Menara Perkebunan 2011 79(2), 49-56

## Peningkatan laju multiplikasi tunas dan keragaan planlet Stevia rebaudiana pada kultur in vitro
Increasing shoot multiplication rate and plantlet vigor of Stevia rebaudiana in vitro culture
SUMARYONO & Masna Maya SINTA
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Jl. Taman Kencana No. 1, Bogor 16151, Indonesia
Diterima tanggal 4 Oktober/Disetujui tanggal 25 Nopember 2011

## Abstract
Stevia (Stevia  rebaudiana Bertoni)  is  a  natural  zero- calorie  sweetener  plant  grown in  a high population density. Tissue culture technique is useful for rapid mass propagation of plants to provide superior planting materials. Experiments were  conducted  to  increase  growth  and  multiplication  of shoots  and  vigor  of  plantlets  of  stevia.  Explants  used  were apical and axillary buds from plantlets grown on MS medium without  plant  growth  regulators.  Combinations  of  BA  and IAA  at  different  concentrations  were  used  for  shoot  growth and  multiplication,  whereas  plant  growth  retardants (ancymidol  and  paclobutrazol) and  light  intensity were used for  plantlet  vigor.  The  results  showed  that  stevia  explants cultured  on  MS  medium  without  plant  growth  regulators produced  the  highest  shoots  (4.5  cm)  with  two  shoots  per explant. The best multiplication rate of shoots were found on MS  medium  added  with  1.13  mg/L  BA  combined  with 0.35  mg/L  IAA  which  produced  on  average  4.5  shoots  and 11.9 nodes per initial  explant.  Ancymidol  and paclobutrazol concentrations  affected  significantly  growth  and  vigor  of stevia  plantlets.    Increasing  the  concentration  of  ancymidol and  paclobutrazol  decreased  plantlet  height  and  biomass fresh  weight,  but  increased  stem  diameter.  Paclobutrazol  at 0.1  mg/L  was  the  best  treatment  to  increase  the  vigor  of stevia  plantlets.  Light  intensity  at  20 µ mol/m 2 /s  gave  better plantlet vigor than other light intensities.  It can be concluded that  multiplication  of  stevia  shoots  should  be  grown  on  MS medium  supplemented  with  1.13  mg/L  BA  +  0.35  mg/L  IAA and the vigor of the shoots can be increased by culturing on MS  medium  containing  0.1  mg/L  paclobutrazol  under fluorescence lamps with 20 µ mol/m 2 /s light intensity.
[ Key  words:  Stevia,  natural  sweetener,  in  vitro  culture, micropropagation, BA, IAA, plantlet vigor]

## Abstrak
Stevia  ( Stevia  rebaudiana Bertoni)  adalah  tanaman pemanis  alami  nir-kalori  yang  ditanam  dengan  kerapatan populasi  yang  sangat  tinggi.  Teknik  kultur  jaringan  dapat digunakan  untuk  perbanyakan  tanaman  secara  massal  dan cepat  untuk  menyediakan  bahan  tanam  unggul.  Penelitian telah  dilakukan  untuk  meningkatkan  pertumbuhan  dan multiplikasi tunas dan keragaan planlet stevia. Eksplan yang digunakan adalah tunas pucuk dan tunas samping dari planlet yang  ditumbuhkan  pada  medium  MS  tanpa  zat  pengatur tumbuh.  Kombinasi  BA  dan  IAA  dengan  konsentrasi  yang berbeda  digunakan  untuk  pertumbuhan  dan  multiplikasi tunas,  sedangkan  zat  penghambat  tumbuh  (ansimidol  dan
paklobutrazol)  serta  intensitas  cahaya  digunakan  untuk keragaan  planlet.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa eksplan stevia yang ditumbuhkan pada medium MS tanpa zat pengatur  tumbuh  menghasilkan  tunas  paling  tinggi  (4,5  cm) dengan  dua  tunas  per  eksplan.  Multiplikasi  tunas  terbaik diperoleh  pada  medium  dengan  BA  1,13  mg/L  yang dikombinasikan  dengan  IAA  0,35  mg/L  yang  menghasilkan 4,5  tunas  dan  11,9  ruas  per  eksplan  awal.  Konsentrasi ansimidol  dan  paklobutrazol  berpengaruh  nyata  terhadap pertumbuhan  dan  keragaan  planlet  stevia.  Meningkatnya konsentrasi  ansimidol  dan  paklobutrazol  menurunkan  tinggi planlet  dan  bobot  basah  biomassa,  tetapi  meningkatkan diameter  batang.  Paklobutrazol  pada  konsentrasi  0,1  mg/L merupakan  perlakuan  terbaik  untuk  meningkatkan  keragaan planlet  stevia.  Intensitas  cahaya  pada  20 µ mol/m 2 /detik memberikan  keragaan  planlet  yang  lebih  baik  dibandingkan intensitas  cahaya  yang  lain.  Dapat  disimpulkan  bahwa multiplikasi  tunas  stevia  sebaiknya  dilakukan  pada  medium MS ditambah BA 1,13 mg/L + IAA 0,35 mg/L dan keragaan planlet  dapat  ditingkatkan  dengan  menanam  planlet  pada medium  MS  ditambah  paklobutrazol  0,1  mg/L  di  bawah lampu fluoresen dengan intensitas cahaya 20 µ mol/m 2 /detik.
[Kata  kunci:  Stevia,  pemanis  alami,  kultur in  vitro , mikropropagasi, BA, IAA, keragaan planlet]

## Pendahuluan
Stevia  ( Stevia  rebaudiana Bertoni)  merupakan tanaman  perdu  famili  Compositae  yang  berasal  dari Paraguay.  Daun  stevia  menghasilkan  rasa  manis  yang disebabkan  oleh  adanya  glikosida  dengan  tingkat kemanisan  200 – 300  kali  lebih  tinggi  dibandingkan gula  tebu  atau  sukrosa  (Geuns,  2003;  Megeji et  al ., 2005; Mogra & Dashora, 2009). Glikosida dalam daun stevia  terdiri  dari  steviosida,  beberapa  rebaudiosida termasuk  rebaudiosida  A  (reb-A),  dulkosida,  dan beberapa  senyawa  lainnya  (Kennelly,  2002;  Geuns, 2003).  Glikosida  tidak  mengandung  kalori  dan mempunyai  indeks  glikemat  hampir  nol  sehingga sesuai  untuk  penderita  diabetes  dan  seseorang  yang sedang  melakukan  diet  makanan  untuk  menurunkan berat  badan  (Jeppesen et  al .,  2002;  Gregersen et  al ., 2004). Stevia digunakan pada minuman ringan rendah- kalori,  bahan  makanan,  pasta  gigi,  bahan  kosmetika, antioksidan,  antihipertensi,  zat  pengatur  tumbuh,  dan berbagai produk lain (Midmore & Rank, 2002).
Peningkatan laju multiplikasi tunas dan keragaan planlet Stevia rebaudiana pada kultur in vitro … Sumaryono &Sinta
Populasi  tanaman  dalam  budidaya  stevia  sangat tinggi  60  ribu  sampai  100  ribu  tanaman  per  ha  dan diremajakan setiap dua atau tiga tahun. Oleh karena itu, diperlukan  bahan  tanam  dalam  jumlah  banyak  dan berkesinambungan.  Perbanyakan  stevia  dengan  biji kurang efektif karena  rendahnya  persentase  perkecam- bahan  biji  (Goettemoeller  &  Ching,  1999)  dan terjadinya  inkompatibilitas-sendiri  yang  menyebabkan turunannya sangat beragam. Perbanyakan stevia paling umum  adalah  dengan  stek  batang  yang  menghasilkan benih  yang  seragam  tetapi  jumlahnya  terbatas.  Teknik kultur  jaringan  diperlukan  untuk  menghasilkan  bibit unggul stevia klonal secara massal dan cepat, terutama pada tahap awal pembibitan.
Kultur  jaringan  stevia  dilakukan  melalui  multi- plikasi  tunas,  organogenesis  dan  embriogenesis somatik.  Prosedur  multiplikasi  tunas  lebih  sederhana dan  kemungkinan  terjadinya  keragaman  somaklonal lebih  rendah  dibandingkan  dengan  organogenesis  dan embriogenesis somatik karena digunakan eksplan yang telah  terdiferensiasi.  Media  MS  (Murashige  &  Skoog, 1962) pada umumnya digunakan sebagai medium baku untuk kultur in vitro stevia. Sebagai bahan eksplan bagi multiplikasi  tunas  adalah  tunas  pucuk  dan  tunas samping.
Untuk  meningkatkan  laju  multiplikasi  tunas stevia,  pada  umumnya  digunakan  sitokinin  atau kombinasi sitokinin dan auksin. Sivaram & Mukundan (2003)  menggunakan  ujung  tunas  sebagai  sumber eksplan dan  mendapatkan 11,2 tunas per eksplan pada perlakuan    BA  2  mg/L  +  IAA  1  mg/L,  sedangkan Anbazhagan et  al .  (2010)  mendapatkan  rata-rata  16 tunas  tiap  eksplan  pada  medium  MS  dengan  BA 1  mg/L  +  IAA  0,5  mg/L.    Rafiq et  al. (2007) melaporkan  bahwa  BA  2  mg/L  dapat  menginduksi tunas  78%  dari  eksplan  dengan  rata-rata  8  tunas  per eksplan.  Mencelupkan  sebentar  tunas  stevia  dalam larutan  BA  250  atau  500  mg/L  sebelum  dikultur  pada medium MS meningkatkan multiplikasi tunas 2 – 5 kali (Manjusha  &  Sathyanarayana,  2010).  Peningkatan konsentrasi  BA  dan  kinetin  dilaporkan  meningkatkan laju  multiplikasi  tunas  stevia,  namun  planlet  yang diperoleh  kecil-kecil  dan  tidak  vigor  (Ibrahim et  al ., 2008).
Peningkatan  keragaan  planlet  dapat  dilakukan dengan  merubah  komposisi  medium  dan  faktor lingkungan in vitro . Penambahan senyawa penghambat aktivitas  giberelin  seperti  ansimidol  dan  paklobutrazol pada  medium  dapat  menghambat  perpanjangan  batang dan menghasilkan planlet yang dapat beradaptasi lebih baik  di  lingkungan  luar  (Ziv,  1995).  Sebagai  contoh penggunaan  ansimidol  3  mg/L  meningkatkan  daya hidup planlet stevia saat aklimatisasi (Manjusha & Sathyanarayana, 2010). Salah satu faktor lingkungan in vitro yang  berperan  dalam  pertumbuhan  dan  keragaan planlet adalah intensitas cahaya (Chen, 2004; Huang &
Chen,  2005).  Keragaan  planlet  yang  baik  berkorelasi positif  dengan  daya  hidup  dan  pertumbuhannya  pada tahap  aklimatisasi  di  lingkungan ex  vitro (Hazarika, 2003).
Tujuan penelitian ini adalah menetapkan pengaruh BA  dan  IAA  terhadap  pertumbuhan  dan  multiplikasi tunas  stevia  serta  pengaruh  paklobutrazol,  ansimidol dan intensitas cahaya terhadap keragaan planlet stevia.

## Bahan dan Metode

## Sumber dan sterilisasi eksplan
Eksplan awal yang digunakan adalah tunas pucuk dan  tunas  samping  dari  batang  perdu  tanaman  stevia varietas  lokal  yang  ditanam  di  Kebun  Percobaan Ciomas,  Bogor.  Batang  eksplan  dibersihkan  dalam  air mengalir,  kemudian  dicuci  menggunakan  disinfektan Desogerme  0,5%  dan  dibilas  dengan  akuades  steril. Batang  kemudian  direndam  dalam  larutan  antioksidan (asam  sitrat  150  mg/L  dan  asam  askorbat  100  mg/L) selama  dua  jam  (Ibrahim et  al .,  2008).  Selanjutnya batang  disterilisasi  dengan  fungisida  Benlate  0,2% selama  15  menit  dan  Na  hipoklorit  Clorox  12,5% selama  15  menit.  Setiap  tahap  sterilisasi  dilakukan pembilasan dengan akuades steril beberapa kali.
Batang dengan satu ruas dipotong dengan ukuran 1-2  cm  kemudian  ditumbuhkan  dalam  medium  MS dengan 30 g/L sukrosa, 3 g/L gelrite, tanpa zat pengatur tumbuh.  Tingkat  pH  medium  diatur  5,7  sebelum disterilisasi  dalam  autoklaf  pada  suhu  121°C  dengan tekanan  1  kg/cm 2 selama  20  menit.  Kultur  diletakkan pada ruang kultur terang. Planlet yang tumbuh in vitro disubkultur  tiga  kali  sebelum  digunakan  sebagai sumber eksplan untuk penelitian selanjutnya.

## Multiplikasi tunas
Tunas samping satu ruas panjang 1 – 1,5 cm dari planlet in vitro digunakan untuk penelitian multiplikasi tunas.  Potongan  tunas  ditumbuhkan  pada  medium  MS dengan 30 g/L sukrosa dan 3 g/L gelrite. Sebanyak lima tunas ditanam dalam satu botol kultur (diameter 6 cm, tinggi  9  cm)  berisi  40  mL  medium.  Zat  pengatur tumbuh yang digunakan adalah kombinasi BA (0; 0,45; 1,13; 2,25 mg/L) dan IAA (0; 0,18; 0,35 mg/L). Setiap perlakuan terdiri dari empat botol kultur berisi masing- masing  lima  eksplan.  Pengamatan  dilakukan  empat minggu  setelah  kultur  meliputi  tinggi  tunas,  serta jumlah tunas dan total ruas per eksplan.
Keragaan planlet stevia in vitro
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  untuk mendapatkan planlet yang vigor ini berupa tunas pucuk satu  ruas  dari  planlet in  vitro .  Eksplan  ditanam  dalam tabung kultur (diameter 2,5 cm, tinggi 15 cm) berisi
Menara Perkebunan 2011 79(2), 49-56
medium  MS  dengan  penambahan  paklobutrazol  atau ansimidol  0;  0,1;  1  dan  10  mg/L.  Masing-masing perlakuan  terdiri  dari  20  ulangan  (tabung  kultur). Pengamatan  dilakukan    empat  minggu  setelah  kultur meliputi  bobot  segar  biomassa  planlet,  tinggi  planlet, jumlah  ruas,  jumlah  daun,  diameter  batang,  dan  daya hidup planlet.
Penelitian  untuk  meningkatkan  keragaan  planlet stevia  dilakukan  juga  dengan  perlakuan  intensitas cahaya  yang  berbeda.  Eksplan  yang  digunakan  adalah tunas pucuk  satu ruas  setinggi 1 – 1,5 cm  dari planlet yang telah ditumbuhkan pada  medium  MS.   Sebanyak lima  tunas  ditanam  dalam  satu  botol  kultur  (diameter 6  cm,  tinggi  9  cm)  berisi  40  mL  medium  MS  dengan 30  g/L  sukrosa,  3  g/L  gelrite  dan  paklobutrazol 0,1  mg/L.  Jenis  penutup  botol  yang  digunakan  adalah tutup  ulir  berbahan  prolipropilen  dan  dibalut  plastik wrap .  Sebanyak  enam  botol  kultur  digunakan  setiap perlakuan.  Botol  kultur  diletakkan  di  bawah  lampu fluoresen putih dengan intensitas cahaya 10; 20; 30 dan 40 µ mol foton/m 2 /detik, dengan fotoperiode 12 jam per hari.  Pengukuran  intensitas  cahaya  dilakukan  meng- gunakan lightmeter (Licor-250)  dengan  sensor kuantummeter.  Parameter  yang  diamati  pada  empat minggu  setelah  kultur  adalah  bobot  segar  biomassa planlet,  tinggi  planlet,  jumlah  daun,  ukuran  daun (panjang  x  lebar),  kelas  warna  daun  (diukur  dengan bagan  warna  daun  dari International  Rice  Research Institute )  dan  diameter  batang.  Intensitas  cahaya  serta suhu di luar dan di dalam botol kultur akibat perlakuan intensitas  cahaya  juga  diamati.  Suhu  di  dalam  botol diukur  dengan  menempatkan  ujung  sensor  dari termometer  digital  Fluke  51  K/J  dalam  botol  kultur yang berisi planlet.

## Kondisi kultur
Kultur  diinkubasikan  dalam  ruang  kultur  terang pada suhu 26 ± 1°C dan diletakkan di bawah lampu TL fluoresen putih 40 W dengan intensitas cahaya 20 µ mol foton/m 2 /detik dan fotoperiode 12 jam per hari, kecuali pada  penelitian  intensitas  cahaya  disesuaikan  dengan perlakuan.

## Rancangan percobaan
Penelitian  diatur  menggunakan  rancangan  acak lengkap.  Data  yang  diperoleh  diolah  dengan  analisis keragaman ( analysis of variance = Anova)  mengguna- kan  program  SPSS  versi  17.  Apabila  terdapat perbedaan  faktor  perlakuan  yang  nyata,  maka perbedaan  antar-perlakuan  diuji  dengan  uji  jarak berganda Duncan dengan tingkat kepercayaan α ≤ 0,05.

## Hasil dan Pembahasan
Pengaruh  BA  dan  IAA  terhadap  multiplikasi  tunas stevia
Perlakuan BA dan IAA berpengaruh sangat nyata secara  statistik  terhadap  pertumbuhan  dan  multiplikasi tunas  stevia,  empat  minggu  setelah  kultur  (Tabel  1; Gambar 1).  Penambahan BA  menurunkan tinggi rata- rata  tunas;  pada  perlakuan  tanpa  BA  dengan  IAA 0;  0,18  dan  0,35  mg/L  tinggi rata-rata  tunas  mencapai 38  mm,  sedangkan  pada  perlakuan  BA  tinggi  tunas hanya  antara  3 – 6  mm,  bahkan  pada  BA  2,25  mg/L pertumbuhan  planlet  sangat  terhambat  (Gambar  1D). Tanpa  BA  setiap  eksplan  menghasilkan  rata-rata  dua tunas,  sedangkan  dengan  penambahan  BA  0,45  dan 1,13 mg/L pembentukan tunas meningkat menjadi 3,5 – 3,6 tunas per eksplan. Jumlah tunas tertinggi diperoleh pada perlakuan BA 1,13 mg/L + IAA 0,35 mg/L yakni sebesar 4,5 tunas per eksplan.  Pada perlakuan kontrol, walaupun hanya diperoleh dua tunas per eksplan tetapi setiap  tunas  mempunyai  banyak  ruas  karena  tunasnya tinggi  (47,6  mm)  sehingga  jumlah  ruas  yang  mampu disubkultur  adalah  6,8  ruas  per  eksplan.  Jumlah  ruas yang  dapat  disubkultur  ini  mencerminkan  laju multiplikasi  planlet.  Walaupun  tinggi  tunas  rata-rata pada perlakuan BA 1,13 mg/L + IAA 0,35 mg/L hanya 20,3  mm  tetapi  karena  jumlah  tunas  per  eksplan sebanyak  4,5  maka  total  ruas  yang  dapat  disubkultur mencapai  11,9  ruas  per  eksplan.  Jadi,  pada  perlakuan BA  1,13  mg/L  +  IAA  0,35  mg/L  dari  satu  ruas  awal setelah 4 minggu diperoleh sebanyak rata-rata 11,9 ruas yang dapat disubkultur (Tabel 1; Gambar 2A).
Hasil  penelitian  ini  memperlihatkan  bahwa penambahan  BA  meningkatkan  laju  multiplikasi  tunas stevia, namun diperlukan juga penambahan IAA untuk memperoleh tingkat multiplikasi tertinggi. Nampaknya perlu  adanya  perimbangan  antara  sitokinin  (BA)  dan auksin  (IAA)  untuk  meningkatkan  laju  multiplikasi tunas stevia, seperti yang dilaporkan juga oleh Sivaram &  Mukundan  (2003)  yang  mendapatkan  rata-rata  11,2 tunas tiap eksplan dengan BA 2 mg/L dan IAA 1 mg/L serta oleh Anbazhagan et al . (2010) yang mendapatkan rata-rata  16  tunas  tiap  eksplan  pada  medium  MS dengan  BA  1  mg/L  dan  IAA  0,5  mg/L.    Kedua  hasil penelitian tersebut menunjukkan laju multiplikasi tunas setara  atau  lebih  tinggi  dari  hasil  yang  diperoleh  pada penelitian  ini,  namun  planlet  yang  dihasilkan  kecil, pendek dan tidak vigor sehingga tidak mampu tumbuh dengan baik ketika disubkultur.
BA  banyak  digunakan  untuk  meningkatkan jumlah tunas stevia (Rafiq et al. , 2007; Ibrahim et al ., 2008; Sairkar et al ., 2009). BA lebih baik dibandingkan jenis sitokinin lain yaitu kinetin dalam pembentukan
Peningkatan laju multiplikasi tunas dan keragaan planlet Stevia rebaudiana pada kultur in vitro … Sumaryono &Sinta tunas  stevia  (Anbazhagan et  al .,  2010).  Namun, pembentukan  tunas  yang  banyak  tidak  diimbangi dengan  keragaan  tunas  yang  baik  yakni  tunas  menjadi kecil,  pendek  dan  tidak  vigor  sehingga  tidak  mampu hidup ketika ditransfer ke medium baru (Ibrahim et al ., 2008;  Sairkar et  al .,  2009).  Pada  penelitian  ini
pembentukan  tunas  yang  banyak  pada  perlakuan  BA 1,13  mg/L  +  IAA  0,35  mg/L  terlihat  daunnya  relatif kecil  (Gambar  1A  dan  1B)  tetapi  menjadi  berukuran lebih  besar  dan  normal  setelah  disubkultur  pada medium MS dengan paklobutrazol 0,1 mg/L  (Gambar 2B).
Tabel  1. Pengaruh BA dan IAA terhadap pertumbuhan dan multiplikasi tunas stevia, setelah kultur selama empat minggu. Table 1.  Effect of BA and IAA on the growth and multiplication of stevia shoots, after four weeks of culture.
Perlakuan Treatment Tinggi tunas Shoot height (mm) Jumlah tunas Shoot number Jumlah ruas yang dapat dikultur Culturable node number BA (mg/L) IAA (mg/L) 0 0 47,6  a *) 2,0  c 6,8  b 0,18 33,6  b 2,0  c 6,7  b 0,35 34,4  b 2,0  c 6,4  b 0,45 0 6,8  d 3,6  ab 3,6  c 0,18 6,5  d 2,4  bc 3,1  c 0,35 4,7  d 2,0  c 2,6  c 1,13 0 4,4  d 3,4  ab 3,5  c 0,18 3,0  d 1,9  c 1,9  c 0,35 20,3  c 4,5  a 11,9  a 2,25 0 3,8  d 2,5  bc 2,6  c 0,18 2,9  d 2,3  bc 2,3  c 0,35 2,8  d 2,1  c 2,1  c
*) Angka dalam kolom yang sama diikuti oleh huruf  yang sama berarti tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan pada α ≤ 0,05.
*) Means in the same column followed by the same letters are not significantly different according  to Duncan’s mul tiple range test at α ≤ 0.05.
Gambar 1. Pengaruh BA dan IAA terhadap pertumbuhan dan multiplikasi tunas stevia pada empat minggu setelah kultur. BA 0 mg/L, (B) BA 0,45 mg/L, (C) BA 1,13 mg/L, (D) BA 2,25 mg/L. Pada setiap gambar, dari kiri ke kanan berturut-turut adalah IAA 0; 0,18 dan 0,35 mg/L. Bar = 2 cm.
Figure 1.   Effect of BA and IAA on the growth and multiplication of stevia shoots after four weeks of culture. 0 mg/L BA,  (B) 0.45  mg/L BA,  (C) 1.13 mg/L BA,  (D) 2.25 mg/L BA. On each figure, from left to right are 0; 0.18 and 0.35 mg/L IAA, respectively. Bar = 2 cm.
A C D A B A
Gambar 2. Pertumbuhan dan multiplikasi tunas stevia terbaik pada medium MS dengan BA 1,13 mg/L dan IAA 0,35 mg/L pada empat minggu setelah kultur  (A) dan  setelah  disubkultur pada  MS  dengan  paklobutrazol 0,1 mg/L (B). Bar = 1 cm.
Figure 2. The best growth and multiplication of stevia shoots on MS medium with 1.13 mg/L BA and 0.35 mg/L IAA after 4 weeks of culture (A) and after had been subcultured on MS medium with 0.1mg/L paclobutrazol (B). Bar = 1 cm.
Pengaruh  paklobutrazol  dan  ansimidol  terhadap keragaan planlet stevia
Semakin  tinggi  konsentrasi  zat  penghambat tumbuh  paklobutrazol  dan  ansimidol  menurunkan secara  nyata  tinggi  planlet,  jumlah  ruas,  jumlah  daun planlet  stevia  dan  persentase  planlet  hidup,  empat minggu  setelah  kultur  (Tabel  2).  Paklobutrazol  dan ansimidol  10  mg/L  meningkatkan  diameter  batang, namun planlet stevia sangat pendek dengan jumlah ruas dan  daun  sangat  sedikit.  Paklobutrazol  10  mg/L  serta ansimidol  1  dan  10  mg/L  menurunkan  secara  nyata daya  hidup  planlet  stevia in  vitro .  Dari  semua perlakuan  yang  diuji,  paklobutrazol  0,1  mg/L memberikan  pengaruh  yang  paling  baik  dalam pertumbuhan  bagian  atas  dan  keragaan  planlet  stevia, walaupun  secara  statistik  tidak  berbeda  nyata  dengan perlakuan  tanpa  zat  penghambat  tumbuh  (Tabel  2). Pertumbuhan  terbaik  planlet  stevia  diperoleh  pada medium  MS  ditambah  paklobutrazol  0,1  mg/L  yakni planlet  paling  tinggi,  jumlah  ruas  dan  daun  terbanyak, diameter  batang  relatif  besar  dan  persentase  planlet hidup 100% (Tabel 2).
Keragaan  planlet  stevia  yang  baik  ditunjukkan dengan  batang  yang  besar  dan  tinggi,  daun  banyak, besar,  tebal  dan  berwarna  hijau  tua,  serta  secara morfologi  normal.  Setelah  tahap  awal  untuk multiplikasi  ruas,  planlet  yang  diperoleh  selanjutnya disubkultur  pada  medium  untuk  meningkatkan keragaan  (vigor)  planlet.  Penambahan  paklobutrazol 0,1  mg/L  terbukti  mampu  meningkatkan  vigor  planlet stevia.  Penambahan  paklobutrazol  juga  dilaporkan berpengaruh  positif  terhadap  pertumbuhan  dan keragaan  planlet  seperti  meningkatkan  pertumbuhan
planlet  daylily  (Chen et  al. ,  2005)  serta  meningkatkan ukuran  daun  dan  memperbaiki  ketegaran  planlet belimbing (Supriati et al ., 2006).
Paklobutrazol  dan  ansimidol  termasuk  zat  peng- hambat  tumbuh  yang  bertindak  sebagai  penghambat enzim  monooksigenase  yang  mengkatalisis  tahap oksidasi dari ent -kaurene ke ent -asam kaurenoat dalam biosintesis  giberelin  (Rademacher,  2000).  Zat  peng- hambat  tumbuh  telah  digunakan  secara  luas  untuk membuat  tanaman  menjadi  kompak  dan  kokoh terutama  pada  tanaman  hias.  Zat  penghambat  tumbuh yang  berperan  sebagai  penghambat  kerja  giberelin, termasuk  ansimidol  dan  paklobutrazol  bermanfaat dalam  mikropropagasi  tanaman  dengan  menghambat perpanjangan  batang  dan  menghasilkan  planlet  yang lebih kokoh sehingga meningkatkan daya hidupnya saat diaklimatisasi pada kondisi luar (Ziv, 1995).

## Pengaruh  intensitas  cahaya  terhadap  kondisi lingkungan mikro
Perbedaan  intensitas  cahaya  berpengaruh  nyata terhadap  intensitas  cahaya  yang  diterima  oleh  planlet stevia di dalam botol  kultur  dan terhadap  suhu di luar dan di dalam botol kultur.  Intensitas cahaya  di dalam botol  lebih  rendah  dibandingkan  di  luar  botol  kultur (Tabel 3), hal ini karena penutup botol kultur dan kaca bening  botol  menghalangi  masuknya  cahaya  ke  dalam botol.  Semakin  tinggi  intensitas  cahaya,  perbedaan intensitas  cahaya  di  luar  dan  di  dalam  botol  semakin tinggi.  Pada  intensitas  cahaya  10 µ mol/m 2 /detik, perbedaan  sebesar  1,6 µ mol/m 2 /detik,  sedangkan  pada intensitas cahaya 40 µ mol/m 2 /detik sebesar 6,8 µ mol/m 2 / detik (Tabel 3). Penutup botol dan kaca
B A
Peningkatan laju multiplikasi tunas dan keragaan planlet Stevia rebaudiana pada kultur in vitro … Sumaryono &Sinta
Tabel  2.  Pengaruh paklobutrazol dan ansimidol terhadap pertumbuhan, keragaan dan daya hidup planlet stevia, setelah kultur selama empat  minggu.
Table 2.  Effect of paclobutrazol and ancymidol on the growth, vigor and survival rate of stevia plantlets, after four weeks of culture.
Perlakuan Treatment Bobot segar planlet Plantlet fresh weight (g) Tinggi planlet Plantlet height (mm) Jumlah ruas Node number Jumlah daun Leaf number Diameter batang Stem diameter (mm) Daya hidup Survival rate (%) Kontrol ( Control ) 0,07  a *) 55,9  ab 5,2  a 11,3  ab 0,72  bc 95  a Paklobutrazol Paclobutrazol 0,1 mg/L 0,08  a 63,3  a 5,6  a 11,7  a 0,80  b 100  a 1 mg/L 0,09  a 34,2  cde 4,8  a 10,7  ab 0,68  bc 90  a 10 mg/L 0,06  a 18,9  e 2,5  b 6,2  c 1,01  a 65  b Ansimidol Ancymidol 0,1 mg/L 0,06  a 46,7  abc 4,7  a 10,2  ab 0,58  c 100  a 1 mg/L 0,10  a 40,8  bcd 4,6  a 9,2  b 0,74  bc 60  b 10 mg/L 0,07  a 24,5  de 2,2  b 6,0  c 1,01  a 50  b
*) Angka dalam kolom yang sama diikuti oleh huruf  yang sama berarti tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan pada α ≤ 0,05.
*)  Means in the same column followed by the same letters are not significantly different according  t o Duncan’s multiple range test at α ≤ 0.05.
Tabel 3. Kondisi lingkungan mikro pada intensitas cahaya yang berbeda. Table 3. Microenvironmental conditions at different light intensities.
Intensitas cahaya
Light intensity ( µ mol/m 2 /s) Intensitas cahaya di luar botol kultur Light intensity outside the
culture vessel ( µ mol/m 2 /s) Intensitas cahaya di dalam botol kultur Light intensity inside the
culture vessel ( µ mol/m 2 /s) Perbedaan intensitas cahaya Light intensity difference
( µ mol/m 2 /s) Suhu di luar botol kultur Temperature outside the vessel (ºC) Suhu di dalam botol kultur Temperature inside the vessel (ºC) Perbedaan suhu Temperature difference (ºC) 10 10,6 9,1 1,58  c *) 26,8  c 28,0  d 1,24  b 20 21,0 19,1 1,84  c 27,9  b 30,1  c 2,12  a 30 31,8 27,9 3,92  b 28,1  b 30,6  b 2,48  a 40 41,8 35,0 6,80  a 28,8  a 31,1  a 2,30  a
*) Angka dalam kolom yang sama diikuti oleh huruf  yang sama berarti tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan pada α ≤ 0,05.
*) Means in the same column followed by the same letters are not significantly different according  t o Duncan’s multiple range test at α ≤ 0.05.
botol  kultur  mengurangi  intensitas  cahaya  yang dilewatkan ke dalam botol kultur (Chen, 2004).
Adanya cahaya yang berasal dari lampu fluoresen sejuk  berwarna  putih  meningkatkan  suhu  di  dalam ruang  kultur.  Semakin  tinggi  intensitas  cahaya  yang digunakan,  suhu  di  luar  botol  kultur  semakin  tinggi, 26,7 °C pada  intensitas 10 µ mol/m 2 /detik  dan  28,8 °C pada  intensitas  cahaya  40 µ mol/m 2 /detik  (Tabel  3). Suhu di dalam botol kultur selalu lebih tinggi dari suhu di  luar  botol  selama  periode  penyinaran,  dengan perbedaan  suhu  tergantung  pada  intensitas  cahaya. Semakin  tinggi  intensitas  cahaya,  suhu  di  dalam  botol kultur  akan  semakin  tinggi  bahkan  mencapai  31,1  °C pada  intensitas  cahaya  40 µ mol/m 2 /detik  (Tabel  3). Peningkatan  suhu  di  dalam  botol  kultur  merupakan
efek rumah kaca dari adanya cahaya dari lampu (Chen, 2003).  Penutup  botol  kultur  pada  penelitian  ini  yakni tutup  ulir  berbalut  plastik wrap dilaporkan  mampu menahan panas paling baik  (Sinta et  al ., 2011) karena terbatasnya  sirkulasi  udara  dari  dan  ke  dalam  botol kultur.

## Pengaruh intensitas cahaya terhadap keragaan planlet stevia
Perlakuan  perbedaan  intensitas  cahaya  tidak berpengaruh secara nyata terhadap bobot segar planlet, diameter  batang,  dan  jumlah  daun  planlet  stevia (Tabel4). Tinggi planlet stevia dipengaruhi secara nyata oleh  intensitas  cahaya,  dengan  tinggi  rata-rata
Tabel  4.  Pengaruh intensitas cahaya terhadap pertumbuhan dan keragaan planlet stevia, setelah kultur selama empat minggu.
Table 4.   Effect of light intensity on the growth and vigor of stevia plantlets, after four weeks of culture.
Intensitas cahaya Light intensity
( µ mol/m 2 /s) Bobot segar planlet Plantlet fresh weight (g) Tinggi planlet Plantlet height (mm) Diameter batang Stem diameter (mm) Jumlah daun Leaf number Kelas warna daun Leaf color class Ukuran daun Leaf size (mm 2 ) 10 0,080  a *) 53,0  ab 0,58  a 13,1  a 2,7  a 37,5  b 20 0,133  a 70,9  a 0,57  a 15,1  a 1,9  b 80,9  a 30 0,119  a 57,3  ab 0,68  a 16,5  a 2,0  b 59,2  b 40 0,117  a 48,1  b 0,57  a 14,2  a 1,9  b 55,0  b
*) Angka dalam kolom yang sama diikuti oleh huruf  yang sama berarti tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan pada α ≤ 0,05.
*) Means in the same column followed by the same letters are not significantly different according  to Duncan’s multiple range test at α ≤ 0.05.
planlet  paling  tinggi  (7,09  mm)  diperoleh  pada  botol kultur  yang  diletakkan  di  bawah  lampu  dengan intensitas  20 µ mol/m 2 /detik.  Perlakuan  intensitas cahaya  yang  paling  rendah  yakni  10 µ mol/m 2 /detik menyebabkan daun stevia lebih hijau (kelas warna daun 2,7;  semakin  tinggi  nilai  bagan  warna  daun  semakin hijau  warna  daunnya).  Intensitas  cahaya  berpengaruh terhadap  ukuran  daun  yang  diperoleh  dari  hasil perkalian  antara  panjang  dan  lebar  daun  terbesar. Ukuran  daun  stevia  terbesar  diperoleh  pada  perlakuan intensitas  cahaya  20 µ mol/m 2 /detik  (Tabel  4).  Dari beberapa parameter pertumbuhan yang diamati terlihat bahwa perlakuan terbaik untuk meningkatkan keragaan planlet stevia adalah intensitas cahaya 20 µ mol/m 2 /detik.  Hasil  serupa  juga  dilaporkan  pada planlet Alocasia  amazonica yang  tumbuh  dan berkembang  lebih  baik  pada  intensitas  cahaya  rendah yakni  15  dan  30 µ mol/m 2 /detik  dibandingkan  dengan intensitas cahaya yang lebih tinggi (Jo et al ., 2008). Walaupun suhu ruang kultur diatur pada 26 ± 1 °C secara konstan namun suhu di dalam botol kultur dapat mencapai  31,1  °C  (Tabel  3).  Lingkungan  tumbuh tanaman stevia yang optimal di lapang adalah antara 20 – 30  °C  sehingga  suhu  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  diperkirakan  terlalu  tinggi  untuk pertumbuhan  planlet  stevia.  Oleh  karena  itu,  perlu dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk  menetapkan kombinasi  intensitas  cahaya  dengan  suhu  ruang  kultur yang  lebih  rendah  untuk  mendapatkan  lingkungan tumbuh in  vitro yang  terbaik  bagi  pertumbuhan  dan keragaan planlet stevia.

## Kesimpulan
1. Laju multiplikasi tunas stevia tertinggi yakni rata- rata  sebanyak  4,5  tunas  dan  11,9  ruas  yang  dapat disubkultur  per  eksplan  awal  dalam  waktu  empat
minggu  diperoleh  pada  medium  MS  dengan penambahan BA 1,13 mg/L dan IAA 0,35 mg/L.
2. Keragaan  planlet  stevia  lebih  baik  pada  medium MS  dengan  penambahan  paklobutrazol  0,1  mg/L dibandingkan  dengan  penambahan  paklobutrazol dan ansimidol konsentrasi lainnya.
3. Keragaan  planlet  stevia  terbaik  diperoleh  pada intensitas  cahaya  20 µ mol/m 2 /detik  dibandingkan intensitas cahaya lainnya

## Daftar Pustaka
Anbazhagan  M,  M  Kalpana,  R  Rajandran,  V  Natarajan  & D  Danavel  (2010). In  vitro production  of Stevia rebaudiana Bertoni . Emir J Food Agric 22(3), 216-222.
Chen  C  (2003).  Development  of  a  heat  transfer  model  for plant  tissue  culture  vessels. Biosystems  Engin 85(1), 67- 77.
Chen  C  (2004).  Fluorescent  lighting  distribution  for  plant micropropagation. Biosystems Engin 90(3), 295-306.
Chen J, DE Hall & V De Luca (2005). Effects of the growth retardant  paclobutrazol  on  large-scale  micropropagation of daylily ( Hemerocallis spp ). In Vitro Cel Dev Biol 41, 58-62.
Geuns  JMC  (2003).  Molecules  of  interest  -  stevioside. Phytochem 64, 913-921.
Goettemoeller  J  &  A  Ching  (1999).  Seed  germination  in Stevia rebaudiana. In : J Janick (ed.) Perspective on New Crops  and  New  Uses .  ASHS  Press,  Alexandria,  VA,  p. 510-511.
Gregersen S, PB Jeppesen, JJ Holst & K Hermansen (2004). Antihyperglycemic effects of stevioside in type 2 diabetic subjects. Metabolism 53(1), 73-76.
Hazarika  BN    (2003).  Acclimatization  of  tissue-cultured plants. Curr Sci 85(12), 1704-1712.
Peningkatan laju multiplikasi tunas dan keragaan planlet Stevia rebaudiana pada kultur in vitro … Sumaryono &Sinta
Huang  C  &  C  Chen  (2005).  Physical  properties  of  culture vessels  for  plant  tissue  culture. Biosystems  Engin 91(4), 501-511.
Ibrahim  I,  MI  Nasr,  BR  Mohammed  &  MM  El  Zefzafi (2008).  Plant  growth  regulators  affecting in  vitro cultivation in Stevia rebaudiana . Sugar Tech 10(3), 254-
259.
Jeppesen PB, S Gregersen & KK Alstrup (2002). Stevioside induces antihyperglycaemic, insulinotropic and glucagonostatic  effects  in  vivo:  studies  in  the  diabetic Goto-Kakizaki (GK) rats. Phytomed 9, 9-14.
Jo  EA,  RK  Tewari,  EJ  Hahn  &  KJ  Paek  (2008).  Effect  of photoperiod and light intensity on in vitro propagation of Alocasia amazonica. Plant Biotechnol Rep 2, 207-212.
Kennelly  EJ  (2002).  Sweet  and  non-sweet  constituents  of Stevia  rebaudiana.  In :  AD  Kinghorn  (ed.) The  genus Stevia . Taylor & Francis, London, p. 68-85.
Manjusha  AVM  &  BN  Sathyanarayana  (2010).  Studies  on pre  acclimatization  treatments  to  improve  post acclimatization  survival  in  stevia  ( Stevia  rebaudiana Bert.). Acta Hort 865, 171-178.
Megeji  NW,  JK  Kumar,  V  Singh,  VK  Kaul  &  PS  Ahuja (2005).  Introducing Stevia  rebaudiana ,  a  natural  zero- calorie sweetener. Curr Sci 88(5), 801-805.
Midmore  DJ  &  AH  Rank  (2002).  A  new  rural  industry – Stevia – to  replace  imported  chemical  sweeteners.  A Report  for  Rural  Industries  Research  and  Development Cooperation. ACT, Australia. 50p.
Mogra  R  &  V  Dashora  (2009). Exploring  the  use  of Stevia rebaudiana as  a  sweetener  in  comparison  with  other sweeteners. J Hum Ecol 25(2), 117-120
Murashige T &  F Skoog  (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15, 473-497.
Rademacher  W  (2000).  Growth  retardants:  effects  on gibberellin  biosynthesis  and  other  metabolic  pathways. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51, 501-531.
Rafiq M, MU Dahot, SM Mangrio, HA Naqvi & QA Qarshi (2007). In  vitro clonal  propagation  and  biochemicals analysis  of  field  established Stevia  rebaudiana Bertoni. Pakistan J Bot 39(7), 2467-2474.
Sairkar  P,  MK  Chandravanshi,  NP  Shukla  &  NN  Mehrotra (2009).  Mass  production  of  an  economically  important medicinal  plant Stevia  rebaudiana using in  vitro propagation techniques. J Med Plant Res 3(4), 266-270.
Sinta  MM,  I  Riyadi  &  Sumaryono  (2011). Pengaruh  jenis penutup botol kultur terhadap pertumbuhan planlet kelapa sawit  ( Elaeis  guineensis Jacq.) . Menara  Perkebunan 79(1), 15-22.
Sivaran L & U Mukundan (2003). In vitro culture studies of Stevia rebaudiana . In Vitro Cell Dev Biol Plant 39, 520- 523.
Supriati Y, I Mariska & Mujiman (2006).  Multiplikasi tunas belimbing Dewi  ( Averrhoa carambola ) melalui  kultur in vitro. Buletin Plasma Nutfah 12(2), 50-55.
Ziv M (1995). In vitro acclimatization. In : J Aitkin-Christine,
T Kozai & L Smith (eds.) Automation and Environmental Control  in  Plant  Tissue  and  Organ  Culture .  Kluwer,
Dondrect, Netherlands, p. 439-516.
.