## UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK METANOL BIJI KESUMBA KELING
( Bixa orellana L)
Antioxidant Activity Test Of Methanol Extract Of Kesumba Keling ( Bixa orellana L) Seeds
Fensia Analda Souhoka * , Nikmans Hattu, Marsye Huliselan
Department of Chemistry, Faculty Mathematics and Natural Science, Pattimura University, Jl. Ir. Putuhena No. 1 Poka Ambon 97233-Maluku
*Corresponding author, e-mail: fensia@fmipa.unpatti.ac.id
Received: Jan. 2019 Published: Jul. 2019

## ABSTRACT
Kesumba keling ( Bixa orellana L ) has been widely used as a natural dye on lips, hair, and cloth. The red pigment in kesumba keling seeds comes from a bixin and norbixin compound which have many conjugated double bonds, so it has the potential of antioxidants. This study aims to determine the antioxidant compound and an antioxidant activity of methanol extract of kesumba keling seeds. The moisture content of kesumba keling seeds is 78.74%. The  powder  of  kesumba  keling  seeds  was  extracted  using  maceration  method  with  80%  of  methanol. Phytochemical test results of methanol extract positively contained flavonoid compound. An antioxidant activity test  of  methanol  extract  of  kesumba  keling  seeds  was  carried  out  by  determining  DPPH  free  radical  deterrent activity. The absorbance measurement were made using a UV-Vis spectrophotometer at a wavelength of 517 nm. Kesumba keling  seeds extract has antioxidant activity  which is indicated by IC 50 value of 69.425 ppm, so it is classified as a strong antioxidant.
Keywords : Antioxidant activity, kesumba keling seeds, methanol extract, phytochemical test.

## PENDAHULUAN
Makanan  dan  minuman  olahan  umumnya dibuat  dengan  menambahkan  pewarna  sintetik agar  lebih  menarik  bagi  konsumen.  Pewarna sintetis  menyebabkan  dampak  yang  tidak  baik dalam  jangka  panjang,  salah  satunya  dapat menyebabkan kanker. Oleh karena itu, pemanfaatan  bahan  alam  sebagai  sumber pewarna  alami  pada  bahan  pangan  perlu dimaksimalkan.
Kesumba  keling  merupakan  salah  satu tanaman  perdu  yang  ditanam  di  pekarangan rumah  atau  di  pinggiran  jalan  sebagai  tanaman hias dan pelindung. Bijinya berbentuk bulat telur dan  mempunyai  selaput  berwarna  merah.  Biji kesumba  mengandung  senyawa  biksin  dan norbiksin,  yaitu  golongan  karotenoid  tetra- terpenoid, yang  merupakan pigmen larut air dan lipid,  serta  tersebar  luas  hampir  ke  semua  jenis tumbuhan.  Biksin  (C 25 H 30 O 4 )  adalah  suatu  asam karboksilat  karotenoid  dan  merupakan  pewarna organik yang tidak berbahaya (Gardjito, 2013).
Senyawa  biksin  dan  norbiksin  memiliki struktur  yang  terdiri  dari  banyak  ikatan  rangkap
terkonjugasi, sehingga berpotensi sebagai antioksidan,
antijamur, antikanker, antiinflamatori,
antimutagenik, dan antigenotoksik  (Suparmi  dan  Martosupono, 2008,  Rustiah,  dkk.,  2018,  Mahardika  dkk., 2018).  Antioksidan  merupakan  senyawa  yang dapat  menghambat  reaksi  oksidasi  dengan  cara mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif. Serangan radikal bebas terhadap molekul di  sekelilingnya  akan  menyebabkan  terjadinya reaksi  berantai,  yang  kemudian  menghasilkan senyawa  radikal  baru.  Dampak  reaktivitas senyawa  radikal  bebas  menyebabkan  kerusakan sel  atau  jaringan,  penyakit  autoimun,  penyakit degeneratif, hingga kanker (Sadikin, 2001).
Potensi  biji  kesumba  keling  sebagai pewarna sekaligus antioksidan alami perlu untuk dikembangkan,  sehingga  dapat  menggantikan pewarna sintetis. Mira dkk . (2013), menggunakan etanol  untuk  mengekstrak  biji  kesumba  keling sebagai  pewarna  bibir.  Pujilestari  (2014), mengekstrak  zat  warna  biji  kesumba  keling dengan  air  untuk  digunakan  sebagai  pewarna pada  kain  batik  katun.  Menurut  Purwaningsih
(2013),  biji  kesumba  keling  dapat  digunakan sebagai pewarna makanan dan antioksidan.
Pada  penelitian  ini  dilakukan  uji  aktivitas antioksidan ekstrak metanol biji kesumba keling melalui  penentuan  aktivitas  penangkal  radikal bebas  DPPH  menggunakan  spektrofotometer UV-Vis.  Parameter  hasil  pengujian  dengan metode DPPH adalah IC 50 ( inhibition concetration ),  yaitu  konsentrasi  larutan  sampel yang  menyebabkan  reduksi  terhadap  aktivitas DPPH  sebesar  50%.  Menurut  Molyneux (2004), secara spesifik suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai  IC 50 <50  ppm,  kuat  50<IC 50 <100  ppm, sedang 100<IC 50 <150 ppm, lemah 150 ppm<IC 50 <200  ppm, dan  sangat lemah IC 50 >200 ppm.
Penelitian  meliputi  penentuan  kadar  air  biji kesumba  keling,  ekstraksi  biji  kesumba  keling dengan  metode  maserasi  menggunakan  metanol 80%, kemudian dilakukan uji fitokimia terhadap ekstrak, yaitu uji fenolik, uji flavonoid, uji tanin, penentuan kandungan total fenolik, dan penentuan  kandungan  total  flavonoid.  Ekstrak metanol biji kesumba diharapkan dapat diaplikasikan secara maksimal sebagai antioksidan  alami  dalam  industri  pangan, kosmetik, dan farmasi.

## METODOLOGI
Alat Alat-alat  yang  digunakan  yaitu  peralatan gelas  laboratorium  ( pyrex ), hot  plate (Cimarec 2), rotary evaporator (Rotavapor R-215 Buchii), neraca analitik ( Electronic Balance ), mikropipet, dan  vortex.  Instrumentasi kimia  yang  digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis (Apel PD-3000 UV).

## Bahan
Bahan  dasar  yang  digunakan  adalah  biji kesumba keling. Bahan-bahan lain yang digunakan  dengan  kualitas  pro  analisis  dari Merck,  yaitu  metanol, reagen  Folin-Ciocalteu , natrium karbonat 2%, FeCl 3 1%, serbuk Mg, HCl 1%, AlCl 3 2%, DPPH, kuersetin (Sigma), kertas saring, dan akuades.

## Prosedur Kerja Preparasi Sampel
Biji  kesumba  keling  segar  dikeringkan  di dalam  oven  pada  suhu  50  C  sampai  berat
konstan,  kemudian  dihitung  kadar  air.  Sampel kering diblender, kemudian disaring menggunakan  ayakan  100  mesh  hingga  menjadi serbuk.

## Ekstraksi biji kesumba keling
Serbuk  biji  kesumba  keling  sebanyak  10  g dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan  200  mL  metanol  80%  hingga sampel  terendam,  selanjutnya  dimaserasi  selama 12 jam. Hasil ekstraksi disaring, kemudian filtrat diuapkan  menggunakan  rotavapor.  Ekstrak metanol  biji  kesumba  keling  yang  diperoleh ditimbang, kemudian dilakukan uji fitokimia.

## Uji Fitokimia
Uji fenolik (Harbone, 2006)
Ekstrak metanol sebanyak 2 mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditambahkan  2  tetes  FeCl 3 1%  kemudian dikocok. Uji positif apabila menghasilkan warna biru pekat.
Uji flavonoid (Nafisah dkk., 2014)
Ekstrak metanol sebanyak 2 mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditambahkan  sedikit  serbuk  Mg  dan  1  mL  HCl 1%.  Uji  positif  bila  menimbulkan  busa  dan berwarna jingga.
Uji tanin (Tiwari dkk., 2011) Ekstrak metanol sebanyak 2 mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditambahkan  dengan  1  mL  akuades  kemudian dididihkan.  Selanjutnya  disaring  dan  filtratnya ditambahkan  2-3  tetes  FeCl 3 1%  dan  dikocok. Uji  positif  bila  menghasilkan  warna  hijau  pekat atau biru pekat.
Penentuan  kandungan  total  fenolik (Conde dkk., 1997)
Kandungan total fenolik ditentukan menggunakan  metode Folin-Ciocalteau .  Fenol dengan  konsentrasi  0,  1,  2,  3,  4,  dan  5  ppm dibuat  sebagai  kurva  standar,  kemudian  analisis dengan  dua  kali  pengukuran.  Sebanyak  0,1  mL ekstrak metanol biji kesumba keling dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 0,1 mL reagen Folin-Ciocalteu 50%. Campuran dihomogenkan  menggunakan  vortex,  kemudian ditambahkan 2 mL larutan natrium karbonat 2%. Selanjutnya  larutan  disimpan  dalam  ruang  gelap
selama  30  menit.  Absorbansi  diamati  pada panjang  gelombang  750  nm.  Kandungan  total fenolik  dinyatakan  sebagai  ekuivalen  fenol dalam mg/g ekstrak.
Kandungan total fenolik = x FP Keterangan: M=  Konsentrasi fenolik (ppm) V=  Volume sampel (L) W= Berat sampel (g)
FP= Faktor pengenceran
Penentuan kandungan total flavonoid (Alhabsyi, dkk. 2014)
Kuersetin dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm dibuat sebagai kurva standar, selanjutnya dianalisis dengan dua kali pengukuran. Sebanyak 0,1  mL  ekstrak  metanol  kesumba  keling dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditambahkan 2 mL AlCl 3 2%. Campuran diaduk kemudian  absorbansinya  diamati  pada  panjang gelombang  415  nm.  Kandungan  total  flavonoid dinyatakan  sebagai  ekuivalen  kuersetin  dalam mg/g ekstrak.
Kandungan total flavanoid = -
Keterangan:
E=  Ekivalen kuersetin (ppm)
V=  Volume sampel (L) W= Berat sampel (g) FP= Faktor pengenceran

## Pembuatan larutan DPPH 40 ppm
Sebanyak  0,01  g  DPPH  dimasukkan  ke dalam labu takar 250 mL kemudian ditambahkan metanol  hingga  tanda  batas.  Larutan  segera digunakan  dan  dijaga  pada  temperatur  rendah dan terlindung dari cahaya.

## Penentuan  panjang  gelombang  maksimum DPPH
Sebanyak  5  mL  larutan  DPPH  40  ppm diamati  serapannya  pada  panjang  gelombang 490–534  nm  dengan  menggunakan  blanko metanol.
Penentuan  aktivitas  penangkal  radikal  bebas DPPH (Mulyani dkk., 2013)
Sebanyak  2  mg  ekstrak  metanol  biji kesumba  keling  dibuat  menjadi  larutan  dengan
konsentrasi  10,  20,  30,  40,  50,  dan  100  ppm. Larutan  pembanding  kuersetin  dibuat  dengan konsentrasi  2,5;  5,0;  7,5;  10;  dan  20  ppm. Masing-masing  larutan  uji  sebanyak  1  mL dimasukkan  ke  dalam  tabung  reaksi  dan ditambahkan  2  mL  larutan  DPPH  40  ppm, kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar.  Pengukuran  absorbansi  dilakukan  pada panjang  gelombang  517  nm  menggunakan spektrofotometer  UV-Vis.  Pengujian  dilakukan dengan  dua  kali  pengukuran.  Selanjutnya dihitung  nilai  IC 50 berdasarkan  persamaan regresi yang diperoleh. IC 50 merupakan konsentrasi  ekstrak  yang  menghambat  aktivitas DPPH  sebesar  50%.  Semakin  kecil  nilai  IC 50 , semakin tinggi aktivitas antioksidan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Preparasi Sampel
Biji  buah  kesumba  keling  dikeringkan dalam  oven  sampai  berat  konstan,  diperoleh kadar  air  78,74%.  Sampel  kering  dihaluskan hingga menjadi serbuk berukuran 100 mesh.

## Ekstraksi Sampel
Serbuk biji buah kesumba diekstrak dengan metanol  80%  menggunakan  metode  maserasi selama  12  jam.  Diperoleh  ekstrak  berwarna merah  bata,  selanjutnya  ekstrak  disaring, kemudian filtrat diuapkan menggunakan rotavapor.

## Uji Fitokimia Uji fenolik
Uji  fenolik  akan  menunjukkan  hasil  positif dengan  terbentuknya  warna  biru  pekat  bila ekstrak  direaksikan  dengan  FeCl  1%,  sesuai reaksi  pada  Gambar  1.  Uji  menunjukkan  hasil negatif,  ditandai  dengan  perubahan  warna sampel dari merah bata menjadi coklat tua.

## Uji flavonoid
Untuk  mengetahui  ada  tidaknya  senyawa flavonoid  dalam  ekstrak  dilakukan  analisis dengan  uji  Shinode  menggunakan  HCl  1%  dan serbuk  Mg,  seperti  reaksi  pada  Gambar  2.  Uji menunjukkan  hasil  positif,  ditandai  dengan perubahan  warna  sampel  dari  merah  bata menjadi  jingga.  Reaksi  uji  flavonoid  menurut Nafisah dkk. (2014) adalah sebagai berikut.
Mg (s) + 2 HCl (l)  MgCl 2(aq) + H 2(g)
MgCl 2(aq) +  6  ArOH (s)  [Mg(OAr) 6 ] -4 (aq) +
6 H + (aq) + 2 Cl - (aq)

## Uji tanin
Uji  positif  adanya  senyawa  tanin  ditandai dengan  terbentuknya  endapan  putih  bila  ekstrak direaksikan  dengan  FeCl 3 1%.  Uji  menunjukkan hasil  negatif,  ditandai  dengan  perubahan  warna sampel dari merah bata menjadi coklat muda.

## Penentuan kandungan total fenolik
Senyawa  fenol  diketahui  memiliki  aktivitas antioksidan. Pengujian dan penentuan kandungan total fenolik merupakan dasar dilakukan pengujian aktivitas antioksidan.
Gambar 1. Reaksi uji fenolik (Harbone, 2006)
Penentuan  kandungan  total  fenolik  diukur menggunakan  metode Folin-Ciocalteu dan diamati  serapan  pada  panjang  gelombang  750 nm.  Dari  hasil  pengukuran  diperoleh  absorbansi larutan  standar  fenol  seperti  disajikan  pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil pengukuran absorbansi larutan
standar fenol No Konsentrasi fenol (ppm) Absorbansi 1 2 3 4 5 6 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 0,000 0,276 0,315 0,553 0,792 0,824
Dari  hasil  yang  diperoleh,  dibuat  kurva standar fenol seperti ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2. Kurva standar fenol
Nilai  absorbansi  yang  diperoleh  dari  tiap ekstrak  diplotkan  terhadap  kurva  standar  fenol dan  dihitung  kandungan  total  fenoliknya. Kandungan  total  fenolik  ekstrak  metanol  biji kesumba  keling  adalah  0,00595  mg/g  ekstrak. Pada  penentuan  kandungan  total  fenolik  terjadi perubahan  warna  dari  kuning  menjadi  hijau, yang merupakan hasil dari reaksi antara senyawa fenolik  dalam  ekstrak  dengan reagen  Folin- Ciocalteu yang ditunjukkan pada Gambar 3.
Penentuan Kandungan Total Senyawa Flavonoid Penentuan kandungan total senyawa flavonoid  dilakukan  dengan  mengamati  serapan pada  panjang  gelombang  415  nm.  Absorbansi standar kuersetin disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil pengukuran absorbansi larutan standar kuersetin No Konsentrasi kuersetin (ppm) Absorbansi
1 2 3 4 5 2 4 6 8 10 0,125 0,224 0,361 0,473 0,583
Dari hasil pengukuran, dibuat kurva standar kuersetin  seperti  ditunjukkan  pada  Gambar  4. Berdasarkan nilai absorbansi yang diperoleh dari tiap  ekstrak  diplotkan  terhadap  kurva  standar kuersetin  (Gambar  4)  dan  dihitung  kandungan total  flavonoid.  Kandungan  total  flavonoid ekstrak  metanol  biji  kesumba  keling  adalah 0,6689 mg/g ekstrak.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 2 4 6 A b so rb an si Konsentrasi fenol (ppm)
Penentuan panjang gelombang maksimum DPPH
Penentuan  panjang  gelombang  maksimum DPPH  dilakukan  dengan  mengamati  serapan panjang  gelombang  pada  rentang  490-534  nm. Hasil  yang  diperoleh  dibuat  kurva  seperti Gambar 5.
Gambar 4. Kurva standar kuersetin
Gambar 5. Panjang gelombang maksimum DPPH
Berdasarkan  Gambar  5  diperoleh  panjang gelombang  maksimum  DPPH  adalah  517  nm. Selanjutnya  panjang  gelombang  maksimum DPPH  digunakan  dalam  penentuan  aktivitas antioksidan.

## Pembuatan kurva standar
Sebelum  dilakukan  penentuan  aktivitas penangkal  radikal  bebas  DPPH  ekstrak  metanol biji  kesumba  keling,  dibuat  kurva  standar  untuk menguji  linearitas  pada  sampel.  Penentuan aktivitas penangkal radikal bebas DPPH dinyatakan  dengan  nilai  IC 50 menggunakan kuersetin sebagai kontrol. Dari hasil pengukuran menggunakan  UV-Vis  pada  panjang  gelombang 517  nm  diperoleh  nilai  absorbansi  dari  masing- masing  konsentrasi.  Nilai  absorbansi  digunakan untuk perhitungan % Inhibisi dan IC 50 kuersetin. Berdasarkan  hasil  perhitungan  diperoleh  data aktivitas  penangkal  radikal  bebas  DPPH  dari kuersetin seperti disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3.   Aktivitas  penangkal  radikal  bebas
DPPH dari kuersetin No Konsentrasi kuersetin (ppm) Abs % Inhibisi U 1 U 2 1 2,5 0,795 0,781 21,00 2 5,0 0,712 0,720 28,20 3 7,5 0,450 0,462 54,26 4 10,0 0,376 0,366 62,81 5 20,0 0,056 0,051 94,63 6 DPPH + Metanol 1,023 0,973 -
0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 5 10 15 A b so rb an si Konsentrasi kuersitin (ppm) 0.54 0.64 0.74 487 497 507 517 527 537 A b so rb an si Panjang Gelombang (nm)
Gambar 3. Reaksi Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol (Conde dkk., 1997)
Dari  hasil  yang  diperoleh,  dibuat  kurva standar  aktivitas  penangkal  radikal  bebas  DPPH dari kuersetin seperti ditunjukkan pada Gambar 6.
Gambar 6. Kurva standar aktivitas penangkal radikal bebas DPPH dari kuersetin
Persamaan  regresi  kurva  standar  aktivitas penangkal  radikal  bebas  DPPH  dari  kuersetin digunakan untuk menentukan nilai IC 50 kuersetin.  Berdasarkan  perhitungan  diperoleh nilai IC 50 kuersetin 8,485 ppm.
Penentuan  aktivitas  penangkal  radikal  bebas DPPH
Aktivitas  antioksidan  ekstrak  metanol  biji kesumba  keling  diuji  menggunakan  metode DPPH.  Uji  DPPH  merupakan  metode  yang efektif  untuk  menentukan  aktivitas  antiradikal bebas.  Radikal  DPPH  adalah  suatu  senyawa organik  yang  mengandung  nitrogen  yang  tidak stabil  dengan  absorbansi  kuat  pada  panjang gelombang  517  nm  dan  berwarna  ungu  gelap. Reaksi penghambatan radikal DPPH ditunjukkan pada Gambar 7.
Gambar 7. Reaksi penghambatan radikal DPPH (Prakash, 2001)
Penentuan aktivitas penangkal radikal bebas DPPH  dilakukan  dengan  mengamati  serapan pada  panjang  gelombang  517  nm.  Absorbansi
ekstrak  metanol  biji  kesumba  keling  disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil pengukuran absorbansi ekstrak
metanol biji kesumba keling No Ekstrak metanol biji kesumba keling Absorbansi 1 2 P1 P2 0,390 0,402
Dari  hasil  pengukuran,  dibuat  kurva aktivitas  penangkal  radikal  bebas  DPPH  ekstrak metanol  biji  kesumba  keling  seperti  ditunjukkan pada  Gambar  8.  Ekstrak  metanol  biji  kesumba keling menunjukkan peningkatan % inhibisi tiap konsentrasinya.  Persen  inhibisi  diperoleh  dari perbedaan absorbansi kontrol dengan absorbansi sampel. Selanjutnya, penentuan aktivitas penangkal  radikal  bebas  DPPH  digunakan parameter IC 50 . Penentuan IC 50 dari sampel yang diekstrak  bertujuan  untuk  menentukan  jumlah kandungan  ekstrak  yang  dapat  menurunkan intensitas  serapan  radikal  bebas  DPPH  sebesar 50%  dibandingkan  dengan  larutan  kontrol. Semakin kecil nilai IC 50 , semakin tinggi aktivitas antioksidan. Ekstrak metanol biji kesumba keling mengandung  senyawa  flavonoid  yang  dapat menyumbangkan  elektron  untuk  menangkal radikal bebas.
Gambar 8. Penentuan aktivitas penangkal radikal bebas DPPH ekstrak metanol biji kesumba keling
Berdasarkan  hasil  perhitungan,  diperoleh aktivitas  penangkal  radikal  bebas  DPPH  ekstrak metanol  biji  kesumba  keling  dengan  persamaan regresi y  =  0,3012x  +  29,089 dan  nilai  IC 50 adalah  69,425  ppm.  Nilai  ini  menunjukkan ekstrak  metanol  biji  kesumba  keling  tergolong antioksidan kuat (50<IC 50 <100 ppm). Dibandingkan  dengan  penelitian  sebelumnya, Suhaling (2016), menentukan aktivitas antioksidan  ekstrak  metanol  kacang  merah
0 50 100 150 0 10 20 30 % In h ib isi Konsentrasi (ppm)
0 20 40 60 80 0 50 100 % In h ib isi Konsentrasi ekstrak (ppm)
( Phaseolus  vulgaris L)  dengan  Metode  DPPH, diperoleh  nilai  IC 50 164,44ppm,  sehingga tergolong  antioksidan  lemah.  Widianingsih (2016),  menguji  aktivitas  antioksidan  ekstrak metanol buah naga merah ( Hylocereus polyrhizy ) hasil  maserasi  dan  dipekatkan  dengan  kering angin  diperoleh  nilai  IC 50 67,42  ppm,  sehingga tergolong antioksidan kuat.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian,  maka  dapat disimpulkan bahwa ekstrak metanol biji kesumba keling  mengandung  senyawa  flavonoid  dan memiliki  aktivitas  antioksidan  yang  ditunjukkan dengan  nilai  IC 50 sebesar  69,425  ppm,  sehingga tergolong sebagai antioksidan kuat.

## DAFTAR PUSTAKA
Alhabsyi, D. F., Suryanto, E., dan Wewengkang, D.  S.,  2014,  Aktivitas  Antioksidan  dan Tabir Surya pada Ekstrak Kulit Buah Pisang Goroh  ( Musa  acuminate  L ), Pharmacon  J. Ilmiah Farmasi , 3(2), 107-114.
Burda,  S.,  dan  Oleszek,  W.,  2001,  Antioxidant and  Antiradical  Activities  of  Flavonoids, J . Agric. and Food Chem ., 49(6), 2774-2779.
Conde,  E.,  Cadahia,  M.  C.,  Vallejo,  G.,  Simon, B. E. D., dan Adrados, J. R. G., 1997, Low Molecular  Weight  Polyphenol  in  Cork  of Quercus  suber , J . Agric.  and  Food  Chem ., 45(7), 2695-2700.
Gardjito  M.,  2013, Bumbu,  Penyedap,  dan Penyerta Masakan Indonesia , PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Harbone  J.  B.,  2006, Metode  Fitokimia: Penuntun  Cara  Modern  Menganalisis Tumbuhan, Terjemahan dari: Phytochemical Method , Penerjemah; Padmawinata K., Soediro I., ITB, Bandung.
Mahardika,  R.,  Roanisca,  O.,  2018,  Aktivitas Antioksidan  dan  Fitokimia  dari  Ekstrak Etil  Asetat  Pucuk  Idat  (Cratoxylum glaucum). Indo.  J.  Chem.  Res .,  5(2),  69- 74.
Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical  Diphenylpicrylhydrazil  (DPPH)  for Estimating  Antioxidant  Activity, J.  Sci. Technol. , 26(2), 211–219.
Mira  E.,  Anggraini  D.,  Sukmayani  P.,  2013, Formulasi  Sediaan  Pewarna  Bibir  dari Ekstrak  Etanol  Biji  Buah  Kesumba  Keling
( Bixa orellana L ), Jurnal Scientia , 3(1), 29- 34.
Mulyani,  W.,  Idiawati,  N.,  dan  Gusrizal,  2013, Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  n-Heksana, Etil  Asetat,  dan  Metanol  Kulit  Buah  Jeruk Sambal  ( Citrus  microcarpa Bunge), Jurnal Kimia Khatulistiwa , 2(2), 90-94.
Nafisah,  M.,  Tukiran,  Suyanto,  Hidayati,  N.,
2017,  Skrining  Fitokimia  dan  Analisis Kromatografi  Lapis  Ekstrak  Tanaman Patikan  Kebo  ( Euphorbiae  hirta L), Medicamento , 3(2), 61-70.
Prakash, A.,  2001, Antioxidant Activity, Medallion Laboratories: Analytical Progress , 19(2), 1-4. Pujilestari  T.,  2014,  Pengaruh  Ekstraksi  Zat
Warna Alam dan Fiksasi terhadap Ketahanan  Luntur  Warna  pada  Kain  Batik Katun, Dinamika  Kerajinan  dan  Batik,
31(1), 31-40.
Purwaningsih,  D.,  2013,  Pemanfaatan  Biji Tanaman  Kesumba  ( Bixa  orellana L) sebagai  Pewarna  Alami  dan  Antioksidan (Vitamin  C)  untuk  Pembuatan  Kue  Bolu dari  Berbagai  Macam  Tepung, Skripsi, Fakultas  Keguruan  dan  Ilmu  Pendidikan, Universitas Muhammadiyah Surakarta,
Solo. Rustiah,  W.,  Umriani,  N.,  2018,  Uji  Aktivitas Antioksidan  Pada  Ekstrak  Buah  Kawista (Limonia Acidissima) Menggunakan Spektrofotometer  UV-Vis., Indo.  J.  Chem. Res ., 6(1), 22-25.
Sadikin,  M.,  2008,  Radikal  Bebas  Harus Dikendalikan, Media Indonesia , 27 Februari 2008, hal. 17.
Suhaling,  S.,  2010,  Uji  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak Metanol Kacang Merah ( Phaseolus vulgaris L)  dengan  Metode  DPPH, Skripsi , Fakultas  Kedokteran  dan  Ilmu  Kesehatan,
Universitas Islam Negeri Alauddin, Makassar.
Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, H., 2011, Phytochemical Screening and Extraction: A Review, Internationale Pharmaceutica Scienciea , 1(1), 96-106.
Widianingsih,  M.,  2016,  Aktivitas  Antioksidan
Ekstrak Metanol Buah Naga Merah ( Hylocereus  polyrhizy (F.A.C.  Weber) Britton  &  Rose)  Hasil  Maserasi  dan dipekatkan  dengan  Kering  Angin, Jurnal Wiyati , 3,(2), 146-150.