Program Studi Pendidikan Kimia Universitas Sebelas Maret https://jurnal.uns.ac.id/jkpk
VALIDASI KIT IRMA TSH UNTUK PENENTUAN KADAR TSH DALAM SERUM DARAH MANUSIA
Validation of the TSH IRMA Kit for Determination of the TSH Levels in Human Blood Serum
Gina Mondrida*, Sutari, Triningsih, Sri Setyowati, V. Yulianti S, Wening Lestari, Agus Ariyanto, dan Puji Widayati
Pusat Teknologi Radioisotop dan Radiofarmaka (PTRR)-BATAN Jl. Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Gedung 11, Tangerang Selatan, Banten 15314, Indonesia
Untuk korespondensi: Tel: 085219410875, e-mail: gina-m@batan.go.id
Received: July 26, 2018
Accepted: November 24, 2018
Online Published: December 31, 2018
DOI : 10.20961/jkpk.v3i3.22334

## ABSTRAK
Kit IRMA TSH adalah kit yang digunakan untuk penentuan kadar TSH ( Thyroid Stimulating Hormone ) di dalam serum darah manusia. Hormon tiroid ini merupakan salah satu hormon yang sangat  diperlukan  tubuh  untuk  pertumbuhan  otak,  tulang  dan  jaringan  lain  serta  mengatur metabolisme  di  dalam  tubuh.  Kisaran  nilai  normal  TSH  untuk  orang  dewasa  0,4-4,5  mIU/L, sedangkan untuk bayi 3-18 mIU/L. Apabila tiroid terganggu akan mempengaruhi kualitas tumbuh kembang  anak  secara  optimal.  Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan  penetapan  kadar  TSH  di  dalam darah guna mengetahui apakah fungsi kelenjar tiroid bekerja secara normal. Penetapan kadar TSH di dalam darah dapat dilakukan dengan metode IRMA ( Immuno radio metric assay ). Metode IRMA merupakan  salah  satu  teknik immunoassay yang  berdasarkan  reaksi  imunologi  (ikatan  antigen- antibodi) dengan menggunakan radionuklida 125 I sebagai perunut sehingga cuplikan dalam jumlah kecil dapat dideteksi. Selama ini kit IRMA TSH didapat dari impor dengan harga yang cukup mahal. Pusat Teknologi Radioisotop dan Radiofarmaka BATAN telah berhasil mengembangkan kit IRMA TSH. Sebelum digunakan dilapangan kit IRMA TSH harus divalidasi meliputi penentuan ketepatan ( accuracy ), kepekaan (sensitivitas), ketelitian (presisi), dan parameter assay ( Non Specific Binding , NSB dan Maximum Binding , MB) sehingga dapat digunakan untuk penentuan kadar TSH dalam darah.  Telah  dilakukan  validasi  kit  IRMA  TSH  yang  menghasilkan  batas  deteksi  0,115  ng/mL dengan ketepatan ( accuracy ) dengan nilai  recovery  sebesar  93,6-108,0 %, ketelitian intra assay diperoleh nilai % CV (QC L) = 1,9848,  % CV (QC M) =  3,6360 dan nilai % CV (QC H) =  2,2085 sedangkan ketelitian inter assay diperoleh nilai % CV (QC L) = 11,0055, % CV (QC M) =  5,6768 dan nilai % CV (QC H) = 5,4181.  Kit IRMA TSH ini disimpulkan memberikan unjuk kerja yang baik karena menghasilkan % NSB sebesar 0,68 dan % B/T sebesar 34,64.
Kata Kunci: Tiroid, IRMA (Immunoradiometricassay), validasi

## ABSTRACT
TSH IRMA kit is a kit used for the determination of TSH (Thyroid Stimulating Hormone) levels in human blood serum. Thyroid hormone is a hormone that our bodies need for growth of the brain, bone and other tissues and regulate the metabolism in the body. TSH normal range for adult is in the  range  of  0.4-4.5  mIU/L,  whereas  for  baby  is  about  3.0-18.0  mIU/L.  Thyroid  would  affect  the quality of optimal growth of children if disturbed. Therefore, TSH assay in the blood needs to be determined to know whether the function of the thyroid gland works normally or not. Detection of TSH in blood can be performed by Immunoradiometricassay (IRMA) method. IRMA method is one
of the immunoassay techniques based on immunological reactions (antigen-antibody binding) using radionuclide 125 I  as  a  tracer,  that  sample  in  small  quantity  can  be  detected. IRMA  method  was developed  locally  by  replacing  TSH  IRMA  kit  which  is  costly  since  imported  from  commercial companies.  Center  for  Radioisotope  and  Radiopharmaceutical  Technology  (PTRR)  BATAN  has successfully developed the TSH IRMA kit that can be used to determine the levels of TSH in human blood. TSH IRMA kit must be validated to know the limit of detection, sensitivity, accuracy, precision and  the  assay  parameters,  such  as  Non-Specific  Binding  (NSB)  and  Maximum  Binding  (MB). Validation of TSH IRMA kit had been carried out resulting in the limit of detection of 0.115 ng/mL, accuracy with a recovery of 93.6-108.0 %, intra-assay precision (% CV) QC L = 1.9848, QC M = 3.6360 % and QC H = 2.2085 % while the inter-assay precision (% CV) QC L = 11.0055, QC M = 5.6768 %  and  QC H = 5.4181 %.  It was concluded that this TSH IRMA kit showed good performance based on the % NSB and % B/T of 0.68 and 34.64 %, respectively.
Keywords: Thyroid, IRMA (Immunoradiometricassay), validation

## PENDAHULUAN
Validasi  adalah  suatu  tindakan  yang membuktikan  bahwa  suatu  proses  /  metode dapat  memberikan  hasil  yang  konsisten dengan  spesifikasi  yang  telah  ditetapkan. Validasi  metode  analisis  bertujuan  untuk menjamin  bahwa  metode  analisis  yang digunakan  mampu  memberikan  hasil  yang cermat  dan  handal  hingga  dapat  dipercaya. Validasi biasanya diperuntukkan untuk metode  analisis  yang  baru  dibuat  dan dikembangkan,  sedangkan  untuk  metode yang memang telah tersedia dan baku tidak perlu  dilakukan  validasi,  hanya  verifikasi. Beberapa  parameter  analisis  yang  harus dipertimbangkan  dalam  validasi  suatu  kit adalah:  ketepatan  ( accuracy ),    ketelitian ( precision )  dan    kepekaan  /  batas  deteksi ( sensitivitas ) [1-4].
Ketepatan  ( accuracy )  adalah  ukuran yang  menunjukkan  derajat  kedekatan  hasil anlisis  dengan  kadar  analit  yang  sebenarnya. Ketepatan dinyatakan sebagai persen peroleh- an kembali ( recovery ) analit yang ditambahkan.
Kepekaan  dapat  ditentukan  melalui  dua  cara, yaitu metode simulasi ( spiked-placebo recovery )
atau  metode  penambahan  baku  ( standard addition method ) [5].
Ketelitian  ( precision ),    adalah  ukuran yang  menunjukkan derajat  kesesuaian antara  hasil  uji  individual,  diukur  melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur  diterapkan  secara  berulang  pada sampel-sampel  yang  diambil  dari  campuran yang  homogen.  Ketelitian  diukur  sebagai simpangan  baku  atau  simpangan  selektif (koefisient variasi). Ketelitian dapat dinyatakan sebagai  keterulangan  ( repeatability )  atau ketertiruan ( reproducibility ). Keterulangan adalah  ketelitian  metode  jika  dilakukan berulang  kali  oleh  analis  yang  sama  pada kondisi yang sama dan dalam interval waktu yang  pendek  ( intra  assay ).  Ketertiruan adalah ketelitian metode jika dikerjakan pada kondisi  yang  berbeda,  biasanya  dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan  peralatan,  pereaksi,  pelarut dan analisis yang berbeda serta sampel yang dianalisa diduga identik sama dari batch yang sama,  tetapi  dapat  juga  dilakukan  dalam laboratorium  yang  sama  dengan  meng- gunakan  peralatan,  pereaksi  dan  analisis yang berbeda ( inter assay ) [5-6].
128 G. Mondrida dkk. Validasi Kit IRMA TSH……….
Kepekaan /Batas deteksi ( sensitivitas ) adalah  jumlah  terkecil  analit  dalam  sampel yang  dapat  dideteksi  yang  masih  mem- berikan  respon  signifikan  dibanding  dengan blanko [5].
Hormon  tiroid  adalah  salah  satu hormon yang sangat diperlukan tubuh untuk pertumbuhan  otak,  tulang  dan  jaringan  lain serta  mengatur  metabolisme  di  tubuh, hormon  tiroid  dibutuhkan  dalam  seluruh tahap  kehidupan  manusia  sejak  dalam kandungan,  setelah  lahir,  masa  anak-anak, masa  remaja  sampai  usia  lanjut.  Apabila tiroid terganggu akan mempengaruhi kualitas tumbuh kembang anak secara optimal.  Agar kelenjar tiroid melakukan fungsinya, hipothalamus harus  melepaskan  TRH  ( thyrotropin  releasing hormon ).  TRH  kemudian  memicu  kelenjar pituitari  untuk  menghasilkan  TSH.  Kisaran nilai  normal  TSH  untuk  orang dewasa  0,4 – 4,5  mIU/L,  sedangkan  untuk  bayi  3 –  18 mIU/L. Kadar TSH yang berada diluar kisaran tersebut diklasifikasikan sebagai hipotiroidisme atau hipertiroidisme. Hipertiroidisme terjadi bila terjadi  kelebihan  produksi  hormone  tiroid. Gejala  dari  kondisi  ini  diantaranya  adalah kelemahan otot, gementar, kelelahan, denyut jantung cepat, penurunan berat badan, peka terhadap masalah suhu dan masalah penglihatan. Kondisi hipotiroidisme didiagnosa ketika produksi hormon tiroid lebih rendah dari kadar  normal. Gejala  hipotiroidisme  ditandai dengan  metabolisme  yang  melambat,  berat badan  naik,  rambut  rontok,  intoleransi  dingin, nyeri  sendi  dan  otot,  kelemahan,  kehilangan memori,  kulit  dan  rambut  kering,  lesu,  pucat, penurunan gairah seksual, dan terlalu banyak tidur [7-10].
Penetapan kadar TSH ( Thyroid
Stimulating  Hormon )  didalam  darah  dapat dilakukan  dengan  teknik  IRMA  ( Immuno- radiometricassay ).  Teknik  IRMA  merupakan salah  satu  teknik  immunoassay  yang menggunakan  radioisotop  sebagai  perunut agar  mudah  dideteksi.  Teknik  assay  ini didasarkan  pada  reaksi  antara  antigen  (Ag) yang  terdapat  pada  cuplikan  atau  standar dengan  antibodi  bertanda  (Ab*)  yang ditambahkan dalam jumlah berlebih membentuk  kompleks  antigen-antibodi  (Ab- Ag-Ab*).  Dengan  demikian,  semakin  tinggi kadar  (Ag)  yang  ada,  maka  kompleks antigen-antibodi yang terbentuk juga semakin  tinggi  sehingga  akan  memberikan cacahan  radioaktivitas  yang  tinggi.  Pada IRMA  reaksi  imunologi  yang  terjadi  non kompetitif karena pereaksi (Ab dan Ab*) yang digunakan  selalu  dalam  keadaan  berlebih. Teknik IRMA pada  umumnya menggunakan antibodi monoklonal yang jauh lebih spesifik sehingga teknik IRMA mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan teknik RIA [11-14]. Persyaratan  Kit  IRMA  yang  baik adalah nilai %CV ( intra assay ) dibawah 10 % dan  %  CV  ( inter  assay )  dibawah    15  % dengan    nilai  ketepatan (accuracy )  sebesar 90%  -  110%    serta  menunjukkan  kinerja assay yang baik dengan NSB ( Non Specific Binding ) dibawah 2 % dan ikatan maksimum (%B/T) diatas 10% [14].
Pusat  Teknologi  Radioisotop  dan Radiofarmaka (PTRR) BATAN telah berhasil mengembangkan  kit  IRMA  TSH  yang  dapat digunakan  untuk  penentuan  kadar  TSH  di dalam  serum  darah  manusia.  Adapun tahapan  proses  pembuatan  kit  IRMA  TSH adalah  pembuatan  komponen  kit,  optimasi
assay  kit  dan  validasi  kit  serta  uji  banding menggunakan  kit  komersil.  Tujuan  dari kegiatan  ini  adalah  untuk  menjamin  kehan- dalan kit IRMA TSH yang meliputi penentuan batas  deteksi,  ketelitian,  ketepatan  dan parameter assay sehingga kit tersebut dapat digunakan  untuk assay  in-vitro dengan persen ikatan immunologi ( Maximum Binding, MB)  yang  tinggi    serta  ikatan  tidak spesifik  ( Non  Specific  Binding, NSB)  yang rendah,  dengan  demikian  kit  IRMA  TSH dapat digunakan untuk penentuan kadar TSH di dalam serum darah manusia.

## METODE PENELITIAN

## 1.  Bahan dan peralatan
Bahan yang digunakan dalam penelitian  ini  diantaranya  adalah  larutan standar  TSH  ( TSH  98  %  pure    H6TO4 ), Monoklonal  antibodi  TSH  beta for  coated (E86214M  dari  Biodesign),  Monoklonal antibodi  TSH intact for  labelling (E86712M dari  Biodesign),  Na 125 I  dari  PTRR-BATAN, Kolom PD-10 dari Pharmacia , Natriumbisulfit (Na 2 S 2 O 5 )  dari  Sigma,  Kloramin-T,  Bovin Serum Albumin, Tricloric Acid, Larutan Dapar Fosfat  dari  Merck,  Tabung  star  (NUNC, Swedia) dan bahan kimia lainnya.
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  diantaranya  adalah  pencacah  gamma ( 600  Gammatec  II  The  Nucleus ), Gamma Management System DPC , berbagai ukuran pipet  mikro  beserta  tipnya,  pH  meter  merek Fisher  Accument model 810, Alat pengaduk ( vortex )  merek  VWR,  timbangan  analitik ( Mettler AE 160 ),  statif, peralatan gelas, stop watch dan rak tabung reaksi.
2.  Pembuatan Larutan Perunut TSH [12]
Ke  dalam  3,5 μl  (10  μg)  larutan Monoklonal  antibodi  TSH intact  for  labelling (E86712M dari Biodesign) yang ada didalam tabung reaksi ditambahkan 10 μl dapar fosfat 0,5  M  pH  7,5  dan  sejumlah  larutan  Na 125 I dengan aktivitas sebesar   0,4 mCi.  Setelah itu  ditambahkan10 μl  (10  μg)  Cloramin-T dalam  larutan  (0,5M  dapar  fosfat  pH  7,5) sebagai oksidator.  Campuran reaksi diaduk dengan menggunakan vortek dan diinkubasi selama 2 menit. Kemudian campuran reaksi tersebut dihentikan dengan penambahan 25 μl  (100  μg)  larutan  Na 2 S 2 O 5 dalam  larutan
(0,5 M dapar fosfat pH 7,5) dan 10 μl (10 μg) KI  0,1  %.  Hasil  penandaan  dimurnikan dengan  menggunakan  kolom PD-10 (yang sudah  dijenuhkan  dengan  1  ml  BSA  10  %) dengan  larutan  dapar  fosfat  0,05  M  pH  7,5. Produk  monoklonal  anti  TSH  bertanda 125 I (TSH- 125 I) selanjutnya disebut perunut dielusi dari kolom PD-10 dengan larutan dapar fosfat 0,05  M  pH  7,5  dan  fraksi  eluat  ditampung dalam  tabung  reaksi  500  ml  per  fraksi.  Tiap fraksi eluat diukur radio-aktivitasnya  dengan alat pencacah gamma selama 1 menit.
3.  Pembuatan Larutan Standar TSH [12]
Sebanyak 10 μl Human TSH 98 % pure (H6TO4) dengan konsentrasi (85000 µIU/mL) dilarutkan  dengan horse serum (yang sudah dilewatkan  kedalam  kolom charcoal  /  celite ) sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi  80  µIU/mL  (  disebut  sebagai larutan  stok  A).  Kemudian  larutan  stok  A diencerkan  menjadi  beberapa  konsentrasi standar TSH : 0,  0,5,  2,5,  5,  10,  20  dan  40 μIU/mL  dengan  menggunakan horse  serum . Larutan standar ini digunakan untuk membuat
kurva kalibrasi meng-gunakan prosedur assay (protokol  pengujian  kit  IRMA  TSH)  sebagai- mana tersebut di bawah ini.
4.  Pembuatan Coated Tube TSH [12]
Sebanyak  500 μl  larutan  monoklonal antibodi  TSH  beta  (E86214M)  dengan konsentrasi  (3  mg/ml)  yang  sudah  dilarutkan dengan  NaHCO 3 0,05M  pH  8,5  (Titer  1:450) dimasukkan  ke  dalam  masing-masing  tabung star NUNC dan diinkubasi selama 22 jam pada suhu kamar. Kemudian tabung  dibilas dengan NaHCO 3 0,05M pH 8,5 yang mengandung 0,1
%  BSA  ( Bovin  Serum  Albumin )  dan  Tween
0,05 % ( washing solution ). Kemudian ditambahkan ke dalam masing-masing tabung 1 ml NaHCO 3 0,05M pH 8,5 mengandung 3 % BSA ( Blocking solution )  dan diinkubasi selama 22  jam  pada  suhu  kamar.  Buang  cairan, kemudian  tabung  tersebut  dibilas  dengan NaHCO 3 0,05M  pH  8,5  +  0,1  %  BSA  ( Bovin Serum  Albumin )  +  Tween  0,05  %  ( washing solution ).  Tabung  dikeringkan  pada  suhu kamar,  setelah  itu  disimpan  pada  suhu  4 o C.
Tabung  bersalut  monoklonal  antibodi  TSH  ini disebut  tabung coated  tube (CT)  dan  siap digunakan untuk assay.
Setelah diperoleh komponen kit IRMA TSH  (perunut,  standard  dan coated  tube TSH)  yang  telah  didesain  menjadi  suatu  kit IRMA TSH, maka perlu dilakukan validasi kit tersebut,  sebelum  kit  tersebut  digunakan untuk suatu assay .
5.  Prosedur Assay kit IRMA TSH [12]
Ke  dalam  masing-masing  tabung coated  tube ( CT )  yang  sudah  diberi  nomor dimasukkan sebanyak  50 μl larutan standar TSH dengan konsentrasi (0,  2,5,  5,  10,  20
dan  40 μIU/mL).  Kemudian  ditambahkan sebanyak 50 μl larutan perunut TSH dengan aktifitas ± 100.000 cacahan per menit (CPM) dan 300 μl assay buffer (PBS 0,05 M pH 7,5 +  BSA  0,1  %)  kedalam  masing-masing tabung.  Tabung  dikocok  hingga  homogen dengan menggunakan vortek dan diinkubasi semalam  pada  suhu  kamar  dengan  meng- gunakan shaker dengan kecepatan 400 rpm.
Supernatan  dibuang  dengan  membalikkan tabung  di  atas  kertas  tisu  selama  5  menit. Masing-masing  tabung  diukur  dengan  alat pencacah gamma selama 1 menit.

## 6.  Penentuan Ketepatan ( Accuracy ) [14]
Suatu  ukuran  yang  menunjukkan perbedaan  antara  nilai  pengukuran  (hasil perhitungan)  dengan  nilai  yang  seharusnya. Ketepatan suatu kit ditentukan dari recovery . Penentuan recovery suatu  kit  dilakukan dengan cara menambahkan antigen dengan kadar  yang  sudah  diketahui  kedalam cuplikan, yang kemudian dianalisis dengan kit yang  akan  divalidasi.  Ketepatan  ( accuracy ) suatu kit yang dianggap baik adalah Recovery
=    90  % –  110  %,  dihitung  menggunakan rumus sebagai berikut :
Kons.diperoleh – Kons.awal Recovery = -----------------------------------     X100%  (1) Kons. ditambahkan
7.  Penentuan Ketelitian ( Precision ) [14]
Kualitas dari suatu kit  juga ditentukan dari  ketelitian  suatu  pengukuran  ( assay ).
Ketelitian  merupakan  aspek  metode  yang memberikan informasi batas ( limitasi ) pengujian klinis yang relevan, yang menentukan  derajat  kepercayaan.  Ketelitian dinyatakan  dalam  persen koefisien  variasi (%CV)  pengamatan  pada  pengulangan
pengujian pada sampel yang sama, umumnya  digunakan  pengulangan  sampel TSH yang sudah diketahui konsentrasinya.
Protokol  pengujian  diatas  digunakan untuk menentukan ketelitian dengan menam- bahkan  sampel  TSH  yang  sudah  diketahui konsentrasinya  (ng/mL)  pada  tabung  CT urutan  selanjutnya  (15,  16).  Pengujian dilakukan  minimal  6  kali  pengulangan  untuk penentuan  ketelitian intra  assay dan inter assay .    Ketelitian  ditentukan  oleh  persen koefisien variasi (%CV)  yang dihasilkan dari analisis, dengan rumus sebagai berikut:
SD % CV      =       -----------     X       100%         (2) X rata-rata
Keterangan.  CV =  Coeficient Variasi SD = Standar Deviasi.
8.  Penentuan  Kepekaan  /  Batas  Deteksi ( Sensitivitas ) [14]
Batas  deteksi  suatu  kit  ditunjukkan oleh konsentrasi minimum antigen yang tidak bertanda yang dapat dibedakan dari sampel yang tidak mengandung antigen. Perbedaan ini  berdasarkan  batas  deteksi    ±  2  Standar Deviasi  (SD)  dari  nilai  rata-rata  standar  0 dengan 10 kali pengulangan. Protokol pengujian diatas digunakan untuk menentukan batas  deteksi  dengan  penambahan  larutan standar TSH 0 ng/ mL pada tabung CT nomor urut selanjutnya sebanyak 10 kali (15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24). Kepekaan dihitung berdasarkan  nilai  ±  2  SD  dari  rata-rata  nilai larutan  standar  TSH  0  (nol)  dalam  satuan konsentrasi (ng/mL).
9. Penentuan Parameter Assay [14]
Parameter assay ditentukan  dengan melakukan pengujian sesuai protokol
pengujian  meliputi  nilai Non  Specific  Binding (%NSB), Maximum Binding (%B/T) dan daerah kerja (rentang kerja). Nilai Non Specific Binding (%NSB), Maximum Binding (%B/T). Penentuan nilai Non  Specific  Binding  (%NSB) dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Cacahan NSB - BG % NSB   =    ----------------------------  X 100%      (3) Cacahan Total – BG
Rumus  penentuan  nilai Maximum  Binding (%B/T) sebagai berikut :
Cacahan fasa terikat - BG % B/T  =   --------------------------------     X 100%  (4) Cacahan Total - BG
Keterangan.   BG = Background

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari  hasil  validasi  kit  IRMA  TSH diperoleh  nilai  ketepatan  ( accuracy )  dengan recovery =  93,6  %  -  108  %,    sehingga memenuhi persyaratan kit yang baik dengan recovery =    90  %  -  110  %,  seperti  yang ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Penentuan ketepatan ( accuracy )
No. Cuplik- an kadar awal (uIU/ml) kadar yang ditambah- kan (uIU/ml) Kadar diperoleh (uIU/ml) Recovery (%) 1 4,80 2,5 7,46 106,4 2 4,76 2,5 7,48 108,0 3 4,84 2,5 7,44 104,0 4 4,85 2,5 7,47 104,8 5 4,81 2,5 7,46 106,0 6 4,94 2,5 7,36 96,8 7 4,88 2,5 7,26 95,2 8 4,91 2,5 7,25 93,6 9 4,86 2,5 7,20 94,0 10 4,82 2,5 7,19 94,8
Pada  pengujian  ketelitian  kit  IRMA TSH intra  assay  (Within  Assay) dilakukan dengan 10  kali  pengulangan  dengan menggunakan    standar  konsentrasi  rendah (QC  Low),  standar  konsentrasi  sedang  (QC Medium)  dan  standar  dengan  konsentrasi tinggi  (QC  High)  yang  dilakukan  oleh  satu orang  operator.  Dari  hasil  pengujian intra assay diperoleh  nilai  %  CV  (QC  L)  sebesar 1,9848  %,    CV  (QC  M)  sebesar    3,6360  % dan  nilai  %  CV  (QC  H)  sebesar    2,2085  % seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2.  Nilai ini  memenuhi  persyaratan  kit  yang  baik dengan % CV < 10 % [14].
Tabel  2.  Hasil  perhitungan  konsentrasi  TSH untuk intra assay (Within Assay) Pengulangan (n=10) QC L (ng/mL ) QC M (ng/mL) QC H (ng/mL) 10 0,49 5,36 10,26 %CV 1,9848 3,6360 2,2085
Pada  pengujian inter  assay  (Between Assay) dilakukan dengan 10 kali pengulang- an  dengan  10  orang  operator  dengan menggunakan    standar  konsentrasi  rendah (QC  Low),  standar  konsentrasi  sedang  (QC Medium)  dan  standar  dengan  konsentrasi tinggi  (QC  High).  Dari  hasil  pengujian inter assay diperoleh  nilai  %  CV  (QC  L)  sebesar 11,0055  %  CV  (QC  M)  sebesar    5,6768  % dan  nilai  %  CV  (QC  H)  sebesar    5,4181  %
seperti  yang ditunjukkan pada Tabel 3. Nilai ini memenuhi persyaratan dengan % CV < 15 % [14].
Tabel  3.  Hasil  perhitungan  konsentrasi  TSH untuk inter assay (Between Assay) Pengulangan (n=10) QC L (ng/mL) QC M (ng/mL) QC H (ng/mL) 10 0,50 4,90 10,38 %CV 11,005 5,6768 5,4181
Pada  penelitian  ini  diperoleh  batas deteksi  (sensitivitas):  X  rata-rata  ±  2  SD sebesar    0,115  ±  0,02    seperti  terlihat  pada Tabel  4.  Setiap  kit  RIA  /  IRMA  mempunyai sensitivitas yang berbeda. Sensitivitas kit yang diinginkan tergantung dari pemakaiannya [14].
Tabel 4. Penentuan batas deteksi
Pengulangan ( n=10) Konsentrasi TSH ( ng/mL) 1 0,11 2 0,10 3 0.10 4 0,11 5 0,12 6 0,11 7 0,12 8 0,12 9 0,13 10 0,13 Nilai Xrata-rata ±  2 SD =   0,115   ±  0,02 1 0,50 5,25 10,00 2 0,50 5,74 10,78 3 0,51 5,74 10,27 4 0,51 5,54 10 , 26 5 0,48 5,36 10,08 6 0,50 5,25 10,00 7 0,51 5,74 10,27 8 0,50 5,36 10,26 9 0,51 5,54 10,08
1 0,51 4,80 10,12 2 0,47 5,54 10,80 3 0,55 4,70 9,85 4 0,40 5,20 10 , 22 5 0,47 5,12 10,65 6 0,55 5,20 9,39 7 0,40 5,41 10,78 8 0,51 4,71 9,25 9 0,52 5,02 10,56
Dari  hasil  pengujian  parameter  assay didapatkan nilai blangko (%NSB) sebesar 0,68 % dan ikatan maksimum (%B/T) sebesar 34,64 %. Nilai ini memenuhi persyaratan kit yang baik dengan nilai NSB < 2 % dan % B/T >10% [6,14] dengan kurva standar yang linear seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1. Kurva standar kit IRMA TSH.

## KESIMPULAN
Dari  hasil  validasi yang  dilakukan diperoleh  ketepatan  ( accuracy )  dengan  nilai recovery sebesar    93,6  % –  108,0  %, ketelitian intra  assay diperoleh  nilai  %  CV (QC  L)  =  1,9848,    %  CV  (QC  M)  =    3,6360 dan nilai % CV (QC H) =  2,2085 sedangkan ketelitian inter  assay diperoleh  nilai  %  CV (QC L) = 11,0055 %, % CV (QC M) =  5,6768 %    dan  nilai  %  CV  (QC  H)  =    5,4181  % dengan nilai batas deteksi sebesar 0,115 ng /mL  serta   nilai blanko (%NSB) = 0,68 % dan ikatan maksimum (%B/T) = 34,64 %. Validasi kit IRMA TSH tersebut menunjukkan kinerja assay yang baik.
Persyaratan Kit IRMA yang baik adalah nilai %CV ( intra assay ) dibawah 10 % dan %
CV ( inter assay ) dibawah  15 %  dengan  nilai ketepatan (accuracy )  sebesar  90%  -  110%
serta  menunjukkan  kinerja assay yang  baik dengan NSB ( Non Specific Binding ) dibawah 2 % dan ikatan maksimum (%B/T) diatas 10%.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih penulis ucapkan kepada staf  Bidang  Teknologi  Radioisotop  dalam penyediaan radioisotop Na 125 I sebagai bahan utama  pembuatan  perunut  TSH  (TSH- 125 I), staf Bidang Teknologi Radiofarmaka dan Tim KPTF  yang  memberi  masukan  untuk penelitian dan penulisan makalah ini.

## DAFTAR RUJUKAN
[1]  Hermita, “Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode  dan  Cara  Perhitungannya ,”
Departemen Farmasi FMIPA –UI, Majalah Ilmu  Kefarmasian ,  vol.  1,  no.  3,  pp.117- 135, Desember 2004.
[2]  U. Andreasson et al ., “A Practical Guide
t o  Immunoassay  Method  Validation,” Journal  Frontiers  in  Neurology ,  vol.
6:179, pp. 1-8, August 2015.
[3]  Riyanto, Validasi & Verifikasi Metode Uji Sesuai  dengan  ISO/IEC  17025 ,    Ed.1, Cet.1., Yogyakarta: Laboratorium Pengujian dan Kalibrasi, 2014.
[4]  I.  G.  Gandjar  and  A.  Rohman, Kimia Farmasi  Analisis ,  Yogyakarta:  Pustaka Pelajar, 2010, pp. 379 –391.
[5]  W. Riyadi, Validasi Metode Analisis , 24 Maret 2009.
[6]  P.  Widayati,  et  al., “Validasi  Kit Radioimmunoassay Aflatoksin B1 ,” Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka , vol. 18,
no. 1, pp. 21 –28, Oktober 2015.
[7]  A.  Purwanti,  Samat,  and  L.  Kusnadi., “Perubahan  Kadar  Hormon  Tiroid  pada Penderita  Sindroma  Nefrotik, ” Majalah Medis  Indonesia,  Fakultas  Kedokteran Universitas  Diponegoro ,  vol.  43,  no.  2,
2008.
0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,5 2,5 5 10 20 40 P ers en Ika ta n (% B /T ) Konsentrasi (ng/mL)
[8]  G.  A.  Brent, “Mechanism  of  Thyroid Hormone  Action, ” Journal  Clin  Invest ,  vol. 122, no. 9, pp. 3035-3043, September 2012.
[9]  M.  P.  Hage  and  S.  T.  Azar, “The  Link between Thyroid Function and Depression, ” Journal of Thyroid Research , vol. 2012, 2012.
[10]  J.  Bernal, Thyroid  Hormones  in  Brain Development  and  Function ,  Madrid  : Instituto  de  Investigaciones  Biomedicas,
Consejo  Superior  de  Investigaciones Científicas  (CSIC)  and  Universidad Autónoma de Madrid (UAM), and Center for  Biomedical  Research  In  Rare Diseases (CIBERER), 2015.
[11]  G. Mondrida et al ., “Pembuatan
Komponen Kit IRMA TSH Untuk  Deteksi Hormon  Tiroid, ” Prosiding  Pertemuan dan  Presentasi  Ilmiah  Penelitian  Dasar Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir 2014, ISSN: 0216-3128.
[12]  G.  Mondrida et  al ., “Optimasi  Assay  Kit IRMA TSH, ” Prosiding Seminar Nasional SDM  Teknologi  Nuklir.  STTN –BATAN ,
September 2015, ISSN: 1978-0176.
[13]  G.  Mondrida et  al., “Pembuatan dan Uji Kestabilan Kit IRMA TSH Produk Litbang
PTRR  2014, ” Prosiding  Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka, Siklotron dan Kedokteran Nuklir , Oktober 2015, ISSN: 2087 – 9652.
[14]  W.  Rediatning, Dasar-Dasar  RIA  dan IRMA. Badan  Tenaga  Atom  Nasional, 1993.