UNPAD Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Journal Homepage : http://jurnal.unpad.ac.id/ijpst/

## Virtual Screening Natural Compounds from Plants as Inhibitor of Estrogen Receptor Alpha I (ESR1)
Andi T. Kusumaˡ*, Daryono Hadi²
ˡDepartement Chemical ,Pharmacy of Faculty Moeslem University of Indonesia, Makassar, Indonesia
²Departement Chemical, School of Pharmacy Bandung Institute of Technology, Bandung,

## Indonesia
Submitted 12 Oktober 2018; Revised 12 Desember 2018; Accepted 16 Januari 2019; Published 31 Maret 2019 *Corresponding author : anditrihadikusuma.kisra@umi.ac.id
Abstract
Flavanoid is one of the chemical compounds found in plants. Isoflavones ( 1,2-diarylpropane ) are the largest group in the flavanoid that can be used to study the anticancer activity. 2IOK is one of target inhibitors which is obtained from  natural product compounds. The purpose of  the research is to design new compounds have anti-cancer activity, especially for breast cancer based on the evaluation of the affinity of the compound against Estrogen Receptor Alpha (ESR1) using the computational method. The parent compound is the test structure of isoflavones which has been reported to have anticancer activity, particularly for breast cancer. Based on the results of the validation method of docking with several combinations, the best method found was Triangle matcher-Affinity dG with an RMSD of 1,0452. Furthermore, this model provides ROC graph value of  0,863. Therefore, the method was used to screen compounds  in the UI database. Three compounds were obtained  from  the process, which are  potentially  active  against  Estrogen  Receptor Alpha  (ESR1),  namely  C00010051,  C00026048, C00025295. The MD simulations of protein-ligand complexes indicated exchanges process, namely the absence of  interaction between  the ligand with the Phe404, instead of the ligand formed  hydrogen bonding  with  Glu353.  Meanwhile,  the  C00025295  compound  formed  hydrogen  bonding  with  the Leu346 residue.
Keywords: ESR1, molecular docking, molecular dynamic, virtual screening
Skrining Virtual Senyawa Bahan Alam Sebagai Inhibitor Estrogen
Receptor Alpha I (ESR1)

## Abstrak
Flavanoid  adalah  salah  satu  senyawa  kimia  yang  ditemukan  pada  tumbuhan.  Isoflavon ( 1,2-diarylpropane )  adalah    kelompok    terbesar  dalam  flavanoid  yang  dapat  digunakan  untuk mempelajari aktivitas antikanker. 2IOK adalah salah satu inhibitor target yang diperoleh dari senyawa produk alami. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk merancang senyawa baru memiliki aktivitas antikanker, terutama untuk kanker payudara berdasarkan evaluasi afinitas senyawa terhadap Estrogen Receptor Alpha (ESR1) menggunakan metode komputasi. Senyawa induk adalah struktur uji isoflavon yang telah dilaporkan  memiliki aktivitas antikanker, terutama untuk kanker payudara. Berdasarkan hasil validasi metode docking dengan beberapa kombinasi, metode terbaik yang ditemukan adalah Triangle matcher-Affinity dG dengan RMSD 1,0452. Selanjutnya, model ini memberikan nilai grafik ROC 0,863. Oleh karena itu, metode ini digunakan untuk menyaring senyawa dalam database UI. Tiga senyawa diperoleh dari proses, yang berpotensi aktif terhadap Estrogen Receptor Alpha (ESR1), yaitu C00010051,  C00026048,  C00025295.  Simulasi  MD  kompleks  protein-ligan  menunjukkan  proses pertukaran, yaitu tidak adanya interaksi antara ligan dengan Phe404, bukan ligan yang membentuk ikatan  hidrogen dengan Glu353. Sementara itu, senyawa C00025295 membentuk ikatan hidrogen dengan residu Leu346.
Kata kunci: ESR1, molecular docking, molecular dynamic, skrining virtual

## IJPST - SUPP1(1), 2019; 30 - 41
1.  Pendahuluan Kanker  merupakan  penyebab  utama morbiditas dan mortalitas di seluruh dunia. Berdasarkan data World Health Organization dalam World Cancer Burden (2012)  ada sekitar  14  juta  kasus  kanker  baru  dan  8,2 juta  kematian  yang  disebabkan  oleh  kanker pada  tahun  2012,  dan  kanker  hati  adalah kanker kedua penyebab kematian di seluruh dunia 1 .  Menurut  laporan American Cancer Society dalam Cancer Facts & Figures (2014)  diperkirakan  ada  33.190  kasus  baru kanker  hati  di  AS  selama  tahun  2014 2 . Angka kejadian kanker hati sekitar tiga kali lebih  tinggi  pada  pria  dibandingkan  pada wanita.  Dari  tahun  2006  sampai  2010,  nilai meningkat 3,7% per tahun pada pria dan 2,9% per  tahun  pada  perempuan.  Diperkirakan kematian akibat kanker hati pada tahun 2014 adalah 23.000 (7.130 perempuan,15.870 pria) dan  sebanyak  80%  kasus  kematian  adalah karsinoma  hepatoselular  (KHS).  Karsinoma hepatoselular  (KHS)  adalah  kanker  hati primer. Faktor resiko terjadinya KHS terkait dengan beberapa jenis penyakit, seperti infeksi hepatitis B dan C kronis, hepatitis alkoholik, nonalcohol steatohepatitis (NASH), diabetes melitus  dan  gangguan  metabolik 3 . Terapi konvensional  untuk  KHS  meliputi  operasi, radioterapi,  dan  kemoterapi.  Di  antara terapi  tersebut,  kemoterapi  dengan  agen sitotoksik  adalah  pengobatan  umum  untuk KHS 4 . Dalam kemoterapi konvensional, efek samping biasanya terjadi di sebagian besar kasus  karena  tingkat  toksisitas  yang  tinggi. Selain  itu,  pengembangan  resistensi  obat terhadap  agen  kemoterapi  sering  mencegah penggunaan  jangka  panjang  terhadap keberhasilan  kemoterapi  untuk  kanker  hati 5 . Maka  perlu  dilakukan  pengembangan  obat kemoterapi dengan aktivitas yang tinggi dan toksisitas yang rendah.
Selanjutnya, perlu dilakukan penelitian dengan metode virtual screening yang merupakan  salah  satu  penunjang  dalam penemuan dan pengembangan obat baru. Dengan  metode virtual screening proses pengembangan dan sintesis obat menjadi lebih  cepat,  efisien  dan  terarah.  Penelitian ini  bertujuan  untuk  memilih  kombinasi
deskriptor  yang  berkorelasi  tinggi  terhadap aktivitas  antikanker  senyawa  (PDB  ID: 2IOK,  Res:  2,40  A)  [7]  kompleks  dengan selektif  ampuh  inhibitor  ˚N- [(1R) -3- (4-hidroksifenil) -1-methylpropyl]-2-(2-fenil- 1H-indol-3-YL) dalam  bentuk  persamaan ROA-AUC,  mendesain  senyawa  turunan baru  yang  memiliki  potensi  antikanker  dari puluhan  ribu  struktur  yang  diperoleh  dari database ,  prediksi  toksisitas  dan  afinitas senyawa  turunan  terhadap  ESR1  ( Estrogen Receptor alpha )  melalui  kajian  interaksi senyawa dengan reseptor ( docking ). Metode  komputasi  dapat  memprediksi interaksi  yang  mungkin  antara  senyawa bioaktif  dan  protein  target  sehingga  dapat diperoleh pemahaman dan gambaran tentang mekanisme  kerjanya.  Dalam  pengembangan obat,  jika  struktur  tiga  dimensi  (3D)  atau model  dari  target  obat  tersedia,  dapat digunakan  teknik  perancangan  obat  dengan bantuan  komputer  ( Computer-Aided Drug Design ) yang berbasiskan struktur ( Structure- Based Drug Design )  untuk  mensimulasi penambatan ( docking ) senyawa uji ke dalam struktur  protein  target  dengan  berbagai posisi,  konformasi  dan  orientasi.  Sejumlah besar program docking telah  dipublikasi salah  satu  di  antaranya  adalah  AutoDock yang  digunakan  dalam  penelitian  ini. Berkas  keluaran  penambatan  menggunakan AutoDock  adalah  pose docking dan energi bebas  tiap  pose  tersebut.  Penentuan  afinitas didasarkan  pada  nilai  terendah  energi  bebas ikatan 6 . Berdasarkan  uraian  tersebut  maka penelitian ini dirancang untuk mengevaluasi afinitas  senyawa  dari Estrogen Receptor Alpha terhadap  sel  kanker  pada  beberapa protein yang telah diketahui merupakan target kerja  sel  kanker.  Selain  itu  juga  dilakukan studi  toksisitas  menggunakan  perangkat lunak ADMET Predictor dan proses Moleculer Dynamic (MD).  Hasil  penelitian ini  diharapkan  dapat  menjadi  acuan  untuk penelitian  ekperimental  selanjutnya  dalam rangka pengembangan obat dengan beberapa tanaman yang berpotensi sebagai antikanker khususnya kanker payudara.
IJPST - SUPP1(1), 2019; 30 - 41
2.  Metode 2.1. Alat
a. Hardware Notebook  ASUS  A455L processor Intel ® CoreTM i5-5500U CPU @ 2.40 GHz, 4.00  Gb  RAM    (Sistem  Operasi:  Microsoft Windows  7  Pro  64-bit;  Memori:  2  GB; Prosesor:  Intel  Celeron  1.6  GHz), Server Computer (Sistem  Operasi:  Kubuntu  14.04 64-bit; Memori: 16 GB; Prosesor: 16 x Intel Xeon 2.4 GHz).
b. Software Decoy  Finder  2.0 7 (Cereto-Massagué dkk.  2012),  FAF-Drugs3 8 (http://fafdrugs3. mti.univ-paris-diderot.fr),  MOE  2014.0901 9 ,
Pharmit
(http://pharmit.csb.pit.edu) 10 , Marvin  Suite  16.8.1 11 ,  Avogadro  1.2.0 12 , MayaChemTools 13 ,  Screening  Explorer 14 , GROMACS 2016.3 15 .
2.2. Bahan Senyawa uji merupakan struktur induk dari  Isoflavon 16,17 . Senyawa yang telah dilaporkan memiliki aktivitas antikanker. Kontrol  positif  adalah  senyawa  yang berdasarkan  hasil  eksperimen  bersifat toksik.  Kontrol  negatif  adalah  senyawa yang  berdasarkan  hasil  eksperimen  bersifat nontoksik.
Protein  target  beberapa  antikanker dan  ID  PDBnya:(PDB  ID:  2IOK,  Res:  2,40 A)  [7]  kompleks  dengan  selektif  ampuh inhibitor ˚N-[(1R)-3-(4-hidroksifenil) -1-methylpropyl]-2-(2-fenil-1H-indol-3-YL) dan struktur dari semua phytochemical.
Ligan  Alami  ( co-crystalled ligand ) yang  digunakan  adalah Human Estrogen Alpha Ligand-Binding Domain in Complex with Compound 1D, Estrogen Receptor Alpha  (ESR1),  ˚N-[(1R)-3-(4-hidroksifenil) -1-methylpropyl]-2-(2-fenil-1H-indol-3-YL).
2.3. Prosedur
2.3.1. Docking Ligan-Reseptor
a. Preparasi Protein Target dan Ligan Struktur kristal protein target diperoleh dari Protein Data Bank diseparasi dari ligan  ko-kristalnya  menggunakan  MOE dan  selanjutnya  digunakan  untuk  validasi. MOE  digunakan  untuk  menambahkan hidrogen polar, menambahkan muatan parsial Gasteigers  dan  menyimpan  semua  struktur protein  dalam  format  PDB. Auto Grid digunakan  untuk  menentukan binding site ligan pada reseptornya.
Struktur  3D  ligan  uji  yaitu  senyawa metabolit  sekunder  didesain  menggunakan MOE  dan  dioptimasi  menggunakan perhitungan  semi  empirik  PM3.    MOE digunakan  untuk  menggabungkan  hidrogen nonpolar,  menambahkan  muatan  parsial Gasteigers  dan  mengatur rotatable bonds dengan Auto Tors.
b. Validasi Docking dan Skor Untuk  validasi docking ,  ligan  yang digunakan  adalah  ligan  ko-kristal.  Ligan ini  di- docking terhadap protein targetnya masing-masing  menggunakan  MOE.  Hasil prediksinya  dibandingkan  dengan  binding pose  ko-kristal  eksperimental  dan  dihitung RMSDnya ( root mean square deviation ). Untuk  validasi  skor,  hasil  skor  MOE dibandingkan  dengan  nilai  inhibisi  (Ki) eksperimental,  kemudian  dihitung  nilai  ρ ( Spearman rank correlation ) dan r ( Pearson correlation coefficient ).
c. Virtual Screening Setiap  ligan  uji  dilakukan docking terhadap semua protein target menggunakan MOE. Moe digunakan untuk analisis manual pose docking -nya pada sisi aktif setiap protein.
2.3.2. Prediksi Toksisitas
a. Optimasi Senyawa
Senyawa  uji,  kontrol  positif  dan kontrol  negatif  digambar  dan  dioptimasi menggunakan MOE v.14. Optimasi dilakukan dengan metode Hartree-fock basis set 6-31G, semi  empirik  PM3,  dengan  waktu  optimasi tergantung dari masing-masing senyawa.
Gambar 1. Struktur Estrogen Receptor Alpha

## Tabel 1. Contingency Table
Frekuensi Populasi Positif Hasil Pengujian Negatif Total Hasil Referensi Positif a b a+b Negatif c d c+d Total a+c b+d a+b+c+d
Sensitivity :a/(a+b); Specificity : d/(c+d); Accuracy : (a+d)/(a+b+c+d); Positive Predictivity : a/(a+c); Negative Predictivity :d/ (b+d); False Positive : c/(c+d); False Negative : b/(a+b)
b. Verifikasi ADMET Predictor
Verifikasi  menggunakan  senyawa kontrol  positif  dan  kontrol  negatif  yang telah dioptimasi sebelumnya. Suatu model pengujian  yang  hasilnya  dinyatakan  dalam dua  kategori  yaitu  hasil  positif  dan  negatif maka goodness-of-fit model pengujian tersebut  dapat  dinilai  menggunakan Cooper Statistic berdasarkan  data  pada  matriks  2x2 ( contingency table ) pada Tabel 1.
c. Prediksi Toksisitas Prediksi terhadap senyawa uji dilakukan dengan  menggunakan ADMET Predictor . Hasil  prediksi  berupa  data  senyawa  yang toksik dan nontoksik.
d. Prediksi  Metabolisme  pada  Sitokrom
P450
Prediksi metabolisme dilakukan terhadap  senyawa  tertentu  yang  diprediksi positif  toksik.  Prediksi  metabolisme  pada sitokrom  P450  digambarkan  dengan  5 pemodelan, yaitu Kinetic Models for Human Cytochrome P450 Enzymes untuk menentukan
nilai  Km  (konstanta  Michaelis  Menten), Vmax  (laju  metabolime  maksimum)  dan Cl int (klirens intrinsik), Inhibition Models for Cytochrome P450 , Probability of Metabolism for Human UGT, Regioselectivity Models for Human Cytochrome P 450 Enzymes dan Substrate  Classification  Models  for Cytochrome P450 .
e. Prediksi Toksisitas Metabolit Prediksi  toksisitas  metabolit  masing- masing senyawa dilakukan dengan menggunakan  perangkat  lunak ADMET
Predictor .
3. Hasil Penelitian
3.1. Docking Ligan-Reseptor a. Preparasi  Molekul Training Set dan Decoy
Telah  dilakukan  proses  penggambaran struktur  dua  dimensi  dan  optimasi  geometri tiga dimensi dari dua puluh molekul training set . Sementara itu, untuk prosedur penyiapan struktur  ESR1  terdapat  koreksi  pada  ikatan rangkap  cincin  propil.  Kedua  puluh file
Gambar 2. Visualisasi Estrogen Receptor Alpha
senyawa training set tersebut disimpan dalam format  ekstensi file *.mol2  dan  kemudian disatukan dalam format ekstensi file *.sdf.
b. Validasi Docking dan Skor Hasil  validasi docking dapat dilihat
pada kuva ROC pada Gambar 3, sedangkan hasil  kombinasi placement scoring dan scoring function tertera pada Tabel 3.
c. Virtual Screening Hasil analisis manual pose docking-
Tabel 2. Training set 20 senyawa aktif dari DUD.E No Rumus Kimia Nama Ligan Nama Mol 1 CHEMBL 182342 Actives_final_000002.pdbqt Actives_final_000002.mol2 2 CHEMBL 64692 Actives_final_000003.pdbqt Actives_final_000003.mol2 3 CHEMBL 1082743 Actives_final_000004.pdbqt Actives_final_000004.mol2 4 CHEMBL 328475 Actives_final_000005.pdbqt Actives_final_000005.mol2 5 CHEMBL 371072 Actives_final_000007.pdbqt Actives_final_000007.mol2 6 CHEMBL 144195 Actives_final_000008.pdbqt Actives_final_000008.mol2 7 CHEMBL 569766 Actives_final_000010.pdbqt Actives_final_000010.mol2 8 CHEMBL 66279 Actives_final_000011.pdbqt Actives_final_000011.mol2 9 CHEMBL 184958 Actives_final_000012.pdbqt Actives_final_000012.mol2 10 CHEMBL 80124 Actives_final_000016.pdbqt Actives_final_000016.mol2 11 CHEMBL 400480 Actives_final_000017.pdbqt Actives_final_000017.mol2 12 CHEMBL 121879 Actives_final_000018.pdbqt Actives_final_000018.mol2 13 CHEMBL 181191 Actives_final_000019.pdbqt Actives_final_000019.mol2 14 CHEMBL 316132 Actives_final_000020.pdbqt Actives_final_000020.mol2 15 CHEMBL 93826 Actives_final_000021.pdbqt Actives_final_000021.mol2 16 CHEMBL 329312 Actives_final_000027.pdbqt Actives_final_000027.mol2 17 CHEMBL 99335 Actives_final_000028.pdbqt Actives_final_000028.mol2 18 CHEMBL 202472 Actives_final_000029.pdbqt Actives_final_000029.mol2 19 CHEMBL 470993 Actives_final_000030.pdbqt Actives_final_000030.mol2 20 CHEMBL 299942 Actives_final_000031.pdbqt Actives_final_000031.mol2
Tabel 3. Hasil Validasi Re-docking Kombinasi Placement Scoring dan Scoring Function Scoring Placement↓ Affinity dG Alpha HB ASE London dG Alpha PMI 1,6043 (9) 1,6403 (4) 1,6403 (5) 1,6403 (1) Alpha Triangle 3,8420 (2) 1,8721 (3) 1,8721 (2) 4,0497 (6) Proxy Triangle 2,9586 (2) 1,7874 (4) 1,6605 (1) 1,6605 (9) Triangle Matcher 1,0452 (3) 3,0175 (10) 4,429 (1) 3,3733 (2) Tabel  5 .  Komparasi  Hasil Docking dengan Simulasi MD
Senyawa
Residu yang berinteraks i Hasil docking Hasil MD (20 ns) ESR1 Phe404 Met343 Glu353 Met343 Glu353 Database UI C00010051 Phe404 Leu346 Leu387 Glu353 Database UI C00026048 Phe404 Glu353 Glu353 Database UI C00025295 Phe404 Leu346 Leu346
nya  pada  sisi  aktif  setiap  protein,  dari  1 konformasi,  direplikasi  masing-masing  100 kali,  dan  didapatkan  urutan  pertama  dari masing-masing  dan  didapatkan  10 ranking teratas.
d. Molekuler Dinamik Hasil  simulasi  molekular  dinamik untuk  senyawa  ESR1,  UI  C00010051,  UI C00026048, dan UI C00025295 dapat dilihat pada tabel 5.
4. Pembahasan 4.1. Docking Ligan-Reseptor
a. Preparasi  Molekul Training Set dan Decoy
Telah  dilakukan  proses  penggambaran struktur  dua  dimensi  dan  optimasi  geometri tiga dimensi dari dua puluh molekul training set. Sementara,  untuk  prosedur  penyiapan struktur  ESR1  terdapat  koreksi  pada  ikatan rangkap  cincin  propil.  Kedua  puluh file senyawa training set tersebut disimpan dalam format  ekstensi file *.mol2  dan  kemudian
disatukan  dalam  format  ekstensi file *.sdf. Selain  itu,  juga  dipersiapkan  sebanyak  500 senyawa decoy set yang diambil dari database UI drug-like . Luaran file dari Decoy Finder sudah  berada  dalam  format  ekstensi  *.sdf. Kemudian  dilakukan  konstruksi database multikonformer dari semua  senyawa tersebut dan  didapatkan  305  konformer training set dan  4.002  konformer decoy yang  masing- masing  diunggah  ke  Pharmit  dalam  format ekstensi file *.sdf.
b. Filter Drug-Likeness ,  Toksisitas,  dan PAINS Sebanyak 6.733 senyawa yang didapat dari  hasil  penapisan  berbasis  farmakofor kemudian  disaring  menggunakan  tiga kriteria drug-likeness ( Lipinski Rule of Five ) 18 , Weber 19 , dan jumlah inti aromatik 20 . Proses  tersebut  menyisakan  sebanyak  5.677 senyawa. Selanjutnya, dilakukan penyaringan berbasis toksisitas dan PAINS 21 dengan FAF- Drugs3. FAF-Drugs3 hanya dapat memproses sebanyak 4.002 senyawa dalam sekali analisis,
Gambar 3. Kurva ROC, nilai Enrichment Factor dan  AUC-ROC  dari  validasi  metode Triangle  Matcher-Affinity  dG  terhadap dataset Gambar  4. Kurva  ROC  dan  nilai  AUC-ROC dari  validasi  metode  Triangle  Matcher- Affinity dG (merah) terhadap dataset
AUC ROC (Merah) =  0.863
AUC ROC = 0.863; EF 1% = 0;
EF 5% = 0; EF 10% = 0; EF 20% = 0
sehingga senyawa yang dianalisis dikerjakan dalam  1  bets,  masing-masing  sebanyak 6.733  senyawa.  Hasil  yang  didapatkan  dari prosedur ini adalah sebanyak 4.002 senyawa masuk  kategori Accepted (tidak  ditemukan adanya  gugus  toksikofor  maupun  PAINS), 1.056 senyawa masuk kategori Intermediate (ditemukan gugus toksikofor beresiko rendah dan  PAINS),  408  senyawa  masuk  kategori Rejected (ditemukan  gugus  toksikofor beresiko  tinggi  atau  gugus  beresiko  rendah dalam  jumlah  banyak  dan  PAINS),  dan  6 senyawa  tidak  dianalisis  karena  termasuk ke  dalam  golongan  senyawa  organologam. Sebanyak  4.002  senyawa  yang  termasuk dalam  kategori Accepted akan  dilanjutkan untuk proses penambatan molekul.
c. Penambatan  Molekul  Tahap  I  ( Rigid Receptor Docking ): Preparasi Ligan dan Protein Telah dilakukan proses preparasi protein (PDB:2IOK)  dengan  mengeliminasi  air, melengkapi sekuens asam amino yang hilang, menambahkan  atom  hidrogen,  minimisasi
energi  kompleks  serta  penambahan  muatan parsial  dengan  medan  gaya  Amber12-EHT. Ketiga  perlakuan  yang  disebut  terakhir  ini dilakukan dengan bantuan modul LigX pada MOE.  Selain  itu,  preparasi  juga  dilakukan terhadap training set dan decoy. Semua senyawa  tersebut  disiapkan  ke  dalam  satu dataset dan diberikan muatan parsial berbasis medan gaya MMFF94X.
4.2.  Validasi Metode Validasi  metode  yang  dilakukan pertama kali adalah re-docking . Prosedur ini dilakukan dengan mencoba semua kombinasi placement scoring dan scoring function yang tersedia pada modul docking MOE. Sebanyak 100 docking pose dihasilkan  untuk  setiap kombinasi  dan  evaluasi  dilakukan  terhadap 10 docking pose dengan  skor  terendah. Parameter yang dievaluasi adalah nilai RMSD tiap docking pose dan reratanya. Hasil  validasi  menunjukkan  bahwa kombinasi placement scoring Triangle Matcher dan scoring  function  Affinity  dG menghasilkan rerata RMSD terendah (1,0452 Å)  dengan  6  dari  10  pose  memiliki  nilai RMSD < 2.0 Å. Kombinasi tersebut kemudian dievaluasi  lebih  lanjut  terkait  dengan kemampuan virtual screening terhadap dataset yang  telah  disiapkan  berdasarkan parameter  AUC  ROC  (>0.5)  dan  nilai Enrichment Factor (EF) pada beberapa titik (1%;5%;10%;20%).  Hasil  yang  didapatkan (Gambar  3)  menunjukkan  bahwa  kombinasi Triangle Matcher dan Afinity  dG memiliki performa  yang  lebih  baik  dengan  penapisan acak 22,23 . Evaluasi performa dilakukan dengan melihat nilai Enrichment Factor 1%,  5%, 10%,  dan  20%  (Tabel  4).  Model  terbaik kemudian  dievaluasi  lebih  lanjut  melalui kurva ROC (Gambar 4).
Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan bahwa penambahan scoring function Affinity dG memberikan nilai EF 1% yang cukup baik sebesar 19 yang merupakan hasil kontribusi dari  ditemukannya  lima  senyawa training set . Akan  tetapi,  hingga dataset 20%,  tidak lagi  ditemukan  senyawa training set yang ditunjukan  dengan  penurunan  drastis  nilai EF  5%  hingga  EF  20%.  Sementara  itu,
Tabel 4. Nilai Log (Δ energi) dari masing-masing 20 struktur aktif ESR1 Ligand Log Out.02 -12,0 Out.03 -10,3 Out.04 -9,2 Out.05 -11,6 Out.07 -9,7 Out.08 -9,7
Out.10 -10,9 Out.11 -9,7 Out.12 -11,4 Out.16 -9,3 Out.17 -10,2 Out.18 -7,8 Out.19 -8,6 Out.20 -8,2 Out.21 -10,1 Out.27 -11,5 Out.28 -10,0 Out.29 -8,1 Out.30 -10,6 Out.31 -9,1
penambahan scoring  function  Affinity  dG memberikan nilai EF yang cukup baik. Total ditemukan 3 senyawa training set pada dataset 20%.  Untuk  mendapatkan  gambaran  yang lebih  jelas,  digunakan  analisis  kurva  ROC terhadap kedua kombinasi tersebut. Hasilnya menunjukkan bahwa metode dengan docking score  Affinity  dG memiliki  performa  yang lebih  baik,  dengan  nilai AUC-ROC  sebesar 0,863.  Sehingga  metode  ini  digunakan dalam  proses  penambatan  molekul.  Selain itu, titik penyaringan senyawa pada tahap ini ditentukan sebesar 1% dari dataset .
4.3.  Penambatan Molekul
Penambatan molekul dilakukan terhadap 4022  senyawa  dengan  kombinasi placement scoring Triangle Matcher , scoring function pertama  Affinity  dG ,  sesuai  dengan  hasil validasi metode yang diperoleh sebelumnya. Sebanyak 1% senyawa dengan docking score terendah (170 senyawa) dipilih untuk disaring lebih jauh. 170 senyawa dengan pengaturan sebanyak  10 docking pose dihasilkan  per
senyawa.  Total  dihasilkan  sebanyak  17.165 docking pose yang kemudian disaring dengan sidik jari Me343 D dan Glu353 D. Hasilnya ditemukan sebanyak 300 docking pose dengan pola dan jenis interaksi yang sesuai.
4.4.  Inspeksi Visual Prosedur  inspeksi  visual  kemudian dilakukan  terhadap  300 docking pose dan didapatkan sebanyak 3 docking pose dari 170 senyawa memiliki orientasi yang memenuhi kriteria. Contoh docking pose yang memenuhi kriteria  seperti  tercantum  pada  Gambar  7, yaitu  berdasarkan  okupasi  senyawa  pada tapak  ikatan N-[(1R)-3-(4-hidroksifenil) -1-methylpropyl]-2-(2-fenil-1H-indol-3-yl) .
4.5.  Molecular Dynamics (MD) Berdasarkan docking score ,  dipilih tiga  senyawa  (Database  UI  C00010051, Database  UI  C00026048  ,  dan  Database  UI C0025295)  beserta  ligan  alami  ( Estrogen Receptor Alpha ) untuk dilanjutkan ke dalam simulasi  MD  dengan  menggunakan  piranti
Gambar 6. Hasil superposisi docking pose dari senyawa Database UI C00010051, terhadap ligan alami
Gambar 7. Plot RMSD backbone protein selama 20 ns simulasi dari kompleks  ligan alami (biru) Database UI C00010051
Gambar 8. Plot RMSF residu asam amino protein selama 20 ns simulasi dari kompleks ligan alami (biru) Database UI C00010051
lunak GROMACS 15 . Ketiga senyawa tersebut memiliki docking score yang lebih rendah dibandingkan  dengan  ligan  alami  (Skor  = -9.6617,  -8.9537,  -8.9377).  Simulasi  MD merupakan  model  prediksi  interaksi  ligan- protein  dalam  kondisi  biologis,  sehingga model kompleks harus diatur berada  dalam lingkungan  yang  menyerupai  keadaan  pada sistem  biologis.  Perlakuan  yang  digunakan antara  lain  adalah  solvasi  kompleks hasil  docking  dengan  model  air  TIP3P 24 , penambahan  ion  (Na+  dan  Cl-),  ekuilibrasi temperatur  pada  310  K  dengan  t hermostat velocity rescale 25 dan  tekanan  pada  1  bar dengan barostat Parrinello-Rahman 26 . Demi  menjaga  konsistensi  proses,  tahapan minimisasi energi kompleks dilakukan dengan medan  gaya  dari  famili  AMBER 27,28 . Hasil yang didapatkan dari simulasi selama 20 ns menunjukkan bahwa nilai RMSD sistem dari kompleks memiliki tendensi untuk mencapai konvergensi. Analisis dari plot RMSD atom backbone protein terhadap  waktu  simulasi mengindikasikan  bahwa  setelah  terjadi
perubahan konformasi di fase awal simulasi, sistem terlihat cukup stabil di kisaran 0.15 Å- 0.2 Å(Gambar 8) dan (Gambar 11). Selain itu juga dilakukan analisis terhadap fleksibilitas protein  dengan  menggunakan  plot  RMSF relatif terhadap residu asam amino protein. Kedua kompleks hasil docking menunjukkan profil yang identik dengan ligan alami, yaitu fluktuasi terutama pada residu 343-353 yang merupakan  daerah  antarmuka  dimer  dan juga meliputi daerah domain katalitik enzim 4 serta pada residu 500 - 545 yang termasuk ke dalam  Z-domain  (Gambar  8),  (Gambar  10), dan (Gambar 12).
5. Kesimpulan Berdasarkan  hasil virtual screening dengan metode docking,  filter drug-likeness , PAINS,  dan  toksisitas,  penambatan  molekul ( Rigid receptor ),  serta  studi molecular dynamics (MD)  terhadap  database  UI, diperoleh  3  kandidat  senyawa  (Database  UI C00010051,  Database  UI  C00026048,  dan Database UI C00025295) yang diprediksi akan
Gambar 11. Plot RMSD backbone protein selama 20 ns simulasi dari kompleks ligan alami (biru) Database UI C00025295
Gambar 12. Plot RMSF backbone protein selama 20 ns simulasi dari kompleks ligan alami (biru) Database UI C00025295 Gambar 9. Plot RMSD backbone protein selama 20 ns simulasi dari kompleks ligan alami (biru) Database UI C00026048 Gambar 10. Plot RMSF backbone protein selama 20 ns simulasi dari kompleks ligan alami (biru) Database UI C00026048
menginhibisi ˚N - [(1R) -3- (4-hidroksifenil) -1-methylpropyl] -2-(2-fenil-1H-indol-3-YL) melalui  mekanisme  inhibisi  yang  identik dengan Estrogen Receptor Alpha .
6.  Saran
Dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  dan
sintesis  terhadap  senyawa  tersebut,  untuk selanjutnya  diuji  kemampuan  inhibisinya terhadap
˚N-[(1R)-3-(4-hidroksifenil)-1- methylpropyl]-2-(2-fenil-1H-indol-3-YL) dan dibandingkan  terhadap Estrogen Receptor Alpha . Jika terbukti bahwa aktivitas senyawa tersebut  setara,  atau  bahkan  lebih  baik,
Gambar 13. Hasil re-docking tiga senyawa terbaik database UI
Gambar 14. Superposisi ligan-protein sebelum dan setelah simulasi 20ns dari Estrogen Receptor Alpha (a), Database UI C00010051 (b), Database UI C00026048 (c), Database UI C00025295 (d)
IJPST - SUPP1(1), 2019; 30 - 41 maka akan dilakukan studi optimasi struktur molekul dengan metode HKSA.
Daftar Pustaka 1. World Health Organization dalam World Cancer  Burden  (2012)  Data  of  Cancer, WHO Press, UK
2. American Cancer Society (ACS), (2014): Cancer  Facts  &  Figures  2014,  www. cancer.org.  diakses  pada  tanggal  16 Desember 2014.
3.  American  Cancer  Society  (ACS), (2015):  Liver  Cancer,  http://www. cancer.org /acs/ groups/cid/documents/ webcontent/003114-pdf  diakses  pada tanggal 20 Februari 2015
4.  Muhammad  Usman  Mirza,  Saba Ferdous., (2013) : Docking Studies reveal Phytochemicals as the longsearched anticancer drugs for Breast Cancer.,Center for  Research  in  Molecular  Medicine (CRiMM),Department  of  Computer Sciences City University London,UK
5.  Liu,  dkk  (2013)  The  Potent  Oxidant Anticancer  Activity  of  Organoiridium Catalysts.
6.  Kroemer  et.al  (2007) Tumor  Cell  Death and ATP  Release  Prime  Dendritic  Cells and Efficient Anticancer Immunity.
7.  Cereto-Massagué, A.,  Guasch,  L., Valls, C., Mulero, M., Pujadas, G., dan Garcia- Vallvé,  S.  (2012):  DecoyFinder:  An Easy-to-Use  Python  GUI  Application for  Building  Target-Specific  Decoy Sets,Bioinformatics,28(12), 1661–1662.
8.  Lagorce,  D.,  Sperandio,  O.,  Baell, J.B.,  Miteva,  M.A.,  dan  Villoutreix, B.O.(2015): FAF-Drugs3: A Web Server for Compound Property Calculation and Chemical  Library  Design,Nucleic Acids Research,43, W200–W207.
9.  Molecular Operating Environment (MOE), v.2014.09.01, Chemical Computing Group Inc., 2014.
10. Sunseri,  J.,  dan  Koes,  D.R.  (2016): Pharmit:  Interactive  Exploration  of Chemical Space, Nucleic Acids Research, 44, W442-W448.
11. Marvin Suite, v.16.8.1, ChemAxon, 2016.
12. Hanwell,  M.D.,  Curtis  D.E.,  Lonie
D.C.,  Vandermeersch  T.,  Zurek  E.,  dan Hutchison,  G.R.(2012):  Avogadro:  An Advanced  Semantic  Chemical  Editor, Visualisation,  and  Analysis  Platform, Journal of Cheminformatics, 4(17), 1–17.
13. Sud,  M.,(2016):  MayaChemTools:  An Open Source Package for Computational Drug  Discovery,Journal  of  Chemical Information and Modeling, 56(12), 2292- 2297.
14. Empereur-Mot,  C.,Zagury,  J-F.,  dan Montes,  M.(2016):  Screening  Explorer – An Interactive Tool for the Analysis of Screening  Results,Journal  of  Chemical Information and Modeling, 56(12), 2281- 2286.
15. Abraham,  M.J.,  Murtola, T.,  Schulz,  R., Páll, S., Smith, J.C., Hess, B., dan Lindahl, E.  (2015):  Gromacs:  High  Performance Molecular  Simulations  through  Multi- Level  Parallelism  from  Laptops  to Supercomputers, SoftwareX,1–2, 19–25.
16. Blunt  et.al  (2012)  ,Marine  natural products
17. Blunt,  dkk  (2015)  Synthesis  and Intracellular  Redox  Cycling  of  Natural Quinones  and  Their  Analogues  and
Identification of Indoleamine‐2,3‐ dioxygenase (IDO) as Potential Target for Anticancer Activity.
18. Lipinski,  C.A.,  Lombardo,  F.,  Dominy, B.W.,  dan  Feeney,  P.J.  (1997): Experimental and Computational
Approaches  to  Estimate  Solubility  and Permeability  in  Drug  Discovery  and Development  Settings,  Advanced  Drug Delivery Reviews, 23, 3-25.
19. Weber, dkk (2002) The Neuroendocrine- Derived  Peptide  Parathyroid  Hormone– Related Protein Promotes Prostate Cancer Cell Growth by Stabilizing the Androgen Receptor
20. Ritchie,  T.J.,  dan  Macdonald,  S.J.F. (2009):  The  Impact  of  Aromatic  Ring Count  on  Compound  Developability  – Are Too Many Aromatic Rings a Liability in  Drug  Design?,Drug  Discovery Today,14(21), 1011–1020.
21. Baell,  J.B.,  dan  Holloway,  G.A.  (2010): New  Substructure  Filters  for  Removal
IJPST - SUPP1(1), 2019; 30 - 41 of Pan Assay Interference Compounds ( PAINS ) from Screening Libraries and for Their Exclusion in Bioassays, Journal of Medicinal Chemistry, 53(7), 2719–2740.
22. Wang,  R.,  dan  Wang,  S.  (2001):  How Does  Consensus  Scoring  Work  for Virtual Library Screening? An Idealized Computer  Experiment,  Journal  of Chemical  Information  and  Computer Sciences,41(5), 1422–1426.
23. Feher,  M.  (2006).  Consensus  Scoring for  Protein-Ligand  Interactions,Drug Discovery Today,11(9–10), 421–428.
24. Jorgensen,  W.L.,  Chandrasekhar,  J., Madura,  J.D.,  Impey,  R.W.,  dan  Klein, M.L.(1983):  Comparison  of  Simple Potential  Functions  for  Simulating Liquid  Water,The  Journal  of  Chemical Physics,79(2), 926.
25. Bussi,  G.,  Donadio,  D.,  dan  Parrinello, M. (2007): Canonical Sampling through
Velocity  Rescaling,Journal  of  Chemical Physics,126(1).
26. Parrinello,  M.,  dan  Rahman,  A. (1981):  Polymorphic  Transitions  in Single  Crystals:  A  New  Molecular Dynamics  Method,  Journal  of  Applied Physics,52(12), 7182–7190.
27. Lindorff-Larsen,  K.,  Piana,  S.,  Palmo, K.,  Maragakis,  P.,  Klepeis,  J.L.,  Dror, R.O.,  dan  Shaw,  D.E.(2010):  Improved Side-Chain  Torsion  Potentials  for the  Amber  ff99SB  Protein  Force Field,Proteins:  Structure,  Function  and Bioinformatics,78(8), 1950–1958.
28. Wang,  J.,  Wolf,  R.M.,  Caldwell, J.W.,  Kollman,  P.A.,  dan  Case,  D.A. (2004):  Development  and  Testing  of  a General  Amber  Force  Field,Journal  of Computational  Chemistry,25(9),  1157– 1174.