## Indonesian Journal of Pure and Applied Chemistry
journal homepage: http://jurnal.untan.ac.id/index.php/IJoPAC
PENENTUAN STRUKTUR  SENYAWA ANTIOKSIDAN LIMONOID DARI BIJI JERUK SAMBAL ( Citrus microcarpa Bunge) KALIMANTAN BARAT
Setyo Widayanti * , Rudiyansyah, Andi Hairil Alimuddin
Program Studi Pascasarjana Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Tanjungpura , Jl. Prof. Dr. H. Hadari N awawi, Pontianak, 74014, Indonesia
* Corresponding author: setyowidayanti74@gmail.com
ARTICLE INFO ABSTRACT Article history: Received 03 November 2018 Accepted 30
November 2018
Available online 30 December 2018
Keywords: Antioksidan,Citrus microcarpa Bunge, Limonin, Triterpenoid
Limonoid  has  been  isolated  from  orange  seeds  of  Citrus  microcarpa Bunge  using  extraction  and  partitioning  methods.  It  is  a  yellowish- white  crystal  with  a  melting  point  of  276-277 o C.  Based  on  the phytochemical  analysis  and  FTIR  spectroscopy, 1 H  NMR  and compared  with  the  literature,  the  compound  is  limonin  which  is  a triterpenoid.  The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the structure  and  evaluate  antioxidant  activity  of  the  limonin.  The antioxidant  activity  by  DPPH  obtained  IC50  value  of  limonin  was 199.18 ppm. Whereas, the test antioxidant activity by FRAP method using a comparative solution of ascorbic acid showed that there was an  increasingly  blue  color  change,  which  meant  that  antioxidant activity was stronger with activity value of 11.88 mgAAE /g sample.
© 2018 IJoPAC. All rights reserved

## 1. Pendahuluan
Jeruk  termasuk  tumbuhan  yang  dimanfaatkan  sebagai  obat  tradisional  seperti  penurun panas,  pereda  nyeri  saluran  napas  bagian  atas,  dan  penyembuh  radang  mata [2] .  Studi farmakologi  sebelumnya  mengungkapkan  bahwa  jeruk  memiliki  aktivitas  antimikroba, anthelmintik, anti nyamuk, antioksidan, antikanker, kardiovaskular, saraf pusat, antiinflamasi, analgesik,  antidiabetes,  gastrointestinal,  imunologis,  dan  pernafasan [3] .  Salah satu  jenis  jeruk yang tumbuh di wilayah Kalimantan Barat yaitu jeruk sambal yang berasal dari spesies Citrus microcarpa Bunge .
Berdasarkan  beberapa  penelitian,  tanaman  jeruk  mengandung  berbagai  jenis  metabolit sekunder. Sikander (2016) melaporkan pada kulit buah C. karna terkandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, fenol, tanin, flavonoid, steroid, asam amino, terpenoid, dan saponin [1] . Bui et al (2004) telah melakukan isolasi senyawa limonin dari Vietnamese Citrus nobilis [11] . Chu et al (2012)  telah  melakukan  isolasi senyawa  limonin  dari Citrus  medica L.  Var. sarcodactylis [12] . Hasegawa et  al (1980)  telah  melakukan  isolasi  limonin  dari  grafefruit [13] .  (Malee  (2011) mengidentifikasi  senyawa  metabolit  sekunder  pada  daun  dan  batang C.  aurantifolia diperoleh enam  kelompok  senyawa  metabolit  sekunder:  (1)  senyawa  kumarin,  (2)  derivat  benzene;  (3) senyawa  flavon;  (4)  senyawa  acridone  alkaloid;  (5)  senyawa  limonoid:  limonin  dan  limonexic
acid,  dan;  (6)  senyawa  lignin [4] .  Kranthi  K., et  al (2006)  sudah  melakukan  isolasi  senyawa limonin  dari  biji  jeruk Red  Mexican  Grapefruit [5] .  Can, et  al (2012)  telah  melakukan  isolasi senyawa  limonin  dari Citrus  reticulate Blanco [6] ; Bauri,  dkk  (2016)  telah  melakukan  isolasi senyawa  limonin  dari Citrus  limetta (Indian  sweet  lemon) [7] ;  Anshori,  dkk  (2006)  telah melakukan isolasi senyawa limonin pada Citrus nobilis var. Microcarpa (Jeruk Siam) [8] .
Hasil  penelitian  Fajarwati  (2014)  diketahui  bahwa  daun  jeruk  nipis  memiliki  aktivitas antioksidan yang kuat dengan nilai konsentrasi penghambatan (IC50) 76,90 ppm [9] . Wulandari, dkk (2013) melaporkan bahwa kulit buah jeruk sambal memiliki aktivitas antioksidan baik yang ditunjukkan  oleh  nilai  konsntrasi  efektif  (EC 50 )  untuk  ekstrak  metanol  sebesar  94,01 μ g/mL (antioksidan kategori kuat) [10] .
Berdasarkan studi dan uji pendahuluan yang dilakukan oleh peneliti (bulan April-Juli 2018), diketahui  bahwa  biji  jeruk  sambal  ( Citrus microcarpa Bunge)  mengandung  senyawa  golongan triterpenoid  dan  belum  ditemukan  laporan  tentang  struktur  senyawa  antioksidan  golongan triterpenoid pada biji jeruk sambal Kalimantan Barat. Penelitian ini untuk mengetahui struktur kimia dan aktivitas antioksidan senyawa golongan triterpenoid pada ekstrak biji jeruk sambal.

## 2. Bahan dan Metode

## 2.1 Pengumpulan Sampel, Alat dan Bahan
Biji  jeruk  sambal  ( Citrus microcarpa Bunge)  dikumpulkan  dari  daerah  Radak,  Kabupaten Kuburaya,  bulan  November  2017.  Sebanyak  10  kg  biji  jeruk  sambal  basah  dibersihkan, kemudian dikeringkan dalam oven suhu 40 0 C sehingga diperoleh 2 kg biji jeruk sambal kering, setelah itu diblender hingga menjadi serbuk.
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  alat  ekstraksi,  blender  Panasonik,  oven Memmert, neraca analitik OHAUS, Lampu UV  = 254 nm dan 366 nm, Spektrofotometer UV- Vis  merek  Genesys  10S  buatan  Cina,  FTIR  Prestige  21  Shimadzu  Jepang, Nuclear  Magnetic Resonance (NMR) Agilent 500 MHz dengan sistem konsol DD2, Rotary evaporator Heidolph dan Melting Point merek Stuart Scientific UK.
Bahan  yang  digunakan,  biji  jeruk  sambal,  metanol  p.a, n -heksana  p.a, kloroform  p.a, etilasetat p.a, pereaksi uji fitokimia (asam sulfat, asam asetat), plat silika gel 60 F 254 , vitamin C murni, DPPH, dapar fosfat, oksalat, ferrisianida, FeCl 3 , dan TCA.

## 2.2 Ekstraksi dan Partisi
Sebanyak  2  kg  serbuk  biji  jeruk  sambal  kering  direndam  dalam  metanol,  lalu  diaduk  dan dibiarkan selama 3x24 jam. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dan filtrat dikumpulkan menjadi satu. Filtrat hasil maserasi dievaporasi sampai pekat.
Ekstrak pekat yang diperoleh selanjutnya dipartisi dengan menggunakan pelarut n -heksana, etil asetat, dan kloroform. Sebanyak 4 fraksi diperoleh yaitu fraksi n -heksana,  fraksi kloroform, fraksi etil asetat, dan metanol. Evaporasi kemudian dilakukan pada masing-masing fraksi untuk memperoleh  ekstrak  pekat.  Kristal  yang  diperoleh  dari  fraksi  pekat n -heksana  dilakukan  uji fitokimia triterpenoid.

## 2.3 Isolasi Senyawa Golongan Triterpenoid
Kristal  yang  terbentuk  pada  fraksi n -heksana  setelah  proses  evaporasi  dan  pendinginan, selanjutnya  disaring  dan dicuci  dengan  sejumlah  pelarut  sampai  bersih  (kristal  menjadi  putih kekuningan). Kristal yang diperoleh dikering-anginkan, ditimbang, dan dilakukan uji kemurnian yaitu uji KLT dan uji titik leleh.
Isolat murni yang diperoleh dilakukan pengukuran FTIR, NMR, dan Isolat selanjutnya dilakukan  uji  aktivitas  antioksidan  dengan  metode  DPPH  dan  FRAP.  Pada  metode  DPPH, tahapan pengujian antioksidan meliputi pembuatan larutan DPPH, pembuatan larutan kontrol, pembuatan larutan uji (larutan induk  100 ppm dan larutan seri 1 ppm, 2 ppm, 3 ppm, dan 4 ppm),  dan  pembuatan  kontrol  positif  larutan  vitamin  C  1  ppm,  2  ppm,  3  ppm,  dan  4  ppm. Absorbansi  metode  DPPH  selanjutnya  diukur  menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  pada panjang  gelombang  515  nm.  Nilai  absorbansi  yang    didapat  dan  dihitung  persen hambatan masing-masing larutan dengan menggunakan rumus:

## % =
− 100%
Nilai  IC50  dicari  setelah  didapatkan  %  aktivitas  hambatan  melalui  persamaan  regresi linier y = a + bx. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FRAP dilihat perubahan warna yang terjadi dan nilai FRAP dinyatakan dalam mg equivalen asam askorbat /gr isolat. Tahapan proses yang dilakukan yaitu sebanyak 5 mg sampel dilarutkan dalam 5 mL etil asetat, lalu dipipet 1 mL, ditambahkan 1 mL dapar fosfat 0,2 M (pH 6.6) dan 1 mL K 3 Fe(CN) 6 1% setelah itu, diinkubasi selama  20  menit  dengan  suhu  50°C,  1  mL  TCA  ditambahkan,  dipipet  1  mL  ke  dalam  tabung reaksi, dan ditambahkan 1 mL aquades dan 0,5 mL FeCl 3 0,1%. Larutan didiamkan selama 10 menit  dan  diukur  absorbansinya  pada  720  nm.  Sebagai  blangko  digunakan  campuran larutan oksalat.  Kurva  kalibrasi  dibuat  menggunakan  larutan  asam  askorbat  dengan  berbagai konsentrasi. Nilai FRAP dinyatakan dalam mg equivalen asam askorbat/g sampel

## 3. Hasil dan Pembahasan
Hasil partisi dan evaporasi dari fraksi n -heksan diperoleh ekstrak pekat, 14,22 gram dari ektrak pekat tersebut dihasilkan kristal putih kekuningan sebanyak 2,93 gram dengan titik leleh 276-277 o C.  Senyawa  dikatakan  murni  karna  memiliki  titik  leleh  dengan  rentang  ±2 o C Interpretasi  spektrum  IR  (KBr)  menunjukan  adanya  ulur  C-H  metil  (2966,52  cm -1 ),  ulur  C-H metilen (2931,80 cm -1 ), ulur C=O ester (1757,15 cm -1 ), ulur C=O alifatik keton, tekuk C-H metil metilen (1462,04 cm -1 ), tekuk C-H metil (1363,67 cm -1 ), tekuk C-O-C eter (1026,13 cm -1 ).
Interpretasi spektrum
NMR menunjukkan adanya 4 sinyal proton singlet kelompok
metil  yaitu  pada δ H 1,07, δ H 1,17, δ H 1,25,  dan δ H 1,29,  -proton  furan [8] [ δ H 7,41  (1H, d, J =5,65 Hz), δ H 7,40 (1H, s )],  -proton furan [8] [ δ H 6,34 (1H, s )], empat proton gugus metoksi [ δ H 5,47 (1H, s ), δ H 4,04 (1H, s ), δ H 4,46 (2H, d, J =13,10 Hz), dan δ H 4,08 (1H, s) ]. Spektrum dari senyawa isolat Citrus  microcarpa Bunge dibandingkan dengan isolat Citrus  aurantifolia Swingle karena Genusnya sama dan menggunakan pelarut yang sama (CDCl 3 ) dengan titik leleh 285-286 o C Berikut  perbandingan  spektrum
NMR  dengan  konsol  DD2  500  MHz  pada Citrus microcarpa Bunge dan Citrus aurantifolia Swingle:
Tabel  1  menunjukkan  bahwa spektrum NMR C.  microcarpa dibandingkan  dengan spektrum
NMR C. aurantifolia Swingle mempunyai kemiripan pergeseran H [4] . Hal tersebut dapat diprediksi bahwa kristal dari fraksi n -heksana biji jeruk sambal ( Citrus microcarpa Bunge) adalah suatu senyawa  golongan limonoid yaitu limonin dengan struktur berikut ini:
Tabel  1  Perbandingan  Spektrum NMR Citrus  microcarpa Bunge  dan Citrus  aurantifolia Swingle Posisi Pergeseran H (Multiplet) ( Citrus microcarpa Bunge) Pergeseran H (Multiplet) ( Citrus aurantifolia Swingle) (4) Tipe 1 4,04 ( s ) 4,09 ( br s ) CH 2 2,31 ( dd, J = 15.4, 3.4) 2,30 ( dd , J = 15.0, 3.0) CH 2 2,67 ( dd, J =16.75, 3,4) 2,70 ( dd , J = 15.0, 3.0) 3 - - - 4 - - - 5 2,46 ( dd, J =17.9, 3,4) 2,44 ( dd , J = 12.0, 3.0) CH 6 2,93 ( dd, J =16.8, 3,4) 2,73 ( dd , J = 12.0, 3.0) CH 2 3,16 ( dd , J = 12.0, 3.0) 7 - - - 8 - - - 9 2,54 ( dd, J =9.5, 2.9) 2,58 ( dd , J = 9.0, 3.0) CH 10 - - - 11 1,80 ( m ) 1,87 ( m ) CH 2 1,79 ( m ) 1,78 ( m ) 12 1,51 ( m ) 1,51 ( m ) CH 2 1,89 ( m ) 1,82 ( m ) 13 - - - 14 - - - 15 4,03 ( s ) 4,05 ( s ) CH 16 - - - 17 5,47 ( s ) 5,48 ( s) CH 18 1,17 ( s ) 1,17 ( s ) CH 3 19 4,46 ( d, J =13,1) 4,50 ( d , J = 12.0) CH 2 4,76 ( d, J =13,05) 4,82 ( d , J = 12.0) 20 - - - 21 7,40 ( s) 7,42 ( s ) CH 22 6,34 ( s ) 6,36 ( d, J =1.5) CH 23 7,41 ( d, J =5,65) 7,45( d, J = 1.5) CH 24 1,07 ( s ) 1,08 ( s ) CH 3 25 1,25 ( s ) 1,25 ( s ) CH 3 26 1,29 ( s ) 1,16 ( s ) CH 3
O O O O O O O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 23 22 19 25 26 24 Gambar 1 Prediksi Struktur dari Data Spektrum
NMR dan FTIR C. microcarpa Bunge Kristal  yang  diperoleh  dari  fraksi n -heksana  selanjutnya  dilakukan  uji  antioksidan menggunakan  metode  DPPH  dan  FRAP.  Hasil  Uji  DPPH  menunjukkan nilai  IC 50 senyawa  limonin dari biji jeruk sambal sebesar 199,18 ppm yang merupakan antioksidan lemah menurut klasifikasi Blois.
Tabel 2. Klasifikasi Aktivitas Antioksidan No. Nilai IC 50 Antioksidan 1. < 50 ppm Sangat kuat 2. 50-100 ppm Kuat 3. 100-150 ppm Sedang 4. 151-200 ppm Lemah
Sedangkan  hasil  uji  aktivitas  antioksidan  metode  FRAP  dengan  pengulangan  tiga  kali  dan konsentrasi sampel yang sama menunjukkan aktivitas antioksidan yang terkandung dalam biji jeruk sambal sebesar 11,88 mg AAE /g sampel. Aktivitas antioksidan semakin kuat ditandai dengan makin pekatnya warna biru yang terbentuk pada sampel [14] .
Gambar 2 Hasil Uji Kualitatif Aktivitas Senyawa Limonin Metode FRAP

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan,  dapat  disimpulkan  hasil  partisi  dan rekristalisasi yang diperoleh berbentuk kristal berwarna putih kekuningan dengan hasil uji fitokimia menunjukkan  adanya  senyawa  golongan  triterpenoid.  Berdasarkan  data  spektrum NMR  dan FTIR  diprediksi  golongan  triterpenoid  yang  terkandung  di  dalam  kristal  fraksi n -heksana  adalah senyawa limonin. Uji aktivitas antioksidan yang telah dilakukan terhadap kristal fraksi n- heksana dengan metode DPPH  diperoleh  nilai  IC 50 sebesar  199,18  ppm  dan uji  antioksidan  menggunakan
metode  FRAP menunjukkan  adanya  perubahan  warna  semakin  biru  berarti  aktivitas  antioksidan semakin kuat dengan nilai aktivitas antioksidan sebesar 11,88 mg AAE /g sampel.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Sikander, Dar M. (2016). Study of Phytoconstituents, antioxidant and Antibacterial Activities of Citrus karna Fruits Peels. Thesis . Technology and Sciences, Allahabad: India.
[2] Kemenristekdikti. (2017). Jeruk . http://migroplus.com/brosur/Budidaya%20 jeruk.pdf, diakses tanggal 02 Februari 2017.
[3] Al-Snafi, A. Esmail. (2016). Nutritional value and pharmacological importance of citrus species grown in Iraq. Journal of Pharmacy , 6(8), 76-108.
[4] Malee,  Tareeyah.  (2011).  Chemical  Constituents  from  the  Leaves  and  Stems  of Citrus aurantifolia Swingle. Thesis . Master of Science Degree. Prince of Songkla University: Songkla.
[5] Kranthi  K. Mandadia,b,  Guddadarangavvanahally  K.  Jayaprakashaa,b, Narayan  G. Bhatc, dan Bhimanagouda  S.  Patila.  (2006). Red  Mexican  Grapefruit:  A  Novel  Source  for  Bioactive Limonoids  and  their Antioxidant  Activity . Vegetable  and  Fruit  Improvement  Center, 62c, 179- 188.
[6] Can Liu, Jing Liu, Yonghai Rong, Nvyong Liang dan Long Rong. (2012). Aqueous extraction of limonin from Citrus reticulate Blanco. Czech J. Food Sci , 4(30), 364–368.
[7] Bauri, A. K.,  Sabine Foro dan Quynh Nguyen Do Nhu. (2016). Limonin isolated from the seeds of Citrus limetta (Indian sweet lemon). IUCrData , 1, x160172.
[8] Anshori, J., Al, Euis Julaeha, Tri Mayanti, Unang Supratman, Hideo Hayashi. (2006). Senyawa Limonin  dari  Biji  Jeruk Citrus  nobilis  var.  Microcarpa (Jeruk  Siam)  dan  Potensi  Aktivitasnya sebagai  Penghambat  Tumbuh  Larva  Instar  ke-empat  Nyamuk Aedes  Aegypti , Jurnal Riset  dan Teknologi Pembangunan Perekonomian.
[9] Fajarwati,  N. (2013).  Uji  Aktivitas Antioksidan  Pada  Ekstrak  Daun  Jeruk  Nipis  ( Citrus aurantifolia )  Dengan  Menggunakan  Metode  DPPH  ( 1,1-DIPHENYL-2-PICRYLHYDRAZYL ). Skripsi . FKIK. UIN Syarif Hidayatullah: Jakarta.
[10] Wulandari, M., Nora Idiawati, Gusrizal. (2013). Aktivitas Antioksidan Ekstrak n-Heksana, Etil Asetat dan Metanol Kulit Buah Jeruk Sambal ( Citrus microcarpa Bunge). JKK . 2(2), 94-94.
[11] Bui, K. A., Duong, A. T., Tran, V. S., Seip, S. (2004). Isolation and structure elucidation of a new limonoid from Vietnamese Citrus nobilis seeds. Tap. Chi. Hoa. Hoc., 42(4), 520-523.
[12] Chu,  J.,  Song-Lin  Li,  Zhi-Qi  Yin,  Wen-Cai  Ye,  Qin-Wen  Zhang.  (2012).  Simultaneous Quantification of Coumarins, Flavonoids, and Limonoids in Fructus Citri Sarcodactylis by High Performance  Liquid  Chromagraphy Coupled  With  Diode  Array  Detector. Journal  of Pharmaceutical and Biomedical analysis . 66, 170-175.
[13] Hasegawa, S., raymond D. Bennett, dan Carl P. Verdon. (1980). Metabolism of Limonoids Via a Deoxylimonoid Pathway in Citrus. Phytochemistry . (19), 1445-1447.
[14] Huang D., Boxin Ou, dan Ronald L. Prior. (2005). The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays. Journal Agric. Food Chem ., 6(53), 1841-1856.
.