## Keanekaragaman Sumberdaya Genetik Sayuran Polong Potensial di Indonesia berdasarkan Penanda Molekuler ISSR
Comparative analysis of Genetic Diversity among Pod Vegetables Genetic Resources Potential in Indonesia Revealed by ISSR Markers
Ria Rif’atunidaudina 1 , Sobir 2,3* , dan Awang Maharijaya 2,3
Diterima 06 Maret 2019/Disetujui 21 Oktober 2019

## ABSTRACT
Cowpea  (Vigna  unguiculata  ssp.  unguiculata),  yard  long  bean  (Vigna  unguiculata  ssp. sesquipedalis), Bambara groundnut (Vigna subterranea), lima bean (Phaseolus lunatus), bush bean (Phaseolus vulgaris), jack bean (Canavaliaen siformis), velvet bean (Mucuna pruriens) and winged bean  (Psophocarpus  tetragonolobus)  are  the  important  pod  vegetable  of  the  legume  crop  in Indonesia. These crops have a high economic and nutritional value. Its dry seeds are rich in proteins just  like  soybeans  that  can  support  human  health  and  future  food  supply.  The  genetic  diversity among  different  pod  vegetables  is  not  very  well  known.  The  objectives  of  this  research  were  to determine the genetic relationships among different pod vegetable species based on ISSR markers. Thirty two  accessions were analyzed by 11 ISSR  primers. The result showed that the ISSR  marker generated  80  DNA  band  with  the  polymorphism  rate  of  100%  and  the  informative  primers  were PKBT  3  and  PKBT  6.  The  result  of  cluster  and  PCA  analysis  grouped  all  32  accessions  of  the vegetable pod into eight clusters, indicating that the majority of the accession of a given species tend to group. Gower's similarity coefficient among all accessions varied from 0.425 to 0.988, and from 0.444  to  0.700  at  the  species  level.  The  ISSR  markers  revealed  the  close  relatedness  between  V. subterranea - C. ensiformis species, while the greatest distance was found between the P. vulgaris - M. pruriens species. Such a determination of relatedness is useful for a better understanding of the relationships among different pod vegetable species, which are generally considered to be a complex group with high phenotypic variability.
Keywords: clustering, genetic distance, polymorphism, pulses, similarity coefficient

## ABSTRAK
Kacang tunggak  ( Vigna unguiculata ssp unguiculata ), kacang panjang ( Vigna unguiculata ssp sesquipedalis ), kacang Bogor ( Vigna subterranea ), koro kratok ( Phaseolus lunatus ), kacang merah ( P. vulgaris ),  koro  pedang  ( Canavalia  ensiformis ),  koro  benguk  ( Mucuna  pruriens )  dan  kecipir ( Psophocarpus tetragonolobus ) merupakan sayuran polong penting di Indonesia dari tanaman kacang- kacangan. Tanaman  tersebut bernilai ekonomi tinggi dan kaya nutrisi dengan kandungan protein biji keringnya  yang  hampir  sama  dengan  kedelaidan  dapat  menunjang  kesehatan  manusia sekaligusmenunjang  pangan  di  masa  depan.  Informasi  keragaman  genetik  di  antara  sayuran  polong yang berbeda masih terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman genetik dalam dan antar  sayuran  polong  yang  berbeda  spesies  berdasarkan  marka  ISSR.  Sebanyak  32  aksesi  sayuran polong  dianalisis  menggunakan  11  primer  ISSR  menghasilkan  80  pita  polimorfik  dengan  persentase polimorfisme  sebesar  100%  dan  primer  informatif  yang  didapat  adalah  PKBT  3  dan  PKBT  6.  Hasil analisis  kluster  dan  analisis  PCA  mengelompokkan  32  aksesi  tersebut  ke  dalam  delapan  kluster  dan menunjukkan mayoritas aksesi yang satu spesies mengelompok bersama. Koefisien kemiripan genetik Gower  keseluruhan  aksesi  berkisar  antara  0.425-0.988,  dan  koefisien  kemiripan  delapan  spesies berkisar  antara  0.444-0.700.  Hubungan  kekerabatan  antara  spesies V.  Subterranean - C.  Ensiformis
1 Mahasiswa Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, IPB
2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Jawa Barat.
3 Pusat Kajian Hortikultura Tropika, LPPM Institut Pertanian Bogor Jl. Pajajaran, Kampus IPB Barangsiang, Bogor 16141, Jawa Barat. E-mail: ridwansobir@gmail.com (*Penulis korespondensi)
memiliki jarak genetik terkecil, sedangkan jarak genetik terbesar ditemukan antara spesies P. vulgaris - M. pruriens . Penentuan kekerabatan tersebut bermanfaat  untuk pemahaman  yang lebih lanjut  tentang hubungan di antara sayuran polong yang berbeda spesies, yang umumnya dianggap sebagai kelompok yang kompleks dengan variabilitas fenotipik yang tinggi.
Kata kunci: jarak genetik, kacang-kacangan, koefisien kemiripan, pengelompokkan, polimorfisme

## PENDAHULUAN
Sayuran  polong  termasuk  ke  dalam famili  Fabaceae  (Leguminosae)  merupakan edible  legume yang  menjadi  komoditas hortikultura.  Indonesia  sebagai  negara  yang terletak  di  kawasan  khatulistiwa  menjadikannya negara  megabiodiversitas,  termasuk  ke  dalam salah satu dari 12 pusat distribusi keanekaragaman  genetik  tanaman  (Dunggio dan Gunawan, 2009), memiliki keanekaragaman sumber  daya  genetik,  salah  satunya  adalah sayuran  polong,  seperti  buncis,  kacang  merah ( Phaseolus  vulgaris ),  kecipir  ( Psophocarpus tetragonolobus ),  koro  karatok  ( Phaseolus lunatus ),  koro  pedang  ( Canavalia  ensiformis ), kacang  panjang  ( Vigna  unguiculata ssp sesquipedalis )  dan  kacang  tunggak  ( Vigna unguiculata ssp ungiculata ),  kacang  Bogor ( Vigna  subterranean ),  koro  benguk  ( Mucuna pruriens )  dan  komak  ( Lablab  purpureus ). Sayuran  polong  adalah  komponen  keragaman hayati  pertanian  yang  memiliki  peranan penting  dalam  keamanan  pangan  sumber protein  bagi  negara  berkembang  dan  sebagai bahan  baku  industri  pangan  di  negara  maju, namun,  di  Indonesia  pemanfaatan  sayuran polong  masih  terbatas  pada  konsumsi  polong muda,  sedangkan  biji  tua  (biji  kering)  belum dimanfaatkan dengan baik.
Biji  kering  sayuran  polong  potensial dikembangkan  sebagai  sumber  protein  nabati (18.8-50.7%) (Ningombam et al., 2012; Yao et al .,  2015),  dapat  dijadikan  pangan  fungsional karena  memiliki  kandungan  karbohidrat  yang tinggi  dengan  indeks  glikemiks  yang  rendah (Marsono et  al., 2002)  dan bahan  obat-obatan ( Dhanasekaran et al ., 2008). Selain kandungan nutrisi  yang  tinggi,  tanaman  sayuran  polong dapat  dibudidayakan  di  lahan-lahan  marginal (Gweyi-Onyango et al., 2011; Hall, 2012; Win dan Oo, 2015) dan mampu berproduksi dengan baik  karena  tanaman  sayuran  polong  umunya berasal  dari  daerah  tropis  dan  telah  menyebar luas  di  Indonesia,  berbeda  dengan  kedelai yang  berasal  dari  daerah  subtropis  sehingga
mengalami  kendala  rendahnya  produktivitas akibat ditanam bukan pada daerah adaptasinya (Nazir et al., 2016).
Keanekaragaman  sayuran  polong  yang melimpah  tersebut  menjadi  hal  penting  bagi pemulia tanaman sehingga diperlukan informasi  keragaman.  Informasi  keragaman genetik  intra  dan  interspesifik  merupakan informasi yang sangat berguna dalam konservasi  dan  pengelolaan  plasma  nutfah potensial dalam pengembangan potensi genetik pada program pemuliaan (Ben-Ying et al., 2010)  sehingga  kuantifikasi  keragaman genetik  tanaman  menjadi  sangat  berguna. Pendekatan  yang  dapat  dilakukan  untuk mendeterminasi  keragaman  genetik  tanaman dapat  berdasarkan  marka  morfologi,  biokimia dan  molekuler.  Studi  keragaman  genetik  pada tanaman  legum  sebelumnya  berfokus  pada keterkaitan  genetik  di  antara  sejumlah  aksesi atau kelompok genotipe spesifik (intraspesifik) menggunakan  marka  morfologi  dan  atau molekuler atau perbandingan jenis marka yang berbeda  dalam  menilai  keterkaitan  genetik dalam  genus  tertentu  (intragenerik)  (Tar’an et al., 2005).  Penelitian  ini  berfokus  pada keragaman  genetik  pada  tingkat  intraspesifik dan  interspesifik  tanaman  legum  yang  banyak tumbuh dan potensial di Indonesia menggunakan marka molekuler.
Keragaman  genetik  berbasis  penanda molekuler  bukan  merupakan  produk  hasil interaksi  antara  gen  dan  lingkungan  sehingga mampu  menunjukan  keragaman  aktual  di antara individu yang diamati dan meningkatkan  estimasi  keragaman  genetik tanaman  dibandingkan  penanda  yang  berbasis morfologi. Inter  Simple  Sequence  Repeat
(ISSR) merupakan salah satu penanda molekuler  yang  menggunakan  teknik  PCR ( Polymerase  Chain  Reaction )  berbasis  DNA yang mampu memberikan informasi mengenai polimorfisme, hubungan genetik dan keragaman (Anne,  2006).  Metode  ini  banyak  digunakan karena  tekniknya  sederhana,  cepat  dan  murah (Vijayan, 2005; Peng et al., 2014),
menghasilkan  pola  polimorfisme  lebih  tinggi daripada RAPD (Gajera et al., 2014), dan telah digunakan  untuk  analisis  keragaman  dan hubungan kekerabatan pada populasi intraspesifik,  interspesifik  dan  intergenerik (Singh et  al., 2014;  Dvořáková et  al .,  2015). Hasil  percobaan  Dvořáková et  al. (2015) melaporkan  marka  ISSR  dapat  digunakan untuk  mengidentifikasi  keragaman  genetik pada 69 aksesi millet yangterdiri dari 8 genus. Informasi  keragaman  genetik  pada tingkat  intraspesifik  maupun  interspesifik memberikan kontribusi positif terhadap proses seleksi  tetua  persilangan  dari  spesies  yang sama (intraspesifik) atau untuk
mengidentifikasi  tetua  yang  paling  dekat hubungan  kekerabatannya  untuk  persilangan interspesifik  dalam  meningkatkan  heterosis dan menggabungkan gen yang diinginkan dari latar  belakang  genetik  yang  lebih  beragam, akan  tetapi  informasi  keragaman  genetik  di antara  spesies  sayuran  polong  yang  berbeda masih  sangat  terbatas.  Penelitian  ini  bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman genetik dan hubungan  kekerabatan  antar  sumber  daya genetik  sayuran  polong  menggunakan  marka ISSR  Hasil  penelitian  ini  dapat  digunakan sebagai  informasi  awal  dalam  kegiatan pemuliaan  sayuran  polong  di  Indonesia  untuk pengelolaan plasma nutfah dan pemilihan tetua potensial.

## BAHAN DAN METODE
Analisis molekuler dilakukan di Laboratorium Molekuler Pusat Kajian Hortikultura Tropika (PKHT), Institut Pertanian  Bogor,  Baranangsiang,  Bogor,  Jawa Barat  pada  bulan  Agustus  2016  sampai Februari 2017. Materi genetik yang digunakan adalah  8  spesies  tanaman  legum  yang  umum dikonsumsi sebagai sayuran polong terdiri dari 32 aksesi (Tabel 1). Benih dari masing-masing aksesi  ditanam,  kemudian  saat  tanaman berumur  14  HST,  pucuk  daun  dipetik  untuk dilakukan  isolasi  DNA.  Isolasi  DNA  genom menggunakan metode cethyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) (Agbagwa et al., 2012) dengan beberapa modifikasi penambahan pasir kuarsa dan antioksidan PVP ( polyvinyl  pyrrolidone ).  Pengujian  kualitas DNA dilakukan dengan menggunakan metode
elektroforesis  pada  gel  agarose  0.8%  (b/v). Primer  yang  digunakan  untuk  ampilfikasi DNA  adalah  11  primer  ISSR  yang  telah  diuji melalui  tahap  optimasi  suhu annealing dan polimorfisme  antar  aksesi  dalam  spesies  dan beda  spesies  koleksi  PKHT,  yakni  primer PKBT 1, PKBT 2, PKBT 3, PKBT 4, PKBT 5, PKBT  6,  PKBT  7,  PKBT  8,  PKBT  9,  PKBT 10 dan PKBT 12.
Komposisi  reaksi  PCR  ( polymerase chain  reaction )  yang  digunakan  terdiri  atas  1 μl  DNA template ,  1  μl  primer,  6  μl go  tag green master mix dan 5 μl nuclease free water
(air  bebas  RNAse)  yang  dicampurkan  dalam satu microtube sehingga  total  volume  PCR mix  sebanyak  13  μl,  kemudian  diamplifikasi menggunakan  mesin  PCR  merk Applied Biosystem 2720 thermal cycler dengan tahapan pre  heat (94 0 C,  5  menit),  dilanjutkan  dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturation (94 0 C, 30  detik), annealing (53-54 0 C,  1  menit)  dan extention (72 0 C,  1  menit)  serta  diakhiri dengan final  extension (72 0 C,  5  menit). Produk PCR  dielektroforesis  pada  gel  agarose dengan  konsentrasi  1.2%  dalam  1×  buffer TAE  selama  47  menit  pada  tegangan  50  volt. Selanjutnya,  agar  direndam  ke  dalam  larutan EtBr 1% selama 10 menit kemudian divisualisasi dengan UV transiluminator dan didokumentasikan menggunakan  kamera  digital  dengan  merek Sonny DSC Cyber-shot DSC-W570, 16.1 mega
pixels, 5x optical zoom . Pengamatan  pola  pita  DNA  yang dihasilkan
menggunakan marka ISSR dilakukan  berdasarkan  tingkat  migrasi  yang sama. Nilai 1 apabila terdapat pita dan nilai 0 apabila  tidak  terdapat  pita.  Data  biner  yang terbentuk  digunakan  untuk  analisis  gerombol ( cluster  analysis )  dan  komponen  utama ( principal component analysis ). Metode pengelompokkan menggunakan metode average lingkage sedangkan  perhitungan  koefisien kemiripan  metode  Gower  (Kaufman  dan Rousseeuw,  1990).  Perangkat  lunak  yang digunakan PBSTAT package “cluster” . Tingkat keselarasan pengelompokkan ditentukan berdasarkan nilai koefisien agglomerative yaitu kesesuaian  pengelompokkan  dengan  kriteria kuat (0.71 ≤ AC ≤ 1.00), sesuai (0.51 ≤ AC ≤ 0.70),  lemah  (0.26  ≤  AC  ≤  0.50)  dan  sangat tidak  sesuai  (AC  ≤  25)  (Kaufman  dan Rousseeuw  1990).  Analisis  komponen  utama menggunakan  perangkat  lunak  MINITAB  16.

## Tabel 1. Materi genetik 32 aksesi sayuran polong yang dianalisis
No. Nama Umum Aksesi Spesies Asal Koleksi Ketinggian Tempat (m dpl) Lintang Geografis 1 Kacang tunggak VUu1 Vigna unguiculata ssp unguiculata Socah, Madura, Jawa Timur 6 7˚07'46"S 112˚43'06"E 2 VUu3 Socah, Madura, Jawa Timur 6 7˚07'46"S 112˚43'06"E 3 VUu5 PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 4 VUu6 PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 5 VUu7 Jepang 37˚07'50"N 137˚59'44"E 6 VUu8 Benteng, Indragiri hilir, Riau 6 0°39'34"S 103°06'54"E 7 VUu9 Ciamis, Jawa Barat 443 7˚33'05"S 108˚09'43"E 8 VUu10 Ciamis, Jawa Barat 443 7˚33'05"S 108˚09'43"E 9 VUu11 PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 10 VUu12 Ciamis, Jawa Barat 443 7˚33'05"S 108˚09'43"E 11 VUu13 PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 12 VUu14 Ciamis, Jawa Barat 443 7˚33'05"S 108˚09'43"E 13 VUu15 PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 14 VUu16 PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 15 Kacang panjang VUs1 Vigna unguiculata ssp sesquipedalis Bogor, Jawa Barat 182 6˚33'37"S 106˚43'39"E 16 VUs2 Madura, Jawa Timur 6 7˚07'46"S 112˚43'06"E 17 VUs3 Labdik Pemuliaan AGH 193 6˚33'19"S 108˚43'44"E 18 VUs4 Labdik Pemuliaan AGH 193 6˚33'19"S 108˚43'44"E 19 Kacang Bogor VS1 Vigna subterranea Madura, Jawa Timur 6 7˚07'46"S 112˚43'06"E 20 VS2 Bogor, Jawa Barat 182 6˚33'37"S 106˚43'39"E 21 Koro kratok PL1 Phaseolus lunatus PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 22 PL3 PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 23 Kacang merah PV4 Phaseolus vulgaris Purwakarta, Jawa Barat 105 6˚32'04"S 107˚27'14"E 24 Koro pedang CE2 Canavalia ensiformis Plumbon, Cirebon, Jawa Barat 8 6˚41'23"S 108˚28'51"E 25 Koro benguk MP2 Mucuna pruriens Madura, Jawa Timur 6 7˚07'46"S 112˚43'06"E 26 Kecipir MP3 Bogor, Jawa Barat 182 6˚33'37"S 106˚43'39"E 27 PT1 Psophocarpus tetragonolobus Madura, Jawa Timur 6 7˚07'46"S 112˚43'06"E 28 PT2 Sumedang, Jawa Barat 520 6˚48'55"S 107˚57'05"E 29 PT3 Klaten, Jawa Tengah 146 7˚38'21"S 110˚39'52"E 30 PT4 PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 31 PT5 PKHT 252 6˚35'47"S 106˚48'34"E 32 Kedelai GM Glycine max Balitkabi 405 8˚02'50"S 112˚37'32"E

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis  dan  Profil  Penanda  Molekuler ISSR
Pada  11  primer  ISSR  digunakan berhasil  mengidentifikasi  keragaman  dan kedekatan  hubungan  dari  32  aksesi  sayuran polong  ditunjukkan  dengan  munculnya  pola pita  yang  polimorfik.  Hal  ini  berarti  primer yang  digunakan  mampu  mengamplifikasi sekuen  genom  sayuran  polong  yang  diamati dengan menghasilkan pola pita yang bervariasi antar aksesi dan antar primer.Jumlah pita DNA yang  dihasilkan  sebanyak  80  pita  dengan jumlah  pita  per  primer  berkisar  antara  5-10 pita dengan ukuran berkisar antara >250-2000 pasang  basa  (Tabel  2).  Penentuan  ukuran  pita DNA  didasarkan  pada  laju  migrasi  tertentu diurutkan  dengan  bantuan  DNA  standar  1  kb Ladder (Promega,  USA)  yang  memiliki ukuran  mulai  dari  250  hingga  10000  pasang basa,  sedangkan  ISSR  adalah  marka  dominan yang  mengamplifikasi  fragment  DNA  yang berukuran  100-3000  pasang  basa  yang  berada di antara dua mikrosatelit (Ng dan Tan, 2015), oleh karena itu, ukuran fragment DNA kurang dari  250  pasang  basa  tidak  dapat  ditentukan dengan bantuan  DNA  standar.Primer  PKBT  1 menghasilkan  jumlah  pita  terendah  dan  dan primer  PKBT  3  menghasilkan  jumlah  pita terbanyak  (Tabel  2).  Perbedaan  jumlah  pita yang  dihasilkan  disebabkan  oleh  banyak  atau sedikitnya  sekuen  komplemen  dari  susunan basa  dari  primer  yang  digunakan.  Hal  ini berarti  susunan  basa  dengan  pola  (AC) 8 TG memiliki  sekuens  komplemen  lebih  sedikit
dibandingkan  dengan  susunan  basa  yang berpola  (AC) 8 T  pada  genom  sayuran  polong. Primer  PKBT  3  dan  PKBT  6  merupakan primer  informatif  karena  sekuen  primer memilki  banyak  kecocokan  dengan  urutan basa  mikrosatelit  yang  terdapat  pada  sampel tanaman  maupun  genom  tanaman  lainnya, seperti  anggrek  (Romeida et  al., 2012), manggis  (Sulassih et  al., 2013)  dan  tarum (Hariri et al., 2017).
Pita  polimorfik  ditentukan  berdasarkan variasi  pita  yang  muncul  pada  jarak  migrasi fragmen  DNA  yang  sama,  yakni  pita  yang berada pada lokus ISSR yang sama. Persentase pita  polimorfik  pada  setiap  primer  yang digunakan sangat tinggi, yakni 100%.
Besarnya  persentase  pita  polimorfik  yang dihasilkan  diduga  dikarenakan  jenis  sayuran polong  yang  digunakan  memiliki  tingkat taksonomi  yang  bervariasi.  Hasil  penelitian menunjukkan  persentase  pita  polimorfik  pada populasi  interspesifik  memiliki  persentase polimorfis lebih tinggi (Thul et al., 2012) bila dibandingkan  dengan  populasi  intraspesifik ( Rana  et  al., 2014).  Menurut  Hariri et  al.
(2017)  pita  polimorfik  dapat  disebabkan  oleh adanya  perbedaan  jenis  tanaman,  tingkat takson,  jumlah  sampel  yang  dianalisis  dan jumlah  primer  ISSR  yang  digunakan,  oleh karena  itu,  semakin  bervariasi  populasi, banyaknya sampel dan primer yang digunakan untuk  analisis  diduga  akan  menghasilkan tingkat  polimorfisme  yang  semakin  tinggi pula. Gambar 1 mempresentasikan jumlah pita tertinggi yang terbentuk oleh primer PKBT 3.
Tabel 2. Rekapitulasi susunan basa, jumlah pita, persentase pita polimorfik dan ukuran pita hasil amplifikasi DNA 11 primer ISSR pada 32 aksesi sayuran polong
No. Nama Sekuen 5'-3' Annealing ( 0 C) Jumlah Pita Pita Polimorfik Persentase Pita Polimorfik (%) Ukuran Fragmen (bp) 1 PKBT 1 (AC) 8 TG 54 5 5 100 >250-2000 2 PKBT 2 (AC) 8 TT 53 6 6 100 250-1500 3 PKBT 3 (AC) 8 T 53 10 10 100 <250 - >1500 4 PKBT 4 (AG) 8 AA 53 7 7 100 <250-1000 5 PKBT 5 (AG) 8 TA 53 7 7 100 <250-1000 6 PKBT 6 (AG) 8 TT 53 9 9 100 <250->2000 7 PKBT 7 (GA) 9 A 53 7 7 100 <250-1000 8 PKBT 8 (GA) 9 C 54 8 8 100 <250-1000 9 PKBT 9 (GA) 9 T 54 6 6 100 250-1000 10 PKBT 10 (GT) 9 A 54 7 7 100 250-2000 11 PKBT 12 (GT) 9 T 54 8 8 100 500-2000 Total 80 80 Rata-rata 7.27 100
Gambar 1.  Elektroforegram  hasil  amplifikasi  DNA  32 aksesi  sayuran polong  menggunakan primer ISSR  kode  PKBT  3.No  1-14  =  VUu  (kacang  tunggak);  No.15-18  =  VUs  (kacang panjang);  N.19-20  =  VS  (kacang  Bogor);  No.  21-22  =  PL  (koro  kratok);  No.  23  =  PV (kacang merah); No. 24 = CE (koro pedang); No. 25 = GM (kedelai); 26-27 = MP (koro benguk); No. 28-32 = PT (kecipir).
Keragaman Genetik dan Hubungan Kekerabatan  Antar  dan  Inter  Spesies Sumber Daya Genetik Sayuran Polong
Analisis  keragaman  dan  hubungan kekerabatan  berbasis  penanda  molekuler bersifat  stabil  dan  independen  dari  pengaruh lingkungan dan jaringan serta dapat identifikasi  pada  tahap  awal  perkembangan dan  menunjukkan  perbedaan  di  level  genetik (DNA)  (Tar’an et  al., 2005).  Keragaman genetik  dan  hubungan  kekerabatan  32  aksesi sayuran  polong  dalam  penelitian  ini  dapat diamati pada tingkat intraspesifik, interspesifik dan intergenerik. Sumber daya genetik sayuran polong  yang  dianalisis  terdiri  dari  8  spesies, yaitu  (1) V.  unguiculata yang  terdiri  dari  dua subspecies, yaitu V. unguiculata ssp Unguiculata (kacang tunggak) dan V. unguiculata ssp Sesquipedalis (kacang panjang) , (2) V. subterranean (kacang Bogor),
(3) P.  lunatus (koro  kratok) , (4) P.  vulgaris
(kacang  merah) , (5) G.  max (kedelai) , (6) C. ensiformis (koro  pedang) , (7) M.  pruriens (koro  benguk)  dan  (8) P.  tetragonolobus (kecipir).  Hasil  analisis  hubungan  genetik berdasarkan  metode  Gower  antar  32  aksesi menghasilkan nilai koefisien kemiripan berkisar  antara  0.425-0.988  atau  jarak  genetik antara  0.012-0.575.  Pasangan  aksesi  yang memiliki  koefisien  kemiripan  terbesar  adalah aksesi V. unguiculata ssp Unguiculata (kacang tunggak)  No.  1-5  dan  3-12,  sedangkan pasangan  aksesi  yang  memiliki  koefisien
kemiripan  terkecil  adalah  antara P.  vulgaris (kacang  merah)  No.  4  dan M.  pruriens (koro benguk) No. 2.
Pada tingkat intraspesifik (dalam spesies),  nilai  koefisien  kemiripan  sumber daya  genetik  sayuran  polong  yang  diamati menunjukkan  tingkat  variasi  yang  rendah. Koefisien  kemiripan  spesies V.  unguiculata berkisar  antara  0.838-0.988  dengan  jarak genetik terendah adalah pasangan VUu1-VUu5 dan  VUu3-VUu12,  sedangkan  jarak  genetik tertinggi adalah pasangan VUu16-VUs1. Spesies V.  subterranea memiliki  koefisien kemiripan  sebesar  0.975  (VS1-VS2).  Spesies P. lunatus (PL1-PL3)  dan M.  pruriens dan  (MP2-
MP3)  sama-sama  memiliki  koefisien  kemiripan sebesar 0.913. Spesies P. tetragonolobus memiliki koefisien  kemiripan  sebesar  0.862-0.975  dengan jarak  genetik  terendah  adalah  pasangan  PT4- PT4,  sedangkan  jarak  genetik  tertinggi  adalah pasangan PT1-PT2.
Nilai  koefisien  kemiripan  pada  tingkat interspesifik  diperoleh  dari  rata-rata  nilai koefisien kemiripan aksesi dari masing-masing spesies . Pada  tingkat  interspesifik  (antar spesies),  nilai  koefisien  kemiripan  sumber daya genetik sayuran polong yang diamati juga menunjukkan  tingkat  variasi  yang  rendah, yakni berkisar antara 0.444-0.700 dengan jarak genetik  terendah  adalah  antar  spesies P. vulgaris dengan M.  pruriens, sedangkanjarak genetik  tertinggi  adalah  antar  spesies C. ensiformis dengan V. subterranea. (Tabel 3) .
Tabel 3. Matriks nilai koefisien kemiripan antar 8 spesies sayuran polong yang diamati
Spesies VU VS PL PV CE MP PT GM VU 1 VS 0.594 1 PL 0.512 0.600 1 PV 0.569 0.625 0.669 1 CE 0.671 0.700 0.631 0.663 1 MP 0.538 0.606 0.506 0.444 0.631 1 PT 0.585 0.641 0.609 0.558 0.667 0.686 1 GM 0.590 0.600 0.606 0.588 0.675 0.544 0.552 1 Keterangan: VU = V. unguiculata , VS = V. subterranea, PV = P. vulgaris, PL = P. lunatus, CE = C. ensiformis, MP = M. pririens , PT = P. tetaragonolobus dan GM = G. max
Hasil  analisis  hubungan  genetik  pada tingkat interspesifik lebih menunjukkan keragaman  yang  lebih  tinggi  dibandingkan  pada tingkat  intraspesifik.  Pada  tingkat  kemiripan 44.40-70.00%  menunjukkan  bahwa  antar  spesies sayuran  polong  berada  pada  kelompok  yang berbeda, sedangkan pada tingkat kemiripan 91.25- 97.50%  menunjukkan  bahwa  antar  aksesi  dalam spesies  yang  sama  berada  pada  kelompok  yang berbeda.  Hal  ini  diduga  dikarenakan  pada umumnya  spesies  pada  sayuran  polong  yang dianalisis  merupakan  tanaman  menyerbuk sendiri  dengan  tingkat  penyerbukan  silang yang  rendah  berkisar  antara  1-20%  dan persarian  terjadi  sebelum  bunga  mekar (kleistogami)  (BOSTID,  1981;  Vaz et  al., 1998;  Liu et  al .,  2014).  Meskipun  demikian antar  spesies  sayuran  polong  yang  diamati dapat dikategorikan ke dalam tingkat keragaman  yang  rendah,  yakni  kurang  dari 40%  (Gambar  2).  Hal  ini  diduga  dikarenakan sayuran  polong  yang  diamati  merupakan monophyletic  group berdasarkan  analisis filogenetik menggunakan lokus DNA kloroplast.  Menurut  Wojciechowski  (2003) dan  Stefanovic et  al. (2009)  bahwa  genus Vigna, Phaseolus, Canavalia, Psophopocarpus, Glycine  dan  Mucuna  termasuk  ke  dalam taksonomi famili Fabaceae tribe Phaseoleae.

## Pengelompokkan  Sumber  Daya  Genetik Sayuran Polong
Pengelompokkan  suatu  koleksi  plama nutfah  tanaman  dapat  dilakukan  dengan analisis  gerombol  dan  analisis  komponen utama.  Teknik  analisis  gerombol  dilakukan dengan  menilai  keterkaitan  dan  jarak  dari setiap  sampel  berdasarkan  kesamaan  maupun perbedaan  yang  dimiliki  antar  aksesi.  Aksesi yang  mengelompok  dalam  satu  kelompok
menunjukkan kemiripan tinggi atau perbedaan jarak  genetik  yang  semakin  dekat  atau kekerabatan  yang  semakin  dekat  (Huda et  al.,
2017).  Berdasarkan  hasil  analisis  gerombol menunjukkan 32 aksesi sayuran polong terbagi ke  dalam  2  kelompok  utama  pada  jarak genetik 0.45, yaiktu kelompok utama A terdiri atas  4  aksesi  meliputi  spesies G.  max,  P. vulgaris dan P . lunatus yang mewakili sayuran polong  yang  berasal  dari  daerah  subtropika, sedangkan  kelompok  utama  B  terdiri  atas  28 aksesi  meliputi  spesies P.  tetragonolobus,  M. pruriens, C. ensiformis, V. subterranea dan V. unguiculata yang  mewakili  sayuran  polong yang  berasal  dari  daerah  tropika .  G.  max berasal  dari  Cina, P.  vulgaris dan P . lunatus berasal  dari  Amerika  Selatan  dan  Amerika Tengah, P.  tetragonolobus berasal  dari Indonesia ,  M.  pruriens berasal  dari  India  dan Afrika , C. ensiformis berasal dari Meksiko , V. subterranea berasal  dari  Afrika  Barat  dan V. unguiculata ssp Unguiculata berasal  dari Afrika  Barat  dan  Afrika  Timur dan  V. unguiculata ssp Sesquipedalis berasal  dari Asia Tenggara (FAO, 2019).
Pada jarak genetik 0.3 menunjukkan 32 aksesi  sayuran  polong  terbagi  menjadi  8 kelompok,  dimana  aksesi-aksesi  tersebut secara tegas mengelompok berdasarkan tingkat spesiesnya,  sedangkan  keragaman  aksesi dalam  spesies  yang  sama  ditunjukkan  pada jarak  genetik  0.085  (Gambar  2).  Tingkat keselarasan  pengelompokkan  tersebut  yang memiliki nilai koefisien agglomerative sebesar 0.82. Hal ini berarti dendogram pengelompokkan  32  aksesi  sayuran  polong berdasarkan  marka  ISSR  dalam  penelitian  ini termasuk  kesesuaian  pengelompokkan  dengan kriteria kuat.
Gambar  2.  Dendogram  pengelompokkan  32  aksesi  sayuran  polong  berdasarkan  marka  molekuler ISSR.
Gambar 3.  Diagram pencar KU1 dan KU2 32 aksesi sayuran polong hasil analisis komponen utama menggunakan 80 karakter ISSR.
Pengelompokkan  32  aksesi  sayuran polong berdasarkan karakter-karakter molekuler  disajikan  dalam  bentuk  diagram pencar  melalui  analisis  komponen  utama.
Komponen utama (KU) ditentukan berdasarkan  nilai  akar  ciri  ( eigenvalue )  >  1. Data karakter yang dapat digambarkan melalui
hasil  analisis  komponen  utama  menggunakan 11  primer  ISSR  hanya  sebesar  64.0%  dan terdapat  tiga  komponen  utama  (KU)  dengan nilai  proporsi  KU1,  KU2  dan  KU3  masing- masing  sebesar  40.90%,  13.80%  dan  9.30%. ISSR yang berpengaruh terhadap pembentukan pengelompokkan  ditentukan  berdasarkan  nilai
vektor  ciri  ( eigenvector ),  yaitu  berpengaruh ( eigenvector >0.20)  dan  berpengaruh  signifikan ( eigenvector >0.61)  (Norouzi et  al ., 2017).  Dari 80  karakter  ISSR  hanya  17  karakter  ISSR  yang berpengaruh terhadap pengelompokkan, meliputi 6 ISSR pada KU1, 7 ISSR pada KU2 dan 4 pada KU3,  akan  tetapi  tidak  terdapat  ISSR  yang berpengaruh  signifikan  terhadap  pembentukan pengelompokkan. Primer PKBT9 dengan posisi pita 500 bp dan PKBT5 dengan posisi pita 750 bp memiliki nilai vektor ciri tertinggi 0.28. Diagram  pencar  pada  Gambar  3  yang dibuat  berdasarkan  nilai  KU1  dan  KU2 menunjukkan  32  aksesi  sayuran  polong tersebar  dalam  4  kuadran  yang  berbeda membentuk 8 kelompok. Pola pengelompokkan  32  aksesi  sayuran  polong hasil  analisis  komponen  utama  menunjukkan hasil yang sejalan dengan pola pengelompokkan pada dendogram hasil analisis  gerombol,  yaitu  aksesi  dalam  satu spesies  selalu  mengelompok  bersama.  Spesies Phaseolus  lunatus,  P.  vugaris,  G.  max,  V. subterranea dan C.  ensiformis mengelompok pada  kuadran  I  memiliki  kesamaan  ISSR dengan  sekuen  (AC) 8 T  berukuran  <  750  pb. Spesies V.  unguiculata ssp unguiculata dan ssp sesquipedalis mengelompok  pada  kuadran II  dan  III  memiliki  kesamaan  ISSR  dengan sekuen  (AC) 8 TT  berukuran  1500  pb;  (AC) 8 T berukuran  >  250  pb;  (AG) 8 AA  berukuran  < 750  pb,  >  250  pb  dan  <  250  pb;  (AG) 8 TA berukuran > 250 pb; dan (AG) 8 TT berukuran < 200 pb dan 1000 pb; (GA) 9 A berukuran < 750 pb  dan  >  250  pb.  Spesies M.  pruriens dan Psophocarpus  tetragonolobus pada  kuadran IV  memiliki  ISSR  dengan  sekuen  (AC) 8 T berukuran  >  250  pb;  (AG) 8 AA  berukuran  > 250 pb; (AG) 8 TA berukuran > 250 pb. (GA) 9 A berukuran  >  250  pb;  (GA) 9 T  berukuran  500 pb; dan (GT) 9 A berukuran 750 pb. Persamaan maupun perbedaan pola pita yang  dimiliki  spesies  sayuran  kacang  bukan berarti  lokus  ISSR  tersebut  merujuk  langsung pada  karakter  morfologi  tertentu.Walaupun demikian,  pengelompokkan  32  aksesi  sayuran polong  menggunakan  penanda  ISSR  yang dianalisis menggunakan analisis gerombol dan analisis  komponen  utama  dapat  menunjukkan tingkat  keragaman  genetik  dan  hubungan kekerabatan  di  dalam  dan  antar  spesies sayuran  kacang  yang  berbeda.  Lebih  lanjut, analisis pengelompokkan menunjukkan bahwa aksesi  dari  suatu  spesies  tertentu  dari  sayuran
polong yang diuji cenderung untuk mengelompok  bersama,  hal  ini  berarti  sumber daya genetik sayuran polong yang diuji bukan merupakan  kelompok  yang  kompleks  karena tidak  terdapat  aksesi  yang  dari  spesies  yang berbeda  mengelompok  bersama  sehingga terlihat  bahwa  terdapat  batasan  yang  jelas antar  spesies.  Informasi  tingkat  keragaman genetik  dan  hubungan  kekerabatan  yang  telah diperoleh ini dapat digunakan sebagai informasi  awal  untuk  memilih  tetua  yang beragam  dari  spesies  yang  sama  (persilangan intraspesifik)  atau  untuk  memilih  tetua  yang paling dekat hubungan kekerabatannya (persilangan  intraspesifik)  untuk  meningkatkan heterosis  maupun  menggabungkan  gen  yang diinginkan  dari  latar  belakang  yang  lebih beragaman  dalam  menghasilkan  genotipe  elit dalam  persilangan.  Selain  itu,  informasi  ini dapat  juga  digunakan  untuk  mengurangi koleksi  aksesi  dalam  spesies  yang  memiliki kemiripan  tinggi  dalam  upaya  konservasi plasma nutfah.

## KESIMPULAN
Hasil penelitian ini menjelaskan pemahaman yang lebih baik tentang hubungan kekerabatan dan keragaman genetik dalam dan antar  spesies  sayuran  polong  yang  berbeda. Analisis  marka  ISSR  menggunakan  11  primer menghasilkan total pita sebanyak 80 pita DNA dengan polimorfisme yang sangat tinggi yakni 100%  dan  primer  informatif  yang  didapat adalah  PKBT  3  ((AC) 8 T)  dan  PKBT  6 ((AG) 8 TT).  Marka  ISSR  ini  mengkonfirmasi adanya  tingkat  keragaman  genetik  yang rendahatau  hubungan  kekerabatan  yang  dekat di  antara  maupun  di  dalam  spesies  sayuran polong  yang  berbeda.  Pada  tingkat  kemiripan 44.40-70.00%  menunjukkan  bahwa  antar spesies sayuran polong berada pada kelompok yang berbeda, sedangkan pada tingkat kemiripan  91.25-97.50%  menunjukkan  bahwa antar  aksesi  dalam  spesies  yang  sama  berada pada  kelompok  yang  berbeda.  Lebih  lanjut, analisis  kluster  dan  analisis  komponen  utama mengungkapkan  bahwa  mayoritas  aksesi  dari suatu  spesies  tertentu  cenderung  untuk dikelompokkan  bersama  yang  berarti  sayuran polong  bukan  merupakan  kelompok  yang kompleks,  32  aksesi  sayuran  polong  tersebut dikelompokkan  menjadi  8  kelompok  utama
dengan  nilai  koefisien agglomerative ataunilai goodness of fit matrix correlation (r) mencapai
0.82  menunjukkan  kesesuaian  pengelompokkan kuat. Pengelompokkan 32 aksesi ini disebabkan  oleh  variasi  dalam  jenis  dan jumlah  aksesi,  asal  yang  berbeda  dari  aksesi, dan  kemampuan  beradaptasi  dengan  kondisi geografis  yang  berbeda.  Sejauh  pengetahuan kami,  hasil  penelitian  ini  merupakan  laporan pertama di  mana  spesies  sayuran polong  yang potensial  di  Indonesia  dengan  spesies  yang berbeda-beda  dibandingkan  secara  bersamaan menggunakan marka ISSR.
Pengamatan ini mengungkapkan
pemahaman  bahwa  aksesi  yang  memiliki kemiripan secara genetis yang tinggi (hubungan kekerabatan dekat) dapat dilakukan penelitian  lebih  lanjut  dengan  melakukan hibridisasi  interspesifik  untuk  menghasilkan varietas  tanaman  yang  lebih  baik  dengan potensi  hasil  biji  kering  yang  tinggi,  seperti hibridisasi  antara  kedelai  dan  koro  pedang karena  memiliki  tingkat  kemiripan  67.50%. Sedangkan  keragaman  intraspesifik  yang rendah  dapat  dilakukan  induksi  mutasi  untuk meningkatkan  keragaman  dengan  memilih aksesi  tertentu  untuk  menghasilkan  varietas baru  dengan  potensi  hasil  lebih  baik,  seperti kacang  tunggak  aksesi  VUu12  (biji  kering berwarna  putih  dengan  kandungan  protein sebesar  22.18%)  dan  VUu9  (biji  kering berwarna  hitam  dengan  kandungan  protein sebesar  25.15%)  serta  kecipir  aksesi PT3  (biji kering berwarna kekuningan dengan kandungan  protein  sebesar  29.43%)  yang dapat  dimanfaatkan  dalam  substitusi  kedelai dan mengurangi ketergantungan impor kedelai.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  disampaikan  kepada Dirjen  DIKTI  yang  telah  mendanai  penelitian ini  melalui  Hibah  Penelitian  Insentif  Sistem Inovasi  Nasional  tahun  2016  atas  nama  Prof.
Dr.  Ir.  Sobir,  M.Si  dan  kepada  Pusat  Kajian Hortikultura Tropika IPB University .

## DAFTAR PUSTAKA
Agbagwa,  I.O.,  S.  Datta,  P.G.  Patil,  P.  Singh, N.  Nadarajan.  2012.  A  protocol  for high-quality  genomic  DNA  extraction from  legumes.  Genet.  Mol.  Res.  11: 4632-4639.
Anne,  C.  2006.  Choosing  the  right  molecular genetic markers for studying biodiversity : from molecular evolution to  practical  aspects.  Genetica.  127: 101-120.
Ben-ying,  L.,  L.  You-Yong,  T.  Yi-Chun,  W. Li-Yuan,  C.  Hao,  W.  Ping-Sheng. 2010.  Assessment  of  genetic  diversity and  relationship  of  tea  germplasm  in Yunnan  as  revealed  by  ISSR  markers. Acta Agron. Sin. 36(3): 391-400.
[BOSTID]  Board  on  Science  and  Technology for  International  Development.  1981. The  Winged  Bean:  A  High-Protein Crop  for  the  Tropics  2 nd ed.  National Academy Press, Washington D.C.
Dhanasekaran, M., B. Tharakan, B.V. Manyam.  2008.  Antiparkinson  drug  – Mucuna  pruriens  shows  antioxidant and  metal  chelating  activity.Phytother Res. 22: 6-11.
Dunggio, I., H. Gunawan. 2009. An overview on  the  history  of  national  park management  policy  in  Indonesia.  J.
Anal. Kebijak. Kehutan. 6: 43-56.
Dvořáková, Z., P.H. Cepkovaa, D. Janovskab, I. Viehmannovaa, E. Svobodovaa, E.F. Cusimamania,  L.  Milellac.  2015. Comparative analysis of genetic diversity of 8 millet genera revealed by ISSR markers. Emirates J. of Food and Agriculture. 27(8): 617-628.
[FAO]  Food  and  Agriculture  Organization. View Crop. http://ecocrop.fao.org. [15Oktober2019].
Gajera, H.P., R.K. Domadiya, S.V. Patel, B.A. Golakiya.  2014.  Appraisal  of  RAPD and ISSR Markers for genetic diversity analysis among cowpea ( Vigna unguiculata L  .)  genotypes.  J.  Crop Sci. Biotech. 17(2): 79-88.
Gweyi-Onyango, J.P., P. Akwee, C. Onyango, T.  Tesfamariam.  2011.  Genotypic responses of cowpea ( Vigna unguiculata )
to  sub-optimal  phosphorus  supply  in alfsols of Western Kenya: a
comparative  analysis  of  legumes.  J.
Agric Sci. 2(1): 1-8.
Hall,  A.E.  2012.  Phenotyping  cowpeas  for adaptation  to  drought.  Front.  Physiol.
3: 1-8.
Hariri,  M.R.,  T.  Chikmawati,  A.  Hartana. 2017.  Genetic  diversity  of  Indigofera tinctoria L . in Java and Madura islands as  natural  batik  dye  based  on  ISSR.  J. Math. Fund. Sci. 49(2): 105-115.
Huda,  A.N.,  W.B.  Suwarno,  A.  Maharijaya. 2017.  Genetic  diversity  of  fruit  traits among  17  melon  genotypes  ( Cucumis melo L.). J. Hort. Indonesia. 8(1): 1-12.
Kaufman,  L.,  P.J.  Rousseeuw.  1990.  Finding Groups  in  Data:  An  Introduction  to Cluster  Analysis.  John  Wiley  &  Sons Inc, Toronto.
Liu,  M.,  M.  Ding,  L.  Chen,  K.  Ouyang,  W.
Hui,  J.  Li,  X.  Chen.  2014.    Genetic diversity  and  relationships  among Canavalia ensiformis (L.) DC. accessions  as  revealed  by  sequence- related amplified polymorphism
markers. Biochem. Syst. Ecol. 57: 242- 249.
Marsono,  Y.,  P.  Wiyono.  2002.  Glycemic index  of  selected  legumes.  J.  Teknol dan Industtri Pangan. 8(3): 211-216.
Nazir,  A.,  T.K.  Suharsi,  M.  Surahman.  2016. Optimasi  produksi  dan  mutu  benih kacang koro pedang (Canavalia ensiformis  L.)  melalui  Pengaturan jarak  tanam.  hal  60-68. Dalam R. Suhartanto,  M.  Sykur,  M.  Surahman,
S.  Ilyas,  A.  Junaedi, A.  Kurniawati, S. Mawiyah,  H.  Furqoni,  F.A.  Refra. Prosiding Seminar Nasional dan Kongres Perhimpunan Agronomi Indonesia  (PERAGI).  Bogor.  27  April
2016.
Ng,  W.L.,  S.G.  Tan.  2015.  Inter-simple sequence  repeat  (ISSR)  markers:  are we doing it right? ASM Sci. J. 9:30-39.
Ningomban,  R.D.,  P.K.  Singh,  J.S.  Salam. 2012. Proximate composition ad nutritional  evaluation  of  underutilized legume Psophocarpus  tetragonolobus
(L.)  DC.  grown  in  Manipur,  Northeast India. American J. of Food
Technology. 7(8): 487-493.
Norouzi,  E.,  J.  Erfani-moghadam,  A.  Fazeli, A.  Khadivi.  2017.  Morphological variability  within  and  among  three species  of  Ziziphus  genus  using multivariate  analysis.  Sci.  Hortic.  222: 180-186.
Peng,  L.,  M.  Ru,  B.  Wang,  B.  Li,  J.  Lu,  Z.
Liang. 2014. Genetic diversity assessment  of  a  germplasm  collection of Salvia miltiorrhiza Bunge . based on morphology, ISSR and SRAP markers. Biochemical Systematics and Ecology. 55: 84-92.
Rana,  M.,  R.  Sharma,  P.  Sharma,  S.V.
Bhardwaj, M. Sharma. 2014.
Estimation  of  genetic  diversity  in Capsicum annuum L. germplasm using PCR-based  molecular  markers.  Natl. Acad. Sci. Lett. 37(3): 295-301.
Romeida,  A.,  S.H.  Sutjahjo,  A.  Purwito,  D. Sukma,  Rustikawati.  2012.  Genetic variations  of  Spathoglottis  plicata Blume.  orchid  mutants  based  on  ISSR markers.  J.  Agron.  Indonesia.  40(3): 218-224.
Sing, A., H.K. Dikshit, N. Jain, D. Singh, R.N. Yadav. 2014. Effiiciency os SSR, ISSR and  RAPD  markers  in  moleculer characterization  of  mungbean  and other  Vigna  species.Indian  J.  of Biotechnology. 13: 81-88.
Stefanović,  S.,  B.E.  Pfeil,  J.D.  Palmer,  J.J. Doyle.  2009.  Relationships  among phaseoloid legumes based on sequences  from  eight  chloroplast regions. Syst. Bot. 34(1): 115-128.
Sulassih, Sobir, E. Santosa. 2013. Phylogenetic  analysis  of  mangosteen ( Garcinia  mangostana l.)  and  its relatives  based  on  morphological  and ISSR markers. SABRAO J. of Breeding  and  Genetics.  45(3):  478- 490.
Tar'an,  B.,  B.  Zhang,  T.  Warkentin,  A.  Tullu,
A. Vandenberg. 2005. Genetic diversity  among  varieties  and  wild species  accessions  of  pea  ( Pisum sativum L.)  based  on  molecular markers, and morphological and physiological  characters.  Genome.  48: 257-272.
Thul,  S.T.,  M.P.  Darokar,  A.K.  Shasany, S.P.S.  Khanuja.  2012.  Molecular profiling  for  genetic  variability  in Capsicum  species  based  on  ISSR  and RAPD  markers.  Mol.  Biotechnol.  51: 137-147.
Vaz,  C.G.,  D.  de  Oliveira.  1998.  Polinator contribution  to  the  production  of cowpea in the Amazon. Hort. Science.
33(7): 1157-1159.
Vijayan, K. 2005. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in mulberry genome analysis.  Int.  J.  Ind.  Entomol.  Inter. 10(2): 79-86.
Win,  K.T.,  A.Z.  Oo.  2015.  Genotypic difference  in  salinity  tolerance  during early  vegetative  growth  of  cowpea ( Vigna  unguiculata L.  Walp.)  from Myanmar. Biocatal. Agric. Biotechnol. 4: 449-455.
Wojciechowski,  M.F.  2003.  Reconstructing the
phylogeny of legumes (leguminosae  ):  an  early  21 st century perspective.  Advance  in  Legume Systematics. 10: 5-35.
Yao,  D.N.,  K.N.  Kouassi,  D.  Erba,  F.
Scazzina, N. Pellegrini, M.C. Casiraghi.  2015.  Nutritive  evaluation of  the  bambara  groundnut  Ci12 landrace  [ Vigna  subterranea (L.) Verdc.  (Fabaceae)]  produced  in  Côte d’Ivoire.  Int.  J.  Mol.  Sci.  16:  21428- 21441.