## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
RESEARCH STUDY
PEMBERIAN EKSTRAK RUMPUT KEBAR (Biophytum petersianum Klotszch) TERHADAP VIABILITAS SPERMATOZOA MENCIT (Mus musculus) DIABETES MELITUS Prima Arundani 1 , Reny I’tishom 2 , Bambang Purwanto 3
Pascasarjana Ilmu Kesehatan Reproduksi, Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga 1
Departemen Biologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga 2 Departemen Fisiologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga 3

## ABSTRAK
Diabetes  mellitus  yang  tidak  ditangani  dengan  baik  akan  mengakibatkan infertilitas yang disebabkan oleh adanya kerusakan salah satu organ reproduksi yaitu testis.  Hiperglikemia  atau  tingginya  kadar  gula  dalam  darah  berperan  dalam kerusakan  sel  dengan  cara  peningkatan reactive  oxygen  spescies (ROS)  sehingga terjadi  stres  oksidatif  jaringan  yang  mengakibatkan  radikal  hidroksil.  Peningkatan Reactive  Oxygen  Species (ROS)  menyebabkan  cedera  sel  melalui  mekanisme peroksidasi lipid dan kerusakan oksidatif protein serta DNA. Proses lipid periksidase pada  akhirnya  merusak  membran  spermatozoa  dan  mitokondria  DNA  sehingga menyebabkan penurunan kualitas spermatozoa.
Penelitian  ini  bertujuan  mengetahui  efek  ekstrak  rumput  kebar  terhadap viabilitas  spermatozoa  mencit  jantan  ( Musmusculus) model  diabetes  melitus . Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan post  test only control group design . Ekstrak rumput kebar menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 96%. Sebanyak 30 ekor mencit yang dibagi ke dalam 5 kelompok, yaitu kelompok  kontrol  negatif  yaitu  mencit  diabates  mellitus  yang  di  sonde  cmc  na, kelompok  kontrol  positif  yaitu  mencit  diabetes  mellitus  yang  di  sonde  metformin, kelompok I, II, dan III yang di sonde ekstrak rumput kebar dengan dosis 67,5; 130; dan  270  mg/kg  BB.  Viabilitas  spermatozoa  dianalisis  dengan  mengambil  sampel spermatozoa dari kauda epididimis.
Hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan hasil yang signifikan p = 0,005 (p ˂ 0,05) pada viabilitas spermatozoa mencit diabetes mellitus dan perbedaan yang bermakna pada  kelompok  kontrol  negatif    mencit  dengan  diabetes  mellitus  dengan  kelompok perlakuan  3  yang  diberi  metformin  dan  ekstrak  rumput  kebar  dosis  270  mg/kg  BB. viabilitas spermatozoa pada kelompok kontrol negatif memiliki persentase terendah sedangkan  pada  kelompok  perlakuan  3  memiliki  persentase  tertinggi.  Simpulan penelitian  ini  adalah  ekstrak  rumput  kebar  ( Biophytum  petersianum Klotzsch) meningkatkan viabilitas spermatozoa mencit ( Mus musculus) model diabetes melitus.
Kata kunci : diabetes mellitus, viabilitas, ekstrak rumput kebar

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
RESEARCH STUDY

## PENDAHULUAN
Diabetes melitus adalah penyakit metabolik dengan karakteristik hiperglikemia yang  terjadi  karena  kelainan  sekresi  insulin,  kerja  insulin,  atau  keduanya  yang berhubungan  dengan  kerusakan  jangka  panjang,  disfungsi,  atau  kegagalan  organ tubuh. Diabetes melitus (DM) yang tidak ditangani dengan baik akan mengakibatkan penyakit  infertilitas  yang  disebabkan  oleh  adanya  kerusakan  salah  satu  organ reproduksi  pria,  yaitu  testis  yang  pada  akhirnya  dapat  menurunkan  kualitas spermatozoa  yang  berujung  pada  masalah  kesuburan  pada  pria.  Infertilitas  karena diabetes  melitus  dapat  disebabkan  oleh  kerusakan  epididimis,  menyebabkan terganggunya  migrasi  spermatozoa,  dan  mengganggu  dari  fungsi  reproduksi sehingga  dapat  ditemukan  penurunan  jumlah  sel  spermatogonium,  jumlah spermatozoa dalam testis dan epididimis, penururunan diameter tubulus seminiferus, dan penurunan motilitas (Vignera et al. , 2012). Hiperglikemia atau tingginya kadar gula dalam darah berperan dalam kerusakan sel dengan cara peningkatan reactive oxygen spescies (ROS)  yang  dapat  mengakibatkan  stres  oksidatif  jaringan  yang  akan mengakibatkan  radikal  hidroksil.  Peningkatan Reactive  Oxygen  Species (ROS)
menyebabkan cedera sel melalui mekanisme peroksidasi lipid dan kerusakan oksidatif protein  serta  DNA.  Proses  lipid  periksidase  pada  akhirnya  merusak  membran spermatozoa  dan  mitokondria  DNA  sehingga  menyebabkan  penurunan  kualitas spermatozoa.
Testis  dalam  proses  reproduksi  mempunyai  dua  fungsi  utama  yaitu memproduksi  hormon  dan  spermatozoa.  Kedua  fungsi  tersebut  secara  anatomi

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
RESEARCH STUDY
berlangsung terpisah yaitu hormon testosteron dihasilkan oleh sel Leydig, sedangkan spermatozoa  dihasilkan  oleh  sel  epitel  tubulus  seminiferus.    Selain  itu,  kadar  FSH yang  turun  pada  darah  memberikan  efek  pada  sel  Sertoli  sehingga  hormon  ABP ( Androgen Binding Protein ) tidak atau berkurang produksinya yang akibatnya  proses spermatogenesis terganggu. Kadar LH yang menurun dalam darah memberikan efek pada sel Leydig berupa menurunnya produksi hormon testosteron. Kondisi defisiensi testosteron  dapat  menyebabkan  penurunan  libido,  kualitas  ereksi  rendah,  tidak adanya spermatozoa dalam semen (Parhizkar et al. , 2013), dan penurunan kualitas spermatozoa (Agbaje et al ., 2007).
Pengobatan yang mampu memberikan efek terapi terhadap kondisi hiperglikemia dan komplikasi  pada  DM  adalah  agen  hipoglikemik,    dapat  juga  digunakan  adjuvant antioksidan  yang  akan  bekerja  dengan  menekan  stress  oksidatif  yang  ditimbulkan karena kondisi hiperglikemik.. Banyak macam dari antioksidan, beberapa diantaranya adalah glutation, beta karotin, vitamin C dan vitamin E (Ciofu dan Lykkesfeldt, 2014).
Tumbuhan yang dapat digunakan sebagai terapi herbal, salah satunya adalah rumput kebar  ( Biophytum  petersianum Klotzsch)  merupakan  tanaman  asli  Papua  dan diketahui  memiliki  kandungan  flavonoid,  dan  saponin,  dan  vitamin  E  (Hendra  dkk,
2011).    Rumput  kebar  adalah  tanaman asal  Indonesia  yang  tersebar  di  Papua  dan
Jawa.  Tanaman  ini  penampilannya  cantik,  ramping,  menyerupai  tanaman  kelapa karena hanya memiliki satu batang tanpa ada cabang, tinggi tanaman 10-12 cm, daun letaknya mengumpul di pucuk serta berpasangan. Penampakan secara visual rumput kebar  memiliki  bunga  berwarna  kuning  dan  warna  daun  hijau  muda  terutama  yang

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
tumbuh  di  Papua,  sedangkan  yang  tumbuh  di  Jawa  Barat  bentuk  daunnya  lebih panjang dan berwarna hijau tua (Wajo, 2005).
Antioksidan  tersebut  merupakan  bahan  dasar  untuk  sintesis  hormone  steroid  yang dapat memperbaiki kinerja sistem reproduksi laki-laki.  Hasil pengamatan Sembiring dan  Darwati  (2014),  menunjukkan  bahwa  aktivitas  antioksidan  pada  rumput  Kebar asal Papua lebih baik dibandingkan dari daerah lain. Hal ini ditunjukkan dengan nilai IC 50 (konsentrasi penghambatan 50%) lebih kecil yaitu 27,24 ppm. Menurut Windono dkk  (2001), nilai  IC 50  berpengaruh  terhadap  aktivitas  penangkapan  radikal  bebas.
Semakin  kecil  nilai  IC-nya,  maka  semakin  baik  aktivitas  antioksidannya  untuk menangkap radikal bebas.

## METODE PENELITIAN

## Rancangan Penelitian
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  true  eksperimental  laboratorium  yang dilakukan dalam laboratorium. Rancangan penelitian ini tergolong jenis penelitian post test only control group design .

## Populasi
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah 30 ekor mencit jantan ( Mus musculus ) dewasa.

## Sampel
Kriteria  inklusi  :  mencit  jantan  ( Mus  musculus )  dengan diabetes  mellitus  berumur 6 sampai 8   minggu dan berat badan antara 25 sampai 30 gram.

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
Kriteria  eksklusi  :  mencit  jantan  ( Mus  musculus )  yang  tidak  berhasil  dibuat  model diabetes mellitus, mencit sakit selain penyakit diabetes mellitus, mencit mati.

## Ekstrak Rumput Kebar
Rumput kebar yang sudah dikeringkan dibawah sinar matahari direbus semua bagian tanamannya baik daun, batang, dan akarnya dengan aquabidest . Sebanyak 350 gram simplisia rumput kebar yang sudah dihaluskan, dimaserasi dengan pelarut etanol 70% dengan perbandingan 1:10 dalam tabung selama 3x24 jam,  kemudian disaring dan ampasnya dimaserasi kembali sebanyak 2 kali dengan perlakuan yang sama. Maserat yang  terkumpul  kemudian  dievaporasi  menggunakan rotary  evaporator pada  suhu
30°-40°  C  hingga  terbentuk  ekstrak  kental  (Harborne,  1987).  Dosis  ekstrak  rumput kebar  ditentukan  berdasarkan  dosis  terbaik  dari  penelitian  Sadsoeitoeboen  (2005) adalah sebanyak 67,5 mg/kg bb/hari, 135 mg/kg bb/hari, dan 270 mg/kg bb/hari.

## Induksi mencit menjadi diabetes melitus
Pembuatan sediaan streptozotocin dan penginduksian diabetik (Purwanto dan Liben,
2014), pertama kali persiapan mencit dipuasakan terlebih dahulu selama 4 jam untuk mengosongkan  lambung  dan  mengurangi  aspirasi.  Kebutuhan  dosis  induksi streptozotocin  40  mg/kg  BB.  Streptozotocin  dilarutkan  dalam  dapar  sitrat  dengan konsentrasi  streptozotocin  22,5  mg/ml.  Larutan  streptozotocin  diinjeksikan  melalui intraperitoneal mencit. Induksi diulang setiap hari dengan dosis yang sama selama 5 hari. Larutan sukrosa 10% diberikan sepanjang malam setelah induksi. Setelah 3 hari, diperiksa gula darahnya dengan mengambil sampel darah dengan spuit needle 30 G di bagian ekor medial mencit.

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021

## Penentuan dosis obat metformin
Penentuan  dosis  pada  mencit  didasarkan  pada  mencit  dihitung  berdasarkan  pada dosis
standar yang diberikan pada manusia. Dosis yang diberikan sebanyak 750 mg. Dosis yang diberikan pada mencit ditentukan berdasarkan penghitungan konversi dosis (Laurence dan Bacharah, 1964).

## Pengambilan spermatozoa
Spermatozoa  diambil  dari  mencit  yang  telah  diinduksi  oleh  streptozotocin  sehingga menjadi diabetes melitus. Untuk mendapatkan spermatozoa di dalam sekresi kauda epididimis  dilakukan  menurut  Soehadi  dan  Arsyad  (1983).  Spermatozoa  diambil  di kauda  dari  epididimis  setelah  mencit  di  terminasi  ( dislocating  the  cervical ).  Kauda epididimis diperoleh dengan cara sayatan pada bagian tengah bawah  abdomen, di kauda  epididimis  adalah  tepat  dibawah  testis.  Kauda  epididimis  diperoleh  dengan menyingkirkan  sebisa  mungkin  darah  dan  lemak.Kauda  epididimis  dicuci  di  MEM ( Minimum  Essential  Medium )  media  dan  diletakkan  pada petri  dish .  Gunting  steril digunakan untuk memotong kauda epididimis sehingga spermatozoa akan keluar dari duktus. Spermatozoa dikoleksi dan dicuci di dalam media cuci.

## Penghitungan Viabiltas Spermatozoa
Viabiltas  spermatozoa  diamati  melalui  warna  dimana  spermatozoa  hidup  nampak translusen dan spermatozoa mati berwarna merah. Satu tetes suspensi spermatozoa (40  µL)  diletakkan  pada  gelas  objek,  kemudian  ditambahkan  10µL  Eosin-Y  0,5  %, kemudian dicampur. Hasil campuran ditutup dengan penutup gelas objek.Pengamatan  dilakukan  dengan  mikroskop  pembesar  400  kali.  Spermatozoa

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
RESEARCH STUDY
hidup  nampak  translusen  dan  spermatozoa  mati  berwarna  merah.Pengamatan dilakukan pada 200 spermatozoa dalam 10 lapangan pandang secara random.
Perhitungan  viabilitas  spermatozoa  dilakukan  dengan  metode  Partodiharjo  (1992).
Persentase  viabilits  spermatozoa  dihitung  dengan  perhitungan  jumlah  spermatozoa hidup  dibagi  dengan  jumlah  spermatozoa  yang  diamati  dikali  100%.  Spermatozoa yang  masih  hidup  tidak  berwarna  sedangkan  yang  sudah  mati  berwarna  merah (Bansal dan Bilaspuri, 2008)
% 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡𝑎𝑠 =

## Jumlah spermatozoa hidup
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑝𝑒𝑟𝑚𝑎𝑡𝑜𝑧𝑜𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑎𝑚𝑎𝑡𝑖 𝑥 100%

## Perlakuan
Sampel  menggunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  30  ekor  mencit  jantan ( Musmusculus ) dewasa, berumur 6-8 minggu, dan berat badan 25-30 gram. Sampel dibagi secara acak ke dalam 5 kelompok perlakuan, sebagai berikut :
Kelompok1:Kelompok  kontrolnegatif,    merupakan  kelompok  yang  diinduksi  dengan streptozotocin dan diberi CMC Na.
Kelompok 2 : Kelompok kontrol positif, merupakankelompok yang diinduksi dengan streptozotocin dan diberi metformin dosis 2 mg.
Kelompok  3  :  Kelompok  perlakuan  1,  merupakan  kelompok  yang  diinduksi  dengan streptozotocin + metformin dosis 2 mg + ekstrak etanol rumput kebar dosis 67,5 mg/kg BB.
Kelompok  4  :  Kelompok  perlakuan  2,  merupakankelompok  yang  diinduksi  dengan streptozotocin + metformin dosis 2 mg + ekstrak etanol rumput Kebar dosis 137 mg/kg BB.

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
Kelompok  5  :  Kelompok  perlakuan  3,  merupakankelompok  yang  diinduksi  dengan streptozotocin + metformin dosis 2 mg + ekstrak etanol rumput Kebar dosis 270 mg/kg BB.

## Analisa Data
Untuk  menguji  distribusi  normalitas  data  menggunakan  Saphiro  Wilk,  apabila  data berdistribusi normal analisis data dilanjutkan dengan uji parametrik One Way ANOVA dengan derajat signifikansi α=0,05. Apabila hasil bermakna analisis data dilanjutkan dengan uji Post Hoc LSD. Apabila hasil distribusi data tidak normal maka dilakukan uji  non  parametrik  Kruskall Wallis  dan  jika  hasil  bermakna  analisis  data  dilanjutkan dengan uji Mann Whitney.

## HASIL
Pengaruh pemberian ekstrak rumput kebar (Biophytum petersianum Klotszch) pada viabilitas spermatozoa mencit (Mus musculus) model diabetes mellitus
Uji  normalitas  menggunakan Saphiro  Wilk karena  sampel  kecil  dengan  jumlah  30.
Hasil untuk uji normalitas pada viabilitas spermatozoa didapatkan p tidak normal (p ˂
0,05).
Tabel 1 Pengaruh pemberian ekstrak rumput kebar ( Biophytum petersianum Klotszch) pada viabilitas spermatozoa mencit ( Mus musculus ) model diabetes mellitus Kelompok N Mean Median Minimum Maksimum K - 6 5,33 26 15 55 K + 6 15,67 54 44 62 P 1 6 14,33 52 43 77 P 2 6 17,75 59,5 51 62 P 3 6 24,42 71,5 53 76 Ket: K- : induksi streptozotocin. K+: induksi streptozotocin + metformin.
P1:induksi streptozotocin+metformin+rumput kebar dosis 67,5 mg/kgBB. P2 :induksi streptozotocin+metformin+rumput kebar dosis 130 mg/kgBB. P3: induksi streptozotocin+metformin+rumput kebar dosis 270 mg/kgBB.

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
RESEARCH STUDY
Data pada tabel menggambarkan nilai rata-rata distribusi viabilitas spermatozoa per kelompok.  Hasil  uji  normalitas  didapatkan  berdistribusi  tidak  normal,  sehingga dilanjutkan  uji  non  parametrik  Kruskal  Wallis  berdasarkan  kelompok  dengan  hasil signifikan p = 0,005 pada persentase viabilitas spermatozoa mencit diabetes melitus (kelompok kontrol K- dan K+) dengan α ˂ 0,05, terhadap kelompok mencit diabetes melitus  yang  diberi  metformin  dan  ekstrak  rumput  kebar  pada  seluruh  kelompok perlakuannya (P1, P2, P3).  Dilanjutkan dengan uji Mann Whitney untuk mengetahui perbedaan yang bermakna pada setiap kelompok dan didapatkan hasil adanya beda yang paling bermakna pada kelompok P3 dengan K- dengan nilai p = 0,04, kemudian tidak ada beda antara K- dengan seluruh kelompok (K+, P1, dan P2) dengan nilai p = 0,05.
Gambar  1  Diagram  Batang  Pengaruh  pemberian  ekstrak  rumput  kebar  ( Biophytum petersianum Klotszch) pada viabilitas spermatozoa mencit ( Mus musculus ) model diabetes mellitus

## PEMBAHASAN
Pemberian  ekstrak  rumput  kebar  menunjukkan  pengaruh  yang  signifikan  terhadap persentase  daya  hidup  (viabilitas)  spermatozoa  (p  ˂  0,05)  pada  seluruh  kelompok perlakuan (P1, P2, P3) dibandingkan kelompok kontrol (K- dan K+). Ekstrak rumput
0 5 10 15 20 25 K - K + P 1 P 2
P 3

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
RESEARCH STUDY
kebar  memberikan  pengaruh  terhadap  persentase  viabilitas  spermatozoa  mencit diabetes  mellitus  terutama  pada  kelompok  perlakuan  dengan  dosis  270  mg/kg  BB (P3). Pada viabilitas kelompok kontrol negatif memiliki persentase yang paling rendah sebesar median 26  dengan  rentang  nilai  minimum  15  dan  nilai  maksimum  55,
sedangkan  pada  kelompok  perlakuan  dengan  dosis  270  mg/kg  BB  (P3)  memiliki persentase  tertinggi  pada  perlakuan  3  sebesar median 71,5  dengan  rentang  nilai minimum  53  dan  nilai  maksimum  76.  Kelompok  negatif  menunjukkan  viabilitas spermatozoa yang paling buruk, sedangkan pada kelompok perlakuan 3 yang diberi penambahan metformin dan ekstrak rumput kebar dosis 270 mg/kg BB menunjukkan hasil yang paling baik. Hasil penelitian ini mendukung hasil penelitian Meliyana (2016) tentang  pengaruh  rebusan  daun  binahong  ( Anredera  cordifolia )  terhadap  kualitas spermatozoa mencit ( Mus musculus) diabetes.
Senyawa  flavonoid  dan  vitamin  E  pada  ekstrak  rumput  kebar  sebagai  antioksidan endogen  yang  melindungi  sel  dari  kerusakan  oleh  radikal  bebas.  Flavonoid  sangat efektif  dalam  mencegah  peroksidase  lipid  dan  peroksidase  lipid  bertanggungjawab pada proses rusaknya membran spermatozoa dan DNA mitokondria pada penderita penyakit diabetes mellitus. Phospholipid mempunyai peranan penting dalam struktur dan aktivitas pada spermatozoa. Bila struktur membran sel spermatozoa tidak rusak (integritas utuh) maka viabilitas spermatozoa akan tetap baik.selain itu flavonoid dan vitamin  E  pada  rumput  kebar  yang  cukup  tinggi  dapat  mengakibatkan  produksi testosteron  mengalami  perubahan.  Testosteron  merupakan  homon  yang  penting untuk  spermatogenesis  dan  maturasi  spermatozoa  sehingga  perubahan  kadar testosteron  akan  berdampak  langsung  terhadap  jumlah,  morofologi,  dan  viabilitas

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
RESEARCH STUDY
spermatozoa.  Pemberian  ekstrak  rumput  kebar  dalam  proses  spermatogenesis mencit selama 35,5 hari dapat menyebabkan efek umpan balik negatif LH di hipofisis sehingga  memberikan  sinyal  kepada  sel  Leydig  mengurangi  sintesis  testosteron.
Kondisi  ini  dapat  memengaruhi  spermatogenesis  dan  maturasi  spermatozoa  di epididimis.
Secara  deskriptif  spermatozoa  yang  memiliki  viabilitas  baik  pada  bagian  kepalanya tidak berwarna akibat pemberian zat pewarna, tidak demikian dengan spermatozoa yang mempunyai viabilitas jelek, pada bagian kepalanya akan berwarna  merah yang disebabkan karena masuknya zat warna akibat membran kepala sperma yang rusak (Ellya, 2010).

## KESIMPULAN
Pemberian  ekstrak  rumput  kebar  ( Biophytum  petersianum Klotzsch)  dapat meningkatkan viabilitas spermatozoa mencit ( Mus musculus ) model diabetes mellitus.
Dosis terbaik untuk penelitian ini adalah 270 mg/kg BB.

## REFERENSI
Agbaje I.M., D.A. Rogers, D.A. McVicar, N. McClure, A.B. Atkinson, C. Mallidis. 2007. ‘Insulin  dependant  diabetes  melitus:  implications  for  male  reproductive function’. Human Reproduction 22(7): 1871-1877.
Bansal A.K. and G.S. Bilaspuri. 2008. Effect of manganese on bovine sperm motility, viability, and lipid peroxidation in vitro. Anim. Reprod. 5(3):90-96 Ciofu O. and J. Lykkesfeldt. 2014. ‘Antioxidant supplementation for lung disease in cys tic fibrosis’. Cochrane Database Syst Rev . 7:8.
Ellya E.S. 2010. Kesehatan reproduksi dan wanita . Jakarta: Trans info medika. Harbone  J.B.  1987. Metode  fitokimia:  penentuan  cara  modern  menganalisis tumbuhan. Edisi  Kedua.  Kosasih  P  dan  Iwang  S,  penerjemah.  Bandung  (ID): ITB  Pr.  Terjemahan  dari:  Phytochemical  Methods:  A  Guide  to  Modern Techniques of Plant Analysis.
Hendra  R.,  S.  Ahmad,  A.  Sukari,  M.Y.  Shukor,  A.  Oskoueian.2011.  ‘Flavonoid analyses  and  antimicrobial  activity  of  various  parts  of Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl fruit’. Int J Mol Sci . 12(6):3422-31.

## Oceana Biomedicina Journal OBJ
ocean-biomedicina.hangtuah.ac.id/index.php/journal
eISSN 2614-0519 Volume 4 Issue 1: January – June 2021
RESEARCH STUDY
Laurence and Bacharach, 1964, Evaluation of Drug Activities Pharmacometrics, cit: Ngatidjan, 1990, Metode Laboratorium dalam Toksikologi, reviewer: Hakim, L., Pusat Antar Universitas Bioteknologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Meliyana  Y.,  Sudiastuti,  R.A.  Nugroho.  2016.  ‘Pengaruh  rebusan  daun  binahong ( Anredera cordifolia ) terhadap kualitas spermatozoa mencit’. Bioprospek:Jurnal Ilmiah Biologi. Vol.11(2):32-40.
Parhizkar S., M.J. Yusoff, M.A. D ollah, 2013.‘Effect of Phaleria macrocarpa on sperm characteristics in adult rats’. Adv Pharm Bull . 3(2): 345-52.
Partodiharjo S. 1992. Ilmu reproduksi hewan . Jakarta. Mutiara. Purwanto B dan P. Liben.2014. Model hewan coba untuk penelitian diabetes .Surabaya. Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga. Sadsoeitoeboen P.D. 2005. Manfaat ekstrak rumput  kebar (Biophytum petersianum Klotzsch) terhadap penampilan reproduksi mencit putih betina (Tesis). Fakultas Kedokteran Hewan, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. 62 hlm.
Sembiring S.B.danI. Darwati . 2014. ‘Identifikasi komponen kimia aksesi rumputkebar ( Biophytum petersianum Klotzsch) asal Papua dan Jawa’. Bul. Littro . Vol 25, No 1.
Soehadi K. dan K.M. Arsyad. 1983. Analisis sperma . Surabaya. Airlangga University press.
Vignera L.S., R. Condorelli, E. Vicari, R. D’Agata, A. Calogero. 2012.‘Diabetes melitus and sperm parameters’. Journal of Andrology . 33(2): 145-152.
Windono T., Soediman, S. Yudawati, U. Ermawati, E. Erowati dan T. Inayah. 2001.
‘Uji perendaman radikal bebas terhadap 1,1- Diphenyl -2- picrylhydrazyl (DPPH) dari  ekstrak  kulit  buah  dan  biji  anggur  ( Vitis  vinifera L.)  Probolinggo  Biri  dan Bali’. Artocarpus . 1(1): 34-43.