Jurnal Ilmiah Kesehatan Sandi Husada hhttps://akper-sandikarsa.e-journal.id/JIKSH Vol 10,  No, 2, Desember 2019, pp;325-330 p-ISSN: 2354-6093 dan e-ISSN: 2654-4563 DOI: 10.35816/jiskh.v10i2.181
LITERATUR REVIEW Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell (BM-MSC) Sebagai Sumber Alternatif Sel Blastema Terhadap Regenerasi Anggota Tubuh Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell (BM-MSC) as an Alternative Source of Blastema Cells Against Regeneration of the Body
Kuntum Sureda Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Lampung
Artikel info Artikel history:
Received; 24 Desember 2019
Revised; 26 Desember 2019
Accepted; 30 Desember 2019

## Abstract
Limb  regeneration  is  initiated  by  blastema  cells  (BC)  and  related genes  that  are  only  present  in  mammals  confined  to  the  distal fingertips of the phalangeal terminals and neonates. If amputated to proximal  phalangeal,  regeneration  will  fail  due  to  lack  of  blastema cells (BC) in adults and difficulty in isolating and using blastema cells (BC) from neonates. BM-MSC has succeeded in increasing its ability to regenerate  various  wound  tissue and its  healing  properties, because of  this  BM-MSC  is  used  as  an  alternative  cell  source  that  produces blastema  cells  (BC).  The  original  blastema  cells  (BC)  that  isolated from neontus and blastema cells (BC) in BM-MSC were compared to the  ability  of  colony  formation,  cell  proliferation,  alkaline phosphatase  activity  (ALP),  calcium  supply,  and  osteogenic  gene expression.  The  ability  to  form  colonies  was  significantly  higher  in BM-MSC compared to original BC (P <0.05). Alizarin red stain (ARS), calcium and ALP tests show higher levels of mineral deposition in BM MSCs.  The  qRT-PCR  analysis  revealed  cells  from  both  sources  were ready  to  differentiate  into  mesodermal  lineages.  The  rate  of expression  of  osteblastic  markers  shows  the  capasity  of  bone differences is higher at BM-MSC at all time points.
Abstrak .
Regenerasi  anggota  tubuh  dimulai  oleh  sel-sel  blastema  (BC)  dan gen-gen yang terkait yang hanya ada pada mamalia terbatas pada ujung jari distal phalangeal terminal dan neonatus. Jika diamputasi hingga  phalangeal  proksimal  maka  regenerasi  akan  gagal  karena kurangnya  sel-sel  blastema  (BC)  pada  orang  dewasa  dan  kesulitan dalam mengisolasi dan memperluas sel blastema (BC) dari neonatus. BM-MSCs telah diakui kemampuannya untuk meregenerasi berbagai jaringan  luka  dan  sifat  penyembuhannya,  karena  hal  ini  BM-MSCs dijadikan  sebagai  sumber  sel  alternatif  yang  menghasilkan  sel blastema (BC). Sel blastema (BC) asli yang diisolasi dari neontus dan sel  blastema  (BC)  pada  BM-MSC  dibandingkan  berdasarkan kemampuan  pembentukan  koloni,  proliferasi,  aktivitas  alkaline phosphatase (ALP), kandungan kalsium, dan ekspresi gen osteogenik. Kemampuan pembentukan koloni secara signifikan lebih tinggi pada
BM-MSC dibandingkan dengan BC asli (P <0, 05). Alizarin red stain (ARS),  kalsium  dan  uji  ALP  menunjukkan  tingkat  deposisi  mineral yang lebih tinggi pada BM-MSCs. Analisis qRT-PCR mengungkapkan bahwa  sel-sel  dari  kedua  sumber  siap  berdiferensiasi  menjadi  garis keturunan  mesodermal.  Tingkat  ekspresi  gen  marker  osteblastik menunjukkan  kapasitas  diferensiasi  tulang  yang  lebih  tinggi  pada BM-MSC pada semua titik waktu. Keywords: Blastema cell; Bone marrow-derived mesenchymal stem cell;
Limb regeneration;
Coresponden author: Email: kuntumsureda93@gmail.com
artikel dengan akses terbuka dibawah lisensi CC BY -4.0

## PENDAHULUAN
Regenerasi  anggota  tubuh  adalah  proses  dinamika  yang  sangat  rumit  dan  sangat  berbeda  di antara  berbagai  spesies  di  dunia  ini  (Bryant  SV  et  al,  2002).  Pada  amfibi  seperti  kadal  air  dan salamander memilikI kemampuan untuk membentuk anggota tubuh seutuhnya di level mana pun bahkan setelah di amputasi. Namun, pada mamalia seperti manusia dan tikus, potensi regenerasi anggota tubuh hanya terbatas pada daerah distal phalanx terminal dan pada neonatus. Berbagai upaya telah dilakukan untuk membuat kemampuan regenerasi anggota tubuh pada amfibi yang kuat diterapkan pada regenerasi anggota tubuh pada mamalia dewasa yang terbatas. Memahami bagaimana  perbedaan  dan  persamaan  penyembuhan  luka  antara  amfibi  dan  mamalia  akan menunjukkan  cara  regenerasi  tubuh  pada  amfibi  yang  bisa  diaplikasikan  pada  mamalia (Dinsmore,  1996;  Spallanzani  et  al,  2009).  Regenerasi  anggota  badan  terdiri  dari  tiga  fase berbeda yang biasanya dimulai dengan pembentukan regenerative epitel yang menutupi anggota tubuh  yang  luka  akibat  diamputasi.  Segera  setelah  penyelesaian  penutupan  luka,  populasi mesenchymal sel [Sel Blastema (BC)] menumpuk di daerah luka.  Secara alami, sel-sel blastema (BC)  dianggap  sebagai  kunci  mediator  utama  regenerasi  ujung  jari  sehingga  hilangnya  sel-sel blastema  (BC)  setelah  amputasi  proksimal  menyebabkan  pembentukan  parut  pada  mamalia dewasa (Muneoka K, Sassoon D, 1992).
BC  diyakini  sebagai  suatu  populasi  sel  heterogen  sel  progenitor  yang  berasal  dari  fibroblas jaringan  penghubung.  Ada  beberapa  biomarker  permukaan  utama  yang  ditugaskan  untuk  BC: antigen  sel-1  (Sca-1),  endothelial  marker  (CD31),  dan  vimentin.  Hal  ini  telah  meyakinkan  dan menunjukkan  bahwa  ketiadaan  BC  dan  gen  yang  terkait,  dimana  dalam  hal  ini  termasuk  gen Msx1  dan  Msx2,  mengakibatkan  kegagalan  regenerasi  anggota  tubuh  yang  di  amputasi  pada bagian proksimal  di  tikus dewasa  (Tamura et  al,  2010).  Pembentukan tulang dianggap sebagai proses utama regenerasi anggota tubuh yang diamati pada amfibi (Ide H, 2012). Dalam hal ini BC memungkinkan  untuk  proses  pembentukan  tulang  dapat  terjadi  dengan  memicu  kaskade  jalur pensinyalan  sel  yang  mencakup  Bone  Morphogenetic  Protein  (BMP)  dan  Fibroblast  Growth Factor(FGF). Meski demikian, ketersediaan adanya BC adalah masalah yang penting. Penggantian BC  oleh  sumber  sel  yang  tersedia  seperti  Sel  Punca  Mesenchymal  (MSC)  yang  memiliki karakteristik  yang  sama  bisa  menjadi  strategi  yang  berharga  dalam  regenerasi  ekstremitas (Fernando et al, 2011; Han M et al, 2003).
Bone  marrow-derived  MSCs  (BM-MSCs)  telah  banyak  diteliti  mengenai  kemampuannya  untuk meregenerasi  berbagai  jaringan  luka  dan  sifat  penyembuhannya  di  lebih  dari  350  uji  klinis  di seluruh  dunia  (Penformis  P,  Pochampally  R,  2011).  Baru-baru  ini,  banyak  penelitian  yang menggunakan  transplantasi  BM-MSC  pada  ujung  digit  neonates  yang  diamputasi  menghasilkan peningkatan  pembentukan  tulang  (Masaki  H,  Ide  H,  2007).  Meskipun  banyak  penelitian  telah dikhususkan untuk aplikasi ini dan peran BM-MSC pada pembentukan tulang, tapi masih sedikit investigasi untuk menjelaskan potensi MSC di Indonesia tentang regenerasi anggota tubuh. Oleh karena  itu,  artikel  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  kemampuan  atau  peran  BM-MSC  sebagai
sumber sel alternatif untuk tersedianya BCs untuk regenerasi anggota tubuh. Di sini, BC diisolasi dari  ujung  jari  neonatal  untuk  pertama  kali  dan  ditandai  bagaimana  morfologi,  kemampuan diferensiasi,  dan  marker  pada  permukaan  sel  dan  di  bandingkan  dengan  sumber  sel  blastema (BC) yang berasal dari BM-MSC. Selanjutnya, menilai kemampuan pembentukan tulang kedua sel yang  diisolasi  oleh  alkali  aktivitas  fosfatase  (ALP),  penanda  tingkat  ekspresi  osteoblastic, kandungan  kalsium,  dan  pewarnaan  alizarin  merah  (ARS).  Hal  ini  meyakini  bahwa  BM-MSCs dapat  digunakan  secara  tepat  sebagai  sumber  sel  untuk  regenerasi  anggota  tubuh  dan mempercepat regenerasi luka.

## Metode
Metode  yang  digunakan  adalah  menggunakan  studi  literature  yang  diambil  dari  berbagai  jurnal internasional  maupun  nasional,  metode  ini  berupaya  untuk  meringkas  kondisi  pemahaman terkini tentang suatu topik. Studi literature menyajikan ulang materi yang diterbitkan  sebelumnya, dan  melaporkan  fakta  atau  analisis  baru.  Tinjauan  literatur  memberikan  ringkasan  berupa publikasi  terbaik  dan  paling  relevan.  Kemudian  membandingkan  hasil  yang  disajikan  dalam makalah.

## Hasil Dan Pembahasan
Regenerasi anggota tubuh dilakukan pada eksremitas yaitu ujung jari distal hewan uji coba yaitu Tikus dewasa ( Rattus norvegicus). Dalam kondisi normal regenerasi hanya terbatas pada setengah ujung  jari  distal  phalangeal  terminal,  sedangkan  pada    ujung  jari  distal  sepertiga  phalangeal proksimal gagal regenerasi karena kurangnya sel blastema (BC) dan gen lainnya seperti Msx 1 dan Msx  2.  Gen-gen  Msx  mengatur  perilaku  seluler  seperti  proliferasi  dan  diferensiasi  dan  juga  pola pertumbuhan  jari  selama  pengembangan dan  regenerasi  ekstremitas.  Pembentukan  sel  blastema (BC)  adalah  langkah  sementara  yang  penting  dalam  proses  regenerasi  tungkai,  yang  tidak  ada dalam ujung jari manusia dan tikus dewasa yang diamputasi secara proksimal (Han M et al, 2003). BC  diisolasi  dari  ujung  jari  neonatal  untuk  pertama  kali  dan  ditandai  bagaimana  morfologi, kemampuan diferensiasi, dan marker pada permukaan sel nya dan di bandingkan dengan sumber sel blastema (BC) yang berasal dari BM-MSC. Baik BC asli maupun BC pada BM-MSC menunjukkan populasi sel heterogen dalam kultur primer, yang menjadi relatif homogen setelah 2-3 bagian. Uji CFU-F menunjukkan bahwa kedua kelompok memiliki kemampuan membentuk koloni, meskipun koloni kultur BC pada BM-MSC punya ukuran, jumlah, dan tingkat pertumbuhan yang lebih besar secara  signifikan.  Banyak  faktor  seperti  proliferasi  sel,  kematian  sel,  migrasi  sel,  sekresi  faktor pertumbuhan, dan matriks berdampak pada ukuran dan jumlah koloni di Uji CFU (Bovette LB et al, 2014).  Uji MTT menunjukkan bahwa kemampuan proliferasi sel pada BC asli dan BC pada BM-MSC dalam  tigkat  yang  sama.  Hal  ini  telah  mengkonfirmasi  bahwa  BC  yang  dihasilkan  pada  BM-MSC akan  menjadi  kandidat  alternatif  yang  tepat  untuk  pengganti  sel  blastema  (BC)  karena  proses proliferasi yang sangat penting untuk perbaikan jaringan mamalia (Shyh-Chang N et al, 2013).
Sel induk yang terisolasi dari kultur BC asli dan BC pada BM-MSC juga diidentifikasi berdasarkan marker permukaan  sel  tertentu.  Analisis  dari marker permukaan  sel  menyatakan  bahwa  kedua populasi  sel  mengungkapkan  bahwa marker sel  mesenchymal  adalah  CD73,  CD90,  dan  CD105. Selain  itu,  CD31,  Vim  dan  Sca-1  dianggap  sebagai marker khusus  untuk  BC  pada  BM-MSC. Flow cytometry dan  hasil  imunofluoresensi  dikonfirmasi  dengan  jelas  bahwa  ekspresi  marker  spesifik lebih tinggi pada BM-MSC (Odelberg, 2004).
Kedua  kelompok  sel  memiliki  kemampuan  untuk  berdiferensiasi  menjadi  kerangka  garis keturunan sel. Kedua sel yang terisolasi memiliki potensi diferensiasi yang sama antara kondrosit dan  garis  turunan  osteoblastik.  Kemampuan  kondrogenik  dan  osteogenik  dari  sel-sel  yang terisolasi didukung oleh penampilan proteoglikan dan nodul termineralisasi yang diwarnai positif dengan toluidine blue dan alizarin merah. Penelitian telah menunjukkan bahwa BM pada BM-MSC memiliki kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi sel kerangka seperti tulang dan tulang rawan. Peneltian mendeteksi peningkatan regulasi osteogenik dan gen terkait kondrogenik untuk BC pada
BM-MSCs yang telah mengkonfirmasi bahwa mereka milik sumber sel mesenchymal (Tanaka EM, 2003).  Akumulasi  lipid  pada  kedua  BC  pada  BM-MSC  dan  BC  asli  mengkonfirmasi  potensi diferensiasi  adipogenik.  Namun,  BC  pada  BM-MSC  memiliki  potensi  adipogenik  yang  lebih  besar dibandingkan  dengan  BC  asli.  BM-MSC  dapat  memunculkan  jenis-jenis  sel  lain  karena  sifat multipotent mereka, sementara BC asli sebagai sel progenitor, memiliki nasib sel yang ditentukan sebelumnya.  Jadi,  pergeseran  diferensiasi  BC  asli  ke  garis  keturunan  osteoblas,  tetapi  tidak adipogenik,  dapat  berkontribusi  pada  aktivas  sinyal  BMP  dan  pembentukan  tulang (Duque  G, 2008).
Gen MSX dianggap sebagai gen spesifik regenerasi yang biasanya diekspresikan dalam BC asli. Gen ini  mengatur  pertumbuhan  sel,  diferensiasi  sel,  pembentukan  tulang,  dan  sangat  penting  untuk pembentukan anggota tubuh fungsional. Hasil qRT-PCR telah menunjukkan perubahan signifikan dalam tingkat ekspresi Msx1 dan Msx2 di BC asli dan BC pada BM-MSC. Demikian pula berdasarkan hasil imunofluoresensi terdapat peningkatan drastis dalam kadar gen MSX1 dan MSX2 dalam BC pada BM-MSC. Sejalan dengan hasil ini, Bmp4 dan Fgf8 secara signifikan juga diregulasi dalam BC pada BM-MSC. Evaluasi ekspresi protein oleh imunofluoresensi juga mengkonfirmasi peningkatan regulasi  BMP4  dalam  BC  pada  BM-MSC.  BMP4  memainkan  peran  kunci  dalam  pengembangan tulang dan perbaikan kerangka, serta  respon regenerasi endogen (Bandyopadhyay A et al, 2006). FGF8, sebagai salah satu dari molekul pensinyalan kritis selama pembentukan blastema, terhubung ke inisiasi, hasil, dan pertumbuhan pola anggota tubuh vertebrata (Han MJ et al, 2001).
Agar  bisa  menjelaskan  dengan  tepat  kemampuan  pembentukan  tulang  BC  pada  BM-MSC, pentingnya mengevaluasi diferensiasi osteoblastik BC asli dan BC pada BM-MSC dengan penilaian aktivitas  ALP,  kandungan  kalsium,  dan  qRT-PCR  pada  titik  waktu  yang  berbeda.  ALP,  sebagai marker awal  untuk  diferensiasi  osteoblastik,  meningkat  secara  signifikan  pada  kedua  jenis  sel dalam  7  hari  pertama.  Yang  diketahui  bahwa  diferensiasi  osteogenik  awal  dimulai  dengan peningkatan  aktivitas  ALP,  levelnya  menurun  ketika  gen  osteoblastik  lain  diregulasi  sebelum deposisi kalsium. Sesuai dengan Hasil ALP, kandungan kalsium meningkat secara signifikan pada BC  pada  BM-MSCs  ketika  aktivitas  ALP  menurun.  Diferensiasi  osteogenik  dikonfirmasi  oleh  ARS yang  secara  khusus  mengecek  nodul  yang  termineralisasi.  Berdasarkan  hasil  saat  ini,  terdapat peningkatan progresif dalam jumlah nodul termineralisasi selama 3 minggu osteoinduksi untuk BC pada BM-MSC (Sugawara Y et al, 2002).
Analisis ekspresi gen Runx2, Kolom I dan OCN Juga mengalami peningkatan terkait gen osteogenik dalam  kelompok  BC  asli  dan  BM-MSCs.  Runx2,  sebagai marker awal  diferensiasi,  dikenal  untuk mengaktifkan  gen  terkait  osteogenik,  termasuk  kolagen  I,  osteopontin,  osteocalcin,  dan sialoprotein tulang (Franceschi RT, Xiao G, 2003). Dengan demikian, perubahan Runx2 meningkat setiap hari ke 7 dan 14, dan menurun pada hari ke 21. Kolom I adalah salah satu protein matriks ekstraseluler  pertama  yang  dihasilkan  selama  induksi  tulang.  Tingkat  ekspresi  yang  lebih  tinggi dari  Kolom  I  membuktikan  kemampuan  membentuk  tulang  pada  BC  pada  BM-MSC.  OCN  adalah marker osteogenik  lain  yang  mulai  berekspresi  selama  masa  akhir  diferensiasi.  Meningkatnya regulasi  Ocn  pada  hari ke  21  berbanding  lurus  BC  pada BM-MSC  dan  BC  asli dapat menginduksi pembentukan  ECM  pada  akhir.  Karena  itu,  data  qRT-PCR  konsisten  dengan  yang  dikumpulkan nodul  mineral  terdeteksi  oleh  ARS  dan  kandungan  kalsium  yang  mendukung  kemampuan pembentukan tulang pada BC pada BM-MSC (Jeon O et al, 2008).
BMP4 sebagai faktor kunci selama perkembangan tulang dan mempercepat proses pembentukan tulang.  Analisis  qRT-PCR  menunjukkan  tingkat  ekspresi sedikit  lebih  tinggi  dari  gen osteoblastik dalam kelompok BC pada BM-MSC. Oleh karena itu, peningkatan aktivitas osteogenik BC pada BM- MSC relatif lebih tinggi terhadap BC asli yang mungkin berhubungan dengan ekspresi gen BMP4.

## Simpulan Dan Saran
Sel  Blastema  (BC)  yang  dihasilkan  oleh  BM-MSC  menghasilkan  Sel  Blastema  (BC)  yang  serupa bahkan lebih signifikan daripada BC asli. Berbagai aspek dari potensi perkembangan sel, proliferasi sel, dan yang terpenting, modulasi imun dan respons inflamasi tampak serupa. Mesenchymal Stem Cell (MSC) selain menyediakan akses sebagai sumber alternatif sel, dapat mempercepat regenerasi luka melalui potensi diferensiasi tulang yang tinggi. Karena hal itu, MSC dapat digunakan sebagai sumber  sel  yang  tepat  dalam  hal  ini  yaitu  sel  blastema  (BC)  sebagai  aplikasi  terapi  untuk regenerasi  anggota  tubuh.  Studi  tambahan  pada  model  hewan  yang  menggunakan  MSC  yang dimodifikasi  atau  direkayasa  dapat  memberikan  pemahaman  yang  lebih  baik  tentang  proses regenerasi dari amputasi proksimal ujung jari.

## Daftar Rujukan
Bandyopadhyay A, Tsuji K, Cox K, Harfe BD, Rosen V, Tabin CJ. 2006. Genetic analysis of the roles of BMP2, BMP4, and BMP7 in limb patterning and skeletogenesis. PLoS Genet. 2(12): e216.
Boyette  LB,  Creasey  OA,  Guzik  L,  Lozito  T,  Tuan  RS.  2014.  Human  bone  marrow-derived mesenchymal stem cells display enhanced clonogenicity but impaired differentiation with hypoxic preconditioning. Stem Cells Transl Med.3(2): 241-254
Bryant SV, Endo T, Gardiner DM. 2002. Vertebrate limb regeneration and the origin of limb stem cells. Int J Dev Biol. 46(7): 887-896.
Dinsmore  CE.  1996.  Urodele  limb  and  tail  regeneration  in  early  biological  thought:  an  essay  on scientific controversy and social change. Int J Dev Biol 40:621-7; PMID:8877433
Duque G. 2008. Bone and fat connection in aging bone. Curr Opin Rheumatol. 20(4): 429-434. Fernando WA, Leininger E, Simkin J, Li N, Malcom CA, Sathyamoorthi S, et al. 2011. Wound healing and  blastema  formation  in  regenerating  digit  tips  of  adult  mice.  Dev  Biol.  350(2):  301- 310.
Franceschi  RT,  Xiao  G.  2003.  Regulation  of  the  osteoblast-specific  transcription  factor,  Runx2: responsiveness to multiple signal transduction pathways. J Cell Biochem. 88(3): 446-454. Han M, Yang X, Farrington JE, Muneoka K. 2003. Digit regeneration is regulated by Msx1 and BMP4 in fetal mice. Development. 130(21): 5123-5132.
Han  MJ,  An  JY,  Kim  WS.  2001.  Expression  patterns  of  Fgf-8  during  development  and  limb regeneration of the axolotl. Dev Dyn. 220(1): 40-48.
Ide H. 2012. Bone pattern formation in mouse limbs after amputation at the forearm level. Dev Dyn.
241(3): 435-441.
Jeon  O,  Rhie  JW,  Kwon  IK,  Kim  JH,  Kim  BS,  Lee  SH.  2008.  In  vivo  bone  formation  following transplantation  of  human  adipose-derived  stromal  cells  that  are  not  differentiated osteogenically. Tissue Eng Part A. 14(8): 1285-1294
Masaki H, Ide H. 2007. Regeneration potency of mouse limbs. Dev Growth Differ. 49(2): 89-98. Muneoka  K,  Sassoon  D.  1992.  Molecular  aspects  of  regeneration  in  developing  vertebrate  limbs. Dev Biol. 152(1): 37-49.
Odelberg  SJ.  2004.  Unraveling  the  molecular  basis  for  regenerative  cellular  plasticity.  PLoS  Biol.;
2(8): E232.
Penfornis  P,  Pochampally  R.  2011.  Isolation  and  expansion  of  mesenchymal  stem cells/multipotential stromal cells from human bone marrow. Methods Mol Biol.; 698: 11- 21.
Shyh-Chang N, Zhu H, Yvanka de Soysa T, Shinoda G, Seligson MT, Tsanov KM, et al. 2013. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155(4): 778-792.
Spallanzani  L.  Nouvelles  Recherches.  2009.  Part  1-2:  SurLes  Decouvertes  Microscopiques  Et  La Generation  Des  Corps  Organises  (1769),  pg  680.  Whitefish,  Montana:  Kessinger Publishing.
Sugawara  Y,  Suzuki  K,  Koshikawa  M,  Ando  M,  Iida  J.  2002.  Necessity  of  enzymatic  activity  of alkaline phosphatase for mineralization of osteoblastic cells. Jpn J Pharmacol. 88(3): 262- 269.
Tamura  K,  Ohgo  S,  Yokoyama  H.  2010.  Limb  blastema  cell:  a  stem  cell  for  morphological regeneration. Dev Growth Differ. 52(1): 89-99.
Tanaka EM. 2003. Cell differentiation and cell fate during urodele tail and limb regeneration. Curr Opin Genet Dev.; 13(5): 497-501.