## EFEKTIFITAS PENGIKATAN LOGAM Pb OLEH BAKTERI, Bacillus subtilis
Maulin Inggraini
Program Studi DIII Analis Kesehatan STIKes Mitra Keluarga Jl. Pengasinan Rawa Semut Margahayu Bekasi Timur 17133 e-mail : molinmool@gmail.com

## ABSTRACT

## Effectiveness of Heavy Metal (Pb) Binding of Bactery Bacillus subtilis
The rapid development of technology and industries lead to higher environmental pollution by heavy metals, especially  Pb.  Reduction  of  heavy  metals  is  commonly  done  using  chemical  and  physical  approach.  Another alternative  is  biological  technique  which  is  more  efficient  due  to  its  higher  metal  binding and  readily  available  as materials.  Bacillus  subtilis  was  a  potential  bacterium  in  reducing  heavy  metal  contamination.  This  study  aimed  to determine the B. subtilis binding effectiveness of Pb; to test the bacterial  tolerance to Pb at varied concentrations; and to detect the accumulation sites of Pb within  B. subtilis. The results showed that B. subtilis was able to bind Pb with the effectiveness percentage  of 17.45%. Pb was accumulated in the cell walls.
Keyword: Bacillus subtilis, Pb binding

## ABSTRAK
Pesatnya  perkembangan  teknologi  dan  industri  menyebabkan  pencemaran  lingkungan  yang  lebih  tinggi dengan  logam  berat,  terutama  Pb.  Pengurangan  logam  berat  yang  biasanya  dilakukan  dengan  menggunakan  bahan kimia  dan  pendekatan  fisik.  Alternatif  lain  adalah  teknik  biologi yang  lebih  efisien  karena  logam  yang  lebih  tinggi mengikat dan tersedia sebagai bahan. Bacillus subtilis adalah bakteri potensial dalam mengurangi kontaminasi logam. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendeterminasi B.  subtilis yang  efektivitas  mengikat  Pb;  untuk  menguji  toleransi bakteri  terhadap  Pb  pada  konsentrasi  yang  bervariasi;  dan  untuk  mendeteksi  akumulasi  Pb  dalam Bacillus  subtilis . Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa B.  subtilis mampu  mengikat  Pb  dengan  efektivitas  persentase  17,45%.  Pb terakumulasi dalam dinding sel.
Kata Kunci : Bacillus subtilis, pengikatan Pb

## PENDAHULUAN
Air  merupakan  salah  satu  kebutuhan hidup yang sangat penting sehingga pencemaran air oleh zat-zat dalam golongan B3    (Bahan  Berbahaya  Beracun)  menjadi permasalahan  besar  karena  menjadi  sumber pencemar dan tempat berkembangnya mikroba  patogen.  Kandungan  logam  berat yang  tinggi  merupakan  penyebab  pence- maran  air  yang  potensial.  Logam  yang mencemari  air  dapat  berasal  dari  limbah rumah  tangga,  dan  limbah  pabrik  yang masuk ke badan air (Akoto et al ., 2008).
Bioremediasi merupakan
proses penggunaan  mahluk  hidup  untuk  men- degradasi  bahan  pencemar  hingga  tercapai kondisi  yang  tidak  membahayakan  atau menurunkan  konsentrasi  pencemar  hingga
berada di bawah ambang batas. Teknik yang digunakan  adalah  dengan  menggunakan mahluk hidup spesifik yang mampu hidup di lingkungan  tercemar  dan  memiliki  kemam- puan  untuk  mengurangi  toksisitas  yang beresiko  terhadap  kesehatan  manusia  dan/ atau  lingkungan  (Kumar et  al. ,  2011). Berdasarkan  hasil  penelitian  (Zulaika et  al .,
2012)  bakteri  dari  genus Bacillus sp.  Ter- masuk  dalam  bakteri  yang  resisten  terhadap logam  Hg,  Pb,  Cu  dan  Cd.  Bakteri  tersebut diisolasi dari sungai Kalimas Surabaya yang sudah tercemar dengan logam berat.
Salah  satu  genus Bacillus sp.  yang mampu  hidup  pada  habitat  yang  tercemar logam  berat  adalah Bacillus  subtilis . Menurut  Issazadeh et  al. (2011) B.  subtilis mampu mengikat logam Pb, Cd, Zn dan Cu. B.  subtilis juga  merupakan  pengakumulasi
logam  Zn  dan  Pb  terbaik  bila  dibandingkan dengan B.  licheniformis,  B.  cereus  dan  B. amyloliquefaciens.
Studi ini bertujuan untuk mengetahui:
1. Efektifitas  pengikatan  logam  Pb  pada bakteri B. subtilis
2. Toleransi B. subtilis terhadap logam Pb
3. Tempat  akumulasi  logam  Pb  pada B. subtilis .
Hasil  penelitian  ini  diharapkan  dapat dijadikan  acuan  dalam  pemanfaatan B. subtilis sebagai  pengelolaan  limbah  logam pada perairan.

## BAHAN DAN METODE

## Alat dan Bahan
Materi  yang  digunakan  dalam  peneliti- an ini adalah isolat bakteri B. subtilis koleksi laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas  Biologi UNSOED,  medium  NB,  aquades  steril, plastik  tahan  panas,  alkohol  70%,  kapas, HCl  pekat,  Pb.  Sedangkan  alat  yang digunakan  adalah  autoklaf, hot  plate  and stirrer, gelas  ukur,  pipet  ukur  10  ml,  labu Erlenmeyer,  botol  gelas  125  ml,  tabung reaksi,  pH  meter,  inkubator, haemo- cytometer , shaker, tissue grinder, sentrifuge , instrument AAS.

## Metode Penelitian

## 1. Rancangan Percobaan
Penelitian  ini  merupakan  penelitian eksperimental,  dengan  menggunakan  ran- cangan percobaan Rancangan Acak Lengkap (RAL).  Perlakuan  untuk  menguji  efektifitas B.  subtilis dalam  mengikat  logam  adalah penambahan  logam  Pb  dengan  konsentrasi 0,35  ppm  pada  medium  NB.  Pengujian kemampuan  toleransi B.  subtilis terhadap logam  adalah  dengan  menum-buhkan B. subtilis pada  medium  NB  dengan  penam- bahan logam Pb pada konsentrasi 1 ppm, 10 ppm  dan  20  ppm.  Penentuan  tempat akumulasi logam berdasarkan jumlah logam yang  terdapat  pada  sitoplasma  dan  dinding sel.
2. Cara Kerja a.  Pembuatan  Medium  Pertumbuhan  NB (Primaharinastiti et al ., 2004)
Medium  NB  ditambah  dengan  aquades steril  1  L  pada  erlenmeyer,  dihomogenkan dengan hot  plate  and  stirer. Medium disterilkan  dengan  autoklaf  pada  suhu  121 o
C, tekanan 2 atm selama 20 menit.
b.  Perbanyakan  Isolat  dan  Pembuatan
Suspensi B. subtilis (Modifikasi Joetono et al ., 1980 dalam Nur, 2005).
Kultur B.  subtilis diinokulasi  sebanyak 1  ose  ke  dalam  50  ml  medium  NB  steril secara aseptis lalu diinkubasi pada suhu  37 o C  selama  48  jam.  Selama  inkubasi,  setiap dua  jam  dilakukan  penghitungan  jumlah  sel bakteri menggunakan haemocytometer untuk mengetahui  pola  pertumbuhan B.  subtilis . Setiap  biakan  yang  berada  dalam  fase pertumbuhan logaritmik tertinggi  digunakan dalam  biakan  starter  untuk  uji  pengikatan logam Pb.

## c.  Pembuatan  Stok  Larutan  Standar
Logam Pb (Badjoeri, 2008).
Stok  larutan  logam  yang  diperlukan adalah 0,35 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm dan 15  ppm.  Larutan  stok  Pb  1000  ppm  dibuat dengan  cara  melarutkan  100  mg  PbCl 2 ke dalam  100  ml  HCl  1%.  Larutan  standar  Pb 1000  ppm  dikonversi  dengan  metode pengenceran  sehingga  didapatkan  larutan logam  dengan  konsentrasi  yang  diinginkan menggunakan rumus:
V 1 x N 1 = V 2 x N 2 V1= Volume logam larutan 1 (ml) V2 = Volume logam larutan 2 (ml) N1  =  Konsentrasi  logam  larutan  1 (mg/ml)
d.  Inokulasi B. subtilis ke  dalam  Medium yang Mengandung Logam (Primaharinastiti et al ., 2004).
1).  Pengukuran  Efektifitas B.  subtilis
dalam Mengikat Logam Pb
Medium  cair  NB  sebanyak  65  ml ditambah logam Pb dengan konsentrasi 0,35
ppm  sesuai  perlakuan.  Medium  diatur hingga  pH  mencapai  7  kemudian  ditambah B. subtilis sebanyak 5% (v/v) lalu diinkubasi pada  suhu  kamar  dan  dikocok  dengan kecepatan  100  rpm.  Sel  dipanen  pada  saat pertumbuhan optimal (fase stationer ). Perlakuan  dilakukan  pengulangan  sebanyak 3 kali.
2).  Toleransi B.  subtilis terhadap  Logam Pb
Medium  NB  sebanyak  10  ml  diberi  Pb hingga mencapai konsentrasi 1 ppm, 10 ppm dan  20  ppm  sesuai  perlakuan.  Medium diatur  hingga  pH  mencapai  7  kemudian ditambah B.  subtilis sebanyak  5%  (v/v)  lalu diinkubasi  pada  suhu  kamar  dan  dikocok dengan  kecepatan  100  rpm.  Sel  dipanen pada jam ke-48.
Pola  Pertumbuhan B.  subtilis pada Medium NB (n=3) terdapat pada Gambar 1. Selama  fase  lag,  massa  sel  bertambah 0,8x10 6 cfu/ml  tanpa  merubah  densitas  sel. Faktor yang mempengaruhi panjangnya fase lag  adalah  tersedianya  nutrient  dan  faktor pertumbuhan  dalam  medium,  yang  pada penelitian  ini  menggunakan  medium  NB yang  memiliki  kandungan  nutrient  yang dibutuhkan  oleh  pertumbuhan B.  subtilis
(Shuler  dan  Kargi,  1992).  Pada  fase  log, bakteri  sudah  mampu  beradaptasi  dengan medium,  kecepatan  pertumbuhan  dipe- ngaruhi  oleh  kandungan  nutrient,  pH,  dan juga  suhu  (Fardiaz,  1992).  Pada  penelitian ini B.  subtilis diinkubasi  pada  pH  dan  suhu yang  optimum  untuk  pertumbuhan B. subtilis, yaitu  pada  pH  7  dan  suhu  37 o C. Menurut  Pelczar  dan  Chan  (1986)  bakteri yang  telah  memasuki  fase  log  mengalami peningkatan proses reproduksi dua kali lipat, sehingga  jumlah  bakteri  bertambah  pesat. Pertumbuhan  terhenti  pada  fase  kematian, karena  sel  sudah  menghabiskan  energi cadangan  ATP  untuk  proses  respirasi (Badjoeri, 2008).

## Analisis Data (Steel dan Torrie, 1991).
Data  yang  diperoleh  dari  pengukuran logam  menggunakan  metode  AAS,  pada tiap-tiap perlakuan dianalisis dengan ANOVA  untuk  mengetahui  apakah  terdapat perbedaan  efektifitas  pada  setiap  perlakuan dan  tempat  akumulasi  logam  pada B. subtilis .  Apabila  diperoleh  hasil  yang berbeda  nyata  dilakukan  uji  BNJ  tingkat kesalahan  5%.  Analisis  toleransi B.  subtilis terhadap logam dilakukan secara deskriptif.
Gambar 1. Pola Pertumbuhan B. subtilis pada Medium NB (n=3)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tabel  1.  Konsentrasi  Logam  pada  Medium NB pada Waktu 0 Jam dan 18 Jam Ulanga n Loga m Konsentra si awal (ppm) 0 jam Konsentra si akhir (ppm) 18 jam 1. Pb 0,35 0,298 ± 0,002 2. Pb 0,35 0,3 ± 0,002 3. Pb 0,35 0,296 ± 0,002 Rata-rata 0,298 ± 0,002
Efektifitas B.  subtilis dalam  Mengikat Logam
Efektifitas pengikatan logam oleh B. subtilis dilakukan dengan rumus (Joshi, 2003 dalam Badjoeri, 2008):
R = Ceq K – Cb P x 100% Ceq K
Ceq K = konsentrasi akhir logam dalam medium kontrol (mg/l)
Cb P   = Jumlah logam yang tidak terserap pada perlakuan (mg/l)
Tabel 2. Efisiensi Pengikatan Logam oleh B. subtilis No Ulangan Efisiensi pengikatan logam oleh B. subtilis (%) 1. I 23,49 ± 0,002 2. II 24 ± 0,002 3. III 4,73 ± 0,002 Rata-rata 17,4 ± 0,002 Kemampuan Toleransi B. subtilis terhadap Logam Pb
Mikroorganisme  mampu  mengabsorbsi  atau mentransfer logam melalui reaksi enzimatik,
logam tersebut kemudian dapat
dimanfaatkan  untuk  proses  metabolisme  di dalam sel atau diubah menjadi bentuk kimia lain  yang  tidak  toksik  di  dalam  tanah,  air
maupun  minyak  (Yadav et  al .,  2012). Menurut  Abdelatey et  al. (2011)  pada konsentrasi  yang  terlalu  tinggi  dapat mengakibatkan  toksik  pada  mikroorganisme tersebut.  Keberadaan  logam  yang  terlalu tinggi  dapat  mempengaruhi  pertumbuhan, morfologi,  aktivitas  biokimia,  penurunan biomassa  dan  keanekaragaman  populasi mikroorganime.
Tabel  3.  Toleransi B.  subtilis terhadap
Logam Pb (n=2, Rata-rata ± sd) No  Logam Jumlah B. subtilis (CFU/ml) 1 ppm 10 ppm 20 ppm 1. Pb 9,13x10 6 ± 0,39 6,4x10 6 ± 0,14 4,45x10 6 ±0,21 2.  kontrol  11,25x10 6 ± 0,21
Lokasi Pengikatan Logam B. subtilis
Tempat  pengikatan  logam  pada B.  subtilis untuk  masing-masing  logam  berbeda-beda, logam Pb hanya diikat di dinding sel.
Tabel 4. Tempat Pengikatan Logam Pb oleh B. subtilis No.  Lokasi penyimpanan Kadar Pb (ppm) 1. Sitoplasma 0 2. Dinding sel 0,104

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan diatas dapat disimpulkan bahwa :
1. B.  subtilis mampu  mengikat  logam  Pb dengan  presentasi  efektifitas  sebesar 17,4 %.
2. B.  subtilis paling  baik  mentoleransi logam Pb pada konsentrasi 1 ppm.
3. Lokasi  pengikatan  logam  Pb  pada B. subtilis adalah di dinding sel.

## DAFTAR REFERENSI
Abdelatey, L. M., W. K. B. Khalil, T. H. Ali and  K.  F.  Mahrous.  2011.  Heavy
Metal Resistence and Gene Expression Analysis of Metal Resistence  Genes  in  Gram-Positive Gram-Negative  Bacteria  Present  in
Egyptian  Soils. Journal  of  Applied Science in Environmental Sanitation , 6(2): 201-211.
Akoto, O., T.N. Bruce and G. Darkol. 2008, Heavy  Metals  Pollution  Profiles  in Streams Serving the Owabi Reservoir. African  Journal  of  Environmental Science and Technology, 2 (11): 354- 359.

## Badjoeri, M. 2008. Uji Kemampuan Bacillus
megaterium  Menyerap  Logam  Berat Merkuri. Jurnal  Kimia  Mulawarman , 6 (1).
Kumar,  A.,  B.  S.  Bisht  and  V.  D.  Joshi. 2010. Biosorption of Heavy Metals by Four  Acclimated  Microbial  Species, Bacillus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp.  and Aspergillus niger . Journal Biology Environmental Science , 4(12): 97-108.
Issazadeh,  K.,  M.  R.  Majid,  K.  Pahlaviani and A. Massiha. 2011. Bioremediation  of  Toxic  Heavy Metals  Pollutan  by Bacillus spp. Isolated from Guilan Bay Sediments, North of Iran. International Conference on Biotechnology  and  Environment Management , 8. Nur,  H.  S.  2005.  Pembentukan  Asam Organik  oleh  Isolat  Bakteri  Asam Laktat  pada  Media  Ekstrak  Daging Buah Durian ( Durio zibethinus Murr .). Bioscientiae , 2 (1): 15-24.
Primaharinastiti, R., A. T. Poernomo dan N. S.  Noor.  2004.  Bioakumulasi  Logam
Berat  Cu  oleh Bacillus sp.. Berkas Penelitian Hayati , 10: 19-23. Steel,  R.E.D.,  dan  J.H.Torrie.  1991. Prinsip dan Prosedur Statistika Suatu Pendekatan Biometrik . Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Yadav,  H.,  N.  Satish,  M.  B.  Prakash,  and Maradala. 2012. Studies on Biological Removal  of  Plumb  (Pb)  by Bacillus subtilis . International  Journal  of Scientific  and  Engineering  Research , 3(7).
Zulaika,  E.,  A.  Luqman,  T.  Arindah  dan  U. Sholikah.  2012.  Bakteri  Resisten Logam Berat yang Berpotensi sebagai Biosorben dan Bioakumulator. Seminar  Nasional Waste  Management  for  Sustainable
Urban  Development .  Program  Studi Biologi  FMIPA,  ITS.  21  Februari 2012, Surabaya.