Menara Perkebunan, 2006, 74(2), 75-85.

## Identifikasi isolat
Phytophthora asal kakao
Identification of isolates of Phytophthora from cocoa
Abu UMAYAH 1) & Agus PURWANTARA 2)
1) Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya, Palembang, Indonesia
2) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor 16151, Indonesia

## Summary
Phytophthora spp.  are  responsible  for some  serious  diseases  of  cocoa  including  pod rot,  stem  canker,  leaf  blight,  seedling  blight, and chupon wilt. Eight species of Phytophthora have  been  isolated  from  diseased  cocoa worldwide,  even  though  only  three  species cause most losses in cocoa production.  Twenty isolates  of Phytophthora sp.  were  isolated from  various  parts  of  the  cocoa  tree  collected from  six  cocoa  producing  provinces  in Indonesia,  viz.  North  Sumatera,  Lampung, West  Java,  East  Java,  South  Sulawesi  and Southeast  Sulawesi.    All  isolates  were  then identified  using  their  morphological  charac- teristics  and  it  was  concluded  that  all  of  the isolates  are Phytophthora  palmivora .  This identification was then confirmed with molecular identification by amplification of ITS of rDNA of the isolates with primers ITS 4 and
ITS  5,  followed  by  restriction  of  the  amplicon with  enzymes.    The  molecular  identification confirmed that all isolates are P. palmivora .
[ Key words: Theobroma  cacao , Phytopthora identification, Internal Transcribed-
Spacer (ITS), pod rot,  stem canker]

## Ringkasan
Phytophthora spp.  merupakan  penyebab beberapa  penyakit  penting  pada  kakao, termasuk  busuk  buah,  kanker  batang,  hawar daun, hawar bibit, dan layu tunas air.  Delapan spesies Phytophthora telah  berhasil  diisolasi dari  tanaman  kakao  sakit  di  seluruh  dunia, meskipun  hanya  tiga  spesies  yang  meng-
akibatkan  kehilangan  produksi  kakao  yang nyata.  Dua puluh isolat Phytophthora sp. telah diisolasi  dari  berbagai  bagian  tanaman  kakao yang  dikumpulkan  dari  enam  provinsi  sentra produksi  kakao  di  Indonesia,  yaitu  Sumatera Utara,  Lampung,  Jawa  Barat,  Jawa  Timur, Sulawesi  Selatan  dan  Sulawesi  Tenggara. Semua  isolat  diidentifikasi  berdasarkan  sifat- sifat  morfologi  dan  dapat  disimpulkan  bahwa semua  isolat  adalah Phytophthora  palmivora . Identifikasi selanjutnya dilakukan secara molekuler  dengan  amplifikasi  daerah  ITS  dari rDNA  isolat  menggunakan  pasangan  primer ITS  4  dan  ITS  5,  kemudian  diikuti  dengan pemotongan  amplikon  menggunakan  enzim restriksi.  Identifikasi  molekuler  juga  menun- jukkan  bahwa  semua  isolat Phytophthora penyebab penyakit pada kakao adalah P. palmivora .

## Pendahuluan
Phytophthora spp.  adalah  penyebab penyakit  penting  pada  kakao,  antara  lain penyakit  busuk  buah,  kanker  batang, hawar  daun,  hawar  bibit,  dan  layu  tunas air.      Di  antara  penyakit  tersebut,  busuk buah  merupakan  penyakit  paling  penting karena  menyebabkan  kerugian  yang  ber- kisar  antara  10  sampai  30%  di  seluruh dunia,  dan kerugian yang jauh lebih tinggi terjadi  di  daerah  endemis,  terutama  di daerah basah pada musim hujan (McMahon & Purwantara, 2004). Delapan spesies Phytophthora telah  dilaporkan dapat menyebabkan penyakit pada kakao,

## Umayah & Purwantara
yaitu P.  palmivora (Butler)  Butler  di seluruh  dunia  (Erwin  &  Ribeiro,  1996) , P.  megakarya (Brasier  &  Griffin)  di Afrika  Barat  (Brasier  &  Griffin,  1979) , P.  citrophthora (R.E.  Smith  &  E.H. Smith)  di  Brazil  dan  India  (Kellam  & Zentmyer, 1981; Chowdappa & Mohanan, 1996), P.  capsici (Leonian)  di  Brazil  dan India (Campelo & Luz, 1981; Chowdappa &  Mohanan,  1996), P.  katsurae (Ko  & Chang)  di  Sri  Lanka  (Liyanage  & Wheeler, 1989), P. megasperma (Dreschler)  di  Venezuela  (Zadoks,  1997), P.  arecae (Coleman)  Pethybridge  dan P.  nicotianae (van  Breda  de  Haan) (Kellam  &  Zentmeyer,    1986;  Erwin  & Ribeiro 1996). Namun, hanya tiga spesies, yaitu P.  palmivora,  P.  megakarya dan P citropthora yang menimbulkan kerugian paling besar pada kakao (Erwin &Ribeiro, 1996;  McMahon  &  Purwantara,  2004). Laporan  yang  ada  menunjukkan  bahwa spesies Phytophthora yang  menyebabkan penyakit  pada  kakao  di  Indonesia  adalah P.  palmivora (Van  Hall,  1912;  1914; Tollenaar,1958; Turner, 1961; Purwantara, 1987;  1990;  Sudarmadji  &  Pawiro- soemardjo, 1990; Semangun 2000). Namun,  Appiah et  al. (2003)  melaporkan terdapat isolat P. citrophthora yang me- nyebabkan  penyakit  pada  kakao  dari Indonesia. Sifat-sifat biologi, epidemiologi dan  cara  pengendalian  penyakit  di  lapang berbeda  di  antara  spesies Phytophthora (Zentmyer, 1974).  Oleh karena itu survai spesies Phytophthora yang ada di Indonesia yang  dilanjutkan dengan identi- fikasi  menjadi  sangat    penting  untuk dilakukan.
Identifikasi  spesies  melalui  studi morfologi  jamur Phytophthora spp.  meli- puti  sifat-sifat  aseksual  (tipe  koloni,  pem- bengkakan  hifa,  produksi   dan   diameter
klamidospora,  percabangan  sporangiofor, bentuk  dan  ukuran  sporangia, caducity (kemudahan  sporangia  untuk  lepas  dari sporangiofor), panjang pedisel dan papila) dan sifat seksual (ukuran anteridia, ukuran oogonia,  ukuran  oospora)  sudah  umum dilakukan  (Waterhouse,  1974a;  1974b), sedangkan  identifikasi  secara  molekuler belum  banyak  dilakukan.  Identifikasi secara molekuler dilakukan dengan ampli- fikasi  daerah Internal  Transcribed  Spacer (ITS)  dari  DNA  ribosom  (rDNA)  meng- gunakan  PCR  dengan  pasangan  primer ITS 5 dan ITS 4 atau ITS 1 dan ITS 4.
Hasil  amplifikasi  berupa  pita  (ampli- kon)  tunggal  berukuran  lebih  kurang  900 pasangan basa (pb) untuk P.  palmivora , 862 pb untuk P. capsici dan 941 pb untuk P.  fragariae .  Sebaliknya,  amplifikasi  de- ngan  primer  ini  pada  jamur  lain  yang berasosiasi  dengan  tanaman  menghasil- kan  pita  berukuran  600  pb.    Selanjutnya digesti  hasil  PCR  dengan  enzim  restriksi menghasilkan pita-pita DNA yang spesifik spesies, sehingga analisis ini dapat diguna- kan  untuk  identifikasi  spesies  (Darmono &Purwantara  2001;  Chowdappa et  al ., 2003).  Identifikasi  spesies  secara  morfo- logi  memiliki  kelemahan  karena  dapat dipengaruhi  oleh  lingkungan,  sebaliknya identifikasi  secara  molekuler  akan  meng- hasilkan  informasi  genetik  dengan  kete- patan  yang  lebih  akurat  dan  relatif  lebih cepat, dan hasilnya tidak dipengaruhi oleh lingkungan.
Tulisan  ini  melaporkan  hasil  isolasi dan  identifikasi Phytophthora spp.  dari berbagai  bagian  tanaman  kakao  yang berasal dari enam provinsi sentra produksi kakao  di  Indonesia.    Dengan  identifikasi spesies yang benar, diharapkan akan dapat direkomendasikan  strategi  pengendalian penyakit pada kakao yang tepat.

## Identifikasi isolat Phytophthora asal kakao

## Bahan dan Metode

## Isolasi jamur patogen
Jamur patogen diisolasi dari sampel buah atau batang kakao sakit atau tanah di sekitar  tanaman  kakao  sakit  yang  dikum- pulkan dari enam provinsi sentra produksi kakao di Indonesia, yaitu Sumatera Utara, Lampung,  Jawa  Barat,  Jawa  Tengah, Sulawesi  Selatan  dan  Sulawesi  Tenggara. Isolasi patogen dari buah atau batang sakit dilakukan  dengan  desinfeksi  permukaan buah  atau  batang  sakit  dan  dilanjutkan dengan  penanaman  jaringan  yang  diambil dari  perbatasan  antara  jaringan  sehat  dan sakit  pada  medium potato  dextrose  agar (PDA).    Jamur  yang  tumbuh  pada  PDA selanjutnya   dibiakkan   dan   dimurnikan pada medium yang sama sampai diperoleh biakan  murni.    Isolasi  patogen  dari  tanah dilakukan  dengan baiting tanah  meng- gunakan  buah  kakao  sehat  dengan  cara sebagai  berikut:    buah  kakao  sehat  diber- sihkan  dengan  menggunakan  air  yang mengalir  dan  permukaan  buah  dides- infeksi dengan alkohol 70 %.  Buah kakao diiris  dengan  pisau  steril  sehingga  mem- bentuk  sobekan  sepanjang  2  cm  dan sampel tanah disisipkan ke dalam sobekan.    Buah  dibungkus  dengan  kertas dan  diikubasi  pada  suhu  ruang  selama 3-5  hari.    Setelah  timbul  gejala  busuk berwarna  kecoklatan  pada  buah,  patogen diisolasi dari buah kakao sakit dengan cara seperti isolasi dari buah sakit.  Isolat jamur patogen  yang  berhasil  diisolasi  disajikan pada Tabel 1.

## Identifikasi morfologi
Identifikasi  jamur  patogen  dilakukan berdasarkan  pada  kriteria  morfologi  yang dikemukakan Waterhouse (1974a, 1974b),
Holliday (1980), Erwin & Ribeiro (1996), Drenth & Sendall  (2001).  Sifat morfologi yang  digunakan  untuk  identifikasi  adalah tipe  koloni,  pembengkakan  hifa,  produksi dan  diameter  klamidospora,  percabangan sporangiofor,  bentuk  dan  ukuran  spo- rangia, caducity ,  panjang  pedisel  dan papila.  Untuk  keperluan  ini,  isolat  ditum- buhkan pada medium PDA, dan pengama- tan dilakukan dengan menggunakan mikroskop  Olympus  BX51  yang  di- lengkapi  dengan  mikrometer  okuler, mikrometer  obyektif,  dan  kamera  Ricoh A50.  Pengukuran  sporangia  dilakukan pada 60 sporangia yang dipilih secara acak untuk masing-masing isolat.

## Identifikasi molekuler
Isolat jamur ditumbuhkan pada
medium Potato  Dextrose  Broth (PDB)
dalam tabung Erlenmeyer sebanyak 100  mL,  di  atas shaker dengan  kecepatan 125  rpm  pada  suhu  ruang  selama  tujuh hari.    Miselia  disaring  dengan  mengguna- kan  saringan  teh  steril,  dicuci  dengan Phosphate  Buffer  Saline (PBS)  sebanyak tiga  kali,  dan  digunakan  untuk  ekstraksi DNA.    Ekstraksi  DNA  jamur  patogen  di- lakukan  menurut  metode  Orozco-Castillo et al . (1994) yang dimodifikasi khususnya penambahan Polyvinyl  Poly  Pyrrolidon (PVPP) pada waktu penggerusan di dalam lumpang  porselin  dan β -merkaptoetanol ke  dalam  bufer  ekstraksi.    Setelah  dilaku- kan  pengujian  kualitas  dan  penentuan kuantitasnya,  larutan  DNA  digunakan untuk  amplifikasi  dengan  PCR  atau  di- simpan  pada  suhu  -20 o C.  Amplifikasi DNA  dilakukan  dengan  menggunakan primer  spesifik  ITS  4  (5’-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3’)  dan  ITS  5  (5'- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG  -  3'  ) (White et  al .,  1990)    pada Thermocycler

## Umayah & Purwantara
Tabel 1. Daftar isolat Phytophhtora sp. asal enam provinsi di Indonesia.
Table 1. List of isolates of Phytophthora sp . from six provinces in Indonesia.
No. No Kode isolat Code of isolate Asal isolat Origin of isolate Bahan isolasi Material for isolation 1 SU-3 Desa Sungai Tahuang, Kec. Secanggang, Kab. Langkat, Prov. Sumatera Utara Buah ( Pod ) 2 SU-4 Desa Sayumsabah, Kec. Sibolangit, Kab. Deli Serdang, Prov. Sumatera Utara Buah ( Pod ) 3 LP-B Desa Negeri Sakti, Kec. Gedong Tataan, Kab. Lampung Selatan, Prov. Lampung Buah ( Pod ) 4 LP-T Desa Negeri Sakti, Kec. Gedong Tataan, Kab. Lampung Selatan, Prov. Lampung Tanah ( soil ) 5 JB-B1-CI0 Kebun BPBP Ciomas, Bogor,  Prov. Jawa Barat Buah ( Pod ) 6 JB-T-CI0 Kebun BPBP Ciomas, Bogor,  Prov. Jawa Barat Tanah ( soil ) 7 JB-BLS2 Kebun  Layungsari,    PT.  Intergreen  Estate,  Cianjur, Prov. Jawa Barat Buah ( Pod ) 8 JB-BLS4 Kebun  Layungsari,    PT.  Intergreen  Estate,  Cianjur, Prov. Jawa Barat Buah ( Pod ) 9 JB-BLS6 Kebun  Layungsari,    PT.  Intergreen  Estate,  Cianjur, Prov. Jawa Barat Buah ( Pod ) 10 JB-RAP Kebun Rajamandala, PTPN VIII, Bandung,  Prov. Jawa Barat Buah ( Pod ) 11 JB-BAP Kebun Bunisari, PTPN VIII, Garut, Prov. Jawa Barat Buah ( Pod ) 12 JT-R Kebun Renteng, PTPN X, Jember, Prov. Jawa Timur Buah ( Pod ) 13 JT-CP Kebun Puslit Kopi & Kakao, Jember, Prov. Jawa Timur Buah ( Pod ) 14 JT-GC7 Kebun Puslit Kopi & Kakao,Jember, Prov. Jawa Timur Buah ( Pod ) 15 SS-B1 Bonepute, Kotip Palopo,  Prov. Sulawesi Selatan Buah ( Pod ) 16 SS-B2 Bonepute, Kotip Palopo,  Prov. Sulawesi Selatan Buah ( Pod ) 17 ST-6 Desa  Tasahea,  Kec.  Tirawuta,  Kab.  Kolaka,  Prov. Sulawesi Tenggara Buah ( Pod ) 18 ST-8 Desa  Ujung,  Kec.  Liliriau,  Kab.  Soppeng,  Prov. Sulawesi Selatan Batang ( stem ) 19 ST-9 Desa  Dangia,  Kec.  Ladongi,  Kab.  Kolaka,  Prov. Sulawesi Tenggara Buah ( Pod ) 20 ST-10 Desa  Gunung  Jaya,  Kec.  Ladongi,  Kab.  Kolaka,  Prov. Sulawesi Tenggara Buah ( Pod )

## Identifikasi isolat Phytophthora asal kakao
Amplitron ® -1  dengan  program:  tahap denaturasi    pada  suhu  94 o C  selama  satu menit,    tahap  pemasangan  penempelan pada  suhu  42 o C  selama  satu  menit,  dan tahap ekstensi pada suhu  72 o C selama dua menit.  Reaksi PCR berlangsung sebanyak 35  siklus,  kemudian  ditambah  72 o C selama  empat  menit.  Campuran  reaksi PCR  terdiri  atas  50  ng  masing-masing primer,  100  ng  DNA  templat,  10  mM masing-masing  dNTP,  satu  unit  poli- merase DNA Taq dan H 2 O sampai volume 50 µ L.      Untuk  mengetahui  keberhasilan amplifikasi  DNA,  hasil  PCR  dielektro- foresis  pada  gel  agarose  2%,  dengan tegangan  50  V,  selama  satu  jam.    Gel kemudian difoto pada transiluminator UV. Sampel  hasil  PCR  kemudian  didigesti dengan  enzim  restriksi Alu I  dan Msp I pada  suhu  37 o C  selama  satu  jam,  serta Taq I  pada  suhu  65 o C  selama  satu  jam. Hasil  digesti  selanjutnya  dielektroforesis pada  gel  agarose  2%,  50  V,  selama  satu jam,    kemudian  difoto  pada    transilumi- nator UV.

## Hasil dan Pembahasan
Sifat-sifat  morfologi  isolat Phytophthora sp.
Sebanyak  20  isolat Phytophthora sp. berhasil  diisolasi  dari  buah  dan  batang kakao  sakit  serta  dari  tanah  di  sekitar pertanaman  kakao  dari  berbagai  sentra produksi  kakao  di  Indonesia,  yaitu Sumatera  Utara,  Lampung,  Jawa  Barat, Jawa  Timur,  Sulawesi  Selatan,  dan Sulawesi  Tenggara.    Koloni  semua  isolat mempunyai  morfologi  yang  sama  walau- pun  disubkulturkan  berkali-kali,  yaitu tumbuh lambat pada PDA, berbentuk bulat dengan pinggiran tidak rata, seperti kapas, berwarna  putih,  jika  dipotong-potong
menggunakan  skalpel  terasa  agak  kenyal (Gambar  1).  Pada  umumnya  spo-rangia berbentuk  buah  pir  (ovoid)  meskipun ditemukan  juga  variasi  bentuk  lainnya, mempunyai  papilla  yang  jelas,  bersifat caducous (mudah lepas dari sporangiofor) dengan  tangkai  pendek  (Gambar  1). Morfologi dan ukuran  sporangia dan kla- midospora disajikan pada Tabel 2 dan 3.
Penelitian  sebelumnya  melaporkan morfologi  jamur  yang  hampir  sama  yaitu koloni berwarna putih, tumbuh sangat baik pada medium Corn Meal Agar (CMA) dan Lima Bean Agar (LBA), dengan sporangia lebih  banyak  diproduksi  pada  medium LBA, tetapi   tumbuh lebih  lambat  dengan sporangia  yang  dihasilkan  lebih  sedikit pada  medium  PDA  dan  V8  Juice  Agar (Purwantara,  1987).  Hendrawati  (1997) juga  melaporkan  bahwa  koloni  beberapa isolat Phytophthora sp.  asal  kakao  yang dipelajarinya  berbentuk  bulat  dengan pinggiran  tidak  rata,  berwarna  putih, dengan  hifa  tampak  lurus,  jika  dipotong menggunakan  skalpel  akan  terasa  kenyal sehingga  agak  menyulitkan  ketika  akan disubkulturkan pada medium kaldu kentang.
Variasi  di  antara  dua  puluh  isolat yang  dipelajari  sangat  sedikit,  terutama terjadi  pada  bentuk  hifa  dan  diameter klamidospora,  sedangkan  semua  isolat memproduksi  klamidospora  berbentuk bulat,  terminal  dan  beberapa  interkalar, dengan cabang sporangiofor simple sympodial , caducous dengan  pedisel  ber- ukuran  4-6 µ m.    Pedisel  dengan  ukuran tersebut  dikatagorikan  sebagai  pedisel yang  pendek  (Waterhouse,  1974a).    Pada umumnya  sporangia berbentuk ovoid  atau buah  pir,  dengan  satu  papila  yang  jelas, banyak  juga  yang  berbentuk  globose  dan ada juga beberapa isolat yang mempunyai bentuk  obpyriform  dan  ellipsoid,  dengan
Umayah & Purwantara
Gambar  1.  A.  Morfologi  koloni Phytophthora sp.  pada  PDA  umur  12  hari.  B.    Sporangia  mempunyai papila  yang  jelas  dengan  tangkai  pendek  (panah).  C.  Klamidospora  (panah).  Perbesaran  B dan C: 400 x.
Figure  1.    A.  Morphology  of  colony  of Phytophthora sp.  on  PDA,  12-day  old.  B.  Sporangia  with prominent papillae and short pedicels (arrow). C. Chlamydospores  (arrow). Magnification for B and C: 400 x.
ukuran  sporangia  53-61  x  32-42 µ m. Sifat-sifat  morfologi  semua  isolat  yang dikumpulkan dari enam provinsi penghasil kakao  di  Indonesia  ini  menunjukkan bahwa  semua  isolat  adalah Phytophthora palmivora (Waterhouse, 1974ab,  Stamps et al ., 1990; Drenth & Sendall, 2001). Menurut Semangun (2000), sporangia P. palmivora penyebab busuk buah kakao berbentuk  buah  pir,  dengan  ukuran  30-60 x  20-53 µ m.  Sporangiofor P.  palmivora tumbuh  sympodial,  dengan  sporangianya berbentuk  ovoid,  ellipsoid  atau  obpyri- form,  mempunyai  papila,  l/b  rasio  1,6  - 2,0, dengan ukuran sporangia 35-60 x 20- 40 µ m. Variasi ukuran ini di antaranya di- sebabkan oleh perbedaan kondisi medium, inang,  umur  biakan,  kelembaban  dan cahaya  (Waterhouse,  1974a;  Holliday, 1980;  Erwin  &  Ribeiro,  1996;  Drenth  & Sendall, 2001).
Identifikasi  molekuler  isolat Phytophthora sp.
Amplifikasi  DNA  20  isolat  patogen dengan  pasangan  primer  ITS  4  dan  ITS  5 menghasilkan  pita  DNA  tunggal  ber-
ukuran  lebih  kurang  900  pb  (Gambar  2). Setelah  digesti  dengan  enzim  restriksi Alu I  diperoleh  pita-pita  yang  berukuran ±  500,  160  dan  155  pb,  dengan  enzim restriksi Msp I  diperoleh  pita-pita  yang berukuran  ±  500  dan  400  pb,  dan  dengan enzim  restriksi Taq I  diperoleh  pita-pita berukuran  ±  300,  280,  150  dan  100  pb (Gambar 3).  Sifat-sifat molekuler tersebut merupakan  sifat-sifat  yang  dimiliki  oleh P.  palmivora (Darmono  &  Purwantara, 2001; Purwantara  & Darmono,  2002).
Berdasarkan  sifat-sifat  morfologi  dan molekuler  di  atas  maka  dapat  diidenti- fikasi  bahwa  dua  puluh  isolat  tersebut adalah P.  palmivora sebagai  penyebab penyakit  busuk  buah  dan  kanker  batang kakao  di  Indonesia.  Hasil  ini  mendukung laporan  sebelumnya  bahwa  penyakit utama  pada tanaman  kakao  di  Indonesia adalah  busuk  buah,  kanker  batang  dan hawar  daun  yang  disebabkan  oleh P. palmivora (Butler) Butler  (MF1)  (Van Hall,  1912;  1914;  Tollenaar,  1958; Turner,  1961;  Purwantara,  1987;  1990; Sudarmadji  &  Pawirosoemardjo,  1990; Semangun,  2000).    Meskipun  Appiah et  al. (2003)  melaporkan  terdapat  isolat
A B C

## Identifikasi isolat Phytophthora asal kakao
Tabel 2.  Karakteristik isolat Phytophthora sp. asal kakao. Table 2. Characteristics of isolates of Phytophthora sp. from cocoa .
Klamidospora Chlamydospore Sporangia Sporangia No. No. Isolat a) Isolate Pembengkakan hifa b) Hyphal swelling Produksi c) Presence ∅ ( µ m) Cabang Sporangiofor Branching Cadu city d) Panjang pedisel Pedicel length ( µ m) 1. SU-3 - + 28-40 Simple sympodial + 4-6 2. SU-4 - + 23-38 ,, + 4-6 3. LP-B +/- + 28-38 ,, + 4-6 4. LP-T - + 34-38 ,, + 4-6 5. JB-BLS2 - + 28-38 ,, + 4-6 6. JB-BLS4 +/- + 25-38 ,, + 4-6 7. JB-BLS6 - + 28-38 ,, + 4-6 8. JB-B-C10 - + 28-38 ,, + 4-6 9. JB-T-C10 - + 21-38 ,, + 4-6 10. JB-BAP - + 34-40 ,, + 4-6 11. JB-RAP - + 28-40 ,, + 4-6 12. JT-GC7 - + 23-38 ,, + 4-6 13. JT-CP +/- + 28-38 ,, + 4-6 14. JT-R - + 28-38 ,, + 4-6 15. SS-B1 +/- + 21-40 ,, + 4-6 16. SS-B2 - + 19-34 ,, + 4-6 17. ST-6 - + 23-47 ,, + 4-6 18. ST-8 +/- + 25-38 ,, + 4-6 19. ST-9 +/- + 19-40 ,, + 4-6 20. ST-10 +/- + 34-47 ,, + 4-6 a) Kode isolat lihat Tabel 1 (See codes of isolates on Table 1)
b) – Tidak ada pembengkakan hifa (No hyphal swelling) ; +/- Ada/tidak ada pembengkakan hifa (Yes/no hyphal swelling)
c) +  Klamidospora diproduksi (Chlamydospores are present)
d) +  Sporangia caducous .
P. citrophthora yang menyebabkan penya- kit  pada  kakao  dari  Indonesia,  diduga P.  citrophthora hanya  ditemukan  secara lokal dan bukan penyebab penyakit utama pada kakao di Indonesia.
Di  antara  spesies Phytophthora yang berasosiasi  dengan  kakao,  empat  spesies, yaitu P.  palmivora,  P.  citrophthora, P.  capsici dan P.  nicotianae sudah  lama dilaporkan  menyerang  tanaman  selain
kakao  di  Indonesia  (Semangun,  2000; Purwantara et al ., 2004).  Di samping itu, P.  palmivora merupakan  patogen  pada lebih  dari  150  spesies  tanaman  di  antara- nya  tanaman  kakao,  kelapa,  durian,  karet, nangka,  pepaya,  jeruk,  anggrek,  lada, vanili  dan  manggis  (Bennet et  al .,  1986; Drenth,  2001).  Hal  ini  menunjukkan  bah- wa  terdapat  spesifisitas  di  dalam  spesies dan  di  antara  spesies Phytophthora

## Umayah & Purwantara
Tabel 3. Morfologi dan ukuran sporangia Phytophthora sp. dari kakao.
Table 3. Morphology and dimension of sporangia of Phytophthora sp. from cocoa.
No. Isolat a) Isolate Bentuk b) Form Panjang Length =L ( µ m) Lebar Breadth =B ( µ m) Rerata Average ( µ m) Rasio L/B L/B Ratio Papila c) Papilla 1. SU-3 Ovo; Glo 44-57 34-40 57x42 1,3-1,4 P 2. SU-4 Ovo; Glo 40-66 34-47 57x40 1,2-1,4 P 3. LP-B Ovo; Glo 38-76 28-42 59x38 1,4-1,8 P 4. LP-T Ovo; Glo 38-76 21-40 57x38 1,8-1,9 P 5. JB-BLS2 Ovo; Glo 38-57 28-38 57x38 1,4-1,8 P 6. JB-BLS4 Ovo; Glo 38-66 34-38 59x38 1,2-1,7 P 7. JB-BLS6 Ovo; Glo 38-57 34-38 57x38 1,4-1,5 P 8. JB-B-C10 Ovo; Glo;Obp 40-61 28-38 59x34 1,4-1,6 P 9. JB-T-C10 Ovo; Glo;Ellip 40-76 28-40 61x38 1,4-1,9 P 10. JB-BAP Ovo; Glo 45-63 34-38 61x34 1,4-1,7 P 11. JB-RAP Ovo; Glo 40-66 25-38 61x38 1,6-1,7 P 12. JT-GC7 Ovo; Glo;Obp 38-66 28-38 57x34 1,4-1,7 P 13. JT-CP Ovo; Glo 40-59 25-34 57x32 1,6-1,7 P 14. JT-R Ovo; Glo 38-66 28-38 61x38 1,4-1,7 P 15. SS-B1 Ovo; Glo;Obp 42-57 28-40 57x38 1,4-1,5 P 16. SS-B2 Ovo 40-53 28-34 53x34 1,4-1,6 P 17. ST-6 Ovo; Glo;Obp 38-76 34-38 57x38 1,4-2,0 P 18. ST-8 Ovo; Glo;Obp 34-76 21-40 59x38 1,6-1,9 P 19. ST-9 Ovo; Glo 38-57 21-38 57x34 1,5-1,8 P 20. ST-10 Ovo; Glo 38-66 19-38 57x38 1,7-2,0 P a) Kode isolat lihat Tabel 1 (See codes of isolates on Table 1) .
b) Ovo = Ovoid; Glo = Globose; Obp = Obpyriform; Ellip = Ellipsoid
c) P = Papilla.
Gambar  2.  Pita  DNA  tunggal  ( ± 900  pb)  hasil  amplifikasi  DNA  dua  puluh  isolat Phytophthora sp. dengan primer ITS 4 dan ITS 5.  (M) Marker, (1) isolat SS-B2, (2) JB-BLS6, (3) JT-CP, (4) ST-10,  (5)  ST-8,  (6)  JT-R,  (7)  JB-T-CIO,  (8)  JB-B1-CIO,  (9)  ST-9,  (10)  ST-6,  (11)  SU-4, (12) SU-3, (13) JB-BLS2, (14) JB-BLS4, (15) SS-B1, (16) JB-BAP, (17) LP-B, (18) LP-T,
(19) JT-GC7, dan (20) isolat JB-RAP.  Detail isolat lihat Tabel 1.
Figure 2.  Single DNA fragment ( ± 900 bp) amplified from DNA of twenty isolates of Phytophthora sp. using primers ITS 4 and ITS 5.  (M) Marker, (1) isolate SS-B2, (2) JB-BLS6, (3) JT-CP, (4) ST-10, (5) ST-8, (6) JT-R, (7) JB-T-CIO, (8) JB-B1-CIO, (9) ST-9, (10) ST-6, (11) SU-4, (12) SU-3, (13) JB-BLS2, (14) JB-BLS4, (15) SS-B1, (16) JB-BAP, (17) LP-B, (18) LP-T, (19) JT- GC7, and (20) isolate JB-RAP.  For details see codes of isolates on Table 1.

## Identifikasi isolat Phytophthora asal kakao
Gambar 3.  Pita-pita  berukuran ± 500, 160, 155 pb hasil  restriksi  dengan  enzim Alu I (atas);  pita-pita berukuran ± 500 dan 400 pb hasil restriksi dengan enzim Msp I (tengah); pita-pita berukuran ± 300, 280, 150, dan 100 pb hasil restriksi dengan enzim Taq I (bawah); M = marker; 1-20 adalah nomor isolat Phytophthora sp. seperti pada Gambar 2.
Figure 3.  Fragments of ± 500, 160, 155 bp as results of digestion of amplified fragment using enzyme Alu I (top); fragments of ± 500 dan 400 bp as results of digestion of amplified fragment using enzyme Msp I (middle); fragments of ± 300, 280, 150, dan 100 bp as results of digestion of amplified  fragment  using  enzyme Taq  I (bottom);  M  =  marker;  1-20  are  numbers  of Phytophthora sp. isolates as shown in Figure 2.
yang  mengakibatkan  tidak  semua  isolat dari  satu  spesies  dapat  menyerang berbagai tanaman inang dalam waktu yang sama,  misal  isolat P.  citrophthora pe- nyebab  penyakit  pada  jeruk  di  Indonesia tidak  dengan  mudah  menyerang  kakao, meskipun di negara lain (Brazil dan India) spesies  ini  mampu  menyerang  kakao dengan menimbulkan kerugian yang besar.

## Kesimpulan
Dua  puluh  isolat  yang  dikumpulkan dari  enam  provinsi  sentra  produksi  kakao di  Indonesia  menunjukkan  sifat-sifat morfologi dan molekuler yang relatif sama dan  semuanya  adalah  isolat P.  palmivora , sebagai  penyebab  penyakit  busuk  buah dan kanker batang kakao di Indonesia

## Umayah & Purwantara

## Ucapan Terima Kasih
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  Dr.  Ir.  Meity  S.  Sinaga,  MSc., Prof.  Dr.  Ir.  Sarsidi  Sastrosumarjo,  dan Prof. Dr. Ir. Sintje Mandang Sumaraw atas saran  dan  masukan  dalam  penelitian  dan penulisan makalah ini.

## Daftar Pustaka
Appiah,  A.A.,  J.  Flood,  P.D.  Bridge  & S.A. Archer (2003). Inter- and intraspecific  morphometric  variation  and characterization  of Phytophthora isolates from cocoa. Plant Path ., 52 , 168-180.
Bennett,  C.P.A.,  G.  Sitepu,  O.  Roboth  & A.  Lolong    (1986).    Pathogenicity  of Phytophthora  palmivora (Butler)  Butler causing  premature  nut  fall  disease  of coconut  ( Cocos  nucifera L.). Indon.  J. Crop Sci ., 2 , 59-70.
Brasier,  C.  M.  &  M.  J.  Griffin    (1979). Taxonomy of Phytophthora palmivora on cocoa. Trans.  Br.  Mycol.  Soc. , 72 ,  111- 143.
Campelo,  A.M.F.L.  &  E.D.M.N.  Luz  (1981). Etiologia de podridao-parda do cacaueiro, nnos  Estados  da  Bahia  e  Esprito  Santo, Brazil. Fitopatol. Bras. , 6 , 313-321.
Chowdappa,  P.,  D.  Brayford,  J.  Smith  & J. Flood (2003).  Molecular discrimination of Phytophthora isolates  on  cocoa  and their  relationship  with  coconut,  black pepper  and  bell  pepper  isolates  based  on rDNA  repeat  and  AFLP  fingerprints.
Curr. Sci ., 84 , 1235-1238.
Chowdappa,  P.  &  C.  R.  Mohanan  (1996). Occurrence  of Phytophthora  citrophthora on  cocoa  in  India. Trop.  Agric. (Trinidad) , 73 , 158-160.
Darmono, T.W.   &   A.    Purwantara (2001).
Practical work on detection of
Phytophthora . In Training  Course  on Early  Detection  of  Woody  Plant  Diseases With  Latent  Infection. Biotechnology Research  Unit  for  Estate  Crops,  Bogor, Indonesia.
Drenth,  A.  (2001).    Genetic  diversity  in Phytophthora  palmivora . In. CRC  for Tropical  Plant  Protection, Brisbane,
Australia.
Drenth,  A.  &  B.  Sendall  (2001).    Practical guide  to  detection  and  identification  of Phytophthora. In. CRC for Tropical Plant Protection , Brisbane, Australia.
Erwin,  D.  C.  &  O.  K.  Ribeiro  (1996).
Phytophthora Diseases Worldwide . Minnesota, APS Press
Hendrawati  (1997).    Analisis  DNA Phytoph- thora spp.  penyebab  penyakit  busuk  pada buah kakao ( Theobroma cacao L.) dengan teknik  RAPD. Skripsi .  Jurusan  Biologi
FMIPA, Universitas Pakuan, Bogor
Holliday,  P.  (1980). Fungus  Diseases  of Tropical  Crops .    London,  Cambridge Univ. Press.
Kellam,  M.K.  &  G.A.  Zentmeyer  (1981). Isolation  of Phytophthora  citrophthora from  cocoa  in  Brazil. Phytopathol. , 71 , 230.
Kellam,  M.K.  &  G.A.  Zentmyer  (1986). Morphological,  physiological,  ecological and pathological comparisons of Phytoph- thora species  isolated  from Theobroma cacao. Phytopathol. , 76 , 159-164.
Liyanage,  N.I.S.  &  E.J.  Wheeler  (1989).
Phytophthora katsurae from cocoa. Plant
Pathol ., 38 , 627-629.
McMahon,  P.  &  A.  Purwantara  (2004). Phytophthora on  cocoa. In Drenth  A.  &
D.I. Guest (eds.). Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia . ACIAR  Monograph No.  114,  p. 104–115

## Identifikasi isolat Phytophthora asal kakao
Orozco-Castillo,  C.,  K.J.  Chalmers,  R.  Waugh & W. Powell (1994).  Detection of genetic diversity  and  selective  gene  introgession in  coffee  using  RAPD  markers. Theor. Appl. Genet. , 89 , 934-938.
Purwantara,  A.  &  T.W.  Darmono  (2002). Insiden dan identifikasi molekuler patogen penyakit  gugur  daun Phytophthora pada
karet. Dalam Prosiding  Kongres Nasional  XVI  dan  Seminar  Ilmiah  PFI Bogor, 22-24 Agustus 2001.  p. 462-466.
Purwantara,  A.    (1987).    Penyebab  penyakit Phytophthora pada  tanaman  kakao  di Jawa. Dalam Prosiding  Seminar  Ilmiah Ilmu  Penyakit  Tumbuhan  dan  Kongres Nasional  IX  Perhimpunan  Fitopatologi Indonesia .  Surabaya  24-26  Nopember 1987, p. 283-290.
Purwantara,  A.    (1990).    Pengaruh  beberapa unsur  cuaca  terhadap  infeksi Phytoph- thora  palmivora pada  buah  kakao. Menara Perkebunan , 58 (3) , 78-83.
Purwantara,  A.,  D.  Manohara  &  J.S.  Warokka (2004). Phytophthora diseases in Indonesia. In Drenth  A.  &  D.I.  Guest (eds.). Diversity  and  Management  of Phytophthora  in  Southeast  Asia.    ACIAR Monograph No. 114, p. 70-76.
Semangun,  H.    (2000). Penyakit-Penyakit Tanaman Perkebunan di Indonesia . Yogyakarta,  Gadjah  Mada  University Press.
Stamps, D.J., G.M. Waterhouse, F.J. Newhook,
G.S.  Hall.  (1990).  Revised  tabular  key  to the  species  of  the Phytophthora .    CAB
London, International Mycological Institute. Mycological Paper 162 .      128 pp.
Sudarmadji,  D & S.  Pawirosoemardjo (1990).
Hama dan penyakit, kendala utama dalam
pengembangan kakao di Indonesia. Dalam S.  Pawirosoemardjo et al . (Eds.)
Perlindungan Tanaman Menunjang
Terwujudnya  Pertanian  Tangguh  dan Kelestarian  Lingkungan .    Bogor,  PT. Agricon
Tollenaar,  D.  (1958). Phytophthora  palmivora of cocoa and its control. Neth. J. Agric. Sci. , 6 , 24-38.
Turner,  P.D.  (1961).  Strains  of Phytophthora palmivora Butl. (Butl.) from Theobroma cacao :  II  Isolates  from  non-African countries. Trans.  Br.  Mycol.  Soc ., 44 , 409-416.
Van  Hall,  C.J.J.  (1912).  De  cacao-kanker  op
Java  en  zijn  bestrijding. Mededelingen Proefstation Midden-Java , 6 , 1-17.
Van  Hall,  C.J.J.  (1914).  De  bestrijding  van  de cacao-kanker op de onderneming Kemiri (Pekalongan). Mededelingen Proef- station Midden-Java , 14 , 1-10.
Waterhouse,  G.M.  (1974a.) Phytophthora palmivora and some  related species. In
Gregory P.H. (ed.). Phytophthora Disease  of  Cocoa .  London,    Longman p. 51-70.
Waterhouse,  G.M.  (1974b).  Other Phytoph- thora species  recorded  on  cacao. In
Gregory  P.H.  (ed.).    Phytophthora
Disease  of  Cocoa .  London,  Longman p. 71-79.
White,  T.J.,  T.  Bruns,  S.  Lee  &  J.W.  Taylor (1990). Amplification and direct sequencing  of  fungal  ribosomal  RNA genes for phylogenetics. In Innis, M.A., D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White (eds.) PCR  Protocol:  A  Guide  to
Methods  and  Applications. New  York, Academic Press Inc. p. 315-322.
Zadoks,  J.C.  (1997). Disease  Resistance Testing  in  Cocoa:  A  Review  on  Behalf of  FAO/INGENIC  (International  Group for  Genetic  Improvement  of  Cocoa). University  of  Reading  UK:  INGENIC.
p. 23-52.
Zentmyer,  G.A.    (1974).    Variation,  genetics and  geographical  distribution  of  mating types. In Gregory P.H. (ed.). Phytophthora Disease of Cocoa , London, Longman,  p. 89-101.