UJI AKTIVITAS EKSTRAK DAN FRAKSI TUNIKATA Lissoclinum patella TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROBA Escherichia coli , Staphylococcus aureus , DAN Candida albicans
Yunike E. Ngantung 1) , Herny E. Simbala 1) , Henki Rotinsulu 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115

## ABSTRACT
Tunicate  is  one  of  the  marine  biota  that  has  the  potential  to  be  utilized  as  a  search  for  bioactive compounds,  as  prospective  drugs  in  the  pharmaceutical  world.  This  study  aims  to  determine  the antimicrobial  activity  of  extracts  and  fractions  of  Tunicates  Lissoclinum  patella  obtained  from  the waters of Tumbak Village against the growth of microbes Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Candida  albicans.  Samples  were  extracted  by  maceration  using  ethanol  as  a  solvent.  Fractionation using  n-hexane,  chloroform  and  methanol.  Antimicrobial  activity  was  tested  using  the  disc  diffusion method (Kirby and Bauer). The results showed that the ethanols extract, n-hexane fraction, chloroform fraction,  methanol  fraction  effectively  inhibited  the  growth  of  microbes  Escherichia  coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans with moderate inhibition strength categories based on Davis and Stout theory .
Keywords :  Tunicata,  Lissoclinum  patella,  antimicrobial,  Candida  albicans,  Escherichia  coli, Staphylococcus aureus.

## ABSTRAK
Tunikata merupakan salah satu biota laut yang berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai bahan pencarian senyawa  bioaktif,  calon  obat  di  dunia  farmasi.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas antimikroba  dari  ekstrak  dan  fraksi  Tunikata Lissoclinum  patella yang  diperoleh  dari  perairan  Desa Tumbak  terhadap  pertumbuhan  mikroba Escherichia  coli,  Staphylococcus  aureus dan Candida albicans .  Sampel  diekstraksi  dengan  cara  maserasi  menggunakan  pelarut  etanol.  Fraksinasi menggunakan  pelarut  n-Heksan,  kloroform  dan  metanol.  Aktivitas  antimikroba  diuji  menggunakan metode disc diffusion test (Kirby dan Bauer). Hasil penelitian menunjukkan bahkwa ekstrak etanol, fraksi  n-Heksan,  fraksi  kloroform,  fraksi  metanol  efektif  menghambat  mikroba Escherichia  coli, Staphylococcus aureus,  Candida albicans dengan  kategori  kekuatan  daya  hambat  sedang  berdasarkan teori Davis dan Stout.
Kata kunci :   Tunikata, Lissoclinum  patella ,  antimikroba, Candida  albicans,  Escherichia  coli, Staphylococcus aureus.

## PENDAHULUAN
Laut Indonesia  memiliki  banyak sumber  daya  alam  termasuk  banyaknya keanekaragaman  jenis  biota  laut  (Nofiani, 2008). Keanekaragaman ini memberi peluang  untuk  memanfaatkan  biota  laut sebagai sumber pengobatan. Menurut Rasyid  (2008)  pemanfaatan  potensi  ini dalam  hal  pengobatan  belum  optimal, padahal,  potensi  yang  sangat  besar  dalam menghasilkan senyawa-senyawa aktif berasal  dari  organisme  laut.  Tunikata merupakan  salah  satu  komponen  biota penyusun  terumbu  karang  yang  mempunyai potensi bioaktif, sehingga menjadikan tunikata  target  yang  sangat  menarik  karena keanekaragamannya  yang  tinggi  dan  unik diantara invertebrata laut karena menghasilkan sejumlah besar senyawa  yang mengandung nitrogen (Wang and Namikoshi, 2007). Berbagai penelitian
menunjukkan bahwa organisme laut memiliki  potensi  yang  sangat  besar  dalam menghasilkan  senyawa-senyawa  aktif  yang dapat  digunakan  sebagai  bahan  baku  obat. Beberapa  organisme  laut  yang  diketahui dapat  menghasilkan  senyawa  aktif,  salah satunya  adalah  tunikata.  Organisme  ini diketahui  dapat  menghasilkan  sejumlah besar  produk  laut  yang  bersifat  alami,  juga mampu  menunjukkan  keragaman  senyawa kimia  yang  sangat  besar  (Thakur  and Muller, 2004).
Tunikata  merupakan  salah  satu  biota laut  yang  belum  mendapat  perhatian  yang serius,  namun  mempunyai  potensi  yang cukup besar di  perairan  Indonesia. Tunikata potensial dijadikan sebagai bahan eksplorasi pencarian  senyawa  bioaktif  baru  sebagai
calon obat untuk dunia farmasi (Wewengkang et  al .,  2014).  Tunikata termasuk  ke  dalam  kelompok  hewan invertebrata  di  ekosistem  terumbu  karang yang banyak menghasilkan senyawa bioaktif. Senyawa bioaktif tunikata berfungsi  sebagai  pertahanan  diri  dan  juga berfungsi  bagi  kehidupan  manusia,  yaitu sebagai antikanker, antiinflamasi, dan antimikroba (Khoeri, 2009).
Berdasarkan  penelusuran  pustaka diketahui  belum  ada  penelitian  mengenai aktivitas menghambat pertumbuhan mikroba dari Tunikata Lissoclinum patella. Sehingga peneliti  tertarik  untuk  melakukan  penelitian aktivitas menghambat pertumbuhan mikroba dari ekstrak dan fraksi Tunikata Lissoclinum patella dari perairan Desa Tumbak, Kecamatan Posumaen, Kabupaten Minahasa Tenggara, Sulawesi Utara.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan  Maret-Juni  2019  di  Laboratorium lanjutan  Program  Studi  Farmasi  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam Universitas Sam Ratulangi.

## Bentuk Penelitian
Bentuk
Penelitian ini ialah eksperimental  laboratorium  yang  akan menguji  komponen  yang  diekstrak  dari
Tunikata Lissoclinum patella sebagai antimikroba  yang  diperoleh  dari  perairan Desa Tumbak, Kecamatan Posumaen, Kabupaten  Minahasa  Tenggara,  Sulawesi Utara.
Volume 8 Nomor 4 November 2019
Alat dan Bahan
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian  ini  yaitu  masker,  sarung  tangan, pisau,  gunting,  telenan, Scuba  Diving , Zipperbag , Aluminium Foil , label,
Erlenmeyer  (Pyrex),  corong  pisah,  gelas ukur  (Pyrex),  gelas  kimia  (Pyrex),  tabung reaksi,  oven,  timbangan  analitik  (Kem), cawan  petri,  autoklaf  (Autoclaf  KT-30s), pinset, batang pengaduk,  pembakar spiritus, pipet  tetes,  mikro  tub, Laminar  Air  Flow (Clean  Bench) , lemari  pendingin,  Fortex, incubator  (N-biotek),  mikropipet,  jangka sorong,  penggaris,  vial,  pot  salep,  kertas cakram,  spidol  permanen,  tissue,  kertas saring, cool  box, kamera  untuk  keperluan dokumentasi.

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  yaitu Tunikata Lissoclinum  patella, bakteri  uji Staphylococcus  aureus,  Escherichia  coli, jamur  uji Candida  albicans, etanol  96%,  n- Heksan,  kloroform, metanol, akuades, ekstrak beef, pepton , NaCl, agar, Kloramfenikol.

## Prosedur Penelitian

## Pengambilan Sampel
Sampel Tunikata Lissoclinum patella diambil  dari  perairan  Desa  Tumbak, Kecamatan Posumaen, Kabupaten Minahasa Tenggara, Sulawesi Utara menggunakan alat bantu  (masker,  tabung  udara,  snorkel,  dan fins). Sampel dibersihkan dari kotoran  yang menempel disekitarnya, difoto lalu dimasukkan  kedalam Zipperbag ,  Sampel
dipotong  kecil-kecil  dan  diekstraksi  dengan cara maserasi dengan etanol 96% lalu diberi label serta nomor sampel kemudian disimpan  dalam cool  box .  Sebagian  dari sampel disimpan dalam vial untuk diawetkan sebagai voucher.

## Ekstraksi
Tunikata
Lissoclinum patella sebanyak  400  g  diekstraksi  dengan  cara maserasi.  Sampel  di  bersihkan,  dipotong kecil-kecil  lalu  dimasukkan  ke  dalam  botol dan  direndam  dengan  larutan  etanol  96% sampai sampel terendam secara keseluruhan dan  dibiarkan  selama  24  jam.  Sampel  yang direndam  disaring  dengan  menggunakan kertas  saring  menghasilkan  filtrat  1  dan debris  1.  Debris  1  direndam  dengan  larutan etanol  96%  sampai  sampel  terendam  secara keseluruhan  kemudian  dibiarkan  selama  24 jam. Sampel tersebut disaring menggunakan kertas  saring  menghasilkan  filtrat  2  dan debris  2.  Debris  2  kemudian  direndam dalam  larutan  etanol  96%  sampai  sampel terendam  secara  keseluruhan  dan  dibiarkan selama  24  jam,  sampel  tersebut  disaring menggunakan  kertas  saring  menghasilkan filtrat  3  dan  debris  3.  Filtrat  1,  2  dan  3 dicampur  menjadi  satu  kemudian  disaring, lalu  dimasukkan  kedalam  Oven  sehingga didapat  ekstrak  kasar  Tunikata Lissoclinum patella kemudian  ditimbang  menggunakan timbangan  analitik.  Ekstrak  kasar  yang diperoleh yaitu 11,4 g selanjutnya digunakan dalam  fraksinasi  dan  pengujian  aktivitas antimikroba.

## Fraksinasi
Ekstrak kasar sebanyak 6 g Lissoclinum  patella dimasukkan  kedalam
erlenmeyer,  kemudian  dilarutkan  dengan metanol  80%  sebanyak  100  mL.  Setelah larut,  dimasukan  kedalam  corong  pisah  dan ditambahkan pelarut n-Heksan sebanyak 100 mL.  Setelah  itu  dikocok  sampai  homogen. Dibiarkan  hingga  terbentuk  lapisan  metanol dan  lapisan  n-Heksan.  Masing-masing lapisan  ditampung  dalam  wadah  yang berbeda.  Lapisan  n-Heksan  selanjutnya dimasukkan  kedalam  oven  hingga  kering, lalu  ditimbang  dan  diperoleh  ekstrak  fraksi n-Heksan sebanyak 0,1495gr.
Lapisan metanol ditambahkan akuades  100  mL,  dipartisi  dengan  pelarut kloroform  dengan  perbandingan  1:1  v/v dalam  corong  pisah  dikocok  sampai homogen.  Dibiarkan  hingga  terbentuk  dua lapisan  yaitu  lapisan  metanol  dan  lapisan kloroform. Masing-masing lapisan ditampung  dalam  wadah  yang  berbeda. Lapisan  kloroform  selanjutnya  dimasukkan kedalam  oven  hingga  kering  lalu  ditimbang dan  diperoleh  fraksi  kloroform  sebanyak 0,0498gr.    Lapisan  metanol  dimasukkan kedalam  oven  hingga  kering  lalu  ditimbang dan  diperoleh  fraksi  methanol  sebanyak 0.1268.  Ketiga  fraksi  yang  diperoleh digunakan dalam pengujian antimikroba dan dihitung nilai rendemen dari masing-masing fraksi dengan persamaan:

## Sterilisasi Alat
Alat-alat  gelas  yang  digunakan dalam  penelitian  aktivitas  antimikroba  ini disterilkan terlebih dahulu dengan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121  ºC selama  15  menit,  pinset  dibakar  dengan pembakaran di  atas api langsung dan media
disterilkan  di  autoklaf  pada  suhu  121  ºC selama 15 menit (Ortez, 2005).

## Pembuatan Media B1
Ditimbang  Pepton  0,5  g,  ekstrak daging 0,3 g (meat extract), Natrium klorida 0,3  g  dilarutkan  dalam  metanol  sebanyak 100 mL menggunakan Erlenmeyer, dikocok sampai homogen. Media yang telah homogen  kemudian  disterilkan  dengan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121˚C selama  15  menit.  Dipipet  1  mL  media  cair B1,  kemudian  masukkan  dalam  tabung reaksi  dan  tutup  dengan  aluminium  foil. Media cair B1 siap digunakan sebagai media kultur mikroba (Ortez, 2005).

## Kultul Mikroba
Masing  –  masing  mikroba  yang sudah dikultur ( Escherichia coli , Staphylococcus aureus dan Candida albicans )  ditambahkan  sebanyak  100  µL kedalam  masing-masing  tabung  reaksi  yang sudah  diisi  media  cair  B1  sebanyak  1  mL. Masing-masing      tabung      reaksi      ditutup dengan aluminium   foil dan dimasukkan kedalam inkubator selama 1x24 jam  dengan suhu 37 oC.

## Pembuatan  Kontrol  Positif  dan  Kontrol
Negatif
Kontrol  positif  dalam  pengujian aktivitas  antimikroba  ini  menggunakan kloramfenikol  paper  disc.  Kontrol  negatif yang  digunakan  dalam  penelitian  ini menggunakan metanol untuk menguji apakah pelarut metanol memberikan pengaruh  terhadap  aktivitas  daya  hambat, dengan  cara  membuat  larutan  stok  metanol dengan  mengambil  sebanyak  200  μL
metanol  kemudian  ditotolkan  pada  kertas cakram.  Kontrol  negatif  digunakan  sebagai pembanding.

## Pembuatan Larutan Uji
Larutan  uji  dibuat  dengan  cara melarutkan  ekstrak  etanol Lissoclinum patella sebanyak  1  mg  ke  dalam  metanol 200  μL  sehingga  menghasilkan  konsentrasi larutan uji sebesar 250 μg/50 μL. Perlakuan yang sama dilakukan untuk fraksi n-Heksan, fraksi  kloroform  dan  fraksi  metanol  (Ortez, 2005).

## Pembuatan Media Agar B1
Pepton  0,5  g,  ekstrak  daging  ( meat extract ) 0,3 g, natrium klorida 0,3 g, nutrient agar 1,5  g  dan  dilarutkan  dalam  akuades sebanyak 100 mL menggunakan Erlenmeyer,  dikocok  sampai  homogen. Media  yang  telah  homogen  kemudian disterilkan  dengan  menggunakan  autoklaf pada  suhu  121˚C  selama  15  menit.  Media agar  B1  siap  digunakan  untuk  uji  aktivitas antimikroba.

## Pengujian Aktivitas Antimikroba
Metode yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu  metode  difusi  agar  (disc diffusion  Kirby  and  Bauer).  Pada  pengujian aktivitas  antimikroba  digunakan  kertas cakram  yang  berukuran  6  mm  dengan  daya serap  50  μL  tiap  cakram.  Suspensi  mikroba kemudian  diinokulasikan  ke  dalam  media dan  dihomogenkan.  Kemudian  media  yang telah  diinokulasi  mikroba  dituangkan  ke dalam  cawan  petri  sebanyak  100  mL  dan ditunggu  hingga  media  mengeras.  Sampel yang  telah  ditentukan  konsentrasinya  (250 μg/50  μL)  ditotolkan  pada  masing-masing
cakram  dengan  menggunakan  mikropipet. Masing-masing cawan petri diberi label dan nomor  sampel  yang  sesuai.  Kertas  cakram yang  telah  ditotolkan  sampel  uji  Tunikata Lissoclinum  patella diletakkan  ke  dalam cawan  petri  dengan  pinset  lalu  diinkubasi selama 1 x 24 jam (Ortez, 2005).
Pengamatan dan Pengukuran Zona Hambat
Pengamatan  dilakukan  setelah  24 jam  masa  inkubasi.  Daerah  pada  sekitaran cakram  menunjukkan  kepekaan  mikroba terhadap  antibiotik  atau  bahan  antimikroba yang  digunakan  sebagai  bahan  uji  yang dinyatakan  dengan  diameter  zona  bening. Diameter  zona  bening  diukur  dalam  satuan millimeter  (mm)  menggunakkan  jangka sorong  dengan  cara  diukur  diameter  zona bening  horizontal  ditambahkan  dengan diameter  zona  bening  vertikal  lalu  dibagi dua.  Kemudian  zona  bening  yang  telah diukur,  dibandingkan  berdasarkan  pedoman Davis dan Stout (1971).

## Teknik  Pengolahan  Data  dan  Analisis Data
Teknik  pengolahan  data  dilakukan dengan model penyajian dalam bentuk tabel dan  gambar,  grafik  dan  dianalisis  secara deskriptif.  Aktivitas  antibakteri  diukur menggunakan penggaris besi skala millimeter berdasarkan zona hambatan yang terbentuk

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Ektraksi dan Fraksinasi
Sampel Tunikata Lissoclinum patella yang  diambil  dari  Perairan  Desa  Tumbak, Kecamatan  Posumaen,  Minahasa  Tenggara,
Sulawesi Utara. Sampel diambil
menggunakan  alat  bantu Scuba  Diving .
Sampel  lalu  dibersikan.  Kemudian  sampel dipotong kecil kecil. Sampel dipotong kecil- kecil  bertujuan  untuk  memperbesar  ukuran permukaan  sampel  karena  semakin  luas permukaan  sampel  maka  interaksi  antara sampel  dan  pelarut  semakin  besar  sehingga proses  ekstraksi  berjalan  optimal  (Ncube et al .,  2008).  Sampel  kemudian  dikstraksi dengan  menggunakan  metode  maserasi. Tujuan  pemilihan  metode  maserasi  karena cara  pengerjaan  dan  peralatannya  yang sederhana,  tidak  dilakukan      pemanasan sehingga dapat mencegah terjadinya penguraian zat aktif  yang terkandung dalam sampel  akibat  pengaruh  suhu  dan  senyawa yang tidak tahan pemanasan (Sa’adah et al ., 2015). Metode maserasi sangat menguntungkan  dalam  isolasi  senyawa bahan  alam  maupun  bahan  laut,  karena dengan perendaman sampel, terjadi pemecahan  dinding  sel  karena  adanya perbedaan  tekanan  didalam  dan  diluar  sel sehingga metabolit sekunder dalam sitoplasma  larut  dalam  pelarut  organic  dan ekstraksi  senyawa  akan  sempurna  karena pedendaman  yang  akan  dilakukan  dapat diatur  (Lenny,  2006).  Proses  maserasi dilakukan  3x24  jam  dengan  dua  kali remaserasi  atau  pergantian  pelarut  yang baru.  Untuk  mendapatkan  penyarian  yang maksimal,  agar  senyawa  yang  terdapat didalam  sampel  dapat  terekstrak  secara menyeluruh maka dilakukan remaserasi atau pengulangan  dengan  penggantian  pelarut sebanyak tiga kali. Proses maserasi dilakukan  berulangkali  dengan  jumlah pelarut  yang  lebih  kecil,  lebih  efisien dibandingkan  dilakukan  sekali  dengan
jumlah  pelarut  yang  banyak  (Khopkar, 2008).
Maserasi
dilakukan dengan menggunakan  pelarut  etanol  96%.  Menurut Suryato  (2012),  pemilihan  pelarut  pada umumnya  dipengaruhi  oleh  beberapa  factor antara  lain  selektivitas,  kelarutan,  dan  titik didih.  Etanol  96%  dipilih  karena  selektif, tidak  toksik,  ekonomis  dan  kemampuan penyariannya  yang  tinggi  sehingga  dapat menyari  senyawa  yang  bersifat  non-polar, semi polar dan bersifat  polar. Pelarut  etanol 96%  lebih  mudah  masuk  berpenetrasi  ke dalam  dinding  sel  sampel  daripada  pelarut etanol  dengan  kosentrasi  lebih  rendah. Sehingga  menghasilkan  ekstrak  yang  pekat. Hasil maserasi selanjutnya diuapkan menggunakan  oven  dengan  suhu  40°C sehingga didapat ekstrak etanol.
Ekstrak  etanol  diperoleh  11,4  g dengan  rendemennya  2,85%  dan  berwarna kuning  kecoklatan  yang  kemudian  diambil sebanyak  6  g  untuk  difraksinasi  dengan menggunakan  tiga  pelarut  yang  berbeda berdasarkan  tingkat  kepolaran.  Pelarut  yang digunakan  yaitu  n-Heksan,  kloroform  dan metanol.  Penggunaan  pelarut  n-Heksan untuk melarutkan senyawa yang bersifat non polar,  pelarut  kloroform  untuk  melarutkan senyawa  yang  bersifat  semi  polar  dan pelarut  metanol  untuk  melarutkan  senyawa yang  bersifat  polar.  Selanjutnya,  Ekstrak etanol  sebanyak  6  g  dengan  menggunakan pelarut  metanol  sebanyak  100  mL,  lalu dipartisi  dengan  menggunakan  pelarut  n- Heksan 100 mL kemudian lapisan n-Heksan ditampung  ke  dalam  wadah,  lalu  diuapkan dengan  oven  dan  diperoleh  fraksi  n-Heksan 0,1495  g  rendemennya  5,98%  dan  warna fraksi  berwarna  coklat  kehijauan.  Lapisan
Metanol kemudian dipartisi kembali dengan pelarut  kloroform  sebanyak  200mL  dan sebelumnya  ditambahkan  akuades  100  mL. Penambahan  akuades  tersebut  dimaksudkan memperjelas  batas  lapisan  tiap  pelarut. Selanjutnya,  Lapisan  kloroform  dan  lapisan metanol  ditampung  kedalam  wadah  dan diuapkan  menggunakan  oven.    Fraksi kloroform  diperoleh  0,0498  g  dengan rendemen  yang  diperoleh  1,99%  warna filtrat  berwarna  coklat,  fraksi  metanol 0,2268  g  diperoleh  rendemennya  9,07% dengan  warna  filtrat  coklat  kehijauan. Pelarut  metanol  yang  dipartisi  dengan pelarut  n-Heksan  membentuk  dua  lapisan yaitu  lapisan  n-Heksan  yang  berada  diatas dan lapisan metanol berada dibawah, pelarut metanol  dipartisi  kembali  dengan  pelarut kloroform  terbentuk  dua  lapisan  yaitu lapisan  metanol  yang  berada  di  atas  dan lapisan klorofom yang berada bawah. Posisi sebuah pelarut berada di  atas atau di  bawah pada saat proses fraksinasi dipengaruhi oleh berat jenis masing masing pelarutnya.
Tabel 1. Rendemen fraksi Tunikata
Lissoclinum patella.
No Sampel Berat (g) Rendemen (%) Warna 1. EE 11,4 2,85 Kuning kecoklatan 2. FH 0,1495 5,98 Coklat kehijauan 3. FK 0,0498 1,99 Coklat 4. FM 0,2268 9,07 Coklat kehijauan Perbedaan nilai rendemen ini disebabkan  oleh  perbedaan  jenis  pelarut yang  digunakan.  Pelarut  yang  berbeda  akan melarutkan  senyawa-senyawa  yang  berbeda tergantung  tingkat  kepolarannya.  Sehingga,
jumlah  ekstrak  yang  dihasilkan  pun  juga tergantung jenis pelarutnya. Jumlah rendemen  terbesar  ditunjukkan  pada  fraksi metanol  dengan  nilai  sebesar  9,07%. Tinginya suatu rendemen yang terdapat pada pelarut  mengindikasikan  pelarut  persebut mampu mengekstrak lebih banyak komponen  bioaktif  yang  memiliki  sifat kepolaran  yang  lebih  tinggi.      Hal  ini menunjukkan bahwa terdapat banyak komponen  bioaktif  yang  bersifat  polar dalam Tunikata Lissoclinum patella.

## Uji  Aktivitas  Antimikroba  Tunikata

## Lissoclinum patella
Pengujian  aktivitas  antimikroba  dari ekstrak  etanol,  fraksi  metanol,  fraksi  n- heksan,  dan  fraksi  kloroform  pada  mikroba uji Escherichia coli, Staphylococcus aureus, dan Candida albicans menggunakan metode difusi agar (difusi Kirby dan Bauer). Metode ini  menjadi  pilihan  karena  untuk  tujuan klinis dengan mempertimbangkan kesederhanaan  teknik,  ketelitian,  metode serbaguna  bagi  semua  bakteri  patogen  yang tumbuh  cepat  dan  sering  digunakan  dalam uji  kepekaan  antibiotik  dalam  program pengendalian  mutu.  menggunakan  metode difusi agar disc diffusion test .
Metode  ini  juga  dipilih  karena mudah,  murah  dan  tidak  memerlukan  alat khusus.  Metode  difusi  agar  adalah  metode yang  dilakukan  dengan  pengukuran  dan pengamatan      diameter  zona  bening  yang terbentuk  disekitar  cakram  yang  berisi antimikroba yang telah diinokulasi mikroba.
Mikroba  uji  yang  digunakan  yaitu Escherichia  coli mewakili  bakteri  Gram negatif, Staphylococcus  aureus mewakili bakteri  Gram  positif,  dan Candida  albicans
mewakili jamur. Tujuan penggunaan mikroba  tersebut  untuk  mengetahui  bahwa apakah  ekstrak  dan  fraksi  dari Lissoclunim patella memiliki  aktivitas  antimikroba  serta untuk  mengetahui  spektrum  dari  aktivitas antimikroba Lissoclunim  patella apakah memiliki spektrum luas, yaitu dapat membunuh  banyak  jenis  mikroba  yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif, atau spektrum sempit yaitu yang hanya
membunuh salah satu dari Gram positif atau Gram negatif.
Dalam  pengujian,  hasil  yang  didapat  yaitu adanya  zona  hambat  disekeliling  cakram berukuran 6 mm yang ditandai dengan zona bening,  hal  ini  menunjukkan  adanya kepekaan  mikroba  terhadap  ekstrak  atau fraksi  dari  Tunikata Lissoclinum  patella . Pengamatan dilakukan setelah inkubasi pada suhu  37°C  selama  1x24  jam  dengan pengulangan  sebanyak  tiga  kali.  Dilakukan pengulangan  untuk  lebih  mengakuratkan hasil yang diperoleh.
Konsentrasi  yang  digunakan  yaitu  250  µg dalam  setiap  kertas  cakram  yang  memiliki daya  serap  50  µg  dari  sampel  Tunikata Lissoclinum  patella terhadap  mikroba  uji Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Candida albicans . Hasil pengukuran diameter  zona  hambat  dari  ekstrak  etanol, fraksi n-Heksan, fraksi kloroform dan fraksi methanol  terhadap  mikroba  uji Escherichia coli,  Staphylococcus  aureus,  dan  Candida albicans ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel  2.  Hasil  pengujian  ekstrak  dan  fraksi Tunikata Lissoclinum patella terhadap  mikroba  uji Escherichia coli,  Staphylococcus  aureus dan Candida albicans.
Dalam  pengujian  digunakan  kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positifnya menggunakan Kloramfenikol paper  disc . Kloramfenikol dipilih  sebagai kontrol  positif  yang  merupakan  larutan pembanding  efek  antara  obat  antimikroba baku  dengan  larutan  ekstrak  uji  dalam  hal ini  ascidian Lissoclinum  patella .  Kontrol positif berfungsi sebagai kontrol dari zat uji, dengan  membandingkan  diameter  daerah hambat  yang  terbentuk  (Dwijendra,  2014). Pemilihan  antibiotik  kloramfenikol  sebagai kontrol  positif  karena  memiliki  aktivitas antimikroba  dengan  spektrum  luas  yaitu dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri gram  negatif,  gram  positif  dan  jamur. Kloramfenikol memiliki aktivitas antimikroba  yang  lebih  besar  terhadap mikroba  uji  dibandingkan  ekstrak  etanol, fraksi n- heksan, fraksi kloroform dan fraksi metanol.
Diameter zona bening yang dihasilkan  kloramfenikol  pada Escherichia coli (24  mm) ,  Staphylococcus  aureus (23 mm) dan Candida  albicans (20  mm). Kontrol negatif digunakan untuk mengetahui  ada  tidaknya  pengaruh  pelarut terhadap pertumbuhan mikroba uji sehingga dapat  diketahui  bahwa  aktivitas  yang ditunjukan  oleh  ekstrak  dan  fraksi  ialah  zat yang  terkandung  dalam  sampel  bukan berasal dari pelarut yang digunakan. Kontrol negatif  yang  digunakan  yaitu  metanol.  Dari hasil  yang  diperoleh,  kontrol  negatif  tidak memiliki daya hambat antimikroba terhadap ketiga  mikroba  uji.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  aktivitas  yang  ditunjukkan  oleh ekstrak  dan  fraksi  tunkata Lissoclinum patella , murni dari senyawa  yang ada dalam sampel dan bukan dari pelarut. Pada  penelitian  ini,  ekstrak  etanol,  fraksi kloroform,  fraksi  n-Heksan  dan  fraksi metanol  menunjukkan  ekstrak  dan  fraksi yang efektif untuk menghambat pertumbuhan  mikroba.  Respon  berbeda diperoleh  dari  setiap  mikroba  uji  terhadap senyawa antimikroba. Dalam tabel 3 bakteri Gram  positif  yaitu Staphylococcus  aureus cenderung lebih sensitif terhadap komponen antimikroba  lebih  khusus  dalam  fraksi kloroform dan metanol dibandingkan bakteri Gram  negatif.  Hal  tersebut  disebabkan karena  adanya  perbedaan  kepekaan  pada Gram  positif,  Gram  negatif  dan  jamur terhadap senyawa  yang ada didalam ekstrak dan  fraksi  Tunikata Lissoclinum  patella . Struktur  dinding  sel  bakteri  Gram  positif lebih  sederhana  sehingga  memudahkan senyawa antimikroba untuk masuk ke dalam sel  dan  menemukan  sasaran  untuk  bekerja, sedangkan struktur dinding sel bakteri Gram
negatif  lebih  kompleks  dan  berlapis  tiga, yaitu lapisan luar berupa lipoprotein, lapisan tengah  yang  berupa  peptidoglikan,  dan lapisan  dalam  lipopolisakarida  (Pelczar  & Chan,1986).
Diameter Zona bening yang ditunjukkan  Jamur  uji Candida  albicans cenderung  lebih  besar  dibandingkan  bakteri uji  pada  ekstrak  etanol  dan  fraksi  n-Heksan walaupun  untuk  fraksi  kloroform  dan  fraksi metanol terdapat nilai diameter zona bening yang sama pada bakteri uji. Berbeda dengan bakteri,  jamur  mempunyai  struktur  dinding sel  yang  sangat  kompleks  dengan  rangka dasar yang terdiri dari polisakarida kristalin, kitin,  dan  ß-glukan,  dan  suatu  matriks  yang terdiri dari polisakarida amorf dan kompleks proteinsakarida. Kitin dan ß-glukan bertanggung jawab terhadap mekanismedinding  sel  jamur  (Siswandono danBambang,1995). Diameter zona hambat yang ditunjukkan  ekstrak  etanol  terhadap  setiap mikroba uji Escherichia
coli,
Staphylococcus aureus dan Candida albicans dikategorikan  sedang.  Hal  ini  juga menunjukkan  adanya  senyawa  aktif  yang memiliki  aktivitas  antimikroba  spektrum luas  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri Gram positif Staphylococcus aureus , bakteri Gram negatif Staphylococcus aureus dan jamur Candidaalbicans.
Diameter zona hambat yang ditunjukkan  pada  fraksi  n-Heksan  terhadap mikroba uji Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Candida
albicans dikategorikan  sedang.  Pada  fraksi n-Heksan  jamur Candida  albicans memiliki nilai yang paling besar dibandingkan dengan esktrak dan fraksi lainnya dalam mengambat
pertumbuhan masing-masing mikroba. Menurut  Roihanah et  al. (2012)  pelarut  n- Heksan  adalah  pelarut  yang  paling  efektif dalam  menghambat  pertumbuhan  mikroba, hal  ini  disebabkan  karena  senyawa  bioaktif yang terkandung pada Tunikata mudah larut dalam  pelarut  non  polar  yang  dapat berfungsi sebagai bahan antimikroba.
Diameter zona hambat yang ditunjukkan pada fraksi  kloroform, terhadap mikroba uji Escherichia
coli,
Staphylococcus aureus dan Candida albicans dikategorikan sedang. Hal ini juga menunjukkan  adanya  senyawa  aktif  yang memiliki  aktivitas  antimikroba  spektrum luas  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri Gram positif Staphylococcus aureus, bakteri  Gram  negatif  Escherichia  coli  dan jamur Candida albicans.
Diameter zona hambat yang ditunjukkan  pada  fraksi  metanol  lebih  kecil bila  dibandingkan  dengan  fraksi  n-Heksan yang ada pada Gram negatif Escherichia coli dan jamur Candida albicans. Walaupun pada fraksi metanol jika dilihat dari perbandingan persen  rendemen  mengandung  senyawa metabolit  sekunder  yang  lebih  banyak daripada fraksi n-Heksan. Menurut Dwijendra  et  al.  (2014)  Hal  ini  mungkin disebabkan  karena  adanya  kerja  yang  tidak sinergis  antara  senyawa  metabolit  sekunder dalam peranannya sebagai antimikroba.
Dalam  pengukuran  diameter  Zona bening  dalam  suatu  ekstrak  atau  fraksi terhadap  tiga  mikroba  uji  terdapat  daerah zona bening yang tidak sama besar pada saat pengulangan  terjadi  pada  fraksi  n-Heksan terhadap  Gram  negatif Escherichia  coli , fraksi n-Heksan dan fraksi metanol terhadap Gram positif Staphylococcus aureus , ekstrak
etanol  dan  Fraksi  metanol  terhadap  jamur Candida  albicans .  Hal  ini  dipengaruhi  oleh daya  serap  yang  diserap  pada  saat  proses menotolan sampel pada paper disc. Menurut Bhorgin  (2014),  besar  kecilnya  daerah hambat  dipengaruhi  oleh  laju  pertumbuhan mikroorganisme, kemampuan dan laju difusi bahan  aktif  pada  medium,  kepekaan mikroorganisme  terhadap  zat  aktif  serta ketebalan dan viskositas medium.

## KESIMPULAN
Ekstrak dan fraksi Tunikata Lissoclinum  patella memiliki  aktivitas antimikroba.  Berdasarkan  hasil  penelitian yang  telah  dilakukan  dapat  disimpulkan bahwa pada ekstrak etanol, fraksi n-Heksan, fraksi  Kloroform  dan  fraksi  metanol  dari Tunikata Lissoclinum  patella terhadap mikroba uji Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Candida albicans memiliki  kategori  kekuatan  daya hambat sedang.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut  dengan  uji  antioksidan  dari  Tunikata Lissoclinum patella .

## DAFTAR PUSTAKA
Bhorgin,  A.  J.  and  Uma,  K.  2014. Antimicrobial Activity of Earthworm Powder  (Lampito  mauritii). Int Jorunal of Current Microbiology and Applied Science . 3 ( 1 ): 437-443.
Davis,  W.W.,  and  Stout,  T.R.  1971.  Disc
Plate  Methods  of  Microbiological Antibiotic Assay. Journal Microbiology . 22(4): 659-665.
Khoeri,  M.M.  2009. Bioprospeksi  Bakteri
Simbion  pada  Tunikata  Didemnum molle dari Perairan Pul au Sambangan  Karimunjawa  Jepara.
Universitas Dipoengoro, Semarang.
Khopkar, S.M. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik . UI Press, Jakarta.
Lenny,  S.  2006. Senyawa  Flavonoida, Fenilpropanoida dan Alkaloida .
FMIPA  Universitas  Sumatera  Utara,
Medan.
Ncube,  N.S.,  Afolayan,  A.J.,  Okoh,  A.I. 2008.  Assesement  Techniques  of Antimicrobial  Properties  of  Natural Compounds of Plant Origin: Current Methods  and  Future  Trends. Africa Journal of Biotechnology. 7(12) : 30-
32.
Nofiani, Risa. 2008. Urgensi dan Mekanisme  Biosintesis  Metabolit Sekunder  Mikroba  Laut. Jurnal Natur Indonesia . 10 (2): 120-125.
Ortez,  J.H.  2005. Disk  Diffusion  Testing  in Manual of Antimicrobial Susceptibility  Testing.  Marie  B .
Coyle (Coord.Ed). American Society for Microbiology.
Pelczar,  M.J.,  Chan,  E.C.S.  1986. Dasar- dasar  Mikrobiologi  2 .  Universitas Indonesia Press, Jakarta.
Rasyid,  A.  2008. Biota  Laut  Sebagai Sumber Obat-obatan . Oseana, 33(1): 11-18.
Roihana  S,  Sukoso,  Andayani  S. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Teripang (Holoturia  Sp)  Terhadap  Bakteri Vibrio  Harveyi  Secara  In-Vitro . [skripsi].  Fakultas  Perikanan  dan Ilmu Kelautan. Universitas Brawijaya. Malang. 2012.
Sa’adah,  H.,  dan  Nurhasnawati,  H.  2015.
Perbandingan Pelarut Etanol dan Air Pada  Pembuatan  Ekstrak  Umbi Bawang Tiwai (Eleutherine Americana Merr). Jurnal Ilmiah Manuntung . 1( 2 ): 149- 153.
Siswandono  dan  Bambang,  S.  1995. Kimia Medisinal . Erlangga, Surabaya.
Suryanto,  E.  2012. Fitokimia  Antioksidan.
Putra Media Nusantara, Surabaya.
Thakur,  N.  L,  and  Muller,  W.E.G.  2004. Biotechnological Potential of Marine Sponges. Jurnal  Current  Science .
86:1506-1512.
Wang,  W.,  and  Namikoshi,  M.  2007. Bioactive  Nitrogenous  Metabolites from  Ascidians . Heterocycles .  74:
53-88
Wewengkang,  D.S.,  Sumilat,  D.A.,  dan Rotinsulu,  H.  2014.  Sitotoksisitas Ekstrak  Kasar  Ascidian  dari  Pulau Bunaken .  Jurnal  LPPM  Bidang Sains dan Teknologi . 1( 1 ): 86-89