## PENINGKATAN PRODUKSI KATARANTIN MELALUI  TEKNIK ELISITASI PADA KULTUR AGREGAT SEL Catharanthus roseus
Dingse Pandiangan 1)
1) Program Studi Biologi FMIPA Universitas Sam Ratulangi Manado, 95115

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk optimasi dan peningkatan produksi antikanker katarantin khususnya elisitasi.  Tujuan  praktisnya  adalah  untuk  mengetahui  pertumbuhan  kalus  agregat  sel C.  roseus yang  diberi  elisitor,  menemukan  kurva  tumbuh S.  cerevisiae dan  bahan  elisitor,  menemukan kandungan  katarantin  pada  agregat  sel  dan  medium    perlakuan  dan  menemukan  waktu  panen perlakuan  elisitasi  yang  menghasilkan    kandungan  katarantin  yang  paling  tinggi.  Dari  hasil penelitian ini diharapkan dapat dihasilkan suatu informasi mengenai peningkatan katarantin yang dihasilkan  (diproduksi)  secara  kultur  ( in  vitro )  untuk  dimanfaatkan  pada  penelitian  selanjutnya. Tahapan  penelitian  dilakukan  antara lain  1) tahap  kultur S.  cerevisiae dan  persiapan elisitor,  2) tahap  kultur  agregat  sel  dengan  perlakuan  elisitasi,  3).  tahap  ekstraksi  dan  isolasinya menggunakan  metanol  dan  diklorometan  4).  tahap  uji  kuantitas  dan  kualitas  katarantin  dengan menggunakan  metode  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi  (KCKT)  yang  dihubungkan  dengan kromatopak CR-7A Plus. Kurva tumbuh ragi menunjukkan bahwa fase pertumbuhan maksimum terjadi  setelah  16  jam  inkubasi.  Kandungan  katarantin  sudah  terdeteksi  pada  hari  ke-3  dan mengalami penurunan pada hari ke-6 dan ke-9. Pada hari ke-12, kandungan katarantin mencapai jumlah  tertinggi  di  agregat  sel  dan  mengalami  penurunan  sampai  hari  ke-24,  Kandungan katarantin tertinggi pada medium terjadi pada hari ke- 18 dan selanjutnya mengalami penurunan sampai  hari  ke-24.  Hasil  elisitasi  menunjukkan  adanya  peningkatan  kandungan  katarantin  pada semua  waktu  panen  yang  dilakukan,  baik  dalam  sel  maupun  dalam  medium.  Kandungan katarantin  tertinggi  setelah  elisitasi  pada  agregat  sel  adalah  sebesar  274,03  µg/g  BK  dengan persentase peningkatan sebesar 218,86 % pada jam ke-18. Namun dalam medium adalah pada jam ke-72 sebesar 856,75 µg/L dengan persentae peningkatan sebesar 266,13 %.
Kata kunci: katarantin, teknik elisitasi

## THE ENHANCEMENT OF CATHARANTHINE PRODUCTION BY
ELICITATION  TECHNIC ON Catharanthus roseus CELL AGGREGATES

## ABSTRACT
This  research  aims  were  to  find  out  the  growth  respons  and  catharanhine  content    of C.  roseus callus elisitor treatment.   Catharanthine content can be produced on each callus after the elisitor treatment, cell aggregates growth pattern, medium that produces the higher catharanthine content. This research is expected to give some information about the increasing of catharanthine content produced  through in  vitro process  which  can  be  used  in  further  research.  The  steps  have  been done in this research, They were 1) Callus culture with elisitor treatment step, 2) cell aggregates culture with elisitor treatment step, 3) extraction and isolation step, 4). The step of qualitative and quantitative  assay  of  catharanthine  by  using  HPLC  (High  Pressure  Liquid  Chromatography) connected to cromathopac CR-7A Plus. The result of research showed that the growth curva of S. cerevisiae showed  that  the  highest  growth  occurred  after  16  hours  incubation.  The  highest catharanthine content of the cell aggregate occurred at the 12 th day  and then decreased up to 24 th day. The result of elisitation indicated, the increasing of catharanthine contents at the all collected days has been done, include in cell and medium. The higest catharanthine content after elicitation of cell aggregate was 274,03 µg/g DW with the presentation of increasing about 218,86 % at the 18 th hour. On the other hand, medium was 856,75 µg/L with the presentation of increasing about 266,13 % at the 72 th hour.
Keywords: catharanthine, elicitation technic

## PENDAHULUAN
Kanker  dijuluki  pembunuh  peringkat atas  bagi  manusia.  Karena  penyakit  kanker ini  tidak  mudah  diatasi  atau  diobati.  Bahkan bisa muncul kembali walaupun telah dioperasi. Pengobatan kanker sangat sulit dan obat-obatannya yang sangat mahal. Kemoterapi kanker leukemia dengan menggunakan  vinblastin  diberikan  dosis normal    untuk  dewasa  1-1,4  mg/m 2 permukaan tubuh setiap  1 kali seminggu (De Padua  &  Bunyapraphatsara,  1999).  Menurut literatur,  berbagai  jenis  alkaloid  antikanker seperti katarantin, vinblastin, vindesin, vinorelbin  dan  vinkristin  telah  di  produksi dari C. roseus secara in vivo. Produksi 50 mg vinkristin dan 2 g vinblastin membutuhkan 1 ton daun kering C. roseus , karena kandungan dalam  daun  hanya  sekitar  0,70-0,82  % (Samiran,  2000).  Namun  Verpoorte et  al. (1993)  menyatakan  bahwa  katarantin  dapat diproduksi  230  mg/l  dalam  kultur  suspensi sel setelah 1 minggu pertumbuhan.
C.  roseus (L)  G.  Don, sering  disebut tapak  dara,  adalah  semak  tahunan  yang banyak  dibudidayakan  sebagai  tanaman  hias dan  obat.  Alexandrova et  al. (2000), menyatakan  tanaman  tapak  dara  ini  berguna untuk mengobati hipertensi, diabetes,
pendarahan akibat penurunan jumlah trombosit, chorionic  epthelioma ,  leukemia limfositik  akut,  leukemia  monositik  akut, limfosarkoma  dan  sarcoma  sel  retikulum.
Sekitar 100 macam alkaloid telah diidentifikasi  pada tanaman  ini (De  Padua  & Bunyapraphatsara, 1999). Diantaranya adalah alkaloid  anti  kanker  seperti  vinblastin (VLB),  vinkristin  (VCR),  katarantin  dan leurosin  (Wijayakusuma et  al. ,  1992).
Demikian juga Samiran (2001) mengemukakan  bahwa  penghasil  vinkristin dan vinblastin yang dikomersialkan kebanyakan berasal dari tapak dara. Senyawa antikanker  ini  menekan  atau  menghambat pembelahan  sel  dengan  membekukan  protein mikrotubular,  nampak  jelas  pada  metafase (Alexandrova et  al. 2000).  Melalui  kultur jaringan  seperti  kultur  suspensi  sel,  kalus, tunas,  akar  dan  agregat  sel  menyebabkan produksi alkaloid Catharanthus roseus mengalami  peningkatan  (Zhao et  al. 2000 , Zhao et al. 2001a).
Kultur  jaringan  ( in  vitro )  tanaman dapat  memproduksi  senyawa  kimia  berupa alkaloid  dan  sejenisnya  yang  tergolong metabolit sekunder. Alkaloid tertentu dihasilkan  dalam  kadar  yang  lebih  tinggi melalui  kultur  jaringan  dari  pada  kandungan tanaman  induknya    (Zhao et  al. 2001b, Vazquez-Fflota et al. 1994). Keuntungan lain dari  penggunaan  kultur  jaringan  ini  untuk produksi  alkaloid  adalah  produksinya  dapat diatur,  kualitas  dan  hasil  produksinya  lebih konsisten,  biaya  produksi  lebih  kecil  dan mengurangi  penggunaan  lahan  (Alexandrova et  al. 2000).  Dengan  demikian  sangat  perlu untuk  menggunakan  kultur  jaringan  dalam memproduksi suatu senyawa alkaloid .
Menurut  Mattel  dan  Smith  (1993), agar produksi metabolit sekunder tinggi maka perlu  optimasi  faktor-faktor  internal  dan eksternal.  Optimasi  faktor  tersebut  dapat dilakukan  dalam  dua  tahap  yaitu  tahap pertumbuhan dan tahap produksi. Pada tahap pertumbuhan, kondisi kultur diarahkan untuk memproduksi  biomassa  sel  dalam  waktu dekat,  sedangkan  tahap  produksi  dilakukan pemindahan  biomassa  sel  ke  dalam  medium produksi dengan tujuan pengkondisian kultur untuk  produksi  metabolit  sekunder.  Selain optimasi pada kedua tahap di atas, pendekatan  lain  yang  dapat  dilakukan  secara efektif untuk meningkatkan produksi biomassa  sel  dan  metabolit  sekunder  adalah penambahan  prekursor  (prazat),  elisitasi  dan amobilisasi.
Elisitasi  adalah  suatu  metode  untuk meningkatkan  fitoaleksin  dan  metabolit sekunder  lainnya  dengan  menambahkan berbagai  elisitor  biotik  maupun  abiotik. Elisitor yang berasal dari miselium Fusarium meningkatkan  kadar  tiopen  hingga  300  % pada  kultur  akar  rambut Tagetas  putula . Beberapa faktor yang mempengaruhi kandungan  metabolit  sekunder  dalam  kultur yang  dielisitasi  antara  lain  macam  elisitor, konsentrasi  elisitor,  waktu  kontak  elisitor dengan  sel  tumbuhan,  galur  sel  yang digunakan,  waktu  penambahan  elisitor  dan fase  pertumbuhan  sel  dalam  kultur,  serta nutrien yang digunakan dalam medium
Penelitian  ini    bertujuan  untuk megetahui  respon  pertumbuhan  kalus C. roseus terhadap  pemberian  perlakuan  variasi elisitor,  mengetahui  respon  pertumbuhan agregat  sel  yang  diberi  perlakuan  elisitasi,
menemukan  kandungan  katarantin  pada setiap  sel  yang  diberi  perlakuan  elisitasi, menemukan  media  yang  diberi  elisitor,  yang menghasilkan    kandungan  katarantin  yang paling  tinggi  dan  pertumbuhan  yang  paling optimum.
Penelitian  ini  bermanfaat  sebagai sumber  informasi  untuk  penelitian  produksi alkaloid  anti  kanker  melalui  kultur  agregat sel, yang merupakan salah satu penanggulangan  langka  dan  mahalnya  obat yang  sangat  berbahaya  (kanker).  Dari  hasil penelitian  ini  diharapkan  dapat  dihasilkan suatu informasi mengenai peningkatan katarantin  pada  kultur  agregat  sel  ( in  vitro )
yang diberi elisitor (elisitasi) untuk dimanfaatkan  pada  penelitian  selanjutnya seperti  penelitian  produksi  katarantin    dalam skala bioreaktor.

## METODE PENELITIAN
Penelitian
dilakukan di Laboratorium  Bioteknologi  Pertanian  Unsrat dan Laboratorium  Fisiologi Tumbuhan SITH ITB Bandung. Penelitian dilaksanakan sekitar Februari 2006 sampai Nopember 2006.
Medium  untuk  induksi  kalus  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah medium  Murashige  dan  Skoog  (MS). Medium perlakuan adalah medium dasar  MS dengan  2  ppm  NAA  dan  Kinetin  0,2  ppm. Medium  dan  alat-alat  yang  digunakan terlebih  dahulu  disterilkan  di  dalam  otoklaf pada  suhu  121 0 C,  tekanan  15  psi  selama  15 menit.  Alat-alat  selanjutnya  disterilisasi dalam oven pada suhu 170 0 C selama 1 jam. Sumber  eksplan  berupa  daun  yang akan  ditanam  pada  medium  terlebih  dahulu dicuci  di  bawah  air  mengalir  selama  15 menit, kemudian direndam dalam etanol 70% selama  enam  menit  dan  dibilas  dengan akuades  steril.  Penanaman  dan  induksi  kalus dilakukan di dalam kotak pemindah beraliran udara. Medium induksi kalus yang telah siap tanam,  alat-alat  seksi  yang  sudah  steril  dan eksplan  yang  sudah  steril  dimasukkan  dalam kotak  pemindah  beraliran  udara.    Setelah penanaman  semua  botol  kultur  disimpan dalam  ruang  kultur  pada  suhu  kamar. Subkultur kalus dilakukan untuk
memperbanyak  kalus  untuk  digunakan  pada kultur  agregat  kalus.  Subkultur  kalus  juga digunakan  sebagai  stok  untuk  ulangan penelitian.
Kalus  kompak  yang  berumur  tiga minggu setelah subkultur kemudian dipindahkan  ke  dalam  medium  cair  untuk digunakan  dalam  optimasi  medium  cair  MS. Kalus  sekitar  1  gram  dipotong-potong kemudian  dimasukkan  ke  dalam  media  cair MS yang mempunyai komposisi sama dengan media  kultur  kalus.  Kultur  diagitasi  dengan kecepatan  120  rpm  pada  suhu  kamar.  Kultur agregat  disubkultur  dengan  mengganti  media lama  dengan  media  baru  yang  sama komposisi  mediumnya  pada  volume  50  ml media  cair  MS  dalam  erlenmeyer  125  ml. Medium cair yang memberikan pertumbuhan sel  terbaik  digunakan  untuk  penelitian selanjutnya.
Medium  yang  digunakan  untuk pemeliharaan  ragi  adalah  “glucose  yeast extract  (GYE)”  padat,  sedangkan  untuk produksi  produksi  ragi  adalah  medium  cair. Kultur  murni Saccharomyces  serevisiae dioptimasi  pada  media  agar  miring  GYE selama 48 jam kemudian ditambahkan larutan NaCl  0,85%  secara  aseptik.  Sebanyak  1  ml suspensi  diambil  dan  dioptimasikan    dalam 100 ml medium cair GYE selama 2 X 24 jam. Kultur hasil optimasi kedua digunakan untuk menentukan  kurva  tumbuh  ragi.  Kurva tumbuh  ragi  diamati  setiap  2  jam  selama  24 jam,  perhitungan  jumlah  sel  dilakukan dengan “plate count”. Ragi yang berada pada fase  pertumbuhan  maksimum    (dari  kurva tumbuh)  digunakan  sebagai  elisitor.    Ragi dipanen  kemudian  di  otoklaf  pada  suhu 121 o C  tekanan  15  lb/inc 2 selama  15  menit, dan  disentrifugasi  sebanyak  3  kali  masing- masing  dengan  1500  rpm  selama  5  menit. Setiap kali sentrifuga supernatan dibuang dan diganti  dengan  akuades  sejumlah  supernatan yang  dibuang.  Setelah  tiga  kali  sentrifuga endapan  kemudian  dikeringkan,  dan  digerus untuk  memperoleh  serbuk  ekstrak  ragi. Serbuk ekstrak ragi ditimbang dan dilarutkan dalam  akuades  steril  sehingga  diperoleh konsentrasi 0,5 % (b/v) kemudian disterilisasi dengan  otoklaf  selama  15  menit,  dan selanjutnya digunakan sebagai elisitor (Esyanti, 1991).
Elisitasi  digunakan  secara  aseptik dengan  cara  menambahkan  5  ml  elisitor  ragi dengan konsentrasi 0,5 % pada kultur agregat sel  subkultur  ke-3  dan  untuk  kontrol dilakukan penambahan akuades steril dengan volume  yang  sama.  Pemanenan  dilakukan
pada  jam  ke  0,  12,  18,  24,  36,  48  dan  72 setelah elisitasi (Esyanti, 1991).
Agregat sel yang telah kering ditimbang  sekitar  satu  gram.  Pengekstrak yang  digunakan  adalah  menurut  metode Pandiangan  dan  Siahaan    (2002)  dengan modifikasi.  Bahan  kering  digerus  dengan metanol, lalu disaring. Residu dibilas dengan metanol  sebanyak  dua  kali.  Ekstrak  metanol digabungkan, kemudian diuapkan. Sari metanol kental diasamkan dengan 10 ml  0.5 M  HCl,  sehingga  diperoleh  sari  asam.  Sari asam  ditambahkan    dengan    NaOH  4  N, sehingga  pH  sama  dengan  10.  Kemudian diekstraksi  dengan  diklorometana  sehingga diperoleh  dua  fraksi    yaitu  fraksi  air  dan diklorometana.  Fraksi  diklorometana  diambil dan  fraksi  air  dibuang.  Ekstraksi  dilakukan sebanyak  3  kali.  Fraksi  diklorometana dikeringkan  dengan  serbuk  Na 2 SO 4 anhidrat. Filtrat  diuapkan  dengan rotary  evaporator hingga  kering  kemudian  dilarutkan  dengan  1 ml methanol.
Analisis  kualitatif  dan  kuantitatif untuk  katarantin  dilakukan  dengan  HPLC atau  alat  kromatografi  cair  kinerja  tinggi (KCKT) yang dihubungkan dengan kromatopak  Shimadzu  CR-7A  Plus.  Fase gerak  yang  akan    digunakan  berupa  larutan yang terdiri dari metanol : asetonitril : 5 mM diamonium hidrogen fosfat = 3 : 4 : 3 secara isokratik.  Kecepatan  aliran  1mL/menit.  Jenis kolom  yang  digunakan  adalah  Shim-pack CLC-ODS  C18  0,15  m  dengan  diameter  6,0 mm. Panjang gelombang UV yang digunakan untuk  mendeteksi  katarantin  adalah  298  nm. Sebagai  senyawa  pembanding  digunakan “catarantine”  standard  yang  diperoleh  dari Magdi El-Sayed dari Laboratorium Gorlaeus, Pusat  Ilmu  Pengetahuan  Biofarma,  Leiden  – Nedherland.  Analisis  kualitatif  dilakukan dengan membandingkan waktu retensi antara katarantin  standar  dengan  waktu  retensi sampel.  Bila  dalam  sampel  terdapat  senyawa yang  mempunyai waktu retensi sama dengan katarantin  standar,  maka  senyawa  tersebut adalah  katarantin.  Koinjeksi  standar  dan sampel dilakukan untuk memastikan
keberadaan kartarantin pada sampel. Analisis kuantitatif untuk
mendapatkan konsentrasi katarantin diperoleh dengan  cara  mengkonversikan  luas  area
sampel  dengan  luas  area  standar  yang  telah diketahui konsentrasinya pada kurva kalibrasi standar.  Kurva  kalibrasi  standar  diperoleh dari  data  luas  area  berbagai  konsentrasi larutan  katarantin  standar  kemudian  dibuat hubungan antara luas area dengan kandungan katarantin.
Data  akan  dikumpulkan,  ditabulasi dan dianalisis secara statistik untuk penarikan kesimpulan.  Data  hasil  penelitian  akan disajikan  dalam  bentuk  persentase,  tabel, grafik  atau  kurva  sesuai  dengan  jenis  data yang  diperoleh  dalam  percobaan.  Hasil pemotretan dibuat sebagai sumber data untuk keperluan  interpretasi  data  hasil  penelitian. Data  dari  hasil  pengukuran  akibat  perlakuan dilakukan  uji  t.  Program  yang  dipakai  untuk analisis statistik adalah program SAS162 atau Excel soft ware

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pertumbuhan dan kurva tumbuh ragi
( S. cerevisiae )
Kultur  murni  ragi  dikultur  pada media  PDA.  Kultur  ragi  yang  sudah diaktivasi pada media GYE dapat dilihat pada Gambar 1A. Kultur tersebut berumur 16 jam. Hasil pengamatan aktivasi dalam media GYE pada  cawan  petri  juga  dapat  dilihat  pada Gambar  1B.  Dari  hasil  aktivasi  tersebut dilakukan  penghitungan  jumlah  sel  setiap  2 jam  sehingga  diperoleh  suatu  kurva  tumbuh ragi pada Gambar 2.
Kurva  tumbuh  ragi  menunjukkan bahwa  fase  pertumbuhan  maksimum  terjadi setelah  16  jam  inkubasi.  Pada  fase  tersebut, biomassa  ragi  diharapkan  sudah  mencapai tingkatan  maksimum,  mengingat  komponen yang  akan  digunakan  sebagai  elisitor  adalah derivat dari dinding sel ragi, yang diperkirakan  berupa  glukan  (Hahn,  1996). Sisi  aktif  dari  elisitor  glukan  ragi  adalah  1,6 β-D  glukopiranosil.  Glukan  dari  ekstrak  ragi secara alami diperkirakan mempunyai „binding  site‟  yang  sesuai  dengan  reseptor yang  ada  pada  agregat  sel  dan  mampu berkompetisi  dibandingkan  dengan  glukan sintetis (Hahn, 1996).
Gambar 1. Kultur S. cerevisiae pada umur 16 jam pada media GYE (A) dalam tabung reaksi (B) dalam cawan petri
Berdasarkan  pada  hasil  pengamatan kurva  pertumbuhan  ragi  pada  Gambar  2, maka  ditetapkan  jam  panen  dari  ragi  yang diaktivasi  pada  media  cair  GYE  adalah  pada jam ke-16 setelah inkubasi. Ekstrak ragi pada Gambar 3 diperoleh setelah 16 hari inkubasi. Serbuk  tersebut  yang  digunakan  sebagai elisitor  setelah  dilarutkan  dalam  akuades hingga  konsentrasi  0,5%.  Konsentrasi  ini merupakan  hasil  penelitian  dari  Silalahi (1999)  yang  menyatakan  bahwa  pada konsentrasi tersebut kandungan alkaloid indol paling tinggi.
Gambar 2. Kurva tumbuh ragi ( S. cerevisiae ) pada media GYE
Gambar 3. Serbuk ekstrak ragi ( S. cerevisiae ) yang diperoleh dan digunakan sebagai elisitor

## Pertumbuhan dan Kultur Agregat Sel Hasil Elisitasi
Setelah  kalus  yang  disubkultur  ke-2 di  media  induksi  sudah  10  hari  kemudian  di subkultur ke media MS cair sekitar 1 g berat basah  kalus  untuk  setiap  media  perlakuan. Kultur agregat pada hari ke-0 nampak seperti pada  Gambar  4A,  setelah  berumur  3  hari pertumbuhan agregat sel nampak seperti pada Gambar 4B. Pada Gambar tersebut ditunjukkan  juga  bahwa  agregat  sel  mulai membesar  dan  semakin  banyak  selnya. Setelah  3  kali  disubkultur  pada  media  cair nampak seperti pada Gambar  5. Dari gambar tersebut  dapat  dibandingkan  bahwa  jumlah sel yang terbentuk pada kontrol lebih banyak dan  lebih  besar  daripada  yang  diberi  elisitor (elisitasi).
Kultur  pada  Gambar  4  dan  5  disebut sebagai kultur suspensi sel karena memanfaatkan  medium  cair  sebagai  sumber nutrisi, dan dari kultur suspensi ini dihasilkan suatu  tipe  sel  yang  disebut  dengan  agregat sel.  Agregat  sel  tersusun  oleh  kumpulan  sel yang  homogen  dan  belum  terdiferensiasi, dengan ukuran diameter 2 – 30 mm dan dapat mengandung  lebih  dari  200  sel  (Ratnasari, 1999).  Proses  pembentukan  kalus  menjadi agregat  sel  disebabkan  adanya  sekresi  dari lapisan  sisa  yang  kaya  akan  karbohidrat, protein,  dan  pektin  yang  melekat  pada permukaan  sel  dan  menyebabkan  sel-sel saling  teragregasi  (Fowler,  1983).  Lindsey dan  Yeoman  (1983)  menyatakan  bahwa kultur  agregat  sel  merupakan  sel  amobil alami,  dengan  pertumbuhan  sel  yang  rendah dan  produksi  metabolit  sekundernya  tinggi.
0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) Ke ra pa ta n s el ra gi (1 00 00 00 /m l) A B
Hal  ini  disebabkan  posisi  sel-sel  yang  rapat dalam agregat sel dapat membatasi pembelahan  sel  dan  pengambilan  nutrisi  dari medium, namun dapat meningkatkan interaksi  kimiawi  dan  fisika  antar  sel sehingga  terbentuk  kondisi  yang  menyerupai
kondisi normal pada tanaman utuh. Gambar 4 dan 5 memperlihatkan kultur agregat sel yang dikultur  dalam  medium  cair  MS  dengan penambahan  NAA  2  ppm  dan  Kinetin  0,2 ppm setelah 14 hari subkultur.
Gambar 4. Penampakan kultur agregat sel pada : A = hari ke-0 (saat kultur), B= hari ke-3 setelah kultur pada subkultur pertama
Gambar 5. Kultur agregat sel C. roseus dalam medium cair MS dengan penambahan NAA 2 ppm dan Kinetin 0,2 ppm setelah 14 hari kultur pada subkultur ke 3 (A) Kontrol, (B).
Elisitasi
Kultur  kalus  dan  agregat  sel C.  roseus yang  dipelihara  dalam  medium  MS  dengan penambahan  NAA  dan  Kinetin  dapat memproduksi  katarantin  yang  lebih  tinggi bila  dibandingkan  dengan  penggunaan  2,4-D dan  kinetin  (Pandiangan  dan  Nainggolan  , 2006).  Hal  ini  disebabkan  2,4-D  mampu menghambat  transkripsi  gen-gen  pengkode enzim  yang  berhubungan  dengan  sintesis katarantin,  seperti  triptofan  dekarboksilase (TDC) dan striktosidin sintase (SSS). Darsini (2001) juga menyatakan bahwa perkembangan  latisifer  pada  kultur  kalus C. roseus diamati  paling  baik  pada  kalus  yang diinduksi  dengan  2,5  µM  NAA  dan  10  µM BAP.  Kinetin  termasuk  golongan  zpt  yang mempunyai  sifat  sama  dengan  BAP  pada metabolisme  tumbuhan.  Pada  konsentrasi tersebut,  pembentukan  latisifer  terjadi  lebih awal dan sempurna bila dibandingkan dengan kalus yang diinduksi oleh kombinasi lainnya.
Pertumbuhan  kultur  agregat  sel  pada medium  cairan  MS  dengan  penambahan  2 ppm NAA dan 0,2 ppm Kinetin pada hari ke- 5  setelah  subkultur  ketiga  baik  kontrol maupun  hasil  elisitasi  dapat  dilihat  pada Gambar 5. Kurva tumbuh dibuat berdasarkan Gambar  tersebut,  sehingga  didapatkan  kurva tumbuh  pada  Gambar  6.  Pola  pertumbuhan kultur agregat sel pada Gambar tersebut dapat diuraikan bahwa kultur agregat sel mengalami  fase  lag  atau  fase  adaptasi  pada umur 0 sampai 4 hari. Kemudian pertumbuhan sel meningkat atau kultur dalam fase  eksponensial  pada  umur  4  sampai  12 hari,  dan  mengalami  fase  penurunan  pada hari  14  sampai  ke  20  (Gambar  6).  Dengan hasil  ini  maka  waktu  subkultur  yang  terbaik adalah pada hari ke-14 setelah kultur.
A B A B
Gambar  6.  Kurva  tumbuh  agregat  sel C. roseus dengan  NAA  2  ppm  dan  Kinetin 0,2
ppm Pengaruh  Pemberian  Elisitor  terhadap

## Kandungan Katarantin
Kultur  agregat  sel C.  roseus yang dielisitasi  dengan  elisitor S.  cerevisiae mengalami  perubahan  warna,  baik  pada  sel maupun  pada  medium,  yaitu  menjadi  lebih coklat  bila  dibandingkan  dengan  kontrol. Pencoklatan pada C. roseus dapat disebabkan oleh  terjadinya  sintesis  senyawa  fenolik DHBA  (asam  2,3-dihidro  benzoat)  yang terakumulasi  dengan  cepat,  yaitu  sekitar  6 jam setelah elisitasi dilakukan (Moreno et al ., 1994).
Gambar 7.Kandungan katarantin dalam sel C. roseus sebelum (kontrol) dan sesudah elisitasi
Gambar 8. Kandungan katarantin dalam medium sebelum (kontrol) dan sesudah elisitasi.
Hasil  elisitasi  menunjukkan  adanya peningkatan  kandungan  katarantin  pada semua  waktu  panen  yang  dilakukan,  baik dalam sel (Gambar 6) maupun dalam medium (Gambar  7).  Akan  tetapi  peningkatan kandungan  katarantin  hasil  elisitasi  yang tertinggi  dalam  sel  diperoleh  pada  waktu panen  jam  ke-18  (Gambar  7),  yaitu  sebesar 274,03 µg/g BK dengan persentase peningkatan  sebesar  218,86  %  sedangkan dalam  medium  adalah  pada  jam  ke-72 (Gambar  8)  sebesar  856,75  µg/L  dengan persentae  peningkatan  sebesar  266,13  %. Kandungan  katarantin  di  dalam  medium hingga jam ke-72 belum mengalami penurunan. Faktor yang menyebabkan
katarantin  ekstraseluler  (dalam  medium) lebih  tinggi  diduga  adalah  karena  adanya perubahan  pH  pada  medium  setelah  elisitasi. Hal  ini  didukung  oleh  Nef-Campa et  al . (1993) yang menyatakan bahwa penambahan elisitor Pythium  vexans pada  kultur  suspensi sel C.  roseus pada  medium  Murashige  dan Skoog  (MS)  dengan  penambahan  2,4-D  dan kinetin  menyebabkan  penurunan  pH  sekitar 0,7  unit  setelah  5  hari  perlakuan,  sehingga metabolit  sekunder  banyak  disekresikan  ke medium.
Peningkatan  kandungan  katarantin setelah  diberi  elisitor  ekstrak  ragi S. cereviseae diduga  karena  terinduksinya serangkaian  proses  yang  mengarah  pada
0 100 200 300 400 500 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 B er a t k er in g a g re g a t sel ( m g ) Umur kultur (hari) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 12 18 24 30 36 48 72 Waktu (jam) K and un ga n k at ara nt in da la m agg re ga t se l ( m g/L) Kontrol Perlakuan 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 12 18 24 30 36 48 72 waktu (jam) ka nd un ga n k at ar an tin d ala m m ed iu m ( m g/L ) Kontrol Perlakuan
akumulasi  katarantin.  Moreno et  al .  (1994) menyatakan  bahwa  hasil  interaksi  antara elisitor  dengan  reseptor  yang  ada  pada membran  sel  tanaman  akan  memicu  jalur tranduksi  sinyal,  antara  lain    mengaktivasi  „ secondary  messenger‟  (misalnya  Ca 2+ dan kalmodulin)  yang  akan  menginduksi  protein kinase untuk berperan dalam induksi transkripsi  gen tdc,  as dan sss .  Proses transkripsi dilanjutkan dengan translasi enzim TDC (triptofan dekarboksilase), AS
(antranilat  sintase)  dan  SSS  (striktosidin sintase)  yang  terlibat  dalam  pembentukan prekursor  untuk  sintesis  katarantin.  Enzim TDC  dan  SS  berperan  dalam  sintesis  dan akumulasi  triptamin,  sedangkan  enzim  SSS berperan  dalam  kondensasi  triptamin  dan sekologanin menjadi striktosidin .
Striktosidin  selanjutnya  diubah  menjadi geisoin,  lalu  katenamin,  dan  akhirnya menjadi katarantin (Moreno et al., 1994) Konsentrasi  elisitor  merupakan  salah satu  faktor  pembatas  yang  menentukan kandungan  metabolit  sekunder  pada  kultur jaringan yang dielisitasi. Hal ini menunjukkan  bahwa  pada  membran  plasma terdapat reseptor untuk elisitor dengan jumlah tertentu, sehingga untuk meningkatkan kandungan  katarantin  diperlukan  konsentrasi elisitor yang optimum (Buitelaar et al ., 1991).
Pada  penelitian  ini  hanya  digunakan  satu konsentrasi elisitor, yaitu 0,5 % (b/v) ekstrak ragi sehingga perlu
dilakukan pengoptimasian  kembali  konsentrasi  elisitor untuk  memperoleh  konsentrasi  elisitor  yang optimum.
Kontak  antara  elisitor  dan  reseptor memerlukan  waktu  yang  optimum  hingga dihasilkan metabolit sekunder yang optimum. Waktu  elisitasi  tersebut  menggambarkan lamanya  waktu  yang  diperlukan  sel  untuk melangsungkan  jalur  metabolit  sekunder hingga  terbentuknya  suatu  produk  (Buitelaar et al ., 1991), dalam hal ini adalah  katarantin

## KESIMPULAN
1.  Elisitasi  kultur  agregat  sel C.  roseus
dengan  ekstrak  ragi  ( Saccharomyces cerevisiae ) dapat meningkatkan kandungan  katarantin,  baik  pada  agregat sel  maupun  pada  medium,  dibandingkan dengan kontrol.
2.  Kandungan  katarantin  sesudah  elisitasi lebih  tinggi  pada  medium  (857  µg/L) dibandingkan agregat sel  (274 µg/g).

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terimakasih  kami  sampaikan kepada  Dr.  Magdi  El  Sayed  dari  Division  of Pharmacognosy, Centre for Biopharmaceutical Sciences, Leiden University, Netherland yang telah
memberikan katarantin murni sebagai senyawa  pembanding  dalam  penelitian  ini. Demikian  juga  kepada  Dirjen  Dikti  lebih khusus  DP2M  yang  memberi  bantuan  dana dalam  pelaksanaan  penelitian  ini  demikian juga  pimpinan  dan  laboran  Laboratorium Fisiologi Tumbuhan SITH ITB Bandung.

## DAFTAR PUSTAKA
Asada M, and Shuler M.L. 1989. Stimulation of ajmalicine  production and excretion from Catharanthus  roseus :  Effect    of adsorption in situ , elicitor and alginate immobilization. Applied of Microbiology Biotechnology . 30: 475 – 481 Alexandrova, R., I. Alexandrova, M.Velcheva,  T.  Varadinova.  2000. Phytoproduct and Cancer. Experimental Pathology and Parasitology .  Bulgarian  Academy  of Sciences.
Buitelaar  R.M,  Cesario  MT  and  Tramper  J. 1991.    Strategies  to  improve  the production  of  secondary  metabolites with  plant  cell  cultures:  a  literature review. Jounal  of  Biotechnology .  23  : 111  –  141Burgess,  J.  1985. An introduction to plant cell development . Cambridge University Press. Britain. p. 137 – 153
Darsini,  N.N.  2001.  Perkembangan  Latisifer pada  Kultur  Kalus Catharanthus roseus (L.)  G.  Don.  Tesis  ITB
Bandung.
De Padua, L.S., Bunyapraphatsara, N. 1999.
Plant Resources of South East Asia no. 12(1).: Medicinal and Poisonous plants 1. Ed. R.H.M.J. Lemmens. PROSEA Bogor, Indonesia.
Esyanti,  R.R.  1991. Elicitor  of  phytoalexin synthesis  from Verticillium albo-
atrum .  Seminar  Vascular  Pathogen. University of  Swansea. U.K. Fowler MW. 1983. Comercial aplication and economic  aspect  of  mass  plant  cell culture.  Dalam  : Plant  biotechnology .
Mantell,  S.H  and  Smith,  H  (Eds). Cambridge University. p. 3 –38. Hahn G.M. 1996. Microbial elicitor and their receptors in plant. Annu. Rev . Phytopathol . 34 : 387 – 412
Lindsey  K.,  Yeoman  MM.  1983.  Novel experiment  system  for  studyng  the production of secondary metabolites by plant  tissue  culture.  Dalam  : Plant Biotechnology .  Mantell,  S.H  &  Smith,
H.  (Eds).  Cambridge  University  Press. p.  39-66. Mattel,  SH.dan  H.  Smith.  1993.  Cultural factor that influence secondary metabolites  accumulation  in  plant  cell and  tissue  cultures.  Dalam  : Plant
Biotecnology .  S.H.  Mattel  &  H.Smith (Eds).  CambridgeUniversity.  London. P. 75-102.
Moreno  RHP,  Van  der  Heijden  R  and Verpoorte  R.  1994.  Cell  and  tissue culture  of  Catharanthus  roseus  (L.)  G. Don.  a  literature  survey  II.  In : Influence  of      stress    factors  on  the secondary  metabolites  in  suspension cultured  Catharanthus    roseus  cells . Moreno, R.P.H (Ed.). p. 9 – 52 Pandiangan,  D.  P.  Siahaan.  2002.  Produksi
Alkaloid  dari  kalus  tapak  dara . Prosiding  Seminar  Nasional  MIPA  I dalam  Rangka  Dies  Natalis    ke-  5 FMIPA UNSRAT Manado.
Pandiangan,  D.  Nainggolan,  N.  2006. Peningkatan  produksi  katarantin  pada kultur  kalus C.  roseus yang  diberi NAA. Jurnal  HAYATI Vol  13  no.3 Edisi September 2006
Pandiangan, D.,  Rompas, D., Aritonang, H., Esyanti,  R.,  Marwani,  E.  2006. Produksi  katarantin  pada  kultur  kalus C. roseus yang diberi triptofan. Jurnal Matematika  dan  Sains ITB  Bandung
(Inpress). Ratnasari  J.  1999.  Pengaruh  pemberian ekstrak ragi ( Saccharomyces cerevisiae Hansen) Terhadap kandungan  ajmalisin  dalam  kultur agregat sel press. London. p. 1 – 39.
Robinson,  T.  1968. The  Biochemistry  of Alkaloids. Springer-Verlag  New  York Inc.
Samiran. 2001. Tapak dara penumpas kanker payudara.  Laboratorium  Fitokimia, Balitbang  Botani  (Herbarium)  LIPI Bogor.    Dalam  Majalah  Intisari bulan Januari 2001.
Silalahi,  M.  1999 . Pengaruh  pemberian elisitor ekstrak ragi terhadap kandungan  ajmalisin  pada kultur  kalus C. roseus (L) . G. Don . Thesis Magister Sains, ITB Bandung.
Sim JS, Chang NH, Liu RJ., Jung HK. 1994. Production  and  secretion  of  indol alkaloids  in  hairy  root  cultures  of Catharanthus  roseus :  Effects  of  in- situ  adsorption,fungal  elicitation  and permebilization.
Jurnal of Fermentation and Bioengineering
78,229-234.
Sumarsi,  Darjianto,  S.  dan  Suprapto.  1990.
Isolasi  Komponen  Aktif  Daun  Tapak Dara.  Balai  Besar  Penelitian  dan Pengembangan Industri Hasil Pertanian.
Trapper, J. & Hulst, A. C. 1992. Immobilized plant  cells:  A  literature  survey  Dalam:
Plant  Cells:  Immobilized  and  oxygen tranfer .  Wageningen.  Netherland.  P.3-
17.
Vazquez-Flota,  F.,  Moreno-Valenjuela,  O., Miranda-Ham, M.L., Coello-Coello, J.,
& Loyola-Vargas, V.M. 1994. Catharanthine and ajmalisine synthesis in Catharanthus  roseus hairy  root cultures.  In: Plant  Cell,  Tissue  and Organ  Culture 38:  273-279.  Kluwer Academic Publisher. Nederlands. Verpoorte,  R.  dan  Van  Der  Heidjen  .  1993.
Plant Biotechnology For
The Production  of  Alkaloids:  Present Status  and  Prospects. Dalam: The Alkaloids.  Vol.  40. Academic  Press. Inc.
Whitmer S, R van der Heijden, R Verpoorte. 2002.  Effect  of  precursor  feeding  on alkaloid  accumulation  by  a  tryptophan decarboxylase over-expressing
transgenic cell line T22 of Catharanthus  roseus. J  Biotechnol .  96 (2) : 193-203.
Wijayakusuma,  H.M.H.,  Dalihmarta,  S.,
Winar,  AS.  1992.Tanaman  Berkasiat
Obat  di  Indonesia,  Jilid  I.  Pustaka Kartini, Ikapi Jaya Zenk  MH,  Ei-Shagi  H,  Arens  H,  Stockigt  J, Weiler  EW  &  Deus  B  (1977)
Formation  of  the  indole  alkaloids serpentine  and  ajmalicine  in  cell suspension  cultures  of  Catharanthus roseus.  In:  Barz  W,  Reinhard  E  & Zenk  MH  (Ed) Plant  Tissue  Culture and  its  Bio-tecnological  Application,
(pp 27-43). Springer-Verlag, Berlin
Zhao  J,  W.  Zhu,  Q.  Hu.  2001a.  Enhanced catharanthine production in catharanthus  roseus  cell cultures by combined elicitor treatment in shake flasks  and  bioreactors. Enzyme Microb Technol. 28(7-8):673-681.
Zhao  J,  Q  Hu,  YQ  Guo,  WH  Zhu.  2001b.
Effects of stress factors, bioregulators, and synthetic precursors on indole alkaloid production in compact callus
clusters  cultures  of  Catharanthus roseus. Appl  Microbiol  Biotechnol .
55(6):693-8. Zhao  J,  WH  Zhu  and  Q  Hu  .  2000.  Rare earths  promote  alkaloid  production by Catharanthus  roseus cells.
Biotechnology Letters 22:825-828.