## AQUASAINS
(Jurnal Ilmu Perikanan dan Sumberdaya Perairan) (Vol 5 No. 1 Tahun 2016)

## PATHOGENICITY AND IN VIVO STUDY OF LOCAL
ISOLATE Bacillus sp. D2.2 AT THE VANNAMEI CULTURE ( Litopenaeus vannamei )
Sera Hardiyani 1 · Esti Harpeni 2 · Agus Setyawan 2 · Supono 2
Ringkasan Penggunaan bakteri biokontrol da- pat dijadikan solusi bagi permasalahan pem- berantasan penyakit untuk menekan pertum- buhan bakteri pathogen pada budidaya udang vaname ( Litopenaeus vannamei ). Bacillus sp. D2.2 merupakan isolat bakteri lokal yang ter- bukti mampu menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi secara in vitro. Potensi lain isolat bak- teri ini perlu diketahui lebih lanjut melalui pe- nelitian ini. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui tingkat patogenisitas bakteri bio- kontrol Bacillus sp. D2.2 terhadap udang va- name dan kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen Vibrio alginolyti- cus secara in vivo. Uji patogenisitas Bacillus sp. D2.2 dilakukan dengan metode LD 50 pada tingkat kepadatan 10 3 , 10 4 , 10 5 dan 10 6 CFU/ml. Hasil LD 50 menunjukkan Bacillus sp. D2.2 ti- dak bersifat patogen karena tidak ada konsen- trasi bakteri yang mematikan hingga 50% la- rva udang vaname. Uji antagonisme Bacillus sp. D2.2 terhadap V.alginolyticus secara in vi- vo dilakukan pada 2 perlakuan, yaitu pemeli- haraan udang vaname tanpa penambahan Ba- cillus sp. D2.2 dan pemeliharaan udang vana- me dengan penambahan Bacillus sp. D2.2. Ke- dua perlakuan diuji tantang dengan V.alginolyticus 10 5 cfu/ml dan diulang 3 kali. Hasil peneli-
1 )Alumni Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung 2 )Dosen Jurusan Perikanan dan Kelautan, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung. Alamat: Jalan Prof. Soemantri Brodjonegoro No. 1 Bandar Lampung 35145. E-mail: edypeni@yahoo.com
tian menunjukkan Bacillus sp. D2.2 mampu menurunkan pertumbuhan V.alginolyticus dari 10 5 CFU/ml sampai 10 3 CFU/ml. Hal tersebut menjelaskan bahwa Bacillus sp. D2.2 berpo- tensi sebagai bakteri biokontrol.
Keywords biokontrol , Bacillus sp. D2.2 , Litopenaeus vannamei , Vibrio alginolyticus
Received : 09 September 2016
Accepted : 21 Oktober 2016

## PENDAHULUAN
Udang vaname (Litopenaeus vannamei ) yang merupakan udang introduksi dari pantai Pasi- fik di Amerika Latin (Briggs et al., 2004), ma- suk ke Indonesia pada awal tahun 2000 (Su- gama et al., 2006). Udang ini memiliki bebe- rapa keunggulan dibanding spesies udang pe- naeid lainnya, diantaranya, pertumbuhan yang cepat, produktivitas tinggi, dan lebih resisten terhadap penyakit (Briggs et al., 2004). Na- mun tidak dapat dipungkiri bahwa seiring per- kembangannya, udang vaname juga mulai ter- serang penyakit. Penyakit yang sering menye- rang udang vaname adalah vibriosis atau pe- nyakit udang berpendar, karena bakteri Vibrio sp. yang merupakan penyebab penyakit vibrio- sis akan mengeluarkan senyawa luminescence yang terlihat seperti cahaya pada malam hari. Jenis bakteri seperti V.harveyi , V.alginolyticus dan V.parahaemolitycus merupakan jenis bak- teri yang paling sering menyebabkan penya-
Sera Hardiyani 1 et al.
kit vibriosis pada udang (Esteve and Herrera, 2000; Fan et al. 2006; Phuoc et al. 2008; Soto- Rodriguez et al. 2010).
Penelitian akuakultur yang membahas tentang antagonisme Bacillus sp. terhadap bakteri Vi- brio telah banyak dilakukan (Vaseeharan and Ramasamy 2003; Domrongpokkaphan and Wan- chaitanawong 2006; Balcázar and Rojas-Luna 2007). Kehadiran bakteri agen biokontrol da- pat dijadikan solusi bagi permasalahan pem- berantasan penyakit untuk menekan pertum- buhan bakteri, bahkan Verschuere et al. (2000) dan Janarthanam et al. (2012) menambahkan tentang pentingnya menggunakan bakteri lo- kal (indigenous) sebagai biokontrol terhadap bakteri patogen karena lebih cepat beradapta- si serta mampu menjaga kualitas air dan ke- sehatan kultivan. patogen. Penelitian sebelum- nya menemukan satu isolat bakteri biokontrol dengan Bacillus sp. D2.2 dari tambak tradisio- nal di Desa Mulyosari, Kecamatan Pasir Sak- ti, Kabupaten Lampung Timur, Provinsi Lam- pung mampu menghambat pertumbuhan bak- teri Vibrio harveyi secara in vitro (Setyawan et al. 2014). Penelitian ini merupakan peneliti- an lanjutan untuk mengetahui tingkat patoge- nisitas bakteri biokontrol Bacillus sp. D2.2 ter- hadap udang vaname dan kemampuannya da- lam menghambat pertumbuhan bakteri pato- gen Vibrio sp. secara in vivo.

## MATERI DAN METODE
Uji Patogenisitas
Uji patogenisitas dilakukan melalui uji LD 50 ( Lethal Dosage 50) untuk mengetahui pada do- sis berapa isolat bakteri Bacillus sp. D2.2 ber- sifat patogen terhadap larva udang vaname. Ni- lai LD 50 yang didapatkan akan digunakan un- tuk menentukan dosis bakteri biokontrol pada uji tantang saat bakteri V.alginolyticus dima- sukkan ke media pemeliharaan. Isolat bakteri biokontrol dikultur pada media TSB kemudian diinkubasi di orbital shaker selama 24 jam pa- da suhu ruang sekitar 27 o C. Isolat bakteri di- sediakan dalam tingkatan kepadatan 10 3 , 10 4 , 10 5 dan 10 6 CFU/ml. Udang uji yang digu- nakan untuk tiap perlakuan berjumlah sepuluh
ekor tiap akuarium dengan tiga ulangan. Uji patogenisitas dilakukan dengan memasukkan bakteri Bacillus sp. D2.2 ke media pemeliha- raan larva udang untuk menciptakan kondisi infeksi secara alami. Udang uji dipelihara da- lam akuarium selama 14 hari dengan menga- mati sintasan dan gejala klinis yang timbul.
Uji Antagonisme Bakteri Bacillus sp. D2.2 se- cara in vivo pada Udang Vaname terhadap Bak- teri Patogen Vibrio alginolyticus.
Setelah mendapatkan nilai LD 50 , dosis bakteri Bacillus sp. D2.2 yang akan digunakan untuk uji tantang terhadap bakteri patogen V. algino- lyticus dapat ditentukan. V. alginolyticus , di- masukkan ke dalam media pemeliharaan udang. Kepadatan bakteri V.alginolyticus yang digu- nakan pada uji tantang sama dengan bakteri bi- okontrol. Uji in vivo dilakukan dengan 2 per- lakuan, yaitu pemeliharaan udang vaname tan- pa penambahan Bacillus sp. D2.2 (P1) dan pe- meliharaan udang vaname dengan penambah- an Bacillus sp. D2.2 (P2). Kedua perlakuan ter- sebut diuji tantang dengan V. alginolyticus . Pe- ngamatan dilakukan selama 3-7 hari dengan parameter pengamatan sintasan hidup udang vaname dan TVC ( Total Vibrio Count ). Da- ta dianalisis dengan menggunakan uji statis- tik nilai tengah (uji t) pada selang kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil uji LD 50 menunjukkan bahwa bakteri Ba- cillus sp. D2.2 tidak bersifat patogen karena dari semua kepadatan bakteri Bacillus sp. yang digunakan tidak ada yang mematikan ingga 50% hewan uji selama 15 hari masa pemeliharaan. Pada kepadatan Bacillus sp. D2.2 10 3 cfu/ml, tidak ada larva udang yang mati, pada kepadat- an bakteri 10 4 dan 10 5 cfu/ml terjadi kematian larva udang sebesar 3%, dan kepadatan bakteri 10 6 cfu/ml menghasilkan tingkat kematian la- rva udang tertinggi sebesar 10% (Gambar 1).
Bacillus sp. juga telah teruji tidak bersifat pa- togen bagi ikan-ikan air tawar (Lusiastuti and
Gambar 1 Tingkat kematian udang saat uji patogeni- sitas
Gambar 2 Kepadatan bakteri V.alginolyticus pada uji in vivo
Taukhid, 2011). Penggunaan suatu bakteri se- bagai agen biokontrol harus dapat memberikan keuntungan dan tidak merugikan pada inang (Nour and El-Ghiet 2011).
Kepadatan bakteri biokontrol Bacillus sp. D2.2 yang dipilih untuk digunakan pada uji in vivo terhadap bakteri patogen V. alginolyticus ada- lah 10 5 cfu/ml yang dinilai lebih aman diban- dingkan kepadatan bakteri 10 6 cfu/ml karena tingkat kematian yang lebih kecil. V. algino- lyticus yang digunakan juga disediakan pada kepadatan 10 5 cfu/ml.
Jumlah kepadatan bakteri V.alginolyticus tan- pa pemberian Bacillus sp. D2.2 terjadi pening- katan sejak hari pertama hingga hari ketiga men- capai puncak kepadatan tertinggi sebesar 2,3 × 10 6 cfu/ml kemudian menurun menjadi 5 × 10 5 cfu/ml di akhir pengamatan (Gambar 2). Sedangkan pada P2, jumlah kepadatan bakteri V.alginolyticus terus mengalami penurunan se- lama waktu pengamatan hingga di akhir waktu pengamatan jumlah kepadatan bakteri menjadi 4,7 × 10 3 cfu/ml.
Hasil analisis uji t menunjukkan penambahan bakteri biokontrol Bacillus sp. D2.2 berpenga- ruh terhadap jumlah kepadatan bakteri V. al-
Gambar 3 Survival rate (SR) udang vaname pada uji in vivo
ginolyticus pada pengamatan hari kedua dan ketiga, namun tidak berpengaruh pada penga- matan hari keempat, kelima dan keenam.
Kemampuan bakteri Bacillus sp. dalam meng- hambat pertumbuhan patogen dikarenakan si- fat antagonisme bakteri tersebut, berupa persa- ingan nutrisi dan senyawa antibiotik yang di- hasilkan oleh bakteri Bacillus sp. yang dapat merugikan bakteri lain. Sedikitnya ada 66 je- nis antibiotik yang dihasilkan oleh bakteri Ba- cillus sp. (Nishijima et al., 2005). Sifat anta- gonisme bakteri Bacillus sp. D2.2 yaitu meng- hasilkan senyawa antibakteri berupa antibak- teri polipeptida yaitu bacitracin, yang mam- pu menghambat sintesis peptidoglikan dinding sel, merusak permeabilitas membran sel dan merubah sistem respirasi (Setyawan et al., 2014).
Penambahan bakteri biokontrol Bacillus sp. D2.2 pada uji in vivo terhadap kelangsungan hidup udang vaname tidak berbeda nyata dengan per- lakuan tanpa penambahan bakteri biokontrol (p<0,05). Gambar 3. menunjukkan kelangsung- an hidup udang vaname yang diberi bakteri Ba- cillus sp. D2.2 dan V. alginolyticus (P2) lebih besar 10% dibandingkan udang vaname yang diberikan V. alginolyticus tanpa penambahan bakteri Bacillus sp. D2.2 (P1). Hal tersebut di- karenakan adanya bakteri biokontrol Bacillus sp. D2.2 yang dapat menekan pertumbuhan bak- teri patogen V. alginolyticus sehingga memini- malkan bakteri V. alginolyticus menyerang tu- buh larva udang vaname.
Kehadiran bakteri Bacillus sp. dalam dunia per- ikanan telah banyak membantu para pembudi- daya dalam mencegah dan mengatasi perma- salahan budidaya akibat serangan bakteri pato- gen. Hasil penelitian Karunasagar et al. (2005) menyatakan 27 strain Bacillus spp. positif meng-
Sera Hardiyani 1 et al.
hambat pertumbuhan 4 strain Vibrio sp. seca- ra in vitro.Janarthanam et al. (2012) mengi- solasi bakteri Bacillus spp. di perairan India dan menguji keefektifannya dalam mengham- bat bakteri patogen V. harveyi secara in vitro maupun in vivo, dan menyatakan bahwa iso- lat bakteri Bacillus spp. mampu meningkatkan kelangsungan hidup udang windu dan mam- pu mengontrol virulensi dari V.harveyi . Sela- in menghambat pertumbuhan bakteri patogen, manfaat pokok yang ditimbulkan bakteri Ba- cillus sp. adalah meningkatkan kelangsungan hidup hewan uji.

## SIMPULAN
Bakteri biokontrol Bacillus sp. D2.2 tidak ber- sifat patogen pada kepadatan 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 CFU/ml. Penambahan bakteri biokontrol Ba- cillu s sp. D2.2 mampu menurunkan pertum- buhan bakteri patogen V. alginolyticus secara in vivo.

## Pustaka
Balcázar, J. L. and Rojas-Luna, T. (2007). Inhibitory activity of probiotic bacillus sub- tilis utm 126 against vibrio species con- fers protection against vibriosis in juvenile shrimp (litopenaeus vannamei). Current mi- crobiology , 55(5):409–412.
Briggs, M., Funge-Smith, S., Subasinghe, R., and Phillips, M. (2004). Introductions and movement of penaeus vannamei and penae- us stylirostris in asia and the pacific. RAP publication , 10:92.
Domrongpokkaphan, V. and Wanchaitana- wong, P. (2006). In vitro antimicrobial acti- vity of bacillus spp. against pathogenic vi- brio spp. in black tiger shrimp (penaeus mo- nodon). Kasetsart Journal (Natural Scien- ce) , 40:949–957.
Esteve, M. and Herrera, F. C. (2000). Hepa- topancreatic alterations in litopenaeus van- namei (boone, 1939)(crustacea: Decapoda: Penaeidae) experimentally infected with a vibrio alginolyticus strain. Journal of inver- tebrate pathology , 76(1):1–5.
Fan, J.-F., Li, W.-Z., Zang, H.-M., Wang, B., and Song, L.-C. (2006). The pathogen of red body disease in litopenaeus vannamei. Acta Hydrobiologica Sinica , 30(6):742–746. Janarthanam, K., George, M. R., John, K. R., and Jeyaseelan, M. (2012). In vitro and in vivo biocontrol of vibrio harveyi using indi- genous bacterium, bacillus spp.
Karunasagar, I., Karunasagar, I., and Umesha, R. (2005). 13. microbial diseases in shrimp aquaculture.
Lusiastuti, A. M. and Taukhid (2011). Selek- si kandidat probiotik anti aeromonas hydro- phila untuk pengendalian penyakit ikan air tawar. Technical Report 2, Balai Riset Pe- nelitian Budidaya Air Tawar.
Nishijima, T., Toyota, K., and Mochizuki, M. (2005). Predominant culturable bacillus species in japanese arable soils and their po- tential as biocontrol agents. Microbes and environments , 20(1):61–68.
Nour, E. and El-Ghiet, E. A. (2011). Effica- cy of pseudomonas fluorescens as biological control agent against aeromonas hydrophila infection in oreo chromisniloticus. World J Fish Marine Sci , 3(6):564–569.
Phuoc, L., Corteel, M., Nauwynck, H., Pensa- ert, M., Alday-Sanz, V., Van Den Broeck, W., Sorgeloos, P., and Bossier, P. (2008). In- creased susceptibility of white spot syndro- me virus-infected litopenaeus vannamei to vibrio campbellii. Environmental microbio- logy , 10(10):2718–2727.
Setyawan, A., Harpeni, E., Ali, M., Maris- ka, D., and Aji, M. (2014). Potensi agen bakteri biokontrol indigenous tambak tradi- sional udang windu (penaeus monodon) di lampung timur strain d.2.2, terhadap bakte- ri patogen pada udang dan ikanpotensi agen bakteri biokontrol indigenous tambak tradi- sional udang windu (penaeus monodon) di lampung timur strain d.2.2, terhadap bakte- ri patogen pada udang dan ikan. Pertemuan Ahli Kesehatan Ikan .
Soto-Rodriguez, S. A., Gomez-Gil, B., and Lozano, R. (2010).
ï¿œbright-
redï¿œsyndrome in pacific white shrimp litopenaeus vannamei is caused by vibrio harveyi. Diseases of aquatic organisms , 92(1):11–19.
Sugama, K., Novita, H., and Koesharyani, I. (2006). Production performance; disea- ses; spf-breeding; and risk issues concer- ning white shrimp, penaeus vannamei intro- duction into indonesia. Indonesian Aqua- culture Journal , 1(1):71–77. Vaseeharan, B. and Ramasamy, P. (2003). Control of pathogenic vibrio spp. by baci- llus subtilis bt23, a possible probiotic tre- atment for black tiger shrimp penaeus mo- nodon. Letters in applied microbiology ,
36(2):83–87.
Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., and Verstraete, W. (2000). Probiotic bacte- ria as biological control agents in aquacul- ture. Microbiology and molecular biology reviews , 64(4):655–671.