# Korespondensi:  Balai  Riset  Budidaya  Ikan  Hias.
Jl.  Perikanan  No.  13,  Pancoran  Mas,  Depok  16346,  Indonesia. Tel.  +  62  21  7520482 E-mail:  enikusrini1309@gmail.com
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## PEMBERIAN VAKSIN DNA  ANTI-KHV IKAN MAS DENGAN  DOSIS BERBEDA TERHADAP  BENIH  IKAN  KOI
Eni Kusrini *)# ,  Sri  Nuryati **) ,  Siti  Zubaidah **) ,  dan  Lili  Sholihah *)
*) Balai Riset Budidaya Ikan Hias Jl. Perikanan No. 13, Pancoran Mas, Depok 16346
**) Institut Pertanian Bogor Jl. Raya Dramaga, Babakan, Dramaga, Babakan,  Kec.  Dramaga, Bogor, Jawa  Barat 16680
(Naskah diterima: 4 April 2019; Revisi final: 6 Agustus 2019; Disetujui publikasi: 6 Agustus 2019)

## ABSTRAK
Salah satu upaya penanggulangan wabah koi herpes virus (KHV) yang biasa menyerang ikan koi dan ikan mas adalah dengan pemberian vaksin DNA. Vaksin DNA dapat merangsang kekebalan spesifik dan kekebalan yang  ditimbulkan relatif  tinggi,  serta  aman digunakan.  Penelitian  ini  bertujuan menguji  beberapa  dosis vaksin DNA terhadap benih ikan koi sehingga didapatkan dosis yang tepat yang dapat memberikan RPS (relative  percent  survival)  dan  imunitas  terbaik.  Perlakuan  yang  diberikan  adalah  vaksinasi  dengan  dosis berbeda melalui teknik injeksi secara intra muskular, yaitu perlakuan A (7,5 µg/100 µL), B (10 µg/100 µL), C (12,5 µg/100 µL), serta kontrol positif (ikan tidak divaksinasi tetapi diuji tantang) dan kontrol negatif (ikan tidak divaksinasi dan tidak diuji tantang). Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian vaksin dengan dosis berbeda mampu meningkatkan sintasan pada ikan koi, serta vaksin DNA dengan dosis 12,5 µg/100 µL mampu memberikan nilai sintasan ikan koi yang diinfeksi KHV sebesar 97,22% dan memberikan nilai RPS sebesar 95,83 ± 0,58%; serta memberikan gambaran sistem imun terbaik dibandingkan perlakuan lainnya.
KATA KUNCI: ikan koi; vaksin DNA; KHV; sintasan; dosis
ABSTRACT: Treatment of DNA vaccines anti_KHV goldfish with different dosage of koi fish seeds. By: Eni Kusrini, Sri Nuryati, Siti Zubaidah, and Lili Sholihah
One of the alternatives to deal with the koi herpesvirus (KHV) infections in koi fish and common carp is through the use of DNA vaccine. DNA vaccines can stimulate a high level of specific immune responses and induced immunity and are relatively safe to be used. This research was aimed to determine the effective dose of DNA vaccine for the best relative percent  survival  (RPS) and  immunity.  The  treatments consisted  of  different  vaccine doses  administered  through intramuscular injection: treatment A (7.5  g/100  L), B (10  g/100  L), C (12.5  g/100  L), and the positive control (non-vaccinated fish but challenged by KHV test) and negative control (non-vaccinated fish and not challenged by KHV test). The results showed that the administration of the vaccine with different doses had increased the survival of koi fish across all treatments (excluding positive and negative controls). Vaccine dose of 12.5  g/100  L was considered as the best vaccine dose.  The vaccine dose had produced the best survival value of 97.22% and resulted in the highest RPS values of 95.83 ± 0.58%. DNA vaccine is expected to be the future vaccine.
KEYWORDS: koi fish; DNA vaccines; KHV; survival rate; dose

## PENDAHULUAN
Ikan hias koi (Cyprinus carpio) merupakan salah satu jenis ikan hias air tawar yang memberikan sumbangan besar  bagi  devisa  negara  dari  sektor  industri perikanan. Budidaya ikan hias ini sudah berkembang
pesat di masyarakat, bahkan di beberapa daerah telah menjadi sentra produksi ikan hias koi. Namun, dalam perkembangannya budidaya ikan hias koi tidak luput dari kendala produksi yang disebabkan oleh serangan penyakit.  Salah  satu  wabah  yang  dapat  merugikan pembudidaya  bahkan  sampai  gulung  tikar  adalah serangan KHV (koi herpes virus). Wabah penyakit KHV menyerang  ikan  mas  dan  ikan  hias  koi  sejak  awal tahun  2002,  sebagai  salah  satu  penyebab  adalah masuknya ikan koi impor pembawa virus KHV. Wabah
KHV tersebut menyebar ke  seluruh sentra budidaya ikan  mas  dan  ikan  koi,  dan  menyebabkan  kerugian ekonomi  yang  sangat  besar.  Akibatnya,  aktivitas perdagangan ikan hidup dari satu daerah ke daerah lain terganggu.
Koi  herpes  virus  (KHV)  ini  dapat  menyebabkan gagal  panen  atau  panen  dini.  Puluhan  atau  bahkan ratusan kasus kematian ikan mas dan koi akibat infeksi KHV  tersebut  hingga  saat  ini  sangat  meresahkan pembudidaya  kedua  jenis  ikan  tersebut,  termasuk pelaku  usaha  lainnya.  Infeksi  KHV  terjadi  pada  saat musim hujan atau pada saat suhu rendah yang berkisar 17°C-24°C. Penyakit ini sangatlah menular, menyerang semua stadia ikan, dan bersifat ganas sehingga dapat menyebabkan  kematian  massal  sekitar  80%-100%. Menurut Hedrick  et  al.  (2005), infeksi  KHV  ditandai dengan  ciri  eksternal,  yaitu  pembengkakan  dan nekrosis pada filamen insang, produksi lendir berlebih ataupun  perubahan  warna  kulit,  sedangkan  ciri internalnya  adalah  terjadinya  pembengkakan  pada limpa dan ginjal. Selain itu, biasanya diikuti oleh infeksi sekunder berupa luka atau bercak putih di permukaan tubuh yang disebabkan oleh Aeromonas hydrophila dan/ atau Flexibacter columnaris (Mudjiutami et al., 2009). Berbagai upaya telah dilakukan untuk menanggulangi penyakit tersebut, di antaranya adalah pembentukan posko penanggulangan wabah, sarasehan, pelatihan daerah  terinfeksi  dengan  Surat  Keputusan  Menteri Departemen Kelautan dan Perikanan Nomor 28 dan 40 tahun 2002, serta vaksinasi.
Vaksinasi  yang  pernah  dilakukan  untuk menanggulangi penyakit KHV adalah vaksin komersial yang  berasal  dari  virus  yang  dilemahkan  dan  telah diproduksi oleh  pabrikan. Namun,  vaksin komersial ini  memiliki  beberapa  kelemahan  selain  harga  yang mahal, harus ekspor dari Israel, aplikasinya pada suhu dingin,  dan  sekarang  statusnya  sudah  tidak  ada  di pasaran. Penemuan vaksin DNA yang diisolasi dari DNA anti virus KHV ikan mas telah berhasil diaplikasikan pada ikan mas (Nuryati et al., 2010b).
Pada penelitian ini digunakan vaksin yang dibuat dari DNA anti virus KHV pada ikan hias koi. DNA vaksin tersebut  diharapkan  dapat  efektif  dalam  mencegah serangan penyakit KHV yang setiap tahun selalu muncul terhadap ikan koi. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan  terhadap  ikan  mas  di  Balai  Besar Pengembangan  Budidaya  Air  Tawar  (BBPBAT) Sukabumi,  dengan  penggunaan  vaksin  10 -3 dapat meningkatkan  sintasan  ikan  sebesar  73,33%  lebih tinggi  dibandingkan  perlakuan  lainnya  (Laelawati, 2008).  Penelitian  lainnya  yang  dilakukan  di  Institut Pertanian  Bogor  (IPB)  telah  membuktikan  bahwa vaksinasi  tiga  kali  seminggu  memberikan kelangsungan hidup relatif 84,6% (Nuryati, 2015).
Vaksin  DNA  merupakan  salah  satu  metode pencegahan penyakit melalui vaksinasi dengan prinsip kerja meningkatkan  sistem kekebalan  spesifik pada inang. Vaksin DNA diperkirakan menjadi vaksin masa depan  karena  memiliki  beberapa  keunggulan,  yaitu mudah  dikembangkan  dan  diproduksi,  tidak menimbulkan  infeksi,  bersifat  stabil  sehingga memudahkan  dalam  penyimpanan  dan  mampu mengaktivasi sistem kekebalan  tubuh baik humoral maupun  seluler  (Lorenzen  &  Lapatra,  2005; Nuswantoro et al., 2012). Vaksin DNA cukup efektif mencegah penyakit viral haemorrhagic septicaemia vi- rus  (VHSV)  pada  ikan  salmon  (Lorenzen  &  Lapatra, 2005) dan KHV pada ikan mas dan koi (Nuryati et al., 2010b; Zhou et al., 2014a; Zhou et al., 2014b) sehingga dapat menghasilkan tingkat kelangsungan hidup yang tinggi.
Penelitian  ini  bertujuan  menguji  beberapa  dosis vaksin  DNA  terhadap  benih  ikan  koi  sehingga didapatkan dosis yang tepat yang dapat memberikan RPS dan imunitas terbaik.

## BAHAN DAN METODE

## Kultur  Bakteri  Pembawa  Vaksin
Bakteri Escherichia coli pembawa vaksin DNA yang diisolasi  dari  DNA  ikan  mas  (Nuryati  et  al.,  2010b; Zhou et al., 2014a; Zhou et al., 2014b) yang disimpan dalam gliserol pada suhu (-80°C) diambil menggunakan tusuk gigi steril dan digoreskan kuadran pada media m  LB  polipepton  +  ampisilin  untuk  mendapatkan koloni tunggal. Sel bakteri diinkubasi pada suhu 37°C selama 16 jam, lalu disimpan pada suhu 4°C hingga akan digunakan. Untuk perbanyakan plasmid, bakteri dikultur di media cair menggunakan shaker incubator dengan  kecepatan  240  rpm  selama  16-18  jam  dan selanjutnya dipanen.
Pemanenan bakteri dan pelleting bakteri bertujuan untuk memisahkan sel bakteri dengan media kultur. Sebanyak 20 mL bakteri hasil kultur dituangkan secara parsial ke dalam masing-masing microtube bervolume 1,5 mL; lalu disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm dan suhu 4°C selama 30 detik. Hasil pelleting bakteri dicuci dengan 1 mL PBS (phospate buffer saline) sebanyak tiga kali. Setelah dicuci dengan PBS, bakteri dimatikan dengan perlakuan panas pada suhu 80°C selama lima menit dan diresuspensi kembali dengan PBS sebanyak 1  mL  kemudian  diisolasi  plasmidnya  (Nuryati  et  al., 2010b).

## Vaksinasi  dan  Uji  Tantang
Ikan  uji  yang  digunakan  adalah  benih  koi  hasil produksi  di  Balai  Riset  Budidaya  Ikan  Hias  (BRBIH) Depok yang memiliki bobot rata-rata 16,98 ± 0,20 g
dengan panjang rata-rata 12,62 ± 0,71 cm sebanyak 240 ekor yang ditebar ke dalam 15 akuarium berukuran 45  cm  x  40  cm  x  40  cm,  sehingga  masing-masing akuarium  diisi  15  ekor  ikan  uji.  Ulangan  yang digunakan untuk masing-masing perlakuan sebanyak empat  ulangan,  tiga  ulangan  digunakan  untuk pengamatan sintasan dan RPS, sedangan satu ulangan (ulangan  keempat)  digunakan  untuk  pengamatan gambaran  darah.  Kemudian  vaksin  yang  digunakan adalah vaksin DNA anti-KHV hasil temuan Nuryati et al.  (2010b;  2013).  Sebelum  divaksin  benih  ikan  koi diadaptasikan  terlebih  dahulu  terhadap  kondisi lingkungan selama satu bulan, kemudian vaksin DNA diambil  dengan  syring  dan  diinjeksikan  ke  ikan sebanyak 0,1 mL dengan frekuensi satu kali.
Adapun rancangan perlakuan  pada penelitian ini adalah sebagai berikut:
Perlakuan A: ikan  diberi  vaksin  DNA  secara  intra muskular  dengan  dosis  7,5  µg/100  µL sebanyak  satu  kali  dan  diuji  tantang dengan filtrat KHV
Perlakuan B: ikan  diberi  vaksin  DNA  secara  intra muskular  dengan  dosis  10  µg/100  µL sebanyak  satu  kali  dan  diuji  tantang dengan filtrat KHV
Perlakuan C: ikan  diberi  vaksin  DNA  secara  intra muskular dengan dosis 12,5 µg/100 µL sebanyak  satu  kali  dan  diuji  tantang dengan filtrat KHV
Kontrol  positif  (K+):  ikan  tanpa  diberi  vaksin  DNA dan diuji tantang dengan filtrat KHV Kontrol negatif (K-): ikan tanpa diberi vaksin DNA dan tidak diuji tantang dengan filtrat KHV
Setelah ikan dipelihara selama 28 hari, perlakuan A, B, C, dan kontrol positif diuji tantang. Uji tantang dilakukan dengan menginjeksi virus aktif sebanyak 0,1 mL secara intra muskular (otot punggung) ke semua ikan uji (Nuryati et al., 2010a). Masa uji tantang untuk melihat gejala klinis dan kelangsungan hidup ikan yang diberi vaksin DNA dilakukan selama 28 hari.

## Parameter  Penelitian

## Sintasan
Penghitungan jumlah ikan yang mati dilakukan pada awal terinfeksi KHV sampai akhir penelitian.

## Sintasan  relatif  (Relative  Percent  Survival/RPS)
Kematian  ikan  dicatat  sebelum  dan  sesudah  uji tantang untuk menghitung kelangsungan hidup relatif (RPS).

## HASIL DAN BAHASAN

## Sintasan  dan  Relative  Percent  Survival  (RPS)
Sintasan  pada  penelitian  ini  diamati  pada  akhir pengamatan yaitu pada saat pasca uji tantang. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1 dan Tabel 1, penggunaan vaksin DNA dengan dosis 7,5 µg/100 µL; 10 µg/100 µL;  dan  12,5  µg/100  µL  pada  benih  ikan  koi menunjukkan nilai sintasan yang tidak berbeda nyata (P>0,05), yaitu sebesar 97,22 ± 0,58% dan RPS 95,83 ± 0,58% yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol positif (33,33 ± 2,0).

## Gejala  Klinis
Pengamatan gejala klinis dilakukan selama masa uji tantang, yaitu selama 28 hari. Pengamatan dilakukan setiap  dua  kali  sehari  pada  saat  pemberian  pakan, namun  pada  saat  puncak  infeksi  (minggu  ke-3) pengamatan dilakukan lebih sering karena khawatir terjadi kematian yang tidak terkontrol. Berdasarkan pengamatan tersebut, terlihat bahwa ikan yang sakit mengalami penurunan nafsu makan, kelainan tingkah laku  dan  perubahan  fisik  pada  tubuhnya.  Adapun gambaran gejala klinis secara visual dari tiap perlakuan disajikan pada Gambar 2.
Pada Gambar 2, terlihat beberapa gejala klinis yang muncul  setelah  ikan  koi  diuji  tantang.  Gejala  klinis yang muncul antara lain: nekrosis pada insang, ulcer pada dorsal, mata cekung, dan insang pucat. Semua gejala klinis  yang muncul  diduga merupakan  akibat serangan virus KHV. Selain itu pula, tersaji dalam Tabel 2 yang memperlihatkan perubahan tingkah laku ikan selama masa uji tantang. Hal tersebut di atas diperkuat dengan  hasil  uji  PCR  yang  dilakukan  pada  ikan  uji sebelumnya  yang  digunakan  sebagai  donor perbanyakan virus (Gambar 3).

## Gambaran  Darah

## Total  eritrosit
Nilai  gambaran  darah diamati  sebanyak  tiga  kali (masa  aklimatisasi,  vaksinasi,  dan  uji  tantang),  nilai total eritrosit setiap perlakuan disajikan pada Gambar 4. Pengamatan terhadap jumlah total rata-rata eritrosit dalam darah ikan koi pada perlakuan yang berbeda, menunjukkan  bahwa  nilai  tertinggi  terdapat  pada perlakuan C (9,03 ± 0,6 x 10 5 sel/mm 3 ) pada masa uji tantang. Nilai terendah diperoleh pada perlakuan K(+) yaitu  2,14  ±  0,46  x  10 5 sel/mm 3 pada  masa aklimatisasi.

## Total  leukosit
Pengamatan  terhadap  jumlah  total  rata-rata leukosit  (Gambar  5)  dalam  darah  ikan  koi  pada
  100 x mortality control % mortality treatment % 1 RPS  
perlakuan  yang  berbeda,  menunjukkan  bahwa  nilai tertinggi terdapat pada perlakuan C yaitu 63,27 ± 0,25 x  10 4 sel/mm 3 pada  masa  vaksinasi.  Nilai  terendah terdapat pada K(-) yaitu 13,3 ± 2,96 x 10 4 sel/mm 3 ; pada  aklimatisasi.  Dari  analisis  statistik  ragam (ANOVA) dan uji lanjut Tukey (P<0,05) diperoleh hasil pada  masa  uji  tantang  nilai  perlakuan  K(+)  dan  A berbeda nyata (P<0,05) dengan pelakuan K(-), B, dan C yakni jumlah total leukosit lebih rendah dari ketiga perlakuan.

## Kadar  Hematokrit
Pengamatan terhadap nilai hematokrit (Gambar 6) dalam darah ikan koi pada perlakuan yang berbeda, menunjukkan  nilai yang  berfluktuasi. Nilai  tertinggi terdapat pada perlakuan K(-) yaitu 35,97 ± 0,54% pada masa uji tantang. Nilai terendah yaitu 19,9 ± 1,27% pada perlakuan K(+) pada masa aklimatisasi.

## Kadar  Haemoglobin
Pengamatan  terhadap  nilai  haemoglobin  dalam darah ikan koi pada perlakuan yang berbeda (Gambar
Keterangan: * Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05) ** A (vaksin DNA dosis 7,5 µg/100 µL), B (vaksin DNA dosis 10 µg/100 µL), C (vaksin DNA dosis 12,5 µg/100 µL), K+ (ikan tidak divaksin tetapi diuji tantang), K- (ikan tidak divaksin dan tidak diuji tantang)
Description: * Different  letters  show  significantly  different  results  (P<0.05) ** A (DNA vaccine dose 7.5 µg/100 µL), B (DNA vaccine dose 10 µg/100 µL), C (DNA vaccine 12.5 mg/100 µL), K+ (fish not vaccinated but  KHV  challenged),  K-  (fish  not  vaccinated  and  not  KHV  challenged)
Gambar 1. Nilai  sintasan  ikan  koi  sebelum  dan  sesudah  uji  tantang dengan KHV. Figure 1. The survival  value of koi fish  before and after the  KHV Chal- lenge test Keterangan: Huruf superskrip di belakang nilai standar deviasi yang berbeda pada setiap kolom menunujukkan pengaruh yang berbeda nyata (P<0,05) Description: The  superscript  of  the  different  standard  deviation  values  shows  a  significantly  different effect (P<0.05))
Tabel 1. Sintasan  relatif  (RPS)  ikan  koi  yang  diberi  vaksin  DNA  anti-KHV  dengan dosis berbeda (N=240) Table 1. Relative percentage of survival rate of koi fish treated with different doses of anti-
KHV DNA vaccine
Before of chalange test  After of chalange test 150.00 100.00 50.00 0.00 Si n ta sa n
Su rv iv al r at e (% ) k+                 k-                   A                    B                   C 33.33 100.00
97.22 97.22 97.22
Sebelum uji tantang Before challenge test Pasca uji tantang After challenge test Perlakuan Treatments Mortalitas
Mortality  (%) RPS (%) A (dosis 7,5 µg/100 mL) / A (7.5 µg/100 mL ) 2.78 ± 0.58 95.83 ± 0.58 a B (dosis 10 µg/100 mL) / B (10 µg/100 mL) 2.78 ± 0.58 95.83 ± 0.58 a C (dosis 12,5 µg/100 mL) / C (12.5 µg/100 mL ) 2.78 ± 0.58 95.83 ± 0.58 a K+ (kontrol positif/positive control ) 66.67 ± 2.0 0 K- (kontrol negatif/negative control ) 0 100
Gambar 2. Gejala  klinis  ikan  koi  yang  terserang  KHV;  a)  insang  nekrosis  dan  geripis,
b) ulcer di bagian dorsal, c) mata cekung, dan d) insang pucat.
Figure 2. Clinical symptoms of koi infected  by KHV; a) necrotic and flaky gills, b) dorsal ulcer,
c) sunken eyes, and d) pale gills
Tabel 2. Gejala klinis harian tiap perlakuan pasca uji tantang
Table 2. Daily clinical symptoms of each post-test treatment challenge
d c a b Perlakuan Treatments Gejala klinis Clinical symptoms
A Memasuki minggu ke-2 nafsu makan mulai berkurang, dan hari ke-19 banyak pakan yang tak termakan
Entering the 2 nd week, appetite began decreasing, and the 19 th day, a lot of feed that was not consumed
B
Hari ke-11 permukaan akuarium berbusa dan nafsu makan berkurang, hari ke-12 ikan menyendiri di tepian, hari ke-25 ikan berenang di permukaan dan lambat The 11 th day, the surface of the aquarium was foaming and appetite reduced, the 12 th day, the fish swam alone on the aquarium side, the 25 th day the fish swam on the surface and slow
C
Hari ke-11 permukaan akuarium berbusa dan nafsu makan berkurang The 11 th day, the surface of the aquarium was foaming and appetite reduced K(+) Memasuki minggu ke-2 ikan mulai lemah, insang mulai berwarna pucat, hari ke-11 permukaan akuarium berbusa dan nafsu makan berkurang, hari ke-15 pergerakan melambat, hari ke-17 ikan banyak menyendiri, minggu ke-3 dan ke-4 mulai banyak terjadi kematian
Entering the 2 nd week, the fish started to weaken, the gills began turning pale, the 11 th day the surface of the aquarium was foaming and appetite reduced, the 15th day the movement of fish slowed down, the 17 th day the fish swam alone and, the 3 rd and 4 th weeks,
mortality started to occur
K(-) Hari ke-13 ikan sering menyendiri di pojok akuarium, hari ke-16 ikan banyak menyendiri di dasar akuarium
Day 13 th fish often swam alone in the corner of the aquarium, the 16 th day many fish were alone in the bottom of the aquarium
7), menunjukkan bahwa nilai tertinggi terdapat pada perlakuan C yaitu 9,65 ± 0,49% pada masa uji tantang. Nilai terendah terdapat pada perlakuan K(+) yaitu 4,9 ±  0,14%  pada  masa  aklimatisasi.  Hasil  masa  uji tantang  perlakuan  K(+)  berbeda  nyata  dengan pelakuan  K(-),  A,  dan  B,  serta  perlakuan  C  berbeda nyata dengan keempat perlakuan lainnya.

## Indeks  Fagositik
Pengamatan terhadap nilai indeks fagositik dalam darah  ikan  koi  pada  perlakuan  yang  berbeda, menunjukkan  nilai yang  berfluktuasi. Nilai  tertinggi terdapat pada perlakuan C yaitu 41,5 ± 0,7% pada masa uji tantang (Gambar 8). Nilai terendah juga terdapat perlakuan C yaitu 19,5 ± 9,1%; pada masa aklimatisasi.
Keterangan: M: marker, K-: kontrol negatif, O: sampel 1 (otak), K+: kontrol positif, I: sampel- 2 (insang). Amplifikasi DNA KHV dengan menggunakan primer sphl 5. F: 5’GAC ACC ACA TAT GCA AGG AG -3, R: 5’GAC ACA TGT TAC AAT GGT CGC-3, @Ziqma.
Description: M: marker, K-: negative control, O: sample 1 (brain), K+: positive control, I: sample-2 (gills). Amplification of KHV DNA using sphl 5 primer. F: 5’GAC ACC ACA TAT GCA AGG AG -3, R: 5’GAC ACA TGT TAC AAT GGT CGC-3, bermerk @Ziqma.
Gambar 3. Hasil uji PCR ikan koi yang terinfeksi KHV.
Figure 3. Test results of koi fish infected with KHV. 400 bp M                      K-                          O                    K+                    I 400 bp
Keterangan: * Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05) ** A (vaksin DNA dosis 7,5 µg/100 µL), B (vaksin DNA dosis 10 µg/100 µL), C (vaksin DNA dosis 12,5 µg/100 µL), K+ (ikan tidak divaksin tetapi diuji tantang), K- (ikan tidak divaksin dan tidak diuji tantang)
Description: * The  letter  on  the  different  bar  values  showed  a  significantly  different  effect  (P<0.05)
** A (DNA vaccine dose 7.5 µg/100 µL), B (DNA vaccine dose 10 µg/100 µL), C (DNA vaccine dose  12.5 µg/100 µL ),  K  + (fish  not vaccinated  but  tested  challenged),  K- (fish   were  not  vaccinated  and  not  challenged)
Gambar 4. Jumlah eritosit dalam darah ikan koi dengan perlakuan vaksin yang berbeda.
Figure 4.
Total of erythrocytes in the blood of koi fish with different vaccine treatments.
a 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 2.20 3.66 2.82 9.03 4.36
K+                     K-                        A                        B                       C
Aklimatisasi Acclimatization Vaksinasi Vaccination
Uji tantang Challenge  test Ju m la h s e l d ara h m er ah R ed b lo od c el l co un t (x 1 0 5 se l/m m 3 )
Masa uji tantang K(+) dan perlakuan B berbeda nyata dengan perlakuan K(-) dan A, sedangkan perlakuan C pada masa uji tantang berbeda nyata dengan keempat perlakuan lainnya.

## Diferensial  Leukosit

## Persentase  monosit
Pengamatan terhadap persentase jumlah monosit dalam  darah  ikan  koi,  menunjukkan  bahwa  nilai
Gambar 5. Jumlah leukosit dalam darah ikan koi dengan perlakuan vaksin yang berbeda. Figure 5. Total of leukocytes on the blood of koi fish with different vaccine treatments.
Keterangan: * Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05)
** A (vaksin DNA dosis 7,5 µg/100 µL), B (vaksin DNA dosis 10 µg/100 µL), C (vaksin DNA dosis 12,5 µg/100 µL), K+ (ikan tidak divaksin tetapi diuji tantang), K- (ikan tidak divaksin dan tidak diuji tantang)
Description: * The  superscript  of  the  different  standard  deviation  values  on  showed  a  significantly different effect (P<0.05) ** A (DNA vaccine dose 7.5 µg/100 µL), B (DNA vaccine dose 10 µg/100 µL), C (DNA vaccine dose  12.5 µg/100  µL), K+  (fish not  vaccinated but  tested challenged),  K- (fish not  vaccinated  and  not  challenged)
K+                        K-                         A                          B                          C Aklimatisasi Acclimatization Vaksinasi Vaccination
Uji tantang Challenge  test 70 60 50 40 30 20 10 0 Ju m la h s e l d ara h p u ti h N um be r of c el ls wh it e bl oo d (x 1 0 4 se l/m m 3 ) 97.22 51.215 18.525 41.31 43.185
Keterangan: * Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05) ** A (vaksin DNA dosis 7,5 µg/100 µL), B (vaksin DNA dosis 10 µg/100 µL), C (vaksin
DNA dosis 12,5 µg/100 µL), K+ (ikan tidak divaksin tetapi diuji tantang), K- (ikan tidak divaksin dan tidak diuji tantang)
Description: * The  superscript  of  the  different  standard  deviation  values  on  showed  a  significantly different effect (P<0.05) ** A (DNA vaccine dose 7.5 µg/100 µL), B (DNA vaccine dose 10 µg/100 µL), C (DNA vaccine dose  12.5 µg/100  µL), K+  (fish not  vaccinated but  tested challenged),  K- (fish not  vaccinated  and  not  challenged)
Gambar 6. Kadar hematokrit dalam darah ikan koi pada perlakuan yang berbeda. Figure 6. Hematocrit levels on the blood of koi fish in different treatments.
40 30 20 10 0 H em at o k ri t H em at oc ri t (% )
Aklimatisasi Acclimatization
Vaksinasi Vaccination
Uji tantang Challenge  test 35.975
28.185
27.095 27.84 35.095
K+                        K-                         A                          B                          C
tertinggi terdapat pada perlakuan K(-) yaitu 6 ± 0% dan nilai terendah terdapat pada perlakuan C yaitu 2,5 ± 0,7% pada masa uji tantang (Gambar 9)dan semua perlakuan tidak berbeda nyata.

## Persentase  limfosit
Pengamatan terhadap persentase jumlah limfosit dalam  darah  ikan  koi,  menunjukkan  bahwa  nilai tertinggi terdapat pada perlakuan C yaitu 92,5 ± 3,5%; sedangkan nilai terendah diperoleh perlakuan K(-) yaitu
Keterangan: * Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05)
** A (vaksin DNA dosis 7,5 µg/100 µL), B (vaksin DNA dosis 10 µg/100 µL), C (vaksin DNA dosis 12,5 µg/100 µL), K+ (ikan tidak divaksin tetapi diuji tantang), K- (ikan tidak divaksin dan tidak diuji tantang)
Description: * The  superscript  of  the  different  standard  deviation  values  on  showed  a  significantly different effect (P<0.05)
** A (DNA vaccine dose 7.5 µg/100 µL), B (DNA vaccine dose 10 µg/100 µL), C (DNA vaccine dose  12.5 µg/100  µL), K+  (fish not  vaccinated but  tested challenged),  K- (fish not  vaccinated  and  not  challenged)
Keterangan: * Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05)
** A (vaksin DNA dosis 7,5 µg/100 µL), B (vaksin DNA dosis 10 µg/100 µL ), C (vaksin DNA dosis 12,5 µg/100 µL ), K+ (ikan tidak divaksin tetapi diuji tantang), K- (ikan tidak divaksin dan tidak diuji tantang)
Description: * The  superscript  of  the  different  standard  deviation  values  on  showed  a  significantly different effect (P<0.05) ** A (DNA vaccine dose 7.5 µg/100 µL), B (DNA vaccine dose 10 µg/100 µL), C (DNA vaccine  dose  12.5  µg/100  µL),  K+  (fish  were  not  vaccinated  but  tested  challenged), K-  (fish  were  not  vaccinated  and  challenged)
a H ae m o g lo b in H em og lo bi n (% ) 12 10 8 6 4 2 0
K+                       K-                        A                         B                          C Aklimatisasi Acclimatization Vaksinasi Vaccination Uji tantang Challenge  test
8.5 7.15 8.5 9.2 9.65
Gambar 7. Kadar haemoglobin dalam darah ikan koi pada perlakuan yang berbeda. Figure 7. The levels of hemoglobin on the blood of koi fish in different treatments.
24.5 3 4 34.5
23.5
41.5
K+                       K-                         A                         B                         C
Aklimatisasi Acclimatization Vaksinasi Vaccination
Uji tantang Challenge  test 70 60 50 40 30 20 10 0 In d e ks fa g o si ti k
Ph ag oc yt ic i nd ex ( % )
Gambar 8. Nilai indeks fagositik dalam darah ikan koi pada perlakuan yang berbeda. Figure 8. Phagocytic index values on the blood of koi fish in different treatments.
Keterangan: * Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05) ** A (vaksin DNA dosis 7,5 µg/100 µL), B (vaksin DNA dosis 10 µg/100 µL), C (vaksin DNA dosis 12,5 µg/100 µL), K+ (ikan tidak divaksin tetapi diuji tantang), K- (ikan tidak divaksin dan tidak diuji tantang)
Description: * The  superscript  of  the  different  standard  deviation  values  on  shows  a  significantly different effect (P<0.05)
** A (DNA vaccine dose 7.5 µg/100 µL), B (DNA vaccine dose 10 µg/100 µL), C (DNA vaccine dose 12.5 µg/100 µL), K+ (fish were not vaccinated but tested challenged), K- (fish were not vaccinated and challenged)
Gambar 9. Jumlah monosit dalam darah ikan koi dengan perlakuan vaksin yang berbeda. Figure 9.
Total of monocytes on the blood of koi fish with different vaccine treatments.
K+                       K-                         A                         B                         C
Aklimatisasi Acclimatization Vaksinasi Vaccination Uji tantang Challenge  test 8 7 6 5 4 3 2 1 0 M o n o si t
M on oc yt es (% )
Keterangan: * Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05) ** A (vaksin DNA dosis 7,5 µg/100 µL), B (vaksin DNA dosis 10 µg/100 µL), C (vaksin DNA dosis 12,5 µg/100 µL), K+ (ikan tidak divaksin tetapi diuji tantang), K- (ikan tidak divaksin dan tidak diuji tantang)
Description: * The  superscript  of  the  different  standard  deviation  values  on  shows  a  significantly different effect (P<0.05)
** A (DNA vaccine dose 7.5 µg/100 µL), B (DNA vaccine dose 10 µg/100 µL), C (DNA vaccine  dose  12.5  µg/100  µL),  K+  (fish  were  not  vaccinated  but  tested  challenged),
K-  (fish  were  not  vaccinated  and  challenged)
Gambar 10. Jumlah limfosit dalam darah ikan koi dengan perlakuan vaksin yang bebeda.
Figure 10. Total of lymphocytes on the blood of koi fish with different vaccine treatments.
100 95 90 85 80 75 70
K+                       K-                          A                         B                         C Aklimatisasi Acclimatization Vaksinasi Vaccination
Uji tantang Challenge  test 8 6 82.5 8 8 89.5 92.5 Li m fo si t Ly m ph oc yt es ( % )
82,5 ± 0% pada masa uji tantang (Gambar 10). Hasil pada masa uji tantang nilai persentase limfosit semua perlakuan tidak berbeda nyata.

## Persentase  neutrofil
Pengamatan terhadap persentase jumlah neutrofil dalam  darah  ikan  koi,  menunjukkan  bahwa  nilai tertinggi terdapat pada perlakuan K(-) dan C yaitu 12,5 ±  0,7%  pada  masa  aklimatisasi  dan  vaksinasi, sedangkan nilai terendah diperoleh perlakuan K(-) yaitu sebesar 11,5 ± 0,7% pada masa uji tantang (Gambar 11).  Hasil  pada  masa  uji  tantang  nilai  persentase neutrofil  perlakuan K(+),  K(-),  dan  A berbeda  nyata dengan perlakuan B dan C.

## Histopatologi
Parameter histopatologi yang merupakan cabang biologi yang mempelajari kondisi dan fungsi jaringan dalam  hubungannya  dengan  penyakit.  Penampang insang ikan yang terserang KHV tersaji pada Gambar 12.
Hasil gambaran organ uji histologi menunjukkan hasil yang berbeda tiap perlakuannya. Perbedaan yang paling  terlihat  muncul  pada  kontrol  positif  dengan kontrol negatif di mana terlihat kondisi lamela insang
pada  kontrol  positif  mengalami  hiperplasia  dan hipertropi.

## Kualitas  Air
Parameter kualitas air yang paling berpengaruh dan merupakan  faktor  pemicu  terhadap  serangan  KHV adalah suhu sehingga pengamatan terhadap parameter ini dilakukan setiap dua kali sehari, sedangkan untuk parameter lainnya diamati sebanyak tiga kali selama penelitian  berlangsung.  Data  kisaran  kualitas  air disajikan dalam Tabel 3.
Pengamatan  terhadap  nilai  kelangsungan  hidup benih ikan koi dilakukan mulai dari awal masa vaksinasi hingga akhir masa uji tantang. Selama masa vaksinasi kondisi  ikan  terlihat  baik  dan  memberikan  nilai kelangsungan hidup 100% untuk semua perlakuan, hal ini membuktikan bahwa pemberian vaksin DNA aman untuk ikan. Sedangkan untuk pengamatan selama masa uji tantang (28 hari) perlakuan A, B, dan C menunjukkan nilai kelangsungan hidup yang sama dan tidak berbeda nyata, yaitu sebesar 97,22% lebih tinggi dibandingkan kontrol positif yang hanya sebesar 33,33%. Selain nilai kelangsungan hidup diamati pula nilai RPS, yaitu nilai kelangsungan  hidup  ikan-ikan  yang  divaksin  yang dibandingkan dengan ikan kontrol positif. Nilai RPS
8 6
Keterangan: * Huruf yang berbeda menunjukkan hasil yang berbeda nyata (P<0,05)
** A (vaksin DNA dosis 7,5 µg/100 µL), B (vaksin DNA dosis 10 µg/100 µL), C (vaksin
DNA dosis 12,5 µg/100 µL), K+ (ikan tidak divaksin tetapi diuji tantang), K- (ikan tidak divaksin dan tidak diuji tantang)
Description: * The  superscript  of  the  different  standard  deviation  values  on  shows  a  significantly different effect (P<0.05)
** A (DNA vaccine dose 7.5 µg/100 µL), B (DNA vaccine dose 10 µg/100 µL), C (DNA vaccine dose 12.5 µg/100 µL), K+ (fish were not vaccinated but tested challenged), K- (fish were not vaccinated and challenged)
Gambar 11. Jumlah neutrofil dalam darah ikan koi dengan perlakuan vaksin yang berbeda. Figure 11. Total of neutrophils on the blood of koi fish with different vaccine treatments.
16 14 12 10 8 6 4 2 0 N eu tr op hi ls ( % )
N e u tr o fi l Aklimatisasi Acclimatization Vaksinasi Vaccination
Uji tantang Challenge  test K+                        K-                          A                          B                          C 1 0 11.5 9 7 5
untuk tiga perlakuan yang berbeda menunjukkan nilai yang tidak berbeda nyata, yaitu sebesar 95,83 ± 0,58%. Hal ini membuktikan bahwa penggunaan vaksin DNA dapat  meningkatkan  sistem  imun  ikan  sehingga memengaruhi  pula  daya  hidupnya.  Hal  ini  sesuai pendapat Naim (2004), yang menyatakan bahwa vaksin dapat  menginduksi  antibodi  yang  merupakan  agen terpenting dari proteksi imun terhadap kebanyakan virus dan bakteri.
Pengamatan terhadap gejala klinis sudah dilakukan dari awal penelitian (masa aklimatisasi) yang bertujuan untuk  memastikan  bahwa  ikan  uji  yang  digunakan sehat  dan  bebas  dari  serangan  bakteri,  patogen ataupun  virus.  Hasil  pengamatan  selama  masa aklimatisasi menunjukkan bahwa ikan dalam kondisi sehat sehingga siap diberikan perlakuan. Pengamatan juga  dilakukan  selama  masa  vaksinasi  dan  hasilnya menunjukkan bahwa ikan masih dalam kondisi sehat, yang dibuktikan dengan tidak terjadi kematian ataupun kelainan pada kondisi tubuh. Sedangkan pada masa uji tantang ikan mulai menunjukkan kelainan pada awal minggu kedua pascauji-tantang. Kelainan yang pertama kali muncul adalah penurunan nafsu makan yang diawali perlakuan A, kemudian disusul oleh perlakuan B, C, kontrol  positif,  dan  kontrol  negatif.  Pada  minggu ketiga  kondisi  ikan  bertambah  parah  yang  ditandai dengan produksi lendir yang berlebih.
Menurut  Utami  et  al.  (2013),  pertahanan  terluar tubuh disebut pertahanan barier epitel yaitu berupa kulit  dan  selaput  lendir.  Lendir,  merupakan  respons tanggap kebal ikan terhadap benda asing dalam hal ini adalah virus KHV aktif yang masuk ke dalam tubuh. Lendir tersebut berfungsi untuk menjerat benda asing sehingga keluar dari tubuh ikan. Kelainan gejala klinis lainnya  terlihat  pada  saat  terjadi  kematian,  pada perlakuan  kontrol  positif  ikan  mengalami  kematian dengan  kondisi  terparah,  yaitu  mengalami  nekrosis pada  insang  yang  disertai  infeksi  sekunder  yaitu tumbuhnya jamur di sekitar operculum. Pada perlakuan A ikan mati dengan kondisi terdapat ulcer di bagian dorsal.  Pada  perlakuan  B  ikan  mati  dengan  kondisi insang pucat disertai titik putih, dan pada perlakuan C ikan mati dengan kondisi mata cekung. Gejala yang muncul menunjukkan gejala klinis dan perubahan fisik yang  sama  dengan  beberapa  penelitian  lainnya mengenai  KHV  dan  hal  ini  sesuai  dengan  pendapat Hedrick et al. (2005) yang menyebutkan bahwa tanda- tanda  ikan  koi  yang  terinfeksi  KHV  adalah  terjadi perubahan warna tubuh, nekrosis pada filamen insang, dan produksi lendir yang berlebih. Adanya kematian pada perlakuan vaksin dikarenakan ikan sudah bersifat carrier  KHV  dan  juga  mengalami  stres  akibat penyuntikan.  Hal  ini  sejalan  dengan  tulisan  OATA (2001), ikan yang bersifat carrier KHV akan terjangkit
Gambar 12. Histopatologi insang ikan kontrol negatif  dan positif. Figure 12. Histopathological examination of gill tissues of negative and positive fish controls.
Tabel 3. Kisaran parameter kualitas air selama penelitian Table 3. The range of water quality parameters during the study
K (-) K (+) hiperplasia hipertropi hiperplasia Hyperplasia
hipertropi Hypertrophy Perlakuan Treatments Suhu Temperature (°C) pH Oksigen terlarut Dissolved oxygen (mg/L) Alkalinitas Alkalinity (mg/L) NH 3 (mg/L) NO 2 (mg/L) NO 3 (mg/L) PO 4 (mg/L) A (7.5 µg) 18-26 6-7.5 7.92-7.95 33.983-56.638 0.004-0.028 0.011-0.159 0.062-0.261 0.086-1.495 B (10 µg) 19-25.5 6-7.5 7.-65-8.06 33.983-56.683 0.007-0.030 0-0.161 0.148-0.484 0.001-1.351 C  (12.5 µg) 18.5-26 6.5-7.5 7.6-7.67 45.310-56.638 0.006-0.035 0.007-0.158 0.014-0.160 0.004-1.745 K (+) 19.5-25.5 6.5-7.5 7.55-7.89 33.983-56.638 0.004-0.037 0.003-0.164 0.032-0.235 0.001-1.821 K (-) 18-26.5 7-7.5 7.52-8.34 45.310-56.638 0.001-0.151 0.001-0.151 0.080-0.174 0.006-1.663
lagi  apabila  terjadi  penurunan  kondisi  tubuh,  serta fluktuasi suhu 24,5°C-28°C termasuk ke dalam rentang yang optimal untuk pertumbuhan KHV.
Pada penelitian ini juga dilakukan analisis gambaran darah  untuk  melihat  secara  deskriptif  pengaruh pemberian  vaksin  DNA  dengan  beberapa  dosis berbeda.  Pengamatan  gambaran  darah  ikan  selama penelitian dilakukan sebanyak tiga kali, yaitu pada masa aklimatisasi, vaksinasi, dan uji tantang yang meliputi jumlah  total  eritrosit,  total  leukosit,  kadar hematokrit, kadar haemoglobin, indeks fagositik, dan differensial  leukosit.  Pemberian  vaksin  DNA (vaksinasi) terhadap ikan koi memberikan pengaruh yang cukup signifikan terhadap gambaran darah ikan. Nilai  total  eritrosit  tertinggi  pada  masa  uji  tantang diperoleh perlakuan C (9,03 ± 0,6 x 10 5 sel/mm 3 ) yang berbeda  nyata  (P<0,05)  dengan  keempat  pelakuan lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian vaksin dengan  dosis  tertinggi  (12,5  µg/100  µL)  mampu memberikan ketahanan tubuh lebih baik dibandingkan perlakuan lainnya, sehingga ginjal sebagai penghasil darah  mampu  bekerja  lebih optimal.  Hal  ini  sejalan dengan penelitian Maswan (2009), pemberian vaksin DNA  dengan  dosis  12,5  ìg/100  ìL  pada  ikan  mas, menunjukkan nilai total eritrosit tertinggi  yaitu 16,8 ± 1,6 x 10 5 sel/mm 3 pada hari ke-70.
Pengamatan terhadap jumlah total leukosit dalam darah  ikan  koi  pada  perlakuan  yang  berbeda menunjukkan  nilai  yang  berbeda  pula.  Selama penelitian  diketahui  bahwa  nilai  tertinggi  terdapat pada perlakuan C yaitu 63,27 ± 0,25 x 10 4 sel/mm 3 pada masa vaksinasi, sedangkan pada masa uji tantang nilai  total  leukosit  cenderung  turun  untuk  semua perlakuan  kecuali  perlakuan  kontrol  negatif. Menurunnya jumlah total leukosit perlakuan lainnya diduga karena pengaruh infeksi KHV yang diberikan (uji  tantang),  hal  tersebut  sejalan  dengan  pendapat Nuryati et al. (2010a), yang menyatakan bahwa secara umum  tren  penurunan  jumlah  leukosit  pada  ikan perlakuan dan ikan kontrol positif setelah uji tantang menunjukkan  bahwa  leukosit  tersebut  diduga  aktif dan keluar dari pembuluh darah menuju jaringan yang terinfeksi.
Pengamatan terhadap nilai hematokrit (Gambar 6) dalam darah ikan koi pada perlakuan yang berbeda, menunjukkan  nilai  yang  berfluktuasi.  Pengamatan selama masa uji tantang menunjukkan bahwa kadar hematokrit  perlakuan  K-  dan  C  menunjukkan  nilai tertinggi, serta tidak berbeda nyata dan berbeda nyata dengan  perlakuan  K(+),  A,  dan  B.  Hal  ini menggambarkan bahwa sistem pertahanan pada ikan perlakuan C mampu merespons lebih baik terhadap infeksi KHV dibanding perlakuan yang lain.
Pengamatan  terhadap  nilai  haemoglobin  dalam darah ikan koi pada perlakuan yang berbeda (Gambar 7), menunjukkan bahwa nilai tertinggi terdapat pada perlakuan C yaitu sebesar 9,65 ± 0,49% pada masa uji tantang. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian vaksin DNA  dengan  dosis  tertinggi  mampu  memberikan pertahanan tubuh terbaik, sehingga insang tetap bisa optimal  mengikat  oksigen  di  udara  dan  tetap  bisa menjaga nilai haemoglobin pada kisaran normal. Sesuai pendapat  Maswan  (2009),  yang  menyatakan  bahwa kisaran kadar Hb normal ikan mas (6%-10%). Kadar Hb yang  cenderung  menurun  diduga  disebabkan  kadar oksigen dalam darah menurun.  Ikan yang terserang KHV akan sulit mendapatkan oksigen karena produksi lendir di insang yang berlebihan dan terjadi nekrosis pada insang.
Pengamatan terhadap nilai indeks fagositik dalam darah  ikan  koi  pada  perlakuan  yang  berbeda, menunjukkan  nilai yang  berfluktuasi. Nilai  tertinggi terdapat pada perlakuan C yaitu 41,5 ± 0,7% pada masa uji tantang (Gambar 8). Nilai tertinggi yang diperoleh perlakuan C pada masa uji tantang menujukkan respons tanggap kebal lebih baik dibanding perlakuan lainnya. Hal  ini  didukung  pernyataan  Nuryati  et  al.  (2010a), bahwa nilai indeks fagositik yang tinggi pada perlakuan vaksinasi  menggambarkan  pula  bahwa  proses fagositosis yang  terjadi dengan  cepat berkontribusi dalam mekanisme penyajian antigen (antigen present- ing cells) untuk merangsang respon sel limfosit.
Proses  fagositosis  dipengaruhi  oleh  persentase jenis  darah  leukosit  masing-masing  pada  limfosit, monosit, dan neutrofil. Pada proses tersebut meliputi tahapan kemotaksis, pelekatan, tahap penelanan, dan pencernaan  (Tizard,  1988).  Pengamatan  terhadap persentase  jumlah  monosit  dalam  darah  ikan  koi, menunjukkan  bahwa  nilai  tertinggi  pada  masa  uji tantang terdapat pada perlakuan K(-) yaitu sebesar 6 ± 0% (Gambar 9) dan secara umum nilai persentase monosit semua perlakuan tidak berbeda nyata. Nilai persentase  monosit  ini  cenderung  lebih  sedikit daripada persentase limfosit karena memang dalam mengatasi serangan virus, monosit kurang dibutuhkan dan memiliki porsi hanya 1%-6% dari total sel darah putih.
Pengamatan terhadap persentase jumlah limfosit dalam  darah  ikan  koi,  menunjukkan  bahwa  nilai tertinggi terdapat pada perlakuan C yaitu sebesar 92,5 ± 3,5% pada masa uji tantang (Gambar 10); selain itu, diperoleh  hasil  bahwa  pada  masa  uji  tantang  nilai persentase  limfosit  semua  perlakuan  tidak  berbeda nyata. Selama masa uji tantang persentase sel limfosit cenderung meningkat dibanding pada masa vaksinasi untuk  semua  perlakuan.  Peningkatan  persentase
limfosit  tersebut  terkait  dengan  peran  sel  limfosit sebagai  sel  pertahanan  tubuh.  Pada  dasarnya  sel limfosit terdiri atas dua populasi: sel B dan sel T. Sel B mempunyai  kemampuan  untuk  bertransformasi menjadi  sel  plasma  yaitu  sel  yang  memproduksi antibodi.  Sedangkan  sel  T  sangat  berperan  dalam kekebalan  berperantara  sel  (sel  T  sitotoksik)  dan mengontrol  respons  imun  (sel  T  supresor)  (Kresno, 2001).  Setelah  terjadi  pengikatan  antigen  dengan reseptor antigen sel limfosit, maka sel limfosit akan membelah dan berdiferensiasi menjadi sel efektor dan sel memori (Tizard, 1988).
Pengamatan terhadap persentase jumlah neutrofil dalam  darah  ikan  koi,  menunjukkan  bahwa  nilai tertinggi terdapat pada perlakuan K(-) dan perlakuan C yaitu sebesar 12,5 ± 0,7% pada masa aklimatisasi dan  vaksinasi  (Gambar  11).  Persentase  sel  neutrofil lebih  sedikit  dibanding  sel  limfosit  dan  cenderung menurun pada masa uji tantang, hal ini dimungkinkan karena fungsi neutrofil yang sesaat dan umurnya yang singkat, sejalan dengan pernyataan Takashima & Hibiya (1995) yang mengatakan bahwa fungsi neutrofil adalah untuk  menahan  serangan  atau  infeksi  bakteri. Menurunnya jumlah neutrofil dalam darah disebabkan neutrofil sudah melakukan aktivitas fagositik di dalam sel dan neutrofil berumur pendek (Tizard, 1988).
Secara umum perlakuan C (dosis vaksin tertinggi) menunjukkan  hasil  terbaik  dibandingkan  perlakuan lainnya,  hal  ini  dapat  dijadikan  acuan  gambaran kesehatan  ikan.  Hal  tersebut  sangat  didukung  oleh pendapat Wedemeyer (1977) yang menyatakan bahwa salah  satu  mekanisme  kerja  vaksin  adalah  mampu meningkatkan  respons  imun  spesifik  inang  dan pengetahuan tentang sistem peredaran darah dapat membantu  dalam  memahami  efek  dari  beberapa masalah kesehatan ikan, baik yang disebabkan penyakit menular maupun tidak menular.
Hasil  pengamatan  histologi  menunjukkan perbedaan yang mencolok antara perlakuan K(+) dan K(-), yaitu terjadinya hiperplasia dan hipertropi pada insang  K(+),  sehingga  filamen  pada  lamela  insang membesar  dan  menyatu  sehingga  mengganggu respirasi ikan. Perbedaan kondisi histologi organ koi ini sangat dimungkinkan akibat aktivitas dari serangan virus KHV, karena pada perlakuan kontrol positif ikan tersebut diinfeksi virus tanpa vaksinasi. Hal ini sejalan dengan pendapat Tamba (2006) yang menyatakan bahwa hiperplasia  dan  hipertropi  pada  insang  dapat menyebabkan pembengkakan antar lamela sehingga dapat  mengganggu  proses  pertukaran  gas  dan terganggunya  respirasi  ikan.  Rusaknya  insang  dan kurangnya suplai oksigen akan menyebabkan kematian ikan mas yang terinfeksi KHV.
Parameter  kualitas  air  hanya  merupakan  data pendukung pada penelitian ini, adapun parameter yang diamati meliputi: suhu, pH, DO, alkalinitas, NH 3 , NO 2 , NO 3 ,  dan  PO 4 ,  namun  parameter  kualitas  air  yang terpenting  pada  penelitian  ini  adalah  suhu,  karena merupakan  faktor  pemicu  terjadinya  serangan  KHV dibandingkan dengan parameter kualitas air yang lain (OATA, 2001). Nilai kisaran suhu yang terukur selama penelitian  yaitu  18°C-26,5°C  dan  dalam  kisaran  ini masih memungkinkan terjadinya perkembangan virus KHV.  Selain  itu,  secara  umum  kondisi  parameter kualitas air lainnya masih dalam kisaran yang dapat ditolerir  oleh  ikan  (SNI,  1999);  sehingga  dapat dipastikan ikan uji murni sakit akibat perlakuan (infeksi KHV) dan bukan karena faktor lingkungan.

## KESIMPULAN
Vaksin  DNA  pada  semua  perlakuan  uji  mampu meningkatkan  sintasan  pada  ikan  koi,  serta  vaksin DNA dengan dosis 7,5 µg/100 µL mampu memberikan nilai  sintasan  ikan  koi  yang  diinfeksi  KHV  sebesar 97,22%  dan  memberikan  nilai RPS  sebesar  95,83  ± 0,58%;  serta  memberikan  gambaran  sistem  imun terbaik dibandingkan perlakuan lainnya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai oleh APBN Riset Perikanan Budidaya Ikan Hias berkerja sama dengan Departemen Budidaya Perairan-FPIK-IPB. Terima kasih disampaikan kepada  semua  pihak  yang  telah  membantu terlaksananya riset vaksinasi benih ikan koi ini.

## DAFTAR  ACUAN
Hedrick,  R.P.,  Glad,  O.,  Yun,  S.C.,  McDowell,  T.S., Walizek, T.B., Kelley, G.O., & Adkison MA. (2005). Initial isolation and characterization of a herpes- like virus (KHV) from koi and common carp. Bull. Fish. Res. Agen. Supplement, 2, 1-7.
Kresno, S.B. (2001). Imunologi diagnosis dan prosedur laboratorium.  Edisi  ketiga.  Fakultas  Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta, 36 hlm.
Laelawati,  E.  (2008).  Respon  tanggap  kebal  ikan  mas Cyprinus  carpio  terhadap  koi  herpes  virus  yang diberikan  melalui  injeksi  dengan  dosis  berbeda. Institut Pertanian Bogor. Bogor (ID), 68 hlm.
Lorenzen, N. & LaPatra, S.E. (2005). DNA vaccine for aquaculture fish. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 24(1), 201-213.
Maswan, N.A. (2009). Pengujian efektivitas dosis vaksin DNA dan korelasinya terhadap parameter hematologi secara kuantitatif. Institut Pertanian Bogor. Bogor, hlm. 19-33.
Mudjiutami, E., Ciptoroso, Zainun,  Z., & Rahmat, S.
(2009).  Pemanfaatan  imunostimulan  untuk pengendalian  penyakit  pada  ikan  mas.  Laporan Balai  Besar  Pengembangan  Budidaya  Air  Tawar.  9 hlm.
Naim,  R.  (2004).  Molecular  medicine:  vaksin  DNA.
Internet.  Kompas.  Diunduh  2012  Agustus  27. Tersedia  pada:  http://www.kompas.com/kompas- cetak/0407/20/ilpeng/1153089.htm.
Nuryati,  S.,  Maswan,  N.A.,  Alimuddin,  Sukenda,
Sumantadinata, K., Pasaribu, F.H., Soejoeno, R.D., & Santika, A. (2010a). Gambaran darah ikan mas setelah divaksinasi dengan vaksin DNA dan diuji tantang dengan koi herpesvirus. Jurnal Akuakultur Indonesia, 9(1), 9-15.
Nuryati,  S.,  Alimudin,  Sukenda,  Soejoedono,  R.D.,
Santika,  A.,  Pasaribu,  F.H.,  &  Sumantadinata,  K. (2010b). Construction of a DNA vaccine using gly- coprotein  gene  and  its  expression  towards  in- creasing  survival  rate  of  KHV-infected  common carp, Cyprinus carpio. J. Natur. Indo., 13, 47-52.
Nuryati, S., Yuliyanti, & Alimuddin. (2013). Frekuensi dan persistensi vaksin DNA penyandi GP25 yang diberikan  melalui  pakan  buatan  pada  ikan  mas Cyprinus carpio. J. Akua. Indo., 12, 151-157.
Nuryati, S., Khodijah, S., Alimuddin, & Setiawati, M. (2015). Efektivitas penggunaan vaksin DNA dalam pakan  pada  ikan  mas  yang  diinfeksi  koi  herpes virus. Jurnal Kedokteran Hewan, 9(1), 33-37.
Nuswantoro, S., Alimuddin, Yuhana,  M., Santika, A., Nuryati,  S.,  Zainun,  Z.,  &  Mawardi,  M.  (2012). Efikasi vaksin DNA penyandi glikoprotein koi her- pes virus GP- 25 pada ikan mas stadia benih melalui perendaman.  Jurnal  Akuakultur  Indonesia,  11(1), 76-85.
Ornamental Aquatic Trade Association [OATA]. (2001).
Koi herpes virus (KHV). United Kingdom, 33 pp. Standar  Nasional  Indonesia  [SNI].  (1999).  Produksi induk  ikan  mas  (Cyprinus  carpio)  strain  sinyonya kelas induk pokok. Badan Standar Nasional: 01- 6135-1999.
Tamba, A. (2006). Kerentanan dan gambaran darah ikan mas Cyprinus carpio yang terinfeksi koi herpes virus (KHV). Tesis. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Tizard, I. (1988). Pengantar imunologi veteriner. Edisi ke-2.  Partodirejo,  M.  &  Hardjosworo,  S. (Penerjemah). Terjemahan dari: An Introduction to Veterinary Immunology. Surabaya: Airlangga Univer- sity Press, 496 hlm.
Utami, D.T., Prayitno,  S.B., Hastuti, S., &  Santika, A.
(2013).  Gambaran  parameter  hematologis  pada ikan nila (Oreochromis niloticus) yang diberi vaksin DNA Streptococcus iniae dengan dosis yang berbeda. Journal of Aquaculture Management and Technology, 2(4), 7-20.
Wedemeyer,  G.A.  &  Yasutake,  W.T.  (1977).  Clinical methods for the assessement of the effect envi- ronmental  stress  on  fish  health.  Technical  Papers of the U.S. Fish  and Wildfield Service. U.S.  Depart- ment  of  the  Interior  Fish  and  Wildlife  Service, 89, 1-17.
Zhou, J-X., Wang, H., Li, X-W., Lu, W-L., & Zhang, D- M.  (2014a).  Construction  of  KHVCJ  ORF25  DNA vaccine  and  immune  challenge  test.  J.  Fish  Dis., 37, 319-325.
Zhou, J., Xue, J., Wang, Q., Zhu, X., Li, X., Wenliang, L.,  &  Zhang,  D.  (2014b).  Vaccination  of  plasmid DNA encoding ORF81 gene of CJ strains of KHV provides protection  to immunized  carp. In  Vitro Cell. Dev. Biol Animal., 50, 489-495.