## PENGARUH EKSTRAK TEH KOMBUCHA (Medusomyces gisevii) TERHADAP BERAT DAN HISTOPATOLOGIS LIMPA TIKUS WISTAR (Rattus norvegicus) YANG DIINFEKSI Escherichia coli
Nurul Hidayah 1* , Indra Rahmawati 1 , Jessica Amelia 1 ,Yos Adi Prakoso 1
1 Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Wijaya Kusuma Surabaya *Email: nurulhidayah78@uwks.ac.id

## Abstract
This study aimed to determine effect extracted from tea kombucha (Medusomyces gisevii) on the weight and histopatica of the wistar mouse’s (Rattus norvegicus) spleen infected with Escherichia coli. The study used 24 male wistar mouse divide into 6 group and 4 repetitions. The mouse were given extract of kombucha tea for 28 days after 1 week of adaptability. The group consisted of positive control (K+), negative control (K-), 30% concentration (P1), 40% concentration (P2), 50% concentration (P3), 60% concentration (P4). Groups K+, P1, P2, P3, P4 were infected by Escherichia coli on 36 th with a dose of 10 6 CFU/ml as much as 1 ml intraperitoneally. Spleen organ harvesting was executed on the 40 th . Data analysis used Analysis Of Variance (ANOVA) and Duncan’s Multiple Range Test (DMRT). The  result  showed  that  there  was  no  significant  difference  between  treatments  in  spleen  weight. Histopathological spleen showed a highly significant difference between treatments. The highest results was at a concentration of 60% (P4) with a white pulp diameter of 440,6 μm , a germinal center diameter of 227,3 μm and marginal zone widht 171,6 μm . The conclusion of the study, kombucha tea extract had an effect on spleen weight, white pulp diameter, germinal center and marginal zone widht at dose of 60% and 40%.
Keywords:  Extract  of  kombucha  tea,  Spleen  weight,  The  diameter  of  white  pulp,  The  diameter  of germinal center, The margin zone.

## PENDAHULUAN
Escherichia  coli merupakan  flora  alami dalam  usus mamalia. Bakteri ini dapat bersifat menguntungkan  dan  juga  merugikan  seperti menyebabkan  diare. Escherichia  coli yang awalnya  bersifat  non  patogen  memperoleh tambahan  gen  virulensi  dari  mikroorganisme lain  melalui  mekanisme  perpindahan  gen, perpindahan  plasmid  akan  berubah  menjadi bakteri  patogen.  Penyakit  yang  diakibatkan EscherichRia  coli patogen  berbeda  tergantung virulensi  dan  mekanisme  patogenesisnya (Rahayu  dkk.,  2018).  Faktor  lain  juga  dapat mendukung  patogenitas Escherichia  coli seperti sistem imun pada hewan, umur hewan, lingkungan dan intensitas infeksi strain patogen (Dewandaru dkk., 2019.
Sistem  kekebalan  dapat  ditingkatkan dengan pemberian imunomodulator. Imunomodulator dapat menekan dan merangsang  aspek-aspek  yang  bekerja  dalam kekebalan  tubuh  (Agnesa  dkk.,  2017).  Bahan alami yang dijadikan sebagai imunomodulator
dalam  penelitian  ini  adalah  ekstrak  teh kombucha. Teh kombucha mengandung bahan kimia  berupa  asam  fenolat,  polifenol,  asam asetat  dan  flavonoid  yang  dapat  menghambat kerja Escherichia coli patogen (Ivanisova et al .,
2019).
Flavonoid  yang  terdapat  di  dalam  ekstrak teh  komucha,  dapat  meningkatkan  dan memperbaiki  sistem  kekebalan  tubuh  karena dapat  meningkatkan  aktivitas  organ  limfoid. Organ  limfoid  yang  akif  ditandai  dengan proliferasi limfosit (Rochmawati, 2015). Salah satu  organ  limfoid  terbesar  di  dalam  tubuh adalah limpa. Limpa merupakan organ limfoid sekunder  yang  responsif  terhadap  stimulasi antigen (Arfanda dkk., 2019). Parenkim limpa tersusun  oleh  pulpa  putih  dan  pulpa  merah. Pulpa  putih  menjadi  tempat  berkumpul  dan berproliferasinya  limfosit  (Matheos  dkk., 2013).
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh ekstrak teh kombucha ( Medusomyces gisevii ) terhadap berat dan histopatologis limpa tikus wistar ( Rattus norvegicus ) yang di infeksi
Eschericia  coli yang  belum  diketahui  secara pasti, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menjawab pertanyaan tersebut.

## MATERI DAN METODE

## Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium Pathology  dan  Laboratorium  Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Wijaya  Kusuma  Surabaya,  Laboratorium Hewan Coba Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga  Surabaya  dan  Laboratorium  Padia Surabaya.  Penelitian  dilakukan  pada  bulan Maret 2021.

## Alat
Kandang tikus ukuran 900 cm 2 dengan alas berupa  sekam  kayu,  sonde  lambung,  toples kaca, kain saring, glove, timbangan, alat bedah minor ( scalpel , gunting bedah, pinset), syringe, spatula, object  glass ,  mikroskop, cover  glass , botol wadah ekstrak teh kombucha, inkubator, shaker, bunsen,  korek  api,  cawan  petri,  pipet tetes,  gelas  ukur, autoklaf ,  jarum  ose, microtube, laminar air flow, timer , kapas steril, gelas beker, batang pengaduk.

## Bahan
24 ekor tikus wistar jantan umur 2-3 bulan dengan berat badan 250-300 gram, ekstrak teh kombucha 1 ml, ethanol, metanol 96%, alkohol konsentrasi  bertingkat,  giemsa, Escherichia coli sebanyak  1  ml    dengan  pengenceran  10 6 colony forming unit (CFU)/1 ml, formalin 10%, pakan  tikus  berupa  pelet  5g/100g  BB,    air minum  8-11ml/100g  BB,  organ  limpa  tikus wistar,  parafin, xylol,  mcfarland ,  hematoksilin eosin, aquades , perekat entellan, zoletil .

## Metode penelitian
Jenis  penelitian  menggunakan  percobaan eksperimental laboratorium, dengan menggunakan metode rancangan acak lengkap (RAL)  yaitu,  mengambil  sample  secara  acak dan  dilakukan  pemberian  tanda  kemudian ditempatkan  pada  masing  masing  kelompok perlakuan. Sampel dibagi menjadi 6 perlakuan dan  masing-masing  kelompok  diberi  4  ekor tikus  wistar  jantan.  Perhitungan  mengunakan rumus Federer, sebagai berikut : sehingga, didapatkan banyak sampel pada tiap kelompok  percobaan  sebanyak  4  ekor  tikus
putih.  Total  sampel  utama  yang  digunakan sebanyak 24 ekor tikus wistar.

## Prosedur Penelitian
Mengadaptasi  24  ekor  tikus  wistar  jantan yang berumur  2 hingga 3 bulan dikandangkan selama 7 hari dan diberi pelet 5 g/100g BB/hari dan air sekitar 8-11 ml/100g BB/hari agar berat badan  dari  hewan  coba  seimbang  mencapai berat sekitar 250 - 300 gram.
Alat disterilkan terlebih dahulu pada suhu 150 o C  selama  90  menit  menggunakan  oven.
Selanjutnya  lakukan  pengkulturan  kombucha dengan mendiamkan  starter  kombucha  selama 14 hari dengan suhu ruang dalam media berupa larutan  teh  hitam  yang  sudah  didinginkan  dan dicampur  dengan  gula  sebanyak  10%.  Wadah ditutup  dengan  kain  saring  dan  diikat  dengan karet  gelang.  Starter  kombucha  SCOBY didapatkan dari pihak komersil (indokombucha) penginokulasian ini disesuaikan dengan Setiani (2014).
Teh  hitam  diperoleh  dengan    memasukan daun teh hitam sebanyak 8 gram ke dalam 500 ml air yang sudah di didihkan dan penambahan gula  pasir  sebanyak  50  gram  dan  lakukan penghomogenan.  Ampas  dipisahkan  dengan menyaring  larutan  teh  hitam  manis.  Starter kombucha sebanyak 50 ml dimasukan kedalam larutan  teh  hitam  manis  yang  sudah  disaring dan  didinginkan.  Wadah  ditutup  dengan  kain saring  dan  diikat  dengan  karet  gelang  lalu simpan  dalam  suhu  ruang  selama  14  hari  dan hindarkan dari sinar matahari langsung  (Safitri, 2020).
Immunomodulator  ekstrak  teh  kombucha diberikan  pada  hewan  coba  pada  hari  ke  8 dengan cara sonde lambung peroral selama 28 hari.  Dosis  konsentrasi  bertingkat  yaitu  30%, 40%, 50% dan 60%. Dosis disesuaikan dengan Effendi dkk (2014) yaitu didapatkan konsentrasi  minim  pada  ektrak  teh  kombucha yang  berpengaruh  pada Escherichia  coli
(t-1) (n-1) ≥ 15
(6-1) (n-1) ≥ 15
5n ≥ 20 n ≥ 20/5
n ≥ 4
sebesar  40%  keatas,  sedangkan  dibawahnya masih terlihat adanya pertumbuhan dari bakteri Escherichia coli . Penelitian ini menguji apakah konsentrasi dibawah dan diatas nilai 40% dapat mempengaruhi berat dan gambaran histopatologis  dari  limpa  tikus  wistar  jantan. Kultur murni Escherichia coli di  dalam MHA miring  pada  media  EMBA  diswab,  untuk diremajakan selama 3 hari.
Inokulasi dilakukan dengan menggunakan ose  streril,  kemudian  diinkubasi pada suhu  37 o C  selama 24 jam. Pembuatan suspensi bakteri sebanyak 80 ml dan disetarakan dengan larutan McFarland I dengan populasi 1,5 x 10 6 colony forming unit (CFU)/1 ml dan diencerkan 1000 x  pipet  1  ml  (Towoliu,  2013).  Hewan  coba diijnjeksi  pada  hari  ke  36  intra  peritoneum (Agnesa,  2017). Escherichia  coli diinjeksikan dengan dosis 10 6 cfu/ml sebanyak 1 ml karena menurut  Arief  dkk.  (2010)  EPEC  atau Escherichia  coli  entero  pathogenik dapat bersifat  patogen  pada  dosis  10 5 cfu/ml  hingga 10 10 colony form unit (CFU)/ml.
Hal  ini  juga  diperkuat  oleh  Effendi  dkk
(2014) bahwa akan terjadi gangguan pada tubuh seperti diare, kram pada perut, juga migrain jika bakteri Escherichia coli yang masuk sekitar 10 6 cfu/ml.  Pemberian  sebanyak  1  ml  disesuaikan dengan  jurnal  pada  penelitian  Towoliu  dkk (2013).  Hari  ketiga  pasca  infeksi  dilakukan eutanasia  dengan  menggunakan  ketamin  pada hewan coba dan pengambilan organ limpa pada hewan coba yang sudah dieuthanasi yang sudah melalui  uji  etik.  Masa  inkubasi  bakteri umumnya  selama  48  jam  (Kobayashi  dkk., 2015).
Organ  limpa  yang  sudah  diambil  dari hewan  coba  dicuci  dengan  larutan  PBS, kemudian dilakukan penimbangan berat limpa ditiap  kelompok  perlakuan  dan  hasil  dicatat untuk nantinya dibandingkan antara kelompok perlakuan  yang  satu  dengan  kelompok perlakuan  yang  lain.  Berat  limpa  tikus umumnya  berkisar  0,2%  dari  BB,  berat  organ limpa  tikus  jantan  normal  yaitu  0,72  sampai 1,10 gram (Anindya dkk., 2019).
Organ limpa yang sudah difiksasi di dalam larutan  formalin  10%  diambil  dan  dicelupkan ke  dalam  aquades.  Organ  dipotong  5  mm menggunakan  microtom.  Potongan  limpa direndam  dalam  formalin  10%  dan  direndam pada larutan etanol secara berturut-turut dengan konsentrasi  bertingkat  yaitu  konsentrasi  70%,
80%,  dan  95%.  Setiap  tingkatan  konsentrasi dilakukan  selama  20  menit  dan  2x  perlakuan. Perendaman selama 20 menit juga dilakukan ke dalam larutan propanol dengan 3x perlakuan.
Penjernihan dilakukan sebanyak 2x dengan menggunakan xylol dan pemanasan selama 60 menit. Preparat potongan limpa dipindahkan ke dalam  blok  preparat  parafin  cair  selama setengah  jam  dan  dinginkan.  Potong  preparat yang  sudah  tercetak  sebesar  lima  mikron dengan microtom kemudian  panaskan  dengan inkubator.  Pengolesan  kaca  preparat  dengan albumin  atau  perekat  entellan  dan  letakan preparat diatasnya agar saling merekat. Preparat dicuci  dengan  air  dan  dicelupkan  ke  dalam pewarnaan hematoksilin eosin. Preparat didiamkan pada suhu ruangan dan tutup dengan object glass (Raharjaningtyas, 2013). Pengamatan pada gambaran histopatologis,  dilakukan  oleh  Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Wijaya Kusuma Surabaya. Dilakukan  dengan  pengamatan  pada  diameter pulpa putih, diameter germinal center dan lebar zona  marginalis  dibawah  mikroskop  cahaya pada perbesaran 40X dan dilakukan pengambilan gambar dengan camera smartphone  dan  dikalibrasi  dengan  dukungan Software image J .
Data pengamatan berat dan histopatologis limpa  pada  tikus  putih  dianalisa  dengan  uji ANOVA  ( Analysis  Of  Variance )  untuk mengetahui signifikan atau tidaknya nilai rata- rata  kelompok  sampel,  kemudian  dilanjutkan uji  DMRT  ( Duncan’s  Multiple  Range )  untuk mengetahui  perbedaan  diantara  kelompok perlakuan. Data dianalisa dengan menggunakan SPSS ( Statistical Program For Social Science ) versi 15.

## HASIL
Gambar 1. Diagram Berat Limpa
Tabel 1 . Hasil fitokimia ektrak teh kombucha dianalisa secara kuantitatif
0 5 K- K+ P1 (30%)P2 (40%)P3 (50%)P4 (60%) Berat limpa
Senyawa Kandungan % Flavonoid 3,74% Polifenol 7,88% Asam phenolat 3,91% Asam asetat 3,85%

## Berat Limpa
Hasil  statistik  ANOVA  berat  limpa  F hitung < F tabel 0,05 sehingga dapat diartikan terdapat  perbedaan yang  tidak  nyata  (non significant) di antara perlakuan (Kusriningrum, 2019).
Tabel 2 . Analysis Of Variance (ANOVA) berat limpa
Sumber Keraga man (S.K.) Dera jat Beba s (d.b. ) Juml ah Kuad rat (J.K.) Kuad rat Teng ah (K.T. ) F. Hitu ng F. Tabel 0,0 5 0,0 1 Perlaku an 5 1,446 0,289 0,91 8 2,7 7 4,2 5 Galat Percoba an 18 5,671 0.315 Total 23 7,117
Data  hasil  pengamatan  dianalisa  dengan  menggunakan SPSS  ( Statistical  Program  For  Social  Science )  metode Duncan’s  Multiple  Range  Test untuk  melihat  adanya pengaruh antar perlakuan.
Tabel 3. Duncan’s Multiple Range Test
(DMRT) berat limpa Perlakuan Mean ± SD K- 1,6250 a ± 0,17711 K+ 2,0250 a ± 0,36629 P1 1,5675 a ± 0,46133 P2 1,6425 a ± 0,59016 P3 1,8850 a ± 0,76909 P4 2,2475 a ± 0,75641 Keterangan : Perbedaan superskrip pada kolom yang sama menunjukan beda nyata.
Hasil analisa uji DMRT menunjukan berat limpa  pada  setiap  kelompok  kontrol  (K-,  K+) dan  perlakuan  (P1,  P2,  P3,  P4)  tidak  terdapat perbedaan  yang  terlihat  pada  notasi  (a). Hipotesis  pada  berat  limpa  didapatkan  H0 diterima dan HI ditolak.
Tabel 4. Hasil rerata pemeriksaan histopatologis limpa
Perlakuan Diameter pulpa putih (µm) Diameter germinal center (µm) Lebar Zona marginalis (µm) K- 295,52 117,84 91,03 K+ 378,61 179,30 96,65 P1(30%) 340,98 157,27 123,93 P2(40%) 423,83 200,84 145,48 P3(50%) 229,20 120,73 103,73 P4(60%) 440,66 227,29 171,63

## Diameter pulpa putih
Tabel  5 . Analysis  Of  Variance (ANOVA) diameter pulpa putih
Sumb er Kerag aman (S.K.) Deraj at Beba s (d.b.) Jumlah Kuadra t (J.K.) Kuadr at Tenga h (K.T.) F. Hitu ng F. Tabel 0 , 0 5 0, 0 1 Perlak uan 5 128480 ,741 25696 ,148 24,1 76* * 2 , 7 7 4, 2 5 Galat Perco baan 18 19132, 175 1062, 899 Total 23 147612 ,916
Hasil  statistik  ANOVA  diameter  pulpa putih, F hitung > F tabel 0,01 yang menandakan terdapat  perbedaan sangat  nyata ( highly significant ) diantara perlakuan. H0 ditolak dan HI  diterima,  kemudian  dilanjutkan  uji  DMRT untuk  mengetahui  perlakuan  mana  yang memberikan pengaruh tertinggi dan terendah.
Tabel 6. Duncan’s Multiple Range Test
(DMRT) diameter pulpa putih
Hasil  analisa  uji  DMRT  menunjukan diameter  pulpa  putih  terbesar  ditunjukan  pada
Perlakuan
Mean ± SD
K- 295,52 b ± 47,75985 K+ 378,61 cd ± 28,02645 P1 340,98 bc ± 22,78324 P2 423,83 de ± 47,74712 P3 229,19 a ± 11,20549 P4 440,66 e ± 19,65909
kelompok P4 dengan notasi (e), dan dilanjutkan P2  sebagai  notasi  tertinggi  kedua  (de). Diameter  pulpa  putih  terkecil  pada  kelompok P3  dengan  notasi  (a),  dan  dilanjutkan  dengan notasi  (b)  pada  perlakuan  kontrol  sehat  yang tidak  berbeda  nyata  dengan  kelompok  P1 dengan notasi (bc). Kelompok P4 (ekstrak teh kombucha 60%) dan P2 (ekstrak teh kombucha 40%)  memberikan  pengaruh  tertinggi  pada diameter pulpa putih.
Germinal center
Tabel 7. Analysis Of Variance (ANOVA) diameter germinal center
Keterangan : Perbedaan superskrip pada kolom yang sama menunjukan beda nyata.
Hasil statistik ANOVA diameter germinal center  ,  F  hitung  >  F  tabel  0,01  yang menandakan terdapat perbedaan sangat nyata (highly  significant) diantara  perlakuan.H0 ditolak dan HI diterima, kemudian dilanjutkan uji  DMRT  untuk  mengetahui  perlakuan  mana
yang  memberikan  pengaruh  tertinggi  dan terendah.
Tabel  8 . Duncan’s Multiple Range Test
(DMRT) diameter germinal center Perlakuan Mean ± SD K- 117,84 a ± 6,24097 K+ 179,29 bc ± 9,72786 P1 157,27 b ± 25,41666 P2 200,84 cd ± 32,66073 P3 120,74 a ± 8,85664 P4 227,30 d ± 8,14663
Keterangan : Perbedaan superskrip pada kolom yang sama menunjukan beda nyata
Hasil  analisa  uji  DMRT  menunjukan diameter  germinal  center  terbesar  pada kelompok  P4  dengan  notasi  (d),  yang  tidak berbeda  nyata  dengan  P2  dengan  notasi  (cd). Diameter  germinal  center  terkecil  pada kelompok  kontrol  dan  P3  dengan  notasi  (a). Kelompok P4 (ekstrak teh kombucha 60%) dan P2  (ekstrak  teh  kombucha  40%)  memberikan pengaruh  tertinggi  pada  diameter  germinal
center.
Gambar  3 .  Diagram  batang  rerata  diameter germinal center
Lebar zona marginalis
Tabel 9. Analysis Of Variance (ANOVA)
lebar zona marginalis Sumbe r Keraga man (S.K.) Der ajat Beb as (d.b. ) Jumla h Kuadr at (J.K.) Kuad rat Teng ah (K.T. ) F. Hitun g F. Tabel 0, 05 0, 01 Perlak uan 5 19810 ,276 3962, 055 18,10 9** 2, 77 4, 25 Galat Percob aan 18 3938, 143 218,7 86 Total 23 23748 ,420 Sumb er Kerag aman (S.K.) Der ajat Beb as (d.b .) Jumla h Kuad rat (J.K.) Kuad rat Teng ah (K.T. ) F. Hitu ng F. Tabel 0, 05 0, 01 Perlak uan 5 3833 2,748 7666 ,550 23,1 02** 2, 77 4, 25 Galat Perco baan 18 5973, 354 331, 853
Total 23 4430
6,102 295 378 340 423 229 440 220 270 320 370 420 K- K+ P1
(30%) P2 (40%) P3 (50%) P4 (60%) Diameter pulpa putih
Gambar 2. Diagram batang rerata diameter pulpa putih
117 179 157 200 120 227 110 135 160 185 210 235 K-
K+ P1
(30%) P2 (40%) P3 (50%) P4 (60%) Diameter germinal center
Hasil  statistik  ANOVA  lebar  zona marginalis,  F  hitung  >  F  tabel  0,01  yang menandakan terdapat perbedaan sangat nyata (highly  significant) diantara  perlakuan.  H0 ditolak dan HI diterima, kemudian dilanjutkan uji  DMRT  untuk  mengetahui  perlakuan  mana yang  memberikan  pengaruh  tertinggi  dan terendah.
Tabel 10 Duncan’s Multiple Range Test
(DMRT) lebar zona marginalis
Sumb er Kerag aman (S.K.) Der ajat Beb as (d.b .) Jumla h Kuad rat (J.K.) Kuad rat Teng ah (K.T. ) F. Hitu ng F. Tabel 0, 05 0, 01 Perlak uan 5 1981 0,276 3962 ,055 18,1 09** 2, 77 4, 25 Galat Perco baan 18 3938, 143 218, 786 Total 23 2374 8,420
Hasil analisa uji DMRT menunjukan lebar zona  marginalis  terbesar  pada  kelompok  P4 dengan notasi (d), kemudian P2 dengan notasi tertinggi  kedua  (c).  Lebar  zona  marginalis terkecil  ditunjukan  pada  kelompok  kontrol dengan  notasi  (a),  yang  tidak  berbeda  nyata dengan  P3  (ab).  Kelompok  P4  dan  P2 memberikan pengaruh tertinggi pada lebar zona marginalis.
Gambar  4 .  Diagram  batang  rerata  lebar  zona marginalis

## Gambaran Histopatologis Limpa
Gambaran  histopatologis  limpa  tikus wistar  yang  diberi  ekstrak  teh  kombucha  dan diinfeksi Escherichia coli menggunakan
pewarnaan  Hematoxylin  Eosin  (HE)  pada kelompok kontrol dan perlakuan Gambar 5. Histologi limpa K- (kontrol normal), K+ (kontrol  positif) , P2  (ekstrak  teh  kombucha  40%), P4(ekstrak  teh  kombucha  60%).  Keterangan: germinal  center  (gc),  zona  marginal  (zm),  pulpa putih (↔) pembesaran 40x.

## PEMBAHASAN
Hasil  analisa  data  berat  limpa  tikus  Sig 0.492  artinya  p>0,05.  Perlakuan  ekstrak  teh kombucha pada berbagai dosis tidak berpengaruh,  namun  berat  limpa  mengalami peningkatan pada perlakuan teh kombucha 60% dibandingkan  kontrol.  Berat  limpa    tertinggi diperoleh pada P4 (ekstrak teh kombucha 60%) yaitu  2,2475.  Hal  ini  menunjukan  adanya kecenderungan  peningkatan  berat  limpa  pada perlakuan teh kombucha dosis tinggi.
Berat limpa yang meningkat menunjukan adanya  stimulasi  dari  imunostimulan  terhadap pulpa putih limpa (Rousdy dkk., 2018). Hal ini sesuai dengan penelitian Hidayanti dkk (2014) yang  menyatakan,  peningkatan  berat  limpa dikarenakan  peningkatan  jumlah  sel  limfosit pada  perlakuan  teh  kombucha  dosis  tinggi. Sofiakmi  dkk  (2014)  juga  menyatakan Imunostimulan teh kombucha dapat meningkatkan IgM dan berat limpa.
Data berat limpa yang berbeda juga dapat dipengaruhi oleh berat badan tikus wistar. Berat limpa  yang  meningkat  dipengaruhi  oleh kandungan  flavonoid  dalam  ekstrak  teh kombucha, kandungan flavonoid pada penelitian  ini  sebesar  3,74.  Khairinal  (2012) juga  menggunakan  ekstrak  herbal  lain  yang mengandung flavonoid dapat meningkatkan Ig E dan berat limpa.
91 96 123 145 103 171 80 100 120 140 160 180 K- K+ P1 (30%) P2 (40%) P3 (50%) P4 (60%) Zona marginalis
Hasil  analisa  statistik  pada  histopatologis limpa tikus Sig 0.000 artinya p<0.05, sehingga ekstrak  teh  kombucha  berpengaruh  terhadap histopatologis  limpa.  Hasil  diameter  pulpa putih  pada  tabel  4.6  menunjukan  diameter pulpa putih terbesar pada kelompok P4 (ekstrak teh  kombucha  60%)  yaitu  440,66 μm ,  dan dilanjutkan  P2  (ekstrak  teh  kombucha  40%) yaitu 423,83 μm.
Pulpa  putih  yang  meningkat,  dikarenakan adanya  senyawa  flavonoid  yang  didalamnya terdapat  kandungan  EGCG  ( quercetin dan epigallocatechin 3-gallate ) yang dapat meningkatkan sistem imun melalui mekanisme peningkatan IL-6 dan IL-10, sehingga mempengaruhi  aktivasi  sel  T  dan  sel  B  untuk berproliferasi  (Sofiakmi  dkk.,  2014).  Hal  ini juga didukung oleh Talmale et al (2014) yang mengatakan bahwa flavonoid sebagai imunomodulator  dapat  meningkatkan  indeks proliferasi limfosit dan splenosit sehingga dapat meningkatkan  diameter  pulpa  putih  yang didalamnya  tersusun  atas  limfosit.  Studi  lain juga menjelaskan ekstrak herbal yang mengandung flavonoid dapat meningkatkan sel imun pada limpa (Karasawa et al. , 2011).
Pulpa  putih  atau  pulpa  alba  merupakan bagian dari limpa yang berfungsi sebagai sistem kekebalan  tubuh  untuk  melawan  infeksi, sedangkan  pada  pulpa  merah  berfungsi membuang  bahan  di  dalam  darah  yang  sudah tidak diperlukan (Filbert dkk., 2011). Peningkatan diameter pulpa putih menandakan adanya  peningkatan  aktivitas  sistem  imun. Reaksi  inflamasi  yang  disebabkan  oleh masuknya  agen  penyakit  akan  menyebabkan migrasi dan berkumpulnya limfosit pada limpa, sehingga mempengaruhi ukuran diameter pulpa putih (Tasminatun et al ., 2017).
Diameter germinal center yang meningkat, menunjukan  adanya  peningkatan  aktivitas sistem  imun.  Hal  ini  dikarenakan  adanya senyawa flavonoid pada ekstrak teh kombucha. Flavonoid  dapat  meningkatkan  proliferasi limfosit B dan imunoglobulin G (IgG) sehingga meningkatkan diameter germinal center (Febrinda, 2013). Flavonol akan  meningkatkan interleukin-2 (IL-2) yang terlibat pada aktivasi dan proliferasi sel T (Dewi et al., 2013).
Interleukin-2 (IL-2) menginduksi T helper , kemudian mengalami proliferasi dan diferensiasi  menjadi  T helper 1  (Th1)  dan  T helper 2 (Th2). Antigen Presenting Cell (APC)
mensekresi  interleukin-1  (IL-1),  kemudian interleukin-1  (IL-1)  menginduksi  T helper 1 (Th-1)  untuk  mensekresi  interferon  γ  dan interleukin  2  (IL-2).  Sitokin  kemudian mengaktivasi  T helper 2  (Th-2)  untuk mensekresi  interleuin  4  (IL-4),  interleukin  5 (IL-5),  IL6,  dan  IL10  yang  mengaktivasi limfosit B untuk berproliferasi dan berdiferensiasi  menjadi  sel  plasma,  sehingga mengakibatkan  peningkatan  pada  diameter germinal center (Carmelita, 2016). Hal ini juga didukung oleh Sulistyana (2015) yang mengatakan  bahwa  peningkatan  diameter germinal center dikarenakan proliferasi limfosit B.
Germinal center merupakan tempat sel-sel limfosit  berkumpul  dan  berproliferasi  saat sistem  imunitas  bekerja  (Tasminatun et  al ., 2017).  Germinal  center  juga  merupakan  pusat pendewasaan  sel  limfosit  (Matheos et  al .,
2013).  Hal  tersebut  dapat  mempengaruhi ukuran. Menurut Rousdy dkk (2018) besarnya pulpa  putih,  germinal  center,  dan  zona marginalis menandakan seberapa kuat imunostimulan berkerja. Germinal center tidak dijumpai  pada  semua  pulpa  putih.  Germinal center akan muncul dan membesar, jika terjadi proses  imunostimulasi  pada  sistem  imun (Rousdy dkk., 2018).
Lebar  zona  marginal  yang  meningkat dikarenakan kandungan flavonoid pada ekstrak teh  kombucha.  Hal  ini  didukung  oleh  Rousdy dkk (2018) yang mengatakan bahwa peningkatan dari limfosit B menyebabkan lebar zona  marginalis  ikut  meningkat.  Kandungan flavonol  di  dalam  flavonoid  dapat  memacu peningkatan  IL2  sehingga  meningkatkan proliferasi  limfosit  B  (Parlinaningrum  dkk., 2014).
Hasil  penelitian  menunjukan  lebar  zona marginalis  terbesar  pada  kelompok  P4  (171 μm ) dan P2 (145 μm ) menempati posisi terbesar kedua dibandingkan kontrol. Hal ini didukung penelitian Nurhastuti dkk (2020) yang menyatakan  bahwa  pemberian  ekstrak  teh kombucha  dosis  40  %  dan  60%  dapat meringankan kerusakan jaringan yang ditimbulkan oleh agen penyakit.
Zona marginalis berfungsi sebagai penyaring patogen dan antigen dalam sirkulasi sistemik dan berperan penting melawan antigen (Filbert  dkk.,  2011).  Antigen  yang  disaring masuk  ke  pulpa  putih  dan  sampai  di  zona
marginal,  makrofag,  dan  sel  dendritik  akan mempresentasikan  antigen  ke  limfosit  B  dan limfosit T untuk memulai respon (Hoffbrand et all ., 2015).

## KESIMPULAN
Penulis menarik kesimpulan dari hasil dan pembahasan  diatas  berupa,  ekstrak  teh kombucha  pada  dosis  60%  berpengaruh terhadap berat limpa dan gambaran histopatologis limpa tikus Wistar yang diinfeksi Escherichia coli .

## REFERENSI
Agnesa,  O.  S.,  Herawati,  S.,  Sri.  R.  L.,  2017.
Aktivitas Imunostimulan Ekstrak Bawang  Putih  Tunggal  pada  Mencit yang  Diinduksi  Escherichia  coli. J. Pharmaciana. 7(1): 105-112.
Anindya,  A.,  Kuncoro,  P.  S.,  Fedik,  A.  R., Kadek, R., Chairul, A. N., Thomas, V. W.,  Hani,  P.,  2019. Pengujian  Vaksin Hepatitis  B  Fase  Subkronis  Terhadap Berat  Organ  Dan  Diameter  Pulpa Putih  Limpa  Tikus  Putih  (Rattus norvegicus) . J. B. M. V. 8(2): 86-91. Arfanda,  A.  I.,  Edjeng,  S.,  Isroli.  2019.
Pengaruh  Frekuensi  dan  Periode Pemberian  Pakan  Terhadap  Bobot Relatif  Organ  Limfoid  Ayam  Buras Super .  J.  Sain  Peternakan  Indonesia.
14(3): 306-311.
Arief,  I.  I.,  B,  Sri.  L.  J.,  M,  Astawan.,  A,  B. Witarto.,  2010. Efektivitas  Probiotik Lactobacillus  plantarum  2C12  dan Lactobacillus acidophilus 2B4 sebagai Pencegah Diare pada Tikus
Percobaan . J. Media Peternakan: 137- 143.
Carmelita,  A.  B.  2016. Pengaruh  Pemberian Ekstrak  Etanol  Umbi  Bawang  Dayak (Eleutherine palmifolia L Merr) Secara Oral  Pada  Mencit  Balb/c  Terhadap Pencegahan Penurunan Diameter Germinal Center Pada Kelenjar Getah Bening  Serta  kadar  IgG  Serum .  J. Biosains Pascasarjana. 18(1): 1-12. Dewandaru, R. A., Soedarmanto, I.,
Yanuartono, A. N., Hary, P., Rusmi, H., 2019. Diare Disebabkan Infeksi
Escherichia  coli  Pada  Anjing .  J.  Ilmu Peternakan dan Veteriner Tropis. 9(2): 38-43.
Dewi,  L.  K.,  Widyarti,  S.,  Rifai,  M.,  2013. Pengaruh  Pemberian  Ekstrak  Etanol Daun  Sirsak  (Annona  muricata  Linn) terhadap peningkatan Jumlah Sel T CD 4+ dan CD8+ pada Timus Mencit (Mus Musculus) . J. Biologi. 1(1): 24-26. Effendi,  F.,  Anna,  P.  R.,  Ernie,  S.,  2014. Uji Aktivitas  Antibakteri  Teh  Kombucha Probiotik terhadap Bakteri Escherichia coli  dan  Staphylococcus  aureus .  J. Fitofarmaka. 4(2): 34-41.
Febrinda,  A.  E.,  Astawan,  M.  Wresdiyati,  T.,
Yuliana,  N.  D.,  2013. Kapasitas
Antioksidan dan  Inhibitor Alpha Glukosidase  Ekstrak  Umbi  Bawang Dayak. J.  Teknologi  dan  Industri Pangan. 24(2): 161-7.
Filbert,  I.,  Jeanny,  E.  L.,  Sylvia,  S.,  2011. Histopatologis  Limpa  Mencit  Galur Swiss Webster Jantan Pasca Pemerian Minyak Buah Merah (Pandanus conoideus  lam) .  [Skripsi].  Fakultas Kedokteran. Universitas Kristen Maranatha.
Hidayanti, M. D., Sussi, A., Maria, E. K., 2014.
Pengaruh  Pemberian  Kombucha  Teh Rosella Terhadap Profil Darah Mencit (Mus  musculus  L) .  J.  Agritech.  34(4): 382-389.
Hoffbrand,  A.  V.,  Paul,  A.  H.  M.  2015. Hoffbrand’s  Essential  Haematology 7th. Wiley Blackwell . United Kingdom : 117.
Ivanisova,  E.  I.,  K.  M.  Enhartova.,  M. Tenrentjeva., L. Godocikova., J. Arvay and  M.  Kacaniova.,  2019. Kombucha Tea Beverage: Microbiological Characteristic,  Antioxidant  Activity, and  Phytochemical  Composition .  J.
Acta Alimentaria. 48 (3): 324-331.
Karasawa, K., Uzuhashi, Y., Hirota, M., Otani, H.,  2011. A  Matures  Fruit  Extract  Of Date Palm Tree (Phoenix dactylifera L) Stimulates The Cellular Immune System  In  Mice .  J.  Agric  Food  Chem. 59(20): 11287-93.
Khairinal.  2012. Efek  Kurkumin  Terhadap Proliferasi  Sel  Limfosit  Dari  Limpa Mencit  C3H  Bertumor  Payudara Secara  In  Vitro .  [Tesis].  Fakultas
Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam Program Pascasarjana Departemen Kimia. Universitas Indonesia.
Kobayashi,  S.  D.,  Natalia,  M.,  dan  DeLeo,  F.
R., 2015. Phatogenesis of Staphylococcus  aureus  Abscesses .  J.
American Pathology. 185(6). Kusriningrum.  2019. Buku  Ajar  Rancangan Percobaan. Dani Abadi. Surabaya: 31- 51.
Matheos,  C.,  Lintong,  P.,  Kairupan,  C.,  2013.
Gambaran Histologik Jaringan Limpa Tikus  Putih  (Rattus  norvegicus)  Yang

## Diinfeksi Escherichia coli dan Diberi
Nurhastuti,  Y.,  Nurul,  H.,  Olan,  R.  P.  A.N.,
Arief,  M.  2020. Potensi  Ekstrak  Teh Kombucha (Medusomyces gisevii) Pada  Tikus  Putih  (Rattus  norvegicus) Yang  Diinduksi Escherichia coli
Dilihat  Dari  Berat  Badan  Dan Histopatologi  Duodenum .  [Skripsi]. Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Wijaya Kusuma Surabaya. Parlinaningrum,  D.,  Sri,  W.,  Muhaimin,  R., 2014. Pengaruh  Pemberian  Ekstrak Etanol Annona muricata Linn Terhadap  Peningkatan  Jumlah  B220
Pada  Mus  musculus .  J.  Biotropika. 2(5): 269-272. Raharjaningtyas,  E.  R.  P.  2013. Pengaruh
Pemberian Infusa Daun Sirsak (Annona muricata L) Secara Subkronis Terhadap  Gambaran  Histopatologis
Lambun  dan  Usus  Tikus  Putih.
[Skripsi]. Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
Rahayu,  W.  P.,  Siti,  N.,  Ema,  K.,  2018.
Escherichia coli : Patogenitas, Analisis Dan  Kajian  Risiko. IPB  Press.  Bogor: 5, 23-24.
Rochmawati,  D.  W.  2015. Efek  Pemberian
Infusum  Meniran  (Phyllanthusniruri, Linn)  terhadap  Diameter  Pulpa  Putih Limpa Ikan Gurami (Osphronemusgouramy) yang Diinfeksi Vibrio Anguillarum . [Skripsi]. Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Airlangga.
Rousdy,  D.  W.,  Elvi,  R.P.W.,  2018. Histologi Limpa  Dan  Hematologi  Mencit  Yang
Diinfeksi  Escherichia  coli  Setelah
Pemberian  Asam  Humat  Gambut
Kalimantan. J. Bioteknologi & Biosains Indonesia. 5(2): 168-176.
Safitri, W. N. dan Irdawati. 2020. Antibacterial Activities  Of  Kombucha  Tea  From Some  Types  Of  Variations  Of  Tea  On Escherichia  Coli  And  Staphylococcus Aureus .  Faculty  of  Mathematics  and
Natural  Science.  Universitas  Negri Padang. Sulistyana, M. I. 2015. Pemanfaatan
Polisakarida  Krestin  Dari  Coriolus Versicolor  Sebagai  Imunomodulator Pada  Mus  Musculus  Yang  Terpapar Mycobacterium Tuberculosis Berdasarkan Indikator Konsentrasi IL- 4  dan  Histologi  Limpa. [Skripsi]. Fakultas Sains dan Teknologi. Universitas Airlangga. Sofiakmi, R. L. Q., Maria, U., Ediati, S. 2014. Uji Aktivitas Imunomodulator Fermentasi Teh Hitam Jamur
Kombucha  Terhadap  Proliferasi  Sel Limfosit Mencit Galur Balb / C Secara
In  Vitro .  J.  Ilmu  Farmasi  dan  Farmasi
Klinik. 3(5): 130-138.
Talmale,  S.,  Bhujade,  A.,  Patil,  M.,  2014.
Immunostimulatory Activity Of Flavonoids  Isolated  From  Stem  Bark
Of  Zizyphus  mauritiana.  J.  Innov  Res Sci  Engineering  Technology .  3(7): 14285-96.
Tasminatun,  S.,  Pravitasari,  R.,  Makiyah,  N.,
2017. Potential  Ethanol  Of  Carica Papaya L. Extract As Immunomodulatory Through Histology
Observation At Mice Balb/C Spleen . J.
Berkala Kedokteran. 13(2): 205-210. Towoliu,  S.,  Poppy,  L.,  Carla,  K.,  2013.
Pengaruh  Pemberian  Lactobacillus terhadap Gambaran Mikroskopis
Mukosa  Usus  Halus  Tikus  Wistar (Rattus  norvegicus)  yang  Diinfeksi dengan Escherichia coli. J. e- Biomedik. 1(2): 930-934.