PENGARUH INDUKSI  BAKTERI Pseudomonas aeruginosa TERHADAP HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS (HUVECs) CULTURE
THE INFLUENCE OF Pseudomonas aeruginosa INDUCTION TO THE HUMAN UMBILICAL VEIN ENDOTHELIAL CELLS (HUVECs) CULTURE
Dwi Yuni Nur Hidayati
Fakultas Kedokteran,Universitas Brawijaya Jl. Veteran, Malang 65145 Telp. 0341-560491

## Abstract
One  of  the  cause  of  negative  gram  bacteria  is Pseudomonas  aeruginosa ( Ps.  aeruginosa ).  It continuing  become  sepsis  on  the  first  step  of  patogenesa  happen  sticking  between  aeruginosa  with endhotel cell. This sticking is mediated by adhesi molecul which have characterize same with hemaglutin protein. The main study of this research is to know the profile of endothelial cell culture within induction of Ps. aeruginosa . The  methods are Ps.  aeruginosa (9064) which  have  been  isolated then processes on TCBS Media and continued with isolation terracely. The profile of weight molecule protein obtained by SDS  PAGE  and  then  conducted  electroelution.  The  test  of  hemaglutinin  using  eritrosit  mencit.  The receptor cell used is endhotel cell (HUVECs) culture. The result show that dosage of hemaglutin protein of Aeruginosa bring effect to profile of HUVECs culture determined by index adhesion of Ps. aeruginosa to  HUVECs  culture.  We  conclude  that protein  38,19  kDa  give  effect  to  profile  of  HUVECs  culture  in vitro.
Key words: Pseudomonas aeruginosa , adhesion protein, HUVECs

## Pendahuluan
Tingginya  kejadian  dan  problema penyakit  infeksi  yang  biasanya  dan  selalu dikaitkan  dengan  keadaan  negara  berkembang atau  higienis  kurang,  ternyata  tidak  seluruhnya benar.  Di  negara  maju  pun  kini  sangat direpotkan  oleh  penyakit  infeksi.  Di  Amerika Serikat,  kematian  akibat  sepsis  tiap  tahunnya mencapai  70.000  orang.  Sekitar  50-60%  sepsis disebabkan  oleh  bakteriemi  Gram–negatif. Penyebab  Gram-negatif  bakteriemia  paling sering  terjadi  adalah  famili Enterobacteriaceae dan Pseudomonaceae , yang terdiri dari
Escherichia coli (35%), Klebsiella, Enterobacter, Proteus (38%), dan Pseudomonas  aeruginosa (12%)  (Virella,
1997).
Pseudomonas aeruginosa ( Ps . aeruginosa )  adalah  bakteri  Gram  negatif berbentuk  batang,  bergerak  dengan  flagela  dan bersifat  aerob.  Bakteri  ini  banyak  menginfeksi penderita  di  rumah  sakit  dengan  predisposisi tertentu. Ps.aeruginosa mempunyai pili type IV yang berfungsi sebagai adhesin untuk mengikat sel host. Ps.aeruginosa dapat melakukan adhesi dan kolonisasi pada bermacam–macam type sel dari  epitel  sel  buccal,  paru,  ginjal  dan  sel endothel (Comolli,1999).
Penemuan  bahwa  adhesi  merupakan tahap  awal  proses  infeksi  pada  kebanyakan bakteri,  menunjukkan  bahwa  protein  adhesin tersebut  sangat  mungkin  digunakan  sebagai komponen  vaksin  yang  baik.  Sebagai  contoh Fim  H  vaccine  yang  sedang  dikembangkan untuk  mencegah  infeksi  saluran  kemih  yang disebabkan E.coli (Wizzeman,2000).
Pada  kultur  sel  endotel  secara  in  vitro yang  disalutkan  bakteri  tertentu    dimaksudkan untuk  menjenuhi  reseptor  yang  terlibat  dari proses  perlekatan  diharapkan  dapt  menjelaskan sebagian  patogenesa  Ps.  aeruginosa  pada  sel host  dengan  melihat  profile  perlekatannya (Wizzeman, 2000).
Penelitian  ini  mengarah  pada    profile kultur  endotel  yang  diinduksi  Ps.  aeruginosa untuk  menjelaskan  faktor  virulensi  yang berpengaruh  pada  proses  adhesi  dengan  sel endotel  HUVECs  sebagai  tempat  pelekatan bakteri Ps.aeruginosa yang  diharapkan  dapat memberikan  informasi      yang  menarik  untuk dikaji lebih lanjut.

## Materi dan Metode Penelitian
Endotel  HUVECs  dikultur  dalam media  DMEM  199,  glutamin,  penicilin  G, gentamicyne, NaHCO 3 , Penol red, HCl 1 N dan NaOH  untuk mengukur pH hingga 7,4. Sediaan
bakteri  P.  aeruginosa  dalam  kultur  pada  BHI (Brain Heart Infusion) dan media pada TCBS.
Isolat Ps.  aeruginosa berasal  dari  koleksi sepuluh  spesimen  yang  ada  di  Laboratorium Mikrobiologi RSSA Malang. Kemudian dilakukan identifikasi spesies dengan
mengggunakan standard baku dari kit Microbact sistem.
Metode Kultur Pseudomonas aeruginosa
Bakteri  yang  digunakan  adalah  koleksi yang ada di Laboratorium Mikrobiologi Rumah sakit  Saiful  Anwar.Media  yang  digunakan menurut petunjuk Ehara (1992) yaitu TCG yang memperkaya  pertumbuhan  pili Ps.  aeruginosa . Media  ini  mengandung    0,02%  thioproline, 0,3%  NaHCO3,  0,1  %  mono  sodium  1- glutamat, 1% bactotryptone, 0,2% yeast extract, 0,5%  NaCl,  2%  bacto  agar  dan  1  mM  EGTA. Media  agar  dibuat  dalam  botol  isinya  250  ml secara  miring sebanyak    50  botol,  setiap  botol berisi  50  ml    agar. Pseudomonas  aeruginosa yang  dipilih  ditanam  pada  media  media  Brain Heart  Infusion  Broth  (BHI),  kemudian  selama dikocok  kuat  selama  30  menit    pada  pemanas air  suhu  37 0 C.  Kemudian  suspensi  bakteri sebanyak  10ml  dimasukkan  dalam  setiap  botol yang  mengandung  media  TCG.  Selanjutnya dilakukan  pengeraman  suhu    37 0 C  selama  2  X 24 jam.
Sodium  Dodecyl  Sulfate  Polyacrylamid  Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Monitoring  bobot  molekul  dikerjakan menggunakan  SDS-PAGE  metode  Laemmli (1970).  Sampel  protein  dipanaskan  100 0 C selama  5  menit  dalam  larutan  penyangga  yang mengandung  5  mM  Tris  HCl  pH  6,8,  2- mercapto  ethanol  5%,    w/v sodium  dodecyl sulfate 2,5% , v/v glyserol 10%  dengan  warna pelacak bromophenol  blue .  Dipilih  12,5% mini slab gel  dengan tracking  gel 4%.  Voltase  yang digunakan  125  mV.  Sebagai  bahan  warna adalah coomassie  brilliant  blue dan  molekul standar sigma low range marker.
Isolasi dan pembuatan kultur sel endotel Semua bahan yang akan digunakan dihangatkan hingga  37 0 C.  Umbilikus  dibersihkan  dari jaringan  dan  clot  yang  ada  dengan  tissue. Masing-masing  ujung  umbilikus  dipotong transversal sehingga terlihat dua arteri dan vena. Vena  akan  terlihat  mempunyai  dinding  yang lebih  tebal,  lebih  besar  dan  lentur.  Masukkan kanul  pada  satu  ujung  vena  (~klem)  kemudian ikat  dengan  erat.  Bersihkan  vena  dengan  “PBS A”  melalui  kanul  yang  telah  terpasang  dengan menggunakan  spuit  20  cm.  Setelah  bersih,  ikat
ujung  umbilikus  yang  tidak  berkanul  dengan ikatan  yang  kuat.  Masukkan  kolagenase  ke dalam vena seperti pada cara 5 dan biarkan spuit masih terpasang pada kanul, kemudian umbilikus sidekap dengan tangan (agar mencapai  ~37 0 C)  selama  8  menit.  Keluarkan kolagenase  yang  telah  mengandung  sel  endotel dengan  cara  menyedot  spuit  yang  masih terpasang.  Dan  larutan  kolagenase  tersebut ditaruh  pada  tabung  sentrifuse  yang  steril. Ulangi  cara  seperti pemberian kolagenase (cara 6) tetapi dengan menggunakan PBS A sebanyak 8 ml. Kemudian sedot kembali seperti pada cara 7  dan  taruhkan  pada  tabung  sentrifuse  yang telah  berisi  dengan  kolagenase.  Larutan  yang telah mengandung sel endotel tersebut disentrifuse dengan kecepatan 1300 rpm selama 8  menit,  ulangi  sentrifuse  satu  kali  lagi  dengan menambahkan  media  sebanyak  2  ml  dalam tabung  sentrifuse,  putar  1300  rpm  selama  8 menit.  Tuangkan  supernatan,  sedangkan  pellet yang  ada  diresuspensi  dengan  medium  kultur sebanyak  4  ml.  Transfer  larutan  tersebut  pada flask 25 cm 2 dan masuk ke dalam inkubator (5% O dan 95% CO 2 ). Pada hati berikutnya medium diambil dan dicuci dengan menggunakan serum free  medium,  kemudian  kembali  diisi  medium kultur (4 ml). Setiap 2 hari  sekali setengah dari medium diambil dan diganti dengan  yang  baru. Sel  endotel  akan  berbentuk  sebagai  monolayer pada hari ke-3.
Metode Uji Adesi. Uji adesi modifikasi Nagayama et al , 1995 dimana  untuk  tes  adesi  bakteri Ps.aeruginosa yang  dibiakkan  dalam  lactose-broth  pada  suhu 37 0 C.  Biakan  cair  disentrifugasi  6.000  rpm selama  10  menit  pada  suhu  4 0 C.  Endapan disuspensikan  dengan  PBS  yang  mengandung BSA  1  %  kandungan  bakteri  dibuat  sekitar 10 8 /ml  dengan  menggunakan  spektrofotometer dengan  panjang  gelombang  600nm.  Suspensi bakteri diambil sebanyak 100 μl  dan dimasukkan  dalam  well  yang  didalamnya terdapat  cover  slip  berisi  endotel.  Well dimasukkan dalam shaking inkubator goyangan 60  kali  per  menit,  30  menit,  suhu    37 0 C, kemudian  cover  slip  dalam  well  dicuci  3  kali dengan  PBS  steril  (calcium  free).  Cover  slip diwarnai  dengan  kristal  violet  selama  1’,  bilas dengan  air,  cuci  dengan  lugol  selama  1’,  bilas dengan air, cuci dengan aseton alkohol 96%  1’, bilas  dengan  air  dan  terakhir  dicuci  dengan safranin.  Kemudian  setelah  dibilas  bersih dengan  air,  cover  slip  dikering  anginkan  diatas tissue  dan  dilakukan  pengamatan  terhadap model  adesi Ps.  aeruginosa pada  endotel  dan model  struktur  endotel.  Kemudian  diamati
dibawah  mikroskop  dengan  pembesaran  200, 400,  dan  1000  X,  dan  dilakukan  perhitungan indeks adesi yaitu jumlah rata-rata bakteri yang menempel per 100 sel endotel.

## Hasil dan Pembahasan
Gambaran dari kultur endotel normal dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Kultur sel endotel normal hari ke 5 Keterangan : 1. Sel endotel, bentuk pipih, permukaan mulus Berdasarkan hasilisolasi  protein  dari
sampel    bakteri Ps.aeruginosa yang  telah diisolasi  dan  dilakukan  SDS-PAGE    diperoleh Bobot  molekul  (BM)  protein    dengan  hasil seperti pada Gambar 2.
Profil  protein  pada  SDS-PAGE  dari beberapa  potongan  pili Ps  aeruginosa tampak pada  gambaran  potongan  pili  ketiga  dengan gambaran pita protein yang menonjol. Gambaran  pita  protein  yang  paling  menonjol yaitu  57,17  kDa;  38,19  kDa  dan  32,1  kDa.. Gambaran  ketiga  protein  yang  menonjol tersebut  dipotong  untuk  dikoleksi,  selanjutnya dilakukan pemurnian dengan elektroelusi sehingga didapatkan protein larutan. Uji Adesi (Metode Nagayama) Hasil Uji adesi Ps.aeruginosa pada sel endotel  (HUVECs)  tampak  seperti  pada Gambar 3.
Berdasarkan hasil analisis varian satu jalur tampak  bahwa  dosis  pengenceran  protein  Ps. aeruginosa  berpengaruh  sangat  nyata  terhadap indeks  adhesi Ps.aeruginosa pada  sel  endotel (HUVECs)  dengan  signifikasi  F  hitung(p)  = 0,00 dan tingkat kepercayaan 95%.
Perhitungan Indeks adesi pada tabel diatas
1
Gambar 3. Gambaran  Adesi  bakteri Pseudomonas  aeruginosa pada  sel  endotel  dengan pembesaran 1000x dengan Perlakuan Kontrol, Sediaan diwarnai Giemsa Keterangan : 1. sel endotel (HUVECs), 2. Bakteri  ( Ps. aeruginosa )
Gambar 2. Hasil SDS- PAGE  Protein Ps. aeruginosa
menunjukkan  kecenderungan  semakin  tinggi protein  hemagglutinin  yang  disalutkan,  maka semakin  sedikit  bakteri  yangmelekat  pada  sel endotel ( HUVECs), seperti pada Gambar 4.
Beberapa  isolat Ps.  aeruginosa yang diperoleh  dari  RSSA  Malang  ternyata  setelah dilakukan uji hemaglutinin
dengan menggunakan  eritrosit  mencit  menunjukkan bahwa  isolat  Ps  9064  menunjukkan  titer tertinggi  pada  pengenceran  0,0625  atau  1  :  64. Hasil  fraksinasi  protein Ps  aeruginosa yang telah dilakukan dengan elektroforesis SDS Page untuk  menentukan  bobot  molekul  57,17  kDa; 38,19kDa;  32  kDa.  Bobot  molekul  tersebut selanjutnya  dielektroelusi  untuk  mendapatkan protein  larutan  yang  kemudian  dilanjutkan dengan  uji  hemaglutinasi.  Pada  saat  interaksi dengan  lingkungan  ekstraseluler,  bakteri  gram negatif menggunakan faktor virulrensi termasuk toksin  ekstraseluler,  pili,  curli,  autotransporter, dan  crystalin  S-layers  (Stathopoulos et  al , 2000). Hal ini membuktikan bahwa Ps.aeruginosa mempunyai protein dengan berat 38,19  kDa  yang  mampu  memberikan  pengaruh nyata terhadap profile perlekatan Ps. aeruginosa pada sel endotel HUVECs.
Adesi Ps. aeruginosa pada sel endotel
HUVECs  diantaranya  ditentukan  oleh  faktor viruleni berupa pili. Penelitian lain menyebutkan bahwa bahwa Ps.aeruginosa juga mengaktivasi sel Mast manusia untuk menginduksi migrasi neutrophil
transendothelial melalui sel M yang berasal dari IL-1alfa dan  beta 1 (Jun et  al ., 2002). Pada sel endothel  HUVECs  apakah  mekanisme  adhesi ini  juga  dibutuhkan Ps.  aeruginosa untuk menginfeksi endothel, masih diperlukan
penelitian lebih jauh lagi. Diduga bahwa adhesi Ps.  aeruginosa terhadap  endothel  ditentukan oleh  sekresi  protein  dengan general  secretory pathway (GSP)  yang  merupakan  dua  bagian proses  yang  membutuhkan Sec  translocase didalam  inner  membrane  dan  suatu  substrat pemisah-sekresi  spesifik  apparatus  selama sekresi  menyeberangi  outer  membran.  Salah satunya  yang  termasuk  dalam  GSP  ini  sebagai faktor virulensi untuk berinteraksi dan komunikasi dengan host adalah pili
(Stathopoulos et al ., 2000 dan Salyers, 1994). Comer et al (2002) menjelaskan bahwa Ps.  aeruginosa strain  1244    mempunyai  pilin glycan  yang  berikatan  secara  kovalen  terhadap residu  serine.  Hasil  sequensing  N-terminal  dari fraksi pilin dihasilkan dari perlakuan endopeptidase  dan  diidentifikasi  dengan  reaksi monoklonal  antibodi  spesifik  glycan    yang terindikasi bahwa glycan ada diantara residu 75 dan terminus pilin  karboksil . Bagian karboksil - proksimal pada pilin  disulfida  loop ,  yang  di ukur pada pilin glycan, merupakan epitop sel B linear utama, ini sebagai epitop peptida.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa bobot  molekul  potongan  pili  ketiga  adalah 38,19  kDa.  Seperti  dijelaskan  oleh  peneliti terdahulu  bahwa  pili Ps.aeruginosa merupakan pili  sub  unit  monomerik  akan  tetapi  bobot molekulnya  adalah  15  kDa-  17kDa,  setelah ditentukan  ternyata  gene  penyandinya  adalah PilO. Diduga  bahwa  dari  penelitian  bobot molekul  38,19  kDa  merupakan  bobot  molekul sub  unit  monomerik  dengan  jenis  gene penyandi yang  berbeda,  sehingga  untuk menentukan  apakah  bobot  molekul  tersebut merupakan  monomer  atau  dimer  sehinggan
Gambar 4.  Scatter plot yang menunjukkan hubungan antara indeks adhesi Ps.aeruginosa dan konsentrasi protein Ps. aeruginosa 38,19 kDa
diperlukan  penelitian  lebih  lanjut  tentang  jenis protein  dan  analisis  gene  penyandi  protein Ps. aeruginosa.
Castric et.al ( 2001 )  juga  menjelaskan bahwa  pili Ps.  Aeruginosa merupakan  pili somatik,  filament  protein    yang  meluas  seperti benang  dari  satu  atau  kedua  sel  poles,  yang merupakan  faktor  virulensi  utama,  memicu adherensi  pada  sel  host  dan  proses  invasi  pada sel  host. Berat molekul protein pili  ini  berkisar antara  16  kDa.  Bentuk  mature  dari  protein  ini dihasilkan  oleh    pergerakan  dari  suatu six- residue  leader  sequense sebuah  proses  yang diatur  oleh  metilasi  pada nascent  amino- terminal  phenylalanine. Determinasi  proses  ini tergantung  jenis  gene  penyadi pilO, yaitu sebuah  gene  yang  terltakpada  bagian  operon yang  juga  mengandung  pilin  struktural gene pilA. .  Bobot  molekul  kisaran  16  kDa  diketahui sebagai  bobot  molekul  penentu  patogen opportunistik  pada  bakteri  gram negatif Ps.aeruginosa. Berdasarkan  kajian  literatur tersebut perlu ditentukan apakah bobot molekul protein dari hasil penelitian potongan pili ketiga 38,19  kDa    isolat  Ps  9064    juga  merupakan patogen oppurtunistik terhadap sel host khususnya sel endotel HUVECs.
Mekanisme  invasi Ps.  aeruginosa whole  cell pada  sel  endotel  HUVECs  normal berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  struktur  morfologi    sel  endotel  kultur yang dengan pewarnaan wright dan pengamatan dengan  mikroskop  merk  Nikon  menunjukkan bentuk sel pipih, dengan struktur sitoplasma dan inti  sel  masih  jelas,  dan  secara  morfologis belum menunjukkan adanya perubahan morfologis secara nyata.
Gambaran adesi bakteri Ps. aeruginosa menunjukkan pola aggregat dan ada pula yang berpola diffuse atau  menyebar  pada  permukaan sel endotel. Kultur sel endotel yang diperlakukan  dengan  adesi Ps.  aeruginosa dan disalut  dengan  protein  pili  hemaglutinin  pada potongan  pili  ketiga  dengan  bobot  molekul 38,19  kDa  dengan  berbagai  pengenceran  dosis menunjukkan  bahwa  semakin  besar  dosis protein  hemaglutinin  yang  disalut    pada  sel endotel  kultur  menunjukkan  adanya  tingkat penghambatan  adesi  yang  semakin  besar, sehingga  semakin  besar  pengenceran  yang diberikan  memberikan  gambaran  adesi  yang jauh  lebih  besar  dibandingkan  dosis  pemberian protein hemaglutinin tanpa pengenceran.
Berdasarkan  scatter  plot  dengan  perlakuan protein hemaglutinin Ps. aeruginosa
menunjukkan bahwa semakin besar
pengenceran  maka  adesi  bakteri  tersebut menunjukkan  peningkatan  secara  signifikan
dengan  nilai regresi (r)  =  0,98  dan p  value = 0,00.  Hal  ini  diduga  bahwa  berdasarkan  hasil regresi menggambarkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara protein dengan bobot  molekul  38,19  kDa  dan  adesi Ps. aeruginosa pada sel endotel kultur normal.
Kesimpulan
Protein  bakteri Ps.  aeruginosa 9064 dengan  bobot  molekul  38,19  kDa,  yang merupakan protein adesi setelah protein tersebut disalutkan pada sel endotel (HUVECs) memberikan  profile  adesi  pada  sel  endotel HUVECs.

## Daftar Pustaka
Castric  Peter,  Cassels  Frederick  J.,Carlson Russel W, 2001, Sructural Charcterization  of    the Pseudomonas aeruginosa 1244 Pilin  Glycan, Journal of  Biological  Chemistry,  270  (  28)  p 26479 - 26485
Comer  Jason  E,Marshal  Mark  A,  Blanch Vincent  J  ,  Deal  Carolyn  D.,  2002, Identifification  of  the Pseudomonas aeruginosa 1244  Pilin  glycosylation Site, Infection and Immunity, 70 ( 6) p 2837 - 2845
Comolli  Janes  C.,  Waite  Leslie  L.,  Mostov Keith  E.,  Engel  Joanne  N.,  1999, Pili Bending  to  Asialo  –  GM  1  on Epithelial Cells Can Mediate Cytotoxicity or Bacterial Internalisation by Pseudomonas aeruginosa ,  Infection  and  Imunity    67 (7) p 3207 – 3214 Jun  Lin-Tong,  Garduno  Rafael,  Boudreau Robert  T.M.,  Issekutz  Andrew  C., 2002, Pseudomonas aeruginosa Activates Human Mast Cells to Induce Neutrophil  Transendothelial  Migration
Via Mast Cell-Derived IL -1  and 1 ,
Journal Immunology, 169: 4522 -4530 Nagayama, K., Oguchi,T., Arita, M., Honda,T.,1995, Purification and Characterization  of  A  Cell  Associated Haemagglutinin of Vibrio
parahaemolyticus , Infec.and Immun 63 (5): 1987 - 1992 Salyers  Abigail  A.,  Whitt  Dixie  D.,  1994. Bacterial  Pathogenesis .  Washington DC: ASM Press, p.31 -35 ; 262 Stathopoulos  Christos,  Hendrixson  David  R. Thanassi  David  G.,  Hultgreen  Scott J.,2000, Secretion of Virulence determinants  by  the  general  secretory pathway in Gram – negative pathogens :  an  evolving  story,  Microbes  and infection,2, p 1061 - 1072
Virella Gabriel, 1997. Gram – negative Rods III : Opportunistic and Zoonotic Bacteri ; Microbiology and infectious disease  3 rd  edition,  Philadelpia  :  Williams  & Willins  awaverly    Company,p.159  – 162 Wizzemann, T.M., Adamoum J.E.,and Langermann,  S.,  1999,  Adhesins  as Targets  for  Vaccine  Development, Centers  for  Disease  Control  and
Prevevtion, USA, p.1-5