## PENGARUH PEMBERIAN TEPUNG KEDELAI KAYA ISOFLAVON TERHADAP KADAR
MALONALDEHID (MDA), AKTIVITAS SUPEROKSIDA DISMUTASE (SOD) TESTIS DAN PROFIL Cu,Zn-

## SOD TUBULI SEMINIFERI TESTIS TIKUS  JANTAN
[The effects of isoflavone-riched soybean flour on MDA Level, Superoxide  dismutase  (SOD)  activity, and profile of Cu,Zn-superoxide dismutase(Cu,Zn-SOD) in the seminiferous tubules of male rats testes]
Sussi Astuti 1)* ,Deddy Muchtadi 2) , Made Astawan 2) , Bambang Purwantara 3) dan  Tutik Wresdiyati 4)
1) Jurusan Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung, Jl. Prof Sumantri Brojonegoro No. 1 Bandar Lampung 2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB. PO Box 220, Kampus IPB Darmaga Bogor 16002
3) Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi, Fakultas Kedokteran, Hewan, IPB.  Jl. Agatis Kampus IPB Darmaga Bogor 16680 4) Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran, Hewan, IPB.  Jl. Agatis Kampus IPB Darmaga Bogor 16680
Diterima 14 Januari  2009 / Disetujui  29 Desember 2009

## ABSTRACT
The  objectives  of  this  experiment  were  to  evaluate  the  effects  of  isoflavone-riched  soybean  flour  with  different  treatment  level  of isoflavone on MDA level, SOD activity, and profile of Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) spermatogenic cells in the seminiferous tubules of male rat testes. Diet was given as isonitrogen and isocaloric with 10% of dietary protein. Twenty five males of Sprague Dawley rats were divided into five groups and treated  with  isoflavone-riched  soybean  flour  by  oral  administration  with  different  concentrations.  The  treatment  was  done  for  2  months.  The  optimum concentration of isoflavone was 1.5 mg/day and resulted in : decreased level of MDA testes (2.29±0.05 nmol/g), mantained high SOD activity of rat testes (729.4±23.73 U/g), and increased content of Cu,Zn-SOD by immunohistochemical technique on spermatocytes and early spermatids. It was concluded that isoflavone-riched soybean flour diet (1.5 mg/day isoflavone) can prevent the formation of lipid peroxide and improve the antioxidant status of rat testes.
Key  words :   isoflavone - riched   soybean    flour,   lipid  peroxide, SOD  activity, immunohistochemistry

## PENDAHULUAN
Radikal  bebas  dibentuk  oleh  metabolisme  xenobiotik  atau metabolisme  sel  aerob  secara  normal.  Reaktif  oksigen  spesies (ROS) adalah radikal bebas yang berperan penting pada beberapa proses  fisiologis  organ  tubuh.  Pembentukan  ROS  dapat menginduksi peroksidasi lipid yang bersifat sitotoksik akibat inisiasi suatu  reaksi  rantai  ke  dalam  membran,  diikuti  reaksi  propagasi sehingga  secara  keseluruhan  akan  mengakibatkan  kerusakan  sel (Sikka, 2004).
Tubuh  memiliki  sistem  pertahanan  enzimatik  maupun  non enzimatik  untuk  menetralkan  pengaruh  toksik  senyawa  ROS, sehingga ROS hanya terdapat dalam jumlah kecil yang diperlukan untuk menjaga fungsi sel tetap normal. 1 Sistem pertahanan radikal bebas  baik  enzimatik  maupun  non  enzimatik  meliputi  proteksi terhadap  berbagai  kompartemen  sel  antara  lain  mitokondria, retikulum  endoplasma,  peroksisom,  sitoplasma  dan  membran  sel. Pemeliharaan integritas sel tergantung pada keseimbangan antara pembentukan  radikal  bebas  dengan  sistem  pertahanan  radikal bebas.  Kerusakan  sel  ketidakseimbangan  antara  pembentukan ROS  dan  aktivitas  pertahanan  enzim  antioksidan  ( scavenger ). Superoksida  dismutase  (SOD)  dilaporkan  merupakan  garis
1 Korespondensi  penulis :  HP.081272359911 E-mail : irfanaffandi2006@yahoo.com
pertahanan terdepan spermatozoa terhadap aktivasi dan toksisitas senyawa ROS (Alvarez et al ., 1987; Sikka et al ., 1995). Terdapatnya radical  scavenger diduga  akan  membersihkan radikal  bebas  pada  jaringan-jaringan  yang  memproduksi spermatozoa  (Sikka,  2004),  serta  menstimulasi  ekspresi  Cu,Zn- SOD  sehingga  melindungi  sel  dari  serangan  stress  oksidatif  dan mencegah  terbentuknya  produk  peroksidasi  lipid  (Toda  &  Sirataki 1999). Bahan pangan alami yang mengandung antioksidan sebagai scavenger radikal  bebas  dilaporkan  Sikka  (2004)  dapat  menekan proses  oksidasi,  peroksidasi  lipid  dan  kerusakan  sel  spermatozoa mencegah  kondisi  stres  oksidatif,  dan  meningkatkan  status antioksidan.
Kedelai  memiliki  senyawa  bioaktif  isoflavon  (salah  satu golongan  flavonoid)  yang  bersifat  sebagai  antioksidan  (Nijveldt et al .,  2001).  Kedelai  dikenal  sebagai  fitoestrogen  karena  struktur molekul  isoflavon  kedelai  mirip  dengan  struktur  molekul  estrogen. Hal  ini  menyebabkan  isoflavon  kedelai  dapat  berikatan  dengan reseptor  estrogen  (RE),  namun  afinitas  RE  ligan  tersebut  lebih rendah dibanding estrogen endogen (Miksicek,1994). Sel epitel dari jaringan  reproduksi  seperti  kelenjar  susu,  ovari  dan  testis merupakan subyek dari aksi isoflavon (Anderson & Graner, 2000). Aksi  biologis  estrogen  adalah  kemampuannya  untuk  bertindak sebagai  estrogen  agonis  yang  dapat  berikatan  dengan  RE  dan menstimulasi  respon  estrogen,  atau  bertindak  sebagai  estrogen antagonis  yang  dapat  berikatan  dengan  RE  namun  menghambat respon estrogen (Helferich et al .,  2001).
Salah  satu  produk  olahan  kedelai  yang  dapat  digunakan sebagai ingredient dalam bentuk kapsul atau tablet adalah tepung kedelai  kaya  isoflavon.  Tepung  kedelai  ini  mengandung    kadar isoflavon sebesar 3%, dihasilkan dari biji kedelai tanpa proses kimia atau penambahan bahan tambahan pangan, serta mempunyai rasa dan flavour yang disukai  (Indiana Soybean Board, 1998).
American  Dietetic  Association  (ADA)  melaporkan  bahwa konsumsi  pangan  alami  akan  memberikan  pengaruh  positif    bagi kesehatan  apabila  dikonsumsi  secara  teratur  pada  dosis  yang efektif. Oleh karena itu, perlu dilakukan kajian asupan antioksidan alami  (isoflavon)  yang  terkandung  dalam  tepung  kedelai  kaya isoflavon  pada  berbagai  tingkatan  dosis  terhadap  kadar  MDA  dan aktivitas  SOD testis, serta profil  Cu,Zn-SOD pada tubuli  seminiferi testis  melalui  deteksi  secara  imunohistokimia  dengan menggunakan tikus jantan sebagai hewan model.

## METODOLOGI

## Bahan
Bahan  utama  yang  digunakan  dalam  penelitian  adalah  tepung kedelai kaya isoflavon (TKI) dari perusahaan SoyLife Extra ORFFA BELGIUM  NV,  Ambachtsstraat  6-B-1840  LONDERZEEL.  Heksan digunakan  untuk  mengurangi  lemak  pada  TKI  sehingga  diperoleh TKI rendah lemak (TKI-RL) (Astuti et al., 2008). Tikus strain Sprague Dawley (SD) jantan umur 21 hari dari PT Indoanilab  Bogor  digunakan  untuk  studi in  vivo .  Bahan  penyusun ransum  adalah  kasein,  mineral  mix,  vitamin  mix,  minyak  jagung, selulosa, air dan pati jagung/maizena. Analisis kadar malonaldehida (MDA)  testis  menggunakan  fosfat  buffer  saline  (PBS),  HCl,  asam tiobarbiturat  (TBA),  asam  trikloroasetat  (TCA),  BHT,  dan  1,1,3,3- tetraetoksipropana (TEP); aktivitas enzim SOD testis menggunakan SOD  murni  komersial,  xantin,  xantin  oksidase,  sitokrom  C,  buffer fosfat, kloroform dan etanol.
Bahan  kimia  untuk  pembuatan  preparat  jaringan  testis  dan proses pewarnaan secara imunohistokimia antara lain NaCl, larutan fiksatif  bouin,  alkohol,  xylol,  parafin,  neofren,  toluen,  phosphat buffer  saline  (PBS),  destilated  water  (DW),  H 2 O 2 ,  metanol,  goat serum  albumin  (GSA),  antibodi  monoklonal  copper,zinc- superoksida dismutase (Cu,Zn-SOD) (Sigma S2147), dako envision peroksidase  system  (DEPS)  (Dako  K1491),  diaminobenzidine (DAB), dan hematoksilin.

## Metode
Perlakuan hewan percobaan (in vivo ) dan sampling
Sebanyak  25  ekor  tikus  jantan  SD  umur  sapih  (21  hari)  terlebih dahulu  diadaptasikan  di  lingkungan  laboratorium  tempat  percobaan selama  1  minggu.  Ransum  basal  kasein    disusun  secara  isonitrogen dan isokalori dengan kadar protein 10%, modifikasi AOAC (1990) diberikan secara ad  libitum . Bahan  penyusun  ransum  tikus  jantan  adalah kasein, mineral mix, vitamin mix, minyak jagung, selulosa, air dan pati  jagung/maizena. Setelah  masa  adaptasi,  tikus  dibagi  dalam  5 kelompok, yaitu : (1) Kontrol, cekok aquades (2) cekok TKI-RL  dosis isoflavon  (IF)  1,5  mg/ekor/hari,  (3)  cekok  TKI-RL  dosis  IF  3
mg/ekor/hari,  (4)  cekok  TKI-RL  dosis  IF  4,5  mg/ekor/hari,  dan  (5) cekok TKI-RL dosis IF 6 mg/ekor/hari.
TKI-RL  diberikan  pada  tikus  jantan  dengan  cara  dicekok menggunakan sonde lambung, dengan melarutkan TKI-RL dalam 1 ml aquades.  Pemberian  TKI-RL  pada    tikus    jantan  secara in  vivo dilakukan  berdasarkan  pengukuran  kandungan  total  senyawa isoflavon.  Hasil  analisis  dengan  HPLC  terhadap  TKI-RL menunjukkan  adanya  tiga  komponen  senyawa  isoflavon  yaitu daidzein, genistein, dan glisitein dengan kandungan total senyawa isoflavon sebesar 2,22 g/100 g bb (Astuti et al., 2008).  Setelah 2 bulan masa  perlakuan, tikus  masing-masing  kelompok (n=5)    dikorbankan dengan dipatahkan  tulang  leher ( dislocasio cervicalis ).  Bagian testis dikoleksi dan dilakukan pengamatan terhadap kadar MDA, aktivitas SOD, serta kandungan Cu,Zn-SOD.

## Pengukuran kadar MDA
Sebanyak  ±  0,5  g  testis  segar  dicacah  dalam  kondisi  dingin dalam 2,5 ml larutan phosphat buffer saline (PBS) yang mengandung 11,5  g/L  KCl.  Homogenat  disentrifugasi  dua  kali  pada  4000  rpm selama 10  menit.  1 ml  supernatan  jernih  ditambah  4  ml  HCl dingin (0.25N)  yang  mengandung 15%  TCA,  0,38%  TBA,  dan  0,5%  BHT. Campuran dipanaskan 80 C selama 1 jam. Setelah dingin, campuran disentrifugasi  3500  rpm  selama  10  menit.    Absorbansi  supernatan diukur  pada  λ  532  nm.  Sebagai  larutan  standar  digunakan  TEP (Singh et al .,  2002).

## Pengukuran aktivitas SOD
Sebanyak ± 0,5 g testis segar yang telah dihaluskan, ditambah 1ml  buffer  fosfat  pH  7,4,  disentrifugasi  pada  10000  rpm,  4 C, selama  20  menit,  kemudian  diambil    bagian    cairannya  (lisat). Sebanyak  800  µl  larutan  kloroform/etanol  dingin  37,5/62,5  (v/v) ditambahkan  ke  dalam  300  µl  lisat,  divorteks  30  detik  dan disentrifugasi  pada  5000  rpm,  4 C,  selama  10  menit.  Supernatan disimpan  pada  2-8 C  sampai  saat  akan  dianalisis  (Nebot et  al., 1993).
Larutan  standar  dibuat  dengan  melarutkan  SOD  murni komersial  sehingga  menghasilkan  beberapa  konsentrasi  larutan untuk  pembuatan  kurva  standar.  Pengukuran  aktivitas  enzim  ini berlangsung pada suhu 25 C,  larutan xantin oksidase harus tetap dalam  keadaan  dingin  sebelum  digunakan.  Sebanyak  2,9  ml campuran larutan xantin dan sitokrom C dimasukkan dalam tabung reaksi 3 mL, ditambah 50 µL larutan baku (kontrol) atau sampel dan divorteks  secara  perlahan.  Selanjutnya  ditambah  50  µL  larutan xantin oksidase dan divorteks secara perlahan.  Absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada λ 550 nm.  Blanko yang digunakan adalah buffer fosfat sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan aquades (Mc Cord & Fridovich  1969).

## Pengamatan  profil  Cu,Zn-SOD  pada  tubuli  seminiferi  testis (imunohistokimia)
Organ testis dicuci dengan  NaCl fisiologis 0,9%,  difiksasi  dalam larutan  Bouin  selama  24  jam.  Jaringan  testis  kemudian  diproses dengan  metode  standar  menggunakan  parafin.  Blok  jaringan  yang didapat dipotong ± 4 µm dan dilekatkan pada gelas obyek yang telah dilem  dengan  neofren,  sehingga  diperoleh  potongan  jaringan (sediaan). Selanjutnya dilakukan proses pewarnaan Imunohistokimia
terhadap potongan jaringan menggunakan metode Wresdiyati et al., (2002).
Pewarnaan  imunohistokimia  dilakukan  untuk  mengamati  profil antioksidan  Cu,Zn-SOD  pada  sel  spermatogenik  tubuli  seminiferi testis  tikus.  Keberadaan  kandungan  antioksidan  Cu,Zn-SOD  terlihat dengan  produk  reaksi  warna  coklat.  Intensitas  warna  coklat menunjukkan  kandungan  Cu,Zn-SOD.  Semakin  tua  warna  coklat, semakin banyak kandungan Cu,Zn-SOD. Sel yang tidak mengandung enzim  Cu,Zn-SOD  atau  bereaksi  negatif  ditunjukkan  dengan  warna biru. Pengamatan dilakukan secara kuantitatif terhadap jumlah inti sel spermatosit  dan  spermatid  awal  pada  berbagai  tingkat  kandungan Cu,Zn-SOD (positif kuat/+++, positif sedang/lemah ++/+, dan negatif/). Pengamatan  dilakukan  pada  sembilan  tubuli  seminiferi  untuk  tiap perlakuan.

## Analisis data
Data  diolah  dengan  sidik  ragam  menggunakan  Rancangan Acak  Lengkap  (RAL)  untuk  mengetahui  pengaruh  perlakuan terhadap parameter yang diuji.  Untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan,  data  yang  menunjukkan  pengaruh  nyata  selanjutnya diuji dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Malonaldehida  (MDA)  merupakan  salah  satu  produk  akhir peroksidasi  lipid  yang  terbentuk  setelah  aksi  senyawa  radikal sehingga  digunakan  sebagai    indikator  keberadaan  radikal  bebas dalam  tubuh  dan  indikator  kerusakan  oksidatif  membran  sel. Perbedaan  nilai  MDA  terkait  dengan  proses  oksidasi  yang  terjadi. Rerata nilai MDA testis akibat perbedaan perlakuan pada tikus jantan disajikan  pada  Gambar  1,  sedangkan    rerata  aktivitas  SOD  testis disajikan  pada  Gambar  2.  Hasil  pengamatan  menunjukkan  bahwa peningkatan  kadar  MDA  diikuti  dengan  penurunan  aktivitas antioksidan  intrasel,  sebaliknya  penurunan  kadar  MDA memperlihatkan peningkatan aktivitas antioksidan intrasel.

## Keterangan  :  Angka  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  berbeda  pada  kelima  perlakuan menunjukkan adanya perbedaan nyata (p<0,05)
Gambar 1.  Kadar MDA testis tikus pada berbagai variasi dosis isoflavon
Pengukuran  aktivitas  enzim  Superoksida  Dismutase  (SOD) testis  tikus  dilakukan  berdasarkan  pengukuran  enzim  secara  tidak langsung menggunakan metode spektrofotometri secara kuantitatif. Sebagai  data  pendukung,  dilakukan  juga  pengamatan  terhadap keberadaan  dan  kandungan  antioksidan  Cu,Zn-SOD  pada  tubuli
seminiferi testis tikus melalui produk reaksi yang berwarna coklat, yaitu pengamatan  histologis  dengan  pewarnaan  secara  imunohistokimia. Intensitas  dan  distribusi  warna  coklat  menunjukkan  kandungan Cu,Zn-SOD  pada  jaringan  tersebut.    Apabila  warna  coklat    semakin tua  dan  semakin  merata,  berarti  kandungan  Cu,Zn-SOD  semakin banyak. Sel yang tidak mengandung enzim Cu,Zn-SOD atau bereaksi negatif  ditunjukkan  dengan  warna  biru.  Pada  Gambar  3  disajikan fotomikrograf  jaringan  testis  tikus  perlakuan  yang  diwarnai  secara imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD.

## Keterangan  :  Angka  yang  diikuti  oleh  huruf  yang  berbeda  pada  kelima  perlakuan menunjukkan adanya perbedaan nyata (p<0,05)
Gambar 2. Aktivitas superoksida Dismutase (SOD) testis tikus pada berbagai variasi dosis isoflavon.
Kandungan  Cu,Zn-SOD  diamati  pada  tahap  spermatosit  dan spermatid  awal  karena  produk  reaksi  warna  coklat  lebih  banyak terdistribusi  pada  tahap  tersebut.  Hal  ini  didukung  oleh  laporan Yoganathan et  al., (1989)  diacu dalam  Peltola et  al .,  (1992),  bahwa pada  tubuli  seminiferi  testis  tikus,  aktivitas  SOD  yang  lebih  tinggi ditemukan pada sel spermatosit dan spermatid awal. Dalam penelitian ini, hasil pengamatan terhadap sel spermatogonia dan spermatid akhir menunjukkan bahwa keduanya tidak mengandung enzim Cu,Zn-SOD atau  bereaksi  negatif,  terlihat  dengan  distribusi  warna  biru  secara merata pada kedua sel tersebut.  Hasil perhitungan secara kuantitatif terhadap  jumlah  inti  sel  spermatosit  dan  spermatid  awal  tubuli seminiferi testis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD tersaji pada Tabel 1 .
Kadar  MDA  testis  kelompok  tikus  yang  dicekok  TKI-RL  pada dosis IF 1,5 mg/ekor/hari paling rendah dibanding ketiga kelompok tikus  yang  dicekok  TKI-RL  dengan  dosis  isoflavon  lebih  tinggi. Penurunan  radikal  bebas  dalam  tubuh  yang  diperlihatkan  dengan rendahnya  kadar  MDA  testis  kelompok  tikus  yang  dicekok  TKI-RL pada  dosis  IF  1,5  mg/ekor/hari  (Gambar  1)  dapat  meningkatkan secara  nyata  aktivitas  enzim  SOD  testis  sebagai  salah  satu  sistem antioksidan endogen dalam tubuh (Gambar 2). Peningkatan aktivitas enzim SOD testis kelompok tikus yang dicekok TKI-RL pada dosis IF 1,5 mg/ekor/hari didukung oleh tingginya kandungan Cu,Zn-SOD sel spermatosit  dan  spermatid  awal  pada  tubuli  seminiferi  testis  yang mengalami peningkatan sangat tajam dibandingkan perlakuan lainnya (Tabel 1), terlihat dari jumlah sel spermatosit dan spermatid awal yang memberikan reaksi positif kuat dan positif sedang/lemah paling tinggi secara nyata (p<0,05). Hal ini menunjukkan bahwa pemberian TKI-RL pada dosis IF 1,5 mg/ekor/hari memberikan pengaruh yang paling
baik terhadap kandungan Cu,Zn-SOD sel spermatosit dan spermatid awal pada tubuli seminiferi testis.
Menurut  Anderson  &  Graner  (2000),  testis  merupakan  subyek dari  aksi  isoflavon.    Pada  pemberian  TKI-RL  dengan  dosis  IF  1,5 mg/ekor/hari,  diduga  isoflavon  bersifat  antagonis,  yaitu menghambat  respon  estrogen  dengan  bertindak  sebagai antioksidan.  Hasil  pengukuran  terhadap  TKI-RL  menunjukkan bahwa TKI-RL memiliki aktivitas antioksidan sebesar 54,19% (Astuti et al., 2008).  Aktivitas antioksidan isoflavon ditentukan oleh jumlah dan  posisi  gugus  hidroksil  (Amic et  al., 2002).  Peran  isoflavon sebagai  antioksidan  diduga  berlangsung  melalui  dua  mekanisme, yaitu  kemampuan  sebagai  donor  ion  hidrogen  dan scavenger radikal bebas yang terbentuk selama peroksidasi lipid (Nijveldt et al . 2001). Rice-Evans et al ., (1997) menyatakan bahwa struktur kimia flavonoid  yang  memiliki  aktivitas  sebagai  antioksidan  ditentukan oleh  susunan  meta  5,7-dihidroksi  pada  cincin  A,  sedangkan sebagai  senyawa  pengkelat  logam  adalah  gugus  4-okso  pada cincin C. Konfigurasi grup hidroksi pada cincin B senyawa flavonoid dilaporkan berperan sebagai scavenger senyawa ROS (Heim et al., 2002).
Flavonoid  mempunyai  kemampuan  sebagai  antioksidan  dan mencegah  terjadinya  kerusakan  akibat  radikal  bebas  melalui mekanisme  flavonoid  untuk  dapat  bertindak  sebagai scavenger radikal  bebas  secara  langsung.  Flavonoid  (flavonoid–OH)  dapat beraksi  sebagai scavenger radikal  peroksil  (ROO * )  yang  akan diregenerasi  menjadi  ROOH.  Flavonoid  juga  dapat  bertindak sebagai scavenger radikal  hidroksil  (OH * )  yang  akan  diregenerasi menjadi H 2 O.  Senyawa hasil regenerasi radikal peroksil dan radikal hidroksil  bersifat  lebih  stabil,  sedangkan  radikal  fenoksil  yang terbentuk  (flavonoid-O * )  menjadi  bersifat  kurang  reaktif  untuk melakukan reaksi propagasi (Nijveldt et al., 2001). Stabilitas radikal fenoksil  dilaporkan  Pokorny et  al .,  (2001)  akan  mengurangi  laju reaksi propagasi pada proses autooksidasi lipid.
Sel testis mampu mempertahankan diri dari serangan oksidatif senyawa  radikal  bebas  sehingga  pembentukan  MDA  testis  dapat dihambat, akibat peran isoflavon sebagai antioksidan. Diduga, dosis IF 1,5 mg/ekor/hari merupakan dosis isoflavon yang paling optimal dan efektif dalam menghambat peroksidasi lipid, di mana sel tidak
mengalami  kerusakan  (utuh)  karena  terlindung  oleh  antioksidan isoflavon. Sel yang normal mempunyai sejumlah enzim pertahanan yang beraksi  sebagai antioksidan endogen untuk mendetoksifikasi radikal  bebas  yang  berbahaya  dan  mencegah  kerusakan  sel. Potensi  pertahanan  spermatozoa  secara  normal  adalah  cukupnya sistem  pertahanan  enzim  antioksidan  endogen.  Apabila  terbentuk radikal  bebas  dalam  jumlah  berlebihan,  enzim-enzim  yang berfungsi sebagai antioksidan endogen dapat menurun aktivitasnya (Sikka et al., 1995; Halliwell & Gutteridge, 1999).
Enzim  Cu,Zn-superoksida  dismutase  (Cu,Zn-SOD)  telah dilaporkan  berperan  sebagai  garis  pertahanan  pertama  terhadap aktivasi  dan  toksisitas  senyawa  reaktif  oksigen  spesies  (ROS) melalui  dismutasi  radikal  anion  superoksida,  serta  merupakan pertahanan  utama  dari  spermatozoa  yang  aktivitasnya  berkorelasi kuat dengan kemampuan sel untuk menghambat produk akhir hasil peroksidasi  lipid  (Alvarez  &  Storey  1982;  Oteiza et  al .,  1995). Terhambatnya  pembentukan  MDA  testis  mengakibatkan meningkatnya  status  pertahanan  antioksidan  endogen,  sehingga aktivitas  enzim  SOD  serta    kandungan  Cu,Zn-SOD  pada  sel spermatosit  dan  spermatid  awal  dipertahankan  tetap  tinggi.  Hasil penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  cekok  TKI-RL  pada  dosis isoflavon  paling  rendah  (1,5  mg/ekor/hari)  memberikan  pengaruh yang  paling  menguntungkan  terhadap  eliminasi  radikal  bebas. Hal ini  didukung  oleh  pendapat  Sikka,  (2004),  bahwa  antioksidan eksogen  yang  dapat  bertindak  sebagai  penangkap  ( scavenger ) radikal  bebas  akan  meningkatkan  sistem  pertahanan  antioksidan endogen  dalam  tubuh  sehingga  mampu  mengurangi  terbentuknya kondisi  stres  oksidatif  akibat  berlebihnya  pembentukan  radikal bebas.
Tidak terlihat adanya perbedaan pada kelompok tikus yang  dicekok TKI-RL dengan dosis IF 3 mg/ekor/hari dengan kelompok kontrol (K) yang  mendapat  cekok  aquades  terhadap  ketiga  parameter pengujian. Hasil ini memperlihatkan bahwa pemberian TKI-RL pada dosis  IF  3  mg/ekor/hari  tidak  memberikan  pengaruh  yang  berarti terhadap kadar MDA testis, aktivitas  SOD testis, serta kandungan Cu,Zn-SOD  sel  spermatosit  dan  spermatid  awal  pada  tubuli seminiferi testis.
Tabel  1.  Profil kandungan Cu,Zn-SOD pada sel-sel spermatogenik (spermatosit, spermatid awal, spermatogonia,dan spermatid akhir)  per lapang pandang tubuli seminiferi jaringan testis tikus dengan perlakuan isoflavon.
Perlakuan Jumlah sel-sel spermatogenik pada berbagai  tingkat kandungan Cu,Zn-SOD per lapang pandang tubuli semineferi (perbesaran 200X) Spermatosit dan Spermatid awal Spermatogonia Spermatid akhir +++ ++/+ - - - Kontrol 149,56±13,69b 71,11±9,61c 40,22±6,69b 40,33±4,82b 130,22±18,17b Isoflavon 1,5 mg/ekor/hari 166,78±6,92c 85,22±9,24d 32,33±5,27a 48,44±4,82c 164,33±17,94c Isoflavon 3 mg/ekor/hari 151,78±8,89b 49,22±14,46b 40,78±6,40b 38,78±2,77b 148,67±16,11c Isoflavon  4,5 mg/ekor/hari 131,56±7,20a 32,44±8,37a 53,56±5,83c 32,00±2,45a 109,67±19,91a Isoflavon  6 mg/ekor/hari 128,56±7,09a 31,22±4,79a 54,33±3,28c 29,56±2,55a 106,44±16,49a
Keterangan :   - Angka yang diikuti oleh huruf berbeda pada kolom yang sama menunjukkan adanya perbedaan nyata (P <0,05)
- Sel-sel spermatosit dan spermatid awal menunjukkan kandungan Cu.Zn-SOD pada berbagai tingkat, yaitu (a) positif dengan kandungan tinggi (+++) berwarna coklat tua, (b) positif dengan kandungan sedang/lemah (++/+) berwarna coklat muda, dan (c) negatif atau tidak mengandung Cu. Zn-SOD yang berwarna biru.
- Sel-sel spermatogonia dan spermatid akhir menunjukkan negatif (-) atau tidak mengandung Cu.Zn-SOD.
K =  ransum basal kasein, cekok aquadest B =  ransum basal kasein, cekok TKI-RL 1,5 mg/ekor/hari C =  ransum basal kasein, cekok TKI-RL 3 mg/ekor/hari D =  ransum basal kasein, cekok TKI-RL 4,5 mg/ekor/hari E =  ransum basal kasein, cekok TKI-RL 6 mg/ekor/hari
Gambar 3.  Fotomikrograf jaringan testis tikus perlakuan yang diwarnai secara imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD, skala = 50 µm
Kelompok  tikus  yang  dicekok  TKI-RL  dengan  dosis  IF  lebih tinggi  (4,5  mg/ekor/hari  dan  6  mg/ekor/hari)  memperlihatkan pengaruh  negatif  yang  diperlihatkan  dengan  tingginya  kadar  MDA testis sebagai produk akhir peroksidasi lipid. Diduga, pada dosis 4,5 mg/ekor/hari dan 6 mg/ekor/hari, isoflavon bersifat sebagai estrogen agonis  dengan  memacu/menstimulasi  respon  estrogen  sehingga pada  dosis  tersebut  isoflavon  berpotensi  menimbulkan  pengaruh toksik dan mengakibatkan kerusakan oksidatif pada jaringan testis. Kondisi tersebut menunjukkan bahwa pemberian TKI-RL pada dosis IF  4,5  mg/ekor/hari  dan  6  mg/ekor/hari  tidak  mampu  menghambat berlanjutnya  proses  peroksidasi  lipid.  Kerusakan  oksidatif  dapat terus  terjadi  apabila  ketidakseimbangan  antara  radikal  bebas  dan sistem pertahanan antioksidan terus berlanjut. Menurut Taylor et al ., (1988)  dan  Sikka  (2004),  ketidakseimbangan  terjadi  apabila pembentukan  radikal  bebas  lebih  tinggi  dibandingkan  sistem pertahanan  antioksidan,  sistem  pertahanan  antioksidan  tidak mampu  mendetoksifikasi  terjadinya  perubahan  oleh  radikal  bebas secara  terus  menerus,  atau  ketika  proses  detoksifikasi  menurun. Adanya  ketidakseimbangan  antara  radikal  bebas  dan  sistem pertahanan  antioksidan  mengakibatkan  status  pertahanan antioksidan  intrasel  kedua  kelompok  tersebut  tidak  mampu  atau tidak  mencukupi  untuk  menangkal  reaktivitas  dan  berlebihnya pembentukan  radikal  bebas,  sehingga  menurunkan  sistem pertahanan enzim SOD intrasel.
Penurunan kemampuan antioksidan SOD intrasel menyebabkan berkurangnya  eliminasi  senyawa  ROS  yang  bertanggung  jawab terhadap  kerusakan  sel  DNA  dan  protein  spermatozoa,  serta terbentuknya  proses  peroksidasi  lipid.  Kekacauan  sistem pertahanan  antioksidan  tersebut  selanjutnya  menyebabkan peroksidasi  membran  fosfolipid  oleh  radikal  bebas.  Sebagai konsekuensinya, terjadi perubahan fluiditas dan integritas membran
oleh  akumulasi  peroksidasi  lipid  sehingga  mengganggu  motilitas spermatozoa. Hal ini sejalan dengan pendapat Rajasekaran et al., (1995),  bahwa  penurunan  aktivitas  SOD  akan  mempengaruhi kemampuan  pertahanan  terhadap  senyawa  ROS  sehingga menyebabkan  kerusakan  spermatozoa.  Reaktivitas  tinggi  dari radikal  bebas    dilaporkan  menyebabkan  pengaruh  toksik  pada membran plasma spermatozoa (Griveau et al., 1995), serta jaringan yang  memproduksi  spermatozoa  (Sikka,  2004).  Karena  radikal bebas  dapat  bereaksi  dengan  komponen-komponen  membran, terjadinya  kerusakan  diduga  tidak  hanya  berlangsung  pada membran  plasma,  tetapi  juga  pada  bagian  internal  sel.  Akibat peningkatan peroksidasi lipid tersebut, metabolisme sel tidak dapat berlangsung  dengan  sempurna. Hal  ini  didukung  oleh  pendapat beberapa  peneliti  bahwa  terbentuknya  peroksida  lipid  pada membran  sel  yang  terjadi  akibat  reaksi  berantai  antara  radikal bebas  dengan  asam  lemak  tidak  jenuh  akan  menyebabkan perubahan  struktur  membran  sel  sehingga  mengubah  kestabilan dan  fungsi  membran  (Griveau et  al .,  1995;  de  Lamirande et  al ., 1997; Sanocka & Kurpisz, 2004).
Pengaruh patologis akibat berlebihnya senyawa ROS sebagian besar  disebabkan  oleh  konversi  anion  superoksida  menjadi hidrogen  peroksida  dan  diinisiasi  oleh  peroksidasi  lipid. Peningkatan  peroksidasi  lipid  pada  kelompok  tikus  yang  dicekok TKI-RL  dengan  dosis  IF  4,5  mg/ekor/hari  dan  6  mg/ekor/hari (Gambar  1)  menunjukkan  bahwa  komponen  membran  sel  testis kedua  kelompok  tersebut  bersifat  lebih  rentan  terhadap  reaksi oksidasi  sehingga  tidak  mampu  mencegah  dan  menghambat reaktivitas  senyawa  radikal  bebas  dalam  tubuh,  dan  berakibat terhadap  peningkatan  kerusakan  membran  sel  testis,  atau kerusakan membran plasma spermatozoa.
C B K D E

## KESIMPULAN
Pemberian tepung kedelai kaya isoflavon pada tikus jantan dengan dosis  isoflavon  1,5  mg/ekor/hari merupakan dosis  isoflavon optimum yang  :  1)  menghambat  pembentukan  peroksidasi  lipid  yang diperlihatkan  dengan  menurunnya  kadar  MDA  testis,  2) mempertahankan  aktivitas  enzim  SOD  testis  tetap  tinggi,  dan  3) meningkatkan  kandungan  Cu,Zn-SOD  tubuli  seminiferi  testis  pada sel spermatosit dan spermatid awal secara imunohistokimia.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didanai oleh Program Hibah Bersaing XIV DIKTI, Departemen  Pendidikan  Nasional  RI.  Penulis  mengucapkan terimakasih kepada DITJEN DIKTI DEPDIKNAS.

## DAFTAR PUSTAKA
AOAC.   1990.   Official   Methods  of  Analysis   of   the   AOAC. AOAC,  Inc.  Arlington, Virginia.
Alvarez  JG,  Touchstone  JC,  Blasco  L,  Storey  BT.  1987. Spontaneous  lipid  peroxidation  and  production  of  hydrogen peroxide  and  superoxide    in  human  spermatozoa  :  superoxide dismutase as major enzyme protectant against oxygen toxixity . J. Androl.  8:338-348.
Amic D, Beslo D, Trinajstic N.  2003.  Structure-radical scavenging activity relationship of flavonoids.  Croat Chem Acta  76(1):56- 61.
Anderson  JJB,  Garner  SC.  2000.    The  Soybean  as  a  Source  of Bioactive Molecules. Di dalam:Schmidl MK & Labuza TP, editor. Essentials  of    Functional  Foods.  Aspen  Publishers,  Inc. Gaithersburg, Maryland.  hlm. 239-266.
Astuti  S,  Muchtadi  D,  Astawan  M,  Purwantara  B,  Wresdiyati  T. 2008. Kadar peroksida lipid dan aktivitas superoksida dismutase (SOD)  testis  tikus  yang  diberi  tepung  kedelai  kaya  isoflavon, seng  (Zn),  dan  vitamin  E.  Majalah  Kedokteran  Bandung 40(2):59-66.
de  Lamirande  E,  Jiang  H,  Zini  A,  Kodama  H.  Gagnon  C.  1997. Reactive  oxygen  species  and  sperm  physiology.  Rev.  Reprod. 2:48-54.
Griveau JF, Dumont E, Renard P, Callegari JP, Le Lannou D.  1995.
Reactive  oxygen  species,  lipid  peroxidation  and  enzymatic defences  systems  in  human  spermatozoa.  J.  Reprod.  Fertil. 103:17-26.
Halliwell  B,Gutteridge  JMC.   1999.   Free  Radicals in Biology and Medicine.  Third  Edition.  Oxford  University  Press,  Inc., New York.
Heim  KE,  Tagliaferro  AR,  Bobilya  DJ  2002.  Flavonoid:  chemistry, metabolism and structure-activity relationship. J. Nutr. Biochem. 13:572-584.
Helferich WG, Allred CD, Ju Young-Hwa. 2001.  Dietary  Estrogens and  Antiestrogens.  Di  dalam    :    Helferich    W    &    Winter    CK, editor. Food Toxicology.   CRC Press, Boca Raton.  hlm. 37-55.
Indiana   Soybean   Board.   1998.   Isoflavone   Concentration   in Soy    Foods.
ttp://www.soyfood.com/nutrition/isoflavoneconcentration.html. [24 Februari 2002].
Miksicek  RJ.    1994.    Interaction  of  naturally  occuring  nonsteroidal estrogens with  expressed  recombinant  human  estrogen receptor.  J.Steroid Biochem. Molec. Biol. 49:153-160.
Mc  Cord  J,  Fridovich  I.    1969.  Di  dalam  : Kartikawati    D.    1999. Studi  Pengaruh  Protektif  Vitamin  C  dan  Vitamin  E  terhadap Respon Imun dan Enzim Antioksidan pada Mencit yang Dipapar Paraquat  [tesis].  Program  Pascasarjana,  Institut  Pertanian Bogor.
Nebot  C,    Moutet  M,  Huet  P,  Xu  Jin-Zhu,  Yadan  Jean-Claude Chaudiere  J.  1993.  Spectrophotometric  assay  of  superoxide dismutase  activity  based  on  the  activated  autooxidation  of  a tetracyclic cathecol. Anal. Biochem.  214:442-451
Nijveldt  RJ,  E.  van  Nood,  DEC  van  Hoorn,  PG  Boelens,  K  Van Norren  PAM,  van  Leeuwen.  2001.  Flavonoids  :  a  review  of probable mechanism of action and potential applications. Am. J. Clin. Nutr. 74:418-425.
Oteiza  PI,  Olin  KL,  Fraga  CG,    Keen  CL    1995.    Zinc  deficiency causes  oxidative  damage  to  proteins,  lipids  and  DNA  in  rat testes.  J. Nutr.  125:823-929.
Peltola  V,  Huhtaniemi  I,  Ahotupa  M.    1992.    Antioxidant  enzyme activity in the maturing rat testis.  J. Androl.  13(5):450-455.
Pokorny  J,  Yanishlieva  N,  Gordon  M.  2001.  Antioxidant  in  Food.
CRC Press, Boca Raton, USA.
Rajasekaran M, Hellstrom WJ, Naz RK. Sikka SC. 1995.  Oxidative stress  and  interleukins  in  seminal  plasma  during leuckocytospermia.  Fertil. Steril. 64:166-171.
Rice-Evans CA, Miller NJ, Paganga G. 1997. Antioxidant properties of phenolic ompounds. Trends in Plant Sci.  2:152-159.
Sanocka  D  Kurpisz M. 2004. Reactive oxygen species and sperm cells. Reprod. Biol. Endocrinol.  2:12.
Sikka  SC,  Rajasekaran  M,Hellstrom  WJG.  1995.  Role  of  oxidative stress and antioxidants in male infertility.  J. Androl.  16(6):464- 468.
Sikka  SC.  2004.    Role  of  oxidative  stress  and  antioxidants  in andrology  and  assisted  reproductive  technology.  J.  Androl. 25(1):5-18.
Singh  RP,  Murthy  KNC,  Jayaprakasha  GK  2002.    Studies  on  the antioxidant activity of pomegranate (Punica granatum) peel and seed extracts using in vitro model.  J. Agric. Food Chem.  50:81- 86.
Taylor CG, Bettger WJ. Bray  TM.  1988.  Effect of dietary zinc or copper deficiency on the primary free radical defense  system  in rats.   J.  Nutr. 118:613-621.
Toda  S,  Shirataki  Y.1999.  Inhibitory  effect  of  isoflavones  on  lipid peroxidation  by  reactive  oxygen  species.  Phytother.  Res. 13:163-165.
Wresdiyati T, Mamba K, Adnyane IKM, Aisyah US.  2002. The effect of stress condition on the intracellular antioxidant copper, zinc- superoxide  dismutase  (Cu,Zn-SOD)  in  the  rat  kidney  :  an immunohistochemical study.  Hayati  9(3):85-88.