Menara Perkebunan 2012 80(2), 77-84
Aktivitas antibakteri ekstrak kulit buah kakao ( Theobroma cacao L.) terhadap Escherichia coli, Bacillus subtilis, dan Staphylococcus aureus
Antibacterial activity of  cocoa pod husk extract ( Theobroma cacao L.) against Escherichia coli, Bacillus subtilis , and Staphylococcus aureus
Agustin Sri MULYATNI *) , Asmini BUDIANI & Darmono TANIWIRYONO
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jalan Taman Kencana No.1 Bogor 16151, Indonesia
Diterima tanggal 20 September 2012/disetujui tanggal 6 Nopember 2012

## Abstract
Cocoa  ( Theobroma  cacao L.),  one  of  the  most important  export  commodities  from  Indonesia,  is  widely planted  with  current  total  area  of  1.6  million  Ha, producing 500.000 metric tons of dry bean  in 2011 . At the  time  of  harvest,  instead  of  seed  approximately  the same  volume  cacao  husk  is  produced.  The  aim  of  the study was to assess the potential of cocoa husk extract as an  antibacterial  against Escherichia  coli , Bacillus subtilis, and Staphylococcus aureus , and to determine the minimum  inhibitory  concentration  (MIC)  of  cocoa  husk extract  to  the  three  test  bacteria.  Extraction  of  cocoa husk  conducted  by  maceration  method  using  ethanol 96%.  Analysis  of  antibacterial  activity  was  done  by paper  disc  diffusion  method.  Completely  Randomized Design  of  single  factor  presentage  that  is  extract concentration  of 0;  1;  2;  4;  8;  16; 32;  and  64%  (g/mL) with  three  replicans  were  applied.The  results  showed that  the  extract  of  cocoa  pod  husk  has  antibacterial activity against S. aureus, B. subtilis, and E. coli with the MIC  are  8%  (g/  mL),  16%  (g/  mL),  and  32%  (g/  mL) respectively.
[ Keywords  :  Antibacteria,    cocoa  pod-husk,  ethanol, alkaloid compound, flavonoid ]

## Abstrak
Kakao  ( Theobroma cacao L.),  salah  satu  komoditi ekspor terpenting Indonesia, ditanam secara luas dengan total  luasan  1,6  juta  Ha,  menghasilkan  500.000  ton  biji kering  pada  tahun  2011.  Di  samping  biji  sebagai  hasil utama, pada saat panen juga dihasilkan kulit buah dengan volume  yang  hampir  sama  dengan  biji.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengkaji  potensi  ekstrak  kulit  buah kakao  sebagai  antibakteri  terhadap Escherichia  coli, Bacillus  subtilis, dan Staphylococcus  aureus serta menentukan  konsentrasi  hambat  minimum  (KHM) ekstrak  kulit  buah  kakao  terhadap  ketiga  bakteri  uji. Ekstraksi  kulit  buah  kakao  dilakukan  dengan  metode Maserasi  menggunakan  pelarut  etanol  96%.  Analisis aktivitas  antibakteri  dilakukan  dengan  metode  difusi cakram  kertas. Penelitian  ini  menggunakan  Rancangan
Acak    Lengkap  (RAL)  dengan  faktor  tunggal    konsen- trasi ekstrak, yaitu 0; 1; 2; 4; 8; 16; 32; dan 64% (g/mL), masing-masing dengan tiga kali ulangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah kakao berpotensi sebagai  antibakteri  terhadap S.  aureus,  B.  subtilis dan E.  coli, dengan  KHM  berturut-turut  adalah  8%  (g/mL),
16% (g/mL), dan 32% (g/mL).
[Kata  kunci:  Antibakteri,    kulit-buah  kakao,  ethanol, senyawa alkoloid, flavonoid]

## Pendahuluan
Kakao  ( Theobroma  cacao L . )  merupakan salah  satu  komoditi  ekspor  negara  Indonesia dengan  nilai  jual  yang  cukup  tinggi.  Kementerian Pertanian  melaporkan  bahwa  pada  tahun  2010 Indonesia  menempati  urutan  ke-3  sebagai  negara penghasil  kakao  terbesar  di  dunia  dengan  total ekspor sebesar 900 ribu ton (Anonim, 2010). Pada saat  panen,  umumnya  petani  memanen  biji  kakao untuk  diolah  menjadi  cokelat,  dan  menghasilkan limbah  kulit  buah  kakao  yang  cukup  banyak. Keberadaan  limbah  tersebut  sering  kali  tidak dimanfaatkan  secara  baik  dan  kadang  dibiarkan begitu saja menjadi sampah pertanian. Limbah kulit buah  kakao  yang  dihasilkan  dalam  jumlah  banyak akan  menjadi  masalah  jika  tidak  ditangani  dengan baik    karena  produksi  limbah  padat  ini  mencapai lebih dari 60% dari total produksi buah (Harsini & Susilowati, 2007). Beberapa teknologi telah dikem- bangkan untuk mengolah kulit buah kakao menjadi pakan  ternak,  kompos,  dan  produk  lain,  tetapi masih  diperlukan  teknologi  lain  untuk  dapat memanfaatkannya  lebih  optimal  (Adamafio et  al ., 2004; Alemawor et al ., 2009).
Beberapa  bakteri dapat menyebabkan timbul- nya  penyakit  pada  manusia.  Bakteri E.  coli dapat menyebabkan  penyakit  diare,  dan S.  aureus dapat menyebabkan penyakit  kulit  dan  infeksi saluran
*) Penulis korespondensi: ti2n84@yahoo.com
Aktivitas antibakteri ekstrak ethanol kulit buah kakao ………(Mulyatni et al.)
pernafasan  seperti  sinusitis.  Secara  alami  kedua bakteri  ini  merupakan  bakteri  flora  normal  pada tubuh  manusia,  tetapi  bila  populasinya  tinggi  dan keberadaannya  di  luar  habitat  aslinya  maka  kedua bakteri  tersebut  berpotensi  untuk  menimbulkan penyakit  (Brooks et  al ,  2001).  Kedua  bakteri tersebut  memproduksi  enterotoksin  yang  dapat mencemari  makanan,  terutama  makanan  yang mengandung  protein,  sehingga  mengakibatkan keracunan (Pratiwi, 2008). Bakteri Bacillus subtilis merupakan  kontaminan  di  udara  yang  tidak  ber- bahaya, akan tetapi keberadaanya dapat menyebab- kan kerusakan pada makanan  khususnya makanan kaleng, sehingga muncul gejala gastroenteritis pada manusia (Talaro, 2002).
Kulit  buah  kakao  diketahui  mengandung senyawa  aktif  alkaloid  yaitu  theobromin  (3,7– dimethylxantine ).  Salah  satu  efek  dari  theobromin adalah  sebagai  penenang,  sehingga  zat  tersebut menjadi  faktor  pembatas  pada  pemakaian  limbah kulit buah kakao sebagai pakan ternak (Helmestein, 2010).  Kulit  buah  kakao  mengandung  senyawa aktif  flavonoid  atau  tanin  terkondensasi  atau terpolimerisasi,  seperti  antosianidin,  katekin,  dan leukoantosianidin  yang  banyak  terikat  dengan glukosa. Senyawa-senyawa bioaktif tersebut diketahui  memiliki  sifat  antibakteri  (Matsumoto et.al, 2004). Keberadaan senyawa tersebut di dalam kulit  buah  kakao  diduga  menjadi  salah  satu penyebab  tidak  ditemukannya  penyakit  pada tanaman  kakao  yang  disebabkan  oleh  bakteri. Penelitian  mengenai  potensi  ekstrak  kulit  buah kakao jenis lindak (Forastero) telah dilakukan oleh Sartini et al . (2007). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah kakao dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, Streptococcus  mutan,  Escherichia  coli, dan Salmonella  thyposai dengan  tingkat  konsentrasi yang berbeda. Bakteri uji yang paling rentan adalah Streptococcus mutan. Meskipun demikian aktivitas antibakteri  dari  ekstrak  kulit  buah  kakao  masih perlu dilakukan lebih mendalam. Tujuan  penelitian ini  untuk menguji aktivitas antibakteri ekstrak kulit buah  kakao  jenis  hibrida  secara in  vitro terhadap E.coli , S. aureus , dan B. subtilis.

## Bahan dan Metode
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Mikroba  dan  Bioproses  Balai  Penelitian  Biotek- nologi  Perkebunan  Indonesia  (BPBPI),  Bogor, Jawa  Barat.  Bahan  yang  digunakan  adalah  kulit buah kakao jenis Hibrida (Upper Hibrida Amazon).

## Preparasi ekstrak konsentrat kulit buah kakao
Kulit  buah  kakao  hibrida  yang  sudah  masak diekstrak  dengan  metode  Maserasi  menggunakan pelarut  etanol  96%  (Goeswin,  2007).  Sebelum proses  ekstraksi  kulit  buah  kakao  dikeringkan  dan dihaluskan hingga menjadi serbuk halus. Sebanyak 40  g  serbuk  kulit  buah  kakao  direndam  dengan 400  mL  etanol  96%  di  dalam  Erlenmeyer.  Peren- daman  dilakukan  dalam  suhu  ruang  pada shaker dengan  kecepatan 120 rpm secara kontinyu selama 24  jam.  Penyaringan  dilakukan  dengan  kertas saring  Whatman  no.41,  sehingga  diperoleh maserat.  Pelarut  (etanol)  dalam  maserat  diuapkan menggunakan rotary  evaporator sampai  diperoleh ekstrak pekat dengan bobot konstan. Ekstrak pekat diambil  0,5  g  kemudian  diencerkan  menjadi beberapa tingkatan konsentrasi, yaitu 1; 2; 4; 8; 16; 32; dan 64% (g/mL) (Das et al ., 2010).

## Pemeriksaan senyawa alkaloid dan flavonoid
Uji  alkaloid  pada  penelitian  ini  dilakukan menggunakan  pereaksi  Bouchardat.  Pereaksi  ter- sebut  dibuat  dengan melarutkan  4  g  kalium  iodida ke  dalam  20  mL  akuades  dan  ditambahkan  2g iodium  kemudian  dikocok  sampai  homogen. Volume  pereaksi  ditepatkan  100  mL  dengan penambahan akuades (Anggriani, 2010). Sebanyak 2  mL  ekstrak  konsentrat  kulit  buah  kakao  ditam- bahkan  1  mL  pereaksi  Bouchardat  dan  dikocok. Alkaloid  dianggap  positif  jika  timbul  endapan berwarna  putih.  Uji  senyawa  flavonoid  dilakukan dengan  cara  menambahkan  serbuk  Mg  dan  HCl pekat ke dalam ekstrak konentrat kulit buah kakao. Apabila  terbentuk  warna  orange,  merah,  atau kuning,  berarti  positif  flavonoid.  (Ditjen  POM, 1995 dalam Anggriani, 2010).

## Uji aktivitas antibakteri
Uji  aktivitas  antibakteri  dilakukan  dengan metode  difusi  agar.  Suspensi  bakteri  uji  ( E  coli, B.  subtilis,  S. aureus)  sebanyak  1  mL  dengan kerapatan  terukur  hasil Total  Plate  Count (TPC) dimasukkan ke dalam cawan petri dan ditambahkan Nutrient  Agar .  Kertas  saring  Whatman  no.  41 berdiameter  1  cm  dicelupkan  pada  cairan  ekstrak hasil  pengenceran  beberapa  konsentrasi  dan  pada akuades  steril  sebagai  kontrol.  Kertas  saring tersebut  diletakkan  secara  teratur  di  atas  biakan cawan,  diinkubasi  pada  suhu 37ºC  selama  24  jam dan kemudian dihitung diameter zona bening yang muncul di  sekitar  kertas  saring  dengan mengguna- kan penggaris (Das et al ., 2010).
78 9

## Penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM)
Berdasarkan  diameter  zona  bening  yang dihasilkan,  selanjutnya  ditentukan  persentase konsentrasi  ekstrak  terkecil  (Andrews,  2006). Parameter  yang  diamati  adalah  diameter  zona bening  yang  terbentuk  di  sekitar  kertas  saring (mm). Rancangan percobaan menggunakan Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  faktor  tunggal yaitu  persentase  konsentrasi  ekstrak  yang  terdiri dari  0%  (kontrol),  1;  2;  4;  8;  16;  32;  dan  64%, (g/mL)  masing-masing  dengan  tiga  kali  ulangan. Rancangan  percobaan  tersebut  berlaku  untuk masing-masing bakteri uji (Hanafiah, 2001).
Normalitas  data  yang  diperoleh,  diuji  meng- gunakan uji statistik Kolmogorov-Smirnov dan data terdistribusi tidak normal dan tidak homogen, maka data  dianalisis  dengan  menggunakan  uji  statistik non  parametrik  Kruskall-Wallis.  Analisis  selanjut- nya dengan uji lanjut Mann-Whitney untuk menge- tahui  perbedaan  diameter  zona  hambat  yang  ber- makna  pada  masing-masing  konsentrasi.  Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Statistical Product  and  Service  Solution (SPSS)  versi  16.00 (Dahlan, 2004).

## Hasil dan Pembahasan

## Aktivitas antibakteri ekstrak kulit buah kakao
Hasil  penelitian  menunjukkan  terjadinya penghambatan  ekstrak  kulit  buah  kakao  terhadap pertumbuhan  ketiga  bakteri  uji  yang  ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat di sekitar kertas cakram yang mengandung ekstrak kulit buah kakao (Gambar 1).  Penghambatan pertumbuhan bakteri
oleh  ekstrak  kulit  buah  kakao  diduga  berasal  dari aktifitas senyawa bioaktif yang terlarut, di antara- nya  adalah  senyawa  alkaloid  dan  flavonoid.  Hasil pemeriksaan fitokimia terhadap ekstrak menunjuk- kan  hasil  yang  positif  terdeteksi  adanya  senyawa alkaloid  maupun  senyawa  flavonoid.  (Gambar  2) Endapan  berwarna  putih    menunjukkan  adanya senyawa  alkaloid.  Dirjen  POM  (1995 dalam Anggriani,  2010)  melaporkan  bahwa  alkaloid dianggap positif jika terjadi  endapan ketika ekstrak direaksikan  dengan  salah  satu  dari  pereaksi Dragendorf, Bouchardat, atau Mayer.
Pemeriksaan  flavonoid  menunjukkan  hasil yang  positif  dengan  terjadinya  perubahan  warna ekstrak  menjadi  kemerahan  (Gambar  2)  setelah ditambahkan  dengan  serbuk  Mg  dan  HCl  pekat (Arifin et  al .,  2006).  Senyawa  alkaloid merupakan senyawa organik yang memiliki atom nitrogen dan bersifat  basa  (alkali)  dan  dapat    menyebabkan koagulasi  protein  sel  bakteri,  sehingga  menyebab- kan penghambatan pertumbuhan bakteri. Koagulasi protein  akan  mengganggu  komponen  penyusun peptidoglikan  pada  sel  bakteri  yang  menyebabkan lapisan  dinding  sel  tidak  terbentuk  secara  utuh, sehingga  menyebabkan  kematian  sel  bakteri. Flavonoid  pada  ekstrak  kulit  kakao  ter-masuk golongan senyawa fenolik  yang mempunyai ikatan glikosida.  Senyawa  fenolik  akan  berinteraksi dengan protein membran sel bakteri melalui proses adsorbsi dengan cara terikat pada bagian hidrofilik membran  sel.  Senyawa  fenolik  selanjutnya  akan masuk  ke  dalam  membran  sel  dan  menyebabkan presipitasi  protein  sel.  Hal  tersebut  mengganggu permeabilitas  membran  sel,  sehingga  membran  sel dapat mengalami lisis.
Gambar 1. Aktivitas antibakteri ekstrak kulit buah kakao pada konsentrasi 64% terhadap  pertumbuhan  (a) E.  coli ,  (b) B.  subtilis, (c) S.  aureus setelah inkubasi 24 jam .
Figure  1.    Antibacterial  activity  of  pod  cacao  extrac  at  a  concentration  64% against  (a)  E.  coli,  (b)  B.  subtilis,  (c)  S.  Aureus  after  24  hours incubation.
79 9
Aktivitas antibakteri ekstrak ethanol kulit buah kakao ………(Mulyatni et al.)
Hasil pengamatan aktivitas antibakteri ekstrak kulit buah kakao dengan konsentrasi 64% terhadap biakan E. coli dan S. aureus, menunjuk-kan adanya daerah  pertumbuhan  bakteri  yang  lebih  subur  di sekitar  zona  hambat,  sedangkan  pada  biakan B. subtilis menunjukkan  adanya  daerah  pertumbuhan bakteri  yang  kurang  subur  di  sekitar  zona  hambat (Gambar  1).  Perbedaan  daerah  pertumbuhan  di sekitar zona hambat tersebut, salah satunya karena adanya  perbedaan  permeabilitas  membran  sel bakteri.  Membran  sel  bakteri  bersifat  selektif permeabel,  dan  setiap  sel  memiliki  permeabilitas membran  yang  berbeda,  karena  perbedaan  struktur membran  sel  dan  enzim  yang  berfungsi  dalam proses  penyerapan  nutrien.  Kusumawati  (2003) menyatakan bahwa perbedaan permeabilitas disebabkan karena keragaman struktur asam lemak membran  sel  bakteri,  dan  diduga  mempengaruhi ketahanan  sel  bakteri.  Kulit  buah  kakao  diketahui mengandung  unsur  kalsium,  fosfor,  kalium,  dan nitrogen  (Sudirja et  al., 2007). Unsur-unsur  ter- sebut  merupakan  nutrien  yang  dibutuhkan  mikro- organisme  dalam  jumlah  yang  relatif  besar,  yakni sebagai  penyusun  protein,  kofaktor  enzim  dan sebagai kation seluler (Prescott, 2005). Pertumbuh- an B.  subtilis di  sekitar  zona  hambat  yang  kurang subur,  diduga  karena  adanya  pengaruh  senyawa aktif di daerah tersebut  yang menyebabkan nutrien dari ekstrak yang berdifusi ke dalam medium tidak dapat diserap dengan baik oleh sel bakteri. Pertum- buhan  bakteri  dengan  tingkat  proloferasi  yang tinggi di sekitar zona hambatan dimungkinkan juga sebagai  respons  bakteri  untuk  mematahkan pengaruh  zat  anti  bakteri  ekstrak  konsentrat  kulit buah kakao.
Hasil analisis statistik Kruskall-Wallis dan uji lanjut  Mann-Whitney  menunjukkan  terdapat  pe- ngaruh  nyata  dari  konsentrasi  ekstrak  terhadap aktivitas penghambatan  masing-masing bakteri uji, yang  ditandai  dengan  adanya  perbedaan  diameter zona  hambat  yang  terbentuk.  Gambar  3  me- nunjukkan  bahwa  ekstrak  kulit  buah  kakao  dapat menghambat pertumbuhan E. coli pada konsentrasi ekstrak  32%  dan  64%,  dengan  rerata  diameter 3,00  mm  dan  8,83  mm.  Analisis  uji  statistik menunjukkan  bahwa  diameter  zona  hambat  pada kedua  konsentrasi  tersebut  berbeda  nyata,  hal  ini menunjukkan  bahwa  kedua  konsentrasi  ekstrak tersebut  berpengaruh  nyata  terhadap  aktivitas penghambatan E.  coli Gambar  4  menunjukkan bahwa  penghambatan  pertumbuhan B.  subtilis mulai  pada  konsentrasi  ekstrak  sebesar  16%. Hambatan  pertumbuhan  paling  besar  terjadi  pada konsentrasi 64% dengan rerata diameter 7,67 mm
Gambar 2. Hasil pemeriksaan fitokimia (a) uji alkaloid, (b) uji flavonoid.
Figure 2. Phytochemical examination results (a)alkaloid test, (b) flavonoid test.
yang tidak berbeda nyata dengan penghambatan pada  konsentrasi  32%  (6,50  mm),  dan  kedua konsentrasi  ekstrak  tersebut  berbeda  nyata  dengan perlakuan konsentrasi ekstrak lainnya.
Gambar  5  menunjukkan  penghambatan  ekstrak kulit  buah  kakao  terhadap  pertumbuhan S.  aureus yang  mulai  terjadi  pada  konsentrasi  ekstrak  8%. Hambatan  pertumbuhan  yang  paling  besar  terjadi pada konsentrasi 64% dengan rerata diameter zona hambat  10  mm  yang  berbeda  nyata  dengan  per- lakuan  lainnya.  Diameter  zona  hambat  pada perlakuan konsentrasi 16% dan  32% tidak berbeda nyata, akan  tetapi berbeda nyata dengan perlakuan lainnya  yang  berarti  bahwa  kedua  konsentrasi ekstrak  tersebut  tidak  berpengaruh  nyata  terhadap aktivitas  penghambatan  bakteri S.  aureus ,  sedang- kan konsentrasi ekstrak lainnya berpengaruh nyata . Berdasarkan  hasil  uji  aktivitas  antibakteri ekstrak  kulit  buah  kakao  terhadap  masing-masing bakteri  uji,  terbukti  bahwa  aktivitas  penghambatan dipengaruhi  oleh  konsentrasi  ekstrak  pada  kertas cakram.  Aktivitas  antibakteri  semakin  meningkat, dengan  semakin  tingginya  konsentrasi  ekstrak. Banyaknya kandungan senyawa aktif dalam ekstrak menyebabkan  senyawa  aktif  akan  lebih  mudah untuk merusak sel bakteri. Selain itu senyawa aktif akan  mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri lebih  banyak    yang  ditandai  dengan  terbentuknya zona hambat di sekitar kertas saring.
Tidak  terbentuknya  zona  hambat  pada  bebe- rapa  perlakuan  konsentrasi  ekstrak  (1%,  2%,  4%), disebabkan  oleh  konsentrasi  ekstrak  yang  rendah. Rendahnya  senyawa  aktif  tersebut  dapat  menye- babkan penghambatan pertumbuhan  masing- masing bakteri uji, terjadi pada sebagian kecil dari jumlah total sel bakteri , sehingga bakteri yang tidak terganggu oleh senyawa aktif dapat tumbuh. Hal ini ditandai  dengan  keruhnya  daerah  di  sekitar  kertas saring.
b a
Menara Perkebunan 2012 80(2), 77-84
Gambar 3. Rerata diameter zona hambat dari ekstrak kulit buah kakao terhadap pertumbuhan bakteri E. coli pada inkubasi 24 jam.
Figure 3.   The mean  diameter of inhibition zone of cacao pod husk extract on the growth of E. coli at 24 hours incubation .
Gambar 4. Rerata diameter zona hambat dari ekstrak kulit buah kakao terhadap pertumbuhan bakteri B. subtilis pada inkubasi 24 jam .
Figure 4.  The mean diameter of inhibition zone of cacao pod husk extract on the growth of B. subtilis at 24 hours incubation.
Gambar 5. Rerata diameter zona hambat dari ekstrak kulit buah kakao terhadap pertumbuhan bakteri S. aureus pada inkubasi 24 jam .
Figure 5.  The mean diameter of inhibition zone of cacao pod husk extract on the growth of S. aureus at 24 hours incubation.
10 8 6 4 2 0 0           1          2          4          8          16           32          64 10 8 6 4 2 0 D ia m et er z ona h am ba t Inh ibi ti on z o ne di am et er ( m m ) Konsentrasi konsentrat ekstrak/
Concentration of the extract concentrate % (g/mL)
0,00 a 0,00 a 0,00 a 0,00 a 3,00 b 8,83 c 0,00 a 0,00 a D ia m et er z ona h am ba t
Inh ibi ta ion z one d iam et er ( m m ) Konsentrasi ekstrak/ Extract concentration % (g/mL) 0        1          2         4            8             16         32         64
0,00 a 0,00 a 0,00 a 2,17 b 6,50 c 7,67 c 0,00 a 0,00 a 12 10 8 6 4 2 0 Konsentrasi ekstrak/ Extract concentration % (g/mL) D ia m et er z ona h am ba t Inh ibi ta ion z one d iam et er ( m m ) 0         1          2         4             8           16         32         64 4,83 c 0,00 a 0,00 a 2,33 b 7,33 c 10,00 d 0,00 a 0,00 a
Aktivitas antibakteri ekstrak ethanol kulit buah kakao ………(Mulyatni et al.)

## KHM ekstrak konsentrat kulit buah kakao
Nilai KHM ekstrak kulit buah kakao terhadap bakteri E.  coli, B.  subtilis dan S.  aureus dengan kerapatan  10 8 CFU/mL  yang  diperoleh  dalam penelitian  ini  berturut-turut  sebesar  32%  (g/mL), 16%  (g/mL),  dan  8%  (g/mL). Tabel  1.  Menunjuk- kan  perbedaan  aktivitas  penghambatan  dan  KHM ekstrak  konsentrat  kulit  buah  kakao  terhadap masing-masing  bakteri  uji.  Perbedaan  KHM tersebut  dapat  disebabkan  oleh  beberapa  faktor, antara  lain  perbedaan  jumlah  populasi  sel  bakteri, struktur  dinding  sel  masing-masing  bakteri  yang menyebabkan perbedaan kepekaan bakteri terhadap komponen senyawa aktif.
Populasi  bakteri  yang  tinggi  lebih  sulit dihambat  daripada  populasi  bakteri  yang  lebih rendah.  Jumlah  populasi E.  coli paling  tinggi  di- bandingkan  dengan  populasi S.  aureus dan B.  subtilis yaitu  7,2  ×  10 8 CFU/mL.  Hal  tersebut kemungkinan  menyebabkan E.  coli lebih  sulit dihambat  oleh  senyawa  aktif  ekstrak  kulit  buah kakao  terutama  pada  konsentrasi  ekstrak  yang rendah. Brooks (2001) menyatakan, bahwa semakin besar  jumlah  sel  inokulum  bakteri,  maka  semakin berkurang  tingkat  kepekaannya  terhadap  senyawa aktif.  Konsentrasi  sel  untuk B.  subtilis dan S.  aureus masing-masing  1,1  ×  10 8 CFU/mL  dan 2,3  ×  10 8 CFU/mL,  atau  lebih  kecil  dibandingkan dengan  konsentrasi E.  coli .  Hal  ini  dapat menyebabkan kedua bakteri ini lebih mudah untuk dihambat  oleh  senyawa  aktif  ekstrak  kulit  buah kakao,  karena  semakin  kecil  jumlah  populasi inokulum  bakteri  maka  akan  semakin  peka  ter- hadap senyawa aktif.
E. coli merupakan bakteri Gram-negatif  yang bersifat  cenderung  lebih  resiten  terhadap  senyawa aktif,  karena  memiliki  struktur  dinding  sel  tipis yaitu sekitar 10-15 µm yang terdiri dari tiga lapisan yaitu  membran  luar,  membran  dalam  dan  lapisan peptidoglikan  tipis  di  sebelah  dalam  dengan kandungan  lipid  yang  tinggi  (11-21%).  Lapisan bagian  luar  terdiri  dari  dua  lapisan  yaitu  lipo-
polisakarida  dan  lipoprotein  (Hawley,  2003).  Hal inilah  yang  kemungkinan  menyebabkan  senyawa bioaktif  yang  ada  pada  ekstrak  konsentrat  kulit buah  kakao  pada  konsentrasi  yang  rendah  tidak dapat  menembus  membran  sel,  sehingga  tidak terjadi penghambatan pertumbuhan.
S.  aureus dan B.  subtilis merupakan  bakteri Gram-positif  yang  struktur  dinding  selnya  lebih sederhana.  Dinding  selnya  tebal  sekitar  25-30  µm, berlapis  tunggal  dengan  komponen  terbesar  terdiri dari  peptidoglikan,  dan  dengan  kandungan  lipid yang  rendah  (1-4%).  Kelompok  bakteri  ini cenderung  lebih  rentan  terhadap  aktifitas  kom- ponen  antibakteri  seperti  senyawa  fenolik  dan penisilin.  Struktur  dinding  sel  yang  sederhana menyebabkan  senyawa  antibakteri  mudah  untuk masuk ke dalam sel dan menemukan sasaran untuk bekerja (Hawley, 2003).
Penelitian  sebelumnya  dalam  pengujian aktivitas antioksidan  dan antimikroba  ekstrak  kulit konsentrat  buah  kakao  varietas  Forastero,  me- nunjukkan    bahwa  ekstrak  kulit  buah  kakao  mem- punyai  aktivitas  antibakteri  terhadap E.  coli dan S.  aureus . E.coli mempunyai  sifat  lebih  peka terhadap  senyawa  aktif  ekstrak.  Pada  penelitian tersebut,  konsentrasi  ekstrak  yang  diujikan  adalah 5%  (250  µg/disc),  10%  (500  µg/disc),  dan  20%
(1000  µg/disc)  dengan  menggunakan  Dimetil sulfoksida  (DMSO)  sebagai  pengencer  ekstrak. Penghambatan  bakteri  terjadi  pada  semua  kon- sentrasi  ekstrak  tersebut  (Sartini et  al .,  2007). Aktivitas  penghambatan  bakteri  yang  berbeda  ini kemungkinan  disebabkan  oleh  perbedaan  bahan pengencer  dan  varietas  kakao  yang  digunakan. DMSO  merupakan  pelarut  polar  berspektrum luas, sehingga  dapat  melarutkan  senyawa  alkaloid  dan flavonoid yang terkandung dalam kulit buah kakao. Sebaliknya pelarut akuades hanya dapat melarutkan senyawa  bersifat  polar.  Elwers et  al .  (2009) melaporkan  bahwa  terdapat  perbedaan  kandungan senyawa  polifenol  antara  kakao  criollo,  forastero dan  trinitario/hibrida  (kadar  senyawa-senyawa
Tabel 1. Konsentrasi hambat minimum ekstrak kulit buah kakao, terhadap E. coli, B. subtilis, dan S . aureus .
Table 1. Minimum inhibitory concentration of pod cacao extrac against E. coli, B. subtilis , and S. aureus.
Bakteri (Bacteria ) Konsentrasi hambat minimum (%) Minimum inhibitory consentration (%) 0 1 2 4 8 16 32 64 Escherichia coli - - - - - - + + Bacillus subtilis - - - - - + + + Staphylococcus aureus - - - - + + + +
Keterangan/ Note : +  berarti terdapat zona hambat ( there are inhibiton zone ) - berarti tidak terdapat zona hambat ( there are no inhibiton zone )
Menara Perkebunan 2012 80(2), 77-84
fenolik  dari  total  kandungan  polifenol  kakao). Lebih  lanjut  Irmalia  (2011)  melaporkan,  bahwa varietas  forastero  memiliki  kandungan  antosianin yang  tidak  ditemukan  pada  varietas  kakao  yang lain.  Hal  tersebut    menunjukkan  bahwa  setiap varietas  kakao  memiliki  perbedaan  akumulasi metabolit  sekunder,  yang  kemungkinan  dapat menyebabkan  perbedaan  aktivitas  antibakteri antara varietas forastero dengan varietas hibrida.
Hasil  penelitian  memiliki  implikasi  yang sangat  penting  dalam  pengembangan  IPTEK  baik yang  menyangkut  buah  kakao  itu  sendiri  maupun yang menyangkut kesehatan manusia dan lingkungan.  Hal  yang  terkait  dengan  buah  kakao adalah memberikan jawaban ilmiah atas pertanyaan mengapa yang menyerang buah kakao di lapangan bukan bakteri tetapi jamur. Hal yang terkait dengan kesehatan  manusia  adalah  hasil  penelitian  ini menunjukkan  bahwa  ektrak  kulit  buah  kakao  ber- potensi  sebagai  sumber  bahan  pengawet  makanan yang aman dan terbarukan.

## Kesimpulan
Ekstrak  konsentrat  kulit  buah  kakao  hibrida mempunyai  potensi  sebagai  bahan  antibakteri terhadap E. coli, B. subtilis , dan S. aureus. Ekstrak konsentrat  kulit  buah  kakao  paling  efektif  meng- hambat pertumbuhan S. aureus dengan konsentrasi hambat  minimum  (KHM)  8%  (g/mL),  jika  di- bandingkan dengan  bakteri B. subtilis dan E. coli dengan      KHM  berturut-turut  sebesar  16%  (g/mL) dan   32% (g/mL).

## Daftar Pustaka
Adamafio  NA,  IK  Afeke,  J  Wepeba,  EK  Ali  & FQ  Quaye  (2004).  Biochemical  composition  and  in vitro  digestibility  of  cocoa  ( Theobromae  cacao ) pod husk,  cassava  ( Manihot  esculenta )  peel  and  plantain ( Musa paradisiacal ) Peel Ghana J Sci 44, 29-38.
Alemawor F, F Victoria, P Dzogbefia1, EOK Oddoye & JH  Oldham  (2009).  Effect  of Pleurotus  ostreatus fermentation  on  cocoa  pod  husk  composition: Influence  of  fermentation  period  and  Mn2+ supplementation on the fermentation process. African J Biotech 8(9), 1950-1958.
Andrews  JA  (2006). Determination  of  Minimum Inhibitory  Concentrations. Birmingham,  Department of Microbiology, City Hospital NHS Trust.
Anggriani  R  (2010).  Karakterisasi  simplisia  dan  isolasi senyawa  antosianin  dari  bunga  tanaman  pacar  air ( Impatiens  balsamina Linn.)  berwarna  merah. Skripsi .  Fakultas  Farmasi  Universitas  Sumatera Utara. Medan.
Anonim (2010). Outlook Komoditas Pertanian- Perkebunan .  Jakarta,  Pusat  Data  dan  Informasi Pertanian, Kementerian Pertanian.
Arifin H, N Anggraini, D Handayani & R Rasyid (2006).
Standarisasi  ekstrak  etanol  daun Eugenia  cimini Merr. J  Sains Tek. Far 11(2), 88-92.
Brooks  GF,  JS  Butel  &  SA  Morse  (2001). Jawetz, Melnick,  and  Adelberg’s:  Mikrobiologi  Kedokteran. Alih Bahasa: Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UNAIR. Salemba Medika, Jakarta.
Dahlan  S  (2004). Statistika  untuk  Kedokteran  dan Kesehatan. Jakarta, PT Arkans.
Das  K,  RKS  Tiwari  &  DK  Shrivastava  (2010).
Techniques of evaluation of medicinal plant products as  antimicrobial  agent:  current  methods  and  future trends. Jof Medicin Plants Res , 4(2), 104-111.
Elwers S, A Zambrano, C Rohsius & R Lieberei (2009). Differences  between  the  content  of  phenolic compounds  in  criollo,  forastero  and  trinitario  cocoa seed ( Theobroma cacao L.). Eur Food Res Technol 229, 937-948.
Goeswin  A  (2007). Teknologi  Bahan  Alam .  Bandung, ITB. 166p.
Hanafiah  KA  (2001). Rancangan  Percobaan  Teori  dan Aplikasi . Jakarta,  PT Raja Grafindo Persada. 238p.
Harsini  T  &  Susilowati  (2010).  Pemanfaatan  kulit  buah kakao  dari  limbah  perkebunan  kakao  sebagai  bahan baku  pulp  dengan  proses  organosolv . J  Ilmiah Teknik Lingkungan 2 (2), 80-89.
Hawley  LB  (2003). Intisari  Mikrobiologi  dan  Penyakit Infeksi .  Alih  Bahasa:  Brahm  U.  Pendit.  Jakarta, Hipokrates.
Helmenstein  AM  (2010). Theobromine  Chemistry: Theobromine is Chocolate’s Caffeine Relative. Taken from [http://chemistry.about.com/od/ facts structures/ a/theobrominechemistry.htm], 6 Mei 2010.
Irmalia WR (2011). Daya Antibakteri Ekstrak Biji Coklat (Theobroma  cacao)  Varietas  Forastero  terhadap Streptococcus  mutans.  Skripsi .  Fakultas  Kedokteran Gigi, Universitas Airlangga.
Kusumawati  N,  BSL  Jenie,  S  Setyahadi,  RD  Haryadi (2003). Seleksi bakteri asam laktat indigenus sebagai galur  probiotik  dengan  kemampuan  menurunkan kolesterol. J Mikrobiol Ind 8(2), 39-43.
Matsumoto  M,  M  Tsuji,  J  Okuda,  H  Sasaki,  K  Nakano,
K  Osawa,  S  Shimura  &  T  Ooshima  (2004). Inhibitory  effects  of  cacao  bean  husk  extract  on plaque formation in vitro and in vivo. Eur J Oral Sci 112 (3), 249-52.
Pratiwi  ST  (2008). Mikrobiologi  Farmasi .  Jakarta, Penerbit Erlangga.
Aktivitas antibakteri ekstrak ethanol kulit buah kakao ………(Mulyatni et al.)
Prescott  LM,  JP  Harley  &  DA  Klein  (2005). Microbiology,  Sixth  Edition .  New  York,  Mc  Graw- Hill.
Sartini,  MN  Djide  &  G  Alam  (2007). Ekstraksi
Komponen  Bioaktif  dari  Limbah  Kulit  Buah  Kakao dan  Pengaruhnya  Terhadap  Aktivitas  Antioksidan dan Antimikroba . Diunduh dari : [http://mot.f armasi. ugm.ac.id/files/18kulitaacao_PakAlam.pdf],  22  Juni 2011
Sudirja  R, MA  Solihin  &  S  Rosniawaty  (2007).  Respon beberapa  sifat  kimia  fluventic  eutrudepts  melalui pendayagunaan  limbah  kakao  dan  berbagai  jenis pupuk organik. Soil  Rens J 8(6), 23-30.
Talaro  KP  (2002). Foundations  in  Microbiology  Fourth Edition . New York, Mc Graw Hill.