## Ekspresi Kalretinin Pada Diagnosis Sitologi Efusi Pleura dengan Gambaran Sitomorfologi Adenokarsinoma
Syeben Hezer , Indra Wijaya , Ika Pawitra Miranti , Meira Dewi Kusuma
Bagian Patologi Anatomi Universitas Diponegoro/ RSUP Dr. Kariadi Jalan dokter Soetomo no 16-18, Semarang 50231. Telp (024) 8441270 Pesawat: 4030 , Email: iapismg@gmail.com

## ABSTRAK
Metastasis adenokarsinoma adalah kasus yang paling sering dijumpai pada efusi pleura yang disebabkan oleh keganasan. calretinin sampai saat ini digunakan sebagai penanda  untuk sel mesothel baik jinak maupun ganas. Calretinin digunakan terutama untuk membedakan mesothelioma dari suatu karsinoma atau metastasis keganasan  lainnya.  Namun  beberapa  penelitian    membuktikan  bahwa  kalretinin  tidak  hanya  positif  untuk  sel- sel  mesothel  tetapi  dapat  pula  pada  keganasan  lain  seperti  metastasis  adenokarsinoma  atau  squamous  sel karsinoma. Penelitian ini bertujuan membuktikan terdapat ekspresi kalretinin pada efusi pleura dengan gambaran sitomorfologi suatu adenokarsinoma. Jenis penelitian ini adalah deskriptif observasional  dengan desain cross sectional. Terdapat 20 blok sitologi dari efusi pleura  yang memenuhi kriteria kemudian dilakukan pengecatan calretinin. Ekspresi positif ditandai dengan tercatnya inti dan sitoplasma sel yang dicurigai ganas. Ekspresinya dibaca  oleh  2  orang  spesialis  Patologi Anatomi  secara  blindly.    Ekspresi  calretinin    negatif    pada  6    sampel, positif I  pada 8 sampel, positif II pada  2 sampel dan positif III   pada   4 sampel. Terdapat ekspresi calretinin pada pada efusi pleura dengan gambaran sitomorfologi suatu adenokarsinoma dengan tingkat positivitas yang berbeda-beda, hal ini menunjukan bahwa kalretinin bukan merupakan penanda yang spesi fi k dan sensitif untuk sel-sel mesothel baik jinak maupun ganas.
Kata kunci: Calretinin, Sitologi efusi, Adenokarsinoma

## ABSTRACT
Metastatic  adenocarcinoma  is  the  most  common  case  in  pleural  effusions  caused  by  malignancy.  Up to  recently,  calretinin  is  used  as  marker  for  benign  and  malignant  mesothelial.      Calretinin  used  primarily  to distinguish  mesothelioma  from  metastatic  carcinoma  or  other  malignancies.  However,  some  studies  shown that not only calretinin positive for mesothelial cells but can also be in other malignancies such as metastatic adenocarcinoma or squamous cell carcinoma. This study aims to prove there are calretinin expression in pleural effusions with cytomorphologic adenocarcinoma. This study is descriptive analytic study using cross sectional design.  Twenty  paraf fi n  embedded  cells  of  pleural  effusion  that  meet  the  criteria  were  stained  with  calretinin. Positive reaction  was de fi ned as nuclear and cytoplasmic staining. The immunoreactivity was evaluated blindly by two pathologists. Calretinin staining was negative in 6 samples, positive I in 8 samples, positive  II  in 2 samples and    positive  III  in  4  samples.  There  was  calretinin  expression  in  the  pleural  effusion  with    cytomorphologic adenocarcinoma on different levels of positivities, this shows that calretinin is not a speci fi c and sensitive marker for benign and malignant mesothel.
Keywords : Calretinin, Cytology effusion, Adenocarcinoma

## Pendahuluan
Efusi  pleura  adalah  penumpukan  cairan dalam  rongga  pleura,  yang  merupakan  ruang antara  paru-paru  dengan  dinding  dada  bagian dalam.  Setengah dari penderita kanker  mengalami
metastasis  ke  ruang  pleura  dan  menyebabkan terjadinya  efusi  .  Lebih  dari  75%  penderita dengan efusi pleura curiga ganas disebabkan oleh metastasis  yang berasal dari paru, ovarium atau lymphoma.  Metastasis  adenokarsinoma  adalah
kasus yang paling sering dijumpai, pada pria paling sering  berasal  dari  paru  sedangkan  pada  wanita terutama berasal dari ovarium (Cancer Net., 2012; Ensani et al ., 2011; Muduly et al ., 2011).
Calretinin  termasuk  keluarga EF-hand merupakan  suatu calcium-binding  protein , keluarga EF-hand yang  banyak  dikenal  yaitu calbindin -D28k  (CB), calretinin (CR)  and parvalbumin (PV). Calretinin  pertama  kali dikemukakan  oleh  Rogers  pada  tahun  1987 dengan  meneliti  sel-sel  retina,  penamaannya berdasarkan kesamaan struktur dengan Calbindin D28k,  terletak  pada  kromosom  16.  Calretinin berupa struktur helix-loop-helix yang mempunyai 269  –  271  asam  amino  dan  berisi  6  rantai  EF, 4-rantainya mengikat Ca2 + dengan a fi nitas tinggi, 1  rantai  mengikat  ca2 + dengan  a fi nitas  rendah dan  1  rantai  non-fungsional.  Calretinin  juga mempunyai a fi nitas terhadap ion cu2 + (Robinson et  al .,  2005;  Kuznicki et  al .,  1995). Calretinin banyak  ditemukan  pada  jaringan  saraf  pusat  dan perifer,  di  sel-sel  retina,  pada  sel-sel  mesothel, kelenjar ekrin kulit, tubulus ginjal,  sel leydig dan sertoli dari testis, endometrium,  stroma ovarium dan  sel  kortical  ginjal  (Bobrowicz et  al .  2011; Invitrigen 2007; Lee et al ., 2006; Hiradfar et al ., 2012) Calretinin berperan dalam buffer fi siologis ion  kalsium  sitosol,  transportasi  kalsium  dan perlindungan  terhadap  kelebihan  ion  kalsium (Hiradfar et al ., 2012).
Imunihistokimia  calretinin  sampai  saat  ini digunakan  sebagai  penanda  untuk  sel  mesothel baik  jinak  maupun  ganas.  Menurut  laporan lebih  dari  95%  positif  pada  mesothelioma  tipe epitheloid.  Calretinin  digunakan  terutama  untuk membedakan mesothelioma dari suatu karsinoma atau  metastasis  keganasan  lain    terutama  yang memiliki    gambaran    mirip  mesothelioma  dari jaringan biopsi atau sitologi (Miller, 2003). Namun penelitian  lain  membuktikan  bahwa  kalretinin tidak  hanya  positif  untuk  sel-sel  mesothel  tetapi dapat pula pada keganasan lain seperti metastasis adenokarsinoma  atau  squamous  sel  karsinoma. Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Barberis  dengan pewarnaan  anticalretinin  menunjukan  100% positif  pada  mesothelioma  maligna  dan  23% yang  positif  pada  metastasis  adenokarsinoma pada  cairan  pleura.  Sebaliknya  penelitian  yang dilakukan  Simsir  27%  positif  pada  reaktif mesothelial,  35%  pada    mesothelioma  maligna dan  48%  positif  pada  adenokarsinoma  (Chhieng
et  al .,  2000).  Menurut  Nelson  calretinin  dapat positif 6-10% pada adenokarsinoma paru, 31-38% pada  serous  karsinoma  dan  0-4%  pada  renal  sel karsinoma,  sedangkan  squamous  sel  karsinoma dari  paru  calretinin  dapat  positif  pada  23-39% kasus  dengan  tingkat  positivitas  yang  berbeda- beda (Ordonez, 2005).
Penelitian  ini  bertujuan  membuktikan terdapat ekspresi kalretinin pada efusi pleura  dengan  gambaran  sitomorfologi  suatu adenokarsinoma.

## Metode
Penelitian  ini  menggunakan  metode deskriptif  observasional    dengan  desain cross sectional, ruang  lingkup  disiplin  penelitian ini  meliputi  bidang  ilmu  Patologi  Anatomi, khususnya  sitologi  cairan  dan  imunositokimia yang dilakukan di laboratorium Patologi Anatomi FK UNDIP/ RSDK Semarang.
Populasi penelitian meliputi penderita yang dirawat inap di Rumah Sakit Umum Dr. Kariadi Semarang periode januari 2012 sampai desember 2013  dengan  diagnosis  klinis  efusi  pleura    yang disebabkan  oleh  metastasis  adenokarsinoma dari  paru  atau  tempat  lain.  Pemilihan  sampel dilakukan  dengan  teknik  sistimatik  yaitu  dengan memilih  blok  sitologi  yang  memberi  gambaran keganasan,  serta  memenuhi  kriteria  inklusi  yaitu penderita yang dirawat inap di RSDK Semarang, mempunyai  blok  sitologi  dengan  gambaran metastasis  adenokarsinoma,  blok  sitologi  masih dapat dipotong 2-5 kali dengan tebal 2-3mm, dan kriteria  eksklusi  blok  sitologi  rusak  atau  tidak terdapat  sel, b lok  sitologi  sudah  tipis  dan  hanya dapat dipotong 2 kali saja , Sediaan sitologi yang tidak  dibuat  blok.  Didapatkan  20  blok  yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
Blok  dipotong  dan  dilakukan  pengecatan immunositokimia  calretinin.  Ekspresi  calretinin merupakan  skor  ekspresi  calretinin  positif  pada sel  ganas,  dengan  pemeriksaan  imunositokimia, berdasarkan    persentase  sel  ganas  yang  tercat pada  inti  dan  sitoplasma  (Ensani et  al .,  2011; Roberts et  al .,  2001;  Foster et  al .,  2001),  yaitu negatif    =  tidak  tampak  sel  ganas  yang  tercat, positif I = 1- 25% tercat pada sel ganas, positif II = 26-50% tercat pada sel ganas, positif  III = 51- 100% tercat pada sel ganas (Chhieng et al ., 2000; Roberts et al ., 2001; Foster et al ., 2001; Ordonez
et  al .,  2006).  Dengan  melihat  pada  10  lapang pandang  menggunakan  pembesaran  400x  secara acak,  kemudian  dibaca  oleh  dua  dokter  spesialis Patologi  Anatomi  secara blindly selanjutnya dibandingkan  dengan  menggunakan  test  Kappa. Slide  dibaca  menggunakan  mikroskop  Olympus PX51,  pembesaran  lensa  okuler  10x  dan  lensa obyektif 40x.
Sitomorfologi adenokarsinoma pada cairan efusi berupa smear yang hiperseluler, dengan sel- sel ganas yang tersebar atau berkelompok member gambaran  dua  atau  tiga  dimensi,  ada  pula  yang tersusun  asiner,  sel  tersebut  memiliki  inti  yang pleomor fi k,  hiperkromatik,  anak  inti  prominen, mitosis  abnormal  dapat  ditemukan,  serta  kadang ditemukan  sel-sel  dengan  bentukan  yang  aneh/ bizarre (Gray W & Kocjan, 2010).

## Hasil dan Pembahasan
Penelitian  ini  meggunakan  20  sampel blok  sitologi,  kemudian    dilakukan  pengecatan calretinin.  Hasil  pengecatan  di  dibaca  oleh  dua dokter  spesialis  Patologi  Anatomi,  independen selanjutnya  dibandingkan  dengan  menggunakan test  Kappa.  Nilai  kappa  yang  diperoleh  adalah 0,88.
Tabel 1. Nilai Mean,  median dan modus dari ekspresi  Calretinin
Mean Media Modus Ekspresi Calretinin 2,2 2,0 2
Pada  tabel  1.  terlihat  nilai  mean,  median dan  modus    ekspresi  calretinin  dan    pada  20 sampel blok sitologi dengan penilaian 1= negatif, 2= positif I, 3= positif II dan 4= positif III.
Tabel 2. Frekuensi ekspresi calretinin
Pada  tabel  2  terlihat  bahwa  frekuensi ekspresi calretinin terbanyak adalah positif I yaitu sebanyak  8  sampel  atau  40%,  sedangkan  yang paling sedikit  positif  II  sebanyak 2 sampel atau 10%.
Gambar 1. Pengecatan HE pada blok sitologi dengan pembesaran 20x, panah menunjukan kelompok sel yang mencurigakan keganasan
.
Gambar 2. Pengecatan calretinin pada blok sitologi dengan pembesaran 200x, menunjukan kontrol positif pada sel-sel

## mesothel
Gambar 3. Pengecatan calretinin pada blok sitologi dengan pembesaran 400x, panah menunjukan sel-sel curiga ganas tercat positif
Gambar 4. Pengecatan calretinin pada blok sitologi dengan pembesaran 200x, panah menunjukan kelompok sel curiga ganas tidak tercat (-)

## Pembahasan
Dari 20 sampel yang digunakan, 14 sampel berekspresi positif atau 70%, sedangkan 6 sampel atau 30% negatif. Dari 14 sampel tersebut 8 sampel atau  40%  positif  I,  2  sampel  atau  10%  positif  II dan  4  sampel  atau  20%  positif  III  .  Nilai  positif ditandai dengan tercatnya inti dan sitoplasma sel yang dicurigai sebagai sel ganas.
Pada  14  sampel  yang  bereaksi  positif menunjukan sel-sel tersebut mengandung calretinin,  dengan  tingkat  positivitas  yang berbeda-beda  sedangkan  pada  6  sampel  yang negatif  menunjukan  sel-sel  tersebut  tidak mengandung  kalretinin.  Secara  teoritis  calretinin terdapat  terutama  pada  sel-sel  saraf  pusat  dan perifer  juga  pada  sel  mesothel  normal  maupun keganasan  (Kuznicki et  al .,  1995),  Namun pada beberapa penelitian menunjukan adenocarcinoma, squamous  cell  carcinoma  atau  tumor  lain    juga dapat  bereaksi  positif  pada  pewarnaan  dengan calretinin  (Chhieng et  al .,  2000;  Foster et  al ., 2001).
Pada  penelitian  ini  didapatkan  70% sampel  yang  digunakan  berekspresi  positif,  hal ini  menunjukan  bahwa  kalretinin  tidak  hanya terdapat  pada  sel-sel  mesothel,  tetapi  dapat  pula ditemukan  pada  adenokarsinom.  Terdapat  20% dengan  nilai  positif  III  atau  lebih  dari  50%  sel tumor  yang  ditemukan  tercat  positif,  hasil  ini bertentangan dengan apa yang dikemukakan oleh
Nelson  yang  mengatakan  bahwa  meskipun  pada adenokarsinoma  hasilnya  dapat  positif  namun nilai    positivitasnya  rendah  atau  hanya  bersifat fokal dibandingkan pada mesothelioma malignan dimana  didapatkan  positif  kuat  dan  difus  pada semua  sel  ganas  (Ordonez,  2005). Terdapat  juga hal-hal yang dapat mempengaruhi hasil diagnosis diantaranya antibodi yang digunakan, prosedurnya, serta  jumlah sel ganas yang ditemuka, serta yang terpenting adalah gambaran sitomorfologi sel-sel yang  didapat  benar-benar  merupakan  gambaran adenokarsinoma  bukan  suatu  mesothel  reaktif (Yahya et al .,  2013). Kelemahan pada penelitian ini  adalah  jumlah  sel  ganas  pada  tiap  sampel tidak  sama,  sehingga  dapat  mempengaruhi persentasinya.
Melihat  hasil  tersebut  maka  penggunaan kalretinin  secara  tunggal  untuk  membedakan mesothelioma dari suatu karsinoma atau metastasis keganasan lain  terutama yang memiliki  gambaran mirip  mesothelioma  dari  jaringan  biopsi  atau sitologi perlu dipikirkan lagi. Perlu juga  diingat belum  ada  satu  immunohistokimia  marker  yang benar-benar 100% spesi fi k dan sensitif (Relan et al., 2013).

## Simpulan
Terdapat  ekspresi  calretinin    pada  pada efusi  pleura  dengan  gambaran  sitomorfologi suatu  adenokarsinoma  dengan  tingkat  positivitas yang  berbeda-beda,  hal  ini  menunjukan  bahwa kalretinin  bukan  merupakan  penanda  yang spesi fi k  dan  sensitif  untuk  sel-sel  mesothel  baik jinak maupun ganas.

## Saran
Untuk  penelitian  selanjutnya  disarankan menggunakan sampel yang lebih besar.

## Daftar Pustaka
Bobrowicz TW, Lowendowska E, Stepieh T, Szpak Gm. 2011.  Differential  expression  of  calbindin D28k,  calretinin  and  parvalbumin  in  the cerebellum of pups of ethanol-treated female rats. Folia Neuropathol , 49 (1): 47-55
Cancer  Net.  Fluid  Around  the  Lungs  or  Malignant Pleural Effusion. [homepage on the Internet]. 2012 [cited 2014 Feb 27]. Available from:,
Oncologist-approved  cancer  information from  the  American  Society  of  Clinical Oncology  Web  site:  http://www.cancer.net/ navigating-cancer-care/side-effects/fluid- around-lungs-or-malignant-pleural-effusion.
Chhieng DC, Yen H, Schefer D, Cangiarella Jf, Jagindar J,  Chiriboga  La, et  al .  2000.    Calretinin Staining Pattern Aids in the Differentiation of  Mesothelioma  from  Adenocarcinoma  in Serous Effusions. American Cancer Society , 90(3):194-200.
Ensani F, Nemetizadeh F, Irvanlou G. 2011. Accuracy of Immunohistochemistery in Evaluation on Malignant  Pleura  and  Peritoneal  Effusion.
Pol. J Patho , 2:95-100.
Foster  MR,  Johnson  JE,  Olson  SJ,  Allred  C.  2001. Immunohistochemical  Analysis  of  Nuclear Versus  Cytoplasmic  Staining  of  WT1  in Malignant  Mesotheliomas  and  Primary Pulmonary  Adenocarcinomas. Arch  Pathol Lab Med , 125:1316-20.
Gray  W  &  Kocjan  C  Dyagnostic  Cytopathology.  3rd ed. China: Livingstone Elsevier; 2010.
Hiradfar  M,  Shari fi M,  Khajedaluee  M,  Zabolinejad N, Jamshidi St. 2012. Calretinin Immunohistochemistery:  An  Aid  in  the Diagnosis of Hirschsprung’s Disease. Iran J
Basic Med Sci ., 15(5):1053-9.
Invitrigen  A.  Rabbit  anti-Calretinin.  [homepage  on the  Internet].  2007  [cited  2014  Feb  27]. Available from: http://tools.lifetechnologies. com/content/sfs/manuals/081211_Rev0808. pdf
Kuznicki,  J,  Wang  TL,  Martin  BM,  Winsky  L, Jacobowitz  Dm.  1995,  Localization  of Ca2+-dependent  conformational  changes of  calretinin  by  limited  tryptic  proteolysis, Biochem. J . 308:607-12.
Lee ES, Leong AS, Kim YS, Lee Jh, Kim I, Ahn Gh. 2006.  Calretinin,  CD34,  and  a-smooth muscle  actin  in  the  identi fi cation  of peritoneal  invasive  implants  of  serous borderline  tumors  of  the  ovary.  Modern Pathology, 19:364-72.
Miller  RT.  Calretinin.  [serial  on  the  Internet].  2003 [cited 2014 Feb 27]. Available from: /http:// www.ihcworld.com/_newsletter/2003/ focus_feb_2003.pdf.
Muduly DK, Deo SV, Kalliapur AA, Shukla. 2011, An Update  in  the  Management  of  Malignant Pleural  Effusion. Indian  J  Palliat  Care, 17(2):98-103
Ordonez  NG,  2005,  Immunohistochemical  Diagnosis of  Epithelioid  Mesothelioma  An  Update, Arch Pathol Lab Med , 129:1407-14.
Ordonez  NG,  2006,    The  diagnostic  utility  of immunohistochemistry  in  distinguishing between  epithelioid  mesotheliomas  and squamous  carcinomas  of  the  lung:  a comparative  study. Modern  Pathology , 19:417-28.
Relan V, Morrison L, Parsonson K, Clarke Be, Duhig Ee,  Windsor  Mn,  et  al.  2013.  Phenotype and  Karyotype  of  Human  Malignant Mesothelioma Cell Lines. Plos One , 8(3):1-
8.
Roberts F, Downie IR, Harper CM, Burnett Ra. 2001,
Immunohistochemical  Analysis  Still  Has  a
Limited Role in the Diagnosis of Malignant
Mesothelioma. Am J Clin Pathol . 116:253-
62.
Robinson BW, Lake RA. 2005, Advances in Malignant Mesothelioma, NEJM ,  353(15):1591-603.
Yahya  ZM,  Ali  HH,  Hussein  HG.  2013,  Evaluation of  the  Sensitivity  and  Speci fi city  of Immunohistochemical  Marker  in  the Differential Diagnosis of Effusion Cytology. Oman Medical Journal, 28(6):410-6.