## MEDIA KESEHATAN MASYARAKAT INDONESIA
p-ISSN: 1412-4920 e-ISSN: 2775-5614 https://ejournal.undip.ac.id/index.php/mkmi Fakultas Kesehatan Masyarakat, Universitas Diponegoro
DOI : 10.14710/mkmi.22.6.358-363
PEMBUATAN KULTUR IN

## VITRO STADIUM ERITROSIT
PLASMODIUM KNOWLESI A1-H.1
Fauzi Muh 1* , Eun-Taek Han 2
1 Department of Epidemiology and Tropical Diseases, Faculty of Public Health, Universitas Diponegoro
2 Department of Environmental Biology and Tropical Medicine, College of Medicine, Kangwon National University * Corresponding author : fauzimuh010@lecturer.undip.ac.id
Info Artikel : Diterima 13 September 2023 ; Disetujui 5 November 2023 ; Publikasi 1 Desember 2023

## ABSTRAK
Latar belakang: Plasmodium knowlesi adalah spesies Plasmodium yang terkenal mampu menyebabkan malaria zoonosis pada manusia. Infeksi P knowlesi dapat menyebabkan penyakit  yang bersifat parah hingga kematian. Parasit malaria ini dapat menginfeksi darah manusia dan juga kera. Kultur in vitro parasit stadium deritrosit ( blood stage ) jangka panjang sangat memungkinkan untuk P falciparum dan P knowlesi . P knowlesi saat ini digunakan sebagai  model  eksperimental  untuk  penelitian  in  vivo,  ex  vivo  dan  in  vitro.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengkultur P knowlesi yang dilakukan secara kontinyu dalam kondisi laboratorium. Metode: Penelitian ini  merupakan penelitian  yang menggunakan  rancangan eksperimental  dengan pendekatan observasional. Kami menggunakan strain P knowlesi A1-H.1 (PkA1-H.1) dengan beberapa kondisi laboratorium, seperti optimasi serum dan konsentrasi glokosa yang digunakan. P knowlesi di kultur selama 10 hari dan morfologi parasit dikonfirmasi dengan pewarnaan giemsa 10%.
Hasil: Strain  PkA1-H.1  mampu  mempertahankan  kemampuannya  untuk  menginfeksi  100%  sel  darah  merah manusia dalam kondisi laboratorium. Serum AB manusia dan serum kuda (10%, v/v) merupakan kondisi optimal untuk pertumbuhan PkA1-H.1. Total 2-4 gram dekstrosa anhidrat merupakan glukosa optimal yang dibutuhkan parasit  untuk  tumbuh. Parasit  tumbuh perlahan pada 5 hari pertama setelah  proses kultur dilakukan (thawing ), namun pertumbuhan bisa meningkat pesat setelah hari ke 6 kultur. Parasit nampak sehat dari hari pertama hingga hari kesepuluh, yang dibuktikan dengan penampakan morfologi ring, tropozoit dan schizont.
Simpulan : Hasil ini menunjukkan pentingnya faktor pertumbuhan yang optimal seperti konsentrasi serum dan dekstrosa  untuk  mendukung  pertumbuhan  PkA1-H.1.  Keberhasilan  kultur  in  vitro  bisa  membantu  penelitian tentang biologi invasi, vaksin dan skrining obat baru.
Kata kunci: malaria; zoonosis; P knowlesi , kultur in-vitro

## ABSTRACT
Title: Re-setting-up the Continous in-vitro Culture of Plasmodium knowlesi Blood Stages
Background: Plasmodium knowlesi is well-known Plasmodium species causing zoonotic malaria in humans. The infection of P knowlesi cause severe illness to death. This simian malaria parasite infects both macaque and human bloods. Long-term  in  vitro  cultures  of  blood-stage  parasites  are  feasible  for Plasmodium  falciparum and P knowlesi. However, P knowlesi is recently used as experimental model for in vivo, ex vivo and in vitro studies. This study aimed to culture continously the P knowlesi in laboratory condition with human red blood cells. Method: This study used an experimental study design with observasional approach. We used P knowlesi A1-H.1 strain (PkA1-H.1) under several laboratory conditions, such as serum and glocuse concentration. The culture was conducted for 10 days. The morphology of parasites was confirmed using 10% Giemsa staining.
Result: PkA1-H.1 human-adapted strain was successfully maintained ability to grow under the 100% human red blood cells. Pooled-human AB serum and horse serum (10%, v/v) was optimal condition for PkA1-H.1 to grow. Total  2-4  gram  of  dextrose  anhydrous  was  optimal  glucose  required  for  parasite  to  grow.  The  parasites  grew slowly in the first 5 days after thawing, but the growth increased rapidly after day 6 of culture. The morphology of parasites was normally observed as seen healthy rings, trophozoites and schizonts.
Conclusion : This result showed the importance of optimal growth factors (serum and dextrose) to support the PkA1-H.1 under the laboratory condition.  Its successful of continous culture highlighted the use of culture for understanding of the invasion biology, vaccine or drug discoveries.
Keywords: malaria; zoonosis; P knowlesi, in vitro culture

## PENDAHULUAN
Plasmodium  knowlesi adalah  salah  satu spesies  penyebab  penyakit  malaria  zoonosis  yang banyak  ditemukan  di  Wilayah  Asia  Tenggara, terutama  di  Malaysia  seperti  yang  banyak ditemukan di tahun 2004 . 1 Saat ini P knowlesi telah banyak  ditemukan  di  wilayah-wilayah  di  kawasan Asia  Tenggara,  seperti  Indonesia,  Thailand, Vietnam,  Myanmar,  Singapura,  India  dan  Brunei Darussalam. 2-5 Infeksi yang disebabkan oleh P knowlesi bisa berdampak  secara  serius.  Pasien  yang  terinfeksi malaria P  knowlesi bisa  berkembang  menjadi malaria berat dan kematian. 6 Di negara endemis dan berkembang,  diagnosis P  knowlesi ditegakkan dengan  menggunakan  mikroskopi.  Diagnosis penyakit  malaria P  knowlesi sering  tidak  tepat, banyak  terjadi  mis-diagnosis  yang  mengakibatkan pada  keterlambatan  penanganan  ataupun  ketidak tepatan  pengobatan  yang  diberikan. 7 Sumber penularan P knowlesi berkaitan erat dengan aktivitas berisiko  yang  dilakukan  dikawasan  hutan  dimana manusia  memasuki  habitat  monyet  dan  nyamuk. Untuk  mendiagnosis P  knowlesi diperlukan  tehnik identifikasi  morfologi  yang  tepat  yang  mampu membedakan dengan spesies Plasmodium yang lain.
Selain  itu,  diperlukan  pula  riset  untuk  mengetahui biologi  proses  invasi  dari P  knowlesi yang  akan bermanfaat  dalam  perancangan  vaksin  dan  atau obat. 8
Pengembangan sistem kultur di laboratorium dari P  knowlesi sangat  bermanfaat  dalam  riset pengembangan  vaksin  dan/atau  obat.  Seperti  yang sudah dilakukan dengan P falciparum, malaria yang paling mematikan, terbukti kultur in vitro membantu pengembangan  riset  untuk  modifikasi  genetik, skrining  kandidat  obat  dan  bahkan  pengembangan vaksin. Kultur in vitro dari Plasmodium merupakan salah  satu  tehnik  yang  tidak  bisa  dengan  mudah dilakukan  disemua  laboratorium  yang  ada.  Ada banyak hal yang mempengaruhi tingkat kesuksesan/ kegagalan  dalam  melakukan  kultur  in  vitro Plasmodium. P knowlesi yang sebelumnya diketahui sebagai  parasit  yang  menyerang  monyet,  kini diketahui bisa hidup di dalam tubuh manusia dengan sangat baik. Hal ini telah menjadikan bahwa kultur in vitro terhadap P knowlesi bisa sangat dilakukan di laboratorium, seperti halnya yang dilakukan pada P falciparum. 9
P knowlesi mempunyai karakteristik biologi yang  berbeda  dengan P  falciparum. Dimana  salah satunya  adalah  mempunyai  siklus  perkembangan
dalam darah berkisar 24 jam untuk 1 siklusnya (dari ring hingga schizont). P knowlesi juga mempunyai merozoit  dalam  jumlah  yang  lebih  sedikit dibandingkan P falciparum tapi mempunyai ukuran merozoit  yang  lebih  besar.  Lebih  dari  itu, P falciparum mempunyai tingkat kesuksesan modifikasi genetik yang lebih rendah dibandingkan dengan P  knowlesi. Banyak  riset  yang  tidak  bisa berjalan lancar untuk melakukan modifikasi genetik dengan P  falciparum, sehingga  kultur  in  vitro dengan P  knowlesi mempunyai  pengaruh  yang sangat  besar  dalam  pengembangan  riset  untuk pengembangan vaksin dan skrining kandidat obat. 8,9
Kesuksesan  kultur  in  vitro  ini  diharapkan  dapat mempermudah peneliti untuk menemukan kandidat vaksin  dan  obat  malaria.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  melakukan  kultur  in  vitro  dari P  knowlesi pada kondisi laboratorium yang kami miliki.

## MATERI DAN METODE

## Jenis penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  rancangan penelitian deskriptif eksperimental yang seluruhnya dilakukan  dengan  pendekatan  observasional  di laboratorium.

## Darah Manusia
Darah  manusia  untuk  kultur  in  vitro  rutin diperoleh  dari  donatur  yang  bergolongan  darah  O setelah  mendapatkan  persetujuan  dengan informed consent . Darah vena sebanyak kurang lebih 10 mL diambil  dengan  tabung  EDTA.  Sel  darah  merah dicuci  sebanyak  tiga  kali  dengan  menggunakan media  RPMI  1640  (Invitrogen  Life  Technologies, Grand  Island,  NY)  yang  disentrifugasi  3,000  rpm selama  5  menit,  diulang  selama  3  kali.  Sel  darah putih akan dibuang. Pelet dari sel darah merah akan di resuspensi dengan media RPMI 1640 (pencampuran  1:1,  v/v).  Kode  etik  penelitian  ini telah  mendapatkan  persetujuan  dari  komite  etik Kangwon  National  University  Hospital  (IRB  No. KWNUIRB-2017-05-009-001).

## Media kultur
Media kultur in vitro yang digunakan adalah RPMI  1640  (Invitrogen)  tidak  lengkap  dengan penambahan  komponen  sebagai  berikut:  2,3  g/L natrium  bikarbonat,  4  g/L  dekstrosa,  5,957  g/L Hepes,  0,05  g/L  hipoksantin,  5  g  /L  Albumax  II, 0,025  g/L  gentamisin  sulfat,  0,292  g/LL-glutamin. Media  RPMI  1640  lengkap  dibuatkan  dengan menambahkan 10% (v/v) serum manusia AB positif
atau dengan menggunakan serum dari kuda (Gibco) ke dalam media RPMI 1640 tidak lengkap.

## Kultur In vitro
Kultur in vitro dilakukan dengan menggunakan  strain  parasit Plasmodium  knowlesi A1-H.1 donasi dari Robert W. Moon. 9 Parasit beku diambil  dari  nitrogen  cair  dan  dicairkan  beberapa saat.  Parasit  yang  sudah  mencair  kemudian ditambahkan  tetes  demi  tetes  dengan  100  uL  12% NaCl, kemudian disentrifugasi 1,500 rpm selama 3 menit, supernatan dibuang. Ulangi dengan menambahkan  1,6%  NaCl,  sentrifugasi  dan  buang supernatan. Ulangi yang ketiga kalinya dengan 0,9% NaCl  dan  0,2%  glukosa,  sentrifugasi,  dan  buang supernatan. Parasit di resuspensi dengan menambahkan  media  lengkap  RPMI  1640  dengan 2%  hematokrit  eritrosit  manusia.  Parasit  dikultur pada suhu 37°C dalam flask T25 (Thermofisher) dan diberi tambahan campuran gas 90% N2, 5%O2, dan 5%  CO2.  Parasit  kemudian  dipisahkan  menjadi  2 flask F1  dan  F2  pada  hari  kelima  (D5)  dan kesembilan (D9). Perumbuhan kultur in vitro parasit di monitor setiap hari dengan menggunakan sedian darah  tipis  yang  diwarnai  dengan  10%  Giemsa. Morfologi  parasit  dan parasitemia dihitung dengan menggunakan mikroskop. Flask dengan parasitemia lebih dari 4%, parasitemia akan diturunkan ke angka kurang  1%  dengan  cara  menambahkan  dengan media lengkap dan darah baru 2% hematokrit.

## Analisis Data
Data  dianalisis  dan  divisualisasikan  dengan menggunakan  GraphPad  Prism  5 (GraphPad Software,  Inc., San Diego, CA). Hasil  pengamatan mikroskop  dilakukan  dengan  perbesaran  objektif 100x dan divisualisasikan dalam bentuk gambar.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Parasitemia harian PkA1-H.1
Parasit  dikultur  secara  in  vitro  selama  lebih  dari tujuh  hari.  Pada  24  jam  kultur,  parasitemia mengalami penurunan dari 1.5% menjadi 1% (D1).
Tahapan  ini  sangat  wajar  terjadi,  dimana  parasit masih  mengalami  syok  dan  mulai  beradaptasi dengan lingkungan baru, dimana kematian beberapa parasit terjadi. Parasitemia kembali naik secara terus menerus hingga hari kelima, parasitemia mencapai hampir  4%  (Gambar  1).  Pada  hari  kelima flask dipisahkan  menjadi  2,  yaitu  F1  dan  F2  dengan parasitemia  di  masing-masing flask berkisar  1%. Parasitemia  di  kedua flask (F1  dan  F2)  terus mengalami  kenaikan  hingga  hari  kesembilan  (D9). Pada hari keenam (D6) flask F1 dipisahkan menjadi 2 flask (F1.1 dan F1.2) yang tumbuh terus menerus secara baik hingga hari kedelapan (D8). Sedangkan F2,  pada  hari  kedelapan  (D8), flask dipisahkan menjadi 2 (F2.1 dan F2.2). F2.2 tumbuh sangat baik hingga  parasitemia  mencapai  hampir  10%  di  hari kesembilan  (D9).  Sedangkan  F2.1  pada  hari kedelapan  (D8)  ditambahkan  volume  media  dan hematokrit  darah  untuk  di  simpan  sebagai kryopreservasi  sampel.  F1.2  juga  mengalami pertumbuhan  hingga  D10  dan  disimpan  sebagai sampel  kryopreservasi.  Pada  hari  kesembilan  F2.1 dipisahkan menjadi 2 flask F2.1.1 dan F2.1.2 (garis berwarna ungu) yang kemudian dilakukan penyimpanan untuk kryopreservasi. Sedangkan F2.2 dipisahkan menjadi 3 flask baru F2.2.1, F2.2.2 dan F2.2.3.  Kesemua flask menunjukkan  pertumbuhan parasit  yang  sangat  baik  dan  sehat.  Tujuan dilakukannya  pemisahan  beberapa flask ini  untuk melihat  tingkat  kemampuan  parasit  tumbuh  dan berkembang  dengan  media  dan  darah  yang  segar atau baru. Sekaligus untuk melihat efisiensi parasit untuk menginfeksi sel darah merah  yang baru.  Ini sejalan  dengan  penelitian  dari  Robert  W.  Moon dimana klone parasit ini berasal, mampu mempertahankan  efisiensi  infeksi  pada  sel  darah merah manusia dan tumbuh dengan baik pada media yang  sudah  dibuat. 9 Dapat  disimpulkan  bahwa, parasit PkA1-H.1 yang dikultur di lab kami juga bisa tumbuh  dengan  sangat  baik.  Jumlah  parasit  yang sangat  tinggi,  didalam  kultur  in  vitro  ini  bisa tercapai,  ini  bisa  disebabkan  oleh  siklus  hidup parasit yang cepat yaitu selama 24 jam. 7
Gambar  1.  Grafik  Pertumbuhan  Kultur  in  vitro  PkA1-H.1. Grafik  ini  menunjukkan  pertumbuhan  dari generasi pertama F1 yang kemudian dipisahkan menjadi F1 dan F2. Kultur in vitro ini dilakukan selama 12 hari hingga pertumbuhan parasit sudah sangat stabil.

## Morfologi parasit hari ke-0 sampai 3
Untuk memastikan kondisi dari parasit yang dikultur secara  in  vitro,  sediaan  darah  tipis  dengan pewarnaan  Giemsa  dilakukan  pada  hari  ke  0  dan ketiga (Gambar 2). Pada hari kedua, parasit terlihat mempunyai  morfologi  yang  terlihat  normal  dari bentuk  ring  atau  cincin,  tropozoit  hingga  schizont. Setelah  12  jam  dikultur,  parasit  bentuk  cincin terlihat  dengan  titik  kromatin  dan  sitoplasma  yang sangat  sehat  (titik  kromatin  warna  pink  kebiru- biruan;  sitoplasma  berwarna  biru).  Infeksi  ganda
juga terlihat pada hari pertama atau 12 jam setelah dikultur,  dimana  satu  sel  darah  merah  dihuni  oleh dua tropozoit dan dua skizon muda. Hasil ini sesuai dengan hasil temuan sebelumnya, bahwa bentuk dari cincin  dan  tropozoit  yang  sehat  terlihat  dengan adanya  titik  kromatin,  dan  sitoplasma. 9 Selain  itu, morfologi yang tampak dari kultur in vitro ini juga terlihat  sama  dengan  hasil  yang  ditemukan  pada kondisi  klinis  infeksi  malaria  pada  pasien  yang ditemukan di Malaysia and Japan. 1,10,11
Gambar  2.  Hasil  pewarnaan  Giemsa  sediaan  darah  tipis. Hasil  mikroskopi  ini  menunjukkan  tahapan perkembangan beberapa parasit dari fase cincin, tropozoit dan skizon setelah 12 jam kultur dilakukan.

## Morfologi parasit hari ke-10
Pada  hari  kesepuluh,  kondisi  parasit  yang mengalami  peningkatakan  parasitemia  diikuti  juga oleh kondisi morfologi parasit yang terlihat normal. Pada  hari  kesepuluh  ini  terlihat  pula  infeksi  ganda (F2_1.1)  dan  tripel (F2_1.2)  dalam  satu  sel  darah merah  (Gambar  3).  Infeksi  ganda  ini  bisa  juga terlihat  dari  hasil  penelitian  sebelumnya 9 dan  juga terlihat bentuk hemozoin yang tersebar pada sampel darah pasien yang terinfeksi. 1,10 Terlihat pula bentuk cincin  yang  mempunyai  2  titik  kromatin  dan  1 sitoplasma,  dimana  ini  ada  tipikal  dari P  knowlesi yang  teramati  pula  pada  kondisi  di  lab  dan  pada pasien  yang  terinfeksi. 9,11-12 Pada  hari  kesepuluh juga  terlihat  morfologi  tropozoit  yang  mempunyai
bentuk hemozoin yang tersebar ( dispersed hemozoin ).  Temuan  ini  sama  dengan  apa  yang ditemukan oleh Robert W. Moon. 9 Bentuk tropozoit PkA1-H.1  juga  sangat  mirip  dengan  bentuk tropozoit  pada P  malariae. 12 Bentuk  skizon  yang sudah  sangat  tua  dan  disiap  dikeluarkan  dari  sel darah  merah  juga  terlihat  di  hari  kesepuluh  pada penelitian ini (F2_1.1). Kesuksesan kultur in vitro di lab ini membuktikan juga bahwa parasit PkA1-H.1 ini  stabil  dari  stok  awalnya  dari  Robert  W.  Moon 9 untuk  bisa  dikultur  diberbagai  tempat  atau laboratorium diseluruh dunia. Kultur in vitro ini bisa mendukung  berbagai  riset  untuk  memahami interaksi host dan parasit. 13
Gambar  3.  Hasil  pewarnaan  Giemsa  sediaan  darah  tipis. Hasil  mikroskopi  ini  menunjukkan  tahapan perkembangan beberapa parasit dari fase cincin, tropozoit dan skizon setelah hari ke-10.

## SIMPULAN
Penelitian  ini  telah  berhasil  menumbuhkan parasit P  knowlesi A1-H.1  di  laboratorium  diluar dari  laboratorium  dimana  PkA1-H.1  pertama  kali dikultur.  Parasit  ini  tumbuh  dengan  level parasitemia  atau  tingkat  infeksi  sel  darah  merah yang  sangat  baik  per  24  jam  sesuai  dengan  siklus hidup  parasit.  Morfologi  yang  tampak  dari P knowlesi ini  juga  terlihat  sangat  normal  dan  sehat yang  ditandai  dengan  bentuk  normal  dari  ring, tropozoit dan skizon. Titik kromatin, sitoplasma dan hemozoin  juga  terlihat  normal  seperti  pada  infeksi yang ditemukan pada sampel darah pasien.

## DAFTAR PUSTAKA
1 Singh,  B. et  al. A  large  focus  of  naturally acquired  Plasmodium  knowlesi  infections  in human  beings. Lancet 363,  1017-1024, doi:10.1016/s0140-6736(04)15836-4 (2004).
2 Zaw,  M.  T.  &  Lin,  Z.  Human  Plasmodium knowlesi  infections  in  South-East  Asian countries. J Microbiol Immunol Infect 52, 679- 684, doi:10.1016/j.jmii.2019.05.012 (2019).
3 Ngernna, S. et al. Case Report: Case Series of Human Plasmodium knowlesi Infection on the Southern  Border  of  Thailand. The  American Journal  of  Tropical  Medicine  and  Hygiene 101,  1397-1401,  doi:10.4269/ajtmh.19-0063
(2019).
4 Lubis,  I.  N.  D. et  al. Contribution  of Plasmodium knowlesi to Multispecies Human
Malaria  Infections  in  North  Sumatera,
Indonesia. J  Infect  Dis 215,  1148-1155, doi:10.1093/infdis/jix091 (2017).
5 Jeslyn, W. P. et al. Molecular epidemiological investigation  of  Plasmodium  knowlesi  in humans  and  macaques  in  Singapore. Vector
Borne
Zoonotic
Dis
11, 131-135,
doi:10.1089/vbz.2010.0024 (2011).
6 Daneshvar,  C. et  al. Clinical  and  laboratory features  of  human  Plasmodium  knowlesi infection. Clin  Infect  Dis 49,  852-860, doi:10.1086/605439 (2009).
7 Grigg,  M.  J. et  al. Plasmodium  knowlesi detection  methods  for  human  infections-
Diagnosis and surveillance. Adv Parasitol 113,
77-130, doi:10.1016/bs.apar.2021.08.002 (2021).
8 Muh,  F. et  al. Cross-species  reactivity  of antibodies  against  Plasmodium  vivax  blood- stage antigens to Plasmodium knowlesi. PLOS Neglected  Tropical  Diseases 14,  e0008323, doi:10.1371/journal.pntd.0008323 (2020).
9 Moon,  R.  W. et  al. Adaptation  of  the genetically tractable malaria pathogen <i>Plasmodium  knowlesi</i>  to  continuous culture in human erythrocytes. Proceedings of the  National  Academy  of  Sciences 110,  531-
536, doi:doi:10.1073/pnas.1216457110
(2013).
10  Tanizaki,  R. et  al. First  case  of  Plasmodium knowlesi  infection  in  a  Japanese  traveller returning from Malaysia. Malaria Journal 12, 128, doi:10.1186/1475-2875-12-128 (2013).
11  Lee,  K.  S.,  Cox-Singh,  J.,  Brooke,  G., Matusop,  A.  &  Singh,  B.  Plasmodium knowlesi  from  archival  blood  films:  further evidence  that  human  infections  are  widely distributed  and  not  newly  emergent  in Malaysian  Borneo. Int  J  Parasitol 39,  1125- 1128, doi:10.1016/j.ijpara.2009.03.003 (2009).
12  Lee,  K.  S.,  Cox-Singh,  J.  &  Singh,  B. Morphological features and differential counts of Plasmodium knowlesi parasites in naturally acquired  human  infections. Malar  J 8,  73, doi:10.1186/1475-2875-8-73 (2009).
13  Kocken,  C.  H. et  al. Plasmodium  knowlesi provides  a  rapid  in  vitro  and  in  vivo transfection  system  that  enables  double- crossover gene knockout studies. Infect Immun 70, 655-660, doi:10.1128/iai.70.2.655- 660.2002 (2002).