## VALIDASI METODE ANALISIS SENYAWA ETIL p- METOKSISINAMAT DALAM PLASMA DARAH TIKUS PUTIH JANTAN GALUR WISTAR MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Revika Rachmaniar, Natalia Suryanata, Nela Simanjuntak *
Program Studi Sarjana Famasi, Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia, Jawa Barat, Indonesia.
* Penulis Korespondensi: nela12345@stfi.ac.id

## ABSTRAK
Etil p-metoksisinamat (EPMS) hasil isolasi dari rimpang kencur ( Kaempferia galanga L ) sedang dikembangkan di STFI. Untuk melakukan analisis EPMS secara in vivo , validasi analisis EPMS dalam plasma darah menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) perlu dilakukan. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  melakukan  validasi  metode  analisis  EPMS  dalam  plasma  darah menggunakan  KCKT.  Kolom  KCKT  yang  digunakan  dalam  validasi  KCKT  ini  adalah  kolom C18, dengan fase gerak metanol:asam fosfat 70:30 dan 80:20, kecepatan laju alir 1,0 mL/menit, dan panjang gelombang maksimum 310 nm. Plasma darah yang digunakan merupakan plasma darah tikus putih jantan galur Wistar. EPMS ditambahkan ke dalam plasma darah dan dianalisis menggunakan  KCKT.  Parameter  validasi  yang  digunakan  adalah  uji  kesesuaian  sistem, linearitas,  akurasi,  presisi, limit  of  detection (LOD),  dan limit  of  quantification (LOQ).  Hasil penelitian  menunjukkan  fase  gerak  yang optimum  untuk  menganalisis  EPMS  di dalam  plasma adalah metanol:asam  fosfat dengan perbandingan 70:30. Berdasarkan hasil validasi didapatkan hasil  regresi  linier  0,998.  Pada  uji  akurasi didapatkan  rentang  nilai rata- rata  persen  perolehan kembali sebesar 98% - 102%. Pada uji presisi didapatkan rentang nilai rata-rata persen relative standard  deviation (RSD)  sebesar  4,10%  - 68,83%. Nilai  LOD  sebesar  2,747 μg/mL  dan nilai LOQ sebesar 9,158 μg/mL. Berdasarkan penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa EPMS dalam plasma darah dapat dianalisis menggunakan KCKT dengan kolom C18, fase gerak metanol:asam fosfat 70:30.
Kata kunci: Validasi  metode, Etil p-Metoksisinamat,  Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

## ABSTRACT
Ethyl p-methoxycinnamate  (EPMC)  isolated from  the  rhizome  of  kencur  (Kaempferia  galanga L)  is  being  developed  at  STFI.  Validation  of  EPMC  analysis  in  blood  plasma  using  High- Performance Liquid Chromatography (HPLC) needs to be conducted to perform in vivo EPMC analysis. This study aims to validate the EPMC analysis method in blood plasma using HPLC. The  HPLC  column  used  is  column  C18,  with  methanol  :  phosphoric  acid  70:30  and  80:20 mobile  phases,  a  flow  rate  of  1.0 mL/min,  and  a  maximum  wavelength of  310  nm. The blood plasma used was the blood plasma of white male rats of the Wistar strain. EPMC was added to blood  plasma  and  analyzed  using  HPLC.  Parameter  validation  used  is  system  suitability  test, linearity, accuracy, precision, limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ). The results  showed  that  the  optimum  mobile  phase  for  analyzing  EPMS  in plasma  was  methanol  : phosphoric acid with a ratio of 70:30. Based on the validation, the linear regression was 0.998.
In  the  accuracy  test,  the  average  value  range  for  the  percent  recovery  is  98%  -  102%.  In  the precision test, the average value of the RSD percentage was 4.10% - 68.83%. The LOD value is 2.747 g/mL, and the LOQ value is 9.158 g/mL. Based on this research, it can be concluded that EPMC  in  blood  plasma  can  be  analyzed  using  KKKT  with  column  C18  and  mobile  phase methanol : phosphoric acid 70:30.
Keywords: Method  validation,  Ethyl  p-Methoxycinnamate,  High-Performance  Liquid Chromatography.

## PENDAHULUAN
Etil  p-Metoksisinamat  (EPMS) merupakan  salah  satu  hasil  isolat  dari rimpang   kencur  ( Kaempferia  galanga.
L ).  EPMS  memiliki  cincin  benzen dan gugus  metoksi  yang  bersifat  non  polar. EPMS juga mengandung gugus karbonil yang  mengikat  etil  yang  bersifat  polar. Oleh  sebab  itu,  EPMS  dapat  larut  pada beberapa    pelarut  polar  dan  nonpolar (Kurniawati,  2016).  Pelarut  polar  yang dapat  melarutkan    EPMS  diantaranya yaitu  metanol,  etanol,  dan  air  (0,0301 mg/mL)  (Rachmaniar,  2020).  Pelarut non polar  yang dapat melarutkan EPMS yaitu  etil  asetat  dan  heksana.    EPMS memiliki  kelarutan  rendah  dalam  air sehingga memiliki kelarutan dan disolusi  yang  rendah.  Penelitian  EPMS mengenai  peningkatan  kelarutan  dan disolusi  masih  terbatas  dan  terus berkembang.  Kelarutan  dan  disolusi yang rendah akan menghambat absorpsi dalam  saluran  cerna  sehingga  sulit mencapai  saluran  sistemik  kemudian efek  farmakologi  akan  lambat  tercapai
(Shargel et al , 2012).
Kelarutan  dan  disolusi  EPMS yang rendah ini menyebabkan terbatasnya  data  profil  EPMS  dalam sampel  biologis,  salah  satunya  adalah plasma  darah.  Analisis  EPMS  dalam plasma  darah  penting  dilakukan  karena data  yang  dihasilkan  dapat  digunakan untuk  melakukan  uji  lebih  lanjut  yaitu profil bioavailabilitas dan farmakokinetika  EPMS  dalam  plasma darah.  Profil  EPMS  tersebut  digunakan sebagai parameter untuk
mempertimbangkan dosis, rute
pemberian,  bentuk  sediaan,    formulasi obat,  dan  efektivitas  terapetik  dari EPMS  (Shargel et  al ,  2012).  Sebelum melakukan  penelitian  secara in  vivo menggunakan  plasma  darah,  perlu diketahui terlebih dahulu metode analisis  yang  dapat  digunakan  untuk menganalisis  EPMS  dalam  plasma darah.  Penelitian  mengenai  metode analisis  EPMS  dalam  plasma  darah menggunakan  KCKT  belum  dilakukan. Metode KCKT digunakan untuk menganalisis  EPMS  dalam  plasma
darah karena KCKT mampu
memisahkan  EPMS  dari  senyawa  lain yang  ada  di  plasma,  analisisnya  cepat, dan  memiliki  kepekaan  tinggi  (Susanti dkk,  2014).  Validasi  metode  analisis pada  KCKT  untuk  menganalisis  EPMS dalam plasma penting untuk dilakukan.
Adapun kebaruan dari penelitian ini  adalah  metode  analisis  EPMS  asal rimpang  kencur  menggunakan  KCKT yang sebelumnya belum pernah dilakukan, tetapi sangat penting dilakukan  untuk  dapat  melakukan evaluasi  profil  bioavailabilitas  dan farmakokinetika  EPMS  dalam  plasma darah.

## METODE PENELITIAN
Penetapan Panjang Gelombang Maksimal EPMS Standar EPMS standar ditimbang
sebanyak  50  mg  dan  dilarutkan  dalam 100  mL  metanol  menggunakan  labu ukur  100  mL.  Larutan  tersebut  diukur nilai serapannya pada panjang gelombang  200-400  nm  menggunakan Spektrofotometer  UV-Visibel.  Hasil puncak  yang  terbentuk  dianalisis  untuk mendapatkan panjang gelombang maksimumnya (Kurniawati, 2016).
Penetapan  Waktu  Retensi  EPMS

## Standar
EPMS standar ditimbang sebanyak  50  mg  dan  dilarutkan  dengan 100  mL metanol  dalam  labu  ukur  100 mL. Larutan tersebut disaring menggunakan syringe  filter 0,45  μm sebanyak  10  mL  dan  diinjeksikan sebanyak  50  μL  pada   KCKT  dengan fase  gerak  metanol:asam  fosfat  70:30, kecepatan  laju  alir  1,0  mL/menit,  dan panjang  gelombang  maksimum.  Hasil kromatogram yang didapatkan kemudian dianalisis untuk mendapatkan waktu  retensi.  Penetapan  dilakukan kembali  dengan  menggunakan  fase gerak metanol:asam fosfat 80:20 (Kurniawati, 2016).

## Preparasi Plasma Tikus
Tikus sebanyak 3 ekor dipuasakan selama  24  jam.  Setelah  itu,  tikus dilakukan  pengambilan  darah  melalui ekor  sebanyak  1  mL.  Darah  tikus dimasukkan  ke  dalam  tabung  litium heparin  dan  disentrifugasi  selama  30 menit    dengan  kecepatan  4000  rpm. Plasma tikus ditambahkan metanol (1:1) dan  dikocok  menggunakan  vortex selama  2  menit.  Setelah  itu,  plasma tikus  disentrifugasi  selama  10  menit dengan  kecepatan  4000  rpm.  Hasil
sentrifugasi diambil  lapisan  paling  atas (supernatan) (Fernando, 2020).

## Validasi Metode EPMS Standar
a. Uji  Kesesuaian  Sistem  EPMS standar
Larutan  EPMS  standar  sebanyak
0,3  mL  ditambahkan  dalam  plasma tikus 0,3 mL. Larutan plasma diinjeksikan  sebanyak  50  μL  pada KCKT dengan fase gerak metanol:asam fosfat  70:30,  kecepatan  laju  alir  1,0 mL/menit,  dan  panjang  gelombang maksimum.  Uji  kesesuaian  sistem dilakukan  dengan  mengukur  resolusi (Rs), tailing  factor ,  kapasitas  kolom (K’),  jumlah  lempeng  teoritis  (N),  dan nilai  simpangan  baku  relatif  (RSD) dengan  pengulangan  sebanyak  6  kali. Pengujian  dilakukan  kembali  dengan menggunakan  fase  gerak  metanol:asam fosfat 80:20 (Harahap, 2006).
b. Uji Linearitas EPMS standar
Larutan  EPMS  standar  sebanyak 0,3  mL  ditambahkan  dalam  plasma tikus  sebanyak  0,3 mL. Larutan  plasma diinjeksikan  sebanyak  50  μL  pada KCKT  dengan fase gerak metanol:asam fosfat  70:30,  kecepatan  laju  alir  1,0 mL/menit,  dan  panjang  gelombang maksimum.  Uji  linearitas  dilakukan
dengan mengukur luas puncak kromatogram dengan pengulangan
sebanyak 3 kali (Harahap, 2006).
c. Uji Akurasi EPMS standar
Larutan  EPMS  standar  sebanyak
0,3  mL  ditambahkan  dalam  plasma tikus 0,3 mL. Larutan plasma diinjeksikan  sebanyak  50  μL  pada KCKT dengan fase gerak metanol:asam fosfat  70:30,  kecepatan  laju  alir  1,0 mL/menit,  dan  panjang  gelombang maksimum.  Uji  akurasi  dilakukan dengan  pengulangan  sebanyak  3  kali (Harahap, 2006).
d. Uji Presisi EPMS standar
Larutan  EPMS  standar  sebanyak
0,3  mL  ditambahkan  dalam  plasma tikus 0,3 mL. Larutan plasma diinjeksikan  sebanyak  50  μL  pada KCKT dengan fase gerak metanol:asam fosfat  70:30,  kecepatan  laju  alir  1,0 mL/menit,  dan  panjang  gelombang maksimum. Uji presisi dilakukan dengan  pengulangan  sebanyak  3  kali pada hari yang sama dan pada 3 hari yang berbeda (Harahap, 2006).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan
Panjang Gelombang Maksimum  Etil  p-Metoksisinamat (EPMS)
Penentuan  panjang  gelombang maksimum  senyawa  EPMS  standar
menggunakan  spektrofotometer  UV- Visibel.  Penggunaan  spektrofotometer UV-  Visibel  dapat  memberikan  hasil analisis  kualitatif  dan  kuantitatif.  Data kualitatif yang didapatkan berupa panjang gelombang maksimum dan data kuantitatif yang didapatkan berupa nilai A  (absorbansi).  Penentuan  panjang gelombang  maksimum  EPMS  diukur pada  rentang  200-400  nm,  karena EPMS memiliki gugus kromofor sehingga  dapat  diperoleh  spektrum serapannya. Panjang gelombang maksimum  memiliki  kepekaan  yang maksimal hal ini menjadi dasar penggunaan panjang gelombang sebagai data  awal  penelitian.  EPMS  standar memiliki panjang gelombang maksimum  pada  310  nm  dapat  dilihat pada  Gambar  1.  Hal  ini  sudah  sesuai dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh Zhang (2020).
Gambar 1. Spektrum UV EPMS.

## Penetapan Waktu Retensi EPMS
Waktu  retensi  merupakan  waktu yang  diperlukan  sampel  keluar  dari kolom  dan  terdeteksi  oleh  detektor, setiap  senyawa  memiliki  waktu  retensi yang  berbeda-beda  karena  dipengaruhi oleh  laju  alir  dan  fase  gerak.  Semakin rendah laju alir maka kemampuan untuk memisahkan  komponen  senyawa  akan semakin tinggi serta menghemat penggunaan  fase  gerak  dan waktu yang dibutuhkan  untuk  analisis  akan semakin lama.  Fase  gerak  yang  digunakan  pada penetapan  waktu  retensi  EPMS  ini adalah  campuran  metanol  dan  asam fosfat.  Dasar  pemilihan  metanol  adalah kepolaran  dari  fase  gerak  yang  dapat disesuaikan.  Asam  fosfat  digunakan pada  fase  gerak  untuk  mengurangi terbentuknya tailing pada puncak EPMS.  Hal  yang  mendasari  pemilihan asam  fosfat  daripada  asam  lain  karena asam fosfat  merupakan asam yang  lebih kuat  daripada  asam  asetat,  tetapi  lebih lemah dari asam sulfat dan asam klorida. Selain itu, juga terkait dengan pencucian dari  kolom.  Asam  fosfat  akan  lebih mudah  untuk  terlarut  dalam  metanol saat  pencucian  dari  kolom.  Asam  yang tertinggal  dalam  kolom  dapat  merusak rantai C18. Perbandingan komposisi fase
gerak  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  untuk  mendapatkan  hasil  analisis EPMS  yang  optimal.  Fase  gerak  yang digunakan pada penelitian ini adalah fase gerak metanol:asam fosfat perbandingan 70:30  dan  80:20.  Peningkatan  jumlah
metanol  dalam  sistem  KCKT  fase terbalik  dilakukan  agar  EPMS  dapat terelusi  dengan  mudah.  Waktu  retensi EPMS  standar  pada  perbandingan metanol:asam fosfat 70:30 adalah 5,880 menit,  dapat  dilihat  pada  Gambar  2.
Gambar 2. Kromatogram EPMS Fase Gerak Metanol:Asam Fosfat 70:30.
Waktu  retensi EPMS  standar  pada  perbandingan  metanol:asam  fosfat  80:20 adalah 3,846 menit, dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Kromatogram EPMS Fase Gerak Metanol:Asam Fosfat 80:20
Waktu  retensi  EPMS  pada  fase gerak metanol:asam fosfat perbandingan 80:20          lebih  cepat  karena  memiliki jumlah  metanol  yang  lebih  banyak
dibandingkan  fase  gerak  metanol:asam fosfat  70:30  sehingga  polaritas  fase geraknya  meningkat.  Jumlah  metanol yang  lebih  besar  dalam  sistem  KCKT
fase  terbalik  akan  membuat  sampel terelusi lebih mudah.

## Preparasi Plasma Tikus
Tikus  diaklimatisasi  selama  14 hari  hal  ini  bertujuan  agar  hewan  uji dapat beradaptasi dengan baik. Aklimatisasi mempengaruhi hasil penelitian,  hal  ini  akan  terjadi  bila hewan uji stress atau tidak mendapatkan perlakuan  yang  sesuai.  Sebelum  uji dilakukan  hewan uji dipuasakan selama 24  jam,  sampel  yang  digunakan  adalah darah  yang  diambil  dari vena  lateralis yang  berada  pada  bagian  ekor  tikus. Darah  tikus  ditampung  dalam  tabung litium heparin yang bertujuan agar tidak terjadi  koagulasi  pada  darah  yang diambil.  Volume  maksimal  darah  yang diambil  dari  hewan  uji tidak  lebih  dari 10% dihitung dari masing-masing bobot badan  tikus.  Setelah  itu,  darah  tikus
akan disentrifugasi untuk
mengendapkan sel darah merah sehingga  didapatkan  plasma  darah.
Plasma  darah  ini  akan berada  di bagian atas dan sel darah  merah akan berada di bagian bawah karena adanya  perbedaan berat  jenis  antara  sel darah  merah  dan plasma  darah.  Plasma  darah  kemudian ditambahkan  dengan  metanol  yang bertujuan  untuk  mengendapkan  protein
yang terdapat di dalam plasma. Metanol akan mengendapkan
protein berdasarkan prinsip polaritas dan menurunkan  solubilitas  dari  protein. Plasma  darah  yang  telah  ditambahkan metanol selanjutnya dihomogenkan menggunakan  vortex  sehingga  proses pengendapan  protein  dalam  plasma darah  berjalan  optimal.  Setelah  itu, plasma  akan  disentrifugasi  kembali untuk  memisahkan  plasma  dengan protein  plasma.  Plasma  darah  ini  akan berada  di  bagian  atas  dan  protein plasma  akan  berada  di  bagian  bawah karena  adanya  perbedaan  berat  jenis antara protein plasma dan plasma darah. Plasma  darah  ini  yang  digunakan sebagai  bahan  pengujian  dengan  EPMS standar. Plasma darah digunakan karena obat  yang  masuk  ke  dalam  darah  akan berikatan  dengan  protein  plasma  yang sifatnya reversible .

## Validasi Metode

## Uji Kesesuaian Sistem
Uji kesesuaian sistem ini dilakukan untuk memastikan dan menjamin  bahwa  sistem  dan  metode yang digunakan harus mampu memberikan  data  yang  dapat  diterima.
Uji kesesuaian sistem dilakukan dengan menginjeksikan plasma yang
mengandung EPMS sebanyak 6 kali dan dihasilkan  data  berupa  lempeng  teoritis (N plate ),  faktor tailing ,  kapasitas kolom  (K+), Resolusi  (Rs),  dan simpangan  baku  relatif  (RSD).  Pada  uji
kesesuaian  sistem  ini  dilakukan  dengan menggunakan dua tipe fase gerak, yaitu metanol:asam fosfat 70:30 dan metanol:asam fosfat 80:20.
Tabel  1. Syarat  Uji  Kesesuaian  Sistem  Menurut International  Council  of Harmonisation (ICH) Guideline. No Parameter Syarat 1 Faktor tailing (TF) <2 2 Kapasitas kolom (K+) 2-10 3 Lempeng teoritis (N plate ) >2000 4 Resolusi (Rs) >1,5 5 Simpangan baku relatif (RSD) <2 Menurut  Gandjar  (2006),  suatu
metode  dapat  diterima  apabila  dari  uji kesesuaian sistem terdapat minimal dua parameter  yang  memenuhi  persyaratan.
Persyaratan uji kesesuaian sistem menurut International Council of Harmonisation  (ICH)  Guideline ada pada Tabel 1.
Tabel 2. Syarat Uji Kesesuaian Sistem menurut International Council of Harmonisation (ICH) Guideline. Perbandingan Pelarut TF K+ N Plates RS RSD 70:30 1,072 4,411 8188,339 1,93 7,317 80:20 1,134 2,506 8025,860 1,4 1,540 Hasil  uji  kesesuaian  sistem  pada Tabel  2  menggunakan  fase  gerak metanol:asam fosfat
perbandingan
70:30  dan  80:20  terdapat  hasil  yang sesuai dengan persyaratan yang disebutkan  dalam ICH  Guideline dapat disimpulkan bahwa sistem yang digunakan  telah  sesuai  dan  data  yang
dihasilkan dari eksperimen dapat diterima.

## Linearitas
Uji  linearitas  dilakukan  untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi  analit  dengan  luas  area dibawah  kurva  yang  dilihat  dari  nilai
koefisiem  relasi  (r).  Uji  linearitas dilakukan  dalam  5  konsentrasi,  yaitu  2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, dan 10 ppm.
Berdasarkan  hasil  uji  linearitas  pada gambar  3.4  ini  didapatkan  nilai  R 2 = 0,998.
Gambar 4. Linieritas EPMS Dalam Plasma.
Hasil  data   yang  didapatkan  telah memenuhi  syarat  uji  linearitas  dengan nilai  koefisien  relasi  mendekati  1. Linearitas  EPMS  dalam  plasma  ini hasilnya  dapat  dipengaruhi  dari  faktor ikatan dari plasma darah dengan EPMS. Ikatan  plasma  darah  dengan  EPMS sifatnya reversible sehingga ada kemungkinan tidak  semua  EPMS  dapat terikat di dalam plasma darah.

## Akurasi
Uji  akurasi bertujuan untuk memperoleh data seberapa tepat hasil  pengujian  dengan  kadar  yang sebenarnya.  Uji  akurasi  ini  dilakukan dengan  menggunakan  plasma  yang mengandung EPMS dengan 3
konsentrasi  yaitu  2,  6,  dan  10  ppm. Masing-masing konsentrasi diinjeksikan sebanyak 3 kali. Dari hasil analisis pada tabel  3.3  didapatkan  nilai  rata-rata  % perolehan kembali.
Tabel 3. Nilai Perolehan Kembali. Konsentrasi (ppm) % Recovery Syarat (%) 2 97,46 98-102 6 103,05 10
100,55
y = 91823x + 952654 R² = 0,998 0 500000 1000000 1500000 2000000 0 2 4 6 8 10 12 AUC ppm Linieritas Linear (Linieritas)
Presisi
Uji presisi bertujuan untuk menggambarkan kedekatan hasil pengukuran yang berulang pada konsentrasi  yang  sama.  Uji  presisi  ini dilakukan dengan menggunakan plasma
yang  mengandung  EPMS  dengan  3 konsentrasi  yaitu  2,  6,  dan  10  ppm. Masing-masing konsentrasi diinjeksikan sebanyak  3  kali.  Berdasarkan  hasil analisis  pada  tabel  3.4,  hasil  %  RSD.
Tabel 4. % RSD. Konsentrasi (ppm) Standar Deviasi % RSD Syarat (%) 2 1,34 68,83 <2% 6 0,25 4,10 10 2,41 23,99
Limit of Detection (LOD) dan Limit of

## Quantification (LOQ)
LOD  adalah  konsentrasi  analit terendah  dalam  sampel  yang  masih dapat  dideteksi,  meskipun  tidak  selalu dapat dikuantifikasi. LOQ adalah kosentrasi analit terendah dalam sampel yang  dapat  ditentukan  dengan  presisi dan  akurasi yang  masih  dapat  diterima pada  metode  yang  digunakan.  Nilai LOD  yang  didapatkan  adalah  2,747 µg/mL  yang  artinya  pada  konsentrasi tersebut EPMS dalam plasma masih bisa dideteksi.  Nilai  LOQ  yang  didapatkan adalah  9,158  µg/mL  yang  artinya  pada konsentrasi  tersebut EPMS dalam
plasma  presisi  dan    akurasinya  dapat ditentukan dan diterima hasilnya.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian, dapat  disimpulkan  bahwa  EPMS  dalam plasma darah dapat dianalisis menggunakan  KCKT.  Adapun  kolom yang  digunakan  untuk  analisis  EPMS dalam  plasma  menggunakan  KCKT  ini adalah  kolom  C18  dan  fase  gerak  yang baik  digunakan  dalam  analisis  ini adalah metanol:asam fosfat 70:30.

## DAFTAR PUSTAKA
European  Medicines  Agency.  2011. Guideline on bioanalytical method validation . United
Kingdom:  European  Medicine Agency. 13-15.
Fernando, E. 2020. Perbandingan Parameter  Bioavailabilitas  Etil P-  Metoksisinamat  (EPMS) Standar  Dengan  EPMS  Isolat Pada  Tikus  Wistar  Jantan. ( Skripsi ). Sekolah Tinggi
Farmasi  Indonesia.  Halaman 11-12.
Gandjar,  I.G.,  dan  Rohman,  A.  2007. Kimia Farmasi Analisis .Yogyakarta: Pustaka
Utama. Halaman 37-43.
Harahap, Y., Mansur, U., dan Sinandang,
T. Analisis Glimepirida Dalam Plasma Tikus . Pharmaceutical Sciences  and  Research . 2006, 3(1): 22-37. Harmita. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah  Ilmu Kefarmasian. 2004,  1(3):  117- 135.
Isadiartuti,  D.,  Prihantini,  I.K.,  dan Agustina,  A.P.  Development and  Validation  of  an  HPLC Method  for  the  Determination of p  -methoxycinnamic Acid  in Rabbit  Plasma. International Conference on Applied Pharmaceutical Sciences . 2018. pp 29-34. Kurniawati,  A.  2016.  Validasi  Metode Analisis Etil p - Metoksisinamat  dalam  Plasma secara  In  Vitro  menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT). ( Skripsi ). Fakultas  Farmasi.  UIN  Syarif
Hidayattulah Jakarta. Halaman. 4; 26-27.
Mukherjee, A., and Bera, A. A detailed study  of  validation  parameters and  system  suitability  test  in
HPLC. Research  Journal  of
Pharmaceutical,
Biological
and  Chemical  Sciences .  2012,
3(4): 426-447.
Rachmaniar, R., Warya, S., Ferdiansyah,  R.,  Riasari,  H., and Kenti. Pharmaceutical Cocrystal of Ethyl p- Methoxycinnamate: Formulation and Characterization. 2nd  Bakti Tunas  Husada-Health  Science International Conference . 2020. 6: 96-101. Setyawan,  E.,  Putratama,  P.,  Ajeng, A.D.,  dan  Rengga,  W.D.P. Optimasi Yield Etil p- Metoksisinamat Pada Ekstraksi Oleoresin  Kencur  ( Kaempferia galanga ) Menggunakan Pelarut Etanol. Jurnal  Bahan  Alam Terbarukan . 2012, 1(2):    31-38.
Shargel,  L.,  and  Andrew,  B.C.  2012. Apllied Biopharmaceutical and Pharmacokinetics ( 7th ed.).  The McGraw-Hill Companies. 469- 470.
Susanti,  M.,  dan  Dachriyanus.  2014. Kromatografi  Cair  Kinerja Tinggi. Padang:  Universitas
Andalas. Halaman. 55-67. Zhang,  K.,  Wenxia,  X.,  and  Shuge,  T. Comparative  Study  On  The Determination  of  Ethyl  p- Methoxycinnamate In Kaempferia  Galanga  Rhizome by HPTLCS and HPLC. Journal of Planar Chromatography .  2020,  33(1): 1-7.