## Cendekia Journal of Pharmacy
STIKES Cendekia Utama Kudus

## EFEK SITOTOKSIK EKSTRAK DAN FRAKSI HERBA KEMANGI
(O cimum basilicum L.) PADA SEL KANKER SERVIKS HELA
Ghani Nurfiana Fadma Sari 1 *, Mamik Ponco Rahayu 2 , Hilda Khairunnisa 3 , Desi Ratna 4 1*,2,3,4 S1 Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Surakarta Email: ghaninurfiana@gmail.com

## ABSTRAK
Di  Indonesia  kanker  serviks  merupakan  salah  satu  kanker  penyebab  kematian  wanita  setelah kanker payudara. Herba  kemangi  ( Ocimum basilicum L.)  banyak digunakan  sebagai  alternatif pengobatan kanker. Tujuan: mengetahui efek sitotoksik dari herba kemangi terhadap sel HeLa dan sel Vero. Metode: ekstraksi herba kemangi dilakukan dengan maserasi kemudian difraksinasi menggunakan pelarut  n-heksan , etil  asetat  dan  air.  Ekstrak dan  fraksi diuji  efek  sitotoksiknya menggunakan metode MTT dengan seri konsentrasi 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 µg/mL. Cisplastin  digunakan  sebagai  kontrol  positif  dan  kontrol  sel  sebagai  kontrol  negatif.  Hasil: aktivitas sitotoksik ekstrak, fraksi n-heksan, etil asetat dan air herba kemangi terhadap sel HeLa menunjukkan  nilai  IC 50 berturut-turut  yaitu  (156,27;  120,55;  170,17;  186,62)  µg/ml  dengan indeks selektivitas lebih dari 3 untuk ekstrak dan ketiga fraksi. Kesimpulan: ekstrak dan fraksi herba kemangi memiliki efek sebagai agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks.
Kata Kunci : kemangi ( Ocimum basilicum L.), sitotoksik, sel HeLa, sel vero

## ABSTRACT
Cervical cancer is one of the major causes of death for women in Indonesia, after breast cancer. Basil herbs (Ocimum basilicum L.) are commonly used as a cancer treatment alternative. Purpose: To  determine  the  cytotoxic  effect  of  basil  herbs  on  HeLa  and  Vero  cells. Methods:  Basil  was extracted by maceration and then fractionated with the solvents n-hexane, ethyl acetate, and water. Extracts and fractions were tested for cytotoxic effects using the MTT method with a concentration series of 500; 250; 125; 62.5; 31.25; 15,625 µg/mL. Cisplastin was used as positive control and cell control as a negative control. Results: The cytotoxic activity of the extract, n-hexane fraction, ethyl acetate and basil herb water against HeLa cells showed IC 50 values  respectively, namely (156.27; 120.55; 170.17; 186.62) µg/ml with a selectivity index of more than 3 for the extract and the  three  fractions. Conclusion:  Extracts  and  fractions  of  Basil  herbs  have a  chemopreventive effect on cervical cancer cells.
Keywords: Ocimum basilicum L. , cytotoksik, HeLa cell, vero cell
P-ISSN 2559 – 2163           E-ISSN 2599 – 2155 Vol. 5, No. 2, November 2021 http://cjp.jurnal.stikescendekiautamakudus.ac.id

## LATAR BELAKANG
Di  Indonesia  kanker  serviks  menempati  urutan  kedua  setelah  kanker  payudara  yang dialami  oleh  wanita.  Berdasarkan  umur  diketahui  bahwa  kanker  serviks  memiliki  persentase tertinggi setelah kanker payudara dan kanker prostat yaitu sebesar 14 % dan persentase kematian akibat  kanker  serviks  adalah  6,8%.  Berdasarkan  kondisi  ini,  pengatasan  kanker  dengan menghambat dan mematikan pertumbuhan sel kanker secara selektif perlu diupayakan (IARC, 2012).
Terapi pengobatan dan penghambatan kanker serviks telah dilakukan diantaranya dengan menggunakan terapi bedah, radioterapi, dan kemoterapi maupun kombinasi ketiganya (Nakano, 2010).  Minat  masyarakat  terhadap  penggunaan  obat  tradisional  akhir-akhir  ini  cenderung meningkat. Hal ini disebabkan adanya kekhawatiran efek samping yang ditimbulkan oleh obat- obat konvensional dan juga dengan alasan obat tradisional mudah didapat dan murah harganya (Kurnijasanti,  2008).  Tanaman  kemangi  merupakan  spesies  dari  genus Lamiaceae yang  telah dilaporkan memiliki banyak kandungan senyawa kimia yang berpotensi sebagai antikanker.
Beberapa  kandungan  senyawa  kimia  dalam  tamanan  kemangi  adalah  tanin  (4,6%), flavonoid, steroid atau triterpenoid, minyak atsiri (2%), dan asam ursolat (Selvi, 2015). Senyawa terbesar yang aktif terkandung dalam kemangi adalah eugenol (70-80%) (Wijayakusuma, 2000). Eugenol  yang  terdapat  pada  minyak  atsiri  kemangi  telah  dilakukan  penelitian  tentang antiproliferatif secara in vitro pada sel HeLa dengan nilai IC 50 16,26 µg/mL (Zarlaha, 2014). Berdasarkan latar belakang di atas, dilakukan penelitian untuk mengetahui efek sitotoksik dan  selektivitas  ekstrak  dan  fraksi  herba  kemangi  terhadap  sel  kanker  serviks  .  Penelitian  uji sitotoksik  dilakukan  menggunakan  metode  [3-(4,5-dimetiltiazol-2- il )-2,5-difenil  tetrazolium bromida  (MTT)  pada  kultur  sel  HeLa dan  sel  Vero  yang  ditunjukkan  dengan  parameter  IC 50 . Selektitivitas ekstrak dan fraksi herba kemangi dibuktikan dengan pembanding sel epitel normal Vero melalui parameter nilai SI ( Selectivity Index ). Data-data ilmiah tersebut dapat menjadi dasar penggunaan herba kemangi sebagai agen kemopreventif yang aman dan selektif.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi timbangan analitik (Shimadzu), plate 96  wells  (Biologix),  kertas  saring  (Sartorius),  microtube  (Axygen),  waterbath,  Erlenmeyer (Pyrex), oven (Memmert), gelas beker (Pyrex), lemari pendingin (Samsung), blender (Miyako), rotary  evaporator  (Heidolph),  mikropipet  (Socorex),  inkubator  CO 2 (Biobase),  inverted microscope (Olympus), serta ELISA reader (Drawel).
Bahan yang digunakan untuk ekstraksi adalah herba kemangi ( Ocimum basilicum L.) serta etanol 96% (Merck) dan n-heksan  (Merck), etil asetat (Merck), aquades sebagai pelarut. Sedangkan bahan yang digunakan untuk menguji sitotoksisitas adalah kultur sel HeLa, Sel Vero, DMEM (Merck), fungizon (Merck), Dimethil Sulfoxide (DMSO) (Merck), Phospat Buffer Saline (PBS)  (Merck),  Fetal  Bovine  Serum  (FBS)  (Merck),  Methyl-Thiazolyl-Tetrazolium  (MTT) (Merck), Tripsin (Merck), Sodium Dodesil Sulfat (SDS) (Merck), 1% HCl 0,1N (Merck), serta Cisplastin (Kalbe).

## Prosedur Kerja
a) Pembuatan ekstrak dan fraksinsi
Serbuk  kering  herba  kemangi  dimaserasi  menggunakan  etanol  96%  dengan  cara menimbang serbuk herba kemangi sebanyak 1000 gram dalam 10 liter etanol 96%. Dilakukan perendaman  selama  6  jam  pertama,  sesekali  diaduk  kemudian  didiamkan  selama  18  jam. Maserat  disaring  menggunakan  penyaring  vakum,  dipisahkan  dari  ampasnya.  Proses penyarian diulangi dengan volume penambahan pelarut setengah dari pelarut awal. Semua maserat  kemudian  dikumpulkan  dan  diuapkan  dengan  penguap  vakum  hingga  diperoleh ekstrak kental (Depkes RI, 2013).
Fraksinasi dari ekstrak etanol kemangi dilakukan secara partisi dengan menggunakan corong pisah. Ekstrak etanolik sebanyak 10 g kemudian disuspensi dengan air sebanyak 75 ml lalu dipartisi dengan n- heksana 75 ml dan di replikasi sebanyak tiga kali menggunakan corong pisah. Lapisan n- heksana selanjutnya dikumpulkan dan dipekatkan dengan vaccum rotaevaporator ,  filtrat n- heksana  yang  kering  ini  selanjutnya  disebut  fraksi n- heksana. Lapisan air sisa partisi dengan n- heksan kemudian dipartisi lagi dengan 75 ml etil asetat dan direplikasi sebanyak tiga kali. Lapisan etil asetat dipisahkan dan dipekatkan dengan vaccum rotaevaporator dan diperoleh fraksi etil asetat. Lapisan air diuapkan di atas waterbath sampai kental, yang kemudian disebut fraksi air. Fraksi yang didapat masing-masing ditimbang untuk mendapat persen rendemen terhadap bobot awal (Sari, 2017).
b) Uji sitotoksik terhadap sel Hela dan sel Vero
Sel HeLa dan sel Vero diaktifkan dengan medium lengkap pada kultur flask, dengan penggantian  medium  dilakukan  setiap  dua  hari  sekali.  Pemeliharaan  sel  HeLa  dilakukan dalam inkubator CO 2 5% dengan suhu 37ºC. Pemanenan sel HeLa dilakukan apabila sel sudah konfluen yaitu meratanya sel sebagai sel HeLa dan sel Vero sampai menutupi tissue disk . Kultur sel HeLa dan sel vero yang telah konfluen dipanen dengan tripsin. Sel dipindah ke dalam tabung conical steril dan ditambah media DMEM 1640 hingga volume 10 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, ditambahkan 3 mL media dan diresuspensikan. Diambil 10 μL dan dipipetkan ke haemocytometer lalu sel dihitung di bawah mikroskop inverted . Jumlah suspensi sel yang harus diambil dan jumlah media yang harus ditambahkan dihitung untuk memperoleh konsentrasi sel sebesar 2 x 10 4 sel/100 μL. Sel didistribusikan ke dalam microplate sumuran 96 dengan konsentrasi 2 x 10 4 sel/sumuran dalam 100 μL kemudian diinkubasi dalam inkubator 24 jam untuk beradaptasi dan menempel di sumuran.
Sebanyak  100  μL  larutan  uji  disuspensikan  dengan  100  μL  sel  dalam  medium DMEM untuk sel HeLa dan sel Vero (kepadatan 2 x 10 4 sel/sumuran). Sampel dimasukkan kedalam microplate 96.  Sel  diinkubasi  selama  24  jam  dalam  inkubator  CO 2 5  %.  Sampel masuk dalam plate dengan seri konsentrasi 500 μg/mL; 250 μg/mL; 125 μg/mL; 62,5 μg/mL; 31,25 μg/mL; 15,6 μg/mL; 7,8 μg/mL, untuk kontrol positif menggunakan Cisplatin dengan seri konsentrasi 100 µg/mL; 50 µg/mL; 25 µg/mL; 12,5 µg/mL; 7,125 µg/mL; 3,5625 µg/mL dan kontrol negatif menggunakan kontrol sel. Selanjutnya plate diinkubasi dalam inkubator CO 2 5 % suhu 37 0 C selama 24 jam. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu (formazan). Lalu dibuang media sel, ditambahkan 100 μL reagen MTT ke setiap sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel). Setelah diinkubasi selama 4 jam, ditambahkan
100 μL SDS 10 % untuk menghentikan reaksi antara sel hidup. Pada akhir inkubasi serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.
c) Analisa hasil
Hasil  uji  sitotoksik  pada  sel  HeLa  dan  sel  Vero  didapatkan  data  absorbsi  dicari hubungan  regresi  linier  antara  log  konsentrasi  dengan  persen  sel  hidup  menghasilkan persamaan  y  =  bx+a,  IC 50 dihitung  dengan  cara  mensubtitusi  nilai  50  pada  Y  sehingga diperoleh  nilai  x  dan  nilai  IC 50 merupakan  antilog  x.  Persentase  sel  hidup  dihitung menggunakan rumus:
Selektivitas  ekstrak  dan  fraksi  herba  kemangi  dievaluasi  dengan  menggunakan parameter Selektivity Index (SI). Suatu sampel dikatakan mempunyai selektivitas yang tinggi apabila nilai SI ≥ 3, dan dikatakan kurang selektif apabila nilai SI ≤ 3 (Rahmawati, 2016). Indeks selektivitas dihitung menggunakan rumus:

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  maserasi  dengan  penyari  etanol  96%  menghasilkan  rendemen  sebesar  6,35%. Penarikan  senyawa  menggunakan  etanol  96%  masih  memiliki  kandungan  senyawa  yang kompleks sehingga perlu dilakukan fraksinasi. Fraksinasi dari ekstrak etanol kemangi dilakukan secara partisi menggunakan ekstrak herba kemangi sebanyak 10 gram. Rata-rata hasil fraksinasi bisa dilihat pada tabel 1 setelah dilakukan 3 kali replikasi.
Tabel 1  Hasil Fraksinasi Ekstrak Etanol Herba Kemangi
Total Berat Ekstrak (g) Fraksi Rata-rata Berat Fraksi (g) Rendemen (%) 30 n -heksan 21,26  0,02 74,23 etil asetat 3,41  0,01 11,36 air 2,56  0,02 8,53
Pada uji sitotoksisitas ekstrak dan fraksi herba kemangi terhadap sel  HeLa dan Vero, hasil  yang  diperoleh  menunjukkan  ekstrak dan fraksi  bersifat  toksik  yang  dapat  menghambat pertumbuhan sel kanker dengan fenomena dose dependent yang ditunjukkan dengan efek toksik meningkat seiring peningkatan konsentrasi. Hasil uji sitotoksik dapat dilihat pada gambar 1.
% sel hidup Indeks selektivitas ∶ IC50 Sel Vero IC50 Sel HeLa
Gambar 1  Morfologi Sel HeLa (A) dan Sel Vero (B) setelah penambahan sampel uji. Ekstrak  etanol    (1),  fraksi  n-heksan  (2),  fraksi  etil  asetat  (3),  fraksi  air  (4), Cisplatin (5).   Keterangan : (        ) sel mati, (        ) sel hidup
Hasil  uji  setelah  penambahan  MTT,  sel  HeLa  dan  sel  Vero  yang  masih  hidup  akan menghasilkan  enzim  mitokondria  reduktase  yang  selanjutnya  akan  bereaksi  dengan  cara mereduksi MTT sehingga membentuk kristal jarum formazan berwarna ungu (gambar 2). Kristal jarum farmazan tidak larut dalam air tetapi larut dalam SDS. Kristal-kristal formazan tersebut dapat menembus membran sel dan terakumulasi di dalam sel sehat. Sel yang mati tidak dapat terwarnai oleh garam MTT sehingga tidak membentuk warna ungu seperti pada sel hidup.
Gambar 2 Morfologi sel hidup yang membentuk kristal formazan pada Sel HeLa (A), Sel Vero (B) pada mikroskop pembesaran 10 x. Keterangan : (1) sel mati, (2) sel hidup
Hasil  analisis  dengan  regresi  linier  diperoleh  nilai  IC 50 untuk  masing-masing  sampel ekstrak, fraksi heksan, etil asetat dan air, serta hasil analisa selektivitas ditunjukkan pada tabel 2.
A B 1 2 3 4 5
Tabel 2  Nilai IC 50 dan Hasil Uji Indeks Selektivitas Ekstrak dan Fraksi Herba Kemangi
Sampel Nilai IC 50 (µg/mL) Indeks Selektivitas Sel HeLa Sel Vero Ekstrak 741,31 3053,25 4,11 Fraksi n-heksan 120,55 1515,37 12,57 Fraksi etil asetat 170,17 1824,37 10,72 Fraksi.Air 186,62 2075,51 11,12 Cisplatin 16,04 11,3765 0,71

## PEMBAHASAN
Herba kemangi yang digunakan pada penelitian ini dalam bentuk fraksi terbukti bekerja lebih  efektif  sebagai  anti  kanker  terhadap  sel  HeLa  daripada  ekstraknya  karena  kombinasi sejumlah bahan aktif yang terdapat pada ekstrak yang bekerja pada target reseptor dimungkinkan memiliki mekanisme kerja antagonis sehingga dapat menurunkan efek terapi secara keseluruhan.
Menurut  hasil  penelitian, nilai  IC 50 di bawah 100  µg/mL  merupakan agen  antikanker poten  sedangkan  nilai  IC 50 di  atas  100  µg/mL  merupakan  agen  kemopreventif  yang  poten. Berdasarkan  nilai  tersebut  kriteria  IC 50 ekstrak  dan  fraksi  herba  kemangi  belum  menunjukan aktivitas sitotoksik yang poten terhadap sel kanker serviks (sel HeLa), tetapi ekstrak dan fraksi herba kemangi kemungkinan memiliki aktivitas kemopreventif yang poten (Uede, 2002).
Ekstrak dan fraksi herba kemangi bersifat sitotoksik terhadap sel HeLa. Penelitian lain menyebutkan bahwa bahwa ekstrak etanol kemangi memiliki efek kemopreventif pada sel HeLa dengan nilai IC 50 adalah 209 µg/mL (Ismiyati, 2016). Ekstrak etanol kemangi juga menunjukkan efek sitotoksik pada sel kanker kolon ( WiDr cell line ) dengan nilai IC 50 adalah 85 µg/mL dan fraksi  aktif  kloroform  IC 50 25  µg/mL  (Haryanti,  2011).  Isolat  minyak  atsiri  daun  kemangi memiliki nilai IC 50 60 µg/mL terhadap sel MCF-7 (Selvi, 2015).
Selektivitas agen kemopreventif artinya hanya sel yang diidentifikasi sebagai sel kanker saja yang diserang, sementara sel normal tidak diserang. Mekanisme ini sangat berbeda dengan cara kerja obat kemoterapi yang menyerang sel kanker dan juga sel normal. Akibatnya sel normal ikut rusak dan mati yang berakibat pada timbulnya berbagai macam efek samping (Rahmawati, 2016). Ekstrak dan fraksi herba kemangi terbukti selektif terhadap sel HeLa dengan nilai IS ≥ 3.

## SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Ekstrak  dan  fraksi  herba  kemangi  dapat  menghambat  pertumbuhan  sel  HeLa  dan  sel normal  (Vero).  Efek  sitotoksisitas  ekstrak dan fraksi  herba  kemangi  paling  poten dan  bekerja selektif pada sel kanker payudara yaitu fraksi n-heksan, sehingga fraksi ini mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai agen kemoterapi pada kanker serviks.

## Saran
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk  dapat  mengetahui  senyawa  apakah  yang berperan dalam aktivitas sitotoksik, pengujian sel kanker lain dan uji apoptosisnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Depkes RI. (2013) . Farmakope Herba Indonesia. Edisi I. Suplemen III. Jakarta : Kemmenkes RI. Haryanti S dan Katno. (2011). Aktivitas Sitotoksik Ocimum sanctum L pada Sel Kanker Kolon WiDr. Simposium Nasional XV PERHIPBA . Hlm 1-7.
IARC  International  Agency  for  Research  on  Cancer.  (2012). All  Cancers  (Excluding  non- melaomaskin cancer) Estimed Incidance . Mortality and Prevelency world wide in 2012. Ismiyati N dan Nurhaeni F. (2016). Efek Ekstrak Etanol Daun Kemangi ( Ocimum sanctum L ) Sebagai  Agen  Kemopreventif  pada  Sel  Kaker  Leher  Rahim  Hela  Melalui  Aktivitas Sitotoksik dan Induksi Apoptosis. Media Farmasi, 13, 35-48.
Kurnijasanti  R,  Hamid  SI,  Rahmawati  K.  (2008).  Efek  Sitotoksik  In Vitro dari  Ekstrak Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) Terhadap Kultur Sel Kanker Mieloma. J. Penelit Media Eksakta, 7, 48-54.
Nakano T, Ohno T, Ishikawa H, Suzuki Y, Takashi T. (2010). Current Advancement in Radiation Therapy for Utarine Cervical Cancer. J Radial Res, 51, 1-8. Rahmawati Ika, Putri H. (2016). Selektivitas Ekstrak Etanolik Buah Makassar (Brucea javanica) pada Kanker Payudara Metastasis secara In Vitro. Journal of Agromedicine and Medical Sciences ,  2, 1.
Sari  GNF,  Mindi  Lukito.  (2017).  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  dan  Fraksi  Daun  Manggis ( Garcinia  mangostana )  terhadap  DPPH  (1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil). Jurnal  farmasi Indonesia ,14, 9-15.
Selvi  MT,  Thirugnanasampandan  R,  Sundarammal  S.  (2015).  Antioxidant  and  Cytotoxic Activities of Essential Oil of Ocimum canum Sims. Journal of Saudi Chemical Society, 19, 97–100.
Uede  JY,  Tesuka  Y,  Banskota  AH,  Tran  QL,  Hariyama  Y,  Saiki  dan  Kadota  S.  (2002). Antiprolifrative activity of Vietmese medicinal plans. Biology phrm, bull, 25, 6, 753-760. Wijayakusuma, M Hembing. (2000). Ensiklopedia Milineum, Tumbuhan Berkhasiat Obat. Jilid ke- 1. Jakarta : Prestasi.
Zarlaha A, Kourkoumelis N, Stanojkovic, TP, Kovala-demertzi D. (2014). Cytotoxic activity of essential oil and extracts of ocimum Basilicum against human carcinoma cells. Molecular Docking  study  of  isoeugenolas  a  potent  cox  and  lox  Inhibitor. Digest  Journal  of Nanomaterials and Biostructures , 9,907-917.