## INHIBITOR KATEPSIN ALAMI UNTUK MENGHAMBAT KEMUNDURAN MUTU IKAN BANDENG SELAMA PENYIMPANAN SUHU DINGIN

## NATURAL CATHEPSIN INHIBITOR TO INHIBIT MILKFISH DETERIORATION DURING CHILLING STORAGE
Tati Nurhayati 1* , Wini Trilaksani 1 , dan Mohammad Zaenuri 1
1 Departemen Teknologi Hasil Perairan, FPIK-IPB, Bogor *E-mail: nurhayati7870@yahoo.com

## ABSTRACT
Quality  deterioration  of  fish  is  caused  by  various  factors,  one  of  them  is  due  to  the  activity  of cathepsin enzyme. Cathepsin enzyme activity can be inhibited by enzyme inhibitors. Inhibitors of the enzyme can be  obtained  from  fish  meat tissue  by separating the  enzyme-inhibitor  complex  with  heat treatment.  The  purpose  of  this  research  was  to  extract  and  apply  the  cathepsin  inhibitors  to  inhibit deterioration of fish quality. This research was conducted in three  steps: (1) the determination of the optimum  extraction  temperature  for  extraction  of  cathepsin  inhibitors,  (2)  the  determination  of  the most  potent  cathepsin  inhibitors  with  various  concentrations,  and  (3)  the  application  of  cathepsin inhibitors  in  inhibiting  the  deterioration  of  fish  quality.  The  results  showed  that  the  cathepsin inhibitors was optimally extracted at 80°C. Cathepsin inhibitors diluted using buffer with a ratio of 1: 1  had  the  same  relative  activity  without  dilution.  The  process  of  quality  deterioration  of  milkfish control in chilling temperatures occured after 504 hours (21 days) storage with a 24-hour observation time  interval.  The  complete  process  during  observation  was  pre-rigor  (0  hour  ),  rigor  mortis  (96 hours),  post-rigor  (360  hours),  and  deterioration  (504  hours).  The  process  of  milkfish  quality deterioration treated with soaking in  cathepsin inhibitors occured after 624 hours (26 days) storage with  the  detailed  process  as  follows:  0  hour  (pre-rigor),  144  hours  (rigor  mortis),  408  hours  (post- rigor),  and  624  hours  (deterioration).  Thus  fish  marinated  with  cathepsin  inhibitors  achieve  slower deterioration phase 5 days.
Keywords: cathepsin inhibitor, deterioration, pre-rigor, rigor mortis, post-rigor, quality deterioration.

## ABSTRAK
Kemunduran mutu ikan disebabkan oleh berbagai faktor, salah satunya adalah  akibat aktivitas enzim katepsin.  Aktivitas  enzim  katepsin  dapat  dihambat  dengan  inhibitor  enzim . Inhibitor  enzim  dapat diperoleh  dari  jaringan  daging  ikan  dengan  cara  memisahkan  kompleks  enzim-inhibitor  dengan perlakuan  pemanasan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  mengekstrak  dan  mengaplikasikan  inhibitor katepsin  untuk  menghambat  kemunduran  mutu  ikan  bandeng.  Penelitian  ini  dilakukan  dalam  tiga tahap,  yaitu  (1)  penentuan  suhu  optimum  ekstraksi  inhibitor  katepsin,  (2)  penentuan  daya  hambat tertinggi  berbagai  konsentrasi  inhibitor  katepsin,  dan  (3)  aplikasi  inhibitor  katepsin  dalam  meng- hambat kemunduran mutu ikan bandeng. Hasil penelitian menunjukkan bahwa inhibitor katepsin dapat diekstrak  dengan  baik  menggunakan  suhu  80 ⁰ C.    Inhibitor  katepsin  yang  diencerkan  menggunakan bufer  dengan  perbandingan  1:1  memiliki  aktivitas  yang  relatif  sama  dengan  tanpa  pengenceran. Proses kemunduran mutu pada ikan bandeng kontrol dalam penyimpanan suhu chilling terjadi selama 504 jam (21 hari) dengan interval waktu pengamatan 24 jam berturut-turut yaitu 0 jam ( pre rigor ), 96 jam ( rigor mortis ), 360 jam ( post rigor ), dan 504 jam (busuk). Proses kemunduran mutu ikan bandeng dengan  perlakuan  perendaman  inhibitor  katepsin  terjadi  selama  624  jam  (26  hari)  dengan  proses sebagai berikut: 0 jam ( pre rigor ), 144 jam ( rigor mortis ), 408 jam ( post rigor ), dan 624 jam (busuk). Dengan  demikian  ikan  bandeng  yang  direndam  dengan  inhibitor  katepsin  mencapai  fase  deteriorasi lebih lambat 5 hari.
Kata kunci: inhibitor katepsin, kemunduran mutu, pre rigor , rigor mortis , post rigor , deteriorasi

## I. PENDAHULUAN
Proses kemunduran mutu ikan disebab- kan oleh adanya aktivitas enzim terutama en- zim  proteolitik  yang  secara  alami  terdapat dalam  ikan.  Enzim  tersebut  bekerja  mengu- raikan  protein  menjadi  pepton,  peptida,  dan asam  amino.  Proses  hidrolisis  protein  oleh suatu protease misalnya katepsin, kalpain dan kolagenase,  mengakibatkan  akumulasi  meta- bolit, perubahan cita rasa dan pelunakan teks- tur, terbentuknya komponen volatil, serta ter- sedianya  asam  amino  sebagai  sumber  maka- nan bakteri, yang akhirnya menimbulkan ke- busukan (Huss, 1995).
Diantara  ketiga  jenis  protease  yang terlibat dalam kemunduran mutu ikan, katep- sin  merupakan  enzim  yang  paling  bertang- gung jawab terhadap kemunduran mutu ikan (Huss,  1995).  Katepsin  ditemukan  di  liso- som serat daging dan di sel fagosit. Lisosom merupakan  organel  intraseluler  yang  banyak mengandung  enzim  hidrolitik  dan  berperan dalam  pencernaan  dalam  sel.  Beberapa  tipe katepsin  telah  diidentifikasi  dengan  asam amino yang berbeda di sisi aktifnya. Katepsin B  (EC  3.4.22.2)  dan  katepsin  L  (EC  3.4.22. 15)  keduanya  merupakan  sistein  proteinase yang kemungkinan paling penting dalam  ke- munduran  tekstur  daging.  Aktivitasnya berbeda-beda  pada  tiap  fraksi  daging  dan spesies  ikan.  Aktivitas  optimum  dilaporkan pada suhu 40-50 ° C dan aktivitasnya menurun dengan  penurunan  suhu.  Katepsin  secara umum bekerja pada pH 3-4 dan beberapa ka- tepsin  juga  mempunyai  aktivitas  tinggi  pada pH  6-6,5    (Kolodziejska  and  Sikorski,  1996; Aoki et al., 2000).
Beberapa  penelitian  menunjukkan bahwa  terdapat  korelasi  yang  erat  antara  ak- tifnya  enzim  katepsin  dengan  laju  kemun- duran  mutu  ikan,  baik  pada  bagian  daging ikan  (Salamah et  al., 2010),  jeroan  ikan (Nurhayati et  al., 2010 a ),  maupun  kulit  ikan (Nurhayati et  al. ,  2010 b ).  Enzim  tersebut  ti- dak aktif pada saat  ikan dalam kondisi  segar (fase pre-rigor ) karena pada kondisi tersebut inhibitor katepsin bekerja untuk menghambat
kerja  enzim  katepsin.  Ketika  ikan  memasuki fase rigor  mortis aktivitas  enzim  katepsin meningkat  dan  menjadi  sangat  aktif  ketika ikan  berada  pada  fase  awal post  rigor .  Pada kondisi  ini  inhibitor  katepsin  mengalami  de- naturasi  akibat  pH  yang  rendah  sehingga tidak bisa menghambat kerja enzim katepsin. pH rendah merupakan pH optimum untuk ak- tivitas enzim katepsin (Huss, 1995).
Salah  satu  cara  untuk  menghambat kemunduran mutu ikan adalah dengan meng- hambat kerja enzim proteolitik menggunakan senyawa  inhibitor  alami  termasuk  yang  ber- asal  dari  kulit  ikan  patin.  Inhibitor  katepsin diekstrak  dengan  baik  pada  saat  ikan  berada pada awal kematian atau fase pre rigor (Nur- hayati et  al. , 2013 b ).  Hasil  penelitian  yang telah dilakukan (Nurhayati et al. , 2013 a ) me- nunjukkan  bahwa  bagian  daging  ikan  patin ( Pangasianodon hypopthalmus) mengandung inhibitor  katepsin.  Nurhayati et  al. (2011) juga  melaporkan  bahwa  inhibitor  katepsin alami dapat diaplikasikan pada ikan dari jenis yang  berbeda  dengan  asal  inhibitornya.  In- formasi  yang  didapat  dari penelitian tersebut memerlukan  kajian  lebih  lanjut,  oleh  karena itu  penelitian  tentang  penggunaan  inhibitor katepsin  dari  daging  ikan  bandeng  untuk menghambat  kemunduran  mutu  ikan  ban- deng penting untuk dilakukan.

## II. METODE PENELITIAN

## 2.1. Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  pada  peneliti- an  ini  adalah  daging  ikan  bandeng  ( Chanos chanos )  yang  diperoleh  dari  ikan  bandeng ukuran konsumsi (200 g/ekor) fase pre-rigor sebagai  sumber inhibitor enzim katepsin dan ikan  bandeng  hidup  dengan  ukuran  yang sama.  Bahan-bahan  untuk  analisis  pH  (larut- an  buffer  standar  pH  4  dan  pH  7,  akuades), analisis total  plate  count (TPC)  (larutan garam  0,85%  steril, nutrient  agar ),  analisis total  volatile  bases (TVB)  (H 3 BO 3 ,  K 2 CO 3 , trichloroacetic acid (TCA) 7%, HCl 0,01 N). Bahan-bahan  untuk  ekstraksi  enzim katepsin  adalah  buffer  tris  HCl  (pH  7,4),
assay aktivitas  enzim  katepsin  (hemoglobin, tirosin,  akuades,  TCA  5%,  pereaksi  folin) dan  pengukuran  konsentrasi  protein  enzim bovine  serum  albumin (BSA), coomasie  bri- liant  blue G-250,  etanol  95%  (v/v),  asam fosfat 85% (w/v), dan akuades. Bahan-bahan untuk ekstraksi inhibitor katepsin adalah aku- ades, sodium fosfat dan asam sitrat.
Alat-alat  yang  digunakan,  yaitu  refri- gerator  (LG),  inkubator  (Termolina),  oven (Yammato),  sentrifuse  Sorvall,  spektrofoto- meter (Yamato), mikropipet (Pipetman), tim- bangan  analitik, homogenizer , magnetic  stir- rer, dan hot plate .

## 2.2. Ekstraksi Inhibitor Katepsin dari Daging Ikan Bandeng
Ekstraksi inhibitor katepsin dilakukan pada  berbagai  suhu  inkubasi  dengan  tujuan untuk  mendapatkan  suhu  optimum  ekstraksi inhibitor  katepsin  dari  daging  ikan.  Proses ekstraksi  ini  dilakukan  pada  saat  ikan  dalam kondisi pre  rigor dengan  metode  (An et  al. , 1995).  Tahap  ekstraksi  inhibitor  enzim  ka- tepsin  dilakukan  sebagai  berikut:  ikan  ban- deng hidup ditusuk bagian medula oblongata, lalu  diambil  bagian  daging.  Daging  tersebut dicincang  sampai  halus  dan  dihomogenisa- sikan  pada  suhu  0-4 ⁰ C  lalu  disentrifugasi pada  5.000  g  selama  30  menit.  Supernatan yang  dihasilkan  ditambah  sebanyak  volume yang  sama  dengan  buffer  Mcllvaine  (0,2  M sodium  fosfat  dan  0,1  M  sitrat),  pH  buffer 5,5.  Campuran  ini  dipanaskan  pada  berbagai suhu  inkubasi  yaitu  60 ⁰ C,  70 ⁰ C,  80 ⁰ C  dan 90 ⁰ C  selama  10  menit,  kemudian  disentrifu- gasi  pada  7.000  g  selama  15  menit.  Super- natan  yang  dihasilkan  merupakan  ekstrak kasar  inhibitor  enzim  katepsin.  Aktivitas  in- hibitor  enzim  katepsin  diukur  menggunakan metode Dinu et al . (2002).
2.3.  Penentuan Konsentrasi Inhibitor Ka- tepsin yang Tepat untuk Diaplikasi- kan dalam Menghambat Kemundur-
an Mutu Ikan Bandeng Ekstrak inhibitor katepsin yang diper- oleh  diencerkan  pada  beberapa  konsentrasi
guna  mendapatkan  konsentrasi  yang  tepat untuk diaplikasikan. Konsentrasi yang diberi- kan merupakan perbandingan antara inhibitor dengan buffer Mcllvaine (0,2 M sodium fos- fat  dan  0,1  M  sitrat)  yaitu  (1:0,  1:1,  1:2  dan 1:3).  Masing-masing  konsentrasi  diukur  ak- tivitas  penghambatan  dan  konsentrasi  pro- teinnya  menggunakan  metode  Dinu et  al . (2002) dan Bradford (1976).

## 2.4. Aplikasi Inhibitor Katepsin dalam Menghambat Kemunduran Mutu
Ekstrak  inhibitor  katepsin  dengan konsentrasi yang tepat digunakan dalam apli- kasi  untuk    mutu  ikan  bandeng.  Tahap  ini bertujuan untuk menganalisis tingkat kesega- ran ikan bandeng yang telah direndam dalam larutan inhibitor. Ikan bandeng hidup ditusuk bagian  medula  oblongata.    Ikan  yang  sudah disiangi  dan  dicuci  bersih  direndam  dalam larutan inhibitor katepsin selama 1 jam.  Ikan bandeng tersebut disimpan pada suhu chilling (±1,1ºC)  selama  26  hari  dengan  pengamatan pada  setiap  fase post  mortem. Analisis  ting- kat  kesegaran  ikan  pada  tahap  aplikasi  ini meliputi  penilaian  organoleptik  mengguna- kan score  sheet berdasarkan  SNI  01-2346- 2006  (Badan  Standardisasi  Nasional,  2006), penentuan  nilai  pH  (Lopez-Caballero et  al. , 2006),  analisis total  volatile  bases (TVB) (Lopez-Caballero et  al. , 2006),  serta  jumlah total  bakteri  dengan  metode  TPC  (Lopez- Caballero et al. , 2006).
2.5.  Pengujian Inhibitor Katepsin (Dinu et al. , 2002)
Uji  ini  ditentukan  dengan  mengukur derajat  penghambatan  dari  aktivitas  enzim katepsin  menggunakan  substrat  hemoglobin. Uji  ini  dimulai  dengan  mereaksikan  ekstrak inhibitor 0,1 mL dengan katepsin 0,1 mL se- lama 30 menit  pada suhu inkubasi 37 ° C.  Se- lanjutnya  ditambahkan  0,5  mL  dari  larutan substrat hemoglobin 2% (w/v) dan diinkubasi kembali pada 37°C selama 10 menit.  Reaksi dihentikan  dengan  penambahan  2  mL  TCA 5%  (w/v).  Campuran  disaring  dan  hasil  re- aksi    ditambah  dengan  1  mL  pereaksi  folin,
kemudian  campuran  diukur  dengan  spektro- fotometer pada λ=750 nm.
Pengukuran  ini  dilakukan  bersamaan dengan pengukuran  larutan blanko dan laru- tan  standar  dengan  prosedur  yang  sama  se- perti  larutan  sampel  hanya  untuk  larutan blanko  larutan  campuran  enzim  digantikan dengan  enzim  digantikan  dengan  akuades dan  untuk  larutan  standar  larutan  campuran enzim  digantikan  dengan  tirosin.  Bersamaan dengan  itu  juga  diperlukan    uji  aktivitas  ka- tepsin  tanpa  penambahan  inhibitor  dengan menggunakan  enzim  katepsin  sebanyak  0,1 mL.  Aktivitas  inhibitor  dihitung  berdasarkan perbedaan  aktivitas  enzim  katepsin  yang ditambah  dengan  inhibitor  dan  yang  tanpa inhibitor.  Aktivitas  enzim  katepsin  dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
T 1 x P x ) abs.blanko ar (Abs.stand ) abs.blanko sampel (Abs. UA   
Keterangan:  UA/mL=  jumlah  tirosin  yang dihasilkan per ml enzim per menit, P =  faktor pengenceran, T= waktu inkubasi (10 menit) Persentase penghambatan:
  100% x inhibitor) tanpa katepsin (aktivitas inhibitor) dengan katepsin (aktivitas
1 
Satu unit inhibitor katepsin adalah jumlah in- hibitor  katepsin  yang  mampu  menghambat aktivitas protease katepsin sebesar 50% pada kondisi pengujian.

## 2.6. Uji Organoleptik (Badan Standardi- sasi Nasional, 2006)
Metode  yang  digunakan  untuk  uji  or- ganoleptik  adalah  dengan score  sheet ber- dasarkan  SNI  01-2346-2006.  Pengujian  or- ganoleptik  merupakan  cara  pengujian  yang bersifat obyektif mengunakan indera yang di- tujukan pada mata, insang, lendir permukaan badan,  daging,  bau,  dan  tekstur.  Pada  uji organoleptik ini ada beberapa syarat yang ha- rus  dipenuhi  oleh  panelis  (SNI  01-2346- 2006), antara lain tertarik dan mau berpartisi- pasi  dalam  uji  organoleptik,  terampil  dan
konsisten  dalam  mengambil  keputusan,  siap sedia pada saat  dibutuhkan dalam pengujian, tidak  menolak  contoh  yang  akan  diuji, berbadan sehat, bebas dari penyakit THT dan tidak buta warna (psikologis), tidak merokok, serta jumlah panelis minimum untuk satu kali pengujian  adalah 15 orang (panelis semi ter- latih).  Dari  data  yang  diperoleh,  kemudian dilakukan analisis kesegaran ikan dengan kri- teria sebagai berikut: segar = nilai organolep- tik  berkisar  antara  7-9,  agak  segar=  nilai organoleptik  berkisar  antara  5-6,  dan  tidak segar= nilai organoleptik berkisar antara 1-3.

## 2.7. Penentuan Nilai pH (Lopez-Caballero
et al. , 2006)
Analisis derajat keasaman (pH) diten- tukan menggunakan pH meter yang sebelum- nya telah dikalibrasi terlebih dahulu. pH me- ter  dinyalakan  dan  dibiarkan  stabil  selama 15-20  menit,  kemudian  elektroda  dibilas dengan  larutan  buffer  atau  akuades.  Bila menggunakan  akuades,  elektroda  dikering- kan  dengan  kertas  tissue.  Elektroda  dicelup- kan  ke  dalam  larutan  buffer  dan  didiamkan beberapa  saat  hingga  diperoleh  pembacaan yang  stabil.  Angka  pH  meter  disesuaikan dengan  pH  buffer,  yaitu  buffer  pH  4  dan buffer pH 7. Sampel sebanyak 10 gram yang diambil  dari  bagian  daging  dinding  perut ikan dihancurkan dan dihomogenkan dengan 90  mL  air  destilat,  lalu  diukur  dengan  pH meter yang telah dikalibrasi.
2.8. Uji TPC (Lopez-Caballero et al. , 2006) Prinsip kerja analisis TPC adalah per- hitungan  jumlah  bakteri  yang  ada  di  dalam sampel  (daging  ikan)  dengan  pengenceran sesuai keperluan dan dilakukan secara duplo. Pembuatan  larutan  contoh  dilakukan  dengan mencampurkan  10  g  sampel  yang  telah  di- hancurkan  yang  diambil  dari  daging  ikan, lalu  dimasukkan  ke  dalam  botol  yang  berisi 90 mL larutan garam 0,85% steril, kemudian dikocok sampai larutan homogen. Campuran larutan contoh tersebut diambil 1 mL dan di- masukkan ke dalam botol berisi 9 mL larutan garam  0,85%  steril  sehingga  diperoleh  con-
toh  dengan  pengenceran  10 -2 ,  setelah  itu dikocok  agar  homogen.  Banyaknya  pengen- ceran  dilakukan  sesuai  dengan  keperluan penelitian,  biasanya  sampai  pengenceran  10 - 5 .  Pemipetan  dilakukan  dari  masing-masing tabung  pengenceran  sebanyak  1  mL  larutan contoh  dan  dipindahkan  ke  dalam  cawan petri  steril  secara  duplo  menggunakan  pipet steril.  Media  agar  dimasukkan  ke  dalam cawan  petri  sebanyak  10  mL  dan  digoyang- kan  sampai  permukaan  agar  merata  (metode tuang),  kemudian  didiamkan  beberapa  saat hingga  dingin  dan  mengeras.  Cawan  petri yang  telah  berisi  agar  dan  larutan  contoh dimasukkan  ke  dalam  inkubator  pada  suhu 30 ⁰ C  selama  48  jam  dengan  posisi  cawan petri  yang  dibalik.  Selanjutnya  dilakukan pengamatan  dengan  menghitung  jumlah  ko- loni  yang  ada  didalam  cawan  petri  tersebut. Jumlah  koloni  bakteri  yang  dihitung  adalah cawan  petri  yang  mempunyai  koloni  bakteri 30-300 koloni.
2.9. Uji TVB (Lopez-Caballero et al. , 2006) Prinsip  dari  analisis  TVB  adalah menguapkan  senyawa-senyawa  basa  volatil (amin,  mono-,  di-,  dan  trimetilamin).  Senya- wa tersebut kemudian diikat oleh asam borat dan kemudian dititrasi dengan larutan HCl.
Preparasi  sampel  dilakukan  dengan cara  menimbang  15  g  sampel  yang  diambil dari  daging  ikan,  kemudian  ditambahkan  45 ml  TCA  7%  dan  dihomogenkan  selama  1 menit. Hasil homogenisasi kemudian disaring sehingga diperoleh  filtrat  yang berwarna jer- nih.  Setelah  penyiapan  sampel  maka  dilaku- kan uji TVB dengan cara memasukkan 1 mL H 3 BO 3 ke  dalam inner  chamber cawan Conway dan  tutup  cawan  diletakkan  dengan posisi  hampir  menutupi  cawan.  Dengan  me- makai pipet 1 mL  yang lain, filtrat dimasuk- kan  ke  dalam outer  chamber disebelah  kiri. Kemudian 1 mL larutan K 2 CO 3 jenuh ditam- bahkan  kedalam outer  chamber sebelah kanan  sehingga  filtrat  dan  K 2 CO 3 tidak  ter- campur.  Cawan  segera  ditutup  dengan sebelumnya  pinggir  cawan  diolesi  vaselin agar  proses  penutupan  sempurna,  lalu  dige-
rakkan  memutar  sehingga  kedua  cairan  di outer  chamber tercampur.  Disamping  itu dikerjakan  blanko  dengan  prosedur  yang sama  tetapi  filtrat  diganti  dengan  TCA  7%. Kemudian  kedua  cawan Conway tersebut diinkubasi  selama  2  jam  pada  suhu  37 ⁰ C. Setelah diinkubasi, larutan asam borat dalam inner  chamber  cawan Conway yang  berisi blanko  dititrasi  dengan  larutan  HCl  0,01  N dan  cawan  digoyang-goyangkan  sampai larutan  asam  borat  berubah  warna  menjadi merah  muda.  Selanjutnya  cawan Conway yang  berisi  sampel  juga  dititrasi  dengan larutan  yang  sama  dengan  blanko.  Kadar TVB dapat dihitung menggunakan rumus:
%N(mg n/100g)= (j – i) x NHCl x 100 x fp x14x mg N/100 g contoh                1
keterangan: j = ml titrasi sampel, fp = faktor pengenceran,  i=  ml  titrasi  blanko,  N= normalitas HCl (0,01 N).

## 2.10. Analisis Data
Rancangan  percobaan  yang  diguna- kan pada penelitian pendahuluan adalah Ran- cangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  satu perlakuan  yaitu  pengenceran  inhibitor  pada berbagai  konsentrasi  (1:0,  1:1,  1:2,  dan  1:3) dengan dua kali ulangan.
Model  linear  untuk  rancangan  acak lengkap  yang  digunakan  adalah  sebagai berikut (Mattjik dan Sumertajaya, 2002):
Y ij = µ + τ i + ε i …………………………...(1) i = faktor (i = 1,2,3,4)……………………(2) j = ulangan (j = 1,2)……………………...(3)
keterangan:
Y ij =  respon  percobaan  karena  pengaruh berbagai  suhu  inkubasi/pengenceran pada faktor ke-i dan ulangan ke-j
µ     = rataan umum τ i =  pengaruh  faktor  perlakuan  (berbagai suhu inkubasi/pengenceran) pada taraf ke-i
ε ij = pengaruh galat percobaan karena faktor berbagai  suhu  inkubasi/pengenceran  pada taraf ke-i dan ulangan ke-j.
Hipotesis:
H0=  semua  perlakuan  memberikan  pengruh yang sama terhadap aktivitas inhibisi H1=  semua  perlakuan  memberikan  penga- ruh  yang  berbeda  terhadap  aktivitas inhibisi Data  parametrik  dianalisis  secara  sta- tistik dengan analisis sidik ragam (ANOVA). Jika hasil analisis menunjukkan berbeda nya- ta  maka  dilanjutkan  dengan  uji  lanjut Duncan.
Adapun  perhitungan  untuk  uji  lanjut Duncan  sebagai berikut:
keterangan: KTG= nilai kuadrat tengah galat; r = jumlah ulangan; r p = ditentukan dari tabel. Analisis  data  yang  digunakan  dalam penelitian  lanjutan  ialah  menggunakan  ana- lisis  deskriptif  dengan  membandingkan  an- tara ikan perlakuan perendaman inhibitor dan ikan  kontrol  (tanpa  perendaman  inhibitor) menggunakan microsoft excel 2007.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1. Ekstraksi Inhibitor Katepsin
Berdasarkan  Gambar  1  terlihat  bahwa aktivitas inhibisi semakin meningkat dari
suhu  60 ⁰ C  sampai  dengan  suhu  80 ⁰ C  dan turun  kembali  pada  suhu  90 ⁰ C.  Berdasarkan uji  statistik,  suhu  inkubasi  memberikan pengaruh  yang  berbeda  terhadap  aktivitas inhibisi  (Sig.<0,05)  sehingga  dilakukan  uji lanjut  untuk  melihat  adanya  perbedaan pengaruh  masing-masing  suhu  terhadap  ak- tivitas  inhibisi.  Hasil  uji  lanjut  menunjukkan bahwa  suhu  inkubasi  terbaik  adalah  80 ⁰ C dengan  aktivitas  inhibisi  sebesar  93,06%. Dengan  demikian  maka  ditetapkan  bahwa suhu  inkubasi  terbaik  adalah  80 ⁰ C  dengan aktivitas inhibisi sebesar 93,06%. Hasil yang sama  ditunjukkan  oleh  hasil  penelitian  Nur- hayati et  al. (2013 b )  yang  menunjukkan bahwa  inhibitor  enzim  katepsin  dari  daging ikan  patin  dapat  diekstrak  dengan  efektif pada  suhu  inkubasi  80 o C.    Nurhayati et  al. (2013 a ) juga melaporkan bahwa inhibitor ka- tepsin  dari  kulit  ikan  patin  juga  dapat  dieks- trak  dengan  baik  menggunakan  suhu  80 ⁰ C. Penelitian  Ylonen et  al .  (1999)  dalam  Li et al .  (2008)  menyatakan  bahwa  pada  suhu 80 ⁰ C, inhibitor protease jenis sistein dari ikan salmon atlantik mempunyai aktivitas inhibisi yang lebih stabil. Menurut Jiang (2000), pada suhu 60-70 ⁰ C terjadi aktivasi enzim katepsin, sedangkan  pada  suhu  80 ⁰ C  aktivitas  enzim telah  menurun  sehingga  penghambatan  yang efektif  terjadi  apabila  suhu  inkubasi  telah mencapai 80 ⁰ C.
Gambar 1. Hasil aktivitas inhibitor katepsin pada berbagai suhu inkubasi.

## 3.2.   Penentuan Daya Hambat Tertinggi Berbagai Konsentrasi Inhibitor Katepsin
Berdasarkan Gambar 2 diketahui bah- wa  semakin  besar  konsentrasi  pengenceran, aktivitas  penghambatan  terhadap  enzim  ka- tepsin  semakin  kecil.  Berdasarkan  uji  statis- tik,  faktor  pengenceran  memberikan  penga- ruh  yang  berbeda  terhadap  aktivitas  inhibisi (Sig.<0,05) sehingga dilakukan uji lanjut un- uk  melihat  adanya  perbedaan  pengaruh masing-masing  faktor  pengenceran  terhadap aktivitas  inhibisi.  Hasil  uji  lanjut  menunjuk- kan  bahwa  faktor  pengenceran  1:1  merupa- kan  faktor  pengenceran  yang  terbaik  diban- dingkan  dengan  faktor  pengenceran  1:2  dan 1:3  sehingga  digunakan  untuk  aplikasi.  Hal ini menunjukkan bahwa semakin besar faktor pengenceran,  semakin  kecil  konsentrasi  pro- tein  inhibitornya  sehingga  aktivitas  peng- hambatan akan berkurang.
Menurut  Apriyanti  (2007)  jenis  in- hibitor  dan  konsentrasi  inhibitor  merupakan faktor  yang  paling  berperan  dalam  mem- pengaruhi  besar  kecilnya  presentase  peng- hambatan  enzim  katepsin.  Inhibitor  kimia (pepstatin) dengan konsentrasi 1 µM mampu menghambat  aktivitas  enzim  katepsin  dari daging  ikan  nila  sebesar  76,79%  dan  pada
konsentrasi  5  µM  mampu  menghambat  akti- vitas  enzim  katepsin  sebesar  92,71%,  lebih besar  daripada  inhibitor  kimia  yang  lain seperti  EDTA  dan  PMSF  pada  konsentrasi yang sama.

## 3.3. Aplikasi Inhibitor Katepsin dalam Menghambat Kemunduran Mutu
3.3.1. Penentuan Tahap Post Mortem Ikan Bandeng yang disimpan pada Suhu
Chilling
Pengamatan kondisi post mortem ikan dilakukan  dari  fase pre  rigor sampai  kebu- sukan.  Tabel  1  menunjukkan  fase mortem ikan  bandeng  yang  disimpan  pada  suhu chilling. Berdasarkan  data  tersebut  dapat  di- ketahui  bahwa  ikan  bandeng  yang  disimpan pada suhu chilling setelah sebelumnya diren- dam terlebih dahulu dalam inhibitor katepsin memasuki  fase rigor  mortis dan post  rigor awal  yang  lebih  lambat  48  jam,  dan  selan- jutnya  memasuki  fase  kebusukan  yang  lebih lambat  120  jam.  Ini  berarti  bahwa  inhibitor katepsin  dapat  berfungsi  untuk  menghambat kemunduran mutu ikan bandeng. Hasil pene- litian  Nurhayati et  al. (2011) menunjukkan bahwa ikan bandeng  yang sebelum disimpan pada  suhu chilling direndam  terlebih  dahulu dengan  larutan  inhibitor  katepsin  yang
Gambar 2.  Perbandingan aktivitas inhibitor katepsin pada berbagai pengenceran.
Tabel 1.  Fase post mortem ikan bandeng yang disimpan pada suhu chilling.
Fase post mortem Perlakuan sebelum disimpan pada suhu chilling Direndam dalam bufer tanpa inhibitor katepsin (kontrol) Direndam dalam  larutan inhibitor katepsin (perlakuan) Pre rigor awal 0 jam 0 jam Rigor mortis awal 96 jam 144 jam Post rigor awal 360 jam 408 jam Deteriorasi awal 504 jam 624 jam
diekstrak  dari  daging  ikan  patin  mampu dihambat  kemunduran  mutunya  hingga  72 jam (3 hari).
3.3.2. Nilai Organoleptik Ikan Bandeng yang Disimpan Pada Suhu Chilling
Ikan  yang  disimpan  pada  suhu chil- ling akan  mengalami  kemunduran  mutu. Gambar 3 menunjukkan bahwa nilai organo- leptik  ikan  bandeng  kontrol  dan  perlakuan mengalami  penurunan  selama  penyimpanan pada suhu chilling , namun nilai organoleptik ikan  bandeng  kontrol  lebih  cepat  mengalami penurunan  dibandingkan  perlakuan.  Ikan bandeng  memiliki  nilai  organoleptik  9  saat fase pre  rigor yang  berarti  bahwa  menurut SNI  01-2346-2006 ikan  masih  berada  pada kondisi sangat segar. Nilai organoleptik turun menjadi  7  saat  memasuki  fase rigor  mortis yang berarti bahwa ikan berada pada kondisi
segar. Penurunan nilai organoleptik terus ber- lanjut  selama  penyimpanan.  Nilai  organo- leptik  turun menjadi  6 ketika memasuki fase post  rigor yang  berarti  bahwa  ikan  berada pada ambang batas diterima.  Fase deteriorasi dicapai  ketika  nilai  organoleptik  mencapai nilai 3. Penurunan nilai organoleptik yang le- bih  lambat  pada  ikan  bandeng  perlakuan disebabkan  oleh  adanya  pengaruh  inhibitor yang  masuk  ke  dalam  daging  ikan  melalui pori-pori  kulit  sehingga  dapat  menghambat aktivitas  enzim  katepsin  dalam  menguraikan protein  menjadi  peptida-peptida  dan  asam- asam  amino.  Akibatnya,  kemunduran  mutu ikan menjadi terhambat lebih lama. Nurhaya- ti et  al. (2011)  melaporkan  bahwa  penu- runan  nilai  organoleptik  yang  lebih  lambat pada  ikan  bandeng  perlakuan  juga  terjadi pada  ikan  bandeng  yang  direndam  terlebih dahulu  dengan  larutan  inhibitor  katepsin yang diekstrak dari daging ikan patin.
Gambar 3. Nilai organoleptik ikan bandeng selama penyimpanan pada suhu chilling.

## 3.3.3. Nilai pH
Nilai  pH  merupakan  salah  satu  indi- kator  pengukuran  tingkat  kesegaran  mutu ikan.  Nilai  pH  daging  ikan  ketika  masih  hi- dup  umumnya  mempunyai  pH  netral  dan setelah  mati  pH  menjadi  turun  (Eskin et  al ., 1990).  Hasil  pengukuran  nilai  pH  daging ikan  bandeng  kontrol    dan  perlakuan  selama penyimpanan  suhu chilling disajikan  pada Gambar  9.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  ikan  bandeng  yang  berada  pada  fase pre rigor memiliki pH mendekati netral yaitu 6,21 (kontrol) dan 6,33 (perlakuan).
Nilai  pH  akan  semakin  menurun  se- iring  semakin  banyaknya  asam  laktat  yang terbentuk dan penurunan ATP. Pada akhirnya pH akan semakin asam, yaitu pada fase rigor mortis .  Nilai  pH  dari  daging  ikan  bandeng pada  fase rigor  mortis berkisar  antara  6 hingga  6,06  dengan  lama  waktu  penyimpan- an 96 jam (kontrol) dan 144 jam (perlakuan). Penelitian Church (1998) diacu dalam Ladrat (2006) menunjukkan bahwa pH ikan menga- lami  penurunan  pada  fase rigor  mortis dari 7,4  menjadi  6  dan  kadang-kadang  dibawah- nya. Perubahan pada fase ini merupakan aki- bat  dari  suatu  rangkaian  kimiawi  yang  kom- pleks  di  dalam  otot  ikan  sesudah  kematian- nya.
pH yang terus menurun menyebabkan enzim  katepsin  semakin  aktif  karena  pH menjadi lebih asam. Aktivitas enzim katepsin akan  memberikan  pengaruh  yang  signifikan jika  nilai  pH  rendah  (Taylor et  al. ,  1995). Macam-macam  enzim  katepsin  yang  aktif dalam  fase  ini  antara  lain  katepsin  B,  D,  H dan  L.  Enzim-enzim  tersebut  diatur  oleh  in- hibitor  protease  yang  disebut  cystatin  (Turk dan  Bode  1991  diacu  dalam  Chereta  2007) dan juga pepstatin (Dinu et al ., 2002). Akibat kerja  katepsin  akan  terbentuk  turunan- turunan protein berupa peptida, asam  amino, bahkan  bisa  terbentuk  turunan  asam  amino yang bersifat basa sehingga pH ikan kembali naik  dan  tekstur  daging  ikan  menjadi  lumak (Jiang,  2000).  Kondisi  ini  menunjukkan  fase post  rigor. Ikan  bandeng  kontrol  memasuki
fase post rigor setelah penyimpanan 360 jam (kontrol)  dan  408  jam  (perlakuan).  Nilai  pH daging  ikan  bandeng  pada  fase  tersebut  ber- kisar  antara  6,65-6,82.  Selanjutnya  pH  terus naik akibat semakin banyak basa volatil yang terbentuk  setelah  penyimpanan  504  jam (kontrol)  dan  624  jam  (perlakuan).  Menurut Taskaya et  al .  (2003),  peningkatan  nilai  pH tergantung  dari  lama  waktu  penyimpanan, suhu  penyimpanan,  kondisi  fisiologis,  kan- dungan protein, dan aktivitas enzim.
Berdasarkan hasil penelitian (Gambar 4)  dapat  diketahui  bahwa  pH  ikan  bandeng perlakuan  mengalami  penurunan  pH  yang lebih lambat dibandingkan kontrol, yaitu saat memasuki  fase rigor  mortis ,  kemudian  ter- jadi  kenaikan  pH  yang  lebih  lambat  di- bandingkan  kontrol  saat  memasuki  fase  post rigor  dan  deteriorasi.    Hal  ini  menunjukkan bahwa  larutan  inhibitor  katepsin  yang  di- gunakan untuk merendam ikan bandeng efek- tif untuk menghambat aktivitas enzim katep- sin  sehingga  laju  kemunduran  mutu  menjadi terhambat pula.

## 3.3.4. Nilai TPC
Hasil  penelitian  (Gambar  5)  menun- jukkan    bahwa  nilai  log  TPC  daging  ikan bandeng  meningkat  seiring  dengan  lamanya waktu penyimpanan. Nilai TPC ikan bandeng kontrol mengalami  kenaikan lebih cepat  dari ikan  bandeng  perlakuan.  Nilai  log  TPC  ter- tinggi  terjadi  ketika  ikan  memasuki  fase busuk,  yaitu  7,49  koloni/g  untuk  ikan  ban- deng  kontrol  dan  7,4  koloni/g  untuk  ikan bandeng  perlakuan.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  perendaman  ikan  bandeng  dalam larutan inhibitor mengakibatkan aktivitas en- zim  katepsin  terhambat.  Nilai  log  TPC  da- ging ikan bandeng fase post rigor dan busuk sudah berada diatas batas maksimum  jumlah mikroba  yang  ditetapkan  dalam  SNI  01- 2729-2006,  yaitu  dengan  nilai  maksimum 5x10 5 koloni/g  atau  nilai  log  TPC  sebesar 5,70  koloni/g  (BSN,  2006).  Penelitian  Sala- mah et  al. (2010)  menyebutkan  bahwa  nilai TPC  ikan  bandeng  dalam  kondisi post
Gambar 4. Nilai pH ikan bandeng selama penyimpanan suhu chilling.
Gambar 5. Nilai log TPC ikan bandeng selama penyimpanan suhu chilling
rigor yang disimpan selama13 hari pada suhu chilling  mempunyai  jumlah  koloni  bakteri sebesar  6,85  koloni/g  dan  mengalami  ke- naikan  setelah  mencapai  kondisi  busuk selama 23 hari dengan jumlah koloni bakteri sebesar 7,38 koloni/g.
Mohammed dan Hamid (2011) mela- porkan bahwa total mikroba pada ikan tilapia dan  ikan  lele  yang  disimpan  selama  7  hari menggunakan  es  dengan  perbandingan  1:1
adalah  sebesar  1,7×10 6 dan  1,3×10 6 cfu/g. Ikan  tilapia  dan  lele  yang  disimpan  pada refrigrasi  selama  7  hari    memiliki  jumlah mikroba sebanyak 1,1×10 7 cfu/g dan 1,6×10 7 CFU/g.  Thai  Agricultural  Commodity  and Food Standard (TACFS 7001, 2004) menun- jukkan  bahwa  titik  kritis  daging  tilapia  yang terkontaminasi  bakteri  memiliki  total  bakteri tidak  lebih  besar  dari  1×10 7 cfu/g  daging ikan.
Ikan  yang  disimpan  pada  suhu chil- ling membutuhkan  waktu  yang  lebih  lama untuk  mencapai  jumlah  bakteri  yang  sama dengan ikan  yang disimpan pada suhu ruang pada  setiap  tahap  kemunduran  mutu.  Menu- rut  Hidayati  (2005)  berbagai  kondisi  suhu dan  lama  penyimpanan  memberikan  penga- ruh  terhadap  kandungan  protein  dan  total koloni  pada  ikan  bandeng.  Jumlah  bakteri pada ikan akan terus mengalami peningkatan seiring dengan lamanya penyimpanan. Pengaruh  suhu  pada  pertumbuhan  bakteri akan  tampak  jelas  pada  siklus  pertumbuhan- nya,  terutama  perpanjangan  atau  perpendek- an masa adaptasi yang tergantung pada tinggi rendahnya  suhu.  Suhu  yang  tinggi  akan menyebabkan  fase  adaptasi  menjadi  lebih pendek.  Sebaliknya  suhu  rendah  akan menyebabkan  fase  adaptasi  menjadi  lebih panjang.  Penyimpanan  ikan  pada  suhu chil- ling merupakan salah satu cara untuk mengu- rangi  laju  kemunduran  mutu  ikan  karena dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri  dan aktivitas  enzim  (Clucas  dan  Sutcliffe  1981). Penelitian  yang  dilakukan  Azanza et  al. (2001)  menunjukkan  bahwa  jenis  mikroba yang  ditemukan  pada  ikan  bandeng  adalah coliform, Staphylococcus, dan Salmonella spp.

## 3.3.5. Nilai TVB
Indeks  kemunduran  mutu  hasil  peri- kanan  dapat  diketahui  melalui  kandungan TVB.  Kandungan  basa  mudah  menguap (TVB)  merupakan  hasil  akhir  penguraian protein,  sehingga  kadar  TVB  tersebut  dapat dipakai  sebagai  indikator  kerusakan  ikan (Soedarto  dan  Siswanto  2008).  Berbagai komponen  TVB,  seperti  amonia  (NH 3 ), DMA,  dan  TMA  terakumulasi  pada  daging setelah  ikan  mati.  Akumulasi  ini  terjadi akibat  reaksi  biokimia post  mortem dan aktivitas  mikroba  pada  daging.  Gambar  6 menunjukkan  bahwa  nilai  TVB  daging  ikan bandeng  kontrol  mengalami  kenaikan  yang lebih  cepat  dengan  waktu  pencapaian  per fase yang lebih pendek dibandingkan dengan ikan bandeng perlakuan.
Ikan  bandeng  yang  berada  pada  fase pre  rigor termasuk  dalam  kategori  sangat segar karena memiliki nilai TVB sangat ren- dah (8,41 mg N/100 g).  Saat memasuki fase rigor  mortis  ikan  bandeng  termasuk  dalam kategori  segar  baik  pada ikan bandeng kon- trol  (nilai  TVB  15,02  mg  N/100  g)  dan  ikan bandeng  perlakuan  (nilai  TVB  16,02  mg  N /100  g)  dengan  waktu  pencapaian  rigor mortis  96  jam  (kontrol)  dan  144  jam  (per- lakuan).  Ikan  bandeng  yang  memasuki  fase post  rigor  termasuk  ke  dalam  ikan  yang masih  dapat  diterima  karena  memiliki  nilai TVB  sebesar  24,42  mg  N/100  g  untuk  ikan bandeng kontrol dan 25,63 mg N/100 g pada ikan  bandeng  perlakuan  dengan  lama  waktu penyimpanan  masing-masing  360  jam  dan 408  jam.  Ikan  yang  berada  pada  fase  busuk memiliki  nilai  TVB  yang  lebih  dari  30  mg N/100 g.
Farber (1965) mengklasifikasikan ke- segaran  ikan  menjadi  4    kriteria  berdasarkan nilai  TVB.  Ikan  termasuk  kriteria  sangat  se- gar  apabila  nilai  TVB  kurang  dari  10  mg N/100 g. Ikan dengan nilai TVB antara 10-20 mg  N/100  g  termasuk  dalam  kriteria  segar. Ikan termasuk kriteria masih bisa dikonsumsi apabila  nilai  TVB  antara  20-30  mg  N/100  g dan tidak bisa dikonsumsi apabila nilai TVB lebih  dari  30  mg  N/100  g.  Taskaya et  al. (2003)  menyatakan  bahwa  nilai  TVB  antara 30-35  mg  N/100  g  masih  bisa  diterima  oleh konsumen,  sedangkan  diatas  35  mg  N/100  g dianggap  sudah  busuk.  Gopakumar  (2000) juga menyatakan bahwa nilai TVB antara 28- 35 mg N/100 g adalah batas ikan masih bisa dikonsumsi.  Berdasarkan  batasan  tersebut, ikan  bandeng  kontrol  dan  perlakuan  yang disimpan  pada  suhu chilling masih  dapat diterima dan layak untuk dikonsumsi sampai waktu  penyimpanan  memasuki  fase post rigor .
Kenaikan  nilai  TVB  disebabkan adanya  pengaruh  lama  penyimpanan.  Selain itu  juga  dipengaruhi  oleh  faktor  suhu,  kom- posisi  garam,  kondisi  fisiologis,  kandungan protein  dan  aktivitas  enzim  (Taskaya et  al. , 2003).
Gambar 6. Nilai TVB ikan bandeng selama penyimpanan suhu chilling.
Nukleotida  utama  yang  berperan  da- lam  mentransfer  energi  yaitu  ATP,  juga berperan  dalam  penambahan  jumlah  amonia pada  volatil  amin  setelah  kematian  ikan. Ketika  ikan  mati,  kondisi  menjadi  anaerob dan  ATP  akan  terurai  dengan  melepaskan energi  (Jiang,  2000).  Nukleotida  ATP  cepat berubah  menjadi  ADP  oleh  enzim  ATPase, kemudian  diubah  menjadi  AMP  oleh  mio- kinase.  Selanjutnya  AMP  diubah  oleh  enzim deaminase menjadi IMP dan dari IMP diubah menjadi  inosin  oleh  enzim  fosfatase.  Kemu- dian  inosin  dengan  cepat  berubah  menjadi hipoksantin.  Deaminasi  AMP  menjadi  IMP telah melepaskan molekul amonia (NH 3 ) dari gugusan  basa  purin  adenin  (Eskin et  al ., 1990).

## IV. KESIMPULAN
Inhibitor  katepsin  baik  digunakan  se- bagai  penghambat  kemunduran  mutu  ikan bandeng  setelah  diencerkan  menggunakan bufer  dengan  perbandingan  1:1.  Perendaman ikan  bandeng  dalam  larutan  inhibitor  katep- sin  selama  1  jam  sebelum  disimpan  pada suhu chilling mampu  menghambat  kemun- duran mutu selama 120 jam (5 hari).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  Direktorat Jenderal DIKTI, Departemen Pendidikan Na- sional    melalui  surat  perjanjian  pelaksanaan desentralisasi  penelitian  nomor  14/13.24.4 /SPK/BG-PD/2009  dengan  ketua  peneliti Tati Nurhayati.

## DAFTAR PUSTAKA
An,  H.,  Y.M.  Peters,  T.A.  Seymour,  and M.T.  Morrissey.  1995.  Isolation  and activation  of  cathepsin  Linhibitor complex  from  Pacific  Whiting  ( Mer- luccius  productus ). J.  Agric.  Food Chem ., 43:327-330.
Aoki,  T.,  T.  Yamashita,  and  R.  Ueno.  2000. Distribution  of  cathepsins  in  red  and white  muscles  among  fish  species. J.
Fisheries Sci., 66 (4):776-782.
Apriyanti  M.  2007.  Peranan  inhibitor  ka- tepsin  dalam  menghambat  proses  ke- munduran  mutu  ikan  nila  ( Oreo- chromis sp.)  [skripsi].  Program  studi Teknologi  Hasil  Perikanan,  Fakultas Perikanan dan Ilmu kelautan, Institut Pertanian Bogor. Bogor. 85hlm.
Azanza, M.P.V., M.P. Ortega, R.G. and R.G.
Valdezco.  2001.  Microbial  quality  of rellenado  milkfish  ( Chanos  chanos , Forskal). Food Control, 12:365-371. Bradford,  M.M.  1976.  A  rapid  and  sensitive for  the  quantitatio  of  microgram  qu- antitites  of  protein  utilizing  the  prin- ciple  of  protein-dye  binding. Anal. Biochem., 72:248-254.
[BSN]  Badan  Standardisasi  Nasional.  Stan- dar  Nasional  Indonesia  01-2346.  20- 06.  Uji  Organoleptik  Ikan  Segar.  Ba- dan  Standardisasi  Nasional  Indone- sia. Jakarta. 137hlm.
Chereta,  R.,  D.L.  Christine,  L.A.  Marie,  and V.B.Veronique.  2007.  Calpain  and cathepsin  activities  in  post  mortem fish  and  meat  muscles. J.  Food Chem., 101(4):1474-1479.
Clucas, I.J. and P.J. Sutcliffe. 1981. An intro- duction  to  fish  handling  and  pro- cesing.  Tropical  Products  Institute. London. 81p.
Dinu,  D.,  I.F.  Dumitru,  and  M.T.  Nechifor. 2002.  Isolation  and  characterization of two cathepsins from muscle of Ca- rassius  auratus  gibelio . Roum.  Bio- technol. Lett ., 7(3):753-758.
Eskin,  N.A.M.,  H.M.  Henderson,  and  R.J.
Townsend.  1990.  Biochemistry  of Food .  Second  Edition. Academic Press. Inc. New York. 58p.
Hidayati,  L.  2005.  Pengaruh  suhu  dan  lama penyimpanan  dalam  penyimpanan freezer lemari es  terhadap kandungan protein  dan  jumlah  total  koloni  bak- teri  ikan  bandeng  ( Chanos  chanos ). [Tesis].  Universitas  Muhammadiyah Malang. Malang. 66hlm.
Huss,  H.H.    1995.    Quality  and  quality changes in fresh fish.  Food and Agri- culture  Organization  of  The  United Nations. Rome. 167p.
Hutagalung, S., A.D. Patria, R. Alex, Ramli,
M.  Ayubar,  and  Kusdiantoro.  2007. Sewindu  DKP  mengawal  pembangu- nan  negara  kepulauan.  Pusat  Data,
Statistik  dan  Informasi  DKP.  Jakarta. 90hlm.
Jiang,  S.T.  2000.  Enzymes  and  their  effects on  seafood  texture. In: Haard,  N.F., B.K.  Simpson  ( eds. ). Seafood  En- zymes .  Marcel  Dekker,  Inc.  New York. 411-450pp .
Kolodziejska,  I.  and    Z.E.  Sikorski.  1996. Neutral and alkaline muscle proteases of  marine  fish  and  invertebrates  -  A review. J,  Food  Biochem. ,  20:349- 363.
Ladrat, C.D., V.B. Veronique, J. Noel, and J. Fleurence. 2004. Proteolytic potential in  white  muscle  of  sea  bass  ( Dicen- trarchus  labrax L.)  during  post  mor- tem  storage  on  ice:  time-dependent changes  in  the  activity  of  the  com- ponents  of  the  calpain  system. J. Food Chem., 84:441-446.
Li,  D.K.,  L.  Hong  L,  and  M.K.  Sang.  2008.
Purufication and characterization of a cysteine  proteinase  inhibitor  from chum  salmon  ( Oncorhynchus  keta ) plasma. J. Agric.  Food  Chem. ,  56: 106-111.
Lopez-Caballero,  M.,  O.  Martinez-Alvarez, M.C.  Gomez-Guillen,  and  P.  Mon- tero.    2006.    Effect  of  natural  com- pounds  alternative  to  commercial  an- timelanosics  on  polyphenol  oxidase activity  and  microbial  growth  in  cul- tured  prawns  ( Marsupenaeus  tiger ) during chilled storage. Eur. Food Res. Technol. , 223:7-15.
Mohammed,  I.M.A.  and  S.H.A.  Hamid. 2011.  Effect of chilling on microbial load of two fish species ( Oreochromis niloticus and Clarias  lazera ). Am.  J. Food and Nutr. , 1(3):109-113.
Nurhayati,  T.,  E.  Salamah,  dan  N.  Fentiana. 2010a. Peranan enzim protease jeroan ikan bandeng ( Chanos chanos ) dalam proses  kemunduran  mutu  ikan.  Prosi- ding  Seminar  Nasional  Pengolahan Produk  dan  Bioteknologi  Kelautan. 25-34hlm.
Nurhayati,  T.,  E.  Salamah,  M.  Irfan,  dan  R. Nugraha.  2010b.  Aktivitas enzim ka- tepsin dan kolagenase pada kulit ikan bandeng  ( Chanos  chanos ,  Forskal) selama  periode  kemunduran  mutu.
Akuatik, 4(1):30-34.
Nurhayati,  T.,  E.  Salamah,  K.  Tampubolon, dan A. Apriland.  2011.  Peranan inhi- bitor katepsin dari ikan patin ( Panga- sius  hyphopthalmus )  untuk  meng- hambat  kemunduran  mutu  ikan  ban- deng  ( Chanos  chanos Forskal). JPHPI XIV, (1):49-55.
Nurhayati  T.,  E.  Chasanah,  dan  S.  Bahri. 2013a.    Potensi    inhibitor    katepsin dari tiga jenis  kulit  ikan  patin  dalam menghambat  aktivitas  katepsin  ikan patin  siam. JPB  Perikanan, 8(2):93- 102.
Nurhayati,  T.,  S.  Rusyadi,  R.  Suwandi,  dan
R.  Nugraha.  2013b.  Purification  and characterization  of  a  cathepsin  inhi- bitor  from  catfish  ( Pangasius sp.)  of Indonesian  Water. IFRJ, 20(2):941-
946.
Salamah  E.,  T.  Nurhayati,  Rustamaji.    2010.
Aktivitas  enzim  katepsin  dan  kolage- nase  pada  ikan  bandeng  ( Chanos chanos )  selama  periode  kemunduran mutu. Logika, 7(2):73-79.
Thai  Agricultural  Commodity  and  Food Standard  (TACFS).    2004.  Tilapia. National Bureau of Agricultural Com- modity  and  Food  Standards  (ACFS).
TACFS 7001-2004. 8p.
Taskaya  L.,  S.  Cakli,  and  U.  Celik.  2003.  A study  on  the  quality  changes  of  cul- tured  gilthead  seabream  ( Sparus  au- rata L.,1758)  and  Seabass  ( Dicen- trarchus  labrac L.,1758)  under  the market conditios. J. Fish. Aquat. Sci. , 20:313-320.
Taylor, R.G., G.H. Geesink, V.F. Thompson, M.  Koohmarie,  and  D.E.  Goll.  1995. Is  Z-disk  degradation  responsible  for postmortem  tenderization ?  J.  Anim Sci., 73:1351-1367. Diterima : 17 Februari 2015 Direview : 30 April 2015 Disetujui : 21 Desember 2015