Jurnal Farmasi,  e-ISSN: 2655-0814 Vol. 4 No.1 Edisi Mei-Oktober 2021 http://ejournal.medistra.ac.id/index.php/JFM ============================================================================================ Received: 26 April 2021 :: Accepted: 21 Juni 2021 :: Published: 31 Oktober 2021
Diagnosa Vibrio cholerae Dengan Metode Kultur Dan PCR Pada Sampel Sumber Air Minum
DESI YUSNITA 1 , VISENSIUS KRISDIANILO 2
Institut Kesehatan Medistra Lubuk Pakam Jl. Sudirman No.38 Lubuk Pakam Pekan, Deli Serdang, Sumatera Utara e-mail :desiyusnitaa54@gmail.com
DOI : https://doi.org/10.35451/jfm.v4i1.669

## Abstract
Acute  diarrhea  due  to  infection  can  be  caused  by  a  bacterial,  viral  or parasitic infection. One of the bacteria that causes diarrhea is Vibrio cholerae and usually the diarrhea caused is called cholera diarrhea. Cholera diarrhea is caused  by  enterotoxins  produced  by V.  cholerae bacteria  and  forms  colonies inside the small intestine. Symptoms include vomiting, defecation such as large amounts of rice water resulting in dehydration, electrolyte loss and increased blood acidity. In severe cases, the sufferer continuously defecates accompanied by vomiting, so that the sufferer will lose fluids and electrolytes quickly from the gastrointestinal tract. This leads to a rationing of metabolic acidity and when left untreated can lead to death. V. cholerae bacteria are not invasive, do not enter the bloodstream but remain in the intestinal tract. At the time of infection through contaminated food and beverages ingested, then after passing through the stomach acid defense V. cholerae produces two virulence factors that cause cholera,  namely  coregulated  pilus  toxin  (TCP)  and  cholera  toxin  (CT).  The existence of specific enterotoxin cholera only found in V. cholerae pathogens can be targeted in laboratory tests for the diagnosis of pathogenic V. cholerae bacteria using biomolecular techniques such as polymerase chain reaction (PCR) methods. From the results of the examination of drinking water samples at the drinking water depot around the bottom of the pakam, obtained the results of the PCR examination confirmed by electrophorensis is 302 bp, which means that in the sample there are bacteria that are identic with Vibrio cholera .
Keywords : Vibrio cholera, PCR
Jurnal Farmasi,  e-ISSN: 2655-0814 Vol. 4 No.1 Edisi Mei-Oktober 2021 http://ejournal.medistra.ac.id/index.php/JFM ============================================================================================ Received: 26 April 2021 :: Accepted: 21 Juni 2021 :: Published: 31 Oktober 2021

## 1.LATAR BELAKANG
Diare  akut masih  menjadi permasalahan bagi sebaian masyarakat di  Negara  berkembang.  Terdapat beberapa  mikroorganisme  yang  dapat menyebabkan diare salah satunya Vibrio cholera, penyakit yang ditimbulkan oleh bakteri ini dikenal dengan diare kolera. Diare  kolera  timbul  karena  bakteri tersebut  berkembang  dalam  usus  kecil dan  juga  memproduksi  enterotoksin. Akibat  yang  ditimbulkan  dari  adanya enterotoksin  dalam  tubuh  ialah  timbul muntah,  serta  buang  air  besar  dengan jumlah  yang  banyak  dan  berwarna seperti air cucian beras, bila munta dan diare dalam waktu yang lama mengakibatkan  naiknya  keasaman  dan akan kehilangan banyak elektrolit dalam
tubuh.  Bila  keadaan  ini  makain  parah
dapat
menyebabkan kematian (Sumarsono, 1996 dan Pelezar, 2005).
Vibrio  cholerae secara  morfologi
termasuk kedalam bakteri gram negative  berbentuk  batang  bengkon seperti koma, ukuran bakteri ini 0,5 µm x  1,5  sampai  3,0  µm, Vibrio  cholerae hidup  secara  aerob  dan  juga  anaerob fakultatif,  bakteri  ini  dapat  bergerak karena terdapat flagel monotrik, bakteri ini  dapat  tumbuh  pada  suhu  18-37ºC, pada biakan yang sudah lama bakteri ini dapat  berubah  ke  bentuk  batang  lurus dan  juga  bakteri  ini  tidak  dapat menghasilkan spora (Matson, 2007).
Vibrio cholerae terdapat hidup di usus  dan  tidak  dapat  masuk  kedalam aliran (Lindmark, 2009). Toxin coregulated  pilus  (TCP)  dan  cholera toxin  (CT)  dihasilkan  dari  kontaminasi Vibrio  cholera yang  maasuk  melalui makanan  ataupun  minuman  yang kemudian dapat melewati asam lambung dalam tubuh  (Chauduri, 2009 dan  Walia,  1999).  cholera  enterotoksin yang  hanya  ada    pada  V.  cholerae pathogen,  menjadi  target  identifikasi dalam pemeriksaan laboratorium untuk mengidentifikasi  bakteri V.  cholerae pathogen, teknik yang digunakan untuk identifikasi  tersebut  adalah  metode polymerase chain reaction (PCR) (Chomvarin, 2007 dan Marashi, 2013).

## 2.METODE
Pembiakan Bakteri
Sampel  air  minum  pada  depot disekitar  lubuk  pakam  diambil  masing masing 50 ml
kemuadian dihomogenkan,  selanjutnya  sampel ditanam  terlebih  dahulu  pada  media pembenihan  berisi  alkaline  peptone water  (APW)  lalu  diinkubasi  pada  suhu 37 ℃ selama 18-24 jam. Hasil pembenihan  disubkultur  ke  media thiosulfate-citrate-bile-sucrose  (TCBS) lalu  diinkubasikan  pada  suhu  37 ℃ selama 18-24 jam.
Uji Biokimia
Biakan  bakteri  hasil  kultur  pada media  TCBS  di  tanam  pada  media
Jurnal Farmasi,  e-ISSN: 2655-0814 Vol. 4 No.1 Edisi Mei-Oktober 2021 http://ejournal.medistra.ac.id/index.php/JFM ============================================================================================ Received: 26 April 2021 :: Accepted: 21 Juni 2021 :: Published: 31 Oktober 2021
biokimia  seperti  uji  Kligler  Iron  Agar (KIA),  uji  oksidase,  uji  pertumbuhan dengan  tidak  menambahkan  NaCl,  uji Sucrose  Semi  Solid(SSS),  uji    Motility
Indole Ornithine (MIO), uji dekarboksilasi (lysine, arginine,
ornithine  ),  serta  uji  maltose,  dan arabinose.
Untuk  Identifikasi  molekuler  secara Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)
menggunakan kit Invitrogen.
Selanjutnya  Primer  akan  diencerkan sesuai dengan instruksi  pada kit dalam tube master. Kemudian melalui tahapan predenaturasi pada suhu 94 o C selama 5 menit, untuk proses denaturasi berlangsung  pada  suhu  94 o C  selama  1 menit,  proses  annealing  (pengikatan) berlangsung pada 55 o C selama 1 Menit,
kemudian proses extention
(pemanjangan) berlangsung  pada suhu
72 o C  selama  1  Menit,  dan  proses
elongation
(pemanjangan
akhir) berlangsung  pada  suhu  72 o C  selama  7 menit.  Siklus  pada  Proses  PCR  terjadi sebanyak  35  siklus.  Setelah  proses pemanjangan  rantai  kemudian  proses selanjutnya identifikasi secara elektroforeses  dengan  terlebih  dahulu menyiapkan Gel agarosa 2% kemudian diletakan  pada    alat  elektroforesis. Proses  selanjutnya  mengambil  sampel sampel  sebanyak  9  µL  yang  sudah
homogen dengan blue juice sebanyak 1 µL kemudian dimasukkan ke dalam well (sumur). Proses deteksi secara Elektroforesa
dilakukan dengan tegangan  100  volt  dan  berlangsung sekitar 45 menit. Setelah proses selesai gel  kkemudian  dimasukan  ke  alat pengamat  DNA  (Gel  Doc)  dan  diamati dengan lampu UV. Hasil yang didapatkan selanjutnya akan dibandingkan dengan pita standar Vibrio cholera .

## 3.HASIL DAN PEMBAHASAN
Gambar  1.  Hasil  penanaman sampel pada media TCBS
Hasil identifikasi sampel pada air minum didapat  morfologi  pada  media  TCBS adalah  permukaan  halus,  agak  datar, bagian tengah koloni buram dan bagian pinggir  koloni  terang  serta  berwarna kuning, hasil dapat dilihat pada gambar 1
Tabel 1. Hasil Uji Biokimia
UJI BIOKIMIA HASIL OKSIDASE +
Jurnal Farmasi,  e-ISSN: 2655-0814 Vol. 4 No.1 Edisi Mei-Oktober 2021 http://ejournal.medistra.ac.id/index.php/JFM ============================================================================================ Received: 26 April 2021 :: Accepted: 21 Juni 2021 :: Published: 31 Oktober 2021

## PERTUMBUHAN  TANPA  PENAMBAHAN
NaCl
Klingler Iron Agar (KIA) Motility Indole Ornithine (MIO) Sucrose Semi Solid (SSS)
Lysine Arginine Ornithine Maltose arabinose + Alkali/ Asam +++ + + - + + -
Hasil  uji  biokimia  dari  isolate hasil kultur dari sampel air minum pada media uji oksidase, pertumbuhan tanpa penambahan  NaCl,  KIA  (Kligler  Iron Agar),  MIO  (Motility  Indole  Ornithine), SSS  (Sucrose  Semi  Solid),  lysine, arginine, ornithine, maltose, dan arabinose,  sebagian  besar  hasilnya positif  kecuali  pada  uji  arginine  dan arabinose  yang  menunjukan  hasil negative.
Gambar  2.  Hasil  elektroforensis sampel bakteri
Hasil  uji  PCR  Pada  sampel  yang di  deteksi  dengan  elektroforensis menggunakan  sinar  UV,  didapatkan panjang  pita  pasangan  basa  DNA  yang nantinya  dibandingkan  dengan  pita standard, untuk hasil identifikasi didapatkan  pita  sepanjang  302  bp,
sedangkan untuk panjang  pita standar V. cholera sekitar 302 bp, yang berarti hasil  identifikasi  pada  sampel  bakteri tersebut  identic  dengan  bakteri Vibrio
cholera . Polymerase Chain Reaction
(PCR)  menjadi  metode  baku  dalam proses  amplifikasi  urutan  basa  DNA tertentu  (selektif).  Polymerase  Chain Reaction (PCR) digunakan  pertama kali oleh  Kary  Mullis  di  tahun  1987. Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat menggandakan jumlah urutan nukleotida  atau  urutan  basa  tertentu secara in vitro (didalam tabung). Proses penggandaan  urutan  basa  tersebut terjadi dengan adanya reaksi polimerisasi  secara  berulang-ulang  dan berantai selama beberapa siklus, dalam setiap  reaksi  polimerisasi  memerlukan untai  DNA  yang  nantinya  digunakan sebagai  template  (cetakan)    (Sachse, 2010).
Keunggulan diagnosis DNA menggunakan metode PCR pada identifikasi  bakteri V.  cholerae yaitu
Jurnal Farmasi,  e-ISSN: 2655-0814 Vol. 4 No.1 Edisi Mei-Oktober 2021 http://ejournal.medistra.ac.id/index.php/JFM ============================================================================================ Received: 26 April 2021 :: Accepted: 21 Juni 2021 :: Published: 31 Oktober 2021
proses  yang  dibutuhkan  relative  cepat dan metode ini memiliki sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi
jika
dibandingkan  dengan  metode  kultur (pembiakan)  yang  menjadi  metode baku  emas  (gold  standard)  pada identifikasi  bakteri  (Kaper,1995  dan Rosilawati, 2002).

## 4.KESIMPULAN
Dari  hasil  pemeriksaan  sampel air  minum  pada  depot  air  minum disekitar lubuk pakam, didapatkan hasil dari pemeriksaan PCR yang dikonfirmasi dengan  elektroforensis  adalah  302  bp, yang  berarti  pada  sampel  tersebut terdapat  bakteri  yang  identic  dengan Vibrio cholera.

## DAFTAR PUSTAKA
Chomvarin C, Namwat W, Wongwajana S,  Alam  M,  Thaew-Nonngiew  K,
Sinchaturus A, Engchanil C.
Application  of  duplex-PCR  in  rapid and  reliable  detection  of  toxigenic Vibrio  cholerae  in  water  samples  in Thailand.  J.  Gen.  Appl.  Microbiol. 2007; 53: 229±237.
Kaper  JB,  Morris  JG,  Levine  MM.
Cholera. Clinical Microbiology
Reviews. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1):48.
Lindmark  Barbro.  Modulators  of  Vibrio cholerae  Predator  iInteraction  and
Virulence.  Sweden:  Department  of
Molecular  Biology  Umea  University; 2009.
Marashi  SMA,  Rajabnia  R,  Fooladi  AAI, Hojati  Z.  Determination  of  ctxAB
Expression in Vibrio cholerae
Classical  and  ElTor  Strains  using Real  Time  PCR.  Int  J  Mol  Cell  Med. 2013;2: 9-13.
Matson  JS,  Withey  JH,  DiRita  VJ. Regulatory  Networks  Controlling Vibrio  cholerae  Virulence  Gene Expression. Infection and Immunity. 2007; 75(12): 5542±49.
Pelczar J.M. Dasar ± Dasar Mikrobiologi.
Jakarta: Universitas Indonesia, 2005. Rosilawati ML, Sudarmono P, Ibrahim F. Sensitivitas metode PCR (Polymerase  chain  reaction)  dalam mendekteksi isolatklinis Mycobacterium tuberculosis. J Kedokteran Trisakti. 2002;.21(1)
Sachse K, Nat R, Frey J. PCR detection of  microbial  pathogens.  Humana Press; 2010.
Soemarsono H. Kolera: dalam Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Jakarta: Balai Penerbit FKUI, 1996. p. 443