Ekstraksi, Karakterisasi dan Uji Aktivitas Antioksidan Astaxanthin dari Produk Fermentasi Udang (Cincalok)
Mauludia 1 , Thamrin Usman 1 , Winda Rahmalia 1 *, Dwi Imam Prayitno 2 , Siti Nani Nurbaeti 3
1 Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Tanjungpura 2 Jurusan Ilmu Kelautan, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Tanjungpura
3 Jurusan Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura Jl. Prof. Dr. H. Hadari Nawawi, Pontianak, 78124 Indonesia Email: winda.rahmalia@chemistry.untan.ac.id

## Abstract

## Extraction, Characterization and Antioxidant Activity Test of Astaxanthin from Fermented Shrimp (Cincalok) Products
Shrimp  is  one  of  the  aquatic  organisms  that  contain  several  active  compounds,  including astaxanthin. Cincalok is one of the fermented shrimp products containing astaxanthin. This study aims to  determine  the  characteristics  of  astaxanthin  extract  from  cincalok  and  its  antioxidant  activity. Extraction  of  astaxanthin  from  cincalok  was  carried  out  using  the  reflux  method  with  acetone  : cyclohexane  (20:80  v/v)  as  a  solvent.  The  identification  and  characterization  of  astaxanthin  was carried  out  using  thin-layer  chromatography  (TLC),  UV-Vis  spectrophotometry,  and  High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC). Meanwhile, the antioxidant activity test was carried out using the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method in one serial concentration (5; 15; 25 ppm). The results of TLC analysis showed that astaxanthin in cincalok extract has Rf value (0.32). The analysis using a UV-Vis  spectrophotometer  produced  a  spectrum  with  a  maximum  wavelength  of  477  nm,  which corresponds to the maximum wavelength of standard astaxanthin. The yield of astaxanthin extract from  cincalok in  this  study  was  1.47  mg/100  g  wet  weight.  The  chromatogram from  the  results  of UHPLC analysis showed that the retention time of cincalok astaxanthin extract was 6.27 minutes with a purity of 18.03%. The antioxidant activity of cincalok astaxanthin extract was 568.32 ppm
Keywords : Astaxanthin, cincalok, extraction, antioxidant

## Abstrak
Udang merupakan salah satu organisme air yang mengandung banyak senyawa aktif, termasuk astaxanthin.  Cincalok  merupakan  salah  satu  produk  hasil  fermentasi  udang  yang  mengandung astaxanthin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik ekstrak astaxanthin dari cincalok dan  aktivitas  antioksidannya.  Ekstraksi  astaxanthin  dari  cincalok  menggunakan  metode  refluks dengan  pelarut  aseton:sikloheksan  (20:80  v/v).  Identifikasi  dan  karakterisasi  astaxanthin  dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT), spektrofotometri UV-Vis, dan High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). Sedangkan uji aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode 1,1- difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dengan memvariasikan konsentrasi larutan uji, yaitu 5; 15; 25 ppm. Hasil dari penelitian ini melaporkan astaxanthin pada ekstrak cincalok menunjukkan nilai Rf 0,32 pada kromatografi  lapis  tipis  (KLT).  Hasil  analisis  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  menghasilkan spektra dengan panjang gelombang maksimum 477 nm, yang sesuai dengan panjang gelombang maksimum  astaxanthin  standar.  Randemen  ekstrak  astaxanthin  dari  cincalok  pada  penelitian  ini adalah  1,47  mg/100  g  berat  basah.  Kromatogram  dari  hasil  analisis  UHPLC  menunjukkan  waktu retensi  ekstrak  astaxanthin  cincalok  yaitu  selama  6,27  menit  dengan  kemurnian  sebesar  18,03%. Aktivitas antioksidan dari ekstrak astaxanthin cincalok diperoleh sebesar 568,32 ppm.
Kata kunci : Astaxanthin, cincalok, ekstraksi, antioksidan

## PENDAHULUAN
Radikal  bebas  memainkan  peran ganda  sebagai  senyawa  beracun  dan bermanfaat,  karena  bisa  berbahaya  atau bermanfaat  bagi  tubuh.  Radikal  bebas diproduksi baik dari metabolisme sel normal in situ atau  dari  sumber  eksternal  (polusi,  asap rokok, radiasi, obat-obatan). Ketika kelebihan radikal  bebas  tidak  dapat  dihancurkan secara bertahap, akumulasi mereka di dalam tubuh menghasilkan fenomena yang disebut stres oksidatif. Proses ini berperan besar dalam perkembangan penyakit
kronis
dan degeneratif seperti kanker, gangguan autoimun,  penuaan,  katarak,  rheumatoid arthritis, penyakit kardiovaskular
dan neurodegeneratif  (Pham-Huy et  al .,  2008). Senyawa yang
dapat
menghambat terjadinya reaksi pembentukan radikal bebas adalah  antioksidan.  Antioksidan  dapat menyumbangkan  satu  atau  lebih  elektron kepada  radikal  bebas,  sehingga  dapat menstabilkan radikal bebas tersebut (Lobo et al ., 2010).
Astaxanthin (3,3-dihidroksi-ß-karoten-4,4- dion)  merupakan  salah  satu  ketokarotenoid yang dapat ditemukan dalam ragi merah dan mikroalga  ( Haematococcus  puviallis )  (Kidd, 2011). Astaxanthin juga  ditemukan  dalam organisme  air  seperti  udang,  salmon,  dan lobster (Silva et al ., 2014). Astaxanthin memiliki aktivitas antioksidan yang baik karena memiliki kekuatan 50-100 kali lebih kuat dibandingkan dengan  vitamin  E  serta  dapat  membantu aktivitas vitamin E dan C sebagai antioksidan (Ekpe et al ., 2018; Oh et al ., 2020). Astaxanthin mampu  menetralkan  radikal  bebas  dengan menerima  atau  menyumbangkan  elektron tanpa  menjadi  pro-oksidan.  Selain  itu, astaxanthin juga diketahui mampu menurunkan  stres  oksidatif  pada  penderita obesitas,  perokok,  serta  berfungsi  sebagai pelindung terhadap peradangan dan penghambat  penuaan  (Wahyuningsih,  2011; Kim dan Kim, 2018).
Udang,  khususnya  pada  bagian  kulit, kaya akan astaxanthin (Ngginak et al ., 2013). Armenta et  al (2002)  melaporkan  bahwa kadar astaxanthin dari produk fermentasi kulit
udang  cenderung  lebih  tinggi  (1,25  µg/g) dibandingkan  dengan  udang  yang  tidak difermentasi  (0,96  µg/g).  Hal  ini  dikarenakan proses  fermentasi  yang  melibatkan  asam laktat  dapat  melarutkan  garam  kalsium dalam  udang  yang  mengandung  pigmen dalam  jumlah  besar  sehingga  meningkatkan kadar astaxanthin saat diekstraksi  (Torrisen et al ., 1981).

## Gambar 1. Cincalok
Cincalok (Gambar 1) merupakan salah satu  makanan  khas  Kalimantan  Barat  yang dibuat  dari  fermentasi  udang  rebon  ( Acetes japonicus atau Acetes  sibogaesibogae ). Waktu optimum fermentasi dilaporkan selama 7-8  hari  yang  ditandai  dengan  aroma  yang khas  serta  munculnya  warna  merah  muda (Nofiani  dan  Ardiningsih,  2018).  Faradilla (2020),  dalam  penelitiannya    membuktikan kadar karotenoid sebagai astaxanthin dalam cincalok dari udang rebon yang difermentasi selama satu minggu mempunyai kadar yang lebih  tinggi  (3,29  mg/100  g  berat  basah) dibandingkan  udang  rebon  yang  tidak difermentasi (2,57 mg/100 g berat basah).
Hingga  saat  ini,  cincalok  hanya dikonsumsi  oleh  masyarakat  lokal  sebagai lauk-pauk  yang  belum  diketahui  manfaat kesehatannya.  Sejauh  penelusuran  kami, penelitian  tentang  karakteristik  serta  aktivitas antioksidan  astaxanthin  yang  diekstraksi  dari cincalok dengan metode reflux belum pernah dilaporkan.  Dalam  penelitian  ini,  dilakukan ekstraksi astaxanthin dari cincalok menggunakan  metode  refluks  dengan campuran  aseton  dan  sikloheksana  sebagai pelarut. Identifikasi dan karakterisasi
astaxanthin dilakukan dengan menggunakan kromatografi  lapis  tipis  (KLT),  spektrofotometri UV-Vis,  dan  kromatografi  cair  kinerja  tinggi (KCKT).  Sedangkan  uji  aktivitas  antioksidan dilakukan menggunakan metode 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil (DPPH).

## MATERI DAN METODE

## Preparasi cincalok
Cincalok  yang  digunakan  dalam penelitian ini dibeli dari salah satu pedagang tradisional  di  pesisir  Kabupaten  Mempawah, Kalimantan  Barat.  Cincalok  disaring  untuk memisahkan  udang  dari  air,  setelah  itu cincalok  dihaluskan  menggunakan  blender. Cincalok  yang  sudah  dihaluskan  lalu disentrifugasi  selama  1  jam.  Filtrat  dibuang sedangkan  residu  digunakan  untuk  proses ekstraksi.

## Ekstraksi Astaxanthin dari Cincalok
Ekstraksi astaxanthin dari  cincalok dilakukan  dengan  memodifikasi  metode Senthamil  dan  Kumaresan (2015).  Ekstraksi dilakukan  dalam  reaktor  refluks.  Cincalok diambil sebanyak 10 gram dan ditambahkan 20  mL  pelarut  aseton:sikloheksana  dengan rasio  20:80  (v/v),  diaduk  secara  kontinu menggunakan magnetic stirrer sambil dipanaskan pada  temperatur 50°C selama 1 jam.  Hasil  refluks  kemudian  disentrifugasi selama  1  jam  untuk  memisahkan  filtrat  dan residu.  Proses  ekstraksi  terhadap  residu dilakukan secara berulang-ulang hingga filtrat yang  diperoleh  tidak  lagi  berwarna.  Filtrat yang diperoleh selanjutnya diuapkan pelarutnya  menggunakan  gas  N 2 sehingga diperoleh  ekstrak  kental.  Ekstrak  kental cincalok  kemudian  dipartisi  menggunakan dietil eter, akuades dan NaCl jenuh. Fasa dietil eter  diambil  dan  diuapkan  pelarutnya menggunakan gas N 2 .

## Karakterisasi Astaxanthin dari Cincalok
Kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  pada penelitian  ini  menggunakan  silika  gel G 60 F 254 (Merck) dan dielusi dengan pelarut aseton:n- heksana 1:4 dan 2:3. Pola pemisahan pigmen diamati  berdasarkan  noda  warna  yang terbentuk,  kemudian  dilakukan  perhitungan
nilai retardation  factor (Rf)  pada  masing- masing noda dan dibandingkan dengan nilai Rf astaxanthin standar ( trans-astaxanthin dari Blakesleatrispora,  >97%  KCKT,  Sigma  Aldrich) (Senthamil  dan  Kumaresan , 2015;  Dalei  dan Sahoo, 2015).
Karakterisasi dan identifikasi astaxanthin menggunakan
spektrofotometer
UV-Vis dilakukan  dengan  membuat  larutan  stok terlebih  dahulu  untuk  membuat  kurva  baku astaxanthin .  Larutan  stok  dibuat  dengan melarutkan astaxanthin standar  sebanyak 1,25 mg ke dalam pelarut aseton sebanyak 50 mL  hingga  diperoleh  konsentrasi  25  ppm. Astaxanthin standar  kemudian  ditentukan panjang  gelombang  maksimumnya  dengan mengambil larutan stok sebanyak 0,4 mL dan dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  10  mL  lalu ditambahkan  aseton  sampai  tanda  batas, hingga  diperoleh  konsentrasi  1  ppm.  Larutan tersebut  kemudian  diukur  serapannya  pada panjang gelombang 400-750 nm.
Selanjutnya  dilakukan  pengenceran dengan  mengambil  larutan  stok  sebanyak 0,24;  0,4;  0,56;  0,72;  dan  0,88  mL,  kemudian dimasukkan  ke  dalam  labu  ukur  10  mL  dan ditambahkan  aseton  sampai  tanda  batas sehingga diperoleh konsentrasi 0,6; 1; 1,4; 1,8; dan 2,2 ppm. Masing-masing larutan disaring lalu  diukur  serapannya  pada  panjang gelombang  maksimum  yang  diperoleh sebelumnya.  Pengukuran  dilakukan  masing- masing 3 kali, kemudian data yang diperoleh dibuat  dalam  bentuk  kurva  linier  yang menunjukkan hubungan linier antara konsentrasi  yang  diukur  dengan  absorbansi yang diperoleh.
Ekstrak astaxanthin cincalok  diambil secukupnya lalu ditimbang dan ditambahkan 3  mL  aseton,  kemudian  larutan  disaring dengan kertas saring dan diukur serapannya pada  panjang  gelombang  maksimum  yang diperoleh  sebelumnya.  Hasil  absorbansi kemudian dikonversi dalam satuan konsentrasi melalui persamaan kurva baku.
Analisis  KCKT astaxanthin cincalok dilakukan  dengan  menggunakan  UHPLC (Ultimate  3000-Dionex)  yang  digabungkan dengan Diode  Array  Detector (DAD). Astaxanthin dideteksi pada panjang
gelombang  433  nm  dan  dipisahkan  dalam UHPLC  dengan  menggunakan  C 18 Sunfire ( Agilent , panjang 50 mm, diameter dalam 2,1 mm,  ukuran  partikel  1,8  µm  dengan  nomor bagian 9579). Identifikasi astaxanthin menggunakan sistem elusi fase gerak isokratik metanol:air  (95:5  v/v)  dengan  laju  alir  0,4 mL/menit  dan  temperatur  28ºC.  Selanjutnya dilakukan  analisis  dengan  prosedur  yang sama untuk ekstrak astaxanthin cincalok dan dideteksi pada panjang gelombang maksimum.
Uji  aktivitas  antioksidan  pada  ekstrak astaxanthin cincalok
Larutan  stok  dari  ekstrak astaxanthin cincalok dibuat dalam konsentrasi 1000 ppm dengan  menimbang  sebanyak  0,05  gram esktrak dan dilarutkan dalam metanol 50 mL, lalu dibuat dalam beberapa konsentrasi yaitu 5, 15 dan 25 ppm. Kemudian ditambahkan 1 mL larutan DPPH 1 mM dan metanol ke dalam labu  ukur  5  mL  sampai  tanda  batas,  lalu dikocok  hingga  homogen.  Larutan  blanko dibuat  dengan  larutan  DPPH  sebanyak  1  mL yang  ditambahkan  metanol  ke  dalam  labu ukur  5  mL  sampai  tanda  batas  dan  dikocok hingga homogen. Selanjutnya larutan diinkubasi  pada temperatur 37° C selama 30 menit.  Kemudian  diukur  absorbansinya dengan  spektrofotometer  UV-  Vis  pada panjang  gelombang  maksimum  dari  DPPH yaitu  516  nm.  Pengujian  dilakukan  dengan tiga  kali  pengulangan.  Absorbansi  yang diperoleh dihitung % inhibisinya dan IC 50 .
Inhibisi (%) = serapan blanko−serapan sampel serapan blanko x 100%

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Astaxanthin  yang  terekstraksi  dari cincalok, dalam penelitian ini, terlarut dalam fasa  lipid  seperti  disajikan  pada  Gambar  2. Hasil ekstraksi diperoleh sebanyak 1,85 g/100 g berat basah cincalok.
Pelarut  aseton:n-heksana  1:4  dipilih sebagai  pelarut  terbaik  berdasarkan  pada efektifitas kemampuan pelarut tersebut dalam memisahkan antara senyawa target dengan kelompok  senyawa  karotenoid  lainnya (Senthamil  dan  Kumaresan,  2015).  Hasil separasi pigmen dengan KLT (Gambar 3).
Hasil  analisis  KLT  pada  Gambar  3 menunjukkan adanya 6 fraksi, dimana 1 fraksi menunjukkan  nilai  Rf  yang  sama  dengan astaxanthin  standar.  Hal  ini  membuktikan bahwa  cincalok  mengandung  astaxanthin dengan  spot  berwarna  jingga.  Nilai  Rf astaxanthin standar  dan  ekstrak astaxanthin cincalok hasil elusi disajikan pada Tabel 1.
Gambar 2. Ekstrak astaxanthin dari cincalok
Gambar 3 .  Kromatogram
lapis
tipis astaxanthin standar (kiri) dan hasil ekstraksi dari cincalok (kanan)
Analisis  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis  dilakukan  karena  pengerjaan  yang cukup  mudah,  waktu  pengerjaan  yang singkat,  jumlah  sampel  yang  digunakan sedikit,  dan  data  yang  dihasilkan  lebih  valid dengan tingkat ketelitian yang tinggi (Kusnadi dan  Devi,  2017).  Hasil  pengukuran  panjang gelombang  maksimum  larutan astaxanthin
standar  yang  diperoleh  menggunakan spektrofotometer UV-Vis yaitu 477 nm. Menurut Armenta et  al (2009),  panjang  gelombang maksimum  pada  pigmen astaxanthin berkisar antara 470-495 nm.
Astaxanthin dapat memberikan serapan  pada  daerah  panjang  gelombang cahaya  tampak  dikarenakan astaxanthin memiliki rantai ganda atau ikatan terkonjugasi yang disebut dengan kromofor dan auksokrom  yang  dapat  menyerap  cahaya. Ketika  cahaya  terserap  oleh  molekul,  semua energi dari cahaya lalu ditransfer oleh molekul tersebut,  sehingga  daya  serap  molekul terhadap  cahaya  meningkat  normal  dari energi rendah ke keadaan energi yang lebih tinggi (Aesha et al ., 2018).  Untuk selanjutnya, pengukuran  ekstrak astaxanthin cincalok dilakukan pada panjang gelombang 477 nm. Ekstrak astaxanthin cincalok  sebanyak  6  mg ditambahkan 3 mL aseton, kemudian larutan
disaring  dengan  kertas  saring  dan  diukur serapannya.  Absorbansi  yang  diperoleh sebesar 0,553 (Gambar 4).
Absorbansi  yang  diperoleh  kemudian dikonversi  dalam  satuan  konsentrasi  melalui persamaan  kurva  baku,  yaitu  y  =  0,3164x  + 0,0313  dengan  nilai  koefisien  korelasi  (R 2 ) sebesar 0,9966 (Gambar 5) yang menunjukkan bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  maka semakin tinggi pula absorbansinya. Persamaan  ini  digunakan  untuk  menghitung kadar astaxanthin dalam sampel, dimana (y) menyatakan  nilai  absorbansi  dan  (x) menyatakan  kadar astaxanthin dalam sampel. Kadar astaxanthin dari cincalok yang diperoleh  pada  penelitian  ini  sebanyak  1,47 mg/100  g  berat  basah.  Hasil  penelitian Faradilla (2020) melaporkan kadar astaxanthin dalam  udang  rebon  yang  difermentasi  0,  1, dan  2  minggu  dalam  100  gr  berat  basah berturut-turut yaitu 2,57 mg, 3,29 mg,  dan 0,92 mg.
Tabel 1. Nilai  Rf  pada astaxanthin standar  dan  ekstrak astaxanthin cincalok  dengan  pelarut aseton:n-heksana (1:4)
Sampel Spot Nilai Rf Astaxanthin standar 1 0,31 Ekstrak astaxanthin cincalok 1 0,18 2 0,28 3 0,32 4 0,76 5 0,80 6 0,86
Gambar 5. Penetapan kurva baku dan linieritas astaxanthin standar
Jika dibandingkan dengan hasil penelitian  yang  dilaporkan  oleh  Faradilla (2020),  kadar astaxanthin dari  penelitian  ini lebih  tinggi  dibandingkan  kadar astaxanthin cincalok yang difermentasi selama 2 minggu, dan  lebih  rendah  dibandingkan  kadar astaxanthin dari  udang  rebon  yang  tidak difermentasi  dan  cincalok  yang  difermentasi selama  1  minggu.  Perbedaan  hasil  yang diperoleh dapat disebabkan karena jenis dan habitat  dari  udang  tersebut,  pengolahan cincalok  serta  perbedaan  waktu  fermentasi dan metode ekstraksi. Metode ekstraksi yang digunakan oleh Faradilla (2020) yaitu maserasi dengan  cara  perendaman  menggunakan pelarut  aseton,  sedangkan  ekstraksi  dalam penelitian  ini  menggunakan  refluks,  yaitu ekstraksi  pada  temperatur  konstan  50°C selama  1  jam.  Ekstraksi  dengan  cara pemanasan ini dapat menghasilkan rendemen yang cukup tinggi jika dibandingkan  dengan  metode  maserasi (Nugroho, 2017) sehingga kandungan senyawa yang tersari juga semakin tinggi.
Cincalok  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  merupakan  cincalok  komersial dengan  waktu  fermentasi  18  hari.  Umumnya proses  fermentasi  dapat  menyebabkan peningkatan  gizi  dan  kualitas  pada  produk fermentasi tersebut serta dapat meningkatkan kandungan  senyawa  organik  karena  bakteri asam  laktat  yang  tumbuh  mendegradasi substrat pada bahan baku produk fermentasi. Proses fermentasi asam laktat yang dihasilkan bakteri  asam  laktat  dapat  menurunkan  pH pada  bahan  baku  cincalok  (Khairina et  al .,
2016). Lamanya waktu fermentasi
mempengaruhi  kadar astaxanthin dalam produk fermentasi cincalok, dimana astaxanthin stabil  pada  rentang  pH  4-11, sedangkan  udang  pada  umumnya  memiliki pH 6 (Rinto, 2018; Azizah et al ., 2012).
Penelitian Leliqia et al. (2014) menunjukkan semakin lama waktu fermentasi maka semakin banyak pula konsentrasi asam laktat  dan  asam  asetat  yang  menyebabkan perubahan  pH  semakin  rendah  pada minuman  kombucha.  Rendahnya  kadar astaxanthin dalam penelitian ini dapat terjadi karena perubahan pH yang berada pada pH ambang  batas  stabilitas astaxanthin (pH=4) seperti  yang  dilaporkan  oleh  Azizah et  al . (2012)  dan  kemungkinan  menyebabkan pigmen astaxanthin terdegradasi.  Selain  itu, kadar  air  yang  masih  tercampur  juga menyebabkan  sampel  memiliki  kelembapan yang  lebih  tinggi,  sehingga  sampel  mudah terdegradasi  oleh  mikroorganisme,  tumbuh jamur, dan penguraian oleh enzim. Zahrah et al .  (2020)  melaporkan  bahwa  tubuh  udang mengandung  enzim  polifenoloksidase  yang dapat mempengaruhi kestabilan astaxanthin dan  menyebabkan  perubahan  warna  pada produk fermentasi udang menjadi kehitaman.
Analisis  KCKT  atau  high  performance liquid  chromatography  (HPLC) astaxanthin cincalok  dilakukan  dengan  menggunakan UHPLC (Ultimate 3000-Dionex) yang digabungkan  dengan Diode  Array  Detector (DAD). UHPLC merupakan instrumentasi yang menghasilkan efisiensi yang lebih tinggi dalam
y = 0.3164x + 0.0313 R² = 0.9966 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0 0.5 1 1.5 2 2.5 A b so rb a n si Konsentrasi
analisis dibanding metode konvensional KCKT. Efisiensi  tersebut  berupa  penurunan  waktu analisis,  jumlah  sampel  dan  fase  gerak  yang diperlukan  serta  biaya  yang  lebih  murah. Selain  itu,  keuntungan  dari  UHPLC  dibanding KCKT  konvensional  yaitu  meningkatkan sensitivitas,  menghasilkan  selektivitas,  dan menghasilkan  puncak  kromatogram  yang lebih sempit, tajam, dan tinggi (Annissa et al ., 2020).
Astaxanthin dideteksi  pada  panjang gelombang  430  nm.  Pemilihan  panjang gelombang  untuk  menentukan astaxanthin didasarkan pada absorbansi maksimum pada pemindaian  UV-Vis.  Pelarut  yang  digunakan untuk  melarutkan astaxanthin dalam  analisis ini menggunakan pelarut aseton:metanol (1:4 v/v).  Metanol  memiliki  polaritas  yang  lebih tinggi  dibandingkan  aseton.  Metanol  lebih banyak digunakan sebagai pelarut, sehingga bila diukur akan terjadi efek hipsokromik. Efek hipsokromik atau pergeseran biru merupakan terjadinya interaksi pada panjang gelombang yang  lebih  kecil  yang  diakibatkan  salah satunya  oleh  bertambahnya  kepolaran pelarut.  Hal  ini  dikarenakan  kemampuan pelarut metanol mengadakan ikatan hidrogen  dengan  senyawa  dalam  keadaan dasar  cukup  kuat  sebelum  tereksitasi, sehingga  elektron non  bonding (n)  untuk melaku kan eksitasi n → π* memerlukan energi yang  lebih  besar,  akibatnya  panjang gelombang  transisi  ini  akan  digeser  ke
panjang  gelombang  maksimum  yang  lebih kecil  (Sudarmadji et al ., 1997; Suhartati, 2017).
Kromatografi  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  merupakan  kromatografi  partisi fase  terbalik,  dimana  digunakan  fase  diam silika  gel  berupa  nonpolar  dan  fase  gerak berupa senyawa yang lebih polar. Fungsi dari fase  gerak  yaitu  melarutkan  campuran  zat dan  membawa  komponen  yang  akan dipisahkan  melewati  fase  diam  sehingga memiliki  waktu  retensi  dan  selektivitas  yang memadai  untuk  campuran  senyawa  yang akan dipisahkan (Wulandari, 2011).
Astaxanthin standar  terdeteksi  pada panjang  gelombang  maksimum  430  nm. Astaxanthin memiliki ikatan rangkap terkonjugasi pada strukturnya yang berperan terhadap penyerapan cahaya pada kromofor,  sehingga  dapat  terdeteksi  pada panjang  gelombang  di  atas  400  nm  yang merupakan  cahaya  tampak.  Selanjutnya dilakukan  analisis  dengan  prosedur  yang sama untuk ekstrak astaxanthin cincalok dan dideteksi pada panjang gelombang maksimum 430 nm. Bentuk kromatogram yang dihasilkan  dari  analisis  UHPLC  dapat  dilihat pada Gambar 6 dan Gambar 7.
Kromatogram dari hasil analisis menunjukkan  waktu  retensi astaxanthin standar  yang  ditempuh  yaitu  selama  6,28 menit dengan persentase luas area 80,27%,
Gambar 6. Kromatogram astaxanthin standar 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 -50 0 50 100 150 200 250 20190703 #2 STD1 UV_VIS_1 mAU min 5 - ASTAXANTHIN - 6,280 WVL:430 nm
Gambar 7. Kromatogram ekstrak astaxanthin cincalok
mendekati waktu retensi astaxanthin standar. Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  dilihat  bahwa cincalok mengandung pigmen trans- astaxanthin dengan  komposisi  terbanyak. Berdasarkan  persentase  luas  area  puncak, derajat  kemurnian trans-astaxanthin dalam ekstrak adalah 18,03%.
Rendahnya kemurnian astaxanthin yang dihasilkan dalam penelitian ini disebabkan  karena  sampel  masih  berupa ekstrak  kasar  dalam  fasa  lipid  yang  masih mengandung asam lemak tak jenuh, omega- 3, dan bentuk ester dari berbagai jenis asam lemak  yang  berupa  metil  ester  atau  dimetil ester (Gastelum et al ., 2015; Rodriguez, 2001). Penelitian Hu et al. (2019) melaporkan ekstrak kasar  dari  cangkang  udang  yang  diekstraksi dengan  cara  saponifikasi  dan  dimurnikan dengan  kromatografi  kolom  silika  gel menghasilkan peningkatan kemurnian astaxanthin dari  0,34%  menjadi  85,1%. Sehingga  untuk  mendapatkan  kemurnian astaxanthin yang  lebih tinggi  perlu  dilakukan pemurnian lebih lanjut.

## Uji  Aktivitas  Antioksidan  pada  Ekstrak Astaxanthin Cincalok
Penentuan  aktivitas  antioksidan  pada ekstrak  cincalok  dilakukan  dengan  uji  DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) menggunakan analisis spektofotometri UV-Vis. DPPH
merupakan salah satu radikal nitrogen organik yang  stabil  berwarna  ungu.  Selain  itu,  DPPH dapat  larut  dalam  pelarut  polar  seperti metanol  dan  etanol.  Adanya  senyawa  yang bersifat  sebagai  peredam  radikal  akan mereduksi
radikal
DPPH dengan mendonorkan atom hidrogennya membentuk senyawa  difenil  pikrilhidrazin  (non  radikal) yang  dapat  ditandai  dengan  perubahan warna dari warna ungu radikal DPPH menjadi warna kuning (golongan pikril). DPPH berfungsi menentukan  konsentrasi  inhibisi  (IC 50 )  yang dinyatakan  dalam  total  antioksidan  yang diperlukan  untuk  meredam  50%  aktivitas radikal  DPPH.  Semakin  kecil  nilai  IC 50 ,  maka semakin besar potensinya sebagai antioksidan  (Molyneux,  2004;  Marxen et  al ., 2007).
Langkah  pertama  dalam  pengujian aktivitas  antioksidan  dilakukan  penentuan panjang  gelombang  maksimum  dan  waktu inkubasi  optimum  pada  larutan  DPPH. Menurut  Marxen et  al (2007),  panjang gelombang  maksimum  DPPH  berkisar  antara 515-520  nm.  Dalam  penelitian  ini,  panjang gelombang  maksimum  DPPH  dalam  pelarut methanol  adalah  516  nm.  Waktu  inkubasi optimum diperoleh selama 30 menit. Panjang gelombang  dan  waktu  inkubasi  optimum inilah  yang  selanjutnya  digunakan  dalam pengukuran  aktivitas  antioksidan  pada sampel.
0,0 5,0 10,0
15,0 20,0 25,0 30,0 -10,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 20190703 #13 [m odified by Adm inis trateur] UV_VIS_1 m AU m in 6 - ASTAXANTHIN - 6,293 WVL:430 nm
Aktivitas  antioksidan  larutan  uji  ekstrak astaxanthin cincalok  dinyatakan  dengan persentase  penghambatan  (%inhibisi)  dan nilai
IC 50 . Persentase
penghambatan (%inhibisi)  adalah  kemampuan  ekstrak  untuk menghambat
radikal bebas
yang berhubungan  dengan  konsentrasi  ekstrak tersebut.  Nilai  IC 50 adalah  penggambaran besarnya  konsentrasi  efektif  pada  ekstrak yang  dapat  menangkap  radikal  bebas sebanyak 50%. Hubungan konsentrasi  ekstrak astaxanthin cincalok  dengan  %inhibisi  dapat dilihat  pada  Gambar  8.  Nilai  IC 50 ekstrak astaxanthin cincalok  dapat  dihitung  dengan persamaan regresi linier y = ax + b, dimana y adalah  besarnya  persentase  inhibisi  dengan nilai  sebesar  50  dan  x  adalah  konsentrasi
larutan  uji  yang  mampu  menghambat  50% larutan  radikal  bebas  DPPH.  Hasil  pengujian antioksidan dapat ditunjukkan pada Tabel 2.
Persentase  penghambatan  (%inhibisi) ekstrak astaxanthin cincalok terhadap radikal bebas  DPPH  menunjukkan  bahwa  semakin tinggi  konsentrasi  ekstrak,  tingkat  inhibisinya semakin naik. Hal ini sesuai dengan penelitian yang  telah  dilakukan  Rohimat et  al (2014) yang  menyatakan  bahwa  tingkat  inhibisi meningkat  seiring  dengan  meningkatnya konsentrasi ekstrak. Nilai IC 50 ekstrak astaxanthin cincalok  menunjukkan  bahwa ekstrak  dapat  menghambat  aktivitas  radikal bebas  DPPH  sebesar  50%.  Semakin  kecil  nilai IC 50 ,  maka  akan  semakin  baik  aktivitas
Gambar 8. Kurva peredaman DPPH ekstrak astaxanthin cincalok pada konsentrasi 5; 15; 25 ppm
Tabel 2. Hasil uji aktivitas antioksidan terhadap ekstrak astaxanthin cincalok
Konsentrasi (ppm) Absorbansi pada panjang gelombang 516 nm Rata-rata absorbansi %Inhibisi IC50
Blanko 1,029
1,061
- 568,32 1,043 1,111 5 1,017
1,038 2,168 1,050 1,047
15 1,034
1,027 3,205 0,994 1,052 25
1,023
1,020 3,864 1,025
1,012
y = 0.0848x + 1.8066 R² = 0.9837 0 1 2 3 4 0 5 10 15 20 25 % In h ib isi Konsentrasi (ppm)
antioksidannya.  Namun  aktivitas  antioksidan ekstrak astaxanthin cincalok  pada  penelitian ini  masih  tergolong  sangat  lemah  karena memiliki  nilai  IC 50 lebih  besar  dari  200  ppm. Suatu  bahan  atau  suatu  senyawa  dapat dikatakan  sebagai  antioksidan  kuat  apabila memiliki  nilai  IC 50 kurang  dari  200  ppm (Molyneux, 2004).
Aktivitas antioksidan yang rendah pada penelitian  ini  dapat  dipengaruhi  oleh kemurnian  ekstrak  astaxanthin  yang  relative rendah (18,03%). Senyawa-senyawa lain yang yang  ikut  tersari  dalam  pelarut  saat  proses ekstraksi  diduga  bukan  merupakan  senyawa antioksidan.  Gastelum et  al (2015)  dan Rodriguez  (2001)  melaporkan  ekstrak  dari produk  sampingan  udang  dapat  berupa minyak  yang  mengandung  asam  lemak  tak jenuh,  omega-3, astaxanthin ,  dan  bentuk ester  dari  berbagai  jenis  asam  lemak  yang berupa metil ester atau dimetil ester.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan,  maka  dapat  disimpulkan  bahwa cincalok  mengandung  astaxanthin  dalam bentuk trans-astaxanthin yang dapat menyerap  cahaya  tampak  karena  memiliki rantai  ganda  atau  ikatan  terkonjugasi  dan auksokrom, menyebabkan cincalok berwarna merah muda. Kadar astaxanthin dari cincalok yang diperoleh pada penelitian ini sebanyak 1,47 mg/100 g berat basah. Kromatogram dari hasil  analisis  UHPLC  menunjukkan  kemurnian trans-astaxanthin yang  terlarut  dalam  fasa lipid  hasil  ekstraksi  adalah  18,03%.  Hasil perhitungan  aktivitas  antioksidan  dari  ekstrak astaxanthin cincalok  diperoleh  IC 50 sebesar 568,32 ppm, mengindikasikan bahwa aktivitas antioksidan pada ekstrak astaxanthin cincalok tergolong sangat lemah.

## DAFTAR PUSTAKA
Aesha,  M.,  Indumathu,  M.  &  Rathu,  C.  2018.
Extraction  and  Characterization  of Astaxanthin  from  Prawn  Shell  Waste. Eurasian  Journal  of  Analytical  Chemistry. 13(2):422-428.
Annissa,  S.,  Musfiroh,  I.  &  Indriati,  L.  2020. Perbandingan  Metode  Analisis  Instrumen
HPLC dan UHPLC: Article Review , Farmaka 17(3):189-196. doi: 10.24198/jf.v17i3.21894 Armenta,  L.R.,  Guerrero,  L.  &  Huerta,  S.  2002. Astaxanthin Extraction From Shrimp Waste by  Lactic  Acid  Fermentation  and Enzymatic  Hidrolysis  of  the  Carotenoprotein Complex. Journal of Food Science 67(3): 1002-1006.  doi:  10.1111/j.1365-2621.2002. tb09443.x Armenta, R.E., Guerrero, S. & Legarreta. 2009. Stability Studies on  Astaxanthin Extracted from  Fermented  Shrimp  Byproducts. Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry 57(14):6095-6099.  doi:  10.1021/ jf901083d Azizah,  N.,  Al-Baarri,  A.  N.  &  Mulyani,  S.  2012. Pengaruh  Lama  Fermentasi  Terhadap Kadar  Alkohol,  pH,  dan  Produksi  Gas pada  Proses  Fermentasi  Bioetanol  dari Whey dengan Substitusi Kulit Nanas. Jurnal Aplikasi Teknologi Pangan. 1(2):72-77. Dalei,  J.  &  Sahoo,  D.  2015.  Extraction  and
Characterization of  Astaxanthin from the Crustacean Shell Waste Shrimp Processing Industries. International Journal of Pharmaceutical  Science  and  Research. 6(6):2532-2537.  doi:  10.13040/IJPSR.0975- 8232.6(6).2532-37
Ekpe,  L.,  Inaku,  K.O.,  Ekpe,  V.  &  Contact,  L. 2018. Antioxidant effects of astaxanthin in various  diseases???  a  review.  Journal  of Molecular  Pathophysiology.  7(1):1-6.  doi: 10.5455/jmp.20180627120817
Faradilla,
A. 2020. Penetapan Kadar Astaxanthin dalam  Udang  Rebon  dan Cincalok, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura, Pontianak (Skripsi).
Gastelum, J.A.N., Machado, D.I.S., Cervantes, J.L.,  Nunez,  J.R.R.,  Murrieta,  M.A.C., Duarte,  R.G.S.  &  Baypoli,  O.N.C.  2015. Astaxanthin and its Esters in Pigmented Oil from  Fermented  Shrimp  by-Products. Journal of Aquatic Food Product Technology. 25(3):  334-343.  doi:  10.1080/10498850. 2013.851756
Hu, J., Lu, W., Lv, M., Wang, Y., Ding, R. & Wang, L.  2019.  Extraction  and  Purification  of Astaxanthin  from  Shrimp  Shells  and  the Effects  of  Different  Treatments  on  its Content. Brasileira de Farmacognosia. 29: 24-29. doi: 10.1016/j.bjp.2018.11.004 Khairina,  R.,  Cahyanto,  M.N.,  Utami,  T.  & Rahardjo,  S.  2016.  Karakteristik  Fisikawi, Kimiawi,  dan  Mikrobiologis  Ronto  selama

## Jurnal Kelautan Tropis November 2021 Vol. 24(3):311-322
Penyimpanan. Jurnal  Pengolahan  Hasil Perikanan  Indonesia. 19(3):348-355.  doi: 10.17844/jphpi.2016.19.3.348 Kidd.  P.  2011.  Astaxanthin  Cell  Membrane Nutrient with Diverse Clinical Benefits and Anti-Aging Potential. Alternative Medicine Review: a Journal of Clinical Therapeutic.
16(4): 355- 362.
Kim,  S.H.  &  Kim,  H.  2018,  Inhibitory  Effect  of Astaxanthin  on  Oxidative  Stress-Induced Mitochondrial Dysfunction-A Mini-Review,
Nutrients 10(1137): 1-14. doi: 10.3390/nu10
081137
Leliqia, N.P.E.,  Susanti, N.M.P. &  Chanjaya, C.
2014. Pengaruh Lama
Fermentasi terhadap  Aktivitas  Antioksidan  Minuman Kombucha  Lokal di Bali dengan Substrat Produk Gambir. Jurnal Farmasi Udayana , 3(1):116-119.
Lobo,  V.,  Patil,  A.  &  Chandra,  N.  2010.  Free Radicals,  Antioxidants  and  Functional Foods on Human Health, Pharmacognosy Reviews. 4(8):118-126.  doi:  10.4103/0973- 7847.70902
Marxen,  K.,  Vanselow,  K.  H.,  Lippemeier,  S.  & Hintze,  R.  2007.  Determination  of  DPPH Radical Oxidation Caused by Methanolic Extracts  of  Some  Microalgal  Species  by Linear  Regression  Analysis  of  Spectro- photometric Measurements, Sensors. 7:2080- 2095. doi: 10.3390/s7102080
Molyneux, P. 2004. The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Journal of Science Technology. 26(2):211-219. Ngginak, J., Semangun, H., Mangimbulude, J.
C.  &  Rondonuwu,  F.S.  2013.  Komponen Senyawa  Aktif  pada  Udang  serta Aplikasinya  dalam  Pangan, Jurnal  Sains Medika. 5(2): 132-133. doi: 10.26532/sains med.v5i2.354
Nofiani, R. & Ardiningsih, P. 2018.
Physicochemical  and  Microbiological Profil  of  Commercial  Cincalok  from  West Kalimantan. Jurnal  Pengolahan  Hasil Perikanan  Indonesia. 21(2):243-249.  doi:
10.17844/jphpi.v21i2.22851
Nugroho,  A.  2017. Buku  Ajar Teknologi Bahan Alam ,  Universitas  Lambung  Mangkurat,
Banjarmasin.
Oh, S., Kim, Y.J., Lee, E.K., Park, S.W. & Yu, H.G. 2020.  Antioxidative  Effects  of  Ascorbic
Acid and Astaxanthin on ARPE-19 Cells in an  Oxidative  Stress  Model. Antioxidants 9(833):1-15. doi: 10.3390/antiox9090833 Pham-Huy,  L.A.,  He,  H.  &  Pham-Huy,  C.  2008. Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health, International Journal of
Biomedical Science. 4(2): 89-96. Rinto,  2018. Manfaat  Fungsional  Produk Fermentasi Hasil Perikanan Indonesia , UPT. Universitas Sriwijaya, Palembang.
Rodriguez,  D.B.  2001. A  Guide  to  Carotenoid Analysis in Food , ILSI Press, Washington.
Rohimat,  Widowati,  I.  &  Trianto,  A.  2014. Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Metanol Rumput Laut Coklat ( Turbinaria conoides dan Sargassum  cristaefolium )  yang Dikoleksi  dari  Pantai  Rancabuaya  Garut Jawa Barat. Journal of Marine Research. 3(3):304-313.
Senthamil, L. & Kumaresan, R. 2015. Extraction and  Identification  of  Astaxanthin  from Shrimp Waste. Indian Journal of Research in  Pharmacy  and  Biotechnology. 3(3): 192-195.
Silva,  F.O.D.,  Tramonte,  V.L.C.,  Parisenti,  J., Lima-Garcia, J.F., Maraschin, M. & Silva, E. L.D. 2015. Litopenaeus Vannamei, Muscle Carotenoids  Versus,  Astaxanthin:  A Comparison of Antioxidant Activity and in Vitro,  Protective  Effect  Against  Lipid Peroxidation. Food  Bioscience. 9:12-19. doi: 10.1016/j.fbio.2014.11.001
Sudarmadji,  S.,  Haryono,  B.,  &  Suhardi.  1997. Prosedur  Analisis  untuk  Bahan  Makanan dan Pertanian , Liberty, Yogyakarta. Suhartati, T. 2017. Dasar-Dasar Spektrofotometri UV-Vis  dan  Spektrometri  Massa  untuk Penentuan  Struktur  Senyawa  Organik , AURA, Bandar Lampung.
Torrisen, O.J., Tidemann, E., Hansen, F. & Raa, J.  1981.  Ensiling  in  Acid  a  Method  to Stabilize Astaxanthin in Shrimp Processing by-Products  and  Improve  Uptake  of  this Pigment  by  Rainbow  Trout  ( Salmo Gairdneri ), Aquaculture. 26:  77-83.  doi:
10.1016/0044-8486(81)90111-3 Wahyuningsih,
K.A. 2011. Astaxanthin
Memberikan  Efek  Proteksi  terhadap
Photoaging . Damianus
Journal of Medicine. 10(3): 149-160. Wulandari,  I.  2011. Kromatografi  Lapis  Tipis , Taman Kampus Presindo, Jember.
Zahrah,  Z.,  Amin,  M.N.G.  &    Alamsjah,  M.A.
2020.  The    Effect  of  Fucoxanthun  as
Coloring  Agent  on  the  Quality  of  Shrimp
Paste, IOP  Conference  Series:  Earth  and Environmental  Science.  441:012079.  d oi: 10.1088/1755-1315/441/1/012079