## TINGGINYA KADAR TUMOR NECROSIS FACTOR-α (TNF-α) PLASMA PADA MENCIT BUNTING YANG TERINFEKSI PLASMODIUM BERGHEI
BERHUBUNGAN KUAT DENGAN KADAR HEMOGLOBIN YANG RENDAH TETAPI TIDAK BERHUBUNGAN DENGAN BERAT BADAN JANIN RENDAH

## Yuliyanik
Yuliyanik_wabiser@yahoo.com

## Prodi Kebidanan STIKES Widyagama Husada

## ABSTRACT
Malaria  infection  in  pregnancy  may  increase the  morbidity  and  mortality  of  both  mother  and fetus.  In  pregnant  women,  it  can  lead  to  severe  anemia,  cerebral  malaria,  pulmonary  edema, renal failure and even death, while in the fetus it can cause abortion, premature birth, low birth weight,  and  fetal  death.  Elevated  levels  of  tumor  necrosis  factor-α(TNF-α  )  is  associated  with low  birth  weight  and  anemia  in  pregnant  women.  This  study  was  conducted  to  measure  the levels of TNF-α in plasma and placental tissue, and hemoglobin levels as well as fetal weight to determine  the  relationship  between  them  in P.  berghei infected  pregnant  mice  and  normal pregnant mice. Seventeen BALB/c mice used in this study were divided into two groups, those were the study group (9 pregnant mice infected with P. berghei ) and control group (8 pregnant mice  not  infected  with P.  berghei ).  Level  of  TNF-α  were  measured  using  Enzyme  Linked Immunosorbent assay (R&D Systems, catalog A00B MT). Hemoglobin levels were determined using flowcytometri, whereas fetal weight were performed with Mettler analytical balance AE 50. T-test statistical analysis showed that the levels of TNF-α in plasma and placental tissue in study group were higher than control group (p=0.000, p=0.034). Hemoglobin levels in the study group    were  lower  than  control  group  (p=0.025).  Fetal  weights  were  also  lower  in  fetuses  of infected  mice  than  fetuses  of  uninfected  mice  (p=0.002).  Pearson  correlation  test  showed increasing  plasma  levels  of  TNF-α  in  infected P.  berghei pregnant  mice  were  related  with  the decreasing  levels  of  Hb,  (r=-0.748;  p=0.020,),  whereas  levels  of  placental  TNF-α  were  not associated with hemoglobin level (p=0.337). Both plasma and placental levels of TNF-α were not associated  with  the  incidence  of  fetal  low  weight  (p=0.380,  and  p=0.365).  It  can  be  concluded that the increased levels of TNF-α is associated with decreased levels of hemoglobin (Hb), but not associated with fetal low weight.
Keywords  :    Plasmodium  berghei,  Tumour  Necrosis  Factor-α  (TNF-  α),  Hemoglobin,  Birth Weight

## ABSTRAK
Infeksi Plasmodium  berghei dapat  menyebabkan  peningkatan  kadar  TNF  α  baik  pada plasma  maupun  pada  jaringan  plasenta.  Peningkatan  kadar  TNF  α  tersebut  dapat menyebabkan  terjadinya  anemia  pada  mencit  bunting  yang  terinfeksi P. berghei. Penelitian ini dilakukan  untuk  mengukur  kadar  TNF  α  plasma  dan  jaringan,  kadar  hemoglobin  dan  berat badan  lahir  pada  mencit  bunting  yang  terinfeksi  maupun  yang  tidak  terinfeksi P.  berghei dan mengetahui hubungan kadar TNF α plasma dan jaringan dengan kejadian anemia serta dengan kejadian berat badan lahir.
Analisis statistik yang digunakan adalah T-test untuk mengetahui perbedaan kadar TNF α  plasma  dan  jaringan,  kadar  hemoglobin  dan  berat  badan  lahir  pada  kelompok  studi  dan kelompok kontrol. Analisis statistik menunjukkan bahwa kadar TNF α pada plasma (p=0,000) dan  jaringan  (p=0,034)  pada  kelompok  studi  lebih  tinggi  daripada  kelompok  kontrol.  Kadar hemoglobin  pada  kelompok  studi  lebih  rendah  (p=0,025)  daripada  kelompok  kontrol  yang tidak  terinfeksi.  Berat  badan  lahir  juga  lebih  rendah  (p=0,001)  pada  mencit  bunting  yang terinfeksi, daripada kelompok kontrol yang tidak terinfeksi.
Hubungan  peningkatan  kadar  TNF  α  plasma  dan  jaringan  plasenta  pada  mencit bunting  yang  diinfeksi P.  berghei dengan  penurunan  kadar  Hb,  menggunakan  uji  korelasi Pearson Correlations , menunjukkan nilai yang bermakna untuk peningkatan kadar TNF α pada plasma  terhadap  penurunan  Hb    (p=0,020;  r=-  0,748),  sedangkan  pada  jaringan  plasenta menunjukkan nilai yang tidak bermakna (p=0,337; r=-0.363). Sedangkan hubungan antara kadar TNF  α  plasma  dengan  berat  badan  lahir  mempunyai  nilai  yang  tidak  bermakna  (p=0,380,  r=- 0,334),  demikian  pula  hubungan  antara  kadar  TNF  α  jaringan  dengan  berat  badan  lahir mempunyai nilai yang tidak bermakna (p=0,365, r=0,344).
Kata kunci : Plasmodium berghei , kadar TNF α, kadar hemoglobin, berat badan lahir

## LATAR BELAKANG
Malaria  merupakan  masalah  kesehatan masyarakat  yang  penting  dan  merupakan penyakit  parasit  yang  menginfeksi  300-500 juta  orang  setiap  tahunnya  (WHO,  2012). Penyakit  yang  menyerang  manusia  ini disebabkan oleh protozoa genus Plasmodium (DFID, 2010).
Selama  bertahun-tahun  dikenal  ada empat  spesies  Plasmodium,  yang  dapat menginfeksi  manusia  yaitu Plasmodium falciparum  (P.  Falciparum),  Plasmodium  vivax (P.  Vivax),  Plasmodium  ovale  (P.  ovale) dan Plasmodium  malariae  (P.  malariae) (WHO, 2012). Plasmodium  knowlesi merupakan spesies  yang  baru-baru  ini  dinyatakan  dapat menginfeksi  manusia. Plasmodium  knowlesi ditemukan  pertama  kali  pada  tahun  1965 menyerang macaca  (Singh, 2004).
Malaria pada
kehamilan dapat disebabkan oleh keempat spesies
Plasmodium,  sedangkan  pada spesies  yang kelima belum pernah dilaporkan. Plasmodium
falciparum merupakan  parasit  yang  dominan pada  ibu  hamil  dan  mempunyai  dampak paling  berat  terhadap  morbiditas  dan mortalitas ibu dan janinnya (Hinderaker et al. , 2002;  Erharbor et  al .,  2010). Plasmodium falciparum menjadi  penyebab  terbanyak anemi pada ibu hamil (Guyatt & Snow, 2001).
Wanita  hamil  yang  tinggal  di  daerah endemik  mudah  terinfeksi  parasit  malaria dibandingkan  wanita  yang  tidak  hamil,  dan berhubungan  dengan  risiko intra  uterine growth retardation (IUGR) persalinan prematur,  anemi  dan  kematian  bayi  (Anya, 2004;  Crawley,  2004;  Uneke,  2007;  Kevenon, 2010).      Infeksi  malaria  pada  wanita  hamil sangat mudah terjadi karena adanya perubahan  sistim  imunitas  ibu  selama kehamilan,  baik  imunitas  seluler  maupun imunitas  humoral,  serta  diduga  juga  akibat peningkatan  hormon  kortisol  pada  wanita selama kehamilan (Desai et al. , 2007).
Sitokin  yang  diduga  banyak  berperan pada  mekanisme  patologi  malaria  adalah
Tumor  Necrosis  Factor α (TNFα) .  Tumor Necrosis  Factor α  (TNFα)  menginduksi terjadinya  perubahan  pada  netrofil  yaitu pelepasan enzim lisosomal, ekspresi  reseptor permukaan  seperti  reseptor  Fc  dan  integrin, adhesi dan migrasi kemotaktik (Costa, 2006). Tumor Necrosis Factor α berhubungan dengan bayi lahir berat rendah dan anemi (Rogerson, 2007).
Ibu  hamil  dengan  infeksi  malaria  selama kehamilannya,  dapat  menyebabkan  anemia, dengan  hemoglobin  <  11  gr/dl  (Erhabor, 2009),  melahirkan  Bayi  Berat  Lahir  Rendah (BBLR),  dengan  berat  badan  bayi  <  2500 gram, yang merupakan risiko tinggi terjadinya kematian bayi serta dapat menyebabkan  lahir  prematur  (gestasi  <  37 minggu)  dan  IUGR  (Moorman,  1999;  Guyatt &Snow, 2004; Rogerson, 2007; Uneke 2007).
Dari  permasalahan  di  atas,  maka dilakukan  penelitian  untuk  mengetahui pengaruh  paparan P.  berghei pada  mencit bunting  terhadap  kadar  TNF  α,  kadar  Hb, berat badan lahir serta hubungan kadar TNF α dengan kadar Hb dan berat badan lahir.

## METODE PENELITIAN Desain Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental yang  menggunakan  mencit  jenis  BALB/c betina  yang  terbagi  menjadi  kelompok  studi sebagai  kelompok  yang  terinfeksi  dan kelompok  tidak  terinfeksi  sebagai  kelompok kontrol.  Parameter  yang  digunakan  adalah kadar  TNF  α,  kadar  Hb  dan  berat  badan lahir.

## Tempat Penelitian
Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium Swasta Malang, Laboratorium Biologi, Laboratorium  Parasitologi  dan  Laboratorium Sentral Biomedik Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya Malang.
Sampel Penelitian
1. Mencit  bunting  terinfeksi Plasmodium berghei sebanyak  30  mencit  sebagai kelompok studi.
2. Mencit bunting tidak terinfeksi Plasmodium  berghei sebanyak  20  mencit sebagai kelompok kontrol.

## Variabel Penelitian Variabel Independen (bebas)
Variabel  bebas  dalam  penelitian  ini  adalah infeksi Plasmodium berghei.

## Variabel Dependen (tergantung)
Variabel  tergantung  dalam  penelitian  ini adalah  kadar  TNF  α,  kadar  Hb  dan  berat badan lahir.

## Definisi Operasional
1. Plasmodium  berghei adalah  Plasmodium yang  menginfeksi  mencit,  pada  manusia memberi  gejala  yang  sama  dengan P. falciparum . Plasmodium  berghei galur  Anka ini  di  dapatkan  dari  Laboratorium Parasitologi
Universitas Brawijaya Malang.  Plasmodium  ini  diinfeksikan pada mencit galur Balb/c dengan konsentrasi parasit 10 6 dalam 0,2 mL darah secara intraperitoneal. Pemberian P. berghei pada  mencit  bunting  dilakukan hari ke 9 kebuntingan.
2. Kadar TNF adalah kadar TNF plasma dan pada jaringan plasenta diukur menggunakan  Quantikine  ELISA (Enzyme Linked Immuno Assay) Inc. 2 plate dari R&D Systems, katalog  MT  A00B.  Satuan  pq/ml dengan  skala  data  rasio.  Kadar  TNF diperiksa  di  Laboratorium  Biomedik Universitas Brawijaya Malang.
3. Kadar  Hb adalah  parameter  status  besi yang memberikan suatu ukuran
kwantitatif  tentang  beratnya  kekurangan zat  besi  setelah  anemia  berkembang.  Alat ukurnya flowcytometri ,  satuan  g/dl  dengan skala data rasio. Pemeriksaan Hb
dilakukan di Laboratorium swasta Malang.
4. Berat  Badan  Lahir adalah  janin  mencit yang lahir pada trimester III (normal berat janin mencit 0,5 – 1,5 gram). Alat ukurnya untuk  mengetahui  janin  mengalami  BBLR adalah  dengan  menimbang  berat  badan janin  mencit  dengan  neraca  analitis Mettler AE 50, di Laboratorium
Parasitologi Universitas Brawijaya
Malang. Skala data rasio.

## Metode Pengumpulan Data
Untuk  mendapatkan  data  yang  valid dan  reliabel,  maka  digunakan  metode pengumpulan  data    mulai  pemeliharaan sampai pembedahan mencit yang meliputi :
a. Pembelian  100  ekor  mencit  dari Fakultas Kedokteran Universitas Gajah  Mada  Yogyakarta,  terdiri  dari
50 ekor mencit jantan,  50  ekor  mencit betina.
b. Pemisahan  mencit,  masing-masing  10 ekor mencit/kandang.
c. Kelompok mencit jantan dan kelompok  mencit  betina  ditempatkan pada ruangan yang berbeda.
d. Pemberian  makan  (BR  -1  dan  kacang hijau),  minum  pada  mencit  2x/hari. Sekam diganti setiap 3 hari.
e. Pemberian tanda pada mencit bunting untuk masing-masing kelompok.
f. Penimbangan  mencit  setiap  hari sampai  satu  hari  sebelum  dilakukan pembedahan.
g. Inokulasi Plasmodium  berghei pada  30 ekor  mencit  bunting  kelompok  studi hari ke 9.
h. Penghitungan  derajad  parasitemia setiap  hari  pada  mencit  bunting kelompok studi yang diinfeksi
Plasmodium berghei . i. Pembedahan mencit bunting kelompok studi yang diinfeksi Plasmodium  berghei dan  kelompok kontrol yang tidak diinfeksi
Plasmodium berghei pada hari ke 19.

## Teknik Analisis Data Uji beda
Uji  t  dua  variabel,  digunakan  untuk membandingkan  atau  membedakan  dua variabel serta untuk menguji generalisasi dari hasil analisis. Teknik ini digunakan antara :
1. Kadar  TNF  α  plasma  kelompok  studi (diinfeksi)  dan  kelompok  kontrol (tanpa infeksi).
2. Kadar TNF α jaringan kelompok studi (diinfeksi)  dan  kelompok  kontrol (tanpa infeksi).
3. Kadar  Hb  kelompok  studi  (diinfeksi) dan kelompok kontrol (tanpa diinfeksi).
4. Berat  badan  lahir  kelompok  studi (diinfeksi)  dan  kelompok  kontrol (tanpa infeksi).

## Uji korelasi
Uji korelasi Pearson Correlations dipergunakan untuk mencari hubungan atau untuk menguji signifikansi  hipotesis  asosiatif  bila  masing- masing variabel yang dihubungkan berbentuk  ordinal  dan  sampelnya  kecil. Teknik ini digunakan antara :
1. Hubungan  kadar  TNF  α  plasma dengan  kadar  Hb  pada  kelompok studi.
2. Hubungan  kadar  TNF  α  jaringan dengan  kadar  Hb  pada  kelompok studi.
3. Hubungan  kadar  TNF  α  plasma dengan  berat  bdan  lahir  pada kelompok studi
4. Hubungan  kadar  TNF  α  jaringan dengan  berat  badan  lahir  pada kelompok studi.

## Prosedur Kerja Penelitian Prosedur pembuntingan mencit
Pembuntingan mencit betina sebanyak 50 ekor dilakukan setelah persiapan sinkronisasi  estrus  melalui  tiga  tahap,  yaitu Leeboot effect, Pheromon effect dan Whiten effect (Sardjono,  2005),  dengan  cara  mencit  betina dikandangkan  dengan  sesama  mencit  betina selama  10  hari  dan  dipisahkan  ruangan  dari kandang  mencit  jantan.  Pada  saat  ini  mencit akan berada dalam kondisi un-estrus ( Leeboot effect). Mencit  betina  yang  sudah  dipisahkan akan  memulai  siklus  birahinya  dengan dipapar  urin  mencit  jantan  yang  terdapat pada  sekam  selama  3  hari (Pheromon  effect) . Mencit  betina  akan  mengalami  birahi  pada malam ke tiga setelah pemaparan urin mencit jantan dengan mendekatkan kandang mencit
jantan  ke  kandang  mencit  betina (Whiten effect) .  Kemudian  mencit  jantan  dan  mencit betina  digabungkan  dalam  satu  kandang selama  satu  malam  dengan  ratio  1:1.  Hari pertama  kebuntingan  adalah  hari  pertama setelah perkawinan.
Mencit yang digunakan adalah mencit galur  Balb/c  yang  berusia  antara  13-15 minggu,  berat  badan  antara  20-30  gram. P. berghei digunakan  untuk  menginfeksi  hewan coba.
Inokulasi P. berghei pada mencit donor Inokulasi P. berghei pada mencit donor diberikan  secara  intraperitoneal,  setelah  4 hari  inokulasi,  setiap  hari    dilakukan penghitungan  parasitemia.  Penghitungan parasitemia  dibuat  dari  sediaan  hapusan darah tipis yang diambil dari ujung ekor dan dibuat  dengan  pewarnaan Giemsa. Jumlah parasit  dihitung  per  1000  eritrosit  dengan mikroskop pembesaran 100x. Jika parasitemia mencit  donor  sudah  >  12%,  berarti  mencit donor  sudah  siap  digunakan  sebagai  donor infeksi mencit studi.
Inokulasi mencit studi
Inokulasi mencit studi dilakukan pada hari ke 9 kebuntingan sebanyak 10 6 parasit dalam 0,2 mL darah untuk tiap mencit studi secara intraperitoneal.
Pengukuran jumlah parasitemia mencit studi
Pengukuran jumlah parasitemia mencit  studi  dilakukan  setiap  hari  dengan membuat  hapusan  darah  tipis  yang  diambil dari ekor mencit, darah diteteskan pada object glass , dikeringkan kemudian ditetesi methanol hingga  merata,  setelah  kering  hapusan  dicat dengan Giemsa .  Didiamkan  selama  30  menit, kemudian dibilas dengan air dan dikeringkan Jumlah  parasitemia  dihitung  per  1000 eritrosit dengan pembesaran mikroskop 100x. Jumlah  parasitemia  mencit  studi  dihitung setiap  hari  sampai  dengan  menjelang pembedahan pada hari ke19 kebuntingan.

## Pembedahan
Pembedahan  dilakukan  pada  hari  ke 19 kebuntingan. Pembedahan dilakukan pada mencit  studi  dan  mencit  kontrol  yang
bunting.    Mencit  dimasukkan  dalam  wadah yang  sudah  diberi  kloroform,  ditunggu sampai  mencit  benar-benar  mati,  kemudian dibedah  untuk  diambil  darah,  janin  dan plasentanya.  Pengambilan  darah  untuk pemeriksaan  kadar  Hb  dan  kadar  TNF  α, pengambilan  janin  dan  plasenta  untuk pemeriksaan  TNF  α  pada  jaringan  serta untuk mengetahui adanya Berat Badan Lahir Rendah  (BBLR).  Darah  dimasukkan  dalam vacutainer ,  disentrifuse  dan  disimpan  dalam lemari  pendingin,  janin  disimpan  dalam cairan formalin, sedangkan plasenta dimasukkan  dalam  tabung  dan  disimpan dalam lemari pendingin.
Prosedur Pemeriksaan TNF α dengan ELISA Kit Prosedur Pemeriksaan TNF α pada plasma dengan ELISA Kit
Pemeriksaan  TNF  α  pada  plasma dilakukan  dengan  metode ELISA  Mouse  TNF α  Immunoassay  Catalog  Number  MTA  00B . Pertama  dipersiapkan reagen,  sample dan standard  dilutions serta well/microplate untuk masing-masing preparat. Kemudian dilakukan persiapan preparasi Standard pada Mouse TNF α standard dengan ditambahkan 1 ml deionized  water ,disentrifuse  kemudian didiamkan  selama  5  menit.  Untuk  preparasi Control Mouse TNF α Kit Control, ditambahkan 1,0 ml deionized water, kemudian  disentrifuse.  Disiapkan microplate untuk sample dan membuat sederetan larutan standard.  Kemudian  memasukkan  50  µl Assay diluents RD 1-63 ke semua well . Setelah itu ditambahkan 50 µl Standard, Control dan sampel  ke  masing-masing well ,  kemudian diinkubasi  selama  2  jam  dalam  suhu  ruang. Sambil mengunggu inkubasi, disiapkan wash buffer  1x  1/25  x  50  ml  =  2  ml.  Setelah diinkubasi  selama  2  jam,  dilakukan washing sebanyak  5x.  Setelah washing ,  dimasukkan 100  µl Mouse  TNF  α  Conjugate ke  masing- masing well , kemudian diinkubasi lagi selama 2  jam  dalam  suhu  ruang.  Setelah  inkubasi, dilakukan washing kembali  sebanyak  5x. Setelah  inkubasi  2  jam  yang  kedua, dimasukkan  100  µl Substrat ,  kemudian
diinkubasi  selama  30  menit  dalam  suhu ruang,  dan  dihindarkan  dari  cahaya.  Setelah inkubasi,  ditambahkan  100  µl Stop  Solution dan dimixing. Kemudian hasil dibaca dengan ELISA  Reader 150nm, correction 540  nm/570 nm.
Prosedur Pemeriksaan TNF α pada jaringan plasenta dengan ELISA Kit
Sebelum  jaringan  plasenta  diperiksa dengan teknik ELISA, jaringan plasenta harus dihomogenizer dulu di Laboratorium Biokimia. Pertama dibuat larutan TBS (Trizma Base Solution) dari Trizma Base 50 mM, Na Cl 0,2  M  dan  aquades  1000mL  dengan  Ph  7,4. Kemudian ditimbang Trizma Base dan Na CL sesuai kebutuhan, dimasukkan dalam tabung valcon  50  cc,  ditambahkan  aquades  20  mL. Kemudian  disentrifuse  dan  diukur  pHnya, kalau  Ph  masih  tinggi  ditambahkan  HCl, disentrifuse  lagi  sampai  pH  mencapai  7,4. Selanjutnya diambil TBS 10 mL, 0,05 Triton X dan  1  tablet  protease,  disentrifuse  sampai larut  dan  tercampur  sempurna.  Jaringan plasenta  yang  akan  digerus  dipersiapkan. Tiga  jaringan  plasenta,  1mL  TBS,  0,05  Triton X  dan  1  tablet  protease  dimasukkan  dalam appendof. Hasil gerusan dibawa ke Laboratorium  Biokimia  untuk  disonikasi dengan  alat  sonikator  panjang  frekuensi  400 Hz,  selama  10  menit  supaya  jaringan homogen. Hasil sonikaasi dibawa ke
Laboratorium
Biomedik, selanjutnya disentrifuse  untuk  persiapan  pemeriksaan TNF α pada jaringan plasenta dengan teknik ELISA.  Selanjutnya  prosedur  pemeriksaan TNF  α  pada  jaringan  plasenta  teknik  ELISA sama  dengan  pemeriksaan  TNF  α  pada plasma.

## HASIL PENELITIAN Hasil Pembuntingan Mencit
Penelitian  dilakukan  di  Laboratorium Parasitologi  dan  Laboratorium  Biomedik Fakultas  Kedokteran  Universitas  Brawijaya, mulai  bulan  Desember  2012  sampai  dengan bulan  April  2013.  Penelitian  dimulai  dengan pemeliharaan mencit,  pembuntingan mencit, inokulasi  mencit  bunting  kelompok  studi
dengan Plasmodium  berghei pada  hari  ke  9 kebuntingan  dan  pembedahan  mencit  yang dilakukan pada hari ke 18 kebuntingan.
Mencit yang digunakan adalah mencit galur  Balb/C  yang  didapat  dari  Universitas Gajah  Mada  Yogyakarta  sebanyak  100  ekor mencit,  terdiri  dari  50  ekor  mencit  betina yang  belum  pernah  bunting  dan  50  ekor mencit jantan. Tiga puluh  ekor mencit betina dipersiapkan  untuk  pembuntingan  dan diinfeksi Plasmodium  berghei atau  sebagai kelompok  perlakuan  dan  20  ekor  mencit dipersiapkan  untuk  pembuntingan  tanpa diinfeksi Plasmodium berghei sebagai kelompok  kontrol.  Dari  30  ekor  mencit  yang dipersiapkan  sebagai  kelompok  perlakuan , ada  8  ekor  mencit  yang  berhasil  bunting, sedangkan  dari  20  ekor  mencit  dipersiapkan untuk  kelompok  kontrol  hanya  2  ekor  yang mengalami  kebuntingan.    Sejak  kebuntingan hari pertama, setiap hari dilakukan penimbangan berat badan dan pada hari ke 9 kebuntingan,  mencit  bunting  kelompok perlakuan  diinfeksi Plasmodium  berghei . Penghitungan  derajat  parasitemia  pada mencit bunting kelompok perlakuan dilakukan setiap hari. Pada hari ke 16 dan 17 kebuntingan,  2  ekor  mencit  kelompok perlakuan mengalami perdarahan pervaginam yang berlanjut kematian sehingga mencit kelompok perlakuan tinggal 6  ekor.  Pembedahan  mencit  kelompok kontrol  dan  perlakuan  dilakukan  pada  hari ke  18  kebuntingan. Pada  pembedahan dilakukan  pengambilan  darah  dari  jantung untuk pemeriksaan kadar Hb dan kadar TNF α plasma, dan pengambilan jaringan plasenta dan  janin  untuk  pemeriksaan  kadar  TNF  α jaringan plasenta dan penimbangan janin.
Untuk  melengkapi  jumlah  sampel pada  kelompok  kontrol  dan  kelompok perlakuan  dilakukan  pembuntingan  kedua pada  mencit  yang  tidak  berhasil  bunting pada  pembuntingan  pertama  (40  ekor)  dan akhirnya  didapatkan  9  ekor  mencit  berhasil bunting  yang  kemudian  dikelompokan  3 ekor  untuk  kelompok  perlakuan  dan  6  ekor untuk  kelompok  kontrol  sehingga  akhirnya
pada  penelitian  ini    jumlah  sampel  pada kelompok  perlakuan  ada  9  ekor  dan  jumlah sampel pada kelompok kontrol ada 8 ekor. Kadar TNF α pada plasma
Hasil laboratorium pemeriksaan kadar  TNF  α  dengan  teknik  ELISA  pada plasma  kelompok  studi  dan  kelompok kontrol  dapat dilihat pada tabel 5.1 Tabel  5.1  Kadar  TNF  α  plasma  pada kelompok  studi  dan  kelompok  kontrol dengan uji T
No  Variabel Mean p- value KS KK 1 Rata-rata kadar TNF α plasma 137,1706  39,0524  0,000
Karena  nilai  p=0,000,  maka  dapat  diambil kesimpulan bahwa terdapat perbedaan kadar TNF α plasma antara kelompok studi dengan kelompok  kontrol,  dimana  kadar  TNF  α plasma  pada  kelompok  studi  lebih  tinggi daripada kelompok kontrol.
Data  kadar  TNF  α  plasma  pada  kelompok studi  dan  kelompok  kontrol  dapat  dilihat pada diagram boxspot berikut :
Gambar 5.1 Data kadar TNF α plasma pada kelompok  studi  dan  kelompok  kontrol menggunakan  boxspot .  Sebaran  data  antara kelompok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan terdapat  perbedaan  yang  bermakna  diantara kedua  kelompok.  Pada  kelompok  perlakuan, rentang  data  lebar  dan  median  diatas  /  lebih besar dari nilai kelompok kontrol.

## Kadar TNF α pada jaringan plasenta
Hasil  pemeriksaan  kadar  TNF  α dengan  teknik  ELISA  pada  jaringan  plasenta dapat dilihat pada tabel 5.2.
Tabel  5.2  Kadar  TNF  α  jaringan  pada kelompok  studi  dan  kelompok  kontrol dengan uji T
No  Variabel Mean p- value KS KK 1 Rata-rata kadar TNF α jaringan 111,2361  83,0988  0,034
Karena  nilai  p=0,034,  maka  dapat  diambil kesimpulan bahwa terdapat perbedaan kadar TNF  α  jaringan antara  kelompok  studi dengan  kelompok  kontrol,  dimana  kadar TNF  α  jaringan  pada  kelompok  studi  lebih tinggi daripada kelompok kontrol.
Data  kadar  TNF  α  jaringan  pada  kelompok studi  dan  kelompok  kontrol  dapat  dilihat pada diagram boxspot berikut :
Gambar 5.2 Data kadar TNF α jaringan pada kelompok  studi  dan  kelompok  kontrol menggunakan  boxspot .  Sebaran  data  antara kelompok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan terdapat  perbedaan  yang  bermakna  diantara kedua  kelompok.  Pada  kelompok  perlakuan, rentang  data  lebar  dan  median  diatas  /  lebih besar dari nilai kelompok kontrol.
Kadar  Hemoglobin  pada  Mencit  Bunting yang Diinfeksi Plasmodium berghei . Hasil  pemeriksaan  Hemoglobin  (Hb) dapat dilihat pada tabel 5.3
Tabel  5.3  Kadar  Hb  pada  kelompok  studi dan kelompok kontrol dengan uji T
No  Variabel Mean p- value KS KK 1 Rata-rata kadar Hb 10,6889  13,0125  0,025
treatment control Group 300.0000 250.0000 200.0000 150.0000 100.0000 50.0000 0.0000 Pl asm a TNF Cases weighted by Group treatment control Group 160.0000 140.0000 120.0000 100.0000 80.0000 60.0000 40.0000 Tissu e TNF Cases weighted by Group
Karena  nilai  p=0,025,  maka  dapat  diambil kesimpulan bahwa terdapat perbedaan kadar Hb antara kelompok studi dengan kelompok kontrol,  dimana  kadar  Hb  pada  kelompok studi  lebih  rendah  daripada  kelompok kontrol.
Data  kadar  Hb  pada  kelompok  studi  dan kelompok kontrol dapat dilihat pada diagram boxspot berikut :
Gambar  5.3  Data  kadar  Hb  pada  kelompok studi  dan  kelompok  kontrol  menggunakan boxspot .  Sebaran  data  antara  kelompok kontrol  dan  kelompok  perlakuan  terdapat perbedaan  yang  bermakna  diantara  kedua kelompok. Pada kelompok perlakuan, rentang  data  lebih  kecil  dan  median  diatas  / lebih kecil dari nilai kelompok kontrol.

## Berat Badan Lahir
Hasil  berat  badan  lahir  dapat  dilihat  pada tabel 5.4
Tabel  5.4  Berat  badan  lahir  pada  kelompok studi dan kelompok kontrol dengan uji T
No  Variabel Mean p- value KS KK 1 Rata-rata berat badan lahir 0,6299  0,9392  0,001
Karena  nilai  p=0,001,  maka  dapat  diambil kesimpulan  bahwa  terdapat  perbedaan  berat badan  lahir antara  kelompok  studi  dengan kelompok  kontrol,  dimana  berat  badan  lahir pada  kelompok  studi  lebih  rendah  daripada kelompok kontrol.
Data  berat  badan  lahir  pada  kelompok  studi dan  kelompok  kontrol  dapat  dilihat  pada diagram boxspot berikut :
Gambar  5.4  Data  berat  badan  lahir  pada kelompok  studi  dan  kelompok  kontrol menggunakan  boxspot .  Sebaran  data  antara kelompok  kontrol  dan  kelompok  perlakuan terdapat  perbedaan  yang  bermakna  diantara kedua  kelompok.  Pada  kelompok  perlakuan, rentang  data  lebih  kecil  dan  median  diatas  / lebih kecil dari nilai kelompok kontrol.
Hubungan  antara  kadar  TNF-α  plasma  dan plasenta  dengan  Berat  Badan  Lahir  dan kadar Hb
Dari  data  hasil  penelitian  yang dianalisis dengan Pearson Correlations dengan memakai  nilai  kepercayaan  p  =  0,05,  maka hubungan  antara  kadar  TNF-α  plasma dengan  Berat  Badan  Lahir  Rendah  memiliki nilai  yang  tidak  bermakna  (p=0,380;  r=- 0,334),  begitu  pula  hubungan  antara  kadar TNF-α  jaringan  dengan  Berat  Badan  Lahir Rendah  memiliki  nilai  yang  tidak  bermakna (p=0,365; r=0.344).
Sebaliknya  hubungan  antara  kadar TNF-α  plasma  dengan  kadar  hemoglobin (Hb)  mempunyai  nilai  yang  bermakna (p=0,020; r=-0,748).
treatment control Group 16.0000 14.0000 12.0000 10.0000 8.0000 6.0000 H b Le ve l Cases weighted by Group control treatment Group 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 LBW Cases weighted by Group
Gambar  5.5  Korelasi  TNF  plasma  dengan kadar  Hb. Sebaran  data  menunjukkan semakin  tinggi  kadar  TNF-α  plasma,  maka semakin rendah kadar Hb.
Hubungan  antara  kadar  Hb  dengan  Berat Badan Lahir
Dari  data  hasil  penelitian  yang dianalisis dengan Pearson Correlations dengan memakai  nilai  kepercayaan  p  =  0,05,  maka hubungan  antara  kadar  Hb  dengan  Berat Badan  Lahir  Rendah  memiliki  nilai  yang tidak bermakna (p=0,774;r=0,112).

## PEMBAHASAN
Peningkatan  kadar Tumor  Necrosis  Factor Alpha (TNF-α)
Peningkatan kadar TNF-α plasma dan jaringan  plasenta  pada  mencit  bunting  yang diinfeksi Plasmodium  berghei dibuktikan dengan  nilai  yang  lebih  tinggi  pada kelompok perlakuan dibandingkan kelompok  kontrol  (tabel  5.1  dan  tabel  5.2). Analisis hasil statistik menggunakan uji beda dengan  T  test,  menunjukkan  bahwa  infeksi Plasmodium  berghei dapat  menyebabkan peningkatan  kadar  TNF  α  baik  pada  plasma maupun  pada  jaringan  plasenta  (p=0.000; p=0.034).
Peningkatan  kadar  TNF-α  terjadi pada manusia yang terkena infeksi, termasuk pada  manusia  yang  terkena  infeksi  malaria, tanpa  terkecuali  terlebih  pada  wanita  hamil. Selama  infeksi  malaria,  Interferon  gamma (IFN-γ) yang dihasilkan oleh sel limfosit yang teraktivasi  akan  mengaktifkan  makrofag untuk  menghasilkan  TNF-α. Tumor  Necrosis Factor Alpha  ( TNF-α)  adalah  suatu  sitokin yang  bersifat  pirogen,  multifungsi  yang
diproduksi oleh makrofag, sel T, sel B dan sel mast,  yang  terlibat  dalam immunoprotection terhadap  infeksi,  tetapi  juga  berperan  dalam peradangan,  autoimun  dan  patofisiologi banyak  penyakit  (Rogerson et  al. ,    2003 c ; Poovassery,  2009 ). Pada kadar  rendah,  dapat menghambat  pertumbuhan  stadium  darah parasit  dengan  mengaktifkan  sistim  imun seluler,  dan  juga  dapat  membunuh  parasit secara  langsung  namun  aktifitasnya  lemah. Tetapi pada kadar berlebihan, yang merupakan tanggapan terhadap hiperparasitemia  dan  pertumbuhan  parasit yang berlebihan, akan menyebabkan kerusakan  jaringan  yang  sangat  berat  dan fatal (Irawati, 2008).
Selama  tahap  infeksi  malaria,  TNF-α dikaitkan  dengan  splenomegali,  penurunan berat  badan,  dan  anemia.  Pada  manusia, TNF-α  berlebihan  dikaitkan  dengan  malaria serebral  dan  demam  malaria,  sedangkan rasio TNF-α dalam plasma dikaitkan dengan anemia pada anak-anak (Abrams, 2005 ). Wanita hamil, terutama primigravida, lebih rentan terhadap infeksi malaria (Achidi, 2005).  Selama  kehamilan  terkait  malaria ( Placental  Associated  Malaria )  terjadi  adhesi eritrosit  yang  terinfeksi P.  falciparum pada sinsitiotrofoblas menyebabkan adanya parasit dalam  ruang  intervili.  Hal  ini  disebabkan karena parasit yang terinfeksi parasit melekat khusus pada Chondroitin Sulfat-A (CSA) yang diekspresikan pada sinsitiotrofoblas.
Perlekatan
P.falciparum di plasenta menyebabkan  ketidakseimbangan    respon imun  dengan  peningkatan  jenis  sitokin  Th1 seperti IFN-ү dan TNF-α (Irawati, 2008), yang menjelaskan  mengapa  immunomodulation lebih  penting  di  plasenta  daripada  dalam darah  perifer  (Suguitan et  al. ,  2004;  Diouf et al ., 2007).
Pada  wanita  hamil  yang  menderita malaria  terdapat  kenaikan  TNF-α,  IL-1  dan IL-8  yang  sangat  nyata  pada  jaringan plasenta  dibandingkan  wanita  hamil  yang tidak  menderita  malaria.  Sitokin-sitokin tersebut  terutama  dihasilkan  oleh  makrofag
14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 HB level (gr/dl) 270.00 240.00 210.00 180.00 150.00 120.00 90.00 Pl asm a TNF al pha ( pg/m L) R Sq Linear = 0.56
akibat  induksi  hemozoin  yang  terdapat  di plasenta (Baratawidjaja & Rengganis, 2009).

## Penurunan Kadar Hemoglobin (Hb)
Menurut  definisi  WHO,  anemi  pada kehamilan  pada  manusia  adalah  ringan  bila kadar hemoglobin  (Hb) 10,0-10,9g/dl, sedang bila 8,0-9,9 g/dl dan berat bila < 8g/dl (Achidi et  al. ,  2005;  Ouma et  al., 2007;  Taseer,  2011; Getachew, 2012). Kriteria anemi pada mencit jika  kadar  hemoglobin  (Hb)  <  14g/dl (Rahardjo, 2011; Koponska, 2012).
Penurunan  kadar  Hb  pada  mencit bunting  yang  terinfeksi Plasmodium  berghei dibuktikan  dengan  nilai  yang  lebih  tinggi, dapat  dilihat  pada  tabel  5.3  dan  tabel  5.4. Analisis hasil statistik menggunakan uji beda dengan  T  test,  menunjukkan  bahwa  infeksi Plasmodium  berghei dapat  menyebabkan penurunan  kadar  Hb  (p=0,025).  Penurunan kadar  Hb  dapat  menyebabkan  anemi,  anemi dapat  terjadi  pada  ibu  hamil  dengan  infeksi malaria. Infeksi  malaria  akan  menyebabkan lisis  sel  darah  merah  yang  mengandung parasit  sehingga  akan  menyebabkan  anemi (Rogerson et al. , 2003 b ; Rogerson SJ. 2007 b ). Luasnya  kerusakan  eritrosit  tergantung pada  lama  dan  beratnya  infeksi.  Hemolisis sering  mengarah  pada  peningkatan  bilirubin serum  dan  pada  malaria  falciparum  dapat sedemikian parahnya sehingga menimbulkan hemoglobinuria  ( Black  Water  Fever ).  Pada setiap  infeksi  malaria,  derajat  anemia disebabkan  oleh  penghancuran  sel-sel  oleh parasit. Perubahan-perubahan otogenik pada eritrosit oleh parasit kemungkinan menimbulkan  hemolisis  dan  peningkatan flagilitas  osmotis  terjadi  dalam  semua eritrosit  baik  yang  terinfeksi  maupun  tidak. Hemolisis  juga  dapat  ditimbulkan  oleh primakuin  pada  penderita  dengan  defisiensi Glukosa-6  fosfat  dehidrogenase  herediter (Ouma, 2007).
Plasmodium  vivax dapat  meningkatkan kelainan hematologi berat seperti anemia dan trombositopenia, serta keguguran dan kelahiran  prematur.  Anemia  berat  dan trombositopenia  yang  disebabkan  oleh P.
vivax atau  infeksi P.  falciparum dapat menyebabkan  diatesis  perdarahan  yang disebabkan  oleh  hemolisis,  pengurangan deformitas  eritrosit,  peningkatan spleenic clearence ,  serta  pengurangan   dan  penurunan kelangsungan  hidup  platelet  (Rodriguez, 2006).
Gregor  (1984)  mendapatkan  data  bahwa penurunan kadar Hb dalam darah hubungannya  dengan  parasitemia,  terbesar terjadi  pada  primigravida  yang  terinfeksi malaria  dan  berkurang  sesuai  dengan penyusunan peningkatan paritas.
Hubungan  Peningkatan  kadar  TNF  α dengan penurunan kadar Hb.
Hubungan  Peningkatan  kadar  TNF  α plasma  dan  jaringan  plasenta  pada  mencit bunting  yang  diinfeksi Plasmodium  berghei dengan  penurunan  kadar  Hb  dapat  dilihat pada  tabel  5.5.  Analisis  hasil  statistik menggunakan  uji  korelasi  dengan Pearson Correlations , menunjukkan nilai yang bermakna  untuk  peningkatan  kadar  TNF  α pada  plasma  terhadap  penurunan  Hb (p=0,020; r=- 0,748), sedangkan pada jaringan plasenta  analisis  hasil  statistik  menggunakan uji  korelasi  dengan Pearson  Correlations , menunjukkan  nilai  yang  tidak  bermakna (p=0,337; r=-0.363)
Pada  daerah  endemis  malaria,  infeksi malaria selama kehamilan merupakan sumber kedua dari anemia ibu, hal ini karena infeksi malaria dapat meningkatkan penghancuran sel darah merah dan penurunan  eritropoiesis.  Efek  ini  dapat dimediasi  sebagian  oleh  peningkatan  pada sitokin  proinflamasi  seperti  TNF-α,  yang terkait  dengan  anemia  ibu  hamil  yang terinfeksi  malaria  (Abrams,  2005  ;  Rogerson, 2007 b ; Clark, 2006).

## Hubungan antara Peningkatan kadar TNF α dengan Berat Badan Lahir
Hubungan  peningkatan  kadar  TNF  α pada plasma dan pada jaringan plasenta yang terinfeksi Plasmodium  berghei dengan  Berat Badan  Lahir    dapat  dilihat  pada  tabel  5.5.
Pada  hasil  penelitian,  data  berat  janin  dapat dilihat  pada  tabel  5.4,  yang  menunjukkan bahwa  mencit  bunting  yang  terinfeksi Plasmodium berghei mempunyai berat janin < 1 gram.  Analisis  statistik  menggunakan  uji korelasi dengan Pearson Correlations , menunjukkan bahwa hubungan antara kadar TNF  α  plasma  dengan  berat  badan  lahir mempunyai  nilai  yang  tidak  bermakna (p=0,380,  r=-0,334),  demikian  pula  hubungan antara  kadar  TNF  α  jaringan  dengan  berat badan  lahir  mempunyai  nilai  yang  tidak bermakna  (p=0,365,  r=0,344). Hal  ini  terjadi mungkin karena imunologi yang prima pada janin,  seperti  beberapa  peneliti  melaporkan bahwa  janin  menghasilkan  proinflamasi sitokin setelah ibu terpapar antigen malaria(Abrams, 2005).
Pada malaria plasenta, TNF-α dikaitkan  dengan  respon  inflamasi  lokal  dan berat  badan  lahir  rendah  (Poovassery.  2009). Penelitian  sebelumnya  menyatakan  bahwa peningkatan ekspresi  sitokin  plasenta seperti tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin 8, g- interferon, IL-6 dan IL-10 terjadi di kehamilan dengan  malaria,  namun  hanya  TNF-α  yang terkait  dengan  BBLR  (Rogerson et  al. ,  2003 c ; Ayoola et al., 2012).
Dalam  studi  yang  berhubungan dengan  perubahan  sitokin  plasenta  yang merugikan  kehamilan,  telah  ditemukan hubungan antara kadar TNF-α dan berat bayi lahir  rendah,  termasuk  berat  bayi  lahir rendah  yang  disebabkan  oleh  terhambatnya pertumbuhan  janin  dan  kelahiran  prematur. Peningkatan  kadar  TNF-α  berhubungan dengan
abortus spontan
tetapi mekanismenya belum bisa dijelaskan.
Tingginya  kadar  TNF-α  dikaitkan  dengan terhambatnya pertumbuhan janin dan kelahiran prematur, terhambatnya pertumbuhan janin akibat dari infeksi kronis, sedangkan  kelahiran  prematur  dikaitkan dengan  tingginya  parasitemi  pada  plasenta (Fried, 1998; Rogerson, 2007 a ).

## KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
Kesimpulan dari penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Infeksi Plasmodium  berghei pada  mencit bunting dapat menyebabkan peningkatan kadar TNF α.
2. Infeksi Plasmodium  berghei pada  mencit bunting  dapat  menyebabkan  penurunan kadar Hb.
3. Terdapat  hubungan  antara  peningkatan kadar  TNF  α  dan  penurunan  kadar  Hb pada  mencit  bunting  yang  diinfeksi Plasmodium berghei .
4. Tidak terdapat hubungan antara peningkatan  kadar  TNF  α  dengan  Berat Badan  Lahir  pada  mencit  bunting  yang diinfeksi Plasmodium berghei .

## 7.2 Saran
Saran  dari  penelitian  ini  adalah  jumlah sample  yang  digunakan  sebaiknya  bisa  lebih banyak,  agar  data  dapat  lebih  mudah dianalisis dengan analisis statistik.

## DAFTAR PUSTAKA
Abrams  ET.  2005. Malaria  During  Pregnancy and  Foetal  Haemological      Status  in Blantyre Malawi. Malaria Journal. 4 (39):1-
8
Achidi  EA,  Kuoh  AJ,  Minang  JT. Et  al. 2005. Malaria  Infection  in  Pregnancy  and  Its Effects  on  Hemoglobin  Levels  in  Women from  a  Malaria  Endemic  Area  of  Feko Division  South  West  Province,  Cameroon. Journal  of  Obstetrics  and  Gynaecology.
25 (3):235-240
Achmad DS. 2000. Ilmu Gizi dan Profesi . Jilid I. Jakarta, Dian Rakyat
Anya  SE.  2004. Seasonal  Variation  in  the  Risk and  Causes  of  Maternal  Death  in  The Gambia  Malaria  Appears  to  be  an Important Factor . Am. J. Trop. Med. Hyg. 70 (5):510-513
Ayoola  OO,  Whatmore  A,  Balogun  WO, Jarret OO, Cruickshank JK, Clayton PE. 2012. Maternal  malaria  status  and metabolic profiles in pregnancy and in cord
blood  :  relationships  with  birth  size  in Nigerian infants. Malaria Journal. 11 :75 Baratawidjaja KG, Rengganis I. 2009.
Imunologi Dasar Edisi 8 . Jakarta. FK UI
Crawley J. 2004. Reducing the Burden of Anemia in  Infants  and  Young  Children  in  Malaria Endemic  Countries  of  Africa.  :  From Evidence  to  Action .  Am.  J.  Trop.  Med. Hyg, 71 (Suppl 2):25-34
Depkes RI. 2008 . Pedoman Pengendalian Kasus Malaria di Indonesia. Dirjen Pengendalian Penyakit dan Penyehatan Lingkungan
Desai  M,  Kuilo  FO,  Nosten  F.  2007.
Epidemiology  and  Burden  of  Malaria  in Pregnancy. 7 (93-104) Diouf I, Fievet N, Doucoure S, et al. 2007. IL- 12  producing  monocytes  and  IFN-ү  and TNF-α  producing  T-lymphocytes  are increased in placentas infected by Plasmodium falciparum. Journal of Reproductive Immunology. 74 :152-162 Erhabor O, Adias TC, Hart ML. 2010. Effects of Falciparum  Malaria  on  the  Indices  of Anemia  among  Pregnant  Women  in  the Niger De ta of Nigeria. Journal of Clinical Medicine and Research. 2 (3):35-41
Fried  M,  Muga  RO,  Misore  AO,  Duffy  PE. 1998. Malaria  Elicits  type  1  Cytokines  in the  Human  PlacentaI  IFN- ƴ and  TNF-α associated  with  Pregnancy  Outcomes. The Journal of Immunology. 160: 2523-30 Getachew  M,  Yewhalaw  D,  Tafess  K, Getachew Y, Zeynudin A. 2012. Anemia and  associated  risk  factors among  pregnant women in Gilgel Gibe dam area, Southwest Ethiopia. Parasites and Vectors. 5: 296 Guyatt HL, Snow RW. 2001. The Epidemiology
and Burden Plasmodium falciparum Related Anemi Among Pregnant Woman in Sub Sahara Africa. Am. J Trop. Med Hyg 64 (1,2):36-44
Hindraker  SG,  Isen  BEO,  Lie  RT, et  al .  2002.
Anemia  in  Pregnancy  in  Rural  Tanzania  : Associations  with  Micronutrients  Status and  Infections .  European  Journal  of
Clinical Nutrition 56 , 192-199
Irawati L, Acang N, Irawati N. 2008. Ekspresi
Tumor  Necrosis  Factor-Alfa  (TNF-α)  dan Inter Leukin-10(IL-10) pada Infeksi Malaria Falciparum. Majalah Kedokteran Andalas. 1 (32)
Kevenon, et all. 2010. Elevated Levels of Soluble TNF  Receptors  1  and  2  Correlate  with  P. falciparum Parasitemia in Pregnant Women Potensial  Markers  for  Malaria  Associated Inflamation . The Journal of Immunology,
185 :7115 - 7122
Moormann, et all. 1999. Malaria and Pregnancy
:  Placental  Cytokine  Expression  and  Its Relationship to Intrauterine Growth Retardation .  The  Journal  of  Infection Diseases, 180 :1987-93
Ouma P, Van Eijk AM, Hamel MJ. et al. 2007. Malaria  and  Anemia  among  pregnant women  at  first  antenatal  clinic  visit  in Kisumu, western Kenya. Tropical Medicine  and  International  Health.
12 (12):1515-1523
Poovassery J, Sarr D, Smith G, Nagy T, Moore
JM. 2009.
MalariaInduced Murine
Pregnancy Failure : Distinct Roles For IFN- ү  And  TNF. J.  Immunol.  2009. 183 (8):5342-5349
Rodriguez  AJ, et  al. 2006.  Short  Report  : Pregnancy  Outcomes  Associated  with Plasmodium Vivax Malaria in Northeastern Venezuela .  Am  J.  Trop.  Med.  Hyg.
74 (5):755-757
Rogerson  SJ,  Hviid  L,  Duffy  PE,  Leke  RFG, Taylor DW. 2007 a. Malaria in Pregnancy : Pathogenesis and Immunity. Lancet Infect Dis. 7 :105-17 Rogerson  SJ.  2007 b . Malaria  in  Pregnancy  : Linking  immunity  and  Pathogenesis  to prevention. Am.  J.  Trop.  Med.  Hyg. 77 (6):14-22
Rogerson SJ, Mkundika P, Kanjala MK. 2003 a . Diagnosis  of  Plasmodium  falciparum Malaria  at  Delivery:  Comparison  of  Blood Film  Preparation  Methods  and  of  Blood Films  with  Histology. J.  Clin.  Microbiol.
41 (4):1370-1374
Rogerson  SJ,  Dollina  E,  Getachew  A, et  al . 2003 b . Placental  Monocyte  Infiltrates  in
Respons to Plasmodium falciparum Malaria Infection  and  Their  Association  With Adverse  Pregnancy  Outcomes. Am.  J. Trop. Hyg, 68 (1):115-119 Rogerson SJ, Brown HC, Pollina E, et al . 2003 c . Placental Tumor Necrosis Factor Alpha but
Not  Gamma  Interferon  Is  Associated  With Placental Malaria and Low Birth Weight in Malawian Women. Infection and Immunity, 71 (1):267-270
Singh B, Lee, Asmad, et al . 2004. A Large Focus of Naturally Acquired Plasmodium knowlesi  Infections  in  Human  Being .  The Lancet Vol. 363(1017-1024)
Singh  N,  Shukla  MM,  Sharma  VP.  1999.
Epidemiology  of  Malaria  in  Pregnancy  in Central  India. Bulletin  of  World  Health
Organization. 77 (7)
Suguitan  AL,  Gowda  DC,  Fouda  G, et  al.
2004 .  Lack  of  an  Association  between
Antibodies  to  Plasmodium  falciparum Glycosylphosphatidylinositols and Malaria- Associated Placental Changes in Cameroonian  Women  with  Preterm  and
Full-Term  Deliveries. Infection  and
Immunity. 72 (9):5267-5273\
Taseer IH, Safdar S, Mirbahar A, Awan Zara. 2011. Anemia  in  pregnancy  ;  Related  Risk
Factors in under developed area.
Professional Med J. 18 (1):1-4
Uneke CJ. 2007 . Impact of Placental Plasmodium
falsiparum Malaria Pregnancy and Perinatal  Outcome  in  Sub  Saharan  Africa.
Yale J.Biomol. Med. 80 (3):95-103