Penentuan Sensitivitas dan Spesifisitas Kit PRIME-CYTO untuk Deteksi Kandungan Babi dengan Metode Polymerase Chain Reaction
Aulia Syalwa Iskandar, Dina Safitri, Bevi Lidya, Sinta Setyaningrum *

## Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri Bandung, 40559, Indonesia

## ABSTRAK
Indonesia  merupakan  negara  dengan  mayoritas  penduduk  beragama  Islam.  Dalam  syariat Islam,  terdapat  larangan  mengkonsumsi  produk  non-halal,  di  antaranya  produk  yang mengandung babi. Gen cytochrome b pada babi terpilih sebagai gen pengkode spesies babi dengan bantuan metode analisis Polymerase Chain Reaction (PCR). Penelitian ini dilakukan untuk  mengetahui  sensitivitas  dan  spesifisitas  kit  PRIME-CYTO  (Gabungan  antara Green Master Mix dan primer CYTB- Full untuk PCR konvensional; gabungan qPCR Master Mix dan primer  CYTB- Full untuk real-time PCR)  untuk  deteksi  kandungan  gen cytochrome  b  (cyt  b) babi.  Hasil  penelitian  menunjukkan  kit  PRIME-CYTO  sensitif  terhadap  gen cyt  b babi  pada metode  PCR  konvensional  dan real-time PCR.  Persentase  sensitivitas  dan  spesifisitas  kit dengan metode PCR konvensional berturut-turut adalah 100% dan 100%; pada real-time PCR adalah  85%  dan  10%.  PCR  konvensional  dapat  mendeteksi  isolat  DNA  daging  babi  hingga kadar minimal  3  ng/μL ;  pada  isolat  DNA  sosis  babi  hingga  kadar  minimal  10 -7 ng/μL. Penggunaan Master  Mix dengan probe disarankan  untuk  meningkatkan  spesifisitas  pada metode real-time PCR.
Keywords: Sensitivitas, spesifisitas, kit, real-time PCR, PCR konvensional, cyt b
© 2023 Pusat Kajian Halal ITS. All rights reserved.

## 1 Pendahuluan
Indonesia  merupakan  negara  yang  mayoritas  penduduknya  beragama  Islam.  Indonesia bahkan  menduduki  peringkat  ke-1  sebagai  negara  dengan  penduduk  beragama  Islam terbanyak berdasarkan Muslim Population by Country 2021 dalam World Population Review . Berdasarkan  data  Direktorat  Jenderal  Kependudukan  dan  Pencatatan  Sipil  (Dukcapil) Kementerian  Dalam  Negeri,  sebanyak  236,53  juta  (86,88%)  dari  272,23  juta  penduduk Indonesia (Juni 2021) beragama Islam. Terdapat beberapa larangan bagi umat Islam, salah satunya adalah bahwa umat Islam dilarang mengonsumsi daging babi [1]. Hal ini dijelaskan dalam  Fatwa  Majelis  Ulama  Indonesia  (MUI)  tentang  Penetapan  Produk  Halal.  Selain  itu, pemerintah Indonesia juga mengupayakan perlindungan terhadap masyarakat muslim terkait peredaran  produk  yang tidak halal  dengan  adanya  Undang-Undang Nomor  33 Tahun  2014 tentang Jaminan Produk Halal. Hasil dari penerapan Undang-Undang ini adalah BPJPH (Badan Penyelenggara  Jaminan  Produk  Halal)  menerbitkan  Sertifikat  Halal  terhadap  suatu  produk berdasarkan keputusan Penetapan Halal Produk dari MUI.
*Corresponding author. Tel: 081809004024; Fax: Email address: sinta.setyaningrum@polban.ac.id
Dalam  daging  babi  pun  terdapat  sejenis  cacing  berbahaya Taenia  solium dan Trichinella spiralis yang  dapat  menimbulkan  penyakit  parasit  pada  manusia. Taenia  solium dapat menyebabkan  dua  infeksi,  yakni  taeniasis  yang  disebabkan  oleh  cacing  dewasa,  serta sisterkosis  yang  disebabkan  oleh  larva  cacing[3].  Sedangkan Trichinella  spiralis merupakan cacing  yang  menyerang  otot  manusia  dan  dapat  menyebabkan  beberapa  penyakit, encephalopathy , gangguan neuromuscular , serta lesi okuler [4].
Terdapat beberapa metode analisis untuk mendeteksi adanya kandungan babi, baik berupa lemak, protein, dan Deoxyribonucleic Acid (DNA) [5]. Metode analisis berdasarkan pada DNA dapat  dilakukan  dengan  metode  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR).  Metode  ini  banyak digunakan untuk mendeteksi cemaran daging babi pada suatu produk pangan karena dinilai lebih  stabil  [6].  Untuk  mengoptimalkan  sensitivitas  dan  spesifisitas,  gen  pengkode  yang digunakan harus dapat dengan spesifik membedakan spesies satu dengan yang lainnya. Gen cyt  b dapat  membedakan  DNA  yang  berasal  dari  jenis  hewan  yang  berbeda  [7].  Hal  ini dikarenakan  gen cyt  b terdapat  pada  mitokondria  hampir  seluruh  mamalia  dan  bersifat polimorfik,  walaupun  terkait  erat,  tetap  dapat  dibedakan  [8].  Beberapa  penelitian  telah menggunakan gen cyt b untuk mendeteksi kandungan babi ([9]; [10], dan [11]).
Dalam metode PCR, dibutuhkan suatu primer yang dapat mengamplifikasi DNA spesies yang dituju  secara  spesifik  dan  sensitif.  Pada  penelitian  [11],  dihasilkan  suatu rancangan primer yang dapat mengamplifikasi gen cyt b babi secara spesifik, yaitu primer CYTB- Full . Primer yang dikombinasikan dengan Green Master Mix untuk PCR konvensional ini secara spesifik hanya dapat mengamplifikasi gen cyt b babi dan tidak dapat mengamplifikasi DNA ayam dan sapi. Setelah diketahui bahwa primer CYTB- Full spesifik terhadap gen cyt b babi, perlu diketahui juga besaran sensitivitas dan spesifisitas dari kit deteksi gen cyt b babi (PRIME-CYTO) yang merupakan kombinasi antara primer CYTB- Full perancangan dari [11] dengan Green Master Mix untuk PCR konvensional dan qPCR Master Mix untuk pengujian dengan Real Time PCR. Besaran  spesifisitas  menunjukkan  proporsi  subjek  yang  negatif  menurut  standar  yang diidentifikasi sebagai negatif benar ( true negative ). Sedangkan sensitivitas ini menunjukkan proporsi subjek yang positif menurut standar yang diidentifikasi sebagai positif benar ( true positive ) [12].
Selain  dilakukan  menggunakan  metode  PCR  konvensional,  deteksi  gen cyt  b babi  dapat dilakukan juga menggunakan metode real-time Polymerase Chain Reaction ( real-time PCR), primer CYTB- Full ini dikombinasikan dengan qPCR Master Mix . Salah satu keunggulan metode real-time PCR, DNA yang teramplifikasi dapat diamati secara langsung tanpa perlu dilakukan analisis  menggunakan  gel  elektroforesis  [13].  Terdapat  beberapa  penelitian  yang menggunakan  metode real-time PCR  untuk  analisis  kandungan  babi  dalam  sampel  produk industri  ([13];  [14];  [15];  dan  [16]).  Dalam  penelitian  [16]  metode real-time PCR  spesifik terhadap gen cyt b babi, serta memiliki batas deteksi absolut sebesar 0,05 ng/µL. real-time PCR digunakan pula untuk menguji banyak sampel dengan waktu yang singkat pada penelitian [14].
Berdasarkan pemaparan di atas, dilakukan penentuan sensitivitas dan spesifisitas kit deteksi kandungan  babi  PRIME-CYTO  yang  merupakan  kombinasi  antara  primer  CYTB- Full dengan Green Master Mix (untuk PCR konvensional) dan qPCR Master Mix (untuk real-time PCR).

## 2 Bahan dan Metode

## 2.1 Alat dan Bahan
Persiapan alat dalam penelitian ini meliputi alat gelas dan alat instrumen, yakni gelas kimia, gelas ukur, mortar dan alu, spatula, neraca analitik, lemari pendingin, stopwatch , microwave ,
Quantus ™ Fluorometer , microsentrifuge  tube 1,5  mL,  PCR tube 0,5  mL, vortex , sentrifuge , mikropipet,  tip, comb elektroforesis, tray elektroforesis,  tangki  elektroforesis, UV transilluminator ,  mesin  PCR  (miniPCR),  Mesin real-time PCR  (MyGo  Pro),  serta Bio  Safety Cabinet level 2.
Pada penelitian ini, bahan yang digunakan adalah daging babi, daging sapi, daging ayam, sosis sapi, sosis ayam, sosis babi, Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega), Primer Forward dan Reverse CYTB- Full ,  aquades,  agarosa  bubuk,  larutan buffer TAE  1X,  etanol  70%, isopropanol, pewarna DNA blue/orange loading dye , Diamond Nucleic Acid Dye , DNA ladder 1 kb, kertas parafilm, GoTaq® Green Master Mix , GoTaq® qPCR Master Mix , QuantiFluor® ONE dsDNA Dye , QuantiFluor® ONE Lambda DNA Standard (400 µg/mL), nuclease free water , tisu, label, masker, dan sarung tangan lateks.

## 2.2 Metode

## Isolasi DNA Sampel
Sebanyak 100 mg sampel dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube 1,5 mL serta ditambah 600 µL nuclei lysis solution , lalu dihomogenkan dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 65 ℃ .  Sampel  yang  telah  diinkubasi  ditambahkan  3  µL  larutan  RNase  dan  dihomogenkan dengan cara dibolak-balik selama 3 menit. Sampel diinkubasi kembali selama 15 menit pada suhu  37 ℃ .  Sampel  didiamkan  sampai  mencapai  suhu  kamar.  Masing-masing tube sampel ditambahkan 200 µL protein precipitation solution lalu dihomogenkan menggunakan vortex selama 20 detik. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama 4 menit. Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ke tube microsentrifuge 1,5 mL bersih yang sebelumnya sudah diisi dengan isopropanol sebanyak 600 µL. Tabung disentrifugasi selama 1 menit pada suhu kamar dengan kecepatan  13.000  rpm.  Supernatan  dari  tabung  dibuang  dengan  hati-hati  lalu pellet yang terdapat  di dasar tube ditambahkan  600  µL  etanol  70%.  Sentrifugasi  selama  1  menit pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu kamar. Ambil etanol dari tube dengan hati-hati, sisa etanol dikeringkan  dengan  cara  membalikkan tube di  atas  tisu  bersih. Pellet dikeringkan  di  udara selama 15 menit. Kemudian tambahkan 100 µL DNA Rehydration Solution dan inkubasi pada 4 ℃ semalaman. Isolat DNA disimpan pada suhu 2-8 ℃ .

## Karakterisasi Isolat DNA Menggunakan Elektroforesis
Sebanyak 0,5 g serbuk agarosa ditimbang dalam gelas kimia. Kemudian ditambahkan 50 mL larutan buffer TAE 1x,  lalu  dipanaskan  dengan microwave selama  2  menit  sampai  padatan agarosa larut dan bening. Larutan agarosa yang sudah larut sempurna kemudian didiamkan di suhu ruang sampai suhu ± 60 ℃ . Tray dan comb dibersihkan terlebih dahulu menggunakan larutan  etanol  70%.  Larutan  agarosa  dituangkan  ke  dalam tray ,  lalu  dipasang comb untuk pembentukan  ‘sumur’  pada  gel  agarosa .  Gel  dibiarkan  hingga  mengeras  (25-30  menit), kemudian lepas comb secara perlahan.
Tray yang berisi gel agarosa ditempatkan dalam tangki elektroforesis. Larutan buffer TAE 1x dimasukkan ke dalam tangki setinggi ± 1 mm di atas permukaan gel atau sampai permukaan gel tenggelam. Sebanyak 5 μL DNA hasil isolasi diletakkan di atas kertas parafilm dan dicampur dengan  1  μL blue/orange  loading  dye lalu  dihomogenkan.  Kemudian,  campuran  larutan dimasukkan  ke  dalam  ‘sumur’  gel  agarosa,  setiap  sumur  berisi  larutan  DNA hasil  isolasi. Selanjutnya,  dimasukkan  sebanyak  5  μL  DNA ladder 1  kb  ke  dalam  salah  satu  ‘sumur’  gel agarosa. Setelah semua ‘sumur’ terisi, tangki elektroforesis ditutup. Pada proses karakterisasi ini digunakan gel agarosa 1% menggunakan buffer Tris Asetat EDTA (TAE) 1X pada tegangan 100  V  selama  25  menit.  Setelah  proses  elektroforesis  selesai,  padamkan  listrik  dan tray
dikeluarkan dari tangki elektroforesis. Lakukan pewarnaan gel dengan 7,5 μL DNA Diamond Nucleic Acid Dye menggunakan 75 mL buffer TAE 1X dengan proses perendaman selama satu jam.  Selanjutnya  elektroforegram  divisualisasi  menggunakan  alat UV  transilluminator kemudian didokumentasikan.

## Penentuan Konsentrasi Isolat DNA
Pengukuran  konsentrasi  DNA  sampel  daging  babi  dilakukan  menggunakan  Quantus ™ Fluorometer .  Sebelum  melakukan  pengukuran  konsentrasi  sampel,  alat  dikalibrasi  dengan larutan  blanko  yang  berisi  200  µL  QuantiFluor®  ONE  dsDNA Dye dalam  PCR tube 0,5  mL. Selanjutnya,  alat  distandarisasi  dengan  200  µL  QuantiFluor®  ONE  dsDNA Dye dan  1  µL QuantiFluor®  ONE Lambda DNA Standard (400  µg/mL).  Kemudian  sampel  sebanyak  2  µL dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube 0,5 mL yang sebelumnya sudah diisi dengan 200 µL QuantiFluor® ONE dsDNA Dye .

## Penentuan Batas Deteksi
Pada penentuan batas deteksi, isolat DNA sampel diencerkan dengan aquadest pada faktor pengenceran sebesar 10, 100, 1.000, 10.000 untuk penentuan sensitivitas dan batas deteksi. Selanjutnya lakukan lagi pengenceran pada batas deteksi yang didapatkan dari pengenceran sebelumnya dengan variasi konsentrasi yang lebih rapat. Perbanyakan seri pengenceran ini dapat meningkatkan ketelitian batas deteksi.

## Analisis Sampel dengan PCR Konvensional
Dibuat komposisi untuk 25 μL reaksi PCR yang disajikan pada Tabel 1.

## Tabel 1. Persiapan komponen PCR konvensional
Komponen Volume ( 𝝁 l) Nuclease Free Water 7,5 GoTaq® Green Master Mix 12,5 Primer Reverse 100 μM 1,25 Primer Forward 100 μM 1,25 DNA Template 2,5 Volume Total 25
Komponen  yang  telah  dicampur  kemudian  ditempatkan  dalam  alat  PCR  konvensional  lalu proses  PCR  dijalankan  dengan  menggunakan  program  berdasarkan  literatur  [11].  Program PCR ini dijalankan sebanyak 30 siklus yang meliputi tahap denaturasi, annealing , dan elongasi. Pengaturan untuk program PCR disajikan dalam Tabel 2.
Tabel 2. Pengaturan program PCR konvensional
Tahapan Suhu ( ℃ ) Waktu (s) Pra-Denaturasi 93 180 Denaturasi 93 60 Annealing 46 30 Elongasi 72 90 Elongasi Final 72 180

## Number of cycles 30
Identifikasi hasil PCR konvensional dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%, lalu didokumentasikan.
Analisis Sampel dengan Real-time PCR
Komposisi untuk real-time PCR disajikan dalam Tabel 3.
Tabel 3. Persiapan komponen real-time PCR Komponen Volume ( 𝝁 l) GoTaq® qPCR Master Mix 10 Primer Reverse 100 μM 0,5 Primer Forward 100 μM 0,5 Nuclease Free Water 9,0 Volume Total 20
Kemudian tambahkan 2,5 DNA template . Well ditutup menggunakan sealing plastic atau caps untuk PCR tube , kemudian spin down untuk menurunkan larutan di bawah tube . Well PCR tube dimasukkan  ke  dalam  mesin real-time PCR  dan  atur  penamaan  sampel  serta  semua parameter yang diperlukan. Pengaturan program real-time PCR dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Pengaturan program real-time PCR Tahapan Suhu ( ℃ ) Waktu (s) GoTaq® Hot Start Polymerase activation 95 120 Denaturasi 95 15 Annealing- extention 60 60

## Number of cycles 40

## 3 Hasil dan Pembahasan

## Isolasi DNA Sampel
Isolasi  DNA  adalah  serangkaian  proses  yang  dilakukan  untuk  memisahkan  DNA  dari komponen-komponen sel seperti lipid, protein, dan RNA  [17]. Isolasi DNA bertujuan untuk mengambil  DNA  dari  sampel  yang  dituju.  Pada  penelitian  ini,  dilakukan  isolasi  DNA  pada sampel  daging  dan  sosis  dari  sapi,  ayam,  dan  babi.  Pemilihan  jenis  sampel  berupa  daging dilakukan karena jumlah mitokondria yang terdapat pada jaringan otot lebih banyak daripada jaringan  yang  lain.  Otot  merupakan  komponen  utama  dalam  daging.  Besarnya  jumlah mitokondria pada otot berkaitan dengan tingkat aktivitas gerak pada jaringan otot yang lebih tinggi daripada jaringan lainnya karena diperlukan suplai energi yang besar. Suplai energi yang besar ini mampu disokong oleh jumlah mitokondria yang banyak. Jumlah mitokondria yang banyak dapat mempermudah proses isolasi DNA [18].
Prinsip dalam proses isolasi DNA meliputi proses lisis pada sel, ekstraksi, dan pengendapan [19]. Seiring dengan perkembangan teknologi, saat ini sudah beredar berbagai kit pengisolasi DNA,  di  antaranya  pada  penelitian  ini  digunakan  kit  komersial  Wizard® Genomic DNA
Purification Kit (Promega). Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) yang digunakan memiliki prinsip salting out (penambahan garam), yaitu dapat mengganggu ikatan hidrogen molekul DNA [20].
Dalam penelitian ini, jenis sampel yang digunakan adalah daging sapi, daging ayam, daging babi,  sosis  sapi,  sosis  ayam,  dan  sosis  babi.  Daging  yang  akan  diisolasi  dihaluskan  terlebih dahulu untuk  memperkecil  ukuran  serta  membantu  proses penghancuran  jaringan  sel dan lisis. Proses lisis kemudian dilanjutkan dengan penambahan larutan nuclei lysis solution yang berfungsi untuk menghancurkan membran nukleus sel, sehingga DNA keluar dari dalam inti sel.
Selanjutnya,  dilakukan  penambahan  RNAse  yang  bertujuan  untuk  mempercepat  proses penghilangan RNA yang terkandung di dalam sampel. RNAse merupakan enzim yang memiliki sifat  menghidrolisis  ikatan  diester  yang  menghubungkan  residu  fosfat  dan  ribosa.  Aktivasi RNAse ini terjadi pada suhu 37 ℃ [21].
Kemudian, dilakukan penambahan protein precipitation solution . Larutan ini berfungsi untuk mengendapkan  dan  memisahkan  senyawa  protein  [20].  Lalu,  dilakukan  sentrifugasi  yang memiliki  prinsip  memisahkan  molekul  berdasarkan  massa  jenisnya.  Pemisahan  ini menghasilkan  dua  bagian  pada  tabung  sentrifugasi  di  antaranya  supernatan  dan pellet . Supernatan merupakan bagian yang berada di atas dan berbentuk cairan, sedangkan pellet merupakan endapan yang terdapat pada dasar tabung sentrifugasi [22]. Pada proses ini, DNA berada  dalam  bentuk  supernatan,  sedangkan pellet merupakan  kumpulan  dari  lemak, protein, dan senyawa lain yang ada di dalam sel.
Tahap  selanjutnya,  dilakukan  proses  pengendapan  DNA.  Proses  ini  dilakukan  dengan  cara penambahan  larutan  isopropanol  yang  berfungsi  untuk  menarik  air  dan membentuk pellet DNA. Proses pengendapan ini terjadi karena fenomena penurunan kelarutan DNA di dalam air. Muatan positif yang terdapat pada air berikatan secara kuat dengan muatan negatif yang terdapat pada gugus fosfat DNA sehingga DNA larut dalam air, sedangkan isopropanol lebih tidak  polar  bila  dibandingkan  dengan  air,  maka  molekul  isopropanol  tidak  dapat berikatan dengan gugus fosfat DNA. Hal ini menyebabkan isopropanol tidak dapat melarutkan DNA [23]. Kemudian, dilakukan sentrifugasi dan menghasilkan dua bagian pada tabung centrifuge , yaitu supernatan dan pellet . Pada proses ini, DNA terpisah menjadi pellet .
Supernatan dibuang, kemudian pellet DNA dimurnikan dengan menggunakan larutan etanol 70%.  Setelah  disentrifugasi  dan  dikeringkan, pellet DNA  kemudian  dihidrasi  dengan  DNA rehydration  Solution .  Isolat DNA  disimpan  pada suhu  4 ℃ untuk  selanjutnya  dikarakterisasi dengan menggunakan elektroforesis.

## Karakterisasi Isolat DNA Menggunakan Elektroforesis
Elektroforesis  adalah  teknik  analisis  pemisahan  DNA  atau  protein  berdasarkan  pergerakan molekul-molekul bermuatan di dalam suatu medan listrik. Pergerakan molekul pada medan listrik dipengaruhi  oleh ukuran, bentuk,  dan  besar  muatan  dari  molekul DNA  atau  protein. Pada  analisis  ini  digunakan marker atau  penanda  untuk  mengetahui  ukuran  DNA  hasil amplifikasi. Marker yang digunakan, yaitu BenchTop 1 kb DNA Ladder . Marker ini merupakan fragmen  DNA  yang  ukurannya  telah  diketahui  dengan  jelas,  yaitu  1  kb  (kilo base )  dengan ukuran pita yang dihasilkan berkisar 100 – 10.000 bp ( base pair ).
Gambar 1. Elektroforegram DNA hasil isolasi.
Keterangan:
1. Marker (1kb)
2. DNA Daging Sapi
3. DNA Sosis Sapi 4. DNA Daging Ayam
5. DNA Sosis Ayam 6. DNA Daging Babi
7. DNA Sosis Babi
Elektroforegram hasil isolasi DNA (Gambar 1) menunjukkan terdapat pita-pita DNA, namun beberapa masih tampak smear . Pada daging sapi, daging ayam, dan daging babi diperoleh kedua hasil isolasi menghasilkan pita DNA yang cukup jelas. Sedangkan pada hasil isolasi sosis sapi  dan  sosis  babi  pita  hanya  muncul  di  salah  satu  hasil  isolasi.  Pada  sosis  ayam,  tidak terbentuk pita yang jelas. Keseluruhan hasil elektroforesis ini menghasilkan pita yang smear . Pita smear dihasilkan karena terdapat residu dari senyawa lain yang masih terbawa selama proses isolasi. Pita pada elektroforegram ini menunjukkan bahwa isolasi DNA dari daging dan sosis sudah berhasil [24].

## Penentuan Konsentrasi Isolat DNA
Penentuan  konsentrasi  DNA  dilakukan  menggunakan  Quantus ™ Fluorometer .  Metode  ini sangat sensitif, memberikan deteksi biomolekuler pada sensitivitas hingga 0,0005 nanogram per  mikroliter  (ng/μL).  Fluorometri  juga  memberikan  deteksi  eksklusif  untuk  analit  yang diinginkan,  menghilangkan  ketidakakuratan  pengukuran  yang  disebabkan  oleh  kontaminan atau elemen yang tidak diketahui dalam sampel. Konsentrasi yang tidak diketahui kemudian dapat  dikuantifikasi  secara  matematis  terhadap  intensitas  fluoresens  dari  biomolekul  [25]. Hasil  dari  penentuan  konsentrasi  DNA  menggunakan  Quantus ™ Fluorometer ditunjukkan pada Tabel 5.
Tabel 5. Hasil penentuan konsentrasi DNA menggunakan Quantus ™ Fluorometer
No. Jenis Sampel Konsentrasi (ng / 𝛍𝐋 ) 1 Daging Sapi 78 2 Sosis Sapi 26 3 Daging Ayam 114 4 Sosis Ayam 27 5 Daging Babi 30 6 Sosis Babi 100

## Penentuan Batas Deteksi
Penentuan batas deteksi dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terkecil DNA yang dapat terdeteksi oleh kit. Penentuan batas deteksi ini dilakukan terhadap sampel daging babi dan sosis babi. Langkah pertama, dilakukan terlebih dahulu pengenceran pada sampel daging babi dengan variasi konsentrasi 30; 3; 0,3; dan 0,03 ng/μL. Tujuan dari pengenceran ini, yaitu untuk mengurangi jumlah kandungan DNA secara bertahap dalam sampel dari variasi konsentrasi yang telah dibuat sehingga dapat diketahui konsentrasi terkecil yang dapat dideteksi.
(a) (b)
Gambar 2. Deret pengenceran batas deteksi pada isolat DNA dari daging babi (a)
pertama, (b) kedua
Keterangan:
(a) Pengenceran pertama ( ng/ μL ) (b) Pengenceran kedua ( ng/ μL)
1. 30
2. 3 3. 0,3 4. 0,03
5. Marker 1kb 1. 2 2. 1 3. 0,9
4. 0,8
5. 0,7 6. 0,6
7. 0,5 8. 0,4 9. Marker 1kb
Berdasarkan elektroforegram pada Gambar 2. (a), pita pengenceran isolat DNA daging babi hanya muncul pada konsentrasi 30 dan 3 ng/μL. Untuk meningkatkan ketelitian batas deteksi dari kit ini, dilakukan pengenceran kembali dengan variasi konsentrasi yang dibuat, yaitu 2; 1; 0,9;  0,8;  0,7;  0,6;  0,5;  dan  0,4  ng/μL.  Berdasarkan  Gambar  2.  (b),  pada  seluruh  deret konsentrasi tidak terbentuk pita DNA. Berdasarkan hasil tersebut, dapat diketahui bahwa kit PRIME-CYTO menggunakan PCR konvensional sensitif mendeteksi kandungan gen cyt b babi dalam isolat DNA daging babi hingga konsentrasi 3 ng/μL.
Selanjutnya,  pada  isolat  DNA  sosis  babi  dilakukan  pengenceran  dengan  variasi  konsentrasi 100; 10; 1; 0,1; dan 0,01 ng/μL.
(a) (b) (c)
Gambar 3. Deret pengenceran batas deteksi pada isolat DNA dari sosis babi (a)
pertama, (b) kedua, dan (c) ketiga
Keterangan:
(a) Pengenceran pertama
( ng/ μL ) (b) Pengenceran kedua ( ng/ μL ) (c) Pengenceran ketiga ( ng/ μL )
1. Marker 1kb
2. 100
3. 10 4. 1
5. 0,1
6. 0,01
1. Marker 1kb 2. 10 -3 3. 10 -4 4. 10 -5 5. 10 -6 6. 10 -7 1. Marker 1kb 2. 5.10 -4
3. 3,3.10 -4 4. 2,5.10 -4 5. 2.10 -4
Dari  Gambar  3.  (a),  pita  DNA  masih  terbentuk  dengan  jelas  pada  isolat  DNA  sosis  babi konsentrasi  0,01  ng/μL .  Dari  hasil  tersebut,  maka  dapat  dilakukan  peningkatan  ketelitian batas deteksi dengan cara dilakukan pengenceran kembali pada isolat DNA sosis babi dengan variasi konsentrasi, yaitu 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 ng/μL. Berdasarkan Gambar 3. (b), pita DNA hanya  terbentuk  semakin  tipis  pada  konsentrasi  10 -3 ,  10 -4 ,  10 -6 ,  dan  10 -7 ng/μL.  Dari  hasil tersebut juga menunjukkan bahwa semakin kecil konsentrasi DNA yang telah diamplifikasi,
maka pita yang terbentuk akan semakin tipis. Pada konsentrasi 10 -5 ng/μL, tidak terbentuk pita. Hal ini diduga adanya ketidakstabilan hasil PCR pada konsentrasi yang semakin kecil. Oleh karena itu, untuk memastikan kembali konsentrasi terkecil yang dapat terdeteksi oleh kit  PRIME-CYTO  secara  akurat,  dilakukan  pengenceran  lebih  lanjut  pada  deret  konsentrasi 5.10 -4 ; 3,3.10 -4 ; 2,5.10 -4 ; dan 2.10 -4 ng/μL. Berdasarkan elektroforegram pada Gambar 3. (c), dapat  dilihat  bahwa  pita  DNA  tidak  terbentuk  pada  seluruh  variasi  konsentrasi.  Dari  hasil tersebut  dapat  diketahui  bahwa  kit  PRIME-CYTO  hanya  sensitif  dan  stabil  mendeteksi kandungan gen cyt b babi dalam isolat DNA sosis babi minimal pada konsentrasi 10 -3 ng/μL. Pada konsentrasi DNA di bawah 10 -3 ng/μL, hasil yang didapatkan kurang stabil.

## Analisis Sampel dengan PCR Konvensional
Penentuan  sensitivitas  dengan  PCR  konvensional  dilakukan  untuk  memastikan  bahwa  kit PRIME-CYTO  yang  merupakan  kombinasi  antara  primer  CYTB- Full dan Green  Master  Mix dapat mengamplifikasi gen cyt b babi atau tidak.
Penentuan spesifisitas dilakukan untuk mengetahui bahwa kit PRIME-CYTO ini hanya dapat mengamplifikasi  gen cyt  b babi  saja.  Primer  CYTB- Full yang  digunakan  adalah  dari  gen penyandi cyt b . Gen ini merupakan salah satu gen penyandi dari 37 jenis gen penyandi yang terdapat pada mitokondria  [19]. Gen cyt b ini memiliki bagian konsisten pada tiap spesies, sehingga gen ini dapat digunakan untuk membedakan atau mengelompokkan spesies hewan [7]. Hasil penentuan sensitivitas dan spesifisitas kit PRIME-CYTO dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Elektroforegram analisis hasil PCR konvensional pada berbagai isolat
DNA. Keterangan:
1. Marker (1kb)
2. DNA Daging Sapi
3. DNA Sosis Sapi
4. DNA Daging Ayam
5. DNA Sosis Ayam
6. DNA Daging Babi
7. DNA Sosis Babi
Berdasarkan hasil elektroforegram (Gambar 4), hanya isolat DNA dari daging babi dan sosis babi yang menunjukkan pita ukuran 1140 bp. Ukuran ini sesuai dengan ukuran gen cyt b dari babi.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  secara  kualitatif  kit  ini  sensitif  terhadap  gen cyt  b babi. Sementara itu, pada isolat DNA dari daging sapi, sosis sapi, daging ayam, sosis ayam, dan air tidak  terbentuk  pita cyt  b babi.  Oleh  karena  itu,  secara  kualitatif  kit  ini  hanya  spesifik mengamplifikasi gen cyt b babi saja.
Penentuan sensitivitas dan spesifisitas kemudian dilanjutkan secara kuantitatif. Didapatkan 76 data yang dihasilkan dari PCR konvensional. Data tersebut dimuat ke dalam tabel 2x2 untuk menentukan persentase tingkat sensitivitas dan spesifisitas kit yang ditampilkan pada Tabel 6.

## Tabel 6. Tabel 2x2 pengukuran sensitivitas dan spesifisitas PCR konvensional
Hasil Tes
Standar Emas Total Positif Negatif Positif 33 ( True positive ) 0 ( False positive ) 33 (Total hasil positif) Negatif 0 ( False negative ) 43 ( True negative ) 43 (Total hasil negatif) Total 33 (Total sampel positif) 43 (Total sampel negatif) 76
Pada pengukuran sensitivitas dan spesifisitas dengan PCR konvensional, jumlah sampel yang digunakan yaitu sebanyak 76 sampel. Berdasarkan Tabel 6, terdapat total 33 sampel  positif dan 43 sampel negatif. Sampel positif adalah sampel yang teridentifikasi sebagai true positive dan false negative , sedangkan sampel negatif adalah sampel yang teridentifikasi sebagai true negative dan false positive . Total sampel positif yang diperoleh digunakan dalam penentuan nilai  sensitivitas,  sedangkan  total  sampel  negatif  digunakan  dalam  penentuan  nilai spesifisitas.
Sensitivitas digambarkan sebagai kemampuan untuk secara tepat mendeteksi sejumlah kecil zat  [26].  Sensitivitas  ini  menunjukkan  proporsi  subjek  yang  positif  menurut  standar  yang diidentifikasi  sebagai  positif  benar  ( true  positive )  [12].  Sensitivitas  dapat  dihitung menggunakan persamaan 1:
𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 = 𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒+𝐹𝑎𝑙𝑠𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑥 100% ……………...…………… (1)
[27]
Persentase sensitivitas dihitung menggunakan persamaan 1. Berikut merupakan perhitungan sensitivitas pada PCR konvensional:
𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 =
𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒+𝐹𝑎𝑙𝑠𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑥 100%
𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 = 33 33 + 0 𝑥 100% 𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 = 100%
True positive merupakan sampel dengan standar emas dan hasil tes positif. Dalam hal ini, true positive berarti  bahwa  berdasarkan  teori  sampel  tersebut  harus  menunjukkan  hasil  yang positif dan terbukti positif. Dalam penelitian ini terdapat 33 sampel yang dinyatakan sebagai true positive , meliputi sampel-sampel yang mengandung gen cyt b babi, di antaranya yaitu sampel  daging  babi  dan  sosis  babi.  Sedangkan false  negative merupakan  sampel  yang dinyatakan sebagai positif oleh standar emas, namun hasil tes yang didapatkan negatif. Dalam
penelitian  ini,  tidak  ada  sampel  yang  ditanyakan false  negative .  Oleh  karena  itu,  nilai sensitivitas untuk kit PRIME-CYTO dengan PCR konvensional adalah 100%.
Spesifisitas  menunjukkan  proporsi  subjek  yang  negatif  menurut  standar  yang  diidentifikasi sebagai  negatif  benar  ( true  negative )  [12].  Spesifisitas  dapat  dihitung  menggunakan persamaan 2:
𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑠𝑖𝑡𝑎𝑠 = 𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒+𝐹𝑎𝑙𝑠𝑒 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑥 100% ……………...…………… (2)
[27]
Persentase spesifisitas dihitung menggunakan persamaan 2. Berikut merupakan perhitungan spesifisitas pada PCR konvensional:

## 𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑠𝑖𝑡𝑎𝑠 =
𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒+𝐹𝑎𝑙𝑠𝑒 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑥 100% 𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑠𝑖𝑡𝑎𝑠 = 43 43 + 0 𝑥 100%
𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑠𝑖𝑡𝑎𝑠 = 100%
True negative merupakan sampel dengan standar emas dan hasil tes negatif. Dalam hal ini, true  negative berarti  berdasarkan  teori  sampel  tersebut  harus  menunjukkan  hasil  yang negatif  dan  terbukti  negatif.  Berdasarkan  Tabel  6,  terdapat  43  sampel  yang  dinyatakan sebagai true negative meliputi sampel dari daging sapi, sosis sapi, daging ayam, sosis ayam, dan air. Sedangkan untuk false positive merupakan sampel yang dinyatakan sebagai negatif oleh  standar  emas,  namun  hasil  tes  yang  didapatkan  positif.  Dalam  penelitian  ini,  tidak terdapat  sampel  yang  dinyatakan  sebagai false  positive .  Oleh  karena  itu,  nilai  spesifisitas untuk kit PRIME-CYTO dengan PCR konvensional adalah 100%.
Sensitivitas dan spesifisitas yang baik adalah yang nilainya mendekati 100%. Secara statistik, semakin banyak jumlah pengujian yang dilakukan, maka semakin tinggi tingkat kepercayaan yang diperoleh [28].
Terdapat  beberapa  sampel  yang  mengalami  kontaminasi.  Sampel-sampel  ini  tidak  dapat dihitung  ke  dalam  perhitungan  sensitivitas  maupun  spesifisitas  karena  kontaminasi  bukan merupakan  kesalahan  dari  kit  PRIME-CYTO  maupun  alat  PCR.  Terdapat  beberapa  sumber umum  kontaminasi  mulai  dari  kontaminasi  di  permukaan  peralatan  hingga  penanganan sampel yang kurang steril serta terbebas dari DNA lain [29].

## Analisis Sampel dengan Real-time PCR
Penentuan sensitivitas secara real-time PCR dilakukan untuk memastikan bahwa kit PRIME- CYTO  yang  merupakan  kombinasi  antara  primer  CYTB- Full dan  qPCR Master  Mix ini  dapat mengamplifikasi gen cyt b babi atau tidak. Sedangkan penentuan spesifisitas dilakukan untuk memastikan  bahwa  kit  ini  hanya  dapat  mengamplifikasi  gen cyt  b babi  saja.  Untuk menentukan  persentase  sensitivitas  dan  spesifisitas  tersebut,  digunakan  tabel  2x2  yang ditunjukkan dengan Tabel 7.
Tabel 7. Tabel 2x2 pengukuran sensitivitas dan spesifisitas real-time PCR Hasil Tes Standar Emas Total Positif Negatif Positif 22 ( True positive ) 37 ( False positive ) 59 (Total hasil positif) Negatif 4 ( False negative ) 4 ( True negative ) 8 (Total hasil negatif) Total 26 (Total sampel positif) 41 (Total sampel negatif) 67
Pada  pengukuran  sensitivitas  dan  spesifisitas  dengan real-time PCR,  jumlah  sampel  yang digunakan yaitu sebanyak 67 sampel. Berdasarkan Tabel 7, terdapat total 26 sampel positif dan 41 sampel negatif. Sampel positif adalah sampel yang teridentifikasi sebagai true positive dan false negative, sedangkan sampel negatif adalah sampel yang teridentifikasi sebagai true negative dan false positive . Total sampel positif yang diperoleh digunakan dalam penentuan nilai  sensitivitas,  sedangkan  total  sampel  negatif  digunakan  dalam  penentuan  nilai spesifisitas.
Persentase sensitivitas dihitung menggunakan persamaan 1. Berikut merupakan perhitungan sensitivitas pada real-time PCR:
𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 =
𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒 + 𝐹𝑎𝑙𝑠𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑥 100% 𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 = 22 22 + 4 𝑥 100%
𝑆𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 = 85%
True positive merupakan sampel dengan standar emas dan hasil tes positif. Dalam penelitian ini, terdapat 22 sampel yang dinyatakan sebagai true positive mengandung gen cyt b babi, di antaranya  yaitu  sampel  daging  babi  dan  sosis  babi.  Sedangkan false  negative merupakan sampel yang dinyatakan sebagai positif oleh standar emas, namun hasil tes yang didapatkan negatif.  Dalam  penelitian  ini,  sampel  yang  dinyatakan false  negative terdapat  sebanyak  4 sampel. Oleh karena itu, diperoleh nilai sensitivitas untuk kit PRIME-CYTO dengan real-time PCR adalah 85%.
Persentase spesifisitas dihitung menggunakan persamaan 2. Berikut merupakan perhitungan spesifisitas pada real-time PCR:
𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑠𝑖𝑡𝑎𝑠 =
𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑇𝑟𝑢𝑒 𝑁𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 + 𝐹𝑎𝑙𝑠𝑒 𝑃𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑥 100% 𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑠𝑖𝑡𝑎𝑠 = 4 4 + 37 𝑥 100%
𝑆𝑝𝑒𝑠𝑖𝑓𝑖𝑠𝑖𝑡𝑎𝑠 = 10%
True negative merupakan sampel dengan standar emas dan hasil tes negatif. Dalam penelitian ini, terdapat 4 sampel yang dinyatakan sebagai true negative meliputi sampel dari daging sapi, sosis sapi, daging ayam, sosis ayam, air, dan pereaksi tanpa DNA template . Sedangkan untuk false positive merupakan sampel yang dinyatakan sebagai negatif oleh standar emas, namun
hasil tes yang didapatkan positif. Dalam penelitian ini, terdapat 37 sampel yang dinyatakan false positive meliputi sampel dari daging sapi, sosis sapi, daging ayam, sosis ayam, air, dan pereaksi tanpa DNA template . Oleh karena itu, nilai spesifisitas untuk kit PRIME-CYTO dengan PCR konvensional adalah 10%.
Berdasarkan  uraian  di  atas,  walaupun  sensitivitas  kit  PRIME-CYTO  menggunakan real-time PCR ini cukup besar yakni 85% tetapi nilai spesifisitas dari kit ini hanya sebesar 10%. Artinya, kit PRIME-CYTO menggunakan real-time PCR ini sudah cukup sensitif terhadap gen cyt b babi, namun  kurang  spesifik  terhadap  gen cyt  b babi  karena  sampel-sampel  yang  seharusnya memiliki hasil pengujian negatif turut terbaca positif.
Terdapat asumsi terkait penyebab kit PRIME-CYTO dengan real-time PCR ini kurang spesifik. Asumsi awal terkait rendahnya nilai spesifisitas ini karena adanya kontaminasi gen cyt b babi pada kontrol negatif, sampel ayam dan sapi, maupun reagen dari kit PRIME-CYTO mulai dari qPCR Master Mix , nuclease free water , dan primer. Setelah digunakan reagen-reagen yang baru, hasil real-time PCR tetap menunjukkan hasil yang tidak sesuai.
Asumsi  lain  mengenai  kurang  spesifiknya  kit  PRIME-CYTO  menggunakan real-time PCR  ini karena  adanya  perbedaan  antara  pewarna  dalam Master  Mix dengan  pewarna  yang terkalibrasi dalam alat real-time PCR. Pewarna SYBR® Green I merupakan jenis pewarna yang umum digunakan pada proses real-time PCR. Pewarna ini telah terkalibrasi dalam detektor alat real-time PCR  yang  digunakan.  Pada  penelitian  ini  pewarna  tersebut  tidak  digunakan, melainkan pewarna lain yang identik dengan pewarna SYBR® Green I, yaitu pewarna BRYT ™ Green yang  telah  tercampur  dalam Master  Mix .  Pewarna  ini  dikatakan  identik  dengan pewarna  SYBR® Green I  karena  eksitasi  dan  emisi  pewarna  serupa  dengan  SYBR® Green I (Gambar  5.),  sehingga  kompatibel  dengan platform instrumentasi  yang  tersedia  secara umum.  Maka,  digunakan  pengaturan  instrumen  yang  sama  seperti  pada  penggunaan pewarna SYBR® Green I.
Gambar 5. Spektrum fluoresens SYBR® Green I dan pewarna Promega eksklusif dalam Campuran GoTaq® qPCR Master Mix [30]
Berdasarkan Gambar 5, spektrum emisi fluoresens SYBR® Green I dan Promega BRYT ™ Green tanpa adanya dsDNA dan dengan adanya 50ng/µL atau 200ng/µL dsDNA. Panjang gelombang emisi puncak adalah 523 nm untuk SYBR® Green I dan 529 nm untuk BRYT ™ Green .
Ada  sedikit  perbedaan  antara  pewarna  SYBR® Green I  dan  pewarna  BRYT ™ Green ,  yaitu pewarna BRYT ™ Green digunakan pada konsentrasi yang lebih tinggi daripada SYBR® Green I karena lebih sedikit menghambat proses reaksi amplifikasi. Sehingga, konsentrasi pewarna dalam Master  Mix dioptimalkan  untuk  menghasilkan  fluoresens  yang  lebih  cerah  secara signifikan selama proses real-time PCR daripada Master Mix yang mengandung SYBR® Green
I. Master Mix ini dilengkapi dengan pewarna referensi CXR tingkat rendah yang identik dengan pewarna referensi ROX ™ [30].
Dilakukan  juga  percobaan  kit  PRIME-CYTO  pada real-time PCR  menggunakan  pewarna refrensi CXR. Dalam alat real-time PCR, pewarna yang telah terkalibrasi selain SYBR® Green I adalah ROX ™ yang identik dengan pewarna referensi CXR. Namun, kontrol negatif yang diuji tetap menunjukkan terjadinya amplifikasi.
Terdapat sebuah forum diskusi yang membahas peristiwa real-time PCR yang kurang spesifik dalam laman researchgate.net. Diskusi dimulai dari pertanyaan yang diajukan oleh Jain [31] mengenai  kontaminasi  yang  terjadi  pada real-time PCR  menggunakan  kit  dengan  pewarna SYBR® Green I  yang  kerap  terjadi  meski  telah  menggunakan molecular grade  water ,  ruang preparasi  terpisah,  tip  berfilter  dan  steril,  mengganti  reagen,  serta  mencuci  pipet  yang digunakan secara berkala. Hasil yang diperoleh tetap menunjukkan adanya amplifikasi pada sampel  non- template dengan  nilai  Ct  di  antara  23-25.  Selain  itu,  telah  dilakukan  juga pengenceran  konsentrasi  primer  serta  pengecekan melt  curve untuk  memastikan  tidak terjadinya primer-dimer. Primer-dimer ini merupakan peristiwa ketika primer yang digunakan akan saling bertaut dan menyebabkan terbentuknya DNA template . Dari pertanyaan tersebut, terjadi diskusi antara beberapa user. Berikut merupakan poin-poin hasil diskusi dari forum tersebut:
1.  Pergantian  primer  baru  disarankan  karena  dikhawatirkan  terjadi  kontaminasi  dari primer;
2.  Disarankan  penggunaan  kit  yang  mengandung probe karena  dapat  meningkatkan spesifisitas lebih baik daripada menggunakan pewarna SYBR® Green I;
3.  Disarankan juga menggunakan nuclease free water yang baru;
4.  Terdapat user lain yang mengalami kejadian yang sama.
Dari  diskusi  tersebut,  terdapat  salah  satu  saran  bahwa  penggunaan  kit  yang  mengandung probe pada real-time PCR dapat meningkatkan spesifisitas lebih baik daripada menggunakan pewarna SYBR® Green I. Perbedaan penggunaan SYBR® Green I dan hyrdolisis probe adalah pewarna  SYBR® Green I  akan  berpendar  ketika  terinterkalasi  dengan  untai  ganda  DNA, sedangkan  pada  kit  yang  mengandung probe ,  fluoresens  akan  berpendar  saat probe dipisahkan secara fisik melalui hidrolisis oleh aktivitas nuklease. Pada kit yang mengandung hydrolysis probe terdapat dua pewarna fluoserens, yaitu reporter dan quencher [32]. Prinsip kerja penggunaan hydrolisis probe dalam real-time PCR yaitu sinyal fluoresens akan dieksitasi oleh molekul reporter ke molekul quencher ketika probe belum berkomplemen dengan target. Probe akan berkomplemen dengan DNA target saat mencapai suhu annealing karena jarak antara dua molekul berdekatan dan proses eksitasi sinyal fluoresens dari reporter ke quencher terhenti karena jarak kedua molekul berjauhan. DNA polimerase akan memanjangkan DNA target  hingga  DNA  polimerase  dan probe berdekatan,  sehingga  5’  nuklease  yang  terdapat pada  DNA  polimerase  akan  menghidrolisis  molekul reporter lalu  dihasilkan  emisi  sinyal fluoresens yang dapat ditangkap oleh detektor pada alat real-time PCR [33]. Metode real-time PCR  menggunakan  kit  yang  mengandung hydrolysis probe lebih  spesifik  daripada menggunakan pewarna SYBR® Green I [32].

## Kesimpulan
Batas deteksi kit PRIME- CYTO dengan PCR konvensional adalah sebesar 3 ng/μL pada isolat DNA dari daging babi dan 10 -3 ng/μL pada isolat DNA sosis babi.
Sensitivitas kit PRIME-CYTO untuk deteksi gen cyt b babi dengan metode PCR konvensional dan real-time PCR  secara  berturut-turut  adalah  sebesar  100%  dan  85%.  Berdasarkan  hasil
tersebut, artinya penggunaan kit PRIME-CYTO baik menggunakan PCR konvensional maupun real-time PCR sensitif terhadap DNA gen cyt b dari babi.
Spesifisitas kit PRIME-CYTO untuk deteksi gen cyt b babi dengan metode PCR konvensional dan real-time PCR  secara  berturut-turut  adalah  sebesar  100%  dan  10%.  Berdasarkan  hasil tersebut, artinya pada metode PCR konvensional kit PRIME-CYTO spesifik dalam mendeteksi gen cyt  b babi,  sedangkan  pada  metode real-time PCR  kit  PRIME-CYTO  kurang  spesifik mendeteksi gen cyt b babi.

## Referensi
[1] Aini, “Sertifikasi Halal Produk Pangan di Badan Penyelenggaran Jaminan Produk Halal (BPJPH),” Institut Pertanian Bogor , Bogor, 2021.
[2] R. Yuningsih, “Perlindungan Konsumen Dari Dampak Buruk Makanan Tidak Halal Bagi Kesehatan.” p. 173, 2010.
[3] H. S. Bekti et al. , “Identifikasi Taenia solium secara Mikroskopis pada Peternakan Babi Microscopic Identification of Taenia solium in Pig Farms,” Online, 2021.
[4] W.  A.  Nadira  and  Yudha  Nurdian,  “Efek  Neurologis  yang  Disebabkan  oleh  Infestasi Trichinella.” 2017.
[5] W.  C.  Anggundari,  Auraga  Dewantoro,  Umi  Nuraeni,  Bambang  Prasetya,  and  Yopi, “Dukungan  Metrologi  untuk  Metode  Deteksi  Terkini  Kandungan  Daging  Babi  dalam Rangka Jaminan Produk Halal,” PRosiding PPIS , pp. 259 – 266, Nov. 2020.
[6] E.  Andriyani,  Nor  Lutfi  Fais,  and  Siti  Muarifah,  “Perkembangan  Penelitian  Metode Deteksi Kandunga n Babi untuk Menjamin Kehalalan Produk Pangan Olahan,” Journal of  Islamic  Studies  and  Humanities ,  vol.  4,  no.  1,  pp.  104 – 126,  2019,  doi: http://dx.doi.org/10.21580/jish.41.4888.
[7] A. Primasari, “Sensitivitas Gen Sitokrom B (Cyt b) sebagai Marka Spesifik pada Genus Rattus  dan  Mus  untuk  Menjamin  Keamanan  Pangan  Produk  Asal  Daging,”  Institut Pertanian Bogor, Bogor, 2011.
[8] B. R. Glick, Jack J. Pasternak, and Cheryl L. Patten, Molecular Biotechnology , 4th ed. Washington, DC: ASM Press, 2010.
[9] L. K. Theod orus, “Identifikasi Gen Sitokrom B (Cyt B) Babi Hutan pada Kornet Sapi di Yogyakarta  dengan  Metode  Polymerase  Chain  Reaction  (2021),”  Universitas  Sanata Dharma, Yogyakarta, 2021.
[10] Y. Erwanto, Abdul Rohman, Mohammad Zainal Abidin, and Dwi Ariyani, “Iden tifikasi Daging  Babi  Menggunakan  Metode  PCR-RFLP  Gen  Cytochrome  B  Dan  PCR  Primer Spesifik Gen Aamelogenin,” AGRITECH , vol. 32, no. 4, pp. 370 – 377, Nov. 2012.
[11] D.  D.  Astari,  Sania  Gustiani Dewi,  Sinta  Setyaningrum,  and  Bevi  Lidya,  “Perancangan Primer untuk Deteksi Kandungan Gen Cytochrome b Babi dengan Metode Polymerase Chain  Reaction  dan  Aplikasinya  pada  Berbagai  Produk  Industri,” Fullerene  Journ.  Of Chem , vol. 6, no. 2, pp. 110 – 117, 2021, doi: 10.37033/fjc.v6i2.329.
[12] B. Murti, “Validitas dan Reliabilitas Pengukuran,” May 2011.
[13] T.  R.  Maulani,  H.  Susilo,  M.  Indriati,  and  A.  Suhaemi,  “Deteksi  Cemaran  DNA  Babi Dengan  RT- PCR  Pada  Sosis  Tanpa  Logo  Halal  di  Kabupaten  Pandeglang,” Gorontalo Agriculture Technology Journal , vol. 3, no. 2, Oct. 2020.
[14] Widayat, Tri Winarni Agustini, Meiny Suzery, Ahmad Ni’matullah Al -Baari, Sylvia Rahmi Putri,  and  Kurdianto,  “Real  Time -Polymerase  Chain  Reaction  (RT-PCR)  sebagai  Alat Deteksi DNA Babi dalam Beberapa Produk Non- Pangan,” Indonesian journal of halal , pp. 26 – 33, 2019.
[15] Y. L. Rahmania, Widayat, Tri Winarni Agustini, Meiny Suzery, and Ahmad Ni’matullah Albaari,  “Pengukuran  Kandungan  DNA  Babi  dalam  Berbagai  Produk  Pangan  dengan Metode Real Time-Polymerase Chain Reaction (RT- PCR),” Indonesian Journal of Halal , pp. 129 – 133, 2021.
[16] Mariyani,  Sismindari,  and  Rumiyati,  “Validasi  Metode  Real -Time  Polymerase  Chain Reaction untuk Deteksi DNA  Babi (Sus scrofa  domestica)  dan  Celeng (Sus barbatus) pada Sosis Sapi,” Syntax Literate: Jurnal Ilmiah Indonesia , vol. 6, pp. 3925 – 3940, Aug. 2021, doi: 10.36418/Syntax-literate.v6i8.3806.
[17]  S. Surzycki, Basic Techniques in Molecular Biology . Berlin: Springer, 2000.
[18] N. Marwayana, “Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat (DNA) dari Sampel Jaringan Otot,” Oseana , vol. XL, pp. 1 – 9, 2015.
[19] D. Y. Maulid and M. Nurimala, “DNA Barcoding untuk Autentikasi Produk Ikan Tenggiri (Scomberomorus sp),” Jurnal Akuatika , vol. VI, no. 2, pp. 154 – 160, Sep. 2015.
[20] F.  G.  Dayanti,  A.  Djuminar,  A.  Dermawan,  and  A.  Tantan,  “Perband ingan  Nilai Pengukuran  Kuantitatif  Hasil  Ekstraksi  DNA  Salmonella  typhi  Menggunakan  Metode Bioling, NaOH, Kit Komersian,” Jurnal Riset Kesehatan Poltekkes Depkes Bandung , vol. 11, no. 1, pp. 350 – 357, 2019.
[21]  J. Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning (A Laboratory Manual) , 3rd ed., vol. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2011.
[22] Pendidikanmu, “Materi Centrifuge,” pendidikanmu.com , 2022. https://pendidikanmu.com/2022/02/centrifuge-adalah.html (accessed Jun. 18, 2022).
[23] G. R. Aristya, A. Agriansyah, and B. S. Daryono, “Deteksi dan Skrining Pewarisan Sifat Ketahanan  Penyakit  Powdery  Mildew  pada  Generasi  Backcross  Tanaman  Melon (Cucumis melo L.) Var Tacapa,” Universitas Gadjah Mada, Y ogyakarta, 2013.
[24] Y. Mulyani, A. Purwanto, and I. Nurruhwati, “Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini Koi Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus carpio L.),” 2011.
[25] G.  Haryanto,  “Probe  Optik  Untuk  Mengukur  Konsentrasi  Fitop lankton,  Studi  Kasus Scenedesmus sp,” 2008.
[26]  G.  J.  Vilijoen,  Louis  H.  Neland,  and  John  R.  Croowther, Molecular  Diagnostic  PCR Handbook . Dordrrercht: Springer, 2005.
[27] A.  K.  Akobeng  and  A.  K.  Akobeng,  “Understanding  diagnostic  tests  1:  sensitivity, s pecificity and predictive values”, doi: 10.1111/j.1651 -2227.2006.00180.x.
[28]  Menteri  Kesehatan  Republik  Indonesia, Peraturan  Menteri  Kesehatan  Republik Indonesia Nomor 43 Tahun 2013 tentang Cara Penyelenggaraan Laboratorium Klinik Yang Baik . 2013.
[29]  I nfiniti Bioanalitika Solusindo, “Kontaminasi di Laboratorium,” ibs.co.id , Aug. 30, 2021. https://ibs.co.id/kontaminasi-laboratorium/ (accessed Jun. 18, 2022).
[30] Promega,  “Introducing  GoTaq®  qPCR  Master  Mix:  The  Bright  Choice  for  Dye -Based qPCR,” 2009. https://worldwide.promega.com/resources/pubhub/introducing-gotaq- qpcr-master-mix-the-bright-choice-for-dye-based- qpcr/#:~:text=%23%20A6001)%20introduces%20a%20new%2C,inhibitory%20in%20a n%20amplification%20reaction. (accessed Jun. 27, 2022).
[31]  R. J ain, “Contamination in real time PCR using SYBR green chemistry, what could be the solution?,” researchgate.com .  Sep.  09,  2017.  Accessed:  Jun.  09,  2022.  [Online]. Available:
https://www.researchgate.net/post/Contamination_in_real_time_PCR_using_SYBR_ green_chemistry_what_could_be_the_solution
[32] Z.  Zilhadia,  A.  N.  Izzah,  and  O.  S.  Betha,  “Perbandingan  Metode  SYBR  Green  dan Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction,” Jurnal Sains Farmasi & Klinis , vol. 4, no. 1, pp. 16 – 23, Dec. 2017, doi: 10.29208/jsfk.2017.4.1.194.