Menara Perkebunan 2011 79(1), 6-14
Analisis keragaman genetik Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan tanaman kakao dan tanaman pelindungnya menggunakan
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Genetic diversity analysis of Ganoderma spp. associated with cocoa and its shade trees using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Hayati MINARSIH 1) , *) Dyah LINGGA NP 2) ,  TW DARMONO 1) & Elis Nina HERLIYANA 3)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana  No. 1, Bogor 16151, Indonesia
2) Departemen Biokimia, Fakultas MIPA, Jl Agatis, Kampus Darmaga,  IPB, Bogor 16680, Indonesia
3) Fakultas Kehutanan, Jl.  Meranti, Kampus Darmaga, IPB,  Bogor 16680, Indonesia
Diterima 19 Agustus 2010/Disetujui 3 Januari 2011

## Abstract
Information  on  genetic  diversity  of Ganoderma spp. causing  root  rot  disease  in  crops  is  important  to  develop a  proper  strategy  for  the  control  of Ganoderma disease.  The objectives of this research were to study the genetic diversity of Ganoderma spp. associated with cacao and its shade trees ( Albazia  faltacaria,  Swietenia  mahogani,  Adenathera microsperma and Leucaena  leucocephala )  by  random amplified  polymorphic  DNA  (RAPD)  analysis.  Fourty  five samples  of Ganoderma spp.  were  used  in  this  research.  The results  showed  that  DNA  amplification  using  10  arbitrary oligonucleotide  primers  produced  220  DNA  fragments showing polymorphisms. The cluster analysis showed that 45 number of Ganoderma samples had a high variability with the coefficient  value  ranged  from  0.71  to  0.91.  Further  analysis using  Winboot  software  showed  that  three  groups  of Ganoderma spp.  had  a  high  degree  of  confidence  (>50  %), which  were Ganoderma samples  from  sengon  ( Paraserianthes sp .)  of  Tasikmalaya,  sengon  ( Paraserianthes  sp .)  of Palembang,  and  mahogany  of  Jember;  whereas  the  other groups of samples had a low degree of confidence         (<50 %).
[ Key  words: Ganoderma spp.,  shading  tree,  sengon  tree, RAPD marker, polymorphic ]

## Abstrak
Informasi  tentang  keragaman  genetik Ganoderma spp. sebagai  penyebab  penyakit  busuk  akar  pada  tanaman perkebunan  sangat  diperlukan  untuk  menerapkan  strategi yang  tepat  dalam  upaya  perlindungan  tanaman  perkebunan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman genetik Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan tanaman kakao dan tanaman  pelindungnya  (sengon,  mahoni,  saga  dan  lamtoro) dari  berbagai  wilayah  di  Indonesia  menggunakan  penanda molekuler random  amplified  polymorphic DNA  (RAPD). Sebanyak  45  sampel Ganoderma spp  digunakan  dalam penelitian  ini.  Amplifikasi  DNA  dengan  10  primer  terpilih menghasilkan 220 fragmen DNA yang menunjukkan adanya polimorfisme. Hasil analisis menunjukkan adanya keragaman yang cukup tinggi di antara sampel Ganoderma spp.  dari pohon  inang  dan  wilayah  yang  berbeda,  dengan  nilai koefisien    0,71-0,91.    Berdasarkan    analisis bootstrap
diketahui  bahwa  tiga  kelompok  sampel Ganoderma spp. memiliki  tingkat  kepercayaan  yang  tinggi  (>50  %)  yaitu kelompok Ganoderma spp.  yang  berasosiasi  dengan  pohon sengon  asal  Tasikmalaya,  sengon  Palembang,  dan  mahoni Jember;  sedangkan  pengelompokan  lainnya  menunjukk menunjukkan tingkat kepercayaan yang rendah (<50 %).
[Kata kunci: Ganoderma spp.,  tanaman   pelindung,  sengon, marka RAPD, polimorfisme]

## Pendahuluan
Tanaman  kakao  merupakan  komoditas  perkebunan penting  dan  banyak  diusahakan  oleh  masyarakat  di Indonesia.  Dalam  penanamannya,  kakao  memerlukan tanaman  pelindung.  Tanaman  sengon  ( Paraserianthes falcataria (L.)  Nielsen)  merupakan  salah  satu  tanaman hutan  rakyat  yang  banyak  diusahakan  oleh  masyarakat dalam sistem agroforestri di Indonesia (Iskandar, 2006; Riyanto,  2009).  Selain  menghasilkan  kayu  untuk berbagai  keperluan  industri,  tanaman  sengon  juga ditanam sebagai penaung tanaman pertanian/perkebunan seperti kopi, kakao dan pisang.  Salah satu kendala yang cukup berarti dalam pengusahaan tanaman kakao adalah terjadinya serangan penyakit akar yang disebabkan oleh cendawan Ganoderma spp.  Tanaman  pelindung terutama  sengon  diketahui  peka  terhadap Ganoderma dengan  tingkat  serangan  berkisar  antara  3-26% (Widyastuti, 2007). Serangan Ganoderma pada tanaman sengon  terus  meningkat  dari  tahun  ke  tahun,  bahkan serangan  setinggi  100  %  dilaporkan  terjadi  pada tanaman sengon generasi kedua (Rumiyati et al., 2002). Ganoderma spp.  merupakan  salah  satu  cendawan golongan Basidiomycetes yang membentuk tubuh buah berupa  lempengan  keras  menempel  pada  pangkal batang  tanaman  inang.  Permukaaan  atas  berwarna coklat  kemerahan  atau  coklat  tua,  sedangkan  bagian bawah  berwarna  putih  kekuning-kuningan  dimana terdapat  berjuta-juta  basidiospora (Widyastuti, 2007). Ganoderma dapat  menyebabkan  penyakit  busuk  akar yang serangannya baru diketahui ketika tingkat infeksi
*) Penulis korespndensi: hmiskan@yahoo.com
Analisis keragaman genetik Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan tanaman kakao …… ( Minarsih et al.)
sudah  kritis  dan  tanaman  sudah  sulit  diselamatkan (Bassett  &  Peters,  2003;  Mohd  Su’ud et  al., 2007). Mekanisme  penularan  penyakit  busuk  akar  terjadi melalui perpindahan spora Ganoderma spp. dari pohon yang  terinfeksi  atau  kontak  antara  akar  pohon  yang sakit  dengan  pohon  yang  masih  sehat  (Flood et  al ., 2000).
Penanda molekuler RAPD dihasilkan melalui proses amplifikasi  DNA  secara in  vitro dengan  PCR  meng- gunakan  primer  acak  (arbitrary).  Prosedur  RAPD  lebih murah,  lebih  cepat,  membutuhkan  sampel  DNA  dalam jumlah  lebih  sedikit  (0,5-50  ng),  tidak  memerlukan radioisotop,  dan  tidak  terlalu  membutuhkan  keahlian untuk  pelaksanaannya  dibanding  penanda  lainnya seperti RFLP. Teknik RAPD telah banyak diaplikasikan dalam analisis keragaman genetik tanaman perkebunan, di antaranya kelapa sawit (Toruan-Mathius et al ., 2001), kakao  (Faleiro et  al .,  2002)  dan  karet  (Nurhaimi-Haris et  al. ,  1998).  Selain  itu,  teknik  RAPD  telah  digunakan dalam  beberapa  penelitian  analisis  genetik  mikroorga- nisme, di antaranya  keragaman genetik Staphylococcus aureus (Morandi et  al .,  2010).  Aplikasi  RAPD  dalam analisis  keragaman  genetik  dan  identifikasi  cendawan telah  banyak  dilakukan  seperti  pada Phytophthora infestans (Atheya et  al., 2005), Aspergillus  flavus (Midorikawa et al ., 2008) dan Colletotrichum truncatum (Sant’Anna et  al. ,  2010).  Saat  ini  penggunaan  teknik molekuler  untuk  penetapan  keragaman  genetik Ganoderma spp. telah dilakukan (Suryanto et al., 2005; Zakaria et  al., 2009).  Namun  demikian  analisis kekerabatan  Ganoderma  pada  tanaman  kakao  dengan tanaman  pelindungnya  sengon  dan  kerabatnya  belum pernah dilakukan.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  kera- gaman genetik Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan tanaman  kakao  dan  tanaman  pelindungnya  (sengon, mahoni,  saga  dan  lamtoro)  dari  berbagai  wilayah  di Indonesia.  Hipotesis  yang  diajukan  adalah  adanya keragaman  yang  cukup  tinggi  di  antara  sampel Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan beberapa jenis pohon  inang  yang  berbeda  dari  berbagai  wilayah Indonesia.  Hasil  penelitian  ini  diharapkan  dapat memberikan  informasi  keragaman  genetik Ganoderma spp.  dan  dapat  dijadikan  bahan  pertimbangan  dalam memilih  tanaman  pelindung  sehingga  tanaman  utama dapat terhindar dari serangan penyakit busuk akar yang disebabkan oleh Ganoderma spp.

## Bahan dan Metode

## Bahan penelitian
Sampel  yang  digunakan  berupa  tubuh  buah cendawan Ganoderma yang dipetik dari tanaman yang masih  tumbuh  di  lapang  maupun  dari  tunggul-tunggul batang  pohon  yang  sudah  mati.  Tubuh  buah Ganoderma spp.  dipetik  dari  berbagai  tanaman  inang
dan  beberapa  daerah  di  Indonesia  meliputi  Jawa, Sumatera dan Kalimantan (Tabel 1).
Pembuatan medium tumbuh Ganoderma spp .
Komposisi  medium  tumbuh Ganoderma spp.terdiri atas; ekstrak ragi 20 g/L, pepton 5 g/L, dan agar Bacto 15 g/L. Bahan-bahan tersebut dilarutkan dengan akuades kemudian  disterilisasi  dalam  autoklaf  selama  15  menit pada suhu 121 o C dan tekanan 1 atm. Antibiotik Strepto- misin  sebanyak  100  mg/L  dan  fungisida  Benlate sebanyak  10  mg/L  ditambahkan  pada  medium  yang sudah diautoklaf pada suhu 30-40 o C, kemudian dituang ke dalam cawan Petri steril dan didiamkan hingga padat.

## Penyiapan isolat murni.
Isolat  murni  diperoleh  dari  45  tubuh  buah Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan pohon kakao, sengon, mahoni, dan lamtoro asal Tasikmalaya, Ciamis, Kediri,  Jember,  Lampung,  Palembang,  dan  Kalimantan (Tabel  1).  Tubuh  buah Ganoderma spp.  dipatahkan dengan tangan dan jaringan tubuh buah yang terletak di tengahnya  (yang  secara  alami  steril)  diambil  satu cuplikan  menggunakan  pinset  steril  kemudian  diino- kulasikan  pada  medium malt  extract  agar (MEA)  dan diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  3-5  hari.  Sebelum kultur Ganoderma spp.  hasil  isolasi  digunakan, dilakukan peremajaan pada medium MEA. Miselia yang digunakan  untuk  bahan  isolasi  DNA  merupakan  hasil subkultur dalam medium cair yang telah dibilas dengan aquades  steril  dan  disimpan  dalam freezer bersuhu  - 60 o C. Pertumbuhan morfologi miselia diamati.

## Isolasi DNA dari isolat murni Ganoderma spp.
Isolasi  DNA  genomik  dilakukan  menggunakan metode Orozco-Castillo et al. (1994) yang telah dimodi- fikasi  yaitu  dengan  penambahan  β-merkaptoetanol  dan polyvinilpolypyrrolidone  (PVPP)  pada  saat  ekstraksi. Pengujian  integritas  DNA  secara  kualitatif  dilakukan dengan  elektroforesis  gel  agarosa  1  %.  Pengukuran kuantitas  DNA  dilakukan  dengan  metode  spektrofoto- metri  menggunakan  spektrofotometer  pada  panjang gelombang (λ) 230, 260 dan 280 nm.

## Seleksi primer untuk amplifikasi DNA
Sebanyak  20  primer  oligonukleotida  acak  dari Operon  yaitu  OPC  1-20  digunakan  untuk  meng- amplifikasi    beberapa    sampel  DNA,  dengan  program RAPD-PCR (Tabel 2).  Produk  PCR  kemudian  diuji dengan elektroforesis gel agarosa untuk melihat pita-pita yang terbentuk.  Dari  pita-pita  yang  dihasilkan, dipilih primer-primer  yang  dapat  menghasilkan  pita  dengan intensitas tinggi dan berjumlah relative banyak. Sepuluh primer terpilih yaitu OPC 01, OPC 02, OPC 03, OPC
Menara Perkebunan 2011 79(1), 6-14
Tabel 1.  Tanaman inang dan lokasi asal sampel Ganoderma spp.
Table 1.  Host plants and origin of Ganoderma spp. samples
Nomor sample Sample’s number Kode sample Sample’s code Pohon inang Host plant Asal wilayah/daerah Origin of location 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
45
P2 P4 P5 P6 P7 10 GL2 G12(2) G16(1) G17(3) KW1 KW2 KW3 KW4 KW5 KW6 KW7 KW8 PL1 PL2 PL3 PL4 PL5 PL6 PL7 PL8 L2 K2 K5 K3 T3 T5 T6 T8 T9 T10 T11 T12 T17 T14 T16 T18 T19 T20 T21 Sengon Sengon Sengon Sengon Saga Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Mahoni Mahoni Mahoni Mahoni Kakao Kakao Sengon laut Lamtoro Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Sengon Pawon, Kediri Pawon, Kediri
Pawon, Kediri Pawon, Kediri Pawon, Kediri
Tasikmalaya Ciamis Tasikmalaya Tasikmalaya Tasikmalaya Kaliwining, Jember Kaliwining, Jember Kaliwining, Jember Kaliwining, Jember Kaliwining, Jember Kaliwining, Jember Kaliwining, Jember Kaliwining, Jember Palembang Palembang Palembang Palembang
Palembang
Palembang Palembang Palembang
Lampung Kalimantan Selatan Kalimantan Selatan Kalimantan Selatan
Tasikmalaya Tasikmalaya Tasikmalaya Tasikmalaya Tasikmalaya
Tasikmalaya Tasikmalaya Tasikmalaya Tasikmalaya Tasikmalaya Tasikmalaya
Tasikmalaya
Tasikmalaya Tasikmalaya Tasikmalaya
04,  OPC  05,  OPC  08,  OPC  12,  OPC  13,  OPC  14,  dan OPC  15  selanjutnya  digunakan  untuk  mengamplifikasi seluruh sampel.

## Amplifikasi DNA dengan metode RAPD
Sampel  DNA Ganoderma spp.  disiapkan  dalam konsentrasi 100 μg/mL. Larutan mix (Fermentas) dibuat dengan  mencampurkan  2,5  μL  bufer  PCR,  0,5  μL dNTPs  10  mM,  0,3  μL  Taq  DNA  polimerase,  dan
19,7 μL NFW ke dalam tabung Eppendorf. Selanjutnya ke dalam tabung mikro dimasukkan 1 μL primer, 1 μL DNA  sampel,  dan  23  μL  larutan  mix.  Reaksi  PCR dilakukan  dengan  program  sebagai  berikut:  satu  siklus denaturasi awal pada suhu 92 o C selama dua menit; satu siklus berikutnya yang terdiri atas denaturasi pada suhu 92 o C  selama  tiga  menit  30  detik, annealing pada  suhu 35 o C  selama  satu  menit,  dan  eksistensi  pada
Analisis keragaman genetik Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan tanaman kakao …… ( Minarsih et al.)
suhu  72 o C  selama  dua  menit;  dilanjutkan  dengan  44 siklus  yang  terdiri  atas  denaturasi  pada  suhu  92 o C selama satu menit, penempelan pada suhu 35 o C selama satu  menit,  dan  ekstensi  pada  suhu  72 o C  selama  dua menit;  kemudian  dilanjutkan  dengan  reaksi  pada  suhu 72 o C  selama  tujuh  menit.  Hasil  amplifikasi  kemudian diseparasi  dengan  elektroforesis  gel  agarosa  1,4  %  dan divisualisasikan dengan UV transiluminator.

## Analisis polimorfisme
Data  yang  diperoleh  dari  pemotretan  gel  hasil RAPD berupa pita-pita DNA diurutkan dari batas bawah sumur  sampai  batas  bawah  pita  yang  masih  tampak. Analisis  data  didasarkan  pada  ada  atau  tidaknya  pita. Profil pita diterjemahkan ke dalam bentuk biner dengan ketentuan  nilai  0  untuk  tidak  ada  pita  dan  1  untuk  ada pita  pada  satu  posisi  yang  sama  dari  nomor-nomor sampel  yang  dibandingkan.  Pengelompokan  data matriks  ( cluster  analysis )  dan  pembuatan  dendogram dilakukan  dengan  metode Unweighted  Pair-Group Method  Arithmetic (UPGMA)  menggunakan  program Numerical Taxonomy and Multivariate System (NTSYS) versi  2.02  (Tarinezhad et  al., 2005).  Studi  statistika untuk  mengetahui  derajat  ketelitian  data  UPGMA dilakukan  dengan  analisis bootstrap menggunakan program Winboot (Yap & Nelson, 1996).

## Hasil dan Pembahasan
Isolasi DNA dari isolat murni Ganoderma spp.
Isolasi Ganoderma spp.  dapat  dilakukan  dengan dua  cara  yaitu  secara  langsung  dari  tubuh  buah  atau secara  tidak  langsung  dari  akar  atau  bagian  tubuh tanaman yang terinfeksi. Isolat murni Ganoderma spp. tumbuh  sebagai  miselium  berwarna  putih  yang menyebar  ke  arah  samping  (Gambar  1).  Banyaknya miselium  yang  diperoleh  beragam  berdasarkan  jenis Ganoderma spp.  dan  usia  pertumbuhannya.  Beberapa sampel Ganoderma spp.  menunjukkan    tingkat pertumbuh-an yang berbeda. Berdasarkan pengamatan, faktor yang sangat berpengaruh adalah usia isolat awal. Isolat  yang  masih  muda  cenderung  mengalami pertumbuhan  yang  lebih  cepat  dibandingkan  dengan isolat sejenis yang berusia lebih tua.
DNA yang telah diisolasi dari isolat murni selanjut- nya  dikarakterisasi  secara  kualitatif  menggunakan elektroforesis  gel  agarosa  1  %.  Ukuran  DNA  total Ganoderma spp. yang diisolasi adalah sekitar  12000 bp (Gambar  2).  Isolasi  DNA  yang  dilakukan  dengan metode Orozco-Castillo et al . (1994) memberikan  hasil yang    cukup    baik,    dilihat    dari  kualitas  dan  kuantitas DNA  yang  diperoleh.  Berdasarkan  pengukuran, konsentrasi    DNA    yang      diperoleh  cukup  baik,  yaitu berkisar  antara  105-2575  μg/mL.  Jumlah  ini  sudah mencukupi  untuk  dijadikan  stok  dalam  analisis,  karena
RAPD  hanya  membutuhkan  DNA  dalam  jumlah  kecil (0,5-50  ng).  Kemurnian  DNA  yang  digambarkan  oleh nilai  rasio  absorbansi  pada  260  dan  280  nm  berkisar antara  1,069  dan  1,918.  Nilai  absorbansi  yang  rendah pada  beberapa  sampel Ganoderma spp.  kemungkinan disebabkan  oleh  banyaknya  polisakarida  yang terkandung  dalam  sampel  miselium Ganoderma spp. yang diisolasi.

## Seleksi primer dan amplifikasi DNA
Primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA total Ganoderma  dipilih  dari  20  primer  yang  tersedia  yaitu OPC 01-OPC 20. Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa sebanyak 18 primer dapat menghasilkan fragmen DNA pada  kedua  sampel,  satu  primer  menghasilkan  fragmen hanya pada satu sampel, dan satu  primer  tidak  meng- hasilkan  fragmen  pada  kedua  sampel  (data  tidak ditunjukkan).  Selanjutnya  dipilih  sepuluh  primer  yang menghasilkan  fragmen  pada  kedua  sampel  secara  jelas dan mudah dibedakan, yaitu OPC 01, OPC 02, OPC 03, OPC 04, OPC 05, OPC 08, OPC 12, OPC 13, OPC 14, dan  OPC15.  Kesepuluh  primer  ini  selanjutnya  diguna- kan  untuk  mengamplifikasi  45  sampel  DNA Ganoderma spp.

## Analisis  polimorfisme
Dari hasil amplifikasi 45 sampel DNA Ganoderma spp.  menggunakan  10  primer  acak  terpilih,  diperoleh 220 fragmen DNA. Gambar 3. memperlihatkan pola pita yang dihasilkan oleh primer OPC 01 dan OPC 03 pada 45  sampel Ganoderma spp.  Ukuran  fragmen    yang dihasilkan    sangat    bervariasi  antara    150  bp    sampai 2000 bp.  Hal  ini  disebabkan oleh primer yang bersifat acak  dan  menempel  secara  acak  pula  pada  bagian genom  yang  sesuai.  Dari  total  220  fragmen  yang dihasilkan,  hampir  seluruhnya  merupakan  fragmen polimorfik, ini menunjukkan bahwa keragaman genetik antar  sampel Ganoderma spp.  yang  dianalisis  cukup tinggi.  Berdasarkan  pola  pita  elektroforesis  tersebut, selanjutnya  dibuat  pengelompokan  sampel Ganoderma spp. yang  berasosiasi  dengan  berbagai  jenis  pohon pelindung (sengon, mahoni, saga dan lamtoro) dan juga kakao,  ditunjukkan  dengan  dendogram  yang  divalidasi dengan  analisis  bootstrap  seperti  ditunjukkan  pada Gambar  4.  Nilai  koefisien  menunjukkan  angka kedekatan  antar  nomor  sampel Ganoderma spp.  secara genetik,  sedangkan    angka-angka      pada      batang menunjukkan  derajat  ketelitian  data  yang   dianalisis menggunakan WinBoot. Nilai koefisien yang dihasilkan berkisar  antara  0,71  dan  0,91.  Hasil  penelitian  Hseu et al .  (1996)  yang  melaporkan  analisis  RAPD  pada beberapa  isolat Ganoderma  lucidum kompleks menghasilkan  nilai  koefisien    yang    kurang    lebih mendekati  yaitu sebesar

## Tabel 2. Primer yang digunakan beserta urutan basanya
Table 2. Primers used with the sequences
Primer Primer Urutan basa Sequences OPC-01 OPC-02 OPC-03 OPC-04 OPC-05 OPC-06 OPC-07 OPC-08 OPC-09 OPC-10 OPC-11 OPC-12 OPC-13 OPC-14 OPC-15 OPC-16 OPC-17 OPC-18 OPC-19 OPC-20 TTCGAGCCAG GTGAGGCGTC GGGGGTCTTT CCGCATCTAC GATGACCGCC
GAACGGACTC
GTCCCGACGA
TGGACCGGTG CTCACCGTCC TGTCTGGGTG AAAGCTGCGG TGTCATCCCC AAGCCTCGTC TGCGTGCTTG GACGGATCAG CACACTCCAG
TTCCCCCCAG TGAGTGGGTG GTTGCCAGCC ACTTCGCCAC
Gambar 1.  Isolat murni Ganoderma spp. yang ditumbuhkan di medium malt extract  agar (MEA).
Figure 1. Ganoderma spp. pure   isolate   cultured  in malt extract agar media (MEA)
Gambar  2.  Elektroforegram  sembilan  sampel  DNA  total Ganoderma spp.  M  =  marker  1kb  plus  DNA ladder. Kode sampel tertera pada Tabel 1.
Figure 2.  Electrophoregram of nine Ganoderma spp. total DNA  samples.  M  =  1kb  plus  DNA  ladder marker. Samples codes are listed in Table 1.
0,60-0,89. Kisaran nilai koefisien pada Ganoderma spp. menggambarkan  bahwa  latar  belakang  genetik  sampel- sampel Ganoderma spp. yang dianalisis tergolong cukup dekat,  mengingat  sampel-sampel  yang  dianalisis  masih berada  dalam  satu  genus.  Nilai  koefisien  dan  tingkat kepercayaan  yang  cukup  tinggi  dihasilkan  pada kelompok T14 sengon Tasik – T20 sengon Tasik (koef. 0,91  dengan  tingkat  kepercayaan  100%),  PL1  sengon Palembang – PL2 sengon Palembang (koef. 0,82 dengan tingkat kepercayaan 88,6 %), serta KW2 mahoni – KW3 mahoni Jember (koef. 0,82 dengan tingkat kepercayaan 55,2 %) (Gambar 4). Masing-masing kelompok tersebut merupakan  sampel Ganoderma spp.  yang  menginfeksi jenis  pohon  yang  sama  dan  berasal  dari  wilayah  yang
sama.  Pola  seperti  ini  terjadi  pula  pada  kelompok  lain dengan koefisien yang lebih kecil.
Analisis  statistika  menggunakan  perangkat  lunak Winboot menghasilkan  derajat  ketelitian  yang  rendah pada beberapa sampel (<50 %), artinya pengelompok- kan  pada  kelompok  tersebut  menghasilkan  pola  yang sama  pada  1000  kali  pengulangan  sebanyak  kurang dari  50  %.  Hal  ini  mungkin  disebabkan  oleh  tingkat reproducibility metode  RAPD  yang  rendah  (Bardakci, 2001).  Kemungkinan  lainnya  adalah  disebabkan  oleh sifat  primer  yang  acak  sehingga  sulit  didapatkan  situs penempelan  yang  spesifik  pada  genom Ganoderma . Menurut  Bustamam  &  Moeljopawiro  (1998),  agar pengelompokan  memiliki  signifikansi  yang  tinggi
100 1,000 12,000 2,000 12,000 bp P2  P4  P5   P6  P7 10 GL2 G12 G17 M    bp
Analisis keragaman genetik Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan tanaman kakao …… ( Minarsih et al.)
(90-100  %),  perlu  dilakukan  penelusuran  primer- primer  yang  mampu  mengelompok  dengan  tingkat keepercayaan  lebih  tinggi,  serta  penggunaan  primer yang  lebih  banyak  dan  beragam  agar  daerah  genom Ganoderma yang  teramplifikasi  dapat  semakin terwakili. Pada penelitian ini, hanya digunakan sepuluh primer  yang  pemilihannya  didasarkan  pada  kemam- puan primer menghasilkan fragmen yang cukup banyak dan tegas.
Dendogram  yang  dihasilkan  dari  analisis  45 sampel Ganoderma spp.  dapat  dikelompokkan  ke dalam lima kelompok besar pada nilai koefisien 0,766 (Gambar  4).  Secara  umum  terlihat  bahwa  sampel- sampel  cenderung  mengelompok  menurut  jenis  pohon inang  yang  diinfeksinya.  Pengelompokan  berdasarkan pohon  inang  ini  kemungkinan  dapat  digunakan  untuk memperkirakan  tingkat  virulensi  ataupun  pola penularan  penyakit  busuk  akar  yang  disebabkan  oleh Ganoderma di antara tanaman perkebunan (kakao) dan pohon pelindungnya yaitu sengon, mahoni,  saga  dan lamtoro.  Kelompok  satu,  dua,  dan  empat  terdiri  atas sampel-sampel Ganoderma spp.  yang  hanya  meng- infeksi  pohon  sengon.  Kelompok  tiga  menunjukkan sedikit perbedaan dengan masuknya sampel Ganoderma spp.  dari  pohon  kakao  (KW5)  ke  dalam kelompok  tersebut.  Hal  ini  dapat  berarti  terdapat kemiripan genetik yang cukup dekat antara Ganoderma asal  pohon  sengon  dan  kakao,  yang  mengindikasikan bahwa  penyakit  busuk  akar  pada  kakao  dapat disebabkan pula oleh Ganoderma spp. dari sengon dan atau sebaliknya. Hal tersebut ditunjang pula oleh hasil uji  patogenisitas  isolat Ganoderma spp.  asal  kakao  ke sengon.  Kemungkinan  ini  dapat  digunakan  sebagai pertim-bangan  untuk  penggunaan  pohon  sengon sebagai  pelindung  tanaman  kakao.  Sedangkan kelompok lima merupakan kelompok besar yang terdiri
dari gabungan antara Ganoderma spp. yang menyerang sengon  dan  juga  mahoni,  lamtoro  dan  kakao  dari berbagai daerah. Adanya sampel Ganoderma spp. pada kakao  dalam  kelompok  tersebut  juga  dapat  meng- indikasikan  bahwa  adanya  kedekatan  genetik  antara Ganoderma pada kakao dan tanaman pelindungnya. Di antara 37 nomor sampel Ganoderma spp. yang menyerang  tanaman  sengon,  hasil  analisis  menunjuk- kan  bahwa  kedekatan  genetik  cenderung  terjadi  pada sampel-sampel  yang  berasal  dari  wilayah  yang  sama (Gambar  5).  Dendogram  yang  terbentuk  juga  dapat dikelompokkan  menjadi  lima  kelompok  besar berdasarkan nilai koefisien 0,766. Berdasarkan wilayah tempat  tumbuhnya,  secara  umum  sampel-sampel  dari wilayah  yang  sama  sebagian  besar  mengelompok secara berdekatan seperti pada kelompok satu dan lima didominasi  oleh  sengon  dari  Tasikmalaya,  sedangkan kelompok  empat  didominasi  oleh  sengon  dari Palembang.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa Gano- derma spp.  pada  wilayah  yang  sama  memiliki  latar belakang  genetik  yang  cukup  dekat.  Beberapa  sampel berbeda wilayah terlihat berdekatan dan terletak dalam satu  kelompok  dengan  sampel Ganoderma berbeda wilayah,  yaitu  sampel Ganoderma Lampung,  KW7 Jember, PL6 Palembang, dan P6 Kediri, dengan tingkat kepercayaan  yang  rendah  (<50  %).  Adanya  beberapa sampel  yang  mengelompok  dengan  sampel  lain  dari wilayah  yang  berbeda  kemungkinan  berkaitan  dengan sejarah  migrasi  sampel  dari  satu  wilayah  ke  wilayah lainnya.  Hal  ini  perlu  ditelusuri  lebih  lanjut  untuk mempelajari  pola  penyebaran Ganoderma spp.  di Indonesia.  Untuk  mendapat  pola  penyebaran Ganoderma spp.  yang  lebih  jelas  perlu  dilakukan kajian  lebih  jauh  dengan  jumlah  sampel  yang  lebih banyak dan variatif serta primer yang lebih banyak dan teruji.
Gambar 3. Hasil amplifikasi 15 sampel DNA Ganoderma spp. menggunakan primer OPC 01 dan OPC 03. 1-45: nomor sampel Ganoderma dari berbagai wilayah di Indonesia. M= marker 1kb plus DNA ladder. Figure 3. Amplification   products   of  15 Ganoderma spp.  DNA   using   primer OPC 01  and   OPC 03, 1-45: samples    number  of Ganoderma from  various  locations  in  Indonesia.  M=  1kb  plus  DNA  ladder marker.

## Menara Perkebunan 2011 79(1), 6-14
Gambar  4.  Dendogram  kemiripan  genetik  45  sampel Ganoderma spp.  yang  berasosiasi  dengan  beberapa  jenis  pohon  (sengon, mahoni, lamtoro, saga dan kakao) dari berbagai wilayah di Indonesia berdasarkan metode UPGMA menggunakan 10 primer
Figure  4.    Dendogram  of  genetic  similarity  of  45 Ganoderma spp.  samples  associated  with  several  plants  (sengon,  mahoni, lamtoro, saga and cocoa) from various locations in Indonesia, based on UPGMA method using 10 primers.
Coefficient 0.71 0.78 0.85 0.93 1.00 P2 P5 T5 K5 K3 T18 T21 10 G16(1) G17(3) KW5 GL2 T17 KW7 PL3 T16 T12 PL6 T6 Lampung T19 KW1 KW8 K2 PL4 PL5 PL7 T10 T11 T8 G12(2) KW2 KW3 T3 P4 P6 P7 T14 T20 PL8 KW4 KW6 PL1 PL2 T9 0.766
100.0 97.1 P2_Sengon Kediri P5_Sengon Kediri T5_Sengon Tasik K5_Sengon Kalimantan K3_Sengon Kalimantan T18_Sengon Tasik T20_ Sengon Tasik 10_ Sengon Tasik G16_ Sengon Tasik G17_ Sengon Tasik KW5_Kakao Jember GL2_ Sengon Tasik T17_ Sengon Tasik KW7_Sengon laut Jember PL3_Sengon Palembang T16_Sengon Tasik T12_Sengon Tasik PL6_Sengon Palembang T6_Sengon Tasik L_Sengon Lampung T19_ Sengon Tasik KW1_Mahoni Jember KW8_Lamtoro Jember K2_Sengon Kalimantan PL4_Sengon Palembang PL5_Sengon Palembang PL7_Sengon Palembang T10_ Sengon Tasik T11_ Sengon Tasik T8_ Sengon Tasik GL2_ Sengon Tasik KW2_Mahoni Jember KW3_Mahoni Jember T3_ Sengon Tasik P4_ Sengon Kediri P6_ Sengon Kediri P7_Saga Kediri T14_ Sengon Tasik T20_ Sengon Tasik PL8_Sengon Palembang KW4_Mahoni Jember KW6_Kakao Jember PL1_Sengon Palembang
PL2_Sengon Palembang T9_ Sengon Tasik 0.71 0.78 0.85 0.93                 1.00 Simple Matching Similarity Coefficient (Sokal & Sneath 1963)
2 1 2 3 4 5 65.8
Analisis keragaman genetik Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan tanaman kakao …… ( Minarsih et al.)
Gambar 5. Dendogram kesamaan genetik 37 sampel Ganoderma spp. yang berasosiasi dengan pohon sengon dari berbagai wilayah di Indonesia  berdasarkan metode UPGMA  menggunakan sepuluh primer.
Figure 5. Dendogram of  genetic similarity of 37 Ganoderma spp. samples associated with sengon tree from various locations   in Indonesia based on UPGMA method using 10 primers.

## Kesimpulan
Penanda  molekuler random  amplified  polymorphic DNA menghasilkan polimorfisme yang tinggi sehingga dapat  digunakan  untuk  menguji  keragaman  genetik Ganoderma spp.  Analisis  kluster  dengan  metode UPGMA  menggunakan  perangkat  lunak  NTSYS  versi 2,02  menghasilkan  dendogram  dengan  nilai  koefisien 0,71-0,91.  Pengelompokan  sampel Ganoderma spp. yang  berdekatan  cenderung  terjadi  di  antara  sampel- sampel dari pohon inang dan wilayah yang sama, namun beberapa  sampel  menunjukkan  pola  yang  berbeda. Ganoderma yang menginfeksi sengon terlihat memiliki kedekatan  genetik  dengan  yang  menginfeksi  kakao. Dengan  demikian  juga  memiliki  potensi  untuk menginfeksi tanaman kakao dan sebaliknya.

## Daftar Pustaka
Atheya I, BP Singh, SK Chakrabarti & D Pattanayak (2005).
Genetic diversity and differentiation of Indian isolates of Phythophthora infestans as revealed by RAPD analysis.
Indian J Exp Biol 43 (9) 817-23
Bardakci  F  (2001).  Random  amplified  polymorphic  DNA (RAPD) markers. Turk J Biol 25, 185-196.
Bassett  K  &  RN  Peters  (2003). Ganoderma :  a  significant root pathogen. Arborilogical services Inc. Pub . Diunduh dari:  http://www.arborilogical.com/articles/  ganoderma. htm [Des 2009].
Bustamam  M  &  S  Moeljopawiro  (1998).  Pemanfaatan teknologi  sidikjari  DNA  di  bidang  pertanian. Zuriat 9
(2), 77-90.
98.3 0.71                            0.78                                 0.85                             0.93                                1.00 98.3 98.3 Coefficient 0.70 0.77 0.85 0.93 1.00 P2_Sengon_Kedir P5_Sengon_Kedir T5_Sengon_Tasik T8_Sengon_Tasik
10_Sengon_Tasik G16_Sengon_Tasi G17_Sengon_Tasi GL2_Sengon_Tasi T17_Sengon_Tasi KW7_SengonLaut_ T12_Sengon_Tasi T16_Sengon_Tasi K5_Sengon_Kalim K3_Sengon_Kalim T18_Sengon_Tasi T21_Sengon_Tasi PL6_Sengon_Pale T6_Sengon_Tasik L_Sengon_Lampun
T19_Sengon_Tasi PL3_Sengon_Pale K2_Sengon_Kalim PL4_Sengon_Pale PL5_Sengon_Pale PL7_Sengon_Pale T10_Sengon_Tasi T11_Sengon_Tasi T14_Sengon_Tasi T20_Sengon_Tasi
P4_Sengon_Kedir T3_Sengon_Tasik G12_Sengon_Tasi P6_Sengon_Kedir PL8_Sengon_Pale PL1_Sengon_Pale PL2_Sengon_Pale T9_Sengon_Tasik 0,766 P2_Sengon Kediri P5_Sengon Kediri T5_Sengon Tasik T8_ Sengon Tasik 10_ Sengon Tasik G16_ Sengon Tasik G17_ Sengon Tasik GL2_ Sengon Tasik T17_ Sengon Tasik KW7_Sengon laut Jember T12_Sengon Tasik T16_Sengon Tasik K5_Sengon Kalimantan K3_Sengon Kalimantan T18_Sengon Tasik T21_ Sengon Tasik PL6_Sengon Palembang T6_Sengon Tasik L_Sengon Lampung T19_ Sengon Tasik PL3_Sengon Palembang K2_Sengon Kalimantan PL4_Sengon Palembang PL5_Sengon Palembang PL7_Sengon Palembang T10_ Sengon Tasik T11_ Sengon Tasik T14_ Sengon Tasik T20_ Sengon Tasik P4_ Sengon Kediri T3_ Sengon Tasik G12_ Sengon Tasik P6_ Sengon Kediri PL8_Sengon Palembang PL1_Sengon Palembang PL2_Sengon Palembang T9_ Sengon Tasik 100.0 5 2 1 3 4 0,71 0,78
0,85 0,93                        100 Simple Matching Similarity Coefficient (Sokal & Sneath 1963)
Faleiro  FG,  MM  Yamada,  UV  Lopes,  ASG  Faleiro, RCS  Bahia,  LMC  Gomes,  RC  Santos  &  RF  Santos (2002).  Genetic  similarity  of Theobroma  cacao L. accessions maintained in duplicate at the cacao research center  germplasm  collection  based  on  RAPD  markers. Crop Breed  and Appl Biotech 2(3), 439-444.
Flood  J,  Y  Hasan,  PD  Turner  &  EB  O’Grady    (2000).  The spread  of Ganoderma from  its  infective  sources  in  the field and its implications for management of the disease in oil palm. In : Flood J et al .  eds. Ganoderma Diseases of Perennial Crops . CABI Publishing. p.101-112.
Hseu R-S, H-H Wang, H-F Wang & J-M Moncalvo (1996). Differentiation  and  grouping  of  isolates  of  the Ganoderma  lucidum complex  by  random  amplified polymorphic DNA-PCR compared with grouping on the basis  of  internal  transcribed  spacer  sequences. App  Env Microbiol 62 (4), 1354-1363.
Iskandar MI (2006). Pemanfaatan kayu hutan rakyat sengon ( Paraserianthes  falcataria (L)  Nielsen)  untuk  kayu rakitan. Dalam: Prosiding Seminar Hasil Litbang Hasil Hutan. Bogor, Pusat penelitian dan Pengembangan Hasil Hutan,  p. 183-195.
Midorikawa GEO, MRR Pinheiro,  BS Vidigal, MC Arruda, FF  Costa,  GJ  Pappas  Jr,  SG  Ribeiro,  F  Freire  & RNG  Miller  (2008).  Characterization  of Aspergillus flavus strain from Brazillian Brazil Nuts and cashew by RAPD and ribosomal DNA analysis. Lett Appl Microbiol 47 (1), 12-18.
Mohd  Su’ud  M,  PIA  Loonis  &  AS  Idris  (2007)  Towards automatic  recognition  and  grading  of Ganoderma infection  pattern  using  fuzzy  systems. Int  J  Biomed  Sci 2, 1306–1216 .
Morandi S, M Brasca, R Lodi, L Brusetti, C Andrighetto & A  Lombardi  (2010).  Biochemical  profiles,  restriction fragment  length  polymorphism  (RFLP),  random amplified  polymorphic  DNA  (RAPD)  and  multilocus variable  number  tandem  repeat  analysis  (MLVA)  for typing Staphylococcus  aureus isolated  from  dairy products. Res Vet Sci 88 (3), 427-435.
Nurhaimi-Haris, S Woelan & A Darussamin  (1998). RAPD analysis  of  genetic  variability  in  plant  rubber  ( Hevea brasiliensis Muell Arg.) clones. Menara Perkebunan 66 (1), 9-19.
Orozco-Castillo,    KJ  Chalmers,  R  Waugh  &  W    Powell (1994).  Detection  of  genetic  diversity  and  selective  gene in  coffea  using  RAPD  markers. Theor  Appl  Genet 87, 332-339.
Riyanto (2009). Penjarangan selektif dalam upaya peningkatan riap diameter hutan rakyat sengon. Tekno Hutan Tanaman 2 (3), 115-120.
Rumiyati,  Sismindari  &  SM  Widyastuti  (2002).  Toksisitas ekstrak  air  tubuh  buah Ganoderma spp.  terhadap  larva udang Artemia selina Leach. Majalah Farmasi Indonesia , 13 (1), 44-49.
Sant’Anna  JR,  CT  Miyamoto,  LJ  Rosada,  CCS  Franco, EN  Kaneshima,  &  MAA  Castro-Prado  (2010).  Genetic relatedness  of  Brazillian Colletotrichum  truncatum isolates  assessed  by  vegetative  compatibility  groups  and RAPD analysis. Biol Res 43, 51-62.
Suryanto  D,    S  Andriani  &  K  Nurtjahja  (2005).  Keragaman genetik Ganoderma spp. dari beberapa tempat di Sumatra Utara. J Ilmiah Pertanian Kultura 40 (2), 70-76.
Tarinezhad  A,  A  Sabouri  &  SA  Mohammadi  (2005). Statistical  software  NTSYS  PC  application  in  plant breeding. In: The 7 th Conference of Iran Statistics . Allame Tobatabaci University, September 2005. Teheran, 10 p.
Toruan-Mathius N, SII Bangun & M Bintang  (2001). Analisis abnormalitas  tanaman  kelapa  sawit  ( Elaeis  guineensis Jacq)  hasil  kultur  jaringan  dengan  teknik Random Amplified  Polymorphic DNA  (RAPD). Menara Perkebunan 69(2), 58-70.
Widyastuti  SM  (2007). Peran Trichoderma spp. dalam Revitalisasi Kehutanan di Indonesia . Yogyakarta, Gadjah Mada University Press, 255p.
Yap  IV  &  RJ  Nelson  (1996). WinBoot:  A  Program  for Performing  Bootstrap  Analysis  of  Binary  Data  to Determine  The  Confidence  Limits  of  UPGMA-based dendograms .  Manila,  International  Rice  Research Institute.
Zakaria  L,  NSB  Saleh  &  M  Zakaria  (2009).  Molecular analysis  of Ganoderma species  from  different  host  in Peninsula Malaysia. J  Biol Sci 1, 12-20.