## Sintesis reagen imunokimia untuk deteksi okratoksin dengan metode imunokromatografik nanopartikel emas
Synthesis of immunochemical reagent for ochratoxin detection using gold nanoparticle immunochromatographic method
Irma KRESNAWATY 1)*) ,  Romsyah MARYAM 2) , SUHARYANTO 1) & Sumi HUDIYONO 3)
1) Pusat Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia, Jl. Taman Kencana No.1, Bogor 16128, Indonesia
2) Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. RE Martadina No. 30, Bogor  16114, Indonesia
3) Departemen Kimia FMIPA Universitas Indonesia, Depok, Indonesia
Diterima tanggal 12 Maret 2015/disetujui tanggal 9 Juni 2015

## Abstract
The  quality  of  Indonesiam  coffee  andcocoa products  has  been  declined  due  to  the contamination  of  fungi  producing  ochratoxin,  a serious  human  mycotoxin.  Therefore,  develop- ment  of  fast,  accurate  and  simple  method  for early  detection  of  ochratoxin  contamination  is required.  As  a  part  of  research  attempted  to develop early detection technique of ochratoxin in severall  commodities,  especially  agricultural products,  the  objective  of  this  study  was  to produce immunochemical  reagent  for  ochratoxin detectionusing immunoglobulin  Y  (IgY)  based  on immunochromatographic method. Results showed that  OTA-OVA could  be  synthesized  using  active ester  method  with  addition  of  N-hydroxy- succiimide  and  dicyclocarboimide.  The  inter- mediate  compound  produced  showed  C=O stretching vibrational band at 1600 cm -1 and C-O stretching  vibrational  band  at  1300-1000  cm -1 . Antibody-gold nanoparticle conjugate was optimally  produced  at  pH  9  and  with  antibody dilution  of  1:7.5  (v/v).  There  was  50  nm  absorb- tion  shift in visible absorbtion  after the antibody was  conjugated  with  gold  nanoparticle.  Even though  the  test  strip  did  not  show    clear  visual- ization,  the  cut  off  of  ochratoxin  concentrationis obviously  determined  at  10  ppb.  This  results suggest thatthe  technique could be  used to detect ochratoxin contamination.
[ Keywords: Ochratoxin, early detection, antibody IgY, lateral flow immunoassay ]

## Abstrak
Komoditas  kopi  dan  kakao  Indonesia  ter- kendala masalah mutu produk yang rendah akibat kontaminasi  jamur  yang  menghasilkan  okra- toksin.  Okratoksin  merupakan  mikotoksin  yang membahayakan  kesehatan  manusia.  Oleh  karena itu, cara deteksi dini kontaminasi okratoksin yang cepat, akurat dan mudah perlu dikembangkan.
Sebagai bagian dari usaha untuk mengembangkan teknik deteksi dini okratoksin pada pada berbagai komoditas,  khususnya  produk  pertanian,  pene- litian  ini  bertujuan  menghasilkan  reagen  imuno- kimia  yang  menggunakan  antibodi immune- globulin Y  (IgY)  berdasarkan  metode  imunokro- matografik  untuk  deteksi  okratoksin.  Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  OTA-OVA  dapat disintesis  dengan  metode  ester  aktif  dengan menambahkan  N-hidroksisuksiimida  dan  disiklo- karboimida.  Senyawa  antara  yang  dihasilkan memiliki absorpsi pada frekuensi 1600 cm -1 yang menunjukkan adanya vibrasi ulur ikatan C=O dan adanya  banyak  absorpsi  pada  1300-1000  cm -1 yang  mengindikasikan  adanya  serapan  ulur  yang kuat  ikatan  C-O.  Konjugat  antibodi-nanopartikel emas dihasilkan optimum pada pH 9 dan dengan pengenceran antibodi 1:7,5 (v/v). Hasil pengujian spektrofotometer visible menunjukkan  adanya pergeseran  serapan  sebesar  50  nm  setelah  anti- bodi  dikonjugasikan  pada  nanopartikel  emas. Meskipun  secara  visual  tidak  begitu  jelas,  tetapi hasil  pengujian  pada test strip  menunjukkan bahwa  nilai cut  off konsentrasi  okratoksin  yang terdeteksi  adalah10  ppb.  Hasil  ini  menunjukkan bahwa  teknik  yang  dikembangkan  dapat  diguna- kan untuk deteksi kontaminasi okratoksin.
[Kata  Kunci:  Okratoksin,  deteksi  dini,  antibodi
IgY, imunoasai aliran lateral]

## Pendahuluan
Indonesia  sebagai  daerah  tropis  dengan fluktuasi  kelembaban  nisbi  udara  (RH)  cukup tinggi  sangat  kondusif  untuk  perkembangbiakan jamur,  termasuk  jamur  toksigenik  penghasil mikotoksin  (Haliza et  al .,  2006).  Salah  satu mikotoksin  tersebut  adalah  okratoksin  yang merupakan metabolit sekunder kelompok Aspergillus dan Penicillium . Okratoksin A (OTA) merupakan  jenis  okratoksin  yang  paling  toksik dibandingkan beberapa jenis okratoksin yang lain. Kandungan okratosin merupakan salah satu aspek
*)Penulis korespondensi: irma.kresnawaty@yahoo.com
Sintesis reagen imunokimia untuk deteksi okratoksin dengan…….. (Kresnawaty et al .)
standar  mutu  kopi  dan  kakao  yang  saat  ini dipersyaratkan  oleh  pasar  dunia,  terutama  Uni Eropa  (ICMSF , 1996 ) .  Selain  pada  kopi  dan kakao, okratoksin juga ditemukan pada komoditas jagung,  anggur,  gandum,  sorgum,  beras,  kedelai, kacang-kacangan  dan  kopra.  Selain  itu,  karena bersifat  larut  dalam  lemak,  OTA  juga ditemukan pada  susu,  daging  babi,  dan  ayam  (Covarelli et al ., 2012). World  Health  Organization (WHO)  dan International  Agency  for  Research  on  Cancer menggolongkan  okratoksin  sebagai  senyawa toksik  yang  bersifat  hepatotoksik,  neurotoksik, teratogenik, imunotoksik, dan genotoksik (IARC, 1997;  El-Khoory  &  Atoui,  2010).  Batas kontaminasi  maksimum  OTA  pada  produk pangan  telah  ditentukan  oleh  Uni  Eropa,  yaitu 5  ppb  untuk  sereal,  5  ppb  untuk  kopi  sangrai, 3  ppb  untuk  produk  jadi  sereal,  2  ppb  untuk anggur  dan  0,5  ppb  untuk  produk  makanan  bayi ( Commision Regulation No 123/2005). Aturan ini diadopsi  oleh  Badan  Pengawas  Obat  dan Makanan  (BPOM)  dalam  Keputusan  Kepala BPOM  tahun  2009.  Batasan  kontaminasi  ini membutuhkan  metode  deteksi  yang  akurat  dan cepat.  Saat  ini  instrumen  yang  umum  digunakan untuk  mendeteksi  OTA adalah high performance liquid  chromatography (HPLC)  dengan  detektor fluoresens, gas  chromatography  mass  spectro- metry (GC-MS)  dan enzyme  linked  immunorbent assay (ELISA).  Metode  analisis  tersebut  meng- hasilkan  data  yang  akurat,  tetapi  biaya  analisis relatif  mahal,  menghasilkan  limbah  pelarut- organik,  membutuhkan  waktu  yang  relatif  lama, membutuhkan preparasi contoh, dan teknisi yang terlatih. Selain itu pengujian ini tidak memungkinkan  dilakukan  langsung  pada  lokasi ( on-site  detection )  (Olsson et  al .,  2002;  Scoot,
2002). Teknik  imunodeteksi  langsung  ( on-site detection )  yang  dapat  dikembangkan  adalah metode imunokromatografik (ICG) pada membran nitroselulosa atau sering disebut lateral flow  immunoassay (LFIA).  Metode  ini  banyak digunakan  untuk  kontrol  klinis  dan  biasanya digunakan  untuk  analisis  makanan.  Teknik  ini memiliki  beberapa  kelebihan,  di  antaranya penyimpanannya  mudah,  formatnya  mudah  di- gunakan dan hasil mudah diamati. Sehingga tidak memerlukan  pelatihan  khusus  dan  waktu  analisis yanglama  jika  dibandingkan  dengan  metode lainnya  (Kaushik et  al .,  2013).Anfossi et  al . (2011)  dan  Shim et  al .  (2009)  telah  me- ngembangkan  metode  imunokromatografik  atau lateral  flow  immunoassay untuk  mengukur kontaminasi  okratoksin  A menggunakan antibodi kelinci  dan  kambing  (IgG),  sedangkanpada penelitian ini dilakukan pengujian metode imuno- kromatografik  menggunakan  imunoglobulin  Y (IgY)  dari  telur  ayam. Imonoglobulin  Y  (IgY) adalah antibodi mayoritas yang dihasilkan oleh
ayam  ( Gallus  domesticus ).  Antibodi  ayam  (IgY) merupakan  sumber  antibodi  yang  murah  diguna- kan  untuk  tujuan  diagnostik.  IgY  memiliki banyak kelebihan dibandingkan IgG.Selain faktor animal  welfare ,  IgY  dapat  diproduksi  dalam jumlah yang lebih banyak dibanding IgG. Seekor ayam  betina  dapat  menghasilkan  20  telur ayam/bulan  yang  sebanding  dengan  2  g  IgY /bulan  ekivalen  dengan  300  mL  serum  IgG  atau total 600 mL total darah. Selain itu antibodi ayam mengenal  lebih  banyak  epitop  ketika  digunakan protein mamalia (Larsson et al ., 1999).
Untuk  menghasilkan  kit  deteksi on  site reaction diperlukan beberapa reagen imunokimia, diantaranya  konjugat  okratoksin-ovalbumin  dan konjugat  antibodi-nanopartikel  emas.  Penelitian ini  bertujuan  untuk  mensintesis  reagen  imuno- kimia  konjugat  okratoksin-ovalbumin  (OTA- OVA)  dan  konjugat  antibodi  IgY-nanopartikel emas,  yang  merupakan  komponen  utama  dari metode/teknik  deteksi  dini  okratoksin  yang sedang dikembangkan.

## Bahan dan Metode

## Bahan
Bahan  penelitian  yang  digunakan  adalah imunoglobulin  Y  (IgY)  anti  OTA  yang  diisolasi dari  telur  ayam,  okratoksin  A  (OTA),  dimetil- furan (DMF), disiklokarboimida (DCC),N- hidroksisuksiimida (NHS), dimetilsufoksida (DMSO),  ovalbumin  (OVA),  larutan  partikel emas  berukuran  40  nm, buffer karbonat, phosphate  buffer  saline (PBS),  NaCl,    Na 2 CO 3 , bovine  serum  albumin (BSA),  tween-20, natrium azida, buffer borat, dan strip imunokromatografik yang terdiri dari tiga bantalan (sampel, pelepasan konjugat  dan  bantalan  absorben)  dan  satu membran nitroselulosa.

## Sintesis OTA-OVA
Sintesis OTA-OVA dilakukan dengan metode Wang-Xi et al. (2014) yang dimodifikasi. Sebanyak  500  μL  OTA  dalam  DMF  ditambah 6  mg  disiklokarboimida  (DCC)  dan  4  mg  N- hidroksisuksiimida  (NHS).  Campuran  tersebut dihomogenkan dengan magnetic stirrer pada suhu kamar  selama  24  jam.  Kemudian  campuran disentrifus  dengan  kecepatan  5.000  rpm  selama 25 menit. untuk memisahkan endapan. Supernatan  dilarutkan  dalam  DMSO  kemudian ditambahkan  ovalbumin  (OVA)  2  mg/mL  dalam buffer karbonat  tetes  demi  tetes  dan  diaduk dengan magnetic stirrer selama empat jam. Hasil reaksi  selanjutnya  didialisis  menggunakan  PBS 0,01  M  pH  7,4  selama  72  jam.  Hasil  reaksi  dan senyawa  antara  dianalisis  dengan  Fourier transform  infrared  spectroscopy  (FTIR),  HPLC dan  kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  dengan  eluen benzen : asam asetat = 3:1.

## Optimasi nanopartikel emas
Nanopartikel  emas  diuji  pH  optimum  dan konsentrasi  optimum  dimana  nanopartikel  emas akan  stabil  menghasilkan  warna  merah  muda. nanopartikel  emas  pada  berbagai  variasi  pH(3- 12)  ditambah  antibodi  IgY  anti  okratoksin  dan didiamkan  selama  15  menit.  Ke  dalam  larutan ditambahkan  NaCl  10%  sebanyak  20  µL. Sedangkan  pengujian  konsentrasi  maksimum antibodi  dilakukan  dengan  variasi  perbandingan volume nanopartikel emas terhadap antibodi IgY yaitu    1:5;1:7,5;1:10;1:15;1:20  dan  1:25  (v/v). Masing-masing  campuran  diukur  absorbansinya pada 525 nm (Li et al ., 2010)

## Pembuatan probe antibodi terlabel nanopartikel
emas
Probe  antibody  terlabel  nanopartikel  emas dibuat  dengan  metode  Majdinasab et  al .,  (2015) yang  dimodifikasi.  Sebanyak  5  mL  larutan  emas nanopartikel  berdiameter  40 nm  dengan  berbagai variasi  pH  (3  -  12)  yang  diatur  menggunakan Na 2 CO 3 ditambah  500  µL  antibodi  IgY  anti  OTA tetes  demi  tetes  dan  diinkubasi  ada  suhu  ruang selama  30  menit.  Ke  dalam  campuran  kemudian ditambahkan  1  mL  BSA  1%  dan  diinkubasi selama  30  menit  pada  suhu  37 o C.  Selanjutnya campuran  diendapkan  dengan  cara  sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm dan suhu 28 o C selama 10 menit. Endapan dicuci tiga kali dengan 0,01% ovalbumin dalam bufer borat dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm  dan suhu  28 o C selama 10 menit.  Supernatan  dibuang  dan  pelet  emas disuspensikan  kembali  dengan  penambahan buffer borat  yang  ditambahkan  BSA,  tween-20 dan natrium azida. Probe antibodi anti okratoksin terlabel  nanopartikel  emas  disimpan  pada  suhu 4 o C sampai digunakan.

## Penyiapan strip imunokromatografik
Strip  imunokromatografik  terdiri  dari  tiga bantalan  (sampel,  pelepasan  konjugat  dan bantalan  absorben)  dan  satu  membran  nitro- selulosa dengan zona uji dan kontrol (Gambar 1). Keseluruhan  plat  yang  dirancang  dipotong  dan dibagi  menjadi  beberapa  strip  (5  mm  x  75  mm). Membran  nitroselulosa  dengan backing  plate dikeringkan di dalam oven suhu  40 o C selama dua jam.  Membran  fiber  kaca  sebagai  bantalan pelepas  ( release  pad )  direndam  dalam  antibodi anti  OTA-nanopartikel  selama  dua  jam  dan kemudian dikeringkan dikeringkan di dalam oven suhu 40 o C selama 30 menit. Bantalan sampel juga dilapiskan  pada  bagian  ini  dengan over-crossing 5  mm  dengan  bantalan  pelepas.  Bantalan absorben dilapiskan pada sisi plat yang lain. Zona uji  dan  kontrol  dari  membran  nitroselulosa dilapisi  berturut-turut  dengan  0,25  µL  konjugat OTA-OVA  (0,1  mg/mL)  dan  0,5  µL  antibodi IgY (0,1 mg/mL) (modifikasi Liu et al ., 2013).

## Pengujian  OTA menggunakan strip imunokroma- tografik
Pengujian  dilakukan  dengan  menambahkan larutan standar okratoksin A dengan pengenceran 0,  5  dan  10  ppb  ke  dalam  sumur  mikroplat. Masing-masing  sampel  ditambahkan  ke  bagian bantalan  sampel  test  strip  masing-masing  tiga ulangan.  Strip  uji  dibiarkan  selama  10  menit untuk  pembentukan  warna  dan  hasil  pengujian diamati secara visual.
Gambar  1.  Perangkat  bahan  deteksi  imuno- kromatografik  yang  terdiri  dari membran  nitroselulosa,  bantalan pelepas, bantalan penyerap, bantalan sampel dan cassete.
Figure 1. Immunochromatographic  detection parts  that  consist  of  nitrocelluse membrane,  release  pad,  absorbtion pad, sample pad and cassete.

## Hasil dan Pembahasan

## Sintesis konjugat OTA-OVA
Hasil  pengujian  kromatografi  lapis  tipis (KLT)  dari  tahapan  proses  sintesis  ini  me- nunjukkan  bahwa  pada  tahap  reaksi  antara terbentuk  endapan  disikloheksilurea  dengan ukuran molekul  lebih  kecil  dibandingkan  dengan OTA  yang  ditandai  dengan  nilai  Rf  lebih  besar daripada  OTA  (Gambar  2).  Hasil  reaksi  OTA- NHS  memiliki  ukuran  molekul  yang  lebih  besar dibanding  OTA,  sehingga  nilai  Rf  lebih  kecil dibandingkan  Rf  OTA  (Gambar  2).  OTA dikonjugasikan dengan ovalbumin (OVA) sebagai reagent  pada  garis  T  pada  test  trip.  OTA merupakan  ikatan  cincin  yang  terbuka,  sehingga bersifat  reaktif.  OTA  biasanya  direaksikan dengan carrier  protein atau  enzim  dengan bantuan  karbodiimida.  Tetapi  reaksi  ini  tidak dapat terjadi secara langsung karena sifat lipofilik OTA  yang  tidak  memungkinkannya  bercampur dengan carrier  protein yang  bersifat  hidrofilik. Oleh karena itu,  sifat lipofilik OTA harus diubah menjadi  hidrofilik  dengan  penambahan  reagen NHS  (N-hidroksisuksinimida).  Gugus  asam karboksilat  pada  OTA  diaktivasi  terlebih  dahulu oleh  NHS  dengan  keberadaan  disiklokarboimida (DCC)  membentuk  ester  aktif.  DCC  biasa digunakan untuk mereaksikan gugus amina untuk membentuk  peptida  secara in  vitro .  Reaksi aktivasi  ini  berlangsung  semalaman  dengan
Gambar  2.  Hasil  kromatografi  lapis  tipis  (KLT) senyawa  antara  pada  reaksi  sintesis
OTA-OVA dengan fasa gerak benzen : asam asetat = 3:1.Lajur 1=OVA; 2&
4=  OTA;  3=  endapan    dan  5  =  hasil reaksi.
Figure 2.   Thin  layer  chromatography  result  of intermediate compound formed during  synthesis  of  OTA-OVA  with eluent  benzene  :  acetic  acid  = 3:1.Lane  1=OVA;  2&  4=  OTA;  3= precipitate,  and  5  =  reaction product.
Gambar  3.  Reaksi  OTA  dan  NHS  membentuk OTA-NHS,  serta  membentuk  hasil samping berupa disikloheksilurea.
Figure 3.   Reaction  of  OTA  and  NHS    formed OTA-NHS and produced dicyclohexyl urea as reaction byproduct.
bantuan stirrer .  Larutan  disentrifus  untuk memisahkan  endapan  hasil  samping  reaksi  yaitu senyawa disikloheksilurea (Gambar 3).
Pada reaksi konjugasi ini terjadi penyerangan oleh  gugus  amina  pada  protein  OVA  terhadap gugus  ester  aktif  OTA-NHS.  Gambar  4  me- nunjukkan  reaksi  OTA-NHS  dengan  OVA kemudian  membentuk  konjugat  OTA-OVA. Nitrogen  pada  gugus  amina  protein  ovalbumin menyerang karbonil pada OTA-NHS membentuk ikatan amina OTA-OVA.
Hasil  reaksi  yang  diuji  dengan  KLT  me- nunjukkan tidak ada OTA dan senyawa antara yang  tersisa.  Molekul  OVA  tidak  terlarut  dalam fasa  gerak  KLT  karena  molekul  yang  besar  dan bersifat  larut  dalam air,  sehingga konjugat  OTA- OVA  tidak  muncul  pada  plat  KLT  (Gambar  5). Protein  konjugat  diukur  konsentrasinya  dan diperoleh konsentrasi OTA-OVA 2,056 mg/mL.
Dialisis  merupakan  salah  satu  metode pemurnian  yang  bertujuan  untuk  menghilangkan pengotor  dalam  hal  ini  OTA  dan  reagen  yang tidak  bereaksi.  Adanya  perbedaan  konsentrasi antara larutan konjugat di dalam membran dialisis dengan  larutan  PBS  mengakibatkan  zat-zat  sisa reaksi  berdifusi  keluar  melalui  pori-pori  kecil membran.  Sedangkan  konjugat-protein  OTA- OVA  yang  memiliki  ukuran  besar  akan  tetap berada  di  dalam  membran  selofan.  Membran dialisis  memiliki  ukuran  pori  17  kDa  sehingga molekul  konjugat  protein  OVA  yang  memiliki massa  molekul  45  kDa  akan  tertahan  dalam membran.
Hasil  karakterisasi  FTIR  OTA  menunjukkan adanya  spektra  gugus    O-H  karboksilat  pada daerah  3202  cm -1 ,  serapan  C=O  pada  1633  cm -1 dan spektra C-Cl pada 1016 cm -1 yang merupakan karakteristik  OTA  (Gambar  6a).  Sementara  hasil reaksi dengan NHS menghasilkan senyawa OTA- NHS  yang  memiliki  absorpsi  ikatan  N-H  dari
Gambar 5. Hasil kromatografi lapis tipis (KLT) proses  sintesis  OTA-OVA  dengan fasa  gerak  benzen  :  asam  asetat  = 3:1.
Figure5.   Thin layer chromatography result of OTA-OVA synthesis with eluent benzene : acetic acid = 3:1.

## Gambar  4.  Reaksi  pembentukan  konjugat  OTA- OVA.
Figure  4.  Reaction  of  OTA-OVA  conjugate formation.
123  4                5
OTA    OTA-OVA   OVA
gugus  amina  sekunder  OTA  (NH)  3400- 3250  cm -1 .  Berbeda  dengan  absorbsi  O-H, absorbsi N-H lebih tajam dan lemah dibanding O- H  yang  memberikan  spektra  yang lebar terutama untuk  gugus  karboksilat  yang  biasanya  mem- bentuk  dimer.  Pada  frekuensi  sekitar  2900  cm -1 terdapat  serapan  ulur  yang  kuat  dari  ikatan  C-H alifatik.  Selain  itu,  terdapat  juga  absorpsi  pada frekuensi  1600  cm -1 yang  menunjukkan  adanya vibrasi  ulur  ikatan  C=O.  Adanya  senyawa  ester terkonjugasi  mengakibatkan  serapan  C=O  ber- geser  dari  1800-1700  cm -1 ke  daerah  1600  cm -1 (Fessenden  &  Fessenden,  1986).    Pada  spektra juga  diamati  adanya  banyak  absorpsi  pada  1300- 1000  cm -1 yangmengindikasikan  adanya  serapan ulur yang kuat dari ikatan C-N dan C-O (Gambar 6b).  Dari  spektra  OTA-OVA  diamati  bahwa adanya  absorbsi  ulur  O-H  di  daerah  3400-
3200 cm -1 (Gambar 6c). Selain itu diamati adanya absorbsi pada 1635  cm -1 yang diduga merupakan gugus  C=O  amida.  Gugus  karbonil  amida biasanya  memiliki  pita  khusus  pada  1650  cm -1 . Karakteristik spektra tersebut diasumsikan merupakan ciri senyawa konjugasi yang terbentuk antara ovalbumin dan OTA.
Pengujian  hasil  reaksi  OTA-OVA  untuk melihat  sisa  OTA  dilakukan  menggunakan HPLC.  Kromatogram  menunjukkan  sisa  OTA hanya  0,12  ppb.  JIka  dibandingkan  dengan jumlah  OTA  yang  digunakan  pada  awal  reaksi yaitu  sebesar  5000  ppb.  Jumlah  0,12  ppb  dapat dianggap hanya sisa OTA yang tidak bereaksi dan mengindikasikan  hampir  semua  OTA  sudah berikatan  dengan  OVA  membentuk  OTA-OVA (Gambar 7).
Gambar 6. Spektra FT-IR senyawa OTA (a), OTA-NHS (b) dan OTA-OVA (c).
Figure 6. FT-IR Spectra of OTA (a), OTA-NHS(b) and OTA-OVA (c) C=O b. OTA-NHS C=O O-H c . OTA- OVA • O T A C=O O-H C-Cl a. OTA b. OTA- NHS C= O C= H C-Cl OTA C-O N- H OT A N-H tekuk OTA C-N OTA- NHS
Gambar 7.   Kromatogram HPLC OTA-OVA dibandingkan dengan OTA standar.
Figure 7. HPLCchromatogram OTA-OVA compared with OTA standar.

## Optimasi nanopartikel emas
Nanopartikel emas digunakan sebagai penanda  ( marker )  karena  memiliki  warna  yang cerah,  kestabilan  tinggi,  mudah  dikonjugasikan dengan  antibodi  dan  pembacaan  hasil  dapat diamati  langsung  secara  visual  (Posthuma- Trumpie et  al .,  2009).  Partikel  yang  berukuran kecil  cenderung  membentuk  aglomerat  jika  :  1) berada  dalam  konsentrasi  tinggi,  2)  terjadi netralisasi  pada  gugus  bermuatan  pada  permuka- an,  dan  3)  konsentrasi  elektrolit  yang  tinggi. Sehingga untuk menjaga nanopartikel  emas  tetap dalam  kondisi  terdispersi  harus  dilakukan optimasi  pH  dan  konsentrasi  (Majdinasab et  al ., 2015). Dalam hal ini pH optimum merupakan pH dimana  konjugat  akanstabil  dan  menghasilkan absorbansi  tertinggi  pada  panjang  gelombang maksimum. Optimasi pH dilakukan pada rentang pH 3-9 dan dari hasil pengujian diperoleh rentang pengujian  optimum  pada  pH  9  (Gambar  9).  Se- Hwan et  al. (2000)  juga  menyimpulkan  pH  9 sebagai  pH  optimum  untuk  pembuatan  probe antibodi dip stik imunokromatografik.
Sedangkan  konsentrasi  optimum  adalah  kon- sentrasi  antibodi  yang  memberikan  visibilitas yang  dibutuhkan  dengan  sensitivitas  terbaik. Hasil  ini  diperoleh  jika  warna  konjugat  tetap berwarna  merah  selama  15  menit.  Tetapi konsentrasi  yang  digunakan  adalah  konsentrasi terendah  dimana  warna  tetap  stabil  (Majdinasab et  al .,  2015).  Untuk  mengoptimalkan  hasil  pem- bacaan immunokratografik nanopartikel emas dan kestabilan  warna  yang  konsisten  dan  konsentrasi maksimum  antibodi  dengan  konsentrasi  1:5 (Gambar 8).

## Pembuatan probe antibodi berlabel nanopartikel emas
Antibodi  diberi  label  dengan  nanopartikel emas  sebagai marker .  Antibodi  akan  terabsorbsi pada  permukaan  nanopartikel  emas  (Fernandez et  al .,  2012)  dan  membentuk  probe  sebagai reagen  yang  digunakan  pada  tes  trip  imuno- kromatografik.  Dalam  proses  sintesisnya  di- tambahkan  BSA  untuk  menghasilkan  konjugat yang  lebih  stabil  dan  mencegah  ikatan  non- spesifik  akibat  interaksi  hidrofobik  dan  dalam beberapa kasus disebabkan oleh interaksi muatan (Majdinasab et al ., 2015). Hasil reaksi dipisahkan dengan  sentrifugasi,  dan  dicuci  dengan  OVA untuk  menghilangkan  protein  yang  tidak  ter- konjugasi.  Saat  nanopartikel  emas  berikatan dengan  antibodi,  ukuran  molekul  nanopartikel emas  meningkat  dan  puncak  absorbansi  bergeser dari  λ525  nm  menjadi  λ575  nm  (Gambar  10). Pergeseran  absorbansi  ini  mengindikasikan  ada- nya  interaksi  antara  antibodi  dan  nanopartikel emas  (Zhao et  al. ,  2010)  yang  terbentuk  karena pembentukan  amida  di  antara  gugus  amina antibodi  dengan  gugus  karboksilat  asam  sitrat pada larutan nanopartikel (Pissuwan et al ., 2011).
Penyiapan strip imunokromatografik dan pengujian OTA
Setelah  diperoleh  konjugat  antibodi-nano- partikel emas dan konjugat OTA-OVA dilakukan perakitan  test  trip.  Test  trip  terdiri  dari  batalan sampel,  bantalan  pelepas  yang  ditambahkan konjugat  antibodi-nanopartikel  emas,  membran nitroselulosa,  bantalan  penyerap,  serta cassete .
Standar OTA OT A OT A Standar OTA OT A 1 : 25 1: 20 1: 15 1: 10 1:7 ,5 1:: 5
Gambar 8.     Optimasi variable pH untuk perakitan konjugat antibodi nanopartikel emas.
Figure 8. Optimatization  of  variable pH  for conjugating antibody-gold nanoparticle .
Gambar 9.   Optimasi pH dan konsentrasi antibodi dan diperoleh pada pengenceran 1: 5 warna merah berubah menjadi ungu.
Figure 9.   Optimazation  of pH and antibody’s concentration  which resulted the change of red colour into purple  in 1: 5 dilution.
.      Gambar 10.   Spektra nanopartikel emas sebelum dan setelah dikonjugasikan dengan antibodi IgY. Figure 10.      Spectra of  gold nanoparticle before and  after conjugated with antibody IgY.
Pada  membran  nitroselulosa  ditambahkan OTA-OVA  pada test  line (T-line)  dan  IgY  pada control  line (C-Line).  Konjugat  antibodi  nano- partikel  emas  diimobilisasi  pada fiber  glass (Gambar  11).  Probe  antibodi-nanopartikel  di- tempatkan  pada  bantalan  pelepas  ( release  pad ) dimana  antibodi  dari  molekul  ini  akan  ber-
interaksi  langsung  dengan  sampel  membentuk kompleks  yang  mengalir  secara  lateral  sampai menemukan  molekul  konjugat  OTA-OVA  dan menghasilkan warna merah pada membran.
Jika  sampel  mengandung  okratoksin,  maka antibodi-  nanopartikel  emas  yang  akan  bereaksi dengan  OVA-OTA  pada  T- line dan  tidak  ada
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 absorbansi konjugat nanopartikel Au- antibodi absorbansi nanopartikel Au panjang gelombang/ wave lenght A bs o rba ns i/ pH           3         4         5          6        7         8        9 9 1 : 25       1: 20         1: 15       1: 10           1:7,5           1::5 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 3 6 7 8 9 10 11 12 pH A 525 nm
Sintesis reagen imunokimia untuk deteksi okratoksin dengan…….. (Kresnawaty et al .)
Gambar 11. Hasil scanning electron microscope (SEM) konjugat antibody nanopartikel emas yang diimobilisasi pada fiber glass .
Figure 11.  Scanning electron microscope (SEM) images of  antibody-gold nanoparticle conjugate immobilized in fiber glass .
Gambar 13. Visualisasi strip pengujian imunokromatografik : 1) kontrol PBS, 2) okratoksin 5 ppb, dan 3) okratoksin 10 ppb.
Figure 13.   Visualization of immunochromatographic test strip : 1) control PBS, 2) ochratoxin  5 ppb, and 3) ochratoxin 10 ppb
antigen yang dapat bereaksi dengan IgY pada C- line ,  sehingga  hanya  akan  membentuk  1  garis. Begitu  sebaliknya,  kontrol  (larutan  PBS)  akan terbentuk  garis  dua  karena  antibodi-nanopartikel emas  bereaksi  dengan  reagen  T  dan  C- line . Visualisasi  hasil  tes  trip  imunokromatografik belum  menunjukkan  hasil  yang  memuaskan (masih  “smear”)  (Gambar12).  Hal  ini  dapat dikarenakan konjugat  antibodi-nanopartikel  emas belum  optimum.  Sehingga  perlu  dilakukan optimasi  sintesis  antibodi-nanopartikel  emas dengan  melakukan  variasi  pada  konsentrasi antibodi,  waktu  inkubasi,  suhu  inkubasi,  dan proses  sentrifugasi.  Selain  itu  perlu  dilakukan variasi  pelarut  sampel.  Kaur et  al .  (2007) menyimpulkan  penambahan  sedikit  senyawa organik  seperti  metanol  dan  agen  ko-presipitasi dapat  meningkatkan coating antibodi  pada membran.

## Kesimpulan
OTA-OVA  dapat  disintesis  dengan  metode ester aktif dengan menambahkan N-hidroksi-
suksiimidadan disiklokarboimida. Nanopartikel emas  memiliki  pH  optimum  9,  sedangkan konsentrasi  antibodi  maksimum  diperoleh  pada pengenceran 1: 5 v/v. Probe antibodi-nanopartikel emas  telah  berhasil  disintesis  yang  ditunjukkan pergeseran  puncak  absorbansi  dari  λ525  nm menjadi  λ575 nm.  Hasil  pengujian  pada test  trip imunokromatografik  masih  belum  terlihat  jelas dan  memiliki cut  off konsentrasi  okratoksin 10  ppb,  tetapi  mengindikasikan  teknik  ini  dapat digunakan untuk deteksi kontaminasi okratoksin.

## Daftar Pustaka
Anfossi  L,  D  Gilda,  B  Claudio,  G  Cristina  & G  Gianfranco  (2011).  A  lateral  flow immunoassay  for  measuring  ochratoxin  A: Development  of  a  single  system  for  maize, wheat  and  durum  wheat. Food  Control 22,
1965-1970.
Covarelli  L,  G  Beccari,  A  Marini  &    L  Tosi (2012)  A  Review  on  the  occurrence  and control  of    ochratoxigenic  fungal  species  and ochratoxin  a  in  dehydrated  grapes, non-
10 ppb 5 ppb  10 ppb Kontro l Kon trol
fortified  dessert  wines  and  dried  vine  fruit  in the mediterranean area. Food Control ,  26(2), 347-356.
El  Khoury  A  &  A  Atoui  (2010).  Ochratoxin  A: General overview and actual molecular status. Toxins 2, 461
Haliza  W,  JS  Munarso  &  Miskiyah  (2006). Keragaan kontaminan mikotoksin pada jagung.  Diunduh  dari: http://repository.ipb. ac.id/  handle/123456789/ 42213
Fernández  F,    Sánchez-Baeza  &  M  Pilar  (2012). Nanogold  probe  enhanced  Surface  Plasmon Resonance  immunosensor  for  improved detection  of  antibiotic  residues. Biosensors and Bioelectr 34, 151– 158
Fessenden  &  Fessenden  (1986). Kimia  Organik II. Jakarta, Penerbit Erlangga
International  Commission  On  Microbiological Specification  For  Foods  (ICMSF)  (1996). Microorganisms  in  Food.  Blackie  Academic and Professional. London.
International  Agency  for  Research  on  Cancer (IARC)(1997). The evaluation of carcinogenic risks to human. IARC Monogr. 1997 No. 56.
Kaushik  A,  KS  Arya,  A  Vasudev  &  S  Bhansali (2013).  Recent  advances  in  detection  of ochratoxin-a. Open J Appl Biosensor 2, 1-11.
Kaur  J,  K  Vikassingh,  KR  Thampl,  Manojraje,
Grosch  Varshney  &  C    Ramansury  (2007)
. Immunochromatographic Dipstick Assay Format  Using  Gold  Nanoparticles  Labeled Protein-Hapten  Conjugate  for  the  Detection of Atrazine.
Larsson  A,  PE  Wejaker  &  PO  Forsberg  (1999).
Peroxidase  labeling  of  chicken  antibodies. Food Agric Immunol 11, 43–49.
Li  J,  H  Gao,  Z  Chen,  X  Wei  &  CF  Yang (2010).An  electrochemical  immunosensor  for carcinoembryonic  antigen  enhanced  by  self- assembled  nanogold  coatings  on  magnetic particles. Analyt Chim Acta 665(1),  98–104.
Liu  BH,  YT  Hsu,  CC  Lu  &  FY  Yu  (2013). Detecting  aflatoxin  b1  in  foods  and  feeds  by using sensitive rapid enzyme-linked immunorbent  assay  and  gold  nanoparticle
immunochromatographic  strip. Food  Control , 30, 184-189.
Majdinasab,M Sheikh-Zeinoddin, S Soleimanian- ZadPeiwu,    Q  Zhang,  X  Li,  X  Tang  &  J  Li (2015). A reliable and sensitive time-resolved fluorescent  immunochromatographic  assay (TRFICA) for ochratoxin  A in agro-products. Food Control , 47, 126-134
Olsson J,  T Borjesson, T Lundstedt & J Schnurer (2002).  Detection  and  quantification  of ochratoxin  A  and  deoxynivalenol  in  barley grains  by  GC–MS  and  electronic  nose. Internat J Food Microbiol 72, 203–214.
Pissuwan  D,    T  Niidome,  B  Michael  &  Cortie
(2011).  The  forthcoming  applications  of  gold nanoparticles  in  drug  and  gene  delivery systems. J Controll Rel 149, 65–71.
Posthuma-Trumpie GA, J Korf & van Amerongen A (2009). Lateral flow (immuno) assay: its strengths, weaknesses, opportunities and  threats.  A  literature  survey. Analyt  and Bioanalyt Chem 393, 569-582.
Scott  PM  (2002).    Methods  of  analysis  for ochratoxin  A. Mycotoxins  and  Food  Safety , 504, 117–134
Se-Hwan  Paek,    L  Seung-Hwa,  C    Joung-Hwan Cho  &  K  Young-Sang.  (2000).  Development of  rapid  one-step  immunochromatographic assay. Methods , 22, 53-60
Shim  WB,  BB  Dzantiev,  SA  Eremin  & DH  Chung  (2009).  One-step  simultaneous immunochromatographic  strip  test  for  multi analysis  of  ochratoxin  A  and  zearale-none. J Microbiol and Biotechnol 19, 83-92.
Wang-Xi  C,  B  Ming,  W  Jin-jie,  LYing, MA  Liang-you,  W  Ying,  Z  Aihua,  H  Cheng- hua  &  Z  Hai-bin  (2014).Characterization  and Comparison  of  ochratoxin  a-ovalbumin  (ota- ova)  conjugation  by  three  methods. J Integrative Agricult 13(5), 1130-1136
Zhao X, X  He, W Li,  Y Liu, L Yang  & J Wang,
(2010).  Development  and  evaluation  of colloidal  gold  immunochromatographic  strip for  detection  of Escherichia  coli O157. African J Microbiol Res 4(9), 663-670.