑ [26]