e- Jurnal Rekayasa dan Teknologi Budidaya Perairan Volume I No 2 Februari 2013 ISSN: 2302-3600

## PENINGKATAN  IMUNOGENISITAS VAKSIN INAKTIF
Aeromonas salmonicida DENGAN PENAMBAHAN ADJUVANT PADA IKAN MAS ( Cyprinus carpio ) ©
Ria Hindra Sari * , Agus Setyawan †,‡ dan Suparmono †

## ABSTRAK
Bakteri Aeromonas salmonicida dapat menyebabkan penyakit carp erytrodermatitis pada  ikan  mas  ( Cyprinus  carpio ).    Salah  satu  cara  untuk mencegah  penyakit  ini  adalah  dengan  vaksinasi .  Adjuvant diketahui  dapat meningkatkan  imunogenisitas  vaksin.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui  tingkat  imunogenesitas  vaksin  inaktif A.  salmonicida dengan penambahan  beberapa  jenis adjuvant yang  berbeda.  Vaksin  diinaktifasi  dengan formalin  1%  dan  diinkubasikan  selama  24  jam  pada  suhu  ruang.  Penelitian  ini terdiri  dari  5  perlakuan  yaitu  tanpa  vaksinasi,  vaksinasi  tanpa adjuvant ,  dan vaksinasi  dengan  penambahan  3  jenis adjuvant yang  berbeda  (6  ppm  Aluminum hidroksida  (Al(OH) 3 ),  6  ppm  Alumunium  Potasium  Sulfat  (KAl(SO 4 ) 2 ),  dan Freud’s Incomplete adjuvant ( FIA ) (1:1 v/v)).  Vaksin diujikan pada 10 ekor ikan mas/perlakuan  (berat  ±30  gr)  dengan  cara  suntik  melalui intra  peritoneal (10 7 sel/ikan). Booster dilakukan  dengan  metode  dan  dosis  yang  sama  dengan vaksinasi pertama pada 7 hari setelah vaksinasi  (hsv). Pengamatan titer antibodi setiap  perlakuan  diukur  dengan  metode  mikroaglutinasi  pada  saat  sebelum vaksinasi, 7 (hsv), 14 (hsv) (7 hari setelah booster), dan 30 (hsv).  Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan adjuvant mampu meningkatkan imunogenisitas vaksin inaktif A. salmonicida yang ditunjukkan dengan nilai rata-rata titer antibodi yaitu 2 5 untuk FIA dan KAl(SO 4 ) 2 , 2 4 untuk Al(OH) 3 dan vaksin tanpa adjuvant , sedangkan  hasil  titer  antibodi  terendah  pada  perlakuan  tanpa  pemberian  vaksin maupun adjuvant sebesar 2 3 .
Kata  kunci :  Aeromonas  salmonicida ,  adjuvant  ,  ikan  mas,  titer  antibodi,  vaksin inaktif
© e-JRTBP 2013
* Mahasiswa Jurusan Budidaya Perairan
† Staf Pengajar Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Unila
‡ Alamat Korespondensi : agusu.san @ gmail.com

## Pendahuluan
Budidaya  ikan  mas    ( Cyprinus  carpio ) tidak terlepas dari adanya kemungkinan terserang  penyakit.  Penyakit  yang disebabkan oleh bakteri A. salmonicida yang  menyerang  ikan  mas  disebut penyakit carp  erytrodermatitis .  Upaya penanggulangan  penyakit  ini  salah satunya dengan menggunakan antibiotik. Namun, pemakaian antibiotik  yang  terus-menerus  dapat menyebabkan resistensi dan residu bagi ikan  (Astuti  dkk.,  2003).    Untuk mengurangi dampak penggunaaan antibiotik tersebut, diperlukan pencegahan  penyakit    yang  aman  bagi ikan dan lingkungan.
Soeripto  (2002)  menyatakan  bahwa vaksin Aeromonas yang  digunakan untuk  mencegah  penyakit  berhasil menurunkan  penggunaan  antibakteria secara drastis. Vaksin yang baik adalah vaksin yang stabil dan imunogenisitasnya tidak mudah berkurang    (Radji,  2010).  Salah  satu cara untuk memperkuat sistem imunogenisitas  vaksin  adalah  dengan penambahan adjuvant .
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan oleh Nur dan Dana (2004) menunjukkan bahwa penyuntikan vaksin Streptococcus  iniae dengan penambahan Freuds complete adjuvant
(FCA) pada  induk  betina  ikan  nila (Oreochomis niloticus) dapat meningkatkan  titer  antibodi  hingga 7,00  (titer  antibodi  dalam 2 log 2 ) dibandingkan  dengan  kontrol  yang kurang  dari  2.    Sedangkan  menurut penelitian yang dilakukan oleh Retmonojati (2007) menunjukkan bahwa  penambahan  KAl(SO 4 ) 2 dan Al(OH) 3 pada  vaksin polivalen  vibrio memberikan  pengaruh  terhadap  hasil titer  antibodi  yang  cukup  tinggi  yaitu sekitar 2 9 dibandingkan dengan kontrol
sebesar  3,33.  Pada  penelitian  yang dilakukan  oleh  Ibrahem  dkk.  (2008) menunjukkan  bahwa  pemberian  vaksin A. septicemia dengan penambahan FIA pada  ikan  nila (O.  niloticus) dapat meningkatkan  titer  antibodi  hingga pengenceran  16-32  kali  dibandingkan dengan  kontrol  yang  hanya  mencapai 10  kali  pengenceran.    Pada  penelitian yang dilakukan oleh Hadie, dkk (2010) tentang  pemberian  vaksin  Hydrovac ®
dengan  penambahan  jenis adjuvant FCA pada ikan patin siam (Pangasinodon hypophthalmus) menunjukkan hasil rata-rata titer
antibodi  hingga  128  kali  pengenceran dibandingkan  dengan  kontrol  yang rata-rata  titer  antibodinya  negatif  atau nol.
Vaksin  dengan  penambahan adjuvant dapat  meningkatkan  potensi  sistem imun serta menambah lamanya perlindungan  terhadap  suatu  infeksi penyakit  pada  hewan  dan  manusia (Rajput,  2007)  sehingga  akan  terjadi kontak  lebih  lama  dengan makrofag dan limfosit ( Hadie dkk., 2010) Tujuan dari  penelitian  ini  adalah  untuk mengetahui  tingkat  imunogenesitas vaksin  inaktif A.  salmonicida dengan penambahan jenis adjuvant yang berbeda .

## Bahan dan Metode
Penelitian  dilaksanakan  pada  bulan Maret  -  Mei  2012  di  Laboratorium Budidaya Perikanan Fakultas Pertanian Universitas Lampung. Rancangan yang dipakai  dalam  penelitian  ini  yaitu rancangan  acak  lengkap  (RAL).  Data yang  didapatkan  dianalisis  dengan analisis  sidik  ragam  (ANOVA).  Jika terdapat  beda  nyata  antar  perlakuan maka  dilakukan  uji    Dunnet  pada selang kepercayaan 95% .
Penelitian menggunakan adjuvant yang  ditambahkan  ke  dalam  vaksin inaktif A.  salmonicida dengan  5 perlakuan dan 3 kali pengulangan. Dosis pemberian Al(OH) 3 dan KAl(SO 4 ) 2 sebanyak  6  ppm  mengacu pada  penelitian  yang  dilakukan  oleh Retmonojati (2007), dan dosis Penambahan FIA dengan perbandingan vaksin  dan  FIA  sebesar  1:1  mengacu pada  penelitian  yang  dilakukan  oleh
Fikri dkk. (2002).
Ikan  mas  ( Cyprinus  carpio )  yang dipakai  dengan  berat  total  ±  30  g sebanyak 200 ekor.
Metode pembuatan vaksin A. salmonicida dengan penambahan adjuvant adalah  Isolat  bakteri A. salmonicida dikultur  pada    media  cair TSB,  lalu  diinkubasi  selama  24  jam pada suhu ruang. Dilakukan pengkayaan dengan memindahkan inokulum A.  salmonicida dari  media TSB  ke  media  TSA  lalu  diinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  ruang. Kemudian dilakukan pemanenan bakteri A.  salmonicida dengan  cara dikumpulkan  dengan  batang spreader dan  dimasukkan  ke  dalam erlenmeyer menggunakan corong. Vaksin diinaktifasi dengan penambahan formalin  1%  kemudian  diinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  ruang.  Uji viabilitas bakteri pada medium spesifik GSP  dan  diinkubasi  selama  24  jam pada  suhu  ruang.  Jika  bakteri  sudah tidak  tumbuh,  dilakukan  pencucian formalin  menggunakan  PBS  dengan cara  di sentrifuse dengan  kecepatan
3500  rpm  selama  30  menit. Sentriifuse dilakukan  sebanyak  3  kali,  setiap  kali sentrifuse, supernatant dibuang.
Dihitung  kepadatan  vaksin inaktif
dengan spektrofotometer (λ=625  nm) mengacu  pada  standar  McFarland. Ditambahkan adjuvant masing-masing
sebanyak 6 ppm (Al(OH) 3 dan KAl(SO 4 ) 2 )  ke  dalam  vaksin,  dan perbandingan 1:1 untuk FIA.
Vaksin  diberikan  pada  setiap  ikan  uji dengan  metode  penyuntikan  secara intra  peritoneal  (i.p)  dengan  dosis pemberian  vaksin  0,1  ml/ikan  dengan kepadatan bakteri 10 7 sel/ikan (Kamiso dkk.,  2005).  Vaksin  diberikan  2  kali yaitu vaksinasi I pada awal pemeliharaan dan vaksinasi II (booster) diberikan seminggu setelah vaksinasi I. Pengambilan  sampel  darah  untuk  uji titer antibodi dilakukan sebelum vaksinasi, seminggu setelah vaksinasi I, seminggu setelah vaksinasi II ( booster ), dan 30 hari setelah pemeliharaan.  Pengambilan  darah  ikan dilakukan  dengan  menggunakan  spuit 1ml,  ½ in 26  G  (Therumo TM )  dari  vena caudalis  kemudian  dimasukkan  ke dalam  tabung eppendorf 1,5  ml.  Darah ikan  yang  telah  diambil  kemudian disentrifuse  dengan  kecepatan  3500 rpm selama 15 menit untuk mendapatkan serumnya. Serum disimpan  di  dalam refrigerator selama
24 jam untuk digunakan dalam uji titer antibodi.
Serum  darah  ikan  yang  telah  disimpan dalam refrigerator kemudian dilakukan pengujian  titer  antibodi  menggunakan mikrodilutium  plate dengan  metode mikroaglutinasi mengacu pada prosedur standar mikroaglutinasi (Roberson, 1990) dengan sedikit modifikasi  secara  lengkap  yaitu  serum @ 25 µl dimasukkan ke dalam sumuran 1  dan  2.  Kemudian  PBS  @  25  µl dimasukkan  ke  dalam  sumuran  2–12. Lalu sumuran kedua direpipeting untuk mengencerkan
serum,
kemudian dilanjutkan  ke  sumuran  3  sampai  11.
Selanjutnya antigen @ 25 µl dimasukkan  ke  dalam  sumuran  1–12. Setelah itu, mikrodilution plate
digoyang  –  goyangkan  selama  3  menit dengan pola membentuk angka 8. Hasil titer  diinkubasi  dalam refrigerator selama  24  jam.    Keesokan  harinya dilakukan pengamatan reaksi aglutinasi pada  masing–masing  sumuran  yang ditandai dengan adanya kabut berwarna putih  yang  menyebar  ke  seluruh sumuran  yang  berarti  antibodi  telah terbentuk.
Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah pengaruh penambahan adjuvant yang dilihat dari titer  antibodi  dan  kualitas  air  (suhu, DO,  dan  pH).  Pengukuran  parameter kualitas  air  dilakukan  secara  harian dengan  harapan  parameter  kualitas  air selama  penelitian  terukur  dan  masih berada dalam kisaran strandar kehidupan ikan mas.

## Hasil dan Pembahasan
Dari  Tabel  1  dan  Gambar  1  dapat dilihat  bahwa  hasil  rata-rata  titer antibodi  tertinggi  didapatkan  pada perlakuan  vaksin  dengan  penambahan FIA dan KAl(SO 4 ) 2 yaitu 2 5 , kemudan hasil  rata-rata  titer  antibodi  perlakuan vaksin  dengan  panambahan  Al(OH) 3
dan pemberian vaksin tanpa penambahan adjuvant yaitu  2 4 dan yang  terendah  yaitu  perlakuan  tanpa pemberian  vaksin  maupun adjuvant yaitu 2 3 (Tabel 1; Gambar 1). Penambahan adjuvant ternyata  dapat meningkatkan  imunogenisitas  vaksin. Hasil  menunjukkan  rata-rata  titer antibodi  dengan  penambahan adjuvant lebih  tinggi  dibandingkan  kontrol (Gambar  1),  meskipun  secara  statistik tidak  berbeda  nyata  (Tabel  1).  Hal  ini kemungkinan  diikarenakan  a djuvant merupakan suspensi  yang ditambahkan ke dalam vaksin dan dapat memperlambat  proses  penghancuran antigen  dalam  tubuh  sehingga  akan
terjadi  kontak  lebih  lama  dengan makrofag dan limposit serta merangsang  pembentukan  sistem  imun yang  tinggi  (Hadie  dkk.,    2010).
Adjuvant yang  menghasilkan  tingkat titer  antibodi  tertinggi  adalah  FIA  dan KAl(SO 4 ) 2 dengan tingkat imunogenisitas  tertinggi  hingga  2 5 dibandingkan  jenis adjuvant yang lainnya.
Vaksin  dengan  penambahan adjuvant yang  disuntikkan  ke  tubuh  ikan  akan masuk  ke  ginjal  bagian  depan  dan dapat  meningkatkan  respon  imun adaptif  terhadap  vaksin  (Anderson, 1997).  Dalam  ginjal  bagian  depan, makrofag dan neutrofil akan  memakan antigen  atau  vaksin  yang  masuk  ke dalam  tubuh  ikan  melalui  proses fagositosis lalu  dibawa  menuju  timus untuk  memicu  aktifasi  sel  T    (Firdaus, 2004). Adjuvant yang  ditambahkan  ke dalam vaksin akan membantu pemindahan  antigen  ke  sel  T  di  mana mereka  dapat  dikenali  oleh  sel  T.    Hal ini  pada  akhirnya  akan  menyebabkan aktivitas  sel  T  meningkat.    Sel  T mengekspresikan  antigen  tersebut  ke reseptor  khusus  yang  dikenali  sebagai kompleks  histokompatibilitas  utama Major histocompatibility complex (MHC).    Lalu  antigen  tersebut  dibawa menuju  limpa,  di  limpa  akan  terjadi pelepasan sitokinin membentuk  sel  B Dalam  proses  ini adjuvant juga menginduksi pelepasan sitokin inflamasi yang  tidak  hanya  merekrut sel  B  dan  T  pada  situs  infeksi  tetapi juga meningkatkan aktivitas transkripsi yang  menyebabkan  peningkatan  dari sel-sel kekebalan tubuh secara keseluruhan. Sitokinin juga  akan memperluas  populasi  sel  darah  seperti limposit, monosit, neutropil, dan makrofag (Anderson,  1997) . Sel  B sebagian  melakukan  poliferasi  atau
memperbanyak  diri  dan  sebagian  lagi berdiferensiasi  menjadi  sel  plasma  dan sel B memori sebagai sistem kekebalan humoral  (Firdaus,  2004) .  Adjuvant dapat  memberikan  perlindungan  fisik terhadap antigen yang akan memperlambat  proses  penghancuran dalam  tubuh.  Sehingga  pada  akhirnya adjuvant diyakini  dapat  meningkatkan kualitas respon dari kekebalan antibodi yang dihasilkan (Hadie dkk., 2010). FIA merupakan adjuvant yang berbentuk cairan minyak mineral kental berwarna  putih  yang  homogen  dan tidak dapat menyebar apabila diteteskan  pada  permukaan  air.    FIA tidak  mengandung  sel  bakteri  yang telah mati, inokulumnya disusun hanya oleh air dalam emulsi minyak sehingga menghasilkan  minyak  mineral  (Stills, 2005).    FIA  yang  berbentuk  minyak mineral akan menyelimuti dan melepaskan  antigen  secara  perlahan- lahan sehingga antigen sulit dihancurkan oleh makrofag , mentransportasi  antigen  ke  seluruh sistem limfatik , serta berinteraksi dengan antigen termasuk fagosit,
makrofag,  dan  sel  dendrite membuat sistem  kekebalan  tubuh  lebih  kuat karena  diperlukan  waktu  tambahan dalam memproduksi sel B dan T untuk memori  imunologis  yang  lebih  besar dalam respon imun adaptif (Hadie dkk., 2010).
Al(OH) 3 dan  KAl(SO 4 ) 2 merupakan adjuvant dari  jenis  garam-garaman. Al(OH) 3 tidak  dapat  bereaksi  secara sederhana  dengan  air  dan  tidak  dapat larut  dalam  air  walaupun  masih mengandung  ion  oksida,  tetapi  terlalu kuat  berada  dalam  kisi  padatan  untuk bereaksi  dengan  air.    Sedangkan KAl(SO 4 ) 2 sangat  mudah  larut  dalam air  (Hem  dan  Harm,  2007).  Al(OH) 3 dan KAl(SO 4 ) 2 menyebabkan terjadinya  ikatan  antigen  melalui  gaya elektrostatik  dengan  interaksi  ikatan hydrogen  yang  saling  tarik  menarik sehingga  memperlambat  pengancuran antigen oleh makrofag (Stills, 2005). Dari hasil penelitian, KAl(SO 4 ) 2 memiliki  tingkat  imunogenisitas  yang lebih  tinggi  dibandingkan  dengan Al(OH) 3 dikarenakan KAl(SO 4 ) 2 memiliki  sifat  garam-garaman  yang larut  di  dalam  air  dibandingkan Al(OH) 3 yang bersifat hidropobik.  Hal ini  menyebabkan  KAl(SO 4 ) 2 mudah diikat  dan  diangkut  dalam  limpa  ke darah,  kemudian  diekskresikan  menuju ginjal.
KAl(SO 4 ) 2 lebih cepat didistribusikan  ke  jaringan-jaringan, dan  memiliki  tingkat  penyebaran  dan penyerapan yang
lebih cepat dibandingkan  Al(OH) 3 (Hem  dan Harm, 2007).
Tabel 1.   Hasil Titer Antibodi Pada Ikan Mas
No Perlakuan Sebelum vaksinasi Vaksinasi I Booster 30 hari pemeliharaan Rata- rata 1 A (Kontrol -) 2.667 3.33 3.667 4 3.416 a 2 B (Kontrol +) 2 3.33 4.667 6.667 4.166 a 3 C (Vaksin+Al(OH) 3 ) 2 4.667 6.33 5.667 4.666 a 4 D (Vaksin+KAl(SO 4 ) 2 ) 2 5 7.667 7 5.41675 a 5 E (Vaksin+FIA) 3 3 8.33 7 5.3325 a
Keterangan : 1. Huruf yang sama ke arah kolom menunjukkan tidak berbeda nyata   (p>0.05)
2. Nilai hasil rata-rata titer dalam 2 log2
.
Gambar 1. Hasil Rata-rata Titer Antibodi dalam 2 log2
Efektifitas  vaksinasi  dipengaruhi  oleh beberapa  faktor  yang  salah  satunya adalah  kualitas  air.  Kualitas  air  dapat mempengaruhi  fisiologi  ikan  dalam hubungannya  dengan  pembentukan antibodi (Isnansetyo, 1996). Berdasarkan Tabel 2 dapat dilihat hasil pengukuran kualitas air selama
pemeliharaan,    kisaran  oksigen  terlarut (DO)  3-7,29,  suhu  berkisar  28-30 0 C, dan  pH  air  berkisar  6-7.    Menurut Cholik  dkk.  (1986),  parameter  kualitas air  yang  baik  untuk  pemeliharaan  ikan mas  adalah  DO  >3,  suhu  berkisar antara  25-32 0 C,  dan  pH  air  berkisar
6,88-6,79. Secara umum hasil pengukuran  suhu  dan  DO  selama penelitian  masih  berada  dalam  kisaran optimum  untuk  kelangsungan  hidup ikan  mas,  walaupun  hasil  pengukuran pH  sedikit  dibawah  kisaran  optimum namun tidak menimbulkan efek negatif bagi  ikan  selama  masa  pemeliharaan. Menurut  Firdaus  (2004)  bahwa  pada ikan,  suhu  lingkungan  yang  tinggi tetapi  masih  dalam  batas  toleransi umumnya  akan mempercepat produksi antibodi  dan  meningkatkan  reaksi antibodi yang dihasilkan.
Tabel 2. Data Kisaran Kualitas Air Selama Penelitian
No Perlakuan Parameter DO (ppm) Suhu ( 0 C) pH 1 A 3,13–7,29 28–30 6–7 2 B 3-7,69 28–30 6–7 3 C 3-6,24 28–30 6–7 4 D 3,18-6,87 28–30 6–7 5 E 3,21-6,59 28–30 6–7 Baku Mutu *) >3 25–32 6,88-6,97 *) Menurut Cholik, 1986

## Kesimpulan
Pemberian vaksin inaktif A. salmonicida dengan penambahan Adjuvant jenis  FIA  dan  KAl(SO 4 ) 2 menghasilkan  tingkat  titer  antibodi tertinggi  hingga  2 5 dibandingkan  jenis adjuvant yang lainnya.

## Daftar Pustaka
Alifuddin,  M.  2002.  Imunostimulasi Pada Hewan Akuatik. J. Akuakultur  Indonesia,  1(2):  87– 92. Anderson,  D.P.  1997.  Adjuvant  and Immunostimulants For Enhancing  Vaccine  Potency  In Fish.  Hal  257-256  In:  Fish Vaccinolgy. Gudding, R., Lillehaug, A., Midtlyng, P.J., and Brown,  F.Leds.  Der  Bid  Stand. Basel. Kager.  484 (90): 257-265. Astuti,  P.,  Alam,  G.,  Pratiwi,  S., Hertiani,  T.,  dan  Wahyuono,  S. 2003.  Skrining  Senyawa  Anti Infeksi Dari Spons Yang Dikoleksi dari Bunaken, Manado. Biota 127 (8): 47-52. Cholik,  F.,  Artati  dan  R.  Arifudin.
1986. Pengelolaan  Kualitas  Air Kolam. INFIS Manual seri nomor 36.  Dirjen  Perikanan.  Jakarta.  52 Hal.
Fikri  A,  Sigit  E.P.,  Afifah,  N.H., Hendry  T.S.,  Rafiqa  H.  dan  Siti I.O.S.  2002.  Pengembangan  KIT Diagnostik Untuk Deteksi Daging  Babi  Dengan  Antibodi Poliklonal. Buletin Penalaran
Mahasiswa UGM 02 (10): 2-5. Firdaus, A. 2004. Pengaruh Pemberian Vitamin  C  Dalam  Percobaan Imunoprofilaksis Terhadap Infeksi Bakteri Streptococcus iniae Pada Ikan Nila
(Oreocromis  niloticus  Linne). Program  Studi  Teknologi  Dan Managemen Akuakultur. Departemen Budidaya Perikanan. Fakultas Perikanan dan Kelautan. Institut Pertanian Bogor. 47 hal. Hadie, W., Angela, M. L., Sularto, dan Evi,  T.  2010.  Imunitas  Maternak Terhadap Aeromonas hydrophila: Pengaruhnya Terhadap  Fekunditas  dan  Daya Tetas Ikan Patin Siam (Pangasionodon  hypophthalmus). Pusat  Riset  Perikanan  Budidaya: Jakarta Selatan. J. Ris. Akuakultur (8): 229-235. Hem,  S.L  dan  Harm,  H.  2007. Alumunium-Containing Adjuvants : Properties,
Formulation,  and  Use.  Hal  81- 114  In:  Vaccine  adjuvant  s  And Delivery  Systems.  Monmohan Singh  (ed).  Novartis  Vaccines Emeryville, California. 470 hal.
Ibrahem,  M.D.,  Arab,R.  Mostafa,  M dan  Rezk,  M.  A.    2008. Evaluation Of Different Vaccination Strategies For Control Of (Mas)  In  Nile Tilapia (O.  Niloticus)  In  Egypt.  8th International Symposium On Tilapia  In  Aquaculture  1157- 1175 pp Isnansetyo,  A.  1996.    Penambahan Vitamin  C  Pada  Pakan  Lele Dumbo ( Clarias gariepinus ) Untuk  Meningkatkan  Tanggap Kebal Terhadap Vaksin Aeromonas  hydrophila .  Jurnal Perikanan  UGM  (GMU  J.  Fish.
Sci. (1):35-41
Kamiso,  H.  N.,  Alim,  I.,  Triyanto,
Muhammad, M dan Lili, S. 2005. Efektifitas Vaksin Polivalen Untuk  Pengendalian  Vibriosis Pada  Kerapu  Tikus  ( Cromileptes
altivelis ). Jurnal Perikanan (J.Fish Sci)  8 (2): 95-100.
Nur.  Sukenda  dan  D,  Dana.  2004.
Ketahanan  Benih  Ikan  Nila  Gift ( Oreochromis  niloticus Linn.) dari  Hasil  Induk  Yang  Diberi Vaksin  Terhadap  Infeksi  Buatan Streptococcus iniae . Jurnal Akuakultur  Indonesia,  3(1):  37- 43. Radji,  M.  2010. Imunologi  dan
Virologi. PT.  Isfi  Penerbitan: Jakarta Barat. 323 Hal.
Rajput,  Z.  Iqbal.,  HU,S.,  Xiao,C.,  dan Arijo,  A.G.  2007 .  Adjuvant
Effects  Of  Saponins  On  Animal Immune  Responses. Journal  of Zhejiang  University  Science  B .
8(3):153-161 Retmonojati,  K.  2007. Penyimpanan
Vaksin  Polivalen  Vibrio  dengan Penambahan  Adjuvant    dan Gliserol . (Skripsi). Jurusan Perikanan.  Fakultas  Pertanian. Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. 29 Hal. Roberson, B.S. 1990. Bacterial Agglutination.  In:  Techniques  In Fish Immunology J. S. Stolen, T. C. Fletcher, D. P. Anderson, B. S. Roberson,  and  W.  B.  Van Muiswinkel (eds). SOS Publication,  Fair  Haven,  New Jersey. Hal 81-86 Soeripto.2002. Pendekatan Konsep Kesehatan Hewan Melalui Vaksinasi. Jurnal Litbang Pertanian, 21(2): 48-55. Stills,  H.  F.  2005 .  Adjuvant s  and Antibodi  Production:  Dispelling The  Myths  Associated  With Freund’s  Complete  and  Other adjuvant ’s. ILAR  Journal .    293
(46): 280-293.