## AKTIVITAS PROTEOLITIK BAKTERI LOKAL YANG DI ISOLASI DARI TEMPAT PENANGKARAN BUAYA
Jendri Mamangkey 1 *, Dwi Suryanto 2
1 Program Studi Pendidikan Biologi, FKIP-Universitas Kristen Indonesia, DKI Jakarta
2 Departemen Biologi, FMIPA-Universitas Sumatera Utara, Medan *Corresponding author: jendri.mamangkey@uki.ac.id

## Abstract
Indonesia has an ecological diversity which can be used as significantly potential habitat for local bacteria. One of such environments is crocodile breeding where research on proteolytic bacteria is still minimal. Proteolytic bacteria  are  a  type  of  bacteria  which  can  produce  protease  enzymes.  This  research  was  performed  aiming  to find selected proteolytic bacteria that can produce protease enzymes. Pour plate method using skim milk agar media  was  employed  to  isolate  the  bacteria.  Bacteria  isolates  were  selected  based  on  qualitative  and quantitative tests. Current research results discovered 6 bacteria isolates which had proteolytic ability  after the qualitative test. Among those 6 isolates, 3 (FB2, THB1b, and THB6a) were able to hydrolyze skim milk media with  the  fastest  incubation  time  of  18  hours.  Meanwhile,  based  on  quantitative  test,  1  isolate  produced  the highest  protease  activity,  which  is  FB2  isolate  with  958  U/mL  having  a  total  of  12.05  cells/mL.  Based  on  this research  report,  FB2  isolate  collected  from  crocodile  feces  (FB)  has  the  potential  to  be  utilized  in  protease enzymes application in the environment.
Keywords : Proteolytic, crocodile breeding, qualitative and quantitative, protease

## PENDAHULUAN
Biodiversitas bakteri proteolitik yang
belum maksimal dieksplorasi mengakibatkan aktualisasi informasi mengenai  aplikasi  industri  enzim  protease melibatkan  bakteri-bakteri  lokal  belum terimplementasikan  dengan  baik.  Salah satu  lingkungan  yang belum banyak dikaji mengenai  bakteri  proteolitiknya  adalah tempat penangkaran buaya. Ekologi penangkaran buaya berpotensi untuk diteliti diversitas bakterinya untuk keperluan  industri.  Upaya  yang  terus dilakukan  adalah  mengoleksi  sebanyak mungkin  enzim  bakteri  yang  berpotensi menghasilkan nilai produk industri bermanfaat  dan  memiliki  nilai  tinggi. Bakteri proteolitik merupakan jenis bakteri
yang memiliki kemampuan untuk memproduksi  enzim  protease.  Protease memiliki  peran  yang  komprehensif,  selain berperan  dalam  mekanisme  metabolisme seluler  protease  dapat    diimplementasikan untuk berbagai macam perindustrian (Gupta et al ., 2002).
Sejak  protease  dari  tumbuhan  dan hewan  tidak  dapat  memenuhi  permintaan yang  terus  meningkat,  saat  ini  lebih difokuskan  pada  protease  mikroorganisme secara global (Sakinala et al ., 2016). Selain itu, protease mikroorganisme yang diperlukan  kira-kira  40%  dari  total produksi enzim di seluruh dunia (Haddar et al .,  2009;  Raval et  al .,  2014).  Bakteri adalah  sumber  enzim  protease  yang menjanjikan untuk menghasilkan
Jendri Mamangkey & Dwi Suryanto: Aktivitas Proteolitik Bakteri Lokal yang di Isolasi dari Tempat Penangkaran Buaya
pemasukan  miliaran  dolar  perdagangan internasional.  Rujukan  Chandra et  al . (2020) menyatakan, protease mikroorganisme dikenal stabilitasnya terhadap  berbagai  pH,  suhu,  dan  sifat substrat.  Enzim,  produk  metabolisme mikroorganisme,  memiliki  relevansi  tinggi dalam  menunjang  ekonomi  hijau  dengan alasan  spesifik  yaitu  substrat  berlimpah  di alam, peningkatan efisiensi katalitik, efektivitas biaya, dan keramahan lingkungan  (Ahuja et  al .,  2004;  Baweja et al ., 2016).
Protease  bakteri  termasuk  kelompok hidrolase  dan  enzim  multifungsi  yang mengkatalisis reaksi-reaksi hidrolisis  dari berbagai polimer protein ke dalam konstituen  yaitu  peptida  dan  asam  amino (Guleria et  al .,  2016;  Johannes  &  Zhao, 2006).  Protease  termasuk  salah  satu  dari tiga  kelompok  enzim  yang  diaplikasikan dalam  industri,  pasar  global  protease meningkat  secara  drastis  setiap  tahunnya. Protease  menyumbang  20%  dari  60% enzim  yang  dipasarkan  di  seluruh  dunia (Kang et  al .,  1995;  Rao et  al .,  2009;
Singhal et  al .,  2012).  Bakteri  proteolitik saat ini terlaporkan adalah bersumber pada substrat  berprotein  tinggi  seperti  limbah sisa  cucian  ayam  potong  dan  sisa  cucian ikan  (Andika  &  Sulistyarsi,  2017),  limbah cair pengolahan bandeng presto (Paskandani et al. 2014), dan tanah tempat pembuangan  akhir  (Mamangkey et  al .,
2020).  Protease  merupakan  kelompok enzim  yang  peranannya  cukup  penting dalam  berbagai  fungsi  biologi  mulai  dari tingkat  sel,  organ  hingga  organisme  yang diistilahkan  sebagai  reaksi  metabolik  dan fungsi regulator (Vazquez et al. , 2008).
Eksplorasi  bakteri  proteolitik  yang berasal  dari  tempat  penangkaran  buaya adalah  bentuk  upaya  untuk  menemukan jenis  bakteri  baru  lokal  yang  belum diketahui
sebelumnya. Ekologi penangkaran buaya menunjang berkembangnya  bakteri  proteolitk,  hal  ini dikarenakan  ketersediaan  substrat  protein berlimpah  dari  sisa  makanan  buaya  yaitu daging burung/ayam dan bulu-bulu burung/ayam yang sudah jelas mengandung  protein  tinggi.  Oleh  karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi  dan  menguji  kemampuan proteolitik  bakteri  lokal  dari  tempat penangkaran buaya Asam Kumbang Medan  Selayang,  Medan,  Sumatra  Utara, Indonesia  sebagai  dasar  awal  penentuan isolat  yang  dapat  diaplikasikan  pada industri pertanian, peternakan, dan lingkungan.

## METODE PENELITIAN Lokasi Pengambilan Sampel
Sampel  feses  buaya  diperoleh  dari tempat penangkaran buaya Asam Kumbang,  Sumatra  Utara,  Indonesia  (E 98 ° 37 ' 11.24 ", N). Feses yang dikoleksi
lalu  disimpan  dalam  plastik  ziplock  steril (30x40 cm). Sampel dimasukkan ke dalam ice  box  untuk  pengerjaan  selanjutnya  di laboratorium.

## Isolasi Bakteri
Isolasi  bakteri  sesuai  metode  Yue et al .  (2017)  dengan  beberapa  modifikasi.
Sampel tanah/feses buaya 1 gram dimasukkan dalam 9 mL NaCl (0,9% w/v) melalui  tahapan  pengenceran  bertingkat 10 -1 sampai  10 -9 .  100  μL  sampel tersuspensi  dari  tiga  pengenceran  terakhir yaitu 10 -7 , 10 -8 , dan 10 -9 dituangkan merata pada  media Nutrient  Agar (OXOID,  kode CM0003).  Komposisi Nutrient  Agar kode CM0003  adalah  pepton  5  gram,  sodium chlorida 5 gram,  agar 15 gram, lab-lemco’ powder  1  gram,  dan yeast  extract 2  gram.
Cawan berisi media dan sampel diinkubasi pada  35°C±2  selama  24  jam.  Koloni bakteri yang tumbuh dipindahkan ke dalam media nutrient agar miring (tabung reaksi) disimpan untuk penelitian lebih lanjut. Skrining Kemampuan Proteolitik Bakteri (Pengujian Kualitatif)
Media Skim  milk  agar (OXOID
LP0031B) digunakan untuk menguji bakteri  yang  diisolasi  dari  tanah/feses buaya. Skim  milk  agar dimasukkan  dalam akuades  steril,  selanjutnya  homogenisasi dan  dipasteurisasi  suhu  ±  70°C  sampai susu  skim  larut.  Koloni  bakteri  terseleksi diinokulasikan pada media skim milk agar .
Bakteri  terdeteksi  menghidrolisis  protein
ketika  terbentuk  zona  bening  pada  sekitar objek  koloni  bakteri.  Aktivitas  proteolitik diketahui  nilainya  dengan  menggunakan rumus:
Aktivitas Proteolitik = Diameter zona bening – Diameter koloni bakteri (Meliah
et al . 2018).
Pengujian Kuantitatif Aktivitas Protease Bakteri
Semua  isolat  bakteri  terpilih  diuji secara kuantitatif kemampuan proteolitiknya. Aktivitas protease diuji dari 500  μL  supernatan  yang  ditambahkan  500 μL  substrat  kasein  2%  dalam  0,05  M buffer  fosfat  (pH  7).  Inkubasi  suspensi dilakukan  pada  suhu  37  ºC  selama  10 menit, setelah itu ditambahkan 1 mL asam trikhloroasetat  (0,4M)  dan  didiamkan  30 menit pada suhu ambient. Larutan disentrifugasi menggunakan kecepatan 4000  rpm  selama  15  menit  (4  ºC). Sebanyak  1  mL crude  enzyme atau supernatan  diambil  dan  dimasukkan  ke dalam tabung reaksi pengenceran, kemudian diencerkan dengan menambahkan  Tris  HCl  sampai  volume total  2  mL.  Aktivitas  protease  diketahui dengan  mengukur  nilai  absorbansi  larutan dengan  panjang  gelombang  450  nm.  Satu unit aktivitas protease didefinisikan sebagai  jumlah  enzim  yang  diperlukan untuk menghasilkan perubahan penyerapan 1  μmol  tirosin  dengan  substrat  azokasein
Jendri Mamangkey & Dwi Suryanto: Aktivitas Proteolitik Bakteri Lokal yang di Isolasi dari Tempat Penangkaran Buaya
dalam  kuvet  1  cm,  di  bawah  kondisi  alat uji (Sarath, et al ., 1989).

## Pengamatan Pertumbuhan Bakteri
Pertumbuhan bakteri proteolitik dapat diamati melalui nilai Optical Density (OD).  Pengukuran  OD  dengan  cara menyiapkan  10  ml  sampel,  larutan disentrifugasi  dengan  kecepatan  3000  rpm (10  menit).  Supernatan  (larutan  hasil sentrifugasi)  dibuang  dan  pelet  yang diperoleh dilarutkan dengan 10 mL larutan PBS selanjutnya divortex untuk
homogenisasi. Nilai OD diamati menggunakan  spektrofotometer  dengan panjang gelombang 600 nm.

## Analisis Data
Data  dianalisis  menggunakan  software OriginLab 2019

## HASIL DAN PEMBAHASAN Pengolahan Sampel
Ada dua jenis sampel yang dikoleksi untuk  mengisolasi  bakteri  dari  tempat penangkaran  buaya,  yang  pertama  habitat buaya (THB) dan kedua adalah feses buaya (FB).  Masing-masing  tipe  sampel  diambil dari beberapa titik dengan tujuan menemukan  jenis  bakteri  yang  lebih variatif.  Total  bakteri  yang  berhasil diisolasi  dari  tempat  penangkaran  buaya adalah  24  isolat  (Tabel  1).  Dari  24  isolat bakteri  hanya  6  isolat  yang  terdeteksi memiliki  kemampuan  proteolitik  yaitu THB1b,  THB6a,  FB1b,  FB2,  FB3b,  dan FB4 ( Gambar  1 ).  Kemampuan proteolitik bakteri  diketahui  setelah  ditumbuhkan dalam media skim milk agar .
Gambar 1. Zona Bening Bakteri Proteolitik dari Tempat Penangkaran Buaya Sumber. Dokumen Penulis
Besarnya
aktivitas proteolitik
masing-masing  isolat  bakteri  bervariasi yang ditunjukkan oleh perbedaan luas zona bening  yang  terbentuk  ( Gambar  1 ).
Terbentuknya  zona  bening  menunjukkan isolat  bakteri  memanfaatkan skim milk pada media sebagai substrat
pertumbuhannya yang mengakibatkan protein di sekitar koloni habis dimanfaatkan.  (Lakshmi et  al .  (2014) berpendapat bahwa keberadaan zona bening  (indeks  proteolitik)  dalam  media padat  dapat  dijadikan  rujukan  untuk mendemonstrasikan  kemampuan  bakteri dalam  memproduksi  protease,  tetapi  tidak dijadikan  referensi  untuk  menentukan kualitas  untuk  menghasilkan  protease (Ningthoujam & Kshetri, 2010; Zilda et al .,
2012).Aktivitas  proteolitik  bakteri  sangat dipengaruhi  oleh  komposisi  media  yang digunakan  sebagai  sumber  nutrisi. Skim milk agar  mengandung  banyak  nutrisi seperti kasein, kalsium, kalium, magnesium,  dan  fosfor.  Kasein  yang mengandung protein fosfor dapat mengikat kalsium untuk membentuk kalsium kalsinat,  sehingga suspensi  berwarna putih dan  lebih  mudah  diamati  zona  hidrolisis bakteri pada media padat (Pakpahan, 2009). Untuk  menguatkan  hasil  penelitian  maka dilakukan  pengamatan  waktu  hidrolisis pada  masing-masing  isolat. Tabel  1 menunjukkan  dari  24  isolat  bakteri,  ada  3 isolat (FB2, THB1b, THB6a) yang mampu menghidrolisis  media skim  milk dengan waktu inkubasi tercepat, yaitu 18 jam.
Tabel 1. Hasil pengujian kemampuan bakteri menghidrolisis protein
Kode isolat Kemampuan Hidrolisis Protein Waktu Yang Diperlukan (Jam) FB1a - 0 FB1b ++ 21 FB2 +++ 18 FB2b - 0 FB3a - 0 FB3b ++ 21 FB4 + 24 FB4b - 0 FB5 - 0 FB5b - 0 FB6 - 0 FB6b - 0 THB1a - 0 THB1b +++ 18 THB2 - 0 THB2b - 0 THB3 - 0 THB3b - 0 THB4 - 0 THB4b - 0 THB5 - 0 THB5b - 0 THB6a +++ 18 THB6b - 0 Keterangan: (-) = 0 mm, (+) = < 10 mm, (++) = > 10 mm, (+++) = > 20 mm
Jendri Mamangkey & Dwi Suryanto: Aktivitas Proteolitik Bakteri Lokal yang di Isolasi dari Tempat Penangkaran Buaya
THB1b THB6a FB1b FB2 FB3b FB4 0 5 10 15 20 25 30 Luas Z ona Benin g ( mm 2 ) Isolat Bakteri Proteolitik Luas Zona Bening (mm2)
Gambar 2. Luas Zona Bening Isolat Bakteri Proteolitik Sumber. Dokumen Penulis
Isolat FB2 diperoleh dari feses buaya pada  titik  lokasi  ke-2,  sedangkan  isolat THB1b dan THB6a berhasil dikoleksi dari tempat  habitat  buaya  diwakili  oleh  sampel tanah  dan  sisa-sisa  pakan  buaya.  Ketiga isolat bakteri proteolitik mampu menggunakan skim milk untuk pertumbuhannnya  sesuai  dengan  nutrisi habitat  aslinya,  buaya  yang  diberi  pakan berupa daging ayam/burung mentah (protein  tinggi)  akan  menghasilkan  feses yang  mengandung  bakteri  proteolitik, selain  itu  akumulasi  alami  bulu  unggas dalam  feses  dan  tanah  di  lingkungan penangkaran  sangat  cocok  bagi  bakteri proteolitik untuk tumbuh. Bakteri proteolitik  dapat  menggunakan  kandungan protein  pakan  ataupun  sisa  pakan  buaya sebagai sumber C dan N-nya.
Isolat  bakteri  proteolitik  dari  feses sebelumnya telah diteliti namun dari objek hewan  yang  berbeda.  Rahmawati  (2016) berhasil  menyeleksi  3  isolat  bakteri proteolitik dari feses hewan luwak ( Paradoxurus  hermaphroditus ).  Ogunnusi & Olorunfemi (2018) melaporkan 12 isolat bakteri  proteolitik  yang  diperoleh  dari sampel  feses  sapi  diantaranya Providencia stuartii , Bacillus  cereus , Staphylococcus sp., Escherichia , Klebsiella  oxytoca ,  dan Streptococcus sp.  Hamdani et  al .  (2019) juga  berhasil  mengisolasi  2  isolat  bakteri proteolitik  dari  kotoran  babi,  setelah diidentifikasi  dengan  metode  16s  rRNA menunjukkan bahwa kedua bakteri proteolitik tersebut adalah Bacillus pseudomycoides dan Staphylococcus sciuri.
THB1b THB6a FB1b FB2 FB3b FB4 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Aktivitas Enzim Protease (U/mL) Jumlah Sel Bakteri (Log 10 Sel/mL) Bakteri Proteolitik 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Gambar 3. Hubungan Jumlah Sel Dengan Aktivitas Protease Isolat Bakteri Proteolitik Sumber. Dokumen Penulis
Ketika  bakteri  ditumbuhkan  pada substrat  protein  seperti  gelatin,  protein susu,  protein  daging,  protein  semata-mata tersedia untuk pertumbuhan bakteri.
Nitrogen,  karbon,  dan  energi  tersedia dalam  protein.  Untuk  mengatur  faktor- faktor pertumbuhan bakteri proses pertama yang  harus  dilakukan  bakteri  proteolitik adalah hidrolisis enzimatik protein. Bakteri proteolitik  akan  mendegradasi  protein  dan memanfaatkan  produk  degradasi  yang lebih  sederhana  seperti  asam  amino sebagai  nutrisi  untuk  pertumbuhannya. Tingginya aktivitas proteolitik oleh bakteri sangat  ditentukan  oleh  jumlah  enzim  yang disekresikan  substrat  setelah  melewati masa  inkubasi  (Sharma,  2010).  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  isolat
bakteri  proteolitik  menghasilkan  luas  zona bening berkisar antara 9-23 mm 2 .
Isolat FB2 terdeteksi memiliki kemampuan  proteolitik  yang  paling  besar yaitu  23,8  mm 2 ,  sedangkan  terendah  yaitu 9,5  mm 2 terdapat  pada  isolat  FB4 ( Gambar  2 ).  Isolat  FB2  dan  FB4  berhasil dikoleksi  dari  feses  buaya,  FB2  pada  titik lokasi  2  dan  FB4  pada  titik  lokasi  4. Tingginya aktivitas proteolitik FB4 kemungkinan  besarnya  karena  konsentrasi substrat  protein  yang  lebih  tinggi  pada hasil  koleksi  feses  buaya.  Penelitian bakteri proteolitik lainnya berhasil dilaporkan oleh beberapa peneliti diantaranya Rizaldi et al . (2018) melaporkan bakteri proteolitik yang berasosiasi  dengan  lamun,  isolat  EA-2 dengan  diameter  zona  bening  7,5  mm
Jendri Mamangkey & Dwi Suryanto: Aktivitas Proteolitik Bakteri Lokal yang di Isolasi dari Tempat Penangkaran Buaya
adalah  aktivitas  protease  terendah  dan zona  bening  terbesar  diperlihatkan  oleh isolat  EA-1  dengan  diameter  18  mm. Fatoni et  al .  (2008)  berhasil  mendapatkan 7 isolat bakteri proteolitik yang bersumber pada limbah  cair tahu,  Wardani  &  Nindita (2012)  berhasil  mengisolasi  30  bakteri proteolitik  dari whey tahu  yang  memiliki aktivitas protease bervariasi.
Enam  isolat  bakteri  dari  tempat penangkaran buaya yang memiliki aktivitas  proteolitik  yaitu  THB1b,  THB6a, FB1b,  FB2,  FB3b,  dan  FB4  ( Gambar  2 ). Aktivitas  protease  bakteri  menyebabkan skim dalam  media skim  milk  agar terhidrolisis dan berubah peptida dan asam amino.  Asam  amino  termasuk  molekul amfoter (dapat bertindak baik sebagai asam atau  basa,  tergantung  mediumnya)  yang terdiri  dari  gugus  amina  dan  asam karboksilat  sebagai  kelompok  fungsional (Andrea & Pierandrea, 2012). Asam amino diumpamakan  sebagai  blok  bangunan protein, yang penting dalam mempertahankan  pertumbuhan  organisme hidup termasuk bakteri (Jakubke & Sewald, 2008).
Besarnya  aktivitas  protease  bakteri sangat  ditentukan  jumlah  sel  bakteri  yang tumbuh  dalam  media  pertumbuhan.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  isolat bakteri  yang  memiliki  aktivitas  protease tertinggi  adalah  isolat  FB2  sebesar  958 U/mL  dengan  jumlah  12,05  sel/mL
sedangkan  isolat  FB4  sebesar  285  U/mL dengan  jumlah  terendah  yaitu  5,80  sel/mL (Gambar  3).  Isolat  FB2  memiliki  aktivitas protease  tertinggi  sangat  dipengaruhi  oleh nutrisi yang ada dalam media pertumbuhan, sumber N media membuat sekresi protease isolat  FB2  maksimal.  Protease  bakteri merupakan  bentuk enzim  konstitutif. Enzim  konstitutif  artinya  ketersediaannya selalu  ada  di  dalam  sel  bakteri  dengan kuantitas  relatif  konstan,  sedangkan  enzim induktif disintesis apabila dilakukan induksi dalam media pertumbuhan bakteri. Sintetis  enzim  induktif  dapat  meningkat beriringan dengan ditingkatkannya konsentrasi substrat terutama ketika substratnya menjadi sumber nutrisi tunggal (Lidya & Djenar, 2000).

## SIMPULAN
Enam  isolat  bakteri  lokal  yang memiliki  kemampuan  proteolitik  berhasil diisolasi,  yaitu  THB1b,  THB6a,  FB1b, FB2,  FB3b,  dan  FB4.  Tiga  isolat  bakteri yaitu  FB2,  THB1b,  THB6a  mampu menghidrolisis  media skim  milk dengan waktu  inkubasi  18  jam.  Isolat  FB2 memiliki  aktivitas  protease  paling  tinggi yaitu  sebesar  958  U/mL  dengan  jumlah 12,05 sel/mL.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahuja  SK,  Ferreira  GM,  &  Moreira  AR. 2004.  Utilization  of  Enzymes  for
Environmental Applications. Crit. Rev. Biotechnol , 24(2-3): 125-154.
Andika ZP & Sulistyarsi. 2017. Isolasi dan
Karakterisasi  Bakteri  Proteolitik  Pada Limbah  Air  Cucian  Ayam  Potong  dan Cucian  Ikan  Sebagai  Penyusun  Modul Biologi  SMA  Kelas  X. Prosiding Seminar  Nasional  SIMBIOSIS  II .  30 September  2017.  Madiun,  Indonesia, 357-367.
Andrea  B  &  Pierandrea  T.  2012.  Nuclear Magnetic  Resonance  of  Amino  Acids, Peptides, and Proteins. In Amino Acids,
Peptides  and  Proteins  in  Organic Chemistry,  Analysis  and  Function  of Amino  Acids  and  Peptides;  Hughes, A.B.,  Ed.;  John  Wiley  and  Sons,  Inc.: Weinheim, Germany, 5: 97-153.
Baweja M, Tiwari R, Singh PK, Nain L, & Shukla  P.  2016.  An  Alkaline  Protease From Bacillus pumilus Mp 27: Functional  Analysis  Of  Its  Binding Model  Toward  Its  Applications  as detergent additive. Front. Microbiol, 7: 1195.
Chandra  SJ,  Shanker  AS,  &  Pindi  PK. 2020.  Isolation  and  characterization  of novel  and  efficient  protease  producing bacteria from drinking water resources. Water Supply , 20 (1): 157-164.
Fatoni  A,  Zusfahair,  &  Lestari  P.  2008.
Isolasi  dan  Karakterisasi  Protease Ekstraseluler dari Bakteri dalam Limbah  Cair  Tahu. Jurnal  Natur Indonesia, 10 (2): 83-88.
Guleria S, Walia A, Chauhan A, & Shirkot
CK. 2016. Purification and Characterization  of  Detergent  Stable Alkaline Protease From Bacillus amyloliquefaciens SP1  Isolated  From Apple Rhizosphere . J. Basic Microbiol , 56(2):138-152.
Haddar A, Bougatef A, Agrebi R, Sellami-
Kamoun  A,  Nasri  M.  2009.  A  novel surfactantstable alkaline serine- protease from a newly isolated Bacillus mojavensis A21. Purif. Charac. Process. Biochem , 44(1): 29-35.
Hamdani  S,  Asstiyani  N,  Astriany  D,
Singgih  M,  &  Ibrahim  S.  2019.
Isolation and identification of proteolytic  bacteria  from  pig  sludge and  protease  activity  determination.
IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science, 230: 012095.
Jakubke  HD  &  Sewald  N.  2008.  Peptides From A to Z: A Concise Encyclopedia; Wiley-VCH  Verlag  GmBH  &  Co.
KGaA: Weinheim, Germany.
Johannes  TW  &  Zhao  H.  2006.  Directed
Evolution of Enzymes and Biosynthetic  Pathways. Curr.  Opin. Microbiol, 9(3): 261-267.
Kang  SG,  Kim  IS,  Rho  YT,  &  Lee  KJ.
1995. Production Dynamics of Extracellular  Proteases  Accompanying Morphological Differentiation of Streptomyces  albidoflavus SMF301.
Microbiology , 141(12): 3095–3103. Lakshmi  BKM,  Ratnasri  PV,  Devi  KA,
Hemalatha  KPJ.  2014.  Screening, optimization  of  producing  and  partial characterization  of  alkaline  protease from  haloalkaliphilic Bacillus sp. IJRET. Int.  J.  Res.  Appl.  Sci.  Eng. Technol , 3(2): 435-443.
Lidya  &  Djenar.  2000.  Dasar  Bioproses
Direktorat  Pembinaan  dan  Fenolinin dan  Pengabdian  Masyarakat  Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Departemen Pendidikan Nasional: Jakarta.
Mamangkey  J,  Suryanto  D,  Munir  E,  & Mustopa AZ. 2020. Keratinase Activity of  A  Newly  Keratinolytic  Bacteria,
Azotobacter  chroococcum B4. J  Pure Appl Microbiol , 14(2): 1203-1211.
Meliah S, Kusumawati DI, & Lisdiyanti P.
2018. The Genus Chitinophaga Isolated  from  Wanggameti  National Park and Their Lytic Activities. Jurnal Biologi Indonesia, 14(2):165-174. Ninghoujam  DS,  Kshetri  P.  2010.  A thermostable  alkaline  protease  from  a moderately halo-alkalithermotolerant
Bacillus subtilis strain SH1. Australian J.Basic Appl Sci , 4(10): 5126-5134. Ogunnusi  TA  &  Olorunfemi  O.  2018.
Isolation and Identification of Proteolytic  and  Lipolytic  Bacteria  in
Jendri Mamangkey & Dwi Suryanto: Aktivitas Proteolitik Bakteri Lokal yang di Isolasi dari Tempat Penangkaran Buaya
Cow  Dung  and  Abattoir  Effluent  from Ekiti  General  Abattoir,  Ekiti  State, Nigeria. Journal  of  Advances  in Microbiology , 11(4): 1-10.
Pakpahan  R.  2009.  Isolasi  Bakteri  dan  Uji Aktivitas  Bakteri  Protease  Termofilik dari  Sumber  Air  Panas  Sipoholon
Tapanuli  Utara  Sumatra  Utara. Tesis . Sekolah Pascasarjana Universitas
Sumatra Utara. Paskandani  R.,  Ustadi  &  Husni  A.  2014. Isolasi dan Pemanfaatan Bakteri Proteolitik Untuk Memperbaiki Kualitas  Limbah  Cair  Pengolahan bandeng  presto. J.  Manusia  dan Lingkungan , 21(3): 310-316.
Rahmawati  NHF.  2016.  Isolasi  dan Karakterisasi  Bakteri  Proteolitik  dari Feses  Hewan  Luwak  ( Paradoxurus hermaphroditus ). Jurnal  Biologi .  5(4): 62-69.
Rao  CS,  Sathish  T,  Ravichandra  P,  & Prakasham  R.  2009.  Characterization of Thermo-and Detergent Stable Serine Protease From isolated Bacillus circulans and  Evaluation  of  Eco-
Friendly Applications.
Process Biochem , 44(3): 262–268.
Raval  VR,  Pillai  S,  Rawal  CM,  Singh  SP. 2014.  Biochemical  and  structural characterization  of  a  detergent-stable serine  alkaline  protease  from  seawater haloalkaliphilic bacteria. Process. Biochem, 49(6) :955-962.
Rizaldi  R,  Setyantini  WH,  &  Sudarno. 2018.  Isolasi  dan  Karakterisasi  Bakteri Proteolitik  yang  Berasosiasi  dengan Lamun  ( Enhalus  acoroides )  di  Pantai Bama, Taman Nasional Baluran, Situbondo, Jawa Timur. 10(1): 4-14.
Sakinala  JC,  Anuradha  BS,  Reddy  K,  & Reddy  SR.  2016.  Screening  and optimization of physical parameters for enhanced  alkaline  protease  production by  alkaliphilic Bacillus  subtilis SH2 isolate. American J. Curr. Microbiol , 4
(1): 55-65.
Sarath  G,  de  la  Motte  R,  &  Wagner  F.
1989. Protease  assay  meth-ods.  In: Beynon  R,  Bond  J  (eds)  Proteolytic Enzymes: A Practical Approach , p. 259.
New York: Oxford University Press.
Sharma  PM.  2010.  Biodegradation  by Proteolytic
Bacteria:An
AttractiveAlternative  for  Biological Waste Treatment. Nat. Environ. Pollut.
Technol, 9(4): 707-711. Singhal P, Nigam V, & Vidyarthi A. 2012. Studies on Production,
Characterization  and  Applications  of Microbial  Alkaline  Proteases. Int.  J. Adv. Biotechnol. Res , 3: 653–669.
Vázquez  SC,  Hernández  E,  &  Cormack WPM.  2008.  Extracellular  Proteases from The Antarctic Marine
Pseudoalteromonas  sp. P96-47  Strain.
Rev. Argent. Microbiol , 40(1):63-71.
Wardani  AK,  &  Nindita  LO.  2012.
Purifikasi  dan  Karakterisasi  Protease dari  Bakteri  Hasil  Isolasi  dari Whey tahu. Jurnal  Teknologi  Pertanian , 13(3): 149-156.
Zilda DS, Harmayani E, Widada J, Asmara W, Irianto HE, Patantis G, Fawzya YN. 2012. Screening of thermostable protease  producing  microorganisms isolated  from  Indonesia  Hotspring.
Squalen , 7(3): 105-114.