Accredited by Ministry of Research, Technology                          DOI: https://doi.org/10.35799/jis.20.2.2020.30069 and Higher Education No: 28/E/KPT/2019                Available online at https://ejournal.unsrat.ac.id/index.php/jis
Analisis Fitokimia dan Uji Toksisitas Daun Leleng Merah ( Graptophyllum pictum (L.) Griffith ) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test
Defrikson Ba’u 1) ,  Dewa G. Katja 1) , Vanda S. Kamu 1) , Paulina V.Y. Yamlean 2) , Max R.J. Runtuwene 1*)
1) Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sam Ratulangi, Manado
2) Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sam Ratulangi Manado
* Corresponding Author: runtuwenemrj@unsrat.ac.id
(Article History:  Received 12-08-2020; Accepted 10-09-2020; Published 09-10-2020)

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan total  phenolic  content (TPC), total  flavonoid  content (TFC), condensed tannin content (CTC) dan nilai toksisitas dari daun leleng merah. Daun leleng merah  diekstraksi  dengan  metode  maserasi  dan  dipartisi  menggunakan  pelarut n -heksana,  etil asetat, dan air. Penentuan nilai  TPC  menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Penentuan nilai TFC menggunakan metode AlCl 3. Penentuan nilai CTC menggunakan metode vanillin-HCl. Penentuan nilai  toksisitas  menggunakan  metode  BSLT.  Nilai  TPC  yang  diperoleh  pada  fraksi n- heksana (FH),  fraksi  air  (FA),  dan  fraksi  etil  asetat  (FEA)  daun  Leleng  Merah  berturut-turut,  adalah: 20,48;  31,7;  dan  37,57  (mg/g).  Nilai  TFC  diperoleh  pada  FH,  FA,  dan  FEA  berturut-turut, adalah: 0,64; 0,99; dan 1,27 (mg/g). Nilai CTC diperoleh pada FH, FA, dan FEA berturut-turut, adalah: 0 ,56; 2,17; dan 6,52 (mg/g). Nilai toksisitas diperoleh pada FEA, FA, FH berturut-turut, adalah: 21,93; 100,7; dan 117,22 (mg/L). FEA memiliki  nilai toksisitas dan kandungan fitokimia tertinggi. Daun leleng merah bersifat toksik.
Kata kunci : Brine shrimp lethality test, leleng merah, fitokimia,
Phytochemical Analysis and Toxicity Test of Leleng Merah Leaves (Graptophyllum pictum (L. ) Griffith) Using the Brine Shrimp Lethality Test

## ABSTRACT
This  study  aims  to  determine  the  total  phenolic  content  (TPC),  flavonoids  (TFC),  condensed tannins (CTC) and toxicity value of Leleng Merah leaves. Leleng merah leaves were extracted by maceration method and partitioned using n -hexane, ethyl acetate,  and water solvent.  TPC values were determined using the Folin-Ciocalteu method. TFC values were determined using the AlCl 3 method.  CTC  values  were  determined  using  the  vanillin-HCl  method.  Toxicity  values  were determined using the BSLT method. TPC values  obtained in the n -hexane (FH), water (FA), and ethyl  acetate  (FEA)  fraction  of  the  Leleng  Merah  leaves,  were:  20.48;  31.7;  37.57  (mg  /  g) respectively.  TFC  values  obtained  in  FH,  FA,  and  FEA,  were  :  0.64;  0.99;  1.27  (mg  /  g) respectively. CTC  values  obtained at  FH, FA, FEA,  were: 0.56; 2.17;  6.52 (mg/g) respectively. Toxicity values  obtained at FEA, FA, FH,  were: 21.93; 100.7; 117.22 (mg/L)  respectively. FEA has the highest toxicity and phytochemical content. Leleng Merah Leaf is toxic.
Keywords : Brine Shrimp Lethality Test, leleng merah, phytochemistry

## PENDAHULUAN
Indonesia
merupakan negara
kepulauan  yang  memiliki  keanekaragaman hayati  yang  sangat  berlimpah.  Salah  satunya adalah tumbuhan obat yang tersebar di setiap
pulau  di  Indonesia  dengan  karakteristik  dan khasiatnya yang berbeda-beda. Tanaman obat dalam  penggunaannya  sebagai  pengobatan tradisional  adalah  alternatif  yang  dipilih dalam  pengobatan  karena  relatif  aman  dan
murah,  terapi  kanker  adalah  salah  satunya (Pangow et al ., 2018).
Ada  banyak  tanaman  obat  yang  sering ditemukan di daerah Sulawesi Utara diantaranya  adalah  tumbuhan  leleng  merah. Tumbuhan  leleng  merah  merupakan  salah satu  tanaman  obat yang  bagi  masyarakat  di daerah  pulau  Sulawesi.    Leleng  merah digunakan sebagai obat herbal yang dimanfaatkan  sebagai  obat  sakit  kepala  dan obat kanker.
Aktivitas  antikanker  suatu  ekstrak sampel ataupun suatu senyawa dapat dideteksi  melalui  suatu  nilai,  yang  disebut dengan  nilai  toksisitas  (Meyer et  al .,  1982). Banyak  atau  sedikitnya  kandungan  senyawa metabolit  sekunder  suatu  ekstrak  tumbuhan obat  sangat  mempengaruhi  nilai  toksisitas ekstrak tersebut. Di antaranya adalah fenolik, flavonoid  dan  tanin  (Michałowicz  &  Duda, 2007).
Sepengetahuan  peneliti  belum  ada penelitian  mengenai  tumbuhan  leleng  merah, termasuk juga pengujian aktivitas sitotoksiknya.  Oleh  karena  itu,  peneliti tertarik untuk melakukan penelitian mengenai kandungan  total fenolik, flavonoid, dan tanin terkondensasi  serta  nilai  toksisitas  daun tanaman  leleng  merah  yang  dikenal  dengan manfaat antikankernya ini berdasarkan tingkat  kepolaran  dengan  menggunakan pelarut n -heksana,  etil  asetat,  dan  air. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan total  phenolic  content (TPC), total  flavonoid content (TFC), condensed  tannin  content (CTC)  dan  nilai  toksisitas  dari  daun  leleng merah.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  selama  2 bulan  di  Laboratorium  Kimia  Organik  dan Bahan  Alam,  Jurusan  Kimia,  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas Sam Ratulangi, Manado.

## Alat dan Bahan
Dalam  penelitian  ini,  peralatan  yang digunakan  adalah  blender,  ayakan  65  mesh, neraca  analitik,  tabung  reaksi,  gelas  kimia, kertas  saring,  erlenmeyer,  rotary  evaporator, oven, corong pisah, spektrofotometri UV-Vis, vortex.  Bahan  baku  yang  digunakan  dalam penelitian ini  adalah daun leleng merah  yang diperoleh  dari  desa  Watuawu,  Kabupaten
Poso, Sulawesi Tengah. Bahan yang digunakan  adalah  pelarut  organik  teknis seperti:  metanol, n -heksana,  etil  asetat,  serta bahan  lainnya  seperti:  telur  udang Artemia salina serta  garam  tak  beryodium yang diperoleh  dari  Balai  Perikanan  Tatelu, Kecamatan  Dimembe,  Kabupaten  Minahasa Utara,  Folin  Ciocalteu,  natrium  karbonat, aluminium  klorida  heksahidrat,  kuersetin, vanilin,  asam  klorida  pekat,  katekin,  asam galat, aquades, dan vaselin.

## Preparasi Sampel
Sampel daun Leleng merah dibersihkan  lalu  dikering-anginkan  selama seminggu.  Setelah  sampel  kering,  sampel diblender  sampai  menjadi  serbuk  kemudian diayak  dengan  ayakan  (65  mesh).  Sebanyak 1000  g  simplisia  dimaserasi  selama  3  x  24 jam  menggunakan  pelarut  metanol.  Setelah itu,  disaring  hingga  diperoleh  filtrat.  Filtrat yang diperoleh kemudian dievaporasi, dikeringkan  didalam  oven  pada  suhu  40°C hingga  diperoleh  ekstrak  pekat.  Sebanyak  15 g  ekstrak  pekat  (hasil  maserasi)  dilarutkan dalam  100  mL  aquades.  Kemudian  larutan dipartisi dengan menambahkan n -heksana (50 mL) ke dalam corong pisah, lalu dikocok dan didiamkan  hingga  terdapat  dua  lapisan. Lapisan yang terbentuk kemudian dipisahkan, lapisan n -heksana  diambil.  Penambahan pelarut n -heksana  dalam  aquades  diulangi hingga n -heksana  menjadi  bening.  Dengan cara  yang  sama,  lapisan  aquades  kemudian dipartisi  kembali menggunakan  pelarut  etil asetat,.  Hasil  partisi  dievaporasi  hingga diperoleh fraksi disetiap pelarut.
Penentuan Total Phenolic Content ( TPC) Penentuan  TPC  dilakukan  dengan menggunakan  prosedur  yang  dikembangkan oleh  Conde et  al .  (1997).  Sebanyak,  0,1  mL larutan  ekstrak  (10.000  mg/L  yang  dibuat dengan  melarutkan  0.05  mg  ekstrak  dengan pelarut aquades 5 mL) dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,1 mL Folin  Ciocalteu  50%,  lalu  divortex,  2  mL larutan  Na 2 CO 3 2%  ditambahkan  dan divortex.  Setelah  itu,  selama  30  menit campuran  diinkubasi  dalam  ruangan  gelap. Absorbansi  dibaca  pada  panjang  gelombang 750  nm  menggunakan  spektrofotometer. Kurva kalibrasi dipersiapkan, dengan menggunakan  asam  galat  sebagai  standar.
TPC  dinyatakan  sebagai  mg  ekivalen  asam galat/g ekstrak.
Penentuan Total Flavonoid Content (TFC)
Penentuan  TFC  dilakukan  dengan mengikuti  prosedur  Meda et  al .  (2005). Sebanyak,  1  mL  larutan  ekstrak  (10.000 mg/L  yang  dibuat  dengan  melarutkan  0.05 mg  ekstrak  dengan  pelarut  aquades  5  mL) dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi.  Setelah itu,    ditambahkan  2  mL  AlCl 3 2%  (dalam metanol),  lalu  divortex.  Absorbansi  ekstrak dibaca  pada  panjang  gelombang  415  nm dengan menggunakan spektrofotometer. Kurva kalibrasi dipersiapkan, dengan menggunakan kuersetin sebagai standar. TFC dinyatakan  sebagai  mg  ekivalen  kuesertin/  g ekstrak.
Penentuan Condensed Tannin Content

## (CTC)
Penentuan  CTC  dilakukan  mengikuti prosedur  Julkunen-Tiitto  (1985),  Sebanyak, 0,1 mL larutan sampel dimasukkan  ke dalam tabung  reaksi  yang  dibungkus  aluminium foil.  Selanjutnya,  2  mL  larutan  vanillin  (4% dalam  metanol)  ditambahkan  dan  divortex. Setelah itu, 1 mL HCl pekat ditambahkan dan divortex  lagi.  Setelah  campuran  diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar, absorbansi sampel  dibaca  pada  panjang  gelombang  319 nm.  Kurva  kalibrasi  dipersiapkan,  dengan menggunakan  katekin  sebagai  standar.  CTC dinyatakan  sebagai  ekivalen  katekin  dalam mg/g ekstrak.

## Uji Toksisitas
Berdasarkan  prosedur  Mayer et  al. (1982),  sebanyak  10  ekor  larva  udang A. salina yang  berumur  48  jam  dimasukkan  ke dalam  wadah  yang  berisi  100  mL  larutan ekstrak  dengan  konsentrasi  62,5;  125;  250; dan  500  ppm.  Dilakukan  2  kali  pengulangan untuk setiap konsentrasi ekstrak dan dibandingkan  dengan  larutan  air  garam dengan  konsentrasi  20  g/L  sebagai  kontrol. Pengamatan dilakukan selama 24 jam dengan interval waktu 6 jam.
Perhitungan  kematian  udang Artemia salina dihitung sesuai dengan rumus berikut:
Apabila  pada  kontrol  ada  udang  yang mati,  prosentase  kematian  udang A.  Salina
ditentukan  dengan  rumus  Abbot’s,  sebagai berikut:
Hasil yang diperoleh dinyatakan sebagai  nilai  LC 50 sampel  uji,  yaitu  jumlah konsentrasi sampel uji yang dapat menyebabkan kematian larva udang sejumlah 50  %  setelah  masa  inkubasi  24  jam,  yang dihitung  menggunakan  persamaan  regresi dengan menghubungkan pengaruh
konsentrasi sampel (logaritma nilai konsentrasi)  terhadap  persen  mortalitas  larva uji yang dikonversi dalam nilai probit.

## Analisis Data
Analisis  data  untuk  menentukan  nilai kandungan  total  fenolik,  total  flavonoid,  dan total tanin terkondensasi menggunakan analisis  regresi  pada  software  microsoft office  excel  untuk  menghasilkan  gambar grafik  yang  maksimal  dan  software  statistik lainnya untuk penentuan nilai toksisitas.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Ekstraksi Maserasi dan Partisi
Hasil  rendemen  yang  didapat  dari ekstraksi  daun  Leleng  Merah  yaitu  12,55  %. Hasil  partisi  yang  diperoleh  dapat  dilihat dalam Tabel 1.
Tabel 1. Rendemen Hasil Partisi Daun Leleng
Merah Hasil Partisi Rendemen (%) n -heksana 12,67 Air 44,87 Etil Asetat 4,47
Berdasarkan  Tabel  1,  hasil  rendemen tertinggi  adalah  pada  fraksi  air  kemudian diikuti  fraksi n- heksana  dan  etil  asetat. Tingginya  rendemen  fraksi  air  disebabkan banyaknya  jumlah  senyawa  polar  yang terkandung  dalam  daun  Leleng  Merah dibandingkan  dengan  2  fraksi  lainnya. Beberapa  senyawa  metabolit  sekunder  yang larut  dalam  air  (bersifat  polar)  antara  lain adalah  fenolik,  flavonoid  dan  juga  tanin. Penggunaan pelarut dengan tingkat kepolaran
yang  berbeda  akan  mempengaruhi  jenis senyawa yang terekstrak.
Penentuan Total Phenolic Content (TPC)
Hasil TPC  fraksi n -heksana, etil asetat dan air daun Leleng Merah dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar  1 . Total  Phenolic  Content (FH= fraksi n -heksana;  FEA= fraksi etil asetat; dan FA= fraksi air)
Berdasarkan  grafik  pada  gambar  1, nilai  TPC  tertinggi  diperoleh  dari  fraksi  etil asetat sebesar 37,57 mg/g. Hal ini menunjukkan  bahwa  pada  fraksi  etil  asetat daun Leleng Merah terdapat banyak senyawa fitokimia jenis fenolik yang aktif dibandingkan  dengan  fraksi  yang  lainnya. Rohman et  al .  (2006),  melaporkan  bahwa untuk  mengektraksi  senyawa  fenolik  pelarut etil  asetat  sangat  cocok,  banyak  senyawa fenolik alami mengandung sedikitnya satu gugus hidroksil dan membentuk senyawa eter,  ester  atau glikosida  yang  lebih  banyak daripada  senyawa  bebasnya.  Hasil  penelitian ini mendukung laporan tersebut.
Uji  TPC  dengan  metode  Folin- Ciocalteu  pada  dasarnya  bertujuan  untuk mengetahui  kandungan  fenol  yang  terdapat dalam  fraksi n- heksana,  etil  asetat  dan  air daun Leleng Merah. Metode ini didasari oleh adanya    kemampuan  fraksi  daun  Leleng merah  untuk  mereduksi  Folin-Ciocalteu berwarna  kuning  yang  mengandung  senyawa fosfomolibdat dan asam fosfotungstat menjadi senyawa kompleks molibden- umtungstat  yang  berwarna  biru  (Julkunen- Tiitto, 1985).
Penentuan Total Flavonoid Content (TFC) Hasil  TFC  fraksi n -heksana,  etil  asetat dan air daun Leleng Merah dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar  2. Total  Flavonoid  Content (FH= fraksi n -heksana;  FEA= fraksi etil asetat; dan FA= fraksi Air)
Berdasarkan  grafik  pada  gambar  2, nilai  TFC  tertinggi  diperoleh  dari  fraksi  etil asetat sebesar 1,27 mg/g. Hal ini menunjukkan  bahwa  pada  fraksi  etil  asetat daun  leleng  merah  terdapat  banyak  senyawa fitokimia jenis flavonoid yang aktif dibandingkan  dengan  fraksi  yang  lainnya. Manik et  al . (2014),  melaporkan  bahwa aktivitas  flavonoid  tertinggi  ditemukan  pada fraksi  etil  asetat  suatu  ekstrak,  hal  ini disebabkan karena aglikon yang kurang polar seperti  isoflavon,  flavanon,  flavon,  memiliki kecenderungan  untuk  mudah  larut  dalam pelarut etil asetat dan hasil dari penelitian ini mendukung laporan tersebut. Pada pengukuran  kadar  flavonoid,  penggunaan AlCl 3 dikarenakan  senyawa  flavonoid  dapat bereaksi  dengan  logam  Al 3+ pada  gugus hidroksi,  keton,  dan  orto-dihidroksi  yang membentuk  senyawa  kompleks  berwarna kuning.  Semakin  pekat  warna  kuning  yang dihasilkan  maka  semakin  tinggi  konsentrasi flavonoid tersebut (Sultana et al ., 2014).
Penentuan Condensed Tannin Content (CTC) Hasil CTC fraksi n -heksana, etil asetat dan air daun Leleng Merah dapat dilihat pada Gambar  3.    Berdasarkan  grafik  pada  gambar 3, hasil yang diperoleh diketahui bahwa CTC tertinggi adalah pada fraksi etil asetat sebesar 6,52 mg/g. Hal ini menunjukkan bahwa pada fraksi  etil  asetat  daun  Leleng  Merah  terdapat banyak  senyawa  fitokimia  jenis  tanin terkondensasi yang aktif dibandingkan dengan  fraksi  yang  lainnya.  Rosamah et  al .
(2017),  melaporkan  bahwa  fraksi  yang  larut dalam  etil  asetat,  kaya  dengan  kandungan tanin  terkondensasi  dan  hasil  penelitian  ini mendukung laporan tersebut. Prinsip pengujian  menggunakan  vanilin-HCl  dalam
0.64 0.99 1.27 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 FH FA FEA K a n d u n g a n T o ta l F la v o n o id (m g / g ) 20.48 31.7 37.57 0 10 20 30 40 FH FA FEA T o ta l k a n d u n g a n fe n o li k ( m g / g )
penentuan  CTC  adalah  vanilin  terprotonasi dalam  asam,  menghasilkan  karbokation  yang bereaksi  dengan  flavonoid.  Senyawa  antara hasil  reaksi  tersebut  mengalami  dehidrasi yang  menghasilkan  senyawa  berwarna  ungu atau merah (Rambi et al ., 2016).
Gambar 3 . Condensed Tannin Content (FH= fraksi n -heksana;  FEA= fraksi etil asetat; dan FA= fraksi air)
Uji Toksisitas ( Brine Shrimp Lethality Test ) Nilai  toksisitas  LC 50 hasil  partisi  daun Leleng Merah dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Nilai Toksisitas LC 50 dari Hasil Partisi Daun Leleng Merah Ekstrak Sampel Nilai Toksisitas LC 50 (mg/L) Etil asetat 21,93 Air 100,7 n- Heksana 117,22 Berdasarkan Tabel 2, aktifitas
sitotoksik  tertinggi  diperoleh  pada  fraksi  etil asetat sebesar 21,93 mg/L. Hal ini disebabkan karena kandungan senyawa fenolik, flavonoid dan  tanin  terkondensasi  tertinggi  terdapat pada  fraksi  etil  asetat  daun  Leleng  Merah. Meyer et  al. (1982),  mengemukakan  bahwa suatu  senyawa  atau  pun  ekstrak  dapat dikatakan  toksik  apabila  memiliki  nilai toksisitas  yang  dinyatakan  dengan  nilai  LC 50 sebesar  <  1000  ppm,  maka  daun  Leleng Merah  pada  seluruh  varian  fraksi  dapat dikatakan toksik.
Semakin  tinggi  kandungan  metabolit sekundernya  hal  ini  berupa  senyawa  fenolik, flavonoid  dan  tanin  terkondensasi,  maka semakin besar pula nilai toksisitasnya. Dalam hal  ini,  besarnya  sumbangsih  kadar  fenolik, flavonoid dan tanin terkondensasi pada fraksi etil asetat daun Leleng Merah menjadi faktor
yang mempengaruhi tingginya nilai toksiksitas.
Adanya  senyawa  flavonoid,  fenolik, dan  tanin  dalam  sel  dapat  menyebabkan pecahnya  membran  sel.  Hal  ini  disebabkan karena  gugus  OH  pada  flavonoid,  fenolik, dan  tanin  berikatan  dengan  protein  integral membran sehingga transpor aktif Na + dan K + terhenti. Transpor aktif yang terhenti menyebabkan  pemasukan  ion  Na + dan  K + tidak terkendali dalam sel, yang menyebabkan pecahnya membran sel. Membran sel yang pecah dapat menyebabkan kematian pada sel (Scheuer, 1994).
Selain  itu,  flavonoid  telah  terbukti menyebabkan  apoptosis  (kematian  sel)  pada beberapa biakan sel kanker, sedangkan sel-sel normal diselamatkan (Ren et al., 2003). Fenol dan turunannya diketahui dapat menyebabkan aktivitas  apoptosis  yang  dimediasi  protein caspase  dan  sitotoksisitas  pada  berbagai biakan sel kanker (Nandi et al. , 2007). Tanin diketahui dapat menyebabkan aktivitas apoptosis  yang  dimediasi  asam  tanat  pada biakan  sel  kanker  (Yildirim  &  Kutlu,  2015). Mekanisme apoptosis sel dalam hal ini adalah karena  fragmentasi  DNA.  Fragmentasi  ini dimulai  dengan  rantai  proksimal  DNA  yang disebut  AIF  (A poptosis  Inducing  Factor), yaitu  protein  yang  memicu  kondensasi kromatin  dan  fragmentasi  DNA  dalam  sel untuk memicu kematian sel terprogram, yang lepas oleh senyawa oksigen reaktif, contohnya  radikal  hidroksil  (Dencic et  al. , 2012).

## KESIMPULAN
Kandungan  total  fenolik  dari  partisi n - heksana,  etil  asetat,  dan  air  secara  berturut- turut  adalah  20,48;  31,7;  dan  37,57  (mg/g). Kandungan  total  flavonoid  dari  partisi n - heksana,  etil  asetat,  dan  air  secara  berturut- turut  adalah  0,64;  0,99;  dan  1,27  (mg/g). Kandungan  total  tanin  terkondensasi  dari partisi n -heksana,  etil  asetat,  dan  air  secara berturut-turut  adalah  0,56;  2,17;  dan  6,52 (mg/g).  Kandungan  total  fenolik,  flavonoid, dan  tanin  tertinggi  adalah  partisi  dengan pelarut  etil  asetat.  Nilai  toksisitas  partisi ekstrak daun Leleng Merah dari fraksi pelarut etil  asetat,  air  dan n- heksana  secara  berturut- turut adalah 21,93; 100,7; dan 117,22 (mg/L). Nilai toksisitas tertinggi diperoleh pada fraksi
0.56
2.17
6.52 0 2 4 6 8 FH FA FEA K a n d u n g a n T o ta l T a n in …
pelarut etil asetat dibandingkan dengan fraksi pelarut lainnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Conde, E.F., M.C. Cadahia, B.F.D. GarciaVallejo,  J.R.G.  Adrabos  & Simon.  1997.  Low  Molecular  Weight
Polyphenols in Cork of Quercus Suber.
Journal Agricultural and Food Chemistry, 45(7): 2695-2700. Dencic, M.S., J. Poljarevic & U. Vilimanovich. 2012. Cyclohexyl Analogues of Ethylenediamine Dipropanoic  Acid  Induce  Caspase- Independent  Mitochondrial  Apoptosis in  Human  Leukemic  Cells. Chemical Research in  Toxicology, 25(4) : 31-39. Julkunen-Tiitto, R. 1985. Phenolic Constituents  in  Leaves  of  Northern Willows: Methods for The Analysis of Certain Phenolics. Journal of Agricultural  and  Food  Chemistry,
33(2) : 213-217.
Manik,  D.F.,  T.  Hertiani  &  H.  Anshory.
2014.  Analisis  Korelasi  Antara  Kadar Flavonoid dengan Aktivitas Antibakteri  Ekstrak  Etanol  dan  Fraksi- Fraksi Daun Kersen ( Muntingia calabura L.)  Terhadap Staphylococcus aureus. Khazanah, 6 (2): 1-11.
Meda,  A.,  C.E.  Lamein,  M.  Romito,  J. Milliogo  &  O.G.  Nacoulina.  2005. Determination  of  the  Total  Phenolic, Flavonoid  and  Proline  Content  in Burkina  Fasan  Honey,  As  Well  As Their  Radical  Scavenging  Activity. Journal  of  Food  Chemistry, 91(1) :
571-577.
Meyer,  B.N.,  N.R.  Ferrigni,  J.E.  Putnam,  L.
B.  Jacobsen,  D.E.  Nichols  &  J.E. McLaughlin.  1982.  Brine  Shrimp:  A Convenient  General  Bioassay  for Active  Plant  Constituents. Planta Medica, 45(5) : 31-34.
Michałowicz, J. & W. Duda. 2007. Phenols – Sources  and  Toxicity .  Polish  Journal of Environment Study, 16 (3): 347-362.
Nandi,  S.,  M.  Vracko  &  M.C.  Bagchi.  2007.
Anticancer Activity of Selected Phenolic  Compounds:  QSAR  Studies Using  Ridge  Regression  and  Neural
Networks. Chem  Biol  Drug . 70(5) :
424–43.
Pangow,  M.E.,  W.  Bodhi  &  E.  de  Queljoe. 2018.  Skrining  Fitokimia  dan  Uji Toksisitas  dari  Ekstrak  Etanol  Daun Manggis  ( Garcinia  mangostana L.) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test  (BSLT). Pharmacon, 7(3) :  97- 107.
Rambi,  G.A.D.,  V.S.  Kamu  &    M.R.J. Runtuwene.  2016.  Uji  Fitokimia  dan Antioksidan dari Daun Yantan ( Blumea  chinensis DC). Jurnal  MIPA UNSRAT Online, 5(1) : 32-35.
Ren, W., Q. Zhenhua, W. Hongwei, Z. Lei & Z.  Lie.  2003. Flavonoid:  Promising Anticancer  Agents .  Department  of Hematology,  2 nd Hospital  of  Shanxi Medical University, Taiyuan.
Rohman,  A.,  S.  Riyanto  &  D.  Utari.  2006. Antioxidant  Activities,  Total  Phenolic and  Flavonoid  Contents  of  Ethyl Acetate Extract of Mengkudu
( Morinda  citrifolia ,  L)  Fruit  and  Its Fractions. Majalah Farmasi Indonesia, 17(3): 136-142.
Rosamah,  E.,  H.M.R.  Awaliyan  &  E. Sukaton.  2017.  Karakteristik  Tanin dari    Ekstrak  Kulit    Kayu  Leda ( Eucalyptus  deglupta Blume.). Jurnal Hutan Tropis, 1(1) : 16-28.
Scheuer,  J.S.  1994.  Produk  Alami  Lautan. IKIP Semarang Press, Semarang.
Sultana, N., A.R. Alimon, K.S. Haque,  A.Q.
Sazili,  H.  Yaakub  &  S.M.J  Hossain. 2014. The Effect of Cutting Interval on Yield  and  Nutrient  Composition  of Different  Plant  Fractions  of Moringa Oleifera Tree. Journal  Food  and
Agricultural  Environment, 12(2) :  599-
604.
Yildirim,  I.  &  T.  Kutlu.  2015.  Anticancer Agents: Saponin and Tannin.
International  Journal  of  Biological Chemistry, 9(6) : 332-340.