BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 1, Nomor 2 (2019): 36-43 E-ISSN: 2714-8564
Penggunaan Marka RAPD Sebagai Penduga untuk Membedakan Jenis Kelamin pada Kantung Semar Nepenthes gymnamphora Koleksi Kebun Raya Baturraden
Dini Rizki Pertiwi*, Murni Dwiati, Agus Hery Susanto
Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto Jalan dr. Soeparno 63 Purwokerto 53122 *Email: drizkipertiwi@gmail.com
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 28/08/2019
Disetujui  : 30/10/2019

## Abstract
Nepenthes gymnamphora is an endemic pitcher plant species in Java Island and one of the plant collections  of  Baturraden  Botanical  Garden. N.  gymnamphora is  a  dioecious  plant  but  its  sex cannot be identified during its vegetative development. Conservating this plant would therefore run in a more efficient way when sex’s type have already been identified earlier which tend to effective  development  of  particular  sexes.  Random  Amplified  Polymorphic  DNA  (RAPD) technique  is  one  molecular  approach  that  can  be  employed  in  early  identification  of N. gymnamphora sex.  The  aims  of  this  study  are  to  assess  whether  there  is  difference  of  RAPD patterns  between  male  and  female N.  gymnamphora and  to  find  out  how  the  difference  is. Explorative  method  was  applied  to  this  study  involving  five N.  gymnamphora individuals  of Baturaden  Botanical  Garden  collection  of  different  sexes  as  samples.  Genomic  DNAs  were extracted  from  the  second  leaf  of  each  of  the  five  samples  (two  males,  two  females  and  one individual of unknown sex) and  then used as templates to amplify RAPD markers. Five random primers  were  used  in  the  amplification,  i.e.  OPK-16,  OPP-15,  OPA-15,  OPP-08,  and  OPD-20. Two  primers,  i.e.  OPP-08  (5’-ACATCGCCA-3’)  and  OPD-20  (5’-ACTTCGGCCAC-3’), produced  RAPD  bands  of  approximately  300  bp  in  males  and  sexually  unknown  individual. These bands did not appear in females, so that it can be presumably related to sex determination genes in N. gymnamphora. Primer OPP-08 also produced RAPD bands of approximately 250 bp in  females  individual.  These  bands  did  not  appear  in  males,  so  it  can  be  presumably  related  to sex determination genes in N. gymnamphora. Keywords : Nepenthes gymnamphora , RAPD, sex

## Abstrak
Nepenthes  gymnamphora merupakan  spesies  kantung  semar  endemik  di  Pulau  Jawa  dan  salah satu  koleksi  tumbuhan  di  Kebun  Raya  Baturraden. N.  gymnamphora merupakan  tumbuhan dioecious dan  jenis  kelaminnya  tidak  dapat  dibedakan  pada  masa  vegetatif.  Apabila  jenis kelamin  tanaman  tersebut  dapat  diketahui  secara  dini,  maka  upaya  konservasi  dapat  dilakukan dengan  lebih  efisien  karena  pengembangan  jenis  kelamin  tertentu  dapat  dilakukan  secara  dini. Salah  satu pendekatan  yang  dapat  dilakukan  dalam  identifikasi  jenis  kelamin N.  gymnamphora adalah  penggunaan  marka Random  Amplified  Polymorphic  DNA (RAPD).  Penelitian  ini bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan pola RAPD antara N. gymnamphora jantan dan  betina,  serta  mengetahui  bagaimana  perbedaan  pola  RAPD  tesebut.  Penelitian  dilakukan secara  eksploratif  dengan  melibatkan  lima  individu N.  gymnamphora koleksi  Kebun  Raya Baturraden dari jenis kelamin yang berbeda sebagai sampel. DNA genomik diekstraksi dari daun ke  dua  pada  kelima  sampel  tersebut  (dua  jantan,  dua  betina,  dan  satu  sampel  yang  belum diketahui  jenis  kelaminnya).  Selanjutnya,  DNA  genomik  ini  digunakan  sebagai  templat  untuk amplifikasi  marka  RAPD.  Sebanyak  lima  macam  primer  acak  digunakan  untuk  amplifikasi marka  tersebut,  yaitu  OPK-16,  OPP-15,  OPA-15,  OPP-08,  dan  OPD-20.  Hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  dua  primer,  yaitu  OPP-08  (5’-ACATCGCCCA-3’)  dan  OPD-20  (5’- ACTTCGCCAC-3’),  menghasilkan  pita  RAPD  berukuran  kurang  lebih  300  pb,  yang  spesifik terdapat pada individu jantan dan individu yang belum diketahui jenis kelaminnya. Pada individu betina tidak dihasilkan pita tersebut sehingga dapat diduga bahwa pita RAPD tersebut berkaitan dengan  gen-gen  penentu  jenis  kelamin  pada N.  gymnamphora .  Primer  OPP-08  juga menghasilkan  pita  RAPD  berukuran  kurang  lebih  250 pb,  yang  spesifik  terdapat  pada  individu betina.  Pita  tersebut  tidak  terlihat  pada    individu  jantan,  sehingga  dapat  diduga  pita  tersebut terkait dengan gen-gen penentu jenis kelamin pada N. gymnamphora. Kata kunci : Nepenthes gymnamphora , RAPD, jenis kelamin

## PENDAHULUAN
Nepenthes  gymnamphora merupakan  salah satu  spesies  tumbuhan  tropis  yang  hidup  pada ketinggian  lebih  dari  900  meter  di  atas  permukaan laut  (mdpl).  Habitatnya  berada  di  hutan  dataran tinggi  yang  miskin  nutrisi  (Cheek  dan  Jebb,  2001). N. gymnamphora digolongkan sebagai spesies  yang dilindungi  menurut  Undang-Undang  Nomor  5 Tahun  1990  tentang  Konservasi  Sumber  Daya Hayati  dan  Ekosistemnya,  Peraturan  Pemerintah Nomor  7  Tahun  1999  tentang  Pengawetan  Jenis Tumbuhan  dan  Satwa,  dan  Peraturan  Pemerintah Nomor  8  Tahun  1999  tentang  Pemanfaatan  Jenis Tumbuhan  dan  Satwa  (Mansur,  2006).  Oleh  karena itu, diperlukan upaya konservasi, baik secara in situ maupun ex  situ untuk  mencegah  spesies  ini  dari kepunahan.
Saat  ini N.  gymnamphora menjadi  salah  satu koleksi tumbuhan di Kebun Raya Baturraden (KRB) yang  terletak  di  kawasan  lereng  selatan  Gunung Slamet,  Jawa  Tengah,  Indonesia.  KRB  merupakan salah  satu  kawasan  konservasi ex-situ yang melindungi  berbagai  spesies  tumbuhan  khas pegunungan  Jawa.  Lokasi  KRB  berada  di  Desa Kemutug  Lor,  Kecamatan  Baturraden,  Kabupaten Banyumas dengan luas area mencapai 143,5 hektar. Seiring  dengan  berjalannya  waktu,  KRB  terus berkembang  untuk  melindungi  spesies-spesies tumbuhan  yang terdapat di dalamnya (Mandiriati et al., 2016).
Upaya  perlindungan  spesies  secara ex  situ antara lain dapat didukung dengan identifikasi jenis kelamin (Scharmann et al ., 2017). N. gymnamphora diketahui  merupakan  tumbuhan dioecious atau memiliki bunga jantan dan betina yang terpisah pada individu  yang  berbeda  (Mansur,  2006).  Sehingga pada  fase  vegetatif  jenis  kelamin  ini  tidak  dapat ditentukan  dengan  metode  identifikasi  morfologi. Oleh  karena  itu,  diperlukan  upaya  identifikasi  jenis kelamin  secara  dini  agar  dapat  terbentuk  populasi dengan  jenis  kelamin  tertentu  secara  efisien  karena pengembangan jenis kelamin tertentu dapat dilakukan secara dini (Parjanto et al ., 2006).
Identifikasi jenis kelamin berdasarkan penanda nonmorfologi  dapat  dilakukan  secara  molekuler dengan menggunakan penanda atau marka ( marker ) tertentu.  Salah  satu  marka  tersebut  dapat  berupa Random  Amplified  Polymorphic  DNA (RAPD) (Parjanto et  al .,  2006).  Keuntungan  penggunaan marka RAPD adalah dapat menunjukkan polimorfisme DNA dengan probabilitas  yang tinggi tanpa  harus  mengetahui  sekuen  DNA  dari  sampel (Zhou et al ., 2018). Selain  itu,  karakterisasi dengan marka  ini  juga  hanya  memerlukan  kuantitas  DNA yang sedikit (Bhau et al., 2009).
Marka  RAPD  dapat  mendeteksi  polimorfisme ruas  nukleotida  pada  DNA  dengan  menggunakan sebuah  primer  tunggal  yang  memiliki  rangkaian nukleotida  acak.  Primer  akan  menempel  pada beberapa  tempat  berbeda  secara  acak  pada  DNA
genomik.  Masing-masing  primer  umumnya  akan mengamplifikasi  beberapa  fragmen  DNA  yang ditempelinya  (Williams et  al .,  1990).  Variasi  pola pita yang  terbentuk dapat  dianalisis untuk menentukan  pita  spesifik  yang  menunjukkan  suatu jenis kelamin (Zhou et al ., 2018).
Berdasarkan  uraian  tersebut  di  atas  dapat dirumuskan  permasalahan  sebagai  berikut:  1) apakah  terdapat  perbedaan  pola  pita  RAPD  antara N.  gymnamphora jantan  dan  betina,  dan  2) bagaimana  perbedaan  pola  pita  RAPD  antara N. gymnamphora jantan  dan  betina.  Berdasarkan rumusan  masalah  tersebut,  penelitian  ini  bertujuan untuk  mengetahui:  1)  ada  tidaknya  perbedaan  pola pita  RAPD  antara N.  gymnamphora jantan  dan betina, dan 2) bagaimana perbedaan pola pita RAPD antara N. gymnamphora jantan dan betina.

## MATERI DAN METODE
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Genetika dan Molekuler Fakultas Biologi Universitas  Jenderal  Soedirman  dari  bulan  Januari hingga  Juni  2019.  Penelitian  terdiri  atas  tiga  tahap, yaitu ekstraksi DNA genomik N. gymnamphora, uji kualitas  dan  kuantitas  DNA  genomik,  dan amplifikasi marka RAPD. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan  metode  CTAB (Cetyl  Trimethyl Ammonium  Bromide) menurut  Doyle  dan  Doyle (1990)  dengan  modifikasi.  Pengujian  kualitas  DNA genomik  dilakukan  dengan  langkah  elektroforesis gel  agarosa  1,5%  dalam  larutan buffer TBE  1x .
Running elektroforesis  dilakukan  selama  50  menit pada  tegangan  80  V  dan  kuat  arus  400  mA. Pengujian  kuantitas  DNA  genomik  dilakukan menggunakan NanoDrop spectrophotometer . Amplifikasi  marka  RAPD  dilakukan  dengan teknik  PCR.  Reaksi  PCR  RAPD  dilakukan menggunakan  12,25  µl  volume  larutan  yang  terdiri atas nuclease  free  water 5,25  µl,  primer  RAPD masing-masing 1 µl (10 pmol), KAPA Taq PCR Kits 5  µl,  dan  1  µl  DNA  cetakan  (50  ng/µl).  PCR dilakukan  menggunakan  5  macam  primer  yang sekuennya  dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Pengaturan suhu  kondisi  PCR  adalah  i)  pra-denaturasi  pada suhu 95 o C selama 3  menit, ii) denaturasi pada suhu 95 o C  selama  30  detik, annealing pada  suhu  30 o C selama 1 menit, dan ekstensi pada suhu 72 o C selama 1 menit 30 detik yang dilakukan sebanyak 35 siklus, iii) ekstensi akhir pada suhu 72 o C selama 10 menit. Hasil PCR kemudian dimigrasikan pada elektroforesis gel agarosa 1,5% dalam larutan buffer TBE  1x.  Fragmen  DNA  yang  terbentuk  kemudian didokumentasikan  menggunakan  paparan  pada UV transilluminator.
Analisis  data  profil  pita  RAPD  dilakukan secara  deskriptif.  Profil  pita  RAPD  untuk  masing- masing  primer  dianalisis  secara  terpisah  pada masing-masing  jenis  kelamin.  Pita  yang  hanya muncul  pada  salah  satu  jenis  kelamin  dapat digunakan sebagai penduga jenis kelamin.

## Tabel 1. Primer yang digunakan
Primer Sekuens (5’-3’) Keterangan OPK-16 5’-GAGCGTCGAA-3’ Penanda Nepenthes ampullaria ♂ OPP-15 5’-GGAAGCCAAC-3’ Penanda Nepenthes mirabilis ♀ OPA-15 5’-TTCCGAACCC-3’ Penanda Nepenthes mirabilis ♂ OPP-08 5’-ACATCGCCCA-3’ Penanda Salacca zalacca ♂ OPD-20 5’-ACTTCGCCAC-3’ Penanda Hippophae rhamnoides ♂

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi DNA Genomik N. gymnamphora
Hasil ekstraksi DNA genomik secara kualitatif dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  Secara  kualitatif, semua DNA sampel memperlihatkan pita yang jelas meskipun ada sedikit smear . Menurut Murtiyaningsih  (2017), smear pada  hasil  isolasi DNA dapat disebabkan oleh kontaminasi RNA yang memiliki  ukuran  lebih  rendah  daripada  DaNA genom (kurang dari 250 pb).
Gambar  1. Elektroforegram  DNA  Genomik N. gymnamphora Koleksi  Kebun  Raya  Baturraden  (M  = DNA ladder ,  J1  = N.  gymnamphora ♂  1,  J2  = N. gymnamphora ♂ 2, B1 = N. gymnamphora ♀ 1, B2 = N. gymnamphora ♀ 2, X = N. gymnamphora belum diketahui jenis kelaminnya)
Pengukuran DNA genomik dilakukan menggunakan NanoDrop  spectrophotometer untuk melihat  kemurnian  dan  konsentrasinya.  Hasil pengukuran kuantitas DNA genomik N. gymnamphora koleksi  Kebun  Raya  Baturraden dapat dilihat pada Tabel 2.  Secara kuantitatif semua DNA sampel menunjukkan tingkat kemurnian DNA yang  berkisar  dari  1,897  hingga  2,034  pada  rasio absorbansi 260 nm/ 280 nm dan 1,275 hingga 1,959 pada  rasio  absorbansi  260  nm/  230  nm.  Menurut Arruda et al. (2017), DNA genomik yang baik untuk digunakan  sebagai  DNA template PCR  memiliki tingkat kemurnian dari kontaminasi protein
(Ǻ260/Ǻ280)  sebesar  1,8  hingga  2,0  dan kontaminasi  karbohidrat  (Ǻ260/Ǻ230)  tidak  lebih dari  2,0.   Data  pada Tabel  4.1  menunjukkan  bahwa keseluruhan  DNA  genomik  hasil  ekstraksi  masih berada  dalam  rentang  murni  walaupun  tingkat kemurnian dari kontaminasi protein pada sampel B1 sedikit melebihi batas 2,0. Sementara itu, konsentrasi  DNA  genomik  yang  diperoleh  berkisar dari  107  hingga  242  ng/µL.  Menurut  Dhatterwal et al. (2017),  konsentrasi  DNA  sebagai template PCR sebaiknya berkisar  sekitar 50  hingga 60  ng/µL. Hal ini  menandakan  konsentrasi  DNA  yang  diperoleh masih  di  atas  konsentrasi  yang  dibutuhkan  untuk PCR  dan  bisa  dilakukan  pengenceran  sebelum digunakan sebagai template. Secara umum, berdasarkan data hasil uji kualitatif dan kuantitatif di atas, DNA genomik yang diperoleh dapat digunakan sebagai template PCR untuk mengamplifikasi marka RAPD.
Tabel 2. Hasil uji kuantitas DNA genomik N. gymnamphora koleksi Kebun Raya Baturraden

## Amplifikasi Marka RAPD
Kelima primer oligonukleotida yang digunakan berhasil memperbanyak marka RAPD pada Nepenthes  gymnamphora .  Hal  ini  menunjukkan bahwa  kelima primer tersebut  memiliki urutan basa nukleotida  yang  komplementer  dengan  kedua  untai DNA  genomik  (Weaver,  2012).  Elektroforegram hasil PCR RAPD beserta interpretasi hasilnya dapat dilihat pada Gambar 4.2 hingga 4.11.
Gambar 2. Elektroforegram PCR RAPD N.gymnamphora koleksi  Kebun  Raya  Baturraden  menggunakan  primer OPK-16 (M = DNA ladder , J1 = N. gymnamphora ♂ 1, J2 = N. gymnamphora ♂ 2, B1 = N. gymnamphora ♀ 1, B2 = N.  gymnamphora ♀  2,  X  = N.  gymnamphora belum diketahui jenis kelaminnya)
Nama Sampel Ǻ260/Ǻ280 Ǻ260/Ǻ230 Konsentrasi (ng/µL) J1 1,954 1,275 107 J2 1,897 1,415 193 B1 2,034 1,959 238 B2 1,940 1,314 161 X 1,984 1,445 242
Amplifikasi marka RAPD pada DNA genomik N.  gymnamphora koleksi  Kebun  Raya  Baturraden dengan primer OPK-16  menghasilkan 30 pita DNA dengan  6  pola  (Gambar  2).  Seluruh  pita  tersebut bersifat  monomorfik  dengan  ukuran  sekitar  200  pb, 300 pb, 400 pb, 500 pb, 700 pb, dan 800 pb. Primer ini  tidak  berhasil  mendapatkan  pita  spesifik  yang dapat  membedakan  individu  jantan  dengan  betina.
Hasil ini berbeda dengan penelitian Enjelina (2011) yang dapat mengamplifikasi fragmen DNA berukuran 400 pb, 500 pb, dan 850 pb yang spesifik pada N.  ampullaria jantan  menggunakan  primer OPK-16.  Primer  ini  juga  dapat  mengamplifikasi fragmen  DNA  spesifik  pada N.  adrianii betina dengan ukuran 290 pb (Aziiza, 2018).
Gambar  3. Elektroforegram  dan  interpretasi  hasil  PCR  RAPD N.  gymnamphora koleksi  Kebun  Raya  Baturraden menggunakan  primer  OPP-15  (M  =  DNA ladder ,  J1  = N.  gymnamphora ♂  1,  J2  = N.  gymnamphora ♂  2,  B1  = N. gymnamphora ♀ 1, B2 = N. gymnamphora ♀ 2, X = N. gymnamphora belum diketahui jenis kelaminnya)
Amplifikasi marka RAPD pada DNA genomik N.  gymnamphora koleksi  Kebun  Raya  Baturraden dengan primer OPP-15  menghasilkan 20 pita DNA dengan 4 pola (Gambar 3). Pola pita tersebut terdiri atas ukuran sekitar 500 pb, 700 pb, 800 pb, dan 900 pb.  Seluruh  pita  tersebut  bersifat  monomorfik. Primer  ini  tidak  berhasil  mendapatkan  pita  spesifik
yang  dapat  membedakan  individu  jantan  dengan betina. Hasil ini berbeda dengan penelitian Enjelina (2011)  yang  dapat  mengamplifikasi  fragmen  DNA berukuran  650  pb  yang  spesifik  pada N.  mirabilis betina menggunakan primer OPP-15.
Gambar  4. Elektroforegram  dan  interpretasi  hasil  PCR  RAPD N.  gymnamphora koleksi  Kebun  Raya  Baturraden menggunakan  primer  OPA-15  (M  =  DNA ladder ,  J1  = N.  gymnamphora ♂  1,  J2  = N.  gymnamphora ♂  2,  B1  = N. gymnamphora ♀ 1, B2 = N. gymnamphora ♀ 2, X = N. gymnamphora belum diketahui jenis kelaminnya)
Primer  OPA-15  berhasil  mengamplifikasi marka RAPD pada DNA genomik N. gymnamphora koleksi  Kebun  Raya  Baturraden    sebanyak  12  pita DNA dengan 4 pola (Gambar 4). Pola pita ini terdiri atas  ukuran  sekitar  600  pb,  700  pb,  1.000  pb,  dan lebih  dari  1.000  pb.  Terdapat  dua  kelompok  pita, yaitu  pita  monomorfik  dan  pita  polimorfik.  Pita monomorfik  berukuran  sekitar  1.000  pb  dan  lebih
dari  1.000  pb.  Pita  polimorfik  hasil  amplifikasi dengan  primer  OPA-15  juga  tidak  berhasil membedakan  individu  jantan  dengan  betina.  Hasil ini  berbeda  dengan  penelitian  Mokkamul et  al.
(2007)  yang  berhasil  memperoleh  fragmen  DNA spesifik  berukuran  750  pb  pada N.  gracilis dan N. mirabilis jantan menggunakan primer OPA-15.
Gambar  5. Elektroforegram  dan  interpretasi  hasil  PCR  RAPD N.  gymnamphora koleksi  Kebun  Raya  Baturraden menggunakan  primer  OPP-08  (M  =  DNA ladder ,  J1  = N.  gymnamphora ♂  1,  J2  = N.  gymnamphora ♂  2,  B1  = N. gymnamphora ♀ 1, B2 = N. gymnamphora ♀ 2, X = N. gymnamphora belum diketahui jenis kelaminnya)
Amplifikasi marka RAPD menggunakan primer  OPP-08  menghasilkan  33  pita  DNA  dengan 9  pola  (Gambar  5).  Ukuran  pita-pita  tersebut bervariasi,  mulai  dari  sekitar  200  pb,  250  pb,  300 pb, 400 pb, lebih dari 400 pb, 500 pb, 600 pb, lebih dari 800 pb hingga 1.000 pb. Kedua gambar di atas menunjukkan  bahwa  primer  OPP-08  menghasilkan pita  DNA  spesifik  berukuran  kurang  lebih  300  pb pada  fragmen  DNA  individu-individu  jantan.  Pita ini  tidak  terlihat  pada  individu-individu  betina. Sementara  itu,  pita  berukuran  sekitar  300  pb tersebut  juga  dijumpai  pada  individu  yang  belum diketahui  jenis  kelaminnya.  Namun,  terdapat  pula pita  berukuran  kurang  lebih  250  pb  pada  individu betina, yang tidak muncul baik pada individu jantan maupun  pada  individu  yang  belum  diketahui  jenis kelaminnya.
Berdasarkan  hasil  amplifikasi  pita  300  pb menggunakan  primer  OPP-08  dapat  diperkirakan bahwa  pita  tersebut  berkaitan  dengan  gen-gen penentu jenis kelamin jantan pada N. gymnamphora .
Selain  itu,  munculnya  pita  300  pb  pada  sampel individu  yang  belum  diketahui  jenis  kelaminnya mengindikasikan  bahwa  individu  ini  cenderung berjenis kelamin jantan. Dugaan bahwa individu ini cenderung  berjenis  kelamin  jantan  didukung  oleh ketidakmunculan  pita  250  pb  yang  hanya  dijumpai pada  individu  betina.  Pita  250  pb  ini  dapat  diduga berkaitan  dengan  gen-gen  penentu  jenis  kelamin betina  pada N.  gymnamphora .  Menurut  Parjanto et al. (2006), primer OPP-08 dilaporkan telah berhasil mengamplifikasi  pita  DNA  spesifik  jenis  kelamin jantan  pada Salacca  zalacca dengan  ukuran  sekitar 400 pb .
Gambar  6. Elektroforegram  dan  interpretasi  hasil  PCR  RAPD N.  gymnamphora koleksi  Kebun  Raya  Baturraden menggunakan  primer  OPD-20  (M  =  DNA ladder ,  J1  = N.  gymnamphora ♂  1,  J2  = N.  gymnamphora ♂  2,  B1  = N. gymnamphora ♀ 1, B2 = N. gymnamphora ♀ 2, X = N. gymnamphora belum diketahui jenis kelaminnya)
Marka  RAPD  berhasil  diamplifikasi  dengan primer  OPD-20    yang  terdiri  atas  23  pita  DNA dengan 5 pola (Gambar 6). Ukuran pita-pita tersebut bervariasi,  mulai dari sekitar  300 pb, lebih dari 500 pb,  lebih  dari  600  pb,  800  pb,  dan  900  pb.  Kedua gambar di atas menunjukkan bahwa primer OPD-20 menghasilkan  pita  DNA  spesifik  berukuran  kurang lebih  300  pb  pada  individu-individu  jantan,  yang tidak  terlihat  pada  individu-individu  betina.  Seperti halnya  pada  primer  OPP-08, pita  spesifik  jantan  ini teramplifikasi  juga  oleh  primer  OPD-20  pada individu yang belum diketahui jenis kelaminnya.
Berdasarkan  hasil  tersebut  dapat  diperkirakan bahwa  pita  DNA  spesifik  berukuran  kurang  lebih 300  pb  tersebut  berkaitan  dengan  gen-gen  penentu jenis  kelamin  jantan  pada N.  gymnamphora .  Oleh karena  pita  DNA  spesifik  ini  terdapat  pula  pada individu  yang  belum  diketahui  jenis  kelaminnya, maka  individu  ini  diduga  memiliki  jenis  kelamin jantan.  Primer  OPD-20  diketahui  telah  berhasil mengamplifikasi  pita  DNA  spesifik  jenis  kelamin jantan  pada Hippophae  rhamnoides dengan  ukuran sekitar  911  pb  (Sharma et  al., 2010)  dan  pita  DNA spesifik  jenis  kelamin  betina  pada Encephalartos natalensis dengan  ukuran  sekitar  850  pb  (Prakash dan van Staden, 2006).
Primer OPP-08 merupakan primer yang paling banyak mengamplifikasi marka RAPD N. gymnamphora ,  yaitu  sebanyak  sembilan  pita. Sementara  itu,  primer  OPP-15  dan  OPK-16 mengamplifikasi  marka  RAPD N.  gymnamphora dengan jumlah yang sama, masing-masing sebanyak empat  pita.  Secara  keseluruhan,  ukuran  pita  yang teramplifikasi  dari  sampel N.  gymnamphora berkisar  dari  200  pb  hingga  lebih  dari  1000  pb. Mayangsari et al. (2017) melaporkan bahwa ukuran pita RAPD pada berbagai spesies Nepenthes koleksi Kebun Raya Baturraden berkisar dari 130 pb hingga 1.500  pb.  Perbedaan  pola  pita  yang  teramplifikasi
disebabkan oleh perbedaan situs penempelan primer (Gusmiaty et  al. ,  2012).  Pola  pita  RAPD  yang dihasilkan  juga  dapat  disebabkan  oleh  ukuran primer  yang  pendek  (sekitar  10  pb)  sehingga  situs penempelannya dapat sangat bervariasi (Korpelainen et al., 2008).

## Penggunaan  Marka  RAPD  sebagai  Pembeda Jenis Kelamin
Pita RAPD berukuran 300 pb hasil amplifikasi dengan  primer  OPP-08  dan  OPD-20  dapat digunakan  sebagai  pembeda  jens  kelamin  pada N. gymnamphora .  Demikian  pula,  pita  ini  dapat digunakan  untuk  menduga  jenis  kelamin N. gymnamphora yang belum diketahui. Parjanto et al.
(2006)  mengatakan  bahwa  penggunaan  marka RAPD sebagai pembeda jenis kelamin N. gymnamphora dapat  dilakukan  pada  individu  yang belum  memasuki  masa  reproduktif.  Menurut  Avise (1994),  karakter  molekuler  yang  terdapat  di  dalam marka  molekuler  memiliki  keistimewaan,  yaitu marka tidak terpengaruh oleh faktor lingkungan dan tahap pertumbuhan sehingga dapat menggambarkan struktur genetik yang terdapat di dalam satu spesies. Walaupun mekanisme penentuan jenis kelamin pada Nepenthes belum  diketahui  secara  pasti,  belum terdapat  laporan  tentang  ada  tidaknya  perubahan jenis kelamin Nepenthes seiring dengan waktu, baik di  alam  maupun  pada  kondisi  dibudidayakan (Clarke,  2001).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa penentuan jenis kelamin sejak tahap awal perkembangan  cenderung  stabil  hingga  tahap reproduktif (Scharmann et al ., 2017).
Jenis kelamin suatu tumbuhan dioecious secara umum  dapat  ditentukan  oleh  kromosom  seks  atau ekspresi  gen-gen  terkait  dengan  jenis  kelamin  yang terdapat pada autosom (Durrand et al. , 1990). Marka yang terkait dengan jenis kelamin tidak hanya dapat membedakan jenis kelamin pada tumbuhan
dioecious, tetapi  juga  dapat  memberikan  gambaran mengenai  struktur  genom  dan  homologi  struktur genom  antara  individu  jantan  dan  betina  (Grewal dan  Goyat,  2015).  Oleh  karena  itu,  penggunaan marka  RAPD  dapat  memberikan  pandangan  yang lebih  luas  mengenai  mekanisme  penentuan  jenis kelamin pada tumbuhan dioecious .
Penggunaan  marka  RAPD  sebagai  pembeda jenis  kelamin  merupakan  salah  satu  langkah  yang mudah,  murah,  dan  cepat  untuk  dianalisis. Amplifikasi  marka  RAPD  hanya  membutuhkan sampel  DNA  dalam  jumlah  sedikit  sehingga memungkinkan  untuk  dilakukannya  pencarian marka  RAPD  dengan  primer  yang  banyak  (Bhau et al. ,  2009).  Hasil  amplifikasi  marka  RAPD  spesifik dapat  dianalisis  lebih  lanjut  dengan  penggunaan marka Sequence  Characterized  Amplified  Region (SCAR) (Busconi et al., 2006). Tujuan penggunaan marka SCAR adalah untuk memvalidasi keberadaan marka  RAPD  spesifik  terkait  jenis  kelamin  (Maki, 2009).  Marka  RAPD  yang  terkait  dengan  jenis kelamin  diambil  lalu  dimurnikan.  Setelah  itu,  hasil pemurnian  tersebut  diligasikan  ke  dalam  plasmid. Plasmid  ini  selanjutnya  ditanam  di  sel  kompeten untuk dikloning. Hasil kloning kemudian disekuensing  dan  urutan  basa  yang  diperoleh digunakan  untuk  merancang  primer  SCAR.  Jika primer  SCAR  ini  berhasil  mengamplifikasi  marka spesifik  yang  didapatkan  sebelumnya  (dengan ukuran  yang  sama),  maka  marka  spesifik  ini menjadi  valid  (Bhagyawant,  2016).  Penggunaan marka  SCAR  ini  telah  diterapkan  pada  beberapa spesies Nepenthes ,  yaitu N.  ampullaria,  N.  gracilis, dan N. kampotiana (Anuniwat et al. , 2009).

## SIMPULAN
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan  tersebut  di atas  dapat  diambil  kesimpulan  bahwa  terdapat perbedaan  pola  pita  RAPD  antara Nepenthes gymnamphora jantan  dan  betina,  khususnya  jika diamplifikasi  menggunakan  primer  OPP-08  dan OPD-20. Primer OPP-08 dan OPD-20 menghasilkan pita  DNA  spesifik  jantan  berukuran  kurang  lebih 300  pb.  Sementara  itu,  primer  OPP-08  juga  dapat menghasilkan  pita  DNA  spesifik  betina  berukuran kurang lebih 250 pb.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada skema Riset Terapan Unggulan Universitas Jenderal tahun anggaran 2018 Soedirman sebagai penyandang dana atas penelitian ini.

## DAFTAR REFERENSI
Anuniwat,  A.,  Chaveerach,  A.,  Tanee,  T.,  & Sudmoon,  R.  2009.  Development  of  SCAR Markers  for  Species  Identification  of  the Genus Nepenthes (Nepenthaceae). Pakistan Journal  of  Biological  Sciences ,  12(22),  pp. 1455-1461.
Arruda,  S.R.,  Pereira,  D.G.,  Silva-Castro,  S.S., Brito, M.G., & Waldschmidt, A.M. 2017. An Optimized  Protocol  for  DNA  Extraction  in Plants  with  A  High  Content  of  Secondary Metabolites,  Based  on  Leaves  of Mimosa tenuiflora (Willd.)  Poir.  (Leguminosae). Genetics and Molecular Research , 16(3), pp. 1-9.
Avise,  J.C.,  1994. Molecular  Markers,  Natural History and Evolution . New York: Chapman and Hall.
Aziiza,  Z.  2018.  Verifikasi  Genetik  Jenis  Kelamin Nepenthes  adrianii Koleksi  Kebun  Raya
Baturraden. Skripsi . Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.
Bhagyawant, S.S. 2016. RAPD-SCAR Markers: An Interface  Tool  for  Authentication  of  Traits. Journal of Biosciences and Medicines , 4, pp. 1-9.
Bhau,  B.S.,  Medhi,  K.,  Sarkar,  T.,  &  Saikia,  S.P. 2009. PCR Based Molecular Characterization of Nepenthes  khasiana Hook.  f.—Pitcher Plant. Genetic Resources and Crop Evolution , 56, pp. 1183-1193.
Busconi,  M.,  Sebastiani,  L.,  &  Corrado,  F.  2006.
Development of SCAR Markers for Characterization in Olive Tree ( Olea europea L.). Molecular Breeding , 17, pp. 59-68. Cheek,  M.,  &  Jebb,  M.  2001. Nepenthaceae .  Flora Malesiana,  Series  1-Seed  Plants,  Vol.  15. Foundation Flora Malesiana.
Clarke,  C.M.  2001. Nepenthes  of  Sumatra  and Peninsular  Malaysia .  Kinabalu:  Natural History Publications.
Dhatterwal,  P.,  Mehrotra,  S.,  &  Mehrotra  R . 2017. Optimization of PCR Conditions for Amplifying  an  AT-Rich  Amino  Acid Transporter  Promoter  Sequence  with  High Number of Tandem Repeats from Arabidopsis  thaliana . BMC  Research  Notes , 10(1), pp. 1-4.
Doyle, J.J., & Doyle, J.L. 1990. A Rapid Total DNA Preparation Procedure for Fresh Plant Tissue. Focus , 12: 13–15.
Durrand,  R.,  Durrand,  B.,  Jacobs,  M.  1990.  Sexual Determination  &  Sexual  Differentiation. Critical  Reviews  in  Plant  Sciences ,  9(4),  pp. 295-316.
Enjelina,  W.  2011.  Analisis  Hibrid  Alam  Kantong Semar  di  Bukit  Taratak  Kabupaten  Pesisir Selatan. FMIPA Universitas Andalas.
Grewal,  A.,  Goyat,  S.  2015.  Marker  Assisted  Sex Differentiation  in  Dioecious  Plants. Journal of Pharmacy Research , 9(8), pp. 531-549. Gusmiaty,  Restu,  M.,  Asrianny,  Larekeng,  S.H . 2012. Seleksi Primer untuk Analisis Keragaman  Genetik  Jenis  Bitti  ( Vitex coffassus ). Jurnal Perennial , 8(1), pp. 25-29. Korpelainen, H., Bisang, I., Hedenäs, L., Kolehmainen, J. 2008. The First Sex-Specific
Molecular  Marker  Discovered  in  the  Moss Pseudocalliergon trifarium . Journal of Heredity , 99(6), pp. 581-587.
Maki, M. 2009. Development of SCAR Markers for Sex  Determination  in  the  Dioecious  Shrub Aucuba  japonica (Cornaceae). Genome ,  52, pp. 231-237.
Mandiriati,  H.,  Marsono,  D.,  Poedjirahajoe,  E.,
Sadono, R. 2016. Konservasi
Keanekaragaman  Jenis  Tumbuhan  Jawa  di Kebun  Raya  Baturraden  di  Kawasan  Bekas Hutan  Produksi  Terbatas. Jurnal  Ilmu Lingkungan , 14(1), pp. 33-38. Mansur,  M.  2006. Nepenthes  Kantong  Semar  yang Unik . Jakarta: Penebar Swadaya.
Mayangsari,  R.,  Susanto,  A.H.,  Yuniaty,  A.  2017. Profil  RAPD  Tanaman  Kantung  Semar Beberapa  Koleksi  Kebun  Raya  Baturraden. Biosfera , 34(2), pp. 89-97.
Mokkamul,  P.,  Chaveerach,  A.,  Sudmoon,  R., Tanee,  T.  2007.  Species  Identification  and Sex  Determination  of  the  Genus Nepenthes (Nepenthaceae). Pakistan Journal of Biological Sciences , 10(4), pp. 561-567.
Murtiyaningsih,  H.  2017.  Isolasi  DNA  Genom  dan Identifikasi  Kekerabatan  Genetik  Nanas Menggunakan  RAPD  ( Random  Amplified Polimorfic DNA ). Agritop , 15(1), pp. 1-15. Parjanto, Moeljopawiro, S., Artama, W.T.,
Purwantoro,  A.  2006.  Identifikasi  Penanda RAPD  untuk  Penentuan  Jenis  Kelamin Tanaman  Salak  ( Salacca  zalacca GART. VOSS.). Berkala  Ilmiah  Biologi ,  5(1),  pp. 57–63.
Prakash, S., van Staden, J . 2006. Sex Identification in Encephalartos  natalensis (Dyer  and Verdoorn)  using  RAPD  Markers. Euphytica , 152, pp. 197-200.
Scharmann, M., Grafe, T.U., Metali, F., Widmer, A.
2017.
Sex-determination and Sex Chromosomes  are  Shared  Across  the Radiation  of  Dioecious  Nepenthes  pitcher plants. bioRxiv .
Sharma,  A.,  Zinta,  G.,  Rana,  S.,  Shirko,  P.  2010. Molecular Identification of Sex in Hippophae rhamnoides L.  using  Isozyme  and  RAPD Markers. Forestry  Studies  in  China ,  12(2), pp. 62-66.
Weaver,  R.  2012. Molecular  Biology .  New  York: McGraw Hill.
Williams,  J.G.K.,  Kubelik,  A.R.,  Livak,  K.J., Rafalski,  J.A.,  Tingey,  S.V.  1990.  DNA Polymorphisms  Amplified  by  Arbitrary Primers  are  Useful  as  Genetic  Markers. Nucleic Acids Research , 18, pp. 6531-6535.
Zhou, W., Wang, Y., Zhang, G., Luan, G., Chen, S.,
Meng,  J.,  Wang,  H.,  Hu,  N.,  Suo,  Y.  2018. Molecular  Sex  Identification  in  Dioecious Hippophae  rhamnoides L.  via  RAPD  and SCAR Markers. Molecules , 23(5), pp. 1-9.