## Original Article
Journal of Science and Applicative Technology vol. 4 (1), 2020, pp. 43-48 | 43
e-ISSN: 2581-0545 - https://journal.itera.ac.id/index.php/jsat/
Copyright © 2020 Journal of Science and Applicative Technology. Content from this work may be used under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International Licence . Any  further distribution of this work must maintain attribution to the  author(s) and the  title of the  work, journal citation and DOI. Published  under licence by Journal of Science and Aplicative Technology  (JSAT).
Received 16th June 2019 Accepted 06th May 2020 Published 15th June 2020
DOI: 10.35472/ jsat.v4i1.191
Penambatan molekul senyawa turunan orizanol terhadap enzim 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reduktase
a Program Studi Farmasi, Institut Teknologi Sumatera, Lampung Selatan, Indonesia, 35365
b Kelompok Keilmuan Biologi Farmasi, Sekolah Farmasi, Institut Teknologi Bandung, Indonesia, 40132 * Corresponding E-mail: syaikhul.aziz@fa.itera.ac.id
Abstract : Oryzanol  has  been  reported  to  reduce  serum  total  cholesterol  (hypolipidemic  agent)  by  inhibiting  HMG-CoA reductase, an enzyme responsible for the metabolic pathway that produces cholesterol and isoprenoid. The purpose of this experiment is to determine the inhibition activity of oryzanol derivatives on HMG-CoA reductase by molecular docking. Four structure  of  oryzanol  derivatives,  Lanosteryl-ferulate,  Brassicasteryl-ferulate,  Lupeol-ferulate,  and  Cholesteryl-ferulate  were used as ligands for molecular docking. The HMG-CoA reductase structure was obtained from protein data bank and the study was performed using AutoDock Tools as a molecular docking software. All oryzanol derivatives show binding affinity against HMG-CoA reductase. Lupeol-ferulate was predicted to be the best inhibitory activity against HMG-CoA reductase because of molecular docking.
Keywords: HMG-CoA reductase, hypolipidemic, molecular docking, oryzanol derivative
Abstrak: Orizanol  telah  dilaporkan  mampu  menurunkan  kolesterol  total  serum  (hipolipidemia)  dengan  cara  menghambat HMG-KoA reduktase, sebuah enzim yang bertanggung jawab untuk jalur metabolit yang memproduksi kolesterol dan isoprenoid. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan aktivitas penghambatan dari turunan orizanol pada HMG-KoA reduktase melalui penambatan molekul. Empat struktur dari turunan orizanol, Lanosteryl-ferulate, Brassicasteryl-ferulate, Lupeol-ferulate, dan Cholesteryl-ferulate digunakan sebagai ligan untuk penambatan molekul. Struktur HMG-KoA reduktase diperoleh dari bank data protein dan kajian penambatan molekul dilakukan menggunakan perangkat lunak AutoDock Tools . Semua turunan senyawa orizanol  menunjukkan  afinitas  ikatan  terhadap  HMG-KoA  reduktase.  Berdasarkan  penambatan  molekul,  Lupeol-ferulate diprediksikan memiliki aktivitas penghambatan yang terbaik terhadap HMG-KoA reduktase.
Kata Kunci : hipolipidemia, HMG-KoA reduktase, penambatan molekul, turunan orizanol

## Pendahuluan
Desain  obat  berbasis  struktur  merupakan  prediksi  struktur tiga dimensi dari target obat yang digunakan sebagai dasar pengembangan  obat.  Perkembangan  tersebut  didasarkan atas dukungan teknik desain obat dengan bantuan komputer ( computer-aided  drug  design ).  Penambatan  molekular merupakan  suatu  alat  bantu  dalam  biologi  molekular struktural dan penemuan obat berbasis struktur. Tujuan dari penambatan ligan-protein tersebut adalah untuk memahami dan  memprediksi  pengenalan  molekular,  menemukan kemungkinan  mode  ikatan,  dan  memprediksi  afinitas pengikatan. Saat ini banyak program komputer yang dapat digunakan  untuk  memprediksikan  interaksi  yang  terjadi antara reseptor (protein) dengan ligan (senyawa uji), seperti GOLD,  FlexX,  Glide,  DOCK,  dan  AutoDock  [1].  Program
komputer komersial tersebut telah banyak digunakan karena memiliki tingkat kepercayaan ( reliability ) yang baik.
Oryzanol  termasuk  ke  dalam  golongan  lipid non- saponifiable dari  minyak  bekatul.  Lebih  spesifik  lagi, oryzanol  merupakan  campuran  senyawa  ester  asam ferulat  dengan  steroid/  triterpenoid  alkohol.  Berbagai jenis  ester  ferulat  dari  fraksi  oryzanol  yang  digunakan sebagai  komponen  utama  yaitu  cycloartenyl-ferulate, 24-methylenecycloartanyl-ferulate,  sitosteryl-ferulate, dan  campesteryl-ferulate  [2].  Berdasarkan  penelitian sebelumnya,  dilaporkan  bahwa  oryzanol  memiliki kemampuan  untuk  menurunkan  kadar  lemak  dalam darah  terutama  kolesterol  total  [3].  Salah  satu mekanisme  dalam  pengaturan  kadar  kolesterol  total dalam  darah  adalah  dengan  cara  menginhibisi  enzim
Open Access Syaikhul Aziz * a , Nur Adliani a , Sukrasno b
e-ISSN: 2581-0545
Penambatan molekul senyawa turunan orizanol terhadap enzim 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reduktase
HMG-CoA  reduktase.  HMG-CoA  reduktase  merupakan salah  satu  enzim  yang  berperan  dalam  pembentukan kolesterol  dan  isoprenoid  lainnya  dalam  tubuh  melalui jalur mevalonate [4]. Namun, informasi tentang aktivitas dari turunan oryzanol sebagai penurun kadar kolesterol masih  terbatas.  Penelitian  tentang  turunan  oryzanol dalam  kaitannya  sebagai  kandidat  penurun  kadar kolesterol  darah  dengan  menggunakan  pendekatan penambatan molekular perlu dilakukan. Oleh karena itu, tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  menentukan aktivitas  penghambatan  dari  turunan  orizanol  pada HMG-KoA reduktase melalui penambatan molekul

## Metode

## Persiapan Struktur Molekul HMG-CoA reduktase
Berkas  digital  struktur  kristal  sinar-X  molekul  HMG-CoA reduktase  diunduh  dari  bank  data  protein  pada  situs www.rcsb.org dengan kode identitas 1HW9. Struktur kristal tersebut  selanjutnya  dipersiapkan  dengan  perangkat  lunak AutoDock Tools 1.5.6 (ADT) [5]. Tahapan persiapan struktur sebelum  proses  penambatan  molekuler  diawali  dengan pemisahan  sub-unit  rantai  protein  A  dan  B,  ligan  asli (simvastatin), dan pelarut dari struktur kristal. Struktur kristal dioptimasi  dengan  cara  menambahkan  atom  hidrogen  dan muatan Kollman.

## Persiapan Struktur Ligan Uji
Empat  buah  struktur  turunan  oryzanol  digunakan sebagai  ligan  uji  yang  akan  ditambatkan  pada  protein target  ( Gambar  1 ).  Struktur  simvastatin  dipilih  sebagai ligan kontrol yang telah terbukti menghambat aktivitas dari  enzim  HMG-CoA  reduktase  [6].  Persiapan  ligan  uji diawali dengan mendesain struktur dua dimensi turunan oryzanol  menggunakan  perangkat  lunak  ChemBioDraw Ultra  12.0.  Optimasi  struktur  geometri  dilakukan menggunakan  perangkat  lunak  ChemBio3D  Ultra  12.0 dengan parameter MM2 dan AM1. Struktur tiga dimensi yang  diperoleh  kemudian  dipersiapkan  menggunakan perangkat  lunak  ADT  [5]  dengan  cara  menambahkan atom hidrogen dan muatan parsial Gestiger.

## Penambatan Molekular
Perangkat  lunak  ADT  [5]  digunakan  dalam  penambatan molekular  senyawa  turunan  oryzanol  dengan  enzim  HMG CoA  reduktase.  Parameter grid yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah pada dimensi 60 x 60 x 60 poin dengan jarak antara setiap poin adalah 0.375 A. Pusat grid box diatur pada koordinat x=3.981; y=-9.204 dan z=-11.326. Parameter perhitungan  penambatan  yang  digunakan  adalah  dengan algoritma Lamarckian. Proses penambatan pada setiap ligan uji  dilakukan  pengulangan,  dengan  setiap  kali  penambatan menghasilkan 10 konformasi.
Gambar 1. Struktur dua dimensi turunan orizanol. (1) Lanosteryl-ferulate, (2) Brassicasteryl-ferulate, (3) Lupeol-ferulate, dan (4) Cholesteryl-ferulate.
Copyright © 2020 Journal of Science and Applicative Technology
J. Sci. Appl. Tech. vol. 4 (1), 2020, pp. 43-48 | 45
Published by: Lembaga Penelitian, Pengabdian Masyarakat, dan Penjaminan Mutu Institut Teknologi Sumatera, Lampung Selatan, Indonesia

## Penambatan Molekular
Perangkat  lunak  ADT  [5]  digunakan  dalam  penambatan molekular  senyawa  turunan  oryzanol  dengan  enzim  HMG CoA  reduktase.  Parameter grid yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah pada dimensi 60 x 60 x 60 poin dengan jarak antara setiap poin adalah 0.375 A. Pusat grid box di atur pada koordinat x=3.981; y=-9.204 dan z=-11.326. Parameter perhitungan  penambatan  yang  digunakan  adalah  dengan algoritma Lamarckian. Proses penambatan pada setiap ligan uji  dilakukan  pengulangan,  dengan  setiap  kali  penambatan menghasilkan 10 konformasi.

## Analisis Data
Struktur  rantai  molekul  dari  HMG-CoA  reduktase  dan  ligan hasil penambatan dibuka menggunakan perangkat lunak ADT [7] dan Discovery Studio digunakan untuk memvisualisasikan jarak  dan  interaksi  hidrogen  yang  terjadi.  Analisis  hasil penambatan  meliputi  energi  bebas  ikatan  dan  ikatan hidrogen antara ligan dan protein target.

## Hasil dan Pembahasan
Tahap  awal  penelitian  ini  diawali  dengan  pengunduhan struktur molekul HMG-CoA reduktase dari bank data protein. Struktur  dengan  identitas  1HW9  memiliki  4  sub-unit (tetramer) yaitu sub-unit rantai A, B, C, dan D. Struktur 1HW9 ini dipilih karena merupakan enzim tetramer asli atau utuh, bukan  hasil  mutasi  ataupun  modifikasi.  Pemilihan  sub-unit rantai  A  dan  B  pada  penelitian  ini  untuk  memperoleh efisiensi  waktu  penambatan  sebagaimana  yang  telah dilaporkan pada penelitian sebelumnya [8].
Struktur dua dimensi ligan uji didesain seperti yang disajikan pada Gambar  1 .  Optimasi  geometri  didapatkan  dari  hasil optimasi  seperti  yang  disajikan  pada Gambar  2 .  Sebelum dilakukannya  proses  penambatan  molekul,  terlebih  dahulu dilakukan  validasi  metode  penambatan  agar  hasil  yang diperoleh  dapat  diterima.  Validasi  metode  penambatan dilakukan  dengan  cara  penambatan  ulang  dari  ligan  yang terdapat  dalam  struktur  kristal  HMG-CoA  reductase. Penambatan ulang dilakukan dengan membandingkan posisi ligan  simvastatin  hasil  penambatan  terhadap  sisi  ikatan HMG-CoA reduktase dengan ligan asli seperti pada struktur kristal.  Penilaian  terhadap  validasi  didasarkan  pada Root Mean  Square  Deviation (RMSD).  Nilai  RMSD  menunjukkan perbedaan  posisi  koordinat  antara  dua  ligan  (ligan  pada
komplek kristal dan ligan hasil penambatan ulang). Semakin kecil  nilai  RMSD,  maka  posisi  tumpang-tindih  kedua  ligan akan  semakin  mirip  [8].  Nilai  RMSD  yang  didapat  pada penelitian yakni sebesar 1,50 Å dan hasil tumpang tindihnya seperti yang disajikan dalam Gambar 3 . Hal ini menunjukkan metode  penambatan  menggunakan  perangkat  lunak  ADT dengan parameter tersebut dapat dikatakan memiliki presisi dan akurasi yang dapat diterima.
Penelitian  ini  memperoleh  hasil  bahwa  semua  senyawa turunan  orizanol  memiliki  energi  bebas  ikatan  yang  lebih besar  dari  pada  simvastatin.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa semua senyawa turunan orizanol memiliki afinitas yang lebih rendah  pada  sisi  ikatan  enzim  HMG-CoA  reduktase  jika dibandingkan  simvastatin.  Berdasarkan  hasil  penelitian  ini dimungkinkan  potensi  panghambatan  semua  senyawa turunan  orizanol dalam menurunkan kadar kolesterol tidak akan sebaik simvastatin. Turunan orizanol juga berinteraksi dengan  beberapa  residu  asam  amino  melalui  ikatan hidrogen.  Berdasarkan  penelitian  Istvan  [6],  telah digambarkan interaksi ligan asli (simvastatin) pada komplek kristal  enzim  HMG-CoA  reduktase.  Residu  asam  amino SER684, ASP690, LYS691  dan LYS692 menjadi residu utama yang diduga berperan dalam proses penghambatan aktivitas pada  sisi  aktif.  Oleh  karena  itu,  senyawa  turunan  orizanol yang memiliki interaksi dengan beberapa residu asam amino diprediksi dapat memberikan aktivitas penghambatan pada protein target.
Berdasarkan  hasil  penambatan  molekul,  jumlah  ikatan hidrogen  paling  banyak  terbentuk  pada  senyawa brassicasteryl-ferulate yaitu 4 ikatan hidrogen. Namun, pada nilai energi bebas ikatan paling tinggi dimiliki oleh senyawa  lupeol-ferulate  yang  hanya  membentuk  3 ikatan  hidrogen.  Penilaian  terhadap  penambatan  lebih diutamakan pada hasil energi bebas ikatannya daripada penentuan  jumlah  ikatan  hidrogennya.  Hal  ini dikarenakan  nilai  energi  bebas  ikatan  merupakan kontribusi dari berbagai efek ikatan, efek-efek elektronik lain,  dan  nilai  regresi  yang  terjadi  selama  proses penambatan. Secara eksperimental energi bebas ikatan ( ΔG ) berhubungan langsung dengan konstanta inhibisi. Oleh  karena  itu,  penentuan  nilai  energi  bebas  ikatan dapat  memprediksi  kemampuan  senyawa  untuk menghambat  kerja  enzim  [9].  Namun,  penelitian  lebih lanjut  berupa  eksperimen  secara  enzimatik  masih diperlukan  untuk  meyakinkan  dan  membuktikan  hasil prediksi tersebut.

## Original Article
Journal of Science and Applicative Technology vol. xx (xx), 20xx, pp. xx-xx | 46
e-ISSN: 2581-0545 - https://journal.itera.ac.id/index.php/jsat/
Copyright © 2020 Journal of Science and Applicative Technology. Content from this work may be used under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International Licence . Any  further distribution of this work must maintain  attribution to the  author(s) and the  title of the  work, journal citation and DOI. Published  under licence by Journal of Science and Aplicative Technology  (JSAT).
Gambar 2. Struktur tiga dimensi turunan orizanol hasil optimasi struktur. (1) Lanosteryl-ferulate, (2) Brassicasteryl-ferulate, (3) Lupeol-ferulate, dan (4) Cholesteryl-ferulate.
Gambar 3. Perbandingan konformasi ligan simvastatin dari struktur kristal kompleks (Biru) dan ligan simvastatin hasil penambatan ulang menggunakan perangkat lunak ADT (Hijau).
Tabel 1 . Nilai energi bebas ikatan ligan uji hasil penambatan pada HMG-CoA reduktase(1HW9) Ligan Uji Energi Bebas Ikatan/ ΔG (kCal/mol) Residu Asam Amino (Ikatan Hidrogen) Lanosteryl-ferulate -2.85 ALA525, GLY560 Brassicasteryl-ferulate -3.36 GLU559, ARG590, SER684, LYS735 Lupeol-ferulate -3.91 SER661, LYS691, HIS752 Cholesteryl-ferulate -2.58 GLY560, LYS691, ASN755 Simvastatin -4.68 GLU559, ALA751, LYS691, SER684, LYS692, LYS735, ASN755 (3) (4)
Copyright © 2020 Journal of Science and Applicative Technology
J. Sci. Appl. Tech. vol. 4 (1), 2020, pp. 43-48 | 47 Published by: Lembaga Penelitian, Pengabdian Masyarakat, dan Penjaminan Mutu Institut Teknologi Sumatera, Lampung Selatan, Indonesia
Gambar 4. Visualisasi interaksi hidrogen ligan uji terhadap HMG-CoA reduktase(1HW9). (1) Lanosteryl-ferulate, (2) Brassicasteryl- ferulate, (3) Lupeol-ferulate, (4) Cholesteryl-ferulate, dan (5) Simvastatin.
(5) (1) (2)
(3) (4)
e-ISSN: 2581-0545
Penambatan molekul senyawa turunan orizanol terhadap enzim 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reduktase

## Kesimpulan
Dari  keempat  senyawa  turunan  orizanol  yang  didesain, semuanya  memiliki  afinitas  pengikatan  terhadap  enzim HMG-CoA reduktase. Semua turunan orizanol dimungkinkan akan  memberikan  hambatan  terhadap  enzim  HMG-CoA reduktase.  Lupeol-ferulate  diprediksi  akan  memberikan aktivitas penghambatan terhadap HMG-CoA reduktase yang lebih  baik  jika  dibandingkan  dengan  senyawa  turunan orizanol lainnya.

## Konflik Kepentingan

## Tidak ada konflik kepentingan dalam penelitian ini

## Penghargaan
Penelitian  ini  didanai  oleh  hibah  penelitian  ITERA  SMART tahun 2018
dengan nomor kontrak
SK
134ac/IT9.C1/PP/2018.

## Pustaka
[1]  A.  Oda,  M.  Okayasu,  Y.  Kamiyama,  T.  Yoshida,  O. Takahashi,  dan  H.  Matsuzaki ,  “Evaluation  of  Docking Accuracy and Investigations of Roles of Parameters and Each  Term  in  Scoring  Functions  for  Protein – Ligand Docking  Using  ArgusLab  Software,” Bull.  Chem.  Soc. Jpn. , vol. 80, no. 10, hal. 1920 – 1925, 2007.
[2]  C. C. Spiazzi, V. Manfredini, F. E. B.  da Silva, E. M. M. Flores, A. P. Izaguirry, L. M. Vargas, M. B. Soares, dan F. W. Santos , “Oryzanol protects against acute cadmium - induced oxidative damage in mice testes,” Food Chem. Toxicol. , vol. 55, hal. 526 – 532, 2013.
[3] P.  Chandrashekar  dan  P.  K.  P.  Kumar,  “Hypolipidemic effect  of  oryzanol  concentrate  and  low  temperature extracted  crude  rice  bran  oil  in  experimental  male wistar  rats,” J.  Food  Sci.  Technol. ,  vol.  51,  no.  7,  hal. 1278 – 1285, 2014.
[4]  M.  H.  Puttananjaiah,  M.  A.  Dhale,  V.  Gaonkar,  dan  S. Keni, “Statins : 3 -Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA ( HMG-
CoA  )  Reduktase  Inhibitors  Demonstrate  Anti- Atherosclerotic  Character  due  to  Their  Antioxidant Capacity,” Biotechnol.  Appl.  Biochem. ,  vol.  163,  no.  2, hal. 215 – 222, 2011.
[5] R. Huey, G. M. Morris, dan S. Forli, “Using autodock 4 and autodock vina with autodocktools : a tutorial.” The Scripps Research Institute, California, 2012.
[6] E. S. Istvan dan J. Deisenhofer, “Structural mechanism
for statin inhibition of hmg- coa reductase,” 2001.
[7] O. Trott dan A. J. Olson, “Au toDock Vina: improving the speed  and  accuracy  of  docking  with  a  new  scoring function, efficient optimization and multithreading,” J. Comput. Chem. , vol. 31, no. 2, hal. 455 – 461, 2010.
[8]  K. A. Hafidz, N. Puspitasari, A. Yanuar, Y. Artha, dan A. Mun’im,  “H MG-CoA  Reductase  Inhibitory  Activity  of Gnetum  gnemon  Seed  Extract  and  Identification  of Potential Inhibitors for Lowering Cholesterol Level,” J. Young Pharm. , vol. 9, no. 4, hal. 559 – 565, 2017.
[9]  R.  E.  Kartasamita,  R.  Herowati,  N.  Harmastuti,  dan  T. Gus dinar,  “Quercetin  Derivatives  Docking  Based  on Study of Flavonoids Interaction to Cyclooxygenase- 2,”
Indones. J. Chem. , vol. 9, no. 2, hal. 297 – 302, 2009.