# Korespondensi:  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,
Universitas  Bung  Hatta.  Gedung  B  Kampus  I,  Jl.  Sumatera  Ulak Karang  Padang,  Sumatera  Barat  25133,  Indonesia.
Tel.  +  62  751  7051678 E-mail:  yusra@bunghatta.ac.id
Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra

## KEMAMPUAN Bacillus subtilis  VITNJ1 DARI  SALURAN  PENCERNAAN IKAN  NILA DALAM  MEMPRODUKSI  ENZIM  PROTEASE
Yusra # dan  Yempita  Efendi
Program Studi Pemanfaatan Sumberdaya Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Bung Hatta Gedung B Kampus I, Jl. Sumatera Ulak Karang Padang, Sumatera Barat 25133
(Naskah diterima: 21 Maret 2019; Revisi final: 30 Juli 2019; Disetujui publikasi: 1 Agustus 2019)

## ABSTRAK
Bacillus subtilis strain VITNJ1 merupakan bakteri potensial yang berasal dari saluran pencernaan ikan nila (Oreochromis niloticus).  Penelitian ini  bertujuan  untuk menganalisis  aktivitas  enzim  protease dari  bakteri Bacillus subtilis strain VITNJ1. Metode yang digunakan adalah eksperimental, data dianalisa secara deskriptif kuantitatif. Hasil  penelitian menunjukkan  B. subtilis  strain  VITNJ1 memiliki  kemampuan produksi  enzim protease  yang diukur  dari  indeks proteolitiknya  yakni  sebesar  26 mm.  Waktu  inkubasi optimum  enzim protease bakteri B. subtilis strain VITNJ1 dicapai pada jam ke-54 dengan aktivitas enzim protease sebesar 9,10 U/mL; kadar protein 110,64 mg/mL; dan aktivitas spesifik sebesar 0,082 U/mg; dan diharapkan dapat dijadikan sebagai probiotik untuk budidaya ikan nila.
KATA KUNCI: kemampuan; enzim; protease; Bacillus subtilis VITNJ1; nila
ABSTRACT: The ability of Bacillus subtilis VITNJ1 derived from digestive tract tilapia to produce protease. By: Yusra and Yempita Efendi
Bacillus subtilis strain VITNJ1 is a potential bacterium derived from nile tilapia’s (Oreochromis niloticus) digestive tract and known to have proteolytic activity. This research aimed to determine the protease activity of B. subtilis strain VITNJ1  bacterium.  The method  used were  experimental design,  the data  were analyzed  in quantitative  descriptive. The research result confirms that B. subtilis strain VITNJ1 can produce protease. The proteolytic activity was 26 mm. The optimum incubation period of B. subtilis strain VITNJ1 was obtained at hour-54 with the proteolytic enzyme activity of 9.10 U/mL, the protein concentration of 110.64 mg/mL, and the specific activity of 0.082 U/mg. This research suggests that the bacteria strain could be used as an alternative probiotic bacterium in nile tilapia farming.
KEYWORDS: ability; enzyme; protease; Bacillus subtilis VITNJ1; nile

## PENDAHULUAN
Saluran  pencernaan  ikan  mengandung  sejumlah bakteri  yang  dapat  dimanfaatkan  sebagai  agen probiotik  pada  budidaya  ikan  nila.  Probiotik  adalah mikroorganisme  yang  memiliki  kemampuan memelihara  keseimbangan  mikroflora  normal  usus, menghambat  bakteri  patogen,  dan  meningkatkan sistem  imun  (Rolfe,  2000).  Mikroorganisme  yang terdapat di dalam saluran pencernaan ikan berasal dari lingkungan  perairan  dan  dari  makanan.  Saluran pencernaan  yang  banyak  mengandung  makanan merupakan  tempat  yang  baik  untuk  pertumbuhan mikroorganisme. Karena pH saluran pencernaan yang
sangat  asam,  menyebabkan  hanya  sedikit  bakteri probiotik  yang  mampu  bertahan  dengan  kondisi tersebut (Fukami et al., 2002).
Prinsip dasar kerja probiotik adalah pemanfaatan kemampuan  mikroorganisme  dalam  memecah  atau menguraikan rantai panjang karbohidrat, protein, dan lemak karena adanya enzim-enzim khusus yang dimiliki oleh  mikroba  untuk  memecah  ikatan  tersebut (Effendie,  2002).  Protease  merupakan  enzim proteolitik  yang  mengkatalisis  pemutusan  ikatan peptida pada protein menjadi oligopeptida dan asam amino. Protease yang aktif dapat ditemukan di saluran pencernaan.  Protease  tidak  hanya  berperan  dalam proses  metabolisme  seluler  pada  ikan,  namun  juga dapat diaplikasikan dalam bidang industri perikanan. Aplikasi  bioteknologi  enzim  protease  yang  berasal dari  beberapa  bahan  pangan  dapat  digunakan  di antaranya pada industri pembuatan detergen, industri
penyamakan kulit, bahan aditif pada industri pangan, farmasi, pertanian, dan perikanan (Gupta et al., 2002; Bhaskar et al., 2007; Jellouli et al., 2009).
Mikroorganisme  merupakan  sumber  enzim  pro- tease yang paling potensial. Beberapa strain mikroba yang  mampu  menghasilkan  protease  di  antaranya adalah  Bacillus  licheniformis,  Bacillus  firmus,  Bacillus alcalo,  Bacillus  subtilis,  Bacillus  thuringiensis,  dan Pseudomonas  sp.  (Said  &  Likadja,  2012).  Beberapa enzim  protease  komersial  berhasil  dimurnikan, misalnya alcalase dari  Bacillus licheniformis,  esperase dari  Bacillus  lentus,  biofeed  pro  dari  Bacillus licheniformis,  dan  subtilisin  dari  Bacillus  alcalophilus (Gupta et al., 2002). Bakteri Bacillus sp. L21 dan Bacil- lus licheniformis dapat menghasilkan enzim protease yang bersifat tahan basa dan halotoleran (Tari et al., 2005; Suganthi et al., 2013).
Penelitian tentang produksi enzim dari bakteri yang berasal  dari  saluran  pencernaan  ikan  telah  banyak dilakukan (Bairagi et al., 2002; Mondal et al., 2008; Ray et al., 2010; Ray et al., 2012). Dari saluran pencernaan ikan Terapon jarbua ditemukan Brevibacillus parabrevis dan dari ikan Mystus gulio ditemukan bakteri Bacillus licheniformis yang dapat menghasilkan enzim protease (Das et  al.,  2013).  Sementara itu,  informasi  tentang produksi  enzim  yang  berasal dari  bakteri  usus  ikan air tawar masih minim (Balaji et al., 2012; Chovatiya et al.,  2014).  Dari  saluran  pencernaan  ikan  nila (Oreochromis niloticus) yang dibudidayakan di keramba jaring apung Danau Maninjau ditemukan satu isolat bakteri potensial yakni isolat B. subtilis strain VITNJ1 (Efendi & Yusra, 2014). Penelitian ini bertujuan untuk untuk  menganalisis  aktivitas  enzim  protease  dari bakteri B. subtilis strain VITNJ1, sehingga diharapkan dapat dijadikan sebagai kandidat probiotik.

## BAHAN DAN METODE

## Isolat  Bakteri  Bacillus  subtilis  VITNJ1
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat  bakteri  terpilih  B.  subtilis  strain  VITNJ1  yang diisolasi  dari  saluran  pencernaan  ikan  nila.  Isolat bakteri tersebut dikultur dalam medium skim milk agar (SMA) (5,0 g pepton; 3,0 g yeast extract; 1,0 g skim milk powder).

## Pengukuran  Enzim  Protease  Secara  Kualitatif
Isolat  bakteri  B.  subtilis  strain  VITNJ1  dikultur menggunakan medium SMA dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Aktivitas proteolitik ditunjukkan dengan  luas  zona  bening  yang  terbentuk  di  sekitar koloni.  Indeks  proteolitik  dihitung  dengan
perbandingan diameter zona bening dengan diameter koloni bakteri (Atlas, 1997).

## Waktu  Optimum  untuk  Menghasilkan  Enzim Protease
Metode  penentuan  waktu  optimum  untuk menghasilkan protease dengan menggunakan medium luria bertani (LB) sebanyak 90 mL dan ditambahkan 10 mL  inokulum  biakan  B.  subtilis  strain  VITNJ1  dalam erlemeyer  dan diinkubasi  menggunakan  water  shaker pada suhu 37°C selama 64 jam. Pengamatan dilakukan setiap enam jam, dan diukur nilai optical density (OD)- nya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang  660  nm.  Blanko  yang  digunakan  adalah medium LB tanpa penambahan inokulum bakteri.

## Aktivitas  Enzim  Protease  Secara  Kuantitatif
Sebanyak 0,2 mL enzim direaksikan dengan 1 mL subtrat kasein hammerstein dan 1 mL buffer, inkubasi pada  suhu  37°C  selama  10  menit,  kemudian ditambahkan 0,2 MTCA. Selanjutnya larutan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama10 menit, kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm 10 menit. Supernatan yang terbentuk selanjutnya ditambahkan  ke  dalam  tabung  reaksi  yang  berisi Na 2 CO 3 0,4M;  pereaksi  folin  ciocalteau  (1:2);  dan diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  20  menit.  Hasil inkubasi diukur  dengan spektrofotometer  pada  = 578  nm.  Satu  unit  aktivitas  protease  didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu µmol produk tirosin per menit pada kondisi optimum pengukuran  dengan  menggunakan  substrat  kasein (Lowry et al., 1951; Mohapatra et al., 2003).

## Karakteristik  Protein  Enzim  Protease
Kadar  protein  ditentukan  dengan  menggunakan bovine  serum  albumin  (BSA)  sebagai  standar  protein. BSA  ditimbang  sebanyak  100  mg  dan  selanjutnya ditambahkan  sebanyak  25  mL  aquades.  Larutan tersebut kemudian dikocok secara perlahan-lahan dan diencerkan sampai volume 50 mL. Konsentrasi akhir larutan  stok  untuk  standar  ini  adalah  2  mg/mL. Kemudian  sederetan  larutan  standar  dibuat  dengan menggunakan larutan stok di atas. Selanjutnya larutan dipipet sebanyak  0,1 mL  dan dimasukkan  ke dalam tabung reaksi, tambahkan dengan pereaksi Bradford sebanyak  5  mL.  Blanko  dibuat  dengan  cara mencampurkan  sebanyak  0,1  mL  dan  direaksikan dengan  5  mL  pereaksi  Bradford.  Setelah  dibiarkan kurang  lebih  lima  menit,  masing-masing  campuran reaksi  diukur  absorbansinya  pada  =  595  nm (Bradford, 1976).

## HASIL DAN BAHASAN
Pengukuran  Enzim  Protease  Secara  Kualitatif
Bakteri  B.  subtilis  strain  VITNJ1  mempunyai kemampuan  menghasilkan  enzim  proteolitik ekstraseluler. Aktivitas kualitatif protease dari isolat bakteri  B.  subtilis  strain  VITNJ1  menggunakan  SMA dapat dilihat pada Gambar 1.
Aktivitas  enzim  protease  dari  bakteri  B.  subtilis strain VITNJ1 diperlihatkan dengan adanya zona bening yang terdapat di sekitar koloni bakteri yakni sebesar 26 mm. Semakin besar zona bening yang terbentuk menandakan mikroba tersebut memiliki kemampuan yang  tinggi  dalam  mengubah  substrat  yang terkandung  di  dalam  medium  (Nurmalinda  et  al., 2013). Aktivitas proteolitik  mikroba akan memecah protein susu yang terkandung dalam kasein menjadi senyawa  nitrogen  terlarut  yang  akan  ditunjukkan dengan  area  bening  di  sekeliling  koloni  mikroba (Fardiaz, 1992; Folasade et al., 2005).
Hasil ini sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya yang melaporkan bahwa dari kotoran ikan Neimterus japonicus yang terdapat di India diperoleh empat ge- nus  bakteri  yakni  Bacillus  sp.,  Pseudomonas  sp., Alkaligenes  sp.,  dan  Lactobacillus  sp.  yang  bersifat proteolitik (Kumaran et al., 2013). Bakteri B.  subtilis yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan air tawar Labeo  rohita  juga  memiliki  aktivitas  proteolitik (Geethanjali  &  Subash,  2011).  Peneliti  lain  juga mengungkapkan bahwa dari ikan Rohu (Labeo rohita) ditemukan  bakteri  B.  cereus  yang  juga  memiliki aktivitas  proteolitik  dan  dapat  digunakan  sebagai
kandidat  probiotik  (Natarajan  &  Rajikkannu,  2014). Dari  saluran  pencernaan  ikan  Channa  punctatus didapatkan bakteri B. subtilis yang memiliki aktivitas enzim protease ekstraseluler dengan diameter zona bening 22 mm (Deepa & Usha, 2016).

## Waktu  Optimum  untuk  Menghasilkan Protease
Waktu  generasi  bakteri  dan  konstanta  laju pertumbuhan  bakteri  B.  subtilis  strain  VITNJ1 didasarkan pada kurva pertumbuhan bakteri dilakukan dari jam ke-6 sampai jam ke-64 seperti terlihat pada Gambar 2.
Laju pertumbuhan maksimum diperoleh pada jam ke-54.  Aktivitas  enzim  meningkat  secara  bertahap semenjak  jam  ke-6  hingga  jam  ke-54;  setelah  itu, terjadi  penurunan.  Fase  eksponensial  berhubungan dengan waktu sel bakteri dalam memproduksi suatu produk atau senyawa metabolit, di antaranya adalah enzim, antibakteri, vitamin, dan asam organik (Putra, 2010). Metabolit primer dihasilkan mikroorganisme pada saat pertumbuhan eksponensial dan metabolit sekunder dihasilkan  pada fase stasioner  (Crueger & Crueger,  1984).  Protease  biasanya  dihasilkan maksimum antara akhir fase eksponensial dan awal fase stasioner (Feng et al., 2001). Produksi enzim dari mikroorganisme  ber variasi,  dipengaruhi  oleh berbagai faktor  fisika (suhu, pH),  kimia (karbon,  ni- trogen),  dan  waktu  inkubasi  (Madigan  et  al.,  2008; Muthulakshmi et al., 2011).
Pola  pertumbuhan isolat  bakteri  B.  subtilis  strain VITNJ1 hampir sama dengan bakteri Bacillus sp. yang
Gambar 1. Performansi  kualitatif  enzim  protease  menggunakan medium SMA.
Figure 1. Qualitative  performance  of  protease  enzyme  using  SMA medium.
diisolasi dari saluran pencernaan ayam broiler, dengan optimasi pertumbuhan maksimumnya terjadi pada jam ke-48 (Gusminarni, 2009). Hal ini juga sesuai dengan hasil  penelitian  sebelumnya  bahwa  bakteri  B. licheniformis  juga  memiliki  aktivitas  pertumbuhan tertinggi pada jam ke-48 (Soeka et al., 2011). Optimasi pertumbuhan  bakteri  B.  subtilis  ITBCCB148  yang merupakan kelompok mikroba mesofilik terjadi pada jam ke-60 (Yandri et al., 2008).

## Aktivitas  Enzim  Protease  Secara  Kuantitatif
Aktivitas enzim protease diukur dengan bantuan grafik  standar  tirosin.  Berdasarkan  kurva  tirosin diketahui  bahwa  aktivitas  protease  dari  bakteri  B. subtilis strain VITNJ1 yang tertinggi dicapai pada suhu 37°C dengan waktu inkubasi 54 jam adalah sebesar 9,10 U/mL. Aktivitas spesifik enzim dipengaruhi oleh jenis  bakteri,  kemungkinan  hal  ini  disebabkan  oleh jumlah  enzim  dan  asam  amino  protein  enzim  yang dihasilkan  oleh  masing-masing  isolat  berbeda  satu sama lainnya (Agustien, 2010). Selanjutnya aktivitas protease dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor di antaranya pH, suhu, konsentrasi substrat, dan waktu inkubasi (Rahman et al., 2005; Naiola & Widhyastuti, 2007; Pratiwi, 2008).
Penelitian tentang produksi enzim protease yang berasal  dari  saluran  pencernaan  ikan  sudah  banyak dilakukan  (Arbaciauskiene,  2007;  Ray  et  al.,  2010; Askarian et al., 2012; Banerjee et al., 2013). Pengukuran aktivitas proteolitik dilakukan pada strain bakteri yang diisolasi dari sembilan jenis ikan teleostei air tawar,
aktivitas  proteolitik  tertinggi  terdapat  pada  bakteri TP3A  yang  berasal  dari  usus  ikan  Oreochromis mossambica (Bairagi et al., 2002). Sementara itu juga, dilaporkan aktivitas proteolitik bakteri yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan Labeo calbasu, Catla catla, Labeo rohita, dan Cirrhinus mrigala (Mondal et al., 2008; Ray  et  al.,  2010).  Selanjutnya  dari  bakteri  B.  subtilis AKRS3,  yang  berasal  dari  kotoran  ikan  yang diperdagangkan di daerah Tamil Nadu, India diperoleh aktivitas  protease  sebesar  42,76  U/mL  (Ravishankar et  al.,  2012),  sedangkan  dari  ikan  Channa  punctatus diketahui  aktivitas  protease  tertinggi  berasal  dari bakteri B.  subtilis  yakni  sebesar  105,3  U/mL  dengan lama waktu inkubasi 36 jam (Deepa & Usha, 2016).

## Karakteristik  Protein  Enzim  Protease
Kadar  protein  enzim  protease  bakteri  B.  subtilis strain VITNJ1 ditentukan dengan menggunakan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar setelah dilakukan inkubasi  selama  48  jam  adalah  110,64  mg/L  dan aktivitas spesifik sebesar 0,082 U/mg seperti terlihat pada Tabel 1.
Aktivitas  spesifik  dapat  dihitung  dengan  cara membagi  aktivitas  enzim  dengan  kadar  protein. Aktivitas  spesifik  enzim  menunjukkan  kemurnian suatu enzim. Semakin tinggi aktivitas spesifik enzim, maka semakin tinggi pula tingkat kemurnian enzim tersebut.  Hal  ini  disebabkan  karena  proses berkurangnya  jumlah  protein  non-enzim  sebagai akibat  dari  tahapan  pemisahan  yang  dilalui  dalam pemurnian enzim (Wijaya, 2002).
Gambar 2. Waktu produksi optimum enzim protease dari bakteri B. subtilis strain VITNJ1.
Figure 2. Optimum production time of protease enzyme derived from B. subtilis strain VITNJ1. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 20 40 60 80 K ep ad at an o p ti k O pt ic al d en si ty (O D )
Waktu inkubasi (jam) / Incubation time (hours)
Hasil penelitian ini sejalan dengan hasil penelitian sebelumnya  yang  melaporkan  bahwa  dari  saluran pencernaan ikan red snapper (Lutjanus campechanus) dan ikan seer fish (Scomberomorus guttatus), yang dijual di pasar ikan Kota Chennai ditemukan kadar protein enzim protease berturut-turut 27,40 dan 23,21 U/mg (Sabtecha  et  al.,  2014).  Selanjutnya  juga  dilaporkan kadar  protein  enzim  protease  dari  bakteri  Bacillus HMT-3 dengan lama waktu inkubasi 12 jam sebesar 0,145  mg/mL;  dan  kadar  protein  dengan  aktivitas tertinggi terdapat pada jam ke-36 sebesar 132,35 mg/ mL  (Indriyani,  2010;  Irwan,  2012).  Penelitian  lain tentang aktivitas  enzim  protease  dari  isolat  Bacillus sp.  B1  galur  lokal  Riau  memiliki  aktivitas  optimum pada waktu produksi 30 jam sebesar 0,2523 ± 0,0050 U/mg (Yuniati et al., 2015). Aktivitas enzim protease Bacillus sp. Ve1 sebesar 397 U/mL pada media gelatin cair (Patel et al., 2004). Selanjutnya dari B. cereus MCM B-326  yang  diisolasi  dari  kulit  kerbau  ditemukan aktivitas enzim protease maksimum sebesar 126,87 U/mL  pada  media  pati  kedelai  (Nilegaonkar  et  al., 2007).

## KESIMPULAN
Bakteri  B.  subtilis  strain  VITNJ1  memiliki kemampuan  untuk  menghasilkan  enzim  protease melalui aktivitas proteolitiknya sebesar 26 mm. Fase eksponensial  mulai  terjadi  pada  jam  ke-6,  fase stasioner  terjadi pada  jam ke-18  sampai jam  ke-48, aktivitas optimum enzim protease dicapai pada jam ke-54. Aktivitas enzim protease dari bakteri B. subtilis strain  VITNJ1  sebesar  9,10  unit/mL;  kadar  protein 110,64  mg/L;  dan  aktivitas spesifik  adalah  0,082  U/ mg.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  disampaikan  kepada  DRPM  Dikti Direktorat  Jenderal  Pendidikan  Tinggi,  Departemen Pendidikan Nasional yang telah mendanai penelitian ini melalui Skim Hibah Fundamental Tahun 2017.

## DAFTAR  ACUAN
Agustien,  A.  (2010).  Protease  bakteri  thermofilik.
Bandung: Universitas Padjajaran Press.
Arbaciauskiene,  S.V.  (2007).  Enzymatic  activity  of intestinal bacteria in roach Rutilus rutilus L. Fisher- ies Science, 73, 964-966.
Askarian,  F.,  Zhou,  Z.,  Olsen,  R.E.,  Sperstad,  S.,  & Ringo,  E.  (2012).  Culturable  autochthonous  gut bacteria in Atlantic salmon (Salmo salar L.) fed di- ets  with  or  without  chitin.  Characterization  by 16S  rRNA  gene  sequencing,  ability  to  produce enzymes and in vitro growth inhibition of for fish pathogens. Aquaculture Journal, 326-329, 1-8.
Atlas, R.M. (1997). Handbook of microbiological me- dia. Florida, USA, Boca Raton: CRC Press.
Bairagi, A., Ghosh, K.S., Sen, S.K., & Ray, A.K. (2002). Enzyme  producing  bacterial  flora  isolated  from fish digestive tracts. Aquaculture International, 10, 109-121.
Balaji,  N.,  Rajasekaran,  K.M.,  Kalaipandian,  N., Vignesh, V., & Thirumurugan, R. (2012). Isolation and screening of proteolytic bacteria from fresh water  fish  Cyprinus  carpio.  International Multidisciplinary Research Journal, 2(6), 56-59.
Banerjee,  G.,  Ray,  A.K.,  Askarian,  F.,  &  Ringo,  E. (2013). Characterization and identification of en- zyme-producing  autochthonous  bacteria  from gastrointestinal tract of two Indian air-breathing fish. Beneficial Microbes Journal, 4(3), 277-284.
Bhaskar, N., Sudeepa, E.S., Rashmi, H.N., & Selvi, A.T. (2007). Partial purification and characterization of protease of Bacillus proteolyticus CFR3001 isolated from fish  processing  waste  and  its  antibacterial activities. Bioresource Technology Journal, 98, 2758- 2764.
Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for  the  quantitation  of  microgram  quantities  of protein utilizing the principle of protein-dye bind- ing. Analytical Biochemistry Journal, 72, 248-254.
Tabel 1. Karakteristik protein dari protease yang diperoleh dari B. subtilis strain VITNJ1
Table 1. The protein characteristics of protease derived from B. subtilis strain VITNJ1 Protein terlarut Dissolved protein (mg/L) Aktivitas enzim protease Protease enzyme activity (U/mL) Aktivitas spesifik Specific activity (U/mg protein) 110. 64 9.10 0.082
Chovatiya, S., Dhola, K., Patel, P., & Ingale, S. (2014).
Characterization  and  optimization  of  protease enzyme  producing  microorganism  from  gas- trointestinal tract of Labeo rohita. International Jour- nal of Pure and Applied Bioscience, 2(3), 124-134.
Crueger,  W.  &  Crueger,  A.  (1984).  A  text  book  of industrial microbiology. New York: Ed. T.D. Brock, Sinauer Associates  Inc.
Das, P., Mandal, S., Khan, A., Manna, S.K., & Ghosh, K.  (2013).  Distribution  of  extracellular  enzyme- producing  bacteria  in  the  digestive  tracts  of  4 brackish water fish species. Turkish Journal of Zoo- logy, 38, 79-88.
Deepa, N. & Usha, R. (2016). Isolation and screening of proteolytic bacteria from the gut of fresh wa- ter  fish  Channa  punctatus.  World  Journal  of  Phar- macy and Pharmaceutical Sciences, 5(9), 2434-2444.
Efendi, Y. & Yusra. (2014). Bacillus subtilis strain VITNJ1 potential probiotic bacteria in  the gut of tilapia (Oreochromis niloticus) are cultured in floating net, Maninjau  Lake,  West  Sumatera.  Pakistan  Journal of Nutrition, 13, 710-715.
Effendie, M.I. (2002). Biologi ikan. Yogyakarta: Yayasan Pustaka Nusatama.
Fardiaz,  S.  (1992).  Mikrobiologi  pangan  1.  Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
Feng,  Y.Y.,  Yang,  W.B.,  Ong,  S.L.,  &  Hu,  J.Y.  (2001). Fermentation of starch for alkaline protease pro- duction  by  constructing  an  alkalophilic  Bacillus pumilus  strains.  Applied  Microbiology  and  Biotech- nology, 57, 153-160.
Folasade, M., Olajuyigbe., Joshua, O., & Ajele. (2005).
Production  dynamics  of  extracellular  protease from  Bacillus  species.  African  Journal  of  Biotech- nology, 4(8), 776-779.
Fukami, K., Ishiyama, S., Yaguramaki, H., Masuzawa, T.,  Nabeta,  Y.,  Endo,  K.,  &  Shimoda,  M.  (2002). Identification  of  distinctive  volatile  compounds in fish sauce. Journal of Agricultural and Food Chem- istry, 50(19), 5412-5416.
Geethanjali, S. & Subash, A. (2011). Optimization of protease  production  by  Bacillus  subtilis  isolated from  mid  gut  of  fresh  water  fish  Labeo  rohita. World Journal of Fish and Marine Sciences, 3(1), 88- 95.
Gupta,  R.,  Beg,  Q.K.,  &  Lorenz,  P.  (2002).  Bacterial alkaline proteases: Molecular approaches and in- dustrial applications. Applied Microbiology and Bio- technology, 59, 15-32.
Gusminarni. (2009). Aktivitas penghambatan bakteri asal saluran  pencernaan  ayam  broiler  terhadap  Escheri- chia  coli  dan  Salmonella  spp.  pada  berbagai  me-
dia,  aerasi,  pH,  dan  suhu.  Tesis.  Program Pascasarjana.  Institut  Pertanian  Bogor.  Bogor, 78 hlm.
Indriyani.  (2010).  Pengaruh  pH  dan  suhu  terhadap aktivitas  protease  dari  isolat  bakteri  HMT-3.  Tesis. Universitas Hasanuddin. Makassar.
Ir wan,  R.  (2012).  Pengaruh  penambahan  MnCl 2 terhadap  produksi  enzim  protease  dari  Bacillus licheniformis  HSA3-1a.  Tesis.  Universitas Hasanuddin. Makassar.
Jellouli, K., Bougatef, A., Manni, L., Agrebi, R., Siala, R., Younes, I., & Nasri, M. (2009). Molecular and biochemical  characterization  of  an  extracellular serine-protease from Vibrio etschnikovii. Microbiol- ogy and Biotechnology, 36, 939-948.
Kumaran, E., Mahalakshmipriya, A., & Rajan, S. (2013). Effect of fish waste based Bacillus protease in sil- ver recovery from waste X-ray films. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 2(3), 49-56.
Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J.,  Farr, A.L., &  Randal, R.J. (1951). Protein measurement with folin phe- nol reagent. Journal of Biological Chemistry, p. 193- 265.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Stahl, D., & Clark, D.P. (2008).  Brock  biology  of  microorganisms.  12th Ed.  San  Francisco,  USA:  Pearson  Benjamin- Cummings.
Mohapatra,  B.R.,  Bapuji,  M.,  &  Sree,  A.  (2003).  Pro- duction  of  industrial  enzymes  (amylase, carboxymethylcellulase and protease) by bacteria isolated  from  marine  sedentary  organisms.  Acta Biotechnology, 23, 75-84.
Mondal,  S.,  Roy,  T.,  Sen,  S.K.,  &  Ray,  A.K.  (2008). Distribution of enzyme-producing bacteria in the digestive  tracts  of  some  freshwater  fish.  Acta Ichthyologica et Piscatoria, 38, 1-8.
Muthulakshmi,  C.,  Gomathi,  D.,  Kumar,  D.G., Ravikumar,  G.,  Kalaiselvi,  M.,  &  Uma,  C.  (2011). Production,  purification  and  characterization  of protease  by  Aspergillus  flavus  under  solid  state fermentation. Jordan Journal of Biological Sciences, 4(3), 137-148.
Naiola, E. & Widhyastuti N. (2007). Semi purification and characterization of proteases Bacillus sp. Peri- odic Biological Research, 13, 51-56.
Natarajan, N. & Rajikkannu, M. (2014). Antimicrobial activity of Bacillus cereus strain isolated from Rohu (Labeo rohita).  International  Journal of  Current  Mi- crobiology Applied Sciences, 3(8), 474-480.
Nilegaonkar,  S.S.,  Zambare,  V.P.,  Kanekar,  P.P., Dhakephalkar,  P.K.,  &  Sarnaik,  S.S.  (2007).  Pro-
Nurmalinda, A., Periadnadi, & Nurmiati. (2013). Isolasi dan  karakterisasi  parsial  bakteri  pemfermentasi dari  buah  durian  (Durio  zibethinus  Murr.).  Jurnal Biologi Universitas Andalas, 2(1), 8-13.
Patel, R., Dodia, M., & Singh, S.P. (2004). Extracellu- lar  alkaline  protease  from  a  newly  isolated haloalkaliphilic  Bacillus  sp:  Production  and  opti- mization. Process Biochemistry, 40, 3569-3575.
Pratiwi,  S.T.  (2008).  Microbiologi  farmasi.  Jakarta: Erlangga Press.
Putra,  A.N.P.  (2010).  Aplikasi  pemberian  probiotik, prebiotik dan sinbiotik untuk meningkatkan kecernaan pakan ikan nila (Oreochromis niloticus). Tesis. Pro- gram Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor.
Rahman, R.N.Z.A., Basri, L.P.G.M., & Saleh, A.B. (2005). Physical factors affecting the production of organis solvent-tolerant  protease  by  Pseudomonas aeruginosa strain K. Bioresource Technology, 96, 429- 436.
Ravishankar, K., Kumar, M.A., & Saravanan, K. (2012). Isolation of alkaline protease from Bacillus subtilis AKRS3.  African  Journal  of  Biotechnology,  11(69), 13415-13427.
Ray,  A.K.,  Roy,  T.,  Mondal,  S.,  &  Ringo,  E.  (2010). Identification  of  gut-associated  amylase,  cellu- lase,  and  protease-producing  bacteria  in  three species  of  Indian  major  carps.  Aquaculture  Re- search, 41, 1462-1469.
Ray,  A.K.,  Ghosh,  K.,  &  Ringo,  E.  (2012).  Enzyme producing  bacteria  isolated  from  fish  gut.  A  re- view. Aquaculture Nutrition, 18, 465-492.
Rolfe, R. (2000). The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health. Journal of Nutri- tion, 130, 396-402.
Sabtecha, B., Jayapriya, J., & Tamilselvi, A. (2014). Ex- traction  and  characterization  of  proteolytic  en- zymes  from  fish  visceral  waste:  Potential
aplications as destainer and dehairing agent. In- ternational  Journal  of  ChemTech  Research,  6(10), 4504-4510.
Said,  M.I.  &  Likadja,  J.C.  (2012).  Isolasi  dan identifikasi  bakteri  yang  berpotensi  sebagai penghasil  enzim  protease  pada  industri penyamakan  kulit  PT.  Adhi  Satria  Abadi  (Asa), Yogyakarta. Makalah Ilmiah. Fakultas Peternakan, Universitas Hasanuddin. Makassar.
Soeka, Y.S., Rahayu, S.H., Setianingrum, N., & Naiola, E. (2011). Kemampuan Bacillus licheniformis dalam memproduksi enzim protease yang bersifat alkali dan  termofilik.  Artikel  Ilmiah.  Media  Litbang Kesehatan, 21(2), 89-95.
Suganthi,  C.,  Mageswari,  A.,  Karthikeyan,  S., Anbalagan, M., Sivakumar, A., & Gothandam, K.M. (2013).  Screening  and  optimization  of  protease production from a halotolerant Bacillus licheniformis isolated from saltern sediments. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 11(1), 47-52.
Tari,  C.,  Genckal,  H.,  &  Tokatl,  F.  (2005).  Optimiza- tion  of  a  growth  medium  using  a  statistical  ap- proach for the production of an alkaline protease from  a  newly  isolated  Bacillus  sp.  L21.  Process Biochemistry Journal, 41, 659-665.
Wijaya,  S.  (2002).  Isolasi  kitinase  dari  Scleroderma columnare dan Trichoderma harzianum. Jurnal Ilmu Dasar, 3(1), 30-35.
Yandri, T.S., Dian, H., & Sutopo, H. (2008). The chemi- cal modification of protease enzyme isolated from local bacteria isolate, Bacillus subtilis  ITBCCB148 with cyanuric chloride polyethylenglycol. European Journal of Scientific Research, 23, 177-186.
Yuniati,  R.,  Nugroho,  T.T.,  &  Puspita,  F.  (2015).  Uji aktivitas  enzim  protease  dari  isolat  Bacillus  sp. galur lokal Riau. JOM FMIPA, 1(2), 116-122.
duction  and  partial  characterization  of  dehairing  protease  from  Bacillus  cereus  MCM  B-326.  Biore Technology, 98(6), 1238-1245.