Perbandingan  Tingkat  Kematangan  Inti  Oosit    Sapi Pasca  Maturasi  In Vitro dengan  Penambahan  Serum Buatan  10  %  dan  Fetal  Bovine  Serum 10 %
(Comparison Nuclear Maturation of  Bovine Oocyte after In Vitro Maturation Suplemented with  10% Home-made Serum and 10 % Fetal Bovine Serum)
Rini Widyastuti 1 , Rangga Setiawan 1 , Siti Darodjah Rasad 1
1) Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan, Departemen Produksi Ternak, Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran Email: widyastuti25@gmail.com
Abstrak
Serum  merupakan  salah  satu  suplemen  yang  diperlukan  pada  media  untuk  maturasi  in vitro.Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan  tingkat kematangan inti oosit maturasi in vitro selama 24 jam dalam media maturasi yang ditambahkan serum buatan 10% dan Fetal Bovine Serum (FBS) 10%. Oosit dikoleksi dengan metode slicing dalam media modified  phosphate buffer saline . Oosit  yang  digunakan  adalah  oosit  yang  masih  dilapisi  dua  lapis  sel kumulus  dan  mempunyai sitoplasma homogen.Oosit dikultur menggunakan media maturasi dalam inkubator CO2 suhu 38 0 C dan  CO2  5%.  Setelah  24  jam  oosit  difiksasi  untuk  mengevaluasi  tingkat  kematangan  inti.  Hasil analisis  menunjukkan  bahwa tingkat  kematangan  inti  oosit  sapi  yang  dimaturasi  secara  in  vitro dengan  penambahan  FBS  10%  nyata  lebihtinggi  apabila  dibandingkan  dengan  yang  ditambahkan dengan serum buatan10% (78,5% vs 62,5% ; P < 0,05) Kata kunci: maturasi in vitro,  tingkat kematangan inti, serum.

## Abstract
Serum is  one of the  important component that supplemented to in  vitro maturation media. The objective of the research was to investigate  their meiotic competence or nuclear maturation of bovine oocytes maturated invitro in maturation media were added with home made serum 10% and Fetal  Bovine  serum  (FBS)  10%.  Oocytes  were  collected  by slicing  the  ovaries  in  modified phosphate  buffer  saline.  Selected  cumulus-oocyte  complexes  (COCs)  homogenousooplasm    were cultured  in  maturation  medium  at  38 0 C  in  humidified  atmosphere  of  5%  CO2  incubator.  After  24 hours, oocytes stained for nuclear maturation’s evaluation.  The result showed that the proportion of  oocytes  at  metaphase  II  was  higher  and  significantly  difference  on  oocytes  that  supplemented with Fetal Bovine Serum 10 % than supplemented with  home- made serum 10% (78,5% vs 62,5% P < 0,05)
Keyword: in vitro maturation,nuclear maturation, serum .

## Pendahuluan
Berdasarkan hasil sensus penduduk, laju pertumbuhan  penduduk  1,5  persen  per  tahun sehingga kebutuhan daging sapi akan lebih dari 500.000  ton  pada  akhir  2019.  Dalam  rangka mendorong  pertumbuhan  ternak  sapi  baik  dari segi kuantitas maupun kualitas maka diperlukan adanya  suatu  pendekatan  yang  inovatif  yang mampu memberikan solusi pemenuhan permintaan  produk  peternakan  yang  tinggi  dan
terus  tumbuh  dengan  cepat.Revolusi serta inovasi ilmu  pengetahuan  dan  teknologi  (Iptek) terutama  dalam  bidang  bioteknologi  menjadi pilihan  yang  rasional  dan  diterima  dengan  baik di bidang  peternakan.  Salah  satu  inovasi bioteknologi  di bidang  peternakan  adalah bioteknologi reproduksi yang meliputi: pengelolaan  semen  cair,  pengolahan  semen beku,  sexing  spermatozoa,  pengelolaan    oosit dan  embrio.  Penerapan  teknologi  reproduksi  di
bidang  peternakan  akan  mampu  membantu meningkatkan populasi hewan, menjaga ketahanan  genetik  dan  mampu  meningkatkan produktivitas  ternak  dalam  waktu  yang  cepat dengan  kualitas  maksimal.    Dengan  penerapan teknologi yang tepat, maka peternak dapatmeningkatan  populasi  dan  kualitas  ternak sehingga pemerintah dapat mengurangi kebutuhan impor produk pangan asal hewan dan mewujudkan  ketahanan  dan  keamanan  pangan nasional.
Salah  satu  metoda  teknologi  reproduksi yang  rutin  dilakukan  di  bidang  peternakan adalah  dengan  teknologi  transfer  embrio. Teknologi ini  meliputi  serangkaian  proses  yang cukup  kompleks  yaitu:  superovulasi  betina, sinkronisasi  estrus,  produksi  embrio  secara in vivo maupun secara in  vitro dan  proses transfer embrio.  Produksi  embrio  secara in  vitro akan lebih  efektif  apabila  dapat  memanfaatkan ovarium yang berasl dari Rumah Potong Hewan (RPH),  namun demikian  sebagian  besar  oosit yang  diperoleh  dari  RPH  masih  berada  pada tahap metaphase I    (MI)  dan  tahap Germinal Vesicle (GV).  Kondisi  tersebut  menunjukkan bahwa  oosit tersebut  perlu  dimatangkan  secara in  vitro hingga  mencapai  tahap  Metafase  II (MII)  agar  dapat  difertilisasi  dan  berkembang lebih  lanjut.  Pada  proses  maturasi invitro diperlukan  media  pematangan  yang  mampu mensupport perkembangan oositimmature menjadioosit matur  yang  siap  untuk  fertilisasi dan  dapat  berkembang  ke  tahap  blastosist. Keberhasilan  maturasi  oosit  secara  in  vitro sangat tergantung pada beberapa faktor diantaranya  jenis  suplemen  yang  digunakan dalam media maturasi in vitro (Hammam et al., 2010), kualitas oosit yang digunakan (Lonergan et  al .,  2003;  Anguita et  al .,  2007),  serta  resiko kontaminasi dan kondisi kultur (Sagirkaya et al., 2007).  Salah  satu  komponen  media kultur  yang paling  krusial  adalah  penambahan  serum. Selama  ini,  serum  yang  digunakan  sebagai suplementasi  untuk  media  kultur  pada  maturasi in  vitro adalah Bovine  Serum  Albumine (BSA), Fetal  Calf  Bovine  Serum (FBS)  dan Newborn Calf  Bovine  Serum (NCBS).Semua  jenis  serum tersebut  merupakan  hasil  dari  industri  dan harganya relative mahal (Wattimena,
2006).Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk mengkaji dan mengetahui pengaruh penambahan  FBS  dan  serum  buatan  terhadap tingkat  kematangan  inti  oosit  sapi  setelah maturasi  invitro.Hasil  dari  penelitian  ini diharapkan dapat dimanfaatkan untuk mendapatkan informasi mengenai sumber serum yang  mudah  diperoleh  dan  lebih  ekonomis untuk media maturasi oosit secara in vitro .

## Materi dan Metode Materi yang digunakan
Ovarium  diambil  dari  sapi  yang diperoleh  dari  RPH  setempat.  Serum  yang digunakan  dibuat  dengan mengambil darah yang  berasal  dari  induk  sapi.  Darah  diambil menggunakan venojack sebanyak  3  cc  pada vena  jugularis kemudian  disimpan  didalam lemari  pendingin  dengan  suhu  5 o C  selama  1 jam.  Darah  kemudian  disentrifugasi  1000  rpm selama  5  menit,  supernatant  dibuang  dan lakukan  kembali  sentrifugasi  1000  rpm  selama 5  menit.  Serum  disimpan  didalam  lemari pendingin  dengan  suhu  5 o C.  Serum  yang  akan digunakan terlebih dahulu deaktivasi kitin.

## Media yang Digunakan
Media  koleksi  ovarium  adalah  NaCl fisiologis  ditambah  penisilin  100  IU/ml, streptomisin  100  µg/ml.  Media  koleksi  oosit adalah modified  phosphate  buffered  saline (mPBS).Media  dasar  yang  digunakan  untuk maturasi in vitro adalah  ( Tissue Culture Media ) TCM  199  ditambah  penisilin  100  IU/ml, streptomisin 100  µg/ml dan follicle stimulating hormone /(FSH  (Sigma,  USA)  0,01  mg/ml. Media  maturasi  dibedakan  menjadi  dua  yaitu; (a)  media  dasar  yang  disuplementasi  dengan Fetal  Bovine  Serum (FBS) 10  %,  Sigma,  USA (b)  media  dasar  yang  disuplementasi  dengan serum buatan yang telah disiapkan sebelumnya.

## Koleksi ovarium dan koleksi Oosit
Ovarium sapi yang diperoleh dari rumah potong  hewan  (RPH)  lokal  disimpan  dalam termos  dengan  media  koleksi  (NaCl  fisiologis) suhu  30-35°C.Ovarium  dicuci  dengan  media koleksi,  oosit  dikoleksi  dengan  metode slicing dan  dicuci  3  kali,  pencucian terakhir  dengan media maturasi.Selanjutnya oosit dibagi menjadi dua bagian, kelompok pertama digunakan untuk
perlakuan maturasi dengan menggunakan media dasar  yang  disuplementasi  dengan  FBS  10% sedangkan  kelompok  oosit  kedua  digunakan untuk  perlakuan  maturasi  menggunakan  media dasar yang disuplementasi dengan serum buatan 10%.Hanya  oosit  dengan  sitoplasma  homogen yang digunakan sebagai penelitian.

## Maturasi oosit
Oosit  dicuci  sebanyak  3  kali  dengan media  dPBS  kemudian  oosit  dipindahkan  ke dalam 100 µLdrop  media maturasi yang dibuat pada petridish steril lalu ditutup dengan mineral oil.  Setiap  drop  media  maturasi  berisi  sekitar yaitu  10-15  oosit.  Selanjutnya  oosit  diinkubasi selama  24  jamdalam    incubator    pada  suhu 38,5°C, 5% CO2 dan kelembaban 95%.

## Evaluasi hasil maturasi
Evaluasi  hasil  maturasi  oosit  dengan metode pewarnaan aceto-orcein 2 %. Oosit yang telah dimaturasi, dilepaskan dari sel-sel cumulus yang  mengelilinginya  dengan  menggunakan enzyme hyaluronidase 0,25 %. Oosit yang telah bebas  dari  sel  cumulus  diletakkan  pada  drop KCl  0.90%  di  atas  kaca  objek,  lalu  difiksir dengan  kaca  penutup  yang  memiliki  bantalan paraffin  dan  vaselin  (1  :9)  pada  keempat sudutnya. Kaca  objek yang berisi  oosit tersebut dimasukkan  ke  dalam  larutan  fiksasi  yang mengandung  asam  asetat  dan  ethanol  (1:3) selama  3-4  hari.  Satu  jam  sebelum  diwarnai, kaca  object  yang  berisi  oosit  direndam  terlebih dahulu dalam larutan ethanol absolut. Setelah itu oosit diwarnai dengan pewarnaan aceto-orcein 2 %  selama  lima  menit.  Larutan  pewarna dibersihkan  dengan  asam  asetat  25%  dan keempat sisi kaca penutup dilapisi  cairan kuteks bening untuk selanjutnya dilakukan pengamatan morfologi  inti  dengan menggunakan  mikroskop fase  kontras.  Evaluasi  tingkat  kematangan  inti yang  diamati  pada  penelitian  ini  adalah  dengan
cara  menghitung  jumlah  oosit  pada  setiap pembelahan  meiosis  mulai  dari Germinal
Vesicle (GV) ,Germinal Vesicle Break Down (GVBD) MetafaseI (MI)  dan  metafase-II (M-II). Analisis data Penelitian menggunakan metode eksperimental laboratorium.Perlakuan yang dicobakan  adalah  maturasi in  vitro dengan menggunakan  mediadasar  yang  disuplementasi dengan  FBS  10%  dan  maturasi in  vitro dengan menggunakan  mediadasaryang  disuplementasi dengan  serum  buatan  10%.    Parameter  yang diamati  adalah:  tingkat  kematangan  inti  oosit yang  terdiri  dari  tahap germinal  vesicle (GV), germinal vesicle breakdown (GVBD), metafase- I  (M-I)  dan  metafase-II  (M-II).  Data  dianalisis dengan menggunakan Chi-Square .

## Hasil dan Pembahasan
Maturasi invitro merupakan  tahapan krusial  pada  fertilisasi  secara in  vitro ,  karena pada  tahap  ini  oosit akan  melanjutkan perkembangan  sampai  tahap  metaphase  II sehingga dapat difertilisasi dan mampu berkembang  ke  tahap  lebih  lanjut.  Pada  proses IVM  diperlukan  media  pematangan  yang  tepat sehingga nutrisi dan komponen yang diperlukan untuk  proses  perkembangan  oosit tersebut. Salah  satu  komponen  utama  yang  diperlukan dalam  media  pematangan  adalah  serum.Serum mengandung  beberapa  komponen  esensial seperti:  protein,  hormone,faktor-faktor  yang mendukung  pertumbuhan  ( growth  factor )yang sangat  diperlukan  oosit pada  proses  maturasi, fertilisasi, maupun perkembangan embrio (Bavister, 1995).Hasil observasi tingkat kematangan  inti  oosit  yang  ditambahkan    FBS 10 % dan serum buatan 10% dapat diamati pada Tabel 1 di bawah:
Tabel 1.Tingkat kematangan inti oosit sapi Perlakuan Tingkat Kematangan Inti (%) jml oosit GV GVBD M-I M-II Serum Buatan 10% 27 0,00 + 0,00 7,50+ 3,54 a 25,00 + 7,07 c 62,50 + 3,50 d FBS 10% 46 0,00 + 0,00 0,00+ 0,00 b 21,50 + 2,12 c 78,50 + 2,12 e
GV: Germinal  Vesicle ,  GVBD :  Germinal  Vesicle  Break  Down ,  M-I  :  Metafase  I,  M-II  :  Metafase  II,  TI  : Tidak teridentifikasi. Huruf berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan nyata (P<0.05)
Oosit yang  berada  pada  tahap  MII merupakan  sel  yang  telah  matang  dan  siap  untuk dilakukan  fertilisasi.  Berdasarkan  tabel  di  atas, dapat diamati bahwa penambahan FBS 10 % pada media  pematangan  memberikan  hasil  yang  lebih baik  apabila  dibandingkan  dengan  penambahan serum buatan  10%  dan  secara  statistik  berbeda nyata  (78,5%  vs    62,5  %).  Hasil  penelitian  ini sejalan dengan  hasil  penelitian  Sagirkaya et  al . (2004) dan  Abdel-Razik  2007  (76,8%)  dalam Gabr  2012,  yang  menunjukkan efektivitas penggunaan 10% FCS jika dibandingkan dengan serum  lain  dan  atau  tanpa  serum.  Namun demikian,  hasil  yang  diperoleh  pada  penelitian ini lebih rendah apabila dibandingkan hasil yang diperoleh  Gabr  2012  (81,3%).  Hal  ini kemungkinan disebabkan oleh perbedaan media kultur yang digunakan.
Oosit yang berada pada tahap Metafase I,  tidak  berbeda  nyata  antara  maturasi  yang menggunakan  FBS  10%  dan  serum  buatan 10%.Selain itu pada penambahan serum buatan 10%  di media maturasi, masih ditemukan oosit yang  berada  pada  tahap  GVBD.Hal  ini kemungkinan  ini  menunjukkan  bahwa  FCS masih lebih efektif digunakan sebagai suplemen pada  media  maturasi  apabila  dibandingkan dengan serum buatan. Menurut Mao et al ., 2002 penggunaan  FCS masih  jauh  lebih  efektif untuk  kultur  folikel  pre  antral  dan  COC dibandingkan  dengan  serum  yang  berasal  dari pre  pubertas.  Hal  ini  disebabkan  karena  FCS merupakan  serum  fetus  sapi  yang  banyak mengandung  zat  yang  dibutuhkan  oleh  oosit selama  proses  kultur  in  vitro.  Mucci et  al . (2006) menyatakan bahwa FCS dapat menyediakan  substrat  energi,  asam  amino, vitamin, growth  factor dan antioksidan. Zat-zat tersebut merupakan zat yang bermanfaat selama proses  kultur in  vitro . Fetal  calf  serum juga
dapat  bersifat  sebagai biosecurity yang  dapat menghambat resiko kontaminasi patogen selama  kondisi  kultur in  vitro (Moore  dan Bonilla, 2006).

## Kesimpulan
Penambahan Fetal  Calf  Serum 10  % dalam  media  maturasi  oosit,  memberikan  hasil yang  lebih  baik  apabila  dibandingkan  dengan penambahan serum buatan 10 %.
Saran
Pada  penelitian  selanjutnya  disarankan untuk melihat perbandingan tingkat perkembangan  embrio  secara  in  vitro  pada media  kultur  yang  menggunakan Fetal  Calf Serum 10 % dengan serum buatan 10 %.

## Daftar Pustaka
Abd  El-Razik,  H.M. 2007. Factors  affecting developmental  competence  of  buffalo oocytes. M. Sc. Thesis, Faculty of Vet. Med.,  Suez  Canal  University,  Egypt dalam Gabr,  S.A.  2012 . Effect  of maturation media with hormonal supplement  on in  vitro maturation  of buffalo oocytes with different qualities. Egyptian J. Anim. Prod. 49:1-10 Anguita,  B.,  L.  Vandaele.,  B.  Mateusen.,  D. Maes  and  A.  Van  Soom.  2007. Developmental  competence  of  bovine oocytes  is  not  related  to  apoptosis incidence  in  oocytes,  cumulus  cells  and blastocysts. Theriogenology. 67: 37-49. Bavister,B.D.1995.  Culture  of  Preimplantation Embrio:  Fact  and  Artifact. Hum.  Rep.
Update 1(2): -98-148.
Gabr,  S.A.  2012 . Effect  of  maturation  media with  hormonal  supplement  on in  vitro maturation  of  buffalo  oocytes  with
different  qualities. Egyptian  J.  Anim. Prod. 49:1-10 Hammam, A. M., C. S. Whisnant,  A. Elias., S. M.  Zaabel.,  A.  O.  Hegab  and  E.  M. Abu-El  Naga.  2010.  Effect  of  media, sera  and  hormones  on in  vitro maturation  and  fertilization  of  water buffallos  ( bubalus  bubalis ). J.  Anim. Vet. Adv . 9: 27-31.
Lonergan, P., D. Rizos, A. G. Adan, T. Fair and M.  T.  Boland.  2003.  Oocyte  and embryo quality: affect of origin, culture conditions and gene expression patterns. Reprod. Domest. Anim . 38: 59-67.
Mao,  J.,  Wu,  G.,  Smith,  MF.,  McCauley,  TC., Cantley, TC., Prather, RS., Didion, BA.,
Day,  BN. Effects  of  Culture  Medium, Serum Type, and Various Concentrations  of  Follicle-Stimulating Hormone on Porcine Preantral Follicular  Development  and  Antrum Formation  In  Vitro. 2002. Biology
ofReproduction. 67 : 1197–1203.
Mucci,  N.  J.  A.,  G.  G.  Kaiser.,  F.  Hozbor.,  J. Cabodevila  and  R.  H.  Alberio.  2006. Effect  of  estrous  cow  serum  during bovine  embryo  culture  on  blastocyst development  and  cryotolerance  after slow freezing
or vitrification.
Theriogenelogy . 65: 15-26.
Moore,  K    and  A.  Q.  Bonilla.  2006. Cryopreservation of mammalian
embryo. Biomed. Sci . 8: 19-32.
Sagirkaya,  H.,  M.  Yaúmur,  Z.  Nur  and  M.  K. Soylu.  2004.  Replacement  of  fetal  calf serum with synthetic serum substitute in the  in  vitro  maturation  medium:  effects on maturation, fertilization and subsequent development of cattle oocytes in vitro. Vet. Anim. Sci . 28: 779- 784.
Wattimena,  J.,  Tagama.,  T.R.,  Hadisusanto,  B. 2006.  Pengaruh  Jenis  dan  Konsentrasi Serum  terhadap  Maturasi  Oosit  Domba In  Vitro. Animal  Production. 8(2):94- 99.
Sagirkaya,  H.,  M.  Misirlioglu.,  A.  Kaya,  N.  L. First., J. J. Parrish and E. Memili. 2007. Developmental  potential  of  bovine oocytes cultured in  different  maturation and  culture  conditions. Anim.  Reprod. Sci . 101: 225-240.
Wu ,J.,  Emery., B.R and  Carrell., DT. 2001. In
Vitro Growth, Maturation, Fertilization, and Embryonic Development of Oocytes from Porcine Preantral Follicles. Biol of Reprod. 64: 375–381