Isolasi dan Karakterisasi Gen Pto Asal 20 Aksesi Anggrek Phalaenopsis

## Isolation and Characterization of Pto Gene from 20 Phalaenopsis Orchid Genotypes
Juanita Elina 1 , Dewi Sukma 2 , Giyanto 3 , dan Sudarsono 2*
1 Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor 2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (Bogor Agricultural University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
3 Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (Bogor Agricultural University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
Diterima 13 Oktober 2016/Disetujui 11 April 2017

## ABSTRACT
Bacterial soft rot disease because of Dickeya sp. infection is the main problem in Phalaenopsis production in Indonesia, but the percentage of infected plants has never been recorded in detail. Isolation and characterization of Pto gene from Phalaenopsis could be useful to support breeding for resistance Phalaenopsis. Encoding serine-threonine kinase, Pto gene confers resistance to bacterial infection of Pseudomonas syringae in tomato. The objectives of this study were to isolate, sequence  and  characterize  fragment  of  Pto  gene  from  20  genotypes  of  Phalaenopsis  (16  species  and  4  hybrids)  and  to evaluate their molecular diversity. Genomic fragments of Phalaenopsis were amplified using Pto specific degenerate primers; and the PCR amplicons were sequenced. Searching the identity of determined sequences was done using BLAST against all accessions  in  NCBI  GenBank  DNA  database  and  in  Conserve  Domain  Database.  PCR  amplification using  Pto  specific primers produced a single DNA fragment of ~500 bp. The determined nucleotide sequences from the amplicon were ~449 bp. The nucleotide sequences of the amplicons from 20 Phalaenopsis genotypes showed high sequence identity to Pto from Musa acuminata. Translation of the amplicon results in ~149 amino acid residues. Comparison of the translated polypeptides identify indicated there were low variations of Pto gene among accessions since they contain the PTO catalytic domain and the Serine/Threonine kinases, sub family of Interleukin-1 Receptor Associated Kinase (STK_IRAK) which are the conserved domains for PTO.
Keywords: catalytic domain, disease resistance, fragment Pto gene, phylogenetic, RGA

## ABSTRAK
Masalah  utama  dalam  budidaya  Phalaenopsis  di  Indonesia  adalah  penyakit  busuk  lunak  yang  disebabkan  oleh infeksi Dickeya sp, namun persentase tanaman yang terserang di Indonesia belum pernah didata secara mendetail. Isolasi dan   karakterisasi  gen  Pto  dari  anggrek  Phalaenopsis  diharapkan  bermanfaat  bagi  pengembangan  program  pemuliaan anggrek  Phalaenopsis  khususnya  ketahanan  terhadap  penyakit.  Gen  Pto  dikenal  sebagai  gen  penyandi  serine-threonine kinase yang memberikan ketahanan pada tomat terhadap infeksi bakteri Pseudomonas syringae. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi dan mengkarakterisasi fragmen gen Pto dari 20 anggrek Phalaenopsis (16 spesies dan 4 hibrida) sehingga diperoleh keragaman molekuler gen Pto untuk mengidentifikasi anggrek Phalaenopsis tahan. Fragmen gen Pto diamplifikasi menggunakan primer spesifik Pto dilanjutkan dengan sekuensing. Identitas sekuen diperoleh dengan menggunakan BLAST terhadap semua aksesi yang terdeposit di NCBI GenBank DNA database dan conserve domain database. Hasil amplifikasi PCR  menggunakan  primer  spesifik  Pto  menghasilkan  produk  ~500  pb.  Berdasarkan  runutan  nukleotida,  fragmen  DNA yang teramplifikasi sepanjang ~449 pb. Runutan nukleotida dari fragmen DNA asal 20 aksesi Phalaenopsis menunjukkan kesamaan identitas yang tinggi dengan gen Pto Musa acuminata. Translasi amplikon asal Phalaenopsis menyandikan 149 asam amino. Analisis pensejajaran asam amino menunjukkan terdapat keragaman yang rendah dari protein PTO antar genotipe Phalaenopsis dan amplikon merupakan bagian dari domain katalitik PTO, yaitu domain serine/threonine kinase sub-famili Interleukin-1 Receptor Associated Kinases (STK_IRAK).
Kata kunci: domain katalitik, filogenetik, fragmen gen Pto, ketahanan penyakit, RGA

## PENDAHULUAN
Phalaenopsis merupakan  salah  satu  jenis  anggrek yang  paling  digemari  dan  banyak  dikembangkan masyarakat. Anggrek ini memiliki keunggulan warna bunga yang beragam, bentuk bunga yang unik dan vase life yang panjang.  Dalam  pengembangan  dan  budidaya  anggrek Phalaenopsis sering  ditemukan  serangan  penyakit  busuk lunak akibat infeksi bakteri Dickeya dadantii (sinonim dari Erwinia chrysanthemi [Toth et al ., 2011]), namun persentase tanaman yang terserang di Indonesia belum pernah didata secara  mendetail.  Salah  satu  alternatif  cara  pengendalian penyakit yang efektif adalah dengan menggunakan varietas resisten terhadap infeksi patogen penyebabnya (Yusnita et al ., 2005). Keberadaan  aksesi  yang  resisten  sangat  bermanfaat dalam  pemuliaan  tanaman Phalaenopsis karena  dapat digunakan  sebagai  donor  sifat  resisten  (Fu  dan  Huang, 2011).  Evaluasi  keragaman  respon  ketahanan  tanaman terhadap  penyakit  (resistensi)  dapat  dilakukan  secara langsung  dengan  inokulasi  tanamannya  menggunakan isolat patogen yang diuji (Zainal et al ., 2011; Sutanto et al. , 2014) atau dengan mengevaluasi keragaman gen ketahanan ( R gene atau resistance gene analog ) yang ada pada genom tanamannya (Quirin et al. , 2012). Produk protein dari gen ketahanan ( R gene ) memiliki kemampuan untuk mendeteksi awal terjadinya infeksi dan mengaktifkan  mekanisme  ketahanan  tanaman  terhadap infeksi  patogen  (Han et  al .,  2011).  Tanaman  mampu mendeteksi  awal  infeksi  melalui  interaksi  spesifik  antara protein yang disandi oleh gen ketahanan ( R gene ) dengan faktor  avirulen  ( avr  factor ) yang  dihasilkan  oleh  patogen (Rose et al. , 2007). Gen  ketahanan  ( R  gene )  dikelompokkan  menjadi delapan  kelas  berdasarkan  motif  domain  terkonservasi pada  polipeptidanya  (Zhai et  al. ,  2014).  Sejumlah  91 gen  ketahanan  asal  tanaman  telah  berhasil  diisolasi  dan dikarakterisasi (Gurunani et al ., 2012), baik dari tanaman dikotil ataupun monokotil (Meyers et al ., 2005). Sebagian besar  polipeptida  yang  disandi  oleh  gen  resisten  tersebut mempunyai  domain  terkonservasi nuclear  binding  site  – leucine rich repeat (NBS – LRR [Quirin et al ., 2012]). Gen Pto merupakan  salah  satu  kelompok  gen  ketahanan  yang tidak  mempunyai  domain  terkonservasi  NBS-LRR  tetapi tergolong sebagai gen ketahanan enzimatik ( enzymatic R- gene [Gurunani et al ., 2012]).
Gen Pto merupakan  salah  satu  anggota  kelompok resistance  gene  analog (RGA)  yang  produk  proteinnya berperanan  dalam  pengenalan  awal  terjadinya  infeksi dan  proses  transduksi  sinyal  terjadinya  infeksi  untuk mengaktifkan mekanisme respon ketahanan tanaman (Wan et al ., 2009). Isolasi dan karakterisasi domain terkonservasi dari  gen Pto telah  berhasil  dilakukan  untuk  kakao  (~540 pb, Kurniasih, 2012), pisang (~550 pb, Peraza-Echeverria et  al .,  2007)  dan  sejumlah  tanaman  lainnya.  Domain terkonservasi pada produk protein PTO berupa kinase serin- treonin ( Serine-Threonin Kinase ), berfungsi sebagai enzim yang  dapat  melakukan  fosforilasi  protein  kinase  tertentu
(Castells  dan  Casacuberta,  2007)  dan  meneruskan  sinyal awal infeksi ke nukleus untuk aktifasi mekanisme resistensi terhadap  infeksi  patogen.  Wan et  al .  (2013)  menyatakan bahwa Pto mengkode serine/threonine kinase yang menjadi perantara ketahanan tanaman tomat terhadap infeksi isolat bakteri Pseudomonas  syringae pv. tomato dengan  faktor avirulensi avrPto .  Keberadaan  gen  penyandi  serine/ threonine kinase diharapkan dapat menghambat penyebaran busuk lunak akibat infeksi Dickeya dadantii pada anggrek Phalaenopsis . Meskipun  telah  diisolasi  dan  dikarakterisasi  dari berbagai  tanaman,  informasi  tentang  keberadaan  gen Pto pada Phalaenopsis ,  isolasi  dan  karakterisasinya belum dilaporkan.  Tersedianya  informasi  tentang  gen Pto asal Phalaenopsis dan keragaman molekulernya dapat digunakan untuk  identifikasi  ketahanan Phalaenopsis terhadap infeksi D.  dadantii ,  patogen  penyebab  busuk  lunak  pada Phalaenopsis di Indonesia (Sudarsono et al ., 2017; Sukma et  al .,  2017).  Penelitian  yang  dilakukan  bertujuan  untuk (1) mengisolasi fragmen gen Pto dengan amplifikasi PCR, (2)  mengkarakterisasi  fragmen  DNA  yang  teramplifikasi dengan DNA sequencing , dan (3) mempelajari keragaman residu  asam  amino  yang  ditranslasikan  dari  fragmen  gen Pto asal Phalaenopsis . Informasi tentang karakter Pto asal Phalaenopsis dan  keragaman  residu  asam  amino  yang diperoleh  sangat  berguna  dalam  pengembangan  marka molekuler  untuk  sifat  ketahanan Phalaenopsis terhadap serangan  patogen  yang  kemudian  akan  digunakan  dalam perakitan varietas tahan.

## BAHAN DAN METODE

## Isolasi DNA Total dari 20 Aksesi Phalaenopsis
Penelitian  dilaksanakan  mulai  tahun  2014  sampai dengan 2015 di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman (PMB  Lab.),  Departemen  Agronomi  dan  Hortikultura, Fakultas  Pertanian,  Institut  Pertanian  Bogor.  Total  DNA tanaman  diisolasi  menggunakan  metode  CTAB  yang dimodifikasi  (Sudarsono et  al .,  2017;  Handini,  2014; Sutanto et al. , 2014). Bahan tanaman yang digunakan adalah daun muda 20 aksesi anggrek Phalaenopsis . Contoh daun muda  (0.3-0.4  g)  digerus  dengan  larutan  penyangga-lisis (700 mL) serta penambahan PVP (0.007 g). Hasil gerusan jaringan  diinkubasi  dalam waterbath pada  suhu  65  °C selama 60 menit. Campuran diendapkan dengan sentrifugasi menggunakan  WEALTEC E-Centrifuge kecepatan  6000 rpm  selama  30  menit.  Supernatan  dipindahkan  ke  tabung eppendorf baru dan ke dalamnya ditambahkan kloroform: isoamil-alkohol (24:1) sebanyak volume supernatan. Setelah dicampur  perlahan  dan  merata  selama  3  menit,  contoh disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 30 menit. Setelah sentrifugasi, supernatannya dipindahkan ke tabung yang baru. Ke dalam tabung Eppendorf ditambahkan sodium asetat  (0.1x  volume  supernatan)  dan    isopropanol  dingin (2x  volume  total  supernatan).  Setelah dicampur  perlahan selama 3  menit, suspensi  disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 30 menit hingga diperoleh endapan DNA.
Endapan DNA dibilas dengan 100 μL etanol dingin (70%), disentrifugasi  dan  dikeringkan.  Endapan  DNA  yang  telah kering disuspensikan dalam 100 μL aquabidest .
Amplifikasi PCR dengan Primer Spesifik Pto
Pasangan  primer degenerate spesifik Pto yang digunakan  terdiri  atas  primer forward (PtoF:  5’- ggaggatttggtaargtntayaar -3’)  dan reverse (PtoR:  5’- accacaccaaatgartanacrtc -3’). Amplifikasi  PCR  dilakukan menggunakan PtoF dan PtoR serta templat total DNA dari 20  aksesi Phalaenopsis .  Setiap  reaksi  amplifikasi  PCR dilakukan dengan menggunakan 4 µL suspensi DNA, 0.75 µL (10 µM) masing-masing primer, 12.5 PCR Ready Mix (KAPA Biosystem), dan 7 µL ddH 2 O.  Tahapan  amplifikasi dilakukan    sebagai    berikut:  denaturasi    awal    pada  suhu 95 °C  selama 3 menit, diikuti dengan 35 siklus amplifikasi yang  masing-masing  siklus  terdiri  atas  denaturasi  pada  95 °C  selama  10 detik, penempelan primer dengan temperatur 45.9 o C selama 15 detik, dan pemanjangan primer pada suhu 72 °C selama 1 detik, serta diakhiri dengan pemanjangan primer pada suhu 72 °C selama 10 menit sesuai rekomendasi kit  PCR  KAPA  Biosystem.  Amplikon  dievaluasi  dengan elektroforesis gel agarose (1%) menggunakan buffer SB 1x dan diwarnai dengan GelRed TM (Biotium Inc.). Visualisasi amplikon  dilakukan  dengan  UV  transilluminator  dan elektroforegram di foto menggunakan kamera digital.

## Penentuan Runutan Nukleotida Amplikon
Amplikon  berupa  pita  tunggal  dari  masing-masing aksesi Phalaenopsis dikirim ke perusahaan penyedia layanan DNA sequencing (BASE-Asia,  Malaysia)  untuk  proses penentuan runutan nukleotida. Penentuan runutan nukleotida menggunakan BigDye terminator sequencing kit ( Applied Biosystems ) dan produk sequencing dipisahkan dengan ABI 3730 automatic sequencer ( Applied Biosystems ). Runutan  basa  nukleotida  hasil  amplifikasi  PCR dianalisis  menggunakan  program  Geneious  Basic  5.6.6 (Biomatters,  USA)  untuk  menentukan  keberadaan  primer PtoF  dan  PtoR  yang  digunakan di  ujung-ujung amplikon. Runutan  nukleotida  amplikon  dan  runutan  asam  amino hasil  translasi  dari  amplikon  dibandingkan  dengan  semua aksesi  yang  tersedia  di NCBI  GenBank  DNA  Database menggunakan basic local allignment search tool (BLAST, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi).  Hasil  BLAST digunakan untuk menduga secara umum identitas amplikon yang didapatkan.

## Penentuan Identitas Amplikon
Protein  PTO  diketahui  mempunyai  domain  katalitik dengan  runutan  asam  amino  yang  terkonservasi  (Oh  dan Martin,  2011).  Keberadaan  domain  katalitik  PTO  pada hasil  translasi  dari  amplikon  dapat  menjadi  indikator bahwa amplikon tersebut merupakan bagian dari gen Pto . Untuk memastikan identitas amplikon, keberadaan domain katalitik  PTO  dievaluasi  dengan  data  yang  tersedia  di  di NCBI  Conserved  Domain  Database (ncbi.nlm.nih.gov/
Structure/cdd/wrpsb.cgi). Hasil positif analisis keberadaan domain  katalitik  PTO  mengindikasikan  bahwa  amplikon yang didapat merupakan bagian dari gen Pto . Protein  PTO  merupakan  salah  satu  anggota  dari serine-threonine kinase protein super family , yang diketahui mempunyai conserved  domain (CD)  dengan  runutan asam  amino  tertentu  (Singh et  al .,  2012).  Keberadaan CD  pada  hasil  translasi  amplikon  dapat  digunakan untuk  mengkonfirmasi  bahwa  amplikon  yang  dievaluasi merupakan  bagian  dari  gen Pto .  Untuk  itu,  translasi  dari amplikon dievaluasi kesamaannya dengan CD yang tersedia di  database Conserved  Domain  NCBI (ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi). Hasil positif analisis keberadaan CD memastikan identitas amplikon sebagai bagian dari gen Pto .
Filogenetika  Polipeptida  Hasil  Translasi  dari  Amplikon Asal Phalaenopsis
Analisis filogenetik runutan asam amino hasil translasi dari  amplikon  dilakukan  untuk  mengevaluasi  hubungan kekerabatan antara amplikon dengan aksesi lain dari NCBI GenBank database .  Runutan  asam  amino  hasil  translasi yang diperoleh dibandingkan dengan runutan asam amino gen Pto dari Musa  acuminata (AAM97914.1), Triticum aestivum (AAL51075.1), Arachis hypogaea (AFB69787.1), Capsicum  chinense (AAQ82660.1), Nicotiana  repanda (ACO25565.1), dan Lycopersicon esculentum (AF220603.1). Konstruksi  pohon  filogenetika  dibangun  menggunakan metode Neighbour-Joining (NJ) dengan bantuan perangkat lunak MEGA versi 5 (Tamura et al ., 2011). Nilai bootstrap berdasarkan  1000  kali  pengulangan  digunakan  untuk menguji keakuratan data.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Amplifikasi PCR dengan Primer Spesifik Pto
Disain pasangan primer degenerate spesifik Pto (PtoF dan PtoR) dilakukan berdasarkan sejumlah aksesi gen Pto dan  posisi  relatif  primer  terhadap  PTO  asal  tomat  dapat dilihat pada Gambar 1.A. Primer PtoF dimulai dari kodon penyandi asam amino ke-65 dan PtoR berakhir pada kodon penyandi asam amino ke-210 dari PTO tomat. Berdasarkan hal tersebut, amplikon yang diharapkan didapat sepanjang ~440 pb. Dari  20  aksesi Phalaenopsis yang  dievaluasi,  PCR dengan  PtoF  dan  PtoR  menghasilkan  amplikon  ~500  pb (Gambar  1B).  Setelah  DNA  sequencing  seluruh  fragmen amplikon,  berhasil  diidentifikasi  runutan  nukleotida sebanyak antara 423-449 pb. Sequencing langsung dilakukan terhadap  produk  PCR,  sehingga  sejumlah  nukleotida  di bagian  ujung  5’  ataupun  ujung  3’  tidak  dapat  ditentukan karena  rendahnya  kualitas  identitas  runutan  DNA  yang didapat. Dengan demikian, terdapat perbedaan panjang (51- 77  pb)  antara  ukuran  fragmen  masing-masing  amplikon dengan total runutan nukleotida yang teridentifikasi.
Primer degenerate spesifik Pto telah  digunakan untuk  mengamplifikasi  bagian  gen Pto dan  menghasilkan
amplikon sepanjang ~540 pb untuk kakao  (Kurniasih, 2012) serta ~550 pb untuk karet (Zhai et al ., 2014). Amplikon dari kakao dan karet tersebut merupakan bagian dari total open reading frame (ORF, 963 pb) gen Pto (Orsi et al ., 2011).

## Runutan Nukleotida Hasil Amplifikasi PCR
DNA  sequencing amplikon  untuk  20  aksesi Phalaenopsis menghasilkan  38  runutan  nukleotida  yang berbeda  dan  teridentifikasi  terdiri  atas  423-449  pb  (salah satu contohnya disajikan pada Gambar 1C). Dibandingkan dengan  gen Pto asal  tomat (AF220603.1),  amplikon  asal Phalaenopsis mengalami  insersi  9  basa  nukleotida  pada posisi 265 dan delesi satu basa pada posisi 442. Translasi amplikon asal Phalaenopsis menyandikan 149 asam amino, tanpa intron dan stop kodon (Gambar 1C).
Analisis  BLAST  dengan  semua  aksesi  di  pangkalan data  GenBank  NCBI  menunjukkan  bahwa  runutan  asam amino yang ditranslasikan dari amplikon asal Phalaenopsis memiliki  tingkat  identitas  yang  tinggi  (88-95%)  dengan protein PTO (Tabel 1), antara lain dari: Musa acuminata (identitas 95%, AAM97914.1), Capsicum chinensis (89%, AAQ82660.1), Nicotiana repanda (89%, ACO25565.1) dan Arachis hypogaea (88%, AFB69787.1), sehingga amplikon tersebut  diduga  merupakan  fragmen  gen Pto .  Runutan nukleotida  amplikon  asal Phalaenopsis (38  aksesi)  yang teridentifikasi  telah  disimpan  di  pangkalan  data  GenBank
NCBI  dengan  nomor  aksesi  KR184099-KR184118  dan KR259359-KR259376.

## Identitas Amplikon Asal Phalaenopsis
Domain  katalitik  merupakan  bagian  terkonservasi pada semua protein PTO (Oh dan Martin, 2011) sehingga dapat digunakan untuk memastikan identitas amplikon asal Phalaenopsis . Polipeptida hasil translasi dari amplikon asal Phalaenopsis merupakan bagian dari domain katalitik PTO (Gambar  2A),  yaitu  pada posisi  nukleotida  ke-192-632 (residu asam amino ke-65-210) jika dibandingkan dengan PTO tomat. Bagian tersebut mempunyai kesamaan identitas yang tinggi dengan domain serine threonine kinase sub-famili Serine/Threonine kinases, Interleukin-1 Receptor Associated Kinases (STK_IRAK) yang merupakan bagian dari domain katalitik PTO (Gambar 2A). Hal ini mengindikasikan bahwa amplikon  asal Phalaenopsis memang  benar  merupakan bagian dari gen Pto . Protein PTO memiliki domain katalitik protein  kinase  yang  berperan  penting  dalam  aktivasi respons ketahanan terhadap patogen bakteri (Lehti-Shiu dan Shiu, 2012). Pada domain katalitik PTO terdapat situs aktif enzim kinase (Castells dan Casacuberta, 2007) tipe serine/ threonine kinase (Afzal et al ., 2008). Analisis  pensejajaran  runutan  asam  amino  hasil translasi  amplikon Phalaenopsis dengan  runutan  domain katalitik PTO asal M. acuminata , T. aestivum dan domain
(C)
1    AGCTGTCAAGCGCGGCAATCCGAAATCCCAGCAAGGTCTCAATGAATTTCACACCGAAATTGAATTGCTTTCGCGGCTTC
A  V  K  R  G  N  P  K  S  Q  Q  G  L  N  E  F  H  T  E  I  E  L  L  S  R  L 81   GTCATCGTCACCTTGTGTCTCTTATCGGATACTGCGACGAGCGAAACGAAATGATTCTTGTATATGAGTACATGGAGAAG
R  H  R  H  L  V  S  L  I  G  Y  C  D  E  R  N  E  M  I  L  V  Y  E  Y  M  E  K 161  GGAACTCTGAAGAGTCATCTTTATGGTTCGGATCTTCCTAACCTCAACTGGGAGCAGCGACTCGAAATCTGCATTGGGTC G  T  L  K  S  H  L  Y  G  S  D  L  P  N  L  N  W  E  Q  R  L  E  I  C  I  G  S 241  CGCACGAGGGCTTCACTATCTTCACACTGGTTCTGCAAAGGCAATCATTCACCGCGACGTCAAGTCTGCAAATATCCTTC A  R  G  L  H  Y  L  H  T  G  S  A  K  A  I  I  H  R  D  V  K  S  A  N  I  L 321  TGGATGAGAATCTCATGGCGAAGGTTGCCGATTTTGGTCTTTCGAAGACGGGTCCTGAGTTGGATCAGACTCATGTGAGC L  D  E  N  L  M  A  K  V  A  D  F  G  L  S  K  T  G  P  E  L  D  Q  T  H  V  S 401  ACCGCAGTTAAAGGGAGCTTCGGGTATCTTGATCCCGAATACTTCCGCA
T  A  V  K  G  S  F  G  Y  L  D  P  E  Y  F  R
(A)  Diagram  representasi  protein  yang  disandi  oleh  gen Pto tomat Lycopersicon  esculentum (aksesi AF220603.1,  NCBI, 2003) dan posisi amplikon hasil PCR dengan primer spesifik Pto dan templat total DNA Phalaenopsis (NCBI, 2003). (B) Elektroforegram  amplikon Phalaenopsis ( genomic  fragment )  menggunakan  sepasang  primer  spesifik Pto .  (C)  Runutan nukleotida dan hasil translasi amplikon Phalaenopsis schilleriana . Nukleotida yang diarsir merupakan bagian dari catalytic domain PTO. Str: Asam amino metionin. Stp: posisi kodon stop. Posisi primer F = forward , R = reverse , pb = pasang basa. Kolom 1-20: 20 aksesi anggrek Phalaenopsis ; M = marka DNA (1 kb ladder )
Gambar 1.
terkonservasi  STK_IRAK  (cd14066)  juga  menunjukkan identitas  yang  tinggi  dan  adanya  situs  aktif  yang  sama (Gambar  2B).  Situs  aktif  sebagai  bagian  dari  domain katalitik  PTO  diawali  dengan  motif  residu  asam  amino DFG dan diakhiri motif PE, kedua motif tersebut dipisahkan oleh 25 residu asam amino (Gambar 2B). Pada situs aktif juga ditemukan domain P+1 loop yang ada di ujung akhir dari  domain  aktivasi  (Gambar  2B).  Residu  asam  amino terkonservasi, yang merupakan ciri domain katalitik PTO, terdiri atas asam amino threonine (T), serine (S) dan situs
P+1  loop  internal  (G[S/T][F/L]GY[L/I]DPE)  sama-sama ditemukan pada hasil translasi amplikon asal Phalaenopsis , PTO  asal M.  acuminata , T.  aestivum ,  dan  CDD14066 (Gambar 2B). Hasil ini mengkonfirmasi identitas amplikon asal Phalaenopsis yang  didapatkan  menggunakan  primer PtoF  dan  PtoR  adalah  bagian  gen Pto ,  salah  satu  gen ketahanan yang ada dalam genom Phalaenopsis . Residu  asam  amino S  dan  T  merupakan  situs autofosforilasi, sedangkan P+1 loop merupakan domain yang berasosiasi dengan AvrPto (Zhai et al ., 2014). Parravicini
Aksesi GenBank Deskripsi aksesi Query coverage (%) Nilai E Identity (%) AAM97914.1 Pto-like serine/threonine kinase ( Musa acuminata ) 100 2.00E-99 95 ACO25565.1 Protein kinase-coding resistance protein ( Nicotiana repanda ) 100 3.00E-93 89 AAQ82660.1 Pto-like serine/threonine kinase ( Capsicum chinense ) 100 10.00E-94 89 AFB69787.1 Pto-like receptor kinase resistance protein ( Arachis hypogaea ) 100 2.00E-94 88
Tabel 1. Sequence identity antara runutan asam amino dari fragmen DNA hasil PCR asal Phalaenopsis bellina dengan fragmen Pto aksesi lain pada data GenBank
Gambar 2.  Posisi relatif antara polipeptida yang ditranslasi dari amplikon asal Phalaenopsis dengan catalytic domain (cd) protein PTO (cd14066) (Marchler-Bauer et al ., 2017). (A) Representasi catalytic domain (cd) protein PTO, posisi relatif polipeptida yang ditranslasi dari amplikon asal Phalaenopsis dan kesamaan residu asam aminonya dengan cd PTO.  (B) Pensejajaran runutan asam  amino  polipeptida  yang  ditranslasi  dari  amplikon  asal Phalaenopsis dengan conserve  domain STKc-PKc  ( Serine/ Threonine Kinase – Protein Kinase catalytic ). AAM97914.1, AAL51075.1 merupakan aksesi PTO yang berasal dari NCBI DNA database dan cd14066 = bagian terkonservasi dari domain katalitik protein kinase. Residu asam amino aktif ditandai dengan segitiga hitam
et  al .  (2011)  menambahkan  ketika P+1 loop berinteraksi dengan AvrPto maka resisdu asam amino serine/threonine mengalami  autofosforilasi  dan  menyebabkan  terjadinya transduksi sinyal untuk mengaktifkan mekanisme resistensi tanaman.

## Analisis Filogenetika Runutan Asam Amino Amplikon Asal Phalaenopsis
Analisis filogenetik berdasarkan seluruh residu asam amino yang ditranslasikan dari amplikon, mengindikasikan adanya  keragaman  residu  asam  amino  yang  rendah  dari gen Pto antar  genotipe Phalaenopsis (Gambar  3.A).
Berdasarkan seluruh residu asam amino yang ditranslasikan dari amplikon dan berdasarkan catalytic domain PTO-nya,
PTO  asal Phalaenopsis diduga  memiliki  progenitor  yang sama dengan PTO asal M. Acuminata, T. aestivum,  Arachis hypogaea,  Capsicum  chinensis dan Nicotiana  repanda (Gambar 3.A dan 3.B). Sebaliknya, PTO asal Phalaenopsis diduga  memiliki  progenitor  yang  berbeda  dengan  PTO asal  tomat  (Gambar  3.A  dan  3.B).  Sebaliknya,  PTO  asal Phalaenopsis diduga  memiliki  progenitor  yang  berbeda dengan PTO asal tomat (Gambar 3.A dan 3.B). Pada Gambar 4  disajikan  keragaman  karakteristik  bunga  dari  20  aksesi anggrek Phalaenopsis yang digunakan dalam penelitian.
Gambar 3. Hasil analisis filogenetik menggunakan: (A) Runutan asam amino hasil translasi dari amplikon, dan (B) Runutan asam amino dari domain terkonservasi gen Pto , untuk 20 aksesi anggrek Phalaenopsis dan tanaman lain dengan metode Neighbor-Joining. Angka pada sumbu percabangan mununjukkan nilai hasil analisis bootstrap dengan 1000 ulangan
1
1
1 1 AMP17 P. amabilis Jawa Barat P. bellina KHM0421 MKW002 V3 P. cornu-cervi P. lueddenmanniana P. pulcherima P. fimbriata P. modesta P. lamelligera P. violaceae P. tetraspis P. stuartiana P. amboinensis P. schilleriana P. gigantea
Gambar 4. Representasi keragaman karakteristik bunga dari berbagai aksesi anggrek Phalaenopsis yang digunakan dalam penelitian

## KESIMPULAN
PCR  dengan  pasangan  primer  PtoF  dan  PtoR  serta templat  genom Phalaenopsis menghasilkan  amplikon sepanjang  ~500  pb,  tetapi  hasil DNA  sequencing hanya  mampu  mengidentifikasi  449  pb.  Amplikon  asal Phalaenopsis menyandi  149  residu  asam  amino,  yang kesamaan identitasnya mencapai 88% sampai 95% dengan sejumlah  aksesi  PTO  di  pangkalan  data  GenBank  NCBI. Hasil analisis pensejajaran runutan asam amino menunjukkan bahwa amplikon merupakan penyandi bagian dari domain katalitik  PTO  dan  domain serine  threonine  kinase sub famili  Serine/Threonine  kinases,  Interleukin-1  Receptor Associated  Kinases  (STK_IRAK).  Berdasarkan  runutan asam  aminonya,  keragaman  protein  PTO  antar  genotipe Phalaenopsis tergolong  rendah.  Berdasarkan catalytic domain -nya,  PTO  asal Phalaenopsis diduga  memiliki progenitor yang sama dengan PTO asal M. acuminata, T. aestivum, A. hypogaea, C. chinensis dan N. repanda tetapi berbeda dengan PTO asal tomat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  merupakan  bagian  dari  tesis  magister Juanita  Elina  yang  berjudul  “Respon  Ketahanan  Inang terhadap Penyakit Busuk Lunak dan Karakterisasi Molekuler dengan  Marka  SNAP  pada  Anggrek Phalaenopsis. ” Penelitian  didukung  dana  dari  Hibah  Kompetensi,  No. Kontrak:  083/SP2H/PL/Dit.Litabmas/II/2015  tahun  2015, Ditjen  Dikti,  Kementerian  Pendidikan  Nasional  RI,  yang dikoordinir Dr Dewi Sukma.

## DAFTAR PUSTAKA
Afzal, A.J., A.J. Wood, D.A. Lightfoot. 2008. Plant receptor- like serine threonine kinases: roles in signaling and plant defense. MPMI 21:507-517.
Castells,  E.,  J.M.  Casacuberta.  2007.  Signalling  through kinase-defective domain: the prevalance of atypical receptor-like kinases in plants. J. Exp. Bot. 58:3503- 3511.
Fu, S.F., H.J. Huang. 2011. Molecular characterization of the early response of orchid Phalaenopsis amabilis to Erwinia  chrysanthemi infection.  Orchid  Biotech II:283-308.
Gurunani,  M.  A.,  J.  Venkatesh,  C.  P.  Upadhyaya,  A. Nookaraju,  S.  K.  Pandey,  S.  W.  Park.  2012.  Plant disease  resistance  genes:  current  status  and  future directions. Physiol. Molec. Plant Pathol. 78:51-65.
Handini,  A.S.  2014.  Analisis  keragaman  morfologi  dan biokimia  pada  anggrek Phalaenopsis serta  analisis keragaman  genetik  dengan  marka  SNAP.  Tesis.
Sekolah  Pascasarjana.  Institut  Pertanian  Bogor. Bogor.
Han,  X.,  L.  Li,  L.  Cui,  J.  Xing,  L.  Tang,  M.  Cao.  2011. Isolation  of  candidate  disease  resistance  genes from  enrichment  library  of Oryza minuta based  on conserved domains. African J. Biotechnol. 10:14738- 14745.
Kurniasih,  S.  2012.  Pemanfaatan  marka  molekuler untuk  mendukung  perakitan  kultivar  unggul kakao  ( Theobroma cacao L.).  Disertasi.  Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Lehti-Shiu,  M.D.,  S.  Shiu.  2012.  Diversity,  classification and function of the plant protein kinase superfamily. Phil. Trans. R. Soc. B. 367:2619-2639.
Marchler-Bauer, A., Y. Bo, L. Han, J. He, C.J. Lanczycki, S.  Lu,  F.  Chitsaz,  M.K.Derbyshire,  R.C.  Geer, N.R.  Gonzales,  M.  Gwadz,  D.I.  Hurwitz,  F.  Lu, G.H.Marchler, J.S. Song, N. Thanki, Z. Wang, R.Z. Yamashita, D. Zhang, C. Zheng, L.Y.Geer, S.H. Bryant. 2017.  CDD/SPARCLE:  functional  classification  of proteins via subfamily domain architectures. Nucleic Acids Res. 45(D1):D200-D203.
Meyers,  B.C.,  S.  Kaushik,  R.S.  Nandety.  2005.  Evolving disease resistance genes. Current Opinion Plant Biol. 8:129-134.
NCBI.  2003.  Lycopersicon  esculentum VFNT  Cherry  Pto locus, complete sequence. https://www.ncbi.nlm.nih. gov/nuccore/8547233/ [8 Agustus 2017].
Oh,  C.,  G.B.  Martin.  2011.  Effector-triggered  immunity mediated  by  the Pto kinase.  Trends  Plant  Sci. 16:1360-1385.
Orsi, I., M. Malatrasi, E. Belfanti, M. Gulli, N. Marmiroli. 2011.  Determining  resistance  to Pseudomonas syringae in  tomato,  a  comparison  of  different molecular markers. Molec. Breeding 30:967-974.
Parravicini, G., C. Gessler, C. Denance, P. Lasserre-Zuber,
E. Vergne, M. Brisset, A. Patocchi, C. Durel, G.A.L. Broggini.  2011.  Identification  of  serine/threonine kinase  and  nucleotide-binding  site-leucine-rich repeat (NBS-LRR) genes in the fire blight resistance quantitative trait locus of apple cultivar ‘Evereste’. Molec. Plant Pathol. 12:493-505.
Peraza-Echeverria, S., A. James-Kay, B. Canto-Canche, E, Castillo-Castro.  2007.  Structural  and  phylogenetic analysis of Pto -type disease resistance gene candidates in banana. Molec. Genet. Genomics 278:443-453.
Quirin,  E.A.,  H.  Mann,  R.S.  Meyer,  A.  Traini,  M.I. Chiusano, A. Litt, J.M. Bradeen. 2012. Evolutionary meta-analysis  of  solanaceous  resistance  gene  and Solanum resistance  gene  analog  sequences  and  a practical  framework  for  cross-spesies  comparisons. MPMI 25:603-612.
Rose, L.E., R.W. Michelmore, C.H. Langley. 2007. Natural variation  in  the Pto disease  resistance  gene  within species of wild tomato ( Lycopersicon ). II. Population genetics of Pto . Genetics 175:1307-1319.
Singh, S.P., S. Vivek, R.L. Bezbaruah, M. Barooah. 2012. Prediction  of  the  three-dimensional  structure  of serine/threonine  protein  kinase  PTO  of  Solanum lycopersicum by homology modelling. Bioinformation 8:212-215.
Sudarsono, M.D. Haristianita, A.S. Handini,  D.  Sukma. 2017.  Molecular  marker  development  based on  diversity  of  genes  associated  with  pigment biosynthetic pathways to support breeding for novel colors in Phalaenopsis. Acta Hort. 1167:305-312.
Sudarsono,  S.,  J.  Elina,  Giyanto,  D.  Sukma.  2017. Pathogen  Causing  Phalaenopsis  Soft  Rot  Disease –  16S  rDNA  and  Virulence  Characterisation.  Plant Protection  Sci.  http://www.agriculturejournals. cz/web/pps.htm?type=article&id=18_2017-PPS. DOI:10.17221/18/2017-PPS.
Sukma,  D.,  J.  Elina,  Giyanto,  Sudarsono.  2017.  Disease resistance breeding of Phalaenopsis spp. for tropical environment and molecular marker development for plant selection. Acta Hort. 1167:237-243.
Sutanto, A., D. Sukma, C. Hermanto, S. Sudarsono. 2014. Isolation  and  characterization  of  Resistance  Gene Analogue  (RGA)  from  Fusarium  resistant  banana cultivars. Emir. J. Food Agric. 26:508-518.
Tamura, K., D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei, S.  Kumar.  2011.  MEGA5:  molecular  evolutionary genetics  analysis  using  maximum  likelihood, evolutionary  distance,  and  maximum  parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28:2731-2739.
Toth,  I.K.,  J.M.  van  der Wolf,  G.  Saddler,  E.  Lojkowska, V.  Helias,  M.  Pirhonen,  L.  Tsror  (Lahkim),  J.G. Elphinstone.  2011. Dickeya spesies:  an  emerging problem  for  potato  production  in  Europe.  Plant Pathol. 60:385-399.
Wan,  H.,  C.  Qian,  A.A.  Malik,  Z.  Zhao,  J.  Chen.  2009. Isolation,  phylogeny  and  evolutionary  analysis  of Pto -type  disease  resistance  gene  analogues  from  a Cucumis hystrix introgression line of cucumber ( C. sativus ). Funct. Plant Biol. 37:513-523.
Wan, H., W. Yuan, M. Ruan, Q. Ye, R. Wang, Z. Li, G. Zhou, Z. Yao, Y. Yang. 2013. Identification, phylogeny, and expression analysis of Pto -like genes in pepper. Plant Molec. Biol. Rep. 31:901-916.
Yusnita,  Y.  W.  Widodo,  S.  Sudarsono.  2005.  In  vitro selection  of  peanut  somatic  embryos  on  medium containing  culture  filtrate  of Sclerotium  rolfsii and plantlet regeneration. HAYATI J. Biosci. 12:50-56.
Zainal, A., A. Anwar, S. Ilyas, Sudarsono, Giyanto. 2011.
Uji  inokulasi  dan  respon  ketahanan  38  genotipe tomat  terhadap Clavibacter  michiganensis subsp. michiganensis . J. Agron. Indonesia 39:85-91.
Zhai, W., Y. Zhao, L.X. Zhang, X.J. Li. 2014. Structural and phylogenetic analysis of Pto -type disease resistance gene candidates in Hevea brasiliensis . Genet. Molec. Res. 13:4348-4360.