* Staf Pengajar Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya, Jl. Raya Palembang-Prabumulih Km 32 Inderalaya Sumatera Selatan.
** Staf Pengajar Departemen Teknologi Hasil Perikanan, FPI K- IPB.
*** Staf pengajar  Departemen Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB
65
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan

## KARAKTERISASI PROTEASE DARI BAKTERI Aeromonas hydrophila
Ace Baehaki*, Tati Nurhayati**,   Maggy T. Suhartono ***

## Abstract
In  the  last  decade,  a  concern  on  protease  as  medicinal  target  for  overcoming    bacterial  and  viral diseases has been rapidly increased because of the obvious involvement of this enzyme in the molecular of the diseases  mechanism.  The purpose of this research was to characterize proteases from fish patogenic bacteria Aeromonas  hydrophila .  The  bacteria  were  grown  in  media    containing  triptone  1%,  NaCl  1%  and  Yeast extract  0,5%.    The  optimum  production  time  of A.hydrophila was  48  h,    the  optimum  pH  was  7,5,    the optimum  temperature    was  50 o C.  Study  on  the  effect  of  metals  ion  and  spesific  inhibitors  indicated  that protease from A. hydrophila was serin metaloprotease.
Key words  :  Protease, characterization, pathogenic bacteria

## PENDAHULUAN
Bakteri  patogen  menghasilkan  berbagai  enzim  yang  pada  dasarnya  tidak  toksik tetapi  berperan  penting  dalam  proses  infeksi.    Beberapa  bakteri  patogen    memproduksi enzim hidrolitik seperti  protease dan hialuronidase, yang mendegradasi  komponen matrik ekstraseluler  sehingga  dapat  merusak  struktur  jaringan  inang.    Enzim  hidrolitik  ini digunakan  oleh  bakteri  untuk  memperoleh  sumber  karbon  dan  energi  dengan menghancurkan polimer inang menjadi gula sederhana dan asam amino (Salyers dan Whitt, 1994).
Genus Aeromonas mempunyai  habitat  di  lingkungan  perairan  tawar.    Keberadaan Aeromonas di suatu perairan erat hubungannya dengan jumlah kandungan senyawa organik di  perairan  atau  sedimen  dasar.    Bakteri  ini  diakui  sebagai  patogen  pada  hewan  aquatik berdarah dingin (Bullock et al . 1971).
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin

## Teknologi  Hasil  Perikanan
Infeksi  bakteri Aeromonas bersifat  sekunder  yaitu  bakteri  akan  masuk  ke  dalam tubuh  ikan  jika  ada  kerusakan  jaringan  yang  disebabkan  oleh  kerusakan  fisik    atau kerusakan    akibat    serangan    virus      atau        mikroorganisme  lainnya    (Angka,  1990). Nabib et al (1989), menyatakan bahwa Aeromonas sp merupakan penyerang sekunder yang memperparah keadaan organisme.
Sifat  patogen Aeromonas yang dikenal  sebagai patogen oportunistik pada  manusia dan    ikan,  melibatkan      beberapa    enzim    ekstraseluler    yang        dilaporkan  berkolerasi dengan  mekanisme  infeksi  dan  invasi  bakteri  tersebut  (Rao et  al .,  1998).    Keterlibatan enzim  bakteri  patogen  ini  dalam  mekanisme  molekuler  timbulnya  berbagai  penyakit memungkinkan  untuk  mencari  dan  mendesain  inhibitor  protease  dalam  rangka  mencari peluang  penemuan  obat  yang  berhubungan  dengan  penyakit  tersebut.    Potensi  yang  besar pada mikroba dan sumber hayati lainnya sebagai penghasil inhibitor protease menyebabkan para peneliti mengkaji aspek tersebut.  Dalam upaya pencarian/penapisan inhibitor protease tersebut, maka informasi karakteristik protease sebagai target menjadi sangat penting.  Oleh karena  itu    perlu  penelitian  tentang    produksi,  pemurnian  dan  karakteristik  dari  protease A. hydrophila .

## METODOLOGI  PENELITIAN

## Bahan dan Alat
Bahan  utama  yang  diperlukan  adalah  isolat  bakteri A.  hydrophila yang  diperoleh dari  Departemen  Budidaya  Perairan  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan  Institut Pertanian Bogor. Bahan-bahan  lain  yang digunakan antara  lain adalah  media-media  yang diperlukan  untuk  menumbuhkan  dan  pengayaan  bakteri  berturut-turut  adalah skim  milk agar (SMA) dan luria broth (LB).
Alat-alat  yang  digunakan  terdiri  dari    alat  sentrifugasi,  inkubator,  effendorf, spektrofotometer dan kromatografi kolom.
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  terdiri  dari  beberapa  tahap,  meliputi    produksi  protease  bakteri patogen,  karakterisasi  ekstrak  kasar  enzim  protease,  pengendapan  ekstrak  kasar  enzim protease  dengan  ammonium  sulfat  dan  penentuan  berat  molekul  enzim  protease  dengan SDS-PAGE dan Zimogram.  Diagram alir kegiatan penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1.  Diagram alir kegiatan penelitian

## Penentuan waktu produksi enzim protease A. hydrophila
Proses  diawali  dengan  menumbuhkan A.  hydrophila selama  8  jam  (optical  density 0,8)  dalam  medium  luria  bertani  broth  (LB)  pada  suhu  37 o C,  120  rpm..    Sebanyak  10% inokulum  tersebut  dipindahkan  ke  dalam  medium    LB  yang  baru  sebagai  media  untuk memproduksi  protease  kemudian  diinkubasi  selama  56  jam,  pada  suhu  37 o C,  120  rpm.
Isolat Aeromonas hydrophila Waktu produksi optimum Enzim ekstrak kasar
Pengendapan dengan
ammonium sulfat
Karakteristik : -  pengaruh pH -  pengaruh suhu
-  pengaruh ion logam
-  pengaruh inhibitor
Dialisis
SDS-PAGE dan Zimogram
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
Setiap  8  jam  dilakukan  pengukuran optical  density (OD),  dan  aktivitas  protease (Modifikasi  Bergmeyer,  1983)  sehingga  diketahui  waktu  yang  tepat  untuk  menghasilkan enzim dengan aktivitas tertinggi.

## Produksi enzim protease A. hydrophila
Produksi  enzim  protease  dilakukan  dengan  menumbuhkan  bakteri  tersebut  dalam media  LB  hingga  OD=0,8.    Selanjutnya  sebanyak  10%  inokulum  tersebut  ditumbuhkan dalam  media  LB  yang  baru  lalu  diinkubasi  dengan  menggunakan  waktu  terpilih,  yaitu waktu yang tepat untuk menghasilkan enzim protease dengan aktivitas tertinggi) pada suhu 37 o C,    120  rpm.    Pemisahan  sel  dilakukan  dengan  sentrifugasi  berkecepatan  3000  rpm selama  15  menit  pada  suhu  4 o C.    Supernatan  yang  mengandung  enzim  diuji  aktivitasnya menggunakan  metode  Bergmeyer  (1983)  pada  media  kasein  Hammarsten  dan  kadar proteinnya  diukur  menurut  metode  Bradford  (1976).    Selanjutnya  supernatan  diendapkan menggunakan ammonium sulfat.

## Pengendapan dengan ammonium sulfat
Pada  tahap  ini  supernatan  diperlakukan  dengan  menambahkan  ammonium  sulfat pada konsentrasi yang berbeda, yaitu 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% dan 90%, kemudian dibiarkan  selama  satu  malam  pada  suhu  rendah  (4 o C).    Endapan  protease  dipisahkan dengan  sentrifugasi 5000 rpm selama 40  menit  lalu dilarutkan dengan  buffer Tris-HCl 10 mM pH 8.   Analisis  yang dilakukan adalah pengukuran aktivitas protease dengan  metode Bergmeyer  (1983) pada substrat kasein hammarsten dan penentuan kadar protein  menurut metode Bradford (1976).
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan

## Karakterisasi  enzim protease ekstrak kasar
Karakterisasi  yang  dilakukan  meliputi  penentuan  pH  optimum,  suhu  optimum, pengaruh ion logam, pengaruh inhibitor spesifik.  Analisis yang dilakukan adalah aktivitas protease dan kadar protein.  Selain  itu dilakukan  penentuan  berat molekul enzim protease dengan SDS-PAGE dan zimogram.  Variasi pH yang digunakan adalah 4, 5, 6, 7, 8 9, dan 10.  Variasi suhu yang digunakan adalah 30 o C, 40 o C, 50 o C, 60 o C dan 70 o C.  Ion logam yang digunakan adalah CaCl 2 , KCl, NaCl, MnCl 2 , CoCl 2 , BaCl 2 , ZnCl 2 , dan FeCl 2 dengan konsentrasi  masing-masing  1  dan  5  mM.    Sedangkan  inhibitor  yang  digunakan  adalah ethylene  diamine  tetraacetic  acid (EDTA)  dan phenyl  methane  sulfonyl  fluoride (PMSF) dengan konsentrasi 1 dan 5 mM.
Penentuan berat molekul dilakukan menggunakan SDS PAGE     (Laemmli, 1970) dengan  konsentrasi  akrilamid  8%  w/v. Running elektroforesis  menggunakan  arus  50  mA serta voltage 100 volt.  Marker yang digunakan Phosphorilase b (97 kD), albumin (66 kD), Ovalbumin  (45  kD),  Carbonic  anhydrase  (30  kD),  Tripsin  inhibitor  (20,1  kD)  dan α - Laktalbumin  (14,4  kD)  (Pharmacia).  Metode  pewarnaan  yang  digunakan  adalah  metode silver staining .
Zimogram dilakukan dengan metode SDS PAGE, hanya pada gel pemisah ditambah dengan substrat kasein hammerstein (modifikasi metode Garnelli-Piperno dan Reich 1978). Renaturasi  dilakukan  merendam  gel  dalam  larutan  Triton  X-100  selama  1  jam,  kemudian dilakukan  inkubasi  dalam  buffer  Tris-Cl  10  mM,  pH  8,  selama  24  jam.  Pewarnaan dilakukan dengan coomassie blue .
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Penentuan Waktu Produksi Protease yang Optimum
Pada tahap ini dilakukan pengukuran OD dan aktivitas protease guna mendapatkan waktu yang optimum. Waktu produksi protease yang optimum protease dapat dilihat  pada Gambar 2.
0 0,5 1 1,5 2 0 8 16 24 36 48 56 Jam ke OD /A k ti v it a s p ro te a s e s p e s if ik ( U /m g ) 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 A k ti v it a s p ro te a s e ( U /m l) Aktivitas Spesifik OD Aktivitas
Gambar  2.  Waktu produksi protease yang optimum A. hydrophila
Protease A.  hydrophila memiliki  waktu  inkubasi  dengan  aktivitas  tertinggi  yaitu pada  inkubasi  selama  48  jam  (0,0524  IU/ml)  dan  aktivitas  protease  spesifik  1,54  U/mg. Protease  diproduksi  seiring  dengan  pertumbuhan  sel  dan  mencapai  aktivitas  maksimum pada fase menjelang stasioner.

## Pengendapan dengan Ammonium Sulfat
Prinsip  pengendapan  dengan  ammonium  sulfat  adalah salting  out yaitu  dengan meningkatkan kekuatan  ion sehingga akan  menyebabkan  molekul air  mengelilingi protein terlepas dan terikat oleh garam (Walker, 1992).
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
Proses pengendapan akan lebih sempurna bila  filtrat enzim yang telah ditambahkan dengan ammonium sulfat dibiarkan semalam pada suhu 4 0 C Endapan yang diperoleh yaitu berupa enzim dan protein lain (Richardson dan Hyslop, 1985).
Berdasarkan Gambar 3 dapat diketahui bahwa  aktivitas tertinggi untuk protease A. hydrophila yaitu pada penambahan ammonium sulfat 70% dengan nilai aktivitas protease 0,0086 U/ml dan aktivitas protease spesifik 2,07.  Dengan demikian, pengendapan dengan ammonium sulfat meningkatkan derajat kemurnian sebanyak 1,3 kali.
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 30 40 50 60 70 80 90 Penambahan Ammonium Sulfat A k ti v it a s P ro te a s e ( IU /m l) Gambar 3.  Pengaruh penambahan ammonium sulfat terhadap aktivitas protease A. hydrophila

## Karakterisasi Protease Ekstrak Kasar
Karakterisasi protease meliputi penentuan suhu optimum, pH optimum, pengaruh penambahan senyawa : kation dan penghambat aktivitas protease, dan penentuan berat molekul.

## Pengaruh pH
Aktivitas enzim  bervariasi dengan adanya perubahan pH.  Diperkirakan perubahan keaktifan enzim akibat perubahan ionisasi pada gugus ionik enzim, pada sisi aktifnya atau
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
sisi lain yang secara tidak langsung mempengaruhi sisi aktif.  Gugus ionik berperan dalam menjaga  konformasi  sisi  aktif  dalam  mengikat  substrat  dan  dalam  mengubah  substrat menjadi produk.  Perubahan ionisasi juga dapat dialami oleh substrat atau kompleks enzim- substrat, yang juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim (Muhtadi et al . 1996).  Pada skala deviasi  pH  yang  besar,  perubahan  pH  akan  mengakibatkan  enzim  mengalami  denaturasi sehubungan  dengan  adanya  gangguan  terhadap  berbagai  interaksi  non  kovalen  yang menjaga kestabilan struktur 3 dimensi enzim (Hames dan Hooper, 2000).
Enzim mempunyai aktivitas maksimum pada kisaran pH yang disebut pH optimum, pada  umumnya  berkisar  antara  pH  4,5  sampai  8,0;  namun  enzim  tertentu  mempunyai kisaran pH  yang sempit.  Di sekitar pH optimum enzim  mempunyai  stabilitas  yang tinggi (Muhtadi et al . 1996).
0 20 40 60 80 100 120 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH A k ti v it a s re la ti f (% )
Gambar 4. Pengaruh pH terhadap aktivitas protease A. hydrophila
Protease A.  hydrophila mempunyai  pH  optimum  7,5  (Gambar  4).    pH  optimum enzim A.  hydrophila menurut  Esteve  dan  Birbeck  (2004)  adalah  8.    pH  optimum  akan tercapai bila terjadi kesesuaian konformasi antara sisi katalitik enzim dengan substrat.  Hal ini  dipengaruhi  oleh  pK  dari  gugus  yang  terionisasi  pada  sisi  aktif  enzim  yang  berperan
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
mengikat substrat, pK gugus molekul substrat yang terikat anzim dan pK gugus fungsional enzim yang bertanggung jawab terhadap aktivitas katalitik (Thenawidjaja, 1988).

## Pengaruh suhu
Pada  umumnya  setiap  enzim  memiliki  aktivitas  maksimum  pada  suhu  tertentu, aktivitas enzim akan semakin  meningkat dengan bertambahnya suhu.  Tetapi setelah suhu optimum tercapai, maka kenaikan suhu menyebabkan aktivitas enzim menurun.
Hasil  pengukuran  aktivitas  enzim  pada  berbagai  suhu  seperti  terlihat  pada Gambar 5.  Berdasarkan Gambar 5 dapat diketahui bahwa aktivitas tertinggi pada protease A. hydrophila pada suhu inkubasi 50 o C.
0 20 40 60 80 100 120 30 40 50 60 70 Suhu (oC) A k ti v it a s p ro te a s e re la ti f (% )
Gambar 5. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease A. hydrophila
Suhu mempengaruhi laju reaksi katalisis enzim dengan dua cara.  Pertama, kenaikan suhu  akan  meningkatkan  energi  molekul  substrat  dan  pada  akhirnya  meningkatkan  laju reaksi enzim.  Peningkatan suhu juga berpengaruh terhadap perubahan konformasi substrat sehingga  sisi  aktif  substrat  mengalami  hambatan  untuk  memasuki  sisi  aktif  enzim  dan menyebabkan  turunnya  aktivitas  enzim.    Kedua,  peningkatan  energi  termal  molekul  yang membentuk  struktur  protein  enzim  itu  sendiri  akan  menyebabkan  rusaknya  interaksi-
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
interaksi non kovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik dan interaksi elektrostatik)  yang menjaga struktur 3 dimensi enzim secara bersama-sama sehingga enzim mengalami  denaturasi.    Denaturasi  menyebabkan  struktur  lipatan  enzim  membuka  pada bagian  permukaannya  sehingga  sisi  aktif  enzim  berubah  dan  terjadi  penurunan  aktivitas enzim (Hames dan Hooper, 2000).
Pada  suhu  yang  lebih  rendah  dari  suhu  optimum,  aktivitas  enzim  juga  rendah,  hal ini disebabkan karena rendahnya energi aktivasi yang tersedia.  Energi tersebut dibutuhkan untuk  menciptakan kondisi tingkat kompleks aktif,  baik dari  molekul enzim  atau  molekul substrat.

## Pengaruh Ion logam
Beberapa  enzim  membutuhkan  ion  logam  sebagai  kofaktor  untuk  mendukung efisiensi katalitik enzim.   Logam tersebut membantu reaksi katalitik dengan cara mengikat substrat  pada  sisi  pemotongan.    Selain  berperan  dalam  pengikatan  antara  enzim  dengan substrat,  beberapa  logam  juga  dapat  mengikat  enzim  secara  langsung  untuk  menstabilkan konformasi aktifnya atau menginduksi formasi situs pengikatan atau situs aktif suatu enzim (Devlin, 1982).
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 K on tro l N aC l K C l C aC l2 M nC l2 C oC l2 Zn C l2 B aC l2 Fe C l2 Ion logam A k ti v it a s p ro te a s e ( U /m l) 1 mM 5 mM
Gambar 6. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas protease A. hydrophila
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
Berdasarkan  Gambar  6  dapat  diketahui  bahwa  logam  yang  bertindak  sebagai aktivator  adalah  Ca + (1  mM)  dan  Zn 2+ (5  mM),  sedangkan  yang  berperan  sebagai penghambat adalah Na + , K + , Mn 2+ Co 2+ (1 dan 5 mM)  dan Fe 3+ (1 mM).

## Pengaruh inhibitor spesifik
Protease  memiliki  kemampuan  menghirolisis  substrat,  maka Nomen  Clature Commite  of  International  Union  of  Biochemistry  and  Moleculer  Biology menggolongkan enzim  ke  dalam  hidrolase.    Sedangkan  para  ahli  menggolongkan  protease  berbeda-beda. Berdasarkan  mekanisme  reaksi  yang  dikatalisis,  endopeptidase  dapat  dikelompokkan menjadi empat yaitu protease serin, protease aspartat, protease sistein, dan protease logam.
Dalam  penelitian  ini  penggolongan  protease  hasil  produksi  dilakukan  dengan  cara mereaksikan dengan senyawa-senyawa inhibitor atau aktivator spesifik, seperti PMSF yang merupakan  inhibitor  spesifik  untuk  protese  serin  dengan  mengubah  pada  sisi  aktif  enzim menjadi derivat phenyl methyl sulfonyl dan EDTA yang merupakan senyawa pengkelat ion logam.
Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa PMSF dan EDTA sudah menghambat 100% aktivitas protease A. hydrophila mulai konsentrasi rendah     (1 mM).  Oleh karena itu protease A. hydrophila dapat digolongkan sebagai protease serin metaloprotease.
Penelitian  lain  yang  dilakukan  pada  aminopeptidase  dari Aeromonas  caviae T-64 menunjukkan  enzim  ini  dihambat  oleh  o-phenanthrolin  dan  EDTA,  sehingga  hasil  ini mengindikasikan sebagai metaloenzim (Noboru et al ., 1997).

## Penentuan berat molekul
Penentuan  berat  molekul  dilakukan  terhadap  protease A.  hydrophila ekstrak  kasar dan  hasil  pengendapan  menggunakan  ammonium  sulfat  dengan  teknik  SDS-PAGE.
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
Melalui  metode  ini  molekul  protein,  akan  terpisah  berdasarkan  berat  molekul.    Hasil analisis menggunakan SDS PAGE dan zymogam dapat dilihat pada Gambar 7.
M     1                  1
A
B
Gambar 7.  Hasil  SDS silver  staining (A)  dan  zimogram  (B)  aktivitas  protease ekstrak  kasar    protease A.  hydrophylla (M=Marker,    1  = A. hydrophylla )
Penentuan berat molekul ditentukan berdasarkan kurva standar dengan persamaan Y=  1,9551-1,068X  dimana  Y=  log  berat  molekul  marker  (kDa),  sedangkan  X=  mobilitas relatif  protein  (cm).    Berdasarkan  analisa  tersebut  diketahui  bahwa  ekstrak  kasar  pada protease A.  hydrophila didapatkan  4  pita  yaitu  51,8  kD,  35  kD,  26,7  kD  dan  19,8  kD (Gambar 7A).
Pada penelitian ini juga dilakukan zimogram untuk mengetahui berat molekul yang berperan  sebagai  protease.    Zimogram  dilakukan  dengan  menggunakan  substrat  kasein. Hasil  zimogram  (Gambar  7B)  menunjukkan A.  hydrophila memiliki  berat  molekul  yaitu 35 kD.
14,4 KDa 97,0 KDa 45,0 KDa 30,0 KDa
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
Hasil  SDS  PAGE  untuk  protease  hasil  pengendapan  dengan  ammonium  sulfat terdapat  pada  Gambar  8.    Penentuan  berat  molekul  ditentukan  berdasarkan  kurva  standar dengan  persamaan  Y=  2,0595-1,1297X  dimana  Y=  log  berat  molekul  marker  (kDa), sedangkan X= mobilitas relatif protein (cm).  Berdasarkan analisa tersebut diketahui bahwa ekstrak kasar pada protease A. hydrophila didapatkan 8 pita yaitu 81,7 kD, 46,2kD, 32 kD, 17,1 kD, 14,8 kD, 12,3 kD,    11,2 kD dan 10,2 kD (Gambar 8A).

## M           1                    1
A
B
Gambar 8. Hasil SDS silver (A) dan Zimogram (B) aktivitas Protease A. hydrophila setelah Pengendapan (M=Marker,  1= A. hydrophila ).
Zimogram  hasil  pengendapan  ammonium  sulfat  (Gambar  8B)  menunjukkan protease A.  hydrophila memiliki  1  pita  yang  berukuran  35  kD.  Penelitian  lain  yang berhubungan dengan protease A. hydrophila adalah penelitian Esteve dan Birbeck (2004) dimana protease utama yang dipisahkan dari kultur supernatan A. hydrophila E063 dengan iso elektroforesis adalah protease serin dengan berat molekul 68 kD, pita protein yang lain (60,  44  dan  31  kD)  memperlihatkan  metaloprotease  termostabil.  Sementara  itu  penelitian
14,4 KDa 30,0 KDa 45,0 KDa 97,0 KDa 20,1 KDa
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
Noboru et  al. (1997)  aminopeptidase  dari A.  caviae T-64  dengan  menggunakan  MALDI- TOF mass Spectrometry dan SDS-PAGE masing-masing berukuran 29,5 dan  31 kD.

## KESIMPULAN
Bakteri A.  hydrophila merupakan  bakteri  patogen  yang  memproduksi  protease dengan  waktu  produksi  optimum  48  jam.    Pengendapan  dengan  ammonium  sulfat menunjukkan    protease A.  hydrophila mempunyai  aktivitas  tertinggi  pada  pengendapan ammonium  sulfat  70%.  pH  optimum  bakteri  ini  adalah 7,5,    suhu  optimum  50 o C  dan digolongkan  serin  metaloprotease.  Analisa  berat molekul  dengan  zimogram  menunjukkan bahwa protease tersebut memiliki berat molekul sekitar 35 kD.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  Direktur  Pembinaan  Penelitian  dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Dikti yang telah mengusahakan dana untuk penelitian ini melalui  HIBAH  BERSAING  XI  atas  nama  Tati  Nurhayati  dan  Maggy  T.  Suhartono. Ucapan  terima  kasih  juga  penulis  ucapkan  kepada  Lembaga  Penelitian  IPB  yang memungkinkan penelitian ini dapat dilaksanakan.

## DAFTAR PUSTAKA
Angka  SL,  1990.    Penyakit  ikan  akibat  bakteri.    Balai  Penataran  dan  Latihan  Pertanian (BPLP) Bogor. 18 hal.
Bergmeyer HU, J Bergmeyer ,  dan M Gra β l. 1983.  Methods of Enzymatic Analysis.  Vol 2. Weinheim : Verlag Chemie. Halm 1007-1009.
Bullock GL, DA Conroy, dan SF Sniezko. 1971.  Bacterial disease of  Fish, Book 2A.  In Sniezko and Axelord (Eds)  Disease Fish.  T.F.H.  Publisation. England.
Vol VIII No. II Tahun 2004
Buletin Teknologi  Hasil  Perikanan
Esteve  C  dan  Birbeck  TH.  2004.    Secretion  of  haemolysins  and  proteases  by Aeromonas hydrophila EO63:  separation  and  characterization  of  the  serine  protease  (caseinase) and the metalloprotease (elastase). J Appl Microbiol. 96:994-1001.
Devlin  TM.  1982.    Textbook  of  Biochemistry  with  clinical  correlation.    John  Wiley  and Sons.  Canada.
Hames  BD  dan  Hooper  NM.  2000.    Biochemistry:  The  Instant  Notes.    Ed.ke-2. Hongkong:Springer-Verlag.
Granelli-Pipemo  A  dan    Reich  E.  1978.    A  study  of  protease  and  protease-inhibitor complexes in biological fluids.  J. Exp. Med. 148:223-234.
Laemmli  UK.  1970.    Cleavage  of  structural  protein  during  the  assembly  of  the  heat  of bacteriophag T4.  Nature 227:680-685.
Muhtadi  D,  Palupi  NS  dan  Astawan  M.  1996.    Enzim  dalam  Pangan.  PAU  Pangan  dan Gizi.  Institut Pertanian Bogor.  Bogor.
Nabib R, Pasaribu H dan Fachriyan. 1989.  Patologi dan Penyakit Ikan.  Depdikbud. Ditjen Dikti.  PAU Biotek.  IPB.
Noboru  I,  I  Satoru,  T  Tadayuki,  O  Kiyoshi  dan  H  Kiyoshy.  1997.    Purification  and characterization  of Aeromonas  caviae aminopeptidase  prossessing  debittering activity.  J. of Agri and Food Chem. 45:4897-4902.
Rao  MM,  AM  Tanksale,  MS  Gatge,  dan  VV  Desphande.  1998.    Molecular  and biotechnological  aspects  of  microbial  proteases.    Microbiol.  and  Mol.  Biol.  Rev. 62:597-635.
Richardson  T,  dan  DB  Hyslop.  1998.    Enzyme. Dalam O.R.  Fennema  (Ed).    Food Chemistry.  Mac Kerel Bekker, Inc.  New York.
Salyers  AA,  dan  DD  Whitt.  1994.    Bacterial  Pathogenesis,  A  Molecular  Approach. Departement of Microbiology.  University of Illinois. ASM Press, Washington D.C.
Thenawijaya  M. 1988.  Dasar-dasar Biokimia.  Jilid I, Penerbit Erlangga.  Jakarta