ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 11 (3) (2008) : 57 – 62
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi dan Uji Potensi L-Asparaginase dari Rimpang Kunyit Putih ( Curcuma mangga Vall ) terhadap Leukimia Tipe K562
Agustina Arpintasari a , Wuryanti a , W.H. Rahmanto a,*
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Matematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275, Telepon (024) 7474754
* Corresponding author: wh.rahmanto@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords:
Anticancer, L- asparaginase, Specific activity, LC 50 A  study  on  the  isolation  of  L-asparaginase  enzyme  derived  from  white  turmeric  ( Curcuma mangga Vall ) and activity test on leukemia K562 type has been conducted. L-asparaginase is a hydrolase enzyme that catalyzes the hydrolysis of asparagine into aspartic acid and ammonia. This  research  was  conducted  through  several  major  stages  which  were  enzyme  isolation, activity  test  and  anticancer  potency  test.  Isolation  of  L-asparaginase  through  two  stages  of stratified  extraction  and  fractionation  using  ammonium sulphate  salt  so that it will  produce pure L-asparaginase enzyme from protein. Specific activity test of L-asparaginase was carried out at optimum condition at 37 0C, pH 8,5, and incubation time 30 min by counting the amount of ammonia formed by Nessler reagent and calculating protein level by Lowry method from each fraction. The results of L-asparaginase obtained from white turmeric ( Curcuma mangga Vall ) with a large specific activity when compared to other sources such as parasite, onion, garlic and onion.  The  specific  activity  of  white  turmeric L-asparaginase  enzyme  is  2195,715  units  / mg protein at the fifth fraction (80-100%). The third stage is anticancer potency test on cell culture Leukimia type K562 by using cell viability method with addition of MTT and measured by ELISA Reader.  Tests  were  performed  with  15  concentration  variations  and  it  was  found  that  L- asparaginase  enzyme  had  good  potential  as  anticancer  with  LC 50 value  at  L-asparaginase addition concentration of 9,419 ppm.

## A b s t r a k
Kata kunci:
Antikanker, L- asparaginase, Aktivitas spesifik, LC 50 Telah dilakukan penelitian tentang isolasi enzim L-asparaginase yang berasal dari kunyit putih ( Curcuma mangga Vall ) dan uji aktifitas pada leukimia tipe K562. L-asparaginase adalah enzim hidrolase  yang  mengkatalisis  hidrolisis  asparagin  menjadi  asam  aspartat  dan  amonia. Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahapan utama yaitu isolasi enzim, uji aktivitas dan uji potensi antikanker. Isolasi L-asparaginase melalui dua tahap yaitu ekstraksi dan fraksinasi bertingkat  menggunakan  garam  amonium  sulfat  sehingga  akan  dihasilkan  enzim  L- asparaginase  yang  murni  dari  protein.  Uji  aktivitas  spesifik  L-asparaginase  dilakukan  pada kondisi  optimum  yaitu  pada  suhu  37 0 C,  pH  8,5,  dan  waktu  inkubasi  30  menit  dengan  cara menghitung  jumlah  amonia  yang  terbentuk  dengan  pereaksi  Nessler  dan  menghitung  kadar protein dengan  metode  Lowry  dari  masing-masing  fraksi.  Dari hasil  penelitian  diperoleh  L- asparaginase dari rimpang kunyit putih ( Curcuma mangga Vall) dengan aktivitas spesifik yang besar bila dibandingkan dari sumber yang lain seperti benalu, bawang merah, bawang putih dan bawang  bombay.  Aktivitas  spesifik  enzim  L-asparaginase  kunyit  putih  sebesar  2195,715 unit/mg  protein  pada  fraksi  kelima  (80-100%).  Tahapan  yang  ketiga  yaitu  uji  potensi antikanker  pada  kultur  sel  Leukimia  tipe  K562  dengan  menggunakan  metode  viabilitas  sel dengan  penambahan  MTT  dan  diukur  dengan ELISA  Reader .  Pengujian  dilakukan  dengan  15 variasi konsentrasi dan diketahui bahwa enzim L-asparaginase mempunyai potensi yang baik sebagai  antikanker  dengan  nilai  LC 50 pada  konsentrasi  penambahan  L-asparaginase  sebesar 9,419 ppm.

## 1. Pendahuluan
Kanker  adalah  salah  satu  golongan  penyakit  yang ditandai  dengan  pembelahan  sel  yang  tidak  terkendali dan  kemampuan  sel-sel  tersebut  untuk  menyerang jaringan  biologis  lainnya,  baik  dengan  pertumbuhan langsung  di  jaringan  yang  bersebelahan  (invasi)  atau dengan  migrasi  sel  ke  tempat  yang  jauh  (metastasis). Kanker merupakan penyakit yang menempati peringkat kedua di dunia sebagai penyebab kematian. Sampai saat ini  telah  banyak  usaha  yang  dilakukan  untuk menyembuhkan penyakit kanker.
Umumnya, pengobatan kanker dilakukan dengan terapi menggunakan  obat-obat  sintesis  dan  radiasi,  tetapi terapi  yang  digunakan  tersebut  banyak  menimbulkan efek samping yang merugikan penderita dan mahal  [1]. Sampai  saat  ini  belum  ditemukan  pengobatan  yang efektif  untuk  kanker,  oleh  karena  itu  dilakukan penelitian  untuk  mencoba  menambah  alternatif  obat antikanker,  salah  satu  cara  yang  dilakukan  adalah dengan  mengembangkan  pengobatan  dari  bahan  alam yang berasal dari tumbuhan. Pengobatan dari bahan alam yang berasal dari tumbuhan menjadi salah satu alternatif karena  harganya  lebih  murah,  efektif  dan  tanpa  efek samping [2]
Indonesia  merupakan  negara  tropis  yang  memiliki keanekaragaman  hayati,  sehingga  berpotensi  besar dalam  memperoleh  obat  alternatif  sebagai  antikanker dari  tumbuhan.  Salah  satu  tumbuhan  yang  diketahui dapat berfungsi sebagai antikanker adalah  kunyit  putih ( Curcuma mangga Vall). Berdasarkan penelitian terdahulu kunyit putih (Curcuma mangga Vall ) mengandung enzim L-asparaginase dengan aktifitas spesifik yang tinggi jika dibandingkan  sumber  lain  seperti  benalu  mangga, bawang  merah,  temulawak,  bawang  bombay,  dan bawang  putih  sehingga  diharapkan  bisa  digunakan sebagai antikanker.
Enzim L-asparaginase  adalah enzim yang mengkatalisis  reaksi  hidrolisis  L-asparagin  menjadi  L- aspartat  dan amonia  [3]. L-asparagin merupakan  asam amino non-esensial [4] yang dibutuhkan oleh sel untuk sintesis  protein  dan  pertumbuhan.  Jumlah  asparagin sintetase pada sel penderita leukemia terbatas, sehingga ketersediaan  Asparagin  bergantung  dari  luar  sel  [3], Sedangkan  pada  sel  normal  asparagin  sintetase  dapat bekerja secara normal menghasilkan asparagin.  Adanya L-asparaginase  dalam  tubuh  akan  mengakibatkan penurunan konsentrasi asparagin dalam darah sehingga asupan  asparagin  bagi  sel  kanker  tersebut  menjadi sangat  terbatas  dan  sintesis  protein  pada  sel  tersebut akan  terganggu  yang  pada  akhirnya  akan  menghambat pertumbuhan  sel  kanker,  dan mengakibatkan  kematian sel kanker tersebut. Aktivitas L-asparaginase tidak akan mengganggu  sel  normal,  karena  sel  normal  memiliki enzim  asparagin  sintetase  dalam  jumlah  yang semestinya,  sehingga  kebutuhan  asparagin  akan  dapat dipenuhi oleh sel normal itu sendiri [4].
Telah dilakukan penelitian dan diketahui bahwa L- asparaginase fraksi ke-5 (80-100%) dari rimpang kunyit putih  memiliki  aktivitas  spesifik  yang  besar  sehingga diharapkan  mempunyai  potensi  yang  besar  sebagai
antikanker  [5].  Enzim  L-asparaginase  dari E  coli telah diujikan pada sel kanker leukimia K562 dan telah dapat menghambat pertumbuhan sel kanker leukimia K562 [6].
Penelitian ini dilakukan untuk menentukan potensi antikanker  enzim  L-asparaginase  dari  rimpang  kunyit putih pada sel kanker leukimia K562. Potensi antikanker dapat diketahui dengan menghitung besarnya nilai LC 50. Nilai  LC 50 menunjukan  besarnya  sel  kanker  leukimia K562  yang  terhambat  pertumbuhannya  oleh  adanya penambahan  enzim  L-.asparaginase  fraksi  ke-5  dari rimpang kunyit putih.

## 2. Metode Penelitian

## 2.1 Isolasi Enzim
Serbuk kunyit putih ( Curcuma mangga Vall ) sebanyak 1000  g  ditambahkan  500  mL  bufer  Tris-hidroksimetil- aminometan  0,2  M  pH  =  8,6  dan  diblender  selama  20 menit.  Campuran  kemudian  dibiarkan  selama  1,5  jam pada  suhu  5°C  lalu  disaring.  Filtrat  kemudian disentrifugasi  pada  3400  rpm  selama  10  menit.  Filtrat yang diperoleh dari sentrifugasi pada 3400 rpm disebut ekstrak kasar (EK).

## 2.2 Fraksinasi Enzim
Fraksinasi  enzim  dilakukan  dengan  menggunakan amonium  sulfat  secara  bertingkat  dengan  tingkat kejenuhan 0 - 20% (F 1 ), 20 – 40% (F 2 ), 40 – 60% (F 3 ), 60 – 80% (F 4 ), 80 - 100% (F 5 ). Amonium sulfat ditimbang sesuai  fraksi  yang  dikehendaki  agar  diperoleh konsentrasi yang diinginkan, lalu dimasukkan ke dalam filtrat hasil akhir tahap isolasi enzim sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan magnetic stirer dalam penangas es. Campuran kemudian didiamkan selama 1 malam dalam keadaan dingin (dimasukkan dalam lemari es), kemudian disentrifugasi  dengan  kecepatan  3500  rpm  selama  50 menit. Endapan yang diperoleh dipisahkan dari filtratnya dan  disuspensi  dengan  3  mL  bufer  Tris-hidroksimetil- aminometan  0,2  M  pH  =  8,6.  Endapan  yang  disuspensi tersebut merupakan EK, F 1 , F 2 , F 3 , F 4 , F 5 .
. 2.3 Dialisis Enzim
Dialisis  dilakukan  dengan  menggunakan  membran selofan  yang  telah  direbus  selama  30  menit  dan  dicuci dengan akuades. Selofan yang berisi suspensi hasil akhir fraksinasi  enzim  direndam  dalam  bufer  Tris- hidroksimetil-aminometan  0,002  M  pH  =  8,6  dalam keadaan  dingin  dan  tiap  2  jam  bufer  diganti  serta  diuji kandungan amonium sulfat  pada  larutan  diluar  selofan dengan  BaCl 2 0,01  M  hingga  tidak  terbentuk  endapan putih. Fraksi yang diujikan pada sel kanker dikeringkan dengan menggunakan Freeze dryer.

## 2.4 Penentuan Unit Aktivitas Enzim
Sebanyak  6  tabung  yang  masing-masing  diisi dengan 1 mL larutan substrat L-asparagin 0,1665 M, 0,1 endapan yang disuspensi (EK, F 1 , F 2 , F 3 , F 4 , F 5 ), dan 0,4 mL  bufer  Tris-hidroksimetil-aminometan  0,2  M  pH  = 8,5 disiapkan dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit, kemudian ditambah 1 mL larutan TCA 1,5 M dan disentrifugasi pada kecepatan 3400 rpm selama 15 menit untuk  memisahkan  endapannya.  Sebanyak  0,25  mL
filtrat  diambil  lalu  ditambah  dengan  4,25  mL  akuades dan  0,5  mL  pereaksi  Nessler,  kemudian  absorbansi larutan  tersebut  diukur  dengan  spektrofotometer  UV- Vis.  Sebagai  kontrol  adalah  0,1  mL  endapan  yang disuspensi, yang telah dihilangkan aktifitasnya (dengan dipanaskan), ditambah 0,4 mL bufer Tris-hidroksimetil- aminometan  0,2  M  pH  =  8,5  dan  0,5  mL  larutan  L- asparagin  0,1665  M.  Aktivitas  enzim  ditentukan  secara regresi linier terhadap kurva standar amonium sulfat.

## 2.5 Penentuan Kadar Protein
Sebanyak 0,1 mL larutan protein hasil fraksinasi (EK, F 1 , F 2 , F 3 , F 4 , F 5 ) ditambah dengan 2 mL larutan Lowry C, diinkubasi  pada  suhu  optimum  (37 0 C)  selama  30  menit sambil  sesekali  dikocok.  Selanjutnya  ditambah  dengan 0,2  mL  Lowry  D  dan  diinkubasi  selama  10  menit  pada suhu  kamar  dengan  sesekali  dikocok,  kemudian  diukur absorbansinya. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang  ( λ )  optimum  BSA  dengan  spektrofotometer UV-Vis.  Kadar  protein  ditentukan  secara  regresi  linier terhadap kurva standar BSA.

## 2.6 Kultur Sel Kanker Leukimia K562
Sel  kanker  leukimia  K562,  FBS  serum  dan  media IMDM  yang  ketiganya  diperoleh  dari  LPPT  UGM Yogyakarta  disiapkan.  Proses  selanjutnya  dikerjakan dengan teknik aseptik di bawah Laminair Air Flow Cabinet (LAFC).

## 2.7 Proses Thawing Sel Kanker Leukimia K562
Sel  kanker  leukimia  K562  disentrifugasi  dengan kecepatan  1500  rpm  selama  lima  menit  pada  suhu  4°C. Endapan sel ditanam pada botol kultur yang berisi media yang  mengandung  10%  serum.  Selanjutnya  kultur disimpan  dalam  inkubator  yang  mengandung  95%  CO 2 dan 5% O 2 pada suhu 37°C selama 24 jam.

## 2.8 Inisiasi Kultur Sel Kanker Leukimia K562
Botol  kultur  steril  bertutup  disiapkan.  Selanjutnya sel  kanker  leukimia  K562  hasil thawing dihomogenkan dan dituangkan ke masing-masing botol kultur sebanyak 2 mL. sel diinkubasi dalam inkubator yang mengandung 95% CO 2 dan 5% O 2 pada suhu 37°C selama 24 jam. Hitung jumlah sel/mL > 10 4 sel/mL.

## 2.9 Uji Hambatan Pertumbuhan Sel Kanker Leukimia K562
Larutan uji yang telah dibuat disiapkan. Kultur hasil inisiasi dihomogenkan. Kontrol terdiri dari sel, medium IMDM, dan larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH = 7,2. Blanko terdiri dari medium IMDM, larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH = 7,2. Perlakuan untuk uji sitotoksisitas terdiri  dari  sel,  medium  IMDM, larutan  dapar  natrium fosfat  5  mM  pH  =  7,2  dan  variasi  konsentrasi  sampel enzim L-asparaginase. Sampel yang diuji adalah larutan yang  dibuat  dari  serbuk  hasil  fraksinasi  enzim  L- asparaginase  dengan  aktivitas  spesifik  tertinggi  pada beberapa variasi konsentrasi.

## 2.10 Penghitungan Persen Kematian Sel Menggunakan Metode MTT
Larutan  MTT  dimasukkan  kedalam  sumuran.  Sel yang hidup akan membentuk kristal formazan berwarna ungu  yang  intensitasnya  dapat  diukur  dengan  ELISA Reader.  Absorbansi  yang  terbaca  sebanding  dengan jumlah sel hidup.

## 2.11 Analisis Hasil
Sitotoksisitas  variasi  konsentrasi  sampel  enzim  L- asparaginase  dianalisa  dengan  menghitung  prosentase kematian  sel  yang  diperoleh  dari  perhitungan menggunakan modifikasi rumus Abbot [7]:
Persen kematian = % 100  − A B A
Keterangan:
A = Nilai rata-rata absorbansi dari beberapa kontrol
B = Nilai rata-rata absorbansi dari beberapa perlakuan
Efek  toksisitas  dianalisis  dari  pengamatan  dengan persen  kematian.  Dengan  mengetahui  kematian  sel kanker, kemudian dicari angka probit melalui tabel dan dibuat persamaan garis :
Y = BX+ A di mana
Y = log konsentrasi
X = Angka probit
Dari  persamaan  tersebut  kemudian  dihitung  LC50 dengan memasukkan nilai probit (50% kematian) [7].

## 3. Hasil dan Pembahasan
Salah  satu  senyawa  yang  bisa  digunakan  sebagai antikanker adalah enzim L-asparaginase. L- asparaginase bisa diperoleh dari berbagai sumber salah satunya adalah dari kunyit putih (Curcuma mangga Vall) . Untuk  mendapatkan  enzim  L-asparaginase  maka dilakukan isolasi dan pemurnian. Enzim L-asparaginase selanjutnya  diujikan  terhadap  sel  kanker  leukimia  tipe K562  dengan  metode  MTT  untuk  mengetahui  potensi antikanker.

## 3.1 Isolasi Enzim L-asparaginase dari Kunyit Putih (Curcuma mangga Vall)
Enzim L-asparaginase dapat diekstrak dari jaringan kunyit  putih  ( Curcuma  mangga  Vall )  dengan  jalan memecah  jaringan  tersebut  secara  mekanik,  yaitu dengan  cara  diblender  dan  sentrifugasi.  Campuran protein  enzim  dan  protein  non  enzim  yang  dihasilkan merupakan  ekstrak  kasar  enzim  (756  mL),  sehingga perlu  dilakukan  pemurnian.  Salah  satu  cara  pemurnian enzim adalah fraksinasi bertingkat dengan menggunakan garam amonium sulfat. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu sebagian besar protein enzim tahan  terhadap  garam  tersebut,  kelarutannya  besar dalam  air,  mempunyai  efek  menstabilkan  terhadap sebagian  besar  enzim  dan  merupakan  garam  divalen yang mempunyai kekuatan ion yang lebih besar dari pada garam  monovalen  [8].  Fraksinasi  diikuti  dengan
sentrifugasi untuk memisahkan endapan dan supernatan. Endapan yang diperoleh merupakan protein enzim yang perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut.
Endapan  protein  hasil  fraksinasi  bertingkat  masih mengandung amonium sulfat. Oleh karena itu, amonium sulfat  dipisahkan  dari  protein  dengan  cara  dialisis, menggunakan membran selofan  [9]. Untuk enzim yang akan  diujikan  terhadap  sel  kanker  dikeringkan  dengan menggunakan freeze  dryer .  Setelah  proses freeze  dryer akan diperoleh enzim kering yang bisa diujikan pada sel kanker leukimia K562. Berat enzim fraksi 5 adalah 0,454 gram dari 1000 gram kunyit putih.

## 3.2 Uji Aktivitas Spesifik Enzim L-asparaginase dari
Kunyit Putih ( Curcuma mangga Vall)
Enzim  L-asparaginase  hasil  isolasi  ditentukan aktivitasnya  dengan  mereaksikan  enzim  tersebut menggunakan  substrat  L-asparagin.  L-asparaginase akan  mengkatalisis  reaksi  hidrolisis  L-asparagin menjadi L-aspartat dan amonia. Aktivitas spesifik enzim L-asparaginase dapat dihitung dari unit aktivitas enzim per mg protein. Satu unit aktivitas enzim L-asparaginase dapat didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang dapat membentuk  1 μ mol  NH 4 + per  menit  pada  kondisi optimum  [10].  Pada  penelitian  ini,  aktivitas  enzim  L- asparaginase  diukur  dari  amonia  yang  dihasilkan,  dan diuji dengan menggunakan pereaksi Nessler menghasilkan  senyawa  kompleks  berwarna  coklat kekuningan  pada  setiap  fraksinya.  Warna  tersebut kemudian  diukur  absorbansinya  dengan  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis,  dan  nilai  absorbansi  yang terukur  kemudian  diplotkan  pada  kurva  standar amonium  sulfat  untuk  mengetahui  besarnya  unit aktivitas yang terdapat pada ekstrak kasar dan tiap-tiap fraksi.
Gambar 1. Grafik penentuan kurva standar larutan amonium sulfat pada λ = 420 nm
Kadar  protein  pada  tiap-tiap  fraksi  diukur  dengan menggunakan  metode  Lowry  [10].  Melalui  metode  ini, protein dalam kunyit putih ( Curcuma mangga Vall ) akan bereaksi dengan pereaksi Lowry, menghasilkan senyawa kompleks  berwarna  biru  dan  di  plotkan  pada  kurva standar BSA.
Gambar 2. Grafik Penentuan Kurva Standar Larutan BSA pada λ = 750 nm
Nilai  aktifitas  spesifik  diketahui  dari  pengukuran unit aktivitas dan kadar protein dari tiap fraksi. Besarnya aktifitas spesifik merupakan rasio dari unit aktivitas dan kadar  protein. Nilai aktifitas  spesifik  dapat dilihat  pada tabel dibawah ini.
Tabel 1. Data penentuan aktivitas spesifik enzim L- asparaginase pada kunyit putih pada kondisi optimum (pH 8,5, waktu inkubasi 30 menit, suhu 37 0 C) Fraksi Aktivitas Enzim (Unit/mL) Kadar Protein (mg/mL) Aktivitas Spesifik (Unit/mg protein) Tingkat Kemurnian EK 3712,192 38,600 96,171 1,000 F 1 3052,101 25,275 120,756 1,256 F 2 3048,834 6,900 441,860 4,595 F 3 3189,348 5,108 624,342 6,492 F 4 2686,111 2,327 1154,489 12,005 F 5 3754,673 1,710 2195,715 22,831
Aktivitas  enzim  L-asparaginase  setiap  fraksi berbeda-beda, Hal ini disebabkan oleh dua faktor, yaitu unit  aktivitas  dan  kadar  protein.  Pada  penelitian  ini diketahui  bahwa  aktivitas  spesifik  tertinggi  diperoleh pada F 5 sebesar  2195,715  unit/mg  protein dan  terendah pada EK sebesar 96,171 unit/mg protein. Aktifitas spesifik tertinggi  pada  F5  dan  terendah  pada  EK  menunjukan bahwa  kemurnian  enzim  tertinggi  pada  F5  dan kemurnian  terendah  pada  EK  yang  artinya  bahwa kandungan  protein  enzim  teringgi  pada  fraksi  ke  lima. Hasil penelitian ini tidak jauh berbeda dengan penelitian terdahulu  oleh  Kurnasih,  2006,  yaitu  bahwa  fraksi dengan aktivitas spesifik tertinggi pada F5 dengan nilai aktivitas spesifik sebesar 1995 Unit/ mg protein.

## 3.3 Uji aktivitas enzim L-asparaginase pada Kultur Sel Kanker Leukimia Tipe K562
Setelah  diketahui  fraksi  dengan  nilai  aktivitas tertinggi  maka  selanjutnya  di  uji  terhadap  sel  kanker leukimia  tipe  K562  dengan  menggunakan  metode  MTT yang mana pembacaan dilakukan dengan ELISA Reader. Metode  MTT  adalah  suatu  tes  laboratorium  dan  suatu metode  standar  kolorimetri  (suatu  metode  yang mengukur  perubahan  warna) untuk  mengukur pertumbuhan  sel.  Metode  ini  juga  digunakan  untuk menentukan  sitotoksisitas  agen  obat  potensial  dan senyawa toksik lainnya.
Uji aktivitas antikanker ini dilakukan dengan metode MTT  untuk  menentukan  viabilitas  sel  sehingga  bisa
digunakan untuk mengetahui efek sitotoksiknya. Prinsip dari  metode  MTT  adalah  adanya  pemecahan  garam tetrazolium  MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium  bromida] oleh  sistem  enzim tetrazolium suksinat reduktase (atau suksinat dehidrogenase) yang terdapat di dalam mitokondria sel hidup sehingga terbentuklah kristal formazan berwarna ungu  [11].  Semakin  tinggi  intensitas  warna  ungu  yang terbentuk  maka  sel  yang  hidup  semakin  banyak. Intensitas  warna  ini  selanjutnya  dapat  dibaca  dengan ELISA Reader dan  diperoleh  data  berupa  absorbansi . Semakin banyak kristal formazan yang terbentuk maka semakin  tinggi  nilai  absorbansi  yang  diperolah  dan mengindikasikan kematian yang rendah.
Sel yang masih hidup berarti masih aktif melakukan aktivitas  metabolisme  sehingga  adanya  MTT  pada lingkungannya  akan  segera  dipecah  oleh  enzim tetrazolium  suksinat  reduktase  yang  terdapat  di  dalam mitokondria  sel  tersebut  membentuk  kristal  formazan berwarna  ungu  [11].  Reaksi  tersebut  melibatkan  piridin nukleotida  kofaktor  NADH  dan  NADPH  yang  hanya dikatalis oleh sel hidup, sehingga jumlah formazan yang terbentuk  proporsional  dengan  jumlah  sel  yang  hidup [12]. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper (10% SDS ( Sodium Dodecyl Sulfate ) dalam 0,01 N HCl) yang berfungsi untuk melarutkan kristal formazan yang  telah  terbentuk.  Pengukuran  absorbansi  dengan ELISA Reader dilakukan  pada  panjang  gelombang  550 nm[13]
Gambar  pengaruh  sampel  dan  perlakuan  terhadap sel  kanker  leukimia  tipe  K562  hasil  penelitian  dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
A B
Gambar 3. A. Foto Sel kanker Leukimia Tipe K562; B.
Sel+Ekstrak (telah mati)
Data dan grafik hasil uji sitotoksisitas serbuk enzim L-asparaginase fraksi ke-5 dari kunyit putih terhadap sel kanker leukimia tipe K562 yang dinyatakan dalam persen kematian dapat dilihat pada gambar di bawah ini. Nilai x merupakan  besarnya  persen  kematian  dan  nilai  y merupakan besarnya logaritma konsentrasi.
Gambar 4. Grafik persentase kematian sel kanker Leukimia tipe K562 oleh adanya enzim L-asparaginase dari kunyit putih
Besarnya  penghambatan  oleh L-asparaginase  pada sel kanker leukimia ditunjukan oleh besarnya nilai LC 50 . Nilai  LC 50 adalah  konsentrasi  yang  digunakan  untuk membunuh  50%  atau  setengah  dari  jumlah  sel  mula- mula.
Persamaan regresi linier yang diperoleh dari grafik yaitu  y  =  0,033  x – 0,676  dapat  dilihat  pada gambar  4. Persamaan  tersebut  selanjutnya  digunakan  untuk menghitung  nilai  LC 50 dengan  memasukkan  nilai  50 sebagai  x  sehingga  didapatkan  nilai  y.  Nilai  y menunjukan  nilai  log  dari  konsentrasi  dari  fraksi  ke-5 enzim L-asparaginase. Konsentrasi fraksi ke-5 enzim L- asparaginase adalah antilog 0,974 yaitu 9,419 µg/ml. Hal ini berarti bahwa kematian dari sel kanker leukimia K562 mencapai  50%  dengan  adanya  penambahan  enzim  L- asparaginase dengan konsentrasi 9,419 µg/ml.
Jika dilihat dari besarnya nilai LC 50 yang didapat bila dibandingkan  dengan  L-asparaginase  dari  temulawak maka  dapat  diketahui  bahwa  penghambatan  oleh  L- asparaginase  kunyit  putih  menunjukan  potensi  yang lebih  baik. Menurut  NCI  ( National  Cancer  Institut e)  jika suatu  uji  sitotoksik suatu senyawa  menghasilkan  harga LC 50 ≤  20 µg/ml  maka  senyawa  tersebut  dinyatakan memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker.  Karena  nilai  LC 50 enzim  L-asparaginase fraksi  ke-5  dari  kunyit  putih  yang  diuji  kurang  dari  20 µg/ml, maka senyawa bioaktif tersebut potensial untuk digunakan  sebagai  antikanker,  khususnya  terhadap  sel kanker Leukimia K562.

## 4. Kesimpulan
1. Enzim L-asparaginase dapat diisolasi dari rimpang kunyit  putih  dengan  berat  enzim  fraksi  5  adalah 0,454 gram dari 1000 gram kunyit putih.
2. Enzim  L-asparaginase  dari  rimpang  kunyit  putih memiliki  aktivitas  spesifik  tertinggi  pada  kondisi optimum  pada  enzim  fraksi  ke-5  (80-100%)  yaitu dengan  aktivitas  spesifik  enzim  L-asparaginase sebesar 2195,715 unit/mg protein.
3. Enzim  L-asparaginase  fraksi  ke-5  rimpang  kunyit putih  mempunyai  potensi  yang  baik  sebagai antikanker dengan LC 50 pada konsentrasi penambahan enzim L-asparaginase 9,419 µg/ml.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  G.S. Nafrialdi, D. Tirza, T. Handoko, Antikanker dan imunosupresan, Setiabudi R, Suyatma FD, Purwantyastuti,  editors.  Farmakologi  dan  terapi. Jakarta: Gaya Baru, (2003) 686-713.
[2]  M. Radji, A. Sumiati, N. Indani, Uji Mutagenisitas dan Anti  Kanker  Ekstrak  Aseton  dan  N-Heksana  Dari Kulit  Batang  Sesoot  (Garcinia  picrorrhiza  Miq.), MajaIah lmu Kefarmasian, 1 (2004) 69-78.
[3] P. Konečná, B. Klejdus, H. Hrstková, Monitoring The Asparaginase  Levels  in  Children  with  Acute Lymphoblastic  Leukaemia  Treated  with  Different Asparaginase  Preparations,  Scripta  Medica,  (2004) 55-62.
[4]  A.L.  Lehninger,  Dasar-dasar  biokimia,  Erlangga, Jakarta, 2000.
[5]  E.F.D.  Kurniasih,  Isolasi,  Karakterisasi  dan  Uji Aktivitas  Spesifik  L  Asparginase  Dalam  Variasi Waktu  Penyimpanan  Dari  Kunyit  Putih  (Curcuma mangga Vall) Pada Suhu Kamar, in:  Jurusan Kimia, Universitas Diponegoro, Semarang, 2006.
[6]  Q.-L.  Guo,  M.-S.  Wu,  Z.  Chen,  Comparison  of antitumor  effect  of  recombinant  L-asparaginase with  wild  type  one  in  vitro  and  in  vivo,  Acta Pharmacologica Sinica, 23 (2002) 946-951.
[7]  B.N. Meyer, N.R. Ferrigni, J.E. Putnam, L.B. Jacobsen, D.E.  Nochols,  J.L.  Mc  Laughlin,  Brine  Shrimp:  A Convinient  General  Bioassay  for  Active  Plant Convinient, Planta Medica, 45 (1982).
[8]  R.K.  Scopes,  Protein  Purification:  Principles  and Practice, 3rd edition ed., Srpinger, Newyork, 1987.
[9]  F.  Franks,  Characterization  of  Proteins,  Humana Press, 2007.
[10] J.  Paul,  Isolation  and  characterization  of  a Chlamydomonas L-asparaginase, Biochemical Journal, 203 (1982) 109-115.
[11]  R.I. Freshney,  Culture  of  Animal  Cells:  A  Manual of Basic Technique and Specialized Aplication, Lissing, Newyork, 1986.
[12] D.  Hughes,  H.  Mehmet,  Cell  proliferation  and apoptosis, Taylor & Francis, 2003.
[13] T.  Mosmann,  Rapid  colorimetric  assay  for  cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity  assays,  Journal  of  immunological methods, 65 (1983) 55-63.