## DETEKSI CEPAT GEN INVA PADA SALMONELLA ATCC DENGAN LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP)
Soni Muhsinin * , Rahma Ziska, Maria Martina Sulastri Sekolah Tinggi Farmasi Bandung
*Email: soni.muhsinin@stfb.ac.id
Artikel diterima: 7 Januari 2019; Disetujui: 20 Maret 2019

## ABSTRAK
Salmonella spp.  merupakan  bakteri  yang  menyebabkan  penyakit typhoid salmonellosis (demam tifoid). Bakteri ini masuk melalui rute oral, biasanya dengan cara mengkontaminasi makanan dan minuman. Salmonella spp. memiliki gen invA yang  menyebabkan  patogenitas  pada  manusia.  Metode  kultur  digunakan  sebagai gold  standard untuk  mendeteksi Salmonella spp. Akan  tetapi,  metode  tersebut membutuhkan  infrastruktur  dan  laborious.  Tujuan  penelitian  ini  untuk pengembangan deteksi Salmonella spp. dengan metode Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP).  Tahapan  penelitian  dimulai  dari  desain  primer  LAMP, kultur Salmonella ATCC,  Isolasi  DNA  kultur Salmonella ATCC,  dan  Optimasi LAMP Salmonella ATCC.  Primer  LAMP  yang  telah  didesain  terdiri  dari  tiga pasang.  DNA Salmonella ATCC  yang  telah  diisolasi  memiliki  konsentrasi  4,5 ng/ul. Metode LAMP menunjukan hasil yang positif dalam mendeteksi gen InvA pada Salmonella ATCC.  Hasil  positif  ditunjukan  dengan  pendaran  warna (fluoresensi)  pada  sampel  DNA Salmonella ATCC,  sedangkan  hasil  negatif sebaliknya  ditunjukan  dengan  tidak  adanya  fluoresensi  pada  kontrol  negatif ( nuclease  free  water ).  Kesimpulan  dari  penelitian  yang  telah  dilakukan,  metode LAMP dapat mendeteksi gen InvA pada Salmonella ATCC.
Kata kunci: LAMP, gen InvA , Salmonella spp., isolasi DNA, demam tifoid.

## ABSTRACT
Salmonella  spp.  is  a  bacterium  that  causes  typhoid  salmonellosis  (typhoid fever). These bacteria enter through the oral route, usually by contaminating food and drinks. Salmonella spp. has an invA gene that causes pathogenicity in humans. The culture method is used as a gold standard to detect Salmonella spp. However, this method requires infrastructure and is laborious. The purpose of this study is to develop  detection  of  Salmonella  spp.  using  the  Loop-Mediated  Isothermal Amplification  (LAMP)  method.  The  stages  of  the  study  began  with  the  primary design  of  LAMP, Salmonella ATCC culture, DNA Isolation of  Salmonella ATCC culture, and Salmonella ATCC LAMP Optimization. Primary LAMP that has been designed consists of three pairs. Salmonella ATCC DNA that has been isolated has a concentration of 4,5 ng/ul. The LAMP method shows positive results in detecting the InvA gene in Salmonella ATCC. Positive results are indicated by fluorescence in Salmonella ATCC DNA samples, whereas the negative results are shown in the
absence of fluorescence in nuclease free water. The conclusion from the research that has been done, LAMP method can detect InvA gene in Salmonella ATCC.
Keywords: LAMP, InvA gene Salmonella spp., DNA Isolation, typhoid fever.

## PENDAHULUAN
Salmonella spp  adalah bakteri gram  negatif  motil  (aktif  bergerak) yang  menginfeksi  manusia  melalui rute oral menyebabkan infeksi saluran pencernaan atau lebih dikenal dengan Salmonellosis. Salah satu serovar dari Salmonella spp.  yaitu Salmonella thypimurium merupakan serovar yang dapat  menyebabkan  penyakit  Tifus (Demam Tifoid) (Pham & McSorley,
2015;  De  Jong et  al .,  2012).
Salmonella spp. merupakan penyebab utama dari penyakit yang disebarkan melalui makanan ( foodborne
diseases ) (Zhao et al ., 2014).
Salmonella spp. memiliki  gen invA yang berperan dalam menyebabkan  sakit  pada  manusia. Gen  tersebut  terletak  di  daerah  yang disebut Salmonella    pathogenicity island (SPI-R).  Gen inv A  pada
Salmonella spp. terletak di kromosom yang  mampu  menghasilkan  protein yang  dapat  memberikan  sifat  invasif pada sel epitel yang terdapat di dalam usus.  Keberadaan  gen InvA ini  yang menyebabkan Salmonella spp bersifat
pathogen pada tubuh manusia. (Pham & McSorley, 2015)
Deteksi
Salmonella spp. biasanya  dilakukan  dengan  metode kultur  sebagai gold  standard .    Akan tetapi metode ini memiliki kelemahan seperti,  waktu  deteksi  yang  cukup lama, hasil pengujian yang terkadang tidak konsisten, dan memerlukan lab pengujian dengan level Biosefty yang tinggi (Bugarel et al., 2017; Kokkinos et al ., 2014).
Pengembangan  metode  deteksi cepat menjadi alternatif untuk mengatasi kelemahan tersebut.  Salah satu metode yang telah dikembangkan  oleh  para  peneliti yaitu  metode  molekuler  berbasis asam nukleat, seperti Metode
LoopMediated
Isothermal Amplification (LAMP). LAMP
adalah  salah  satu  teknik  diagnostik molekuler  yang  telah  dikembangkan dari  tahun  1999  di  Jepang.  Teknik LAMP  menggunakan  amplifikasi DNA  pada  suhu  tetap,  sehingga penggunaan  alat thermocycler yang mahal  tidak  diperlukan.  Amplifikasi
pada suhu  tetap dapat  terjadi  dengan menggunakan  jumlah  primer  yang lebih  banyak  berdasarkan  prinsip nested dan reverse transcriptase PCR ( Polymerase Chain Reaction ). Proses amplifikasi  pada  metode  LAMP menggunakan  enzim  yang  dapat menjadi substrat selama proses reaksi amplifikasi  berlangsung.  Analisis hasil  metode  LAMP  ini  sangat sederhana  karena  dapat  dideteksi secara visual dengan melihat endapan (pada  proses  reaksi  ditambahkan reagen pengendap) atau dapat berupa perubahan  pendar  warna  fluoresensi. (Li  et  al.,  2017;  Wu et  al .,  2015;
Zhuang  et  al.,  2014).  Berdasarkan latar belakang tersebut telah
dilakukan penelitian untuk
pengembangan  deteksi  cepat  gen InvA pada Salmonella spp.  dengan menggunakan metode LAMP.

## METODE PENELITIAN Kultur Salmonella ATCC
Kultur Salmonella ATCC didapatkan dari POLTEKES
Bandung.  Kultur  tersebut  kemudian disubkultur  dengan  menggunakan media  pertumbuhan  Nutrien  Agar (NA). Koloni Salmonella ATCC yang
tumbuh  setelah  inkubasi  selama  24 jam  pada  suhu  37 0 C,  kemudian diambil untuk dilakukan isolasi DNA.

## Desain dan Proyeksi Primer LAMP
Primer LAMP
untuk mendeteksi Salmonella terdiri  dari enam  buah  primer.  Primer  didesain untuk  mendeteksi  gen InvA pada Salmonella yang berhubungan dengan  sifat  patogenitas  dari  bakteri tersebut.  Primer  didesain  dengan menggunakan Software
PrimerExplorer  V5  secara  online  di web: https://primerexplorer.jp/e/. Hasil dari software tersebut kemudian dibandingkan  dengan  literaur  yang telah  melakukan  penelitian  LAMP. Primer yang telah didesain kemudian dilakukan  proyeksi  atau  mapping primer dengan menggunakan software SnapGene Viewer 4.2.4.
Isolasi DNA Salmonella sp.
Isolasi DNA pada sampel kultur positif Salmonella sp  menggunakan KIT  isolasi  DNA Wizard®  Genomic DNA  Purification  Kit (Promega).
Hasil  isolasi  DNA  ini  dijadikan kontrol  positif  yang  akan  digunakan pada  tahapan  pengembangan  assay yaitu optimasi LAMP.
Analisis Kuantitatif DNA
DNA  yang  telah  diisolasi kemudian dianalisis secara kuantitatif dengan  menggunakan  instrument Nanodrop. Pengukuran DNA dilakukan untuk mengetahui konsentrasi DNA dan tingkat kemurnian  DNA  (Sambrook et  al.,
2001).

## Optimasi LAMP
Optimasi LAMP diawali
dengan  optimasi  protokol  LAMP pada tahapan penentuan suhu inkubasi yang  tepat.  Kemudian dilanjutkan  optimasi  waktu  inkubasi karena semakin lama waktu inkubasi dapat  menghasilkan  produk  PCR yang  semakin  banyak.  Pada  tahapan optimasi  LAMP  ini  menggunakan sampel DNA yang positif Salmonella ATCC.  Hasil  produk  LAMP  yang positif  ditunjukan  dengan  adanya fluoresensi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Desain dan Proyeksi Primer LAMP
Primer  LAMP  sebanyak  tiga pasang  didapat  berdasarkan  studi literatur  Hara-kudo et  al .  (2005)
(gambar 1) . Primer tersebut dilakukan  pemetaan  pada  gen InvA
yang urutan
nukleotidanya
didapatkan  pada  NCBI.  Primer  yang telah didapat kemudian diproyeksikan  dengan  menggunakan software SnapGene . Hasil dari proyeksi  primer  dapat  dilihat  bahwa tiga  pasang  primer  dapat  menempel pada gen InvA (gambar 2).
Isolasi DNA Salmonella sp.
Tahapan isolasi dilakukan untuk mendapatkan DNA murni baik pada Salmonella ATCC. Isolasi DNA pada  penelitian  ini  menggunakan Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega). Isolasi DNA memiliki beberapa  tahapan,  yaitu:  (1)  Lisis dinding  sel;  (2)  Purifikasi;  dan  (3) Presipitasi.  Isolasi  DNA  dilakukan sesuai dengan protocol KIT Promega. Salmonella merupakan  bakteri  gram negatif sehingga isolasi menggunakan protokol khusus untuk bakteri gram negatif.
Langkah  awal  1  ml  kultur  di sentifugasi  dengan  kecepatan  14.500 rpm.  Sentrifugasi  bertujuan  untuk mengendapkan  sel  dari  komponen lainnya  berdasarkan  berat  jenis molekul.    Pemecahan  sel  (lisis) merupakan  tahapan  dari  awal  isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel dengan
penambahan Nuclei  Lysis (Wilson, 2001).  Tahap  selanjutnya  yaitu penambahan RNAse untuk
menghilangkan  RNA  pada  larutan
DNA. RNAse merupakan  enzim pendegradasi  RNA  dan protein presipitation digunakan untuk mengendapkan  protein  (Sambrook dkk ., 2001). Supernatan yang mengandung  DNA  dipisahkan  dan ditambahkan  larutan isopropanol
sebagai  agen  presipitasi  lanjutan Pellet DNA kemudian dicuci dengan etanol  70%  untuk  menghilangkan pengotor (Wilson, 2001). Supernatan dipisahkan dan pellet DNA dikeringkan  kemudian  ditambahkan
DNA rehidrase sebagai  pelarut  dan mencegah degradasi DNA, selanjutnya dilakukan analisis kualitas dan kuantitas DNA.
Gambar 1. Urutan Primer LAMP
Gambar 2. Hasil proyeksi Primer LAMP pada gen InvA

## Analisis Kuantitatif DNA
Konsentrasi DNA dapat
dihitung  dengan  alat  Nanodrop
(Thermo  Scientific) yang  memiliki prisip seperti spektrofotometer.
Kemurnian  larutan  DNA  dapat dihitung  melalui  perbandingan  A260 nm  dengan  A280  nm.  Hasil  isolasi DNA  dikatakan  murni  apabila  rasio perbandingan A260 nm dan A280 nm adalah  1,8-  2,0  (Sambrook dkk., 2001). Berdasarkan hasil pengukuran diperoleh kemurnian DNA 1,66 yang menunjukan adanya sedikit
kandungan  protein,  sehinnga  masih dapat digunakan untuk proses amplifikasi  (Sambrook dkk., 2001).
DNA dapat menyerap cahaya ultraviolet  karena  keberadaan  basa- basa purin dan pirimidin. Penyerapan sinar  ultraviolet  oleh  nukleotida
secara  maksimal  dapat  dicapai  pada panjang gelombang A260 nm, sedangkan penyerapan sinar ultraviolet  maksimal  oleh  protein dicapai  pada  panjang  gelombang A280  nm.  Pita  ganda  DNA  dapat menyerap cahaya UV pada  260 nm dan    kontaminan  protein  akan menyerap cahaya pada  280 nm.
Pengukuran  kuantitas  DNA selanjutnya adalah pengukuran konsentrasi  DNA,  yang  bertujuan untuk  mengetahui  banyak  sedikitnya DNA yang terkandung dalam larutan. Banyaknya  radiasi  ultraviolet  yang diserap oleh larutan DNA berbanding lurus dengan banyaknya DNA dalam sampel  yang  diisolasi  (Sambrook dkk., 2001).    Berdasarkan  hasil pengukuran  konsentrasi  DNA  yang didapat yaitu 4,5 ng/µl.

## Optimasi LAMP
Hasil dari isolasi DNA Salmonella ATCC kemudian dideteksi gen InvA dengan
menggunakan  metode  LAMP.  Tiga pasang primer ditambahkan pada mix LAMP, kemudian dilakukan optimasi
waktu inkubasi 30 menit dan 45 menit
pada  suhu  65 0 C.  Hasil  LAMP menunjukan hasil positif pada waktu inkubasi 30 menit dan 45 menit yang ditunjukan  dengan  pendaran  warna (gambar  3).  Hasil  positif  tersebut menunjukan  bahwa  LAMP  dapat mendeteksi gen InvA pada Salmonella
ATCC. A B C Gambar 3. Hasil LAMP Keterangan: A: Kontrol negatif (NFW); B: inkubasi 30 menit; C: inkubasi 45 menit Prinsip metode LAMP merupakan metode modifikasi
amplifikasi  PCR  pada  suhu  tetap dengan  menggunakan  empat  sampai enam pasang primer dari gen dengan sekuens highly  conserved pada spesies target. Primer yang digunakan terdiri  dari inner  primer (FIP  =  F1, F2), backward  primer (BIP  =  B1, B2), outer primer (F3  dan  B3)  dan untuk mempercepat reaksi dapat pula dengan  cara  menambahkan sekuens loop  primer (loop  F  &  B).  Primer LAMP  mencakup Forward  Inner
Primer (FIP),  yang  terdiri  dari  aerah F2  (di  bagian  3'  ujung)  yang merupakan komplementer daerah F2c serta  daerah  Flc  di  bagian  5'  ujung dari  sekuens  yang  sama,  disebut primer FIP dan merupakan gabungan dari  primer  F2  dan  F1. Forward Outer  Primer terdiri  dari  daerah  F3 yang merupakan komplementer daerah  F3c,  dikenal  juga  dengan primer  F3. Backward  Inner  Primer (BIP),  terdiri  dari  daerah  B2  (di bagian  3'  ujung)  yang  merupakan komplementer  daerah  B2c  serta
daerah  B1c  di  bagian  5'  ujung  dari sekuens  yang  sama  disebut  primer BIP.  (Fan et  al .,  2015;  Sun et  al .,
2015).

## KESIMPULAN
Metode Loop-Mediated
Isothermal  Amplification (LAMP)
dapat  digunakan  untuk  mendeteksi gen InvA pada  bakteri Salmonella
ATCC pada waktu inkubasi 30 menit dan suhu 65 0 C.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada
KEMENRISTEK  DIKTI  yang  telah memberikan  dana  Penelitian  Dosen Pemula (PDP) untuk  anggaran tahun 2018.

## DAFTAR PUSTAKA
Bugarel,  M.,  Tudor,  A.,  Loneragan,
G.  H.,  &  Nightingale,  K.  K. (2017).  Molecular  detection assay of five Salmonella serotypes  of  public  interest: Typhimurium,
Enteritidis,
Newport, Heidelberg, and Hadar. Journal
of microbiological  methods , 134 ,
14-
20.doi:10.1016/j.mimet.2016.1 2.011 De  Jong,  Hanna  K.,  Chris  M.  Parry, Tom van der Poll, and W. Joost Wiersinga. 2012. Host– Pathogen Interaction in Invasive  Salmonellosis.  PLoS Pathogens 8(10) Fan,  F.,  Du,  P.,  Kan,  B.,  Yan,  M., 2015.  The  Development  and Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for the Rapid Detection of  Salmonella  enterica  serovar Typhi. PLOS ONE 10, e0124507. doi:10.1371/journal.pone.0124 507 Hara-Kudo, Y., Yoshino, M., Kojima, T.,  &  Ikedo,  M.  (2005).  Loop- mediated isothermal amplification  for  the  rapid detection of Salmonella. FEMS
microbiology letters , 253 (1),
155-161.
Kokkinos, P. A., Ziros, P. G., Bellou,
M.,  &  Vantarakis,  A.  (2014). Loop-mediated isothermal amplification  (LAMP)  for  the detection  of  Salmonella  in food. Food Analytical Methods , 7 (2), 512-526.
Li, Y., Fan, P., Zhou, S., & Zhang, L.
(2017). Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a novel rapid detection platform for pathogens. Microbial
pathogenesis , 107 , 54-61.
Pham,  O.H.,  McSorley,  S.J.,  2015. Protective host immune responses to Salmonella
infection. Future Microbiol. 10, 101–110. doi:10.2217/fmb.14.98
Sambrook,  J.,  Russell,  D.  W., Janssen,  K.,  &  Argentine,  J. (2001). Molecular  cloning:  a
laboratory manual on the web . Cold Spring Harbor Laboratory. Sun,  Y.,  Quyen,  T.  L.,  Hung,  T.  Q., Chin,  W.  H.,  Wolff,  A.,  & Bang, D. D. (2015). A lab-on-a- chip  system  with  integrated sample  preparation  and  loop- mediated isothermal amplification  for  rapid  and quantitative detection of Salmonella spp. in food samples. Lab  on  a  Chip , 15 (8), 1898-1904.
Wilson,  K.  (2001).  Preparation  of genomic DNA from bacteria. Current  protocols  in molecular biology , 56 (1), 2-4.
Wu,  G.P.,  Chen,  S.H.,  Levin,  R.E., 2015.  Application  of  ethidium bromide monoazide for
quantification  of  viable  and
dead cells of Salmonella enterica  by  real-time  loop- mediated isothermal amplification.  J.  Microbiol. Methods 117, 41– 48.doi:10.1016/j.mimet.2015.0 7.012 Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., & Oh, D. H. (2014). Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J. Microbiol. Biotechnol , 24 (3),
297-312.
Zhuang, L., Gong, J., Li, Q., Zhu, C.,
Yu,  Y.,  Dou,  X.,  Liu,  X.,  Xu, B.,  Wang,  C.,  2014.  Detection of Salmonella spp.  by  a  loop- mediated isothermal amplification  (LAMP)  method targeting bcfD gene. Lett. Appl. Microbiol. 59, 658–664. doi:10.1111/lam.12328