p-ISSN 2354-6565 /e-ISSN 2502-3438
KEMAMPUAN Aspergillus wentii DALAM MENGHASILKAN ASAM SITRAT
Ririn Puspadewi, Rina Anugrah, Della Sabila Fakultas Farmasi Universitas Jenderal Achmad Yani Cimahi Corresponding author e-mail : ririn.puspadewi@lecture.unjani.ac.id

## ABSTRAK
Kegunaan  asam  sitrat  dalam  industri  makanan,  minuman  dan  farmasi  sangat  besar  salah  satunya adalah sebagai pengawet. Beberapa mikroorganisme diketahui dapat menghasilkan asam sitrat melalui proses fermentasi, diantaranya adalah Aspergillus wentii dengan memanfaatkan glukosa yang berasal dari  karbohidrat  sebagai  bahan  utama.  Berdasarkan  hal  ini  maka  telah  dilakukan  penelitian  untuk melihat  kemampuan Aspergillus  wentii dalam  menghasilkan  asam  sitrat  dengan  menggunakan  kulit singkong  sebagai  sumber  karbohidrat.  Hasil  fermentasi  antara Aspergillus  wentii dan  kulit  singkong dilakukan uji keberadaan asam sitrat secara reaksi kimia. Untuk mengetahui jumlah asam sitrat yang dihasilkan  digunakan    spektrofotometer  UV-Vis.  Analisis  kualitatif  menunjukan  bahwa  supernatan hasil  fermentasi  mengandung  asam  sitrat.  Secara  kuantitatif  asam  sitrat  dapat  dihasilkan  pada  masa inkubasi selama enam hari sebesar 0,312 % b/v.
Kata Kunci : Asam sitrat, Aspergillus wentii , fermentasi, kulit singkong.

## ABSTRACT
The usef of citric acid in the food, beverage and pharmaceutical industries is wide, one of them is as a preservative.  Some  microorganisms  are  known  to  produce  citric  acid  through  the  fermentation process,  such  as  Aspergillus  wentii.  Aspergillus  wentii  uses  carbohydrate  as  glucose  source  in fermantation.This research is conducted toevaluate the ability of Aspergillus wentii to produced citric acid  using  cassavaskin  as  carbohydrate.  The  level  of  citric  acid  is  tested  using  UV-Vis spectrophotometer. The result showed that citric acid is found in supernatant. Optimal incubation of fermentationis in six days and the level of citricacid is 0,312 % b/v
Keywords : citric acid , Aspergillus wentii, fermentation, cassava skin

## PENDAHULUAN
Asam  sitrat  adalah  salah  satu  asam  organik penting dalam kehidupan manusia, karena cukup banyak  digunakan  dalam  dunia  industri.  Sekitar 70%  dari  asam  sitrat  yang  dihasilkan  digunakan dalam  industri  makanan  dan  minuman  untuk berbagai  keperluan,  sedangkan  12%  digunakan dalam  industri  obat-obatan  dan  sekitar  18% untuk kegunaan industri lainnya (Kareem SO dan Rahman RA,2011) .
Permintaan  yang  tinggi  oleh  banyak  industri sehingga produksi asam sitrat menjadi meningkat dan  diproduksi  masal  di  seluruh  dunia.  Secara alami asam  sitrat  terdapat  dalam  buah-buahan seperti jeruk,  nanas,  pir  dan  sebagainya. Asam sitrat juga dapat dihasilkan melalui proses kimia dan proses mikrobiologi (Iqbal Q, 2008).
Indonesia  mulai  diproduksi  asam  sitrat  pada tahun  1993  melalui  proses  fermentasi.  Banyak mikroba  yang  dapat  membentuk  asam  sitrat sebagai  metabolit  primer,  antara  lain  adalah
Aspergillus  niger , A.  wentii,  A.  clavatus , Penicillium luteum , P. citrinum, Mucor piriformis, Paecilomyces divaricatum, Citromyces pfefferianus, Candida guilliermondii, Saccharomycopsis lipolytica, Trichoderma viride, Arthrobacter paraffineus, dan Corynebacterium sp.  Namun  sampai  saat  ini, hanya Aspergillus  niger yang  paling  sering digunakan untuk produksi asam sitrat (Soetrisnanto,  dkk,  2013).  Penelitian  dari National  Chemical  Laboratory,  Pune,  India  juga menyatakan  bahwa Aspergillus  wentii dapat memproduksi asam sitrat (Biswas S, dkk, 2011).
Dalam  proses  fermentasi,  asam    sitrat merupakan    produk    metabolit  primer    yang terbentuk  dari  siklus TCA (‘Tricarboxylic  Acid Cycle’).    Glukosa  merupakan    sumber    karbon utama    dalam  produksinya.  Pada  sebagian  besar mikroba, 80% glukosa  dipecah  melalui  reaksi- reaksi    dalam  lintasan    ‘Embden    Meyerhof Parnas’    (EMP).  Asam  piruvat  yang  merupakan produk akhir dari lintasan  EMP  akan  dioksidasi
lebih    lanjut    dan  kemudian    dengan    bantuan enzim    dekarboksilase  membentuk  asetat (dekarboksilasi). Asetat yang terbentuk berikatan    dengan    koenzim-A  menghasilkan Acetyl-CoA.  Selanjutnya  Acetyl-CoA    dan oksaloasetat yang merupakan salah satu senyawa antara    siklus    TCA    berkondensasi  membentuk asam    sitrat    dengan    bantuan    enzim pengoksidasi nitrat sintase (Haryani K, 2011).
Di    Indonesia,    singkong    atau    ubi  kayu merupakan    makanan    pokok    ke    tiga  setelah padi    dan    jagung.  Produksi  rata-ratanya  kurang dari  14  ton  per  hektar,  di  tahun  1988  Indonesia memproduksi  13  juta  ton,  dan  ini  menjadikan Indonesia  sebagai  produser  singkong  terbesar kedua  di  dunia  setelah  Brazil  (Tisnadjadja  Dj, 1996).
Dalam  pemanfaatan    singkong,    sering  kali menghasilkan    limbah  kulit  singkong.  Kulit singkong    masih  mengandung    karbohidrat seperti pati yang merupakan sumber karbon yan g baik untuk berbagai proses fermentasi. Sehingga kulit  singkong  dapat  sebagai  alternatif  lain sumber  karbon  pada  produksi  asam  sitrat  secara fermentasi.  Tujuan  dilakukan  penelitian  ini adalah  melihat  kemampuan Aspergillus  wentii dalam  menghasilkan  asam  sitrat  melalui  proses fermentasi  dengan  menggunakan  limbah  kulit singkong sebagai substrat.

## METODE PENELITIAN
Bahan .  Substrat  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah kulit singkong, asam sulfat, media  ‘Potato  Dextrose  Agar’  (PDA),  media ‘Potato  Dextrose  Broth’ (PDB),  amonium klorida,  kalium  dihidrogen  fosfat,  magnesium klorida, kalsium klorida, perak nitrat, asam sulfat pekat, natrium hidroksida p.a, indikator phenolphthalein,  asam  oksalat  p.a,  alkohol  70%, piridin  p.a,  asetat  anhidrida  p.a,  asam  sitrat  p.a, aquabidestilata,  kertas  saring  Whatman  no.1. Kultur kapang Aspergillus wentii yang diperoleh dari  koleksi  Institut  Pertanian  Bogor,  nomor koleksi IPBCC 10649/Bio-236.
Alat. Gelas  piala,  erlenmeyer,  gelas  ukur, labu  takar,  tabung  reaksi,  cawan  petri,  spatula, batang  pengaduk,  bunsen,  kaki  tiga  dan  kasa, kawat  ose,  erlenmeyer,  pH  meter, ‘rotary  shaker incubator’,  autoklaf,  kapas  steril,  corong  gelas, pipet  tetes,  pipet  volume,  krus,  timbangan analitik, buret dan statif, spektrofotometer visible (Camspec  Model  M150),  spektrofotometer  UV- Vis  (Shimadzu  UV-1800  Pharmaspec),  blender, oven, inkubator, lemari es.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan Aspergillus wentii. Media PBD sebanyak 30 mL dimasukkan  ke  dalam  masing-masing  15  botol penampung  yang  telah  disterilisasi.  Starter Aspergillus  wentii yang  telah  diremajakan disuspensikan ke dalam air steril sebanyak 10%, kemudian  suspensi  starter  dimasukkan  ke  dalam masing-masing  15  botol  penampung  yang  berisi media  PDB.  Satu  buah  botol  penampung dijadikan  kontrol  (tanpa  inkubasi).  Botol penampung  ditutup  menggunakan  kapas  sumbat dan  ditutup  dengan  alumunium  foil,  kemudian diinkubasi  dalam  ‘rotary  shaker  incubator’ dengan  kecepatan  pengadukan  150  rpm  pada suhu kamar. Pengamatan dilakukan setiap 24 jam selama  14  hari  dengan  menimbang  berat  sel kering.  Data  berat  sel  kering  yang  ditimbang merupakan gambaran jumlah populasi sel kapang pada  setiap  fase  pertumbuhan. Berat sel kering diperoleh dengan cara menyaring sel kapang dengan menggunakan kertas saring Whatman  no.1,  dan  kemudian  sel  kapang  di oven  pada  suhu  105ºC  hingga  didapatkan bobot  tetap.  Kurva  pertumbuhan  dibuat dengan  membuat  grafik  hubungan  antara berat  sel  kering  (g)  dengan  waktu  (hari) (Haryani K, 2011).
Penyiapan  Substrat  Cair  Limbah  Kulit Singkong. Kulit singkong yang telah dibersihkan dan  dipotong-potong  ditimbang  sebanyak  yang dibutuhkan  dan  diblender  kemudian  dimasak dengan H 2 SO 4 4% selama 2 jam pada suhu 80ºC untuk  memecah  karbohidrat  menjadi  glukosa (19) . Setelah  dimasak  sari  kulit  singkong  disaring. Filtrat  dimasukkan  ke  dalam  erlenmeyer  yang bersih untuk masing-masing konsentrasi. Ditambahkan  amonium  klorida  0,167  %,  kalium dihidrogen fosfat 0,008 %, dan magnesium fosfat 0,05  %  sebagai  nutrisi.  Selanjutnya  erlenmeyer yang  berisi  medium  tersebut  ditutup  dengan kapas  sumbat  serta  dilapisi  dengan  alumunium foil,  lalu  disterilisasi  dalam  autoklaf  pada temperatur  121ºC  selama  15  menit  (Rahmawati A, 2010).
Proses  Fermentasi. Proses  fermentasi dilakukan  dengan  menambahkan  sebanyak  10% suspensi  starter Aspergillus  wentii dalam  air steril  secara  aseptis  ke  dalam  masing-masing labu  erlenmeyer  yang  berisi  substrat  kulit singkong. Campuran diinkubasi ke dalam ‘rotary shaker  incubator’  dengan  kecepatan  pengadukan 150  rpm  pada  suhu  kamar  dan  difermentasikan hingga  fasa  stasioner.  Cairan  hasil  fermentasi yang  diharapkan  mengandung  asam  sitrat
kemudian  disaring  dan  di  sentrifugasi  dengan kecepatan  3000  rpm  selama  20  menit  untuk memisahkan  kapang  dari  larutan (Rahmawati  A, 2010).

## Uji Kualitatif Asam Sitrat
(i) Larutan supernatan hasil fermentasi direaksikan  dengan  kalsium  klorida  yang kemudian  dididihkan  selama  beberapa menit,  akan  dihasilkan  suatu  endapan kristalin  kalsium  sitrat. Jika  larutan  natrium hidroksida  ditambahkan  kepada  larutan yang  dingin  yang  mengandung  kalsium klorida  berlebihan,  terjadi  pengendapan segera dari kalsium sitrat yang amorf.
(ii) Larutan supernatan hasil fermentasi dipanaskan  dengan  asam  sulfat  pekat, dilepaskan karbonmonoksida dan karbondioksida,  dan  larutan  perlahan-lahan akan  berubah  warna  menjadi  gelap  akibat pemisahan  karbon  dan  belerang  dioksida dilepaskan.
(iii)  Larutan supernatan hasil fermentasi direaksikan  dengan  perak  nitrat,  maka  akan terbentuk  endapan  yang  putih  dan  seperti dadih  susu.  Endapan  larut  dalam  larutan ammonia  encer  dan  larutan  ini  mengalami hanya  sedikit  sekali  reduksi  menjadi  perak setelah didihkan (Setiono L, 1985)
. Isolasi  Asam  Sitrat. Isolasi  asam  sitrat dilakukan  dengan  cara  10  mL  supernatan diendapkan  dengan  kalsium  klorida,  kemudian endapan  yang  terbentuk  disaring.  Reaksi pengendapan  diulangi  pada  filtrat  hingga  tidak terbentuk lagi endapan (pengendapan asam sitrat sempurna). Endapan yang diperoleh ditambahkan sedikit natrium klorida 0,1 N, kemudian disaring kembali.  Endapan  dibilas  dengan  aquadest  dan ditambahkan  asam  sulfat  1  N  hingga  terbentuk endapan kalsium sitrat dan filtratnya adalah asam sitrat (Ovelando R, dkk, 2013).
Pengukuran  Asam  Sitrat  dalam  Sampel. Hasil isolasi asam sitrat diambil sebanyak 3 mL, ditambahkan  1,3  mL  piridin,  dikocok  sampai rata,  kemudian  ditambahkan  5,7  mL  asetat anhidrat  dan  dikocok  dengan  menggunakan vortex  sampai  merata.  Campuran  larutan diinkubasikan  pada  suhu  32 o C  selama  30  menit dan  akan  terbentuk  warna  kuning  muda  pada larutan.  Dilakukan    pembacaan    dengan spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  407 nm. Nilai serapan yang diperoleh
diinterpolasikan  ke  dalam  persamaan  regresi linier  kurva  kalibrasi  dan  dihitung  kadar  asam sitrat dalam sampel (% b / v ) (Boulet M dan Marier JR,1958).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva  Pertumbuhan Aspergillus  wentii . Kurva pertumbuhan Aspergillus wentii diperoleh dari  hasil  pengukuran  berat  sel  kering,  yang menunjukkan bahwa Aspergillus wentii memasuki  awal  fase  log  pada  hari  ke-3  sampai hari  ke-8  yang  dicirikan  dengan  adanya pertumbuhan  yang  signifikan  dari  sel-selnya dilihat  dari  kenaikan  berat  sel  kering.  Pada  hari ke-9 Aspergillus wentii mengalami fase berikutnya  yaitu  fase  stasioner  dan  fase  ini berlangsung  sampai  hari  ke  14.  Fase  stasioner dilihat  dari  hasil  berat  sel  kering  yang  konstan. Pada  fase  ini  jumlah  populasi  sel    konstan karena  jumlah  sel  yang  tumbuh  sama dengan jumlah  sel  yang  mati (Yuliana N., 2008)
Gambar 1. Kurva pertumbuhan Aspergillus wentii
Dari  kurva  pertumbuhan  yang  dihasilkan, terlihat  bahwa  semakin  lama  inkubasi,  maka berat sel kering semakin besar, kecuali pada hari ke 5. Pada hari ke 5 berat sel kering Aspergillus wentii mengalami penurunan. Hal ini kemungkinan  terjadi  karena  kurangnya  aerasi dan  agitasi  pada  saat  proses  pengadukan. Sehingga sel-sel Aspergillus wentii yang seharusnya  dihasilkan  secara  optimal  pada  fase log  terhambat  karena  kurangnya  asupan  oksigen yang  merupakan  kebutuhan  untuk  pertumbuhan Aspergillus wentii .
Substrat  Cair  Limbah  Kulit  Singkong. Untuk  memecah  karbohidrat  yang  terkandung dalam  kulit  singkong  menjadi  glukosa,  kulit singkong  dipanaskan  dengan  asam  sulfat  4%
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0 5 10 15 B e ra t se l k e ri n g ( g )
Waktu (hari)
pada  suhu  80ºC  selama  2  jam  (Ferbriningrum PN, 2013).
Glukosa  merupakan  nutrisi  karbon  utama yang  digunakan  dalam  produksi  asam  sitrat secara  fermentasi.  Dalam  proses  ferrmentasi, asam  sitrat  dibentuk  melalui  siklus  TCA ( Tricarboxylic    Acid    Cycle ).  Lintasan Embden Meyerhof    Parnas (EMP)  akan  memecah glukosa  melalui    reaksi–reaksi    dalam  lintasan tersebut.  Asam  piruvat  yang  merupakan  produk akhir dari lintasan  EMP  akan  dioksidasi  lebih lanjut    dan  kemudian  dengan  bantuan  enzim dekarboksilase membentuk asetat (dekarboksilasi). Asetat yang terbentuk berikatan dengan  koenzim-A  menghasilkan  Acetyl-CoA . Acetyl-CoA  dan  oksaloasetatdalam  siklus  TCA dengan adanya nitrat sintase akan  berkondensasi membentuk asam sitrat (Haryani K, 2011).
Fermentasi. Dalam proses fermentasi dilakukan  penambahan  nutrisi  untuk  menunjang pertumbuhan Aspergillus  wentii .  Nutrisi  yang ditambahkan  adalah  ammonium  klorida,  kalium dihidrogen fosfat, dan magnesium sulfat (Karow E,  1947).  Amonium  klorida  berperan  sebagai sumber  nitrogen,  sedangkan  kalium  dihidrogen fosfat  dan  magnesium  sulfat  berperan  sebagai sumber mineral. Mikroba  membutuhkan  zat-zat nutrisi    untuk    sintesa    komponen    sel  dan menghasilkan energi. Mineral dibutuhkan mikroba  sebagai  akseptor  elektron  dalam metabolisme  glukosa  dan  gula  lainnya  (Malaka R, Metusalach, Abustam E, 2013).
Fermentasi  dilakukan  menggunakan  starter Aspergillus  wentii yang  ditambahkan  sebanyak 10%. Proses fermentasi dilakukan hingga hari ke 13.  Pengambilan  sampel  hasil  fermentasi dilakukan pada hari ke 3 yaitu awal fase log, hari ke  6  yaitu  pertengahan  fase  log,  hari  ke  9  yaitu awal  fase  stasioner  dan  hari  13  yaitu  fase stasioner. Hasil fermentasi disaring dan disentrifugasi  pada  kecepatan  3000  rpm  selama 20  menit  untuk  memisahkan  sel-sel  kapang  dari larutan hasil fermentasi.
Gambar 2. Aspergillus  wentii yang  digunakan  pada proses fermentasi
Uji  Kualitatif  Asam  Sitrat. Pengamatan asam  sitrat  secara  kualitatif  dilakukan  dengan cara penambahan reaksi kimia terhadap supernatan hasil fermentasi menggunakan CaCl 2 , H 2 SO 4(p) dan  AgNO 3 (Setiono  L,  1985).  Hasil reaksi  menunjukkan  bahwa  supernatan  positif mengandung  asam  sitrat.  Supernatan  hasil fermentasi  direaksikan  dengan  kalsium  klorida yang  kemudian  dididihkan  selama  beberapa menit  dan  menunjukkan  hasil  positif  dengan terbentuknya  suatu  endapan  kristalin  kalsium sitrat. Jika larutan natrium hidroksida ditambahkan  kepada  larutan  yang  dingin  yang mengandung  kalsium  klorida  berlebihan,  terjadi pengendapan  segera  dari  kalsium  sitrat  yang amorf (Setiono L, 1985).

## Gambar 3.   Hasil  reaksi  kimia  supernatan  hasil fermentasi  dengan  penambahan  kalsium klorida.
Reaksi berikutnya supernatan hasil fermentasi dipanaskan dengan asam sulfat pekat menunjukkan  hasil  positif  berupa  larutan  yang berubah  warna  menjadi  lebih  gelap  akibat pelepasan karbon (Setiono L, 1985).  .
Gambar 4.   Hasil  reaksi  kimia  supernatan  hasil fermentasi  dengan  penambahan  asam sulfat pekat.
Pengujian  terakhir  yaitu  supernatan  hasil fermentasi  direaksikan  dengan  perak  nirat menunjukkan  hasil  positif  dengan  terbentuknya endapan  perak  sitrat  yang  putih  seperti  dadih susu.  Endapan  kemudian  larut  dalam  amonia encer,  dan  jika  dididihkan  larutan  akan  berubah warna menjadi gelap (Setiono L, 1985).
(a) (b) (c) Gambar 5.   Hasil  reaksi  kimia  supernatan  hasil fermentasi  dengan  penambahan  perak nitrat;  (a)  terbentuk  endapan  putih;  (b) endapan  putih  larut;  (c)  larutan  setelah dipanaskan
Isolasi Asam Sitrat. Isolasi dilakukan dengan prinsip  pengendapan  dan  filtrasi.  Pengendapan asam  sitrat  menggunakan  CaCl 2 ,  NaOH  dan H 2 SO 4 .
Penambahan  natrium  hidroksida  berfungsi untuk  membuat  suasana  menjadi  basa  sehingga endapan  kristal  kalsium  sitrat  lebih  terlihat  jelas (berbentuk  amorf)  (Setiono  L,  1985).    Hasil pengendapan  kalsium  sitrat  dan  kalsium  fosfat (dipisahkan  dengan  penyaringan  (filtrasi).  Filtrat akhir yang didapat adalah asam sitrat yang telah diisolasi  yang  akan  digunakan  untuk  pengujian kuantitatif asam sitrat.
Pengukuran  Asam  Sitrat  dalam  Sampel. Analisis  kuantitatif  asam  sitrat  dilakukan menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  dengan pembentukan  kompleks  mengunakan  pereaksi piridin  dan  asetat  anhidrat.  Pembentukan kompleks  dilakukan  karena  asam  sitrat  tidak memiliki  gugus  kromofor  yang  dapat  terukur spektrum  absorbannya  pada  spektrofotometer UV-Vis.  Dari  penentuan  panjang  gelombang maksimum  yang  dilakukan,  terlihat  bahwa larutan  kompleks  asam  sitrat  menunjukkan panjang  gelombang  maksimum  pada  407  nm, tidak  berbeda  jauh  dengan  panjang  gelombang maksimum  pada  literatur  yaitu  420  nm  (Boulet M  dan  Marier  JR,  1958).  Jika  dilihat  dari perbandingan  spektrum  larutan  standar  dan sampel, terlihat bahwa asam sitrat yang diperoleh masih belum terlalu murni.
Hasil  analisis  kuantitatif  asam  sitrat  dari larutan  fermentasi  yang  terbentuk    hari  ke  3  = 0,269% b / v ,  hari  ke  6  =  0,312% b / v ,  hari  ke  9  = 0,186% b / v , hari ke 13 = 0,308% b / v . Berdasarkan kurva pertumbuhan hari ke-6 merupakan fase log dimana  jumlah  metabolit  yang  dihasilkan  oleh mikroorganisme  akan  meningkat  sehingga  pada hari  ke-6  dari  fase  ini  kemampuan Aspergillus wentii dalam  menghasilkan  asam  sitrat  lebih
besar  dibanding  dengan  hari  ke-3,  ke-9  dan  ke- 13.

## KESIMPULAN
Aspergillus wentii mampu menghasikan asam sitrat melalui proses fermentasi dengan penambahan substrat limbah kulit singkog. Asam sitrat  yang  terbentuk  paling  banyak  adalah  pada fermentasi hari ke-6 sebanyak 0,312 %b/v.

## DAFTAR PUSTAKA
Biswas  Supratim,  Banerjee  Pataki  C,  Mukherjee Siddhartha,  Dey  Rajib.  2013.  Microbial Extraction  of  Cobalt  and  Nickel  from Lateritic  Chromite  Overburden    using Aspergillus  wentii . Agriculture  and  Biology
Journal Of North Americ. Jadavpur University. Kolkat.; 739.
Boulet  M  dan  Marier  JR.  Direct    Determination of    Citric    Acid    in   Milk    with  an  Improved Pyridine-Acetic  Anhydride  Method. 1958. Division    of  Applied    Biology.    National Research Council. Ottawa. Canada.
Ferbriningrum  PN.  2013.  Pengaruh  Konsentrasi
Substrat Kulit Nanas dan Kecepatan Pengadukan terhadap Pertumbuhan Lactobacillus  plantarum untuk  Produksi Asam  Laktat. Jurnal  Rekayasa  Kimia  dan Lingkungan . 9: 144-151.
Haryani  Kristinah.  Studi  Kinetika  Pertumbuhan Aspergillus  niger Pada  Fermentasi  Asam Sitrat  dari  Kulit  Nanas  Dalam  Reaktor  Air- Lift  External  Loop. 2011.  Jurusan  Teknik
Kimia. Fakultas Teknik Universitas Diponegoro. Semarang, 7 : 48–52.
Iqbal  Qaiser.  Quantification  of  Fungal  Biomass Growth  During  Citric  Acid  Production  by Aspergillus  nigeron Expanded  Clay  Solid Substrate. 2008. Department  of  Bioresource Engineering  McGill  University,  Montréal;. Hal. 2.
Kareem  SO  dan  Rahman  RA,  Utilization  of Banana  Peels  for  Citric  Acid  Production  by Aspergillus  niger. 2011. Agriculture  and Biology Journal Of North America .; 384-387.
Karow  Edward  O  dan  Waksman  Selman  A.
1947. Production of Citric Acid in Submerged Culture. New Jersey  Agricultural  Experiment Station. Rutgers University. New Brunsuick.
Malaka Ratmawati, Metusalach, Abustam Effendi.  2013.  Pengaruh  Jenis  Mineral
Terhadap  Produksi  Eksopolisakarida  dan Karakteristik Pertumbuhan Lactobacillus bulgaricus Strain  Ropy  dalam  Media  Susu. Fakultas Peternakan. Program Studi Teknologi Hasil Ternak. Universitas
Hasanuddin.  Fakultas  Perikanan  Universitas Hasanuddin.
Ovelando  Redho,  Nabilla  Mutiara  A  dan  Surest Azhary  A.  2013.  Fermentasi  Buah  Markisa ( Passiflora )  Menjadi  Asam  Sitrat. Teknik Kimia. Universitas Sriwijaya. 1–7.
Rahmawati  Ani. Pemanfaatan  Limbah  Kulit  Ubi Kayu  ( Manihot  utilissima Pohl.)  dan  Kulit Nanas (Ananas  comosus  L.) Pada  Produksi Bioetanol  Menggunakan Aspergillus  niger . 2010.  Jurusan  Biologi.  Fakultas  Matematika dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam.  Universitas Sebelas Maret. Surakarta.
Setiono  L.  1985.  Vogel  Buku  Teks  Analisis Anorganik  Kualitatif  Makro  dan  Semimikro. PT. Kalman Media Pusaka. Jakarta.
Soetrisnanto  Danny,  Istadi,  Nugroho  Amin, Susanto Heru dan Widayat. 1998. Pembuatan Asam  Sitrat  dari  Sagu  dengan  Cara Fermentasi  pada  Media  Cair.  Fakultas Teknik. Universitas Diponogoro. Semarang.
Tisnadjaja  Djatdjat.  Pemanfaatan  Bahan  Berpati Sebagai  Bahan  Baku  Dalam  Industri  Asam Sitrat, 1996.  Bogor  Warta  Biotek  TH.X No.1.Puslitbang Bioteknologi-LIPI; Hal 3–5.
Yuliana  Neti.  Kinetika  Pertumbuhan  Bakteri Asam  Laktat  Isolat  T5  yang  Berasal  dari Tempoyak. 2008.  Staf  Pengajar  Jurusan
Teknologi Industri Pertanian. Fakultas Pertanian. Universitas Lampung.