## Produksi β-Glukosidase Aspergillus niger Bio 2173 dengan Fermentasi Padat menggunakan Substrat Dedak
Sri Sugiwati a,b , Maggy Thenawidjaja Suhartono a *, Muhammad Hanafi b , Hanifah Nuryani Lioe a a Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor, Indonesia
b Pusat Penelitian Kimia, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Kawasan Puspiptek Serpong, Tangerang, Indonesia
Diterima : 07 Maret 2018, Revisi akhir : 03 Mei 2018, Disetujui terbit : 07 Mei 2018
Production of β-Glucosidas e Aspergillus niger Bio 2173 on Solid State Fermentation using Rice Bran as Substrate

## Abstract
β-Glucosidase (EC 3.2.1.21) is a part of the cellulase enzyme complex which acts synergistically with exoglucanase and endoglucanase to hydrolize cellulose into glucose. The purpose of this study was to obtain the maximum fermentation conditions for production of β-glucosidase Aspergillus niger BIO 2173 with solid state fermentation using rice bran as fermentation substrate. The factors that affect the production of β-glucosidase  which consist of initial pH of the fermentation medium, incubation period, ratio of water content to fermentation substrate, incubation temperature and addition of the Mandel ’ s mineral  salts  solution  were  examined  in  the  study.  The  results  showed  that  maximum  fermentation conditions for β-glucosidase production were at initial of fermentation pH of 2,0, incubation period of 7 days, ratio of water content to substrate of 1:1, and incubation temperature of 32 o C. Addition of Mandel’s mineral salts solution to the fermentation substrate at maximum fermentation conditions increased the activity and spesific activity of β-glucosidase crude extract up to 5,24 ± 0,57 U / mL and 2,46 ± 0,04 U / mg respectively.
Keywords: β-glucosidase, Aspergillus niger, rice bran, solid state fermentation, crude extract

## Abstrak
β-Glukosidase ( EC 3.2.1.21) merupakan bagian dari enzim multi kompleks selulase, yang bekerja secara sinergis dengan eksoglukanase dan endoglukanase menghidrolisis selulosa menjadi glukosa. Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan kondisi fermentasi maksimum untuk produksi β-glukosidase Aspergillus niger BIO 2173 dengan fermentasi media padat menggunakan substrat dedak. Pengujian dilakukan terhadap faktor-faktor yang mempengaruhi produksi β-glukosidase, yaitu pH awal medium fermentasi, waktu inkubasi, perbandingan kandungan air terhadap substrat medium fermentasi, suhu inkubasi  dan  penambahan  larutan  garam  mineral  Mandels.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa kondisi fermentasi maksimum untuk produksi β-glukosidase adalah pada pH awal medium fermentasi 2,0, waktu inkubasi 7 hari, perbandingan kandungan air terhadap substrat medium fermentasi 1:1, dan suhu inkubasi 32 o C. Penambahan larutan garam mineral Mandels ke dalam substrat fermentasi pada kondisi fermentasi maksimum menyebabkan peningkatan aktivitas dan aktivitas spesifik ekstrak kasar β-glukosidase masing-masing sebesar 5,24 ± 0,57 U/mL dan 2,46 ± 0,04 U/mg protein .
Kata kunci: β-glukosidase, Aspergillus niger , dedak padi, fermentasi padat, ekstrak kasar
Jurnal Selulosa Vol. 8 No. 1 Juni 2018 Hal. 33 - 42

## JURNAL SELULOSA
e-ISSN: 2527 - 6662 p-ISSN: 2088 - 7000
( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ ) DOI: http://dx.doi.org/10.25269/jsel.v8i01.221

## Pendahuluan
β-Glukosidase (β-D-glu kosida glukohidrolase, EC 3.2.1.21) merupakan bagian dari enzim multi kompleks selulase. β-Glukosidase memiliki banyak manfaat potensial untuk digunakan pada berbagai proses bioteknologi seperti pelepasan rasa ( flavor ), aroma, aglikon isoflavon dan untuk sintesis oligosakarida dan alkil glikosida. Pada produksi bioetanol dari biomassa lignoselulosa, β-glukosidase  berperan  dalam  menghidrolisis selobiosa yang merupakan senyawa intermediet dari hidrolisis selulosa menjadi monomer glukosa (Krisch et  al ., 2010, Singhania et  al ., 2013) sedangkan pada industri pulp dan kertas, β-glukosidase bersama-sama dengan selulase dan hemiselulase digunakan untuk menghilangkan warna tinta pada proses daur ulang limbah kertas (Ahmed et al ., 2017).
Hidrolisis selulosa menjadi glukosa melibatkan enzim multi kompleks selulase yang terdiri dari tiga macam enzim, yaitu endoglukanase, eksoglukanase  dan  β-glukosidase.  Ketiga  macam enzim tersebut bekerja secara sinergis untuk hidrolisis lengkap selulosa menjadi glukosa melalui beberapa tahapan hidrolisis. Pada tahap pertama, serat selulosa dihidrolisis oleh endoglukanase melepaskan fragmen selulosa kecil dengan bagian ujung/terminal  bebas  dalam  bentuk  pereduksi dan non pereduksi, yang kemudian dihidrolisis lebih lanjut oleh eksoglukanase melepaskan oligosakarida berukuran kecil dan selobiosa. Pada tahap  akhir,  β-glukosidase  melengkapi  hidrolisis selulosa dengan menghidrolisis selobiosa (produk intermediet hidrolisis selulosa) menjadi monomer glukosa (Krisch et al ., 2010, Singhania et al ., 2013). β-Glukosidase terdapat pada bakteri, kapang, tanaman dan hewan. Kapang merupakan sumber β-glukosidase yang  telah banyak dilaporkan. Isolasi β-glukosidase dari kapang dilakukan baik dengan menggunakan metode fermentasi media padat maupun fermentasi media cair (Singhania et al ., 2013) . Berbagai jenis kapang telah dijadikan sebagai sumber β-glukosidase seperti Aspergillus niger (Raza et  al .,  2011; Zahoor et  al ., 2011;
Qian et al ., 2012; Junior et al ., 2014 ; Ahmed et al ., 2015 Julia et al ., 2016 ), Aspergillus terreus (Elshafei et  al ., 2011), Aspergillus  fumigatus (Liu et al ., 2012), Fusarium proliferatum (Gao et al ., 2012), Penicillium pinophilum (Joo et al ., 2010), Penicillium  italicum (Park et  al ., 2012),
Trichoderma  viride (Irshad et  al ., 2013), dan Trichoderma reesei (Zheng et al ., 2017).
Aspergillus niger merupakan mikroorganisme yang  paling banyak digunakan dalam industri fermentasi seperti produksi asam organik (Yang et al ., 2017), enzim hidrolitik lipase (Salihu et al ., 2016) dan amilase (Carrillo-Sancen et al ., 2016) . Aspergillus niger juga merupakan sumber β-glukosidase yang potensial. Hal ini disebabkan karena kemudahannya untuk dikultivasi pada media produk agro dengan fermentasi media padat maupun fermentasi media cair. Selain itu, Aspergillus  niger telah  dinyatakan oleh Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat  sebagai  GRAS  ( generally  regarded as  safe )  (Silva et  al ., 2011; Qian et  al ., 2012) . Beberapa  penelitian  produksi  β-glukosidase yang menggunakan Aspergillus niger sebagai sumber enzim, diantaranya adalah  Junior et al .
( 2014 ) yang  melakukan  isolasi  β-glukosidase dari Aspergillus niger dengan fermentasi media padat menggunakan substrat kulit ari gandum ( wheat bran ) dan purifikasi parsial menggunakan MANAE-agarose menghasilkan larutan enzim dengan aktivitas spesifik 17,1 IU/mg dan Hu et al . ( 2011) yang melakukan isolasi β-glukosidase dari Aspergillus niger dengan medium minimal Aspergillus dan 1% wheat  bran menghasilkan ekstrak kasar enzim dengan aktivitas 3,3  ±  0,1  nmol/ min / mL dan kultur campuran Aspergillus niger dan A. oryzae dengan aktivitas 4,9 ± 0,1 nmol/ min / mL. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi β-glukosidase Aspergillus  niger BIO 2173 dan mempelajari  faktor-faktor  yang  mempengaruhi produksinya, yaitu pH awal medium fermentasi, waktu inkubasi fermentasi, perbandingan kandungan air terhadap substrat media fermentasi, suhu inkubasi fermentasi dan penambahan larutan garam mineral Mandels (Mandels dan Reese, 1957).  Proses  fermentasi  dilakukan    dengan teknik fermentasi media padat menggunakan substrat  dedak.  Hasil  fermentasi  diekstrak  dan terhadap ekstrak kasar  dilakukan uji aktivitas dengan menggunakan substrat p -nitrophenyl- β-D-glucopyranoside ( p NPG),  uji  protein  dan ditentukan aktivitas spesifiknya.

## Bahan dan Metode

## Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Na 2 CO 3 , CuSO 4 .5H 2 O,  KNa-Tartrat, pereaksi Folin-Ciocalteu, Bovin Serum Albumin
(BSA) , - p -nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (Sigma Aldrich), CH 3 COONa, asam asetat 96% , Potato  Dextrose  Agar  (PDA) , larutan garam mineral Mandels : urea 0,3 g/L, (NH 4 ) 2 SO 4 1,4 g/L, KH 2 PO 4 2,0  g/L,  CaCl 2 .2H 2 O  0,4  g/L, MgSO 4 .7H 2 O 0,3 g/L, pepton 1,0 g/L, Tween 80 0,2  g/L,  FeSO 4 .7H 2 O  0,005  g/L,  MnSO 4 .7H 2 O 0,0016  g/L,  ZnSO 4 .7H 2 O  0,0016  g/L,  dan CoCl 2 .6H 2 O 0,02 g/L. Peralatan yang digunakan antara  lain  Spektrofotometer  UV/Vis  (Optizen 2120 uv, Mecacys Co., Ltd, Korea Selatan), sentrifuge  refrigerator (Combi  514R,  Hanil Scientific InC, Korea Selatan), pH meter (Seven Easy S20, Mettler Toledo, USA).

## Substrat Media Fermentasi
Substrat yang digunakan sebagai media fermentasi pada penelitian ini adalah dedak padi yang diperoleh dari daerah Karawang, Jawa Barat.

## Mikroorganisme
Mikroorganisme yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat kapang Aspergillus niger BIO 2173 yang diisolasi dari gabah, diperoleh dari Laboratorium Fitopatologi, Southeast  Asian  Regional  Centre  for  Tropical Biology (SEAMEO BIOTROP), Bogor.

## Metode
Penyegaran (Regenerasi) Aspergillus niger
Penyegaran kapang Aspergillus  niger dilakukan dengan menumbuhkan kapang yang berasal dari media agar miring Potato Dextrose Agar (PDA). Kapang Aspergillus niger diinokulasikan pada tabung reaksi berisi media agar miring PDA steril secara aseptis, selanjutnya diinkubasi pada suhu 28 o C selama  5  hari (Ahmed et al ., 2015).
Produksi dan Ekstraksi β-Glukosidase
Produksi  β-glukosidase  dilakukan  dengan fermentasi media padat menggunakan substrat dedak padi berukuran 40 mesh. Ke dalam 10 g substrat ditambahkan akuades sebanyak 10 mL. Kemudian dimasukkan kedalam erlenmeyer 100 mL dan disterilisasi dalam autoklaf pada 121 o C selama 30 menit. Setelah dingin, ke dalam
masing-masing  erlenmeyer  tersebut  diinokulasi dengan Aspergillus niger hasil peremajaan yang berusia 5 hari sebanyak 1 mL suspensi spora (10 7 spora). Selanjutnya, diinkubasi selama 7 hari pada suhu 28 o C dengan pH awal media fermentasi 6,0 . Jumlah spora kapang Aspergillus niger yang digunakan ditentukan dengan hemocytometer (Junior et al ., 2014 ; Raza et al ., 2011). Hasil  fermentasi  diekstrak  dengan  larutan penyangga asetat 0,05 M (pH 5,0) sebanyak 50 mL kemudian digoyang dengan shaker dengan kecepatan 120 rpm selama 1 jam. Selanjutnya, larutan tersebut disaring menggunakan kain kasa untuk menghilangkan miselia. Filtrat yang dihasilkan kemudian disentrifugasi pada suhu 4 o C dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit (Junior et al ., 2014 ; Raza et al ., 2011). Supernatant yang didapat merupakan ekstrak kasar enzim untuk selanjutnya ditentukan aktivitas dan aktivitas spesifiknya.

## Penentuan  Kondisi  Maksimum  Produksi β-Glukosidase
Penentuan kondisi fermentasi maksimum untuk  produksi  β-glukosidase  dilakukan dengan  pengujian  terhadap  faktor-faktor  yang mempengaruhi  produksi  enzim,  yaitu  pH  awal medium fermentasi, waktu inkubasi fermentasi, perbandingan kandungan air terhadap substrat medium fermentasi, suhu inkubasi fermentasi dan penambahan larutan garam mineral Mandels pada medium fermentasi. Berikut ini adalah prosedur  pengujian  terhadap  faktor-faktor  yang mempengaruhi produksi β-glukosidase:
a. Pengujian  terhadap  pengaruh  pH  dilakukan dengan mengatur pH awal medium fermentasi pada kisaran pH dari 2,0; 3,0; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5;  6,0;  dan  7,0  menggunakan  1  mmol/L HCl  atau  1  mmol/L  NaOH.  Nilai  kisaran pH 2,0 – 7,0 mengacu pada penelitian Qian et  al . (2012). Fermentasi dilakukan dengan menambahkan 10 mL pelarut (pH 2,0 – 7,0) ke dalam 10 g substrat, kemudian diinkubasi pada suhu 28 o C selama 7 hari.
b. Pengujian terhadap pengaruh waktu inkubasi fermentasi dilakukan dengan menambahkan 10 mL akuades ke dalam 10 g substrat, kemudian diinkubasi pada suhu inkubasi 28 o C dengan variasi waktu inkubasi selama 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9 hari, dan pH awal medium fermentasi 6,0. Penambahan volume akuades sebanyak 10 mL ke dalam 10 g substrat,
mengacu pada penelitian Raza et al . (2011). Nilai  pH  6,0  adalah  pH  awal  media  yang terukur tanpa penambahan HCl atau NaOH.
c. Pengujian terhadap pengaruh variasi perbandingan kandungan air terhadap substrat media  fermentasi, dilakukan dengan menambahkan  masing-masing  sebanyak  5, 10, 15, 20 dan 25 mL akuades ke dalam 10 g substrat dalam erlenmeyer 100 mL. Inkubasi fermentasi dilakukan pada suhu 28 o C selama 7 hari dan pH awal media fermentasi 6,0.
d. Pengujian terhadap pengaruh suhu inkubasi fermentasi dilakukan pada variasi suhu 28 o C,
32 o C, dan 36 o C dengan waktu inkubasi selama 7 hari dan pH awal media fermentasi 6,0 .
e. Pengujian terhadap pengaruh penambahan larutan garam mineral Mandels dilakukan dengan fermentasi pada kondisi maksimum dengan menambahkan larutan garam mineral
Mandels sebanyak 10 mL ke dalam 10 g substrat. Sebagai pembanding dilakukan juga fermentasi dengan substrat sebanyak 10 g dan akuades10 mL (Raza et al ., 2011).
Penentuan Aktivitas Ekstrak Kasar β-Glukosidase
Aktivitas  ekstrak  kasar  β-glukosidase ditentukan dengan menggunakan p -nitrophenyl- β-D-glucopyranoside  ( p NPG)  sebagai  substrat. Sebanyak 1,0 mL larutan 2 mM substrat p -nitrophenyl-β-D-glucopyranoside dalam 0,05 M larutan  penyangga  natrium  asetat  (pH  5,0) diinkubasi  pada  suhu  40 o C  selama  5  menit. Selanjutnya, ditambahkan 0,1 mL larutan ekstrak kasar. Setelah 10 menit, reaksi dihentikan dengan menambahkan 2,0 mL larutan 1 M Na 2 CO 3 . Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang
gelombang 405 nm. Satu unit (U) β-glukosidase dinyatakan sebagai jumlah ekstrak kasar yang mengkatalisa hidrolisis p -NPG untuk melepaskan 1 µmol p -nitrophenol  per  menit  pada  kondisi percobaan (Herr et al ., 1978).
Penentuan  Kadar  Protein  dalam  Ekstrak Kasar β-Glukosidase
Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry menggunakan Bovine  Serum Albumin (BSA) sebagai standar. Selanjutnya, kadar protein digunakan untuk menghitung aktivitas spesifik yang merupakan rasio dari aktivitas enzim terhadap kadar protein (Lowry et al ., 1951).

## Hasil dan Pembahasan
Efek pH Awal Medium Fermentasi terhadap Produksi β-Glukosidase
Nilai  pH  medium  fermentasi  dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme sehingga berpengaruh terhadap produksi metabolit.  Untuk  mengetahui  pengaruh  pH terhadap  produksi  β-glukosidase  dilakukan fermentasi padat Aspergillus  niger BIO 2173 menggunakan substrat dedak dengan rentang pH awal medi um fermentasi, yaitu pH 2,0 – 7,0 . Nilai pH  yang  diatur  adalah  pH  kondisi  awal fermentasi, sedangkan terhadap pH selama proses berlangsung tidak dilakukan pengendalian. Pada Gambar  1 dan Tabel  1 dapat dilihat pengaruh pH  awal  medium  fermentasi  terhadap  aktivitas,
Gambar  1. Efek  pH  Awal  Medium  Fermentasi terhadap  Aktivitas  Ekstrak  Kasar  β-glukosidase Aspergillus niger BIO 2173
Tabel 1. Aktivitas Spesifik dan Kadar Protein Ekstrak Kasar β-glukosidase Aspergillus niger BIO 2173 pada Berbagai pH Awal Medium Fermentasi
pH awal medium fermentasi Kadar protein (mg / mL) Aktivitas spesifik (U/ mg protein) 2,0 2,03 ± 0,08 2,10 ± 0,07 3,0 2,01 ±0,06 1,76 ± 0,01 4,0 2,25 ±0,05 1,58 ± 0,03 5,0 2,39 ± 0,06 1,01 ± 0,13 5,5 1,93 ± 0,13 1,38 ± 0,06 6,0 2,06 ± 0,24 0,94 ± 0,05 7,0 1,98 ± 0,10 1,16 ± 0,04
Produksi β-Glukosidase Aspergillus niger BIO 2173 dengan Fermentasi Padat... : Sri Sugiwati, dkk.
aktivitas spesifik dan kadar protein ekstrak kasar β-glukosidase Aspergillus niger BIO 2173. Produksi  β-glukosidase  pada  rentang  pH awal medium fermentasi 2,0 – 7,0 menghasilkan ekstrak  kasar  β-glukosidase  dengan  nilai aktivitas  1,94  –  4,25  U/mL  dan  nilai  aktivitas spesifik  0,94  –  2,10  U/mg  protein.  Produksi β-glukosidase  mencapai  maksimum  pada  pH awal medium fermentasi 2,0. Selanjutnya, peningkatan  pH  awal  medium  fermentasi menyebabkan penurunan aktivitas dan aktivitas spesifik ekstrak kasar β-glukosidase. Penurunan produksi  β-glukosidase  dengan  meningkatnya pH awal medium fermentasi disebabkan karena sebagian besar kapang berfilamen tumbuh lebih baik pada pH asam dan karenanya menghasilkan produksi  enzim  yang  lebih  tinggi.  Kondisi  pH basa memiliki efek penghambatan terhadap pertumbuhan kapang dan produksi enzim. Selain itu, kultivasi kapang pada nilai pH yang kurang menguntungkan juga dapat menurunkan produksi enzim dengan cara mengurangi aksesibilitas substrat (Bakri et al ., 2008). Nilai  pH  maksimum  untuk  produksi β-gluko sidase yang diperoleh pada penelitian ini berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Zahoor et  al . (2011) yang melakukan produksi  β-glukosidase  dari Aspergillus  niger NRRL  599  dengan  teknik  fermentasi  media cair menggunakan substrat kulit ari biji gandum mendapatkan pH maksimumpada 5,5. Raza et al. (2011) yang mempelajari efek pH awal medium fermentasi terhadap produksi β-glukosidase dari campuran kultur Aspergillus niger dan A. oryzae menggunakan substrat kulit ari biji gandum juga mendapatkan  pH  maksimum  pada  5,5.  Qian et al .  (2012)  mempelajari  efek  pH  awal  medium fermentasi  terhadap  produksi  β-glukosidase dari Aspergillus niger AS 3.4309 menggunakan substrat  kulit  ari  biji  gandum  mendapatkan  pH maksimum pada 6,0.
Efek  Waktu  Inkubasi  Fermentasi  terhadap Produksi β-Glukosidase
Produksi  β-glukosidase  dipengaruhi  oleh waktu inkubasi fermentasi. Penentuan waktu inkubasi fermentasi maksimum pada produksi ekstrak  kasar  β-glukosidase  dari Aspergillus niger BIO 2173 dilakukan dengan variasi waktu inkubasi 1 – 9 hari. Produksi enzim akan meningkat dengan bertambahnya periode waktu inkubasi dan menurun setelah mencapai waktu
inkubasi maksimum. Pada Gambar 2 dan Tabel 2 dapat dilihat pengaruh waktu inkubasi fermentasi Aspergillus  niger BIO 2173 terhadap aktivitas, aktivitas spesifik dan kadar protein ekstrak kasar β-glukosidase.
Produksi β-glukosidase pada waktu inkubasi  fermentasi  1  –  9  hari,  menghasilkan ekstrak  kasar  β-glukosidase  dengan  nilai aktivitas  0,03  –  3,70  U/mL  dan  nilai aktivitas  spesifik  0,01  –  1,29  U/mg  protein. Pada fermentasi hari ke-1 produksi β- glukosidase sangat rendah dan mulai meningkat secara perlahan  pada  fermentasi  hari  ke-2  sampai  ke- 4.  Produksi  β-glukosidase  meningkat  dengan cepat  pada  fermentasi  hari  ke-5  sampai  ke-6 dan mencapaimaksimum pada fermentasi hari ke-7.  Penambahan  waktu  inkubasi  fermentasi menjadi 9 hari menyebabkan penurunan aktivitas dan  aktivitas  spesifiknya.  Penurunan  produksi β-glukosidase  dengan  penambahan  waktu fermentasi setelah mencapai produksi maksimum kemungkinan disebabkan oleh berkurangnya makronutrien dan mikronutrien di dalam media fermentasi, sejalan dengan berlangsungnya proses  fermentasi,  sehingga  menekan  fisiologi jamur yang menyebabkan inaktivasi dari mesin- mesin  (organel  sel)  penghasil  enzim  (Ikram-ul- Haq et al ., 2006) . Hasil  penelitian  Raza et  al . (2011) yang melakukan  produksi  β-glukosidase  dari campuran kultur Aspergillus niger dan A oryzae menggunakan substrat kulit ari biji gandum dengan  variasi  waktu  inkubasi  1  –  5  hari mendapatkan waktu inkubasi maksimum pada hari  ke-3.  Sementara  itu,  Gautam et  al . (2011) yang  melakukan  produksi  β-glukosidase  dari
Gambar 2. Efek Waktu Fermentasi terhadap Aktivitas Ekstrak  Kasar  b-glukosidase Aspergillus  Niger BIO 2173
Aspergillus  niger yang diinokulasi pada media basal dengan waktu inkubasi pada suhu 45 o C selama 7 hari memperoleh aktivitas β-glukosidase  maksimum  (1,61  U/mL)  pada fermentasi hari ke-3 – 5.

## Efek Kandungan Air pada Substrat Medium Fermentasi terhadap Produksi β-Glukosidase
Efek dari variasi kandungan air dalam substrat medium fermentasi terhadap aktivitas, aktivitas spesifik dan kadar protein β-glukosidase Aspergillus  niger BIO 2173 dapat dilihat pada Gambar  3 dan Tabel  3 . Pada substrat dedak sebanyak 10 gram yang ditambahkan akuades masing-masing sebanyak 5 – 30 mL menghasilkan ekstrak kasar β-glukosidase dengan nilai aktivitas 0,25  –  6,32  U/mL  dan  nilai  aktivitas  spesifik 0,10  – 1,99 U/mg protein.
Produksi  β-glukosidase  mencapai  maksimum pada kandungan air  10 mL dan substrat dedak 10 gram dengan rasio perbandingan volume air terhadap substrat sebesar 1:1. Selanjutnya, penambahan volume air sampai 30 mL menyebabkan penurunan produksi ekstrak kasar β-glukosidase. Terjadinya penurunan produksi β-glukosidase  dengan  bertambahnya  volume air, kemungkinan disebabkan oleh ketidakcukupan asupan udara akibat tingginya volume air sehingga menyebabkan terhambatnya pertumbuhan mikroba dan produksi enzim (Raza et al ., 2011). Produksi β-glukosidase  pada  penambahan akuades  sebanyak  5  mL  lebih  rendah
daripada 10 mL. Hal  ini  disebabkan  karena berkurangnya volume air pada media fermentasi padat menyebabkan berkurangnya kandungan air dalam media sehingga menurunkan kelarutan nutrisi substrat dan terjadinya pengembangan ( swelling ) meningkatkan kehilangan air akibat penguapan yang cepat selama fermentasi sehingga menghambat pertumbuhan mikroorganisme (Lonsane et al ., 1985) .
Efek  Suhu  Inkubasi  Fermentasi  terhadap Produksi β-Glukosidase
Faktor fermentasi lainnya yang mempengaruhi produksi β-glukosidase selain pH, waktu inkubasi fermentasi, dan perbedaan rasio kandungan air terhadap substrat medium fermentasi, adalah suhu inkubasi fermentasi. Penentuan pengaruh suhu terhadap produksi β-glukosidase dilakukan inkubasi fermentasi pada tiga suhu yang berbeda, yaitu 28 o C, 32 o C dan 36 o C. Pada Gambar 4 dan Tabel  4 dapat dilihat pengaruh suhu inkubasi
Tabel 2. Aktivitas Spesifik dan Kadar Protein Ekstrak Kasar b-glukosidase dari Aspergillus niger BIO 2173 pada berbagai Waktu Fermentasi Waktu fermentasi (hari) Kadar Protein (mg / mL) Aktivitas spesifik (U/ mg protein) 1 4,66 ± 0,01 0,01 ± 0,00 2 5,18 ± 0,08 0,04 ± 0,00 3 4,48 ± 0,33 0,13 ± 0,02 4 3,56 ± 0,01 0,22 ± 0,00 5 3,42 ± 0,00 0,50 ± 0,06 6 3,39 ± 0,24 0,86 ± 0,14 7 2,88 ± 0,18 1,29 ± 0,06 8 2,88 ± 0,05 1,15 ± 0,04 9 2,61 ± 0,51 1,19 ± 0,11 Gambar  3 .  Efek  Perbedaan  Kandungan  Air  yang Ditambahkan pada 10 gram Substrat Dedak terhadap Aktivitas  Ekstrak  Kasar  β-glukosidase Aspergillus niger BIO 2173
Tabel 3 . Aktivitas Spesifik dan Kadar Protein Ekstrak Kasar β-glukosidase Aspergillus niger BIO 2173 pada Berbagai  Kandungan  Air  dalam  10  gram  Substrat
Dedak Volume akuades (mL) Kadar Protein (mg m / L) Aktivitas spesifik (U mg/ protein) 5 4,80 ± 0,05 0,77 ± 0,01 10 3,18 ± 0,08 1,99 ± 0,02 15 2,80 ± 0,10 1,11 ± 0,02 20 1,98 ± 0,03 0,72 ± 0,05 25 1,98 ± 0,08 0,19 ± 0,02 30 2,47 ± 0,14 0,10 ± 0,01
terhadap  aktivitas,  aktivitas  spesifik  dan  kadar protein  ekstrak kasar β-glukosidase Aspergillus niger BIO 2137. Produksi β-glukosidase paling tinggi dicapai pada suhu inkubasi fermentasi 32 o C. Penurunan suhu inkubasi menjadi 28 o C dan peningkatan menjadi 36 o C menyebabkan penurunan produksi ekstrak  kasar  β-glukosidase. Berkurangnya produksi pada suhu yang lebih rendah disebabkan oleh terhambatnya transport nutrisi ke dalam sel, sedangkan pada suhu tinggi terjadi peningkatan kebutuhan energi untuk pemeliharaan sel akibat dari inaktivasi protein dari jalur metabolik sehingga pembentukan produk menjadi berkurang (Rajoka et al ., 2004) . Suhu inkubasi maksimum yang didapatkan pada penelitian ini tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian Zahoor et al . (2011) yang melakukan produksi  β-glukosidase  dari Aspergillus  niger NRRL  599  menggunakan  substrat  kulit  ari  biji gandum, yaitu pada suhu 30 o C, dan Qian et al . (2012)  yang  melakulan  produksi  β-glukosidase dari Aspergillus niger AS 3.4309 dengan substrat kulit ari biji gandum, mendapatkan suhu optimum pada 28 o C.  Sedangkan  Gautam et  al . (2011) yang melakukan produksi  β-glukosidase  dari Aspergillus niger pada media basal mendapatkan suhu  optimum  antara  45 o C  dan  55 o C dengan aktivitas sebesar 1,98 U/ mL.
Efek  Penambahan  Larutan  Garam  Mineral Mandels  pada  Media  Fermentasi  terhadap Produksi β-Glukosidase
Kapang memerlukan makronutrien oksigen, hidrogen, karbon, nitrogen dan mikronutrien P, K, S, Mg, Fe, Zn, Cu untuk pertumbuhan
dan aktivitas metabolitnya (Norouzian, 2008). Larutan garam mineral Mandels merupakan larutan garam yang mengandung mikronutrien (KH 2 PO 4 , CaCl 2 , MgSO 4 , FeSO 4 , MnSO 4 , ZnSO 4 , CoCl 2 ) dan makronutrien (urea, ammonium sulfat, pepton) (Mandels dan Reese, 1957) . Penambahan larutan garam mineral Mandels ke dalam media fermentasi Aspergillus niger BIO 2173 dengan substrat dedak pada kondisi fermentasi maksimum (pH  2,0; volume akuades 10 mL; suhu 32 o C; waktu fermentasi 7 hari) menyebabkan peningkatan produksi  β-glukosidase  dengan  nilai  aktivitas dan aktivitas spesifik sebesar 5,24 ± 0,57 U/mL dan 2,46 ± 0,04 U/mg protein ( Tabel 5 ). Berdasarkan hasil penelitian Mandels dan Reese,  ( 1957) dilaporkan bahwa mineral Ca dan Mg dapat mempengaruhi produksi enzim dan konsumsi glukosa. Tidak adanya Mg pada media fermentasi menyebabkan pertumbuhan yang lambat dan kurangnya produksi selulase. Produksi selulase meningkat dengan adanya penambahan MgSO 4 dan CaCl 2 pada konsentrasi hingga 0,03%.
Julia et  al .  (2016)  melakukan  isolasi β-glukosidase  dari Aspergillus niger NRRL3 dengan fermentasi media padat menggunakan substrat bungkil kedelai ( soybean  hull ) dan limbah kertas dengan penambahan larutan garam mineral Mandels menghasilkan ekstrak kasar enzim dengan nilai aktivitas maksimum untuk substrat  bungkil  kedelai  sebesar  0,984  U/mL, lebih tinggi 1,7 kali daripada substrat limbah kertas. Raza et  al . (2011) melakukan seleksi terhadap 10 jenis pelarut yang digunakan pada  fermentasi  padat  produksi  β-glukosidase dari campuran kultur Aspergillus  niger dan A.  oryzae . Hasil  penelitiannya  menunjukkan bahwa fermentasi dengan larutan garam mineral Mandels menghasilkan  produk  β-glukosidase
Gambar  4. Pengaruh Suhu Inkubasi Fermentasi terhadap  Aktivitas  Ekstrak  Kasar  β-glukosidase Aspergillus niger BIO 2173
Tabel 4. Aktivitas Spesifik dan Kadar Protein Ekstrak Kasar β -glukosidase Aspergillus niger BIO 2173 yang Diproduksi dengan Suhu Fermentasi yang Berbeda Suhu fermentasi ( o C) Kadar protein (mg m / L) Aktivitas spesifik (U/mg protein) 28 2,82 ± 0,17 1,13 ± 0,14 32 2,78 ± 0,05 1,63 ± 0,14 36 3,39 ± 0,14 0,95 ± 0,09
yang lebih tinggi dibandingkan pelarut lainnya. Hal ini kemungkinan disebabkan karena medium yang menggunakan larutan garam Mandels mengandung semua nutrisi tambahan, sumber nitrogen baik organik (urea dan pepton) maupun anorganik (ammonium sulfat) dan konsentrasi Tween-80  yang  tinggi,  dimana  komponen- komponen tersebut dapat meningkatkan produksi β-glukosidase (Chellapandi dan Jani, 2008).

## Kesimpulan
Produksi  β-glukosidase  dari Aspergillus niger BIO 2173 dengan fermentasi media padat dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu pH awal media fermentasi, waktu inkubasi fermentasi, kandungan air dalam substrat media fermentasi dan suhu inkubasi fermentasi. Produksi β-glukosidase mencapai  maksimum  pada  pH  awal  media fermentasi 2,0, waktu inkubasi fermentasi 7 hari, perbandingan (rasio) kandungan air terhadap substrat dedak sebesar 1:1 dan suhu inkubasi fermentasi 32 o C. Penambahan larutan garam mineral Mandels ke dalam media fermentasi pada kondisi fermentasi maksimum menyebabkan peningkatan aktivitas ekstrak kasar β-glukosidase sebesar 26,88% dibandingkan dengan fermentasi tanpa penambahan larutan garam mineral Mandels.

## Ucapan Terimakasih
Ucapan  terimakasih  disampaikan  kepada Kemenristekdikti atas bantuan dana beasiswa karyasiswa program pascasarjana tahun 2012 - 2016.

## Daftar Pustaka
Ahmed, A., Nasim, F.U.H., Batool, K., Bibi, A. (2017)  ‘Microbial  β-glucosidase:  Sources, Production  and  Applications’, Journal  of Applied  &  Environmental  Microbiology, 5(1), pp. 31-46.
Ahmed,  S.A.,  El-Shayeb,  N.M.A., Hashem, A.G.M.,  Saleh,  S.A.A.,  Abdel-Fattah, A.F.  (2015)  ‘Chemical  Modification  of Aspergillus  niger β-glucosidase  and  Its Catalytic  Properties’, Brazilian  Journal  of Microbiology , 46(1), pp. 23-28. Bakri, Y., Jawahar, M., Arabi, M.I.E. (2008) ‘Improvement of Xylanase Production by Cochliobus  sativus in  Submerged  Culture’, Brazilian  Journal  of Microbiology, 39, pp. 602-604. Carrillo-Sancen,  G.,  Carrasco-Navarro,  U., Tomasini-Campocosio,  A.,  Corzo,  G., Pedraza-Escalano,  M.M.,  Favela-Torres, E.  (2016)  ‘Effect  of  Glucose  as  a  Carbon Repressor  on  The  Extracellular  Proteome of Aspergillus  niger During The Production of  Amylases  by  Solid  State  Cultivitation’, Process Biochemistry , 51(12), pp. 2001-2010 . Chellapandi,  P.,  Jani,  H.M.  (2008)  ‘Production of Endoglucanase by The Native Strains of Streptomyces Isolates in Submerged Fermentation’, Brazilian  Journal  of Microbiology , 39(1), pp. 122-127. Elshafei,  A.M.,  Hassan,  A.M., Morsi, N.M., Elghonamy ,  D.H.  ( 2011) ‘ Purification  and Some Kinetic P roperties of β- glucosidase from Aspergillus terreus NRRL 265’, African Journal of Biotechnology , 10(84), pp. 19556-19569. Gao, Z., Hop, D.V., Yen, L.T.H., Ando, K., Hiyamuta, S., Kondo, R. (2012) ‘The  Production of β- glucosidase by Fusarium  proliferatum NBRC109045 Isolated from Vietnamese Forest ’, AMB Express , 2(1)( 49), pp. 1-13. Gautam,  S.P.,  Bundela,  P.S.,  Pandey,  A.K., Khan,  J.,  Awasthi,  M.K.,  S.  Sarsaiya,  S. (2011) ‘Optimization for The Production of Cellulase Enzyme from Municipal Solid Waste Residue by Two Novel Cellulolytic Fungi’ Biotechnology Research International , 2011, pp. 1-8.
Herr,  D.,  Baumer, F., Dellweg ,  H . ( 1978 )‘ Purification  and Properties of an E xtracellular  β- glucosidase from Lenzites trabea ’, European  Journal  of  Applied Microbiology  and  Biotechnology , 5 (1),  pp. 29-36.
Tabel 5 . Aktivitas, Aktivitas Spesifik dan Kadar Protein Ekstrak Kasar β-glukosidase dari Fermentasi Aspergillus niger BIO 2173 pada Kondisi Fermentasi Maksimum (pH 2,0; Rasio Kandungan Air terhadap Substrat 1:1; Suhu
Inkubasi 32 o C; Waktu Fermentasi 7 hari)
Perlakuan fermentasi Aktivitas (U/ mL) Kadar protein (mg / mL) Aktivitas spesifik (U/ mg protein) Tanpa penambahan larutan Mandels 4,13 ± 0,35 1,75 ± 0,05 2,35 ± 0,13 Dengan penambahan larutan Mandels 5,24 ± 0,57 2,13 ± 0,27 2,46 ± 0,04
Produksi β-Glukosidase Aspergillus niger BIO 2173 dengan Fermentasi Padat... : Sri Sugiwati, dkk.
Hu,  H.L.,  van  den  Brink,  J.K,  Gruben,  B.S., Wösten,  H.A.B.,  Gu,  J.D.,  de  Vries, R.P.(2011) ‘Improved Enzyme Production by  Co-Cultivation  of Aspergillus  niger and Aspergillus  oryzae and with Other Fungi’, International  Biodeterioration  & Biodegradation , 65, pp. 248–252. Ikram-ul-Haq,Javed,  M.M.,  Khan,  T.S.  (2006) ‘An  Innovative  for  Hyperproduction  of Cellulolytic  and  Hemicellulolytic  Enzymes by Consortium of Aspergillus  niger MSK- 1 and Trichoderma  viride MSK-10’, AfricanJournal  of  Biotechnology , 5(8),  pp. 609-614. Irshad, M., Anwar, Z., Ramzan, M., Mahmood, Z.,  Nawaz ,  H . (2013) ‘Characterization of  P urified  β- glucosidase  Produced from Trichoderma  viride Through  B io- processing of  Orange  Peel  Waste ’, Advances  in Bioscience  and  Biotechnology , 4 , pp. 941- 944.
Joo, A.R., Jeya, M., Lee, K.M., Lee, K.M., Moon, H.J., Kim, Y.S., Lee, J.K. (2010) ‘Production and Characterization of β -1,4-Glucosidase from a Strain of Penicillium  pinophilum ’, Process Biochemistry , 45, pp. 851-858. Julia, B.M., Belen, A.M., Georgina, B., Beatriz, F.  (2016)  ‘Potential  Use  of  Soybean  Hulls and Waste Paper as Supports in SSF for Cellulase Production by Aspergillus niger ’, Biocatalyst  and  Agricultural  Bitechnology , 6, pp. 1-8.
Junior,  A.  B.,Borges,  D.G., Tardioli,  P.W., Farinas, C.S.( 2014 ) ‘Characterization of β- glucosidase  Produced by Aspergillus niger U sing  S olid- State  Fermentation and Partially  P urified  Using  MANAE-Agarose’ Biotechnology  Research  International , ( 2014 ), pp. 1-8. Krisch, J., Takó, M., Papp, T., Vágvölgyi, C. (2010) ‘Characteristics and Potential Use of β -Glucosidase from Zygomycetes’, Current Research,  Technology  Education  Topics in  Applied  Microbiology  and  Microbial Biotechnologogy. A. Mendez-Vilaz (Ed.) , pp. 891–896. Liu, D., Zhang, R., Yang, X.,  Zhang,  Z., Song,  S.,  Miao, ,  Y., Shen, Q. (2012) ‘Characterization of a Thermostable β- glucosidase from Aspergillus  fumigatus Z5, and Its Functional E xpression in Pichia pastoris X33 ’, Microbial  Cell  Factories , 11(25), pp. 1-15. Lonsane,  B.K.,  Ghildyal,  N.P.,  Budiatman,  S., Ramakhrisna,  S.V.  (1985)  ‘Engineering Aspects  of  Solid  State  Fermentation’. Enzyme and Microbial Technology , 7(6), pp. 258-265.
Lowry,  O.H.,  Rosebrough,  N.J.,  Farr,  A.L., Randall,  R.J.  (1951)  ‘Protein  Measurement with The Folin Phenol Reagent’, Journal of Biological Chemistry , 193, pp. 265-275. Mandels,  M.,  Reese,  E.T.  (1957)  ‘Induction  of Cellulase in Trichoderma viride as Influenced by Carbon Sources and Metals’, Journal of Bacteriology’ , 73, pp. 269-278. Norouzian, D. (2008) ‘Effect of Different Factors on Fermentative Production of Enzymes by Fungi. Dynamic  Biochemistry’,  Process Biotechnology and Molecular Biology , 2(1), pp. 14-18. Park,  A.H,  Hong,  J.H., Kim, J.J., Yoon , J.J.
(2012)‘Biochemical  Characterization of an  E xtracellular  β- glucosidase from the Fungus, Penicillium italicum , Isolated from Rotten citrus peel ’, Mycrobiology , 40 (3), pp. 173-180. Qian, L.C.,Fu, S.J., Zhou, H.M., Sun, J.Y., Weng ,  X.Y.( 2012) ‘Optimization of Fermentation P arameters for β- glucosidase Production by Aspergillus niger ’, Journal of Animal and Veterinary Advances , 11(5), pp. 583-591.
Rajoka, M.I., Khan, S., Latif, F., Shahid, R. ( 2004 ) ‘Influence of Carbon and Nitrogen Sources and  Temperature  on  Hyperproduction of  a  Thermotolerant  β-glucosidase  from Synthetic Medium by Kluyveromyces marxianus’,  Appl.  Biochem.  Biotechnol ., 117(2), pp. 75-92. Raza, F., Raza , N.A.,Hameed, U., Ikram-ul-Haq, Mariam, I. (2011) ‘Solid State Fermentation for the P roduction of β- glucosidase by C o- Culture of Aspergillus niger and A. oryzae ’, Park. J. Bot ., 43 (1), pp. 75-83. Salihu, A., Bala, M., Alam, Md.Z. (2016) ‘Lipase Production by Aspergillus  niger Using Sheanut  Cake:  An  Optimization  Study’, Journal oF Taibah University of Science , 10, pp. 850-859.
Silva, D.M., Batista, L.R., Rezende, E.F., Fungaro,  M.H.P,  Sartori,  D.,  Alves,  E. (2011)  ‘Identification  of  Fungi  of  The Genus Aspergillus Section  Nigri  Using Polyphasic Taxonomy’ Brazilian Journal of Microbiology , 42, pp. 761-773 . Singhania,  R.R.,  Patel, A.K.,  Sukumaran,  R.K., Larroche,  C.,  Pandey,  A.  (2013)  ‘Role  of Significance  of  Beta-Glucosidases  in  The Hydrolysis  of  Cellulose  for  Bioethenol Production’, Bioresource  Technology , 127, pp. 500-507. Yang,  L.,  Lubeck,  M.,  Lubeck,  P.S.  (2017)
‘ Aspergillus as a Versatile Cell Factory for Organic  Acid  Production’, Fungal  Biology Reviews , 31(1), pp. 33-49.
Jurnal Selulosa, Vol. 8, No. 1, Juni 2018 : 33 - 42
Zahoor, S., Javed, M.M., Aftab, S., Latif, F.,ul- Haq , I.,(2011) ‘Metabolic  Engineering and  Thermodynamic  Characterization of an  E xtracellular  β- glucosidase  Produced by Aspergillus  niger ’, African  Journal  of Biotechnology , 10(41), pp. 8107-8116. Zheng, W., Chen, X., Xue, Y., Hu, J., Gao, M.T., Tsang, Y.F. (2017) ‘The Influence of Soluble Polysaccharides Derived from Rice Straw upon Cellulose Production by Trichoderma reesei ’, Process Biochemistry ,  61,  pp.  130-
136.