## Efektifitas Waktu Ekuilibrasi Sebelum Pembekuan Spermatozoa Kambing Sapera Pasca Electric Separating Sperm
The Effectiveness of Time Equilibration Before Freezing in Sapera Goat Spermatozoa After Electric Separating Sperm
Amung Logam Saputro 1* , Ragil Angga Prastiya 2 , Meidina Zulva Ulinuha 3 ,
Prasita Widayani 3
1 Departemen Klinik Veteriner, 2 Departemen Reproduksi Veteriner, 3 Pendidikan Profesi Dokter Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Kampus C Mulyorejo, Surabaya, Indonesia, 60115 . * Corresponding author : amunglogamsaputro@fkh.unair.ac.id

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  efektifitas  waktu  ekuilibrasi  sebelum  pembekuan spermatozoa kambing sapera setelah Electric Separating Sperm (ESS) terhadap motilitas, viabilitas, integritas membran,  normalitas  dan  abnormalitas  spermatozoa.  Spermatozoa  pada  kambing  sapera  dikumpulkan menggunakan  vagina  buatan  kemudian  dipisahkan  menggunakan  metode  EES.  Penelitian  ini  menggunakan rumus acak lengkap dengan tiga perlakuan yaitu waktu kesetimbangan P1 (1 jam), P2 (3 jam), dan P3 (4 jam), dengan  enam  pengulangan.  Analisis  dalam  penelitian  ini  meggunakan  uji  ANOVA  dilanjutkan  dengan  uji Duncan  untuk  mengetahui  perbedaan  nyata  antar  perlakuan.  Kesimpulan  dari  penelitian  ini  menunjukkan presentase  motilitas,  viabilitas,  integritas  membram,  normalitas  spermatozoa  kambing  sapera  tertinggi  pada perlakuan 1 jam, untuk persentase kelainan terendah pada perlakuan 1 jam. Hasil yang berbeda nyata (p<0,05) pada sisi anoda dan katoda pada semua perlakuan dengan perbedan waktu.
Kata kunci: ekuilibrasi , Electric Separating Sperm , kambing Sapera

## Abstract
The purpose of this study was to determine the effectiveness of time equilibration before freezing sapera goat spermatozoa after ESS (Electric Separating Sperm) on motility, viability, membrane integrity, normality and abnormality of spermatozoa. Sapera goat spermatozoa were collected using an artificial vagina and then separated using the ESS method. This study used a completely randomized formula with three treatments, which are the equilibration time of P1 (1 hour), P2 (3 hours), and P3 (4 hours), with six replications. The analysis in this study used the ANOVA test followed by the Duncan test to determine the real difference between treatments. The conclusion of this study showed the highest percentage of motility, viability, membrane integrity, normality of  sapera  goat  spermatozoa  at  1-hour  treatment,  for  the  lowest  percentage  of  abnormalities  at  1-hour treatment.  Significantly  different  results  (p  <0.05)  on  the  anode  and  cathode  sides  in  all  equilibration  time treatments.
Keywords: equilibration, Electric Separating Sperm, Sapera goat
Received: 24 Desember 2021 Revised: 1 Maret 2022 Accepted: 9 April 2022

## PENDAHULUAN
Kambing  Sapera  merupakan  hasil  dari persilangan antara kambing Saanen dan kambing Peranakan  Etawah  (PE).  Kambing  jenis  Sapera ini  adalah  kambing  perah  yang  memiliki produktifitas  susu  yang  tinggi  (Saputro  dkk., 2018).  Persilangan  antara  kambing  Saanen  dan Peranakan Etawa ini menghasilkan Jenis kambing
yang  mempunyai  sifat  mudah  beradaptasi terhadap  iklim  yang  ada  di  Indonesia,  memiliki postur  tubuh  yang  cukup  besar  dan  mampu memproduksi susu yang tinggi serta mudah untuk di  budidayakan  (Batubara  dkk.,  2016;  Lailiyah dkk., 2018).
Usaha dalam menunjang peningkatan populasi kambing Sapera di Indonesia, diperlukan suatu pendekatan bioteknologi reproduksi. Salah
satu  cara  pendekatan  tersebut  melalui  teknologi inseminasi  buatan  (IB)  (Nogueira et  al., 2011). Inseminasi  Buatan  penggunaannya  bertujuan untuk memperbaiki kualitas ternak, meningkatkan  angka  kelahiran,  efisiensi  biaya, mencegah  perkawinan  sedarah  dan  mencegah penularan  penyakit  kelamin  (Gunawan  dkk., 2015). Perkembangan bioteknologi pada Inseminasi  Buatan  sudah  mengalami  kemajuan salah  satunya sexing spermatozoa. Sexing spermatozoa  merupakan  salah  satu  metode  yang dapat dipilih untuk efisiensi usaha peternakan dan pengontrolan  jenis  kelamin  pada  ternak  (Afiati, 2004).  Teknologi sexing pada  spermatozoa memudahkan  peternak  dalam  usaha  peternakan, karena  jenis  kelamin  bibit  yang  diinginkan  bisa disesuaikan  dengan  tujuan  peternakan  tersebut. Peternakan  yang menghasilkan dan memasarkan produk berupa susu, membutuhkan lebih banyak bibit  berjenis  kelamin  betina  daripada  jantan. untuk  meningkatkan  rasio  kelahiran  anakan berjenis  kelamin  betina,  dapat  menggunakan teknologi  inseminasi  buatan  dengan  melakukan sexing terhadap  spermatozoa  (Pasaribu  dkk., 2014).
Teknik-teknik sexing spermatozoa kromosom  X  dan  Y  yang  pernah  dikembangkan adalah  elektroforesis,  sentrifuse,  sedimentasi, pemilihan selektif, perbedaan tekanan, viskositas, filtrasi,  dan  pemilihan  sel  (Priatmoko,  2018). Electric Separating Sperm (ESS) merupakan alat metode sexing elektroforesis  yang  digunakan untuk  memisahkan  spermatozoa  kromosom  X dan  Y  dengan  aliran  listrik  searah,  terdapat  dua elektroda  yang  berbeda  pada  ESS  yaitu  katoda dan  anoda.  Spermatozoa  dengan  kromosom  X akan menuju katoda dan sebaliknya spermatozoa dengan  kromosom  Y  akan  bergerak  menuju anoda  ( Lailiyah  dkk. ,  2018).  Hasil  dari sexing spermatozoa digunakan  untuk inseminasi buatan dipengaruhi oleh proses pembekuan spermatozoa, masalah  yang  sering  timbul  pada  proses pembekuan  adalah  pengaruh cold  shock yang dapat  merusak  membran  plasma  sel  pada  saat pembekuan  serta  terjadi  pembentukan  kristal- kristal  es  dan  berakibat  kematian  spermatozoa. Penambahan  krioprotektan  seperti  gliserol  dapat mengatasi  rendahnya  kualitas  spermatozoa
karena  peranan  gliserol  dapat  masuk  ke  dalam spermatozoa  menggantikan  kristal  es  yang terbentuk  (Takdir  dkk.,  2017).  Menurut  Mumu (2009),  efisiensi  gliserol  pada  masa  pembekuan sangat  ditentukan  oleh  proses  ekuilibrasi  yang merupakan periode yang diperlukan spermatozoa sebelum  pembekuan  untuk  menyesuaikan  diri dengan  diluter,  sebagai  upaya  dalam  waktu pembekuan kematian spermatozoa yang berlebihan dapat di cegah.

## METODE PENELITIAN

## Sampel Penelitian
Sampel  Penelitian  yang  digunakan  yaitu semen  Kambing  Sapera  yang  berasal  dari  satu ekor  pejantan  unggul  yang  berusia  2-3  tahun . Pengambilan  semen  dilakukan  satu  kali  dalam seminggu dan besar sampel diambil berdasarkan rumus  Rancangan  Acak  Lengkap  dengan  3 perlakuan yang didapatkan 6 kali ulangan.

## Alat dan Bahan
Bahan  untuk  pemeriksaan  hidup  dan  mati spermatozoa yaitu pewarna Eosin-Nigrosin, Nacl fisiologis,  gelas  objek,  gelas  penutup.  Bahan diluter semen yaitu Tris Kuning Telur.
Bahan untuk pemeriksaan membran plasma spermatozoa yaitu hyposmotic swelling test (HOS Test)  dilakukan  dengan  cara mencampur  0,1  ml semen  dengan  9,9  ml  medium hipoosmotik. Medium  hipoosmotik  dibuat  dengan melarutkan 0,3 gram fruktosa dan 0,7 gram NaCitrat kedalam 100  ml  aquabidestilata.  Sediaan  yang  sudah dicampurkan  kemudian  di  inkubasi  dalam waterbath bersuhu  37 0 C  selama  30  menit (Rodriguez et al., 1994).
Alat  yang  digunakan  untuk  penelitian meliputi: vagina buatan kambing lengkap dengan tabung  penampung  berskala  iwaki ® ,  air  panas (40-52 o C),  thermometer  100 o C,  gelas  ukur iwaki ® ,  gelas  beker  iwaki ® , erlenmeyer iwaki ® , kertas  pH indicator  universal,  micropipet , pemanas  bunsen,  pengaduk,  pipet  pasteur, counter , aluminum foil , kertas saring, mikroskop binocular  Nicon  Eclips E200  LED,  microskop, timbangan  mikro  ohaus,  pinset, show  case dan ESS.

## Penampungan Semen
Penampungan  semen  kambing  Sapera menggunakan  vagina  buatan.  Vagina  buatan merupakan alat yang dirancang untuk menstimulasikan  reproduksi  saluran  betina dengan  keunggulan  mudah  digunakan,  semen yang  dikumpulkan  umumnya  relatif  bersih  dan Ejakulasi mirip dengan ejakulasi alami (Matshaba,  2010;  Munyai,  2012).  Semen  yang sudah  ditampung  harus  memiliki  kualitas  yang baik  dengan  dilakukan  pemeriksaan  secara makroskopis  dan  mikroskopis.  Pemeriksaan makroskopis  terdiri  atas  pemeriksaan  volume semen, warna, bau, dan konsistensi (kekentalan), sedangkan  pemeriksaan  mikroskopik  bertujuan untuk  mengevaluasi  motilitas  (gerakan  individu spermatozoa), gerakan massa, konsentrasi, viabilitas,  abnormalitas,  dan  membran  plasma utuh (Susilowati dkk., 2010).

## Metode ESS dan Pemeriksaan Spermatozoa
Proses sexing spermatozoa dengan alat ESS dilakukan  dengan  penyampuran  semen  dan diluter (larutan A) terlebih dahulu.. Larutan A ini merupakan larutan yang dimasukan kedalam alat ESS, yang nantinya larutan A akan dicampurkan oleh larutan B pada proses ekuilibrasi . Proses ekuilibrasi dimulai dengan penampungan  semen  kambing  Sapera  kemudian di  lihat  kualitas  makroskopis  meliputi  volume, warna, bau, konsistensi dan mikroskopis meliputi viabilitas  dan  abnormalitas,  setelah  pemeriksaan semen  selesai  dan  dinyatakan  baik  dengan presentasi progresif yang layak tidak kurang dari 70%  maka  selanjutnya  di  lakukan  penambahan diluter dengan tris kuning telur, setelah dilakukan pencampuran,  kemudian  dilakukan  mekanisme sexing  s permatozoa  dengan  menggunakan  ESS yang selanjutnya dilakukan penambahan gliserol 6%.  Penambahan  gliserol  dilakukan  dengan membuat dua diluter yaitu antara larutan A yang berisi  (diluter  dan  semen),  dan  larutan  B  berisi (gliserol dan diluter). Diluter beserta glisrol telah dicampur  maka  masukan  ke  dalam  tabung microtube sesuai volume yang sudah di tentukan dengan  rumus  pegenceran,  kemudian  setelah selesai  dimasukan  kedalam  lemari  pendingin dengan  suhu  5 0 C,  setelah  dimasukan  kedalam
lemari  pendingin  di  tunggu  waktu  ekuilibrasi selam 1 jam, 3 jam , dan 4 jam sedangkan setiap jamnya dilakukan pengecekan secara makroskopis dan mikroskopis meliputi motilitas, viabilitas, membran plasma utuh, dan abnormalitas.

## Analisis Data
Analisis pada penelitian ini menggunakan uji ANOVA apabila  terdapat  perbedaan,  dilanjut dengan uji Duncan  untuk mengetahui perbedaan yang nyata antar perlakuan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Semen segar kambing Sapera sebelum diberi perlakuan terlebih dahulu dilakukan pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis untuk mengetahui semen layak atau tidak sebelum dilakukan proses selanjutnya.  Rata-  rata  volume  semen  Kambing Sapera  1,07  ml  ±  0,10.  pH  rata-rata  semen kambing  Sapera  6,8%.  Motilitas  spermatozoa kambing Sapera rata-rata adalah 85%±3,16 yang artinya  spermatozoa  kambing  Sapera  yang bergerak progresif 85% dengan kecepatan 3 yang menandakan spermatozoa bergerak dengan cepat. Viabilitas  spermatozoa  kambing  Sapera  berkisar 89%  sampai  95%  dengan  rata-rata  91%±2,73 perhitungan  spermatozoa  dilakukan  pada  100 spermatozoa. Abnormalitas spermatozoa kambing  Sapera  berkisar  antara  2  sampai  5%
dengan rata-rata 3,0%±1,41 perhitungan dilakukan pada 100 Spermatozoa (Tabel 1).
Data  persentasi  motilitas  kambing  Sapera setelah diberi perlakuan waktu ekuilibrasi dengan tiga perlakuan menunjukan rata-rata dan standart deviasi berturut-turut yaitu (P1) sebesar 71,50%±3,94,  (P2)  sebesar  66,00%±2,60,  dan (P3)  sebesar  60,33%±2,42.  Data  presentasi viabilitas spermatozoa Kambing Sapera setelah di berikan  perlakuan  waktu  ekuilibrasi  dengan  tiga perlakuan  yaitu  menunjukan  rata-rata  dan standart  deviasi  berturut-turut  yaitu  P1  sebesar 83,00%±6,16,  P2  sebesar  75,17%±4,70,  dan  P3 sebesar  69,00%±3,40.  Data  presentasi  membran plasma utuh spermatozoa kambing Sapera setelah diberi  perlakuan  waktu  ekuilibrasi  dengan  tiga perlakuan menunjukan rata-rata dan standard
Tabel 1. Waktu ekuilibrasi before freezing spermatozoa kambing Sapera pasca ESS Mortalitas Viabilitas Membran Plasma Abnormalitas Normalitas Anoda Katoda Anoda Katoda Anoda Katoda Anoda Katoda Anoda Katoda P1 62.50 a ± 6.124 67.50 a ± 6,124 74.83 a ± 3.371 74.83 a ± 3.312 68.83 a ± 2.787 70.50 a ± 3.146 4.17 a ± 1.169 3.50 a ± 1.049 95.83 a ± 1.169 96.50 a ± 1.049 P2 50.00 b ±4,472 51.67 b ± 4.082 58.00 b ± 2.098 57.50 b ± 4.087 51.33 b ± 1.751 52.00 b ± 3,162 6.17 b ± 1.169 5.17 b ± 1.169 93.83 b ± 1.169 1.169 b ± 1.169 P3 34.17 c ± 4,916 35.00 c ± 6,325 46.33 c ± 1.506 46.67 c ± 2.160 40.17 c ± 2.483 40,83 c ± 2,317 8.33 c ± 1.211 8.33 b ± 0.8161 91.67 c ± 1.211 91.67 c ± 0.8161
Superskrip berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (p<0,05).
Perlakuan ekuilibrasi dilakukan selama 1 jam (P1), 3 jam (P2), dan 4 jam (P3).
deviasi berturut-turut yaitu P1 sebesar 79.50%±8.50, P2 sebesar 72.67%±5,28, dan (P3) sebesar 65.67%±3),78. dapat dilihat pada Tabel 1. Data presentasi abnormalitas spermatozoa Kambing  Sapera  setelah  diberi  perlakuan  waktu ekuilibrasi dengan tiga perlakuan yaitu menunjukan  rata-rata  dan  standar  deviasi berturut-turut  yaitu  (P1)  sebesaar  2,50%±0,55, (P2)  sebesar  3,33%±1,18,  dan  (P3)  sebesar 6,50%±2,88.  1  jam  (P1),  3  jam  (P2)  dan  4  jam (P3).
Hasil analisis statistik dengan menggunakan Anova  One  Way  dan  dilanjutkan  dengan  Uji Duncan,  menunjukan  bahwa  terdapat  efek perbedaan waktu ekeulibrasi memberikan perbedaan nyata (p<0,05) terhadap motilitas  dan viabilitas  spermatozoa  kambing  Sapera.  Waktu ekuilibrasi  1  jam  (P1)  menunjukan  perbedaan nyata dengan waktu ekuilibrasi 3 jam (P2) dan 4 jam  (P3),  terhadap  membran  plasma  utuh spermatozoa  kambing  Sapera.  Waktu  ekuilibrasi 1 jam (P1) menunjukan perbedaan nyata dengan waktu ekuilibrasi 4 jam (P3), waktu ekuilibrasi 3 jam  (P2)  menunjukan  hasil  tidak  berbeda terhadap waktu ekuilibrasi 1 jam (P1), dan waktu 4  jam  (P3)  menunjukan  bahwa  abnormalitas waktu  ekuilibrasi  1  jam  (P1)  menunjukan perbedaan nyata dengan waktu 4 jam (P3) waktu 3  jam  (P2)  juga  menunjukan  perbedaan  nyata pada  waktu  4  jam  (P3),  sedangkan  waktu ekuilibrasi 3 jam (P2) tidak berbeda nyata dengan waktu 1 jam (P1) (Tabel 1).
Indikator  yang  bisa  digunakan  untuk mengetahui  kromosom  penentuan  jenis  kelamin yang  terkandung  pada  kepala  spermatozoa  yaitu ukuran  kepala  spermatozoa.  Ukuran  kepala spermatozoa  pada  kambing  memiliki  rata-rata panjang 8,5 µm, lebar 4,2 µm, luas 29 µm, dan
keliling 17 µm. Spermatozoa mengandung gugus yang  bermuatan  berbeda,  Spermatozoa  yang mengandung DNA lebih dari 4% pada kromosom X  menyebabkan  adanya  perbedaan  muatan. Perbedaan muatan tersebut menyebabkan spermatozoa dengan kromosom X akan bergerak menuju kutub positif. Muatan yang terdapat pada spermatozoa  dipengaruhi  oleh  kandungan  ion kalium  intraseluler.  Spermatozoa  yang  memiliki kandungan  ion  kalium  lebih  besar,  diasumsikan memiliki muatan positif sehingga akan berenang menuju sisi katoda. Begitu pula sebaliknya, pada spermatozoa  yang  mengandung  lebih  sedikit  ion kalium  dianggap  memiliki  muatan  negatif sehingga  akan  bergerak  menuju  sisi  anoda ( Lailiyah dkk. , 2018).
Mekanisme pendeasaan dan migrasi spermatozoa pada epididimis, terjadi rekasi kimia dengan asam silikat dan membran glikopolipeptida  pada  CD52.  CD52  adalah  gen penyandi  protein  sekretori  yang  terekspresi spesifik  pada  cauda  epididimis  dan  regulasinya dipengaruhi  oleh  androgen  faktor  testikular  dan perkembangan  pasca  lahir  (Permatasari,  2015). CD52 yang menyebabkan permukaan spermatozoa mengandung muatan negatif. Ekpresi  yang  ditunjukkan  oleh  CD52  tersebut normal  terjadi  pada  morfologi  dan  kapasitasi spermatozoa  dan  merupakan  landasan  dari metode sexing spermatozoa dengan elektroforesis (Parati et al. , 2006).
Penentuan  jenis  kelamin  pada sexing spermatozoa didasarkan pada kandungan kromosom yang terdapat pada kepala spermatozoa.  Spermatozoa  kromosom  X  yang membuahi  sel  telur  akan  menghasilkan  embrio berjenis kelamin betina, sedangkan kromosom Y akan menghasilkan embrio jantan. Kromosom X
dan Y dapat dibedakan berdasarkan muatan listrik permukaan,  ukuran,  protein  makromolekul, perbedaan  efek  terhadap  pH  dan  efek  terhadap tekanan udara (Malik et al ., 2011).
Berdasarkan  muatan  listrik  yang  terdapat pada permukaan sel spermatozoa, maka pemisahan spermatozoa kromosom X dan Y bisa dilakukan  dengan  memanfaatkan  muatan  listrik. Spermatozoa  jika  diletakkan  pada  daerah  yang mengandung muatan listrik, maka spermatozoa Y akan  dipindahkan  menuju  anoda  (Aitken  dan Ainsworth ,  2012).  Pemisahan  spermatozoa menggunakan  arus  listrik  mampu  menyebabkan terbentuknya reactive  oxygen  species (ROS), karena  tegangan  listrik  tersebut  akan  berubah menjadi  panas.  Panas  yang  terjadi  dapat menyebabkan kerusakan sel terutama pada lipid, protein dan DNA (Priyanto dkk., 2015). Electric Separating  Sperm (ESS)  bekerja  pada  tegangan listrik  rendah  yaitu  1.5  Volt.  Tegangan  listrik yang rendah ini dapat meminimalisir pembentukan ROS. Berdasarkan penelitian yang dilakukan  oleh Lailiyah  dkk. (2018),  alat  ini mampu  memisahkan  kromosom  X  dan  Y  pada spermatozoa  dalam  waktu  yang  relatif  singkat pada domba Merino.
Hasil temuan kami ekuilibrasi 1 jam pada P1 menunjukan motilitas yang baik. Waktu ekuilibrasi  merupakan  waktu  yang  dibutuhkan spermatozoa beradaptasi dengan diluter agar saat pembekuan kematian spermatozoa dapat dicegah (Apriyanti, 2012). Kerusakan spermatozoa akibat pembekuan terjadi karena peningkatan konsentrasi elektrolit, dehidrasi, dan terbentuknya kristalisasi es intraselular yang dapat mempengaruhi permiabilitas dinding sel sehingga spermatozoa kehilangan daya motilitasnya (Kwon et al. , 2002).
Waktu ekuilibrasi  yang  tepat dapat memicu gliserol yang berada di dalam diluter Tris kuning telur mencapai keseimbangan elektrolit intra dan ekstraseluler sehingga dapat melindungi terbentuknya  kristalisasi  pada  spermatozoa  dan kerusakan spermatozoa disaat proses pembekuan dapat  dicegah  (Anggarsari,  2015).  Penurunan motilitas spermatozoa dapat terjadi karena sudah terbentuknya asam laktat sehingga menghasilkan motilitas  progresif  yang  lebih  rendah  (Suryani,
2012).  Motilitas  yang  tinggi  pada  spermatozoa juga  membutuhkan  energi  yang  tinggi,  yang dihasilkan dari metabolisme mitokondria sehingga menyebabkan tingginya tingkat reactive oxygen  spesies (ROS)  sehingga  viabilitas spermatozoa  akan  menurun  (Susilowati  dkk ., 2010).
Pengaruh waktu ekuilibrasi terhadap presentasi  viabilitas  dan  membran  plasma  utuh spermatozoa  kambing  Sapera  setelah  diberi perlakuan menunjukan perbedaan nyata (p<0.05) antara, waktu ekuilibrasi 1 jam (P1), 3 jam (P2) , dan  4  jam  (P3).  Viabilitas  dan  membran  plasma utuh  spermatozoa  tertinggi  terdapat  pada perlakuan  P1  dengan  waktu  ekuilibrasi  1  jam. Waktu ekuilibrasi 1 jam pada temuan kami sudah terjadi  keseimbangan  elektrolit  dengan  gliserol secara  baik  dan  merata  di  dalam  spermatozoa sehingga  kerusakan  selama  proses  pembekuan dapat  diminimalisir.  Kerusakan  pada  membran plasma  spermatozoa  yang  akan  membuat viabilitas  spermatozoa  menjadi  rendah  dapat disebabkan  efek  waktu  ekuilibrasi  yang  lama (Apriyanti, 2012), selain itu penurunan viabilitas spermatozoa  dikarenakan  perubahan  biokimia karena  kerusakan  membran,  osmotik  dan cold shock yang berkaitan dengan Penurunan suhu dan durasi penyimpanan (Susilowati dkk., 2010).
Penurunan persentase viabilitas spermatozoa disebakan  oleh  kondisi  membran  plasma  yang telah  rusak.  Membran  plasma  spermatozoa berfungsi  sebagai  penjaga  organel  sel  dan pengatur keseimbangan elektrolit dalam metabolisme (Salmah, 2014). Menurut Susilowati,  (2010)  ROS  memiliki  peran  yang penting  dalam  fosforilasi  tirosin,  oksidasi  sterol, dan penembusan kolesterol dari membran plasma dalam  proses  kapasitasi  spermatozoa  dalam proses  fertilisasi  dan  lemak  dalam  membran plasma spermatozoa kambing memiliki konsentrasi  asam  lemak  tak  jenuh  yang  lebih tinggi  di  bandingkan  ruminansia  lainya.  Karena itu,  dalam  proses  pendinginan,  lemak  dari membran plasma dapat rusak, yang mengakibatkan  peroksidasi  lipid.  Pengamatan membran  plasma  utuh  sangat  penting  karena spermatozoa  yang  memiliki  membran  plasma utuh  akan  dapat  mempertahankan  kehidupannya
dan  berhasil  dalam  proses  pembuahan.  Fungsi dari  membran  plasma  adalah  mengatur  keluar masuknya  zat-zat  makanan,  melindungi  organel organel  intraseluler  secara  fisik,  serta  menjaga keseimbangan  elektrolit  intra  dan  ektraseluler (Takdir dkk., 2017).
Abnormalitas spermatozoa merupakan penyimpangan  bentuk  morfologi  dari  struktur spermatozoa  normal.  Abnormalitas  spermatozoa di bagi menjadi dua yaitu abnormalitas primer dan abnormalitas  skunder.  Abnormalitas  primer merupakan  kelainan  spermatogenesis  sejak berada  di  dalam  tubulus  seminifirus  berupa kelainan yang meliputi ukuran kepala macrochepalic atau microchepalic , kepala pendek  melebar,  pipih  memanjang,  piriformis, kepala  rangkap,  ekor  ganda,  bagian  tengah melipat, membengkok, membesar, ekor melingkar,  putus  dan  terbelah  (Hardijanto  dkk., 2010).
Abnormalitas sekunder merupakan kelainan yang  terjadi  sesudah  spermatozoa  meninggalkan tubulus  seminifirus  selama  perjalanan  melalui epididimis,  selama  ejakulasi,  manipulasi  dan perlakuan lainyaPerbedaan presentasi abnormalitas  spermatozoa  pada  setiap  perlakuan dikarenakan  dalam  larutan  diluter  keseimbangan intraseluler dan ekstraseluler dengan spermatozoa tidak  stabil  karena  adanya  penurunan  suhu  pada saat  ekuilibrasi  (Tuhu, et  al., 2013).  Menurut Herdiawan,  (2004)  perbedaan  konsentrasi  cairan intraseluler dengan ekstraseluler akan menimbulkan  perubahan  tekanan  osmotik  sel selama pembekuan, sehingga akan menyebabkan selubung  lipoprotein  pecah  dan  membran  sel mengalami  kerusakan.  Kondisi  tersebut  dapat menyebabkan spermatozoa menjadi abnormal.

## KESIMPULAN
Hasil temuan kami waktu ekuilibrasi terbaik didapat pada (P1) dengan perlakuan waktu 1 jam ekuilibrasi di lihat dari hasil kualitas spermatozoa berdasarkan  motilitas,  viabilitas,  dan  membran plasma utuh. Abnormalitas spermatozoa kambing Sapera  menggunakan  tris  kuning  telur  dengan waktu ekuilibrasi terbaik 1 dan 3 jam.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Bumi  Kesilir  Farm  atas  fasilitas  dan  sampel penelitian  yang  telah  disediakan.  Penelitian  juga didanai oleh Universitas Airlangga melalui skema hibah dosen pemula No.613/UN3/2019.

## DAFTAR PUSTAKA
Afiati,  F.  (2004).  Proporsi  dan  karakteristik spermatozoa  X  dan  Y  hasil  separasi  kolom albumin. Media Peternakan , 27(1).
Anggarsari,  L.  Y.  (2015).  Pengaruh  Waktu Equilibrasi terhadap Motilitas dan Viabilitas Spermatozoa  Kambing  Boer After  Thawing dalam  Diluter  yang  Mengandung  Lisitin Nabari.  [Skripsi].  Fakultas  Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Hal: 9-14.
Aitken,  R.  J.,  &  Ainsworth,  C.  J.  (2012).  U.S. Patent No. 8,123,924. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.
Apriyanti, C. (2012). Pengaruh Waktu Ekuilibrasi terhadap  Kualitas  Semen  Beku  Sapi  Pesisir Pre  dan  Post  Thawing.  [Tesis].  Program Studi Ilmu Ternak Universitas Andalas. Hal: 8-16.
Batubara,  A.,  Nasution,  S.,  Subandriyo,  Inounu,
I., Tiesnamurti, B., & Anggraeni, A. (2016). Kambing  Peranakan  Etawah  (PE).  IAARD Press. Jakarta. Hal: 13.
Gunawan,  M.,  Kaiin,  E.  M.,  &  Said  S,.  (2015). Aplikasi  Inseminasi Buatan dengan  Sperma Sexing  dalam  Meningkatkan  Produktivitas Sapi  di  Peternakan  Rakyat.  Prosiding
Seminar Nasional May Biodiversitas Masyarakat. Bogor. Hal: 93-96.
Hardijanto,  Susilowati,  S.,  Sarjito,  T.,  & Suprayogi,  T.  W.  (2010).  Buku  Ajar Inseminasi  Buatan.  Airlangga  University Press. Hal: 20-24, 27-24, 62-63.
Herdiawan,  I.  (2004).  Pengaruh  laju  penurunan suhu  dan  jenis  pengencer  terhadap  kualitas semen  beku  domba  Priangan. Jurnal  Ilmu Ternak Veteriner , 9 (2), 98-107.
Kwon,  Y.  A.,  Ko,  H.  J.,  &  Park,  C.  S.  (2002). Effects of diluent component, freezing rate, thawing  time  and  thawing  temperature  on acrosome  morphology  and  motility  of frozen-thawed boar sperm. Asian- Australasian Journal of Animal Sciences , 15 (11), 1553-1558.
Lailiyah,  F.,  Srianto,  P.,  Saputro,  A.  L., Madyawati, S. P., Agustono, B., & Prastiya, R. A. (2018). Efektifitas daya pisah Electric
Separating Sperm (ESS) terhadap
spermatozoa  kromosom  X  dan  Y  pada kambing  sapera. Jurnal  Medik  Veteriner , 1(3), 93-98.
Malik,  A.,  Haron,  A.W.,  Yusoff,  R.,  Bukar,  M., Kasim, A., & Sabri, M. (2011). Verification Of  X-  And  Y-Spermatozoa  Separation  by Nested  Polymerase  Chain  Reaction  (PCR), Motility and Membrane Integrity in Bovine. African  Journal  of  Biotechnology ,  10(85), 19796-19801.
Matshaba,  B.  (2010).  Characterization  and cryopreservation of South African unimproved indigenous goat
semen  (Doctoral  dissertation,  University  of the Free State). Pp: 34.
Mumu,  M.  I.  (2009).  Viabilitas  semen  sapi simental  yang  dibekukan  menggunakan krioprotektan  gliserol. Agroland:  Jurnal Ilmu-ilmu Pertanian , 16(2).
Munyai, P. H. (2012). Cryopreservation of South African  indigenous  ram  semen  (Doctoral dissertation,  University  of  the  Free  State). Pp: 45.
Nogueira, D. M., Lopes Júnior, E. S., Peixoto, R.
M.  D.,  Christilis,  M.,  Martins,  S.  R.,  &
Monte, A. P. O. D. (2011). Using the same CIDR  up  to  three  times  for  estrus synchronization  and  artificial  insemination in  dairy  goats.  Acta  Scientiarum. Animal Sciences , 33, 321-325.
Parati, K., Bongioni, G., Aleandri, R., & Galli, A. (2006).  Sex  ratio  determination  in  bovine semen: A new approach by quantitative real time  PCR. Theriogenology ,  66(9),  2202- 2209.
Pasaribu, E., Dasrul, D., & Riady, G. (2014). The Effect  of  the  Separation  of  Spermatozoa  X and Y Using Swim up Method on the Quality of  Etawah  Crossbreed  Goats  Spermatozoa.
Jurnal Medika Veterinaria , 8(2).
Priatmoko,  S.  (2018).  Strategi  implementasi pembelajaran  inklusif  gender  di  madrasah ibtida’iyah.  In  PROCEEDING: The  Annual International Conference on Islamic Education , 3(1), 244-257.
Priyanto,  L.,  Arifiantini,  R.  I.,  &  Yusuf,  T.  L.
(2015). Deteksi kerusakan DNA spermatozoa  semen  segar  dan  semen  beku sapi  menggunakan  pewarnaan  toluidine blue. Jurnal Veteriner , 16(1), 48-55.
Rodriguez-Gil, J. E., Montserrat, A., & Rigau, T. (1994).  Effects  of  hypoosmotic  incubation on  acrosome  and  tail  structure  on  canine spermatozoa. Theriogenology , 42 (5),  815- 829.
Salmah,  N.  (2014).  Motilitas,  Presentase  Hidup dan Abnormalitas Spermatozoa Semen Beku Sapi  Bali  pada  Diluter  Andromed  dan  Tris Kuning Telur. [Skripsi]. Fakultas Peternakan Universitas Hassanudin. Makassar. Hal: 51.
Saputro,  A.  L.,  Hamid,  I.  S.,  Prastiya,  R.  A.,  & Purnama,  M.  T.  E.  (2018).  Hidroponik fodder  jagung  sebagai  substitusi  hijauan pakan ternak ditinjau dari produktivitas susu kambing  Sapera. Jurnal  medik  veteriner , 1(2), 48-51.
Suryani,  E.  F.  P.  (2012).  Pengaruh  Waktu Equilibrasi  Terhadap  Motilitas,  Viabilitas dan Integritas Membran Spermatozoa
Domba Merino dalam Diluter yang Mengandung  Lesitin  Nabati.  [Skripsi].
Fakultas  Kedokteran  Hewan  Universitas Airlangga. Surabaya. Hal: 15.
Susilowati,  S.,  Hardijanto,  Suprayogi,  T.  W.,
Sardjito,  T.,  &  Hernawati,  T.  (2010). Penuntun  Praktikum  Inseminasi  Buatan. Universitas Airlangga Press. Surabaya. Hal: 29.
Takdir,  M.,  Ismaya,  &  Bintara,  S.  (2017).
Proporsi  X  dan  Y,Viabilitas  dan  mortilitas Spermatozoa  Domba  Sesudah  Pemisahan dengan  Putih  Telur. Buletin  Peternakan. Yogyakarta , 41(1), 3.
Tuhu,  A.  D.,  Ondho,  Y.  S.,  &  Samsudewa,  D.
(2013). Pengaruh perbedaan waktu pelepasan  water  jacket  dalam  proses ekuilibrasi  terhadap  kualitas  semen  beku sapi jawa pada tahap before freezing dan post thawing. Animal  Agriculture  Journal , 2 (1),
466-477.
***