## UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK KULIT
BATANG DALU-DALU  ( Salix tetrasperma Roxb) MENGGUNAKAN METODE DPPH (1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL)
Syafrinal (1) , Sari Ramadhani (2)
(1) Analisis Kimia, Politeknik ATI Padang
(2) Kimia, Universitas Andalas

## rinal1450@gmail.com

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan  dari   ekstrak kulit  batang  Dalu  –  Dalu  ( Salix  tetrasperma Roxb)  dengan  menggunakan  metode DPPH  (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil).  Ekstraksi  dilakukan  dengan  metode  maserasi menggunakan  n-heksana  ,etil  asetat    dan  metanol.  Aktivitas  antioksidan  diukur menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  dan  dinyatakan  sebagai  nilai  IC50.  Hasil pengukuran  secara  spektrofotometri  menunjukkan  bahwa  fraksi  n-heksana  memiliki aktivitas antioksidan  yang sangat lemah  dengan  nilai  IC50   sebesar  713,58 ppm, fraksi etil asetat dan metanol memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat  dengan nilai  IC50   sebesar  9,14 ppm dan 12,68 ppm  serta asam askorbat sebagai  kontrol positif memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat dengan IC50 sebesar 10,65 ppm.
Kata Kunci : aktivitas antioksidan, kulit batang Dalu – Dalu, metode DPPH.

## PENDAHULUAN
Radikal bebas adalah suatu molekul yang  mempunyai  elektron  yang  tidak berpasangan.
Elektron yang tidak berpasangan tersebut menyebabkan rasikal bebas  yang  sangat  reaktif  yang  kemudian akan menangkap atau mengambil elektron dari  senyawa  lain  seperti  proteon,  lipid, karbohidrat  dan  DNA  untuk  menetralkan diri. Radikal bebas dapat masuk ke dalam tubuh  dan  menyerang  sel-sel  yang  sehat dan menyebabkan sel-sel tersebut kehilangan fungsi dan strukturnya. Akumulasi dari kerusakan tersebut berkontibusi  terhadap  beberapa  penyakit dan  menyebabkan  kondisi  yang  biasa disebut penuaan dini (Liochev, 2013).
Radikal bebas dapat ditangkal oleh antioksidan.  Antioksidan  berdasarkan
sumbernya  dapat  dibedakan  menjadi antioksidan  sintetik  dan  alami. Adanya kekhawatiran  terhadap  efek  samping antioksidan  sintetik  berupa  hepatomegali, mempengaruhi  aktivitas  enzim  di  hati serta karsinogenik, menyebabkan antioksidan  alami  menjadi  alternatif yang terpilih ( Sunarni,  dkk. 2007). Dalu-dalu ( Salix tetrasperma Roxb.) adalah salah satu tumbuhan yang digunakan sebagai bahan obat tradisional yang  umum  dikenal  dengan  Indian Willow  (Kiritikar  KR  and  Basu  BD, 2005). Pemeriksaan  profil  fitokimia ekstrak kulit batang dalu-dalu mengungkapkan  adanya  steroid,  sterol, triterpen, tanin, senyawa fenolik, saponin dan  flavonoid  ( Raj,  Chhetree  R. et  al . 2010).
Senyawa antioksidan alami tanaman  umumnya  adalah  senyawa fenolik  atau  polifenolik  yang  dapat berupa golongan flavonoid, bioflavonoid, vitamin  C,  tokoferol,  β-karoten,  katekin, resveratrol, turunan asam sinamat, kumarin, dan asam-asam organik polifungsional. Kelompok flavonoid utama adalah flavanol, flavanon, isoflavon,  katekin,  proantosianidin  dan antosianin.  Sementara  turunan  asam sinamat  meliputi  asam  kafeat,  asam ferulat, asam klorogenat, dan lain-lain.
Metode  yang  digunakan  untuk mengidentifikasi  aktifitas  antioksidan salah  satunya  adalah  DPPH  (1,1-difenil 2-pikrilhidrazil). DPPH merupakan radikal  bebas  yang  apabila  direkasikan dengan ektrak tanaman
yang mengandung  antioksidan,  maka  akan terjadi  reaksi  penaangkapan  radikal bebas DPPH  yang diubah menjadi  1,1  – difenil  2-pikrilhidrazin  (kuning)  (Yen dan  Chen,  1995).  Keuntungan  metode DPPH  adalah  metode  yang  sederhana, cepat  dan  mudah  diukur  absorbansinya dengan  spektrofotometer  Uv  –  Vis  pada panjang gelombang 517 nm (Kurniawan, 2013).
Penentuan  aktivitas  antioksidan menggunakan  asam  askorbat  sebagai pembanding  .  Selain  itu,  parameter  lain yang digunakan untuk mengetahui kekuatan antioksidan ialah IC 50 (inhibition  Concentration  50  Value  ). IC 50 merupakan  konsentrasi  yang  dapat menghambat  aktivitas  radikal  bebas DPPH  sebanyak  50  %  .  Semakin  kecil IC 50 menandakan semakin besar aktivitas antioksidan  (Molyneux,  2004).  Setiap ektrak dengan pelarut yang berbeda akan memiliki  kandungan  senyawa  yang bermacam-macam  serta  berpengaruh terhadap besarnya aktivitas penangkapan radikal bebas.

## METODE PENELITIAN

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  untuk  uji fitokimia  hingga  uji  antioksidan  adalah kloroform  (Brataco),  akuades,  besi(III) klorida (Merck), anhidrida asetat
(Fisson),  amonia  (Merck),  pereaksi
Liebermann-Burchard (asam sulfat pekat dan  anhidrida  asetat),  NaOH,  metanol (Merck),  etil  asetat  (Merck),  n-heksana (Merck),
1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
(DPPH) dan asam askorbat.

## Alat
Alat yang digunakan adalah peralatan gelas yang umum digunakan di laboratorium,  alat  destilasi,  alat rotary evaporator (Betracher Lamag ® ), spektrofotometer  UV-Vis  (Shimadzu® UV 1700).

## Metode Penelitian
Prosedur Penelitian
1. Pengambilan dan persiapan sampel
Sampel yang diperlukan untuk
penelitian  ini  diperoleh  dari  Sianik Sago,  Kec.  IV  Jurai,  Kab.  Pesisir Selatan.  Sebanyak  13  kg  sampel segar  kulit  batang  dalu-dalu  dikering anginkan  sehingga  diperoleh  6  kg kulit batang Dalu-dalu kering, dibersihkan, dipotong kecil-kecil, kemudian  di  haluskan  menggunakan alat grinder sehingga berbentuk serbuk halus. 2. Pembuatan larutan 1,1-difenil-2-
pikrilhidrazil (DPPH)
Sebanyak  1,97  mg  DPPH  dilarutkan dengan  metanol  dalam  labu  ukur sampai  100  mL  sehingga  diperoleh larutan dengan konsentrasi 50 µM.
3. Uji fitokimia
Sampel  sebanyak  2  gram  dipotong halus dan dimasukan ke dalam tabung reaksi,  kemudian  dimaserasi  dengan metanol  yang  telah  dipanaskan  (di atas  penangas  air)  selama  15  menit. Kemudian  disaring  panas  panas  ke dalam  tabung  reaksi  lain  dan  biarkan seluruh  metanol  menguap  hingga kering.  Lalu  ditambahkan  kloroform dan akuades dengan perbandingan 1:1 masing  masingnya  sebanyak  5  mL,
kocok dengan baik, kemudian pindahkan  ke  dalam  tabung  reaksi, biarkan  sejenak  hingga  terbentuk  dua lapisan kloroform-air. Lapisan kloroform di bagian bawah digunakan untuk pemeriksaan senyawa triterpenoid  dan  steroid.  Lapisan  air digunakan untuk pemeriksaan senyawa  flavonoid,  fenolik,  dan saponin. 3.1 Pemeriksaan Flavonoid (Sianidin Tes) Sebagian  dari  lapisan  air  diambil  dan dipindahkan  dengan  menggunakan pipet  ke  dalam  tabung reaksi,
kemudian  tambahkan  asam  klorida pekat  dan  beberapa  butir  bubuk magnesium, terbentuknya warna jingga  sampai  merah  menunjukkan adanya  flavonoid  (kecuali  untuk flavon). 3.2 Pemeriksaan Fenolik Sebagian  dari  lapisan  air  diambil  dan dipindahkan  dengan  pipet  ke  dalam tabung reaksi kecil, kemudian tambahkan pereaksi besi (III) klorida, terbentuknya
warna biru/ungu menandakan adanya senyawa fenolik. 3.3 Pemeriksaan Saponin Dari  lapisan  air,  kocok  kuat-kuat dalam sebuah tabung reaksi,
terbentuknya  busa  yang  tidak  hilang
dengan  penambahan  beberapa  tetes asam  klorida  pekat  menunjukkan adanya saponin.
3.4 Pemeriksaan  Triterpenoid  dan Steroid (Liebermann - Burchard) Dari lapisan kloroform diambil sedikit dan dimasukkan ke dalam dua lubang  plat  tetes,  biarkan  hingga kering.  Ke  dalam  satu  lubang  plat tetes  ditambahkan  asam  sulfat  pekat, ke  dalam  lubang  plat  tetes  lainnya ditambahkan  setetes  anhidrida  asetat dan  setetes  asam  sulfat  pekat. Terbentuknya  warna  hijau  atau  hijau biru  menandakan  adanya  steroid, sedangkan  bila  terbentuknya  warna merah  atau  merah  ungu  menandakan adanya triterpenoid.
3.5 Pemeriksaan Alkaloid.
Sampel  sebanyak  2-4  gram  dipotong kecil-kecil, kemudian dihaluskan dalam  lumpang  dengan  penambahan sedikit  pasir  dan  10  mL  kloroform– amoniak 0,05N, kemudian diaduk dan digerus  perlahan.  Larutan  disaring dengan  corong  kecil,  di  dalamnya diletakkan  kapas  sebagai  penyaring dan  hasil  saringan  dimasukkan  ke dalam sebuahtabung reaksi, kemudian tambah  kan  10  tetes  asam  sulfat  N dan  kocok  secara  perlahan.  Biarkan sejenak  sampai  terbentuk    pemisahan lapisan  asam  dan  kloroform.  Lapisan asam  diambil  dengan  bantuan  pipet dan  dipindahkan  ke  dalam  sebuah tabung reaksi kecil. Kemudian tambahkan  pereaksi  Meyer,  reaksi positif ditandai dengan adanya endapan  putih  (+4),  kabut  putih  tebal (+3),  kabut  putih  tipis  (+2),  kabut putih sangat tipis (+1).
3.6 Pemeriksaan Kumarin
Sampel  sebanyak  2-5  gram  dirajang halus  dan  diekstrak  dengan  pelarut metanol.  Hasil  ekstrak  ditotolkan
pada  batas  bawah  plat  KLT  dengan menggunakan  pipa  kapiler,  dibiarkan kering pada udara terbuka. Kemudian dielusi  dalam  bejana  yang  berisi  10 mL  eluen  etil  asetat  100  %.  Noda yang  dihasilkan  dimonitor  di  bawah lampu  UV  (365  nm).  Hasil  KLT kemudian  disemprot  dengan  larutan natrium hidroksida 1% dalam etanol : air  (1:1)  dan  selanjutnya  dilihat dibawah  lampu  UV  (365  nm). Adanya  fluorisensi  yang  bertambah terang  setelah  disemprot  dengan larutan natrium hidroksida 1% menandakan adanya senyawa kumarin. 4. Ekstraksi
Ekstraksi  sampel  kulit  batang  Dalu- dalu dilakukan dengan metoda maserasi.  6  kg  serbuk  halus  kulit batang  Dalu-dalu  dimasukkan  ke botol gelap,dimaserasi dengan pelarut n-heksana  selama  3  hari.Proses maserasi  diulangi  dengan    pelarut yang  sama  hingga  hasil  perendaman tersebut  menjadi  bening.  Sampel disaring sehingga diperoleh filtrat dan ampas.Filtrat n-heksana yang dihasilkan tersebut dipekatkan dengan rotary  evaporator pada  suhu
40 0 Csehingga didapatkan ekstrak pekat  n-heksana.  Ampas  yang  tersisa dimaserasi  dengan  pelarut  etil  asetat (enam  kali  perendaman)  dan  pelarut metanol  (enam  kali  perendaman). Hasil  maserasi  dipekatkan  dengan rotary  evaporator pada  suhu  40 0 C
sehingga  diperoleh  ekstrak  pekat  etil asetat dan ekstrak pekat metanol.ekstrak  kental  dilakukan  uji fitokimia dan uji antioksidan.
5. Metode Pengujian Aktivitas Antioksidan
Penentuan  absorban  dari  larutan DPPH dilakukan dengan dipipet 4 mL larutan  1,1-difenil-2-pikrilhidrazil  50 µM  dan  ditambahkan  1  mL  metanol. Setelah  dibiarkan  30  menit  ditempat gelap,  diukur  serapannya  alat  dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm,
absorban  yang  diperoleh  digunakan sebagai kontrol.
Pemeriksaan  aktivitas  antioksidan, dilakukan dengan menimbang ekstrak sebanyak 2,5 mg dan larutkan dengan metanol  dalam  labu  ukur  25  mL sampai tanda batas, sehingga diperoleh  konsentrasi  sampel  100 ppm lalu diencerkan menjadi konsentrasi  40,  20,  10  dan  5  ppm. Kemudian  untuk  penentuan  aktivitas antioksidan  dipipet  sebanyak  1  mL larutan  sampel  dengan  pipet  mikro dan  masukkan  kedalam  botol  vial, kemudian  ditambahkan  4  mL  larutan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil  50  µM.
Campuran dihomogenkan dan dibiarkan  selama  30  menit  ditempat gelap, serapan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan sampel ditentukan  oleh  besarnya  hambatan serapan radikal bebas melalui perhitungan
persentase inhibisi serapan  1,1-difenil-2  pikrilhidrazil dengan menggunakan rumus :
%Inhibisi   =   Absorban kontrol – Absorban sampel  x 100% Absorban kontrol

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Uji Fitokimia
Hasil  fitokimia  dari  kulit  batang Dalu  dalu  dapat  dilihat  pada  Tabel  1.
Dari  data  pada  Tabel  1  dapat  diketahui bahwa kulit batang Dalu-dalu mengandung senyawa flavonoid, fenolik,
terpenoid, saponin dan steroid.
Masing-masing  ekstrak  (ekstrak metanol,  etil  asetat  dan  n-heksana)  kulit batang Dalu-dalu dilakukan uji fitokimia untuk  melihat  senyawa  apa  saja  yang terkandung  di  dalam  masing-masing ekstrak.  Hasil  uji  profil  fitokimia  dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel  1.  Hasil  Uji  Fitokimia  pada  Kulit
Batang Dalu-dalu N o Kandungan kimia Reagent/ pereaksi Hasil 1.  Alkaloid Mayer - 2.  Flavonoid Sianidin test + 3.  Fenolik Besi (III) klorida 5% + 4.  Terpenoid Liebermann -Burchard + 5.  Saponin Aquadest + 6.  Steroid Liebermann -Burchard + 7 Kumarin Natrium Hidrokisda 10 % - Keterangan; (+) berarti terdeteksi. Tabel 2. Hasil Uji Fitokimia Ektrak Kulit Batang Dalu-Dalu No Kandungan kimia Reagent/ pereaksi Ekstrak n heksana Ekstrak Etil Asetat Ekstrak Metanol 1. Alkaloid Mayer - - - 2. Flavonoid Sianidin test - + + 3. Fenolik Besi (III) klorida 5% + + + 4. Terpenoid Liebermann -Burchard + + + 5. Saponin Aquadest + + + 6. Steroid Liebermann -Burchard + + + 7 Kumarin Natrium Hidrokisda 10 % - - - Dari  hasil  fitokimia,  senyawa yang  paling  dominan  yang  terdapat  di ketiga  ekstrak  adalah  senyawa  fenolik, flavonoid,  steroid,  triterpenoid  dan saponin sedangkan alkaloid dan kumarin tidak teridentifikasi pada masing- masing ekstrak.
Uji Antioksidan
Pada pengujian awal uji antioksidan  ini  ditentukan  terlebih  dulu panjang  gelombang  maksimum  DPPH.
Dari hasil pengukuran didapatkan
panjang gelombang DPPH λmaks adalah 517 nm. Panjang gelombang ini digunakan  untuk  pengukuran  absorban larutan sampel. Dari 4 mL DPPH 50 µM yang  ditambahkan dalam  1  mL  metanol digunakan  sebagai kontrol  didapatkan absorban sebesar 0,4128. Parameter  yang  umum  digunakan untuk  mengetahui  aktivitas  antioksidan adalah dengan menentukan nilai inhibition  concentration 50% (IC). Nilai IC  dari  ektrak  heksana,  etil  asetat  dan metanol  dari kulit  batang  Dalu-Dalu
( Salix  tetrasperma Roxb) serta  asam askorbat  sebagai  pembanding  dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel  3. Tabel  Nilai IC 50 Ekstak kulit Batang  Dalu-Dalu  dan  Asam Askorbat Ekstrak Persamaan Grafik Nilai IC 50 (ppm) n-Heksana  y = 0,0706x - 0,3793 R² = 0,9664 713,58 Etil Asetat  y = 3,1246x + 21,44 R² = 0,9389 9,14 Metanol y = 4,2287x - 3,625 R² = 0,9726 12,68
Asam
Askorbat y = 3,6111x + 11,54
R² = 1 10,65
Berdasarkan hasil yang didapatkan pada  Tabel  3,  menunjukkan  bahwa  nilai IC 50 ektrak  etil  asetat    <  asam  askorbat <  ektrak etanol <  ektrak n-heksana, bila semakin  kecil  nilai  IC 50 maka  aktivitas antioksidan  semakin  tinggi (Molyneux. 2004), yang berarti . aktivitas antioksidan  ektrak  etil  asetat  >  asam askorbat    >  ektrak  etanol  >  ektrak  n- heksana.  Hal  ini  diduga  karena  Ekstak etil  asetat kulit      batang  Dalu-Dalu melarutkan  senyawa-senyawa  baik  dari yang  polar  sampai  yang  kurang  polar, sehingga  senyawa-senyawa  yang  aktif antioksidan  banyak  terekstrak  pada pelarut  ini.  Sedangkan ektrak  n-heksana hanya  mengekstrak  senyawa-senyawa yang bersifat non polar saja .
Kategori aktivitas antioksidan suatu senyawa dapat digolongkan
berdasarkan Tabel 4 (Andriani dkk, 2015).
Tabel  4.  Penggolongan  Aktivitas  Anti- oksidan Berdasarkan Nilai IC 50 Nilai IC 50 Kategori < 50 ppm Sangat Kuat 50 ppm – 100 ppm Kuat 100 ppm – 150 ppm Sedang 150 ppm – 200 ppm Lemah > 200 ppm Sangat Lemah
Dari  Tabel  4  menunjukan  bahwa ektrak  etil  asetat    dengan  nilai  IC 50 9,14 ppm dan ektrak  etanol  dengan nilai  IC 50 12,68 ppm dikategorikan sebagai
antioksidan  yang sangat  kuat  seperti asam  askorbat  yang  dijadikan  sebagai pembanding  dengan  nilai  IC 50 10,65 ppm sedangkan    ektrak  n-heksana sebagai  antioksidan yang  sangat    lemah dengan nilai IC 50 713,58 ppm

## KESIMPULAN
Dari  hasil  uji  fitokimia  diketahui kulit      batang  Dalu-Dalu  mengandung senyawa  metabolit  sekunder  diantaranya flavonoid,  fenolik,  terpenoid,  saponin dan  steroid.  Pada  uji  antioksidan  nilai IC 50 terbesar  terdapat  pada  ekstrak  etil asetat  yaitu  9,14  ppm    dan  ektrak metanol  12,68  ppm  yang  menandakan bahwa  kedua  ekstrak  ini  memiliki aktivitas  antioksidan  yang  sangat  kuat sedangkan ektrak n-heksana mempunyai aktivitas  antioksidan yang sangat lemah dengan nilai IC 50 713,58  ppm.

## DAFTAR PUSTAKA
Andriani, Y. N.M. Ramli, D.F.
Syamsumir,  M.N.I.  Kassim,  J. Jaafar, N.A. Aziz, L. Marlina, N.S. Musa, H. Mohamad,, 2015, Phytochemical Analysis, Antioxidant,  Anti  bacterial    and Cytotoxicity  Properties  Of  Keys and  Cores  Parts  Of  Pandanus
tectorius  Fruits ,  Arabian  Journal of Chemistry.
Kiritikar KR and Basu BD. 2005. Indian medicinal plants . Deharadun,
India,  Lalit  Mohan  Basu.  2362- 2363. Kurniawan  J.C,  Suryanto  Edi,  dan Yudistira A. 2013. Analisis Fitokimia dan Uji aktivitas Antioksidan dari Getah Kulit Buah Pisang  Goroho  (Musa  acuminate L ). Jurnah Ilmiah Farmasi.
UNSRAT Vol 2 No 3.
Liochev,  S.I.  2013.Reactive  Oxygeb Species  and  the  free  Radical
Theory  of  Aging. free  Radical
Biology and Medicine .60. 1-4 Molyneux.  2004. The  Use  of  The  Stable Free Radical Diphenyl picrylhydrazyl (DPPH ) for Estimating  Antioxidant  Activity. Songklanakarin    Journal  Science
Technology . Vol 26 (2): 211- 219.
Raj,  Chhetree  R.,  Dash  GK,  Mondal  S
AndParhi R. 2010. Studies On The
Hypoglycaemic  Activity  Of  The Bark Salix Tetrasperma Roxburgh. International  Journal  of  Drug Development & Research. Covered  in  Official  Product  of Elsevier,  The  Netherlands  Vol.  2 Issue 4 ISSN 0975-9344.
Sunarni,  T.,  Pramono,  S.,  dan  Asmah, R. 2007. Flavonoid      Antioksidan Penangkap    Radikal    dari    Daun Kepel  ( Stelechocarpus  burahol (Bl. Hook  f.  &  Th). Majalah  Informasi
Indonesia 18 (3) : 111- 116 Yen, G.C. dan Chen. H.Y. 1995. Antioxidant Activity of Variaous  Tea  Extract  In  Relation to  Their  Antimutagenicity.J.Agric . Food. Chem.