Abstrak —Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui viabilitas Bacillus S1 terhadap paparan HgCl 2 2,5 mg/L selama 36 jam dan aktivitas enzim amilase, protease, selulase dan lipase. Penentuan viabilitas  dilakukan  dengan  menghitung  CFU Bacillus S1  yang ditumbuhkan pada medium NA setelah terpapar HgCl 2 2,5 mg/L dengan metode pour plate , sedangkan aktivitas enzim ditentukan dengan  menumbuhkan Bacillus S1  pada  medium  spesifik  dan diamati  zona  bening  yang  terbentuk  di  sekitar  koloni.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  viabilitas Bacillus S1  terhadap paparan  HgCl 2 2,5  mg/L  mengalami  penurunan  dalam  kurun waktu 36 jam dari 4,7 × 10 8 CFU/ml menjadi 0,6 × 10 8 CFU/ml. Bacillus S1  mampu  menghasilkan  enzim  amilase,  protease  dan selulase.
Kata Kunci — Bacillus S1, viabilitas, merkuri, aktivitas enzim.

## I. PENDAHULUAN
erkuri  merupakan  logam  berwarna  perak  dan  bersifat cair  dalam  suhu  ruang.  Merkuri  dapat  berikatan  secara kimiawi  dengan  elemen  lain  menjadi  bentuk  organik  dan anorganik  [1].  Merkuri  dalam  bentuk  anorganik  (Hg 2+ )  dapat mengakibatkan  kerusakan  pada  ginjal,  kardiovaskular  dan organ  pencernaan  [2].Sedangkan  dalam  bentuk  organik (CH 3 Hg) dalam konsentrasi yang tinggi dapat mengakibatkan kerusakan  pada  sistem  pusat  saraf  dan  perkembangan  otak [3].Rujukan [4] merkuri memasuki sistem peredaran darah dan terakumulasi  di  otak,  tubuh  menanggapinya  dengan mengoksidasi merkuri menjadi gas dan mengakumulasinya di ginjal sehingga terjadi kerusakan ginjal.
Beberapa  jenis  bakteri  diketahui  mempunyai  kemampuan mereduksi    atau  menyerap  logam  berat  [5].  Rujukan  [6] bakteri  yang  tahan  terhadap  cekaman  merkuri  disebut  bakteri resisten  merkuri  (BRM).  Mekanisme  yang  terdapat  dalam BRM  untuk  mendetoksifikasi  merkurisalah  satunya  dengan mengubah Hg 2+ menjadi Hg 0 dengan enzim merkuri reduktase yang  dikode  gen merA [7]. Bacillus merupakan  bakteri  yang ditemukan di berbagai lokasi seperti tanah [8], danau [9], dan laut [10]. Bacillus yang resisten merkuri dapat mereduksi kadar merkuri  dari  lingkungannya. Bacillus  megaterium adalah BRM  yang  mampu  mereduksi  kadar  merkuri  sampai  98% [11].
Genus Bacillus juga  merupakan  bakteri  yang  mampu menghasilkan  enzim  amilase  [12],  lipase  [13],  protease  [14] dan selulase [15]. Enzim amilase, lipase, protease dan selulase
merupakan  enzim  yang  dibutuhkan  dalam  perombakan senyawa  organik  seperti  karbohidrat,  selulosa,lipid,  dan protein menjadi bentuk yang lebih sederhana [16]
Isolat Bacillus S1  merupakan  isolat  bakteri  koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Biologi ITS  yang  diisolasi  dari  hilir  sungai  Kalimas  yang  tercemar merkuri  dengan  konsentrasi  yang  melebihi  ambang  batas, yakni  6,38  mg/L  [17]. Bacillus S1  merupakan  BRM  yang berpotensi dikembangkan sebagai agen bioremediasi merkuri, disamping  itu  genus Bacillus mampu  menghasilkan  amilase, lipase,  protein  dan  selulase  sehingga  bakteri  dari  genus Bacillus S1  dapat  digunakan  sebagai  pengurai  senyawa organik yang banyak terdapat pada limbah padat maupun cair.

## II. METODE PENELITIAN

## A. Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Kultur Bacillus S1sebanyak 25 ml berumur  umur <24 jam diinokulasikan ke 225 ml media cair Nutrient Broth (NB). Sebanyak  2  ml  kultur  dimasukkan  dalam  kuvet  dan  diukur nilai optycal  dencity (OD)  dengan  spektrofotometer  pada panjang gelombang (λ) 600 nm. Pengukuran OD dimulai dari jam ke-0 hingga 24 jam dengan selang waktu 1 jam. Data OD yang didapatkan kemudian dibuat kurva pertumbuhan dengan sumbu x sebagai  waktu  (t)  dan  sumbu y sebagai  nilai  OD. Setelah  diketahui  fase  pertumbuhannya,  maka  dapat ditentukan  umur  starter  (µ)  yaitu  diambil  dari  nilai pertengahan fase eksponensial [18].

## B. Viabilitas Bacillus S1
Viabilitas Bacillus S1 diamati dengan menghitung CFU/ml. Pengamatan viabilitas dilakukan setelah pemaparan HgCl 2 2,5 mg/L pada jam ke-6, jam ke-12, jam ke-18, jam ke-24, jam ke- 30  dan  jam  ke-36.  Satu  ml  kultur  uji  diambil  secara  aseptis dan diencerkan secara bertingkat hingga 10 -6 dan ditumbuhkan pada  media  NA  secara pour  plate [18].  Jumlah  koloni  yang tumbuh  dihitung  dengan  menggunakan  formulasi  jumlah koloni dikali faktor pengenceran (CFU/ml).

## C. Uji Potensi Aktivitas Enzim
Uji  potensi  aktivitas  enzim  amilase,  selulase,  lipase  dan protease  dilakukan  secara  kualitatif  dengan  menumbuhkan isolate Bacillus S1  pada  medium  spesifik.  Medium  NA- amilum 0,5% untuk uji amilase, medium NA-susu skim 2%

## Pengaruh HgCl
2 terhadap Viabilitas Bacillus S1 dan Potensi Enzim Pendegradasi Senyawa Organik
Wahyu Dewi Iftita, Maya Shovitri dan Enny Zulaika Jurusan Bilogi, Fakultas MIPA, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
e-mail : enny@bio.its.ac.id
M
Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Bacillus S1 untuk uji protease  [18], medium CMC untuk uji selulase  [19] dan medium Tween 80 untuk uji lipase [20]. Setelah inokulasi kemudian  diinkubasi  24-48  jam.  Zona  bening  yang terbentuk di  sekitar  koloni  menunjukkan  adanya  aktivitas  enzim.  Pada medium  NA-amilum  0,5%  diteteskan  larutan  iodin  dan  pada medium  CMC  diteteskan congo  red 1%  untuk  mempertegas zona bening yang terbentuk.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Kurva Pertumbuhan Bacillus S1
Pada  kurva  pertumbuhan Bacillus S1  dengan  medium  NB tidak  menunjukkan  adanya  fase  lag,  karena  pada  masa persiapan kultur, Bacillus S1 sudah beradaptasi sehingga pada saat  pengukuran  OD  langsung  menunjukkan  peningkatan kepadatan  sel.  Rujukan  [21]  menyebutkan  bakteri  yang dikultur  pada  media  dan  lingkungan  yang  sama  seperti sebelumnya,  tidak  memerlukan  adanya  masa  adaptasi. Sedangkan  pada  pertumbuhan Bacillus S1  dengan  medium NB-HgCl 2 2,5  mg/L,  kondisi  mediumnya  tidak  sama  dengan medium  sebelumnyadan  mengakibatkan  adanyafase  lag  di  1 jam pertama pada kurva pertumbuhan (Gambar 1).
Pada  kurva  pertumbuhan  yang  menggunakan  media  NB, fase eksponensial terjadi setelah jam ke-0 sampai dengan jam ke-17,  sedangkan  pada  medium  NB-HgCl 2 2,5  mg/L  fase eksponensial  dimulai  pada  jam  ke-1  sampai  jam  ke-17.  Fase eksponensial  merupakan  fase  dimana  bakteri  dalam pertumbuhan  yang  stabil,  sel-sel  baru  terbentuk  dengan  laju yang  konstan  dan  sel-sel  bakteri  membelah  secara  optimum [22]. Fase stasioner berlangsung setelah jam ke-17 sampai jam ke-24baik  pada  kultur  NB  maupun    NB-HgCl 2 2,5  mg/L. Tidak terlihat adanya fase kematian karena pengamatan hanya dilakukan  sampai  jam  ke-24  dan  yang  teramati  masih  fase stasioner.
B. Viabilitas Bacillus S1
Viabilitas  merupakan  tingkat  ketahanan  dan  kemampuan hidup  dari  suatu  organism termasuk bakteri  pada
Gambar 2. Viabilitas Bacillus S1
lingkungan  yang  baru  [23].  CFU  Bacillus  S1  setelah pemaparan  6  jam  dan  12  jam  relatif  sama  (3,7-4,7  × 10 8 CFU/ml), setelah 18 jam dan 24 jam umlah CFU menurun dari  waktu  kultur  6  jam  dan  12  jam.  Hal  ini  sesuai  dengan kurva  pertumbuhan  pada  media  NB-HgCl 2 2,5  mg/L  bahwa fase eksponensial terjadi pada jam ke 1 – 17. Setelah jam ke- 18 pada kurva pertumbuhan menunjukkan fase stasioner, CFU setelah  pemaparan  18  dan  24  jam menunjukkan  jumlah  CFU menurun (1,1-1,8 × 10 8 CFU/ml), setelah 24 jam jumlah CFU pada pemaparan 30 jam dan 36 jam  menurun drastic menjadi 0,5 – 0,6 × 10 8 , hal ini mengindikasikan terjadi fase kematian (Gambar 2).
C. Uji Enzimatis pada Bacillus S1
Bacillus S1 mampu menghasilkan zona bening pada media NA-amilum  0,5%,  hal  ini  menunjukkan  bahwa Bacillus S1 menghasilkan  enzim  amilase  (Gambar  3.a).  Rujukan  [24] menyatakan  bahwa  enzim  amilase  merupakan  anzim induksibel  yang  dapat  dihasilkan  jika  terdapat  induksi keberadaan amilum atau  produk hidrolisisnya  seperti  maltose di  dalam  medium  tumbuh.  Rujukan  [25]  menyatakan  spesies Bacillus  acidocaldarius memiliki  aktivitas  enzim  amilase yang mampu menghidrolisis amilum sebanyak 87% dan dapat mencapai  100%  dengan  substrat  glikogen.  Rujukan  [18] menyebutkan  hidrolisis  amilum  dengan  amilase  tidak  akan menghasilkan perubahan warna pada media. Untuk mempertegas  visualisasi  zona  bening  hasil  hidrolisis  amilum digunakan  indikator  iodin.  Iodin  akan  berikatan  dengan penyusun  amilum  (monosakarida  atau  disakarisa)  yang menghasilkan  warna  biru  sampai  coklat.  Zona  bening  yang terbentuk  tidak  akan  terwarnai  sehingga  dapat  dijadikan sebagai indikator terhidrolisisnya polisakarida karena munculnya enzim amilase yang disekresikan oleh Bacillus S1. Bacillus S1  mampu  menghasilkan  enzim  kaseinase  yang membentuk zona bening atau zona proteolitik di sekitar koloni pada  media  NA-kasein  (Gambar  3.b).  Kaseinase  merupakan enzim  golongan  protease  yang  dapat  menghidrolisis  kasein menjadi  komponen  yang  lebih  sederhana  yaitu  asam  amino [18].  Zona  bening  yang  muncul  di  sekitar  koloni mengindikasikan adanya aktifitas enzim protease.
Bacillus S1  mampu  menghasilkan  zona  bening  pada medium Carboxy Methyl Cellulose (CMC). Zona bening
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 N ila i O D (λ 6 00 n m ) Waktu  (jam) Kurva Pertumbuhan Bacillus S1 Tanpa HgCl2 HgCl2 2,5 ppm 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 6 12 18 24 30 36 C F U /m l x 1 0 8 waktu  (jam) Viabilitas Bacillus S1 setelah Terpapar HgCl 2 2,5 mg/L
Gambar 3. Zona Bening Aktifitas Enzim yang Dihasilkan Bacillus S1. a. Amilase, b. Kaseinase, c. Selulase dan d. Lipase
adalah  indikasi  selulosa  terhidrolisis  oleh  enzim  selulase (Gambar  3.c).  Penambahan congo  red 1%  sebagai  indikator untuk  memperjelas daerah zona bening di sekitar koloni [26]. CMC merupakan turunan selulosa yang mudah larut dalam air sehingga mudah dihidrolisis oleh enzim selulase menjadi gula sederhana  [27].  Enzim  selulase  merupakan  enzim  selulolitik yang  mampu  menghidrolisis  selulosa  menjadi  glukosa  [28], dapat disimpulkan Bacillus S1 memiliki enzim selulolitik.
Pada  uji  enzim  lipase  digunakanmetode  yang  dilakukan oleh Kumar [20] dengan medium yg mengandung  komposisi NaCl, CaCl, pepton, agar dan Tween 80, hasilnya tidak dapat diketahui  apakah  terdapat  aktifitas  enzim  lipase,  sebab  tidak terlihat  zona  bening  atau  perubahan  warna  di  sekitar  koloni (Gambar  3.d).  Rujukan  [28]  menyatakan  metode  penentuan aktifitas  lipolitik  dari  lipase  dilakukan  dengan  menambahkan indikator  pewarna  seperti phenol  red .  Aktifitas  enzim  lipase ditunjukkan  dengan  adanya  perubahan  warna  medium  dari merah  menjadi  kuning-orange  di  sekitar  koloni.  Pada penelitian  ini  tidak  terjadi  perubahan  warna  ada  media, sehingga Bacillus S1 belum diketahui apakah memiliki enzim lipase atau tidak.

## IV. KESIMPULAN
Bacillus S1  mampu  tumbuh  pada  medium  NA  setelah terpapar HgCl 2 2,5 mg/L pada interval waktu 6 jam selama 36 jam  dengan  jumlah  sel  sebanyak  0,5  –  4,7  ×  10 8 CFU/ml. Bacillus S1 menghasilkan enzim amilase, kaseinase (protease) dan selulase.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Direktorat Pendidikan    Diniyah  dan  Pondok  Pesantren  KEMENAG  RI yang  telah  memberikan  dukungan  finansial  melalui  Program Beasiswa  Santri  Berprestasi  2009-2014.  Penulis  juga
menyampaikan  terimakasih  kepada  Dr.rer.nat.  Ir.  Maya Shovitri,  M.Si.  dan  Dr.  Enny  Zulaika,  MP,  rekan-rekan laboratorium  Mikrobiologi  dan  Bioteknologi,  serta  civitas akademik Jurusan Biologi-ITS.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] EPA. “Organic Mercury : TEACH Chemical Summary”. United States : Enviromental Protection Agency (2006) .
[2] Risher,  J.  F.  “Elemental  Mercury  and  Inorganic  Mercury  Compounds  : Human Health Aspects”. Geneva :WHO (2003).
[3] Guynup,  S.  “Mercury  :  Sources  in  Environment,  Healt  Effects  and Politics” New York : Blue Ocean Institute (2010).
[4] Griesbauer,  L.  (2012,  Nopember  17)  Methylmercury  Contamination  in Fish and Shellfish. [online]. Available :http://www.csa.com
[5] Bourquin, A. W. “Bioremediation of Hadzarous Waste Biofutur” (1990). p 24 – 35.
[6] De, J.  dan N, Ramaiah. “Characterterization  of Marine Bacteria Highly Resistant  to  Mercury  Exhibiting  Multiple  Resistances  to  Toxic Chemicals”. Ecological Indicators , 7   (2007) : 511 – 520 .
[7] Barkay,  T.,  S.  M.  Miller  dan  A.  O.  Summers.  “Bacterial  Mercury Resistance from Atom to Ecosystems”. FEMS Microbiology Reviews, 27
(2003) : 355-384
[8] Medina,  J.A.C.,  J.E.  Farias,  A.C.  Hernandez,  R.G  Martinez,  S.  S. Valdes, G. H. Silva, G. H. Jones dan J. Campos-Guillen. “Isolation and Characterization  of  Mercury  Resistant Bacillus sp.  from  Soil  with  an Extensive  History  as  Substrates  for  Mercury  Extraction  in  Mexico”. Geomicrobiology Journal , 30 (2013): 454-461.
[9] Kannan,  S.  K.  dan R.  Krishnamoorthy. “Isolation  of Mercury Resistant Bacteria and Influence of Abiotic Factors on Bioavailability of Mercury –  A  Case  Study  in  Pulikat  Lake  North  of  Chennai,  South  East  India”. Science of Total Environment , 367 (2005): 341 – 353.
[10] Francois,  F.,  C.  Lombard,  J.  Guigner,  P.  Soreau,  F.  Brian-Jaisson,  G. Martino,  M.  Vandervennet,  D.  Garcia,  A.  Molinier,  D.  Pignol,  J. Peduzzi,  S.  Zirah  dan  S.  Rebuffa.  “Isolation  and  Charactization  of Environmental  Bacteria  Capable  of  Extracellular  Biosoption  of Mercury”. Applied  and  Environmental  Microbology ,  (2011)  p.1097- 1106
[11] Badjoeri,  M.  “Uji  Kemampuan Bacillus  megaterium Menyerap  Logam Berat Merkuri”. Jurnal Kimia Mulawarman, 1 (2008): 5 – 11
[12] Gurudeeban, S., K. Satyavani dan T. Ramanathan. “Production of Extra Cellular  α-amylase  using Bacillus  megaterium isolated  from  White Mangrove  ( Avicennia  marina )”. Asian  Journal  of  Biotechnology ,  3 (2011): 310-316
[13] Sekhon, A., N. Daniya, R. P. Tewari dan G. S. Hoondal. “Production of Extracellular  Lipase  by Bacillus  megaterium AKG-1  in  Submerged Fermentation”. Indian  Journal  of  Biotechnology Vol  5  (2006)  pp  179- 183
[14] Rajkumar.  R.,  K.  R.  Jayappryan.,  P.  R.  Kannan,  dan  R,  Rengasamy. “Optimization  of  Culture  Conditions  for  Production  of  Protease  From Bacillus  megaterium”. Journal of Ecobiotechnology. Vol 2. (2010). 40- 46.
[15] Pelletier,  A dan J. Sygusch. “Purification and Characterization  of Three Chitosanase  Activities  from Bacillus  megaterium  P1 ”. Applied  and Environmental Microbiology ,  (1990) :844-848 .
[16] Haq,  P.  S.  E.  dan  E.  S.  Soedjono.  “Potensi  Lumpur  Tinja  Manusia Sebagai Pengahasil Biogas”. (2009) Jurusan Teknik Lingkungan FTSP- ITS.
[17] Widiyanti, A. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Resisten Merkuri di Hilir Kali  Mas  Surabaya.  Tugas  Akhir.  (2011)  Surabaya  :  Jurusan  Biologi FMIPA-ITS.
[18] Harley, J.  P.  dan  L.  M Prescott.  “Laboratory  Exercise  in  Microbiology, 5 th Edition”. New York : The Mc Graw Hill Companies (2002).
[19] Florencio,  C.,  Couri,  S.  dan  Farinas,  C.  S.  “Correlation  between  Agar Plate Sreening and  Solid-State  Fermentation  for  Prediction  of Cellulase Production by Trichoderma Strains”. Enzyme Research, (2012) 793708 :
1 – 7
[20] Kumar, D., L. Kumar, S. Nagar, C. Raina, R. Parshad dan V. K. Gupta. “Screening,  Isolatation  and  Production  of  Lipase/Esterase Bacillus sp. Strain  DVL2  and  its  Potential  Evaluation  in  Esterification  and Resolution  Reactions”. Archives  of  Applied  Science  Research ,  Vol  4 (2012) : 1763 – 1770.
[21] Middlebeek,  E.J.,  R.O.  Jenkins  and  J.S.  Drijver-de  Haas. Growth  in batch culture. In Vitro Cultivation of Micro-organisms .  Biotechnology by Open Learning (1992)
[22] Hogg,  S.  “Essential  Microbiology”.  United  Kingdom  :  John  Wiley  & Sons (2005)
[23] Sobariah,  E.  “Viabilitas  Bakteri    Probiotik In    Vitro dan    Pengaruh Pemberian Air Beroksigen  terhadap  Viabilitas Bakteri Probiotik  secara In Vivo ”. Tesis. Bogor : Pasca Sarjana IPB (2007)
[24] Gupta,  R.,  P.  Gigras,  H.  Mohapatra,  V.  K.  Goswani  dan  B.  Chauhan. “Microbial  α-amylases  :  a  Biotechnological  Perspective”. Process
Biochemistry, 00 (2003): 1-18.
[25] Buonocore,  V.,  C.  Caporale,  M.  De  Rosa  dan  A.  Gambacorta.  “Stable, Inducible Thermoacidophilic α-Amylase from Bacillus acidocaldarius ”.
Journal of Bacteriology , 2 (1976): 515-521
[26] Apun,  K.  “Cellulase  Production  -  Practical  Biotechnology”.  Malaysia  : National Centre for Biotechnology Education (1995).
[27] Jo,  K., Y.  Lee, B.  Kim, B.  Lee, C.  Chung, S. Nam, S.  Kim  dan J. Lee.
“Pilot-scale  Production  of  Carboxymethylcellulase  from  Rice  Hull  by Bacillus  amyloliquefaciens DL-3”. Biotechnology  and  Bioprocess Engineering , 13 (2012):182 – 188.
[28] Sharma, S., A. Shrestha. dan B. Rai. “Screening, Optimization and Pilot Scale  Production  of  Enzyme  Lipase  in  a  Bioreactor  from Aspergilus Spesies”.  Lalitpur  :  White  House  Institute  of  Science  and  Technology (2012).