Embriogenesis dan Desikasi Embrio Somatik Jeruk Keprok Batu 55 ( Citrus reticulata Blanco.) untuk Meningkatkan
Frekuensi Perkecambahan
Embryogenesis and Desiccation of Tangerine var. Batu 55 (Citrus reticulata Blanco.) Somatic Embryo on Enhancing Germination Frequency
Atika Fathur Rahmi 1* , Agus Purwito 2 , Ali Husni 3 , dan Diny Dinarti 2
Diterima 23 November 2016/Disetujui 10 Juli 2017

## ABSTRACT
In vitro breeding technique of citrus is effective when optimum explant regeneration method is obtained.  Low  germination  frequency  and  high  abnormality  were  barrier  in  citrus  somatic embryogenesis.  This  research  aimed  at  optimizing  somatic  embryogenesis  in  Tangerine  var.  Batu 55.  This  research  consisted  of  3  experiments.  First  experiment  was  maturation  of  embryogenesis, using Completely Randomized Design (CRD) method. Modified MS+MW  was used as basic media added with 500 mg L -1 malt extract (control) and addition of 3 mg L -1 BAP, and 2.5 mg L -1 ABA as treatments. Second experiment was SE (cotyledonary phage) desiccation. Factorial CRD used in two factors. First factor was poly-ethylene-glicol/PEG 8000 (0, 2.5, 5, 7.5 and 10%), while second factor was  immersed  periods  (control,  3,  6,  and  9  hours),  in  desiccant  solution  (base  medium  +  PEG). Third experiment was studied of plantlet growth and development planlets. Based on CRD 2 factor method,  the  first  factor  was  PEG  concentrations  from  the  second  experiment.  Second  factor  were active charcoal treatments (with or without), in basic media. The result showed that 2.5 mg L -1 ABA produced  has  highest  mature  somatic  embryo  (SE).  Desiccation  for  9  hours,  induced  the  highestt germination frequencies (90.29%). The best growth of plantlets shown in previous experiments immersed desiccant PEG 2.5% for 9 hours, and cultured in basic media with 2 g L -1 of activated charcoal.
Keywords: desiccant, embryogenic callus, maturation, PEG 8000, somatic embryo

## ABSTRAK
Pemuliaan  tanaman  melalui  teknik in  vitro efektif  bila  metode  regenerasi  eksplan  optimum telah diperoleh. Rendahnya  frekuensi  perkecambahan dan tingginya abnormalitas,  menjadi kendala pada  embriogenesis  somatik  jeruk.  Penelitian  terdiri  atas  3  percobaan  paralel,  bertujuan mengoptimalkan  metode  embriogenesis  somatik  jeruk,  khususnya  Keprok  Batu  55.  Percobaan pertama pematangan kalus embriogenik menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor, dengan perlakuan penambahan ZPT (kontrol, 3 mg L -1 BAP, dan 2.5 mg L -1 ABA) pada media dasar (MS modifikasi vitamin MW) diperkaya 500 mg L -1 ekstrak malt. Percobaan kedua desikasi embrio somatik  (fase  kotiledon)  menggunakan  RAL  dua  faktor.  Faktor  pertama  konsentrasi poly-ethylene- glicol/ PEG 8000 (0, 2.5, 5, 7.5 dan 10%), dan faktor kedua waktu perendaman (kontrol, 3, 6, dan 9 jam)  pada  larutan  desikan  (media  dasar  +  PEG).  Percobaan  ketiga  mempelajari  pertumbuhan  dan perkembangan planlet, menggunakan RAL dua faktor. Faktor pertama konsentrasi PEG planlet pada percobaan  kedua,  dan  faktor  kedua  perbedaan  media  dasar  (tanpa  dan  dengan  arang  aktif).  Hasil percobaan  menunjukkan  penambahan  2.5  mg  L -1 ABA  menghasilkan  maturasi  embrio  somatik terbaik.  Desikasi  9  jam  menghasilkan  frekuensi  perkecambahan  90.29%.  Pertumbuhan  terbaik ditunjukkan  planlet  yang  pada  percobaan  sebelumnya  direndam  9  jam  desikan  PEG  2.5%,  dan dibesarkan pada media dasar dengan 2 g L -1 arang aktif.
Kata kunci : desikan, embrio somatik, kalus embriogenik, PEG 8000, pematangan
1) Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
2) Departemen Agronomi dan Hortikultura, Institut Pertanian Bogor Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
3) Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Kementerian Pertanian, Jl. Tentara Pelajar No.3A Bogor Barat, Jawa Barat 16111, Indonesia email: atikafathurrahmi@ymail.com (*penulis korespondensi)

## PENDAHULUAN
Jeruk Keprok Batu 55 ( Citrus reticulata
Blanco.)  merupakan  salah  satu  jeruk  lokal unggulan nasional, berdasarkan Surat Keputusan Menteri Pertanian Nomor: 307/Kpts/SR.120/4/2006.  Jeruk  Keprok  Batu
55  memiliki  keunggulan  dapat  beradaptasi dengan  baik  di  dataran  tinggi,  memiliki  buah cukup  besar  berbentuk  bulat,  kulit  buah matang dapat mencapai kuning sempurna, dan daging  buah  berwarna  jingga  (Balitbangtan, 2006).  Namun,  buah  jeruk  Keprok  Batu  55 mempunyai  banyak  biji  (rata-rata  12  biji  per buah),  dan  rentan  serangan  beberapa  hama penyakit.  Peningkatan  produksi  serta  kulitas jeruk  agar  memenuhi  selera  konsumen  dan mampu  bersaing  di  pasar  global  dapat diusahakan  melalui  pemuliaan in  vitro . Keberhasilan  peningkatan  mutu  dan  kualitas jeruk  secara in  vitro sangat  tergantung  pada penguasaan sistem regenerasi, khususnya jalur embriogenesis somatik.
Embriogenesis  somatik  jeruk  telah banyak  dilakukan,  namun  masih  terdapat beberapa permasalahan diantaranya persentase perkecambahan  yang  rendah  dan  tingginya abnormalitas.  Beberapa  peneliti  melaporkan rendahnya  frekuensi  perkecambahan  pada embriogenesis  jeruk in  vitro ,  diantaranya Husni et  al. (2010)  pada  Siam  Pontianak  dan Simadu  (58%),  Merigo  (2011)  pada  Keprok Batu  55  (84%),  Kosmiatin et  al. (2014) pada Siam  Simadu  (14.1%),  dan  Karyanti et  al. (2015)  pada kalus  Keprok  Garut  hasil  iradiasi sinar gamma (31.76%).
Perbaikan  metode  regenerasi  jeruk secara in  vitro dapat  dilakukan  dengan menambahkan  tahapan  desikasi  pada  proses embriogenesis  somatik.  Sesuai  pernyataan West  dan  Harada  (1993)  embriogenesis merupakan  proses  regenerasi  tanaman  melalui beberapa  tahapan  yang  dimulai  dengan terbentuknya  masa  pro  embriogenik  (PEM), diikuti pembentukan embrio, maturasi (pematangan),  desikasi  (pengeringan)  dan proses pertumbuhan tanaman regeneran.
Embriogenesis  tanaman  (jeruk) in  vitro umumnya  tanpa  melalui  tahapan  desikasi. Sebagaimana  pernyataan  George et  al .  (2008) embriogenesis  tanaman in  vitro umumnya melalui  tahapan;  inisiasi  kultur  embriogenik, proliferasi  kalus  embriogenik,  pre-maturasi
dan  maturasi  ES  serta  pembesaran  tanaman regeneran.
Proses  desikasi  secara in  vitro dapat dilakukan  dengan  teknik  Sistem  Perendaman Sesaat  (SPS)  atau Temporary  Immersion System (TIS)  (Riyadi  dan  Sumaryono,  2009), dengan  meningkatkan  pemberian sukrosa  (Rai et  al .,  2008),  meningkatkan konsentrasi  bahan pemadat  medium  (Marquez-Martin et  al .,
2011; Hidayahti et al ., 2013) atau menambahkan osmotikum seperti poly-
ethylene-glycol (PEG) (Hidayahti et al ., 2013).
Sebagai  osmotikum  PEG  dapat  larut  secara sempurna dan menurunkan potensial air secara homogen. Bartels dan Sunkar (2005)
menyatakan PEG tidak mempunyai efek toksik pada tanaman, tetapi menurunkan potensial air media sehingga eksplan yang dikulturkan tidak mampu  menyerap  air  dan  nutrisi  dari  media. Pada  penelitian  ini  dilakukan  perendaman embrio  somatik  menggunakan  PEG  8000 untuk meningkatkan frekuensi perkecambahan.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  telah  dilaksanakan  dari bulan  Agustus  2014  sampai  Mei  2015  di Laboratorium  Kultur  Jaringan  I  Departemen Agronomi  dan  Hortikultura,  Institut  Pertanian Bogor.  Bahan  yang  digunakan  adalah  media MS  (Murashige  dan  Skoog)  modifikasi vitamin  MW  (Morel  dan  Wetmore)  sebagai media dasar, ekstrak malt (EM), poly-ethylene- glycol (PEG) 8000, arang aktif, gula, agar-agar dan zat pengatur tumbuh (ZPT): benzil  amino purin  (BAP),  abcisic  acid  (ABA),  giberelin (GA 3 ).  Penelitian  terdiri  atas  tiga  tahap percobaan:  1)  induksi  maturasi  ES  jeruk Keprok Batu 55; 2) desikasi dan germinasi ES jeruk  Keprok  Batu  55;  dan  3)  pertumbuhan dan perkembangan planlet hasil embriogenesis jeruk Keprok Batu 55.

## 1. Induksi  Maturasi  Embrio  Somatik Jeruk Keprok Batu 55
Bahan  yang  digunakan  adalah  kalus embriogenik jeruk Keprok Batu 55 (berumur ± 4  tahun  sejak  inisiasi).  Rancangan  percobaan yang  digunakan  adalah  Rancangan  Acak Lengkap  (RAL)  faktor  tunggal.  Media  dasar ditambah 500 mg  L -1 EM dengan 1) 3 mg L -1 BAP, 2) 2.5 mg L -1 ABA dan 3) kontrol tanpa
penambahan  ZPT,  sebagai  faktor  perlakuan. Setiap  perlakuan  diulang  11  kali.  Setiap ulangan terdiri atas 5 clump kalus embriogenik berdiameter  ±  0.75  cm  (berkisar  ±  35  PEM). Karyanti et  al. (2015)  melaporkan  setiap clump kalus  jeruk  Keprok  Garut  berdiameter sekitar  0.5  cm  terdiri  atas  ±  20  proembrio, sehingga  kalus  dengan  diameter  ±  0.75  cm diduga  memiliki  sekitar  35  embrio.  Peubah yang  diamati:  ES  yang  terbentuk  (fase globular,  jantung,  torpedo,  dan  kotiledon). Minggu  keenam  dilakukan  penghitungan efisiensi  pembentukan ES dengan  menghitung jumlah  tahap  (globular  +  jantung  +  torpedo  + kotiledon) dibagi jumlah PEM awal dan dikali 100%.
Kalus  embriogenik  dengan  ES  yang belum dewasa (belum mencapai fase kotiledon)  disubkultur  pada  media  maturasi terbaik  di  6  minggu  pertama.  Subkultur dilakukan  secara  berulang  setiap  4  minggu, hingga  memenuhi  kebutuhan  eksplan  (embrio fase kotiledon) untuk desikasi pada percobaan berikutnya.  Setiap  kali  subkultur,  dilakukan penghitungan  embrio  fase  kotiledon  yang terbentuk.
2. Desikasi dan Germinasi Embrio Somatik Jeruk Keprok Batu 55
Bahan  yang  digunakan  adalah  ES  jeruk Keprok Batu 55 fase kotiledon (dari perlakuan induksi  maturasi).  Rancangan  percobaan  yang digunakan  adalah  RAL  dua  faktor.  Faktor pertama  larutan  media  dasar  (MS  modifikasi vitamin  MW) dengan PEG 8000  (konsentrasi: 0,  2.5,  5,  7.5  dan  10%),  sebagai  desikan. Faktor  kedua  merupakan  waktu  perendaman (3,  6  dan  9  jam).  Kombinasi  ke  dua  faktor menghasilkan  15  perlakuan,  dilengkapi  satu kontrol  tanpa  perendaman  sehingga  menjadi 16 perlakuan. Setelah desikasi, ES dikecambahkan  pada  media  dasar  dengan  500 mg  L -1 EM  dan  2.5  mg  L -1 GA 3 (Merigo, 2011). Setiap perlakuan terdiri atas 7 ulangan, sehingga  terdapat  112  satuan  percobaan. Setiap  satu  satuan percobaan  terdiri  atas  5  ES fase  kotiledon.  Lima  minggu  setelah  tanam (MST) dilakukan penghitungan: jumlah eksplan  berkecambah,  eksplan  membentuk kecambah normal, dan berkalus.
3. Pertumbuhan dan Perkembangan Planlet Jeruk Keprok Batu 55
Kecambah  ES  terbaik  dari  percobaan  2 Desikasi  dan  Germinasi  Embrio,  disubkultur  ke media pembesaran. Rancangan percobaan yang digunakan  adalah  RAL  dua  faktor.  Faktor pertama terdiri atas 6 perlakuan ES sebelumya (PEG konsentrasi 0, 2.5, 5, 7.5 dan 10%, serta dilengkapi  satu  kontrol  tanpa  perendaman). Faktor  kedua  media  dasar,  tanpa  dan  dengan arang  aktif  2  g  L -1 .  Terdapat  12  kombinasi perlakuan,  yang  terdiri  atas  4  ulangan,  sehingga terdapat  48  satuan  percobaan.  Setiap  satuan percobaan  terdiri  atas  3  planlet.  Pada  minggu keenam  dilakukan  penghitungan:  persentase eksplan  hidup,  membentuk  planlet  normal, membentuk tunas, membentuk daun, membentuk akar  dan  membentuk  ES  sekunder  serta  jumlah tunas, daun, akar, dan tinggi pada setiap eksplan.
Data  yang  diperoleh  pada  setiap percobaan  dianalisis  menggunakan  program Statistical  Tool  for  Agricultural  Reasearch (STAR-2.0.1).  Perlakuan  yang  menunjukkan pengaruh  berdasarkan  hasil  uji  F,  diuji  lanjut menggunakan  uji  beda  nyata  terkecil  (BNT) atau least  significant  differences (LSD)  pada taraf 5% (P < 0.05).

## HASIL PEMBAHASAN
1. Induksi  Maturasi  Embrio  Somatik Jeruk Keprok Batu 55
Formulasi  media  sangat  menentukan keberhasilan  induksi  dan  maturasi ES. Interaksi dan perimbangan ZPT yang ditambahkan  ke  dalam  media  dan  hormon yang  diproduksi  secara  endogen  menentukan arah  perkembangan  suatu  kultur.  Minggu pertama  dan  ke  dua  semua  kalus  masih menunjukkan warna putih kekuningan.
Perubahan warna mulai terjadi pada minggu ke tiga  setelah  sub  kultur  (Gambar  1).  Kalus- kalus  yang  berpotensi  membentuk  embrio mulai  menunjukkan  warna  kuning  kehijauan seiring dengan mulai berkembangnya proembrio  menjadi  embrio.  Penghitungan  ES pada  minggu  ke  enam  menunjukkan  fase globular lebih banyak ditemukan dibandingkan jantung,  torpedo  dan  kotiledon.  Souza et  al .
(2011)  menyatakan  embrio  tahap  globular lebih  mudah  dideteksi  pada Citrus  sinensis L.
Obseck cv. Valencia.
Gambar 1. Induksi maturasi kalus embriogenik jeruk Keprok Batu 55 a) 2 MST b) 3 MST c) 4 MST d) 6 MST pada media dasar + 500 mgL -1 EM + 2.5 mgL -1 ABA, bar=1 cm.
Beberapa  proembrio  dapat  berkembang menjadi embrio tanpa penambahan ZPT (Tabel 1). Kandungan hormon pada jaringan proembrio  yang  dimaturasi  di  media  tanpa penambahan ZPT diduga telah dapat mendukung  perkembangannya  menjadi  ES. Menurut  Husni et  al. (2010)  embriogenesis somatik  dapat  terjadi  secara  langsung  dari  sel- sel meristemoid dan embrioid yang tumbuh dan berkembang  menjadi  ES  dengan  dua  kutub (bipolar).  Penambahan  3  mg  L -1 BAP menginduksi  maturasi  lebih  baik  dibandingkan kontrol.  Secara  umum,  populasi  kalus  pada media  dengan  3  mg  L -1 BAP  kembali berproliferasi. Kandungan sitokinin yang tinggi menginduksi  populasi  kalus  untuk  cenderung berproliferasi  menjadi  kalus  baru.  Tabel  1 menunjukkan  penambahan  2.5  mg  L -1 ABA menghasilkan  (maturasi)  ES  paling  baik (34.89%).  Sesuai  penelitian  George et  al . (2008) dengan eksplan daun jeruk, Husni et al.
(2010)  pada  Siam  Pontianak  dan  Simadu, Merigo  (2011)  pada  Keprok  Batu  55,
Wulansari et  al. (2015)  pada  regenerasi  kalus Siam,  Karyanti et  al. (2015)  pada  Keprok Garut,  Purwito et  al. (2015)  Keprok  Batu  55,
bahwa  ABA  meningkatkan  diferensiasi  ES menjadi embrio dewasa. Abcisic acid termasuk kelompok ZPT yang berperan sebagai inhibitor, berperan dalam peningkatan embriogenesis,  ketahanan  terhadap  stres, dormansi,  perkecambahan  dan  pertumbuhan (Harjadi, 2009).
Gambar  2.  Persentase  embrio  dewasa  (fase kotiledon)  yang  terbentuk  setiap  kali subkultur, pada media dengan penambahan ABA 2.5 mg L -1
Tabel 1. Pematangan ES jeruk Keprok Batu 55, pada 6 MST di media induksi maturasi
MS modifikasi Vitamin MW Jumlah PEM* Tahapan Pendewasaan Embrio Somatik Efisiensi Pendewasaan (%) Globular Jantung Torpedo Kotiledon Kontrol 35 0.84  c 0.00  b 0.00  b 0.00  b 2.4 3 mg L -1 BAP 35 2.48  b 0.06  b 0.00  b 0.00  b 7.3 2.5 mg L -1 ABA 35 10.24  a 1.31  a 0.36  a 0.30  a 34.9 KK (%) 2.4 18.7 11.0 9.5
Keterangan:  Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata (α =  0.05)  pada  uji  LSD.  KK  merupakan  hasil  transformasi  menggunakan  √(x+1).  *Perkiraan  jumlah proembrio per clump dengan diameter kalus ± 0.75 cm.
b c d a
Kalus  embriogenik  dengan  ES  yang belum dewasa (belum mencapai fase kotiledon)  selanjutnya  disubkultur  ke  media dengan  ABA  2.5  mg  L -1 ,  dengan  subkultur setiap  4  minggu  sekali.  Pembentukan  embrio dewasa  fase  kotiledon  tertinggi  (Gambar  2) diperoleh  pada  minggu  ke-10,  mencapai 32.24% (255 kotiledon). Hal tersebut menunjukkan,  bahwa  selain  ditentukan  oleh kemampuan  sel  menerima  rangsangan  dari media  dengan  ABA,  proses  pematangan  ES juga  ditentukan  oleh  umur  fisiologis  sel embrio somatik.
2. Desikasi dan Germinasi Embrio
Somatik Jeruk Keprok Batu 55 Perkecambahan  terlihat  optimal  pada minggu  ke  enam,  meskipun  tidak  semua  ES berkecambah dan berkembang menjadi kecambah  normal.  Tidak  terdapat  interaksi antara  waktu  perendaman  dan  konsentrasi PEG  desikan.  Perbedaan  konsentrasi  PEG pada  larutan  desikan  juga  tidak  berpengaruh nyata.  Lama  (waktu)  perendaman  ES  fase kotiledon  pada  larutan  desikan  (sebelum pengecambahan),  berpengaruh  terhadap  rata- rata  eksplan  yang  dapat  berkecambah  dan membentuk kecambah normal.
Tabel  2  menunjukkan  ES  jeruk  Keprok Batu  55  dapat  berkecambah  tanpa  proses desikasi,  terlihat  dari  hasil  perkecambahan kontrol  tanpa  perendaman  (68.57%).  Embrio yang  matang  sempurna  dapat  berkecambah alami  pada  media  yang  optimal.  Rendahnya
embrio berkecambah (2.40 ES) dan berkecambah  normal  (0.09  ES)  pada  desikasi tiga  jam,  diduga  karena shock  effect yang dialami  embrio  akibat  tercekam.  Konservasi air  antar  sel  pada  jaringan  embrio  diduga belum  optimal  pada  desikasi  singkat.  Masih kurang beradaptasinya embrio terhadap larutan desikan  pada  tiga  jam  pertama,  menyebabkan perkecambahan yang lebih rendah dari kontrol, mengindikasikan  prelakuan  desikasi  selama tiga jam belum optimal.
Proses desikasi ES meningkatkan frekuensi  perkecambahan  pada  perendaman selama  enam  jam  (89.72%)  dan  sembilan  jam (90.29%).  Perendaman  ES  jeruk  Keprok  Batu 55 selama sembilan jam dalam larutan desikan menunjukkan  hasil  terbaik,  dengan  rata-rata 4.51  ES  berkecambah  dan  2.80  diantaranya (dari  4.51  kecambah)  berkecambah  normal. Penggunaan  desikan  pada  konsentrasi  rendah dan  waktu  relatif  lama,  menarik  air  yang tersimpan  pada  lapisan  jaringan  sel  bagian dalam ke lapisan luar secara bertahap, sebagai mekanisme pertahanan embrio terhadap cekaman kekeringan yang diterima oleh sel-sel yang berada pada permukaan. Sesuai pernyataan  Jones  (1992)  bahwa  peningkatan konservasi  air  pada  jaringan  merupakan  salah satu  mekanisme  tanaman  untuk  menghindari defisit  air.  Hal  ini  menyebabkan  embrio- embrio  yang  lebih  lama  direndam  larutan desikan  lebih  adaptif  dan  menghasilkan frekuensi perkecambahan yang lebih tinggi.
Tabel 2. Perkembangan ES fase kotiledon jeruk Keprok Batu 55, pada 6 MST di media dasar dengan 500 mg L -1 EM dan 2.5 mg L -1 GA 3 (setelah perlakuan desikasi) Perlakuan PEG Rataan Jumlah Embrio (kotiledon) Efisiensi Perkecambahan (%) Persentase ES Berkalus (%) Awal Tanam Berkecambah Kecambah Normal Waktu (jam) Tanpa Perendaman 5 3.4 b 0.9 b 68.6 b 48.0  a 3 5 2.4 c 0.1 c 48.0 c 57.9  a 6 5 4.5 a 1.3 b 89.7 a 36.9  ab 9 5 4.5 a 2.8 a 90.3 a 20.4  b Konsentrasi (%) 0 5 4.1 1.5 81.9 33.7 2.5 5 3.6 1.4 72.4 42.7 5.0 5 3.5 1.3 69.5 36.8 7.5 5 4.1 1.3 82.9 34.4 10.0 5 3.7 1.4 73.3 44.5 KK 6.58% 11.41%
Keterangan: Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata (α = 0.05) pada uji LSD. KK merupakan hasil transformasi menggunakan √(x+1).
Selain fator kematangan, perkecambahan ES  dipengaruhi  kemampuan  sel  embrio somatik  menerima  rangsangan  media  dengan penambahan  GA 3. Husni et  al. (2010) menyatakan  semakin  tinggi  konsentrasi  GA 3, semakin banyak jumlah ES yang berkecambah menjadi  planlet.  Penambahan  4  ppm  GA 3 meningkatkan  berat  basah  embrio  sedangkan aplikasi  8  ppm  GA 3 pada  tahap  multiplikasi menghasilkan  persentase  regenerasi  embrio paling tinggi (Firdiana et al ., 2015).
Perendaman eksplan selama 3 jam pada 10 mg L -1 GA 3 meningkatkan  perkecambahan  dan pemanjangan tunas (Putra et al., 2015) Terdapat  pembentukan  kalus  disekitar meristem  embrio  yang  berkecambah.  Eksplan membentuk kalus tertinggi ditunjukkan perlakuan  perendaman  3  jam  yang  tidak berbeda nyata dengan kontrol tanpa perendaman (Tabel 2). Kosmiatin et al. (2014)
juga melaporkan terdapat pembentukan (88.9%)  kalus  embriogenik  pada  pangkal eksplan  jaringan  endosperm  jeruk  Siam Simadu  yang  berkecambah.  Terinduksinya kalus  di  sekitar  meristem  embrio  yang berkecambah  mengindikasikan  media  dasar yang digunakan sangat optimal untuk regenerasi ES jeruk, sehingga dapat merangsang  jaringan  meristemoid  berproliferasi membentuk sel-sel baru (kalus).
Kalus  disekitar  eksplan  yang  sangat aktif
berproliferasi terkadang
justru
menghambat perkembangan planlet dan diduga  menyebabkan  kematian  pada  beberapa eksplan.  Kalus  tersebut  bersaing  dengan
eksplan  dalam  hal  pemenuhan  kebutuhannya di  dalam  botol  kultur.  Sejalan  dengan penelitian  Devy et  al .  (2012)  bahwa  densitas
(kepadatan) kultur sangat berpengaruh terhadap daya regenerasi eksplan.

## Pertumbuhan  dan  Perkembangan  Planlet Jeruk Keprok Batu 55
Analisis  ragam  planlet  hasil  desikasi selama  9  jam  pada  5  MST  di  media pembesaran  (Tabel  3),  menunjukkan  media berpengaruh  nyata  terhadap  tinggi  planlet. Rata-rata  tinggi  planlet  pada  media  dengan arang  aktif  (0.99  cm)  mencapai  hampir  dua kali lipat tinggi planlet pada media tanpa arang aktif  (0.54  cm).  Mengindikasikan  media  MS modifikasi  vitamin  MW  dengan  penambahan arang  aktif,  lebih  optimal  dalam  mendukung pertumbuhan tinggi planlet.
Konsentrasi  PEG  berpengaruh  terhadap beberapa  peubah  yang  diamati.  Nilai  terbaik berdasarkan  persentase  eksplan  membentuk planlet  normal  (50%),  bertunas  (50%), berdaun  (41.67%),  berakar  (70.83%),  serta rata-rata  jumlah  tunas  (1.92)  per  eksplan ditunjukkan  oleh planlet  yang  pada percobaan sebelumnya  direndam  larutan  desikan  PEG 2.5%  selama  9  jam  (Tabel  3).  Interaksi  antar media  pembesaran  dengan  konsentrasi  PEG larutan  desikan,  terdapat  pada  parameter  rata- rata  jumlah  akar  yang  terbentuk  pada  setiap eksplan  (Tabel  4)  dan  persentase  planlet membentuk embrio somatik sekunder (Tabel 5).
Tabel 3. Perkembangan planlet jeruk Keprok Batu 55 (hasil desikasi 9 jam), pada 5 MST di media pembesaran
Perlakuan ( treatments ) Persentase Eksplan Rata-rata (per eksplan) Normal (%) Bertunas (%) Berdaun (%) Berakar (%) Tunas Daun Tinggi (cm) Media MS + vit MW 26.4 27.8 25.0 43.1 1.4 2.5 0.5 b MS+vit MW+aa 30.6 37.5 30.6 51.4 1.1 3.1 1.0 a Konsentrasi PEG (%) Kontrol 4.2 c 8.3 b 0.0 c 4.2 b 0.3 b 0.0 c 0.2 0 37.5 ab 37.5 a 41.7 ab 54.2 a 1.3 a 5.8 a 1.0 2.5 50.0 a 50.0 a 41.7 a 70.8 a 1.9 a 4.8 a 1.2 5.0 25.0 ab 37.5 a 29.2 ab 58.3 a 1.1 ab 1.4 bc 0.7 7.5 20.8 b 25.0 a 20.8 b 45.8 a 1.4 a 1.8 bc 0.6 10.0 33.3 ab 37.5 a 33.3 ab 50.0 a 1.7 a 2.9 ab 0.9
Keterangan: Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata (α = 0.05) pada uji LSD. KK merupakan hasil transformasi menggunakan log (x+1).
Tabel  4.  Pengaruh  interaksi  media  dan  konsentrasi  PEG  terhadap  rata-rata  jumlah  akar  per  planlet jeruk Keprok Batu 55 setelah 5 minggu berada pada media pertumbuhan
Konsentrasi PEG (%) Media MS+vit MW MS+vit MW + Arang Aktif Kontrol 0.3   c    A 0.0  b    A 0 1.6   b    A 1.3  a    A 2.5 3.2   a    A 1.4  a    B 5.0 1.0   bc  A 1.9  a    A 7.5 1.4   b    A 1.0  a    A 10.0 1.3   b    A 1.3  a    A
Keterangan:  Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf kecil yang sama tidak berbeda nyata (α  = 0.05),  sedangkan  angka-angka  pada  baris  yang  sama  yang  diikuti  oleh  huruf  kapital  yang  sama  tidak berbeda nyata (α = 0.05) pada uji LSD.
Tabel  5.  Pengaruh  interaksi  media  dan  konsentrasi  PEG  terhadap  persentase  planlet  jeruk  Keprok Batu 55 membentuk ES sekunder pada 5 MST di media pertumbuhan.
Konsentrasi PEG (%) Media MS + vit MW MS + vit MW + Arang Aktif Kontrol 25.0  ab    B 75.0  a    A 0 50.0  ab    A 0.0  b    B 2.5 33.3  ab    A 16.7  b    A 5.0 25.0  ab    A 16.7  b    A 7.5 58.3  a      A 0.0  b    B 10.0 8.3  b      A 16.7  b    A
Keterangan:  Angka-angka pada kolom yang sama yang diikuti oleh huruf kecil yang sama tidak berbeda nyata (α = 0.05),  sedangkan  angka-angka  pada  baris  yang  sama  yang  diikuti  oleh  huruf  kapital  yang  sama  tidak berbeda nyata (α = 0.05) pada uji LSD.
Pada  media  tanpa  arang  aktif,  rata-rata jumlah akar terbanyak terdapat pada konsentrasi PEG 2.5% (3.17 akar per eksplan), sedangkan  pada  media  dengan  arang  aktif terdapat  pada  eksplan  yang  sebelumnya direndam  larutan  desikan  PEG  dengan konsentrasi  5%,  yaitu  1.92  akar  per  eksplan (Tabel  4).  Pada  parameter  persentase  planlet membentuk  embrio  somatik  sekunder  (Tabel 5), persentase eksplan membentuk ES sekunder  di  media  tanpa  arang  aktif  (Gambar 3d)  tertinggi  ditunujukkan  eksplan  yang sebelumnya  direndam  desikan  7.5%  PEG (58.33%),  sedangkan  pada  media  dengan penambahan  arang  aktif  terdapat  pada  kontrol tanpa  perendaman  (75%).  Kosmiatin et  al . (2014)  melaporkan  44.4%  planlet  membentuk ES  sekunder  di  sekitar  pangkal  batang,  pada tahap  pemanjangan  tunas  kultur  endosperm Siam Simadu.
Pada  percobaan  ini  terlihat  keragaman morfologi  planlet  seperti  abnormal,  tunas, batang  dan  atau  daun  tidak  dapat  dibedakan dengan  jelas,  keriting,  menebal,  roset,  dan
tidak berkembang dengan baik. Penyimpangan yang  terjadi  tidak  selalu  dapat  dikategorikan sebagai abnormalitas, karena beberapa tanaman  yang  dihasilkan  masih  memenuhi kriteria  sebagai  planlet  yaitu  memiliki  batang, akar  dan  daun.  Beberapa  eksplan  yang abnormal  juga  dapat  tumbuh  dan  berkembang menjadi  planlet  normal  setelah  subkultur berulang,  seiring  dengan  semakin  dewasanya planlet (Gambar 3 abc).
Proses  embriogenesis  pada  beberapa eksplan  juga  terlihat  menyimpang,  karena embriogenesis pada tanaman dikotil seharusnya  menghasilkan  planlet  berakar tunggang  dengan  tunas  tunggal.  Rata-rata planlet pada penelitian ini menghasilkan tunas (Tabel  3)  dan  akar  (Tabel  4)  lebih  dari  satu, pada  satu  eksplan.  Beberapa  penyimpangan yang  terjadi  diduga  karena  terdapat  kelebihan cadangan  protein  pada  eksplan.  Penggunaan media  dasar  MS  modifikasi  vitamin  MW merupakan  media  yang  kaya  nutrisi.  Vitamin MW  mengandung  biotin  dan  Ca-pantotenat yang tidak terdapat pada vitamin MS.
Gambar 3.  Perkembangan  planlet  jeruk  Keprok  Batu  55  abnormal  menjadi  planlet  normal  pada media  MS  modifikasi  vitamin  MW  a)  3  MST  b)  6  MST  c)  12  MST    d)  ES  sekunder terbentuk pada pangkal batang, bar = 3 cm.
Ca-pantotenat berperan sebagai penyumbang  kalsium  dan  asam  pantotenat yang  berfungsi  mencegah  penuaan  pada jaringan. Biotin dapat mempengaruhi perkembangan  kalus  embriogenik.  Aktivitas biotin  yang  bersifat  sebagai  kofaktor  sintesis protein  cadangan,  menyebabkan  terjadinya akumulasi  cadangan  protein  (Dodeman et  al., 1997).  Selama  pertumbuhan  (sejak  kalus hingga  berkecambah)  media  yang  digunakan diperkaya  ekstrak  malt,  sehingga  terdapat ketersediaan  nitrogen  organik  yang  mudah diserap tanaman. Tingginya akumulasi protein cadangan  pada  eksplan  diduga  menyebabkan terjadinya  abnormalitas  dan  terbentuknya embrio  somatik  sekunder.  Kosmiatin et  al. (2014)  menyatakan  penumpukan  protein cadangan  menyebabkan  terbentuknya  embrio somatik  sekunder  dan  terjadinya  abnormalitas pada embriogenesis somatik.
Faktor kalus sebagai eksplan awal  yang telah  berumur  lebih  dari  4  tahun  (sejak inisiasi)  dan  mengalami  sub  kultur  berulang kali  juga  diduga  memunculkan  pengaruh variasi  somaklonal.  Yulianti et  al. (2012) melaporkan  penggunaan  ZPT  BAP  yang cukup  tinggi  dan  periode  kultur  yang  lama pada  perbanyakan  melalui  embriogenesis somatik,  menyebabkan  terjadinya  perubahan genetik.  Pengaruh  dari  lingkungan in  vitro yang  sangat  berbeda  dengan  habitat  asli tanaman  di  lapangan,  kemungkinan  juga memunculkan efek epigenetik.

## KESIMPULAN
Penambahan  2.5  mg  L -1 ABA  pada media  kultur  meningkatkan  jumlah  embrio somatik  dewasa  dengan  efisiensi  keberhasilan
mencapai  34.53%.  Desikasi  embrio  somatik dewasa  (fase  kotiledon)  menggunakan  larutan desikan  PEG  8000  selama  9  jam  berhasil meningkatkan frekuensi perkecambahan hingga  90.29%.  Pertumbuhan  planlet  hasil desikasi  9  jam  paling  baik  berasal  dari perlakuan  menggunakan  desikan  2.5%  PEG yang  ditumbuhkan  pada  media  dengan penambahan arang aktif 2 g L -1 .

## DAFTAR PUSTAKA
[Balitbangtan] Badan Penelitian dan Pengembangan  Departemen  Pertanian. 2006. Surat Keputusan Menteri Pertanian  Nomor  307/Kpts/SR.1204/ 4/2006  tentang  Pelepasan  Jeruk  Keprok Batu  55  sebagai  varietas  unggul.
Jakarta: Balitbangtan Deptan.
Bartels, D., R. Sunkar. 2005. Drought and salt tolerance  in  plants.  Crit.  Rev.  in  Plant Sci. 24: 1-36.
Devy,  N.F.,  F.  Yulianti,  Hardiyanto.  2012. Pengaruh  densitas  awal  kalus  dalam perbanyakan melalui embriogenesis somatik  terhadap  daya  multiplikasi  dan stabilitas genetik planlet siam
Kintamani. J. Hort . 22(4): 309-315.
Dodeman,  V.L.,  G.  Ducreux,  M.  Kreis.  1997. Zygotic  embryogenesis  versus  somatic embryogenesis . J.  Exp.  Bot.  48:  1493-
1509.
Firdiana,  E.F.,  S.  Indriyani,  W.  Widoretno.
2015  The  effect  of  gibbberellin  on somatic  embryo  growth  and  maturtion
a b
c
d
and  plantlet  regeneration  of  tangerine ( Citrus  reticulata Blanco.)  var.Batu  55. J. Exp.Life Sci. 5(1): 19-23.
George, E.F., M.A. Hall, G.J. De Klerk. 2008. Plant  Propagation  by  Tissue  Culture. Volume  ke  1.  The  Background.  Edisi ke-3.  Netherland:  Springer.  hlm  335- 354.
Harjadi,  S.S.  2009.  Zat  Pengatur  Tumbuh. Jakarta. Penebar Swadaya.
Hidayahti,  N.,  W.  Widoretno,  R.  Mastuti. 2013. Pengaruh osmolit terhadap maturasi embrio  somatik  jeruk  ( C.  reticulata Blanco.). El-Hayah. 3(2): 83-87.
Husni, A., A. Purwito, I. Mariska, Sudarsono. 2010.  Regenerasi  jeruk  siam  melalui embriogenesis  somatik.  J.  AgroBiogen. 6(2): 75-83.
Jones  HG.  1992.  Plants  and  Microclimate.  A Quantitative Approach to Environmental Plant Physiology. Second  edition  Cambridge  University Press. p: 265-295.
Karyanti,  A.  Purwito,  A.  Husni.  2015. Radiosensitivitas  dan  seleksi  mutan putatif  jeruk  keprok  Garut  ( Citrus reticulata L.)  berdasarkan  penanda morfologi.  J. Agron.  Indonesia  43(2): 126-132.
Kosmiatin, M., A. Purwito, G.A. Wattimena, I. Mariska.  2014.  Induksi  embriogenesis somatik  jaringan endosperm  jeruk Siam Simadu. J. Agron. Indonesia. 42(1): 44- 51.
Marquez-Martin,  B.,  R.  Sesmeroa,  M.A. Quesada, F. Pliego-Alfaroc, C. Sanchez- Romero.  2011.  Water  relations  in culture  media  influence  maturation  of avocado somatic embryos. Plant Physiol. 168: 2028-2034.
Merigo,  J.A.  2011.  Studi  regenerasi  tanaman jeruk  Keprok  Batu  55  melalui  jalur embrigenesis  somatik.  [Tesis].  Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor.
Purwito,  A.,  M.  Prayogi,  M.  Kosmiatin,  A. Husni.  2015.  Embriogenesis  somatik jeruk Keprok ( Citrus L. cv Batu 55) asal hasil  perlakuan  kolkisin.  J.  Hort. Indonesia. 6(3): 161-171.
Putra, I.M.A., A. Purwito, M. Kosmiatin. 2015 Propagasi  mikro  dan  sambung  mikro jeruk  keprok  ( Citrus  reticulata )  Garut hasil mutagenesis in vitro dengan batang bawah  Japansche  Citroen.  J.  Hort. Indonesia. 8(2): 99-108.
Rai,  M.K.,  V.S.  Jaiswal,  U.  Jaiswal.  2008. Effect  of  ABA  and  sucrose  on germination  of  encapsulated  somatic embryos of guava ( Psidium guajava L.). Sci. Hort. 117: 302-305.
Riyadi,  I.,  Sumaryono.  2009.  Pengaruh interval  dan  lama  perendaman  terhadap pertumbuhan  dan  pendewasaan  embrio somatik tanaman sagu ( Metroxylon sagu Rottb.).  J.  Menara  Perkebunan . 77(2):
101-110.
Souza,  J.M.M.,  M.L  .Tomaz,  S.C.C.  Arruda, C.G.B.  Demetrio,  W.N.  Venables,  A.P. Martinelli.  2011.  Callus  sieving  is effective  in  improving  synchronization and frequency of somatic embryogenesis in Citrus sinensis. Biologia Plantarum. 55(4): 703-707. West, M.A.L., J.J. Harada. 1993. Embryogenesis  in  higher  plants:  An overview. J. Plant Cell. 5: 1361-1369.
Wulansari,  A.,  A.  Purwito,  A.  Husni,  E. Sudarmonowati. 2015. Kemampuan regenerasi kalus embriogenik asal nuselus jeruk siam serta variasi fenotipe tunas  regeneran.  Prosiding  Seminar Nasional Masyarakat Biodiversitas
Indonesia. 1(1): 97-104.
Yulianti,  F.,  N.F.  Devy.  F.  Widyaningsih.
2012.  Evaluasi  variasi  somaklonal  pada benih  jeruk  hasil  perbanyakan  melalui embriogenesis  somatik.  J.  Hort.  22(3):
210-216.