This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.
Efek  Kombinasi  2,4  D  Dan  Kinetin  Pada  Pembentukan  Kalus  Daun Catharanthus roseus (L.) G. Don Serta Deteksi Alkaloidnya
Effects of Combination of 2,4 D and Kinetin on Callus Formation of Catharanthus roseus (L.) G. Don Leaves and Detection of Alkaloid Content
Siti Khoiriyah 1 , Djoko Santosa 2,3 , Indah Purwantini 2,3* 1 Magister Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada 2 Departemen Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada 3 Pusat Riset Tumbuhan Obat Dan Bahan Alam, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada Corresponding author:  Indah Purwantini : Email: indahp@ugm.ac.id
Submitted: 26-02-2023 Revised: 13-03-2023 Accepted: 13-03-2023

## ABSTRAK
Catharanthus  roseus (L.)  G.  Don  dikenal  dengan  tapak  dara  merupakan  tanaman  obat tradisional, yang telah dibudidayakan sebagai tanaman penghasil senyawa alkaloid vinkristin dan vinblastin sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh kombinasi 2,4 D dan kinetin terhadap keberhasilan pembentukan dan pertumbuhan kalus serta mengetahui adanya kandungan senyawa alkaloid pada kalus. Eksplan diinokulasi dalam media Murashige-Skoog (MS) padat yang ditambahkan 2,4 D 1 mg/L dan kinetin 4 mg/L untuk menghasilkan kalus, kemudian kalus disubkultur dan dipanen setelah berumur 21 hari. Kalus dimaserasi dengan etanol p.a. Identifikasi senyawa dilakukan menggunakan KLT dengan fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak berupa kloroform:metanol (9:1). Bercak pada pelat KLT dideteksi dengan sinar UV 254 dan 366 nm serta pereaksi Dragendorff. Hasil penelitian menunjukkan  kombinasi 2,4 D 1 mg/L dan kinetin 4 mg/L berpengaruh dalam memacu keberhasilan pembentukan dan pertumbuhan kalus dengan rata-rata berat basah dan berat kering kalus masing-masing sebesar 2,359 dan 0,249 gram. Hasil identifikasi senyawa  menunjukkan  bahwa  pada  kalus  dan  tanaman  asal  mengandung  alkaloid  yang kemungkinan sama, yaitu senyawa dengan nilai Rf 0,89 dan 0,86. Kata kunci: Catharanthus roseus (L.) G. Don; 2,4 D; kinetin; kalus; alkaloid

## ABSTRACT
Catharanthus roseus (L.) G. Don known as tapak dara is a traditional medicinal plant, which has  been  cultivated  as  a  plant  producing  vincristine  and  vinblastine  alkaloid  compounds  as anticancer agents. This study aimed to determine the effect of the combination of 2,4 D and kinetin on the callus formation and growth  and to  determine the presence of alkaloid compounds  in the callus. The explants were inoculated in solid Murashige-Skoog (MS) medium added with 2.4 D 1 mg/L and 4 mg/L kinetin and were incubated untill the callus formed. The callus then were subcultured and harvested after 21 days old. Callus was macerated with ethanol pa. The alkaloid compounds were identified using TLC with silica gel 60 F254 as the stationary phase and chloroform: methanol (9:1) as  mobile  phase.  Spots  on  the  TLC  plates  were  detected  with  254  and  366  nm  UV  light  and Dragendorff reagent. The results showed that the combination of 2.4 D 1 mg/L and kinetin 4 mg/L affected promoting the formation and growth of callus with an average wet weight and dry weight 2.359 and 0.249 grams respectively. The alkaloid of the callus was predicted of the same compound as in the plants source since the Rf values of 0.89 and 0.86. Keywords : Catharanthus roseus (L.) G. Don; 2,4 D; kinetin; callus; alkaloids

## PENDAHULUAN
Catharanthus  roseus (L.)  G.  Don  dikenal  dengan  tapak  dara  famili  Apocynaceae  telah digunakan  sebagai  obat  tradisional  untuk  diabetes  di  Natal,  Afrika  Selatan,  India  dan  Ceylon.  Air perasan daunnya digunakan sebagai obat sengatan tawon  (George dan Eapen, 1999). Tapak dara banyak dibudidayakan sebagai tanaman hias.  Dan saat ini tapak dara juga dibudidayakan sebagai tanaman  penghasil  senyawa  alkaloid  yang  bermanfaat  untuk  pengobatan,  diantaranya  adalah vinkristin dan vinblastin sebagai antikanker (Lombonbitung dkk., 2015).
Menurut  Shukla  dkk.  (2006),  meskipun  daun  tapak  dara  mudah  dibudidayakan  dengan populasi yang tinggi tetapi tingkat produksi vinblastin dan vinkristin dalam daun tapak dara sangat rendah, yaitu sekitar 0,0003% dari total kandungan alkaloid 2,56%. Dengan demikian perlu dicari metode untuk meningkatkan produksi metabolit sekunder tersebut melalui kultur in vitro . Salah satu metodenya dengan menggunakan kultur kalus (Darsini, 2011; Namdeo, 2007) . Metabolit yang dihasilkan dari kalus sering kali kadarnya lebih tinggi dibanding metabolit yang diambil langsung dari tanamannya. Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk meningkatkan pertumbuhan kalus adalah dengan menambahkan suatu zat atau hormon ke dalam media kultur (Sitorus dkk., 2011) . Hormon  pertumbuhan  yang  paling  umum  digunakan  dalam  metode  kultur  jaringan  yaitu golongan auksin dan sitokinin. Auksin berfungsi dalam merangsang kalus atau proliferasi sel dan menginduksi embriogenesis somatik, sedangkan sitokinin berperan dalam pengaturan pembelahan sel serta morfogenesis (Phillips dan Garda, 2019) . Salah satu golongan auksin yang sering digunakan dan sangat efektif adalah 2,4 D ( Dichlorophenoxyacetic acid ) yang dapat merangsang pembentukan sel-sel  (Mahadi,  2012).  Zat  pengatur  tumbuh  sitokinin  yang  digunakan  adalah  kinetin  yang merupakan sitokinin sintetik yang mempunyai aktivitas yang lebih tinggi dari pada sitokinin alami (Santosa dan Nursandi, 2003). Kinetin dapat merangsang pertumbuhan percabangan tunas adventif yang  merupakan  perkembangan  organ  seperti  tunas  yang  berasal  dari  suatu  titik  tumbuh (Nurhidayah  dkk.,  2017).  Kombinasi  kedua  zat  pengatur  tumbuh  tersebut  mampu  mempercepat pembentukan  kalus  (Karimi,  2014).  Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  mengetahui  pengaruh kombinasi 2,4 D dan kinetin terhadap keberhasilan pembentukan dan pertumbuhan kalus dan untuk mengetahui  adanya  kandungan  senyawa  alkaloid  pada  kalus  daun  tapak  dara  dengan membandingkan dengan tanaman aslinya.

## METODE
Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Catharanthus rosesus (L.) G. Don. atau tapak dara yang diperoleh dari daerah Sleman yang berbunga merah. Bagian tanaman yang digunakan  adalah  daun  pada  urutan  2-4  dari  ujung  tanaman  tapak  dara.  Bahan-bahan  yang digunakan adalah etanol p.a, kloroform dan metanol, media Murashige-Skoog, Agar Bacteriological (Agargellan), sukrosa, myo-inositol, sumber besi, natrium hipoklorit, zat pengatur tumbuh (2,4 D dan kinetin), etanol 70%, kertas saring, dan aluminium foil.
Alat Peralatan yang digunakan antara lain seperangkat alat gelas, autoklaf, laminar air flow (LAF), pinset,  mata  pisau  dan  gagang  pisau,  cawan  petri,  botol  kultur,  seperangkat  peralatan  untuk kromatografi lapis tipis (KLT).

## Cara Kerja
Pembuatan media Murashige-Skoog (MS) padat
Ditimbang  Murashige-Skoog  (MS)  4,4  gram,  sukrosa  30  gram,  myo-inositol  100  mg  dan agarose 5 gram yang dilarutkan dalam akuades 1 L, kemudian ditambahkan Fe EDTA 5 mg/L dan zat pengatur tumbuh  (2,4 D 1 mg/L+kinetin 4 mg/L) untuk penumbuhan kalus. Media ditetapkan pHnya 5-6 kemudian dididihkan sampai jernih. Media dibagi ke dalam 100 botol kultur dan tutup rapat dengan aluminium foil . Media disterilisasi dalam autoklaf selama 20 menit dengan tekanan 1,5 atm dan suhu 121 o C.

## Sterilisasi eksplan
Daun  tapak  dara  dicuci  dengan  air  mengalir  dan  sabun  cair,  direndam  selama  10  menit kemudian  airnya  dibuang.  Daun  kemudian  direndam  dengan  akuades  tidak  steril  dan  sabun  cair selama 15 dan 20 menit, kemudian airnya dibuang. Daun direndam dengan alkohol 70%  selama 1 menit. Daun disterilkan dengan natrium hipoklorit 20% dalam akuades steril 80 ml selama 50 menit kemudian dibilas sebanyak 3 kali dengan akuades steril untuk menghilangkan sisa sterilan.

## Induksi dan subkultur kalus
Di  dalam  cawan  petri,  daun  tapak  dara  dipotong-potong  menjadi  bagian  yang  lebih  kecil (eksplan) dengan ukuran panjang 2 cm.  Potongan daun ditanam di dalam botol kultur yang berisi media MS padat. Kalus diinkubasi selama 21 hari pada suhu 25 o C disinari lampu TL 40 W selama 16 jam/hari.  Subkultur  dilakukan  dengan  memindah  kalus  sebanyak  250 mg pada  media  MS  padat dengan  penambahan  zat  pengatur  tumbuh  2,4 D sebanyak 1 mg/L dan kinetin sebanyak 4 mg/L. Subkultur  diinkubasi  selama  21  hari,  kalus  dipanen  dan  dilakukan  kuantifikasi  dengan  cara menimbang berat basah dan berat kering kalus.

## Identifikasi alkaloid menggunakan Kromatografi Lapis Tipis
Persiapan sampel
Kalus basah dikeringkan dalam lemari pengering pada suhu 40 𝑜 C selama 24 jam. Kalus kering sebanyak 500 mg dihaluskan dengan baik dalam mortar. Kalus kering dimaserasi dengan 5 ml etanol p.a selama 24 jam, selanjutnya disaring dan hasil maserasi dipekatkan dengan menguapkan di atas penangas air. Ekstraksi yang sama juga dilakukan pada daun tapak dara.
Analisis dengan metode KLT
Analisis  dilakukan  dengan  metode  kromatografi  lapis  tipis  dengan  cara  ekstrak  ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F254 dengan menggunakan fase gerak kloroform:metanol (9:1). Bercak diamati  dengan  sinar  UV  pada  panjang  gelombang  254  nm  dan  366  nm  dan  pereaksi  penampak bercak Dragendorff. Bercak pada plat KLT kemudian dihitung nilai Rf .
Analisis Data
Data pembentukan dan pertumbuhan kalus berupa warna, tekstur kalus, saat muncul kalus, bobot basah dan bobot kering kalus serta profil kromatogram kultur kalus daun tapak dara dianalisis secara deskriptif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Optimasi Sterilisasi Eksplan Dalam Pembentukan Kalus
Teknik  sterilisasi  merupakan  salah  satu  tahapan  yang  menentukan  keberhasilan  dalam melakukan  kultur in  vitro .  Sterilisasi  ini  bertujuan  untuk  menciptakan  kondisi  yang  steril  dari mikroorganisme (Sugiri, 2005). Selain media, alat dan ruangan yang steril, diperlukan juga sterilisasi pada eksplan. Sterilisasi eksplan ini merupakan salah satu proses yang sangat penting agar inisiasi kultur  bebas  dari  kontaminan  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan  eksplan.  Sterilisasi  eksplan dilakukan dengan mencuci bersih eksplan daun, perendaman dengan sabun cair dan alkohol serta perendaman menggunakan natrium hipoklorit.
Keberhasilan  sterilisasi  dalam  membentuk  kalus  dipengaruhi  oleh  pemilihan  eksplan  yang tepat.  Umur  tanaman  yang  digunakan  bisa  mempengaruhi  pembentukan  kalus.  Eksplan  yang digunakan merupakan jaringan tanaman yang masih muda tapi tidak terlalu muda. Jika jaringan yang digunakan  terlalu  muda  akan  terjadi  kegagalan  pembentukan  kalus  karena  terjadi  kerusakan jaringan eksplan saat dilakukan pensterilan dengan alkohol 70 % dan natrium hipoklorit. Menurut penelitian Samsumaharto dkk. (2010), jika daun yang diambil terlalu tua maka proses pembelahan lambat karena aktifitas metabolisme yang rendah sehingga zat pengatur tumbuh perlu ditambahkan untuk  memenuhi  kebutuhan  sel  tersebut.  Daun  yang  terlalu  tua  juga  sering  menyebabkan kontaminasi pada pembentukan eksplan. Pada penelitian ini, eksplan yang digunakan yaitu bagian daun pada urutan 2-4 dari ujung tanaman dengan umur tanaman yang belum berbunga.
Berdasarkan Tabel I dapat dilihat bahwa dari enam kali sterilisasi pada penanaman eksplan untuk membentuk kalus, pada waktu 50 menit adalah waktu yang efektif dalam menanam eksplan untuk menghasilkan kalus dengan tingkat keberhasilan 100 %.  Optimasi waktu sterilisasi yang yang dilakukan  oleh  Sartika  dan  Santosa  (2012)  menunjukkan  untuk  pembentukan  kalus  pada  daun mahkota dewa dengan waktu sterilisasi 20, 25, 30 dan 35 menggunakan natrium hipoklorit, pada waktu  30 menit adalah  waktu  yang efektif dalam menanam eksplan dengan tingkat keberhasilan 93,33%.
Pada  penelitian  ini,  lama  tidaknya  waktu  sterilisasi  tidak  menjamin  keberhasilan  dalam sterilisasi eksplan untuk membentuk kalus. Dimana terlihat pada penanaman eksplan dengan waktu sterilisasi 30, 35, 40 dan 45 menit semua eksplan mengalami kontaminasi, tidak ada yang berhasil dalam  membentuk  kalus  (Gambar  1).  Hal  ini  disebabkan  waktu  dalam  proses  sterilisasi  eksplan masih  kurang optimal, kemungkinan eksplan  masih mengandung kotoran-kotoran,  debu  maupun berbagai kontaminan yang berada pada permukaan eksplan. Dalam penelitian ini, kontaminan pada permukaan  eksplan  daun  tapak  dara  adalah  jamur . Tumbuhnya  jamur  pada  eksplan  awalnya ditandai dengan berupa kumpulan spora berwarna putih maupun coklat pada media atau eksplan yang  kemudian  menyebar  disekeliling  media  dan  menutupi  seluruh  permukaan  eksplan,  hingga akhirnya eksplan tersebut mati. Kontaminasi jamur ini rata-rata muncul pada hari ketiga dan hari kelima.  Kontaminasi jamur lebih dominan terjadi pada kultur karena hifa jamur yang cukup ringan dan banyak terdapat diudara sehingga cukup sulit dikendalikan kontaminasinya dibanding bakteri.
Masalah  pada pembuatan kalus selain kontaminasi adalah  rusaknya  jaringan eksplan atau browning pada waktu sterilisasi 55 dan 60 menit (Gambar 2). Hal ini mengakibatkan eksplan tidak dapat tumbuh membentuk kalus, namun pada sterilisasi dengan waktu 55 menit ada beberapa yang
Gambar 1. Jamur kontaminan pada eksplan daun tapak dara
Gambar 2. Jaringan rusak pada eksplan daun tapak dara Tabel I. Hasil Optimasi Sterilisasi Eksplan Daun Tapak Dara
Jenis Sterilan Waktu Sterilisasi (Menit) Pengamatan Eksplan Persentase Keberhasilan Pembentukan Kalus (%) Natrium hipoklorit 20 % 30 Kontaminasi 0 35 Kontaminasi 0 40 Kontaminasi 0 45 Kontaminasi 0 50 Terbentuk kalus 100 55 Jaringan eksplan rusak, terbentuk kalus 30 60 Jaringan eksplan rusak 0
dapat membentuk kalus sebesar 30 %. Browning merupakan suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam akibat adanya peristiwa teroksidasinya senyawa fenol menjadi quinon yang berasal dari eksplan yang bersifat toksik dan sering timbul akibat proses sterilisasi pada eksplan. Senyawa fenol umumnya  menghambat  pertumbuhan  dan  perkembangan  eksplan  atau  bahkan  menyebabkan kematian jaringan   (Andaryani, 2010; Fitriani dkk., 2019).
Browning umumnya  disebabkan  oleh  senyawa  fenolik  yang  biasanya  muncul  dan terakumulasi  saat  eksplan  dilukai,  biasanya  disebabkan  oleh  aktivasi  enzim Polyphenol  Oxidase (PPO). Pembukaan organ dapat menyebabkan ketidakseimbangan metabolisme dari Reactive Oxygen Species (ROS), peroksidasi membran lipid, dan hilangnya integritas membran sel yang dapat memicu akumulasi senyawa fenolik berlebihan dan menyebabkan browning (I’anatushshoimah dkk., 2020) . Oksidasi fenol akan meningkat dengan adanya cahaya  (Hutami, 2016). Oksidasi yang terjadi pada senyawa fenolik dapat melalui autoksidasi atau reaksi oksidasi enzimatik (Andarwulan dan Faradilla, 2012). Enzim PPO, bila terjadi secara meluas dengan adanya oksigen dan cahaya akan mengubah gugus  monofenol  menjadi  orto-hidroksi  fenol  kemudian  diubah  lagi  menjadi  gugus  orto-kuinon. Gugus orto-kuinon ini membentuk warna coklat ( I’anatushshoimah dkk., 2020). Menurut Santosa dan Nursandi (2003) browning ini juga dapat disebabkan oleh penggunaan bahan tanaman jaringan yang dewasa, tindakan berlebihan dalam sterilisasi, media yang tidak cocok atau lingkungan yang tidak mendukung. Faktor teknis saat penanaman juga sangat mempengaruhi, seperti penggunaan pisau dan pinset yang masih panas dan lamanya proses pengeringan eksplan yang sudah disterilisasi dengan larutan sterilan pada saat penanaman.
Upaya untuk mengatasi browning pada kultur dapat dilakukan dengan penambahan senyawa askorbat, modifikasi lingkungan kultur dengan menempatkan dalam ruangan gelap total, subkultur berulang  atau  pencelupan  dalam  cairan  seperti  arang  aktif  dan  sukrosa  (Corduk  dan  Aki,  2011). Penelitian Admojo dan Indrianto (2016), pencegahan browning pada induksi kalus kultur daun klon karet  dengan  perendaman  asam  askorbat  steril  100  mg/L  selama  30  menit  sebelum  tanam  dan inkubasi dalam kondisi gelap dapat mencegah munculnya browning hingga mampu terbentuk kalus. Kalus  yang  telah  terbentuk  disarankan  segera  disubkultur  pada  media  diferensiasi  kalus  untuk mencegah terjadinya browning susulan akibat terlalu lama berada dalam media yang sama.

## Pengaruh Kombinasi Zat Pengatur Tumbuh 2,4 D dan Kinetin
Selain  teknik  sterilisasi  eksplan,  hasil  yang  optimum  juga  akan  didapatkan  dengan penambahan  zat  pengatur  tumbuh  untuk  merangsang  pembentukan  dan  pertumbuhan  kalus. Menurut George dkk. (2008), untuk pembentukan kalus dibutuhkan fitohormon berupa auksin dan sitokinin. Senyawa auksin dan sitokinin secara endogen terdapat di dalam tanaman sehingga pada eksplan daun juga mengandung auksin dan sitokinin. Kartika dkk. (2013) menyatakan bahwa auksin dapat  mengubah  aktivitas  enzim  yang  berperan  dalam  sintesis  komponen  dinding  sel  dan menyusunnya kembali menjadi matriks dinding sel yang utuh yang akan mempengaruhi berat sel. Auksin dapat mendorong  pemanjangan sel yang diikuti dengan pembesaran sel dan peningkatan bobot  basah.  Menurut  (Zulkarnain,  2009),  pemberian  sitokinin  ke  dalam  media  kultur  jaringan penting untuk menginduksi perkembangan dan pertumbuhan eksplan. Jika ketersediaan sitokinin dalam media kultur sangat terbatas, maka pembelahan sel dalam jaringan akan terhambat.
Penelitian ini digunakan penambahan zat pengatur tumbuh untuk kedua golongan hormon tersebut,  berupa  2,4  D  sebagai  auksin  dan  kinetin  sebagai  sitokinin.  Pemilihan  2,4  D  karena mempunyai sifat stabil, tidak mudah terurai oleh enzim-enzim yang dikeluarkan sel atau pemanasan pada proses sterilisasi (Kartikasari dkk., 2013). Diantara jenis-jenis auksin 2,4 D sangat efektif untuk menginduksi terbentuknya kalus dan pertumbuhan kalus (Manuhara, 2014). Pemilihan kinetin juga digunakan karena kinetin penting dalam pengaturan pertumbuhan dan morfogenesis pada kultur in vitro (George dan Sherrington, 1984).
Penanaman  atau  inokulasi  eksplan  daun  tapak  dara  dilakukan  secara  aseptik.  Eskplan diletakkan pada media padat kemudian ditekan pelan-pelan agar terjadi persinggungan yang baik antara eksplan dan media (Gambar 3a). Keberhasilan inokulasi eksplan dalam pembentukan kalus ditandai dengan adanya respon positif berupa benjolan-benjolan kecil pada eksplan yang muncul pada  hari  ke  3  sejak  inokulasi  eksplan  (Gambar  3b).    Pada  7  hari  terlihat  respon  positif  kembali
dengan terjadinya pembengkakan atau menggulungnya bagian-bagian tertentu dari eksplan daun (Gambar 3c). Tonjolan berupa titik putih pada irisan eksplan menunjukkan mulai adanya tumbuh kalus yang terlihat pada hari ke 14 (Gambar 3d) dan pada 21 hari eksplan sudah terbentuk kalus (Gambar 3e). Hasil penelitian ini menunjukkan penambahan zat pengatur 2,4 D 1 mg/L dan kinetin 4 mg/L berpengaruh dalam memacu  keberhasilan pembentukan dan pertumbuhan kalus dengan rata-rata berat basah dan berat kering kalus masing-masing sebesar 2,359 dan 0,249 gram. Inokulasi eksplan pada media tanpa penambahan zat pengatur tumbuh 2,4 D 1 mg/L dan kinetin 4 mg/L pada inkubasi  21  hari,  eksplan  tidak  mampu  membentuk  kalus  meskipun  memberikan  respon  positif (Gambar 4). Kalus yang dihasilkan pada penelitian ini mempunyai tekstur yang kompak dan remah serta warna putih kehijauan. Tekstur kalus merupakan salah satu penanda yang digunakan untuk menilai  kualitas  kalus.  Tekstur  kalus  yang  kompak  dinilai  baik  karena  mampu  mengakumulasi metabolit sekunder lebih banyak (Yelnititis, 2012). Menurut Kusumawardhani (2017), Kalus yang berwarna putih kehijauan dan bertekstur meremah merupakan kalus terbaik, disebut dengan kalus embriogenik yang berkorelasi dengan kecepatan tumbuh sel sehingga produksi metabolit sekunder tertentu dapat segera dicapai.
Kecepatan induksi kalus pada tiap eksplan berbeda- beda karena kecepatan pembelahan sel pada tiap eksplan juga berbeda. Munculnya kalus ini merupakan reaksi penutupan jaringan akibat adanya  pelukaan  pada  jaringan  tersebut  (Sartika  dan  Santosa,  2012).  Pembentukan  kalus  pada jaringan  luka  dipacu  oleh  zat  pengatur  tumbuh  auksin  dan  sitokinin  endogen.  Secara in  vivo , umumnya kalus terbentuk pada bekas luka akibat serangan infeksi mikroorganisme dan stress (PYD dkk., 2012). Menurut Pandiangan dan Nainggolan (2006), analisis pertumbuhan kalus ditunjukkan dengan pertumbuhan linier berakhir pada hari ke 21 setelah inisiasi kalus. Maka kalus disubkultur sekali  tiap  3  minggu  agar  pertumbuhan  kalus  tidak  sempat  menurun  yang  dapat  mempengaruhi produksi alkaloidnya.
(a) (b) (c) (d) (e)
Gambar 3. Inokulasi eksplan daun tapak dara dengan 2,4 D dan kinetin. (a) Pertama kali inokulasi eksplan, (b) respon positif eksplan, (c) pembengkakan eksplan, (d) mulai muncul kalus berupa titik putih, (e) kalus pada hari ke 21
Gambar 4. Inokulasi eksplan daun tapak dara tanpa 2,4 D dan kinetin pada hari ke 21

## Identifikasi Senyawa Alkaloid Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Metode  KLT  digunakan  untuk  identifikasi  golongan  senyawa  alkaloid  ekstrak  kalus  daun tapak dara dengan mengamati warna bercak yang timbul dibandingkan dengan ekstrak daun tapak dara.  Fase  diam  pada  system  ini  dipakai  silika  gel  60  F254  dan  fase  gerak  berupa  campuran kloroform:metanol (9:1) dengan jarak pengembangan 8 cm. Deteksi senyawa menggunakan sinar UV 254 nm dan 366 nm serta pereaksi Dragendorff. Hasil analisis ekstrak daun dan kalus tapak dara menunjukkan pemisahan yang baik dengan sistem KLT tersebut.
Profil  KLT  ekstrak  daun  dan  kalus  tapak  dara  menunjukkan  hasil  yang  mirip.  Ketika  plat disinari dengan UV 254 tidak terbentuk warna, tapi terjadi peredaman fluoresensi  dengan nilai Rf 0,11 pada ekstrak daun dan ada 2 bercak pada ekstrak kalus dengan nilai Rf masing-masing 0,15 dan 0,89 (Gambar 5a). Deteksi dengan sinar UV 366 menunjukkan adanya bercak yang berfluoresensi biru dengan nilai Rf 0,11 pada ekstrak daun dan 0,18 pada ekstrak kalus (Gambar 5b). Setelah plat disemprot dengan pereaksi Dragendorff terdapat bercak berwarna jingga yang dapat dilihat secara visual  dengan nilai Rf 0,86 pada ekstrak daun dan  0,89 pada ekstrak kalus (Gambar  5c).  Bercak berwarna  jingga  dengan  pereaksi  Dragendorff  tersebut  menandakan  adanya  senyawa  golongan alkaloid (Samsumaharto dkk., 2010). Hasil penelitian menunjukkan bahwa baik kalus maupun daun tanaman aslinya sama-sama mengandung senyawa alkaloid. Produksi metabolit sekunder dengan kalus  ini  hanya  diperlukan  jaringan  tanaman  yang  sedikit  saja  dari  tanaman  asli  dan  jaringan tersebut dapat diperbanyak dalam waktu singkat untuk menghasilkan senyawa yang sama dengan tanaman  aslinya.  Kultur  kalus  ini  memilliki  kelebihan  dalam  produksi  metabolit  sekunder dibandingkan  dengan  tanaman  aslinya  yaitu  tidak  memerlukan  lahan  yang  luas,  tidak  adanya keterbatasan iklim serta senyawa aktif yang diperoleh bersifat kontinyu dalam keadaan terkontrol (Sugiyarto dan Kuswandi, 2014).

## KESIMPULAN
Kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  2,4  D  dan  kinetin  mampu  memacu  pembentukan  dan pertumbuhan kalus. Berat kalus yang diperoleh dalam penelitian ini yaitu dengan rata-rata berat basah dan berat kering kalus masing-masing sebesar 2,359 dan 0,249 gram.  Kalus yang dihasilkan berwarna putih kehijauan dengan tekstur kompak dan remah. Kalus daun tapak dara hasil kultur jaringan  dengan  penambahan  kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  2,4  D  dan  kinetin  mengandung senyawa alkaloid yang sama dengan tanaman aslinya.
(a) (b) (c)
Gambar 5. Kromatogram ekstrak daun dan kalus tapak dara, (a) disinari UV 254 nm, (b) disinari UV 366 nm, (c) disemprot pereaksi Dragendorff ; D= ekstrak daun tapak dara (tanaman asli), K= ekstrak kalus daun tapak dara
D K
D K D K

## DAFTAR PUSTAKA
Admojo, L.  dan Indrianto, A., 2016.  Pencegahan Browning Fase Inisiasi Kalus Pada  Kultur Midrib Daun Klon Karet (Hevea brasiliensis Muell.Arg) 34 : 25 – 34.
Andarwulan, N. dan Faradilla, R.F., 2012. Senyawa Fenolik Pada Beberapa Sayuran Indigenous Dari Indonesia. Bogor: Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center Research and Community Service Institution Bogor Agricultural University .
Andaryani, S., 2010. Kajian penggunaan berbagai konsentrasi BAP dan 2,4-D terhadap induksi kalus jarak pagar (Jatropha curcas L.) secara in vitro. Skripsi Universitas Sebelas Maret Surakarta , . Corduk, N. dan Aki, C., 2011. Inhibition of browning problem during micropropagation of Sideritis trojana Bornm. an endemic medicinal herb of Turkey. Romanian Biotechnological Letters , 16 : 6760 – 6765.
Darsini, N.N., 2011. Perkembangan Latisifer Pada Kultur Kalus Catharanthus roseus (L) G. Don Yang Diinduksi Dengan Kombinasi Zat Pengatur Tumbuh Kinetin + NAA 5. Jurnal Biologi , 15 : 34 – 38.
Fitriani, Y., Wijana, G., dan Darmawati, I.A.P., 2019. Teknik Sterilisasi Dan Efektivitas 2,4-D Terhadap Pembentukan Kalus Eksplan Daun Nilam (Pogostemon cablin Benth) In Vitro. J. Agric. Sci. and Biotechnol , 8 : 41 – 52. George,  E.F.,  Hall,  M.A.,  dan  Klerk,  G.-J.  de,  2008. Plant  Propagation  by  Tissue  Culture ,  3rd  ed.  ed. Springer, Dordrecht.
George, L. dan Eapen, S., 1999. Biotecnological Approaches For The Development Of Anticancer Drugs From Plants. In Role Of  Biotechnology In Medicinal And Aromatic Plants (Eds) 1 , 2 : 1 – 10. Hutami, S., 2016. ULASAN Masalah Pencoklatan pada Kultur Jaringan. Jurnal AgroBiogen , 4 : 83 – 88. I’anatushshoimah,  Nurchayati, Y.,  Prihastanti, E., dan Hatuti, R.B., 2020. Effects of Light  for Callus Induction of Mangrove Plant (Rhizophora Apiculata Bi) by In Vitro. Life Science , 9 : 138 – 148. Karimi, N., 2014. Effect of Different Growth Regulators on Callus Induction and Plant Regeneration of Satureja species. Annual Research & Review in Biology , 4 : 2646 – 2654.
Kartika,  L.,  Atmodjo,  P.K.,  dan  Purwijantiningsih,  L.M.E.,  2013.  Kecepatan  Induksi  Kalus  Dan Kandungan  Eugenol  Sirih  Merah  (Piper  crocatum  Ruiz  and  Pav.)  Yang  Diperlakukan Menggunakan Variasi Jenis Dan Konsentrasi Auksin 1 – 15.
Kartikasari, P., Hidayat, M.T., dan Ratnasari, E., 2013. Pengaruh Zat Pengatur Tumbuh 2,4-D (2,4- Dichlorophenoxyacetic acid) dan Kinetin (6-Furfurylaminopurine) untuk Pertumbuhan Tunas Eksplan  Pucuk  Tanaman  Jabon  (Anthocephalus  cadamba  Miq.  ex  Roxb.)  secara  In  Vitro.
LenteraBio , 2 : 75 – 80.
Kusumawardhani,  L.R.,  2017.  Analisis  Kandungan  Flavonoid  Dan  Alkaloid  Pada  Kalus  Tanaman Pohpohan  (Pilea  Trinervia  W.)  Yang  Diinduksi  Dengan  Hormon  Kinetin  Dan  2,4 Diklorofenoksiasetat. Fakultas Teknobiologi Universitas Atmajaya Yogyakarta. , . Lombonbitung,  E.,  Tilaar,  W.,  dan  Pandiangan,  D.,  2015.  Kandungan  Vinkristin  Pada  Kultur  Kalus Catharaanthus roseus (L) G. Don Yang Diberi Perlakuan Triptofan dana Vindolin. Jurnal Ilmiah Farmasi , 4 : 12.
Mahadi,  I.,  2012.  Induksi  Kalus  Kenerak  (Goniothalamus  umbrosus)  Berdasarkan  Jenis  Eksplan Menggunakan Metode In Vitro. J. Agrotek. Trop , 1 : 18 – 22.
Namdeo  A.  G,  2007.  Plant  Cell  Elicitation  for  Production  of  Secondary  Metabolites:  A  Review. Pharmacognosy Reviews , 1 : 69 – 79.
Nurhidayah, T., Mardhiansyah, M., dan Mulyani, D., 2017. Pengaruh Sitokinin (Kinetin) dan Auksin (2,4-D)  dalam  Media  Induksi  Murashige  dan  Skoog  terhadap  Perkembangan  Eksplan Meristem Apikal Tunas Anakan Tanaman Sagu (Metroxylon sagu Rottb.). J. Agrotek. Trop , 6 :
23 – 28.
Pandiangan, D. dan Nainggolan, N., 2006. Produksi Alkaloid Dari Kalus (Catharanthus roseus (L) G. Don. Jurnal Ilmiah Sains , 6 : 48 – 54.
Phillips, G.C.  dan Garda, M., 2019. Plant tissue culture  media and practices: an overview. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant , 55 : 242 – 257.
PYD, N.M.D., Waeniati, Muslimin, dan Suwastika, I.N., 2012. Pengaruh Penambahan Air Kelapa Dan Berbagai Konsentrasi Hormon 2,4-D Pada Medium Ms  Dalam Menginduksi Kalus Tanaman Anggur Hijau (Vitis vinifera L.) 1 : 53 – 62.
Samsumaharto, R.A., Harti, A.S., Yuansari, C.P., dan Sutoyo, J.L.J., 2010. Deteksi Alkaloid Dalam Kalus Daun Tapak Dara (Catharanthus roseus (L) G. Don Dengan Perlakuan Kombinasi Hormon NAA dan FAP pada Kultur In Vitro 8.
Sartika, D. dan Santosa, D., 2012. Pengaruh Kombinasi Zat Pengatur Tumbuh (2,4 D Dan Kinetin) Terhadap Pertumbuhan Dan Kandungan Metabolit Sekunder Pada Kalus Phaleria Macrocarpa (Scheff.) Boerl. ) 5 : 53 – 62.
Shukla,  A.K.,  Shasany,  A.K.,  Gupta,  M.M.,  dan  Khanuja,  S.P.S.,  2006.  Transcriptome  analysis  in Catharanthus  roseus  leaves  and  roots  for  comparative  terpenoid  indole  alkaloid  profiles. Journal of Experimental Botany , 57: 3921 – 3932.
Sitorus, E.N., Hastuti, E.D., dan Setiari, N.-, 2011. Induksi Kalus Binahong (Basella rubra L.) Secara In Vitro  Pada  Media  Murashige  &  Skoog  Dengan  Konsentrasi  Sukrosa  Yang  Berbeda. Bioma : Berkala Ilmiah Biologi , 13 : 1 – 7.
Sugiri,  A.,  2005.  Pembentukan  Kalus  Embrioid  Kultur  Ovary  Pisang  Melalui  Beberapa  Komposisi Media Kultur. Pengantar Falsafah Sains , 1 – 8.
Sugiyarto,  L.  dan  Kuswandi,  P.C.,  2014.  Pengaruh  2,4-Diklorofenoksiasetat  (2,4-D)  Dan  Benzyl Aminopurin  (BAP)  Terhadap  Pertumbuhan  Kalus  Daun  Binahong  (Anredera  cordifolia  L.) Serta Analisis Kandungan Flavonoid Total. Jurnal Penelitian Saintek , 19 : 23 – 30. Yelnititis, 2012. Pembentukan Kalus Remah Dari Eksplan Daun Ramin (Gonystylus bancanus (Miq) Kurz.). Jurnal Pemuliaan Tanaman Hutan , 6 : 181 – 194. Zulkarnain, 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Solusi Perbanyakan Tanaman Budi Daya . Jakarta: Bumi Aksara.