## EFEK ANTIBAKTERI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER YANG DIPRODUKSI OLEH KAPANG ENDOFITIK AT 32

## DARI Artemisia annua
Djadjat Tisnadjaja
Puslit Bioteknologi–LIPI F MIPA Jl. Raya Bogor Km. 46 Kotak Pos 422 Cibinong Bogor 160044 email : dtisnadjaja@yahoo.com

## ABSTRACT
Antibacterial Effect of Secondary Metabolite Compound Produced by Endophyte Mould AT 32

## By. Djadjat Tisnadjaja
Infection diseases such as malaria, dengue hemorrhagic fever, and tuberculosis still counted as one of major  health  problem  in  Indonesia.  On  the  other  hand  Indonesia  has  mega  biodiversity  including  plant  and microbes potentially used for the production of antibacterial or lead compound for antibiotic. One of a potential resources  is  Artemisia  annua.  This  plant  is  already  known  as  a  secondary  metabolite  compound  artemisinin producer, an active compound against malaria virus. This research work  was aimed to study the possible used of endophyte  microbe  isolated  from  Artemisia  annua  to  produce  antibacterial  active  compound  through  a fermentation  process.  Research  result  shown  that  extract  of  fermentation  broth,  either  fermentation  was conducted in Erlenmeyer flask or two liters stirred tank reactor,  gave antimicrobial activity. It is shown by the clearing zone formation on the dish inoculated with bacterial seed.  Two bacterial strains Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Escherichia coli BCC 2210 were used for this study. The biggest clearing zone diameter formed was 20 mm for inhibition of Staphylococcus aureus and 9.5 mm for Eschericia coli, those were obtained by using extract of fermentation broth of two liters stirred tank reactor.
Keywords  :  Artemisis annua, antimicrobial, endophyte, fermentation, secondary metabolite

## ABSTRAK
Penyakit  infeksi  seperti  malaria,  demam  berdarah  dan  tuberculosis  (TBC)  masih  merupakan  masalah kesehatan  utama  di  Indonesia.  Pada  sisi  lain  Indonesia  memiliki  mega  biodiversitas  termasuk  tanaman  dan mikroba  yang  berpotensi  untuk  dimanfaatkan  dalam  produksi  antibakteri  atau    senyawa  aktif  untuk  antibiotik. Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mempelajari  kemungkinan  pemanfaatan  mikroba  endofitik  yang  diisolasi  dari tumbuhan Artemisia  annua untuk  memproduksi  senyawa  aktif  antibakteri  melalui  proses  fermentasi.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak  dari  cairan  fermentasi,  baik  ketika  fermentasi  dilakukan  dalam  skala Erlenmeyer  maupun  fermentor stirred  tank skala  2  liter,  menunjukkan  adanya  aktivitas  antimikroba.  Aktivitas antimikroba  ini  ditunjukkan  dengan  terbentuknya  zona  jernih  pada  petri  dish  yang  diinokulasi  dengan  bakteri. Dalam  hal  ini digunakan  dua  galur  bakteri  patogen  yaitu Staphylococcus  aureus ATCC  25923  dan Escherichia coli BCC  2210.  Diameter  zona  jernih  terbesar  yang  terbentuk  yaitu  20  mm  untuk  inhibisi  dari Staphylococus aureus dan 9,5 mm untuk penghambatan Escherichia coli keduanya diperoleh dengan pemberian ekstrak  cairan fermentasi yang dilakukan dengan fermentor stirred tank skala 2 liter.
Kata kunci : Artemisis annua , anti mikroba , endophyte , fermentasi, metabolit sekunder

## PENDAHULUAN
Sampai  saat  ini,  penyakit  infeksi seperti  malaria,  demam  berdarah  dengue (DBD), diare dan tuberkulosis (TB) masih merupakan  masalah  kesehatan  utama  di Indonesia.
Perkembangan resistensi bakteri penyebab penyakit infeksi terhadap  beberapa  antibiotik  tertentu menyebabkan permasalahan dalam mengatasi penyakit infeksi menjadi
semakin  sulit  (Sardjoko,  1991;  Smith,
1995).  Kondisi  ini  mendorong  terus dilakukannya penelitian
mengenai
pencarian  antibiotik  baru  (Sardjoko,
1991). Malaria  merupakan  salah  satu
contoh klasik dari penyakit yang
diakibatkan oleh infeksi, yaitu oleh parasit Plasmodium  falciparum .  Pada  awalnya pengobatan malaria bisa dilakukan dengan menggunakan senyawa quinin yang diekstraksi  dari    tanaman  kina  ( Chincona spp )  sampai P.  falciparum melakukan adaptasi  dan  menjadi  resisten  terhadap senyawa  ini.  Alternatif  obat  antimalaria yang  tersedia  adalah chloroquin yang merupakan  hasil  sintesa  yang  pada akhirnya P.  falciparum juga  resisten terhadap senyawa ini. Dengan meningkatnya  resistensi P.  falciparum terhadap  choloroquin  menyebabkan  para peneliti  memfokuskan  perhatiannya  pada senyawa Artemisinin yang  ditemukan pada  tumbuhan Artemisia  annua dan dalam  jumlah  yang  lebih  sedikit  pada Artemisia apiacea (Namdeo, et al 2006)
Mikroba  merupakan  salah  satu sumber  penghasil  senyawa  antibiotik, bahkan  saat  ini  hampir  semua  antibiotik yang  ditemukan  berasal  dari  mikroba,
yaitu dari bakteri, jamur dan
Actinomycetes (Akmal  &  Romita,  1996).
Belakangan  diketahui  mikroba  endofitik dari berbagai tanaman mampu menghasilkan  metabolit  sekunder  yang memiliki  aktifitas  antibakteri.  Dimana metabolit  sekunder  terbentuk  karena adanya hubungan simbiosis antara mikroba  endofit  dengan  tanaman  sebagai hostnya.  Rosana  (2001)  melaporkan bahwa dari 19 isolat jamur endofitik yang diisolasinya  dari  tanaman  belimbing wuluh  ( Averrhoa  bilimbi L)  5,3%  dari isolat  berpotensi  menghasilkan  metabolit sekunder dengan aktivitas antibakteri, dan 15,8%  lainnya  berpotensi  menghasilkan antijamur.  Sedangkan  dari  54  isolat bakteri  endofitik  yang  terisolasi  1,9% diantaranya  menunjukkan  potensi  sebagai penghasil antibakteri dan 5,6% berpotensi menghasilkan antijamur.
Keuntungan memanfaatkan mikroba  melalui  proses  fermentasi  untuk memproduksi  metabolit  sekunder  dengan aktivitas tertentu adalah kecepatan pertumbuhan  yang  jauh  lebih  tinggi
dibandingkan  tanaman  serta  kemudahan dalam penggandaan skala.
Artemisia L  tergolong  dalam famili compositae dan  beberapa  species diantaranya telah lama digunakan sebagai obat  tradisional  di  Cina.  Tanaman  ini tumbuh  di  dataran  menengah  sampai pegunungan  atau  pada  ketinggian  800  m sampai  2.300  m  diatas  permukaan  laut. Salah  satu  sumber  potensial  adalah Artemisia annua . Tumbuhan yang berasal dari  daratan  Cina  ini  sudah  diketahui sebagai  penghasil  senyawa  artemisinin, suatu  senyawa  aktif  untuk  melawan malaria.  Di  Cina  tumbuhan  ini  sudah dimanfaatkan  secara  tradisional  untuk pengobatan  demam  sejak  lebih  dari  2000 tahun  lalu  (Namdeo, et  al 2006)    Di
Indonesia Artemisia annua dapat ditemukan  pada  daerah-daerah  berhawa dingin, seperti Tawangmangu dan dataran tinggi  di  wilayah  Irian  Jaya.  Secara tradisional  tanaman  ini  biasa  digunakan sebagai  obat  flu,  demam,  rematik,  bisul, disentri, radang tenggorokan, dan antimalaria  (Djumidi  &  Sutjipto,  1999). Sedangkan  komponen  senyawa  kimia yang  telah  diisolasi  dari Artemisia  annua lebih  menunjukkan  aktivitas  sebagai antimalaria,  antibakteri  dan  antiinflamasi (Tan,  dkk,  1998).  Daun  dan  seluruh bagian  tanaman A.  Annua mengandung saponin,  seskuiterpen,  sterol,  acetylen, fenilpropan, flavonoid, kumarin,
polyfenol  dan  minyak  atsiri  (Keys,  1976; Tan,  dkk,  1998).    Golongan  seskuiterpen yang  terkandung  antara  lain  adalah artemisinin,  artemisinol,  artemisiten  dan asam artemisinat (Tan, dkk, 1998).
Liu, et  al (2001)  melalui  hasil penelitiannya menunjukkan bahwa dari 39 isolat  mikroba  endofitik  yang  diisolasi dari  tanaman Artemisis  annua ,  21  isolat diantaranya
mampu menghasilkan
senyawa  dengan  aktivitas  anti  jamur patogen  untuk  tanaman  ( Phytopathogenic fungi ). Dalam hal ini digunakan beberapa jamur  patogen  yang  sering  mengganggu panen  yaitu, Gaeumannomyces  graminis var. tritici, Rhizoctonia cerealis,
Helminthosporium  sativum,  Fusarium graminearum,  Gerlachia  nivalis  and
Phytophthora capsici .
Pada penelitian ini telah dipelajari aktivitas antibakteri dari metabolit sekunder  yang  dihasilkan  isolat  kapang endofitik AT 32 yang diisolasi dari tanaman Artemisia annua asal Tawangmanggu.

## BAHAN DAN METODA

## Bahan
Mikroorganisme :
kapang
endofitik  AT  32  adalah  kapang  endofitik hasil isolasi dari tanaman Artemisia annua yang dikoleksi dari daerah Tawangmanggu,  Jawa  Tengah.  Kapang ini  merupakan  koleksi  dari  Laboratorium Fitofarmaka,  Puslit  Bioteknologi-LIPI.
Sementara  itu  uji  aktivitas  antibakteri dilakukan  dengan  menggunakan  bakteri uji Staphylococcus  aureus ATCC  25923,
yang  diperoleh  dari  Balai  Penelitian Veteriner (Balitvet), Bogor dan Escherichia  coli BCC  2210,  yang
diperoleh  dari  Puslit  Bioteknologi-LIPI, Cibinong.
Media  :  media  pemeliharaan kapang digunakan SDA (Sobourant Dextrose Agar), sementara media pemeliharaan untuk  bakteri  uji  digunakan media NA (Nutrien Agar). Untuk menguji aktivitas antibakteri dari metabolit
sekunder  yang  dihasilkan  kapang  AT  32, bakteri  ditumbuhkan  dalam  media  agar lunak  NA  (Tabel  1).  Sedangkan  proses fermentasi dilakukan dengan menggunakan  media    Sucrose  Yeast Pepton (SYP) (Tabel 2). Tabel 1. Komposisi media agar lunak Bahan Kandungan (g/100 ml) Nutrien Broth 0,8 Bacto pepton 0,5 Natrium klorida 0,5 Bacto agar 1,0
Tabel 2. Komposisi media SYP Bahan Kandungan/ 100 ml Sukrosa 1,0 g Gliserol 1,0 ml Yeast Extract 1,0 g Bacto pepton 0,5 g K2HPO4 0,5 g NaCl 0,5 g

## Metode
Pengamatan morfologi kapang : Pengamatan  morfologi  kapang endofitik dilakukan pada media SDA serta pengamatan secara mikroskopik. Pengamatan  morfologi  ini  dilakukan setelah  kapang  dibiarkan  tumbuh  dalam media  SDA  selama  5  hari,  dimana pengamatan  dilakukan  terhadap  bentuk dan warna kapang. Sementara pengamatan mikroskopik dilakukan
dengan  mengambil  dan  meletakkan  hifa dari  kapang  pada  kaca  objek  yang  telah dibasahi  aquadest  steril.  Pengamatan dilakukan dengan pembesaran 40 kali.
Fermentasi :
Pada  tahap  pendahuluan  proses fermentasi dilakukan dengan menggunakan  labu  Erlenmeyer  100  ml dengan menggunakan media SYP sebanyak  20  ml  dan  inkubasi  dilakukan pada  shaker  dengan  kecepatan  100  rpm dan suhu ruang. Sementara inokulum atau prekultur dari kapang AT 32 ditumbuhkan dalam  tabung  reaksi  selama  2  hari.  Pada tahap selanjutnya proses fermentasi dilakukan  dengan  menggunakan stirred tank fermentor  2  L,  dimana  media  yang digunakan sebanyak 1500 ml.
Ekstraksi Ekstraksi terhadap hasil fermentasi  dilakukan  dengan  pelarut kloroform, dimana jumlah kloroform yang digunakan  sebanding  dengan  jumlah cairan  hasil  fermentasi  yang  diekstraksi atau (1:1), dan dilakukan dengan menggunakan  corong  pisah.  Ekstraksi dilakukan  sebanyak  3  kali  ulangan. Selanjutnya  fasa  kloroform  dari  hasil ekstraksi  dikumpulkan  dan  dipekatkan dengan menggunakan evaporator vakum.

## Pengamatan laju pertumbuhan
Laju  pertumbuhan  kapang  AT  32 diamati  dengan  cara  menimbang  bobot kering  dari  biomasa  yang  diambil  dari beberapa umur fermentasi

## Pengujian aktifitas
Pengujian  aktifitas  antibakteri metabolit  sekunder  dilakukan  terhadap bakteri Staphylococcus  aureus ATCC 25923  dan Escherichia  coli BCC  2210. Uji aktivitas ini dilakukan dengan metode difusi  cakram,  dimana  senyawa  uji dimasukkan  kedalam  kertas  cakram  yang kemudian  diletakkan  diatas  media  agar padat  yang  telah  diinokulasi  bakteri  uji dan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama 18–24  jam.  Besarnya  aktivitas  akan ditunjukkan  oleh  besarnya  zona  hambat atau zona jernih yang terbentuk disekeliling cakram.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Pengamatan morfologi kapang
Morfologi  dari  isolat  kapang endofitik  yang digunakan  diamati secara mikroskopik,  dalam  hal  ini  digunakan media  SDA  untuk  pertumbuhannya,  dan pengamatan  dilakukan  setelah  kapang diinkubasi selama 5 hari pada suhu 30 o C. Pengamatan  dibawah  mikroskop  dengan pembesaran  40  kali  memperlihatkan bahwa  sel  kapang  memiliki  bentuk memanjang  seperti  benang.  Sementara
pengamatan  langsung  terhadap  morfologi kapang  yang  tumbuh  pada  media  SDA menunjukkan bahwa kapang endofitik AT 32  ini  berwarna  putih  dengan  bentuk serabut  keriting  dan  bergumpal  (Gambar 1).

## Pengamatan pertumbuhan kapang
Gambar  2  menunjukkan  pola pertumbuhan  dari  kapang  AT  32,  dimana fase  eksponensial  mulai  terjadi  pada  hari kedua  yang  ditandai  dengan  peningkatan bobot  biomasa  yang  sangat  nyata.  Pada hari  pertama  bobot  biomasa  kering  hanya 0,6375  mg/ml  dan  meningkat  menjadi 5,3700  mg/ml  pada  hari  kedua.  Fase eksponensial ini berakhir pada hari kelima dimana  pada  awal  fase  stasioner  (hari  ke 5)  bobot  biomasa  mencapai  9,6025 mg/ml.  Sementara  fase  kematian,  dimana bobot  biomasa  kering  turun  menjadi 8,8450 mg/ml, terjadi pada hari ke 11.
Pola  pertumbuhan  ini  diikuti dengan perubahan pH kultur, dimana pada awal  fermentasi  terjadi  penurunan  nilai pH  dari  semula  7,38  dan  turun  menjadi 5,85  pada  hari  kedua.  pH  kemudian meningkat kembali pada proses fermentasi  selanjutnya  dengan  mencapai nilai  tertinggi  pada  hari  ke  tujuh,  yaitu sebesar 7,99.
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Umur Fermentasi (Hari) pH kultur Biomassa kering

## Gambar 2. Pertumbuhan kapang AT 32
Perubahan  pH  kultur  ini  dapat disebabkan  karena  adanya  senyawa- senyawa  asam/basa  yang  dihasilkan  oleh kapang  selama  proses  fermentasi.  Oleh karena itu perubahan pH kultur mencerminkan  adanya  pertumbuhan  dan metabolisme selama proses fermentasi.
Uji  aktivitas  antibakteri  dari  hasil fermentasi.
Produksi senyawa metabolit sekunder melalui proses fermentasi umumnya  terjadi  setelah  memasuki  fase stasioner. Sehubungan dengan itu,
pengambilan  sampel  untuk  pengujian aktivitas antibakteri terhadap hasil fermentasi  dilakukan  pada  hari  ke  5 sampai  ke  12,  dimana  hari  ke  5 merupakan awal dari fase stasioner. Hasil uji  aktivitas  antibakteri  menunjukkan bahwa pengujian langsung terhadap cairan hasil  fermentasi  yang  dilakukan  dalam skala  Erlenmeyer  tidak  menunjukkan aktivitas antibakteri
terhadap
Staphylococcus  aureus ATCC  25923  dan Eschericia  coli BCC  2210  (Gambar  3). Sedangkan  pengujian  terhadap  ekstrak kloroform  dari  cairan  hasil  fermentasi menunjukkan  adanya  aktivitas  antibakteri baik  terhadap Staphylococcus  aureus
ATCC  25923  maupun Eschericia  coli BCC 2210 (Gambar 4). Aktivitas  antibakteri  dari  ekstrak kloroform  cairan  hasil  fermentasi  ini diberikan  oleh    sampel  yang  diambil mulai  pada  hari  ke  8  sampai  hari  ke  12
dengan diameter zona hambat rata-rata 10 mm.  Sementara  ekstrak  dari  sampel  hari ke  5,  6  dan  7  tidak  memberikan  aktivitas antibakteri.  Hal  ini  membuktikan  bahwa pembentukan senyawa metabolit sekunder antibakteri  ini  terjadi  pada  fase  stasioner, dan  pada  hari  ke  5  sampai  7  konsentrasi senyawa  tersebut  kemungkinan  masih sangat kecil.
Dari  hasil  pengujian  terhadap cairan  hasil  fermentasi  dan  ekstrak kloroformnya  tersebut  dapat  disimpulkan bahwa  kapang  endofitik  AT 32 mampu memproduksi  senyawa  antibakteri.  Tidak terbentuknya zona hambat ketika pengujian  dilakukan  terhadap  cairan  hasil fermentasi menunjukkan bahwa konsentrasi senyawa aktif antibakteri yang dihasilkan tidak terlalu besar dibandingkan dengan keberadaan senyawa-senyawa  lain  didalam  cairan hasil  fermentasi.  Melalui  proses  ekstraksi dengan pelarut kloroform sebagian senyawa  telah  terpisahkan,  khususnya senyawa-senyawa  yang  lebih  cenderung larut  dalam  air,  termasuk  air  yang merupakan  pelarut  dari  media.  Dengan terpisahkannya  air  dan  beberapa  senyawa yang  larut  didalamnya  maka    konsentrasi senyawa  aktif  antibakteri  yang  terdapat dalam ekstrak menjadi cukup tinggi.
Untuk  mempelajari  kemungkinan  adanya senyawa  antibakteri  yang  diproduksi  dan tertahan didalam sel kapang
(intracellular ),  telah  dilakukan  ektraksi dan pengujian aktivitas terhadap biomassa sel.  Dari  pengujian  ini  tidak  tampak pembentukan  zona  hambat.  Ini  berarti bahwa  senyawa  aktif  antibakteri  yang diproduksi bersifat ekstraselluler.
Produksi  senyawa  antibakteri  dalam fermentor skala 2 liter.
Pada tahap selanjutnya, fermentasi dilakukan dengan menggunakan stirred tank reactor  skala  2 liter.  Seperti pada fermentasi dalam skala Erlenmeyer,  selama  proses  fermentasi diamati laju perubahan pH dan
pertumbuhan dari kapang. pH media awal ditetapkan  7,44  dan  pH  kultur  pada  akhir fermentasi turun menjadi 6,55. Penurunan
nilai  pH  sedikit  lebih  kecil  dibandingkan pada  saat  fermentasi  dilakukan  dengan menggunakan Erlenmeyer. Hal ini kemungkinan    disebabkan  kondisi  agitasi yang lebih baik. Sementara itu pengamatan  laju  pertumbuhan  kapang yang  dilakukan  dengan  cara  pengambilan sampel  setiap  hari  dan  menghitung  berat kering biomassanya sulit dilakukan dengan  baik.  Karena  kapang  tumbuh dalam  bentuk  benang-benang  panjang yang menggumpal maka sampel biomassa yang  terambil  tidak  bisa  mewakili keadaan yang sebenarnya. Dapat diperkirakan  bahwa  konsentrasi  biomassa yang  terukur  selalu  jauh  lebih  rendah dibandingkan keadaan sebenarnya. Pengujian  aktifitas  antibakteri dari hasil fermentasi dengan
menggunakan  fermentor  ini  dilakukan terhadap  ekstrak  pekat  maupun  ekstrak yang  diencerkan  sampai  dengan  1000 μg/ml.  Sementara  pengambilan  sampel hanya dilakukan pada hari ke 8. Dari hasil pengamatan  (Gambar  5)  terlihat  bahwa ekstrak pekat memberikan zona hambatan rata-rata  pada Staphylococcus  aureus sebesar  20  mm,  sedangkan  dengan konsentrasi  1000  μg/ml  zona  hambatan yang terbentuk sebesar 9,5 mm. Sementara  itu  pada  pengujian  dengan menggunakan Eschericia coli , zona hambatan  yang  terbentuk  dengan  ekstrak pekat  adalah  sebesar  9,5  mm  dan  hasil pengencerannya memberikan zona hambat sebesar 7 mm.
Gb. 5.  Sebelah  kiri  zona  hambat terhadap S. aureus dan kanan terhadap E. coli .

## KESIMPULAN
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa kapang endofitik hasil isolasi dari tanaman Artemisia annua (AT
32 ) yang tumbuh didaerah Tawangmanggu dapat  menghasilkan  senyawa  metabolit sekunder dengan aktifitas antibakteri yang yang  cukup  kuat.  Aktifitas  antibakteri  ini terlihat  dari  pembentukan  zona  hambatan baik  yang  diberikan  oleh  ekstrak  pekat maupun  setelah  ekstrak  pekat  tersebut diencerkan  sampai  1000  μg/ml.  Sebagai mana  kebanyakan  senyawa  metabolit sekunder, senyawa aktif antibakteri tersebut diproduksi pada fase eksponensial  dari  pertumbuhan  kapang dan merupakan senyawa ekstraselluler.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih kami sampaikan  pada  Bapak  Dr.  Partomuan Simanjuntak,  APU  (Lab.  Fitofarmaka,  P2 Bioteknologi-LIPI),  yang  telah  banyak membantu,  baik  dalam  menyediakan isolat kapang endofitik AT 32 maupun pada saat pelaksanaan penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Akmal,  A.  H.  dan  A.  Romita.,  1996.
Isolasi  mikroba  tanah  penghasil antibiotik  dari  sampel  tanah pada lokasi penumpukan sampah. Cermin Dunia Kedokteran, No.18. 1996 . Djumidi  dan  Sutjipto.  1999. Inventaris tanaman  obat.  Jilid  V .  Badan Penelitian  dan  Pengembangan Kesehatan, Depkes. Jakarta. 1999. Keys,  D.  J.,  1976, Chinese  herbs,  their botany, chemistry and pharmacodynamics . Swindow book Company, Ltd. Hongkong,
1976.
Liu,  C.  H.,  W.  X.  Zou,  H.  Lu  and  R.  X. Tan.  2001.  Antifungal  activity of  Artemisia  annua  endophyte cultures against phythopathogenic fungi. Journal  of  Biotechnology  ;  88 (3), Hal. 277 – 282 .
Namdeo,  A.  G.,  Mahadik  K.  R.  and
Kadam S. S., 2006, Antimalarial drug – Artemisia annua, Pharmacognosy  Magazine  Vol 2, Issue 6, Apr-Jun, 2006. Sardjoko,  1991. Bioteknologi,  Latar belakang dan beberapa penerapan . PT. Gramedia, Jakarta, 1991.
Smith,  E.  J.,  1995. Bioteknologi,  Ed.  2 , terjemahan  Hartono,  A.,  EGC. Jakarta. 1995.
Rosana,  Y.,  2001,  Isolasi  dan  seleksi mikroba endofit penghasil antimikroba dari tanaman belimbing wuluh ( Averhoa bilimbi Lin). Kekhususan mikrobiologi  kedokteran.  PS Ilmu  Biomedik-Program  Pasca Sarjana, FK, UI. Jakarta. Tan, X. R., W. F. Zheng dan Q. H. Tang, 1998. Biological active substance from genus Artemisia ,
Planta Medica , No. 54.