Potensi Antibakteri dan Antibiofilm Ekstrak Etanol Bunga Bintaro ( Cerbera odollam ) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 6538
Dwi Rahma Suci Lestari a* , Lisa Soegianto a , Liliek S. Hermanu a a Fakultas Farmasi, Unika Widya Mandala Surabaya
Cerbera  odollam termasuk  dalam  jenis  tanaman  yang  berpotensi  bisa  menghambat  pertumbuhan  bakteri  yang menyebabkan  penyakit  infeksi.  Penggunaan  antibiotik  yang  tidak  benar  pada  penyakit  infeksi  sering menyebabkan resistensi bakteri. Bakteri resisten adalah bakteri patogen yang mampu membentuk biofilm pada makhluk  hidup.  Penelitian  ini  dilakukan  untuk  menentukan  aktivitas  antibakteri  dan  antibiofilm  ekstrak  etanol dari bunga Cerbera odollam terhadap Staphylococcus aureus . Ekstrak etanol diperoleh dengan metode maserasi dan  pelarut  yang  digunakan  adalah    etanol  96%.  Ekstrak  etanol  bunga  Bintaro  dibuat  dalam  konsentrasi  10%, 20%  dan  30%  yang  digunakan  untuk  uji  antibakteri  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus dengan  metode difusi  sumuran  dan  aktivitas  antibiofilm  diuji  dengan  metode  mikrodilusi.  Dari  penelitian  yang  dilakukan menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  bunga Cerbera  odollam memiliki  Daerah  Hambatan  Pertumbuhan  (DHP) pada konsentrasi 10% sebesar 21,66 ± 0,73 mm, konsentrasi 20% sebesar 25,66 ± 1,50 mm dan konsentrasi 30% sebesar 27,10 ± 1,06 mm, sedangkan untuk uji hasil antibiofilm mampu menghambat pembentukan biofilm terbesar  di  konsentrasi  3,75%  dengan  persentase  penghambatan  sebesar  98,29%.  Hasil  bioautografi menunjukkan  bahwa  metabolit  sekunder  yang  memiliki  aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak  etanol  dari    bunga Cerbera odollam adalah alkaloid dan tanin.
Kata kunci: Cerbera odollam , antibakteri, antibiofilm, bioautografi, Staphylococcus aureus
Antibacterial and Antibiofilm Potential of The Ethanolic Extract of Suicide Tree ( Cerbera odollam ) Flower against Staphylococcus aureus ATCC 6538
Cerbera odollam was one of the plants that can inhibit the growth of bacteria that cause infectious diseases. The misuse  of  antibiotic  in  the  treatment  of  infection  frequent  caused  bacterial  resistance.  One  of  the  forms  of antibiotic resistance was the capability of microorganism forming biofilm. This study was conducted to determine the antibacterial and anti-biofilm activity of ethanolic extract from Cerbera odollam flower against Staphylococcus aureus . The ethanolic extract obtained by maceration method using 96% ethanol as a solvent. The ethanol extract of Suicide tree (10, 20 and 30%) were tested for antibacterial activity against Staphylococcus aureus using well diffusion  method  and  anti-biofilm  activity  using  microdilution  method.  Based  on  the  results,  ethanol  extract  of flowers Cerbera  odollam inhibit  the  growth  of Staphylococcus  aureus with  inhibition  zone  of  21.66±0.73  mm (10%),  25.66±1.50  mm  (20%)  and  27.10±1.06  mm  (30%).  The  ethanol  extract  of  Suicide  tree  flower  inhibit biofilm  formation  98.29%  at  the  concentration  of  3.75%.  The  bio  autography  results  showed  that  alkaloid  and tannin responsible as bioactive compounds from the ethanol extract Suicide tree flower.
Keywords: Cerbera odollam , antibacterial, antibiofilm, bioautografi, Staphylococcus aureus
*Corresponding  author:  Fakultas  Farmasi  Universitas  Katolik  Widya  Mandala  Surabaya,  Jl.  Raya  Kalisari Selatan No. 1 Surabaya, e-mail : dwirahma627@gmail.com

## PENDAHULUAN
Penyakit  infeksi  merupakan  salah  satu masalah  dalam  bidang  kesehatan  yang  terus berkembang  dari  waktu  ke  waktu.  Infeksi disebabkan  oleh  bakteri,  virus,  jamur,  protozoa dan  beberapa  kelompok  minor  lain  seperti mikroplasma, dan klamidia (O’toole et al. , 2000). Sebagai  pertahanan  diri,  bakteri  membentuk suatu lapisan lendir yang disebut dengan biofilm. Biofilm  merupakan  bentuk  struktural  dari sekumpulan mikroorganisme yang dilindungi oleh matrik  ekstraseluler  yang  disebut Extracelluler Polymeric  Substance (EPS),  dimana  EPS merupakan  produk  yang  dihasilkan  sendiri  oleh mikroorganisme  tersebut  dan  dapat  melindungi dari  pengaruh  buruk  lingkungan  (Prakash, Veeregowda and Krishnappa , 2003).  Beberapa contoh  bakteri  yang  dapat  menyebabkan  infeksi dan  membentuk  biofilm  adalah Staphylococcus aureus.
Biofilm  saat  ini  dianggap  sebagai  mediator utama  infeksi,  dengan  perkiraan  80  %  kejadian infeksi  berkaitan  dengan  pembentukan  biofilm (Archer et  al ,  2011).  Hal  ini  disebabkan pembentukan biofilm pada mikroorganisme dapat meningkatkan  toleransi  terhadap  antimikroba dan desinfektan, sehingga biofilm berperan besar dalam  terjadinya  resistensi  dan  penyakit  kronis. Terapi  antibiotik  pada  umumnya  hanya  akan membunuh  sel-sel  yang  bersifat  planktonik, sedangkan  bentuk  bakteri  yang  tersusun  rapat dalam  biofilm  akan  tetap  hidup.  Hal  ini dikarenakan  antibiotik  tidak  dapat  menembus lapisan biofilm (Mah dan Toole, 2001).
Obat  tradisional  dapat  menjadi  alternatif dalam  pengobatan  infeksi.  Senyawa  alami  yang berpotensi sebagai antibakteri adalah mengandung  steroid,  tanin,  polifenol,  flavonoid (Rahman,  Paul  dan  Rahman, 2011),  alkaloid, saponin (Ahmed et al., 2008). Salah satu tanaman yang  berpotensi  sebagai  antibakteri  alami  adalah tanaman bintaro ( Cerbera odollam). Penelitian Ahmed et al., (2008)
menunjukkan  ekstrak  metanol  biji  bintaro mampu  menghambat  beberapa  bakteri  seperti
Staphylococcus
aureus ,
Streptococcus saprophyticus , Streptococcus
pyogenes , Salmonella  typhi,  Shigella  flexneri, dan Shigella dysentriae .  Zona  hambatan  terhadap  bakteri Salmonella typhi sebesar 15 mm dan Staphylococcus  aureus sebesar  6  mm,  dengan konsentrasi ekstrak 50 μg/mL.
Berdasarkan  latar  belakang  yang  telah diuraikan  di  atas  dan  belum  adanya  laporan mengenai  aktivitas  antibakteri  dan  antibiofilm ekstrak bunga bintaro terhadap bakteri Staphylococcus  aureus ,  pada  penelitian  ini dilakukan uji aktivitas antibakteri dan antibiofilm ekstrak bunga bintaro terhadap bakteri Staphylococcus  aureus dengan  tujuan  untuk menemukan  golongan  antibakteri  baru  yang dapat  membunuh  bakteri  dan  menghambat pertumbuhan bakteri pembentuk biofilm.

## METODE PENELITIAN Bahan
Bahan  utama  yang  digunakan  adalah ekstrak  etanol  96%  bunga  bintaro,  kloroform  P, air  panas,  kertas  saring  bebas  abu,  kertas  saring, silika pengering, asam sulfat encer P, serbuk Mg, larutan  alkohol  klorhidrik,  amil  alkohol,  CHCl 3 , HCl  10%  v/v,  pereaksi  Dragendorff,  pereaksi Mayer, FeCl 3 , larutan gelatin, NaOH 1N, Mueller Hinton  Agar (MHA)  (Merck,  Germany), Mueller Hinton  Broth (MHB)  (Merck,  Germany),  DMSO (Merck  Schuchardt,  Germany),  aquadest  steril), Trypticase  Soy  Broth (TSB)  (Merck,  Germany), H 2 SO 4 1%  (Fluka  Riedel  de  Haen,  Germany), BaCl 2 (Merck,  Germany), microplate ,  akuades, sumuran, larutan kristal violet 1%.

## Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian sebagai  berikut  timbangan  analitis  (Sartorius  TE 214  S,  Germany),  corong  pisah,  cawan  porselen, eksikator,  krus  silikat,  penangas  air,  lemari pendingin (Sanyo, Jepang), micropipet , microplate  reader (Thermofisher  Scientific, Amerika),  lampu  UV,  Chambers, Laminar  Air Flow (LAF)  (Type  V-130,  Indonesia),  inkubator (Memmert and Binder, Germany), oven (Memmert,  Germany),  autoklaf  (All  America Model 25x, USA), mikroskop (Olympus, Jerman), vorteks (Labinco,  Belanda), hot  plate dan magnetic strirer (Faithful SH-3, China).

## Tahapan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah  bunga  dari  tanaman  bintaro  ( Cerbera odollam )  segar  yang  diperoleh  dari  daerah Surabaya bagian Timur pada bulan Agustus tahun 2016  dan  distandarisasi  di  Laboratorium Fitokimia-Farmakognosi Fakultas
Farmasi Universitas  Katolik  Widya  Mandala  Surabaya. Determinasi tanaman bertujuan untuk menetapkan kebenaran dari tanaman. Determinasi  tanaman  bunga  bintaro  ( Cerbera odollam ) dilakukan  oleh  UPT  Materia  Medica. Ekstrak  diperoleh  dengan  metode  maserasi menggunakan pelarut etanol 96%.

## Uji Aktivitas Antibakteri secara Difusi
Suspensi  bakteri  uji  yang  sudah  di setarakan  dengan  0,5  Mc  Farland  I  (~1,5  x  10 8 CFU/ml)  diinokulasikan  sebanyak  0,25ml  ke dalam 25 ml media MHA  50°C  dan dihomogenkan menggunakan vortex . Media MHA dipindahkan  ke  dalam  cawan  petri  steril  dan dirotasi.  Pra-pengeraman  dilakukan  selama  1,5-2 jam pada suhu 37°C. Sumuran dibuat menggunakan perforator dengan diameter 6 mm. Konsentrasi  10  %;  20%  dan  30%  ekstrak  bunga bintaro dimasukkan  sebanyak  20  μl  ke  dalam sumuran dan Tetrasiklin HCl sebanyak 20μl yang dimasukkan  ke  dalam  sumuran  digunakan sebagai  kontrol  positif.  Untuk  kontrol   negative
menggunakan  DMSO  2%.  Media  diinkubasi selama  24  jam  dengan  suhu  37°C.  Diameter hambat  pertumbuhan  diukur  dengan  jangka sorong.

## Uji  Aktivitas  Penghambatan  Pembentuk- an Biofilm (Soegianto, 2012)
Microplate  U-bottom  96  well masing- masing  diisi  dengan  ekstrak  kental  (konsentrasi 30%)  sebanyak  100  μl,  suspensi  bakteri  yang sudah  disetarakan  dengan  0,5  Mc  Farland  I sebanyak  20  μl  pada  masing-masing  sumuran, dan  TSB  ( Tryptic  Soy  Broth )  2,5%  sebanyak  100 μl. Sebagai kontrol positif pembanding digunakan tetrasiklin  HCl  sebanyak  100  μl.  Kontrol  negatif berisi media TSB yang mengandung glukosa 2,5%. Kontrol positif berisi suspensi bakteri konsentrasi
1,5  x  10⁵  CFU/ml  dan  media  TSB Microplate diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C (dalam kondisi  lembab  sebelum  masuk  inkubator). Setelah inkubasi, isi sumuran dibuang dan dibilas 3  kali  dengan  air  mengalir  dan  keringkan  dalam inkubator  37°C  selama  15  menit.  Masing-masing sumuran diberi crystal violet 1% sebanyak 200 μl selama  15  menit  pada  suhu  ruang  yang  berguna untuk  mewarnai  biofilm  yang  terbentuk. Microplate dicuci  atau  dibilas  dengan  air mengalir  sebanyak  2  kali.  Masing-masing sumuran diberi tween 2% sebanyak 200 μl selama 15 menit yang digunakan untuk melarutkan cincin biofilm  yang  terbentuk. Microplate  reader dimasukkan  dan  di shake selama  30  detik, absorbansi dibaca pada λ 595 nm.
x 100% Keterangan: DO = Densitas Optik DO sampel = DO rata-rata abs. sampel – DO rata-rata abs. kontrol ekstrak DO kontrol positif = DO rata-rata abs. kontrol positif  –  DO rata-rata abs. Kontrol negatif Kontrol negatif = media pertumbuhan Kontrol positif = media pertumbuhan dengan suspensi bakteri
Kontrol ekstrak                =  media + ekstrak etanol tanaman + larutan DMSO
Penentuan  Golongan  Senyawa  Anti- bakteri pada Ekstrak dengan Bioautografi
Bioautografi  menggunakan  ekstrak  bunga Cerbera  odollam yang  ditimbang  sebanyak  0,3g dan dilarutkan dengan etanol 96% sebanyak 10 ml ke  dalam  labu  takar.  Ekstrak  tersebut  kemudian ditotolkan  ke  plat  KLT  sebanyak  15  μl  dengan konsentrasi  3%  dan  di  eluasi  menggunakan  n- butanol,  asam  asetat  dan  air  perbandingan  4:1:5. Plat  KLT  selanjutnya  di  tempelkan  pada  media agar selama 1 jam. Media agar adalah media agar padat yang berisi suspensi bakteri Staphylococcus aureus konsentrasi 10⁶ CFU/ml yang telah di pra- inkubasi  1,5-2  jam  (Valeri,  2014),  selanjutnya media  agar  diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu 37°C.  Daerah  bening  pada  media,  menunjukkan adanya  hambatan  pertumbuhan  bakteri  oleh kandungan senyawa antibakteri dari ekstrak. Plat KLT  yang  telah  dieluasi  diamati  pada  sinar  UV 254  nm  dan  UV  366  nm  serta  pereksi  semprot Dragendorff,  Liebermann-Burchard ,  FeCl3,  dan AlCl₃, kemudian dilakukan perhitungan nilai Rf .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Bunga  bintaro  yang  digunakan  adalah bunga  segar  berwarna  putih  dengan  mahkota bunga  berbentuk  tabung,  pada  bagian  tengahnya berwarna kuning. Bunga memiliki lima petal yang sama  dan  beraroma  khas.  Sebelum  digunakan bunga  dideterminasi  terlebih  dahulu  dengan tujuan  untuk  menetapkan  kebenaran  yang  ber- kaitan dengan ciri-ciri morfologi secara makroskopis  bunga  bintaro  terhadap  kepus- takaan.
Dari  hasil  pengujian  diperoleh  bahwa ekstrak  bunga  bintaro    pada  konsentrasi  10%, 20%,  30%  memberikan  DHP  (Daerah  Hambat Pertumbuhan) rata-rata 21,66±0,73 mm, 25,66±1,50  mm,  27,10±1,06  mm  terhadap Staphylococcus  aureus. Pembanding  Tetrasiklin HCl  memberikan  DHP  rata-rata  30,54±0,83  mm terhadap Staphylococcus aureus dan  dari hasil di atas  diketahui  bahwa  ekstrak  bunga  bintaro memiliki daya antibakteri (Tabel 1 dan gambar 1).
Pada  uji  bioautografi,  penentuan  golongan senyawa  aktif  dilakukan  dengan  menggunakan beberapa  penampak  noda,  yaitu  FeCl₃  AlCl₃, pereaksi Dragendorff , dan pereaksi Liebermann- Burchard (gambar 2). Noda ekstrak etanol bunga bintaro  pada Rf 0,18  dengan  penampak  noda Dragendorff memberikan  hasil  positif  warna merah jingga yang menunjukkan adanya golongan senyawa  alkaloid.  Noda  ekstrak  etanol  bunga bintaro pada Rf 0,58  dengan  penampak  noda FeCl₃  memberikan  hasil  positif  warna  hijau kehitaman  yang  menunjukkan  adanya  tanin. FeCl₃  menghasilkan  warna  hijau  kebiruan  yang
menunjukan  adanya  senyawa  tanin  (Wagner, Bladt dan Zgainski, 1984).
Mekanisme kerja alkaloid sebagai antibakteri  adalah  dengan  cara  mengganggu komponen  penyusun  peptidoglikan  pada  sel bakteri  sehingga  lapisan  dinding  sel  tidak terbentuk  secara  utuh,  terganggunya  sintesis peptidoglikan  sehingga  pembentukan  sel  tidak sempurna karena tidak mengandung peptidoglikan  dan  dindingnya  sel  hanya  meliputi membran  sel  (Cowan,  1999).  Golongan  senyawa fenolik  tanin  merupakan  senyawa  golongan
polifenol yang dapat merusak membran sel akibat denaturasi protein bakteri (Cowan, 1999).
Pengujian
antibiofilm dilakukan menggunakan  metode  mikro  dilusi  dengan pengenceran  berderet  menggunakan microplate . Microplate berisi  larutan  ekstrak  dengan konsentrasi  30%  pada  konsentrasi  awal.  Media TSB-glukosa  2,5%  digunakan  sebagai  larutan pengencer  karena  glokusa  dapat  membantu pertumbuhan  biofilm,  konsentrasi  suspensi bakteri yang digunakan adalah 1,5 x 10⁵ CFU/ml. Pewarnaan  biofilm  menggunakan  kristal  violet 1%.  Kristal  violet  yang  larut  dalam  air  akan terdisosiasi  menjadi  ion  kristal  violet  yang bermuatan  positif  dan  ion  klorida  bermuatan negatif.  Ion  kristal  violet  yang  bermuatan  positif akan berikatan dengan molekul-molekul bermuatan  negatif  sehingga  biofilm  akan berwarna violet. Pengamatan persentase penghambatan pembentukan biofilm pada gambar  3  menunjukkan    ekstrak  etanol  bunga bintaro  dapat  menghambat  pertumbuhan  biofilm Staphylococcus  aureus dibandingkan  dengan kontrol  negatif.  Pada  konsentrasi  3,75  % menunjukkan hasil penghambatan biofilm sebesar  98,29  %.  Pada  konsentrasi  1,875  % mengalami  penurunan,  prosentase  ini  terus menurun  hingga  yang  terkecil  adalah  persentase penghambatan  sebesar  17,68%  pada  konsentrasi 0,23%. Namun pada konsentrasi 0,11%
mengalami  kenaikan  menjadi  44,93  %.  Hal  ini
terjadi  kemungkinan  karena  konsentrasi  yang tinggi  mengalami  kejenuhan  yang  berarti  ekstrak sukar  larut  pada  pelarutnya  (Kanja,  2017). Sedangkan pada konsentrasi 7,5%-30% penghambatan pertumbuhan biofilm diatas 100% diduga  karena  adanya  ekstrak  menempel  pada dinding  microplate  sehingga  akan  mengikat kristal  violet  sehingga  absorbansi  kristal  violet yang terbaca besar yang menunjukkan penghambatan  biofilm  berkurang  sehingga berdampak  pada  prosentase  penghambatan biofilm yang menjadikan lebih dari 100%.
Teori  lain  oleh  Aenderek  (2005)  yang menyebutkan  bahwa  mekanisme  penghambatan pertumbuhan  biofilm  dapat  dengan  cara menembus  dinding  sel  bakteri  sehingga  dapat menganggu  sinyal  sinyal  komunikasi (Quorum sensing) antar  bakteri  yang  berperan  dalam pembentukan  biofilm  atau  menginaktivasi  gen- gen pada bakteri yang memicu sintesis EPS. Pada aktivitas  ini,  ekstrak  bunga  bintaro  dengan konsentrasi  15%  yang  memiliki  kekeruhan  tinggi dibanding  yang  lain  tentunya  tidak  dapat menembus sel bakteri secara maksimal dibandingkan dengan konsentrasi rendah. Namun hasil  yang  diperoleh  lebih  dari  100%  dapat disebabkan  karena  menempelnya  ekstrak  pada dinding  yang  dapat  mengakibatkan  absorbansi yang  didapat  lebih  besar  sehingga  prosentase penghambatan juga besar.
Gambar 1. Hasil uji daya antibakteri pada bunga bintaro, DMSO 2% dan pembanding Tetrasiklin HCL 8μg/20μl  terhadap Staphylococcus aureus ATCC 6538 pada media MHA dengan metode difusi sumuran. Keterangan :
E1
: Ekstrak bunga bintaro dengan konsentrasi 10% E2
: Ekstrak bunga bintaro dengan konsentrasi 20%
E3 : Ekstrak bunga bintaro dengan konsentrasi 30%
T : Tetrasiklin HCL 8μg/20μl sebagai pembanding  antibiotika
D
: DMSO 2% sebagai pembanding negative
Tabel 1 . Hasil Pengukuran Diameter Daerah Hambatan Pertumbuhan (DHP) Bunga Bintaro, Pembanding
Tetrasiklin HCl 8μg/20μl dan DMSO 2% terhadap Staphylococcus aureus Replikasi Daerah Hambatan Pertumbuhan (DHP) (mm) Ekstrak Tetrasiklin HCl DMSO 2% 10% 20% 30% 1 21,10 23,65 27,95 30,05 - 2 21,40 25,20 27,95 31,50 - 3 22,50 26,65 26,10 30,07 - x ± SD 21,66±0,73 25,66±1,50  27,10±1,06  30,54±0,83
Keterangan :
1. Pengukuran diameter DHP dilakukan dengan diameter sumuran 6 mm.
2. - = Tidak terdapat Daerah Hambatan Pertumbuhan (DHP)
Gambar. 2. Hasil pengujian bioautografi ekstrak bunga bintaro terhadap Staphylococcus aureus
a. Hasil uji bioautografi pada lempengan agar
b. Hasil KLT dengan pereaksi Dragendorff
c. Hasil KLT pereaksi FeCl₃ dan dipanaskan
d. Hasil KLT pereaksi Liebermann-Burchard dengan pemanasan
e. Hasil KLT pereaksi AlCl3 pada lampu UV 366 nm.
Gambar 3. Grafik persentase penghambatan biofilm ekstrak pada berbagai konsentrasi

## KESIMPULAN
Ekstrak  etanol  bunga  bintaro  ( Cerberra odollam) memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap Staphylococcus  aureus ATCC  6538  dengan adanya  DHP  (Daerah  Hambat  Pertumbuhan) pada  konsentrasi  10  %  sebesar    21,66±0,73  mm, konsentrasi  20  %  sebesar    25,66±1,50  mm  dan konsentrasi 30% sebesar 27,10±1,06 dan memiliki aktivitas  penghambatan  biofilm Staphylococcus aureus dengan  penghambatan  pembentukan biofilm 98,29% pada konsentrasi 3,75%. Golongan
senyawa  ekstrak  etanol  bunga  bintaro  ( Cerberra odollam )    yang  diduga  memiliki  aktivitas antibakteri  terhadap  terhadap Staphylococcus aureus ATCC 6538 adalah alkaloid dan tanin.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada PPOT  (Pusat  Penelitian  Obat  Tradisional)  yang telah  memberi  dukungan  finansial  terhadap penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Aenderek, S, Diggle S, Song, Z, Hoiby, N, Cornelis, P, Williams Pand Camara, M. 2005. The MexGHI-OpmD multidrug efflux pump controls growth, antibiotic susceptibility and virulence in  Pseudomonas  aeruginosa  via  4-quinolonedependent cell- to-cell communication. Microbiology 151(4), 1113-1125.
Archer,  N.K,  M.J.  Mazaitis,  J.W.  Costerton,  J.G.  Leid,  M.E. Powers,  M.E  Shirtliff.  2011. Staphylococcus  Aureus Biofilms Properties,  Regulation  and  Roles  in  Human  Disease.  Landes Bioscience. Virulence 2:5, 445-459.
Ahmed,  F.,  Amin,  R.,  Shahid,  IZ.,  &  Sobhani,  MME.,  2008, Antibacterial, cytotoxic and neuropharmacological activities of Cerbera odollam seeds , Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, 8 (4), 323-328.
Cowan,  M.M.  1999.  Plant  Products  as  Antimicrobial  Agents, Clinical Microbiology Reviews, 12(4):564-82.
DitJen  POM  RI  [Direktorat  Jenderal  Pengawasan  Obat  dan Makanan  Republik  Indonesia],  2000, Parameter  Standar Umum  Ekstrak  Tumbuhan  Obat .  Departemen  Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Kanja,    F.S.    2017,  Efektivitas    Antibakteri    dan    Antibiofilm ekstrak    etnaol  daun  bintaro  ( Cerbera  odollam )  terhadap Staphylococcus  aureus ATCC      6538, Skripsi ,      Sarjana Farmasi,   Universitas   Katolik Widya Mandala, Surabaya.
Mah TFC,  dan  O’Toole GA.  2001, Mechanism Of Biofilm
Resistance To Antimikrobiology Agent .Trends In
Microbiology : 9 No 1.
Mhaske,  M.,  Samad,  B.  N.,  Jawade,  R.  &  Bhansali,  A.,  2012, Chemical Agents in Control of Dental Plaque in Dentistry: An Overview  of  Current  Knowledge  and  Future  Challenges, Pelagia Research Library , 3 (1), 268-272.
O'Toole et  al .  2000. Biofilm  formation  as  microbial development . Annu Rev Microbiology. Vol 54 Hal 49-79.
Prakash  B.,  B.M.  Veeregowda and G.  Krishnappa.  2003. Biofilms:  A  Survival  Strategy  of  Bacteri. Current  Sci.,  85: 1299-1307.
Smith J.L, Fratamico P.M, Novak J.S. 2004 . Quorum sensing: a primer for food microbiologists . Journal of Food Protection 67: 1053-1070.
Rahman,  M.D.A.,  Paul,  P.,  &  Rahman,  A.A.,  2011, Antinociceptive, Antibacterial & Diuretic Activities of Cerbera odollam Gaertn  Roots, Research Journal  of  Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences , 2 (3), 16-23.
Soegianto  L,  2012,  Isolasi  dan  Identifikasi  Zat  Antibakteri dalam Ekstrak Kelopak Bunga Rosela ( Hibiscus sabdariffa L.). Thesis Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Wagner,  H.,  Bladt,  S.,  &  Zgainski,  E.M.,  1984,  Plant  Drug Analisys: A Thin Layer Chomatography Atlas, Springer-Verlag, Berlin.