## EKSPLORASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI SELULOLITIK PADA LIMBAH DADUK TEBU ( Saccharum Officinarum L)
Evy Ratnasari Ekawati 1 , Ni’matuzahroh 2 , Tini Surtiningsih 2 , dan Agus Supriyanto 2 1 Mahasiswa Pascasarjana S2 Biologi, F-Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya E-mail: ephie.nies@gmail.com
2 Staf Pengajar Departemen Biologi, F-Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya

## ABSTRACT
This study aims to determine the diversity of cellulolytic bacteria in sugarcane trash ( Saccharum of fi cinarum L). This study was an explorative research by observing the clear zone in the medium CMC (carboxyl methyl cellulose) with 0.1% congo red. Characterization of cellulolytic bacteria was through by observing the bacterial of colony morphology, cell shape and physiology characteristics. The research datas were analyzed descriptively. From the results of this study, it were obtained six types of isolates that grew well on CMC medium. Based on the characterization of bacteria, six kinds of these isolates belongs to Cellulomonas sp., Cellvibrio sp., Cytophaga sp., Micrococcus sp. and Pseudomonas sp. genera.
Key words : Cellulolytic bacteria, Exploration, Identi fi cation, Sugarcane ( Saccharum of fi cinarum L), Trash

## PENGANTAR
Daduk pada perkebunan tebu merupakan limbah padat dari pabrik gula, bila dibiarkan akan menjadi serasah daduk. Serasah daduk merupakan materi organik yang terdapat di lantai perkebunan tebu, sebagian besar tersusun atas tumbuhan mati dan potongan organ tumbuhan, sehingga produksi serasah dapat diidenti fi kasi sebagai berat material yang mati dalam luas area tertentu per satuan waktu. Serasah dapat berupa sisa-sisa tanaman termasuk dedaunan, cabang, ranting dan batang (Feliatra, 2001).
Pengolahan langsung limbah daduk secara biologi dari bahan baku lignoselulosa, secara ekonomis lebih menguntungkan (Pan et al ., 2005). Daun tebu pada umumnya tersusun atas selulosa dan lignin yang sulit untuk didegradasi. Selulosa membentuk komponen serat dari dinding sel tumbuhan. Secara alami proses degradasi selulosa memerlukan bantuan mikroorganisme yang mengeluarkan enzim selulase. Beberapa genus bakteri selulolitik diantaranya adalah Cytophaga, Cellulomonas, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Cellovibrio, dan Sporocytophaga (Santoso, 1997).
Kondisi lingkungan perkebunan tebu tiap daerah berbeda, karena dipengaruhi oleh faktor biotik dan abiotik. Faktor-faktor tersebut menyebabkan perbedaan keanekaragaman bakteri selulolitik yang terdapat pada daduk di setiap daerah. Proses dekomposisi selulosa di alam secara alami berlangsung lambat sehingga diperlukan bantuan, diantaranya dengan menggunakan konsorsium bakteri selulolitik indigenus yang terdapat pada limbah daduk tersebut. Aktivitas selulolitik diuji menggunakan
berbagai media selektif. Kemampuan bakteri dalam menghidrolisis selulosa diindikasikan dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni pada media selektif agar (Perez et al ., 2002).
Berdasarkan hal yang telah disebutkan di atas, perlu dilakukan eksplorasi dan identi fi kasi bakteri selulolitik dari seresah daduk, yang nantinya dapat dimanfaatkan sebagai bakteri pendegradasi limbah daduk tebu. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui Genus bakteri selulolitik yang didapatkan dari hasil isolasi seresah daduk yang terdapat pada lahan perkebunan tebu. Bakteri selulolitik tersebut selanjutnya diformulasikan untuk digunakan dalam uji biodegradasi limbah daduk.

## BAHAN DAN CARA KERJA

## Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel seresah tebu (daduk), alkohol 70% , mikroskop olympus, media CMC ( Carboxyl Methyl Cellulose ) Agar, media NA ( Nutrient Agar ), akuades, congo red 0,1%, NaCl 1%, microbact identi fi cation kits .

## Cara Kerja Penelitian
Isolasi dan Identi fi kasi Bakteri Selulolitik Pemilihan Sampel Seresah
Sampel seresah diambil dari 5 titik secara random/acak pada lahan perkebunan tebu Puslit Gula PTPN X Djengkol Kabupaten Kediri, Jawa Timur. Seresah merupakan daduk tebu yang berjatuhan di lantai tanah perkebunan tebu.
Eksplorasi dan Identi fi kasi Bakteri Selulolitik 32

## Penanganan Sampel Daduk
Seresah daduk dipotong-potong dan dihomogenkan. Diambil sebanyak 1 kg seresah yang telah dipotong- potong,kemudian diblender sampai halus.

## Isolasi Bakteri Selulolitik
Berdasarkan prosedur Cappucino dan Sherman (2006), serasah yang telah dihaluskan menggunakan alat blender diambil sebanyak 50 g, kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass 500 ml . Selanjutnya dibuat suspensi dengan cara menambahkan akuades steril sampai mencapai volume 450 ml, kemudian dihomogenkan, didiamkan sesaat sekitar 15 menit supaya seresah mengendap. Pengenceran seresah tebu tersebut adalah 10 –1 . Dari Pengenceran 10 –1 , diambil sebanyak 1 ml dengan pipet, kemudian diencerkan dengan pengenceran seri 10 –2 dan 10 –3 dalam 2 tabung reaksi yang masing-masing berisi 9 ml akuades steril. Masing-masing pengenceran dibiakkan pada media CMC ( Carboxyl Methyl Cellulose ) agar dalam cawan petri dengan pengulangan sebanyak 3 kali. Diinkubasi selama 72 jam pada suhu 35° C. Koloni bakteri yang tumbuh kemudian dimurnikan dengan membuat sub biakan ke media NAS ( Nutrient Agar Slant ) dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35° C. Sub biakan ini digunakan sebagai bahan untuk identifikasi bakteri selulolitik dan sebagai stok kultur.

## Identifikasi Bakteri Selulolitik

## Pengamatan Makroskopis Koloni Bakteri
Untuk melihat karakteristik koloni bakteri, maka dilakukan pengamatan koloni secara makroskopis koloni dengan cara setiap isolat murni ditumbuhkan pada cawan petri berisi media NA dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35° C untuk menampilkan karakter dari masing- masing isolat meliputi: warna, bentuk, tepian, elevasi, permukaan, karakteristik optik, ukuran koloni, dan diameter koloni. Setiap cawan petri berisi satu jenis isolat hasil dari pemurnian pada NAS ( Nutrient Agar Slant ).

## Pengamatan Mikroskopis Sel Bakteri
Untuk melihat karakteristik sel bakteri, maka dilakukan pengamatan secara mikroskopis yang meliputi: bentuk sel dan pengamatan hasil pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram negatif).

## Pengamatan Fisiologis Bakteri
Karakteristik fisiologis bakteri selulolitik diamati dengan cara menumbuhkan pada berbagai media uji. Pada penelitian ini, uji dilakukan dengan menggunakan Microbact Identi fi cation Kits. Masing-masing isolat bakteri selulolitik
terpilih yang telah murni dalam NAS ( Nutrient Agar Slant ), diambil 1–3 koloni dan disuspensikan dengan 10 ml air fi siologis. Suspensi bakteri diambil sebanyak 100 μ l kemudian dimasukkan pada masing-masing sumuran Microbact Identi fi cation Kits, diinkubasi pada suhu optimum pertumbuhan bakteri selulolitik (35° C) selama 24 jam dan diamati perubahan warna yang terbentuk.
Hasil uji fi siologis dicocokkan dengan karakteristik fi siologi bakteri selulolitik yang terdapat pada buku panduan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology edisi 9 (Holt, et al ., 2000).

## Uji Skrining Bakteri Selulolitik

## Peremajaan Isolat Bakteri Selulolitik
Isolat murni diremajakan dengan cara diambil 1–3 koloni dari stok kultur pada NAS ( Nutrient Agar Slant ). Ditumbuhkan pada media NAS ( Nutrient Agar Slant) diinkubasi pada suhu 35° C selama 24 jam.

## Uji Potensi Bakteri Selulolitik
Isolat bakteri potensial selulolitik dipindahkan pada media CMC agar plate dengan cara ditutul pada 3 titik. Masing-masing cawan petri berisi 1 isolat. Pemberian tutulan pada media selektif diupayakan sama. Inkubasi selama 4–7 hari dalam suhu 35° C. Setelah itu dilakukan pengujian ada tidaknya zona bening yang terbentuk pada media CMC agar.

## Pengamatan Uji Potensi Selulolitik
Pengujian zona bening dilakukan dengan menggunakan larutan congo red 0,1% sebagai larutan penguji dan NaCl 1% sebagai larutan pencuci. Sebanyak 2 ml larutan congo red 0,1% dituangkan ke dalam media yang berisi isolat, kemudian didiamkan selama 20–30 menit. Larutan dibuang dan dibilas dengan larutan NaCl 1%, kemudian diamati keberadaan zona bening ( Clear zone). Hasil positif dinyatakan dengan adanya zona bening ( clear zone ) di sekitar koloni.

## HASIL

## Karakteristik Makroskopis dan Mikroskopis Bakteri Selulolitik
Hasil pengamatan makroskopis bakteri didapatkan dengan cara mencandra koloni bakteri pada medium Nutrient Agar Plate (NAP). Pengamatan mikroskopis bakteri dilakukan dengan cara mengamati bentuk sel dan warna sel bakteri yang telah diwarnai dengan pewarnaan Gram. Hasil karakteristik makroskopis dan mikroskopis bakteri selulolitik disajikan pada tabel 1.

## Uji Skrining
Uji skrining untuk mengetahui kemampuan selulolitik dari isolat bakteri dilakukan pada medium spesi fi k CMC ( Carboxyl Methyl Cellulose ) sebagai media selektif untuk pertumbuhan bakteri selulolitik. Skrining untuk mengetahui potensi bakteri sebagai dekomposer selulosa adalah dengan terbentuknya zona bening ( clear zone ) di sekitar koloni bakteri pada medium CMC Agar. Hasil uji skrining bakteri selulolitik disajikan pada tabel 2.
Tabel 2. Hasil uji skrining bakteri selulolitik pada medium CMC
Agar umur 7 hari No Isolat bakteri selulolitik Zona bening (clear zone) 1 UV 1 + 2 UV 2 + 3 UV 3 + 4 UV 4 + 5 UV 5
+ 6
UV 6 +
Tabel 1. Karakteristik makroskopis dan mikroskopis bakteri selulolitik dari medium NAP umur 48 jam
No Kode Isolat Bakteri Karakteristik Makroskopis Karakteristik Mikroskopis Bentuk Koloni Warna Koloni Tepi Elevasi Bentuk sel Gram 1 UV1 Bulat Kuning Rata Konveks Batang pendek Negatif 2 UV2 Bulat Putih kekuningan Rata Konveks Kokoid Positif 3 UV3 Bulat Kuning Rata Konveks Batang Negatif 4 UV4 Bulat Putih kekuningan Rata Konveks Kokoid Negatif 5 UV5 Bulat Kuning jernih Rata Konveks Batang gemuk pendek Negatif 6 UV6 Bulat Kuning jernih Rata Konveks Kokoid
Positif
Tabel 3. Daftar uji fisiologi bakteri selulolitik dengan microbact kit 12A dan 12B
No Uji fisiologi Kode isolat bakteri UV 1 UV 2 UV 3 UV 4 UV 5 UV 6 1 Lysin - - + + + + 2 Ornithine - - + - - - 3 H 2 S - - - - - + 4 Glucose - - - - - - 5 Manitol - - - - - - 6 Xylose + + + + - - 7 ONPG + + + + + - 8 Indol - - - - - - 9 Urease + - - + - + 10 VP - - - + - - 11 Citrat - - + + - - 12 TDA - - - - - - 13 Gelatin - - - - - - 14 Malonate - - - - - - 15 Inositol - - - + - - 16 Sorbitol - - - + - - 17 Rhamnose - - - - - - 18 Sucrose - - - + - - 19 Lactose - - - + - - 20 Arabinose + + + + + + 21 Adonitol - - - - + - 22 Raffinose - - - + - - 23 Salicin - - - + - - 24 Arginin + + + + + + 25 Motilitas + + + + + + 26 Oksidase + + + + + + 27 Katalase + + + + + + Genus Pseudomonas sp. Micrococcus sp.
Cellvibrio sp. Cellvibrio sp. Cytophaga sp. Cytophaga sp. Cytophaga sp. Probabilitas genus (%) 77,6 84,1 74 83,1 70,5 78,6
Eksplorasi dan Identi fi kasi Bakteri Selulolitik 34

## Identifikasi Bakteri Selulolitik
Bakteri selulolitik dari limbah daduk yang tumbuh pada media selektif CMC ( Carboxy Methyl Cellulose ), diisolasi ulang dan diremajakan menggunakan medium NAS ( Nutrient Agar Slant ). Pada masing-masing isolat menunjukkan beberapa kesamaan karakter, yaitu bersifat motil, katalase dan oksidase positif. Hasil uji fi siologis disajikan dalam tabel 3.
Berdasarkan dari hasil isolasi dan identifikasi dari limbah daduk diperoleh 6 jenis isolat dengan karakteristik yang beraneka ragam. Enam isolat tesebut tergolong dalam genus Pseudomonas sp. UV1 dengan probabilitas genus sebesar 77,6%, Micrococcus sp. UV2 dengan probabilitas genus sebesar 84,1%, Cellvibrio sp1. UV3 dengan probabilitas genus sebesar 74%, Cellvibrio sp2. UV4 dengan probabilitas genus sebesar 83,1%, Cytophaga sp1. UV5 dengan probabilitas genus sebesar 70,5% dan Cytophaga sp2. UV5 dengan probabilitas genus sebesar 78,6%.

## PEMBAHASAN
Kemampuan bakteri untuk tumbuh pada medium spesifik CMC ( Carboxyl Methyl Cellulose ) Agar menunjukkan bahwa bakteri tersebut mampu memanfaatkan selulosa sebagai salah satu sumber nutrien terutama sebagai sumber karbon. Zona bening ( clear zone ) merupakan indikasi awal untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam mendekomposisi selulosa. Semakin luas zona bening ( clear zone ) yang terbentuk, secara kualitatif, dianggap potensi bakteri selulolitik semakin besar. Isolat bakteri selulolitik potensial diperoleh dengan indikasi membentuk zona halo terluas dan kecerahan clear zone yang terbentuk (Irwanto, 2000; Meryandini et al ., 2009).
Dari hasil isolasi dan identifikasi limbah daduk, didapatkan 6 jenis isolat dari 5 genus bakteri, yaitu
Cellulomonas sp., Cellvibrio sp., Cytophaga sp ., Microccus sp. dan Pseudomonas sp. Pada beberapa penelitian, kelima genus bakteri tersebut merupakan pendegradasi selulosa yang handal. Hal ini perlu dikaji lebih lanjut lagi kemampuannya dalam mendegradasi selulosa. Enam jenis bakteri selulolitik yang telah didapatkan, selanjutnya dimanfaatkan sebagai bakteri uji untuk mendegradasi limbah daduk tebu yang sejauh ini belum mendapatkan perhatian dalam pengelolaannya selain dibakar. Uji enzimatis dari 6 jenis isolat bakteri selulolitik sedang diteliti.

## KEPUSTAKAAN
Cappucino, J.G., dan Sherman, N. 2006. Microbiology a Laboratory Manual. Benjamin Cumming Publisher, New York. Feliatra. 2001. Isolasi dan Identi fi kasi Bakteri Heterotrof yang terdapat di daun Mangrove ( Avicennia sp. dan Sonneratia sp) Dari Kawasan Stasiun Dumai. Jurnal Nature Indonesia. 3(2): 104–112.
Holt, J.G., Noel, R.K., Peter, H.A.S., James, T.S., dan Stanley, T.W. 2000. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9 th Edition, Williams and Wilkins, Baltimore.
Irwanto, R. 2000. Diversitas Bakteri yang Berasosiasi dengan Kompetisi Seresah Mangrove di Pantai Utara Surabaya.
Skripsi , Biologi FMIPA, Universitas Airlangga, Surabaya.
Meryandini, A., Widosari, W., Maranatha, B., Sunarti, T.C., Rahmania, N., dan Satria, H. 2009. Isolasi Bakteri Selulolitik dan Karakterisasi Enzimnya. Makara Sains 13(1).
Pan, X., Xie, D., Gilkes, N.R., Gregg, D., Mabee, W., dan Pye, K. 2005.
Biore fi ning of Softwood using Ethanol Oranosolv Pulping Preliminary Evaluation of Process Streams for Manufacture of Fuel-grade Ethanol Co-products. Biotech Bioeng. 90: 473–481.
Perez, J. , Munoz-Dorado, J., dan Martinez, J. 2002. Biodegradation and Biologycal Treatments of Cellulose, Hemicellulose and Lignin. Int Microbiol. 5: 53–63.
Santoso, A. 1997. Isolasi dan Estimasi Aktivitas Bakteri Selulolitik yang berasosiasi dengan Wood-Barer. Fakultas Perikanan dan Kelautan, UNDIP, Semarang.