Versi Online: Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood

## KARAKTERISASI BAKTERI LIPOLITIK Bacillus sp. PADA WADI ORGAN
PENCERNAAN IKAN SIDAT ( Anguilla sp.)
[ Characterization of Lipolitic Bacteria Bacillus sp. in Wadi of Digestive Organs of Sidat Fish (Anguilla sp.)]
Vicky Mahendra Nurzhulian 1) Ayu Rahmawati Sulistyaningtyas 2) Stalis Norma Ethica 3)*
1) Program Studi DIV Analis Kesehatan, Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Semarang
2) Program Studi DIII Analis Kesehatan, Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Semarang
3) Program Studi Magister Ilmu Laboratorium Klinis, Sekolah Pascasarjana, Universitas Muhammadiyah Semarang
*email: norma@unimus.ac.id
Diterima 25 November 2021/ Disetujui 3 Januari 2022

## ABSTRACT
One of the leading enzymes having the potential to donate profit of billions of dollars in food and health sector is lipase. Lipase can be produced from microorganisms including bacteria. Lipolytic bacteria can be found in the digestive tract of fish. This study aims to obtain lipolytic bacteria ifrom the wadi fermentation products of digestive organs of Sidat Fish ( Anguilla sp.) and to identify bacterial species based on the 16S rRNA gene sequence. Samples of wadi fermentation products of  fish  digestive  organs  were  serially  diluted  and  cultured  on  Nutrient  Agar  (NA).  The  purified  bacterial  isolates  were microscopically identified and tested for their lipolytic activity using Tween-80 agar media. Bacterial isolates with the highest lipolytic index were subjected to bacterial identification based on the 16S rRNA gene using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. The results showed that from the prepared wadi samples, five bacterial isolates coded WFAD-1 to WFAD-5 (WFAD stands for Wadi Fermentation of Anguilla sp. Digestive organs) could be obtained. Of these 5 isolates, two of them, WFAD-1 and WFAD-3, were capable of producing lipase and in particular, WFAD-1 had the highest lipolytic index of 2.95. BLAST analysis result on the amplified 16S rRNA gene of WFAD-1 isolate revealed a similarity level 85.79% and query coverage of 61% with Bacillus velezensis. Based on microscopic and molecular identification results, the lipolytic isolate WFAD-1 can be categorized into the genus Bacillus. As conclusion, Bacillus sp. WFAD-1 isolated from wadi fermentation product of digestive organs of ikan sidat has a potential as a source of bacterial lipase.
Keywords: Sidat fish, wadi fermentation, lipase, intestine organ, Anguilla sp.

## ABSTRAK
Salah satu enzim utama berpotensi menyumbang keuntungan miliaran rupiah di bidang pangan dan kesehatan adalah lipase. Lipase dapat dihasilkan dari mikroorganisme termasuk bakteri. Bakteri lipolitik dapat ditemukan di saluran pencernaan ikan. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan bakteri lipolitik pada produk fermentasi wadi organ pencernaan ikan Sidat ( Anguilla sp.) dan mengidentifikasi spesies bakteri tersebut berdasarkan urutan gen 16S rRNA. Sampel hasil fermentasi wadi organ  pencernaan  sidat  diencerkan  bertingkat  lalu  dikultur  pada  media  Nutrient  Agar  (NA).  Isolat  bakteri  yang  telah dimurnikan diidentifikasi secara mikroskopis dan diuji aktivitas lipolitiknya menggunakan media agar Tween-80. Isolat bakteri dengan indeks lipolitik tertinggi diidentifikasi berdasarkan gen 16S rRNA dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari sampel wadi yang telah dibuat, dapat diperoleh lima isolat bakteri yang diberi kode WFAD-1 hingga  WFAD-5  (WFAD  singkatan dari  Wadi Fermentation  of Anguilla sp. Digestive organ). Dari 5 isolat tersebut, dua di antaranya yaitu WFAD-1 dan WFAD-3 mampu menghasilkan lipase dan khususnya WFAD-1 memiliki indeks lipolitik tertinggi yaitu 2,95. Hasil analisis BLAST pada produk amplifikasi gen 16S rRNA isolat WFAD-1 menunjukkan tingkat kemiripan  85,79%  dan  cakupan query 61%  dengan  Bacillus  velezensis.  Berdasarkan  hasil  identifikasi  mikroskopis  dan molekuler,  WFAD-1  lipolitik  dapat  dikategorikan  dalam  genus  Bacillus.  Sebagai  kesimpulan,  Bacillus  sp.  WFAD-1  yang diisolasi dari produk fermentasi wadi organ pencernaan ikan sidat berpotensi sebagai sumber lipase bakterial.
Kata kunci: Ikan sidat, fermentasi wadi, lipase, organ pencernaan, Anguilla sp.
Versi Online: Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood
e-ISSN: 2443-3446

## PENDAHULUAN
Kemampuan  enzim  yang  unik  dan spesifik  mendorong  penggunaannya  dalam proses  industri  yang  dikenal  dengan  istilah teknologi enzim (Susanti dan Fibriana, 2017). Salah  satu  enzim  terkemuka  dan  berpotensi menyumbangkan  dana  miliaran  dolar,  yaitu enzim  lipase  (Zheng,  2018).  Salah  satu keunggulan enzim lipase dibandingkan enzim lainnya adalah ketahanan terhadap suhu, pH, dan  zat  kimia  terlarut.  Sayangnya,  produksi enzim  lipase  dalam  pasar  global  masih tergolong rendah dibandingkan enzim lainnya, yaitu  sebesar  kurang  dari  10%  (Guerrand, 2017).  Hal  ini  disebabkan  biaya  yang dikeluarkan  untuk  memproduksi  golongan enzim ini sangat tinggi (Verma dkk., 2012).
Enzim  lipase  dapat  diproduksi  dari mikroorganisme,  hewan,  dan  tumbuhan. Kelebihan  mikroorganisme  sebagai  sumber enzim lipase karena stabil pada pH netral atau basa,  memiliki  lama  generasi  yang  pendek, dapat dimanipulasi secara genetik, dan biaya produksi yang lebih rendah (Lee dkk., 2015). Aplikasi  enzim  lipase  telah  diterapkan  di bidang  industri  makanan,  detergen,  kertas, kosmetik, sebagai bioremediasi bagi lingkungan, dan dunia kesehatan. Bagi dunia kesehatan  lipase  digunakan  untuk  biosensor penyakit  pankreatitis  akut,  agen  bakterisida terhadap Mycobacterium  tuberculosis,  dan digunakan untuk sintesis obat Iovastatin, yaitu obat  untuk  menurunkan  kadar  kolesterol (Verma dkk., 2012). Keanekaragaman hayati Indonesia  memberi  peluang  temuan  sumber enzim  baru  untuk  mengembangkan  produksi enzim  lipase  (Ervina  dkk.,  2020;  Arifiani  & Ethica, 2018).
Wadi  merupakan  salah  satu  makanan tradisional berbahan dasar ikan yang berasal dari  Kalimantan  Tengah.  Pembuatan  wadi menerapkan  prinsip  fermentasi  dengan penambahan  lumu  dan  garam.  Lumu merupakan bahan pendukung untuk pertumbuhan  beberapa  spesies  bakteri,  baik bakteri kontaminan maupun
bakteri menguntungkan. Kelompok bakteri
menguntungkan  tersebut  setelah  dilakukan penelitian  bersifat  amilolitik,  proteolitik,  dan lipolitik (Dewi dkk., 2018; 2017).
Ikan  sidat  ( Anguilla  sp.)  adalah  salah satu  komoditas  perikanan  bernilai  ekonomis tinggi yang berpotensi untuk dikembangkan di Indonesia  (Dzikri  dkk.,  2020).  Kandungan protein  ikan  sidat  tergolong  tinggi  karena berkisar  antara  15-20%.  Kandungan  nutrisi
protein  yang  tinggi  dalam  ikan  sidat  dapat dimanfaatkan oleh manusia untuk pemenuhan kebutuhan gizi. Kandungan nutrisi dalam ikan sidat  ditentukan  oleh  spesies,  usia,  jenis kelamin, pakan ikan, dan kondisi habitat ikan. Saat  ini  ikan  sidat  mentah  telah  menjadi komoditi ekspor bahan pangan bagi Indonesia (Nafsiyah dkk., 2018)
Binatang  akuatik  seperti  ikan  sidat adalah  bagian  yang  sering  dikolonisasi  oleh bakteri,  khususnya  pada  saluran  pencernaan dan  insangnya.  Sementara  bagian  kulitnya jarang dikolonisasi oleh bakteri karena bagian ini berhubungan langsung dengan air (Lestari dkk.,  2016).  Saluran  pencernaan  ikan merupakan  bagian  yang  digemari  bakteri karena bagian tersebut kaya akan nutrisi yang dibutuhkan  untuk  pertumbuhan.  Keberadaan bakteri di dalam saluran pencernaan ikan laut dan  air  tawar  telah  banyak  diteliti.  Organ pencernaan  ikan  dapat  ditemukan  bakteri penghasil  enzim  ekstraseluler,  meliputi amilase,  selulase,  protease,  dan  lipase. Kemampuan  bakteri  dalam  menghasilkan enzim-enzim  tersebut  didasarkan  pada  jenis makanan  yang  dikonsumsi  oleh  ikan.  Bakteri lipolitik  dapat  ditemukan  pada  saluran pencernaan ikan omnivora dan karnivora (Das dkk., 2014).
Saat  ini  identifikasi  bakteri  lipolitik dapat  dilakukan  dengan  metode  berbasis biologi  molekuler,  di  mana  metode  tersebut dinilai  cepat  serta  memiliki  spesifisitas  dan sensitivitas yang tinggi. Metode tersebut yaitu analisis sekuen gen 16S rRNA. Gen 16S rRNA memiliki bagian yang lestari dan pada setiap organisme  gen  tersebut  dapat  ditemukan. Oleh  karena  itu,  gen  16S  rRNA  dapat digunakan  dalam  PCR  dan  analisis  sekuen (Fazri  dkk.,  2019;  Islami  dkk.,  2019). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri  lipolitik  yang  terdapat  pada  produk fermentasi wadi organ pencernaan ikan sidat berdasarkan sekuen Gen 16S rRNA.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Sampel berupa produk fermentasi wadi dibuat dari organ pencernaan ikan sidat segar seberat  0,5  g  yang  dipotong-potong  dengan gunting  steril.  Potongan  sampel  kemudian dicampur  dengan  garam  koser  dan  lumu untuk menghasilkan wadi. Tween-80 digunakan sebagai bahan utama atau substrat pada  media  selektif  untuk  pertumbuhan bakteri  lipolitik.  Alat  utama  berupa  1  set thermacylcer dan elektroforesis dengan merek
Versi Online: Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood
e-ISSN: 2443-3446
Biorad  digunakan  dalam  analisis Polymerase Chain  Reaction.  Sepasang  primer  yang digunakan  dalam  amplifikasi  gen  16S  rRNA bakteri  lipolitik  hasil  isolasi  adalah  27F  (5’ -
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’)  dan  primer 1492R
(5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT- 3’). Piranti  bioinformatika  BLASTn  ( Basic  Local Alignment  Search  Tool  -  nucleotide) digunakan  dalam  analisis  sekuen  produk amplifikasi  gen  16S  rRNA  (Ethica  &  Raharjo, 2014).
Metode Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Terpadu Universitas Muhammadiyah
Semarang  pada  bulan  Mei-Juni  2021.  Tahap pertama penelitian adalah pembuatan produk wadi  yang  dibuat  dari  lumu.  Lumu disiapkan dengan cara menyangrai beras dan ditumbuk hingga  halus.  Organ  pencernaan  ikan  sidat dicuci  hingga  bersih  dan  dicampur  dengan garam koser dengan perbandingan 1:1 hingga merata. Organ pencernaan tersebut didiamkan dalam toples yang tertutup selama ± 24 jam. Organ pencernaan dicuci kembali, kemudian  dicampur  dengan  lumu  hingga merata. Organ pencernaan tersebut didiamkan kembali dalam toples yang tertutup selama  7-10  hari  (Restu,  2018;  Waty  dkk., 2019).
Tabung  reaksi  steril  sebanyak  6  buah diisi  dengan  NaCl  fisiologis  masing-masing sebanyak  4,5  ml.  Sampel  dimasukkan  ke dalam  tabung  tanpa  pengenceran  dan dihomogenkan.
Pengenceran
secara bertingkat dilakukan dari seri 10-1 hingga 10- 5,  lalu  diinokulasikan  pada  media  Nutrient Agar (NA). Media NA diinkubasi selama 24 jam pada  suhu  37°C  (Sabrina  dkk.,  2018). Morfologi koloni diamati dan pewarnaan Gram dilakukan  untuk  mengamati  morfologi  sel. Koloni-koloni  bakteri  dipisahkan  berdasarkan perbedaan  karakteristik  makroskopik  dan mikroskopik, dipurifikasi pada media NA baru dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C (Rau  dkk.,  2018;  Safitri  dkk.,  2018).  Isolat bakteri  yang  telah  murni  diuji  aktivitas lipolitiknya pada media agar Tween-80 secara dotting  dan  diinkubasi  selama  48  jam  pada
suhu  37°C.  Zona  kalsinasi  di  sekitar  koloni bakteri  diukur  diameternya  dengan  jangka sorong dan indeks lipolitiknya dihitung (Rizky dkk., 2017; Ilesanmi dkk., 2020).
Isolat  bakteri  dengan  indeks  lipolitik tertinggi
dilakukan ekstraksi DNA menggunakan protokol dan reagen PrestoTM Mini  gDNA  Bacteria  Kit  GBB100  (Geneaid). Tahap  preparasi  sampel  dalam  protokol  kit dilakukan dengan penambahan Gram+ Buffer (berisi  lisozim)  dan  Proteinase  K.  Tahap  lisis sel  dilakukan  dengan  penambahan buffer.
Tahap  pengikatan  DNA  dilakukan  dengan penambahan  etanol  absolut  dalam GD Column.  Tahap  pencucian  DNA  dilakukan dengan  penambahan  W1 Buffer  dan  Wash Buffer.  Tahap  elusi  dilakukan  dengan penambahan Elution  Buffer.  Ekstrak  DNA genomik  bakteri  diukur  kemurnian  dan konsentrasinya dengan alat spektrofotometer NanoDrop  pada  λ260  nm  dan  λ280  nm (Pambudiono dkk., 2016).
Formulasi  PCR  disiapkan  dalam microtube 0,2 ml yang terdiri dari : 6 µl DNA genomik  (1,32  ng/µl);  masing-masing  2  µl primer  27F  dan  1492R  (10  µM);  12,5  µl GoTaq®  Green  Master  Mix;  dan  2,5  µl  NFW ( Nuclease Free Water). Microtube dimasukkan ke  dalam  alat thermalcycler.  Thermalcycler diprogram  sebagai  berikut:  pra-denaturation pada 95°C selama 4 menit, denaturation pada 95°C  selama  30  detik, annealing  pada  55°C selama 30 detik, extention pada 72°C selama 2 menit, dan final extention pada 72°C selama 10  menit.  Hasil  PCR  diamati  pada  gel elektroforesis  agarosa  2%  (Ethica  dan Raharjo, 2014).
Produk  PCR  dikirimkan  ke  PT  Indolab Utama, Jakarta Barat untuk dilakukan proses sekuensing  gen  16S  rRNA  dengan  metode Sanger.  Software  Geneious  digunakan  untuk memperoleh  sekuen  konsensus  yang  berasal dari  hasil  sekuensing.  Sekuen  konsensus tersebut dicek dengan program BLAST ( Basic Local  Alignment  Search  Tool)  untuk  mencari kesamaan  sekuen  16S  rRNA  dari  bakteri  lain yang  tersimpan  dalam  database  GenBank (Ethica dan Raharjo, 2014; Untu dkk., 2015).
Tabel 1. Karakteristik Makroskopik Isolat Bakteri Kode Bentuk Warna Ukuran (mm) Konsistensi Elevasi Tepi WFAD-1 circular putih 4 kasar umbonate erose WFAD-2 circular putih 2 halus convex entire WFAD-3 circular krem 2 halus flat entire WFAD-4 circular kuning 3 halus flat entire WFAD-5 punctiform putih 0,5 halus flat entire
Versi Online: Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood
e-ISSN: 2443-3446

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian  ini  menggunakan  sampel berupa  produk  fermentasi  wadi  organ pencernaan  ikan  sidat  ( Anguilla  sp.).  Proses fermentasi  berlangsung  selama  tujuh  hari setelah proses penggaraman. Karakteristik dari produk fermentasi wadi organ pencernaan ikan sidat:  berwarna  coklat,  berbau  asam  khas beras, dan tekstur lunak sedikit berair. Produk fermentasi  wadi  organ  pencernaan  ikan  sidat ditunjukkan oleh Gambar 1.
Gambar 1. Produk fermentasi wadi organ pencernaan ikan Sidat
Dari sampel diperoleh lima isolat bakteri berbeda  setelah  dikultur  pada  media Nutrient Agar  (NA).  Kelima  isolat  tersebut  diberi  kode WFAD-1,  WFAD-2,  WFAD-3,  WFAD-4,  dan WFAD-5.  WFAD  merupakan  singkatan  dari Wadi  Fermentation  of  Anguilla  sp.  Digestive organs.  Karakteristik  makroskopik  seluruh isolat bakteri ditunjukkan pada Gambar 2 dan Tabel 1.
Gambar 2. Hasil kultur bakteri isolat wadi organ pencernaan ikan Sidat pada Media NA (a) WFAD-1, (b) WFAD-2, (c) WFAD-3, (d) WFAD-4, dan (e) WFAD-5
Masing-masing isolat bakteri dengan kode WFAD-1,  WFAD-2,  WFAD-3,  WFAD-4,  dan WFAD-5 dilakukan pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram bertujuan untuk mengidentifikasi karakteristik  mikroskopik,  sifat  Gram,  dan memastikan  bahwa  sel-sel  bakteri  sejenis.
Karakteristik mikroskopik dari lima isolat bakteri dapat ditunjukkan oleh Gambar 3 dan Tabel 2.
Gambar  3.  Hasil  Pewarnaan  Gram  Isolat  Bakteri  (a) WFAD-1, (b) WFAD-2, (c) WFAD-3, (d) WFAD-4,
dan (e) WFAD-5 Tabel 2. Karakteristik Mikroskopik Isolat Bakteri Kode Bentuk Susunan Gram WFAD-1 basil berspora berderet positif WFAD-2 kokus duplo positif WFAD-3 basil soliter negatif WFAD-4 kokus bergerombol positif WFAD-5 kokus duplo positif
Lima  isolat  bakteri  yang  telah  murni  pada media  NA  diuji  aktivitas  lipolitiknya  secara kualitatif  dengan  media  agar  Tween-80.  Isolat bakteri  yang  bersifat  lipolitik  akan  membentuk zona  kalsinasi  di  sekitar  koloni  bakteri  yang tampak sebagai krital tak terlarut. Isolat bakteri WFAD-1 dan WFAD-3 dapat tumbuh pada media agar  Tween-80  dan  mampu  membentuk  zona kalsinasi.  Indeks  lipolitik  dari  isolat  bakteri WFAD-3  memiliki nilai sebesar 2,08 sedangkan isolat  bakteri  WFAD-1  memiliki  nilai  indeks lipolitik  sebesar  2,95  dan  merupakan  indeks lipolitik  tertinggi.  Hasil  pengujian  aktivitas lipolitik  dari  kelima  isolat  bakteri  dapat  diamati pada Gambar 4.
Gambar  4.  Hasil  Uji  Aktivitas  Lipolitik  bakteri  isolate wadi produk organ pencernaan ikan Sidat pada Media Agar Tween-80
Versi Online: Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood
Penelitian  yang  terkait  dengan  isolasi bakteri  proteolitik  untuk  mencari  sumber  baru enzim  lipase  telah  banyak  dilakukan.  Namun produk  enzim  lipase  bakteri  tidak  semuanya dapat  diklasifikasikan  dalam  kelompok food- grade  karena  diisolasi  dari  limbah.  Sebagai contoh  Arifiani  &  Ethica  (2018)  serta Purwaningrum  dkk.  (2021)  melaporkan  bakteri proteolitik  yang  berasal  dari  limbah  biomedis. Dalam  penelitian  tersebut  dilaporkan  adanya bakteri  lipolitik  namun  indeks  lipolitiknya  tidak diinformasikan. Mazhar dkk. (2018) melaporkan sejumlah  strain  bakteri  lipolitik Bacillus  cereus yang  diisolasi  dari  tanah  menggunakan  media tributyrin  yang  memiliki  rentang  nilai  indeks lipolitik 0,53 – 1,97. Rizky dkk. (2017) juga telah melaporkan  sejumlah  isolat  bakteri  penghasil lipase  pada  wadi,  dengan  rentang  nilai  indeks lipolitik sebesar 1,51-1,94. Rentang nilai indeks lipolitik  ini  lebih  rendah  dibandingkan  yang diperoleh dari penelitian ini (2,95). Isolasi bakteri lipolitik  pada  organ  pencernaan  ikan  lele dilaporkan  oleh  Kurniasih  dkk.  (2014),  namun indeks  lipolitik  bakteri  yang  diperoleh  tidak diukur.  Penelitian  Sarastiti  dkk.  (2020)  juga berhasil  mengisolasi  bakteri  lipolitik  dari  organ pencernaan  udang  namun  pada  penelitian tersebut  pengamatan  zona  lipolitik  hanya dilakukan secara kuantitatif Isolat  bakteri  WFAD-1  diesktrak  DNA genomnya  dan  hasilnya  berupa  sampel  DNA genomik  bakteri  sebanyak  50  µl.  Sampel  DNA genomik bakteri selanjutnya diukur kemurniannya menggunakan alat
spektrofotometer NanoDrop pada λ260 nm dan λ280  nm.  Hasil  pengukuran  kemurnian  sampel DNA genomik bakteri dapat diamati pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil Pengukuran Kemurnian Sampel DNA Genomik Bakteri Sample ID Konsentrasi  A260  A280  A260/280 WFAD- 1 1,32 ng/µl  0,026  0,008 1,923
Sampel  DNA  genomik  bakteri  dengan konsentrasi  1,32  ng/µl  digunakan  sebagai DNA template  untuk  mengamplifikasi  gen  16S  rRNA dengan  metode  PCR.  Primer  27F  dan  1492R digunakan  dalam  proses  amplifikasi  gen  16S rRNA  yang  akan  menghasilkan  amplikon berukuran ~1500 bp. Amplikon di-run pada alat elektroforesis gel agarosa 2% untuk mengetahui apakah  amplikon  tersebut  memiliki  panjang spesifik ~1500 bp dibandingkan dengan marker. Hasil dari running elektroforesis gel agarosa 2% dapat ditunjukkan oleh Gambar 5.
Gambar 5. Hasil Elektroforesis Gel Agarosa 2%
Hasil  sekuensing  yaitu  urutan  basa nukleotida primer forward dan reverse gen 16S rRNA  berupa  file  dengan  format  ab1.  File tersebut  dikonversikan  menjadi  format  fasta agar dapat dilakukan proses editing. Pensejajaran  hasil  pembacaan  primer forward dan reverse  dengan  software  Geneious menghasilkan  sekuen  konsensus  dengan panjang  1557  bp.  Sekuen  konsensus  tersebut kemudian  dicek  dengan  program  BLAST  yang dapat diakses melalui website
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi . Hasil analisis BLAST menunjukkan bahwa sekuen gen 16S  rRNA  isolat  bakteri  WFAD-1  memiliki  nilai kemiripan  tertinggi  sebesar  85,79%  dan query coverage  sebesar  61%  dengan  sekuen  spesies bakteri Bacillus velezensis.

## DISKUSI
Isolasi bakteri diawali dengan pengenceran bertingkat  sampel  yang  bertujuan  untuk mengurangi  jumlah  mikroorganisme  yang tersuspensi  di  dalam  cairan.  Koloni  bakteri  dari pengenceran  sampel  dilakukan  purifikasi  yang bertujuan  untuk  memperoleh  koloni-koloni bakteri  tunggal  terpisah  yang  murni  (Fitriani dkk.,  2016).  Koloni  bakteri  dapat  dikatakan murni apabila koloni tersebut memiliki morfologi yang sama karena berasal dari pembelahan satu sel.  Morfologi  koloni  tersebut  didasarkan  pada bentuk, warna, ukuran, konsistensi, elevasi, dan tepi (Restuati dan Gultom, 2012).
Isolat  bakteri  hasil  purifikasi  dilakukan pewarnaan  Gram  untuk  mengetahui  sifat Gramnya  dan  memastikan  bahwa  isolat  terdiri dari satu jenis sel bakteri yang seragam. Bakteri Gram-positif  berwarna  ungu  karena  memiliki struktur dinding sel yang tebal dan mengandung
Versi Online: Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood
e-ISSN: 2443-3446
sedikit  lapisan  lipid  pada  membran  selnya. Kompleks  kristal  violet-iodin  terbentuk  karena pemberian  cat  Gram  A  dan  Gram  B  yang mewarnai seluruh permukaan bakteri. Pemberian  cat  Gram  C  yang  berisi  etanol  96% akan  mengakibatkan  denaturasi  protein  pada dinding  sel  bakteri  Gram-positif,  sehingga  pori- pori  mengecil  dan  kompleks  kristal  violet-iodin yang  berwarna  ungu  dapat  dipertahankan. Bakteri  Gram-negatif  memiliki  banyak  lapisan lipid  pada  membran  selnya,  sehingga  etanol 96%  akan  melarutkan  lipid  tersebut.  Pori-pori bakteri  Gram-negatif  akan  membesar  dan  zat warna  kristal  violet  mudah  terlepas.  Pemberian cat Gram D yang berisi safranin berwarna merah menjadi zat pewarna utama bagi bakteri Gram- negatif (Mubarak dkk., 2016).
Masing-masing  isolat  bakteri  dilakukan  uji aktivitas lipolitik dengan media agar Tween-80. Isolat  bakteri  yang  bersifat  lipolitik  akan membentuk  zona  buram  (kalsinasi)  di  sekitar koloni  bakteri.  Zona  tersebut  dapat  terbentuk karena  isolat  bakteri  mampu  menghasilkan enzim  lipase  untuk  menghidrolisis  Tween-80 menjadi asam lemak. Asam lemak tersebut akan berikatan dengan ion kalsium yang berasal dari penggunaan CaCl 2 .2H 2 O dalam media. Kompleks asam  lemak  dengan  ion  kalsium  tersebut teramati sebagai endapan putih keruh di sekitar koloni bakteri (Mazhar dkk., 2018).
Tahap  ekstraksi  DNA  isolat  bakteri  pada penelitian ini menggunakan metode spin column. Proses  pengikatan  DNA  di  dalam GD  Column dapat  terjadi  karena  terdapat  membran  silika. Partikel  silika  bermuatan  positif  akan  mengikat DNA  bermuatan  negatif  dan  menahannya selama proses sentrifugasi (Ariyanti dan Sianturi, 2019).  Nilai  kemurnian  DNA  dihitung  dengan cara membag i nilai absorbansi λ260 nm dan nilai absorbansi λ280 nm. Isolat DNA dikatakan murni apabila  rasio  absorbansi  berada  pada rentang 1,8-2,0.  Rasio  absorbansi  yang  menunjukkan nilai  di  bawah  1,8  berarti  terdapat  kontaminan berupa  protein.  Rasio  absorbansi  yang menunjukkan  nilai  di  atas  2,0  berarti  terdapat kontaminan berupa RNA (Setiawan dkk., 2021). Gambaran  pita  DNA  menandakan  bahwa penelitian ini telah berhasil mengamplifikasi gen 16S rRNA. Keberhasilan amplifikasi fragmen DNA dipengaruhi oleh : DNA Template, primer, MgCl 2 , enzim  polimerase,  suhu,  waktu,  dan  jumlah siklus.  Penelitian  ini  menggunakan  kondisi  PCR yang  tepat,  sehingga  dihasilkan  amplikon  yang spesifik (Muhsinin dkk., 2018).
Persentase  minimal query  coverage  yang dapat  diterima  adalah  sebesar  95%,  kecuali sekuen  dengan  bacaan  yang  lebih  rendah
diberlakukan  minimal  75%  (Narita  dkk.,  2012). Nilai  homologi  sekuen  gen  16S  rRNA  sebesar <97,5%  menunjukkan  spesies  yang  berbeda atau  dapat  dipertimbangkan  sebagai  spesies bakteri baru (Akihary dan Kolondam, 2020; Putri dan  Nurkanto,  2016).  Isolat  WFAD-1  memiliki nilai query  coverage  sebesar  61%  dan  percent identity  sebesar  85,79%,  sehingga  tidak  dapat dikategorikan  sebagai  spesies  bakteri Bacillus velezensis. Nama spesies isolat bakteri WFAD-1 belum  dapat  ditentukan  dan  hanya  dapat dikategorikan  ke  dalam  genus Bacillus.  Hasil identifikasi tersebut diperkuat dengan kesamaan morfologi koloni dan sel dari isolat bakteri WFAD- 1 yang diperoleh dari penelitian ini yaitu memiliki karakteristik  sel  berbentuk  batang,  bersifat Gram-positif,  menghasilkan  endospora,  motil dengan  tipe  flagel  peritrikus,  dan  bersifat katalase positif. Umumnya koloni bakteri Bacillus sp.  berwarna  putih  kekuningan  hingga  putih suram,  permukaannya  kering  kasar,  dan berukuran besar (Purwadi et al., 2020).
Kemampuan produksi protease yang dimiliki Bacillus  sp.  berpotensi  untuk  dikembangkan dalam industri bioteknologi. Kemampuan Bacillus sp.  yang  telah  diketahui  antara  lain:  bersifat aerob  atau  fakultatif  anaerob,  memiliki kemampuan  enzimatik  yang  bervariasi,  tidak memerlukan  faktor  penumbuh  yang  relatif mahal, dan memiliki kisaran suhu pertumbuhan yang luas (Napitupulu dkk., 2019).

## KESIMPULAN
Kesimpulan  diambil  dari  hasil  dan pembahasan  serta  mengacu  pada  tujuan penelitian.  Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat disimpulkan  bahwa  dari  sampel  produk fermentasi  wadi  organ  pencernaan  ikan  sidat ( Anguilla sp.) diperoleh lima isolat bakteri yang diberi kode WFAD-1 hingga WFAD-5. Dari lima isolat  bakteri  tersebut  yang  bersifat  lipolitik adalah  isolat  bakteri  WFAD-1  dan  WFAD-3. Isolat  WFAD-1  memiliki  indeks  lipolitik tertinggi,  yaitu  sebesar  2,95  sehingga diidentifikasi secara molekuler. Hasil identifikasi berbasis gen 16S rRNA menunjukkan  bahwa  isolat  bakteri  WFAD-1 masuk dalam Bacillus sp. Bacillus sp. WFAD-1
pada produk fermentasi wadi organ pencernaan  ikan  sidat  ( Anguilla  sp.)  dapat dijadikan sumber alternatif enzim lipase.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  ucapan  terima kasih disampaikan kepada institusi Universitas
Versi Online: Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood
e-ISSN: 2443-3446
Muhammadiyah  Semarang  atas  dukungan finansial  yang  telah  diberikan  dalam  bentuk hibah  penelitian  internal  untuk  mendukung pekerjaan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Akihary,  C.V.,  Kolondam,  B.J.,  2020. Pemanfaatan  Gen  16S  rRNA  sebagai Perangkat  Identifikasi  Bakteri  untuk Penelitian-Penelitian di Indonesia. Pharmacon 9, 16 – 22.
Arifiani, N. and Ethica, S.N., 2018, November. Isolasi  Bakteri  Penghasil  Lipase  dan Protease  yang  Berpotensi  sebagaiAgen
Bioremediasi  dari  Limbah  Biomedis  Cair Puskesmas  Halmahera  Kota  Semarang. In Prosiding Seminar Nasional Mahasiswa Unimus (Vol. 1). https://prosiding.unimus.ac.id/index.php/ mahasiswa/article/view/156 Ariyanti,  Y.,  Sianturi,  S.,  2019.  Ekstraksi  DNA
Total  dari  Sumber  Jaringan  Hewan  (Ikan Kerapu)  Menggunakan  Metode  Kit  for Animal Tissue. J. Sci. Appl. Technol. 3, 40 –
45.
Das,  P.,  Mandal,  S.,  Khan,  A.,  Manna,  S.K., Ghosh,  K.,  2014.  Distribution  of Extracellular  Enzyme-Producing  Bacteria in the Digestive Tracts of 4 Brackish Water Fish  Species.  Turkish  J.  Zool.  38,  79 – 88. https://dergipark.org.tr/en/download/arti cle-file/134348
Dewi, I.S., Hastuti, U.S., Lestari, U., Suwono, H.,  2017.  The  Effects  of  Kinds  of  Lumus and the Storage Period on the Quality of Patin  Wadi  Based  on  the  Results  of Nutrient  Tests,  in:  AIP  Conference Proceedings.  AIP  Publishing,  pp.  0 – 8. https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/
1.4983430
Dewi, I.S., Hastuti, U.S., Lestari, U., Suwono,
H.,  2018.  Consumer  Preference  Toward Catfish  Wadi  Based  on  the  Organoleptic Quality  Regarding  The  Types  of  Lumu  in Various Concentration, in: AIP Conference Proceedings. AIP Publishing, pp. 0 – 7.
Dzikri,  M.,  Shafruddin,  D.  and  Supriyono,  E.,
2020.  Potensi  Besar  Budidaya  Ikan  Sidat (Anguilla  sp.)  di  Kecamatan  Simpenan, Sukabumi. Jurnal Pusat Inovasi Masyarakat  (PIM), 2(2),  pp.268-274. https://journal.ipb.ac.id/index.php/pim/ar ticle/view/30407
Ervina, E., Sumardi, S., Ekowati, C.N. and Rosa,
E.,  2020.  Lipolytic-screening  of  Bacillus genera as Biocontrol candidate In Coffee Plantation. Jurnal Ilmiah Biologi
Eksperimen dan Keanekaragaman Hayati, 7(1), pp.31-34. Ethica, S.N. and Raharjo, T.J., 2014. Detection of  genes  involved  in  glycerol  metabolism of Alcaligenes  sp.  JG3.  Doctoral dissertation,  Universitas  Gadjah  Mada. http://etd.repository.ugm.ac.id/home/det ail_pencarian/75357 Fazri,  M.,  Kartika,  A.I.,  Darmawati,  S.  and Ethica, S.N., 2019. Isolasi dan Identifikasi Molekuler Bakteri Staphylococcus epidermidis  pada  Rusip  Udang  Windu (Penaeus monodon) Pasca Fermentasi 24 Jam Berdasarkan Sekuen Gen 16S rRNA. In Prosiding Seminar Nasional Mahasiswa Unimus (Vol. 2). https://prosiding.unimus.ac.id/index.php/ mahasiswa/article/view/463 Fitriani, Meylina, L., Rijai, L., 2016. Isolasi dan Karakterisasi  Bakteri  Penghasil  Antibiotik dari  Tanah  Sawah,  in:  Proceeding  of Mulawarman Pharmaceuticals
Conferences. pp. 125 – 132. Guerrand,  D.,  2017.  Lipases  Industrial Applications :  Focus  on  Food  and Agroindustries. OCL - Oilseeds fats, Crop. Lipids 24, 0 – 7. https://ejournal.unsrat.ac.id/index.php/p harmacon/article/view/27405
Ilesanmi, O.I., Adekunle, A.E., Omolaiye, J.A., Olorode,  E.M.,  Ogunkanmi,  A.L.,  2020. Isolation,  Optimization  and  Molecular Characterization  of  Lipase  Producing Bacteria  from  Contaminated  Soil.  Sci. African 8, 1 – 10. Islami, H.N., Sulistyaningtyas, A.R., Darmawati,  S.  and  Ethica,  S.N.,  2019. Isolasi  dan  Identifikasi  Molekuler  Bakteri Proteolitik Staphylococcus  warneri  Strain IRLV2  pada  Udang  Putih  ( Litopeaneus vannemei) Berdasarkan  Sekuen  Gen  16S rRNA.  In Prosiding  Seminar  Nasional Mahasiswa Unimus (Vol. 2). https://prosiding.unimus.ac.id/index.php/ mahasiswa/article/view/436
Kurniasih, T., Lusiastuti, A.M., Azwar, Z.I. and Melati, I., 2014. Isolasi Dan Seleksi Bakteri Saluran  Pencernaan  Ikan  Lele  Sebagai Upaya  Mendapatkan  Kandidat  Probiotik
Untuk  Efisiensi  Pakan  Ikan. Jurnal  Riset Akuakultur, 9(1), pp.99-109. http://ejournal- balitbang.kkp.go.id/index.php/jra/article/
viewFile/511/517
Lee, L.P., Karbul, H.M., Citartan, M., Gopinath,
S.C.B.,  Lakshmipriya,  T.,  Tang,  T.-H.,
2015. Lipase-Secreting Bacillus Species in an  Oil- Contaminated  Habitat :  Promising
Versi Online: Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood
e-ISSN: 2443-3446
Strains  to  Alleviate  Oil  Pollution.  Biomed Res. Int. 2015, 1 – 9.
Lestari,  N.W.,  Budiharjo,  A.,  2016.  Bakteri Heterotrof Aerobik Asal Saluran Pencernaan  Ikan  Sidat  ( Anguilla  bicolor bicolor) dan Potensinya sebagai Probiotik. Bioteknologi 13, 9 – 17.
Mazhar,  H.,  Abbas,  N.,  Zamir,  T.,  Hussain,  Z. and Ali, S.S., 2018. Optimization study of lipolytic  enzyme  from Bacillus  cereus, PCSIR NL-37. Punjab University Journal of Zoology, 33(2), pp.217-224.
Mubarak,  Z.,  Chismirina,  S.,  Daulay,  H.H.,
2016.  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak Propolis Alami dari Sarang Lebah terhadap Pertumbuhan Enterococcus  faecalis.  J. Syiah Kuala Dent. Soc. 1, 175 – 186. Muhsinin, S., Sulastri, M.M., Supriadi, D., 2018.
Deteksi Cepat Gen InvA pada Salmonella spp. dengan Metode PCR. J. Sains Farm. Klin. 5, 191 – 200. http://jsfk.ffarmasi.unand.ac.id/index.php
/jsfk/article/view/290
Nafsiyah, I., Nurilmala, M., Abdullah, A., 2018.
Komposisi Nutrisi Ikan Sidat Anguilla bicolor bicolor dan Anguilla marmorata. J. Pengolah. Has. Perikan. Indones. 21,
504 – 512.
https://doi.org/10.17844/jphpi.v21i3.247
33
Napitupulu,  H.G.,  Rumengan,  I.F.M.,  Wullur, S., Ginting, E.L., Rimper, J.R.T.S.L., Toloh, B.H.,  2019. Bacillus  sp.  sebagai  Agensia
Pengurai dalam Pemeliharaan Brachionus rotundiformis  yang  Menggunakan  Ikan Mentah  sebagai  Sumber  Nutrisi.  J.  Ilm. Platax 7, 158 – 169.
Narita,  V.,  Arum,  A.L.,  Isnaeni,  S.,  Fawzya, N.Y.,  2012.  Analisis  Bioinformatika Berbasis  WEB  untuk  Eksplorasi  Enzim Kitosanase Berdasarkan Kemiripan Sekuens.  J.  Al-Azhar  Indones.  Seri  Sains dan Teknol. 1, 197 – 203. https://jurnal.uai.ac.id/index.php/SST/arti cle/view/84
Pambudiono, A., Suarsini, E., Amin, M., 2016. Isolasi  DNA  Genom  Bakteri  Potensial Pengkelat  Logam  Berat  Kadmium  dari Limbah  Cair  Penepungan  Agar.  Semin. Nas.  Pendidik.  dan  Saintek  103 – 107. http://hdl.handle.net/11617/7565 Purwadi, A.A., Darmawati, S., Sulistyaningtyas, A.R.  and  Ethica,  S.N.,  2019.  Isolasi  dan Identifikasi  Bakteri  Proteolitik Bacillus cereus strain IRPMD-3 pada Rusip Udang Windu  (Penaeus  monodon)  Berdasarkan Gen  16S  rRNA.  In Prosiding  Seminar Nasional  Mahasiswa  Unimus (Vol.  2).
https://prosiding.unimus.ac.id/index.php/ mahasiswa/article/view/462
Purwaningrum, E., Zulaikhah, S.T. and Ethica, S.N.,  Characterization  Of  Bacteria  From Liquid  Clinical  Laboratory  Waste  With Potential As Bioremediation Agent. World Journal of Pharmaceutical & Lifa Sciences.
7(9), pp.1626. https://www.wjpls.org/admin/assets/artic le_issue/69082021/1630407963.pdf Putri,  A.L.,  Nurkanto,  A.,  2016.  Keragaman Aktinomisetes  Serasah,  Sedimen,  dan Tanah  Pulau  Enggano,  Bengkulu.  Ber. Biol. 15, 217 – 225. https://e-
journal.biologi.lipi.go.id/index.php/berita_ biologi/article/view/2238
Rau, C.H., Yudistira, A., Simbala, H.E.I., 2018. Isolasi,  Identifikasi  secara  Molekuler Menggunakan  Gen  16S  rRNA,  dan  Uji Aktivitas  Antibakteri  bakteri  Simbion Endofit yang Diisolasi dari Alga Halimeda opuntia. Pharmacon 7, 53 – 61.
Restu, 2018. Pengolahan Wadi Ikan Bawal Air Tawar ( Colossoma macropomum). J. Ilmu Hewani Trop. 7, 70 – 73. https://garuda.ristekbrin.go.id/documents /detail/1157360
Restuati,  M.,  Gultom,  E.S.,  2012.  Uji  Potensi
Bakteri  yang  Berasosiasi  dengan  Spons Asal Pulau Ngge (Sibolga) sebagai Sumber Antibakteri. J. Saintika 12, 98 – 104.
Rizky,  M.Y.,  Fitri,  R.D.,  Hastuti,  U.S.,
Prabaningtyas,  S.,  2017.  Identifikasi  Uji Kemampuan  Hidrolisis  Lemak dan Penentuan  Indeks  Zona  Bening  Asam
Laktat pada Bakteri Dalam Wadi Makanan Traditional Kalimantan Tengah. Bionature 18, 87 – 98.
Sabrina,  A.N.  and  Ethica,  S.N.,  2018, November.  Potensi  Bakteri  Indigen Penghasil  Enzim  Protease  dan  Lipase sebagai  Agen  Bioremediasi  Limbah Biomedis  Puskesmas  Tlogosari  Kulon. In Prosiding Seminar Nasional Mahasiswa Unimus (Vol. 1). https://prosiding.unimus.ac.id/index.php/ mahasiswa/article/view/157
Safitri,  R.,  Muchlissin,  S.I.,  Mukaromah,  A.H., Darmawati, S., Ethica, S.N., 2018. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Bacillus thuringiensis  pada  Oncom  Merah  Pasca Fermentasi  24  Jam.  Semin.  Nas. Edusainstek FMIPA UNIMUS 2018 62 – 69. https://jurnal.unimus.ac.id/index.php/psn 12012010/article/view/4239
Sarastiti, S., Suminto, S. and Sarjito, S., 2019. Identifikasi Molekuler Spesies Bakteri Kandidat Probiotik Yang Diisolasi Dari
Versi Online: Pro Food (Jurnal Ilmu dan Teknologi Pangan) http://www.profood.unram.ac.id/index.php/profood
Usus Udang Vaname ( Litopenaeus vannamei) Koleksi Dari Kabupaten Subang, Jawa Barat. Jurnal Pasir Laut, 4(1), pp.9-15. https://doi.org/10.14710/pasir%20laut.2 020.30519 Setiawan,  A.,  Sebastian,  A.,  Purwestri,  Y.A., 2021. Deteksi Gen Ketahanan Hawar Daun Bakteri  Xa21  pada  Padi  ( Oryza  sativa  L.) Hitam  dan  Merah  Lokal  Indonesia. Vegetalika 10, 120 – 132. Susanti,  R.,  Fibriana,  F.,  2017.  Teknologi Enzim,  1st  ed.  CV  ANDI  OFFSET, Yogyakarta. Untu,  P.,  Rumengan,  I.F.M.,  Ginting,  E.L., 2015.  Identifikasi  Mikroba  yang  Koeksis dengan  Ascidia Lissoclinum  patella Menggunakan Sekuens Gen 16S rRNA. J.
Pesisir dan Laut Trop. 2, 23 – 33. Verma,  N.,  Thakur,  S.,  Bhatt,  A.K.,  2012. Microbial  Lipases :  Industrial  Applications and  Properties  (A  Review).  Int.  Res.  J. Biol. Sci. 1, 88 – 92.
http://www.isca.me/IJBS/Archive/v1/i8/1 5.ISCA-IRJBS-2012-180.pdf Waty,  K.,  Purwijantiningsih,  E.,  Pranata,  S.,
2019.  Kualitas  Fermentasi  Spontan  Wadi Ikan Patin ( Pangasius Sp.) dengan Variasi
Konsentrasi Garam. J. Biota 4, 24 – 32. Zheng C. Screening and identification of lipase producing  bacterium.  In  IOP  Conference Series:  Earth  and  Environmental  Science 2018  (Vol.  108,  No.  4,  p.  042088).  IOP Publishing https://iopscience.iop.org/article/10.1088 /1755-1315/108/4/042088/pdf