Isolasi dan Identifikasi Steroid dari Ekstrak N -Heksana Daun Afrika ( Vernonia amygdalina Del.)
[Isolation and Identification of Steroid from N -Hexane Extract of Vernonia amygdalina Del.]
Evi Mashunah 1 , Erwin 1 *, Saibun Sitorus 1
1) Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman, Samarinda 75123
* ) Coresponding author: winulica@yahoo.co.id
ABSTRACT. Isolation and identification of steroids from the n-hexane fraction of Vernonia amygdalina Del. was carried  out.  Separation  and  purification  were  performed  using  flash  chromatographic  and  gravity chromatography.  Based  on  the  results  of  phytochemical  tests  supported  by  UV  and  FT-IR  data  analysis,  the isolate  obtained  was  a  steroid  (sterol  type).  Toxicity  test  results  using  the  Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT) were known that the steroid has moderate toxicity with an LC 50 value of 48.39 ppm.
Keywords : Vernonia amygdalina Del. , toxicity, BSLT, sterol, steroid
ABSTRAK. Isolasi  dan  identifikasi  steroid  dari  fraksi  n-heksana  daun  Afrika  ( Vernonia  amygdalina Del.)  telah dilakukan.  Pemisahan  dan  pemurnian  dilakukan  dengan  cara  kromatografi  tekan  dan  kromatografi  grafitasi. Berdasarkan  hasil  uji  fitokimia  yang  didukung  oleh  data  UV  dan  FT-IR  dapat  diketahui  bahwa  isolat  yang diperoleh adalah golongan steroid jenis sterol.  Uji toksisitas dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) diketahui bahwa toksistas isolat adalah moderat  dengan nilai LC 50 adalah 48,39 ppm.
Kata kunci : Vernonia amygdalina Del., toksisitas, BSLT, sterol, steroid
Riwayat artikel: Diterima  8 Maret 2020, Disetujui 9 April 2020 Cara sitasi: Mashunah,  E.,  Erwin.,  Sitorus,  S.  (2020).  Isolasi  dan  Identifikasi  Steroid  dari  Ekstrak N -Heksana  Daun  Afrika  ( Vernonia amygdalina Del.). KOVALEN: Jurnal Riset Kimia , 6(1): 18-22. DOI: https://doi.org/10.22487/kovalen.2020.v6.i1.15032

## LATAR BELAKANG
Indonesia  yang  dikenal  sebagai  salah satu megadiversity  country , memiliki  berbagai jenis tumbuhan tropis. Berbagai jenis tumbuhan  telah  digunakan  oleh  masyarakat dalam  pengobatan  tradisional.  Salah  satu tumbuhan obat ditemukan di Kalimantan Timur adalah adalah daun Afrika ( Vernonia amygdalina Del.).
V.  amygdalina adalah  tumbuhan  semak yang  selama  ini  dikenal  dengan  nama bitter leaf (daun pahit) karena daunnya terasa pahit.
Tumbuhan  ini  banyak  digunakan  sebagai sayuran  hijau  atau  ramuan  untuk  mengobati malaria  dan  diabetes  (Yeap et  al .,  2010).
Dalam pengobatan tradisonal tanaman ini juga digunakan  sebagai  obat  anti-cacing,  anti malaria, pencahar, cairan pencernaan,
makanan  pembuka,  obat  penurun  panas  dan untuk pengobatan luka (Ijeh & Ejike, 2011).
Beberapa  penelitan  sebelum  tentang daun  Afrika  memperlihatkan  aktivitas  yang menarik  seperti  sebagai  antibakteri  (Sobrinho et  al .,  2015),  menurunkan  kolesterol  total dalam darah Tikus (Ardiani, 2017), hapatoprotektif    (Johnson et  al. ,  2015), antidiabetik  (Asante et  al. ,  2016)  dan  tidak menimbulkan  efek  toksik  terhadap  ginjal (Suryati et al. , 2016). Penelitian lain
memperlihatkan bioaktivitas yang lebih banyak
yang  dimiliki  oleh  ekstrak  tanaman  ini  seperti antidiabetes, antibakteri, antimalaria,
antijamur,  antioksidan,  perlindungan  hati  dan efek sitotoksik yang bermanfaat bagi kesehatan (Sarofah  et  al.,  2016;  Yeap  et  al. ,
2010)  dan  dapat mengobati  luka  (Ernawaty et al ,  2014).  Daun  Afrika  juga  memiliki  khasiat seperti  menurunkan  asam  urat  (Krisnawati,
2015).  Hasil  penelitian  (Sitorus et  al. ,  2016)
diperoleh  bahwa  fraksi  etil  asetat,  fraksi  n- heksana dan fraksi etanol  daun  Afrika bersifat toksik.
Penelitian ini dilakukan untuk mengungkap  kandungan  senyawa  metabolit sekunder  daun  Afrika      ( V.  amygdalina Del.) yang  selama  ini  banyak  digunakan  sebagai obat.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Bahan dan Peralatan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian adalah  tumbuhan  Daun  Afrika  ( V.  amygdalina
Del.),  etanol  95%,  n-heksana,  etil  asetat, pereaksi dragendorf , larutan H 2 SO 4 2N,  asam asetat  glasial,  asam  klorida  pekat,  serbuk magnesium,  asam  sulfat  pekat,  larutan  FeCl 3
1%,  akuades,  silika  gel  60  (70-230 mesh ),
silika gel F 254 , kertas saring dan aluminium foil.
Peralatan yang digunakan, yaitu seperangkat  alat  gelas,  neraca  analitik, blender, pisau, serangkaian alat rotary evaporator ,  lampu  UV,  seperangkat  alat kromatografi  lapis  tipis  dan  kolom,  desikator, chamber ,  tabung  reaksi,  batang  pengaduk, spatula, botol semprot, pipa kapiler,
spektrofotometer UV-Vis Variant Cary 100/300 dan  spektrofotometer  FTIR Shimadzu  IR
Prestige-21 FTIR .

## Prosedur Kerja

## Ekstraksi dan pemurnian
Ekstraksi  dan  isolasi  dalam  penelitian  ini dilakukan  dengan  cara  yang  lazim,  yakni ekstraksi dengan cara maserasi dan dilanjutkan  dengan  isolasi  dan  pemurnian dengan  menggunakan  kromatografi    kolom
(Erwin et al. , 2014, 2015).
Sejumlah 500 gr Daun Afrika kering yang sudah  dihaluskan,  dimaserasi  menggunakan pelarut etanol 96% selama 3 x 24 jam. Setelah disaring,  filtrat  yang  diperoleh  kemudian dipekatkan menggunakan rotaevaporator sampai  diperoleh  maserat  kentas.  Maserat dipartisi dengan n-heksana, kemudian filtrat n- heksan  dipekatkan  menggunakan  rotavapour dan diperoleh ekstrak n-heksan 2,10 gram.
Sejumlah    2,10  gram  fraksi  n-heksana dipisahkan menggunakan   kromatografi kolom flash dengan  fase  diam  silika  gel  60  (70-230 mesh)  dengan  cara  gradien  menggunakan eluen  n-heksan:  etil  asetat  (mulai  100  n- heksan sampai 100% etil asetat), dengan cara bergradient. Hasil yang diperoleh sebanyak 33 vial. Berdasarkan hasil analisis KLT
menggunan eluen etil asetat : n-heksan (2 : 8) yang  selanjutnya  dimonitoring  dengan  lampu UV  pada λ  254  nm  dan  366  nm,  diperoleh    8 fraksi  utama  yaitu  H1  (137  mg)  ,  H2  (152,3 mg)  ,  H3  (99,5  mg),  H4  (131,5  mg),  H5  (82,3
mg),  H6  (56,4  mg),  H7  (68,9  mg),  dan  H8 (119,3 mg).
Pada  fraksi  H2  (152,3  mg)    dilakukan kromatografi  flash  lebih  lanjut  menggunakan eluen n-heksan:etil (mulai perbandingan 18,5:1,5  -  2:8).  Kemudian  dimonitoring  lagi dengan  KLT  menggunakan  eluen  etil  asetat: n-heksan  (1:19)  diperoleh  4  fraksi  utama (H21=11,0 mg, H22=14,1 mg, H23=102,0 mg, dan H244=17,1 mg).
Selanjutnya    fraksi  H22  dan  H23 dipisahkan  secara  terpisah  menggunakan
Kromatografi
gravitasi.
Fraksi
H22 menghasilkan  4  fraksi  (H221=  1,2  mg,  H222= 7,3  mg, H223=2,4  mg),  sedangkan  fraksi  H23 menghasilkan  5  fraksi  utama  (H231=39,5  mg, H232=11,3 mg, H233=17,1 mg, H234=9,2 mg, dan  H235=15,2  mg).    H222,  dan  H231 digabung  kemudian  dilakukan  rekristalisasi menggunakan  pelarut  n-heksan  dan  diperoleh kristal amorf berwarna putih (2,02 mg).
Isolat selanjutnya di uji kemurnian dengan
KLT  menggunakan  tiga  eluen  yang  berbeda.
Selanjutnya isolat diuji fitokimia dan dilanjutkan  dengan  analisis  spektrofotometri UV-Vis dan spektrofotometri FT-IR.
Uji toksisitas
isolat
dilakukan dengan
menggunakan  metode Brine  Shrimp  Lethality Test (BSLT) dan analisis probit SAS.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat yang diperoleh berupa kristal amorf berwarna  putih  seberat  2,02 mg.  Berdasarkan hasil uji kemurnian menggunakan KLT dengan tiga  perbandingan  eluen  yang  berbeda  (etil asetat:  n-heksan  (0,5:19,5);  etil  aseta:  n- heksan  (1;19);  dan  kloroform:  n-heksan  (1:9) diperoleh  noda  tunggal,    dengan  demikian hasil  ini  dapat  dipastikan  bahwa  isolat mempunyai kemurnian yang cukup tinggi.
Tabel  1. Nilai  Rf  Kromatogram  KLT  isolat dengan tiga eluen yang berbeda
Eluen Nilai Rf etil asetat: n-heksan =  0,5: 19,5 etil asetat: n-heksan =  1: 19 kloroform: n-heksan=  1:9 0,285 0,571 0,857
Pada  hasil  uji  fitokimia  menunjukkan bahwa  isolat  adalah  golongan  senyawa
steroid.
Hal ini dibuktikan dengan terbentuknya  warna  hijau  setelah  direaksikan dengan pereaksi Lieberman-Buchard . 19,5:0,5 19:1 9:1
Gambar 1. Kromatogram  dari  KLT  Isolat dengan 3 perbandingan eluen

## Hasil Identifikasi Senyawa Isolat
Hasil  spektrum  UV  dalam  pelarut  n- heksana menunjukkan dua serapan maksimum  pada  panjang  gelombang (λ maks )
202,04  nm  dan    202,04  nm  dan  205,60  nm mengindikasikan  bahwa  senyawa  hasil  isolasi mempunyai  ikatan  rangkap  tidak  terkonjugasi. Eksitasi elektron dari    * merupakan suatu transisi  yang  terjadi  pada  ikatan  rangkap  dan menurut  (Silverstein,  1986;  Supratman,  2010) untuk ikatan rangkap terkonjugasi pada sistem diena  berada  pada  serapan  dengan  harga dasar 215 – 230 nm.
Hasil  spektrofotometer  FTIR  (Gambar  2), senyawa  hasil  isolasi  menunjukkan  adanya serapan  dari  OH  (alkohol)  pada  daerah 3427,51  cm -1 ,  dugaan  ini  diperkuat  oleh adanya  serapan  pada  daerah  1058,92  cm -1 dari C-O alkohol. Kemudian serapan C=C non konjugasi pada daerah 1658,78 cm - 1. Serapan
stretching CH  alkana  pada  daerah  2920,23
cm -1 ,  didukung  serapan    dari  CH 2 bending pada  daerah  1465,90  cm -1 dan  serapan  dari
CH 3 bending pada  daerah  1381,03  cm -1
(Sastrohamidjojo,  1992).  Berdasarkan  hasil identifikasi  spektrum  UV  dan  FT-IR  maka isolat yang diperoleh diperkirakan steroid jenis sterol.
Gambar 2. Hasil spektrum FTIR dari isolat fraksi n-heksan Daun Afrika ( V. amygdalina Del.)

## Hasil  Uji  Toksisitas  Isolat  dengan  Metode BSLT
Hasil  uji  toksisitas  pada  isolat  dari  fraksi n-heksana  daun  Afrika  dengan  metode  BSLT ini diperoleh nilai LC 50 sebesar 48,39 ppm. Hal ini  menunjukkan  bahwa  isolat  yang  diperoleh memiliki toksisitas moderat.

## KESIMPULAN
Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa  isolat  yang  diperoleh  adalah  golongan steroid  jenis  sterol  dengan  toksisitas  yang moderat.

## DAFTAR PUSTAKA
Ardiani,  R.  (2017).  Efek  Antikolesterol  Ekstrak Etanol Daun  Afrika ( Vernonia amygdalina Del.)  pada  Tikus. JURNAL  PENELITIAN PENDIDIKAN MIPA , 2 (1): 116 –121.
Asante,  D.-B.,  Effah-Yeboah,  E.,  Barnes,  P., Abban, H. A., Ameyaw, E. O., Boampong, J. N., Ofori, E. G., & Dadzie, J. B. (2016). Antidiabetic  Effect  of  Young  and  Old Ethanolic  Leaf  Extracts  of Vernonia amygdalina : A Comparative Study.
Journal  of  Diabetes  Research , 2016 :  1 – 13. https://doi.org/10.1155/2016/8252741
Erwin, Noor,  A., Soekamto, N.  H.,  van  Altena, I.,  &  Syah,  Y.  M.  (2014).  Waltherione  C and
Cleomiscosin
from
Melochia umbellata var. Degrabrata K. ( Malvaceae ), Biosynthetic and Chemotaxonomic Significance. Biochemical  Systematics  and  Ecology , 55 : 358 –361.
https://doi.org/10.1016/j.bse.2014.03.020
Erwin,  Sulistyaningsih,  S.,  &  Kusuma,  I.
(2015).  Isolation  and  MS  Study  of Friedelinol  from  The  Leaves  of  Terap ( Artocarpus odoratissimus Blanco). International  Journal  of  Pharma  and  Bio Sciences , 6 (1): 598 –604.
Ijeh,  I.  I.,  &  Ejike,  C.  E.  C.  C.  (2011).  Current Perspectives  on  The  Medicinal  Potentials of Vernonia  amygdalina Del. Journal  of Medicinal  Plants  Research , 5 (7):  1051 –
1061.
Johnson,  M.,  Olufunmilayo,  L. A.,  Anthony,  D.
O., & Olusoji, E. O. (2015). Hepatoprotective  Effect  of  Ethanolic  Leaf Extract  of Vernonia  amygdalina and Azadirachta indica against Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity inSprague-Dawley  Male  Albino  Rats. American  Journal  of  Pharmacological Sciences , 3 (3): 79 –86.
https://doi.org/10.12691/ajps-3-3-5
Krisnawati,  D.  (2015).  Uji  Aktivitas  Fraksi
Etanol  dan  N-heksana  Daun  Afrika ( Vernonia  amygdalina Delile)  Sebagai
Antihiperurisemia  pada  Mencit  Putih Jantan  yang  Diinduksi  Kalium  Oksonat.
[ Skripsi ]. Universitas
Mulawarman,
Samarinda.
Sarofah,  U.,  Sudrajat,  &  Hariani,  N.  (2016).
Pengaruh Ekstrak Daun Vernonia
amygdalina Delile dan Beras Ketan Hitam
( Oryza sativa
glutinosa) Terhadap Penurunan  Kadar  Gula  Darah  Mencit ( Mus  musculus )  Yang  diinduksi  Aloksan. Prosiding  Seminar  Sains  Dan  Teknologi FMIPA Unmul , 419 –423.
Sastrohamidjojo,  H.  (1992). Spektroskopi Inframerah . Liberty Yogyakarta, Yogyakarta. Silverstein,
R.
(1986). Penyidikan Spektrometrik Senyawa Organik . Erlangga, Jakarta.
Sitorus,  S.,  Saleh,  C.,  &  Panggabean,  A. (2016). Pemanfaatan Ekstrak Daun Afrika ( Vernonia  amygdalina Delile)  sebagai
Antihiperurisemia  (Asam Urat) pada Mencit  Putih  Jantan.  [ Laporan  Penelitian Hibah Fundamental ], Samarinda.
Sobrinho,  A.  C.  N.,  Souza,  E.  B.  de,  & Fontenelle, R. O. dos S. (2015). A Review on  Antimicrobial  Potential  of  Species  of The Genus Vernonia (Asteraceae). Journal  of  Medicinal  Plants  Research , 9 (31):
838 –850. https://doi.org/10.5897/JMPR2015.5868
Supratman,  U.  (2010). Elusidasi  Struktur Senyawa  Organik  Metode  Spektroskopi untuk  Penentuan  Senyawa  Organik .
Widya Padjajaran, Bandung.
Suryati,  S.,  Dillasamola,  D.,  &  Rahadiant,  F.
(2016).  Pengaruh  Ekstrak  Etanol  Daun Vernonia amygdalina Del terhadap Kadar Kreatinin  Serum  Mencit  Putih  Jantan. Jurnal  Sains  Farmasi  &  Klinis , 3 (1):  79 – 83.
https://doi.org/10.29208/jsfk.2016.3.1.103
Yeap,  S.  K.,  Ho,  W.  Y.,  Beh,  B.  K.,  Liang, W.
S., Ky, H., Yousr, A. H. N., & Alitheen, N. B.  (2010). Vernonia  amygdalina ,  an Ethnoveterinary  and  Ethnomedical  Used Green  Vegetable  with  Multiple  Bio- Activities. Journal  of  Medicinal  Plants Research , 4 (25): 2787 –2812.