PENGARUH PENAMBAHAN AMMONIUM SULFAT (NH 4 ) 2 SO 4 DAN WAKTU PERENDAMAN BUFFER FOSFAT TERHADAP PEROLEHAN CRUDE PAPAIN DARI DAUN PEPAYA ( CARICA PAPAYA, L )
Mitha Alviyulita * , Pinta Rizki Mala Hasibuan, Farida Hanum Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Sumatera Utara Jl. Almamater Kampus USU Medan, 20155 Indonesia
*Email : chanameh@yahoo.com

## Abstrak
Daun  pepaya  merupakan  salah  satu  hasil  tanaman  yang  kaya  manfaat.  Daun  pepaya  mengandung  enzim papain  yang  merupakan  enzim  protease  yang  sangat  bermanfaat  bagi industri. Penelitian ini  bertujuan untuk mengetahui pengaruh tingkat kejenuhan ammonium sulfat (NH 4 ) 2 SO 4 dan perendaman buffer fosfat terhadap rendemen  protease  kasar  daun  pepaya.  Penelitian  ini  memvariasikan  waktu  perendaman  buffer  fosfat  pada waktu 0, 12, 24, dan 36 jam dan tingkat kejenuhan ammonium sulfat (NH 4 ) 2 SO 4 pada konsentrasi 40, 50, 60, 70,  80,  dan  90  %.  Analisis  aktivitas  protease  dilakukan  dengan  menggunakan  spektrofotometer  UV  untuk mengukur  panjang  gelombang  dan  nilai  absorbansinya.  Hasil  penelitian  aktivitas  protease  yang  terbaik diperoleh  pada  perendaman  buffer  fosfat  selama  36  jam  dengan  konsentrasi  ammonium  sulfat  (NH 4 ) 2 SO 4 60%  yaitu  132,98%  unit/ml.  Rendemen  dan  kadar  air  terbaik  diperoleh  pada  perendaman  36  jam  pada konsentrasi 90% masing – masing sebesar 37,62% dan 65,70%.
Kata kunci : pepaya, ammonium sulfat (NH 4 ) 2 SO 4 , buffer fosfat, enzim papain, aktivitas protease

## Abstract
Papaya  leaves  is  a  plant  that  rich  in  benefits.  Papaya  leaves  contains  papain  enzyme  which  is  a  protease enzyme  that  very  helpful  for  the  industry.  This  study  aims  to  determine  the  effect  of  the  saturation  level  of ammonium sulphate (NH 4 ) 2 SO 4 and immersion time with phosphate buffer to get yield of protease from crude papaya.  In  this  study  varied  immersion  time  with  phosphate  buffer  is  0,  12,  24,  and  36  hours  and  the saturation  level  of  ammonium  sulphate  (NH 4 ) 2 SO 4 is  40,  50,  60,  70,  80,  and  90  %.  Analysis  of  protease activity was performed using UV spectrophotometer to measure the wavelength and absorbance values. The highest  value  of  the  protease  activation  (132,98%  unit/ml)  was  obtained  during  36  h  of  immersion  time  in phosphate  buffer  with  60%  concentration  of  ammonium  sulphate  (NH 4 ) 2 SO 4 .  The  results  found  on  36  h  of immersion  time  in    90%  of  ammonium  sulphate  concentration  were  the  highest  for  rendement  and  water content value of 37,62 and 65,70%, respectively.
Keywords : papaya, ammonium sulphate (NH 4 ) 2 SO 4 , phosphate buffer, enzyme papain, activity of protease

## Pendahuluan
Indonesia  merupakan  negara  tropis  dengan kekayaan  flora  yang  berlimpah.  Salah  satu tanaman tropis  yang  banyak  dijumpai  di  Indonesia  adalah tanaman  pepaya  ( Carica  papaya  L )  [8].    Semua bagian daripada pepaya dapat digunakan [12].
Selain  buah,  bagian  tanaman  pepaya  lainnya dapat  dimanfaatkan  untuk  berbagai  keperluan mulai sebagai  bahan  makanan  dan  minuman,  obat tradisional, pakan ternak, industri penyamakan kulit, kosmetik, dan sebagainya. Bahkan bijinya pun dapat diolah lebih lanjut menjadi minyak dan tepung [10].
Papain  merupakan  enzim  proteolitik,  yaitu enzim  yang  dapat  mengurai  dan  memecah  protein [10]. Papain digunakan untuk pengempukan daging, bahan penjernih pada industri minuman bir, industri tekstil,  industri  penyamakan  kulit,  industri  farmasi, alat-alat kecantikan (kosmetik) dan lain lain. Papain biasa  diperdagangkan  dalam  bentuk  serbuk  putih kekuningan dan harus disimpan dibawah temperatur 4 °C [4].
Pengambilan  enzim  papain  dari  getah  pepaya akan  mengakibatkan  penurunan  kualitas  pada  buah segarnya.  Maka  dari  itu  papain  yang  diambil  dari tanaman  pepaya  berupa  daunnya  sehingga  tidak mengalami  kerusakan  pada  tanman  pepaya  itu sendiri  dan  dapat  meningkatkan  nilai  tambah tanaman pepaya.  Enzim papain diperoleh dari hasil ekstraksi.  Semakin  tinggi  enzim  proteasenya  maka papain  yang  dihasilkan  semakin  baik.  Enzim  ini dapat diekstrak dan kemudian proses, pengendapannya dapat dilakukan dengan penambahan  garam  (NH 4 ) 2 SO 4 (ammonium  sulfat) [11].
Garam  amonium  sulfat  sering  digunakan untuk salting out protein enzim. Karena kelarutannya  sangat  tinggi,  tidak  beracun  untuk kebanyakan  enzim, murah  dan  pada  beberapa  kasus memberikan efek menstabilkan enzim [6].
Pada penelitian  ini,  daun  pepaya  akan  diteliti sebagai  bahan  baku  pembutan crude papain.  Yang
menjadi  permasalahan  dalam  penelitian  ini  adalah bagaimana  pengaruh  waktu  perendaman  buffer fosfat  dan  konsentrasi  terhadap  perolehan crude papain.

## Teori
Tanaman  pepaya  ( Carica  papaya L.)  ini berasal  dari  kawasan  sekitar  Meksiko  dan  Costa Rica.  Dewasa  ini  tanaman  pepaya  telah  menyebar keseluruh  dunia  termasuk  Indonesia  [1].  Daun pepaya merupakan salah satu komponen obat herbal yang telah digunakan oleh nenek moyang kita sejak dahulu  kala.  Di  era  modern,  dimana  teknologi mampu  mengurai  sisi  ilmiah,  diketemukan  fakta pembenar  mengenai  daun  pepaya.  Selain  enzim papain  pepaya  juga  megandung  alkaloid  karpaina, pseudo karpaina, glikosid, karposid, dan saponin [7]. Kompleksnya  senyawa  ini  menjadikan khasiat  daun pepaya  juga  ikut  beragam.  Untuk  mendapatkan manfaat  tersebut,  daun  pepaya  biasanya  diolah. Khusus untuk ekstrak daun pepaya, banyak diistimewakan  sebab  bisa  digunakan  dari  dalam maupun luar dan tak hanya untuk kesehatan manusia saja  tetapi  untuk  pertanian,  perikanan  dan  lain-lain [5].
Enzim  papain  adalah  enzim  yang  terdapat pada  getah  pepaya  merupakan  jenis  enzim proteolitik  yaitu  enzim  yang  mengkatalisa  reaksi pemecahan  rantai  polipeptida  pada  protein  dengan cara  menghidrolisa  ikatan  peptidanya  menjadi senyawa-senyawa  yang  lebih  sederhana  seperti dipeptida  dan  asam  amino.  Kualitas  aktivitas proteolitik  yang  baik  ada  pada  bagian  buah,  batang dan daun [17].
Ekstraksi  enzim  dapat  dilakukan  dengan prinsip  bahwa  protein  enzim  dapat  diendapkan dengan  penambahan  aseton,  etanol,  sodium  sulfat atau  ammonium  sulfat.  Sifat  ini  digunakan  sebagai prinsip dari isolasi enzim. Enzim ini dapat diekstrak dan  kemudian  proses  pengendapannya  dapat dilakukan  dengan  penambahan  garam  (NH 4 ) 2 SO 4 (ammonium sulfat) [11].
Ekstraksi  enzim  dapat  dilakukan  dengan prinsip  bahwa  protein  enzim  dapat  diendapkan dengan  penambahan  aseton,  etanol,  sodium  sulfat atau  ammonium  sulfat.  Sifat  ini  digunakan  sebagai prinsip dari isolasi enzim. Enzim ini dapat diekstrak dan  kemudian  proses  pengendapannya  dapat dilakukan  dengan  penambahan  garam  (NH 4 ) 2 SO 4 (ammonium sulfat) [11].

## Metodologi Penelitian
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini  daun  pepaya.  Bahan  kimia  yang  digunakan adalah  aquadest,  buffer  fosfat,  ammonium  sulfat, kasein,  asam  trikhloroasetat  (TCA),  dan  reagen ninhidrin.
Peralatan  utama  yang  akan  digunakan adalah blender, magnetic  stirrer ,  timbangan  elektrik,  alat
alat  gelas, incubator ,  kertas  saring  whatman  No.  4, sentrifius, dan spektrofotometer.

## Ekstrak Papain
100  gram  daun  pepaya  ditimbang  dan diblender  dengan  200  ml  buffer  fosfat  pH  7. Campuran  kemudian  disaring  dengan  menggunakan kertas  saring  whatman  No.  4,  hasil  residunya dibuang  dan  filtratnya  ditambahkan  ammonium sulfat pada tingkat kejenuhan 40, 50, 60, 70, 80 dan 90%. Setelah itu filtrat distirer selama 20 menit pada temperatur  4 o C  sampai  tercampur  rata.  Kemudian disentrifius  dengan  kecepatan  8000  rpm  selama  7 menit pada temperatur 4 o C. Endapan yang terbentuk dilarutkan  dengan  0,5  ml  larutan  0,05  buffer  fosfat pH 7 dan didiamkan selama 0, 12, 24, dan 36 jam.

## Uji Aktivitas Protease
Kualitas  papain  sangat  ditentukan  oleh kekuatan  atau  kemampuan  papain  untuk  memecah protein.  Kemampuan  papain  ini  disebut  aktivitas proteolitik ( Proteolytic activity ) yang sering dinyatakan dengan satuan unit [12].
Ekstrak  papain  sebanyak  0,1  ml  dilarutkan dengan  0,1  ml  larutan  buffer  fosfat  pH  7  dan dipreinkubasi pada temperature 37 o C selama 5 menit dan ditambahkan dengan substrat (2% kasein dalam 0,05  M  buffer  fosfat  pH  7)  sebanyak  0,1  ml. kemudian  diinkubasi  selama  10  menit  pada temperatur  37 o C.  Kemudian  reaksi  dihentikan dengan  menambahkan  0,2  ml  asam  trikhloroasetat (TCA) 0,4 M serta disentrifius pada kecepatan 1000 rpm  selama 10 menit.  0,2 ml  filtrat  yang  dihasilkan diprainkubasi  selama  50  menit.  Setelah  itu  1  ml reagen  ninhidrin.  Lalu  absorbansi  dapat  diukur dengan  menggukan  alat  spektrofotometer  dengan panjang  gelombang  274,80  nm.  Sehingga  aktivitas protease  dapat  dihitung  dengan  menggunakan Persamaan :
……...…………(1) Keterangan :
tirosin : konsentrasi tirosin yang terbentuk v : volume total sampel pada tiap tabung q : waktu inkubasi p
: jumlah enzim (mL)
Fp : faktor pengenceran

## Analisa Rendemen
Penghitungan  rendemen  dilakukan  dengan menimbang crude protease kering kemudian  dibandingkan  dengan  berat  sampel dikalikan 100%. Penghitungan rendeman  dapat  menggunakan  rumus  sebagai berikut [1]:
……...…………(2) Keterangan: A
: berat crude papain (gram)
B
: berat sampel daun pepaya (gram)
Hasil dan Pembahasan Ekstrak Crude Papain dari Daun Pepaya ( Carica Papaya, L. ) Ekstrak crude papain  merupakan  hasil  dari sentrifugasi  yang  diperoleh  dari  filtrat  daun  pepaya. Hasil  sentrifugasi  yang  diperoleh  berupa sludge berwarna  hijau  pekat.  Filtrat  diperoleh  dari  daun papaya  yang  dihaluskan  dengan  penambahan buffer fosfat dan  disaring  dengan  menggunakan  kertas saring.  Hasil  penyaringan  ditambahkan ammonium sulfat dengan  konsentrasi  40%  sampai  90% kemudian  distirer  selama  20  menit  sampai ammonium  sulfat tercampur  semua  pada  suhu  4 o C. Pemilihan temperatur 4 o C dilakukan untuk mencegah  kerusakan  enzim  [9].  Garam ammonium sulfat sering  digunakan  untuk salting  out protein enzim,  karena  kelarutannya  sangat  tinggi  dan  pada beberapa  kasus  memberikan  efek  menstabilkan enzim [6].
Kemudian  disentrifugasi  pada  suhu  4 o C. Endapan yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan  kertas  saring  dan  direndam  dengan larutan buffer  fosfat 0.05  M  pH  7  sebanyak  0,5  ml selama sesuai perlakuan (0 jam, 12 jam, 24 jam, dan 36  jam).  Perendaman  dilakukan  untuk  memisahkan protein  enzim  dari  ion  logam,  ion  logam  dan molekul-molekul kecil,  sehingga  dapat  memurnikan protein enzim [19].

## Pembuatan Kurva Standar LarutanTirosin
Panjang  gelombang  maksimum  274,80  nm yang  dihasilkan  digunakan  untuk  membuat  kurva larutan  standar  tirosin.  Kemudian,  kurva  standar tirosin  dibuat  dengan  cara  mengukur  absorbansi larutan.
Dari  data  absorbansi  larutan  tirosin  pada berbagai  konsentrasi  dibuat  kurva  larutan  standar tirosin  antara  konsentrasi  larutan  tirosin  terhadap absorbansi  berdasarkan  hukum Lambert  Beer . Grafik konsentrasi larutan tirosin terhadap absorbansi dapat dilihat pada Gambar 1.

## Gambar 1. Kurva kalibrasi Larutan Tirosin
Berdasarkan data dan perhitungan didapatkan persamaan  regresi  linier  larutan  standar  tirosin adalah y = 0,0027x + 0,9 dengan nilai R 2 = 0,9033. Harga  R  yang  diperoleh  mendekati  1,  maka  dapat disimpulkan  bahwa  nilai  koefisien  korelasi  layak
artinya  titik-titik  pada  kurva  kalibrasi  mendekati kemiringannya.

## Aanalisa Rendemen
Analisa  rendemen  dilakukan  dengan  cara menimbang  ekstrak  papain  yang  dihasilkan  dan membandingkan  dengan  berat  sampel  daun  pepaya. Rendemen yang diperoleh ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar  2.  Pengaruh  Penambahan  Konsentrasi Ammoniun  Sulfat  dan  Waktu  Perendaman Buffer Fosfat terhadap Rendemen yang dihasilkan
Berdasarkan Gambar 2 dilihat bahwa rendemen  yang  dihasilkan  semakin  meningkat seiring  penambahan  konsentrasi  yang  dilakukan. Namun  untuk  perendaman  tidak  terjadi  pengaruh yang  besar  terhadapnya.  Kondisi  optimum  yang terjadi  terlihat  pada  penambahan  konsentrasi ammonium  sulfat  90%  pada  perendaman  36  jam sebesar  18,81%.  Seidman  and  Mowery  [13], menyatakan bahwa ketika garam ammonium sulphat ditambahkan  pada  larutan  protein  enzim,  maka sebagian  besar  molekul  air  akan  berikatan  dengan ion  garam  yang  selanjutnya  akan  menurunkan jumlah  air  yang  tersedia  untuk  berikatan  dengan protein, sehingga protein akan mengendap. Selanjutnya  menurut  Wang  [15], crude protease hasil  presipitasi  dengan  ammonium  sulphat  masih merupakan  fraksi  campuran  yang  terdiri  dari  fraksi protein enzim dan protein non enzim.
Jika ditinjau dari pengaruh waktu perendaman buffer fosfat, tidak terjadi perubahan yang signifikan. Dari  grafik  di  atas  dapat  dilihat  bahwa  rendemen yang dihasilkan semakin meningkat seiring penambahan  waktu  perendaman  buffer  fosfat  yang dilakukan. Hal ini dikarenakan semakin lama waktu reaksi enzimatik maka semakin banyak produk yang terbentuk,  yang  juga  berarti  aktivitasnya  semakin besar [2].
y = 0.0027x + 0.9 R² = 0.9033 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 0  200 400 600 800 1000 A b so r b a n si Konsentrasi Larutan Tirosin Kalibrasi 線形 … 0 5 10 15 20 25 30 35 40 40 50 60 70 80 90 R ende m en (% ) Konsentrasi Ammonium Sulfat (%) 0 jam 12 jam 24 jam 36 jam
Pengaruh  Penambahan  Konsentrasi  Ammonium Sulfat (NH 4 ) 2 SO 4 dan Waktu Perendaman Buffer Fosfat terhadap Aktivitas Protease
Aktivitas  protease  diperoleh  dengan  cara menghitung  hasil  absorbansi  yang  diperoleh  dari hasil  analisa  spektrofotometer  sampel  dengan menggunakan  kurva  standar  tirosin  yang  telah ditetapkan sebelumnya kemudian dilakukan perhitungan aktivitas proteasenya.
Gambar  3.  Pengaruh  Penambahan  Konsentrasi Ammoniun  Sulfat  dan  Waktu  Penambahan Perendaman  Buffer  Fosfat  terhadap  Aktivitas Protease
Dari  Gambar  3  dapat  dilihat  bahwa  aktivitas protease cenderung meningkat seiring bertambahnya konsentrasi.  Akan  tetapi  pada  konsentrasi  tertentu aktivitas  protease  menurun,  kemudian  meningkat kembali  apabila  konsentrasi  ammonium  sulfat ditambahkan terus-menerus. Aktivitas protease yang terbaik diperoleh pada konsentrasi ammonium sulfat 60%  pada  perendaman  36  jam  sebesar  132,98 (unit/ml).  Kemudian  ketika  konsentrasi  ammonium sulfat  ditambahkan  menjadi  70%,  aktivitas  protease menurun menjadi 116,13 (unit/ml).
Penambahan  amonium  sulfat  menyebabkan protein  mengendap  dan  aktivitas  enzim  menjadi meningkat  karena  menurunnya  jumlah  kontaminan yang  menghalangi  sisi  aktif  enzim  untuk  berikatan dengan substrat [16].
Menurut  Aulanni’am  [3],  penambahan amonium  sulfat  berpengaruh  terhadap  protein  yang terendapkan  selama  proses  pemurnian.  Ion-ion garam  amonium  sulfat  akan  berkompetisi  dengan protein  untuk  menarik  molekul  air.  Ion-ion  garam memiliki kelarutan lebih besar dibandingkan dengan protein  sehingga  ion  garam  akan  menarik  molekul air  dari  protein  enzim.  Protein-protein  enzim  akan berinteraksi membentuk gumpalan dan mengendap.
Sedangkan  untuk  hasil  perendaman  yang dilakukan,  perendaman  yang  terbaik  terlihat  waktu perendaman  36  jam,  karena  Semakin  lama  waktu reaksi enzimatik maka semakin banyak produk yang
terbentuk,  yang  juga  berarti  aktivitasnya  semakin besar [2].

## Analisa Kadar Air
Kadar air merupakan  salah satu parameter uji yang  penting.  Kadar  air  memerankan  peranan penting  dalam  menentukan umur  simpan.  Selain itu pada  proses  pembuatan  tepung  papain  menurut Supiyatna  [14],  kadar  air  tepung  papain  jangan sampai lebih dari 9%.
Gambar  4.  Pengaruh  Penambahan  Konsentrasi Ammoniun  Sulfat  dan  Waktu  Perendaman Buffer  Fosfat  terhadap  Kadar  Air  yang dihasilkan
Dari  Gambar  4  dapat  dilihat  bahwa  semakin besar  konsentrasi  ammonium  sulfat  yang  diberikan maka kadar airnya semakin menurun. Kadar air yang terbaik  terjadi  pada  perendaman  36  jam  pada konsentrasi  ammonium  sulfat  90%  yaitu  sebesar 65,69%. Hal ini disebabkan oleh ion-ion garam yang memiliki kelarutan lebih besar dibandingkan dengan protein  sehingga  ion  garam  akan  menarik  molekul air  dari  protein  enzim.  Kadar air  bebas  yang rendah menghambat  difusi  enzim  atau  substrat,  akibatnya hidrolisis  hanya  terjadi  pada  bagian  substrat  yang langsung berhubungan dengan enzim [18].
Gambar  5.  Pengaruh  Penambahan  Konsentrasi Ammoniun  Sulfat  dan  Waktu  Perendaman Buffer  Fosfat  terhadap  Berat  Kering  yang dihasilkan
0 20 40 60 80 100 120 140 40  50  60  70  80  90 A kt iv it as P ro te as e Konsentrasi Ammonium Sulfat (%) 0 jam 12 jam 24 jam 36 jam 60 70 80 90 100 40  50  60  70  80  90 K ada r A ir ( % ) Konsentrasi Ammonium Sulfat (%) 0 jam 12 jam 24 jam 36 jam 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 40  50  60  70  80  90 B er at K er ing ( g ram ) Konsentrasi Ammonium Sulfat (%) 0 jam 12 jam 24 jam 36 jam
Dari  Gambar  5  dapat  dilihat  bahwa  semakin besar  konsentrasi  ammonium  sulfat  yang  diberikan maka  berat  kering  yang  dihasilkan  semakin meningkat.  Berat  kering  maksimum  yang  diperoleh terjadi  pada  perendaman  36  jam  pada  konsentrasi ammonium sulfat 90% yaitu sebesar 1,37 gram.
Hasil  percobaan  yang  dilakukan  belum mencapai berat kering yang diinginkan yaitu sebesar >  9%.  Hal  ini  disebabkan  karena  sampel  yang dianalisa  kadar  airnya  berupa  sludge.  Banyak kandungan  air  pada  sludge  karena  sludge  yang dihasilkan belum dilakukan proses tahapan pengeringan  menjadi  tepung  papain.  Pembuatan papain  hingga  menjadi  tepung  perlu  dilakukan proses lanjutan yaitu freeze drying.

## Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan  bahwa  Pengaruh  perendaman  buffer fosfat  dan  konsentrasi  ammonium  sulfat  (NH 4 ) 2 SO 4 terhadap aktivitas protease tertinggi pada konsentrasi ammonium  sulfat  60%  pada  perendaman  36  jam sebesar 132,98 (unit/ml).

## Daftar Pustaka
[1] Ashari S, Hortikultura Aspek Budidaya, Edisi Revisi, UI Press, Jakarta, 2006.
[2] Askurrahman,  Tesis,  Isolasi  Karakterisasi Linamarase Hasil Isolasi Dari Umbi Singkong (Manihot Esculenta Craintz), Jurusan Teknologi Industri Pertanian Fakultas
Pertanian Universitas Trunojoyo, 2010.
[3] Aulanni’am,  Protein  dan  Analisisnya,  Citra Mentari Group, Malang, 2005.
[4] Fitriani  V,  2006.  Getah  Sejuta  Manfaat,  PT. Trubus Swadaya. Edisi April, Jakarta, 2006.
[5]    Konradlew, Khasiat Daun Pepaya. http://khasiatdaunpepaya. blogspot.
com, 2013, diakses tanggal 4 Mei 2013.
[6] Lee  J. M, Biochemical Engineering, Prentice Hall Inc, New Jersey, 1992.
[7] Muchlisah  F,  Tanaman  Obat  Keluarga (TOGA), Penebar Swadaya, Jakarta, 2004.
[8] Mulyaningrum dan Sri Redjeki Hesti,  Isolasi, Karakterisasi,  dan  Amobilisasi  Enzim  Papain dari  Getah  Pepaya.  Fakultas  Matematika  dan Ilmu Penfetahuan Alam. Universitas Diponegoro, 1999.
[9] Noviyanti dkk, Pengaruh Temperatur
terhadap  Aktivitas Enzim  Protease  dari  Daun Sansakng (Pycnarrhena cauliflora Diels), JKK, tahun  2012,  volume  1  (1),  halaman  31-34,
2012.
[10]  Rahmadani,  Kajian  Pemanfaatan  Enzim Papain dari  Getah  Pepaya  (Carica  papaya  L.) untuk Melunakkan Daging. Universitas Negeri Medan, 2012.
[11]  Rahman  A,  Teknologi  Fermentasi.  Penerbit Arcan. Jakarta, 1992.
[12]  Sani,  Panambahan  Natrium,  Bisulfit  pada Kualitas  Enzim  Papain  dari  Getah  Pepaya Secara  MCU,  Unesa  University  Press,  Hal 1- 41, 2008.
[13]  Seidman,  L.  and  Mowery,  J,  Salting  out Ammonium Sulfate Precipitation, The Biotechnology Project, Illinois State University, 2006. [14]  Supiyatna, Manfaat Getah Pepaya. http://halalguide.info,  2007,  diakses  tanggal 05 Mei 2014.
[15]  Wang,  N.  S,    Enzyme  Purification  by  Salt (Ammonium  Sulfate)        Precipitation, Department of Chemical Engineering. University of Maryland, 2006.
[16]  Wardani,  Agustin  Kristina  dan  Nindita,  Lia Oriana, Jurnal Teknologi Pertanian Vol 13 No. 3, 149 – 156, 2012.
[17]  Winarno,  F.  G,  Enzim  Pangan,  Edisi  dua, Institut Pertanian Bogor, Bogor, 1973.
[18]  Winarno,  F.  G,  Enzim  Pangan,  Penerbit Gramedia, Jakarta, 1983.
[19]  Witono  dkk,  Pemurnian  Parsial  Enzim Protease dari Getah Tanaman Biduri (Calotropis gigantea) menggunakan Ammonium Sulphat, Jurnal Teknologi Pertanian,  Vol.  7  No.  1  (April  2006)  20-26, 2006.