PENDAHULUAN
Hipertensi masih menjadi masalah
kesehatan  utama  di  dunia. Salah  satu  faktor pemicunya  yaitu adanya  polimorfisme  pada gen  hAGT  yang mempengaruhi  tingkat kerentanan  seseorang  menderita  hipertensi [1]. Variasi  di titik -217  A/G gen  hAGT ternyata mampu mempengaruhi pengikatan faktor transkripsi  tiga  jenis glucocorticoid  receptor binding  site (GR) dan C/EBP- β [13] .
Glucocorticoid ini mampu memodulasi banyak
faktor  transkripsi  yang  meningkatkan  laju transkripsi gen hAGT [14][15] .
Di  Indonesia,  penelitian SNP -217 gen hAGT di  daerah  5’UTR belum  pernah dilakukan  pada populasi  komunitas  hipertensi. Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  dilakukan  pada populasi  komunitas  hipertensi  di  Kota  Malang dengan  sampel  penderita  hipertensi  di  Rumah Sakit Syaiful  Anwar.  Penelitian  ini  mengkaji ada  atau  tidaknya SNP -217 gen human angiotensinogen (hAGT) pada daerah 5’UTR .
Analisis Single Nucleotide Polymorphism (SNP) -217 Gen Human Angiotensinogen (hAGT) pada Penderita Hipertensi di Rumah Sakit Syaiful Anwar secara PCR-Sekuensing
S.Fatiyatur Rahmah 1) , Widodo 1) , Jayarani Fatimah Putri 1) , Mifetika Lukitasari 2) , M. Saifur Rahman 3)
1) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya
2) Jurusan Keperawatan, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya
3) Departemen Kardiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya-Rumah Sakit Syaiful Anwar
S. Fatiyatur Rahmah : fatiaturrahmah@yahoo.co.id

## ABSTRAK
Hipertensi  masih  menjadi  masalah  kesehatan  utama  di  dunia.  Polimorfisme  RAS (Renin Angiotensin  System) dikatakan  sebagai  penentu  hipertensi  dan beberapa kerusakan  organ  target. Angiotensinogen merupakan protein awal dalam RAS yang memicu timbulnya hipertensi. Diketahui bahwa populasi  skala  besar  ras  Amerika  dan  Afrika  yang  terkena  hipertensi, terjadi  polimorfisme  pada  daerah 5’ untranslated  region di  titik -217  A/G.  Variasi  basa  pada  titik -217 guanine atau adenine meningkatkan laju  ekspresi  gen  angiotensinogen.  Peningkatan  ini  terjadi  akibat  dari  interaksi  kuat  antara  faktor transkripsi  GR  dan  C/EBP- β yang  berikatan  dengan  daerah  enhanser  kemudian  mempengaruhi  laju transkripsi  RNA  polimerase  III  di daerah  promoter  gen  angiotensinogen.  Tujuan  dari  penelitian  ini  yaitu mengetahui adanya single  nucleotide  polymorphism (SNP) -217  gen human Angiotensinogen  (hAGT) pada penderita hipertensi di Rumah Sakit Syaiful Anwar secara PCR-Sekuensing. Metode yang digunakan yaitu isolasi whole genome (QIAamp DNA Blood  Mini Kit) dari 14 sampel darah  pasien  hipertensi, gen  hAGT di amplifikasi  dengan Polymerase  Chain  Reaction (PCR)  dan disekuensing untuk  mengetahui  adanya  SNP -217.  Analisis  yang  dilakukan  yaitu  menggunakan  software  AB  sequence  Scanner,  Bioedit  dan  BLAST NCBI. Hasil  analisis  menunjukkan bahwa  tidak  ditemukan  adanya SNP -217  gen  hAGT  pada  sampel pasien. Namun terdapat varian -6A pada gen tersebut yang juga mampu memicu terjadinya hipertensi.
Kata Kunci : angiotensinogen, gen hAGT, hipertensi, SNP -217 A/G

## ABSTRACT
Hypertension still become   main problem in the world. Angiotensinogen is  an early protein in RAS which  increase  hypertension  risk.  Nucleotide  base  variant    in -217  point  of  human  angiotensinogen  gene at 5’untranslated region in which from guanine to adenine can accelerate these transcription. These problem is caused  by strongly  interaction  between  transcription  factor  of  GR  and  C/EBP- β  with  hAGT when  adenine nucleotide base in -217 hAGT. The aim of this research was to examine single nucleotide polymorphism -217 at  5’untranslated  region  in  hAGT gene in Syaiful  Anwar  Hospital  hypertension  patients.  Methods  of  this research  is  whole  genome isolation (QIAamp DNA  Blood  Mini Kit)  from fourteen blood  samples of hypertension  patients, hAGT gene  amplification with  Polymerase  Chain  Reaction  and  sequencing    gene  of interest. The result was analyzed using AB sequence scanner and  Bioedit software also BLAST NCBI. There is no SNP -217 in 5’ untranslated region hAGT gene. But there is -6A variant in 5’untranslated region, that have affect to increasing hypertension risk.
Keywords : angiotensinogen, hAGT gene, hypertension, SNP -217 A/G

## METODE PENELITIAN
Pengambilan  data  dilakukan  mulai Bulan Agustus 2012 sampai Februari 2013 dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Laboratorium Biologi Komputasi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika  dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Brawijaya, Malang.
Empat  belas  pasien  yang  diambil  sampel darahnya  memiliki  kriteria  inklusi  yaitu tekanan  sistolik  >120  mmHg  dan  tekanan diastolik  >  80  mmHg,  fungsi  ginjal  normal (kreatinin  <2.5  mg/dl),  memiliki  kepatuhan yang  baik  terhadap  terapi  antihipertensi,  tidak sedang  terapi  hormon dan tidak  sedang  hamil. Metode  isolasi  DNA menggunakan QIAamp DNA  Blood  Mini  Kit. Kemudian  dibuat  gel agarosa  0.9  %  untuk running whole  genome. Hasil  elektroforesis whole  genome berupa  gel agarosa  dengan  DNA  hasil running dilihat menggunakan  UV  transluminator,  difoto  dan data  disimpan. Sampel  DNA,  PCR mix (HotstarTaq  Master  Mix),  ddH2O, primer forward dan primer reverse (1st  BASE)
dicampur kemudian disentrifugasi dan dimasukkan dalam mesin PCR dengan program PCR yang telah dimodifikasi [16]. Produk PCR untuk sekuensing dikirim  ke  Macrogen  Korea Selatan. Setelah  data  sekuensing  didapat  maka dianalisis  dengan AB  Sequence  Scanner, software Bioedit, dan program BLAST NCBI.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  analisis  BLAST  NCBI  dan Bioedit  yang  dibandingkan  dengan  hasil penelitian sebelumnya [4][10] diketahui bahwa sekuens yang teramplifikasi dan terbaca dengan sempurna berada pada posisi basa -469 sampai +10.  Posisi  tersebut  mengandung  sekuens konserve TATA Box yang menandakan daerah promoter  dekat  dengan transcription initiation site +1,  SNP -6,  SNP -20,  SNP -217,  daerah binding faktor  transkripsi  glukokortikoid, estrogen, Acute phase, RNA polimerase III dan sebagian daerah ekson 1 [6].
Hasil  analisis  juga  menyebutkan  bahwa tidak ditemukannya polimorfisme pada posisi - 217  untuk  semua  sampel  yang  diuji  (Tabel  1). Ketiadaan  polimorfisme  pada  sampel  darah pasien  yang  diteliti  kemungkinan  karena jumlah  sampel  yang  diteliti  kurang  banyak. Varian -217 G yang ditemukan pada penelitian ini diketahui tidak menjadi faktor  resiko terjadinya hipertensi [15].
Tabel 1. Polimorfisme -217 daerah 5’ UTR gen human Angiotensinogen
NO KODE PASIEN POLIMORFISME -217 A G Normotensive (SBP/DBP<120/80 mmHg) - + 1. DS - + 2. EM - + 3. IS - + 4. LC - + 5. MS - + 6. MR - + 7. MC - + 8. SK - + 9. SR - + 10. SM - + 11. SP - + 12. ST - + 13. TR - + 14. US - +
Hasil  pada  penelitian  ini  berbeda  dengan penelitian polimorfisme -217  yang  biasanya signifikan  ditemukan  pada  ras  Afrika-Amerika dan  ras  Kaukasian  di  negara  Kanada  dan  USA yang  menggunakan  ratusan  sampel  darah pasien [6][7][10]. Perbedaan  hasil  penelitian juga ditemukan pada negara Taiwan dan China di  kota  Shanghai,  Jiangsu  serta  Henan  yang mana  terjadi  polimorfisme  di  titik  G-217A. Jumlah  sample  yang  digunakan  berkisar minimal  dua  ratus  sampel  darah  pasien [8][9][12][17][19].
Kasus terjadinya polimorphisme G-217A untuk populasi Chinese di  kawasan  Asia  Timur  sebanyak  1268  pasien dengan jumlah kontrol 1081 pasien (SBP/DBP<140/90 mmHg) [18].
Kasus  terjadinya  polimorphisme  G-217A untuk kawasan negara-negara di Asia Tenggara masih  belum  diketahui.  Faktor  distribusi geografi  dan  ras  dalam  beberapa  penelitian diketahui  mampu  mempengaruhi  polimorfisme pada gen hAGT [2][5]. Ketiadaan polimorfisme di  titik -217  sedangkan  pasien  tersebut menderita  hipertensi,  kemungkinan  disebabkan oleh faktor yang lain yaitu adanya polimorfisme  di  titik  lain dalam  5’UTR  hAGT [10].
Berdasarkan  penelitian sebelumnya  [11] diketahui  bahwa  adanya  varian -217A  selalu diikuti  oleh  varian  yang  lain  yaitu -532A, - 793T dan -1074T membentuk haplotipe ATAT. Haplotipe  ini  mampu  meningkatkan  aktivitas promoter  hAGT  pada  sel  adiposa  sebesar  1.4- fold selama tiga hari dan 1,7-fold selama enam hari  setelah  perlakuan  dibanding haplotipe GCGG  (-217G, -532C, -793G  dan -1074G).
Sehingga dimungkinkan jika pada penelitian ini ditemukan  varian -217G,  maka  SNP  yang menjadi kandidat penyebab hipertensi yaitu -20 dan -6. Analisis berikutnya
menelusuri kemungkinan  adanya  polimorfisme  pada  titik lain  yaitu -20  dan -6.  Kedua  titik  tersebut mampu  memicu  datangnya  faktor  transkripsi tambahan  untuk  meningkatkan  laju  transkripsi gen  hAGT  yaitu  dari  kelompok  glukokortikoid dan USF/ERE [10]. Hasil analisis menunjukkan tidak  ditemukan  adanya  polimorfisme  pada kedua  titik  tersebut  (-20  A  dan -6A) untuk semua pasien hipertensi. Namun jika dilakukan perbandingan  antara  sekuens  gen  dari  NCBI yang  memiliki  normotensive  dengan  sampel hasil  sekuensing,  terdapat  varian  yang  berbeda pada posisi -6  hAGT. Varian -6A  diketahui mampu meningkatkan aktifitas promoter hAGT untuk mentranskripsi mRNA hAGT.
Berdasarkan  penelitian  yang  lain  [3] ada keterkaitan  kuat  antara  varian -6A  dengan T235.  Polimorfisme  M235T  diketahui  sebagai kandidat  utama  marker  resiko  hipertensi  untuk protein  angiotensinogen.  Pengujian  populasi hipertensi pada ras Caucasian dan Japanese di Utah,  Jepang  dan  Prancis  menunjukkan  bahwa -6A/T235 merupakan bentuk ancestral dari gen hAGT  yang  secara  langsung  terkait  pada hipertensi.  Hal  ini  ditunjukkan  oleh    adanya frekuensi yang sama dan selalu dominan(antara -6A dengan T235 yang terletak di ekson 2 gen hAGT) ditemukan pada hampir semua penderita hipertensi [10]. Keberadaan -6A juga diketahui lebih signifikan dominan dibanding - 217A  pada  penderita  hipertensi  populasi  ras Chinese [21].
Keberadaan  SNP -217  hAGT  sebenarnya hanya  faktor  untuk  memperbesar  resiko terjadinya  hipertensi  dan  belum  ada  penelitian yang menunjukkan keterkaitan langsung dengan  penyakit  hipertensi.  Ketentuan  ini  juga berlaku  pada  SNP  yang  lain  yaitu  dalam penelitian  ini -6  hAGT.  Diketahui bahwa polimorfisme  gen  hAGT  berasosiasi  dengan peningkatan  laju  transkripsi  gen  hAGT  dan sedikit
peningkatan
konsentrasi
angiotensinogen  di  plasma  dan  jaringan.
Peningkatan  protein  angiotensinogen  pada plasma dan jaringan terutama dikendalikan oleh peningkatan konsentrasi ANG II, yang dipengaruhi  oleh  overstimulasi  sistem  renin pada  reabsorbsi  natrium  di  ginjal,  hipertropi vaskular,  peningkatan  aktivitas  sistem  syaraf dan adanya penyakit kardiovaskular [3].

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  analisa  sekuens  gen angiotensinogen  yang  diambil  dari 14 sampel darah    pasien di  Rumah  Sakit  Syaiful  Anwar Kota Malang, Jawa Timur, Indonesia diketahui bahwa  tidak  ditemukan  polimorfisme  gen  di daerah  5’UTR -217. Namun  terdapat  varian - 6A  yang  juga  berperan  sebagai  faktor  resiko hipertensi.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  kepada  PERKI  dan  SPP- DBP yang telah mendanai penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]Aziza, L ,  M.  Sja’ bani,  S.M.  Haryana, M.N.H.E.Soesatyo &  A.H. Sadewa. 2010. Hubungan  Polimorfisme  Gen  Angiotensin- Converting  Enzyme  Insersi/Delesi  dengan Hipertensi pada  Penduduk  Mlati,  Sleman, Yogyakarta,  Indonesia. Maj  Kedokt  Indon. 60 (4).
[2] Baker, M.,T. Rahman,D. Hall, P.J. Avery,B. M. Mayosi, J.  M. Connell, M.  Farrall, H.Watkins & B. Keavney.  2007. The  C- 532T Polymorphism of The Angiotensinogen  Gene  is  Associated  with Pulse Pressure: A Possible Explanation for Heterogeneity  in  Genetic  Association
Studies of AGT and Hypertension. International  Journal  of  Epidemiology. 36:1356 – 1362 [3] Corvol,  P.  & X.  Jeunemaitre.  1997. Molecular Genetics of Human Hypertension:  Role  of  Angiotensinogen.
Endocrine Reviews. 18(5): 662 – 677.
[4] Fukamizu, A.,  S.  Takahashi,  M.S.Seo,  M. Tada,  K.  Tanimoto,  S.  Uehara  &  K. Murakami. 1990. Structure and Expression of Human Angiotensinogen Gen : Identification  of  a  Unique  and  Highly Active Promoter. The Journal Of
Biological  Chemistry. 265  (13): 7576-
7582.
[5] Goldenberg, I.,  A.  J.  Moss,  D.  Ryan,  S. McNitt,  S.  W.  Eberly  & W. Zareba.  2007. Polymorphism  in  the  Angiotensinogen Gene,
Hypertension, and Ethnic
Differences  in  the Risk  of  Recurrent Coronary  Events. Hypertension. 48:693- 699
[6] Jain, S., X.  Tang, C.S.  Narayanan, Y. Agarwal, S.M.  Peterson, C.D.  Brown, J. Ott  &  A.  Kumar. 2002.Angiotensinogen
Gene Polymorphism  at -217 Affects Basal Promoter Activity  and Is Associated  with Hypertension in African-Americans. J Biol
Chem. 277: 36889 – 36896.
[7] Jeunemaitre, X., F.  Soubrier, Y.V. Kotelevtsev, R.P. Lifton, C.S. Williams, A. Charru, S. C.  Hunt, P. N.  Hopkins, R. R. Williams, J.M. Lalouel & Pierre  Corvol .
1992. Molecular Basis of Human
Hypertension: Role  of Angiotensinogen. Cell. 71(1): 169-180.
[8] Jiang, X., H. Sheng, J.  Li,  P.  Xun,  Y. Cheng,  J.  Huang,  H.  Xiao  &  Y.  Zhan.
2008. Association Between Renin Angiotensin  System  Gene  Polymorphism and Essential Hypertension: a Community-
Based  Study. J  Hum  Hypertens. 23:  176 – 181.
[9] Kong, X.D.,Y.X. Yang & S.Z. Zhang. 2004. Haplotypes  Extending  Across  AGT  Are Associated Essential Hypertension. Hereditas. 26: 797 – 802.
[10]Kumar,  A.  2005. Angiotensinogen  Gene Polymorphisms  and  Hypertension. cit. M.K. Raizada, J.F.R. Paton, M.J. Katovich & S. Kasparov. Contemporary Cardiology: Cardiovascular  Genomics. Humana  Press Inc. Totowa, NJ. hal. 61
[11]Li, Y., S. Jain, S. Patil & A. Kumar. 2006. A Haplotype of Angiotensinogen Gene that
Is  Associated  with  Essential Hypertension
Increases Its Promoter Activity in Adipocytes. Vascular  Pharmacology. 44
(2006) 29 – 33.
[12]Liu  Y,  Jin  W,  Jiang  ZW,  K.  X. Zhang, H.H. Sheng, L. Jin, Y.Y. Sheng, W. Huang &  J.  D.  Yu. 2004. Relationship Between Six Single  Nucleotide  Polymorphisms  of Angiotensinogen Gene and Essential
Hypertension. Chin  J  Med  Genet.  21:116 – 119.
[13]Rupert, J.L., K. K. Kidd, L. E. Norman, M. V. Monsalve, P.W. Hochachka &  D.  V. Devine. 2003.  Genetic Polymorphisms in
The  Renin-Angiotensin  System  in High Altitude  and Low – Altitude  Native American Populations. Annals  of  Human Genetics. 67:17 – 25.
[14]Sherman, C. T. & A. R. Brasier. 2001. Role of  Signal  Transducers  and  Activators  of Transcription  1  and -3  in  Inducible Regulation of the Human  Angiotensinogen Gene  by  Interleukin-6. Mol  Endocrinol. 15:441 – 457.
[15]Sigmund, C.D. 2008. A Growing Chain of
Evidence  Linking  Genetic  Variation  in Angiotensinogen with Essential Hypertension:  Focus  on  “A  Haplotype  of Human Angiotensinogen Gene Containing -217A Increases Blood Pressure in
Transgenic  Mice  Compared  with - 217G,” by Jain  et  al. Am  J  Physiol  Regul  Integr Comp Physiol. 295:R1846-R1848.
[16]Woodiwiss, A.J., B. Nkeh, N.J. Samani, D. Badenhorst, M. Maseko, A. D. Tiago, G.P. Candy,  E. Libhaber,  P.  Sareli,  R.
Brooksbank  &  G.  R.  Norton.  2006. Functional Variants of The Angiotensinogen Gene Determine Antihypertensive Responses to Angiotensin-Converting  Enzyme  Inhibitors in  Subjects of  African  Origin. Journal  of Hypertension. 24(6): 1065-1073.
[17]Wu, S.J., F.T. Chiang, J.R. Jiang, K.L. Hsu, T.H. Chern & Y.Z. Tseng. 2003. The  G- 217A Variant  of  The  Angiotensinogen Gene  Affects  Basal  Transcription  and  Is Associated  With  Hypertension  in  A Taiwanese Population. J  Hypertens. 21:
2061 – 2067.
[18]Xi,  B.,  Y.Shen,  Y.Yan  & J.  Mi.  2011. Association of Polymorphisms in The AGT Gene  with  Essential  Hypertension  in  The Chinese  Population. Journal  of  the  Renin- Angiotensin Aldosterone  System. 13  (2)  : 282-288.
[19]Zhan,Y., X. Jiang, H. Sheng, J. Li, P. Xun, Y.  Cheng,  J.,  Huang  &  H.  Xiao. 2007. Association  of  Angiotensinogen  Gene Polymorphisms with The  Risk of Essential Hypertension  in  The  Elderly. Chin  J  Lab
Med. 30: 762 – 766.