Menara Perkebunan , 2007, 75(2), 93-105.

## Optimasi pertumbuhan dan aktivitas enzim ligninolitik
Omphalina sp. dan Pleurotus ostreatus

## pada fermentasi padat
Optimization  of growth and ligninolytic enzymes activity of Omphalina sp. and Pleurotus ostreatus using solid state fermentation
Happy WIDIASTUTI, SISWANTO & SUHARYANTO
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor, 16151, Indonesia

## Summary
Solid  wastes  of  bagasse  and  empty  fruit bunch  (EFB)  respectively  from  sugarcane  and palm oil mill in Indonesia are abundant.  Now days, up to now these solid wastes have not yet been optimally utilized so that the added value is  still  very  low  and  even  cause  an  environ- mental problem. Research on bioconversion of bagasse and EFB with two culture of white-rot fungi (WRF) i.e., Omphalina sp. and Pleurotus ostreatus to  produce  ligninolytic  enzymes  was conducted  to  provide  added  value  to  this lignocellulosic  waste.  Production  of  extra cellular  enzymes  from  WRF  was  not  only determined  by  the  type  of  isolate  but  also  the culture  condition.  This  research  was  aimed  to determine  the  optimum  culture  condition  of solid  state  fermentation  in  producing  lignino- lytic  enzymes  at  laboratory  scale.  In  this research,  WRF  was  examined  for  ligninolytic producing enzymes  (laccase, lignin peroxidase /  LiP  and  Mn-peroxidase  /  MnP),  using  media consisting  of  bagasse  and  EFB  separately  as main  substrate  with  supplementation  of  rice bran,  Cu 2+ with  or  without  rice  bran.  The observation  was  based  on  their  growth  and ligninolytic  enzyme  activities.  Characteristics of  optimum  pH  of  LiP,  MnP  and  laccase activity  were  also  determined.  The  results showed  that  addition  of  supplement  was  not able  to  increase  the  Cu 2+ growth  of  mycelia especially in the first and second months but in
the  third  month  the  addition  of  supplement enhanced  the  mycelia  growth.  The  growth  of mycelia on the addition of Cu 2+ with or without rice  bran  significantly  lower  compared  to  the controls both of Omphalina sp. and P. ostreatus in  bagasse  and  EFB.  The  optimum  pH  of laccase, MnP, and LiP activities was five both for Omphalina  sp. and P.  ostreatus at  EFB and  bagasse. Omphalina sp. was  better  than P.  ostreatus in  producing  laccase  on  bagasse and  EFB  without  any  supplementations.  The highest laccase activity showed by P. ostreatus with bagasse  and EFB media treated with Cu and  Cu  +  rice  bran.  Supplementation  with Cu 2+ was  more  effective  in  increasing  laccase activity  than  rice  bran.  Activities  of  Li-P  on bagasse  and  EFB  for  the  two  WRF  cultures were  significantly  influenced  by  supple- mentation of both of rice bran and  Cu 2+ . Li-P activity  on  EFB  was  slightly    higher  than  that on  bagasse.  Mn-P  activity  was  not  influenced by rice bran, Cu 2+ or the combination of both. However,  these  enzymes  activities  on  EFB were  higher  compared  to  bagasse  especially for P.  ostreatus .  Suplementation  of  Cu  was enhance the activity of laccase and LiP both of P. ostreatus and Omphalina sp in baggasse and EFB though inhibited the growth of those fungi especially in the initial growth.
[ Key words: Lignocellulosic waste, ligninolytic enzymes, solid-state fermentation, empty-fruit bunch, bagasse]
Widiastuti et al.

## Ringkasan
Limbah  padat  bagas  tebu  dan  tandan kosong  kelapa  sawit  (TKKS)  masing-masing dari  proses  pengolahan  gula  tebu  dan  minyak sawit  di  Indonesia  jumlahnya  melimpah  dan sampai  saat  ini  belum  mendapat  penanganan yang  efektif  sehingga  nilai  tambahnya  masih sangat  rendah  dan  bahkan  mengganggu lingkungan.  Penelitian  biokonversi  limbah padat bagas tebu dan TKKS menggunakan dua isolat  fungi  pelapuk  putih  (FPP)  yaitu Omphalina sp.  dan Pleurotus  ostreatus untuk produksi  enzim  ligninolitik  dilakukan  untuk meningkatkan  nilai  tambah  limbah  ligno- selulosa  tersebut.  Penelitian  ini,  menguji aktivitas  enzim  ekstraseluler  dari  FPP  antara lain lakase,  lignin  peroksidase  (LiP),  dan  Mn- peroksidase  (MnP)  dari  dua  spesies  FPP  yaitu Omphalina sp.  dan P.  ostreatus .  Penelitian bertujuan  menetapkan  kondisi  optimum  media fermentasi  untuk  produksi  enzim  ligninolitik dari bagas tebu dan TKKS sebagai substrat dan karakterisasi  pH  optimum  enzim  ligninolitik dari  dua  FPP  yaitu Omphalina sp.  dan P.  ostreatus .  Pengamatan  dilakukan  berdasar- kan  laju  pertumbuhan  dan  aktivitas  enzim ligninolitik.  Enzim  lakase,  MnP,  dan  LiP diekstraksi  dan  dikarakterisasi  pH  optimum aktivitasnya.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  pemberian  suplemen  menghambat pertumbuhan  miselia  pada  satu  dan  dua  bulan pertama  inkubasi,  namun  laju  pertumbuhan miselium khususnya pada perlakuan pemberian Cu 2+ dan  Cu 2+ +  dedak  meningkat  tajam  pada bulan  ketiga  setelah  inkubasi.  Pertumbuhan miselium Omphalina sp dan P. ostreatus pada medium  yang  ditambah  Cu 2+ dan  Cu 2+ +dedak lebih  rendah  dibandingkan  dengan  kontrol. Pada  inkubasi  tiga  bulan,  aktivitas  optimum lakase, MnP dan LiP diperoleh pada pH 5, baik untuk Omphalina sp.  maupun P.  ostreatus yang  diekstrak  dari  bahan  lignoselulosa  bagas tebu  dan  TKKS.  Aktivitas  lakase  dari Omphalina sp. lebih tinggi daripada P.  ostreatus pada  substrat  TKKS  dan  bagas tebu  tanpa  suplementasi.  Pemberian  suplemen berupa  Cu 2+ dan  dedak  atau  kombinasinya meningkatkan aktivitas lakase baik pada bagas tebu  maupun  pada  TKKS.  Aktivitas  lakase
tertinggi  ditunjukkan  oleh  isolat P.  ostreatus pada  medium  bagas  tebu  dan  TKKS  pada perlakuan  pemberian  Cu 2+ dengan  atau  tanpa dedak.  Aktivitas  lakase  nampaknya  lebih dipengaruhi oleh penambahan Cu 2+ dibanding- kan  dengan  pemberian  dedak.  Aktivitas  LiP baik  pada  bagas  tebu  maupun  TKKS  untuk kedua  FPP  yang  diuji  pada  perlakuan penambahan  dedak  dan  Cu  nyata  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  aktivitas  LiP  yang diekstrak  dari medium  tanpa  penambahan suplemen.  Aktivitas  LiP  pada  TKKS  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  pada  bagas  tebu khususnya  untuk P.  ostreatus .  Sedangkan aktivitas  MnP  tidak  dipengaruhi  penambahan dedak  dan  Cu 2+ demikian  pula  kombinasi keduanya.  Aktivitas  MnP  yang  diekstrak  dari TKKS  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan aktivitas  MnP  yang  diekstrak  dari  bagas  tebu khususnya  untuk P.  ostreatus .  Penambahan Cu 2+ meningkatkan  aktivitas  lakase  dan  LiP P.  ostreatus dan Omphalina sp  yang  ditum- buhkan  pada  bagas  dan  TKKS  walaupun  ion logam  ini  menghambat  pertumbuhan  kedua JPP ini khususnya pada awal pertumbuhan.

## Pendahuluan
Luas  areal  perkebunan  kelapa  sawit di Indonesia pada tahun 2006 diperkirakan mencapai  6  juta  Ha  (Witjaksana,  2006). Proses  produksi  crude  palm  oil  (CPO) akan  menghasilkan  limbah  padat  tandan kosong  kelapa  sawit  (TKKS)  sekitar  10 juta  ton/tahun,  yang  hingga  sekarang belum dimanfaatkan secara optimal sehingga  belum  diperoleh  nilai  tambah ekonomis  yang  tinggi.  Tandan  kosong kelapa  sawit  terdiri  dari  tiga  komponen utama,  yaitu  lignin,  selulosa  dan  hemi- selulosa.  Hasil  analisis  menunjukkan bahwa  kandungan  lignin  TKKS  cukup tinggi  yaitu  40,86%.  Tingginya  lignin pada  TKKS  di  satu  sisi  menghambat dekomposisi  di  lapang  tetapi  di  sisi  lain dapat membuka peluang untuk mengguna- kan  limbah  TKKS  ini  sebagai  substrat
Optimasi pertumbuhan dan aktivitas enzim ligninolitik dari Omphalina sp. dan….
fungi  pelapuk  putih  (FPP)  penghasil enzim  ligninolitik.  Isolasi  dan  seleksi untuk  mendapatkan  fungi  pelapuk  putih unggul  telah  dilakukan  dari  lingkungan pabrik  kelapa  sawit  (Suharyanto  & Siswanto, 2003).
Penggunaan enzim ligninolitik sangat  beragam  misalnya  untuk pulping dan bleaching dalam  industri  pulp  dan kertas,  remediasi  daerah  bekas  tambang, penjernihan  air  ( water  clean  up ),  dan biodeguming  serat  rami  (Jeffries  & Vikarii,  1996),  biosensor  untuk  senyawa fenol dan oksigen, reaksi katoda dalam sel biofuel (Bulter et al ., 2003), dan degradasi hidrokarbon  aromatik  polisiklik  (Baldrian et al ., 2000).  Menurut Maeda et al . (2001) tidak  semua  FPP  menghasilkan  ketiga jenis  enzim  ligninolitik. Phanerochaete chrysosporium dilaporkan  mampu  meng- hasilkan  enzim  lignin  peroksidase  dan mangan  peroksidase  (Matsubara et  al ., 1996;  Jimenez-Tobon et  al .,  1997)  untuk dekolorisasi  pewarna  tekstil  (Darah  & Ibrahim,  1998;  Sani  &  Banerjee,  1999), Phanerochaete  flavido-alba menghasilkan lakase  (Perez et  al .,  1996), Bjerkandera sp.  menghasilkan  lignin  peroksidase  dan mangan  peroksidase  (Have et  al .,  1998), Trametes  versicolor menghasilkan  lakase (Collins et  al .,  1998). Ganoderma  appla- natum menghasilkan  mangan  peroksidase dan  dilaporkan  mendegradasi  lignin  lebih efisien daripada Pleurotus ostreatus (Maeda et  al .,  2001;  Sarkar et  al .,  1997).
Ganoderma  aplanatum dikenal  sebagai patogen  penyakit  penting  pada  tanaman perkebunan  dan  kehutanan,  sehingga pemanfaatan  fungi  ini  untuk  degradasi lignin  berisiko  menimbulkan  penyakit pada  tanaman.  Cohen et  al. (2002) mengemukakan bahwa P. ostreatus meng- hasilkan  ensim  ekstraseluler  oksidatif yaitu  MnP,  veratril  peroksidase  yang
merupakan  hibrida  MnP  dan  LiP  serta lakase.
Rolle  (1998)  mengemukakan  bahwa fermentasi  substrat  padat  ( solid-state fermentation ) untuk produksi enzim memiliki beberapa keunggulan dibanding- kan  dengan  fermentasi  terbenam  ( sub- merged  fermentation )  karena  tidak  perlu energi  untuk  aerasi,  penyiapan  medium dan  pengendalian  proses  lebih  sederhana, serta  peralatan  produksi  lebih  sederhana sehingga  sesuai  untuk  industri  skala  kecil hingga  menengah.  Dedak  padi  dikenal kaya akan protein, karbohidrat, dan lemak, sumber  vitamin  B1,  B2,  B3,  biotin,  asam pantotenat,  dan  besi,  sehingga  sesuai untuk  medium  fermentasi  dalam  produksi protease  asam  (Ikasari  &  Mitchell,  1994) dan selulase kapang (Sudaryati & Sastraatmadja, 1993). Sedangkan ion Cu 2+ merupakan  sumber  logam  kofaktor  yang menginduksi  dan  dapat  meningkatkan transkripsi  gen  lakase  (Palmieri et  al., 1997).  Penelitian  bertujuan  menetapkan kondisi  optimum  medium  fermentasi untuk  produksi  enzim  ligninolitik  dari bagas tebu dan TKKS sebagai substrat dan karakterisasi  pH  optimum  enzim  lignino- litik dari dua FPP yaitu Omphalina sp. dan P. ostreatus .

## Bahan dan Metode
Bagas  tebu  diperoleh  dari  pabrik  gula PT.  Rajawali  Nusantara,  Subang  sedang- kan  TKKS  diperoleh  dari  Pabrik  Kelapa Sawit,  Kertajaya,  PTPN  VIII,  Banten. Percobaan  dilakukan  pada bag  log berisi 500  g  medium  berupa  bagas  tebu  atau TKKS.  Selanjutnya bag  log yang  telah berisi  TKKS  atau  bagas  tebu  disterilisasi menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121 o C dengan  tekanan  1,2  kg/cm 2 selama  satu jam.

## Widiastuti et al.

## Perbanyakan inokulum FPP
Omphalina sp. dan P.  ostreatus diremajakan  pada  medium  PDA  dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 5-7 hari.  Biakan  FPP  yang  telah  tumbuh merata  pada  medium  PDA  diinokulasikan dengan  medium  biji  jewawut  (kadar  air 50-60%)  dalam  botol  selai  (100  g)  steril dan  diinkubasi  selama  dua  minggu  pada suhu  ruang.  Biakan  FPP  dalam  medium biji  jewawut  tersebut  digunakan  sebagai inokulum.

## Penyiapan medium fermentasi
Sebelum digunakan dalam penelitian, bagas  tebu  dan  TKKS  dianalisis  lignin metode  Klakson  (SNI  14-0492-1989), sedangkan  selulosa  dan  hemiselulosa berdasarkan  SNI  14-044-1989.  Empat jenis  medium  diuji  dalam  penelitian  ini yaitu  kontrol  (bagas  tebu  atau  TKKS), bagas  tebu  atau  TKKS  dengan  penam- bahan dedak (15%, b/b), CuSO 4 (150 µM) (Palmieri et  al. ,  1997),  dan  kombinasi keduanya.  Setiap  perlakuan  diulang  tiga kali sehingga terdapat 24 bag log masing- masing untuk bagas tebu dan TKKS.
Tandan  kosong  kelapa  sawit  (500  g) yang  sudah  dipotong-potong  ditambah dengan dedak (15%) dan air (500 mL) dan diaduk  sampai  merata.  Campuran  TKKS dan  dedak  dimasukkan  ke  dalam  plastik tahan panas kemudian ditutup dengan pipa PVC dan sumbat kapas dan diikat dengan karet gelang.  Penambahan CuSO 4 dilaku- kan  dengan  merendam  TKKS  dengan larutan  CuSO 4 150  uM.  Hal  yang  sama juga  dilakukan  pada  perlakuan  kombinasi penambahan  dedak  dan  CuSO 4 .  Medium selanjutnya  disterilisasi  dengan  autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 1,2  kg/cm 2 selama  satu  jam.  Setelah dingin bag  log diinokulasi  dengan  20  g
inokulum  FPP  dalam  medium  jewawut dan diinkubasi pada suhu ruang (25-28 o C) selama  tiga  bulan.  Setiap  medium  diuji untuk  dua  jenis  FPP  yaitu Omphalina sp. dan P.  ostreatus .  Hal  yang  sama  juga dilakukan  pada  penggunaan  bagas  tebu sebagai medium tumbuh.

## Ekstraksi dan analisis aktivitas enzim
Ekstraksi  enzim  dari  kultur  FPP umur  tiga  bulan  dilakukan  dengan  bufer fosfat  0,2  M  pH  7  dengan  perbandingan bufer  :  kultur  FPP  1:2  (v/b)  dan  digerus dalam  mortar  sampai  benar-benar  halus. Hasil  gerusan  dimasukkan  ke  dalam tabung  mikro  lalu  disentrifugasi  pada kecepatan  10.000  rpm  dengan  rotor 11 mm selama 10 menit pada suhu 0-4 ºC. Supernatan  hasil  sentrifugasi  dipisahkan dari  endapannya  dan  dimasukkan  ke dalam tabung mikro, jika supernatan yang diperoleh  masih  keruh,  maka  dilakukan sentrifugasi  ulang  dengan  kecepatan, waktu,  dan  kondisi  yang  sama,  hingga diperoleh  supernatan  yang  benar-benar bersih  tanpa  kotoran.  Enzim  kasar  yang diperoleh  selanjutnya  dikarakterisasi  pH optimum aktivitasnya dengan mereaksikan enzim  kasar  dengan  substrat  enzim  yang sesuai dalam  larutan  bufer  fosfat  pH  5,  6, dan 7.
Analisis  aktivitas  enzim  lakase dilakukan dengan metode Perez & Jeffries (1992). Satu unit aktivitas lakase didefini- sikan sebagai jumlah enzim yang dibutuh- kan  untuk  mengoksidasi  1  nmol  senyawa ABTS (2,2–azino–bis–3–ethlybenzothia zoline  –6–sulphonic  acid)  per  menit  pada suhu  37 o C.  Lignin  peroksidase  dianalisis berdasarkan  metode  yang  dikembangkan Tien  &  Kirk  (1984).  Satu  unit  LiP didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang mengoksidasi 1 nmol substrat guaiakol per
Optimasi pertumbuhan dan aktivitas enzim ligninolitik dari Omphalina sp. dan…
menit.  Mangan  peroksidase  (Hatakka, 1994)  merupakan  selisih  aktivitas  enzim dengan  penambahan  MnSO 4 dan  pengu- rangan  MnSO 4 .  Satu  unit  MnP  didefinisi- kan  sebanding  dengan  1  nmol  produk yang dihasilkan per menit.

## Hasil dan Pembahasan

## Pertumbuhan miselia FPP
Pengamatan  morfologi  miselia  di medium  juwawut  menunjukkan  bahwa Omphalina sp. tumbuh lebih cepat  diban-
dingkan  dengan P.  ostreatus .  Selain  itu, struktur  miselia Omphalina sp.  lebih kompak  dibandingkan  dengan  struktur miselia P.  ostreatus .  Pengamatan  pertum- buhan  miselia  pada  bulan  kesatu  pada medium  fermentasi  menunjukkan  bahwa pemberian  Cu 2+ dengan  atau  tanpa  dedak sangat  menghambat  pertumbuhan  miselia, namun  pada  bulan  ketiga  terjadi  laju peningkatan  pertumbuhan  miselia  yang lebih  besar  dibandingkan  dengan  pertum- buhan  miselia  pada  perlakuan  pemberian dedak  atau  kontrol  (Tabel  1).  Hasil  ini menunjukkan bahwa diperlukan waktu
Tabel 1. Pertumbuhan miselium FPP Omphalina sp dan P. ostreatus pada medium bagas tebu dan TKKS dengan penambahan suplemen dedak dan Cu 2+ dan kombinasinya selama 1-3 bulan inkubasi.
Table 1. Growth of Omphalina sp and P. ostreatus mycelia on bagasse  and EFB media with supplemen- tation of rice bran, Cu 2+ , and its combination for 1-3 month incubation.
Pertumbuhan miselium (cm) diukur dari permukaan atas bag log bulan ke 1-3
Mycelia growth (cm) measured from top surface of bag log from 1-3 month
Limbah lignoselulosa Lignocellulosic waste FPP WRF Suplemen Supplement 1 2 3 Bagas tebu Bagasse TKKS EFB Omphalina sp. P. ostreatus Omphalina sp. P. ostreatus Kontrol/ Control
Dedak/ Rice bran CuSO 4 Dedak/ Rice bran +CuSO 4 Kontrol/ Control Dedak/ Rice bran CuSO 4 Dedak/ Rice bran +CuSO 4 Kontrol/ Control Dedak/ Rice bran CuSO 4 Dedak/ Rice bran +CuSO 4 Kontrol/ Control Dedak/ Rice bran CuSO 4 Dedak/ Rice bran +CuSO 4 4,3 6,3 2,7 4,0 4,0 4,0 3,3 2,7 5,7 7,7 3,7 5,3 6,3 4,3 3,3 2,3 11,0 12,3 6,7 7,7 11,3 11,3 9,0 8,0 12,3 13,3 6,3 8,7 12,3 13,0 7,3 8,3 15,0 * a 15,0 a 14,0 b 14,7 b 15,0 a 14,3 a 13,3 b 14,3 b 14,7 a 14,7 a 12,0 b 14,0 b 15,0 a 14,7 a 13,3 b 14,3 b
Keterangan : * Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada satu kelompok menunjukkan tidak  ber- beda nyata pada uji beda nyata Duncan (P < 0,05).
Note :* The numbers followed with the same letter on one group showed insignificantly different with Duncan’s test (P < 0.05).
Widiastuti et al.
adaptasi bagi Omphalina sp. dan P. ostreatus terhadap pemberian suplemen khususnya berupa CuSO 4 .
Tabel 1  menunjukkan bahwa setelah inkubasi  tiga  bulan  pertumbuhan  FPP bervariasi  pada  jenis  suplemen  yang  ber- beda.  Pada  medium  bagas  tebu,  pertum- buhan miselia Omphalina sp . dan P.  ostreatus nyata  lebih  lambat  dengan pemberian suplemen berupa Cu 2+ maupun dedak  dan  Cu 2+ dibandingkan  dengan pemberian dedak dan kontrol. Nampaknya Cu 2+ berpengaruh  negatif  terhadap  per- tumbuhan  miselia.  Kecenderungan  yang sama  juga  dijumpai  pada  pertumbuhan miselia Omphalina sp. dan P. ostreatus di TKKS.
Pertumbuhan  miselia Omphalina sp. pada bagas tebu relative lebih cepat diban- dingkan  dengan  pada  TKKS.  Perbedaan kecepatan tumbuh miselia FPP ini menun- jukkan  adanya  kespesifikan  FPP  tersebut terhadap  substrat  medium.  Perbedaan komposisi  kimia  antara  bagas  tebu  dan TKKS  diduga  mempengaruhi  kecepatan tumbuh  miselia Omphalina sp.  Hasil analisis  lignin  dan  selulosa,  serta  hemi- selulosa TKKS berturut-turut ialah 27,52%,  51,4%  dan  1,92%,  sedangkan bagas  tebu mengandung  lignin,  selulosa, dan  hemiselulosa  berturut-turut  ialah 36,28%,  45,7%  dan  8,59%.  Sedangkan kecepatan  tumbuh  miselia P.  ostreatus pada  limbah  lignoselulosa  bagas  dan TKKS tidak menunjukkan perbedaan.
Optimasi komposisi medium untuk produksi lakase
Lakase  yang  dihasilkan  kedua  FPP aktif  pada  pH  5-7,  baik  pada  medium bagas  tebu  maupun  TKKS.  Aktivitas lakase dari Omphalina sp.dan P. ostreatus
optimum  pada  pH  5  baik  yang  diekstrak dari  bagas  tebu  maupun  yang  diekstrak dari TKKS (Gambar 1). Menurut Thurston (1994)  lakase  merupakan  enzim  yang tidak  terlalu  spesifik  karena  dapat  meng- katalisis  oksidasi  beberapa  jenis  senyawa. Aktivitas  lakase Trametes  trogii adalah pada  pH  3,4  walaupun  sangat  stabil  pada pH  4,4  (Levin et  al .,  2002).  Nampaknya pH  optimum  yang  diperoleh  dalam penelitian  ini  sedikit  lebih  tinggi  diban- dingkan  dengan  pH  optimum T.  trogii . Walaupun  demikian  aktivitas  lakase  pada pH  di  bawah  lima  belum  diuji  dalam penelitian ini.  Enzim lakase tidak spesifik dalam  mekanisme  pembebasan  senyawa radikal  sehingga  dapat  mengkatalisis degradasi  lignin  dan  sangat  diuntungkan pada  senyawa  yang  mempunyai  potensial redoks  tinggi  (430  –  780  mv)  (Cavallazzi et al ., 2004).
Lakase  dari  fungi  isolat  liar  mem- punyai  aktivitas  tertinggi  pada  pH  4,5 pada medium ABTS sedangkan mutannya mempunyai  kisaran  pH  optimum  pada pH 3-6. Pada galur liar, aktivitas enzimnya turun  pada  pH  3-6  walaupun  penurunan aktivitas  pada  pH  4,5  tidak  nyata  (Munoz et  al .,  1997).  Lakase  yang  diekstrak  dari Marasmius  quercophilus mempunyai  pH optimum  4,5  pada  suhu  75 0 C  (Thurston, 1994). Substrat buatan seperti ABTS dapat berfungsi  sebagai  mediator  dalam  reaksi oksidasi  senyawa  non-fenolik  yang  tidak dapat  dioksidasi  oleh  lakase  itu  sendiri. Pemberian  suplemen  pada  substrat  utama bagas maupun TKKS tidak mempengaruhi pH  optimum  aktivitas  enzim  baik  pada Omphalina sp. maupun P. ostreatus . Omphalina sp.  lebih  unggul  daripada P.  ostreatus dalam  menghasilkan  lakase pada medium bagas tebu dan TKKS tanpa penambahan  suplemen  (Gambar  2).  Pada
Optimasi pertumbuhan dan aktivitas enzim ligninolitik dari Omphalina sp. dan…
Gambar 1.   Aktivitas  lakase Omphalina sp.  dan P.  ostreatus yang  tumbuh  pada  medium  bagas  tebu (kiri)  dan  TKKS  (kanan)  setelah  inkubasi  tiga  bulan,  yang  diekstraksi  pada  berbagai  pH. Bar vertikal menunjukkan standar deviasi.
Figure 1.
Laccase activity of Omphalina sp. and P. ostreatus grown for three months in bagasse (left) and EFB (right), extracted  in selected pH. The vertical bar showed standard deviation.

## medium  tanpa  penambahan  suplemen
Omphalina sp.  menghasilkan  aktivitas lakase  sekitar  0,2  dan  0,3  U/mL  sedang- kan aktivitas lakase dari P. ostreatus ialah sekitar  0,1  dan  0,2  U/mL  masing-masing pada  bagas  tebu  dan  TKKS.  Pemberian suplemen berupa dedak dapat secara nyata meningkatkan aktivitas lakase dan aktivitas  lakase  dapat  lebih  ditingkatkan dengan  pemberian  Cu 2+ atau  kombinasi Cu 2+ dan  dedak  (Gambar  2).  Hasil  ini menunjukkan bahwa suplemen ber- pengaruh terhadap aktivitas lakase. Dedak merupakan  sumber  vitamin  terutama vitamin  B  kompleks  yang  umum  diguna- kan dalam budidaya jamur tiram. Vitamin B  kompleks  sangat  diperlukan  dalam pembentukan  miselium  dan  tubuh  buah jamur.  Dedak  merupakan  substrat  alami yang dapat mendukung miselium Rhizopus  oligosporus menjadi  tebal  dan kompak (Ikasari & Mitchell, 1994). Selain itu, dedak juga merupakan sumber vitamin B1  yang  diperlukan  dalam  reaksi  enzim
khususnya  sebagai  koenzim.  Lakase  (p- difenol  oksidase  E.C  1.10.  32)  juga dikenal  sebagai  enzim multi  coper yang mengandung  Cu 2+ dan  mampu  meng- katalisis  abstraksi  satu  elektron  dari substrat  organik  dan  anorganik  seiring reduksi  empat  elektron  dari  oksigen menjadi  air  (Eggert et  al .,  1996).  Enzim ini  merupakan  glikoprotein  yang  me- ngandung  2-4  atom  Cu 2+ per  molekul. Walaupun  demikian  nampaknya  tidak terdapat  pengaruh  yang  sinergi  antara dedak  dengan  Cu 2+ dalam  menginduksi aktivitas  lakase  baik  pada Omphalina sp. maupun P. ostreatus yang ditumbuhkan di bagas  tebu.  Kecenderungan  yang  sama juga  dijumpai  pada  pengaruh  suplemen dedak dan CuSO 4 terhadap aktivitas lakase pada medium TKKS (Gambar 2).
Lakase  tertinggi  yang  diperoleh dalam  penelitian  ini  ialah  berkisar 0,6  U/mL  yaitu  yang  dihasilkan  oleh P.  ostreatus. Hasil  ini  jauh  lebih  rendah dibandingkan  dengan  aktivitas  lakase
0,6 0,5 0,4 0,3
0,2
0,1 0 pH5  pH6  pH7          pH5  pH6  pH7 Omphalina sp. P. ostreatus A k ti v it a s la k a se ( U /m L ) L a cc a se a ct iv it y ( U /m L ) Bagas Bagasse pH5  pH6  pH7          pH5  pH6  pH7 Omphalina sp. P. ostreatus Bagas Bagasse TKKS EFB
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
pH5   pH6  pH7          pH5  pH6  pH7 Omphalina sp. P. ostreatus A k ti v it as l a k as e ( U /m L ) L a cc a se a ct iv it y ( U /m L )
Widiastuti et al.
Gambar 2.  Pengaruh penambahan dedak dan CuSO 4 atau kombinasi keduanya terhadap aktivitas lakase Omphalina sp. dan P. ostreatus pada bagas tebu (kiri) dan TKKS (kanan) setelah tiga bulan masa inkubasi yang diuji pada pH 5. Bar vertikal menunjukkan standar deviasi. Bar dengan huruf sama menunjukkan tidak beda nyata menurut uji Duncan (P < 0,05).
Figure 2. Effect of addition of rice bran and CuSO 4 4 or both on laccase activity of Omphalina sp. and P. ostreatus in bagasse (left) and EFB (right) incubated for three months assessed on pH 5. The vertical bar showed standard deviation. Bar with the same letter showed insignificantly different according to Duncan’s test (P < 0.05).
P.  ostreatus yang  telah  dilaporkan  oleh Palmieri et  al. (2000)  yaitu  sebesar 30  U/mL.  Perbedaan  yang  tinggi  ini kemungkinan  disebabkan  oleh  perbedaan galur  isolat  serta  medium  tumbuh. Aktivitas  lakase P.  ostreatus pada  TKKS dengan  penambahan  dedak  dan  CuSO4 sedikit  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan aktivitas  lakase P.  ostreatus pada  bagas tebu.  Perbedaan  komponen  senyawa karbon  khususnya  perbedaan  kandungan lignin  kemungkinan  dapat  menyebabkan perbedaan  aktivitas  lakase P.  ostreatus pada kedua limbah lignoselulosa tersebut.
Optimasi komposisi medium untuk produksi LiP
Aktivitas enzim LiP pada bagas tebu dan  TKKS  optimum  pada  pH  5  (Gambar 3).  Hasil  ini  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  yang  dilaporkan  Tien  &  Kirk (1998) pada P. pulmonarius yang menyebutkan  bahwa  pH  optimum  LiP
adalah  tiga.  Namun  demikian  aktivitas enzim  LiP  pada  pH  3  belum  diuji  dalam penelitian ini.
Pada  bagas  tebu,  dedak  hanya  ber- pengaruh  terhadap  aktivitas  LiP  dari P.  ostreatus sedangkan  aktivitas  LiP  dari Omphalina sp.  tidak  dipengaruhi  penam- bahan dedak. Walaupun demikian penam- bahan  dedak  dan  Cu 2+ secara  bersama- sama  menghasilkan  aktivitas  LiP  nyata lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  kontrol (Gambar  4).  Kulit  serealia  merupakan substrat  alami  lignoselulosa  yang  dapat mendukung  produksi  enzim  lakase  JPP Coriolopsis gallica UAMH 8260 dan MnP pada Bjerkandera  adusta UAMH  8258 (Pickard et al ., 1999). Kapich et al ., 2005 melaporkan  bahwa  lignoselulosa  dapat meningkatkan produksi MnP dan LiP oleh JPP P. chrysosporium . Selain itu, kemung- kinan  dedak  bukan  sebagai  sumber  N tetapi  tampaknya  lebih  sebagai  sumber vitamin  B  yang  dapat  berperan  sebagai
Bagas Bagasse K   D   Cu  D+Cu             K    D    Cu  D+Cu Omphalina sp. P. ostreatus A k ti v it a s la k as e ( U /m L ) L a cc a se a ct iv it y ( U /m L ) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 c a b c a b c c TKKS EFB A k ti v it a s la k a se ( U /m L ) L a cc a se a c ti v it y ( U /m L ) K    D    Cu  D+Cu        K     D    Cu   D+Cu Omphalina sp. P. ostreatus
0,8 0,7 0,6 0,5
0,4 0,3 0,2 0,1 0 a b c c a b c c
Optimasi pertumbuhan dan aktivitas enzim ligninolitik dari Omphalina sp. dan…
Gambar 3.   Aktivitas LiP Omphalina sp. dan P. ostreatus yang tumbuh pada medium bagas tebu (kiri) dan  TKKS  (kanan)  setelah  inkubasi  tiga  bulan,  yang  diekstraksi  pada  berbagai  pH.  Bar vertikal menunjukkan standar deviasi.
Figure 3.
LiP activity of Omphalina sp. and P. ostreatus grown for three months in bagasse (left) and EFB (right), extracted  in selected pH. The vertical bar showed standard deviation.
Gambar 4.  Pengaruh  penambahan  dedak  dan  CuSO  atau  kombinasi  keduanya  terhadap  aktivitas  LiP Omphalina sp. dan P. ostreatus pada bagas tebu (kiri) dan TKKS (kanan) setelah tiga bulan masa inkubasi yang diuji pada pH 5. Bar vertikal menunjukkan standar deviasi. Bar dengan huruf sama menunjukkan tidak beda nyata menurut uji Duncan (P < 0,05).
Figure 4. Effect  of  addition  of  rice  bran  and CuSO or  both  on  LiP  activity  of Omphalina  sp. and P. ostreatus in bagasse (left) and EFB (right) incubated for three months assessed on pH 5. The vertical bar showed standard deviation. Bar with the same letter showed insignificantly different according to Duncan’s test (P < 0.05).
TKKS EFB
pH 5 pH 6  pH 7     pH 5  pH 6 pH 7 Omphalina sp P.ostreatus 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 A k ti v it as L iP ( U /m L ) L iP a c ti v it y (U /m L ) A k ti v it a s L iP ( U /m L ) L iP a ct iv it y ( U /m L ) Bagas Bagasse pH 5   pH 6  pH 7       pH 5  pH 6  pH 7 Omphalina sp. P. ostreatus 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 Bagas Bagasse K    D    Cu  K+Cu    K   D   Cu   K+Cu Omphalina sp P.ostreatus A k ti v it as L iP ( U /m L ) L iP a c ti v it y (U /m L ) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 a ab ab  b a b ab b TKKS EFB
3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0
K    D     Cu    K+Cu      K     D    Cu   K+Cu Omphalina sp P.ostreatus a b ab b a ab ab b A k ti v it a s L iP ( U /m L ) L iP a ct iv it y ( U /m L )
Widiastuti et al.
pemacu pertumbuhan (Coyne, 1999). Pada TKKS,  pemberian  dedak  meningkatkan aktivitas  LiP Omphalina sp.  sedangkan pemberian  Cu 2+ tidak  berpengaruh  secara nyata  terhadap  aktivitas  LiP  (Gambar  4). Pada P.  ostreatus baik  pemberian  dedak maupun  Cu 2+ tidak  berpengaruh  terhadap aktivitas LiP.
Optimasi komposisi medium untuk produksi MnP
Mangan  peroksidase  (MnP;  1.11. 1.13)  mengkatalisis  oksidasi  lignin  dan senyawa  fenol  melalui  perantara  Mn. Analisis  aktivitas  enzim  pada  medium bagas  tebu  menunjukkan  bahwa  aktivitas MnP  tertinggi  dicapai  pada  pH  5  baik untuk Omphalina sp. maupun P. ostreatus yang diekstrak dari bagas tebu dan TKKS
(Gambar  5).  Dari  hasil  analisis    ditunjuk- kan  bahwa  pengaruh  penambahan  dedak atau  CuSO 4 atau  kombinasi  keduanya meningkatkan  aktivitas  enzim MnP. Walaupun  demikian,  pemberian  dedak lebih  berpengaruh  terhadap  peningkatan aktivitas  enzim  MnP  khususnya  pada bagas  tebu.  Aktivitas  enzim  MnP  pada substrat  yang  diberi  dedak,  Cu 2+ maupun kombinasi  keduanya  tidak  berbeda  nyata dibandingkan dengan kontrol. Hasil analisis  mengindikasikan bahwa  tidak ter- dapat sinergisme antara dedak dan CuSO 4 dalam   mempengaruhi aktivitas MnP baik pada Omphalina sp. maupun P. ostreatus . Selain  itu,  secara  umum  ditunjukkan bahwa  aktivitas  MnP P.  ostreatus lebih tinggi  dibandingkan    dengan  aktivitas MnP Omphalina sp. (Gambar 6).
Gambar 5.   Aktivitas MnP Omphalina sp. dan P. ostreatus yang tumbuh pada medium bagas tebu (kiri) dan  TKKS  (kanan)  setelah  inkubasi  tiga    bulan,  yang  diekstraksi  pada  berbagai  pH.  Bar vertikal menunjukkan standar deviasi.
Figure 5.
MnP  activity  of Omphalina  sp. and P.  ostreatus grown  for  three  months  in  bagasse  (left) and EFB (right), extracted  in selected pH. The vertical bar showed standard deviation.
Bagas Bagasse pH 5  pH 6 pH 7     pH 5 pH 6 pH 7 Omphalina sp. P.ostreatus A k ti v it a s M n P ( U /m L ) M n P a ct iv it y ( U /m L ) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 TKKS EFB
1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 A k ti v it as M n P ( U /m L ) M n P a ct iv it y ( U /m L )

## pH 5  pH 6 pH 7     pH 5 pH 6 pH 7
Omphalina sp. P.ostreatus
Optimasi pertumbuhan dan aktivitas enzim ligninolitik dari Omphalina sp. dan…
Gambar 6.  Pengaruh penambahan dedak dan CuSO 4 atau kombinasi keduanya terhadap aktivitas MnP Omphalina sp. dan P. ostreatus pada bagas tebu (kiri) dan TKKS (kanan) setelah tiga bulan masa inkubasi yang diuji pada pH 5. Bar vertikal menunjukkan standar deviasi. Bar dengan huruf sama menunjukkan tidak beda nyata menurut uji Duncan (P < 0,05).
Figure 6. Effect of addition of rice bran and CuSO 4 4 or both on MniP activity of Omphalina sp. and P. ostreatus in bagasse (left) and EFB (right) incubated for three  months assessed on pH 5. The vertical bar showed standard deviation. Bar with the same letter showed insignificantly different according to Duncan’s test (P < 0.05).

## Kesimpulan
Pertumbuhan  miselium  FPP  tidak berkorelasi  dengan  aktivitas  enzim  ligni- nolitik.  Pemberian  suplemen  berupa  Cu 2+ dengan  atau  tanpa  dedak menyebabkan pertumbuhan  yang  lebih  lambat  diban- dingkan dengan kontrol, namun pemberian suplemen  ini  meningkatkan  aktivitas enzim  ligninolitik  lakase  dan  LiP  diban- dingkan  dengan  kontrol.  Aktivitas  opti- mum  enzim  ligninolitik  yang  diekstrak dari  bagas  tebu  dan  TKKS  ialah  pada pH  5,  baik  yang  berasal  dari Omphalina sp.  maupun P.  ostreatus . Omphalina sp. menghasilkan  aktivitas  lakase  yang  lebih tinggi  daripada P. ostreatus pada  bagas tebu  dan  TKKS  tanpa  penambahan suplemen.  Sedangkan P. ostreatus meng-
hasilkan aktivitas lakase yang lebih tinggi daripada Omphalina sp.  pada  medium dengan  penambahan  dedak  dan  CuSO 4 baik  pada  bagas  tebu  maupun  TKKS. Penambahan suplemen berupa dedak, Cu 2+ atau  kombinasi  keduanya  tidak  berpe- ngaruh  terhadap  peningkatan  aktivitas MnP Omphalina sp. dan P. ostreatus .

## Daftar Pustaka
Baldrian, P., C. Wiesche, J. Gabriel, F. Nerud, &  F.  Zadrazil  (2000).  Influence  of cadmium  and  mercury  on  activities  of ligninolytic  enzymes  and  degradation  of polycyclic  aromatic  hydrocarbons  by Pleurotus ostreatus in soil. Appl. Environ. Microbiol . , 66, 2471-2478.

## K      D    Cu  D+Cu    K    D   Cu   D+Cu
Omphalina sp. P. ostreatus Bagas Bagasse A k ti v it a s M n P ( U /m L ) M n P a ct iv it y ( U /m L ) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 a a a a a a a a TKKS EFB a A k ti v it a s M n P ( U /m L ) M n P a c ti vi ty ( U /m L ) 1,2
1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0
K      D    Cu  D+Cu    K    D   Cu   D+Cu
Omphalina sp. P. ostreatus
a a a a a a a a
Widiastuti et al.
Bulter, T., M. Alcalde, V. Sieber, P. Meinhold. (2003).  Functional  expression  of  a  fungal laccase  in Saccharomyces  cerevisiae by directed evolution. Appl. Environ. Microbiol ., 69, 987-995.
Cavallazzi,J.R.P.,  M.G.A.  Oliveira.,  M.C.M. Kasuya  (2004).  Laccase  Production  by Lepista  sordida . Brazilian  J.  Microbiol., 35 , 261-263.
Cohen,  R.,  O.  Yarden  &  Y.  Hadar  (2002). Lignocellulose  affects  Mn 2+ regulation  of peroxidase  transcript  levels  in  solid-state cultures  of Pleurotus  ostreatus . Appl. Environ. Microbiol., 68,  3154-3158.
Coyne,  M.  (1999). Soil  Microbiology:  An Exploratory  Approach .  USA,  Delmar Publisher, 15p.
Collins,  P.J.,  A.D.W.  Dobson  &  J.A.  Field
(1998).  Reduction  of  the  2,2-azinobis  (3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)  cation radical  by  physiological  organic  acids  in the  absence  and  presence  of  manganese. Appl. Environ. Microbiol., 64 , 1749-1755.
Darah, I. & C.O. Ibrahim (1998). Decolourisation of waste water from local textile  mills  by  cultures  of Phanero- chaetae chrysosporium.  Ann.  Bogoriens,
5 , 25-30.
Eggert,  C.,  U.  Temp  &  K.E.  Eriksson  (1996).
The  ligninolytic  system  of  the  white  rot fungus Pycroporus  cinnabarinus :  purifi- cation and characterization of the laccase. Appl. Environ. Microbiol., 62 , 1151-1158.
Hatakka, A. (1994). Lignin modifying enzyme from  selected  white-rot  fungi:  production and  role  in  lignin  degradation. FEMS Microbiol.Rev ., 13 , 125-135.
Have,  R.,  S.  Hartmans,  P.J.M.  Teunissen  & J.A.  Field  (1998).  Purification  and characterization  of  two  lignin  peroxidase isozymes  produced  by Bjerkandera sp. strain  BOS55. FEBS  Letters, 422 ,  391- 394.
Ikasari,  L.  &  D.A.  Mitchell  (1994).  Protease production  by Rhizopus  oligosporus in solid-state fermentation. World J.
Microbiol. Biotechnol ., 19 , 171-175.
Jeffries, T.W. & L. Viikari (1996). Enzymes for Pulp  and  Paper  Processing .  Washington American Chemical Society, 326p.
Jimenez-Tobon, G.A., M. Penninck &
R.  Lejeune  (1997).  The  relationship between pellet size and production of Mn (II) peroxidase by Phanerochaete chryso- sporium in  submerged  culture. Enzyme
Microb. Technol., 21 , 537-542.
Kapich  A.N.,  Steffen  K.,  Hofrichter  M.  & Hatakka  A.  (2005).  A  rapid  method  to quantify  pro-oxidant  activity  in  cultures of wood-decaying white-rot fungi . J. Microbiol. Methods , 61 , 261-271 .
Levin,  I.,  F.  Forchiassin  &  A.M.  Ramos (2002).  Copper  induction  of  lignin- modifying  enzymes  in  the  white-rot fungus Trametes  trogii . Mycologia , 94 , 377-383.
Maeda Y., S. Kajiwara & K. Ohtaguchi (2001).
Manganese  peroxidase  gene  of  the perennial mushroom Elfvingia applanata : cloning  and  evaluation  of  its  relationship with lignin degradation. Biotechnol. Lett., 23 , 103-109.
Matsubara  M.,  J.  Suzuki,  T.  Deguchi, M.  Miura  &  Y.  Kitaoka  (1996). Characterization of manganese peroxidase from the hyperlignolytic fungus IZU-154. Appl. Environ. Microbiol., 62 , 4066-4073.
Muñoz,  C.,  F.  Guillén,  A.T.  Matínez  & Martínez  (1997).  Induction  and  charac- terization  of  laccase  in  the  ligninoliytic fungus Pleurotus eryngii. Current
Microbiol., 34 , 1-5.
Palmieri, G. P. Giardina, C. Bianco, A.  Sealoni,  A.  Capasso  &  G.  Sannia
(1997). A novel white laccase from
Optimasi pertumbuhan dan aktivitas enzim ligninolitik dari Omphalina sp. dan…
Pleurotus  ostreatus . J.  Biol.  Chem. , 272 (50), 31301-31307.
Palmieri, G. P. Giardina, C. Bianco, B.  Fontanella  &  G.  Sannia    (2000). Copper  induction  of  laccase  isoenzymes in  the  ligninolytic  fungus Pleurotus ostreatus . Appl.  Environ.  Microbiol., 66 , 920-924.
Perez  J  &  Jeffries  TN.  (1992).  Mineralization of 14 CO 2 ringlabeled  synthetic  lignin correlates  with  the  production  of  lignin peroxidase,    not  manganese  or  laccase. Appl. Environ. Microbiol ., 58 , 1806-1812.
Perez  J., J. Martinez & T. de la Rubia (1996). Purification and partial characterization of a  laccase  from  the  white  rot  fungus Phanerochaete flavido-alba. Appl.
Environ. Microbiol . , 62 , 4263-4267.
Pickard  M  A,  H  Vandertol,  R  Roman  &        R vazquez-Duhalt.  (1999).  High  production of  ligninolytic  enzymes  from  white  rot fungi  in  cereal  bran  liquid  medium. Microbiol ., 45 , 627-631.
Rolle,  R.S.  (1998).  Enzyme  application  for agro-processing  in  developing  countries: An  inventory  of  current  and  potential applications. World J. Microbiol. Biotechnol., 14 , 614-619.
Sani, R.K. & U.C. Banerjee (1999). Decolorization  of  acid  green  20,  a  textile dye, by  the  white  rot  fungus Phanero- chaete  chrysosporium in   a   low    cost medium. Adv.  in  Environ.  Res.  , 2 ,  485- 490.
Sarkar  S.,  A.T.  Martinez  &  A.J.  Martinez (1997). Biochemical and molecular characterization  of  a  manganese  peroxi- dase isoenzyme from Pleurotus ostreatus .
Biochem. Biophys Acta., 1339 , 23-30.
Sudaryati,  Y  &  D.  D.  Sastraatmadja  (1993). Seleksi  strain Aspergillus spp.  untuk menghasilkan  enzim  selulase  dalam media  dedak. J.  Mikrobiol.  Indonesia,
2 (2), 30-32.
Suharyanto  &  Siswanto  (2003).  Produksi enzim  ligninolitik  dari  fungi  pelapuk putih  untuk  biodegradasi  dan  bio- transformasi  tandan  kosong  kelapa  sawit. Laporan  Akhir  Tahun  2003 ,  APBN/ADB 1526-1NO. Bogor, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, 65 p.
Thurston.  C.F.  (1994).  The  structure  and function  of  fungal  laccase. Microbiol.,
140 , 19-26.
Tien, M. & T.K. Kirk (1984). Lignin-degrading enzyme  from Phanerochaete  chryso- sporium :  Purification,  characterization, and  catalytic  properties  of  a  unique H2O2-requiring oxygenase. In Proc, Natl,
Acad, Sci.USA , 81 , 2280-2284.
Tien,  M.,  and  T.K.  Kirk  (1998).  Lignin peroxidase  of Phanerochaete  chryso- sporium . Methods  Enzymol., 161 ,  238- 248.
Witjaksana,  D.  2006.  Towards  sustainable  palm oil  development  in  Indonesia. In  Proc.  Int.
Oil Palm Conf. 19-23 June, Bali. Indonesia. p. 1-12