## RESEARCH   ARTICLE
The Effect of Giving The Antioxidant Vitamin C in Tris-Egg Yolk Extender During The Preservation Period on The Quality of The Epididymal Spermatozoa of Mice ( Mus musculus L.)
(Pengaruh Pemberian Antioksidan Vitamin C dalam Pengencer Tris Kuning Telur Selama Masa Preservasi Terhadap Kualitas Spermatozoa Epididimis Mencit ( Mus musculus L.))
Efie Fadjrijah Eka Dewi *) , Mahriani Program Studi Biologi, FMIPA, Universitas Jember, Jl. Kalimantan No.37, Jember, 68121, Indonesia

## ABSTRACT
Spermatozoa preservation is a method used to store spermatozoa in a diluent solution such as NaCl or tris-egg yolk. However, the longer  storage  of  spermatozoa  in  the  diluent  solution  can  generally  form  ROS  (Reactive  Oxygen  Species).  The  addition  of antioxidants such as vitamin C to the diluent is expected to be able to bind ROS so that they are not toxic to spermatozoa and sperm quality  can  be  maintained  during  the  preservation  period.  The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the  effect  of  giving  the antioxidant vitamin C in tris-egg yolk diluent during the preservation period on the quality of mice epididymal spermatozoa. Vitamin C used in this study was 0.5 mg, 1 mg, and 2 mg in 100 ml of tris-egg yolk diluent. Observation of spermatozoa quality was carried out within 0 to 48 hours with a span of 12 hours. The results showed that the addition of Vitamin C concentrations of 0.5 mg, 1 mg, and 2 mg in 100 ml of tris-egg yolk diluent was able to maintain the percentage of motility and vitality, but the longer the storage the quality of spermatozoa decreased. The concentration of vitamin C 0.5 mg, 1 mg, and 2 mg in 100 ml of tris-egg yolk diluent is a good concentration to maintain the quality of spermatozoa during 12 hours of storage, the rest will decrease. Further research is needed to increase the storage time of spermatozoa by using vitamin C and tris-egg yolk.
Preservasi spermatozoa merupakan metode yang digunakan untuk menyimpan spermatozoa dalam suatu larutan pengencer seperti NaCl ataupun tris kuning telur. Namun penyimpanan spermatozoa yang semakin lama di dalam larutan pengencer umumnya bisa membentuk ROS (Reactive Oxygen Species). Penambahan zat antioksidan seperti vitamin C ke dalam larutan pengencer diharapkan mampu mengikat ROS sehingga tidak bersifat toxic terhadap spermatozoa dan kualitas sperma dapat dipertahankan selama masa preservasi. Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui pengaruh pemberian antioksidan vitamin C dalam pengencer tris kuning telur selama masa preservasi terhadap kualitas spermatozoa epididimis mencit. Vitamin C yang digunakan dalam penelitian ini 0.5 mg, 1 mg dan 2 mg dalam 100 ml larutan pengencer Tris Kuning Telur. Pengamatan kualitas spermatozoa dilakukan dalam waktu 0 hingga 48 jam dengan rentang waktu 12 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian Vitamin C konsentrasi  0,5 mg, 1 mg dan 2 mg dalam 100 ml pengencer tris kuning telur mampu mempertahankan persentase motilitas dan daya hidup , tetapi semakin lama penyimpanan kualitas spermatozoa mengalami penurunan. Konsentrasi vitamin C  0,5  mg, 1 mg dan 2 mg dalam 100 ml pengencer tris kuning telur  merupakan konsentrasi yang baik untuk mempertahankan kualitas spermatozoa  selama penyimpanan 12  jam,  selebihnya  akan  mengalami  penurunan.  Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  agar  meningkatkan  waktu  penyimpanan spermatozoa dengan menggunakan vitamin C dan tris kuning telur.
Keywords: Antioxidant, Mus musculus L., Preservation, Spermatozoa.

## PENDAHULUAN
Mencit  merupakan  jenis  hewan  uji  coba  yang banyak  digunakan  dalam  penelitian  maupun praktikum di laboratorium. Hal ini dikarenakan mencit memiliki  kelebihan  seperti  siklus  hidup  relative
pendek, banyaknya jumlah anak per kelahiran, mudah ditangani,  memiliki  karakteristik  reproduksinya  yang mirip  dengan  hewan  mamalia  lainnya,  serta  struktur anatomi,  fisiologi  dan  genetik  yang  mirip  dengan manusia  [1],  [2].  Salah  satu  bagian  mencit  yang digunakan  dalam  penelitian  maupun  praktikum  di
*) Corresponding author: Efie Fadjrijah Eka Dewi E-mail: efie.fmipa@unej.ac.id
Laboratorium  Zoologi  FMIPA  Universitas  Jember adalah spermatozoa.
Spermatozoa  mencit  memliki  struktur  yang  sama dengan  sperma  hewan  lainnya  yaitu  terdiri  atas  2 bagian  utama  kepala  dan  ekor  yang  dilindungi  oleh membrane  plasma.  Salah  satu  spermatozoa  yang digunakan  dalam  kegiatan  praktikum  preservasi spermatozoa  adalah  yang  dikoleksi  dari  kauda epididimis mencit ( Mus musculus L.). Spermatozoa yang terdapat  di  dalam  kauda  epididimis  telah  mampu bergerak atau motil serta mampu membuahi oosit. Hal ini terjadi karena spermatozoa yang terdapat di bagian kauda epididimis telah mengalami proses pematangan di bagian kaput dan korpus [3].
Proses preservasi spermatozoa epididymis mencit yang  dilakukan  selama  ini  menggunakan  larutan pengencer berupa NaCl dengan konsentrasi tertentu dan disimpan pada suhu dingin. Namun penggunaan NaCl  0.9%  sebagai  larutan  pengencer  memiliki kelemahan yaitu tidak bisa digunakan untuk preservasi spermatozoa    dalam  waktu  lama  dan  kurang mengandung sumber energi. Menurut Nilna [4], NaCl memberikan sifat buffer, mempertahankan pH semen, bersifat  isotonis  dengan  cairan  sel,  melindungi spermatozoa terhadap coldshock dan penyeimbangan elektron  yang  sesuai,  tetapi  penyimpanan  semen dengan  larutan  NaCl  sebagai  garam  fisiologis  hanya bisa  digunakan  tidak  lebih  dari  60  menit  setelah penampungan.  Hal  ini  dikarenakan  NaCl  kurang mengandung  sumber  energi  yang  dibutuhkan  oleh spermatozoa.  Perlu tambahan bahan lain yang dapat memberikan energi atau nutritif  sehingga menambah atau  memperpanjang  waktu  spermatozoa  untuk bertahan  hidup  dan  mempertahankan  pergerakan spermatozoa dalam media penyimpanan [5].
Menurut Prasetyaningtyas [6], plasma semen secara biokimiawi mengandung larutan penyanggah (buffer) sitrat,  fruktosa  serta  lipid  yang  berfungsi  menjaga integritas spermatozoa. Sehingga untuk mempertahankan  kualitas  spermatozoa  asal  kauda epididimis  diperlukan  pengenceran  yang  mampu menjaga  kualitas  selama  penyimpanan  pada  suhu rendah. Pengenceran harus memiliki komposisi yang mirip  dengan  plasma  semen  secara  alami  sehingga dapat memenuhi kebutuhan dan mampu mempertahankan fungsi fisiologis spermatozoa.
Jenis  pengencer  yang  lain  yang  bisa  digunakan adalah  pengencer  Tris  kuning  telur.  Penelitian  D. Hartanti,  dkk  [7]    membuktikan  bahwa  pengencer
sitrat  kuning  telur  dan  tris  kuning  telur  mempunyai pengaruh yang sama terhadap kemampuan daya hidup spermatozoa  pada  berbagai  interval  pengamatan setelah  pengenceran.  Tris  merupakan  larutan  yang mengandung asam sitrat dan fruktosa yang berperan sebagai  penyangga  (buffer),  untuk  mencegah perubahan  pH  akibat  asam  laktat  dari  hasil metabolisme  spermatozoa  serta  mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit, sumber energi dan melindungi spermatozoa dari kejut dingin ( cold shock ). Penyimpanan spermatozoa yang semakin lama  di  dalam  larutan  pengencer  umumnya  bisa membentuk  ROS  ( Reactive  Oxygen  Species ),  dengan menambahkan  zat  antioksidan  ke  dalam  larutan pengencer  harapannya  adalah  dapat  mengikat  ROS sehingga  tidak  bersifat  toxic  terhadap  spermatozoa dan kualitas sperma dapat dipertahankan selama masa preservasi.  Menurut  Wibisono  [8],  vitamin  C merupakan salah satu antioksidan dan non enzimatis yang  mempunyai  sifat  polaritas  yang  tinggi  karena banyak mengandung gugus hidroksil sehingga mudah larut  dalam  air.  Karena  itu,  vitamin  ini  terdapat  di cairan extra seluler. Hal ini memberikan keuntungan karena  mudah  diubah  oleh  tubuh.  Vitamin  C  dapat bereaksi dan mampu menetralisir radikal bebas. Oleh sebab  itu  tujuan  dari  penelitian  ini  yaitu  ingin mengetahui pengaruh pemberian antioksidan vitamin C  dalam  pengencer  tris  kuning  telur  selama  masa preservasi  terhadap  kualitas  spermatozoa  epididimis mencit.

## METODE
Penambahan  Antioksidan    Vitamin  C  dalam Pengencer  Tris Kuning Telur
Dosis vitamin C yang digunakan dalam penelitian ini  mengacu  pada  Pahlevy et  al., [9]  yang  telah dimodifikasi yaitu 0.5 mg, 1 mg dan 2 mg dalam 100 ml  larutan  pengencer  Tris  Kuning  Telur.  Larutan pengencer Tris Kuning Telur terdiri atas 80% tris dasar (Tris  (Hidroksimetil)  Aminomethan,  Asam  Sitran, Fructosa,  Aquades),  20%  kuning  telur,  0.001  g/ml penicillin  dan  0.001  g/ml  streptomycin.  Larutan pengencer Tris Kuning Telur yang sudah ditambahkan vitamin C disimpan dalam suhu ruang.
Sampling spermatozoa Sampling  spermatozoa  mencit  ( M.  musculus L.) dilakukan  melalui  metode  maserasi  dengan  lima  kali
pengulangan  mencit  ( M.  musculus L.).  Mencit    yang digunakan dibedah kemudian dipotong bagian kauda epididimis masing-masing testis. Kedua bagian kauda epididimis tersebut dicuci menggunakan NaCl 0,9%. Setelah  itu,  dilakukan  pencacahan  pada  kedua  kauda epididimis  masing-masing  menggunakan    1000  µl NaCl  0,9%  kemudian  dimasukkan  ke  dalam  empat macam pengencer sesuai dengan kelompok perlakuan [10].

## Pengamatan  Kualitas  Spermatozoa  Sebelum pengenceran
Pengamatan  kualitas  spermatozoa  yang  dilakukan sebelum  pengenceran  meliputi  persentase  motilitas spermatozoa,  persentase  viabilitas  spermatozoa, persentase abnormalitas dan konsentrasi spermatozoa.  Metode  pengujian  terhadap  kualitas spermatozoa yang dilakukan adalah sebagai berikut:
a. Persentase Motilitas Spermatozoa Motilitas  spermatozoa  diamati  dengan  melihat persentase  motil  progresif   yaitu  spermatozoa  yang bergerak  lurus  kedepan  [11].  Motilitas  spermatozoa dievaluasi  dengan  cara  mengambil  10  μl  suspensi spermatozoa, diletakkan diatas gelas objek kemudian ditutup  dengan  gelas  penutup  dan  diamati menggunakan  mikroskop  dengan  perbesaran  400x [12].
Pengamatan dilakukan terhadap 100
spermatozoa dan kategori spermatozoa yang diamati adalah sebagai berikut:
• Kategori 0 : spermatozoa tidak bergerak sama sekali •  Kategori 1 : spermatozoa bergerak lambat • Kategori 2 : spermatozoa bergerak ke depan dengan kecepatan sedang atau berputar-putar • Kategori 3 : spermatozoa bergerak lurus ke depan Persentase  jumlah  spermatozoa  yang  motil ditentukan  dengan  menjumlahkan  kategori  2  dan  3, dibagi  100  kemudian  dikalikan  100%.  Angka  100 merupakan jumlah kategori 0, 1, 2 dan 3 [13].
b. Persentase Daya Hidup Spermatozoa Persentase  daya  hidup  spermatozoa  dilakukan melalui  teknik  pewarnaan  eosin  1%  dalam  alkohol. Spermatozoa  yang  hidup  ditandai  oleh  kepala  tidak berwarna  atau  transparan  sedangkan  yang  mati ditandai  oleh  kepala  berwarna  merah.  Sebanyak  200 spermatozoa  diamati  dengan  mikroskop  cahaya menggunakan perbesaran 400x [14].
Prosedur pengamatan dilakukan dengan mengambil  ±  10  μl  spermatozoa,  diletakkan  pada
obyek glass kemudian ditambah dengan pewarna eosin dan  dicampurkan.  Preparat  dibuat  dengan  cara menekan  dan  mendorong  menggunakan cover  glass membentuk  sudut  45 o dan  didorong  sepanjang preparat  untuk  mendapatkan  lapisan  yang  setipis mungkin  [15].  Rumus  perhitungan  persentase  hidup spermatozoa  menurut  Hidayaturrahmah  [16]  adalah sebagai berikut:
Persentase hidup sperma ( % ) = Σ sperma hidup Σ total sperma x 100% .... (1) c. Persentase Abnormalitas Spermatozoa Perhitungan  persentase  spermatozoa  abnormal dilakukan  dengan  menggunakan  preparat  yang digunakan untuk mengevaluasi persentase daya hidup spermatozoa. Evaluasi dilakukan dengan menghitung jumlah spermatozoa yang normal dan abnormal. [17].
Abnormalitas diamati pada bagian kepala dan ekor melalui  perhitungan  sebanyak  200  spermatozoa. Pengamatan  abnormalitas  dilakukan  menggunakan mikroskop  dengan  perbesaran  400x.  Menurut Arifianti et al ., [18] persentase spermatozoa abnormal dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut:
Jumlah spermatozoa normal= Σ sel spermatozoa abnormal Σ total sel spermatozoa x 100% .. (2) d. Konsentrasi Spermatozoa Perhitungan  konsentrasi  spermatozoa  dilakukan menggunakan haemocytometer yang bertujuan untuk mengetahui  jumlah  spermatozoa/ml.  Perhitungan spermatozoa yang terdapat pada 5 kotak yaitu 4 kotak di  sudut  dan  1  kotak  ditengah  dihitung  di  bawah mikroskop  dengan  perbesaran  400  x.  Jika  jumlah spermatozoa  dalam  5  kotak  adalah  X  dan  rata-rata adalah  Y,  maka  konsentrasi  dalam  cairan  tersebut adalah Y x 10 6 sel/ml. [19].
Pengenceran dan Pengawetan Spermatozoa Spermatozoa  diencerkan  menggunakan  larutan pengencer  Tris  kuning  telur  yang  telah  ditambahkan vitamin C masing-masing dosis perlakuan. Perbandingan spermatozoa dengan larutan pengencer yaitu  1:1.  Spermatozoa  yang  telah  diencerkan kemudian disimpan pada suhu 5 o C selama waktu yang ditentukan [10]. Pengamatan  Kualitas  Spermatozoa  seteleh pengenceran
Pengamatan kualitas spermatozoa setelah pengenceran meliputi persentase motilitas spermatozoa,  persentase  viabilitas  spermatozoa  dan persentase abnormalitas selama 5 waktu penyimpanan.
Waktu penyimpanan yang digunakan pada penelitian ini mengacu pada Rahardianto et al ., [15] yaitu 0 jam, 12 jam, 24 jam, 36 jam dan 48 jam.

## Parameter Uji
Parameter  yang  menjadi  indikator  spermatozoa memiliki  kualitas  baik  untuk  dilakukan  preservasi adalah  kualitas  spermatozoa  dengan  persentase motilitas dan daya hidup ˃ 70% [20], serta  persentase abnormalitas adalah ˂ 30% [21].
Analisis Data
Persentase kualitas spermatozoa dengan penambahan  beberapa  dosis  vitamin  C  dalam pengencer  Tris  kuning  telur  dianalisis  menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA) dengan tingkat akurasi 95%. Apabila terdapat perbedaan pada masing-masing perlakuan, maka dilakukan uji lanjut menggunakan uji Duncan untuk  mengetahui  signifikansi  konsentrasi Vitamin  C  antar  kelompok  perlakuan  pada  setiap parameter uji. Analisis statistik dilakukan menggunakan SPSS Window Version 15.0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan  Kualitas  Spermatozoa  Sebelum Proses Pengenceran Sebelum  dilakukan  preservasi  dan    pengenceran dilakukan  evaluasi  terlebih  dahulu  terhadap spermatozoa  mencit  ( M.  musculus L.)    untuk menentukan  kualitas  spermatozoanya.  Evaluasi  yang dilakukan  meliputi    persentase  motilitas,  persentase daya hidup , persentase abnormalitas dan konsentrasi spermatozoa. Hasil pengamatan kualitas spermatozoa kauda  epididimis  sebelum  pengenceran  dapat  dilihat pada Tabel 1.
Tabel  1.  Kualitas  spermatozoa  kauda  epididimis mencit    ( Mus  musculus L.)  sebelum pengenceran Kualitas Spermatozoa Rata-rata ± SD Motilitas (%) 71,60 C 7,47 Daya Hidup (%) 71,50 ± 12,94 Abnormalitas (%) 17,70 ± 6,76 Kosentrasi (per ml) 51,7 x 10 6 ± 32,10
Berdasarkan  data  kualitas  spermatozoa  kauda epidimis pada Tabel 1 di atas, dapat diketahui bahwa spermatozoa  mencit  ( M.  musculus L.)  yang  akan digunakan penelitian memiliki kualitas yang baik dan memenuhi syarat untuk dilakukan preservasi. Hal ini
sesuai dengan indikator spermatozoa yang baik yaitu persentase motilitas dan daya hidup adalah ˃ 70% [20], persentase  abnormalitas  adalah ˂ 30%  [21]  serta konsentrasi  spermatozoa  kauda  epididimis  pada hewan mamalia berkisar 10-50 juta sel/ml [14].

## Pengamatan  Kualitas  Spermatozoa  Setelah Proses Pengenceran
Selama masa preservasi, evaluasi terhadap  kualitas spermatozoa  setelah  proses  pengenceran  meliputi persentase  motilitas,  persentase  daya  hidup  dan persentase abnormalitas yang dilakukan pada waktu 0 jam,  12  jam,  24  jam,  36  jam  dan  48  jam.  Hasil pengamatan  kualitas  spermatozoa  kauda  epididimis yang dipreservasi hingga 48 jam penyimpanan dapat dilihat pada Tabel 2.
Pengaruh  Konsentrasi  Vitamin  C  Terhadap Kualitas Spermatozoa Pengaruh konsentrasi vitamin C terhadap kualitas spermatozoa  mencit  meliputi  motilitas,  daya  hidup dan  abnormalitas  dapat  dilihat  berdarasakan  nilai presentase yang didapatkan pada Tabel 2. Berdasarkan Tabel  2  menunjukkan  bahwa  rerata  persentase motilitas  spermatozoa  semakin  meningkat  seiring meningkatnya konsentrasi vitamin C yang digunakan pada lama penyimpanan 12 dan 24 jam dengan nilai rerata persentase tertinggi pada konsentrasi 2 mg yaitu 79,00%  (penyimpanan  0  Jam)  dan  44,40% (penyimpanan  48  jam).  Begitu  pula  untuk  rerata presentase  daya  hidup  spermatozoa  juga  meningkat seiring meningkatnya konsentrasi vitamin C pada lama penyimpanan 12  dan 24  jam.  Nilai  rerata  persentase daya  hidup  spermatozoa  paling  tinggi  untuk penyimpanan 0 - 36 jam yaitu pada konsentrasi 2 mg dengan nilai berturut-turut 80,20%; 79,40%, 75,60% dan  67,80%.  Sedangkan  pada  penyimpanan  48  jam nilai  rerata  persentase  daya  hidup  spermatozoa tertinggi  pada  konsentrasi  vitamin  C  0,5  mg  yaitu 54,40%.  Nilai  rerata  persentase  abnormalitas spermatozoa  dapat  menurun  seiring  meningkatnya konsentrasi  vitamin  C  yang  digunakan  hanya  pada penyimpanan 0 dan 48 jam, dengan nilai terkecil yaitu pada konsentrasi 2 mg berturut-turut sebesar 12,00% dan  13,20%.  Namun  secara  keseluruhan  nilai  rerata presentase  abnormalitas  spermatozoa  paling  kecil yaitu  pada  perlakuan  kontrol  penyimpanan  24  jam yaitu 7,80%.
Tabel  2.  Persentase  motilitas,  daya  hidup  dan  abnormalitas  spermatozoa  mencit Mus  musculus L.)  selama penyimpanan 0 jam, 12 jam, 24 jam, 36 jam dan 48 jam
Lama Penyimpanan (Jam) Dosis Vitamin C (mg) Variabel Kualitas Spermatozoa Motilitas (%) Daya Hidup (%) Abnormalitas (%) 0 0 72,20 ± 8,78 b 69,90 ± 6,77 b 18,00 ± 8,63 b 0,5 71,60 ± 5,68 a 72,60 ± 1,64 a 15,40 ± 7,70 b 1 72,20 ± 8,70 a 72,00 ± 1,18 a 11,20 ± 3,89 b 2 79,00 ± 7,77 a 80,20 ± 9,28 a 12,00 ± 5,70 b 12 0 69,69 ± 4,39 b 72,80 ± 8,78 b 10,80 ± 8,93 b 0,5 70,60 ± 4,33 a 71,40 ± 1,86 a 18,60 ± 7,64 a 1 72,00 ± 6,82 a 73,60 ± 1,35 a 23,00 ± 1,43 b 2 74,40 ± 3,97 a 79,40 ± 9,86 a 18,60 ± 7,30 b 24 0 56,40 ± 8,90 a 43,00 ± 5,15 a 7,80 ± 2,59 b 0,5 62,00 ± 5,96 a 69,00 ± 1,62 a 14,00 ± 8,94 a 1 63,60 ± 0,99 a 52,80 ± 1,27 b 14,00 ± 8,94 b 2 67,00 ± 2,12 a 75,60 ± 1,00 a 10,20 ± 4,55 a 36 0 45,80 ± 8,22 a 33,70  ± 2,44 a 16,00 ± 8,75 b 0,5 52,80 ± 3,03 a 66,90 ± 1,58 a 14,40 ± 2,41 b 1 46,60 ± 6,35 a 45,20 ± 1,48 b 16,80 ± 9,63 b 2 52,80 ± 9,04 a 67,80 ± 1,29 a 12,20 ± 4,55 b 48 0 41,60 ± 5,64 a 18,60 ± 8,90 a 20,00 ± 9,98 b 0,5 43,40 ± 2,97 a 54,40 ± 1,14 a 20,80 ± 7,26 b 1 40,49 ± 1,00 a 12,20 ± 3,86 a 19,00 ± 6,63 a 2 44,40 ± 1,04 a 44,40 ± 1,73 a 13,20 ± 6,32 b Superskrip ( a,b ) yang berbeda dalam kolom yang sama pada masing-masing variable kualitas spermatozoa menunjukkan berbeda nyata (P ˂ 0,05).
Pengambilan
sampel spermatozoa kauda epididimis  dari  mencit  ( Mus  musculus L.)  dilakukan dengan  melalui  teknik  maserasi.  Spermatozoa  yang telah diambil, diberikan perlakuan larutan pengencer tris  kuning  telur  yang  telah  ditambah  vitamin  C berbagai dosis kemudian segera disimpan pada suhu 5 o C.  Sisa  dari  spermatozoa  yang  tidak  disimpan digunakan sebagai evaluasi awal sebelum pengenceran guna  mengetahui  kualitas  spermatozoa  berdasarkan standar  preservasi.  Spermatozoa  yang  berasal  dari epididimis  ini  hanya  mengandung  sedikit  plasma semen,  sedangkan  spermatozoa  yang  diencerkan dalam pengencer tris kuning telur tanpa atau dengan penambahan  vitamin  C  dan  telah  mengalami  masa penyimpanan  selama  beberapa  jam  diduga  telah memanfaatkan kandungan pengencer tris kuning telur. Tris  aminomethan  mempunyai  kemampuan  sebagai penyangga  yang  baik  dengan  toksisitas  yang  rendah. Sementara  itu,  khasiat  kuning  telur  terletak  pada lipoprotein dan lecithin yang terkandung didalamnya, yang  berfungsi  untuk  mempertahankan  dan melindungi integritas selubung lipoprotein spermatozoa  [22].  Spermatozoa  yang  diencerkan dalam  pengencer  tris  kuning  telur  dengan penambahan  vitamin  C  yang  telah  mengalami  masa
penyimpanan  selama  beberapa  jam  diduga  telah memanfaatkan kandungan pengencer serta tambahan antioksidan  yang  berasal  dari  vitamin  C  untuk mempertahankan  motilitas  dan  daya  hidup spermatozoa.    Hal  ini  dapat  dilihat  pada  perlakuan penambahan 1 mg dan 2 mg vitamin C dalam 100 ml pengencer tris kuning telur pada waktu penyimpanan 0  jam  dan  12  jam  menunjukkan  rerata  persentase motilitas dan persentase daya hidup yang lebih tinggi dibandingkan dengan rerata persentase keduanya pada evaluasi sebelum pengenceran (Tabel 1 dan 2).
Hasil  analisis  data  menggunakan  uji  statistic ANOVA (α = 5%) menunjukkan bahwa tidak terdapat perbadaan  yang  signifikan  (P  =  0,309)  >  0,05  pada perlakuan  pemberian  berbagai  dosis  vitamin  C terhadap  abnormalitas  spermatozoa.  Namun,  pada parameter  motilitas  dan  daya  hidup  spermatozoa memiliki nilai yang signifikan dengan nilai P berturut- turut adalah (P = 0.017) > 0,05 dan (P = 0.000) > 0,05. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan vitamin C berbagai  dosis  dalam  larutan  pengencer  tris  kuning telur berpengaruh secara signifikan terhadap motilitas dan daya hidup spermatozoa.
Hasil  uji  lanjut  Duncan  pada  parameter  motilitas dan  daya  hidup  spermatozoa  mencit  menunjukkan
bahwa  dosis  vitamin  C  0  mg  tidak  berbeda  nyata dengan dosis vitamin C 1 mg, namun berbeda nyata dengan dosis vitamin C 0,5 mg  dan 2 mg. Hasil ini membuktikan  bahwa  penambahan  vitamin  C  dalam pengencer  tris  kuning  telur  berpengaruh  terhadap persentase  motilitas  dan  daya  hidup  spermatozoa setelah  penyimpanan  pada  suhu  5°C.  Pemberian vitamin C pada penelitian ini sebagai antioksidan yang dapat menetralisir radikal bebas. Vitamin C atau asam askorbat merupakan senyawa kimia yang larut dalam air [23]. Radikal bebas dapat dikendalikan dan dicegah oleh antioksidan. Salah satu antioksidan yang efektif dalam  mengatasi  radikal  bebas  adalah  vitamin  C. Vitamin  C  merupakan  antioksidan  yang  dapat menetralisir  hidroksil,  superoksid,  dan  radikal hidrogen dan radikal peroksida  [24]. Vitamin C atau asam askorbat non enzimatik pada cairan seminal akan melindungi  spermatozoa  dari  kerusakan  oksidatif. Defisiensi  vitamin  C  akan  mempengaruhi  kualitas spermatozoa,  baik  jumlah,  morfologi  maupun motilitasnya [25].
Pengaruh  Lama  Penyimpanan  Terhadap Kualitas Spermatozoa Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pada perlakuan  kontrol  nilai  persentase  mortalitas spermatozoa menurun seiring lama waktu
penyimpanan. Nilai  persentase daya hidup spermatozoa meningkat pada waktu penyimpanan 12 jam  sebesar  2,9%  dari  waktu  penyimpanan  0  jam, setelah  itu  mengalami  penurunan  hingga  waktu penyimpanan 48 jam. Namun secara keseluruhan nilai persentase  mortalitas  spermatozoa  pada  perlakuan kontrol  lebih  tinggi  dari  pada  nilai  persentase  daya hidup  spermatozoa  (Gambar  1a.).  Pada  perlakuan dosis vitamin C 0,5 mg dan 2 mg, semakin lama waktu penyimpanan,  nilai  persentase  mortalitas  dan  daya hidup  spermatozoa  juga  menurun  dengan  nilai persentase  daya  hidup  spermatozoa  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  nilai  persentase  mortalitas spermatozoa  disetiap  waktu  penyimpanan  (Gambar 1b dan 1d). Namun hal ini berbeda pada dosis vitamin C 1 mg. Nilai persentase mortalitas spermatozoa pada kelompok perlakuan dosis vitamin C 1 mg mengalami penurunan seiring waktu penyimpanan semakin lama. Nilai  persentase  daya  hidup  spermatozoa  pada kelompok perlakuan dosis vitamin C 1 mg meningkat pada  waktu  penyimpanan  12  jam  sebesar  1,6%  dari waktu  penyimpanan  0  jam,  setelah  itu  mengalami penurunan  hingga  waktu  penyimpanan  48  jam, dengan  nilai  penurunan  tertinggi  terjadi  pada  waktu penyimpanan  48  jam  yaitu  33%  dari  waktu penyimpanan 36 jam (Gambar 1c).
Gambar  1.  Grafik  pengaruh  lama  waktu  penyimpanan  terhadap  mortalitas  dan  daya  hidup  spermatozoa,  a. kelompok kontrol, b. kelompok perlakuan dosis Vitamin C 0,5 mg, c. kelompok perlakuan dosis Vitamin C 1 mg, d. kelompok perlakuan dosis Vitamin C 2 mg
Hasil  analisis  data  menggunakan  uji  statistic ANOVA  (α  =  5%)  menunjukkan  bahwa  lama penyimpanan  spermatozoa  dalam  pengencer  tris kuning  telur  berpengaruh  signifikan  terhadap abnormalitas  spermatozoa  (P  =  0,048)  <  0,05; mortalitas spermarozoa (P = 0,000) < 0,05 dan daya hidup spermatozoa (P = 0,000) < 0,05. Hasil uji lanjut Duncan pada  parameter  abnormalitas  spermatozoa menunjukkan  bahwa  lama  penyimpanan  0  jam  tidak berbeda nyata dengan lama penyimpanan 12,jam, 24 jam, 36 jam dan 48 jam tetapi lama penyimpanan 24 jam berbeda nyata dengan penyimpanan 12 jam dan 48  jam.  Hasil  uji  lanjut  pada  parameter  mortalitas spermatozoa menunjukkan bahwa lama penyimpanan 0 jam tidak berbeda nyata dengan lama  penyimpanan 12 jam, tetapi berbeda nyata dengan lama penimpnana 24 jam, 36 jam dan 48 jam.
Hasil uji lanjut Duncan pada parameter daya hidup spermatozoa menunjukkan bahwa lama penyimpanan 0 jam tidak berbeda nyata dengan lama penyimpanan 12  jam,  namun  berbeda  nyata  dengan  lama penyimpanan 24, 36 dan 48 jam. Lama penyimpanan 12 jam tidak berbeda nyata dengan lama penyimpanan 0 jam, namun berbeda nyata dengan 24, 36 dan 48 jam. Lama  penyimpanan  24  jam  tidak  berbeda  nyata dengan  36  jam,  namun  berbeda  nyata  dengan  0, 12, dan  48  jam,  begitu  pula  untuk  hasil  uji  lanjut  lama penyimpanan  36  jam.  Hasil  uji  lanjut  menunjukkan bahwa lama penyimpanan 48 jam berbeda nyata pada lama penyimpanan 0, 12, 24 dan 36 jam.
Suhu  penyimpanan  merupakan  salah  satu  faktor yang  berpengaruh  terhadap  kualitas  sperma.  Untuk mengetahui  pengaruh  lama  penyimpanan  pada  suhu tertentu terhadap kualitas sperma dapat diketahui dari motilitas, mortalitas dan abnormalitas sperma setelah disimpan dalam suhu 5°C. Motilitas menurun seiring dengan  lamanya  penyimpanan.  Menurunnya  daya gerak  atau  motilitasini  dikarenakan  spermatozoa setelah dikeluarkan masih melakukan aktivitaspergerakan  dan  metabolisme.  Aktivitas pergerakan/motilitas  ini  sangat  dipengaruhi  oleh temperatur sekitarnya [26]. Semakin tinggi temperatur penyimpanan maka akan semakin tinggi pula aktivitas pergerakan spermatozoa. Pergerakan ini memerlukan energi  sedangkan  pembentukan  energi  yang diproduksi oleh spermatozoa di luar tubuhnya sangat terbatas.  Selain  itu  hasil  metabolisme  menghasilkan hasil sampingan yaitu berupa asam laktat yang dapat menyebabkan perubahan pH pada medium sekitarnya
[27],  [28].  Angka  pH  ini  akan  mempengaruhi  daya hidup/pergerakan spermatozoa. Menurut Siudzinska dan  Lukaszewicz  [28],  semakin  lama  penyimpanan akan  semakin  banyak  spermatozoa    yang  mati  yang akan  merubah  pH  menjadi  semakin  asam  dan akibatnya akan mematikan spermatozoa lainnya.
Pemberian  Vitamin  C  konsentrasi    0,5  mg,  1  mg dan  2  mg  dalam  100  ml pengencer  tris  kuning  telur mampu  mempertahankan  persentase  motilitas  dan daya hidup , tetapi semakin lama penyimpanan kualitas spermatozoa  mengalami  penurunan.  Konsentrasi vitamin  C    0,5  mg,  1  mg  dan  2  mg  dalam  100  ml pengencer  tris  kuning  telur    merupakan  konsentrasi yang  baik  untuk  mempertahankan  kualitas spermatozoa selama penyimpanan 12 jam, selebihnya akan mengalami penurunan.

## KESIMPULAN
Pemberian  Vitamin  C  konsentrasi    0,5  mg,  1  mg dan  2  mg  dalam  100  ml pengencer  tris  kuning  telur mampu  mempertahankan  persentase  motilitas  dan daya hidup , tetapi semakin lama penyimpanan kualitas spermatozoa  mengalami  penurunan.  Konsentrasi vitamin  C    0,5  mg,  1  mg  dan  2  mg  dalam  100  ml pengencer  tris  kuning  telur    merupakan  konsentrasi yang  baik  untuk  mempertahankan  kualitas spermatozoa selama penyimpanan 12 jam, selebihnya akan  mengalami  penurunan.  Perlu  dilakukan penelitian  lebih  lanjut  agar  meningkatkan  waktu penyimpanan  spermatozoa  dengan  menggunakan vitamin C dan tris kuning telur.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada  DIPA Universitas  Jember  tahun  anggaran  2018  yang  telah memberikan dukungan finansial penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1]  K. Herrmann, F. Pistollato, and M. Stephens, “Beyond the  3Rs:  expanding  the  use  of   humanrelevant replacement  methods  in  biomedical  research,” ALTEX , vol. 36, no. 3, pp. 343-352, 2019.
[2]  L. Fianti, “Efektivitas perasan daun afrika (Vernonia amygdalina  Del)  terhadap  penurunan  kadar  glukosa darah  mencit  ( Mus  musculus ),”  Universitas  Pasundan, 2017.
[3]  D. Nuraisyah, “Motilitas spermatozoa asal epididimis monyet  ekor  panjang  ( Macaca  fascicularis )  dalam pengencer tris kuning telur & midified human turbal fluid,” Institut Pertanian Bogor, 2002.
[4]  Nilna, Standar  operasional  Pekerjaan  Prosesing  Semen . Sumatera Barat: Dinas Peternakan, 2010.
[5]  N. Isnaini, and Suyadi, “Semen ayam kedu pada suhu kamar  dalam  pengencer  Larutan  NaCl  Fisiologi  & Ringer’s,” J. Ternak Trop. , vol. 1, no. 2, pp. 55–56, 2000.
[6]  W. E. Prasetyaningtyas, M. Agus, S. Mokhamad, F. K. Hewan, dan I. P. Bogor, “Karakteristik dan komposisi semen  kancil  (Tragulus  javanicus)  yang  dikoleksi dengan elektroejakulator,” J. Anat. Indones. , vol. 1, no. 1, pp. 30-37, 2012.
[7]  D. Hartanti, E. T. Setiatin, and Sutopo, “Perbandingan penggunaan pengencer semen sitrat kuning telur dan tris  kuning  telur  terhadap  persentase  daya  hidup spermatozoa sapi jawa brebes,” Anim. Agric. J. , vol. 1, no. 1, pp. 33-42, 2012.
[8]  M.  Wibisono,  “Pengaruh  vitamin  c  terhadap  jumlah spermatid  pada  mus  musculus  yang  dipapar gelombang ultrasonik,” J. Kedokt. Yars. , vol. 9, no. 1, pp. 96-103, 2001.
[9]  J. R. Pahlevy, H. Ratnani, T. I. Restiadi, F. Fikri, A. L. Saputro, and B. Agustono, “The addition of  vitamin C in  tris–egg  yolk  extender  maintained  Sapera  goat semen quality in 5° C storage,” Ovozoa  J. Anim. Reprod. , vol. 11, no. 1, pp. 1-8, 2022.
[10] T.  Nugraheni,  O.  P.  Astirin,  and  T.  Widiyani, “Pengaruh vitamin C terhadap perbaikan spermatogenesis  dan  kualitas  spermatozoa  mencit ( Mus musculus L.) setelah pemberian ekstrak tembakau (Nicotiana tabacum L.),” Biofarmasi , vol. 1, no. 1, pp. 1693-2242, 2003.
[11] C.  Nazlie,  S.  Iman,  A.  Srihardi,  and  B.  Arief, “Konsentrasi  dan  kualitas  spermatozoa  kucing domestik (Felis catus) yang diambil dari epididimis dan ductus  deferens  setelah  preservasi  pada  suhu  4 o C,” Biota , vol. XI, no. 1, pp. 34-39, 2006.
[12] W.  M.  M.  Nalley,  R.  Handarini,  T.  L.  Yusuf,  B.
Purwantara, and G. Semiadi, “The Effect of  glycerol concentration in tris glucose egg yolk extender on the quality of  timor deer frozen semen,” J. Indones. Trop. Anim. Agric. , vol. 36, no. 2, 2011.
[13] Nafa  and  Eshre-Siga,  Manual  on  Basic  Semen Analysis.  Cambridge:  Cambridge  University  Press, 2002.
[14] M. Rizal, M. Riyadhi, B. Irawan, A. Wahdi, Habibah, and Herdis, “Daya hidup spermatozoa epididimis sapi persilangan yang dipreservasi dengan air kelapa muda pada suhu 5 o C,” vol. 18, no. 36, pp. 571-579, 2017. [15] A. Rahardhianto, N. Abdulgani, N. Trisyani, J. Biologi,
F.  Matematika,  and  P.  Alam,  “Pengaruh  konsentrasi
larutan madu dalam NaCl fisiologis terhadap viabilitas dan motilitas masa penyimpanan,” J. Sains & Seni , vol. 1, no. 1, 2012.
[16] Hidayaturrahmah,  “Waktu  motilitas  dan  viabilitas spermatozoa  ikan  mas  ( Cyprinus  carpio L.)  pada beberapa konsentrasi larutan fruktosa,” Bioscientiae , vol. 4, no.1, pp. 9-18, 2007.
[17] M.  Surachman,  M.  Rizal,  and  H.  Maheshwari, “Kualitas  semen  cair  asal  epididimis  kerbau  belang dalam  bahan  pengencer  andromed  yang  mendapat penambahan sukrosa,” Media Peternakan, vol. 32, no. 2, pp. 88-94, 2009.
[18] R.  I.  Arifiantini  and  F.  Ferdian,  “Tinjauan  aspek morfologi dan morfometri spermatozoa kerbau rawa ( Bubalus  Bubalis )  yang  dikoleksi  dengan  Teknik Masase”, Scientific Repository , 2006.
[19] H.  S.  Condro,  A.  S.  Mubarak,  and  L.  Sulmartiwi,
“Pengaruh penambahan madu pada media pengencer nacl  fisiologis  dalam  proses  penyimpanan  sperma terhadap kualitas sperma ikan komet ( Carassius auratus auratus ),” Media Journal of  Marine and Coastal Science, vol. 1, no. 1, pp. 1-12, 2012.
[20] J. A. Delgadillo, B. Leboeuf, P. Chemineau, and L. N. R. A. R. Physiology, “Abolition of  seasonal variations in semen quality and maintenance of  sperm fertilizing ability  by  photoperiodic  cycles  in  goat  bucks,” Small Ruminant Research , vol. 9, no. 1, pp. 47-59, 1992.
[21] R.  Menkveld,  C.  A.  G.  Holleboom,  and  J.  P.  T. Rhemrev,  “Measurement  and  significance  of   sperm morphology,” Asian J. Androl. , vol. 13, no. 1, pp. 59-68, 2011.
[22] R.  I.  Arifiantini  and  T.  Yusuf,  “Keberhasilan penggunaan tiga pengencer dalam dua jenis kemasan pada  proses  pembekuan  semen  sapi,” Majalah  Ilmiah Peternakan , vol. 9, no.3, pp. 1-11, 2006.
[23] M.  Aina  and  D.  Suprayogi,  “Uji  kualitatif   vitamin  c pada  berbagai  makanan  dan  pengaruhnya  terhadap pemanasan,” Sainmatika , pp. 61-67, 2014.
[24] J. H. Siregar, “Pengaruh pemberian vitamin c terhadap jumlah  sel  leydig  dan  jumlah  sperma  mencit  jantan dewasa ( Mus musculus L.) yang dipapari Monosodium Glutamate (MSG),” Universitas Sumatera Utara, 2009.
[25] A. H. Colagar and E. T. Marzony, “for Acid Ascorbic Seminal Plasma : Determination and Its Relationship to Sperm Quality,” no. September, pp. 144-149, 2009.
[26] P.  R.  Dumpala,  H.  M.  Parker,  dan  C.  D.  McDaniel, “The effect of  semen storage temperature and diluent type  on  the  sperm  quality  index  of   broiler  breeder semen,” Int.  J.  Poult.  Sci. ,  vol.  5,  no.  9,  pp.  838-845, 2006.
[27] A. Latif, A. Ijaz, M. Aleem, and A. Mahmud, “Effect of  osmotic pressure and ph on the short-term storage
and  fertility  of   broiler  breeder  sperm,” Pakistan Veterinary , vol. 25, no. 4, pp. 4-7, 2005.
[28] A. Siudzinska and E. Łukaszewicz, “Effect of  semen extenders and storage time on sperm morphology of four  chicken  breeds,”  Journal  of   Applied  Poultry Research, vol. 17, no 1, pp. 101-108, 2008.