p–ISSN: 2723 - 6609  e-ISSN : 2745-5254 Vol. 4, No. 4, April 2023 http://jist.publikasiindonesia.id/
Konstruksi Pustaka Metagenom Prokariot Dari Permukaan Eucheuma Cottonii Untuk Mencari Gen Penyandi

## Κ-Karaginase
Zahrotun Nafisah 1* , Afaf Baktir 2 , Zimon Pereiz 3 Universitas Palangka Raya Kalimantan, Indonesia 1,3
Universitas Airlangga Surabaya, Indonesia 2
Email: nafisah@chem.upr.ac.id
*Correspondence INFO ARTIKEL ABSTRAK Diterima  : 27-04-2023 Direvisi : 29-04-2023 Disetujui  : 30-04-2023 κ-Karaginan  adalah  koloid  hidrofilik  yang  diekstrak  dari  makroalga Eucheuma cottonii. κ-karaginan mempunyai berat molekul yang sangat besar  sehingga  pemanfaatannya  terbatas.  Namun,  dalam  bentuk Carrageenan Oligosaccharide (COs), κ-karaginan mempunyai aktivitas fisik dan biologi yang bervariasi, termasuk anti tumor, anti oksidan dan anti angiogenik. Enzim κ-karaginase  berperan  memutus ikatan β-(1,4) pada  κ-karaginan  untuk  menghasilkan  κ-COs  (κ-carrageenan oligosaccharide).  Ada  berbagai  macam  bakteri  yang  hidup  di permukaan  Eucheuma  cottonii,  namun  hanya  ada  1%  bakteri  yang dapat  dikultur.  Metode  alternatif  untuk  eksplorasi  bakteri  di  alam adalah metode metagenomik. Dalam penelitian ini dilakukan eksplorasi gen  κ-karaginase  dari  DNA  metagenom  prokariot  yang  menempel  di permukaan  Eucheuma  cottonii.  Konstruksi  pustaka  metagenom prokariot  dilakukan  terhadap  kumpulan  fragmen  DNA  hasil  digesti dengan  enzim  restriksi  SfiI.  Kemudian  fragmen  DNA  diligasi  dengan fag λTriplEx2 dan dilakukan penentuan titer. Titer tertinggi didapatkan dari  campuran  ligasi  dengan  perbandingan  DNA  dan  fag  yaitu  3:2 sebesar 10,3 x 107. Kemudian plak positif diekspresikan melalui E.coli BM25,8  untuk  mencari  gen  penyandi  enzim  κ-karaginase.  Aktivitas positif  enzim  κ-karaginase  ditandai  dengan  terbentuknya  daerah  halo.
Kemudian  klon  rekombinan  yang  membentuk  halo  dikultivasi  untuk produksi enzim κ-karaginase, dan diuji aktivitasnya untuk menentukan suhu  dan  pH  optimum.  Berdasarkan  uji  aktivitas  ekstrak  κ-karaginase terhadap suhu dan pH didapatkan 4 profil suhu dan pH optimum yang berbeda,  dengan  demikian  telah  didapatkan  4  macam  gen  penyandi enzim κ-karaginase.

## ABSTRACT
κ-Carrageenan  is  a hydrophilic  colloid  extracted  from  the  macroalga Eucheuma cottonii. κ-carageenan has a very large molecular weight so its  utilization  is  limited.  However,  in  the  form  of  Carrageenan Oligosaccharide  (COs),  κ-carrageenan  has  varied  physical  and biological  activities,  including  anti-tumor,  anti-oxidant  and  anti- angiogenic.  The  enzyme  κ-carrageinase  breaks  the  β-(1,4)  bond  in  κ- carrageenan  to  produce  κ-COs  (κ-carrageenan  oligosaccharide).
There  is  a  wide  variety of  bacteria  living  on  the  surface  of  Eucheuma cottonii,  but  only  1%  of  bacteria  can  be  cultured.  An  alternative method  for  the  exploration  of  bacteria  in  nature  is  the  metagenomic method. In this study, the κ-carcinase gene was explored from the DNA of  the  prokaryotic  metagenome  attached  to  the  surface  of  Eucheuma cottonii.  Construction  of  prokaryotic  metagenome  library  was performed  on  a  collection  of  DNA  fragments  digested  with  SfiI restriction  enzyme.  Then,  the  DNA  fragments  were  ligated  with
Kata kunci : κ-karaginase;
Eucheuma
cottonii;
metagenomik.
Keywords: κ-caraginas;, Eucheuma cottonii; metagenomics.
λTriplEx2  phage  and  the  titer  was  determined.  The  highest  titer  was obtained from the ligation mixture with a DNA and phage ratio of 3:2 of  10.3  x  107.  Then  the  positive  plaque  was  expressed  through  E.coli
BM25.8  to  find  the  gene  encoding  κ-carcinase  enzyme.  The  positive activity  of  κ-carcinase  enzyme  was  characterized  by  the  formation  of halo  region.  Then  the  recombinant  clone  that  formed  the  halo  was cultivated  for  κ-caraginase  enzyme  production, and  tested  for  activity to  determine  the  optimum  temperature  and  pH.  Based  on  the  activity test  of  κ-caraginase  extract  against  temperature  and  pH,  4  different optimum  temperature  and  pH  profiles  were  obtained,  thus  4  kinds  of genes encoding κ-caraginase enzyme have been obtained.

## Attribution-ShareAlike 4.0 International

## Pendahuluan
Eucheuma  cottonii merupakan  salah  satu  Carragaenaphyces,  yaitu  makroalga penghasil  karaginan.  Kadar  karaginan  dalam  setiap  spesies  Eucheuma  berkisar  antara 54%  73%  tergantung  pada  jenis  dan  lokasinya  (Wibowo,  2013).  Di  Indonesia  kadar karaginan makroalga jenis Eucheuma berkisar antara 61,5 % - 67,5 %.
Karaginan  adalah  polimer  galaktosa  sulfat  rantai  lurus  yang  diekstrak  dari Eucheuma  cottonii  dan  merupakan  sumber  karbon  penting  bagi  mikrobiota  perairan heterotropik (Prabha, Vasuki, KayalVizhi, & Manikandan, 2018). Karaginan merupakan koloid  hidrofilik,  substansi  yang  bila  berinteraksi  dengan  air  akan  membentuk  sistem koloid  (Chauhan  &  Saxena,  2016).  Koloid  hidrofilik  sangat  penting  karena  keunikan susunan fisik dan kimianya sehingga banyak digunakan di berbagai bidang bioteknologi industri (Xiao et al., 2016).
Akibat ukuran molekul κ-karaginan yang besar dan kemampuannya yang rendah dalam  menembus  jaringan  menyebabkan  aplikasinya  terbatasi.  Dalam  bentuk oligosakaridanya  yaitu  Carrageeenan  Oligosaccharides  (COs),  mempunyai  aktivitas fisik  dan  biologi  yang  bervariasi,  termasuk  anti  tumor,  anti  oksidan,  dan  anti angiogenik.  Dibandingkan  dengan  ι-  dan  λ-COs,  κ-COs  mempunyai  aktivitas antioksidan yang paling tinggi (Zhu, Ni, Ning, Yao, & Du, 2018). Enzim κ- karaginase berperan  dalam  memutus  ikatan  β-(1-4)  pada  κ-karaginan  untuk  menghasilkan  κ-COs (Chauhan & Saxena, 2016).
Pada  2017,  Kawaroe  menjelaskan  bahwa  banyak  mikrobiota  yang  dapat mendegradasi  dinding  sel  makroalga.  Namun  selama  ini  hanya  ada  1%  dari  jumlah keseluruhan  bakteri  yang  dapat  dikultur  (cultivable)  di  dalam  laboraturium. Metagenomik  digunakan  untuk  isolasi  DNA  total  bakteri  dari  sampel  alam.  Sehingga dapat  mengetahui  karakter  bakteri  dan  kelimpahannya,  serta  ekspresi  gen  bakteri uncultivable  dapat  dilakukan  (Nam  et  al.,  2018).  Efisiensi  hasil  konstruksi  pustaka metagenom dinyatakan dalam titering. Titering dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti efisiensi ligasi, digesti dan transformasi. Keberhasilan konstruksi pustaka metagenomik apabila jumlah titer di atas standar minimal yaitu 1,7 x 105 (Fitriyah, 2017).
Dalam penelitian ini akan dilakukan eksplorasi gen penyandi enzim κ- karaginase yang  didapat  dari  isolasi  DNA  metagenom  prokariotik  dari  sampel  permukaan
Eucheuma  cottonii.  Kelebihan  dan  keuntungan  Eucheuma  cottonii  merupakan  sumber κ-karaginan  yang  melimpah  sehingga  diharapkan  bakteri  yang  terdapat  gen  penyandi enzim κ- karaginase ada di sana (Kawaroe, Pratiwi, & Sunudin, 2017).

## Metode Penelitian

## Isolasi DNA Metagenom Prokariot
Sampel DNA metagenom berupa makroalga Eucheuma cottonii yang diambil dari laut Madura. Untuk mendapatkan sampel prokariot maka dilakkan penyaringan dengan membran  berukuran  3µm  dan  diambil  supernatan  yang  lolos,  kemudian  disaring  lagi menggunakan membran berukuran 0,2µm dan membran disuspensi dengan PBS. Isolasi DNA  metagenom  menggunakan  TIANamp  Bacterial  DNA  Kit.  Hasil  isolasi  DNA metagenom prokariot divisualisasi dengan elektroforesis DNA.

## Konstruksi Pustaka Metagenom
DNA metagenom hasil isolasi dilakukan digesti dengan enzim restriksi SfiI untuk mendapatkan  fragmen  DNA.  Proses  digesti  dilakukan  pada  suhu  50°C  dan  diinkubasi selama  1,  2  dan  3  jam.  Fragmen  DNA  yang  diambil  adalah  fragmen  DNA  dengan ukuran  2-10  kB.  Fragmen  DNA  tersebut  kemudian  diligasi  dengan  vektor  bakteriofag λTriplEx2. Dilakukan optimasi komposisi campuran antara fragmen DNA metagenom dan vektor untuk mendapatkan nilai titer yang tinggi. Komposisi campuran ligasi  yang digunakan  antara  DNA  dan  vektor  adalah  1:2,  1:1  dan  3:2.  Kemudian  dilakukan packaging  in  vitro  untuk  mendapatkan  fag  utuh.  Tranduksi  dilakukan  ke  dalam  inang E.coli  XL-1Blue.  Blue-white  screening  dalam  media  yang  mengandung  MgSO4 digunakan untuk memastikan adanya DNA insert dalam vektor.

## Seleksi Klon Rekombinan dengan Aktivitas κ-Karaginase
24 plak putih dari analisis Blue-white screening diambil untuk ditransduksikan ke dalam E.coli BM25,8 untuk dilakukan untuk menemukan aktivitas κ-karaginase. Media yang  digunakan  adalah  media  LB  padat  yang  mengandung  0,5%  κ-karaginan,  0,05% (NH4)2SO4 dan 0,001% FeCl3.

## Karakterisasi Ekstrak κ-Karaginase
Klon  rekombinan  yang  menghasilkan  daerah  halo  dilakukan  kultivasi  untuk produksi  enzim  κ-karaginase.  Kultivasi  dilakukan  dengan  melakukan  shaking  pada media  LB  cair  dengan  kecepatan  200  rpm  dan  suhu  31°C  sampai  nilai  OD600  adalah 2,1.  Kemudian  hasil  inokulasi  diambil  200  µl  untuk  dipindahkan  di  media  produksi berupa LB cair yang mengundung 0,1% κ- karaginan, 0,05% (NH4)2SO4 dan 0,001% FeCl3.  Shaking  dilakukan  selama  12  jam  untuk  kemudian  ditambahkan  IPTG  sebesar 1%. Lalu dilakukan shaking lanjutan selama 6 jam. Hasil produksi disentrifugasi dengan kecepatan  2.000  rpm  selama  10  menit  untuk  mendapatkan  pellet  sel.  Pellet  sel disuspensi dengan PBS dan dilakukan sonikasi selama 10 menit. Ekstrak κ- karaginase diuji aktivitasnya dengan metode DNS pada suhu 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 dan 80°C. Selain  itu  juga  diuji  aktivitasnya  pada  pH  4,  5,  6,  7,  8  dan  9.  Buffer  yang  digunakan untuk  pH  4-7  adalah  buffer  fosfat  sitrat,  sedangkan  pH  8-9  menggunakan  buffer  Tris- HCl.

## Hasil dan Pembahasan Isolasi DNA Metagenom Prokariot
Penyaringan  dengan  membran  ukuran  3µm  dan  0,2µm  berfungai  untuk mendapatkan sampel prkariot karena ukuran prokariot berkisar antara 0,2 sampai 3µm. Setelah  didapatkan  suspensi  bakteri  dalam  buffer  PBS,  dilakukan  pegukuran  nilai OD600  untuk  memperkirakan  jumlah  sel  bakteri.  Nilai  absorbansi  didapatkan  sebesar 0,0989. Syarat jumlah sel bakteri yang direkomendasikan kit adalah absorbansi 0,001 – 0,125. Hasil isolasi DNA metagenom divisualisasi dengan elektroforesis DNA (Gambar 1).
Metagenom hasil isolasi. Lane 1 dan 2 berturut-turut adalah DNA metagenom dari hasil elusi pertama dan kedua

## Gambar 1. Visualisasi DNA
1                      2

## Konstruksi Pustaka Metagenom
Hasil  isolasi  DNA  metagenom  didigesti  dengan  enzim  SfiI.  Visualisasi  tiga variasi  waktu  dapat  dilihat  pada  Gambar  2.  Enzim  SfiI  dipilih  karena  memiliki kemampuan  restriksi  8  pasang  basa  spesifik  dan  bersifat  jarang  memotong  sehingga mencegah  terjadinya  kemungkinan  pemotongan  gen  target  secara  internal.  Inkubasi dilakukan pada suhu optimum enzim SfiI yaitu 50°C. Berdasarkan hasil digesti tersebut, DNA  dengan  ukuran  2  kB  –  10  kB  diambil  untuk  disisipkan  pada  vektor  λtriplEx2. Pemilihan panjang 2 kB – 10 kB berdasarkan kemampuan fag dalam menampung insert sampai 13 kB (Zelvi, Suryani, & Setyaningsih, 2017).
Kemudian  fragmen  DNA  metagenom  yang  didapatkan  diligasi  dengan  vektor λTriplEx2.  Untuk  tujuan  optimalisasi  ligasi,  dilakukan  3  variasi  ligasi  dengan perbandingan  DNA  dan  vektor  berturut-  turut  1:2,  1:1  dan  3:2.  Selain  itu  juga  dibuat kontrol positif menggunakan DNA insert dari Kit SMART library construction kit dan kontrol negatif berupa E.coli tanpa insert (Gambar 3). Dari kedua kontrol tersebut dapat
dibedakan bentuk plak dan koloni bakteri E.coli. Plak berwarna putih dan warna putih akan semakin jelas seiring berjalannya hari, sedangkan koloni E.coli diameternya akan bertambah seiring berjalannya hari.
Produk  ligasi  perlu  dilakukan  packaging  menjadi  bakteriofag  utuh.  Produk packaging  diencerkan  1  :  1.000.000  yang  bertujuan  agar  plak  yang  dihasilkan  tidak tumpang tindih atau menyatu sehingga memudahkan proses seleksi.

## 1                2                 3             4                5

## Gambar 2.
Elektroforesis  fragmen  DNA  metagenom  prokariot  hasil  digesti  dengan  enzim restriksi SfiI A&B. Lane 1 : marker restriksi λ/HindIII. Lane 2, 3, 4 dan 5 adalah waktu inkubasi proses digesti berturut-turut 0, 1, 2, dan 3 jam

## 1                                                      2

## Gambar 3.
Kontrol  positif  dan  negatif  untuk  analisis  blue-White  Screening.  A  :  kontrol positif  berupa  bakteri  E.coli  XL-1Blue  yang  disisipi  DNA  insert  dari  Kit  yang
ditumbuhkan  pada  media  LB/MgSO4  dengan  IPTG  dan  X-Gal.  B  :  kontrol  negatif berupa bakteri E.coli XL-1Blue yang ditumbuhkan pada media LB/MgSO4.
Untuk  mengetahui  inang  manakah  yang  membawa  fag  dengan  insert  dan  tanpa insert,  dilakukan  seleksi  dengan  metode  blue-white  screening  karena  fag  λTriplEx2 mengkode sintesis enzim β-galaktosidase (Buwono, 2017). Enzim β-galaktosidase akan memecah  substrat  laktosa  atau  5-bromo-4-kloro-3-  indolilbeta-D-galaktopiranosid  (X- gal).  Zat  warna  biru  akan  dilepas  pada  proses  hidrolisis  X-gal  oleh  β-galaktosidase menjadi  galaktosa  dan  5.5’-dibromo-4.4’-  dikloro-indigo.  Dalam  pengamatannya  akan terbentuk plak berwarna biru. Sedangkan fag dengan insert tidak akan dapat mengkode enzim β-galaktosidase sehingga akan tampak plak berwarna putih.

## A                                                    B

## C

## Gambar 4
Hasil  ligasi  pada  3  macam  campuran  ligasi.  A,  B  dan  C  berturut-turut  adalah perbandingan jumlah DNA metagenom dan fag 1:2, 1:1 dan 2:3
Untuk mengetahui efisiensi ligasi, dilakukan penghitungan titer. Dihitung jumlah plak  yang  terbentuk  pada  setiap  komposisi  campuran  ligasi  (Gambar  4).  Hasil perhitungan titer pada setiap komposisi campuran ligasi ada pada Tabel 1.

## Tabel 1.

## Hasil perhitungan titering 3 macam komposisi campuran ligasi
Campuran Ligasi Perbandingan DNA dan fag Titer (pfu/mL)*
I 1 : 2 192 𝑥 1.000.000 𝑥 103 = 9,6 x 107 2.000 II 1 : 1 107 𝑥 1.000.000 𝑥 103 = 5,35 x 107 2.000 III 3 : 2 206 𝑥 1.000.000 𝑥 103 = 10,3 x 107 2.000
*pfu/mL = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑝𝑙𝑎𝑘 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑥 10 3

## 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑖𝑛𝑔
Seleksi Klon  Rekombinan  dengan Aktivitas κ-Karaginase
Dipilih  24  fag  yang  diambil  dari  hasil blue-white  screening  dan  ditransduksikan ke  E.coli  BM25.8.  E.coli  BM25.8  rekombinan  akan  dilakukan  streak  pada  media  LB yang  telah  ditambahkan  substrat  berupa  κ-karaginan.  Enzim  κ-karaginase  akan memotong polimer κ-karaginan menjadi κ-COS. Aktivitas κ-karaginase ditandai dengan adanya daerah halo yang terbentuk (Gambar 5).

## Gambar 5
Hasil screening menggunakan substrak κ-karaginase dengan pewarnaan congo red 1%.  Panah  hitam  menunjukkan  koloni  dengan  daerah  halo  sedangkan  panah  putih menunjukkan koloni tanpa daerah halo. A merupakan koloni yang memiliki daerah halo sedangkan B adalah koloni tanpa daerah halo

## Karakterisasi Ekstrak κ-Karaginase
Karakterisasi  ekstrak  κ-karaginase  ditentukan  berdasarkan  aktivitas  ekstrak  κ- karaginase  terhadap  suhu  dan  pH.  Ekstrak  κ-karaginase  didapat  dari  koloni  yang mengandung  gen  penyandi  enzim  κ-  karaginase  yang  menghasilkan  daerah  halo.

## B
12 0 100 80 60 40 20 0 20 40 60 80 100 12 0 100 80 60 40 20 0 20 40 60 80 100
Diambil  4  koloni  dengan  daerah  halo  untuk  mengamati  perbedaan  karakteristiknya. Selanjutnya, masing-masing ekstrak κ- karaginase diberi nama ekstrak κ- karaginase A, B, C dan D.
Aktivitas  enzim  didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang  digunakan  untuk membebaskan  1µmol  gula  pereduksi.  Pada  setiap  pengukuran  aktivitas  ekstrak  κ- karaginase  digunakan  kontrol  berupa  ekstrak  κ-karaginase  yang  sudah  didenaturasi untuk menghitung adanya gula pereduksi yang masih tersisa pada ekstrak κ-karaginase. Aktivitas  diukur  pada  rentang  suhu  antara  10-80°C.  Profil  masing-masing  aktivitas relatif dari keempat ekstrak κ-karaginase dapat dilihat pada Gambar 6.

## Gambar 6

## Grafik profil suhu optimum ekstrak κ-karaginase dari klon A, B, C dan D

## A                                                                                B
Aktivitas relatif (%)                                                               Aktivitas relatif (%)
Suhu (°C) Suhu (°C)

## C
Aktivitas relatif (%)                                                                 Aktivitas relatif (%) Suhu (°C)                                                                                  Suhu (°C)
Aktivitas  ekstrak  κ-karaginase  A  mengalami  kenaikan  pada  rentang  suhu  10- 40°C.  Namun  pada  suhu  50°C  sampai  80°C  terjadi  penurunan.  Hal  ini  tidak  jauh
120 100 80 60 40 20 0 20
40 60 80 100
15 0 100 50 0 0 5 10 150 100 50 0 0 5 10 150 100 50 0 0 5 10
berbeda dengan ekstrak κ-karaginase B dan C  yang profilnya mirip dengan ekstrak κ- karaginase A. Sedangkan pada ekstrak κ- karaginase D, aktivitas cenderung stabil pada suhu rendah dan mengalami kenaikan yang signifikan pada suhu 40°C serta penurunan pada tingkat suhu yang lebih tinggi. Namun, aktivitas ekstrak κ- karaginase D pada suhu 50°C  masih  mempunyai  aktivitas  di  atas  80%  sehingga  bisa  dikategorikan  sebagai enzim  thermostabil.  Keempat  profil  suhu  optimum  ekstrak  κ-karaginase  tersebut menunjukkan pada suhu 40°C.
Sedangkan aktivitas ekstrak κ- karaginase terhadap pH diukur pada pH 4, 5, 6, 7, 8  dan  9.  pH  4-7  menggunakan  buffer  sitrat-fosfat,  sedangkan  pH  8-9  menggunakan buffer Tris HCl. Aktivitas relatif ekstrak κ-karaginase dalam berbagai variasi pH dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7.

## Grafik profil pH optimum ekstrak κ-karaginase dari klon A, B, C dan D

## A                                                                                        B
Aktivitas relatif (%)                                                                                 Aktivitas relatif (%) Ph                                                                                                              pH

## C                                                                                        D
Aktivitas relatif (%)                                                                         Aktivitas relatif (%) pH                                                                                                      pH
Ekstrak  κ-karaginase  A  dan  D  mempunyai  aktivitas  optimum  pada  pH  8, sedangkan ekstrak enzim κ-karaginase B dan C mempunyai aktivitas optimum pada pH 7. Keempat aktivitas ekstrak κ- karaginase cenderung mengalami kenaikan mulai pH 4 sampai pH 7. Suhu optimum keempat ekstrak karaginase adalah 40°C. pH optimum 2
ekstrak  κ-karaginase  adalah  7,  sedangkan  2  ekstrak  κ-karaginase  yang  lain  adalah  8. Walaupun demikian, diketahui bahwa masing-masing ekstrak κ-karaginase mempunyai profil  yang  berbeda.  Berdasarkan  hal  tersebut,  keempat  ekstrak  κ-karaginase  berasal dari gen yang berbeda.

## Kesimpulan
Pustaka  metagenom  prokariot  yang  menempel  pada  permukaan  Eucheuma cottonii  memberikan  nilai  titer  10,3  x  107,  tergolong  pustaka  metagenom  dengan  titer tinggi  (high  titer).  Dari  pustaka  metagenom  yang  ada  didapatkan  4  klon  rekombinan yang  menunjukkan  aktivitas  κ-karaginase  dengan  profil  suhu  dan  pH  optimum  yang berbeda-beda.
Penelitian  selanjutnya  disarankan  untuk  dilakukan  analisis  SDS-PAGE  dan zimogram  untuk  memperkirakan  berat  molekul  enzim  κ-karaginase.  Selain  itu  perlu dilakukan isolasi plasmid rekombinan dan sekuensing gen untuk mengetahui urutan gen penyandi  enzim  κ-karaginase.  Eksplorasi  lebih  lanjut  dari  pustaka  metagenom  yang telah didapat untuk mendapatkan gen-gen penyandi  enzim yang lain.

## Bibliografi
Buwono,  Ibnu  Dwi.  (2017). Buku  Ajar  Aplikasi  Teknologi  DNA  Rekombinan  untuk Perakitan Konstruksi Vektor Ekspresi Ikan Lele Transgenik . Deepublish.
Chauhan,  Prakram  Singh,  &  Saxena,  Arunika.  (2016).  Bacterial  carrageenases:  an overview of production and biotechnological applications. 3 Biotech , 6 (2), 146.
Fitriyah,  Umaya  Rizka.  (2017). Isolasi  dan  identifikasi  molekuler  bakteri  endofit  akar mangrove Sonneratia alba penghasil enzim gelatinase . Universitas Brawijaya.
Kawaroe, M., Pratiwi, I., & Sunudin, A. (2017). Isolation and characterization of marine bacteria  from  macroalgae  Gracilaria  salicornia  and  Gelidium  latifolium  on agarolitic  activity  for  bioethanol  production. IOP  Conference  Series:  Earth  and Environmental Science , 65 (1), 12025. IOP Publishing.
Nam,  Bo  Hye,  Jang,  Jisung,  Caetano-Anolles,  Kelsey,  Kim,  Young  Ok,  Park,  Jung Youn,  Sohn,  Hawsun,  Yoon,  Sook  Hee,  Kim,  Heebal,  &  Kwak,  Woori.  (2018). Microbial  community  and  functions  associated  with  digestion  of  algal polysaccharides  in  the  visceral  tract  of  Haliotis  discus  hannai:  Insights  from metagenome and metatranscriptome analysis. Plos One , 13 (10), e0205594.
Prabha,  D.  R.  A.  Lakshmi,  Vasuki,  A.,  KayalVizhi,  R.,  &  Manikandan,  T.  (2018). Identification  of  Endophytic  Bacteria  From  Murraya  koenigii  And  Their  L- Asparaginase Activity .
Wibowo,  Pascalis  Danny  Kristi.  (2013). Variasi  Karaginan  (Eucheuma  cottonii  Doty) pada Proses  Pembuatan Bakso Daging Sapi  dengan Bahan Pengawet  Tanin  dari Pisang Kluthuk . UAJY.
Xiao, Anfeng, Xu, Caiyun, Lin, Yan, Ni, Hui, Zhu, Yanbing, & Cai, Huinong.  (2016). Preparation and characterization of κ-carrageenase immobilized onto magnetic iron oxide nanoparticles. Electronic Journal of Biotechnology , 19 , 1–7.
Zelvi,  Mustika,  Suryani,  Ani,  &  Setyaningsih,  Dwi.  (2017).  Hidrolisis  Eucheuma cottonii  Dengan  Enzim  K-Karagenase  Dalam  Menghasilkan  Gula  Reduksi  Untuk Produksi Bioetanol. Jurnal Teknologi Industri Pertanian , 27 (1).
Zhu, Benwei, Ni, Fang, Ning, Limin, Yao, Zhong, & Du, Yuguang. (2018). Cloning and biochemical characterization of a novel κ-carrageenase from newly isolated marine bacterium  Pedobacter  hainanensis  NJ-02. International  Journal  of  Biological Macromolecules , 108 , 1331–1338. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.11.040