## IDENTIFIKASI ANTOSIANIN BUAH DUWET ( Syzygium cumini ) MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI - DIODE ARRAY DETECTION
[Identification of Anthocyanins in Jambolan Fruit ( Syzygium cumini ) by High Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detection]
Puspita Sari 1) * , Christofora Hanny Wijaya 2) , Dondin Sajuthi 3) , dan Unang Supratman 4)
1) Jurusan Teknologi Hasil Pertanian,Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Jember Kampus Tegalboto Jl. Kalimantan I, Jember 68121
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680
3) Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680
4) Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Padjadjaran, Jl. Raya Bandung-Sumedang Jatinangor, Sumedang 45363
Diterima  1 Juli  2009 / Disetujui  7 Desember 2009

## ABSTRACT
The  aim  of  this  study  was  to  determine  the  content  of  total  monomeric  anthocyanins  and  to  identify  the  anthocyanin  composition  of  jambolan  fruit (Syzygium cumini) growing in Indonesia. Anthocyanins were extracted with methanol containing 0.1% HCl, removed from non-polar impurities by partition with  chloroform  and  purified  in  a  C 18 solid  phase  cartridge.  Anthocyanins  were  identified  by  high-performance  liquid  chromatography  with  diode  array detection (HPLC-DAD), UV-visible spectral analysis, and physico-chemical reactions. Using pH-differential method, it was known that the content of total monomeric anthocyanin in the ripe fruit was 161 mg/100 g fresh fruit (731 mg/100 g skin on wet basis or 3430 mg/100 g skin on dry basis), based on cyanidin-3-glucoside.  Furthermore,  five  anthocyanins  without  acylating  groups  were  identified  as  3,5-diglucoside  derivatives  of  delphinidin  (41.29%), petunidin (27.79%), malvidin (25.60%), cyanidin (4.19%), and peonidin (1.13%). These results demonstrate that the skin of jambolan fruit especially the ripe one is rich in anthocyanin, with wide range in anthocyanidin backbone (five aglycons).

## Key words : jambolan fruit, Syzygium cumini, anthocyanin, HPLC-DAD

## PENDAHULUAN
Buah  duwet  merupakan  salah  satu  buah  tropis  yang  juga banyak  ditemui  di  Indonesia.  Buah  duwet  biasanya  dikonsumsi secara langsung dalam bentuk buah segar, mempunyai rasa manis, asam,  dan  sedikit  sepat  ( astringent ).  Kulit  buah  yang  mentah berwarna merah dan berubah menjadi ungu kehitaman pada waktu buah  telah  matang,  menunjukkan  kandungan  pigmen  berwarna, yaitu  antosianin.  Pigmen  ini  dapat  memberikan  warna  biru,  ungu, violet, dan merah pada bagian tertentu pada tanaman dan bersifat larut dalam air (Bridle dan Timberlake, 1997; Giusti dan Wrolstad, 2003).  Antosianin  telah  digunakan  secara  luas  sebagai  pewarna alami untuk pangan (Mateus & Freitas, 2009). Selain itu, antosianin juga  memiliki  peranan  penting  untuk  kesehatan  manusia  (Kong et al ., 2003).
Antosianin  termasuk  dalam  kelompok  flavonoid  dari  senyawa polifenol  dan  merupakan  glikosida  dari  turunan  polihidroksi  dan polimetoksi  dari  kation  2-fenilbenzopirilium  atau  kation  flavilium (Brouillard,  1982;  Kong et  al .,  2003).  Antosianin  yang  ditemukan pada  tanaman  pangan  umumnya  dalam  bentuk  glikosida  dan asilglikosida dari 6 antosianidin (aglikon) utama, * yaitu pelargonidin,
*Korespondensi penulis : HP. 081559601972 E-mail : poespitha_s@yahoo.com
sianidin,  delfinidin,  peonidin,  petunidin,  dan  malvidin  (Castaňeda- Ovando et  al .,  2009).  Sebanyak  258  antosianin  telah  ditemukan dalam buah, sayuran, dan biji-bijian (Mazza dan Miniati, 1993) dan sampai sekarang telah dilaporkan lebih dari 500 antosianin berasal dari berbagai tanaman (Andersen dan Jordhein, 2006).
Sejumlah  kajian  telah  mengidentifikasi  antosianin  dalam beberapa  bahan  pangan  dan  pewarna  yang  mengandung antosianin  dengan  menggunakan  kromatografi  cair  kinerja  tinggi- diode array detection (KCKT-DAD) (Hong dan Wrolstad, 1990a dan 1990b)  dan  kromatografi  cair  kinerja  tinggi- electrospray  ionization tandem mass spectrometry (KCKT-ESI-MS/MS) (Giusti et al ., 1999; Wu  dan  Prior,  2005a  dan  2005b).  Selain  itu,  antosianin  dapat diidentifikasi dengan menggabungkan metode KCKT dan elusidasi struktur  menggunakan  spektrometer  resonans  magnetik  inti (Cabrita dan Andersen, 1999; Cabrita et al ., 2000; Hanamura et al ., 2005;  Lee et  al .,  2009).  Identifikasi  antosianin  diperlukan  untuk mengetahui  struktur  dan  komposisi  antosianin  dalam  suatu  bahan pangan  karena  ciri  kimia  antosianin  berhubungan  dengan kestabilan dan aktivitas hayati dari antosianin.
Untuk  itu  penelitian  ini  bertujuan  mengidentifikasi  antosianin dalam  buah  duwet  dengan  menggunakan  KCKT-DAD.  Antosianin pada  buah  duwet  diidentifikasi  untuk  konfirmasi  karena  terdapat perbedaan  hasil  identifikasi  antosianin  buah  duwet  dari  beberapa peneliti  sebelumnya,  yaitu  dari  Lestario  (2003),  Nazif    (2007), Veigas et al ., (2007), dan Brito et al ., (2007).

## METODOLOGI

## Bahan
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah buah duwet matang berwarna ungu kehitaman yang diperoleh dari hutan di Probolinggo, Jawa Timur.

## Persiapan sampel kering beku
Buah  duwet  disortasi,  dicuci  dengan  air  bersih,  lalu  ditiriskan. Kulit buah duwet dikupas menggunakan pisau baja tahan-karat dan diblansir selama 3 menit. Selanjutnya kulit buah duwet dihancurkan dengan  menggunakan hand  blender dan  dikeringkan  dengan menggunakan pengering beku. Sampel kering beku dikemas dalam kantong plastik polietilena (PE) dan wadah plastik kedap udara lalu disimpan pada suhu -20 C.

## Ekstraksi antosianin
Antosianin  diekstraksi  dengan  pelarut  metanol  yang mengandung  0,1%  HCl  (Francis,  1982)  dengan  nisbah  sampel kering  dan  pelarut  1:25.  Ekstraksi  dilakukan  secara  maserasi (diaduk) pada suhu ruang selama 30 menit lalu disentrifus (3552 g) untuk  memisahkan  filtrat  dan  residu.  Ekstraksi  diulang  kembali dengan  menggunakan  pelarut  yang  sama  hingga  diperoleh  filtrat yang bening (4 kali ekstraksi). Filtrat digabung dan disaring dengan menggunakan  penyaring  vakum,  lalu  pelarut  diuapkan  dengan rotavapor  pada  suhu  40 C.  Selanjutnya  ekstrak  dipisahkan  dari impurities non-polar dengan kloroform secara partisi. Residu pelarut organik  (kloroform)  dalam  ekstrak  dihilangkan  dengan menggunakan rotavapor. Ekstrak ditempatkan dalam vial, dihembus nitrogen, dan disimpan pada suhu -20 C.
Ekstrak  dianalisis  kandungan  total  antosianin  monomerik dengan  metode  pH-diferensial  (Giusti  dan  Wrolstad,2001).  Total antosianin  monomerik  dihitung  sebagai  sianidin-3-glukosida menggunakan  koefisien  pemadaman  molar  sebesar  29600 L cm -1 mg -1 dan bobot molekul sebesar 448,8.
Purifikasi antosianin Antosianin dipurifikasi secara parsial menggunakan solid-phase extraction (SPE)  dengan  C 18 Sep-Pak cartridge yang  telah diaktivasi.  Ekstrak  dilewatkan  pada  kolom  mini  C 18 Sep-Pak cartridge ,  lalu  dicuci  dengan  0,01%  HCl-akuades  (v/v)  dan  etil asetat.  Antosianin  yang  diserap  pada  kolom  mini  dielusi  dengan 0,01%  HCl-metanol  (v/v).  Selanjutnya  pelarut  organik  diuapkan dengan  menggunakan  rotavapor  pada  suhu  40 C  (Hong  dan Wrolstad, 1990a).

## Hidrolisis asam
Hidrolisis  dilakukan  dengan  menempatkan  antosianin  yang sudah  dipurifikasi  ke  dalam  tabung  reaksi  berulir,  kemudian ditambahkan  larutan  2  N  HCl.  Campuran  dalam  tabung  reaksi berulir  diembus  gas  nitrogen  lalu  ditutup.  Pigmen  antosianin dihidrolisis selama 45 menit di dalam penangas berisi air mendidih, lalu  didinginkan  menggunakan  serpihan  es.  Hidrolisat  selanjutnya dipurifikasi  menggunakan  C 18 Sep-Pak cartridge .  Gula  dielusi  dari kolom mini dengan 0,01% HCl-akuades (v/v) dan ditampung untuk
identifikasi.  Antosianidin  yang  diserap  pada  kolom  mini  dielusi dengan 0,01% HCl-metanol (v/v) (Hong dan Wrolstad, 1990a).

## Identifikasi gula
Larutan  gula  dari  hasil  hidrolisis  dipekatkan  dengan  rotavapor, dikeringkan  pada  suhu  45 C,  dan  disimpan  semalam  dalam desikator  vakum  (Fang et  al .,  2006).  Gula  diidentifikasi  dengan kromatografi  lapis  tipis  (KLT-gel  silika)  dengan  pengembang  (fase gerak)  2-propanol:piridin:akuades  (3,25:1,25:0,5).  Gula  diwarnai menggunakan  pelarut  difenilamin/anilin/asam  ortofosfat  (Gamar et al ., 1997).

## Analisis antosianin dengan KCKT-DAD
Analisis KCKT dilakukan pada Shimadzu liquid chromatography (Kyoto, Jepang) dengan menggunakan detektor diode array (SPD- M20A, Shimadzu, Kyoto, Jepang). Data diproses melalui komputer personal  menggunakan  program Lab  Solution (LC  solution Shimadzu). Kolom analitik yang digunakan adalah Shimadzu-ODS (250    4  mm  diameter  internal,  5  μm  ukuran  partikel;  Shimadzu, Jepang) dengan kondisi suhu 30 C.
KCKT dikondisikan mengikuti prosedur dari Durst dan Wrolstad (2001). Fase gerak yang digunakan untuk memisahkan antosianidin (aglikon)  dan  antosianin  (glikon)  adalah  fase  gerak  A:  100% asetonitril dan fase gerak B: 10% asam asetat, 5% asetonitril, 1% asam  fosfat,  dan  84%  akuades.  Sistem  elusi  KCKT  dilakukan secara gradien linear dari 5% ke 20% fase gerak A selama 20 menit lalu dari 20% ke 5% fase gerak A selama 5 menit dengan laju alir 1 ml/menit.  Sampel  diinjeksikan  sebanyak  20  μl,  sebelum diinjeksikan, sampel disaring menggunakan 0,45 μm membran filter PP Whatman.
Spektrum absorpsi UV-vis diukur secara on-line selama analisis KCKT.  Spektrum  direkam  pada  panjang  gelombang  200-600  nm dengan  520  nm  sebagai  panjang  gelombang  deteksi.  Kandungan individu  antosianidin  dan  antosianin  dinyatakan  secara  relatif  dan dilaporkan sebagai persen dari total luas puncak.

## Reaksi fisiko-kimia
Reaksi  dengan  aluminium  klorida  (AlCl 3 )  digunakan  untuk mendeteksi  keberadaan  gugus  hidroksil  aromatik.  Spektrum absorpsi  dari  antosianin  yang  dilarutkan  dalam  metanol  diukur sebelum dan sesudah penambahan metanol yang mengandung 5% AlCl 3 (Markakis, 1982; Jackman dan Smith, 1996).
Keberadaan  substituen  pada  C-5  antosianin  dapat  dideteksi dengan adanya senyawa antosianin yang berpendar ( fluorescence ) di  bawah  radiasi  ultraviolet  (Francis,  1982).  Sebelum  dideteksi  di bawah  radiasi  ultraviolet,  antosianin  dipisahkan  dengan kromatografi  lapis  tipis  (KLT-ODS)  menggunakan  fase  gerak air:metanol (2:2) yang mengandung asam format.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kandungan total antosianin monomerik
Hasil pengujian kandungan total antosianin monomerik (metode pH-diferensial)  dari  buah  duwet  segar  yang  matang  rata-rata sebesar  161  mg/100  g  buah  segar  (bb).  Bagian  kulit  buah  duwet
matang  mengandung  antosianin  rata-rata  sebesar  731  mg/100  g kulit  buah  (bb)  atau  3430  mg/100  g  kulit  buah  (bk).  Kandungan antosianin pada bagian kulit buah memiliki kandungan 4,5 kali lebih banyak  dibandingkan  pada  buah  utuh  yang  segar.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  bagian  kulit  buah  duwet  berpotensi  untuk digunakan sebagai sumber antosianin. Antosianin yang terkandung dalam  buah  duwet  banyak  terdapat  pada  bagian  kulit  buah  yang berwarna ungu kehitaman. Salah satu ciri khas adanya kandungan antosianin  pada  bagian  tanaman  adalah  warna  biru,  ungu,  violet, dan  merah,  sebagaimana  dinyatakan  oleh  Bridle  dan  Timberlake (1997) serta Giusti dan Wrolstad (2003).
Beberapa  buah  dan  sayuran  lainnya  yang  juga  mengandung antosianin,  dinyatakan  sebagai  bobot  buah  dan  sayuran  segar, seperti apel (10 mg/100 g), blackberry (83-326 mg/100 g), bilberry (300-320  mg/100  g), black  currant (130-400  mg/100  g), cranberry (60-200 mg/100 g), blueberry (25-495 mg/100 g), kubis merah (25 mg/100  g),  anggur  (6-600  mg/100  g),  plum  (2-25  mg/100  g), bawang  merah  (7-21  mg/100  g),  lobak  merah  (11-60  mg/100  g), strawberi  (15-35  mg/100  g)  (Mazza  dan  Miniati,  1993;  Clifford, 2000).  Kandungan  antosianin  buah  duwet  segar  (161  mg/100  g buah  segar)  lebih  tinggi  dibandingkan  apel,  kubis  merah,  plum, bawang  merah,  lobak  merah,  dan  strawberi  yang  mengandung antosianin pada kisaran nilai antara 2-60 mg/g buah segar, namun lebih rendah dibandingkan dengan bilberry (300-320 mg/100 g buah segar). Kandungan antosianin buah duwet segar di dalam kisaran nilai kandungan antosianin dari blackberry , black currant , cranberry , blueberry ,  dan  anggur  dengan  kisaran  nilai  antara  25-600  mg/g buah segar.

## Komposisi antosianidin
Analisis  antosianidin  merupakan  pendekatan  awal  yang diperlukan  untuk  mendapatkan  informasi  jenis  aglikon  antosianin
(antosianidin). Identifikasi awal menjadi lebih mudah karena hanya terdapat 6 antosianidin utama yang ditemukan pada bahan pangan, yaitu  pelargonidin,  sianidin,  delfinidin,  peonidin,  petunidin,  dan malvidin  (Brouillard,  1982;  Hong  dan  Wrolstad,  1990a).  Hidrolisis dari  antosianin  buah  duwet  terpurifikasi  menghasilkan  5 antosianidin  yang  dipisahkan  menggunakan  KCKT-DAD  dideteksi pada panjang gelombang 520 nm (Gambar 1). Identifikasi dilakukan dengan membandingkan waktu retensi dan spektrum (λ vis-maks ) dari antosianidin  buah  duwet  dengan  standar  antosianidin.  Selain  itu, kromatogram  KCKT  dari  antosianidin  buah  duwet  juga dibandingkan  dengan  antosianidin  dari  anggur  ( concord  grape ) yang diperoleh dari pustaka (Ordaz-Galindo et al ., 1999; Durst dan Wrolstad, 2001). Lebih lanjut menurut Hong dan Wrolstad (1990a), pada  pemisahan  antosianidin  dengan  sistem  KCKT  fase  terbalik, urutan elusi dari antosianidin (aglikon) dapat diprediksi berdasarkan jumlah  fenolik  hidrofilik  dan  gugus  metoksil  hidrofobik,  dengan urutan  elusi  adalah  delfinidin,  sianidin,  petunidin,  pelargonidin, peonidin, dan malvidin.
Lima  antosianidin  yang  terdapat  pada  buah  duwet  adalah delfinidin  (41,03%),  sianidin  (6,75%),  petunidin  (26,90%),  peonidin (1,82%), dan malvidin (23,50%). Delfinidin, petunidin, dan malvidin merupakan antosianidin utama. Kandungan antosianidin pada buah duwet  memiliki  komposisi  antosianidin  yang  sama  dengan  anggur ( red dan concord  grape ),  namun  berbeda  dalam  persentase relatifnya.  Antosianidin  utama  pada  anggur concord adalah delfinidin  dan  sianidin  (Ordaz-Galindo et  al .,  1999;  Durst  dan Wrolstad, 2001; Wu dan Prior, 2005a). Ciri kromatogram KCKT dan spektrum  antosianidin  buah  duwet  ditabulasi  pada  Tabel  1, sedangkan  struktur  kimia  dari  kelima  antosianidin  buah  duwet ditampilkan pada Gambar 2.
Gambar 1  Kromatogram KCKT dari antosianin duwet terhidrolisis asam (antosianidin): (1) delfinidin, (2) sianidin, (3) petunidin, (4) peonidin, dan (5) malvidin.
Waktu retensi (menit) 0,0              2,5              5,0              7,5            10,0             12,5           15,0             17,5 20,0 2 4 1 3 5 A bsor bans ( 52 0 nm )
Tabel  1.  Ciri  kromatogram  KCKT  dan  spektrum  dari  antosianin  duwet terhidolisis asam (antosianidin)
a t R , waktu retensi
b persen relatif antosianidin didasarkan pada total luas puncak c panjang gelombang daerah visibel yang menghasilkan nilai absorbans maksimum

## Komposisi antosianin
Gambar  3  menampilkan  kromatogram  KCKT  dari  antosianin buah  duwet  terpurifikasi  yang  dideteksi  menggunakan  detektor diode  array pada  panjang  gelombang  520  nm.  Hasil  pemisahan antosianin  dengan  KCKT-DAD  diperoleh  5  puncak  antosianin (Gambar 3) yang memiliki jumlah puncak yang sama dengan hasil pemisahan  pada  antosianidin  (Gambar  1),  sehingga  5  puncak antosianin  dapat  diidentifikasi  secara  berurutan  sebagai  delfinidin glikosida  (puncak  1),  sianidin  glikosida  (puncak  2),  petunidin glikosida  (puncak  3),  peonidin  glikosida  (puncak  4),  dan  malvidin glikosida (puncak 5). Identifikasi antosianin pada sistem KCKT fase terbalik  didasarkan  pada  relatif  hidrofobisitas  dari  antosianin  serta tingkat glikosidasi (tri, di, dan mono-glikosida) dan jenis gula yang terkonjugasi  (heksosa  dan  pentosa).  Pola  elusi  antosianin  pada sistem KCKT fase terbalik adalah antosianin dengan substitusi tri- glikosida  dielusi  sebelum  di-glikosida  dan  di-glikosida  dielusi sebelum  mono-glikosida.  Sementara  itu,  glikosida  dari  heksosa lebih  polar  dan  terelusi  lebih  dahulu  daripada  glikosida  gula pentosa.  Urutan  elusi  dari  aglikon  didasarkan  pada  gugus  fenolik hidrofilik dan metoksil hidrofobik (Hong dan Wrolstad, 1990a; Durst dan Wrolstad, 2001).
Data  spektrum  memberikan  informasi  tentang  keberadaan gugus asil pada molekul antosianin. Keberadaan gugus asil asam organik  aromatik  dapat  dideteksi  dengan  adanya  puncak  pada
spektrum pada daerah panjang gelombang 310-340 nm (Harborne, 1958; Hong dan Wrolstad, 1990a). Pada setiap spektrum antosianin buah  duwet  tidak  ditemukan  absorbans  maksimum  pada  daerah 310-340 nm yang mengindikasikan tidak ada asilasi asam organik aromatik (asam sinamat) pada antosianin buah duwet.
Selain  itu,  informasi  mengenai  pola  substitusi  glikosidasi antosianin juga dapat diperoleh dari data spektrum. Pola substitusi 3-glikosida dan 3,5-diglikosida memiliki spektrum visibel maksimum yang  sama  tetapi  menunjukkan  perbedaan  pada  daerah  400-460 nm. Umumnya digunakan nisbah A 440 /A λvis-maks untuk menunjukkan perbedaan  karakteristik  spektrum  dari  3-glikosida  dan  3,5- diglikosida;  3-glikosida  menunjukkan  nisbah  dua  kali  lebih  besar daripada  3,5-diglikosida.  Apabila  nisbah  lebih  besar  dari  ~0,3 (30%),  maka  antosianin  diidentifikasi  sebagai  3-glikosida  dan apabila  nisbah  lebih  kecil  dari  0,2  (20%)  maka  antosianin diidentifikasi  sebagai  3,5-diglikosida  (Harborne  1967  dan  1958; Hong dan Wrolstad, 1990a). Pada Tabel 2 dicantumkan nilai nisbah A 440 /A λvis-maks dari  masing-masing  antosianin  buah  duwet.  Nilai nisbah A 440 /A λvis-maks berkisar 10-17%. Nilai nisbah ini menunjukkan bahwa seluruh antosianin buah duwet mengandung glikosida pada posisi  3  dan  5  (3,5-diglikosida).  Keberadaan  substituen  glikosidik pada posisi 5 juga dikonfirmasi dengan berpendarnya antosianin di bawah  radiasi  ultraviolet  (Francis,  1982).  Identifikasi  gula  dengan kromatografi  lapis  tipis  (KLT-gel  silika)  menunjukkan  bahwa  gula yang berikatan pada antosianin buah duwet adalah glukosa.
Dari semua informasi yang diperoleh, dapat diidentifikasi bahwa semua  antosianin  pada  buah  duwet  dalam  bentuk  3,5-diglukosida tanpa adanya asilasi dari asam sinamat. Oleh karena itu, puncak 1, 2,  3,  4,  dan  5  berturut-turut  dapat  diidentifikasi  sebagai  delfinidin- 3,5-diglukosida  (41,29%),  sianidin-3,5-diglukosida  (4,19%), petunidin-3,5-diglukosida (27,79%), peonidin-3,5-diglukosida (1,13%), dan malvidin-3,5-diglukosida (25,60%). Struktur antosianin yang  terkandung  dalam  buah  duwet  disajikan  pada  Gambar  4. Besarnya  nilai  persen  relatif  dari  delfinidin  dan  petunidin  (69%) dapat juga dikonfirmasi oleh adanya pergeseran batokromik setelah penambahan  AlCl 3 pada  ekstrak  terpurifikasi  (Markakis,  1982; Jackman dan Smith, 1996).
Gambar 2  Struktur antosianidin buah duwet. Struktur antosianidin berdasarkan sitasi dari Brouillard (1982).
Puncak t Ra (menit) % Relatif antosianidin b λ vis-maksc (nm) Antosianidin 1 7,3 41,03 531 delfinidin 2 11,35 6,75 524 sianidin 3 12,73 26,90 533 petunidin 4 16,96 1,82 526 peonidin 5 17,84 23,50 535 malvidin sianidin peonidin delfinidin malvidin petunidin
Gambar 3  Kromatogram KCKT dari antosianin buah duwet yang telah dipurifikasi: (1) delfinidin glikosida, (2) sianidin glikosida, (3) petunidin glikosida, (4) peonidin glikosida, dan (5) malvidin glikosida.
Tabel 2. Ciri kromatogram KCKT dan spektrum dari antosianin buah duwet
a t R , waktu retensi b persen relatif antosianin didasarkan pada total luas puncak
c panjang gelombang daerah visibel yang menghasilkan nilai absorbans maksimum d nisbah nilai absorbans pada panjang gelombang 440 nm dengan nilai absorbans maksimum pada panjang gelombang daerah visibel e dpd, delfinidin; cyd, sianidin; ptd, petunidin; pnd, peonidin; mvd, malvidin
Gambar 4  Struktur antosianin buah duwet
Nilai  persen  relatif  dari  setiap  antosianidin  (Tabel  1)  dan antosianin (Tabel 2) yang hampir sama menunjukkan bahwa kedua metode yang digunakan memberikan hasil yang tidak jauh berbeda.
Perbedaan hanya ditemui pada waktu retensi, dengan antosianidin menunjukkan  waktu  retensi  yang  lebih  lama  dibandingkan antosianin.  Hal  ini  berhubungan  dengan  ciri  kepolaran  dari  kedua molekul. Antosianidin bersifat nonpolar dan antosianin bersifat polar karena adanya gugus gula (diglukosida).
Hasil  identifikasi  antosianin  pada  penelitian  ini  menunjukkan kesamaan hasil seperti yang dilakukan oleh Brito et al., (2007) yang juga mengidentifikasi antosianin buah duwet yang tumbuh di Brazil. Identifikasi  dilakukan  menggunakan  KCKT-ESI-MS/MS.  Lima antosianin yang berhasil diidentifikasi oleh Brito et al ., (2007) yaitu delfinidin  (33,2%),  sianidin  (3,8%),  petunidin  (31,8%),  peonidin (9,7%)  dan  malvidin  (21,5%),  dengan  semua  antosianin  dalam bentuk  3,5-diglukosida.  Sementara  itu,  hasil  identifikasi  antosianin buah duwet yang dilakukan oleh Lestario (2003), Nazif (2007), dan Veigas et  al .,  (2007)  menunjukkan  hasil  yang  berbeda.  Lestario (2003)  melaporkan  tiga  jenis  antosianin  yang  terkandung  dalam buah  duwet  yang  tumbuh  di  Indonesia,  yaitu  pelargonidin-3,5- diglukosida, sianidin-3-ramnosil-glukosida-5-glukosida, dan pelargonidin-3-( p -kumaril-glukosida)-5-glukosida. Antosianin
Puncak t Ra (menit) % Relatif antosianin b λ vis-maksc (nm) A 440 /A λvis- maksd Antosianin e 1 3,14 41,29 524 0,15 (15%) dpd-3,5-diglukosida 2 3,64 4,19 516 0,16 (16%) cyd-3,5-diglukosida 3 3,88 27,79 525 0,17 (17%) ptd-3,5-diglukosida 4 4,89 1,13 520 0,16 (16%) pnd-3,5-diglukosida 5 5,35 25,60 526 0,10 (10%) mvd-3,5-diglukosida 0,0                  2,5                 5,0                 7,5                10,0               12,5                15,0               17,5                20,0 Waktu retensi (menit) 5 A bsor bans ( 52 0 nm ) 4 3 2 1 sianidin-3,5-diglukosida       R 1 = OH, R 2 = H  (orange - merah) delfinidin-3,5-diglukosida     R 1 = R 2 = OH (biru - merah) malvidin-3,5-diglukosida      R 1 = R 2 = OCH 3 (biru - merah) peonidin-3,5-diglukosida      R 1 = OCH 3 , R 2 = H (orange - merah) petunidin-3,5-diglukosida     R 1 = OH, R 2 = OCH 3 (biru - merah) R1 R2
dipisahkan  dengan  kromatografi  kertas.  Nazif  (2007)  melaporkan empat  antosianin  yang  diisolasi  dari  buah  duwet  yang  tumbuh  di Arab,  yaitu  pelargonidin-3-glukosida,  pelargonidin-3,5-diglukosida, sianidin-3-malonil-glukosida,  dan  delfinidin-3-glukosida.  Identifikasi dilakukan dengan analisis spektrum ( 1 H-NMR dan FAB/MS). Veigas et al ., (2007) melaporkan tiga jenis antosianin didalam buah duwet yang tumbuh di India, yaitu delfinidin (23%), petunidin (35%), dan malvidin  (38%)  yang  diidentifikasi  sebagai  diglukosida menggunakan KCKT-ESI-MS.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Kandungan  total  antosianin  monomerik  buah  duwet  matang yang  tumbuh  di  Indonesia  rata-rata  sebesar  161  mg/100  g  buah segar (bb) dan pada bagian kulit sebesar 731 mg/100 g kulit buah (bb).  Lima  antosianin  dapat  diidentifikasi  dengan  menggunakan KCKT-DAD, yaitu delfinidin-3,5-diglukosida (41,29%), petunidin-3,5- diglukosida  (27,79%),  malvidin-3,5-diglukosida  (25,60%),  sianidin- 3,5-diglukosida  (4,19%),  dan  peonidin-3,5-diglukosida  (1,13%). Komposisi  antosianin  dari  hasil  penelitian  ini  (buah  duwet  yang tumbuh  di  Indonesia)  memiliki  kesamaan  komposisi  dengan  buah duwet yang tumbuh di Brazil dan berbeda dalam komposisi dengan buah  duwet  yang  tumbuh  di  Arab  dan  India.  Antosianin  yang terkandung  dalam  buah  duwet  dapat  dikembangkan  sebagai pewarna alami untuk pangan dan nutraseutikal.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Puspita  Sari  mengucapkan  terima  kasih  kepada International Foundation for Science (IFS), Stockholm, Sweden dan Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons (OPCW), The Hague, The Netherlands  yang  telah  mendanai  penelitian  ini  melalui Research Project of First IFS Research Grant .

## DAFTAR PUSTAKA
Andersen  ØM,  Jordheim  M.  2006.  The  Anthocyanins.  Di  dalam: Andersen  ØM,  Markham  KR,  editor.  Flavonoids:  Chemistry, biochemisitry, and applications. CRC Press, Boca Raton.
Bridle  P,  Timberlake  CF.  1997.  Anthocyanins  as  natural  food colours - selected aspects. Food Chemistry 58(1-2):103-109.
Brito  ES,  Araŭjo  MCP,  Alves  RE,  Carkeet  C,  Clevidence  BA,
Novotny  JA.  2007.  Anthocyanins  present  in  selected  tropical fruits:  Acerola,  jambolão,  jussara,  and  guajiru.  J  Agric  Food Chem 55:9389-9394.
Brouillard R. 1982. Chemical Structure of Anthocyanins.  Di dalam: Markakis  P,  editor.  Anthocyanins  as  Food  Colors.  Academic Press, New York.
Cabrita  L,  Andersen  ØM.  1999.  Anthocyanins  in  blue  berries  of Vaccinium padifolium . Phytochemistry 52:1693-1696.
Cabrita  L,  Frøystein  NA,Andersen  ØM.  2000.  Anthocyanin trisaccharides  in  blue  berries  of Vaccinium  padifolium .  Food Chemistry 69:33-36.
Castaňeda-Ovando  A,  Pacheco-Hernández  ML,  Páez-  Hernández ME, Rodríguez JA, Galán-Vidal CA. 2009. Chemical studies of anthocyanins: A review. Food Chemistry 113:859-871.
Clifford  MN.  2000.  Anthocyanins  -  Nature,  occurrence  and  dietary burden. J Sci Food Agric 80:1063-1072.
Durst RW, Wrolstad RE. 2001. Separation and Characterization of Anthocyanins  by  HPLC.  Di  dalam:  Current  Protocols  in  Food Analytical Chemistry. John Wiley and sons, New York.
Fang  ZX,  Zhang  M,  Wang  LX,  Sun  JC.  2006.  Identification  of anthocyanin in bayberry ( Myrica rubra Sieb.et Zucc.) by HPLC- DAD-ESI/MS and GC. J Food Drug Analysis 14(4):368-372.
Francis FJ. 1982. Analysis of anthocyanins. Di dalam: Markakis P, editor.  Anthocyanins  as  food  colors.  Academic  Press,  New York.
Gamar L, Blondeau  K,  Simonet  JM. 1997. Physiological approach to  extracellular  polysaccharide  production  by  Lactobacillus rhamnosus strain C83. J Applied Microbiology 83:281-287.
Giusti  MM,  Rodriguez-Saona  LE,  Griffin  D,  Wrolstad  RE.  1999. Electrospray  and  tandem  mass  spectroscopy  as  tools  for anthocyanin  characterization.  J  Agric  Food  Chem  47:4657- 4664.
Giusti MM, Wrolstad RE. 2001. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. Di dalam: Current Protocols  in  Food  Analytical  Chemistry.  John  Wiley  and  sons, New York.
Giusti MM, Wrolstad RE. 2003. Acylated anthocyanins from edible sources  and  their  applications  in  food  system:  Review. Biochemical Engineering Journal 14:217-225.
Hanamura  T,  Hagiwara  T,  Kawagishi  H.  2005.  Structural  and functional characterization of polyphenols isolated from acerola ( Malpighia  emarginate DC.)  fruit.  Biosci  Biotechnol  Biochem 69(2):280-286.
Harborne  JB.  1958.  Spectral  methods  of  characterizing anthocyanins. Biochem J 70:22-28.
Harborne  JB.  1967.  Comparative  Biochemistry  of  the  Flavonoids. Academic Press, New York.
Hong V, Wrolstad RE. 1990a. Use of HPLC separation/photodiode array  detection  for  characterization  of  anthocyanins.  J  Agric Food Chem 38:708-715.
Hong  V,  Wrolstad  RE.  1990b.  Characterization  of  anthocyanin- containing colorants and fruit juices by HPLC/photodiode array detection. J Agric Food Chem 38:698-708.
Jackman  RL,  Smith,  JL.  1996.  Anthocyanins  and  Betalains.  Di dalam:  Hendry  GAF,  Houghton  JD,  editor.  Natural  Food Colorants.  Ed  ke-2.  Blackie  Academic  and  Professional, London.
Kong JM, Chia LS, Goh NK, Chia TF, Brouillard R. 2003. Analysis and  biological  activities  of  anthocyanins.  Phytochemistry 64:923-933.
Lee JH, Kang NS, Shin S-O, Shin S-H, Lim, S-G, Suh D-Y, Baek I- Y, Park K-Y, Ha TJ. 2009. Characterisation of anthocyanins in
the  black  soybean  ( Glycine  max L.)  by  HPLC-DAD-ESI/MS analysis. Food Chemistry 112:226-231.
Lestario LN. 2003. The potential of java plum ( Syzygium cumini ) as source  of  food  natural  antioxidant.  Indonesian  Food  and Nutrition Progress 10(1):40-45.
Markakis  P.  1982.  Stability  of  Anthocyanins  in  Food.  Di  dalam: Markakis  P,  editor.  Anthocyanins  as  Food  Colors.  Academic Press, New York.
Mateus  N,  Freitas  V.  2009.  Anthocyanins  as  Food  Colorants.  Di dalam:  Gould  K,  Davies  K,  Winefield  C,  editor.  Anthocyanins :Biosynthesis,  Functions,  and  Applications. Springer Science+Business Media, LLC, New York.
Mazza G, Miniati E. 1993. Anthocyanins in Fruits, Vegetables, and Grains. CRC Press, Boca Raton.
Nazif NM. 2007. The Anthocyanin components and cytotoxic activity of Syzygium cumini (L.) fruits growing in Egypt. Natural Product Sciences 13(2):135-139.
Ordaz-Galindo  A,  Wesche-Ebeling  P,  Wrolstad  RE,  Rodriguez- Saona L, Argaiz-Jamet A. 1999. Purification and identification of Capulin  ( Prunus  serotina Ehrh)  anthocyanins.  Food  Chemistry 65:201-206.
Veigas  JM,  Narayan  MS,  Laxman  PM,  Neelwarne  B.  2007. Chemical nature, stability and bioefficacies of anthocyanins from fruit peel of Syzygium cumini Skeels. Food Chemistry 105:619- 627.
Wu  X,  Prior  RL.  2005a.  Systematic  identification  and characterization  of  anthocyanins  by  HPLC-ESI-MS/MS  in common foods in the United States: Fruits and berries.   J Agric Food Chem 53:2589-2599.
Wu  X,  Prior  RL.  2005b.  Identification  and  characterization  of anthocyanins  by  high-performance  liquid  chromatography- electrospray  ionization-tandem  mass  spectrometry  in  common foods  in  the  United  States:  Vegetables,  Nuts,  and  Grains.  J Agric Food Chem 53:3101-3113.