DAYA ANTIBAKTERI EKSTRAK BUAH ADAS ( Foeniculum vulgare ) TERHADAP BAKTERI Micrococcus luteus SECARA IN VITRO
ANTIBACTERIAL EFFORT OF ADAS FRUIT ( Foeniculum vulgare ) EXTRACT  ON Micrococcus luteus BACTERIAL BY IN VITRO
Rahayu Kusdarwati, Ludira Sari dan Akhmad Taufiq Mukti
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451

## Abstract
One of the disease attack of freshwater fish is micrococcus which caused by Micrococcus luteus bacterial. Antibiotic was caused of residual, polluted and expensive. Therefore, it was looked for alternative using natural and safety materials. The study used the fruit extract of adas as antibacterial to Micrococcus luteus . This experiment purpose  to  investigate  of  Minimum  Inhibitory  Concentration  (MIC)  and  Minimum  Bactericidal  Concentration (MBC) of fruit extract of adas to Micrococcus luteus . The study was done on 15 June-05 July 2009 on Development Center of Quarantine Fish Juanda; Institute Tropical Disease, Airlangga University Surabaya; and Department of Faculty Pharmacology of Medicine, Airlangga University Surabaya. The experiment was used experimental method which completely randomized design with twelve treatments and three replicates. The parameters observed were Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC). The data analyzed used F  test  and  was  continued  with  Duncan's  Multiple  Range Test. The  result  indicated  that  fruit  extract  of  adas  had antibactericidal to Micrococcus luteus . According to  inhibitory test growth of bacterial had inhibitory capacity (MIC) at concentration 1,56% (0,018 g/m l ). Therefore, the bactericidal capacity (MBC) was at concentration 3,13% (0,036 g/m l ).
Key words : fruit adas, Micrococcus luteus, antibacterial

## Pendahuluan
Seiring  dengan  meningkatnya  jumlah  dan populasi  penduduk  dunia,  kebutuhan  bahan  pangan dan  gizi  semakin  meningkat  dari  tahun  ke  tahun, terutama  konsumsi  ikan  sebagai  sumber  protein hewani.  Pemenuhan  kebutuhan  tersebut  harus ditunjang  dengan  ketersediaan  stok  ikan  yang mencukupi terutama dari usaha budidaya baik secara tradisional  maupun  intensif.  Banyak  kendala  yang menghalangi  peningkatan  jumlah  produksi  di  dalam usaha  budidaya  perikanan.  Salah  satu  kendala  yang dapat menurunkan jumlah produksi adalah penyakit.
Penyakit  ikan  dapat  didefinisikan  sebagai segala  sesuatu  yang  dapat  menimbulkan  gangguan pada  ikan,  baik  secara  langsung  maupun  tidak langsung. Gangguan terhadap ikan dapat disebabkan oleh  organisme  lain,  pakan  maupun  kondisi lingkungan yang kurang menunjang kehidupan ikan. Oleh  karena  itu  timbulnya  serangan  penyakit  ikan merupakan hasil interaksi yang tidak serasi antara ikan, kondisi lingkungan dan organisme penyakit. Interaksi yang  tidak  sesuai  ini  dapat  menyebabkan  stres  pada ikan,  sehingga  mekanisme  pertahanan  diri  yang dimilikinya  menjadi  lemah  dan  akhirnya  mudah diserang oleh penyakit (Afrianto dan Liviawati, 1992).
Faktor  utama  penyebab  penyakit  pada  ikan  adalah faktor  internal  dan  eksternal.  Faktor  internal disebabkan  oleh  mikroorganisme,  seperti  bakteri, jamur, virus atau protozoa. Sementara, faktor eksternal disebabkan oleh kualitas air yang buruk, kekurangan pakan,  keracunan  atau  konsentrasi  oksigen  terlarut menurun (Budiana dan Munajat, 2003).
Salah  satu  jenis  bakteri  yang  sering menginfeksi ikan adalah Micrococcus luteus . Penyakit yang disebabkan oleh bakteri gram positif berbentuk bulat ini biasa disebut micrococcosis . Ciri yang paling umum  dari  infeksi  bakteri  ini  adalah  timbulnya  luka pada  kulit  dan  organ  internal  seperti  otot,  liver  dan limpa dengan diikuti penurunan nafsu makan (Aydin dkk., 2005).
Dewasa ini telah banyak dilakukan penelitian tentang  pengobatan  yang  aman  dan  berwawasan lingkungan, yaitu menggunakan sumber daya hayati. Salah  satu  alternatif  yang  dapat  dilakukan  adalah penggunaan buah adas ( Foeniculum vulgare ) sebagai bahan  antibakteri.  Adas  merupakan  herba  tahunan yang  dapat  mencapai  ketinggian  berkisar  antara  1-2 meter dengan percabangan yang banyak serta batang beralur.  Adas  mempunyai  banyak  manfaat  sebagai tanaman obat, salah satu bagian yang dapat digunakan
adalah buah adas (Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik, 2008).
Buah  adas  mengandung  minyak  atsiri sebesar 1-6 persen (Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik,  2008).  Kandungan  minyak  atsiri  tersebut lebih  tinggi  bila  dibandingkan  dengan  jahe  merah ( Zingiber  officinale  Rosc. )  yang  mempunyai kandungan  minyak  atsiri  sebesar  2.58-2.72  persen (Tim  Lentera,  2002). Adanya  senyawa  aktif  minyak atsiri  yang  tinggi  pada  buah  adas  diharapkan  dapat digunakan  sebagai  obat  antibakteri yang  aman  tanpa menimbulkan  residu  yang  berdampak  negatif  bagi konsumen,  sehingga  dapat  mengontrol  pertumbuhan bakteri M. luteus pada budidaya ikan air tawar.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui pengaruh  ekstrak  buah  adas  untuk  menghambat  dan membunuh bakteri M. luteus secara in vitro .

## Materi dan Metode Penelitian
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  dilaksanakan  pada  15  Juni  –  05 Juli  2009  bertempat  di  Laboratorium  Bakteriologi, Balai  Karantina  Ikan    Juanda  dan  Tropical  Disease Center  Universitas  Airlangga  Surabaya.  Pembuatan ekstrak  buah  adas  di  Departemen  Farmakologi Fakultas Farmasi Universias Airlangga Surabaya.
Materi Penelitian
Materi penelitian terdiri atas bahan dan alat penelitian.  Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian, antara lain: biakan murni bakteri M. luteus dari insang ikan  koi,  buah  adas, TSA  ( Tryptone  Soy Agar ), TSB ( Tryptone  Soy  Broth ),  MR  ( Methyl  Red ),  VP  ( Voger Prokaeur ),  Gelatin,  TSIA  ( Triple  Sugar  Iron  Agar ), MIO ( Motility Indol Ornithin ), LIA ( Lysine Iron Agar ), media  O/F  ( Oksidatif/Fermentatif ),  media  uji  gula (maltosa, laktosa, arabinosa, inositol, manitol, sukrosa, sorbitol) dan aquades steril, sedangkan peralatan yang digunakan  dalam  penelitian  diantaranya  petridish, tabung  reaksi,  erlenmeyer,  gelas  ukur,  jarum  ose, pembakar  bunsen,  rak  tabung  reaksi,  pipet  tetes, autoklave,  mikroskop,  lemari  pendingin,  timbangan analitik,  inkubator,  pipet  ukur,  oven,  blender  dan vortex.

## Metode Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan, yaitu Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  sepuluh perlakuan dan tiga kali ulangan (Kusriningrum, 1989). Penelitian  ini  menguji  daya  antibakteri  ekstrak  buah adas terhadap bakteri M. luteus secara in vitro . Uji yang
digunakan dalam penelitian ini menggunakan metode pengenceran  untuk  mengetahui Minimum  Inhibitory Concentration (MIC)  dan Minimum  Bacterial Concentration (MBC).

## Hasil dan Pembahasan
Pengamatan  dilihat  warna  coklat  mulai konsentrasi 100% sampai 3,13%, hal ini menandakan pertumbuhan  bakteri  terhambat  dalam  konsentrasi minimum 3,13%, sedangkan pada konsentrasi 1,56% warna variabel coklat menandakan kadar ekstrak buah adas  yang  ada  didalamnya  sudah  mulai  pudar  dan merupakan transisi dari warna coklat ke warna kuning, tetapi pertumbuhan bakteri belum dapat terlihat.  Pada konsentrasi 0,78% sampai dengan konsentrasi 0,195% sudah terlihat warna keruh yang menandakan bakteri telah dapat tumbuh di dalamnya.
Konsentrasi  awal  (100%)  mempunyai  nilai
kekeruhan sebesar 3,523 dan bakteri dapat terhambat pertumbuhannya.  Pertumbuhan  bakteri  terhambat pertumbuhannya bila kadar buah adas masih ada dan tabung berwarna coklat.   Mulai dari konsentrasi awal (100%)  sampai  konsentrasi  3,13%  tabung  masih berwarna coklat, dan pada konsentrasi 1,56% tabung berwarna  variabel  coklat  (artinya  kadar  buah  adas dalam  jumlah  yang  sedikit).  Nilai  kekeruhan spektrofotometer dari konsentrasi 100% sampai 1,56% mengalami  penurunan  yang  stabil,  yaitu  dari  nilai 3,523  sampai  0,699.  Tetapi  pada  konsentrasi  0,78% nilai  kekeruhan  mengalami  kenaikan  sebesar  1,581. Nilai kekeruhan dapat naik dikarenakan kadar ekstrak buah adas sudah tidak ada, dan yang tertinggal adalah TSB  yang  berwarna  kuning  menyebabkan  bakteri dapat tumbuh.
Pertumbuhan  koloni  bakteri  terhambat sampai  konsentrasi  3,13%.  Pertumbuhan  koloni bakteri  tidak  terhambat  mulai  konsentrasi  1,56%. Berdasarkan  hasil  uji  MBC  ekstrak  buah  adas mempunyai  aktivitas  membunuh  atau  bersifat bakterisidal  terhadap  bakteri M.  luteus pada konsentrasi 100% sampai dengan konsentrasi 3,13%. Pada konsentrasi 1,56% sampai dengan 0,195% tidak bersifat bakterisidal terhadap bakteri M. luteus . Pada kontrol negatif yang terdiri dari 1 mL aquades steril dan 1 mL ekstrak buah adas, tidak terdapat pertumbuhan bakteri M.  luteus dan  tidak  terdapat  pertumbuhan bakteri lain, sehingga dapat disimpulkan tidak terjadi kontaminasi selama perlakuan pemberian ekstrak buah adas  pada  semua  tabung  reaksi  dengan  pengenceran yang berbeda.

## Daya Antibakteri Ekstrak ......
Tabel 1. Hasil  uji  MIC  dengan  menggunakan spektrofotometer
Keterangan : Notasi  pada  superskrip  yang  berbeda menunjukkan  perbedaan  yang    nyata (p<0,05)
Zat  yang  berperan  aktif  dalam  buah  adas adalah minyak atsiri (Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik, 2008). Isolat bakteri diperlukan dalam pengujian  efektivitas  ekstrak  buah  adas  untuk  dapat menghambat  dan  membunuh  bakteri  tersebut.  Uji biokomia dan  uji  pewarnaan Gram  diperlukan untuk mengidentifikasi bakteri M. luteus . Hasil uji biokimia bakteri bersifat tidak bergerak, katalase positif, indol negatif, oksidase negatif (Edward and Gerald, 1992). Ekstrak buah adas yang dihasilkan berwarna coklat  tua  dan  kental.  Minyak  atsiri  yang  baru diekstraksi  biasanya  tidak  berwarna  atau  berwarna kekuningan. Namun, faktor warna tersebut bergantung juga  pada  bahan-bahan  yang  dibuat  ekstrak.  Minyak atsiri meningkat dengan meningkatnya temperatur dan perolehan  minyak  atsiri  tertinggi  dicapai  dengan pelarut etanol (Sundari, 2001).
Pengujian  MIC  secara  visual  dapat  dilihat pada kontrol (-), 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% dan 3,13%  terlihat  jernih  dan  berwarna  coklat.  Hal  ini
menandakan  bahwa  ekstrak  buah  adas  masih  dapat menghambat  bakteri,  sedangkan  pada  konsentrasi 1,56% merupakan transisi dari warna coklat ke warna kuning, pada konsentrasi ini masih belum dapat dilihat pertumbuhan bakteri secara visual. Mulai konsentrasi 0,78% dan kontrol (+) sudah terlihat keruh dan tabung berwarna  kuning.  Hal  ini  menandakan  bahwa  pada konsentrasi  ini  ekstrak  buah  adas  sudah  tidak  dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri.  Warna  kuning disebabkan  warna  TSB  yang  dominan  dibandingkan ekstrak buah adas.
P e n g u j i a n   M I C   m e n g g u n a k a n spektrofotometer  yang  mempunyai  nilai  kekeruhan dan  memiliki  sensitifitas  yang  tinggi  terhadap kekeruhan  dan  warna  media.  Pada  penelitian  ini memiliki  dua  warna  yang  berbeda,  pada  konsentrasi awal  (100%)  berisi  ekstrak  buah  adas  yang  sangat pekat  berwarna  coklat  dan  TSB  berwarna  kuning, maka  pada  tabung  akan  terlihat  warna  coklat  yang dominan.  Bila  konsentrasi  semakin  rendah  maka ekstrak  buah  adas  akan  semakin  sedikit  dan  TSB semakin banyak, sehingga terlihat warna kuning yang dominan.  Pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%,  3,13%,  1,56%  nilai  kekeruhan  di spektrofotometer turun secara signifikan. Konsentrasi tersebut  memperlihatkan  warna  coklat  yang  berarti warna dari ekstrak buah adas yang dominan (coklat), sedangkan  konsentrasi  0,78%  0,39%,  0,195%  dan kontrol (+) nilai kekeruhan pada spektrofotometer naik secara  signifikan.  Pada  konsentrasi  tersebut  terlihat warna kuning yang berarti warna TSB yang dominan dan ekstrak buah adas dalam kadar sedikit. Sulit untuk membedakan  tingkat  kekeruhan  secara  pasti  pada pengamatan hasil uji MIC secara visual, sehingga perlu d i l a k u k a n   p e n g a m a t a n   b e r i k u t n y a   d e n g a n menggunakan  spektrofotometer  (Blanc  dan  Michel, 2001).
Semua  perlakuan  yang  diberikan  dalam keadaan  terkontrol,  seperti  saat  proses  pegenceran berisi  ekstrak  buah  adas  dan  saat  proses  peberian suspensi  bakteri M.  luteus tepat  dalam  jumlah  yang sama,  penggunaan  media  yang  tepat,  tidak  terjadi kontaminasi serta tidak terjadi penurunan suhu selama proses  inkubasi.  Hal  ini  sesuai  dengan  pendapat Christofilogiannis  (2001)  yang  menyatakan  bahwa, faktor-faktor  yang  bisa  mempengaruhi  keakuratan hasil akhir uji MIC antara lain: agen antibakteri, suhu, jumlah  inokulum  bakteri  dan  media  kultur.  Apabila terjadi  kesalahan  dalam  penggunaan  media,  suhu inkubasi  tidak  stabil  dan  terjadi  kontaminasi,  maka akan  menimbulkan  masalah,  yaitu  terjadi  kesalahan pangamatan hasil akhir uji MIC (Edward, 2001).
Konsentrasi Rata - rata nilai kekeruhan Kontrol (-) h 3,523 100 h 3,523 50 g 3,304
25
f 2,876 12,5 e 2,417 6,25 c 1,653 3,13 b 1,355 1,56 a 0,699 0,78 c 1,581 0,39 d 2,254 0,195 de 2,309 Kontrol (+) d 2,120
H a s i l   u j i   M I C   m e n g g u n a k a n spektrofotometer setelah dihitung dengan Rancangan Acak  Lengkap  (RAL)  menunjukkan  perbedaan  yang nyata  maka  perlu  dilakukan  uji  Jarak  Berganda Duncan.  Pada  pengujian  MIC  setelah  dilakukan  Uji Berjarak Duncan dapat dilihat nilai terendah terdapat pada  konsentrasi  1,56%.    Pada  konsentrasi  tersebut menandakan bakteri sudah dapat tumbuh didalamnya, hal  ini  sesuai  dengan  pengujian  MBC  sedangkan pembacaan  spektrofotometer  tertinggi  terdapat  pada konsentrasi  100%  dan  kontrol  (-)  mempunyai  nilai sebesar  3,523,  hal  ini  juga  sesuai  dengan  pengujian MBC bakteri tidak dapat tumbuh didalamnya.
Daya bunuh ( bakterisidal ) ekstrak buah adas dapat  diketahui  melalui  uji  MBC  ( Minimum Bakterisidal  Concentration )  dengan  mengamati adanya pertumbuhan koloni pada media TSA setelah inkubasi pada suhu kamar di laminar flow selama 24 jam.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13% ekstrak buah adas bersifat bakterisidal yang dibuktikan dengan  tidak  tumbuhnya  bakteri  pada  media  TSA, sedangkan pada konsentrasi 1,56%, 0,78%, 0,39% dan 0,195% ekstrak buah adas bersifat bakteriostatik yaitu terlihat adanya pertumbuhan bakteri pada media TSA. Gillespie  (1994)  menyatakan  bahwa  zat  antibakteri bersifat  bekterisidal  ditandai  dengan  tidak  adanya pertumbuhan koloni bakteri pada media agar.
Pelczar dan Chan (1988) menyatakan bahwa semakin tinggi konsentrasi antibakteri yang digunakan maka  akan  semakin  cepat  bakteri  yang  terbunuh. Tetapi,  penggunaan  konsentrasi  yang  tinggi  dalam pengobatan  juga  tidak  dianjurkan  karena  disamping menimbulkan resistensi, penggunaan konsentrasi yang tinggi  dapat  bersifat  toksik  pada  hospes  (ikan)  serta kurang  ekonomis  dalam  pemakaiannya.  Hasil penelitian tentang daya antibakteri ekstrak buah adas terhadap  bakteri M.  luteus dapat  dikatakan  bahwa ekstrak buah adas mamiliki daya antibakteri dan efektif sebagai obat antibakteri yang aman.
Mekanisme  kerja  zat  antibakteri  meliputi: antibakteri  yang  menghambat  dan  mengganggu metabolisme sel bakteri, antibakteri yang menghambat sintesis  dinding  sel  bakteri,  antibakteri  yang mengganggu  permeabilitas  membran  sel  bakteri, antibakteri  yang  menghambat  sintesis  protein  sel bakteri  dan  antibakteri  yang  menghambat  atau merusak sintesis nukleat sel bakteri (Amir dkk., 1995).
Ekstrak  buah  adas  memiliki  kandungan  zat aktif minyak atsiri dan flavonoid yang memiliki daya membunuh  bakteri.  Minyak  atsiri  ektrak  buah  adas mengandung senyawa fenol yang terdiri dari chavacrol
dan chavicol. Mekanisme kerja senyawa fenol dalam membunuh  sel  bakteri,  yaitu  dengan  cara mendenaturasi  protein  sel  bakteri.  Akibat terdenaturasinya  protein  sel  bakteri,  maka  semua aktivitas metabolism sel bakteri terhenti, sebab semua aktivitas  metabolisme  sel  bakteri  dikatalisis  oleh enzim yang merupakan protein (Lawrence dan Block, 1968).
Senyawa  flavonoid  memiliki  kemampuan membentuk  kompleks  dengan  protein  sel  bakteri melalui  ikatan  hidrogen.  Struktur  dinding  sel  dan membran  sitoplasma  bakteri  yang  mengandung protein, menjadi tidak stabil karena struktur protein sel bakteri menjadi rusak karena adanya ikatan hidrogen dengan flavonoid, sehingga protein sel bakteri menjadi kahilangan  aktivitas  biologinya,  akibatnya  fungsi permeabilitas  sel  bakteri  terganggu  dan  sel  bakteri akan mengalami lisis yang berakibat pada kematian sel bakteri (Harborne, 1987).
Flavonoid  juga  menyebabkan  perubahan pada  membran  sel  bakteri  yang  diikuti  dengan masuknya  air  yang  tidak  terkontrol  ke  dalam  sel bakteri,  hal  ini  menyebabkan  pembengkakan  sel bakteri  dan  akhirnya  membran  sel  bakteri  pecah. P e c a h n y a   m e m b r a n   s e l   b a k t e r i   i n i ,   j u g a mengakibatkan  kematian  sel  bakteri  (Black  dan Jacobs, 1993).

## Kesimpulan
Ekstrak  buah  adas  ( Foeniculum  vulgare ) mempunyai  kemampuan  menghambat  bakteri Micrococcus  luteus secara in  vitro pada  konsentrasi minimum 1,56% atau 0,018 g/mL.
Konsentrasi  minimum  ekstrak  buah  adas ( Foeniculum vulgare ) yang dapat membunuh bakteri
Micrococcus luteus adalah 3,13% atau 0,036 g/mL.
Diharapkan  dapat  memberikan  informasi dalam  penggunaan  ekstrak  buah  adas  ( Foeniculum vulgare )  sebagai  antibakteri  terhadap  bakteri
Micrococcus luteus secara in vitro .
Diharapkan  adanya  penelitian  lebih  lanjut tentang  daya  antibakteri  ekstrak  buah  adas  secara  i n vivo terhadap ikan.

## Daftar Pustaka
Afrianto,  E.  dan  E.  Liviawaty.  1992.  Pengendalian Hama  dan  Penyakitr  Ikan.  Kanisius.
Yogyakarta. hal. 1-3.
Amir, S., A. Setiawati,. A. Muchtar., A. Arif., B. Bahry., D. Tirza., H. R. Dewoto dan L. Darmansjah. 1995.  Farmakologi  dan  Terapi.  Gaya  Baru.
Jakarta.   hal. 572-573.

## Daya Antibakteri Ekstrak ......
Aydin,  S.,  A  Ciltas,  H.  Yetim  and  I.  Akyurt.  2005. Clinical,  Pathologi  and  Haematological Effect  of  Micrococcus  luteus  in  Rainbow Trout  (Oncorhyncus  mykiss  Walbaum). Journal  of  Animal  and  Veterinary Advances,4 (2): 167-174.
Balai  Penelitian Tanaman  Obat  dan Aromatik.  2008.
A d a s   Ta n a m a n   Ya n g   B e r p o t e n s i Dikembangkan Sebagai Bahan Obat Alami. h t t p : / / b a l i t ro . l i t b a n g . d e p t a n . g o . i d . 21/08/2008. 3pp.
Black, J. M. and E. M. Jacobs. 1993. Medical Surgical Nursing.  4th  edition.  W.  B.  Saunders Company Philadelphia. pp.373-387.
Blanc, G.,and C. Michel. 2001. Minimum Inhibitory
C o n c e n t r a t i o n   M e t h o d o l o g y b i n Aquaculture. Aquaculture, 196: 311-318.
Budiana, N. S., dan A, Munajat. 2003. Pestisida Nabati untuk  Penyakit  Ikan.  Penebar  Swadaya. Jakarta. hal. 1-10.
Christofilogiannis,  P.  2001.  Current  Inoculation M e t h o d s   i n   M I C   D e t e r m i n a t i o n . Aquaculture, 208:1-10.
Edward,  B.  2001.  Clinical  Relevance  of  Minimum
I n h i b i t o r y   C o n c e n t r a t i o n   ( M I C ) . Aquaculture, 196:289-296.
Edward,  J.  and  K.S.  Gerald.  1992.  Riboflavin
Production  During  Growth  of  Micrococcus l u t e u s   o n   P y r i d i n .   A p p l i e d   a n d Environmental  Microbiology.  58,  (No.10): 3423-3425.
Gillespie,  S.  H.  1994.  Medical  Microbiology Illustrated.  Butterworth-Heinemann.
London. pp.234-247.
Harborne,  J.  B.  1987.  Metode  Fitokimia:  Penuntun Cara  Modern  Menganalisa  Tumbuhan. Penerjemah:  Soediro.    ITB.  Bandung.  hal. 154-285.
Kusriningrum.  1989.  Dasar  Perancangan  Percobaan dan  Rancangan  Acak  Lengkap.  Fakultas Kedokteran  Hewan.  Universitas  Airlangga. Surabaya. hal. 53-92.
Lawrence, C. A. and S. S. Block. 1968. Disinfection, Sterilization  and  Preservation.  Lea  and Febiger. Philadelphia.  pp.401-417.
Pelczar, M. J.   dan E. C. S. Chan. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi.  Universitas  Indonesia  Press. Jakarta. hal. 80-86.
Sudjana.  2002.  Metode  Statistika.  Tarsito.  Bandung. hal. 115-130.
Sundari,  E.  2001.  Pengambilan  Minyak  Atsiri  dan Oleoresin  dari  Kulit  Kayu  Manis,  ITB Central Library. Bandung. hal. 1-4.
Tim Lentera. 2002. Khasiat dan Manfaat Jahe Merah Si Rimpang Ajaib. Agromedia Pustaka. Jakarta. hal. 3-15.