## S RIWIJAYA J OURNAL OF M EDICINE
Hubungan Lama Penyimpanan Sampel Arsip Jaringan dalam Blok Parafin Terfiksasi Formalin dengan Kualitas Hasil Ekstraksi DNA Mitokondria Jaringan
Zen Hafy 1 , Veny Larasati 1 , Riana Sari Puspita 1 , Novizar S 2 , Haekal M 2 , Rafdi A 2 , Sentani R 2
1 Bagian Histologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya, Palembang, Indonesia
2 Program Pendidikan Dokter Umum, Fakultas Kedokteran, Universitas Sriwijaya, Palembang, Indonesia E-mail: zhafy@yahoo.com

## Abstrak
Sampel  arsip  jaringan  terfiksasi  formalin  dalam  blok  paraffin  atau Formalin-fixed  paraffin-embedded (FFPE) menyediakan sumber materi biologis yang melimpah dalam studi molekuler saat ini. Kualitas asam nukelat, terutama mtDNA yang diekstraksi dari jaringan FFPE dapat dipengaruhi oleh waktu penyimpanan. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah lama waktu penyimpanan jaringan FFPE mempengaruhi kualitas hasil ekstraksi mtDNA di Bagian Patologi Anatomi RSUP Dr. Mohammad Hoesin Palembang. DNA diekstraksi dari 16 sampel arsip FFPE yang diambil secara  acak  dari  Laboratorium  Patologi  Anatomi  RSUP  dr.  Mohammad  Hoesin  Palembang.  Sampel  tersebut  dibagi menjadi dua kelompok berdasarkan lama waktu penyimpanan (kurang dari 1 tahun dan 1 sampai 5 tahun). Isolat DNA dari kedua grup diamplifikasi menggunakan PCR dengan dua primer mitokondria yag didisain khusus masing-masing sepanjang 320 pb dan 142 pb. Visualisasi hasil PCR dilakukan dengan metode elektroforesis. Tidak ada sampel dari kedua kelompok lama waktu penyimpanan yang dapat diamplifikasi dengan menggunakan primer sepanjang 320pb. Namun,  hasil  PCR  menggunakan  primer  142  pb  menunjukkan  hasil  yang  positif  pada  semua  sampel  dari  kedua kelompok  lama  waktu  penyimpanan.  Penelitian  ini  mengisyaratkan  bahwa  kualitas  mtDNA  hasil  isolasi  dari  sampel arsip  FFPE  yang  ada  di  Bagian  Patologi  Anatomi  RSUP  Dr.  Mohammad  Hoesin  Palembang  tidak  dipengaruhi  oleh lamanya  waktu  penyimpanan  arsip.  Lebih  lanjut,  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  mtDNA  yang  diekstraksi  dari sampel  arsip  FFPE  sudah  mengalami  degradasi  sehingga  kurang  baik  bila  digunakan  untuk  analisis  genetik  yang membutuhkan amplikon DNA yang Panjang.
Kata kunci: FFPE, mtDNA, degradasi.

## Abstract
Formalin-fixed  paraffin-embedded  (FFPE)  archival  tissue  presents  a  readily  available  resource  in  molecular  study nowadays.  The  quality  of  nucleid  acid,  especially  mitochondrial  DNA  (mtDNA)  extracted  from  FFPE  tissue  could  be affected by the storage time. Thus, this study investigated if the FFPE tissue’s storage time had an effect on the quality of  the  extracted  mtDNA  at  Department of  Pathology  RSUP  Dr.  Mohammad  Hoesin  Palembang. DNA was extracted from 16 randomly selected archival FFPE tissues in Laboratory of Pathology Anatomy, RSUP dr. Mohammad Hoesin Palembang. The samples were grouped based on their storage time (less than 1 year and 1 to 5 yrs.’ old). The isolated DNA from each group was amplified using PCR with two primer pairs specifically design to amplify mtDNA of 320 bp and 142bp length, respectively.  The PCR products were visualized by electrophoresis method. None of the samples from both groups could be amplified witht the 320bp primers. However, the PCR result of the 149 bp primers showed positive for all of the samples from each study group. The study indicated that the storage time does not affect the quality of mtDNA isolated from the FFPE samples archived in Department of Pathology RSUP Dr. Mohammad Hoesin Palembang.  Furthermore,  the  study  showed  that  the  mtDNA  extracted  from  FFPE  tissue  has  been  degraded, therefore, the samples are not suitable for genetic studies require a long mtDNA amplicon.
Keywords: FFPE, mtDNA, Mito In, Mito ND

## 1. Pendahuluan
DNA mitokondria (mtDNA) manusia terletak di dalam matriks mitokondria pada sel eukariotik. MtDNA  mempunyai  jumlah  salinan  1000- 10.000, dan mempunyai ukuran yang relatif kecil yaitu 16.569 pasang basa. 1,2 MtDNA telah banyak digunakan sebagai penanda molekul untuk studi genetika  populasi,  penelusuran  asal-usul  dan pelacakan  beberapa  penyakit  degeneratif, penuaan, serta kanker yang terkait dengan garis keturunan  ibu. 3,4 MtDNA  dapat  diperoleh  dari darah,  jaringan  baru  hasil  biopsi  potong  beku atau fresh  frozen  tissue dan  arsip  jaringan terfiksasi formalin dalam blok paraffin atau FFPE ( Formalin-fixed  paraffin-embedded ).  Sampel arsip  FFPE  sangat  besar  manfaatnya  karena tersedia dalam jumlah yang banyak dan mudah diakses  guna  mempelajari  berbagai  biomarker untuk  memfasilitasi  prosedur  diagnosis,  terapi target,  menentukan  prognosis,  serta  dapat menjadi  sumber  tersedia  bagi  penelitian retrospektif  skala  besar. 5 Namun  demikian, tantangan  utama  penggunaan  FFPE  daam penelitan  genetik  adalah  sulitnya  mendapatkan DNA  yang  berkualitas  khususnya  karena kerusakan  DNA  akibat  proses  fiksasi  jaringan dengan formalin dan tentunya pengaruh kondisi dan lama waktu penyimpanan sampel arsip.
Molekul  mtDNA  yang  tidak  dilindungi oleh  histon  jauh  lebih  rentan  terhadap kerusakan  akibat  proses  fiksasi  dengan formalin dibanding DNA inti. 2 Berbagai teknik ekstraksi  mtDNA  telah  dikembangkan  untuk mendapatkan isolat mtDNA dari jaringan FFPE agar  bisa  diperlakukan  atau  dianalisis  lebih lanjut  misalnya  untuk  diamplifikasi  dengan metode Polymerase  Chain  Reaction (PCR)dan lain-lain.  Namun,  untuk  mendapatkan  hasil ekstraksi  mtDNA  dari  FFPE  yang  cukup  baik secara  kualitas  dan  integritas  agar  bisa dianalisis  lebih  lanjut  masih  merupakan tantangan  tersendiri  bagi  para  peneliti  di bidang  molekular.  Umur  atau  lama  waktu arsip jaringan blok parafin tersebut tersimpan
diyakini mempengaruhi kualitas dan integritas mtDNA hasil ekstraksi dari FFPE. 6 Sampel DNA yang  diekstraksi  dari  jaringan  FFPE  yang disimpan  dalam  periode  waktu  yang  lama diyakini tidak terlalu cocok untuk analisis jika dibutuhkan molekul DNA yang lebih panjang. 7 Walaupun  demikian,  beberapa  penelitian yang  membandingkan  kualitas  hasil  ekstraksi DNA sampel arsip jaringan FFPE dengan lama penyimpanan  berbeda  justru  melaporkan hasil  yang  sebaliknya,  dimana  sampel  yang tersimpan lebih dari 10 ternyata menunjukkan kualias hasil ekstraksi DNA yang sama baiknya dengan sampel baru. 8,9
Studi  ini  didesain  untuk  menganalisis kualitas  mtDNA  yang  diisolasi  dari  sampel  arsip jarngan  FFPE  baru  dan  lama  yang  tersimpan  di bagian Patologi Anatomi RSMH Palembang.

## 2. Metode
Penelitian  ini  merupakan  penelitian observasional analitik dengan desain pengambilan  data  potong  lintang.  Penelitian ini  dirancang  sebagai  penelitian  pendahuluan untuk  melihat  hubungan  lama  waktu penyimpanan  arsip  jaringan  FFPE  dengan kualitas ekstrak mtDNA.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekular FK Unsri dan Bagian Patologi Anatomi RSUP  Dr.  Mohammad  Hoesin  Palembang. Seluruh  kegiatan  dari  mulai  pengumpulan sampel, pengerjaan di laboratorium, pengumpulan  data  hingga  analisis  data dilaksanakan  pada  bulan  September  hingga November  2016.  Populasi  penelitian  ini  adalah jaringan  arsip  FFPE  yang  tersimpan  di  Bagian Patologi  Anatomi  RSUP  Dr.  Mohammad  Hoesin Palembang.  Sebagai  penelitian  pendahuluan, penelitian  ini  hanya  akan  mengambil  sampel dalam  jumlah  tertentu  dari  populasi  penelitian yang  merepresentasikan  variabel  uji  untuk  tiap grup penelitian.
Sebanyak  16  sampel  FFPE  yang memenuhi  kriteria  inklusi  telah  dikumpulkan
dari  Bagian  Patologi  Anatomi  RSUP  dr.
Mohammad Hoesin
Palembang pada November  2016.  Sampel  dipilih  berdasarkan kriteria  inklusi  dan  eksklusi.  Sampel  dibagi menjadi  dua  kelompok  yaitu  sampel  dengan lama  waktu  penyimpanan  kurang  dari  satu tahun  dan  sampel  dengan  lama  waktu penyimpanan lebih dari satu tahun.
Setiap  blok  sampel  dipotong  secara  seri sebanyak  10  potongan  dengan  ketebalan  8-10 mikrometer setiap potongannya dan dimasukkan ke  dalam  mikrotube  1.5ml.  Sampel  akan dideparafinasi dengan metode basah menggunak  cairan xylene atau mineral  oil yang dilanjutkan dengan pencucian pencucian dengan etanol  konsentrasi  bertingkat,  sampel-sampel disentrifugasi dan dikeringkan di suhu 37oC. Sebanyak  20  ul  enzim  Proteinase  K  dan 200  ul  larutan  daparnya  ditambahkan kedalam  endapan  sampel  yang  telah  kering untuk  diinkubasi  di  dalam  inkubator.  Setelah proses  inkubasi,  semua  sampel  akan  diisolasi DNA nya dengan menggunakan QiaAMP DNA FFPE  kit  dari  QiaGen.  Isolat  DNA  kemudian diuji dengan spektrofotmetri untuk mengetahui kemurnian DNA. Kemurnian DNA dinyatakan  dengan  membandingkan  panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (A260/A280).
Kualitas  hasil  isolat  DNA  akan  dilihat dengan  menggunakan  metode gel-based PCR dengan menggunakan 2 pasangan primer hasil modifikasi yang dinamai Mito ND dan Mito IN yang  menghasilkan  amplicon  masing-masing 320  pb  dan  142  pb.  Sikuen  masing-masing pasangan primer sebagai berikut:
Mito ND: 5’-GTCATCTACTCTACCATCTT-3’ 5’-TCGGGGGTATGCTGTTCG-3’
Mito IN: 5’-CTCAACTTAGTATTATACCC-3’ 5’GGAAATACTTGATGGCAGCT-3’
PCR  dari  hasil  isolasi  DNA    dilakukan dengan  volume total PCR 50 µ L terdiri dari 1
µ l  primer  (1,5 µ g/ml),  1 µ l  (200 µ M) deoxynucleoside  triphosphates (dNTPs),  5 µ l buffer PCR  (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3), 1,5 µ l (2.5 mM) MgCl2, 0,2 µ l (1 unit) Taq polymerase ,  5 µ l  DNA template dan  ditambah air  sampai  volume  50  µl.  Campuran  tersebut diamplifikasi  menggunakan  mesin PCR  i-cycler Biorad ( Biorad  System ,  USA).    PCR  dilakukan dengan  2  macam  pasangan primer untuk memastikan  bahwa  area  target  benar-benar dapat  diidentifikasi.  Sampel  DNA  diamplifikasi sebanyak  35  siklus  dengan  kondisi  amplifikasi: denaturasi  awal  94 o C  selama  4  menit  yang dilanjutkan  dengan  denaturasi  94 o C  selama  45 detik,  tahap annealing primer  54 o C  selama  1 menit 15 detik dan pemanjangan (ekstensi) DNA pada 72 o C selama 45 detik. Pada akhir siklus ke 35 dilakukan penambahan waktu ekstensi 72 o C selama 8 menit.
Hasil  PCR  dilihat  kualitasnya  menggunakan teknik  elektroforesis  pada  gel  agarose konsentrasi  1.5%  yang  diberikan  ethidium bromide  untuk  selanjutnya  divisualisasi  dengan sinar UV pada mesin GelDoc (Biorad).

## 3. Hasil
Penilaian  kualitas  kemurnian  DNA  hasil isolasi  dinilai  dengan  membandingkan pembacaan  DNA  pada  panjang  gelombang 260 nm dan 280 nm (A260/A280). Hasil rata- rata pengukuran spektrofotometri pada kedua kelompok  sampeltidak  jauh  berbeda.  Nilai rata-rata  hasil  spektrofotometri  disajikan dalam tabel 1.
Tabel 1. Nilai rata- rata hasil spektrofotometri
Subjek Usia Penyimpanan FFPE < 1 tahun > 1 tahun A260 0.32250 0.26288 A280 0.27363 0.23300 Rasio A260/280 1.17212 1.12750
Visualisasi hasil PCR dengan primer Mito ND yang  diharapkan  akan  menghasilkan  amplikon
sepanjang  320  pb  ternyata  menunjukkan  hasil negatif pada semua sampel penelitian pada dua kelompok  lama  waktu  penyimpaanan.  Hasil visualisasi  hanya  terlihat  berupa  sebaran  DNA dan fragmen - fragmen DNA yang tidak spesifik. Visualisasi  hasil  PCR  dengan  primer  Mito  ND menggunakan  elektroforesis  disajikan  dalam gambar 1.
Gambar 1. Hasil elektroforesis menggunakan primer Mito ND menunjukkan hasil negatif pada seluruh sampel pada ketinggian pita DNA320 bp. M = DNA Marker 50 bp. M adalah Marker dan KP adalah
Kontrol Positif
Sebaliknya, visualisasi elektroforesis untukproduk  PCR  dengan  primer  Mito  In menunjukkan hasil positif pada semua sampel penelitian,  yaitu  dengan  didapatkannya  pita DNA  sepanjang  142  bp  pada  semua  sampel. Visualisasi  hasil  PCR  dengan  primer  Mito  In menggunakan  elektroforesis  disajikan  dalam gambar 2.
Gambar 2. Hasil elektroforesis menggunakan primer Mito In menunjukkan hasil positif pada seluruh sampel pada ketinggian pita DNA142 bp. M = DNA Marker 50 bp.

## 4. Pembahasan
Formalin fixation and paraffin embedding (FFPE)  merupakan  salah  satu  metode
penyimpanan  sampel  arsip  yang  dapat digunakan  untuk  menyimpan  sampel  arsip dalam  jangka  waktu  lama  di  Bagian  Patologi Anatomi.  Penyimpanan  dalam  bentuk  blok FFPE ini memungkinkan suatu sampel jaringan dapat  disimpan  selama  bertahun-tahun.  Blok FFPE  di  RSUP  Dr.  Mohammad  Hoesin Palembang menyimpan sampel-sampel jaringan  dengan  penyakit  degeneratif  yang sangat  banyak  dan  dapat  menjadi  sumber ilmu  pengetahuan  yang  melimpah,  sehingga sangat  penting  untuk  mengetahui  kualitas DNA dari blok FFPE tersebut. Umur atau lama waktu  arsip  jaringan  blok  parafin  tersebut tersimpan diyakini memengaruhi kualitas dan integritas  mtDNA  hasil  ekstraksi  dari  FFPE. 6 Oleh  karena  itu,  mengetahui  hubungan  lama waku  penyimpanan  dengan  kualitas  mtDNA hasil  ekstraksi  dari  FFPE  di  bagian  Patologi Anatomi  RSUP  Dr.  Mohammad  Hoesin Palembang  merupakan  suatu  hal  yang esensial bagi penelitian di bidang biologimolekuler.
Untuk dapat menganalisis isolat DNA dari blok  FFPE  perlu  dilakukan  proses  ekstraksi DNA  berupa  deparafinisasi  dan  isolasi  DNA. Setelah  dideparafinisasi  dan  dilakukan  isolasi DNA,  isolat  DNA  kemudian  diuji  dengan spektrofotmetri untuk mengetahui kemurnian DNA.  Kemurnian  DNA  dinyatakan  dengan membandingkan  panjang  gelombang  260  nm dan 280 nm (A260/A280).
Pada  penelitian  ini,  hasil  pengukuran spektrofotometri  yang  dilakukan  pada  isolat DNA dari 16 sampel arsip FFPE, menunjukkan kadar  kemurnian  yang  kurang  baik  karena semuanya  berada  di  rentang  rasio  1.6-2.0 yang  merupakan  rentang  ideal  nilai pengukuran DNA. Rendahnya tingkat kemurnian  isolat  DNA  bisa  disebabkan  oleh kontaminasi  protein  dan  molekul  lain  yang tidak  hilang  saat  dilakukan  isolasi.    Terlepas dari rendahnya kualitas DNA hasil isolasi, bila dilihat hasil pengukuran rata-rata untuk setiap sampel  seperti  uang  ditunjukkan  tabel  1  di
atas,  ternyata  isolat  DNA  dari  FFPE  yang disimpan  dibawah  satu  tahun  memiliki kemurnian yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan yang disimpan lebih dari satu tahun.
Kemurnian  isolat  DNA  dari  blok  FFPE dapat dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti proses  fiksasi  dengan  formalin,  teknik  isolasi dan purifikasi DNA yang belum sempurna, dan beberapa  faktor  teknis  lainnya.  Proses  fiksasi dengan formalin membuat crosslinking antara asam  nukleat  dan  protein.  Semakin  lama waktu penyimpanan maka akan semakin kuat crosslink yang terjadi. Selain itu, teknik isolasi dan  purifikasi  yang  kurang  tepat  dan  tidak sempurna  juga  mempengaruhi  tingkat pelepasan crosslinking antara  asam  nukleat dan protein. 6 Pengujian
kualitas isolat DNA menggunakan  teknik  PCR  dan  elektroforesis menunjukkan  pada  penelitian  ini  dilakukan dengan  menggunakan  2  jenis  primer,  yaitu primer Mito ND (320 bp) dan Mito In (149 bp). Penggunaan  2  pasang  primer  dengan  ukuran berbeda  ini  untuk  melihat  seberapa  besar fragmentasi  molekul-molekul  DNA  yang umumnya mengalami degradasi akibat proses parafinisasi  dan  fiksasi  dengan  formalin. Sampel  hasil  amplifikasi  PCR  kemudian dielektroforesis.  Pada  umumnya  bila  molekul DNA  mulai  mengalami  degradasi  atau kerusakan  maka  molekulnya  akan  terpotong- potong  atau  terfragmentasi  oleh  enzim endonuklease  sehingga  biasanya  hanya fragmen-fragmen DNA yang berkuruan kurang dari  200pb  yang  masih  bisa  diamplifikasi dengan  PCR.  Pada  kerusakan  tingkat  lanjut, DNA  akan  benar-benar  terdegradasi  akibat masifnya  aktifitas  enzim  eksonuklease  yang akan  mengurai  satu  demi  satu  basa-basa nukleotida DNA tersebut.  Hasil penelitian ini membuktikan  bahwa  semua  sampel  arsip sampel  FFPE  pada  penelitian  ini  sudah mengalami  fragmentasi  pada  DNA  nya sehingga  hasil  amplifikasi  untuk  amplikon
sepanjang  320pb  tidak  didapatkan  pada semua sampel penelitian baik yang berusia di bawah satu tahun maupun di atas satu tahun. Walapun demikian, amplifikasi untuk amplikon  berukuran  149  menunjukkan  hasil yang positif dan berkualitas baik untuk semua sampel.
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa semua  sampel  pada  penelitian  ini  baik  itu kelompok  sampel  yang  kurang  dari  setahun maupun  lebih  dari  setahun  penyimpanannya sudah  mulai  mengalami  fragmentasi.  Dengan kata lain, penelitian ini mengisyaratkan waktu penyimpanan  atau  umur  sampel  arsip  tidak memberikan  pengaruh  langsung  terhadap intergritas  atau  kualitas  mtDNA  pada  sampel arsip  FFPE  penelitian  ini.  Kesimpulan  ini sejalan dengan sejumlah penelitian terdahulu yang  dilakukan  di  beberapa  negara.  Lin  dan kawan-kawan  melaporkan  bahwa  DNA    dari seluruh  sampel  arsip  FFPE  yang  diujinya  dari tahun  penyimpanan  yang  berbeda,  ternyata hanya  dapat  diamplifikasi  secara  efektif sampai ukuran 191bp,  Lin juga menyimpulkan bahwa isolat DNA dari FFPE hanya baik untuk analisis  tingkat  genetik  yang  hanya membutuhkan  molekul  DNA  yang  pendek, seperti Single  Nucleotide  Polymorphism , Micosatelite , dan methylation status analyses . 7 Ludyga dan kawan-kawan melaporkan bahwa total DNA hasi isolasi dari sampel  arsip  FFPE  yang  berusia  40  tahun relatif memiliki kualias yang sama dibandingkan  dengan  sampel  arsip  FFPE  usia 10  tahun. 9 Penelitian  yang  dilakukan  Kokkat dan  kawan-kawan  yangmembandingkan  hasil ekstraksi DNA jaringan FFPE dari arsip jaringan parafin yang berusia antara 2001– 2013, juga tidak mendapatkan perbedaan yang signifikan pada  kualitas  DNA  antara  sampel  arsip  yang berusia  beberapa  tahundenga  arsip  jaringan FFPE yang baru tesimpan selama 1–2 bulan. 8 Fragmentasi  DNA  ini  dapat  disebabkan oleh  banyak  faktor,  Selain  umur  atau  lama waktu penyimpanan, terdapat faktor lain yang
dapat  memengaruhi  validitas  hasil  penelitian kualitas  DNA  dalam  FFPE  yaitu  kondisi  ketika dilakukan  fiksasi  formalin  pada  proses pembuatan,  iklim,  pH,  suhu  dan  kelembapan lingkungan  penyimpanan  FFPE. 6,10 Secara umum digambarkan bahwa ada 3 faktor yang dapat  menyebabkan  DNA  terfragmentasi  di dalam  FFPE,    yaitu  faktor  proses  pra-fiksasi, faktor fiksasi dan parafinisasi, dan faktor post- fiksasi.  Selain  proses  fiksasi,  proses  ekstraksi juga dapat mempengaruhi terjadinya degradasi  DNA  seperti  faktor pre-treatment , faktor  metode  ekstraksi,  dan  faktor manipulasi DNA post-ekstraksi. 10

## 5. Kesimpulan
Secara  keseluruhan  dari  penelitian  ini diketahui  bahwa  hubungan  kualitas  mtDNA tidak tergntung dari lama waktu penyimpanan sampel  arsip  FFPE.  Sebagai  penelitian pendahuluan  dengan  jumlah  sampel  yang terbatas  tentunya  penelitian  ini  belum  bisa menyatakan bahwa semua sampel arsip FFPE yang  tersimpat  di  tempat  penelitian dilaksanakan  memiliki  kualitas  DNA  yang kurang  baik.  Setidaknya  hasil  penelitian  ini bisa  memberikan  masukan  yang  berarti  bagi penelitian-penelitian genetik selanjutnya yang akan  menggunakan  sampel  arisp  FFPE  di lingkungan tempat penelitian ini sehingga bisa lebih  menyesuaikan  metode  analisis  yang akan dilakukan.
Daftar Pustaka 1. Clayton,  D.  A.  Mitochondrial  DNA Replication. DNA  Replication  Eukaryot. Cell 1015–1027 (1996).
2. Clayton,  D.  A.  Mitochondrial  DNA replication:  What  we  know.  IUBMB  Life, 55(4–5), 213–217. (2003)
3. Jakupciak, J. P., Dakubo, G. D., Maragh, S. &  Parr,  R.  L.  Analysis  of  potential  cancer biomarkers  in  mitochondrial  DNA. Curr. Opin. Mol. Ther . 8, 500–506 (2006).
4. Cza  as  rnecka,  A.  M.,  Gammazza,  A.  M.,
Felice,  V.  Di,  Zummo,  G.,  &  Cappello,  F. (2007). Cancer as a “Mitochondriopathy.” Journal of Cancer Molecules, 71–79.
5. Font, A., Tort, F., Navarro-Sastre, A., Cusi’, V., Garcia-Villoria, J., Briones, P., Ribes, A.
Quantitative  Analysis  of  mtDNA  Content in Formalin-Fixed Parffin-Embedded
Muscle  Tissue.  JIMD  Reports  125  -129 (2011).
6. Xie, R., Chung, JY., Ylaya, K., Williams R. L., Guerero,  N.,  Nakatsuka,  N.,  Badie,  C., Hewitt,  M.  S ., Factors  Influencing  the Degradation  of  Archival  Formalin-Fixed Paraffin-Embedded  Tissue  Sections. J.
Histochem. Cytochem. 59, 356–365 (2011).
7. Lin,  J.,  Kennedy,  S.  H.,  Svarovsky.  T., Rogers,  J.,  Keminitz,  J.  W.,  Xu,  A.,
Zondervan,  K.  T.  High-quality  genomic DNA  extraction  from  formalin-fixed  and paraffin-embedded samples deparaffinized  using  mineral  oil. Anal. Biochem. 395, 265–267 (2009).
8. Kokkat,  T.  J.,  Patel,  M.  S.,  McGarvey,  D., LiVolsi,  V.  A.  &  Baloch,  Z.  W.  Archived Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) Blocks:  A  Valuable  Underexploited Resource for Extraction of DNA, RNA, and Protein. Biopreserv. Biobank. 11, 101–106 (2013).
9. Ludyga,  N.,  Grunwald,  B.,  Azimzadeh,  O., Englesrt,  S.,  Hofler,  H.,  Tapio,  S.,  Aubele, M.  Nucleic  acids  from  long-term preserved  FFPE  tissues  are  suitable  for downstream  analyses.  Virchows  Arch. 460, 131–140 (2012).
10. Gilbert, M. T. P., Haselkorn, T., Bunce, M., Sanchez, J. J., Lucas, S. B., Jewell, L. D., … Worobey,  M.  (2007).  The  Isolation  of Nucleic  Acids  from  Fixed,  Paraffin- Embedded  Tissues-Which  Methods  Are Useful When? PLoS ONE, 2(6). https://doi.org/10.1371/journal.pone.000 0537