## ALCHEMY Journal of Chemistry

## Artikel Penelitian
Pengembangan dan Validasi Metode Destruksi Gelombang Mikro untuk Penentuan Logam Berat Kadmium dan Timbal dalam Cokelat dengan Spektoskopi Serapan Atom (SSA)
Moh. Taufiq * , Akhmad Sabarudin, Ani Mulyasuryani
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia

## INFO ARTIKEL

## ABSTRAK
Sejarah artikel: Revisi 13 Agustus 2016 Diterima 29 September 2016 Tersedia online 31 Oktober 2016 Development and validation of analytical methods has been performed for determination of heavy metals cadmium (Cd) and lead (Pb) in two types of chocolate, prior to use of domestic microwave-assisted acid digestion method  without  modification.  Heavy  metals  were  analyzed  by  flame atomic absorption spectrometry . The analysis showed that the microwave digestion  has  complied  to  the  terms  of  validation,  linearity  >0.99,  mean recoveries  from  92.6  to  103.2%,  repeatability  of  the  method  (inter-day) and  intra-day  gave  relative  standard  deviation  (RSD)  from  1.6  to  4.8%. Limit  of  detection  (LOD)  of  Cd  and  Pb  of  0.006  and  0.02  mg/kg respectively  and  quantification  (LOQ)  0.025  mg/kg  for  Cd  and  0.042 mg/kg for Pb. Robustness of the method gave relative standard deviation from 2.6 to 4.8%. The procedure of microwave digestion of developed is very practical, easy, fast, accurate, precise, reliable and useful for routine laboratory analyses of a large number of samples.
Keywords : AAS, microwave digestion, heavy metal, validation method Pengembangan  dan  validasi  metode  analisis  telah  dilakukan  untuk penentuan  logam  berat  cadmium  (Cd)  dan  timbal  (Pb)  dalam  dua  jenis cokelat.  Sampel  ditambahkan  asam  dan  didestruksi  dengan  gelombang mikro  rumah  tangga  tanpa  modifikasi.  Pengukuran  logam  berat menggunakan  spektroskopi  serapan  atom  (SSA).  Hasil  analisis menunjukkan  bahwa  destruksi  gelombang  mikro  telah  memenuhi persyaratan  validasi  seperti  linieritas  >0,99  dan  rata-rata  perolehan kembali 92,6-103,2%. Parameter ketelitian yang dilakukan pada hari yang sama  maupun  berbeda  memperoleh  standar  deviasi  relatif  (RSD)  <5%, batas  deteksi metode  (LOD)  Cd  dan  Pb  masing-masing  0,006  dan  0,02 mg/kg,  sedangkan  batas  kuantitasi  (LOQ)  0,025  mg/kg  untuk  Cd  dan 0,042  mg/kg  untuk  Pb.  Kekuatan  metode  menghasilkan standar  deviasi relatif  2,6-4,7%.  Prosedur  destruksi  gelombang  mikro  yang dikembangkan  sangat  praktis,  dan  dikategorikan  sebagai  metode preparasi  yang  mudah, cepat,  akurat,  teliti,  dapat  diandalkan dan  dapat dijadikan  sebagai  metode  analisis  rutin  di  dalam  laboratorium  dengan beberapa jenis sampel dalam jumlah yang banyak.
Kata  Kunci :  destruksi  gelombang  mikro,  SSA,  logam  berat, validasi metode
*Penulis korespodensi: Email: mohtaufiq84@gmail.com

## 1. Pendahuluan
Validasi  metode  analisis  merupakan  langkah penting  dalam  mengontrol  kualitas  analisis kuantitatif  (Abarca,  Canfranc,  Sierra,  &  Marina, 2001).  Validasi  ini  dilakukan  untuk  memastikan bahwa  suatu  metode  analitik  secara  ilmiah  baik diaplikasikan  untuk  keperluan  analisis  di laboratorium  sehingga  memperoleh  suatu  data yang valid  (Purwanto, Supriyanto, & Samin,  2007; Hanjani,  2013).  Upaya  untuk  memperoleh  suatu metode  yang  valid  memerlukan  beberapa parameter yang harus dilakukan meliputi ketepatan, ketelitian,  linieritas,  batas  deteksi  instrumen  (IDL) batas  deteksi  dan  batas  kuantitasi  metode  (LOD dan  LOQ),  dan  uji  kekuatan  metode (robustness). Apabila  parameter-parameter  tersebut  memenuhi persyaratan  validasi,  maka  mudah  memperoleh kepercayaan  dari  metode  analisis  yang  sedang dilakukan,  khususnya  untuk  analisis  logam  berat kadmium (Cd) dan timbal (Pb) dalam cokelat.
Logam Cd dan Pb merupakan dua jenis logam berat  yang  dapat  menimbulkan  bahaya  kesehatan apabila masuk ke dalam tubuh. Beberapa penyakit yang disebabkan logam Cd yaitu gangguan saluran pernafasan  dan  pencernaan,  radang  paru-paru, hati dan menjadi racun pada tulang (Zhong, Ren, & Zhao,  2016).  Penyakit  yang  sebabkan  oleh keracunan  logam  Pb  antara  lain  mengurangi tingkat  IQ,  menghambat  pertumbuhan  dan merusak ginjal, keguguran, kehilangan keseimbangan,  gangguan  pendengaran,  anemia, dan merusak alat pendengaran (Suherni, 2010)
Sumber  utama  kontaminasi  logam  berat  Cd dalam cokelat berasal dari bahan baku pembuatan cokelat,  proses  produksi  dan  pengolahan  cokelat yang  dilakukan  di  dalam  alat  berbahan  baja, pencucian  logam  dari vessel yang  digunakan (Dahiya,  Karpe,  Hegde,  &  Sharma,  2005). Sementara itu, logam berat Pb dalam cokelat dapat berasal  dari  bahan  pangan  yang  ditambahkan, peralatan  produksi  yang  digunakan  serta  bahan pembungkus  cokelat  yang  beraneka  warna. Kebanyakan  perusahaan  menggunakan  wadah cokelat  yang  tidak  diperuntukkan  pada  makanan seperti  pewarna  yang  digunakan  mengandung PbCrO 4 dan  tidak  cocok  untuk  makanan  (Dias  & Wickramasinghe, 2016).
Studi penelitian tentang cokelat telah dilakukan terhadap  69  merk  cokelat  di  Mumbai  India. Hasilnya menunjukkan bahwa cokelat mengandung logam  berat  Pb,  Cd,  dan  Ni  dengan  konsentrasi
berturut-turut  sebesar  0,93;  0,105  dan  1,63  µg/g (Dahiya  et  al.,  2005).  Penelitian  lain  juga  pernah dilaporkan  bahwa  cokelat  mengandung  logam berat  Cd,  Cu,  Ni  dan  Zn  dengan  konsentrasi masing-masing  sebesar  1,95;  14,15;  2,90  dan 20,02 µg/g (Ramtahal et al., 2014).
Preparasi  sampel  cokelat  dalam  penelitian  ini menggunakan  metode  destruksi  basah  sistem gelombang  mikro,  sedangkan  pengukuran  logam berat  Cd  dan  Pb  menggunakan  spektroskopi serapan atom (SSA). Metode ini memiliki beberapa keunggulan antara lain waktu destruksi lebih cepat, mengurangi  polusi  saat  destruksi,  mengurangi penguapan analit, penggunaan asam lebih sedikit, dan mudah dilakukan (Zhong et al., 2016).
Metode  analisis  logam  dalam  penelitian  ini merupakan  pengembangan  dari  metode  standar SNI  7934:2014  tentang  produk  cokelat,  untuk  itu perlu  dilakukan  proses  validasi.  Hal  ini  sesuai dengan  peraturan  ISO/IEC  17025  (2005)  yang menyebutkan  bahwa  salah  satu  metode  yang harus  divalidasi  adalah  metode  standar  yang sedang dikembangkan.

## 2. Bahan dan metode

## 2.1. Bahan
Bahan  yang  digunakan  yaitu  asam  nitrat (HNO 3 )  65%  for  analysis  EMSURE  (Merck), akuabides  ( pro  injection ),  larutan  standar  Cu (Merck-SRM) 1000 mg/L, standar Pb (Merck-SRM) 1000  mg/L,  standar  Cd  (Merck-SRM)  1000  mg/L, Na 2 EDTA 0,1 mol/L, HNO 3 0,5 mol/L dan 1,0 mol/L.

## 2.2. Preparasi sampel
Sampel cokelat jenis bars ditimbang sebanyak 0,2  g  dan  masukkan  ke  dalam  tabung vessel polipropilena,  tambahkan  HNO 3 65%  sebanyak  5 mL dan ditutup rapat.

## 2.3. Destruksi Basah Sistem Gelombang Mikro yang diusulkan
Sampel  cokelat  0,2  g  yang  sudah  disiapkan dalam  tabung vessel polipropilena,  didestruksi menggunakan  gelombang  mikro  tanpa  modifikasi (MODENA 2502) dengan tingkat pemanasan 100% dan  daya  900  Watt,  lama  destruksi  2  menit, didinginkan  di  dalam  gelombang  mikro  5  menit pada  suhu  kamar  5  menit,  kemudian  saring menggunakan  kertas  Whatman  40.  Filtrat  diukur menggunakan SSA-AA240 (Varian Australia)  pada panjang  gelombang  228,8  nm  untuk  Cd  dan  283
nm  untuk  Pb.  Data  yang  dilaporkan  adalah  rata- rata  dari  5  replikasi  sampel  hasil  destruksi. Selanjutnya,  dilakukan  validasi  yang  meliputi linieritas,  presisi,  akurasi,  batas  deteksi  (LOD), batas  kuantitasi  (LOQ)  dan  kekuatan  metode ( robustness).

## 3. Hasil dan pembahasan
3.1. Optimasi Spektroskopi Serapan Atom (Manual Book AA240, 1989)
Proses  optimasi  telah  berhasil  dilakukan  pada SSA yang meliputi lampu katoda berongga, burner , nebulizer , sensitivitas dan verifikasi larutan standar Cd  dan  Pb  untuk  kalibrasi  (Tabel  1).  Hasil  presisi ditunjukkan  dengan  nilai  standar  deviasi  relatif (RSD)  yaitu  1,5%  untuk  Cd  dan  1,8%  untuk  Pb. Sementara  itu,  perolehan  kembali  yang  diperoleh sebesar  104,3%  untuk  Cd  dan  98,4%  untuk  Pb. Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  performa  instrumen SSA-AA240  cukup  baik  digunakan  sebagai  alat ukur  logam  Cd  dan  Pb  karena  memiliki  ketelitian dan  ketepatan  yang  cukup  baik  dan  telah memenuhi ekspektasi akurasi dari instrumen yaitu 95-105%.

## 3.2. Destruksi dengan gelombang mikro
Proses  destruksi  merupakah  salah  satu  hal penting  yang  perlu  diperhatikan  dalam  proses preparasi  sampel  untuk  penentuan  konsentrasi suatu  logam.  Destruksi  merupakan  pemutusan ikatan  organologam  menjadi  logam-logam anorganik dalam bentuk larutannya (ion) yang siap dianalisis  dengan  spektroskopi  serapan  atom. Penelitian  ini  menggunakan  metode  destruksi sistem  gelombang  mikro  dengan  daya  900  Watt, waktu  destruksi  2  menit,  dan  sampel  yang dihasilkan  berupa  larutan  jernih  berwarna  kuning kecokelatan.  Metode  ini  adalah  pengembangan dari  metode  standar  yaitu  destruksi  kering sehingga perlu dilakukan validasi.

## Tabel 2.
Hasil pengukuran Cd dan Pb dalam cokelat dengan metode  destruksi  gelombang  mikro  yang dikembangkan (n = 5)
Parameter Logam Cd Pb Konsentrasi (mg/kg) 1,1 1,5 Standar deviasi 0,020 0,053 Baku  mutu  cokelat (mg/kg) SNI 7934:2014 0,5 1,0
Berdasarkan  Tabel  2  diketahui  bahwa  cokelat bars mengandung logam Cd dan Pb sangat tinggi masing-masing  1,1  dan  1,6  mg/kg.  Konsentrasi tersebut lebih besar jika dibandingkan dengan nilai ambang  batas  maksimum  yang  dipersyaratkan oleh standar nasional Indonesia dengan nomor SNI 7934:2014  (BSN,  2014),  sedangkan  menurut food and  drug  administration (FDA)  konsentrasi  Pb maksimum 0,1 mg/kg. Tingginya konsentrasi logam Cd  dan  Pb  dapat  disebabkan  beberapa  faktor antara lain asal tanaman cokelat (Suherni & Group, 2010), komposisi bahan pangan yang ditambahkan, peralatan  yang  digunakan  saat  proses  produksi, dan jumlah zat warna yang dicampurkan baik pada cokelat  itu  sendiri  (Dahiya  et  al.,  2005)  maupun pada  wadah  atau  pembungkus  yang  digunakan (Dias & Wickramasinghe, 2016).

## 3.3. Validasi metode
Berdasarkan  peraturan  ISO/EIC  17025  (2005) disebutkan bahwa proses validasi merupakan satu hal  penting  yang  perlu  dilakukan  untuk mengkonfirmasi  melalui  pengujian  dan  dibuktikan dengan  data-data  yang  objektif.  Hal  ini  untuk mengetahui  bahwa  persyaratan  tertentu  untuk maksud  tertentu  telah  terpenuhi.  Salah  satu metode  yang  perlu  dilakukan  validasi  adalah metode  standar  yang  sedang  dikembangkan  atau dimodifikasi  seperti  metode  yang  dilakukan  pada penelitian ini.

## Tabel 1.
Kondisi instrument SSA-AA240untuk pengukuran Cd dan Pb
Linieritas  dikonfirmasi  melalui  larutan  standar Cd  dan  Pb  dengan  hasil  cukup  baik  (Tabel  3) karena  absorbansi  Cd  dan  Pb  meningkat  secara eksponensial  sesuai  dengan  konsentrasinya  dan menghasilkan  koefisien  korelasi  (R 2 )  mendekati  1. Menurut Harmita (2004), linieritas yang ideal dapat diperoleh  apabila  nilai  b  =  0  dan  r  =  +1  atau  -1 tergantung pada arah garis.

## Tabel 3
Hasil linieritas Cd dan Pb Konsentrasi (mg/kg) Persamaan R 2 Cd 0,02 - 0,40 Y=0,7433X+0,0024 0,9999 Pb 0,10 - 0,20 Y=0,0307X+0,0018 0,9960
Uji  batas  deteksi  metode  (LOD)  bertujuan untuk  mengetahui  batas  konsentrasi  Cd  dan  Pb terkecil  yang  dapat  terukur  oleh  instrumen  dan memberikan  respon  signifikan  dibandingkan dengan blanko, sedangkan batas kuantitasi metode (LOQ)  adalah  batas  terkecil  analit  yang  dapat terdeteksi  secara  kuantitatif  (Harmita,  2004). Penentuan batas deteksi metode dilakukan dengan mengukur  HNO 3 65%  yang  sudah  didestruksi dengan gelombang mikro (9 kali ulangan).
Berdasarkan  hasil  pengujian  diketahui  bahwa batas deteksi metode (LOD) penentuan logam Cd dan  Pb  masing-masing  sebesar  0,006  dan  0,020 mg/kg, sedangkan batas kuantitasi (LOQ) sebesar 0,025 mg/kg untuk Cd dan 0,042 mg/kg untuk Pb. Hasil tersebut memberikan informasi bahwa logam Cd  dan  Pb  dapat  terdeteksi  apabila  sampel  yang diukur  memiliki  konsentrasi  lebih  besar  dari  nilai LOQ,  sehingga  hasilnya  dapat  dipercaya.  Namun, apabila sampel yang terdeteksi lebih kecil dari nilai LOQ  dapat  dipastikan  bahwa  hasil  tersebut bukanlah  murni  dari  sampel  melainkan noise atau gangguan  saat  analisis,  dengan  demikian  data yang  dihasikan  kurang  akurat  atau  tidak  dapat dipercaya.
Parameter  akurasi  metode  menggunakan spiking  method yang  didasarkan  pada  persen  (%) perolehan  kembali  (Ravichandran,  Shalini, Sundram,  &  Rajak,  2010).  Proses  ini  dilakukan dengan  cara  menambahkan  larutan  standar  (Cd dan Pb) yang sudah diketahui konsentrasinya, dan berdasarkan  AOAC  (2002),  konsentrasi  standar yang  ditambahkan  harus  identik  atau  relatif  sama dengan  konsentrasi  sampel.  Perbandingan destruksi  basah  sistem  gelombang  mikro  yang diusulkan  dengan  destruksi  kering  (standar) ditunjukkan pada Tabel 4.

## Tabel 4.
Perbandingan destruksi basah sistem gelombang mikro yang diusulkan dengan destruksi kering (standar)
Hasil  pengujian  akurasi  ditunjukkan  dengan persen perolehan kembali logam Cd dan Pb dalam cokelat  masing-masing  sebesar  94,3  dan  92,6% untuk cokelat a, sedangkan pada cokelat b sebesar 103,2  dan  94,1%,  berturut-turut  (Tabel  5).  Nilai tersebut  menunjukkan  bahwa  metode  destruksi basah  sistem  gelombang  mikro  yang  diusulkan memiliki ketepatan yang cukup baik dan memenuhi kriteria yang dipersyaratkan dalam validasi metode yaitu 80-110% (AOAC, 2002).
Perolehan  kembali  yang  tinggi  menunjukkan bahwa  destruksi  basah  sistem  gelombang  mikro yang  diusulkan  memiliki  ketepatan  yang  baik, karena sampel hasil didestruksi dimasukkan dalam vessel polipropilena  dan  kondisi  tertutup  sehingga penguapan  analit  dapat  dihindari.  Energi  panas dari  gelombang  mikro  diserap  secara  merata  oleh sampel sehingga logam Cd dan Pb terlarut secara sempurna dan tetap terlindungi dengan baik karena tidak  terjadi  penguapan  selama  proses  destruksi (Zhong et al., 2016).
Tabel  6  menunjukkan  bahwa  destruksi  basah sistem  gelombang  mikro  memiliki  ketepatan (akurasi)  yang  cukup  baik  untuk  preparasi beberapa  jenis  logam  dalam  beberapa  jenis sampel  dengan  waktu  destruksi  yang  singkat. Namun,  pada  penelitian  ini  proses  destruksi dilakukan  dalam  waktu  2  menit  dan  perolehan kembali  mencapai  92,3-103,6%  sehingga  metode destruksi  gelombang  mikro  yang  diusulkan  dapat dukategorikan lebih efisien.
Hasil  akurasi  metode  yang  baik  sangat diperlukan dalam penelitian ini sebagai bukti bahwa metode  yang  sedang  dikembangkan  memenuhi persyaratan  validasi.  Hal  ini  sangat  tergantung pada  seluruh  tahapan  dalam  metode  analisis antara  lain  kondisi  laboratorium  yang  baik, ketelitian  dalam  preparasi  sampel,  pereaksi  dan pelarut  yang  baik,  taat  asas  sesuai  dengan prosedur, dan alat ukur yang terkalibrasi.
Tabel 5.
Hasil perolehan kembali logam Cd dan Pb dalam cokelat (n=5)
1 sampel 0,2-0,25 g, waktu destruksi 5-15 menit, menggunakan multiwave dan domestic microwave 2 sampel 0,2 g, waktu destruksi 2 menit, menggunakan domestic microwave

## Tabel 6.
Perbandingan destruksi gelombang mikro yang diusulkan dengan destruksi gelombang mikro yang lain
Parameter ketelitian (presisi) metode dilakukan dengan  mengukur  Cd  dan  Pb  dalam  kondisi  yang sama  baik  sampel,  metode,  analis,  instrumen, kondisi laboratorium dan dianalisis pada hari yang sama dengan interval waktu relatif singkat, proses ini disebut dengan repeatability (intra-day) .
Presisi  metode  juga  dilakukan  dengan intermediate precision (inter-day) .  Proses  ini dilakukan  pada  sampel  sama,  menggunakan metode  sama,  analis  sama  dan  instrumen  yang sama,  namun  dilakukan  pada  hari  yang  berbeda, kemudian  dihitung  nilai  standar  deviasi  relatif (RSD) yang dihasilkan.
Berdasarkan hasil uji presisi pada Tabel 7 dan Tabel  8 diketahui  bahwa  standar  deviasi  relatif (RSD)  yang  dihasilkan  kisaran  1,6-4,8%.  Hasil  ini menunjukkan  bahwa  metode  destruksi  sistem gelombang  mikro  memiliki  keterulangan  yang cukup  baik.  Menurut  AOAC  (2002),  semakin  kecil konsentrasi analit yang diteliti, semakin besar pula kriteria  RSD  yang  dapat  diterima.  Analit  dengan konsentrasi 10 µg/g kriteria RSD yang diterima 6% sedangkan  1  µg/g  kriteria  RSD  sebesar  8% Apabila  hasil  yang  diperoleh  kurang  dari  kisaran tersebut,  maka  metode  analisis  dianggap  memiliki keterulangan yang kurang baik.

## Tabel 8
Hasil uji presisi metode untuk Cd dan Pb pada hari berbeda (inter-day) (n = 5)
Robustness (kekuatan  metode)  dilakukan untuk  mengetahui  kemiripan  hasil  pengukuran yang dilakukan  dalam beberapa kondisi instrumen yang  berbeda  (parameter  kondisi  instrumen  yang dirubah).  Apabila  perubahan  kondisi  instrumen menghasilkan  suatu  data  yang  memiliki  kemiripan dengan  kondisi  standar  (normal),  maka sesungguhnya metode tersebut dapat dikategorikan robust (metode  yang  kuat).  Tabel  9 menunjukkan  bahwa  hasil  standar  deviasi  relatif (RSD)  Cd  pada  kondisi  a  (normal)  dan  kondisi  b (berbeda)  masing-masing  sebesar  2,6  dan  2,8%, sedangkan RSD Pb sebesar 4,0 dan 4,7%.
Adanya  kemiripan  hasil  pengukuran  dengan beberapa kondisi pengukuran berbeda menunjukkan  bahwa  metode  destruksi  gelombang mikro  yang  diusulkan  untuk  penentuan  logam  Cd dan Pb memiliki ketelitian cukup baik dengan nilai RSD  <5%,  dan  memenuhi  kriteria  validasi  dalam hal robustness karena  telah  berhasil  digunakan pada  berbagai  kondisi  pengukuran  berbeda dengan hasil yang relatif sama atau tidak berbeda secara signifikan.

## 4. Kesimpulan
Konsentrasi  Cd  dan  Pb  dalam  cokelat  yang diteliti  melebihi  baku  mutu  maksimum  yang dipersyaratkan oleh SNI 7934:2014 yaitu 0,5 mg/kg untuk  Cd  dan  1,0  mg/kg  untuk  Pb.  Metode destruksi  basah  sistem  gelombang  mikro  yang dikembangkan  telah  memenuhi  persyaratan validasi  seperti  linieritas  lebih  besar  dari  0,99, perolehan kembali mencapai 92,6-103,2%, standar deviasi  relatif  (RSD)  <5%,  konsentrasi  Cd  dan  Pb lebih  besar  dari  batas  deteksi  metode  (LOD)  dan batas  kuantitasi  (LOQ),  memiliki  kekuatan  metode (robustness) cukup  baik  untuk  penentuan  logam Cd  dan  Pb  dalam  cokelat.  Prosedur  destruksi gelombang  mikro  yang  dikembangkan  sangat praktis,  mudah,  cepat,  akurat,  teliti,  dan  dapat diandalkan.
Cokelat  Logam  Hari  Konsentr asi (mg/kg) Standar deviasi relatif (%) a Cd 1 1,07 2,7 2 1,08 1,6 Pb 1 1,43 4,7 2 1,48 4,8 b Cd 1 1,11 1,9 2 1,13 2,4 Pb 1 1,66 4,3 2 1,68 4,5

## Tabel 7
Hasil uji presisi metode untuk Cd dan Pb pada hari yang sama (intra-day) (n = 5)
*Sampel dianalisis setelah 3 jam

## 5. Daftar pustaka
Abarca, A., Canfranc, E., Sierra, I., & Marina, M. L. (2001).  A  validated  flame  AAS  method  for determining  magnesium  in  a  multivitamin pharmaceutical  preparation. Journal  of Pharmaceutical  and  Biomedical  Analysis , 25 (5–6), 941–945.
Akinyele,  I.  O.,  &  Shokunbi,  O.  S.  (2015). Comparative  analysis  of  dry  ashing  and  wet digestion  methods  for  the  determination  of trace  and  heavy  metals  in  food  samples. Food Chemistry , 173 , 682–684.
Ansari, R., Kazi, T. G., Jamali, M. K., Arain, M. B.,
Wagan,  M.  D.,  Jalbani,  N.,  …  Shah,  A.  Q. (2009).  Variation  in  accumulation  of  heavy metals  in  different  varities  of  sunflower  seed oil with the aid of multivariate technique. Food Chemistry , 115 (1), 318–323.
AOAC.  (2002).  Guidelines  for  single  laboratory validation  of  chemical  methods  for  dietary supplements and botanicals. AOAC International , 1–38. Badan  standarisasi  nasional  (BSN)  2014  Standar Nasional  Indonesia  (SNI)  7934:2014  Cokelat dan produk-produk cokelat. (2014), 7934.
Dahiya, S., Karpe, R., Hegde, A. G., & Sharma, R.
M.  (2005).  Lead,  cadmium  and  nickel  in chocolates and candies from suburban areas of  Mumbai,  India. Journal  of  Food Composition and Analysis , 18 (6), 517–522.
Dias,  A.  R.  M.,  &  Wickramasinghe,  I.  (2016).
Determination  of  toxic  metals  in  chocolate confectionery wrappers used by the chocolate manufacturers in Sri Lanka, and it's migration to  chocolates  under  different  storage conditions. International  Journal  of  Science and Research , 5 (1), 352–357.
Hanjani,  F.N.,  (2013).  Validasi  metode  analisis unsur  logam  Pb,  Cu,  dan  Zn  produk  saus tomat  y  dari  pasar  tradisional  x  daerah surabaya timur dengan ICPS, 2 (2), 1–11.
Harmita.  (2004).  Petunjuk  pelaksanaan  validasi metode dan cara perhitungannya. 117–135.
Manual  Book  AA240,  (1989).  Analytical  methods, varian of flame atomic absorption spectrometry.
Purwanto,  A., Supriyanto,  C.,  &  Samin,  P.  (2007). Validasi  pengujian  Cr,  Cu  dan  Pb  dengan metode spektrometri serapan atom, Prosiding PPI-PDIPTN. 151–158.
Ramtahal, G., Chang Yen, I., Bekele, I., Bekele, F., Wilson,  L.,  Sukha,  B.,  &  Maharaj,  K.  (2014). Cost-effective  method  of  analysis  for  the determination of cadmium, copper, nickel and zinc  in  cocoa  beans  and  chocolates. Journal of Food Research , 4 (1), 193-199.
Ravichandran,  V.,  Shalini,  S.,  Sundram,  K.  M.,  & Rajak,  H.  (2010).  Validation  of  analytical methods  -  Strategies  &  importance.
International Journal Pharmacy and Pharmaceutical Science,  2 (3) , 18-22 . Standar  Internasional  ISO/IEC  17025  (Versi Bahasa  Indonesia)  Persyaratan  umum kompetensi  laboratorium  pengujian  dan laboratorium.
Suherni, O., (2010). Keracunan Timbal di Indonesia, global lead advice & support service, 1-19.
Zhong,  W.  S.,  Ren,  T.,  &  Zhao,  L.  J.  (2016). Determination  of  Pb  (Lead),  Cd  (Cadmium), Cr (Chromium), Cu (Copper), and Ni (Nickel) in Chinese tea with high-resolution continuum source  graphite  furnace  atomic  absorption spectrometry. Journal  of  Food  and  Drug Analysis , 24 (1), 46–55.

## Tabel 9
Robustness penentuan logam Cd dan Pb dalam cokelat (n = 5)
1 lebar celah = 0,5 nm, waktu pengukuran = 3 detik, waktu tunggu pembacaan = 3 detik, arus lampu = 4 mA
2 lebar celah = 0,2 nm, waktu pengukuran = 4 detik, waktu tunggu pembacaan = 4 detik, arus lampu = 6 mA
1 * lebar celah = 0,5 nm, waktu pengukuran = 3 detik, waktu tunggu pembacaan = 3 detik, arus lampu = 10 mA
* standar deviasi relatif merupakan hasil rata-rata dari dua jenis sampel cokelat