https://doi.org/10.22487/kovalen.2021.v7.i1.15314
Identifikasi dan Purifikasi Vitelogenin Arwana Asia: Banjar, Pinoh ( Scleropages macrocephalus ), Papua ( Scleropages jardinii ) dan Super Red ( Scleropages legendrei )
[Identification and Purification of Asian Arowana Vitellogenin: Banjar, Pin o h (Scleropages macrocephalus), Papua (Scleropages jardinii) and Super Red (Scleropages legendrei) ]
Ahmad Musa 1* , Remi Dugue 2 , Rina Hirnawati 1 , Bastiar Nur 1 , Rendy Ginanjar 1 , Sawung Cindelaras 1 , Slamet Sugito 1
1 Balai Riset Budidaya Ikan Hias, Depok, Indonesia
2 Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier, France
Abstract . Arowana fish ( Scleropages sp. ) are monomorphic species, those animals that physically could not be distinguished between male and female. The research was aimed to identify and purify Vitellogenin of four variants of  Asian  Arowana:  Banjar,  Papua,  Pinoh,  and  Super  red.  12  fishes,  3  from  each  variant  were  given  estradiol stimulation  through  toad  for  vitellogenin production  purpose.  The  SDS-PAGE  results  expressed that  there  were two  types  of  Asian  Arowana  vitellogenin  characters,  single  Vtg  for  Arowana  Banjar,  Pinoh  ( Scleropages macrocephalus ) and Super Red ( Scleropages legendrei ) with a molecular weight of 180 kDa and double Vtg in Papuan  Arowana  ( Scleropages  jardinii )  with  molecular  weight  180  and  110  kDa.  Pure  vitellogenin  has  been collected from 3 varieties, Banjar, Papua, and Super red with a concentration range between 0.1 - 0.67 mg / mL. The actual concentration is believed to be greater than the measured concentration.
Keywords: Asian arowana, Scleropages sp., purification, vitellogenin.
Abstrak. Ikan arwana ( Scleropages sp ) merupakan spesies monomorfik, yaitu hewan yang secara fisik tidak dapat atau tidak mudah dibedakan antara jantan dan betina. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan karakter Vtg dari  arwana  Banjar,  Pinoh  ( Sceleropages  macrocepha lus),  Papua  ( Scleropages  jardinii )  dan  Super  red ( Scleropages legendrei ). Ikan uji yang digunakan sebanyak 3 ekor per varietas yang diberi rangsangan hormon estradiol melalui percil sebagai pakan untuk menstimulasi produksi Vitelogenin. Hasil SDS-PAGE menunjukkan bahwa terdapat dua jenis karakter vitelogenin arwana asia yaitu tunggal pada arwana Banjar, Pinoh ( Scleropages macrocephalu s) dan Super Red ( Scleropages legendrei ) dengan berat molekul 180 kDa serta ganda pada arwana Papua  ( Scleropages  jardinii )  dengan  berat  molekul  180  dan  110  kDa.  Telah  dikoleksi  Vitelogenin  murni  dari  3 varietas  yaitu  Banjar,  Papua  dan  Super  red  dengan  kisaran  konsentrasi  antara  0,1 – 0,67 mg/mL. Konsentrasi aktual diyakini lebih besar dari konsentrasi terukur tersebut..
Kata Kunci : Arwana asia, Scleropages sp., purifikasi, vitelogenin.
Diterima:  23 Oktober 2020, Disetujui: 3 Desember 2020
Sitasi:   Musa,  A.,  Dugue,  R.,  Hirnawati,  R.,  Nur,  B.,  Ginanjar,  R.,  Cindelaras,  S.,  &  Sugioto,  S.  (2021).  Identifikasi  dan  Purifikasi Vitelogenin Arwana Asia: Banjar, Pinoh ( Scleropages macrocephalus ), Papua ( Scleropages jardinii ) dan Super Red (Scleropages legendrei ). KOVALEN: Jurnal Riset Kimia , 7(1): 1-11.
https://bestjournal.untad.ac.id/index.php/kovalen
*  Corresponding author E-mail : ahmadmusasaid@kkp.go.id

## Musa et al.

## LATAR BELAKANG
Ikan arwana ( Scleropages sp ) merupakan spesies monomorfik, yaitu hewan yang secara fisik  tidak  dapat  atau  tidak  mudah  dibedakan antara jantan dan betina berdasarkan pengamatan  visual  terhadap  morfologinya (Chumaidi et al., 2012). Indonesia memiliki lima spesies  ikan  arwana,  yaitu  arwana  super  red ( S.  legendrei ),  arwana  hijau  ( S.  formosus ), arwana  golden  ( S.  aureus ),  arwana  pinoh  ( S. macrocephalus ), dan arwana papua (S. jardinii ) (Pouyaud et  al., 2003).  Selain  kelima  ini,  juga terdapat Scleropages  inscriptus dari Myanmar (Roberts,  2012), Scleropages  leichardti dari
Australia (Pusey et al., 2016) dan Scleropages sinensis  dari  Cina  (Zhang  &  Wilson,  2017). Khusus ikan arwana super red, konservasinya di  alam  sudah  sangat  diperhatikan  karena penangkarannya telah banyak dilakukan (Kartamihardja et al., 2014)
Studi biokimia dan molekuler ikan arwana telah  banyak  dilakukan,  termasuk  untuk keragaman genetik (Austin et al., 2015; Chao et al., 2016;  Ngili et  al., 2015;  Lavoue,  2015;
Manoharan et  al., 2011;  Shen et  al., 2014), reproduksi (Chang, 2009), pakan (Thipwong et al. , 2015) dan identifikasi kelaminnya
(Benjaboonyazit,  2014;  Chansue et  al., 2013;
Esmaeili et al., 2017).
Salah satu fase pematangan gonad pada ikan  betina  adalah  terjadinya  vitelogenesis. Vitelogenesis  adalah  sintesis  vitelogenin  (Vtg) atau  prekursor  kuning  telur  yang  terjadi  di dalam  hati.  Vitelogenesis  dipicu  oleh  adanya pengaruh  hormon  estrogen  17β-estradiol (Brion et  al., 2000)  melalui  proses  fosforilasi, glikosilasi  dan  lipidasi  di  dalam  hati  yang kemudian  menghasilkan  Vtg  (Parks et  al., 1999). Vtg adalah glikofosfoprotein yang terdiri dari  sekitar  20  %  lemak,  terutama  fosfolipid,
trigliserida dan kolesterol (Tyler, 1991). Protein ini  diangkut  menuju  ovarium  oleh  darah  dan dimasukkan  ke  dalam  oosit  yang  sedang berkembang lalu terdegradasi menjadi lipovitelin pada kuning telur (Parks et al., 1999).
Vtg  yang  merupakan  prekursor  kuning  telur merupakan ciri spesifik induk betina hingga bila terdeteksi  pada  seekor  ikan,  maka  dipastikan ikan  tersebut  betina.  Vtg  sebagai  parameter kematangan  gonad  telah  diamati  pada  ikan Arapaima  gigas  (Chu-Koo et  al., 2008)  ikan kerapu  (Daud  Om et  al., 2016)  dan  Sturgeon Hosu  hosu  (Kazemi et  al., 2020)  dan  berhasil ditemukan  perbedaan  jantan  dan  betinanya berdasarkan kadar Vtg ini.
Stimulasi  produksi  Vtg  menggunakan hormon  estradiol  pada  arwana  baik  oral maupun injeksi menunjukkan hasil yang sama efektif  (Musa  &  Hirnawati,  2018).  Untuk memecahkan  masalah  monomorfisme  pada arwana  dibutuhkan  proses  identifikasi  Vtg. Identifikasi Vtg dapat dilakukan dengan metode immunoassay  (Wang et  al., 2017).  Metode immunoassay  membutuhkan  adanya  antigen dan antibodi (Tsukada et al., 2019).  Dalam hal ini  Vtg  berperan  sebagai  antigen  untuk memproduksi anti-Vtg (Caza et al., 2020).
Untuk memperoleh Vtg murni dari spesies ikan arwana maka dibutuhkan proses karakterisasi  profil  Vtg  (Costa et  al., 2016;
Upadhyay et  al., 2016)  dari  berbagai  spesies ikan  arwana  yang  kemudian  dilanjutkan dengan proses purifikasi.  Penelitian ini bertujuan  untuk  membandingkan  karakter  Vtg dari  arwana  Banjar,  Papua,  Pinoh  dan  Super red dan mempurifikasi Vtg dari arwana Banjar, Papua dan Pinoh. Hasil dari penelitian ini akan dilanjutkan  untuk  ke  tahap  produksi  antibodi dan metode immunoassay lanjutan.

## Musa et al.

## METODE PENELITIAN

## Bahan dan Peralatan
Ikan uji yang digunakan sebanyak 12 ekor dengan  3  ekor  per  varietas  (Tabel  1).    Bahan lain yang digunakan meliputi hormon Estradiol, etanol, Phenoxyethanol, H 2 O,  0.5  M  Tris-HCl, pH  6.8,  Glycerol,  10%  (w/v)  SDS  dan mercaptoethanol , 1 % (w/v) bromophenol blue ,
Bovine Serum Albumin (BSA), dan heparin.
Peralatan yang digunakan meliputi vortex, botol falcon, sentifugator, nano spektrofotometer, dan seperangkat alat Elektroforesis SDS-PAGE.

## Prosedur Penelitian
Ikan uji dipelihara dalam akuarium ukuran 80 x 40 cm dengan ketinggian air 20 - 30 cm. Ikan  uji  diadaptasi  selama  sebulan  sebelum diberikan perlakuan hormon. Masing – masing ikan  uji  ditempatkan  pada  akuarium  yang berbeda  untuk  identifikasi.  Ikan  diberikan
pakan  percil  yang  telah  diberi  hormon  ke bagian perut yang selanjutnya diberikan ke ikan sebagai pakan sebanyak 2 ekor perhari.
250 mg hormon Estradiol dilarutkan dalam 5 mL etanol absolut pada  botol falcon, larutan dihangatkan  pada  suhu  maksimal  62,5 o C  dan divortex  hingga  larutan  berwarna  bening. Larutan dibiarkan menguap hingga jenuh yaitu setelah  tidak  terjadi  pengurangan  volume akibat  etanol  menguap,  lalu  ditambahkan dengan cairan cocoa butter yang hangat hingga volume  8  mL  lalu  divortex.  Setelah  merata suspensi didiamkan hingga membentuk padatan. Sebelum digunakan, suspensi dihangatkan  hingga  mencair  lalu  disuntikkan secepatnya  50  mg/kg  ke  perut  ikan  langsung maupun  ke  percil  dengan  dosis  hormon  yang diberikan  0,1  mL  per  percil,  selanjutnya  percil akan diumpankan ke ikan uji sebanyak 2 ekor perhari.
Tabel 1. Data kode, nomor tag, panjang total (cm) dan bobot (g) ikan uji.
Kode/ code Nomor tag/ tag number Panjang total/ Total Length (cm) Bobot/ Weight (g) B1 O168003057 30,5 225,0 B2 O168003367 29,0 198,0 B3 O168003616 29,0 177,0 P1 407A0B6821 37,5 440,0 P2 146256161A 38,0 444,5 P3 1B0B005461 33,0 320,5 J1 7F7F116130 34,0 266,0 J2 7F7F106177 31,0 362,0 J3 1B0B007427 45,0 820,4 S1 1B0B005419 37,0 439,0 S2 1B0B005411 37,5 409,2 S3 1B0B005435 34,0 320,0
Catatan:  Inisial  mengacu  pada  spesies;  B:  Banjar,  J:  Papua,  P:  Pinoh  dan  S:  Super  red.  Angka mengacu pada nomor ikan .
Pemingsanan ikan uji  dilakukan sebelum pengukuran  panjang  dan  bobot  badan, pengambilan  darah  dan  penyuntikan  hormon. Pemingsanan dilakukan dengan menggunakan Phenoxyethanol 0,4  mL/L  air.  Ikan    sadar beberapa menit setelah dimasukkan ke wadah
yang  terisi  air  yang  diaerasi.  Darah  diambil dengan cara penyuntikan pada bagian pangkal ekor  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  plastik tube  tipe centrifuge yang  telah  diberi  heparin sebagai  anti  koagulan.  Pengambilan  darah dilakukan  sebelum  stimulasi  hormon  (kontrol)

## Musa et al.
dan  hari  kesepuluh.  Darah  yang  telah  diambil lalu  disentrifugasi  dengan  kecepatan  10.000 rpm selama lima menit pada suhu 4 o C. Plasma kemudian  dibuat  dalam  alikuot  dan  disimpan pada suhu -20 o C
Karakterisasi  Vtg  dilakukan  dengan membandingkan  kandungan  protein  plasma darah  sebelum  dan  sesudah  rangsangan hormon dengan menggunakan metode Sodium Dodecyl  Sulphate –  Polyacrylamide  Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970) yang  dilakukan  dengan  memigrasikan  sampel melalui stacking gel dan separating gel.
5  µL  plasma  darah  dari  12  sampel  ikan uji  dilarutkan  dalam  100  µL  buffer  sampel  (dd H2O,  0,5  M  Tris-HCl,  pH  6,8,  Glycerol,  10% (w/v)  SDS  dan  -mercaptoethanol,  1  %  (w/v) bromophenol  blue)  lalu  dimasukkan  ke  dalam sumur  gel  sebanyak  10  µL  per  sumur.  Sumur yang digunakan sebanyak 14, 12 untuk sampel ikan uji dan dua untuk standar protein.  Migrasi protein  dilakukan  selama  45 –  60  menit  atau hingga sampel mencapai bagian terbawah dari gel.  Gel  lalu  direndam  dengan  menggunakan larutan  staining  selama  2  jam  lalu  dibilas dengan larutan fiksatif. Pita yang terlihat pada sampel  yang  diberi  rangsangan  hormon  lalu dibandingkan dengan pita sampel kontrol. Pita yang  berbeda  dapat  dianggap  sebagai  Vtg. Penentuan berat molekul Vtg dilakukan melalui perbandingan  dengan  standar  protein  yang digunakan.
Purifikasi  Vtg  dilakukan  pada  varietas Banjar,  Papua  dan  Super  Red,  mengingat bahwa  Pinoh  dan  Banjar  dianggap  satu spesies.  Purifikasi  dilakukan  dengan  teknik SDS-PAGE menggunakan gel dengan ketebalan  1,5  mm  untuk  memisahkan  protein dalam  kandungan  plasma  darah  ikan  uji. Tegangan  yang  digunakan  sebesar  150  Volt
selama  45  menit.  Setelah  migrasi  terjadi,  pita yang menunjukkan Vtg kemudian dipotong lalu dimasukkan  ke  dalam  tabung  elusi  untuk memisahkan  protein  dari  gel  dengan  arus sebesar 10 mA/tabung selama 3 jam. Purifikasi Vtg  dilakukan  secara  berulang-ulang  hingga Vtg  murni  yang  didapatkan  cukup  untuk digunakan  sebagai  antigen  untuk  produksi antibodi maupun pada proses ELISA.
Konsentrasi Vtg murni dalam sampel dianalisis secara kuantitatif dengan pengukuran menggunakan  nano  spektrofotometer  pada panjang  gelombang  280  (Metode  Protein A280).  Untuk  tujuan  validasi Bovine  Serum Albumin (BSA)  digunakan  sebagai  standar untuk  membandingkan  antara  konsentrasi aktual  dan  konsentrasi  terukur  (Hirnawati  & Musa, 2015).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dengan  pemberian  stimulasi  hormon secara  oral,  ikan  menunjukkan  kondisi  yang sehat  dimana  respon  terhadap  pakan  agresif dan bergerak lincah (Musa & Hirnawati, 2018). Setelah pengambilan darah terakhir, ikan tetap bertahan dan dapat dipelihara untuk penelitian lanjutan.  Produksi  Vtg  dengan  cara  oral  juga efektif  karena  ukuran  bukaan  mulut  arwana yang  dapat  memangsa  percil.  Hasil  pengujian menunjukkan  bahwa  proses  produksi  Vtg berhasil  dilakukan.  Estradiol  efektif  untuk merangsang  Vitelogenesis  dan  menghasilkan banyak  vitelogenin  yang  diproduksi  pada  hati ikan (Magalhães et al., 2004; Brion et al., 2000;
Madsen et  al., 2013;  Zhong et  al., 2014).
Ekspresi vtg secara signifikan lebih tinggi di hati dan  gonad  dibandingkan  dengan  ekspresi  di jaringan lain (Pan et al., 2019).
Hasil  identifikasi  berdasarkan  metode SDS-PAGE  pada  sampel  hari  ke-10  masing-

## Musa et al.
masing  ikan  uji  menunjukkan  bahwa  terdapat kesamaan  karakter  Vtg  pada  Arwana  Banjar, Pinoh dan Super red (Gambar 1). Berat molekul Vtg yang terukur pada ketiga varietas tersebut adalah  180  kiloDalton  (kDa),  sedangkan  pada Arwana  Papua  terdapat  dua  jenis  Vtg  yang terlihat yaitu pada berat molekul 180 kDa untuk Vtg1 dan 110 kDa untuk Vtg2. Durasi ekspresi Vtg setelah pemberian estradiol ini sama pada
ikan marbled  flounder ( Pseudopleuronectes yokohamae ), black rockfish ( Sebastes schlegelii )  dan fat  greenling ( Hexagrammos otakii )  (Li et  al., 2018),  sedangkan  pada  ikan Astyanax bifasciatus , Chrenicicla iguassuensis dan Geophagus  brasiliensis adalah  15  hari (Yamamoto et  al., 2017)  begitu  pula  pada
Rhamdia quelen (Costa et al., 2016).
Gambar 1. Karakter Vtg empat varietas arwana. Inisial mengacu pada spesies; B: Banjar, J: Papua, P: Pinoh dan S: Super red. Angka mengacu pada angka ikan. Garis coklat mengacu pada Vtg1 and garis kuning mengacu pada Vtg2.
Vtg  tunggal  terdapat  pada  patin  albino ( Pangasianodon  hypophthalmus )  dan  gurame padang  ( Osphronemus  goramy )  (Musa  &
Hirnawati, 2016), marbled flounder ( Pseudopleuronectes yokohamae ), black rockfish ( Sebastes schlegelii ) dan fat greenling ( Hexagrammos  otakii )  (Li et  al., 2018),
Geophagus  brasiliensis (Yamamoto et  al.,
2017),  serta Rhamdia  quelen (Costa et  al.,
2016).  Karakter  Vtg  Arwana  Papua  memiliki kesamaan  dengan Arapaima  gigas yang memiliki 2 Vtg yaitu Vtg 1 dan Vtg 2 (Chu-Koo et al., 2008) dengan dugaan berat molekul 180 kDa  dan  110  kDa  masing-masing.  Dua  jenis Vtg  juga  ditemukan  di  Rainbow  Trout
( Oncorhynchus  mykiss )  pada  berat  molekul 390 dan 176 kDa (Bon et al., 1997). Ikan ringau ( Datnioides  microlepis )  memiliki  dua  jenis  Vtg dengan molekul berat 180 dan 110 kDa (Musa, 2016)  dan Clarias  batrachus memiliki  dua  Vtg dengan  berat  molekul  95  dan  67  kDa (Mahapatra et al., 2017).
Belum  diketahui apakah perbedaan karakter  Vtg  antara  Arwana  Papua  dan  ketiga varietas  lainnya  memiliki  korelasi  dengan perbedaan  pendapat  tentang  spesiasi  Arwana Asia,  di  mana  Pouyaud et  al. (2003) mengklasifikasikan  bahwa  arwana  asia  di Indonesia terdiri dari lima spesies, sedang Yue et al., (2002)  dan  Mohd-Shamsudin et  al., (2011)
Musa et al.
tetap  menganggap  bahwa  hanya  ada  dua spesies  di  arwana  asia  yaitu Scleropages formosus dan Scleropages jardinii .
Hasil purifikasi menunjukkan bahwa telah berhasil  didapatkan  Vtg  murni  dari  tiga  varietas arwana  yaitu  Banjar,  Papua  dan  Super  Red (Gambar 2).  Keberhasilan purifikasi terlihat dari adanya  pita  tunggal  tipis  dan  jelas  pada  setiap
sumur. Purifikasi Vtg ikan telah banyak dilakukan untuk tujuan immunoassay seperti pada Alburnus tarichi (Oguz et  al., 2019),  Giant  grouper
( Epinephelus  lanceolatus )  (Daud  Om et  al., 2016), Mugil  cephalus (Amano et  al., 2019),
Heteropneustes  fossil is  (Biswas,  2018)  dan Oryzias melastigma (Yi et al., 2018) serta banyak ikan lainnya.
Gambar 2. Uji kualitas hasil pemurnian dari tiga varietas arwana. Inisial mengacu pada spesies ; B : Banjar, J : Papua dan S : Super red. Angka mengacu pada nomor ikan
Berdasarkan  kualitas  hasil  pemurnian pada Gambar 2 maka kadar Vtg yang berhasil dipurifikasi  ditentukan  melalui  uji  kuantifikasi. Hasil  uji  kuantifikasi  dengan  metode  protein A280  pada  standar  BSA  menunjukkan  bahwa konsentrasi terukur jauh lebih rendah dibanding konsentrasi  aktual  (Hirnawati  &  Musa,  2015). Hal ini menunjukkan bahwa meskipun pembacaan kecil, konsentrasi aktual Vtg dalam sampel  hasil  purifikasi  dapat  lebih  tinggi  dari konsentrasi terukur (Tabel 2).
Penggunaan  metode  protein  A280  ini memiliki  banyak  keuntungan  di  antaranya adalah penggunaan sampel yang sedikit (2 µL), tidak  perlu  mengganti  pelarut  sampel  dan waktu  yang  lebih  cepat  karena  tidak  perlu mencampur dengan pereaksi tertentu (Anonim, 2008).
Tabel 2. Kode sampel dan konsentrasi terukur
(mg/mL) sampel hasil purifikasi.
Kode sampel Konsentrasi terukur (mg/mL) B11 0,67 B12 0,65 B13 0,33 J11 0,40 J12 0,10 J13 0,48 S11 0,51 S12 0,11 S13 0,42
Catatan: Inisial mengacu pada spesies dan standar;
B:  Banjar,  J:  Papua  dan  S:  Super  red. Angka mengacu pada nomor ikan.
Metode protein A280 juga sangat bagus untuk  pengukuran  protein  murni  yang  telah melalui  proses  purifikasi  (Anonim,  2008). Metode protein A280 telah dimanfaatkan untuk
Musa et al.
pengukuran  Xylanase  dari Aspergillus  ficuum
(Lu et al., 2008), protein imunogenik Mycobacterium s p pada ikan mas (Rahmaningsih & Yanuhar, 2012) serta Vtg dari ovarium Amphioxus (Sun  &  Zhang,  2001). Metode A280 juga digunakan untuk pengukuran  konsentrasi  protein  pada  bisa (Bocian et al., 2020), protein monoklonal canine sera (Harris et al., 2019) bahkan untuk protein rekombinan dalam pengujian Covid-19 (Johari et al., 2020).
Konsentrasi  Vtg  murni  terukur  yang berhasil  diperoleh  dari  proses  purifikasi berkisar dari 0,1 sampai 0,67 mg/mL. Vtg yang diperoleh dapat dimanfaatkan untuk memproduksi  antibodi  proses imunoassay yang  kedepannya  sangat  berguna  untuk proses  deteksi  Vtg  baik  secara  kualitatif maupun kuantitatif (Li et al., 2018).
Permasalahan  di  arwana  yang  bersifat monomorfik dengan diperolehnya Vtg ini akan dapat  dipecahkan  dan  didapatkan  jalan keluarnya. Di mana pada spesies lain, Vtg juga telah  banyak  digunakan  sebagai  indikator pembeda kelamin seperti pada Arapaima gigas (Chu-Koo et  al., 2008), Giant  Grouper
Epinephelus  lanceolatus (Daud  Om et  al., 2016), Yellowfin  Seabream  Acanthopagrus latus (Negintaji et al., 2019) dan lainnya.
Meskipun pada ikan jantan juga terkadang  terdeteksi  adanya  vitellogenin  (Pan et al., 2019), namun hal ini diduga disebabkan oleh adanya gangguan dari senyawa estrogen yang  terekspos  ke  lingkungan  ( endocrine disruptor  compounds )  seperti  yang  teramati pada  beberapa  ikan  di  sungai  Iguacu,  Brazil (Yamamoto et al., 2017), ikan rainbow trout di Park City, Utah, Amerika Serikat (Franco, 2020) dan brown  trout di  sungai  Liri,  Italia  (Zezza,
2020).  Dalam  keadaan  normal,  Vtg  hanya terdapat pada ikan betina (Li & Zhang, 2017).
Dengan  diperolehnya  isolat  Vtg  yang murni,  maka  proses  i mmunoassay dapat dilanjutkan  ke  tahap  produksi  antibodi  untuk selanjutnya  dapat  didesain  metode  interaksi Vtg  dengan  anti-Vtg  baik  melalui western  blot (O ğ uz et  al., 2019),  ELISA  (Li et  al., 2018) maupun dot blot (Nanthanawat & Prasatkaew,
2018) dengan hasil ini diharapkan kelamin ikan arwana  dapat  ditentukan  secara  akurat.  Jika kelamin  ikan  arwana  dapat  dibedakan  maka akan  memudahkan  proses  budidaya  secara efektif  (Medipally et  al., 2016).  Pemasangan induk  jantan  dan  betina  dengan  rasio  tertentu dapat  dilakukan  untuk  memudahkan  proses pemijahan  (Yue et  al., 2020).  Pemijahan  ikan arwana dengan rasio kelamin jantan dan betina yang  efektif  tentu  akan  membuat  usaha budidaya  arwana  ini  menjadi  lebih  efisien dengan produktitifas yang tinggi.

## KESIMPULAN
Terdapat  dua  jenis  karakter  vitelogenin arwana asia yaitu tunggal pada arwana Banjar, Pinoh ( Scleropages macrocephalus ) dan Super Red  ( Scleropages  legendrei )  dengan  berat molekul  180  kDa  serta  ganda  pada  arwana Papua  ( Scleropages  jardinii )  dengan  berat molekul  180  dan  110  kDa.  Telah  dikoleksi Vitelogenin  murni  dari  3  varietas  yaitu  Banjar, Pinoh  dan  Papua  dengan  kisaran  konsentrasi antara  0,1 –  0,67  mg/mL.  Konsentrasi  aktual diyakini  lebih  besar  dari  konsentrasi  terukur tersebut.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih pada Marjono dan Angga Gumelar atas
Musa et al.
partisipasinya  dalam  membantu  pelaksanaan sampling.

## DAFTAR PUSTAKA
Amano,  H.,  Kotake,  A.,  Hiramatsu,  N.,  Fujita,
T.,  Todo,  T.,  Aoki,  J.  Y.,  ...  &  Hara,  A. (2019). Development of specific chemiluminescent  immunoassays  for three  subtypes  of  vitellogenin  in  grey mullet  ( Mugil  cephalus ). General  and comparative endocrinology, 271: 30-38.
Anonim, (2008), NanoDrop 1000
Spectrophotometer  V3  .  7  User ’  s Manual. Thermo Scientific Austin,  C.M.,  Tan,  M.H.,  Croft,  L.J.,  Hammer, M.P., Gan, H.M. (2015). Whole genome sequencing  of  the  Asian  arowana
( Scleropages formosus ) provides insights  into  the  evolution  of  ray-finned fishes. Genome  Biol  Evol. 7(10):  2885 – 2895. doi:10.1093/gbe/evv186
Benjaboonyazit,
T. (2014) Systematic approach to arowana gender identification problem using algorithm of inventive problem solving (ARIZ). Eng J. 18(2):13 –28. doi:10.4186/ej.2014.18.2.13
Biswas, A. (2018). Development of Vitellogenin
ELISA and study of vitellogenin synthesis  of  Triploid  Heteropneustes fossilis (Bloch). IJRAR , 6(1):1175-1184.
Bocian, A., Sławek, S., Jaromin, M., Hus, K. K., Buczkowicz, J., Łysiak, D., ... & Legáth, J.  (2020).  Comparison  of  Methods  for Measuring  Protein  Concentration  in Venom Samples. Animals , 10 (3): 448.
Bon,  E.,  Barbe,  U.,  Nuñez,  R.J.,  Cuisset,  B., Pelissero, C., Sumpter, J.P., Le Menn, F. (1997). Plasma vitellogenin levels during the  annual  reproductive  cycle  of  the female  rainbow  trout  ( Oncorhynchus mykiss ): Establishment and validation of an  ELISA, Comp  Biochem  Physiol, 117 B: 75 –84.
Brion, F., Rogerieux, F., Noury, P., Migeon, B., Flammarion, P., Thybaud, E., & Porcher, J.M. (2000). Two-step purification method of vitellogenin from three teleost fish species: rainbow trout ( Oncorhynchus mykiss ), gudgeon ( Gobio  gobio )  and  chub  ( Leuciscus cephalus ). J Chromatography, B .737: 3- 12.
Caza, J.,  Fernández,  R.,  Arias,  M.  T.,  Muñoz, D.,  Tirado,  J.  O.,  Manjunatha,  B.,  &
Kundapur, S. I. (2020). The Development, Purification and Characterization of Anti-Vitellogenin Antibodies Raised in Hens (Gallus gallus domesticus) Against Tilapia (Oreochromis niloticus) Vitellogenin Protein. Journal of Microbiology,
Biotechnology and Food Sciences , 9 (4):
1165-1168.
Chang,  K.W.  (2009)  Molecular  analysis  of  the breeding  biology  of  the  Asian  arowana ( Scleropages  formosus )  [ PhD  thesis ]. National University of Singapore
Chansue, N., Tangtrongpiros, J., Sermwatanakul, A., Haetrakul, T.,
Jongcheranjai, M., Kiesslich, J., Jantapanon,  T.K.,  Anekthanakul,  K. (2013).  Asian  arowana  (Scleropages formosus)  sex  determination  using different methods. Acad. Confer. Fisher . 40:137 –150.
Chao,  B.,  Hu,  Y.,  Ravi,  V.,  Kuznetsova,  IS., Shen, X., Mu, X., Sun, Y., You, X., et al. (2016). The Asian arowana ( Scleropages formosus ) genome provides  new  insights  into  the  evolution of an early lineage of teleosts. Sci. Rep. 6:24501.
Chu-Koo,  F.,  Dugue  R.,  Aguilar  M.A.,  Daza A.C., Bocanegra, F.A., Veintemilla, C.C., Duponchelle,  F.,  Renno,  J.F.,  Tello,  S., Nunez, J. (2008). Gender determination in  the  Paiche  or  Pirarucu  ( Arapaima gigas )  using  plasma  vitellogenin,  17b- estradiol, and 11-ketotestosterone levels, Fish  Physiol  Biochem .,  35(1): 125-136. doi:10.1007/s10695-008-9211- 8.
Chumaidi,  C.,  Priyadi,  A.,  Ginanjar,  R.,  & Sugiarti, L. (2012). Ciri Kelamin Sekunder Pada Arwana Silver
( Sclerophages macrocephalus ) Varietas
Pinoh. Jurnal Riset Akuakultur , 7 (2): 221-229.
Costa,  D.  D.  M.,  Bozza,  D.  A.,  Rizzo,  L.  E., Garcia, J., Costa, M. D. M., & de Oliveira Ribeiro,  C.  A.  (2016).  Characterization, specificity  and  sensibility  of  produced anti-Rhamdia  quelen  vitellogenin  in Brazilian  fish  species. Fish  physiology and biochemistry , 42 (6): 1721-1732.
Daud Om, A., Jasmani, S., Sung, Y.Y., Bolong, A.A.  (2016).  Use  of  Vitellogenin  as
Biomarker Indicator in Sex Identification of Giant Grouper ( Epinephelus
Musa et al.
lanceolatus ). Poult Fish Wildl Sci 4: 163. doi:10.4172/2375-446X.1000163
Esmaeili, C., Heng, L.Y., Chiang, C.P., Rashid, Z.A.,  Safitri,  E.,  Marugan,  R.  (2017).  A
DNA
biosensor
based on kappacarrageenan-polypyrrole-gold nanoparticles  composite  for  gender determination of
arowana fish ( Scleropages formosus ). Sens. Actuator B-Chem .242:616 –624. doi:10.1016/j.snb.2016.11.061
Franco,  M.  E.,  Stroski,  K.  M.,  Sims,  J.  L., Burket, S. R., Ashcroft, C., Luers, M., ...
& Lavado, R. (2020). Plasma Vitellogenin  Reveals Potential  Seasonal Estrogenicity  in  Fish  from  On-Site Wastewater Treatment Systems in Semi- Arid  Streams  Influenced  by  Snowmelt.
Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology , 105(5): 692-698.
Harris,  A.  D.,  Rout,  E.,  Avery,  A.,  Bolte,  D., Belling ‐ Kelly, E., & Moore, A. R. (2019). Validation and method comparison of the use of densitometry to quantify monoclonal  proteins  in  canine  sera. Veterinary clinical pathology , 48 : 78-87.
Hirnawati,  R.  &  Musa,  A.  (2015).  Penentuan Konsentrasi  Vitelogenin  Hasil  Purifikasi Dengan  Metode  DC  Protein  Assay  Dan Protein  A280. Prosiding  Forum  Inovasi Teknologi  Akuakultur  2015 .  ISBN  978- 979-789-049-0.
Johari,  Y.  B.,  Jaffé,  S.  R.,  Scarrott,  J.  M., Johnson, A. O., Mozzanino, T., Pohle, T. H., ... & Tee, K. L. (2020). Production of Trimeric  SARS ‐ CoV ‐ 2  Spike  Protein  by
CHO  Cells  for  Serological  COVID ‐ 19 Testing. Biotechnology and bioengineering . Kartamihardja,  E.  S.,  Umar,  C.,  &  Aisyah,  A.
(2014).  Pembelajaran  Dari  Pengelolaan dan Konservasi Sumberdaya Ikan
Arwana  Merah  (Scleropages  formosus, Muller  and  Schlegel,  1844)  Berbasis Masyarakat di Danau Empangau, Kalimantan  Barat. Jurnal  Kebijakan Perikanan Indonesia , 6(2): 65-74.
Kazemi, R., Yarmohammadi, M., Hallajian A., & Tizkar  B.  (2020).  Determination  of gender  and  sexual  maturity  stages  of reared great sturgeon (Huso huso) using blood  plasma  sex  steroid  ratios. Iranian Journal  of  Fisheries  Sciences .  19(4): 2185-2198.
Laemmli,  U.K.,  (1970),  Cleavage  of  structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4, Nature, 227(5259): 680-685.
Lavoue, S. (2015). Testing a time hypothesis in the biogeography of the arowana genus
Scleropages ( Osteoglossidae ). J Biogeogr. 42(12):2427 –2439.
doi:10.1111/jbi.12585
Li,  H.,  &  Zhang,  S.  (2017). Functions  of vitellogenin in eggs. In Oocytes (pp. 389- 401). Springer, Cham.
Li, Y., Wang, J., Zheng, M., Zhang, Y., & Ru, S. (2018).  Development  of  ELISAs  for  the detection  of  vitellogenin  in  three  marine fish from coastal areas of China. Marine pollution bulletin , 133 : 415-422.
Lu, F., Lu, M., Lu, Z., Bie, X., Zhao, H., & Wang,
Y. (2008).
Purification and characterization of xylanase from Aspergillus  ficuum  AF-98. Bioresource Technology , 99 (13): 5938 –5941.
http://doi.org/10.1016/j.biortech.2007.10
.051 Madsen,  L.L.,  Korsgaard,  B.,  Pedersen,  K.L., Bjerregaard, L.B., Aagaard, T., Bjerregaard,  P.  (2013).  Vitellogenin  as biomarker  for  estrogenicity  in  flounder Platichthys  flesus  in  the  field  and exposed to 17α-ethinylestradiol via food and water in the laboratory. Mar. Environ.
Res. 92: 79 –86. doi:10.1016/j.marenvres.2013.09.002.
Magalhães, I., Ledrich, M.L., Pihan, J.C., Falla, J.  (2004).  One-step,  non-denaturing purification  method  of  carp  ( Cyprinus carpio )  vitellogenin, J  Chromatography B ., 799 (1): 87-93.
Mahapatra,  S.,  Kabita,  S.,  Bhattacharya,  D., Sarkar, S., Juin, S. K., Maitra, S., & Nath, P.  (2017).  Purification  and  development of ELISAs for two forms of vitellogenin in Indian walking catfish, Clarias batrachus (L.).  Fish  physiology  and  biochemistry, 43(2), 477-491.
Manoharan,  B.,  Sulaimen,  Z.,  Omar,  F., Othman,  R.,  Mohamed,  S.,  Bhassu,  S.
(2011).  Isolation  and  characterization  of novel microsatellite markers in commercial  selected  golden  Malaysian arowana  fish, Scleropages  formosus (Osteoglossidae). Genet Mol Res. 10(2):
712 –716. doi:10.4238/vol10-2gmr944 Medipally, S.R., Yusoff, F.M., Sharifhuddin, N., Shariff, M. (2016) Sustainable aquaculture of Asian arowana - a review. J. Environ. Biol. 37(4 Spec No):829 –838.

## Musa et al.
Mohd-Shamsudin, M. I., Fard, M. Z., Mather, P.
B., Suleiman, Z., Hassan, R., Othman, R. Y.,  &  Bhassu,  S.  (2011).  Molecular characterization  of  relatedness  among colour  variants  of  Asian  Arowana (Scleropages  formosus). Gene , 490 (1- 2): 47-53.
Musa,  A.,  &  Hirnawati,  R.,  (2016).  Uji Spesifisitas Anti-Vitelogenin Ikan Gurami Padang  ( Osphronemus  goramy )  dan Patin Albino ( Pangasianodon hypophthalmus ), ( Belum dipublikasi )
Musa,  A.,  &  Hirnawati,  R.,  (2018),  The
Effectivity of Arowana Pinoh ( Scleropages macrocephalus ) Vitellogenin  Production  using  Estradiol Stimulation  by  Injection  and  Oral  in Proceedings  of  The  5th  International Conference On Research, Implementation and Education of Mathematics and Sciences (5th ICRIEMS):  Revitalizing  Research  And
Education On Mathematics And Science For Innovations And Social Development (pp.  C-19 –  C-24) .  FMIPA  Universitas Negeri  Yogyakarta,Yogyakarta  ISBN 978-602-74529-3-0.
Musa, A. (2016). Uji Koaglutinasi untuk Deteksi Vitelogenin dan Penentuan Kelamin Ikan Ringau  ( Datnioides  microlepis ), Thesis, Pasca Sarjana IPB, Bogor.
Nanthanawat,  P.,  &  Prasatkaew,  W.  (2018).
Development  of  Dot  Blot  Technique  for Detection of Vitellogenin as a Biomarker of  Endocrine  Disrupting  Chemicals.
Burapha Science Journal ( วารสาร
วิทยาศาสตร ์ บูรพา ), 23(3): 1448-1457.
Negintaji,  A.,  Safahieh,  A.,  Zolgharnein,  H.,  & Matroodi,  S.  (2019).  Vitellogenin  Gene Expression  and  Sex  Steroid  Levels  as Biomarkers  in  Yellowfin  Seabream (Acanthopagrus latus) Exposed to Bisphenol-A. Iranian Journal of Toxicology , 13(1): 27-33.
Ngili, Y., Lantang, D., Ubyaan, R., Palit, E.I.Y. (2015).  Mitochondrial  DNA  genetic diversity of arowana fish local variants on the D-loop hypervariable region: Study in the southern region of Papua-Indonesia. Der Pharma Chem. 7:223 –228.
Oğuz, E. K., Özdemir, K., Ünal, G., & Oğuz, A. R.  (2019).  Polyclonal  antibody-based immunoassay  of vitellogenin in Van fish (Alburnus  tarichi). International  Journal of Environmental Health Research , 1-12.
Pan,  X.,  Liu,  Y.,  Zhou,  K.,  Mu,  X.,  Zheng,  S., Liu, C., Hu, Y. (2019). Tissue expression and  bioinformatics  analysis  of  the vitellogenin  gene  of  Asian  arowana ( Scleropages formosus ). J. Appl. Ichthyol . 35:970 –977.
Parks,  L.G.,  Cheek,  A.O.,  Denslow,  N.D., Hepell,  S.A.,  McLachlan,  J.A.,  LeBlanc, G.A.,  &  Sullivan,  C.V.  (1999).  Fathead minnow ( Pimephales promelas ) vitellogenin: purification, characterization andquantitative  immunoassay  for  the detection of estrogeniccompounds,
Comp  Biochem  Physiol  C., 123:  113 – 125.
Pouyaud,  L.,  &  Teugels,  G.  G.  (2003).  The different  colour  varieties  of  the  Asian arowana Scleropages formosus (Osteoglossidae)  are  distinct  species: morphologic and genetic evidences. Cybium , 27 (4): 287-305.
Pusey, B. J., Fisher, C., & Maclaine, J. (2016). On  the  nature  of  Scleropages  leichardti Günther, 1864 (Pisces: Osteoglossidae). Zootaxa, 4173(1): 75-84.
Rahmaningsih,  S.,  &  Yanuhar,  U.  (2012).
Identifikasi Protein Imunogenik
Mycobacterium  sp  pada  Ikan  Mas (Cyprinus  carpio).  Prosiding  Seminar
Nasional  Tahunan  IX  Hasil  Penelitian Perikanan  dan  Kelautan,  14  Juli  2012 Penyakit  Ikan  &  Lingkungan  (  PL-13  )  :
1 –8.
Roberts, T.R. (2012) Scleropages inscriptus , a new fish species from the Tananthayi or Tenasserim
River basin,
Malay
Peninsula of Myanmar (Osteoglossidae:
Osteoglossiformes). Aqua  International Journal of Ichthyology , 18: 113 –118.
Sun,  X.,  &  Zhang,  S.  (2001).  Purification  and characterization of a putative vitellogenin from the ovary of amphioxus (Branchiostoma  belcheri  tsingtaunese ).
Comparative Biochemistry and
Physiology  -  B  Biochemistry  and Molecular Biology, 129(1): 121 –127.
Shen, X.Y., Kwan, H.Y., Thevasagayam, N.M., Prakki,  S.R.S.,  Kuznetsova,  I.S.,  Ngoh, S.Y., Lim, Z., Feng, F., Chang, A., Orban, L., et  al. (2014).  The  first  transcriptome and  genetic  linkage  map  for  Asian arowana. Mol  Ecol  Resour. 14(3):622 – 635. doi:10.1111/1755-0998.12212
Sun,  X.,  &  Zhang,  S.  (2001)  Purification  and characterization of a putative vitellogenin from the ovary of amphioxus
Musa et al.
( Branchiostoma  belcheri tsingtaunese). Comparative Biochemistry and Physiology  -  B  Biochemistry  and
Molecular Biology, 129(1): 121 –127.
Thipwong,  S.,  Banyen,  S.,  Mahasawad,  J. (2015).  Appropriate  weaning  period  of Asia  arowana Scleropages  formosus (Schlegel and Muller, 1844) by replacing live  feed  with  pelleted  feed. Thai  Fish. Gazette . 8:1 –28.
Tsukada,  K.,  Tsunashima,  K.,  Jinno,  K., Hiramatsu,  B.,  Takeuchi,  S.,  Fujimoto, K.,  ...  &  Saari,  M.  M.  (2019).  Using magnetic  field  gradients  to  shorten  the antigen-antibody  reaction  time  for  a magnetic immunoassay. IEEE
Transactions on Magnetics , 55 (7): 1-5.
Tyler,  C.  R.,  (1991),  Vitellogenesis  in Salmonids ,  Proceedings  of  the  Fourth International
Symposium on the Reproductive Physiology of Fish , (University  of  East  Anglia  Press, Norwich).
Upadhyay, S. K., Singh, H., Dixit, S., Mendu, V., &  Verma,  P.  C.  (2016).  Molecular characterization  of  vitellogenin  and vitellogenin  receptor  of  Bemisia  tabaci.
PloS one , 11 (5), e0155306.
Wang, J., Zhang, Z., Zhang, X., Ru, S., & Dong,
Y. (2017). Development of an immunosensor  for  quantifying  zebrafish vitellogenin  based  on  the  Octet  system.
Analytical Biochemistry , 533 : 60-65.
Yamamoto, F. Y., Garcia, J. R. E., Kupsco, A., &  Ribeiro,  C.  O.  (2017).  Vitellogenin levels  and  others  biomarkers  show evidences of endocrine disruption in fish species  from  Iguaçu  River-Southern Brazil. Chemosphere , 186: 88-99.
Yi,  X.,  Li,  C.,  Zhong,  X.,  &  Gong,  Y.  (2018). Development  of  a  lipovitellin-based sandwich  ELISA  for  determination  of vitellogenin  in  the  marine  medaka Oryzias melastigma. Chemosphere, 197: 477-484.
Yue,  G.  H.,  Chang,  A.,  Yuzer,  A.,  &  Suwanto, A.  (2020).  Current  Knowledge  on  the
Biology and Aquaculture of the Endangered Asian Arowana. Reviews in Fisheries Science  & Aquaculture, 28(2): 193-210.
Yue, G., Li, Y., Chen, F., Cho, S., Lim, L. C., & Orban,  L.  (2002).  Comparison  of  three DNA  marker  systems  for  assessing genetic  diversity  in  Asian  arowana
( Scleropages formosus ). Electrophoresis , 23 (7 ‐ 8):1025-1032.
Zezza, D., Bisegna, A., Angelozzi, G., Merola, C., Conte, A., Amorena, M., & Perugini, M. (2020). Impact of endocrine disruptors on  vitellogenin  concentrations  in  wild brown trout (Salmo trutta trutta). Bulletin of  Environmental  Contamination  and Toxicology , 105(2): 218-223.
Zhang  J.,  &  Wilson,  M.  (2017)  First  complete fossil Scleropages
(Osteoglossomorpha). Vertebr  PalAsiat. 55:1 –23.
Zhong, L., Yuan, L., Rao, Y., Li, Z., Zhang, X., Liao,  T.,  Xu,  Y.,  Dai,  H.  (2014). Distribution  of  vitellogenin  in  zebrafish ( Danio  rerio )  tissues  for  biomarker analysis. Aquat.  Toxicol. 149:  1 –7. doi:10.1016/j.aquatox.2014.01.022