## ANTIOXIDANT ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT SPONGE Stylissa carteri COLLECTED FROM MANADO BAY

## UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL SPONS Stylissa carteri YANG DIKOLEKSI DARI TELUK MANADO
Christo Togelang 1) , Adithya Yudistira 1) , Erladys M. Rumondor 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT Manado, 95115 *togelangchrissto36@gmail.com

## ABSTRACT
Sea sponges have enormous bioactive potential. The research was to identify the antioxidant and ethanol  sponge  ethanol  Stylissa  carteri  collected  from  the  mando  bay.  The  study  is  an experimental laboratory that will test the antioxidant activity of collected Stylissa carteri sponge extract  from  manado  bay.  The  findings  suggest  the  antioxidant  activity  of  the  Stylissa  carteri sponge obtained from manado bay has antioxidant activity and the higher the concentration of it increases.  The  most  high  antioxidant  activity  found  on  the  Stylissa  carteri  spong  with  a concentration of 25 ppm.
Keywords: Antioxidant, DPPH, Stylissa carteri, Manado Bay

## ABSTRAK
Spons laut memliki potensi bioaktif yang sangat besar. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas  antioksidan  ektrak  etanol  spons Stylissa  carteri yang  dikoleksi  dari  Teluk  Mando. Penelitian  ini  merupakan  eksperimental  laboratorium  yang  akan  menguji  aktivitas  antioksidan dari  ekstrak  spons Stylissa  carteri yang  dikoleksi  dari  teluk  Manado.  Hasil  penelitian  ini menunjukan aktivitas antioksidan dari spons Stylissa carteri yang diperoleh dari Teluk Manado memiliki  aktivitas  antioksidan  dan  semakin  tinggi  konsentrasi  semakin  tinggi  pula  kadar antioksidan  yang  dihasilkan.  Aktivitas  antioksidan  yang  paling  tinggi  terdapat  pada  Spons Stylissa carteri dengan konsentrasi 25 ppm.
Kata Kunci : Antioksidan, DPPH, Stylissa carteri, Teluk Manado

## PENDAHULUAN
Indonesia  sebagai  negara  yang  sangat kaya  dengan  sumber  daya  alam  yang  melimpah denga  luas  lautannya  terdiri  dari  5,8  juta  km 2 atau  sekitar  70%  dari  luas  total  wilayah Indonesia.  Wilayah  lautan  Indonesia  terdapat berbagai  macam  spesies  laut  baik  tumbuhan maupun  hewan.  Salah  satu  invertebrate  yang jumlahnya  sangat  banyak  dilautan  Indonesia ialah spons. Spons laut memliki potensi bioaktif yang  sangat  besar.  Selama  50  tahun  terakhir telah banyak kandungan bioaktif yang ditemukan. Kandungan bioaktif tersebut dikelompokan  kedalam  kelompok    yang  sangat besar seperti antiflammantory, antitumor, antivirus,  antimalarial  dan  antibiotik  (Rasyid, 2009).
Senyawa antioksidan merupakan senyawa  yang  bekerja  dengan  cara  mengikat radikal  bebas  dan  molekul  yang  sangat  reaktif sehingga  dapat  menghambat  reaksi  oksidasi. Dampak reaktivitas senyawa radikal bebas dapat menyebabkan  terjadinya  kerusakan  sel  atau jaringan,  penyakit  degeneratif  serta  kanker (Sutrisna,  2013).  Radikal  bebas  didalam  tubuh manusia  berperan  dalam  patologi  dari  berbagai penyakit  degeneratif  yakni  jantung  coroner, aterosklerosis,  kanker,  rematik,  katarak  dan penyakit  degenerasi  saraf  seperti  parkinson (Silalahi, 2006).
Metode peredaman radikal bebas DPPH ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil )  adalah  metode  uji antioksidan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini. Metode ini memerlukan sedikit sampel, sederhana,  mudah,  cepat  dan  peka  untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dari senyawa bahan  alam  (Hanani,  Mun’im  dan  Sekarini, 2005).  Berdasarkan  uraian  latar  belakang tersebut,  peneliti  menganggap  bahwa  penelitian tentang  “Uji  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak Etanol  Spons Stylissa  carteri Yang  Dikoleksi Dari Teluk Manado” perlu dilakukan.

## METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan April  sampai  September  2021  di  Laboratorium Farmasi Lanjut Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas Sam Ratulangi

## Bentuk Penelitian
Bentuk  dari  penelitian  ini  adalah eksperimental  laboratorium  yang  akan  menguji aktivitas  antioksidan  dengan  menggunakan metode  DPPH  ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil )  dari ekstrak spons Stylissa carteri yang dikoleksi dari teluk Manado.
Alat dan Bahan
Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian  ini  yaitu scuba  diving ,  kamera, gunting,  pisau,  wadah  botol,  kertas  saring , ziplok,  sarung  tangan,  telenan,  spatula,  alat- alat  gelas  (Iwaki  ST  Pyrex  ®),  timbangan digital (AE Adam®), mikropipet, spektrofotometer  UV-Vis, aluminium  foil, Vortex (Mixer Hwashin), evaporator.

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu etanol  95%,  DPPH (1,1  difenil-2-pikrilhidrazil), spons Stylissa  carteri dan  serbuk  vitamin  C  p.a sebagai pembanding.

## Prosedur Penelitian Pengambilan Sampel
Sampel  ini  diambil  di  teluk  Manado, Sulawesi Utara menggunakan alat bantu scuba diving.  Sebelum  diambil  sampel  di  foto menggunakan  kamera  bawah  laut.  Setelah diambil,  dimasukan  dalam  kantong  plastik jepit  yang  sudah  disiapkan  dan  disimpan dalam  kotak  pendingin  lalu  dibawa  ke Laboratorium  Farmasi  Lanjut  Program  Studi Farmasi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sam Ratulangi.

## Preparasi Sampel
Sampel  spons Stylissa  carteri yang sudah  di  ambil  dicuci  kembali  dan  dipotong- potong  kecil  lalu  dimasukan  kedalam  wadah botol,  sampel  yang  di  dalam  botol  diisi  dengan etanol 95% sebanyak 200 mL.

## Ekstraksi
Sampel  spons Stylissa carteri.  sebanyak 140  g  di  maserasi  dengan  pelarut  etanol  95% sebanyak  200mL  dengan  3  kali  pengulangan selama  24  jam  dengan  sesekali  di  kocok.  Hasil dari  maserasi  kemudian  di  saring  untuk
mendapatkan  hasil  filtrat,  kemudian  hasil  filtrat yang  di  dapatkan  dari  3  kali  pengulangan  di uapkan menggunakan rotary evaporator sehingga  menghasilkan  ekstrak  kental  dari sampel,  lalu  di  taruh  di  cawan  petri  dan  di masukan kedalam oven pemanas untuk mendapatkan  ekstrak  kasar  dari  sampel  spons Stylissa carteri.

## Pembuatan Larutan Stok 1000 ppm
Sebanyak 100 mg ekstrak spons Stylissa carteri dilarutkan  dalam  100  mL  etanol  95%. Dengan  masing-masing  konsentrasi  10,  15,  20, dan  25  ppm,  dihitung  dengan  menggunakan rumus pengenceran, yaitu:
𝑽 𝟏 𝑴 𝟏 = 𝑽 𝟐 𝑴 𝟐
Masing-masing  hasil  yang  didapatkan dari  hasil  V1  dipipet  dan  ditambahkan  etanol 95%  hingga  mencapai  tanda  batas  (10  mL), kemudian  dipindahkan  ke  dalam  tabung  reaksi dan ditutup dengan menggunakan aluminium foil untuk digunakan pada perlakuan selanjutnya.

## Pembuatan Larutan DPPH
Sebanyak  4  mg  DPPH  ditimbang  dan dilarutkan dalam etanol 95% sebanyak 100 mL, dan  buat  larutan  stok  DPPH  sesuai  konsentrasi yang sama dengan konsentrasi pada larutan stok sebelumnya  yaitu  10,  15,  20,  dan  25  ppm. Masing-masing konsentrasi, ditambahkan etanol sampai tanda batas (10 mL). Selanjutnya larutan yang di buat untuk uji aktivitas antioksidan yaitu ekstrak  etanol  spons Stylissa  carteri di  pipet sebanyak  0,5  mL  dimasukan  kedalam  tabung reaksi  dengan  masing-masing  konsentrasi  10, 15,  20,  dan  25  ppm  dan  di  tambahkan  1,5  mL larutan DPPH kedalam masing-masing kosentrasi  dan  divortex  selama  2  detik.  Sampel dibuat sebanyak 3 kali pengulangan.

## Pembuatan Larutan Vitamin C
Vitamin  C  p.a  ditimbang  sebanyak  10 mg.  Kemudian,  vitamin  C  p.a  dilarutkan  dalam etanol  p.a  sebanyak  10  mL,  buat  larutan  stok dengan konsentrasi yang sama, yaitu konsentrasi 10,  15,  20,  dan  25  ppm  dengan  ditambahkan masing-masing  larutan  dengan  etanol  p.a mencapai  tanda  batas  (10  mL),  dengan pengulangan  sebanyak  3  kali  pada  masing- masing  konsentrasi.  Sampel  vitamin  C  p.a  diuji pada  spektrofotometer  UV-Vis  dengan  panjang gelombang 517 nm..
Pengujian  Larutan  Kontrol  DPPH  dan Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
Larutan kontrol DPPH diuji menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan  panjang  gelombang  517  nm  sebagai absorbansi  kontrol  dalam  pengujian  ini. Sampel  diinkubasi  selama  30  menit  pada suhu  37ºC.  Berubahnya  warna  ungu  menjadi warna kuning menunjukkan efisiensi penangkal  radikal  bebas.  Diukur  absorbansi pada spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 517 nm setelah diinkubasi  selama  30  menit.  Kemudian diamati  perbandingannya  dengan  vitamin  C p.a  sebagai  standar.  Aktivitas  penangkapan radikal  bebas  (persen  inhibisi)  dihitung sebagai persentase berkurangnya warna DPPH dengan menggunakan rumus:
% inhibisi = 1 − 𝐚𝐛𝐬𝐨𝐫𝐛𝐚𝐧𝐬𝐢 𝐬𝐚𝐦𝐩𝐞𝐥 𝐚𝐛𝐬𝐨𝐫𝐛𝐚𝐧𝐬𝐢 𝐤𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥 X 100%

## HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil
Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas dari penangkal radikal bebas,  dengan  menggunakan  Spektrofotometer UV-Vis.  Hasil  pengujian  disajikan  pada  tabel dibawah ini:
Tabel  1. Hasil  perbandingan  pengujian  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Etanol  spons Stylissa  carteri dengan Vitamin C p.a
Konsentrasi Ekstrak dan Vitamin C Pengulangan rata-rata I II III 10 ppm Ekstrak 66,1 % 61,6 % 64,8 % 64,1 % Vitamin C 95,2 % 95,3 % 95,2 % 95,2 % 15 ppm Ekstrak 65 % 65 % 64,7 % 64,9 % Vitamin C 95,3 % 95,2% 95 % 95,1 % 20 ppm Ekstrak 69,4 % 65,3 % 69,6 % 68,1 % Vitamin C 95,2 % 95,5% 95,6 % 95,4 % 25 ppm Ekstrak 72,9 % 71,3 % 70,6 % 71,6 % Vitamin C 95,1 % 95,5 % 95,5 % 95,4 %

## Pembahasan
Spons  merupakan  biota  laut  yang  hidup menetap  di  dasar  perairan,  yang memiliki  peran yang cukup penting di dalam ekosistem terumbu karang.  Selain  itu  spons  merupakan  salah  satu komponen biota penyusun terumbu karang yang mempunyai potensi bioaktif yang belum banyak dimanfaatkan.  Hewan  laut  ini  mengandung senyawa  aktif  yang  persentase  keaktifannya lebih  besar  dibandingkan  dengan  senyawa- senyawa  yang  dihasilkan  oleh  tumbuhan  darat contohnya pada biota laut spons Stylissa carteri (Rachmaniar, 1998).
Ekstraksi  pada  spons Stylissa  carteri menggunakan  metode  maserasi.  Metode  ini digunakan  untuk  mengekstrak    zat  aktif  yang mudah  larut  dalam  cairan  pengekstrak,  dimana sediaan cair yang dibuat dengan cara mengekstraksi  bahan  nabati  yaitu  direndam menggunakan pelarut bukan air (pelarut nonpolar)  atau  setengah  air,  misalnya  etanol encer,  selama  periode  waktu  tertentu,  waktu yang  digunakan  untuk  perlakuan  ini  selama  24 jam  untuk  3x  pengulangan  dengan  sampel sebanyak  140  g.  Keuntungan  dari  ekstraksi dengan  metode  maserasi  adalah  peraatannya yang mudah ditemukan dan pengerjaannya yang sederhana,  biaya  operasionalnya  relatif  rendah dan  prosesnya  relatif  hemat  penyari  dan  tanpa pemanasan.
Pembuatan larutan stok dengan menggunakan  konsentrasi  10,  15,  20,  dan  25 ppm.  Pada  penelitian  ini  dilakukan  pengujian dengan  3  kali  pengulangan  pada  konsentrasi tersebut. Pembuatan larutan stok harus
memperhatikan  daya  simpan  larutan  karena apabila  larutan  sudah  mengalami  pengendapan tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok  umumnya  terjadi  bila  kepekatan  larutan terlalu tinggi.
Tujuan  dari  pembuatan  larutan  stok sendiri  ialah  untuk  menghindari  penimbangan yang  berulang-ulang,  dimana  penimbangan berulang-ulang  ini  lebih  membutuhkan  banyak waktu. Selanjutnya tinggal mengencerkan larutan stok saja larutan stok dibuat hanya untuk satu  jenis  bahan.  Langkah  ini  bertujuan  untuk menghindari pengendapan larutan.
Metode  yang  digunakan  pada  penelitian ini  adalah  DPPH  (1,1- difenil -2- pikrilhidrazil ). karena merupakan metode yang paling sederhana,  mudah,  cepat  dan  peka  serta  hanya memerlukan sedikit sampel untuk mengevaluasi aktivitas  antioksidan  dari  senyawa  bahan  alam sehingga  digunakan  secara  luas  untuk  menguji kemampuan  senyawa  yang  berperan  sebagai pendonor electron (Molyneux, 2004).
Uji DPPH digunakan panjang gelombang  517  nm,  dengan  menimbang sebanyak 4 mg DPPH ditimbang dan dilarutkan dalam  etanol  95%  sebanyak  100  mL,  larutan DPPH  tersebut  diukur  pada  panjang  gelombang 400  sampai  600  nm  dan  hasil  absorbansi  yang didapat  adalah  0,874.  Selanjutnya  larutan  yang di  buat  untuk  uji  aktivitas  antioksidan  yaitu ekstrak  etanol  spons Stylissa  carteri .  di  pipet sebanyak  0,5  mL  dimasukan  kedalam  tabung reaksi  dengan  masing-masing  konsentrasi  10, 15,  20  dan  25  ppm  dan  di  tambahkan  1,5  mL
larutan DPPH kedalam masing-masing kosentrasi dan divortex selama 5 detik.
Penelitian  ini  menggunakan  vitamin  C p.a  sebagai  Pembanding  untuk  kontrol  positif sampel  spons Stylissa  carteri karena  berfungsi sebagai  antioksidan  sekunder  yaitu  menangkap radikal  bebas,  mencegah  terjadinya  reaksi berantai,  aktivitas  antioksidannya  sangat  tinggi, mudah diperoleh dan vitamin C lebih polar dari vitamin yang lain. Vitamin C mempunyai gugus hidroksi bebas yang bertindak sebagai penangkap radikal bebas.
Sebelum  memasuki  pengujian  dengan alat  spektrofotometer  UV-Vis,  sampel  spons Stylissa carteri dan larutan sampel vitamin C p.a diinkubasi terlebih dahulu dengan cara menutup sampel dengan aluminium foil selama 30 menit. Spektrofotometer  umum  digunakan  karena kemampuannya  dalam  menganalisa  begitu banyak  senyawa  kimia  serta  kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan  dengan  beberapa  metode  analisa. Spektrofotometri  UV/Vis  melibatkan  energi elektronik  yang  cukup  besar  saat  analisis, sehingga spektrofotometer UV/Vis lebih banyak dipakai  untuk  analisis  kuantitatif  dibanding kualitatif.  Spektrofotometri  UV-vis  adalah pengukuran serapan cahaya di daerah ultraviolet (200 –350 nm) dan sinar tampak (350 – 800 nm) oleh suatu senyawa
Konsentrasi 10, 15, 20 dan 25 ppm hasil pengukuran  aktivitas  antioksidan  pada  larutan sampel  spons Stylissa  carteri menunjukkan bahwa  spons Stylissa  carteri memiliki  aktivitas antioksidan  yang  cukup  tinggi  hal  ini  dapat dilihat pada (Tabel 1) dengan rata-rata 64,1% di konsentrasi  10  ppm,  64,9%  di  konsentrasi  15 ppm,  68,1%  di  konsentrasi  20  ppm  dan  yang paling besar di konsentrasi 25 ppm yaitu sebesar 71,6%  perbanding  dengan  aktivitas  pada konsentrasi sampel spons Stylissa carteri dengan kontrol  positif  dari  sampel  vitamin  C    yang tinggi hal ini dapat dilihat pada (tabel 1) dengan rata-rata 95,2% di konsentrasi 10 ppm, 95,1% di konsentrasi  15  ppm  dan  95,4%  di  masing- masing konsentrasi 20 ppm dan 25 ppm. Berdasarkan hasil yang diperoleh pada (Tabel 1) menunjukkan bahwa pengukuran persen inhibisi pada  ekstrak  etanol  spons Stylissa  carteri memiliki  aktivitas  antioksidan  dan  mengalami peningkatan  dari  konsentrasi  10  mg/L  sampai
dengan  25  ppm.  Pada  ekstrak  etanol  spons Stylissa  carteri dengan  konsentrasi  25  ppm memiliki  persen  inhibisi  rata-rata  paling  tinggi yaitu  sebesar  71,6%  Penigkatan  persen  inhibisi pada  ekstrak  etanol  spons Stylissa  carteri menandakan  bahwa  konsentrasi  ekstrak  yang ditambahkan mempengaruhi kemampuan ekstrak  dalam  merendam  radikal  bebas.  Hal  ini didukung  oleh  penelitian  yang  dilakukan  oleh Hanani et al ., (2005) sebagai jurnal pembanding yang menyatakan bahwa presentasi penghambat atau  persen  inhibisi  terhadap  aktivitas  radikal bebas  akan  ikut  meningkat  seiring  dengan meningkatnya  konsentrasi.  Hasil  pengujian perbandingan aktivitas antioksidan ekstrak spons Stylissa  carteri dan  vitamin  C  (Tabel  1)  juga menukjukkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak  etanol  spons Stylissa  carteri lebih rendah dibandingkan dengan vitamin C.

## KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan  dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak etanol spons Stylissa carteri yang dikoleksi dari Teluk  Manado  memiliki  aktivitas  antioksidan dan  aktivitas  antioksidan  yang  paling  tinggi terdapat  pada  Spons Stylissa  carteri dengan konsentrasi 25 ppm.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut mengenai senyawa aktif yang terkandung dalam spons Stylissa  carteri dengan  konsentrasi  lebih kecil  dan  pengujian  aktivitas  antioksidan menggunakan  metode  yang  berbeda  untuk membandingkan hasilnya dengan penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
David  Pakaya,  2014.  Peranan  Vitamin  C  Pada Kulit.  Bagian  Histologi,  Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Tadulako, Tadulako. MEDIKA TADULAKO, Jurnal Ilmiah  Kedokteran ,  Vol. 1 No.2  Mei 2014. Handbook Spectrofotometry. (2017). www.gelifesciences.com,  [19  April 2017] Hendra,  H.,  Yudistira,  A.,  Sumantri,  S.,  (2020). Evaluasi Aktivitas Antioksidan
Ekstrak  Etanol  Spons Aplysina  sp . Dipesisir  Pantai  Lembeh  Kota  Bitung. Pharmacon , 9(3), 458–460. Gozcelioğlu,  B.,  Konuklugil,  B.,  2012,
Qualitative Detection of Some Secondary  Metabolites  from  Three Turkish  Marine  Sponges, Fabad  J. Pharm. Sci ., 37: 73-78.
Hanani  E,  Mun’im  B,  Sekarini  R.  2005 .
Identifikasi senyawa antioksidan dalam  spons  Callispongia  sp.  dari Kepulauan Seribu. Jurnal Ilmu Kefarmasian2 (3): 127-133.  Jurnal
(Endang Hanani).
Houghton  PJ  and  Raman.  1998. Laboratory Handbook  for  The  Fractination  of Natural  Extract. Chapman  and  Hall, London, UK. Istiqomah. 2013. Perbandingan Metode Ekstraksi  Maserasi  Dan  Sokletasi Terhadap  Kadar  Piperin  Buah  Cabe
Jawa  ( Piperis  Retrofracti  Fructus) . [Skripsi]. UIN Jakarta.
Membri,  D.K.,  Yudistira,  A.,   Sumantri ,  S. (2021).  Uji  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak Etanol Spons Liosina paradoxa Yang  Dikoleksi  Dari  Pulau
Mantehage. Pharmacon ,  10(2),  775–
777.
Molyneux,  P.  2004.  The  use  of  the  stable  free radikal diphenyl picrylhydrazyl (DPPH)  for  estimating  antioxidant activity. Journal Science of Technology. 24(2); 211-219.
Pabel, C. T., Joachim, V., Wilde, C., Franke, P., Hofemeister, J., Adler, B., Bringmann, G., Hacker, J., and Hentschel, V. 2003. Antimicrobial  activities  and  matrix assisted  laser  desorption/  ionization mass spectrometry of Baccilus isolated from  the  marine  spons  Aplysina aerophoba . Marine Biotechnology.
Percival.M.  1998. Antioxidants. [terhubung berkala] http://acudoc.com/Antioxidant s.pdf [19 Feb 09].
Prayoga  G.  2013.  Fraksinasi  Uji  Aktivitas Antioksidan  dengan  Metode  DPPH dan  Identifikasi  Golongan  Senyawa Kimia  dari  Ekstrak  Teraktif  Daun Sambang Darah (Excoecaria cochinchinensis Lour). Fakultas Farmasi Program Studi Sarjana Ekstensi Universitas Indonesia.
Pratimasari,  D.  2009. “Uji  Aktivitas  Penangkap
Radikal  Buah  Carica  Papaya  L.
Dengan  Metode  DPPH  dan  Penetapan Kadar Fenolik Serta Flavonoid Totalnya”. [Skripsi]. Surakarta: Universitas Muhammadiyah Surakarta. Rasyid, A. 2009. Senyawa-senyawa bioaktif dari Spons. Oseana. Hlm 25-32. Schlagel.G.H. 1993. General Microbiologi seventh edition. Cambrige University Press. Silalahi, J. 2006. Makanan Fungsional . Kanisius. Jogjakarta. Suryanto, E. 2012. Fitokimia Antioksidan . Putra Media Nusantara, Surabaya. Sutrisna. 2013. Penyakit Degeneratif . Universitas Muhammadiyah, Surakarta. Turak, F., Dinç, M., Dülger, Ö. & Özgür, M.U. (2014). Four derivative spectrophotometric  methods  for  the simultaneous determination
of carmoisine  and  ponceau  4R  in  drinks and comparison with high performance liquid  chromatography. International Journal of Analytical Chemistry . 2014: 650465.
Winarsi,  Hery.  2007.  Antioksidan  Alami  dan Radikal Bebas. Yogyakarta : Kanisius;
p. 11, 13, 15, 77-78, 137-138..