Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau Vol. 2 No. 1 Tahun 2017  Hal. 43 – 50 ISSN Online 2503-4766
Diterbitkan oleh Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Unbari

## METODE PENENTUAN PLOIDI PADA IKAN NILA OREOCHROMIS NILOTICUS MENGGUNAKAN KOMBINASI SEBARAN KROMOSOM DAN NUKLEOLI SECARA BERSAMAAN
Akhmad Taufiq Mukti Departemen Manajemen Kesehatan Ikan dan Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Kelautan,
Universitas Airlangga, Kampus C Unair, Jl, Mulyorejo Surabaya 60115 Korespondensi: atm_mlg@yahoo.com

## Abstract
Ploidy  determination  in  fish  was  need  the  accurate,  simple  and  rapid  method.  This  research  was aimed to develop ploidy determination method in Nile tilapia use combination of chromosome and nucleoli  spreads  simultaneously.  Ten  fish  of  30-day-old  Nile  tilapias  were  used  in  this  research. Solid  tissues  for  preparation  were  collected  on  the  caudal  fin  of  the  fish.  The  result  showed  that chromosome and nucleoli spreads simultaneously were  easily observed in same preparate. Ploidy determination in Nile tilapia can done very accurate and fast use combination of chromosome and nucleoli spreads simultaneously as indicators to ploidy level determination in fish. Keywords: chromosome spread, nucleoli spread, simultaneously, ploidy level, tilapia

## Abstrak
Penentuan ploidi pada ikan diperlukan metode yang akurat, mudah dan cepat. Tujuan penelitian ini  adalah  mengembangkan  metode  penentuan  ploidi  pada  ikan  nila  menggunakan  kombinasi sebaran kromosom dan nukleoli secara bersamaan.  Sebanyak sepuluh ekor ikan nila umur 30 hari digunakan  dalam  penelitian  ini.  Jaringan  padat  untuk  preparasi  dikoleksi  untuk  preparasi  adalah sirip  ekor  ikan.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  sebaran  kromosom  dan  nukleoli  secara bersamaan  mudah  diamati  pada  preparat  yang  sama.  Penentuan  ploidi  pada  ikan  nila  dapat dilakukan  secara lebih  akurat  dan  cepat  menggunakan  kombinasi  sebaran  kromosom  dan  nukleoli secara bersamaan sebagai indikator penentu tingkat ploidi pada ikan.
Kata kunci: sebaran kromosom, sebaran nukleoli, secara bersamaan, penentuan ploidi, ikan nila

## PENDAHULUAN
Metode identifikasi pengujian tingkat ploidi tergantung pada peralatan, pengalaman staf laboratorium  atau farm ,  dan  studi  materialnya,  seperti  spesies  ikan,  umur,  dan  ukuran spesimen.  Kombinasi  beberapa  teknik  mudah  dapat  sangat  membantu  lebih  cepat, dipercaya,  dan  penduga  pengaruh  manipulasi  genom  (Jankun et  al .  2007).  Pada  beberapa penelitian,  metode  mudah  dan  cepat  untuk  verifikasi  tingkat  ploidi  diperlukan.  Perlakuan poliploidisasi  tidak  selalu  berhasil  100%  dan  kemungkinan  masih  campuran  ( mosaic ), sehingga  diperlukan  metode  penentuan  ploidi  yang  akurat.  Beberapa  metode  penentuan ploidi,  antara  lain:  menghitung  jumlah  kromosom,  menghitung  jumlah  nukleoli  atau nucleolar  organizer  regions ( NORs ),  menguji  ukuran  sel  dan  jumlah  sel,  menguji  ukuran sel  eritrosit  dan  ukuran  inti  sel  eritrosit,  analisis  densitas  sel,  penentuan  komponen  atau kandungan DNA pada nukleus eritrosit menggunakan flow cytometry dan mikrosatelit (Bai et  al .  2011). Flow  cytometry , spectrofluorometry atau microdensitometry adalah  teknik
Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau Vol. 2 No. 1 Tahun 2017  Hal. 43 – 50 ISSN Online 2503-4766
Diterbitkan oleh Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Unbari
yang  mudah  dan  cepat  untuk  validasi  jumlah  DNA  (Hardie et  al .  2002),  tetapi  biaya  dan peralatan yang diperlukan sangat mahal, termasuk juga mikrosatelit. Parameter sitologi lain yang  dapat  digunakan  dalam  penentuan  tingkat  ploidi,  seperti  Wlasow et  al .  (2004)  yang menjabarkan “ ploidy specific pattern ” dari nukleoli eritrosit dan granulosit pada ikan brook trout maupun  analisis  dimensi  eritrosit,  seperti  pada  ikan brook  trout (Woznicki  & Kuzminski 2002).
Penghitungan  jumlah  kromosom  adalah  satu  metode  yang  memungkinkan  penentuan secara langsung tingkat ploidi, karena jumlah kromosom mengindikasikan jumlah molekul DNA. Preparasi kromosom dapat dibuat dari head kidney , epithelium insang, seluruh tubuh ikan,  atau  dari  kultur  sel  darah  (Ozouf-Costaz  &  Foresti  1992).  Struktur  dasar  kromosom dapat diamati di bawah mikroskop cahaya (Schreck & Moyle 1990). Keberhasilan preparasi kromosom secara umum hingga saat ini masih mengandalkan bahan penghambat metafase, seperti kolkisin dan atau kolsemid, sehingga ketergantungan terhadap bahan kimia tersebut sangat tinggi.
Metode  pewarnaan  perat  nitrat  telah  dikembangkan  oleh  Howell  dan  Black  (1980). Metode  pewarnaan  perak  nitrat  untuk  menghitung  nukleoli  ( NORs )  telah  diaplikasikan untuk verifikasi ploidi Abramis brama dan Esox lucius (Kucharczyk et al. 1999), rainbow trout (Babiak et al . 1998), brook trout (Phillips & Ihssen 1985), common carp (Carman et al . 1992; Carman 1992; Mukti et al . 2001; Mukti 2005, Mukti & Mubarak 2007), dan nila merah  (Carman et  al .  1997).  Metode  ini  tidak  bermanfaat  pada sturgeon (termasuk Huso huso ) karena sistem yang multi dari NORs (Fontana 2002).
Beberapa  peneliti  juga  telah  menentukan  tingkat  ploidi  pada  ikan  menggunakan kombinasi  indikator  penentu  tingkat  ploidi,  seperti  jumlah  kromosom  dan  ukuran  inti eritrosit  (Pradeep et  al .  2011a),  jumlah  nukleoli  dan  ukuran  inti  eritrosit  (Jankun et  al . 2007), jumlah kromosom dan ukuran inti eritrosit (Woznicki & Kuzminski 2002; Dorota et al . 2006), serta jumlah kromosom   dan jumlah nukleoli (Uma dan Chandran 2008). Akan tetapi, kombinasi-kombinasi tersebut dilakukan melalui metode preparasi yang berbeda dan umumnya  menggunakan  spesimen  yang  berbeda,  sehingga  dirasa  kurang  efisien  dan efektif.  Berdasarkan  kenyataan  tersebut,  perlu  dikembangkan  metode  identifikasi  ploidi pada  ikan  yang  lebih  mudah,  cepat  dan  murah  menggunakan  indikator  penentu  tingkat ploidi  secara  bersamaan.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  mengembangkan  metode  penentuan ploidi  pada  ikan  nila  menggunakan  kombinasi  sebaran  kromosom  dan  nukleoli  secara bersamaan.

## Materi dan Metode
Ikan  nila yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  ikan  nila  strain  Wanayasa (NIRWANA).  Perkawinan  induk  ikan  nila  dilakukan  secara  alami  dan  terkontrol  dalam akuarium dengan volume 100 L, sedangkan pemijahan dan fertilisasi telur dilakukan secara buatan.  Inkubasi  dan  penetasan  telur  dilakukan  secara  terkontrol  menggunakan  sistem resirkulasi  air  tertutup  dengan  volume  wadah  penetasan  sekitar  350  mL  dengan  suhu  air inkubasi  terkontrol  sekitar  29-30 o C.  Ikan  nila  triploid  diproduksi  melalui  perlakuan  kejut suhu  41 o C  selama  empat  menit  embrio  umur  empat  menit  setelah  fertilisasi  berdasarkan Mukti (2016), Mukti et al . (2016a, b, c).
Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau Vol. 2 No. 1 Tahun 2017  Hal. 43 – 50 ISSN Online 2503-4766
Setelah  telur  menetas,  larva  ikan  dipelihara  dalam  akuarium  volume  50  L  dan  ikan diberi  pakan  alami Moina sp.  dan Tubifex sp.  secara  bertahap.  Selanjutnya,  benih  ikan diberi pakan buatan pellet halus dengan kandungan protein sekitar 33% dan pakan buatan pellet kecil dengan kandungan protein sekitar 40% secara bertahap. Saat  ikan berumur 30 hari, sebanyak sepuluh ekor ikan diambil sebagai sampel untuk preparasi.
Preparasi  menggunakan  jaringan  padat  kombinasi  metode  Kligerman  dan  Bloom (1977)  yang  dimodifikasi  tanpa  perlakuan  bahan  kimia  penghambat  metafase  dengan pewarnaan  perak  nitrat  metode  Howell  dan  Black  (1980),  sedangkan  jaringan  padat  yang digunakan  untuk  preparasi  adalah  potongan  sirip  ekor  sebagaimana  Mukti  (2016)  dan Mukti et  al .  (2016).  Sebaran  sel  diamati  di  bawah  mikroskop  untuk  mengamati  dan menghitung sebaran kromosom dan nukleoli. Sebaran kromosom dan nukleoli dihitung dari seratus  sel  yang  diamati,  sedangkan  sebaran  metafase  kromosom  yang  baik  dihitung maksimal  dari  20  sel  yang  ditemukan  berdasarkan  penelitian  Pradeep et  al .  (2011b). Mikroskop  yang  digunakan  untuk  mengamati  preparat  adalah  mikroskop  Olympus  BH2- RFCA yang dilengkapi dengan kamera Canon. Pembesaran yang digunakan 400-1000 kali tanpa minyak imersi.
Sebaran kromosom dan nukleoli  yang baik difoto dan didokumentasikan. Selanjutnya, data dianalisis secara deskriptif.

## Hasil
Berdasarkan  hasil  penelitian  ini,  sebaran  kromosom  dan  nukleoli  dapat  terlihat  secara bersamaan  dalam  satu  lapang  pandang  pada  preparat  yang  sama,  seperti  terlihat  pada Gambar 1. Sebaran kromosom ikan nila diploid berkisar antara 29-50 sel (29-50%) dengan rerata 39.1±2.88%, sedangkan ikan nila triploid berkisar antara 20-27 sel (20-27%) dengan rerata 23.29±2.63%  (Tabel  1). Akan tetapi  berdasarkan sebaran metafase  kromosom  yang baik,  ikan  nila  diploid  dan  triploid,  masing-masing  sekitar  85-100%  dengan  rerata 97±4.83% dan sekitar 70-90% dengan rerata 81.43±8.52% (Tabel 2).
Gambar  1.  Sebaran  kromosom  dan  nukleoli  ikan  nila  secara  bersamaan;  diploid  (a)  dan triploid (b) dalam satu preparat pada pembesaran 400 x
a b
Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau Vol. 2 No. 1 Tahun 2017  Hal. 43 – 50 ISSN Online 2503-4766
Tabel 1. Sebaran kromosom ikan nila diploid dan triploid hasil preparasi
Ikan Jumlah Sel Sebaran Kromosom (sel) (sel) Diploid Triploid 1 100 40 20 2 100 35 23 3 100 37 23 4 100 42 25 5 100 42 20 6 100 40 25 7 100 42 27 8 100 40 - 9 100 34 - 10 100 39 - Tabel 2. Sebaran metafase kromosom ikan nila diploid dan triploid yang baik Ikan Sebaran Metafase Kromosom (sel) Diploid Triploid (sel) (%) (sel) (%) 1 20 100 16 80 2 20 100 17 85 3 19 95 14 70 4 19 95 17 85 5 20 100 14 70 6 20 100 18 90 7 20 100 18 90 8 20 100 - - 9 17 85 - - 10 19 95 - -
Keterangan  : Jumlah  dan  persentase  sebaran  metafase  kromosom  yang  baik  berdasarkan penelitian Pradeep et al . (2011b), yaitu 20 sel (100%)
Berdasarkan  sebaran  nukleoli,  ikan  nila  diploid  dan  triploid  memiliki  variasi  jumlah nukleoli  dalam  inti  selnya.  Ikan  nila  diploid  memilki  jumlah  nukleoli  1,  2,  3,  dan  4 (maksimal),  sedangkan  ikan  nila  triploid  memiliki  jumlah  nukleoli  1,  2,  3,  4,  5,  dan  6 (maksimal), masing-masing juga memiliki variasi jumlah nukleoli yang berbeda (Tabel 3).
Tabel 3. Sebaran dan variasi nukleoli ikan nila diploid dan triploid hasil preparasi
Ikan Jumlah Ikan Jumlah Sel / Ikan Jumlah Nukleoli / Sel / Ikan Total Sel (ekor) (sel) 1 2 3 4 5 6 7 (sel) Diploid 10 100 29 40 11  20 - - - 1000 Triploid 10 100 4 11 30  18  25  12 - 1000
Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau Vol. 2 No. 1 Tahun 2017  Hal. 43 – 50 ISSN Online 2503-4766
Diterbitkan oleh Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Unbari

## Pembahasan
Jumlah  kromosom  ikan  nila  diploid  adalah  44  atau  22  pasang,  walaupun  ditemukan pula beberapa yang terhitung 40-42 atau  20-21 pasang, termasuk dua GC , sedangkan ikan nila  triploid  memiliki  kromosom  sejumlah  66  atau  33  pasang  dengan  tiga GC .  Ikan  nila telah  diteliti  oleh  beberapa  peneliti  memiliki  jumlah  kromosom  2n  =  44  dan  3n  =  66 (Hussain 1995;  Pradeep et  al . 2011a,b;  Mukti et al . 2016b,c).  Ikan nila  yang memiliki 15 jenis dari tiga genus utama, yaitu Oreochromis , Sarotherodon , dan Tilapia telah diteliti dan beberapa spesies memiliki kariotip yang sama, 22 pasang kromosom termasuk satu pasang kromosom  besar  (Harvey et  al .  2002a).  Ada  empat  pengecualian,  yaitu Tilapia  mariae dengan 2n=40 (Ferreira et al . 2010), Tilapia sparrmanii dengan 2n=42 (Thompson 1981), Oreochromis  alcalicus dengan  2n=48  (Park  1974),  dan Oreochromis  karongae dengan 2n=38  (Harvey et  al .  2002b).  Jumlah  kromosom  ikan  nila  hasil  preparasi  yang  terhitung kurang  dari  44,  kemungkinan  besar  akibat  terjadinya  penumpukan  dan  atau  terpisah  dari kumpulan kromosomnya. Hal  ini dimungkinkan terjadi diakibatkan proses penyebaran sel ke slide yang kurang sempurna, baik karena suhu hot plate terlalu dingin atau panas, terlalu keras droping , larutan suspensi sel saat chopping terlalu banyak (encer), dan atau perlakuan hipotonik yang kurang tepat.
Pembuatan slide adalah aspek kritis preparasi kromosom. Variabel yang mempengaruhi preparasi  termasuk  kelembaban,  suhu  ruang,  waktu  pengeringanginan,  dan  jumlah  sel  per slide .  Hal  ini  juga  terlihat  dari  hasil  penelitian,  bahwa  sebaran  kromosom  yang  diperoleh masih  rendah  sekitar  40%  untuk  diploid  dan  20-30%  untuk  triploid  (dari  100  sel  yang dihitung,  Tabel  1).  Akan  tetapi,  sebaran  metafase  kromosom  yang  baik  dapat  mencapai 100% (75-100) untuk ikan nila diploid dan 70-90% untuk ikan nila triploid. Pada ikan nila, persentase  sebaran  metafase  kromosom  ini  kemungkinan  tidak  terlalu  signifikan  untuk penentuan tingkat ploidi ikan, karena keuntungan dari kromosom ikan nila adalah memiliki kromosom  penanda  ( GC )  yang  secara  umum  dapat  dijadikan  sebagai  indikator  tingkat ploidi ikan dengan menghitung jumlah GC , yaitu 1n = 1 GC , 2n = 2 GC , 3n = 3 GC , dan 4n = 4 GC .
Pradeep et  al .  (2011b)  menjelaskan,  setiap  tahapan  preparasi  kromosom,  mulai preparasi  jaringan,  penyebaran  sel  pada slide ,  hingga  akhir  proses  preparasi  (pewarnaan) merupakan  faktor  penting  yang  kritis  pada  keberhasilan  preparasi  kromosom,  terutama mendapatkan sebaran metafase kromosom yang baik dan banyak. Sebaran kromosom yang baik  juga  dapat  dipengaruhi  oleh  faktor  perlakuan  hipotonik.  Foresti et  al .  (1992) menemukan  bahwa  selain  perlakuan  prefiksatif,  volume  larutan  hipotonik  mempengaruhi keberhasilan  mendapatkan  sebaran  kromosom  yang  baik  saat  preparasi  kromosom  ikan Silurus glanis (Siluridae) dan Scardinus erythropththalmus (Cyprinidae).
Pada penelitian ini, jaringan sirip ekor yang digunakan menunjukkan hasil yang  relatif bagus terhadap sebaran kromosom dan nukleoli. Jaringan atau organ yang digunakan dalam preparasi kromosom mempengaruhi keberhasilan mendapatkan sel mitotik tinggi, sehingga diharapkan sebaran metafase kromosom banyak didapat. Jaringan yang dapat tumbuh cepat memiliki  sel  mitotik  tinggi,  sehingga  memungkinkan  sebaran  metafase  kromosom  yang diperoleh dalam preparasi kromosom juga tinggi, walaupun hal ini masih dipengaruhi oleh tahapan preparasi kromosom yang lainnya. Jaringan sirip ikan nila memiliki indeks mitotik tinggi sebagaimana penelitian Mukti (2016) dan Mukti et al . (2016b). Sirip dan insang ikan
Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau Vol. 2 No. 1 Tahun 2017  Hal. 43 – 50 ISSN Online 2503-4766
Diterbitkan oleh Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Unbari
termasuk jaringan yang cepat tumbuh. Pradeep et al . (2011b) menyatakan bahwa efektivitas preparasi kromosom hanya dapat dihasilkan dengan jumlah populasi sel dari jaringan yang memiliki  sel  mitotik  tinggi.  Tan et  al .  (2004)  menyatakan  bahwa  jaringan  yang  tumbuh sangat cepat diperlukan untuk mendapatkan jumlah besar sebaran kromosom pada metafase untuk studi kariologi.
Berdasarkan sebaran nukleoli, ikan nila diploid memiliki variasi jumlah nukleoli 1, 2, 3, dan maksimal 4, sedangkan ikan nila triploid memiliki variasi jumlah nukleoli 1, 2, 3, 4, 5, dan maksimal 6. Variasi jumlah dan persentase nukleoli per sel juga berbeda, baik diploid maupun  triploid  (Tabel  3).  Carman et  al .  (1992)  menjelaskan  bahwa  variasi  yang  terjadi pada  jumlah  maksimum  nukleoli  kemungkinan  disebabkan  fusi  dan  fisi  dari  bentuk nukleoli tunggal atau tiga, karena beberapa proses fisiologis yang terjadi selama siklus sel. Variasi  ini  adalah  merupakan  faktor  sulit  pada  interpretasi  level  ploidi  pada  pengamatan individu-individu  yang  dipergunakan.  Variasi  jumlah  maksimum  nukleoli  per  sel  pada individu  diploid  dan  triploid  berhubungan  dengan  umurnya.  Phillips et  al .  (1986) mengatakan  bahwa  peningkatan  jumlah  nukleoli  pada  ikan  triploid  disebabkan  karena adanya  penambahan  sejumlah  nukleoli  yang  berasal  dari polar  body II  dan  berhasil bergabung  dengan  pronukleus  betina  dan  pronukleus  jantan  akibat  adanya  kejutan  panas yang  dilakukan.  Peningkatan  jumlah  nukleoli  merupakan  indikasi  peningkatan  jumlah kromosom pada ikan triploid.
Penentuan ploidi pada ikan nila dapat dilakukan melalui pengamatan jumlah kromosom dan  jumlah  nukleoli  secara  bersamaan  sebagai  indikator  kuat  penentu  tingkat  ploidi  pada ikan.  Hasil  penelitian  ini  memungkinkan  dikembangkan  untuk  preparasi  yang menghasilkan  gambaran  sebaran  kromosom  dan  nukleoli  secara  bersamaan  pada  spesies ikan yang lain menggunakan jaringan yang mudah dikoleksi tanpa menyebabkan kematian ikan serta lebih mudah, cepat, dan murah.

## Simpulan
Metode penentuan ploidi pada ikan nila dapat dilakukan menggunakan kombinasi sebaran kromosom dan nukleoli secara bersamaan. Preparasi tanpa perlakuan bahan penghambat metafase seperti kolkisin dan kolsemid dengan pewarnaan perak nitrat dapat menghasilkan sebaran kromosom dan nukleoli secara bersamaan sebagai indikator kuat penentu tingkat ploidi pada ikan nila.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis  haturkan  terima  kasih  kepada  Kementerian  Riset,  Teknologi  dan  Pendidikan Tinggi  atas  sponsor  BPP-DN  dan  Lembaga  Pengelola  Dana  Pendidikan  (LPDP) Kementerian Keuangan atas Beasiswa Disertasi, Drs. Odang Carman dan Alimuddin serta Profs.  Muhammad Zairin Junior dan Komar Sumantadinata (alm.)  atas  arahan, bimbingan dan  ilmunya  serta  Kepala  dan  Staf  Balai  Pengembangan  Budidaya  Ikan  Nila  dan  Mas Wanayasa, Purwakarta, Jawa Barat atas bantuan penyediaan induk ikan NIRWANA.
Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau Vol. 2 No. 1 Tahun 2017  Hal. 43 – 50 ISSN Online 2503-4766
Diterbitkan oleh Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Unbari

## Daftar Pustaka
Babiak  I,  Dobosz  S,  Goryczko  K,  Kuzminski  H,  Woznicki  P.  1998.  Androgenesis  in Rainbow  Trout, Oncorhynchus  mykiss ,  Using  Gamma  Irradiation  and  Heat  Shock. Aquaculture  Europe  ‘98.  Aquaculture  and  Water:  Fish  Culture,  Shellfish  Culture  and Water Usage . Bordeaux, France. October 7-10, 1998.
Bai Z, Liu F, Li J, Yue GH. 2011. Identification of triploid individuals and clonal lines in Carassius auratus complex using microsatellites. Int. J. Biol. Sci. 7: 279-285. Carman  O,  Alimuddin,  Sastrawibawa  S,  Arfah  H.  1997.  Determinasi  kromosom  dan nukleoli kelamin pada ikan nila merah ( Oreochromis sp.). Zuriat 8(2):83-89.
Carman O., Oshiro T, Takashima F. 1992. Variation in the maximum number of nucleoli in diploid and triploid common carp. Nippon Suisan Gakkaishi 58(12):2303-2309. Dorota  F-B,  Jankun  M,  Woznicki  P.  2006.  Chromosome  number  and  erythrocyte  nuclei length in triploid Siberian sturgeon Acipenser baeri Brandt. Caryologia 59(4): 319-321. Ferreira  IA,  Poletto  AB,  Mota-Velasco  J,  Penman  DJ,  Kocher  TD,  Martins  C.  2010. Chromosome  evolution  in  African  Cichlid  fish:  Contributions  from  the  physical mapping of repeated DNAs. Cytogenetics and Genome Research ( in press ).
Fontana  F.  2002.  A  cytogenetic  approach  to  the  study  of  taxonomy  and  evolution  in sturgeons. J. Appl. Ichthyol . 18:226-233.
Foresti F, Ozouf-Costaz C, Rab P. 1992. Volume dependent effect of hypotonic treatment on good spreading of fish chromosomes. Cybium 16(3):209-212. Hardie DC, Gregory TR, Hebert PDN. 2002. From pixels to picograms: A beginners' guide to  genome  quantification  by  Feulgen  image  analysis  densitometry. J.  Histochem. Cytochem . 50:735-749.
Harvey  SC,  Campos-Ramos  R,  Kennedy  RR.  2002a.  Karyotype  evolution  in  Tilapia: Mitotic and meiotic chromosome analysis of Oreochromis karongae and O. niloticus × O. karongae hybrids. Genetica 115:169-177.
Harvey  SC,  Powell  SF,  Kennedy  DD,  McAndrew  BJ,  Penman  DJ.  2002b.  Karyotype analysis  of Oreochromis  mortimeri (Trewavas)  and Sarotherodon  melanotheron (Rüppell). Aqua. Res . 33:339–342.
Howell  WM,  Black  DA.  1980.  Controlled  silver  staining  of  nucleolus  organizer  regions with a protective colloidal developer: A 1-step method. Experientia 36:1014-1015. Hussain  MG.  1995.  Suppression  of  meiotic  and  mitotic  cell  divisions  in  Nile  tilapia, Oreochromis niloticus L., and induction of triploids two types of gynogenetic diploids. Asian Fish. Sci . 8:133-142.
Jankun  M,  Kuzminski  H,  Furgala-Selezniow  G.  2007.  Cytologic  ploidy  determination  in fish - an example of two salmonid species. Environ. Biotechnol . 3(2):52-56. Klingerman  AD,  Bloom  SE.  1977.  Rapid  chromosome  preparation  from  solid  tissues  of fish. J. Fish. Res. Bd Can . 34:266-269. Kucharczyk  D,  Woznicki  P,  Luczynski  MJ,  Klinger  M,  Luczynski  M.  1999. Ploidy  level determination in  genetically manipulated northern pike based on the number of active nucleoli per cell. North Am. J. Aqua . 61:38-42. Mukti AT. 2005. Perbedaan keberhasilan tingkat poliploidisasi ikan mas ( Cyprinus carpio Linn.) melalui kejutan panas. Berkala Penel. Hayati 10(2):133-138.
Jurnal Akuakultur Sungai dan Danau Vol. 2 No. 1 Tahun 2017  Hal. 43 – 50 ISSN Online 2503-4766
Diterbitkan oleh Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Unbari
Mukti  AT.  2016.  Triploidi  dan  Dimorfisme  Seks,  Performa  Reproduksi  dan  Produksinya pada  Ikan  Nila Oreochromis  niloticus .  Disertasi.  Sekolah  Pascasarjana,  Institut Pertanian Bogor. Bogor. 100 hal.
Mukti  AT,  Carman  O,  Alimuddin,  Zairin  Jr.  M.  2016b.  A  rapid  chromosome  preparation technique  without  metaphase  arrest  for  ploidy  determination  in  Nile  tilapia, Oreochromis niloticus . Caryologia 69(2):175-180.
Mukti  AT,  Carman  O, Alimuddin,  Zairin  Jr.  M.  2016c.  Triploidy  Success  of  Nile  Tilapia Oreochromis  niloticus Strain  Wanayasa  by  Heat  Shock  and  Zygote  Age  Treatments. First  International  Conference  on  Aquaculture  Biotechnology  (ICAB)  Bogor,  12 Oktober 2016.
Mukti  AT,  Mubarak  AS.  2007.  Identifikasi  Variasi  Nukleoli  pada  Ikan  Mas  ( Cyprinus carpio )  Dengan  Tingkat  Ploidi  Berbeda. Prosiding  Seminar  Nasional  Breeding, Genetika dan Bioteknologi Perikanan , Nov 12, 2007. Bali, Indonesia. pp. 80-83. Mukti AT, Rustidja, Sumitro SB, Djati MS. 2001. Poliploidisasi ikan mas ( Cyprinus carpio L.). J. Ilmu-Ilmu Hayati BIOSAIN 1(1):111-123.
Ozouf-Costaz  C,  Foresti  F.  1992.  Fish  cytogenetic  research:  Advances,  applications,  and perspectives. Netherland J. Zool . 42:277-290. Park EH. 1974. A list of the chromosome numbers of fishes. Coll. Rev. Lib. Arts Sci. Seoul Nat. Univ . 20:346-372.
Phillips RB, Ihssen PE. 1985. Chromosome banding in salmonid fish: Nucleolar organizer regions in Salmo and Salvelinus . Can. J. Gen. Cytol . 27:433-440. Phillips RB, Zajicek KD, Ihssen PE, Johnson O. 1986. Application of silver staining to the identification of triploid fish cells. Aquaculture 54:313-319.
Pradeep PJ, Srijaya TC, Jose D, Papini A, Hassan A, Chatterji AK. 2011a. Identification of diploid and triploid red tilapia by using erythrocyte indices. Caryologia 64(4):485-492. Pradeep PJ, Srijaya TC, Zain RBM, Papini A, Chatterji AK. 2011b. A simple technique for chromosome  preparation  from  embryonic  tissues  of  teleosts  for  ploidy  verification. Caryologia 64(2):235-241. Schreck  CB,  Moyle  PB.  1990. Methods  for  Fish  Biology .  American  Fisheries  Society, Maryland, USA. 553 p.
Tan X,  Qin JG, Chen B, Chen  L,  Li  X. 2004.  Karyological  analysis on red claw crayfish Cherax quadricarinatus (Decapoda: Parastacidae). Aquaculture 234:65-76.
Thompson  KW.  1981.  Karyotypes  of  six  species  of  African  Cichlidae  (Pisces:
Perciformes). Experientia 37:351-352.
Uma  B,  Chandran  MR.  2008.  Induction  of  triploidy  in Gymnocorymbus  ternetzi (Boulenger). Res. J. Fish. Hydrobiol. 3(2): 41-47.
Wlasow  T,  Kuzminski  H,  Woznicki  P,  Ziomek  E.  2004.  Blood  cells  alteration  in  triploid brook trout Salvelinus fontinalis (Mitchill). Acta Vet. ( Brno ) 73:25-29.
Woznicki  P,  Kuzminski  H.  2002.  Chromosome  number  and  erythrocyte  nuclei  length  in triploid brook trout ( Salvelinus fontinalis ). Caryologia 55:295-298.