## Original Article
The Effect of Methanolic Extract and Ethyl Acetate Fraction of Kepel Fruits to Lipid Peroxide Concentration in Liver of CCl 4 -induced Rat
Pengaruh Ekstrak Metanol dan Fraksi Etil Asetat Buah Kepel terhadap Konsentrasi Lipid Peroksida pada Tikus yang diinduksi CCl 4
Mitsalina Fildzah Arifah 1 , Sudibyo Martono 1,2 , Sugeng Riyanto 2 , Claude Mona Airin 3*
1 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 55281, Indonesia
2 Departemen Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 55281, Indonesia
3 Departemen Anatomi dan Fisiologi Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, 55281, Indonesia *Corresponding author: Claude Mona Airin | email: monaairin@ugm.ac.id
Received: 1 October 2019; Revised: 30 October 2019; Accepted: 10 November 2019; Published: 6 December 2019
Abstract:  Accumulation  lipid  peroxidation  can  lead  to  the  formation  of  malondialdehyde  to  generate  free radicals. Antioxidant will minimize free radical related health problems, such as natural antioxidant from meat of kepel (Stelechocarpus burahol) (Blume) Hook. F. & Thompson) fruits. Antioxidant activities of methanol extracts and acetate ethyl fractions meat of kepel fruits calculated profile of malondialdehyde concentration (ng/mL) in CCl 4 induced acute liver toxicity in female Sprague Dawley rats using ELISA competitively method. All of groups induced CCl 4 i.p. at 0 h, except untreated and solvent control group, then vitamin C , methanol extracts and acetate ethyl fractions p.o. once daily for 72 h. Identification of secondary metabolite was using phytochemical screening and Thin Layer Chromatography (TLC). Liver weighed and calculated relative organ weight (ROW) of liver, then all of data analyzed using statistic tests, One Way ANOVA and Kruskall Wallis. This study showed methanol extracts can decrease MDA concentration, ALT and AST were more potent (significantly p<0.05) than acetate ethyl fractions and vitamin C. The TLC analysis identified methanol extracts have same polarity with quercetin (Rf = 0,26) and acetate ethyl fractions showed other flavonoid class, except rutin and quercetin. ROW of acute liver toxicity in rats increased significantly in CCl 4 and vitamin C groups.
Keywords: Antioxidant, lipid peroxidation, MDA, meat of kepel fruit.
Abstrak: Akumulasi lipid peroksida dapat memicu pembentukan malondialdehid yang menghasilkan radikal bebas. Antioksidan dapat meminimalkan radikal bebas yang menyebabkan masalah kesehatan, salah satunya antioksidan  alami  berasal  dari  daging  buah  kepel  (Stelechocarpus  burahol  (Blume)  Hook.  F.  &  Thompson). Aktivitas  antioksidan  ekstrak  metanolik  dan  fraksi  etil  asetat  daging  buah  kepel  diukur  profil  konsentrasi malondialdehid  (ng/mL)  pada  liver  tikus  betina  galur  Sprague  Dawley  yang  diinduksi  CCl 4 menyebabkan toksisitas akut menggunakan metode ELISA secara kompetitif. Semua kelompok diinduksi dengan CCl 4 secara i.p. pada jam ke-0, kecuali kelompok tanpa perlakuan dan kontrol pelarut, dilanjutkan pemberian vitamin C, ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat daging buah kepel p.o. setiap hari selama 72 jam. Identifikasi metabolit sekunder menggunakan skrining fitokimia dan Kromatografi Lapis Tipis. Liver ditimbang untuk menentukan nilai berat relatif organ liver (BRO), kemudian semua data dianalisis dengan uji statistik, One Way ANOVA dan Kruskall  Wallis.  Dalam  penelitian  ini,  ekstrak  metanolik  dapat  menurunkan  konsentrasi MDA,  AST  dan  ALT
(signifikan p<0,05) dibandingkan fraksi etil asetat dan vitamin C. Analisis KLT pada ekstrak metanolik memiliki kepolaran mirip dengan kuersetin (Rf = 0,26) dan fraksi etil asetat menunjukkan adanya golongan flavonoid lain selain rutin dan kuersetin. BRO perlakuan hewan uji meningkat secara signifikan (p<0,05) pada kelompok CCl 4 dan vitamin C.
Kata kunci: Antioksidan, lipid peroksida, MDA, daging buah kepel.

## 1. PENDAHULUAN
Antioksidan  adalah  senyawa  yang  dapat  menghambat  oksidasi  radikal  bebas,  sehingga radikal bebas yang mengikat asam lemak tidak jenuh mengakibatkan terbentuknya lipid peroksida [7]. Lipid peroksida terbentuk akibat kelebihan produk reactive oxygen species (ROS) yang menyerang membran lipid dan protein dengan melibatkan residu asam lemak ganda dari fosfolipid yang sangat sensitif  terhadap  oksigen  [33].  Lipid  peroksida  menghasilkan  metabolit  malondialdehid  [33], sehingga  antioksidan  dapat  mendetoksifikasi  lipid  peroksida,  salah  satunya  antioksidan  endogen seperti enzim katalase dan enzim 𝛼 - GST [20].
Buah kepel (Stelechocarpus burahol) (Blume) Hook. F. & Thomson dikenal sebagai buah khas Yogyakarta yang sering dimanfaatkan masyarakat sebagai parfum, obat tradisional menghilangkan bau  badan  dan  bahan  kontrasepsi  [18].  Buah  kepel  berwarna  kecoklat-coklatan,  bergerombol, diameternya 5-6 cm, dan berisi daging buah yang dapat dimakan [16]. Beberapa penelitian aktivitas antioksidan  secara  in  vitro,  buah  kepel  diketahui  memiliki  senyawa  fenolik  total  dari  ekstrak metanolik daging buah kepel dengan nilai IC 50 441,64 µg/mL [29] dan ekstrak etil asetat buah kepel memiliki nilai IC 50 29,12 µg/mL pada uji peredaman radikal bebas 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) [32]. Hasil skrining fitokimia daging buah kepel menunjukkan adanya metabolit sekunder golongan alkaloid,  flavonoid,  polifenol,  saponin,  triterpenoid  dan  kuinon  [30].  Menurut  Batubara  et  al.[5] melaporkan  pula  bahwa  hasil  skrining  fitokimia  daging  buah  kepel  dari  Yogyakarta  diketahui mengandung flavonoid dan tanin, sedangkan yang diambil dari Karanganyar hanya mengandung tanin. Pada penelitian fraksi etil asetat daging buah kepel menunjukkan adanya tiga isolat, salah satu isolatnya diketahui mengandung campuran senyawa Bis (2-etil heksil) ftalat dan etil oleat [23].
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  efek  ekstrak  metanolik  dan  fraksi  etil  asetat daging buah kepel dapat dengan pemeriksaan sampel darah dan organ liver pada hewan uji yang terpapar CCl 4 secara akut. Pemeriksaan sampel darah diukur dengan konsentrasi malondialdehid dan profil enzim AST dan ALT. Pemeriksaan organ liver melalui berat relative organ (BRO) pada tikus yang diinduksi CCl 4 sehingga data dianalisis dengan uji statistik menggunakan aplikasi IBM SPSS versi 19. Dengan demikian, penelitian ini diharapkan ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat kepel berperan sebagai hepatoprotektif.

## 2. BAHAN DAN METODE

## 2.1. Bahan
Sampel  daging  buah  kepel  yang  diperoleh  dari  Dusun  Mriyan,  Seyegan,  Sleman; diklorometan  (Merck,  pro  analisis);  etil  asetat  (Merck,  pro  analisis);  Na 2 SO 4 anhidrat  (Merck,  pro analisis);  petroleum  eter  (Merck,  pro  analisis);  metanol  teknis;  kain  kassa;  kertas  saring  kasar (berukuran 60 x 60 cm); akuades; rutin hidrat (Sigma); kuersetin dihidrat (Sigma); dan penyemprot sitroborat.

## 2.2. Instrumentasi dan Perangkat Lunak
Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini adalah Malondialdehyde (MDA) ELISA Kit, Microsentrifuge MPW-55, Microplate Reader (Bio-Rad, 680 XR) dan plat silika gel 60 F 254 (Merck). Data diolah dengan Microsoft Excel (Windows) untuk kemudian dilakukan analisis uji statistika One Way Anova dan    Kruskall Wallis dengan taraf kepercayaan 95% menggunakan program IBM SPSS versi 19.

## 2.3. Metode Ekstraksi dan Fraksinasi Daging Buah Kepel
Metode ekstraksi dan fraksinasi daging buah kepel mengacu pada  [5]. Daging buah kepel dicuci,  dikupas  dan  dipotong-potong  kecil  menggunakan  blender,  selanjutnya  dimaserasi  dengan metanol (2000g/L) dengan dilakukan 2 kali maserasi. Maserasi 1 digunakan 60% dari total metanol yang digunakan selama 3 x 24 jam dengan pengadukan dua kali sehari selama 15 menit. Maserasi 2 digunakan  40%  dari  total  volume  metanol  yang  digunakan,  dilakukan  selama  3  x  24  jam  dengan pengadukan  dua  kali  sehari  selama  15  menit.  Setelah  maserasi  selesai,  dilakukan  penguapan menggunakan rotary evaporator untuk diperoleh ekstrak kental daging buah kepel. Ekstrak metanolik ditimbang  dengan  neraca  analitik  sejumlah  50  g  ditambahkan  ke  dalam  1000  mL  akuades,  lalu difraksinasi  berdasarkan  kepolarannya  dari  non-polar  ke  polar  yakni  pelarut  petroleum  eter, diklorometan,  lalu  etil  asetat.  Fraksinasi  sampel  menggunakan  pelarut  non  polar  hingga  pelarut polar  (perbandingan  1:1  v/v),  dibiarkan  hingga  terbentuk  dua  lapisan  dan  dibilas  kembali (perbandingan  1:0,5  v/v)  dengan  pengulangan  hingga  lapisan  atas  berwarna  jernih  sesuai  metode ekstraksi cair-cair menggunakan corong pisah.

## 2.4. Identifikasi Kualitatif Flavonoid
Penentuan  identifikasi  kualitatif  flavonoid  menggunakan  kromatografi  lapis  tipis  (KLT) karena  metode  ini  dipilih  sebagai  skrining  awal  golongan  senyawa  flavonoid.  Fase  diam  yang digunakan  adalah  plat  silika  gel  60  F 254 yang  bersifat  polar.  Fase  gerak  yang  digunakan  telah dimodifikasi    dengan mengacu pada Markam & Andersen [22] adalah etil asetat: asam format: asam asetat glasial: air (100: 11: 11: 20 v/v/v) dan kloroform: etil asetat (60 : 40 v/v). Standar flavonoid yang digunakan rutin dan kuersetin. Sampel ditotolkan 2-3 tetes pada plat silika KLT, selanjutnya dielusi pada  fase  gerak  yang  telah  dijenuhkan.  Hasil  bercak  pada  plat  silika  disemprot  dengan  pereaksi sitroborat, kemudian bercak dideteksi pada sinar tampak, UV 254 nm dan UV 366 nm .

## 2.5. Perlakuan Hewan Uji
Tikus  galur  Sprague  Dawley,  sehat,  berumur  2-3  bulan,  berat  110-160  g.  Tikus  yang digunakan sebanyak 42 ekor betina yakni 18 ekor untuk kelompok pemodelan hewan uji dan 24 ekor untuk  kelompok  perlakuan  hewan  uji  dengan  masing-masing  4  ekor  setiap  kelompoknya.  Dalam penelitian ini, jumlah tikus setiap kelompok berdasarkan rumus Frederer 1967 yakni (t-1) (n-1) ≥ 15 dimana  t  merupakan  jumlah  kelompok  perlakuan  dan  n  adalah  jumlah  sampel  tiap  kelompok, sehingga digunakan 4 ekor tikus setiap kelompoknya. Hewan uji dikarantina menggunakan fasilitas kandang  di  Unit  Layanan  Penelitian  Pra-klinik  Laboratorium  Penelitian  dan  Pengujian  Terpadu (LPPT) UGM, Yogyakarta sesuai Surat Kelaikan Etik dengan No. 00128/04/LPPT/X/2017.
Tikus dikelompokkan menjadi 6 kelompok dengan masing-masing 4 ekor. Pada kelompok I merupakan  kelompok  tanpa  diberikan  perlakuan,  kelompok  II  adalah  kelompok  kontrol  pelarut CMC-Na 0,1% diberikan secara p.o., kelompok III-IV diberi induksi CCl 4 dalam minyak zaitun (1:1)
secara i.p. dengan pemberian ekstrak metanolik (kelompok III) dan fraksi etil asetat (kelompok IV) buah kepel secara p.o. Kelompok V diberi induksi CCl 4 dalam minyak zaitun (1:1) secara i.p. dengan pemberian vitamin C (antioksidan sintesis) secara p.o. Kelompok VI, tikus diinduksi menggunakan CCl 4 dalam minyak zaitun (1:1) secara i.p. Dosis ekstrak metanolik, fraksi etil asetat buah kepel dan pelarut  CMC-Na  0,1%  sebanyak  150  mg/kgBB  dan  dosis  vitamin  C  sebesar  200  mg/kgBB. Pengambilan volume sampel (mL) secara per oral (p.o.) yang dihitung yakni:
Berat Badan Tikus (g) x Dosis ( mg kgBB ) Kadar sampel  ( mg mL )  x 1000

## 2.6. Pengukuran Konsentrasi Lipid Peroksida

## 2.6.1. Penyiapan serum darah
Tikus  dianastesi  menggunakan  0,1  mL  ketamin  10%    secara  intramuskular.  Daerah  otot paha  posterior  tikus  diusap  dengan  kapas  beralkohol  terlebih  dahulu,  lalu  disuntikkan  larutan ketamin dosis 50 mg/kgBB pada daerah otot tersebut. Setelah selesai, dicabut perlahan-lahan jarum suntik dan ditekan daerah tersebut dengan kapas beralkohol. Pengambilan sampel darah pada jam ke-0, 24, 48, dan 72 sebesar 1,5 mL menggunakan mikrohematokrit dengan menusukkan pipa kapiler pada plexus retroorbitalis (daerah sudut mata), diputar pipa kapiler perlahan-lahan sampai darah keluar.  Sampel  darah  ditampung  di  dalam  microtube  berkapasitas  1,5  mL,  kemudian  dibiarkan menggumpal  selama  dua  jam  pada  suhu  kamar  atau  ditunggu  selama  semalam  pada  suhu  4 o C. Sampel  tersebut  disentrifugasi  dengan  kecepatan  3000  x  g  selama  10  menit,  lalu  diambil  bagian supernatan  (serum  darah)  menggunakan  mikropipet.  Serum  darah  disimpan  pada  suhu  -80 o C  di dalam  deep  freezer  untuk  pengukuran  konsentrasi  lipid  peroksida  menggunakan  MDA  ELISA  Kit, dilanjutkan  pengukuran  aktivitas  enzim  alanin  aminotransferase  (ALT)  dan  aspartat aminotransferase (AST). Setelah jam ke-72, tikus dinekropsi untuk diambil organ liver tikus. 2.6.2. Persiapan reagen ELISA Kit
a) Penyiapan wash buffer
Wash buffer diambil sejumlah 30 mL, lalu diencerkan ke dalam 750 mL deionized water. Jika wash buffer tidak terpakai dapat disimpan pada suhu 4 °C. Apabila terbentuk kristal di dalam wash buffer, dapat dihangatkan dengan pemanasan 40°C sampai kristal benar-benar larut  namun  suhu  pemanas  tidak  boleh  melebihi  50°C,  kemudian  wash  buffer  harus didinginkan sampai suhu kamar apabila akan digunakan.
b) Penyiapan larutan standar malondialdehid
Pembuatan  larutan  standar  500  ng/mL  diawali  dengan  dimasukkan  1  mL  larutan standar  500  ng/mL  ke  dalam  tabung  standar  500  ng/mL,  diaduk  sampai  homogen  dan disimpan tabung pada suhu kamar selama 10 menit. Sejumlah 7 tabung microtube diberi label dengan tulisan 250 ng/mL (tabung pertama), 125 ng/mL (tabung ke-2), 62,5 ng/mL (tabung ke-3), 31,25 ng/mL (tabung ke-4), 15,625 ng/mL (tabung ke-5), 7,813 ng/mL (tabung ke-6) dan blangko (tabung ke-7). Dimasukkan 0,3 mL standard dilution buffer di dalam tabung pertama hingga tabung ke-7. Selanjutnya ditambahkan 0,3 mL larutan standar 500 ng/mL di dalam tabung pertama dan dihomogenkan dengan  vortex. Kemudian diambil 0,3 mL dari tabung pertama  (larutan  standar  250  ng/mL)  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung  2  dan dihomogenkan,  lalu  dilanjutkan  hingga  tabung  ke-6.  Larutan  standar  tersebut  hanya
digunakan dalam jangka dua jam atau bila disimpan pada suhu 4°C dapat bertahan selama 12 jam atau pada suhu -20°C dapat bertahan selama 48 jam.

## Gambar 1. Pengenceran Larutan Standar (10)
c) Penyiapan biotin-detection antibody working solution
Penyiapan biotin-detecting antibody working solution dapat dilakukan satu jam sebelum pengujian. Volume total working solution dihitung yakni 0,05 mL/sumuran × jumlah sumuran. Pengambilan working solution ditambahkan 0,1-0,2 mL dari volume total. Working solution dibuat dengan perbandingan 1 : 100 yakni 1 μL biotin-detection antibody dilarutkan ke dalam 99 μL Antibody dilution buffer, lalu dihomogenkan larutan tersebut.
d) Penyiapan SABC working solution
HRP-Streptavidin Conjugate (SABC) working solution disiapkan selama 30 menit pada suhu  37°C  sebelum  dilakukan  prosedur  pengujian.  Volume  total  SABC  working  solution dihitung  yakni  0,1  mL/sumuran  ×  jumlah  sumuran.  Pengambilan  SABC  working  solution ditambahkan  0,1-0,2  mL  dari  volume  total.  SABC  diencerkan  dengan  SABC  dilution  buffer dengan perbandingan 1:100.
e) Penyiapan substrat TMB
Substrat  TMB  (tetramethylbenzidine)  disiapkan  selama  30  menit  pada  suhu  37°C sebelum  dilakukan  prosedur  pengujian.  Volume  total  substrat  TMB  dihitung  0,09 mL/sumuran × jumlah sumuran. Pengambilan substrat TMB ditambahkan 0,1-0,2 mL dari volume total.

## 2.6.3. Prosedur pengujian
Metode ELISA yang digunakan mengacu pada protokol Fine Test (10). Metode ini memiliki prinsip adanya kompetisi antigen target dengan antigen bebas dari sampel, sehingga biotin sebagai antigen target akan berkompetisi dengan malondialdehid pada serum darah untuk berikatan dengan malondialdehid yang menempel pada mikroplate (antibodi primer), selanjutnya berikatan dengan SABC (antibodi sekunder dilabeli enzim), lalu ditambahkan substrat dan terjadi reaksi enzim dengan substrat  yang  membentuk  warna  kuning.  Reaksi  tersebut  dihentikan  dengan  penambahan  reagen stop solution, sehingga dapat dideteksi menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 405 nm.Tahapan ini disiapkan terlebih dahulu larutan standar, blangko, sampel dan kontrol pada  pre- coated  plate,  lalu  dicatat  posisi  pada  masing-masing  sumurannya.  Sebelum  ditambahkan  standar, blangko,  sampel  dan  kontrol,  masing-masing  sumuran  dicuci  terlebih  dahulu  dengan  wash  buffer sebanyak dua kali, lalu ditambahkan 50 μL larutan standar, blanko, dan sampel serum darah pada setiap sumuran. Blanko sumuran berupa standard dilution buffer. Kemudian ditambahkan 50 μL biotin- detection  antibody  working  solution  pada  masing-masing  sumuran,  lalu  ditutupi  dengan  plate  sealer yang telah tersedia. Selanjutnya, diinkubasi pada suhu 37°C selama 45 menit. Pencucian dengan 350 μL  wash  buffer  pada  masing-masing  sumuran  dan  diulangi  prosesnya  tiga  kali.  Lalu  dibuang  sisa wash  buffer  dengan  dibalikkan  mikroplate  dan  ditepuk  pelan  di  atas  kertas  penyerap  yang  bersih.
Selanjutnya  ditambahkan  100  μL  SABC  working  solution  pada  masing-masing  sumuran,  ditutupi dengan plate sealer yang baru, lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Kemudian pencucian diulangi lagi sebanyak lima kali dengan 350 μL  wash buffer pada  masing-masing sumuran. Tahap selanjutnya ditambahkan 90 μL substrat TMB  ke dalam masing-masing sumuran sehingga terjadi reaksi  antara  enzim  dengan  substrat,  lalu  ditutupi  dengan  plate  sealer  baru.  Kemudian  diinkubasi pada  suhu  37  °C  selama  15-20  menit.  Waktu  reaksi  dapat  dipersingkat  atau  diperpanjang  sesuai dengan perubahan warna yang sebenarnya, namun tidak lebih dari 30 menit. Saat muncul perubahan warna biru pada sumuran, proses reaksi dihentikan dengan menambahkan stop solution sebanyak 50 μL  ke  dalam  masing-masing  sumuran,  sehingga  tampak  warna  berubah  menjadi  kuning  segera. Urutan penambahan stop solution dipastikan sama dengan penambahan substrat.

## 2.7. Metode Analisis
Pengukuran  nilai  densitas  optik  (Optical  Density)  MDA  ELISA  menggunakan  microplate reader pada panjang gelombang 450 nm. Hasil pengukuran densitas optik seri kadar larutan standar diperoleh persamaan y = b log x + a.    Nilai densitas optik sampel dimasukkan di dalam persamaan kurva  standar  diperoleh  nilai  konsentrasi  malondialdehid  (ng/mL).  Nilai  densitas  optik  sampel berbanding terbalik dengan konsentrasi malondialdehid sebagai parameter lipid peroksida sampel. Pengukuran  aktivitas  ALT  dan  AST  pada  pemodelan  hewan  dan  perlakuan  hewan  uji  dianalisis menggunakan metode optimasi pengujian UV berdasarkan IFCC termodifikasi. Data-data tersebut dianalisis  menggunakan  uji  statistika  menggunakan  IBM  SPSS  versi  19  pada  taraf  kepercayaan 95%(27).

## 2.8. Pengukuran Berat Organ Relatif (BRO)
Tikus dikorbankan terlebih dahulu dengan dosis anestesi letal menggunakan ketamin (159 mg/kgBB) secara intramuskular setelah jam ke-72. Hewan dipastikan mati dengan memeriksa denyut jantung  dan  tidak  munculnya  rasa  sakit  saat  dipegang,  kemudian  tikus  diposisikan  rebah  dorsal. Organ liver tikus dikeluarkan dari rongga tubuh, dibersihkan dari lemak, dibilas dengan NaCl 0,9% dan  ditimbang  berat  absolut.  Perhitungan  berat  absolut  rata-rata  liver  hewan  uji  dan  BRO  pda masing-masing kelompok, disajikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku dan dianalisis dengan uji statistik dengan program IBM SPSS versi 19 terhadap berat liver tikus dari kelompok percobaan tersebut. Berat relatif organ (BRO) diperoleh rumus menurut Halim et al. (12) yakni:
BRO = berat organ liver tikus (g)
berat badan tikus (g) 𝑥100

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1. Preparasi Sampel
Bagian tanaman yang digunakan untuk penelitian ini adalah daging buah kepel masak. Buah kepel masak diambil langsung dari pohon pada bulan April-Mei 2017 yang diperoleh dari Dusun Mriyan, Seyegan, Sleman pada ketinggian tanah sekitar 165 m dpl dengan ditandai berwarna kuning saat digores pada kulit buah kepel. Pengambilan buah kepel dari satu pohon yang diperoleh 49,240 kg  buah,  sehingga  diperoleh  daging  buah  kepel  yang  matang  sebesar  13,3665  kg  dan  rendemen sebesar  27,15%.  Buah  kepel  dideterminasi  untuk  memastikan  kebenaran  sampel  di  Laboratorium Farmakognosi, Fakultas Farmasi UGM. Pembuatan ekstrak metanolik daging buah kepel diperoleh melalui proses ekstraksi cara dingin menggunakan metode maserasi dengan pelarut metanol. Hasil maserasi dipekatkan dengan bantuan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak metanolik
kental  buah  kepel  sebesar  107,54  g  dan  rendemen  yang  dihasilkan  sebesar  0,81  %,  serta  ekstrak metanolik cair yang tidak dapat menguap sebesar 5,894 L karena kandungan air buah kepel yang besar sehingga digunakan untuk fraksinasi.
Fraksinasi  dilakukan  menggunakan  corong  pisah  karena  metodenya  mudah  memisahkan senyawa-senyawa  yang  terdapat  di  dalam  ekstrak.  Pelarut  petroleum  eter  dapat  menarik  lipid, diklorometan dapat menarik senyawa flavonoid aglikon dan senyawa kurang polar lainnya, serta etil  asetat  dapat  mengambil  flavonoid  kurang  polar  seperti  isoflavon,  flavanon,  metil  flavon  dan flavonol (22). Hasil fraksi etil asetat diperoleh sebesar 40,0848 g, fraksi diklorometan sebesar 12,2850 g  dan  fraksi  petroleum  eter  daging  buah  kepel  sebesar  26,5069  g.  Rendemen  fraksi  etil  asetat, diklorometan dan petroleum eter daging buah kepel diperoleh sebesar 0,30 %, 0,09% dan 0,20 %.

## 3.2. Identifikasi Kualitatif
Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan fase diam silika gel 60 F 254 dengan fase gerak pertama etil asetat:asam format:asam asetat glasial: air (100:11:11:20 v/v/v) dan fase gerak kedua untuk deteksi flavonoid aglikon menggunakan kloroform : etil asetat (60:40 v/v/v). Hasil elusi KLT disemprot menggunakan pereaksi sitroborat. Reaksi antara sitroborat dengan flavonoid dapat membentuk  ikatan  komplek  antara  hidroksil  dengan  keton  yang  bertetangga  tahan  asam  atau dengan  kelompok  tidak  tahan  asam  ortohidroksil  (15).  Plat  KLT  pada  fase  gerak  pertama  (FG1) menunjukkan marker rutin (Rf = 0,31) dibandingkan fraksi etil asetat (Rf = 0,44 dan 0,94) pada UV 366 nm. Bercak D tampak berpendar berwarna kuning kehijauan, sehingga bercak D kemungkinan dapat dikategorikan dalam kaempferol atau 3-dan 7-O- glikosida lainnya (22). Sedangkan fase gerak kedua (FG2), ekstrak metanolik (Rf=0,26) memiliki kepolaran senyawa ini mirip dengan kuersetin (Rf = 0,26), sedangkan  Rf sebesar 0,11 dan 0,56  dimungkinkan senyawa flavonoid lain jika bercak meredam  dengan  latar  belakang  hijau  berfluoresensi  di  bawah  sinar  UV  254  nm  (22)  dengan ditunjukkan pada Gambar 2.
FG1-ST FG1-UV254 FG1-UV366 FG2-ST FG2-UV254 FG2-UV366
Gambar 2. Plat KLT dengan Fase Gerak (FG) pada Sinar Tampak (ST), Sinar UV 254 nm, dan Sinar UV 366 nm dengan sampel A=    Rutin, B= Kuersetin, C= Ekstrak Metanolik, D= Fraksi Etil Asetat

## 3.3. Pemodelan Tikus
Pemodelan tikus ditujukan untuk pemilihan dosis CCl 4 yang tepat agar kondisi hepatotoksik pada kerusakan liver akut tanpa disertai kematian hewan uji. Parameter yang digunakan pengujian aktivitas  enzim  alanin  aminotransferase  (ALT)  dan  aspartat  aminotransferase  (AST).  Enzim  ALT
0,2 5 0,75 0,00 0,50 1,0 0
sebagai biomarker enzim spesifik liver yang mendeteksi adanya gangguan penyakit liver, sedangkan peningkatan level AST dikaitkan dengan kerusakan otot jantung dan skeletal pada parenkim liver (3). Sampel yang dipilih adalah serum darah karena jumlah enzim aminotransferase lebih besar di dalam  sel  darah  merah  (34).  CCl 4 disuspensikan  dalam  minyak  zaitun  (1:1  v/v)  bertujuan memperlambat  absorbsi  agen  toksik  tersebut,  apabila  CCl 4 tanpa  pelarut  minyak  zaitun  dapat menyebabkan perubahan struktur dan fungsional poliribosom yang lebih cepat  (26). Pada rentang dosis CCl 4 antara 1-2,5 mL dapat menyebabkan hepatotoksik  (21), maka dosis CCl 4 dalam minyak zaitun untuk pemodelan tikus sebesar 3, 1,5 dan 0,75 mL/kgBB. Menurut Janakat & Al-Merie (21), kadar  toksik  CCl 4 diketahui  mengalami  peningkatan  signifikan  pada  jam  ke-2  setelah  pemberian CCl 4 secara  i.p.,  sehingga  efek  maksimalnya  terjadi  pada  jam  ke-24,  selanjutnya  akan  mengalami penurunan kadar toksik selama tiga hari. Oleh karena itu, pengambilan serum darah pada jam ke-0, 2, 24, 48 dan 72.
Aktivitas  enzim  alanin  aminotransferase  (ALT)  merupakan  indikator  kerusakan  liver berdasarkan  jumlah  berlebihan  protein  ALT  yang  diekspresikan  (35).  Analisis  enzim  ALT menggunakan  uji  statistika  SPSS  untuk  setiap  jam  ke-0,  2,  24,  48  dan  72  dengan  membandingkan antar  kelompok  menunjukkan  tidak  berbeda  signifikan  (p>0,05).  Analisis  kedua  pengujian  enzim ALT  pada  masing-masing  kelompok  dengan  jam  yang  berbeda  dianalisis  menggunakan  SPSS. Kelompok tanpa perlakuan tidak mengalami berbeda signifikan (p>0,05) antar jam sehingga tikus yang tidak diberi perlakuan tidak menunjukkan perubahan nilai ALT. Begitu pula pada dosis 3 dan 0,75 mL/kgBB menunjukkan nilai ALT tidak berbeda signifikan (p>0,05) seiring perubahan jamnya. Akan tetapi, dosis 1,5 mL/kgBB menunjukkan nilai ALT berbeda signifikan (p<0,05) karena terjadi peningkatan mulai jam ke-0 hingga jam ke-2 sebesar 21 %, lalu menurun signifikan pada jam ke-2 hingga jam ke-48 sebesar 91,2 %. Dapat disimpulkan CCl 4 pada dosis 1,5 mL/kgBB dapat berpotensi mempengaruhi  perubahan  nilai  ALT  selama  72  jam  dibandingkan  dosis  lainnya.  Data  hasil pengukuran enzim ALT pada kelompok pemodelan disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Nilai ALT pada Pemberian CCl 4 Dosis Bertingkat
Dosis (ml/kgBB) Perlakuan jam ke-    (U/I) 0 2 24 48 72 TP 51,37 ± 10,84 44,23 ± 7,46 36,67 ± 14,15 39,67 ± 7,24 38,43 ± 12,18 3 43,16 ± 13,91* 53,88 ± 7,22* 48,22 ± 10,02* 49,50 ± 21,39* 43,24 ± 4,31* 1,5 57,84 ± 5,70* # 70,00 ± 27,75* # 48,20 ± 11,19* # 36,62 ± 6,40* # 41,22 ± 11,64* # 0,75 53,58 ± 7,50* 53,84 ± 12,97* 54,18 ± 10,55* 43,26 ± 12,15* 41,36 ± 10,91*
*  nilai  rata-rata  ±  simpangan  baku  (n=5/kelompok),  kecuali  tanpa  perlakuan  (TP)  (n=3/kelompok), # p  <  0,05 dibandingkan pada kelompok sama, ^ p < 0,05 dibandingkan pada jam sama
Peningkatan  aktivitas  enzim  aspartat  aminotransferase  (AST)  dikaitkan  dengan  adanya kerusakan  pada  parenkim  liver  (3),  karena  CCl 4 dimetabolisme  oleh  sitokrom  P 450 menjadi triklorometil  radikal  memicu  kerusakan  sel  parenkim  akibat  aktivasi  sel  Kupffer  dan  dapat melepaskan enzim-enzim sel di dalam peredaran darah (9). Analisis statistika data AST berdasarkan pengambilan  sampel  pada  jam  yang  sama  diperoleh  sampel  jam  ke-0  menunjukkan  data  berbeda signifikan p<0,05 yakni kelompok dosis 3 mL/kgBB dengan dosis 1,5 mL/kgBB, kelompok dosis 0,75 mL/kgBB  dengan  tanpa  perlakuan  dan  kelompok  1,5  mL/kgBB  dengan  tanpa  perlakuan.  Hal  ini
dapat  disebabkan  adanya  peningkatan  kadar  hepatotoksin  CCl4  pada  kedua  dosisnya,  namun berbeda dengan kelompok dosis 3 mL/kgBB yang belum menunjukkan peningkatan kadar AST di dalam serum darah karena dapat dimungkinkan pelarut minyak zaitun dapat memperlambat agen toksik  tersebut  (26).  Pengambilan  sampel  jam  ke-2,  ke-24  dan  ke-48  menunjukkan  tidak  adanya perbedaan signifikan (p>0,05) antar data kelompok. Pengambilan sampel jam ke-72 dianalisis melalui uji One Way ANOVA dan uji Scheffe menunjukkan data antar kelompok berbeda signifikan yakni antara  dosis  3  mL/kgBB  sebesar  3,5  kali  lebih  besar  dibandingkan  tanpa  perlakuan,  dosis  1,5 mL/kgBB sebesar 3,8 kali lebih besar dibandingkan tanpa perlakuan, dan dosis 0,75 mL/kgBB lebih besar 3,4 kali lebih besar dibandingkan tanpa perlakuan. Hal tersebut menunjukkan hewan uji yang diinduksi CCl 4 dengan berbagai dosis mengalami peningkatan AST dibandingkan tanpa perlakuan. Data hasil pengukuran enzim AST pada kelompok pemodelan disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Nilai AST pada Pemberian CCl 4 Dosis Bertingkat
CCl 4 (ml/kgBB) Perlakuan jam ke- (U/I) 0 2 24 48 72 TP 92,77 ± 3,64 # 127,23 ± 25,93 72,63 ± 19,96 127,00 ± 19,96 23,83 ± 5,30 # 3 107,98 ± 18,30* 177,28 ± 41,63* 191,66 ± 73,22* 132,56 ± 33,21* 107,48 ± 9,95* # 1,5 168,74 ± 70,88* # 392,84 ± 337,68* 204,96 ± 143,48* 110,82 ± 41,48* 113,20 ± 45,87* # 0,75 141,54 ± 25,39* # 241,12 ± 138,75* 226,08 ± 61,83* 130,90 ± 34,76* 104,84 ± 21,33* #
* nilai rata-rata ± simpangan baku (n=5/kelompok), kecuali tanpa perlakuan (TP) (n=3/kelompok),
# nilai signifikan p < 0,05 dibandingkan tanpa perlakuan.
Berdasarkan data ALT menunjukkan dosis 1,5 mL/kgBB berbeda signifikan daripada dosis lainnya,  sedangkan  data  AST  menunjukkan  ketiga  dosis  mengalami  peningkatan  kadar  AST dibandingkan tanpa perlakuan,  maka dapat disimpulkan  bahwa  pemodelan tikus ini untuk dosis yang tepat digunakan dosis 1,5 ml/kgBB karena dapat menyebabkan hepatotoksik pada tikus namun tidak mematikan hewan uji.

## 3.4. Pemeriksaan Sampel Darah
Tikus  diinduksi  CCl 4 sebagai  hepatotoksin  dapat  memproduksi  kelebihan  lipid  peroksida yang diisolasi dari serum darah tikus dan dideteksi menggunakan MDA ELISA sehingga diperoleh kurva  standar  y  =  -0,3641  x  +  1,1317  dengan  linearitas  (r)  sebesar  0,9875  (r 2 =  0,9731)  sesuai  pada gambar 3. Standar kurva penelitian dapat dikatakan reliabel jika regresi linear memiliki nilai r 2 lebih dari  0,97  (24).    Densitas  optik  sampel  dikonversikan  menjadi  konsentrasi  MDA  (µg/  mL),  karena nilai densitas optik sampel yang diperoleh berbanding terbalik dengan konsentrasi malondialdehid sebagai  parameter  lipid  peroksida  masing-masing  sampel.  Hasil  analisis  malondialdehid  (MDA) dengan uji statistika diketahui perbandingan kelompok berbeda pada jam yang sama (ke-24, ke-48 dan ke-72 ) tidak berbeda signifikan (p>0,05). Perbandingan kedua antara kelompok yang sama pada jam  berbeda,  kelompok  tanpa  perlakuan  tidak  berbeda  signifikan  (p>0,05)  antar  jam  karena  tidak diberikan  perlakuan.  Konsentrasi  MDA  pada  kelompok  kontrol  pelarut  CMCNa  0,1  %  menurun secara signifikan (p<0,05) sebesar 58,9 % (24 ke 72) dan 58,2% (48 ke 72). Kelompok CCl 4 menurun
secara signifikan (p<0,05) sebesar 52,6% (24 ke 48) dan sebesar 81,8% (48 ke 72). Puncak peningkatan dosis hepatotoksik induksi CCl 4 pada jam ke-24, lalu kembali normal setelah hari ke-3 (21). Vitamin C dapat menangkal radikal bebas sehingga menurunkan lipid peroksida secara in vivo  (14). Hasil konsentrasi MDA pada kelompok vitamin C menurun antar jam walaupun tidak berbeda signifikan (p>0,05). Pemberian ekstrak metanolik menunjukkan penurunan konsentrasi MDA antar jam secara signifikan (p<0,05) sebesar 41,3% (24 ke 48) dan sebesar 71,6% (48 ke 72), sedangkan pemberian fraksi etil asetat tidak menunjukkan perbedaan signifikan (p>0,05) antar jam, hal ini disebabkan ekstrak metanolik memiliki hasil sinergisme dari beberapa senyawa ekstrak, sedangkan proses pemisahan fraksinasi menyebabkan penurunan aktivitas antioksidan (32).
Gambar 3. Grafik Kurva Standar Malondialdehid
Tabel 3. Konsentrasi Malondialdehid Perlakuan Hewan Uji
Kelompok Konsentrasi Malondialdehid (ng/mL) Jam ke-24 Jam ke-48 Jam ke-72 Tanpa perlakuan 108,14 ± 35,61* 95,98 ± 68,56* 28,42 ± 2,04* Kontrol pelarut 150,14 ± 66,93* # 147,68 ± 43,51* # 61,76 ± 24,66* # Ekstrak metanolik 168,70 ± 42,89* # 98,96 ± 24,19* # 28,15 ± 14,52* # Fraksi etil asetat 124,17 ± 52,82* 182,27 ± 82,95* 55,81 ± 63,26* Vitamin C 112,84 ± 65,04* 111,02 ± 85,72* 36,00 ± 35,59* CCl 4 155,19 ± 124,65* # 73,64 ± 39,36* # 13,40 ± 13,99* #
* nilai rata-rata ± simpangan baku (n=4/kelompok), # p < 0,05 dibandingkan pada kelompok sama,
^ p < 0,05 dibandingkan pada jam sama
Enzim  alanin  aminotransferase  (ALT)  dan  enzim  aspartat  aminotransferase  (AST) merupakan biomarker enzim spesifik untuk deteksi penyakit liver (3). Data ALT menunjukkan tidak berbeda signifikan (p>0,05) dengan perbandingan antar kelompok berbeda pada jam yang sama (jam ke-0, ke-24 dan ke-72). Analisis statistika kedua pada jam berbeda di dalam kelompok sama, ALT pada kelompok tanpa perlakuan, kontrol pelarut, fraksi etil asetat, vitamin C dan CCl 4 tidak berbeda signifikan (p>0,05), sedangkan terjadi fluktuatif pada ekstrak metanolik. Analisis AST berdasarkan
y = -0,3641x + 1,1317
r² = 0,9731 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0.5 1 1.5 2 2.5 3 O p tic a l D en sity (y )
Konsentrasi MDA (log x)
kelompok berbeda pada jam yang sama menunjukkan tidak berbeda signifikan pada jam ke-0 dan jam  ke-72,  namun  berbeda  signifikan  pada  jam  ke-24  antara  kelompok  tanpa  perlakuan dibandingkan  dengan  kelompok  ekstrak  metanolik,  fraksi  etil  asetat  dan  vitamin  C,  serta  antara kelompok  kontrol  pelarut  dibandingkan  dengan  kelompok  ekstrak  metanolik,  fraksi  etil  asetat, vitamin C dan CCl 4 . Kelompok CCl 4 tidak berbeda signifikan dengan tanpa perlakuan karena induksi CCl 4 belum menyebabkan gangguan liver.
Analisis  statistika  antar  jam  yang  berbeda  pada  kelompok  yang  sama  menunjukkan  data kelompok tanpa perlakuan dan kontrol pelarut tidak berbeda signifikan nilai AST antar jam. Pada kelompok CCl 4 menunjukkan peningkatan  nilai AST sebesar 38,7% (0 ke 24) dan penurunan  nilai AST sebesar 38,7% (24 ke72). Menurut Janakat & Al-Merie (21), pemberian CCl 4 secara i.p. mengalami puncak  peningkatan  dosis  hepatotoksik  pada  jam  ke-24,  dan  akan  menurun  setelah  hari  ketiga. Kelompok ekstrak metanolik, fraksi etil asetat dan vitamin C mengalami perbedaan signifikan (p< 0,05) antar jam dengan menunjukkan peningkatan AST seiring peningkatan toksik pada CCl 4 secara berurutan  sebesar  97,3%,  54,5%  dan  99,0%  pada  jam  ke-24  dan  menurun  sebesar  28%,  29,9%  dan 45,5% pada jam ke-72
Tabel 4. Aktivitas Enzim ALT dan AST pada Perlakuan Hewan Uji Kelompok Aktivitas Enzim ALT (U/I) Aktivitas Enzim AST (U/I) Jam ke-0 Jam ke-24 Jam ke-72 Jam ke-0 Jam ke-24 Jam ke-72 TP 53,80 ± 5,84 * 51,50 ± 4,03 * 53,53 ± 6,98 * 101,55 ± 17,66* 124,50 ± 20,43* 97,48 ± 29,31* Kontrol pelarut 51,20 ± 7,13 * 49,35 ± 10,97 * 52,90 ± 11,47 * 103,90 ± 10,73* 122,68 ± 26,09* 116,50 ± 40,21* EM 50,10 ± 3,96 *# 58,15 ± 5,08 *# 45,15 ± 5,39 *# 91,93 ± 39,96* # 181,40 ± 23,32* #^$ 130,68 ± 14,86* # Fraksi EA 48,85 ± 10,33 * 46,20 ± 6,18 * 48,08 ± 9,75 * 111,05 ± 12,62* # 171,63 ± 22,05* #^$ 120,38 ± 34,37 * # Vitamin C 54,98 ± 4,47 * 55,15 ± 11,86 * 52,85 ± 11,49 * 123,10 ± 56,67* # 244,93 ± 74,69* #^$ 133,48 ± 60,62* # CCl 4 46,33 ± 5,52 * 51,10 ± 11,22 * 48,20 ± 10,72 * 127,65 ± 17,65* # 173,25 ± 50,92* #$ 106,18 ± 29,92* #
* nilai rata-rata ± simpangan baku (n=4/kelompok), # p < 0,05 dibandingkan pada kelompok sama,
^ p < 0,05 dibandingkan pada jam sama

## 3.5. Pemeriksaan Sampel Organ
Liver adalah organ yang berfungi untuk metabolisme dan ekskresi. BRO merupakan parameter kerusakan liver akibat paparan CCl 4 ditandai peningkatan berat liver karena akumulasi lemak. Berat Relative Organ (BRO) liver adalah perbandingan antara berat liver dengan berat hewan uji x 100% (19). Sel memiliki kemampuan untuk adaptasi terhadap kondisi yang tidak menguntungkan, baik secara struktur atau fisiologi, namun paparan toksin dengan dosis tertentu mampu menimbulkan perubahan fisiologi yang dapat bersifat reversibel (25). Data berat relatif organ liver disajikan dalam Tabel 5.
Tabel 5. Berat Relatif Organ Liver Hewan Uji Kelompok Berat badan tikus sebelum perlakuan (g) Berat badan tikus sesudah perlakuan (g) Berat liver (g) BRO (g/100 g) Tanpa Perlakuan 139,25 ± 6,82* 138,28 ± 3,98* 5,22 ± 0,27* 3,77 ± 0,16* # Kontrol pelarut 153,98 ± 6,18* 149,58 ± 3,86* 5,99 ± 0,72* 4,00 ± 0,40* # Ekstrak metanolik 139,30 ± 7,55* 130,23 ± 7,27* 5,27 ± 0,45* 4,05 ± 0,18* # Fraksi etil asetat 143,55 ± 6,64* 141,25 ± 10,33* 5,72 ± 0,31* 4,05 ± 0,12* # Vitamin C 118,53 ± 0,89* 113,95 ± 4,50* 4,80 ± 0,53* 4,20 ± 0,30* CCl 4 114,88 ± 2,80* 112,08 ± 7,02* 5,06 ± 0,47* 4,51 ± 0,27*
*nilai rata-rata ± simpangan baku (n=4/kelompok), # nilai signifikan p < 0,05 dibandingkan CCl 4
Berdasarkan pada Tabel 5, hasil BRO liver tertinggi pada kelompok CCl 4 (4,51 ± 0,27 g/100 g) dan BRO liver terendah pada tanpa perlakuan (3,77 ± 0,16 g/100g). Analisis statistika menunjukkan data BRO homogen dan terdistribusi normal. Berdasarkan uji One Way ANOVA menunjukkan BRO antar kelompok berbeda signifikan (p<0,05). Berdasarkan uji LSD, terdapat perbedaan kondisi BRO antara kelompok CCl 4 dengan kelompok tanpa perlakuan, kontrol pelarut, ekstrak metanolik, dan fraksi etil asetat, namun antara kelompok vitamin C dengan CCl 4 tidak berbeda signifikan (p>0,05). Kelompok  vitamin  C  mengalami  peningkatan  BRO  liver  dibandingkan  tanpa  perlakuan. Peningkatan BRO liver secara signifikan (p<0,05) menunjukkan terjadi degenerasi pada liver akibat senyawa toksin CCl 4 terjadi pada kelompok CCl 4 dan vitamin C.

## 4. KESIMPULAN
Ekstrak metanolik memiliki kepolaran mirip (Rf=0,26) dengan kuersetin dan fraksi etil asetat daging  buah  kepel  menunjukkan  adanya  golongan  flavonoid  lain.  Ekstrak  metanolik  dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida dan profil kerusakan liver (AST dan ALT) dibandingkan fraksi etil asetat seiring dengan nilai BRO ekstrak metanolik dan fraksi etil asetat yang lebih rendah dibandingkan BRO CCl 4 .
Ucapan  terima  kasih:  Penulis  mengucapkan  terima  kasih  yang  sebesar-besarnya  kepada Kementerian  Riset  dan  Teknologi  serta  Kementerian  Pendidikan  dan  kebudayaan  yang  telah membiayai penelitian ini.

## Referensi
1. Anonim. Farmakope Herbal Indonesia Edisi I; Departemen Kesehatan Republik Indonesia; Jakarta, 2008.
2. Anonim.  ALAT  (GPT)  FS*  (IFCC  mod.)  with/without  Pyridoxal-5-Phosphate:  Diagnostic  Reagent  for Quantitative In Vitro Determination of ASAT(GOT) in Serum or Plasma on Photometric Systems, DiaSys Diagnostic Systems GmbH, 2009.
3. Anonim.  ASAT  (GOT)  FS*  (IFCC  mod.)  with/without  Pyridoxal-5-Phosphate:  Diagnostic  Reagent  for Quantitative In Vitro Determination of ASAT(GOT) in Serum or Plasma on Photometric Systems, DiaSys Diagnostic Systems GmbH, 2013.
4. Anonim. Pedoman Uji Toksisitas Nonklinik Secara In Vivo; Badan POM; Jakarta, 2014, 20-21.
5. Batubara,  I.;  Darusman,  L.K.;  Djauhari,  E.;  Mitsunaga,  T.  Potency  of  Kepel  (Stelechocarpus  burahol)  as Cyclooxygenase-2 Inhibitor. The Journal of Indonesian Medicinal Plant, 2010, 3(2): 110-114.
6. Cannel, R.J.P. Natural Products Isolation 2nd Edition. Humana Press Inc: Totowa, New Jersey, 2006, 347- 350, 357.
7. Cutler, R.G.; Rodriguez, H. Critical Review of Oxidative Stress and Aging: Advances    in Basic Science, Diagnostic and Intervention. World Scientific; Singapore, 2003, Volume 2, 870-880.
8. Darusman,  H.S.;  Rahminiwati,  M.;  Sadiah,  S.;  Batubara,  I.;  Darusman,  L.K.;  Mitsunaga,  T.  Indonesian Kepel Fruits (Stelechocarpus burahol) as Deodorant. Research Journal of Medical Plant, 2012, 6, 2, 180-188.
9. Edwards, M. J.; Keller, B.J.; Kauffman, F.C.;    Thurman, R.G., The Involvement of Kupffer Cells in Carbon Tetrachloride Toxicity. Toxicology and Applied Pharmacology, 1993, 119, 275-279.
10. Fine Test. MDA (Malondialdehyde) ELISA Kit, https://www.fn-test.com/elisa/universal/mda- malondialdehyde-elisa-kit-elisa-kit/, 2017, 22 November 2017 pukul 23:08 WIB.
11. Ghozali,  Imam,  2011,  Aplikasi  Analisis  Multivariate  dengan  Program  IBM  SPSS  19;  Badan  Penerbit Universitas Diponegoro; Semarang.
12. Halim, S.Z.; Abdullah, N.R.; Afzan, A.; Rashid, B.A.A.; Jantan, I.; Ismail, Z. Acute Toxicity Study of Carica Papaya Leaf Extract in Sprague Dawley Rats. Journal of Medicinal Plants Research, 2011, 5, 1867-1872.
13. Halliwell, B.; Zhao K.; Whiteman M. The Gastrointestinal Tract: A Major Site of Antioxidant Action? Free Radical Research, 2000, 33, 819-830.
14. Halliwell, B. Vitamin C and Genomic Stability, Mutation Research, 2001, 475, 29–35.
15. Hamidu,  L.;  Ahmad,  A.R.;  Najib,  A.  Qualitative  and  Quantitative  Test  of  Total  Flavonoid  Buni  Fruit (Antidesma bunius (L.) Spreng) with UV-Vis Spectrophotometry Method. Pharmacognosy Journal, 2018, 10, 1, 60-63.
16. Haryjanto,  L.  Konservasi  Kepel  (Stelechocarpus  burahol  (Blume)  Hook.f  Thomson):  Jenis  yang  telah Langka, Mitra Hutan Tanaman, 2012, 7, 1, 11-17.
17. Hatmi,  R.U.;  Widyayanti  S.;  Sudarmaji.  Potensi  Kepel  (Stelechocarpus  burahol  (Blume)  Hook.F  &  Th.) sebagai Sumber Pangan Fungsional. Prosiding Seminar Nasional Sumber Daya Genetik Pertanian, 2015, 248- 257.
18. Heriyanto, N.M.; Garsetiasih, R. Kajian Ekologi Pohon Burahol (Stelechocarpus burahol) di Taman Nasional Meru Betiri, Jawa Timur. Buletin Plasma Nutfah, 2005, 11, 2, 65-73.
19. Huo, H.Z.; Wang, B.; Liang, Y.K.; Bao, Y.Y.; Gu, Y. Hepatoprotective and Antioxidant Effects of Licorice Extract against CCl 4 -Induced Oxidative Damage in Rats. International Journal Molecular Sciences, 2011, 12, 6529-6543.
20. Ighodaro, O.M.; Akinloye, O.A. First Line Defence Antioxidants-Superoxide Dismutase (SOD), Catalase (CAT) and Glutathione Peroxidase (GPx): Their Fundamental Role in The Entire Antioxidant Defence Grid. Alexandria Journal of Medicine, 2017.
21. Janakat, S.; Al-Merie, H. Optimization of The Dose and Route of Injection and Characterisation of The Time Course of Carbon Tetrachloride-Induced Hepatotoxicity in The Rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 2002, 48, 41– 44.
22. Markam, K.R.; Andersen, O.M. Flavonoids : Chemistry, Biochemistry and Applications, CRC Press; Taylor & Francis Group; LLC, 2006, 2, 11-12,.
23. Nasir, H. N. Uji Aktivitas Antioksidan In Vitro Daging Buah Kepel (Stelecocarpus burahol (Blume) Hook. F.  &  Thomson)  dan  Penentuan  Struktur  Kimia  Senyawa  Aktifnya.  Tesis.  Pasca  Sarjana;  Prodi  Ilmu Farmasi; Universitas Gadjah Mada; Yogyakarta, 2007.
24. Natarajan, S.; Remick, D.G. The ELISA Standard Save: Calculation of Sample Concentrations in Assays with A Failed Standard Curve. Journal of Immunological Methods, 2008, 336, 242–245.
25. Nurmawanti; Soekanto, A. Pengaruh Paparan Uap Anti Nyamuk Elektrik Kandungan Allethrin terhadap Berat dan Warna Liver Tikus. Jurnal Ilmiah Kedokteran Wijaya Kusuma, 2015, 6, 2, 6–13.
26. Rao,  K.S.;  Recknagel,  R.O.  Early  Onset  of  Lipoperoxidation  in  Rat  Liver  After  Carbon  Tetrachloride Administration. Experimental and Molecular Pathology, 1968, 9, 271-278.
27. Razali,  N.M.;  Wah,  Y.B.  Power  comparisons  of  Shapiro-Wilk,  Kolmogorov-Smirnov,  Lilliefors  and Anderson-Darling Tests. Journal of Statistical Modeling and Analytics, 2011, 2, 1, 21-33.
28. Sakamoto S.; Putalun W.; Vimolmangkang S.; Phoolcharoen W.; Shoyama Y.; Tanaka, H.; Morimoto, S. Enzyme‑linked  Immunosorbent  Assay  for  The  Quantitative/  Qualitative  Analysis  of  Plant  Secondary Metabolites, Journal of Natural Medicines, 2018, 72, 32-42.
29. Sumartini.  Studi  Aktivitas  Antioksidan  Senyawa  Fenolik  dalam  Daging  Buah  Kepel  (Stelechocarpus burahol). Tesis; Airlangga University Library; Surabaya, 2011.
30. Sunardi,  C.;  Sumiwi,  S.A.;  Hertati,  A.  Penelitian  Antiimplantasi  Ekstrak  Etanol  Daging  Buah  Burahol (Stelechocarpus Burahol Hook F. & Thomson) pada Tikus Putih. Majalah Ilmu Farmasi, 2010, 7, 1, 1-8.
31. Sunarni, T.; Pramono, S.; Asmah, R. Antioxidant–Free Radical Scavenging of Flavonoid from The Leaves of Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook f. & Th., Majalah Farmasi Indonesia, 2007, 18, 3, 111-116.
32. Tisnadjaja,  D.;  Saliman,  E.;  Silvia;  Simanjuntak,  P.  Pengkajian  Burahol  (Stelechocarpus  burahol  (Blume) Hook & Thomson) sebagai Buah yang Memiliki Kandungan Senyawa Antioksidan. Biodiversitas, 2006, 7, 2, 199-202.
33. Valko, M.; Leibfritz, D.; Moncol, J.; Cronin, M.T.D.; Mazur, M.; Telser, J. Free Radicals and Antioxidants in Normal Physiological Functions and Human Disease.  The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2007, 39, 44-48.
34. Vroon, D.H.; Israili, Z. Aminotransferases, In: Walker HK, Hall WD, Hurst JW, editors, Clinical Method: The History, Physical, and Laboratory Examinations, 3rd edition, Boston: Butterworths,  1990, Chapter 99.
35. Yang, R-Z.; Park, S.; Reagan, W.J.; Goldstein, R.; Zhong, S.; Lawton, M.; Rajamohan, F.; Qian, K.; Liu, L.; Gong,  D-W.  Alanine  Aminotransferase  Isoenzymes:  Molecular  Cloning  and  Quantitative  Analysis  of Tissue Expression in Rats, and Serum Elevation in Liver Toxicity. Hepatology, 2009, 49, 2, 598–607.
© 2019 by the authors. Submitted for possible open access publication under the terms  and  conditions  of  the  Creative  Commons  Attribution  (CC  BY)  license ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ).