IMOBILISASI ENZIM LIPASE DEDAK PADI ( Oryza Sativa L. ) PADA KARBON AKTIF: KARAKTERISASI, DAN UJI STABILITAS

## KERJA ENZIM IMOBIL
Immobilization of Lipase Enzyme From The Bran Rice ( Oryza Sativa L.) on Activated Carbon: Characterization and Stability Test Of Immobile Enzyme Work
Firdaus 1 , Seniwati Dali 1 , Hendra J. Rusman 1*
1 Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Hasanuddin University Jl. Perintis Kemerdekaan Km. 10, Tamalanrea, Makassar, 90245 - Indonesia
* Corresponding Author, e-mail: hendrarusmanlipase@gmail.com
Received: June 2017 Published: July 2017

## ABSTRACT
This research  aims to  immobilize,  characterize the enzyme of  immobilized, test the effectiveness of the enzyme of immobilized. This research begins with the immobilization to process of enzyme lipase using activated carbon matrix, enzyme characterization covering of immobile determination of temperature and pH optimum of the enzyme of immobilized, as well as test the stability of work covering immobilized of enzyme the test thermal stability and repeated use. The results showed that the immobile of enzyme work optimally  at  50 o C  of  temperature  and  pH  6.5  with  each  activity  0.040  U/mL.  The  research  results  also showed  that  the  immobile  of  enzyme  has  higher  thermal  stability  in  comparison  with  the  free  enzyme with  the  relative  activity  of  57.50%  at  the  time  of  45  minutes  of  exposure  and  the  exposure  time  at 47.50% at 75-105 minutes and it can be used as many as six times with the relative activity of 52.5% in 6 times of use.
Keywords: Rice  bran  (Oryza  Sativa  L.),  lipase  of  enzymes,  immobilization,  activated  carbon, characterization

## PENDAHULUAN
Penggunaan  enzim  lipase  di  bidang bioteknologi semakin berkembang pesat. Oleh karena  itu,  banyak  industri  pangan  dan  non- pangan yang telah memanfaatkan kerja enzim lipase sebagai biokatalisator di dalam memodifikasi minyak dan lemak (Yuneta dan Saputra,  2010).  Enzim  lipase  dapat  diisolasi dari  mikroba,  tumbuhan  dan  hewan.  Salah satu  jenis  enzim  lipase  terdapat  di  dalam tumbuhan yang dapat diisolasi dan dimanfaatkan  adalah  enzim  lipase  dedak  padi (Dharsono  dan  Oktari,  2010,  Christianisari et.al., 2014,  Fitriyana  dkk.,  2012).    Namun, enzim  lipase  yang  telah  diisolasi  biasanya masih  dalam  bentuk  terlarut  sehingga  tidak stabil  terhadap  pengaruh  lingkungan.  Ini menyebabkan  enzim  terlarut  tidak  dapat digunakan  secara  berulang-ulang;  sehingga
tidak  ekonomis  di  dalam  penggunaanya sebagai  biokatalisator.  Untuk  mengatasi kelemahan  tersebut,  dilakukan  imobilisasi enzim  secara  adsorpsi  menggunakan  karbon aktif  sebagai  material  pendukung  ( carrier ). Metode adsorbsi umumnya merupakan metode imobilisasi enzim lipase yang sederhana  dan  memiliki  kelebihan  yakni: (1)  proses  pengikatan  enzim  dan  carrier  lebih cepat,  (2)  tidak  membentuk  ikatan  silang sehingga tidak memungkinkan untuk terjadinya  perubahan  konformasi  struktur enzim,  dan  (3)  tidak  menunjukkan  penurunan aktivitas  enzim  yang  signifikan  terhadap pengaruh  suhu  dan  pH  (Dali,  2010). Pemanfaatan  enzim  imobil  dalam  skala industri umumnya memerlukan aktivitas yang maksimum  sehingga  tidak  diperlukan  lagi enzim  dalam  jumlah  banyak  untuk  dapat bekerja secara maksimal sebagai
biokatalisator. Oleh karena itu, perlu dilakukan  karakterisasi  enzim  imobil  yang meliputi  penentuan  suhu  dan  pH  optimum; selain  itu,  perlu  dilakukan  uji  stabilitas  kerja enzim  imobil  yang  meliputi  uji  stabilitas termal dan uji stabilitas enzim imobil terhadap penggunaan berulang.

## METODOLOGI

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  yaitu:  Enzim lipase  dedak  padi  ( Oryza  Sativa  L. ),  karbon aktif,  minyak  zaitun,  asam  oleat  p.a  (merck), n-heksana p.a (merck), HCl 6 N, buffer fosfat, aquades,  aquabides,  reagen  Cu(II)  asetat (5%)-Piridin pH 6.
Alat
Alat
yang digunakan yaitu: spektrofotometer  20  D + (Genesys),  sentrifuge (Hettic  Universal  320R),  neraca  analitik (Acculab),  oven,  blender, hot  plate  stirrer (Vella), shaker incubator (BL Barnstead/Lab- line  Max  Q  4000),  mikropipet,  neraca  lengan (Ohaus), batang pengaduk, pH meter, magnetig  styrrer (VWR  scientific),  Gelas ukur,  gelas  kimia,  erlenmeyer,  tabung  reaksi, pipet volume, dan pipet tetes.

## Prosedur Kerja Imobilisasi Enzim Lipase
Sebanyak  7,5  mL  enzim  lipase  dedak padi  ( Oryza  Sativa  L. )  ditambahkan  dengan 7,5  mL  buffer  fosfat  pH  6,5  dan  5  gram karbon  aktif  kemudian  di  shaker  selama  30 menit  dengan  kecepatan  150  rpm  pada  suhu kamar.    Selanjutnya  disentrifugasi  selama  5 menit dengan kecepatan 1000 rpm.

## Penentuan Aktivitas Lipase Imobil
Penentuan  aktivitas  lipase  dilakukan dengan menggunakan metode Kwon dan Rhee sebagai  berikut:  Sebanyak  0,70  mL  enzim bebas  ditambahkan  0,35  mL  buffer  fosfat  pH 6,5 dan substrat minyak  zaitun sebanyak 0,70 mL.  Campuran  tersebut  diinkubasi  pada  suhu 45 0 C  dengan  kecepatan  120  rpm  selama  15 menit.  Setelah  proses  inkubasi,  ditambahkan 0,5 mL  HCl  6  N dan  3,25  mL  n-heksana  dan dikocok  dengan  kuat  lalu  didiamkan  selama 15  menit.  Setelah  terbentuk  dua  fase,  fase minyak  diambil  sebanyak  2,50  mL  dan
ditambahkan  n-heksana  sebanyak  1,25  mL; kemudian  ditambahkan  0,5  mL  reagen tembaga  (II)  asetat  5%  pH  6  lalu  dikocok dengan kuat. Fase atas diambil sebanyak 3,20 mL  dan  ditentukan  nilai  absorbansi  dengan menggunakan  spekrofotometer  20  D + pada panjang gelombang 615 nm.

## Penentuan suhu Optimum
Penentuan  suhu  optimum  dilakukan dengan  menguji  aktivitas  enzim  lipase  yang telah  diimobilisasi  menggunakan  metode Kwon  dan  Rhee  pada  suhu  yang  bervariasi (yaitu:  30;  35;  40;  45;  50;  55;  60;  65;  dan 70) 0 C.

## Penentuan pH Optimum
Penentuan pH optimum dilakukan dengan  menguji  aktivitas  enzim  lipase menggunakan  metode  Kwon  dan  Rhee  pada pH  yang  bervariasi  (yaitu:  5,5;  6,0;  6,5;  7,0; 7,5; dan 8,0).

## Uji Stabilitas termal enzim imobil
Uji  stabilitas  termal  enzim  imobil dilakukan  dengan  menguji  aktivitas  enzim lipase  menggunakan  metode  Kwon  dan  Rhee pada waktu pemaparan yang bervariasi (yaitu: 15, 45, 75, 105 dan 135) menit.

## Uji  Stabilitas  enzim  imobil  terhadap penggunaan berulang
Uji  stabilitas  enzim  imobil  terhadap penggunaan  berulang  adalah  sebagai  berikut: sebanyak 1 g enzim imobil ditambahkan 5 mL buffer fosfat pH 6,5 dan 5 mL substrat minyak zaitun; kemudian campuran tersebut diinkubasi  pada  waktu  15  menit  pada  suhu 50 o C  dengan  kecepatan  250  rpm;  selanjutnya campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan  1000  rpm  selama  5  menit.  Produk yang  dihasilkan  diuji  aktivitas  enzimnya dengan menggunakan metode Kwon dan Rhee pada  panjang  gelombang  615  nm,  sedangkan enzim  imobil  dicuci  dengan  20  mL  buffer fosfat  pH  6,5,  disaring,  dan  dikeringkan  di dalam oven pada suhu 40 o C selama 30 menit; selanjutnya,  enzim  imobil  yang  telah  kering digunakan  untuk  penentuan  aktivitas  enzim lipase berikutnya.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Penentuan Suhu Optimum
Penentuan  suhu  optimum  dilakukan untuk  mengetahui  suhu  optimal  kerja  enzim imobil.  Peningkatan  suhu  berpengaruh  pada peningkatan aktivitas enzim lipase imobil.  Ini disebabkan  oleh  meningkatnya  intensitas tumbukan  antara  enzim  imobil  dengan substrat  minyak  zaitun.  Pada  saat  suhu ditingkatkan, aktivitas enzim akan mengalami penurunan  yang  disebabkan  oleh  proses denaturasi  enzim.  Kestabilan  enzim  imobil terhadap  pengaruh  suhu  tergantung  pada kesesuaian  matriks  dengan  enzim  dan kandungan gugus-gugus hidrofobik pada asam amino  penyusun  enzim.  Kandungan  gugus- gugus  hidrofobik  menyebabkan  molekul enzim  membentuk  konformasi  struktur  lebih rapat  di  dalam  larutan  dan  mudah  untuk terikat  secara  fisik  dengan  matriks  karbon aktif;  dengan  demikian,  matriks  karbon  aktif akan  melindungi  enzim  dari  putusnya  ikatan fisik  akibat  pemanasan  (Christianasari  dkk., 2014). Dalam penelitian ini, suhu divariasikan mulai  dari  (30,  35,  40,  45,  50,  55,  60,  65, 70) o C;  Hasil  penelitian  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Gambar 1  Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim imobil
Berdasarkan  hasil  penelitian,  enzim lipase  imobil  bekerja  secara  optimal  pada suhu  50 o C  dengan  aktivitas  lipase  sebesar 0,040 U.

## Penentuan pH Optimum
Penentuan  pH  optimum  dilakukan  untuk mengetahui  pH  optimal  kerja  enzim  imobil. Dalam  penelitian  ini,  buffer  yang  digunakan adalah buffer fosfat dan pH divariasikan mulai
dari  5,5;  6,0;  6,5;  7,0;  7,5  dan  8,0.  Hasil penelitian dapat dilihat dari Gambar 2.
Gambar 2 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim imobil
Berdasarkan  hasil  penelitian,  enzim lipase  murni  dan  enzim  lipase  imobil  bekerja secara  optimal  pada  pH  6,5  dengan  aktivitas dan  0,040  U.  Ini  menunjukkan  bahwa perubahan  pH  berpengaruh  pada  perubahan konformasi  struktur  enzim  di  dalam  matriks akibat pembentukkan atau pemutusan interaksi  ionik  terutama  pada  bagian  enzim yang  mengandung  R–NH 3 + dan  R–COO - akibat  pengaruh  lingkungan  yang  asam  atau basa.  Hal  ini  disebabkan  karena  setiap  enzim memiliki  pH  optimum  yang  berbeda-beda sehingga  pH  yang  jauh  dari  kondisi  optimum akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi (Bintang dkk., 2015).

## Uji Stabilitas Termal Enzim Imobil
Uji  stabilitas  termal  dilakukan  untuk mengetahui  kestabilan  konformasi  struktur enzim  terhadap  waktu  pemanasan  dan perubahan  kondisi  lingkungan  akibat  proses reaksi  yang  dapat  mengakibatkan  terjadinya proses  denaturasi  enzim  secara  perlahan (Murty et al., 2002).
Gambar 3 Hasil uji stabilitas termal enzim imobil 0.01 0.02 0.03 0.04 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Ak ti vi tas L ip as e (U) Suhu  ( 0 C) 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 A k ti v ita s Li pa se (U ) pH larutan buffer 0 50 100 15 45 75 105 Aktivitas Relatif Lipase Bebas (%) Aktivitas Relatif Lipase Imobil (%) A k tiv it as R ela tif (% ) Waktu pemaparan (menit)
Dalam  penelitian  ini,  digunakan  kondisi optimum  reaksi  enzim  bebas  dan  enzim imobil  dengan  waktu  yang  bervariasi  mulai dari  (15,  45,  75,  dan  105)  menit.  Hasil penelitian  dapat  dilihat  pada  Gambar  3  dan Tabel 1.
Tabel 1 Perbandingan aktivitas enzim bebas dan enzim imobil Waktu (menit) Aktivitas Lipase Bebas (U/mL) Aktivitas Lipase Imobil (U) 15 0.050 0.040 45 0.019 0.023 75 0.013 0.019 105 0.013 0.019
Berdasarkan  Tabel  1,  aktivitas  enzim lipase  bebas  mengalami  penurunan  dalam selang waktu 45 menit dengan aktivitas relatif sebesar  38%  dan  relatif  konstan  pada  selang waktu  75-105  menit  dengan  aktivitas  relatif sebesar  26%,  sedangkan  aktivitas  enzim imobil  mengalami  penurunan  dalam  selang waktu  45  menit  dengan  aktivitas  relatif sebesar  57,50%  dan  relatif  konstan  pada selang  waktu  75-105  menit  dengan  aktivitas relatif  sebesar  47,50%.  Ini  menunjukkan imobilisasi  enzim  menggunakan  matriks karbon  aktif  mampu  meningkatkan  stabilitas enzim  terhadap  waktu  pemanasan  dan perubahan  kondisi  lingkungan  akibat  proses reaksi.
Gambar 4 Uji Stabilitas enzim imobil terhadap penggunaan berulang.

## Uji  Kestabilan  Enzim  Imobil  Terhadap Penggunaan Berulang
Uji  Stabilitas  enzim  imobil  terhadap penggunaan berulang dilakukan untuk mengetahui  efektifitas  operasional  enzim lipase dedak padi yang diimobilisasi menggunakan  matriks  karbon  aktif  di  dalam penelitian  ini,  enzim  imobil  digunakan sebanyak  lima  kali.  Hasil  penelitian  dapat dilihat pada Gambar 4 dan Tabel 2.
Tabel 2 Aktivitas enzim imobil pada penggunaan berulang
Penggunaan Enzim Imobil Aktivitas Lipase (U) 1 0.04 2 0.04 3 0.037 4 0.032 5 0.029 6 0.021 Berdasarkan hasil penelitian pada Tabel  2,  enzim  imobil  sangat  efektif  hingga dua  kali  penggunaan  dengan  aktivitas  relatif 100%  dan  aktivitas  lipase  sebesar  0,040  U, pada  penggunaan  ketiga,  keempat,  kelima, dan  keenam,  aktivitas  enzim  mengalami penurunan  yaitu  92,5%,  80%,  72,5%  dan 52,5%  yang  disebabkan  karena  terlepasnya ikatan Van  Der  Waals antara  gugus-gugus hidrofobik enzim dengan matriks karbon aktif (Dali,  2010).  Ini  menunjukkan  bahwa  enzim lipase  dedak  padi  yang  diimobilisasi  dengan menggunakan  matriks  karbon  aktif  efektif untuk digunakan dalam skala industri.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh  maka dapat disimpulkan sebagai berikut:
1. Enzim  lipase  imobil  memiliki  suhu optimum  50 o C  dan  pH  optimum  6,5 dengan aktivitas lipase sebesar 0,040 U.
2. Enzim  lipase  imobil  memiliki  stabilitas termal yang lebih tinggi dari enzim bebas yakni  dengan  memiliki  aktivitas  relatif sebesar  57,50%  pada  waktu  pemaparan 45  menit  dan  47,50%  pada  waktu pemaparan 75-105 menit.
0 20 40 60 80 100 0 1 2 3 4 5 6 A k tiv it as R ela tif (% ) Jumlah penggunaan berulang
3. Enzim  lipase  imobil  dapat  digunakan sebanyak  6  kali  dengan  aktivitas  relatif sebesar 52,5% pada 6 kali penggunaan.

## DAFTAR PUSTAKA
Bintang  M;  Panji  T;  Saadah  S,  2015, Imobilisasi  Lipase Rhizopus  oryzae pada Zeolit,  CaCO 3 ,  Silika  Gel,  dan  Tulang Sapi, Current  Biochemistry, Volume  2 (2): 54 – 63, ISSN: 2355-7877.
Christianasari  R;  Widi  R.K;  Halim  B.A;
Purwanto  M.  G.M.,  2014,  Imobilisasi Enzim  Lipase  Pada  Ca-Bentonit  Serta Apilkasinya Pada Produksi  Asam Lemak Omega-3  Pada  Limbah  Minyak  Ikan, Seminar  Nasional  Bioteknologi  2014, Biotechnological  Approaces  to  Blue Economy Implementation . Dharsono  W;  Oktari  Y.S,  2010, Pembuatan
Biodiesel  Dari  Dedak  Padi  dan  Metanol Dengan  Esterifikasi  In  Situ ,  Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Diponegoro, Semarang. Fitriyana  L.A.,  Soeprodjo,  Kardawati  S., 2012,  Produksi  Biodiesel  Dari  Dedak
Padi  (Rice  Bran)  Melalui  Dua  Tahap Reaksi In-situ , Idn.  J.  Chem.  Sci 1(2), ISSN: 2252-6951.
Murty V.R; Bhat J; Muniswaran P.K.A, 2002, Hydrolysis  of  Rice  Bran  Oil  Using Immobilized  Lipase  in  a  Stirred  Batch Reactor, Biotechnol,  Bioprocess  Eng. 7: 367-370.
Dali  S.,  2010, Studi  Enzim  Lipase  Dari Aspergillus Oryzae Pada Kopra
Berjamur  dan  Pemanfaatannya  Dalam Menghidrolisis  Minyak  Kelapa  Menjadi DAG ,  Disertasi,  Universitas  Hassanudin, Makassar.
Yuneta R;  Saputra S.R, 2010, Pengaruh Suhu Pada  Lipase  Dari  Bakteri  Bacillus Subtilis, Prosiding Kimia FMIPA,
Institut  Teknologi  Sepuluh  November,
Surabaya.