## Pengaruh Variasi Waktu Fiksasi Sediaan Apus Darah Tepi (SADT) pada Pengecatan Giemsa terhadap Morfologi Sel Darah Merah
Abdul Ghofur, Tuti Suparyati, Siti Fatimah
Email: tutisuparyati@gmail.com Akademi Analis Kesehatan Pekalongan, Indonesia Jl. Ade Irma Suryani No.6 Tirto Kabupaten Pekalongan

## Abstrak
Sediaan  Apus  Darah  Tepi  (SADT)  merupakan  slide  yang  salah  satu  permukaannya  dilapisi menggunakan  lapisan  tipis  dari  darah  dan  diwarnai  dengan  pengecatan  giemsa  atau  wright. Sebelum pengecatan, preparat difiksasi dengan methanol (methyl alkohol). Fiksasi berkepanjangan harus  dihindari  karena  methanol  mempengaruhi  pengecatan  selanjutnya  dan  menyebabkan beberapa penghambatan enzim intraseluler. Methanol yang dibiarkan terlalu lama di udara terbuka akan  menguap  (mengalami  penurunan  konsentrasi)  dan  mengandung  air  sehingga  akan mempengaruhi  morfologi  eritrosit.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh  variasi waktu fiksasi SADT pada pengecatan giemsa terhadap morfologi sel darah merah. Jenis penelitian ini adalah eksperimen.  Sampel berjumlah 30 dalam bentuk sediaan apus darah tepi yang dibagi 3 berdasarkan  variasi  waktu  fiksasi  yaitu 3  menit, 5  menit dan 10  menit..  Hasil penelitian pada uji statistic  Chi-Square  didapatkan  nilai  signifikasi  0,00  <  0.05  artinya  ada  perbedaan  bermakna variasi  waktu  terhadap  kualitas  morfologi  sel.  Dan  waktu  fiksasi  yang  paling  baik  dengan  waktu fiksasi 3 menit, pada fiksasi waktu 5 menit masih ditemukan beberapa sel krenasi (Pengerutan sel) dengan kriteria sedang (<3) sedangkan fiksasi dengan waktu 10 menit banyak sekali ditemukan sel krenasi (>3).
Kata kunci : SADT; fiksasi; morfologi sel darah merah.

## Abstract
The  Blood  Smear  is  a  slide  whose  one  of  the  surfaces  is  coated  using  a  thin  layer  of  blood  and stained  with  painting  of  giemsa  or  wright.  Before  painting,  the  preparation  is  fixated  with methanol  (methyl  alcohol).  Prolonged  fixation  should  be  avoided  because  methanol  affects subsequent painting and causes some inhibition of intracellular enzymes. Methanol that is left too long  in  the  open  air  will  evaporate  (decrease  in  concentration)  and  contain  water  so  that  it  will affect erythrocyte morphology. This study aims to find out the effect of variations in sadt fixation time  on  giemsa  painting  on  the  morphology  of  red  blood  cells.  This  type  of  research  is  an experiment.  The sample numbered 30 in the form of peripheral blood smear preparations divided by 3 based on variations in fixation time of 3 minutes, 5 minutes and 10 minutes. The results of the Chi-Square  statistical  test  obtained  a  signification  value  of  0.00  <  0.05  means  that  there  is  a significant difference in time variation in the morphological quality of cells. And the fixation time is best with a fixation time of 3 minutes, at a fixation of 5 minutes still found some crenation cells (cell grinding) with moderate criteria (<3) while fixation with a time of 10 minutes is found a lot of crenation cells (>3).
Keywords : SADT; fixation; morphology of red blood cells.
Jurnal Kebidanan Harapan Ibu Pekalongan
1. Pendahuluan Pemeriksaan hematologi merupakan  salah  satu  pemeriksaan yang dapat digunakan untuk penunjang diagnosis yang berhubungan  dengan  terapi  dan prognosis. (1) Pemeriksaan hematologi terdiri dari pemeriksaan hematologi  rutin  dan  pemeriksaan hematologi  khusus.  Salah  satu prosedur  pemeriksaan  hematologi rutin  yaitu  pemeriksaan  Sediaan Apus Darah Tepi (SADT). (2) Sediaan  Apus  Darah  Tepi (SADT) adalah pemeriksaan mikroskopis  yang  digunakan  untuk mengamati sel darah beserta komponen  lainnya  yang  dapat memberikan  informasi  yang  berarti tentang kondisi hemtologi seseorang.  SADT  layak  untuk diperiksa,  jika  memenuhi  beberapa syarat yang telah ditetapkan. (2)(3)
Sediaan  Apus  Darah  Tepi (SADT)  merupakan  slide  yang salah  satu  permukaannya  dilapisi menggunakan  lapisan  tipis  darah dan  diwarnai  dengan  pengecatan giemsa atau wright. Sebelum pengecatan, preparat terlebih dahulu difiksasi menggunakan methanol  (methyl  alkohol).  Proses fiksasi  bertujuan  untuk  merekatkan apusan  darah  tepi  supaya  tidak terkelupas dari preparat dan menghentikan  proses  metabolisme tanpa mengubah struktur sel. Larutan  fiksasi  yang  tidak  baik karena  mengalami  penguapan  atau penurunan konsentrasi mempengarhi  perubahan  morfologi sel  dan  perlekatan  yang  tidak baik. (4) Berdasarkan  penelitian  yang pernah dilakukan oleh Dian Rachmawati tahun 2016 menunjukkan  bahwa  penguapan larutan  fiksasi  yang  lama  dapat menurunkan  konsentrasi  larutan fiksasi  sehingga  dapat  berpengaruh
terhadap  hasil  makroskopik  dan mikroskopik  SADT. (5) Penelitian lain  yang  dilakukan  oleh  Fatimah Emy  Sholekha  pada  tahun  2018 menunjukan bahwa terdapat perbedaan  bermakna  konsentrasi larutan fiksasi terhadap hasil mikroskopik SADT. (6) Menurut Romanowsky, terdapat  4 macam pengecatan yaitu pengecatan Wright, pengecatan Liesman, pengecatan May Grundwald, dan pengecatan Giemsa.  Menurut  Kiswari,  apusan darah  yang  difiksasi  dan  digenangi methanol  dibiarkan  selama  2-3 menit. (7) Sedangkan menurut Trevor dalam  pengecatan  film  darah,  film darah harus direndam dalam fiksatif yang direkomendasikan untuk teknik  ini  selama  15  menit. (8)
Menurut Barbara J setelah dikering udarakan,  film  darah  difiksasi dengan  Methanol  absolute  selama 10-20 menit. (9) Larutan yang digunakan  untuk  fiksasi  harus sebisa  mungkin  bebas  dari  air (<3%)  atau  biasanya  digunakan larutan absolute. (4)
Proses fiksasi dengan methanol  absolute  selama  lima menit  berfungsi  untuk  membuka dinding sel eritrosit agar cat giemsa dapat masuk sehingga dapat mewarnai  sel  eritrosit.  Methanol yang di biarkan terlalu lama diudara terbuka  akan  menguap  (mengalami penurunan konsentrasi) dan mengandung  air  sehingga  akan mempengaruhi morfologi eritrosit. (10) Waktu  fiksasi  optimal tergantung  dalam  beberapa  faktor dan bervariasi tergantung penggunaan jenis agen fiksatif yang digunakan. (11) Fiksasi berkepanjangan harus dihindari karena reagen mempengaruhi pengecatan selanjutnya dan menyebabkan beberapa penghambatan  enzim  intraseluler. (8)
Jurnal Kebidanan Harapan Ibu Pekalongan
Banyaknya  teori  tentang  lamanya waktu fiksasi memungkinkan terjadinya  variasi  waktu  fiksasi sesuai dengan acuan yang digunakan. Hal ini akan berdampak pada morfologi sel darah merah dan dapat mempengaruhi hasil Pemeriksaan  SADT.  Berdasarkan permasalahan  di  atas,  peneliti bermaksud  melakukan  penelitian tentang  “Pengaruh  Variasi  Waktu Fiksasi  SADT  pada  Pengecatan
Giemsa  Terhadap  Morfologi  Sel
Darah Merah”.
2. Metode Penelitian Jenis penelitian yang digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  eksperimen  yaitu  peneliti memberikan perlakuan waktu fiksasi  terhadap  preparate  SADT sebagai  Subyek  penelitian  Peneliti memberikan perlakuan waktu fiksasi yang berbeda dengan menggunakan methanol  absolute untuk mengetahui pengaruhnya terhadap morfologi sel darah merah. Total sampel yang digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  30  sampel  yang  dibagi menjadi  3  untuk  masing  –  masing variasi  waktu  fiksasi  yaitu  untuk  3 menit,  5  menit  dan  10  menit.  Pada masing-masing
kelompok perlakuan  akan  dilakukan  duplo untuk mendapatkan hasil yang valid dan  akurat.  Pemeriksaan  sampel dilakukan  di  Laboratorium  Klinik AAK  Pekalongan.  Hasil  penelitian diuji  dengan  menggunakan  uji  spss Chi-Square.  Untuk  melihat  adanya pengaruh  dari  variasi  waktu  fiksasi terhadap morfologi sel darah merah.
Pemeriksaan Sampel Sampel  darah  yang  telah diambil dibuat apusan yang kemudian  difiksasi  dengan  beda waktu  3  menit,  5  menit,  dan  10 menit. Kemudian dilanjutkan dengan  pengecatan  giemsa  yang telah diencerkan terlebih  dahulu 20 kali  dengan  larutan  buffer  :  1  tetes giemsa  stok  untuk  setiap  1  ml penyangga.  Pengecatan  dilakukan selama  30-45  menit,  kemudian dibilas  dengan  air  mengalir  dan dikering  udarakan  dalam  posisi vertikal. Setelah sediaan mengering diperiksa dengan mikroskop menggunakan perbesaran kuat dengan penambahan minyak imersi. Pemeriksaan dilakukan dengan melihat adanya Sel Krenasi (Pengerutan  sel)  dengan  kriteria sebagai berikut: Baik (tidak menunjukan adanya kelainan morfologi  sel  krenasi), Sedang (menunjukan  terjadinya  kelainan morfologi sel krenasi yang jumlahnya  <3  sel  krenasi),  Buruk (menunjukan  terjadinya  kelainan morfologi sel (krenasi) yang jumlahnya >3 sel krenasi).
Jurnal Kebidanan Harapan Ibu Pekalongan

## 3. Hasil dan Pembahasan
Tabel 3.1 Hasil Pemeriksaan Morfologi Sel Darah Merah pada Sediaan Apus Darah Tepi Berdasarkan Waktu Fiksasi
No. Sampel Waktu Fiksasi 3 Menit 5 Menit 10 Menit Bk S Br Bk S Br Bk S Br A1    A2    A3    A4    A5    A6    A7    A8    A9    A10    Jumlah 10 - - 8 2 - - 7 3 Keterangan : Bk : Baik (Tidak Terdapat Sel Krenasi) S : Sedang (Terdapat Sel Krenasi < 3) Br : Buruk (Terdapat Sel Krenasi > 3)
Sel Krenasi  :  Kelainan  bentuk  eritrosit  (poikilositosis)  yang  berbentuk    seperti artefak.
Berdasarkan  tabel  3.1  dapat dilihat  dengan  waktu  fiksasi  3 menit  didapatkan  hasil  morfologi seluruhnya baik, pada waktu fiksasi 5  menit  didapatkan  hasil  8  sampel baik  dan  2  sampel  kriteria  sedang
dan  pada  waktu  fiksasi  10  menit didapatkan  hasil  7  sampel  kriteria sedang dan 3 sampel buruk.
Tabel  3.2.  Hasil  Persentase  Kualitas  Morfologi  Sel  darah  Merah  pada    SADT Berdasarkan Waktu Fiksasi
Waktu Fiksasi Baik Sedang Buruk Total 3 Menit 100 % 0 % 0 % 100 % 5 Menit 80 % 20 % 0 % 100 % 10 Menit 0% 70% 30% 100 %
Jurnal Kebidanan Harapan Ibu Pekalongan
Berdasarkan  tabel  3.2  di  atas,
persentase hasil berdasarkan kualitas    pada    waktu  fiksasi  3 menit didapatkan 100% hasil sampel  baik,  pada  waktu    fiksasi  5 menit  didapatkan    80%  sampel memiliki  kualitas  sedang  dan  20% berkualitas  sedang  dan  pada  waktu fiksasi  10  menit  didapatkan  hasil 70% sampel berkualitas sedang dan 30% berkualitas buruk.
Berdasarkan pengamatan sediaan  apus  darah  tepi  secara mikroskopis  didapat  hasil  terbaik pada waktu fiksasi 3 menit. Hal ini relevan  dengan  teori  yang  ada menurut  Kiswari,  apusan  darah yang difiksasi dan digenangi methanol  dibiarkan  selama  2-3 menit. (3) Pada waktu fiksasi 3 menit tidak  ditemukan  sel  krenasi  pada hasil  SADT,  morfologi  sel  darah merah  baik  dengan  bentuk  bentuk cakram  bikonkaf,  tidak  berinti, tidak  bergerak,  memiliki  diameter sekitar  7,5  mikron  dan  tebal  2,0 mikron  dan  central  pallor  1/3 bagian sel darah merah. Pada waktu fiksasi  5  menit  di  temukan  sel krenasi pada 2 preparat. Sedangkan pada  waktu  fiksasi  10  menit ditemukan lebih banyak sel krenasi.
Hampir diseluruh SADT di temukan sel krenasi yang jumlahnya  kurang  dari  3  bahkan didapati sel krenasi yang jumlahnya lebih dari 3 pada beberapa preparat. Hasil uji Chi- square Test didapatkan  nilai  Sig.  (P  Value) sebesar  0,000<0,05  yang  berarti terdapat  pengaruh  variasi  waktu fiksasi  SADT  pada  pengecatan giemsa terhadap hasil morfologi sel darah  merah.  Hal  ini  terjadi  karena larutan  fiksasi  yang  telah  menguap membuat  volume  larutan  menurun sehingga  bersifat  hipertonis.  Sel darah  yang  dimasukan  kedalam larutan  hipertonis  menyebabkan tekanan  osmosis  akan  terjadi  dari
dalam  sel  keluar  sel  yang  akan mengakibatkan sel mengalami krenasi (pengerutan). (12)
Sel  Krenasi  adalah  kelainan bentuk eritrosit (poikilositosis) yang  berbentuk  seperti  artefak. Suhu yang panas bisa mengakibatkan membran sel eritrosit pecah sebagai akibatnya sel mengalami pengerutan yang disebut krenasi akibat cairan yang berada di dalam sel keluar melalui membran. (13) Morfologi krenasi bisa disebabkan  oleh  beberapa  faktor, seperti  terjadinya  kesalahan  dalam prosedur pemeriksaan pra- analitik. (2) Fiksasi bertujuan untuk menghentikan  proses  metabolisme secara  cepat,  mencegah  kerusakan jaringan, dan mempertahankan keadaan  sel  sebenarnya  sehingga struktur sel didalamnya tetap normal  dan  mampu  menyerap  cat dengan  baik.  Fiksasi  yang  tidak baik dapat menyebabkan perubahan morfologi  sel  dan  warna  sediaan. Hal  ini  dapat  terjadi  apabila  fiksasi dilakukan  menggunakan  methanol yang  tidak  absolute  dikarenakan telah menguap dan memiliki kandungan air>3% sehingga larutan menjadi hipertonis. (4) Hasil penelitian sejalan dengan penelitian terdahulu  yang  dilakukan  oleh Koko  Putro  Pamungkas  dengan judul “Gambaran Morfologi Eritrosit dengan Perbandingan Lama  Fiksasi”  dengan  waktu  5 menit dan lebih dari 5 menit dengan hasil semakin lama sel krenasi akan semakin  banyak.  (Pamungkas  KP,
2014) Dan penelitian yang dilakukan  oleh  Dian  Rachmawati dengan  judul  “Pengaruh  Lama Penguapan Larutan Fiksasi Terhadap  Hasil  Makroskopis  Dan Mikroskopis  Sediaan  Apus  Darah Tepi”  dengan  waktu  fiksasi  segera,
10,  20  dan  30  menit  hasilnya
Jurnal Kebidanan Harapan Ibu Pekalongan
semakin  lama  semakin  terjadi  sel krenasi. (Rachmawati D, 2018). Hal ini  membuktikan  bahwa  semakin lama waktu fiksasi akan menyebabkan  kelainan  ukuran  sel yang ditandai dengan ditemukannya sel  krenasi  dalam  sediaan  apus darah  tepi  yang  difiksasi  lebih lama.

## 4. Kesimpulan
Hasil  penelitian  membuktikan bahwa berdasarkan Hasil pengujian Chi  Square  didapatkan  nlai  p sebesar  0,000  (<0,05)  sehingga dapat dinyatakan terdapat pengaruh variasi  waktu  fiksasi  SADT  pada pengecatan giemsa secara signifikan  terhadap  hasil  morfologi sel  darah  merah.  Berdasarkan  hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa waktu fiksasi yang paling baik yaitu 3 menit  karena tidak ditemukan sel krenasi, pada waktu fiksasi 5 menit masih terdapat beberapa sel krenasi (<3).  Sedangkan  waktu  fiksasi  10 menit    terdapat  banyak  sel  krenasi (>3).

## 5. Daftar Pustaka
[1] Dekayana  A.  Hitung  Laju
Endap Darah (Led). Ponorogo: Uwais Inspirasi Indonesia; 2019.
[2] G  N.  Panduan  Pemeriksaan Laboratorium Hematologi Dasar.  Jakarta:  Cv.  Trans  Info Media; 2015. [3] Kiswari  R. HEMATOLOGI  &
TRANSFUSI. Carolina S, Astikawati  R,  editors.  Jakarta: Erlangga; 2014. [4] Houwen B. Blood Film Preparation And Staining Procedures [Internet]. Lab Hematol. 2002. p. 1–14. Available from: http://mmserver.cjp.com/Gems /Blood/Lh.6.1.Houwen.Pdf [5] Rachmawati D. Pengaruh Lama Penguapan Larutan Fiksasi Terhadap Hasil Makroskopis Dan Mikroskopis Sediaan  Apus  Darah  Tepi. Universitas Muhammadiyah Semarang; 2016. [6] Sholekha Fe. Pengaruh Konsentrasi  Larutan  Fiksasi Terhadap  Hasil  Makroskopis Dan Mikroskopis Sediaan Apus  Darah  Tepi.  Universitas Muhammadiyah Semarang; 2018. [7] Wirawan R. Pemeriksaan Laboratorium Hematologi. Jakarta: Dept. Patologi Klinik - FKUI; 2011. [8] Harper  Ta.  The  Peripheral Blood Film. London: Butterworths & Co. Ltd; 1974. [9] Bain  Bj.  Blood  Cells :  A Practical Guide. Australia: Blackwell  Publishing  Asia  Pty Ltd; 2014.
[10] Pamungkas  Kp.  Gambaran Morfologi  Eritrosit  Dengan Perbandingan  Lama  Fiksasi.  J Food Syst Res. 2014;14(2):70–
5. [11] Musyarifah  Z  AS.  Proses Fiksasi Pada Pemeriksaan Apus Darah. J Kesehat Andalas. 2018;7(3):443.
Jurnal Kebidanan Harapan Ibu Pekalongan
[12] Warsita  N,  Fikri  Z  AP.
Pengaruh  Lama  Penundaan Pengecatan  Setelah  Fiksasi Apusan  Darah  Tepi  Terhadap Morfologi  Eritrosit.  J  Anal Med Biosains. 2019;6(2):125. [13] Masters.  Farmakologi  Dasar Dan  Klinik  Katzing:  Alkohol. Jakarta: Salemba Medika; 2002.