© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia

## PENGARUH PEMBERIAN DEAE DEXTRAN DAN PENGATURAN SUHU INKUBASI TERHADAP REPLIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BEREMBRIO
Sapto Rini Budi Prasetyowati* 1 , Jusak Nugraha 2 , Chairul A. Nidom 3 1.2. Prodi S2 Imunologi Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga 1.2. Universitas Airlangga: Jl. Airlangga Surabaya (031) 5041566, 5041536
e-mail: rinifarah14@gmail.com *1

## Abstrak
Kemampuan  replikasi  virus  Avian  Influenza  (AI)  di  telur  ayam  berembrio  (TAB)  tidak stabil.  Titer virus yang dihasilkan rendah dan sangat bervariasi antar tiap TAB.  Suhu inkubasi yang optimal bervariasi untuk masing masing virus AI berkisar 35 0 C- 37 0 C. Di-ethyl amino ethyl Dextran  (DEAE  Dextran)  bersifat  polikationik  sehingga  bisa  meningkatkan  adesi  antara  virus dan sel embrio.  Penelitian ini menggunakan suhu 35 0 C dan suhu 37 0 C serta konsentrasi DEAE Dextran  25  dan  50  mikrogram.    Peningkatan  replikasi  virus  diketahui  dengan  Uji Haemagglutinasi  (HA)  dan  Egg  Infectious  Dose  50.  Hasil  uji  HA  yang  dibutuhkan  adalah Prosentase  titer  HA  ≥  128  HAU.  Hasil  penelitian  dengan  analisa  Chi-square  didapatkan  hasil bahwa virus A/chicken/Subang29/clade 2.1.3/Pusvetma 2012 ada hubungan  prosentase titer HA ≥128, pada suhu inkubasi 37 0 C  dan  antara  tanpa  pemberian  Dextran    dan  dengan  pem-berian DEAE  Dextran  25  dan  50  mikrogram.  Sedangkan  virus  A/Chicken/Sukoharjo/clade 2.3.2/Pusvetma 2012 menunjukkan adanya hubungan besarnya  prosentase titer HA ≥ 128 HAU dengan  suhu  inkubasi  35 0 C  dan  pemberian  Dextran  25  dan  50  mikrogram.  Perbedaan kemampuan  replikasi  kedua  virus  tersebut  dipengaruhi  oleh  perbedaan  susunan  asam  amino pada Haemagglutinin yang ditunjukkan dengan homologi antara keduanya adalah 87,8%-88.1%. DEAE
Dextran  berpengaruh  positif  terhadap  peningkatan  kemampuan  replikasi  virus  Avian Influenza HPAI A/chicken/Subang29/clade 2.1.3/Pusvetma 2012 dan A/ Chicken /Sukoharjo/clade 2.3.2/Pusvetma 2012 pada suhu inkubasi yang berbeda
Keyword: Avian Influenza, DEAE Dextran, Suhu Inkubasi

## 1. PENDAHULUAN
Antigen AI produk Pusvetma berupa whole  virus  AI  strain tertentu  yang inaktif .
Sebagai bahan diagnostik, antigen Pusvetma diharapkan  mempunyai  sifat-  sifat  stabil;
akurasi  (tepat  uji);  dan  antigennya  mudah direplikasi  (dikembangkan).  Sifat  mudah dikembangkan  adalah  salah  satu  kendala dalam produksi vaksin dan antigen.
Berdasarkan  pengalaman  di  laboratorium
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
Pusvetma,  terdapat  perbedaan    kemampuan replikasi di antara virus AI.  Virus AI H5N1 yang diisolasi dari daerah Pare yang pertama muncul pada tahun 2004
(A/Ck/Pare/PVF/2004)  relatif  lebih  cepat berkembang  biak,  lebih  stabil  dan  lebih tinggi  jumlah  virus  yang  dihasilkan  artinya lebih  mudah  bereplikasi.  Sifat  ini  membuat proses  produksi  lebih  mudah,  lebih  cepat dan lebih murah.
Saat  ini  virus  yang  beredar  di Indonesia  adalah  virus  AI  clade  2.3.1  dan virus  AI  clade  2.3.2.  (Azhar,  2014;  Hendra, 2014). Dalam rangka monitoring virus AI di Indonesia  maka  dibutuhkan  antisera  dan antigen  yang  mengandung  kedua  virus tersebut.  Sesuai tupoksinya maka Pusvetma melaksanakan pembuatan hiperimmune serum  AI  clade  2.1.3  dan  clade  2.3.2  di mana dalam proses produksinya membutuhkan  pembuatan  antigen  virus  AI clade 2.1.3 dan 2.3.2.

## 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Faktor-faktor  yang  mempengaruhi kemampuan replikasi virus AI
Respon  kekebalan  telur  ayam  berembrio; suhu inkubasi dan kelembaban, keseragaman  umur  embrio,  strain  virus  AI dan  kemampuan  virus  AI  bereplikasi  pada TAB.
Dalam  produksi  antigen,  hasil  uji Haemagglutinasi  diharapkan  bisa  mencapai nilai  sama  dengan  atau lebih  besar  dari  128 HAU  sehingga  keseluruhan  proses  produksi bisa  efisien  dan  efektif.    Kemampuan replikasi virus berubah dari waktu ke waktu yang ditunjukkan dengan hasil uji Haemagglutinasi  yang  cenderung  menurun. Oleh  karena  itu  dicari  cara  untuk  bisa menyelesaikan  masalah  ini.    Suhu  inkubasi adalah salah satu faktor yang mempengaruhi kemampuan  replikasi  virus  AI  pada  telur ayam  berembrio  (TAB).  Suhu  yang  tinggi mempengaruhi kadar penguapan yang terjadi  melalui  pori  kerabang.    Keadaan  ini mempengaruhi  volume  alantois.  Semakin banyak  terjadi  penguapan  ,  volume  alantois semakin  berkurang.    Aktifitas  yang  tinggi dari Haemagglutinasi (HA) dan
Neurominidase  (NA)  membebani  embrio dan  menyebabkan  kematian  awal  pada
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
embrio.  Kematian awal embrio berpengaruh terhadap  efisiensi  produksi.  Hasil  penelitian Khalili  didapatkan  bahwa  telur  ayam berembrio  yang  bisa  dipakai  lebih  banyak jika  diinkubasikan  pada  suhu  35 0 C.    Hasil penelitian mengenai suhu inkubasi berdasarkan analisa statistik, perbedaan suhu
berpengaruh  secara  signifikan  terhadap aktivitas enzyme polymerase yang meningkat  pada  suhu  39 0 C  dibandingkan pada  suhu  35 0 C  (Lang  et  al.,  2011).  Tapi peneliti  lain  menulis  bahwa  titer  HA tertinggi  didapatkan  jika  suhu  inkubasi 34,4 0 C  tergantung  strain  virus  (Khalili,
2013)
2.2. DEAE Dextran
Penggunaan senyawa di-ethyl aminoethyl  dextran  (DEAE  Dextran)  untuk meningkatkan  kemampuan  replikasi  virus yang  ditunjukkan  dengan  tingginya  titer virus  baik  dalam  EID50  maupun  HA. Penambahan  inokulum  dengan  Di-Ethyl Amino Ethyl Dextran (DEAE Dextran) akan meningkatkan  titer  HA  2  log.      DEAE Dextran  juga  dapat    mempermudah  partikel virus  untuk  melekat  pada  permukaan  sel
karena sifatnya sebagai polikation . Informasi  yang  lain  menyebutkan  bahwa DEAE  Dextran  bertindak  sebagai  pengikat di permukaan sel sebagai sumber ionik virus untuk melekat.  (Hassan et al, 2011)

## 3. METODE PENELITIAN
Telur  ayam  berembrio  yang  dipakai adalah  Spesifik  Antibodi  Negatif  (SAN) diinokulasi dengan virus AI  clade 2.1.3 dan clade 2.3.2.   Di-Ethyl Amino Ethyl Dextran (DEAE  Dextran)  produk  dari  Sigma kemasan  10  gram.    DEAE  Dextran diencerkan menjadi 25 µg DEAE Dextran/0.1 ml dan 50 µg DEAE Dextran/0.1  ml.    Inokulum  virus  berisi  10 3
EID 50/0.1 ml larutan working seed virus AI clade 2.1.3 dan clade 2.3.2.  Besarnya dosis DEAE  Dextran  ditentukan  dari  penelitian Eman  A.  Hassan  et  al    2011.    Inokulasi dilakukan  inokulasi  DEAE  dextran  terlebih dahulu 0.1 ml,  kemudian suspensi virus 0.1 ml.    Perlakuan  antar  strain  dilakukan  pada waktu  yang  berbeda  untuk  mencegah kontaminasi.    Telur  ayam  berembrio  yang telah  diinfeksi  virus  AI  H5N1  diberi identitas  yang  jelas  dan  diinkubasi  pada
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
suhu  35 o C  dan  37 o C  di  dalam  inkubator selama  dua  hari.  Pengamatan  terhadap keadaan  embrio  dilakukan  setiap  jam dengan  cara  diteropong  (candling)  untuk memastikan  bahwa  embrio  masih  hidup. Telur  yang  mengandung  embrio  yang  telah mati segera dikeluarkan dari inkubator untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam refrigerator  bersuhu  4 o C  guna  mencegah terjadinya  pembusukan.    Telur  ayam berembrio yang telah disimpan pada suhu 4 o
C  selama  4-24  jam  kemudian  dikeluarkan. Bagian  kerabang  telur  didesinfeksi  dengan menggunakan  alkohol  70%,  kemudian kulit/kerabang telur dikelupas secara aseptik. Membran khorioallantois dan amnion  disingkap  dan  digunting  lalu  cairan allantoisnya  disedot  dengan  mengunakan spuit  secara  hati-hati  ,  agar  kuning  telur tidak  ikut  terhisap.  Masing-masing  telur yang dipanen menggunakan spuit yang baru,
Setiap spuit diberi tanda sesuai dengan label yang  ada  pada  telur.  Hasil  panen  cairan alantois  selanjutnya  dibagi  dalam  wadah steril  masing  masing  1  cc  dan  disimpan  di suhu -80 0 C sampai dipergunakan.

## UJI HA
Penyiapan  Sel  Darah  Merah  /  Red  Blood Cell (RBC) Ayam  1 %.
Darah  ayam  segar  diambil  dengan menggunakan  spuit  5  ml  melalui  vena brachialis,  selanjutnya  ditampung  dalam tabung  reaksi  yang  telah  diisi  antikoagulan EDTA,  dengan  dosis  1  mg/mL  darah.  Sel darah merah dalam tabung reaksi ditambahkan PBS pH 7,0 kemudian disentrifugasi  dengan  kecepatan  2000  RPM selama 15 menit. Supernatan dibuang, pellet ditambahkan PBS dan disentifugasi kembali. Hal  ini  dilakukan  sebanyak  tiga  kali sehingga diperoleh suspensi sel darah merah yang  bersih  dan    dibuat  RBC  5  %  dan  1% dengan penambahan PBS pH 7,0.
Metode titrasi virus dengan cara Hemagglutination Assay (HA) (FAO,2014)(OIE,2012)
a. Virus    dititrasi  pada  mikroplate  U- bottom 96-well plate .
b. 25  µl  PBS  dimasukkan  kedalam seluruh well sesuai jumlah baris yang sudah  dihitung  untuk  mengadakan pengujian.
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
c. 25  µl  alantois  dimasukkan  ke  dalam
well pertama  di  masing-masing  baris pertama untuk pengujian.
Pengenceran  serial  dua  kali  dari alantois  mulai  kolom  1  ke  kolom  11 dan  buang  25  µl  dari  kolom  11. Kolom 12 sebagai kontrol RBC d. 25  µl    PBS  dimasukkan  ke  semua wells yang  akan  digunakan  untuk
pengujian.
e. Darah  merah  ayam  (RBC)  1% dimasukkan  ke  dalam  semua  well yang  digunakan  untuk  pengujian, tutup  semua  plate,  goyangkan  selama 10 sampai 15 detik.
f. Inkubasi  dalam  suhu  4  C  selama  45
sampai 60 menit
g. Periksa plate untuk haemagglutinasi;
Titrasi  endpoint  adalah  pengenceran
antigen tertinggi dimana terjadi agglutinasi  lengkap.  Pada  tingkat pengenceran  ini,  virus  dianggap
mengandung 1 haemagglutinating unit
(HAU) per 25 µl.
Metoda titrasi EID 50 (Young,2010)
Alantois  yang  dikumpulkan  dari masing  masing TAB untuk setiap perlakuan diencerkan  secara  desimal  dalam  larutan fosfat  penyangga  steril  PBS  ( Phosphat Buffer  Saline )  dengan  pH  7,2  yang mengandung  Gentamicin  0.2%.    Dari pengenceran  itu  kemudian  diambil  5 pengenceran  tertinggi  yaitu  10 -5 sampai dengan 10 -9 untuk disuntikkan kedalam telur -  telur  ayam  berembrio  umur  11  hari  .  Tiap pengenceran  tersebut  disuntikkan  kedalam ruang  khorio  alantoik  telur  ayam  berembrio sebanyak  5  butir  dengan  volume  0,1  ml  per butir  telur.  Sedangkan  untuk  kontrol  terdiri dari  5  butir  telur  ayam  berembrio  umur  10 hari,  disuntik  dengan  0,1  ml  larutan  PBS steril  dengan  pH  7,2  .  Kemudian  telur-telur yang telah disuntik disimpan dalam inkubator  pada  suhu  37  °  C  .  Telur-telur tersebut  diamati  setiap  hari  dengan  cara meneropong memakai bola lampu ( Candling ). Kematian embrio pasca inokulasi  harus  dicatat  kemudian  cairan khorio  alantoiknya  diambil  untuk  dilakukan uji  hemaglutinasi  (HA)  untuk  memastikan bahwa  kematian  tersebut  disebabkan  oleh
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
virus  AI.  Penginkubasian  dilakukan  selama 5 hari, setelah 5 hari semua telur yang masih tersisa (embrio belum mati) dibunuh dengan cara  menyimpan  didalam  lemari  es  pada suhu  4  °  C  selama  satu  malam.  Dari  setiap telur  diambil  cairan  khorio  alantoiknya  dan dilakukan  uji      Hemagglutinasi  (HA)  satu persatu . Selanjutnya kandungan virus dalam EID50 ditentukan berdasarkan rumus sbb . :
M    = Titik akhir (endpoint) (EID so); Xk  =
Nilai log pada garis akhir titrasi (10)
d        =  Log  -pengenceran  dalam  hal  ini pengenceran 10 kali (log 10=   1);
∑  r  i  =  Jumlah  semua  telur  yang  tidak
terinfeksi;  n    =  Jumlah  telur  yang diinokulasi  setiap  pengenceran  (  5 butir telur)
Analisa data
Analisa  data  menggunakan  Chi- square  karena  yang  dibandingkan  dua variabel  yakni    hasil  uji  HA  sama  dengan atau  lebih  dari  128  HAU  dengan  alantois dengan  nilai  HA  dibawah  128  HAU  .
Tujuannya  untuk  melihat  apakah  ada hubungan  antara  prosentase  HA  sama
dengan  atau  di  atas  128  HAU  dengan  3 variabel  bebas.    Dalam  penelitian  ini variable  bebasnya  ada  3,  yakni  DEAE dextran,  Strain  virus  ,  dan  suhu  yang berbeda.

## 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
Tabel 5.2 Crosstab dan Chi-square test
A/chicken/Subang29-clade 2.1.3/Pus-vetma-2012
m=X k +1 d -d. ∑ri 2              n
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
Ho  :  Tidak  ada  hubungan  antara  prosentase alantois  yang  mengandung  virus  di
≥128 HAU dengan perlakuan,
pemberian DEAE  Dextran  25  dan  50
Mikrogram  dengan  0.1  ml  alantois, dan  tanpa  pemberian  Dextran jika diinkubasikan pada suhu 37 0 C
H1  :    ada  hubungan  antara  prosentase
alantois yang mengandung virus ≥128
HAU  dengan  perlakuan,  pemberian
DEAE Dextran 25 dan 50 Mikrogram dengan  0.1  ml  alantois,dan  tanpa pemberian Dextran jika diinkubasikan pada suhu 37 0 C
Jika  Chi-square  hitung  <  Chi-square tabel,  maka  Ho  diterima;  Jika  Chi- square  hitung  >  Chi-square  tabel, maka Ho ditolak; Dari Tabel 5.2, jika α=  0.05,  df=2  maka  Chi-square  tabel adalah  5.991,  sedangkan  pada  tabel 5.2  Chisquare  hitung  adalah  13.467, maka  Chisquare  >  chisquare  tabel, sehingga Ho ditolak. Probabilitas atau Asymp hitung adalah 0.01, lebih kecil dari 0.05 maka Ho ditolak.  Replikasi virus  AI  Subang  29  clade  2.1.3  akan
meningkat    jika  inokulum  diberi DEAE  Dextran  dan  diinkubasikan pada suhu 37 0 C
Dari  Tabel,  jika  α=  0.05,  maka  Chi-square tabel adalah 3.841, sedangkan pada tabel 5.2 Chisquare  hitung  adalah  6,438,  maka Chisquare hitung > chisquare tabel, sehingga Ho ditolak.  Probabilitas atau Asymp hitung adalah 0.004, lebih kecil dari 0.05 maka Ho ditolak.    Kesimpulan :  ada  hubungan  antara prosentase  alantois  yang  mengandung  virus di  atas  128  HAU  dengan  perlakuan pemberian
DEAE Dextran 25
Mikrogram/0.1  ml  PBS  dengan  0.1  ml alantois, yang  diinkubasikan  pada  suhu  37 0
C dan 35 0 C
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
JBP Vol. 17, No. 3, Desember 2015—Sapto Rini Budi Prasetyo
Tabel 5.4. Nilai EID 50 virus
Nilai  EID  50  diperoleh  dari  koleksi  seluruh alantois masing masing perlakuan dari HA 0 sampai 512.  EID50 bukan merupakan hasil pengulangan oleh karena itu dianalisa secara deskriptif.    Dari  tabel  terlihat  dari  masing masing  virus,  dan  perlakuan  suhu  inkubasi, nilai EID 50 terkecil adalah perlakuan tanpa DEAE Dextran.
Hasil uji haemaglutinasi virus A/chicken/Subang29/clade  2.1.3  /Pusvetma 2012 menunjukkan adanya hubungan antara prosentase  HA  lebih  atau  sama  dengan  128 dengan dengan penambahan DEAE Dextran 50  mikro  dan  25  mikro  dengan  inokulum tanpa  DEAE  dextran.  Pada  virus  AI A/Chicken/Sukoharjo/clade  2.3.2/Pusvetma 2012  ada  hubungan  antara  prosentase  HA lebih  atau  sama  dengan  128  HAU  dengan
penambahan  DEAE  Dextran  50  mikro  dan
25 mikro Pada penelitian ini DEAE terbukti mempengaruhi  kemampuan  replikasi  virus Avian  Influenza  sesuai  dengan  hasil penelitian  yang  dilakukan  oleh  Pari  dan  Xu pada  tahun  2004  yang  menggunakan  Deae Dextran  dalam  proses  transfeksi  DNA  ke dalam  sel  sejak  awal  tahun  80  an. Penggunaan DEAE Dextran dapat menghemat  jumlah  DNA  yang  dipakai sampai 8-14 kali lipat ( Gauss,1992).  DEAE Dextran bersifat polikation sehingga memfasilitasi  infeksi  virus  pada  sel  secara efisien.    DEAE  dapat  berikatan  pada permukaan sel sehingga memudahkan perlekatan  virus  pada  sel  sehingga  ada hubungan  antara  pemberian  DEAE  Dextran pada  infektifitas  virus  New  Castle  disease (Hasaan et al., 2011).
Pada penelitian ini virus AI A/chicken/Sukoharjo/clade  2.3.2/Pusvetma 2012  ada  hubungan  antara  prosentase  HA lebih  atau  sama  dengan  128  HAU  dengan penambahan  DEAE  Dextran  50  mikro  dan 25 mikro jika diinkubasikan pada suhu 35 0 C.
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
Virus A/chicken/Subang29/clade 2.1.3
/Pusvetma  2012  menunjukkan  adanya  hu- bungan  antara  prosentase  HA  lebih  atau sama dengan 128 dengan dengan penambahan  DEAE  Dextran  50  mikro  dan 25  mikro  dengan  inokulum  tanpa  DEAE dextran  jika  diinkubasikan  pada  suhu  37 0 C.
Suhu inkubasi berpengaruh pada pertumbuhan virus.  Lang et al (2011) Suhu 37 0 C  mempengaruhi  aktivitas polymerase viral, dan mendorong kecepatan pertumbuhan  embrio.    Aktifitas  polymerase virus  meningkatkan  replikasi  virus  AI. Suhu  inkubasi  juga  berpengaruh  pada aktifitas trypsin like protease yang ada pada cairan  alantois  dan  amniotic.    Protease membelah HA pada LPAI pada temperature di  atas    35 0 C  .    Hasilnya  adalah  mening- katnya  perlekatan  virus  pada  sel  epitel  dan meningkatnya replikasi virus pada sel epitel dan meningkatkan replikasi pada TAB umur 10,  sebaliknya  pada  umur  14  hari  aktifitas protease  merusak  protein  HA  virus Avian
Influenza . Khalili menuliskan bahwa
temperature berpengaruh pada jumlah alantois.    Hal  ini  disebabkan  karena  semua
telur  secara  pasti  kehilangan  air  yang menguap  ,  keluar  melalui  kerabang  telur sekitar  10-11%.    Semakin  tinggi  suhu inkubasi  maka  penguapan  akan  semakin banyak.
Sebagian  virus  lebih  menyukai  suhu 35 0 C untuk multiplikasi virus pada membrane  alantois  dengan  penyebab  yang belum diketahui (Khalili et al.,2013). Seperti pada  hasil  penelitian  ini    virus  AI A/chicken/Sukoharjo/clade  2.3.2/Pusvetma 2012  ada  hubungan  antara  prosentase  HA lebih  atau  sama  dengan  128  HAU  dengan penambahan  DEAE  Dextran  50  mikro  dan 25 mikro jika diinkubasikan pada suhu 35 0 C

## 5. KESIMPULAN
Penambahan  DEAE  Dextran  berpe- ngaruh  positif  pada  kemampuan  re- plikasi kedua virus dengan suhu inkubasi yang berbeda.  Dengan mengetahui pola replikasi  virus  AI  untuk  bisa  mencapai titer HA sama dengan atau lebih dari 128 HAU  dengan  prosentase  yang  tinggi maka  dalam  produksi  antigen  selanjut- nya  akan  digunakan  DEAE  Dextran
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
dengan  penyesuaian  suhu  inkubasi  se- suai  dengan  jenis  virusnya.      Dalam  In- dustri  produksi  vaksin  dan  antigen,  per- kembangan  virus  AI  demikian  cepat  di Indonesia  maka  diperlukan  penelitian terhadap  setiap  virus  strain  baru  untuk mengetahui  kemampuan  replikasi  virus secara optimal.

## DAFTAR PUSTAKA
Azhar  M.,2014.  “Perkembangan  Kasus  AI pada Unggas dan Kematian Itik akibat AI  sampai  dengan  31  Januari  2014”. Technical  Briefing  Meeting    ke  10 Ditkeswan – FAO, 7 Februari 2014
Dhamayanti  NLPI,,  Hartawan  R,  Hewajuli DA, Hardiman, Wibawa H, Pudjiatmoko.  2013.  “”Karakteristik Molekuler  dan  Patogenesitas  Virus H5N1  clade  2.3.2  asal  Indonesia .
JITV Vol. 18 No2 Th. 2013: 99-113
Gauss G., and Lieber M.R., “DEAE-dextran enhances electroporation of mammalian  cells”.    1992. Nucleic Acids Research, 1992, Vol. 20, No. 24 6739-6740 Hassan,E.A,  Wanis,  N.A  and  Susan  K. Tolba. 2011. “Study Of Incorporation Deae  Dextran  During  Production  Of Local Avian Influenza (Ai) Inactivated Vaccine” Egypt. J. Agric. Res., 89 (3), 2011 FAO, OFFLU. 2010.”Prescreen HI
protocol”. Prescreen  HI  Protocol Training
Khalili, I, Ghadimipour,R, Ameghi,A, Sedigh-Eteghad, S. 2013. “Optimization of incubation temperature  in    embryonated  chicken eggs  inoculated  with  H9N2  vaccinal subtype  of  avian  influenza  virus”. Veterinary  Research  Forum.  2013;  4 (3)  145  -.  148.  Journal  Homepage: vrf.iranjournals.ir
Lang,  V.,Marjuki,V.,  Krauss,S.L.,  Webby
R.J., and. Webste R.G. 2011. “Different  Incubation  Temperatures Affect Viral Polymerase Activity And Yields  Of  Low-Pathogenic  Avian Influenza  Viruses  In  Embryonated Chicken  Eggs”. Arch  Virol.  2011 June ; 156(6): 987–994.
Nongluk.S.,  and  Yasuo  Suzuki.  2012. “Molecular  basis  of  the  structure  and function  of  H1  hemagglutinin  of influenza  virus”. Proc.  Jpn.  Acad., Ser. B88(2012) doi: 10.2183
/pjab.88.226
OIE Terrestrial Manual.2012. Chapter 2.3.4. Avian influenza Pari  G.S.,Xu  Y.,  2004.  “Gene  Transfer  into Mammalian  Cells  Using  Calcium Phospat dan DEAE Dextran. Methodes” in Molecular Biology. Vol
245. Humana Peress Inc.
Wibawa  H.  2014.  “Genetic  and  antigenic mapping  of  H5N1  HPAI  virus  in Indonesia,  2008  –  2013”. Technical Briefing  Meeting    ke  10  Ditkeswan  – FAO, 7 Februari 2014
Young M., Alders R., Grimes S., Spradbrow P.,  Dias  P.,  da  Silva  A.  and  Lobo  Q. 2012.  “Controlling  Newcastle  disease in  village  chickens”  A  laboratory manual.  2nd  edn. ACIAR  Monograph No. 87. Australian Centre for
International Agricultural
© (2015) Program Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
JBP Vol. 17, No. 3, Desember 2015—Sapto Rini Budi Prasetyo