## OPTIMIZATION THE GROWTH OF PROTEOLYTIC BACTERIA
Bacillus toyonensis AT DIFFERENT SALINITY AND

## CONCENTRATION OF TOFU WASTEWATER
Dewi Asmiati Oktavia 1 , Nursyirwani 1* , Dessy Yoswaty 1
1 Department of  Marine Science, Faculty of Fisheries and Marine, Universitas Riau Kampus Bina Widya KM. 12,5, Simpang Baru, Kec. Tampan, Kota Pekanbaru, Riau 28293
* nursyirwani@lecturer.unri.ac.id

## ABSTRACT
Proteolythic bacteria, including Bacillus toyonensis, have potencial to be used in feed industry  and  in  processing  of  industrial  waste.  Cultivation  of  this  bacteria  requires appropriate  enviromental  condition  and  substrate  for  the  growth.  The  objective  of  this research was to observe the growth of B. toyonensis at different salinity and tofu wastewater concentration.  This  experimental  research  used  completely  randomized  design  consisted  of two  factors.  Those  were  salinity  (0‰,  15‰,  dan  30‰)  and  different  concentrations  of  tofu wastewater  (8%,  10%,  and  12%).  Bacterial  cell  growth  was  observed  by  the spectrophotometric  method  and  total  plate  count  (TPC)  method.  The  bacterial  cell  growth was  observed  at  0,  24,  48,  72  and  96  hours-incubation.  The  results  indicated  that  the  best medium for the growth B. toyonensis was in tofu wastewater concentration of 12% at salinity of 15‰. The optimum growth occurred at 48 hours-incubation.
Keywords: Optimization,  Proteolytic  Bacteria, Bacillus  toyonensis ,  Salinity,  Tofu Wastewater.

## I. PENDAHULUAN
Bakteri  proteolitik  adalah  kelompok bakteri  yang  mampu  memproduksi  enzim protease secara ekstraseluler. Enzim tersebut  merupakan  enzim  yang  dapat mendegradasi  protein  yang  diproduksi  di dalam  sel  dan  dilepaskan  keluar  sel. Bacillus merupakan  salah  satu  genus bakteri  proteolitik  yang  telah  banyak digunakan dalam berbagai industri, bioteknologi dan lingkungan.
Dua  sifat  utama  yang  membedakan Bacillus dari  jenis  bakteri  lain  adalah kemampuannya hidup secara aerob (meskipun  ada  yang  bersifat  fakultatif anaerob).  Dari  sifat  biokimia,  kebanyakan jenis  dari Bacillus mampu  memproduksi enzim  katalase  [1].  Aktivitas  proteolitik bakteri Bacillus ,  sebagaimana Proteus , Pseudomonas dan Staphylococcus dijumpai
pada  proses  pengomposan  [2].  Bakteri proteolitik  dapat  tumbuh  pada  kondisi  pH antara  2,5  sampai  8,5  dan  dapat  bertahan pada salinitas 35 ppt [3].
Bacillus mempunyai kemampuan untuk  menghasilkan  senyawa  antibakteri, bakteriosin , dan senyawa kimia antimikroba  lainnya  seperti bacitracin , pumulin , gramicidin , laterosporin dan tyrocidine ,  yang  secara  efektif  menentang bakteri  Gram  positif,  serta colistin dan polymyxin yang  berfungsi  untuk  melawan bakteri Gram negatif [4].
Bacillus  toyonensis merupakan  salah satu  genus Bacillus yang  telah  dijumpai  di berbagai  lingkungan  seperti  dari  zona neritik  Laut  Arabian  [5],  sedimen  laut  di Eastern Cape, Afrika Selatan  [6], dan pada sedimen  laut  dalam  di  Terusan  Okinawa Selatan  [7].  Jenis  bakteri  ini  juga  telah
dijumpai  pada  sedimen  mangrove  di Stasiun  Kelautan  Dumai,  Riau  [8-9], namun  belum  diketahui  kondisi  optimal pertumbuhannya.
Bacillus seperti  mikroorganisme  lain memerlukan  nutrisi  atau  substrat  dan kondisi  yang  sesuai  untuk  pertumbuhan. Salah satu sumber substrat yang diperlukan untuk  pertumbuhan  bakteri  adalah  limbah cair  tahu.  Setiap  kilogram  kedelai  akan menghasilkan  limbah  cair  berkisar  antara 1,5–2  L.  Limbah tahu memiliki kandungan organik  yaitu  protein  yang  tinggi  (40%- 50%),  karbohidrat  (25%-50%),  dan  lemak (10%). Oleh karena bahan organik tersebut masih  dalam  bentuk  senyawa  kompleks, sehingga  sulit  untuk  didegradasi  oleh organisme tanah dan menyebabkan pencemaran air dan tanah. Salah satu upaya yang  dilakukan  dalam  penanganan  limbah cair  tahu  adalah  dengan  memanfaatkannya sebagai  substrat  isolasi  bakteri  proteolitik [10]. [11] menemukan bahwa pertumbuhan Bacillus terbaik adalah dengan menggunakan  media  limbah  cair  tahu ditambah dengan susu skim.
Dampak  positif  dari  industri  tahu adalah  dapat  meningkatkan  perekonomian masyarakat.  Namun,  industri  tahu  dapat menimbulkan  dampak  negatif,  dimana limbah  cair  tahu  dapat  mengganggu lingkungan,  khususnya  kualitas  dan  biota perairan.  Untuk  mengatasi  permasalahan permasalahan  tersebut,  dapat  dilakukan dengan  memanfaatkan  mikroorganisme pengurai seperti bakteri proteolitik.
Salah  satu  faktor  lingkungan  yang dapat  mempengaruhi  pertumbuhan  bakteri dari  lingkungan  laut  adalah  salinitas. Beberapa  penelitian  terdahulu  melaporkan pertumbuhan bakteri pada kisaran 0-20 ppt [12], menunjukkan pertumbuhan lebih baik pada  kadar  garam  9%  daripada  3%  [13]. Oleh  karena  itu  penelitian  ini  bertujuan untuk  mengetahui  pertumbuhan  bakteri proteolitik ( B. toyonensis ) pada konsentrasi limbah cair tahu.

## 2.      METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  telah  dilaksanakan  dari bulan  Maret–Mei  2021.  Uji  optimasi pertumbuhan  bakteri  adanya  pengaruh salinitas dan substrat terhadap pertumbuhan B.toyonensis dilakukan  di  Laboratorium Mikrobiologi  Laut  Fakultas  Perikanan  dan Kelautan Universitas Riau.

## Metode Penelitian
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode eksperimen di laboratorium, yakni mengamati
pertumbuhan B.  toyonensis pada  salinitas dan  substrat  berbeda.  Penelitian  ini dilaksanakan  dengan  Rancangan  Acak Lengkap (RAL) faktorial dua faktor. Faktor pertama  adalah  limbah  cair  tahu  dengan konsentrasi  berbeda  (8%,  10  %  dan  12%), dan  faktor  kedua  adalah  salinitas  berbeda (0‰,  15‰  dan  30‰).  Isolat  bakteri  yang digunakan  yaitu B.  toyonensis strain  B.S. SP  1.7  yang  diperoleh  dari  hasil  penelitian sebelumnya  [8].  Sebagai  kontrol  bakteri ditumbuhkan  pada  medium  TSB  pada salinitas 0‰. Ulangan perlakuan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan.

## Prosedur Penelitian Sterilisasi Alat
Peralatan  yang  digunakan  seperti tabung reaksi, tabung erlenmeyer dibungkus dengan aluminium foil, sedangkan  cawan  petri  dibungkus  dengan kertas  padi  lalu  dimasukkan  ke  dalam keranjang  yang  telah  disiapkan.  Kemudian keranjang  dimasukkan  kedalam  autoklaf untuk  disterilisasi  pada  suhu  121°C  dan tekanan  2  atm  selama  15  menit.  Setelah dingin  dan  kering  semua  peralatan  siap digunakan.

## Penyiapan Media Kultur
Sebanyak  10  g nutrient  agar (NA) dilarutkan  dalam  500  mL  akuades  dan dihomogenkan  diatas hot  plate dengan stirrer ,  lalu  medium  NA  disterilisasi  pada
suhu 121°C selama 15 menit. Setelah agak dingin  sebanyak  15-20  mL  media  NA dituangkan ke dalam cawan petri steril.

## Penyediaan Biakan Murni
Biakan  murni B.  toyonensis berasal dari  stok  laboratorium  mikrobiologi  laut Universitas  Riau  dibuat  sub  kultur  pada media  NA  dan  diinkubasi  pada  suhu  37 o C selama  ±24  jam.  Biakan  ini  nantinya dijadikan  sebagai  stok  kultur  dan  disimpan dalam lemari pendingin.

## Penyediaan Larutan McFarland
Pembuatan larutan McFarland bertujuan untuk penyetaraan jumlah bakteri yang  akan  digunakan  pada  media  uji pertumbuhan.  Larutan  McFarland  dibuat dengan  menggunakan  larutan  BaCl 2 1% dan  H 2 SO 4 1%  di  dalam  tabung  reaksi, ditutup  dengan  aluminium  foil,  divorteks dan  disimpan  pada  suhu  ruang  [14]. Suspensi  bakteri  yang  digunakan  pada penelitian  ini,  yaitu  1  McFarland  yaitu setara dengan 1,5 x 10 8 CFU/mL [15].

## Penyiapan Media Uji Pertumbuhan
Media  yang  digunakan  limbah  cair tahu  yang  didapatkan  di  pabrik  industri rumah tangga pembuatan tahu  yang berada di  Suka  Karya,  Kecamatan  Tampan  Kota Pekanbaru.  Media kultur bakteri disiapkan dengan volume total masing-masing perlakuan sebanyak 100 mL. Pada perlakuan pertama (A1B1) pada erlenmeyer dimasukkan  limbah  cair  tahu  sebanyak  8 mL  lalu  ditambah  akuades  (salinitas  0‰) sebanyak  82  mL.  Untuk  perlakuan  kedua (A1B2)  sebanyak  8  mL  limbah  cair  tahu ditambah air bersalinitas 15‰ sebanyak 82 mL.  Untuk  perlakuan  ketiga  (A1B3) sebanyak  8  mL  limbah  cair  tahu  ditambah air  bersalinitas  30  ‰.  Prosedur  yang  sama dilakukan  untuk  menyiapkan  perlakuan keempat (A2B1) sampai perlakuan kesembilan  (A3B3).  Semua  media  yang telah disiapkan, kecuali susu skim, disterilisasi  pada  suhu  121 o C  selama  15
menit.  Setelah  dingin  ke  dalam tiap  wadah kultur  ditambahkan  10  mL  larutan  susu skim.  Larutan  susu  skim  dibuat  dengan melarutkan 10 g susu skim di dalam 90 mL akuades, lalu dipasteurisasi pada suhu 67 o C selama  30  menit    di  dalam waterbath shaker .  Kultur  bakteri  dengan  media pertumbuhan  tersebut  diikubasi  pada  suhu 37 o C  di  dalam waterbath  shaker dan penghitungan  jumlah  sel  bakteri  dilakukan pada waktu 0, 24, 48, 72 dan 96 jam.
Kultur Bakteri pada Media Pertumbuhan
Isolat  bakteri B.  toyonensis strain B.S. SP 1.7 diambil dari media NA dengan menggunakan jarum ose, lalu disuspensikan  ke  dalam  10  mL  larutan fisiologis  0,9%  NaCl  secara  aseptis  dan dihomogenkan menggunakan vortex sampai  kekeruhan  suspensi  bakteri  setara dengan  larutan  standar  0,5  McFarland. Kemudian  sebanyak  10  mL  suspensi bakteri  tersebut  dimasukkan  ke  dalam media uji pertumbuhan yang telah disiapkan.  Semua  wadah  kultur  tersebut diletakkan  di  atas Waterbath  shaker pada suhu  37°C  dengan  kecepatan  90  rpm selama  24  jam.  Pengamatan  pertumbuhan bakteri  dilakukan  pada  jam  ke-24,  48,  72 dan 97.

## Perhitungan Jumlah Bakteri
Jumlah  bakteri  pada  masing-masing perlakuan  dihitung  dengan  dua  metode, yaitu  secara  spektrofotometri  dan  dengan hitungan cawan ( Total Plate Count , TPC).

## Metode Spektrofotometri
Metode  ini  berdasarkan  pengukuran kekeruhan  karena  pertumbuhan  bakteri dengan menggunakan. Sampel bakteri pada masing-masing  media  uji  di  ambil  dan dimasukkan  ke  dalam  kuvet.  Kemudian kuvet diletakkan di dalam spektrofotometer dan  diukur  nilai  absorbansinya  pada panjang  gelombang  630  nm.  Prosedur  ini mengikuti  prosedur  yang  dilakukan  oleh
[16]  yang  mengukur  pertumbuhan  bakteri Bacillus sp. menggunakan spektrofotometer dengan  panjang  gelombang  630  nm.  Nilai absorbansi  kemudian  dikonversikan  ke dalam  rumus  regresi  linear  yang  telah didapat  dari  data  kurva  standar  McFarland untuk  mendapatkan  kepadatan  sel  pada media pertumbuhan.
Metode Total Plate Count (TPC) Langkah  pertama  dalam  metode  ini yaitu menyiapkan media PCA ( Plate Count Agar ). Sampel bakteri pada masing-masing media  pertumbuhan  diambil  sebanyak  1 mL, lalu diencerkan di dalam larutan garam fisiologis (0,9 %) sampai pengenceran 10 -5 . Sebanyak  0,1  mL  dari  tiap  pengenceran diambil  dan  diinokulasikan  pada  cawan petri  yang  berisi  media  PCA.  Setelah  rata, semua  cawan  petri  diinkubasi  selama  24 jam.  Koloni  bakteri  yang  tumbuh  pada media  PCA  dihitung  menggunakan colony counter .  Jumlah  koloni  yang  didapat kemudian  dimasukkan  ke  dalam  rumus perhitungan bakteri [17], yaitu:

## Analisis Data
Data  jumlah  bakteri  pada  perlakuan salinitas  dan  substrat  (limbah  cair  tahu) disajikan  dalam  bentuk  tabel  dan  grafik. Kemudian data dijelaskan secara deskriptif. Untuk  melihat  adanya  perbedaan  antar perlakuan, dilakukan uji statistik (ANOVA),  apabila  terdapat  perbedaan yang  nyata  pada  tingkat  kepercayaan  95%, maka  akan  dilanjutkan  dengan  uji  beda nyata  (Newman-Keuls).  Deskripsi  hasil diperoleh didukung dengan referensi penelitian terkait

## 3.  HASIL DAN PEMBAHASAN
Kepadatan Sel Bakteri B.toyonensis Pertumbuhan  dan  jumlah  bakteri B.toyonensis strain  B.S  SP  1.7  dengan metode  spektrofotometri  diperoleh  dari
nilai  absorbansi  dan  setelah  dikonversikan dengan  nilai  absorbansi  kurva  standar  dari larutan  McFarland,  dengan  persamaan regresi  Y=  -0,8524+25,696x.  Rata-rata kepadatan  sel  bakteri  pada  media  uji pertumbuhan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel  1. Rata-Rata  Kepadatan  Sel  Bakteri B.toyonensis Metode Spektro- fotometri Media (%) Waktu Pengukuran (Jam ke-) (×10 8 CFU’s/mL) 0 24 48 72 96 A1B1  1,746   1,752   1,726   1,717   1,708 A1B2 1,762   1,765   1,750   1,723   1,717 A1B3 1,759   1,766   1,745   1,733   1,730 A2B1 1,739   1,777   1,777   1,751   1,731 A2B2 1,756   1,777   1,745   1,727   1,717 A2B3 1,778   1,783   1,764   1,714   1,675 A3B1 1,796   1,799   1,797   1,793   1,792 A3B2 1,790   1,798   1,793 1,779   1,763 A3B3 1,797   1,811 1,816 1,814   1,808 K (+) 0,725   0,949   1,029   1,142   1,123
Keterangan:
A1B1: Media+limbah tahu 8% salinitas 0‰
A1B2: Media+limbah tahu 8% salinitas 15‰ A1B3: Media+ limbah tahu 8% salinitas 30‰ A2B1: Media+limbah tahu 10% salinitas 0‰ A2B2: Media+limbah tahu 10% salinitas 15‰ A2B3: Media+limbah tahu 10% salinitas 30‰ A3B1: Media+limbah tahu 12% salinitas 0‰
A3B2: Media+limbah tahu 12% salinitas 15‰ A3B3: Media+limbah tahu 12% salinitas 30‰ Kontrol (+): TSB salinitas 0‰.
Pada  Tabel  1  dapat  dilihat  bahwa terjadi peningkatan jumlah sel bakteri pada semua  perlakuan.  Pertumbuhan  bakteri optimum  terjadi  pada  jam  ke-24,  kecuali pada perlakuan A3B3 yang terjadi pada jam ke-48  dan  perlakuan  kontrol  terjadi  pada jam  ke-72.  Pada  penelitian  ini  diketahui bahwa  penambahan  limbah  cair  tahu  12% pada  salinitas  30‰  (perlakuan  A3B3) menunjukkan  penambahan  jumlah  bakteri tertinggi (1,816 x 10 8 CFU’s/mL). Hasil penemuan tersebut
menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi  limbah  cair  tahu  pada  media kultur bakteri menyebabkan semakin tinggi kandungan  nutrien  yang  tersedia  bagi
pertumbuhan  bakteri  [18].  Selain  itu, penambahan  susu  skim  sebagai  sumber nutrisi terutama protein juga mempengaruhi pertumbuhan sel secara cepat. Menurut [19] penambahan  konsentrasi  susu  skim  dan maltodekstrin  yang  semakin  tinggi  dapat meningkatkan  viskositas  suatu  cairan. Semakin  tinggi  viskositas  maka  lapisan yang  mengelilingi  bahan  inti  sel  bakteri akan terbentuk lebih cepat, sehingga bahan inti segera terlindungi.
Sumber
mikronutrien yang ditambahkan ke dalam media pertumbuhan seperti Vitamin B12, KH 2 PO 4 dan K 2 HPO 4 . Hasil  penelitian  [20],  menunjukkan  terjadi efek  peningkatan  kepadatan  sel  pada  awal waktu kultivasi karena penambahan sumber P dalam bentuk  KH 2 PO 4 dan K 2 HPO 4, efek yang terjadi pada penambahan garam posfat ini  terjadi  melalui  mekanisme buffering yaitu pengendalian nilai pH.
Salinitas  optimal  untuk  pertumbuhan bakteri  pada  penelitian  ini  adalah  15‰. Pada  salinitas  yang  lebih  tinggi  (30‰)
menyebabkan  terjadinya  penurunan  jumlah sel  bakteri.  Hal  ini  disebabkan  karena peningkatan  kadar  NaCl  berefek  negatif pada  pertumbuhan  sel  bakteri  karena terjadinya  gangguan  pada  membran  sel mikroba  [21].  Di  samping  itu,  salinitas tinggi menyebabkan konsentrasi ion eksternal  meningkat.  Untuk  mencapai kesetimbangan, ion akan memasuki sel dan air  akan  keluar  dari  sel.  Pada  kasus  yang lebih parah, membran sel, organel intraseluler, dan enzim  akan rusak.
Sedangkan  pada  salinitas  menurun,  untuk mencapai  keseimbangan  ion,  air  akan masuk  dalam  sel  untuk  mengurangi konsentrasi  ion,  jika  air  masuk  terlalu banyak sel akan rusak [22].
Pola pertumbuhan bakteri pada media dengan  konsentrasi  limbah  cair  tahu  12% dan  pada  salinitas  30‰,  dibandingkan dengan  pertumbuhan  pada  media  TSB sebagai  kontrol  dapat  dilihat  pada  Gambar 1.
Gambar 1. Grafik pertumbuhan optimum B. toyonensis pada medium limbah cair tahu 12% salinitas 30‰ (A3B3) dan medium TSB.
Gambar 1 terlihat bahwa pertumbuhan  optimum B.  toyonensis pada media  A3B3  dengan  konsentrasi  limbah cair  tahu  12%  dan  salinitas  30‰  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  kontrol  positif (media TSB). Data ini membuktikan bahwa limbah  cair  tahu  12%  dapat  digunakan
sebagai pengganti media untuk menumbuhkan bakteri.
Jumlah Total  Plate  Count (TPC)  Sel B.toyonensis
Hasil perhitungan rata-rata jumlah sel bakteri B.  toyonensis dengan  metode total plate count (TPC) disajikan pada Tabel 2.
7.50 7.60 7.70 7.80 7.90 8.00 8.10 8.20 0 24 48 72 96 A3B3 Kontrol + L og S el /m L
Tabel  2. Jumlah  TPC B.  toyonensis pada
Salinitas  dan  Limbah  Cair   Tahu Berbeda Media (%) Waktu Pengukuran (Jam ke-) (×10 8 CFU’s/mL) 0       24 24 48 72 96 A1B1 0,40  0,65 0,88 0,74   0,74     0,57 A1B2 0,43  0,61 0,99 0,89  0,65 A1B3 0,37  0,65 0,94 0,80  0,61 A2B1 0,46  0,62 1,03 0,62  0,47 A2B2 0,47  0,61 0,97 0,80  0,66 A2B3 0,32  0,80 0,95 0,89  0,73 A3B1 0,34  0,57 1,01 0,82  0,61 A3B2 0,47  0,74 0,86 0,78  0,58 A3B3 0,73  1,24 1,46 1,15  0,93 K (+) 0,58  0,74 1,25 0,88  0,72
Pada  Tabel  2  dapat  dilihat  bahwa peningkatan  jumlah  total  sel  bakteri B.toyonensis juga  terjadi  seiring  dengan meningkatnya  konsentrasi  limbah  cair  tahu sebagai substrat pertumbuhan. Pertambahan jumlah  sel  bakteri  pada  semua  perlakuan terjadi  pada  jam  ke-48.  Pertumbuhan bakteri  optimum  terlihat  pada  perlakuan A3B3  yaitu  pemberian  konsentrasi  limbah cair  tahu  12%  dan  salinitas  30‰  (1,46  × 10 8 CFU’s/mL).  Kemudian  jumlah  bakteri pada  semua  perlakuan  menurun  sampai waktu pengamatan 96 jam.
Pertumbuhan  bakteri B.  toyonensis pada  perlakuan  A3B3  juga  melebihi pertumbuhan  bakteri  pada  medium  TSB sebagai  kontrol  positif.  Hasil  penelitian  ini
sama dengan hasil penelitian yang dilakukan  oleh  [11],  dimana  pertumbuhan terbaik  dijumpai  pada  bakteri  konsorsium yang  dikultur  pada  limbah  cair  tahu konsentrasi 12%.
Pertumbuhan  bakteri  pada  setiap konsentrasi  limbah  cair  tahu  dan  salinitas berbeda  meningkat  menurut  substrat  dan menurun pada salinitas yang tinggi. Hal ini sesuai  dengan  pendapat  [23],  menjelaskan bahwa  kompleks  enzim  dan  substrat  dapat diperoleh  melalui  adanya  kontak  antara enzim  dengan  ketersediaan  substrat  pada sisi  aktif  enzim.  Jika  konsentrasi  substrat rendah maka aktivitas enzim yang dihasilkan  juga  rendah,  sedangkan  jika konsentrasi  substrat  ditingkatkan,  maka hasil  dari  aktivitas  enzim  pun  meningkat. Namun  pada  batas  konsentrasi  substrat tertentu,  seluruh  sisi  aktif  enzim  telah berikatan  dengan  substrat  maka  aktivitas enzim pun dapat menurun.

## 4.      KESIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan  hasil  ini  didapatkan bahwa B.  toyonensis dapat  tumbuh  pada medium  limbah  cair  tahu  pada  salinitas berbeda.  Pertumbuhan  optimum  bakteri terjadi  pada  medium  limbah cair  tahu  12% dan salinitas 15‰ pada jam ke- 48.
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut  tentang  pengaruh  suhu  dan  pH terhadap pertumbuhan B. toyonensis .

## DAFTAR PUSTAKA
1. Doi,  R.H.,  M.  Mcgloughlin.  (1992). Biology  of  Bacilli :  Applications  to  Industry. Butterworth-Hcinemann,  Boston,  London,  Oxford,  Singapore,  Sydney  Toronto, Wellington: 370 Pp.
2. Puspitasari,  F.D.,  M.  Shovitri,  N.D.  Kuswytasari.  (2012).  Isolasi  dan  Karakterisasi Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik . Jurnal Sains dan Seni ITS, 1: 1-4.
3. Marlida,  R.,  M.A.  Suprayudi,  Widanarni,  E.  Harris.  (2014).  Isolation,  Selection  and Application  of  Probiotic  Bacteria  for  Improvement  the  Growth  Performance  of Humpback  Groupers  ( Cromileptes  altivelis ). International  Journal  of  Sciences:  Basic and Applied Research (IJSBAR), 16 (1): 364-379
4. Feliatra.,  I.  Lukistyowati.,  N.  Nursyirwani.,  D.  Melina,  M.  Ramadhani.  (2018). Comparative  Study  Between  Probiotics  Isolated  from  Giant  Freshwater  Prawns  and Giant  Tiger  Prawns  in  Improving  the  Health  of  Nile  Tilapia  ( Oreochromis  nilotius ). IOP Conference Series: Earth and Environmental Science . 216 (012009): 1-8
5. Tallur, P.N., D.B. Sajjan, S.I. Mulla, M.P. Talwar, A. Pragasam, V.M. Nayak. (2016). Characterization of antibiotic resistant and enzyme producing bacterial strains isolated from the Arabian Sea. Biotech . 6 (1): 28. doi: 10.1007/s13205-015-0332-3
6. Okaiyeto,  K.,  U.U.  Nwodo,  L.V.  Mabinya,  A.I.  Okoh.  (2015). Bacillus  toyonensis Strain  AEMREG6,  a  Bacterium  Isolated  from  South  African  Marine  Environment Sediment  Samples  Produces  a  Glycoprotein  Bioflocculant. Molecules 20  (3):  5239– 5259.
7. Luo, J.C.,  Hao,  L., Jian, Z., Zhao, Y.,  Sun,  L. (2021). Characterization of a Deep Sea Bacillus  toyonensis Isolate:  Genomic  and  Pathogenic  Features. Frontier  in  Cellular and Infection Microbiology 11. Article 629116. https://10.3389/fcimb.2021.629116
8. Nursyirwani,  N.,  F.  Feliatra,  A.  Tanjung,  F.  Harjuni.  (2020).  Isolation  of  cellulolytic bacteria  from  mangrove  sediment  in  Dumai  marine  station  riau  and  the  antibacterial activity against pathogens. The 8 th International and National Seminar on Fisheries and Marine  Science. IOP  Conf.  Series:  Earth  and  Environmental  Science 430  (2020) 012012. doi:10.1088/1755-1315/430/1/012012.
9. Nursyirwani, N., J. Samiaji, A. Tanjung, I. Effendi, K.M. Claudia. (2021). Growth and Enzyme  Production  of  Proteolytic  Bacteria  from  Mangrove  Sediment.  The  9 th International and National Seminar on Fisheries and Marine Science. IOP Conf. Series: Earth  and  Environmental  Science 695  (2021)  012044.  doi:10.1088/1755- 1315/695/1/012044.
10. Asril,  M.,  I.  Oktaviani,  S.S.  Leksikowati.  (2019).  Isolasi  Bakteri  Indigineous  dari Limbah  Cair  Tahu  dalam  Mendegradasi  Protein  dan  Melarutkan  Fosfat. Jurnal Teknologi Lingkungan 20(1): 67-72.
11. Nasution,  M.N.,  Feliatra,  I.  Effendi.  (2021).  Growth  Analysis  of  Single  Cell  Protein (PST) Bacteria Bacillus cereus using Different Media. Jurnal Perikanan dan Kealutan, 26(1): 47-53. DOI: http://dx.doi.org/10.31258/jpk.26.1.47-53
12. Arisandi,  A.,  M.K.  Wardani,  K.  Badami,  G.D.  Araninda.  (2017).  Dampak  perbedaan salinitas  terhadap  viabilitas  bakteri Vibrio  fluvialis . Jurnal  Ilmiah  Perikanan  dan Kelautan 9(2): 91-97
13. Wijanarka,  Sudarno,  N.A.  Pratama.  (2017).  Pertumbuhan  bakteri  anaerobic  ammonia oxidation (anammox) pada salinitas 2 dan 9 persen. Jurnal Biologi Papua 9(2): 55-62. 14. Haris,  A.,  Arniati,  S.  Werorilangi.  (2013).  Uji  Antibakteri  Patogen  Ekstrak  Sponge Menggunakan  Metode High  Troughput  Screening (HTS)  dengan  Indikator  MTT  (3 [4,5- dimethylthiazol -2- yl ]-2,5- diphenyltetrazolium  bromide ). Jurusan  Ilmu  Kelautan , FIKP, UNHAS: 1 – 14
15. Rizky, W.D. (2013). Pengaruh Kandungan Protein Tepung Bulu Ayam sebagai Media Pertumbuhan Bakteri Escherichia coli . Skirpsi. Poltekkes Kemenkes Semarang.
16. Imron,  M.F.,  I.F.  Purwanti.  (2016).  Uji  Kemampuan  Bakteri Azotobacter S8  dan Bacillus  subtilis untuk  Menyisihkan Trivalent  Chromium (Cr3+)  pada  Limbah  Cair. Jurnal Teknik ITS 5(1)
17. Tyas,  D.E.,  N.  Widyorini,  A.  Solichin.  (2018).  Perbedaan  Jumlah  Bakteri  dalam Sedimen  pada  Kawasan  Bermangrove  dan  Tidak  Bermangrove  di  Perairan  Desa Bedono, Demak. Journal of Maquares 7(2): 189-196.
18. Lizayana.,  Mudatsir,  Iswadi.  (2016).  Densitas  Bakteri  pada  Limbah  Cair  Pasar Tradisional. Jurnal Ilmiah Mahasiswa Pendidikan Biologi 1(1): 95-106.
19. Triyono,  A.  (2010).  Mempelajari  Pengaruh  Maltodekstrin  dan  Susu  Skim  terhadap Karakteristik Yoghurt Kacang Hijau ( Phaseolus radiatus L .). Seminar Rekayasa Kimia
dan  Proses ,  Jurusan  Teknik  Kimia.  Fakultas  Teknik.  Universitas  Diponegoro. Semarang 20. Hidayati,  A.D.  (2017). Pengaruh  Hasil Reformulasi dengan Penambahan KH 2 PO 4 dan NH 4 Cl pada MHB ( Mycorrhiza Helper Bacteria ) dan Glomus spp . Terhadap Populasi Pratylenchus  Coffeae dan  Pertumbuhan  Bibit  Kopi  serta  Pemanfaatannya  Sebagai Buku Nonteks. Skripsi. Universitas Jember.
21. Gardini, F., M. Martuscelli., M. C. Caruso.,F. Galgano., M. A. Crudele., F. Favati., M. E. Guerzoni, G. Suzzi. (2001). Effects of pH, Temperature and NaCl Concentration on the  Growth  Kinetics,  Proteolytic  Activity  and  Biogenic  Amine  Production  of Enterococcus faecalis . Int. J. Food Microb. 64,105-117
22. Lobban,  C.S.,  P.J.  Harrison.  (1987). Seaweed  Ecology  and  Physiology .  Cambridge University Press.
23. Poedjiadi, A., T.F.M. Supriyanti. (2006). Dasar-Dasar Biokimia . Jakarta: UI Press.