Cell Line Monolayer Tissue Culture FKDL Dan Cell Line OL Sebagai Media Penumbuh Virus  pada Pengembangan  Bioteknologi Biomolekuler  (Penelitian Eksperimental Laboratoris)
Hasdianah

## STIKes Surya Mitra Husada Kediri

## Abstrak
Cell  line sangatlah  penting  dalam  dunia  medis,    khususnya  dibidang  diagnosis,  produksi vaksin  maupun  dibidang  bioteknologi  serta    biomolekuler.    Berbagai  penelitian  telah dilakukan  untuk  tehnik  pembuatan Cell Line  Monolayer  Tissue  Culture .  Namun  selama ini  kita  dapat  membeli  cell  line  di  ITCC  Canada;  dengan  harga  yang  cukup  tinggi  dan memerlukan  waktu  yang  cukup  lama  untuk  tibanya seed cell line ini  ke  Indonesia. Bertitik  tolak  dari  permasalahan  diatas,  pada  ini  penelitian    dikembangkan    biakan jaringan dari FKDL  (Foetal Kidney Lamb) dan  OL ( Ovine Lung ).  Biakan jaringan dapat digunakan    untuk  kepentingan  pengembangan  Bioteknologi,  Bio  Molekuer,  Identifikasi Virus,  diagnosis  ,maupun  Rekayasa  Genetik,  Stem  Cell.  Bahan  yang  digunakan  pada penelitian ini adalah  Foetus Domba Muda yang diambil ginjal ( Kidney Lamb) dan paru- paru  domba  muda  ( Ovine  Lung ),  eagle  medium,  versen  tripsin, phosphate  buffer  saline yang manganding Ca ++ dan Mg ++ serta yang Ca dan Mg Free, serta Foetal Calf Serum dan Serum sapi (semua bahan dan alat haruslah steril). Pembuatan vaksin sub unit molekuler dengan menggunakan cell line (OL). Cell OL ditanami virus EBL, terbentuk CPE, dititrasi dengan  menemukan  titer  virus  EBL  yang  sesuai  standar  10 5,5 TCD 50 .  suspensi  virus dikumpulkan kemudian disonikasi untuk mendapatkan envelope virus, selanjutnya dilihat berat  molekul  antigen  melalui  SDS  page,  ditemukan  51  Kda.  Kemudian  diadakan  uji postulat  koch,  dengan  menggunakan  cell  line  (OL),  dilanjutkan  dengan  PCR,  setelah  itu diadakan  uji  serum  netralisasi  untuk  melihat  titer  antibody  serta  diadakan  uji immunoblotting ditemukan satu band envelope protein Egp51, yang berarti protein Egp51 adalah murni dan dapat digunakan sebagai kandidat vaksin sub unit molekuler. Dari hasil penelitian  dapat  disimpulkan  Virus  EBL  isolat  lokal  mengandung sub  unit  protein envelope gp 51 yang merupakan protein hemaglutinin. Protein hemaglutinin envelope gp 51 virus EBL isolat lokal bersifat imunogenik dan protektif.
Keywords : Cell line,FKDL.OL,SDS PAGE,Immunobloting,Elusi,Sub Unit Molekuler

## Pendahuluan
Cell (sel)  adalah  unit  terkecil kehidupan  semua  makhluk  hidup  tersusun atau  satu  atau  lebih  sel.  Sel-sel  paling primitive  yang  masih  hidup  saat  ini  adalah bakteri. Sel dibatasi oleh membrane plasma, serta  mengandung  semua  zat-zat  kimiawi dan struktur yang diperlukan bagi keberlangsungan hidup tipe sel tertentu.
Di dalam sel terdapat inti sel, dan di dalam inti  sel  ditemukan adanya nucleolus. Di  dalam  nucleolus  ditemukan  adanya khromosom.  Pada  organisme-organisme yang  lebih  kompleks,  misalnya  tumbuhan
dan hewan. Setiap sel somatik mengandung satu sel kromosom yang diwarisi dari induk (maternal).
Khromosom  tersusun  dari  DNA yang  berassosiasi  dengan  berbagai  protein. Tahun 1953 Watson dan Crick mempublikasikan  model  struktur  DNA. Itulah kunci yang membuka ledakan bidang Biologi  yang  dikenal  sebagai  revolusi molekuler. (Stamofield,w.,et.al, 2006)
Evaluasi organissi multisel, menyebabkan  terjadinya  diferensiasi  sel, yang  berarti  bahwa  sel  yang  berlainan mengalami evolusi untuk melakukan fungsi
dan proses tertentu yang memberi konstribusi  pada  kesejahteraan  organism secara  keseluruhan.  Sel-sel  berdiferensiasi untuk  membentuk  jaringan  yang  berpadu dengan jaringan lain dan untuk membentuk organ. (Dunstall, M. at.al., 2007)
Kurang  lebih  70  tahun  yang  lalu pertama  kali  dilakukan  percobaan  dengan kultur sel  dan jaringan sel  yang  mana pada waktu  itu anti biotik  sangat  berperan untuk menghindari kontaminasi bakteri dan jamur.  Sejak  itu  kultur  sel  sangat  berarti dalam  penelitian  terutama  dalam  bidang virology.  Awal  keberhasilan  isolasi  virus dengan  kultur  sel  adalah  pada  tahun  1949, pertama kali polio virus berhasil diisolasi.
Ada dua jenis kultur sel yaitu kultur primer  ( primary  cell  culture )  dan cell  line (sel  skunder).  Cell  culture  adalah  seperti pada  Gambar  2.1  dikenal  dengan  primary cells  culture.  Sel  ini  hanya  mampu membelah  3-4 kali, karena mempunyai inti cell  dan  khromosom  yang  bersifat  tidak stabil.  Bila  dipasasi  lanjut    maka  primary cell  culture  akan  membentuk  Giant  cells (Hasdianah,  2005).  Primary  cells  culture jarang  digunakan  untuk  diagnostik  maupun untuk  produksi  vaksin,  tetapi  sering digunakan  untuk  mempelajari  virus  yang mempunyai sifat latent . Pada sel yang aktif, juga mempelajari virus yang belum dikenal atau belum terkarakterisasi dan terklasifikasi.  Cell  line  (sel  skunder) bersifat  tidak  immortal,  tidak  mengalami deferensiasi,  mempunyai  inti  sel  dan khromosom  bersifat  stabil,  sehingga  dapat dipasasi    berkali-kali,  melebihi  pasasi  50 (Hasdianah,  2005;  Fedik,  A.R,  2005).
Diikuti  dengan  kariotyping  cell dengan cara :  mempersiapkan 0,1 ml MTX yang ditambahkan pada media maintenance kemudian  diinkubasikan  7  jam  pada  CO 2 Inkubator  setelah  itu  disentrifus  dan dilakukan aspirasi 15 menit. Ambil supernatant  ditambahkan  0,1  ml  thymidin buat  preparat  dengan  jalan fixative 5x sampai dengan supernatant jernih. Teteskan pada  obyek  gelas,  keringkan  dan  dilihat  di bawah microscope fase  kontras  untuk
melihat  kromosom.  Terlihat  bentukan kromosom  dan  inti cell yang  bersifat  stabil walaupun  telah  dipasasi  melebihi  50,  yang menunjukkan  sifat  dari cell  line . Cell  line dapat  disimpan  dalam  media stored pada suhu yang stabil (-80 o C) dan liquid nitrogen (-196 o C)  sebagai Mater  Seed .  Penggunaan cell  line sangat  penting  dalam  bidang diagnosis  penyakit,  produksi  vaksin  dan bidang biomolekuler (bioteknologi)
Penggunaan cell line FKDL dan OL yang  ditanam  dengan  virus  EBL  terlihat adanya cytopathogenic effect (CPE) sebagai indikasi  adanya  pertumbuhan  virus  di dalam cell  line tersebut.  Dapat  ditarik kesimpulan  bahwa  penggunaan cell  line sangat  luas  di  bidang  diagnosis,  produksi vaksin dan bidang biomolekuler (bioteknologi).
Selama  ini  kita  dapat  membeli  cell line  di  ITCC  Canada;  dengan  harga  yang cukup  tinggi  dan  memerlukan  waktu  yang cukup lama untuk tibanya seed cell line ini ke Indonesia.   Bertitik tolak dari permasalahan  diatas,  maka  saya  membuat penelitian  terdahulu  tentang  perbandingan cell  line  FKDL  dan  primary  cells  culture (Hasdianah, 2005) ; dan dilanjutkan dengan disertasi yang berjudul Isolasi dan Karakterisasi    Bakteri  Imunogenik  Egp51 virus  EBL  Isolat  Lokal  Sebagai  Kandidat Vaksin    Sub  Unitmolekuler  (Hasdianah, 2006),  dengan  menggunakan  sel  OL sebagai  penumbuh  virus  EBL  isolat  lokal, dan  sebelumnya  saya  telah  membuat  Studi Banding Pembuatan KIT diagnosis penyakit  EBL  Produksi  Canada;  yang hasilnya  sama  dengan  antigen  tes  Kit diagnosis penyakit EBL isolate lokal.
Dapat  ditarik  kesimpulan  :  bahwa  memang cell  line sangatlah  penting  dalam  dunia medis;  khususnya  dibidang  diagnosis, produksi vaksin maupun dibidang bioteknologi serta  biomolekuler.
Metoda Pembuatan vaksin sub unit molekuler  dengan  menggunakan  cell  line (OL).  Cell  OL  ditanami  virus  EBL,
terbentuk CPE, dititrasi dengan menemukan titer  virus  EBL  yang  sesuai  standar  10 5,5
TCD 50 . suspensi virus dikumpulkan kemudian  disonikasi  untuk  mendapatkan envelope  virus,  selanjutnya  dilihat  berat molekul  antigen  melalui  SDS  page, ditemukan  51  Kda.  Kemudian  diadakan  uji postulat  koch,  dengan  menggunakan  cell line (OL), dilanjutkan dengan PCR, setelah itu  diadakan  uji  serum  netralisasi  untuk melihat  titer  antibody  serta  diadakan  uji immunoblotting ditemukan satu band envelope  protein  Egp51,  yang  berarti protein  Egp51  adalah  murni  dan  dapat digunakan sebagai kandidat vaksin sub unit molekuler.

## Hasil Penelitian
Cell line Cell  line yang  didapat  dengan menggunakan  metode  Kaplan, et.al., 1973, Johan, et.al.,
1975. Hasil tersebut sebagaimana  Gambar  berikut    dan  Tabel  1 pada Lampiran 1 , dan Gambar
Gambar  Foetus Domba untuk Persiapan Pembuatan Cell Line OL .
Keterangan : 1  Media eagle dan  antibiotik Kanamycin 0,4%
2  Janin  domba  umur  4-6
minggu
Sifat  dari cell  line mempunyai  inti sel  dan  kromosom  yang  bersifat  stabil, sehingga  dapat  dipasase  berkali-kali  dan tidak  bersifat  toksik;  sehingga  sel  tetap
tumbuh dengan baik dan confluent sebagaimana Gambar berikut.
1 2 D 4 C 3 B 2 A 1
Gambar Cell OL dalam beberapa tingkat pertumbuhan
Pada  awal  pertumbuhan  sel  OL masih  terlihat  berupa  bundaran  bening sebagai  pertanda  sel  yang  hidup  (Gambar A).  Pada  perkembangan  berikutnya  sel mulai  memamnjang  ke  atas  ke  bawah,  ke kiri  dan  ke  kanan  mengisi  bagian  kosong (Gambar B). Perkembangan mulai
confluent pada  hari  ke  5  pada  pasase  awal sebagaimana  Gambar  (C)  tetapi  sertelah pasase  ke  ke  9  (perkembangan  sudah tampak confluent pada  hari  ke  3,  hal  ini berlangsung  sampai  pasase  50  sebagai pertanda  sel  sudah  mengalihkan  sifat cell line (Kaplan et.al. ,  1973  dan  Johan  P., 1975).
Selanjutnya cell line OL diinokulasi dengan  virus  EBL,  secara  berkali–kali untuk  mengetahui  keberadaan  virus  EBL; karena cell  line  OL merupakan  media penumbuh  dari  virus  EBL  (Kaplan, et.al.,
1973  dan  Ishino, et.al., 2000;  Hasdianah,
1998).  Keberhasilan  pembuatan cell  line seperti  yang  ditampilkan  Gambar  2    A
sampai  Gambar  2  D,  maka  penelitian selanjutnya dapat dikerjakan yaitu pembuktian mengenai adanya virus EBL.

## Pembuktian adanya virus EBL
Keberadaan virus EBL dapat dibuktikan  dengan  beberapa  cara  yaitu dengan    CPE,  uji  postulat  Koch    dan    uji imunodiffusi dengan ouchterlony.

## Cytophatogenic effect (CPE)
Untuk  mendeteksi  keberadaan  virus EBL dilakukan uji  CPE  dengan melakukan pemeparan  virus  pada cell  OL dimana hasilnya dapat dilaihat pada Gambar 5.4.
Cyto  Pathogenic  Effect sebagai akibat kerusakan cell line OL yang terpapar oleh virus EBL.
Gambar Kerusakan cell OL akibat pemaparan Virus EBL
Foto : Pembesaran 400X dengan inverted microscope Keterangan : A. Gambar  sel OL dalam
pertumbuhan tahap awal pasase tiga, B.  Gambar sel OL mulai mengalami perkembangan C. Gambar sel OL pada
pasase 50
D. Gambar sel OL pada pasase 58 1.  Sel tampak hidup pada tahap awal tampak being bulat 2.  Sel mengalami perkembangan tampak memanjang 3.  Sel confluent (memanjang yang memenuhi seluruh permukaan) pada  pasase 50 4.   Sel tampak sama dengan 3, pada pasase 58 A 1 1 B 3
benjolan (tumor) cutaneus
nanah (hepato megali)
Foto : Pembesaran 400X dengan inverted microscope Keterangan :  A.   Gambar cell OL yang terpapar virus pada hari ke-5 1. Cell OL yang mengalami
kerusakan yang menunjukan sifat CPE 2. Cell OL yang belum
mengalami kerusakkan
B Gambar cell OL (3) yang mengalami  kerusakan yang
menunjukkansifa total (100%) pada hari ke 7.
Pada hari ke 5 cell OL yang terpapar virus EBL mulai tampak adanya CPE yang menunjukkan  kerusakan cell yang  ditandai adanya  bagian cell  toxic yang    tampak menyeluruh setelah hari ke 7.

## Uji Postulat Koch
Pustulat  Koch  digunakan  untuk menentukan  apakah  suatu  mikroba  (virus EBL) dapat menimbulkan penyakit.
Hasil  uji Postulat  Koch dapat dilihat pada  Gambar berikut
Ditemukan reaksi peradangan akibat pemaparan  virus  EBL  sehingga  timbul benjolan    pada  bagian  kulit    Gambar  A,
Gambar   Hasil Uji Postulat Koch Klasik Keterangan :   A.  Benjolan (peradangan) pada
kulit domba. B.  Nanah (pus) pada hepar yang mengalami pembesaran. C.  Nanah (pus) pada lambung. D.  Nanah  (pus)  dari  bagian tumor kelenjar limpha .
B A C nanah pada lambung D nanah
pada  bagian  hepar  terjadi  hepatomegali Gambar B, pembesaran lambung Gambar C dan  Gambar D terlihat adanya nanah  yang berwarna putih kekuningan, mengeras, yang merupakan massa dari EBL dan mengeluarkan  bau  yang  tidak  sedap.  Hasil ini merupakan uji Postulat Koch klasik.
Berbasis  dari  uji Postulat  Koch klasik yang digunakan pada bidang virologi yang  sukar  dan  lama  untuk  dikultur  maka pengujian  dapat  dilakukan  dengan  uji Postulat  Koch molekular.  Reaksi  serologi untuk  menentukan  adanya  antigen  atau antibodi  dengan  metode    imunodiffusi dengan  ouchterlony  dan  keberadaan  materi genetik  dari  virus  EBL  dapat  digunakan untuk uji Postulat Koch molekuler
Uji imunodiffusi dengan ouchterlony
Pembuktian lanjut untuk mengetahui  keberadaan  virus  EBL  adalah melalui  uji ouchterlony dengan  Agar  Gel Imunodiffusi  (AGID),  ditemukan  adanya ikatan  antigen  dan  antibodi  yang  ditandai dengan timbulnya garis presipitasi berwarna  putih  diantara  sumuran-sumuran AGID.
Gambar   Kontrol negatip Hasil Uji Agar gel presipitasi
Data presipitasi sebagaimana
Gambar berikut
Gambar  5 Hasil Uji Agar gel presipitasi Foto : Pembesaran 400X dengan inverted microscope
Gambar  A  :  adalah agar ouchterlony Gambar  B   :  adalah  garis  presipitasi,  sebagai reaksi antigen antibodi spesifik Pada Gambar 5. terlihat jelas adanya ikatan  antigen  dan    antibodi  spesifik  EBL, terlihat  adanya  garis  presipitasi  pada  plate yang berdiameter 15 cm dan jarak sumuran satu dengan yang lain adalah 3 mm. Di situ terlihat  seperti  pada  Bagian  A  adalah merupakan bagian agar ouchterlony . Sedangkan  pada  Gambar  B  adalah  garis presipitasi  yang  merupakan  hasil  ikatan antigen  antibodi  spesifik  EBL  isolat  lokal, di  antara  lubang  yang  berisi  antigen  dan antibodi.

## Polymerase Chain Reaction (PCR)
Untuk  lebih  lengkap  pembuktian keberadaan  virus  EBL  dilakukan  pula  uji Polymerase  Chain  Reaction  (PCR) yang digunakan  adalah Nested  PCR ,  dengan susunan  primer    (5’  dan  3’  primer)  gp51 adalah :
1 2 3 4 5 6 7 B A Keterangan :
Sumuran 1 : antigen EBL isolat lokal Sumuran 2,3,4,5,6,7 : serum antibodi protein Egp 51
Keterangan : Sumuran 1 : antigen EBL isolat lokal
Sumuran 2,3,4,5,6,7 : serum antibodi kelinci tanpa perlakuan (kontrol negatip) 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7
protein E virus EBL
5’GTL-GCC-CGA-TAC-TGA-CTT-CGA- AGA 3’
3GGG-CCG-CGA-GAG-CTC-AAC-GTC (Splitter GA, 1996).
Hasil sebagaimana Gambar  6.
Pada  lajur  2  ditemukan  pita  (band) dengan  ukuran  603  bp  yang  merupakan bagian  dari  gen  yang  menyandi  protein envelope dari virus EBL (Safitri, IM, 1993; Blease et.al. , 1997; Yoko, 1998)

## Penelitian Tahap II Hasil pemurnian virus EBL
Pemurnian virus dengan cara mengambil supernatan dari biakan cell yang telah  diinokulasi  dengan  virus  EBL, kemudian  dikoleksi  dengan  menggunakan tabung  50  ml. Hasil  yang  didapat  dari pemurnian  virus  sebanyak  1,22  g/cm 3 /4  ml suspensi  virus  EBL  pasase  29  dengan  titer 10 7,8 TCID 50 sebagaimana Gambar berikut.
Gambar  9  Suspensi  virus  EBL  yang  akan dimurnikan di dalam ultrasentrifus
1
Gambar  9a  Hasil  Suspensi  virus  EBL  yang telah dimurnikan
Keterangan : 1.  Hasil Suspensi virus yang telah
dimurnikan Hasil  pemurnian  protein envelope virus EBL
Hasil  pemurnian protein  Egp  51 virus  EBL  digunakan  untuk  penelitian selanjutnya sebagaimana Gambar 10 (B).
Gambar10 Hasil pemecahan protein E virus EBL dengan menggunakan alat sonikator Pengukuran    Berat    Molekul    Protein Egp  51 virus  EBL  dengan  SDS- PAGE (Sodium  Dodecyl  Sulphate  – Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Dengan  alat  ini  dapat  diketahui berat  molekul  protein  E  virus  EBL  isolat lokal.
Virus  EBL  terdiri  dari  beberapa macam protein. Hasil sebagaimana
Gambar  10.  Didapat  hasil  protein capside ,
603 bp
Virus EBL
Gambar   6 Hasil PCR dari virus EBL M adalah Marker RF DNA/Hae III
Keterangan : 1. Marker RF DNA/Hae III
2. Hasil PCR dari virus EBL 1,353 1,078 872 603 310 603 bp Virus EBL M 1 2 1
nucleo  capside , matrix ,  dan envelope virus EBL.
Gambar  11  Hasil  berat  molekul  protein virus EBL dengan SDS-PAGE Keterangan  :  Analisis  protein  dengan SDS- PAGE kadar gel 12%.
Lajur  1-7  berisi  protein  virus EBL; yang terdiri dari protein 15 kDa,  24  kDa,  dan  protein e nvelope 51  kDa;  M  adalah Marker.
Hasil SDS-PAGE pada  gambar  11 menunjukkan protein virus EBL terdiri dari protein dengan berat molekul antara 14 kDa –  116  kDa.  Pada  hasil SDS-PAGE tersebut dihasilkan protein virus EBL dalam berat 51 kDa  yang  merupakan  protein  virus EBL yang  paling  menonjol.  Protein  virus  EBL dengan  berat  51  kDa  adalah  merupakan protein    di  bagian E .  Untuk  mengetahui protein E  virus  EBL merupakan protein hemaglutinin, maka  diperlukan  pemurnian dengan  elektro  elusi.  Tujuan  dari    elektro elusi  untuk  menghasilkan  bagian  protein yang murni.
Isolasi protein virus EBL dengan elektro elusi
Pada  gambar  5.11  ada  beberapa protein virus EBL dengan berat molekul 15 kDa,  24  kDa  dan  51  kDa.  Untuk mengetahui  bagian  dari  protein  yang  mana yang mempunyai sifat hemaglutinin dilakukan uji HA seperti pada gambar 5.12 Elektro  elusi  dilakukan  pula  pada protein  dengan  berat  molekul  51  kDa,  24
kDa,  dan  15  kDa,  yang  diambil  dari  hasil SDS-PAGE .  Hasil  elektro  elusi  dilanjutkan untuk  membuktikan  bagian  protein  murni. Kemudian  hasil  elektro  elusi  dilanjutkan dengan uji hemaglutinasi, untuk mengetahui  bagian  mana  yang  mempunyai sifat hemaglutinin dan  bersifat  sebagai molekul adhesin. Untuk mengetahui bagian dari  protein  mana  yang  mempunyai  sifat hemaglutinin maka  dilakukan uji HA dari hasil  elektro  elusi  tersebut  seperti  pada gambar 5.12.
Hasil  uji  hemaglutinasi    dari    protein E virus  EBL  hasil  elektro elusi
Hasil  uji  hemaglutinasi  dari  protein di  bagian E  virus  EBL. ditemukan  protein dengan  berat  molekul  51  kDa  adalah protein hemaglutinin. Protein  dengan  berat molekul 51 kDa adalah protein hemaglutinin yang  merupakan  molekul adhesin. Hasil sebagaimana Gambar berikut
Pada  protein Egp  51 ,  titer  yang didapat  adalah 64 HA Unit.  Pada kontrol  + terlihat HA Sempurna (100%). Hasil terlihat pada Gambar berikut  dan Tabel dibawah
Gambar 12 Hasil Uji HA protein E virus EBL
Keterangan : L = lajur PBS = Posphat Buffer Saline RBC = Red Blood Cell Gambar lajur A kontrol tidak terjadinya aglutinasi (kontrol negatip yang berisi PBS dan RBC) Gambar lajur B dan C adalah protein 15 kDa tidak terjadi aglutinasi Gambar lajur D dan E adalah protein 24 kDa tidak terjadi aglutinasi Gambar lajur H berisi kontrol aglutinasi (kontrol positip yang berisi protein E gp 51 dan RBC tanpa pengenceran)
Pada lajur A kontrol negatife (tidak dilakukan pengenceran)
Pada lajur H kontrol positip (dilakukan pengenceran) Pada lajur B – G dilakukan pengenceran secara duplo di mulai 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, dan 1/256
56 kDa 116 kDa 97 kDa 51 kDa 45 kDa 30 kDa 24 kDa 15 kDa 14 kDa A B C D E G F H K neg. 15kDa 15 kDa 24 kDa 24 kDa 51 kDa 51 kDa K pos. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hasil  uji  hemaglutinasi  protein dengan  berat  molekul  15  kDa  dan  24  kDa adalah  menghasilkan  aglutinasi  negatip. Hasil  uji  aglutinasi  pada  protein  dengan berat  molekul  51  kDa  menghasilkan aglutinasi  yang  positip  dimana  terjadi aglutinasi. Hasil title aglutinasi pada protein dengan  berat  molekul  51  kDa  adalah sebesar 4 HA unit seperti gambar 5.12.
Hasil  aglutinasi  dapat  ditabulasi  seperti pada tabel berikut
Tabel 1  Hasil Uji HA
Pengenceran
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10  11  12 Protein dengan berat molekul
A Kontrol negatif - - - - - - - - - - - - B 15 kDa - - - - - - - - - - - - C 15 kDa - - - - - - - - - - - - D 24 kDa - - - - - - - - - - - - E 24 kDa - - - - - - - - - - - - F 51 kDa
+ + + + - - - - - - - -
G 51 kDa
+ + + + + + + + + + + + H Kontrol positip aglutinasi + + + + + + + + + + + +
Penelitian Tahap III Hasil Uji I n Vitro Hasil Uji I n Vitro terdiri dari :
Hasil    pembuatan   antibodi   poliklonal protein Egp 51 molekul  hemaglutinin
Serum dari hasil pembuatan antibodi  poliklonal  protein Egp  51 virus EBL  digunakan  untuk HI  Test, Uji Imunositokimia,  Uji Immunoblotting ,  dan Uji Serum Netralisasi, sebagaimana gambar 13
Hasil Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI

## Test)
Uji  hambatan  hemaglutinasi  untuk mengukur  derajat kekebalan  terhadap penyakit  EBL  (daya  proteksi  protein  sub unit  gp51  sebagai  kandidat  vaksin).  Uji hambatan aglutinasi dikerjakan dan disesuaikan  dengan  petunjuk  OIE  (2003) dan Wriningati (2005).
Pada  Uji HI digunakan  serum (antibodi  dari protein  Egp  51 Isolat  Lokal Virus EBL) dengan antigen 4 HA Unit dari hasil  Uji HA .  Hasil  sebagaimana  Gambar 13 dan Tabel .2.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A B C D E F G H 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
Gambar   Hasil Uji HI protein Egp 51 hemaglutinin virus EBL
Keterangan : L = lajur PBS = Posphat Buffer Saline
RBC = Red Blood Cell
Gambar lajur A kontrol tidak terjadinya aglutinasi (kontrol negatip yang berisi PBS dan RBC) Gambar lajur B dan C adalah protein 15 kDa Gambar lajur D dan E adalah protein 24 kDa Gambar lajur F sampai sumuran 4 adalah aglutinasi dari protein E gp 51 kDa pada pengenceran 1/128 dan 1/256
Keterangan : Lajur A sampai dengan H kolom 1 sampai dengan kolom 8 adalah kontrol positip terlihat endapan sel darah merah yang tidak terikat oleh antigen yang menandakan adanya antibodi
Lajur A sampai dengan H kolom 9 dan 10 adalah kontrol negatip, terjadi aglutinasi berarti terjadi pengikatan antigen terhadap sel darah merah.
Kolom 1 sampai dengan kolom 8 adalah lajur pengenceran yang terdiri dari 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256.
Gambar lajur G sumuran 1 sampai sumuran 12 adalah protein E gp 51 kDa pada pengenceran 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 masing – masing pengenceran dimasukkan pada 2 sumuran Gambar lajur H berisi kontrol aglutinasi (kontrol positip yang berisi protein E gp 51 dan RBC tanpa pengenceran)
Pada  Uji HI yang  digunakan  hanya protein Egp  51 kDa  yang  merupakan protein  hemaglutinin;  karena  hanya  protein Egp  51 kDa  yang  menimbulkan  aglutinasi; sedangkan pada protein 15 kDa dan 24 kDa tidak  menimbulkan  reaksi  aglutinasi.  Pada pengenceran tertinggi (1/256) masih menimbulkan  pengendapan,  karena  ikatan antigen dan antibodi spesifik (imunogenik).
Tabel 2. Hasil Uji HI
Pengenceran K negatip
1/2  1/4  1/8  1/16  1/32  1/64 1/128  1/256 1 2 3 4 5 6 7 8 9  10 L HA 4 Unit 2 4 8  16  32  64  128  256
A Protein 51 kDa         - - B Protein 51 kDa         - - C Protein 51 kDa         - - D Protein 51 kDa         - -

## 5.1.2.8   Hasil Uji Imunositokimia
Uji Imunositokimia
untuk mengetahui  kemampuan  daripada  antibodi yang  berlabel  mengenal  antigen,  adanya ikatan antigen antibodi yang spesifik.
Hasil  akan  terlihat  adanya  sel  yang masih intack ,  bagian  yang  berwarna  coklat yang  merupakan  bagian  yang  mengenal antibodi.
Terjadinya  ikatan  antigen  antibodi menunjukkan  protein Egp  51 bersifat imunogenik. Hasil imunositokimia sebagaimana Gambar berikut.
Hasil Uji Immunoblotting
Hasil  Uji Immunoblotting dengan menggunakan Westernblot sebagai pertanda untuk  menentukan  bobot  molekul  protein imungenik Egp  51 sudah  murni  yang  akan digunakan  pada  uji  serum  netralisasi, sebagaimana Gambar.

## Gambar Hasil Uji imunositokimia
Keterangan :
Gambar  A  kontrol  sel  yang  tidak  dipapar virus EBL dan tidak diberi protein Egp 51 terlihat sel masih utuh ( intack ) (1) Gambar  B  sel  yang  dipapar  virus  EBL kemudian diberi protein Egp 51 terlihat bagian yang berwarna coklat merupakan  bagian  yang  mengenal antibodi; terjadi ikatan antigen antibodi (2 = imunogenik)
Gambar C sel yang dipapar virus EBL tanpa pemberian  protein Egp  51 terlihat bagian  yang  berwarna  hijau  yang menandakan tidak terjadi ikatan antigen antibodi. Sel mengalami kerusakan (3)
Keterangan : Lajur A sampai dengan D kolom 1 sampai dengan kolom 8 adalah kontrol positip terlihat endapan sel darah merah yang tidak terikat oleh antigen yang menandakan adanya antibodi Lajur A sampai dengan D kolom 9 dan 10 adalah kontrol negatip terjadi aglutinasi berarti terjadi pengikatan antigen terhadap sel darah merah.
Kolom 1 sampai dengan kolom 8 adalah lajur pengenceran yang terdiri dari 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256.
B 2 C 3
Gambar  Hasil Western  blot pada Immunoblotting

## Hasil Uji Serum Netralisasi
Hasil  Uji  Serum  Netralisasi  untuk mengetahui  daya  protektif  imunogenik  dari protein Egp 51 kDa.
Pada  titer SN  test yang  rendah setelah  dihitung  dengan  metode  Karber menunjukkan  jumlah  antibodi  meningkat equal dengan  titer  SN  yang  rendah,  yang menandakan  adanya  sifat  protektif;  sejalan dengan peningkatan jumlah antibodi berarti protein Egp  51 kDa  bersifat  imunogenik. Positif cytopathogenic  effect menandakan tidak  terbentuknya  antibodi  (-);  negatif cytopathogenic
effect
menandakan
terbentuknya antibodi (+). Hasil sebagaimana Lampiran 3

## Hasil Penelitian Tahap III
Hasilnya  berupa  larutan  kandidat vaksin  berwarna  putih  yang  diperoleh  dari suspensi protein hemaglutinin Egp 51 virus EBL  isolat  lokal  yang  disuntikkan  pada hewan coba kelinci yang sehat. Hewan coba
kelinci  yang  digunakan  adalah  yang  bebas dari penyakit EBL setelah diuji dengan agar gel imunodifusi. Hasil sebagaimana Lampiran 4.
Kemudian dari semua sample negatip dibagi  atas kelompok  I tidak diberi suntikan protein Egp 51 (sebagai kelompok kontrol  =  K)  hanya  disuntik  Pbs  dan di challenge virus  EBL  dengan  titer  10 7,8
TCID 50 ,  kelompok  IIa  disuntik  protein  sub unit  dan booster sebanyak  satu  kali  (P2), kelompok  IIb  disuntik  protein  sub  unit  dan dilakukan  booster  sebanyak  dua  kali  (P3), sedangkan  kelompok  IIc  disuntik  protein sub unit E gp51 satu kali tanpa booster dan pada  minggu  ketiga  dilakukan challenge dengan  memberikan  suspensi  virus  EBL isolat  lokal  yang  ganas  sebagai  kelompok uji  tantang (challenge test = Ch) dengan titer  10 7,8 TCID 50 .  Hasil  sebagaimana Lampiran 5.
Pemeriksaan  limfosit  diikuti  pula dengan  uji  protektif  pada  hewan  kelinci. Hewan kelinci disuntik dengan protein Egp 51 dan di challenge dengan virus ganas titer 10 7,8 TCID 50 setelah  diseksio  terlihat  hati dan lambung yang terproteksi tanpa adanya nanah  dan  tidak  terjadinya  pembengkakan pada  hati  dan  lambung,  semuanya  terlihat normal,  dengan  adanya  pemberian  protein Egp 51 . Hasil sebagaimana Gambar 5.16
Demikian  isolasi  dan  karakterisasi sub  unit  protein gp  51 virus  EBL  isolat lokal  sebagai  protein  spesifik  dan  dipakai sebagai kandidat vaksin sub unit.
Keterangan  :  Pada  lajur  2  dan  3  berisi  protein 15  kDa  dan  24  kDa  tidak  terlihat band (pita protein) yang berarti tidak terjadi respon imun. Pada  lajur  4,  5,  dan  6  berisi  protein Egp 51 kDa  terjadi  respon  imun  ditandai    dengan terlihatnya band (pita protein).
Pada lajur 8 berisi Marker
8 51 kDa 25 kDa 30 kDa 45 kDa 66 kDa 1 2  3 4 5 6 7 M 51 kDa 15 kDa
Gambar  Hasil  uji  protektifitas  pada hewan kelinci dengan pemberian protein Egp  51 dan  di challenge dengan  virus ganas titer 10 7,8 TCID 50
Keterangan: A. Hati yang terproteksi dengan pemberian protein Egp 51
B.  Lambung yang terproteksi dengan pemberian protein Egp 51
Pada Uji protektifitas yang
dilakukan  pada  hewan  coba  kelinci  dengan pemberian  protein Egp  51  kDa dan di challenge dengan  virus  ganas  titer  10 7,8
TCID 50 ,  terlihat  hati  dan  lambung  tidak menunjukkan adanya pus (nanah) walaupun telah  di challenge dengan  virus  ganas  titer 10 7,8 TCID 50 ;  yang  menunjukkan  bahwa protein Egp  51  kDa bersifat  protektif seperti pada Gambar 5.16. A dan B.

## Hasil analisis data penelitian
Penelitian  isolasi  dan  karakterisasi sub  unit  protein gp  51 virus  EBL  isolat lokal  sebagai  protein  spesifik  dan  dipakai sebagai  kandidat  vaksin  sub  unit  telah dilakukan, dan selanjutnya diadakan analisis  data  penelitian.  Hasil  sebagaimana Tabel 5.3.
Pada  sel  limfosit  yang  mengalami kenaikan  secara  persisten  akibat  proliferasi dan  diferensiasi  sel  –  sel  limfosit  yang abnormal,  maka  akan  terjadi  pengecilan bagian  sitoplasma  dari  sel  limfosit  dan sampai  dengan  bagian  sitoplasma  tersebut
tertutup  secara  keseluruhan  oleh  inti  sel limfosit,  yang  merupakan  sebagai  pertanda adanya leukemia (Djalil, 1994) sebagaimana  pada  lampiran  6.    Pemberian protein Egp  51  kDa hemaglutinin dapat menghambat terjadinya limfositosis persisten  sebagai  akibat  adanya  kenaikan jumlah sel limfosit karena adanya proliferasi  dan  diferensiasi  abnormal  dari sel  limfosit  sebagai  akibat  adanya  infeksi virus  EBL.  Menurut  Spitter,  1996,  adanya limfositosis  persisten  sebagai  pertanda adanya  penyakit bovine  leukemia  virus (BLV) . Hasil sebagaimana Tabel 5.3.
Salah satu pertanda adanya penyakit EBL,  ditunjukkan  dengan  adanya  kenaikan jumlah limfosit secara abnormal.
Tabel Hasil jumlah limfosit pada Uji In
Vivo Peme - Perlakuan Riksaan Virus Virus + Protein Egp 51 Hari Ke Boster  1 Kali Boster 2 Kali Tanpa Boster 5 18843,40  375,21 a* 405,80  5,31 b 395  5,45 b 400,60  4,51 b 10 18751,00  512,96 a 413,40  5,58 b 400,00  1,00 b 403,00  4,12 b 15 18878,40  515,54. a 411,60  3.58 b 400,60  0,89 b 401,80  2,39 b 20 19018,00  475,03 a 412,00  3,08 b 399,60  0,55 b 406,20  5,26 b
25 19149,20  472,40 a 411,60  4,39 b 397,80  2,86 b 402,80  4.86 b
30 19269,80  496,60 a 411,60  4,39 b 397,80  2,86 b 402,80  4,82 b 35 19388,20  475,25 a 393,80  41,96 b 399,80  0,84 b 401,80  5,75 b
40 19690,90  430,48 a 408,00  4,53 b 400,00  0,71 b 397,40  8,79 b
45 20564,00  871,19 a 412,00  3,78 b 389,40  22,60 b 404,20  8,84 b
Superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda sangat nyata (p < 0,05)
Pada  Tabel  3  terlihat  adanya perbedaan yang signifikan dari hewan coba yang  diberi  protein Egp  51  kDa dengan yang  tidak  diberi  protein Egp  51  kDa (kelompok  kontrol);  tetapi  di challenge
B
dengan  virus  EBL  yang  ganas  titer  tinggi 10 7,8 TCID 50 .  Pada  kelompok  kontrol hewan  coba  akhirnya  mati  setelah  hari  ke 45,  sebagai  pertanda  bahwa  virus  yang digunakan sebagai challenge adalah memang virus EBL dengan titer tinggi yang ganas. Pada kelompok II a dan II b (P2 dan P3)  terlihat  adanya  daya  protektif  pada masing –  masing  kelompok,  letak perbedaannya adalah pada jumlah pemberian booster ;  tetapi  daya  protektif yang  ditimbulkan  kurang  lebih  sama. Sedangkan  pada  kelompok  II  c  adalah kelompok yang tidak di booster , tetapi tetap mempunyai  daya  protektif;  karena  dengan adanya  pemberian  protein Egp  51  kDa , maka akan timbul daya protektif.

## Penelitian Tahap I
EBL  adalah  penyakit  ganas  yang menyebabkan  angka  kematian  80  –  90  % dan menimbulkan kerugian ekonomi cukup tinggi,  sampai  saat  ini  pengobatan  maupun vaksinnya belum ditemukan (Resang et al. , 1996; OIE, 2000).
Untuk  mengetahui  apakah  virus EBL  ini  memenuhi Postulat  Koch maka dilakukan  penelitian  pendahuluan  yang terdiri  dari  serangkaian  peneltian  yaitu: pembuatan cell  OL ,  inokulasi  dan  titrasi virus  EBL  pada cell uji  OL,  patologi anatomis,  uji  agar  gel  imunodifusi  dan deteksi materi genetik
Pembuatan cell OL Metoda  isolasi  dan  identifikasi cell dilakukan  dengan  mengambil  fetus  domba muda  umur  4  minggu  dari  RPH  Pegirian Surabaya,  kemudian  dicuci  dengan  PBS, direndam  dengan  media  RPMI  ditambah dengan  antibiotika.  Kemudian  diambil paru-paru, dipotong kecil –  kecil, ditripsinasi,  sentrifus,  diambil  endapannya diberi  media maintenance  cell ditambah dengan foetal  calf serum 5-10% dalam 100 ml  media;  diinkubasikan  selama  5-7  hari pada  suhu  37 o C,  diobservasi  sampai dengan cell  confluent kemudian  dipasase berulang-ulang  sampai  pasase  50  yang merupakan sifat cell line . Pada perkembangan  pertama  terlihat cell masih
mengalami adaptasi, sehingga perlu diadakan  penggantian media  maintenance untuk  mendapatkan cell yang confluent . Masa  inkubasi  yang  dibutuhkan  pada pengembangan cell awalnya masih memerlukan  waktu  berkisar  5-7  hari, dengan  perkembangan cell yang  masih belum  maksimal;  ini  terjadi  pada  pasase satu  sampai  pasasi  dua  belas.  Pasase selanjutnya  sudah  terlihat  perkembangan cell line yang  mulai  mengalami  adaptasi dan berkembang cepat, dimana inti cell dan kromosom  bersifat  stabil,  yang  dapat dipasasi  secara terus menerus dengan masa inkubasi  yang  semakin  pendek.  Sifat cell line adalah  dapat  berkembang  dan  dipasasi secara  terus  menerus  sampai  pasase  50, sebagaimana Tabel 1. dan Gambar 2 (A, B, C).
Menurut Johan, 1975 dan Kaplan et al. ,  1973,  bahwa cell dikatakan  dapat bersifat cell line , bila dapat dipasase sampai pasase  50.  Pada  penelitian  ini  ternyata cell OL bersifat cell  line dan  dapat  dipasase melebihi pasase 50 yaitu sampai pasase 58, sebagaimana pada Tabel 5.1.1. dan Gambar 5.2 (D) Menurut Johan, 1975 dan Kaplan et al. ,  1973,  media maintenance cell yang digunakan  adalah  terdiri  dari media  eagle overlay sembilan  puluh  lima  persen ditambah  dengan foetal  calf  serum lima persen;  tetapi  pada  penelitian  ini  media maintenance  cell yang  digunakan  sama seperti peneliti terdahulu kemudian ditambahkan  pula  TPB  sebanyak  sepuluh persen  karena  menurut  Burke et  al. ,  1973 TPB dapat merangsang peningkatan pertumbuhan  dan  perkembangan cell , ternyata dengan menggunakan TPB sepuluh persen memang dapat meningkatkan pertumbuhan dan perkembangan cell (Hasdianah, 1998).
Inokulasi dan titrasi virus EBL pada cell OL
Virus  EBL  diisolasi  dari  sapi  di Lembang  oleh  BPMSOH  tahun  1998 diinokulasikan menggunakan cell OL sampai  dengan  pasasi  15;  kemudian  dalam
penelitian  ini  diadaptasikan  pada cell  OL sampai dengan pasasi 29.
Virus  EBL  adalah  virus  RNA  yang mempunyai  sifat  stabil.  Oleh  karena  itu virus ini dalam memproduksi antigen untuk karakterisasi  proteinnya  telah  dipasasekan sampai  29  kali,  sehingga  didapatkan  virus yang  mempunyai  titer  cukup  tinggi  (sesuai dengan  OIE,  2000).  Sifat  pertumbuhan virus  EBL  pada Cell  OL pasase  15 membentuk CPE 50% memerlukan waktu 7 hari  dengan TCID 50 10 4.4 .  Selanjutnya semakin  meningkat  jumlah  pasasenya semakin  cepat  daya  multiplikasinya  hingga pada pasase 25 daya multiplikasinya sangat meningkat  tajam, CPE terbentuk  90% memerlukan  waktu  hanya  3  hari  dengan nilai TCID 50 10 7.4 .  Walaupun  demikian untuk  mencari  sifat  yang  stabil,  maka diperlukan pasase ulang sampai pada pasase 27  virus  mampu  membentuk CPE 90% dalam  waktu  2  hari  dengan TCID 50 10 7.8 sebagaimana  Gambar  5.4  (A,  B).  Hal  ini menunjukkan  bahwa  virus  EBL  sifat pertumbuhannya  stabil  dengan  harapan tidak  mengalami  mutasi.  Hasil  titrasi  virus selengkapnya  dapat  dilihat  pada  Tabel  5.2. (Kaplan, 1973; Sarjono, 1993; Ishino, et.al , 2000).
Uji Postulat  Koch pada  perubahan patologi anatomis
Adanya  kenyataan  bahwa  yeast mempunyai  peranan  yang  nyata  terhadap terjadinya  fermentasi  maka  para    ilmuan sekitar  tahun  1860-an  yang  salah  satu diantarnya adalah Louis Pasteur mempunyai  kesamaan  ide  mengenai germ theory  of  disease (teori  penyakit  yang dihubungkan dengan mikroorganisme).
Pada  kurun  waktu  tesebut  belum  dikenal istilah  bakteri,  virus,  jamur  maupun protozoa.    Teori  ini  berdasar  atas    adanya peristiwa  yang  terjadi  pada  fermentasi yaitu adanya perubahan materi organik oleh pengaruh  mikroorganisme  secara  fisik maupun kimiawi.
Pembuktian  yang  pertama  bahwa bakteri dapat menimbulkan penyakit dilakukan  oleh  Robert  Koch  pada  1876
seorang  sarjana  fisika  yang  berasal  dari Jerman.  Beliau  dapat  membuktikan  bahwa penyakit  Anthrax  yang  menyerang  pada domba  yang  menimbulkan    kematian ternyata  disebabkan  oleh  bakteri  yang kemudian    diberi  nama Bacillus  anthracis. Robert  Koch  melakukan  kultur  darah domba  yang  mati  tersebut  pada  media perbenihan yang ternyata ditemukan pertumbuhan  bakteri,  selanjutnya  media perbenihan  yang  mengandung  bakteri tersebut yang disuntikan pada domba sehat, ternyata    menimbulkan  gejala  yang  sama dan  akan  menimbulkan  kematian  (Tortora et al. , 2001).
Hasil  penelitian  Koch  tersebut merupakan  dasar  dari  penelitian  penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme yang menimbulkan infeksi. Sampai saat ini maka untuk menentukan apakah suatu mikroorganisme dapat menyebabkan terjadinya  penyakit  harus  merujuk  pada hasil  penelitian  dari  Robert  Koch.  Rujukan tersebut  kemudian  diformulasikan  menjadi Postulat  Koch yang  terdapat  empat  syarat. Syarat  pertama:  Mikroorganisme  patogen tersebut  dapat  ditemukan pada setiap kasus penyakitnya. Syarat kedua:
Mikroorganisme  pathogen  tersebut  dapat diisolasi  dari  kasus  penyakitnya  dan  dapat ditumbuhkan  pada  medium  perbenihan secara murni. Syarat ke tiga: Mikroorganisme pathogen yang murni yang tumbuh  pada  perbenihan    tersebut  apabila disuntikkan  pada  hewan  yang  peka  akan menimbulkan  gejala  yang  sama.  Syarat  ke empat:  Mikroorgansme  pathogen  yang sama harus bisa diiolasi dari binatang  yang peka tersebut.
Pada kenyataannya ternyata beberapa  penyakit  yang  telah  diketahui tidak  dapat  memenuhi Postulat  Koch tersebut secara lengkap. Penyebab penyakit Lues  yaitu Treponema  pallidum dan Morbus  Hansen  yaitu Mycobacterium leprae tidak dapat ditumbuhkan pada media perbenihan.  Apalagi  penyakit  infeksi  yang disebabkan oleh virus sukar untuk
ditumbuhkan pada media perbenihan misalnya virus penyebab AIDS dan SARS.
Atas dasar kenyataan tersebut diatas maka    mulai  akhir  1960-an  dengan ditemukannya plasmid bakteri yang selanjutnya    sekitar  1970-an  adanya revolusi dalam bidang biomolekuler dengan ditemukannya DNA rekombin maka Postulat  Koch (Robert  Koch)  direvisi menjadi Postulat  Koch versi  molekuler. Pustulat tersebut juga terdapat empat syarat yaitu, syarat pertama : Gen atau produknya harus  ditemukan  pada  strain  bakteri  yang virulent,  yang  menimbulkan  penyakit  dan tidak  ditemukan  pada  bakteri  yang  tidak menimbulkan  penyakit  ( avirulent ).  Syarat ke  dua  :  Kerusakan  atau  kehilangan  gen virulensi tersebut akan menyebabkan penurunan atau kehilangan sifat virulensinya. Syarat ke tiga : Gene virulensi tersebut  dapat  ditemukan  pada  penderita yang  sakit  akibat  infeksi  bakteri  yang virulent  tersebut.  Syarat  yang  ke  empat  : Antibodi yang dihasilkan oleh pruduksi gen yang  virulent  tersebut  bersifat  protektif (Salyers and Whitt, 1994)
Untuk  mengetahui  apakah  virus EBL  ini  memenuhi Postulat  Koch maka dilakukan  serangkaian  peneltian  yaitu: pembuatan cell OL,  inokulasi  dan  titrasi virus EBL pada cell OL , patologi anatomis, agar  gel  imunodifusi  dan  deteksi materi genetik
Kelaianan patologi anatomis terlihat jelas  bahwa  adanya  virus  EBL  ditunjukkan dengan pembesaran hati yang menyebabkan hepatomegali,  pembesaran  lambung  yang berisi  nanah  serta  adanya  benjolan  – benjolan  pada  hampir  seluruh  permukaan tubuh ternak sapi yang terserang virus EBL, yang mana bila bagian tersebut  diiris maka akan  mengeluarkan  nanah  yang  berwarna putih  kekuning  –  kuningan,  padat,  dan mengeras,  juga  menimbulkan  bau  yang sangat tidak sedap. Benjolan-benjolan yang terbentuk  adalah  merupakan  hasil  dari proliferasi  dan  differensiasi  abnormal  dari cell limfosit yang menyebabkan limfositosis  persisten.  Kenaikan  jumlah
limfosit  secara  abnormal  dan  sangat menyolok  sebagai  akibat  dari  infeksi  virus EBL;  sebagaimana  Tabel  3.  Dengan pemberian antibodi terhadap protein Egp 51 mekanisme  terjadinya  kenaikan  limfosit secara  persisten  ini  dapat  dihambat  dan dicegah  sebagaimana  gambar  limfositosis. Dari  hasil  seperti  pada  Gambar  5.4  terlihat adanya perbedaan yang nyata pada percobaan in  vivo dengan  pemberian protein Egp  51 di  mana  terlihat  tidak terbentuknya  nanah  pada  bagian  hepar hewan  percobaan,  yang  menunjukkan mekanisme  limfositosis  persisten  dapat dicegah.  Hal  ini  seperti  yang  dinyatakan oleh Robert  Koch tahun  1876  untuk mengetahui  keberadaan  suatu  virus  maka diadakan  Uji Postulat  Koch klasik.  Hasil tersebut  sebagaimana  dapat  dilihat  pada Gambar 4. (OIE, 2000)

## Uji agar gel imunodifusi
Pembuktian  lain  untuk  mengetahui keberadaan  virus  EBL  dilakukan  pula  uji serum melalui uji agar gel imunodifusi.
Hasil  peneltian  mengenai  reaksi antigen antibodi yang dikerjakan menggunakan  agar  gel  imunodifusi  metode Nakajima, et.al. ,  2000  dapat  dilihat  adanya garis  presipitasi  yang  merupakan  hasil ikatan  antigen  dan  antibodi  di  antara sumuran  –  sumuran  agar  gel  imunodifusi yang membuktikan bahwa virus EBL dapat berikatan dengan antibodi spesifik. Sebagaimana  pada  Gambar  6.  Seperti  pada penelitian terdahulu bahwa untuk mendeteksi keberadaan virus EBL digunakan  uji  serologi  yaitu  uji  agar  gel imunodifusi; hal ini sesuai dengan kesepakatan  ahli  EBL  berdasarkan  hasil pertemuan  di  Copenhagen  tahun  1989. Keberhasilan  pembuatan  antigen test  KIT penyakit  EBL  yang  berisi  antigen test , serum refferen ,  serum  negatip,  serum kontrol positip, serum kontrol positip lemah ( weak positive ); yang telah digunakan untuk pengujian  serum  lapangan  penyakit  EBL, dan  sebagai  kontrol  digunakan  antigen test KIT penyakit  EBL  produksi  Kanada,  di mana  hasilnya  adalah  kurang  lebih  sama;
yang  membuktikan  pula  bahwa  virus  EBL isolat lokal yang digunakan dalam penelitian ini benar adalah virus EBL isolat lokal; sebagaimana Tabel 1.
Garis  presipitasi  di  antara  sumuran antigen  dan  antibodi  menunjukkan  bahwa adanya  ikatan  antigen  antibodi  spesifik, berarti  yang  digunakan  adalah  benar  virus EBL  (Miller,  1995;  OIE,  2000;  Hasdianah, 2000).
Hasil pemeriksaan keberadaan materi genetik virus EBL seperti pada Gambar 5.8 ternyata  memperkuat  hasil  uji Postulat Koch yaitu  versi  molekuler.  Produk  hasil PCR menghasilkan 803 bp nukleotida yang merupakan  bagian  dari  gen  penyandi protein E berat  molekul  gp  51  kDa. Penelitian tahap akhir menyimpulkan bahwa  protein  hemaglutinin  E  gp  51  kDa virus EBL merupakan protein yang bersifat imunogenik dan protektif. Hal ini menunjukan  bahwa  protein  hemaglutinin  E gp  51  kDa  virus  EBL  merupakan  faktor virulensi.
Berdasarkan  hasil  penelitian  tahap  I maka  dapat  disimpulkan  mengenai    uji Postulat  Koch baik  secara  klasik  maupun molekuler  dapat  terpenuhi  untuk    virus yang akan digunakan pada   peneltian tahap berikutnya  adalah  benar  virus  EBL  yang virulen.  Penelitian  selanjutnya  meliputi penelitian  tahap  II  yaitu  eksploratif  dan tahap  III  penelitian  eksperimental  yang terdiri dari peneltian in vitro dan in vivo .

## Penelitian Tahap II
Penelitian  Tahap  II  bertujuan  untuk menentukan  protein Egp  51 adalah  protein hemaglutinin.  Penelitian  ini  meliputi  : pemurnian  virus  EBL,  pemurnian  protein envelope virus  EBL,  pengukuran  berat molekul  protein Egp  51 virus  EBL  dengan SDS-PAGE pada  Gambar  5.7 , terlihat  ada beberapa  jenis  protein  virus  EBL  yang terdiri dari protein struktural yang mempunyai  berat  molekul  yang  berbeda, yaitu  15  kDa,  24  kDa,  serta  protein envelope yang  merupakan  glikoprotein dengan  berat  molekul  51  kDa.  Dari  ketiga
macam  protein  yang  memungkinkan  dapat digunakan  sebagai  vaksin,  perlu  diuji mengenai karakter hemaglutinin, uji imunogenisitas yang terdiri dari uji hemaglutinasi  (Uji HA ),  uji  hambatan hemaglutinasi  (Uji HI ),  uji  imunositokimia dan uji imunoblotting . Hasil pengujian yang telah  dilakukan  ternyata  hanya  protein Egp 51 yang  bersifat  protein  hemaglutinin. Protein hemaglutinin pada umumnya merupakan  protein  adhesin,  yaitu  protein yang  berperan  pada  perekatan  suatu mikroba baik virus maupun bakteri pada sel hospes  (Karzenstein et  al. ,  1999;  Sumarno, 2000;  Fitri  L.E.,  2005).  Pada  beberapa bakteri telah ditemukan protein hemaglutinin yang bertindak sebagai molekul adhesin seperti halnya pada bakteri Vibrio  Cholera 38  kDa;  dan  pada Salmonella  thypi 36  kDa  (Sumarno,  2000; Sunarto  S.,  2002).  Pada  virus  yang digunakan pada penelitian ini telah ditemukan  pula  protein  hemaglutinin  berat molekul  51  kDa,  sedangkan  pada    virus HIV ditemukan  protein  yang  berasal  dari envelope glycoprotein dengan berat molekul  140  kDa  yang  berperan  pada pelekatan virus HIV pada cell CD 8+ (Weiner et al. , 1999; Karzenstein et al. , 1999). Pada parasit telah ditemukan protein hemaglutinin  pada  penyakit  malaria  yang disebabkan  oleh Plasmodium  falciparum yang  mempunyai  berat  molekul  270  kDa, protein  hemaglutinin  ini  berfungsi  sebagai protein  adhesin  (Fitri  L.E.,  2005).  Protein Egp  51 adalah  protein  hemaglutinin  serta merupakan  molekul  adhesin  yang  bersifat protektif  dan  imunogenik  yang  terdapat pada  bagian envelope virus  EBL;  hal  ini menunjukkan protein Egp 51 dapat digunakan  sebagai  kandidat  vaksin,  seperti pada Gambar 10 dan Tabel .3.
Beberapa penelitian mengenai hemaglutinin  dapat  digunakan  sebagai bahan  dasar  vaksin,  sebagai  contoh  dalam menanggulangi  penyakit  pertusis  yang disebabkan  oleh Bordella  pertusis ,  dan vaksin lain yang berbasis protein hemaglutinin  yang  berisi  molekul  adhesin yaitu  vaksin  pertactin.  Bakteri  lain  yang
akan digunakan sebagai  bahan vaksin  yang mengandung  protein  hemaglutinin  dan masih dalam penelitian adalah pada bakteri yang menyebabkan infeksi saluran kencing, yaitu  bakteri  yang  mengandung  protein hemaglutinin strain UPEC ( Uro Pathogenic Eicesheria  colli )  (Sumarno,  2000).  Dari hasil  pembahasan  yang  didukung  dengan hasil  penelitian,  maka  dapat  disimpulkan bahwa protein hemaglutinin yang berada di daerah envelope virus  EBL,  adalah  protein Egp 51 yang bersifat imunogenik.

## Penelitian Tahap III
Uji In Vitro
Peneltian  tahap  III  terdiri  dari penelitian in  vitro yang  tujuannya  untuk membuktikan  respon  imun  dari  protein hemaglutinin berat molekul 51 kDa bersifat imonogenik  dan  protektif.  Penelitian in vitro yang  dilakukan  di  dalam mikroplate dihasilkan  bahwa  protein Egp  51 kDa mempunyai  sifat  imunogenik  di  mana  di dalam mikroplate protein Egp  51 dapat menghasilkan aglutinasi, menunjukkan adanya virus EBL.
Sifat  imunogenesitas  dari  protein hemaglutinin  51  kDa  virus  EBL  dapat dilihat dari hasil peneltian yang ditampilkan pada Gambar 5.11. dan Tabel 5.1. Hasil HA menunjukkan  pada  protein Egp  51 dapat menghasilkan  titer  4 HA unit,  berarti  pada titer 4 HA unit ini dapat dilanjutkan dengan uji respon imun,  yang menunjukkan bahwa virus EBL bersifat imunogenik.
Uji Postulat Koch Molekuler melalui Uji imunoblotting, yang menunukkan adanya  ikatan kuat antara protein (antigen) dan  antibodi  poliklonal  EBL.  Hal  ini  tidak akan  terjadi  bila  mereaksikan  protein dengan serum normal, karena serum normal tidak  dapat  mengenal  epitop  yang  terdapat pada  protein.  Oleh  karena  itu  selanjutnya hasil  purifikasi  virus  EBL  dari  supernatan biakan  kultur cell dapat  digunakan  untuk karakterisasi protein antigenik dan imunogenik  (Doran, et.al ,  1996;  Parslow, 1990;  Grossman, et.al ,  2001;  Abigael, et.al ., 2002).
Eksperimen reaksi hambatan hemaglutinasi dapat dilihat pada baris yang berisi protein Egp 51 dimana menunjukkan protein sub unit Egp 51 virus EBL tersebut menghambat aglutinasi virus  EBL. Terlihat adanya  endapan  dari cell darah  merah  sapi yang menandakan protein Egp 51 berikatan dengan  antigen  virus  EBL  sebagai  petujuk bahwa protein  Egp  51 tersebut  bersifat imunogenik  (OIE,  2003;  Sumarno,  2000).
Pada Uji Imunositokimia terlihat sebagaimana Gambar 5.10, bagian cell yang terlihat  masih intack walaupun  telah  diberi virus ganas titer 10 7.8 TCID 50 menunjukkan bahwa  antibodi  anti protein  E  gp51 yang diberikan  bersifat  imunogenik  protektif, adanya  warna  coklat  menunjukkan  adanya bagian virus dan  warna  hijau menunjukkan bagian yang terproteksi.
Sedangkan untuk membuktikan bahwa  anti  bodi  protein  hemaglutinin  51 kDa  adalah  bersifat  protektif  dapat  dilihat dari  hasil  peneltian  Uji HI seperti  pada Gambar  5.13.  dan  Tabel  5.2.  Pada  Uji  ini ditemukan  sifat  protektif  dari  antibodi protein  hemaglutinin E  gp  51 ,  dengan  titer 64 HI unit  yang  menandakan    antibodi protein  hemaglutinin E  gp  51 ,  bersifat protektif.  Pada  uji  serum  netralisasi  test terlihat  bahwa  antibodi gp  51 mempunyai daya protektifitas lebih tinggi dibandingkan dengan  protein  lainnya.  Hal  ini  berarti protein gp 51 mempunyai sifat imunogenik. Sedang jenis protein yang mempunyai berat molekul  24  kDa  dan  protein  15  kDa  lebih cocok  untuk  digunakan  sebagai  bahan diagnostik, karena kemungkinan protein ini diekspresi  pada  awal  infeksi  dan  yang menginduksi  respon  imun  pertama  kali  di dalam  induk  semang.  Hasil    Tabel  5.3, Tabel  5.4,  Tabel  5.5,    Tabel  5.6,  Tabel  5.7 dan  Tabel  5.8,  terlihat  pada  Kelompok  I titer  rendah  tidak  ada  daya  imunogenisitas dan  protektifitas  karena  pada  kelompok  ini tidak  diberi    suntikan  protein  hemaglutinin E  gp  51 tetapi  langsung  di- challenge dengan Virus EBL Titer 10 7.8 TCID 50 . Pada kelompok  II  sudah  mulai  terlihat  adanya daya  imunogenisitas  dan  protektifitas  yang positif;  karena  pada  kelompok  II  (IIa,  IIb,
IIc)  merupakan  kelompok  yang  diberi suntikan protein hemaglutinin E gp 51 , dari hasil  kelompok  II  dapat  ditarik  kesimpulan bahwa melalui uji serum netralisasi terdapat titer antibodi yang tinggi dengan pemberian protein  hemaglutinin E  gp  51 pada  yang diboster 1 kali maupun yang diboster 2 kali. Hasil  tersebut  di  atas  membuktikan  bahwa protein  hemaglutinin E  gp  51 bersifat imunogenik dan protektif.
Uji In Vivo
Jumlah  limfosit  subyek  yang  tidak mendapat  perlakuan    pemberian  protein Egp 51 yang  kemudian  di- challenge virus EBL ganas  dengan titier 10 7.8 TCID 50 pada hari  ke  lima    menunjukkan  jumlah  lebih banyak  sacara  sangat  signifikan  daripada jumlah  limfosit    yang  di- challenge virus yang  sama  tetapi  sebelumnya  mendapat perlakuan  pemberian  protein Egp 51 ,  baik yang  mengalami  suntikan  ulangan    satu kali,  dua  kali,    bahkan  yang  tidak  disuntik ulang (P < 0,01).
Subyek yang diberi perlakuan pemberian  protein Egp 51 ,  menunjukkan bahwa suntikan ulangan tidak menunjukkan pengaruh  terhadap  jumlah  limfosit  yang signifikan.    Hal  itu    dapat  dilihat    diantara subyek  yang  disuntik  ulang    satu  kali, disuntik  ulang    dua  kali  atau  terhadap subyek  yang  tanpa  disuntik  ulang      tidak menunjukkan  perbedaan  jumlah  limfosit yang signifikan ( p > 0,05).
Jumlah  limfosit  subyek  yang  tidak mendapat  perlakuan    pemberian  protein Egp 51 yang  kemudian  di challenge virus EBL ganas  dengan titier 10 7.8 TCID 50 pada hari ke sepuluh  menunjukkan jumlah lebih banyak  sacara  sangat  signifikan  daripada jumlah  limfosit    yang  di challenge virus yang  sama  tetapi  sebelumnya  mendapat perlakuan  pemberian  potein Egp  51 ,  baik yang  mengalami booster ulang  satu  kali, dua  kali    bahkan  yang  tidak  di booster (p  < 0,01).    Seperti  pada  hari  ke  lima pemeriksaan  jumlah  limfosit  di  antara subyek  yang  diberi  perlakuan  pemberian protein Egp 51 , menunjukkan bahwa pembosteran  tidak  menunjukkan  pengaruh
terhadap  jumlah  limfosit  yang  signifikan. Hal  itu    dapat  dilihat  dari  antara  subyek yang  diboster  satu  kali    terhadap  subyek yang diboster dua kali atau terhadap subyek yang  tanpa  diboster    dan  subyek  yang diboster  dua  kali  terhadap  subyek  yang tidak  mengalami  pembosteran    tidak menunjukkan  perbedaan  jumlah  limfosit yang signifikan ( p > 0,05). Jumlah limfosit subyek  yang  di challenge virus  EBL . Jumlah  limfosit  subyek  yang  di challenge virus  EBL  tetapi  mendapat  perlakuan pemberian protein Egp 51 baik yang mengalami  pembosteran  satu  kali,  dua  kali dan  tanap  pembosteran  berturut  –  turut adalah 18751,00  512, 96; 413,40  5,58; 400,00  1,00;  403,00  4,12.
Jumlah  limfosit  subyek  yang  tidak mendapat  perlakuan    pemberian  protein Egp 51 yang  kemudian  di challenge virus EBL ganas  dengan titier 10 7.8 TCID 50 pada hari  ke  lma  belas  sebesar  18878,40  515,54.    Jumlah  ini  lebih  banyak  secara sangat signifikan bila dibandingkan dengan jumlah  limfosit  subyek  yang  mendapat perlakuan  sama  dan  diperiksa  pada  hari yang  sama  tetapi  ditambahkan  protein Egp 51 , baik terhadap subyek yang mengalami  pembosteran  satu  kali  yaitu sebesar  411,60  3.58,  subyek  yang mengalami  pembosteran    dua  kali,  sebesar 400,60  0,89  atau  tanpa  pembosteran 401,80  2,39  (p > 0,05).
Hasil  pemeriksan  yang  dilakukan pada  hari  ke  dua  puluh  menunjukkan jumlah limfosit subyek yang tidak mendapat  perlakuan    pemberian  protein Egp 51 adalah 19018,00  475,03 sedangkan tiga  perlakuan  lainnya  ,  terdiri  atas pemberian  protein Egp 51 dan  diboster  satu kali,  pemberian  protein Egp 51 dan  diboster dua kali dan pemberian protein Egp 51 tanpa pembosteran berturut  – turut adalah 412,00  3,08;    399,60  0,55  dan  406,20  5,26. Hasil  analisis  data  menunujukkan  jumlah limfosit  subyek  yang  tidak  mendapat perlakuan    pemberian  protein Egp 51 lebih banyak  secara  sangat  signifikan  terhadap jumlah  limfosit  subyek  yang  mendapat
perlakuan  protein Egp 51 baik  yang  diboster maupun  tanpa  pembosteran  (p  <  0,01). Jumlah  limfosit  subyek  yang  mendapat perlakuan  protein Egp 51 dan  mengalami pembosteran  satu  kali  tidak  menujukkan perbedaan  jumlah  limfosit  yang  signifikan terhadap  subyek  yang  mendapat  perlakuan sama  tetapi  mengalami  pembosteran  dua kali  (p  >  0,05).    Demikian  pula  jumlah limfosit  limfosit  subyek  yang  mendapat perlakuan  protein Egp 51 dan  mengalami pembosteran  satu  kali  tidak  menunjukkan perbedaan  yang  signifikan  terhadap  jumlah limfosit  subyek  yang  mendapat  perlakuan sama  tetapi  tanpa  pembosteran    (p  >  0,05). Antara  subyek  yang  mendapat  perlakuan protein Egp 51 dan  mengalami  pembosteran dua  kali  terhadap  jumlah  limfosit  subyek yang  mendapat  perlakuan  protein Egp 51 tetapi  tanpa  mengalami  pembosteran  tidak menunjukkan  perbedaan  jumlah  limfosit yang signifikan (p > 0,05).
Pada  hari  ke  25  hasil  pemeriksaan memperlihatkan    bahwa  jumlah  limfosit subyek  yang  tidak  mendapat  perlakuan pemberian  protein Egp 51 sebesar  19149,20  472,40.    jumlah  limfosit  pada  subyek  ini lebih  banyak    secara  sangat  signifikan  bila dibandingkan  tiga  perlakuan  lainnya    yaitu pemberian  protein Egp 51 (p  <  0,01).    Di antara    subyek  yang  mendapat  perlakuan pemberian  protein Egp 51 diperoleh  hasil jumlah  limfosit  subyek  yang  diboster  dua kali  tidak  berbeda  nyata  dengan  jumlah limfosit subyek yang diboster dua kali (p > 0,05).    Jumlah  limfosit  subyek  yang  tidak diboster    tidak  menunjukkan  perbedaaan yang  signifikan  baik  terhadap  subyek  yang mengalami pembosteran dsatu kali atau dua kali  (p  >  0,05).  Jumlah  limfosit  subyek yang mendapat perlakuan pemberian protein Egp 51 baik  yang  mengalami pembosteran  satu  kali,  dua  kali  atau  tanpa pembosteran  masing  –  masing  sebesar 411,60  4,39;    397,80  2,86  dan  402,80  4.86.
Hasil  pemeriksaan  jumlah  limfosit pada  keempat  perlakuan  yang  dilakukan pada  hari  ke  tiga  puluh  masing  sebesar
19269,80  496,60  untuk  subyek  yang di challenge virus  EBL  ganas, 411,60  4,39  untuk subyek  yang  di challenge virus EBL ganas, dan diberi perlakuan pemberian protein Egp 51 dengan  pembosteran  satu kali,    397,80  2,86  subyek  yang di challenge virus  EBL  ganas, dengan pembosteran  dua  kali  dan  402,80  4,82 untuk  subyek  yang  di challenge virus  EBL ganas, dan  diberi  perlakuan  pemberian protein Egp 51 dengan  tanpa  pembosteran. Dari hasil analisis data yang diperoleh pada pemeriksaan  yang  dilakukan  pada  hari  ke tiga  puluh  memperlihatkan  jumlah  limfosit subyek  yang  tidak  mendapat  perlakuan pemberian  protein Egp 51 lebih  banyak secara  sangat  signifikan  bila  dibandingkan tiga  perlakuan  lainnya    yaitu  pemberian protein Egp 51 (p  <  0,01).    Di  antara perlakuan yang menerima perlakuan protein Egp 51 memperlihatkan    jumlah limfosit  subyek  yang  mendapat  perlakuan dan mengalami pembosteran satu kali tidak menujukkan  perbedaan  yang  signifikan terhadap  subyek  yang  mendapat  perlakuan sama  tetapi  mengalami  pembosteran  dua kali atau tidak mengalami pembosteran (p > 0,05).    Demikian  pula  jumlah  limfosit subyek  yang  mendapat  perlakuan  protein Egp 51 dan mengalami pembosteran dua kali tidak  menunjukkan    perbedaan  yang signifikan  terhadap  jumlah  limfosit  subyek yang mendapat perlakuan sama tetapi tanpa pembosteran  (p > 0,05).
Dan  melalui  uji in  vivo terlihat adanya daya protektifitas dengan pemberian protein  hemaglutinin E  gp  51 ,  baik  yang di booster 1  kali  maupun  yang  di booster 2 kali menunjukkan hasil yang sama.
Analisis  data  jumlah  limfosit  yang diperoleh  dari  pemeriksaan  yang  dilakukan pada  hari  ke  35  menunjukkan  jumlah limfosit subyek yang tidak diberi perlakuan pemberian  protein Egp 51 lebih  banyak secara  sangat  signifikan  disbanding  jumlah limfosit  subyek  yang  diberi  perlakuan pemberian protein Egp 51 dengan mengalami pembosteran  satu  kali,  dua  kali  atau  tanpa pembosteran  (p  <  0,01).  Jumlah  limfosit
subyek yang mendapat perlakuan pemberian protein Egp 51 dengan pembosteran  satu  kali  tidak  menunjukkan perbedaan yang signifikan  terhadap jumlah limfosit  subyek  yang  mendapat  perlakuan sama  tetapi  mengalami  pembosteran  dua kali  (p  >  0,05).    Demikian  pula  jumlah limfosit  subyek  yang  mendapat  perlakuan pemberian protein Egp 51 dengan pembosteran  satu  kali  tidak  menunjukkan perbedaan yang signifikan  terhadap jumlah limfosit  subyek  yang  mendapat  perlakuan sama dan tidak  mengalami pembosteran (p >  0,05).  Jumlah  limfosit  subyek  yang mendapat  perlakuan  pemberian  protein Egp 51 dengan  pembosteran  dua  kali terhadap  subyek  yang  mendapat  perlakuan sama  tetapi  tanpa  mengalami  pembosteran tidak  menunjukkan  perbedaan  jumlah limfosit yang signifikan  (p > 0,05). Jumlah limfosit  yang  diperoleh  pada  pemeriksaan hari ke 35 dari subyek yang tidak mendapat perlakuan  pemberian  protein Egp 51 ,  jumlah limfosit  subyek  yang  mendapat  perlakuan pemberian protein
Egp 51
dengan pembosteran  satu  kali,  jumlah  limfosit subyek yang mendapat perlakuan pemberian protein
Egp 51
dengan pembosteran  dua  kali  dan  jumlah  limfosit subyek yang mendapat perlakuan pemberian  protein Egp 51 dengan  tanpa pembosteran    berturut  –  turut  adalah 19388,20  475,25;  393,80  41,96; 399,80  0,84 dan 401,80  5,75.
Jumlah  limfosit  yang  diperoleh  dari hasil pemeriksaan yang dilakukan pada hari ke  empat  puluh  pada  subyek  yang  tidak mendapat  perlakuan  pemberian  protein Egp 51 ,  pemberian  protein Egp 51 dengan pembosteran  satu  kali,    pemberian  protein Egp 51 dengan  pembosteran  dua  kali  dan pemberian protein Egp 51 tanpa pembosteran berturut  –  turut  adalah  19690,90  430,48; 408,00  4,53;  400,00  0,71 dan 397,40  8,79.    Hasil  selengkapnya  pemeriksaan jumlah  limfosit  pada  hari  ke  empat  puluh lebih jelas disajikan dalam Tabel 5.11
Seperti  yang  terlihat  dalam  Tabel 5.11,  jumlah  limfosit  subyek  yang  tidak
mendapat  perlakuan    pemberian  protein Egp 51 lebih banyak  secara sangat signifikan bila  dibandingkan  tiga  perlakuan  lainnya yaitu  pemberian  protein Egp 51 (p  <  0,01). Di antara subyek  yang mendapat perlakuan pemberian  protein Egp 51 diperoleh  hasil jumlah  limfosit  subyek  yang  diboster  dua kali  tidak  berbeda  nyata  dengan  jumlah limfosit subyek yang diboster dua kali (p > 0,05).    Jumlah  limfosit  subyek  yang  tidak diboster  tidak  menunjukkan  perbedaaan yang  signifikan  baik  terhadap  subyek  yang mengalami pembosteran dsatu kali atau dua kali (p > 0,05).
Seperti  hasil  pemeriksaan  yang diperoleh  pada  hari  sebelumnya,  analisis data  jumlah  limfosit  pada  hari  ke  45 menunjukkan  jumlah  limfosit  subyek  yang tidak  mendapat  ini  lebih  banyak  secara signifikan  bila  dibandingkan    subyek  yang mendapat  perlakuan  pemberian  protein Egp 51 baik  yang  mengalami  pembosteran satu  kali,  dua  kali  atau  tanpa  pembosteran (p  <  0,01).    Subyek  yang  mendapat perlakuan  pemberian  protein Egp 51 dengan pembosteran  satu  kali  tidak  menunjukkan perbedaan  jumlah    limfosit  yang  signifikan baik  terhadap  subyek  yang  subyek  yang mendapat  perlakuan  pemberian  protein Egp 51 dengan  pembosteran  dua  kali  atau mendapat  perlakuan  pemberian  protein Egp 51 dengan  tanpa    (p  >  0,05).  Jumlah limfosit subyek mendapat perlakuan pemberian protein
Egp 51 dengan pembosteran  dua  kali  tidak  menunjukkan perbedaaan yang signifikan terhadap subyek  yang  mengalami  pembosteran  satu kali  atau  dua  kali  (p  >  0,05).  Data  hasil pemeriksaan  jumlah  limfosit  pada  eempat perlakuan  yang  dilakukan  pada  hari  ke  45 selengkapnya disajikan dalam Tabel 5.10.
Dari  hasil  tersebut  menunjukkan bahwa protein Egp 51 bersifat protektif. Hasil lain terlihat pada Gambar 5.16. menunjukkan protein Egp 51 bersifat protektif,  sebagaimana  pada  Gambar  5.16 tersebut  bagian  hati  dan  lambung  tidak menunjukkan  benjolan  –  benjolan  tumor yang  berisi  pus  (nanah)  masa  tumor  EBL,
dengan  pemberian  protein Egp 51 dan di challenge dengan  virus  EBL  yang  ganas mempunyai  titer  10 7,8 TCID 50 . Dari  hasil penelitian  dan  pembahasan  maka  dapat disimpulkan  pernyataan  ilmiah  sebagai berikut bahwa :
Protein  hemaglutinin  E  gp  51  kDa virus EBL merupakan  protein  yang bersifat imunogenik dan protektif.

## Kesimpulan
Berdasarkan  atas  hasil  penelitian yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan sebagai berikut :
1.  Virus EBL isolat lokal mengandung sub unit  protein  envelope  gp  51 yang merupakan protein hemaglutinin.
2.  Protein  hemaglutinin envelope  gp  51 virus EBL isolat lokal bersifat
imunogenik dan protektif.

## Saran
1. Perlu dilakukan pengembangan
penelitian  lanjutan  dan  uji  lapangan untuk  menentukan  apakah sub  unit protein  E  gp  51 isolat  lokal  ini  dapat digunakan sebagai vaksin.
2. Perlu dilakukan pengembangan penelitian  lanjutan  untuk  menentukan apakah sub  unit  protein  E  gp  51 isolat lokal dapat dipakai sebagai alat diagnosis cepat EBL (rapid diagnostic) .
3. Untuk mengevaluasi struktur virus yang telah  ditemukan  perlu  pemeriksaan lanjut  dengan  menggunakan  elektron mikroskop

## DAFTAR PUSTAKA
Altaner,  C,  ban  J,  Altanerocva.  V,  and Janik.
V., 1991. Protective
Vaccination Againts Bovine Leukaemia  Virus  Infection  by Means  of  cell  Drived  Vaccine
Ver.Sci. Vol (9). pp 889-894.
Direktorat  Jenderal  Peternakan,  1996. Pedoman  Pengendalian  Penyakit Hewan  Menular .  Jilid  IV.  Direktur
Kesehatan
Hewan. Direktorat Jenderal Peternakan. Departemen Pertanian. Jakarta. hlm 1-4
Emanuelson, U., Scherling, K. and
Petterson,  H.,  1992. Relationship between  Herd  Bovine  Leukemia Virus
Infection Status and Reproduction,  Disease  Incidence, and  Productivity  in  Swedish  Dairy Herds . Prev. Vet. Med. 12:121-131
Fedik A. Rantam. 2005. Virologi . Airlangga  University  Press.  Hlm  60- 70.
Goldsby.  R.A,  Kindit  Tj,  Osboerne.  B.A., 2000. Kuby  Immunology, forth edition , WH  Freeman  and  Company New York. pp : 1-514.
Goodman  J,  in  Stites  DP,  Ter  Al.,  1994. The  immune  Respons. Prentice international Inc, pp 34-60.
Hasdianah,
R. H., 1998. Studi Perbandingan  Pembuatan Primary Cell Chicken Embrio Kidney dengan Cell Line Foetal Kidney Lamb . Pada Kongres PDHI di Yogyakarta.
Hasdianah, R. H., 2000 . Studi Perbandingan Antigen KIT
Enzootic  Bovine  Leucosis (EBL) isolate  Lokal  dengan  Antigen  KIT EBL produk  Canada .    Tesis. Perpustakaan  Unversitas  Airlangga Program  Pasca  Sarjana,  Surabaya 2000, hlm 3-40.
Hasdianah,  R.  H.,  2006. Isolasi  dan Karakterisasi  Protein  Imunogenik Egp  51  Virus EBL Isolat  Lokal Sebagai  Kandidat  Vaksin  Sub  Unit Molekuler. Disertasi.  Perpustakaan Unversitas  Airlangga  Program  Pasca Sarjana, Surabaya 2006, hlm 87-103.
Hudson,  L  ;  hay,  F.C.,  2001. Practical Immunology
3 rd ed., Oxford
Blackwell Scientific Publications London Edinburgh Boston Melbourne paris-Berlin Vienna, pp 251-254.
Ishino,  S,  Nhara,  S.  Konoy,  Sentsui  H.,
2000. Experiment infection of bovine  Leukosit  Virus  in  Small aboratory Animal , National Institute on  Animal  health  1-3  Kannodai Tsukuba,  Ibaraki  305 Japan.  J. Versci 50(6), pp 124-1251.
Johan,  P.,  1975. Cell  andb  tissue  Culture (Ed 5) Churchill Livingstone Ediburg London and New York, pp 261-290.

## Johnson, R. Kanee JB, Anderson, M., 1987.
Bovine  leukemia  Virus  :  Duration of  BLV  Colostral  Antibodies  in Calves  from  Commercial  Dairy
Herds  Prev. Vet,med,  4  :  pp  371- 376.
Miller, J.M and Van der Maaten MJ, 1999. Use  of  Glycoprotein  Antigen  in  the Immunodiffison  Test  for  Bovine Leukemia  Virus  Antibodies .  Eur  J. Cancer, 13, 1369-1375.
Office  International  des  Epizooties  (OIE) Journal  Oktober  Copy  right  @  2000. Enzootic  Bovine  Leucosis  manual of  Standart  for  Doiagnostic  Test and Vaccine. Amarican Type Culture Collection, 10801. university  Bourklevard, Manassas-
Virginia. 2210-2209, United States of America, pp 328-345.
Ressang,  AA,  1989. Penyakit  Viral  pada Hewan  Mamalia  yang  Penting  di Indonesia. Penerbit Universitas Indonesia-UI  Press ,  Jakarta.  hlm 110-119
Spitter,  G.A,  Orlik,  O.,  1996. Progression to  Persistent  Lymphocytosis  and Tumor  Development  in  Bovine leukemia  Virus  (BLV)  Infected Cattle  Correlates  with  Inpaired
Proliferaion  of  CD 4+ +  Cell  in Response to gag and env - Encoded BLV  Proteins .  Journals  of  Virology, NDV, 1996,         pp 7584-7593.
Trainin, Z, Berstein, S, Rosental and Berner J.,  1990. The  Fat  of  Milk  From Dairy  Cattle  Infected  with  bovine leucosis  Virus ,  J.  Vet.  Research Communications (14) ; pp 436-448.
Yoko,  A  ;  Ikawa,  Y.,  Tajima,  S.,  1998. Complete  Bovine  Leukemia  Virus (BLV)  Provirus  is  Conserved  in
BLV-Infected  Cattle  through  out the Course of B-Cell
Lymphosarcoma Development.