PENYIMPANAN TANAMAN JERUK ( Japansche citroen ) SECARA IN VITRO

## DENGAN TEKNIK ENKAPSULASI
Rani Wulan Suci 1)
1) Anggota Peneliti Muda Utama, Kelompok Peneliti Muda Universitas Negeri Jakarta
Email : raniwulansuci190@gmail.com

## ABSTRAK
Enkapsulasi  adalah  teknik  pembungkusan  eksplan  yang  dapat  berupa  embrio somatik,  meristem  atau  tunas  pucuk  dengan  suatu  pembungkus  khusus  sehingga eksplan  tidak  mudah  rusak  selama  masa  penyimpanan.  Enkapsulasi  dilakukan  pada tunas  buku jeruk  ( Citus  x  limonia cv. Japansche  Citroen). Jeruk  ini  memiliki  karakter unggul berupa tahan kering dan organ batang yang kokoh. Tanaman ini juga lebih cepat pertumbuhannya  dibandingkan  jeruk  RL  dan  Volkameriana  (Budiarti et  al .,  2013). Tujuan  penelitian  ini  adalah  mendapatkan  kombinasi  media  untuk  teknik  enkapsulasi yang  mampu  menyimpan  eksplan  satu  buku  tunas  jeruk  JC . Metode  yang  digunakan adalah eksperimen. Ada 3 tahapan percobaan yang dilakukan. Tahapan pertama adalah percobaan pendahuluan. Hasilnya menunjukan jika penambahan hormon giberelin pada media  perkecambahan  menyebabkan  perkecambahan  lebih  cepat.  Regenerasi  tunas lebih  baik  pada  media  MS+VMW+Kin  0.3 mgL -1 ,  pembentukan kapsul  menggunakan alginat  tipe  kepadatan  tinggi  dan  menggunakan  zat  osmoregulator  manitol.  Percobaan kedua adalah enkapsulasi pada manitol. Hasilnya adalah kombinasi antara media alginat (Ma) media inkubasi (Mi) MS+VMW Manitol 3% ½ (MS+VMW) Manitol 3% dan MS+VMW  Manitol  4% ½(MS+VMW)  Manitol  4%  dapat  menyimpan  eksplan  tetap hijau selama 5 bulan. Percobaan ketiga adalah regenerasi eksplan hasil enkapsulasi dan penyimpanan.  Hasil  menunjukan  tidak  terdapat  perbedaan  nilai  regenerasi  antara eksplan hasil enkapsulasi dan penyimpanan dengan eksplan kontrol.
Kata Kunci: Enkapsulasi, Osmoregulator, Penyimpanan In Vitro, Regenerasi

## ABSTRACT
Encapsulation  is  a  technique  that  can  wrap  eksplan  somatic  embryo,  meristem  or shoot buds with a special wrapping so eksplan not easily damaged during the storage period.  Encapsulation  is  done  on  citrus  book  shoots  (Citus  x  limonia  cv  Japansche Citroen).  This  orange  has  a  superior  character  of  dry  resistance  and  a  sturdy  stem organ. This plant is also faster growth than oranges RL and Volkameriana (Budiarti et al.,  2013).  The  purpose  of  this  research  is  to  get  a  combination  of  media  for  the encapsulation technique that is able to store the explanation of one book of JC orange buds. The method used is experiment. There are 3 stages of experiments performed. The first stage is a  preliminary experiment.  The  results show  if the addition of gibberellin hormone in germination media causes faster germination. Better shoot regeneration on MS  +  VMW +  Kin  0.3 mgL-1  medium,  capsule  formation  using high  density  alginate
type  and  using  mannitol  osmoregulator  substance.  The  second  experiment  was encapsulation on mannitol. The result is a combination of Alginate media (Ma) -media incubation (Mi) MS + VMW Manitol 3% -½ (MS + VMW) Manitol 3% and MS + VMW Manitol 4% -½ (MS + VMW) Manitol 4% eksplan remain green for 5 months. The third experiment  is  the  regeneration  of  explosive  encapsulation  and  storage.  The  result showed no difference of regeneration value between eksplan encapsulation and storage with eksplan control.
Keywords: Encapsulation, Osmoregulator, In Vitro Storage, Regeneration

## PENDAHULUAN
Jeruk  merupakan  komoditas  dagang yang  memiliki  nilai  ekonomi  di  semua tempat. Buah jeruk mempunyai prospek yang baik untuk dikembangkan dan  merupakan  salah  satu  buah unggulan  nasional  karena  banyak dikonsumsi  sebagai  sumber  nutrisi (terutama  vitamin  C)  oleh  penduduk baik  dalam  negeri  maupun  luar  negeri. Produksi buah jeruk di Indonesia selalu mengalami  penurunan  karena  faktor penurunan  luas  lahan  dan  sulitnya mendapatkan  indukan  yang  unggul. Data  menyatakan  luas  lahan  dan produksi buah jeruk dari tahun 2012 ke tahun  2013  mengalami  penurunan sebesar  1.722  Ha  dan  42.963  ton (Pusdatin, 2015).
Budidaya  tanaman  jeruk  untuk mendapat  indukan  yang  produktif adalah  dengan  menyambung  atau menempel  jenis  jeruk  yang  memiliki tajuk  lebat  sebagai  batang  atas  ( scion ) dengan  jenis  jeruk  yang  memiliki batang  bawah  ( rootstock )  yang  kokoh. Salah satu jenis jeruk sering digunakan di Indonesia adalah Jeruk JC (Japansche Citroen). Tanaman jeruk JC memiliki  keunggulan  berupa  tahan kering,  organ  batang  yang  kokoh  tebal serta  susunan  perakaran  serabut  yang luas  dan  kuat.  Jayanti et  al., (2015), menyatakan batang bawah JC memiliki kompatibilitas dengan tingkat keberhasilan  tempelan  sebesar  100% pada  kultivar  jeruk  Citrumello  (jeruk besar
cikoneng). Banyaknya
keunggulan  jeruk  JC  juga  sebanding dengan  kendalanya.  Kendala  pada tanaman  ini  adalah  masa  penyimpanan benih, tingginya tingkat poliembrio biji dan  rasa  buah  yang  asam.  Rasa  asam pada buah jeruk JC merupakan kendala karena  kultivar  ini  dianggap  tidak menguntungkan secara ekonomi (Towill,  1992).  Sementara  itu jeruk  ini merupakan sumber plasma nutfah yang perlu  di konservasi.  Benih  jeruk  JC dalam  bentuk  buah  hanya  dapat  di simpan selama 7 hari dan indukan tidak bisa  di simpan  dalam  bentuk  biji, karena biji bersifat rekalsitran.
Alternatif  pemecahan  masalah  pada tanaman  tersebut  adalah  konservasi dengan  teknik  kultur  jaringan  atau kultur in vitro (Suryowinoto, 1996).
Terdapat  tiga  teknik  konservasi in vitro yaitu  penyimpanan  pada  media tumbuh atau subkultur berulang, penyimpanan secara kriopreservasi dan penyimpanan secara pertumbuhan minimal (Mariska et al., 1996; Leunufna, 2004).
Pada teknik
penyimpanan secara pertumbuhan minimal  memiliki  keunggulan  yaitu tidak  memerlukan  subkultur  yang frekuentif sehingga mengurangi tingkat kontaminasi  dan  biaya  yang  relatif murah  serta  dapat  menyimpan  eskplan dalam  jangka  waktu  menengah  (<1 tahun)  (Roostika,  2009).  Salah  satu modifikasi teknik ini adalah enkapsulasi.
Enkapsulasi adalah proses pelapisan bahan  biakan  (eksplan)  dengan  media alginat. Penelitian ini melakukan enkapsulasi  pada  ekplan  satu  buku tunas  jeruk  JC.  Hasil  enkapsulasi disimpan  di  media  cair  atau  media inkubasi untuk mempertahankan kelembaban  kapsul.  Media  enkapsulasi dan media inkubasi ditambahkan manitol sebagai zat osmotikum. Hal ini dilakukan  untuk  menjaga  stabilitas tekanan  osmotik  sel  sehingga  sel  tetap viabel  dan  dapat  tumbuh  ketika dikulturkan kembali (Suryowinoto, 1989). Belum adanya penelitian enkapsulasi  pada  jeruk  JC  dan  untuk mengatasi  kendala-kendala  pada  jeruk JC,  menjadikan  penelitian  ini  perlu dilakukan dan dikembangkan sehingga, tujuan umum penelitian adalah mengetahui  komposisi  media  yang tepat  agar  eksplan  hasil  enkapsulasi memiliki  masa  simpan  yang  maksimal, dan kualitas ekspan yang baik. Kualitas eksplan  yang  baik  ditdanai  dengan lengkapnya  regenerasi  mencapai  tahap planlet.

## METODE PENELITIAN
Metode  yang  digunakan  adalah eksperimen  dengan  Rancangan  Acak Lengkap  pola  faktroial.  Terdapat  3 percobaan pada penelitian ini, yaitu :

## Percobaan pendahuluan
Terdiri dari 4 tahapan : A.  Perkecambahan  biji  JC  (Japansche Citroen)  secara  in  vitro  :  terdapat  satu faktor yaitu konsentrasi hormon Giberelin  :  1  mgL -1 ,  3  mgL -1 dan 5mgL 1 .
B. Optimasi  media  regenerasi  tunas buku jeruk JC. terdapat dua faktor yaitu media  dasar  MS  +  MT,  jenis  hormon Kin, 2iP,BAP 0.3 mgL -1
C.  Pengaruh  jenis  alginat  terhadap bentuk kapsul.
D.  Pengaruh  penambahan  jenis  dan
konsentrasi    zat  osmoregulator  pada media enkapsulasi
Percobaan  1. .. Enkapsulasi  eksplan satu  buku  tunas  jeruk  JC  (Japansche Citroen) dengan penambahan manitol Percobaan teknik enkapsulasi dilakukan  untuk  mengetahui  formulasi antara  media  alginat  dan  media inkubasi yang dapat menyimpan eksplan  selama  5  bulan.  Percobaan  ini terdiri  dari  2  faktor  dan  setiap  faktor terdiri  dari  2  taraf.  Faktor  tersebut yaitu  :  Media  Alginat  (1)  Konsentrasi manitol : 3 % dan 4%; (2) media dasar : ½  (MS  +  VMW)  dan  MS  +  VMW Media Inkubasi (1) Konsentrasi manitol: 3 % dan 4% (2) media dasar  : ½ (MS + VMW)  dan  MS  +  VMW.  Parameter yang  diamati  pada  pecobaan  adalah kualitas  eksplan.  Kualitas  ini  dibagi jadi  tiga  yaitu  jumlah  ekplan  berwarna hijau, coklat, menembus kapsul, eksplan  tumbuh  dan  waktu  awal eksplan menembus kapsul.
Percobaan  2.  Regenerasi  tanaman jeruk JC setelah penyimpanan in vitro
Regenerasi tanaman dilakukan
untuk melihat pengaruh  penyimpanan terhadap  daya  regenerasi  tanaman. Sebelum  regenerasi  pada  media  padat dilakukan  percobaan  optimasi  media dasar  (MS+VMW  dan  MT)  dengan menambahkan  zat  pengatur  tumbuh sitokinin  (Kinetin,  2iP  dan  BAP)  pada konsentrasi  0.3  mg/L.  Optimasi  media regenerasi  diamati  selama  tiga  bulan. Setelah  dilakukan  percobaan  optimasi media,  maka  dilakukan  regenerasi dengan  membuka  kapsul.  Eksplan  lalu ditanam di media regenerasi. Parameter yang  diamati  adalah  pertumbuhan eksplan  yang  meliputi  waktu  inisiasi terbentuknya tunas, jumlah daun tunas, waktu  inisiasi  akar,  jumlah  akar  dan panjang akar.
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Percobaan pendahuluan 1. Perkecambahan biji JC (Japansche Citroen) secara in  vitro :
Media  MS  +  VMW  Giberelin  1,  3 dan 5mgL -1
Perkecambahan  dilakukan  secara in vitro untuk  mendapat  tunas-tunas  steril yang akan digunakan bagian buku atau nodus untuk sumber eksplan percobaan berikutnya.
Penambahan hormon giberelin pada media dikarenakan dapat memicu pematahan masa dormansi biji dan menyebabkan perkecambahan lebih  cepat.  Berdasarkan  hasil  yang diperoleh pada tabel 5, diketahui bahwa efek  penambahan  hormon  giberelin pada  parameter  waktu  inisiasi  akar, inisiasi  tunas,  panjang  akar  dan  tinggi akar  tidak  berbeda  nyata,  tetapi penambahan  hormon  giberelin  dengan konsentrasi 3 mgL -1 merupakan perlakuan  yang  lebih  memaksimalkan perkecambahan  dibanding  perlakuan lainnya.
Tabel 1. Hasil pengamatan perkecambahan jeruk JC secara in vitro pada media dasar MS + VMW dan ditambahkan hormon Giberelin.
Hasil pengamatan  pada  parameter inisiasi  tunas  (15.78 a ±  0.618),  tinggi tunas  (6.12 b ±  0.344)  dan  panjang  akar (5.98 b ±  0.328)  juga  menunjukan  jika nilai  yang tertinggi pada media dengan penambahan hormon giberelin 3 mgL -1 . Hal ini dikarenakan waktu inisiasi akar yang  lebih  dahulu  dan  jumlah  akar yang  lebih  banyak,  sehingga  hara terserap  dengan  lebih  cepat  ke  seluruh
bagian  tanaman.  Samanhudi, (2010) menyatakan  akar  merupakan  organ vegetatif  utama  yang  memasok  air, mineral,  dan  bahan  yang  penting lainnya untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman, sehingga semakin  cepat  munculnya  akar  maka semakin cepat pula nutrisi diserap oleh tanaman.

## 2.  Optimasi  media  regenerasi  tunas buku jeruk JC
Optimasi media regenerasi
dilakukan  pada  3  jenis  sitokinin  (2iP, BAP  dan  Kinetin)  dan  2  media  dasar (MT  dan  MS+VMW).  Berdasarkan hasil  pengamatan  terihat  jika  tunas lebih dahulu muncul dibandingkan akar. Eksplan  hasil  beberapa  kombinasi media  bahkan  tidak  menghasikan  akar sehingga memiliki nilai 0. Berdasarkan hasil  pengamatan  diketahui  jika  media MS+VMW+Kin  0.3  mgL -1 merupakan media  yang  optimum  karena  mampu menghasilkan nilai tinggi terbesar pada parameter  tinggi  tunas  (4.05 a ±0.166), panjang  akar  (2.63 a ±0.263),  dan  nilai waktu inisiasi akar (32.25 b ±3.028) dan inisiasi  tunas  (6.25 a ±0.861)  tercepat serta menstimulasi pertumbuhan tanaman  menjadi  planlet  (Tabel  2), sehingga  media  ini  digunakan  untuk regenerasi  satu  buku  tunas  pada percobaan berikutnya.
Tabel 2. Regenerasi eksplan buku satu tunas jeruk JC setelah 12 MST
Kedua  media  dasar  ini  memiliki kandungan  dan  komposisi  hara  makro
dan  mikro  yang  sama,  tetapi  jumlah vitaminnya  berbeda.  Vitamin  berperan dalam  proses  pertumbuhan  sebagai katalisator  dalam  proses  metabolisme. Media  dasar  MS+VMW  memiliki kandungan vitamin dengan penambahan Biotin (Vitamin H). Biotin bekerja sebagai kofaktor enzim karboksilase. Enzim
karboksilase meliputi  asetil  Co-A  yang  membantu sinteis  asam  lemak,  propionil  Co-A karboksilase  untuk  metabolisme  asam amino  (Hildebrdan et  al. ,  2005). Penelitian  pada  kultur  jeruk  keprok ( Citrus  nobilis )  menunjukkan  biotin secara signifikan mempengaruhi koenzim bagi  piruvat  karboksilase, salah  satu  jenis  enzim  yang  berperan dalam metabolisme energi (Aini, 2012).
3.  Pengaruh  jenis  alginat  terhadap bentuk kapsul
Berdasarkan
hasil diketahui penambahan 3% (30 gL -1 )  alginat pada media menghasilkan 100% kapsul bulat pada  media  alginat  kepadatan  tinggi ( high  viscocity )  dan  0%  kapsul  bulat pada  media  alginat  kepadatan  rendah ( low viscocity ) tidak dapat menghasilkan  kapsul  bulat  (Gambar
16).  Bentuk  bulat  terjadi  karena molekul natrium pada alginat digantikan dengan kalsium saat
perendaman  pada  kalsium  klorida sehingga  membentuk  sol  kalsium alginat.
(a) Skoring 0        (b) Skoring 1 Gambar 16. .. Kategori skoring bentuk  kapsul alginat. (a) Skoring 0, kapsul  tidak  bulat  sempurna  (b) Skoring 1, kapsul bulat sempurna
Prakash et  al. ,  (2004),  menyatakan bahwa  perbandingan  yang  bervariasi
dari  ketiga  segmen  residu  asam  pada alginat  menyebabkan  perbedaan  sifat produk yang dihasilkan. Alginat dengan  kandungan  asam  guluronat tinggi  akan  mempunyai  struktur  yang kaku (rigid) serta mempunyai porositas yang besar, sedangkan yang mengandung  asam  mannuronat  tinggi mempunyai struktur yang kenyal (Morris et al. ,1978).
4.  Pengaruh penambahan  jenis  dan konsentrasi  zat  osmoregulator  pada media enkapsulasi
Hasil  pengamatan  pada  eksplan terlihat  jika  presentase  eksplan  tetap hijau  terbesar  ada  pada  kombinasi (Ma)Manitol-(Mi)Manitol  dan  (Ma) Sukrosa-(Mi)Manitol dengan nilai 68.08  dan  65.36.  Presentase  eksplan hijau terkecil pada (Ma)sukrosa- (Mi)Sukrosa dengan nilai 24.76.
Pemberian  manitol  dengan  beberapa konsentrasi  yang  berbeda  pada  media menyebabkan terjadinya cekaman osmotik  yang  berbeda  pula.  Menurut Hendaryono  dan  Wijayani  (1994), cekaman  osmotik  dapat  menyebabkan potensial  osmotik  medium  rendah sehingga  sel  sedikit  mendapatkan  air. Manitol dapat berfungsi sebagai sumber  karbon  dan  regulator  osmotik. Sebagai  sumber  karbon,  manitol  dapat mendukung pertumbuhan kultur,
namun  sebagai  regulator  osmotik, manitol dapat meningkatkan osmolaritas media atau potensial osmotik  media  sehingga  nutrisi  yang mengalir  ke  dalam  jaringan  tanaman berjalan  lambat.  Lambatnya  aliran nutrisi  tersebut  dapat  menyebabkan penghambatan  terhadap  pertumbuhan kultur (Roostika et al. , 2008).
Gambar 2. Rerata kondisi eksplan pada berbagai kombinasi zat osmoregulator
B.  Enkapsulasi  eksplan  satu  buku tunas  jeruk  JC  (Japansche  Citroen) dengan penambahan manitol
Berdasarkan hasil skoring pada tabel
7 diketahui ada dua perlakuan enkapsulasi  yang  dapat  menyimpan eksplan  selama  5  bulan tanpa  merubah kondisi  eksplan  (eksplan  tetap  hijau). Perlakuan  pertama  adalah  Manitol  3%
(Ma) ½  Manitol  3%  (Mi)  dan perlakuan  kedua  adalah  Manitol  4%
(Ma) ½  Manitol  4%  (Mi).  Kedua
perlakuan  ini  memiliki  rerata  nilai skoring  (1.00 a ±  0.000)  yang  artinya kondisi  semua eksplan yang ada dalam perlakuan  adalah  hijau.  Eksplan  tidak mengalami  pertumbuhan  dan  tetap hijau  mungkin  dikarenakan  media masih  menyediakan  hara  dan  air  untuk eksplan tapi tidak cukup untuk pertumbuhan. Aslani (1996), menyatakan  bahwa  alginat  merupakan hidrogel  yang  mengandung  85  %  air.
Air  tersebut  rentan  terhadap  distorsi yang terkait dengan imbibisi (penyerapan  air)  atau  dengan  sineresis (penguapan air). Tendensi perkembangan  eksplan  setelah  5  bulan masa  penyimpanan  adalah  mengalami penurunan. Hal ini dikarenakan semakin
lama eksplan hasil penyimpanan  dan  enkapsulasi  semakin
banyak  mengalami  pecoklatan  atau klorosis
Tabel 3. Skoring kualitas kapsul setelah masa penyimpanan selama 5 bulan
C. Regenerasi eksplan hasil

## enkapsulasi dan penyimpanan
Berdasarkan  pengamatan  diketahui bahwa eksplan yang dienkapsulasi pada media  alginat  (Ma)  ½  M3%  dan  ½ M4%  tidak  mengalami  regenerasi.  Hal ini dikarenakan saat disubkultur eksplan  telah  mengalami  pencoklatan. Roostika  (2004)  juga  melaporkan bahwa  pencoklatan  jaringan  sangat menurunkan  regenerasi  secara  in  vitro dari  kultur  melalui  jalur  organogenesis pada beberapa tanaman berkayu.
Regenerasi  terjadi  pada  eksplan yang  dibungkus  media  alginat  (Ma) M3%  dan  M4%.  Pengamatan  terhadap parameter  waktu  inisiasi  tunas  eksplan hasil  enkapsulasi  dan  penyimpanan berbeda sacara sangat signifikan dengan  eksplan  kontrol.  eksplan  hasil enkapsulasi dan penyimpanan membutuhkan  waktu  lebih dari  30 hari untuk  inisiasi,  sedangkan  eksplan kontrol  hanya  membutuhkan  waktu rerata  6.25  hari.  Waktu  inisiasi  akar eksplan hasil enkapsulasi membutuhkan waktu lebih dari 50 hari, eksplan  kontrol  hanya  membutuhkan waktu  rerata  35.83  hari.  Perbedaan waktu  inisiasi  eksplan  terjadi  karena penyesuaian  metabolisme  karbohidrat. Perlakuan enkapsulasi dan penyimpanan  menggunakan  manitol
sebagai  sumber  karbohidrat  sedangkan pada media regenerasi sumber karbohidratnya adalah sukrosa. Peristiwa ini dikenal dengan nama efek residu. Penelitian pada tanaman porwoceng (Pimpinella pruatjan) menunjukan bahwa
pemberian osmoregulator  yang  cukup  tinggi,
membuat pertumbuhan menjadi abnormal (Roostika et al., 2009).
Tabel 4. Regenerasi buku tunas jeruk JC hasil enkapsulasi pada usia tiga bulan
setelah masa penyimpanan

## KESIMPULAN
Kombinasi  media  M3%  (Ma) ½
Manitol 3% (Mi) dan Manitol 4% (Ma) ½ Manitol 4% (Mi) dapat menyimpan  eksplan tanaman  jeruk  Japansche  Citroen  (JC) selama  lima  bulan  dengan  skoring  kualitas 1.00 a ±  0.000  yang artinya  kondisi  eksplan semua hijau.
Media  pertumbuhan  yang  cocok  untuk regenerasi  potongan  buku  jeruk  JC  adalah MS+VMW+Kin  0.3  mgL -1 .  Tidak  terdapat perbedaan  nyata  nilai  regenerasi  eksplan hasil enkapsulasi dan penyimpanan terhadap eksplan  kontrol.  Eksplan  hasil  enkapsulasi dan penyimpanan menjadi normal setelah 12 MST masa pertumbuhan

## DAFTAR PUSTAKA
Aini, O., K.  Quesenberry,  M.  Gallo,  2012. Photoperiod affects in vitro flowering in wild peanut Arachis  paraguariensis .
American Journal of Plant Sciences. 3(5): 567- 571.
Aslani P dan Ross AK. 1996. Diffusion in alginate gel. Effec of cross linking with calcium or zinc ions in diffusion acetamnophem , controed release 42: 75-82.
Budiarti D, Setyohadi, Sumarno. 2013.
Uji efektivitas ekstrak etanol kulit buah jeruk purut (Citrus hystrix D.C.) sebagai antibakteri terhadap Streptococcus mutans secara in vitro . hlm 1 8.
Hildebrdan, D.F. YU, C.K. McCracken dan S.S. Rao. 2005. Fatty acid manipulation In Plant Lipids: Biology, Utilisation dan Mamipulation .  (D.J.  Murphy  (Ed)
Blackwell Publishing. Jayanti, D. A. M, Agus S, Moch. Roviq, dan Moch.  Dawam  M.  2015.
Kompatibilitas Tujuh Variwtas
Calon  Interstock Tanaman  Jeruk pada  Batang  Bawah Japansche
Citroen  (JC) . Jurnal  Produksi Tanaman . 5 (5).
Leunufna, S. 2004. Improvement of the
in vitro maintenance dan cryopreservation of yams ( Dioscorea spp.).  Martin  Luther
Universitat
Halle-Wittenberg.
Berlin.  1.  20  p.  [Dissertation]. Mariska, I.,
Suwarno, dan Djoko S. Damardjati. 1996. Pengembangan konservasi in vitro sebagai salah satu  bentuk pelestarian plasma nutfah di dalam bank gen. Seminar Penyusunan Konsep Pelestarian Ex Situ Plasma Nutfah Pertanian. f, 18 Desember 1996. Bogor : Balitbio. Pusdatin [Pusat data dan sistem informasi pertanian]. 2015. Outlook jeruk, komodias pertanian subsektor hortkultura jeruk. Jakarta: Direktorat Jenderal  Hortikultura.
ISSN 1907-1507. Hlm 78.
Roostika I., Purnamaninsih R., dan Darwati. 2009. in vitro preservation of Pruatjan ( Pimpinella pruatjan
Molk.) using dilution paclobutrazo. AgroBiogen . 15(2): 84 90. Suryowinoto, M. 1989. Fusi protoplas. Yogyakarta : PAU Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada. hlm.3-301, 03-260. Suryowinoto,  M. 2000.
Petunjuk laboratorium, pemuliaan tanaman secarain vitro.  Yogyakarta :
PAU Universitas Gadjah Mada. hlm. 213-234, 269-294.
Suryowinoto, M. 1996. Prospek kultur jaringan dalam per-kembangan pertanian modern. Yogyakarta :
Universitas  Gadjah  Mada.  hlm.  2-1. Towill, L.E. dan R.L. Jarret. 1992.
Cryopreservation of sweet potato ( Ipomoea batatas [L.] Lam.) shoot by vitrification. Plant Cell Rep . 11:175- 178.
.