ISSN 2085-2916  e-ISSN 2337-3652 Tersedia daring http://jai.ipb.ac.id J. Agron. Indonesia, April 2020, 47(3):59-67 DOI: https://dx.doi.org/10.24831/jai.v48i1.29149 Multiplikasi Tunas In Vitro Anggrek Phalaenopsis dan Analisis Keragaman Genetik dengan Marka SNAP
In Vitro Shoot Multiplication of Phalaenopsis Orchid and Genetic Diversity Analysis using SNAP Markers
Mira Humaira 1 , Agus Purwito 2 , Sudarsono 2 , dan Dewi Sukma 2*
1 Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor 2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (Bogor Agricultural University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
Diterima 17 Januari 2020/Disetujui 17 April 2020

## ABSTRACT
Clonal propagation of orchid by in vitro culture is needed to obtain the high quantity and quality of orchid propagules. This study aimed to understand the effect of BAP (benzyl amino purine) concentrations on the shoot multiplication of three Phalaenopsis hybrid populations and to analyze genetic diversity of the clonal shoot population using Pto-SNAP markers. The experiments were performed separately for each population, namely shoots from seed germination of Phal. amabilis x Phal. ‘KHM 421’ multiplicated on media with four levels of BAP (0.00, 11.09, 22.19, 33.29, 44.39 µM),  clonal shoots from Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-38’, and Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’ with four level of BAP (11.09, 22.19, 33.29, 44.39 µM). The results showed that the optimum BAP concentration for shoot multiplication for the three populations was 22.19 µM which generated an average of 3.7, 4.7, and 6.0 shoots per explant at 12 week after planting (WAP) for each of the tested population. Protocorm like bodies (PLBs) was only produced on Phal. amabilis x Phal.  ‘KHM 421’ population and the highest number of PLBs was obtained on medium containing 11.09 BAP. Evaluation of genetic diversity was performed using 11 Pto-SNAP markers for shoots of Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’. The results revealed the presence of 7.7% somaclonal variation at the Pto-241 locus among shoots from medium containing BAP 22.19 uM and 11.1% at the Pto 424 locus among those from medium with BAP 44.39 uM, respectively.
Keywords: clonal propagation, cytokinin, molecular markers, Pto, somaclonal variation

## ABSTRAK
Perbanyakan klonal anggrek melalui kultur in vitro dibutuhkan untuk memperoleh sejumlah besar propagul tanaman yang  berkualitas.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  pengaruh  konsentrasi  BAP  terhadap  kemampuan multiplikasi tunas dalam propagasi klonal beberapa anggrek hibrida Phalaenopsis dan menganalisis keragaman genetik pada tunas klonal menggunakan marka Pto-SNAP. Percobaan  dilakukan secara terpisah pada 3 populasi tunas anggrek hibrida Phalaenopsis yaitu, tunas hasil perkecambahan biji dari Phal. amabilis x Phal. ‘KHM 421’ diperbanyak dalam media dengan 5 taraf BAP (0.00, 11.09, 22.19, 33.29, 44.39 µM), dan tunas klon Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-38’ dan Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’ diperbanyak dalam media dengan 4 taraf BAP (11.09, 22.19, 33.29, 44.39 µM). Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi BAP terbaik untuk multiplikasi tunas pada tiga populasi yang diuji adalah 22.19 µM dengan jumlah tunas masing-masing 3.7, 4.7, dan 6.0 tunas pada 12 minggu setelah tanam (MST). Protocorm like  bodies  (PLBs)  hanya  dihasilkan  pada  populasi  Phal.  amabilis  x  Phal.  ‘KHM  421’  dengan  jumlah  PLBs  terbanyak diperoleh pada perlakuan BAP 11.09 µM. Evaluasi keragaman genetik menggunakan 11 marker Pto-SNAP dilakukan pada tunas klonal Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’. Hasil analisis menunjukkan adanya variasi somaklonal dengan keragaman 7.7% pada lokus Pto-241 pada tunas dari media perlakuan BAP 22.19 µM dan 11.1% pada lokus Pto-424 pada tunas dari media dengan BAP 44.39 µM.
Kata kunci: marka molekuler, propagasi klonal, Pto, sitokinin, variasi somaklonal

## PENDAHULUAN
Anggrek (Famili Orchidaceae ) merupakan salah satu famili tanaman berbunga terbesar, terdiri 6 sub famili dan 19,000-24,000  spesies  (Cetzal et  al .,  2014).  Diperkirakan lebih  dari  4,000  spesies  anggrek  terdapat  di  wilayah Indonesia  (Handoyo  dan  Prasetya,  2009). Phalaenopsis merupakan  salah  satu  genus  anggrek  yang  populer  yang banyak  digemari  oleh  masyarakat  karena  memiliki  nilai estetika  tinggi,  dengan  warna  dan  bentuk  bunga  yang beragam, vase life yang panjang dan harga yang relatif stabil dan  terjangkau  oleh  masyarakat.  Pengembangan  agribinis anggrek sering terkendala karena terbatasnya ketersediaan bibit dari varietas unggul baru yang berkualitas (Gow et al., 2009).  Kontribusi  nilai  impor  bibit  anggrek  di  Indonesia mencapai 61.57% dari total nilai impor anggrek di Indonesia (Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian, 2015).
Salah satu alternatif untuk mempercepat pertumbuhan serta memenuhi kebutuhan bibit anggrek dalam jumlah yang banyak  dan  seragam  adalah  melalui  induksi  tunas  aksilar dalam teknik kultur jaringan (Jones dan Tisserat, 1990; Kosir et al., 2004;  Yuswanti et al., 2015) atau induksi protocorm like bodies (PLBs) dari protokorm atau eksplan daun (Paek et  al .,  2011;  Rittirat et  al .,  2012;  Raynalta et  al., 2013; Raynalta et al., 2018). Eksplan yang umumnya digunakan untuk  memperbanyak  tunas  anggrek Phalaenopsis secara vegetatif  adalah  tangkai  bunga  yang  mengandung  mata tunas dorman (Kosir et al., 2004; Dwiyani, 2012; Yuswanti et  al., 2015).  Keberhasilan  dalam  induksi  tunas  baru  dari tangkai bunga sangat dipengaruhi oleh zat pengatur tumbuh, diantaranya auksin dan sitokinin (Balilashaki et al., 2014). Sitokinin  berfungsi  dalam  pembelahan  sel,  morfogenesis pada  kultur  jaringan,  pertumbuhan  tunas  lateral,  ekspansi daun, menghambat senesen daun, dan memacu inisiasi tunas (Davies, 2004; Restiani et al., 2016). Alternatif lain dalam perbanyakan anggrek adalah melalui induksi protocorm like bodies (PLB s ). PLB s merupakan struktur yang menyerupai protocorm yang  diinduksi  dari  eksplan protocorm atau potongan  daun  (Balilashaki et  al., 2014;  Raynalta et  al., 2018).  Perkembangan PLB s didefinisikan  sebagai  proses embryogenesis  somatic karena protocorm merupakan fase  perkembangan  lanjut  dari  embrio  (Lee et  al. ,  2013). Perkembangan PLB s pada Phalaenopsis dipengaruhi oleh berbagai faktor diantaranya zat pengatur tumbuh dan bahan organik (Raynalta dan Sukma, 2013; Yulianti et al. , 2016; Raynalta et al., 2018). Penerapan  metode  mikropropagasi  klonal in  vitro pada anggrek Phalaenopsis memiliki beberapa kelemahan, salah  satunya  adalah  variasi  somaklonal  pada  bibit  hasil perbanyakan  (Chen  dan  Chen,  2007;  Chen et  al. ,  2008). Deteksi  dini  adanya  variasi  somaklonal  dapat  membantu proses  seleksi  propagul  yang true  to  type. Menurut  Bairu et  al .  (2011),  variasi  somaklonal  maka  dapat  diketahui dengan  aplikasi  marka  molekuler.  Salah  satu  marka molekuler  yang  populer  akhir-akhir  ini  adalah  marka SNAP  ( single  nucleotide  amplified  polymorphic ).  Marka SNAP  merupakan  penanda  genetik  yang  dikembangkan berdasarkan  pada single  nucleotide  polymorphism (SNP,
keragaman satu basa nukleotida) pada sekuen gen tertentu pada  tanaman  (Mammadov et  al., 2012).  Pada  anggrek Phalaenopsis, Elina et  al .  (2017)  telah  mengkarakterisasi dan  mengidentifikasi  keberadaan  SNP  dari  gen Pto. Gen Pto merupakan salah satu gen ketahanan tanaman terhadap patogen bakteri yang ditemukan pada tanaman tomat (Sun et al ., 2011). Sukma et al. (2017) dan Raynalta et al . (2018) telah  menggunakan  beberapa  marka  Pto-SNAP  untuk analisis  keragaman  tunas  klonal  asal  PLBs  anggrek Phal. amabilis . Penelitian ini bertujuan untuk: (1) mengevaluasi pengaruh konsentrasi BAP terhadap multiplikasi tunas tiga genotipe  anggrek  hibrida Phalaenopsis, (2)  menganalisis keragaman  genetik  menggunakan  marka  molekuler  Pto- SNAP pada tunas klonal hasil multiplikasi in vitro .

## BAHAN DAN METODE
Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2018 sampai dengan Maret 2019 di Laboratorium Kultur Jaringan 1 dan Laboratorium  Biologi  Molekuler  Tanaman,  Departemen Agronomi  dan  Hortikultura,  Fakultas  Pertanian,  Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini terdiri dari dua tahap, tahap 1  adalah  multiplikasi  tunas  tiga  genotipe  hibrida  anggrek Phalaenopsis pada  berbagai  konsentrasi  BAP in  vitro . Percobaan dilakukan terpisah pada populasi tanaman yaitu tunas  hasil  perkecambahan  biji  hasil  persilangan Phal. amabilis x Phal. ‘KHM 421’, tunas klon Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘ 1102-38’,  dan Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’. Tunas  klon Phal. ‘Salu  Spot’  x Phal. bellina ‘1102-38’    dan Phal. ‘Salu  Spot’ x Phal.  bellina ‘1102-44’  diinisiasi dan diinduksi dari eksplan awal mata tunas dorman pada buku dari tangkai bunga dan diperbanyak di ½ konsentrasi media MS (½ MS) dengan BAP 11.09 µM hingga diperoleh jumlah tunas yang cukup untuk percobaan. Tunas Phal. amabilis x Phal. ‘KHM 421’ berasal dari  hasil perkecambahan  benih  sehingga  terdapat  kemungkinan secara genetik bahan tanaman bervariasi.
Rancangan  percobaan  yang  digunakan  adalah rancangan  acak  lengkap  (RAL)  satu  faktor  perlakuan yaitu konsentrasi BAP. Media dasar yang digunakan untuk multiplikasi  tunas  adalah  ½  MS  ditambah  0.53  µM  NAA (1 mg L -1 ), air kelapa muda 10% (v/v), pepton 1 g L -1 , dan PVP 0.5 g L -1 . Perlakuan konsentrasi BAP sebagai berikut : 0 µM, 11.09 µM, 22.19 µM, 33.29 µM, dan 44.39 µM atau 0.0, 2.5, 5.0, 7.5 dan 10.0 mg L -1 BAP untuk Phal. amabilis x Phal. ‘KHM 421’ dan 11.09 µM, 22.19 µM, 33.29 µM, dan 44.39 µM untuk Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-38’ dan Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’. Volume media per botol kultur sebanyak 20 ml. Eksplan awal berupa tunas tunggal ditanam pada media perlakuan. Peubah yang diamati adalah jumlah tunas, jumlah daun, jumlah akar, dan jumlah  PLBs  per  sampel  pengamatan  (per  botol)  pada  2 sampai 12 MST. Setiap perlakuan terdiri atas tiga ulangan dan tiap ulangan terdiri dari 10 tunas dengan satu tunas per botol. Analisis  data  menggunakan  perangkat  lunak  STAR ( Statistical  Tool  for Agricultural  Research ). Apabila  hasil uji  F-nyata  maka  dilakukan  uji Duncan’s  Multiple  Range Test (DMRT) dengan α 5%.
Pada tahap 2, dilakukan uji Pto-SNAP marker untuk analisis keragaman genetik secara molekuler pada 30 tunas klonal hasil perlakuan BAP dari Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’,  untuk    menghindari  bias  keragaman planlet antar perlakuan yang dapat bersumber dari segregasi jika  menggunakan  planlet  asal  biji  dari Phal.  amabilis x Phal. ‘KHM  421’ . DNA  diisolasi  30  tunas  klonal  dari tanaman  F1 Phal. ‘Salu  Spot’  x Phal.  bellina ‘1102-44’, menggunakan  metode  CTAB  (Doyle  dan  Doyle,  1987) yang  dimodifikasi  oleh  Elina et  al. (2017).  DNA  yang dihasilkan selanjutnya diamplifikasi PCR dengan 11 primer Pto-SNAP  (Pto-64,  Pto-94,  Pto-181,  Pto-220,  Pto-229, Pto-241,  Pto-292,  Pto-340,  Pto-349,  Pto-380,  dan  Pto- 424 mengikuti metode yang telah dioptimasi Sukma et al . (2017) dan Raynalta et al . (2018). Produk amplifikasi PCR dielektroforesis pada gel agarose 2% selama 35 menit (50 V). Data visual dari elektroforesis dikonversi menjadi data alelik berdasarkan kemunculan pita dan jenis pasang basa ( reference dan alternate ) pada masing-masing lokus. Skor yang  diperoleh  digunakan  untuk  mendapatkan  persentase keragaman antar klon.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Jumlah Tunas, Daun, Akar, dan PLBs
Hasil  analisis  ragam  dan  rata-rata  jumlah  tunas, daun, akar, dan PLB s pada populasi hibrida Phal. amabilis x Phal. ‘KHM 421’ disajikan pada Tabel 1. Pada populasi genotipe tersebut, BAP berpengaruh nyata terhadap jumlah, tunas,  daun,  akar, dan PLBs. Perlakuan 22.19 µM BAP (5 mg L -1 ) menghasilkan  jumlah tunas dan daun terbanyak yaitu  3.7  tunas  dan  7  daun  pada  12  MST.  Hasil  tersebut menunjukkan tunas yang terbentuk mengalami morfogenesis daun  yang  normal  sehingga  jumlah  daun  yang  dihasilkan maksimal.  Keragaan  tunas  pada  penelitian  disajikan  pada Gambar 1A-E.
Akar  mulai  terbentuk  pada  saat  2  MST  pada  semua komposisi  media.  Konsentrasi  BAP  cenderung  menekan jumlah  akar,  sehingga  jumlah  akar  terbanyak  dihasilkan pada media tanpa BAP (kontrol) sebesar 3.3 akar pada 12 MST.  Pada  media  perlakuan  lainnya  yang  mengandung BAP, jumlah akar lebih rendah, namun tidak berbeda nyata antar 4 konsentrasi BAP. Media dasar dari semua perlakuan mengandung  0.53  µM  NAA,  sehingga  pada  media  tanpa BAP,  rasio  auksin  dan  sitokinin  menjadi  lebih  tinggi  dan meningkatkan jumlah akar.
Protocorm  like  bodies  (PLB s )  pada  populasi Phal. amabilis x Phal .‘KHM 421’ percobaan ini mulai terbentuk pada  dasar  tunas  pada  saat  8  MST.  Konsentrasi  BAP berpengaruh nyata terhadap jumlah PLBs,  dengan jumlah PLBs  terbanyak  (3.7  PLBs)  dihasilkan  pada  konsentrasi 11.09 µM BAP pada 12 MST. PLBs terlihat sebagai struktur seperti nodul pada dasar tunas, seperti terlihat pada gambar 1F-J. Rata-rata jumlah tunas, daun dan akar pada  dan daun terbanyak  pada Phal. ‘Salu  Spot’ x  Phal.  bellina ‘1102- 38’  seperti  terlihat  pada  Tabel  2.  Jumlah  tunas  dan  daun terbanyak pada  genotipe tersebut diperoleh pada perlakuan
22.19 µM BAP sebanyak 4.7 tunas dan 7.0 pada 12 MST. Rata-rata jumlah akar tidak berbeda nyata antar perlakuan, yaitu sekitar 2-3 akar per eksplan. Sebaliknya PLBs tidak dihasilkan  pada  tunas  dari  semua  perlakuan  konsentrasi BAP.
Rata-rata jumlah tunas, daun dan akar pada  dan daun terbanyak  pada Phal. ‘Salu  Spot’ x  Phal.  bellina ‘1102- 44’  seperti  terlihat  pada  Tabel  3.  Hasil  analisis  ragam menunjukkan bahwa perlakuan konsentrasi BAP pada Phal. ‘Salu  Spot’ x  Phal.  bellina ‘1102-44’ berpengaruh  nyata terhadap jumlah tunas, daun pada 6 hingga 12 MST, namun tidak berpengaruh nyata terhadap jumlah akar. Jumlah tunas dan daun terbanyak pada Phal . ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’  juga  diperoleh  pada  perlakuan  22.19  µM  BAP, sebanyak 6.0 tunas dan 7.7 daun pada 12 MST. Sebaliknya jumlah akar tidak berbeda nyata antar perlakuan BAP, yaitu sekitar 1-2 akar per eksplan. Tunas pada semua perlakuan juga  tidak  menghasilkan  PLBs  seperti  pada Phal .  ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-38’. Multiplikasi tunas pada ketiga genotipe tanaman yang diuji menunjukkan respon yang relatif sama, yaitu jumlah tunas terbanyak dihasilkan pada  perlakuan 22.19 µM BAP (5.0  mg  L -1 ).  Kosir et  al .  (2004)  melaporkan  multiplikasi terbanyak tunas Phalaenopsis sp. diperoleh pada  0.5 mg L -1 NAA dan 2.0 mg L -1 BAP dengan faktor multiplikasi sebesar  8.35  dalam  waktu  160  hari  setelah  pengkulturan. Sementara Balilashaki et al. (2014) mendapatkan regenerasi tunas   terbaik   pada Phalaenopsis ‘Cool  Breeze’ yaitu 1 mg L -1 NAA dan  4 mg L -1 BAP  dengan  jumlah  tunas yang  diperoleh  sebanyak  15.3  tunas.  Jumlah  tunas  yang diperoleh pada 3 genotipe yang diuji dalam penelitian masih lebih rendah dibanding yang dihasilkan Kosir et al . (2004) dan  Balilashaki et  al. (2014),  walaupun  keduanya  pada genotipe tanaman yang berbeda. Jumlah tunas kemungkinan masih dapat ditingkatkan dengan mengoptimalkan beberapa faktor lain selain konsentrasi BAP, seperti Balilashaki et al. (2014) mendapatkan tunas terbanyak dengan memodifikasi media 1/2MS mengikuti Chen et al. (1999), yaitu dengan menambahkan NaH2PO4 170 mg L -1 , pepton 2 mg L -1 dan mengganti agar dengan gelrite dan menurunkan konsentrasi sukrosa  menjadi  20  g  L -1 .  Penambahan  bahan  organik ekstrak toge dilaporkan dapat mendorong multiplikasi tunas in vitro Phal. gigantea (Ramdan, 2011).
Kemampuan multiplikasi tunas pada ketiga genotipe tanaman  tidak  diuji  statistik  karena  percobaan  dilakukan secara  terpisah,  namun  terlihat  kecendrungan  bahwa genotype Phal .  ‘Salu  Spot’  x Phal. bellina ‘1102-38’  dan Phal . ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’ menghasilkan jumlah tunas yang lebih banyak dari populasi tunas Phal. amabilis x Phal . ‘KHM 421’. Demikian juga antara Phal . ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-38’ dan Phal . ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’. Meskipun berasal dari tetua yang sama, daya multiplikasinya berbeda, menunjukkan adanya perbedaan genetik antara kedua genotipe tersebut. Perbedaan genetik tersebut juga terlihat secara visual dari perbedaan morfologi tunas seperti terlihat pada Gambar 2. Tunas-tunas dari Phal. amabilis x Phal .‘KHM 421’ cenderung berukuran lebih kecil dibanding dua genotipe lainnya, sedangkan Phal . ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-38’ memiliki daun yang
Konsentrasi BAP (µM) Jumlah tunas 2 4 6 8 10 12 0.00 1.0 1.0 1.3 1.3b 1.3b 1.3b 11.09 1.0 1.3 1.3 1.7b 1.7b 2.0b 22.19 1.0 2.0 2.3 3.3a 3.7a 3.7a 33.29 1.0 1.3 1.7 1.7b 1.7b 1.7b 44.39 1.0 1.7 1.7 1.7b 2.0b 2.0b Jumlah daun 0.00 2.7 3.3 3.7 3.7 3.7c 3.7c 11.09 2.7 3.0 3.7 4.0 4.3bc 4.3bc 22.19 3.7 4.0 4.7 5.3 6.3a 7.0a 33.29 3.0 4.0 4.0 4.3 4.7bc 4.7bc 44.39 3.3 4.3 4.3 4.7 5.3ab 5.3b Jumlah akar 0.00 2.0 2.0 2.0 2.3 3.0 3.3a 11.09 1.0 1.7 1.7 1.7 1.7 2.0b 22.19 1.7 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0b 33.29 1.3 1.3 1.7 1.7 1.7 1.7b 44.39 1.3 1.7 2.0 2.0 2.0 2.0b Jumlah PLBs 0.00 0.0 0.0 0.0 1.0 1.0 1.0b 11.09 0.0 0.0 0.0 2.3 3.0 3.7a 22.19 0.0 0.0 0.0 0.7 2.3 2.0b 33.29 0.0 0.0 0.0 1.0 1.7 1.7b 44.39 0.0 0.0 0.0 1.0 1.3 1.7b
Tabel 1. Rata-rata jumlah tunas, jumlah daun, jumlah akar, jumlah PLBs pada perlakuan perlakuan konsentrasi BAP populasi hibrida Phal. amabilis x Phal . ‘KHM 421’ pada 2 sampai 12 MST
Keterangan: Rata-rata  dengan  huruf  yang  sama  tidak berbeda  nyata pada uji lanjut duncan multiple range test (DMRT) taraf  α 5%.
*/** = nyata/sangat nyata; tn = tidak nyata A B C D
E F G H
I
J
Gambar 1.  Keragaan tunas (A-E) dan PLBs (F-J) Phal. amabilis x Phal . ‘KHM 421’ pada berbagai media perlakuan BAP: A & F) 0 µM, B & G) 11.09 µM, C & H) 22.19 µM, D & I) 33.29 µM, E & J) 44.39 µM. Tunas terbanyak di hasilkan pada perlakuan BAP 22.19 µM (C). PLBs ditunjukkan oleh tanda panah, terbanyak pada perlakuan BAP 11.09 µM (G)
lebih panjang dan langsing dibandingkan Phal . ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’ yang memiliki daun lebih oval. Pada penelitian ini, jumlah daun terbanyak juga dihasilkan pada  media  optimum  untuk  tunas,  menunjukkan  bahwa konsentrasi  auksin  (0.53  µM  NAA)  dan  sitokinin  (22.19
µM BAP) juga sesuai untuk pertumbuhan dan morfogenesis daun sehingga daun terbentuk sempurna dan tidak roset.
Jumlah akar pada Phal. amabilis x Phal .‘KHM 421’ terhambat oleh perlakuan BAP namun tidak berbeda nyata antar konsentrasi BAP, menunjukkan konsentrasi BAP pada
Konsentrasi BAP (µM) Jumlah tunas 2 4 6 8 10 12 11.09 1.0 1.3 1.3 1.7 1.7b 1.7b 22.19 1.3 2.7 3.0 3.7 4.7a 4.7a 33.29 1.3 1.3 1.7 2.3 2.3b 2.3b 44.39 1.0 1.3 2.0 2.3 2.0b 2.3b Jumlah daun 11.09 2.3 2.7 2.7 3.0 3.3b 3.7b 22.19 2.7 3.0 4.3 5.7 6.3a 7.0a 33.29 1.7 2.0 3.3 3.7 4.3b 5.0b 44.39 2.0 2.3 3.0 3.3 3.7b 4.7b Jumlah akar 11.09 2.0 2.3 2.7 3.3 3.3 3.3 22.19 1.3 1.3 2.0 2.3 2.7 3.0 33.29 1.7 1.7 1.7 2.3 2.3 2.3 44.39 1.7 1.7 2.3 2.3 2.3 2.3
Tabel 2.  Rata-rata jumlah tunas, daun, akar, dan PLBs pada perlakuan konsentrasi BAP pada Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-38’ pada 2 sampai 12 MST
Keterangan: Rata-rata  dengan  huruf  yang  sama  tidak berbeda  nyata pada uji lanjut duncan multiple range test (DMRT) taraf  α 5%.
*/** = nyata/sangat nyata; tn = tidak nyata
Konsentrasi BAP (µM) Jumlah tunas 2 4 6 8 10 12 11.09 1.33 1.7 2.0b 2.0b 2.0b 2.0b 22.19 1.33 2.7 3.7a 4.7a 5.7a 6.0a 33.29 1.33 1.7 2.3b 2.7b 2.7b 3.3b 44.39 1.67 2.0 2.7b 3.0b 3.3b 3.7b Jumlah daun 11.09 1.3 2.3 2.3 4.7 4.7 4.7b 22.19 2.3 3.0 4.3 5.7 6.3 7.7a 33.29 1.7 2.3 3.0 4.3 5.0 5.3b 44.39 1.3 2.0 3.0 5.3 5.7 5.7b Jumlah akar 11.09 1.0 1.0 1.3 1.3 1.3 1.3 22.19 1.7 2.0 2.0 2.3 2.3 2.7 33.29 1.0 1.0 1.0 1.7 1.7 2.0 44.39 1.7 1.7 1.7 2.0 2.0 2.0
Tabel 3. Rata-rata jumlah tunas, daun, dan akar, pada perlakuan konsentrasi BAP pada Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’ pada 2 sampai 12 MST
Keterangan: Rata-rata  dengan  huruf  yang  sama  tidak berbeda  nyata pada uji lanjut duncan multiple range test (DMRT) taraf  α 5%. */** = nyata/sangat nyata; tn = tidak nyata
level yang terendah sudah dapat menghambat inisiasi akar. Pada Phal . ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-38’ dan Phal . ‘Salu  Spot’  x Phal . bellina ‘1102-44’  jumlah  akar  tidak berbeda  nyata  antar  perlakuan  konsentrasi  BAP.  Untuk mengetahui  apakah  BAP  menghambat  inisiasi  akar  pada kedua genotipe tersebut, perlu diuji pertumbuhan tunas pada media  kontrol  (tanpa  BAP)  dan  media  dengan  perlakuan BAP. Peran auksin dalam mendorong pertumbuhan akar telah dijelaskan pada tanaman model oleh Aloni et al . (2006), dan khusus  pada  anggrek  auksin  umumnya  dibutuhkan  untuk induksi akar dan regenerasi planlet (Novak et al., 2014). Meskipun  dalam  penelitian  ini  perlakuan  ditujukan untuk  induksi  dan  multiplikasi  tunas  aksilar,  pada Phal. amabilis x Phal .‘KHM  421’  ternyata  dapat  terbentuk PLBs.  Menurut  Lee et  al. (2013),  PLBs  identik  dengan embrio somatik karena pola perkembangannya yang serupa dengan perkembangan embrio anggrek in vivo dan adanya hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGPs) pada dinding sel PLBs seperti yang ditemukan pada embrio zigotik. Namun Fang et al. (2016) menjelaskan bahwa PLBs memiliki proses regenerasi yang tidak mengikuti pola embriogenesis yang ditunjukkan oleh adanya peran SHOOT MERISTEMLESS , sebuah  gen KNOTTED-LIKE  HOMEOBOX kelas  I  yang tidak  ditemukan  pada  embriogenesis  somatik  umumnya. Kemampuan  membentuk  PLBs  pada Phal.  amabilis x Phal .‘KHM  421’  diduga  karena  tunas  yang  berasal dari  perkecambahan  biji  masih  memiliki  sel-sel  induk yang  embriogenik  atau protocormgenic sehingga  mudah membentuk embrio dengan adanya induksi oleh auksin dan sitokinin.
Keragaman Genetik Tunas Klonal Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’ dengan Pto-SNAP Marker
SNAP  adalah  marka  genetik  yang  dapat  digunakan dalam  mempelajari  keragaman  genetik  spesies  dan membantu dalam pengaplikasian studi asosiasi marka suatu sifat  (Ong et  al., 2015).  Uji  aplikasi  marka  SNAP  untuk analisis keragaman dalam penelitian ini menggunakan klon Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina, ‘1102-44’ karena jumlah tunas yang dihasilkan pada genotype tersebut lebih banyak dari Phal. ‘Salu  Spot’ x  Phal.  bellina ‘1102-38’ . Tunas- tunas  dari Phal.  amabilis x Phal .‘KHM  421’  tidak  dapat digunakan  karena  berasal  dari  benih  yang  kemungkinan bersegregasi  sehingga  dapat  menimbulkan  bias  tentang sumber keragaman pada tunas.
Hasil analisis dengan 11 set ( reference and alternate ) primer Pto-SNAP disajikan pada Tabel 4.  Hasil elektroforesis produk  PCR,  menunjukkan  sebagian  besar  lokus  SNAP berada dalam kondisi heterozigot, dan terdapat 2 tunas yang memiliki profil SNAP berbeda dari klon lainnya, yaitu tunas no. 16 dari perlakuan 22.19 µM BAP pada lokus Pto- 241 dan tunas no. 19 dari perlakuan 44.39 µM BAP pada Pto- 424 (Gambar 3). Persentase keragaman pada masing-masing lokus  tersebut  sebesar  7.7%  dan  11.1%.  Hasil  tersebut mengindikasikan terjadinya perubahan susunan basa DNA pada  masing-masing  planlet  untuk  masing-masing  lokus tersebut.
Aplikasi  marka  SNAP  berbasis  gen  Pto  telah dilaporkan dapat membuktikan adanya variasi somaklonal pada planlet klonal asal PLBs dari Phal. amabilis. Raynalta
e f g h B B A C D E F
G
H
Gambar 2. Keragaan tunas Phal . ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-38’ (A-D) dan Phal . ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’ (E-H) pada berbagai media perlakuan BAP : A &E) 11.09 µM, B & F) 22.19 µM, C & G) 33.29 µM, D & H) 44.39 µM. Tunas terbanyak (B & F) pada kedua genotipe dihasilkan pada perlakuan BAP 22.19 µM.
et  al. (2018) menganalisis  keragaman  pada  34  planlet klonal Phal.  amabilis dengan  18  marka  Pto-SNAP  dan menunjukkan  adanya  variasi  pada  3  lokus  SNP  dengan frekuensi mutasi 0.25%. Penggunaan marka molekuler juga telah dilakukan oleh Khoddamzadeh et al. (2010) pada Phal. bellina menggunakan marka RAPD , dimana tidak terdapat perbedaan  antara  tanaman  induk  dengan  PLBs  setelah
subkultur selama 3 bulan, namun setelah PLBs disubkultur kembali  selama  6  bulan  hasilnya  menunjukkan  terdapat disimilaritas sebesar 17% dengan tanaman induknya. Hasil di atas menunjukkan tingginya peluang variasi somaklonal namun perlu dievaluasi lebih lanjut apakah perubahan pada tingkat  molekuler  tersebut  akan  menimbulkan  fenotipik yang kurang menguntungkan pada tanaman sehingga tidak diperoleh tanaman yang ‘ true to type’.
Konsentrasi BAP (µM) Σ planlet dievaluasi % Keragaman planlet Nomor tunas dan Pto-SNAP sumber keragaman 11.09 4 0.0 0 22.19 13 7.7 16 (Pto-241) 33.29 4 0.0 0 44.39 9 11.1 19 (Pto-424) Total 30 18.8 2 planlet Tabel  4.  Persentase  keragaman  tunas  klonal Phal. ‘Salu  Spot’ x  Phal.  bellina ‘1102-44’  berdasarkan  analisis  molekuler dengan Pto-SNAP marker
(Ref) (Alt) B A (Ref) (Alt )
Gambar 3. Representasi hasil analisis molekuler klon Phal. ‘Salu Spot’ x Phal. bellina ‘1102-44’ pada lokus SNAP Pto-241 (A), Pto-424 (B). *Nomor klon yang memiliki profil SNP berbeda dengan profil SNP mayoritas. L = ladder (100bp); Ref = alel reference ;
Alt = alel alternative L bp 300> 200> 300> 200> (Ref) (Alt) B A (Ref) (Alt ) (Ref) (Alt) L bp 300> 200> 300> 200> (Ref) (Alt) * A * B

## KESIMPULAN
Konsentrasi  BAP  optimum  untuk  multiplikasi  tunas dan  jumlah  daun  pada  ketiga  genotipe  hibrida  yang  diuji adalah  22.19  µM  BAP,  sedangkan  pertumbuhan  akar cenderung terhambat oleh perlakuan BAP. Phal.amabilis x Phal ‘KHM 421’ menghasilkan PLB s terbanyak pada 11.09 µM  BAP,  dua  genotipe  lainnya  tidak  membentuk  PLBs. Marka Pto-SNAP berhasil mengidentifikasi keragaman pada tunas  klonal Phal. ‘Salu  Spot’ x  Phal.  bellina  ‘ 1102-44’, yaitu menghasilkan 2 tunas dengan profil SNP berbeda dari tunas lainnya pada lokus Pto- 241 dan Pto- 424. Persentase
keragaman  tunas  pada  media  perlakuan  BAP  22.19  µM sebesar  7.7%  dan  perlakuan  BAP  44.39  µM  terdapat keragaman sebesar 11.1%.

## DAFTAR PUSTAKA
Aloni,  R.,  E.  Aloni,  M.  Langhans,  M.C.I.  Ullrich.  2006. Role  of  cytokinin  and  auxin  in  shaping  root architecture:  regulating  vascular  differentiation, lateral root initiation, root apical dominance and root gravitropism. Ann. Bot. 97:883-93.
Bairu, M.W., A.O. Aremu, J.V. Staden. 2011. Somaclonal variation  in  plants:  causes  and  detection  methods. Plant Growth Regul . 63:147-173.
Balilashaki,  K.,  R.Naderi,  S.  Kalantari,  M. Vahedi.  2015. Efficient  in  vitro  culture  protocols  for  propagating Phalaenopsis ‘Cool Breeze’. Plant Tissue Culture and Biotechnology  24:191-203.  https://doi.org/10.3329/ ptcb.v24i2.23552.
Cetzal  Ix,  W.,  E.  Noguera-Savelli.  2014.  Oechidaceae: The  Largest  Family  of  Flowering  Plants. h t t p : / / w w w. e o e a r t h . o r g / v i e w / a r t i c l e / 53725e080cf2aafa2ccd8e15/.
Chen,  J.T.,  C.  Chang,  W.C.  Chang.  1999.  Direct  somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium Gower Ramsey  and  subsequent  plant  regeneration.  Plant Cell Rep. 19:143-149.
Chen,  J.T.,  W.C.  Chang.  2001.  Effects  of  auxins  and cytokinins on direct somatic embryogenesis on leaf explants of Oncidium ‘Gower Ramsey’. Plant  Growth Reg. 34: 229-232.
Doyle,  J.J.,  J.L.  Doyle.  1987.  A  rapid  DNA  isolation procedure  for  small  quantities  of  fresh  leaf  tissue. Phytochem Bull . 19:11-15.
Davies,  P.J.  2004.  Plant  Hormones  Biosynthesis,  Signal Transduction, Action . Dordrecht: Kluwer Academic Publisher, USA.
Dwiyani,  R.  2012.  Mikropropagansi  Tanaman  Anggrek Vanda  tricolor Lindl.  Var. Suavis forma  Bali  yang membawa  Gen KNOTTEDI-LIKE  Arabidopsis thaliana  (KNATI) .  Disertasi . Sekolah  Pascasarjana.
Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta, ID.
Elina,  J.,  D.  Sukma,  Giyanto,  Sudarsono.  2017.  Isolasi dan  karakterisasi  gen Pto asal  20  aksesi  anggrek Phalaenopsis . J. Agron. Indonesia 45:204-211.
Fang,  S.C.,  J.C.  Chen,  M.J.  Wei,  2016.  Protocorms  and Protocorm-Like  Bodies  Are  Molecularly  Distinct from  Zygotic  Embryonic  Tissues  in Phalaenopsis aphrodite . Plant Physiol. 17:2682-2700.
Gow, W.P., J.T. Chen, W.C. Chang. 2009. Effect of genotype, light  regime,  explant  position  and  orientation  on direct somatic embryogenesis from leaf explants of Phalaenopsis orchids. Acta Physiol. Plant 31:363-9.
Handoyo, F., R. Prasetya. 2009. Native orchids of Indonesia.
Indonesian Orchid Society. Jakarta, ID.
Jones, D., B. Tisserat. 1990. Clonal propagation of orchids. Methods Mol. Biol. 6:181-191.
Khoddamzadeh,  A.A.,  U.R.  Sinniah,  M.A.  Kadir,  S.B. Kadzimin,  M.  Mahmood,  S.  Sreeramanan.  2010. Detection  of  somaclonal  variation  by  random amplified  polymorphic  DNA  analysis  during micropropagation of Phalaenopsis bellina (Rchb.f.) Christenson. Afr. J. Biotech. 9:6632-6639.
Kosir, P., S. Skof, Z.Luthar. 2004. Direct shoot regeneration from  nodes  of Phalaenopsis orchids.  Acta  Agric. Slovenica 83:233-242.
Lee, Y.L., S.T. Hsu, E.C. Yeung. 2013. Orchid protocorm- like bodies are somatic embryos. Am. J. Soc. Hortic. Sci. 100:2121-2131.
Mammadov,  J., R. Aggarwal, R. Buyyarapu, S. Kumpatla,
S.  2012.  SNP  markers  and  their  impact  on  plant breeding.  Internat.  J.  Plant  Gen.  2012:728398. Doi:10.1155/2012/728398.
Novak, S.D., J.L. Luna, N.R. Gamage. 2014. Role of auxin in  orchid  development.  Plant  Signal.  Behav.  9: e972277-1 - e972277-8.
Ong,  P.W.,  I.  Maizura,  N.A. Abdullah,  M.Y.  Raffii,  L.C. Oii.  2015.  Development  of  SNP  markers  and  their application  for  genetic  diversity  analysis  in  the  oil palm ( Elaeis guineensis ). Genet. Mol. Res. 14:12205- 12216.
Paek, K.Y., E.J. Hahn, S.Y. Park. 2011. Micropropagation of Phalaenopsis orchids via Protocorms and Protocorm- Like  Bodies. In Clifton,  N.J.  ( Ed. ).  Methods  in Molecular  Biology  710:293-306.  Doi:10.1007/978- 1-61737-988-8_20.
Pusat Data dan Sistem Informasi Pertanian. 2015. Outlook Komoditas  Pertanian  Subsektor  Hortikultura: Anggrek. Sekretaris Jenderal Kementrian Pertanian. Jakarta, ID.
Ramdan.  2011.  Kultur  daun  dan  pangkal  batang  in  vitro anggrek  bulan  raksasa  ( Phalaenopsis  gigantea J.J. Smith) pada beberapa media kultur jaringan. Skripsi. Departemen  Agronomi  Dan  Hortikultura.  Fakultas Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Bogor
Raynalta,  E.,  D.  Sukma.  2013.  Pengaruh  komposisi media  dalam  perbanyakan  protocorm-like  bodies, pertumbuhan planlet dan aklimatisasi Phalaenopsis amabilis . J. Hort. Indonesia 4:131-139.
Raynalta, E., J. Elina, Sudarsono, D. Sukma. 2018. Clonal fidelity  of  micro-propagated Phalaenopsis planlets based  on  assessment  using  eighteen Ph-Pto SNAP marker loci. Agrivita J. Agric. Sci. 40:390-402.
Restiani,  R.,  E.  Semiarti, A.  Indrianto.  2016.  Konservasi anggrek hitam ( Coelogyne pandurata Lindl.) melalui mikropropagasi  pada  berbagai  medium  kultur.  hal. 393-404. Prosiding Symbion. Yogyakarta 27 Agustus 2016.
Rittirat, S., K. Thammasiri, S. Te-chato, S. 2012. Effect of media  and  sucrose  concentrations  with  or  without activated charcoal on the plantlet growth of P. cornu- cervi (Breda) Blume & Rchb. f. J. Agric. Technol. 8: 2077-2087.
Sukma, D., J. Elina, Giyanto, S. Sudarsono. 2017. Disease resistance breeding of Phalaenopsis spp. for tropical environment  and  molecular  marker  development
for  plant  selection.  Acta  Hort.  1167:237-244.  Doi: 10.17660/ActaHortic.2017.1167.36.
Sun, W.Y., W.Y. Zhao, Y.Y. Wang, C.C. Pei, W.C. Yang. 2011. Natural variation of Pto and Fen genes and marker- assisted selection for resistance to bacterial speck in tomato. Agric. Sci. China 10:827-837. Doi:10.1016/ S1671-2927(11)60068-0.
Yulianti, Y., S.I. Aisyah, D. Sukma. 2016. Pengaruh bahan organik  nabati  dan  hewani  terhadap  pertumbuhan protocorm-like  bodies Phalaenopsis  amabilis (L.) Blume. J. Hort. Indonesia 7:176-186.
Yuswanti, H., I.P. Dharma, Utami, I.W. Wiraatmaja. 2015.
Mikropropagasi  anggrek Phalaenopsis dengan menggunakan  eksplan  tangkai  bunga.  Agrotrop 5:161-166.