J. Kartika Kimia , November 2019, 2, (2), 78-85 Journal homepage : http://jkk.unjani.ac.id/index.php/jkk P-ISSN: 2655-1322     E-ISSN: 2655-0938

## Optimasi Pengendapan Albumin dengan Variasi Suhu, pH dan Konsentrasi Etanol dalam Plasma Darah melalui Metode Simplex Lattice Design
Optimization of Albumin Precipitation with Variations in Temperature, pH and Ethanol Concentration in Blood Plasma by the Simplex Lattice Design
Method
Trisna Yuliana 1,* , Sandi Adityawarman 2 , Agus Setiyawan 2
1 Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Informatika, Universitas Jenderal Achmad Yani, Jl. Terusan Jenderal Sudirman, PO BOX 148, Cimahi
2 Divisi Vaksin Bakteri, Bagian Hib., PT. Biofarma, Bandung *E-mail: trisyuliana@gmail.com
DOI: https://doi.org/10.26874/jkk.v2i2.36
Received : 29 Oct 2019, Revised : 21 Nov 2019, Accepted : 22 Nov 2019, O nline : 30 Nov 2019

## Abstrak
Albumin digunakanan untuk mengatasi kondisi hipoalbumimenia pada berbagai penyakit. Pemanfaatan bahan baku albumin dari darah hasil donor yang sudah melebihi batas waktu penggunaan dapat memberi manfaat,  yaitu  mengurangi  ketergantungan  terhadap  albumin  impor  dan  dapat  mengurangi  biaya pengolahan darah limbah. Kemurnian dan perolehan albumin dapat dipengaruhi oleh berbagai parameter diantaranya;  suhu,  pH  dan  konsentrasi  etanol.  Pada  penelitian  ini  dilakukan  proses  optimasi menggunakan metode Simplex Lattice Design agar diperoleh komposisi variasi parameter yang optimal dari 7 (tujuh) komposisi variasi parameter untuk mendapatkan albumin dengan kadar yang cukup tinggi. Albumin dipisahkan berdasarkan metode fraksinasi etanol melalui perbedaan kelarutan protein dalam plasma.  Berdasarkan  uji  anava,  ke-7  (tujuh)  komposisi  variasi  parameter  yang  dibuat  menunjukkan perbedaan yang nyata dengan p = 0,0282 (< 0,05) dan F hitung > F tabel . Hasil evaluasi menunjukkan bahwa komposisi formula ke-5 (lima) menunjukkan  respon albumin optimal dengan parameter suhu -10 ℃, pH  4,8  dan  konsentrasi  etanol  40%.  Kadar  albumin  yang  diperoleh  dengan  komposisi  tersebut  yaitu 53,59 µg.
Kata kunci: Albumin, suhu, pH, etanol, dan Simplex Lattice Design

## Abstract
Albumin is used to treat hypoalbumimenia in various diseases. The utilization of albumin raw materials from  donor  blood  that  has  exceeded  the  time  limit  of  use  could  be  advantages,  which  are  reducing dependence on imported albumin and could reduce the cost of processing waste blood. The purity and resulting of albumin can be influenced by various parameters including; temperature, pH and ethanol concentration. In this research, the optimization process is conduct using the Simplex Lattice Design method  in  order  to  obtain  an  optimal  composition  variation  of  7  (seven)  parameters  variation composition to obtain albumin with a high concentration. Albumin is separated by ethanol fractionation method  through  differences  in  protein  solubility  in  plasma.  Based  on  Anova  test,  the  7  (seven) composition variations of the parameters showed significant differences with p = 0.0282 (<0.05) and F test > F table . The evaluation results show that the composition of the 5th composition formula shows the optimal albumin response with temperature parameters -10 ℃, pH 4.8 and ethanol concentration of 40%. The albumin content obtained with the composition is 53.59 µg.
Keywords: Albumin, temperature, pH, ethanol ,and Simplex Lattice Design

## 1 Pendahuluan
Albumin  telah  dipakai  sejak  puluhan  tahun yang lalu sebagai salah satu pilihan terapi dalam praktek  medis  antara  lain  untuk  pemulihan  serta menjaga  kondisi  volume  sirkulasi  darah  pasien saat  kondisi  trauma,  pembedahan,  pendarahan, perawatan  luka  bakar,  pertukaran  plasma, hypoproteinemia,  fetal  erythroblastosis,  dan ascites  yang  disebabkan  oleh  sirosis  hati  [1]. Human  Serum  Albumin (HSA)  merupakan  salah satu  protein  dalam  plasma darah,  yang  berfungsi sebagai alat transpor untuk hormon, enzim, asam lemak,  ion  logam,  dan  obat.  Albumin  adalah protein  yang  mampu  larut  dalam  air,  memiliki ukuran  molekul  66.000  Da  dengan  struktur molekul  yang  cukup  stabil.  Dalam  kondisi fisiologi  normal,  albumin  memiliki  kontribusi 80%  untuk  tekanan  osmosis  koloidal  (oncotic) dalam plasma darah.
Berdasarkan data IMS Health, potensi pasar nasional  albumin  diperkirakan  mencapai  Rp  400 M  pada  tahun  2014,  dan  masih  dipenuhi  dengan human  serum  albumin (HSA)  impor.  Hal  ini menunjukan  bahwa  kebutuhan  albumin  dalam negeri  sangat  tinggi.  Salah  satu  sumber  bahan baku albumin adalah darah hasil donor yang sudah melebihi  batas  waktu  yang  ditentukan.  Secara teknologi  pengolahan  dan  ketersediaan  bahan baku  albumin  sendiri  sudah  dapat  diproduksi  di Indonesia.  Palang  Merah  Indonesia  menyatakan proses  pengolahan  darah  membutuhkan  biaya cukup  tinggi,  karena  untuk  mengolah  limbah medis  ini  per  tahun  nya  diperlukan  biaya  yang sangat besar. Oleh karena itu, pemanfaatan darah menjadi  albumin  dapat  memberi  manfaat,  yaitu mengurangi  ketergantungan  terhadap  albumin impor  dan  dapat  mengurangi  biaya  pengolahan limbah darah [2].
Proses pemisahan albumin dari plasma darah dapat  dilakukan  dengan  beberapa  metode, diantaranya  metode  fraksinasi  etanol  yang dikembangkan  oleh  Cohn  tahun  1946.  Metode Fraksinasi etanol merupakan metode yang paling banyak  digunakan,  untuk  memisahkan  albumin berdasarkan  perbedaan  kelarutan  protein  plasma dalam  campuran  etanol  [3].  Keuntungan  dari metode Fraksinasi etanol adalah metode ini cukup sederhana,  menggunakan  reagen  yang  minimal dan dapat digunakan untuk memisahkan albumin dari  plasma  darah  dalam  jumlah  besar  dengan biaya yang lebih rendah [4].
Cohn, et  al. mengembangkan  proses pemisahan plasma dan menentukan lima variabel yang  dapat  mempengaruhi  pemisahan  protein plasma berdasarkan pH, kekuatan ion, konsentrasi
etanol,  suhu  dan  konsentrasi  protein.  Kelarutan protein dapat berkurang dengan dipengaruhi oleh pH  larutan,  dan  penambahan  etanol,  atau  pelarut organik  yang  mudah  larut  dalam  air  sedangkan proses  pemisahan  dilakukan  pada  suhu  rendah bertujuan  untuk  mencegah  protein  terdenaturasi. Hasil  fraksinasi  plasma  protein  diperoleh  lima fraksi  protein  yaitu  fraksi  I  (Fibrinogen,  faktor VIII dan fibronectin), Fraksi II (IgG, IgA, Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X dan globulin), Fraksi  III  (α-globulin  dan  β-globulin,  igM  dan komplement),  Fraksi  IV  (α-globulin  dan  β- globulin, transferin dan haptoglobulin) dan Fraksi V  (Albumin  dan  α-globulin  dan  β-globulin). Kelima  fraksi  tersebut  dapat  diperoleh  dengan mengatur pH dan konsentrasi etanol [5]. Albumin memiliki  kelarutan  yang  tinggi  dan  titik isoelektrik  rendah  dari  plasma  protein.  Oleh karenanya  perlu  dilakukan  penelitian  untuk melihat pengaruh faktor suhu, pH, dan konsentrasi etanol terhadap kualitas hasil kemurnian albumin. Ketiga pengaruh ini dievaluasi dengan mengubah level  parameter  secara  bersamaan  kemudian diolah  dengan  teknik  optimasi  menggunakan metode Simplex  Lattice  Design agar  di  peroleh komposisi  parameter  yang  optimal  untuk mendapatkan  albumin  dengan  kemurnian  paling tinggi dalam plasma darah [3,6].

## 2 Metode Penelitian

## 2.1. Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan yaitu: sampel plasma darah, etanol 96%, asam asetat, water for injection (WFI),  Reagen  BCA  Protein  Assay  A  (Natrium karbonat, Natrium bikarbonat, asam dicinchoninat dan  natrium  tartrat  dalam  0,1  M  NaOH)  dan Reagen  BCA  Protein  Assay  A  (4%  CuSO4), standar  albumin,  reagen  ladder  protein,  running buffer,  pre  cast  gel,  buffer  sample,  larutan pewarnaan gel & larutan pencuci gel, Microplate spektrofotometer dan Sodium Dodesil Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS- PAGE)-mini  protein  II  Dual  Slab  Cell  (BioRad) [7].

## 2.2. Tahapan Penelitian
Penelitian  dilakukan  di  laboratorium  PT Biofarma.  Sampel  plasma  darah  beku  setelah dicairkan  pada  suhu  2  –  4  ℃  kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10  menit.  140  mL  bagian  supernatant  dibagi menjadi 7 (tujuh) bagian. Ketujuh bagian ini diberi perlakuan dengan variasi konsentrasi etanol, suhu dan  pH  yang  berbeda.  Kedalam  masing  masing
bagian ditambahan etanol secara perlahan hingga mencapai  konsentrasi  tertentu.  pH  diatur  dengan menggunakan larutan asam asetat 4 M. dan suhu. Pemberian  perlakuan  dapat  dilihat  pada  Table  1. Masing  masing  bagian  disentrifugasi  kembali pada  6000  rpm  selama  10  menit.  Endapan  yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam WFI hingga volume mencapai 20mL dan ditentukan kandungan total protein menggunakan Microplate spektrofotometer serta kandungan albumin menggunakan SDS-PAGE.
Rentang  konsentrasi  larutan  standar  dibuat bervariasi dari 25 – 2000 µg/mL. campuran 25 mL reagen A dan 0,5 mL reagen B digunakan sebagai blanko pelarut. Pengukuran serapan menggunakan microplate  reader  pada  panjang  gelombang  562 nm dengan cara mengambil 25 µL masing masing larutan  standar  dan  200  µL  blanko  pelarut kedalam  masing  masing  sumur  microplate. Setelah  dihomogenkan  dengan  shaker  30  detik, microplate  ditutup  dan  diinkubasi  pada  37  ℃ selama  30  menit.  Pembacaan  serapan  dilakukan setelah  setiap  larutan  standar  didinginkan  pada suhu kamar.
Sebanyak  15  µL  setiap  variasi  larutan endapan protein sampel dalam WFI ditambahkan 12,4  µL  buffer  sampel  dalam  wadah  eppendorf, kemudian dipanaskan pada suhu 100 ℃ selama 2 menit.  Setelah  didinginkan,  10  µL  setiap  variasi larutan  sampel  dimasukkan  kedalam  masing masing  sumur  gel  pada  alat  elektroforesis  secara hati hati.
Setelah
perangkat elektroforesis dihubungkan dengan arus listrik 120 V selama 60 menit, gel dilepaskan dan direndam dalam 50mL larutan  pewarna  sambal  dikocok  30  menit. Berikutnya dilakukan pencucian tiga kali ulangan masing  masing  menggunakan  50  mL  larutan pencuci  sambil  dishaker  30  menit.  Setelah direndam  dalam  WFI,  albumin  diukur  dengan densitometer  yaitu  dengan  cara  dilakukan scanning  gel  menggunakan  alat  View  fix  700. Data yang diperoleh dianalisis secara densitometri dan hasilnya diolah dengan perangkat lunak total lab untuk mendapatkan nilai respon albumin. Nilai respon  ini  selanjutnya  diolah  dan  dievaluasi dengan  menggunakan  perangkat  lunak  Design Expert  10.0  berdasarkan  metode simplex  lattice design .

## 3 Hasil dan Diskusi
Pengendapan  albumin  dalam  plasma  darah dipengaruhi oleh beberapa parameter, diantaranya suhu, pH dan konsentrasi etanol. Albumin dalam plasma  darah  diendapkan  dengan  metode fraksinasi  etanol,    menggunakan  tujuh  formula yang diperoleh dari metode simplex lattice design dengan  masing  –  masing  nilai  parameter  yang berbeda.
Menurut  Bolton  dan  Bon,  2004, simplex lattice design secara umum terdiri dari serangkaian formula dan memvariasikan komposisi  variabel  formula  secara  sistematis. Variasi nilai parameter digunakan untuk mendapatkan  hasil  albumin  yang  optimal  dari proses  pengendapan  yang  dilakukan  dalam  satu tahap  pada  penelitian  [8],  berbeda  dengan penelitian  yang  dilakukan  Cohn  1946,  Tanaka 1998,  dan  Denizli  2011  yang  dilakukan  dengan memisahkan plasma darah dalam beberapa tahap pengendapan  [3-5].  Komposisi  variasi  yang dimaksud  untuk  kepentingan  pengolahan  data dengan metode smplex lattice design dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Variasi Penelitian Formula Parameter Suhu (℃) pH [Etanol] (%) Formula 1 0 3,8 20 Formula 2 -10 5,8 20 Formula 3 -10 3,8 60 Formula 4 -5 4,8 20 Formula 5 -10 4,8 40 Formula 6 -5 3,8 40 Formula 7 -3.3 4,5 46 Table 2. Kandungan protein dalam setiap formula Formula Replikasi [Protein] (µg/mL) Formula 1 1 891,252 2 838,777 Formula 2 1 398,702 2 402,073 Formula 3 1 574,348 2 557,364 Formula 4 1 586,092 2 533,001 Formula 5 1 1194,913 2 1199,676 Formula 6 1 870,244 2 982,391 Formula 7 1 1320,788 2 1171,401
Plasma  darah  diendapkan  dan  dilakukan pengukuran kadar protein total untuk mengetahui kadar  protein  dalam  sampel  masing  –  masing formula  penelitian,  hasil  pengukuran  tersebut kemudian dijadikan data untuk pengujian Sodium
Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel
Electrophoresis (SDS-PAGE). Kadar protein total dalam masing masing formula dapat dilihat pada Tabel 2.
Gambar 1. Pembentukan kompleks warna ungu menggunakan reagen bicinchoninic acid (BCA) [10]
Gambar 2.    Hasil scaning Gel Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel  Electrophoresis (SDS- PAGE) dengan Viewpix 700.
Keterangan : Formula 1 ; 1 dan 8, Formula 2 ; 2 dan 9, Formula 3 ; 3 dan 10, Formula 4 ; 4 dan 11, Formula 5 ; 5 dan12, Formula 6 ; 6 dan 13, Formula 7 ;  7 dan 14, serta Protein ladder ; 15
-- OOC -- OOC COO -- COO -- BCA – Cu + Complex Cu + +  BCA Protein + Cu +2 Cu + OH -- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10  11 12 13  14  15 14
Albumin
Gambar 3.   Hasil  analisis Gel Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS- PAGE) dengan aplikasi totallab.
Keterangan : Formula 1 ; 1 dan 8, Formula 2 ; 2 dan 9, Formula 3 ; 3 dan 10, Formula 4 ; 4 dan 11, Formula 5 ; 5 dan12, Formula 6 ; 6 dan 13, Formula 7 ;  7 dan 14, serta Protein ladder ; 15
Pengukuran protein total metode bicinchoninic  acid  (BCA),  berdasarkan  pada konversi  Cu 2+ menjadi  Cu + dalam  kondisi  basa. Protein  akan  bereaksi  dengan  CuSO 4 dalam suasana  basa  menghasilkan  Cu + kemudian dideteksi dengan reagen bicinchoninic acid (BCA) yang  stabil  dalam  kondisi  basa  seperti  dalam Gambar 1. Hasil reaksi ialah terbentuknya warna ungu yang dapat diukur pada panjang gelombang 562  nm,  Cu + yang  terbentuk  dalam  uji menunjukan konsentrasi protein [9].
Sodium  Dodecyl  Sulphate  -  Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) adalah metode yang  digunakan  untuk  menganalisis  campuran protein,  berdasarkan  pada  pemisahan  protein sesuai  ukuran  molekul  [9].  Data  hasil  scanning formula  sampel  menggunakan  alat  Viewfix  700 dapat dilihat pada Gambar 2. Dan pada Gambar 3 menunjukkan  data  hasil  scanning  kemudian dianalisis  dengan  aplikasi  Totallab  untuk memperlihatkan hasil ukuran molekul.
Berdasarkan  data  protein  ladder  yang dijadikan  sebagai  pemandu,  albumin  memiliki ukuran  molekul  66.000  Dalton,  hasil  pemisahan plasma protein pada gel elektroforesis menunjukkan  albumin  berada  diantara  ukuran molekul 63.000 dan 75.000 Dalton.
Hasil  pengukuran  konsentrasi  albumin dengan  densitometer  untuk  setiap  komposisi formula yang dirancang dapat dilihat pada Tabel 3.
Berdasarkan hasil pengolahan data menggunakan  analisis  varian  menggunakan perangkat  lunak  Design  Expert  diperoleh  nilai  p sebesar 0,0282 (< 0,05) dan nilai F hitung 4,88 (> 3,87: Ftabel (db 6,7; 95%)) hal ini menunjukkan terdapat  perbedaan  hasil  albumin  yang  nyata diantara komposisi formula dalam penelitian yang dirancang.
Dari  hasil  analisis  simplex  lattice  design untuk  albumin,  kemudian  dibuat  contour  plot seperti tampak pada Gambar 4. Notasi pada setiap sudut  segitiga  menunjukan  nilai  maksimal  untuk setiap  parameter.  Notasi  A  pada  gambar  segitiga menunjukan suhu pada 0 ᵒC, Notasi B menunjukan pH pada 5,8 dan Notasi C menunjukan konsentrasi etanol  60%.  Pada  Gambar  tersebut  menunjukan daerah  optimal  untuk  respon  albumin  yang ditandai  dengan  warna  kuning  pada  gambar. Daerah optimal tersebut berada diantara parameter pH dan konsentrasi etanol.
Hal ini pun menunjukan hasil yang signifikan antar parameter penelitian, dari tiga variabel yang digunakan;  pH,  konsentrasi  etanol,  dan  suhu,
180.000 Dalton Ukuran Molekul 63.000 Dalton 48.000 Dalton 35.000 Dalton 25.000 Dalton 20.000 Dalton 100.000 Dalton 245.000 Dalton 17.000 Dalton 11.000 Dalton 75.000 Dalton 135.000 Dalton Albumin
parameter  pH  dan  konsentrasi  etanol  memiliki pengaruh yang lebih  besar pada  proses pengendapan  albumin  dibanding  dengan  suhu. Suhu yang digunakan selama proses pengendapan antara  0℃  sampai  -10℃  untuk  menjaga  agar
protein  tidak  terjadi  denaturasi.  Suhu  rendah selama  proses  pengendapan  menurut  Oss,  1989 membantu  menurunkan  konstanta  dielektrik protein  dengan  etanol,  sehingga  menyebabkan berkurangnya kelarutan protein [11].
Tabel 3.  Hasil Respon Albumin Formula Parameter Respon Albumin (µg) Rata-Rata Respon Albumin (µg) Suhu (℃) pH [Etanol] (%) Formula 1 0 3,8 20 42,252 39,724 37,196 Formula 2 -10 5,8 20 45,614 42,160 38,705 Formula 3 -10 3,8 60 49,777 46,262 42,746 Formula 4 -5 4,8 20 41,164 41,275 41,385 Formula 5 -10 4,8 40 57,497 53,590 49,683 Formula 6 -5 3,8 40 33,843 35,476 37,108 Formula 7 -3.3 4,5 46 50,959 48,842 46,725
Gambar 4. Contour plot respon albumin
Setiap  protein  mempunyai  daya  kelarutan yang  berbeda  –  beda  dalam  air  atau  pelarut organik.  Albumin  memiliki  beberapa  sifat  unik yang memungkinkan pemisahan relatif sederhana dan efektif dengan metode pengendapan. Albumin memiliki  kelarutan  tinggi  dan  titik  isoelektrik terendah  [1].  Titik  isoelektrik  yaitu  dimana  pH
protein  menunjukan  jumlah  muatan  yang  sama antara  muatan  positif  dan  negatif,  sehingga  pada keadaan ini kemampuan protein untuk berinteraksi  dengan  molekul  air  menjadi  rendah dan  mengakibatkan  daya  larut  protein  menjadi minimum  [12].  Pengendapan  protein  dapat dilakukan berdasarkan pada pengaturan pH, setiap
A: Suhu 1 B: pH 1 C: Kons. Etanol 1 0,5 0,5 0,5 Respon Albumin (µg)
jenis  protein  memiliki  pH  yang  berbeda  dalam proses pengendapan, sehingga tidak semua protein dapat  diendapkan  dalam  suasana  pH  yang  sama. Pada umumnya molekul protein mempunyai daya kelarutan minimum pada pH atau titik isoelektriknya. Pada titik isoelektriknya beberapa protein  akan  mengendap  dari  larutan,  sehingga dengan cara pengaturan pH, larutan protein dalam campuran dapat dipisahkan satu dari yang lainnya [13].
Cohn, et  al., 1946  pada  penelitiannya menggunakan  lima  tahap  proses  pengendapan albumin  dengan  penurunan  pH  dan  kenaikan konsentrasi  etanol  pada  setiap  tahapnya,  dalam penelitiannya  Cohn  memperoleh  albumin  pada tahap  kelima  dengan  pH  4,8,  rentang  pH  yang digunakan Cohn yakni 4,4 sampai 7,4.  Sedangkan pada penelitian ini bermaksud untuk memperoleh albumin  dari  satu  tahap  pengendapan  dengan rentang  pH  yang  digunakan  antara  pH  3,8  –  5,8 bertujuan untuk mencari pH optimal dalam proses pengendapan  [5].  Menurut  Wirahadikusumah, 2012, nilai pH terendah protein adalah kurang dari satu  yaitu  pepsin  dan  nilai  pH  tertinggi  11  yaitu lisozim,  albumin  pada  plasma  darah  dapat dipisahkan dari protein lain dengan mengatur pH atau titik isoelektrik larutan pada pH 4,9 keadaan di mana daya larut protein minimum [13].
Penambahan  pelarut  organik,  seperti  etanol kedalam larutan protein akan mengubah konstanta dielektrika  air  yang  menyebabkan  berkurangnya kelarutan protein, sehingga dapat mengakibatkan protein  mengendap  [13].  Menurut  Michnik  & Drzazga,  2007,  struktur,  kestabilan,  dan  fungsi protein  dapat  dipengaruhi  oleh  interaksi  dengan etanol  [14].  Dua  efek  utama  etanol  pada  protein adalah destabilisasi struktur tersier dan stabilisasi struktur  sekunder.  Pada  struktur  tersier  protein terdapat  empat  jenis  interaksi  yang  membentuk ikatan pada protein, yaitu ikatan hidrogen, ikatan ionik, ikatan kovalen dan ikatan hidrofobik yang memungkinkan  salah  satu  ikatan  menjadi terganggu  karena  adanya  etanol.  Dari  studi Differential Scanning Calorimetry (DSC), menyimpulkan  bahwa  etanol  dapat  secara sederhana mampu menembus molekul protein dan mengganggu  kestabilan  protein.  Etanol  akan berinteraksi  dengan  molekul  air  yang  ada  pada protein,  sehingga  terjadi  proses  pengikatan molekul  air  oleh  etanol  membentuk  ikatan hidrogen, mengakibatkan protein mengendap.
Tanaka, et  al. ,  1998,  dalam  penelitiannya menggunakan  konsentrasi  etanol  20%  pada  saat pengendapan  dan  selanjutnya  menggunakan metode  kromatografi  cair  untuk  mendapatkan
albumin  [4].  Sedangkan  Cohn  menggunakan rentang  konsentrasi  etanol  0  –  53,3%,  dalam penelitian  ini  konsentrasi  etanol  60%  digunakan bertujuan  untuk  mengetahui  apakah  pada konsentrasi  tersebut  albumin  masih  dapat diendapkan, sehingga digunakan rentang konsentrasi etanol antara 20 – 60% [5].

## 4 Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  analisis  data  penelitian, pada  parameter  suhu  –10  ℃,  pH  4,8  dan konsentrasi etanol 40% atau komposisi formula 5 diperoleh  hasil  respon  albumin  yang  optimal dengan  rata  -    rata  respon  albumin  53,590  µg dibandingkan  dengan  rata  –  rata  komposisi formula yang lain.

## Daftar Pustaka
[1] Matejtschuk, P., Dash, C. H. & Gascoigne, E. W., 2000. Production of Human albumin solution:  a  continually  developing  colloid. Bristish Journal  of  Anaesthesia,  6(85),  pp. 887 - 95.
[2] Kemenristek,  2015.  Membedah  Industri Albumin  dari  Segala  Aspek.  [Online] Available at: http://www.ristek.go.id
[Diakses 04 11 2015].
[3] Denizli,  A.,  2011.  Plasma  fractination  : conventional and chromatographic methods for albumin purification. Hacettepe J. Biol & Chem, Volume 39 (4), pp. 315 - 341.
[4] Tanaka,  k;  Shigueoka,  E.M;  Sawatani,  E; Dias, G. A; Arashiro, F; Campos, T.C.X.B; Nakao, H.C., 1998. Purification of Human albumin by the combination of the method of  cohn  with  liquid  chromatography. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, Vol 31(11), pp. 1382 - 1388.
[5] Cohn,  E.  J.,  Strong,  L.E.,  Hughes,  W.L., Mulford,  D.J.,  Ashworth,  J.N.,  Melin,  M., dan  Taylor,  H.L.,  1946.  Preparation  and Properties  of  Serum  and  Plasma  Proteins. Harvard  Medical  School,  Volume  68,  pp. 459 - 475.
[6] Prajapati, S. T., Patel, L. D. & Patel, C. N., 2011. Floating matrix tablets of domperidone: formulation and optimization using simplex lattice design. Thai J. Pharm, 10(3) pp. 113 - 122.
[7] Bio-Rad,  2012.  A  Guide  of  Polyarilamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulleten 6040 Rev B.
[8] Bolton, S. & Bon, C., 2004. Pharmaceutical
Statistic Practical and Clinical Applications.  4th.  New  York:  MARCEL DEKKER, INC
[9] Walker, J. M., 2002. The Protein Protocols Handbook. II. New Jersy: Humana Press.
[10] Smith, P K; Krohn, R I; Hermanson, G T; Mallia, A K; Gartner, F H; Provenzano, M D; Fujimoto, E K; Goeke, N M; Olson, B J; Klenk, D C., 1985. Measurement of Protein Using  Bicinchoninic  Acid.  Analytical Biochemistry, Volume 150, pp. 76 - 85.
[11] Oss, C. J. V., 1989. On the Mechanism of the  cold  ethanol  precipitation  method  of
plasma  protein  fractionation.  Journal  of protein chemistry, 8(5), pp. 661-668.
[12] Buxbaum,  E.,  2007.  Fundamentals  of Protein Structure and Function. Dominica: Springer.
[13] Wirahadikusumah,  M.,  2012.  Biokimia protein, enzim dan asam nukleat. Bandung: ITB.
[14] Michnik, A. & Drzazga, Z., 2007. Effect of ethanol  on  the  thermal  stability  of  human serum albumn. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, Volume 88, pp. 449-454.