## IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI DALAM FESES KUCING
(Felis domestica) YANG DITUMBUHKAN PADA DE MANN ROGOSA
SHARPE AGAR (MRSA)
MOLECULAR IDENTIFICATION OF BACTERIA IN CAT (Felis domestica) FECES GROWN ON DE MANN ROGOSA SHARPE AGAR

## (MRSA)
Pingkan Stela Mende 1) , Johanis Pelealu 1) , Beivy Kolondam 1)
1) Jurusan Biologi, FMIPA Unsrat Manado, 95115

## ABSTRACT
Bacteria has many important role in the digestive tract of animals. Beneficial bacteria in the digestive tract are thought to be able to inhibit the growth of pathogenic bacteria, while  pathogenic bacteria can cause diseases and infections. This research aimed to grow bacteria living in cat feces and to identify it with molecular method. This study used moleculer identification based on 16S rRNA gene  as  marker.  There  were  three  isolate  if  bacteria  taken  from  the  culture.  Two  isolates  were identified  as  Enterococcus  faecalis  (with  99%  and  100%  in  similarity  compared  with  GenBank database). One isolate was identified as Kurthia gibsonii (100% in similarity).
Keywords : Bacteria, cat feces, MRS Agar, gen 16s rRNA

## ABSTRAK
Bakteri  memiliki  peran  penting  dalam  saluran  pencernaan  hewan.  Bakteri  yang menguntungkan  dalam  saluran  pencernaan  dianggap  mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri patogen,  sedangkan  bakteri  yang  merugikan  dalam  saluran  pencernaan  hewan  dianggap  mampu menyebabkan penyakit dan infeksi. Penelitian ini bertujuan untuk menumbuhkan bakteri-bakteri yang ada  dalam  feses  kucing  dan  mengidentifikasikannya  dengan  metode  molekuler.  Penelitian  ini menggunakan identifikasi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA sebagai penanda. Hasil penelitian ini mendapatkan  tiga  isolat  bakteri.  Dua  diantaranya  teridentifikasi  sebagai Enterococcus  faecalis (kemiripan 99% dan 100% dengan yang ada di GenBank). Satu isolat teridentifikasi sebagai Kurthia gibsonii (kemiripan 100%).
Kata kunci : Bakteri, feses kucing, Agar MRS, gen 16S rRNA

## PENDAHULUAN
Bakteri merupakan organisme yang jumlahnya paling banyak di bumi, umumnya  bersel  satu,  tidak  memiliki membran  inti  sel,  berukuran  sangat  kecil, serta  memiliki  peran  besar  di  bumi.  . Secara  umum,  bakteri  dapat  dijumpai  di berbagai  habitat  yang  cukup  luas,  salah satunya dalam saluran pencernaan manusia dan  hewan  (Misgiyarti et  al .,  2002).
Berdasarkan  peranannya,  bakteri  terbagi atas  dua  macam,  yaitu  bakteri  yang merugikan
dan bakteri yang menguntungkan. Bakteri yang menguntungkan dalam saluran pencernaan dianggap  memiliki  peran  penting  dalam saluran pencernaan karena dapat memberikan manfaat dalam meningkatkan kesehatan  dan  daya  imunitas  hewan (Ziemer dan Gibson, 1998), dapat mencegah  infeksi  saluran  cerna  (Saranraj et  al., 2013),  dan  dapat  menghambat pertumbuhan bakteri patogen dalam saluran  pencernaan  manusia  dan  hewan (Savadogo et al., 2004).
Bakteri  yang  merugikan  dianggap mampu menyebabkan penyakit dan infeksi saluran  pencernaan.  Beberapa  penelitian telah  dilakukan  untuk  mengeksplorasi jenis-jenis  bakteri  yang  ada  dalam  saluran pencernaan  hewan,  tetapi  belum  ada penelitian  tentang  jenis-jenis  bakteri- bakteri  yang  terdapat  dalam  saluran pencernaan kucing liar, terutama  yang ada di Indonesia.
Untuk mengetahui jenis-jenis bakteri yang ada dalam saluran pencernaan perlu  adanya  media.  Media  adalah  suatu bahan  yang  terdiri  dari  campuran  zat-zat dan nutrisi yang diperlukan mikroba untuk pertumbuhannya, untuk tujuan-tujuan seperti  isolasi,  seleksi  dan  diferensiasi
biakan  yang  didapat  (Antonita,  2010). Berdasarkan  sifat-sifatnya,  media  terbagi atas  beberapa  macam  media  salah  satunya media umum dan media selektif (Dwidjoseputro, 1994). MRSA merupakan media selektif yang diperkenalkan oleh De Mann,  Rogosa,  dan  Sharpe  tahun  1960 untuk  memperkaya,  menumbuhkan  dan mengisolasi  jenis  bakteri  asam  laktat  dari seluruh jenis bahan. Di lain sisi, MRS agar tidak cukup selektif, karena ada kemungkinan  jenis  bakteri  lain  dapat tumbuh dalam media tersebut.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk menumbuhkan  bakteri  dalam  feses  kucing pada  media  MRSA.  Bakteri-bakteri  yang tumbuh dapa media MRSA akan diidentifikasi menggunakan teknik molekuler  berdasarkan  sekuens  gen  16S rRNA.

## METODE PENELITIAN

## Preparasi Sampel
Penelitian  ini  dimulai  dengan pengambilan sampel. Sampel feses kucing jantan  yang  berumur  2  tahun  4  bulan diambil  menggunakan  sendok  steril  dan ditampung  di  botol  kaca  steril  dengan menambahkan  5  mL  aquades.  Setelah  itu mulut botol ditutup menggunakan aluminium  foil  kemudian  dibawa  ke laboratorium.

## Isolasi Bakteri
Sebanyak  5  mg  feces  kucing  yang  telah dicampurkan  aquades  yang  mengandung bakteri  dipindahkan  ke  dalam  tabung reaksi  dengan  menambahkan  10  ml aquades  dan  di  homogenkan.  Sebanyak  1 ml  sampel  dipipet  ke  dalam  tabung  reaksi yang  baru  dengan  menambahkan  9  ml
aquades  (pengenceran ),  lakukan pengenceran  ini  dengan  cara  yang  sama sampai  ke  (Pengenceran  ke
)  untuk
memperkecil  atau  mengurangi  jumlah mikroba (Wasteson et al ., 2009). Sebanyak 1 ml sampel dari masing-masing tabung reaksi dipindahkan dengan pipet ke dalam  cawan  petri  yang  berisi  agar  MRS, selanjutnya  diinkubasikan  selama  48  jam dengan suhu C (Lawalata et al ., 2011) .
Diambil tiga koloni bakteri untuk dimurnikan  pada  agar  MRS  yang  baru dengan  metode Streak  plate. Setelah  itu, bakteri  tunggal  dipindahkan  ke  agar  MRS miring untuk ditumbuhkan.

## Ekstraksi DNA dan Amplifikasikan Gen 16S rRNA
Ekstraksi  DNA  bakteri  dilakukan menggunakan  Plant  Genomic  DNA  mini kit  (Geneaid).  Amplifikasi  gen  16S  rRNA menggunakan  kit  My  Taq  HS  Red  Mix (Bioline).  Primer  yang  digunakan  yaitu BKXF  (forward)  dan  BKXR  (reverse) (Kolondam  2018,  komunikasi  pribadi). Sebelum  memulai  proses  amplifikasi terlebih dahulu membuat Mastermix dengan  komposisi  MyTaq  20  µL,  DNA  2 µL,  primer  forward  dan  reverse  masing- masing 1,5 µL dan miliQ water 15 µL total reaksinya  sebesar  40  µL.  Pengaturan  suhu untuk  PCR:  denaturasi  awal  pada  suhu C  selama  3  menit,    kemudian dilanjutkan  dengan  35  siklus  denaturasi
pada  suhu C  selama  30  detik,
penempelan  primer  pada  suhu C selama 30 detik, elongasi pada suhu C selama  50  detik  dan  tahap  terakhir  yaitu polimerisasi  pada  suhu C  selama  1
menit. Fragmen DNA yang telah diamplifikasi beserta dengan primer dikirim  ke  First  Base  C.O  Malaysia  untuk di sekuensing.

## Analisis Data
Analisis  data  hasil  sekuensing dianalisis  dengan  menggunakan  software Geneious  V.5.6.  Sekuens  DNA  dianalisis menggunakan software Basi Local
Alignment  Search  Tool (BLAST)  pada situs  ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov )  untuk mencari sekuens yang serupa yang tersedia di GenBank.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Pengamatan Morfologi Koloni
Bakteri  diisolasi  dari  sampel  feses kucing  dengan  menggunakan  metode pengenceran berseri. Dari hasil pengenceran,  setelah  diamati  ada  tiga isolat  dengan  morfologi  koloni  yang berbeda.  Isolat  tersebut  terdapat  pada pengenceran sampai yang kemudian  diberi  nama  PSM1,  PSM2  dan
PSM3 (Gambar 1). Morfologi koloni dapat dilihat dalam (Tabel 1).
Tabel 1. Hasil Pengamatan morfologi koloni bakteri dari feses kucing pada media MRSA
Isolat Bakteri Morfologi Koloni Warna Tepi Bentuk Bentuk Permukaan PSM1 Putih Susu Bergerigi Bulat Cembung PSM2 Putih Krem Rata Bulat Cembung
PSM3 Putih bening Bergerigi Bulat Cembung
Gambar 1. Isolat hasil pemurnian bakteri: (a) PSM1 (b) PSM2 (c) PSM3
Identifikasi  Bakteri  Menggunakan  Gen

## Penanda 16S rRNA
Berdasarkan  hasil  elektroforesis
fragmen DNA bakteri yang telah diamplifikasikan  dengan  gen  16S  rRNA, dapat  diketahui  bahwa  panjang  fragmen DNA  berada  pada  kisaran  100-1100  bp (Gambar  2).  Dari  hasil  sekuensing,  dicari sekuens-sekuens  gen  16S  rRNA  yang mirip  dengan  sekuens  PSM1,  PSM2  dan PSM3  dengan  menggunakan  BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Dari
hasil  pencarian  ini  diketahui  PSM1 memiliki kemiripan 99% dengan Enterococcus  faecalis (nomor  aksesi:
MH819482.1) , PSM2  memiliki  kemiripan 100%  dengan E.  faecalis (nomor  aksesi:
MH779826.1) , dan PSM3 memiliki kemiripan 100%  dengan Kurthia  gibsonii
(nomor  aksesi:  MH619509.1) . Dua  dari tiga  bakteri  ini  merupakan  bakteri  yang berjenis sama berdasarkan data di GenBank.
Gambar 2. Visualisasi hasil amplifikasi gen 16S rRNA sampel bakteri dalam elektroforesis gel agarosa 0.8%
PSM1  dan  PSM2  memiliki  koloni  yang berbeda  tetapi  diidentifikasi  menghasilkan jenis  yang  sama  yaitu E.  faecalis. Perbedaan morfologi koloni diduga karena adanya variasi koloni pada saat pertumbuhan E.  faecalis. Variasi  koloni juga terjadi sesuai dengan yang digambarkan  oleh  penelitian  Proctor et  al. (2006). Penelitian  ini  membahas  tentang variasi  koloni,  yakni  populasi  koloni  yang berkembang lambat dengan karakter fenotip  yang  khas.  Ditemukan  variasi berupa ukuran koloni, tingkat pertumbuhan  dan  morfologi  koloni  yang atipikal pada E. faecalis.

## Deskripsi Bakteri Yang Tumbuh Pada Media MRSA
E.  faecalis merupakan  bakteri Gram  positif,  tidak  membentuk  spora, fakultatif  anaerob,  kokus,  dan  tidak menghasilkan  reaksi  katalase  dengan hidrogen  peroksida  (Rollins et  al., 2009).
Bakteri  ini  bersifat  homofermentatif  yang mengubah glukosa menjadi asam laktat (de Vos et  al .,  2009).  Selain  hidup  dalam
dalam  saluran  pencernaan  manusia  dan hewan, E.  faecalis juga  dapat  dijumpai dalam  saluran  kemih  dan  dapat  juga berkoloni  dalam  rongga  mulut  manusia.
Secara filogenetik, Enterococcus termasuk dalam Divisi Firmicitus, Ordo Lactobacillales dan famili Enterococcaceae (Dian, 2005). Kurthia gibsonii merupakan bakteri  Gram  positif,  tidak  berspora  dan berbentuk  batang  (Kediie,  1991).  Selain hidup  dalam  saluran  pencernaan  hewan, bakteri ini juga dapat ditemui di lingkungan  dengan  bahan  organik  yang membusuk seperti bangkai babi (Shaw and Keddie,  1993),  kotoran  hewan  ternak,  dan makanan lainnya (Pin and Baranyi, 1998). Pada penelitian sebelumnya juga menunjukan  bahwa K.  gibsonii juga  telah berhasil  diisolasi  dari  feses  orang  dewasa yang mengalami diare akut. Genus Kurthia tidak  dianggap  sebagai  bakteri  patogen. Kurthia  termasuk  dalam  divisi  Firmicitus, ordo  Bacillales  dan  famili  Planococcaceae (Shaw dan Keddie, 1993).

## KESIMPULAN
Bakteri  hasil  isolasi  dari  feses kucing  yang  tumbuh  pada  media  MRSA yang diidentifikasi secara molekuler menunjukkan  sampel  PSM1  memiliki kemiripan  99%    dengan Enterococcus faecalis (MH819482.1) , PSM2  memiliki kemiripan  100%  dengan Enterococcus
faecalis (MH779826.1) dan PSM3 memiliki kemiripan 100% dengan Kurthia gibsonii (MH619509.1) .

## DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro. 1990.
Dasar-Dasar Mikrobiologi . Jakarta: Djambatan.
Keddie,  RM.  1981. The  Prokaryotes:  A Handbook  tentang  Habitat,  Isolasi dan  Identifikasi  Bakteri  (1  ed.).
Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Lawalata, H.J., Sembiring, L., and Rahayu,
E.S. 2011. Moleculer Identification of  Lactid  Acid  Bacteria  Producing
Antimicrobial Agents from Bakasang, An Indonesian Traditional Fermented Fish Product. Indonesian  Journal  of Biotechnology. 16 (2): 93-99.
Misgiyarta  dan  Widowati.  2005. Seleksi
dan  Karakterisasi  Bakteri  Asam Laktat (BAL)   Indigenus . Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Bogor. Pin C, Baranyi J. 1998.  Predictive models
as means to quantify the
interactions  of  spoilage  organisms. Int J Food Microbiol . 41:59–72.
Proctor, R. A., C. von Eiff, B. C. Kahl, K.
Becker, P. McNamara, M.
Herrmann,  and  G.  Peters.  2006. Small colony variants: a pathogenic form  of  bacteria  that  facilitates persistent  and  recurrent  infections. Nat. Rev. Microbiol. 4295-305. Rollins,  D.  M.  dan  Joseph,  S.  W.,  2000,
Enterococcus Summary, Pathogenic Microbiology , J Microbiol. 2:13-28 Salvadogo,  A.  2006.  Bacteriocins  and Lactic  Acid  Bacteria-a  miniriview. African Journal of Biotechnology 5(9): 678-683.
Shaw,  S.  and  Keddie,  R.  M.1983.  A numerical  taxonomic  study  of  the genus Kurthia with revised description  of  Kurthia  zopfi  and  a description  of  Kurthia  gibsonii  sp. nov. Systematic and Applied
Microbiology 4, 253-276.
Wasteson,  Y,  and  Hornes,  E.  2009.
Pathogenic Escherichia Coli Found in Food. International
Journal  of  Food  Microbiology 12:
103-114
Ziemer, C.J., and Gibson, G.R (1998). An Overview  of  Probiotic,  Prebiotics and  Synbiotic  in  Functional  Food
Concept:  Perspectives  and  Future Strategies. International Dairy Journal . 8:473-479.