## ANALISIS MODEL REGRESI SEDIMEN KOLAM LELE, SUKROSA, DAN BIOFERTILIZER TERHADAP PROSES NITRIFIKASI

## REGRESSION MODEL FOR SEDIMENT FOR SEDIMENTS OF CATFISH PONDS, SUCROSES, AND BIOFERTILIZERS ON THE NITRIFICATION PROCESS
Neng Rian Nur’aeni 1) , Hanies Ambarsari 2) , Rohmatussolihat 3) , Endang Sukara 1)*
1) Fakultas Ilmu Hayati, Universitas Surya, Great Western Resort Km.2,7 Lt.1 Jl MH. Thamrin Serpong, Panunggangan Utara, Pinang, Kota Tangerang, Banten 15163 Email: nuraenirian@gmail.com
2) Laboratorium Pusat Teknologi Lingkungan (PTL) –BPPT, Puspiptek Serpong, Tangerang Selatan, Banten
3) Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong Science Center, Cibinong-Bogor, Jawa Barat
Makalah: Diterima 14 Agustus 2018; Diperbaiki 12 Maret 2019; Disetujui 26 Maret 2019

## ABSTRACT
Response  Surface  Methodology  (RSM)  was  used  to  create  regression  model  for  sediment  of  catfish ponds, sucroses, and biofertilizers on the nitrification process. The sediment of catfish pond used was sediment collected  from  catfish  farm  at  age  of  21  days  after  seed  stocking.  The  nitrification  process  was  done  in  active sludge reactor of 1 L reactor working capacity which was entirely given ammonia in the form of NH 3 -N as much as  77.65  ppm.  Central  Composite  Design  (CCD)  was  used  to  determine  the  amount  of  sediment,  sucrose,  and biofertilizer.  The  ammonia  nitrification  process  was  carried  out  over  a  period  of  21  days.  The  three  main parameters,  including  rate  of  ammonia  oxidation  (NH 3 -N),  nitrite  accumulation  (NO 2 -N),  and  nitrate accumulation (NO 3 -N). From this research, it was known that 74 g/L sediments of catfish ponds, 6.6 g/L sucrose 7.5 mL/L biofertilizer  were required to obtain maximum ammonia oxidation rate. The result of the verification experiment obtained was 99.85%. In this research, two isolates of bacteria were isolated. Biochemical test using kit  of  VITEK  GN+  (bioMerieux)  indicated  that  the  isolated  bacteria  were  belong  to  the  species  of Sphingobacterium thalpophilum (probability = 99%) and Cupriavidus pauculus (probabililty = 98%).
Keywords:  ammonia,  central  composite  design  (CCD),  nitrifying  bacteria,  Response  Surface  Methodology (RSM)

## ABSTRAK
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  membuat  model  regresi  pengaruh  sedimen  kolam,  sukrosa  dan biofertilize r  pada  proses  nitrifikasi.  Analisis  model  dilakukan  dengan  menggunakan  metode Response  Surface Methodology (RSM).  Sedimen  kolam  lele  yang  digunakan  adalah  sedimen  yang  diambil  dari  kolam  lele  pada usia 21 hari setelah tebar benih. Proses nitrifikasi dilakukan reaktor sistem lumpur aktif kapasitas kerja reaktor 1 L yang seluruhnya diberi ammonia dalam bentuk NH 3 -N sebanyak 77,65 ppm. Central Composite Design (CCD) digunakan  untuk  menentukan  jumlah  sedimen,  sukrosa  dan biofertilizer yang  optimum  untuk  menghasilkan respon yang tinggi. Proses nitrifikasi amonia dilakukan selama kurun waktu 21 hari. Tiga parameter utama yang diamati yaitul aju penurunan amonia, akumulasi nitrit, dan akumulasi nitrat. Dari penelitian ini diketahui bahwa 74 g/L sedimen kolam lele, 6,6 g/L sukrosa7,5 mL/L biofertilizer diperlukan untuk mendapatkan laju penurunan amonia  maksimum.  Hasil  verifikasi  eksperimen  diperoleh  penurunan  amonia  mencapai  99,85%.  Dalam penelitian  ini  berhasil  diisolasi  dua  jenis  mikroba.  Uji  biokimia  menggunakan  kit  VITEK  GN+  (bioMerieux) diperoleh  indikasi  bahwa  kedua  jenis  mikroba  itu Sphingobacterium  thalpophilum (probabilitas  =  99%)  dan Cupriavidus pauculus (probalilitas = 98%) .
Kata  kunci:  amonia,  bakteri  nitrifikasi, Central  Composite  Design (CCD), Response  Surface  Methodology (RSM)

## PENDAHULUAN
Limbah  cair  yang  mengandung  polutan organik dapat menjadi penyebab terjadinya akumulasi  amonia.  Amonia  umumnya  berasal  dari proses dekomposisi bahan organik, terutama protein (Effendi et  al .,  2015).  Akumulasi  kadar  amonia tinggi  dapat  dijumpai  dalam  limbah  industri  karet (Nainggolan et  al .,  2015),  industri  tempe  (Harahap, 2013),  dan  kolam  ikan  seperti  lele  (Effendi et  al., 2015).  Potensi  amonia  yang  terakumulasi  pada
tambak  sebesar  75%  dari  kadar  nitrogen  dalam pakan  (Gunadi  dan  Hafsaridewi,  2008).  Amonia dapat membunuh organisme perairan khususnya ikan pada konsentrasi 0,06 ppm (Ogbonna dan Chinomso, 2010).  Selain itu, pada manusia kadar amonia yang tinggi  dapat  menyebabkan  masalah  kesehatan termasuk  iritasi  mata,  kulit,  selaput  lendir,  rongga mulut,  dan  saluran  pernafasan  (National  Research Council, 2008). Pencemaran amonia juga mengakibatkan  kesuburan  tanah  berkurang  (Good dan Beatty, 2011).
Jurnal Teknologi Industri Pertanian 29 (1):88-96 (2019) Nomor DOI: 10.24961/j.tek.ind.pert.2019.29.1.88 ISSN: 0216-3160    EISSN: 2252-390
Terakreditasi Peringkat 2 Dirjen Penguatan Riset dan Pengembangan No 30/E/KPT/2018 Tersedia online http://journal.ipb.ac.id/index.php/jurnaltin
Peraturan  Menteri  Lingkungan  Hidup Republik  Indonesia  Nomor  5  (2014)  menyatakan bahwa  kadar  amonia  bagi  usaha  atau  kegiatan  yang belum  memiliki  baku  mutu  yang  ditetapkan  adalah kurang dari 5 ppm. Salah satu metode penanggulangan pencemaran amonia adalah menggunakan  sistem  lumpur  aktif  yang  didalamnya mengandung  mikroba  pengurai  amonia  (Hastuti, 2011).
Central Composite
Desaign (CCD) merupakan  model  regresi  dari  metode  analisa Response  Surface  Methodology (RSM).  Metode RSM  memiliki  kemampuan  untuk  menghilangkan kesalahan  secara  sistematis  dengan  perkiraan perlakuan ekperimen, meminimalkan jumlah eksperimen, dan menentukan model empiris berdasarkan  kecocokan  data  ekperimen  dan  design ekeperimen.  Kondisi dan pengoptimalan ekperimen yang  dilakukan  akan  ditampilkan  dalam  sistem fungsi  polinomial  linear  atau  kuadratik  (Bezzera et al .,  2008;  Mousavi  dan  Ibrahim,  2015).  Model regresi  ditentukan  oleh  nilai  determinasi  dan  uji-F. Selain  itu,  uji  kelayakan  model  regresi  dapat menghasilkan  model  prediksi  yang  layak  untuk percobaan (Nuryanti dan Salimy, 2008; El-Gendy et al ., 2013).
Penelitian  ini  difokuskan  untuk  membuat model  regresi  proses  nitrifikasi  (pengurai  amonia) dan mengisolasi bakteri yang tahan terhadap amonia tinggi.  Untuk  itu,  limbah  cair  yang  mengandung amonia tinggi dibuat sengaja dengan cara menambahkan  amonia  dalam  bentuk  NH 3 -N sebanyak  77,65  ppm  kedalam  seluruh  perlakuan. Pengaruh penambahan sedimen kolam lele, sukrosa, dan biofertilizer dalam  lima  tingkat  kombinasi diteliti  dengan  menggunakan  rancangan Central Composite  Design (CCD)  dan  data  yang  diperoleh dianalisis  dengan  menggunakan Response  Surfasce Metode (RSM).  Laju penguraian amonia, akumulasi nitrit  dan  nitrat  diamati,  demikian  juga  perubahan pH, suhu, dan oksigen terlarut. Pada akhir penelitian, bakteri  yang  bertanggungjawab  dalam  proses nitrifikasi diisolasi dan diidentifikasi.

## METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  dari  bulan Oktober  2017  sampai  Mei  2018  bertempat  di Laboratorium Pusat Teknologi Lingkungan – BPPT,
Gedung 802 Geostech, Puspiptek, Serpong, Tangerang Selatan, Banten 15314.

## Penyiapan Reaktor
Reaktor  yang  digunakan  adalah  reaktor sederhana yang dibuat dari galon plastik volume 2 L dan  diberi  aerasi  dengan  laju  aliran  udara  1500 L/jam.

## Penyiapan Sedimen, Sukrosa, dan Biofertilizer
Sedimen kolam lele diambil dari pembudidaya  ikan  lele  di  daerah  Pengasinan, Gunung  Sindur,  Bogor.  Sampel  sedimen  diambil dari  empat  titik  kolam.  Sedimen  yang  digunakan adalah  sedimen  berumur  21  hari  setelah  tebar  benih sehingga diharapkan mengandung bakteri pengoksidasi  amonia  yang  tahan  dalam  kadar amonia  tinggi.  Sukrosa  berasal  dari  Laboratorium BTPAL  yang  berfungsi  sebagai  sumber  karbon. Sementara  itu, Biofertilizer yang  digunakan  adalah probiotik  dengan  merk  dagang  Petrofish  yang mengandung bakteri Nitrosomonas europaea, Bacillus subtilis, Bacillus apiarius, dan Lactobacillus plantarum.

## Desain dan Prosedur Penelitian
Desain  penelitian  yang  dipilih  adalah Central Composite Design (CCD) menggunakan tiga faktor (sedimen kolam lele, sukrosa, dan biofertilizer )  dalam  lima  level  kombinasi  (Tabel  1). Penelitian ini menggunakan 20 kombinasi (Tabel 2). Penelitian  dilakukan  dalam  bioreaktor.  Seluruh perlakuan  diberi  amonia  (NH 3 -N)  sebanyak  77,65 ppm  dan  ditera  dengan  1  L  akuades.  Proses nitrifikasi  dilakukan  selama  21  hari.  Hasil  yang diperoleh  dianalisis  menggunakan  metode  statistik Response Surface Method (RSM) sehingga diperoleh model  regresi  laju  proses  nitrifikasi.  Verifikasi dilakukan  pada  kondisi  optimum  untuk  mengetahui hasil sebenarnya.

## Pengujian Parameter
Tiga  parameter,  yaitu  laju  penurunan amonia,  laju  akumulasi  nitrit  dan  nitrat  diukur  dan dianalisa  menggunakan  spektofotometer  UV-VIS (berdasarkan  metode  standar  pengujian  kadar amonia  (secara  fenat),  nitrit,  dan  nitrat  dari  BBPT). Selain itu, perubahan oksigen terlarut, suhu, dan pH juga diamati menggunakan DO meter dan pH meter. Parameter diukur dan diamati setiap tiga hari.
Tabel 1. Desain penelitian CCD-RSM
Kode Faktor Faktor Kode Level -α(-1,682) -1 0 +1 +α(1,682) X 1 Sedimen (g/L) 0 20 50 80 100 , 45 X 2 Sukrosa (g/L) 0 0 , 7 3 , 7 6 , 7 8 , 75 X 3 Biofertilizer (ml/L) 0 2 5 8 10 , 05

## Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Bakteri  dari  reaktor  diisolasi  dengan menggunakan  media  Stainer  (Fujitani et  al., 2015) yang  dimodifikasi  dengan  penambahan  3,7  g/L sukrosa.  Kemudian,  isolat  bakteri  yang  diperoleh diobservasi  morfologi  koloni,  morfologi  selnya  dan diuji  secara  biokimia  menggunakan  VITEK  GN+ (bioMerieux).

## Analisis Statistik
Laju  penurunan  amonia,  akumulasi  nitrit dan nitrat dianalisa menggunakan aplikasi Microsoft Excel dan  analisis  model  regresi Response  Surface Methology (RSM)  dengan  rancangan Central Composite  Design (CCD)  menggunakan  aplikasi Design  Expert  version 7.0.0  (Stat-Ease  Inc., Minneapolis, MN, USA, 2005). Koefisien determinasi  R 2 menentukan  kualitas  persamaan regresi.  Signifikansi  diuji  menggunakan  uji-F  serta uji  kelayakan  untuk  memastikan  asumsi  ANOVA terpenuhi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh  sedimen  kolam  lele,  sukrosa  dan biofertilizer pada  laju  penurunan  amonia,  lajua kumulasi  nitrit,  dan  laju  akumulasi  nitrat  diamati. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2.
Hasil  analisis  varian  laju  penurunan amonia,  akumulasi  nitrit,  dan  akumulasi  nitrat selama  kurun  waktu ±21 hari disajikan dalam Tabel 3.  X 1 ,  X 2 ,  dan  X 3 masing-masing  merupakan konsentrasi  sedimen,  sukrosa,  dan biofertilizer. Sukrosa (X 2 ) terbukti secara signifikan mempengaruhi  laju  penurunan  amonia  (p<0,05). Selain  itu,  faktor  kuadratik  sedimen  (X 1 2 )  dan interaksi antara sukrosa dan biofertilizer (X 2 X 3 ) juga menunjukkan  pengaruh  terhadap  proses  penurunan amonia  (p<0,05).  Hubungan  antara  dua  variabel yang  saling  berinteraksi  divisualisasikan  dalam plot contour dan grafik tiga dimensi (Gambar 1).
Pada  laju  akumulasi  nitrit,  bakteri  sedimen dan  sukrosa  (X 1 dan  X 2 )  menunjukkan  pengaruh yang  signifikan  (p<0,05),  namun  tidak  ditemukan variabel  yang  signifikan  pada  kuadrat  faktor.  Selain itu,  interaksi  antara  bakteri  sedimen  dan  sukrosa (X 1 X 2 )  menunjukkan  pengaruh  terhadap  laju akumulasi  nitrit  (p<0,05).  Sementara  itu,  hanya sukrosa  (X 2 )  yang  terbukti  secara  signifikan mempengaruhi  laju  akumulasi  nitrat  (p<0,05).  Hasil ini  sesuai  dengan  penelitian  lain  yakni  p<0,05 sehingga model lebih disukai dalam merepresentasikan  hasil  Mousavi  dan  Ibrahim, 2015).
Persamaan  model  regresi  yang  dihasilkan dari ANOVA dapat dilihat pada Tabel 4. Persamaan tersebut  memperhitungkan  bentuk  linear,  kuadratik, dan efek interaksi antar faktor-faktor yang diteliti.
Tabel 2. Pengaruh sedimen kolam  lele, sukrosa dan biofertilizer terhadap laju penurunan amonia (NH 3 -N), laju akumulasi nitrit dan nitrat (NO 3 -N) menggunakan Central Composite Design (CCD)
No Std Sedimen (g/L) Glukosa (g/L) Biofertilizer (mL/L) Laju NH 3 – N Laju NO 2 – N Laju NO 3 – N 1 F1 20 0,7 2 -2,29 -0,07 1,38 2 F2 80 0,7 2 -1,05 -0,22 1,30 3 F3 20 6,7 2 -1,77 0,81 -0,07 4 F4 80 6,7 2 -2,24 -0,09 0,62 5 F5 20 0,7 8 -0,91 -0,16 0,99 6 F6 80 0,7 8 -1,45 -0,04 2,29 7 F7 20 6,7 8 -3,53 1,02 0,18 8 F8 80 6,7 8 -3,00 0,10 -0,05 9 A1 0 3,7 5 -2,05 -0,02 0,74 10 A2 100 3,7 5 -1,26 -0,07 0,53 11 A3 50 0 5 -1,56 -0,17 1,74 12 A4 50 8,75 5 -2,75 0,44 0,41 13 A5 50 3,7 0 -1,80 0,10 0,58 14 A6 50 3,7 10 -2,62 0,09 1,07 15 C1 50 3,7 5 -3,22 0,08 0,24 16 C2 50 3,7 5 -2,15 0,12 0,85 17 C3 50 3,7 5 -2,47 0,22 0,78 18 C4 50 3,7 5 -3,07 0,09 0,33 19 C5 50 3,7 5 -2,40 0,14 0,67 20 C6 50 3,7 5 -3,29 -0,10 0,76

## Tabel 3. ANOVA untuk laju penurunan amonia
ANOVA for Response Surface Quadratic Model Source Sum of Squares df Mean Square F  Value nilai p Prob > F Laju Penurunan Amonia (NH 3 -N) Model 8,72 9 0,97 3,97 0,0213 significant X 2 3,43 1 3,43 14,07 0,0038 significant X 2 X 3 1,53 1 1,53 6,28 0,0311 significant X 1 2 2,05 1 2,05 8,38 0,0160 significant Lack of fit 1,26 5 0,25 1,07 0,4715 not significant R 2 = 0,7813 , Adequate Precision = 5,842
Laju Akumulasi nitrit (NH 2 -N) Model 1,57 9 0,17 5,48 0,0069 significant X 1 0,27 1 0,27 8,46 0,0156 significant X 2 0,82 1 0,82 25,81 0,0005 significant X 1 X 2 0,40 1 0,40 12,68 0,0052 significant Lack of fit 0,26 5 0,05 4,42 0,0642 not significant R 2 = 0,8315, Adequate Precision = 8,052
Laju Akumulasi nitrat (NH 3 -N) Model 5,04 9 0,56 3,74 0,0259 significant X 2 4,18 1 4,18 27,89 0,0004 significant Lack of fit 1,18 5 0,24 3,76 0,0863 not significant R 2 = 0,7652Adequate Precision = 6,693 Catatan: R 2 : determinasi, X 1 : bakteri sedimen, X 2 : sukrosa, X 3 : biofertilizer
Tabel 4. Persamaan regresi pada penurunan amonia, akumulasi nitrit, dan akumulasi nitrat
Parameter Persamaan Regresi Laju Penurunan Amonia (NH 3 -N) y = -2,76 + 0,15X 1 - 0,50X 2 - 0,21X 3 - 0,081X 1 X 2 - 0,097X 1 X 3 -
0,44X 2 X 3 + 0,38X 1 2 + 0,20X 2 2 + 0,18X 3 2 Laju Akumulasi Nitrit (NO 2 -N) y = +0,087 - 0,14X 1 + 0,25X 2 + 0,035X 3 - 0,22X 1 X 2 + 0,029X 1 X 3 +0,038X 2 X 3 - 0,024X 1 2 + 0,038X 2 2 +0,025X 3 2
Laju Akumulasi Nitrat (NO 3 -N) y = +0,61 + 0,097X 1 - 0,55X 2 + 0,075X 3 -   0,094X 1 X 2 +0,056X 1 X 3 -
0,13X 2 X 3 +  0,004X 1 2 +  0,16X 2 2 + 0,071X 3 2
Hasil  ANOVA  pada  laju  penurunan amonia,  laju  akumulasi  nitrat  dan  nitrit  secara signifikan  menunjukkan  model  regresi  yang  sesuai ( p <0,05).  Sementara itu, ditinjau uji ketidaksesuaian ( lack  of  fit )  menunjukkan  ( p >0,1)    sehingga  tidak ada lack  of  fit pada  model,  artinya  model  yang diusulkan  telah  sesuai  dengan  data  eksperimen (Shabbiri et al., 2012). Model kuadratik menunjukkan  bahwa  R 2 sebesar  0.7813  (NH 3 -N), 0,8315  (NO 2 -N),  dan  0,7652  (NO 3 -N)  yang  berarti sekitar  78,13%;  83,15%;  dan  76,52%  variasi  dari respon (laju penurunan amonia, laju akumulasi nitrit dan  nitrat)  dipengaruhi  oleh  variabel  X,  sedangkan sisanya  dipengaruhi  oleh  variabel  yang  belum diketahui.  Selain  itu,  nilai  presisi  ( Adequate Precision )  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini  lebih dari 4, yang berarti sinyal telah memadai, yakni nilai yang  diprediksi  pada  model  terhadap  kesalahan prediksi  rata-rata  masih  dapat  ditoleransi  sehingga secara  signifikan  menyatakan  kesesuaian  model (Thakkar dan Saraf, 2014).
Untuk  memastikan  bahwa  asumsi  ANOVA terpenuhi,  dilakukan  uji  residual  untuk  menentukan kelayakan  model  regresi.  Hasilnya  menunjukkan bahwa titik residu terletak disekitar garis linier yang
berarti  model  terdistribusi  normal.    Selain  itu,  nilai residual  versus  nilai  prediksi  memperlihatkan  titik residu  yang  menyebar  secara  acak  dan  tidak membentuk  magapon  (Chun et  al., 2015;  El-Gendy et  al .,  2013).  Representasi  hasil  dapat  dilihat  pada Gambar 2.
Berdasarkan  persamaan  yang  diperoleh pada  laju  penurunan  amonia,  laju  akumulasi  nitrit dan  nitrat  maka  nilai  prediksi  pada  kondisi  optimal akan diperoleh jika jumlah sedimen ikan lele adalah 74 g/L, sukrosa 6,6 g/L sukrosa, dan biofertilizer 7,5 mL/L.  Untuk  memverifikasi  model,  penelitian dilanjutkan  dengan  menggunakan  jumlah  sedimen ikan  lele,  sukrosa  dan biofertilizer yang  disarankan. Hasilnya dapat dilihat padaTabel 5.
Nilai verifikasi pada laju penurunan amonia menurun  25%  dibandingkan  nilai  prediksi,  namun meningkat  7%  dibandingkan  dengan  nilai  optimasi. Sementara  itu,  nilai  verifikasi  laju  akumulasi  nitrit menurun  191%  dibandingkan  nilai  prediksi  dan menurun  224%  dibandingkan  nilai  optimasi. Selanjutnya,  nilai  verifikasi  pada  laju  akumulasi nitrat menurun 94% dibandingkan nilai prediksi dan menurun 97,9% dibandingkan nilai optimasi.

## (a)
(b)
Gambar 1. Plot Contour (A) dan Grafik 3D (B) untuk laju penurunan amonia. laju penurunan amonia semakin tinggi ketika konsentrasi Biofertilizer (probiotik) dan sukrosa semakin tinggi
(a)
(b)
Gambar  2.  Uji  residual  model  regresi  pada  laju  oksidasi  amonia.  model  regresi  dianggap  layak  jika  A)  Plot residual normalitas berada disepanjang garis linear, dan B) plot residual menyebar secara acak
Tabel  5.  Verifikasi  eksperimen  pengaruh  sedimen  ikan  lele,  sukrosa  dan biofertilizer terhadap  laju  penurunan ammonia, akumulasi nitrit dan nitrat
Laju penurunan Amonia(NH 3 -N) ppm
Laju akumulasi nitrit (NO 2 -N) ppm Laju akumulasi nitrat (NO 3 -N) ppm Nilai Prediksi -3,227 0,155 0,276 Nilai Optimasi Rata-rata -2,244 0,114 0,752 Nilai Verifikasi Rata-rata -2,408 -0,142 0,016
Gambar  3.  Grafik  penurun  anamonia  (■),  akumulasi  nitrit  (▲),  dan  akumulasi  nitrat  (♦)selama  21  haripada proses nitrifikasi
Des ign-Expert® Software Am onia (s lope) Des ign Points -0.913534 -3.53011
X1 = B: Sukros a
X2 = C: Probiotik
Actual Factor
A: Sedim en = 5.00
0.07 0.22 0.37 0.52 0.67 0.20 0.35 0.50 0.65 0.80 Amonia (slope) B: Sukrosa C : P ro bio tik -3.21978 -2.90678 -2.59377 -2.28076 -2.28076 -1.96776 6 6 6 6 6 6 Design-Expert® Software Am onia (slope) -0.913534 -3.53011 X1 = B: Sukrosa X2 = C: Probiotik Actual Factor A: Sedim en = 5.00
0.07 0.22 0.37 0.52 0.67    0.20 0.35 0.50 0.65 0.80 -3.6 -3.075 -2.55 -2.025 -1.5 A m o n ia ( sl o p e ) B: Sukrosa C: Probiotik
Des ign-Expert® Software
Am onia (s lope)
Color points  by value of
Am onia (s lope): -0.913534 -3.53011 Internally Studentized Residuals N or m al % P ro ba bil ity Normal Plot of Residuals -1.97 -1.04 -0.10 0.84 1.77 1 5 10 20 30 50 70 80 90 95 99 Des ign-Expert® Software Am onia (s lope) Color points  by value of Am onia (s lope): -0.913534 -3.53011 Predicted In te rn a lly S tu d e n tiz e d R e si d u a ls Residuals vs. Predicted -3.00 -1.50 0.00 1.50 3.00 -3.18 -2.67 -2.16 -1.65 -1.14
-10.00 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 0 3 6 9 12 15 18 21 ppm Amonia Nitrit Nitrat
Hasil  ini  mengindikasikan  bahwa  pada reaktor  terjadi  proses  nitrifikasi  heterotrof  dan denitrifikasi  aerobic.  Penurunan  amonia  mencapai 99,85% dari konsentrasi awal amonia (NH 3 -N) 75,77 ppm  menjadi  0,11  ppm  (Gambar  3).  Kadar  amonia yang  rendah  ini  terus  berlangsung  hingga  21  hari pengamatan.    Meskipun  demikian,  penurunan amonia yang tajam ini tidak diikuti oleh peningkatan nitrit dan nitrat yang nyata kecuali nitrit pada hari ke 9 dan nitrat pada hari ke 21.
Proses  nitrifikasi  secara  umum  dilakukan oleh  bakteri  pengoksidasi  amonia  atau  disebut  juga sebagai bakteri nitrifikasi autotrof seperti Nitrosomonas yang  kemudian  diikuti  bakteri pengoksidasi  nitrit  seperti Nitrobacter (Ebeling et al .,  2006).  Pada  penelitian  Hommes et  al .  (2003), Nitrosomonas  europaea yang  merupakan  bakteri nitrifikasi  autotrof  yang  tidak  dapat  tumbuh  pada media  glukosa,  namun  dapat  mentolelir  media fruktosa  tunggal.  Kehadiran  sukrosa  pada  reaktor mendukung pertumbuhan bakteri nitrifikasi heterotrof. Dalam penelitian ini, sukrosa berpengaruh   signifikan terhadap penurunan amonia (NH 3 -N).
Penurunan amonia akan menghasilkan nitrit dan  selanjutnya  nitrit  akan  teroksidasi  kembali menjadi nitrat.  Proses ini berlangsung pada suasana aerobik  oleh  bakteri  nitrifikasi  heterotrof  seperti Agrobacterium sp.  (Chen  dan  Ni,  2012), Bacillus subtilis (Yang et  al .,  2011), Chryseobacterium haifense (Kundu et al ., 2014), Klebsiella pneumonia (Padhi et al ., 2013), dan Achromobacter xylosoxidans (Kundu et  al .,  2012).  Berdasarkan analisis  statistik  ANOVA,  sukrosa  dan biofertilizer menunjukkan pengaruh yang signifikan terhadap laju akumulasi nitrit.
Dalam  penelitian  ini,  laju  akumulasi  nitrat dipengaruhi oleh sukrosa secara signifikan walaupun kehadiran  sukrosa  menyebabkan  fluktuasi  pada  laju akumulasi  nitrat  yang  ditandai  dengan  terjadinya penurunan  konsentrasi  nitrat.  Hal  ini  mungkin disebabkan  oleh  kehadiran  bakteri  denitrifikasi aerobik  yang  berasal  dari  genera  heterotrof,  seperti Pseudomonas,  Achromobacter , Acinetobacter (Zhu et al ., 2012) dan Bacillus subtilis (Yang et al ., 2011). Bakteri  denitrifikasi  heterotrof  menggunakan  enzim nitrate  periplasmic  reductase untuk  melakukan aktivitas  denitrifikasi  aerobik  (Zhu et  al .,  2012). Beberapa bakteri denitrifikasi mampu memanfaatkan amonia sebagai sumber energi untuk bertahan hidup. Bakteri  tersebut  disebut  sebagai  bakteri  nitrifikasi- denitrifikasi  simultan  yang  dapat  melakukan  proses nitrifikasi heterotrof dan denitrifikasi aerobik (Shoda dan  Ishikawa,  2014).  Beberapa  genus  bakteri tersebut  diantaranya Thiosphaera  patotropha, B. subtilis,  Agrobacterium sp. ,   Rhodococcus sp. , K. pneumonia dan Marinobacter sp.  yang  memilki jalur  nitrifikasi  dan  denitrifikasi  lengkap  (NH 4 + → NH 2 OH → NO 2 - → NO 3 - → N 2 O → N 2 )serta bakteri
Alcaligenes  faecalis dan Alcaligenes  calcoaceticus yang  bisa  melakukan  nitrifikasi  dan  denitrifikasi simultan  tanpa  melalui  jalur  nitrit  dan  nitrat (NH 4 + →  NH 2 OH  →  N 2 O  →  N 2 )  (Kundu et  al., 2014).
Secara teoritis, bakteri nitrifikasi- denitrifikasi simultan mengalami koeksistensi ketika oksigen  terlarut  mencapai  0,3  -  0,8  ppm  (Peng  dan Qi, 2007). Bakteri B. licheniformis dapat mengoksidasi  amonia  56-67%  sekitar  40  ppm dengan  kehadiran  oksigen  terlarut  sekitar  5  ppm (Khanichaidecha et  al .,  2018). Acinetobacter dapat mentolerir  oksigen  terlarut  3  -  10  mg/L  (Zhu et  al ., 2012) dan Bacillus subtilis pada rentang 3,93  - 7,65 ppm  (Yang et  al .,  2011).  Pada  penelitian  ini, konsentrasi oksigen terlarut berada pada rentang 5,3 - 7,8 ppm.  Fluktuatifitas oksigen terlarut disebabkan oleh  penggunaan  oksigen  dalam  proses  nitrifikasi serta  proses  respirasi  aerobik  melalui  jalur  karbon berupa  sukrosa.  Sementara  itu,  suhu  berada  pada rentang 25,8 - 27,7 o C. Fluktuatifitas suhu kemungkinan besar dipengaruhi oleh suhu lingkungan.
Pada  penelitian  ini,  pH  yang  teramati cenderung  fluktuatif  dengan  rentang  pH  2,5—7,6. Kondisi  asam  pada  reaktor  diasumsikan  oleh kehadiran  bakteri Lactobacillus  plantarum yang berasal  dari biofertilizer. Penelitian  Smetanková et al. (2012),  menunjukkan  bahwa Lactobacillus plantarum dapat  menghasilkan  asam  laktat  dengan rentang  9,83—11,48  g/L  dan  asam  asetat  sekitar 1,03—1,65  g/L  dalam  kondisi  aerobik  lebih  tinggi dibandingkan  pada  kondisi  anaerobik.  Kehadiran Lactobacillus tidak  mendominasi  pada  waktu tertentu,  produksi  asam  dari Lactobacillus tidak mendominasi  sehingga  pH  reaktor  kembali  menjadi basa. Lactobacillus juga ditemukan dapat mendegradasi nitrit dan mengakumulasi N 2 O melalui jalur respirasi nitrat (Liu et al. , 2014).

## Isolasi,  Karakterisasi  dan  Identifikasi  Bakteri Nitrifikasi
Berdasarkan  pengamatan  morfologi  koloni, morfologi  sel,  dan  uji  biokimia  menggunakan VITEK  GN+  (biomeriex)  diperoleh  empat  isolat beda  yaitu,  isolat  L1,  L2,  L3,  L4.  Namun,  hanya isolat  L2,  L3  danL4  yang  disertakan  dalam  uji biokimia  menggunakanVITEK  GN+  (bioMerieux). Berdasarkan pengamatan yang dilakukan dibuktikan bahwa  isolat  L1,  L2,  L3,  L4  murni  berasal  dari sedimen  kolam  lele.  Hal  ini  dikarenakan  tidak tersisolasinya bakteri Biofertilizer, seperti Nitrosomonas europaea sebagai bakteri pengoksidasi amonia autotrof (Caranto dan Lancaster,  2017)  maupun Bacillus  subtilis dan Bacillus  apiarius .  Menurut  Yao et  al. (2014), kelompok bakteri Bacillus mampu melakukan proses nitrifikasi-denitrifikasi.

## Tabel 6. Isolasi, karakterisasi dan identifikasi bakteri nitrifikasi
Bakteri Isolat L1 Isolat L2 Isolat L3 Isolat L4 Morfologi Koloni Warna Merah muda Kuning Putih Putih kecoklatan Bentuk Bundar Bundar Bundar bundar Tepian Licin Licin Licin Licin Elevasi Cembung Cembung Datar Datar Morfologi Sel Bentuk sel Basil Basil Basil Kokus Warna Sel Merah Merah Merah Merah Biokimia Persentase VITEK GN+ (bioMerieux) - 99% ( Sphingobacterium thalpophilum ) 98% ( Cupriavidus pauculus ) 93% ( Burkholderia cepacia ) Pada  Tabel  6,  isolat  L2  diindikasikan sebagai bakteri
jenis
Sphingobacterium thalpophilum berdasarkan  uji  biokimia  dengan probabilitas  mencapai  99%.  Genus Sphingobacteria merupakan  genus  bakteri  denitrifikasi  yang  masuk dalam  proses Coupled  Nitrification-Denitrification (CND),  yaitu  jalur  nitrifikasi    NH 4 + →  N 2 O  →  N 2 (Codispoti dan Christensen, 1985; Zhu et al. , 2018). Pada  uji  biokimia  VITEK  GN+  (bioMerieux), Sphingobacterium thalpophilum dapat menggunakan Saccharose/Sucrose (SAC) dan memproduksi enzim Alpha-Glucosidase (AGLU), Beta-Glucuronidase (BGUR), Ala-Phe-Pro-Arylamidase (APPA),  dan Tyrosine Arylamidase (TyrA).
Isolat L3 diindikasikan sebagai bakteri jenis Cupriavidus  pauculus berdasarkan  uji  biokimia dengan  probabilitas  mencapai  98%. Cupriavidus pauculus termasuk dalam golongan bakteri nitrifikasi-denitrifikasi  heterotrof,  namun  sementara adalah  bakteri  nitrifikasi  heterotrof  dikarenakan tidak menghasilkan N 2 dan N 2 O. Penelitian Ramirez et  al .  (2014),  memperlihatkan  bahwa Cupriavidus pauculus mengpenurunan PO ( Piruvate oxime ) tanpa menghasilkan  N 2 dan  N 2 O,  namun  menjadi  NO 2 - yang  mungkin  melalui  jalur  organik,  yaitu  melalui perantara  karbon  dan  bukan  melalui  NH 2 OH. Cupriavidus  pauculus dapat  memprodukasi L- Pyrrolydonyl-Arylamidase (PyrA), L-Proline Arylamidase (ProA), Gamma-Glutamyl-Tranferase
(GGT)  dan  dapat  menggunakan Citrate/Sodium (CIT), Malonate (MNT), L-Lactate  Alkalinisation (ILATk), Succinate Alkalinisation (SUCT), L-malate assimilation , dan 5-5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) atau (ELLM).
Isolat  L4  memiliki  probabilitas  mencapai 93%  dengan  jenis  bakteri Burkholderia  cepacia. Namun,  terdapat  7%  kemungkinan  bahwa  jenis bakteri  bukan Burkholderia  cepacia.  Burkholderia cepacia memiliki  sel  berbentuk  basil  (Omar et  al. , 2015),  sementara  isolat  L4  memiliki  sel  berbentuk kokus.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Model  regresi Central  Composite  Design (CCD)  dengan  analisis  statistik Response  Surface Method (RSM)  dalam  simulasi  proses  nitrifikasi menggunakan  amonia  (NH 3 -N)  77,65  ppm  selama ±21 hari dianggap layak berdasarkan uji determinasi (R 2 ),  presisi,  dan  uji  kelayakan.  Persamaan  model regresi laju penurunan amonia:
y =  -2,76  +  0,15X 1 - 0,50X 2 -  0,21X 3 -  0,081X 1 X 2 -
0,097X 1 X 3 -  0,44X 2 X 3 +  0,38X 1 2 +  0,20X 2 2 + 0,18X 3 2
Berdasarkan  persamaan  model  regresi diperoleh  nilai  optimal  kolam  lele  74  g/L,  sukrosa 6,6  g/L,  dan  biofertilizer  7,4  g/L  dengan  penurunan ammonia  mencapai  99,85%  ppm  pada  kurun  waktu 21 hari.
Hasil  isolasi,  karakterisasi  dan  identifikasi bakteri  berdasarkan  uji  morfologi  koloni,  morfologi sel,  dan  uji  biokimia  diperoleh  indikasi  bahwa bakteri  yang  berhasil  diisolasi  termasuk  kedalam jenis Sphingobacterium  thalpophilum (probablilitas =  99%)  dan Cupriavidus  pauculus (probabilitas  = 98%) . Kedua  jenis  bakteri  ini  terbukti  mampu melakukan proses nitrifikasi dan denitrifikasi.

## Saran
1. Bakteri  yang  telah  diisolasi  perlu  diuji  kembali kinerjanya  dalam  proses  nitrifikasi  menggantikan sedimen  kolam  lele  sehingga  model  regresi  akan lebih  baik  dan  diperoleh  pemodelan  yang  lebih paripurna.
2. Perlu dilakukan penelitian aplikasi proses dilapangan untuk menangani pencemaran amonia.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terimakasih kami sampaikan kepada  Pusat  Teknologi  Pengolahan  Air  Limbah  – BPPT  yang  telah  membiayai  penelitian  ini  melalui INSINAS 2017 dan 2018 Kementrian Ristek Diksti.

## DAFTAR PUSTAKA
Bezerra  BA,  Santelli  RE,  Oliveira  EP,  Villar  LS, Escaleira  LA.  2008.  Response  surface methodology  (RSM)  as  a  tool  for optimization  in  analytical  chemistry. Jurnal Talanta. 76:965–977.
Caranto JD dan Lancaster KM. 2017. Nitric oxide is an obligate bacterial nitrification intermediate  produced  by  hydroxylamine oxidoreductase. J PNAS: 1-6.
Chen  Q    dan  Ni  J.  2012.  Ammonium  removal  by Agrobacterium  sp.  LAD9  capable  of heterotrophic
nitrification-aerobic
denitrification. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113(5): 619–623.
Chun  CW,  Jamaludin  NFM  dan  Zainol  N.  2015. Optimization  of  biogas  production  from poultry  manure  wastewater  in  250  ml flasks. Jurnal Teknologi .75(1):275-285. Codispoti LA dan Christensen JP. 1985. Nitrification,  denitrification  and  nitrous oxide cycling in the eastern tropical South Pacific  ocean. Marine  Chemistry, 16(4): 277—300.
Ebeling  JM,  Timmons  MB  dan  Bisogni  JJ.  2006.
Engineering  analysis  of  the  stoichiometry of  photoautotrophic,  autotrophic,  and heterotrophic  removal  of  ammonia– nitrogen in aquaculture systems. Aquaculture. 257(1–4): 346-358.
Effendi  H,  Utomo  BA,  Darmawangsa  GM,  Karo- karo  RE.  2015.  Fitoremediasi  limbah budidaya  ikan  lele  (Clarias  Sp.)  dengan kangkung (Ipomoea Aquatica) dan pakcoy  (Brassica  Rapa  Chinensis)  dalam sistem resirkulasi. Ecolab. 9(2): 47–104. El-GendyNS,  Madian  HR,  dan  Amr  SSA.  2013.
Design  and  optimization  of  a  process  for sugarcane molasses fermentation by Saccharomyces cerevisiae Using Response Surface Methodology. International Journal Microbiology . 2013:1-9.
Fujitani  H,  Kumagai  A,  Ushiki  N,  Momiuchi  K,
Tsuneda  S.  2015.  Selective  isolation  of ammonia-oxidizing bacteria
from
autotrophic nitrifying granules by applying  cell-sorting  and  sub-culturing  of microcolonies. Frontiers in Microbiology . 6:1159.
Gunadi  B  dan  Hapsaridewi  R.  2008.  Pengendalian
Limbah  Amonia  Budidaya  Ikan  Lele dengan  Sistem  Heterotrofik  Menuju Sistem  Akuakultur  Nir-Limbah. Jurnal Ris. Akuakultur. 3(3): 437-448.
Good  AG  dan  Beatty  PH.  2011.  Fertilizing  Nature: A Tragedy of Excess in the Commons. PLoS Biology. 9(8):1-9,
Harahap S. 2013. Pencemaran  perairan akibat  kadar amonia  yang  tinggi  dari  limbah  cair industri  tempe. Jurnal  Akuatika. 4(2): 183-194.
Hastuti  YP.  2011.  Nitrifikasi  dan  denitrifikasi  di kolam. Jurnal  Akuakultur  Indonesia,
10(1): 89–98.
Hommes  NG,  Sayavedra-Soto  LA  dan   Arp  DJ. 2003.  Chemolithoorganotrophic  Growth of Nitrosomonas  europaea on  Fructose.
Journal Bacteriol. 185(23): 6809-6814. Khanichaidecha  W,  NakarukA,  Ratananikom K, Eamrat R, Kazama F. 2018. Heterotrophic nitrification  and  aerobic  denitrification using pure-culture bacteria for wastewater treatment. Journal  Water  Reuse  and Desalination , 2018064. doi 10.2166.
Kundu  P,  Pramanik  A,  Dasgupta  A,  Mukherjee  S,
Mukherjee J. 2014. Simultaneous heterotrophic  nitrification  and  aerobic denitrification  by  Chryseobacterium  sp. R31  Isolated  from  Abattoir  Wastewater.
BioMed Research International , 2014:12.
Kundu  P,  Pramanik  A,  Mitra  S,  Choudhury  JD,
MukherjeeJ, Mukherjee S. 2012. Heterotrophic nitrification by Achromobacter xylosoxidans S18 isolated from a small-scale slaughterhouse wastewater. Bioprocess  and  Biosystems Engineering. 35(5): 721-728.
Liu  D-M,  Wang  P,  Zhang,  X-y,  Wu  H,  Li  L.  2014. Characterization  of  Nitrite  Degradation by Lactobacillus  caseisubsp. rhamnosus LCR  6013. PLoS  ONE 9(4):  93308.  doi 10.1371.
Mousavi  SA    dan  Ibrahim  S.  2015.  Application  of response  surface  methodology  (RSM)  for analyzing  and  modeling  of  nitrification process  using  sequencing  batch  reactors.
Desalination and Water Treatment . 1-10. Nainggolan  TA,  Khotimah  S,  dan  Turnip  M.  2015. Bakteri  pendegradasi  amonia  limbah  cair karet pontianak kalimantan barat. Protobiont. 4(2) : 69-76. National  Research  Council.  2008. Acute  Exposure Guideline  Levels  for  Selected  Airborne
Chemicals. Washington DC: National Academy Press, P6.
Nuryanti dan Salimy DH. 2008. Metode permukaan respon  dan  aplikasinya  pada  optimasi eksperimen  kimia. Risalah  Lokakarya Komputasi  dalam  Sains  dan  Teknologi Nuklir . 373-391.
Ogbonna  J  dan  Chinomso  A.  2010.    Determination of  the  concentration  of  ammonia  that could  have  lethal  effect  on  fish  pond. Arpn  Journal  Engineering  And  Applied Sciences. 5(2): 1-4.
Omar  N,  Raouf  HAE,  Okasha  H,  Nabil  N.  2015.
Microbiological Assessment of
Burkholderia  cepacia complex  (Bcc) isolated  in  Alexandria  Main  University Hospital. Alexandria  Journal  Medicine, 51(1):41-46
Padhi  SK,  Tripathy  S,  Sen,  MahapatraAS,  Mohanty S,  Maiti  NK.  2013.  Characterisation  of heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying Klebsiella pneumoniae CF-S9 strain  for  bioremediation  of  wastewater.
International Biodeterioration and Biodegradation . 78: 67-73.
Peng  Z  dan  Qi  Z.  2007.  Simultaneous  nitrification and  denitrification  in  activated  sludge system  under  low  oxygen  concentration. Front Environ. Sci. En. 1: 49–52. Peraturan  Menteri  Lingkungan  Hidup  Republik
Indonesia.  2014. Baku  Mutu  Air  Limbah . Indonesia, P1815.
Ramirez  M,  Obrzydowski  J,  Ayers  M,  Virparia  S, Wang  M,  Stefan  K,  Castignetti  D.  2014.
Pyruvic  oxime  nitrification  and  copper and  nickel  resistance  by  a cupriavidus pauculus, an active heterotrophic nitrifier- denitrifier. The Scientific World Journal. 2014 (901702): 1-11. Shabbiri  K,  Adnan  A,  Jamil  S,  Ahmad  W,  Noor  B and  Rafique  H  M  2012  Medium optimization  of  protease  production  by Brevibacterium linens DSM  20158, using statistical  approach  Brazilian. Journal Microbiology. 43(3). Shoda  M  dan  Ishikawa  Y.  2014.  Heterotrophic nitrification  and  aerobic  denitrification  of high-strength ammonium in anaerobically digested sludge
by Alcaligenes faecalis strain  No.  4. Journal  Bioscience and Bioengineering, 117(6):737-741. Smetanková J, Hladíková Z, Valach F, Zimanová M, Kohajdová  Z,  Greif  G,  Greifová  M.2012.
Influence  of  aerobic  and  anaerobic conditions  on  the  growth  and  metabolism of  selected  strains  of  Lactobacillus plantarum. Acta Chimica Slovaca.
5(2):204-210.
Thakkar  A  dan  Saraf  M.  2014.  Application  of Statistically  Based  Experimental  Designs to  optimize  cellulase  production  and identification  of  gene. Natural  Products and Bioprospecting, 4(6):341–351. Yang  XP,  Wang  SM,  Zhang  DW,  Zhou  LX.  2011.
Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic heterotrophic nitrifying–denitrifying bacterium, Bacillus subtilis A1. Bioresource Technology,
102(2):854-862.
Yao Q dan Peng DC. 2017. Nitrite oxidizing bacteria
(NOB) dominating
in nitrifying community in full-scale biological nutrient  removal  wastewater  treatment plants. AMB Express. 7:25.
Zhu  L,  Ding  W,  Feng  LJ,  Kong  Y,  Xu  J,  Xu  XY. 2012.Isolation  of  aerobic  denitrifiers  and characterization for their potential application  in  the  bioremediation  of oligotrophic ecosystem. Bioresource Technology. 108: 1–7.
Zhu  W,  Wang  C,  Hill  J,  He  Y,  Tao  B,  Mao  Z,  dan Wu  W.  2018.  A  missing  link  in  the estuarine nitrogen cycle?: Coupled nitrification-denitrification  mediated  by suspended  particulate  matter. Scientific Reports. 8(2282). doi 10.1038.