## Identifikasi dan pencegahan kontaminasi pada kultur cair sistem perendaman sesaat
Identification and prevention of  contamination in liquid culture of temporary immersion system
Masna Maya SINTA*), Imron RIYADI & SUMARYONO
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No.1, Bogor 16128, Indonesia
Diterima tanggal 27 Juni 2014/disetujui tanggal 8 Oktober 2014

## Abstract
Liquid  culture  is  commonly  used  to  scale  up  in  vitro culture production as well as to optimize the developmental phase  of  plant  in  vitro  culture.  One  of  the  liquid  cultures that  has  been  used  widely  is  temporary  immersion  system (TIS). The main problem of liquid culture is contamination. The use of antibiotics sometimes controls the contaminants less effectively and hinders the growth of plant culture. The purpose  of  this  research  was  to  determine  sources  of contaminant  on  whole  sequence  of  TIS  to  identify  and  to prevent  the  emergence  of  the  contaminants.  Sampling method was applied to each section and stage of TIS culture and  the  contaminants  found  were  identified.  The  results revealed  that  compartment  of  TIS  was  the  main  source  of contaminant  (100%).  Furthermore,  from  all  components of TIS  compartment,  washer  (a  small  ring  seal  connecting screen  disc  and  basket)  was  the  main  source  of  TIS contaminant  (41.2%).  Four  contaminants  found  were identified  as Bacillus  macerans,  Bacillus  megaterium, Bacillus  sphaericus and Bacillus  firmus .  Two  times sterilization  of  washer  in  an  autoclave  at  temperature  of 121 o C and  air  pressure of 1  kg/cm 2 for 20  minutes  before and after being installed reduced the contamination level on TIS culture significantly.
[ Keywords: In-vitro culture,  bacterial  contamination, sterilization method, Bacillus spp. ]

## Abstrak
Kultur  cair  umumnya  digunakan  untuk  meningkatkan skala  produksi  dan  mengoptimalkan  fase  perkembangan kultur in  vitro tanaman.  Salah  satu  jenis  kultur  cair  yang banyak  digunakan  adalah  sistem  perendaman  sesaat  (SPS). Masalah  utama  dalam  kultur  cair  adalah  kontaminasi. Penggunaan antibiotika terkadang kurang efektif dalam me- ngendalikan  kontaminan  dan  menghambat  pertumbuhan kultur  tanaman.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui  sumber  kontaminan  pada  seluruh  rangkaian kultur SPS serta mengidentifikasi dan mencegah munculnya kontaminan  tersebut.  Metode  yang  digunakan  adalah pengambilan  contoh  pada  tiap  bagian  dan  fase  kultur  SPS, serta  kontaminan  yang  ditemukan  kemudian  diidentifikasi. Hasil  penelitian  memperlihatkan  bahwa  kompartemen  SPS merupakan sumber utama kontaminan (100%). Selanjutnya, dari  seluruh  komponen  kompartemen  SPS, washer (cincin penutup  yang  menghubungkan penyaring dan keranjang) di dalam rangkaian SPS merupakan sumber utama kontaminan (41,2%).  Empat  kontaminan yang ditemukan diidentifikasi sebagai Bacillus  macerans,  Bacillus  megaterium,  Bacillus sphaericus dan Bacillus  firmus. Sterilisasi  cincin  penutup sebanyak  dua  kali dalam  autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan  udara  1  kg/cm 2 selama  20  menit  sebelum  dan
sesudah  dirangkai  secara  nyata  menurunkan  tingkat  konta- minasi pada kultur SPS.
[Kata  kunci:  Kultur in-vitro, kontaminasi  bakteri,  metode sterilisasi, Bacillus spp.]

## Pendahuluan
Kontaminasi oleh  mikroba  merupakan salah satu masalah serius dalam kultur in vitro tanaman (Leifert &  Cassells,  2001)  dan  merupakan  penyebab  utama hilangnya kultur tanaman. Upaya untuk meningkatkan skala  produksi  ( scaling  up )  kultur in  vitro tanaman seringkali  terhambat  oleh  adanya  kontaminasi mikroba.  Berbagai  jenis  mikroorganisme  (fungi, kapang,  bakteri,  virus,  dan  viroid)  dan  mikroantro- poda  (tungau  dan  trips)  telah  diidentifikasi  sebagai kontaminan  dalam    kultur    jaringan  tanaman  (Leifert & Cassells, 2001).
Peningkatan  skala  produksi  kultur in  vitro tanaman  umumnya  dilakukan  pada  media  cair,  baik dalam  labu  Erlenmeyer,  sistem  perendaman  sesaat (SPS)  maupun  bioreaktor.    Kontaminasi  merupakan salah  satu  masalah  utama  dalam  penggunaan  media cair.  Satu  bejana  berkapasitas  satu  liter  media  cair mampu menampung ratusan sampai ribuan propagula sehingga  kehilangan  yang  dialami  sangat  merugikan. Pada  medium  padat  terkadang  mikroba  kontaminan bersifat laten namun akan muncul ketika berada pada medium  cair  yang  memiliki  lingkungan  yang  sesuai untuk  pertumbuhannya.  Salah  satu  jenis  kultur  cair yang banyak digunakan dalam kultur in vitro tanaman adalah  SPS.  Kultur  SPS  memungkinkan  eksplan memperoleh  nutrisi  yang  cukup  ketika  eksplan  te- rendam  dalam  media,  serta  memperoleh  aerasi  yang baik.  Pencegahan  kontaminasi  mikroba  pada  kultur cair SPS lebih sulit dibandingkan dengan kultur padat karena  peralatan  yang  digunakan  lebih  kompleks. Alat  SPS  terdiri  dari  dua  wadah  yaitu  wadah  bawah sebagai  tempat  medium  cair  dan  wadah  atas  sebagai tempat propagula.  Pompa menekan udara luar masuk melalui   selang  ke  dalam  wadah bawah mendorong medium  ke    wadah  atas  dan  merendam  propagula selama  jangka  waktu  tertentu.  Setelah  waktu  peren- daman  selesai  aliran  udara  yang  masuk  ke  wadah berhenti  dan  medium  turun  ke  wadah  bawah  karena gravitasi.  Udara  masuk  dan  keluar  wadah  melalui filter untuk mencegah masuknya kontaminan. Adanya aliran udara dari dan keluar medium menyebabkan
Identifikasi dan pencegahan kontaminasi pada kultur cair…………… (Sinta et al .)
terjadinya  kontaminasi  pada  SPS  lebih  besar  diban- dingkan  pada  kultur  padat  yang  statis.    Di  bioreaktor kabut  yang prinsip kerjanya  mirip dengan SPS, fungi dan  bakteri  dapat  bergerak  dari  wadah  medium  dan generator  pengkabutan  ke  dalam  ruang  tanam  tempat propagula  yang  akan  menimbulkan  kontaminasi  tiga sampai  tujuh  hari  kemudian  (Sharaf-Eldin  & Weathers, 2006).
Pencegahan  terhadap  kontaminasi  harus  dilaku- kan sebelum pembuatan kultur  karena apabila kultur cair  diketahui  terkontaminasi,  penanggulangannya sudah terlambat.  Sterilisasi dalam autoklaf dilakukan terhadap  alat  dan  medium.    Penambahan  fungisida, bakterisida,  antibiotika,  dan  biosida  lain  ke  dalam medium  dapat  dilakukan  untuk  mencegah  timbulnya kontaminasi.  Berdasarkan  pengamatan  hasil  kultur SPS pada beberapa tanaman di Laboratorium Biak Sel dan  Mikropropagasi,  Balai  Penelitian  Bioteknologi Perkebunan  Indonesia  periode  2009-2014,  ditemukan kontaminasi  bakteri  cukup  tinggi  yaitu  antara  lain 27,5%  pada  kelapa  sawit,  30%  pada  sagu,  dan  25% pada  tebu.  Untuk  menanggulangi  kontaminasi  pada kultur SPS kelapa sawit, maka ditambahkan antibiotik rifampisin  15  mL/L  dan  tetrasiklin  15  mL/L  pada media,  tetapi  masih  terjadi  kontaminasi  oleh  bakteri sebesar  5%,  dan  penambahan  antibiotika  tersebut dapat  menurunkan  perkembangan  kultur  sawit (Sumaryono et  al .,  2010).  Penggunaan  antibiotika yang  tidak  tepat  akan  mempengaruhi  pertumbuhan planlet,  sedangkan  pemaparan  kultur    terhadap  anti- biotika  yang  terlalu  lama  dapat  menyebabkan kematian  (Wojtania  &  Pulawska,  2005).  Penggunaan erythromycin,  ciprofloxacin  dan  sulfamethoxazole secara signifikan menurunkan pertumbuhan, kandung- an  klorofil  dan  laju  fotosintesis  pada  kultur Sele- nastrum capricornutum (Liu et al ., 2011).
Salah  satu  bahan  biosida  yang  banyak  digunakan dalam  kultur  cair  adalah  golongan  isotiazolon  dalam bentuk Plant  Preservative  Mixture (PPM)  (Sharaf- Eldin & Weathers, 2006).  PPM terdiri dari campuran metilkloroisotiazolinon  dan  metilisotiazolinon.  PPM merupakan  biosida  dengan  spektrum  yang  lebih  luas dibandingkan  dengan  antibiotika  lainnya  dan  relatif tahan  terhadap  suhu  tinggi  sehingga  dapat  diberikan ke  dalam  medium  sebelum  diautoklaf.    Walaupun demikian, keefektifan senyawa biosida dalam mengendalikan  kontaminan  mikroba  tidak  dianjurkan apabila  dapat  menghambat  pertumbuhan  propagula. Oleh  karena  itu  tujuan  penelitian  ini  adalah menetapkan  sumber  terjadinya  kontaminasi  pada seluruh  rangkaian  kultur  SPS  serta  mengidentifikasi dan mencegah munculnya kontaminan tersebut.

## Bahan dan Metode

## Waktu dan tempat penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan  Juni-Oktober 2014  di  Laboratorium  Biak  Sel  dan  Mikropropagasi,
Balai  Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan  Indonesia, Bogor.

## Alat dan bahan deteksi
Alat  dan  bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  antara  lain:  pinset  dan  spatula  sendok  yang disterilisasi  dengan  cara  dibakar  dalam  bunsen; media, millipore filter 0,2 µm dan kompartemen  SPS yang  disterilisasi  dengan  dimasukkan  ke  dalam autoklaf    pada  suhu  121 o C  dan  tekanan  udara 1  kg/cm 2 selama  20  menit;  dan laminar  air  flow (LAF) cabinet yang  disterilisasi  dengan  sinar  UV selama 45  menit. Kompartemen  SPS  yang digunakan adalah  SPS  RITA ® (Etienne  &  Berthouly,  2002) dengan  ukuran  diameter  12,5  cm  dan  tinggi  15  cm. Eksplan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah kalus friable karet  klon  PB  260.  Media  pendeteksi kontaminan  adalah  media Nutrient  Agar (NA) yang disterilisasi  dalam  autoklaf  pada  suhu  121 o C  dan tekanan udara 1 kg/cm 2 selama 20 menit.

## Penentuan sumber kontaminan
Penentuan  sumber  kontaminan  dilakukan  secara bertahap.    Tahap  pertama  dilakukan  untuk  menentu- kan sumber kontaminan sesuai alur kerja kultur SPS. Untuk  mengetahui  sumber  kontaminan  bakteri  pada kultur in  vitro ,  dilakukan  pengambilan  contoh ( sampling )  pada  tiap  bagian  proses  kultur  yang dilakukan.  Titik  pengambilan  contoh  yang  diambil antara  lain:  peralatan  kultur  (pinset  dan  spatula sendok), LAF  cabinet ,  media,  eksplan,  kompartemen SPS,  udara  dalam  SPS,  pelaksana  kultur,  serta lingkungan sekitar SPS berada.
Pengambilan  contoh  peralatan  kultur  dilakukan dengan  menggoreskan  bagian  tersebut  pada  media NA.    Pengambilan  contoh  LAF  dilakukan  dengan meletakkan media NA pada LAF selama empat menit (karena  proses  kultur  pada  SPS  rata-rata  dilakukan selama  empat  menit).  Pengambilan  contoh  media dilakukan  dengan  menuang  sedikit  media  setelah diautoklaf  pada  media  NA  (metode pour  plate ). Pengambilan  contoh  eksplan  dilakukan  dengan mengkultur  eksplan  pada  media  NA.  Pengambilan contoh  kompartemen  SPS  dilakukan  dengan  meng- gores  bagian-bagian  kompartemen  SPS  dengan menggunakan  jarum  ose  steril  kemudian  digoreskan pada  media  NA  (streak).  Pengambilan  contoh  udara dalam  SPS  dilakukan  dengan  meletakkan  media  NA di dalam kompartemen SPS yang dioperasikan secara normal. Pengambilan contoh pelaksana kultur dilaku- kan  dengan  menggores  ujung  jari  dengan  jarum  ose steril  kemudian  digoreskan  pada  media  NA. Pengambilan  contoh  dilakukan  sebanyak  sembilan kali  dengan  tiga  ulangan  waktu.  Contoh  kemudian diinkubasi  pada  suhu  ruangan.  Penentuan  sumber kontaminan  tahap  dua  dilakukan  untuk  memperinci lebih  lanjut  bagian  dari  sumber  kontaminan  hasil
tahap 1 yakni kompartemen SPS. Pengambilan contoh dilakukan  dengan  melepaskan  setiap  bagian  kompar- temen  SPS,  kemudian  menggores  bagian-bagian tersebut  kembali  pada  media  NA.    Media  NA  berisi hasil pengambilan contoh selanjutnya diinkubasi pada suhu ruangan selama satu minggu.

## Isolasi dan identifikasi kontaminan
Kontaminan  yang  tumbuh  pada  media  NA  hasil pengambilan  contoh  kemudian  diisolasi  berdasarkan perbedaan  warna  koloni  yang  muncul.  Kontaminan yang  telah  diisolasi  tersebut  kemudian  diidentifikasi di  Balai  Besar  Penelitian  Veteriner,  Bogor.    Metode identifikasi  yang  digunakan  berdasarkan  karakter morfologi serta uji biokimia yang dicocokkan dengan panduan Bergey’s  Manual  of  Systemic  Bacteriology (Holt, 1994).

## Pencegahan kontaminasi
Pencegahan kontaminasi dikhususkan pada bagian utama sumber kontaminan berdasarkan deteksi kontaminan  tahap  1  dan  2.  Pencegahan  kontaminasi dilakukan  secara  fisik  dengan  perlakuan  (1)  kontrol yakni  sterilisasi  pada  autoklaf  setelah  dirangkai,  (2) sterilisasi  menggunakan  sinar  UV  dengan  panjang gelombang  245  nm  selama  45  menit  lalu  diautoklaf, (3) sterilisasi  dengan   diautoklaf   terpisah   sebelum dirangkai dan  diautoklaf  kembali  setelah  dirangkai, dan  (4)  sterilisasi    dengan    direndam    dalam    larutan alkohol 70% selama 10  menit sebelum dirangkai  lalu diautoklaf.  Deteksi  efektifitas  sterilisasi  dilakukan dengan  metode  pengambilan  contoh  dan  contoh dikultur pada media NA.

## Analisis statistik
Data  hasil  pengamatan  dianalisis  dengan  sidik ragam ( analysis of variance ).  Apabila ada perbedaan
yang  nyata  maka  perbedaan  antar  perlakuan ditentukan  menurut  uji  jarak  berganda  Duncan  pada P=0,05.

## Hasil dan Pembahasan

## Sumber kontaminan
Penentuan sumber kontaminan tahap 1 dilakukan dengan  pengambilan  contoh  pada  peralatan,  eksplan yang  digunakan,  ruang  kultur  dan  pelaksana  kultur SPS.  Hasil  pengambilan  contoh  yang  kemudian dikulturkan  pada  media  NA  menunjukkan  bahwa kompartemen  SPS  merupakan  sumber  kontaminan utama  dengan  tingkat  kontaminasi  mencapai  100% (Tabel 1).  Proses kultur in vitro terdiri dari beberapa tahap pelaksanaan yang melibatkan beberapa komponen, sehingga memungkinkan terjadinya konta- minasi.  Komponen  tersebut  antara  lain:  peralatan kultur,  media  kultur,  eksplan,  ruang  penanaman, pelaksana  kultur  serta  ruang  kultur.  Berdasarkan penelitian  ini  sumber  kontaminan  utama  berasal  dari kompartemen  SPS  (100%  terkontaminasi).  Udara  di dalam  kompartemen  SPS  juga  menimbulkan  konta- minasi  sebesar  33,3%,  sedangkan  contoh  lainnya bukan  merupakan  sumber  kontaminan.  Peralatan kultur, ruang LAF, media, eksplan kalus embriogenik karet,  pelaksana  kultur    dan    lingkungan   sekitar kompartemen  SPS  menunjukkan  tingkat  kontaminasi yang rendah (0  - 11,1%), sehingga  bukan  merupakan sumber kontaminasi.
Kompartemen  SPS  terdiri  dari  12  komponen utama  yaitu  dua  saluran  udara (air  vent ),  filter  udara dengan ukuran lubang 2,5 µm ( millipore filter ), tutup ( cap ),  segel  tutup  ( cap  O  ring ),  segel  tabung  ( tube O  ring ),  tabung  tengah (central  tube ),  penyaring ( screen  disc ),  cincin  penutup  ( washer ),  keranjang ( basket ),  lonceng  ( bell ),  dan  wadah (vessel )  (Gambar 1a).  Komponen  tersebut  disusun  secara  berurutan
Tabel 1. Sumber kontaminan pada kultur in vitro tahap 1.
Table 1. Source of contamination in in vitro culture at phase 1.
Titik pengambilan contoh ( Sampling point)
Tingkat kontaminasi Contamination level (%) Kontrol ( control) 0 c *) Pinset (forcep) 0 c Spatula dengan sendok (spatula with spoon) 0 c Laminar air flow cabinet 11,1 bc Media (medium) 11,1 bc Eksplan kalus karet (explant of rubber callus) 0 c Kompartemen SPS (TIS compartment) 100 a Udara di dalam SPS ( air inside TIS) 33,3 b Pelaksana kultur (lab workers) 0 c Lingkungan sekitar SPS (surrounding TIS) 0 c
*) Rerata pada kolom yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan pada P= 0,05.
*) Means on column followed by the same letters are not significantly different according to Duncan’s multiple range test at P= 0.05.
Identifikasi dan pencegahan kontaminasi pada kultur cair…………… (Sinta et al .)
menjadi satu kesatuan seperti terlihat pada Gambar 1b dan  dibungkus  kertas  sebelum  disterilisasi  dalam autoklaf.
Penentuan  sumber  kontaminan  tahap  2  dilakukan untuk  menentukan  lebih  rinci  sumber  utama  konta- minan (berdasarkan hasil tahap 1), sehingga pengam- bilan  contoh  hanya  dilakukan  pada  kompartemen SPS.  Pengambilan  contoh  pada  setiap  komponen kompartemen  SPS  memperlihatkan  bahwa  sumber kontaminan  utama  pada  kultur  SPS  terdapat  pada cincin  penutup  ( washer ),  yang  menghubungkan panyaring dan keranjang, dengan tingkat kontaminasi sebesar 41,6% (Tabel 2).  Tingkat  kontaminasi pada cincin penutup tersebut berbeda  nyata dengan tingkat kontaminasi  pada  bagian  komponen  lainnya  ber- dasarkan  uji  jarak  berganda  Duncan.  Cincin  penutup ketika  dirangkaikan  akan  berada  tepat  di  tengah kompartemen  SPS,  sehingga  kemungkinan  ketika proses  sterilisasi  tekanan  udara    1  kg/cm 2 dan  uap panas  dengan  suhu  121  °C  dalam  autoklaf  kurang efektif menjangkaunya.
Hasil  identifikasi  kontaminan  yang  diisolasi  dari media  NA  menunjukkan  terdapat  empat  jenis  bakteri yang  menyebabkan  kontaminasi  yaitu Bacillus macerans,  Bacillus  megaterium,  Bacillus  sphaericus dan Bacillus firmus . Genus Bacillus mampu tumbuh
dengan  baik  pada  suhu  10-50  °C  dan  membentuk endospora  yang  dikenal  tahan  terhadap  panas. Karakter  utama  dari  bakteri  genus Bacillus adalah adanya  endospora.  Resistensi  endospora Bacillus lebih  tinggi  dibandingkan  sel  vegetatifnya.    Spora B.  megaterium dan B.  sphaericus mampu  bertahan hingga  suhu  120 o C    (Jantova  &  Lukasova,  2001). Lokasi  cincin  penutup  pada  rangkaian  SPS  yang tersembunyi  serta  ketahanan  endospora  bakteri kontaminan pada suhu tinggi menyebabkan timbulnya kontaminasi pada kultur SPS.

## Pencegahan kontaminasi
Pencegahan  kontaminasi  pada  SPS  dilakukan dengan  perbaikan  sistem  sterilisasi  sumber  konta- minan  utama  pada  kompartemen  SPS  yaitu  cincin penutup  ( washer ).  Berdasarkan  beberapa  perlakuan sterilisasi, pencegahan kontaminasi SPS paling efektif adalah  dengan  sterilisasi  cincin  penutup  diautoklaf sebanyak  dua  kali  yaitu  sebelum  dirangkai  (terpisah) dengan  memasukkan  cincin  pada  botol  jam,  dan setelah  dirangkai  bersama  komponen  SPS  lainnya (Gambar 2).  Sterilisasi cincin penutup secara terpisah dalam  autoklaf  sebelum  dirangkai  kemudian  di- autoklaf  kembali  setelah  dirangkai  pada  kompar- temen SPS mampu mengurangi tingkat kontaminasi
Gambar 1. Rangkaian kompartemen SPS, a) Komponen penyusun kompartemen SPS, b) Kompartemen SPS yang telah dirangkai .
Figure 1.  Series of TIS compartment, a) Components of TIS compartment, b) TIS compartment has been assembled.
(b)
(a)

## Tabel 2. Sumber kontaminan pada kompartemen SPS.
Table 2. Source of contamination on TIS compartment.
Titik pengambilan contoh ( Sampling point)
Kontaminasi Contamination (%) Selang udara masuk (inlet air vent) 0,0 b *) Selang udara keluar (outlet air vent) 0,0 b Segel pada tutup (cap O ring) 0,0 b Dudukan cincin pada tutup (cap O ring holder) 0,0 b Tutup (cap) 8,3 b Ulir pada tutup (screw on cap) 0,0 b Segel pada tabung ( tube o ring) 8,3 b Dudukan cincin tabung (tube o ring holder) 8,3 b Tengah tabung luar (outer central tube) 0,0 b Tengah tabung dalam (inner central tube) 0,0 b Dinding wadah atas ( upper vessel wall ) 0,0 b Permukaan atas saringan (upper surface of screen disc) 0,0 b Permukaan bawah saringan (lower surface of screen disc) 8,3 b Wadah bawah (lower vessel) 8,3 b Dinding dalam keranjang ( basket inner wall ) 0,0 b Dinding luar keranjang ( basket outer wall ) 8,3 b Dinding dalam lonceng (inner bell) 0,0 b Dinding luar lonceng (outer bell) 0,0 b Cincin penutup (washer) 41,6 a Ulir tabung (tube screw) 0,0 b Ulir pada lonceng (screw on bell) 0,0 b Permukaan keranjang  ( basket surface ) 8,3 b Lubang keranjang ( basket holes) 0,0 b
*) Rerata pada kolom yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata menurut uji jarak berganda Duncan pada P= 0,05.
*) Means on column followed by the same letters are not significantly different according to Duncan’s multiple range test at P= 0.05.
pada SPS menjadi sebesar 11,1%. Sterilisasi satu kali dalam  autoklaf  setelah  dirangkai  atau  dengan perlakuan perendaman dalam alkohol 70% selama 10 menit  sebelum  diautoklaf  tidak  menurunkan  secara nyata tingkat kontaminasi, sedangkan dengan penyinaran  sinar  UV  selama  45  menit  sebelum diautoklaf  me-nurunkan  tingkat  kontaminasi  menjadi 40%.
Bakteri  kontaminan  yang  muncul  pada  SPS  ini berasal  dari  genus Bacillus yang  tergolong  dalam bakteri  gram  positif.  Bakteri  gram  positif  memiliki dinding  sel  yang  lebih  tebal  sehingga  tidak  ter- pengaruh  oleh  perendaman  alkohol,  berbeda  dengan gram  negatif  yang  memiliki  dinding  sel  tipis  dan mudah  luruh  oleh  alkohol  pada  pewarnaan  gram. Ketika  cincin  penutup tersebut  dirangkaikan  bersama komponen  lain  pada  rangkaian  SPS,  cincin  penutup akan  berada  tepat  di  tengah  rangkaian  dan  terjepit  di antara penyaring dan keranjang. Hal ini menyebabkan udara panas dan tekanan dalam autoklaf tidak mampu menjangkau  cincin  tersebut,  oleh  karena  itu  bakteri yang memiliki endospora tahan terhadap panas seperti B.  megaterium dan B.  sphaericus yang  berada  pada cincin  penutup  masih  mampu  bertahan  hidup. Kontaminan dari genus Bacillus umumnya disebab-
kan karena kurang efektifnya teknik sterilisasi (Leifert & Woodward, 1998), oleh karena itu perbaikan sistem sterilisasi  seperti pada penelitian  ini  memang penting untuk dilakukan.
Beragamnya  sumber  dan  jenis  mikroba  konta- minan  menyebabkan  perbedaan  penanganan  konta- minasi.  Sumber  kontaminan  dari  bakteri  endogen seperti pada Jatropa curcas (Misra et al ., 2010), lada (Anjali et  al .,  2007),  pisang  (Titov et  al .,  2007), dan yam  (Mbah  &  Wakil,  2012)  ditanggulangi  dengan penambahan  antibiotika  yang  sesuai  pada  media. Penggunaan   beberapa    buku   tanpa  daun    sebagai sumber  eksplan  mampu  menekan  kontaminan  dan efek  negatif  sterilan  pada    kultur  bambu,  teh  dan mawar (Thakur & Sood, 2007).  Nurhaimi-Haris et al. (2009)  menemukan  bahwa  sumber  kontaminan  pada kultur microcutting karet  berasal  dari  permukaan eksplan,  dan  sterilisasi  eksplan  dengan  penggunaan desogerme  efektif  menurunkan  tingkat  kontaminasi. Laboratorium  kultur  jaringan  di  daerah  tropis  seperti Nigeria,  lingkungan  dan  pelaksana  kultur  merupakan sumber  utama  kontaminan  (Odutayo et  al .,  2007). Good  Laboratory  Practice dalam  proses  kultur jaringan  mutlak  diperlukan  untuk  menghindari  dan menurunkan tingkat kontaminasi.
Identifikasi dan pencegahan kontaminasi pada kultur cair…………… (Sinta et al .)
Gambar 2. Perlakuan sterilisasi pada  cincin penutup SPS. Kolom diikuti oleh huruf  yang sama  menunjukkan tidak berbeda nyata.
Figure 2.    Sterilization methods on washer of TIS.  Column followed by the same letters are not  significantly different.

## Kesimpulan
Kontaminasi  pada  kultur  SPS  disebabkan  ter- utama  oleh  kurang  efektifnya  proses  sterilisasi kompartemen  SPS.  Empat  bakteri  kontaminan  telah terdeteksi  yaitu Bacillus  macerans,  B.  megaterium, B. sphaericus dan B. firmus . Dari rangkaian kompar- temen  SPS  terdeteksi  bahwa  sumber  utama  konta- minan  adalah  cincin  penutup  ( washer ).  Sterilisasi cincin  penutup  tersebut  sebelum  dan  sesudah  dirang- kai  pada  autoklaf  selama  20  menit  menurunkan tingkat kontaminasi pada kultur SPS.

## Daftar Pustaka
Anjali  AK,  SM  Kelkar,  MG  Watve  &  KV  Khrisnamurthy (2007).  Characterization  and  control  of  endophytic bacterial contaminants in in vitro cultures of Piper spp., Taxus  baccata subsp.  Wallichiana,  and Withania somnifera . Canadian J Microbiol 53, 63-74.
Etienne  H  &  M  Berthouly    (2002).   Temporary  immersion systems in plant micropropagation. Plant Cell Tiss Org Cult 69, 215-231
Holt  JG  (1994) Bergey,s  Manual  of  Determinative Bacteriology, ninth eds. Baltimore, William & Wilkins
Jantova B & J Lukasova (2001). Heat resistance of Bacillus spp .  spores  isolated  from  cow’s  milk  and  farm environment. Acta Vet Brno 70, 197-184.
Leifert C & AC Cassells (2001).  Microbial hazards in plant tissue and cell cultures. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 37, 133-138.
Leifert C & S Woodward (1998). Laboratory contamination management:  the  requirement  for  microbiological quality assurance. Plant Cell Tiss Org Cult 52, 83-88.
Liu B,  W  Liu,  X Nie, C Guan, Y  Yang,  Zwang &  W  Liao (2011).  Growth  response  and  toxic  effects  of  three antibiotics  on Selenastrum  capricornutum evaluated  by photosynthetic  rate  and  chlorophyll  biosynthesis. J Environ Sci 23(9), 1558-1563.
Mbah EI  & SM Wakil (2012). Elimination of bacteria from in  vitro yam  tissue  cultures  using  antibiotics. J  Plant Pathol 94 (1), 53-58
Misra  P,  N  Gupta,  DD  Toppo,  V  Pandey,    MK  Mishra  & R Tuli (2010). Establishment of long-term proliferating shoot cultures of elite Jatropha curcas L. by controlling endophytic bacterial contamination. Plant Cell Tiss Org Cult 100, 189-197.
Nurhaimi-Haris,  Sumaryono  &  MP  Carron  (2009).
Pengaruh  bahan  pra-sterilan,  tutup  tabung  kultur,  dan musim terhadap tingkat kontaminasi eksplan pada kultur microcutting karet. Menara Perkebunan 77(2), 89-99.
Odutayo,  OI,  NA  Amusa,  OO  Okutade  &  YR  Ogunsanwo (2007). Sources  of  microbial  contamination  in  tissue culture  laboratories  in  Southwestern  Nigeria. African  J Agric Res 2(3), 067-072.
Sharaf-Eldin  MA  &  P  Weathers    (2006).    Movement  and containment  of  microbial  contamination  in  the  nutrient mist  bioreactor. In  Vitro  Cell  Dev  Biol-Plant 42,  553- 557.
Sumaryono,  I  Riyadi  &  MM  Sinta  (2010).  Clonal propagation of elite genotypes of oil palm through tissue culture. Laporan  Akhir  Tahun  BPBPI  2010 .  Bogor, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia.
Thakur R & A Sood (2007). An efficient method for explant sterilization  for  reduced  contamination. Plant  Cell  Tiss Org  Cult 84, 369-371.
Titov  S,  SK  Bhowmik,  MS  Alam  &  SN  Uddin  (2007).
Control  of  endogenous  bacterial  contamination  and micropropagation  of  a  traditional  table  banana  ( Musa spp  cv.  Kathali)  of  Bangladesh. Chinese  J    Biotechnol 23(6), 1042-1048.
Wojtania  A  &  J  Pulawska  (2005).  Identification  and elimination of bacterial contaminants from Pelargonium tissue  cultures. J  Fruit  Ornamental  Plant  Res 13,  101- 108.
K o n tam in as i ( Co n ta m in a ti o n ) % Alkohol+Autoklaf Autoklaf 2x Autoklaf 1x UV+Autoklaf Perlaukan sterilisasi ( Sterilization method ) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 c b a a