Abstrak —Ketersediaan  fosfat  terlarut  di  dalam  tanah  sangat terbatas karena kecenderungannya terikat dengan mineral tanah membentuk  fosfat  kompleks.  Bakteri  pelarut  fosfat,  salah satunya  adalah Bacillus ,  dapat  digunakan  untuk  membantu ketersediaan  fosfat  terlarut  di  dalam  tanah  sehingga  dapat menggantikan  pupuk  fosfat.  Tujuan  penelitian  adalah  untuk mengetahui  potensi  isolat Bacillus spp.  koleksi  laboratorium Mikrobiologi  dan  Bioteknologi  Biologi  ITS  Surabaya  dalam melarutkan  fosfat.  Potensi  pelarutan  fosfat  dilihat  dari kemampuannya  membentuk  zona  bening  pada  medium Pikovskaya.  Hasil  penelitian  menunjukkan Bacillus S1, Bacillus SS19,  dan Bacillus DA11  mampu  melarutkan  fosfat  secara kualitatif dengan nilai IPF secara berurutan 2,44; 2,34; dan 2,42. Berdasarkan  nilai  IPFnya, Bacillus S1  memiliki  kemampuan melarutkan  fosfat  tertinggi  dibanding  isolat Bacillus SS19  dan Bacillus DA11.
Kata  Kunci — Bacillus ,  fosfat  terlarut,  indeks  pelarutan  fosfat, Pikovskaya .

## I. PENDAHULUAN
OSFOR  merupakan  nutrisi kedua  yang sangat dibutuhkan oleh  tanaman  setelah  nitrogen  [1].  Sebagian  besar  fosfor terdapat  di  alam  dalam  bentuk  fosfat  [2].  Fosfat  dapat berbentuk senyawa organik maupun anorganik. Di alam, fosfat tersedia  dalam  konsentrasi  rendah  karena  fosfat  difiksasi membentuk  kompleks  fosfat  besi,  aluminium,  dan  kalsium yang  tidak  larut.  Kekurangan  fosfat  merupakan  faktor pembatas  pertumbuhan  yang  utama  untuk  tanaman,  sehingga penambahan  pupuk  kimia  berfosfat  dilakukan  untuk mengoptimalisasikan hasil tanaman tersebut [1].
Ketersediaan  fosfat  bagi  tanaman  dapat  ditanggulangi dengan  agen  hayati  berupa  mikroorganisme  yang  mampu melarutkan  fosfat  di  tanah  secara  alami  [3].  Bakteri  yang mampu  melarutkan  fosfat  antara  lain Phyllobacterium , Pseudomonas , Bacillus [4], Rhodococcus , Arthrobacter , Serratia , Chryseobacterium , Delftia , Gordonia , dan Rhizobium [5].  Kelompok  bakteri  pelarut  fosfat  di  lahan Indonesia yang melimpah adalah dari genus Enterobacter dan Mycobacterium [6].  Beberapa  jenis Bacillus yang  mampu melarutkan fosfat yaitu B. megatherium dan B. circulans [7]. Bacillus spp.  yang  disolasi  dari  Kalimas  Surabaya  telah diketahui mampu menghasilkan asam organik dari metabolisme  karbohidrat  [8],  dimana  sekresi  asam  organik merupakan  salah  satu  mekanisme  untuk  pelarutan  fosfat  oleh
bakteri.  Sedangkan  untuk  potensi  pelarutan  fosfat  sendiri, isolat Bacillus dari Kalimas Surabaya belum pernah diteliti. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  isolat Bacillus endogenik  Kalimas  yang  berpotensi  melarutkan  fosfat  secara kualitatif.

## II. METODOLOGI

## A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  dilakukan  sejak  bulan  Desember  2014  sampai dengan  April  2015.  Tempat  penelitian  di  laboratorium Mikrobiologi  dan  Bioteknologi  jurusan  Biologi  Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya.

## B. Subkultur Isolat Uji
Isolat yang digunakan adalah Bacillus koleksi laboratorium Mikrobiologi  dan  Bioteknologi  jurusan  Biologi  Institut Teknologi  Sepuluh  Nopember  Surabaya,  dengan  kode  isolat S1,  SS19,  DA11,  dan Bacillus  cereus ATCC  1178.  Serta Azotobacter chroococcum sebagai  isolat  pembanding.  Isolat diinokulasikan  pada  medium Nutrient  Agar miring  secara aseptik  dengan  metode streak  continue .  Subkultur  diinkubasi 24 jam atau lebih pada suhu ruangan [9].

## C. Medium Pikovskaya
Kemampuan  bakteri  pelarut  fosfat  diseleksi  menggunakan medium  Pikovskaya  [10].  Bahan  untuk  membuat  medium Pikovskaya  per  liternya  adalah  glukosa  10  g;  Ca 3 (PO 4 ) 2 5  g; (NH 4 ) 2 SO 4 0,5 g; NaCl 0,2 g; MgSO 4 .7H 2 O 0,1 g; KCl 0,2 g; yeast ekstrak 0,5 g; MnSO 4 .H 2 O 0,002 g; FeSO 4 .7H 2 O 0,002 g [11]. Semua bahan dilarutkan dengan akuades hingga  volume 1 L dan dihomogenkan. Pembuatan medium Pikovskaya padat dilakukan  dengan  penambahan  agar  sebanyak  15  g.  Medium tersebut  disterilisasi  menggunakan  autoklaf  pada  tekanan  1 atm dengan suhu 121°C selama 20 menit.
D. Uji Pelarutan Fosfat oleh Bacillus secara Kualitatif
Isolat  diinokulasikan  pada  medium  Pikovskaya  agar menggunakan  metode spot  inoculation .  Selanjutnya  kultur diinkubasi  pada  suhu  ruang  [1]  dan  diamati  setiap  24  jam selama  7  hari.  Koloni  yang  membentuk  zona  bening  pada medium Pikovskaya diindikasikan sebagai isolat yang mampu melarutkan  fosfat  Ca 3 (PO 4 ) 2 [12].  Diameter  zona  bening  dan diameter  koloni  dihitung  setiap  24  jam  selama  7  hari  untuk

## Isolat Bacillus Pelarut Fosfat dari Kalimas Surabaya
Nadia Ulfiyati dan Enny Zulaika
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia e-mail : ennyzulaika@bio.its.ac.id
F
mendapatkan  lebar  zona  bening  (LZB)  dan  indeks  pelarutan fosfat (IPF) menggunakan formula (1) dan (2) [1].
(1)
(2)

## III. HASIL DAN DISKUSI
Semua  isolat Bacillus dan Azotobacter  chroococcum berpotensi  melarutkan  fosfat  yang  ditunjukkan  dengan terbentuknya  zona  bening  di  sekitar  koloni  (Gambar  1). Berdasarkan kecepatan terbentuknya zona bening, kemampuan  masing-masing  isolat  dalam  melarutkan  fosfat bervariasi. Bacillus S1  dan Bacillus SS19  membentuk  zona bening  setelah  24  jam  inkubasi, Bacillus  cereus ATCC  1178 pada  jam  48, Azotobacter  chroococcum pada  jam  72,  dan Bacillus DA11 pada jam ke 96. Medium Pikovskaya memiliki warna  putih  keruh  disebabkan  kandungan  trikalsium  fosfat (Ca 3 [PO 4 ] 2 ) sebagai fosfat tidak larut dalam medium [Raharjo et al ., 2007].
Zona bening yang terbentuk di sekeliling koloni merupakan indikasi  bahwa  isolat  mampu  melarutkan  fosfat  kompleks. Zona  bening  pada  agar  dapat  terbentuk  akibat  pelarutan suspensi trikalsium  fosfat (Ca 3 [PO 4 ] 2 ) [1]. Pembentukan zona bening  pada  medium  Pikovskaya  mengindikasikan  bahwa mikroorganisme tersebut dapat melarutkan fosfat [13].
Empat  isolat Bacillus uji  serta Azotobacter  chroococcum mampu melakukan mekanisme pelarutan fosfat, diduga karena kemampuannya  dalam  menghasilkan  asam  organik. Bacillus S1, Bacillus SS19, Bacillus DA11, dan Bacillus cereus ATCC 1178  diketahui  membentuk  asam  melalui  katabolisme  dari beberapa  sumber  gula  [8]. Azotobacter  chroococcum mampu menghasilkan  asam  organik,  seperti  asam  indol  asetat  [14]. Mikroorganisme  mampu  menurunkan  pH  di  dalam  medium tumbuhnya melalui produksi asam organik atau proton-proton yang menyebabkan pelarutan kompleks mineral-fosfat melalui pertukaran  anion  PO 4 2- dengan  anion  asam  atau  pengkhelatan ion  mineral  yang  mengikat  fosfat  [15].  Jika  pH  medium dinaikkan,  maka  fosfat  terlarut  dapat  bereaksi  kembali (refiksasi) dengan ion pengikat [14].
Gambar  1.  Koloni  Isolat  dan  Zona  Bening  yang  Terbentuk  selama  7  Hari (Keterangan:  zb  =  zona  bening;  k  =  koloni  Isolat;  a  = Bacillus S1;  b  = B Bacillus SS19;  c  = Bacillus DA11;  d  = Bacillus  cereus ATCC  1178;  e  = Azotobacter chroococcum ).
Semua  isolat  uji  mengalami  pertambahan  diameter  koloni seiring dengan waktu inkubasi (Tabel 1). Hal ini menunjukkan adanya  pertumbuhan  isolat  pada  medium  Pikovskaya.  Pada hari terakhir pengamatan (7 x 24 jam), Bacillus cereus ATCC 1178  memiliki  diameter  koloni  serta  diameter  zona  bening terkecil,  sedangkan Bacillus SS19  berdiameter  koloni  dan berdiameter  zona  bening  terbesar.  Begitu  pula  lebar  zona bening Bacillus cereus ATCC 1178 merupakan nilai terendah dan Bacillus SS19  memiliki  lebar  zona  bening  tertinggi diantara  isolat  lainnya.  Lebar  zona  bening  merupakan  hasil selisih  antara  diameter  koloni  dengan  diameter  zona  bening. Pada  umumnya,  diameter  zona  bening  akan  mengalami pertambahan  seiring  dengan  bertambahnya  diameter  koloni [1].
Bacillus cereus ATCC 1178 mempunyai nilai IPF tertinggi dibanding  isolat  lainnya,  diikuti  dengan Bacillus S1. Sedangkan Bacillus SS19 memiliki nilai IPF terendah. Indeks pelarutan  fosfat  diperoleh  dari  rasio  diameter  total  (DK  + DZB)  dengan  diameter  koloni.  Besarnya  lebar  zona  bening tidak  selalu  mengindikasikan  banyaknya  jumlah  konsentrasi fosfat  yang  terlarut  [1].  Kemampuan  pelarutan  fosfat  bakteri dapat  dilihat  dari  nilai  indeks  pelarutan  fosfatnya  [16]. Sehingga  berdasarkan  nilai  IPF, Bacillus  cereus ATCC  1178 dan Bacillus S1 memiliki potensi pelarutan fosfat lebih tinggi dibanding isolat uji lainnya.
Mekanisme pelarutan fosfat oleh isolat uji dikaitkan dengan kemampuannya  dalam  menghasilkan  asam  organik.  Semua genus Bacillus di  atas  telah  diuji  menghasilkan  asam  dari metabolisme  glukosa  [8],  dimana  sumber  karbon  pada medium  Pikovskaya  adalah  glukosa.  Asam  organik  diketahui mampu  menurunkan  pH  dan  menyebabkan  pelarutan  fosfat [17].  Meskipun  demikian,  belum  diketahui  jenis  dan  jumlah asam  organik  yang  dihasilkan  masing-masing  isolat Bacillus . Diperkirakan,  jenis  asam  organik  yang  diproduksi  tiap  isolat berbeda, sehingga mempengaruhi kemampuan pelarutan fosfat kompleks  pada  medium.  Aktivitas  pelarutan  fosfat  dapat diketahui dari kemampuan biokimia bakteri dalam menghasilkan  asam  organik,  yang  mampu  mengkhelat  kation (terutama  Ca)  yang  berikatan  dengan  fosfat  melalui  gugus karboksilnya  sehingga  fosfat  lepas  dan  menjadi  terlarut  [5]. Jenis dan jumlah asam organik yang dihasilkan mikroorganisme  pelarut  fosfat  tergantung  dari  strain, komposisi media, kondisi pertumbuhan, dan lainnya [18].
Tabel  1  Lebar  Zona  Bening  dan  Indeks  Pelarutan  Fosfat  setelah  7  Hari Inkubasi No Isolat DK (cm) DZB (cm) LZB (cm) IPF 1 Bacillus S1 0,58 0,82 0,24 2,44 2 Bacillus SS19 0,8 1,05 0,25 2,34 3 Bacillus DA11 0,6 0,84 0,24 2,42 4 Bacillus cereus ATCC 1178 0,43 0,63 0,2 2,52 5 Azotobacter chroococcum 0,52 0,73 0,21 2,40
Keterangan:  DK  =  diameter  koloni;  DZB  =  diameter  zona  bening;  LZB  = lebar zona bening; IPF = indeks pelarutan fosfat
zb k k k k zb k zb (a) (b) (c) (d) (e) zb zb

## IV. KESIMPULAN/RINGKASAN
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan  yang  telah  dilakukan, maka kesimpulan dari penelitian ini adalah:
1. Bacillus S1, Bacillus SS19, dan Bacillus DA11 endogenik Kalimas  mampu  melarutkan  fosfat  secara  kualitatif  yang ditunjukkan  dengan  pembentukan  zona  bening  pada medium  Pikovskaya.  Nilai  IPF Bacillus S1  =  2,44; Bacillus SS19  =  2,34;  dan Bacillus DA11  =  2,42. Demikian pula Bacillus cereus ATCC 1178 memiliki nilai IPF 2,52.
2. Bacillus S1  memiliki  kemampuan  melarutkan  fosfat tertinggi  dibanding  isolat Bacillus SS19  dan Bacillus DA11.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Ibu  Dr.  Enny Zulaika,  M.P.  yang  telah  memberikan  dukungan  melalui pendanaan
PNBP ITS sesuai nomor kontrak: 003246.256/IT2.11/PN.08/2015.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] S. Alam, S. Khalil, N. Ayub, dan M. Rashid, “ In vitro Solubilization of
Inorganic  Phosphate  by  Phosphate  Solubilizing Microorganisms  (PSM) from  Maize  Rhizosphere,”  International  Journal  of  Agriculture  & Biology, Vol. 4, No. 4 (2002) 454-458.
[2] L. S. Clescerl, A. E. Greenberg, dan A. D. Eaton, “Standard Methods for Examination  of  Water  &  Wastewater  20 th Edition,”  Washington,  D.C.: American  Public  Health  Association,  American  Water  Works Association, Water Environment Federation (1999).
[3] A.  A.  Khan,  G.  Jilani,  M.  S.  Akhtar,  S.  M.  S.  Naqvi, dan  M.  Rasheed, “Phosphorus  Solubilizing  Bacteria:  Occurrence,  Mechanisms  and  their Role  in Crop  Production,”  Journal  Agriculture  Biol.  Sci.,  Vol. 1,  No. 1 (2009) 48-58.
[4] H.  Rodríguez  dan  R.  Fraga,  ”Phosphate  solubilizing  bacteria  and  their role  in  plant  growth  promotion,”  Biotechnology  Advances,  Vol.  17 (1999) 319-339.
[5] Y. P. Chen,  P. D. Rekha, A. B. Arun, F. T. Shen, W. A. Lai, dan C. C. Young,  “Phosphate  Solubilizing  Bacteria  from  Subtropical  Soil  and Their  Tricalcium  Phosphate  Solubilizing  Abilities,”  Applied  Soil Ecology, Vol. 34, No. 1 (2006) 33-41.
[6] R.  C.  B.  Ginting,  R.  Saraswati,  dan  E.  Husen,  “Pupuk  Organik  dan Pupuk  Hayati,”  Bogor:  Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian (2006).
[7] P. D. Bajpai dan W. V. B. S. Rao, “Extracellular Production of Organic Acids  by  Selected  Bacteria  Solubilising  Insoluble  Phosphate,”
Phosphate  solubilising  bacteria,  Soil  Science  and  Plant  Nutrition,  Vol.
17, No. 2 (2012) 44-45.
[8] E.  Zulaika,  L.  Sembiring,  dan  A.  Soegianto,  “Characterization  and Identification  Of  Mercury-resistant  Bacteria  From  Kalimas  River Surabaya-Indonesia  By  Numerical  Phenetic  Taxonomy,” Journal  of Basic and Applied Scientific Research, Vol. 2, No. 7 (2012) 7263-7269 .
[9] J. P. Harley dan L. M. Prescott, “Laboratory Exercises in Microbiology
5 th Edition,” U.S.A: McGraw-Hill Publishers (2002).
[10] M. G. Z. Girgis, H. M. A. Khalil, dan M. S. Sharaf, “ In Vitro Evaluation of  Rock  Phosphate  and  Potassium  Solubilizing  Potential  of  Some Bacillus Strains,”  Australian  Journal  of  Basic  and  Applied  Sciences, Vol. 2, No.1 (2008) 68-81.
[11] A.  B.  Saragih,  “Skrining  Bakteri  Pelarut  Fosfat  Adaptif  Vinasse  dari Lahan  Tebu  Pabrik  Gula  Jatiroto  Kabupaten  Lumajang  Jawa  Timur,”
Skripsi, Jurusan Biologi, Universitas Jember, Jember, Indonesia (2013).
[12] A.  Prasanna,  V.  Deepa,  P. B.  Murthy,  M.  Deecaraman, R.  Sridhar, dan P. Dhandapani, ”Insoluble Phosphate Solubilization by Bacterial Strains Isolated  from  Rice  Rhizosphere  Soils  from  Southern  India,” International Journal of Soil Science, Vol. 6, No. 2 (2011) 134-141.
[13] S.  Mehta  dan  C.  S.  Nautiyal,  “An  Efficient  Method  for  Qualitative Screening  of  Phosphate-Solubilizing  Bacteria,”  Current  Microbiology, Vol. 43 (2001) 51-56.
[14] V.  Kumar  dan  N.  Narula,  “Solubilization  of  Inorganic  Phosphates  and Growth Emergence of  Wheat as Affected by  Azotobacter chroococcum Mutans,” Biology Fertil Soils, Vol. 28 (1999) 301-305.
[15] P. Gyaneshwar, G. N. Kumar, L. J. Parekh, dan P. S. Poole, “Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants,” Plant and Soil, Vol. 245 (2002) 83-93.
[16] A.  E.  Hesham  dan  H.  M.  Mohamed,  “Molecular  Genetic  Identification of  Yeast  Strains  Isolated  from  Egyptian  Soils  for  Solubilization  of Inorganic  Phosphates  and  Growth  Promotion  of  Corn  Plants,”  Journal Microbiology Biotechnology, Vol. 21, No. 1 (2011) 55-61.
[17] M.  T.  Islam,  A.  Deoraa,  Y.  Hashidokoa,  A.  Rahmana,  T.  Itoa,  dan  S. Tahara, “Isolation and Identification of Potential Phosphate Solubilizing Bacteria  from  the  Rhizoplane  of Oryza  sativa L.  cv.  BR29  of Bangladesh,” Phosphate Solubilizing Soil Bacteria, Vol. 62 (2007) 103- 110.
[18] M.  Jayadi,  Baharuddin,  dan  B.  Ibrahim,  “ In  Vitro Selection  of  Rock Phosphate Solubility by Microorganism from Ultisols in South Sulawesi, Indonesia,” American Journal of Agriculture and Forestry, Vol. 1, No. 4 (2013) 68-73.