## VALIDASI METODE ANALISA PADA PENETAPAN KADAR KOENZIM Q10 DALAM SEDIAAN MIKROEMULSI MENGGUNAKAN METODE SPEKTROPHOTOMETER UV-VIS
Silvi Ayu Wulansari * , Eziah Ika Lubada Akademi Farmasi Surabaya, Surabaya, Indonesia
* email: silviayu25@gmail.com
Received 12 March 2020
Accepted 18 May 2020

## Abstrak
Koenzim Q10 banyak digunakan dalam bidang kosmetika karena dapat digunakan sebagai antioksidan,  namun  koenzim  Q10  memiliki  kekurangan  yaitu  hanya  dapat  larut  dalam minyak  dan  memiliki  ukuran  partikel  yang  besar  sehingga  sulit  untuk  masuk  pada  kulit. Koenzim  Q10  diformulasikan  dalam  sediaan  mikroemulsi  untuk  memperbaiki  penetrasi dalam kulit. Untuk menunjang efek terapetik dari sediaan mikroemulsi perlu dikembangkan penetapan  kadar  koenzim  Q10  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis,  menggunakan pelarut [Acetonitril : 2-propanol (84:16)] dan diukur pada panjang gelombag 275 nm. Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  koenzim  Q10  linier  pada  rentang  konsentrasi  25,5–153,0 ppm dengan LOD dan LOQ sebesar 5,25 µg/mL dan 17,48 µg/mL. Metode penetapan kadar koenzim Q10 pada sampel mikroemulsi memiliki nilai akurasi dan presisi yang cukup baik dengan  rata-rata  perolehan  kembali  100,70%  dan  SD  0,41%  .  Spektrofotometer  UV-Vis dapat  digunakan  sebagai  metode  dalam  penetapan  kadar  koenzim  Q10  dalam  sediaan mikroemulsi yang memenuhi persyaratan validasi penetapan kadar sediaan farmasi.
Katakunci : Validasi,  koenzim  Q10,  mikroemulsi,  penetapan  kadar,  spektrofotometri  UV- Vis

## Abstract
Coenzyme Q10 is widely used in cosmetics because it can be used as an antioxidant, but coenzyme Q10 has the disadvantage of being soluble in oil and having a large particle size making  it  difficult  to  enter  the  skin.  Coenzyme  Q10  is  formulated  in  microemulsion preparations  to  improve  penetration  in  the  skin.  To  support  the  therapeutic  effect  of microemulsion preparations, it is necessary to develop levels of Coenzyme Q10 using a Uv- Vis spectrophotometer, using a [Acetonitril: 2-propanol (84:16)] solvent and measured at a 275  nm  wave  length.  The  results  showed  that  linear  coenzyme  Q10  in  the  concentration range  of  25.5 – 153.0  ppm  with  LOD  and  LOQ  was  5.25  μg/mL  and  17.48  μg/mL.  The method  of  determining  the  levels  of  coenzyme  Q10  in  microemulsion  samples  has  good accuracy and precision with an average recovery rate of 100.70% and SD 0.41%. UV-Vis spectrophotometer can be used as a method in determining the levels of coenzyme Q10 in microemulsion preparations that meet the validation requirements for the determination of pharmaceutical dosage levels.
Keywords :  Validation,  coenzyme  Q10,  microemulsion,  determination  of  dosage  level, spectrophotometer UV-Vis

## Pendahuluan
Kemajuan  ilmu  pengetahuan  dan teknologi  menyebabkan  bentuk  sediaan telah  berevolusi  dari  campuran  sederhana dan  pil,  menjadi  sistem  yang  sangat canggih,  yang  dikenal  sebagai  sistem pengiriman obat baru. Mikroemulsi adalah sistem  pengiriman  obat  baru  yang  terdiri dari sistem emulsi minyak dan air dengan rata-rata  diameter  droplet  mulai  dari  50- 1000  nm.  Biasanya,  ukuran  droplet  rata- rata  adalah  antara  100-500  nm  dan  dapat berupa bentuk minyak dalam air (m/a) atau air  dalam  minyak  (a/m)  (Chime  et  al., 2014).
Koenzim Q10 atau ubiquinon merupakan  vitamin  dan  antioksidan  larut lemak  yang  berguna  untuk  meningkatkan produksi energi di dalam sel mitokondria. Pada  kulit  konsentrasi  koenzim  Q10  10 kali lebih tinggi pada epidermis dari pada di  dermis  (Montenegro,  2014).  Sebagai bahan  kosmetik  koenzim  Q10  bertindak sebagai antioksidan yang dapat melindungi tubuh dari kerusakan diakibatkan. oleh molekul berbahaya yang biasanya disebut radikal bebas (Kapoor A. &Kapoor  P.,  2013).  Koenzim  Q10 memiliki  kekurangan  yaitu  hanya  dapat larut  dalam  minyak  dan  memiliki  ukuran partikel  yang  besar  sehingga  sulit  untuk masuk pada kulit. Koenzim Q10 diformulasikan dalam sediaan mikroemulsi untuk memperbaiki penetrasi dalam  kulit  (Deapsari,  2016).  Untuk menunjang  efek  terapetik  dari  sediaan mikroemulsi  perlu  dilakukan  penetapan kadar  Koenzim  Q10  untuk  menjamin kualitas sediaan mikroemulsi, oleh karena itu  diperlukan  sebuah  metode  penetapan kadar koenzim Q10 menggunakan pelarut yang  sesuai  untuk  bisa  memisahkan koenzim  Q10 dari kandungan–kandungan yang  ada  di  dalam  mikroemulsi.  Metode ini  belum  pernah  dilakunakan  untuk penetapan  kadar  koenzim  Q10  dalam mikroemulsi  maka  diperlukan  validasi metode terlebih dahulu sebelum dilakukan penetapan kadar untuk sediaan mikroemulsi  yang  mengandung  koenzim
Q10.
Validasi metode bertujuan utuk mengetahui apakah metode yang digunakan untuk penetapan kadar koenzim Q10 dalam sediaan mikroemulsi ini sahih atau valid dilihat dari parameter– parameter tertentu. Parameter yang digunakan untuk menentukan validasi dari metode penetapan kadar ini adalah akurasi, presisi,  spesifitas,  linieritas,  LOQ  dan LOQ.  Parameter  tersebut  merupakan syarat  parameter  analisis  yang  harus dipenuhi  untuk  prosedur  analisis  kategori I.  Kategori  I  mencakup  prosedur  analisis kuantitatif untuk menetapkan kadar komponen utama bahan obat atau zat aktif dalam sediaan farmasi (Anonim, 2007).

## Metode Penelitian
Alat dan bahan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Timbangan analitik (ACIS  AD-300i),  Botol  timbang,  Beaker glass (Pyrex), Labu ukur (Pyrex),   Tabung reaksi,  Vortex,  Mikro  Pipet  1000µl, Milipore  0,45µm,  Spektrofotometri  UV- Vis (Genesys 10S).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini  adalah  koenzim Q10 (Chemco), mikroemulsi  koenzim  Q10, water  for injection ,  asetonitril  (Merck),  2-propanol (Merck).
Pembuatan  stok  larutan  standar  koenzim Q10 (500 µg/ml ) Pembuatan stok larutan standar Koenzim  Q10  dilakukan  dengan  cara timbang 5 mg, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, kemudian ditambahkan pelarut [Acetonitril : 2-propanol (84:16)] (Mahendra ,  et  al .,  2011)  sampai  batas  10 mL  pada  labu  ukur  dan  dikocok  sampai homogen dan diberi label penandaan (500 µg/mL koenzim Q10).

## Penetapan panjang gelombang maksimal
Larutan  standar  dipipet  1,5  ml  larutan tersebut  kemudian  dibaca  absorbansinya dengan  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang (λ) 200–
400  nm.  Absorbansi  tertinggi  yang diperoleh  dapat  digunakan  sebagai  (λ) maksimum.

## Pembuatan larutan kurva baku
Disiapkan  larutan  kurva  baku  yang mengandung  25;  50;  75;  100;  125;  150 µg/ml  koenzim  Q10,  dengan  cara  dipipet masing-masing:  0,5;  1;  1,5;  2;  2,5;  3  ml larutan stok standart koenzim Q10 dengan menggunakan pipet volume dan dimasukkan masing-masing kedalam labu ukur  10  ml.  Masing-masing  ditambahkan dengan  pelarut  [Acetonitril  :  2-propanol (84:16)]  sampai  batas  10  ml,  dikocok sampai  homogen  dan  diberi  label  pada setiap labu ukur.
Metode  validasi  linieritas,  LOD,  LOQ, akurasi, presisi dan perolehan kembali
Pengujian  LOD  dan  LOQ  untuk menentukan  batas  terendah  konsentrasi standar,  baik  yang  dapat  dianalisis  secara kualitatif (LOD) maupun secara kuantitatif (LOQ).  Perhitungan  LOD  dan  LOQ  dari standar  deviasi  (SD)  dan  slope  dari persamaan regresi kurva baku (S), dengan perhitungan  sebagai  berikut:  LOD  =  3,3 (SD/S) dan LOQ = 10 (SD/S).
Penentuan rentang dan linieritas diperoleh  dari  kurva  baku  yang  dibuat, dengan  memplot  data  perbandingan absorbansi (y) dengan konsentrasi  larutan (x).  Dari  data  yang  diperolehdilakukan perhitungan untuk mendapatkan persamaan  regresi  dan  koefisien  korelasi (r).  Koefisien  korelasi  (r)  ≥  0,99 (Rochman, 2016).
Pengujian akurasi dan presisi dilakukan dengan meggunakan metode spike membuat sediaan dengan rentang konsentrasi 0,8; 1; 1,2 gram koenzim Q10 (  80%;  100%;  120%  )  dan  konsentrasi akhir  sediaan  adalah  80;100;120  µg/ml koenzim Q10. Masing–masing konsentrasi dibuat 3 replikasi kemudian di dibaca
absorbansinya dengan menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis pada  panjang  gelombang  (λ)  maksimum. Hasil  absorbansinya  digunakan  untuk
menghitung  harga  perolehan  kembali ( recovery )  dengan  standar  deviasi  (SD) dan standar deviasi relative (RSD) ≤ 2,7%.
Bandingkan nilai persen perolehan kembali dengan keterimaan persen perolehan standar (AOAC, 2016). Analisa dilakukan pada hari yang sama ( interday ) dan selanjutnya akan dianalisa pada 3 hari yang berbeda secara berturut–turut
( intraday ).

## Penetapan  kadar  koenzim  Q10  dalam mikroemulsi
Dipipet  0,2  ml  sampel  dari  4  formula mikroemulsi  masing–masing  dimasukkan ke dalam tabung reaksi 10 ml, ditambahkan  pelarut  [Acetonitril  :  2- propanol (84:16)] sampai batas 10 ml dan di  kocok  sampai  homogen,  kemudian sampel  divortex  selama  2  menit  dan disonifikasi  selama  2  menit  kemudian difiltrasi  menggunakan  membran  filter 0,45  µm  diperoleh  supernatan  dan  diberi label  sampel  terlebih  dahulu.  Masing– masing sampel diamati dengan menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis pada panjang gelombang (λ) makasimum. Hasil  absorbansinya  digunakan  untuk menghitung  harga  perolehan  kembali ( recovery )  dengan  standar  deviasi  (SD) dan standar deviasi relatif (RSD) ≤ 2,7 %.

## Hasil dan Pembahasan

## Larutan baku koenzim Q10
Larutan  baku  koenzim  Q10  dengan konsentrasi  tertentu  dibuat  dengan  cara melarutkan  bahan  koenzim  Q10  dengan pelarut  [Acetonitril  :  2-propanol  (84:16)] (Mahendra ,  et  al .,  2011).  Penggunaan kombinasi  pelarut  dalam  melarutkan koenzim  Q10  dikarenakan  koenzim  Q10 sangat sukar larut dalam pelarut polar.

## Penentuan panjang gelombang maksimum
(λ maks) p ada koenzim Q10 Panjang  gelombang  maksimum    (λ maks)  merupakan  panjang  gelombang dimana  terjadi  eksitasi  elektronik  yang memberikan absorbansi maksimum. Alasan dilakukan pengukuran pada
panjang  gelombang  maksimum  adalah perubahan  absorban  untuk  setiap  satuan kosentrasi  adalah  paling  besar  pada panjang  gelombang  maksimum,  sehingga akan  diperoleh  kepekaan  analisis  yang maksimum. Penentuan panjang gelombang  pada  penelitian  ini  dilakukan dengan mengukur absorbansi dari koenzim Q10  pada  panjang  gelombang  ultraviolet yaitu antara panjang gelombang 200 nm – 400nm. Hasil spektrum senyawa koenzim Q10 dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar  1. Spektrum  senyawa  koenzim Q10
Berdasarkan hasil pengukuran diperoleh  panjang  gelombang  maksimum adalah  274nm.  Secara  teoritis  serapan maksimum  koenzim  Q10  adalah  275  nm (Eman S . et al ., 2016). Terjadi pergeseran
(λ  maks)  karena  pada  koenzim  Q10 memiliki  gugus  auksokrom  yang  terikat pada gugus kromofor yang bisa menyebabkan  pergeseran  pada  panjang gelombang maksimum.
Uji validasi metode analisa Linieritas
Kurva kalibrasi
dibuat
enam
konsentrasi  yang  mengandung  koenzim
Q10 25,0; 50,0; 75,0; 100,0; 125,0; 150,0 µg/ml. Masing-masing konsentasi diamati sebanyak  tiga  kali  replikasi.  Kurva kalibrasi  dibuat  dengan  memplot  data absorbansi (y) dengan konsentrasi  larutan (x).  Dari  data  yang  diperoleh  dilakukan perhitungan
untuk
mendapatkan persamaan  regresi  dan  koefisien  korelasi
(r).  Persamaan  regresi  kurva  kalibrasi koenzim Q10 adalah y = 0,0151x + 0,2039 dengan koefisien korelasi 0,9992. Koefisien korelasi (r) dalam penelitian ini sudah  memenuhi  persyaratan,  standar koefisien  korelasi  (r)  ≥  0,99  (Rohman, 2016).  Hasil  linearitas  kurva  kalibrasi koenzim  Q10  dilihat  pada  Gambar  2, sedangkan  data  absorbansi  pada  kurva kalibrasi  koenzim  Q10  dapat  dilihat  pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil uji linieritas kurva kalibrasi koenzim Q10 Sampel (ppm) Replikasi  Absorbansi 25,5 1 0.589 2 0.586 3 0.581 51,0 1 0.952 2 0.951 3 0.954 76,5 1 1.373 2 1.374 3 1.375 102,0 1 1.772 2 1.776 3 1.777 127,5 1 2.128 2 2.129 3 2.134 153,0 1 2.493 2 2.491 3 2.499
Gambar  2. Kurva  linieritas  kalibrasi koenzim Q10

## Batas deteksi  (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)
Batas  deteksi  (LOD)  dan  batas kuantitasi (LOQ) ditentukan pada rentang linieritas. Perhitungan LOD dan LOQ dari standar  deviasi  (SD)  dan  slope  dari persamaan regresi kurva baku (S), dengan perhitungan  sebagai  berikut:  LOD  =  3,3 (SD/S) dan LOQ = 10 (SD/S). Hasil LOD koenzim  Q105,25  µg/ml  dan  LOQ  17,48 µg/ml,  data  LOD  dan  LOQ  dapat  dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil pengujian LOD dan LOQ Item Absorbansi r 0,9992 SD 0,0264 LOD (µg/ml) 5,25 LOQ (µg/ml) 17,48

## Akurasi dan presisi
Data hasil uji presisi dan akurasi untuk sampel  mikroemulsi  dapat  dilihat  pada Tabel 3. Hasil penentuan akurasi, diperoleh  rata-rata  persen  perolehan koenzim Q10 adalah 100,70% dan rentang persen  perolehan  kembali  yang  didapat adalah 99,98–101,29%, di mana persyaratan  persen  perolehan  kembali yang  dapat  diterima  adalah  97–103% (AOAC,  2016).  Hal  itu  menunjukkan perolehan kembali untuk parameter akurasi  dan  presisi  telah  memenuhi persyaratan  yang  telah  ditentukan.  Pada penentuan akurasi dan presisi, didapatkan nilai  RSD  0,041%.  Nilai  RSD  tersebut memenuhi  kriteria  penerimaan  yang ditentukan  yaitu  tidak  lebih  dari  2%
(Snyder et  al. ,  2010).  Dengan  demikian keterulangan  dan  peroleh  kembali  untuk koenzim Q10 pada parameter akurasi dan presisi telah memenuhi persyaratan validasi.

## Tabel 3. Hasil uji akurasi dan presisi
Preparasi Sampel  Replikasi %Recovery (Hari ke- ) 1 2 3 80 ppm 1 100.86 100.26 100.43 2 101.29 101.09 101.34 3 100.28 101.58 101.04 100 ppm 1 100.74 100.33 100.06 2 101.05 100.29 100.76 3 99.98 101.09 100.59 120 ppm 1 100.78 100.17 100.39 2 100.87 100.84 100.93 3 100.48 100.53 100.89
Penetapan  kadar  koenzim  Q10  pada mikroemulsi
Pada penelitian ini konsentrasi koenzim Q10  yang  dianalisis  dalam  mikroemulsi sebesar 1% b/v). Hasil kadar Koenzim Q10 dapat  dilihat  di  Tabel  4.  Hasil  kadar koenzim  Q10  pada  sampel  mikroemulsi yaitu  100,11%  (F1);  100,52%  (F2); 100,19% (F3) dan 100,48% (F4) dan rata– rata  perolehan  kembali  koenzim  Q10 adalah 100,32%, itu menunjukkan perolehan  kembali  untuk  koenzim  Q10 telah  memenuhi  persyaratan  yang  telah
ditentukan  di  mana  rentang  perolehan kembali  senyawa  dengan  konsentrasi1% b/b  yang  dapat  diterima  adalah  97-103% (AOAC,  2016).    Nilai  RSD  pada penetapan  kadar  koenzim  Q10  adalah 0,0042%,  dan  telah    memenuhi  kriteria penerimaan  yang  ditentukan  yaitu  tidak lebih  dari  2%  (Snyder et  al. ,  2010). Dengan demikian keterulangan dan peroleh kembali untuk koenzim Q10  telah memenuhi persyaratan validasi.
Tabel 4. Hasil uji penetapan kadar koenzim Q10 pada sediaan mikroemulsi
Sampel  Replikasi  Absorbansi % Kadar Rata–Rata %Perolehan kembali F1 1 1.712 99.92 100.11 2 1.716 100.14 3 1.718 100.27 F2 1 1.732 101.21 100.52 2 1.713 99.95 3 1.719 100.39 F3 1 1.720 100.41 100.19 2 1.716 100.18 3 1.713 99.97 F4 1 1.732 101.24 100.48 2 1.716 100.17 3 1.715 100.04

## Kesimpulan
Berdasarkan  penelitian  yang  telah dilakukan  dapat  disimpulkan  bahwa penetapan  kadar  koenzim  Q10  dalam sediaan  mikroemulsi  dapat  dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometer UV-Vis.
Metode penetapan  kadar  yang  digunakan  telah memenuhi  persyaratan  validasi  metode analisa.  Hasil  rata-rata  persen  perolehan koenzim Q10 pada parameter Akurasi dan Presisi  adalah  100,70%  masuk  dalam rentang  perolehan  kembali  yang  didapat diterima (99,98–101,29%). Hasil rata–rata perolehan  kembali  pada  penetapan  kadar koenzim Q10  dalam sediaan mikroemulsi adalah  100,32%  yang  masuk  dalam rentang  perolehan  kembali  yang  didapat diterima yaitu (97–103%).

## Saran
Disarankan  untuk  peneliti  selanjutnya melakukan  optimasi  macam  pelarut  yang digunakan  untuk  ekstrasi  koenzim  Q10 pada  sediaan  mikroemulsi  uji  validasi metode  analisa  penetapan  kadar  koenzim Q10  menggunakan  alat  yang  tidak terpengaruh  oleh  adanya  gugus  kromofor seperti  HPLC  atau  alat  lain  yang  lebih spesifik.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Akademi Farmasi Surabaya selaku institusi yang memfasilitasi dan memberikan  banyak  dukungan  untuk penulis dapat menyelesaikan penelitian ini.

## Daftar Pustaka
Anonim. 2007. Farmakope Herbal edisi I ,
Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Association of Official Analytical Chemists  (AOAC).  2016 .  Official Methods  of  Analysis .  (20th  Ed.). Washington  Dc:  Association  of Official Analytical Chemist Inc.
Chime, S., Kenechukwu, F., & Attama, A.
2014. Nanoemulsions—Advances in Formulation,  Characterization  and
applications in drug delivery. In: Ali, D.S., Application of Nanotechnology in  Drug  Delivery .  Croatia:  In  Tech, 77–111.
Deapsari, F. 2016. Efektivitas Nanoemulsi sebagai  Penghantar  Coenzym  Q10 sebagai Kosmetika Antiaging (Dengan menggunakan fase minyak
Olive Oil). Tesis . Universitas Airlangga.
Eman  S.  E.,  &  Rania  S.  A.  2016.
Validation and application of Vierordt’sspectrophotometric method for simultaneous estimation of  tamoxifen/coenzyme  Q10  in theirbinary mixture and pharmaceutical dosage forms. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences,
11(2), 318-325
Kapoor,  P.,  &  A.  K.,  Kapoor.  2013, Coenzyme Q10 - A Novel Molecule, Journal, Indian Academy of Clinical Medicine , 14 (1), 37-45 Mahendra,  K.,  Murthy,  Y.L.N., et.al .
2011,  Determination  of  Coenzym Q10  and  its  synthesis  releated impurities  by  High  Performance
liquid Chromatography (HPLC) and
Mass Spectrometry (MS), International Journal of Pharm Tech Research , 3 (3), 1468-1477.
Martonegoro,  L.  2014.  Nanocarriers  for skin Delivery of cosmetic Antioxidant. Journal of Pharmacy &
Pharmacognosi Research , 73-92.
Rochman, A. 2016. Validasi dan Penjaminan Mutu Metode Analisis.Kimia .  Yogyakarta:  UGM
Press.
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan J.W., 2010 . Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3th Ed . USA:John Wiley & Sons, Inc. Publication.