## Inaktivasi Bakteri Patogen Planktonik dan Biofilm oleh Sanitaiser Komersial

## Inactivation of Planktonic and Biofilm of Pathogenic Bacteria by Commercial Sanitizers
Ratih Dewanti-Hariyadi 1,2 dan Cynthia 1
1 1Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
2 Southeast Asian Food and Agriculture Science and Technology Center, Lembaga Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor
Abstract . Cleaning and sanitizing are important aspects in providing quality and safe foods. In the US, contaminated equipment is the third most important factor contributing to foodborne disease outbreaks. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of commercial sanitizers against planctonic cells and biofilms of pathogenic bacteria Salmonella Typhimurium and Staphylococcus aureus. Commercial sanitizers used in this study were single sanitizers (quaternary ammonium, peroxy acetic acid, coconut fatty acid) and combined sanitizers ( Oxyquart ® , Bioclean 520 ® , Bioclean 540 ® ) at the recommended application concentrations. Of the sanitizers tested on planctonic cells, peroxy acetic acid at 100 ppm as well as Oxyquart ® and Bioclean 540 ® at concentrations of 0.010% are effective against S. Typhimurium; while Oxyquart ® at a concentration of 0.005% is the most effective sanitizer against  S. aureus. The study also shows that Oxyquart ® is more effective against biofilms and capable of inactivating 3.94-5.02 log CFU/cm 2 of S. Typhimurium or S. aureus biofilm.
Keywords: commercial sanitizers, foodborne pathogen, biofilm, planktonic, combined sanitizers
Abstrak. Pembersihan dan sanitasi peralatan adalah aspek penting dalam untuk menghasilkan pangan yang bermutu dan aman. Di Amerika Serikat, peralatan yang kotor dan tidak saniter merupakan penyebab ketiga terpenting kejadian keracunan pangan. Pembersihan dan sanitasi peralatan pengolahan pangan dapat  dilakukan  dengan  menggunakan  cara  fisik  maupun  dengan  pembersih  dan  sanitaiser  kimia  yang diijinkan. Sanitaiser peralatan pangan umumnya diformulasikan dengan senyawa kimia yang efektif membunuh mikroorganisme dan tidak meninggalkan residu dalam jumlah yang membahayakan kesehatan manusia. Tujuan penelitian ini adalah mengevaluasi efektivitas sanitaiser komersial untuk menginaktivasi bakteri planktonik dan biofilm patogen Salmonella Typhimurium dan Staphylococcus aureus . Sanitaiser komersial yang digunakan adalah sanitaiser tunggal (amonium kuaterner, asam peroksi asetat dan coconut fatty acid) serta sanitaiser kombinasi (Oxyquart ® , Bioclean 520 ® , Bioclean 540 ® ) pada konsentrasi yang direkomendasikan. Diantara sanitaiser yang diuji terhadap sel planktonik, asam peroksi asetat 100 ppm, Oxyquart ® dan Bioclean 540 ® pada konsentrasi 0.015% adalah yang paling efektif mereduksi S. Typhimurium, sementara Oxyquart ® pada konsentrasi 0.005% efektif mereduksi S. aureus . Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa Oxyquart ® paling efektif dalam mereduksi biofilm kedua bakteri patogen dan mampu mereduksi bakteri biofilm sebesar 3.94-5.02 log CFU/cm 2 .
Kata kunci : sanitaiser komersial, patogen bawaan pangan, biofilm, planktonik, sanitaiser kombinasi
Aplikasi Praktis: Penelitian ini menguji kemampuan sanitaiser komersial dalam menginaktifkan bakteri patogen bawaan pangan Salmonella Typhimurium dan Staphylococcus aureus baik sebagai sel planktonik maupun biofilm pada permukaan stainless steel. Sanitaiser yang digunakan terdiri dari sanitaiser tunggal maupun kombinasi yangdihasilkan oleh produsen domestik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa satu sanitaiser tunggal dan dua sanitaiser kombinasi dapat menginaktifkan S . Typhimurium maupun S. aureus . Kedua sanitaiser kombinasi berpotensi digunakan untuk mereduksi densitas bakteri biofilm pada permukaan stainless steel.

## PENDAHULUAN
1
Penyakit bawaan pangan ( foodborne disease ) terus menjadi masalah kesehatan di dunia (WHO 2007). Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Korespondensi: rdewantih@yahoo.com
melaporkan penyakit bawaan pangan di Amerika Serikat selama  2009-2010  sebanyak  29,444  kasus  dengan  23 orang meninggal dunia (CDC 2013). Di Indonesia, Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia (BPOM RI)  melaporkan  6,901  kasus  orang  sakit  dan  11  kasus
orang meninggal dunia karena penyakit bawaan pangan di tahun 2011 (BPOM 2012).
Menurut US Food and Drug Administration (FDA) (2009),  lima  faktor  utama  penyebab  kejadian  penyakit bawaan pangan adalah pangan dari sumber yang tidak aman, higiene personal yang kurang, proses pemasakan yang tidak tepat, penyimpangan suhu penyimpanan pangan dan kontaminasi dari peralatan. Di Amerika Serikat,  peralatan  pangan  yang  terkontaminasi  berkon- tribusi sebesar 16% atau berada pada peringkat ketiga setelah penyimpangan suhu penyimpanan pangan (36%) dan higiene pekerja yang kurang (19%).
Di industri pangan, pembersihan atau penghilangkan kotoran  dari  permukaan  alat  selalu  diikuti  dengan  sani- tasi untuk membunuh mikroorganisme dengan sanitaiser. Sanitaiser untuk peralatan yang kontak dengan pangan harus memenuhi beberapa persyaratan, yaitu memiliki spektrum aktivitas yang luas (terhadap bakteri, kapang, kamir, virus dan parasit), mampu mereduksi mikroba 5 log dalam waktu 30 detik pada suhu 25 o C, tidak toksik, kompatibel dengan bahan kimia lain, aktif baik sebelum maupun sesudah diencerkan dengan air sadah, ekonomis dan tidak merusak lingkungan. Efektivitas sanitaiser juga dipengaruhi oleh jumlah dan lokasi, ketahanan mikroorganisme,  waktu  kontak,  faktor  kimia  dan  fisik (pH, suhu, RH, kesadahan air), keberadaan senyawa organik (lemak, karbohidrat, protein) dan biofilm (Rutala et al. 2008). Mikroorganisme yang menempel pada pemukaan peralatan yang kontak dapat membentuk biofilm (Srey et al. 2013) dan dapat berpindah ke bahan pangan sehingga menimbulkan penyakit (Todd et al. 2007). Bakteri biofilm umumnya lebih resisten terhadap panas, kekeringan atau senyawa antimikroba jika dibandingkan dengan sel planktoniknya karena memiliki polimer ekstraseluler yang dapat mencegah atau mengurangi kontak dengan senyawa antimikroba (Srey et al. 2013). Sanitaiser kimia yang digunakan oleh industri pangan meliputi senyawa klorin, senyawa iodin, senyawa amonium kuaterner, asam organik, asam peroksi atau gabungan asam peroksi dengan asam organik (Simoes et al. 2010). Sanitaiser tunggal di atas telah disetujui oleh  US  FDA  sebagai  sanitaiser  untuk  peralatan  yang kontak dengan pangan (CFR 2011). Untuk meningkatkan efektivitas sanitasi, berbagai sanitaiser kombinasi telah diformulasikan. Oleh karena itu, perlu dilakukan evaluasi efektivitas sanitaiser komersial baik dalam bentuk tunggal maupun kombinasi dalam menginaktivasi bakteri patogen dan biofilm pada peralatan pangan.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengevaluasi  efekti- vitas sanitaiser komersial baik dalam bentuk tunggal maupun kombinasi dalam menginaktivasi bakteri planktonik  dan  biofilm Salmonella Typhimurium dan Staphylococcus aureus .

## BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini
adalah Salmonella Typhimurium yang diisolasi dari udang dan Staphylococcus aureus ATCC  25923.  Kedua kultur diperoleh dari Laboratorium Patogen SEAFAST CENTER IPB.
Sanitaiser komersial yang digunakan diperoleh dari PT  Kevin  Chemindo Anugerah,  Jakarta,  berupa  sanitai- ser  tunggal  (senyawa  amonium  kuaterner/quat,  asam peroksi  asetat/PAA, coconut fatty acid/CFA )  dan  sani- taiser kombinasi (Oxyquart ® , Bioclean 520 ® , Bioclean 540 ® ). Sanitaiser kombinasi mengandung 2 atau 3 kom- ponen sanitaiser tunggal dengan atau tanpa penambahan senyawa pembersih asam.  Bahan lainnya yang diguna- kan adalah pelat stainless steel (SS) tipe  304  dari  CV Halilintar Mekanika, Bogor, swab yang dilapis kalsium- alginat (Sigma Aldrich), alkohol 70%, kristal violet, lugol,  alkohol  96%,  safranin,  minyak  imersi,  larutan pengencer KH 2 PO 4 , CaCl 2 , H 2 SO 4 pekat, BaSO 4, Tween 80 (Merck), Naheksametafosfat (Sigma Aldrich) dan deterjen komersial.
Media yang digunakan adalah Tryptone Soy Agar/ TSA (Oxoid), Tryptone Soy Broth/ TSB (Oxoid), Nutrient Broth/ NB (Oxoid), Broth (Oxoid), dan buffer penetralisasi Letheen Broth (Scharlau). Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat gelas untuk uji mikrobiologi, sentrifus (Hermle type Z  383K),  spektrofotometer  (Shimadzu  2450  UV-Vis), inkubator  goyang  (New  Brunswick  Scientific  Excella E250),  inkubator  suhu  37 o C dan 55 o C (Fisher Isotemp 300 Series).
Metode Penelitian Penelitian terdiri atas (1) evaluasi sanitaiser komer- sial dalam menginaktivasi sel planktonik S . Typhimurium dan S. aureus dan (2) aplikasi sanitaiser komersial terbaik untuk menginaktivasi sel biofilm bakteri patogen tersebut. Tahapan  penelitian  adalah  sebagai  berikut:  konfirmasi kultur bakteri uji, persiapan inokulum, persiapan larutan stok sanitaiser, inaktivasi sel planktonik, persiapan pelat SS dan inaktivasi bakteri biofilm.
Konfirmasi Kultur Bakteri Uji. Sebelum digunakan, kultur S .  Typhimurium  mau- pun S. aureus dalam bentuk kering beku disegarkan dalam TSB dan dikonfirmasi secara biokimiawi dengan metode BAM (FDA 2011).

## Persiapan Inokulum
Kultur  bakteri  pada  fase  akhir  log  dipanen,  disen- trifus pada suhu 4 o C dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit untuk memisahkan massa sel dari medium per- tumbuhan. Massa sel atau endapan diresuspensi dalam larutan pengencer sehingga diperoleh larutan dengan kekeruhan setara dengan larutan standar McFarland 0.5. Larutan standar McFarland 0.5 diasumsikan setara dengan  populasi  kultur  1-2x10 8 CFU/mL  (CLSI  2012). Kultur setara dengan larutan standar McFarland 0.5 siap diencerkan untuk digunakan sebagai inokulum.

## Persiapan Larutan Stok Sanitaiser Komersial
Sanitaiser komersial berbentuk cair dan dibuat larutan stoknya pada konsentrasi 1% dengan akuades, kecuali untuk coconut fatty acid ditambahkan 1% Tween 80 (Preuss et al. 2005).
Inaktivasi  Sel  Planktonik  S.  Typhimurium  dan  S. aureus dengan Sanitaiser Komersial
Sebanyak 6 buah tabung reaksi disiapkan, 1 buah untuk  kontrol  positif  dan  5  untuk  sampel  uji.  Untuk sampel uji, ke dalam tabung dimasukkan medium NB, larutan stok sanitaiser komersial dan kultur bakteri secara berurutan sedangkan tabung kontrol diisi dengan medium NB dan kultur bakteri saja. Volume total campuran dua atau tiga bahan tersebut adalah 5 mL.
Jumlah awal kultur bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah sekitar 10 5 CFU/mL  (CLSI  2012). Untuk  memperoleh  larutan  sanitaiser  komersial  dengan konsentrasi yang diinginkan, sejumlah larutan stok sanitaiser dipipet secara aseptik ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi sejumlah medium NB. Konsentrasi sanitaiser komersial yang digunakan adalah 0.005, 0.010, 0.015, 0.020 dan 0.025% atau 50-250 ppm untuk sanitaiser tunggal. Pemilihan kisaran konsentrasi di atas mengacu pada konsentrasi sanitaiser yang umumnya digunakan pada peralatan pangan, yaitu 200 ppm untuk quat, 150-200 ppm untuk PAA dan 70-1500 ppm untuk asam lemak (Gaulin et al . 2011).
Tabung reaksi dikocok dengan vortex dan diinkubasi dalam  inkubator  bergoyang  pada  suhu  37 o C,  130  rpm selama 24 jam. Setelah inkubasi, dilakukan pengenceran berseri dan pemupukan papa TSA serta diinkubasi selama 48  jam  pada  suhu  37 o C.  Untuk  tabung  kontrol  positif, dilakukan pemupukan pada 0 dan 24 jam. Koloni yang terbentuk dihitung dan dilaporkan sebagai colony forming unit per mL (CFU/mL). Reduksi jumlah bakteri uji adalah selisih  antara  jumlah  log  CFU/mL  kontrol  dengan  log CFU/mL perlakuan
Persiapan  Pelat  Stainless Steel (SS)  untuk  Pemben- tukan Biofilm
Pelat SS tipe  304  dipotong  berukuran  1x1  cm 2 , direndam dalam larutan deterjen komersial selama 1 jam, disikat, dibilas dengan akuades dan dicelupkan dalam alkohol 70%. Pelat SS kemudian dikeringkan dalam oven bersuhu 55 o C sampai kering dan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit (Marques et al. 2007).
Pembentukan  Biofilm  dan  Uji  Efektivitas  Sanitaiser Komersial  Terpilih  Terhadap  Biofilm  (Dewanti  and Wong 1995)
Biofilm dibuat dengan memasukkan 1 mL inokulum ke dalam Erlenmeyer berisi 100 mL medium TSB yang diencerkan 5 kali dan pelat SS sehingga jumlah awal bakteri sekitar 10 5 CFU/mL.  Erlenmeyer  kemudian diinkubasi dalam inkubator bergoyang pada suhu kamar
(28-30 o C), kecepatan 70 rpm selama 48 jam. Setelah inkubasi,  pelat  SS  yang  telah  mengandung  biofilm diambil secara aseptik, dibilas dengan larutan pengencer dan direndam dalam 10 mL larutan sanitaiser komersial selama  2  menit.  Untuk  pengujian  ini,  digunakan  Oxy- quart ® dan Bioclean 540 ® dengan konsentrasi 0.125, 0.25, 0.5 dan 1% sesuai rekomendasi produsen. Setelah kontak dengan sanitaiser, pelat SS dipaparkan pada 10 mL buffer penetralisasi letheen broth selama 2 menit dan  dibilas  dengan  larutan  pengencer.  Sel  biofilm  pada pelat  SS  kemudian  diseka  3  kali  dengan  swab  kalsium alginat.  Swab  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  9  mL larutan pengencer dan 1 mL Naheksametafosfat 0.1% dan dikocok selama 1 menit. Setelah itu, dilakukan pengen- ceran berseri dan pemupukan dengan metode tuang menggunakan medium TSA serta diinkubasi pada suhu 37 o C selama 48 jam. Koloni yang terbentuk dihitung dan dilaporkan sebagai CFU/cm 2 .
Analisis Data Seluruh data hasil penelitian disajikan diolah secara statistik menggunakan program SAS ( Statistical Analysis Software )  versi  9.1  dengan  uji Analysis of Variance dilanjutkan dengan uji berbeda nyata Duncan pada taraf signifikansi 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Inaktivasi  Sel  Planktonik  S.  Typhimurium  dan  S. aureus oleh Sanitaiser Komersial
Gambar 1 menunjukkan bahwa inaktivasi S. Typhi- murium oleh sanitaiser tunggal baru terlihat pada konsentrasi sanitaiser 100 ppm. Pada konsentrasi 100 ppm,  PAA  menunjukkan  inaktivasi  sebesar  9.32  log, sementara quat belum menunjukkan aktivitas inaktivasi. Pada kisaran konsentrasi yang diaplikasikan, quat mereduksi 0.17-9.02 log CFU/mL, PAA mereduksi 0.17- 9.32  log  CFU/mL  sementara  CFA tidak memiliki daya bunuh  dan  hanya  mereduksi  0.04-0.14  log  CFU/mL S. Typhimurium.
Gambar 1. Reduksi sel planktonik S. Typhimurium oleh sanitaiser komersial tunggal
Efektivitas pembunuhan S. aureus oleh sanitaiser tunggal telah nampak pada konsentrasi sanitaiser 50
ppm oleh quat, meskipun reduksi maksimal baru dicapai pada konsentrasi 150 ppm. Sementara itu, meski belum menunjukkan inaktivasi yang berarti pada konsentrasi 50 ppm, PAA mereduksi 9.43 log S. aureus pada konsentrasi 100 ppm. Pada konsentrasi yang diaplikasikan, reduksi S. aureus oleh quat berkisar antara 4.43-9.27 log CFU/mL, PAA mampu mereduksi 0.59-9.43 log CFU/ mL dan tidak ada inaktivasi oleh CFA (Gambar 2).
Gambar  2 . Reduksi sel planktonik S. aureus oleh sanitaiser komersial tunggal
Dari Gambar 1 dan 2 terlihat bahwa sanitaiser tunggal yang efektif mereduksi kedua patogen planktonik adalah PAA. PAA adalah senyawa yang dibentuk melalui reaksi penggabungan antara hidrogen peroksida dan asam asetat. Senyawa ini memiliki aroma asam yang kuat, pH rendah (2.8) dan kapasitas oksidasi yang kuat (FDA 1986). PAA membunuh mikroba dengan menggangu permeabilitas dinding sel¸ mendenaturasi protein serta mengoksidasi ikatan sulfur pada protein, enzim dan metabolit lainnya. Keunggulan sanitaiser ini adalah tetap efektif meskipun terdapat senyawa organik lainnya, tidak terpengaruh oleh perubahan suhu dan memiliki spektrum penghambatan yang luas, sementara kelemahannya adalah bersifat korosif, tidak stabil bila diencerkan serta dapatmengiritasi kulit, mata dan membran mukosa (Rodgers et al. 2004). Quat atau senyawa amonium kuaterner adalah sanitaiser yang efektif menghambat bakteri Gram positif (Marriott 1999) dan oleh karenanya diperlukan konsen- trasi yang lebih tinggi untuk mereduksi S. Typhimurium daripada S. aureus . Quat menginaktivasi mikroba dengan membentuk lapisan ( film ) yang menyebabkan kerusakan dinding sel sehingga terjadi kebocoran pada organ  internal  dan  penghambatan  enzim.  Keunggulan quat adalah tidak berbau, tidak berwarna, stabil pada suhu tinggi, tidak bersifat korosif, tidak mengiritasi kulit, relatif stabil terhadap keberadaan senyawa organik dan daya penetrasinya baik sehingga dapat digunakan untuk permukaan peralatan yang berpori. Kelemahan quat adalah efektivitas berkurang pada pH kurang dari 6, tidak kompatibel dengan deterjen anionik dan tidak membunuh spora bakteri (Marriott 1999).
CFA pada konsentrasi yang digunakan ternyata tidak tidak efektif mereduksi S. Typhimurium dan S. aureus. Pengujian CFA dilakukan karena bahan ini ditambahkan ke dalam sanitaiser kombinasi untuk mengurangi pengu-
apan PAA. Asam lemak kelapa, yakni asam laurat serta monogliseridanya (monolaurin) telah dilaporkan dapat membunuh mikroorganisme tertentu. Widiyarti et al. (2009) melaporkan bahwa monolaurin memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. aureus. Zhang et al. (2009) menunjukkan bahwa monolaurin mampu menghambat S. aureus dengan  nilai  MIC  sebesar  12.5  μg/mL. Akan tetapi, CFA yang digunakan adalah ekstrak kasar yang tidak  diketahui  kandungan  asam  laurat  dan  atau  mono- laurinnya.
Sanitaiser kombinasi Oxyquart ® , Bioclean 520 ® dan Bioclean 540 ® diuji efektivitasnya pada konsentrasi apli- kasi lebih rendah daripada yang direkomendasikan yakni 1-2%.  Pada  konsentrasi  yang  diaplikasikan,  Oxyquart ® mampu  mereduksi  0.35-9.29  log  CFU/mL,  Bioclean 520 ® mereduksi  0.13-7.52  log  CFU/mL  dan  Bioclean 540 ® mereduksi 0.06-9.23 log CFU/mL S. Typhimurium (Gambar 3). Reduksi sebesar 9 log CFU/ml telah dicapai pada konsentrasi aplikasi 0.015% Oxyquart ® dan Bioclean 540 ® . Terhadap bakteri Gram positif S. aureus , Oxyquat ® mereduksi 9.29 log CFU/mL, Bioclean 520 ® mereduksi 0.26-9.46 log CFU/mL dan Bioclean 540 ® mereduksi 0.26- 9.39  log  CFU/mL  (Gambar  4).  Hasil  ini  menunjukkan bahwa Oxyquart ® juga efektif untuk mereduksi S. aureus .
Gambar 3. Reduksi sel planktonik S. Typhimurium oleh sanitaiser komersial kombinasi
Gambar 4. Reduksi sel planktonik S. Typhimurium
Menurut  Lehmann  (1988),  kombinasi  sanitaiser dapat menghasilkan tiga pengaruh: sinergis, aditif dan antagonis. Pengaruh sinergis terjadi jika dengan kemam- puan membunuh mikroba yang sama, konsentrasi sanitaiser kombinasi yang digunakan lebih rendah
dibandingkan konsentrasi sanitaiser secara individu, sedangkan pengaruh antagonis terjadi jika sanitaiser yang satu menghambat kerja sanitaiser lainnya.
Pengaruh sinergis diduga terjadi pada pada sanitaiser Oxyquart ® yang mengandung PAA dan quat terhadap S. aureus . Sanitaiser ini menghambat 9 log S. aureus pada konsentrasi yang jauh lebih rendah (0.005%) dibanding senyawa penyusunnya yakni PAA pada konsentrasi 100 ppm (0.010%) dan quat pada 150 ppm (0.015%). Pengaruh sinergis ini tidak terjadi pada S. Typhimurium . Oxyquart yang didominasi oleh quat tidak efektif meng- hambat bakteri Gram negatif.
Analisis statistik data inaktivasi sel planktonik S. Typhimurium dan S. aureus oleh sanitaiser komersial disajikan pada Tabel 1. Tabel ini menunjukkan bahwa pengaruh PAA pada konsentrasi 100 ppm tidak berbeda nyata dengan quat 200 ppm dalam mereduksi S. Typhimurium dan penggunaan PAA pada konsentrasi  100 ppm tidak berbeda nyata dengan quat pada konsentrasi 150 ppm dalam mereduksi S. aureus . Dengan kata lain, PAA  secara  signifikan  lebih  efektif  dibandingkan  quat dalam mereduksi S. Typhimurium dan S. aureus karena konsentrasi yang dibutuhkan lebih rendah.
Quat dan Oxyquart ® efektif mereduksi bakteri pato- gen Gram positif S. aureus sedangkan PAA dan Bio-clean 540 ® efektif mereduksi baik Gram positif S. aureus maupun Gram negatif S. Typhimurium. Kandungan quat dalam Oxyquart ® lebih besar sehingga lebih efektif dalam mereduksi bakteri Gram positif, sebaliknya Oxyquart ® tidak terlalu efektif mereduksi Gram negatif. Bioclean 540 ® mengandung komponen PAA dalam jumlah lebih besar sehingga efektif mereduksi bakteri Gram positif maupun negatif. Block (2001) menyatakan bahwa PAA memiliki spektrum aktivitas antibakteri yang luas sehingga efektif terhadap bakteri Gram positif dan negatif.
S. aureus lebih sensitif terhadap kelima sanitaiser komersial dibandingkan S. Typhimurium. Hal ini ditun- jukkan dari nilai log reduksi S. aureus yang lebih besar dan konsentrasi sanitaiser komersial yang dibutuhkan untuk mereduksi S. aureus lebih rendah. S. aureus lebih peka terhadap sanitaiser karena bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang sebagian besar tersusun atas lapisan peptidoglikan dan asam teikoat sehingga mudah dilewati oleh komponen yang bersifat hidrofilik, sedang- kan bakteri Gram negatif memiliki dinding sel yang lebih kompleks karena terdapat membran luar yang melindungi lapisan peptidoglikan, yaitu lipopolisakarida (LPS). Perbedaan struktur dinding sel berpengaruh pada ketahanan  mikroba  terhadap  perlakuan  bahan  antimik- roba dan bagian penting dari dinding sel adalah lapisan peptidoglikan. Lapisan in berfungsi untuk melindungi sel bakteri  dari  perubahan  kondisi  lingkungan  dan  faktor- faktor luar yang dapat menyebabkan kerusakan membran sel dan akhirnya mengakibatkan kematian sel. Pada bakteri Gram positif, senyawa antimikroba lebih mudah masuk dan mencapai lapisan peptidoglikan, sedangkan pada bakteri Gram negatif, senyawa antimikroba harus melalui membran terluar yang mengandung banyak
LPS. Oleh karena itu, bakteri Gram positif lebih mudah diinaktivasi dibandingkan bakteri Gram negatif.
Bioclean 520 ® mengandung komponen aktif quat, PAA  dan  pembersih  asam.  Tujuan  penambahan  pem- bersih asam pada sanitaiser kombinasi ini adalah untuk menjadikan sampel ini sebagai produk “2 in 1”, yang membersihkan sekaligus mensanitasi. Bioclean 520 ® kurang efektif dalam mereduksi S. Typhimurium dan S. aureus. Penambahan pembersih asam menyebabkan efektivitas quat berkurang sehingga efektivitas Bioclean 520 ® pun menjadi berkurang. Marriott (1999) menyata- kan bahwa efektivitas quat turun pada pH kurang dari 6. Kombinasi  senyawa  sanitaiser  ternyata  bersifat  antago- nistik.
Dari keenam jenis sanitaiser komersial yang diuji, PAA 100 ppm efektif mereduksi S. Typhimurium dan S. aureus dengan  nilai  log  reduksi  masing-masing  sebesar 9.32  dan  9.43  CFU/mL.  Meskipun  demikian,  hasil analisis statistik pada Tabel 1 menunjukkan bahwa peng-
Tabel 1. Analisis statistik reduksi S . Typhimurium dan S . aureus oleh berbagai sanitaiser
Sanitai- ser Konsentrasi penggunaan (%v/v) Reduksi bakteri (log CFU/mL) S. Typhimurium S. aureus Quat 0.005 0.17 ± 0.01 d 4.43 ± 0.33 d 0.01 0.46 ± 0.02 d 6.98 ± 0.14 c 0.015 6.90 ± 0.40 c 9.27 ± 0.01 a 0.02 9.02 ± 0.09 a 9.27 ± 0.01 a 0.025 9.02 ± 0.09 a 9.27 ± 0.01 a PAA 0.005 0.17 ± 0.08 d 0.59 ± 0.37 f 0.01 9.32 ± 0.05 a 9.43 ± 0.15 a 0.015 9.32 ± 0.05 a 9.43 ± 0.15 a 0.02 9.32 ± 0.05 a 9.43 ± 0.15 a 0.025 9.32 ± 0.05 a 9.43 ± 0.15 a CFA 0.005 0.04 ± 0.02 d -0.17 ± 0.16 g 0.010 0.05 ± 0.01 d -0.12 ± 0.12 g 0.015 0.06 ± 0.00 d -0.09 ± 0.10 g 0.020 0.09 ± 0.04 d -0.04 ± 0.13 g 0.025 0.14 ± 0.01 d 0.07 ± 0.10 g Oxy- quart ®
0.005 0.35 ± 0.19 d 9.29 ± 0.01 a 0.01 7.02 ± 1.05 c 9.29 ± 0.01 a 0.015 9.29 ± 0.03 a 9.29 ± 0.01 a 0.02 9.29 ± 0.03 a 9.29 ± 0.01 a 0.025 9.29 ± 0.03 a 9.29 ± 0.01 a Bioclean 520 ® 0.005 0.13 ± 0.10 d 0.26 ± 0.19 fg 0.01 0.18 ± 0.08 d 2.21 ± 0.21 e 0.015 0.23 ± 0.10 d 9.46 ± 0.19 a 0.02 0.46 ± 0.04 d 9.46 ± 0.19 a 0.025 7.52 ± 2.74 bc 9.46 ± 0.19 a Bioclean 540 ® 0.005 0.06 ± 0.03 d 0.26 ± 0.02 fg 0.01 8.53 ± 1.17 ab 8.69 ± 0.90 b 0.015 9.23 ± 0.18 a 9.39 ± 0.09 a 0.02 9.23 ± 0.18 a 9.39 ± 0.09 a 0.025 9.23 ± 0.18 a 9.39 ± 0.09 a a Data yang diikuti huruf sama pada kolom sama tidak berbeda nyata pada uji Duncan taraf 0.05 a Tanda negatif menunjukkan tidak terjadi reduksi jumlah bakteri uj
gunaan PAA 100 ppm tidak berbeda nyata dengan quat 200 ppm, Bioclean 520 ® 0.015% dan Bioclean 540 ® 0.015% dalam mereduksi S. Typhimurium. Hal di atas berlaku juga untuk reduksi S. aureus dimana hasil analisis statistik menunjukkan bahwa penggunaan PAA 100 ppm tidak berbeda nyata dengan quat 150 ppm, Bioclean 520 ® 0.005% maupun Bioclean 540 ® 0.015% dalam mereduksi S. aureus.
Reduksi S. Typhimurium oleh sanitaiser kombinasi Oxyquart ® 0.015% atau Bioclean 540 ® 0.005% atau
0.015% tidak berbeda nyata. Sementara itu Oxyquart ® pada konsentrasi 0.05% dan Bioclean 540 ® pada konsentrasi 0.015% mereduksi S. aureus dalam jumlah yang sama. Dengan demikian, sanitaiser Oxyquart ® sama efektifnya dengan Bioclean 540 ® dalam mereduksi S. Typhimurium, tetapi Oxyquart ® lebih efektif dalam mereduksi S. aureus karena konsentrasi yang dibutuhkan lebih rendah.

## Pengaruh Sanitaiser Komersial Terhadap Biofilm
Pada Gambar 5, terlihat bahwa pada kisaran konsen- trasi yang diaplikasikan, Oxyquart ® mampu mereduksi 5.02  log  CFU/cm 2 dan Bioclean 540 ® mereduksi  1.68- 4.70  log  CFU/cm 2 biofilm S. Typhimurium. Selain itu, Oxyquart ® mereduksi 1.65-3.94 log CFU/cm 2 sementara Bioclean 540 ® mereduksi  0.72-2.73  log  CFU/cm 2 bio- film S. aureus (Gambar  6).  Karena  sifat  biofilm  yang lebih tahan kondisi yang tidak menguntungkan termasuk adanya bahan sanitasi, terlihat bahwa pada konsentrasi aplikasi yang lebih tinggi, jumlah bakteri yang direduksi lebih rendah dibandingkan dengan bakteri planktoniknya.
Gambar 5. Reduksi densitas biofilm S . Typhimurium oleh sanitaiser kombinasi
Oxyquart ® lebih  efektif  dalam  mereduksi  biofilm S. Typhimurium dan S. aureus dibandingkan dengan Bioclean 540 ® . Analisis statistik (Tabel 2) menunjukkan bahwa penggunaan Oxyquart ® 0.125% tidak berbeda nyata dengan Bioclean 540 ® 0.5% dalam mereduksi biofilm S. Typhimurium, sementara Oxyquart ® 1% paling efektif dalam mereduksi S. aureus. Oxyquart ® mengandung komponen quat yang lebih dominan sehingga dapat diharapkan lebih efektif dalam mereduksi  biofim.  Menurut  Marriot  (1999),  quat  meru- pakan sanitaiser sekaligus surfaktan kationik sehingga quat juga memiliki kemampuan pembersihan ( cleaning ).
Gambar  6. Reduksi  densitas  biofilm S. sureus oleh sanitaiser kombinasi
Tabel 2. Analisis statistik untuk reduksi densitas biofilm
Sanitaiser Konsentrasi penggunaan (%v/v) Reduksi densitas biofilm (log CFU/cm 2 )
S. Typhimurium S. aureus Oxyquart ® 0.125 5.02 ± 0.18 a 1.65 ± 0.66 cd 0.25 5.02 ± 0.18 a 2.21 ± 0.33 bc 0.5 5.02 ± 0.18 a 2.90 ± 0.07 b 1 5.02 ± 0.18 a 3.94 ± 0.19 a Bioclean 540 ® 0.125 1.68 ± 0.05 c 0.72 ± 0.62 d 0.25 3.71 ± 0.86 b 1.01 ± 0.36 d 0.5 4.70 ± 0.11 a 1.53 ± 0.31 cd 1 4.70 ± 0.11 a 2.73 ± 0.08 b
Sebagai deterjen (bahan pembersih), quat dapat melarut-kan EPS biofilm sehingga sanitaiser memperoleh akses untuk kontak dengan sel bakteri, selanjutnya quat seba-gai  sanitaiser  akan  bereaksi  dengan  dinding  sel bakteri dan menyebabkan kebocoran sel (Simoes et al. 2006, Grinstead 2009). Simoes et al. (2006) menyarankan bahwa langkah penting mencegah pembentukan biofilm adalah mengaplikasikan pembersihan yang dilanjutkan dengan sanitasi. Penelitian Pan et al. (2006) menunjuk- kan bahwa Listeria monocytogenes dalam bentuk biofilm bersifat resisten terhadap sanitaiser peroksi asetat, quat dan klorin, tetapi ketika lapisan pelindungnya (EPS) larut oleh bahan pembersih maka tidak terjadi sifat resisten terhadap sanitaiser tersebut.
Dari Tabel 2, terlihat bahwa biofilm S. aureus lebih sulit  direduksi  dibandingkan  biofilm S. Typhimurium, baik oleh Oxyquart ® maupun Bioclean 540 ® . Rossoni dan Gaylarde (2000) menunjukkan bahwa biofilm S. aureus lebih resisten terhadap peroksi asetat dibandingkan bakteri lainnya. Resistensi biofilm S. aureus terhadap sanitaiser diduga terjadi karena adanya natrium klorida dan glukosa dalam medium TSB. Moretro et al. (2003)  melaporkan bahwa biofilm Staphylococcus lebih tebal dengan adanya natrium klorida dan glukosa. Oleh karena itu, dibutuhkan konsentrasi bahan pembersih dan sanitaiser yang lebih tinggi .

## KESIMPULAN
Dari keenam jenis sanitaiser komersial yang diuji, PAA, Oxyquart ® maupun Bioclean 540 ® efektif mengin- aktivasi sel planktonik S. Typhimurium dengan nilai reduksi  9  log  CFU/mL.  Sel  planktonik S. aureus lebih sensitif terhadap sanitaiser komersial dibandingkan dengan S. Typhimurium dan dapat diinaktifkan dengan konsentrasi sanitaiser lebih rendah. Biofilm S. Typhimu- rium maupun S. aureus memerlukan konsentrasi sanitaiser lebih tinggi. Oxyquart ® lebih efektif dalam menginaktivasi  sel  biofilm  dibandingkan  dengan Bioclean 540 ® . Meskipun sel planktonik S. aureus relatif sensitif terhadap sanitaiser, biofilm S. aureus memerlukan konsentrasi sanitaiser lebih tinggi untuk inaktivasinya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada PT Kevin Chemindo Anugerah, Jakarta yang telah mendanai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2012.
Laporan tahun 2011 [Internet]. [diunduh 2013 Februari 11].  Tersedia  pada:  http://www.pom.go.  id  /ppid/rar/ LAPTAH_ 2011.pdf.
[CDC]  Centers  for  Disease  Control  and  Prevention.  2013.
Surveillance  for  foodborne  disease  outbreaks  United States 2009-2010. 62(3):41-47.
[CFR] Code of Federal Regulations. 2011. Indirect food additives: adjuvants, production aids, and sanitizers: substances utilized to control the growth of microorganism. Washington DC: US FDA.
[CLSI] Clinical and Laboratory Standards Institute. 2012. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard- ninth edition. 32(2):52.
Dewanti R, Wong ACL. 1995. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. Int J Food Microbiol 26 :147-164
[FDA]  Food  and  Drug  Administration.  1986. Hydrogen peroxide . Code of Federal Regulations 21, Parts 170- 199, Section 184.1366, pp506 –507.
[FDA]  Food  and  Drug  Administration.  2001.  Bacterio- logical analytical manual chapter 12 Staphylococcus aureus [Internet].  [diunduh  2013  Maret10].Tersedia pada: http://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/ laboratory methods/ ucm071429.htm .
[FDA]  Food  and  Drug Administration.  2009.  FDA  report on the occurrence of foodborne illness risk factors in selected institutional foodservice, restaurant, and retail  food  storef  types  [Internet].  [diunduh  2013
Februari 11]. Tersedia pada: http://www.fda.gov/ downloads/ Food/FoodSafety/RetailFoodProtect ion/Foodborne-IllnessandRiskFactorReduction/
RetailFoodRiskFactorStudies/UCM224682.pdf.
[FDA]  Food  and  Drug  Administration.  2011.  Bacteriolo- gical analytical manual chapter 5 Salmonella [Internet]. [diunduh 2013 Maret 10]. Tersedia pada: http://www. fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ ucm070149.htm.
[WHO] World Health Organization. 2007. Food safety and foodborne illness. Geneva: WHO.
Gaulin C, Le ML, Shum M, Fong D. 2011. Disinfectants and sanitizers for use on food contact surfaces. Canada: National Colaborating Centre for Environmental Health.
Grinstead  D.  2009.  Cleaning  and  Sanitation  in  Food Processing Environment for the Prevention of Biofilm Formation  and  Biofilm  Removal.  Fratamico  PM, Annous BA, Gunther NW, editors. Biofilm in the food and beverage industries. Boca Raton: CRC Press.
Lehmann  RH.  1988.  Synergisms  in  Disinfectant  Formu- lations. Payne KR, editor. Industrial biocides, hal 68-90. Chichester: John Wiley Sons,
Marques SC, Rezende JdGOS, Alves LAdF, Silva BC, Alves E, Abreu LRd, Piccoli RH. 2007. Formation of biofilms by Staphylococcus aureus on stainless steel and glass surfaces and its resistance to some selected chemical sanitizers. Brazilian J Microbiol 38:538-543.
Marriott NG. 1999. Principles of Food Sanitation 4 th edition. Gaithersburg (MD): Aspen.
Moretro T, Hermansen L, Holck AL, Sidhu MS, Rudi K,  Langsrud  S.  2003.  Biofilm  formation  and  the presence of the intercellular adhesion Locus ica among Staphylococci from food and food processing environ- ments. Appl Environ Microbiol 69(9):5648-5655.
Pan Y, Breidt F, Kathariou S. 2006. Resistance of Listeria monocytogenes biofilms  to  sanitizing  agents  in  a simulated food processing environment. Appl Environ Microbiol 72:7711-7717.
Preuss HG, Echard B, Dadgar A, Talpur N, Manohar V, Eniq M, Baqchi D, Ingram C. 2005. Effects of essential oils and monolaurin on Staphylococcus aureus : in vitro and  in  vivo  studies  [Internet].  [diunduh  2013  Maret 10]. Tersedia pada: http://www.  ncbi.  nlm.nih.gov/ pubmed/20021093.
Rodgers SL, JN Cash, M Siddq, ET Ryser. 2004. A comparison  of  different  chemical  sanitizers  for inactivating Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes in solution and on apples, lettuce, strawberries, and cantaloupe. J Food Prot. 67:721-731.
Rossoni EMM, Gaylarde CC. 2000. Comparison of sodium hypochlorite  and  peracetic  acid  as  sanitizing  agents for stainless steel food processing surfaces using epifluorescence  microscopy.  Int  J  Food  Microbiol 61(1):81-85.
Rutala WA, Weber DJ. 2008. Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities [Internet]. [diunduh 2013  April  17].  Tersedia  pada: http://www.cdc.gov/ hicpac/Disinfection_Sterilization/4_0efficacyDS.html.
Simoes  M,  Simoes  LC,  Machado  I,  Pereira  MO,  Vieira MJ.  2006.  Control  of  flowgenerated  biofilms  using surfactantsevidence of resistance and recovery. Food Bioprod Processing. 84:338-345.
Simoes M, Simoes LC, Vieira M. 2010. A review of current and emergent biofilm control strategies. LWT-Food Sci Technol 43:573-583.
Srey  S  ,  Jahid  IK,  Ha  S-D.  2013.  Biofilm  formation  in industries : a food safety concern. Food Control 31:572-585
Todd EC, Greig JD, Bartleson CA, Michaels BS. 2007. Outbreaks where food workers have been implicated
in  the  spread  of  foodborne  disease,  part  3,  factors contributing to outbreaks and description of outbreak categories.   J Food Prot 70(9):2199-2217.
Widiyarti  G,  Hanafi  M,  Soewarso  WP.  2009.  Kajian  awal sintesis monolaurin sebagai antibakteri Staphylo- coccus aureus . Indonesian J Chem 9(1): 99-106.
Zhang H, Wei H, Cui Y, Zhao G, Feng F. 2009. Antibacterial interactions of monolaurin with commonly used antimicrobials and food components. J Food Sci. 74:418-421.
JMP08-14-003 - Naskah diterima untuk ditelaah pada 29 Agustus 2014. Revisi makalah disetujui untuk dipublikasi pada 09 September 2014. Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jmp