## Current Biochemistry

## CURRENT BIOCHEMISTRY
ISSN: 2355-7877 Homepage: http://biokimia.ipb.ac.id E-mail: current.biochemistry@gmail.com

## Volume 5 (3): 1 - 10, 2018
Antibacterial Activities of Sirih Merah ( Piper crocatum ) Leaf Extracts (Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Sirih Merah) Puspa Julistia Puspita 1* , Mega Safithri 1 , Nirmala Peni Sugiharti 1
1 Department of Biochemistry, Bogor Agricultural University, Bogor, 16680, Indonesia
Received : 3 December 2018 ; Accepted: 23 January 2019
*Corresponding author: Puspa Julistia Puspita; Departemen Biokimia, Jl. Agatis Gd. Fapet Lt. 5, Wing 5, Bogor 16680; Telp/Fax. +62251-8423267; E-mail: puspajulistia@gmail.com

## ABSTRACT
Piper crocatum is one of medicinal herbal plants with a large number of benefits. Usually herbal plants have activity as antibacterial agent. Therefore, the objectives of this research were to obtain information on antibacterial activities of the leaf extracts of Piper crocatum againts four types of bacteria, in that Staphylococcus, Bacillus substilis, Escherichia coli, and Pseudomonas aerugino- sa and then to analyze the phytochemistry of the leaf extracts of Piper crocatum. The leaves of Piper crocatum were extracted by maceration and reflux using ethanol 30%. The assays of the antibacterial activities and phytochemistry on the extracts were carried out using the method of Maria Bintang. Results  showed  that  the  yield  of  the  extraction  using  ethanol  by  maceration  method  was  20.8%. Meanwhile, using the reflux method, the yield was obtained about 26.25%. The phytochemistry anal- ysis showed that the leaf extracts of Piper crocatum contained alkaloid, steroid and tanin. According to this study, it was found that the leaf extract of Piper crocatum can be used to inhibit the growth of B. subtilis and P. aeuruginosa, but can not inhibit the growth of E.coli and S. aureus.
Keywords: antibacterial, maceration, medicinal herbal plant, Piper crocatum, reflux.

## ABSTRAK
Piper crocatum adalah tanaman obat herbal dengan sejumlah besar manfaat. Biasanya ta- naman herbal memiliki fungsi sebagai antibakteri. Oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan informasi mengenai aktivitas antibakteri dari ekstrak daun sirih merah (Piper croca- tum) terhadap empat jenis bakteri, yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus substilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa, serta untuk menemukan senyawa fitokimia pada ekstrak daun sirih merah  tersebut.  Daun  sirih  merah  diekstraksi  dengan  metode  maserasi  dan  reflux  menggunakan etanol 30%. Pengukuran aktivitas antibakteri dan fitokimia dilakukan dengan menggunakan metode Maria Bintang. Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh rendeman dari ekstrak etanol dengan metode maserasi sebesar 20.8, sedangkan dengan metode reflux rendeman yang dihasilkan sebesar 26.25%.

## Puspita et al. - Antibakteri Daun Sirih Merah ( Piper crocatum )
Analisis  fitokimia  ekstrak  daun  sirih  merah  ditemukan  memiliki  kandungan  alkaloid,  steroid  dan tanin. Berdasarkan dari hasil penelitian juga diperoleh bahwa ekstrak daun sirih merah dapat meng- hambat pertumbuhan B. substilis dan P.aeuruginosa, tetapi tidak dapat menghambat pertumbuhan dari E.coli dan S. aureus.
Kata kunci : antibakteri, maserasi, Piper crocatum, reflux, tanaman obat herbal.

## 1. PENDAHULUAN
Indonesia terletak di daerah khatulistiwa yang beriklim tropis dengan kelembaban udara tinggi. Indonesia kaya akan sumber daya alam baik itu hayati dan nonhayati. Khusus sumber daya alam hayati, Indonesia terkenal sebagai negara yang banyak mempunyai berbagai jenis tumbuhan.
Telah banyak dihasilkan berbagai ma- cam obat tradisional berbahan dasar tanaman obat alami yang disebut dengan jamu. Ramuan herbal yang berasal dari tanaman sudah banyak terbukti dapat mengobati berbagai penyakit. Ta- naman sirih merah ( Piper crocatum ) adalah ta- naman yang hingga sekarang masih digunakan sebagai pelengkap upacara adat seperti di daer- ah Yogyakarta (Astuti et al ., 2014). Sirih mer- ah memiliki kandungan senyawa aktif seperti flavonoid,  alkaloid,  tanin,  senyawa  polifenolat dan minyak atsiri (Lestari ABS, 2014; Safithri et al ., 2012). Senyawa aktif yang terkandung oleh tanaman sirih merah menyebabkan tanaman ini memiliki banyak potensi untuk mengobati berbagai penyakit, diantaranya berpotensi  se- bagai antioksidan, antihiperglikemia,  antikan- ker  dengan meningkatkan proliferasi sel  kank- er dan juga dapat sebagai antidiabetes (Safithri dan Fahma, 2008; Alfarabi et al ., 2010; Safithri, 2011).
Pemanfaatan sirih merah sebagai bahan antibakteri alami mempunyai keuntungan kare- na kemungkinan senyawa tersebut lebih aman
dibandingkan dengan penggunaan bahan sinte- tik. Penggunaan bahan sintetik banyak menim- bulkan kekhawatiran tentang efek sampingnya yang merugikan kesehatan. Berdasarkan kand- ungan senyawa dari sirih merah yaitu senyawa polifenolat, tanaman ini juga dapat berpotensi sebagai antibakteri. Pelezar dan Chan (1988) melaporkan beberapa kelompok bahan antibak- teri adalah fenol, alkohol, halogen, logam berat dan detergen (Pelezar 1988). Potensi sirih mer- ah sebagai antibakteri belum banyak dilakukan, sehingga ini mendorong untuk dilakukannya penelitian terkait aktivitas antibakteri terhadap bakteri Gram negatif dan Gram positif. Selain itu, penelitian yang dilakukan oleh Astuti (2014) melaporkan bahwa fungi endofit dari sirih merah memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli , Bacillus substilis dan S taph- ylococcus aureus (Astuti et al ., 2014). Tujuan penelitian ini adalah mengetahui kandungan fi - tokimia sirih merah dan menguji potensi aktivi- tas antibakteri daun sirih merah ( Piper croca- tum ) terhadap 4 jenis bakteri, yaitu Gram positif ( Staphylococcus aureus dan Bacillus substilis ) dan bakteri Gram negatif ( Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa ).

## 2. METODOLOGI
Pembuatan Media Agar Pepton Yeast Gluko- sa (PYG) (Bintang, 1993)
Sebanyak 10 gram pepton, 10 gram ek- strak yeast, dan 20 gram glukosa dan 15 gram
Curr. Biochem. 2018. 5 (3): 1 - 10
agar dilarutkan dalam 1 L akuades, dengan pH yang diukur ± 7.0. Campuran diaduk sambil di- panaskan hingga larut, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing seban- yak 20 mL. Media agar kemudian disterilisasi pada suhu 121 o C selama 15 menit dan didin- ginkan pada suhu kamar.

## Pembuatan Media NB
Media NB digunakan untuk penentuan aktivitas antibakteri. Sebanyak 2.5 gram ek- strak yeast, 5 gram tripton, dan 2.5 gram NaCl dilarutkan di dalam 450 mL akuades. Larutan ini diukur pHnya pada rentang 7.0 – 7.2 dan kemu- dian ditera masing-masing sebanyak 25 mL dan disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 120 o C.

## Ekstraksi (Safithri 2004)
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi yaitu daun sirih merah segar ditimbang sebanyak 50 gram, kemudian dimaserasi meng- gunakan pelarut etanol 30% sebanyak 250 mL di atas shaker pada suhu kamar selama 24 jam. Selanjutnya disaring dan filtrat diambil serta si - sanya dilakukan ekstraksi lagi dengan volumen yang jernih. Ekstraksi dilakukan sampai pelarut jernih. Hasil yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator (T<60 o C). Kemudian didesti- lasi uap untuk mengeluarkan fraksi volatilnya, setelah itu didapat fraksi non volatil.
Ekstraksi dengan cara refluks yaitu ser - buk daun sirih merah ditimbang sebanyak 20 gram, kemudian direfluks menggunakan pelar - ut etanol sebanyak 100 mL pada suhu 60-70 o C. Filtrat yang diperoleh disaring dan diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator pada suhu 40 o C dan tekanan 60 mmHg. Setelah itu diper- oleh ekstrak etanol.

## Analisis Fitokimia (Harborne 1987)
Senyawa yang diidentifikasi adalah sen - yawa alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, trit - erpenoid dan tanin.
Uji Alkaloid . Sebanyak 0.1 gram ek- strak daun sirih merah dilarutkan dengan 5 mL kloroform dan 3 tetes NH 4 OH. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 2 tetes H 2 SO 4 2 M. Lapisan atas (asam) diambil, lapisan ini diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan 3 tetes pereaksi Dragendorf, Mayer dan Wagner yang akan menimbulkan endapan dengan warna berturut-turut merah, jingga, putih dan cokelat.
Uji Flavonoid. Sebanyak 0.1 gram ek- strak daun sirih merah ditambahkan 5 mL meta- nol 30%, lalu dipanaskan selama 5 menit. Filtrat ditambahkan dengan H 2 SO 4 . Warna merah kare- na penambahan H 2 SO 4 menunjukkan adanya flavonoid. Sebagai pembanding digunakan buah pinang.
Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram ek- strak daun sirih merah ditambah dengan 5 mL akuades kemudian dididihkan selama 5 menit. Selanjutnya  dilakukan  penyaringan  dan  filtrat yang didapat ditambahkan dengan 5 tetes FeCl 3 1%. Jika terbentuk warna biru tua atau hijau ke- hitaman menunjukkan adanya tanin.
Uji Saponin. Sebanyak 0.1 gram ek- strak daun sirih merah ditambah dengan 5 mL akuades lalu dipanaskan 100 o C selama 5 menit. Kemudian dikocok selama 5 menit. Busa yang terbentuk setinggi tidak kurang dari 1 cm dan tetap stabil setelah didiamkan selama 15 menit menunjukkan adanya saponin.
Uji Triterpenoid dan Steroid. Seban- yak 0.1 gram ekstrak daun sirih merah ditam- bahkan 5 mL etanol 30% lalu dipanaskan dan disaring. Filtrat diuapkan, lapisan eter ditambah dengan pereaksi Lieberman Buchard (3 tetes
Puspita et al. - Antibakteri Daun Sirih Merah ( Piper crocatum )
asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pe- kat). Terbentuk warna hijau atau biru menunjuk- kan adanya steroid dan warna merah atau ungu menunjukkan adanya senywa triterpenoid.

## Uji Aktivitas Antibakteri (Bintang 1993)
Uji aktivitas antibakteri dilakukan den- gan menggunakan ampisilin dengan konsentrasi 0.1 mg/mL sebagai kontrol positif.
Peremajaan Bakteri Uji. Biakan bak- teri dibuat di media agar miring yang kemudian dinkubasi selama 24 jam pada suh 37 o C. Isolat bakteri kemudian disimpan pada suhu 4-5 o C se- belum digunakan. Bakteri yang akan digunakan pada uji aktivitas adalah bakteri yang telah di- remajakan di media Nutrient Broth (NB) kemu- dian diinkubasi dalam inkubator bergoyang se- lama 24 jam pada suhu 37 o C.
Uji Aktivitas Antibakteri. Aktivitas antibakteri diuji dengan menggunakan metode sumur. Biakan bakteri diinokulasikan 1 ose pada 10 mL media NB,    kemudian diinkubasi pada inkubator bergoyang pada suhu 37 o C sela- ma 18-24 jam. Kemudian nilai OD diukur pada panjang gelombang 620 nm. Apabila nila OD > 1 maka biakan yang diambil sebanyak 50 µL, bila OD < 1 maka biakan yang diambil 100 µL. Lalu biakan tersebut disebar di media cawan. Kemudian, sebanyak 20 mL media agar PYG dituangkan ke dalam cawan dan digoyang untuk meratakan media ke seluruh permukaan cawan. Sumur pada agar dibuat dengan diameter 5.5 mm menggunakan pipet tetes yang telah diasah ujungnya, kemudian ekstrak sebanyak 50 µL di- masukkan ke dalam lubang tersebut, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Kon- sentrasi ekstrak yang digunakan adalah 25, 50, 75, 100 mg/mL. Zona bening yang terbentuk di sekeliling lubang diukur sebagai zona hambat.

## 3. HASIL Rendeman Ekstrak Daun Sirih Merah
Ekstraksi daun sirih merah dilakukan dengan  metode  maserasi  dan  refluks  dengan menggunakan pelarut etanol 30% dengan bobot sampel 50 gram dan 20 gram secara berurutan. Hasil pada Tabel 1 menunjukkan bahwa bob- ot ekstrak pekat lebih besar dihasilkan dengan menggunakan metode maserasi sebesar 10.4 gram dibandingkan metode refluks yaitu sebe - sar 5.25 g dengan nilai rendeman secara beruru- tan yaitu 20.8% dan 26.25%. Hasil pada Tabel 1 menunjukkan bahwa nilai rendeman yang dihasilkan dari metode refluks lebih besar jika dibandingkan dengan metode maserasi.

## Senyawa Fitokimia Ekstrak Daun Sirih Merah
Analisis fitokimia dilakukan untuk men - getahui kandungan metabolit sekunder pada suatu  tanaman  secara  kualitatif.  Uji  fitokimia yang dilakukan pada ekstrak daun sirih merah dilakukan untuk memastikan senyawa metabo- lit sekunder yang berperan sebagai antibakteri, Senyawa yang diuji adalah alkaloid, flavonoid, tanin, steroid, triterpenoid, dan saponin. Hasil yang ditunjukkan pada Tabel 2 menunjukkan bahwa ekstrak daun sirih merah mengandung al- kaloid, stroid, dan tanin baik pada ekstrak hasil maserasi dan refluks. Selain itu, pada uji alka - loid, sampel menunjukkan hasil positif terhadap ketiga pereaksi yang ditunjukkan dengan terben-

## Pengujian
Hasil Ekstrak Maserasi Ekstrak Refluks Bobot ekstrak 10.4 g 5.25 g Rendemen 20.8% 26.25%
Tabel 1. Hasil ekstraksi sirih merah dengan metode maserasi dan refluks
tuknya warna cokelat dengan pereaksi Wagner, terbentuk endapan putih dengan pereaksi Mayer dan terbentuk endapan merah dengan pereaksi Dragendorf (Gambar tidak ditampilkan).

## Aktivitas Antibakteri
Bakteri yang diuji aktivitasnya ada- lah bakteri Gram positif, yaitu Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis dan bakteri Gram negatif, yaitu Escherichia coli dan Pseudomo- nas aeruginosa . Uji aktivitas antibakteri dilaku- kan dengan menggunakan eksktrak yang diper- oleh dari hasil maserasi dan hasil refluks dengan menggunakan ampisilin sebagai standar. Aktivi- tas antibakteri dilihat melalui zona bening yang terbentuk di sekitar  sumur (Gambar 1 dan 2). Dari hasil yang ditunjukkan pada Gambar 1 dan 2 memperlihatkan bahwa semakin besar zona bening yang terbentuk menunjukkan semakin besar aktivitas antibakterinya yang juga dipen- garuhi oleh konsentrasi ekstrak. Hasil yang di- tunjukkan pada Gambar 1 dan 2 didukung oleh hasil pada Tabel 3 yang menujukkan bahwa ter- hadap keempat bakteri uji, ekstrak daun sirih merah terbukti dapat menghambat pertumbuhan bakteri B. subtilis dari ekstrak secara maserasi dan refluks dan menghambat P. aeruginosa dari

## Tabel 2. Kandungan senyawa fitokimia ekstrak
daun sirih merah
Sampel Senyawa Fitokimia Ekstrak etanol 30% (maserasi) Ekstrak etanol 30% (refluks) + + Alkaloid - -
Flavonoid
- - Saponin - - Triterpenoid + + Steroid + + Tanin Ket:
+  = mengandung senyawa uji -   = tidak mengandung senyawa uji
Gambar 1. Aktivitas antibakteri ekstrak (maserasi) daun sirih merah (1). 25 mg/mL, (2). 50 mg/mL, (3). 75 mg/mL, (4). 100 mg/mL, (5) Ampisilin 0.1 mg/mL terhadap bakteri uji B.substilis (a), S.aureus (b), E.coli (c), P.aeruginosa (d). (a) (b) (c) (d) (a) (b)
Gambar 2.   Aktivitas antibakteri ekstrak (refluks) daun sirih mer - ah (1). 25 mg/mL, (2). 50 mg/mL, (3). 75 mg/mL, (4). 100 mg/ mL, (5) Ampisilin 0.1 mg/mL terhadap bakteri uji B.substilis (a), S.aureus (b), E.coli (c), P.aeruginosa (d).
(c) (d)
Puspita et al. - Antibakteri Daun Sirih Merah ( Piper crocatum )
metode maserasi saja. Sedangkan ampisilin sebagai kontrol positif terbukti memiliki pengaruh terhadap aktivitas keempat bakteri uji. Akan tetapi ekstrak daun sirih merah tidak memiliki aktivitas terhadap bakteri uji S. aureus dan E.coli.
Penghambatan pertumbuhan bakteri B.  substilis dan P.  aeruginosa berdasarkan diameter zona bening yang terbentuk paling baik pada konsentrasi 100 mg/mL yaitu 1.12-1.32 mm ( B.substilis ) dan 1.03 mm ( P.aeruginosa ), sedangkan zona bening terkecil diameternya diperoleh dengan penggunaan 25 mg/mL konsentrasi sampel (Tabel 3).
30%, didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Marlina (2008) serta Alfarabi (2010) yang menyatakan bahwa pelarut air dan etanol meng- hasilkan senyawa aktif pada ekstrak daun sirih merah (Marlina, 2008; Alfarabi et al ., 2010). Selain itu, aturan Depkes 1981, bahwa untuk mengekstrak tanaman obat herbal digunakan etanol 30% yang paling baik, dan dalam peng- gunaan aplikasi obat herbal menurut Darusman et al . (2001), pelarut polar seperti etanol sering digunakan untuk pembuatan jamu dan obat- obatan fitofarmaka (Darusman et al. , 2001). Dari hasil yang diperoleh pada Ta- bel 1 menunjukkan bahwa nilai rendeman ek- strak daun sirih merah secara refluks lebih baik dibandingkan secara maserasi. Hasil yang diper- oleh pada penelitian ini lebih tinggi jika diband- ingkan dengan rendeman ekstrak daun sirih merah yang diperoleh pada penelitian Septiani (2017) dengan menggunakan pelarut etanol 70% yaitu hanya sebesar 10.10% dengan metode maserasi (Septiani 2017). Perbedaan nilai ren- demen menurut Azwanida (2015) dipengaruhi oleh jenis pelarut, rasio pelarut terhadap sam- pel, ukuran partikel sampel, waktu ekstraksi dan suhu ekstraksi (Azwanida 2015). Semakin kecil ukuran partikel sampel maka akan meningkat- kan luas permukaan antara sampel dan pelarut untuk terekstrak sempurna, sehingga akan mem- pengaruhi nilai rendemen.
Senyawa  fitokimia  merupakan  senya - wa metabolit sekunder yang termasuk dalam senyawa bioaktif dan mempunyai peranan penting dalam penelitian obat yang dihasilkan dari  tumbuh-tumbuhan.  Pengujian  senyawa  fi - tokimia dilakukan secara kualitatif dan perlu dilakukan untuk membuktikan senyawa metab- olit sekunder yang berperan sebagai antibakteri. Prinsip yang digunakan untuk mengekstrak sen- yawa pada tanaman obat adalah like dissolve
Bakteri Uji Konsentrasi (mg/mL) Zona Hambat (mm) Ekstrak maserasi Ekstrak refluks Ampisilin 0.1 mg/mL B.sub- stilis 25 0.89 0.79 1.55 50 1.03 0.94 75 1.09 1.24 100 1.12 1.32 S.aureus 25 - - 1.42 50 - - 75 - - 100 - - E.coli 25 - - 1.27 50 - - 75 - - + 100 - - P.aerugi- nosa 25 0.95 - 1.23 50 1.02 - - 75 0.95 - - 100 1.03 - -
Tabel 3. Aktivitas antibakteri ekstrak daun sirih merah terhadap bakteri uji

## 4. PEMBAHASAN
Ekstraksi daun sirih merah menggunakan dua metode, yaitu maserasi dan refluks. Perbe - daan keduanya adalah jika maserasi dilakukan dengan  teknik  perebusan,  sedangkan  refluks dengan menggunakan panas (Safithri dan Fah - ma 2008). Pelarut yang digunakan adalah etanol
Curr. Biochem. 2018. 5 (3): 1 - 10
like , artinya sifat kepolaran suatu senyawa akan menentukan pelarut yang digunakan untuk mengekstrak senyawa tersebut. Berdasarkan Tabel 2, menunjukkan bahwa ekstrak daun sirih merah mengandung senyawa alkaloid, steroid dan tanin yang ditunjukkan hasil positif pada uji fitokimia  dan  menunjukkan  hasil  negatif  pada senyawa flavonoid, saponin dan triterpenoid.
Hasil yang diperoleh pada penelitian ini terkait senyawa fitokimia sedikit berbeda den - gan penelitian yang dilakukan oleh Safithri dan Fahma (2008) serta Weni (2014) yang menya- takan bahwa ekstrak daun sirih merah mengand- ung senyawa flavonoid, alkaloid dan tanin pada ekstrak  kasar  70%  etanol  (Safithri  dan  Fahma 2008; Weni 2014). Penelitian ini menggunakan pelarut 30% etanol dan negatif terhadap flavo - noid. Menurut Pelezar dan Chan (1988) senyawa yang bersifat antimikroba antara lain alkohol, senyawa fenolik, klor, iodium, dan etilen oksida (Pelezar 1988). Flavonoid, senyawa fenolik, hi- drokuinon dan tanin termasuk golongan senya- wa fenol. Harborne (1987), dalam penelitiannya mengatakan  bahwa  flavonoid  adalah  senyawa yang dapat larut air dan berperan sebagai fak- tor pertahanan alam (Harborne 1987). Harborne juga mengungkapkan bahwa etanol 70% lebih baik dalam mengekstrak senyawa flavonoid. Se - hingga dapat dikatakan bahwa konsentrasi eta- nol 30% tidak cukup baik dalam mengekstrak senyawa flavonoid.
Hasil analisis pada Tabel 2 menunjuk- kan bahwa ekstrak daun sirih merah mengand- ung senyawa steroid. Senyawa steroid pada ta- naman terdapat pada lapisan malam (lilin) daun dan buah yang berfungsi sebagai pelindung dari serangga dan mikroba. Steroid menurut Zhu et al . (2000) dan Varricchio et  al. (1967) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif (Zhu et al ., 2001; Varricchio et al ., 1967).
Senyawa alkaloid juga terdapat pada ek- strak daun sirih merah. Alkaloid adalah senyawa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen yang terbentuk dan biasanya terdapat dalam bentuk gabungan sebagai bagian dari sistem siklik (Harborne 1987). Senyawa alkaloid dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif dengan mendorong terjadinya lisis sel dan perubahan morfologi bakteri (Karou 2006; Jouvenaz et al. , 1972)
Tanin juga berpotensi sebagai senyawa antibakteri. Tanin adalah senyawa polifenol yang dapat larut dalam air, gliserol, metanol, hidroalkoholik, propilena glikol tetapi tidak larut dalam benzena, kloroform, eter, petroleum eter dan karbondisulfida (Harborne 1987). Me - kanisme penghambatan senyawa tanin sebagai antibakteri dengan cara bereaksi dengan mem- bran sel, inaktivasi enzim-enzim esensial, dan destruksi atau inaktivasi fungsi material genetik (Brannen LA and PM 1993).
Penetuan aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode sumur. Metode ini dilakukan dengan membiarkan sampel meresap ke dalam media bakteri dan dibiarkan selama 18-24 jam dalam inkubator pada suhu 37 o C. Pengukuran zona bening sebagai bentuk dari aktivitas anti- bakteri dilakukan pada media pepton yeast glu- kosa (PYG). Media ini mengandung glukosa sebagai sumber karbon dalam jumlah yang ban- yak untuk pertumbuhan bakteri.
Berdasarkan hasil yang ditunjukkan pada Gambar 1, 2 dan Tabel 3 dinyatakan bahwa senyawa antibakteri yang ada pada ekstrak daun sirih merah mampu menghambat pertumbuhan B.substilis dan P.aeruginosa , tapi tidak mampu menghambat bakteri S.aureus dan E.coli . Ber- dasarkan tahapan terlihat adanya perbedaan di- ameter hambatan dari ekstrak etanol. Perbedaan besar kecil diameter hambatan ini dapat disebab-
Puspita et al. - Antibakteri Daun Sirih Merah ( Piper crocatum )
kan adanya perbedaan kecepatan ekstrak berdi- fusi ke medium agar. Faktor lain penyebab per- bedaan diameter hambatan dari ekstrak etanol tersebut adalah perbedaan konsentrasi senyawa aktif yang terdapat pada ekstrak tersebut baik ekstrak yang diperoleh secara maserasi maupun secara refluks. Prescot (2005), menyatakan bah - wa ukuran dari zona hambat dipengaruhi oleh kesensitifan dari organisme uji, medium kultur, kondisi inkubasi, kecepatan difusi dari senyawa antibakteri dan konsentrasi senyawa antibakteri (Prescott 2005).
Senyawa antibakteri yang kemungkinan berperan adalah alkaloid, steroid dan tannin dengan mekanisme yang berbeda-beda. Alka- loid menghambat aktivitas antibakteri melalui lisis sel (Karou 2006), sedangkan tannin dengan membentuk interaksi dengan membran sel bak- teri, inaktivasi enzim yang berperan pada regen- erasi bakteri dan destruksi atau inaktivasi fungsi material genetik bakteri (Brannen LA and PM 1993).
Hasil pada Tabel 3 menunjukkan bah- wa ekstrak secara maserasi dan refluks  memi - liki aktivitas penghambatan yang berbeda pada keempat jenis bakteri. Ekstrak daun sirih merah secara maserasi menghasilkan aktivitas yang lebih rendah dibandingkan ekstrak secara re- fluks  dlihat  dari  zona  hambat  yang  terbentuk pada bakteri B.substilis , akan tetapi ekstrak secara  refluks  tidak  memiliki  aktivitas  peng - hambatan terhadap bakteri P.aeruginosa seperti yang dimiliki oleh ekstrak secara maserasi. Hal ini diduga adanya mekanisme yang spesifik dari bakteri Gram negatif dan Gram positif dalam menghadapi kondisi tekanan serta dalam mem- pertahankan kelangsungan hidupnya.
Konsentrasi senyawa antibakteri yang diberikan berbeda-beda dari konsentasi 25, 50,
75 dan 100 mg/mL. Setiap konsentrasi juga memberikan aktivitas yang berbeda-beda. Ber- dasarkan Tabel 3 menunjukkan bahwa aktivitas terbesar diperoleh dari konsentrasi ekstrak 100 mg/mL meskipun aktivitasnya masih dikatakan lemah yaitu dibawah 5 mm. Semakin tinggi kon- sentrasi ekstrak, maka aktivitas penghambatan suatu senyawa akan semakin tinggi, dikare- nakan konsentrasi senyawa aktif yang berperan sebagai antibakteri juga mengalami peningka- tan atau semakin besar.  Hal ini sesuai dengan pernyataan Hartman (1968) yang menyatakan bahwa diameter zona hambat sebanding dengan konsentrasi (Hartman, 1968).
Gambar 1 dan 2 menunjukkan perbe- daan aktivitas ekstrak secara maserasi dan se- cara  refluks.  Gambar  1  menunjukkan  bahwa ekstrak daun sirih merah dapat menghambat pertumbuhan bakteri P.aeruginosa dan B.substi- lis . Berdasarkan zona yang terbentuk, aktivitas penghambatan ekstrak maserasi lebih efektif dalam menghambat bakteri Gram positif yaitu B.substilis . Sedangkan pada Gambar 2 ekstrak refluks  daun  sirih  merah  hanya  memiliki  ak - tivitas penghambatan hanya terhadap bakteri P.aeruginosa . Sehingga dapat dikatakan bahwa ekstrak refluks juga efektif dalam menghambat bakteri Gram positif.
Berdasarkan besarnya diamter zona hambat antara B.substilis dan P.aeruginosa disebabkan karena perbedaan struktur mem- bran sel pada kedua jenis bakteri ini. B.substilis merupakan bakteri Gram positif yang memili- ki struktur membran relatif sederhana sehingga memudahkan senyawa aktif untuk masuk dan menginfeksi sel bakteri. Sedangkan pada bak- teri Gram negatif, struktur membrannya tebal dan berlapis-lapis, terdiri dari lipoprotein, lipo- polisakarida, dan peptidoglikan (Pelezar 1988).
Curr. Biochem. 2018. 5 (3): 1 - 10
Membran terluar bakteri Gram negatif dapat menghalangi penembusan senyawa antibakteri (Siswandono 1995). Kondisi ini menyebabkan sulitnya senyawa antibakteri untuk dapat masuk ke dalam sel.
Kekuatan senyawa antibakteri ekstrak daun sirih merah berdarkan hasil yang ditunjuk- kan pada Tabel 3 tergolong lemah, karena diam- eter zona yang terbentuk < 5 mm baik ekstrak maupun standar ampisilin 0.1 mg/mL. Menurut Suryawiria (1978), berdasarkan metode Davis Stout, suatu ekstrak dikatakan sangat kuat apa- bila daerah hambat 20 mm atau lebih, dikatakan kuat apabila daerah hambat 10 – 20 mm, dika- takan sedang apabila daerah hambat 5 – 10 mm dan dikatakan lemah apabila daerah hambat < 5 mm (Suryawiria 1978). Penggunaan ampisi- lin sebagai standar sesuai dengan pernyataan Siswandono dan Soekarjo (1995) bahwa ampis- ilin memiliki spektrum luas, yaitu dapat meng- hambat pertumbuhan bakteri Gram negatif dan Gram positif (Siswandono 1995).
Dari hasil yang diperoleh pada peneli- tian ini, dapat disimpulkan bahwa ekstrak daun sirih merah dengan menggunakan pelarut etanol 30% menghasilkan rendeman 26.25% dengan kandungan fitokimia yaitu berupa alkaloid, ste - roid dan tanin. Ekstrak daun sirih merah ( Piper crocatum ) terbukti dapat menghambat pertum- buhan bakteri B.substilis dan P.aeruginosa teta- pi aktivitasnya lemah baik pada ekstrak maupun pada standar ampisilin yang ditunjukkan dengan zona hambat < 5mm.

## 5. UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Mega Safithri, M.Si atas dorongan dan bimbingannya, serta semua pihak yang membantu dalam penelitian ini.

## 6. DAFTAR PUSTAKA
Alfarabi,  M.,  Bintang,  M.,  Suryani  &Safithri,  M. 2010. The Comparative Ability of Antiox- idant Activity of Piper crocatum in Inhibit- ing Fatty Acid Oxidation and Free Radical Scavenging. HAYATI Journal of Biosciences 17(4): 201-204.
Astuti, P., Wahyono &Nababan, O. A. 2014. Antimi- crobial and cytotoxic activities of endophyt- ic fungi isolated from Piper crocatum Ruiz & Pav. Asian  Pacific  Journal  of  Tropical Biomedicine 4: S592-S596.
Azwanida, N. 2015. A review on the extraction methods use in medicinal plants, principle, strength, and limitation. Medicinal and Aro- matic Plants 4: 196.
Bintang, M. 1993.Studi antimikroba dari Strepto- coccus lactis BCC2259. Vol. DoctorBand- ung: Institut Teknologi Bandung.
Brannen LA &PM, D. 1993. Antimicrobials in Foods . New York: Marcel Dekker.
Darusman LK, Rohaeti E &Sulistiyani. 2001.Kaji- an  senyawa  golongan  flavonoid  asal  tana - man bangle sebagai senyawa peluruh lemak melalui aktivitas lipase Vol. Laporan Peneli- tian Bogor: Pusat Studi Biofarmaka Lemba- ga Penelitian, IPB.
Harborne, H. 1987. Metode  Fitokimia. Bandung: ITB.
Hartman, P. 1968. Miniaturized Microbiological Methods . New York: Academic Pr.
Jouvenaz, D. P., Blum, M. S. &MacConnell, J. G. 1972. Antibacterial activity of venom alka- loids from the imported fire ant, Solenopsis invicta Buren. Antimicrobial agents and che- motherapy 2(4): 291-293.
Karou D, A. S., Antonella C, Saydou Y, Carla M, Jacques S, Vittorio C, Alfred ST. 2006. Anti- bacterial activity of alkaloids from Sida acu- ta. African  Journal  of  Biotechnology 5(2): 195-299.
Lestari ABS, D. Y. 2014. Aktivitas antioksidan ek- strak daun sirih merah (Piper crocatum) hasil optimasi pelarut etanol-air. Ilmu Kefarma- sian Indonesia 12(1): 75-79.

## Puspita et al. - Antibakteri Daun Sirih Merah ( Piper crocatum )
Marlina,  P.  2008.Konsentrasi  flavonoid  dan  lethal concentration 50 (LC50) ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum). In Biokimia, Vol. SarjanaBogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Pelezar MJ, C. E. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi . Jakarta: UI Pr.
Prescott, L. 2005. Microbiology . New York: Mc.
Grow-Hill.
Safithri, M. 2004. Aktivitas antibakteri bawang pu - tih (Allium sativum) terhadap bakteri masti- tis subklinis secara in vitro dan in vivo pada ambing tikus putih (Rattus novergicus). In Kimia, Vol. Graduate Bogor: Sekolah Pas- casarjana, IPB.
Safithri,  M.  2011.  Mekanisme  antihiperglikemik minuman fungsional campuran sirih merah (Piper crocatum) dan kayu manis (Cinnamo- mum burmannii Blume). Vol. Doctor  Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Safithri, M, Fahma, F. 2008. Potency of Piper cro - catum Decoction as an Antihiperglycemia in Rat Strain Sprague dawley. HAYATI Journal of Biosciences 15(1): 45-48.
Safithri,  M., Yasni,  S.,  Bintang,  M.  &Setiadi  Ran - ti, A. 2012. Toxicity Study of Antidiabetics Functional Drink of Piper crocatum and Cin- namomum burmannii.
Septiani, R. 2017. Ekstrak dan fraksi daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) se- bagai antioksidan dengan metode 2,2-dife- nil-1-pikrilhidrazil. In Biokimia, Vol. Sarja- na Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Siswandono, S. B. 1995. Kimia Medisinal. Suraba- ya: Airlangga Universitas Pr.
Suryawiria, U. 1978. Mikroba Lingkungan. Band- ung: ITB Pr.
Varricchio, F., Dorrenbos, N. J. &Stevens, A. 1967.
Effect of azasteroids on gram-positive bacte- ria. Journal of bacteriology 93(2): 627-635.
Weni, M. 2014. Aktivitas penghambatan ekstrak sirih merah (Piper crocatum) terhadap pem- bentukan malondialdehida (MDA) dan en- zim tirosinase In Biokimia, Vol. Bachelor- Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Zhu, Y., Zhu, Q. X. &Jia, Z. J. 2001. Epoxide Sesqui-
terpenes and Steroids from Cremanthodium dis- coideum. Australian  Journal  of  Chemistry 53(10): 831-834.