ISOLASI, IDENTIFIKASI, KARAKTERISASI DAN UJI TOKSISITAS SENYAWA METABOLIT SEKUNDER FRAKSI NONPOLAR AKAR BABANDOTAN Ageratum conyzoides L.
Isolation, Identification, Characteriterization, an Toxicity Essay of Non-Polar Secondary Metabolite Fraction from Ageratum conyzoides L
Muhammad Irmawan*, Fredryk W. Mandey, Seniwati Dali
Department of Chemistry, Faculty of Matemathics and Natural Sciences, Hasanuddin University Jln. Perintis Kemerdekaan Km.10 Makassar 90245-Indonesia
*Corresponding author, e-mail: muhammadirmawan47@yahoo.com
Received: March 2018 Published: July 2018

## ABSTRACT
Ageratum Conyzoides L.  has  a toxic and bioactive component as anti-cancer and especially  for the root, it has anti-tumor. In order to figure out the active component, it is necessary to do four steps; isolation, identification, characterization,  and  toxicity  essay Brine  Shrimp  Lethality Test  (BSLT)  of  non-polar  fraction Ageratum conyzoides L  plant.  Isolation  method  consist  of  four  parts;  extraction,  partitioning  of  Kupchan  method, fractionation,  and  purification.  Fractionation  method  uses  press  column  chromatography  (KTT).  Furthermore, purification  process  uses  thin  layer  chromatography  (TLC)  and  characterization  with  spectroscopy  FTIR, 1 H- NMR  and 13 C-NMR.  Then  characterization  utilizes  spectroscopy  FTIR, 1 H-NMR  and 13 C-NMR.  The  toxicity essay toward Artemia Salina Leach n-hexane fraction and dichloromethane fraction showed that the fraction had toxic properties with number of LC 50 are 0.0237 and 4.642 µg/mL respectively. Moreover, n-hexane fraction  has succeed in isolating Stigmasterol compound shaped  white crystalline needles with 19.6 mg weight, 143-144 °C melting point and and had toxic properties with number of LC 50 are 30.33 µg/mL.
Keywords : Root of Ageratum Conyzoides L., Brine Shrimp  Lethality Test (BSLT), isolation, stigmasterol

## PENDAHULUAN
Ageratum conyzoides L. merupakan tumbuhan yang termasuk dalam genus Ageratum , famili Asteraceae, dan dikenal dengan berbagai  nama,  antara  lain:  bandotan  (Jawa), babandotan  (Sunda),  dus  bedusan  (Madura)  dan ruku-ruku bembe (Makassar). Tumbuhan Ageratum conyzoides L. dikenal sebagai tumbuhan  gulma  oleh  masyarakat,  tetapi tumbuhan  ini  merupakan  salah  satu  tumbuhan herbal  yang  memiliki  sejarah  panjang  sebagai obat  tradisional  seperti  obat  maag,  demam, rematik, sekit kepala, sakit perut, diare dan sakit tenggorokan  di  negara  yang  beriklim  tropis  dan sub tropis  (Singh dkk., 2013; Tambaru, 2017a). Ageratum conyzoides L. juga memiliki kemampuan untuk  tumbuh dan menyebar secara cepat,  dengan  daerah  penyebaran  ekologi  yang luas (Kaur dkk., 2012)
Penelitian terus dilakukan mengenai potensi Ageratum  conyzoides L.  di  bidang  kesehatan salah  satunya  yaitu  potensinya  sebagai  obat
antikanker.  seperti  menguji  sifat  toksisitas  dari senyawa  metabolit  sekunder  dari  tumbuhan tersebut, diantaranya, dilakukan oleh Rahim dkk. (2012)  yang  menunjukkan  bahwa  ekstrak n-heksana Ageratum  conyzoides L. bersifat toksik  terhadap  larva Artemia  salina Leach dengan  LC 50 sebesar  19,906  µg/mL.  Nasrin (2013)  membuktikan  bahwa  ekstrak  metanol batang Ageratum  conyzoides L.  juga  memiliki bioaktivitas yang sangat besar dan bersifat toksik terhadap larva Artemia salina Leach dengan nilai LC 50 sebesar  1,32  µg/mL.  Sifat  toksisitas  fraksi atau  suatu  senyawa  memiliki  kolerasi  terhadap kemampuan  suatu  bahan  obat  yang  memiliki efek antikanker dalam mematikan suatu unit sel, terkhususnya  sel  kanker  (Carballo  dkk,  2002). Hal  ini  memerlukan  pengembangan  lebih  lanjut dari  fraksi  atau  senyawa  untuk  menjadi  bahan obat antikanker.
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan bahwa tumbuhan Ageratum conyzoides L. sangat bersifat tosik dan memiliki potensial  sebagai  antikanker,  oleh  karena  itu
perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk menguji sifat toksisitas dan sifat antikanker dari fraksi  nonpolar  akar Ageratum  conyzoides L. Pada  penelitian  ini  telah  dilakukan  isolasi, identifikasi  dan  karakterisasi  senyawa  dalam fraksi  yang  bertanggungjawab  terhadap  sifat toksisitas dan sifat antikanker tersebut.

## METODOLOGI

## Bahan
Sampel  yang  digunakan  pada  penelitian  ini berupa  akar  Bandotan Ageratum  conyzoides L. diperoleh dari pulau Tarakan, Kalimantan Utara. Bahan  penelitian  lain  seperti:  metanol  teknis, akuades, akuabides, n-heksana p.a, diklorometan p.a, aseton p.a, es batu, plastik wrap, aluminium foil , tissue  roll ,  kertas  saring Whatman nomor 42,    plat  KLT  (Merk  Kieselgel  60  F254  0,25 mm),  silika  gel  60  (Merk,  no.  katalog  7733), silika  gel  60  (Merk,  no.  katalog  7734),  telur udang Artemia  salina Leach,  NaCl  laut  (Sigma, no.  katalog  S-9883),  dan  DMSO  (Merck,  no. katalog 802912).

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  antara  lain peralatan  gelas,  corong  pisah,  statif,  klem,  botol vial,    timbangan  digital  (Ohaus  AP-110),  alat evaporasi  (BUCHI  Rotavapor  R-200),  botol semprot,  alat  destilasi,  alat  kromatografi  lapis tipis  (KLT)  seperti chamber dan  pipa  kapiler, pensil, cutter ,  mistar,  inkubator,  penangas  air, kromatografi  kolom  tekan  (KKT),  lampu  UV 254-365 nm, sementara untuk analisis spektrofotometer  IR  dengan  varian  FTIR Prestige-21 Shimadzu, JEOL JMN A 5000 yang bekerja  pada  500,0  MHz  untuk  spektrum 1 H- NMR  dan  125,65  MHz  untuk  spektrum 13 C- NMR.

## Prosedur Kerja
Pengolahan  dan  ekstrasi  Akar Ageratum conyzoides L.
Ageratum conyzoides L. yang diperoleh dari hasil  sampling,  selanjunya  dipotong  antara  akar dan  batangnya  kemudian  dibersihkan  dan dikering anginkan. Akar Ageratum conyzoides L. yang telah kering, dihaluskan sehingga diperoleh serbuk  akar  sebanyak  1,9  kg.  Selanjutnya dimaserasi dengan metanol beberapa kali selama 4  x  24  jam.  Kumpulan  maserat  yang  diperoleh selanjutnya di pekatkan dengan rotary
evaporator pada  suhu  rendah  40–50 o C,  maka diperoleh  ekstrak  metanol  ( crude  extract ) berwujud semi semi padat berwarna hijau tua.
Fraksinasi  dan  isolasi  fraksi  nonpolar  akar Ageratum conyzoides L.
Ekstrak metanol yang diperoleh selanjutnya difraksinasi dengan metode  Kupchan. Fraksinasi dimulai dengan mensuspensikan ekstrak metanol menggunakan air dan dipartisi dengan diklorometan,  sehingga  diperoleh  fraksi  air  dan fraksi  diklorometan.  Fraksi  diklorometan  yang telah  pekatkan  dengan rotary  evaporator pada suhu  rendah  27 o C,  selanjutnya  disuspensikan dengan metanol air (9:1) dan dipartisi dengan n- heksana. Fraksi metanol air hasil partisi dan telah di pekatkan dengan rotary evaporator pada suhu rendah  37 o C,  kemudian  disuspensikan  dengan metanol  air  (5:5)  dan  dipartisi  lebih  lanjut dengan  diklorometan  (Kupchan  dkk.,  1978). Sehingga  diperoleh  fraksi  n-heksana,  fraksi diklorometan, fraksi metanol (5:5) dan fraksi air. Pada  penelitian  kali  ini  difokuskan  pada  fraksi non  polar  yaitu  fraksi  n-heksan  berbentuk  semi padat  berwarna  hijau  dan  fraksi  diklorometan berbentuk semi padat berwarna hitam. Selanjutnya  fraksi  tersebut  dilakukan  pengujian toksisitas  metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT),  Meyer  dkk,  (1982).  Berdasarkan  hasil pengujian  toksisitas  diperoleh  fraksi  n-heksan bersifat lebih  toksik dibandingkan fraksi diklorometan,  maka  dari  itu  fraksi  n-heksan dilanjukkan  keproses isolasi  senyawa  murni  dan pengujian  fitokimia.  Proses  isolasi  senyawa melalui tahap fraksinasi dengan (KKT) menggunakan  eluen  yang  sesuai  berdasarkan analisis  KLT,  dimana  setiap  hasil  fraksinasi dimonitor  kembali  melalui  analisis  KLT  dan tahap pemurnian menggunakan metode kristalisasi  dan  rekristalisasi,  hingga  diperoleh senyawa isolat murni.
Uji  Toksisitas  Metode Brine  Shrimp  Lethality

## Test (BSLT)

## Penyiapan Larva Udang
Telur  udang  dimasukkan  ke  dalam  wadah  yang berisi  air  laut  untuk  ditetaskan.  Diaerasi  di bawah  cahaya  lampu  pijar 40-60  watt  agar suhu penetasan  tetap  terjaga  pada  kisaran  25-30  °C. lampu  dinyalakan  selam  48  jam,  setelah  telur menetas diambil larva udang yang akan di uji.

## Pelaksanaan Uji
Sampel  dibuat  dalam  konsentrasi  1000 g/mL,  100 g/mL,  10 g/mL  lalu  di tempatkkan  dalam  3  vial  berbeda.  Air  laut  steril yang  mengandung  10  larva  udang  ditambahkan hingga  volume  akhir  sebanyak  5  mL.  di  simpan di bawah pencahayaan selama 24 jam. Amati dan hitung  jumlah  larva  yang  mati.  Persen  kematian diperoleh dari rumus (Meyer dkk, 1982).
% kematian = ∑ ∑
× 100 %
Kemudian ditentukan nilai lC 50 dengan menggunakan analisis Probit.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi, Fraksinasi dan Isolasi Serbuk  akar Ageratum  conyzoides L.  (1,9 kg) dimaserasi dengan pelarut  metanol selama 4 x  24  jam  sebanyak  3  kali,  dan  menghasilkan meserat metanol berwarna hijau, yang selanjutnya  dievaporasi  untuk    menghasilkan ekstrak  kental  metanol  ( crude  extract )  semi padat  berwarna  hijau  tua  sebanyak  20,6153  g. Selanjutnya, ekstrak metanol difraksinasi menggunakan  metode  Kupchan  dkk,  (1978), menghasilkan  fraksi  utama  yaitu,  fraksi  air, metanol:air (5:5), n-heksan, dan diklorometan.
Namun,  pada  penelitian  kali  ini  hanya terfokus  pada  fraksi  non  polor  yaitu  fraksi diklorometan  berwujud  semi  padat  berwarna coklat  kehitaman  sebanyak  1,9112  g  dan  fraksi n-heksan  berwujud  semi  padat  berwarna  hijau sebanyak  3,1487  g.  Fraksi  yang  diperoleh selanjutnya  dilakukan  pengujian  toksisitas.  Uji toksisitas  dilakukan  bertujuan  untuk  praskrining efek  toksik  dari  fraksi  yang  berpotensi dilanjutkan  ke  proses  isolasi  senyawa  yang diindikasi memiliki bioaktivitas sebagai antikanker.  Menurut  Meyer  dkk,  (1982),  efek toksik memiliki kolerasi positif dalam mematikan  suatu  unit  sel,  khusunya  sel  kanker. Suatu  fraksi  atau  senyawa  dinyatakan  bersifat toksik  jika  memiliki  nilai  LC 50 sebesar  <1000 µg/mL.
Berdasarkan data nilai toksisitas LC 50 (Tabel 1)  dari  fraksi  n-heksan  dan  fraksi  diklorometan yang  diperoleh  dapat  disimpulkan  bahwa  kedua fraksi  tersebut  bersifat  toksik.  Tetapi  jika dibandingkan dari kedua fraksi tersebut berdasarkan  nilai  LC 50 ,  fraksi  n-heksan  bersifat
lebih toksik dari fraksi diklorometan, karena jika semakin  kecil  konsentrasi  suatu  fraksi  untuk mematikan  suatu  unit  sel,  maka  fraksi  tersebut semakin bersfat toksik, sehingga fraksi n-heksan selanjutnya  dilakukan  proses  isolasi  senyawa murni.
Tabel 1. Nilai toksisitas (LC 50 ) fraksi nonpolar akar Ageratum conyzoides L.
Proses  isolasi  senyawa  murni  dari  fraksi  n- heksan  dimulai  dengan  tahap  kromatografi kolom  tekan  (KKT)  dengan  komposisi  pelarut eluen  yang  tepat  digunakan  yaitu  etil  asetat  : n-heksan  (0,5  :  9,5).  Proses  pemisahan menggunakan metode kromatografi kolom tekan (KKT)  bertujuan  untuk  memperoleh  kelompok senyawa  yang  sederhana.  Pada  tahap  pemisahan KKT  diperoleh  52  sub-fraksi,  dari  semua  sub- fraksi yang didapatkan hanya sub-fraksi 16 yang memiliki  potensi  untuk  dilanjutkan  ke  proses pemurnian  karena  memiliki  bobot  yang  besar yaitu sebesar 40,4 mg berbentuk kristal jarum.
Sub-fraksi  16  selanjunya  di  KLT  dan  di rekristalisasi  yang  bertujuan  menghilangkan pengotor yang tercampur. Hasil proses rekristalisasi  sub-fraksi  16  diperoleh  berbentuk kristal  jarum  berwarna  putih  yang  teramati berpendar  dibawah  lampu  UV long  wave (365 nm) dengan bobot sebesar 19,6 mg, dengan titik leleh  143-144  °C  dan  bereaksi  positif  dengan pereaksi Liebermann Buchard yang menunjukkan  bahawa  isolat  tersebut  merupakan senyawa golongan steroid.

## Karakterisasi dengan metode spektroskopi
Analisis  spektroskopi  FTIR  senyawa  isolat memperlihatkan  pita  serapan  gugus  hidroksil (-OH) yang khas pada daerah 3433,41 cm -1 .bilangan Kemudian serapan bilangan gelombang  2934,79    cm -1 dan  2863,42  cm -1 menunjukkan  gugus  –CHsp 3 ,  didukung  pita serapan daerah 1376,26 cm -1 menunjukkan gugus –CH 3 dan  sinyal  1462,09  cm -1 menunjukkan gugus  –CH 2. Selanjutnya  bilangan  gelombang 1645,33  cm -1 menujukkan  adanya  gugus  alkena (C=C)  dan  pada  serapan  bilangan  gelombang
No. Fraksi Nilai toksisitas (LC 50 ) (µg/mL) 1 n-heksan 0,0237 2 diklorometan 4,642
1055,10  cm -1 dan  877,6  cm -1 menunjukkan adanya gugus sikloalkana.
Analisis  data  spektrum 13 C  NMR  (126 MHz,  CDCl 3 )  senyawa  isolat  memperlihatkan beberapa  sinyal  karbon.  Adapun  geseran  kimia,  C (ppm)  sinyal-sinyal  karbon  senyawa  isolat. Geseran kimia khas yang terdapat pada senyawa A terdiri atas 1 sinyal C sp 3 gugus turunan yang mengikat  O  yaitu  oksikarbon  (C-O)  ditunjukkan pada  pergeseran  kimia    δ  71,8  (C-3).  Sinyal dengan  pergeseran  kimia  antara  90-160  ppm menunjukkan  gugus  alkena  yaitu  pada  sinyal δ 140,7 (C-5), δ 121,7 (C-6), δ 138,3 (C-22) dan δ  129,2  (C-23).  Selanjutnya  nilai  geseran  kimia antara 10-50 ppm yaitu δ 12,2 (C-18) dan δ 18,9 (C-19)  menunjukkan  C sp 3 alkil  yang  tidak mengikat O.
Analisis data spektrum 1 H NMR (500 MHz, CDCl 3 ) senyawa isolat memperlihatkan beberapa sinyal  khas.    Adapun  geseran  kimia,  C (ppm) sinyal  khas 1 H  NMR  senyawa  isolat,  dimana beberapa  sinyal  khas 1 H  NMR  pada  senyawa isolat diantaranya terdapat 1 sinyal proton δ 5,36 (2H,  d, J  = 5,1  Hz,  H6)  yang  mengindikasikan sinyal  proton  yang  terikat  pada  gugus  olefin kuartener  (C=C).  Kemudian  sinyal  δ  5,  03  (1H, dd, J = 15,1 8,5 Hz, H22)  dan δ 5,16 (1H, dd, J =  15,1,  H23)  ppm  yang  mengindikasikan  2 proton  yang  terikat  pada  sistem  olefin  (C=C) pada posisi geometri trans. Sinyal δ 3,53 (2H, tt, J  =  10,4,  4,6  Hz,  H3)  menunjukkan  adanya proton  yang  terikat  pada  gugus  oksikarbon (-OCH).  Selanjutnya  sinyal  berada  pada  posisi antara  0,7-1,0  ppm  menunjukkan  adanya  gugus
metil  yang  juga  terdapat  pada  senyawa  yaitu δ 1,02 (9H, s, H18), δ 0,70 (6H, d, J =  9,2  Hz, H19) dan δ 0,93 (3H, d, J = 6,7 Hz, H21) ppm.
Berdasarkan  hasil  analisis 13 C  NMR  dan 1 H NMR yang diperkuat dengan data spektroskopi  FTIR,  uji  golongan  dan  uji  titik leleh  maka  dapat  disimpulkan  bahwa  senyawa isolat yang telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari Ageratum conyzoides L. fraksi n-heksan adalah senyawa stigmasterol.

## Pengujian Toksisitas dan bioativitas antikanker
Senyawa stigmasterol yang berhasil diisolasi  dari  fraksi  n-heksan  tumbuhan  akar Ageratum  conyzoides L.  selanjutnya  dilakukan pengujian  toksisitas  terhadap Artemia  salina
Leach.  Berdasarkan  hasil  pengujian  toksisitas diperolah  LC 50 senyawa  stigmasterol  yaitu sebesar  30,33  µg/mL.  Menurut  Meyer,  1982 suatu senyawa murni dinyatakan toksik jika nilai LC 50 <200  µg/mL.  Maka  dapat  disimpulkam bahwa  senyawa  stigmasterol  yang  berhasil diisolasi  memiliki  sifat  toksik  yang  berpotensi dikembangkan  sebagai  senyawa  antikanker, untuk  mengetahui  sifat  antikanker  dari  senyawa stigmasterol  maka  lakukan  pegujian  biokativitas antikanker  metode  MTT  terhadap  sel  kanker jenis sel murin Leukemia P-388.
Hasil  pengujian  bioaktivitas  antikanker senyawa  stigmasterol  dengan  menggunakan metode  MTT,  diperoleh  nilai  IC 50 senyawa stigmasterol  yaitu  sebesar  184,80  µg/mL.  Hasil data  IC 50 senyawa  stigmasterol  menunjukkan
Gambar 1. Hasil identifikasi spektrofotometer FTIR senyawa isolat
bahwa senyawa tersebut tidak memiliki bioaktivitas terhadap sel leukemia P-388.
Gambar 2. Stigmasterol
Menurut Suffness dan Pezzuto (1990), suatu senyawa murni dinyatakan memiliki bioaktivitas antikanker  terhadap  sel  leukemia  P-388  jika memiliki nilai IC 50 sebesar <4 µg/mL. Sehingga dapat  disimpulkan  senyawa  stigmasterol  yang berhasil  di  isolasi  tidak  memiliki  bioaktivitas sebagai antikanker terhadap sel kanker leukemia P-388.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian terhadap fraksi nonpolar  n-heksan  dan  diklorometan  akar tumbuhan Ageratum conyzoides L. pada pengujian  toksisitas  terhadap Artemia  salina Leach  diperoleh  fraksi  tersebut  bersifat  toksik dengan  nilai  LC 50 berturut-turut  sebesar  0,0237 dan  4,642  µg/mL,  selanjutnya  dari  fraksi  n- heksan  berhasil  diisolasi    senyawa  stigmasterol golongan  steroid  berbentuk  kristal  jarum  putih dengan  bobot  sebesar  19,6  mg,  titik  leleh    143- 144  °C  dan  besifat  toksik  terhadap Artemia salina Leach  dengan  nilai  LC 50 sebesar  30,33 µg/mL  tetapi  tidak  memiliki  aktivitas  sebagai antikanker terhadap sel murin leukemia P-388.

## DAFTAR PUSTAKA
Carballo,  J.L.,  Hernandes-Inda,  Z.L.,  Perez, P.,  Garcia-Gravalos,  M.D.,  2002,  A
Comparison Between Two Brine Shrimp  Assays  to  Detect  in  Vitro Cytotoxicity in Marine Natural
Products, BMC  Biotech-nology ,  2(17),
1-5.
Kaur, S., Batish, D. R., Kohli, R. K.,  Singh, H.  P.,  2012, Ageratum  conyzoides:  an Alien  Invasive  Weed  in  India ,  CAB International, 57-76.
Kupchan, S. M., Stevens, K. L., Rohlfing, E. A., Sickless, B. R., Sneden, A. T., 1978, New  Cytotoxic  Neolignans  From Aniba megaphylia Mez , J. Org. Chem ,
43(4):586-590. Meyer, B. N., Ferrigni, N. R., Putnam, J. E., Jacobsen,  L.  B.,  Nichols,  D.  E.,  dan McLaughlin,  J.  L.,  Brine  Shrimp:  A Convenient General Bioassay For Active  Plant  Constituents, Journal  Of Medicinal Plant Research, 45:33-34. Nasrin,  F.,  2013,  Antioxidant  and  Citotoxic
Activities Of Ageratum conyzoids Stems, International Current Pharmaceutical Journal, 2(2):33-37. Rahim,  A.,  Gemini,  A.,  Agustina,  R., Rusydi,  M.,  2012,  Skrining  Toksisitas Ekstrak  Herba  Bandotan  ( Ageratum conyzoides  L) dengan  Metode Brine Shrimp Lethality Test , Majalah Farmasi dan Farmakologi, 16(2):99-106.
Singh, S. B., Devi, W. R., Marina, A., Devi, I.,  Swapana,  N.,  Sing,  C.  B.,  2013, Ethnobotany,
Phytochemistry and Pharmacology  Of Ageratum  conyzoides Linn (Asteraceae), Journal Of Medicinal Plants Research, 7(8):371-385. Suffness,  M.,  Pezzuto,  J.  M.,  1990, Assays Related  to  Cancer  Drug  Discovery Hostettmann  K(Ed).  Mtode  In  Plant Biochemistry.  Assays  for  Bioactivity, London.
Tambaru,  E.,  2017a,  Keragaman  Jenis Tumbuhan Obat Indigenous di Sulawesi Selatan, Jurnal Ilmu Alam dan Lingkungan , 8(15), 7-13.