Abstrak —Besi  merupakan  logam  yang  dibutuhkan  oleh organisme  untuk  metabolismenya,  namun  dalam  konsentrasi tinggi  besi  dapat  membahayakan  organisme  dan  lingkungan. Beberapa  bakteri  resisten  terhadap  logam  besi,  salah  satu  genus bakteri  resisten  besi  adalah Bacillus .  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mengetahui  isolat Bacillus yang  resisten  terhadap  logam besi  dan  viabilitasnya  saat  terpapar  logam  besi.  Uji  resistensi  Fe dilakukan  di  medium nutrient  agar -FeCl 3 .6H 2 O  0,1  mg/L  dan dilanjutkan  sampai  dengan  konsentrasi  yang  mampu  ditoleransi isolat. Uji viabilitas isolat Bacillus dilakukan dengan menumbuhkan  isolat  pada  medium nutrient  broth -FeCl 3 .6H 2 O dengan tingkat konsentrasi di bawah konsentrasi maksimum yang dapat ditoleransi isolat. Viabilitas divisualisasi dengan pola kurva pertumbuhan. Hasil dari penelitian isolat Bacillus A6, DA11, S6, dan SS19 resisten terhadap logam besi (Fe) pada medium nutrient agar -Fe  sampai  dengan  300  mg/L.  Semua  isolat  mempunyai viabilitas terhadap pemaparan logam Fe dengan pola pertumbuhan  isolat    lebih  tinggi  daripada  tanpa  penambahan logam  besi  (Fe).  Isolat Bacillus yang  memiliki  kemampuan viabilitas  baik  dalam  medium  terpapar  Fe  adalah Bacillus A6, DA11, dan SS19.
Kata Kunci — Bacillus , besi (Fe), resistensi, viabilitas.

## I. PENDAHULUAN
ESI  atau  Ferrum  (Fe)  adalah  metal  berwarna  putih keperakan,  liat,  dan  dapat  dibentuk.  Di  alam  didapat sebagai  hematit  [1].  Besi  sangat  penting  sebagai  komponen pigmen  sitokrom  pada  respirasi  seluler  [2]  dan  sebagai kofaktor  enzim  [3]  pada  mikroorganisme.  Namun  besi  dalam konsentrasi  tinggi  yang  mencemari  lingkungan  dapat menimbulkan  bahaya  bagi  organisme.  Menurut  Peraturan Menteri  Lingkungan  Hidup  Republik  Indonesia  Nomor  5 Tahun  2014  Tentang  Baku  Mutu  Air  Limbah,  baku  mutu logam besi terlarut (Fe) yaitu 7 mg/L.
Beberapa  bakteri  telah  mengembangkan  beberapa  sistem yang  efisien  untuk  detoksifikasi  logam.  Mekanismenya  dapat digolongkan  ke  dalam  5  kategori,  yaitu  (1)  penyerapan intraseluler;  (2)  mengekspor;  (3)  mereduksi;  (4)  absorpsi ekstraseluler;  dan  (5)  detoksifikasi  ekstraseluler  [4].  Hampir semua  mekanisme  resitensi  bakteri  dikode  gen  yang  terdapat pada  plasmid  dan  transposon  [4]  dan  hal  itu  memungkinkan transfer  gen  atau  mutasi  spontan  yang  menyebabkan  bakteri resisten  terhadap  logam.  Bakteri  yang  mampu  resisten
terhadap  logam  diharapkan  mampu  meremediasi  cemaran logam  di  lingkungan. Resistensi bakteri terhadap logam dapat melalui  mekanisme  biosorbsi  dan  bioakumulasi.  Mekanisme biosorpsi  merupakan  proses  pasif  sehingga  logam  tidak meracuni  bakteri.  Sedangkan  mekanisme  bioakumulasi merupakan proses aktif dimana logam berat dapat meracuni sel bakteri  [5].  Mekanisme  toleransi  mikroba  terhadap  logam berat  dengan cara kompleksasi meliputi produksi polisakarida ekstraselular  yang  memiliki  anion  dan  berfungsi  sebagai bioakumulator  yang  efisien,  produksi  metabolit  organik  yang memiliki  sifat  pengkelat  dan  membentuk  kompleks  dengan logam, presipitasi, serta kristalisasi ekstraselular [6].
Beberapa  bakteri  resisten  terhadap  logam,  salah  satunya adalah Bacillus .  Sebuah  penelitian  menyebutkan  bahwa beberapa anggota genus Bacillus resisten terhadap logam berat Hg,  Pb,  Cu,  Cd  [7],  As,  Fe  dan  Mn  [8].  Genera Bacillus merupakan  genera  yang  tergolong  melimpah  di  alam  [9]. Beberapa  karakter  yang  membedakan  genus  ini  dengan  genus bakteri  yang  lain  yaitu  produksi  endospora,  berbentuk  batang [10],  Gram  positif,  bersifat  aerobik  atau  anaerobik  fakultatif, dan katalase positif [11].
Bacillus yang  diisolasi  dari  Kalimas  Surabaya  (isolat  A6, S1,  S6,  SS19,  dan  DA11)  merupakan  genera  yang  resisten logam Hg, Pb, Cd, dan Cu [7]. Bacillus tersebut belum diteliti resistensinya  terhadap  logam  Fe.  Sehingga  dilakukan  uji resistensi Bacillus terhadap  logam  Fe  untuk  mengetahui potensinya sebagai agen bioremediasi pencemaran Fe.

## II. METODOLOGI

## A. Uji Resistensi Bacillus
Isolat Bacillus S6,  SS19,  DA11,  dan  A6  berumur  24  jam ditumbuhkan  pada  media nutrient  agar -FeCl 3 .6H 2 O  dengan metode continue  streak  plate .  Konsentrasi  FeCl 3 .6H 2 O  yang digunakan  yaitu  0.1  mg/L.  Kultur Bacillus diinkubasi  selama 24  jam  pada  suhu  ruang.  Koloni  yang  tumbuh  merupakan isolat yang resisten terhadap FeCl 3 .6H 2 O. Koloni yang tumbuh selanjutnya diuji resistensinya secara bertingkat pada logam Fe sampai  konsentrasi  maksimum  yang  dapat  ditoleransi  oleh isolat.  Kultur  diinkubasi  selama  24  jam  pada  suhu  ruang. Koloni  yang  tumbuh  adalah  isolat  yang  resisten  logam  Fe.

## Resistensi Bacillus Endogenik Kalimas Surabaya terhadap Logam Besi (Fe)
Septa T. Farisna dan Enny Zulaika
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia e-mail : enny@bio.its.ac.id
B
Kemudian dipilih 3 isolat yang memiliki kemampuan resistensi terhadap FeCl 3 .6H 2 O lebih baik dibanding isolat lain untuk uji viabilitas.
B. Uji Viabilitas Bacillus
Pada Medium Tercekam
FeCl 3 .6H 2 O
Sebelum  uji  viabilitas,  dibuat  kultur  starter.  Pembuatan kultur starter dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama untuk kultur  starter  I.  Satu  ose  isolat Bacillus berumur  24  jam diinokulasikan secara aseptis ke dalam 10 ml medium nutrient broth dalam Erlenmeyer, diinkubasi selama 18 jam pada suhu ruang  di  atas rotary  shaker (100  rpm).  Selanjutnya  tahap kedua  untuk  kultur  starter  II.  Setelah  diinkubasi  18 jam, 5 ml kultur  starter  I  diinokulasikan  secara  aseptis  ke  dalam  45  ml medium nutrient  broth dalam  Erlenmeyer  dan  diinkubasi selama  18  jam  pada  suhu  ruang  di  atas rotary  shaker (100 rpm) .
Sebanyak  10  ml  kultur  starter  II  diinokulasikan  secara aseptis  ke  dalam  Erlenmeyer  berisi  90  ml  medium nutrient broth dengan penambahan FeCl 3 .6H 2 O sesuai konsentrasi yang dibutuhkan.  Untuk  kontrol  tidak  ditambahkan  FeCl 3 .6H 2 O. Setiap  2  jam  sebanyak  1,5  ml  kultur  diambil  dan dimasukkan ke  dalam  kuvet  kemudian  diukur  nilai Optical  Density (OD) nya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang (λ) 600 nm [12]. Pengukuran OD dimulai dari jam ke-0 sampai jam ke 24.  Data  OD  yang  didapatkan  kemudian  dibuat  kurva pertumbuhan  dengan  sumbu  x  sebagai  waktu  (t) dan sumbu y sebagai nilai OD.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Resistensi Bacillus Terhadap Logam Fe
Uji  resistensi  dilakukan  untuk  mengetahui  kemampuan isolate dalam medium yang mengandung logam Fe. Isolat yang digunakan  untuk  uji  resistensi  adalah  isolat Bacillus A6, DA11,  S6,  dan  SS19.  Konsentrasi  perlakuan  Fe  untuk  uji viabilitas  adalah  50,  100,  dan  150  mg/L,  setelah  pengukuran AAS, konsentrasi Fe pada media mengalami penurunan cukup besar  sekitar  ≥  70%  yang  menyebabkan  konsentrasi  Fe  di media  rendah.  Hasil  yang  didapat,  semua  isolat Bacillus mampu  tumbuh  pada  media  yang  mengandung  logam  Fe (Tabel 1 dan Gambar 1) sampai dengan 300 mg/L Fe- nutrient agar .  Sesuai  dengan  [13], Bacillus mampu  tumbuh  dengan baik  pada  medium  yang  mengandung  Fe  (III)  konsentrasi rendah.
Semua Bacillus (A6,  DA11,  S6,  dan  SS19)  mampu  tumbuh dalam  medium  yang  mengandung  Fe  karena  Fe  dibutuhkan dalam  metabolisme  sel  bakteri.  Hal  tersebut  juga  dinyatakan oleh  [14]  secara  umum  semua  mikroorganisme,  termasuk Bacillus membutuhkan  Fe  untuk  aktivitas  metabolisme  dan juga sebagai komponen struktural utama pada beberapa enzim. Dalam penelitiannya [13] menyatakan bahwa beberapa spesies Bacillus resisten terhadap logam Fe sampai dengan 6000 mg/L pada  medium nutrient  agar ,  walaupun  ada  beberapa  spesies Bacillus yang hanya mampu resisten hingga 100 mg/L.
Tabel 1. Hasil Uji Resistensi FeCl 3 .6H 2 O
Keterangan:  (+++)  =  tumbuh  baik,  (++)  =  tumbuh  sedang,  (+)  = tumbuh rendah, (-) = tidak tumbuh
Gambar 1. Hasil Uji Resistensi Bacillus
Ket:  (a:  Hasil  uji  resistensi Bacillus A6  pada  0,1  mg/L  FeCl 3 .6H 2 O, b: Hasil uji resistensi Bacillus A6 pada 300 mg/L FeCl 3 .6H 2 O).
Menurut [5], bakteri yang diisolasi dari lingkungan yang tercemar  logam  berat  merupakan  bakteri  yang  mempunyai resistensi  tinggi  terhadap  logam  berat  di  sekitarnya.  Isolat Bacillus yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  diisolasi  dari sungai  Kalimas  Surabaya  yang  diketahui  telah  tercemar merkuri  antara  0,105  hingga  6,38  mg/L  [15]  dan  resisten terhadap  25  mg/L  HgCl 2 [16],  sehingga Bacillus yang  diuji pada  penelitian  ini  memiliki  toleransi  yang  baik  terhadap logam,  sebab  Hg  merupakan  logam  berat  yang  paling  toksik dibandingkan  logam  berat  lainnya.  Mikroba  yang  hidup  pada lingkungan  kaya  logam  cenderung  lebih  resisten  terhadap logam  berat  daripada  yang  hidup  di  lingkungan  tidak  kaya logam  [17].  Resistensi  tersebut  melalui  mekanisme  adaptasi [18],  hal  ini  karena  adanya  perbedaan  kromosomal, transposon, dan plasmid yang mengatur sistem resistensi pada masing-masing  bakteri  [14]  Pada  dasarnya,  populasi mikroorganisme  yang  resisten  terhadap  logam  melibatkan perubahan  kelarutan  dari  logam  tersebut  melalui  reduksi, akumulasi,  dan  immobilisasi  in-situ  [14].  Menurut  [18]  salah satu mekanisme resistensi pada bakteri terhadap logam adalah adanya  protein  RND  ( Resistence,  Nodulation,  Cell  Division ) yang  mengatur  transportasi  logam  melalui  membran  sel. Pada Bacillus  subtilis pengambilan  Fe  diatur  oleh  protein  Fur. Dalam  kondisi  lingkungan  yang  kaya  akan  Fe,  protein  Fur menekan sistem pengambilan Fe [19].
B. Viabilitas Bacillus Pada Medium Tercekam Logam Fe Kurva  pertumbuhan  isolat Bacillus dalam  medium nutrient  broth yang  tercekam  logam  Fe  digunakan  untuk mengetahui kemampuan hidup (viabilitas) isolat pada medium yang terpapar logam Fe. Konsentrasi Fe yang digunakan untuk uji viabilitas adalah 50, 100, dan 150 mg/L Fe- nutrient broth . Semua  isolat Bacillus mempunyai  kemampuan  hidup  pada medium  terpapar  logam  Fe  dapat  dilihat  dari  hasil  kurva pertumbuhan (Gambar 2-5).
a b
Gambar 2. Kurva Pertumbuhan Bacillus A6 yang Terpapar Logam Fe.
Gambar 3. Kurva Pertumbuhan Bacillus DA11 yang Terpapar Logam
Fe.
Gambar 4. Kurva Pertumbuhan Bacillus S6 yang Terpapar Logam
Fe.
Gambar 5.  Kurva Pertumbuhan Bacillus SS19 yang Terpapar Logam Fe.
Berdasarkan  pola  pertumbuhan  pada  Gambar  2-5,  pada Bacillus A6, DA11, dan SS19 menunjukkan pola pertumbuhan yang  hampir  serupa,  sedangkan  isolat Bacillus S6  memiliki pola  pertumbuhan  yang  berbeda.  Nilai  OD  paling  tinggi berkisar  pada  nilai  3,25  (pengenceran  5x)  pada  semua konsentrasi  logam  Fe  dan  untuk  isolat Bacillus S6  berkisar pada  nilai  OD  0,85  (tanpa  pengenceran).  Nilai  OD  tersebut
lebih tinggi dibandingkan dengan nilai OD isolat Bacillus yang ditumbuhkan  pada  medium nutrient  broth tanpa  terpapar logam  yang  berkisar  antara  0,5  -  0,6  Å  (tanpa  pengenceran). Nilai  OD  semakin  tinggi  seiring  meningkatnya  konsentrasi logam  Fe.  Hal  tersebut  dapat  terjadi  karena Bacillus resisten terhadap  300  mg/L  Fe- nutrient  agar sehingga  dalam  medium nutrient  broth tercekam  logam  Fe, Bacillus masih  mampu tumbuh dengan baik. Hal tersebut disebabkan logam besi (Fe) merupakan  komponen  pigmen  sitokrom  pada  respirasi  seluler [20]  dan  sebagai  kofaktor  enzim  [21]  serta  karena  adanya protein Fur yang menekan sistem pengambilan Fe berlebih saat kondisi lingkungan bakteri kaya akan Fe [19].
Kurva pertumbuhan Bacillus S6 menunjukkan pertumbuhan  yang  paling  rendah  jika  dibandingkan  dengan ketiga  isolat Bacillus lainnya.  Hal  ini  dapat    terjadi  karena setiap  organisme  mempunyai  respon  genetik  yang  berbeda terhadap  lingkungan  sekitar  termasuk  bakteri. Bacillus S6 merupakan  satu  genus  dengan  A6,  DA11,  dan  SS19,  dengan adanya pola pertumbuhan yang berbeda kemungkinan Bacillus S6 berbeda spesies dengan Bacillus A6, DA11, dan SS19 [10]. Pada  uji  resistensi Bacillus S6  menunjukkan  pertumbuhan yang  kurang  baik  pada  konsentrasi  75  mg/L  Fe- nutrient  agar demikian  juga  untuk  konsentrasi  yang  lebih  tinggi.  Hal tersebut  dapat  dikarenakan  adaptasi  kromosomal,  transposon dan  plasmid  pada Bacillus S6  yang  kurang  baik  terhadap cekaman logam Fe [14]. Berdasarkan hasil kurva pertumbuhan ini,  tiga  isolat Bacillus uji  yang  memiliki  kemampuan viabilitas  baik  dalam  medium  terpapar  Fe  yaitu Bacillus A6, DA11, dan SS19.

## IV. KESIMPULAN/RINGKASAN
Isolat Bacillus A6,  DA11,  S6,  dan  SS19  resisten  terhadap logam  besi  (Fe)  sampai  dengan  300  mg/L  pada  medium  Fe- nutrient  ngar .  Semua  isolat Bacillus memiliki  kemampuan viabilitas  yang  baik  kecuali  isolat Bacillus S6  dalam  medium Fe- nutrient broth yaitu Bacillus A6, DA11, dan SS19.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis S. T. F mengucapkan terima kasih kepada Dr. Enny Zulaika,  MP  atas  dukungan  penelitian  melalui  pendanaan PNBP  ITS  tahun  anggaran  2015  sesuai  nomor  kontrak 003246.IT2.11/PN.08/2015.
DAFTAR PUSTAKA
[1] S.  Yudo,  “Kondisi  Pencemaran  Logam  Berat  di  Perairan  Sungai  DKI Jakarta,” (2006) JAI 2: No 1.
[2] M.  T.  Madigan,  J.  M.  Martinko,  D.  A.  Stahl,  and  D.  P.  Clark,  “Brock Biology of Microorganims,” San Fransisco: Pearson Education (2012).
[3] Prescott,  Harley,  and  Klein,  “Microbiology,  Seventh  Edition,”  New York: McGraw-Hill (2008).
[4] I.  Sheramati  and  A.  Varma,  “Soil  Biology:  Soil  Heavy  Metals,”  New York: Springer Heidelberg Dordrecht (2010).
[5] K.  Chojnacka,  “Biosorption  and  Bioaccumulation-The  Prospects  for Practical Applications”, (2010) Environment International 36: 299-307.
[6] R.  Saraswati  dan  E.  Yuniarti,  “Metode Analisis Biologi Tanah”,  Balai Besar  Litbang  Sumberdaya  Lahan  Pertanian,  Badan  Penelitian  dan Pengembangan Pertanian, Departemen Pertanian (2007).
Konsentrasi Fe
Konsentrasi Fe Konsentrasi Fe Konsentrasi Fe
[7] E.  Zulaika,  L.  Sembiring,  and  A.  Soegianto,  “Characterization  and Identification  of  Mercury-resistant  Bacteria  From  Kalimas  River Surabaya-Indonesia By Numerical Phenetic Taxonomy”, (2012) Journal of Basic and Applied Scientific Research 2 (7): 7263-7269.
[8] R. Kanwal, T. Ahmed, S. S. Tahir, and N. Rauf, “Resistance of Bacillus cereus and E.  coli Towards  Lead,  Copper,  Iron,  Manganese  and Arsenic”, (2004) Pakistan Journal of Biological Sciences 7: 6-9.
[9] K.  Elder,  D.  Baker,  and  J.  Ribes,  “Infections,  Infertility,  and  Assisted Reproduction”, Cambridge: Cambridge University Press (2005).
[10] M.  Dworkin,  S.  Falkow,  E.  Rosenberg,  K.  H.  Schleifer,  and  E. Stackebrand,  “The  Prokaryotes:  A  Handbook  on  The  Biology  of Bacteria:  Firmicutes,  Cyanobacteria”,  Springer  Science  Bussiness Media (2006).
[11] A. K. Patel, M. K. Deshattiwar, B. L. Chaudari, and S. B. Chincholkar, “Production,  Purification,  and  Chemical  Characterization  of  The Catecholate Siderophore from Potent Probiotic Strains of Bacillus sp.”,
(2008) Bioresource Technology 100: 368-373.
[12] Harley  and  Prescott,  “Laboratory  Exercises  in  Microbiology,  Fifth Edition”,  The McGraw-Hill Companies (2002).
[13] V.  Baby,  S.  Rajakumar,  and  P.  M.  Ayyasamy,  “Prevalence  and Screening  of  Potential Fe(III) and Mn(VI) Resistant Microorganisms in Industrial  Soil”,  (2014)  International  Journal  of  Innovative  Research  in Science, Engineering and Technology Vol. 3: 7.
[14] V. Baby, S. Rajakumar, and P. M. Ayyasamy, “Reduction of Ferric Iron in  Synthetic  Medium  Amended  with  Acetate  As  A  Sole  Carbon Source”,  (2013)  International  Journal  of  Current  Microbiology  and Applied Sciences Vol. 2 No. 12: 501-513.
[15] E.  Zulaika,  U.  Sholikah,  dan  A.  Prasetya,  “Potensi  Bakteri Bacillus
Sebagai  Agensia  Bioremediasi  Limbah  Industri  yang  Mengandung Merkuri”,  (2012)  Seminar  Pemetaan  Potensi  dan  Inovasi  Ilmu Pengetahuan, Teknologi, Seni dan Budaya (IPTEKSB).
[16] E.  Zulaika,  L.  Sembiring,  dan  A.  Soegianto,  “Characterization  and Identification  of  Mercury-resistant  Bacteria  From  Kalimas  River Surabaya-Indonesia By Numerical Phenetic Taxonomy”, (2012) Journal of Basic and Applied Scientific Research 2 (7): 7263-7269.
[17] R.  Kumar,  Nongkhlaw,  C.  Acharya,  and  S.  R.  Joshi,  “Growth  Media Composition  and  Heavy  Metal  Tolerance  Behaviour  of  Bacteria Characterized From The Sub-Surface Soil of Uranium Rich Ore Bearing Site of Domiasiat in Meghalaya”, (2013) Indian Journal of Biotecnology Vol. 12: 115-119.
[18] C.  Nithya,  B.  Gnanalakshmi,  and  S.  K.  Pandian,  “Assesment  and Characterization  of  Heavy  Metal  Resistance  in  Palk  Bay  Sediment Bacteria”, (2011) Marine Envioronmental Research: 283-294.
[19] M. Fuangthong, A. F. Herbig, N. Bsat, dan J. D. Helmann, “Regulation of The Bacillus subtilis fur and perR Genes by PerR: Not All Members of  The  PerR  Regulon  Are  Peroxide  Inducible”,  (2002)  Journal  of Bacteriology: 3276-3286.
[20] M. T. Madigan, J. M. Martinko, D. A. Stahl, and D. P. Clark, “Brock Biology of Microorganisms”, San Fransisco: Pearson Education (2012).
[21] Prescott,  Harley,  Klein,  “Microbiology,  Seventh  Edition”,  New  York: McGraw-Hill (2008).