Uji Efektivitas Analgesik Ekstrak Kulit Kakao ( Theobroma cacao L.) terhadap Licking Time Mencit yang Diinduksi Formalin
The Analgesic Effectiveness Test of Cocoa Husk (Theobroma cacao L.) Extract to Licking Time of Mice Induced by Formalin
Yuli Lusiana Sari 1 , Desie Dwi Wisudanti 2 , Muhammad Ali Shodikin 3
1 Program Studi Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember
2 Laboratorium Farmakologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember
3 Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember Jalan Kalimantan No. 37, Jember, Indonesia, 68121 e-mail korespondensi: desie.fk@unej.ac.id

## Abstrak
Kakao ( Theobroma cacao L.) merupakan bahan industri yang sering dimanfaatkan dalam produksi coklat, namun bagian  yang  dimanfaatkan  adalah  biji  sehingga  kulitnya  menumpuk  sebagai  limbah.  Tujuan  penelitian  ini  adalah untuk mengetahui efektivitas analgesik ekstrak kulit kakao terhadap licking time mencit yang diinduksi formalin. Penelitian ini menggunakan sampel berjumlah 28 ekor mencit yang dibagi menjadi tujuh kelompok. Kelompok K (-) diberikan  NaCMC  1%,  K (+) diberikan  0,0048  mg/gBB  natrium  diklofenak,  serta  kelompok  K 1 ,  K 2 ,  K 3 ,  K 4 ,  dan  K 5 diberikan  variasi  dosis  ekstrak  kulit  kakao,  yaitu  0,25  mg/gBB,  0,5  mg/gBB,  1  mg/gBB,  2  mg/gBB  dan  4  mg/gBB secara peroral 30 menit sebelum injeksi subkutan 200 μL formalin 2,5% pada kaki belakang. Grafik dose response data licking time fase pertama bersifat fluktuatif dengan persentase inhibisi tertinggi terjadi pada kelompok ekstrak dosis 0,5 mg/gBB dan 1 mg/gBB, yaitu 68,750% sedangkan pada data licking time fase kedua bersifat bifasik dengan persentase  inhibisi  tertinggi  terjadi  pada  kelompok  ekstrak  dosis  1  mg/gBB,  yaitu  94,052%.  Analisis One  Way ANOVA menunjukkan  perbedaan  yang  tidak  signifikan  (p>0,05)  pada  data licking  time fase pertama,  namun menunjukkan  perbedaan  yang  signifikan  (p<0,05)  pada  data licking  time fase  kedua.  Kesimpulan  penelitian  ini adalah ekstrak kulit kakao dapat menurunkan licking time fase kedua, yaitu fase inflamasi secara signifikan.
Kata kunci : kakao, analgesik, licking time, formalin, fase inflamasi

## Abstract
Cocoa  (Theobroma  cacao L )  is  an  industrial  material  that  often  used  in  chocolates  production,  but  the  part  that used is cocoa bean, so that cocoa husk accumulate as waste. This study aimed to determine effectiveness of cocoa husk  extracts  to  first  and  second  phase  of  licking  time  of  mice  induced  formalin.  This  study  used  28  mices  that divided  into  seven  groups.  NaCMC  1%  to  group  K (-  ) ,  0.0048  mg/gBW  sodium  diclofenac  to  K (+) ,  extracts  dose variations,  ie  0.25  mg/gBW,  0.5  mg/gBW,  1  mg/gBW,  2mg/gBW  and  4  mg/gBW  to  group  K 1 ,  K 2 ,  K 3 ,  K 4 ,  and  K 5 administered orally 30 minutes before subcutaneous injectionof 200 μl formaldehyde 2.5% on hind paw. Graph of dose  response  on  first  phase  data  was  fluctuate  with  highest  inhibition  percentage  occurred  on  dose  group  0,5 mg/gBW  and  1  mg/gBW,  that  is  68,750%  while  on  second  phase  data  was  biphasic  with  highest  inhibition percentage occurred on dose group 1mg/gBW, that is 94,052%. One Way ANOVA analysis showed no significant difference  (p>  0.05)  on  first  phase,  but  showed  significant  difference  (p  <0,05)  on  second  phase.  This  results indicated that cocoa husk extracts can decrease secondphase, inflammatory phase significantly.
Keywords : cocoa, analgesic, licking time, formaldehyde, inflammatory phase

## Pendahuluan
Indonesia  merupakan  produsen  kakao  terbesar ketiga  di  dunia  setelah  negara Pantai Gading dan Ghana .  Luas  lahan  tanaman  kakao ( Theobroma cacao L.)  di  indonesia  kurang  lebih  992.448  Ha dengan  produksi  biji  kakao  sekitar  456.000  ton  per tahun. Theobroma  cacao  L merupakan  bahan industri yang sering dimanfaatkan dalam pembuatan coklat,  namun  bagian  yang  dimanfaatkan  dari tanaman  tersebut  adalah  biji  sehingga  bagian kulitnya menumpuk sebagai limbah, yaitu mencapai 75%  dari  total  produksi  (DEPPERIN,  2007  dan Wahyudi et al., 2008).
Kulit  kakao  mengandung  zat  fenolik  yang konsentrasinya lebih tinggi dibandingkan dengan biji kakao  (Kumari et  al., 2011).  Senyawa  fenolik  dalam kulit kakao terdiri dari polifenol, katekin, epikatekin, prosianidin  polimer,  prosianidin  B2,  dan  jenis molekul  flavonoid  lainnya.  Senyawa  tersebut  dapat menghambat  reaksi  imun  pro-inflamasi  penginduksi nyeri,  misalnya  polifenol  dapat  menghambat  efek PGE2,  TNF- α,  IL -6,  dan  IL- 1β,  epikatekin  dapat menghambat  TNF- α  dan  IL -6,  serta  prosianidin  B2 dan  katekin  dapat  menurunkan  TNF- α  (Andujar et al., 2011).
Nyeri  merupakan  suatu  respons  peradangan  akibat sensasi  perangsangan  sistem  saraf  (Price et al., 2006).  Sensitisasi  respons  nyeri  perifer dimodulasi oleh mediator proinflamasi yang diproduksi oleh sel imun,  seperti  IL-5,  serotonin,  dan  histamin  yang diproduksi  oleh  sel  mast.  Sedangkan  TNF- α,  IL - 1β, dan  IL  6  diproduksi  oleh  sel  mast,  neutrofil,  dan makrofag.  Selain  itu,  juga  terdapat  PGE2  yang diproduksi  oleh  makrofag  den  sel innate lainnya. Mediator-mediator  tersebut  akan  merangsang neuron  nosiseptor  sehingga  menimbulkan  nyeri (Ribeiro et al., 2016).
Analgesik  merupakan  istilah  medis  yang  digunakan untuk  suatu  bahan  yang  mengurangi  nyeri  tanpa menyebabkan  hilangnya  kesadaran  (Dorland,  2012). Golongan  analgesik  non  opioid  yang  paling  sering digunakan  adalah  ibuprofen,  asam  mefenamat,  dan natrium diklofenak. Penggunaan analgesik yang tidak terkontrol  dapat  menyebabkan  efek  samping  pada pencernaan  secara  signifikan.  Salah  satu  efek samping penggunaan Non Steroidal Anti
Inflammatory Drugs (NSAID) dalam dosis tinggi pada sistem pencernaan,  yaitu  kerusakan  mukosa lambung. Hal  itu terjadi karena  NSAID menghambat enzim cyclooxygenase-1 (COX-1),  enzim  katalisator dalam produksi  prostaglandin  yang  berfungsi  untuk
melindungi mukosa lambung (Syarif et al., 2012).
Pusat penelitian kopi dan kakao (Puslit Koka) jember merupakan  salah  satu  pusat  penelitian  kopi  dan kakao  di  Indonesia  yang  telah  mengalami nasionalisasi,  yaitu  suatu  perusahaan  milik  swasta yang  telah  diambil  alih  oleh  negara  (DEPPERIN, 2007)  Kondisi  tersebut  sangat  mendukung  adanya kegiatan  penelitian  terkait  pemanfaatan  tanaman Theobroma cacao L.
Pada penelitian ini dilakukan uji efektivitas analgesik ekstrak kulit kakao dilihat dari akumulasi waktu yang dibutuhkan  untuk  respons  menjilat  ( licking  time ) pada  kaki  belakang  mencit  yang  diinduksi  formalin. Pada  uji paw  licking  time, hewan  coba  akan mengalami  efek  perilaku  dalam  dua  fase  respons nosiseptif.  Substansi  P  dan  bradikinin  berperan penting  dalam  respons  nyeri  fase  pertama,  yaitu fase neurogenik (3-5 menit setelah injeksi formalin) yang  terjadi  karena  stimulasi  direk  serat  saraf sensori.  Mediator  inflamasi  seperti  histamin, serotonin,  prostaglandin,  dan  bradikinin  berperan penting  dalam  respons  nyeri  fase  kedua,  yaitu  fase inflamasi  (Chang et  al., 2010  dan  Shibata et  al., 1989).  Peneliti  berharap  hasil  penelitian  ini  dapat memberikan  wawasan  baru  bagi  dunia  kesehatan bidang farmakologi dan bagi masyarakat.

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  sudah  mendapatkan  perijinan ethical clearence dari  Komisi  etik  Fakultas Kedokteran Universitas  Jember.  Identifikasi  tanaman  kakao ( Theobroma  cacao L.)  dilakukan  di  Laboratorium Agronomi  Fakultas  Pertanian  Universitas  Jember. Proses  ekstraksi  kulit  kakao  ( Theobroma  cacao L.) dengan larutan aseton dan akuades dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas  Jember.  Pemeliharaan  dan  perlakuan hewan coba dilakukan di Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember.
Kandungan  yang  terdapat  pada  kulit  kakao ( Theobroma cacao L.) diambil dengan menggunakan proses  ekstraksi.  Ekstraksi  tersebut  menggunakan larutan  aseton  dan  akuades  dengan  metode maserasi. Prosedur pengekstrakan dilakukan melalui tahap pemisahan kulit dengan biji kakao, pencucian, pemotongan,  pengeringan  di  dalam  inkubator  60 o C selama  lima  hari,  penghalusan  menggunakan blender,  dan  pengayakan  sehingga  didapatkan serbuk  halus  kulit  kakao  ( Theobroma  cacao L.). Sebanyak 400 gram serbuk halus dimaserasi dengan
larutan  4  L  aseton/akuades  v/v  50/50  pada  suhu kamar selama 24 jam. Maserat disaring menggunakan  kertas buchner dan  disentrifugasi dengan  kecepatan  5000  rpm.  Filtrat  diuapkan menggunakan waterbath pada  suhu  60 o C  hingga diperoleh ekstrak kental (Kim et al., 2004).
Penelitian  ini  menggunakan  sampel  berjumlah  28 ekor  mencit  jantan  dengan  berat  20-30  gram  dan umur  2-3  bulan.  Sampel  dibagi  menjadi  tujuh kelompok, yaitu satu kelompok kontrol negatif (K (-) ), kelompok  kontrol  positif  (K (+) )  dan  lima  kelompok perlakuan  yang  diberi  ekstrak  kulit  kakao ( Theobroma  cacao L.).  Pemberian  NaCMC  1%  pada kelompok  K (-) ,  0,00448  mg/gBB  natrium  diklofenak yang  dilarutkan  dalam  NaCMC  1%  pada  kelompok K (+) ,  dan  variasi  dosis  ekstrak  kulit  kakao  pada  lima kelompok  perlakuan  diberikan  secara  peroral  30 menit  sebelum  injeksi  subkutan  200  μL  formalin 2,5%  pada  kaki  belakang  mencit.  Variasi  dosis ekstrak  kulit  kakao  yaitu,  0,25  mg/gBB  (K 1 ),  0,5 mg/gBB  (K 2 ),  1  mg/gBB  (K 3 ),  2  mg/gBB  (K 4 ),  dan  4 mg/gBB (K 5 ).
Pengambilan  data  dilakukan  dengan  menghitung akumulasi  waktu  menjilat  mencit  ( licking  time) selama  1-5  menit  pertama  setelah  injeksi  formalin (fase  pertama)  dan  15-45  menit  setelah  injeksi formalin  (fase  kedua).  Setelah  itu,  dilakukan perhitungan  persentase  inhibisi  dari  data  rata-rata licking  time mencit  fase  pertama  dan  kedua  pada masing-masing kelompok. Persentase inhibisi merupakan  kemampuan  natrium  diklofenak  pada kelompok kontrol positif dan ekstrak pada kelompok perlakuan dalam menghambat respons nyeri (Jakaria et al., 2015).
Analisis data dilakukan secara komputerisasi dengan SPSS. Uji normalitas dilakukan dengan menggunakan uji Shapiro-wilk kemudian dilakukan uji homogenitas.  Setelah  itu,  dilakukan  uji One Way ANOVA .  Hasil  uji One  Way  ANOVA signifikan (p<0,05),  maka  dilanjutkan  dengan  uji Post  Hoc untuk  mengetahui  kelompok  yang  memiliki perbedaan signifikan .

## Hasil Penelitian
Setelah  dilakukan  pengujian  daya  analgesik  sesuai dengan  kelompok  perlakuan,  didapatkan  hasil berupa licking  time fase  pertama  dan  fase  kedua pada  masing-masing  mencit,  kemudian  dilakukan perhitungan  persentase  inhibisi  pada  kelompok kontrol  positif  dan  kelompok  perlakuan.  Rata-rata
licking  time dan  persentase  inhibisi  tiap  kelompok pada  fase  pertama  dan  kedua  dapat  dilihat  pada Tabel 1 dan Tabel 2.
Tabel 1. Rata-rata licking  time mencit  tiap  kelompok pada fase pertama Kelompok Rata-rata waktu menjilat (detik) (X ± SEM) % inhibisi K (-) 4,00 ±0,408 - K (+) 3,00 ±2,121 25,00 K 1 3,00 ± 0,707 25,00 K 2 1,25 ± 0,479 68,75 K 3 1,25 ± 0,479 68,75 K 4 4,00 ± 1,472 0,000 K 5 2,00 ± 0,707 50,00
Pada  Tabel  1.  terlihat  bahwa  rata-rata  waktu menjilat mencit menurun pada kelompok K 2 dan K 3 , namun  meningkat  kembali  pada  kelompok  K 4 dan K 5 .  Persentase  inhibisi  tertinggi  terdapat  pada kelompok ekstrak kulit kakao dosis 0,5 mg/gBB dan 1  mg/gBB,  yaitu  sebesar  68,75  %  kemudian  tidak menunjukkan  adanya  persentase  inhibisi  pada kelompok K 4 .
Tabel 2. Rata-rata licking time mencit tiap kelompok pada fase kedua Kelompok Rata-rata waktu menjilat (detik) (X ± SEM) % inhibisi K (-) 201,75 ±14,008 - K (+) 45,5  ± 3,202 77,447 K 1 40,00 ± 28,577 80,173 K 2 37,75 ± 26,964 81,289 K 3 12,00 ± 8,256 94,052 K 4 54,00 ±39,931 73,234 K 5 60,75 ±35,184 69,888
Pada  Tabel  2.  rata-rata  waktu  menjilat  mencit menurun  secara  berturut-turut  pada  kelompok  K 1 , K 2 ,  dan  K 3 ,  namun  meningkat  kembali  pada kelompok  K 4 dan  K 5 .  Persentase  inhibisi  tertinggi terdapat pada kelompok ekstrak kulit kakao dosis 1 mg/gBB,  yaitu  sebesar  94,052%.  Data  rata-rata akumulasi  waktu  menjilat  mencit  tersebut  dapat digambarkan secara histogram pada Gambar 1.
Gambar 1. Histogram rata-rata licking time
Data rata-rata licking time mencit diuji normalitasnya  dengan  menggunakan  uji Shapiro Wilk .  Hasil  uji  normalitas  menunjukkan  data licking time fase  pertama  dan  kedua  terdistribusi  normal (p>0,05) kemudian dilanjutkan dengan uji homogenitas.  Hasil  uji  homogenitas  menunjukkan bahwa  varians  data licking  time fase  pertama homogen (p>0,05) dan varians data licking time fase kedua  tidak  homogen  (p<0,05).  Setelah  itu, dilakukan uji One Way ANOVA . Uji analisis One Way ANOVA menunjukkan  bahwa  data licking  time fase pertama  tidak  signifikan  (p>0,05)  sedangkan  data licking  time fase  kedua  signifikan  (p<0,05)  sehingga analisis  data licking  time fase  kedua  dilanjutkan dengan  uji Post  Hoc. Data  terdistribusi  normal, namun  varians  tidak  homogen  atau  heterogen sehingga uji Post Hoc yang digunakan adalah Games- Howell (Santosa dan Ashari, 2005). Hasil uji Games- Howell data licking  time fase  kedua  tersebut  dapat digambarkan dengan histogram pada Gambar 2.
Gambar 2. Histogram hasil uji Games Howell licking time fase kedua. *signifikan terhadap kontrol negatif (p<0,05)
Pembahasan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektivitas  ekstrak  kulit  kakao  sebagai  analgesik dilihat  dari licking  time mencit  yang  diinduksi formalin.  Efektivitas  ekstrak  biji  kakao  sebagai antiinflamasi  dan  analgesik  telah  diteliti  oleh peneliti-peneliti  terdahulu  (Kumari et  al., 2011  dan Andujar et  al., 2011),  namun  penelitian  terkait efektivitas  ekstrak  kulit  kakao  sebagai  analgesik masih belum pernah dilakukan.
Hasil  dan  analisis  data licking  time fase  pertama menunjukkan natrium diklofenak dapat
menurunkan licking time fase pertama, namun tidak memiliki perbedaan yang signifikan jika dibandingkan  kelompok  K (-) .  Hal  itu  serupa  dengan penelitian lain yang menunjukkan bahwa pemberian 15  mg/kgBB  dan  10  mg/kgBB  natrium  diklofenak secara  intraperitoneal  dapat  menurunkan licking time mencit  fase  pertama,  namun  tidak  berbeda signifikan  jika  dibandingkan  dengan  kelompok  K (-) (DeRuiter,  2002;  Hassani et  al., 2011;  Hasani et  al.,
2011).  Hasil  penelitian  Hassani et  al. (2011) menunjukkan  bahwa  efek  signifikan  mulai  terlihat pada  menit  ke  25  (fase  kedua).  Natrium  diklofenak merupakan  golongan  obat  yang  bekerja  dengan menghambat  enzim  siklooksigenase  sehingga konversi asam arakhidonat menjadi PGE 2 terganggu (Syarif et al., 2012). Enzim siklooksigenase dan PGE 2 tersebut  berkaitan  dengan  fase  kedua,  yaitu  fase inflamasi.  Oleh  karena  itu,  efek  signifikan  natrium diklofenak  terhadap licking  time terjadi  pada  fase kedua  (fase  inflamasi),  meskipun  berdasarkan  hasil penelitian  yang  tersebut  di  atas  natrium  diklofenak juga  dapat  menurunkan  efek  induksi  formalin  pada fase  pertama.  Fase  pertama  disebut  juga  dengan fase  neurogenik  karena  nyeri  pada  fase  ini ditimbulkan  oleh  stimulasi  direk  serat  saraf  sensori akibat  induksi  formalin,  yaitu  1-5  menit  setelah injeksi formalin (Chang et al ., 2010).
Hasil dan analisis data licking time fase pertama juga menunjukkan  bahwa  ekstrak  kulit  kakao  dapat menurunkan licking time fase pertama, namun tidak menunjukkan  pengaruh  yang  signifikan  jika dibandingkan  kelompok  kontrol  negatif.  Dosis tertentu ekstrak kulit kakao yang dapat menurunkan licking  time fase  pertama  ditunjukkan  dengan  hasil perhitungan  persentase  inhibisi  kelompok  kontrol positif  dan  kelompok  perlakuan.  Persentase  inhibisi kelompok  ekstrak  kulit  kakao  dosis  0,25  mg/gBB
* * * *
sama dengan persentase inhibisi kelompok K (+) , yaitu sebesar  25%.  Hasil  data licking  time fase  pertama menunjukkan  kondisi  histogram  yang  fluktuatif.  Hal tersebut  sesuai  dengan  penelitian  mengenai efektivitas Combretum  leprosum terhadap licking time mencit  yang  diinduksi  formalin. Combretum leprosum memiliki  kandungan  yang  serupa  dengan ekstrak  kulit  kakao,  yaitu  epikatekin.  Penelitian tersebut  menyatakan  bahwa  hasil  yang  tidak signifikan  dan  grafik dose  response yang  fluktuatif terjadi  karena Combretum  leprosum tidak  memiliki pengaruh terhadap bradikinin yang berperan penting dalam  respons  nyeri  fase  pertama  (Lopes et  al., 2010).  Selain  itu,  hal  serupa  juga  terjadi pada penelitian  mengenai  efek silymarin terhadap licking time mencit  yang  diinduksi  formalin. Penelitian tersebut menyatakan bahwa silymarin yang memiliki kandungan serupa dengan ekstrak kulit kakao, yaitu flavonol (turunan polifenol) tidak memiliki pengaruh signifikan  terhadap  fase  pertama  (fase  neurogenik) karena silymarin tidak  dapat  menstimulasi  reseptor β2 -adrenergik.  Hasil  penelitian  tersebut  juga menunjukkan  bahwa  terdapat  dosis  tertentu  yang menunjukkan  adanya  hambatan  terhadap licking time fase pertama, namun grafik dose response yang didapatkan  fluktuatif.  Hal  itu  terjadi  karena  hanya dosis  tertentu  yang  memiliki  aktivitas  anti  TNF- α indirek  pada  saraf  perifer  sehingga  hambatan  yang ditimbulkan  pada licking  time fase  pertama  tidak stabil  atau  fluktuatif  (Hasani et  al., 2011). Hasil penelitian  mengenai  efek  ekstrak  kulit  kakao terhadap fomalin  test ini  juga  didukung  oleh penelitian  yang  menyatakan  bahwa  kulit  kakao mengandung  senyawa  fenolik,  yaitu  polifenol, katekin, epikatekin, prosianidin, dan senyawa fenolik lainnya yang dapat menghambat mediator proinflamasi pemicu nyeri, seperti PGE2, TNF- α , IL-6, dan  IL-1 β sehingga  efek  signifikan  ekstrak  tersebut bukan  terjadi  pada  fase  pertama  (fase  neurogenik) (Andujar et al., 2011).
Hasil  dan  analisis  data licking  time fase  kedua  pada penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  pemberian natrium  diklofenak  pada  mencit  yang  diinduksi formalin  dapat  menurunkan licking  time secara signifikan. Hal itu sesuai dengan hasil penelitian yang menunjukkan bahwa pemberian 10 mg/kgBB dan 15 mg/kgBB  natrium  diklofenak  secara  intraperitoneal dapat  menurunkan licking time mencit  fase  kedua secara signifikan jika dibandingkan dengan kelompok kontrol  negatif  (Jakaria et  al., 2015;  Hasani et  al., 2011;  dan  Hassani et  al., 2015)  Pemberian  natrium diklofenak  dosis  10  mg/kgBB  secara  intraperitoneal
mulai  menurunkan  efek  formalin  secara  signifikan pada  menit  ke  25,  yaitu  fase  kedua  respons  nyeri (Hasani et  al., 2011).  Natrium  diklofenak  memiliki efek  signifikan  pada  fase  kedua  (fase  inflamasi) respons nyeri karena natrium diklofenak merupakan obat  NSAID  yang  tergolong  sebagai  penghambat COX  relatif.  Obat  ini  bekerja  dengan  menghambat proses inflamasi, yaitu menghambat enzim siklooksigenase sehingga konversi asam arakhidonat menjadi  PGE 2 terganggu  (Syarif et  al .,  2012).  Efek signifikan  natrium  diklofenak  dalam  menurunkan licking  time mencit  fase  kedua  pada  penelitian  ini juga  ditunjukkan  dengan  tingkat  persentase  inhibisi sebesar 77,447%.
Hasil  penelitian  ini  juga  menunjukkan  bahwa pemberian  ekstrak  kulit  kakao  pada  dosis  0,25 mg/gBB,  0,5  mg/gBB,  dan  1  mg/gBB  dapat menurunkan licking  time fase  kedua  secara signifikan  sedangkan  pemberian  ekstrak  kulit  kakao dosis  2  mg/gBB  dan  4  mg/gBB  tidak  menunjukkan adanya  penurunan licking  time secara  signifikan. Oleh  karena  itu,  hasil  pada  data licking  time fase kedua  menunjukkan  grafik dose  response yang bifasik. Efek ekstrak kulit kakao dalam menurunkan licking  time mencit  fase  kedua  juga  ditunjukkan dengan  tingkat  persentase  inhibisi  dari  rata-rata licking time mencit. Persentase inhibisi pada K 1 ,  K 2 , K 3 lebih  besar  daripada  K (+), sedangkan  K 4 dan  K 5 memiliki  persentase  inhbisi  lebih  rendah  daripada K (+) .  Hasil  tersebut  sesuai  dengan  penelitian mengenai  efek  pemberian Combretum  leprosum terhadap licking  time mencit  yang  diinduksi formalin. Combretum leprosum memiliki kandungan serupa dengan ekstrak kulit kakao, yaitu epikatekin. Penelitian  tersebut  menyatakan  bahwa  grafik dose response bifasik  terjadi  karena  efek  farmakologis maksimal  terjadi  pada  dosis  intermediet  sehingga efek farmakologis menurun ketika dosis ditingkatkan melebihi  dosis  intermediet  (Lopes et  al .,  2010). Selain  itu,  penelitian  lain  juga  menunjukkan  bahwa efek dose  response yang  bifasik  terjadi  pada pemberian  ekstrak Iranian Green  tea terhadap licking  time hewan  coba  yang diinduksi  formalin. Iranian  Green  tea memiliki  kandungan  serupa dengan ekstrak kulit kakao, yaitu katekin (Arzi et al., 2012).  Pada formalin  test, seringkali  terjadi fenomena dose  response yang  bifasik  ketika  dosis dari  bahan  analgesik  yang  digunakan  sebagai supresor  mediator  penginduksi  nyeri  ditingkatkan melebihi  dosis  pada  efek  maksimal.  Hal  itu  terjadi karena  penurunan  mediator  inflamasi  pada dose
response maksimal memicu aktivasi sel imun kembali untuk  meningkatkan  produksi  mediator  tersebut sehingga efek farmakologis menurun (Shibata et al., 1989). Ekstrak kulit kakao dapat menurunkan licking time fase  kedua  mencit  yang  diinduksi  formalin secara  signifikan  karena  kulit  kakao  mengandung senyawa  fenolik  yang  terdiri  dari  polifenol,  katekin, epikatekin,  prosianidin  polimer,  prosianidin  B2,  dan jenis  molekul  flavonoid  lainnya  yang  dapat menghambat  mediator  proinflamasi  pemicu  nyeri, seperti  PGE2,  TNF- α,  IL -6,  dan  IL- 1β.  Ekstrak  kakao yang  kaya  akan  polifenol  dengan  dosis  sebesar  500 mg/kgBB  atau  0,5  mg/gBB  efektif  menurunkan kerusakan  jaringan  kolon  akibat  proses  inflamasi pada kolitis ulseratif akut (Andujar et al., 2011).
Berdasarkan  uraian  di  atas,  hasil  penelitian  ini menunjukkan bahwa ekstrak kulit kakao tidak dapat menurunkan licking time fase pertama mencit secara signifikan,  namun  menunjukkan  persentase  inhibisi yang  lebih  besar  dari  kelompok  K (+) ,  yaitu  sebesar 68,75%.  Oleh  karena  itu,  ekstrak  kulit  kakao  dapat dikembangkan  dalam  penelitian  lebih  lanjut mengenai  efektivitasnya  sebagai  analgesik  yang bekerja  pada  respons  nyeri  fase  neurogenik  dan dibandingkan  dengan  obat  yang  memiliki  efek dominan pada nyeri sentral, misalnya morfin sebagai kontrol positif. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa  ekstrak  kulit  kakao  dapat  menurunkan respons nyeri fase inflamasi secara signifikan dengan persentase  inhibisi  sebesar  94,052%.  Oleh  karena itu,  ekstrak  kulit  kakao  dapat  dikembangkan  dalam penelitian  lebih  lanjut  mengenai  efektivitasnya sebagai analgesik yang dikombinasikan dengan obat NSAID, misalnya natrium diklofenak.
Kelemahan  penelitian  ini  adalah  keterbatasan jumlah pengamat sehingga dalam waktu bersamaan satu pengamat mengamati dua kelompok perlakuan yang  berbeda.  Kelemahan  lain  dalam  penelitian  ini adalah  pengeringan  kulit  dilakukan  dalam  waktu yang  cukup  lama,  yaitu  5  hari  karena  kondisi  kulit yang memiliki banyak kandungan air.

## Kesimpulan
Kesimpulan penelitian ini adalah ekstrak kulit kakao ( Theobroma  cacao  L. )  dapat  menurunkan licking time fase kedua mencit yang yang diinduksi formalin secara  signifikan,  namun  tidak  menurunkan licking time fase pertama secara signifikan.
Penelitian  selanjutnya  yang  perlu  dilakukan  adalah penelitian  mengenai  efektivitas  ekstrak  kulit  kakao
( Theobroma  cacao L.)  sebagai  analgesik,  khususnya terhadap licking  time fase  pertama  mencit  yang diinduksi  formalin  dengan  menggunakan  morfin sebagai  kontrol  positif.  Penelitian  terkait  efektivitas ekstrak  kulit  kakao  ( Theobroma  cacao L.)  yang dikombinasikan  dengan  natrium  diklofenak  juga perlu dilakukan.

## Daftar Pustaka
Andújar MI et al . 2011. Inhibition of ulcerative colitis in  mice  after  ora  administration  of  a polyphenol-enriched cocoa extract is mediated  by  the  inhibition  of  STAT1  and STAT3 phosphorylation in colon cells. J. Agric. Food Chem. 59: 6474 – 6483.
Arzi  A,  B  Ghorbanzadeh,  dan  ZN  Khorasgani.  2012.
Antinociceptive  effect  of  hydroalcoholic extract  of  Iranian  Green  tea  in  the  formalin test  in  rats. Jundishapur  Journal  of  Natural.
8(1): 10-14.
Chang  HY et  al .  2009.  Analgesic  effects  and  the mechanisms of anti-inflammation of hispolon in  mice. Hindawi  Publishing Corporation. 2010: 1-8.
Departemen Perindustrian. 2007. Gambaran Sekilas Industri  Kakao .  Jakarta  Selatan: DEPPERIN Jakarta.
DeRuiter  J.  2002.  Principles  of  drug  action.  2 nd ed. Fall . 1-25.
Dorland  WAN.  2012. Dorland’s  pocket  Medical Dictionary. Twenty  Eighth  Edition. Michigan: Elsevier.  Terjemahan  oleh  A.  A.  Mahode. 2012. Kamus  Saku  Kedokteran Dorland . Jakarta: EGC.
Hasani AS et al . 2011. Preemptive analgesic effect of diclofenac: Experimental study in rats. M.E.J.
Anesth. 21(3): 355-359.
Hassani et  al. 2015.  Effects  of  silymarin  on neuropathic  pain  and  formalin  induced nociception  in  mice. Iranian  Journal  of Basic Medical Science. 18: 715-720.
Jakaria  M et  al .  2015.  Investigations  of  analgesic activity  of  the  methanol  extract  of haldina
cordifolia (Roxb.) bark by using in vivo animal model  studies. Research  Journal  of  Botany. 10(3): 98-103.
Kim KH et al. 2003. Extraction and fractionation of glucosyltransferase inhibitors from cacao bean husk. Elsevier. 39 (2004) 2043-2046.
Kumari  IPNP  dan  DC  Abeysinghe.  2011.  Phenolic Content and Antioxidant Capacity of Beans, Bean Husks,  and  Pod  husks  of  Cocoa  ( Theobroma cacao  L. ). Proceedings of  11th  Agricultural Research Symposium. 362-366.
Lopes  LS et  al 2010.  Antinociceptive  effect  on  mice of  the  hydroalcoholic  fraction  and  (-)epicatechin obtained from Combretum leprosum Mart & Eich.
Brazilian  Journal  of  Medical  and  Biologial Research. 43(12): 1184-1192.
Price  SA  dan  LM  Wilson.  2006. Pathophysiology: Clinical Concepts of Disease Processes.
Sixth Edition. Michigan: Elsevier. Terjemahan oleh B. U.  Pendit,  H.  Hartanto,  P.  Wulansari,  dan  D.  A. Mahanani.  2006. Patofisiologi:  Konsep Klinis Proses-proses Penyakit . Jakarta: EGC.
Ribeiro  FAP,  WA  Verri,  dan  IM  Chiu.  2016. Nociceptor sensory neuron-immune interactions in pain and inflammation. Trends in Immunology. 1-6.
Santosa  BP  dan  Ashari.  2005. Analisis  Statistik dengan Microsoft Excel & SPSS. Yogyakarta: Andi Offset.
Shibata  M et  al .  1989.  Modified  formalin  test: characteristic  biphasic  pain  response. Pain. 38(3): 347-352.
Syarif A et al. 2012. Farmakologi dan Terapi. 5 th ed. Jakarta: Badan Penerbit FKUI.
Wahyudi  T,  TR  Panggabean,  dan  Pujiyanto.  2008.
Panduan  Lengkap  Kakao .  Jakarta:  Penebar Swadaya.