## ANALISIS KANDUNGAN FITOKIMIA DAN UJI TOKSISITAS DARI HASIL PARTISI DAUN LIWAS DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY TEST
Zulkifli 1 ) , Max R.J. Runtuwene 1 ) , Jemmy Abidjulu 1 )
1) Jurusan Kimia FMIPA Universitas Sam Ratulangi  Manado, 95115

## ABSTRACT
A  research  aimed  to  determine  total  phenolic,  flavonoid,  and  tannin  content  and  toxicity  of ethyl  acetate,  n-hexane,  and  water  fractions  of  liwas  leaves  had  been  done.  Toxicity  test  were accomplished using Brine Shrimp Lethality Test on 48 hours old shrimp A. salina Leach. The number of dead shrimp was used to determine the percentage of shrimp mortality and the value of LC 50 was calculated  using  Probit  Analysis.  The  results  showed that  LC 50 value  of  water,  ethyl  acetate,  and  n- hexane fractions were 2.219, 3.393, and 207.625 mg/L respectively. The total phenolic and flavonoid content  in  n-hexane,  ethyl  acetate,  and  water  were  29.713,  41.142,  78.286  mg/g  and  7.129,  19.401, 41.004 mg/g respectively.
Keywords : Liwas Leaves, Phenolic, Flavonoid, Tannin, BSLT, LC 50 .

## ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian untuk menentukan kandungan total fenolik, flavonoid, tanin dan uji toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dari partisi etil asetat, partisi n - heksan,  dan  partisi  air  daun  liwas.  Uji  toksisitas  dilakukan  dengan  menggunakan  udang A . salina Leach  yang  berumur  48  jam.  Jumlah  udang  yang  mati  dihitung  dengan  menentukan  prosentase kematian A . salina , nilai LC 50 dihitung dengan metode analisa Probit menggunakan SPSS 15.0. Hasil penelitian  menunjukan  nilai  LC 50 didapatkan  pada  partisi  air,  partisi  etil  asetat,  dan n -heksan  yaitu 2,219;  3,393;  207,625  mg/L.  Hasil  partisi n -heksan,  etil  asetat,  dan  air  memiliki  kandungan  total fenolik  dan  flavonoid  dengan  nilai  berturut-turut  29,713;  41,142;  78,286  mg/g  dan  7,129;  19,401; 41,004 mg/g.
Kata kunci : Daun Liwas, Fenolik, Flavonoid, Tanin, BSLT, LC 50.

## PENDAHULUAN
Indonesia merupakan negara kepulauan di  Asia  Tenggara  yang  kaya  akan tumbuhan.  Tumbuhan  sangat  dibutuhkan dalam  hidup  manusia.  Oleh  karena  itu, tumbuhan  dapat  dijadikan  sebagai  bahan baku obat tradisional yang banyak digunakan oleh masyarakat untuk berbagai macam  tujuan  seperti  menjaga  kesehatan tubuh secara keseluruhan, dan menyembuhkan  penyakit  tertentu  (Liu, 1999).
Tumbuhan umumnya mengandung senyawa  bioaktif  dalam  bentuk  metabolit sekunder seperti flavonoid, tannin,
alkaloid, triterpenoid, steroid, saponin, dan lain-lain (lenny, 2006). Flavonoid menunjukan  aktivitas  biokimia  misalnya antioksidan,  anti  virus,  anti  bakteri,  dan anti  kanker  (Fowler et  al .,  2009). Flavonoid  merupakan  senyawa  polar karena  memiliki  gugus  OH - dan  larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, dan air (Markham, 1988).
Menurut Sumihe (2014) liwas merupakan  tumbuhan  obat  tradisional  di daerah  kabupaten  Minahasa  Tenggara provinsi  Sulawesi  Utara.  Daun  Liwas digunakan  sebagai  anti  rabies  dan  infeksi oleh  masyarakat  Minahasa  Tenggara. Sumihe (2014) melaporkan bahwa senyawa  fitokimia  yang  diidentifikasi adalah  flavonoid,  tanin,  saponin.  Telah diuji  nilai  toksisitasnya  dari  ekstrak metanol,  hasilnya  menunjukkan  nilai Lethal  Concentration 50  sampel  ekstrak metanol 15,69 mg/L ini  berarti  daun liwas bersifat sangat toksik.
Berdasarkan  penelitian  sebelumnya dapat  menjadi  informasi  awal  untuk melakukan  penelitian  lebih  lanjut,  maka dilakukan  penelitian  tentang  kandungan total fenolik, flavonoid, dan tanin terkondensasi  serta  melihat  nilai  LC 50
berdasarkan  tingkat  kepolaran  dengan menggunakan  pelarut  metanol, n -heksan, etil asetat, dan air. Penelitian ini diharapkan  dapat  memberikan  informasi secara ilmiah mengenai daun liwas kepada masyarakat ilmiah.

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Peralatan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  neraca  analitik, Alumunium foil , desikator, alat – alat gelas, oven,  blender,  ayakan  65 mesh ,  kertas saring , waterbath, rotary  evaporator , spektrofotometri  UV-Vis,  Vortex,  spatula, lampu  pijar  40  watt,  wadah  bening, blender,  termometer,  pipet  mikro,  pipet tetes, lemari asam, kaca pembesar.
Bahan baku  yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  daun  liwas  yang diperoleh  dari  Desa  Liwutung.  Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah  pelarut  organik  teknis  (redestilasi) seperti:  metanol, n -heksana,  etil  asetat, serta  bahan  kimia  lainnya  seperti:  telur udang A.  salina ,  garam  tak  beryodium, silica gel 60 F 254 , Folin Ciocalteu, natrium karbonat,  aluminium  klorida  hexahydrate, quercetin,  vanilin,  asam  klorida  pekat, katekin, asam galat, aquades, vaselin.

## Preparasi Sampel
Sampel  daun  liwas  dibersihkan kemudian  dikering-anginkan  selama  1 minggu.  Setelah  kering  sampel  diblender hingga  berbentuk  serbuk  lalu  diayak dengan ayakan 65 mesh .

## Ekstraksi Maserasi
Sebanyak 300 g simplisia
diekstraksi  dengan  cara  maserasi  selama  3 x  24  jam  menggunakan  pelarut  metanol sebanyak 2 L. Selanjutnya disaring hingga diperoleh  filtrat.  Filtrat  yang  diperoleh kemudian dievaporasi menggunakan rotary  evaporator .  Kemudian  dikeringkan
dalam  oven  pada  suhu  40 0 C  hingga diperoleh ekstrak pekat.

## Partisi
Sebanyak  10  g  ekstrak  pekat  yang dihasilkan  dari  proses  maserasi  dilarutkan dalam 100 ml aquades. Larutan selanjutnya dipartisi  dengan  menambahkan  50  mL  n- heksan,  dikocok  dalam  corong  pisah  dan didiamkan  hingga  terdapat  dua  lapisan (aquades  pada  bagian  bawah  dan  n- heksana  dibagian  atas).  Kedua  lapisan yang  terbentuk  kemudian  dipisahkan, diambil lapisan n-heksan. Proses penambahan pelarut n-heksan yang terbentuk  dalam  air  diulangi  sampai  n- heksan  menjadi  bening.  Lapisan  aquades kemudian  dipartisi  kembali  dengan  cara yang  sama  menggunakan  pelarut  etil asetat. Hasil partisi diuapkan menggunakan  alat rotary  evaporator hingga diperoleh ekstrak pekat .
Penentuan  Kandungan  Total  Fenolik (Conde et al ., 1997)
Kandungan  total  fenolik  ekstrak
daun
liwas ditentukan dengan
menggunakan  metode  Folin  Ciocalteu. Sebanyak  0,1  mL  larutan  ekstrak  dengan konsentrasi  10.000  mg/L  dimasukkan dalam tabung reaksi,  lalu ditambahkan 0,1 mL reagen Folin Ciocalteu 50%. Kemudian  divortex,  lalu  ditambahkan  2 mL  larutan  Na 2 CO 3 2%  dan  divortex. Selanjutnya,  campuran  diinkubasi  dalam ruangan gelap selama 30 menit.
Pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 750 nm menggunakan spektrofotometer.  Kandungan  total  fenolik dari ekstrak dihitung dengan menggunakan kurva standar asam galat.
Penentuan  Kandungan  Total  Flavanoid (Meda et al ., 2005)
Sebanyak  1  mL  larutan  ekstrak 10.000  mg/mL  dimasukkan  dalam  tabung
reaksi,  kemudian  ditambah  dengan  2  mL AlCl 3 2%  yang  telah  dilarutkan  dalam metanol,  kemudiam  divortex.  Absorbansi ekstrak  dibaca  pada  spektrofotometer dengan  panjang  gelomang  415  nm. Kandungan  total  flavonoid  dinyatakan sebagai mg ekivalen kuesertin / g ekstrak.

## Penentuan  Kandungan  Total  Tanin Terkondensasi (Julkunen-Titto, 1985)
Sebanyak  0,1  mL  larutan  sampel dimasukkan  dalam  tabung  reaksi  yang dibungkus aluminium foil, lalu ditambahkan  2  mL  laurutan  vanillin  4% dalam  metanol  dan  divortex.  Kemudian ditambahkan 1 mL HCl pekat dan divortex lagi.  Absorbansi  sampel  dibaca  pada panjang  gelombang  500  nm  setelah campuran diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Kandungan tanin
terkondensasi  dinyatakan  sebagai  ekivalen katekin  dalam  mg/kg  ekstrak.  Kurva kalibrasi dipersiapkan pada cara yang sama menggunakan katekin sebagai standar.
Uji Larva Udang A. salina (Brine Shrimp Lethality Test) Penetasan Larva Udang A. salina Telur  udang A.  salina ditetaskan dalam wadah bening dengan menggunakan media  air  garam.  Sebelumnya  telur  udang A.  salina ditimbang  dan  direndam  dalam 75  mL  air  biasa  kemudian  dibiarkan selama  2  jam.  Selanjutnya  telur  udang A. salina dipindahkan  ke  dalam  air  garam dengan  konsentrasi  20  g/L  yang  sudah disediakan untuk proses penetasan. Selama proses penetasan diberi penerangan dengan cahaya  lampu  pijar  40  watt  agar  suhu penetasan  25 -  40 tetap  terjaga (Indrayani et al ., 2006).

## Pembuatan  larutan  stok  hasil  partisi daun liwas
Larutan  stok  hasil  partisi  daun liwas  2000  mg/L  dengan  cara,  200  mg ekstrak  dilarutkan  dengan  konsentrasi  20
g/L.  Selanjutnya  diencerkan  menjadi  100, 10, 1, 0.1 mg/L untuk pengujian toksisitas.
Untuk kontrol-1 (0 mg/L) tanpa
penambahan  ekstrak  sedangkan  kontrol-2 (0  mg/L)  dengan  penambahan  5  tetes metanol,  apabila  ekstrak  tidak  larut  di dalam air garam (Sirait, 2001).
Uji Toksisitas (Mayer et al., 1982) Pengujian dilakukan dengan memasukan  10  ekor  udang A.  salina yang berumur 48 jam di dalam gelas yang berisi 100 mL larutan ekstrak. Setiap konsentrasi dilakukan 2 kali pengulangan dan dibandingkan  dengan  kontrol.  Pengamatan dilakukan  selama  24  jam.  Perhitungan kematian  udang A.  salina dihitung  sesuai dengan rumus berikut:
Mortalitas =
Apabila pada kontrol ada udang yang mati, prosentase  kematian  udang A.  salina ditentukan dengan rumus Abbot’s, sebagai berikut:
Mortalitas =

## Analisis Data
Analisis data untuk menentukan nilai LC 50 menggunakan SPSS 15.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Uji Kadar Air
Pengujian  kadar  air  dilakukan bertujuan untuk menentukan kadar air dari simplisia (serbuk kering).
Setelah
dilakukan  3  kali  perlakuan,  kadar  air  dari simplisia  adalah  kurang  dari  10%.  Hasil pada pengujian bahwa daun liwas memiliki kandungan  kadar  air  yang  baik  yaitu dibawah  10%,  sehingga  akan  tahan  dalam
penyimpanan  (Winarno,  1997).  Kadar  air rata-rata daun liwas adalah 7,04%.

## Ekstraksi Maserasi
Sebanyak  300  g  simplisia  (serbuk kering)  daun  Liwas  diekstraksi  dengan cara  maserasi  selama  3  x  24  jam menggunakan  pelarut  metanol  sebanyak  2 L.  Digunakan  metode  maserasi  ini  karena memiliki  keuntungan  yaitu  prosedur  dan peralatannya  sederhana  (Agoes,  2007), serta  dapat  menghindarkan  perubahan kimia  terhadap  senyawa-senyawa  tertentu oleh  karena  pemanasan,  namun  proses  ini membutuhkan  waktu  yang  relatif  lama. Maserasi  yang  dilakukan  pengadukan secara  terus-menerus  disebut  maserasi kinetik sedangkan yang dilakukan pengulangan  penambahan  pelarut  setelah dilakukan  penyaringan  terhadap  maserat pertama dan seterusnya  disebut remaserasi (Afriani et al ., 2013).
Proses  ekstraksi  dengan  metode maserasi  dikombinasikan  dengan  alat vaccum  rotary  evaporator yang  bertujuan untuk  mendapat  hasil  pemisahan  yang maksimal. Vaccum  rotary  evaporator merupakan  alat  yang  dirancang  untuk memindahkan pelarut yang mudah menguap  dalam  jumlah  yang  besar  dari larutan pada penurunan tekanan,
meninggalkan komponen yang tidak mudah menguap. Perbedaan utama pekerjaan  ini  dengan  kerja  distilasi  adalah dilakukannya  pemutaran  labu  distilasi selama  penguapan  pelarut.  Pemutaran memiliki  fungsi  penting  yakni  dapat menghindari resiko bumping dan
meningkatkan kecepatan pemindahan pelarut.
Hasil  evaporasi  di  pindahkan  pada wadah  dan  dimasukan  kedalam  oven dengan  suhu  maksimal  40 0 C  agar  tidak merusak  senyawa  yang  terkandung  dalam ekstrak,  hingga  diperoleh  ekstrak  kental.
Berdasarkan hasil ekstraksi 300 gram daun liwas  maka  diketahui  jumlah  rendemen yaitu 15,62 %

## Partisi
Dalam  ekstrak  metanol  masih terdapat  berbagai  kelompok  senyawa
metabolit sekunder sehingga perlu
dilakukan  pemisahan  senyawa  melalui proses partisi. Dalam proses partisi ekstrak metanol  daun  liwas  dilakukan  dengan menggunakan  pelarut n -heksan,  etil  asetat dan  air.  Hasil  partisi  yang  diperoleh  dapat dilihat dalam Tabel 2.
Tabel 2. Rendemen partisi daun liwas
Berdasarkan  data  tersebut  hasil partisi  air  rendemen  tertinggi  kemudian diikuti  partisi  etil  asetat  dan  partisi n - heksan.  Tingginya  rendemen  partisi  air disebabkan  banyaknya  jumlah  senyawa polar  yang  terkandung  dalam  daun  liwas tersebut. Firdausi et al ., (2015) menyatakan  bahwa  penggunaan  pelarut yang
berbeda tingkat kepolaran mempengaruhi jenis senyawa yang terekstrak.
Penentuan Kandungan Total Fenolik
Penentuan  kandungan  total  fenolik dilakukan untuk mengetahui total kandungan  senyawa  fenolik  yang  terdapat dalam hasil partisi n -heksan, etil asetat dan air. Penentuan kandungan fenolik dinyatakan  sebagai  mg  ekivalen  asam galat/g  ekstrak.  Hasil  total  kandungan fenolik  hasil  partisi n -heksan,  etil  asetat dan air ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar  2. Kandungan  total  fenolik  (FH=  Partisi  n-Heksan;  FEA=  Partisi  Etil  Asetat; dan FA= Partisi Air)
Berdasarkan  Gambar  2.  dapat diketahui  bahwa  partisi  air  daun  liwas  ini memiliki  kandungan  fenolik  yang  paling tinggi yaitu 78,286 mg/g, diikuti partisi etil asetat  yaitu  41,142  mg/g  dan  partisi n - heksan  yaitu  29,713  mg/g.  Kandungan total  fenol  yang  tinggi  pada  partisi  air menunjukan bahwa senyawa fenol merupakan  senyawa  yang  bersifat  polar yang  cenderung  larut  dalam  pelarut  polar (Harbone, 1987).
Penggunaan  asam  galat  sebagai standar  dikarenakan  senyawa  ini  sangat
efektif untuk membentuk senyawa kompleks  dengan  reagen  Folin-Ciocalteu (Julkunen-Tiito,1985). Uji kandungan total fenolik  dengan  metode  Folin-Ciocalteu bertujuan  untuk  mengetahui  jumlah  fenol yang  terkandung  dalam  partisi  air,  partisi etil asetat dan partisi n -heksan. Metode ini didasarkan pada kemampuan ekstrak untuk mereduksi  reagen  Folin-Ciocalteu  yang mengandung  senyawa  fosfomolibdat  dan asam  fosfotungstat.  Adapun  kandungan total fenolik ditunjukan pada Gambar 2.
7.129 19.401 41.004 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 FH FEA FA K a n d u n g a n To ta l Fen o li k (m g /g ) Partisi
Rendemen (%) Warna n -heksan 26.732 Hijau Kehitaman etil asetat 11.223 Merah Kekuningan Air 52.045 Hijau Kehitaman
Rendahnya kandungan total fenolik pada partisi n -heksan dikarenakan pelarut  ini  bersifat  non  polar  dan  juga dapat  dilihat  dari  intensitas  warna  yang terbentuk  (Lampiran.  18),  dimana  partisi n -heksan terjadi perubahan warna menjadi biru  namun  tidak  sepekat  perubahan warna  pada  partisi  air.  Intensitas  warna biru digunakan sebagai indikator keberadaan senyawa fenolik dalam sampel,  dimana  semakin  pekat  intensitas warna  menunjukan  kandungan  total  fenol semakin  besar.  Metode  Folin-Ciocalteau ditunjukkan  dengan  berubahnya  warna
larutan  dari  kuning  menjadi  biru,  hal  ini dikarenakan pada reagen Folin-Ciocalteau yang mengandung senyawa asam fosfomolibdat-fosfotungsat yang direduksi oleh sampel sehingga
membentuk senyawa kompleks molybdenum  tungstate  berwarna  biru. Warna  biru  yang  terbentuk  akan  semakin pekat  setara  dengan  konsentrasi  ion fenolat  yang  terbentuk.  Semakin  besar intensitas  warna  yang  ditunjukkan  maka akan  semakin  besar  pula  kandungan fenolik  yang  terkandung  (Julkenen-Titto, 1985).
H 3 PO 4 (MoO 3 ) 12 OH H 2 O O O H 3 (PMo 12 O 40 )
Gambar 3. Reaksi senyawa fenol dengan reagen Folin-Ciocalteu (Hardiana et al ., 2012)
Menurut  Nely  (2007)  penambahan Na 2 CO 3 pada  uji  fenolik  bertujuan  untuk membentuk suasana basa karena cenderung  ragen  Folin-Ciocalteu    lebih mudah  bereaksi  dengan  sampel  dalam keadaan  basa  oleh  gugus  hidroksil  dari fenolik di dalam sampel. Penentuan Kandungan Total Flavonoid Penentuan  kandungan  flavonoid dinyatakan sebagai mg ekivalen kuersetin/g  ekstrak.  Hasil  total  kandungan flavonoid  hasil  partisi n -heksan,  etil  asetat dan air ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar 4. Kandungan total flavonoid (FH= Partisi n-Heksan; FEA= Partisi Etil Asetat; dan FA= Partisi Air) 7.129 19.401 41.004 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 FH FEA FA Ka n d u n g a n T o ta l Fl a v o n o id ( m g /g )
Dari Gambar 4. kandungan flavonoid  daun  liwas  yang  tertinggi diperoleh  pada  partisi  air  yaitu  41,004 mg/g  dimana  pengujian  flavonoid  pada partisi  air  ini  memiliki  warna  yang  lebih kuning  dibandingkan  dengan  partisi  etil asetat  dan  n-heksan.  Sehingga  kandungan total flavonoid  pada daun liwas ini banyak terdapat pada partisi air.
Analisis  senyawa  flavonoid  diukur berdasarkan  membentuk  kompleks  dengan logam Al 3+ pada gugus hidroksi (cincin A) dan  keton  (cincin  C)  yang  bertangga  dan orto-hidroksi  (cincin  B)  yang  dapat menghasilkan  warna  kuning,  sehingga dapat  disimpulkan  bahwa  semakin  kuat
intensitas  warna  kuning  maka  kandungan flavonoid  yang  terkandung  dalam  ekstrak akan semakin tinggi (Meda et al, 2005).

## Penentuan  Kandungan  Total  Tanin Terkondensasi
Hasil  analisis  kandungan  total tannin  terkondensasi  terhadap  air,  partisi etil  asetat  dan  partisi n -heksan  ini dikatakan  tidak  aktif  dikarenakan  tidak terjadi perubahan warna.
Uji  Toksisitas (Brine  Shrimp  Lethality Test)
Hasil  toksisitas  partisi  air,  partisi etil  asetat,  dan  partisi n -heksan  terhadap udang A. salina dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Nilai LC 50 dari hasil partisi daun liwas Sampel Nilai LC 50 (mg/L) n -heksan 207,625 Etil asetat 3,393 Air 2,219 Data  hasil  toksisitas  pada  Tabel  3 menunjukan bahwa semakin besar konsentrasi  suatu  ekstrak  kematian  hewan uji  akan  semakin  besar.  Nilai  LC 50 diperoleh menggunakan SPSS 15.0 dengan cara analisis probit. Tingkat kematian larva A.  salina dipengaruhi  dari  banyaknya kandungan flavonoid pada ekstrak uji. Hal ini  dapat  dilihat  pada  hasil  uji  total flavonoid  partisi  air,  LC 50 pada  partisi  air yaitu  2,219  mg/L,  LC 50 pada  partisi  etil asetat  yaitu  3,393  mg/L,  dan  LC 50 pada partisi n -heksan  yaitu  207,625  mg/L. Semakin kecil nilai LC 50 dari suatu sampel maka  semakin  tinggi  senyawa  bioakifnya. Tingginya aktivitas  bioaktif dari partisi air daun  liwas  terhadap  udang A.  salina disebabkan  adanya  kandungan  senyawa saponin  dan  fenolik  yang  cukup  tinggi (Harbone,  1996).  Adanya  flavonoid  dalam lingkungan sel dapat menyebabkan
pecahnya membran sel. Hal ini disebabkan gugus  OH - pada  flavonoid  berikatan dengan  protein  integral  membran  sel sehingga  terbendungnya  transport  aktif Na + dan  K + .  Transpor  aktif  yang  berhenti menyebabkan  pemasukan  ion  Na + yang tidak  terkendali  ke  dalam  sel,  yang menyebabkan  pecahnya  membran  sel. Pecahnya  membran  sel  inilah  yang menyebabkan  kematian  sel  (Scheuer, 1994).  Hal  ini  dibuktikan  juga  pada  uji toksisitas  partisi n -heksan  yang  memiliki kandungan  flavonoid  yang  rendah  juga memiliki tingkat toksisitas yang rendah.

## KESIMPULAN
Kandungan  total  fenolik    dan  total flavonoid  paling  tinggi  terdapat  pada ekstrak  partisi  air  diikuti  partisi  etil  asetat dan n -heksan.  Daun  liwas  tidak  memiliki kandungan  tanin  terkondensasi.  LC 50 pada partisi  air  paling  tinggi  diikuti  partisi partisi etil asetat, dan n -heksan.

## DAFTAR PUSTAKA
Afriani,  S.,  Idiawati,  N.,  Destiarti,  L.,  dan Arianie,  L.  2013.  Uji  Aktivitas Antioksidan  Daging  Buah  Asam Paya (Eleiodoxa  conferta Burret ) dengan Metode DPPH dan Tiosianat. Jurnal Kimia Khatulistiwa. 3 : 49-56 Ansel,  H.C.  1989. Pengantar  Bentuk
Sediaan Farmasi . Universitas Indonesia Press, Jakarta.
Conde,  E.F.,  Cadahia,  M.C.,  Garcia- Vallejo, B.F.D., Simon and Adrabos,
J.R.G. 1997.  Low Molecular Weight Polyphenol  in  Cork  of  Quercus Suber. J . Agric.  Food.  Chem. 45 : 2695-2700.
Damanik,  D.P.D.,  Surbakti,  P.,  dan
Hasibuan, R. 2014. Ekstraksi
Katekin  dari  Daun  Gambir  ( Uncaria gambir roxb ) dengan Metode Maserasi. Jurnal Teknik Kimia . 2( 3 ).
Firdausi,  I.,  Retnowati,  R.,  dan  Sutrisno. 2015.  Fraksinasi  Ekstrak  Metanol Daun  Mangga  Kasturi  ( Mangifera casturi Kosterm)  dengan  Pelarut  n- Butanol. Kimia Student Journal . 1 ( 1)
: 785-790
Fowler,  L.Z.,  Mattheos,  A.,  dan  Koffas.
2009. Biosynthesis and Biotechnological Production of Flavanones: current state and perspectives.  J.  App.  Microbial. Biotechnol. 83: 799-808 Gali-Muhtasib,  H.U.,  Yamout,  S.Z.  and Sidani, M.M. 1999. Plants Tannin as Inhibitors of Hydroperoxide Production  and  Tumor  Promotion Induced  by  Ultraviolet  B  Radiation
in Mouse Skin in vivo. Oncol Rep . 6 : 547-553.
Harbone,  J.  B.  1987. Uji  Fitokimia. Bandung : Institut Teknologi Bandung. Harbone,  J.B.  1996.  Metode  Fitokimia: Penentuan Cara Moderen Menganalisa Tumbuhan. Terjemahan Kosasih  Padmawinata  dan  Iwang Soediro. ITB, Bandung
Hardiana,  R.,  Rudiyansyah.,  dan  Zaharah,
T.  A.  2012.  Aktivitas  Antioksidan
Senyawa Golongan Fenol dari Beberapa  Jenis  Tumbuhan  Famili Malvaceae. JKK. 1(1) : 8-13
Harjadi,  W.  1993.  Ilmu  Kimia  Analitik
Dasar. Erlangga, Jakarta
Indrayani,  L.,  Soetjipto,  H.,  Sihasale,  L. 2006.  Skrining  Fitokimia  dan  Uji Toksisitas  Ekstrak  Daun  Pecut  Kuda (Stachytarpheta  jamacensis  L.  Vahl) Terhadap  Larva  Udang  Artemia Salina  Leach.  Fakultas  Sains  dan
Matematika Universitas Kristen satya Wacana, Salatiga. Journal. 12 : 57-61. Julkunen-Titto, R. 1985. Phenolic
Constituents  in  Leaves  of  Northern Willows:  Methods  for  the  Analysis of  Certain  Phenolics. Journal  of Agricultural  and  Food  Chemistry . 33(2) : 213-217
Katzung.  B.G.  1987. Basic  and  Clinical Pharmacology .  3 rd Edition.  Penerbit Buku Kedokteran. EGC, Jakarta.
Klaassen, C. D., Aqmdur, M. O., Doull, J, 1986. Toxicology, The Basic Science of  Poisons.  Mc  Millan  Publishing Compane, New York.
Lenny,  S.  2006.  Senyawa  Flavonoida,
Fenilpropanoida dan Alkaloida. Departemen  Kimia  Kimia  FMIPA USU, Medan.
Liu,  K.  1999. Soybeans  :  Chemistry, Technology,  and  Utilization .  New York : Chapman and Hall
Loomis. T.A. 1978. Essential of Toxicology. Edisi ke-4. IKIP,
Semarang.
Lu,  F.C.  1995.  Toksikologi  Dasar:  Asas,
Organ Sasaran, dan Penilaian
Resiko.  Edisi  ke-2.  Terjemahan Koensoenmardiyah.  IKIP  Semarang Press, Semarang. Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi  Flavanoid.  Divisi kelima  Departemen  Penelitian  Ilmu Pengetahuan  dan  Industeri,  Petone Selandia Baru. Penerbit ITB, Bandung.
Mayer, B.N., N.R. Ferrigni., J.E. Putnam.,L.B. Jacobsen., D. E. Nichols.,  and  J.L.  Mc  Laughlin. 1982.  Brine  shrimp:  A  Convenient General  Bioassay  for  Active  Plant Constituents.  J.  Planta  Medica. 45(5): 31-45.
Meda,  A.,  C.  E.  Lamein,  M.  Romito,  J. Milliogo, dan O. G. Nacoulina. 2005.
Determination of the Total Phenolic,
Flavonoid  and  Proline  Content  in Burkina  Fasan  Honey,  as  well  as Their  Radical  Scavenging  Activity.
Journal  of Food Chemistry. 91 :  571- 577.
Nely  F.  2007.  Aktivitas  Antioksidan
Rempah  Pasar  dan  Bubuk  Rempah Pabrik  dengan  Metode  Polifenol  dan Uji  AOM  ( Active  Oxygen  Method ) [Skripsi]. Fakutas Teknologi
Pertanian IPB. Bogor.
Scheuer,  J.S.  1994.  Produk  Alami  Lautan.
IKIP Semarang Press, Semarang.
Shahidi,  F.  and  M.  Naczk.  1995. Food
Phenolics : Sources, Chemistry, Effects and Application .
Technomic  Publishsing  Co.  Inc., Lancaster-Basel. Sirait,  M.  2001.  Pengembangan  Obat Bahan Alam. Edisi ke-4. Perhimpunan  Peneliti  Bahan  Obat, Jakarta. Soemirat, J. 2005. Toksikologi Lingkungan. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Sumihe,  G.,  Runtuwene,  M.  R.  J.,  dan Rorong, J. A. 2014. Analisis Fitokimia dan  Penentuan Nilai LC 50 Ekstrak Metanol Daun Liwas. Jurnal Ilmiah Sains . 14(2) : 125-128 Suryanto, E. 2012. Fitokimia Antioksidan . Surabaya : CV. Putra Media Nusantara (PMN).
Voigt,  R, 1994,  Buku Pelajaran Teknologi Farmasi  edisi  5,  Gadjah  Mada University  Press,  Yogyakarta,  hal 170.
Winarno,  F.G.  2007. Kimia  Pangan  dan Gizi . M-Biro Press, Bogor.
Winarno,  M.  W.  1997.  Efek  Daun  Katu ( Saurophus androgenus Merr.) terhadap  Diare  Tikus  Putih.  J. Cermin Dunia Farmasi. 33: 31-35.
Wungkana,  I.  2013.  Aktivitas  Antioksidan dan  Tabir  Surya  Fraksi  Fenolik Limbah  Tongkol  Jagung  (Zea mays L )  pada  Fotooksidasi  Kulit  Kelinci [Skripsi]. FMIPA UNSRAT, Manado.
Yussuf,  A.Z.,  A.  Zakir.,  Z.  Shenan.,  M.
Abdullahi.,  &  S.A.  Halima.  2014. Phytochemical  Analysis  of  The
Mehanol Leaves Extract of Paullinia Pinnata Linn . Journal of
Pharmacognosy  and  Phtotherapy . 6(2): 10-16.