## ANALISIS IN SILICO VARIASI SEKUENS GEN NON-STRUKTURAL
3 (NS3) VIRUS DENGUE SEROTIPE 2 DI INDONESIA
Pangerapan Meiranty Cikita 1) , Feky R. Mantiri 1) , Beivy J. Kolondam 1)
1) Program Studi Biologi, FMIPA UNSRAT

## ABSTRACT
Dengue virus (DENV) is the causal agent of dengue fever that is transmitted by Aedes aegypti and Aedes  albopictus  mosquitoes.  DENV  has  four  serotypes  that  have  been  widely  recognized  in  the world: DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. DENV has RNA as the genome, and its length is almost 11 kilo bases. DENV RNA composed of 5'- and 3'-UTR; 3 structural genes; 7 non-structural genes  (NS).  Among  the  seven  non-structural  genes  exist,  NS3  plays  an  important  role  in  viral replication  as  protease,  helicase  and  NTPase.  This  study  aimed  to  compare  the  variation  of  NS3 gene and amino acid sequences of DENV-2 in Indonesia with DENV-2 from several other countries. This research is an in silico study by using softwares to analyze the data retrieved from GenBank. The result of the multiple alignment of 100 sequences showed that NS3 gene from Indonesia samples had variations at 10 amino acid sites, which were occured at sites number 14, 119, 122, 171, 248, 289, 308, 392, 453 and 535, while the remaining global samples had 69 amino acid sites that were found to be variated.
Key words : Dengue Virus, DENV-2, NS3, in silico, sequence variation

## ABSTRAK
Virus Dengue (DENV) merupakan penyebab penyakit demam berdarah yang ditransmisikan melalui nyamuk Aedes  aegypti dan Aedes  albopictus .  DENV  memiliki  empat  serotipe  yang  telah  dikenal secara  luas  oleh  dunia,  yaitu  DENV-1,  DENV-2,  DENV-3  dan  DENV-4.  DENV  merupakan  virus dengan  materi  genetik  berupa  rantai  RNA  yang  panjangnya  hampir  11  kilo  basa.  RNA  DENV tersusun atas 5’- dan 3’-UTR; 3 gen struktural; 7 gen non-struktural (NS). Di antara ketujuh gen non- struktural yang ada, NS3 merupakan gen yang berperan penting dalam replikasi virus, yaitu sebagai protease,  helikase dan  NTPase.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  membandingkan  variasi  sekuens  dan asam  amino  gen  NS3  DENV-2  yang  ada  di  Indonesia  dengan  DENV-2  dari  beberapa  negara  lain. Penelitian ini merupakan studi in silico dengan menggunakan software yang menganalisis data yang diperoleh  dari  GenBank.  Hasil  penjajaran  100  sekuens  menunjukkan  bahwa  gen  NS3  sampel Indonesia  memiliki  variasi  yang  terjadi  pada 10 situs  asam  amino,  yaitu  pada  nomor  14,  119,  122, 171, 248, 289, 308, 392, 453 dan 535, sedangkan sampel global memiliki 69 situs asam amino yang mengalami variasi.
Kata kunci : Virus Dengue, DENV-2, NS3, in silico , variasi sekuens

## PENDAHULUAN
Virus  Dengue  (DENV)  merupakan  virus yang  paling  diwaspadai  secara  global.  Virus ini disebarkan oleh nyamuk sebagai vektornya. DENV merupakan ancaman serius bagi sekitar 2,5  miliar  orang  yang  tinggal  di  128  daerah endemik dengue di seluruh dunia. Setiap tahun terjadi  390  juta  kasus  infeksi  dengue,  dengan jumlah  insidensi  yang  menunjukkan  gejala klinis mencapai 96 juta (WHO, 2015).
Di  Indonesia,  jumlah  kasus  demam berdarah  (DBD)  berfluktuasi  dari  tahun  ke tahun.  Berdasarkan  data  Kemenkes  (2012), angka kesakitan atau incidence rate (IR) DBD per  100.000  penduduk  selama  kurun  waktu 2007-2012  yaitu:  71,78  (2007);  59,02  (2008); 68,22  (2009);  65,70  (2010);  27,67  (2011); 37,11  (2012).  Jumlah  penderita  DBD  yang dilaporkan  pada  tahun  2012  mencapai  90.245 kasus  dengan  jumlah  kematian  816  orang (IR=37,11). Terjadi  peningkatan jumlah kasus pada  tahun  2012  dibandingkan  pada  tahun 2011  (65.725  kasus  dengan  IR=27,67).  Dari tulisan  lain  yang  diterbitkan  oleh  Kemenkes (2014), diketahui bahwa pada tahun 2014, dari bulan  Januari  sampai  pertengahan  bulan Desember  penderita  DBD  di  34  provinsi berjumlah  71.668  orang,  641  diantaranya meninggal dunia. Angka tersebut sedikit lebih rendah dibandingkan pada tahun 2013, dengan jumlah penderita sebanyak 112.511 orang dan jumlah kasus meninggal sebanyak 871.
Penyakit  DBD  disebabkan  oleh  DENV yang  ditransmisikan  melalui  nyamuk  Aedes aegypti  dan  Aedes  albopictus.  Virus  ini temasuk  ke  dalam  genus  Flavivirus  dengan nama  famili  Flaviviridae  (Cardozo et  al ., 2014; Anoop et al ., 2010). Ada empat serotipe DENV  yang  telah  dikenal,  yaitu  DENV-1, DENV-2,  DENV-3  dan  DENV-4.  Semua serotipe  dapat  menimbulkan  penyakit  demam berdarah  yang  disebut  Demam  Dengue  (DD), Demam Berdarah Dengue (DBD) dan
Sindrom  Syok  Dengue  (SSD)  (CDC,  2014; WHO,  2009).  Pada  umumnya  istilah  demam berdarah  yang  sering  digunakan  masyarakat mengacu pada ketiga jenis penyakit tersebut.
DENV  merupakan  virus  dengan  materi genetik  berupa  rantai  RNA  yang  panjangnya hampir  11  kilo  basa.  Dalam  RNA  DENV terdapat  3  gen  struktural  (gen  C,  gen  M  dan gen E) dan 7 gen non-struktural (NS1, NS2A, NS2B,  NS3,  NS4A,  NS4B  dan  NS5).  Semua gen  berperan  penting  dalam  patologi  virus. Sebagai gen non-struktural, gen NS3 menghasilkan  protein  NS3  yang  memiliki fungsi  enzimatik  yang  diperlukan  dalam replikasi  virus  (Pangerapan  dan  Kolondam, 2015). Penelitian yang dilakukan oleh Ayub et al . (2013) dan Li et al . (1999) memperlihatkan bahwa  protein  NS3  berperan  sebagai  helikase dan  nucleoside  triphosphatase  (NTPase),  serta merupakan  komponen  dari  NS2B-NS3pro yang memiliki fungsi protease. Kerusakan atau kecacatan pada protein NS3 dapat mengganggu  proses  replikasi  virus,  sehingga laju  perkembangan  virus  Dengue  dalam  sel menjadi terhambat. Peran penting protein NS3 bagi  virus  menjadikan  protein  NS3  sebagai target  potensial  untuk  obat-obatan  antivirus (Ayub et al ., 2013).
Meskipun DENV merupakan virus RNA yang memiliki laju mutasi yang tinggi, namun sebagian  sekuens  dari  gen  NS3  yang menghasilkan  residu  asam  amino  untuk replikasi  virus  ini  terus dikonservasi  (Ayub et al .,  2013;  Lauring et  al .,  2013).  Penelitian semacam  ini sebelumnya telah dilakukan oleh Ayub et  al .  (2013),  namun  sekuens  yang digunakan  adalah  konsensus  semua  serotipe Virus  Dengue.  Penelitian  tersebut  tidak berfokus  pada  variasi  yang  terjadi  pada  situs- situs yang tidak terkonservasi.
Hingga  akhir  Juni  2015,  terdapat  40 sekuens  genom  DENV-2  yang  berasal  dari Indonesia yang tersedia di GenBank.
Berdasarkan  penelusuran  yang  dilakukan, belum pernah ada penelitian yang memanfaatkan data tersebut. DENV-2 merupakan  serotipe  yang  berkembang  dengan pesat dalam dekade terakhir dan memiliki laju pertumbuhan  populasi  tertinggi  secara  global dibandingkan ketiga serotipe lainnya (Costa et al .,  2012).  Dengan  dasar  tersebut,  maka DENV-2  dipilih  sebagai  objek  penelitian  ini. Dalam penelitian ini dikaji variasi sekuens gen NS3  yang  ada  di  Indonesia  dengan  DENV-2 dari berbagai negara di dunia.

## METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan Juni  2015  sampai  bulan  Januari  2016. Pengumpulan  dan  pengolahan  data  dilakukan di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sam Ratulangi, Manado.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu  berupa  laptop  dan  beberapa software untuk  pengumpulan  dan  pengolahan  data, yaitu  Geneious  versi  5.6  (Drummond et  al. , 2012),  Paint,  PAUP  versi  4.0b10  (Swofford, 2000) dan  TreeView versi  1.6.6 (Page, 1996). Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitan  ini adalah  data  sekuens  gen  NS3  Virus  Dengue Serotipe  2  (DENV-2)  dan  Virus  Dengue Serotipe  4  (DENV-4)  yang  bersumber  dari GenBank (Benson et al ., 2005).

## Pencarian Database dan Ekstraksi Gen NS3
Database  genom  DENV-2  beserta  virus outgroup diperoleh dari GenBank dan diproses menggunakan  Geneious.  Alamat  situs  yang diakses  yaitu  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Dari  sekitar  300  hasil  pencarian,  dipilih  data sekuens  yang  mewakili  setiap  negara  yang ada.  Khusus  data  sekuens  yang  berasal  dari Indonesia, diambil sebanyak mungkin sekuens yang memiliki kelengkapan informasi
penunjang  yang  diperlukan  (nama  sekuens, accession  number,  tahun  pengambilan  sampel dan sumber isolat). Setiap data sekuens genom virus  utuh  disalin  dalam  bentuk  FASTA  dan disimpan  sebagai new  sequence dalam  piranti Geneious. Dari data sekuens genom virus utuh yang  diperoleh  kemudian  dilakukan  ekstraksi yang  menghasilkan  sekuens  gen  NS3  untuh untuk dilakukan analisis.

## Penjajaran Nukleotida
Penjajaran  nukleotida  dikerjakan  dengan menggunakan piranti lunak
Geneious. Sebanyak  100  data  sekuens  yang  telah disimpan  ditambah  tujuh  sekuens outgroup dipilih  dan  kemudian  dijajarkan  ( alignment ) menggunakan algoritma ClustalW.

## Translasi  Sekuens  Nukleotida  menjadi Asam Amino
Translasi dikerjakan dengan
menggunakan  opsi translate pada software Geneious.  Translasi  dilakukan  berdasarkan kode  genetik  standar  yang  tersedia  pada pilihan genetic code .

## Analisis Data
Penelitian  ini  merupakan  penelitian in silico yang  mengolah  sekuens  RNA  DENV-2 yang  terdata  dalam  GenBank.  Semua  sekuens RNA virus Dengue dijajarkan dan dibandingkan urutan asam aminonya. Berdasarkan  urutan  RNA  dan  asam  amino, ditentukan  region  RNA  yang  menjadi hotspot variasi  genetik  beserta  perubahan  molekul asam amino penyusun protein NS3.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Database Genom  dan  Gen  NS3  Virus Dengue Serotipe 2
Dari  pencarian database yang  dilakukan di  GenBank,  diperoleh  100  sekuens  RNA DENV-2  dan  7  sekuens  RNA  Virus  Dengue Serotipe 4 (DENV-4)  yang digunakan sebagai outgroup .  Dari  100  sekuens  DENV-2  yang diambil,  30  sekuens  berasal  dari  Indonesia yang  dikoleksi  dari  Jakarta,  Makassar  dan Sumatera,  sedangkan  70  sekuens  lainnya merupakan sekuens yang berasal dari berbagai negara  lainnya.  Sebanyak  70  sekuens  tersebut berasal  dari  negara-negara  Amerika,  Asia, Australia,  Kepulauan  Karibia  dan  Oceania. Semua  sekuens  DENV-2  tersebut  berasal  dari sampel  yang  dikoleksi  antara  tahun  1944- 2014.
Data  gen  NS3  yang  diperoleh  berasal dari sekuens  genom  virus  utuh  yang diekstrak dengan  bantuan software Geneious.  Ekstraksi genom  pada  akhirnya  menghasilkan  107 sekuens gen NS3 yang terdiri dari 100 sekuens gen  NS3  DENV-2  dan  7  sekuens  gen  NS3 DENV-4.  Pemilihan  DENV-4  sebagai  virus outgroup didasarkan pada hubungan filogeninya  dengan  DENV-2.  Penelitian  yang dilakukan  oleh  Costa et  al. (2012)  dan Huhtamo et  al. (2014)  menunjukkan  bahwa DENV-4  merupakan  leluhur  dari  DENV-1, DENV-2  dan  DENV-3.  DENV-2  merupakan serotipe  yang  pertama  kali  berevolusi  dari DENV-4.

## Variasi Sekuens Gen NS3 dan Asam Amino Virus Dengue Serotipe 2
Multiple  alignment 107  sekuens  virus Dengue  yang  dikerjakan  dengan  bantuan software Geneious  menunjukkan  adanya variasi  genetik  antar  sampel  yang  berasal  dari negara-negara  yang  berbeda.  Variasi  basa nukleotida terdapat pada banyak titik gen NS3. Namun jika hanya dilihat dari hasil penjajaran
nukleotida saja, tidak dapat ditentukan hotspot tempat terjadinya variasi yang berarti. Maksud dari  variasi  nukleotida  yang  berarti  yaitu variasi yang mengakibatkan terjadinya perubahan  pada  asam  amino  yang  dikodekan. Titik-titik  variasi  gen  yang  berarti  dapat ditentukan dengan melihat variasi yang terjadi pada penjajaran asam amino.
Gen  NS3  DENV-2  mengodekan  618 asam  amino.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa pada 618 asam amino tersebut terdapat 69  situs  yang  memiliki  variasi.  Dari  69  situs tersebut,  untuk  setiap  posisi  asam  amino terdapat  dua  atau  tiga  variasi  asam  amino. Variasi  asam  amino  banyak  ditemukan  pada ujung  N  gen  NS3.  Variasi  pada  ujung  N teridentifikasi pada asam amino nomor 5, 6, 8, 10,  13,  14,  15,  20,  22,  28,  31  dan  38.  Pada posisi  39-60  tidak  terdapat  variasi  dan nampaknya merupakan posisi yang terkonservasi.  Asam  amino  nomor  39-60 dikodekan  oleh  nukleotida  nomor  115-180. Variasi  juga  ditemukan  antara  asam  amino nomor  61-83,  115-142,  158-176,  186-190, 208-213,  248-251,  273,  289-294,  308,  318, 333-345,  367,  381,  392,  395-399,  418,  435, 451-466,  499,  508,  535,  548-549,  561-568, 577 dan 600. Variasi asam amino yang terjadi pada  situs-situs  tersebut  disebabkan  karena adanya  variasi  pada  nukleotida  pengode. Variasi  terjadi  karena  adanya  substitusi  basa nukleotida.  Perubahan  basa  nukleotida  yang terjadi  berupa  transisi  maupun  transversi, tetapi  tidak  ditemukan  pola  khusus.  Transisi dan transversi terjadi secara acak di sepanjang gen.
Variasi  nukleotida  juga  ditemukan  pada posisi asam amino lain yang tidak disebutkan, namun  variasi  tersebut  tidak  menyebabkan perubahan  asam  amino  yang  dikodekan. Walaupun  terdapat  variasi  pada  titik-titik tertentu  pada  nukleotida,  tetapi  kodon  yang
dihasilkan  masih  mengodekan  asam  amino yang sama.
Berdasarkan  hasil  penjajaran  nukleotida dan  asam  amino  yang  dilakukan,  terlihat bahwa  DENV-2  memiliki  sekuens  gen  NS3 yang bervariasi antar negara yang ada. Variasi tersebut  berdampak  pada  variasi  asam  amino yang  dikodekan.  Variasi  asam  amino  juga ditemukan  pada  sampel-sampel  yang  berasal dari  satu  negara  yang  sama.  Penjelasan  untuk hal  ini  adalah  karena  DENV  merupakan  virus RNA.  Virus  RNA  memiliki  laju  mutasi  yang tinggi  sehingga  sekalipun  sampel  memiliki serotipe  yang  sama  dan  berasal  dari  negara yang  sama  tetap  saja  akan  terdapat  variasi pada  sekuens  gennya.  Hal  ini  sejalan  dengan hasil  penelitian  Lauring et  al. (2013)  bahwa laju  mutasi  virus  RNA  jauh  lebih  tinggi dibandingkan laju mutasi virus DNA.
Pada  30  sampel  yang  berasal  dari Indonesia  ditemukan  10  titik  variasi  triplet nukleotida  yang  mempunyai  arti  (Gambar  1). Yang  dimaksudkan  dengan  variasi  nukleotida yang  mempunyai  arti  adalah  variasi  yang
terjadi pada nukleotida tersebut mengakibatkan variasi  pada asam  amino  yang dikodekan.  Posisi  nukleotida  tersebut  adalah 40-42,  355-357,  364-366,  511-513,  742-744, 865-867, 922-924, 1174-1176, 1357-1359 dan 1603-1605. Sepuluh triplet nukleotida tersebut secara berturut-turut mengodekan asam amino nomor 14, 119, 122, 171, 248, 289, 308, 392, 453  dan  535.  Perubahan  nukleotida  yang terjadi  pada  kesepuluh  kodon  tersebut  adalah pada posisi pertama (asam amino nomor 308), kedua  (asam  amino  nomor  14,  119,  122,  171, 248,  289,  392,  453)  dan  posisi  ketiga  (asam amino  nomor  535).  Asam  amino  yang ditemukan  yaitu:  pada  posisi  14  dapat  berupa E atau G; pada posisi 119 dapat berupa N atau S; pada posisi 122 dapat berupa T atau I; pada posisi  171 dapat  berupa N atau S;  pada posisi 248  dapat  berupa  K  atau  R;  pada  posisi  289 dapat  berupa  T  atau  I;  pada  posisi  308  dapat berupa    E  atau  K;  pada  posisi  392  dapat berupa F atau S; pada posisi 453 dapat berupa S atau  I;  pada posisi  535 dapat  berupa D atau E.
Gambar 1. Variasi Asam Amino Gen NS3 DENV-2
Meskipun  terdapat    variasi  di beberapa  titik  asam  amino,  namun perubahan pada situs-situs pengode tersebut secara keseluruhan tidak berdampak  pada  fungsi  protein  NS3  yang dihasilkan. Koleksi sampel yang digunakan  dalam  penelitian  ini  semuanya diisolasi  dari  pasien  yang  terdeteksi penyakit demam berdarah. Jadi jika variasi
yang  ditemukan  berdampak  pada  fungsi protein  NS3  yang  dikodekan  maka seharusnya virus tersebut tidak menimbulkan  gejala  sakit  pada  pasien hingga  titik  pasien  dibawa  ke  rumah  sakit dan  sampelnya  diambil.  Virus  yang memiliki  protein  NS3  yang  cacat  tidak dapat bereplikasi. Jika tidak dapat bereplikasi maka  virus  tidak  dapat
berproliferasi. Virus yang gagal berproliferasi  tidak  akan  bertahan  dalam tubuh  inang  sampai  titik  yang  dapat menimbulkan  gejala  sakit.  Gejala  sakit akan timbul dalam kisaran 4-7 hari setelah gigitan nyamuk (CDC, 2014).
Variasi  asam amino  yang ditemukan bukan terjadi pada situs yang terkonservasi.  Situs  asam  amino  yang terkonservasi  menandakan  vitalnya  peran situs tersebut terhadap fungsi protein yang dihasilkan.  Apabila  terjadi  mutasi  atau perubahan  pada  situs  tersebut  maka berdampak  pada  tidak  optimalnya  kerja protein, kecacatan bahkan tidak berfungsinya  suatu  protein  (Chua et  al , 2004; Kolondam et al ., 2015).
Gen  NS3  mengodekan  beberapa
domain  yang  memiliki  peran  spesifik terhadap  fungsi  protein  NS3.  Beberapa domain  yang  diketahui  terdapat  pada protein  NS3  yaitu  peptidase  S1,  peptidase S7, helicase  superfamily,  ATP  binding domain , DEAD- Box, P-loop  NTPase dan helicase  C-terminal .  Menurut  Mitchell et al. (2015),  posisi  domain  tersebut  secara keseluruhan  adalah  pada  asam  amino nomor 17-182 (peptidase S7 dan peptidase S1)  dan  180-513  ( helicase  superfamily,
ATP  binding  domain,  DEAD-box , P-loop NTPase dan helicase  C-terminal ).  Pada masing-masing domain terdapat situs-situs tertentu yang terkonservasi karena memiliki  peran  vital  bagi  fungsi  domain tersebut. Situs-situs asam amino NS3 yang terkonservasi  pada  DENV-2  ditemukan pada  nomor  46-57,  148-156,  216-235, 256-271, 295-304, 356-366, 405-417, 436- 446,  486-498  dan  536-546.  Dalam penelitiannya Ayub et al. (2013)
menemukan  situs-situs  lain  yang  juga terkonservasi,  yaitu  nomor  128-139,  306- 320, 339-347 dan 456-464.
Hasil yang diperoleh dalam penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  situs nomor  128-139,  306-320,  339-347  dan 456-464  tidak  terkonservasi  pada  DENV- 2.  Hal  ini  dapat  berarti  bahwa  situs-situs tersebut sebenarnya tidak memegang peran vital  bagi  fungsi  domain  yang  dikodekan. Menurut  Ayub et  al. (2013),  situs-situs tersebut  juga  terkonservasi  pada  gen  NS3 DENV-1,  DENV-3  dan  DENV-4.  Selain situs-situs  yang  telah  disebutkan,  terdapat juga tiga situs lain yang terkonservasi pada DENV-2,  yaitu  H51,  D75  dan  S135. Ketiga  asam  amino  tersebut  merupakan triad  katalitik  yang  diduga  terlibat  dalam aktivitas  katalitik  NS2B-NS3pro  (Chua et al ., 2004).

## KESIMPULAN
Virus  Dengue  Serotipe  2  (DENV-2) dari  Indonesia  memiliki  10  situs  asam amino  pada  gen  NS3  yang  cenderung mengalami  variasi.  Variasi  ditemukan pada kodon nomor 14, 119, 122, 171, 248, 289,  308,  392,  453  dan  535,  sedangkan pada DENV-2  global ditemukan sebanyak 69 situs.

## SARAN
Ada  beberapa  temuan  dari  hasil penelitian ini yang belum dapat dijelaskan. Temuan yang ada dapat menjadi permasalahan yang menarik untuk dilakukan penelitian lanjutan.

## DAFTAR PUSTAKA
Anoop,  M.,  Issac,  A.,  Mathew,  T.,  Philip, S.,  Kareem,  N.A.,  Unnikrishnan,  R. dan  Sreekumar,  E.  2010.  Genetic Characterization  of  Dengue  Virus Serotipes Causing Concurrent
Infection in an Outbreak in
Ernakulam,  Kerala,  South  India. Indian  Journal  of  Experimental
Biology 48:849-857.
Ayub,  A.,  Ashfaq,  U.A.,  Idrees,  S.  dan
Haque,  A.  2013.  Global  Consensus Sequence Development and Analysis of Dengue NS3 Conserved Domains. BioResearch 2(5):392-396.
Benson, D.A. Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D.J., Ostell, J. dan Wheeler, D.L.  2005.  GenBank. Nucleic  Acids Research 33:D34-D38.
Cardozo,  D.M.,  Moliterno,  R.A.,  Sell, A.M.,  Guelsing,  S.G.A.,  Beltrame, L.M.,  Clemention,  S.L.,  Reis,  P.G., Alves,  H.V.,  Mazini,  P.S.  dan Visentainer,  L.J.E.  2014.  Evidence of  HLA-DQB1  Contribution  to Susceptibility  of  Dengue  Serotype  3 in  Dengue  Patients  in  Southern Brazil. Journal of Tropical Medicine
2014:2.
Centers  for Disease Control  (CDC). 2014.
Epidemiology  of  Dengue  Fever . http://www.cdc.gov/dengue/epidemi ology/ [26 September 2015].
Chua,  J.J.E.,  Ng,  M.M.L.  dan  Chow,
V.T.K.  2004.  The  Non-Structrual  3 (NS3) Protein of Dengue Virus Type 2  Interacts  with  Human  Nuclear Receptor  Binding  Protein  and  is Associated with Alterations in Membrane Structure. Virus Research
102:151-153.
Costa,  R.L,  Voloch,  C.M.  dan  Schrago,
C.G. 2012. Comparative
Evolutionary
Epidemiology of Dengue  Virus  Serotypes. Infection, Genetics and Evolution 12:309-314.
Drummond  A.J.,  Ashton  B.,  Buxton  S.,
Cheung  M.,  Cooper  A.,  Duran  C., Field  M.,  Heled  J.,  Kearse  M., Markowitz  S.,  Moir  R.,  Stones- Havas S., Sturrock S., Thierer T. dan Wilson  A.  2012.  Geneious  v5.6. http://www.geneious.com
Huhtamo,  E.,  Cook,  S.,  Moureau,  G.,
Uzcátegui, N.Y., Sironen, T., Kuivanen,  S.,  Putkuri,  N.,  Kurkela,
S.,  Harbach,  R.E.,  Firth,  A.E., Vapalahti,  O.,  Gould,  E.A.  dan
Lamballerie,  X.  de.  2014.  Novel Flaviviruses from Mosquitoes: Mosquito-Specific Evolutionary Lineages  within  the  Phylogenetic Group of Mosquito-Borne
Flaviviruses. Virology 464-465:320- 329. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia  (Kemenkes).  2012.  Profil Kesehatan Indonesia 2012. http://www.depkes.go.id/resources/d ownload/pusdatin/  profil-kesehatan- indonesia/profil-kesehatan- indonesia-2012.pdf. [17 April 2015]. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia (Kemenkes). 2014. Waspada DBD di Musim Pancaroba. http://www.depkes.go.id/article/print /15010200002/ waspada-dbd-di- musim-pancaroba.html.  [30  April 2015].
Kolondam,  B.,  Rao,  P.,  Sztuba-Solinska,
J., Weber, P.H., Dzianott, A., Johns,
M.A.,  dan  Bujarski,  J.J.  2015.  Co-
infection with Two Strains of Brome Mosaic Bromovirus Reveals Common  RNA  Recombination  Sites in  Different  Hosts. Virus  Evolution 1(1):vev021.
Lauring, A.S., Frydman, J. dan Andino, R.
2013.  Box  1:  Mutation  Rates  of
RNA  Viruses  and  Quasispecies Theory. Nature Reviews Microbiology 11:327-336. Li, H., Clum, S., You, S., Ebner, K.E. dan Padmanabhan,  R.,  1999.  The  Serine Protease and RNA-Stimulated
Nucleoside Triphosphatase and RNA Helicase  Functional  Domains  of Dengue Virus Type 2 NS3 Converge within a Region of 20 Amino Acids.
J. Virol. 73:3108-3116.
Mitchell,  A.,  Chang,  H.Y.,  Daugherty,  L.,
Fraser,  M.,  Hunter,  S.,  Lopez,  R., McAnulla,  C.,  McMenamin,  C.,
Nuka,  G.,  Pesseat,  S.,  Sangrador- Vegas,  A.,  Scheremetjew,  M.,  Rato,
C., Yong, S.Y.,  Bateman, A., Punta,
M.,  Attwood,  T.K.,  Sigrist,  C.J.A.,
Redaschi,  N.,  Rivoire,  C.,  Xenarios,
I.,  Kahn,  D.,  Guyot,  D.,  Bork,  P.,
Letunic,  I.,  Gough,  J.,  Oates,  M., Haft,  D.,  Huang,  H.,  Natale,  D.A., Wu,  C.H.,  Orengo,  C.,  Sillitoe,  I., Mi, H., Thomas, P.D. dan Finn, R.D.
2015.  The  InterPro  Protein  Families Database: The Classification
Resource after 15 Years. Nucl. Acids
Res. 43(D1):D213-D221.
Page,  R.D.M.  1996.  TREEVIEW:  An Application  to  Display  Phylogenetic
Trees on Personal Computers.
Comput.  Appl.  Biosci. 12(4):357- 358.
Pangerapan,  M.C.  dan  Kolondam,  B.J. 2015.  Peran  Gen  Struktural,  Gen
Non-struktural,  dan  Untranslated Region dalam Perakitan Virus
Dengue. Jurnal  Biomedik 7(2):71-
78.
Swofford, D.L. 2000. PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsimony  (*and  Other  Methods). Sinauer  Associates.  Massachusetts.
Sunderland.
World Health Organization (WHO). 2009.
Dengue:  Guidelines  for  Diagnosis, Treatment,  Prevention  and  Control.
Geneva. Switzerland.
World Health Organization (WHO). 2015.
Dengue and Severe Dengue. http://www.who.int/mediacentre/fa ctsheets/fs117/en/. [26 Januari
2016].