MORFOGENESIS ANGGREK ( Anoectochilus formosanus )

## SECARA IN VITRO
( Morphogenesis of Anoectochilus formosanus Orchids by in Vitro )
L. D. Saputri 1 , S. Isminingsih 1 , A. A. Fatmawaty 1 , F. Rachmawati 2
1 Jurusan Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian, Universitas Sultan Ageng Tirtayasa, Jl. Raya Jakarta KM.4 Pakupatan, Serang, Banten, Telpon 0254-280330, Fax 0254- 281254
2 Balai Penelitian Tanaman Hias-Segunung (Indonesian Ornamental Crop Research Institute), Jl. Raya Ciherang Segunung, Pacet Cianjur 43253, PO Box 8 Sindanglaya, Indonesia, e-mail: liadwisp24@gmail.com

## ABSTRACT
Anoectochilus formosanus is one species of Orchids, known as a “Jewel Orchids” and have been used as a folk medicine in China and Taiwan.The aim of this study was to examine the response of using different types of explants and combination of  growth  regulators  TDZ  and  BAP  to  morphogenesis  of Anoectochilus formosanus Orchids by in vitro.  The results showed that using different types of explants  had  very  significant  effect  to  the  percentage  of  callus  and  shoot morphogenesis  on  12  weeks  after  planting,  the  number  of  adventitious  buds, adventitious shoot length, and callus diameter on three weeks until 12 weeks after planting.  The  best  explant  to  callus  morphogenesis  was  showing  on  shoot  tip explant  (50%)  and  to  shoot  morphogenesis  was  showing  on  auxillary  buds  and internode explant (100%). The best number of adventitious buds was observed in second internode explant with average number of shoots are 7.62 shoots. The best adventititous length was observed in axillary buds explant with average number of shoot  length  in  1.16  cm,  and  the  best  callus  diameter  was  observed  in  shoot  tip explant  with  average  of  diameter  in  2.2  mm.  The  combination  of  plant  growth regulator TDZ and BAP had a very significant effect to adventitious length on 10 weeks after planting, and a significant effect to adventitious length on 11 and 12 weeks  after  planting.  The  best  adventitious  length  was  observed  on  0.25  mg  L -1 TDZ + 0.75 mg L -1 BAP in 1.13 cm per explant on 12 weeks after planting. The best combination to callus and shoot morphogenesis was observed on 0.75 mg L -1 TDZ + 0.25 mg L -1 BAP. There was no interaction between used a different types of  explant  and  combination  plant  growth  regulator  to  morphogenesis Anoectochilus formosanus orchids by in vitro.
Keywords: Adventitious buds, Axillary buds, Internode, Morphogenesis explants, Shoot tip, TDZ and BAP.

## PENDAHULUAN
Salah  satu  spesies  anggrek
bernilai ekonomi tinggi yang berpotensi  sebagai  tanaman  hias  dan memiliki manfaat sebagai obat
adalah anggrek Anoectochilus formosanus .  Jika  biasanya  anggrek dikenal  sebagai  tanaman  hias  bunga, maka tanaman A. formosanus berpotensi  sebagai  tanaman  hias daun  dikarenakan  bentuk  daunnya yang  lebar,  tipis,  berwarna  hijau gelap  atau  coklat  keunguan  dengan tulang  daun  berbentuk  jaring  dan berwarna perak (Ket et al ., 2004).
Di Asia, A. formosanus dikenal sebagai tanaman obat bagi masyarakat dan suplemen diet (Kuan et al ., 2011). Anggrek A. formosanus telah  digunakan  untuk  mengobati penyakit  hipertensi,  paru-paru,  dan kelainan  hati  di  banyak  negara khususnya di China dan Taiwan (Ket et  al., 2004).  Anggrek  ini  banyak dimanfaatkan  sebagai  bahan  obat- obatan  untuk  mengobati  beberapa jenis penyakit dikarenakan mengandung senyawa bioaktif seperti flavonoid, glikosida
sianogenik,  tanin,  karbohidrat  dan terpenoid (Maridass et al., 2008).
Dalam  pengobatan  tradisional di  Taiwan, A.  formosanus dalam keadaan segar  maupun  dikeringkan, dapat  direbus  dan  digunakan  untuk mengobati  luka  di  dada  dan  perut, diabetes, nephritis, demam, hipertensi, impoten, liver dan penyakit  limpa,  pleurodynia,  dan dalam  keadaan  segar  digunakan sebagai  obat  luar  luka  akibat  gigitan ular (Hu, 1971; Kan, 1986; Chiu dan Chang,  1995 dalam Shiau et  al ., 2002).    Selain  itu,  ekstrak planlet A. formosanus berpotensi sebagai bahan baku  alami  produk  kosmetik  untuk pemutih  dan  obat  diet  (Chang et  al ., 2010).  Berdasarkan  hasil  penelitian Yang et al. (2012), ekstrak encer dari A. formosanus efektif untuk kesehatan tulang dan dapat menghambat osteoporosis.
A.  formosanus termasuk  jenis tanaman  herbal  tahunan  sehingga pertumbuhan  dan  perkembangannya dari  perkecambahan  benih  sampai menjadi tanaman dewasa dan menghasilkan benih yang siap ditanam  membutuhkan  waktu  2-3 tahun  (Tsay,  2002).  Oleh  karena  itu diperlukan metode perbanyakan yang cepat  yang  mampu  menghasilkan
benih  dengan  jumlah  banyak  dalam waktu yang lebih singkat.
Salah satu metode perbanyakan A.  formosanus yang  dapat  dilakukan adalah dengan metode kultur
jaringan.  Selain  karena  waktu  yang digunakan  lebih  singkat,  teknik kultur jaringan juga dapat
menghasilkan  tanaman  yang  sama dengan induknya. Keberhasilan
teknik  kultur  jaringan  dipengaruhi oleh  beberapa  faktor,  seperti  jenis eksplan  yang  ditanam  dan  zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan.  Interaksi  antara  jenis eksplan  dan  ZPT  yang  digunakan, akan  mempengaruhi  morfogenesis eksplan  yang  ditanam.  Morfogenesis pada  tanaman  adalah  permulaan karakteristik morfologi tanaman menjadi bentuk tanaman yang seutuhnya  dimana  terjadi  proses pertumbuhan  dan  diferensiasi  sel-sel individu  menjadi  organisme  utuh yang  dapat  dipengaruhi  oleh  faktor genetik maupun lingkungan.
Hasil  penelitian  Ket et  al .
(2004)  eksplan  ujung  tunas  yang ditanam pada media MS dan Hyponex  dengan  penambahan  ZPT
Thidiazuron dan BAP dengan konsentrasi  1-2  mgL -1 menghasilkan
rata-rata  5,1-5,2  tunas  baru  dalam waktu tiga bulan. Sherif et al. (2017) menunjukkan  eksplan  tunas  aksilar muda  yang  ditanam  pada  media MS+1,5 mgL -1 , Thidiazuron
menghasilkan  rata-rata  4,2  tunas  per eksplan,    rata-rata    panjang      tunas 0,6 cm dan  induksi  tunas 70%. Putri (2018) menggunakan eksplan internode ,  dalam  waktu  delapan mingggu setelah
tanam menghasilkan regenerasi eksplan 92,36%  dan  inisiasi  tunas  adventif 83,33%.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  pengaruh  jenis  eksplan tunas  pucuk,  tunas  aksilar,  dan internode serta kombinasi zat pengatur tumbuh TDZ dan BAP juga interaksi di antara keduanya terhadap arah morfogenesis anggrek Anoectochilus  formosanus secara in vitro .

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan pada  bulan  November  2018  sampai bulan  Febuari  2019  bertempat  di Laboratorium  Kultur  Jaringan  Balai Penelitian  Tanaman  Hias  (Balithi). Bahan tanam (eksplan) yang digunakan adalah planlet steril
Anoectochilus formosanus hasil
perbanyakan  di  Laboratorium  Kultur
Jaringan Balithi. Penelitian ini dirancang menggunakan Rancangan Acak
Lengkap  (RAL)  pola  faktorial  yang terdiri  dari  dua  faktor  yang  diulang sebanyak  lima  kali.  Faktor  pertama adalah  jenis  eksplan  yaitu  E 1 (tunas pucuk),  E 2 (tunas aksilar),  E 3 ( internode pertama),  E 4 ( internode kedua)  dan  faktor  kedua  adalah empat kombinasi zat pengatur tumbuh  TDZ  dan  BAP  yaitu:  T 1
(0,25  mgL -1 TDZ  +  0,75  mgL -1
BAP),  T 2 (0,50  mgL -1 TDZ  +  0,50 mgL -1 BAP), T 3 (0,75 mgL -1 TDZ + 0,25    mgL -1 BAP),  dan  T 4 (1,00 mgL -1 TDZ).

## Pelaksanaan Penelitian Pembuatan Media Tanam
Media  dasar  yang  digunakan adalah  media  ½  MS  yang  dibuat dengan  memipet  setengah  volume dari stok hara makro, hara mikro, Fe- Chellate, dan vitamin. Media dasar ½ MS ditambahkan dengan zat pengatur  tumbuh  sesuai  konsentrasi perlakuan  dan  ditambahkan  gula sebanyak  20  gL -1 dan  aquadest hingga  mencapai  volume  1  liter  lalu
dihomogenkan  dan  diukur  pH  media hingga  mencapai  5,8,  ditambahkan agar-agar  sebanyak  6  gL -1 .  Setelah itu media diautoklaf selama 20 menit dengan suhu 121°C.

## Persiapan Bahan Tanam
Bahan  tanam  yang  digunakan pada  penelitian  ini  adalah  planlet steril Anoectochilus formosanus yang berumur  kira-kira  satu  tahun  yang ditanam pada media MS + 0,2 mgL -1
BAP  +  0,02  mgL -1 NAA  dengan gula 30 gL -1 dan agar 6 gL -1 (Putri, 2018).

## Penanaman (Inokulasi)
Planlet A. formosanus dikeluarkan dalam botol dan diletakan pada petri kemudian diambil  bagian  tunas  pucuk,  tunas aksilar, internode kesatu, dan internode kedua. Bagian tunas pucuk diambil dengan cara membelah tunas aksilar  yang  tidak  dijadikan  bahan eksplan menggunakan bantuan pinset dan scalpel .
Setelah  bahan  tanam  siap, masing-masing jenis eksplan ditanam pada  botol  berisi  media  sesuai perlakuan.  Setiap  perlakuan  terdiri dari  satu  botol  kultur  yang  diulang
sebanyak lima kali dan tiap botolnya berisi tiga buah eksplan.

## Inkubasi Kultur
Hasil kultur diinkubasi  di rak kultur  di  dalam  ruang  pemeliharaan dengan suhu 18-20°C yang dilengkapi  dengan lampu fluorescent dengan  penyinaran  selama  20  jam per  hari  sampai  dengan  12  minggu setelah kultur/inisiasi.

## Pengamatan dan Analisis Data
Pengamatan  dilakukan  secara berkala setiap minggu dan
pengambilan  data  dilakukan  sesuai dengan  rancangan  respons  yang sudah ditentukan. Selama pengamatan dilakukan juga
pengambilan  foto  dari  setiap  satuan percobaan sebagai dokumentasi dalam penelitian.
Hasil  pengamatan  dilakukan analisis  ragam  dan  perlakuan  yang memberikan  pengaruh  nyata  hingga sangat  nyata  dilakukan  uji  lanjut menggunakan Duncan Multiple Range  Test taraf  5%  menggunakan software DSAASTAT 1.101.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Morfogenesis Kultur
Hasil analisis keragaman menunjukkan penggunaan jenis eksplan memberikan pengaruh sangat  nyata  terhadap  morfogenesis kalus dan morfogenesis tunas.
Tabel 1. Pengaruh tunggal jenis eksplan terhadap persentase morfogenesis kultur (%).
Jenis Eksplan (E) Morfogenesis Kalus Morfogenesis Tunas ………..…………………%........................................ E 1 (Tunas Pucuk) 50,00  a 50,00  a E 2 (Tunas Aksilar) 0,00  b 100,00  b E 3 ( Internode Pertama) 0,00  b 100,00  b E 4 ( Internode Kedua) 0,00  b 100,00  b Rata-rata 12,50 87,50
Keterangan: Angka-angka yang diikuti huruf  kecil  yang sama  pada kolom menunjukkan berbeda tidak nyata menurut uji DMRT taraf 5%
Gambar 1. Morfogenesis kalus pada tunas pucuk
Gambar 2. Morfogenesis tunas pada tunas pucuk
Gambar 3. Morfogenesis tunas pada internode kedua
Berdasarkan  Tabel  1,  eksplan yang lebih muda mengalami morfogenesis ke arah kalus,
sedangkan semakin tua eksplan yang digunakan
cenderung bermorfogenesis  secara  langsung  ke arah  tunas  (organogenesis).  Tunas pucuk merupakan jenis eksplan yang memiliki umur jaringan  paling muda diantara  jenis  eksplan  tunas  aksilar dan internode .
Selain  karena  perbedaan  umur jaringan,  perbedaan  respons  antara tunas  pucuk  dengan  jenis  eksplan yang  lain  disebabkan  karena  tunas pucuk mengandung hormon endogen
auksin  yang  lebih  tinggi  dari  pada jenis  eksplan  lain  yang  digunakan dan  merangsang  pembentukan  kalus ketika  ditanam  pada  media  yang mengandung sitokinin sehinga terjadi interaksi  antara sitokinin pada media tanam  dengan  hormon  endogen auksin  yang  memicu  terjadinya pembelahan sel secara cepat.
Pada  penelitian  ini,  media tanam  mengandung  TDZ  dimana menurut  Guo et  al .  (2011)  TDZ berpotensi  untuk  menginduksi  atau meningkatkan aktivitas hormon endogen  auksin  yang  dapat  memicu pembelahan pada jaringan tanaman.
Kondisi ini yang menyebabkan pada  jaringan  yang  muda  sel-selnya
lebih  aktif  membelah  dibandingkan dengan  jaringan  yang  lebih  tua.
Tabel 2. Pengaruh tunggal kombinasi zat pengatur tumbuh tdz dan bap terhadap persentase morfogenesis kultur (%).
Kombinasi TDZ dan BAP Morfogenesis Kalus Morfogenesis Tunas ………….…..%....................... T 1 (0,25 mg L -1 TDZ + 0,75 mg L -1 BAP) 86,67 88,33 T 2 (0,50 mg L -1 TDZ + 0,50 mg L -1 BAP) 86,67 86,67 T 3 (0,75 mg L -1 TDZ + 0,25 mg L -1 BAP) 90,00 90,00 T 4 (1,00 mg L -1 TDZ) 85,00 85,00 Rata-rata 87,08 87,50 Berdasarkan Tabel 2 konsentrasi optimal untuk penggunaan  TDZ  dan  BAP  adalah
dengan perbandingan konsentrasi 3:1. Pemberian  TDZ  tunggal  dalam konsentrasi tinggi menghambat proses  morfogenesis  yang  optimal pada  eksplan,  sedangkan  konsentrasi TDZ  yang  lebih  rendah  dari  pada BAP  dan  konsentrasi  TDZ  dan  BAP yang  seimbang  belum  memberikan hasil  yang  optimal  pada  proses morfogenesis eksplan.
Peningkatan  konsentrasi  TDZ (0,75  mgL -1 )  yang  dikombinasikan dengan BAP pada konsentrasi rendah
(0,25  mgL -1 )  memberikan  persentase morfogenesis  kalus  dan  tunas  yang paling  baik.  Hasil  yang  sama  juga
dilaporkan  oleh  Rachmawati et  al . (2016a)  bahwa  eksplan  tunas  pucuk Dendrobium Indonesia  Raya  ‘Ina’ yang  ditanam  pada  media  ½  MS  + 1,5 mgL -1 TDZ + 0,50  mgL -1 BAP menghasilkan  kalus  embrionik  pada 9,3 hari setelah kultur.
Hal  tersebut  sesuai  dengan Lestari  (2011)  bahwa  zat  pengatur tumbuh  yang  dapat  merangsang pembentukan tunas umumnya menggunakan  golongan  sitokinin salah  satunya  adalah  BA  ( Benzyl Adenin) yang  mempunyai  aktivitas yang  lebih  kuat  dalam  memacu penggandaan tunas dikarenakan mempunyai gugus Benzyl .
Interaksi  antara  jenis  eksplan dengan  kombinasi  zat  pengatur
tumbuh  TDZ  dan  BAP  memberikan pengaruh  yang  tidak  nyata  pada morfogenesis kalus maupun morfogenesis tunas.
Gambar 1. Pengaruh jenis eksplan dan kombinasi zat pengatur tumbuh TDZ dan  BAP  terhadap  persentase  morfogenesis  kalus  (%) Anoectochilus formosanus secara in vitro
Dari Gambar 1 terlihat eksplan yang  merespons  pembentukan  kalus hanya  eksplan  tunas  pucuk  (eksplan dengan  jaringan  paling  muda),  dan tunas pucuk (E 1 )  pada media dengan konsentrasi  0,75 mgL -1 TDZ + 0,25 mgL -1 BAP  (T 3 )  memberikan persentase  morfogenesis  kalus  yang cenderung  lebih  baik  dibandingkan perlakuan lainnya.
Kehadiran TDZ dalam konsentrasi tinggi yang dikombinasikan  dengan  BAP  dalam media terbukti merangsang
pembentukan  kalus  pada  eksplan
tunas  pucuk,    menurut  Rachmawati et  al .  (2016b)  potensi  embriogenesis yang  tinggi  diduga  dipengaruhi  oleh seinergisme  antara  TDZ  dan  BA dimana BA berperan dalam menstimulasi pembelahan dan diferensiasi  sel,  sedangkan  TDZ berperan dalam menstimulasi produksi  dan  akumulasi  sitokinin pada  sel-sel  meristematik  eksplan dan perannya sebagai inhibitor sitokinin  oksidase  yang  mencegah terjadinya  degradasi  sitokinin  tipe adenin.
46.67 53.33 60 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 % M or fogen esi s K al u s
Gambar 2.  Pengaruh jenis eksplan dan kombinasi zat pengatur tumbuh TDZ dan  BAP  terhadap  persentase  morfogenesis  tunas  (%) Anoectochilus formosanus secara in vitro
Dilihat dari Gambar 2, semua eksplan  pada  semua  kombinasi  TDZ dan BAP memberikan respons dalam morfogenesis  tunas,  akan  tetapi eksplan dengan jaringan paling muda cenderung  mengalami  morfogenesis tunas yang paling rendah dibandingkan  dengan  jenis  eksplan lain  yang  memiliki  umur  jaringan lebih  tua.  Eksplan  tunas aksilar  (E 2 ), internode pertama (E 3 ), dan internode kedua (E 4 ) 100%
mengalami morfogenesis tunas (organogenesis).
Dilihat  dari  kedua  Gambar, semakin  tinggi  konsentrasi  TDZ yang  diberikan  maka  akan  semakin menghambat  morfogenesis  eksplan, sedangkan semakin tinggi
konsentrasi  BAP  yang  digunakan maka  akan  semakin  membantu mengoptimalkan proses morfogenesis eksplan.

## Jumlah Tunas Adventif
Jenis eksplan memberikan
pengaruh sangat nyata pada parameter  jumlah  tunas  adventif. Semakin  tua  umur  jaringan  eksplan maka  semakin  banyak  jumlah  tunas adventif  yang  dihasilkan.  Selain  itu, terjadinya  perbedaan  fase  awal
pertumbuhan pada setiap jenis eksplan  mempengaruhi  jumlah  tunas yang dihasilkan. Tunas pucuk mengalami  fase  pembentukan  kalus terlebih  dahulu  sedangkan  eksplan tunas  aksilar  dan internode langsung mengalami pembentukan tunas.
53.33 46.67 60 40 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0 20 40 60 80 100 120 % M o rfogen e si s Tu n as
Tabel 3. Pengaruh tunggal jenis eksplan terhadap jumlah tunas advenif (tunas).
Jenis Eksplan Umur Tanaman (MST) Rata- rata 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 E 1 0,00 0,15a 0,33a 0,45a 0,65a 0,87a 1,30a 1,68a 2,24a 2,52a 3,26a 1,20 E 2 0,00 0,50b 0,90b 1,43b 1,77b 1,97b 2,59b 3,12b 3,35b 3,65b 3,92b 1,93 E 3 0,00 0,65c 1,10c 1,70b 2,23c 2,55c 3,22c 4,10c 4,73c 5,04c 5,32c 2,55 E 4 0,00 0,61c 0,95bc 2,06c 2,74d 3,57d 4,66d 6,44d 6,10 d 6,98d 7,62d 3,48 Rata- rata 0,00 0,48 0,82 1,41 1,85 2,24 2,94 3,84 4,10 4,55 5,03 2,27
Keterangan:  angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada baris atau kolom yang sama menunjukkan berbeda tidak nyata menurut uji DMRT taraf 5%.
E 1 (tunas  pucuk);  E 2 (tunas  aksilar);  E 3 ( internode pertama);  E 4 ( internode kedua).
Dilihat  dari  Tabel  3,  jenis
eksplan internode kedua  merupakan
jenis eksplan
terbaik yang memberikan  jumlah  tunas  sebanyak 7,62  tunas  per  eksplan  selama  12 MST.  Hal  tersebut  sejalan  dengan hasil  penelitian  yang  dilakukan  oleh
Chen et al . (2000) bahwa penggunaan internode lebih  efektif dalam  meregenerasi  pembentukan tunas adventif pada tanaman Adenophora
trphylla
dan
Adenophora
verticillata dibandingkan  dengan  eksplan  daun dan nodus.

## Tinggi Tunas Adventif
Jenis  eksplan  dan  kombinasi zat  pengatur  tumbuh  TDZ  dan  BAP memberikan  pengaruh  tunggal  yang berbeda  nyata  pada  parameter  tinggi tunas  adventif,  akan  tetapi  interaksi keduanya memberikan pengaruh yang  tidak  nyata  (Tabel  4  dan  5).
Tabel 4. Pengaruh tunggal jenis eksplan terhadap tinggi tunas adventif (cm).
Jenis Eksplan n Umur Tanaman (MST) Rata- rata 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 E 1 0,00 0,03a 0,09a 0,15a 0,19a 0,28a 0,31a 0,37a 0,41a 0,43a 0,44a 0,19 E 2 0,01 0,24b 0,51b 0,69b 0,81b 0,89c 0,91b 0,96b 1,05c 1,08c 1,16c 0,69 E 3 0,01 0,26b 0,55c 0,71b 0,80b 0,84bc 0,88b 0,91b 0,9bc 1,01bc 1,06bc 0,67
E 4 0,00255 0,27b 0,51bc 0,67b 0,77b 0,79b 0,84b 0,86b 0,92b 0,94b 1,00b 0,63 Rata- rata 0,005 0,20 0,42 0,55 0,64 0,70 0,74 0,78 0,84 0,6 0,9 0,54
Keterangan:  Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada baris atau kolom yang sama menunjukkan berbeda tidak nyata menurut uji DMRT taraf 5%.
E 1 (tunas pucuk); E 2 (tunas aksilar); E 3 ( internode pertama); E 4 ( internode kedua).
Eksplan tunas aksilar memberikan nilai tinggi tunas tertinggi  dibandingkan  jenis  eksplan lainnya  dikarenakan  jaringan  pada eksplan  tunas  aksilar  lebih  muda dibandingkan  dengan  jaringan  pada internode pertama  maupun  kedua.
Semakin muda jaringan maka semakin  aktif  pula  jaringan  tersebut mengalami  pembelahan.  Meskipun tunas  pucuk  memiliki  jaringan  lebih muda  dari  tunas  aksilar,  terjadinya fase  morfogenesis  kalus  terlebih dahulu pada tunas pucuk
menyebabkan  tinggi  tunas  yang dihasilkan  lebih  rendah  dari  pada jenis  eksplan  lain.  Hal  tersebut serupa dengan hasil penelitian Sherif et  al .  (2017)  yang  menggunakan eksplan  tunas  pucuk  dan  tunas aksilar  dalam  propagasi  secara in vitro tanaman Anoectochilus  elatus dimana eksplan tunas aksilar memberikan respons  yang lebih baik pada  inisiasi  tunas,  jumlah  tunas yang  dihasilkan,  dan  tinggi  tunas dibandingkan  dengan  eksplan  tunas pucuk.
Tabel 5.   Pengaruh tunggal kombinasi zat pengatur tumbuh tdz dan bap terhadap tinggi tunas adventif (cm).
Kombinasi ZPT Umur Tanaman (MST) Rata- rata 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5 0,0025 0,18 0,42 0,58 0,66 0,78 0,77 0,80 0,92b 0,98b 1,03b 0,59 T 2 0,005 0,24 0,41 0,52 0,61 0,67 0,76 0,82 0,92b 0,90b 0,95b 0,57 T 3 0,005 0,23 0,44 0,58 0,69 0,73 0,79 0,82 0,86b 0,89b 0,93b 0,58 T 4 0,005 0,14 0,39 0,52 0,59 0,62 0,62 0,65 0,66a 0,70a 0,74a 0,47 Rata-rata 0,004 0,20 0,42 0,55 0,64 0,70 0,74 0,77 0,84 0,87 0,91 0,55
Keterangan:    Angka-angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama  pada  baris  atau  kolom  yang sama menunjukkan berbeda tidak nyata menurut uji DMRT taraf 5%.
T 1 (½ MS + 0,25 mgL -1 TDZ + 0,75 mgL -1 BAP); T 2 (½ MS + 0,50 mgL -1 TDZ + 0,50 mgL -1 BAP); T 3 (½ MS + 0,75 mgL -1 TDZ + 0,25 mgL -1 BAP); T 4 (½ MS + 1,00 mgL -1 TDZ).
Kombinasi  0,25 mgL -1 TDZ dengan 0,75 mgL -1 BAP memberikan
pengaruh  terbaik  pada  parameter tinggi tunas adventif. Semakin tinggi
konsentrasi  TDZ  akan  menghambat pertumbuhan  tinggi  tanaman.  Hal tersebut dikarenakan TDZ menginduksi dan mengaktifkan etilen  endogen  yang  memberikan respons terhadap penghambatan pemanjangan  batang  terutama  pada tanaman dikotil (Salisbury dan Ross, 1995).
Thidiazuron termasuk ke dalam kelompok  zat  pengatur  tumbuh sitokinin  yang  paling  aktif  diantara
zat sitokinin lainnya dalam
menstimulasi pembentukan dan perkembangan  tunas  secara in  vitro pada berbagai spesies tanaman
(Khawar et al ., 2004). TDZ merupakan  salah  satu  sitokinin  yang dapat meningkatkan kemampuan multiplikasi tunas, menginduksi pembentukan  tunas  adventif  dan proliferasi tunas aksilar (Lu, 1993).

## Diameter Kalus
Kalus  merupakan  respons  dari organogenesis  tidak  langsung  yang umum  terjadi  pada  perbanyakan tanaman  secara in  vitro .  Jenis eksplan memberikan pengaruh sangat nyata pada parameter diameter  kalus  dikarenakan  hanya eksplan tunas pucuk yang mengalami pembentukan  kalus  terlebih  dahulu.
Tabel 6. Pengaruh tunggal jenis eksplan terhadap diameter kalus (mm).
Jenis Eksplan Umur Tanaman (MST) Rata- rata 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 E 1 0,02 0,23a 0,58a 0,92a 1,30a 1,63a 1,72a 1,81a 2,06a 2,13a 2,22a 1,22a E 2 0,00 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b E 3 0,00 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b E 4 0,00 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b 0,00b Rata- rata 0,005 0,06 0,14 0,23 0,32 0,41 0,43 0,45 0,52 0,53 0,55 0,31
Keterangan:    Angka-angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama  pada  baris  atau  kolom  yang sama menunjukkan berbeda tidak nyata menurut uji DMRT taraf 5%.
E 1 (tunas  pucuk);  E 2 (tunas  aksilar);  E 3 ( internode pertama);  E 4 ( internode kedua).
Rendahnya diameter kalus yang  dihasilkan  diduga  karena  zat pengatur  tumbuh  yang  ditambahkan pada  media  bukan  merupakan  zat pengatur tumbuh yang dapat memicu
induksi  kalus  pada  eksplan. Menurut Lestari  (2011),  zat  pengatur  tumbuh yang  digunakan  untuk  memproduksi kalus  embrionik  adalah  zat  pengatur
tumbuh golongan auksin kuat seperti 2.4-D, dicamba atau picloram.
Hal  tersebut  sejalan  dengan hasil  penelitian  yang  dilakukan  Putri
(2018) yang menggunakan kombinasi media MS dengan
penambahan  zat  pengatur  tumbuh
NAA  dan  BAP  pada  regenerasi eksplan internode tanaman
Anoectochilus formosanus tidak menghasilkan  pembentukan  kalus pada semua perlakuan yang digunakan.
Gambar 3.   Pengaruh  tunggal  kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  TDZ  dan BAP  terhadap  diameter  kalus  (mm) Anoectochilus  formosanus pada 12 MST secara In Vitro.
Dari hasil penelitian ini terlihat bahwa media dengan kombinasi 1,00 mgL -1 TDZ  (T4)  tanpa  penambahan BAP  menjadi  media  yang cenderung lebih baik dalam membantu pertumbuhan dan perkembangan kalus.

## SIMPULAN
Morfogenesis  kalus  terbaik dihasilkan pada eksplan tunas pucuk,
sedangkan  tunas  terbaik  dihasilkan pada eksplan tunas aksilar. Kombinasi zat pengatur tumbuh TDZ dan BAP yang memberikan persentase morfogenesis paling optimal  baik  morfogenesis  kalus maupun tunas adalah kombinasi pada konsentrasi  0,75  mgL -1 TDZ + 0,25
m g L - 1 BAP. 0.45 0.49 0.58 0.7 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 T1 T2 T3 T4 D iam e te r Kal u s

## SARAN
1. Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut menggunakan kondisi
inkubasi  gelap  untuk  proses inisiasi  dan  proliferasi  kalus anggrek Anoectochilus
formosanus secara in vitro .
2. Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut  menggunakan  komposisi media yang berbeda untuk pembesaran dan pengakaran anggrek Anoectochilus
formosanus secara in vitro .

## UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih kepada Balai Penelitian  Tanaman  Hias  yang  telah membiayai dan memfasilitasi pelaksanaan  kegiatan  penelitian  ini dan kepada program studi
Agroekoteknologi,
Fakultas
Pertanian  Universitas  Sultan  Ageng Tirtayasa  yang telah mendukung dan memberikan masukan pada penulisan jurnal ini.

## DAFTAR PUSTAKA
C.C. Chen., S.J. Chen., A.P. Sagare., dan H.S. Tsay. 2000. Adventitious Shoot Regeneration from Stem Internode Explans of Adenophora  triphylla  (Thunb.) A.  DC.  (Campanulaceae)-an
Important Medicinal Herb. Bot. Bull. Acad. Sin . 42: 1-7. Chang,  M.P.,  M.S.  Jeoung.,  K.Y.
Paek.,  dan  J.W.  Choi.  2010. Inhibitory  Effect  of  Jewel Orchid (Anoectochilus formosanus)  Planlet  Extract against Melanogenesis and
Lipid Droplet Accumulation. J. Soc.  Cosmet.  Scientist  Korea.
36 (2): 145-150.
Chiu,  N.Y.,  dan  K.H.  Chang.  1995.
Anoectochilus formosanus Hayata,  in  The  Illustrated Medical Plants of Taiwan. Vol. 4, SMC Publishing Inc., Taipei, Taiwan. 282-283 (in Chinese). Guo,  B.,  Abbasi,  B.H.,  Zeb,  A.,  Xu LL., Wei, Y.H. 2011. Thidiazuron: a Multi- Dimensional Plant Growth Regulator. Afr  J  Biotech 10 (45): 8984-9000.
Hu,  S.Y.  1971.  The  Orchidaceae  of China. Quart.  J .  Taiwan  Mus.
24: 67-103.
Kan,  W.S.  1986. Anoectochilus formosanus Hay. In Pharmaceutical Botany. National  Research  Institue  of Chinese Medicine, Taipei, Taiwan. 647. (in Chinese). Ket, N.V., E.J. Hahn., S.Y. Park., D. Chakrabarty.,  dan  K.Y.  Paek. 2004.  Micropropagation  of  an Endangered Orchid Anoectochilus formosanus. Biologi  Plantarium 48  (3):
339-334.
Khawar,  K.M.,  C.  Sancak.,  S. Uranbey., dan S.  Ӧzcan. 2004.
Effect of Thidiazuron on Shoot
Regeneration  from  Different
Explants of Lentil (Lens culinaris Medik.) via Organogenesis.  Turk. J.  Bot. 28: 421-426.
Kuan,  Y.C.,  Wu,  T.J.,  Kuo,  C.Y., Hsu,  J.C.,  Chang  W.Y.,  Sheu,
F.  2011.  Molecular  Cloning  of a New Immunomodulatory Protein  from Anoectochilus
formosanus which  Induces  B Cell  IgM  Secretion  through  a T-Independent Mechanism. PLoS ONE 6 (6): e21004. Lestari,  E.G.  2011.  Peranan  Zat Pengatur Tumbuh dalam Perbanyakan  Tanaman  secara Kultur Jaringan. Jurnal Agrobiogen 7 (1): 63-68. Lu,  C.Y.  1993.  The  Use  of Thidiazuron  in  Tissue  Culture. In Vitro Cellular & Develpomental Biology . 29:92- 96. Maridass,  M.,  M.I.  Zahir  Hussain., dan G. Raju. 2008. Phytochemical Survey of Orchids in the Tirunelveli Hills of  South  India. Ethnobotanical
Leaflets 12: 705-12. Putri, Y. A. 2018. Pengaruh Eksplan Internode dan Komposisi Media  Terhadap  Inisiasi  Tunas Adventif Anggrek Anoectochilus formosanus secara In Vitro . Skripsi
Agroekoteknologi. Fakultas Pertanian  Universitas  Sultan Ageng Tirtayasa. Serang. Rachmawati, F., B. Winarno., N.M.A.
Wiendi.,  N.A.  Mattjik.,  dan  A.
Purwito.  2016a.  Perbanyakan In Vitro Dendrobium Indonesia Raya ‘Ina’ melalui Embriogenesis Somatik Berbasis  Sistem  Bioreaktor. J. Agron.  Indonesia 44  (3):  306- 314.
Rachmawati, F., Purwito, A.,Wiendi, N.M.A.,  Mattjik,  N.A.,  dan Winarno, B. 2016b. Pengembangan Teknologi Perbanyakan Dendrobium Melalui Embriogenesis Somatik  Berbasis  Bioreaktor. Disertasi. Program Pascasarjana  Institut  Pertanian Bogor. Bogor. Salisbury, B.F., dan C.W. Ross. 1995. Fisiologi  Tumbuhan  Jilid  3.
Terjemahan:  DR.  Lukman  dan
Sumaryono. Bandung: ITB Bandung. 238-255. Sherif, N.A., T.S. Kumar., dan M.V. Rao. 2017. In vitro Propagation and Genetic Stability Assessment  of  an  Endangered Terrestrial Jewel Orchid Anoectochilus  elantus Lindl. Indian Journal of Experimental
Biology . 55: 853-863. Shiau, Y.J., A.P. Sagare., U.C. Chen., S.R.  Yang.,  dan  H.S.  Tsay. 2002. Conservation of Anoectochilus formosanus Hayata  by  Artificial  Cross- Pollination and In Vitro
Culture  of  Seeds. Botanical Bulletin of Academia Sinica 43:
123-130.
Tsay,  H.S.  2002.  Use  of  Tissue Culture for the Mass Propagation  of  Pathogen-Free Plants. http://www.tc.agnet.org/htmlar ea_file/library/2011080511595 6/tb158.pdf. Diakses pada Januari 2019. Yang,  L.C.,  J.B.  Wu,  T.J.  Lu,  dan W.C.  Lin.  2012.  The  Prebiotic Effect of Anoectochilus formosanus and Its Consequemces on Bone Health. British  Journal  of  Nutrition 109: 1779-1788.