BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 2, Nomor 1 (2020): 29 - 33 E-ISSN: 2714-8564
Karakterisasi Isolat Khamir Gf1 terhadap Kondisi Asam Saluran Pencernaan Unggas
Awwaluz Zahroh Mahya Ainillah 1 *, Nuraeni Ekowati 1 , Ade Erma Suryani 2
1 Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman
2 BPTBA LIPI Gunung Kidul, Yogyakarta, 55861, Indonesia *email : awwaluzzahroh22@gmail.com
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 26/08/2019 Disetujui  : 31/01/2020

## Abstract
Probiotics  are  microorganism  which  can  improve  intestinal  microecology  and  give  positive impact  on  host  health.  Probiotic  candidates  are  microorganism  which  potential  to  used  as probiotic,such as potential to producing phytase enzyme to optimalize gastrointestinal tract. One of  microorganism  as  probiotic  candidates  is  yeast  producing  phytase.  Yeast  producing  phytase has been isolated by BPTBA-LIPI Yogyakarta from Indonesian traditional fermented food such as gathot .  Characterization  of  probiotic  candidates  is  done  by  stimulate  gastrointestinal  tract condition,  include  acid  condition  such  as  low  pH  and  gastric  acid.  Condition  of  low  pH  and gastric acid are inhibitor microorganism entered to gastrointestinal tract. However, acid tolerance test  are  used  to  understand  the  potential  probiotic  characteristic  of  microorganism.  Testing  is done  by  invitro  by  regulating  the  resistance  of  yeast  under  acidic  conditions  with  pH  values  2 and 3, and gastric acid conditions using pepsin 0.3%.The result of this study are yeast producing phytase GF1 isolated from Indonesian traditional fermented food are tolerance of acid condition because it can viable on pH 3 and gastric acid condition.
Key Words : Acid , Yeast , Viability

## Abstrak
Probiotik  merupakan  mikroorganisme  yang  dapat  memperbaiki  mikroekologi  usus  yang berdampak  positif  terhadap  kesehatan  inang.  Kandidat  probiotik  merupakan    mikroorganisme yang  memiliki  potensi  sebagai  probiotik,  seperti  menghasilkan  enzim  fitase  sehingga  mampu mengoptimalkan  kondisi  saluran  pencernaan.    Salah  satu  mikroorganisme  sebagai  kandidat probiotik  adalah  khamir  penghasil  enzim  fitase.  Khamir  penghasil  fitase  telah  diisolasi  oleh BPTBA-LIPI Yogyakarta asal makanan  fermentasi tradisional Indonesia yaitu gathot .Pengujian khamir  fitase  sebagai  kandidat  probiotik  dilakukan  dengan  menstimulasikan  kondisi  saluran pencernaan seperti kondisi asam yaitu pada  pH rendah dan  kondisi asam lambung. Kondisi pH yang  rendah  dan  asam  lambungmerupakan  suatu  penghalang  masuknya  mikroorganisme  ke saluran  gastrointestinal,  oleh  karena  itu  pengujian  terhadap  asam  dilakukan  untuk  mengetahui karakteristik  mikroorganisme  yang  akan  digunakan  sebagai  kandidat  probiotik.  Pengujian dilakukan secara invitro dengan menguji ketahanan khamir pada kondisi asam dengan  nilai pH 2 dan  3  serta  kondisi  asam  lambung  dengan  menggunakan  pepsin  0,3%.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  isolat  khamir  GF1  asal  makanan  tradisional  fermentasi  mampu  tahan terhadap  kondisi  asam  karena  mampu  mempertahankan  viabilitasnya  pada  pH  3  dan  kondisi asam lambung.
Kata kunci : Asam, Khamir,  Viabilitas

## PENDAHULUAN
Mikroorganisme
probiotik memiliki karakteristik  toleran  terhadap  kondisi  asam,  garam empedu, asam lambung; berpotensi sebagai antimikroba  pada  saluran  pencernaan;  serta  tahan terhadap  antibotik.  Pengujian  khamir  fitase  sebagai kandidat probiotik dilakukan dengan menstimulasikan kondisi saluran pencernaan seperti pH  rendah,  kondisi  asam  lambung,    dan  garam empedu.    Kondisi  pH  rendah  (2,5-3,5)    merupakan penghalang masuknya strain mikroorganisme probiotik  ke  saluran  usus  (Damayanti et  al. ,  2014). Khamir  yang  bersumber  dari  makanan  fermentasi memiliki  sifat  toleransi  terhadap  lingkungan  asam.
Menurut  Syal & Vohra (2013), hasil isolasi khamir pada makanan fermentasi seperti roti India memiliki viabilitas  56  hingga  100%  dalam  HCl  dengan  nilai pH  2.  Berdasarkan  Fadda et  al .  (2017),  beberapa strain  khamir Kluyveromyces yang  diisolasi  dari keju  mampu  hidup  pada  pH  2,  sedangkan  semua strain uji Kluyveromyces mampu hidup pada kondisi lambung  di  pH  3.  Kedua  strain  yang  diuji menunjukkan  tingkat  kelangsungan  hidup  hingga 100%.    Khamir  yang  diisolasi  dari  feses  dan  kefir dicirikan  toleran  pada  asam,  yaitu  memiliki viabilitas  86-97%  ketika  terpapar  pH  2,5  dan viabilitas 85- 92% pada pH 1,5 (Lara-Hidalgo et al. , 2017).  Hambatan  khamir  sebagai  probiotik  pada
tubuh  terjadi  pada  lambung  karena  adanya  asam lambung. Asam lambung dapat membunuh mikroorganisme  dengan  mekanisme  pH  asam  dan enzim. Asam lambung disekresikan oleh proventrikulus  pada  pH  sekitar  2  (Duke,  1986). Menurut  Chen et  al .  (2010),  untuk  mendapatkan kondisi  asam  lambung  pada  gastrointestinal  dapat digunakan  0,3%  pepsin.  Menurut  Ogunremi et  al. (2015),  strain  khamir  hasil  isolasi  dari  makanan tradisional  fermentasi  di  Nigeria  yaitu Pichia kluyveri LKC17, Issatchenkia  orientalis OSL11, Pichia kudriavzevii OG32 , P. kudriavzevii ROM 11 yang  distimulasikan  pada  kondisi  asam  lambung (0,3%  pepsin,  pH  2)  memiliki  viabilitas  hingga 100%.
Eksplorasi  mikroorganisme  sebagai  kandidat probiotik unggas asal makanan tradisional khususnya  khamir  telah  dilakukan  oleh  Balai Penelitian  Teknologi  Bahan  Alam-Lembaga  Ilmu Pengetahuan  Indonesia  (BPTBA-LIPI)  Yogyakarta. Karakterisasi  mikroorganisme  sebagai  kandidat probiotik  dilakukan  karena  memiliki  potensi menghasilkan  enzim  yang  dapat  meningkatkan kecernaan  unggas  yaitu  enzim  fitase.  Eksplorasi khamir  penghasil  fitase  telah  diperoleh  dari beberapa  makanan  tradisional  antara  lain  tempe kedelai,  tempe  gembus,  tempe  koro,  dan gathot. Hasil  eksplorasi  diperoleh  isolat  khamir  dari  g athot (GF1)  memiliki  aktivitasenzim  fitase. Gathot merupakan makanan tradisional khas Gunung Kidul, Yogyakarta  yang  terbuat  dari  singkong  yang difermentasi. Gathot dibuat  dengan  mengeringkan singkong  yang  telah  dikupas  kemudian  di  rendam air  untuk  mendapatkan  warna  hitam  khas gathot (Oktaviana,  2014).  Isolat  khamir  asal  gathot  (GF1) dipilih  dan  dilakukan  pengujian  terhadap  ketahanan asam  (sesuai  pH  didalam  provetriculus)  dan pengujian terhadap asam lambung guna memberikan sebagian informasi karakteristik isolat khamir untuk dapat  digunakan  sebagai  kandidat  probiotik  pada unggas. Pengujian karakterisasi isolat dapat dilakukan  pada  kondisi  asam  (pH  2  dan  3)  dan  uji asam  lambung.  Berdasarkan  uraian  tersebut,  maka tujuan dari penelitian ini adalah  mengetahui apakah isolat  khamir  GF1  asal  makanan  tradisional terfermentasi  memiliki  ketahanan  terhadap  asam saluran pencernaan unggas.

## MATERI DAN METODE
Materi  yang  digunakan  pada  penelitian  ini antara  lain autoclave (TOMY  SX-700),  vortex mixer  (VM-300),  mikropipet  Eppendorf, Laminar Air  Flow (JSCB-1200SB),  pH  meter  (Bench  700 series ),  sentrifugator  (Selecta  Centrofriger  BL-II),
inkubator 30 o C (Memmert), inkubator 37 o C (Binder), timbangan analitik (KERN), isolat khamir penghasil  fitase  asal  makanan  asal  gathot  (GF1), medium Yeast  Glucose  Choramphenicol  Broth
(YGCB),  medium Yeast  Glucose  Choramphenicol Agar (YGCA), millipore 0,45µm  (Corning), syringe , NaCl fisiologis (0,85%), , Phosphate Buffer Saline (PBS), HCl, dan pepsin 0,3%

## Uji ketahanan khamir terhadap pH2 dan pH 3
Uji  ketahanan  khamir  terhadap  pH2  dan  pH 3 dilakukan  berdasarkan  metode  Damayanti et  al .
(2014)  yang  dimodifikasi.  Isolat  khamir  dalam medium YGCB berumur 24 jam  disentrifus dengan kecepatan  5000  rpm  dengan  suhu  4 o C  selama  10 menit.  Pelet  hasil  sentrifugasi  dibersihkan  dari media  menggunakan  PBS  sebanyak  2  kali.  Pelet ditambahkan    PBS  steril  dan  dihomogenkan. Suspensi pelet ditambahkan masing-masing ke PBS steril pH 2 dan pH 3, kemudian dilakukan  inkubasi pada  suhu  30 o C.  Sampel  diambil  pada  waktu inkubasi    0 jam,  45  menit,  dan  90  menit,  kemudian dilakukan  pengenceran  berseri  dilanjutkan  dengan inokulasi  pada  medium  YGCA . Hasil  inokulasi diinkubasi  pada  30 o C  selama  48  jam.  Viabilitas diamati  berdasarkan  hasil Total  Plate  Count (TPC) pada medium.

## Uji ketahanan khamir terhadap asam lambung
Uji  ketahanan  khamir  terhadap  asam  lambung dilakukan    berdasarkan  metode  Damayanti et  al .
(2014)  yang  dimodifikasi.  Isolat  khamir  dalam medium YGCB berumur 24 jam  disentrifus dengan kecepatan  5000  rpm  dengan  suhu  4 o C  selama  10 menit.  Pelet  hasil  sentrifugasi  dibersihkan  dari media  menggunakan  PBS  sebanyak  2  kali.  Pelet dilarutkan dalam PBS steril kemudian dihomogenkan.  Pelet  yang  dilarutkan  ditambahkan PBS  pH  asam  yang  mengandung  0,3%  pepsin, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  30 o C.  Sampel diambil pada  waktu inkubasi0  menit, 60  menit, dan 120  menit  kemudian  dilakukan  pengenceran  berseri dan  inokulasi  ke  medium  YGCA.  Hasil  inokulasi diinkubasi  pada  30 o C  selama  48  jam.  Viabilitas diamati berdasarkan hasil TPC pada medium.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ketahanan isolat khamir GF1 terhadap kondisi asam dilakukan  dengan menghitung viabilitas isolat khamir  terhadap  paparan  kondisi  asam  meliputi kondisi  pH  2,  pH  3  dan  kondisi  asam  lambung. Hasilnya ditunjukkan pada diagram berikut (Gambar 1 dan Gambar 2).
5.4545 5.959 1.477
5.5536 1.6191 5.4407 0.0000 1.0000 2.0000 3.0000 4.0000 5.0000 6.0000 7.0000 pH 2 pH 3 V ia b ili ta s (Lo g C FU /m L) pH 0 menit 45 menit 90 menit
Gambar 1. Viabilitas khamir GF1 terhadap pH 2 dan pH 3
6.9375 7.6759 7.3219 6.4000 6.6000 6.8000 7.0000 7.2000 7.4000 7.6000 7.8000 V ia b ili ta s (L o g C FU /m L) Asam lambung (0,3% pepsin) 0 menit 60 menit 120 menit
Gambar 2. Viabilitas khamir GF1 terhadap kondisi asam lambung
Berdasarkan  Gambar  1,  isolat  khamir  GF1 memiliki  viabilitas  lebih  tinggi  pada  pH  3 dibandingkan  dengan  pH  2.  Isolat  khamir  GF1 memiliki  penurunan  viabilitas  pada  pH  2  dan  pH  3 seiring  lamanya  waktu  inkubasi.  Hal  tersebut menunjukkan  bahwa  isolat  khamir  GF1  memiliki ketahanan  lebih  baik  pada  pH  3.  Berdasarkan penelitian  Hu et  al. (2018),terdapat  khamir  yang mampu  mempertahankan  viabilitasnya  pada  pH rendah  yaitu  pH  2  dan  pH  3  seperti  pada Saccharomyces  cereviceae .  Menurut  Rajkowska  & Kunicka-Styczynska  (2010),  nilai  pH  menentukan kemampuan  pertumbuhan  khamir  yang  tahan terhadap  pH  menuju  ke  saluran  gastrointestinal. Berdasarkan  penelitian  Chen et  al. (2010),  nilai  pH dapat  mempengaruhi  viabilitas  isolat  khamir. Khamir  tahan  uji  terhadap    pH  3  lebih  banyak dibandingkan  dengan  pH  2.  Beberapa  khamir  yang tahan  pada  pH  2  yaitu Pichia  kudriavzevii BY10, Yarrowia  lipolytica HJ6  dan Y.  lipolytica HY15. Menurut  Ogunremi et  al .  (2015),  khamir  yang mampu  tumbuh  pada  kondisi  asam  dipengaruhi waktu inkubasi yang digunakan. Khamir yang tahan terhadap  asam  antara  lain Pichia  kluyveri LKC17, Issatchenkia  orientalis OSL11, Pichia  kudriavzevii OG32,  dan Candida  tropicalis BOM21  pada  pH  3 waktu  inkubasi  3  jam,  sedangkan  khamir  yang mampu tumbuh pada pH 2 yaitu Pichia kudriavzevii ROM11, Pichia  kluyveri LKC17,  dan
Pichia  kudriavzevii OG32, Issatchenkia  orientalis OSL11, Pichia  kudriavzevii dan Candida  tropicalis BOM21
Berdasarkan  Gambar  2,  menunjukkan  bahwa isolat khamir GF1 memiliki viabilitas tertinggi pada waktu  inkubasi  60  menit  dan  menunjukkan penurunan  viabilitas  pada  menit  ke-120.  Hal tersebut  menunjukkan  bahwa  waktu  inkubasi  dan enzim  yang  ditambahkan  dapat  mempengaruhi viabilitas isolat khamir terhadap suasana asam. Menurut Fietto et al . (2004), Saccharomyces boulardii mampu
mempertahankan  viabilitas  dalam  lingkungan lambung.Menurut  Kumura et  al. (2004), resistensi  khamir  terhadap  pepsin  berkaitan dengan kemampuan adhesi dan ekspresi protein pada  khamir.  Menurut  Moradi et  al .  (2018), khamir yang resisten terhadap pepsin menunjukkan khamir tersebut memiliki aktivitas proteolitik, misalnya khamir Kluyveromyces  yang  mampu  tahan  terhadap pepsin  yaitu  pada  strain  Kluyveromyces  S97 dan S106.
Nilai pH rendah berhubungan dengan konsentrasi  HCl  di  saluran  pencernaan  (Psomas et al., 2001).  Lambung  merupakan  tempat  sekresi asam klorida (HCl). HCl lambung berfungsi sebagai pertahanan  utama  terhadap  patogen  yang  dapat
tertelan  bersama  makanan  atau  air.  HCl  lambung meningkatkan  penyerapan  kalsium  dan  zat  besi makanan serta mengaktifkan enzim yaitu pepsinogen  menjadi  pepsin.  Enzim  tersebut  terlibat dalam  hidrolisis  protein  (Smith,  2003).  Pepsin merupakan  enzim  proteolitik  dalam  asam  lambung. Residu asam yang dihasilkan pepsin berperan dalam proteolisis  substrat  dengan  mekanisme  katalisis basa.  Enzim  pepsin  dapat  aktif  pada  pH  asam  serta menunjukkan  aktivitas  katalitik  tertinggi  pada  pH 2.0 (Niu et al ., 2016).
Mekanisme  penghambatan  tersebut  berkaitan dengan  aktivitas  enzim  dan  pH  rendah  (Ouwehand et    al., 1999).  Nilai  pH  rendah  dalam  lambung berkaitan  dengan    konsentrasi  asam  klorida  HCl (Khidhr & Zubaidy, 2014). Toleransi asam lambung dari  strain  mikroorganisme  dikaitkan  dengan keberadaan  transporter  resistensi  asam yang mempertahankan  gradien  pH  konstan  antara  cairan ekstraseluler dan sitoplasma sel mikroba (Illeghems et  al., 2013).  Menurut  Sorrels  &  Leonard  (1988), ketahanan  strain  khamir  terhadap  suasana  asam dipengaruhi  oleh  keterlibatan  dinding  sel  khamir dalam  mekanisme  transport.  Struktur  dinding  sel mempengaruhi transport aktif dan kebutuhan energi khamir. Penghambatan pada suasana asam meningkatkan kebutuhan energi untuk pompa asam. Penurunan  tingkat  pertumbuhan  khamir  dalam medium  asam  menunjukkan  permintaan  energi untuk transport  yang besar.  Menurur Brandao et al. (2014),  Sebagian  besar  sel  akan  mempertahankan gradien  konsentrasi  H + ekstraseluler  terhadap intraseluler  di  plasma  membran.  Faktor  stress  asam dapat  mempengaruhi  gradien  konsentrasi    H + yang melintasi  membran  plasma.  Toleransi  khamir  pada asam  bergantung  pada  aktivitas  ATPase  setelah terpapar  asam.  Aktivitas  ATPase  mempengaruhi ekspresi  sistem  transport  sekunder  pada  membran plasma.

## SIMPULAN
Isolat  khamir  GF1  memiliki  ketahanan terhadap  pH  rendah  yaitu  pada  kondisi  pH  3  serta pada  kondisi  asam  lambung  dalam  waktu  inkubasi 90  menit,  sedangkan  pada  kondisi  pH  2,  khamir mengalami  penurunan  viabitias  setelah  waktu inkubasi 45 menit.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada BPTBA-LIPI  Yogyakarta  yang  telah  mengizinkan penulis  melakukan  penelitian  dengan  sumber  dana Penelitian Tematik BPTBA-LIPI Tahun 2018.

## DAFTAR REFERENSI
Damayanti,  E.,  Julendra,  H.,  Sofyan,  A.,  &  Hayati,
S.  N.  2014.  Bile  salt  and  acid  tolerant  of lactic acid bacteria isolated from
proventriculus  of  broiler  chicken. Media Peternakan , 37(2), pp. 80-86.
Duke,  G.  E.  1986. Alimentary  canal:  Anatomy, regulation  of  feeding,  and  motility. Pages 269–288  in  Avian  Physiology.  P.  D.  New York: Sturkie, ed. Springer-Verlag.
Fadda,  M.  E.,  Mossa,  V.,  Deplano,  M.,  Pisano,  M. B.,  &  Cosentino,  S.  2017.  In  vitro  screening of Kluyveromyces strains isolated from Fiore Sardo  cheese  for  potential  use  as  probiotics. LWT- Food  Science  and  Technology , 75, pp. 100-106.
Fietto, J. L. R., Araujo, R. S., Valadao, F.N., Fietto, L.G., Brandao, R.L., Neves, M. J., Gomes, F. C.  O.,  Nicoli,  J.  R.  and  Castro,  I.  M.  2004. Molecular  and  physiological  comparison between  Saccharomyces  cerevisiae  and Saccharomyces  boulardii. Candian  Journal of Microbiology , 50, pp. 615-621.
Hu, X. Q., Liu, Q., Hu, J. P., Zhou, J. J., Zhang, X., Peng,  S.  Y.,  &  Wang,  X.  D.  2018. Identification and characterization of probiotic  yeast  isolated  from  digestive  tract of  ducks. Poultry  science ,  97(8),  pp.  2902- 2908.
Illeghems,  K.,  De  Vuyst,  L.  &  Weckx,  S.  2013. Complete genome sequence and comparative analysis of Acetobacter pasteurianus 386B, a strain  well-adapted  to  the  cocoa  bean fermentation ecosystem. BMC Genomics , 14, pp. 526.
Khidhr, K. O., & Zubaidy, Z. M. A. 2014. Isolation and Identification of Saccharomyces cerevisiae  var  boulardii  and  its  Uses  as  a Probiotic  (in  vitro). Rafidain  journal  of science, 25(1E), pp. 1-11.
Kumura, H., Tanoue, Y., Tsukahara, M., Tanaka, T.,
&  Shimazaki,  K.  2004.Screening  of  dairy yeast  strains  for  probiotic  applications. Journal  of  dairy  science ,  87(12),  pp.  4050- 4056.
Lara-Hidalgo, C., Hernández-Sánchez, H., Hernández-Rodríguez,  C.,  &  Dorantes- Álvarez, L. 2017. Yeasts in Fermented Foods and  their  Probiotic  Potential. Austin  Journal of Nutrition & Metabolism , 4(1045), pp. 1-8.
Moradi,  R.,  Nosrati,  R.,  Zare,  H.,  Tahmasebi,  T., Saderi, H., & Owlia, P. 2018. Screening and characterization  of  in-vitro  probiotic  criteria of Saccharomyces and Kluyveromyces strains. Iranian  Journal  of  Microbiology , 10(2), pp. 121-131.
Niu,  C.,  Luo,  H.,  Shi,  P.,  Huang,  H.,  Wang,  Y., Yang,  P.,  &  Yao,  B.  2016.  N-Glycosylation Improves  the  Pepsin  Resistance  of  Histidine
Acid  Phosphatase  Phytases  by  Enhancing Their  Stability  at  Acidic  pHs  and  Reducing Pepsin's  Accessibility  to  Its  Cleavage  Sites. Applied  and    Environmental  Microbiology , 82(4), pp. 1004-1014.
Ogunremi, O. R., Sanni, A. I., & Agrawal, R. 2015. Probiotic potentials of khamirs isolated from some  cereal  based  Nigerian  traditional fermented  food  products. Journal  of  applied microbiology , 119(3), pp. 797-808.
Oktaviana,  R.  S.  2014.  Pengaruh  Substitusi  Puree Gatot  Instan  Terhadap  Sifat  Organoleptik Roti Manis. Jurnal Tata Boga , 3(3), pp. 141- 150
Ouwehand,  A.  C.,  Kirjavainen,  P.  V.,  Shortt,  C., &Salminen, S. 1999. Probiotics: mechanisms and  established  effects. International  Dairy Journal , 9, pp. 43-52.
Psomas, E.I., Andrighetto, C., Litopoulou- Tzanetaki,  E.,  Lombardi.  A.  and  Tzanetakis, N. 2001. Some probiotic properties of yeasts isolates  from  infant  faeces  and  feta  chees. International Journal Food Microbiology , 69, pp. 125-133.
Rajkowska,  K.,  &  Kunicka-Styczynska,  A.  2010. Probiotic  properties  of  yeasts  isolated  from chicken  feces  and  kefirs. Pol  J  Microbiol , 59(4), pp. 257-263.
Smith,  J.  L.  2003.  The  role  of  gastric  acid  in preventing  foodborne  disease  and  how bacteria  overcome  acid  conditions. Journal of food protection , 66(7), pp. 1292-1303.
Sorrells, K. M., & Leonard, B. 1988. Mechanism of acid  tolerance  by  a  yeast  isolated  from spoiled ketchup. Journal of Food Protection , 51(6), pp. 489-490.
Syal,  P  &  Vohra,  A.  2013.  Probiotic  Potential  of Yeasts  Isolated  From  Traditional  Indian Fermented  Foods. International  Journal  of Microbiol ogy Research , 5, pp. 390-398