## PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL DAUN BUAS-BUAS (Premna cordifolia. LINN) TERHADAP KADAR MDA TIKUS WISTAR JANTAN PASCA PAPARAN ASAP ROKOK
Asri Adyttia 1*), Eka Kartika Untari 2 , Sri Wahdaningsih 3
1. Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura
2. Bagian Farmakologi Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura
3. Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura
* ) Email:

## ABSTRACT
Free  radical  from  cigarrete  smoke  can  cause  lipid peroxidation  that  could  lead  to  tissue  damage.  Tissue damage can be identified by increased levels of MDA (Malondialdehyde). Leavesof buas-buas (Premna cordifolia. Linn)  has  an  antioxidant  activity  in  invitro  study.  This  study  aimed  to  analyze  the  effect  of  P.  cordifolia leaves extract  on  the  levels  of  malondialdehyde  (MDA)  after  exposure  to  cigarette  smoke.  The  simplicia  extracted  by maseration using 70% ethanol. Twenty four  wistar strain of Rattus novergicus were divided into six groups , i.e. : normal group without any treatment, positive control group with cigarette smoke exposure and vitamin e treatment, negative  control  groupwith  only  cigarette  smoke  exposure,  treatment  groupwith  cigarette  smoke  exposure  and ethanolic extract from P. cordifolialeaves with doses 200; 400; 600 mg/kg of body weight/day. All rats were treated for  14  days  using  3  cigarette  non  filetered  each  day.  After  14  days,  plasma  MDA  was  measured  in  this  research. Measurement  of  plasma MDA  are  using Spectrophotometer  UV-Vis  in  532.2  nm.  MDA  level  in  this  study  was analyzed by the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test. The result showed that plasma MDA level of groupreceived ethanol  extract  of  P.  cordifolia  leaves  doses  at  600  mg/kg  of  body  weight/day significantly  (p<0.05)lower  than negative control group and not significantly differ (p<0.05) to normal group and positive control group.
Keyword: Cigarette smoke, plasma MDA, antioxidant, ethanolic extract from P.cordifolia leaves

## 1. PENDAHULUAN

## Latar Belakang
Merokok  merupakan  salah  satu  gaya  hidup utama  yang  berpengaruh  pada  kesehatan  manusia. Sebagian  besar  perokok  berasal  dari  negara berkembang  dan  dari  golongan  sosial  ekonomi rendah.  Indonesia  merupakan  negara  ketiga  yang memiliki  jumlah  perokok  aktif  terbanyak  di  dunia yaitu  61,4  juta  perokok  setelah  Cina  dan  India. Perilaku  merokok  penduduk  Indonesia  cenderung meningkat dari 34,2 persen pada tahun 2007 menjadi 36,3 persen pada tahun 2013. Merokok dalam jangka waktu  yang  panjang mempunyai  pravelensi  terhadap beberapa penyakit seperti atherosclerosis dan chronic obstructive  pulmonary  disease (COPD)  dengan dampak sistemik yang signifikan. 1, 2, 3 .
Rokok mengandung berbagai bahan kimia antara lain  nikotin,  karbon  monoksida,  tar  dan  eugenol (dalam rokok kretek).Asap rokok mengandung 10 14-16 molekul  oksidan  seperti  superoksida,  hidrogen peroksida,  hidrkosil  dan  peroksil  dalam  satu  kali hisapan.  Asap  rokok  mengakibatkan  stress  oksidatif yang  ditandai  dengan  meningkatnya  radikal  oksidan dan reaksi inflamasi berupa peningkatan jumlah total leukosit  dan  neutrofil  darah  perifer.  Radikal  bebas dari  asap  rokok  menyebabkan  peroksidasi  dari  asam
lemak  ganda  tak  jenuh  membran  sel  yang memperkuat stres oksidatif selama merokok. Penggunaan  rokok  dalam  waktu  yang  lama  dapat menyebabkan ketidakseimbangan oksidan- antioksidan  sistemik  yang  ditandai  dengan  adanya hasil dari peroksidasi lipid yaitu MDA (Malondialdehid).  Terdapat  hubungan  antara  lama pemaparan  rokok  dengan  peningkatan  kadar  MDA 1,
4, 5, 6, 7 .
Antioksidan  merupakan  senyawa  yang  berguna mengatasi  kerusakan  oksidatif  akibat  radikal  bebas dalam  tubuh.Daun  buas-buas  merupakan  salah  satu alternatif  bahan  makanan  sumber  antioksidan  yang belum  banyak  diteliti kegunaannya.Masyarakat umumnya  menggunakan  daun  buas-buas (Premna cordifolia) sebagai bumbu masakan dan makanan.Buas-buas  memiliki  kandungan  kimia fenolik  dan  flavonoid  yang  berperan  dalam  aktivitas antioksidan.Ekstrak methanol daun buas-buas memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  sangat  aktif dengan  nilai  IC 50 sebesar  31,91±  0,43  µg/ml 8,  9,  10 . Penelitian  tersebut  menjadi  dasar  dilakukannya pengujian  aktivitas  antioksidan  secara in  vivo dari ekstrak  etanol  70%  daun buas-buas.  Pengujian  ini dilakukan dengan mengukur kadar MDA tikus wistar
jantan  yang  diberi  paparan  asap  rokok  dan  ekstrak etanol daun buas-buas.

## II. METODOLOGI PENELITIAN

## A. Alat
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah blender simplisia  (IlinQi FZ-10®),  bejana  maserasi, cawan  krusibel, waterbath (Memmert WNB  14®), timbangan analitik (BEL M254AI®), rotary evaporator  (Heldolph®) , spektrofotometer  UV-Vis (Shimadzu MR  2500®), oven  (Memmert UP400®), desikator,  timbangan  analitik  (Precisa®),  alat-alat gelas (Pyrex Iwaki®), Vortex (Barnstead M37610®), mikropipet (Rainin E1019705K®) , blood tube, sonde oral,  spuit  1  cc  dan  3cc, hot  plate (Schott Instrument®),  mortir  dan  stamper, alat  bedah, sentrifuge, shaker,yellow tip dan smoking chamber.

## B. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun  buas-buas,  vitamin  E,  etanol  70%  (Merck®), serbuk  magnesium,  larutan  HCL  pekat,  larutan  HCl 2N,  larutan  FeCl 3 5%,  asam  asetat  glasial, asam asetat  anhidrat, larutan  H 2 SO 4 pekat,  larutan  H 2 SO 4 2N,    pereaksi Dragendorff,  pereaksi Wagner, pereaksi Mayer, aquades, kloroform, amonia, larutan NaCl  10%,  gelatin  1%,  CMC Carboxy  Methyl Cellulose (CMC), aluminium foil, kertas saring, TBA (tiobarbituricacid),TCA (trichloroacid), TMP (tetrametoksipropana).

## C. Hewan Uji
Hewan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  tikus  putih  (Rattus  norvegicus)  galur wistarjantan.  Sampel  diperoleh  secara  acak  yang memenuhikriteria  inklusi  yaitu  tikus  putih  wistar jantan,  umur  2 – 3  bulan,  berat  badan  100-200  gram dan  tidak  cacat  secara  anatomi,  sedangkan  kriteria eksklusinya adalahtikus  yang  sakit  secara  fisiologis sebelum  perlakuan  dan  terdapat  penurunan  berat badan yang drastis.

## D. Tahap Penelitian
1. Determinasi Tanaman Tanaman buas-buas yang digunakan di determinasi  di  Laboratorium  Biologi  Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Tanjungpura  dengan  menyerahkan  sampel  berupa tanaman utuh dari daun, batang, bunga dan buah 2. Pembuatan Ekstrak
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  ekstraksi  maserasi.Simplisia daun  buas-buas  sebanyak  300gram  direndam  dengan
pelarut  etanol  70%  sebanyak  6  liter,  dilakukan pergantian  pelarut  setiap  1x24  jam  dan  pengadukan sesering  mungkin.Kemudian  ekstrak  etanol  tersebut dipekatkan  menggunakan rotary  evaporator dan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental.

## 3. Penetapan Susut Pengeringan
Ekstrak yang digunakan yaitu sebanyak  2,2536; 2,1675; 2,1930  gram  dan  dimasukkan  ke  dalam  kurs porselen  yang  sudah  mencapai  bobot  konstan. Kemudian  dipanaskan  di  dalam  oven..Pemanasan dilakukan  pada  suhu  105 o C  dan  ditimbang  setiap  30 menit  hingga  bobot  konstan  setelah  dua  kali penimbangan.  Selama  proses  pemanasan  penutup kurs porselen dibuka. Sebelum dilakukan penimbangan  ekstrak  terlebih  dahulu  dimasukkan  ke dalam  desikator  yang  berisi  silika  gel  selama  15 menit 11 .Selama  penyimpanan  di  dalam  desikator kurs porselen ditutup.

## 4. Skrining Fitokima Pemeriksaan Alkaloid
Larutan  ekstrak  sebanyak  1  mlditambahkan dengan 1 ml asam sulfat 2 N dan dikocok.Ditambahkan  1  ml  kloroform,  dikocok hingga  terbentuk  2  lapisan.Lapisan  atas  yang merupakan lapisan asam diambil menggunakan pipet tetes  dan  ditambahkan  1  ml  ammonia.  Kemudia larutan  dibagi  menjdai  tiga  tabung,  tabung  A ditambahkan  3  tetes  pereaksi  Dragendroff,  tabung  B ditambahkan  3  tetes  perekasi  Mayer  dan  tabung  c ditambahkan  3  tetes  perekasi  Wagner.  Hasil  positif alkaloid ditandai dengan adanya endapan warna putih pada tabung A dan adanya endapan merah bata pada tabung B dan C 12 .

## Pemeriksaan Flavonoid
Larutan ekstrak sebanyak 1 ml ditambah dengan sedikit  serbuk  magnesium  sebanyak  1  gram  dan larutan  HCl  pekat.Perubahan  warna  larutan  menjadi warna merah menandakan adanya flavonoid 13 .

## Pemeriksaan Steroid dan Triterpenoid
Larutan  ekstrak  sebanyak  1  ml  ditambahkan dengan  1  ml  pereaksi  Lieberman- Burchard (CH 3 COOH  glasial  dan  larutan  H 2 SO 4 pekat).Warna berubah  menjadi  merah  yang  menunjukkan  adanya senyawa triterpenoid dan warna berubah menjadi biru yang menunjukkan adanya senyawa steroid 14 . Pemerikasaan Tanin
Larutan ekstraksebanyak 1 ml ditambahkan 1 ml larutan  gelatin  1%  dan  diikuti  larutan  NaCl  10%. Hasil  positif  ditandai  dengan  terbentuknya  endapan putih 12 .

## Pemeriksaan Fenol
Larutan  ekstraksebanyak  1  ml  ditambahkan  3 tetes  larutan  FeCl 3 5%.  Hasil  positif  yaitu  timbul warna biru kehitaman 12 .

## Pemeriksaan Saponin
Larutan  ekstraksebanyak  2  ml  dimasukkan  ke dalam  tabung  reaksi,  lalu  ditambahkan  dengan  air dan  dikocok  dengan  kuat  selama  15  menit.Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya busa dengan tinggi 2 cm 12 .

## 5. Pengujian Aktivitas Antiokisdan Pemaparan Asap Rokok
Rokok  yang  digunakan  adalah  rokok  kretek tanpa  filter.  Semua  tikus  diberi  paparan  asap.  Proses pemaparan  dilakukan  dalam smoking  chamber. Proses pemaparan dilakukan setiap pagi menggunakan  3  batang  rokok.  Pemaparan  dilakukan selama  14  hari  didalam smoking  chamber yang terbuat  dari  plastik  ukuran  38,5x28,5x22,5  cm dilengkapi  dengan  ventilasi,  dua  buah air  pump dan tempat  pembakaran  rokok.  Satu  jam  setelah pemaparan  asap  rokok,  tikus  diberi  ektstrak  etanol daun buas-buas sesuai variasi dosis.

## Perlakuan Hewan Percobaan
Seluruh  hewan  percobaan  diadaptasikan  selama tujuh  hari.  Tikus  yang  diadaptasi  akan  diberikan makan  dan  minum  secukupnya.  Kemudian  hewan percobaan  dipilih  secara  acak  dibagi  menjadi  enam kelompok.  Kelompok  A  merupakan  kelompok normal  tanpa paparan  asap  rokok  dan  hanya    diberi suspensi  CMC  1%  Kelompok  B  adalah  kelompok kontrol  postif  yang    diberikan  paparan  asap  rokok dan vitamin E. Kelompok C adalah kelompok kontrol negatif yang hanya diberikan paparan asap rokok dan suspensi  CMC  1%.  Kelompok  D,  E  dan  F  adalah kelompok  perlakuan  yang  diberikan  paparan  asap rokok dan ektrak etanol daun buas-buas dengan dosis 200, 400 dan 600 mg/kg BB.

## Pengambilan Sampel Darah
Tikus  dipuasakan  selama  1x24  jam  sebelum dilakukan  pengambilan  darah.  Dilakukan  dislokasi tulang  leher  dan  pembedahan  tikus.Darah  diambil melalui jantung dengan menggunakan spuitberukuran 3  cc.  Darah  yang  telah  diambil  ditampung  dalam blood  tube dan  disentrifugasi  pada  kecepatan  3000 rpm  selama  10  menit.Plasma  darah  yang  terletak pada  bagian  atas  dipisahkan  dan  diambil  untuk dianalisis konsentrasi MDA 15 .

## Pembuatan Kurva Baku
Larutan  stok  pereaksi  1,1,3,3-tetraetoksipropana (TEP)  konsentrasi  6  M diencerkan  menjadi  0,3;  0,4; 0,5;  0,7;  0,8;  0,9  ppm.  Setiap  konsentrasi  TMP direaksikan  dengan  1,0  mL  TCA  20%  dan  1,0  mL TBA  1%  dalam  pelarut  asam  asetat  glasial  50%. Semua larutan kemudian diinkubasi selama 45 menit pada suhu 95 o C.Setelah didinginkan, larutan disentrifugasi  pada  kecepatan  1000  rpm  selama  15 menit.  Supernatan  pada  lapisan  atas  diukur absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang 532,2 nm 15 .

## Pengukuran Sampel
Pengukuran  konsentrasi  dari  sampel  percobaan dilakukan  dengan  cara  yang  sama  seperti  larutan standar,  yaitu  1,0  mL  plasma  darah  direaksikan dengan  1,0  mL  TCA  20%  dan  1,0  mL  TBA  1% dalam asam asetat  glasial 50%, kemudian diinkubasi selama 45 menit pada suhu 95 o C, kemudian dibiarkan dingin.  Larutan  disentrifugasi  selama  15  menit  pada kecepatan 1000 rpm. Supernatan dipisahkan kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang 532,2  nm.  Konsentrasi  sampel  diperoleh  dengan memplot  data  absorbansi  sampel  ke  dalam  kurva standar 15 .
6. Analisis Data Analisis statistik dilakukan
dengan menggunakan program komputer Statistical Program Service  Solution (SPSS)  versi 17 trial.Analisis  data menggunakan  uji  non  parametric  yaitu dengan  Uji Uji  Kruskal-Wallis  dan  dilanjutkan  Uji Mann- Whitney.Uji statistik dilakukan pada derajat kepercayaan 95%.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan  identitas  tanaman  dan  menghindari kesalahan dalam pengambilan tanaman.Hasil determinasi tanaman yang dilakukan di Laboratorium Biologi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam Universitas Tanjungpura Pontianak menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  benar  tanaman  buas-buas (Premna  cordifolia Linn)  dari  famili Verbenaceae spesies.
2. Ekstraksi Teknik ekstraksi daun buas-buas dalam penelitiaan  ini  menggunakan  metode  maserasi dengan pelarut etanol 70%. Ekstrak etanol daun buas- buas  yang  diperoleh  sebesar  88  gram  dengan  nilai rendemen 29,33 %.

## 3. Penetapan Susut Pengeringan
Hasil penetapan susut pengeringan ekstrak etanol daun  buas-buas  adalah  8,96  %.  Ekstrak  dengan persentase  8,96%    termasuk  dalam  rentang  ekstrak kental yaitu 5-30% 16 .

## 4. Skrining Fitokimia
Tabel  1.  Hasil  Skrining  Fitokimia  Ekstrak  Etanol Daun Buas-Buas Pemeriksaan Hasil Alkaloid + Flavonoid + Triterpenoid dan Steroid + Tanin - Fenol + Saponin +
Keterangan:  (+)  positif  :  mengandung  golongan senyawa;  (-)  negatif:  tidak  mengandung  golongan senyawa.
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh  pada  tabel 1, dapat  dilihat  bahwa  pada  ekstrak  etanol  70%  dari daun buas-buas mengandung senyawa yang tergolong alkaloid,  flavonoid, triterpenoid, fenol,  tanin  dan saponin,

## 5. Pengujian Antioksidan Perlakuan Hewan Uji
Sumber  radikal  bebas  yang  digunakan  adalah asap  rokok  yang  berasal  dari  rokok  tanpa  filter. Hewan  uji  tikus  dikondisikan  sebagai  perokok  pasif yang  terpapar  asap  rokok.  Menurut  Dewi et  al (2003),  asapasap  yang  dilepaskan  ke  udara  lebih berbahaya  karena  kandungan  nikotin  yang  lebih tinggi  (4-6  kali)  dibandingkan  asap  rokok  yang dihisap  oleh  perokok 17. Hewan  uji  diberi  paparan asap  rokok  secara  akut  selama  14  hari  dengan  tiga batang  rokok  pada  setiap  kali  pemaparan.  Jumlah rokok  yang  digunakan  didasarkan  pada    nilai  LD 50 nikotin  untuk  tikus  yaitu  sebesar  50  mg/kg  BB 18 . Menurut  Vanet  all (2005),  pemaparan  rokok  secara akut  merupakan  metode  yang  relatif  mudah  dan sensitif  untuk  menyelidiki  efek  spesifik  dari  asap rokok  pada  stress  oksidatif.  Paparan  asap  rokok secara  akut  dapat  menyebabkan  kerusakan  jaringan yang  diikuti  dengan  peningkatan  produk  peroksidasi
lipid 19. Sebelum  diberikan  perlakuan  semua  hewan uji  diadaptasikan  selama  satu  minggu  untuk menghindari  resiko  timbulnya  stres  selama  proses transportasi serta  menyeragamkan  pola  makan ataupun  pola  hidup  dengan  lingkungan  baru. Perlakuan  ini  bertujuan  untuk  meningkatkan  berat badan  tikus  hingga  sesuai  dengan  berat  badan  yang diinginkan pada pengujian.Berat badan yang digunakan  pada  saat  pengujian  berkisar  antara  100- 200  gram.  Berdasarkan  hasil  analisis  statitistik  data berat  badan,  hewan  uji  yang  digunakan  memiliki berat  badan  yang  homogen  (p>0,05).  Hal  ini menandakan  hewan  uji  berada  dalam  kondisi lingkungan  yang  sama  sehingga  diharapkan  tidak menimbulkan  hasil  yang  bias  pada  hasil  pengukuran kadar MDA.
Pengamatan yang dilakukan menunjukkan adanya  perubahan  pada  hewan  uji  sebelum  dan sesudah  diberi  paparan  asap  rokok.  Perubahan  yang terjadi  menunjukkan  terjadinya  stres  pada  hewan uji.Perubahan  yang  terjadi  meliputi  dehidrasi  yang ditandai  dengan  hewan  uji  yang  berkeringat, keaktifan  hewan  uji  yang  menurun,  detak  jantung yang  lebih  cepat,  bunyi  seperti  mengi  pada  saat bernapas dan meningkatnya suhu tubuh hewan.

## Pengambilan Sampel Darah
Pengorbanan atau terminasi hewan uji dilakukan pada  hari  kelima  belas  dari  tiap  kelompok perlakuan.Sebelum diterminasi hewan uji dipuasakan selama  satu  malam.  Hewan  uji    diterminasi  secara dislocatio  servicalis yaitu  dislokasi  tulang  leher hewan uji. Setelah itu, hewan uji dibedah dan diambil darahnya  melalui  organ  jantung.  Menurut  Mitruka dan Rawnsley (1981), volume darah  maksimal dapat diambil  dari  jantung    dibandingkan  volume  darah yang diambil dari vena ekor 20 .
Darah  yang  diperoleh  ditempatkan  dalam blood tube berisi EDTA yang berfungsi sebagai antikoagulan, kemudian disentrifugasi untuk memisahkan  bagian  supernatan  dan  platelet.Bagian yang  diambil  adalah  supernatan  yang  mengandung plasma  darah.Pengukuran  MDA  pada  plasma  darah karena  sebagian  besar  MDA  pada  darah  terdapat  di dalam  plasma,  selain  pada  serum  dan  jaringan 21 . Plasma  darah  yang  diperoleh  selanjutnya  digunakan untuk pemeriksaan kadar MDA.

## Metode Pengukuran Kadar MDA
Metode  pengukuran  MDA  yang  digunakan adalah  metode  TBA  (Thiobarbituric  Acid).  Menurut Yagi (1994), metode TBA mempunyai nilai kepekaan yang  tinggi  terhadap  radikal  bebas  dan  mudah diaplikasikan  untuk  sampel  dalam  berbagai  tahap
0 2 4 6 8 10 12 14 16 M D A ( ppm )
oksidasi.  TBA  akan  bereaksi  dengan  gugus karboksilat dari MDA melalui penambahan nukleofilik  membentuk  kompleks  MDA-TBA  dalam suasana  asam  dan  menghasilkan  produk  yang berwarna  sehingga  dapat  dikuantifikasi  dengan spektrofotometri 22 .
Plasma  yang  diperoleh  kemudian  ditambahkan
TCA 20%
(Trichloroacetat)
dan
TBA 1%.Penambahan  TBA  harus  dalam  keadaan  asam yaitu  dengan  ditambahkan  asam  asetat  glasial  50%, agar dapat berekasi sempurna dengan MDA.Sedangkan
TCA
berfungsi untuk mengendapkan  protein  yang  terdapat  di  dalam plasma.Selanjutnya  dilakukan  inkubasi  slama  45 menit  pada  suhu  95 ˚C  untuk  mempercepat  reaksi 22 .Kemudian disentrifugasi untuk memisahkan supernatan  berwarna  merah  jambu-kecokelatan. Supernatant yang  diperoleh  kemudian  diukur kadarnya  menggunakan  spektrofotometri  UV-Vis. Pengukuran kadar MDA dilakukan melalui pengukuran  absorbansi  plasma  darah  dari  tiap kelompok percobaan.

## Pembuatan Kurva Baku
Persamaan kurva baku diperoleh setelah membuat  kurva  baku  kalibrasi  TMP  dengan menggunakan larutan standar yaitu 1,1,3,3- tetrametoksipropan.  TMP  merupakan  prekusor  dari MDA,  karena  sifatnya  yang  tidak  stabil  sehingga dijadikan  sebagai standar  MDA.  TMP  akan dihidrolisis oleh air menjadi MDA dan alkohol.
Panjang  gelombang  MDA  yang  diperoleh  dari pembuatan  kurva  baku  adalah  532,2  nm.  Panjang gelombang MDA teoritis adalah 532 nm 22 . Toleransi panjang  gelombang  yang  diperbolehkan  untuk jangkauan 400 nm hingga 600 nm yaitu lebih kurang 3  nm,  sehingga  panjang  gelombang  yang  diperoleh dapat digunakan untuk mengukur kadar MDA sampel
82 .  Persamaan  kurva  baku  yang  diperoleh  adalah y=0,8264285714 x 0,06580952381 dengan r=0,993066.

## 6. Analisis Kadar MDA
Kadar  MDA  plasma  dianalisis  secara  statistik menggunakan  uji  Kruskal-Wallis  dan  uji  Mann- Whitney.  Uji  Kruskal-Wallis  digunakan  untuk melihat  perbedaan  kadar  MDA  plasma  antara kelompok normal, kelompok kontrol positif, kelompok  kontrol  negatif,  kelompok  ekstrak  etanol daun  buas-buas  dengan  dosis  200,  400  dan  600 mg/kg  BB.  Berdasarkan  hasil  analisis  bahwa  paling sedikit  ada  dua  kelompok  perlakuan  yang  memiliki kadar  MDA  plasma  yang  berbeda  signifikan (p<0,05).

## Tabel 2.Perbandingan Kadar MDA Plasma
Kelompok Perlakuan dengan Uji  Kruskal-Wallis
Kelompok N = 4 mean±SD MDA (ppm) p-value Normal 0,094±0,080 0,003
Vitamin E 0,051±0,045 Negatif 13,743±2,839 Dosis 1 9,142±2,365 Dosis 2 0,120±0,019 Dosis 3 0,053±0,041 Keterangan: p-value<0,05 = berbeda signifikan Kemudian  dilanjutkan  analisis  untuk  mengetahui perbedaan kadar MDA Gambar 2. Kurva Kadar MDA Plasma Tikus
Wistar Jantan Pasca Paparan Asap Rokok
Gambar 1. Kurva Regresi Linier MDA 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 baku 1 baku 2 baku 3 baku 4 baku 5 baku 6
Gambar 1. Kurva Regresi Linier MDA
plasma  antar  kelompok  perlakuan  menggunakan  uji Mann-Whitney.
Berdasarkan  hasil  analisis  kadar  MDA  plasma kelompok  perlakuan  negatif  memiliki perbedaan yang  signifikan  terhadap  semua  kelompok  (p<0,05). Kelompok  negatif  merupakan  kelompok  yang  hanya diberi  paparan  asap  rokok  tanpa  diberikan  asupan antioksidan.  Radikal  bebas  dari  asap  rokok menyebabkan terjadinya peroksidase asam lemak tak jenuh membran sel yang memperkuat  stres oksidatif 23 .Menurut Somwanshi et  all(2013)  bahwa terjadi  peningkatan  kadar  MDA  akibat  adanya paparan asap rokok 24 .
Penurunan kadar MDA plasma secara signifikan terjadi pada kelompok perlakuan positif. Kadar MDA plasma  kelompok  kontrol  positif  berbeda  signifikan terhadap  kelompok  dosis  1  dan  dosis  2  (p<0,05), tetapi  tidak  berbeda  signifikan  terhadap  kelompok normal  dan  dosis  3  (p>0,05).  Menurut  Traber et  al (2007),  vitamin  E  merupakan  penangkap  radikal peroksil  yang  dapat  mencegah  propagasi  radikal bebas  pada  membran  sel    dan  plasma  lipoprotein 25 . Berdasarkan  O’Donnel  (1997)  radikal  peroksil  akan berikatan  dengan  atom  H  fenolik  dari  gugus  OH tokoferol.    Tokoferol  menangkap  radikal  peroksil lebih  cepat  daripada  radikal  peroksil  yang  akan bereaksi  dengan  substrat  lipid.  Tokoferol  akan menjadi  radikal  bebas  yang  stabil  (tocopheroxyl radical).  Reaksi  antara tocopheroxyl  radical dan radikal peroksil akan menghasilkan dua produk yang bersifat  stabil  yaitu  α – tocopherylquinone dan epoxyquinone 26 .
Kadar  MDA  plasma  kelompok  dosis  3  lebih rendah  secara  signifikan  jika  dibandingkan  dengan kelompok  dosis  1  dan  dosis  2.  Selain  itu  memiliki kadar MDA  yang tidak bebrbeda signifikan terhadap kelompok normal dan kelompok vitamin E Sehingga dapat  disimpulkan  dosis  ekstrak  etanol  daun  buas- buas  yang  dapat  menurunkan  kadar  MDA  secara signifikan adalah 600 mg/kg BB. Kemampuan dalam menurunkan  kadar  MDA  karena  diduga  kandungan flavonoid  dari  ekstrak  etanol  daun  buas-buas.  Selain itu kandungan senyawa lain seperti alkaloid, triterpen dan saponin diduga ikut berperan sebagai antioksidan.
Menurut  Wayanet  al (2012)  flavonoid  adalah antioksidan eksogen yang telah dibuktikan bermanfaat  dalam  mencegah  kerusakan  sel  akibat stres  oksidatif  ,  terdapat  dua  mekanisme  flavonoid sebagai antioksidan  yaitu  mendonorkan ion hidrogen sehingga  menetralisir  efek  toksik  dari  radikal  bebas serta meningkatkan ekspresi gen antioksidan endogen melalui  aktivasi nuclear  factor  erythroid  2  related factor 2 (Nrf2) sehingga terjadi peningkatan gen yang berperan  dalam  sistesis  enzim  antioksidan  endogen 27 .  Kekuatan  aktivitas  antioksidan  dari  flavonoid
bergantung  pada  jumlah  dan  posisi  dari  gugus -OH yang  terdapat  pada  molekul.Kekuatan  aktivitas antioksidan  dari  flavonoid  bergantung pada  jumlah dan  posisi  dari  gugus -OH  yang  terdapat  pada molekul.Semakin banyak gugus -OH pada flavonoid, maka aktivitas antiradikalnya semakin tinggi 28 . Berdasarkan Nzaramba (2008) kompenen fenolik  merupakan  terminator  dari  radikal  bebas  dan sebagai pengkelat ion  logam  redoks aktif. Ion logam ini  memungkinkan  peranannya  untuk  mengatalisis reaksi  peroksidasi  lipid.  Antioksidan  fenolik  ini menghalangi  oksidasi  lipid  dan  molekul  lain  dengan cara  mendonasikan  atom  hidrogen  ke  senyawa radikal  membentuk  intermediet  radikal  fenoksil. Senyawa  intermediet  radikal  fenoksil  relatif  stabil sehingga  tidak  mampu  lagi  menginisiasi  reaksi radikal  selanjutnya  .Aktivitas  biologis  yang  tinggi pada  senyawa  fenolik  ini  terletak  pada  posisi  dan jumlah gugus hidroksil (-OH) 29 .
Menurut  Dinara et  al (2007),  senyawa  alkaloid dapat bertindak sebagai penangkap radikal bebas dan dapat  mencegah  terjadinya  peroksidasi  lipid  pada hepatik  mikrosomal 30 .  Senyawa  alkaloid,  terutama indol,  memiliki  kemampuan  untuk  menghentikan reaksi  rantai  radikal  bebas  secara  efisien.Senyawa radikal  turunan  dari  senyawa  amina  ini  memiliki tahap  terminasi  yang  sangat  lama.  Senyawa  alkaloid lain  yang  bersifat  antioksidan  adalah  kafein  yang dapat  bertindak  sebagai  peredam  radikal  hidroksil. Namun  dalam  penelitian  ini  belum  dapat  diketahui jenis  alkaloid  yang  berperan  dalam  bioaktivitas antioksidan 31 .
Berdasarkan  Lichuan et  al (2009),  triterpenoid secara  potensial  dapat  menginduksi  pengekspresian gen  Nrf2  dan  mengaktifkan  mengaktifkan pathway ARE  (Antioxidant Response  Element)  dalam  sel neuronal.  Nrf2/ARE  akan  meregulasi  lebih  dari  200 gen termasuk gen antioksidatif 32 . Selain itu menurut Grassman (2005), triterpenoid akan mengikat radikal HOO*  yang  dapat  bereaksi  secara  cepat  dengan radikal  lonoleilperoksil  sehingga  membawa  reaksi menuju  tahap  terminasi 33 .  Senyawa  saponin  dapat bertindak sebagai antioksidan dan memiliki kemampuan  dalam  menangkap  radikal  bebas. Kemampuan  senyawa  saponin  dalam  menurunkan stress  oksidatif  pada  tikus  yang  diinduksi  aloksan sudah dilaporkan oleh Alii et al (2014) 34 .

## IV. KESIMPULAN
Kesimpulan  yang  dapat  diambil  berdasarkan hasil penelitian ini adalah:
1. Ekstrak etanol daun buas-buas dapat menurunkan  kadar  MDA  plasma  tikus  yang terpapar asap rokok.
2. Dosis  ekstrak  600  mg/kg  BB  dapat  menurunkan kadar MDA plasma secara signifikan.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Yanbaeva  DG,  Dentener  MA,  Creutzberg  EC, Wesseling  G,  Wouters  EF. Systemic  Effect  of Smoking. Chest. Mei 2007. 131(5): 1557-1566.
2. World  Health  Organization.  WHO  Report: the global  tobacco  epidemic.  Indonesia:  World Health Organization; 2013.
3. Kementerian  Kesehatan  Republik  Indonesia.
Riset  Kesehatan  Dasar  2013.  Jakarta:  Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian  Kesehatan  Republik  Indonesia; 2013.
4. Nagamma  T,  Anjaneyulu  K,  Baxi  J,  Dayaram PP. Effects  of  Cigarette  Smoking  on  Lipid Peroxidation  and  Antioxidant  Status  in  Cancer Patients  from  Western  Nepal. Asian  Pacific  J Cancer Prev. 2007. 13(1): 313-316.
5. Sela  S,  Shurtz-Swirski  R,  Awad  J,  Shapiro  G, Nasser  L,  Shasha,  S.  M. The Involvement  of Peripheral Polymorphonuclear Leukocytes in the Oxidative  Stress  and  Inflammation  among Cigarette  Smokers.  Israel  Medical  Association Journal. Nopember 2004. 4(11): 1015-1019.
6. Rumley  AG,  Woodward  M,  Rumley  A. Plasma Lipid Peroxides:
Relationships to Cardiovascular  Risk  Factors  and  Prevalent
Cardiovascular  Disease. QJM.    Agustus  2004. 97(12): 809-816.
7. Yueniwati  Y,  Ali  M. Pengaruh  Paparan  Asap Rokok  Kretek  terhadap  Peroksidasi  Lemak  dan System  Proteksi  Superoksid  Dismutase  Hepar Tikus  Wistar. Jurnal  Kedokteran  Yarsi.  2004. 12(1): 85-92.
8. Wulansari  D,  Chairul. Penapisan  Aktivitas Antioksidan  dan  Beberapa  Tumbuhan  Obat Indonesia Menggunakan Radikal 2,2-Diphenyl-1
Picrylhydrazyl (DPPH). Majalah Obat Tradisional.2011.16(1): 22-25
9. Ali  Mat  MS. Analysis  of  Phenolics  and  Other
Phytochemicals in Selected Malaysian
Traditional  Vegetables  and  Their  Activities In Vitro. Thesis. 2008. Universtas of Glasgow.
10. Bakar  FA,  Mohamed  S,  Hamid  AA,    Mustafa RA. Total Phenolic Compounds, Flavonoids and Radical  Scavenging  Activity  Of  21  Selected
Tropical  Plants. Journal  Of  Food  Science. Januari- Februari 2010. 75(1): 28-35.
11. Departemen  Kesehatan  Republik  Indonesia. Parameter  Standar  Umum  Ekstrak  Tumbuhan Obat.  Jakarta: Departemen  Kesehatan  Republik Indonesia; 2000. p. 5, 9-12.
12. Raaman,  N. Phytochemical  Technique.  New Delhi: New India Publishing Agency; 2006. Hal 21-22, 230.
13. Robinson,  T. The  Organic  Constituents  of Higher Plants Their Chemistry and Interrelationships.  5th  Ed.  North  Amherst: Cordus Press; 1983.
14. Kristanti AN, Aminah NS, Tanjung M, Kurniadi B. Buku  Ajar  Fitokimia.  Surabaya:  Airlangga University Press. 2008. Hal 48-49.
15. Momuat  LI,  Meiske  SS,  Ni  Putu  Purwati. Pengaruh  VCO  Mengandung  Ekstrak  Wortel terhadap Peroksida  Lipid  Plasma.  Jurnal  Ilmiah Sains. Oktober 2013. 11(2): 296-301.
16. Voigt  R. Buku  Pelajaran  Teknologi  Farmasi. Yogyakarta  :  Gadjah  Mada  University  Press; 1995. Hal. 561.
17. Dewi  S,  Budi  H,  Hendra  F. Penentuan  Kadar Nikotin  Dalam  Asap  Rokok.  Makara  Kesehatan. Desember 2013. 7(2): 38-41.
18. Bradbury,  S. Reregistration  Eligibility  Decision
for Nicotine. DirectorSpecial Review andReregistration Division. United States Prevention; 2008.
19. Van der Vaart, DS Postma, W Timens, NHT Ten Hacken. Accute Effect  of  Cigarette  Smoke  on Inflammation  and  Oxidative  Stress:  a  Review. Thorax. 2004. 59: 713-721.
20. Mitruka BM, Rawnsley HM. Clinical, Biochemical  and  Hematological  Reference Values  in  Normal  Experimental  Animals  and Normal Humans. New York: Masson Publishing; 1981. Hal 413.
21. Konig D, Berg A. Exercise and Oxidative Stress: Is  there  a  Need  for  Additional  Antioxidant. Osterreichisches J Fur Sportmedizin. 2002. 3: 6- 15.
22. Yagi  K. Free  Radical  in  Diagnostic  Medicine.
Armstrong  D,  editor.  New  York:  Plenum Pr; 1994.
23. Kevin  C,  Kregel,  Hannah  J,  Zhang. An Integrated  View  of  Oxidative  Stress  in  Aging: Basic  Mechanisms,  Functional  Efects,  and Pathological  Considerations.  Am  J  Physiol Regul  Integr  Comp  Physiol.  Agustus  2006. 292(1): 18-36.
24. Somwanshi  DS,  Mahesh  BM,  Sandeep  G, Mahendra  B,  Sachin  BI. Effect  of  Cigarette Smoking  on  Lipid  Peroxidation  In  Semen. International  Journal  of  Basic  and  Applied Medical  Sciences.  Mei- Agustus  2013.  ISSN: 2277-2103. 3(2): 289-294.
25. MG  Traber,  J  Atkinson. Vitamin  E,  Antioxidant and  Nothing  More.  Free  Radical  biology  and Medicine. Juli 2007. 43(1): 4-15.
26. O’Donnel, VB Chumley, PH Hogg,Bloodsworth A,  Darley-Usmar  VM,  Freeman  BA. Nitric Oxide  Inhibition  of  Lipid  Peroxidation:  Kinetics of  Reactions  with  Lipid  Peroxyl  Radicals  and Comparison  with  Tocopherol.  Biochem.  1997. 15216-15223.
27. I  Wayan  S,  I  Made  J. Ekstrak  Air  Daun  Ubi Jalar  Ungu  Memperbaiki  Profil  Lipid  dan Meningkatkan  Kadar  SOD  Darah  Tikus  yang Diberi  Makanan  Tinggi  Kolesterol.  Medicina.
Mei 2012. 43(2): 67-70.
28. Amic  D,  Beslo  D,  Trinajstic  N,  Davidovic. Structure-Radical Scavenging
Activity Relationships of Flavonoids. Croatia Chem Acta. Oktober 2002. ISSN-0011-1643 7. 6(1): 55-61 .
29. Nzaramba MN. Relationships Among Antioxidants,  Phenolics,  and  Specific  Gravity  in Potato Cultivars, and Evaluation of Wild Potato Species  for  Antioxidants,  Glycoalkaloids,  and Anti-Cancer  Activity  on  Human  Prostate  and Colon  Cancer  Cells In  Vitro. Disertasi. 2008. Texas A&M University.
30. Yuhernita  dan  Juniarti. Analisis  Senyawa Metabolit Sekunder  dari  Ekstrak  Metanol  Daun Surian  Yang  Berpotensi  Sebagai  Antioksidan.
MAKARA. April 2011. 15(1): 48-52.
31. Dinara  JM,  Marc  FR,  Jane  MB,  Joa˜o  APAH, Jenifer S. Antioxidant Properties of B-Carboline Alkaloids  are  Related  to  Their  Antimutagenic
and  Antigenotoxic  Activities.  Mutagenesis.  Juni 2007. 22(4): 293-302.
32. Lichuan  Yang,  Noel  Y.  Calingasan,  Bobby Thomas, Rajnish KC, Mahmoud Kiaei, Elizabeth JW,  Karen  TL,  Charlotte  Williams,  Darlene Royce,  Renee  Risingsong,  Eric  SM,  Jason  D. Morrow3,  Michael  Sporn,  M. Flint  Beal. Neuroprotective  Effects  of  the Triterpenoid, CDDO Methyl Amide, a Potent Inducer of Nrf2- Mediated Transcription. Plos One. Juni 2009. 6: 1-13.
33. Grassman  J. Terpenoids  as  Plant  Antioxidant. Germany: Elseiver Inc; 2005. Hal 516.
34. Alli  Smith  YR,    Adanlawo  IG. In  Vitro and In Vivo Antioxidant  Activity  of  Saponin  Extracted from The Root ff Garcinia Kola (Bitter Kola) on Alloxan-Induced Diabetic Rats. World Journal of Pharmacy  and  Pharmaceutical  Sciences.  Juni 2014. 3(7): 8-26, ISSN 2278 – 4357.