Modulasi Sel T CD4 + dan CD8 + pada Spleen Ayam Arab Putih (Gallus turcicus) dengan Ransum yang Mengandung Daun Pepaya (Carica papaya L.)
Herminah Febrianty 1) , M. Sasmito Djati 2)
1), 2) Laboratorium Anatomi dan Fisiologi Hewan, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang
Email: 1) hermin.febrianty@gmail.com, 2) msdjati@ub.ac.id

## ABSTRAK
Usaha peternakan ayam arab (Gallus turcicus) saat ini telah berkembang pesat di Indonesia. Ayam ini  memiliki  berbagai  macam  keunggulan,  salah  satunya  adalah  produktivitas  telur  yang  tinggi. Penggunaaan  feed  additive    merupakan  kebutuhan  yang  hampir  tidak  terpisahkan  dalam  pemeliharaan ayam yang umumnya berguna  sebagai Antibiotic Growth Promote (AGP). Konsumsi ransum  dengan feed additive  sintetis  dapat  menyebabkan  residu  antibiotik  di  dalam  hasil  produksi  seperti  telur  dan  daging, karena  proses  ekskresi  yang  tidak  sempurna.  Daun  pepaya  (Carica  papaya  L.)  yang  memiliki  senyawa flavonoid dan alkaloid untuk memodulasi aktivitas sistem imun. Tujuan percobaan ini untuk mengetahui pengaruh pemberian daun pepaya dalam ransum terhadap  modulasi jumlah sel T CD4 + dan CD8 + pada spleen ayam arab putih. Metode penelitian diantaranya pembuatan ransum kontrol (0 %), dosis 1 (6 %) dan  dosis  2  (12  %)  dari  daun  pepaya,  dengan  bahan  lain  yaitu  jagung,  bekatul  dan  konsentrat. Pembedahan dilakukan setelah perlakuan selama 2 bulan. Sel limfosit diisolasi dari spleen dan diinkubasi dengan  antibodi  rat-anti-CD4 + PE  dan  rat-anti-CD8 + FITC  dengan  pengenceran  PBS  (1:100  μl),  masing- masing sebanyak 50 μl, kemudian dilakukan running pada flowcytometer, selanjutnya dilakukan analisis jumlah  relatif  sel  limfosit  T  CD4 + dan  CD8 + menggunakan  SPSS  16  for  Windows  dengan  α=0,05.  Hasil menunjukkan  bahwa  pemberian  pakan  dengan  tambahan  daun  pepaya  secara  signfikan  dapat memodulasi jumlah relatif sel limfosit, terutama pada sel T CD4 + . Perlakuan dengan kemampuan paling baik dalam  meningkatkan jumlah relatif sel T CD4 + secara  signifikan  adalah  ransum  daun  pepaya 6 % yakni  sebesar  2,39  %,  sedangkan  perlakuan  kontrol  sebesar  0,58  %  dan  dosis  12  %  sebesar  0,50  %. Sedangkan jumlah relatif CD8 + memiliki nilai yang tidak berbeda nyata dari semua perlakuan. Sehingga dapat dibuktikan bahwa daun pepaya mampu berperan sebagai imunomodulator dalam sistem imunitas ayam arab.
Kata kunci : ayam  arab, CD4 + , CD8 + , daun  pepaya

## ABSTRACT
Arabic  hen  farm  (Gallus  turcicus)  has  recently  been  growing  rapidly  in  Indonesia.  This  chicken has  a wide range of advantages, one  of which is high productivity of eggs. The use of a feed additive is a requirement  that  almost  inseparable  in  chicken  maintenance  generally  used  as  Antibiotics  Promote Growth (AGP). Consumption of feed with synthetic additives causing antibiotic residues in dairy products such  as  eggs  and  meat,  because  the  excretion  process  is  imperfect.  Papaya  leaf  (Carica  papaya  L.)  has flavonoids and alkaloids to modulate the activity of the immune system. The purpose of this experiment is to determine effect of papaya leaf in feed for the number of CD4 + T cells and CD8 + T cells in the spleen of white arabic hen. The methods include the manufacture control diet (0 %), a dose of 1 (6 %) and a dose of 2  (12  %)  of  papaya,  with  other  materials  such  as  corn,  rice  bran  and  concentrates.  Surgery  performed after  2  months  treatment.  Lymphocytes  isolated  from  the  spleen  was  incubated  with  antibody-anti-rat CD4 + PE  and  rat-anti-CD8 + FITC  with  PBS  dilution  (1  :  100  mL),  each  of  50  mL,  then  ran  by flowcytometri  and  analyzed  using  SPSS  16  for  Windows  with  α=0.05  for  the  relative  number  of lymphocytes  T  CD4 + and  CD8 + .  The  results  showed  that  feeding  with  additional  papaya  leaves  can  be exhibited  significantly  influence  the  development  of  the  relative  number  of  lymphocytes,  particularly  in CD4 + T cells. Treatment with the best ability to increase significantly the relative number of CD4 + T cells is  addition  6  %  papaya  leaves  (2,39  %).  While  the  relative  number  of  CD8 + has  a  value  that  is  not significantly  different  from  all  treatments.  So  it  can  be  proved  that  papaya  leaf  capable  of  acting  as  an immunomodulator in the immune system.
Key words : Arabic hen, CD4 + , CD8 + , papaya leaf

## PENDAHULUAN
Usaha peternakan ayam arab saat ini telah berkembang  pesat  di  Indonesia.  Hal  ini
dikarenakan  ayam  arab  memiliki  berbagai macam keunggulan, salah satu keunggulan ayam arab  adalah  produktivitas  telur  yang  tinggi  [1].
pemeliharaannya  yang  mudah,  efisiensi  pakan tinggi,  betina  tidak  mengeram,  bertelur  hampir sepanjang  tahun,  kandungan  gizi  telur  dan daging  memiliki  kemiripan  dengan  ayam kampung biasa [2].
Penggunaan antibiotik sebagai feed additive    dalam  usaha  peternakan  hampir  tidak dapat  dihindarkan.  Penggunaan  antibiotik  pada pakan  ternak  memiliki  tujuan  umum  yaitu meningkatkan laju pertumbuhan ternak, mencegah penyakit dengan meningkatkan imunitas  dan  pengobatan  penyakit,  sehingga dapat mendukung bagi ternak dalam berproduksi [3].  Konsumsi ransum dengan tambahan antibiotik secara berkesinambungan dapat menyebabkan resistensi antibiotik dan menyebabkan  residu  antibiotik  di  dalam  daging ternak,  karena  proses  ekskresi  yang  tidak sempurna  [4].  Residu  obat  terutama  dari antibiotika  dikhawatirkan  akan  menimbulkan dampak  buruk  bagi  manusia  yang  mengonsumsi daging  ternak  [5].  Organisasi  Kesehatan  Dunia (WHO)  telah  meminta  agar  praktek  pemberian antibiotik  yang  merangsang  pertumbuhan  pada pakan  ternak  dihentikan  [6].  Keadaan  demikian sangatlah perlu dipertimbangkan untuk memperoleh  imunomodulator  dari  bahan  alam, sehingga  dampak  negatif  dari  penggunaan antibiotik dapat ditekan dan lebih aman. Bahan  alam  tersebut  adalah  daun  pepaya
(Carica  papaya  L.),  merupakan  herba  menahun yang  memiliki  banyak  manfaat.  Daunnya mengandung  flavonoid  yang  diduga  dapat berguna  sebgai  imunomodulator  [7].  Senyawa flavonoid  dapat  bekerja  terhadap  limfokin (interferon  γ)  yang  dihasilkan  oleh  sel  T sehingga  akan  merangsang  sel-sel  fagosit  untuk melakukan  respon  fagositosis  [8].  Sel  T merupakan  salah  satu  sel  yang  berperan  penting dalam  respon  imun  yang  terbagi  menjadi  dua kelas, yaitu sel T CD4 dan CD8. sel T sitotoksik (CTLs)  atau  CD8  berperan  pada  respons  imun terhadap  antigen  virus  pada  sel  yang  diinfeksi dengan cara membunuh sel yang terinfeksi untuk mencegah penyebaran infeksi virus. Sel T helper (CD4)  adalah  subset  sel  T  yang  berperan membantu  sel  B  untuk  memproduksi  antibodi [9].

## METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat. Percobaan dilakukan mulai Bulan  Februari  sampai  Juli  2014,  bertempat  di Laboratorium  Anatomi  dan  Fisiologi  Hewan, Jurusan  Biologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu
Pengetahuan  Alam  dan  Peternakan  ayam  arab, Sumber Sekar, Dau, Malang.
Pembuatan  Tepung  Daun  Pepaya.  Pembuatan tepung  dilakukan  dengan  cara  disiapkan  daun pepaya berumur tua kemudian dikering anginkan.  Daun  pepaya  kemudian  dijemur dibawah  sinar  matahari  hingga  kering.  Daun pepaya  yang  telah  kering  digiling  menggunakan mesin penggiling agar didapat hasil yaitu tepung daun pepaya.
Pembuatan  Ransum  Daun  Pepaya.  Ransum yang  digunakan  terdiri  atas  beberapa  campuran bahan  pakan  yang  terdiri  atas  20%  konsentrat, 30%  bekatul  dan  50%  jagung.  Tepung  daun pepaya  yang  telah  jadi  ditimbang  berdasarkan perbandingan  dosis  1  (6%)  dan  dosis  2  (12%) dari keseluruhan berat satu kali pakan 120 gram. Selanjutnya  semua  bahan  dicampur  langsung menjadi satu.
Perlakuan.  Ayam  dibagi  menjadi  3  perlakuan: P0 = Ransum Kontrol (tidak mengandung tepung daun  pepaya),  P1  =  Ransum  mengandung  6% tepung daun  pepaya, P2 =  Ransum  mengandung 12%  tepung  daun  pepaya.  pemberian  ransum daun  pepaya  dilakukan  selama  2  bulan,  yang diberikan  dua  kali  sehari  secara  ad  libitum. Setiap  hari  tempat  pakan  dan  tempat  minum dibersihkan  sebelum  pemberian  pakan  dan  air minum  yang  baru,  serta  dilakukan  penimbangan sisa pakan.
Isolasi  Sel.  Sel  yang  akan  dihitung  populasinya, diisolasi  dari  organ  spleen.  Sel  tersebut  digerus dengan menggunakan ujung spuid, dan disuspensi  dengan  PBS.  Selanjutnya  sel-sel difilter  menggunakan  wire  sampai  10  ml  pada tabung  propilen.  Kemudian  hasil  yang  diperoleh disentrifugasi  dengan  kecepatan  2500  rpm  pada suhu  10 0 C  selama  5  menit.  Supernatan  yang diperoleh dibuang dan pellet diresuspensi dengan PBS  1  ml  yang  selanjutnya  digunakan  untuk analisis flowcytometry.
Analisis Flowcytometry. Suspensi  limfosit diambil  sebanyak  200  µl    dan  ditambah  PBS sebanyak  500  µl,  lalu  disentrifuse  pada kecepatan 2500 rpm, suhu 10 0 C selama 5 menit. Supernatan  dibuang  dan  pellet  selanjutnya diinkubasi  dengan  antibodi  dan  diinkubasi dengan  antibodi  rat-anti-CD4 + PE  dan  rat-anti- CD8 + FITC dengan pengenceran PBS (1:100 μl), masing-masing sebanyak 50 μl selama 30 menit, kemudian  sampel  yang  telah  diberi  antibodi ditambah  300  µl  PBS  dan  ditempatkan  pada kuvet flowcytometer. Selanjutnya dipilih acquire dan  flowcytometry  akan  menghitung  jumlah  sel yang terdeteksi oleh label antibodi.
Analisis  Data.  Rancangan  percobaan  adalah Rancangan acak lengkap.
Data hasil flowcytometry dalam bentuk persentase dilakukan transformasi arcsin, selanjutnya dianalisis menggunakan analisis ragam ANOVA pada  program  SPSS  16  for  Windows  dengan α=0,05.  Apabila  diperoleh  hasil  yang  signifikan maka dilakukan uji lanjut Tukey.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis  jumlah  relatif  sel  T  CD4 + dan CD8 + pada  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  pengaruh  pemberian  tepung  daun pepaya  dalam  ransum  terhadap  modulasi  jumlah sel  T  CD4 + dan  CD8 + pada  organ  spleen  ayam arab putih. Hasil rata-rata dari jumlah sel limfosit T  CD4+  pada  perlakuan  kontrol  sebesar  0,58%, perlakuan  daun  pepaya  dosis  6%  sebesar  2,39% dan  dosis  12%  sebesar  0,50%.  Rata-rata  jumlah sel  limfosit  T  CD8+  pada  perlakuan  kontrol sebesar  9,14%,  perlakuan  daun  pepaya  6% sebesar  8,45%  dan  dosis  12%  sebesar  16,59% (Gambar 1).
Gambar  1.    Profil  persentase  jumlah  relatif  sel  CD4 + dan  CD8 + pada  setiap  perlakuan.  Hasil analisa menggunakan flowcytometry pada organ  spleen  (K  =  Kontrol,  P1  =  dosis 6%, P2 = dosis 12%)
Hasil uji lanjut Tukey menunjukkan bahwa pemberian  daun  pepaya  dalam  ransum  dapat mempengaruhi  jumlah  relatif  sel  T  CD4 + (p<0,05) pada spleen ayam arab putih, sedangkan jumlah  relatif  sel  T  CD8 + dari  semua  perlakuan tidak  menunjukkan  adanya  nilai  yang  berbeda nyata  dari  dari  perlakuan  kontrol  (p>0,05) (Gambar 2).
* Data telah ditransformasi arcsin
Gambar 2.  Rata-rata dan rasio jumlah relatif sel CD4 + dan  CD8 + pada  perlakuan  pemberian daun  pepaya dengan  dosis  yang berbeda. Notasi yang sama menunjukkan  tidak  berbeda  nyata berdasarkan  uji  Tukey  α  =  0,05
(mean±SE)
Pemberian  tepung  daun  pepaya  dalam ransum  ayam  arab  menyebabkan  terjadinya peningkatan  signifikan  jumlah  relatif  sel  CD4 + pada  perlakuan  dosis  6%  dibandingkan  dengan perlakuan kontrol. Hasil berbeda pada perlakuan kontrol  yang  tidak  memiliki  nilai  berbeda signifikan terhadap perlakuan daun pepaya dosis 12%.  Jumlah  relatif  CD4 + paling  tinggi  yaitu pada  perlakuan  daun  pepaya  6%  sebesar  8,68, selanjutnya  perlakuan  kontrol  sebesar  4,36  dan perlakuan  daun  pepaya  12%  memiliki  nilai paling rendah sebesar 4,02. Sedangkan
peningkatan  tidak  terjadi  pada  jumlah  relatif  sel T  CD8 + (P>0,05),  dari  semua  kelompok perlakuan  daun  pepaya  memiliki  jumlah  sel CD8 + yang  tidak  berbeda  signifikan  dari perlakuan kontrol (Gambar 2).
Peningkatan  jumlah  sel  T  CD4 + tersebut mengindikasikan bahwa senyawa yang terkandung dalam daun pepaya bersifat imunostimulan.  Daun  pepaya  mengandung metabolit  sekunder  yang  cukup  banyak  seperti flavonoid  [7].  Senyawa  flavonoid  memiliki  efek imunostimulan dengan cara meningkatkan proliferasi  dari  sel  B  dan  sel  T  limfosit,  dan peningkatan produksi IL-2 [10]. Proliferasi sel T ini  yang akan meningkatkan aktivasi dari CD 4 + dan  CD  8 + .  Mekanisme  kerja  CD4 + sebagai modulasi sistem imun jangka panjang antara lain melalui  aktivasi  dari  beberapa  sitokin  yang mampu memfasilitasi perkembangan dan pematangan  sel  T  CD8 + .  Sitokin  tersebut  antara lain IL-1, IL-2 dan IFN γ [11].
Sel  T  CD4  yang  telah  teraktivasi  akan berdiferensiasi tergantung tipe stimulan terutama adalah  sitokin  yang  dihasilkan  pada  saat pengenalan  antigen.  Penelitian  ini  sel  T  CD4 bekerja  sebagai  regulator  dan  fungsi  efektor. Fungsi  regulator  terutama  dilakukan  oleh  salah satu  subset  sel  T  yaitu  CD4,  untuk  mengenal antigen  bekerja  sama  dengan  MHC  kelas  II  dan dikatakan  sebagai  MHC  kelas  II  restriksi. Antigen  endogen  dihasilkan  oleh  tubuh  inang. Sel-sel  T  CD4  mengeluarkan  molekul  yang dikenal  dengan  nama  sitokin  (protein  berberat molekul  rendah  yang  diseksresikan  oleh  sel-sel sistem  imun)  untuk  melaksanakan  fungsi regulatornya. Sitokin dari sel T CD4 mengendalikan proses imun seperti pembentukan antibodi [12].
Pengaruh pemberian daun pepaya terhadap perkembangan  sel  limfosit  T  tergantung  pada besarnya  dosis.  Pada  pemberian  daun  pepaya dengan  dosis  tertinggi  yaitu  12%  menunjukkan jumlah  sel  CD4 + yang  tidak  berbeda  signifikan terhadap  perlakuan  kontrol.  Hal  ini  juga  dapat dilihat  berdasarkaa  nilai  rasio  dari  CD4/CD8 yang  mengalami  peningkatan  dari  perlakuan kontrol  yaitu  pada  dosis  6%,  dan  mengalami penurunan  pada  dosis  12%  (Gambar  4).  Pada perlakuan  ini  ditemukan    indikasi  terjadinya penurunan sel T CD4 + oleh daun pepaya. Hal ini diindikasi  bahwa  daun  pepaya  mengandung senyawa  aktif  lain  seperti  alkaloid  yang  dapat bersifat  sitotoksik.  Berdasarkan  Hargono  (1996) senyawa yang bersifat sitotoksik seperti alkaloid yang  terkandung  pada  daun  pepaya  dapat mempunyai  efek  imunosupresif  pada  dosis tinggi. Imunosupresif dapat menghambat proliferasi sel imun, sitotoksiksitas, dan menghambat produksi limfosit sel T [13]. Penelitian  ini  juga  menunjukkan  jumlah relatif  sel  CD4 + lebih  rendah  jika  dibandingkan dengan  sel  CD8 + (Gambar  1  dan  2).  Nilai  rasio CD4/CD8  pada  perlakuan  kontrol  sebesar  1/4 atau  0,25,  pada  dosis  daun  pepaya  6% mengalami peningkatan sebesar 1/1,6 atau 0,625. Nilai rasio CD4/CD8 mengalami penurunan pada perlakuan  daun  pepaya  dosis  12%  yakni  sebesar 1/5,4  atau  0,18.  Rasio  CD4/CD8  merupakan cerminan dari kesehatan sistem kekebalan tubuh. Sebuah  rasio  normal  adalah  antara  1  dan  4. Individu normal tanpa infeksi umumnya memiliki lebih banyak sel CD4 dari daripada sel CD8.  Pertahanan  sistem  kekebalan  tubuh terhadap  patogen  lebih  lemah  dengan  nilai  rasio CD4/CD8  cenderung  menurun  [14].  Nilai perbandingan dari CD4 dan CD8 juga
dipengaruhi  oleh  beberapa  implikasi  bahkan faktor  genetik  juga  dapat  berpengaruh  terhadap nilai rasio CD4 dan CD8 [15].
KESIMPULAN Pemberian ransum dengan tambahan daun pepaya secara signfikan mempengaruhi perkembangan  jumlah  relatif  sel  T  CD4 + . Perlakuan dengan kemampuan paling baik dalam meningkatkan  jumlah  relatif  sel  T  CD4 + adalah ransum  daun  pepaya  dosis  6%  sebesar  2,39%. Jumlah  relatif  sel  T  CD8 + memiliki  nilai  yang tidak  berbeda  nyata  dari  semua  perlakuan.  Hasil penelitian  ini  membuktikan  bahwa  daun  pepaya mampu berperan sebagai imunomodulator dalam sistem imunitas ayam arab.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu  Ir.  Muharlien,  MP  sebagai  ketua  project dalam  penelitian  ini,  serta  seluruh  pihak  yang membantu dalam penyusunan skripsi.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Sarwono,  B.  2001.  Ayam  Arab  Petelur Unggul. Penebar Swadaya. Jakarta.
[2] Darmana,  W  &  M.  Sitanggang.  2003. Meningkatkan  Produktivitas  Ayam Arab  Petelur.  AgroMedia  Pustaka.
Jakarta.
[3] Solomons,  I.A.  1978.  Antibiotic  in animal  feeds-human  and  aninial  safety issues.  Journal  of  Aninial  Science. 46:1360-1368.
[4] Pelczar,  M.J  &  E.  C.  S  Chan.  1986.
Dasar-dasar  Mikrobiologi.  UI  Press. Jakarta. [5] Murtidjo, B.A. 2003. Pedoman Meramu  Pangan  Unggas.  Kanisius. Yogyakarta. [6] European Commission. 1998. Commission  Regulation  of  Amending Council Directive 70/524/DEC Concerning Additives in Feedingstuffs as Regards  Withdrawal  of  Authorization  of Certain  Antibiotics.  No.  VI/7767//98, Brussels, Belgium. [7] Dalimartha, S. 2003. Ramuan Tradisional Untuk Pengobatan Kanker, Seri Agrosehat. Penebar
Swadaya. Jakarta.
[8] Nugroho,  A.E.  2012,  Farmakologi. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.
[9] Mayer,  G.  2003.  Virology  Chapter Twelve  “Virus  Host  Interactions”.
University of South Caorlina.
[10] Jiao Y., Wen J., & Yux. 1999. Influence
of flavanoid
of astragalus membranaceus’  stem  and  leaves  on the function of cell mediated immunity in mice. Heilongjiang University. China.
[11] Peters, B., Schneider-Stock R., Boltze C,
Jager  V.,  Epplen  J,  Landt  O,  Rys,  J.,  & Roessner,  A.  2003.  Elevated  telomerase activity, c-myc-, and htert mrna expression:  association  with  tumour progression  in  malignant  lipomatous tumours. Jpathol. 199:517-525.
[12] Mittrucker,  H.  W&  S.  H.  Kaufmann. 2000. Immune response to infection with salmonella typhimurium in mice.
Journal of Leukocyte Biology. 67(4):457-
463.
[13] Hargono,  J.  1996.  Efek  Samping  Obat dari Bahan Alam Lebih Kecil
daripada  Efek  Samping  Obat  Kimia Murni.  Cermin  Dunia  Farmasi.  Edisi
Khusus Cermin Dunia Kedokteran.
[14] Ratnam  I.,  Chiu,  C.,  Kandala,  N.B.,  & Easterbrook,  P.J.  2006.    Incidence  and risk  factors  for  immune  reconstitution inflammatory  syndrome  in  an  ethnically diverse HIV type-1-infected cohort. Clin
Infect Dis. 42:418-427.
[15] Chakravarti,  A.  1995.  The  CD4/CD8 ratio:  message  in  a  bottle?.  Nature  Med. 1:1240-1241.