## ISOLASI, AMPLIFIKASI DAN SEKUENSING FRAGMEN 1,9 KILOBASA GEN HEAT SHOCK PROTEIN 70 SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHI
Muktiningsih * , Fera Kurniadewi, Imanuelle Orchidea R.P
Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Science, Universitas Negeri Jakarta Jl. Pemuda No. 10, Rawamangun 13220, Jakarta, Indonesia
* Keperluan korespondensi: muktiningsih@unj.ac.id

## ABSTRAK
Salmonella enterica serovar Typhi merupakan penyebab demam tifoid atau penyakit tifus pada  manusia.  Mekanisme  molekuler  patogenesitas Salmonella merupakan  sistem  yang kompleks  dan  diatur  oleh  sejumlah  gen  dan  faktor-faktor  virulen.  Salah  satu  gen  tersebut adalah  dnaK  yang  mengatur  sintesis Heat  Shock  Protein 70  (HSP70).  Penelitian  ini  bertujuan untuk  memperoleh  gen  HSP70  yang  berukuran  1,9  kilobasa  dari  bakteri Salmonella  enterica serovar Typhi. Gen tersebut dapat digunakan untuk pengembangan vaksin tifus maupun diteliti lebih lanjut untuk mengungkap fungsi lainnya. Gen HSP70 berhasil diamplifikasi dari genom S. Typhi dengan reaksi polimerisasi DNA (PCR) menggunakan pasangan primer spesifik HSP70. Hasil  elektroforesis  menunjukkan  bahwa  produk  amplifikasi  tersebut  berukuran  1900  pasang basa.Produk  PCR  dimurnikan  sebelum  urutan  nukleotidanya  ditentukan  melalui  sekuensing. Analisis  hasil  sekuensing  menunjukkan  produk  PCR  tersebut  memiliki  homologi  sebesar  99% dengan  dnaK  (gen  HSP70) S.enterica serovar  Typhi  strain  CT18  yang  terdapat  pada gene database NCBI.
Kata Kunci : Salmonella enterica serovar Typhi, PCR, dnaK, HSP 70,sekuensing

## ABSTRACT
Salmonella  enterica serovar  Typhi  is  the  main  agent  causing  typhoid  fever  on  human. Molecular pathogenicity mechanism of Salmonella is a highly complex system and regulated by a number of genes and virulen factors. One of these genes is dnaK which control the synthesis of  Heat  Shock  Protein  70  (HSP70).  The  aim  of  this  study  is  to  obtain  1,9  kilobases  length  of HSP70  gene  from Salmonella  enterica serovar  Typhi.  The  gene  could  serve  as  an  alternative antigen  for  typhoid  vaccine  development  either  used  in  further  study  to  reveal  other  roles  and mechanism  of  actions.  HSP70  gene  had  been  successfully  amplified  from S .Typhi’s  genome using Polymerase Chain Reaction with specific primer pair of HSP70. Electrophoresis result has been  shown    that  amplicon  product  was 1900  base  pairs  in  length.  PCR  product  had  been purified  before  sequencing  process  done.  Sequencing  result  analysis  shown  that  the  PCR product has approximately 99% homologous with dnaK S. enterica serovar Typhi strain CT18 in NCBI gene database.
Keywords : Salmonella enterica serovar Typhi, PCR, dnaK, HSP70, sequencing.

## PENDAHULUAN
Demam  tifoid,  atau  yang  lebih populer  dengan  sebutan  penyakit  tifus
adalah  suatu  infeksi  akut  pada  usus  yang disebabkan oleh bakteri Salmonella enterica serovar  Typhi. Demam  tifoid  merupakan problem kesehatan masya-rakat yang umum
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK) , Vol.1, No.1, April 2016 Program Studi Pendidikan Kimia  Universitas Sebelas Maret http://jurnal.fkip.uns.ac.id/index.php/ jkpk halaman 32 - 4 0
ISSN 2503-4146 ISSN 2503-4154 (online)
Received: January 6, 2016                                 Accepted: April 5, 2016                          Online Published: April 28, 2016
terjadi  di  negara-negara  berkembang  di benua Afrika dan Asia, termasuk
Indonesia.Hal
ini disebabkan oleh kurangnya kesadaran masyarakat di negara- negara  berkembang  terhadap  pentingnya kebersihan dalam pengolahan makanan dan minuman  yang  dikon-sumsinya. Selain  itu, buruknya  sanitasi  dan  kurang  memadainya sarana  air  bersih  di  negara  berkembang turut menjadi salah satu penyebab penyebaran demam tifoid [1].
Secara global  insidensi  demam  tifoid mencapai  27  juta  kasus  setiap  tahun [1]. Penyakit  ini  memiliki  tingkat  morbiditas  dan mortalitas  yang  signifikan  setiap  tahunnya, yaitu  sebanyak  90  juta  orang  secara  global [12]. Pada  tahun  2002  insidensi  demam tifoid  di  Indonesia  sebanyak  148-200  kasus per  100.000  penduduk  [11]. Sementara pada tahun 2007,jumlah kasus demam tifoid bertambah  menjadi  358-810  kasus  per 100.000  penduduk  [7]. Fakta  tersebut menunjukkan  bahwa  insidensi  demam  tifoid di  Indonesia  cenderung  meningkat  setiap tahun.
Selain  itu,  berkembangnya  resis-tensi bakteri  dari  genus Salmonella terhadap
beberapa
jenis
antibiotika seperti
fluorokuinolon, trimethoprim-sulfame- thoxazole (TMP-SMZ),  ampisilin,  maupun kelas  antibiotika  spektrum  luas  seperti sefalosporin  misalnya ceftriaxone ,  atau cefixime [5]. Hal ini menyebabkan peneliti di seluruh  dunia  berusaha  menemukan  cara baru  untuk  menanggulangi  demam  tifoid; antara  lain  dengan  cara  mempelajari mekanisme  patogenesis,  jenis-jenis  antigen dan faktor virulen bakteri S. Typhi [2,5,6,9,11,16,17,18,20], memetakan genom S .  Typhi  [3], menemukan  alat  deteksi
demam  tifoid  [7],  dan  membuat  vaksin demam tifoid [15].
Infeksi oleh bakteri Salmonella enterica serovar Typhi  terjadi  melalui  jalur oral.Yaitu  melalui  makanan/ minuman  yang terkontaminasi  bakteri Salmonella  enterica serovar Typhi.  Bakteri  yang  menempel  di makanan/ minuman masuk ke mulut, melalui saluran  pencernaan,  menembus  dinding usus halus, masuk ke sistem limpa, beredar lewat  aliran  darah,  dapat  menyerang  liver, kantung  empedu,  limpa,  ginjal  dan  sumsum tulang [16].
Bakteri S. Typhi  mampu  bertahan dalam  sel-sel  fagosit,  tinggal  di  dalamnya, memperbanyak  diri  dan  menyebar  dalam aliran  darah. Hal  tersebut  dimungkinkan oleh  mekanisme  pertahanan  bakteri  yang melibatkan  sekelompok Heat  Shock  Protein (HSP),  yaitu  gabungan  DnaK  dan  DnaJ. Terdapat beragam jenis HSP, salah satunya adalah
HSP70.
HSP70 merupakan golongan  protein  stres  yang  berperan sebagai  pemandu  ( chaperone )  molekul dalam sel. Protein ini berfungsi menstabilkan  dan  melindungi  polipeptida- polipeptida  yang  terlipat  sebagian  atau terdenaturasi  dalam  sel  sebagai  akibat  dari stres  yang  disebabkan  proses  fagositosis oleh  makrofag  [20].  DnaK  (HSP70)  sendiri juga dilaporkan mampu mengaktivasi ekspresi  gen-gen  flagela  melalui  modulator kompleks  protein  natif  yang  terdiri  dari  FlhD dan  FlhC.  Sintesis  HSP70  suatu  organisme diatur oleh dnaK, yaitu gen HSP70 [18]. Gen HSP70  merupakan  salah  satu  regulator dalam tahap awal patogenesis dan mengatur  pertahanan  bakteri Salmonella enterica serovarTyphi terhadap sel-sel fagosit [20]. Oleh karena itu, HSP
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK) , Vol. 1, No. 1, April 2016, hal. 32 - 40 33
merupakan  kelompok  protein  yang  dapat digunakan  sebagai  kandidat  vaksin,  karena dapat berfungsi sebagai antigen  yang dapat menimbulkan respon imun, sekaligus sebagai  ajuvan  yang  dapat  meningkatkan kekebalan  sel  terhadap  antigen  peptida spesifik [13,15].
Secara umum, penelitian ini bertujuan untuk  memperoleh  gen  HSP70  (dnaK) berukuran 1,9 kilobasa dari bakteri Salmonella  enterica serovar Typhi.  Suatu gen  dapat  diperoleh  dengan  memper- banyaknya  dari  hasil  isolasi  DNA  genom melalui  reaksi  yang  disebut Polymerase Chain Reaction [14].
Penelitian  ini  merupakan  studi  awal terhadap  gen Heat  Shock  Protein (HSP). Penelitian  ini  penting  dilakukan  untuk memperoleh gen HSP70
Salmonella enterica serovar Typhi  untuk  diteliti  lebih lanjut  dalam  rangka  pengembangan  vaksin tifus  berbasis Heat  Shock  Protein, ataupun untuk  mengungkap  fungsi  lainnya  dalam patogenesis demam tifoid.
.

## METODE PENELITIAN
1. Pembiakkan Bakteri S. Typhi
Kultur  bakteri S. Typh i ditumbuh-kan dalam  medium Salmonella-Shigella  Agar
pada  37 o C  selama  18-24  jam. Kemudian koloni  murni S.Typhi hasil  biakan  diambil dengan  jarum  ose  steril  dan  diinokulasi  ke dalam medium cair Luria Bertani Broth steril.
Biakan bakteri dalam medium cair diinkubasi selama  18-24  jam  dengan  bantuan orbital shaker .
2. Isolasi Genom Bakteri S .Typhi
Suspensi  bakteri S.Typhi sebanyak 1,5 ml disentrifugasi pada  13000g selama 2 menit.    Pellet  sel  bakteri dilisis  dengan
Nuclei Lysis Solution (Promega) dan diinkubasi  pada  80 o C  selama  5  menit.
Selanjutnya RNAse (Promega) ditambahkan ke  dalam  campuran  lisat  bakteri,  lalu diinkubasi  selama  30  menit  pada  37 o C. Setelah inkubasi selesai, ke dalam campuran  tersebut ditambahkan  200  µl Protein  Precipitation  Solution (Promega).
Campuran  divorteks  dan  diinkubasi  dalam es  selama  5  menit  sebelum  disentrifugasi kembali pada 13000g.
Supernatan hasil sentrifugasi di-ambil. lalu  ditambahkan  isopropanol.  Pellet  DNA dipisahkan dengan sentrifugasi pada 13000g  selama  2  menit.  Pellet  DNA  dicuci dengan  etanol  70%.  Setelah  itu  disentri- fugasi  kembali  pada  13000g. Sentrifugat dilarutkan  dalam DNA  Rehydration  Solution
(Promega) sebanyak 100 µl.
Isolat  genom S. Typh i dikarakterisasi dengan  elektroforesis  agarosa  2%  yang diberi  tambahan  pewarna  etidium  bromida 0,05%. Elektroforesis dilakukan selama satu jam pada tegangan 80 V.

## 3. Amplifikasi Gen HSP70 S. Typhi
Amplifikasi  gen  HSP70 S. Typhi telah dilakukan melalui reaksi berantai polimerase
(PCR),  menggunakan  pasangan  primer spesifik HSP70 Forward (5’- ggatccggtaaaattattggtatcgac-3’)  dan  HSP70 Reverse (5’-aagcttttatcttttacttcttcaaactc-3’)
(Tabel 1) dalam campuran reaksi PCR yang mengandung  master  mix (dNTP,  Enzym DNA  Polymerase,  buffer  enzim), pasangan
primer HSP70,  DNA Genom  S. Typhi,  dan
Nuclease Free Water . PCR dilakukan terhadap  larutan sampel, kontrol positif (K+)
dan  kontrol  negatif  (K-)  (Tabel  2). Hasil amplifikasi gen HSP70 dikarakterisasi dengan  elektroforesis  gel  agarosa  1,5% dengan tambahan pewarna etidium bromida 0,05%. Elektroforesis dilakukan selama satu jam pada tegangan 80 V.

## Tabel 1. Data Pasangan Primer HSP70
DATA HSP70 Forward HSP70 Reverse OD 7,4 8,2 MW 8338,4 10881,2 T o m 65,3 o C 65,3 o C Nmol 23,9 22 GC% 40,7 22,2

## Tabel 2. Formulasi Campuran PCR
K (+) Tabung Sampel K (-) Master mix 12,5 µL Master mix 12,5 µL - Primer F – HSP70 1 µL Primer F - HSP70 1 µL - Primer R –HSP70 1 µL Primer R - HSP70 1 µL - Stock Genom S. Typhi, 1 µL DNA Template 1 µL - Nuclease Free Water 9,5 µL Nuclease Free Water 9,5 µL Nuclease Free Water 25 µL Hasil amplifikasi gen HSP70
dimurnikan  dengan  teknik spin  column sebelum  dikirim  ke  Macrogen,  Inc.  Korea Selatan  untuk  disekuensing.  Konsentrasi minimum  DNA  yang  diperlukan  untuk sekuensing  sebanyak  200ng/µl  dengan volum minimal 30µl.
4. Sekuensing Gen HSP70 S. Typhi
Amplikon  gen  HSP70  hasil  purifikasi dikirim  ke  Macrogen,  Inc.  Korea  Selatan untuk  disekuensing dengan  cara  disaring dengan penyaring buchner.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Pembiakkan Bakteri S. Typhi
Bakteri S. Typhi telah berhasil
dibiakkan  dalam  medium  padat Salmonella- Shigella  Agar (SSA) (Gambar 1).  Koloni bakteri  yang  berwarna  hitam  menandakan bahwa  bakteri  tersebut  positif  berasal  dari genus
Salmonella , dan bebas dari kontaminasi  bakteri  lain.  Medium  SSA adalah medium spesifik yang biasa digunakan  untuk  mendeteksi  kontaminasi bakteri dari genus Salmonella pada makanan [4]. Komponen utama Salmonella-
Shigella Agar yang berperan dalam selektivitasnya  adalah  laktosa,  pepton, garam empedu, besi (III) sitrat, dan indikator neutral red. Garam empedu selektif terhadap  bakteri  gram  negatif,  dengan  kata lain,  bakteri  gram  positif  tak  dapat  tumbuh dalam  medium  ini. Komponen  lainnya berfungsi  untuk  diferensiasi  antara  genus bakteri gram-negatif yang satu dengan yang lainnya.
Prinsip  diferensiasi  jenis-jenis  bakteri tersebut didasarkan perbedaan kemampuan metabolisme  bakteri.  Bakteri  dari  genus Salmonella tidak  memfermentasi laktosa, namun  menghasilkan  H 2 S  dan  enzim tiosulfat reduktase
sehingga akan membentuk  koloni  berwarna  hitam.  Koloni bakteri dari genus Shigella tidak memfermentasi laktosa dan tidak
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK) , Vol. 1, No. 1, April 2016, hal. 32 - 40 35
menghasilkan  H 2 S  maupun  enzim  tiosulfat reduktase  sehingga  akan  tumbuh  sebagai koloni  berwarna  putih,  atau  tidak  berwarna. Bakteri  koliform Escherichia  coli juga  dapat tumbuh  pada  medium  SSA  dengan  koloni berwarna  merah  muda  karena  kemam- puannya  memfermentasi  laktosa,  namun tidak  menghasilkan  H 2 S  sehingga tidak membentuk endapan hitam [4, 5].
Gambar 1. Biakan Bakteri S. Typhi pada SS Agar.
Warna  medium  SSA  yang  semula merah berubah menjadi kuning . Hal tersebut menunjukkan  adanya  perubahan  pH  pada medium. Bakteri  dari  genus Salmonella menggunakan pepton sebagai sumber energi  karena  tidak  dapat  memfermentasi laktosa. Hasil sampingan metabolisme tersebut  adalah  amonia,  yang  menaikkan pH  medium  SSA  [10]. Reaksi  kimia  yang terjadi  pada  pembiakan  bakteri S. Typhi adalah  reduksi  natrium  tiosulfat  di  dalam SSA  oleh  enzim  tiosulfat  reduktase  menjadi sulfit  [4]. H 2 S  yang  dihasilkan  sebagai metabolit  bersama  ion  S 2- dalam  sulfit bereaksi  dengan  besi  (III)  sitrat membentuk endapan hitam besi (II) sulfida [19].
Bakteri S. Typhi  perlu  dibiakkan  dalam medium selektif seperti SSA untuk memastikan kemurnian koloni S. Typhi yang akan  diinokulasi  dalam  medium  cair Luria Bertani  Broth (Gambar  2). Medium  non selektif  harus  disterilisasi  dengan  baik, namun kemungkinan kontaminasi mikroorganisme  lain  masih  ada.  Medium SSA  tidak  perlu  disterilisasi,  karena  telah mengandung  inhibitor  mikroorganisme  lain, selain  bakteri Salmonella , Shigella , dan Escherichia .

## Gambar 2. Biakan S. Typhi dalam Luria
Bertani Broth.
2. Isolasi Genom Bakteri S .Typhi
Isolasi  genom  bakteri  Salmonella enterica serovar Typhi telah berhasil dilakukan menggunakan Wizard ® Genomic DNA  Purification  Kit dari  Promega.Prinsip isolasi  DNA  pada  dasarnya  terdiri  dari empat  tahap  utama;  (1)  Lisis  sel  untuk mengeluarkan  materi  genetik,  dapat  berupa DNA dan RNA. (2) Mengeliminasi RNA, dan protein pengikat dengan penambahan enzim dan  reagen  pendenaturasi  protein.  (3) Pengendapan debris protein dengan sentrifugasi agar larutan DNA dapat dipisahkan dengan mudah. (4)
pengendapan  DNA  dengan isopropanol, sentrifugasi  untuk  memisahkan  presipitat DNAdan  dilanjutkan  pencucian  dengan etanol 70% untuk memperoleh hasil ekstraksi DNA dengan kemurnian yang baik.

## Gambar  3. Hasil  Elektroforesis  DNA Genom S. Typhi
Hasil  elektroforesis  agarosa  me- nunjukkan pita DNA genom S. Typhi berupa pita  ganda,  yang  berarti  DNA  genom  yang diisolasi  berbentuk  sirkular (Gambar  3). Selain  itu,  letak  pita  DNA  yang  jauh  di  atas pita  marker  DNA  1500  bp  menandakan bahwa  ukuran  DNA  yang  diisolasi  sangat besar. Semakin besar ukuran molekul suatu DNA, semakin lambat migrasinya sepanjang agarosa  dalam  proses  elektroforesis.  Hasil elektroforesis  genom  S.  Typhi  sesuai dengan  referensi,  yang  menyatakan  bahwa genom S. Typhi  berbentuk  sirkular  dengan ukuran 4,8 megabasa [3].
Kemurnian  dan  konsentrasi  DNA hasil  isolasi  genom S. Typhi  diukur  dengan spektrofotometer nanodrop. Konsentrasi
DNA  genom  yang  telah  diisolasi  sebesar 346,23ng/µl  dalam  tabung  1  dan  157,64 ng/µl  dalam  tabung  2.  Pita  ganda  DNA menyerap  spektrum  UV  pada  panjang gelombang 260 nm. Sementara konta-minan protein  dan  fenol  menyerap  spektrum  UV pada  panjang  gelombang  280  nm. Dengan demikian,  kemurnian  DNA  dapat  diukur dengan  menghitung  rasil  nilai  absorbansi pada  panjang  gelombang  260  nm  dan  280 nm.
3. Amplifikasi  dan  Purifikasi  Gen  HSP70
S. Typhi. Gen  HSP70 S. Typhi  telah  berhasil diamplifikasi dengan pasangan primer HSP70 Forward (5’-ggatccggtaaaat tattggtatcgac-3’)  dan  HSP70 Reverse (5’- aagcttttatcttttacttcttcaaactc-3’). Pasangan primer HSP70 tersebut dirancang  untuk menghasilkan produk amplifikasi yang mengandung  situs  restriksi Bam HI  (ggatcc) dan Hind III  (aagtcc)  pada  ujung  5’  dan 3’ secara berturut-turut. Kondisi optimum untuk amplifikasi  gen  HSP70 S. Typhi  antara  lain, pra-denaturasi  selama  5  menit  pada  95 o C sebanyak  satu  siklus,  dilanjutkan  dengan denaturasi  pada  95 o C  selama  30  detik, tahap annealing primer  pada  47,4 o C,  dan ekstensi pada 72 o C selama 2 menit masing- masing  tiga  puluh  siklus.  Selanjutnya  tahap ekstensi  akhir  untuk  menyempurnakan amplifikasi  DNA,  72 o C  selama  5  menit sebanyak satu siklus dan  pendinginan pada 12 o C  selama  5  menit  sebanyak  satu  siklus.
Nilai  %GC  dalam  primer  F  dan  R  berturut- turut  sebesar  40,7  dan  22,2,  menyebabkan rendahnya suhu annealing optimum.
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK) , Vol. 1, No. 1, April 2016, hal. 32 - 40 37
Amplikon  gen  HSP70 S. Typhi  telah dikarakterisasi  dengan  elektroforesis  gel agarosa  1,5%  pada  tegangan  80  V  selama satu  jam.  Hasil  analisa gel  documentation system setelah  elektroforesis  menunjukkan bahwa  amplikon  Gen  HSP70  berukuran  1,9 kilobasa (Gambar 4).
Gambar 4. Hasil Elektroforesis Produk PCR. Lane :  (1)  K+  ;(2-5)  Produk  PCR  gen HSP 70 ; (6) K-
Hasil  amplifikasi  DNA  tersebut  masih  belum bebas  dari  pengotor,  yaitu  sisa-sisa  primer maupun  dNTP  yang  ditandai  dengan  pita- pita  DNA  di  bawah  marker  DNA  250  bp. Pita-pita  berukuran  1900  bp  tersebut kemudian  dipotong  dengan  pisau cutter yang  telah  disterilkan  dalam UV  sterilizer ,
lalu  ditimbang.  Potongan  gel  tersebut digunakan  untuk  proses  purifikasi  DNA menggunakan  metode  ekstraksi  gel  dengan spin  column. Konsentrasi  amplikon  gen HSP70 S. Typhi  hasil  purifikasi  yang memenuhi  syarat  sekuensing  sebesar  200 ng/µl (Gambar 5).
Gambar  5. Hasil Elektroforesis  Produk PCR  Setelah  Purifikasi. Diperoleh ukuran pita dan massa DNA  sebagai berikut  :  (1)  DNA Marker 1000bp  (2)
14  ng  (3)  9  ng  (4)  138  ng  (5)  113  ng
(6) 200 ng (7) 187 ng.

## 4. Sekuensing Gen HSP70 S. Typhi
Amplikon  gen  HSP70 S .Typhi  telah melewati  tahap  sekuensing  di  Macrogen, Inc.  Korea  Selatan (Gambar  6).  Hasil analisis  BLAST  menunjukkan  bahwa  urutan nukleotida  hasil  amplifikasi  gen  HSP70 tersebut 99% identik dengan urutan nukleotida  gen  HSP70 Salmonella  enterica serovar Typhi dalam GeneBank NCBI.

## KESIMPULAN
Penelitian  ini  telah  berhasil;  (1) mengisolasi  genom  dari  kultur  bakteri Salmonella enterica
serovar Typhi(2)
mengamplifikasi  gen  HSP70 S. Typhi berukuran  1,9  kilobasa  (3)  memperoleh urutan  nukleotida  hasil  amplifikasi  gen HSP70 S. Typhidengan  sekuensing primer
walking dengan  homologi  terhadap  gen database NCBI sebesar 99%.
Gambar  6. Hasil  Sekuensing  Gen  HSP70 (dnaK) S. Typhi

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  menyampaikan  terimakasih kepada Jurusan Kimia  PMIPA,  Universitas Negeri  Jakarta  yang  telah  memfasilitasi peralatan dalam penelitian ini.

## DAFTAR RUJUKAN
[1] Crump,  John.  A  and  Eric  D.  Mintz. 2010. Clinical  Infectious  Diseases 2010, 50, 241-6.
[2] De  Jong,  HK, et.al .  2012.. PLoS Pathog 8(10): e1002933.
[3] Deng, W., Liou, S. R., Plunkett, G. III, Mayhew,  G.  F.,  Rose,  D.  J.,  Burland, V.,  Kodoyianni,  V.,  Schwartz,  D.  C., and  Blattner,  F.  R.  2003. J.  Bacteriol. 2003 , 185(7), 2330-2337.
[4] Downes,  F.  P.  dan  Ito  K.  2001. Compendium  of  Methods  for  The Microbiological Examination of Foods,
4 th Ed., APHA, Washingtion, D.C.
[5] Fabrega,  Anna  dan  Jordi  Vila, 2013, Clinical Microbiology Reviews . Vol. 26 No. 2. p.308-341.
[6] Grimont  PAD,  Weill  FX., 2007, Antigenic  formulae  of  the Salmonella serovars,  9th revision, World  Health Organization  Collaborating  Center for Reference and Research on Salmonella,  Pasteur  Institute,  Paris,
Perancis.
[7] Grimont  PAD,  Weill  FX., 2007, Antigenic  formulae  of  the Salmonella serovars,  9th  revision, World  Health Organization  Collaborating  Center for Reference and Research on
Salmonella,  Pasteur  Institute,  Paris, Perancis.
[8] Heymann,  DL.  Ed., 2008, Control  of
Communicable Diseases Manual (19 th Edition). American  Public  Health
Association, 978-0-87553-189-2, Washington, D.C.
[9] Kaufmann,  S.  H.  E., 1990, Immunol. Today, 11,129–136.
[10] Lehman,  Donald., 2013, Triple  Sugar Iron Agar Protocols. ASM.
[11 Leon,  R.  O.,  2008 , Bulletin  of  The World  Health  Organization.  86, 4, 241-320.
[12] Majowicz, S. E., 2010, Clin.Infect Dis , 50, 882-889.
GGTAAAATTATTGGTATCGACCTGGGTCTCCANCTCTT GTGTAGCGATTATGGATGGAACGCAGGCACGCGTGCTG GAGAACGCCGAGGGCGATCGCACTACGCCTTCTATCAT TGCTTATACCCAGGATGGTGAAACTCTGGTTGGTCAGC CGGCTAAACGTCAGGCAGTGACAAACCCGCAAAACACC CTGTTTGCGATTAAACGCCTGATTGGCCGCCGCTTCCA GGACGAAGAAGTTCAACGTGACGTTTCTATCATGCCGT ACAAAATCATCGGCGCCGACAACGGCGACGCATGGCTT GATGTGAAAGGTCAGAAAATGGCGCCGCCGCAGATTTC TGCCGAAGTGCTGAAGAAAATGAAGAAAACGGCTGAAG ATTATCTGGGCGAACCGGTAACTGAAGCGGTTATCACC GTACCGGCTTACTTTAACGATGCGCAGCGTCAGGCAAC CAAAGATGCTGGTCGTATCGCGGGGCTGGAAGTTAAAC GTATCATCAACGAACCGACTGCCGCAGCGCTGGCTTAC GGTCTGGATAAAGAAGTCGGCAACCGTACTATCGCGGT TTACGACCTCGGTGGTGGTACTTTCGATATCTCTATTA TCGAAATCGACGAAGTTGATGGCGAAAAAACCTTTGAA GTTCTGGCAACCAACGGTGATACCCACCTGGGTTGGTG AAGACTTCGATACCCGCCTGATCAACTACCTCGTTGAC GAGTTTAAGAAAGATCAGGGCATTGACCTGCGTAACGA TCCGCTGGCCATGCAGCGCCTGAAAGAAGCCGCAGAAA AAGCCAAAATCGAACTGTCTTCTGCGCAACAAAACCTA CCTGGAACCTGCCGTACATTAACCGCAAATGCCACCTG TTCCCAAACCCATTGAACATCCAAATTGACCCGTGCGA AACTGGAAAGCCTGGTTGAAGATCTGGTGAACCGTTCT ATCGAGCCGCTGAAAGTCGCACTGCAGGACGCTGGCCT GTCCGTGTCTGATATCAACGACGTGATCCTCGTCGGCG GTCAGACCCGTATGCCAATGGTGCAGAAAAAAGTGGCT GAGTTCTTCGGTAAAGAGCCGCGTAAAGACGTTAACCC GGACGAAGCTGTGGCTATCGGCGCAGCGGTACAGGGCG GCGTATTGACCGGTGATGTGAAAGACGTACTGCTGCTG GACGTTACCCCGCTGTCTCTGGGTATCGAAACGATGGG TGGCGTGATGACTCCGCTTATCACCAAAAACACCACCA TCCCGACCAAGCACAGCCAGGTGTTATGTACTGTGGAA GACAACCTGTTTGCGGTAACCATCCATGTGCTGCAGGG TGAGCGTAAACGTGCGTCTGATAACAAATCTCTGGGTC AGTTCAACCTGGATGGCATCAACCCGGCGCCGCGCGGT ATGCCGCAGATCGAAGTCACCTTCGATATCGATGCTGA CGGTATCCTGCACGTCTCCGCGAAAGATAAAAATAGCG GTAAAGAGCAGAAGATCACTATCAAGGCGTCTTCTGGT CTGAACGAGGAAGAAATTCAGAAAATGGTTCGCGATGC AGAAGCGAACGCTGAATCCGACCGTAAGTTCGAAGAGC TGGTTCAGACCCGTAACCAGGGTGACCATCTGCTGCAC AGCACCCGTAAGCAGGTTGAAGAAGCAGGCGATAAACT GCCGGCTGATGACAAAACCGCTATCGAGTCTGCGCTGA GCGCGCTGGAAACTGCCCTGAAAGGGGAAGATAAAGCC GCTATCGAAGCGAAAATGCAGGAGCTGGCGCAGGTTTC CCAGAAACTGATGGAAATCGCTCAGCAGCAACATGCGC AGCAGCAGGCTGGCTCCGCCGACGCTTCTGCAAACAAT GCGAAAGATGACGACGTTGTCGACGCTGAGTTTGAAGA AGTAAAAGATAAAAGCTT
JURNAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA (JKPK) , Vol. 1, No. 1, April 2016, hal. 32 - 40 39
[13] McNulty,  S., 2013, Rev.Immunology , 139, 407-415.
[14] McPherson,  M.J.  and  Møller, S., 2006, PCR 2 nd Edition.  Taylor  & Francis Group, New York
[15] Paliwal,  P.K., 2011, Vaccine, 29, 6532-6539.
[16] Takaya, A., Tomoyasu, T., Matsui, H., Yamamoto,  T., 2004, Infection  and Immunity , 72, 3,1364-1373.
[17] Takaya, A,  Kubota, Y,  Isogai, E, Yamamoto, T., 2005, Mol.  Microbiol., 55, 839–852.
[18] Takaya, A.,  Matsui  M.,  Tomoyasu  T ., Mol. Microbiol ., 59, 1327–1340.
[19] Vogel,  A.  I.  dan  G.  Svehla,  1996. Vogel’s  Qualitative  Inorganic  Analysis 7 th ed. Prentice Hall, Inc. New Jersey,
USA.
[20] Yamamoto, T., Sashinami, H., Takaya, A., Tomoyasu, T., Matsui, H.,
Kikuchi, Y.,  Hanawa  T.,  Kamiya  S. and Nakane, A., 2001, Infect  Immun,
69, 3164–3174.
.