## VALIDASI METODE ANALISIS KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI UNTUK PENETAPAN KADAR AMOXICILIN DALAM PLASMA SECARA IN VITRO
Ni Nyoman Puspita Sari 1) , Fatimawali 1) , Max Revolta John Runtuwene 2)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115
2) Jurusan Kimia FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Amoxicillin was an antibiotic concentration in the blood which measly quantity so it requires the sensitive, selective, and valid methods for analysis. In this study, optimization of the  analysis  condition  and  validation  of  analysis  methods  was  carried  out  using  the  HPLC system  for  analysis  of  amoxicillin  in  plasma  levels.  Chromatography  system  consisting  of symmetry  C18  column  (15  cm  x  4.6  mm,  5  m)  with  a  mobile  phase  methanol:  potassium dihydrogen phosphate buffer (10:90 v / v), pH 5. The solution was detected at a wavelength of 230 nm, the analysis was performed at a flow rate of 2.0 ml/min and the injection volume of 20 uL. In the amoxicillin solution validation showed good linearity values (r = 0.9409) as well as the value of LOD 2.5 mg/mL and the LOQ of 8.36 mg/mL. This method also meets the criteria of accuracy  (% diff does  not  exceed  ± 15% except  at  a concentration of 3 mg / mL) and precision (intra-day and inter-day for 2 days with% RSD ≤ 15%). While the results of the analysis of amoxicillin levels in the blood by using the validation is very small because of the low bioavailability of amoxicillin.
Keywords: Amoxicillin, HPLC, Validation, Methanol, Bioavailability

## ABSTRAK
Amoxicillin  merupakan  antibiotik  yang  konsentrasinya  dalam  darah  sangat  kecil  sehingga diperlukan  metode  analisis  yang  sensitif,  selektif,  dan  valid  untuk  analisis.  Pada  penelitian ini,  dilakukan  optimasi  kondisi  analisis  dan  validasi  metode  analisis  menggunakan  sistem KCKT untuk analisis kadar Amoxicilin dalam plasma. Sistem kromatografi terdiri dari kolom symmetry  C 18 (15  cm  x  4,6  mm,  5  µm)  dengan  fase  gerak  methanol:  buffer  kalium dihidrogen  fosfat  (10:90  v/v),  pH  5.  Larutan  dideteksi  pada  panjang  gelombang  230  nm, analisis dilakukan pada laju alir 2,0 ml/menit dan volume penyuntikan 20 µL. Pada validasi larutan amoxicillin memperlihatkan nilai linearitas yang baik (r = 0,9409) serta nilai LOD 2,5 µg/mL  dan  LOQ  8,36  µg/mL.  Metode  ini  juga  memenuhi  kriteria  akurasi  (%  diff  tidak melampaui  ±  15%  kecuali  pada  konsentrasi  3  µg/mL)  dan  presisi  (intra  hari  dan  inter  hari selama 2 hari dengan % RSD ≤ 15%). Sedangkan hasil analisis kadar amoxicillin di dalam darah dengan menggunakan validasi tersebut sangat kecil karena bioavailabilitas amoxicillin yang rendah.
Kata kunci: Amoxicilin, KCKT, Validasi, Metanol, Bioavailabilitas

## PENDAHULUAN
Validasi metode analisis merupakan  suatu  tindakan  penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium
untuk membuktikan  bahwa  parameter  tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.  Beberapa  parameter analisis  yang  harus  dipertimbangkan dalam validasi metode analisis diuraikan dan  didefinisikan  sebagaimana  cara penentuannya. Adapun parameter- parameter  tersebut  antara  lain  adalah kecermatan (akurasi), keseksamaan (presisi),  selektivitas,  linearitas  dan rentang,  batas  deteksi(LOD)  dan  batas kuantitas  (LOQ),  ketangguhan  metode, kekuatan metode (Lestari, 2008).
Berdasarkan Food  and  Drug Administration (FDA),  salah  satu  obat yang  wajib  diuji  bioekuivalensinya adalah amoxicilin. Amoxicilin merupakan  obat  golongan β-laktam termasuk  dalam  kelompok  antibiotik yang  paling  sering  digunakan  pada pengobatan  anti-infeksi  termasuk  pada pengobatan bronkitis. Pengobatan Bronkitis menggunakan amoxicilin harus dengan dosis yang tinggi (Sudjadi,
2012). Telah
dilakukan beberapa penelitian tentang validasi metode analisis untuk obat amoxicilin diantaranya  yaitu  yang  dilakukan  oleh Dhoka  tahun  2010,  penelitian  ini bertujuan  untuk  penentuan  kadar  obat amoxicilin  dan  bromheksin  hidroklorida dalam  bentuk  sediaan  oral  dengan menggunakan  metode  kromatografi  cair kinerja  tinggi  (KCKT)  serta  dilakukan juga  validasi  untuk  metode  analisisnya, hasil  validasinya  menunjukan  presisi dan  akurasi  yang  baik  sehingga  metode HPLC  ini  dapat  digunakan  secara  rutin untuk analisis kualitatif sediaan oral obat tersebut  serta  baik  digunakan  untuk penetapan  kadar  obat  amoxicilin  dan bromheksin
Penelitian oleh Suresh et al ., 2011,
penelitian ini bertujuan untuk melakukan  pengembangan  dan  validasi dalam  bahan  baku  obat  dan  sediaan farmasi amoxicilin menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. Validasinya  menunjukan  hasil  yang sederhana,  cepat  akurat  dan  tepat sehingga  metode  ini  dapat  diterapkan untuk  analisis  pengendalian  kualitas rutin Amoksisilin dalam jumlah besar.
Metode analisis yang telah dipublikasi seringkali dimodifikasi untuk  menyesuaikan  kondisi  dengan peralatan  dan  bahan  yang  tersedia  di laboratorium  pengujian.  Modifikasi  ini perlu  di  validasi  untuk  memastikan pelaksanaan  pengujian  yang  sesuai  dari metode  analisis  (  Food  and  drug administration,  2001).  Pada  penelitian ini,  akan  dilakukan  modifikasi  terhadap metode  analisis  yang  telah  dipublikasi dan  validasi  dari  modifikasi  tersebut. Modifakasi  metode  tersebut  selanjutnya akan  digunakan  untuk  penetapan  kadar obat  amoxicilin  dalam  plasma  darah secara in vitro.
Tujuan Penelitian ini yaitu melakukan  validasi  metode  analisis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)  terhadap  penetapan  kadar amoxicilin  serta  melakukan  penetapan kadar  Amoxicilin  dalam  plasma  darah secara  in  vitro  menggunakan    metode analisis yang telah di validasi.

## BAHAN DAN CARA KERJA Alat
KCKT  dengan  detektor  UV  230 nm  (Shimadzu),  kolom  symmetry  C 18 (15 cm x 4,6 mm; ukuran partikel 5 μm), spektrofotometer  UV-Vis  (Shimadzu UV  1800),  sentrifugator,  timbangan analitik,  pH  meter,  mikropipet  100  dan 1000 μL, blue tip, tabung reaksi, tabung sentrifuge,  rak  tabung  dan  lemari pendingin.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah zat aktif  amoxicilin,    metanol  HPLC, Metanol (P.A), buffer kalium dihidrogen fosfat  (pH  diatur  5,0  dengan  asam fosfat), NaOH, larutan EDTA, aquabidestilata,  plasma darah .

## Cara Kerja Pembuatan Larutan IndukAmoxicilin
Ditimbang  sebanyak  25  mg  zat aktif  amoxicilin.  Dilarutkan  ke  dalam metanol  hingga  volume  akhir  100  mL. Konsentrasi  250  μg/mL  digunakan sebagai larutan induk.
Penentuan
Panjang Gelombang Maksimum untuk Analisis Dibuat spektrum serapan
ultraviolet  larutan  amoxicilin  dengan konsentrasi  250,  100,  50,10,  3,  dan  1 μg/mL  dalam  metanol  pada  panjang gelombang  200-400  nm  mengunakan spektrofotometer Ultraviolet-Visibel, ditentukan panjang gelombang maksimumnya yang sesuai.
Optimasi  waktu  ( Operaiting  time ) untuk Analisis
Dilihat waktu kestabilan
(Operaiting time) Amoxicilin selama 0 – 10 menit dengan menggunakan spektrofotometri Ultraviolet-visibel pada panjang  gelombang  maksimum  dan konsentasi terpilih. Kestabilannya dilihat dari perubahan absorbansi.
Pembuatan Dapar Fosfat pH 5
Dilarutkan  KH 2 PO 4 sebanyak  7,8 gram dalam 900 mL air, disesuaikan pH 5 dengan penambahan NaOH.
Diencerkan dengan air hingga 1000 mL. Penetapan Fase Gerak
Larutan  standar  amoxicilin  pada konsentrasi  20  μg/mL  diinjeksikan sebanyak  20  μL  pada  komposisi  fase gerak metanol : buffer kalium dihidrogen  fosfat  pada  perbandingan 10:90  dan  40:60  (v/v)  (pH  5)  dengan perbandingan fase gerak terpilih ditentukan  laju  alir  1,2  –  2,0  mL/menit dan  deteksi  pada  panjang  gelombang terpilih.  Catat  waktu  retensi,  luas
puncak,  dihitung  jumlah  plat  teoritis, faktor kapasitas dan asimetris.

## Validasi Metode Analisis Amoxicilin
Pembuatan  Kurva  Kalibrasi  dan  Uji Linearitas
Larutan Sampel dengan konsentrasi 3, 6, 9,  12  dan  15  μg/mL  Sebanyak  20  μL larutan  tersebut  disuntikkan  ke  alat KCKT  pada  kondisi  terpilih.  Setelah  itu dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis linear (y=a+bx). Dihitung koefisien korelasi (r) dari kurva tersebut.

## Uji Akurasi
Larutan  amoxicilin  dengan  konsentrasi (3,  6  dan  9  μg/mL).  Analisis  dengan prosedur yang sama seperti pada sampel yaitu disuntikkan sebanyak 20 μL ke alat KCKT  dengan  kondisi  fase  gerak  dan kecepatan alir terpilih. Diulangi sebanyak tiga kali untuk setiap konsentrasi  kemudian  hitung  persentase akurasi  (%  diff)  dan  perolehan  kembali (%  recovery).  Nilai  rata-rata  %  diff disyaratkan ± 15% .
Uji Presisi Dari  hasil  akurasi  tersebut  dilakukan pengukuran intraday dan interday (selama  2  hari  berturut-turut,  kemudian hitung persentase simpangan baku relatif %  RSD  dari  masing-masing  konsentrasi dengan  nilai  lebih  kecil  sama  dengan 15%.
Batas Deteksi dan Batas Kuantitas
Batas  deteksi  ( Limit  of  Detection /LOD) dan batas kuantitas ( Limit Of Quantitation /LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
SY =
LOD =
LOQ =

## Uji Kesesuaian Sistem
Larutan  amoxicilin  pada  konsentrasi  3 μL/ml  diinjeksikan  sebanyak  20  μL  ke alat  KCKT  dengan  fase  gerak  terpilih, diulangi  sebanyak enam  kali. Kemudian dihitung  jumlah  plat  teoritis,  faktor kapasitas, asimetris.
Penetapan  Kadar  Amoxicilin  dalam plasma Darah Pengambilan sampel darah Darah diperoleh dari pengambilan darah peneliti sebanyak 12 mL. Darah tersebut
diambil menggunakan  dispo  12  mL.  Darah kemudian  dimasukkan  de  dalam  tabung yang sudah berisi larutan EDTA.
Ekstraksi  dan  Penetapan  Kadar Amoxicilin Dalam Plasma Sebelum penetapan kadar amoxicilin  dalam  plasma,  dilakukan
spaiking sampel  yaitu  dengan  cara pengukur  larutan  induk  amoxicilin  500 µg/mL ke dalam sistem KCKT.
Sebanyak  0,5  mL  darah  yang  diambil dari  sampel  pada  tabung  EDTA  di masukkan ke dalam  tabung sentrifuge  + Pelarut Organik ( Metanol) sebanyak 0,7 mL  divorteks  30  detik,  kemudian disentrifugasi  selama  10  menit  pada 3000  rpm.  Kemudian  Alikuot  disaring  , diambil supernatan (plasma) lalu supernatan  diinjeksi  sebanyak  20  μL  ke alat  KCKT.  Dianalisis  kromatogram untuk  mengetahui  kondisi  kromatogram blanko darah.
Dilakukan hal yang sama terhadap darah  yang  sudah  mengandung  larutan amoxicilin masing-masing dengan konsentrasi  250  dan  500  μg/mL. Diekstraksi  dan  diinjeksi  sebanyak  20 μL ke alat KCKT dengan kondisi KCKT yang  telah  ditentukan  sebelumnya, kemudian dicatat waktu  retensi dan luas puncaknya.  Hitung  kadar  Amoxicilin dalam darah dengan cara mensubtitusikan  luas  puncak  yang  telah terpilih  ke  dalam  persamaan  regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan Panjang
Gelombang Maksimum Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometri ultraviolet-visibel.
Dari beberapa
konsentrasi yaitu 250, 100, 50, 10, 3 dan
1  µg/mL  diperoleh  serapan  maksimum Amoxicilin  pada  panjang  gelombang 230 nm dan konsentrasi paling optimum yaitu pada konsentrasi 3 µg/mL.
Gambar 6.1. Spektrum panjang gelombang maksimum Amoxicilin pada konsentrasi 3 µg/mL.
Optimasi
Waktu Kestabilan ( Operating Time Pada optimasi waktu kestabilan ( Operating  time )  dengan  menggunakan panjang  gelombang  terpilih  yaitu  230 dan  konsentrasi  3  µg/mL  dengan  waktu 0-10  menit  menunjukkan  absorbansi yang stabil yaitu 0,11.
Penetapan  komposisi  fase  gerak dan  laju  alir  dilakukan  pada  kondisi optimum yang terpilih, kromatografi cair kinerja  tinggi  menggunakan  kolom Symmetry  (C18)  pada  dua  kondisi, pertama  kecepatan  alir  2,0  mL/menit, panjang gelombang 230 nm dan volume penyuntikan  20  µL.  Komposisi  fase gerak  semula  terdiri  dari  metanol  : buffer  kalium  dihidrogen  fosfat  dengan PH 5 (10:90). Pada komposisi ini, waktu retensi  amoxicilin  yaitu  1,87  menit. Dimana  hasil  dari  kondisi  pertama menunjukkan plat teoritis (N) 7790,62  , HETP  0,0019,  faktor  kapasitasnya  2,75 dan  asimetri  atau  faktor  pengekorannya 0,50.Kemudian  dilakukan  modifikasi fase  gerak  yaitu  komposisi  kedua metanol  :  Buffer  kalium  dihidrogen fosfat  PH  5  (40:60)  waktu  retensi amoxicilin  yaitu  2,85  menit  dengan menggunakan  laju  alir  2,0  mL/menit.
Pada  kondisi  kedua  dihasilkan    kondisi kromatogram yang melebar dan dihasilkan double  peak, hasil  plat teoritisnya  (N)  182,65,  HETP  0,0820  , faktor kapasitasnya 4,74 dan asimetrinya 0,71.  Jika  dibandingkan  dari  kedua kondisi tersebut kondisi pertama memberikan hasil parameter yang memenuhi  persyaratan  karena  semakin banyak  lempeng  teoritis  (N)  maka pemisahan  semakin  baik.  Sedangkan jika  HETP  semakin  rendah  maka efisiensi  kolom  semakin  baik.  Sehingga dipilihlah  kondisi  pertama  sebagai parameter terhadap penetapan amoxicilin selanjutnya.
Gambar  6.2.  Kromatogram  Amoxicilin dengan konsentrasi 3 µg/mL
Kondisi Analisis :
Fase gerak :  Metanol  :  buffer kalium  dihidrogen fosfat (10 : 90) Kolom :  Acclaim  (C18  ; 15 cm X 4,6 mm) Volume injeksi : 20 µL Kecepatan Alir : 2,0 mL/menit Detektor :Diode Array Detector Panjang gelombang  : 230 nm

## Validasi Metode Analisis Amoxicilin
Uji Linearitas
Uji  ini  dilakukan  pada  seri  larutan standar Amoxicilin dengan empat konsentrasi yaitu 3, 6, 9, dan 12 µg/mL. Dari  uji  ini  diperoleh  persamaan  regresi liniear  dan  koefisien  korelasi  (r).  Hasil uji  ini  diperoleh  persamaan  y  = 853835X  -  990947  dan  koefisien korelasi (r) 0,9409

## Uji Akurasi
Pada  uji  akurasi  ini  digunakan  3 konsentrasi  yaitu  3  µg/mL  ,  6  µg/mL dan 9 µg/mL. Persyaratan yang ditentukan  adalah  %diff  ±15%  (Gandjar &  Rohman,  2007).  Pada  konsentrasi  3 µg/mL  diperoleh  hasil  %diff  rata-rata sebesar  21,55%,  konsentrasi  6  µg/mL diperoleh  %diff  rata-rata  sebesar  1,55 dan  konsentrasi  9  diperoleh  %diff  rata- rata sebesar -0,91%. Kemudian dihitung juga  nilai  perolehan  kembalinya  (% Recovery)  dengan  cara  membandingkan konsentrasi  amoxicilin  yang  terukur dengan  kadar  amoxicilin  sebenarnya dikalikan  100%.  Nilai  uji  perolehan kembali  pada  konsentrasi  3  µg/mL berkisar 121,33% , konsentrasi 6 µg/mL berkisar  101,55%  dan  konsentrasi  9 µg/mL  berkisar  99,10%.  Perolehan kembali  disyaratkan  pada  kisaran  99- 101%  pada  tiap  level  (Gandjar  & Rohman, 2007).
Berdasarkan  ketiga  konsentrasi yang telah diperoleh,  perolehan kembali yang belum sesuai yaitu pada konsentrasi  3  µg/mL  sedangkan  untuk konsentrasi  6 µg/mL dan 9  µg/mL telah sesuai  dengan  persyaratan  yang  ada. Perbedaan  hasil  perolehan  kembali  dan %diff  ini  disebabkan  oleh  luas  area puncak  yang  timbul  saat  pembacaan  di sistem KCKT. Keakuratan  data tersebut disebabkan oleh sistem yang ada karena sistem  tersebut  berubah-ubah  sehingga keakuratan  data  tersebut  berkurang.
Pengujian  perolehan  kembali  dilakukan pada  tiga  konsentrasi  dengan  tujuan untuk  memeberikan  batas  range  bahwa pada  konsentrasi  demikian  analit  yang
terukur  pada  daerah  tersebut  masih terbaca dengan baik oleh detektor

## Uji Presisi
Uji  presisi  dilakukan  intra-hari dan inter-hari, pada pengujian intra-hari, konsentrasi  yang  digunakan  yaitu  3 µg/mL diperoleh %RSD ( Relative Standard  Deviation) sebesar  0,32%, pada  konsentrasi  6  µg/mL  sebesar 0,85%  dan  konsentrasi 9  µg/mL diperoleh 0,06%. Sedangkan pada pengujian  inter-hari  %RSD  ( Relative Standard Deviation) yang diperoleh dari konsentrasi  3  µg/mL  yaitu  2,63%, konsentrasi  6  µg/mL  yaitu  1,15%  dan  9 µg/mL yaitu 1,56%.  Terlihat dari kedua data  intra-hari  dan  inter-hari  selama  2 hari berturut-turut hasil %RSD (Relative Standard  Deviation)  ≤  15  %.  Hasil  ini sesuai  dengan  teori  yang  mengatakan bahwa  untuk  senyawa-senyawa  dengan pengukuran kadar sekelumit, nilai %RSD  dapat  diterima  jika  ≤  15% (Gandjar  &  Rohman,  2007).  sehingga bisa  dikatakan  pada  uji  presisi  ini memenuhi  syarat.  Uji  ini  dilakukan intra-hari  dan  inter  hari  selama  2  hari untuk memastikan bahwa setelah sediaan  disimpan  masih  stabil  dan  tidak mengganggu hasil analisa.

## Uji  Batas  Deteksi  (LOD)  dan  Batas Kuantitas (LOQ)
Hasil  dari  uji  batas  deteksi  ini adalah  2,5  µg/mL  dan  batas  kuantitasi sebesar  8,36.  Sehingga  bisa  dikatakan bahwa amoxicilin tidak akan terbaca lagi pada  konsentrasi  di  bawah  2,50  µg/mL dan hasil tersebut terbukti.

## Uji Kesesuaian Sistem
Uji  kesesuaian  sistem  dilakukan untuk memastikan kesesuaian dan keefektifan  sistem  yang  digunakan  agar diperoleh kondisi oprasional dan kromatogram  yang  baik.  Dari  hasil percobaan diperoleh nilai rata-rata, yaitu jumlah  plat  teoritis  18,19,  faktor
kapasitas  4,71,  asimetris  0,70  dan %RSD  (standar  deviasi  relatif)  15,35%. Berdasarkan  hasil  tersebut  ada  beberapa parameter  yang  tidak  sesuai  dengan persyaratan yaitu untuk plat teoritis yang dipersyaratkan >2500 sedangkan
hasilnya  <2500  dan  untuk  %RSD  yang dipersyaratkan  yaitu  5-15%  (Gandjar  & Rohman, 2007) sedangkan yang dihasilkan adalah 15,35%. Namun untuk faktor  kapasistas  dan  faktor  tailing (asimetris) telah sesuai. Ketidak sesuaian  hasil  plat  teoritis  disebabkan oleh  perubahan  HETP  (lebar  lempeng teoritis) dan juga pelebaran puncak.

## Penetapan Kadar Amoxicilin
Pada  penetapan  kadar  amoxicilin dalam  plasma  digunakan  satu  sampel darah yang diambil plasmanya kemudian  dengan  menggunakan  dua konsentrasi yaitu konsentrasi 250 µg/mL dan  500  µg/mL.  Dari  setiap  konsentrasi dilakukan  pengulangan  tiga  kali.  Untuk konsentrasi  250  µg/mL  dihasilkan  rata2 puncak  441847,33,  rata-rata  waktu retensi 2,76 dan rata-rata kadar terukurnya  1,67.  Sedangkan  untuk konsentrasi  500  µg/mL  rata-rata  luas puncaknya 2069980,33, waktu retensinya  2,71  dan  kadar  terukurnya 3,88.  Dari  kedua  konsentrasi  tersebut terlihat  bahwa  pada  konsentrasi  250 µg/mL  nilai  kadar  terukur  kurang  dari LOD  (2,50  µg/mL)  sehingga  pada konsentrasi tersebut tidak dapat terdeteksi  sedangkan  pada  konsentrasi 500  µg/mL  nilai  kadar  terukurnya  lebih besar  dari  nilai  LOD  (2,50  µg/mL) sehingga dapat dikatakan pada konsentrasi  tersebut  amoxicilin  dapat terdeteksi. Kadar amoxicilin yang terukur  dalam  plasma  sangat  sedikit,  ini berarti amoxicili memiliki biovailabilitas yang sangat kecil dalam plasma sehingga  konsentrasi  yang  digunakan harus tepat.
Gambar 6.6 kromatogram Blanko Darah
Gambar  6.7.  Kromatogram  sampel Darah  +  Amoxicilin konsentrasi 250 µg/mL
Gambar  6.8.  Kromatogram  sampel Darah + Amoxicilin
konsentrasi 500 µg/mL

## KESIMPULAN
1. Kondisi  optimasi  untuk  penetapan kadar  amoxicilin  secara  KCKT dengan  menggunakan  kolom  C18, kolom  (250  X  4,6  mm,  5  µm) dengan  fase  gerak  Metanol  : Buffer  kalium  dihidrogen  fosfat  ( 10  :  90),  PH  5  dan  laju  alir  2,0 mL/menit.Sedangkan hasil Validasi menunjukkan bahwa metode bioanalisis yang dilakukan sudah cukup memenuhi persyaratan  untuk  uji  kesesuaian sistem, linearitas (r=9,409), akurasi    (%diff  ≤  15  kecuali  pada konsentrasi  3  µg/mL)  ,  presisi  (% RSD  ≤  15),  batas  deteksi  (2,5 µg/mL) dan batas kuantitas (8,36). Hanya saja ada beberapa konsentrasi  yang  belum  sesuai yaitu  pada  uji  akurasi.  Namun secara  keseluruhan  metode  yang telah  divalidasi  bisa  digunakan untuk penetapan kadar amoxicilin. 2. Penetapan kadar Amoxicilin
dalam  plasma  secara in  vitro dengan menggunakan metode yang disudah divalidasi menunjukkan  hasil  kadar  yang sangat rendah. Dan semakin rendah konsentrasi maka kadarnya semakin rendah ini karena bioavailabilitas  amoxicilin  dalam plasma darah sangat rendah sehingga  jika  menggunakan  kadar yang sangat kecil kadar amoxicilin  dalam  plasma  tidak dapat terukur.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmed, M., G.Babu, S., A.Sathish, K, S. 2011. Development and Validation of  Amoxicillin  by  RP-HPLC
Method in Bulk drug and
Pharmaceutical dosage forms. International
Journal of ChemTech  Research. IJCRGG, CODEN(USA).  Vol.  3,  No.3,  pp
1037-1041.
Depkes  RI.1984. Farmakope  Indonesia. Edisi  III .  Departemen  Kesehatan RI, Jakarta. Halaman 9, 31, 902.
Dhoka, M., Gawande, V., Joshi, P. 2010.
High performance Liquid Chromatographic Method For Determination Of Amoxicilin Trihydrate and Bromhexine
Hydrochloride  In  Oral  Dosage Forms. International  Journal  of Pharmacy  and  Pharmaceutical Science. 2 : 129-133.
Dirjen  POM  Departemen  Kesehatan Republik
Indonesia. 1995.
Farmakope    Indonesia,  Edisi  IV. Departemen  Kesehatan    Republik Indonesia.  Jakarta.  Hal  :1083,
1084.
Gandjar,  G.I.,  Rohman,  A.  2007. Kimia Farmasi  Analisis .  Pustaka  Pelajar, Yogyakarta.
Harahap,  Y.  2008.  Validasi  Metode Analisis  Cilostazol  dalam  Plasma In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja  Tinggi. Jurnal  Program
Sarjana Farmasi. Departemen
Farmasi  FMIPA  UI,  Jakarta. Hal:09-20.
Hermita. 2004. Metode Penetapan Kadar Meloxicam  dalam  Darah  Manusia In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja  Tinggi. Jurnal  Program
Sarjana Farmasi . Departemen
Farmasi  FMIPA  UI,  Jakarta.
Hal:79-92.
Johnson,  E.L.,  Stevenson;  R  .  1978. Basic liquid chromatography .
Varian, California.
Kelly  MT.  1990.  Drug  Analysis  in
Biological Fluids. Chemical Analysis in  Complex  Matrices .
Dublin, Ireland. Hal.17-97.
Lestari  Dewi.  2008.  Validasi  Metode Analisis Levofloksasin dalam Plasma In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi- Fluoresensi . Skripsi . Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam UI, Depok.
Martina  Alfan.2009.  Optimasi  Fase Gerak  Dapar  Fosfat  PH  4,4-
Metanol  Pada  Penetapan  Kadar Campuran Amoksisilin dan Kalium  Klavulanat  dalam  Tablet Secara Simultan dengan
Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi (KCKT). Skripsi . USU, Medan.
Shargel,  Leon;  Andrew  B.C.Yu.  1941. Applied  Biopharmaceutics  and Pharmacokinetics,  Third  edition . Appleton , Lange. Hal: 33-110.
Sudjadi  dan  Rohman.  2012. Analisis Farmasi . Pustaka Pelajar, Yogyakarta.