ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 19 (1) (2016) : 1 – 6
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi, Identifikasi dan Uji Aktivitas Senyawa Triterpenoid Rimpang Bengle ( Zingiber cassumunar Roxb .) sebagai Antibakteri
Afrezza Lukman Rosyid a , Enny Fachriyah a* , Dewi Kusrini a
a Organic Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: enny.fachriyah@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords: isolation, Zingiber cassumunar Roxb ,
triterpenoids, Liebermann- Burchard, antibacterial
Research  on  the  isolation,  identification  and  test  activity  of  triterpenoid  compound rhizome bengle (Zingiber cassumunar Roxb) as antibacterial has been conducted. The aim of this research is to get triterpenoid group compound from bengle rhizome and to know its  activity  against  E.coli  and  S.aureus  bacteria.  The  stages  of  this  study  included  the extraction using 96% ethanol and then partitioned with n-hexane. The concentrated n- hexane  extract  was  then  subjected  to  column  chromatography.  The  identification  of positive  column  fractions  containing  triterpenoids  was  performed  using  Liebermann- Burchard  reagents.  The  triterpenoid  positive  fraction  was  further  separated  by  the preparative chromatography method. The obtained isolates were then tested for purity using various TLC methods and two-dimensional TLC. Isolates were also analyzed using FT-IR and KG-SM. The result of FT-IR analysis showed that the isolate has vibration at wave  number  2924  cm -1 which  is  asymmetric  CH  as  vibration  stretching,  2862  cm -1 vibration CH symmetry, 1720 cm -1 vibration C = O, 1465 cm -1 bending vibration CH of CH2, 1395 cm -1 is the vibration of the gem-dimethyl group. The results of the KG-SM analysis showed that the isolates had a retention time of 24.5 minutes, the molecular weight of 426,  with  the  base  peak  of  m/z  69.  Based  on  the  isolate  database  is  a  friedelen-3-o compound.

## A b s t r a k
Kata Kunci: isolasi, Zingiber cassumunar Roxb ,
triterpenoid, Liebermann- Burchard, antibakteri
Penelitian mengenai isolasi, identifikasi dan uji aktivitas senyawa triterpenoid rimpang bengle  (Zingiber  cassumunar  Roxb)  sebagai  antibakteri  telah  dilakukan.  Penelitian  ini bertujuan untuk mendapatkan senyawa golongan triterpenoid dari rimpang bengle serta mengetahui  aktivitasnya  terhadap  bakteri E.coli dan S.aureus .  Tahapan  penelitian  ini meliputi ekstraksi menggunakan etanol 96% dan kemudian dipartisi dengan n-heksana. Ekstrak  n-heksana  yang  telah  dipekatkan  kemudian  dilakukan  kromatografi  kolom. Identifikasi  fraksi  kolom  yang  positif  mengandung  triterpenoid  dilakukan  dengan menggunakan  pereaksi  Liebermann-Burchard.  Fraksi  positif  triterpenoid  selanjutnya dipisahkan melalui metode kromatografi preparatif. Isolat yang didapat selanjutnya diuji kemurnian menggunakan metode KLT berbagai eluen dan KLT dua dimensi. Isolat juga dianalisis  menggunakan  FT-IR  dan  KG-SM.  Hasil  analisis  FT-IR  menunjukkan  isolat memiliki vibrasi pada bilangan gelombang 2924 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur C-H asimetri, 2862 cm -1 vibrasi ulur C-H simetri, 1720 cm -1 vibrasi ulur C=O, 1465 cm -1 vibrasi tekuk C-H dari CH2, 1395 cm -1 adalah vibrasi gugus gem-dimetil. Hasil analisis KG-SM menunjukkan  isolat  memiliki  waktu  retensi  24,5  menit,  bobot  molekul  426,  dengan puncak dasar m/z 69. Berdasarkan database isolat merupakan senyawa friedelen-3-o.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 19 (1) (2016) : 1 – 6

## 1. Pendahuluan
Indonesia merupakan negara kepulauan yang sangat luas, mempunyai kurang lebih 35.000 pulau yang besar dan kecil dengan keanekaragaman jenis flora dan fauna. Indonesia  diperkirakan  mempunyai  100  sampai  150 famili  tumbuh-tumbuhan,  dan  dari  jumlah  tersebut sebagian besar mempunyai potensi untuk dimanfaatkan sebagai  tanaman  industri,  tanaman  buah-buahan, tanaman rempah-rempah dan tanaman obat-obatan [1]. Wilayah  Nusantara  memiliki  40.000  spesies  tanaman dan  940  diantaranya  memiliki  khasiat  obat.  Indonesia merupakan  salah  satu  negara  penghasil  tanaman  obat terbesar di dunia.
Salah  satu  tanaman  obat  yang  banyak  terdapat  di Indonesia  adalah  bengle  ( Zingiber  cassumunar  Roxb .). Sebanyak 300 ton per bulan bengle dihasilkan hanya dari wilayah  Jawa  Tengah.  Bagian  tanaman  bengle  yang sering  digunakan  adalah  rimpangnya.  Rimpang  bengle selama  ini  digunakan  sebagai  obat  sembelit,  sakit kuning, demam, sakit kepala, perut nyeri, masuk angin, rematik,  asma,  serta  mengatasi  peradangan  [2]. Kandungan yang terdapat dalam rimpang bengle adalah flavonoid,  tanin,  saponin,  dan  triterpenoid.  Selain  itu juga  terdapat  senyawa  asam  organik,  mineral,  lemak, gom, albuminoit, gula, damar, serta minyak atsiri.
Triterpenoid merupakan golongan senyawa metabolit  sekunder.  Golongan  senyawa  triterpenoid mempunyai nilai ekologi bagi tumbuhan karena senyawa ini  bekerja  sebagai  antifungi  [3],  insektisida,  antivirus [4],antioksidan [5] dan antibakteri  [6]. Kajian terhadap terpenoid  pada  rimpang  bengle  yang  telah  dilakukan salah satunya dilakukan oleh Heny Prihartini pada tahun 2000  yang  sudah  berhasil  mengisolasi  Seskuiterpena pada Fraksi Etil Asetat dari Rimpang Bengle. Mengingat bengle merupakan tanaman yang digunakan sebagai obat tradisional dan secara kualitatif mengandung triterpenoid,  maka  perlu  dilakukan  isolasi,  identifikasi dan  uji  aktivitas  antibakteri  triterpenoid  dari  rimpang bengle ( Zingiber cassumunar Roxb ).

## 2. Metode Penelitian
Preparasi sampel.
Rimpang bengle ( Zingiber cassumunar Roxb .) berasal dari Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO)
Tawangmangu,  Jawa  Tengah.  Sampel  dicuci,  diiris  tipis kemudian  dikeringkan  dengan  cara  diangin-anginkan, sampel  kemudian  digiling,  sehingga  diperoleh  serbuk rimpang bengle.

## Uji Skrinning.
Uji skrinning terhadap rimpang bengle meliputi uji alkaloid, saponin, flavonoid, tanin, kuinon, triterpenoid.

## Uji Alkaloid.
Sebanyak 5 g serbuk rimpang bangle diletakkan pada kurs  porselen  dan  dilembabkan  dengan  5  mL ammonia 25%, digerus dan ditambahkan dengan 20 mL kloroform kemudian  disaring.  Sebanyak  10  mL  filtrat  diekstraksi dengan HCl (1:10) sebanyak 2 kali. Sebanyak 5 mL larutan
ini  dimasukkan  dalam  tabung  reaksi.  Adanya  alkaloid ditunjukkan  dengan  terbentuknya  endapan  putih  pada larutan setelah penambahan pereaksi Mayer.

## Uji Saponin.
Sebanyak  5  g  serbuk  rimpang  bangle  dididihkan dalam  100  mL  aquades  dan  disaring  dalam  keadaan panas. Sebanyak 10 mL filtrat ditampung dalam tabung reaksi,  dikocok  kuat  secara  vertikal  dan  ditambahkan HCl. Adanya saponin ditunjukkan dengan timbulnya busa yang tetap stabil dalam larutan setelah penambahan HCl

## Uji Flavonoid.
Sebanyak  5  g  serbuk  rimpang  bangle  dididihkan dalam  100  mL  aquades,  didinginkan,  dan  disaring. Sebanyak 5 mL filtrat ditambahkan serbuk Magnesium, 1 mL  HCl,  dan  2  mL  amilalkohol,  dikocok  kuat-kuat  dan dibiarkan  memisah.  Adanya  flavonod  ditunjukkan  jika terbentuk warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amilalkohol.

## Uji Tanin.
Sebanyak  10  g  serbuk  rimpang  bangle  dididihkan dalam 100 mL aquades, didinginkan, kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh ditambahkan dengan larutan FeCl3 1%.  Terbentuknya  larutan  berwarna  coklat  kehitaman menunjukkan adanya tannin.

## Uji Steroid/Triterpenoid.
Sebanyak  5  g  serbuk  rimpang  bangle  dimaserasi dengan 20 mL eter selama 2 jam dan disaring. Sebanyak 5  mL  filtrat  diuapkan  hingga  kering  dan  ditambahkan dengan  pereaksi  Lieberman-Burchard  yaitu  2  tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4. Terbentuknya warna  biru/  merah  menunjukkan  adanya  senyawa steroid/ triterpenoid.

## Maserasi.
Maserasi dilakukan dengan perendaman menggunakan  etanol  96%.  Serbuk  rimpang  bengle sebanyak 1070 g dimaserasi ke dalam etanol sebanyak 4 liter. Pelarut etanol tersebut diganti selama 24 jam sekali selama  1  minggu.  Ekstrak  etanol  kemudian  dipekatkan menggunakan  rotary  evaporator  untuk  mendapatkan ekstrak  kental  etanol.  Tahap  selanjutnya  adalah  partisi ekstrak  kental  etanol  dengan  menggunakan  n-heksana pada  perbandingan  1:1  untuk  diambil  fraksi  n-heksana yang  bersifat  non-polar.  Fraksi  n-heksana  selanjutnya dipekatkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh fraksi kental n-heksana.

## Pemisahan.
Fraksi  n-heksana  selanjutnya  dikromatografi  lapis tipis  dengan  menggunakan  silika  gel  dengan  berbagai eluen hingga didapatkan eluen yang dapat memisahkan ekstrak tersebut dengan bagus. Setelah didapatkan eluen yang  sesuai  selanjutnya  dilakukan  kromatografi  kolom dengan  eluen  tersebut.  Dari  hasil  kromatografi  kolom tersebut didapatkan beberapa vial, selanjutnya vial-vial tersebut  dikromatografi  lapis  tipis  untuk  menentukan fraksi  besar  dari  masing-masing  vial  tersebut.  Fraksi besar dapat dikelompokkan berdasarkan pola noda KLT
yang  sama.  Selanjutnya  dari  fraksi-fraksi  tersebut dilakukan  uji  Libermann-Burchard  untuk  menentukan adanya triterpenoid.

## KLT Preparatif.
Fraksi  yang  positif  mengandung  triterpenoid selanjutnya dilakukan pemisahan lebih lanjut.
Kromatografi
preparatif dilakukan dengan menggunakan fase diam silika gel 60 GF254 ketebalan 1 mm dengan fase gerak kloroform: n-heksana (7:5).

## Uji kemurnian.
solat  hasil  pemisahan  kromatografi  preparatif kemudian  diuji  kemurniannya  dengan  metode  KLT berbagai  eluen  dan  KLT  dua  dimensi.  Uji  kemurnian dilakukan pada plat KLT menggunakan eluen etil asetat : n-heksana  (1:1),  aseton  :  n-heksana  (1:1),  metanol  : kloroform  (1:1),  n-butanol,  dan  n-heksana  :  metanol (1:1).  Metode  KLT  dua  dimensi  diakukan  pada  plat  KLT berukuran  10  cm  x  10  cm  dengan  menggunakan  eluen metanol : klorofom (1:1) dan aseton : n-heksana (1:1).

## Analisis FT-IR dan KG-SM.
Isolat  murni  dianalisis  menggunakan  FT-IR bertujuan untuk mengetahui gugus fungsi apa saja yang terdapat dalam isolat murni tersebut. KG-SM digunakan untuk mengetahui bobot molekul serta pola fragmentasi dari isolat murni yang didapat.

## Uji antibakteri.
Pelaksanaan  uji  aktivitas  antibakteri  ini  dilakukan dengan  metode  difusi  cakram.  Isolat  triterpenoid rimpang bengle diuji pada konsentrasi 10%, 7%, 5%, dan 3%  terhadap  pertumbuhan  bakteri.  Nutrien  Agar  yang telah  dibuat  kemudian  disterilisasi  dalam  autoklaf selama  24  jam.  Cawan  petri  yang  berisi  media  Nutrien Agar yang telah disterilisasi dan memadat diberi supensi bakteri dan  diratakan dengan menggunakan  jarum  ose. Setelah itu cakram kertas dengan diameter tertentu yang telah  dicelupkan  ke  dalam  ekstrak  rimpang  bengle masing-masing  dengan  konsentrasi  yang  berbeda diletakan  pada  permukaan  media  NA  yang  telah diinokulasikan bakteri. Cawan petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Populasi mikroba yang digunakan adalah 1x108 CFU/ml.

## 3. Hasil Dan Pembahasan

## Preparasi sampel dan Uji Skrinning
Pada penapisan fitokimia didapatkan bahwa serbuk rimpang  bengle  mengandung  senyawa  flavonoid, saponin, tannin, dan triterpenoid.

## Maserasi
Metode maserasi dipilih karena memiliki kelebihan antara lain sederhana, relatif murah, tidak memerlukan peralatan yang rumit, dan dapat menghindari kerusakan komponen  senyawa  yang  tidak  tahan  panas  karena metode ini dilakukan tanpa proses pemanasan. Maserasi dengan  pelarut  etanol  berfungsi  untuk  mengambil senyawa  metabolit  sekunder  dalam  rimpang  bengle. Ekstrak  etanol  hasil  maserasi  didapatkan  cairan
berwarna  coklat  kehitaman.  Selanjutnya  dipekatkan dengan  menggunakan  rotary  evaporator  sehingga didapatkan 150 ml ekstrak etanol rimpang bengle.
Ekstrak  etanol  pekat  selanjutnya  dipartisi  dengan menggunakan  pelarut n-heksana  yang berfungsi  untuk memisahkan  senyawa  non  polar  dengan  senyawa  polar lainnya. Triterpenoid merupakan senyawa non polar dan dapat  larut  dalam  n-heksana.  Partisi  dilakukan  dengan perbandingan 1:1 sampai tidak ada lagi bagian non polar dari ekstrak etanol tersebut yang tersisa, ditandai dengan warna  fraksi  n-heksana  tetap  jernih  ketika  dilakukan ekstraksi.  Setelah  didapatkan  fraksi  n-heksana selanjutnya dipekatkan menggunakan rotary evaporator, sehingga didapatkan fraksi kental n-heksana sebanyak 7 gram.

## Pemisahan
Fraksi  kental  n-heksana  yang  didapat  kemudian dipisahkan  dengan  kromatografi  kolom.  Eluen  yang digunakan dalam kromatografi kolom adalah kloroform:n-heksana  (11:9).  Ekstrak  kental  yang digunakan  sebanyak  2  gram.  Kromatografi  kolom menghasilkan  220  vial.  Uji  KLT  yang  dilakukan menunjukkan  terdapat  5  fraksi  besar  A,  B,  C,  D,  dan  E, fraksi  yang  positif  mengandung  triterpenoid  adalah fraksi D.
Fraksi  D  yang  positif  mengandung  triterpenoid kemudian dilanjutkan pemisahannya untuk mendapatkan  isolat  triterpenoid  dengan  metode kromatografi  preparatif.  Eluen  yang  digunakan  dalam kromatografi  preparatif  yaitu  kloroform:n-heksana (7:5). Gambar kromatografi prepatifnya sebagai berikut:
Gambar 1. Hasil kromatografi preparatif fraksi D menggunakan eluen kloroform:n-heksana (7:5)
Pita  yang  positif  mengandung  triterpenoid  adalah pita  D3.  Tahap  selanjutnya  pita  D3  kemudian  dikerok untuk  mendapatkan  isolat  murni,  dan  dilakukan  KLT kembali  untuk  mengetahui  apakah  hasil  dari kromatografi  preparatif  sudah  murni.  Kemurnian ditunjukkan dengan adanya noda tunggal pada saat diuji. Namun  ternyata  masih  terdapat  dua  noda  yang terdeteksi,  sehingga  perlu  dilakukan  KLT  preparatif kembali untuk mendapatkan noda tunggal. Kromatografi preparatif D3 masih menunjukkan adanya dua pita, yang positif  triterpenoid  adalah  D3A.  Berikut  adalah  gambar kromatografi preparatif yang kedua:
Gambar 2. Hasil kromatografi preparatif fraksi D3 menggunakan eluen kloroform:n-heksana (7:5)

## Uji Kemurnian
Setelah  dilakukan  kromatografi  preparatif  kedua, pita D3A dikerok lalu direndam menggunakan n-heksana pro  analis.  Pelarut  n-heksana  akan  melarutkan  isolat triterpenoid yang diperoleh, selanjutnya diuji kemurniannya  menggunakan  KLT  dengan  berbagai eluen.  Dari  hasil  KLT  berbagai  eluen,  didapatkan  satu noda  yang membuktikan bahwa  isolat  yang didapatkan merupakan  isolat  murni.  Gambar  hasil  uji  kemurnian dengan berbagai eluen adalah sebagai berikut:
Gambar 3. Hasil uji kemurnian isolat menggunakan KLT berbagai eluen: a. etil asetat:n-heksan (1:1); b. aseton:n- heksan (1:1); c. metanol:kloroform (1:1) d. n-butanol; e. n-heksan:metanol (1:1)
Uji  kemurnian  dilanjutkan  menggunakan  KLT  dua dimensi.  Proses  analisis  dengan  KLT  dua  dimensi menggunakan  eluen  yang  berbeda  pada  elusi  pertama dan kedua. Elusi pertama dilakukan menggunakan eluen metanol  :  kloroform  (1:1).  Setelah  elusi  pertama  selesai maka  plat  KLT  kemudian  dikeringkan  lalu  diputar  900 kemudian  dielusi  kembali  menggunakan  eluen  aseton  : n-heksan  (1:1).  Hasil  analisis  menggunakan  KLT  dua dimensi ditunjukkan pada gambar berikut:
Gambar 4. Hasil uji kemurnian isolat menggunakan KLT dua dimensi

## Analisis FT-IR dan KG-SM
Isolat  triterpenoid  murni  dikarakterisasi  dengan spektrofotometer  FTIR  untuk  menunjukkan  adanya beberapa gugus fungsi, spektra inframerah dapat dilihat pada gambar berikut:
Gambar 5. Spektrum FTIR isolat triterpenoid rimpang bengle
Hasil  FTIR  terhadap  isolat  menunjukkan  adanya serapan  pada  bilangan  gelombang  2924  cm -1 yang merupakan  serapan  vibrasi  ulur  ikatan  C-H  asimetri. Serapan  pada  bilangan  gelombang  2862  cm -1 adalah vibrasi ulur ikatan C-H simetri. Bilangan gelombang 1720 cm -1 menunjukkan adanya gugus karbonil (C=O). Vibrasi yang muncul pada daerah bilangan gelombang 1465 cm -1 menunjukkan  adanya  serapan  tekuk  dari  gugus  fungsi CH2.  Vibrasi  yang  terjadi  pada  daerah  bilangan gelombang 1395 cm -1 merupakan vibrasi tekuk dari gugus fungsi  gem-dimetil.  Analisis  sementara  dari  hasil spektrum  inframerah  diduga  isolat  memiliki  rantai karbon  yang  memiliki  gugus  gem-dimetil  dan  gugus keton pada kerangkanya.
Analisis selanjutnya yang dilakukan adalah dengan menggunakan KG-SM. Hasil analisis dengan KG seperti yang terlihat pada gambar berikut:
Gambar 6. Kromatogram isolat triterpenoid rimpang bengle
Gambar 7. Spektogram MS (a) isolat triterpenoid rimpang bengle (b) friedelen-3-on (database)
Berdasarkan  kromatogram  di  atas  dapat  dilihat muncul  satu  puncak  yang  memiliki  waktu  retensi  24,5 menit.  Kromatogram  yang  hanya  memunculkan  satu puncak  saja,  dapat  dikatakan  isolat  telah  murni. Selanjutnya untuk mengetahui berat molekul dari isolat senyawa  hasil  analisis  kita  dapat  ketahui  dari spektrogram  MS.  Spektrogram  SM  dari  isolat  dan spektrogram senyawa friedelen-3-on dari database pada gambar 7.
Berdasarkan  spektogram  yang  dihasilkan,  dapat diketahui isolat memiliki berat molekul sebesar m/z 426 dan  puncak  dasarnya  adalah  m/z  69.  Spektrogram menunjukkan nilai m/z sebesar 426, 411, 302, 273, 246, 232, 218, 205, 191, 179, 163, 123, 109, 93, 82, 69, 54, 41, 29. Spektogram  isolat  kemudian  dibandingkan  dengan spektogram database yang memiliki Similarity Index (SI) 96  yaitu  senyawa  friedelen-3-on.  Spektogram  antara senyawa isolat dan senyawa dari database menunjukkan berat  molekul  dan  pola  fragmentasi  yang  sama,  yang artinya  diduga  bahwa  senyawa  isolat  dan  senyawa  dari database  identik.  Senyawa  hasil  isolasi  diduga  adalah friedelen-3-on.  Struktur  senyawa  dari  friedelen-3-on berdasarkan  SDBS  ( Spectral  Database  for  Organic Compound ) pada gambar 8.
Gambar 8. Struktur Friedelen-3-on

## Uji Antibakteri
Uji  antibakteri  isolat  triterpenoid  dilakukan terhadap bakteri Eschercia coli dan Staphilococcus aureus . Eschercia coli mewakili gram negatif dan Staphylococcus aureus  mewakili  gram  positif.  Isolat  triterpenoid  yang didapatkan sebanyak 0,03 gram kemudian dilarutkan ke dalam 3 mL aquades dengan ditambahkan 2 tetes DMSO.
Penambahan  DMSO  berfungsi  agar  isolat  triterpenoid dapat  larut  sempurna  dengan  aquades.  Isolat triterpenoid yang telah dilarutkan dengan 3 ml aquades merupakan ekstrak dengan konsentrasi 10%. Selanjutnya ekstrak  10%  tersebut  diencerkan  sehingga  didapatkan variasi  ekstrak  3%,  5%,  7%  dan  10%.  Dengan  variasi konsentrasi  tersebut  isolat  terpenoid  kemudian  diuji menggunakan  metode  difusi  cakram  terhadap  bakteri Eschercia  coli dan Staphilococcus  aureus .  Hasil  uji antibakteri dapat dilihat pada gambar berikut ini:
Gambar 9. Hasil uji antibakteri (a) S.aureus dan (b) E.coli
Dari  hasil  uji  aktivitas  antibakteri  di  atas  dapat diketahui  isolat  triterpenoid  tidak  memiliki  aktivitas antibakteri.  Hal  tersebut  dibuktikan  tidak  adanya  zona bening  di  sekitar  cakram.  Sehingga  dapat  disimpulkan bahwa  isolat  triterpenoid  hasil  isolasi  tidak  memiliki aktivitas  antibakteri  untuk  bakteri Eschercia  coli dan Staphilococcus aureus . Hal tersebut dapat diakibatkan oleh beberapa  faktor  diantaranya  populasi  bakteri  uji  yang terlalu padat yaitu 1x108 CFU/mL. Faktor lainnya kondisi bakteri  yang  sudah  resisten  terhadap  senyawa antibakteri.

## 4. Kesimpulan
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kitinase dapat diisolasi  dari  kapang Trichoderma  viride FNCC  6013 dengan  kitin  koloid  sebagai  induser.  Pertumbuhan biomassa sel Trichoderma viride FNCC 6013 dan produksi kitinase  mengalami  peningkatan  dengan  adanya penambahan  biotin  meskipun  tidak  signifikan.  Kondisi pH optimum  pada reaksi  enzimatik  kitinase dari media produksi tanpa penambahan biotin, dengan penambahan biotin sebesar 0,1 mg/mL dan 0,3 mg/mL berturut-turut pada  pH  3,6;  4,2;  dan  4,2.  Kondisi  suhu  optimum  pada reaksi  enzimatik  kitinase  dari  media  produksi  tanpa penambahan  biotin,  dengan  penambahan  biotin  0,1 mg/mL dan 0,3 mg/mL berturut-turut pada suhu 27,5°C, 29°C dan 29°C.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  RE Nasution, S Riswan, P Tjitropranoto, EB Walujo, W  Martowikromo,  H  Roemantyo,  SS  Wardoyo, Prosiding  Seminar  dan  Loka  Karya  Nasional Etnobotani, Departement Pendidikan dan Kebudayaan RI-LIPI. Perpustakaan Nasional RI. Jakarta , (1992)
[2]  Hembing  Wijayakusuma,  Tanaman  berkhasiat  obat di Indonesia, Pustaka Kartini, 1996.
[3]  Pedro  Aqueveque,  Timm  Anke,  Heidrun  Anke,  Olov Sterner, José Becerra, Mario Silva, Favolon B, a new triterpenoid  isolated  from  the  chilean  Mycena  sp. strain  96180, Journal  of  Antibiotics ,  58,  1,  (2005)  61 http://dx.doi.org/10.1038/ja.2005.7
[4]  Loisyana,  Identifikasi,  Inventarisasi  Senyawa Triterpenoid  dan  Uji  Brine  Shrimp  pada  Beberapa Tanaman  Obat  Tradisional  Masyarakat  Bengkulu, Skripsi, Chemistry, Universitas Bengkulu, Bengkulu
[5]  Buyung  Rukmantara  Susena  Putra,  Dewi  Kusrini, Enny  Fachriyah,  Isolasi  Senyawa  Antioksidan  dari Fraksi  Etil  Asetat  Daun  Tempuyung  (Sonchus arvensis  L), Jurnal  Kimia  Sains  dan  Aplikasi ,  16,  3,
(2013) 69-72
[6]  Tanushree  Patnaik,  RK  Dey,  Panchanan  Gouda, Isolation  of  triterpenoid  glycoside  from  bark  of Terminalia arjuna using chromatographic technique and investigation of pharmacological behavior upon muscle  tissues, Journal  of  Chemistry ,  4,  4,  (2007) 474-479