Hasil Penelitian

## KARAKTERISASI FISIKOKIMIA NANOKALSIUM HASIL EKSTRAKSI TULANG IKAN NILA MENGGUNAKAN LARUTAN BASA DAN ASAM
[Physicochemical Characterization of Nano Calcium from Tilapia Bone Extracted by Alkaline and Acid Solution]
Vanessa Lekahena 1) *, Didah Nur Faridah 2) , Rizal Syarief 2) dan R. Peranginangin 3)
1) Fakultas Pertanian, Universitas Muhammadiyah Maluku Utara, Ternate
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor 3) Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi, Kementerian Kelautan dan Perikanan, Jakarta
Diterima 26 Maret 2013 / Disetujui 29 April 2014

## ABSTRACT
The utilization of tilapia (Oreochromis niloticus) bones as a source of natural calcium was done by alkaline (NaOH) and acid (HCl) extraction. The extraction process aims to soften the bones are milled using disc mill into nano sized calcium powder or nanocalcium. The objective of this research was to study the physicochemical properties of nanocalcium obtained from alkaline and acid extraction of tilapia bones. The results of physicochemical analysis properties of nanocalcium sample showed that nanocalcium extracted by alkaline solution had better properties than that of the untreated sample and nanocalcium extracted by acid solution. The results was indicated by the higher yield, brighter colors, smaller particle size, and calcium content (20.67%)  and phosphorus (10.09%) with a ratio of Ca/P = 2.0. The Fourier Transform Infrared (FTIR) spectra profile indicated the presence of  phosphate group (PO 43- ) at the bands of 469, 563, 603, 961 and 1035 cm- 1 , and the presence of  apatite carbonate group (CO 32- ) was  indicated by intense bands at 873, 1416, 1456 and 1563 cm- 1 . The morphology of the sampel surface of the  alkaline extracted sample  was    smoother,  denser,  and  the  grain  size  formed  were  relatively  larger.  The  formed  crystalline  phases  were  HAp  (hydroxyapatite), carbonate apatite type A [Ca 10 (PO 4 ) 6 CO 3 ] and B [Ca 10 (PO 4 ) 3 (CO 3 ) 3 (OH) 2 ] with crystalline degree of 78.4%.
Keyword : extraction, nanocalcium, physicochemical properties, tilapia (Oreochromis niloticus)

## ABSTRAK
Pemanfaatan tulang ikan nila ( Oreochromis niloticus ) sebagai sumber kalsium alami dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan larutan basa (NaOH) dan asam (HCl). Proses ekstraksi dilakukan untuk melunakkan tulang agar mudah dalam proses penepungan menggunakan disc mill hingga  menghasilkan  bubuk  kalsium  dalam  ukuran  nano  atau  nanokalsium . Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mempelajari  karakteristik  fisikokimia nanokalsium hasil ekstraksi menggunakan larutan basa dan asam dari tulang ikan nila. Hasil analisis menunjukkan bahwa sampel nanokalsium ekstraksi basa memiliki sifat yang lebih baik dibandingkan sampel bahan baku dan nanokalsium ekstraksi asam.  Hasil tersebut ditunjukkan dengan rendemen yang tinggi, warna yang lebih cerah dan ukuran partikel yang lebih kecil serta kadar kalsium (20.67%) dan fosfor (10.09%) dengan rasio Ca/P = 2.09. Hasil analisis menggunakan Fourier Transform Infrared (FTIR) menunjukkan adanya gugus fosfat (PO 43- ) pada pita absorpsi 469, 563, 603, 961 dan 1035 cm -1 , dan apatit karbonat (CO 32- ) pada pita absorpsi 873, 1416, 1456 dan 1563 cm -1 . Morfologi permukaan sampel ekstraksi basa terlihat lebih halus, padat dan ukuran butiran yang terbentuk relatif lebih besar. Fasa kristalin yang terbentuk adalah HAp (hidroksiapatit), apatit karbonat tipe A [Ca 10 (PO 4 ) 6 CO 3 ] dan B [Ca 10 (PO 4 ) 3 (CO 3 ) 3 (OH) 2 ] dengan derajat kristalinitas 78.4%.
Kata kunci: ekstraksi, ikan nila ( Oreochromis niloticus ), nanokalsium, sifat fisikokimia

## PENDAHULUAN
1
Produksi pengolahan ikan umumnya menghasilkan 10-15% limbah  tulang  ikan  dengan  kandungan  mineral  60-70%  dalam bentuk garam anorganik terutama kalsium fosfat, kreatin fosfat dan  hidroksiapatit  [Ca 10 (OH) 2 (PO 4 ) 6 ]  yang  merupakan  bentuk kristal yang melekat pada kolagen fibril (Kim dan Mendis, 2006; Phiraphinyo et al . 2006; Malde et al . 2010; Huang et al . 2011). Kalsium tulang ikan membentuk kompleks dengan fosfor dalam bentuk  apatit  atau  trikalsiumfosfat,  merupakan  mineral  yang
*Penulis Korespondensi: E-mail: enchalekahena@yahoo.com
dibutuhkan  oleh  tubuh  sebagai  komponen  metabolisme  pada berbagai  proses  biokimia,  fisiologis  dan  pemeliharan  jaringan tulang  (Sittikulwitit et  al .  2004).  Kandungan  kalsium  dan  fosfor yang  tinggi  pada  tulang  ikan  (2%  atau  20  g/kg,  bk)  sehingga tulang ikan dapat dimanfaatkan  sebagai sumber kalsium alami untuk memenuhi asupan kalsium harian.
Berbagai  kajian  tentang  pemanfaatan  tulang  ikan  sebagai sumber  kalsium  alami  telah  dilakukan  termasuk  analisis bioavaibilitas  dan  potensi  aplikasinya.  Diantaranya  ekstraksi kalsium dari tulang ikan  tuna dengan metode hidrolisis protein menggunakan  parameter  waktu autoclaving dan  frekuensi perebusan (Trilaksani, 2006); tepung tulang ikan patin sebagai sumber kalsium dan fosfor dalam pembuatan biskuit (Kaya et al .
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
2007);  tepung  tulang  ikan  kakap  merah  dalam  susu  kedelai (Dongoran et al . 2007); dan tepung tulang ikan salmon, kakap dan lele pada produk roti (Luu dan Nguyen, 2009).  Berdasar- kan  kajian  tersebut  tepung  tulang  ikan  berpotensi  sebagai bahan  fortifikan  pada  produk  pangan  untuk  memperkaya  nilai gizinya.
Kalsium  pada  tulang  sebelum  difortifikasi  harus  diubah menjadi  bentuk  yang  dapat  dicerna.  Proses  ekstraksi  meng- gunakan  akuades,  larutan  asam  dan  basa,  serta  enzim  pada suhu  yang  tinggi  dapat  merubah  dan  melunakkan  struktur matriks  tulang  (Sittikulwitit et  al .  2004;  Kim  dan  Mendis,  2006; Suptijah et al . 2010). Kalsium umumnya tersedia dalam ukuran mikro (µ), yang diduga dalam proses metabolisme tubuh hanya terserap  50%  dari  total  kalsium  yang  di  konsumsi  (Guyton, 1987) dan salah satu alternatif untuk meningkatkan penyerapan kalsium  secara  maksimal  dengan  membentuk  nanokalsium (Suptijah et al . 2010).
Nanokalsium  adalah  kalsium  yang  dihasilkan  dengan memanfaatkan  teknologi  nano  sehingga  membentuk  kalsium dalam ukuran yang sangat kecil (nanometer, nm). Nanokalsium merupakan  mineral  predigestif  yang  sangat  efiesien  dalam memasuki sel tubuh karena ukuran yang super kecil menyebab- kan  mudah  memasuki  reseptor  sehingga  dapat  terabsorpsi secara cepat dan sempurna ke dalam tubuh (Park et al. 2007). Teknologi  nano  adalah  suatu  desain,  karakterisasi,  produksi dan  penerapan  struktur,  perangkat  dan  sistem  dengan  me- ngontrol bentuk dan ukuran pada skala nanometer (Park, 2007). Aplikasi  teknologi  nano  dalam  bahan  pangan  meliputi peningkatan rasa, warna, flavor , tekstur dan konsistensi produk pangan, serta meningkatkan penyerapan, bioavailabilitas nutrisi dan senyawa bioaktif (Greiner, 2009).
Sintesis nanomaterial dapat dilakukan secara top down dan bottom  up.  Top  down merupakan  pembuatan  struktur  nano dengan  memperkecil  ukuran  material,  sedangkan bottom-up adalah  dengan  cara  merangkai  atom  atau  molekul  dan  meng- gabungkannya  melalui  reaksi  kimia  untuk  membentuk  struktur nano  Greiner,  2009).  Metode top  down adalah  teknik  pem- bentukan  nanopartikel  dengan  proses  penggilingan  meng- gunakan milling ,  sedangkan  metode bottom  up adalah  pem- bentukan  menggunakan  teknik  sol-gel,  presipitasi  kimia,  dan aglomerasi  fasa  gas  (Uskokovic,  2007).  Penelitian  ini  meng- gunakan metode top down melalui proses  penggilingan meng- gunakan milling .
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mempelajari  karakteristik fisikokimia  nanokalsium  hasil  ekstraksi  menggunakan  larutan basa  (NKEB)  dan  asam  (NKEA)  dari  tulang  ikan  nila. Karakteristik  fisikokimia  yang  diuji  meliputi:  rendemen,  warna, ukuran  partikel,  analisis  proksimat  (kadar  air,  abu,  protein  dan lemak), kadar kalsium dan fosfor, uji morfologi, analisis senyawa penyusun dan sifat kritalinitas bahan.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan adalah limbah tulang ikan nila yang diperoleh dari PT. Aqua Farm, Semarang.

## Metode penelitian
Penelitian  ini  dibagi  menjadi  tiga  tahapan  proses  yaitu:  (1) Persiapan  bahan  baku;  (2)  Ekstraksi  nanokalsium  tulang  ikan dan (3) Karakterisasi sifat fisikokimia  sampel bahan baku (BB) dan nanokalsium (NKEB dan NKEA) seperti pada Gambar 1.

## Gambar 1. Diagram alir tahapan penelitian
Tahap  pertama  yaitu  persiapan  bahan  baku  (bubuk  tulang ikan  nila),  yang  bertujuan  untuk  menghasilkan  bahan  baku tulang ikan nila yang siap diekstraksi melalui beberapa tahapan proses  seperti  pencucian,  perebusan,  pengeringan  dan  pe- ngecilan ukuran menggunakan hammer mill .
Tahapan  kedua  yaitu  ekstraksi  tulang  ikan  nila  meng- gunakan 2 pelarut yang berbeda yaitu larutan basa (NaOH) dan asam (HCl) secara terpisah, yang bertujuan untuk melunakkan tulang  ikan  nila  sehingga  memudahkan  dalam  proses  pe- nepungan.

## Ekstraksi dengan larutan basa (NaOH)
Bubuk  kasar  tulang  ikan  nila  diekstraksi  dengan  larutan NaOH  (Merck)  1  N  (sampel:pelarut  =  1:3)  pada  suhu  100°C selama  60  menit.    Proses  ekstraksi  ini  dilakukan  sebanyak  3 kali.  Hasil  ekstraksi  selanjutnya  didinginkan,  difiltrasi,  dinetrali- sasi hingga mencapai pH netral dan dikeringkan menggunakan oven pada suhu 50°C hingga mencapai kadar air < 8%.
Limbah Tulang Ikan Nila Persiapan  Bahan Baku Bubuk Kasar Tulang Nila Nano Kalsium Karakterisasi Sifat Fisikokimia: -Rendemen, Derajat putih, PSA -Proksimat -Analisis Ca & P -SEM/EDS, FTIR, XRD Penepungan dan diayak Pengeringan 50°C KA < 8% Sterilisasi
Ekstraksi NaOH 1 N 100°C, (3 kali perebusan) Pendinginan, filtrasi dan netralisasi Ekstrasi HCl 1.0 N, 100°C, 60 mnt (3 kali perebusan) Pendinginan, filtrasi dan netralisasi
Pengeringan 50°C KA < 8%
Penepungan dan diayak
Sterilisasi Perendaman HCl 1 N, 24 jam
Hasil Penelitian

## Ekstraksi dengan larutan asam (HCl)
Bubuk kasar tulang ikan nila dihidrolisis menggunakan HCl (Merck)  1  N  (sampel:pelarut  =  1:3)  selama  24  jam  pada  suhu ruang,  selanjutnya  diekstraksi  pada  suhu  100°C  selama  60 menit.  Proses ekstraksi ini dilakukan sebanyak 3 kali dan hasil ekstraksi kemudian didinginkan, difiltrasi dan dinetralkan meng- gunakan akuades hingga sampel pH netral, setelah itu dikering- kan  menggunakan  oven  pada  suhu  50°C  hingga  mencapai kadar air < 8%.
Bubuk tulang ikan nila yang telah diekstraksi menggunakan NaOH dan HCl selanjutnya dijadikan tepung menggunakan disc mill kemudian  diayak  menggunakan  pengayak  berukuran  100 mesh . Proses sterilisasi dilakukan pada suhu 121°C selama 15 menit  untuk  mempertahankan  mutu  dan  memperpajang  umur simpan tepung tulang yang dihasilkan, seperti pada Gambar 1.
Karakterisasi  sifat  fisikokimia  sampel  bahan  baku  dan nanokalsium
Pengujian  yang  dilakukan  meliputi  penentuan  rendeman, warna  diukur  menggunakan spectrophotometer ( Hunterlab Color  Flex  EZ  spectrophotometers ( Lab  Color  Solid ))  dan ukuran  partikel  menggunakan Particle  Size  Analyzer (PSA) merek  Vasco-PSA,  reflactometer  Arago  DL  135,  Cordouan. Sampel diukur menggunakan metode LALLS ( Low Angle Laser Light  Scattering )  dapat  digunakan  untuk  ukuran  partikel  0.1- 3000  μm  dengan  sinar  laser  pada  intensitas  gas  He-Ne (λ=0.63μm).  Analisis  proksimat  meliputi  kadar  air  (AOAC, 925.09,  2005),  abu  (AOAC,  941.12,  2005),  protein  kasar (AOAC,  920.87,  2005)  dan  lemak  (AOAC,  960.39,  2005). Analisis kalsium menggunakan Atomic Absorption Spectrometry (AAS)  ( Perkin  Elmer  Analyst  100  type  flame) dengan  metode pengabuan  basah  pada  λ  =  422.7  nm  (AOAC,  968.08,  2005) dan fosfor (spektro-fotometer UV-vis) pada  = 660 nm (AOAC, 948.09,  2005).  Analisis  morfologi  pada  sampel  yang  dilapisi dengan  emas-palladium  (60:40)  setebal  48  nm,  selanjutnya diamati  menggunakan  SEM  (JEOL,  JSM-35C)  pada  tegangan 22 kV. (Toya et al . 1986). Analisis senyawa penyusun dilakukan pada  sampel  yang  dihomogenisasi  dengan  KBr,  dan  dibentuk pellet  kepingan  tipis,  selanjutnya  diukur  spektrumnya  meng- gunakan  FTIR  ( Spectrum  one-FT-IR  Spectrometer C69526, Perkins Eimer Precisely pada area IR (4000-400 cm -1 ), dengan kecepatan  32  detik  dan  resolusi  4  cm -1 .  (Huang et  al .  2011). Sifat kristalinitas sampel diukur menggunakan X-ray Diffraction (XRD)  merek  Emma  GBC  kisaran  2  pada  suhu  10°  sampai 80°  dan  ukuran  langkah  0.1°  pada  Cu  dengan  panjang gelombang 1.5406 Å (Huang et al . 2011).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik fisikokimia
Rendemen  adalah  parameter  penting  untuk  mengetahui nilai  ekonomis  dan  efektivitas  suatu  produk  atau  bahan. Rendemen tulang  ikan nila  bersih  setelah dipisahkan dari sisa daging,  lendir  dan  darah  yang  menempel  pada  tulang  dan dikeringkan  adalah  9.45%  (bk),    setelah  dilakukan  pengecilan ukuran menggunakan hammer mill menjadi bubuk tulang kasar
atau  sampel  BB  (0.2-0.5  cm)  adalah  7.39%  (bk).  Rendemen NKEB  (nanokalsium  ekstraksi  basa)  adalah  5.91%  (bk)  dan NKEA  (nanokalsium  ekstraksi  asam)  adalah  4.41%  (bk).  Ber- dasarkan hasil rendemen menunjukkan bahwa ekstraksi meng- gunakan  basa  memiliki  hasil  yang  lebih  tinggi  dibandingkan dengan ekstraksi menggunakan asam. Hasil analisis rendemen, warna, ukuran partikel dan proksimat, serta kalsium dan fosfor sampel BB, NKEB dan NKEA seperti terlihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Sifat fisikokimia BB, NKEB, NKEA dan TPB
Parameter BB NKEB NKEA TBP Rendemen (%) 7.39 5.91 4.41 - Warna L* 88.34± 0.69 94.78± 2.57 93.14± 0.16 98.08± 0.04 a* -0.86± 0.01 0.21± 0.68 0.49± 0.04 16.79± 0.06 b* 10.15± 0.02 6.57± 1.75 11.00± 0.22 79.48± 0.09 Ukuran Partikel (nm) 655.69 235.93 242.35 - Air (%) 8.76± 0.26 4.67± 0.05 4.34± 0.56 2.46± 0.03 Abu (%) 69.37± 0.03 95.93± 0.14 85.44± 0.41 75.83± 0.12 Protein (%) 26.06± 0.31 0.38± 0.13 7.03± 0.17 14.81± 0.33 Lemak (%) 2.85± 0.09 0.94± 0.11 1.79± 0.24 5.82± 0.04 Kalsium (%) 18.70± 0.140 20.67± 0.340 21.48± 0.030 - Fosfor (%) 8.91± 0.039 10.09± 0.546 11.78± 0.448 -
Keterangan:  Bahan  baku  (BB);  NKEB  (NaOH);  NKEA  (HCl); Tilapia  Bone Powder (TPB) Hemung (2013)
Hasil  analisis  warna  pada  penelitian  ini  (Tabel  1)  lebih rendah  dibandingkan  warna  tepung  tulang  ikan  nila  pada penelitan  Hemung  (2013)  dengan  nilai L* , a* dan b* adalah 98.08;  16.79;  dan  79.48.  Namun  lebih  tinggi  dibandingkan kalsium tulang ikan nila pada penelitian Techochatchawal et al. (2009) dengan nilai L* , a* dan b* adalah 73.57; 0.88; dan 18.44. Warna  tepung  yang  dihasilkan  berkaitan  dengan  kandungan senyawa organik yang terdapat dalam tepung (Hemung, 2013). Warna alami tulang ikan adalah kuning cerah (Venkatesan dan Kim,  2010),  sementara  warna  sampel  NKEB  dan  NKEA  ber- warna putih cerah. Perbandingan warna NKEB lebih putih dan cerah dibandingkan sampel NKEA, hal ini menunjukkan bahwa ekstraksi  menggunakan  larutan  basa  menghasilkan  warna tepung  yang  lebih  baik  dibandingkan  menggunakan  larutan asam. Ekstraksi dengan larutan asam mengakibatkan terbentuk warna kehitaman atau melamin akibat adanya kandungan indol triptopan  dengan  aldehid  yang  berasal  dari  karbohidrat  yang terdapat pada bahan (Venkatesan dan Kim, 2010). Hasil ini juga ditunjukkan  dalam  bentuk  kalsinasi  sampel  NKEA  pada  suhu 550°C  menghasilkan  bubuk  yang  berwarna  hitam  dan  NKEB berwarna putih, sementara sampel BB berwarna kuning cerah.
Rata-rata hasil pengukuran partikel sampel BB (655.69 nm), NKEB (235.93 nm) dan NKEA (242.35 nm) seperti pada Tabel 1 dengan  intensitas  ukuran  terdispersi  seperti  pada  Gambar  2. Berdasarkan  nilai  ukuran  partikel  menunjukkan  bahwa  partikel sampel  NKEA  relatif  lebih  besar  dibandingkan  NKEB.    Ukuran partikel  sampel  pada  penelitain  dapat  digolongkan  ke  dalam nanopartikel  seperti  yang  dijelaskan  oleh  Mohanraj  dan  Chen
Hasil Penelitian
(2006)  nanopartikel  adalah  partikel  yang  berukuran  10-1000 nm.  Menurut Greiner (2009), nanopartikel umumnya digunakan ketika  mengacu  pada  bahan-bahan  dengan  ukuran  1-100  nm. Ukuran  partikel  nanokalsium  yang  dihasilkan  tidak  berbeda dengan  ukuran  nanopartikel  yang  dihasilkan  oleh  Khoerunnisa (2011)  yaitu  120-573  nm  dengan  SEM  pada  pembesaran 20.000x.  Ukuran  partikel  dan  ukuran  distribusi  merupakan karakteristik  terpenting  dalam  sistem  nanopartikel  karena  ber- pengaruh  dalam  penentuan  distribusi  parikel  secara in  vivo , kondisi  biologis,  toksisitas  dan  kemampuan  target  dari  sistem- nya,  serta  mempengaruhi  sistem  kelarutan  dan  stabilitasnya (Mohanraj dan Chen, 2006).
Gambar 2.  Ukuran  partikel  sampel  (a)  bahan  baku  (BB),  (b) nanokalsium ekstraksi basa (NKEB) dan (c) nanokalsium ekstraksi asam (NKEA)
. Hasil  analisis  proksimat  sampel  pada  penelitian  seperti disajikan  pada  Tabel  1.  Kadar  abu  sampel  BB  (69.37%  bk), NKEB  (95.93%  bk)  lebih  tinggi  dibandingkan  NKEA  (85.44%
bk). Kadar abu penelitian ini lebih tinggi dibandingkan kadar abu tulang  ikan  salmon,  kakap  dan  lele  yang  dihidrolisis  meng- gunakan  NaOH  3%  yaitu  21-24.4%  (Luu  dan  Nguyen,  2009) serta  kadar  abu Tilapia  Bone  Powder (TBP)  pada  penelitian Hemung (2013) yaitu 75.83% (bk).
Kadar  protein  sampel  BB  (26.06%  bk)  lebih  rendah dibandingkan kadar protein tepung tulang ikan nila tilapia pada penelitian  Vignesh  dan  Srinivasa  (2012)  yaitu  31.52%.  Kadar protein sampel NKEB (0.38% bk) dan NKEA (7.03% bk), lebih rendah  dibandingkan  kadar  protein  TBP  pada  penelitian Hemung (2013) yaitu 14.81% (bk). Hasil ini menunjukkan bahwa ekstraksi  menggunakan  NaOH  1  N  dapat  menurunkan  kadar protein  tulang  ikan  sebesar  98%  sedangkan  ekstraksi  meng- gunakan  HCl  1  N  hanya  71%,  sehingga  disimpulkan  bahwa hidrolisis  protein  pada  tulang  ikan  menggunakan  larutan  basa lebih efektif dibandingkan larutan asam.

## Kadar kalsium dan fosfor
Kadar  kalsium  sampel  BB  (18.70%),  NKEB  (20.67%)  dan NKEA  (21.48%),  sedangkan  kadar  fosfor  sampel  BB  (8.91%), NKEB  (10.09%)  dan  NKEA  (11.78%)  dengan  rasio  per- bandingan  Ca/P  secara  berturut  adalah  2.09;  2.05;  dan  1.82. Perubahan  rasio  perbandingan  Ca/P  pada  sampel  NKEB  dan NKEA,  disebabkan  karena  perlakuan  ekstraksi  menggunakan asam  dan  basa  mengakibatkan  terhidrolisisnya  protein  dan lemak yang terdapat pada matriks tulang (sampel BB), sehingga meningkatkan  kadar  kalsium  dan  fosfor  pada  sampel.  Kadar kalsium  dan  fosfor  pada  penelitian  ini  relatif  lebih  rendah dibandingkan  kadar  kalsium  dan  fosfor  tulang  ikan  nila  tilapia pada penelitian Petenuci et al . (2008) yaitu 27.15 dan 11.33%, serta  tepung  tulang  ikan  salmon,  kakap  dan  lele  yaitu  21.0- 23.3% dan 10.5-11.0% (Luu dan Nguyen, 2009).
Spektra Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektra FTIR menunjukkan  terbentuk gugus fosfat (PO 43- ), apatit karbonat (CO 32- ) dan hidroksil (OH - ) pada semua sampel yang  dianalisi  seperti  disajikan  pada  Tabel  2.  Apatit  karbonat adalah  komponen  anorganik  dalam  tulang  dan  gigi,  berdasar- kan  lokasinya  subtitusi  CO 32- terdiri  dari  2  tipe  yaitu  apatit karbonat tipe A (AKA) terbentuk jika ion karbonat menggantikan posisi OH - dan apatit karbonat tipe B (AKB) jika karbonat meng- gantikan posisi ion PO 43- (Mathai dan Takagi, 2001).
Tabel 2. Hasil spektra FTIR bahan baku, NKEB dan NKEA
Senyawa BB NKEB NKEA cm -1 %T cm -1 %T cm -1 %T PO 4 - 962 25.4 959 33.9 PO 4 - 469 43.13 474 50.29 PO 4 1035 12.63 1035 0 1031 6.67 PO 4 563 25.08 564 2.94 562 18.75 602 28.66 603 4.72 603 24.5 AKA - 1547 41.73 1563 50.48 AKB 872 47.09 873 41.1 873 46.64 1417 37.9 1416 19.35 1415 47.3 1455 38.06 1455 19.06 1456 46.66 OH 1648 40.79 1634 42.06 1647; 43.79 3429 36.55 3435 13.97 3430 38.24 OH Kristal 3698 59.83 - -
Keterangan:  Bahan  baku  (BB);  nanokalsium  ekstraksi  basa  (NKEB); nanokalsium ekstraksi  asam  (NKEA);  Sumber  refensi:  Dahlan et al. (2006); Huang et al. (2011); Karthikeyan (2011)
(a) Size Dispersion by Intensity 10000 1000 0.000 0.100 Size (nm) In te ns ity (u .a ) 10000 1000 100 10 0.0 0.1 0.2 In te ns ity (u .a ) Size (nm) Size Dispersion by Inensity (b) 0.0 In te ns ity (u .a ) Size Dispersion by Inensity
Size (nm) 10000 1000 100 10 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 (c)
Hasil Penelitian
Spektra FTIR yang terbentuk pada sampel  BB, NKEB dan NKEA seperti terlihat pada Gambar 3 dalam jangkauan bilangan gelombang 400-4000 cm -1 . Pita absorpsi fosfat fosfat  1 (vibrasi simetris strectching )  dan  2 (vibrasi  simetris bending )  pada spektra sampel NKEB berada di daerah 962 cm -1 dan 469 cm -1 , sedangkan  sampel  NKEA  berada  pada  pita  absorpsi  959  cm -1 dan  474  cm -1 ,  sementara  kedua  pita  absorpsi  fosfat  1 dan fosfat  2 tidak tampak pada spektra sampel BB. Pita  absorpsi  fosfat  3 (vibrasi  asimetris strectching )  pada spektra  sampel  BB  dan  NKEB  terdapat  bilangan  gelombang 1035 cm -1 , sementara NKEA terbentuk disekitar 1031 cm -1 . Pita absorpsi  fosfat  4 (vibrasi  asimetris bending )  ditandai  dengan pita absorpsi dalam bentuk belah di daerah 563 dan 603 cm -1 pada  semua  spektra  sampel,  yang  menunjukkan  akan kehadiran  kristal  hidroksiapatit  (HAP).  Derajat  belah  pita absorpsi  fosfat  4 (vibrasi  asimetris bending )  selain  meng- indikasi adanya kristal apatit tapi juga menunjukkan kandungan fasa kristal dalam sampel (Dahlan et al . 2006).
Pita  absorpsi  gugus  apatit  karbonat  tipe  B  (AKB)  ter- indentifikasi  pada  sampel  BB,  NKEB  dan  NKEA  di  daerah sekitar 873, 1416 dan 1455 cm -1 ,  pita absorpsi 1547 cm -1 pada sampel  NKEB  dan  1563  cm -1 pada  NKEA  mencirikan  apatit karbonat tipe A (AKA), sementara pada spektra sampel BB pita absorpsi AKA tidak tampak.
Spektra yang menunjukkan adanya kehadiran air permuka- an  terbentuk  pada  semua  sampel  pada  pita  absorpsi  lebar gugus  hidroksil  di  daerah  3429-3435  cm -1 dan  pita  absorpsi kecil  di  daerah  1634-1656  cm -1 ,  sedangkan  indikasi  air  kristal hanya terdapat pada spektra sampel BB di daerah 3698 cm -1 .
Gambar 3.  Spektrum  FTIR  sampel  bahan  baku  (BB),  nanokalsium ekstraksi  basa  (NKEB)  dan  nanokalsium  ekstraksi  asam (NKEA)
Pita  absorpsi  spektra  FTIR  pada  penelitian  ini  memiliki kemiripan  dengan  hasil  penelitian  Huang et  al .  (2011)  dimana karakteristik  spektra  bubuk  FHAP  ( fish  hidroxyapatite )  me- nunjukkan gugus fosfat (PO 43- ) terdapat di daerah 563, 957 dan 1030 cm -1 , sementara gugus apatit karbonat (CO 32- ) terindikasi pada 876 dan 1412-1547 cm -1 .
Kristalinitas  kalsium  fosfat  ditunjukkan  oleh  pita  absorpsi fosfat  3 sampel  BB  dan  NKEB  terlihat  di  daerah  1035  cm -1 sedangkan  untuk  NKEA  terbentuk  di  daerah  1031  cm -1 hal  ini menunjukkan bahwa kalsium fosfat pada tulang nila hadir dalam
bentuk  campuran  fasa  amorfus  dan  fasa  kristalin.  Hasil  yang sama  pada  tulang  tikus  di  daerah  pita  absorpsi  1036  cm -1 menunjukkan adanya campuran fasa amorfus dan fasa kristalin (Dahlan et al. 2006), selanjutnya dijelaskan pula bahwa bentuk pita  3 fosfat  dan  4 fosfat  adalah  pita  asimetris  yang  meng- indikasikan  bahwa  senyawa  sampel  tidak  seluruhnya  dalam bentuk amorf.
Morfologi Scanning Electron Microscopy (SEM) Analisis  morfologi  menggunakan  SEM  semua  sampel seperti  pada  Gambar  4,  menunjukkan  morfologi  permukaan sampel  BB  memiliki  ukuran  butiran  kalsium  yang  relatif  besar dengan  bentuk  tidak  beraturan,  halus,  datar  dan  padat. Morfologi  permukaan  sampel  NKEB  terlihat  lebih  halus,  padat dan  berbentuk  bongkahan  akibat  gabungan  beberapa  butiran kalsium.  Ukuran  butiran  sampel  NKEB  yang  terbentuk  relatif lebih besar dibandingkan dengan butiran NKEA. Sampel NKEA memiliki  struktur  permukaan  lebih  kasar,  tajam  dan  berpori dengan butiran yang relatif kecil dan tidak beraturan.
Hasil ini didukung dengan hasil analisis menggunakan XRD, yang  menunjukkan  derajat  kristalinitas  dan  ukuran  kristal sampel  NKEB  lebih  besar  dibandingkan  sampel  NKEA  (Tabel 4),  sehingga  mengakibatkan  terjadinya  perbedaan  morfologi permukaan  sampel  akibat  perlakuan  yang  diberikan.  Sampel hasil ekstraksi menggunakan asam memiliki ukuran kristal yang lebih kecil dan derajat kristalinitas yang lebih rendah akibatnya morfologi permukaan sampel yang dihasilkan lebih berpori dan tajam, sementara hasil ekstraksi menggunakan basa menunjuk- kan hasil yang sebaliknya.
Gambar 4.  Morfologi  SEM  sampel  (a)  sampel  bahan  baku  (BB),  (b) nanokalsium ekstraksi basa (NKEB) dan (c) nanokalsium ekstraksi asam (NKEA) pembesaran 5.000 x
% T 450.0 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2400 2800 3200 3600 4000.0 NKEA NKEB BB cm -1 (a) (c) (b)
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
BB NKEB NKEA 20 60 50 2θ
40 70 30

## X-ray Diffraction (XRD)
Analisis  menggunakan  XRD  dilakukan  untuk  mengetahui fasa  yang  terbentuk,  derajat  kristalinitas,  dan  ukuran  kristal sampel  yang  dilakukan  dengan  mencocokkan  data  JCPDS ( Joint  Committee  on  Powder  Diffraction  Standards ).  Hasil analisis XRD untuk sampel BB, NKEB dan NKEA, seperti yang disajikan pada Tabel 3.
Senyawa  yang  terbentuk  dalam  sampel  adalah  kalsium fosfat dengan rumus kimia Ca 4 P 2 O 9 , dalam bentuk kristalin dan amorf. Fasa kristalin yang terbentuk dan mendominasi  sampel BB  adalah  apatit  karbonat  atau  [Ca 10 (PO 4 ) 3 (CO 3 ) 3 (OH) 2 ].  Fasa kristalin pada sampel NKEB dan NKEA  adalah apatit karbonat dan hidroksiapatit [Ca 5 (PO 4 ) 3 (OH)]. Kehadiran fasa amorf pada tulang  menunjukkan  bahwa  pembentukan  kristal  stabil  apatit didahului oleh pembentukan kristal non apatit.
Apatit  karbonat  pada  sampel  BB  merupakan  bentuk  apatit karbonat  tipe  B  (AKB)  atau  [Ca 10 (PO 4 ) 3 (CO 3 ) 3 (OH) 2 ]  yang terbentuk  pada  sudut  25.92,  31.84,  40.1,  46.82  dan  49.47°, sedangkan pada sampel NKEB terbentuk pada sudut 2  = 28.6 dan  46.74°,  sementara  untuk  sampel  NKEB  terbentuk  pada sudut 2  = 25.96, 28.6, 46.4 dan 49.36  . Apatit karbonat tipe A (AKA)  atau  [Ca 10 (PO 4 ) 6 CO 3 ]  tidak  terlihat  pada  sampel  BB, sedangkan pada sampel NKEB terbentuk pada sudut 2  = 25.9 dan  53.18°,  dan  sampel  NKEA  terlihat  pada  sudut  2  =  33.9, 39.68 dan 53.28°. Fasa kristalin pada sampel NKEB dan NKEA selain apatit karbonat juga terbentuk fasa HAp (hidroksiapatit). Fasa HAp sampel NKEB terbentuk pada sudut 2  = 31.86, 40.1 dan  49.64°,  sedangkan  sampel  D  terbentuk  pada  sudut  2  = 30.2 dan 31.6°.
Tabel 3. Puncak-puncak profil XRD sampel BB, NKEB dan NKEA
Fasa BB NKEB NKEA 2  (  ) 2  (  ) 2  (  ) AKA - 25.9 33.9 - 53.18 39.68 - - 53.28 AKB 25.92 28.6 25.96 31.84 46.74 28.6 40.1 - 46.4 46.82 - 49.36 49.47 - - HAp - 31.86 30.2 - 40.1 31.6 - 49.64 -
Keterangan:  Bahan  baku  (BB);  nanokalsium  ekstraksi  basa  (NKEB); nanokalsium  ekstraksi  asam  (NKEA);  apatit  karbonat  tipe  A  (AKA);  apatit karbonat tipe B (AKB); hidroksiapatit (HAp)
Hasil  pengukuran  derajat  kristalinitas  sampel  (Tabel  4), menunjukkan  sampel  NKEB  lebih  kristalin  dibanding  sampel nanokalsium  lainnya.  Tulang  ikan  nila  secara  alami  memiliki derajat  kristalinitas  yang  lebih  rendah  (sampel  BB)  dibanding- kan  dengan  sampel  hasil  ekstraksi  menggunakan  asam  dan basa,  hal  ini  diduga  berhubungan  dengan  hilangnya  sejumlah senyawa  organik  selama  proses  ekstraksi.  Derajat  kristalinitas sampel secara berturut-turut adalah sampel BB (71.4%), NKEB (78.4%) dan NKEA (73.5%). Proses isolasi hidroksiapatit (HAp)
dari tulang ikan tuna menggunakan suhu tinggi mengakibatkan hilangnya senyawa organik sehingga meningkatkan kemurnian, stabilitas dan kristalinitas HAp yang terbentuk (Venkatesan dan Kim,  2010).  Ukuran  kristal,  seperti  terlihat  pada  Tabel  4  me- rupakan  hasil  perhitungan  menggunakan  persamaan  Scherrer yaitu:
=  os (θ )
Dari  rumus  tersebut  diketahui  bahwa  k  adalah  konstanta yang  nilainya  bervariasi,  untuk  tulang  nilainya  adalah  0.9,  adalah  panjang  gelombang  sinar-X  yang  digunakan  yaitu 1.540958  (Å),  merupakan  panjang  gelombang  Cu  sebagai sumber sinar-X, adalah sudut Bragg, B adalah FWHM ( full with  half  maximum )  yang  dipilih.  Harga  FWHM  berbanding terbalik dengan ukuran kristal,  makin kecil harga FWHM maka ukuran kristal yang dihasilkan semakin besar.
Tabel 4. Derajat kristalinitas dan ukuran kristal sampel
Sampel Kristalinitas (%) 2  (°) FWHM (  ) (  ) (rad) D (002) (nm) BB 71.4 25.92 0.504 0.252 0.0044 283.68 NKEB 78.4 25.9 0.332 0.166 0.0029 430.69 NKEA 73.5 25.96 0.894 0.447 0.0078 159.87
Ukuran  kristal  pada  sudut  2  =  25.8-25.96  seperti  pada Tabel  4,  menunjukkan  sampel  NKEB  memiliki  ukuran  kristal lebih  besar  dibandingkan  dengan  sampel  lainnya,  sedangkan ukuran  kristal  terkecil  terbentuk  pada  sampel  NKEA.  Hasil  ini menunjukkan bahwa ekstraksi menggunakan asam menghasil- kan ukuran kristal lebih kecil dibandingkan penggunaan larutan basa.  Puncak  maksimum  intensitas  fasa  (Gambar  5)  pada sampel  BB  terbentuk  pada  sudut  2  =  31.84°  dan  sampel NKEB pada sudut 2  = 31.86° sedangkan NKEA pada sudut 2  = 31.6°. Berdasarkan hasil ini dapat disimpulkan bahwa metode ekstraksi  yang  digunakan  tidak  mempengaruhi  sudut  dengan intensitas  maksimum  kalsium  pada  sampel,  akan  tetapi  jenis pelarut  untuk  ekstraksi  mempengaruhi  perubahan  fasa  yang terbentuk  pada  puncak  tertinggi.  Pada  sampel  BB  puncak tertinggi  merupakan  apatit  karbonat  tipe  B  [Ca 10 (PO 4 ) 3 (CO 3 ) 3 (OH) 2 ],  sedangkan  pada  sampel  NKEB  dan  NKEA  merupakan fasa kalsium hidroksiapatit [Ca 5 (PO 4 ) 3 (OH)].
Gambar 5.  Grafik  XRD  sampel  bahan  baku  (BB),  nanokalsium ekstraksi  basa  (NKEB)  dan  nanokalsium  ekstraksi  asam (NKEA)
Hasil Penelitian
Deklinasi spektrum pada 2  sudut 20 hingga 25° menunjuk- kan  adanya  amorfus  sedangkan  puncak  pada  2  sudut  30 hingga  35°  menunjukkan  bahwa  kristal  mineral  sampel  NKEB dan NKEA memiliki partikel berukuran kecil dalam skala nano. Hasil  yang  sama  ditunjukkan  pada  difraksi  sinar-x  tulang  tikus (Dahlan et al . 2006).
Hasil  analisis  FTIR  menunjukkan  gugus  fungsi  terbentuk pada sampel adalah gugus fosfat (PO 43- ), karbonat (CO 32- ) dan hidroksil  (OH - )  dalam  fasa  amorf  dan  kristalin,  yang  ditandai dengan  4 fosfat  dalam  bentuk  pita  belah  pada  bilangan gelombang  563  dan  603  cm -1 .  Hasil  ini  didukung  oleh  data analisis  menggunakan  XRD  yang  menunjukkan  adanya  fasa amorf dan kristalin pada  semua  sampel, yang didominasi oleh fasa apatit karbonat pada sampel BB, sedangkan sampel NKEB dan  NKEA  selain  apatit  karbonat,  terbentuk  juga  hidroksiapatit [Ca 5 (PO 4 ) 3 (OH)]. Analisis morfologi menggunakan SEM terlihat bahwa sampel NKEB memiliki permukaan yang tidak beraturan, datar  dan  berbentuk  bongkahan  serta  terlihat  hidroskopis, sedang  sampel  NKEA  memiliki  permukaan  lebih  berpori, sedangkan  derajat  kristanilitas  tidak  berhubungan  dengan kekerasan tulang hal ini diperlihatkan hasil morfologi sampel BB yang  terlihat  lebih  padat  dan  keras  tetapi  memiliki  derajat kristanilitas yang rendah.

## KESIMPULAN
Hasil  analisis  menunjukkan  bahwa  sampel  nanokalsium ekstraksi basa (NKEB) memiliki sifat yang lebih baik dibanding- kan sampel bahan baku (BB) dan nanokalsium ekstraksi asam (NKEA)  yang  ditunjukkan  dengan  rendemen  dan  derajat  putih yang  tinggi,  rata-rata  ukuran  partikel  yang  relatif  lebih  kecil, kadar abu yang lebih tinggi dengan kadar kalsium (20.67%) dan fosfor (10.09%) dengan rasio Ca/P = 2.0.  Hasil analisis spektra FTIR  menunjukkan  bahwa  kalsium  pada  semua  sampel merupakan  apatit  kalsium  fosfat  amorf  dan  kristalin.  Apatit karbonat tipe A (AKA) terbentuk pada sampel NKEB dan NKEA sedangkan  apatit  tipe  B  (AKB)  terdapat  pada  semua  sampel kalsium.  Analisis  XRD  menunjukkan  bahwa  fasa  fosfat  dan karbonat pada semua sampel merupakan campuran amorf dan kistalin,  dengan  derajat  kristalinitas  sampel  NKEB  lebih  tinggi atau  lebih  kristalin  dibandingkan  sampel  lainnya,  hal  ini didukung oleh morfologi permukaan sampel NKEB yang halus, datar dan berbentuk bongkahan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Pimpinan  beserta  jajaran  Balai  Besar  Penelitian  dan Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan  Perikanan  (BBP4BKP),  Kementerian  Kelautan  dan Perikanan,  Jakarta  atas  bantuan  biaya  dan  fasilitas  dalam penelitian.
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2005. Official Methods  of  Analytical  of  The  Association  of  Official Analytical  Chemist.  Method:  925.09,  941.12,  920.87, 960.39,  968.08,  948.09.  AOAC  International,  Washington, DC.
Dahlan K, Sari YW, Yiniarti E, Soejoko DS. 2006. Karakterisasi gugus  fosfat  dan  karbonat  dalam  tulang  tikus  dengan Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy . Indonesian J Materials Sci Edisi Khusus Oktober: 221-224.
Dongoran  N,  Kustiyah  L,  Marliyati  SA.  2007.  Pembuatan  susu kedelai  berkalsium  tinggi  dengan  penambahan  tepung tulang  ikan  kakap  merah  ( Lutjanus  Sanguineus ).  J  Media Gizi dan Keluarga 31: 71-79.
Greiner  R.  2009.  Current  and  projected  of  nanotechnology  in the food sector. J Nutrire - Revista da Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição 34: 243-260.
Hemung  BO.  2013.  Properties  of  tilapia  bone  powder  and  its calcium bioavailability based on transglutaminase assay. Int J  Biosci,  Biochem  and  Bioinform  3:  306-309.  DOI: 10.7763/IJBBB.2013.V3.219.
Huang YC, Hsiao PC, Chai HJ. 2011. Hydroxyapatite extracted from  fish  scale:  Effects  on  MG63  osteoblast-like  cells. Ceram  Int 37:  1825-1831.  DOI:  10.1016/j.ceramint.2011. 01.018
Karthikeyan  S.  2011.  X-ray  diffraction  and  Fourier  transform study of toxic effect of heavy metals on bone tissues of an edible fish cirrhinus mrigala. Acta Phys Pol A 122: 236-239.
Kaya AOW, Santoso J, Salamah E. 2008. Pemanfaatan tepung tulang  ikan  patin  ( Pangasius sp)  sebagai  sumber  kalsium dan fosfor dalam pembuatan biskuit. J Ichtyos 1: 9-14.
Khoerunnisa. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Nano Kalsium dari Cangkang  Kijing  Lokal  ( Pilisbryoconcha  exilis )  dengan Metode Presipitasi [Skripsi]. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Kim  SK,  Mendis  E.  2006.  Bioactive  compounds  from  marine processing  by  products  -  A  review.  Food  Res  Int  39:  383- 393.
Luu PH, Nguyen MH. 2009. Recovery and utilization of calcium from  fish  bones  byproducts  as  a  rich  calcium  source. Vietnam J Sci and Technol 47: 91-103.
Malde MK, Bugel S, Kristensen M, Malde K, Graff IE, Pedersen JI.  2010.  Calcium  from  salmon  and  cod  bone  is  well absorbed  in  young  healthy  men:  a  double-blinded randomized  crossover  design.  Nutr  Metab  7:  1-9.  DOI: 10.1186/1743-7075-7-61.
Mathai  M,  Takagi  S.  2001.  Structures  of  biological  minerals  in dental research. J Res Nat of Ins Stand Technol 106: 1035- 1044.
Mohanraj VJ, Chen Y. 2006. Nanoparticels - A Review. Trop J Pharm Res 5: 561-573.
supplemented  milk  on  calcium  metabolisme  in

## DAFTAR PUSTAKA
Park  HS,  Ahn  J,  Kwak  HS.  2007.  Effect  of  nanocalcium
Hasil Penelitian
Park  B.  2007.  Current  and  Future  Application  of nanotechnology. Di dalam: Hester RE, Harrison RM, editor. Nanotechnology:  Consequences  for  Human  Health  and Environment.  Volume  24.  Cambridge:  Royal  Society  of Chemistry  Publishing,  London.  DOI:  10.1039/978184 7557766-00001.
Petenuci  ME,  Stevanato  FB,  Visentainer  JE,  Matsushita  M, Garcia EE, de Souza NE, Visentainer JV. 2008. Fatty acid concentration,  proximate  composition,  and  mineral composition  in  fishbone  of  nile  tilapia.  Arch  Latinoam  Nutr 58: 87-90.
Phiraphinyo P, Taepakpurenat S, Lakkanatiporn P, Suntornsuk W, Suntornsuk L. 2006. Physical and chemical properties of fish  and  chicken  bones  as  calcium  source  for  mineral supplements. Songklanakarin J Sci Technol 28: 327-335.
Sittikulwitit  S,  Sirichakwal  PP,  Puwastien  P,  Chavasit  V, Sungpuag  P.  2004. In  vitro bioavailability  of  calcium  from chicken  bone  extracts  powder  and  its  fortified  products.  J Food  Compos  Anal  17:  321-329.  DOI:  10.1016/j.jfca. 2004.03.023
Suptijah  P,  Hardjito  L,  Haluan  J,  Suhartono  MG.  2010.
Recovery  dan  manfaat  nano  kalsium  hewan  perairan  (dari cangkang udang). Logika 2: 61-64.
Techochatchawal  K,  Therdthai  N,  Khotavivattana  S.  2009. Development of calcium supplement from the bone of Nile Tilapia ( Tilapia nilotica ). Asian J Food Agro-Indy 2: 539-546.
Toya T, Jotaki R, Kato A. 1986. Specimen Preparation in EPMA and SEM. JEOL Training Center EP Section.
Trilaksani  W,  Salamah  E,  Nabil  M.  2006.  Pemanfaatan  limbah tulang  ikan  tuna  ( Thunnus sp.)  sebagai  sumber  kalsium dengan  metode  hidrolisis  protein.  Buletin  Teknologi  Hasil Perikanan 9: 34-45.
Uskokovic  V.  2007.  Nanotechnologies:  What  we  do  not  know.
Technol  Soc  29:  43-61.  DOI:  10.1016/j.techsoc. 2006.10.005.
Vignesh  R,  Srinivasa  M.  2012.  Nutritional  quality  of  processed head and bone flours of tilapia ( Oreochromis mossambicus, Peters  1852)  from  Parangipetai estuary,  South  East  Coast of India. Asian Pacific Jl Tropl Biomed 2: S368-S372. DOI: 10.1016/S2221-1691(12)60189-0
Venkatesan J, Kim SK. 2010. Effect of temperature on isolation and  characterization  of  hydroxyapatite  from  tuna  ( Thunnus obesus ) bone.  Materials  3:  4761-4772.  DOI:  10.3390/ ma3104761.
ovariectomized  rats.  Asian-August  J  Anim  Sci  20:  1266- 1271.