Vol. 2, No. 2, Desember 2022, hal. 96-106                                                                 e-ISSN: 2798-558x (online)

## PENETAPAN . KADAR FLAVONOID TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DARI EKSTRAK ETANOL DAN FRAKSI KULIT BATANG WARU (Hibiscus tiliaceus L.)
DENGAN METODE ABTS
Determination of Flavonoid Levels Total and Test Antioxidant Activity from Ethanol Extracts and Fractions  Waru Skin ( Hibiscus tiliaceus L.) with ABTS Method
Ade Erma Novita Sari 1*)
1) Universitas Duta Bangsa, Jalan Pinang Nomor 47, Jati, Cemani, Jawa Tengah Indonesia
* e-mail: adeermanovitasari25@gmail.com

## ABSTRAK
Antioksidan adalah senyawa yang dapat menetralkan, menurunkan dan menjadi penghambat terbentuknya  radikal  bebas  baru  ditubuh  menjadi  pendonor  elektron  dari  radikal  bebas sehingga  berpasangan  serta  menghentikan  kerusakan  pada  tubuh.  Kulit  batang  waru  atau Hibiscus tiliaceus L. adalah tanaman yang berpotensi menjadi sumber utama antioksidan yang terbentuk  alami.  Kulit  batang  waru  diketahui  memiliki  aktivitas  antioksidan  di  fraksi  n- heksan,  fraksi  etil  asetat  serta  fraksi  air.  Tujuan  dalam  penelitian  yaitu  mengetahui  aktivitas antioksidan  dari  ekstrak  etanol  dan  fraksi  kulit  batang  waru  memakai  metode  ABTS (2,2 Azinobis  (3  ethylbenothiazoline)  6-Sulfonic  Acid) .  Kulit  batang  waru  di  ekstraksi  memakai metode  maserasi  memakai  etanol  96%  dapat  dilanjutkan  fraksinasi  menggunakan  pelarut  n- heksan,  etil  asetat  serta  air.  Kadar  flavonoid  ditentukan  menggunakan  spektrofotometri  UV- VIS  di  panjang  gelombang  435  nm.  Uji  aktivitas  antioksidan  memakai  metode  ABTS  di panjang  gelombang  730  nm.  hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kadar  flavonoid  ekstrak etanol kulit batang waru adalah 11.973± 0.055QE. Hasil uji aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol, fraksi  n-heksan, fraksi  etil  asetat serta fraksi  air dengan nilai  IC 50 berturut-turut ialah 71.78  ppm,  105.45  ppm,  40.90  ppm,  dan  64.23  ppm  aktivitas  antioksidan  tertinggi ditunjukkan oleh fraksi etil asetat dengan nilai IC50 40.90 ppm dengan aktivitas sangat kuat.
Kata kunci: ABTS,  antioksidan, flavonoid,  fraksi, kulit batang waru

## ABSTRACT
Antioxidants  consists  of compounds that neutralize, reduce and inhibit the formation  of  new free radicals in the body by becoming free radical electron donors so that they become paired and stop damage to the body. The bark of waru (Hibiscus tiliaceus L.) has the potential to be a source of natural antioxidants. Waru bark is known to have antioxidant activity in several fractions. This research was to determine the antioxidant activity test of ethanol extract and hibiscus bark fraction using the ABTS method (2.2 Azinobis (3 ethylbenothiazoline) 6-Sulfonic Acid). The hibiscus bark was extracted using maceration method using 96% ethanol followed by  fractionation  using  solvent  n-Hexane,  ethyl  acetate  and  water.  Flavonoid  levels  were determined  using  UV-VIS  spectrophotometry  at  a  wavelength  of  435  nm.  The  antioxidant
activity  test  used  the  ABTS  method  at  a  wavelength  of  730  nm.  The  results  showed  that  the flavonoid content of the ethanol extract of waru stem bark was 11.973 ± 0.055QE. The results of the antioxidant activity test of ethanol extract, n-hexane fraction, ethyl acetate fraction and water fraction with IC 50 values were 71.78 ppm, 105.45 ppm, 40.90 ppm, and 64.23 ppm. The highest antioxidant activity is indicated by the ethyl acetate fraction with IC 50 value of 40.90. ppm with very strong activity.
Keywords: ABTS, antioxidants, flavonoids, fractions, waru bark

## PENDAHULUAN
Kemajuan  IPTEK  merubah  gaya  hidup  masyarakat  di  era  terkini.  Perubahan  tersebut antara lain terkait dengan nutrisi, kebiasaan makan yang buruk, olahraga yang tidak seimbang dan  istirahat.  Selain  itu,  kualitas  lingkungan  yang  buruk  akan  menurunkan  kualitas  hidup masyarakat dan mengurangi pembentukan zat yang melidungi tubuh kita.
Radikal  bebas  yaitu  molekul-molekul  labil  dan  reaktif  satu  atau  lebih  elektron  tidak berpasangan  diorbit  luar  yang  memiliki  kemampuan  untuk  merusak  biomolekul  integritas lipid, protein, dan DNA serta meningkatkan stres oksidatif (Soeksmanto dkk, 2007). Senyawa antioksidan  diperlukan  menetralisir,  mengurangi,  dan  menghambat  terbentuknya  radikal bebas  yang  baru  di  dalam  tubuh  sebagai  pendonor  elektron  bagi  radikal  bebas  sehingga elektron  bebas  pada  radikal  bebas  akan  berpasangan  dan  menghentikan  kerusakan  ditubuh guna  mencegah  penumpukan  radikal  bebas  yang  dapat  mengakibatkan  perkembangan penyakit  degeneratif  (Rao  &  Møller,  2011).  Senyawa  antioksidan  ada  di  tanaman  baik  di daun,  bunga,  batang,  serta  akar.  tanaman  yang  memiliki  senyawa  bioaktif  yaitu  flavonoid, alkaloid serta terpenoid memiliki potensi antioksidan yang alami.
Tanaman  waru  ialah  jenis  tanaman  yang  relatif  berpotensi  mempunyai  kandungan senyawa  antioksidan  yang  merupakan  suku  kapas-kapasan  atau  Malvaceae.  Kandungan fitokimia  tanaman  waru  ( Hibiscus  tiliaceus L.)  yang  dilaporkan  ialah  protein,  karbohidrat, fenol, tanin, flavonoid, saponin, glikosida, steroid, terpenoid, serta konstituen kimia alkaloid (Andriani  et  al.,  2017).  Menurut  Kumar et  al (2008)  kulit  batang  tanaman  waru  memiliki kandungan  bahan  kimia Hibiscusamide,N-trans  feruloyltiramine,  dan  N-cis  feruloyltiramine serta  memiliki  sifat  toksik  bagi  sel-sel  kanker.  Akar  kulit  batang  waru  juga  mengandung tanin, saponin, dan flavonoid.

## METODE Alat dan Bahan
Peralatan  yang  dipergunakan  yaitu  alat  maserasi,  timbangan  analitik  (Fujitsu), rotary evaporator (RE-100  PRO), waterbath (Faithful),  oven  (Binder),  spektrofotometri  UV-VIS (genesys 10 s).
Bahan  yang  dipergunakan  yaitu  kulit  batang  waru (Hibiscus  tiliaceus  L.), standar kuersetin,  metanol  p.a,  etanol  96%,  serbuk  magnesium,  AlCl 3 p.a,  akuades,  C 4 H 8 O 2 (etil asetat), C 6 H 14 ( n- heksan), serbuk ABTS, 2,2’azinobis (3-ethylbenzthiazoline 6-sulfonic acid), K 2 S 2 O 8 (kalium persulfat), C 2 H 3 NaO 2 (natrium asetat), NaCl (natrium klorida), KCl  (kalium klorida), Na 2 HPO 4 (natrium idrogen fosfat ), CaHPO 4 (kalium hidrogen fosfat).

## Ekstrak Kulit Batang Waru.
Kulit batang waru berasal Kecamatan Jogonalan, Kabupaten Klaten, Jawa Tengah. Kulit batang  waru  selanjutnya  dibuat  menjadi  simplisia  dengan  cara  pengeringan  mengunakan metode diangin-anginkan selanjutnya diserbukkan hingga menjadi serbuk simplisia. Sebanyak
500 g serbuk kulit batang waru dimaserasi menggunakan 5000 mL pelarut etanol 96%. Hasil penyaringan  diuapkan  menggunakan  mesin  vacum rotary  evaporator sampai  diperoleh ekstrak  kental  kulit  batang  waru.  Selanjutnya  melakukan  ekstraksi  cair-cair  memakai  tiga jenis pelarut yg berbeda yaitu C 6 H 14 ( n- heksan), C 4 H 8 O 2 (etil asetat) serta akuades.
Fraksinasi Kulit Batang Waru.
Sebanyak  10  g  ekstrak  kental  kulit  batang  waru (Hibiscus  tiliaceus  L) lalu  dilarutkan menggunakan  150  mL  akuades  dimasukan  ke  alat  corong  pisah  dengan  150  mL  n-heksan kemudian dibiarkan memisah terbentuk dua lapisan  (akuades di bawah dan lapisan n-heksan di  atas)  kemudian  ambil  lapisan  n-heksan  selanjutnya  dilarutkan  150  mL  etil  asetat  digojog dan  didiamkan  hingga  terbentuk  dua  lapisan  (akuades  di  bawah  serta  lapisan  etil  asetat  di atas).  Pemisahan  dilakukan  sebanyak  tiga  kali  hingga  fase  n-heksan  jernih,  seluruh  fasa kemudian dipekatkan dengan mesin rotary evaporator untuk menghasilkan fraksi n-heksana, etil asetat, dan air (Vifta & Advistasari, 2018).

## Pengukuran Parameter
Parameter Non Spesifik
1) Penetapan Susut Pengeringan
Dua gram serbuk dan ekstrak dimasukkan pada kurs porselin tertutup dan sebelumnya telah  dipanaskan  dalam  waktu  30  menit  serta  pada  suhu  105 0 C  dan  harus  sudah  ditara. Serbuk  dan  ekstrak  diratakan  pada  kurs  dengan  cara  menggoyangkan  kurs  sampai terbentuknya lapisan tebal 5 - 10 mm, kemudian ditimbang. Tahap selanjutnya masukkan kedalam  oven  lalu  dibuka  tutupnya  dan  tunggu  hingga  beratnya  stabil.  Tentukan persentase setelah didinginkan dalam desikator (Depkes RI, 2000).
2) Kadar Air Sebanyak 2 gram  serbuk dan ekstrak dimasukan kedalam oven selama > 5 jam suhu stabil  105 0 C.  Setelah  dingin  dalam  desikator  >  15  menit,  ditimbang  hingga  bobot  tetap (Depkes RI, 2000).
3) Kadar Abu Total
Sebanyak 2 gram serbuk dan ekstrak dimasukkan pada krus porselin yang sudah ditara yang  kemudian  melakukan  penguapan  di  atas  penangas  air  hingga  kering.  Pembakaran arang  di  lakukan  dengan  tanur  listrik  selama  kurang  lebih  3  jam  pada  suhu  maksimum 550°C  sambil  sedikit  membuka  pintu  tungku  agar  oksigen  masuk  di  suhu  maksimum. Dinginkan  pada  deksikator,  kemudian  timbang  menggunakan  bobot  tetap  (Depkes  RI, 2000).
Uji Kandungan Kimia
1) Uji Flavonoid
Serbuk HCl dan Mg pekat diteteskan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1 g ekstrak. Bila  mengandung  flavonoid  jika  timbul  warna  merah  atau  kuning  (Muthmainnah  B, 2017).
2) Uji Alkaloid
Lima mL HCl 2 N dari ekstrak 2 gram dimasukkan kedalam tabung reaksi, dan dibagi menjadi 3 tabung reaksi masing-masing 1 mL. Setiap tabung ditambahkan menggunakan masing-masing  reagen.  Jika  menghasilkan  endapan  putih  atau  kuning  setelah  dicampur dengan  pereaksi  Mayer  positif  alkaloid.  Selain  pereaksi  Wagner  jika  terbentuk  endapan coklat  positif  mengandung  alkaloid.  Dan  penambahan  reagen  Dragendrof  jika  terbentuk endapan jingga positif alkaloid (Muthmainnah, 2017).
3) Uji Terpenoid Steroid
Pereaksi  Lieberman-Burchard  ditambahkan  e  dalam  1  gram  ekstrak  yang  telah dilarutkan  dalam  etanol.  Munculnya  warna  biru  atau  ungu  menunjukkan  hasil  positif untuk  senyawa  steroid,  sedangkan  warna  merah  kecoklatan  menunjukkan  hasil  yang untuk senyawa triterpenoid (Muthmainnah, 2017).

## 4) Uji Saponin
Satu gram ekstrak yang diuji dicampur dengan 10 mL air panas dan dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Saponin positif jika busa setinggi 1 sampai 10 cm dan bertahan minimal 10 menit (Muthmainnah B, 2017).
5) Uji Tanin
Satu gram ekstrak dimasukkan kedalam tabung berisi 10mL air mendidih, dipanaskan 5  menit,  kemudian  ditambahkan  3  -  4  tetes  FeCl 3 ke  dalam  filtrat.  Jika  berwarna  biru kehijauan  menunjukkan  adanya  gugus  tanin  katekol,  sedangkan  jika  berwarna  biru  dan hitam menunjukkan adanya gugus tanin pirogarol (Muthmainnah B, 2017).
6) Pengujian dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Pemisahan  menggunakan  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT)  secara  berulang  kali dengan  berbagai  eluen  dengan  berbagai  tingkat  polaritas.  Mengunakan  lampu  di  UV 254nm  dan  UV  365nm  digunakan  untuk  memantau  bercak  pada  pelat  KLT.  Penentuan pada golongan senyawa uji KLT menggunakan penyemprotan dengan memakai pereaksi Sitoborat, Dragendorff, FeCl 3 , serta Lieberman-Burchard.

## Analisis Kuantitatif
A) Pembuatan Kuersetin
1) Pembuatan Larutan Standart Kuersetin Dibuat  deret  konsentrasi  5  ppm,  10  ppm,  15  ppm,  20  ppm  serta  25  ppm  dengan diambil sebanyak 0,25 mL, 0,5 mL, 0,75 mL, 1 mL dan 1,25 mL dengan menimbang 10 mg bubuk kuersetin yang dilarutkan menggunakan metanol p.a ke dalam labu ukur 100 mL sehingga dihasilkan konsentrasi 100 ppm.
2) Penentuan Panjang Gelombang
Suatu larutan kuersetin 20 ppm diambil 1 mL ditambah 1 mL larutan AlCl 3 dan 1 mL larutan  C 2 H 3 NaO 2 yang  digunakan  untuk  mengukur  panjang  gelombang  maksimum, menghitung panjang gelombang maksimum antara 400- 450 nm (Aminah et al , 2017) 3) Penentuan Operating Time
Satu  mL  larutan  kuersetin  20  ppm  ditambah  1  mL  larutan  AlCl 3 10%  serta  1  mL larutan C 2 H 3 NaO 2 diukur serapannya di panjang gelombang maksimum dengan setiap dua menit sampai diperoleh absorbansi stabil (Indrayani, 2008).
4) Pembuatan Kurva Baku
Ambil  0,25  mL,  0,5  mL,  0,75  mL,  1  mL,  dan  1,25  mL  larutan  baku  kuersetin diencerkan hingga 5 mL pada masing-masing konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm,  dan  25  ppm.  Masing-masing  konsentrasi  larutan  diambil  1  mL  ditambahkan 1mL  AlCl 3 dan  1  mL  larutan  C 2 H 3 NaO 2 Sampel  diinkubasi  selama  waktu  operating time yang diperoleh dan absorbansi ditentukan memakai teknik spektrofotometri UV- VIS di panjang gelombang maksimum (Kusuma, 2012).
5) Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak. Timbang  10  mg  ekstrak  kulit  batang  waru  dilarutkan  dalam  10  mL  p.a.  Larutan diambil  1  mL  ditambahkan  1  mL  AlCl 3 10%  serta  1  mL  larutan  C 2 H 3 NaO 2 .  Sampel diinkubasi  selama  waktu  operating  time  di  suhu  kamar.  Kandungan  flavonoid ditentukan  dengan  persamaan  regenerasi  linier  dan  pembacaan  dari  kurva  kalibrasi spektrofotometer  UV-VIS,  dengan  rumus  y  =  a  +  bx.  Data  absorbansi  hasil pengukuran  ini  terapkan  kedalam  persamaan  regresi  linier  dimana  y  menjadi konsentrasi larutan standar.
B) Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan Metodoe ABTS.
1) Pembuatan Larutan Baku Pembanding Kuersetin
Membuat kuersetin konsentrasi  100 ppm  dengan menimbang sebanyak 10 mg  bubuk kuersetin  dilarutkan  dengan  menggunakan  metanol  p.a  dengan  labu  ukur  100  mL. Larutan baku 100 ppm dipipet masing-masing pada 0,25 mL, 0,5 mL, 0,75 mL, dan 1 mL,  1,25  mL  pada  konsentrasi  5  ppm,  10  ppm,  15  ppm,  20  ppm,  dan  25  ppm. Tambahkan  metanol  p.a  perlahan-lahan  sampai  garis  batas  setelah  ditambahkan  ke dalam labu ukur 5 mL (Kusuma, 2012).
2) Pembuatan Larutan Blanko ABTS.
a. Larutan ABTS: Masukkan 18 mg ABTS (7 mM) ke dalam labu ukur 5 mL setelah dilarutkan dengan akuades.
b. Larutan  K 2 S 2 O 8 :  Ditimbang  Kalium  persulfat  (2,45  mM)  sebesar  14  mg  yang dilarutkan dengan akuades sampai tanda batas 250 mL (Pulungan, 2018).
c. Larutan  PBS:  Ditimbang  sebesar  8  g  NaCl,  0,2  g  KCl,  14  g  Na 2 HPO 4 serta  0,24 CaHPO 4 dilarutkan dengan akuades sampai 1 L.
d. Larutan  stok  ABTS:  Sebanyak  5  mL  larutan  ABTS  ditambahkan  5  mL  larutan K 2 S 2 O 8 diinkubasi di ruang gelap suhu kamar 22-24 0 C selama 12-16 jam sebelum digunakan serta menghasilkan ABTS dengan warna biru gelap.
3) Penentuan Panjang Gelombang. Ambil  1  mL  larutan  stok  ABTS,  kemudian  campurkan  dengan  25  mL  PBS.
Absorbansi  larutan  diukur  antara  700  dan  750  nm  dan  panjang  gelombang  di  mana larutan menunjukkan penyerapan terbesar diidentifikasi (Pulungan, 2018).
4) Penentuan Operating Time
Larutan  standar  kuersetin  15  ppm  diambil  0,1  mL  ditambahkan  2  mL  larutan  stok ABTS. Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang maksimum dengan waktu 1 menit sampai diperoleh absorbansi yang stabil (Rosidah et al, 2008).
5) Pengukuran Aktivitas Antioksidan Dengan Baku Pembanding Larutan standar kuersetin dibuat konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, dan  25 ppm  masing  -  masing  konsentrasi  diambil  sebesar 1  mL  ditambah 2  mL larutan stok ABTS,  larutan  diinkubasi  selama  operating  time  yang  diperoleh  dan  diukur  serapan menggunakan  metode  spektrofotometri  UV-VIS  di  panjang  gelombang  maksimum (Faisal, 2019).
6) Pengukuran Aktivitas Antioksidan Kontrol Larutan  ABTS  diambil  1  mL  dan  ditambahkan  2  mL  PBS,  diinkubasi  selama operating time, baca di panjang gelombang maksimum.
7) Pengukuran  Aktivitas  Antioksidan  Sampel  (Ekstrak  Etanol,  Fraksi  n-Heksan,  etil asetat dan air)
Larutan stok sampel 1000 ppm dibuat dengan menimbang (Ekstrak Etanol, Fraksi Air,
Fraksi  n-Heksan  dan  Fraksi  Etil  Asetat  Kulit  batang  Waru)10  mg,  dilarutkan menggunakan  metanol  p.a  hingga  10  mL.  dibuat  larutan  ekstrak  menggunakan  deret konsetransi  10  ppm,  20  ppm,  30  ppm,  40  ppm,  serta  50  ppm  dibuat  dari  larutan ekstrak  100  ppm  yang  dipipet  masing-masing  sebesar  0,5  mL,  1  mL,  1,5  mL,  2  mL serta  2,5  mL  kemudian  ditambahkan  metanol  p.a  sampai  5  mL.  Setiap  konsetrasi dipipet  sebesar  0,1  mL  larutan  ekstrak  ditambah  2  mL  larutan  stok  ABTS,  larutan diinkubasi  selama  waktu  operating  time  yang  diperoleh  dan    diukur  serapan menggunakan spektrofotometri  UV-VIS di  panjang gelombang maksimum  dilakukan replikasi 3 kali (Faisal, 2019).

## HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi
Sampel  kulit  batang  waru (Hibiscus  tiliaceus L ) sebanyak  500  gram  yang  diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96% sebanyak 5000 mL menghasilkan
berat ekstrak yaitu 20,968 gram dengan persen rendamen sebanyak 4,19%. Hasil ekstrak kulit batang waru terlampir pada tabel 1.
Tabel 1 Ekstraksi Kulit batang Waru Serbuk Simplisia Ekstrak Kental Persentase Rendemen 500g 20,968 g 4.19%

## Fraksi Kulit Batang Waru
Fraksi  air  dari  ekstrak  kulit  batang  sebanyak  2  g  dengan  rendemen  20%.  Fraksi n - heksan  kulit  batang  waru  sebanyak  1.15  g  dengan  rendemen  11.5  %  sedangakan  fraksi  etil asetat sebanyak  2.25 g dengan rendemen 22.5 %. Dari ketiga fraksi,  fraksi  etil  asetat  adalah fraksi dengan rendemen tertinggi.
Tabel 2 Fraksinasi Kulit Batang Waru Bobot Ekstrak (gr) Fraksi Bobot Fraksi (gr) Rendemen (%) 10 Fraksi Air 2.00 20 Fraksi n -Heksan 1.15 11.5 fraksi etil asetat 2.25 22.5

## Pengukuran Parameter
a. Susut Pengeringan.
Parameter non spesifik ini bertujuan membuat batasan yang maksimal terhadap besar senyawa  yang  akan  hilang  diproses  pengeringan.  Parameter  ini  intinya  ialah  mengukur residu  zat  sesudah  dilakukan  pengeringan  di  temperatur  105 o C  sehingga  berat  menjadi konstan  yang  berbentuk  nilai  persen.  Nilai  susut  pengeringan  yang  diperoleh  dari simplisia  serta  ekstrak  etanol  kulit  batang  waru  adalah  sebanyak  8  %  dan  3,3%.  Massa yang  bisa  hilang  sebab  pemanasan  tersebut  mencakup  pelarut  etanol,  minyak  atsiri  dan molekul air.
b. Kadar Air.
Tujuan penentuan kadar air adalah untuk memastikan berapa banyak air yang tersisa dalam  bahan  setelah  pengeringan.  Syarat  kadar  air  tidak  boleh  melebihi  10%.  Pada penelitian  ini  dilakukan  pengukuran  kadar  air  menggunakan  oven  memperoleh  hasil serbuk dan ekstrak kulit batang waru (Hibiscus tiliaceus L.) masing-masing mengandung 8% dan 5,5%.
c. Kadar Abu Total.
Penentuan  kadar  abu  total  dilakukan  bertujuan  mendeskripsikan  kandungan  mineral pada  simplisia  dan  ekstrak.  Kandungan  abu  total  berkaitan  dengan  senyawa  mineral anorganik (Depkes RI, 2000). Hasil kadar abu total serbuk dan ekstrak  dari kulit batang waru adalah 8,78% dan 1,75%.

## Uji Kandungan Kimia
a. Tujuan penapisan fitokimia adalah untuk mengetahui apakah suatu ekstrak mengandung golongan metabolit sekunder tertentu. Ini juga dapat berfungsi sebagai deskripsi kualitatif komposisi ekstrak. Komposisi kimia ekstrak etanol kulit  batang waru diuji mengandung alkaloid, steroid/terpenoid, flavonoid, dan tanin (Guntarti et al ., 2015).

## Tabel 3 Uji Tabung
No Pemeriksaan Cara Kerja Hasil 1 Flavanoid Ekstrak + HCl Pekat+Mg (+)  Terbentuk  warna kuning
2 Alkaloid Ekstrak+HCl +Mayer/Wagner/Dragendroff (+)  Mayer:  Terbentuk endapan kuning (+) Wagner: Terbentuk endapan Coklat (+) Dragendrof: Terbentuk endapan jingga 3 Terpenoid Ekstrak+lieberman-burchard (+)  Terbentuk  warna merah kecoklatan 4 Saponin Ekstrak + Akuades (+)  Terbentuk  busa setinggi 1-10 cm 5 Tanin Ekstrak +Akuades+FeCl 3 (+)  Terbentuk  warna biru kehitaman
b. Uji Kromatografi Lapis Tipis
Hasil  skirining  fitokimia  yang  dilakukan  dengan  menotolkan  ekstrak  kulit  batang  waru pada lempengan KLT ukuran 1x5 cm yang telah diberi garis batas elusi yang terdiri dari flavonoid, alkaloid, tanin, dan steroid/terpenoid
Tabel 4 Hasil KLT Senyawa Perekasi Warna Rf Flavonoid Sitoborat UV254 nm dan UV366 nm terlihat fluoresensis berwarna biru 0.5 Alkaloid Dragendroff UV254 nm dan UV366 nm terlihat fluoresensis berwarna biru atau kuning 0.5 Tanin FeCI 3 UV254 nm dan UV366 nm terlihat berwarna hitam 0.5 Steroid Lieberman Buchard Adanya noda berwarna merah kecoklatan ber fluoresensis hijau biru 0.8

## Analisis Kuantitatif
1) Pengukuran Kuersetin
a. Hasil Penentuan Panjang Gelombang. Panjang gelombang dari serapan maksimum kuersetin digunakan menentukan panjang dari gelombang yang digunakan pada tahap analisis kuantitatif.
Kesalahan  dalam  pembacaan  penyerapan  diminimalkan  selama  tahap  ini. Spektrofotometer  UV-Vis  rentang  serapan  maksimum  400-440  nm  untuk  mengukur absorbansi  dengan  cara  1mL  larutan  kuersetin  20  ppm  dan  1  mL  larutan  C 2 H 3 NaO 2 serta larutan AlCl 3 . Hasil penelitian ini memperoleh panjang gelombang 435 nm.
b. Hasil Penentuan Operating Time
Operating  time ini  dimaksudkan  untuk  mengetahui  waktu  pengukuran  yang  lebih stabil  ditandai  dengan  tidak  terjadi  lagi  tingkat  penurunan  dari  absorbansinya. Operating  time dilakukan  menggunakan  larutan  standart  kuersetin  20  ppm.  Pada penelitian  ini  memperoleh  di  menit  22,  sebab  diwaktu  22  menit  mendapatkan absobransi yang stabil.
Gambar 2. Hasil Penentuan Operating Time
c. Pembuatan Kurva Baku
Larutan standart kuersetin memakai konsentrasi 100 ppm dibuat seri konsentrasi yakni 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm, 25 ppm yang masing-masing konsentrasi diambil 1 mL  kemudian  ditambahkan  larutan  1  mL  AlCl 3 dan  juga  1  mL  larutan  C 2 H 3 NaO 2 . Hasil pengukuran absorbansi standar kuersetin di λ maksimum yakni 435 nm.
Tabel 5 Kurva Kaliberasi Konsentrasi Abs 5 0.236 10 0.344 15 0.420 20 0.457 25 0.565
Tabel  5  menampilkan  hasil  nilai  absorbansi  dari  larutan  standar  kuarsetin  memakai spektrofotometri  UV-  VIS  dan  bersumber  pada  data  hasil  perhitungan  regresi  linear pembanding kuarsetin diperoleh persamaan regresi linear yakni Y=0, 0086x+ 0,2097. Koefisien korelasi( R2)= 0, 9953.
Gambar 3. Regresi linear larutan standar kuersetin
d. Pengukuran Kadar Flavonoid
Pengukuran kadar flavonoid ditunjukkan pada tabel 6 beserta hasil analisis kandungan total senyawa flavonoid total berupa flavon dan flavonol yang dihitung pada % b/b.
Tabel 6. Hasil Pengukuran Kadar Flavonoid Replikasi Absorbansi Rata- rata Kadar Kuersetin Mg QE/g Sampel SD Rata-rata  + SD 1 0.313 0.31267 12.012 11.973 0.055 11.973 + 0.055 2 0.312 11.895 3 0.313 12.012
Kadar flavonoid total yang berasal dari ekstrak etanol kulit batang waru adalah sebesar 11.973  ±  0,055  yang  dihitung  terhadap  kuersetin.  Standar  deviasi,  yang  dihitung dengan menggunakan ketiga nilai kandungan flavonoid total (EK) mg/g ekstrak sama dengan 0,005.

## 2) Pengukuran Antioksidan dengan ABTS
1. Hasil Penentuan Panjang Gelombang Hasil pengukuran serapan maksimum larutan ABTS diambil 1 mL ditambahkan PBS pH7,4  hingga  25  mL  dengan  menggunakan  spektrofotometri  UV-VIS.  Hasil pengukuran  menunjukkan  bahwa  larutan  ABTS  mempunyai  panjang  gelombang  730 nm.
2. Hasil Penentuan Operating Time
Waktu operating  time ditentukan  dengan  mengukur  hubungan  antara  waktu pengukuran  dengan  absorbansi  larutan  (Rohman,  2007).  Pada  penelitian  ini memperoleh  di  menit  ke  24,  sebab  diwaktu  24  menit  mendapatkan  absobransi  yang stabil.  dengan  cara  larutan  standar  kuersetin  15  ppm  diambil  0,1  mL  ditambahkan  2 mL  larutan  ABTS  yang  diukur  dengan  panjang  gelombang  730  nm  menggunakan waktu selama 30 menit sampai diperoleh absorbansi stabil.
Gambar 4. Penentuan Operating Time

## 3. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan
Pengujian  absorbansi  ABTS  dilakukan  pada  ekstrak  serta  fraksi  dengan  deret konsetransi  10  ppm,20  ppm,30  ppm,40  ppm,  dan  50ppm  tahap  selanjutnya ditambahkan  1mL  larutan  ABTS  di  setiap  konsentrasi  serta  dibaca  absorbansinya  di panjang  gelombang  730  nm.  Pembacaan  absorbansi  di  penelitian  ini  dilakukan  pada saat  operating  time  yang  sudah  ditentukan  yaitu  menit  ke-24  kemudian  dihitung persen peredamannya.
Tabel 7. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan Larutan Uji Konsentrasi (ppm) Rata-rata Absorbansi % Inhibisi Fraksi Air 10 0.327 26.067 20 0.318 29.213 30 0.293 33.708 40 0.272 38.876 50 0.250 44.045 Fraksi n- Heksan 10 0.355 20.225 20 0.343 23.146 30 0.327 26.742 40 0.313 29.213 50 0.275 32.809 Fraksi Etil- Asetat 10 0.238 46.966 20 0.237 47.865 30 0.229 48.764 40 0.226 49.880 50 0.221 51.011 Ekstrak 10 0.332 25.843 20 0.319 28.539 30 0.297 33.258 40 0.280 37.079 50 0.262 41.798 Baku Pembanding 5 0.235 48.315 10 0.197 55.506 15 0.182 59.775 20 0.154 66.067 25 0.131 71.011
IC 50 ( Inhibition  Concentration )  dapat  digunakan  untuk  menyatakan  aktivitas antioksidan  ekstrak  kulit  batang  waru (Hibiscus  tiliaceus L . ),  fraksi  air,  fraksi  n- heksan,  fraksi  etil  asetat,  dan  kuersetin.  Konsentrasi  sampel  yang  dikenal  sebagai IC 50 diperlukan untuk dapat menangkap 50% radikal bebas ABTS selama operating time . Data ekstrak kulit kayu waru (Hibiscus tiliaceus L.), fraksi n-heksan, fraksi etil asetat,  dan  standar  dari  perbandingan  quercetin  digunakan  untuk  menghitung  nilai IC 50 menggunakan persamaan regresi linier dan rumus Y = a + b.
Tabel 8. Nilai IC 50 Ekstrak Kulit Kayu Waru dengan Pembanding Kuersetin Fraksi air 64.23 Fraksi n-Heksan Fraksi Etil asetat 105.45 Ekstrak Kulit Batang Waru Baku Pembanding 40.90 Kuersetin 71.28 Baku Pembanding Kuersetin 6.095
Nilai IC50 sebesar 40, 90 ppm  yang setara dengan nilai  kuersetin di  dasar 50 ppm, hasil pengujian menampilkan jika fraksi  etil  asetat mempunyai  aktifitas antioksidan karena  adanya  molekul  flavonoid  dalam  fraksi  etil  asetat,  yang  akan  membatasi reaksi dari oksidasi dengan mekanisme radikal dan fenolik paling efisien.

## KESIMPULAN
Kadar  flavonoid  dari  ektrak  etanol  kulit  batang  waru (Hibiscus  tiliaceus L . ) ialah sebesar  11.973  ±  0.055 QE.  Aktivitas  antioksidan  ekstrak  dari  etanol  fraksi  n-heksan,  fraksi etil  asetat,  fraksi  air  kulit  batang  waru (Hibiscus  tiliaceus L.)  metode  ABTS  menunjukkan bahwa semuanya mempunyai aktivitas antioksidan.

## DAFTAR PUSTAKA
Andriani, Y., Mohamad, H., Bhubalan, K., Abdullah, M., & Amir, H. (2017). Phytochemical analyses,  anti-bacterial  and  anti-biofilm  activities  of  mangrove-associated  Hibiscus tiliaceus  extracts  and  fractions  against  Pseudomonas  aeruginosa. Journal  of Sustainability Science and Management , 12 , 45–51.
Depkes  RI.  (2000). Parameter  Standart  Umum  Ekstrak  Tumbuhan  Obat .  Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Faisal,  H.  (2019).  Uji  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Etanol  Buah  Okra  (  Abelmoschus esculentus  L  .  Moench  )  Dengan  Metode  DPPH  (  1  ,  1-  difenil-2-pikrilhidrazil  )  dan Metode ABTS. Regional Development Industry & Health Science, Technology and Art of Life , 2 (1) , 1–5.
Kumar,  S.,  Kumar,  D.,  &  Prakash,  O.  (2008).  Evaluation  of  antioxidant potential,  phenolic and  flavonoid  contents  of  Hibiscus  tiliaceus  flowers. Electronic  Journal  of Environmental, Agricultural and Food Chemistry , 7 (4), 2863–2871.
Muthmainnah  B.  (2017).  Skrining  Fitokimia  Senyawa  Metabolit  Sekunder  Dari  Ekstrak Etanol Buah Delima (Punica Granatum L.) Dengan Metode Uji Warna. Media Farmasi , XIII (December).
Rao,  R.  S.  P.,  &  Møller,  I.  (2011).  Pattern  of  occurrence  and  occupancy  of  carbonylation sites in proteins. Proteomics , 11 , 4166–4173. https://doi.org/10.1002/pmic.201100223 Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis . Pustaka Pelajar.
Soeksmanto,  Arif  Hapsari,  Yatri  Simanjuntak,  P.  (2007).  Antioxidant  content  of  parts  of Mahkota  dewa,  Phaleria  macrocarpa  [Scheff]  Boerl.  (Thymelaceae). Biodiversitas Journal of Biological Diversity , 8 (2), 92–95. https://doi.org/10.13057/biodiv/d080203
Vifta, R. L., & Advistasari, Y. D. (2018). Skrining Fitokimia, Karakterisasi, dan Penentuan Kadar Flavonoid Total Ekstrak dan Fraksi-Fraksi Buah Parijoto ( Medinilla speciosa B.). Prosiding Seminar Nasional Unimus , 1 , 8–14.