PENGARUH EKSTRAK DIKLOROMETAN JAHE ( Zingiber officinale Roscoe) TERHADAP  PENGIKATAN   TOKSIN KOLERA B-subunit CONJUGASI (FITC)
PADA RECEPTOR
SEL HIBRIDOMA LV DAN CACO-2
[Effect of Ginger  ( Zingiber officinale Roscoe) Dichloromethane Extract on Inhibition of Cholera Toxin B-subunit Conjugated FITC Binding to Receptor on LV Hibridome and Caco-2 Cells]
Radiati, L.E 1) , Nabet, P , Franck,  P 2) , Nabet B 2) , Capiaumont,  J 2) ., Fardiaz, D 3) .  Zakaria, R.F 3) ,
I. Sudirman
4) , dan Hariyadi, R.D 3)
1) Program Studi teknologi Hasil Ternak, FAPET-Universitas Brawijaya, Jl. Veteran Malang
2) Laboratorium Biokimia Univ. Henri Poincare Nancy Perancis
3) Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, FATETA- IPB, Kampus IPB Darmaga Bogor 16002
4) Kedokteran Hewan IPB, Jl. Agatis, Kampus IPB Darmaga Bogor  16680.
Diterima 25 Agustus 2002/Disetujui 25 April 2003

## ABSTRACT
Cholera toxin is main factor that responsibility of watery diarrhea. The objectives of this investigation was to study the effect of ginger extract (GDE) in blocking  cholera toxin binding to  receptors of  LV hybridome and Caco-2 cells.
Analysis of toxin binding by flow cytometry of 0-5  g/ml of B-FITC conjugated cholera toxin to 10 5 cells/ml of LV hybridome and Caco-2 cells  in RPMI, at   4  C for one hour   showed that specific interaction of B-FITC by 44,44  3,49  percent to LV hybridome and by 94,58  1,83 percent to Caco-2 cells A total of 10 5 cells/ml of hybridome and Caco-2 cells were incubated with 0-5  g/ml toxin B-FITC and 25 or 50  g/ml  GDE  in RPMI, at   4  C for one hour showed that the addition of  GDE  inhibited the toxin binding. The binding inhibition   respectively were 4.76-15.66 and 12.55-24.60 percent to Caco-2 cells, and  3.55-17.95 and 3.58-27.83 percent to hybridome cells.  The inhibition on the toxin binding  may be due to modification of the receptor by GDE or interaction of GDE with the toxin.
Key words :  Hibridoma LV, Caco2, ekstrak diklorometan jahe,  and  toksin kolera B-FITC

## PENDAHULUAN
Salah satu manfaat jahe untuk kesehatan adalah sebagai  ramuan  obat    tradisional,  yang  dapat menyembuhkan  berbagai  jenis  penyakit  termasuk gangguan  pencernaan  (Wijayakusuma,  1997),  septisemia (Sohni  et    al.,  1995),  inflamasi  kronis  rematik  artritis (Kimura  et    al.,  1991),  hepatitis kronis  dan  asma  bronsitis (Watanabe  et  al.,  1994).  Pada  percobaan in  vitro , septisemia  pada  mencit  dapat  disembuhkan  dengan ayurvedic ,  yaitu  ramuan  obat  tradisional  di  India  yang mengandung  ekstrak  jahe    (Sohni  et    al.,  1995). Pengobatan  tradisional  di  Cina  dan  Jepang  terhadap hepatitis  kronis  dan  asma  bronsitis  dapat  disembuhkan dengan Syosaiko-to yang juga merupakan obat tradisional mengandung  jahe  dan  panax  ginseng  (Watanabe  et  al., 1994).  Selain  itu  ekstrak  jahe  dapat  meningkatkan  daya tahan  tubuh  yang  direfleksikan  dalam  sistem  kekebalan, yaitu  memberikan  respon  kekebalan  inang  terhadap mikroba  patogen  yang  masuk  kedalam  tubuh.  Hal  itu disebabkan ekstrak jahe dapat  memacu proliferasi limfosit
dan  menekan  limfosit  yang  mati  (Zakaria  et  al.,  1996), meningkatkan  aktivitas  fagositosis  makrofag  (Zakaria  dan Rajab, 1999), meningkatkan aktivitas sel  NK dan proliferasi sel T secara in vitro (Tejasari, 2000). Menurut Nurrahman et    al.,  (1999),  mengkonsumsi  sari  jahe  setiap  hari  dapat meningkatkan  aktivitas  sel  T  dan  daya  tahan  limfosit terhadap stres oksidatif.
Manfaat  jahe  yang  lain  adalah  sebagai  pemberi citarasa    dalam  minuman  tradisional,  kembang  gula    dan sebagai  bumbu  dalam  makanan  (Fardiaz  et  al.,  1992). Rasa jahe yang pedas disebabkan oleh komponen bioaktif oleoresin,  sedangkan  citarasa  jahe  disebabkan  oleh kandungan  minyak  atsiri.      Komponen  bioaktif    tersebut diketahui  dapat  berfungsi sebagai bahan pengawet yang tidak  toksik,  dan  dapat  menghambat  pertumbuhan  atau membunuh  mikroba  namun  tergantung  dari  dosisnya (Mishra  dan  Dhirendra,  1990;  Nychas,  1995;  Neinaber  et al., 1997 dan Hiserodt  et  al., 1998, Radiati, 2002).
Peranan  ekstrak  jahe  dalam  minuman  fungsional dan  obat  tradisional  (Wijayakusuma,  1997)  dapat meningkatkan  ketahanan  tubuh  dan  mengobati  diare.
Kasus kejadian diare di negara berkembang menunjukkan 70  persen  dari  penyakit  diare  disebabkan  oleh  konsumsi makanan yang tercemar bakteri. Dari kasus diare tersebut resiko  kematian  yang  disebabkan  oleh Vibrio  cholerae mencapai  0,001-0,010  persen  per  bulan  (Calderwood, 2000).
Toksin kolera merupakan salah satu faktor virulensi dari V.  cholerae O1  yang  bertanggungjawab  terhadap terjadinya  diare.  Toksin  terdiri  atas  subunit  A  (toksin-A) yang  bersifat  toksik  dikelilingi  oleh  lima  molekul  subunit  B (toksin-B)  yang  berfungsi  sebagai  sisi  toksin  yang menempel  pada  reseptor  dari  permukaan  sel  inang (Holmgren, 1978).
Penempelan  toksin-B  (ligan)  pada  reseptor  terjadi karena  adanya  interaksi  dari  molekul  yang  mempunyai struktur  yang  cocok  (Duncan-Hewitt,  1990),    interaksi  ini distabilkan  oleh  ikatan:  (1)  elektrostatik  antara  sisi  yang mempunyai  muatan  ionik  berlawanan,  seperti  rantai  asam amino  yang  mempunyai  gugus  samping  NH 3+ dari  lisin dengan  gugus  –COO - dari    asam  amino  glutamat.  (2) Ikatan hidrogen adalah ikatan yang dibentuk antara gugus hidrofil molekul, dan (3) ikatan hidrofobik yaitu ikatan yang dibentuk oleh gugus non polar molekul.
Penggunaan  sel  Caco-2  sebagai  model  sel  untuk penelitian tentang pengikatan toksin kolera  pada reseptor memenuhi  kriteria  sebagai  sel  epitel,  karena  merupakan turunan  alur  adenokarsinoma  kolon  manusia  dan mempunyai  reseptor  spesifik  terhadap  toksin  kolera. Secara in  vitro sel  tersebut  tumbuh  sebagai  monolayer, yang  mempunyai    morfologi  dan  fungsi  diferensiasi  serta karakteristik  enterosit  (Crociani  et  al., 1995).    Analisis pengikatan toksin kolera pada  sel Caco-2 dapat dilakukan dengan  metoda flow  cytometry dan  mikroskopis,  melalui suatu  pelabelan  pada  toksin  dengan  menggunakan senyawa  berfluoresens.  Adanya  perubahan  intensitas fluoresens  yang  terukur  dapat  menunjukkan  adanya perubahan ikatan toksin dengan sel  Caco-2.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak  diklorometan  jahe  terhadap  pengikatan  toksin kolera-B  terkonjugasi-FITC  ( fluoresence  isothiocyanat )  (B- FITC) pada sel hibridoma dan Caco-2.

## METODOLOGI
Bahan Bahan  penelitian  yang  digunakan  adalah  sel hibridoma    dan    enterosit  Caco-2  yang    diperoleh  dalam keadaan  beku  dari  Laboratorium  Biokimia,  Universitas Henri  Poincare  Nancy  Perancis.    Media  RPMI  (Roosevelt Park  Medical  Institute)  1640  yang  mengandung  4  mM  L- glutamin  dan  pH  fenol  merah  (Boehringer,  M12-702,
Mannheim, German) dan serum anak sapi   (Jacques Boy, Reims, France).
Peralatan  yang  digunakan  antara  lain:  Inkubator CO 2 (Jouan  E.G.  115  IR),  sentrifus  (Jouan  CR.  3000), laminar  flow (Glass  100  GELAIR)  dan    EPICS  XL flow cytometry (Coultronics  Margency,  France)  dan  mikroskop (Diaphon-NIKON).

## Ekstrak diklorometan jahe
Sebanyak  10  g  bubuk  jahe  diekstrak  dua  kali masing-masing  dengan  100  ml  heksan,  residu    diekstrak dua kali  masing-masing dengan 100 ml diklorometan dan residu  kedua    diekstraksi  dua  kali  masing-masing  dengan 100 ml etanol. Proses ekstraksi dilakukan secara maserasi pada suhu ruang, dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 6 jam.  Tiap-tiap filtrat dipisahkan dari pelarut dengan cara penguapan dalam rotavapor.
Ekstrak  diklorometan  jahe,  yang  telah  dihilangkan residu  pelarutnya  dengan  gas  nitrogen,  dilarutkan  dalam DMSO, yang kemudian diencerkan  dengan PBS sehingga diperoleh  konsentrasi  akhir  4  mg/ml  ekstrak  jahe  dengan 0,75 persen DMSO dalam bufer PBS.

## Toksin kolera  subunit B terkonjugasi-FITC
Toksin  kolera    subunit  B-terkonjugasi-FITC ( fluoresence  isothiocyanat )  (B-FITC)  dan  toksin  kolera subunit  B  tanpa  konjugasi  (Sigma).    Sebanyak  0,5  mg protein  toksin  dilarutkan  dalam  2,5  ml  PBS,  sehingga didapat konsentrasi akhir 200  g/ml.

## Kultur sel hibridoma LV dan Caco-2
Sel  hibridoma  LV  merupakan  turunan  hibridomaa HPL  (Human  plasenta).    Sel  hibridoma  LV  dan    Caco-2 ditumbuhkan  dalam tabung kultur 50 cm 2 (Plastik Nunclon- Delta) yang berisi media RPMI  1640 yang mengandung 4 mM L-glutamin, dengan indikator pH fenol merah  dan 10 persen  serum  anak  sapi.    Kultur    diinkubasi  pada  suhu 37  C, 5 persen CO 2 , 95 persen udara dengan kelembaban 99 persen.  Media kultur diganti setiap dua hari.  Sel pada fase  pertumbuhan  ekponensial  dengan  densitas  minimum 10 6 sel/ml  digunakan  sebagai  sample.  Sel  Caco-2 digunakan  setelah  tripsinasi    dengan  1,25  persen  tripsin pada 37  C selama 5 menit.
Cara menghitung viabilitas sel yaitu  mengambil 100  l kultur ditambah 100  l tripan biru, lalu diteteskan pada hemasitometer.  Sel hidup memberikan penampakan yang bersinar  dan  yang  mati  berwara  biru.    Setiap  kotak  besar dari  hemasitometer  mempunyai  volume  10 -4 ml,  sehingga jumlah  sel  terhitung  dikalikan  dengan  faktor  pengenceran 10 4 sel/ml. Pengamatan ini dilakukan  3 kali ulangan.

## Penambahan ekstrak jahe pada kultur sel
Kurva  pertumbuhan  hibridoma  LV  atau  Caco-2 diperoleh  dari  menginkubasi  sel  10 5 sel/ml  dengan berbagai  konsentrasi  12,5,  25,  50  g/ml    ekstrak diklorometan  jahe  dalam  tabung  kultur  50  cm 2 (Plastik Nunclon-Delta)  yang  mengandung  9  ml  RPMI  1640. Pengamatan  setiap  hari  terhadap  proliferasi  sel  dilakukan dengan  penambahan  tripan  biru  pada  sampel  sel  dan penghitungan menggunakan hemasitometer.    Selanjutnya kultur diinkubasi  hingga 4 hari.
Aplikasi flow  Cytometry untuk  menentukan viabilitas sel Viabilitas  sel  ditentukan  berdasarkan  morfologi dengan  metoda flow  cytometry .  Alat  yang  digunakan adalah   EPICS-XL flow cytometer yang dilengkapi dengan laser argon  dengan  eksitasi pada  488 nm. Sel hidup pada  umumnya  mempunyai  volume  yang  penuh  dan membran  plasma  tidak  berglanular.    Jika  sel  mulai  mati maka  bentuk  sel  mulai  menyempit  dan  membran  plasma bergranular.    Aspek  morfologi  sel  yang  dapat  dideteksi dengan flow  cytometry adalah  sinar  yang  mengenai  sel hidup,  permukaan  sel  hidup  dapat  mendifraksi    sinar dengan sudut sinar yang kecil  (FLS : Forward light Scatter ) sedangkan  sel  yang  mati  dengan  struktur  membran  sel bergranula      merefraksi    sinar  sampai  90  (90LS: light Scatter ). Hasil analisis dengan flow cytometry dapat dilihat pada  sitogram  FLS  x    90LS  yang  menunjukkan  dua populasi yang berbeda, satu polulasi  sel hidup dan kedua populasi sel mati (Gambar 1). Dimana yang terukur adalah log  intensitas  sinar  difraksi    (LFLS)  dengan  log  intensitas sinar refraksi (L90LS) (Al-Rubeai dan Emery, 1996).

## Analisis ikatan toksin B-FITC pada reseptor dengan Flow Cytometry
Penggunaan  FITC    sebagai  label  pada  toksin-B, memungkinkan  adanya  ikatan  toksin  B-FITC  dengan  sel hibridoma LV dan Caco-2 dapat dideteksi dengan metoda flow  cytometry. Isotiosianat  mempunyai  emisi  fluoresens hijau  543 nm,  pada histrogram monometrik (1024 skala logaritma),  yang  diekspresikan  sebagai  nilai  tengah intensitas fluoresens (MIF: mean intensity of fluorescence ; MIF= e {(ln 1000/1024) x } ), dimana x adalah nilai tengah puncak logaritma (Gambar 2).
Penjenuhan  dan    ikatan  spesifik    toksin    B-FITC pada  sel hibridoma LV  dan Caco-2
Kurva    ikatan  toksin  B-FITC  diperoleh  dengan menginkubasi  10 5 sel/ml  hibridoma  LV  dan      Caco-2 dengan  berbagai  konsentrasi  0,00,  0,01,  0,10,  0,50  dan 5,00  g/ml  toksin  B-FITC  dalam  media  RPMI  pada  suhu 4  C selama 1 jam.  Nilai tengah fluoresens tiap konsentrasi toksin  subunit  B-FITC  adalah  ikatan  total    toksin    B-FITC pada hibridoma atau Caco-2 (Al-Rubeai dan Emery, 1993).
Ikatan  non spesifik diperoleh dari menginkubasi 10 5 sel/ml  hibridoma  LV  dan  Caco-2    pada  konsentrasi  40  g/ml  toksin  B  tanpa-FITC  dengan    masing-masing konsentrasi 0, 0,05, 0,10, 0,50, 1,00 dan 5,00  g/ml toksin- FITC  dalam  suspensi  sel.  Kultur  diikubasi  pada  suhu  4  C selama 1 jam, kemudian kultur disentrifus  300 g, pada 4  C selama 5 menit dan pelet sel  dicuci  dua kali dengan 1 ml PBS.  Selanjutnya  pelet  sel  diresuspensikan  dalam  1  ml PBS dan segera dianalisis pada flow cytometry .
Gambar  1.    Sitogram flow    cytometry :    Log  intensitas  sinar  difraksi  (LFLS)  meningkat  menunjukkan  populasi  sel hidup  (H)  dan  log  intensitas  sinar  refraksi  (90LS)  meningkat  dengan  LFLS  menurun  menunjukkan populasi sel mati (G);.  Populasi (a) sel hibridoma dan (b) sel Caco-2.
Log Intensitas difraksi LFLS L90LS Lo g int en si ta s re fra k si
Gambar 2.   Histogram   fluoresens      dari     toksin B-FITC;  (a) populasi sel tanpa toksin B-FITC, tidak berfluoresens, (b) populasi sel berfluoresens dengan toksin B-FITC yang terikat pada reseptor, penambahan 40  g/ml toksin-FITC pada 10 6 sel/ml  sel hibridoma LV
Ikatan  spesifik  adalah  terikatnya  toksin  pada spesifik  reseptor  yang  terdapat  pada  membran  sel hibridoma  LV  maupun  pada  Caco-2.  Karakteristik  spesifik antara  lain  adalah  mempunyai  afinitas  tinggi  terhadap reseptor  dan  pada  konsentrasi  yang  sedikit  akan memberikan respon fluoresens. Ikatan ini dapat ditentukan dengan  metoda  inkubasi  kompetitif  antara  toksin  B-FITC pada  konsentrasi  yang  terbatas  dengan  toksin-B  tanpa- FITC  pada  konsentrasi  yang  berlebih.    Penambahan secara bersamaan antara toksin tersebut akan memberikan fluoresens  pada  kultur,  dimana  nilai  fluoresens  ini dikatagorikan  sebagai  ikatan  non  spesifik  toksin  B-FITC pada  hibridoma  LV  dan  Caco-2.  Dengan  demikian  nilai persen  ikatan  spesifik    toksin    B-FITC    merupakan  selisih dari  total  ikatan  dengan  ikatan  non  spesifik  dibagi  total ikatan dikalikan 100 persen. Inkubasi kultur dilakukan pada suhu 4  C untuk menghindari terjadinya internalisasi toksin B-FITC  pada  sel  hibridoma  LV  dan  Caco-2  karena pengaruh suhu.
Analisis  penghambatan  ekstrak  diklorometan jahe terhadap pengikatan toksin B-FITC pada sel hibridoma LV dan Caco-2
Sebanyak  10 5 sel/ml  hibridoma  dan  Caco-2 ditambah 25 dan 50  g/ml ekstrak diklorometan jahe  dan berbagai  konsentrasi  0,  0,01,  0,05,  0,10,  0,50  dan  5,00  g/ml toksin B-FITC (konsentrasi akhir) dalam media RPMI 1640.  Kultur  diinkubasi  pada  4  C  selama  1  jam. Selanjutnya  kultur  disentrifus  pada  300  g,  4  C  selama  5 menit  dan    pelet  sel  dicuci  dua  kali  dengan  1ml  PBS, kemudian pelet sel  diresuspensikan  dalam 1 ml PBS dan segera dianalisis pada flow cytometry .
Penghambatan  ekstrak  jahe  terhadap  pengikatan toksin  B-FITC  pada  sel  hibridoma  LV  dan  Caco-2 ditentukan berdasarkan penurunan intensitas fluoresen  sel tersebut.  % penghambatan : {MIF (toksin-B-FITC) - MIF (toksin-B-FITC + jahe) }/  MIF (toksin-B-FITC) x 100 %.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh  ekstrak  diklorometan  jahe  terhadap pertumbuhan sel hibridoma LV dan  Caco -2 Kultur  hibridoma  LV  dan  Caco-2  yang ditumbuhkan  pada  media  RPMI,  10  persen  FCS,  yang mengandung  12,5,  25  dan  50  g/ml  ekstrak  diklorometan jahe.  Pertumbuhan  kultur  ini  selama    4  hari  dapat  dilihat pada  Gambar  3-4.      Pada  umumnya  kurva  pertumbuhan terdiri  atas  4  fase  yaitu  fase  adaptasi  pada  hari  ke  0-1, proliferasi  eksponensial  pada  hari  ke  1-3,  stasioner  dan penurunan    pada        hari    ke  4.      Penambahan  ekstrak diklorometan jahe  menyebabkan penurunan pertumbuhan kedua  jenis  sel  dibanding  kontrol  tetapi  dapat  menekan jumlah sel yang mati.
Hasil pengamatan ini sesuai dengan hasil penelitian yang  dilakukan  oleh  Surh  (1999)  bahwa  ekstrak  jahe terutama gingerol mempunyai pengaruh antiproliferasi pada sel HL-60.  Hal ini disebabkan gingerol dapat menghambat penyerapan Ca ++ pada  kondisi fosforilasi mikrosom.  Data tersebut  dapat  menduga    bahwa  gingerol  menghambat penyerapan  Ca ++ pada  fase  pertumbuhan,  tetapi  pada kondisi  tidak  fosforilasi  dapat  meningkatkan  penyerapan Ca ++ .
Log intensitas fluoresens Jum lah sel
0 30 60 90 120 0 1 2 3 4 Lama inkubasi  (hari) 0 ug/ml 12.5 ug/ml 25 ug/ml 50 ug/ml 0 10 20 30 0 1 2 3 4 Lama inkubasi (hari) 0 ug/ml 12.5 ug/ml 25 ug/ml 50 ug/ml
Gambar 3.   Pertumbuhan   10 5 sel/ml  Caco-2 pada  media RPMI 1640, yang mengandung 12,5, 25 dan 50  g/ml ekstrak diklorometan jahe.
0 30 60 90 120 0 1 2 3 4 Lama inkubasi (hari) Jahe 0 ug/ml Jahe 12.5 ug/ml Jahe 25 ug/ml Jahe 50 ug/ml 0 10 20 30 0 1 2 3 4 Lama inkubasi (hari) 0 ug/ml 12.5 ug/ml 25 ug/ml 50 ug/ml
Gambar 4.  Pertumbuhan  10 5 sel/ml   hibridoma  pada media RPMI 1640 yang mengandung 12,5, 25 dan  g/ml ekstrak diklorometan jahe.
Sehingga pada fase pertumbuhan tetap (stasioner) gingerol mempunyai aktivitas mempertahankan keseimbangan Ca ++ dan dapat menekan sel yang mati (Antipenko et  al., 1999).
Dijelaskan  lebih  lanjut  bahwa  Ca ++ mempunyai peranan  penting  dalam  pengaturan  intraseluler  dan mempunyai  fungsi  sebagai  pembawa  pesan  kedua  untuk molekul  ekstraseluler.  Hal  ini  di  tunjukkan  bahwa penyuntikan intraseluler dengan sejumlah kecil Ca ++ dapat mengakibatkan  sel  otot  berkontraksi,    sehingga  dapat dikatakan  bahwa  gingerol  dapat  mempertahankan keseimbangan  penyerapan  dan  pengeluaran  Ca ++ pada plasma membran tanpa fosforilasi.

## Reseptor kolera toksin B-FITC pada hibridoma LV dan Caco-2
Analisis  terhadap  populasi  sel  hidup  dan  mati dengan flow  cytometry (Gambar 2) memungkinkan untuk melihat pengikatan toksin  B-FITC pada populasi sel yang
hidup saja.  Kriteria terjadinya ikatan antara toksin B-FITC pada  reseptor  permukaan  sel  hibridoma  LV  dan  Caco-2 dengan  metoda flow  cytometry berdasarkan  pada peningkatan intensitas fluoresens permukaan sel.  Gambar 5 menunjukkan  kejenuhan reseptor toksin pada hibridoma LV dan Caco-2.  Peningkatan konsentrasi 0-5 ug/ml toksin B-FITC  pada  kultur  sel  hibridoma  LV  dan  Caco-2 meningkatan  intensitas  fluoresens,  yang  menunjukkan bahwa  kedua  jenis  sel  ini  mempunyai  reseptor  toksin kolera.    Kejenuhan  toksin  B-FITC  pada  hibridoma  LV kemungkinan  terjadi  pada  konsentrasi    0,5-1  g/ml  toksin B-FITC,  dan  peningkatan  intensitas  fluoresens  pada penambahan 1-5  g/ml toksin B-FITC kemungkinan karena adanya ikatan yang tidak spesifik dari toksin B-FITC pada hibridoma LV (Gambar 5a). Konsentrasi 1-5  g/ml toksin B- FITC terlihat dapat  menjenuhi semua pada   sel   Caco-2 (Gambar 5b).
Ju m lah se l m ati (x 1 0 4 se l/ m l)
Ju m lah se l h id u p (x 1 0 4 se l/ m l)
Ju m lah se l m ati (x 1 0 4 se l/ m l)
Ju m lah se l h id u p
(x 1 0 4 se l/ m l)
0 0.5 1 1.5 0 0.1 1 5 Kons.  toksin-FITC (ug/ml) In te n s it a s f lu o re s e n s 0 30 60 90 0 0.1 1 5 Kons. toksin-FITC (ug/ml) In te n s it a s f lu o re s e n s
Gambar 5.    Kurva  penjenuhan reseptor oleh  toksin B-FITC pada sel  hibridoma  LV (a) dan Caco-2 (b)
Reseptor  spesifik  toksin  B-FITC  pada  hibridoma LV dan Caco-2
Analisis  ikatan  spesifik  toksin  B-FITC  pada reseptor hibridoma LV dan Caco-2 dapat dilihat pada Tabel 1    dan  2.  Penambahan  konsentrasi  toksin  B-tanpa  FITC secara  berlebihan  pada  analisis  ikatan  spesifik  toksin- reseptor  bertujuan  untuk  memblok  keseluruhan  reseptor pada  permukaan  membran  sel  hibridoma  LV  dan  Caco-2, sehingga fluoresens yang dihasilkan merupakan fluoresens dari  toksin  B-FITC  yang  terikat  secara  tidak  spesifik. Penambahan   toksin  B-FITC pada berbagai konsentrasi 0- 5  g/ml  terhadap    hibridoma  LV  dan  Caco-2,  yang diasumsikan  sebagai  total  ikatan  menghasilkan  intensitas fluoresens  yang  lebih  tinggi  pada  Caco-2  daripada hibridoma  LV,  ini  berarti  jumlah  reseptor  toksin  B-FITC lebih  banyak  pada  Caco-2,  dengan  stereospsifik (kespesifikan)  ikatan  toksin  B-FITC  pada  Caco-2  sebesar 94,58  1,83  persen  dan  pada  hibridoma  LV    sebesar 44,62  3,49 persen.
Pengaruh  ekstrak  diklorometan  jahe  terhadap pengikatan  toksin  B-FITC  pada  sel  hibridoma  LV dan Caco-2
Pengaruh  25  dan  50  g/ml  ekstrak  diklorometan jahe  terhadap  pengikatan  0-5  g/ml  toksin  B-FITC  pada 10 5 sel  hibridoma  LV  dan  Caco-2  dalam  1  ml  RPMI disajikan  pada  Gambar    6  dan  7.      Ekstrak  diklorometan jahe  dalam        kultur  hibridoma  LV  dan  Caco-2    dapat menurunkan terikatnya toksin B-FITC  (Gambar 6a dan 7a) dengan  persentase  penghambatan  dapat  dilihat  pada Gambar  6b  dan  7b.  Nilai  penghambatan  dari  25  dan  50  g/ml  ekstrak  diklorometan  jahe  pada  hibridoma  LV berturut-turut   4,76-15,66 persen dan 12,96-24,68 persen. Penghambatan 25 dan 50  g/ml ekstrak diklorometan jahe pada  sel  Caco-2  berturut-turut  3,55-17,95  persen  dan 4,39-15,95 persen.
Tabel  1 . Total ikatan, ikatan  non spesifik dan  spesifik dari toksin  B-FITC pada     10 5 sel /ml  hibridoma LV, pada konsentrasi 40 ug/ml toksin  B-tanpa-FITC dengan berbagai konsentrasi toksin  B-FITC
Toksin-FITC (ug/ml) Nilai tengah intensitas fluoresens Ikatan total Ikatan non spesifik Ikatan spesifik % ikatan spesifik 0,00 0,00 0,00 0,00 0.00 0,05 0,54 0,30 0,24 44,44 0,10 0,73 0,40 0,33 45,20 0,50 0,83 0,42 0,41 49,97 1,00 0,91 0,51 0,40 43,00 5,00 1,26 0,75 0,51 40,47
a
b
Tabel 2.    Total ikatan, ikatan non spesifik dan    spesifik     toksin  B-FITC pada  10 5 sel /ml  Caco-2, pada konsentrasi 40 ug/ml toksin B tanpa-FITC dengan berbagai konsentrasi toksin  B-FITC
Toksin-FITC (ug/ml) Nilai tengah intensitas fluoresens Ikatan total Ikatan non spesifik Ikatan spesifik % ikatan spesifik 0,00 0.00 0,00 0.00 0,00 0,05 32,91 1,93 30,98 94,13 0,10 48,51 1,92 46,58 96,02 0,50 76,21 3,07 73,14 95,97 1,00 79,51 3,84 75,67 95,17 5,00 81,91 6,87 75,04 91,61
Penghambatan ekstrak diklorometan jahe terhadap ikatan  toksin  B-FITC  pada  hibridoma  LV  dan  Caco-2, mungkin  disebabkan  karena  ekstrak  jahe  memodifikasi receptor toksin.  Menurut (Nychas, 1995)   senyawa fenolik dan  minyak  atsiri  dapat  berinteraksi  dengan  fosfolipid, protein  dan  oligosakarida  yang  merupakan  komponen membran  sel.  Komponen  yang  terdapat  dalam  ekstrak diklorometan  jahe  seperti        gingerol,  shogaol,    zingeron dan  minyak  atsiri      dapat  berinteraksi  dengan  GM 1 yang merupakan  reseptor  pada  permukaan  sel  (Gill,1978), sehingga  toksin-FITC  tidak  dapat  berinteraksi  dengan  sel. Penggunaan  50  g/ml  ekstrak  diklorometan  jahe  dalam
suspensi  10 5 sel/ml  belum  cukup  untuk  menghambat keseluruhan  toksin  B-FITC,  yang  berarti  konsentrasi  ini tidak cukup untuk menjenuhi reseptor. Penggunaan ekstrak jahe  dengan  konsentrasi  diatas  50  g/ml  tidak  dilakukan karena  penggunaan  ekstrak  jahe  pada  penelitian  ini dibatasi  pada  konsentrasi  minimal      yang  mempengaruhi penurunan  proliferasi  sel  hibridoma  LV  dan  Caco-2.  Oleh karena itu penggunaan konsentrasi diklorometan jahe pada analisis  pengikatan  toksin  B-FITC  menggunakan  batas konsentrasi tersebut.
0 0.5 1 1.5 0 0.05 0.1 0.5 1 5 Kons.  toksin-FITC (ug/ml) In te n si ta s fl u o re se n si Jahe 0 ug/ml Jahe 25 ug/ml Jahe 50 ug/ml 0 10 20 30 0 0.05 0.1 0.5 1 5 Kons.  toksin-FITC (ug/ml) % P e n g h a m b a ta n Jahe 25 ug/ml Jahe 50 ug/ml
Gambar 6.    Pengaruh   ekstrak  diklorometan jahe 25 dan 50  g/ml terhadap ikatan toksin B-FITC pada sel hibridoma LV
10 5 sel/ml; (a)  intensitas fluoresens dan (b) persen penghambtan intensitas fluoresens.
a b
0 30 60 90 0 0.05 0.1 0.5 1 5 Kons. toksin-FITC (ug/ml) In te n si ta s fl io re se n si Jahe 0 ug/ml Jahe 25 ug/ml Jahe 50 ug/ml 0 10 20 0 0.05 0.1 0.5 1 5 Kons.  toksin-FITC (ug/ml) % P e n g h a m b a ta n Jahe 25 ug/ml Jahe 50 ug/ml
Gambar 7.  Pengaruh ekstrak diklorometan jahe  25 dan 50  g/ml terhadap ikatan toksin-FITC pada 10 5 sel/ml Caco- 2;
(a) intensitas fluoresens dan (b) persen penghambatan intensitas fluoresens.
Penghambatan  ikatan  toksin  B-FITC  pada  sel hibridoma  LV  dan  Caco-2  kemungkinan    disebabkan  oleh interaksi  senyawa  fenolik  yang  terkandung  dalam  ekstrak jahe    dengan  protein  toksin,  sehingga  toksin  B-FITC tersebut  tidak  dapat  mengenali  reseptornya.  Senyawa fenolik  tidak  hanya  berinteraksi  dengan  reseptor  toksin  B- FITC  pada  hibridoma  LV  dan  Caco-2,  tetapi  dapat berinteraksi  dengan  komponen  lain,  seperti  fosfolipid, protein  dan  lipoprotein.  Sedangkan  kolera  toksin  lebih spesifik  pada  gangliosida  GM 1 ,  sehingga  peluang komponen jahe untuk dapat berikatan dengan gangliosida GM 1 lebih rendah dibandingkan  GM 1 dengan toksin      B- FITC.
Menurut  Gill  (1978)  reseptor  toksin  pada  sel eukariot  lebih  banyak  pada  sel  usus  kecil  daripada  sel limfosit,  sehingga  turunannya  akan  membawa  sifat  sel primer.  Caco-2  yang  merupakan  turunan  sel    enterosit mempunyai reseptor toksin kolera lebih banyak dan spesifik daripada hibridoma LV, sehingga penghambatan terhadap ikatan toksin pada reseptor  cenderung lebih rendah pada Caco-2 daripada hibridoma LV.

## KESIMPULAN
Ekstrak  diklorometan  jahe  dapat  menghambat pengikatan  toksin  B-FITC    pada  reseptor  yang  terdapat pada  permukaan  sel  hibridoma  LV  dan  Caco-2. Penggunaan  25  dan  50  g/ml  ekstrak  diklorometan  jahe pada  kultur  sel  hibridoma  LV  berturut-turut  menunjukkan penghambatan  pengikatan  toksin  B-FITC  sebesar  4,76- 15,66  persen  dan  12,96-24,60  persen,  sedangkan    pada
sel Caco-2 menunjukkan  penghambatan pengikatan toksin B-FITC sebesar 3.55-17,95 persen dan 3,58-27,83 persen.
Ini  berarti  ekstrak  diklorometan  jahe    menghambat faktor  virulensi  bakteri  melalui  kemungkinan  mekanisme interaksi        komponen  ekstrak  jahe  dengan  reseptor  atau interaksi  dengan   toksin B-FITC.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terimakasih  kepada  DIKTI (Proyek  URGE)  dan  Pemerintah  Perancis  yang  telah mendanai penelitian ini

## DAFTAR PUSTAKA
Al-Rubeai,  M.  and  A.N.  Emery.    1996. Flow  cytometry applications  in  cell  culture.  Marcel  Dekker,  Inc. Hongkong.
Antipenko,  A.Y,  A.I.  Spielman    and  M.A.  Kirchberge. 1999. Interaction of 6-gingerol and ellagic acid with the cardiac sarcoplasmic reticulum Ca ++ ATPase. J. Pharmacol Exp. Ther. 290 (1): 227-234.
Calderwood,  E.T.  2000 .  Cholera  vaccines.  J.  Clin.  Infect. Dis. 31 (2): 561-565
Crociani, J., J.P. Grill, M. Humppert and J.    Ballongus. 1995 . Adhesion of different bifidobacteria strains to human  enterocyte-like  Caco-2  cell  and  comparison with in vivo study. J. Letters In Appl. Microbiol. 21: 146-148.
a
b
Duncan-Hewitt,  W.C.  1990 .  Natural  of  the  hydrophobic effect.  In    Doyle  RJ  and  M  .Rosenberg.  Eds. Microbial  Cell  Surface  Hydrophobicity.    American Society for Microbiology. Washington. D.C.
Fardiaz,  D.,  S.  Fardiaz  dan  C.H.  Wijaya.  1992. Antioxidant  and  antimicrobial  activity  of  food flavorings.    Proceedings  of  Symposium  on  Flavour Technology and Its Application in the Food Industry. November 26, 1992. Jakarta.
Hiserodt, R.D., S.G.  Franzblau and  R.T. Rosen.  1998. Isolation  of  6-,  8-  and  10-gingerol  from  ginger rhizome  by  HPLC  and  preliminary  evaluation  of inhibition of Mycobacterium avium and Mycobacterium  tuberculosis. J.  Agric.  Food  Chem. 46: 2504-2508.
Holmgren, J. 1978. Cholera toxin and the cell membrane. In Jeljaszewicz, J. and T. Wadstrom. Eds. Bacterial Toxins  And  Cell    Membranes.    Academic  Press. New york.
Kimura M., L. Kimura, B. Luo and S.  Kobayashi. 1991 . Antiinflammatory effect of Japanese-Seno medicine Keishi-Kajutsubu-to  and  its  component  drugs  on adjuvant  air  pouch  granuloma  of  mice.    J. Phytotherapy-Res. 5 (5): 195-200.
Mishra,  D.  and  M.    Dhirendra.  1990. Seed  protectant property  of  essential  oil  of Zingiber  officinale Roscoe. J. Indian Perfumer. 34 (4): 266-268.
Neinaber,  N.L.P.,  W.P.  Rahayu  dan  N.  Andarwulan. 1997. Sifat  antioksidan  dan  antimikroba  rempah- rempah  dan  bumbu  tradisional  Makalah  Seminar Khasiat dan Keamanan Rempah, Bumbu dan Jamu Tradisional. PKMT, PAU Pangan dan Gizi dan LPM. IPB. Bogor.
Nurrahman, F.R. Zakaria, D. Sajuthi dan Sanjaya. 1999 . Pengaruh konsumsi sari jahe terhadap perlindungan limfosit dari stres oksidatif pada mahasiswa pondok pesantren Ulil Al Baab. Prosiding Seminar Nasional Teknologi Pangan. 707-716.
Nychas, G.J.E. 1995 . Natural antimicrobials from plans. In Gould  GW.  Ed.      New  Methods  of  Food
Preservation.    Blackie  Academic  and  Profesional. London.
Radiati,  E.L.  2002 .  Mekanisme  Penghambatan  Virulensi Bakteri  Enteropatogen  oleh  Ekstrak  Rimpang  Jahe (Zingiber officinale Roscoe). Disertasi IPB. Bogor
Sohni,Y.R., Padmaja-Kaimal, R.M. Bhatt and P. Kaimal.
1995. Prophylactic  therapy  of Salmonella  typhi septicemia  in  mice  with  a  traditionally  prescribed crude  drug  formulation.  J.  Ethnopharmacol.  45  (2): 141-147.
Surh, Y.J., E. Lee.  and J.M. Lee.  1998 .  Chemoprotective properties  of  some  pungent  ingredients  present  in red  pepper  and  ginger.  J.  Mutat.  Res.  402  (1-2): 259-257.
Watanabe,  K.,  N.  Tamaru,  H.  Takihara  and  M.  Yosida.
1994. Syosaiko-to  and  Saibuku-to  (Chinese- Japanese herbal medicine) suppress the release of arachidonic acid metabolites from  cultured porcine pulmonary artery
endothelial cell.
J. Entnopharmacol. 43 (3): 191-196.
Wijayakusuma,  H.  1997 .  Khasiat  rempah-rempah  dan bumbu dalam makanan minuman. Makalah seminar khasiat  dan  keamanan  rempah,  bumbu  dan  jamu tradisional. PKMT, PAU Pangan dan Gizi dan LPM. IPB. Bogor.
Zakaria, F.R, L. Darsana and. H. Wijaya 1996 . Immunity enhancement  and  cell  protection  activity  of  ginger buds  and  fresh  ginger  flesh  on  mouse  spleen lymphocytes.  In  Non-Nutritive  Health  Factors  for Future  Foods.  Proceedings  IUFoST  ’96  Regional Symposium.  Seoul  Education  and  Culture  Center. Seoul, Korea.
Zakaria, F.R dan T.M. Rajab. 1999. Pengaruh ekstrak jahe ( Zingiber  officinale Roscoe)  terhadap  produksi radikal  bebas  makrofag  mencit  sebagai  indikator imunostimulan  secara  invitro.  Prosiding  Seminar Nasional Teknologi Pangan. 707-716.