## PENDAHULUAN
Potensi kekayaan alam ikan hias Indonesia telah diakui secara internasional baik tawar maupun laut. Kekayaan keanekaragaman hayati ini semestinya menjadi kekuatan komperatif di berbagai sektor pembangunan ekonomi. Keanekaragaman hayati yang meliputi keanekaragaman
ekosistem, keanekaragaman jenis, dan keanekaragaman jenis inilah merupakan potensi yang perlu dimanfaatkan secara  berkelanjutan.  Seiring  dengan  kemajuan  ilmu pengetahuan  dan  teknologi  terutama  dengan  per- kembangan  ilmu  genetika  dan  bioteknologi  modern, sumberdaya  hayati  telah  dapat  digunakan  untuk menghasilkan sumber-sumber baru senyawa kimia, gen, varietas, dan produk bioteknologi lainnya baik untuk tujuan  ilmiah  maupun  komersial.  Pemanfaatan  ke- anekaragaman hayati melalui bioteknologi modern atau yang dikenal sebagai rekayasa genetika memberi peluang untuk menunjang produksi pertanian, ketahanan pangan, dan peningkatan kualitas hidup manusia.
Beberapa  puluh  pangan  transgenik  saat  ini  telah beredar di pasaran. Para pakar rDNA telah mampu me- motong  atau mencopot  suatu  gen yang  dikehendaki, dari individu hidup apa saja ke individu yang lain. Di bidang  akuakultur,  telah  dilakukan  beberapa  metode transgenik antara lain penggunaan vektor yang dinamakan replication-defective pantropic retroviral untuk menginfeksi sel lines ikan,  kadal air, kodok, dan  nyamuk. Metode alternatif lainnya adalah transfer gen dengan bantuan sel. Teknik  ini  merupakan  pengembangan  dari  metode mikroinjeksi,  dengan  pertimbangan  bahwa  untuk menghasilkan  ikan  transgenik  membutuhkan  banyak waktu, biaya, fasilitas, dan tenaga. Teknik ini telah berhasil diaplikasikan ke ikan rainbow trout dengan menggunakan sel bakal gonad yang membawa gen GFP. Namun demikian teknik ini masih memerlukan penelitian lebih lanjut untuk dapat diaplikasikan pada spesies ikan lainnya (Alimuddin et al., 2003).
Pada bidang akuakultur teknologi rekyasa genetika yang selama ini telah banyak digunakan untuk ikan-ikan konsumsi (salmon, nila, udang, patin, mas) ini berguna untuk meningkatkan laju pertumbuhan ikan, mengatur kematangan  gonad,  diferensiasi  seks  dan  sterilitas; meningkatkan resistensi terhadap patogen, mengadaptasi ikan terhadap lingkungan baru (freeze resistance), merubah karakteristik biokimia dari daging ikan sehingga men- ciptakan rasa daging yang diinginkan, mengubah jalur

## PERKEMBANGAN REKAYASA GENETIKA DALAM BUDIDAYA IKAN HIAS DI INDONESIA

## Eni Kusrini
Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Ikan Hias Jl. Perikanan No. 13, Pancoran Mas, Depok 16436 E-mail:  ennyperikanan@yahoo.com

## ABSTRAK
Teknologi rekayasa genetika transgenesis telah digunakan sejak 1980 dan sekarang berkembang memproduksi  makhluk  hidup  dengan  fenotip yang diinginkan. Di bidang akuakultur, telah di- lakukan beberapa metode transgenik antara lain penggunaan vektor yang dinamakan replication- defective  pantropic  retroviral  (salah  satu  elemen vektor)  untuk  menginfeksi  sel  lines  ikan.  Per- kembangan riset transgenik yang dilakukan sudah sampai  tahapan  dapat  menghasilkan  generasi pertama (F-1) yang masih membutuhkan verifikasi untuk mendapatkan keturunan-keturunan trans- genik  homozigot  yang dapat  digunakan  untuk memproduksi massal ikan transgenik heterozigot hasil  perkawinan  dengan  ikan  normal. Teknik rekayasa  genetika  terus-menerus  mengalami perkembangan dan penyempurnaan dari metode- metode  sebelumnya.  Adapun  metode-metode yang telah berhasil diterapkan dalam teknologi transfer  gen  antara  lain  adalah  mikroinjeksi, elektroporasi,  dan  transfeksi.  Keberhasilan menghasilkan ikan hias transgenik melalui biologi molekuler dengan karakter keunggulan tertentu memberikan harapan baru dalam budidaya ikan khususnya dalam menunjang peningkatan kualitas warna dan bentuk. Meskipun rekayasa genetika bukan segala-galanya, karena adanya keterbatasan dalam menghasilkan ikan transgenik seperti badan yang bengkok, kepala bercabang, dan lain-lain.
KATA KUNCI: rekayasa genetika, metode trans- fer gen, promotor
metabolisme sehingga terjadi efisiensi pakan. Selanjutnya untuk ikan hias masih sedikit penelitian tentang rekayasa genetika tersebut. Target pada produksi ikan hias adalah berfokus pada penampilan baik bentuk, warna, maupun resisten penyakit.

## Keberhasilan Rekayasa Genetika Ikan
Sejak tahun 2006, Indonesia telah mulai melakukan penelitian dasar di bidang bioteknologi yang berkaitan dengan pembentukkan ikan transgenik. Sebagian besar institusi yang melakukan aktivitas penelitian transgenik tersebut adalah institusi pemerintah baik yang termasuk lembaga penelitian pemerintah di bawah Badan Litbang Kelautan dan Perikanan (BPPI Sukamandi untuk ikan patin dan mas, BPPBAT Bogor untuk GH ikan gurami, BPPBAP Maros untuk udang windu, BPPBIH Depok untuk ikan hias),  maupun  di  bawah  ditjen  teknis  yaitu  BBPBAT Sukabumi untuk mas dan lele, BBAP Situbondo untuk ikan kerapu) serta institusi riset di bawah koordinasi Menteri Negara Riset dan Teknologi seperti Badan Penerapan dan Pengkajian  Teknologi  (Bioteknologi  Serpong),  serta Perguruan Tinggi pemerintah (BDP-IPB).
Hingga  saat  ini  fokus  komoditas  yang  digunakan dalam  kegiatan  rekayasa  genetik  ikan  di  Indonesia meliputi jenis-jenis ikan air tawar sebagai berikut: ikan mas, nila, lele, patin, dan gurame. Untuk komoditas air ekosistem  payau  diwakili  oleh  udang  windu,  udang vaname, dan ikan kerapu. Secara umum perkembangan riset transgenik yang dilakukan sudah sampai tahapan dapat menghasilkan generasi pertama (F-1) yang masih membutuhkan verifikasi untuk mendapatkan keturunan- keturunan transgenik homozigot yang dapat digunakan untuk memproduksi massal ikan transgenik heterozigot hasil perkawinan dengan ikan normal. Dengan hasil yang diperoleh  sejalan  dengan  perkembangan  penelitian transgenik yang telah dilakukan di Indonesia, teknologi ini  telah  dikuasai  mulai  dari  aktivitas  isolasi  gen, pembuatan kontruksi gen, penyisipan gen asing ke dalam ikan target. Namun demikian keberhasilan dan pengujian produk sebagaimana yang diharapkan masih membutuh- kan pengujian lebih lanjut. Adapun gen-gen yang telah berhasil ditransfer pada ikan disajikan pada Tabel 1.
Karakter  genetik  yang  dapat  meningkatkan  laju pertumbuhan,  ketahanan  terhadap  suhu  dingin  dan penyakit, daya tahan terhadap gas oksigen terlarut rendah, dan efisiensi konversi pakan telah dicapai pada beberapa spesies ikan dan diintroduksikan terhadap ikan bernilai ekonomis penting sehingga menguntungkan. Di samping itu,  membuat  ikan  dengan  warna  berbeda  pada  ikan zebra dengan menggunakan gen GFP (Green fluoroscent
protein),  YFP  (Yellow  fluoroscent  protein),  dan  RFP  (Red fluoroscent protein) yang dapat terlihat pada kondisi cahaya biasa. Ikan zebra (Brachydanio rerio) biasanya berwarna perak  dengan  garis-garis  hitam  keunguan,  dengan teknologi transgenik dapat memendarkan warna hijau atau merah pada tubuhnya (Gambar1). Warna tersebut diambil dari warna ubur-ubur yang disuntikan ke telur ikan zebra. Ikan jenis ini sebenarnya dirancang sebagai detektor  adanya  racun-racun  yang  ada  di  alam.  Agar berfungsi  sebagai  indikator  polusi,  para  pakar  me- masukkan  gen  pemicu  yang  akan  mengaktifkan pancaran cahaya pada ikan apabila ikan berada dalam lingkungan  yang  mengandung  zat  tertentu.  Menurut penelitian yang dilakukan oleh Zhiyuan Gong dari National University of Singapure, sejauh ini ikan-ikan zebra atau yang lebih populer disebut goldfish hasil rekayasa tersebut tidak menimbulkan ancaman terhadap lingkungan. Ikan- ikan ini hanya memancarkan warna terang di bawah segala macam sinar, namun tidak akan mencemari lingkungan. Meskipun sebenarnya  ikan ini hanya  mempunyai dua macam warna tambahan, namun dapat dikembangkan menjadi lima warna yang berbeda, di mana masing-masing warna tersebut akan bersinar sesuai dengan jenis polutan yang dijumpai ikan (Blake, 2007).
Keberhasilan yang lain yaitu mentransfer gen hormon pertumbuhan  manusia  (hGH)  dengan  promoter  gen metallothionein mouse (mMT), ke dalam telur-telur ikan goldfish yang telah dibuahi. Selanjutnya rekayasa genetik juga dilakukan pada ikan-ikan medaka (Ozato et al., 1989), ikan catfish (Yan & Özgünen, 1993), crayfish dan zebrafish (Tsai, 2008). Perkembangan teknik transfer gen di ikan bermula dari penggunaan mikroinjeksi (Zhu et al., 1985). Perkembangan selanjutnya sampai tahun 1990, transgenik ikan telah dilakukan pada 13 jenis ikan yaitu atlantic salmon, common carp, goldfish, loach, medaka, mud carp, northern pike, rainbow trout, silver crucian, nile tilapia, wuchang fish, dan zebra fish (Chen, 1994). Penelitian
Tabel 1. Gen-gen yang telah berhasil ditransfer ke ikan
Sumber:  Pinkert (1994)
Spesies
Konstruksi gen Daftar acuan Goldfish mMT/hGH Zhu et al.  (1985) Trout SV40/hGH Chourrout et al.  (1986) Cathfish mMT/hGH Dunham & Eash (1987) Salmon FAFP/fAFP Fletcher et al.  (1988) Loach mMT/hGH Benyumov et al.  (1989) Medaka FLus/fLuc Tamiya et al.  (1990) Pike RSV/bGH Guise et al.  (1991) Common carp mMT/hGH Hernandez et al.  (1993)
pendahuluan  terhadap  ikan  hias  di  Indonesia  telah dilakukan dengan menggunakan model ikan komet dan diinsersi dengan green fluorescent protein (GFP) sebagai target yang diinginkan (Gambar 2). Transfer gen hasil rekombinan yang telah dimurnikan diinsersikan ke dalam masing-masing telur ikan komet, yang merupakan tahapan selanjutnya dapat dilakukan dengan beberapa metode.

## Prinsip Dasar Transfer Gen
Teknologi transgenesis merupakan piranti yang sangat ampuh dalam menganalisis fungsi biologi molekuler dan dalam  menghasilkan  trait  (karakter)  penting  yang komersial  dalam  akuakultur  khususnya  ikan  hias. Teknologi  transgenesis  adalah  suatu  proses  meng- introduksikan DNA eksogenous atau DNA asing ke hewan uji dengan tujuan untuk memanipulasi struktur genetiknya
(Glick & Pasternak, 2003). Secara umum prinsip dasar transfer gen digambarkan dalam diagram pada Gambar 3. Adapun  prinsip  dasar  teknik  memproduksi  ikan transgenik didasarkan kepada beberapa tahapan yaitu:
1. Penentuan ikan spesies; menurut Ozato et al. (1994), menyarankan penggunaan jenis ikan “model” sangat perlu untuk kepentingan pengembangan penelitian. Ikan yang digunakan mempunyai karakteristik ideal di antaranya; siklus hidup dan reproduksi pendek, dalam  satu  tahun  dapat  memijah  beberapa  kali; produksi telur, dan sperma ikan banyak.
2. Menyiapkan spesifik gen dengan spesifik produk dari gen tersebut yang diinginkan.
3. Isolasi DNA yang mengandung gen target atau gen of interest (GOI).
Gambar 1. Ikan zebra berpendar hijau hasil rekayasa genetika
Gambar 2. Ikan komet  sebelum diinsersi GFP (kiri)  dan turunan F-1 ikan  transgenik GFP (kanan) foto  di bawah mikroskop  flouresen
4. Isolasi plasmid DNA bakteri yang akan digunakan sebagai vector.
5. Manipulasi sekuen DNA melalui penyelipan DNA ke dalam vektor. (a) pemotongan DNA menggunakan enzim restriksi endonuklease. (b) penyambungan ke vektor menggunakan DNA ligase.
6. Transformasi ke sel mikroorganisme inang
7. Pengklonan sel-sel dan gen asing.
8. Identifikasi  sel  inang  yang  mengandung  DNA rekombinan yang diinginkan.
9. Penyimpanan gen hasil klon dalam perpustakaan DNA.
10. Memasukkan (mentransfer) perbanyakan gen hasil rekombinan  yang  telah  dimurnikan  tersebut  ke dalam masing-masing telur atau sperma ikan yang dipilih sebagai ikan transgenik.
11. Pembuahan buatan dengan menggabungkan telur dan sperma tersebut pada wadah tertentu dalam media air.

## Metode Transfer Gen
Sejak ditemukannya struktur DNA oleh Watson & Crick pada  tahun  1953,  kemudian  mulai  berkembanglah teknologi rekayasa genetika pada tahun 1970-an dengan tujuan  untuk  membantu  menciptakan  produk  dan organisme baru yang bermanfaat. Sejarah membuktikan bahwa  teknik  rekayasa  genetika  terus-menerus mengalami  perkembangan  dan  penyempurnaan  dari metode-metode sebelumnya. Adapun metode-metode
yang telah berhasil diterapkan dalam teknologi transfer gen antara lain adalah:

## Mikroinjeksi
Telur yang telah dibuahi dalam beberapa saat (sesuai perkembangan telur untuk setiap jenis ikan, umumnya pada saat perkembangan 2 sampai 4 sel, dilakukan trans- fer  gen  menggunakan  mikroinjeksi.  Penyuntikan  gen berikut promoter dapat dilakukan ke dalam inti zigot atau  sitoplasma.  Sesungguhnya  pada  telur  ikan, penyuntikan gen ke dalam inti zigot menunjukkan hasil yang lebih baik dibanding penyuntikan gen ke dalam sitoplasma. Akan tetapi inti zigot sangat kecil dan sangat tidak mungkin terlihat, sehingga gen selalu disuntikkan ke dalam sitoplasma dekat dengan inti. Kemudian setelah itu,  di  dalam  inti,  gen  diharapkan  mengalami  peng- gabungan (integration) ke dalam salah satu kromosom. Penggabungan ini merupakan hal yang penting karena dengan terjadinya hal ini gen dapat diturunkan dari ikan transgenik  kepada  turunannya.  Transfer  gen  melalui teknik  mikroinjeksi  mempunyai  banyak  kelemahan, karena teknik membutuhkan keterampilan yang tinggi. Efek  dari  teknik  ini  telur  yang  sedang  diperlakukan terganggu sehingga tingkat keberhasilan kecil. Selain itu, hasil  yang  didapatkan  tidak  bisa  banyak,  mengingat pengerjaan  yang  manual  satu  per  satu  telur  pada pembelahan satu sel diinjeksi. Percobaan transfer gen GFP terhadap ikan komet melalui metode mikroinjeksi yang telah dicobakan di Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya  Ikan  Hias  belum  pernah  berhasil  sampai mendapatkan individu founder. Hal tersebut disebabkan
Gambar 3. Roadmap secara umum dasar-dasar transfer gen
Mikroinjeksi elektroporasi transfeksi Ekspresi sementara pada sperma atau telur Identifikasi transgenik F-0 pada sirip ekor Pembesaran transgenik F-0 Pemilihan induk, pemijahan, pengambilan telur dan sperma Perbanyakan konstruksi gen Identifikasi transgenik F-0 pada individu matang gonad Persilangan transgenik F-0 dengan non transgenik
banyaknya  kesulitan  dan  hambatan  seperti  yang dikemukakan oleh Khoo et al. (1992) dan Chen (1994):
1. Memasukkan jarum mikroinjeksi ke dalam mikropil
2. Jarum  mikroinjeksi  sulit  menembus  korion  telur komet yang agak keras
3. Perlu memindahkan cairan korion telur
4. Peralatan yang sangat mahal
5. Lambat dan cenderung menjemukan

## Elektroporasi
Elektroporasi adalah sebuah metode yang pertama kali dikembangkan  untuk  bekerja  dengan  sel-sel  dalam jaringan budaya dan menundukkan melibatkan sel untuk ledakan pendek impuls listrik. Keuntungan utama dari elektroporasi atas microinjection adalah bahwa ada tidak perlu menangani dan memanipulasi telur secara individual. Elektroporasi telah dicoba pada telur ikan, tetapi kesulitan adalah bahwa telur cukup besar dan memiliki korion. Prinsip metode ini adalah penggunaan secara singkat dan cepat rangsangan listrik untuk menembus membran sel, sehingga memungkinkan masuknya molekul DNA ke dalam embrio. Metode ini memberikan harapan keberhasilan transfer  gen  ikan  yang  digunakan.  Selain  praktis, memerlukan  waktu  yang  tidak  terlalu  lama,  dapat menggunakan telur maupun sperma sebagai vektornya. Chen (1994) mengemukakan metode ini pada ikan baru popular sekitar awal tahun 1990-an dan baru berhasil menghasilkan ikan transgenik pada tahun 1992, yang dilakukan oleh Lu pada ikan medaka dan Power pada ikan catfish, sedangkan metode ini dilakukan oleh Baekon tahun 2000. Selanjutnya metode ini dikembangkan dengan penggunaan sperma sebagai vector. Keberhasilan metode ini pertama kali dilakukan oleh Khoo et al. (1992) yaitu keberhasilan dalam penggunaan sperma ikan zebrafish (Brachydanio rerio), melalui pembuahan secara in vitro.

## Transfeksi
Metode transfer gen yang bertujuan untuk pengujian aktivitas  promoter  salah  satunya  dengan  metode transfeksi ke sel kultur (Kato et al., 2007). Pada metode ini yang diperlakukan adalah telur yang baru keluar dan sebelum terjadi pembelahan 1 sel. Sebagaimana metode transfer gen yang lain transfeksi ini juga diawali dengan isolasi plasmid konstruksi gen.
Teknik perlakuan metode tersebut pada umumnya mengacu pada protokol yang telah diuraikan pada bahan larutan transfeksi jetPEI (Polyplus Transfection) yang telah umum  digunakan.  Metode  transfeksi  lebih  cocok digunakan untuk ikan yang mempunyai ukuran telur kecil,
korion tipis dan daya tetas tinggi seperti halnya udang. Jumlah telur yang diaplikasikan pada metode tersebut relatif lebih besar, tergantung kemampuan dan keahlian dalam penyediaan telur dalam jumlah banyak dan waktunya singkat (Parenrengi, 2010).

## Karakterisasi  Ikan  Transgenik
Keberhasilan transfer gen atau penyisipan gen pada telur  maupun  sperma  ikan  tersebut  (ekspresi)  dapat diidentifikasi  mulai  dari  perkembangan  telur  dengan mikroskop  flouresen.  Tahapan  karakterisasi  terhadap ikan-ikan  hasil  transfer  gen  meliputi  beberapa  yang membutuhkan ketelitian, keterampilan, dan cukup banyak menyita waktu. Hal-hal yang diperlukan pada tahap ini adalah:
1. Identifikasi  individu  yang  diduga  berhasil  sebagai ikan transgenik.
2. Identifikasi  apakah  benar  telah  mengalami  peng- gabungan dengan genom ikan (host genom).
3. Identifikasi apakah sifat genetiknya diturunkan pada F-1 keturunannya.
4. Identifikasi ekspresi (kenampakan) dari produk gen tersebut secara fenotip apakah sesuai dengan yang diharapkan.
Identifikasi  penentuan  ikan  transgenik  dilakukan dengan  dot  blot  dan  shorthern  blot  hybridization  dari genomic  DNA.  Kemudian  identifikasi  tersebut  dikem- bangkan dengan menggunakan PCR, yang diambil dari jaringan  sirip.  Amplifikasi  PCR  dari  urutan  gen  yang ditransfer dan  analisis  Southern blot untuk  amplifikasi produk  dari  gen,  menghasilkan  analisis  yang  cukup sensitif dan cepat untuk dapat mendeteksi ribuan ikan yang diduga sebagai ikan transgenik. Untuk ekspresi gen yang  ditransfer  umumnya  dideterminasi  melalui pengukuran suatu produksi dari masing-masing mRNA melalui nothern RNA blot hybridization, RNA protein assay atau RT-PCR atau mengukur masing-masing produk gen melalui immunichemical (Subagyo, 2000). Secara umum yang sering digunakan adalah immunochemical seperti radio imunoassay dan western immunoblot anaysis (Chen, 1994).

## PENUTUP
Teknologi transgenik dalam bidang akuakultur di masa mendatang memiliki prospek yang sangat cerah terutama dalam  memproduksi  benih  ikan-ikan  yang  memiliki potensi tumbuh, seperti: efisiensi pemanfaatan pakan yang tinggi, ketahanan terhadap stres dan penyakit, dan mampu beradaptasi pada perubahan lingkungan yang luas.
Ke semua hal tersebut sangat menunjang dalam upaya peningkatan produksi ikan-ikan budidaya.
Keberhasilan  menghasilkan  ikan  hias  transgenik melalui biologi molekuler dengan karakter keunggulan tertentu memberikan harapan baru dalam budidaya ikan khususnya dalam menunjang peningkatan kualitas warna dan bentuk. Meskipun rekayasa genetika bukan segala- galanya, karena adanya keterbatasan dalam menghasilkan ikan transgenik seperti badang yang bengkok, kepala bercabang, dan lain-lain.

## DAFTAR ACUAN
Alimuddin, Yoshizaki, G., Carman, O., dan Sumantadinata,
K. 2003. Aplikasi transfer gen dalam akuakultur. Jurnal Akuakultur, 2(1): 40-51.
Blake, A. 2007. Rekayasa genetika. http//:www/rekayasa genetika//
Chen, T.T. 1994. Gene Transfer and Transgenic Fish: Mo- lecular and physiological approach the action of growth hormone. In Chou, L.M., Munro, A.D., Lam, T.J., Chen, T.W., Cheong, L.K.K., Ding, J.K., Hooi, K.K., Koo, H.W., Phang, V.P.E., Shim, K.F., & Tan, C.H. (Eds.) The third Asian Fisheries Forum. Asian Fisheries Society, Ma- nila, Philippines, p. 584-590.
Glick, B.R. & Pasternak, J.J. 2003. Molecular Biotechnol- ogy. Principle and Application of Recombinant DNA. Washington. ASM Press, 153 pp.
Kato, K., Tagaki, M., Tamaru, Y., Akiyama, S.I., Konishi, T., Murata, O., & Kumai, H. 2007. Construction of an
expression vector containing a  -actin promoter re- gion for gene transfer by microinjection in red sea bream Pagrus major. Fish Sci., 73: 440-445.
Khoo, H.W., Ang, L.H., Limand, H.B., & Wong, K.Y. 1992.
Sperm cells as vectors for introducing forign DNA into zebra fish. Aquaculture, 107: 1-19.
Ozato, K., Inoue, K., & Wakamatsu, Y. 1989. Transgenic fish:  biologycal  and  technical  problems.  Zoological Science, 6: 445-457.
Parenrengi, A. 2010. Peningkatan Resistensi Udang Windu Penaeus monodon terhadap Penyakit White Spot Syndrome Virus melalui Transfer Gen Penaeus Monodon Antiviral. Disertasi. IPB, 113 hlm.
Pinkert, C.A. 1994. Transgenic Animal Technology. Aca- demic Press, Inc., New York, p. 297-313.
Subagyo. 2000. Ikan Transgenik (transgenic fish): trend baru rekayasa genetika dalam budidaya ikan. Univer- sitas Indonesia. Jakarta, 15 hlm.
Tsai, H.J. 2008. Use of Transgenic Fish Possessing Spe- cial Genes as Model Organisms and Potential Applica- tions. Journal of Genetics and Molecular Biology, 19(1): 22-38.
Yan, S.Y. & Özgünen, T. 1993. Fish breeding and biotech- nology. Journal of Islamic Academy of Sciences, 6(3): 220- 242.
Zhu, Z., Li, G., He, L., & Chen, S. 1985. Novel gene trans- fer  into  the  fertilized  eggs  of  gold  fish  (Carassius auratus L. 1758). Z. Angew.Ichthyol., 1: 31-34.