**   Staf Peneliti LON – LIPI  Jakarta *** Alumnus Departemen Teknologi Hasil Perikanan,  FPIK-IPB
37
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan

## PEMISAHAN EKSTRAK INTRASELULER DARI MIKROALGA
Nitzschia closterium DAN PENENTUAN KONSENTRASI HAMBATAN MINIMUMNYA TERHADAP MIKROBA PATOGEN
Iriani Setyaningsih * , Desniar * , Lyli Pangagabean ** dan Titik Harsita Widyah ***

## Abstrak
Penelitian  ini  dilakukan dengan  tujuan  untuk mengekstrak antimikroba  intraselular  dar Nitzschia closterium ,  menguji  aktivitasnya  dan  menentukan  konsentrasi  hambatan  minimumnya  terhadap  beberapa mikroba patogen.  Kultivasi Nitzschia  closterium, dilakukan dalam f medium dengan kepadatan awal sel sebesar  1,00  x  10 4 sel/ml  dengan  dilengkapi  aerasi,  lampu  neon  serta  dilakukan  pada  suhu  kamar.    Fase eksponensial dicapai pada saat kultivasi awal sampai pada hari ke-7, fase penurunan laju pertumbuhan pada hari  ke-8,  fase  stasioner  pada  hari  ke-9  sampai  hari  ke-47,  dan  fase  kematian  dimulai  pada  hari  ke-48. Pemisahan  biomassa  dilakukan  dengan  menggunakan  sentrifus,  selanjutnya  dikeringkan  dan  ditambah pelarut  metanol  dan  sel  dipecah  menggunakan  soniprep.    Kemudian  disaring  dan  pelarutnya  diuapkan sehingga  diperoleh  ekstrak  kasar  intraseluler.    Hasil  pengujian  aktivitas  menunjukkan  bahwa  ekstrak intraseluler  dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri Eschericia  coli,  Salmonella  typhii dan  kapang Penicillium sp., tetapi  tidak  menghambat Aspergillus  niger. Nilai  konsentrasi hambatan  minimum  untuk E. Coli dan S. typhii terjadi pada konsentrasi 2000 ppm dengan potensi hambatan masing-masing 30-40 % dan 29,41-35,29 %.
Kata kunci: Nitzschia , mikroalga, bahan aktif.

## PENDAHULUAN
Mikroalga  merupakan  salah  satu  biota  perairan  yang  memiliki  potensi  sebagai penghasil  bahan  aktif  dan  bahan  kimia  yang  bermanfaat  untuk  industri  farmasi,  kimia, kosmetik,  pertanian  dan  lainnya.    Namun  di  Indonesia,  pemanfaatan  mikroalga  masih terbatas sebagai pakan alami.
Sejumlah  peneliti  menyatakan  pendapatnya  secara  pasti  bahwa  beberapa  spesies mikroalga  menghasilkan  metabolit  sekunder  yang  dapat  menghambat    pertumbuhan mikroorganisme  lain.    Selain  vitamin,  asam  amino,  karbohidrat  dan  nutrien  lainnya, mikroalga  juga  mengandung  komponen  aktif  biologi    yang  didalamnya  juga  termasuk antibiotik,  algasidal,  racun,  komponen  aktif  farmasi  (antitumor,  antikanker),  komponen pemacu pertumbuhan.
Hellebust  (1879) yang dikutip Stewart  (1974)  menyatakan  bahwa  mikroalga menghasilkan  metabolit  sekunder  yang  berlimpah  dalam  selnya,  yang  disebut  dengan subtansi intraseluler dan menghasilkan ekstraseluler yang disekresikan dari sel ke medium pertumbuhannya.  Metabolit sekunder yang berupa karbon organik lebih banyak dihasilkan pada  fase  lag  dan  fase  stasioner  daripada  fase  log.    Akan  tetapi  tidak  setiap  pada  kondisi suatu  metabolit  dapat  dihasilkan,  tergantung  pada  pH,  salinitas,  kondisi  aerob/anaerob, cahaya dan nutrien (Hellebust, 1879 yang dikutip Stewart, 1974).
Salah satu mikroalga yang memiliki  potensi untuk menghasilkan antimikroba adalah Nitzschia  closterium .    Hasil  penelitian  Santioso  (1998),  menunjukkan  bahwa Nitzschia  closterium mengandung  antimikroba  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan bakteri  gram  negatif  ( Pseudomonas sp.  dan Escherichia  coli )  dan  bakteri  gram  positif ( Basillus subtilis ).
Senyawa antimikroba adalah senyawa kimia yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme.  Antimikroba sebagai subtansi, dapat berupa senyawa kimia sintetik atau produk alami (Brock and Madigan, 1994).
Beberapa faktor yang mempengaruhi kerja dari senyawa antimikroba (antibakteri dan antifungal),  antara  lain  konsentrasi  antibakteri  yang  digunakan,  jumlah  dan  spesies bakteri/kapang, suhu, keberadaan bahan organik lain, dan pH (Pelczar dan Chan, 1986).
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  ekstraksi  antimikroba  intraseluler  dari Nietzschia closterium , menguji aktivitas ekstrak intraseluler yang dihasilkan Nitzschia  closterium terhadap  beberapa  patogen  dan  menentukan  hambatan  konsentrasi minimum  ekstrak    intraseluler Nitzschia  closterium dalam  menghambat  pertumbuhan beberapa mikroba patogen.

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah Nitzschia  closterium yang diperoleh  dari  Puslitbang  Oseanologi  –  LIPI,  Jakarta.    Medium  yang  digunakan  untuk kultivasi adalah F medium dengan penambahan air laut.  Sedangkan bahan untuk pengujian aktivitas antimikroba meliputi nutrient broth, nutrient agar, potato dextrose agar , DMSO, streptomycin dan sebagainya.
Alat-alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  meliputi  erlenmeyer,  lampu  neon, aerator,  mikropipet,  mikroskop,  hemasitometer,  sonikator,  cawan  petri,  desikator,  vortex, laminar flow , inkubator, refrigerator, otoklaf dan sebagainya.

## Metode
Kultivasi  dilakukan  dengan  menggunakan  erlenmeyer  yang  dilengkapi  dengan aerasi,  lampe  neon  sebagai  sumber  cahaya  dan  dilakukan  pada  suhu  ruangan.    Selama kultivasi  diamati  perkembangan  jumlah  sel  untuk  mendapatkan  jumlah  pertumbuhannya. Penghitungan sel dilakukan setiap hari.
Kultur mikroalga dilakukan dalam gelas erlenmeyer dengan cara memindahkan stok kultur  ke  dalam  medium.    Media  yang  digunakan  merupakan  modifikasi  F  medium Guillard  dan  Ryther  yang  dilakukan  oleh  Puslitbang  Oseanologi,  LIPI.    Kultur  mikroalga ini  dilakukan  dalam  keadaan  aseptik,  pada  suhu  ruangan  antara  26  –  30 o C  dan  diberi cahaya  lampu TL 20 watt dengan  jarak 15 cm.  Kultur diberi aerasi  melalui selang  silikon yang diberi kapas, yang berfungsi sebagai saringan udara.  Pengukuran kurva pertumbuhan diatom Nitzschia  closterium dilakukan  setiap  hari  dengan  menggunakan  hemasitometer dengan pembesaran 40 kali dan metode perhitungannya berdasarkan Mujiman (1984).
Untuk proses ekstraksi, pengambilan sampel dilakukan pada fase stasioner hari ke- 20.    Kultur  dipisahkan  antara  biomassa  dan  filtrat  dengan  sentrifuse  selama  30  menit dengan  kecepatan  3000  rpm  pada  suhu  ruang.    Ektraksi  berdasarkan  modifikasi  metode yang  digunakan  oleh    Naviner et  al. (1998).    Biomassa  yang  didapat  dikeringkan  dengan f reeze dryer selama  24 jam  atau sampai kering pada suhu  90 o C.  Biomassa yang telah dikeringkan kemudian dimasukkan ke  dalam erlenmeyer 100  ml dan ditambahkan pelarut metanol dengan perbandingan 1 : 25 (b/v).   Selanjutnya biomassa dipecah dengan sonikasi selama 5 menit per 5 ml sampel, kemudian larutan ekstrak biomassa disaring dengan kertas saring  whatman  no.  42,  lalu  diuapkan  dalam  desikator.    Hasilnya  merupakan  ekstrak intraseluler.
Pengujian  ekstrak  intraseluler  dilakukan  terhadap  mikroba  uji  dengan  konsentrasi ekstrak  untuk  bakteri  sebesar  2500,  2000,  500,  dan  250  ppm  (mg/L)  dan  untuk  kapang sebesar  2500,  2000,  dan  1000  ppm  (mg/L).    Ekstrak  tersebut  terlebih  dahulu  dilarutkan kedalam pelarut d imetil sulfoksida (DMSO).  Selajutnya suspensi bakteri dan kapang yang ditumbuhkan dalam media pertumbuhannya disuspensikan  dengan akuades hingga dicapai kekeruhan  25  %  T  dan  sebanyak  25  l  suspensi  mikroba  tersebut  dimasukkan  ke  dalam cawan petri dan dituangkan nutrien agar sebanyak 15 ml, diratakan dan didiamkan sampai membeku.    Setelah  itu paper  disch yang  berisi  25  l  ekstrak  intraseluler Nietzschia  closterium diletakkan  diatas  permukaan  agar,  diinkubasi  selama  12  –  18  jam pada suhu 30 o C (Sherley, 1998).  Selanjutnya diukur diameter penghambatannya dengan cara  mengukur  diameter  areal  bening  dikurangi  diameter paper  disch ,  selain  itu  juga dihitung nilai potensinya.
Rumus perhitungan uji antimikroba :
Potensi =   Diameter hambatan senyawa yang diperiksa              x 100% Diameter senyawa kontrol dengan konsentrasi sama

## HASIL PEMBAHASAN
Selama  kultivasi Nietzschia  closterium dilakukan  penghitungan  jumlah  sel  hingga dapat  kurva  pertumbuhannya.    Fase  lag  (adaptasi)  pada  kultur  tidak  terdeteksi  sehingga kultur telah  mulai  memasuki  fase eksponensial (fase  log) pada saat kultivasi  awal  sampai hari ke- 7 dengan kepadatan 1,00 x 10 4 sel/ ml sampai 5,98 x 10 5 sel/ml,  kemudian diikuti fase  penurunan  laju  pertumbuhan  pada  hari  ke-  8  dengan  kepadatan  sel  sebesar  antara 4,5  x  10 5 sel/ml,  fase  stasioner  dimulai  pada  hari  ke-  9  sampai  hari  ke-  47  dengan kepadatan sel antara 4,5 x 10 5 sampai 7,57 x 10 5 sel/ml dan diikuti dengan fase kematian yang dimulai pada hari ke- 48.
Pemanenan dilakukan pada  fase pertengahan stasioner kultur Nitzschia closterium, yaitu  hari  ke-  20  dengan  jumlah  kultur  sebanyak  1900  ml.    Berdasarkan  hasil  pemisahan dan pengeringan beku diperoleh biomassa sebesar 34,2278 gram per berat basah dan 1,8989 gram per berat kering atau sekitar 5,55 % per berat basah biomassanya.   Setelah dilakukan ekstraksi  dengan  penambahan  pelarut  organik  metanol,  diikuti  dengan    pemecahan  sel menggunakan soniprep, penyaringan dan penguapan diperoleh ekstrak intraseluler sebesar 1,5623 gram per berat kering atau  82, 27 % dari serbuk kasar antimikrobanya.
Hasil  pengujian  aktivitas  ekstrak  intraseluler  terhadap  bakteri  gram  negatif Salmonella  typhii dan Escherichia  coli dapat  dilihat  pada  Tabel  1  dan  Tabel  2.    Hasil pengujian terhadap aktivitas ekstrak intraseluler Salmonella typhii memperlihatkan  bahwa ekstrak intraseluler Nitzschia closterium pada konsentrasi 2000 ppm (mg/L)  menunjukkan adanya zona  bening  yang ukurannya  berkisar antara  5  mm sampai 6  mm dengan potensi sebesar 29,41 – 35,29 %.  Pada konsentrasi 1000 ppm (mg/L), zona bening hambatan yang terbentuk sebesar 3  – 4  mm dengan potensi sebesar 20  – 26,67 %.  Pada konsentrasi 500 ppm  (mg/L),  zona  bening  hambatan  sebesar  3  mm  dengan  potensi  sebesar  20  %. Sedangkan  pada  konsentrasi  250  ppm  (mg/L),  ekstrak  intraseluler Nitzschia  closterium
tidak  menunjukkan  adanya  zona  hambatan  terhadap  bakteri Salmonella  typhii. Nilai konsentrasi hambatan minimum  terjadi  pada  konsentrasi  eksraks intraseluler Nitzschia closterium sebesar 2000 ppm.
Tabel 1.  Diameter  hambatan  ekstrak  intraseluler Nitzschia  closterium terhadap bakteri Salmonella typhii
Jenis mikroorganisme Salmonella typhii Konsentrasi ppm (mg/mL)  Hambatan (mm) Potensi (%) Kontrol (A) 17 Ekstrak Intraseluler (B) 6 35,29 2000 Ekstrak Intraseluler (C) 5 29,41 Kontrol (A) 15 Ekstrak Intraseluler (B) 4 26,6 1000 Ekstrak Intraseluler (C) 3 20 Kontrol (A) 15 Ekstrak Intraseluler (B) 3 20 500 Ekstrak Intraseluler (C) 3 20 Kontrol (A) 11 Ekstrak Intraseluler (B) - 0 250 Ekstrak Intraseluler (C) - 0
Keterangan :  Kontrol = Streptomycin      - = Tidak ada hambatan
Hasil  pengujian  terhadap Escherichia  coli memperlihatkan  bahwa  ekstrak intraseluler Nitzschia  closterium menunjukkan  adanya  zona  bening  hambatan  pada konsentrasi  2000  ppm  (mg/L)  dengan  ukuran  kisaran  sebesar  6  –8    mm  dan    potensinya sebesar  30  –40    %  .    Pada  konsentrasi  1000  ppm  (mg/L),  zona  bening    hambatan  yang terbentuk  sebesar  4-5  mm  dengan  potensi  sebesar  25-31,25  %.    Zona  bening  hambatan yang  terbentuk  pada  konsentrasi  500  ppm  (mg/L)  sebesar  2  mm  dengan  potensi  sebesar
12,5 %.  Pada konsentrasi 250 ppm (mg/L), ekstrak intraseluler Nitzschia closterium tidak menunjukkan    adanya    aktivitas  penghambatan  terhadap    pertumbuhan  bakteri Escherichia  coli. Nilai  konsentrasi  hambatan  minimum  terjadi  pada  konsentrasi  ekstrak intraseluler Nitzschia closterium sebesar 2000 ppm (mg/L).
Tabel 2.   Diameter  hambatan  ekstrak  intraseluler Nitzschia  closterium terhadap bakteri Escherichia coli
Jenis mikroorganisme Escherichia coli Konsentrasi ppm (mg/mL)  Hambatan (mm) Potensi (%) Kontrol (A) 20 Ekstrak Intraseluler (B) 6 30 2000 Ekstrak Intraseluler (C) 8 40 Kontrol (A) 16 Ekstrak Intraseluler (B) 4 25 1000 Ekstrak Intraseluler (C) 5 31,25 Kontrol (A) 16 Ekstrak Intraseluler (B) 2 12,25 500 Ekstrak Intraseluler (C) 2 15,25 Kontrol (A) 11 Ekstrak Intraseluler (B) - 0 250 Ekstrak Intraseluler (C) - 0
Keterangan :  Kontrol = Streptomycin      - = Tidak ada hambatan
Jika  dilihat  dari  nilai  konsentrasi  hambatan  minimum  dan  potensi  dapat  dikatakan bahwa  ekstrak  tersebut  memiliki  potensi  yang  rendah  dalam  menghambat  pertumbuhan bakteri Salmonella  thypii dan Escherichia  coli .    Hal  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak intraseluler  yang  diperoleh  tidak  efektif  digunakan  untuk  menghambat  pertumbuhan  atau membunuh  sel  bakteri Salmonella  thypii dan Escherichia  coli pada  konsentrasi  yang
rendah.  Potensi yang rendah ini diduga karena ekstrak yang diperoleh masih dalam bentuk kasar  dan  efektifitasnya  yang  kecil.    Efektifitas  ekstrak  intraseluler  yang  kecil  ini  diduga karena dalam ekstrak tersebut tidak ada atau sedikitnya kandungan senyawa-senyawa aktif yang  memiliki  struktur  yang  sama  dengan  antibiotik  yang  umum  dipakai  untuk menghambat pertumbuhan  bakteri Salmonella thypii dan Escherichia coli , kerentanan dari bakteri yang diuji, usia bakteri dan kondisi lingkungan.   Antibiotik yang umum digunakan untuk  dapat  menghambat  pertumbuhan  atau  membunuh  bakteri Salmonella  thypii digunakan chloramphenicol,  amphicilin dan co-trimoxazole (Lewis,  1992).    Sedangkan untuk  bakteri Escherichia  coli digunakan  antibakteri sulfanomide,  chloraphenicol, kanamycin dan penicillin (Tortora et al. , 1989).
Berdasarkan hasil pengujian ekstra intraseluler Nitzschia closterium terhadap kedua jenis bakteri tersebut dapat dikatakan bahwa bakteri Salmonella typhii dan Escherichia coli tahan  terhadap  konsentrasi  ekstrak  intraseluler  yang  rendah.    Hal  ini  diduga  disebabkan bakteri  tersebut  merupakan  bakteri  gram  negatif  yang  memiliki  struktur  dinding  sel  yang tebal  dan  berlapis-lapis  yang  terdiri  dari  peptidoglikan,  lipopolisakarida  dan  lipoprotein. Adanya  lapisan  ini  menyebabkan  dinding  sel  tidak  mudah  dipisahkan  dari  senyawa  aktif (Moat, 1988).
Selain itu kerentanan bakteri terhadap antimikroba dapat disebabkan karena bakteri memproduksi  enzim  yang  dapat  melakukan  inaktivasi  antimikroba,  terjadi  gangguan permeabililtas  membran  sel  sehingga  tidak  tercapai  konsentrasi  antimikroba  yang  efektif didalam  sel  dan  terjadi  modifikasi  pada  molekul  dalam  sel  yang  merupakan  target antimikroba (Neu, 1992 dalam Yuliani, 1999).
Hasil pengujian aktivitas ekstrak intraseluler terhadap kapang Aspergillus niger dan Penicillium sp  dapat  dilihat  pada  Tabel  3.    Hasil  pengujian  ekstrak  intraseluler Nitzschia  closterium terhadap  kapang Aspergillus  niger dan Penicillium sp  tidak
menunjukan adanya aktivitas penghambatan pada beberapa konsentrasi yang diujikan, yaitu 2500, 2000 dan 1000 ppm (mg/L), sehingga dapat dikatakan bahwa ekstrak tersebut belum memiliki aktivitas sebagai zat antifungi.
Tabel 3.  Diameter  hambatan  ekstrak  intraseluler Nitzschia  closterium terhadap kapang Aspergillus niger dan Penicillium sponge
Jenis mikroorganisme Aspergillus niger Penicillium sp
Konsentasi ppm (mg/mL)  Hambatan (mm) Potensi (%)  Hambatan (mm) Potensi (%) Kontrol (A) - - - - Ekstrak Intraseluler (B) - - 5 - 2500 Ekstrak Intraseluler (C) - - 2 - Kontrol (A) - - - - Ekstrak Intraseluler (B) - - 1 - 2000 Ekstrak Intraseluler (C) - - 0 - Kontrol (A) - - - - Ekstrak Intraseluler (B) - - - - 1000 Ekstrak Intraseluler (C) - - - -
Keterangan :  Kontrol = Streptomycin      - = Tidak ada hambatan
Dilihat  kejernihan  zona  penghambatan  yang  dihasilkan  maka  ekstrak  zat  aktif intraseluler  dari  kultur Nitzschia  closterium tergolong  ke  dalam  zat  yang  memiliki  efek statik, yaitu  menghambat pertumbuhan tanpa membunuh sel mikroba tersebut.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Kurva  pertumbuhan Nitzschia  closterium yang  diperoleh  dimulai  dari  fase  log eksponensial  (0-7  hari)  dengan  kepadatan  1,00  x  10 4 sel/  ml  sampai  5,98  x  10 5 se/ml, kemudian fase penurunan laju pertumbuhan (hari ke-8) dengan kepadatan 4,00 x 10 5 sel/ml, fase stasioner (9 – 47 hari) kepadatan sel berkisar antara 4,50  x 10 5 sel/ ml – 7,57 x 10 5 sel/ ml dan diakhiri dengan fase kematian (sejak hari ke-48).
Hasil  ekstraksi  terhadap  biomassa  yang  dihasilkan  mikroalaga Nitzschia  closterium yaitu  berupa ekstrak intra seluler dengan rendemen sebesar 1,5623 atau kira-kira 82,27 % dari berat kering serbuk biomassanya.
Ekstrak  intraseluler  yang  dihasilkan  dari Nitzschia  closterium mempunyai  aktivitas penghambatan  terhadap  pertumbuhan Escherichia  coli , Salmonella  typhii dan Penicillium sp,  tetapi  tidak  mempunyai  aktivitas  penghambatan  terhadap  pertumbuhan Aspergillus  niger .      Konsentrasi  hambatan  minimum  bakteri Escherichia  coli dan Salmonella  typhi terjadi  pada  konsentrasi  2000  ppm  (mg/L)  dengan  jumlah  ekstrak intraseluler yang diujikan sebesar 25  l dan nilai potensi masing-masing sebesar 30 – 40 % dan  29,41  –  35,29  %.    Ekstrak  intraseluler Nitzschia  closterium tersebut  memiliki kemampuan  yang  rendah  dalam  menghambat  pertumbuhan  bakteri Escherichia  coli , Salmonella typhii dan Penicillium sp.

## DAFTAR PUSTAKA
Brock TD dan Madigan.  1994.  Biology of Microorganism.  Prentice Hall International.
Lewis  MJ.    1992.  Medical  Microbiology  : Salmonella .      D  Greenwood,  RCB  Slack  dan JF  Peutherer  (Eds.).    Low-Priced  Edition.    ELBS  with  Churchill  Livingstone Educational    low-Priced  Books  Scheme  Funded  by  The  British  Government. Nottingham and Edinburgh.  London.
Moat AG.  1988.  Microbial Physiology.  New York.
Mujiman A. 1984.  Makanan Ikan. Penebar Swadaya. Jakarta.
Naviner  M,    JP    Berge,  P  Durand  dan  H  Lee  Bris.    1999.    Antibacterial  activity  of  the marine  diatom Skeletonema  costatum against  aquacultural  pathogens.    Aquaculture 174 (1999): 15 – 24.
Pelczar  MJ dan ECS Chan.  1986.  Dasar-dasar  Mikrobiologi Jilid 1 dan 2.   Penterjemah RS  Hadioetomo, T Imas, SS Tjitrosomo dan SL Angka.  UI Press.  Jakarta.
Santioso  E.    1998.    Ekstraksi  senyawa    antibakteri  dari  diatom  laut Nitzschia sp    dan  uji aktivitasnya terhadap bakteri gram positif  dan gram negatif.  Jurusan Teknologi Hasil Perikanan.  Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.  Bogor.
Sherley.    1998.    Sintesis  dan  uji  aktivitas  senyawa  analog  antibiotik  UK-3 (2-hidrosinikotinil-heksil-serin-ester  dan  turunannya).    Thesis  Magister  Sain  Ilmu Kimia.    Program  Studi  Ilmu  Kimia,  Program  Studi  Pasca  Sarjana  Universitas Indonesia.  Depok.
Stewart  DP.  1974.  Algal  Physiology  and  Biochemistry.  Blackwell  Scientific  Published. London.
Yuliani E.  1999.  Biodiversitas dan karakteristik senyawa antibakteri dari Streptomyces sp. Jurusan Biologi.  FMIPA.  IPB
Tortora  GJ    dan    DR  Funke  dan  CL  Case.    1989.    Microbiology  an  Introduction.    Third Edition.  The Benjamin/Cummings Publ. Co. Inc., California.