Accredited by Ministry of Research, Technology                           DOI: https://doi.org/10.35799/jis.20.1.2020.27032 and Higher Education No: 28/E/KPT/2019                    Available online at https://ejournal.unsrat.ac.id/index.php/jis
Aktivitas Sitotoksik dan Antiangiogenesis Ekstrak Fraksi Umbi Mentimun Papasan ( Coccinia grandis (L.) Voigt) Terhadap Sel Kanker Payudara T47D Dan Chorio Allantoic Membrane (CAM) Embrio Ayam yang Diinduksi bFGF
Agustinus Alfred Seran 1) , Jason M. Peranginangin 1) , Rizal M. Rukmana 2)
1) Program Studi S2 Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi Surakarta,
2) Program Studi Analis Kesehatan, Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Setia Budi Surakarta e-mail : alfredagustinus16@gmail.com ; Jason.merari@yahoo.com ; rizal.nerazuri@gmail.com
(Article History:  Received 07-01-2020; Accepted 28-04-2020; Published 30-04-2020)

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas  sitotoksik  dan  antiangiogenesis  ekstrak  dan fraksi umbi mentimun papasan ( Cocconia grandis (L.) Voigt) terhadap sel kanker payudara T47D dan Chorio  Allantoic  Membrane (CAM)  embrio  ayam  yang  diinduksi  protein  bFGF.  Ekstrak diperoleh  melalui  metode  maserasi  dengan  pelarut  etanol  96%.  Ekstrak  etanol  selanjutnya difraksinasi  dengan  metode  partisi  cair-cair.  Fraksi  yang  diperoleh  dilakukan  analisis  kualitatif dengan  metode  kromatografi  lapis  tipis  (KLT).  Dari  analisis  KLT  menunjukan  bahwa  terdapat beberapa golongan senyawa aktif yaitu alkaloid, flavonoid, tanin, saponin dan terpen. Uji sitotoksik dilakukan  menggunakan  sel  kanker  payudara  T47D  dan  sel  VERO  dengan  metode  MTT assay kemudian dibaca absorbansinya pada ELISA reader dengan parameter pengamatan nilai IC 50 . Uji antiangiogenesis  dilakukan  menggunakan  metode Chorio  Allantoic  Membrane (CAM)  embrio ayam  yang  diinduksi  protein  bFGF  dengan  parameter  pengamatan  jumlah  pembuluh  darah  baru. Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  ekstrak,  fraksi  n-heksan,  fraksi  etil  asetat,  dan  fraksi  air memiliki nilai  IC 50 berturut-turut  adalah 500,167; 353,131; 109,975;  dan 303,990 µg/mL. Fraksi etil asetat memiliki nilai IC 50 paling kecil sehingga dilanjutkan ke uji antiangiogenesis. Fraksi etil asetat  memiliki  aktivitas  antiangiogenesis  terhadap Chorio  Allantoic  Membrane (CAM)  dengan konsentrasi efektif sebesar 219,95 µg/mL ditandai dengan persentase penghambatan angiogenesis sebesar 56,78%.
Kata kunci :  Antiangiogenesis; Chorio Allantoic Membrane (CAM); mentimun papasan ( Cocconia Grandis (L.) Voigt); Sitotoksik; T47D
Cytotoxic Activity and Antiangiogenesis of  Extract Fraction of Coccinia grandis (L.) Voigt) Base Towards T47D Breast Cancer Cells and Chorio Allantoic Membrane
(CAM) of Chicken Embryo Induced by bFGF

## ABSTRACT
This  study  aims  to  identify  the  cytotoxic  activity  and  antiangiogenesis  of  extract  and  fraction  of (Coccinia  Grandis  (L.)  Voigt)  base  towards  T47D  breast  cancer  cells  and  Chorio  Allantoic Membrane  (CAM)  of  chiken  embryo  induced  by  bFGF.  The  extract  was  extracted  throught maceration  method  with  ethanol  96%  soluble.  The  ethanol  extract  was  then  fractionated  by  the liquid-liquid partition method. The fractions obtained were analyzed qualitatively by the thin layer chromatography  (TLC)  method.  The  TLC  analysis  shows  that  there  are  several  classes  of  active compounds, namely alkaloids, flavonoids, tannins, saponons and terpenes. The ethanol extraction was then fractionated using the liquid-liquid extraction. The cytotoxic test was conducted using the T47D breast cancer cells and VERO cells with the MTT assay method which their absorbance were read on ELISA reader with the value of observation parameters IC50. The antiangiogenesis test was conducted using the Chorio Allantoic Membrane (CAM) method of chicken embryo induced with bFGF protein with the new blood vessels count as the observation parameters. The results showed
that  the  extract,  n-hexane  fraction,  ethyl  acetate  fraction,  and  water  fraction  had  IC50  values  of 500.167;  353.131;  109.975;  and  303.990  µg/mL,  respectively.  Ethyl  acetate  fraction  has  the smallest  IC50  value  so  it  is  continued  to  the  antiangiogenesis  test.  Ethyl  acetate  fraction  had  an antiangiogenesis  activity  towards  Chorio  Allantoic  Membrane  (CAM)  with  the  effective concentration 219,95 µg/mL marked by the angiogenesis inhibitors percentage of 56,78%.
Keywords : Antiangiogenesis; Chorio Allantoic Membrane (CAM); Coccinia grandis (L.) Voigt); cytotoxic; T47D

## PENDAHULUAN
Penelitian terhadap penanganan kanker sekarang  ini  mulai  diarahkan  pada  pengujian potensi bahan alam sebagai agen kemopreventif  yang  berpotensi  sebagai  agen pendamping  kemoterapi.  Tujuannya  adalah untuk  meningkatkan  sensitifitas  sel  kanker serta mengurangi efek samping yang ditimbulkan oleh agen kemoterapi (Adelina et al ., 2014).
Tanaman mentimun papasan ( Coccinia grandis (L . )  Voigt)  merupakan  salah  satu tanaman  asli  Nusa  Tenggara  Timur  (NTT) yang  secara  empiris  digunakan  untuk mengobati  demam  pada  anak,  mengobati gatal-gatal  pada  kulit,  dan  juga  untuk mengobati  atau  menurunkan  gula  darah. Beberapa  penelitian  telah  dilakukan  untuk mengetahui  aktivitas  tanaman  mentimun papasan  ini,  beberapa  diantaranya  adalah antimikroba,  antidiabetes  dan  antikanker. Penelitian  terkait  kandungan  kimia  dari bagian-bagian  tumbuhan  ini  juga  telah dilakukan  oleh  (Nagare et  al .,  2015)  yang mengatakan bahwa daun dan batang mengandung senyawa
sitosterol, cephalandrol, cephalandrine A & B, heptacosane.  Akar  mengandung  senyawa alkaloid,  amirin  sitosterol,  asam  karbonat, saponin, Coccinoside, flavonoid, lupeol, resin. Buah  mengandung  amirin  asetat,  sitosterol, carotene,  cucurbitacin  B,  lycopene,  lupeol, taraxerol,  taraxerone.  Sedangkan  pada  biji mengandung  minyak  lemak  terutama  ester linoleat, oleat dan asam palmitat.
Penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan oleh  (Sathees  &  Muruga,  2011)  dari  College University  Kerala  India,  mengatakan  bahwa daun  tanaman  mentimun  papasan  memiliki aktivitas  antimikroba.  Penelitian  lain  juga telah dilakukan oleh (Munasinghe et al ., 2011) dari Fakultas Kedokteran Universitas
Kelaniya Sri Lanka dalam studi klinis dengan pemberian  daun  mentimun  papasan  pada pasien penderita diabetes melitus mengatakan
bahwa  kadar  gula  darah  secara  keseluruhan pada  kelompok  eksperimen  secara  signifikan lebih  rendah  dibandingkan  dengan  kelompok kontrol.
Telah  dilaporkan  sebelumnya  oleh (Churiyah  &  Harran,  2010)  dari  Departemen Biologi  Fakultas  MIPA  Institut  Pertanian Bogor, bahwa fraksi protein bioaktif dari buah matang,  buah  belum  matang  dan  akar mentimun  papasan  dalam  uji  toksisitas terhadap galur sel kanker menunjukan bahwa semua  fraksi  protein  bioaktif  dari  ketiga protein  yang  dihasilkan,  beracun  pasa  BSLT dengan LC 50 dalam kisaran 23-32 μg/mL. Uji sitotoksik dari fraksi protein buah yang belum matang  menggunakan  galur  sel  kanker menunjukan bahwa protein ini dapat menghambat proliferasi sel hela hingga 34,4% dan  sel  K-562  hingga  40,98%.  Selain  itu penelitian lain terkait aktivitas in vitro dan in vivo terkait  aktivitas  antikanker  juga  telah dilaporkan  oleh  (Bhattacharya et  al .,  2011)
dari Departemen Teknologi Farmasi
Universitas  Jadavpur  India,  mengatakan bahwa ekstrak etanol daun mentimun papasan pada  parameter in  vitro dan in  vivo memiliki aktivitas  antikanker  terhadap  sel  EAC sehingga  senyawa  terisolasi  dari  ekstrak etanol dapat digunakan  untuk desain rasional obat  antikanker.  Oleh  karena  itu,  akan dilakukan  penelitian  untuk  menguji  aktivitas sitotoksik  umbi  tanaman  mentimun  papasan ( Coccinia  grandis (L.)  Voigt)  terhadap  sel kanker  T47D  serta  ingin  megetahui  efek antiangiogenik terhadap Chorioallantoic membrane (CAM)  yang  diinduksi  protein bFGF.

## METODE  PENELITIAN

## Tempat dan waktu penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium Parasitologi Fakultas kedokteran dan laboratorium Anatomi Hewan Fakultas
Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta pada bulan Mei - November 2019.

## Metode
Penelitian  ini  merupakan  penelitian eksperimental  laboratorium.  Penelitian  ini dilakukan  untuk  melihat  aktivitas  sitotoksik dan antiangiogenesis ekstrak dan fraksi-fraksi umbi  mentimun  papasan  ( Coccinia  grandis (L.)  Voigt)  pada  kultur  sel  kanker  payudara T47D  dan Chorio  Allantoic  Membrane (CAM)  embrio  ayam  yang  diinduksi  protein bFGF.  Aktivitas  sitotoksik  dilakukan  dengan metode  MTT Assay sedangkan  pengamatan angiogenesis dilakukan dengan menggunakan metode CAM .

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini,  di  antaranya:  alat  penyari  terdiri  atas bejana  maserasi,  kain  flanel,  ayakan  no.  40, batang pengaduk, blender, corong pisah, klem &  batang  statip, moisture  balance O’haus MB23,  kertas  saring,  eksikator,  timbangan elektrik,  corong  Buchner,  oven,  evaporator dan  alat  gelas.  Alat  uji  sitotoksik  meliputi tangki  nitrogen  cair, sentrifuge Sigma  3K12 (B.  Braun  Biotech  Internasional), autoclave , inkubator  37 0 C  aliran  CO2  5%  model  6200 (Napco), l aminar air flow class II (Labconco), spektrokolorimeter  pada  alat  ELISA reader (SLT  240  ATC), Nebauer  haemocytometer (Olympus  CKX41),  tabung  konikal  steril (Nunclone), tissue  culture  flask (Nunclone), mikroplate 96  sumuran  (Nunclone),  lampu ultraviolet, neraca elektrik (Sartorius), mikropipet  20-200  μL  dan    200-1000  μL (Pipetman), mesin vortex , mikroskop inverted (Axiovert-25), magnetic stirrer dan  kamera digital, pinset, gunting, minidril, dan inkubator embrio
Bahan  yang  digunakan  adalah  serbuk umbi  mentimun  papasan  ( Coccinia  grandis (L.) Voigt) dan ekstraksi menggunakan etanol 96%, serta pelarut n heksana, etil asetat dan air untuk fraksinasi, sel kanker payudara cell line ; T47D;  media  stok:  DMEM    (Gibco);  media kultur sel: media DMEM (Gibco), NaHCO3, Fetal Bovine Serum (FBS) 10% v/v (Gibco),  Penisillin-Streptomisin  (Penstep)2% v/v  (Gibco), Fungizone (Amphoterisin  B) 0,5%  v/v  (Gibco),  Dimetil  sulfoksida (DMSO), Tripsin 0,5%, MTT 5mg/mL dalam PBS;  media  pencuci  sel:  larutan Phospat
Buffer  Saline (PBS)  pH  7,2; Sodium  Dodesil Sulfat (SDS)  10%  dalam  HCl  0,1  N  sebagai penghenti  ( stopper ),  telur  ayam  berembrio SPF, protein bFGF, NaCl fisiologis, formalin, aquadest,  alkohol, paper  disc ,  paraffin  cair, plastik parafilm.

## Determinasi Tanaman
Determinasi  tanaman  dilakukan  untuk mengetahui kebenaran tanaman yang berkaitan dengan ciri-ciri morfologi yang ada pada  tanaman  mentimun  papasan  sesuai kepustakaan  dan  dibuktikan  di  laboratorium B2P2TOOT Tawangmangu.

## Pembuatan Serbuk
Pembuatan  serbuk  umbi  mentimun papasan  dilakukan  dengan  cara  digiling  dan diblender  kemudian  diayak,  dan  hasil  berupa serbuk  kering  yang  disimpan  dalam  wadah kering serta tertutup rapat, kemudian dilakukan  refluks  dan  penetapan  susut pengeringan serbuk umbi mentimun papasan.

## Pembuatan Ekstrak Etanol
Sebanyak  500  gram  serbuk  umbi mentimun  papasan  kemudian  dimasukan kedalam wadah berwarna gelap lalu ditambahkan etanol 96% dengan perbandingan  1  :  10  selanjutnya  direndam selama 6 jam pertama sambil sesekali diaduk kemudian didiamkan selama 18 jam. Pisahkan maserat  dengan  cara  disaring,  dekantasi  atau filtrasi.  Ulangi  proses  penyaringan  sekurang- kurangnya satu kali dengan jenis pelarut yang sama  dan  jumlah  volume  pelarut  sebanyak setengah  kali  jumlah  volume  pelarut  pada penyarian  pertama.  Ekstrak  yang  diperoleh dipekatkan  dengan vacumrotary  evaporator (suhu  dijaga  pada  50 o C)  sampai  diperoleh ekstrak kental (Depkes RI, 2001).

## Penetapan Susut Pengeringan
Penetapan susut pengeringan dilakukan dengan  metode  gravimetrik.  Alat  yang digunakan adalah Moisture Balance dengan 3 kali replikasi. Caranya dengan memasukan 2 g serbuk umbi mentimun papasan dalam wadah yang  sudah  ditara.  Wadah  tersebut  kemudian dimasukkan ke dalam alat Moisture Balance. Pengoperasian  alat  telah  selesai  jika  alat tersebut  berbunyi  dengan  ditandai  adanya
bunyi  tertentu,  kemudian  catat  hasil  susut pengeringan  (dalam  satuan  %).  Cara  yang sama diulangi 2 kali (Depkes RI, 2001).

## Penentuan Bobot Jenis
Bobot jenis ekstrak ditentukan terhadap hasil pengenceran ekstrak  10% dalam pelarut tertentu  (etanol)  dengan  alat  piknometer. Bobot jenis ekstrak ditentukan terhadap hasil pengenceran ekstrak 10% dalam pelarut etanol dengan  alat  piknometer  kering,  bersih  dan telah  dikalibrasi  dengan  menetapkan  bobot piknometer dan bobot air yang baru didihkan pada suhu 25 0 C, masukkan kedalam piknometer yang telah diisi hingga suhu 25 0 C (Depkes RI, 2001).

## Penetapan Kadar Air
Menimbang  sebanyak  1  gram  ekstrak umbi mentimun papasan kemudian dimasukan  kedalam  labu  alas  bulat  pada  alat sterling-bidwell kemudian ditambahkan xylen sebanyak  100  ml  dan  panaskan  sampai  tidak ada  tetesan  air  lagi  kemudian  dilihat  volume tetesan  tadi  dan  dihitung  kadarnya  dalam satuan persen (Depkes RI, 2001).

## Pembuatan Fraksi
Ekstrak etanol umbi mentimun papasan sebanyak  10  gram  dilarutkan  sedikit  dengan air panas, kemudian dipartisi dengan air 50 ml dan pelarut n-heksana 50 ml ke dalam corong pisah  diulang  sebanyak  3  kali.  Fraksi  n- heksana merupakan filtrat yang terletak diatas dan  fraksi  air  merupakan  filtrat  yang  terletak dibawah.  Fraksi n -heksana  dipisahkan  dari fraksi  air  ditampung  dan  dipekatkan  dengan rotary  evaporator pada  suhu  penangas  50°C. Fraksi air sisa dari fraksi n-heksana kemudian difraksinasi kembali dengan pelarut etil asetat 50  ml  menggunakan  corong  pisah  proses  ini diulang  sebanyak  3  kali.  Fraksi  etil  asetat merupakan  filtrat  yang  terletak  diatas  dan fraksi  air  terletak  dibawah.  Fraksi  etil  asetat dipisahkan dari fraksi air kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator dengan suhu  penangas  50°C.  Filtrat  sisa  fraksinasi dengan  etil  asetat  adalah  fraksi  air,  yang kemudian  dikentalkan  dengan  penangas  air sampai kental.
Identifikasi  kandungan  senyawa  dengan Kromarografi Lapis Tipis (KLT)
a. Identifikasi polifenol
Sampel ditotolkan pada lempeng Silika Gel 60 F254. Lempeng kemudian dimasukkan ke  dalam  bejana  jenuh  berisi  fase  gerak  etil asetat  :  asam  formiat  :  toluena  :  air (6:1,5:3:0,5)  lalu  dieluasikan  hingga  batas, lempeng  dikeringkan  dan  diamati  di  bawah sinar UV. Deteksi senyawa polifenol dilakukan  dengan  pereaksi  FeCl 3 .  Setelah dipanaskan  selama  5  menit  pada  suhu  100°C akan  terjadi  fluoresensi  hijau  tua  kehitaman pada UV 366 nm (Harborne, 1987).

## b. Identifikasi tanin
Tanin diidentifikasi secara
Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT)  pada  fase diam  silica  gel  60  F254  dan  dielusi  dengan fase  gerak  yaitu  kloroform,  etil  asetat  dan asam  formiat  (0,5:9:0,5).  Bercak  diamati  di bawah lampu UV 254 nm dengan pembanding tanin  10  mg/1  ml  etanol.  Hasil  positif  jika terjadi bercak hijau lembayung pada lempeng KLT .

## c. Identifikasi flavonoid
Sampel ditotolkan pada lempeng Silika Gel F254. Lempeng kemudian dimasukkan ke dalam bejana jenuh berisi fase gerak etil asetat :  asam  formiat  :  asam  asetat  glasial  :  air (100:11:11:27)  lalu  dieluasikan  hingga  batas, lempeng  dikeringkan  dan  diamati  di  bawah sinar  UV.  Deteksi  senyawa  flavonoid dilakukan dengan pereaksi sitroborat. Setelah dipanaskan  selama  5  menit  pada  suhu  100°C akan  terjadi  fluoresensi  kuning,  kehijauan pada UV 366 nm (Harborne, 1987).

## d. Identifikasi alkaloid
Sampel ditotolkan pada lempeng silika gel  60  F254,  dimasukkan  ke  dalam  bejana jenuh  berisi  fase  gerak  toluen  :  etil  asetat  : dietilamin  (7:2:1),  dieluasi  hingga  batas, diangkat dan dikeringkan, kemudian disemprot  dengan  pereaksi  dragendorff. Senyawa  alkaloid  menggunakan  Dragendorff memberikan warna orange atau coklat setelah dipanaskan  selama  5-10  menit  pada  suhu 100°C.  Hasil  analisis  menunjukkan  bercak warna orange (Harborne, 1987).
Uji Aktivitas Sitotoksik
a. Pembuatan media stok dan media komplit DMEM
Media padat DMEM disiapkan, kemudian  dimasukkan  950  mL aquabidest steril dalam gelas beker 1 liter di dalam LAF. Media  bubuk  dituang  ke  dalam aquabidest steril ke dalam gelas beker, aduk hingga rata. Bagian  dalam  pembungkus  media  bubuk dibilas  dengan aquabidest ,  tuang  cairannya kedalam  gelas  beker  di  atas.  NaHCO 3 ditambahkan sebanyak 2,2 gram untuk setiap liter  media  yang  dibuat,  diaduk  rata. Aquabidest steril ditambahkan hingga volume 1  liter.  Media  padat  dan  NaHCO 3 diaduk dengan magnetic  stirrer hingga  semua  dapat larut. Adjusting pH dilakukan (seharga 0,2-0,3 dibawah pH yang diinginan) dengan menambahan NaOH 1 N atau HCl 1 N. Filtrasi media  dilakukan  dengan  menggunakan  filter 0,2 mikron, tamping ke dalam botol duran 500 mL.  Media  diberi  penanda  dan  simpan  di kulkas  dengan  suhu  4 0 C.  Pembuatan  media komplit  DMEM  dibuat  dari  100  mL  DMEM stock ditambah Fetal  Bovine  Serum (FBS)
sebanyak 10%, antibiotika penisillin- streptomisin 2%
dan Fungizone (Amphoteresin) 0,5%.

## b. Pengaktifan sel kanker payudara T47D
Sel  yang  inaktif  diambil  dari  tangki nitrogen cair dan segera dicairkan dalam water bath (suhu  37 0 C)  kemudian  vial  disemprot dengan etanol 70%. Di dalam LAF, sel kanker payudara  T47D  dimasukkan  dalam  tabung sentrifuge lalu disentrifugasi dengan kecepatan  1500  rpm  selama  5  menit. Supernatan  dibuang,  endapan  yang  terbentuk ditambah media komplit DMEM dengan FBS 10%.  Selanjutnya  sel  ditumbuhkan  dalam beberapa tissue culture flask kecil (2-3 buah) dan  diamati  di  bawah  mikroskop  untuk memperkirakan  jumlah  sel.  Sel  hidup kelihatan  bulat,  jernih  dan  bersinar. Flask dimasukkan  dalam  inkubator  beraliran  CO 2 5% pada suhu 37 0 C. Setelah 24 jam, medium diganti  dan  sel  ditumbuhkan  lagi  hingga konfluen  serta  jumlahnya  cukup  untuk penelitian.
c. Pemanenan dan perhitungan jumlah sel
Media  dalam tissue  culture  flask dibuang  lalu  dicuci  dengan Phosphat  Buffer
Saline (PBS)  kurang  lebih  7  mL  sebanyak  2 kali.  Kemudian  ditambahkan  tripsin  ½  dari jumlah  PBS.  Diinkubasi  selama  3-5  menit, lalu  diamati  pelepasan  sel  dari  dasar flask dengan  mikroskop.  Sel  dipipet  masuk  ke conical steril,  ditambah  media  penumbuh sebanyak  2-3  mL  untuk  menghentikan  kerja tripsin.  Sel  dilakukan  pencampuran  dengan pipet  sampai  sel  terlepas,  kemudian  diamati keadaan  sel  di  mikroskop.  Sel  yang  terlepas dipindahkan ke dalam tabung conical baru dan disisakan  sedikit  di  dalam flask yang kemudian ditambahkan media kultur 2-3 mL, diresuspensikan.  Suspensi  sel  diambil  10  μl dan  dipipetkan  ke  hemositometer,  kemudian sel dihitung di bawah mikroskop inverted .
d. Treatmen sel (pemberian ekstrak dan

## MTT)
Sumuran-sumuran  yang  berisi  sel tersebut ditambahkan 100 μL larutan uji yaitu ekstrak, fraksi n -heksana, fraksi etil asetat dan fraksi  air  yang  dilarutkan  dalam  pelarut DMSO,  sehingga  diperoleh  kadar  akhir sampel  dengan  variasi  konsentrasi  tertentu (100; 500; 250; 125; 62,5; 31,25;) μg/mL tiap sumuran.  Sebagai  kontrol  sel  digunakan  sel dengan  penambahan  media  komplit  DMEM. Sebagai  kontrol  media  digunakan  hanya larutan uji media komplit DMEM. Kemudian sel tersebut diinkubasi pada inkubator CO 2 5% pada  suhu  37 0 C  selama  24  jam.  Pada  akhir inkubasi,  media  masing-masing  sumuran dibuang  dengan  cara microplate dibalikkan 180 0 C di atas tempat buangan kemudian plate ditekan untuk meniriskan sisa cairan. Setelah itu,  ditambahkan  100  μL  MTT  0,3%  dalam PBS. Microplate diinkubasikan  kembali selama  4  jam  pada  inkubator  CO 2 5%  pada suhu  37 0 C.  Sel  hidup  akan  bereaksi  dengan MTT  membentuk  formazan  berwarna  ungu, sedangkan  sel  yang  mati  akan  memberikan warna  kuning.  Untuk  menghentikan  reaksi antara  sel  dengan  MTT  serta  melarutkan formazan  maka  ditambahkan  100  μL  SDS 10%  dalam  0,1  N  HCl. Plate kemudian dibungkus  dengan  kertas  aluminium  foil, diinkubasikan  semalaman  pada  suhu  kamar, kemudian  sel  dikocok  dengan shaker selama 10 menit. Serapan dibaca dengan menggunakan  spektrofotometer  pada  alat ELISA reader pada  panjang  gelombang  595 nm.
Hasil  uji  sitotoksik  berupa  respon serapan  dikonversikan  ke  dalam  persen kehidupan  sel  dengan  persamaan  sebagai berikut:
Dilanjutkan analisis untuk menentukan regresi linear antara log konsentrasi sampel uji (ekstrak, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi  air  umbi  mentimun  papasan) versus persen  sel  hidup  menggunakan Microsoft Excel 2010, hingga akan didapatkan persamaan: Y = a + bx
Hasil  antilog  x  dari  persamaan  di  atas, merupakan nilai IC 50 . Analisis lanjutan untuk melihat  adanya  keefektifitasan  pada  ekstrak, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat dan fraksi air umbi  mentimun  papasan  dilakukan  analisis Independent  T-test menggunakan  SPSS  versi 17.

## Uji Aktivitas Antiangiogenesis
Preprasi bFGF yang digunakan sebanyak 25 mikro gram dibuat stok kadar 50 nano  gram/mikro  liter  dengan  menggunakan larutan  tris-HCL  10  mM  pH  7,5  kemudian diencerkan  sehingga  mendapatkan  kadar  1 nano  gram/  mikro  liter.  Preparasi  bFGF dilakukan secara aseptis di dalam laminar air flow. Dosis bFGF untuk setiap telur perlakuan terinduksi  adalah  10  nano  gram  (Sun et  al ., 2004).
Fraksi  etil  asetat  umbi  mentimun papasan  dilarutkan  dengan  DMSO-aquades 0,8% streril untuk kemudian dibuat seri kadar dan  distrerilkan  menggunakan  mikrofilter. Preparasi  dilakukan  secara  aseptis  didalam laminar air flow.
Telur ayam SPF umur 8 hari (inkubasi) segera  diinkubasikan  lagi  dalam  inkobator laboraturium  pada  suhu  39 0 C.  tahap  awal yaitu  dengan  memberi  tanda  pada  kerabang telur  yang  meliputi  batas  ruang  udara,  lokasi embrio  dan  daerah  yang  akan  dibuat segiempat  (jendela)  berukuran  1x1  cm diatas embrio.  Lokasi  embrio  diketahui  melalui candling pada  telur.  Kerabang  telur  pada
bagian  kutub  yang  mengandung  udara  dan kerabang diatas embrio disucihamakan dengan  alkohol.  Selanjutnya  pada  kedua daerah tersebut dibuat lubang kecil menggunakan sebuah mini drill.
Udara  dari  ruang  udara  diaspirasi  atau disedot  dengan  bola  karet  sampai  berpindah dari  kutub  ke  kerabang  bagian  atas  telur. Perlakuan ini dilakukan pada posisi horizontal di ruang gelap dan melalui candling, sehingga ruang  udara  buatan  yang  terbentuk  diatas embrio  dapat  terlihat.  Kerabang  telur  diatas embrio  dipotong  dengan  gergaji  atau  ( mini drill ) , untuk  membuat  lubang  segiempat dengan luas 1 cm 2. . Melalui lubang ini bFGF dan  larutan  uji  di  implantasi  kedalam membran korio alantois yang telah terbentuk, setelah  sebelumnya  telur  disucihamakan  lagi dan dimasukan dalam laminar air flow dengan posisi  horizontal  dengan  ruang  udara  buatan terlentak dibagian atas. Subjek uji berupa telur yang  dibagi  dalam  8  kelompok.  (Masing- masing  kelompok  perlakuan  terdiri  dari  5 telur).
1. Kelompok I adalah sebagai kontrol, untuk memastikan  bahwa  paper  disc  yang digunakan sebagai pembawa tidak berpengaruh pada membran korio alantois telur ayam.
2. Kelompok II adalah telur dengan implantasi paper disc yang telah ditambahkan  10  mikro  liter  bFGF  1  nano gram/mikro liter, sebagai kelompok kontrol  bFGF  untuk  melihat  pengaruh induksi bFGF terhadap angiogenesis.
3. Kelompok  III  adalah  kelompok  telur dengan  implantasi  paper  disc  yang  berisi 10  mikro  liter  bFGF  1  nano  gram/mikro gram + 10 ml pelarut DMSO 0,8% sebagai control  bFGF  +  pelarut  untuk  mengetahui pengaruh  pelarut  terhadap  angiogenesis pada membrane korio allantois.
4. Kelompok IV, V, VI, merupakan kelompok  telur  yang  digunakan  untuk melihat  efek  penghambatan  fraksi  etil asetat  umbi  mentimun  papasan  terhadap angiogenesis  membrane  korio  allantois. Telur pada kelompok ini diberi implantasi dengan  variasi  konsentrasi  59,987  µg/ml, 109,975 µg/ml, dan 219,950 µg/ml.
5. Telur  yang  sudah  diberi  perlakuan kemudian  diinkubasi  dengan  kelembaban relatif 60 % selama 3 hari pada suhu 38,5- 39 0 C.  telur  kemudian  dimatikan  dengan cara disimpan kedalam lemari es selama 24
Ket: Y= log konsentrasi sampel uji
X= % viabilitas sel
% Sel hidup
= (Abs. Perlakuan  − Abs. Kontrol Media) (Abs. kontrol sel  − Abs. Kontrol Media) X 100%
jam dengan suhu 4-5 0 C dan dibuka (umur 12  hari)  kemudian  isi  telur  dikeluarkan. Telur  dibuka  dengan  cara  menggunting cangkang  telur  menjadi  2  bagian  dari cangkang  yang  terdekat  dengan  rongga udara, setelah itu CAM yang melekat pada cangkang  dicuci  dengan  larutan  isotonis NaCl 0,9%.
Langkah  terakhir  adalah  CAM  yang didapatkan diamati secara makroskopis. Hasil pengamatan  makroskopis  difoto  dengan kamera.  Parameter  yang  diamati  dalam penelitian adalah banyaknya pembuluh darah baru  atau  respon  angiogenesis  pada  CAM setelah  pemberian  fraksi  umbi  mentimun papasan.  Evaluasi  efek  antiangiogenesis secara makroskopik dilakukan dengan menggunakan modifikasi metode
Jumlah  pembuluh  darah  baru  yang terbentuk  pada  membran  korio  alantois dihitung  dan  diolah  sehingga  diperoleh persentase pertumbuhan angiogenesis, selanjutnya dihitung nilai persentase penghambatan angiogenesis dengan persamaan: Setelah diperoleh persentase pertumbuhan angiogenesis kemudian dilakukan perhitungan nilai persentase penghambatan angiogenesis
dengan persamaan:

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengumpulan  bahan,  pengeringan,  dan pembuatan serbuk
Umbi tanaman mentimun papasan yang akan  digunakan  merupakan  umbi  dengan ukuran  besar  berwarna  putih  dan  memiliki tekstur  kulit  yang  kasar,  kemudian  dilakukan sortasi kering terlebih dahulu, untuk memisahkan  sampel  dengan  pengotor  atau bagian  tanaman  lain  yang  terbawa  bersama sampel.  Proses  pencucian  bertujuan  untuk menghilangkan  sampel  dengan  tanah  atau debu.  Perajangan  pada  umbi  mentimun papasan bertujuan untuk memperkecil ukuran
sampel  sehingga  mudah  untuk  dilakukkan pengeringan. Proses pengeringan umbi mentimun papasan bertujuan untuk mencegah terjadinya  proses  kimiawi  yang  terjadi  pada sampel dan mencegah sampel dari  kerusakan akibat bakteri dan jamur.
Tabel  1.  Hasil  penimbangan  sampel  basah  dan sampel kering dan rendemen
Sampel Berat basah (g) Berat kering (g) Rendemen (%) Serbuk umbi mentimun papasan 2.100 1000 47,61
Tabel  1  menunjukan  bahwa  berat sampel  basah  umbi  mentimun  papasan  yang didapat  dari  proses  sebelumnya  sekitar  2100 gram, sedangkan sampel  kering yang didapat setelah  proses  pengeringan  yaitu  sebanyak 1000 gram dengan persen rendemen sebanyak 47,61%.
Serbuk  umbi  mentimun  papasan  yang diperoleh  kemudian  digunakan  untuk  proses ekstraksi. Metode ekstraksi pada penelitian ini adalah dengan menggunakan metode maserasi.  Pelarut  yang  digunakan  adalah etanol 96%. Wadah maserasi yang digunakan berkaca  gelap  agar  terhindar  dari  sinar matahari langsung, sehingga senyawa- senyawa  yang  terkandung  dalam  tanaman tidak  mengalami  perubahan  warna  pada  saat proses pemisahan. Proses maserasi dilakukan dalam  keadaan  tertutup  agar  etanol  tidak menguap  pada  suhu  kamar  selama  5  hari. Maserat yang diperoleh dievaporator kemudian dipekatkan di dalam oven pada suhu 50 0 C hingga diperoleh ekstrak kental.
Tabel  2.  Hasil  pembuatan  ekstrak  etanol  umbi mentimun  papasan  dan  perhitungan  persen rendemen ekstrak.
Sampel Berat ser- buk (g) Eta- nol (ml) Berat ekstrak (g) Rend emen (%) Serbuk umbi mentimun papasan 500 2500 97.65 19,53 500 2500 99.27 19,85 Total 1000 5000 196.92 39,38
Tabel  2  dapat  memperlihatkan  hasil rendemen  ekstrak  umbi  Mentimun  Papasan
% penghambatan angiogenesis 100% - % pertumbuhan angiogenesis.
% Pertumbuhan Angiogenesis
rata − rata  ⅀ P. darah pada kel. perlakuan rata − rata  ⅀ P. darah pada kontrol bFGF X 100%
dengan  persentasi  rendemen  39,38%.  Hasil rendemen  yang  tinggi  menunjukkan  bahwa senyawa-senyawa  kimia  yang  dapat  tersari dalam ekstrak juga cukup besar.
Tabel  3.  Hasil  penetapan  kadar  air  ekstrak  umbi Mentimun Papasan
Bobot ekstrak (g) Skala terbaca (ml) Kadar air (%) 20 1,8 9 20 1,7 8,5 20 1,6 8 Rata-rata 1,7 8,5
Tabel  3  menunjukan  hasil  persentasi rata-rata  kadar  air  ekstrak  umbi  Mentimun Papasan  8,5%.  Nilai  ini  menunjukkan  nilai ekstrak  umbi  mentimun  papasan  memenuhi syarat yaitu kurang dari 30% (Voigth., 1994). Prinsip  penentuan  kadar  air  dengan  destilasi yaitu menguapkan air dengan pembawa cairan kimia yang mempunyai titik didih yang lebih tinggi dari pada air dan tidak dapat dicampur dengan air  serta mempunyai berat jenis  lebih rendah  dari  air,  zat  kimia  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  yaitu  toluena.  Toluena mempunyai berat jenis lebih ringan dari air.
Tabel  4.  Hasil  pembuatan  fraksi n -heksana,  etil asetat dan fraksi air umbi mentimun papasan
ekstrak (g) fraksi n- heksan (g) fraksi etil asetat (g) fraksi air (g) 40 10,35 6,21 12,37 rendemen 25,87 15,52 30,92
Hasil  rendemen  fraksi n -heksan  umbi mentimun  papasan  yang  diperoleh  adalah 25,87%,  fraksi  etil  asetat  yang  diperoleh 15,52% dan fraksi air yang diperoleh 30,92%. Hasil fraksi air yang didapatkan lebih banyak dibandingkan fraksi yang lain karena sebagian besar  senyawa  yang  terkandung  dalam  umbi mentimun  papasan  bersifat  polar.  Rendemen dari  hasil  setiap  pelarut  berbeda  karena kemampuan  dari  masing-masing  pelarut dalam  menyari  senyawa  yang  terkandung dalam ekstrak etanol umbi mentimun papasan berbeda (Tabel 4).
Pengujian  sitotoksik  yang  dilakukan pada  pengujian  ini,  yaitu  jumlah  sel  kanker hidup  dalam  suspensi  yang  digunakan dalam kultur  adalah  99,75  x  10 4 sel/ml.  Sedangkan
jumlah sel VERO hidup dalam suspensi yang digunakan dalam  kultur  adalah  102,5  x  10 4 sel/ml.  Kemudian  dilakukan  pengenceran suspensi untuk  mendapatkan  konsentrasi  sel kanker  payudara  T47D  dan  sel  VERO  untuk 96  sumuran  dimana tiap  sumuran  sebanyak 100 μL/sumuran. Pada tahap kedua dilakukan treatment sampel  menggunakan  sampel  uji ekstrak, fraksi n -heksana, fraksi etil asetat dan fraksi  air.  DMSO  berfungsi sebagai buffer agar  fraksi  dapat  larut  dengan  baik.  Pelarut DMSO  ( dimetil  sulfoksida ) digunakan  secara luas untuk melarutkan senyawa polar maupun non  polar  dan  tidak bersifat  toksik.  Seri konsentrasi  ekstrak  yang  digunakan  dalam penelitian ini yaitu 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,2  μg/mL.  Sedangkan  konsentrasi  untuk fraksi-fraksi yang digunakan adalah 250; 125; 62,5; 31,2; 15,6; 7,81 μg/mL, dan konsentrasi doxorubicin adalah 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 μg/mL (Tabel 5).
Tabel 5. Hasil pengujian sitotoksik larutan control dan sampel uji terhadap sel kanker payudara T47D dan sel VERO serta indeks selektivitas
Sampel Nilai IC 50 (µg/ml) SI Hasil Sel Kanker T47D Sel VERO Ekstrak 500,167 377,631 0,75 Kurang selektif n-Heksan 353,131 426,940 1,20 Kurang selektif Etil Asetat 109,975 208,057 1,89 Kurang selektif Air 303,990 542,847 1,78 Kurang selektif Doxorubi cin 16,612 23,330 1,40 Kurang selektif
Data  pada  tabel  5  menunjukan  bahwa sampel  uji  yang  digunakan  kurang  selektif dengan nilai selktivitas index kurang dari 3.
Menurut USA National Cancer  Institut mengatakan  bahwa  rentan  nilai  IC 50 ≤  20 μg/ml sangat toksik, 21-200 μg/ml moderat/cukup aktif, 201-500 μg/ml lemah/sedang,  dan  ≥  500  μg/ml  tidak  toksik (Hameed-Abdel et  al .,  2012)  Berdasarkan kriteria tersebut kelompok pengujian sitotoksik terhadap sel kanker T47D menunjukan bahwa perlakuan ekstrak termasuk dalam kategori tidak toksik, fraksi n- heksan dan fraksi air termasuk dalam kategori lemah/  sedang,  fraksi  etil  asetat  termasuk dalam  kategori  moderat/cukup  aktif,  dan pembanding  doxorubicin  sangat  toksik.
Perlakuan  uji  sitotosik  terhadap  sel  Vero menunjukan bahwa fraksi air termasuk dalam kategori  tidak  toksik,  sedangkan  ekstrak, fraksi n-heksan, dan fraksi etil asetat tergolong memiliki  aktivitas  sitotoksik  lemah  dan pembanding  doxorubisin  termasuk  dalam kategori moderat atau cukup aktif terhadap sel VERO.
Hasil  perlakuan  uji  sitotoksik  terhadap sel  kanker  payudara  T47D  dan  sel  VERO dapat dilihat pada gambar 1 dan 2.
a b

## c
Gambar  1.  Mofrologi  sel  kanker  payudara  T47D  (a) sebelum diberi perlakuan (b) setelah pemberian fraksi etil asetat  konsentrasi  250  µg/mL,  (c)  setelah  pemberian doxorubicin dengan pembesaran 100X. Ket : panah merah sel hidup, panah hitam sel mati
Morfologi  sel  kanker  payudara  T47D seperti yang terlihat pada gambar 1 merupakan morfologi  kematian  sel  kanker  payudara akibat  pemberian  larutan  uji.  Jelas  sangat berbeda dari setiap gambar yang diperlihatkan.
Pengujian  ini  juga  menggunakan  sel normal  VERO  untuk  mengetahui  indeks selektivitas senyawa uji. Kultur sel merupakan salah  satu  teknik  untuk  mengembangkan  sel diluar tubuh ( in vitro ). Penggunaan kultur sel mempunyai  keuntungan  yaitu  lingkungan tempat  hidup  sel  dapat  dikontrol  dan  diatur sehingga  kondisi  fisiologis  dari  kultur  relatif konstan.  Perubahan  morfologi  sel  VERO sebelum  dan  setelah  pemberian  larutan  uji dapat dilihat pada gambar 2.
a b c
Gamber 2. Mofrologi VERO (a) sebelum diberi perlakuan (b)  setelah  pemberian  fraksi  etil  asetat  konsentrasi  250 µg/mL,  (c)  setelah  pemberian  doxorubicin  dengan pembesaran  100X.  Ket  :  panah  merah  sel  hidup,  panah hitam sel mati .
Gambar 2 menunjukan adanya kematian sel VERO setelah pemberian larutan uji.  Pada  pengujian  kanker,  sebenarnya  yang diharapkan  adalah  kematian  pada  sel  kanker
karena  jika  Sel  VERO  jug  ikut  mati  artinya bahwa sampel atau larutan uji yang digunakan tidak  selektif  membunuh  sel  kanker  namun jugamembunuh  sel  normal.  Hal  ini  akan mempengaruhi nilai akhir Selektivita Indeks.
Senyawa  kimia  pada  tanaman  terdapat dalam  metabolit  primer  dan  metabolit sekunder.  Sebagian  besar  produk  metabolit sekunder  berfungsi  sebagai  agen  pelindung terhadap  berbagai  pathogen  atau  molekul pengatur  pertumbuhan  (misalnya  zat  yang merangsang hormon atau menghambat pembelahan  sel  dan  morfogenesis).  Potensi obat antikanker memiliki fungsi-fungsi fisiologis,  metabolit  sekunder  yang  bekerja secara  langsung  pada  sel  kanker  dengan memodulasi  sehingga  akan  menghambat pertumbuhan sel kanker. Beberapa komponen metabolit pada tanaman yang memiliki khasiat antikanker  (antitumor):  aldehid,  alkaloid, annonaceous acetogenins , flavonoid, glikosida,  lignin,  lipid,  lipid  ( unsaponified ), asam nukleat, fenol dan turunannya, polisakarida, protein, terpenoid, serta beberapa  senyawa  yang  tidak  teridentifikasi (Kintzios dan Barberaki, 2003).

## Uji Aktivitas Antiangiogenesis
Uji  anti  angiogenesis  ini  dilakukan menggunakan metode yang telah dimodifikasi yaitu  tidak  menggunakan gelatin  sponges sebagai pembawa sediaan uji tetapi menggunakan paper  disc steril.  Penggunaan paper  disc  memiliki  kelemahan  terutama berkaitan dengan kemampuan daya serapnya. Selain  itu  pengamatan  terhadap  pembuluh darah  baru  dapat  terganggu  oleh  adanya pembuluh  darah  asal  dimana paper  disc diimplankan dan adanya reaksi inflamasi non- spesifik, sehingga menyulitkan ketika dilakukan  kuantifikasi  respon  angiogenesis.
Namun  modifikasi  ini  kemudian  dikontrol dengan  menambah  satu  variabel  pada percobaan yaitu kelompok kontrol paper disc untuk  meminimalisir  kelemahan  tersebut (Salamah et al .,2010).
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan beberapa kontrol pada variabel percobaan meliputi kontrol paper disc , kontrol pelarut,  kontrol  bFGF.  Konsentrasi  yang digunakan  untuk  kontrol  bFGF  dan  kontrol pelarut  yaitu  tiap paper  disc mengandung  10 μg/mL pelarut dan bFG.
46 Jurnal Ilmiah Sains Vol. 20 No. 1, April 2020
Hasil respon angiogenesis pada kelompok kontrol dapat dilihat pada gambar 3.
Gambar  3.  Perbandingan  respon  angiogenesis  kelompok kontrol.  (A). paper  disc ,  (B). paper  disc +  Pelarut  DMSO 0,8%,  (C). Paper  disc +  bFGF.  Ket  :  bulatan  merah paper disc ,  panah  hitam  pembuluh  darah  utama,  panah  kuning pembuluh darah baru .
Pengamatan secara makroskopik terhadap CAM kelompok kontrol paper disc , menunjukkan  bahwa  angiogenesis  di  dalam paper  disc ,  maupun  pada  daerah  di  sekitar paper disc memperlihatkan gambaran angiogenesis  yang  sangat  berbeda,  dimana pada  gambar  A  atau  kontrol paper  disc dan kontrol B atau kontrol pelarut hanya terbentuk sedikit angiogenesis di sekitar paper disc atau di  luar paper  disc yaitu  dengan  jumlah  rata- rata 13 pembuluh darah untuk paper disc dan 10,66  pembuluh  darah  baru  untuk  kontrol pelarut DMSO 0,8%. Sedangkan pada gambar C  atau  kontrol  bFGF  sangat  jelas  terlihat bahwa terdapat banyak pembentukan pembuluh darah baru di sekitar dan bahkan di dalam paper disc tersebut yaitu dengan jumlah pembuluh  darah  baru  sebanyak  24,66 (Gambar 3).
Hal  ini  menunjukan  bahwa  protein bFGF  yang  terdapat  pada  sel  kanker  dapat memicu pertumbuhan pembuluh darah baru ke daerah di sekitar sel kanker tersebut sehingga suplai  oksigen  dan  nutrisi  untuk  sel  kanker dapat  terpenuhi  akibatnya  sel  kanker  akan semakin  banyak  berkembang.  Pemberian kontrol paper  disc dan  induktor  bFGF digunakan untuk mengetahui potensi induktor tersebut terhadap munculnya pembuluh darah baru pada paper disc maupun di sekitar paper disc. Pada  pembuatan  seri  kadar  senyawa  uji digunakan  pelarut  DMSO  0,8  %.  Pelarut DMSO 0,8 % secara statistik tidak menyebabkan  pertumbuhan  pembuluh  darah baru. Kemudian dilakukan perhitungan pertumbuhan  pembuluh  darah  baru  pada replikasi  tiap-tiap  kontrol  untuk  mengetahui jumlah rata-rata pertumbuhan pembuluh darah serta dilakukan perhitungan standar deviasi.
Hasil respon angiogenesis pada kelompok kontrol dapat dilihat pada gambar 4.
Gambar  4.  Perbandingan  respon  angiogenesis  kelompok kontrol.  (A). paper  disc ,  (B). paper  disc +  Pelarut  DMSO 0,8%,  (C). Paper  disc +  bFGF.  Ket  :  bulatan  merah paper disc ,  panah  hitam  pembuluh  darah  utama,  panah  kuning pembuluh darah baru .
Kelompok  kontrol  perlakuan  atau kontrol  uji  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu  fraksi  etil  asetat  dengan  tiga  seri konsentrasi  yaitu  konsentrasi  ½  IC 50 =59,987 μg/mL, 1 IC 50 = 109,975 μg/mL dan 2 IC 50 = 219,95  μg/mL,  yang  kemudian  dilakukan pengenceran.
Persentase pertumbuhan pembuluh darah  baru  pada  masing-masing  kelompok perlakuan  fraksi  etil  asetat  umbi  mentimun papasan  dibandingkan  dengan  kontrol  bFGF. Urutan  pertumbuhan  pembuluh  darah  dari terbanyak yaitu kelompok perlakuan fraksi etil asetat  umbi  mentimun  papasan  dengan konsentrasi  59,987  μg/mL,  109,975  μg/mL, dan 219,95 μg/mL. Hal ini menunjukan bahwa semakin  tinggi  konsentrasi  fraksi  etil  asetat umbi  mentimun  papasan  yang  digunakan semakin sedikit jumlah pertumbuhan pembuluh  darah  baru.  Sedangkan  persentase penghambatan  konsentrasi  terbesar  ada  pada konsentrasi  219,95  μg/mL  dengan  angka penghambatan  sebesar  56,78  %,  diikuti konsentrasi  109,975  μg/mL  dengan  persen penghambatan  sebesar  53,34  %,  serta konsentrasi  59,987  μg/mL  dengan  angka hambatan sebesar 27,01 %.
Hasil perhitungan persentase pertumbuhan pembuluh darah baru
menunjukan bahwa semakin tinggi konsentrasi  fraksi  etil  asetat  umbi  mentimun papasan  yang  digunakan  maka  persen pertumbuhan  pembuluh  darah  baru  semakin kecil sehingga persen penghambatan pembuluh darah baru semakin besar. Semakin besar  konsentrasi  fraksi  etil  asetat  umbi mentimun  papasan  yang  digunakan,  maka akan semakin besar pula persen penghambatan angiogenesisnya.
Gambar  5.  Rata-rata  pertumbuhan  pembuluh darah  baru  pada  tiap-tiap  kelompok  kontrol dan kelompok uji.
Gambar 5 menunjukan jumlah rata-rata pembuluh  darah  pada  tiap  kelompok  kontrol dan kelompok perlakuan fraksi etil asetat umbi mentimun  papasan.  Terlihat  jelas  bahwa kontrol  bFGF  mempunyai  pengaruh  yang sangat kuat dalam menginduksi pertumbuhan pembuluh darah baru dengan jumlah rata-rata terbanyak dibandingkan dengan kontrol paper disc dan  kontrol  pelarut.  Rata-rata  pembuluh darah  terbanyak  pada  kelompok  bFGF kemudian  mengalami  penurunan  saat  diberi perlakuan  konsentrasi  larutan  uji  fraksi  etil asetat.  Hal  ini  dapat  dikatakan  bahwa  fraksi etil  asetat  dapat  menghambat  pertumbuhan pembuluh darah baru pada Membrane Chorio Allantoic (CAM)  pada  konsentrasi  tertentu.
Semakin  besar  konsentrasi  fraksi  etil  asetat yang diberikan, maka semakin sedikit jumlah pembuluh darah baru yang dihasilkan.
Gambar  6.  Hubungan  konsentrasi  fraksi  etil asetat  dengan  persentase  penghambatan pembuluh darah baru.
Peningkatan  persentase  penghambatan angiogenesis seperti yang tertera pada gambar 6  menunjukan  bahwa  setiap  konsentrasi perlakuan fraksi  etil asetat memiliki aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan pembuluh darah. Seiring peningkatan konsentrasi  fraksi  etil  asetat  yang  diujikan, maka semakin besar pula persentase penghambatan yang dihasilkan. Hal  ini dapat dikatakan bahwa kemungkinan besar beberapa golongan  senyawa  aktif  yang  terkandung dalam  fraksi  etil  asetat  memiliki  aktivitas antiangiogenesis

## KESIMPULAN
Fraksi  etil  asetat  umbi  mentimun papasan  ( Coccinia  Grandis (L).  Voigt) memiliki  aktivitas  sitotoksik  terhadap  sel kanker  payudara  T47D  dengan  kategori moderat/cukup.    Nilai  IC 50 fraksi  etil  asetat umbi  mentimun  papasan  ( Coccinia  Grandis (L). Voigt terhadap sel kanker payudara T47D sebesar  109,975  μg/mL,  dan  208,057  μg/mL terhadap  sel  VERO  sehingga  dinyatakan kurang  selektif  dengan  nilai  selektivitas indeks dibawah 3 yaitu sebesar 1,891.  Fraksi etil asetat memiliki aktivitas antiangiogenesis terhadap  CAM  embrio  ayam  yang  diinduksi bFGF.    Konsentrasi  efektif  dari  fraksi  etil asetat  terhadap  CAM  embrio  ayam  yang diinduksi bFGF yaitu sebesar 219,95 μg/mL.

## DAFTAR PUSTAKA
Adelina, R., R. Febriyanti, I.S. Oktoberia & P. Reno.  2014.  Ekstrak  Daun Annona muricata Linn.  sebagai Antiproliferasi terhadap  Sel  Hepar  Tikus  Terinduksi 7,12 Dimetilbenz [a] antracene (DMBA). Jurnal Kefarmasian Indonesia, 4(1) : 1-12.
Bhattacharya,  B.,  Pinaki  Pal,  Asif  Lalee, Dipak Kumar Mal & Amalesh Samanta. 2011. In  Vivo and In  Vitro anticancer activity of Coccinia grandis (L.) Voigt (Family:  Curcubitaceae)  on  Swiss albino  mice. Journal  of  Pharmacy Research , 4(3) : 567-569.
13 10.66 24.66 18 12 10.66 0 5 10 15 20 25 30 Rata-rata pembuluh darah baru paper disc pelarut
(DMSO) bFGF fraksi etil asetat konsentrasi 60, 110, dan 220 μg/mL
27.01 55.54 56.78 0 10 20 30 40 50 60 konsentrasi 60 µg/ml konsentrasi 110 µg/ml konsentrasi 220 µg/ml
% Penghambatan angiogenesis
Churiyah  &  S.  Harran.  2010.  The  Bioactive Proteins of Coccinia grandis (L). Voigh Plant  Parts  and  Their  Activity  on Cancer  Cells  Lines. Jurnal  Farmasi
Sains, 1(1) .
DEPKES RI. (Departemen Kesehatan Republik  Indonesia).  2001.  Invertaris Tanaman  Obat.  Jilid  I.  Depkes  RI, Jakarta. Hameed-Abdel,  E.S.S.,  S.A.  Bazaid,  M.M. Shohayeb,  M.M.  El-Sayed  &  E.A.  El- Walkil.  2012.  Phytochemical  Studies and Evaluation of Antioxidant, Anticancer and Antimicrobial Properties  of  Conocarpus  erectus  L. Growing  in  Taif,  Saudi  Arabia.
European Journal of Medicinal Plants , 2(2) : 93-112.
Harbone,  J.B.  1987.  Metode  Fitokimia Penuntun  Cara  Modern  menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB. Bandung.
Kintzios, S.E & M.G. Baberaki. 2004. Plants That  Fight  Cancer .  D.C.CRC  Press, Washington, p:296.
Munasinghe,  K.A.A.M,  C.  Abeysena,  I.S. Yaddehige,  T.  Vidanapathirana  &  K. P.B.  Piyumal. Blood  sugar  Lowering Effect of Coccinia grandis .
Nagare,  S.,  G.S. Deokar  &  N.R.  Phad.  2015. Review on coccinia grandis (L) Voigt (Ivy  Gourd). World  Journal  of Pharmaceutical Research, 4(10) : 728-743. Salamah,  N.,  Sugiyanto,  Mae  Sri  Hartati  & Farida Hayati. 2010. Efek
antiangiogenik  ekstrak  metanol  akar pasak  bumi  ( eurycoma  longifolia , jack)  pada  membran  korio  alantois (cam)  embrio  ayam  yang  terinduksi bFGF. Majalah  Obat  Tradisional, 15(1).
Sathees,  L.  Shilpa  &  K.  Murugan.  2011. Antimicrobial  activity  of  protease inhibitor  from  leaves  of Coccinia grandis (L.) Voigt. Indian Journal of Experimental Biology, 49 : 366-374.
Sun, X.T, Y.T Ding, X.G. Yan, L.Y. Wu, Q. Li,  N.  Ceng,  Y.D.  Qiu  &  M.  Zhang. 2004. Angiogenic synergistic effect of basic  fibroblast  growth  factor  and vascular  endothelial  growth  factor  in an in  vitro quantitative  microcarrier- based three-dimensional fibrin
angiogenesis system. World J Gastroenterol, 10(17) : 2524-2528.