Identifikasi Senyawa Aktif Ekstrak Daun Tembakau (Nicotiana tabacum L.) sebagai Antibakteri Terhadap Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
Anis Uswatun Khasanah 1  , Sri Juni Nastiti 2
1 Fakultas Sains UIN Sultan Maulana Hasanuddin Banten
2 Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada

## Abstract
Tobacco leaf contains bioactive compounds as antibacterial. Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium causing several infection diseases. The purpose of this study was to identify the active compounds group that have antibacterial against and determine the optimum concentration which was able to inhibit S. aureus  ATCC 25923 activities in tobacco leaf extract. The assay of inhibitory activity of tobacco leaf extract was carried out qualitatively using diffusion disc method at various concentration of tobacco leaf extract; 40, 50, 60, 70, 80, 90, and 100%. Gradual maceration (M2) and total maceration were used to perform the extraction process, using methanol 70% and etanol 96% as  the  solvent.  Thin  Layer  Chromatografi  (TLC)  assay  were  carried  out  to  identify  the  bioactive compounds. The results showed that the methanol (M2) and etanol (E) extract of tobacco leaf had antibacterial avtivity against S. aureus . Their bactericidal activity (inner diameter of inhibition) was 12,5 mm, and bacteriostatic (outer diameter inhibition) was 20 mm. The optimum concentration of antibacterial  methanol  extract  was  50%,  and  the  optimum  concentration  of  antibacterial  etanol extract  was  60%.  It  was  found  that  the  antibacterial  compound  was  detected  as  flavanoid  and terpenoid.
Keywords:   Antibacterial; Tobacco leaf; Staphylococcus aureus ATCC 25923

## Abstrak
Daun  tembakau  mengandung  senyawa  bioaktif  yang  diduga  bersifat  antibakteri.  Staphylococcus aureus merupakan bakteri patogen penyebab beberapa penyakit infeksi. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi golongan senyawa aktif dan mengetahui konsentrasi optimum ekstrak daun tembakau  dalam  menghambat  aktivitas  S.  aureus    ATCC  25923.  Pengujian  daya  hambat  ekstrak dilakukan secara kualitatif yaitu dengan metode difusi cakram/paper disc dengan variasi konsentrasi ekstrak  40,  50,  60,  70,  80,  90  dan  100%.  Metode  ekstraksi  yang  digunakan  adalah  maserasi berjenjang dengan pelarut metanol 70% (M2) dan maserasi total dengan pelarut etanol 96% (E). Dilakukan uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk mengetahui golongan senyawa aktif antibakteri. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak metanol berjenjang (M2) dan etanol (E) memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. aureus , serta memiliki sifat bakterisidal (diameter penghambatan dalam) sebesar  12,5  mm  dan  bakteriostatik  (diameter  penghambatan  luar)  sebesar  20  mm.  Konsentrasi optimum antibakterial ekstrak metanol berjenjang pada konsentrasi 50%, dan konsentrasi optimum antibakterial  ekstrak  etanol  pada  konsentrasi  60%.  Golongan  senyawa  yang  terdeteksi  bersifat antibakteri adalah flavanoid, dan terpenoid.
Kata Kunci:  Antibakteri; daun tembakau; Staphylococcus aureus ATCC 25923
*Corresponding  Author:  Anis  Uswatun  Khasanah,  email:  anis.uk@uinbanten.ac.id,  Fakultas  Sains  UIN  Sultan Maulana  Hasanuddin  Banten,  Jalan  Jendral  Sudirman  No.  30  Panancangan  Cipocok  Jaya,  Sumurpecung, Kecamatan Serang, Kota Serang, Banten 42118.
Copyright © 2021 Al-Hayat: Journal of Biology and Apllied Biolog
Anis Uswatun Khasanah, Sri Juni Nastiti

## Pendahuluan
Tanaman kaya akan senyawa terapetik yang  dapat  diaplikasikan  di  dalam  dunia farmasi  (Akhtar,  2018).  Daun  tembakau (Nicotiana  tabacum  L.)  mengandung  lebih dari 4000 komponen senyawa aktif. Ekstrak metanolik daun tembakau dapat digunakan sebagai  langkah  awal  untuk  mendapatkan senyawa  aktif  yang  dikehendaki.  Nikotin merupakan  alkaloid  yang  dominan  di- temukan  dalam  ekstrak  kasar  daun tembakau.  Senyawa  non  alkaloid  seperti tannin, saponin, gula reduksi, flavonoid dan triterpen belum banyak diketahui aktivitas- nya.  N.  tabacum  K326  and  Nicotiana glutinosa  diketahui  memiliki  aktivitas antelmintik (Schorderet et al., 2019).
Rebusan  daun  tembakau  secara tradisional digunakan sebagai anti- spasmodik,  ekspektoran,  emetika,  obat penenang, reumatik, pembengkakan, anestesi,
antikonvulsan, antibakteri, diuretik,  antimikroba,  antijamur,  dan antelmintik  (Sastya  et  al.,  2017).  Senyawa yang  memiliki  sifat  antimikrobial  di antaranya  alkaloid,  tannin,  terpenoid, flavonoid dan fenol (Jaberian et al., 2013)
S.  aureus  merupakan  bakteri  patogen Gram  positif  yang  dapat  menyebabkan penyakit  infeksi.  S.  aureus    bertanggung jawab atas 80% penyakit kulit (Tang et al., 2020).  S.  aureus    berbentuk  bulat,  dapat ditemukan  dalam  saluran  pernafasan (Mustopa et al., 2016).
Flavonoid  diketahui  memiliki  fungsi antioksidan,  antibakteri,  antivirus,  anti- alergi,  dan  antikanker.  Senyawa  flavonoid adalah  senyawa  yang  mengandung  C15, terdiri  dari  dua  inti  fenolat  yang  di- hubungkan  dengan  tiga  satuan  karbon. Flavonoid terdapat pada daun, bunga, buah, biji-bijian,  kacang-kacangan,  bulir  padi,
rempah dan pada tumbuhan berkhasiat obat (Chem, 2017)
Dari  semua  produk  alami  yang ditemukan  pada  tumbuhan,  terpenoid merupakan kelas terbesar, beragam secara fungsional  dan  struktural.  Sebanyak  5.000 senyawa yang telah teridentifikasi.
Beberapa terpenoid diketahui memiliki sifat antikanker,  pestisida,  antimikrobia,  anti- inflamasi  dan  imunodulasi.  Terpenoid memiliki  profil  rasa  dan  aroma  yang menguntungkan bagi dunia industri sebagai minyak  esensial,  penyedap  makanan,  dan parfum (Nguyen et al., 2020)
Dari  informasi  tersebut,  maka  perlu dilakukan penelitian lebih  lanjut mengenai golongan senyawa antibakteri yang terdapat di  dalam  daun  tembakau,  aktivitas antibakteri  ekstrak  daun  tembakau terhadap  S.  aureus,  dan  konsentrasi optimum  ekstrak  daun  tembakau  dalam menghambat pertumbuhan S. aureus. Hasil yang  diperoleh  diharapkan  dapat  menjadi solusi alternatif pemanfaatan lain dari daun tembakau sebagai antibakteri.

## Metode Penelitian
Prosedur  penelitian  meliputi  preparasi sampel, yaitu menghitung berat kering dari daun  tembakau  kemudian  dibuat  sediaan serbuk.  Pembuatan  ekstrak  dilakukan dengan  metode  maserasi,  menggunakan pelarut  metanol  dan  etanol.  Serbuk  daun tembakau  yang  telah  kering,  diekstraksi dengan perbandingan serbuk tembakau dan pelarut  1:10.  Untuk  optimasi,  maserasi dilakukan  dengan  menggunakan  dua perlakuan  (berjenjang  dan  total)  dan  dua pelarut methanol 70% dan etanol 96%.
Konfirmasi  mikrobia  dilakukan  untuk memastikan  strain  S.  aureus  ATCC  25923 merupakan  strain  murni.  Identifikasi dilakukan  dengan  pengecatan  Gram,  dan
ditumbuhkan  dalam  medium  selektif Mannitol  Salt  Agar  (MSA).  Uji  aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi paper  disc.  Penentuan  golongan  senyawa aktif  menggunakan  metode  Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

## Hasil Penelitian dan Pembahasan
Daun tembakau yang digunakan adalah daun dengan kondisi sehat, dicirikan dengan warna hijau, segar, dan tidak terdapat bekas penyakit  pada  daun,  seperti  bercak  daun atau  belang  daun.  Daun  yang  diambil merupakan  daun  yang  berada  pada  posisi tiga terbawah.
Daun  tembakau  yang  telah  dikoleksi, selanjutnya dilakukan pengukuran panjang dan lebarnya, dikeringkan dengan menggunakan oven suhu 50 0C selama 14 hari  untuk  mengetahui  kadar  airnya, selanjutnya dihaluskan menggunakan blender,  dan  diekstraksi  dengan  metode maserasi.  Maserasi  dilakukan  dengan  dua pelarut; metanol 70% dan etanol 96%. Hasil dapat dilihat dalam Tabel 1 dan 2.
Konfirmasi  bakteri  S.  aureus  dengan pengecatan  gram  dapat  dilihat  pada (Gambar 1) dan pengamatan pertumbuhan pada  medium  selektif  Mannitol  Salt Agar/MSA terdapat pada (Gambar 2).
Berdasarkan hasil pengamatan (Gambar 2) dapat diketahui bahwa S. aureus mampu memfermentasi manitol pada medium MSA. Medium MSA digunakan untuk mengetahui prevalensi  dan  karakteristik  S.  aureus (Akkou  et  al.,  2018).  Hasil  positif  di- tunjukkan  dengan  perubahan  warna medium  setelah  diinokulasi  dari  merah menjadi kuning. Medium MSA mengandung indikator asam basa, yaitu fenol merah yang akan berwarna kuning dalam kondisi asam.
Medium MSA mengandung kasein, beef extract  sebagai  sumber  nitrogen,  vitamin dan  karbon,  D-manitol  sebagai  sumber karbohidrat, dan sodium klorida yang dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  lain selain Staphylococcus, seperti Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, dan Salmonella.

## Tabel 1
Panjang, lebar, serta pengukuran kadar air daun tembakau Daun Tembakau Panjang (cm) Lebar (cm)  Kadar Air (%) G1 46,6 34 13,36 G2 45,5 29,5 12,10 G3 47,5 29,5 12,06 G4 48 30 10,58 G5 49 37 11,56 G6 51,8 35 13,84 Rerata 48,5 32,5 12,25

## Tabel 2
Hasil Ekstraksi daun tembakau (Nicotiana tabacum var. Garut) dengan pelarut methanol 70% dan etanol 96%
Metode Ekstraksi Pelarut Ekstrak (g) Organoleptik Maserasi berjenjang 1:10 (M2) Metanol 70% 1,79 Berwarna coklat kehijauan, bau khas tembakau,  rasa  pahit  menggigit, konsistensi  ekstrak  kental  hamper padat Maserasi Total (E) Etanol 96% 1,14 Berwarna coklat kehijauan, bau khas tembakau,  rasa  pahit  menggigit, konsistensi kental seperti karamel

## Gambar 1

## Panjang, lebar, serta pengukuran kadar air daun tembakau
Keterangan: 1. Hasil Pengecatan Gram S. aureus . Menunjukkan warna ungu, Gambar 2. Pertumbuhan S. aureus  pada medium MSA. A (kontrol), B (medium MSA yang telah diinokulasi S. aureus ), Gambar 3.  Aktivitas  antibakteri  ekstrak  dalam  pelarut  DMSO  5%  terhadap  S.  aureus.  Keterangan:  DMSO: DMSO 5%
Medium MSA mengandung kasein, beef extract  sebagai  sumber  nitrogen,  vitamin dan  karbon,  D-manitol  sebagai  sumber karbohidrat, dan sodium klorida yang dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  lain selain Staphylococcus, seperti Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, dan Salmonella.
Dalam penelitian ini digunakan pelarut DMSO  dengan  konsentrasi  5%  untuk melarutkan  ekstrak  daun  tembakau  (M2 dan  E).  Untuk  memastikan  pelarut  tidak bersifat  antibakteri,  maka  diuji  terlebih dengan difusi cakram. Hasilnya terlihat pada Gambar 3.
Metode yang digunakan dalam
pengujian  ini  adalah  difusi  cakram  (disc diffusion  method).  Berdasarkan  hasil  uji aktivitas  antibakteri  DMSO  terhadap  S. aureus  dapat  diketahui  bahwa  dengan menggunakan metode difusi cakram, DMSO 5% tidak menunjukkan adanya penghambatan terhadap aktivitas S. aureus, sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa pengaruh  pelarut  terhadap  hambatan pertumbuhan  S.  aureus  dapat  diabaikan. Sementara  pada  kontrol  positif,  terdapat diameter hambatan sebesar 16 mm.
Konsentrasi  DMSO  yang  rendah  lebih disarankan  untuk  digunakan,  hal  ini dikarenakan  masing-masing  ekstrak  daun tembakau memiliki batas tingkat kelarutan
tersendiri  terhadap  DMSO.  Dalam  hal  ini, DMSO 5% memberikan kelarutan yang lebih tinggi terhadap ekstrak daun tembakau, dan meningkatkan efektivitas dari ekstrak yang akan diuji (Koo et al., 2003).
Uji aktivitas antibakteri adalah suatu uji yang digunakan untuk mengetahui aktivitas suatu bahan terhadap bakteri uji. Digunakan variasi konsentrasi 40, 50, 60, 70, 80, 90, dan 100%.  Pada  penelitian  ini  digunakan metode  difusi  cakram  sebagai  uji pendahuluan  untuk  mengetahui  aktivitas ekstrak  daun  tembakau  (M2,  dan  E) terhadap  S.  aureus.  Hasil  pengamatan  uji aktivitas antibakteri dapat dilihat pada Tabel 3 dan Gambar 4, 5, 6 dan 7.

## Tabel 3
Diameter hambatan ekstrak daun  tembakau terhadap S. aureus
Kons. Ekstrak (%) Diameter hambatan ekstrak methanol (mm) Diameter hambatan ekstrak etanol (mm) Diameter kontrol positif Amoxicillin (mm) Dalam Luar Dalam Luar  Dalam Luar 100 9,38 - 10 - 34 39,5 90 8,75 - 10,5 20 28 39,5 80 9 - 9,13 - 29,8 40,25 70 9,13 13,5 9,6 - 28,5 39,8 60 8,9 - 12 - 27,3 38,8 50 12,5 - - - 33,3 39,3 40 - - - - 12,3 39,5
Keterangan :
- Diameter hambatan merupakan diameter zona hambatan
- Diameter paper disc adalah 7,00 mm
- Perhitungan diameter merupakan hasil perhitungan untuk tiga replikasi

## Gambar 2
Diameter hambatan dalam, ekstrak metanol 70% daun tembakau terhadap S. aureus

## Gambar 3
Diameter hambatan luar, ekstrak metanol 70% daun tembakau terhadap S. aureus .

## Gambar 4
Diameter hambatan dalam, ekstrak etanol 96% daun tembakau terhadap S. aureus .
Gambar 5 Diameter hambatan luar, ekstrak etanol 96% daun tembakau terhadap S. aureus.
Setelah dilakukan uji aktivitas antibakteri ekstrak Metanol (M2) dan etanol
(E)  dari  daun  tembakau,  maka  dapat diketahui  bahwa  kedua  macam  ekstrak memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap bakteri patogen S. aureus . Sifat antibakteri dapat  dibagi  lagi  menjadi  bakterisidal (membunuh  mikrobia)  dan  bakteriostatik (menghambat  pertumbuhan  mikrobia) (Prescott et al., 1999).
Sifat  bakterisidal  diduga  ditunjukkan dengan  zona  jernih  di  sekitar  paper  disc (diameter  dalam),  dan  sifat  bakteriostatik ditunjukkan  dengan  adanya  zona  per- tumbuhan  S.  aureus  disekitar  paper  disc yang  lebih  sedikit  dibandingkan  per- tumbuhan normal pada medium (diameter luar).
Dalam  ekstrak  metanol  (M2),  sifat bakterisidal  tertinggi  terlihat  pada  kon- sentrasi  50%,  dengan  diameter  hambatan dalam  sebesar  12,5  mm.  Sedangkan bakteriostatik  optimum  pada  konsentrasi 70%,  (Gambar  5)  terlihat  dari  adanya diameter hambatan luar sebesar 13,5 mm. Pada  kontrol  positif,  sifat  bakterisidal tertinggi pada konsentrasi 100% sebesar 34 mm,  dan  bakteriostatik  optimum  pada
konsentrasi  60%  sebesar  40,25  mm. Sehingga dari data ini, diketahui konsentrasi optimum  ekstrak  metanol  sebagai  anti- bakteri terhadap S. aureus  adalah 50%.
Dalam  ekstrak  etanol  (E),  sifat antibakteri/bakterisidal  tertinggi  terlihat pada  konsentrasi  60%,  dengan  diameter hambatan dalam sebesar 12 mm. Sedangkan bakteriostatik  optimum  pada  konsentrasi 90%,  terlihat  dari  adanya  diameter hambatan luar sebesar 20 mm (Gambar 6). Kontrol  positif  menunjukkan  sifat  bakteri- sidal  tertinggi  pada  konsentrasi  ekstrak 100%  dengan  diameter  34  mm,  dan bakteriostatik  tertinggi  pada  konsentrasi 80%  dengan  diameter  40,3  mm.  Sehingga dari data ini, diketahui konsentrasi optimum ekstrak  etanol  (E)  sebagai  antibakteri terhadap S. aureus  adalah 60%.
Hasil ini menunjukkan bahwa semakin tinggi  konsentrasi  ekstrak  yang  digunakan tidak  menunjukkan  pengaruh  yang  ber- banding  lurus  dengan  zona  jernih  yang dihasilkan. Bahkan, jika dilihat dari diameter hambatan pada keenam variasi konsentrasi yang  digunakan,  tidak  terjadi  perbedaan yang  signifikan.  Hal  ini  dapat  disebabkan karena  konsentrasi  senyawa  aktif  daun
Anis Uswatun Khasanah, Sri Juni Nastiti
tembakau,  termasuk  yang  bersifat  anti- bakterial mengalami agregat/pengumpulan, sehingga membentuk masa yang besar, dan tidak  dapat  dibawa  oleh  protein  transport dinding  sel  S.  aureus    untuk  menetrasi  ke dalam sel. Selain itu, dapat juga dilihat dari kelarutan  senyawa  antibakteri  oleh  DMSO. Diduga senyawa antibakteri konsentrasi 50 dan  60  %  lebih  banyak  terlarut  dengan pelarut DMSO 5%, secara kuantitas pelarut pada  konsentrasi  50%  lebih  banyak  di- bandingkan konsentrasi 60 sampai 100%.
Dari hasil yang diperoleh, terlihat bahwa tidak  pada  semua  variasi  konsetrasi memiliki  aktifitas  bakteriostatik,  yang ditunjukkan  dengan  adanya  diameter hambatan  luar.  Namun  semua  ekstrak tembakau pada variasi konsentrasi menunjukkan sifat bakterisidal, ditunjukkan dengan diameter hambatan dalam, meskipun  tidak  terlalu  besar.  Hal  ini menunjukkan  mekanisme  penghambatan ekstrak  diduga  lebih  banyak  bersifat bakterisidal.
Pengujian lebih lanjut dapat digunakan untuk  menunjukkan  sifat  antibakteri  dari ekstrak  daun  tembakau,  yaitu  dengan mencari  Konsentrasi  Hambat  Minimum (KHM)  dan  Konsentrasi  Bunuh  Minimum (KBM). KHM didefinisikan sebagai konsentrasi terendah yang mampu menghambat seluruh pertumbuhan mikrobia.  Nilai  KHM  ini  dapat  diperoleh dengan  metode  mikrodilusi.  Sedangkan KBM  didefinisikan  sebagai  konsentrasi terendah yang mampu membunuh seluruh pertumbuhan  bakteri  uji  dan  ditetapkan pada  konsentrasi  yang  memberikan  zona jernih tanpa pertumbuhan mikrobia uji pada media  agar  dengan  pengamatan  secara visual (Jawetz et al., 2005).
Perbedaan variasi pelarut (metanol dan etanol)  dimaksudkan  untuk  mendapatkan
pelarut yang optimum dalam menghasilkan ekstrak yang bersifat antibakteri. Dari hasil (Tabel  3)  dapat  terlihat  bahwa  pelarut metanol  lebih  optimum  digunakan,  karena pada  konsentrasi  50%  masih  bersifat antibakteri.  Sedangkan  pelarut  etanol optimum digunakan pada konsentrasi 60%.
Sehingga dapat dikatakan senyawa antibakteri  lebih  banyak  terlarut  pada pelarut metanol. Hal ini dapat dipengaruhi oleh  kepolaran  kedua  pelarut.  Pelarut metanol  70%  bersifat  lebih  polar dibandingkan etanol 96%, karena kandungan  airnya  lebih  besar,  sehingga diduga  lebih  banyak  senyawa  antibakteri yang  bersifat  polar  yang  terekstrak  dalam pelarut metanol, dibandingkan pada pelarut etanol. Ektraksi dengan pelarut pada tingkat kepolaran  tertentu  maka  akan  menarik senyawa  dengan  tingkat  kepolaran  serupa (Seidel, 2006).
Perlakuan maserasi yang berbeda, yaitu maserasi  berjenjang  pada  metanol  dan maserasi  total  pada  etanol  diduga  tidak memberikan  pengaruh  yang  signifikan. Tetapi  hasil  yang  berbeda  terdapat  pada jumlah  ekstrak  yang  dihasilkan  (Tabel  2) pada maserasi berjenjang diperoleh jumlah ekstrak  sebanyak  1,79  g,  lebih  besar dibandingkan ekstrak pada etanol, sebesar 1,41  g.  Sehingga,  untuk  menghasilkan jumlah  ekstrak  yang  lebih  besar  dapat dilakukan maserasi berjenjang.
Penggunaan kontrol pelarut menunjukkan bahwa pelarut yang
digunakan  yaitu  DMSO  5%,  tidak  dapat menghambat  pertumbuhan  mikroba  uji sehingga  dapat  disimpulkan  bahwa pengaruh  pelarut  terhadap  hambatan pertumbuhan mikroba uji dapat diabaikan. Sedangkan  kontrol  positif/pembanding berupa  amoxicillin  pada  setiap  media mikroba  uji  menunjukkan  bahwa  terdapat
pertumbuhan  dan  aktivitas  penghambatan mikroba uji pada media tersebut.
Masing-masing ekstrak daun tembakau memiliki  tingkat  kelarutan  tersendiri  di dalam  pelarut yang akan  digunakan untuk uji.  Pada  penelitian  ini  digunakan  pelarut DMSO  dengan  konsentrasi  5%,  karena DMSO pada konsentrasi ini aman digunakan untuk  uji  dan  mampu  digunakan  untuk melarutkan  kedua  macam  ekstrak  daun tembakau. Adanya DMSO dalam larutan uji dapat  meningkatkan  keefektifan  dari masing-masing ekstrak yang akan diuji.
Bakteri  Gram  positif  diketahui  lebih sensitif  terhadap  zat  antibakteri  daripada Gram  negatif.  Bakteri  Gram  negatif mempunyai  struktur  yang  lebih  kompleks dibandingkan dengan bakteri Gram positif. Membran sel pada Gram negatif terdiri dari dua  lapisan,  sedangkan  Gram  positif  satu lapisan  (tidak  memiliki  outer  membrane). Dinding  sel  bakteri  Gram  negatif  me- ngandung lipid, lemak, atau subtitusi seperti lemak  dalam  prosentase  yang  lebih  tinggi dibandingkan dengan Gram positif. Bakteri Gram positif memiliki 60%-100% peptidoglikan  sedangkan  bakteri  Gram negatif mengandung lebih sedikit
peptidoglikan yaitu 10%-20% (Siegel et al., n.d.). Maka senyawa aktif yang bersifat polar akan  lebih  sulit  menembus  dinding  sel bakteri Gram negatif daripada Gram positif.
Selain memiliki peptidoglikan yang lebih tebal, bakteri Gram positif juga mengandung sejumlah besar asam berupa polimer yang larut  air.  Hal  ini  menyebabkan  dinding  sel bersifat polar, sehingga bakteri Gram positif seperti  S.  aureus  mudah  ditembus  oleh senyawa  yang  bersifat  polar  jika dibandingkan bakteri Gram negatif.
Amoxicillin  25  µg  digunakan  sebagai kontrol positif pada uji antibakteri S. aureus
karena  termasuk  dalam  obat  antimikroba yang  telah  diketahui  nilai  KHM-nya  dan telah  digunakan  secara  luas  untuk pengobatan antibakteri. Mekanisme antibiotic  amoxicillin  adalah  dengan berikatannya golongan aminoglikosida pada ribosom  bakteri  subunit  30S  dan menghambat translokasi peptidyl-tRNA dari situs  A  ke  situs  P  sehingga  menyebabkan kesalahan pembacaan mRNA yang mengakibatkan  bakteri  tidak  mampu mensintesis protein vital untuk pertumbuhannya. Mekanisme  kerja  antimikrobia  dapat dikelompokkan  menjadi  empat  yaitu antimikrobia yang bekerja melalui penghambatan sintesis dinding sel (Basitrasin, Penisilin, Vankomisin, Sealosporin,  Sikloserin),  penghambatan fungsi membrane sel (Amfosterin, Kolistin, Imidasol,  Triasol,  Polien,  Polimiksin), penghambatan sintesis protein (Kloramfenikol,  Eritromisin,  Linkomisin,
Tetrasiklin)  dan  penghambatan  sintesis asam nukleat.
Mekanisme  antibakteri  dari  flavonoid melalui  pembentukan  kompleks  flavonoid dengan dinding sel bakteri yang menyebabkan  terganggunya  permeabilitas sel, mengakibatkan pengangkutan zat-zat ke dalam  sel  terganggu,  dan  selanjutnya menyebabkan  lisisnya  bakteri.  Sedangkan mekanisme kerja terpenoid dalam menghambat pertumbuhan S. aureus  belum banyak diketahui.
Identifikasi  golongan  senyawa  dari ekstrak  daun  N.  tabacum  menggunakan metode  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT) dilakukan  untuk  mengetahui  kandungan kimia secara kualitatif. Dari uji pendahuluan yang  telah  dilakukan,  terdapat  senyawa antibakterial  di  dalam  ekstrak  daun tembakau.  Kandungan  senyawa  yang
Anis Uswatun Khasanah, Sri Juni Nastiti
terdapat  di  dalam  daun  tembakau  antara lain  alkaloid,  saponin,  flavanoid  dan polifenol. Turunan dari alkaloid diantaranya saponin  dan  flavonoid.  Menurut  Ruiz- Rodriguez  et  al.  (2007)  di  dalam  daun tembakau juga terdapat senyawa solanesol yang  merupakan  derivat  dari  terpenoid.
Ekstrak methanol digunakan karena dalam konsentrasi yang lebih rendah masih dapat menunjukkan sifat antibakteri di-
bandingkan ekstrak etanol.
Fase  gerak  yang  digunakan  untuk analisis  senyawa  flavonoid  adalah  etil asetat-metanol-  asam  formiat  dengan perbandingan 95:5:0,5. Pemilihan fase gerak berdasarkan  sifat  kelarutan  dan  polaritas. Untuk  memisahkan  sampel  yang  bersifat polar maka digunakan pelarut yang bersifat polar dan juga sebaliknya. Pereaksi semprot yang digunakan adalah Alumunium Klorida. Fase  gerak  yang  digunakan  untuk  analisis senyawa  terpenoid  adalah  Toluen  –  Etil Asetat dengan perbandingan 93:7. Pereaksi semprot  yang  digunakan  adalah  Vanilin Asam  Sulfat.  Hasil  profil  KLT  dan perhitungan  Rf  bercak  dapat  dilihat  pada
gambar  8  untuk  flavanoid,  dan  gambar  9 untuk terpenoid.
Deteksi  hasil  kromatografi  ekstrak metanol  berjenjang  (M2)  menggunakan sinar  UV  dengan  λ  254  nm  (Gambar  8) menunjukkan  adanya  bercak  yang  tidak berpendar dan sedikit kekuningan. Pengamatan di bawah UV λ 365 nm (Gambar 8) dijumpai bercak yang berfluoresensi dan pengamatan pada cahaya visible terlihat spot berwarna kuning.
Identifikasi  flavonoid  dapat  dideteksi dengan diuapi amoniak. Alumunium Korida digunakan sebagai pereaksi semprot untuk mendeteksi  adanya  flavonoid  dengan ditunjukkannya adanya bercak pada UV365 warna  berfluoresensi  kuning,  hijau,  atau oranye  dan  berwarna  kuning  pada  sinar tampak. Dalam struktur flavonoid tertentu, terdapat  gugus  ortohidroksi  dan  hidroksi- karbonil  sehingga  logam  aluminium  dapat membentuk kompleks dengan gugus-gugus tersebut  dan  memberikan  warna  bercak yang khas. Umumya berwarna kuning pada cahaya tampak dan ungu tua pada sinar UV.

## Gambar 6
Diagram rata-rata morfologi normal spermatozoa
A B
Keterangan A: Fase diam : silika gel F254 Fase gerak : etil asetat-metanol-asam   formiat dengan perbandingan 95:5:0,5 P : Komparator Quercetin, Rf = 0,82 S : Ekstrak tembakau Rf S1 : 0,61 Rf S2 : 0,69 Keterangan B Fase diam : Silika gel F254 Fase gerak : Toluen – Etil Asetat (93:7) P : Komparator Terpineol, Rf= 0,39 S : Ekstrak tembakau Rf S1 : 0,16 Rf S2 : 0,41 Rf S3 : 0,86

## Tabel 4
Profil Kromatografi Lapis Tipis pada Ekstrak daun tembakau
Dari  tabel  4  di  atas  diketahui  bahwa daun tembakau (N. tabacum) mengandung flavonoid  dan  terpenoid  yang  diduga memiliki sifat antibakteri.
Hasil  penyemprotan  menunjuk-kan adanya  senyawa  flavonoid  pada  lempeng KLT  (spot  berwarna  kuning)  dengan  Rf flavanoid  terdeksi  0,61  dan  0,69.  Rf flavanoid terdeteksi sedikit berbeda dengan Rf  komparator  quercetin  (0,82)  sebagai pembanding,  hal  ini  dapat  terjadi  karena senyawa  flavonoid  yang  terdapat  didalam ekstrak  diduga  bukan  termasuk  quercetin, namun masih dalam golongan flavanoid.
Anisaldehid asam sulfat maupun vanilin asam sulfat merupakan pereaksi yang dapat digunakan  untuk  mendeteksi  senyawa turunan terpenoid seperti saponin. Anisaldehid  akan  berkondensasi  dengan
suatu  senyawa  sehingga  terbentuk  ikatan rangkap terkonjugasi yang semakin panjang dan  berwarna  pada  pengamatan  di  bawah sinar  tampak.  Senyawa  terpenoid  di- tunjukkan dengan warna biru dan biru violet di bawah sinar UV 366 nm, dan ditunjukkan oleh warna biru, biru violet, merah, abu-abu, dan  hijau  setelah  dilakukan  pemanasan pada  suhu  110°C  selama  5  menit  setelah penyemprotan. Pada penelitian ini, penyem- protan dengan pereaksi vanillin asam sulfat dan  pemanasan  memperlihat-kan  bercak yang  diduga  adalah  senyawa  terpenoid (bercak warna ungu violet).
Hasil pengamatan di bawah UV365 nm (Gambar  9)  juga  menunjukkan  bercak berfluoresensi biru maupun biru violet yang menjadi tanda senyawa terpenoid. Terdapat tiga spot yang memiliki nilai Rf sebesar 0,61; Analisis Pereaksi Semprot UV 254 UV 365 Visibel Rf Flavonoid  Alumunium Chloride Teredam  Fluoresens kuning Kuning 0,61; 0,69 Terpenoid  Vanilin Asam Sulfat Teredam Biru Merah Violet  0,16; 0,41; 0,86

## Anis Uswatun Khasanah, Sri Juni Nastiti
0,41,  dan  0,86.  Berbeda  dengan  Rf pembanding  terpineol  sebesar  0,39. Terdapatnya tiga  spot dalam  plate menun- jukkan  tiga  senyawa  berbeda  terelusi  dan masih tergolong terpenoid, dengan Rf yang berbeda.
Silika  gel  bertindak  sebagai  penyerab (adsorbent)  yang  berfungsi  sebagai  fase diam dan bersama-sama fase gerak tertentu akan  memisahkan  senyawa  berdasarkan tingkat  kepolaran-nya.  Bercak  yang  telah dipisahkan  dapat  tertinggal  pada  silica  gel karena  adanya  ikatan  hidrogen  antara senyawa  yang  diadsorb  dengan  penyerap (sorbent).

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  dan pembahasan  yang  telah  diuraikan  maka diperoleh  kesimpulan  sebagai  berikut, ekstrak daun tembakau (Metanol berjenjang dan  Etanol)  memiliki  aktivitas  antibakteri (bakterisidal dan bakteriostatik) terhadap S. aureus . Konsentrasi optimum antibakterial ekstrak  metanol  berjenjang  adalah  50%. Konsentrasi optimum antibakterial ekstrak etanol  pada  konsentrasi  60%.  Golongan senyawa  yang  memiliki  aktivitas  anti- mikrobia adalah flavanoid dan terpenoid.

## Daftar Pustaka
Akhtar,  N.  (2018).  Phytochemical  analysis and  comprehensive  evaluation  of antimicrobial and antioxidant properties  of  61  medicinal  plant species.  Arabian  Journal  of  Chemistry, 11(8), 1223–1235. https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2015 .01.013 Akkou, M., Bentayeb, L., Ferdji, K., Medrouh, B., Bachtarzi, M. A., Ziane, H., Kaidi, R., & Tazir, M. (2018). Phenotypic characterization  of  Staphylococci
causing  mastitis  in  goats  and microarray-based genotyping of Staphylococcus  aureus  isolates.  Small
Ruminant  Research,  169,  29–33. https://doi.org/10.1016/j.smallrumre s.2018.10.015
Chem,  J.  (2017).  Isolasi,  Identifikasi,  Uji Aktivitas  Senyawa  Flavonoid  Sebagai Antibakteri  Dari  Daun  Mangga. Indonesian Journal of Chemical Science,
6(2), 91–96.
Jaberian,  H.,  Piri,  K.,  &  Nazari,  J.  (2013). Phytochemical  composition  and  in vitro  antimicrobial  and  antioxidant activities  of  some  medicinal  plants.
Food  Chemistry,  136(1),  237–244.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2 012.07.084
Jawetz,  E.,  Melnick  J.L.  and  Adelberg,  E.A. 2005.  Mikrobiologi  untuk  Profesi Kesehatan. Edisi 14.Jakarta : Penerbit
EGC. Hlm 801-806, 438
Koo, H., Hayacibara, M.F., Schobel, B.D., Cury,
J.A.,  Rosalen,  P.A.,  Park,  Y.K.,  Vacca- Smith,  A.M.,  dan  Bowen,  W.H.,  2003, Inhibition  of  Streptococcus  mutans Biofilm Accumulation and Polisaccharide Production by Apigenin and tt-Farnesol, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 52, 782- 789. Mustopa, A. Z., Budiarto, B. R., & Tarman, K.
(2016).  Antibacterial  Activity  of Extracellular Protease Isolated From an Algicolous  Fungus  Xylaria  psidii  KT30
Against Gram-Positive Bacteria. 23, 73– 78.
https://doi.org/10.1016/j.hjb.2016.0
6.005
Nguyen, T. D., Riordan-Short, S., Dang, T. T. T., O’Brien, R.,  & Noestheden, M. (2020).
Quantitating terpenes / terpenoids and nicotine in plant materials and vaping products  using  high-temperature headspace
gas chromatography–mass spectrometry. In Comprehensive  Analytical  Chemistry (1st ed.). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/bs.coac.2020 .04.006 Prescott,  L  M.,  John  P.  H.,  and  Donal  A.  K.
1999. Microbiology. Forth edition. Mc Graw  Hill  Company.  North  America.
113 pp
Ruiz-Rodriguez,  Bronze  Maria-Rosario, Nunes da Ponte, M. 2007. Supercritical Fluid Extraction of Tobacco Leaves: A preliminary Study on The Extraction of Solanesol.  Journal  of  Supercritical Fluids 45 (2008) 171-176 Sastya, S., Kumar, R. R., & Vatsya, S. (2017). Evaluation  of  Anthelmintic  Efficacy  of Nicotiana tabacum against Gastrointestinal  Nematodes  of  Goats. 6(10), 780–789.
Schorderet,  S.,  Kaminski,  K.  P.,  Perret,  J., Leroy,  P.,  Mazurov,  A.,  Peitsch,  M.  C.,
Ivanov,  N.  V,  &  Hoeng,  J.  (2019). Antiparasitic properties of leaf extracts derived  from  selected  Nicotiana species  and  Nicotiana  tabacum varieties.
Food and Chemical
Toxicology, 132(July), 110660. https://doi.org/10.1016/j.fct.2019.11 0660 Seidel, V. 2006. Natural Product Isolation 2 nd edition. Humana Press Inc. new Jarsey, pp 27-37.
Siegel,  S.  D.,  Liu,  J.,  &  Ton-that,  H.  (n.d.). ScienceDirect Biogenesis of the Gram- positive  bacterial  cell  envelope. Current  Opinion  in  Microbiology,  34, 31–37. https://doi.org/10.1016/j.mib.2016.0 7.015
Tang, C., Chen, J., Zhang, L., Zhang, R., Zhang, S.,  Ye,  S.,  Zhao,  Z.,  &  Yang,  D.  (2020). International  Journal  of  Medical Microbiology Exploring the antibacterial  mechanism  of  essential oils  by  membrane  permeability  , apoptosis  and  bio  fi  lm  formation combination with proteomics analysis against methicillin-resistant staphylococcus  aureus.  International Journal  of  Medical  Microbiology, 310(5), 151435. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2020. 151435
Anis Uswatun Khasanah, Sri Juni Nastiti