## MOLECULAR IDENTIFICATION OF PROTEOLITIC BACTERIA FROM MANGROVE SEDIMENT IN DUMAI MARINE STATION
Abdi Hikmat Petra Zebua* 1 , Nursyirwani 2 , Feliatra 2
1 Student of The Faculty of Fisheries and Marine Universitas Riau, Pekanbaru
2 Lecturer at The Faculty of Fisheries and Marine Universitas Riau, Pekanbaru *abdizebua1997@gmail.com

## ABSTRACT
Proteolytic bacteria  have important role in the degradation of complex compounds to simple  compound  by  the  enzyme  proteases.  Sediment  in  mangrove  ecosystem  of  Dumai Marine  Station  may  contain  the  bacteria.  This  research  aims  to  identify  the  proteolytic bacteria  of  mangrove  sediments  molecularly  and  to  examine  the  antagonism  of  pathogenic bacteria.    The  method  used  in  this  research  was  survey.  The  results  obtained  10  bacterial isolates (AZ1, AZ2, AZ3, AZ4, AZ6, AZ10, AZ11, AZ15, AZ18, and AZ20). Identification using 16S rRNA analysis revealed that 3 isolates showed different results, namely AZ2 had a similarity to Bacillus proteolyticus with strain MCCC 1A00365, AZ6 had a similarity to the bacteria B.  monlinensis with  strain  BL4-6  and  AZ20  had  similarity  to  the  bacterium B. toyonensis with  strain  MCCC  1A00365  BCT-7112.    Three  of  the  10  isolates  that  had  the highest  inhibition  against  pathogens.  Isolates  AZ2  shovued  inhibition  zone  against Pseudomonas aeruginosa with a diameter of 9.65 mm, AZ6 shovued inhibition zone against Escherichia  coli bacteria  with  a  diameter  of  5.18  mm,  and  AZ20  shovued  inhibition  zone against Vibrio alginolyticus bacteria with a diameter of 4, 01 mm.
Keywords: Proteolytic Bacteria, Antagonism, 16S rRNA Sequence, Pathogenic Bacteria

## I. PENDAHULUAN
Stasiun  Kelautan  Purnama  Dumai sebagai  lokasi  penelitian  berada  pada pesisir  timur  Pulau  Sumatera  dengan substrat  dasar  berlumpur  yang  banyak ditumbuhi mangrove dengan berbagai jenis biota  yang  hidup  didalamnya.  Kondisi hutan  mangrove  yang  berada  di  kawasan Stasiun Kelautan Purnama Dumai.
Bakteri  memainkan  peran  penting dalam ekosistem mangrove terutama dalam mengurai serasah daun. Keberadaan bakteri ini sangat dipengaruhi oleh berbagai faktor lingkungan  (Yahya et  al., 2014).  Beberapa bakteri  proteolitik  yang  menghasil  enzim protease  digunakan  dalam  skala  industri terutama digunakan dalam industri detergen,  farmasi,  produk-produk  kulit,
pengempukan  daging,  hidrolisat  protein, produk-produk makanan, maupun pengolahan  limbah  industri.  Penggunaan mikroorganisme  sebagai  penghasil  enzim juga  merupakan  salah  satu  upaya  yang lebih mudah dan efisien karena pertumbuhannya  yang  cepat,  dapat  tumbuh pada substrat yang mudah didapat (Yusriah dan Kuswytasari, 2013).
Bakteri proteolitik di uji antagonisme terhadap  pertumbuhan  bakteri  patogen. Bakteri  patogen  merupakan  bakteri  yang menyebabkan penyakit pada ikan. Aktivitas mikroba  pada  bakteri  sedimen  laut  dari Perairan  Pulau  Lemukutun,  diperoleh sebanyak  4  isolat.  Penapisan  aktivitas antibakteri  dilakukan  dengan  metode  cross streak.  Bakteri  patogen  yang  digunakan
adalah  adalah Pseudomonas  aeruginosa, Escherichia  coli,  Vibro  alginolyticus dan Salmonella typhimurium . Aktivitas
antibakteri  terbaik  diperoleh  pada  bakteri SKA04 dapat menghambat bakteri patogen S.  typhimurium .  Penapisan  aktivitas  enzim ekstraseluler  dilakukan  untuk  mengetahui potensi  isolat  bakteri  sedimen  laut  dalam menghasilkan  enzim  amilolitik  dan  lipase (Idiawati et al ., 2019).
Untuk  menentukan  jenis  bakteri proteolitik dari sedimen ekosistem mangrove  perlu  dilakukan  identifikasi secara  molekuler.  Metode  terbaik  untuk menentukan taksonomi
suatu mikroorganisme adalah metode yang menggunakan  hubungan  kekerabatan  DNA (genotip)  dan  karakterisasi  fenotip  dalam mengklasifikasi  mikroorganisme.  Untuk melakukan  analisis  komposisi  gen  dan keanekaragaman filogenetika suatu mikroorganisme metode yang paling sering digunakan  adalah  menggunakan  analisis skuensing  gen  16S  rRNA.  Teknik  ini dilakukan  dengan  menganalisis  struktur atau  susunan  basa  nukleotida  DNA  yang terdapat di daerah 16S rRNA.
Tujuan penelitian ini dilakukan adalah  sebagai  untuk  mengisolasi  dan mengidentifikasi  jenis  bakteri  proteolitik pada  sedimen  di  ekosistem  mangrove  di Stasiun  Kelautan  Kelurahan  Purnama  Kota Dumai  secara  molekuler  dan  menguji antagonisme  untuk  bakteri  proteolitik terhadap bakteri patogen

## 2.      METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan April - Mei 2019. Identifikasi bakteri proteolitik  dilakukan  di  Laboratorium Mikrobiologi  Laut  Jurusan  Ilmu  Kelautan Fakultas  Perikanan  dan  Kelautan,  dan  di Laboratorium  Genetika  Jurusan  Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau Pekanbaru.
Metode yang digunakan pada penelitian  ini  adalah  metode  survei  yaitu dengan  mengambil  sampel  sedimen  di
lapangan  dan  mengisolasi  dan  identifikasi bakteri proteolitik di laboratorium.

## Penentuan Lokasi Penelitian
Lokasi  pengambilan  sampel  pada  3 titik  stasiun,  setiap  titik  stasiun  dilakukan pengulangan pengambilan sampel sebanyak 3  kali.  Pada  stasiun  1  yaitu  pada  hutan mangrove,  kemudian  pada  stasiun  2  yaitu rumah  kapal,  dan  stasiun  3  pada  muara sungai  mesjid.    Setiap  titik  sampling berjarak  50  meter  dan  setiap  pengulangan berjarak 10 meter.
Pengambilan sampel sedimen diambil dari ekosistem mangrove Kelurahan Purnama Kota Dumai dengan menggunakan  spatula,  kemudian  sampel yang  diperoleh  dimasukkan  ke  dalam kantong  plastik  dan  diberi  label.  Sampel sedimen  yang  sudah  ada  dimasukkan kedalam ice  box dan  dilapisi  es,  kemudian sampel dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi Laut untuk dianalisis.

## Sterilisasi Alat dan Pembuatan Media
Peralatan  yang  digunakan  seperti tabung reaksi, tabung erlenmeyer dibungkus  dengan  aluminium  foil,  cawan petri  dibungkus  dengan  kertas  padi  lalu dimasukkan  kedalam  keranjang  yang  telah disiapkan,  keranjang  dimasukkan  kedalam autoklaf  untuk  sterilisasi  dengan  suhu 121°C  dengan  tekanan  2  atm  dalam  waktu 15  menit.  Setelah  proses  autoklaf  selesai, alat-alat tersebut dibiarkan kering kemudian disusun pada lemari
penyimpanan.
Pembuatan  media  Zobell  2216  E adalah  sebagai  berikut  :  5  gram Bacto Pepton ,  1  gram  Yeast  extrat,  dan  15  gram Bacto  agar,  dimasukkan  dalam Erlenmeyer dan  dilarutkan  dalam  1  liter  air  laut  steril. Lalu  sebagian  media  dituang  ke  dalam tabung  reaksi  (media  agar  tegak  dan miring). Kemudian media disterilkan dalam autoklaf  dengan  suhu  121  ᵒC  selama  15 menit.  Setelah  itu  sisa  media  dituang  ke dalam  cawan  petri.  Setelah  mengeras
semua  media  disimpan  dengan  posisi terbalik selama 24 jam pada suhu 36°C

## Isolasi dan Seleksi Bakteri
Sampel  sedimen  ditimbang  sebanyak 1  gram,  lalu  dimasukkan  ke  dalam  larutan fisiologis  (NaCl  0,9%)  yang  terdiri  dari 1000  ml  akuades.  Sebanyak  10  gram  dari masing-masing  sampel  diambil,  kemudian dimasukkan  ke  dalam  labu erlenmeyer yang  berisi  90  ml  air  laut  steril, vortex hingga homogen dan diperoleh pengenceran 10 -1 . Selanjutnya dari pengenceran 10 -1 diambil 1 ml menggunakan pipet steril kemudian dimasukkan  ke  dalam  9  ml  air  laut  steril dan  diperoleh  pengenceran  10 -2 .  Demikian selanjutnya  dilakukan  pengenceran  hingga diperoleh  pengenceran  10 -5 ,  10 -6 dan  10 -7 . Pada  masing-masing  pengenceran  diambil 1  ml  suspensi  bakteri  menggunakan  pipet steril  dan  dimasukkan  ke  dalam  masing- masing  cawan  petri  steril.  Selanjutnya  di tambahkan  ke  dalamnya  10  ml  media Zobell  2216  E  (dengan  suhu  sekitar  45°C yang  telah  dicairkan  sebelumnya)  dan diratakan.  Selanjutnya  cawan  petri  tersebut dibungkus  dengan  kertas  pembungkus  dan diinkubasikan selama 2 x 24 jam.
Skrining dilakukan berdasarkan kemampuan  mendegradasi  protein  dengan pendekatan  aktivitas  enzim  protase.  Uji aktivitas produksi enzim protease ekstraseluler  dilakukan  dengan  prosedur menurut  Biairagi et  al .  (2002).  Kultur  cair solat-isolat yang diperoleh dari hasil isolasi diinokulasikan  ke paper  disc  blank yang telah  diletakan  pada  media  media  Zobell 2216  E  yang  diperkaya  dengan skim  milk (1%). Inkubasi pada 32°C selama 48 jam.
Pemisahan dan Pemurnian Isolat Bakteri
Pemisahan  dan  pemurnian  isolat bakteri  dilakukan  dengan  metoda  goresan ( streak  method ).  Masing-masing  cawan petri pada tiap pengenceran diambil koloni- koloni bakteri yang menampakkan
morfologi  dan  warna  yang  berbeda. Selanjutnya  masing-masing  koloni  bakteri tersebut digoreskan pada permukaan media Zobell  2216  E  pada  masing-masing  cawan petri  yang  telah  disiapkan.  Selanjutnya cawan-cawan  petri  tersebut  diinkubasikan pada  suhu  kamar  selama  2  x  24  jam  dan diamati  pertumbuhannya,  apakah  sudah terpisah  dan  menjadi  kultur  murni  atau belum.  Apabila  masih  terdapat  campuran bakteri  pada  cawan  petri  tersebut,  maka dilakukan  pemisahan  kembali  dengan metode  goresan  hingga  diperoleh  kultur murni  pada  masing-masing  cawan  petri. Kultur  murni  dari  isolat  bakteri  tersebut dipindahkan  ke  dalam  media  agar  miring Zobell  2216  E  pada  tabung  reaksi  dengan teknik  goresan.

## Identifikasi Isolat
Identifikasi  isolat  bakteri  proteolitik dilakukan  secara  fenotip  dan  genotip. Secara fenotip dilakukan melalui pengamatan  morfologi  dan  sel  dan  uji-uji biokimia Sedangkan secara genotip dilakukan  dengan  pengamatan  secara melekuler dengan teknik 16S rRNA.
Pengamatan morfologi koloni meliputi  jumlah,  bentuk,  ukuran,  tepian, permukaan dan warna koloni dapat diamati secara  langsung  pada  isolat  yang  tumbuh pada  media.  Pengamatan  bentuk  sel dilakukan  dengan  langsung  yaitu  melihat secara  morfologi  dari  tiap  koloni  yang tumbuh.
Identifikasi  bakteri  berdasarkan  uji aktivitas  biokimia  dilakukan  dengan  cara membandingkan  aktivitas  biokimia  setiap bakteri.  Aktivitas  biokimia  setiap  jenis bakteri  berbeda.  Hal  ini  disebabkan  karena setiap bakteri mempunyai aktivitas enzimatik yang berbeda.

## Isolasi DNA
Amplifikasi  DNA  dilakukan  dengan menggunakan polymerase  chain  reaction (PCR) 50 μl dilakukan dengan menggunakan Primer 27F: 5’
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG  3’  dan 1492R:  5’  ACCTTGTTACGACTT  3’ dengan  cara template DNA  diambil sebanyak 1 μl dipindahkan ke dalam tabung berukuran  0,2  ml  dan  dimasukkan  49  μl master  mix. Tabung  dimasukkan  ke  dalam thermal  cycler .  Proses  pra-PCR  dijalankan pada suhu 94 °C selama 3 menit.
Purifikasi dan Sekuensing Sampel DNA dikirim ke PT.
Genetika  Science  Indonesia  Jakarta  Barat untuk dipurifikasi dan disekuensing di First Base . Data hasil sekuensing dianalisis lebih lanjut.  Purifikasi  DNA  hasil  PCR  dari  gel
agarose  dilakukan  dengan  menggunakan Geneaid®  Gel/PCR  DNA Fragments Extraction Kit.

## 3.     HASIL DAN PEMBAHASAN Kondisi Umum Lokasi Penelitian
Perairan  pantai  Purnama  Dumai termasuk  wilayah  Kelurahan  Purnama Kecamatan  Dumai  Barat.  Secara  geografis Perairan  Pantai  Purnama  Dumai  berada pada titil kordinat 1⁰ 42’10” - 1⁰ 43’05” LU dan 101⁰ 22’45” - 101⁰ 24’10” BT. Tempat pengambilan  sampel  dan  titik  kordinat dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Titik Stasiun Lokasi Sampling Stasiun Tempat Titik Koordinat Stasiun 1 Hutan Mangrove Stasiun Kelautan Purnama N : 01⁰ 42’ 50,57” E : 101⁰ 23’ 19,17” Stasiun 2 Rumah Kapal N : 01⁰ 42’ 54,39” E : 101⁰ 23’ 15,31” Stasiun 3 Muara Sungai Mesjid N : 01⁰ 43’ 11,03” E : 101⁰ 23’ 14,05”

## Isolasi Bakteri
Pengambilan  sampel  dilakukan  pada 3  stasiun  dimana  jumlah  isolasinya sebanyak 81 isolat, dimana disetiap stasiun berjumlah  27  isolat.  Berdasarkan  hasil isolasi bakteri proteolitik yang
ditumbuhkan  pada  medium  Skim  Milk Agar.  Di  dapatkan  10  isolat  yaitu  AZ1,
AZ2, AZ3, AZ4, AZ6, AZ10, AZ11, AZ15, AZ18,  dan  AZ20.  Isolat  bakteri  ini memiliki  bentuk  morfologi  koloni  yang dapat  dilihat  dari  diameter,  bentuk  koloni, waarna,  tepian,  permukaan,  dan  jumlah koloni. Lebih jelas dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2 . Morfologi koloni isolat bakteri dari sedimen mangrove Kode Isolat Stasiun Diameter (mm) Bentuk Kolonni Warna Tepian Permukaan Jumlah Koloni AZ1 II 10 Bulat Kuning Putih Licin Timbul 32 AZ2 II 6 Rizoid Kuning Merah Licin Timbul 36 AZ3 III 2 Bulat Putih Licin Timbul 39 AZ4 I 3 Bulat Kuning Putih Licin Timbul 75 AZ6 II 2 Bulat Kuning Putih Licin Timbul 31 AZ10 III 2 Bulat Kuning Putih Licin Timbul 35 AZ11 III 2 Rizoid Kuning Putih Licin Timbul 37 AZ15 I 3 Rizoid Kuning Putih Licin Timbul 38 AZ18 I 6 Bulat Kuning Putih Licin Timbul 39 AZ20 III 1 Bulat Kuning Putih Licin Timbul 30
Bentuk  bakteri  dapat  dibagi  kedalam tiga  golongan  yaitu  kokus,  basil  dan bentuknya  lain  yang  bervariasi.  Bakteri kokus  memiliki  bentuk  bulat  seperti  bola namun  pada  perkembangannya  bakteri  ini bentuknya  bisa  bervariasi.  Bakteri  basil memiliki  bentuk  batang  atau  silinder namun bisa juga memiliki beberapa variasi bentuk lainnya (Hidayat, 2011).
Berdasarkan  penelitian  yang  didapatkan untuk  morfologi  koloni  bakteri  dari  bentuk adalah bulat.

## Uji Biokimia
Uji biokimia merupakan salah satu uji yang  digunakan  untuk  menentukan  spesies bakteri secara manual, karena setiap bakteri memiliki  sifat  biokimia  yang  berbeda
sehingga  tahapan  uji  biokimia  ini  sangat membantu  proses  identifikasi.  Bakteri diidentifikasi.  dengan  mengamati  reaksi biokimia  dari  bakteri  tersebut  terhadap beberapa  medium  uji.  Uji  biokimia  yang dilakukan  pada  penelitian  ini  di  antaranya yaitu uji pewarnaan Gram, motilitas, indol, katalase, sitrat, sulfida, dan TSIA.
Berdasarkan  hasil  pengujian  morfologi untuk  uji  pewarnaan  Gram  yaitu  terdapat besifat  Gram  positif  (+)  yang  ditandai dengan sel berwarna ungu. Bakteri jenis ini akan  berwarna  biru  atau  ungu  dibawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan  berwarna  merah.  Hasil  dari  uji biokimia  setiap  isolat  bakteri  dapat  dilihat Tabel 3.

## Tabel 3. Karakteristik Biokimia Isolat Bakteri
Kode Isolat Uji Biokimia Pewarnaan Gram Motilitasi Indol Katalase Sitrat Sulfida TSIA T M1 AZ1 + (Bacil) - - + - - K K AZ2 + (Coccus) + - + - - K K AZ3 + (Coccus) + - + - - K K AZ4 + (Bacil) + - + - - K K AZ6 + (Coccus) + - + - - K K AZ10 + (Bacil) + - + + - K K AZ11 + (Bacil) - - + + - K K AZ15 + (Bacil) + - + - - K K AZ18 + (Bacil) + - + - + M M AZ20 + (Bacil) + - + + - K K
Keterangan : ( + ) : Uji bersifat positif, ( -) : Uji bersifat negatif, T  :  Posisi  tegak,  M1:  Posisi  agak miring, K : Berwarna kuning, M  : Berwarna merah
Menurut  Sari  (2017)  Bakteri  gram positif  mampu  mengikat  sangat  kuat  dan pori-pori  tidak  mudah  membesar  karena lapisan  bakteri  tidak  banyak  mengandung lipid  sehingga  pada  saat  pencucian  dengan alkohol kristal violet tidak larut, sedangkan gram negatif menghasilkan warna kemerahan  atau  merah  muda  karena  saat pewarnaan pori-pori lapisan bakteri tersebut  membesar  karena  lapisan  tersebut mengandung  lipid.  Dwijoseputro  (2017) mengatakan  bahwa  bentuk  tubuh  (sel) bakteri  dipengaruhi  oleh  keadaan  medium dan usia bakteri.
Untuk  uji  motilitas  semua  isolat bersifat  positif  (+),  sedangkan  isolat  AZ1 dan  AZ18  uji  motil  bersifat  negatif    (-). Menurut  Sudarsono  (2008)  uji  motilitas bersifat positif ditandai dengan pertumbuhan bakteri yang menyebar, maka bakteri  tersebut  bergerak  (motil)  dan  bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar hanya berupa  satu  garis  maka  bakteri  tersebut tidak bergerak. Berdasarkan (Semuel et al., 2013)  uji  motilitas  ditandai  dengan pertumbuhan  koloni  pada  media  SIM  jika bersifat  postif  dan  jika  bersifat  negatif ditandai  dengan  tidak adanya  pertumbuhan
koloni  yang  terdapat  pada  media  tumbuh SIM.
Untuk  uji  indol  pada  semua  isolat bakteri  bersifat  negatif  (-)  yang  ditandai larutnya  senyawa  amino  benzealdehid dalam air sehingga tidak membentuk warna merah  seperti  cincin  sebagai  pembentukan indol. Uji indol dilakukan untuk mengetahui  kemampuan  bakteri  memecah triptofan  asam  amino  membentuk  senyawa indol.
Triptofan
dihidrolisis oleh triptofanase untuk menghasilkan tiga kemungkinan  produk  akhir,  salah  satunya adalah indol. Produksi indol terdeteksi oleh reagen  Kovac  atau  Ehrlich  yang  tersusun atas 4-p-benzaldehid dimethylamino, reagen  ini  bereaksi  dengan  indol,  sehingga menghasilkan  senyawa  berwarna  merah. Reaksi  positif  ditandai  jika  terdapat  warna merah  pada  permukaan  medium  yang menunjukkan bahwa bakteri mampu memecah  asam  amino  triptofan  (Acharya, 2012).
Untuk  hasil  uji  katalase  pada  semua isolat  bakteri  bersifat  positif  (+)  yang ditandai  dengan  pembentukan  gelembung udara  pada  media  Nutrien  Broth  sebagai tanda  bakteri  dapat  membentuk  O 2 dengan memproduksi enzim katalase lewat
degradasi hidrogen peroksida yang dilakukan  oleh  bakteri.  Menurut  Wahid (2009)  pada  bakteri  yang  bersifat  katalase positif  akan  terlihat  adanya  gelembung  gas dan  jika  gelembung  gas  tidak  terbentuk berarti  katalase  bersifat  negatif.  Bakteri katalase  negatif  tidak  memiliki  enzim katalase yang menguraikan
H2O 2 (Cappucino dan Sherman, 2017).
Mekanisme  enzim  katalase  memecah H2O2  yaitu  saat  melakukan  respirasi, bakteri  menghasilkan  berbagai  macam komponen  salah  satunya  H2O2.  Bakteri yang  memiliki  kemampuan  memecah H2O2  dengan  enzim  katalase  maka  segera membentuk  suatu  system  pertahanan  dari toksik  H2O2  yang  dihasilkannya  sendiri (Murali, 2017).
Untuk  hasil  uji  sitrat  pada  isolat AZ10, AZ11, dan AZ20 bersifat positif (+) yang  ditandai  dengan  perubahan  warna pada  medium  Simmons’s  Citrate  Agardari warna  hijau  menjadi  warna  biru  karena terjadi  peningkatan  pH  pada  media  karena adanya ammonia yang dihasilkan monoamomonia  fosfat  yang  terdapat  pada media (Sardiani et al, 2015).
Untuk  hasil  uji    Sulfida  (H 2 S)  pada isolat  AZ1,  AZ2,  AZ3,  AZ4,  AZ6, AZ10,AZ11,AZ15,  dan  AZ20,  bersifat negatif  (-)  yang  ditandai  dengan  tidak terbentuk  endapan  berwarna  hitam  pada dasar media Triple Sugar Iron Agar sebagai tanda  bakteri  dapat  menghasilkan  H 2 S, Sedangkan  AZ18  bersifat  positif  (+). Menurut  Suhandono  dalam  adithya  (2017) menyatakan bahwa uji sulfida mudah untuk dideteksi  karena  bau  gas  H 2 S  yang  seperti telur  busuk  atau  terjadinya  penghitaman dari proses inokulasi.
Hasil  uji  pada  media Triple  Sugar Iron  Agar (TSIA)  isolat  bakteri  AZ1,AZ2, AZ3,  AZ4,  AZ6,  AZ10,  AZ11,  AZ15,  dan AZ20  berwarna  kuning  pada  media  tegak dan  miring  sebagai  tanda  isolat  tersebut mampu memfermentasikan glukosa, laktosa, dan sukrosa.
Menurut  Silitonga et  al. (2016) bahwa  isolat  bakteri  hetorotrofik  yang memfermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa  ditandai  dengan  berubah  warna media  agar  tegak  berwarna  kuning  dan media  agar  miring  berwarna  merah. Sedangkan isolat bakteri yang memfermentasi glukosa, laktosa dan sukrosa, hal ini ditandai dengan berubahnya warna  merah  dan  media  miring  berwarna kuning bakteri tersebut mampu memfermentasi  glukosa.  Jika  media  tegak dan  miring  berwarna  merah  bakteri  tidak mampu  memfermentasi  glukosa,  laktosa, dan sukrosa.

## Uji Antagonisme terhadap Baktreri
Hasil  pengamatan  uji  antagonisme dari  10  isolat  bakteri  terhadap  3  bakteri
e-issn: 2716-4608 p-issn: 2655-366X patogen yaitu Bakteri Pseudomonas aerugunosa,  Escherichia  coli,  dan  Vibrio alginolyticus menunjukan  tidak  semua mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri patogen.  Lebih  jelas  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Keterangan: (+)  :  control positif, (-)  :  control negative (1,2,3) : Ulangan Gambar  1. Daya  hambat  isolat  bakteri proteolitik  terhadap  bakteri patogen
Menurut  Greenwood dalam Afriza et al (2019) bahwa terdapat beberapa klasifikasi  respon  hambatan  pertumbuhan bakteri.  Jika  diameter  zona  hambat  lebih besar  dari  20mm  maka  respon  hambatan pertumbuhannya  sangat  kuat,  sedangkan diameter  zona  hambat  berkisar  antara  10- 20mm maka respon hambatan pertumbuhannya dikategorikan kuat. Apabila  diameter  zona  hambat  berkisar antara  5-10  mm  maka  respon  hambatan pertumbuhannya dikategorikan sedang, sementara diameter zona hambat lebih kecil dari  5  mm  maka  respon  hambatan pertumbuhannya dikategorikan lemah. Aktifitas  dari  10  isolat  ditunjukan  dengan adanya  zona  bening  pada  sekitar  cakram, kemudian  diukur  zona  bening  yang terbentuk.  Lebih  jelas  dapat  dilihat  pada Tabel 4 Tabel 4. Antagonisme Isolat Bakteri Proteolitik terhadap Bakteri Patogen
Kode Isolat Zona Hambat (mm) ±Std.Dev P. aeruginosa E. coli V.alginolyticus AZ1 2,25 ± 0,95 9,65 ± 1,55 2,11±0,64 2,58±0,15 8,05±1,41 2,55±0,69 2,11±0,49 3,55±2,12 2,10±0,61 3,05±2,71 4,21±0,64 2,88±0,95 4,41±0,51 2,68±1,00 5,18±2,18 2,51±1,40 3,21±2,05 1,81±1,03 1,75±1,21 5,15±0,62 1,41±0,84 1,05±0,69 2,71±2,16 2,41±0,42 2,48±1,19 1,31±0,92 3,61±0,58 2,25±0,52 2,38±0,55 4,01±1,37 AZ2 AZ3 AZ4 AZ6 AZ10 AZ11 AZ15 AZ18 AZ20

## Hasil Elektroforesis DNA
Elektroforesis  DNA  total  dengan  1% gel  agarose,  tegangan  50  Volt  selama  45 menit, menunjukan DNA kromosomal yang
telah  dimurnikan  dapat  dilihat  pada Gambar 2.
Keterangan : M        : Fragmen marker DNA Az.2    : Isolat bakteri Az.6    : Isolat bakteri
Az.20  : Isolat bakteri
Gambar 2. Hasil Elektroforesis isolat bakteri proteolitik
Analisis  BLAST  ( Basic  Local  Alignment
Search Tool )
Analisis  BLASST  dari  fasta  DNA didapatkan hasil sequencing dengan merujuk  pada Genkbank menunjukan bahwa  AZ2  memiliki  tingkat  kekerabatan dengan  bakteri Bacillus  proteolyticus dengan  nilai  homolog  yaitu  99,26%  dan strain MCCC 1A00365. Pada AZ6 memiliki tingkat kekerabatan dengan bakteri B.  manliponensis dengan  nilai
homolog  yaitu  98,09%  dan  strain  BL4-6. Sementara  pada  AZ20  memiliki  tingkat kekerabatan  dengan  bakteri B.  toyonensius dengan  nilai  homolog  yaitu  99,67%  dan strain  BCT-7112.  Menurut  Feliatra et  al. (2015)  menyatakan  bahwa  isolat  yang mempunyai  persamaan  homolog  antara lebih dari 97% dapat mewakili pada tingkat spesies yang sama. Lebih Jelas dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Hasil BLAST isolat bakteri proteolitik Kode Isolat Spesies Strain Kode akses Referensi Homolog AZ2 Bacillus proteolyticus MCCC 1A00365 NR_157735.1 Liu,Y., et al . (2014) 99,26% AZ6 Bacillus manliponensis BL4-6 NR_125530.1 Jung,M.Y. and Chang,Y.H. (2014) 98.09% AZ20 Bacillus toyonensis BCT-7112 NR_121761.1 Jimenez,G., Blanch et al., (2013) 99.67% Selain  dapat  dilihat  pada  Tabel  5. data  ditampilkan  dalam  bentuk  pohon filogenetik  menggunakan  aplikasi  program
UPGMA.  Seperti  pada  Gambar  3  dibawah ini:
Gambar 3. Pohon Filogenetik

## 4. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
Pada  penelitian  ini  didapatkan  10 isolat  bakteri  yang  memiliki  aktifitas antagonisme  terhadap  bakteri  patogen antara  lain  bakteri P.  aerugunosa,  E.  coli, dan  V.  alginolyticus, yang  didapati  hasil pada isolat bakteri Pseudomonas aerugunosa berkisar  antara  2,01-9,65  mm, diameter  zona  hambat  isolat  bakteri  yang tertinggi  yaitu  isolat  AZ2  dan  terendah yaitu  AZ18.  Bakteri  terhadap  bakteri Escherichia  coli berkisar  antara  1,75-5.18 mm,  diameter  zona  hambat  bakteri  yang tertinggi  yaitu  isolat  AZ6  dan  yang terendah  yaitu  isolat  AZ18.  Sedangkan bakteri Vibrio  algynoliticus berkisar  antara 1,05-4,01  mm,  diameter  zona  hambat bakteri yang tertinggi yaitu isolat AZ20 dan yang terendah yaitu isolat AZ2.
Hasil identifikasi dengan
menggunakan analisis 16S rRNA diketahui bahwa  3  isolat  menunjukan hasil  yang berbeda.  AZ2  memiliki  kekerabatan  pada bakteri B. proteolyticus , AZ6 memiliki kekerabatan  pada  bakteri B.  monlinensis ,  dan AZ20  memiliki  kekerabatan  pada  bakteri B. toyonensis .  Berdasarkan  pada  penelitian  ini didapatkan  10  isolat  bakteri  berdasarkan morfologi koloni bakteri yang pada kesemuanya  tidak  memiliki  perbedaan  yang mencolok  baik  dalam  bentuk,  warna,  tepian, maupun jumlah koloni bakteri.

## Saran
Disarankan untuk penelitian selanjutnya  agar  meneliti  pengaruh  bakteri proteolitik  sebagai  produk  pakan  pada makhlup hidup.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Acharya,  T.  (2012).  Indole  Test:  Principle,  Procedure  and  Results  (Online). http: //microbeonline.com  /indole-test-principle-procedure-results/ .  Di  akses  tanggal  15 Agustus 2019.
2. Afriza, D., I. Effendi, YI. Siregar. (2019). Isolation, Identification andAntagonisme Test of  Heterotrophic  Bacteria  in  Mangrove  Plants  Againts  Pathogenic  bacteria  ( Vibrio alginolyticus,  Aeromonas  hydrophila, and Pseudomonas sp. Jurnal  Perikanan  dan Kelautan, Volume 24(1). Pages 61-68
3. Akhdiya,  A. (2017). Isolasi bakteri penghasil enzim protease alkalin termostabil. Buletin Plasma Nutfah . Volume 9(2), pages 38-44.
4. Cappucino,  JG  and  N.  Sherman.  (2017).  Microbiology  :  A  Laboratory  Manual.  Edisi Kedua. New York : Benjamin Cummings Publishing Company.
5. Dwidjoseputro, D. 2017. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta. 214 hlm
6. Hidayat,  H.  (2011).  Karakterisasi  Molekuler  BAL  Dengan  Gen  16S  rRNA  Penghasil ENzim Protease Yang berpotensi sebagai Probiotik Dari Fermentasi Markisa Kuning di Sumatera Barat.Padang: Universitas Andalas.
7. Murali,  A  and  S.  Patel.  (2017). The Effect  of  Different  Heavy  Metal  Acetate  Solutions on  the  Inhibition  of  Catalase  Enzyme. Journal  of  the  South  Carolina  Academy  of Science , Volume 15(2), pages 13.
8. Nora,  I.,  K.  Adelita,  MSJ.  Sofiana.  (2019).  Penapisan  aktivitas  Amilolitik  dan Antibakteri dari Bakteri Sedimen Perairan Pulau Lemukutun. Jurnal Enggano . Volume.4 (1) : pages 65-71.
9. Sardiani.  N,  M.  Litaay,  RG.  Budji,  D.  Priosambodo,  Syahribulan,  dan  Z.  Dwyana. (2015). Potensi Tunikata Rhopalaea sp sebagai Sumber Inokulum Bakteri Endosimbion Penghasil Antibakteri, Karakterisasi Isolat. Jurnal Alam dan Lingkungan . Volume 6 (11).
10. Sari., YN. Maya, S. Sumyarti dan Jamsari. (2013). Isoalsi, Karakterisasi dan Identifikasi DNA Bakteri Asam Laktat (BAL) yang Berpotensi sebagai Antimikroba dan Fermentasi Markisa Kuning ( Passiflora edulisvar flavicarfa). Jurnal Kimia Unand . Volume 2(2).
11. Sayuti,  I.,  N.  Istami,  dan  H.  Butar-Butar.  2016.  Isolasi  dan  identifikasi  bakteri  limbah minyak  bumi  dari  perairan  pelabuhan  sungai  duku.  Program  Studi  Pendidikan  Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Riau.
12. Semuel,  F.,  Lumantouw,  EF.  Febby,  BR.  Sendy,  FO.  Marina,  dan  Singkoh.  (2013). Isolasi dan Identifikasi Bakteri yang Toleran terhadap Fungisida Mankozeb pada Lahan PertanianTomatdi Desa Tempok, Kecamatan Tompaso, Sulawesi Utara. Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Sam Ratulangi Manado
13. Silitonga,  LR.,  Nursyirwani,  dan  I.  Effendi.  (2019).  Isolation,  Identification,  and Sensitivity  of  Amilolitic  Bacteria  from  Mangrove  Ecosystem  Sediment  in  Purnama Marine  Station  Dumai  on  the  Pathogenic  Bacteria. Asian  Journal  of  Aquatic  Sciences, Volume 2(3). Pages 257-266
14. Sudarsono,  A.  (2008).  Isolasi  dan  Karakterisasi  Bakteri  pada  Ikan  Laut  dalam  Spesies Ikan Gindara ( Lepidocibium flavobronneum).Skripsi ]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
15. Wahid,  I.,  Mubarak,    dan  N.  Chayatin.  (2009).  Ilmu  Kesehatan  Masyarakat  Teori  dan Aplikasi. Salemba Medika, Jakarta.