Journal Syifa Sciences and Clinical Research Volume 3 Nomor 2, September  2021
Journal Homepage: http://ejurnal.ung.ac.id/index.php/jsscr , E-ISSN: 2656-9612 P-ISSN:2656-8187
Analisis Kadar Metabolit Sekunder, Histokimia, dan Aktivitas Antioksidan Akar Acalypha indica L.
Novia Agustina 1* , Nurul Istiqomah 1
1 Jurusan Biologi, Fakultas Teknologi dan Manajemen Kesehatan, Institut Ilmu Kesehatan Bhakti Wiyata Kediri ,
Jl. KH. Wahid Hasyim No. 65 Kota Kediri 64114, Indonesia
* Penulis Korespondensi. Email: novia.agustina05@gmail.com

## ABSTRAK
Acalypha  indica L.  merupakan  spesies  tumbuhan  liar  yang  diketahui  memiliki  senyawa metabolit sekunder yang dapat digunakan sebagai bahan obat, namun penggunaannya sampai saat  ini  masih  belum  optimal.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengukur  kadar,  mengetahui lokasi dan distribusi senyawa metabolit sekunder yang terdapat di dalam akar Acalypha indica L., serta mengetahui kemampuannya sebagai agen antioksidan. Pengukuran kadar metabolit sekunder,  meliputi  fenol,  flavonoid,  dan  tanin  dari  ekstrak  kloroform  dan  methanol  akar Acalypha  indica L  menggunakan  spektrofotometer.  Analisis  histokimia  dilakukan  dengan membuat irisan segar akar yang direaksikan dengan reagen. Sedangkan pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH. Hasil penelitian menunjukkan kadar metabolit sekunder pada ekstrak kloroform, meliputi fenol 9,89 ± 0,77 %GAE, flavonoid 5,87 ± 1,40 %QE, dan  tanin  3,33  ±  1,21  %GAE.  Sedangkan  pada  ekstrak  methanol,  fenol  45,11  ±  4,86  %GAE, flavonoid  19,87  ±  0,61  %QE,  dan  tanin  6,76  ±  0,31  %GAE.  Hasil  analisis  histokimia menunjukkan  adanya  fenol,  flavonoid,  tanin  dan  alkaloid  pada  akar Acalypha  indica L. Pengukuran aktivitas antioksidan menunjukkan nilai IC50 161,81 ± 7,88 μg/mL untuk ekstrak kloroform dan 92,81 ± 4,33 μg/mL untuk ekstrak metanol .
Kata Kunci: Metabolit sekunder; Histokimia; Antioksidan; Akar Acalypha indica Diterima: 11-08-2021 Disetujui: 16-08-2021 Online: 25-08-2021

## ABSTRACT
Acalypha indica L. is a species of wild plant that has secondary metabolites are used as medicine, but the usage is not optimized yet. The objective of of this study was to determine secondary metabolites content, location  and  distribution  of  secondary  metabolites,  and  also  the  capacity  for  antioxidant.  Secondary metabolites  content  was  determined  included  phenol,  flavonoids,  tannin  of  chloroform  and  methanol extracts from Acalypha indica L. root, using spectrophotometre. Histochemical test was done by making fresh sliced preparation which was reacted with reagent. Antioxidant activity was determined by using DPPH method. The result of this study showed that secondary metabolites content of chloroform extract, were phenol 9,89 ± 0,77 %GAE, flavonoids 5,87 ± 1,40 %QE, and tannin 3,33 ± 1,21 %GAE, while methanol extract were phenol 45,11 ± 4,86 %GAE, flavonoids 19,87 ± 0,61 %QE, and tannin 6,76 ± 0,31 %GAE. Histochemical test showed that phenol, flavonoids, tannin, and alkaloids were found in Acalypha  indica  L.  root.  Antioxidant  activity  showed  the  IC50  value  was  161,81  ±  7,88  μg/mL  for chloroform extract and 92,81 ± 4,33 μg/mL for methanol extract.

## Keywords:
Secondary metabolites; Histochemical; Antioxidant; Acalypha indica’s root
Received: Accepted: Online:
2021-08-11 2021-08-16 2021-08-25

## 1. Pendahuluan
Metabolit sekunder merupakan zat kimia bukan nutrisi yang memainkan peran penting dalam  proses  keberadaan  suatu  organisme  di  lingkungan.  Tumbuhan  diketahui memiliki ragam metabolit sekunder yang lebih banyak dibandingkan organisme lain, seperti hewan, maupun mikroorganisme [1] . Sebagian besar metabolit sekunder dapat dimanfaatkan  sebagai  bahan  obat.  Tumbuhan  memiliki  banyak  senyawa  kimia  yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat, seperti tanin, flavonoid, alkaloid, antosianin, fenol, dan senyawa lain. Komponen senyawa bioaktif tersebut bersifat farmakologi dan sebagian besar berasal dari metabolit sekunder [2] .
Acalypha  indica L.  merupakan  spesies  tumbuhan  yang  umumnya  dikenal  sebagai tumbuhan  liar  karena  dapat  tumbuh  di  pinggir  jalan,  lapangan  rumput  dan  lereng gunung. Acalypha indica L. masuk dalam kelompok famili Euphorbiaceae. Acalypha indica L.  memiliki  daun  berseling,  bentuk  bulat  lonjong  sampai  lanset,  bagian  ujung  dan pangkal daun lancip, tepi bergerigi, panjang daun 2,5-8 cm dan lebar 1,5-3,5 cm. Bunga berkelamin tunggal dan berumah satu, keluar dari ketiak daun dan bertipe malai [3] .
Acalypha indica L. telah digunakan dalam pengobatan tradisional sejak dahulu. Acalypha indica L.  biasa  digunakan  untuk  mengobati  disentri,  diare,  malnutrisi,  gangguan pencernaan, melena, hematuria, malaria, bisul, dermatitis, eksema dan gigitan ular [3] . Daun Acalypha indica L. juga berkhasiat untuk pencahar dan obat sakit mata [4] . Beberapa negara lain juga memanfaatkan Acalypha indica L. sebagai  tumbuhan obat, seperti Sri Lanka dan India. Di India, daun, akar, batang dan bunga Acalypha indica L digunakan sebagai antelmintik, ekspektoran, emetik, dan anodyne [5] [6] . Senyawa metabolit sekunder yang  diketahui  terkandung  dalam Acalypha  indica  L. di  antaranya  saponin,  tannin, flavonoid, dan minyak atsiri [4]

## 2.  Metode
Penelitian  yang  dilakukan  meliputi  pengukuran  kadar  fenol,  flavonoid,  dan  tanin, pengamatan  histokimia  lokasi  dan  distribusi  senyawa  metabolit  sekunder,  serta pengukuran  aktivitas  antioksidan.  Data  pengukuran  kadar  metabolit  sekunder dilakukan dengan menggunakan kurva standard. Data hasil uji  histokimia diperoleh melalui foto dari preparat segar penampang melintang sampel yang direaksikan dengan reagen  pereaksi,  dan  dianalisis  secara  deskriptif.  Sedangkan  aktivitas  antioksidan diukur  menggunakan  metode  DPPH,  dan  dianalisis  menggunakan  regresi  sehingga dihasilkan nilai IC 50

## 2.1. Bahan
Sampel  yang  dipakai  adalah  akar Acalypha  indica L.  yang  diperoleh  dari  kawasan Bulaksumur, Yogyakarta.

## 2..2 Ekstraksi Tumbuhan
Ekstraksi sampel menggunakan metode maserasi bertingkat. Sampel simplisia serbuk sebanyak 10 gr dilarutkan dengan 150 mL pelarut kloroform selama 3 hari, kemudian di
remaserasi  2  kali  dengan  masing-masing  volume  50  mL  pelarut.  Ekstrak  kemudian disaring dan dikeringkan. Ekstrak tersebut kemudian dikeringkan hingga kloroformnya hilang dan dilarutkan kembali menggunakan metanol dengan cara yang sama.

## 2.3 Pengukuran Kadar Fenol Total
Pengukuran  kadar  fenol  total  menggunakan  metode  Folin  Ciocalteau  dengan modifikasi [7] .  Ekstrak  sampel  dilarutkan  ke  dalam  metanol  dengan  konsentrasi 1mg/mL. Sebanyak 100 µL campuran tersebut ditambahkan dengan 100 µL reagen Folin Ciocalteau  50%.  Larutan  kemudian  diinkubasi  selama  3  menit  pada  suhu  ruang  dan ditambahkan 2 mL Natrium karbonat 2%. Volume larutan dibuat menjadi 3 mL dengan menambahkan akuades. Larutan tersebut kemudian disimpan 1 menit dalam water bath 100°C kemudian dibiarkan dingin dalam gelap. Sampel kemudian diabsorbansi dengan spektrofotometer Visible pada  panjang  gelombang  760  nm.  Total  fenol  dihitung menggunakan kurva standar dari asam galat 1 mg/mL.

## 2.3. Pengukuran Kadar Flavonoid Total
Pengukuran kadar flavonoid total menggunakan spektrofotometer [8] . Ekstrak sampel dengan konsentrasi 1 mg/mL, sebanyak 500 µl, ditambahkan dengan 2 ml akuabides dan 150 µL NaNO 2 5%, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 6 menit. Sampel kemudian  ditambahkan  dengan  150  µL  AlCl 3 10%  dan  diinkubasi  pada  suhu  ruang selama  6  menit.  Sampel  kemudian  ditambahkan  lagi  dengan  1  mL  NaOH  1M  dan akuabides  hingga  volume  5  mL.  Selanjutnya,  sampel  diabsorbansi  pada  panjang gelombang  510  nm.  Total  flavonoid  dihitung  menggunakan  kurva  standar  dari Quercetin 1 mg/mL.

## 2.4. Pengukuran Kadar Tanin
Tanin diukur dengan metode Folin Ciocalteu dengan modifikasi [9] . Sebanyak 500 µL ekstrak sampel 1 mg/mL ditambahkan dengan 500 µL reagen Folin Ciocalteu, serta 1 mL Na 2 CO 3 35%. Larutan tersebut kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 10 mL.  Larutan  dikocok  dan  disimpan  pada  suhu  kamar  selama  30  menit.  Asam  galat digunakan  sebagai  standar  dan  dibuat  seri  (20,  40,  60,  80  and  100  μg/mL).  Larutan sampel dan standar diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-vis pada panjang gelombang 725 nm.

## 2.5. Analisis Histokimia
Analisis  histokimia  dilakukan  dengan  membuat  preparat  segar  yang  direaksikan dengan reagen [10] [11] . Preparat diamati dengan mikroskop cahaya monokuler Nikon dan dipotret menggunakan kamera digital CASIO Exilim EX-ZS6.

## 2.6. Pengukuran Aktivitas Antioksidan
Aktivitas antioksidan diukur dengan metode DPPH.  Ekstrak sampel sebanyak 10 mg dilarutkan ke dalam 10 mL metanol. Larutan stok ekstrak dibuat lima seri, misalnya  200, 400, 600, 800, dan 1000 μg/mL hingga didapatkan nilai tengah inhibisi (inhibisi ±50%). Larutan ekstrak tersebut sebanyak 1 mL ditambahkan dengan 2 mL larutan DPPH 0,05 mM dan diinkubasi dalam gelap selama 30 menit. Asam askorbat (vitamin C) digunakan sebagai kontrol positif dengan seri pengenceran (20, 40, 60, 80, dan 100 μg/mL).

## 3.  Hasil dan Pembahasan
Pengukuran kadar metabolit sekunder pada penelitian ini dilakukan dengan mengukur kadar fenol, flavonoid dan tanin. Data pengukuran kadar metabolit sekunder pada akar Acalypha indica L., meliputi fenol, flavonoid, dan tanin, dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kadar Metabolit Sekunder Ekstrak Kloroform dan Methanol Akar Acalypha indica L. Ekstrak akar A.indica Kadar metabolit sekunder Fenol %GAE Flavonoid %QE Tanin %GAE Kloroform 9,89 ± 0,77 5,87 ± 1,40 3,33 ± 1,21 Metanol 45,11 ± 4,86 19,87 ± 0,61 6,76 ± 0,31
Hasil penelitian menunjukkan adanya senyawa fenol, flavonoid, dan tanin pada ekstrak klroroform dan metanol akar Acalypha indica L. Penelitian yang dilakukan oleh [12] juga membuktikan adanya senyawa kimia alkaloid, saponin, flavonoid, fenol, dan glikosida pada daun Acalypha indica , sedangkan pada batang dan akar Acalypha indica terkandung tanin, alkaloid, saponin, flavonoid, fenol dan glikosida. Kadar senyawa fenol, flavonoid, dan  tanin  lebih  banyak  terkandung  di  dalam  ekstrak  metanol  dibandingkan  ekstrak kloroform akar Acalypha indica L. Hal ini dikarenakan senyawa tersebut lebih bersifat polar, dan metanol merupakan pelarut yang lebih polar dibandingkan kloroform.
Analisis histokimia dilakukan untuk mengetahui lokasi dan distribusi senyawa kimia tumbuhan. Analisis histokimia dilakukan dengan membuat preparat irisan segar dari akar Acalypha  indica L.  yang  direaksikan  dengan  reagen  spesifik.  Hasil  analisis histokimia  menunjukkan  adanya  distribusi  senyawa  fenol,  tanin,  flavonoid,  dan alkaloid, seperti pada Tabel 2 dan Gambar 1..
Tabel 2 . Lokasi Senyawa Metabolit Sekunder pada Akar Acalypha indica L.
Metabolit sekunder Lokasi senyawa metabolit sekunder pada akar A.indica Fenol Jaringan pelindung, jaringan xylem, lapisan dinding sel parenkim korteks Flavonoid Jaringan pelindung, jaringan xylem, parenkim korteks Tanin Jaringan pelindung, jaringan xylem, parenkim korteks Alkaloid Parenkim korteks, jaringan xylem
Gambar 1 . Distribusi Metabolit Sekunder pada Akar Acalypha indica L., (a) Fenol, (b) Flavonoid, (c) Tanin, (d) Alkaloid; tanda panah menunjukkan lokasi metabolit sekunder
Deteksi senyawa fenol ditandai dengan terbentuknya warna biru pada jaringan akar. Hal  ini  seperti  yang  dinyatakan  oleh [11] ,  deteksi  fenol  dilakukan  dengan  reagen Toluidine blue  yang  menunjukkan  positif  warna  biru.  Flavonoid, tanin,  dan  alkaloid ditandai dengan terbentuknya warna kuning, hijau, dan jingga pada jaringan. Reagen AlCl 3 untuk flavonoid dengan warna positif kuning [13] . FeCl 3 untuk tanin dengan warna positif hijau kehitaman dan biru kehitaman [14] [15] . Dragendorf untuk alkaloid [15]
Pengukuran  aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan  mencari  nilai  IC 50 dari  ekstrak kloroform  dan  ekstrak  metanol  akar Acalypha  indica L.  Aktivitas  antioksidan  diukur dengan metode DPPH. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan menunjukkan hasil nilai IC 50 161,81 ± 7,88 μg/mL untuk ekstrak kloroform dan 92,81 ± 4,33 μg/mL untuk ekstrak metanol  akar Acalypha  indica L.  Nilai  IC 50 menunjukkan  jumlah  antioksidan  yang dibutuhkan untuk menghambat 50% konsentrasi DPPH [16] [17] . Semakin tinggi aktivitas antioksidan maka nilai IC 50 semakin rendah [18] . Sampel yang menunjukkan nilai IC 50 <50 μg/mL  merupakan  antioksidan  yang  sangat  kuat,  50-100  μg/mL  merupakan antioksidan kuat, 101-150 μg/mL merupakan antioksidan tingkat sedang, sedangkan >150 μg/mL merupakan antioksidan yang lemah [19] , sehingga ekstrak metanol Acalypha indica L. termasuk dalam kategori antioksidan kuat.
Hasil penelitian di beberapa negara juga menyebutkan adanya khasiat Acalypha indica L. sebagai antioksidan. Penelitian Shanmugapriya, et al . menunjukkan hasil bahwa ekstrak metanol akar Acalypha indica L. memiliki aktivitas antioksidan 53,27% pada konsentrasi 600  μg  yang  diuji  dengan  metode  DPPH [20] .  Penelitian  Balakhrisnan et  al .  juga membuktikan  bahwa  ekstrak  air  akar Acalypha  indica L.  menunjukkan  aktivitas antioksidan 59,83%, sedangkan ekstrak etanol 64,74% pada konsentrasi 1000 μg [21] .

## 4.  Kesimpulan
Akar Acalypha  indica L.  memiliki  kandungan  senyawa  fenol,  flavonoid,  dan  tanin. Ekstrak  methanol  akar Acalypha  indica L.  memiliki  kadar  fenol,  flavonoid,  dan  tanin yang  lebih  tinggi  dibandingkan  ekstrak  kloroform.  Sebagian  besar  senyawa  tersebut terdapat di jaringan pelindung, jaringan xylem, dan parenkim korteks. Ekstrak methanol akar Acalypha indica l. juga menunjukkan aktivitas antioksidan yang cukup kuat

## Referensi
[1] Mursyidi,  A.  1990. Analisis  Metabolit  Sekunder:  Alkaloid .  Yogyakarta:  Proyek Pengembangan Pusat Fasilitas Bersama Antar Universitas (Bank Dunia XVII)- PAU Bioteknologi Universitas Gadjah Mada.
[2] Dewick, P.M. (2009). Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach , Third Edition. United Kingdom: John Wiley and Sons Ltd.
[3] Wijayakusuma, H., Wirian, A.S., Yaputra, T., Dalimartha,S., dan Wibowo, B. (1992). Tanaman Berkhasiat Obat di Indonesia . Jakarta: Pustaka Kartini
[4] Hutapea, J.R. et al . (1993). Inventaris Tanaman Obat Indonesia (II). Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan-DepKes RI.
[5] Handa, S.S., Rakesh, D.D. dan Vasisht, K. (2006). Compendium of Medicinal and Aromatic  Plants  ASIA .  Italia:  United  Nations  Industrial  Development Organization and the International Centre for Science and High Technology.
[6] Joy, P.P., Thomas, J., Mathew, S. Dan Skaria, B.P. (1998). Medicinal Plants . India: Kerala Agricultural University.
[7] Mullick, A., Mandal, S., Bhattacharjee, R. dan Banerjee, A. (2013). In-Vitro Assay of  Antioxidant  and  Antibacterial  Activity  of  Leaf  Extract  and  Leaf  Derived Callus Extract of Acalypha indica L. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences , 3(1): 504-510.
[8] Woraratphoka,  J.,  Intarapichet,  K.,  &  Indrapichate,  K.  (2012).  Antioxidant Activity and Cytotoxicity of Six Selected, Regional, Thai Vegetables. American- Eurasian Journal of Toxicological Sciences 4 (2): 108-117.
[9] Mythili,  K.,  Reddy,  C.U.,  Chamundeeswari,  D.,  dan  Manna,  P.K.  (2014). Determination  of  Total  Phenol,  Alkaloid,  Flavonoid  and  Tannin  in  Different Extracts of Calanthe Triplicata. Journal of Pharmacognsoy and Phytochemistry , 2(2): April – June
[10] Berlyn, G.P. dan Miksche, J.P. (1976). Botanical Microtechnique and Cytochemistry . Lowa: The Lowa State University Press.
[11] Stahl, E. (1985). Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi . Bandung: ITB.
[12] Nkumah, O.C., Esther, A.E., , Adimonyemma, R.N., Cletus, N.O., dan Iroka, C.F. (2016). Preliminary Phytochemical Screening on the Leave, Stem and Root of Acalypha Indica , The Pharmaceutical and Chemical Journal 3(3):8-11
[13] Markham,  K.R.  (1988). Cara  Mengidentifikasi  Flavonoid .  Terjemahan  Kosasih Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB
[14] Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. & Swisher, D. (2011). Botanical  Pharmacognosy-Microscopic  Characterization  of  Botanical  Medicines . United State: CRC Press Taylor & Francis Group.
[15] Evans, W.C. & Trease. (2009). Pharmacognosy, 15 th edition . Edinburgh, London, New York, Philadelphia, St.Louis, Sydney, Toronto: Saunders Elsevier.
[16] Antolovich, M., Prenzler, P.D., Patsalides, E., McDonald, S., dan Robards, K. (2002). Methods for Testing Antioxidant Activity. Analyst , 127: 183–198
[17] Tirzitis,  G.  dan  Bartosz,  G.  (2010).  Determination  of  Antiradical  and Antioxidant  Activity:  Basic  Principles  and  New  Insights. Acta  Biochimica Polonica , 57(1): 139–142.
[18] Molyneux,  P.  (2004).  The  Use  of  The  Stable  Free  Radical Diphenylpicrylhydrazyl  (DPPH)  for  Estimating  Antioxidant  Activity. Songklanakarin J. Sci. Technol. , 26(2): Maret-April
[19] Fidrianny, I., Nurfitri, H., Sukrasno. (2015). In Vitro Antioxidant Activities, Phenolic, Flavonoid, and Carotenoid Content From Different Polarity Extracts of Five Citrus Peels Using DPPH and Cuprac Method, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 7(4): 1525-1531
[20] Shanmugapriya, R., Ramanathan, T. dan Thirunavukkarasu, P. (2011). Evaluation of Antioxidant Potential and Antibacterial Activity of Acalypha indica Linn. Using in vitro Model. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences , 1(1): 18-22.
[21] Balakhrisnan, N., Panda A.B., Raj, N.R., Shrivastava, a., dan Prathani, R. (2009). The Evaluation of Nitric Oxide Scavenging Activity of Acalypha Indica Linn Root. Asian Journal of Research in Chemistry , 2(2): April-June.