Biofaal Journal; Vol 3, No 1. Juni 2022. Pp 19 – 27. ISSN: 2723-4959 (online)

## ANALISIS FILOGENETIK SUBUNIT ALFA DNA POLIMERASE III DAN ERROR-PRONE DNA POLIMERASE DARI GENUS RHODOBACTER
Edwin Thomas Apituley 1*) , Amos Killay 2) 1*,2) Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas pattimura, Ambon. 1*) Corresponding Author e-mail: edwin.apituley.mail@gmail.com
Informasi
Abstrak. Kata kunci: DNA polimerase , Error –prone
DNA polymerase, filogeni,  Rhodobacter Sekuens nukleotida dari gen dna E yang mengkodekan subunit alfa dari DNA polimerase III maupun sekuen asam amino produknya dari genus Rhodobacter dan beberapa genus yang  berhubungan  dianalisis  untuk  menentukan  hubungan  evolusioner  mereka.  Metode Maximum  Likelihood  dan  model  Kimura  2  parameter  masing-masing  untuk mengkonstruksi  pohon  filogenetik  dan  mengukur  jarak  genetik.  Pohon  filogenetik berdasarkan  sekuen  nukleotida  dari  gen  yang  mengkodekan  subunit  alfa  dari  DNA polimerase  III  dibandingkan  terhadap  pohon  filogenetik  berdasarkan  sekuen  gen 16S rRNA, Genus Rhodobacter maupun genus lain yang diuji memiliki 2 jenis dnaE, diberi nama dna E1 dan dna E2. Perbandingan pasangan sekuen menunjukkan bahwa persentase keidentikan sekuen antara kedua jenis gen dibawah 50 persen untuk sekuens nukleotida dan  25  persen  untuk  sekuen  asam  amino.  Satu  anggota  genus Rhodobacter , R.sediminicola JA983  memiliki  tiga  salinan  gen  dnaE  dengan  rentang  keidentikan  40 persen  hingga  54  persen  untuk  sekuen  nukleotida  dan  22.6  hingga  50.6  persen  untuk sekuen asam amino. Pohon filogenetik berdasarkan sekuen nukleotida dna E memiliki dua percabangan  utama,  masing-masing  mewakili dna E1  dan dna E2.  Topologi  dari  pohon filogenetik  berdasarkan  gen  dnaE  memiliki  kemiripan  terhadap  pohon  filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA, terutama untuk percabangan dna E1. R.sediminicola memiliki  satu  salinan  gen  pada  percabangan dna E1  dan  dua  salinan  gen  pada percabangan dna E2, pada pohon filogenetik berdasarkan sekeun gen dna E, dan dianotasi sebagai dna E2.1 dan dna E2.2.
Information Abstract. Key words : DNA
polymerase , Error – prone DNA polymerase, phylogeny, Rhodobacter Nucleotide sequences of dna E gene encoding subunit alpha of DNA polymerase III as well as amino acid sequence of their products from genus Rhodobacter and some related genus were analyzed to determine their evolutionary relationship. Maximum Likelihood method and Kimura 2 Parameter model were each used to construct phylogenetic tree and measure genetics distance. The phylogenetic tree based on nucleotide sequences of gene encoding subunit alpha of DNA polymerase III was compared to phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence. Genus Rhodobacter as well as other genus examined had two  types  of dnaE gene,  namelly dnaE 1  and dnaE 2.    Pairwise  sequence  comparison showed  that  percentage  of  sequence  identity  between  these  two  types  of  genes  were below 50 percent for nucleotide sequence and 25 percent for amino acid sequence. One member Genus Rhodobacter , R.sediminicola JA983 had three copies of dnaE gene with percentage  of identity  among  them  were 40  to  54  percent  for nucleotide  sequence  and 22.6 to 50.6 percent for amino acid sequence. The phylogenetic tree based on nucleotide sequence of dnaE gene have two main branch, each represent dnaE 1 cluster  and dnaE 2 cluster.  The  topology  of  phylogenetic  tree  based  on dna E    showed  similarity  to phylogenetic  tree  based  on 16S rRNA  gene,  especially  for  branch  of dnaE 1. R. sediminicola had one copy of dnaE on dnaE 1 branch and two copy of dnaE on the dnaE 2 branch in phylogenetic tree based on nucleotide sequence of dnaE gene, which annotated here as dnaE 2.1 and dnaE 2,2.
Received: 20 April 2022 Accepted: 14 Mei 2022 ©2022 Jurusan Biologi FMIPA Unpatti, IAIFI Cab. Ambon
Biofaal Journal; Vol 3, No 1. Juni 2022. Pp 19 – 27.

## ISSN: 2723-4959 (online)

## A. PENDAHULUAN
DNA polimerase adalah suatu kompleks enzim yang berperan pada sejumlah proses yang berlangsung  didalam  sel,  termasuk  didalamnya  replikasi  DNA,  perbaikan,  pencegahan  dan perbaikan  kesalahan  dengan  ketepatan  proses-proses  ini  adalah  sumber  utama  variasi  sekuen DNA  (McHenry,  C.S,  2011;  Zhao et.  al .,  2006 ) .  Polimerase,  sebuah  sliding  clamp  dan  camp loader  adalah  tiga  komponen  yang  dibutuhkan  untuk  sel  untuk  mereplikasikan  kromosomnya (Kornberg dan Baker, 1992). Enzim polimerase yang bertanggung jawab replikasi DNA bakteri adalah DNA polimerase III (O’Donnell et. al ., 2013) yang terdiri dari tiga subunit, salah satunya adalah  subunit  alfa  yang  bertanggung  jawab  untuk  aktifitas  katalitik  dari  enzim  (Beattie  and Reyes-Lamothe,  2015).  Pada Escherichia  coli ,  subunit  alfa  adalah  produk  dari  gen dna E (Fijalkowska et.al., 2012), sedangkan beberapa bakteri memiliki dua jenis gen dna E, yaitu dna E1 dan dna E2, yang mengkodekan produk DnaE1 dan DnaE2. Pseudomonas aeruginosa memiliki DnaE1  yang  berfungsi  untuk  pemanjangan  primer  RNA  dan  pemrosesan  replikasi  kromosom secara  cepat,  Dna2  merupakan  error-prone  DNA  polymerase  yang  memiliki  fungsi  dalam replikasi  rawan  kesalahan  dan  induksi  mutagenesis  (McHenry,  C.S,  2011).  Error-prone  DNA polymerase atau DNA polimerase rawan kesalahan adalah produk dari gen dna E2 dan bertindak sebagai  penyeimbang  yang  memastikan  laju  mutasi  rendah  pada  genom Myxococcus  xanthus pada sel yang beradaptasi pada lingkungan baru  (Peng et.al ., 2017) dan sebagai mediator utama untuk Myc obacterium tuberculosis bertahan melalui mutagenesis yang terinduksi (Boshoff et.al ., 2003). Rhodobacter adalah  suatu  genus  bakteri  yang  secara  taxonomi  berada  pada  kelas Alphaproteobacteria dan memiliki kemampuan untuk melakukan fotosintesis secara anoksigenik dan  hidup  pada  lingkungan  yang  bervariasi    (Hördt et.al .,  2020;  Imhoff et.al .,  1984.,  Imhoff, 2017).  Anggota  genus Rhodobacte r  juga  memiliki  kemampuan  metabolisme  yang  lain  seperti respirasi aerob, anaerob, dan fermentasi untuk menghasilkan ATP, kemampuan untuk beradaptasi terhadap lingkungannya (Licht et al ., 2020). Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis filogeni subunit  alfa  DNA  polimerase  III  dan  error-prone  DNA  polymerase  dari  genus Rhodobacter berdasarkan sekuen gen dan asam amino.

## B. METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari hingga Mei 2022 pada laboratorium jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pattimura, Ambon. Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  berupa  perangkat  komputer  untuk  mengumpulkan  dan  mengolah data.  Bahan  yang  digunakan  berupa  sekuen  nukleotida  dan  asam  amino  yang  diperoleh  dari National  Center  for  Biotechnology  Information  (NCBI)  Data  Bank,  United  State  of  America (Sayers et.al .,  2021).  Sumber  sekuen  ini  adalah  were Rhodobacter aestuarii DSM19945, Rhodobacter  maris JA276, Rhodobacter  capsulatus SB1002, Rhodobacter  viridis JA737, Rhodobacter  xinxiangensis TJ48, Rhodobacter  sp .LPB0142, Rhodobacter  sediminicola JA983, Rhodobacter  flagellatus SYSU, Rhodobacter  thermarum YIM73036, Luteovulum  sphaeroides
Biofaal Journal; Vol 3, No 1. Juni 2022. Pp 19 – 27.

## ISSN: 2723-4959 (online)
2.4.1, Luteovulum  azotoformans Ka25, Luteovulukm  ovatus, JA234 Bieblia  veldkampii DSM11550, Tabrizicola aquatica RCRI19 and Tabrizicola blasticus 28/5.
Analisis Data Data  hasil  penelitian  ini  dianalisis  dengan  metode  analisis  filogenetik,  yang  dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak MEGA X (Kumar et.al ., 2018), dengan metode Maximum Likelihood (Felsenstein,  1981) dan model Kimura 2 Parameter (Kimura, 1980). Penjajaran multi sekuen diperoleh menggunakan Clustal-W (Thompson et.al., 1994). Analisis bootstrap dilakukan dengan melakukan 1000 uji bootstrapped untuk  mengevaluasi  topologi dari  pohon  filogenetik. Persentase  keidentikan  antar  sekuen  dihitung  sebagai  persentase  jumlah  nukleotida  atau  asam amino yang identik pada suatu sekuen relatif terhadap jumlah total nukleotida atau asam amino. Conserved Protein Domain Family pada NCBI digunakan untuk memvalidasi setiap salinan gen dna E dari R.sediminicola (Lu et.al ., 2020).

## C. HASIL DAN PEMBAHASAN
Sembilan strain dari genus Rhodobacter dan tujuh strain dari genus yang berhubungan, dan  sebelumnya  dimasukkan  dalam  genus Rhodobacter (Hördt et.al .,  2020),  dianalisis  pada penelitian ini. Semua strain yang diuji dalam penelitian ini memiliki dua jenis  gen dna E, jenis pertama menyandikan subunit alfa dari DNA polimerase III dan dianotasi sebagai dna E1, jenis yang  kedua  menyandikan    polimerase  rawan  kesalahan  dan  dianotasi  sebagai dna E2. Rhodobacter sediminicola merupakan satu-satunya strain yang memiliki satu salinan dna E1 dan dua salinan dnaE 2, yaitu dnaE 2.1 dan dna E2.2.  Conserved Protein Domain Family pada NCBI digunakan untuk memvalidasi satu salinan dna E dari R.sediminicola JA983 sebagai subunit alfa dari  DNA  polimerase  IIII  ( dna E1)  dan  dua  salinan  yang  lain  sebagai  DNA  polimerase  rawan kesalahan ( dna E2.1 dan dna E2.2). Persentase keidentikan sekuen nukleotida antara dna E1 dan dna E2  untuk  semua  strain  yang  diuji  berada  dibawah  50  persen,  sedangkan  persentase keidentikan  sekuen  asam  amino  antara  produk dna E1  dan dna E2  berada  dibawah  25  persen (Gambar 1). Persentase keidentikan sekuen nukleotida pada ketiga gen dna E pada R.sediminicola JA983 juga berada dibawah 50 persen,  kecuali  antara dnaE 2,1 dan dna E 2 .2  yaitu 54.3 persen (Gambar  2).  Ketiga  gen dna E  pada R.sediminicola JA983  menyandikan  sekuen  asam  amino dengan  persentase  keidentikan  diantara mereka  berada  dibawah  25  persen  kecuali  50.6  persen antara dnaE 2.1  dengan dna E2.2.  Pohon  filogenetik  berdasarkan  sekuen  nukleotida  gen dna E menunjukan terdapat dua percabangan utama pada pohon (Gambar 3).
Biofaal Journal; Vol 3, No 1. Juni 2022. Pp 19 – 27. ISSN: 2723-4959 (online)
Gambar 1.   Persentase keidentikan sekuen nukleotida (kotak teriisi) dan asam amino (kotak terbuka)  antara gen dna E1 dan dna E2,  dan produk proteinnya.
Gambar 2.  Persentase  keidentikan  sekuen  nukleotida  (kotak  terisi)  dan  asam  amino  (kotak    terbuka)  antara gen dna E1, dna E2.1 dan dna E2.2  dari R.sediminicola JA983 dan  asam amino proteinnya.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Pe rs en ta se k eid en tik an 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 dnaE1 vs dnaE2.1 dnaE1 vs dnaE2.2 dnaE2.1 vs dnaE2.2 Pe rs en ta se k eid en tik an
Biofaal Journal; Vol 3, No 1. Juni 2022. Pp 19 – 27.

## ISSN: 2723-4959 (online)
Gambar 3. Pohon filogenetik berdasarkan analisis sekuen gen dna E. Jarak genetik diindikasikan oleh skala.
dnaE 2
dnaE 1
Biofaal Journal; Vol 3, No 1. Juni 2022. Pp 19 – 27.

## ISSN: 2723-4959 (online)
Gambar 4.  Pohon filogenetik berdasarkan pada analisis sekuen gen 16S rRNA. Jarak genetik diindikasikan  oleh skala.
Percabangan  pertama  mewakili  kelompok  gen dna E1  dan  jika  dibandingkan  terhadap pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA (Gambar 4), keduanya memiliki kemiripan topologi. Percabangan kedua mewakili kelompok gen dna E2 dan memiliki perbedaan topologi jika  dibandingkan  terhadap  topologi  percabangan  yang  pertama.  Terdapat  sub  kelompok  pada percabangan dna E2  yang  terdiri  dari  strain  yang  berasal  dari  genus  yang  berbeda  seperti Rhodobacter  sediminicola JA983, Luteovulum  ovatus JA234, Bieblia  veldkampii DSM11550, Tabrizicola blasticus 28/5 dan Rhodobacter xinxiangensis TJ48.
Biofaal Journal; Vol 3, No 1. Juni 2022. Pp 19 – 27. ISSN: 2723-4959 (online)
Bakteri dari genus Rhodobacter memiliki 2 produk dari gen dna E, dinamai pada NCBI sebagai subunit alfa DNA polimerase  III, produk dari  gen dna E1 dan DNA polimerase rawan kesalahan,  produk  dari  gen dna E2,  Persentase  keidentikan  antara  gen dna E1  dan dna E2  atau produk protein dari kedua gen tersebut diantara strain dari  genus Rhodobacte r bersifat rendah, yaitu dibawah 50 persen pada tingkatan sekuen nukleotida dan dibawah 25 persen untuk sekuen asam amino. Persentase keidentikan antara gen dna E1 dan dna E2 dan produknya, terutama untuk sekuen  asam  amino  bersifat  rendah  dibandingkan  mikroba  lain  misalnya  30  persen  untuk Myxococcus xanthus (Peng et.al ., 2017) dan 28  persen untuk Mycobacterium tuberculosis (Le Chatelier et.al ., 2004). Produk  dari  gen dna E2  merupakan  suatu  homologi  dari  subunit  alfa  enzim  DNA polimerase  III  dari  bakteri  gram  negatif  (Boshoff et.al .,  2003).  Mengikuti  model  klasik  dari pembentukan gen baru  oleh  Ohno (Ohno, 1970), dna E2 mungkin berasal dari duplikasi  nenek moyang  bersama  dari  gen dna E  diikuti  oleh  proses  divergensi.  Gen  terduplikasi  mungkin kemudian mengalami modifikasi yang menuju pada diperolehnya suatu peranan baru. Mekanisme dari  divergensi  fungsional  pada  enzim  memberikan  kontribusi  terhadap  diversitas  fungsi  dari mikroba (Serres et.al ., 2009).
Pohon filogenetik dikonstruksi dengan menggunakan metode maximum likelihood untuk sembilan strain dari genus Rhodobacter dan tujuh strain uji lain dari genus yang berbeda. Pohon filogenetik  ini  menunjukkan  bahwa  gen dna E1  yang  mengkodekan  subunit  alfa  dari  DNA polymerase III membentuk suatu kelompok utama yang terpisah dari kelompok utama yang lain, yang dibentuk oleh gen-gen dna E2 yang mengkodekan error-prone DNA polymerase atau DNA polymerase rawan kesalahan. Topologi pohon menunjukkan kemiripan terhadap topologi pohon filogenetik  berdasarkan  sekuen  gen  16S  rRNA,  terutama  kelompok  utama  yang  dibentuk  oleh gen-gen dna E1. Sekuen dari gen 16S rRNA sangat terkonservasi diantara bakteri dan kingdom yang lain, terdistribusi secara universal dan konstan secara fungsional, sehingga dapat digunakan untuk menduga hubungan evolusioner di antara organisme (Woese, 1987; Woese et.al ., 1990). Genus Rhodobacter nampak  bersifat  non  monofiletik  pada  pohon  yang  berdasarkan  gen  16S rRNA (Hördt et.al ., 2020), hal ini juga ditemukan pada penelitian ini untuk pohon filogenetik yang didasarkan gen dna E, karena kelompok taxonomi yang dibentuk oleh gen dna E pada strain dari Rhodobacter berbagi nenek moyang bersama dengan grup taxonomi yang lain. Rhodobacter sediminicola JA983 memiliki dua salinan dna E2 yang dianotasikan sebagai dna E2.1  dan dna E2.2,  masing-masing  ditempatkan  pada  dua  sub  kelompok  terpisah  dari kelompok yang dibentuk oleh gen dna E2, yang mengkodekan DNA polimerase rawan kesalahan. Salah satu dari gen ini, yaitu dna E2,2 berada pada kelompok yang terdiri dari strain yang berasal dari genus yang berbeda dimana salah satu dari strain ini adalah Tabrizicola blasticus 28/5 yang membawa dna E2 pada plasmidnya, membuatnya mungkin untuk dipertukarkan dengan  bakteri yang  lain  melalui  mekanisme  transfer  gen  secara  horisontal.  Transfer  secara  horizontal  dapat berlangsung pada bakteri, melalui penyebaran elemen genetik yang mobil, plasmid dan elemen konjugasi integratif (Iranzo et.al ., 2016; Koonin, 2016).
Biofaal Journal; Vol 3, No 1. Juni 2022. Pp 19 – 27. ISSN: 2723-4959 (online)

## D. KESIMPULAN
Genus Rhodobacter memiliki dua jenis gen dna E, yaitu satu salinan dna E1 dan dna E2, kecuali pada Rhodobacter sediminicola JA983 yang memiki satu salinan dna E1 dan dua salinan dna E2, dengan persentase keidentikan diantara  gen-gen dna E1 dan dna E2 serendah 50  persen pada sekuen nukleotida dan 25 persen pada sekuen asam amino. Berdasarkan analisis filogenetik, hubungan  evolusioner  untuk  gen dna E  dari  genus Rhodobacter memiliki  kemiripan  dengan hubungan evolusioner  pada  gen 16S rRNA yang bersifat non monofiletik.

## E. DAFTAR PUSTAKA
Beattie  T.R,  and  R.A  Reyes-Lamothe.  2015.  Replisome’s  journey  through  the  bacterial  chromosome.  Front. Microbiol. 6(562):55-66.
Boshoff HIM, Reed MB, Barry CE, and V Mizrahi. 2003. DnaE2 Polymerase Contributes to In Vivo Survival and the Emergence of Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis . Cell. 133: 183 – 193. Felsenstein J. 1981. Evolutionary trees from DNA sequences: A Maximum likelihood approach. J. Mol. Evol 1981; 17:368-376.
Fijalkowska IJ, Schaaper RM, and P Jonezyk. 2012. DNA replication fidelity in Escherichia coli : a multi – DNA polymerase affair. FEMS Microbiol. Rev. 36:1105-1121.
Hördt  A,  Lopez  MG,  Meier-Kolthoff  JP,  Schleuning  M,  Weinhold  LM,  Tindall  BJ,  Gronow  S,  Kyripides  NC, Woyke  T,  and  M  Göker.  2020.  Analysis  0f  1,000  +  Type  –  Strain  Genomes  Substantially  Improves Taxonomic Classification of Alpha – proteobacteria. Front. Microbiol. 468(11):1-112.
Imhoff JF, Trüper HG, and N Pfennig. 1984. Rearrangement of the species and genera of the phototrophic “purple non sulfur bacteria”. Int.J.Syst.Bacteriol. 34:340-343.
Imhoff JF. 2017. Diversity of anaerobic anoxygenic phototrophic purple bacteria. In P. C. Hallenbeck (Ed). Modern topics in the phototrophic prokaryotes . Springer International Publishing. Switzerland. Iranzo J, Puigbó P, Lobkoovsky  AE, Wolf YI, and EV Koonin. 2016. Inevitability of genetic parasites. Genome Biol.Evol. 8:2856 – 2869.
Koonin, EV. 2016. Horizontal gene transfer: essentiality and evolvability in prokaryotes, and roles in evolutionary transitions. F1000Res. 5: 1805.
Kornberg A, and TA Baker. 1992. DNA Replication . New York, USA: W.H. Freeman Company. Kumar S, Stecher G, Li M, Knyaz C, and K Tamura. 2018. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 2018; 35:1547-1549.
Kimura M. 1980. Simple method for estimating evolutionary rates of base subtitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16:111-120.
Le Chatelier E, Becherel OJ, d’Alencon E, Canceill D, Ehrlich SD, Fuchs RPP, and L Janniere. 2004.  Involvment of DnaE,  the  Second  Replication  DNA  Polymerase  from Bacillus  subtilis ,  in  DNA  Mutagenesis.  J.  Biol. Chem. 279(3):1757-1767.
Licht  MK,  Nuss  AM,  Volk  M,  Konzer  A,  Backstette  M,  Berghoff  BA,  and  G  Klug.  2020.  Adaptation  to photooxidative stress: Common and Special Strategies of the Alphaproteobacteria Rhodobacter sphaeroides and Rhodobacter capsulatus . Microorganisms. 2020; 8(2):283. Lu S, Wang J, Chitsaz F, Derbyshire MK,  Geer RC, Gonzales N, Gwadz M, Hurwitz DI, Machler GH, Song  JS, Thanki  N,  Yamashita  RA,  Yang  M,  Zhang  D,  Zhang  C,  Lanczycki  CJ,  and  A  Marchler-  Bauer.  2020. CDD/SPARCLE: the conserved domain database in 2020. Nucleic Acid Res. 48;265-268.
McHenry, C.S. 2011. Breaking the rules: bacteria that use several DNA polymerase IIIs. EMBO reports. 12(5):408- 414.
O’Donnell M, Langston L, and B Stillman. 2013. Principles and Concepts of DNA Replication in Bacteria, Archaea and Eukarya. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5:a010108. Ohno, S. 1970. Evolution by gene duplication . Springer-Verlag, Heidelberg, Germany. Peng R, Chen JH, Feng WW, Zhang Z, Yin J, Li Z.S, and YZ Li. 2017. Error-prone DNA E2 Balances the Genome Mutation Rates in Myxococcus xanthus DK1622. Front. Microbiol. 122(8):1-10. Sayers  EW,  Beck  J,  Bolton  EE,  Bourexis  D,  Bristes  JR,  Canese  K,  Comeau  DC,  Funk  K,  Kim  S,  Klimke  W, Marcher-Bauer A, Landrum M, Lathrop S, Lu Z, Madden TL, O’Leary N, Phan L, Rangwala SH, Schneider VA, Skripchenko Y, Wang JY, Ye J, Trawick BW, Pruitt KD and ST Sherry. 2021. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acid research. 49:10-13.
Biofaal Journal; Vol 3, No 1. Juni 2022. Pp 19 – 27. ISSN: 2723-4959 (online)
Serres  MH,  Ker  ARW,  McCormack  TJ,  and  M.  Riley.  2009.  Evolution  by  leaps:  gene  duplication  in  bacteria. Biology Direct. 4:46.
Thompson JD, Higgins DG, and TJ Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Research. 22:4673-4680.
Woese CR. 1987. Bacterial evolution. Microbial.Rev.15:221-271. Woese CR, Kandler O, and  ML Wheelis. 1990. Towards a natural system of organisms proposal for the domain Archaea , Bacteria and Eukarya . Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 87:4576-4579. Zhao XQ,  Hu, JF, and J Yu. 2006. Comparative Analysis of Eubacterial DNA Polymerase III Alpha subunits. Geno, Prot, Bioinfo. 4(1):203-211.