Menara Perkebunan 2018, 86(1), 29-37 DOI: http://dx.doi.org/10.22302/iribb.jur.mp.v1i1.278 p-ISSN: 0215-9318/ e-ISSN: 1858-3768                                          Accreditation Number: 588/AU3/P2MI-LIPI/03/2015

## Optimasi produksi enzim ligninolitik dari medium limbah produksi Pleurotus ostreatus menggunakan metode respons permukaan
Optimization of ligninolytic enzyme production from Pleurotus ostreatus medium waste production using surface response methodology
Urip PERWITASARI 1)*) , Firda DIMAWARNITA 2) & Shanti RATNAKOMALA 1)
1) Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, Jl. Raya Bogor Km. 46, Nanggewer Mekar, Cibinong, Bogor 16912, Indonesia
2) Pusat Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia, Jl. Taman Kencana No. 1, Bogor 16128, Indonesia
Diterima tgl  25 Oktober 2017 / disetujui tgl 2 Februari 2018

## Abstract
White  rot  fungi Pleurotus  ostreatus has  long been  produced  on  a  large  scale  for  human consumption.  This  fungi  is  known  to  produce ligninolytic enzymes. The aim of this study was to utilize  waste  fungal  medium  from  empty  fruit bunch  oil  palm  (EFBOP)  for  production  of ligninolytic enzymes. Determination of the optimal conditions  in  this  study  used  the  design  of statistical  experiments  Response  Surface  Method (RSM) with Design Expert ® 10 software. Variables used in this research were EFBOP composition (0, 25,  50,  75,  100  %),  part  baglog  (top,  middle, bottom),  and  time  of  incubation  (1,  2,  and  3 month). The highest lignin peroxidase activity was
1.72  U/mL obtained  on  baglog  composition  with 50% EFBOP the top past of baglog after 2 months incubation.  The  highest  manganese  peroxidase activity  was  23.00  U/mL  obtained  on  baglog composition  with  100%  EFBOP  at  the  bottom  of baglog after 3 months incubation and  the highest laccase  activity  was  0.14  U/mL on  baglog composition  with  100%  EFBOP  the  top  past  of baglog after 1 month.
[Keywords:  Pleurotus  ostreatus ,  ligninolytic enzyme,  fungal  medium  waste, response surface methodology].

## Abstrak
Jamur pelapuk putih Pleurotus ostreatus telah lama  diproduksi  skala  besar  untuk  dikonsumsi. Jamur  ini  diketahui  mampu  menghasilkan  enzim ligninolitik.  Selama  ini  medium  limbah  produksi P.  ostreatus belum  dimanfaatkan.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  memanfaatkan  medium  limbah produksi jamur tiram yang berbahan dasar tandan kosong  kelapa  sawit  (TKKS)  untuk  produksi enzim ligninolitik. Penentuan kondisi optimal pada penelitian  ini  menggunakan  desain  eksperimen statistika  Metode  Respons  Permukaan  ( Response Surface  Method (RSM))  dengan software  Design Expert ® 10 .  Variabel  yang  digunakan  dalam  riset ini  adalah  konsentrasi  TKKS  (0,  25,  50,  75,  100
%), bagian baglog (atas, tengah, dan bawah), dan
waktu inkubasi (1, 2, dan 3 bulan). Aktivitas lignin peroksidase  tertinggi  diperoleh  pada  medium dengan komposisi 50% medium pada bagian atas baglog  setelah  2  bulan  inkubasi  dengan  aktivitas sebesar 1,72 U/mL. Aktivitas mangan peroksidase tertinggi diperoleh pada medium komposisi 100% TKKS pada bagian bawah baglog setelah 3 bulan inkubasi sebesar 23,00 U/mL, dan lakase tertinggi pada medium komposisi 100% TKKS pada bagian atas baglog setelah 1 bulan inkubasi, yaitu sebesar 0,14 U/mL.
[Kata kunci: Pleurotus ostreatus, enzim ligninolitik, limbah media jamur, Metode Respons Permukaan]

## Pendahuluan
Pleurotus  ostreatus atau  lebih  dikenal  dengan nama  jamur  tiram  merupakan  jamur  golongan Basidiomycetes yang  memiliki  tubuh  buah berwarna  putih  dan  berbentuk  seperti  cakram. Jamur  ini  tumbuh  pada  limbah  lignoselulosa seperti jerami padi, sisa gergaji kayu, kulit coklat, ampas  tebu,  pulp  kopi,  pulp  kertas  dan  batang- batang  kapas  ( Sánchez,  2010 ).  Lignoselulosa adalah  bahan  organik  yang  paling  melimpah  di bumi  dan  sebagian  besar  terdapat  pada  limbah agroindustri.  Pemanfaatan  limbah  lignoselulosa untuk  produksi  enzim  ligninolitik  telah  dipelajari secara  ekstensif.  Penelitian  tentang  produksi lakase,  mangan  peroksidase  (MnP),  dan  lignin peroksidase (LiP) dari berbagai residu agroindustri telah banyak dilaporkan. Sebagian besar produksi enzim  ligninolitik  dari  residu  agroindustri berkaitan dengan jamur ( Gassara et al. , 2010).
Konversi  biomassa  lignoselulosa  menjadi bahan berguna dan bernilai ekonomi memerlukan perlakuan  awal  ( pre-treatment )  (Kumar et  al. ,
2009).  Salah  satu  perlakuan  awal  adalah delignifikasi.  Tujuan delignifikasi yang dilakukan oleh  berbagai  industri  adalah  untuk  mendapat selulosa  yang  tidak  terlapisi  oleh  lignin. Biodegradasi lignin sangat penting untuk diaplikasikan  di  industri  pulp  dan  kertas.  Hal  ini merupakan aplikasi  bioteknologi  proses  di pabrik
Optimasi produksi enzim ligninolitik dari limbah baglog TKKS ……………………………… ………….. (Perwitasari et al .)
pulp  dan  kertas.  Enzim  ligninolitik  dapat menjawab  tantangan  industri  pulp  dan  kertas dalam kegunaannya untuk biopulping (Widiastuti et  al. ,  2008).  Selain  itu  enzim  ligninolitik  juga dapat  dijadikan   bahan   farmaseutikal    sebagai pemutih  wajah  dengan  mekanisme  yang  baru (Falade et  al. ,  2017).  Enzim  pelarut  lignin ekstraselular utama adalah lakase, MnP, dan  LiP. Lakase  adalah  oksidase    polifenol    yang mengandung      tembaga.  Lakase  mengkatalisis pelepasan  empat  elektron  oksigen  ke  air  dan  ini biasanya disertai dengan  oksidasi substrat fenolik menjadi  fenoksi  radikal.  Berat  molekul  lakase antara 60-80 kDa dan titik isoelektriknya antara 3 dan  4.  Mangan  peroksidase  adalah  enzim  yang mengoksidasi  Mn 1+ menjadi  Mn 3+ menggunakan H 2 O 2 sebagai  oksidator.  Bobot  molekul  MnP adalah 40-50 kDa dan titik isoelektriknya antara 3 sampai  4.  Lignin  peroksidase  juga  dapat mengoksidasi senyawa aromatik non fenolik.
Gen  penyandi  enzim  ligninolitik  dapat terekspresi  pada  media  dengan  kondisi  sedikit nitrogen  dan  karbon  (Sindhu et  al. ,  2016). Pengaturan  ekspresi  gen  yang  mengkode  enzim ligninolitik  merupakan  proses  yang  sangat kompleks  dengan  berbagai  faktor  salah  satunya adalah sumber nitrogen (Janusz et al ., 2013).
Penelitian  tentang  ekstraksi  enzim  ligninolitik dari  fermentasi  padat  pernah  dilakukan  oleh Szabo et  al. (2015)  ekstraksi  enzim  dilakukan dengan  proses  sonifikasi  media  dalam  buffer. Ergun et al . (2017) menunjukkan bahwa produksi enzim  MnP  maupun  lakase  optimum  setelah  17 hari  inkubasi.  Widiastuti et  al. (2008)  meneliti aktivitas  enzim  ligninolitik  selama  pertumbuhan miselium  dan  munculnya  tubuh  buah Pleurotus ostreatus .  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa aktivitas enzim lakase tinggi adalah pada minggu pertama  inkubasi  sedangkan  MnP  dan  LiP  tinggi adalah  setelah  minggu  kedua  dan  keempat inkubasi.  Suharyanto et  al. (2012)  melaporkan kemampuan enzim ligninolitik dari Omphalina sp. dalam  menjernihkan  limbah  cair  pabrik  kosmetik setelah  delapan  hari.  Kuswytasari et  al. (2015) memproduksi  enzim  ligninolitik  dari Gliomastix sp. dengan media limbah agroindustri. Selama ini produksi jamur tiram dilakukan menggunakan sisa serbuk  gergaji  sebagai  sumber  karbon,  padahal limbah agroindustri yang menumpuk pada saat ini adalah  limbah  tandan  kosong  kelapa  sawit (TKKS).  Oleh  sebab  itu  penelitian  ini  bertujuan untuk  memperoleh  titik  optimum  produksi  enzim ligninolitik  dari  medium  limbah  produksi  jamur tiram  yang  ditanam  pada  baglog  dengan  substrat TKKS.

## Bahan dan Metode

## Isolat dan baglog
Isolat  jamur P.  ostreatus yang  digunakan berasal  dari  CV  Asa  Agro  Corporation.  Isolat  ini
ditumbuhkan pada baglog dengan variasi konsentrasi  TKKS  dan  serbuk  gergaji  (Tabel  1). Selain  TKKS  dan  serbuk  gergaji,  media  tumbuh jamur  juga  ditambahkan  dedak  44,64  g,    CaCO 3 13,39 g, dan TSP 4,47 g.  Setelah baglog ditumbuhi jamur  setiap  bulan  ke  1,  ke  2,  dan  ke  3  media tersebut  dibagi  menjadi  tiga  bagian  (bagian  atas, tengah  dan  bawah).  Kemudian  diekstraksi  untuk diuji aktivitas enzim ligninolitiknya.

## Analisis aktivitas enzim
Aktivitas  enzim  ligninolitik  diukur  per  bulan pada  baglog  jamur.  Sebanyak  2,5  g  substrat dihaluskan  dengan  penambahan  20  mL  buffer fosfat.  Kemudian disentrifugasi 9000 rpm selama 15  menit.  Kemudian  supernatan  (filtrat)  yang diperoleh  digunakan  sebagai  sumber  enzim. Penentuan  aktivitas  enzim  untuk  masing-masing jenis enzim mengikuti metode sebagai berikut:
a. Aktivitas lakase (Buswell et al., 1995)
Sebanyak 0,4 mL filtrat enzim ditambah bufer asetat pH 5 0,05 M sebanyak 0,5 mL dan 0,1 mL ABTS  1  mM.  Selanjutnya  larutan  divorteks  dan pengukuran  dibaca  pada  panjang  gelombang  420 nm.  Pembacaan  dilakukan  pada  menit  ke-0  dan menit 30.
b. Aktivitas  mangan  peroksidase  (Kofujita et  al.,
1992)
Sebanyak 0,1 ml bufer Na-laktat 50 mM pH 5 ditambahkan  dengan  0,1  mL  guaiacol  4  mM;  0,2 mL MnSO 4 1mM; 0,1 ml H 2 O 2 1 mM dan aquades 0,3  mL,  kemudian  ditambahkan  0,2  mL  filtrat enzim.  Larutan  kemudian  divorteks  dan  dibaca pada panjang gelombang 465 nm, pada menit ke-0 dan 30.
c. Aktivitas lignin peroksidase (Tien & Kirk, 1984)
Veratril  alkohol  8  mM  sebanyak  0,1  mL ditambahkan  dengan  0,2  mL  bufer  asetat  0,05  M pH 5, akuades 0,4 mL,  H 2 O 2 1 mM sebanyak 0,1 mL  dan  0,2  mL  filtrat  enzim  divorteks  dan dilakukan pembacaan pada menit ke-0 dan 30 pada panjang gelombang 310 nm.
Perhitungan akitivitas enzim =
t x ml enzim xVol d x x ml Vtotal x Ao At maks ) ( 10 ) ( ) ( 6  −
Ao =  absorbansi awal (menit ke-0) At =  absorbansi akhir (menit ke-30) d =  ketebalan kuvet ɛ maks =  absorpsivitas  molar,  untuk  masing- masing  substrat  pada  uji  enzim: ABTS:  36000  M -1 cm -1 ,  Guaiacol:
12100  M -1 cm -1 ,  Veratril  alcohol  :
9300 M -1 cm -1 .

## Desain penelitian
Penelitian  dirancang  menggunakan  tiga  buah variabel yaitu  konsentrasi  TKKS, bagian  baglog,
Menara Perkebunan 2018, 86(1), 29-37
serta waktu sampling baglog (Tabel 2). Penentuan kondisi  optimal pada penelitian ini  menggunakan desain  eksperimen  statistika  Metode  Respon Permukaan  ( Response  Surface  Method (RSM)) dengan software  Design  Expert®  10 .  Hasil pengolahan software diperoleh 20 percobaan yang merupakan kombinasi konsentrasi medium limbah (A),  bagian  baglog  (B),  serta  waktu  inkubasi  (C) (Tabel 3).

## Hasil dan Pembahasan
Media  tumbuh  dari  limbah  produksi  jamur tiram  diekstraksi  untuk  mendapatkan  enzim ligninolitik.  Komposisi  baglog  diberikan  variasi perbandingan substrat antara TKKS dengan serbuk gergaji  (Tabel 1).  Ekstraksi enzim dilakukan di 3 bagian  baglog  (bawah,  tengah,  atas)  serta  variasi waktu  pemanenan  dari  media  limbah  produksi jamur  tiram  (1,  2,  dan  3  bulan).  Hasil  analisis aktivitas enzim ligninolitik, hasil eksperimen serta prediksi  tersaji  pada  Tabel  4.  Nilai  ANOVA  p- value  dari  masing-masing  variabel  untuk  model persamaan  kuadratik  dalam  produksi  enzim ligninolitik tersaji pada Tabel 5.

## Lignin peroksidase
Melalui  aplikasi  RSM  ditunjukkan  bahwa produksi  enzim  lignin  peroksidase  dari  medium limbah  baglog  dengan  tiga  buah  variabel konsentrasi  TKKS  (A),  bagian  baglog  (B),  dan waktu  inkubasi  (C)  dapat  diprediksi  dengan persamaan di bawah ini:
Lignin peroxidase (LiP) = 0,670 + 0,054 (A) + 0,180 (B) + 0,007 (C) – 0,044 (AB) + 0,004 (AC) – 0,019 (BC) – 0,582 (A 2 ) + 0,540 (B 2 ) – 0,607 (C 2 )
Hasil  uji  aktivitas  enzim  lignin  peroksidase serta prediksinya dapat dilihat pada Tabel 4. Lignin peroksidase  optimum  didapat  pada  komposisi baglog dengan 50 % medium limbah produksi P. ostreatus di  bagian  atas  baglog  setelah  2  bulan inkubasi. Kondisi optimum tersebut sama baik dari hasil pengamatan maupun dari prediksi. Aktivitas lignin  peroksidase  hasil  pengamatan  sebesar  1,72 ±  0,0  U/mL  lebih  tinggi  dari  hasil  prediksi  yang sebesar  1,38  U/mL.  Hasil  pengamatan  ANOVA untuk  produksi  lignin  peroksidase  menunjukkan bahwa  model  riset  ini  signifikan  dengan  nilai  P sebesar 0,017 dan nilai R 2 sebesar 0,790.

## Tabel 1. Perbandingan TKKS dan serbuk gergaji yang dilakukan dalam percobaan
Table 1. Comparison of TKKS and sawdust conducted in the experiment
Komposisi/composition TKKS/ EFBOP (g) Serbuk gergaji/ Sawdust (g) B1 0 937,5 B2 234,375 703,125 B3 468,75 468,75 B4 703,125 234,375 B5 937,5 0
Table 2.Variabel optimasi produksi enzim ligninolitik dari limbah baglog P. ostreatus
Table 2. Variable optimation of ligninolitic enzyme production from exbaglog P.ostreatus
Variabel/ Variable Kode/ Code Level/ Level 2 -1 0 1 2 Konsentrasi TKKS (%)/ Concectration of EFBOP (%) A 0 25 50 75 100 Bagian baglog/ Part of baglog B - Bawah/ under (1) Tengah/ middle (2) Atas/ above (3) - Waktu inkubasi (bulan)/ Time of incubation (month) C - 1 2 3 -
Keterangan: A= Konsentrasi TKKS (%), B= Bagian baglog, C= Waktu inkubasi (bulan) Notes: A= Concectration of EFBOP(%), B= Part of baglog, C= Time of incubation (month)
Tabel 3. Rancangan percobaan hasil Design Expert® 10 Table 3. Experimental design from Design Expert® 10
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A 0 50 100 50 25 50 50 100 100 100 0 50 0 100 0 75 100 0 0 50 B 3 2 2 3 1 3 2 2 1 3 1 2 2 3 2 2 1 1 3 1 C 3 3 2 2 2 2 3 2 3 3 1 3 2 1 2 1 1 3 1 1
Keterangan: A= Konsentrasi TKKS (%), B= Bagian baglog, C= Waktu inkubasi (bulan) Notes: A= Concectration of TKKS (%), B= Part of baglog, C= Time of incubation (month)
Optimasi produksi enzim ligninolitik dari limbah baglog TKKS ………………….. …………………….….. (Perwitasari et al. )
Analisis respon permukaan konsentrasi medium limbah P. ostreatus , bagian baglog, serta waktu inkubasi terhadap produksi lignin peroksidase ditunjukkan pada Gambar 1. Semakin tinggi komposisi konsentrasi medium limbah tidak linier  dengan  aktivitas  lignin  peroksidase  yang dihasilkan.  Waktu  inkubasi  baglog  yang  semakin lama  juga  tidak  meningkatkan  aktivitas  lignin peroksidase. Bagian baglog terbaik untuk produksi enzim  lignin  peroksidase  terletak  di  atas  baglog. Hasil  ANOVA  memperlihatkan  masing-masing variabel maupun interaksi antar variabel mempengaruhi produksi enzim lignin peroksidase. Namun  kuadratik  dari  masing-masing  variabel tidak  mempengaruhi  produksi  lignin  peroksidase (Tabel 5).
Aktivitas tertinggi lignin peroksidase diperoleh pada  bagian  baglog  paling  atas  (Tabel  4).  Hal tersebut  disebabkan  bagian  atas  baglog  adalah tempat  inokulasi  jamur.  Lignin  peroksidase diproduksi oleh P. ostreatus untuk memutus ikatan C-C atau C-O-C pada rantai non-fenolik aromatik dari  substrat  dengan  cepat  (Wong,  2009; Pollegioni et  al .,  2014).  Substrat  yang  telah terdegradasi akan lebih mudah dimanfaatkan oleh P.  ostreatus untuk  pertumbuhannya.  Sehingga  di bagian  atas  baglog  miselium P.  ostreatus mulai tumbuh  baru  merambat  ke  bawah.  Pertumbuhan miselium  berbentuk  seperti  kapas  putih  yang dimulai dari tempat  inokulasi bibit jamur (bagian atas baglog) kemudian menjalar ke bawah  baglog

## Tabel 4. Aktivitas enzim ligninolitik
Table 4. Activity of enzyme ligninolytic
No A B C LiP (U/mL) MnP (U/mL) Lakase (U/mL) actual/ actual prediksi/ prediction actual/ actual prediksi/ prediction actual/ actual prediksi/ prediction 1 0 3 3 0,036 0,164 0,551 0,817 0,003 -0,014 2 50 2 3 0,036 0,071 10,193 9,256 0,006 0,002 3 100 2 2 0,161 0,143 3,719 4,927 0,052 0,041 4 50 3 2 1,72 1,382 3,306 4,707 0,018 0,037 5 25 1 2 0,143 0,825 6,887 4,651 0,018 0,027 6 50 3 2 1,72 1,382 3,306 4,708 0,019 0,037 7 50 2 3 0,036 0,071 10,193 9,255 0,006 0,002 8 100 2 2 0,161 0,143 3,719 4,927 0,052 0,041 9 100 1 3 0,072 -0,038 23,002 22,899 0 -0,008 10 100 3 3 0,036 0,195 10,193 10,073 0,009 0,023 11 0 1 1 0,036 -0,29 2,617 3,721 0,006 0,025 12 50 2 3 0,036 0,071 10,192 9,255 0,003 0,002 13 0 2 2 0,018 0,033 1,928 0,436 0,025 0,013 14 100 3 1 0 0,209 7,3 4,245 0,145 0,105 15 0 2 2 0,018 0,033 1,928 0,4365 0,024 0,013 16 75 2 1 0,036 -0,064 0,413 3,794 0,003 0,057 17 100 1 1 0 -0,1 4,132 3,446 0,006 0,044 18 0 1 3 0,036 -0,247 3,444 6,213 0,003 0,023 19 0 3 1 0,018 0,198 11,845 11,95 0,012 0,017 20 50 1 1 0,251 0,387 5,647 4,798 0,111 0,035
Keterangan: A= Konsentrasi TKKS (%), B= Bagian baglog, C= Waktu inkubasi (bulan) Notes: A= Concectration of EFBOP (%), B= Part of baglog, C= Time of incubation (month)
Tabel 5. ANOVA p-value untuk model persamaan kuadratik dalam produksi enzim ligninolitik Table 5. ANOVA p-value for model quadratic equations in the production of ligninolytic enzymes
Enzime Model A B C AB AC BC A 2 B 2 C 2 LiP 0,0178 0,5665 0,0896 0,9411 0,7015 0,9661 0,8650 0,0047 0,0080 0,0037 MnP 0,0005 0,0055 0,1121 0,0094 0,0390 0,0003 0,0012 0,2974 0,1067 0,0146 Lakase 0,4824 0,2261 0,6017 0,0870 0,2253 0,3595 0,5791 0,9873 0,8378 0,8335
Gambar 1. Respon produksi lignin peroksidase
Figure 1.   Respons production of lignin peroxidase
dimana nutrisi jamur banyak tersedia (Gern et al. , 2008).
Respon  lignin  peroksidase  terhadap  waktu inkubasi  terlihat  naik  pada  bulan  kedua  inkubasi kemudian turun kembali di bulan ketiga (Gambar
1). Hal tersebut dikarenakan pada bulan pertama P. ostreatus baru  mulai  tumbuh  dan  pada  bulan  ke tiga nutrisinya sudah habis.
Hasil ANOVA untuk produksi lignin peroksidase menunjukkan nilai Fisher’s F-test dari model ini sebesar 4,18, dengan nilai p untuk model ini  cukup  rendah  yaitu  sebesar  0,017.  Angka  ini menunjukkan  bahwa  model  ini  signifikan  untuk menentukan  titik  optimum  dalam  memproduksi lignin  peroksidase.  Pada  Tabel  5  Nilai  p  untuk masing-masing  variabel  konsentrasi  TKKS  (A), bagian baglog (B), serta waktu inkubasi (C) yang berada  di  atas  0,017  mengindikasikan  setiap parameter tersebut mempengaruhi produksi lignin peroksidase  secara  signifikan.  Regresi  kuadarat dari analisis ini sebesar 0,79, artinya 79% produksi lignin peroksidase dapat dijelaskan dengan model riset ini.

## Mangan peroksidase
Aplikasi  RSM  menunjukan  produksi  enzim mangan peroksidase dari medium limbah produksi P. ostreatus dengan tiga buah variabel konsentrasi medium  (A),  bagian  baglog  (B),  dan  waktu inkubasi (C) dapat diprediksi melalui persamaan di bawah ini:
Mangan peroxidase (MnP) = 3,896 + 2,245 (A) – 1,149 (B) + 2,080 (C) – 1,858 (AB) + 4,240 (AC) – 3,406 (BC) – 1,214 (A 2 ) + 1,960 (B 2 ) + 3,278 (C 2 )
Hasil  uji  aktivitas  enzim  mangan  peroksidase serta  prediksinya  dapat  dilihat  pada  Tabel  4. Mangan  peroksidase  optimum  didapat  pada komposisi baglog dengan 100% medium limbah di bagian  bawah  baglog  setelah  3  bulan  inkubasi. Kondisi  optimum  tersebut  sama  baik  dari  hasil pengamatan  maupun  dari  prediksi.  Aktivitas mangan  peroksi-dase  hasil  pengamatan  sebesar
23,00 ± 0,00 U/mL lebih tinggi dari hasil prediksi yang  sebesar            22,89  U/mL.  Hasil  pengamatan ANOVA  untuk  produksi  mangan  peroksidase menunjukkan  bahwa  model  riset  ini  signifikan dengan  nilai  P  sebesar  0,000452  dan  nilai R 2 sebesar 0,9068.
Analisis respon permukaan konsentrasi medium  limbah,  bagian  baglog,  serta  waktu inkubasi  terhadap  produksi  mangan  peroksidase ditunjukkan  pada  Gambar  2.  Semakin  tinggi konsentrasi  medium  limbah  maka  aktivitas mangan  peroksidase  yang  dihasilkan  semakin tinggi. Waktu inkubasi baglog yang semakin lama dapat meningkatkan aktivitas mangan peroksidase. Hasil  ANOVA  memper-lihatkan  masing-masing variabel,  kuadratik  dari  masing-masing  variabel maupun  interaksi  antar  variabel  seluruhnya mempengaruhi produksi enzim mangan peroksidase (Tabel 5).
Pada  penelitian  ini  aktivitas  MnP  meningkat pada  bulan  ke  tiga  (Gambar  2).  Penelitian  yang dilakukan  Lechner  &  Papinutti  (2006)  juga menunjukkan  aktivitas  MnP  tertinggi  setelah  90 hari  inkubasi.  Baglog  dengan  komposisi  medium limbah  100%  menghasilkan  aktivitas  MnP  yang paling  tinggi,  hal  ini  menunjukkan  bahwa  TKKS sebagai  mahan  medium  dapat  dijadikan  sebagai substrat  pengganti  selain  serbuk  gergaji  untuk pertumbuhan P.  ostreatus .  Aktivitas  enzim ligninolitik  dipengaruhi  pH,  konsentrasi  substrat, suhu, nitrogen, dan mineral seperti tembaga (Patel et al., 2009 , Kenkebashvili et al ., 2015). Montoya et  al. (2015)  menunjukan  aktivitas  MnP  nilainya relatif  stabil  selama  50  hari  inkubasi.  Enzim mempunyai  aktivitas  yang  optimum  pada  satu harga pH tertentu yang disebut juga pH optimum. Jika  enzim  berada  pada  pH  yang  lebih  kecil  dari pH  optimum, maka aktivitas enzim mengkatalitik reaksi belum optimal. Sebaliknya pada pH di atas pH  optimum,  enzim  akan  terdenaturasi  karena rantai polipeptida akan terputus sehingga struktur protein akan membuka (Khouni et al. , 2011). Hal ini  menyebabkan  enzim  tidak  lagi  mempunyai aktivitas katalitik.
Gambar 2. Respon produksi mangan peroksidase
Figure 2. Responce production of mangan peroxidase
Peran  enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi sangat  bergantung  pada  jenis  substrat  yang spesifik.  Kontak  antara  substrat  dengan  enzim terjadi  pada  sisi  aktif  enzim.  Kontak  ini  hanya mungkin  terjadi  apabila  sisi  aktif  enzim mempunyai  ruang  yang  tepat  untuk  menampung substrat  yang  sesuai.  Penambahan  substrat  akan semakin  meningkatkan  kontak  yang  terjadi  pada sisi  aktif  enzim  sampai  pada  konsentrasi  yang optimum.
Hasil  ANOVA  untuk  produksi  mangan peroksidase menunjukkan nilai Fisher’s F-test dari model  ini  sebesar  10,82  dengan  nilai  p  untuk model  ini  cukup  rendah  yaitu  sebesar  0,0005, angka  ini  menunjukkan  bahwa  model  ini signifikan untuk menentukan titik optimum dalam memproduksi  mangan  peroksidase.  Pada  Tabel  5 Nilai p untuk masing-masing variabel konsentrasi TKKS  (A),  bagian  baglog  (B),  serta  waktu inkubasi  (C)  yang  berada  di  atas  0,0005 mengindikasikan setiap parameter tersebut mempengaruhi  produksi  mangan  peroksidase secara signifikan. Regresi kuadarat dari analisis ini sebesar  0,90,  artinya  90%  produksi  mangan peroksidase  dapat  dijelaskan  dengan  model  riset ini.

## Lakase
Aplikasi  RSM  menunjukan  produksi  enzim lakase  dari  medium  limbah  produksi P.  ostreatus dengan tiga buah variabel konsentrasi medium (A), bagian  baglog  (B),  dan  waktu  inkubasi  (C)  dapat diprediksi melalui persamaan di bawah ini:
Lakase =  0,027 + 0,014 (A) + 0,006 (B) – 0,020 (C) + 0,017 (AB) – 0,012 (AC) – 0,007 (BC) – 0,000 (A 2 ) + 0,003 (B 2 ) – 0,004 (C 2 )
Hasil  uji  aktivitas  enzim  lakase  serta prediksinya  dapat  dilihat  pada  Tabel  4.  Lakase optimum  didapat  pada  100  %  medium  limbah  di bagian  atas  baglog  setelah  1  bulan  inkubasi. Kondisi  optimum  tersebut  sama  baik  dari  hasil pengamatan  maupun  dari  prediksi.  Aktivitas lakase hasil pengamatan sebesar 0,14 ± 1,27 x 10 -6 U/mL lebih tinggi dari hasil prediksi yang sebesar
0,10  U/mL.  Hasil  pengamatan  ANOVA  untuk produksi  lakase  menunjukkan  bahwa  model  riset ini tidak signifikan dengan nilai P sebesar 0,48 dan nilai R 2 yang sangat kecil hanya sebesar 0,48. Analisis respon permukaan konsentrasi medium  limbah,  bagian  baglog,  serta  waktu inkubasi  terhadap  produksi  lakase  ditunjukkan pada  Gambar  3.  Semakin  tinggi  konsentrasi medium  limbah  maka  aktivitas  lakase  yang dihasilkan semakin tinggi. Waktu inkubasi baglog yang  semakin  lama  dapat  meningkatkan  aktivitas lakase.  Hasil  ANOVA  memperlihatkan  masing- masing  variabel,  kuadratik  dari  masing-masing variabel maupun interaksi antar variabel seluruhnya mempengaruhi produksi enzim lakase (Tabel 5).
Aktivitas lakase pada baglog bagian atas tinggi pada  saat  awal  inkubasi,  pola  ini  sama  dengan Lechner & Papinutti (2006). Aktivitas lakase yang dihasilkan dalam riset ini masih kurang tinggi, hal tersebut  diduga  disebabkan  karena  variasi  dari bahan aromatik suatu bahan dapat mempengaruhi aktivitas  dari  enzim  ligninolitik  yang  dihasilkan (Haritash & Kaushik, 2009).
Penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan  oleh Mikiashvili et al. (2004), menggunakan kulit jeruk mandarin  sebagai  substratnya,  menunjukkan bahwa P. ostreatus adalah jamur penghasil enzim lakase  dan  MnP.  Dengan  substrat  kulit  jeruk tersebut  menghasilkan  aktivitas  enzim  lakase tertinggi sebesar 62 U/mL. Sedangkan menggunakan  substrat  CMC    aktivitas  enzim lakase  yang  dihasilkan  sebesar  18  U/mL, menggunakan  sodium  glukonat  menghasilkan nilai  aktivitas  9,3  U/mL.  Tidak  satupun  dari karbohidrat murni yang digunakan sebagai substrat dapat  menghasilkan  enzim  lakase  melebihi substrat kulit jeruk mandarain. Karbohidrat murni yang  memiliki  partikel  berupa  selulosa  kristal tidak  dapat  larut  sempurna  sehingga  menjadi substrat  yang  buruk  dalam  memproduksi  enzim. Sedangkan senyawa metabolis relatif mudah larut sempurna  sehingga  dapat  menghasilkan  aktivitas enzim yang relatif tinggi.
Gambar 3. Respon produksi lakase Figure 3.   Responce production of laccase
Enzim  lakase  aktivitas  tertinggi  sebelum muncul tubuh buah Agrocybe aegerita ( Isikhuemhen et  al. ,  2009).  Stajic' et  al .  (2006) mengamati aktivitas lakase tertinggi pada substrat yang  mengandung  manitol,  glukosa,  dan  natrium glukonat  pada  dua  strain P.  ostreatus .  Aktivitas lakase  tertinggi  dihasilkan  oleh P.  ostreatus 98 yang  ditanam  pada  medium  dengan  substrat polisakarida xilan. Selain itu, aktivitas lakase dapat ditingkatkan  dengan  cara  co-cultur  antara Ganoderma  lucidum dan Trametes  versicolor (Kuhar et al., 2015)
Hasil ANOVA untuk produksi lakase menunjukkan  nilai Fisher’s  F-test dari  model  ini sebesar 1,02 dengan nilai p untuk model ini cukup tinggi yaitu sebesar 0,48. Angka ini menunjukkan bahwa  model  ini  tidak  signifikan  untuk menentukan  titik  optimum  dalam  memproduksi lakase. Pada Tabel 5 Nilai p untuk masing-masing variable  konsentrasi  medium  limbah  (A),  bagian baglog (B), serta waktu inkubasi (C) yang berada di  atas  0,48  mengindikasikan  setiap  parameter tersebut mempengaruhi produksi mangan peroksidase  secara  signifikan.  Regresi  kuadarat dari  analisis  ini  sebesar  0,48,  artinya  hanya  48% produksi  lakase  dapat  dijelaskan  dengan  model riset ini.

## Kesimpulan
Media produksi jamur tiram dengan substrat TKKS  dapat  dimanfaatkan  untuk  produksi  enzim ligninolitik.  Dari  hasil  ANOVA  model  riset  ini dengan variabel konsentrasi media limbah, bagian baglog,  dan  waktu  inkubasi  secara  signifikan mempengaruhi produksi lignin peroksidase dengan aktivitas tertinggi sebesar 1,72 U/mL yang diperoleh  pada  komposisi  media  limbah  50% media limbah di bagian atas baglog setelah 2 bulan inkubasi.  Aktivitas  mangan  peroksidase  juga secara signifikan dipangaruhi oleh ketiga variabel di atas, dengan aktivitas tertinggi pada komposisi 100%  media  limbah  di  bagian  bawah  baglog setelah  3  bulan  inkubasi  sebesar  23  U/mL. Sedangkan produksi lakase tidak secara signifikan dipengaruhi  oleh  ketiga  varibel  tersebut.  Hasil
aktivitas  lakase  tertinggi  sebesar  0,14  U/mL didapat  pada  komposisi  100%  media  limbah  di bagian atas baglog setelah 1 bulan inkubasi

## Ucapan Terima Kasih
Kami  ucapkan  terima  kasih  kepada  Dr.Yopi atas  dukungan,  arahan,  atas  kerja  sama  antara Pusat  Penelitian  Bioteknologi  LIPI  dengan  Pusat Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri Indonesia, sehingga riset yang didanai oleh Badan Pengelola Dana Perkebunan Kelapa Sawit (BPDPKS) tahun 2016 ini dapat berjalan dengan lancar.

## Daftar Pustaka
Buswell JA , Yijin C &  Shu-ting C (1995). Effect of  nutrient  nitrogen  and  manganase  on manganase peroxidase and laccase production by Lentinula (Lentinus) edodes . FEMS Microbiol Lett 128 (1), 81-87.
Ergun  SO  &  RO  Urek  (2017).  Production  of ligninolytic enzymes by solid state fermentation using Pleurotus ostreatus. Annals of Agrarian Science 15, 237-277.
Falade  AO,  UU  Nwodo,  BC  Iweriebor,  E  Green, LV  Mabinya  &  AI  Okoh  (2017).  Lignin peroxidase  functionalities  and  prospective applications. Microbiology Open 6(1), 1-14.
GassaraF,  Brar  SK,  Tyagi  RD,  Verma  M  & Surampalli  RY  (2010).  Screening  of  agro- industrial  wastes  to  produce  ligninolytic enzymes  by Phanerochaete  chrysosporium . Biochemical  Engineering  Journal 49(3),  388-
394.
Gern RMM, Wisbeck E, Rampinelli JR, Ninow JL
&  Furlan  SA(2008).  Alternative  medium  for production of Pleurotus ostreatus biomass and potential antitumor polysacchari- des. Bioresource Technology 99(1), 76-82.
Haritash AK & Kaushik CP (2009). Biodegradation aspects of polycyclic aromatic hydrocarbons  (PAHs):  a  review. Journal  of Hazardous Materials 169(1), 1-15.
Optimasi produksi enzim ligninolitik dari limbah baglog TKKS ………………….. ……………………….. (Perwitasari et al. )
Hassan  A,  Salema  AA,  Ani  FN  &  Bakar  AA (2010). A review on oil palm empty fruit bunch fiber ‐ reinforced polymer composite  materials. Polymer Composites 31(12), 2079-2101.
Isikhuemhen  OS,  Mikiashvili  NA&  Kelkar  V
(2009).  Application  of  solid  waste  from anaerobic  digestion  of  poultry  litter  in Agrocybe  aegerita cultivation:  mushroom production,  lignocellulolytic  enzymes  activity and substrate  utilization. Biodegradation 20 (3), 351-361.
Janusz  G,  KH  Kucharzyk,  A  Pawlik,  M Staszczak&  AJ  Paszczynski  (2013).  Fungal laccase,  manganese  peroxidase  and  lignin peroxidase:  gene  expression  and  regulation.
Enzyme Microb Technol 52, 1-12.
KenkebashviliN,  V  Elisashvili  &  SP  Wasser
(2012). Effect of carbon, nitrogen sources, and copper  concentration  on  the  ligninolytic enzyme  production  by Coriolopsis  gallica . Journal of Waste Conversion, Bioproducts and Biotechnology 1(2), 22-27.
Khouni I, B Marrot, P Moulin & RB Amar (2011). Decolourization of reconstituted textile effluent  by  different  process  treatments: Enzymatic  caltalysis,  coagulation/flocculation and nanofiltration processes. Desalination 268 (1-3), 27-37.
Kofujita H, Matsushima A, Ohsaki T, Asada Y&
Kuwahara  M  (1992).  Production  of  phenol oxidizing  enzyme  in  wood-meal  medium  by white  rot  fungi. Mokuzai  Gakkaishi 38,  950– 955.
Kuhar  F,  V  Castiglia  &  L  Levin  (2015). Enhancement  of  laccase  production  and malachite green decolorization by co-culturing Ganoderma  lucidum and Trametes  versicolor in  solid-state  fermentation. International Biodeterioration  &  Biodegradation 104,  238- 243.
Kumar P, Barrett DM, Delwiche MJ & Stroeve P (2009). Methods for pretreatment of lignocellulosic biomass for efficient hydrolysis and biofuel production. Industrial & engineering  chemistry  research 48(8),  3713-
3729.
Kuswytasari ND, M  Shovitri& E Zulaika (2015). Ligninolitic  enzymes  produced  by Gliomastix s p.  in  an  organic  waste  medium. IPTEK  the Journal for Technology and Science 26 (1), 5-
9.
Lechner BE & VL Papinutti (2006). Production of lignocellulosic  enzymes  during  growth  and fruiting  of the edible  fungus Lentinus tigrinus
on wheat straw. Process Biochemistry 41,594– 598
Levin  L,  C  Hermann  &  VL  Papinutti  (2008).
Optimization  of  lignocellulolytic  enzyme production  by  the  white-rot  fungus Trametes trogii in  solid-state  fermentation  using response  surface  methodology. Biochemical Engineering Journal 39, 207–214
Mikiashvili  N,  Wasser  S,  Nevo  E,  Chichua  D  &
Elisashvili V (2004). Lignocellulolytic enzyme activities of medicinally important basidiomycetes  from  different  ecological niches. International  Journal  of  Medicinal Mushrooms 6, 63–71.
Montoya  S,  OJ  Sánchez  &  L  Levin  (2015).
Production  of  lignocellulolytic  enzymes  from three white-rot fungi by solid-state fermentation and mathematical modeling . Afr J Biotechnol 14,1304–1317.
Patel  H,  A  Gupte  &  S  Gupte  (2009).  Effect  of different  culture  conditions  and  inducers  on production  of  laccase  by  a  basidiomycete fungal isolate Pleurotus ostreatus HP-1 under solid state fermentation. Bioresource 4(1), 268- 284.
Plácido  J  &  S  Capareda  (2015).  Ligninolytic enzymes:  a  biotechnological  alternative  for bioethanol  production. Bioresources  and Bioprocessing 2(23), 1-14.
Pollegioni  L,  Tonin  F  &  Rosini  E(2015).Lignin ‐ degrading enzymes. The FEBS journal 282 (7), 1190-1213.
Roushdy MM, Abdel-Shakour EH & El-Agamy EI
(2011).  Biotechnological  approach  for  lignin peroxidase  (lip)  production  from  agricultural wastes (rice husk) by Cunninghamella elegans . Journal of American Science 7, 6-13.
Sánchez  C  (2010).  Cultivation  of Pleurotus ostreatus and other edible mushrooms. Applied microbiology  and  biotechnology 85 (5),  1321- 1337.
Sindhu R, P Binod & A Pandey (2016). Biological pretreatment  of  lignocellulosic  biomass  –  an overview. Bioresour Technol 199, 76-82.
Stajic´ M, Persky L, Friesem D, Hadar Y, Wasser S,  Nevo  E  &  Vukojevic´  J  (2006).  Effect  of different  carbon  and  nitrogen  sources  on laccase and peroxidases production by selected Pleurotus  species. Enzyme  and  Microbial Technology 38, 65–73.
Suharyanto, I Kresnawaty, HT Prakoso & DD Eris.
(2012). Ligninolytic activity of Omphalina sp.
Menara Perkebunan 2018, 86(1), 29-37
isolated  from  EFB  and  its  application  for decolorization  of  cosmetic  waste. Menara Perkebunan 80 (2), 48-56.
Szabo  OE,  E  Csiszar,  K  Toth,  G  Szakacs  &  B
Koczka  (2015).Ultrasound-assisted  extraction and  characterization  of  hydrolytic  and oxidative  enzymes  produced  by  solid  state fermentation ultrason. Sonochem 22, 249-256.
Tien  M  &  TK  Kirk  (1984).  Lignin  degrading enzyme  from Phanerochaete  chrysosporium : Purification,  characterization,  and  catalytic properties of a unique H 2 O 2 -requiring oxygenase. In:  Proc  Natl  Acad  Sci  ,USA ,  81,
2280-2284.
Widiastuti  H,  Suharyanto,  A  Wulaningtyas  & Sutamihardja  (2008).  Actvity  of  ligninolitic enzymes  during  growth  and  fruiting  body development of white rot fungi Omphalina sp. and Pleurotus  ostreatus . HAYATI  Journal  of Biosciences 15(4), 140-144.
Wong  DW  (2009).  Structure  and  action mechanism  of  ligninolytic  enzymes. Applied Biochemistry and Biotechnology 157,174–209.
Yasmeen  Q,  M  Asgher,  MA  Sheikh  &  H  Nawaz
(2013).  Optimization  of  ligninolytic  enzymes production through response surface methodology. BioResources 8(1), 944-968.