## AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETIL ASETAT JAMUR ENDOFITIK RS-1 DARI TUMBUHAN ANDROGRAPHIS PANICULATA MENGGUNAKAN MEDIA BERAS HITAM

## ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE ETHYL ACETATE EXTRACT OF ENDOPHYTIC FUNGUS RS-1 FROM ANDROGRAPHIS PANICULATA USING BLACK RICE MEDIA
Salsabila Safitri 1 , Sri Benti Etika 2 , Riga Riga 3*
1,2,3 Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Padang, Jalan Prof. Dr. Hamka, Air Tawar Barat, Padang 25132
* e-mail korespondensi: rigakimia@fmipa.unp.ac.id

## Abstrak
Tumbuhan Andrographis  paniculata menghasilkan  beragam  metabolit  sekunder  yang  memiliki berbagai  aktivitas  biologis  termasuk  antibakteri.  Senyawa  antibakteri  pada  tumbuhan  ini  juga  dapat diekplorasi  dari  jamur  endofitik  yang  berasosiasi  dengan  tumbuhan A.  paniculata. Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas  antibakteri  jamur  endofitik  RS-1  dari  ranting  tumbuhan A. paniculata menggunakan  media  beras  hitam.  Tahapan  penelitian  terdiri  dari  isolasi,  kultivasi, ekstraksi,  uji  antibakteri  dan  uji  kandungan  metabolit  sekunder  dari  jamur  endofitik  pada  ranting tumbuhan A. paniculata. Uji efektivitas aktivitas antibakteri terhadap ekstrak EtOAc jamur endofitik RS-1  menunjukkan  bahwa  ekstrak  jamur  RS-1  pada  media  beras  hitam  mampu  menghambat pertumbuhan tiga bakteri uji pada konsentrasi 1%, 3% dan 5%. Ekstrak EtOAc  jamur endofitik RS-1 dari  tumbuhan A.  paniculata menggunakan  media  beras  hitam  mempunyai  potensi  sebagai  sumber senyawa antibakteri.
Kata kunci: Andrographis paniculata , antibakteri, beras hitam, jamur endofitik, RS-1

## Abstract
Andrographis paniculata is reported to produce a variety of secondary metabolites that have various biological activities including antibacterial. Antibacterial compounds in this plant can be also explored from  endophytic  fungus  associated  with A.  paniculata. The  aim  of  study  was  to  determine  the effectiveness of antibacterial activity of  the endophytic fungus RS-1  from the twigs of A. paniculata using black rice media. The steps of this research were isolation, cultivation, extraction, antibacterial test, and secondary metabolite content test of endophytic fungus from the twigs of the A. paniculata. The  effectiveness  test  of  antibacterial  activity  of  the  EtOAc  extract  of  the  endophytic  fungus  RS-1 showed that the  ethyl acetate  extract of  RS-1  fungal using  black redia  media  was able to inhibit the growth of three tested bacteria at concentration of 1%, 3%, and 5%. The EtOAc extract of endophytic fungus from A. paniculata using black rice media has potential as source of antibacterial.
Keywords: Andrographis paniculata, antibacterial, black rice, endophytic fungus, RS-1

## PENDAHULUAN
Penggunaan  antibiotik  yang  berlebihan dalam  bidang  kesehatan  merupakan  salah  satu penyebab terjadinya resistensi antibiotik. Resistensi  antibiotik  terjadi  ketika  bakteri
tumbuh  dan  beradaptasi  dengan  kehadiran antibiotik. Kemampuan beradaptasi untuk kelangsungan  hidup  bakteri  muncul  sebagai ancaman bagi dunia kesehatan. Selain penggunaan antibiotik yang berlebihan,
penyebab  terjadinya  resistensi  antibiotik  yaitu peresepan  antibiotik  yang  tidak  tepat  dan ketersediaan  antibiotik  baru  (Yadav  &  Kapley, 2021;  Iwu et  al .,  2020).  Berdasarkan  hal tersebut, pencarian sumber  alternatif yang dapat menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas  antibakteri  perlu  dilakukan.  salah  satu sumber  yang  mampu  menghasilkan  senyawa bioaktif yang potensial adalah jamur endofitik.
Jamur  endofitik  adalah  mikroorganisme yang  berkolonisasi  pada  jaringan  internal tumbuhan  tanpa  merusak  tanaman  inangnya. Interaksi  antara  jamur  endofitik  dan  tanaman inangnya  merupakan  simbiosis  mutualisme, karena jamur endofitik membantu meningkatkan pertumbuhan tanaman dan memberikan perlindungan  tanaman.  Sedangkan  tanaman inangnya memberikan nutrisi untuk pertumbuhan  jamur  endofitik  (Manganyi  & Ateba, 2020; Riga et al ., 2022). Jamur endofitik dalam  jaringan  internal  mampu  menghasilkan senyawa  bioaktif  yang  sama  bahkan  berbeda dengan  tanaman  inangnya  antara  lain  seperti terpenoid,  steroid,  alkaloid,  senyawa  fenolik dengan beragam  aktivitas biologis  (Wang et  al ., 2018).
Tumbuhan  yang memiliki potensi sebagai inang  bagi  jamur  endofitik  dalam  menghasilkan senyawa  bioaktif  adalah  tumbuhan  sambiloto yang  memiliki nama  latin Andrographis paniculata. Tumbuhan A.  paniculata banyak digunakan sebagai obat tradisional yang mampu menyembuhkan  berbagai  macam  penyakit seperti  demam,  pilek,  dan  diabetes  (Sanower Hossain et al. , 2014; Yang et al ., 2020). Bagian dari A. paniculata seperti akar, batang, daun dan bunga  telah  dimanfaatkan  sebagai  obat  karena mengandung  metabolit  sekunder  yang  memiliki aktivitas  sebagai  antibakteri,  antii-inflamasi, antikanker,  antioksidan,  dan  antivirus  (Singh et al ., 2017; Munawar et al ., 2015).
Penelitian  tentang  kajian  fitokimia  dan sifat  antibakteri  dari  jamur  endofitik  pada ranting  tumbuhan A.  paniculata menggunakan media  beras  putih  telah  pernah  dilaporkan sebelumnya  (Anshar et  al .,  2021;  Suryelita et. al .,  2021;  Riga et  al .,  2022).  Studi  terkait antibakteri dari jamur endofitik yang berasosiasi pada  bagian  ranting  tumbuhan A.  paniculata menggunakan  media  beras  hitam  baru  pertama kali  dilaporkan  pada  penelitian  ini.  Berdasarkan hal  tersebut.  Penelitian  ini  bertujuan  menggali potensi  jamur  endofitik  yang  berasosiasi  dalam jaringan internal ranting tumbuhan A. paniculata
menggunakan  media  beras  hitam  sebagai sumber senyawa antibakteri.

## METODE PENELITIAN

## Inokulasi Jamur Endofitik
Tumbuhan A.  paniculata diperoleh  dari Tabing  Banda  Gadang,  Kecamatan  Nanggalo, Kota Padang. Bagian ranting segar A. paniculata berukuran 2x2 cm dibersihkan dengan air bersih mengalir. Selanjutnya, permukaan ranting dilakukan  sterilisasi  dengan  merendam  ranting dalam  larutan  etanol  70%  selama  45  detik  dan larutan NaOCl 3,5% selama 30 detik. Sterilisasi bertujuan  untuk  membunuh  mikroba  epifit  yang terdapat  dipermukaan  ranting  tumbuhan A. paniculata. Bagian  ranting  yang  telah  steril ditempelkan  pada  media  padat  PDA  sebagai kontrol  negatif.  Ranting A.  paniculata dipotong dengan  ukuran  1x1  cm  dan  diinokulasikan  di atas  media  PDA  kemudian  diinkubasi  selama  7 hari  pada  suhu  28℃.  Jamur  endofitik  yang tumbuh pada media di sub-kultur ke media PDA lainnya  sehingga  diperoleh  isolat  tunggal  jamur endofitik.

## Kultivasi dan Ekstraksi Jamur Endofitik
Isolat tunggal jamur endofitik dari media PDA  dikultivasikan  ke  dalam  Erlenmeyer  250 mL  yang  berisi  100  ml  media  beras  hitam  dan diinkubasi  pada  suhu  28℃.  Setelah  waktu kultivasi  optimum,  fermentasi  jamur  endofitik dipanen  kemudian  diekstraksi  menggunakan pelarut  etil  asetat  sebanyak  tiga  kali  sehingga diperoleh ekstrak pekat  etil asetat. Hasil  ekstrak pekat  etil  asetat  dilakukan  uji  efektivitas aktivitas antibakteri dan uji fitokimia.

## Uji Aktivitas Antibakteri
Ekstrak  pekat  etil  asetat  dilakukan  uji aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi cakram.  Alat  yang  digunakan  pada  tahap  ini yaitu  autoclave,  laminar,  cawan  petri,  gelas ukur,  kertas  cakram,  dan  jarum  ose.  Semua  alat disterilisasi  terlebih  dahulu.  Bahan  yang digunakan  antara  lain  media  MHA,  aquades, DMSO.
Bakteri  uji  aktivitas  antibakteri  yang digunakan adalah Escherichia coli, Staphylococcus  aureus, dan Streptococcus pyogenes. Sebanyak 20 µL ekstrak pekat dengan berbagai  konsentrasi  yaitu  1%,  3%,  dan  5% (pelarut:  DMSO).  Kontrol  positif  dan  negatif diteteskan  pada  kertas  cakram  yang  terletak diatas  inokulan  masing-masing  bakteri  uji. Kontrol positif yang digunakan  yaitu amoksilin.
124 | Jurnal Zarah , Vol. 10 No. 2 (2022)
Setelah siinkubasi 1x24 jam, aktivitas antibakteri  masing-masing  ekstrak  diukur  dan dinyatakan  dalam  zona  hambat.  Proses  uji dilakukan kondisi aseptik dan aktivitas antibakteri dilakukan sebanyak triplo.

## Uji Kandungan Metabolit Sekunder
Terpenoid dan Steroid Ekstrak
jamur endofitik RS-1
dimasukkan  ke  dalam  tiga  tabung  reaksi  yang berbeda.  Masing-masing  tabung  ditambahkan amoniak-kloroform  dan  H 2 SO 4 2  N  kemudian dikocok  kuat  dan  didiamkan  sehingga  terbentuk dua  lapisan.  Lapisan  bawah  yang  terbentuk diambil dan dipindahkan pada plat tetes, biarkan hingga  pelarut  menguap  kemudian  diteteskan asam asetat anhidrat dan H 2 SO 4 p.a. Terbentuknya warna merah menunjukkan positif terpenoid  dan  biru-kehijauan  menunjukkan positif steroid.

## Alkaloid
Lapisan  atas  pada  uji  terpenoid  dan steroid  dimasukkan  ke  dalam  tiga  tabung  reaksi berbeda.  Masing-masing  tabung  reaksi  secara berurutan  ditambahkan  reagen  wagner,  mayer dan dragendorf. Hasil positif alkaloid terbentuknya endapan jingga, endapan putih dan endapan coklat.

## Senyawa Fenolik
Ekstrak jamur
endofitik
RS-1
dimasukkan ke dalam plat  tetes, lalu tambahkan FeCl 3 1%.  Perubahan  warna  merah  muda menunjukkan positif senyawa fenolik.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ranting A.  paniculata yang  telah  steril diinokulasikan  pada  media  padat  PDA  yang telah  ditambahkan  antibiotik.  Penambahan antibiotik ini berfungsi untuk membunuh bakteri yang terdapat dalam jaringan ranting tumbuhan. Jamur  endofitik  yang  tumbuh  pada  media  PDA setelah  7  hari  kemudian  di  sub-kultur  ke  media lainnya  sehingga  menghasilkan  dua  isolat tunggal jamur endofitik. Jamur endofitik dengan kode RS-1 dipilih untuk dilanjutkan pada proses selanjutnya  berdasarkan  pengamatan  morfologi jamur endofitik RS-1.
Gambar 1. Morfologi jamur endofitik RS-1
Bentuk jamur endofitik RS-1 seperti yang terlihat pada Gambar 1, memiliki ciri makroskopik  antara  lain  koloni  berwarna  putih, berbentuk  bulat,  dan  membentuk  koloni  yang memusat.  Permukaan  koloni  jamur  endofitik RS-1  cukup  kasar  dan  tersebar  tipis  merata  ke seluruh  permukaan  media.  Permukaan  bagian bawah  jamur  endofitik  RS-1  juga  membentuk koloni  berwarna  putih  (Calvo  et  al.,  2002). Jamur endofitik RS-1 dengan morfologi makroskopik  tersebut  belum  pernah  dilaporkan dari ranting tumbuhan A. paniculata.
Jamur  endofitik  RS-1  dikultivasi  pada erlenmeyer  250  ml  yang  berisi  media  beras hitam.  Kultivasi  dilakukan  pada  25  erlenmeyer untuk  memperoleh  ekstrak  dalam  jumlah  yang besar.  Kemudian  dipanen  setelah  mencapai waktu  optimum  dan  diekstraksi  menggunakan pelarut  etil  asetat.  Ekstrak  yang  diperoleh  lalu dipekatkan  sehingga  didapatkan  ekstrak  pekat etil  asetat.    Ekstrak  EtOAc  tersebut  dilanjutkan pengujian  aktivitas  antibakteri  menggunakan metode cakram (Riga et al ., 2019).
Tahapan  uji  aktivitas  antibakteri  ekstrak EtOAc  dilakukan  terhadap  bakteri  uji  yaitu Escherichia  coli,  Staphylococcus  aureus, dan Streptococcus  pyogenes dengan  memvariasikan konsentrasi    ekstrak  jamur  RS-1  dengan konsentrasi  1%,  3%,  dan  5%.  Adapun  kontrol positif  yang  digunakan  adalah  amoksilin  (Riga &  Hakim,  2021).  Hasil  uji  aktivitas  antibakteri dinyatakan  dalam  zona  hambat  yang  dilakukan secara  triplo  seperti  yang  ditampilkan  pada Tabel 1.
Data  zona  hambat  pada Tabel  1 mengindikasikan ekstrak EtOAc jamur endofitik RS-1  yang  tumbuh  pada  media  beras  hitam memiliki
kemampuan menghambat pertumbuhan  terhadap  ketiga  bakteri  uji.
Konsentrasi  ekstrak  yang  tinggi  berkorelasi positif dengan kemampuannya sebagai antibakteri.  Hal  tersebut  disebabkan  oleh kandungan senyawa aktif dalam ekstrak semakin banyak. Peningkatan senyawa aktif menyebabkan kemampuan ekstrak dalam
menghambat  pertumbuhan  bakteri  uji  juga
semakin meningkat (Riga & Hakim, 2021). Data zona hambat jamur RS-1 pada media pertumbuhan media beras hitam terhadap bakteri uji  yang  sama  lebih  besar  dibandingkan  media beras putih.
Tabel 1. Data zona hambat ekstrak EtOAc
Bakteri uji Diameter Zona Hambat* 1% 3% 5% Kontrol (+) E. coli 6,57 ± 0,25 9,57 ± 0,32 11,83 ± 0,15 14,37 ± 0,21 S. aureus 0 7,67 ± 0,06 9,37 ± 0,11 13,27 ± 0,21 S. pyogenes 0 8,3 ± 0,17 9,67 ± 0,06 10,9 ± 0,26
*Zona hambat ± standar deviasi
Hasil  aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak EtOAc  jamur  endofitik  RS-1  menunjukkan adanya  senyawa  metabolit  sekunder  yang memiliki  potensi  sebagai  senyawa  antibakteri. Ekstrak  EtOAc  tersebut  juga  dilakukan  uji kandungan  metabolit  sekunder  antara  lain, terpenoid,  steroid,  alkaloid,  dan  senyawa fenolik. Senyawa golongan terpenoid dan steroid termasuk  ke  dalam  senyawa  fenolik  yang memiliki aktivitas antibakteri dengan mekanisme  kerja  yaitu  mengganggu    proses pembentukan membran sel. Hal ini menyebabkan  membran  sel  tersebut  tidak  akan terbentuk  secara  sempurna.  Sedangkan  senyawa golongan  alkaloid  memiliki  mekanisme  kerja dalam menghambat pertumbuhan bakteri dengan merusak  susunan  komponen  peptidoglikan  pada sel  bakteri  (Kurniawan  &  Aryana,  2015).  Sifat antibakteri  dari  senyawa  fenolik  dipengaruhi oleh  lipofilisitas,  sifat  elektronik  dan  muatan felifenol  yang  dapat  menghambat  sistem  kerja enzim reverse transkripsi dan DNA topoimerase (Bouarab-Chibane et  al .,  2019;  Kursia et  al ., 2018).
Tabel 2. Hasil uji kandungan metabolit sekunder ekstrak EtOAc jamur endofitik RS-1
Uji Metabolit Sekunder Hasil Uji Terpenoid/steroid + Alkaloid + Fenolik +
Hasil  uji  kandungan  metabolit  sekunder ekstrak  EtOAc  jamur  endofitik  RS-1  disajikan pada  Tabel  2.  Penelitian  terkait  uji  metabolit sekunder  yang  berperan  sebagai  aktivitas antibakteri  pada  ekstrak  jamur  endofitik  RS-1 perlu  dilanjutkan  sehingga  dapat  melengkapi informasi  terkait  senyawa  yang  memiliki aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak  EtOAc  jamur endofitik RS-1.

## KESIMPULAN
Hasil  uji  aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak EtOAc  jamur  endofitik  RS-1  yang  berasosiasi pada  tumbuhan A.  paniculata menggunakan media  beras  hitam  terhadap  bakteri  uji  yaitu E. coli,  S.  aureus, dan S.  pyogenes memiliki potensi dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji.

## DAFTAR RUJUKAN
Anshar,  V.,  Khairi,  A.,  Etika,  S.  B.,  Ulfah,  M.,
Riga, R., Info, A., Sciences, N., & Padang, U.  N.  (2021). Study  of  The  Antibacterial Activity  of  Endophytic  Fungus  That Colonize  With  The  Twig  of  Andrographis paniculata . 21 (02), 137–144. Bouarab-Chibane,  L.,  Forquet,  V.,  Lantéri,  P., Clément,  Y.,  Léonard-Akkari,  L.,  Oulahal, N.,  Degraeve,  P.,  &  Bordes,  C.  (2019). Antibacterial  properties  of  polyphenols: Characterization  and  QSAR  (Quantitative structure-activity relationship) models. Frontiers  in  Microbiology , 10 (APR). https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00829
Calvo,  A.  M.,  Wilson,  R.  A.,  Bok,  J.  W.,  & Keller, N. P. (2002). Investigating the over sporulation effect of A . fumigatus induced by  P  .  aeruginosa. Microbiology  and Molecular  Biology  Reviews , 66 (3),  51. https://doi.org/10.1128/MMBR.66.3.447
Iwu,  C.  D.,  Korsten,  L.,  &  Okoh,  A.  I.  (2020).
The  incidence  of  antibiotic  resistance within and beyond the agricultural ecosystem:  A  concern  for  public  health.
MicrobiologyOpen , 9 (9), 1–28. https://doi.org/10.1002/mbo3.1035
Kurniawan, B., & Aryana, W. (2015). Binahong (Cassia  Alata  L.)  For  Inhibiting  The Growth  of  Bacteria  Escherichia  coli. J Majority , 4 (4), 100–104.
Kursia,  S.,  Aksa,  R.,  &  Nolo,  M.  M.  (2018).
Potensi  Antibakteri  Isolat  Jamur  Endofit dari  Daun  Kelor  (Moringa  oleifera  Lam.). Pharmauho:  Jurnal  Farmasi,  Sains,  Dan
126 | Jurnal Zarah , Vol. 10 No. 2 (2022)
Kesehatan , 4 (1), 30–33. https://doi.org/10.33772/pharmauho.v4i1.4
631 Manganyi,  M.  C.,  &  Ateba,  C.  N.  (2020). Untapped potentials of endophytic fungi: A review of novel bioactive  compounds with biological  applications. Microorganisms ,
8 (12),
1–25. https://doi.org/10.3390/microorganisms812 1934
Munawar, M., Muharni, M., & Ivantri, I. (2015).
Chemical  Constituen  from  an  Endophytic Fungus  Aspergillus  sp  (SbD5)  Isolated from  Sambiloto  (Andrographis  paniculata Nees). Microbiology  Indonesia , 9 (2),  82– 88. https://doi.org/10.5454/mi.9.2.5
Riga,  R.,  &  Hakim,  E.  H.  (2021).  Aktivitas Sitotoksik  dan  Antibakteri  Ekstrak  Etil Asetat  Jamur  Endofitik  Colletotrichum gloeosporioides. Jurnal Farmasi Udayana , 10 (2), 193-198. Riga,  R.,  Happyana,  N.,  Quentmeier,  A., Zammarelli,  C.,  Kayser,  O.,  &  Hakim,  E. H.  (2021).  Secondary  metabolites  from Diaporthe lithocarpus isolated from Artocarpus  heterophyllus. Natural Product Research , 35 (14), 2324–2328.
Riga, R., Suryelita, S., Etika, S. B., Suhanah, R. A.,  &  Khairi,  V.  A.  (2022).  Aktivitas Antibakteri  Jamur  Endofitik  R-2  yang Diisolasi Dari Tumbuhan Sambiloto ( Andrographis  paniculata ). Jurnal  Zarah, 10(1), 1-5.
Sanower  Hossain,  M.,  Urbi,  Z.,  Sule,  A.,  & Hafizur Rahman, K. M. (2014). A Review of  Ethnobotany,  Phytochemistry,  and Pharmacology. The Scientific World
Journal , 2014 , 1–28.
Singh,  A.,  Maqsood  Ahamad  Khan,  M.,  Sahu,
D.,  Vishwakarma,  N.,  Yadav,  A.,  Nath
Singh,  A.,  &  Anurag  Singh,  C.  (2017).
Pharmacological and Anti-bacterial Activities  of  the  leaves  of  Andrographis paniculata Nees. Journal of Pharmacognosy  and  Phytochemistry , 6 (3), 418–420. Suryelita, S., Riga, R., Etika, S. B., Ulfah, M., & Artasasta,  M.  A.  (2021).  Antibacterial
Screening  of  Endophytic  Fungus Xylaria sp.  derived  from Andrographis  paniculata (Sambiloto). Open  Access  Macedonian Journal  of  Medical  Sciences,  9(A), 971-
975.
Wang, W., Arshad, M. I., Khurshid, M., Rasool, M.  H.,  Nisar,  M.  A.,  Aslam,  M.  A.,  &
Qamar, M. U. (2018). Antibiotic resistance :  a  rundown  of  a  global  crisis.
Infection  and  Drug  Resistance ,  1645– 1658.
Yadav,  S.,  &  Kapley,  A.  (2021).  Antibiotic resistance:  Global  health  crisis  and metagenomics. Biotechnology Reports , 29 , e00604. https://doi.org/10.1016/j.btre.2021.e00604 Yang, W., Chen, X., Li, Y., Guo, S., Wang, Z.,
& Yu, X. (2020). Advances in Pharmacological Activities of Terpenoids. Natural Product Communications , 15 (3). https://doi.org/10.1177/1934578X2090355 5