## Original Article
DOI : 10.35311/jmpi.v10i1.484
Uji Aktivitas Antibakteri dan Antibiofilm Fraksi Ekstrak Daun Gamal ( Gliricidia Sepium ( Jacq Walp)) Terhadap Staphylococcus Aureus ATCC 25923
Herman * , Titik Sunarni, Opstaria Saptarini Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Surakarta

## ABSTRAK
Daun  gamal  ( Gliricidia  sepium (Jacq  Walp))  di  dalamnya  terkandung  zat  flavonoid, alkaloid, tanin, saponin, dan terpenoid. Senyawa dalam daun gamal mempunyai sifat uang antibakteri. Tujuan dari penelitian ini yakni untuk mengetahui bagaimana peran ekstrak serta fraksi n-heksana, etil asetat, serta air terhadap aktivitas antibakteri dengan menghambat pembentukan dan degradasi biofilm. Metode maserasi digunakan untuk mengekstraksi daun gamal menggunakan pelarut etanol 96%. Ekstrak kental dilakukan fraksinasi  dengan  pelarut  n-heksana,  air,  serta  etil  asetat.  Uji  aktivitas  antibakteri dilaksanakan  melalui  metode  dilusi  dilanjutkan  observasi  pengaruh  kerja  melalui  uji AAS  kebocoran  ion.  Uji  aktivitas  antibiofilm  menggunakan  alat  microplate  serta pembacaannya dilaksanakan pada panjang gelombang 595 nm. Hasil penelitian bahwa fraksi etil asetat daun gamal teraktif terhadap bakteri S. aureus . Fraksi etil asetat daung gamal  dapat merusak pada membran  sel bakteri. Rata-rata persentase penghambatan pembentukan biofilm terhadap S. aureus terbesara di konsentrasi 50%, yaitu fraksi etil asetat sebanyak 40,69%, ekstrak 37,51%, fraksi n-heksana 28,93% dan fraksi air 30,20%, sedangkan rata-rata persentase degradasi biofilm terlihat yang tertinggi adalah fraksi etil  asetat  dengan  konsentrasi  50%  yaitu  sebesar  37,27%,  ekstrak    34,55%,  fraksi  air 31,77%,  fraksi  n-heksan  nilai  30,05%.  Kontrol  positif  (Tetrasiklin)  memiliki  aktivitas dengan nilai 51,66 %.
Kata Kunci : Antibakteri, Kebocoron Ion, Antibiofilm, Daun Gamal, S. Aureus

## ABSTRACT
Gamal  leaves  ( Gliricidia  sepium (Jacq  Walp))  contain  flavonoids,  alkaloids,  tannins, saponins,  and  terpenoids.  Compounds  in  gamal  leaves  have  antibacterial  properties. The  purpose  of  this  study  is  to  find  out  how  the  role  of  extracts  and  fractions  of  n- hexane, ethyl acetate, and water on antibacterial activity by inhibiting biofilm formation and  degradation.  Maceration  method  was  used  to  extract  gamal  leaves  using  96% ethanol  solvent.  The  thick  extract  was  fractionated  using  n-hexane,  water,  and  ethyl acetate  solvents.  The  antibacterial  activity  test  was  carried  out  by  dilution  method followed by observation of the effect of work with ion leakage AAS test. The antibiofilm activity test used a microplate device and the readings were taken at a wavelength of 595  nm.  The  results  showed  that  the  ethyl  acetate  fraction  of  gamal  leaves  was  most active against S. aureus bacteria. The ethyl acetate fraction of gamal leaves can damage the bacterial cell membrane. The average percentage of inhibition of biofilm formation against S. aureus is highest at a concentration of 50%, namely the ethyl acetate fraction of 40.69%, extract 37.51%, n-hexane fraction 28.93% and water fraction 30.20%, while the average percentage of biofilm degradation seen the highest is the ethyl acetate fraction with a concentration of 50% which is 37.27%, extract 34.55%, water fraction 31.77%, n- hexane  fraction  value  30.05%.  The  positive  control  (Tetracycline)  has  activity  with  a value of 51.66%.
Keywords : Antibacterial, Ion Leakage, Antibiofilm, Gamal Leaf, S. aureus

## PENDAHULUAN
Salah satu dari  faktor penyebab terjadinya infeksi  adalah  bakteri  yang  merupakan  fenomena yang paling banyak terjadi dikalangan masyarakat, tak  terkecuali  pada  wilayah  negara  berkembang seperti  Indonesia  (Katrin et  al .,  2015).  Bakteri S. aureus dapat  menyebabkan  banyak  penyakit peradangan dan biofilm yang terkait dengan infeksi
serta  resistensi  antibiotik  (Ahn et  al .,  2018). Kemampuan  yang  dimiliki  oleh  bakteri S.  aureus adalah  dapat  melekat  dipermuakaan  benda  serta membentuk  biofilm  (Matilla et  al .,  2020)  yang mayoritas mampu dikendalikan melalui pembuatan polysaccharide intercellular adhesin (PIA).
Bakteri S.  aureus dapat  membentuk  biofilm yang dapat menetralisir suhu, keasaman, dan faktor
Sitasi: Herman, Sunarni, T., & Saptarini, O. (2024). Uji Aktivitas Antibakteri dan Antibiofilm Fraksi Ekstrak Daun Gamal (Gliricidia
Sepium (Jacq Walp)) Terhadap Staphylococcus
Aureus ATCC 25923. Jurnal Mandala Pharmacon Indonesia, 10(1), 314-327.
https://doi.org/10.35311/jmpi
.v10i1.484
Submitted: 28 Februari 2024 Accepted: 16 April 2024 Published: 30 Juni 2024
*Penulis Korespondensi:
Herman
Email:
hermannh615@gmail.com Jurnal Mandala
Pharmacon Indonesia is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
lingkungan lainnya juga mampu dijadikan pelindung  bagi  bakteri  dari  pertahanan  tubuh inangnya (Kining et al ., 2016). Pembentukan biofilm meningkatkan  kemungkinan  kontaminasi  silang dan  infeksi  mikroorganisme  yang  lebih  parah (Coughlan et  al. ,  2016).  Di  masa  sekarang,  biofilm dianggap  menjadi  mediator  utama  infeksi,  dan sekitar  80%  peristiwa  infeksi  dikaitkan  melalui pembentukan biofilm (Archer et al ., 2011).
Beberapa bakteri resisten terhadap antibiotik  tertentu,  sehingga  diperlukan  solusi  lain dengan  menggunakan  zat  antimikroba  dari tumbuhan  (Sari et  al .,  2020).  Pemanfaatan  material alami  bisa  dijadikan  alternatif  pengobatan  untuk mengatasi  masalah  resistensi  bakteri  disebabkan adanya  biofilm  yang  menimbulkan  infeksi,  bahan alam memiliki toksisitas rendah, mudah didapatkan serta biayanya murah.  Sebuah tanaman yang dapat digunakan dalam penelitian antibakteri dan biofilm ialah  daun  gamal  ( Gliricidia  sepium (Jacq  Walp).
Penelitian sebelumnya bahwa  daun gamal terdapat kandungan flavonoid, alkaloid, steroid, tanin, serta terpenoid  yang  mempunyai  aktivitas  antibakteri (Akharaiyi et al ., 2012).
Daun  gamal  dianggap  mempunyai  efek antibakteri  dikarenakan  mengandung  senyawa flavonoid yang berfungsi sebagai antimikroba. Hasil penelitian  sebelumnya  tentang  aktivitas  antibakteri ekstrak  daun  gamal  dengan  metode  difusi menunjukkan daya hambat sebesar 15 mm dan 14,5 mm Luh et al , (2018). Penelitian  Kamal, (2020) bahwa ekstrak  daun  gamal  menunjukkan  aktivitas penghambatan  pertumbuhan  bakteri S.  aureus. Membran  sel  mikroba  rusak  karena  kemampuan flavonoid  lipofilik  untuk  menghancurkan  protein ekstraseluler yang terlarut pada dinding sel..
Rusaknya membran sel  cenderung menjadi penyebab  keluarnya  metabolit  penting  pada  sel, karenanya sel bisa mati (Dermawan, 2021). JH et al ., (2013) menyebutkan flavonoid serta tanin memiliki potensi  dalam  menekan  pertumbuhan  biofilm diakrenakan  mampu  menekan intercellular  adhesion genes ica A  dan ica D.  Kerusakan  membran  sel ditentukan  jumlah  ion  Ca 2+ pada  plasma  sel  serta bahan  yang  sel  lepaskan  mampu  diserap  dalam panjang  gelombang  tertentu  (Bunduki et  al. ,  1995). Kerusakan  membran  sel  bakteri  dapat  dilakukan pengamatan menggunakan ASS dan SEM.
Penelitian ini bertujuan mencari tahu fraksi teraktif yang menunjukkan sifat antbakteri terhadap Staphylococcus  aureus, serta  mengetahui  sifat antibakteri  dan  antibiofilm  ekstrak  serta  etil  asetat, fraksi  n-heksana,  serta  air  daun  gamal  terhadap S. aureus .

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini berjenis eksperimental melalui ekstraksi daun gamal kemudian dilanjutkan dengan fraksinasi,  dari  fraksi n -heksan,  air,  serta  etil  asetat yang  diperoleh  kemudian  aktivitas  antibakteri  dan antibiofilmnya  diuji  terhadap  bakteri S.  aureus kemudian dilanjutkan dengan uji SEM fraksi teraktif dari ekstrak daun gamal.

## Alat
Alat ekstraksi serta fraksinasi yang peneliti gunakan ialah bejana kaca, gelas ukur, corong pisah, rotary  evaporatory,  freeze  dryer ,  pengaduk  kaca  dan wadah  kaca.  Untuk  pengujian  mikrobiologi  adalah tabung reaksi, botol coklat, cawan petri, erlenmayer, corong  kaca,  corong  pisah,  water  bath,  pipet  tetes, pipet  volume,  inkubator,  pinset,  bunsen,  inkubator (Memmert® ), lampu UV, gelas (Pyrex® ), microplate flat  bottom  96  wells ( Iwaki ),  yellow  tip,  mikropipet ( Socorex ), ose, serta blu tip.

## Bahan
Bahan yang digunakan adalah daun berupa simplisia kering yang dibuat menjadi serbuk Bahan yang  peneliti  gunakan  yakni  ekstraksi  etanol  96%. Lempeng  Selika  Gel  F254  untuk  megedintifikasi kandungan kimia pada daun gamal. Bakteri S. aureus yang  didapat  di  Laboratorium  Mikrobiologi Universitas Setia Budi Surakarta, daun gamal, etanol 96%, Mannitol  Salt Agar (MSA), Brain  heart  infusion (BHI ),  Vogel  Jhonson Agar (VJA),  NaCl  0,9%,  DMSO 5%,  akuades,safranin,  lugol,  iodin, Natrium  Broth (NB), kristal violet 1%.

## Ekstraksi
Serbuk daun gamal dilakukan pengambilan sejumlah  1000  gram  dilakukan  perendaman menggunakan pelarut etanol 96% (1:10) pada wadah kaca ditutup aluminium foil dilaksanakan maserasi dalam  24  jam  dengan  temperatur  ruang  dengan sesekali diaduk di 6 jam pertama. Pisahkan maserat melalui  penyaringan  dengan  kertas  whatman, penyaringannya diulang minimal sekali menggunakan  pelarut  yang  sama  serta  jumlah volume  pelarut  yang  digunakan  setengah  kali jumlah  volume  pelarut  dalam  penyarian  pertama. Ekstraknya kemudian dilakukan pemekatan dengan bantuan Vacuum  Rotary  Evaporator di  temperatur 55°C hingga didapat ekstrak kental serta dilakukan penghitungan pada rendemen yang didapat.

## Fraksinasi
Sebanyak  20  gram  ekstrak  etanol  96% dijadikan homogen menggunakan aquadest 50 mL. kemudian masukkan larutan ekstrak menuju corong pisah, serta ditambahkan 50 mL n- heksan.
Dilakukan pengocokan sampai homogen kemudian dilakukan  pendiaman  hingga  terbentuklah  2 lapisan.  Sesudah  terbentukya  2  lapisan  fasa n- heksan,  keluarkan  air  dengan  penampung  yang berbeda.  Simpan  fasa n -heksan  serta  air  ke  corong pisah  serta  tambahkan  50  mL n -heksan.  Proses tersebut  dilakukan  pengulangan  sampai  fasa n - heksan  terlihat  tanpa  warna  ataupun  jernih. Lakukan  penggabungan  serta  penguapan  Fasa n - heksan  samapi  didapat  fraksi  ekstrak  kental. Lanjutkan  fraksinasi  melalui  penuangan  fasa  air menuju corong pisah selanjutnya lakukan penambahan  etil  asetat  dengan  volume  50  mL, dilakukan pengocokan sampai homogen keluarkan setiap fasanya untuk dilakukan penampungan pada wadah  yang  lain.  Hal  tersebut  diulang  sampai didapat  fasa  etil  asetat  dengan  sifat  tanpa  warna serta jernih. Kemudian lakukan penguapan Fasa etil asetat serta air sampai memperoleh ekstrak kental.
Identifikasi  Kandungan  Senyawa  Ekstrak  Dan Fraksi Duan Gamal
Pengidentifikasian senyawa yang terkandung  dalam  ekstrak  daun  gamal  dengan tujuan mengetahui kandungan senyawa kimia pada tanaman gamal misalnya flavonoid, alkaloid, tanin, saponin, serta terpenoid (Harborne, 1987).
1. Flavonoid
Identifikasi pereaksi warna 2 ml ekstrak dan fraksi  daun  gamal  diambil  dan  dicampur  dengan methanol Kemudian ditambahkan 5 tetes HCl pekat serta 2 ml  gram serbuk Mg. Adanya flavonoid pada ekstrak  dan  fraksi  daun  gamal  menunjukkan endapan berwarna jingga dalam hasil (Agusti et al ., 2016).
2. Saponin
Identifikasi  pereaksi  warna  ekstrak  dan fraksi  ekstrak  daun  gamal  diambil  sebanyak  2  ml ditambahkan  10  mL  air  panas  pada  tabung  reaksi, selanjutnya kocok secara kuat dalam waktu 10 detik. Bila ada buih dengan sifat yang stabil maka menjadi indikasi terdapat saponin (Putri et al ., 2022).
3. Alkaloid
Identifikasi  pereaksi  warna  ekstrak  dan fraksi  ditimbang  2  ml  ditambahkan  5  ml  HCl  2N Larutan  dengan  cara  mendapatkannya  melalui pembagian  dijadikan  3  bagian,  Tabung  pertama dipergunakan  menjadi  blanko,  tabung  kedua ditambah  pereaksi  Dragendroff  sejumlah  3  tetes serta  tabung  ketiga  ditambah  pereaksi  Mayer sejumlah  3  tetes.  Hasil  positif  ekstrak  dan  fraksi mengandung alkaloid ditunjukkan dengan pembentukan endapan jingga  dalam tabung kedua
serta  endapan  putih  sampai  kekuningan  dalam tabung ketiganya (Farnsworth, 1966).
4. Tanin
Identifikasi  pereaksi  warna  ekstrak  dan fraksi daun gamal diambil sebanyak 2 ml ditambah 5cc  aquadest  selanjutnya  dilakukan  pendidihan dalam  waktu  a  5  menit  Larutan  tersebut  difiltrasi serta  tambahkan  5  tetes  tetes  FeCl  1  %  pada filtratnya. Uji tanin memperlihatkan hasil positif bila terbentuk warna hitam ataupun biru tua (Farnsworth, 1966)
5. Terpenoid
Identifikasi pereaksi warna  ekstrak dan fraksi daun  gamal  masing-masing  dilakukan  pengambilan sejumlah  2  mL,  dilakukan  penguapan  pada  cawan penguap  Residu  dilakukan  pelarutan  menggunakan 0,5 ml kloroform selanjutnya pinahkan menuju tabung reaksi  serta  tambahkan  0,5  ml  asam  asetat  anhidrat serta  2  ml  asam  sulfat  pekat  lewat  dinding  tabung. Pembentukan cincin kecoklatan ataupun violet dalam perbatasan  larutan  memperlihatkan  di  dalamnya terdapat triterpenoid (Fransworth, 1966).

## Persiapan Sampel Uji dan Identifikasi Bakteri
Pengujian menggunakan fraksi etil asetat, n- heksana, dan air digunakan dalam konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6, 25%, 0,3125%, 1,4%, 0,8%, 0,4%, 0,2%, dan 0,1%. Setelah sampel ditimbang, masing-masing sampel  dilarutkan  dalam  DMSO  5%  hingga 5ml serta  dilakukan  pengambilan  berdasarkan volume  yang  diperlukan  dalam  pengujiannya. Untuk  membuat  larutan  kontrol  positif,  tetrasiklin dilarutkan  menggunakan  aquadest  steril.  Untuk memastikan  bakteri S.  aureus benar,  digunakanlah metode identifikasi makroskopis, mikroskopis, dan biokimia.

## Uji Aktivitas Antibakteri Dengan Metode Dilusi
Penetapan  KHM  dilaksanakan  melalui metode dilusi cair broth dilution test (Serial dilution). Media  ujinya  yakni Brain  Heart  Infusion (BHI). Metode tersebut mempergunakan 1 deretan tabung reaksi  dengan meliputi 12 tabung steril yang berisi fraksi  aktif  daun  gamal  dengan  konsentrasi. Pengujian  KHM  dilakukan  dengan  membuat konsentrasi  fraksi    daun  gamal    yaitu  50%;  25%; 12,5%  6,25%;  0,3125%;  1,4%;  0,8%;  0,4%;  0,2%  dan 0,1%. Tabung 1 serta 2 dijadikan  kontrol positif serta negatif. Tabung 3 hingga 12 berisikan konsentrasi 0,5 ml menggunakan pengenceran bertingkat selanjutnya  tambahkan  suspensi  bakteri  sejumlah 0,5 ml dengan cara aseptik fraksi-fraksi daun gamal.
Tabung 12 dijadikan kontrol positif dengan berisikan suspensi bakteri saja, kemudian dilakukan
inkubasi  di  temperatur  37ºC  dalam  waktu  24  jam. Konsentrasi  paling  kecil  untuk  tabung  yang  jernih dengan  tidak  disertai  pertumbuhan  bakteri  uji dinilai menjadi  KHM.  Nilai  KHM  ialah konsentrasi paling rendah fraksi teraktif daun gamal yang masih dapat  menghambat  bakteri  uji  (Sari,  2017). Konsentrasi  Bunuh  Minimum  KBM)  ditetapkan melalui penginokulasian tabung media yang jernih dengan  menggoreskannya  dalam  media  selektif untuk dilakukan inkubasi dalam suhu 37 o C dalam waktu  24-48  jam.  Dilihat  apakah  terdapat  koloni yang bertumbuh dalam permukaan media lempengnya.

## Pengamatan Marfologi Membran Sel Bakteri
Pada penelitian ini, karakter pada permukaan  struktur  biomaterial  serta  perubahan morfologi  bakteri  diamati  melalui  teknik Scanning Electrotron Microscopy (SEM). Hasil KBM dan kontrol dilakukan  inkubasi  selama  24  jam  serta  dilakukan pengocokan  di  temperatur  22-25 o C.  Hasilnya disentrifugasi, selanjutnya biomassa sel dimasukkan menuju larutan prefiksatif (2,5% glutaraldehid pada phosphat bufer serta cocodylate buffer ), dalam waktu 2 jam. Hasilnya dilakukan sentrifugasi serta endapannya selanjutnya dilakukan pencucian ulang menggunakan  larutan buffer  fosfat serta  tambahkan pula tannic acid 2% sebagai pemfiksasi.
Hasil  disentrifugasi  serta  endapannya selanjutnya dilakukan pencucian ulang menggunakan  larutan cocodylate  buffer , buffer  fosfat serta  divortex,  didiamkan  10  menit  serta  tahapan tersebut  dilakukan  pengulangan  2  kali.  Kemudian selnya dilakukan sentrifugasi ulang serta dilakukan pengambilan  biomassa  sel,  dilakukan  penambahan osmium  tetra  oksida  1%,  divortex  dilakukan pendiaman dalam waktu 1 jam di temperatur yang dingin. Sel didehidrasi  melalui penambahan etanol (50%,  70%,  80%,  95%,  serta  etanol  absolut)  yang selanjutnya dilakukan suspensi pada t-butanol serta dilakukan pengeringan menggunakan freeze drying.
Sampel  selanjutnya  ditempatkan  dalam carbon  tip yang  telah  ditempel  dalam  stube.  Selnya kemudian  diberi  lapisan  logam  emas  dalam  waktu 10  detik  melalui  ion  sputter  dan  dilakukan pengamatan  menggunakan  mikroskop  analisis pemindaian  elektron  SEM  JEOL  JSM  5310 LV(Saptarini O, 2021).

## Analisis Kebocoran Membran Sel Bakteri Dengan Metode AAS
Analisis  kebocoran  sel  pada  penelitian  ini menggunakan metode AAS. Analisis kebocoran ion dilaksanakan  dalam  tabung  dengan  dinyatakan menggunakan  1  kali  KBM  dalam  metode  dilusi.
Kebocoran  ion-ion  Ca 2+ dlakukan  pendeteksian melalui  AAS.  Hasil  1  kali  KBM  selanjutnya dilakukan  pengambilan  sejumlah  1  ml  serta kemudian dilakukan pengenceran dalam labu takar 100 ml. Hasilnya dilakukan pengukuran menggunakan AAS melalui destruksi basah dengan HNO3  (Park,  1996).  Kebocoran  diukur  melalui pengamatan ion-ion logam pada bakteri uji sesudah terjadinya  kontak  dengan  fraksi  aktif  dalam konsentrasi 0 (kontrol), 1 serta 2. Cairan supernatan dilakukan  analisis  melalui  AAS Thermo  Elemental tipe. Solar MS larutan sel hasil kontak dengan fraksi dilakukan  pengambilan  supaya  diketahui  ukuran kandungan  berbagai  ion  di  dalamnya  (Cox et  al , 2000).

## Optimasi Waktu Pembentukan Biofilm
Tujuan
optimasi adalah dapat memaksimalkan waktu inkubasi untuk membentuk biofilm.  Waktu  inkubasinya  ialah  1  hari,  2  hari,  3 hari,  hingga  tiga  hari.    Suspensi  bakteri  disetarakan dengan  Mc  Farland  0,5  dilakukan  pengambilan dengan  jumlah  200  µL  dimasukan  menuju  masing- masing wells selanjutnya  dilakukan  inkubasi  di temperatur 37 0 C. Pengamatan saat inkubasi dilaksanakan di hari ke 1, 2 serta 3. Sesudah diinkubasi, dilakukan  pencucian microplate dengan  air  steril sejumlah 3 kali selanjutnya masukkan 200 µL larutan kristal violet 1% menuju masing-masing sumuran serta dilakukan  inkubasi  di  suhu  ruang  dalam  waktu  15 menit. Cuci Microplate dengan air steril sejumlah 3 kali serta dikeringkan di suhu ruangan.
Saat microplate kering, masukkan 200 µL etanol 96% menuju masing-masing sumuran serta dilakukan inkubasi  di  suhu  ruangan  dalam  waktu  15  menit. Kemudian  dilaksanakan  pembacaan  OD  ( Optical Density )  dengan  peralatan iMark-Biorad  Microplate Reader dengan  panjang  gelombangnya  di Absorbansi 595  nm.  Pengujian  dikerjakan  secara  aseptis. Optimalnya, panjang gelombang serta waktu inkubasi akan  dimanfaatkan  pada  saat  pengujian  aktivitas penghambatan serta degradasi biofilm.

## Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm
Pengujian
dalam penghambatan pembentukan biofilm dilaksanakan dengan microplate  polystyrene  96  wells  bermedia  BHI. Tujuannya  adalah  untuk  mengetahui  apakah  daun gamal memiliki efek antimikroba terhadap bakteri S. aureus selama proses pertumbuhan biofilm. Setelah sampel diinkubasi, setiap sumuran mengandung 70 µl  sampel  dengan  seri  konsnetrasi  50%,  25%,  dan 12,5  %  (b/v)  dalam  media.  Selanjutnya,  70  µl suspensi  bakteri  pada  media  yang  setara  dengan

## 1,5x10
8 CFU/mL  ditambah  ke  sumuran  yang mengandung sampel.
Sumurnya dilakukan inkubasi dalam waktu 72 jam di temperatur ± 370°C. Sesudahnya dilakukan pengeringan pada mikroplate dalam waktu 15 menit dengan  mengembalikannya  ke  suhu  ruang.  Setiap sumuran  diisi  dengan  200  µl  larutan  kristal  violet 1%,  dan  pewarnaan  dilakukan  dalam  waktu  15 menit. Selanjutnya, sumurannya dilakukan
pembilasan
menggunakan
air mengalir. Sesudahnya, mikroplate dikeringkan kembali dalam temperatur ruangan dalam waktu satu jam.
Larutan etanol 96% selanjutnya ditambahkan  ke  tiap  sumuran  pada  plat  sebanyak 200 µL. uji dilakukan dengan densitas optik 595 nm dilakukan tiga kali (Kırmusaoglu, 2019). Kontrol uji (bakteri+media+fraksi-fraksi) merupakan kontrol uji aktivitas daun gamal dalam menghambat pertumbuhan biofilm Kontrol positif menggunakan Tetrasiklin.
% Penghambatan Biofilm :
OD Negatif – OD Sampel
OD Kontrol Negatif × 100%

## Uji Degradasi Biofilm
Uji ini dilakukan sama seperti uji penghambatan  biofilm,  tetapi  untuk  uji  aktivitas degradasi biofilm, masing-masing fraksi ditambahkan saat biofilm mulai terbentuk. Uji  aktivitas  degradasi biofilm dilaksanakan dengan microplate round bottom polystyrene  96  wells bermedia  BHI.  Setelah  70  µL media ditambahkan di masing-masing sumuran, 70 µL suspensi  bakteri  pada  BHI  ditambahkan,  yang  setara dengan  1,5x10 8 CFU/mL.  Ini  menghasilkan  biofilm. Selanjutanya mikroplate disimpan selama 72 jam pada suhu ± 37 o C. Setelah itu, isi sumuran dikeluarkan, dan air mengalir digunakan untuk membersihkannya. Seri konsnetrasi 50%, 25%, dan 12,5% (b/v) diterapkan pada media  200  µL  untuk  setiap  sampel.  Selanjutnya,  plat mikroplate  dilakukan  inkubasi  dalam  waktu  24  jam dalam temperatur ±370°C.
Biofilm  dapat  diidentifikasi  menggunakan teknik  yang  sama  yang  digunakan  untuk  menguji kinerja penghambatan pembentukan biofilm (Kırmusaoglu,  2019).  Kontrol  dalam  uji  ini  ialah kontrol  negatif  (bakteri  +  media)  merupakan  kontrol pembentukan  biofilm  yang  mana  pertumbuhan bakteri tidak diganggu, kontrol sampel (bakteri+media+fraksi) merupakan kontrol uji aktivitas daun gamal dalam mendegrasi biofilm. % Penghangcuran Biofilm :
OD Negatif – OD Sampel OD Kontrol Negatif × 100%

## Analisis Data Statistik
Dianalisis data secara statistik uji normalitas oleh Shapiro  Tes  Wilk ,  bila  datanya  memiliki distribusi  normal  (p>  0,05).  Uji  statistik  analisis varians satu arah dilakuan dengan tingkat signifikan (p<0,05),  uji  ini  akan  diikuti  oleh Post  Hoc  Tukey dengan  tingkat  siginfikan  p<0,05.  Uji  statistik  yang digunakan SPSS versi 26.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Peneliti  mempergunakan  serbuk  daun gamal sebanyak 1000 g dalam rangka mendapatkan ekstrak  sebanyak  317  g  dan  dengan  demikian didapat  persen  rendemen  31,7%.  Penelitian  Ulfa et al. ,  (2016)  melaporkan  daun  gamal  yang  dilakukan ekstraksi  menggunakan  pelarut  etanol  memiliki rendemen ekstrak sejumlah 24,7%. Penelitian Dina et al .,  (2023)  menggunakan  pelarut  etil  asetat menghasilkan rendemen ekstrak daun gamal 18,708 gram  dengan  rendemen  3,74%.  Hasil  ini  tak  sama dengan  pelarut  etanol  96%  yang  memperoleh  hasil rendemen ekstrak 31,7%.
Menurut  sejumlah  penelitian,  konsentrasi pelarut  beserta  lama  tahap  maserasi  berhubungan satu  sama  lain  (Satria et  al. ,  (2020).  Semakin  lama proses  maserasi,  semakin  banyak  ekstrak  yang dihasilkan.  Seberapa  efektif  proses  ekstraksi dilakukan  memengaruhi  kecil  besarnya  perolehan hasil rendemen. Menurut Febrina et al ., (2015) suhu, waktu,  pelarut,  pengadukan,  ukuran  sampel,  serta interaksi yang kuat dengan pelarut adalah beberapa faktor  yang  memengaruhi  hasil  ekstraksi.  Luas permukaan  sampel  juga  memengaruhi  jumlah rendemen  karena  kontak  yang  lebih  luas  dan interaksi yang lebih kuat dengan pelarutnya (Sineke et al ., 2016).
Sebanyak  20  gram  ekstrak  kental  daun gamal  difraksisasi,  menghasilkan  5  gram  fraksi  etil asetat, 3 gram fraksi n-heksana, serta 7 gram fraksi air.  Akibatnya,  persentase  rendemen  daun  gamal tidak  genap  100%.  Sebagian  besar  senyawa  dalam daun  gamal  memiliki  sifat  yang  polar.  Maka darinya, fraksi air yang didapat mempunyai jumlah terbesar  dibandingkan  dengan  semua  fraksi  yang lain.
Hasil identifikasi kandungan kimia ekstrak dan  fraksi  daun  gamal:  fraksi  n-heksana  terdapat kandungan alkaloid serta flavonoid; fraksi etil asetat terdapat kandungan alkaloid, flavonoid, serta tanin; dan  fraksi  air  terdapat  kandungan  alkaloid,  tanin, serta terpenoid (Tabel 1).
Hasil identifikasi
makroskopis menunjukkan  bahwa  bakteri S.  aureus membentuk koloni  kuning  pada  media  MSA  dan  membuat
media  menjadi  kuning  (Gambar  1).  Perubahan  ini disebabkan oleh fermentasi manitol, yang mengubah  warna  phenol  merah  menjadi  kuning (Dewi,  2013).  Bakteri Staphylococcus dapat  mengurai
gula pada larutan manitol, menyebabkan peningkatan kadar asam serta media berwarna kuning (Hayati et al. , 2019).
Tabel 1. Hasil identifikasi kandungan kimia ekstrak dan fraksi daun gamal
No. Metabolit Skunder Ekstrak Fraksi n- heksan Fraksi etil asetat Fraksi air 1 Flavonoid + + + - 2 Saponin + - - - 3 Alkaloid + + + + 4 Tanin + - + + 5 Terpenoid + -
- +
Gambar 1. Hasil Identifikasi Mikroskopis Staphylococcus aureus Pada Media MSA
Marfologi  memastikan  bahwa  bakteri S. aureus yang  digunakan  adalah  yang  asli  dan  tidak terkontaminasi  oleh  bakteri  lain.  Pewarnaan  gram perbesaran kuat (100x) digunakan untuk mengidentifikasi  bakteri  dengan  warna  ungu (Gambar 2), memiliki bentuk bulat, serta bergerombol  serupa  dengan  buah  anggur.  Larutan lugol  dan  kristal  violet  diterapkan  pada  lapisan
peptidoglikan  untuk  membuat  pori  peptidoglik. Sebagai  bagian  dari  proses  identifikasi,  pewarnaan gram  digunakan  untuk  mengidentifikasi  kompleks kristal violet. Dengan demikian, lugol dan kompleks kristal  violet  tidak  terlepas,  dinding  sel  tetap berwarna ungu, dan warna bakteri tidak diubah oleh penambahan safranin (Rachma et al , 2009).

## .
Gambar 2. Hasil Pewarnaan Gram Bakteri Staphylococcus aureus Perbesaran (100x)
Uji  biokimia  dilakukan  untuk  menemukan biakan bakteri murni berdasarkan sifat fisiologinya. Metabolisme  sel  adalah  bagian  penting  dari  proses biokimia karena mencakup reaksi kimia yang terjadi oleh  sel,  yang  baik  menghasilkan  energi  dan mempergunakan  energinya  untuk  membentuk bagian  dan  melakukan  kegiatan  lain  seperti  ada pergerakan  (Pelczar et  al. ,  2010). Identifikasi biokimia  pada  bakteri S.  aureus ialah  uji  koagulase serta katalase
Penguujian kouagulase
S. aureus menunjukkan reaksi positif (Gambar 3), yang berarti ada  penggumpalan  dalam  plasma  darah  kelinci yang  terkena  bakteri.  Hasil  identifikasi  ini
membuktikan  keberadaan  bakteri Staphylococcus aureus . Kriteria yang paling umum digunakan untuk mengidentifikasi S.  aureus secara  sementara  adalah produksi  koagulase,  yang  menunjukkan  kapasitas bakteri  untuk  menghasilkan  enzim  yang  dikenal sebagai koagulase (Abrar, 2001). Koagulase, protein ekstraseluler yang mampu menggumpalkan plasma menggunakan  bantuan  faktor  pada  serum,  sebagai pembeda S. aureus dari jenis staphylococcus yang lain (Brückler et al ., 1994).
Hasil pengujian aktivitas antibakteri (Tabel 2) dilakukan  dengan  teknik  dilusi  ataupun  pengujian seri  pengenceran.  Metode  tersebut  berguna  dalam rangka mencari tahu dosis minimal dari obat dengan
sifat  yang  bakterisid  serta  bakteriostatik.  Uji  Kadar Kadar Hambat Minimum (KHM) etil asetat, fraksi n- heksan, serta  air  menggunakan  metode  dilusi  cair
terhadap bakteri S. aureus yang berkonsentrasi 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,125%; 1,4%; 0,8%; 0,4%; 0,2 dan 0,1%.
Gambar 3. Hasil (1) Koagulase dan (2) Katalase bakteri Staphylococcus aureus
Tabel 2. Hasil Uji KHM Fraksi-Fraksi Daun Gamal
No. Konsentrasi (%) Fraksi n-heksana Fraksi etil asetat Fraksi air R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 1 50 % - - - - - - - - - 2 25 % + + + - - - + + + 3 12,5 % + + + - - - + + + 4 6,25 % + + +
+ + + + + + 5 3,125 % + + + + + + + + + 6 1,4 % + + +
+ + + + + + 7 0,8 % + + +
+ + + + + + 8 0,4 % + + +
+ + + + + + 9 0,2 % + + +
+ + + + + + 10 0,1 % + + + + + + + + + 11 Tetrsiklin (+) - - - 12 Kontrol media (BHI) + + +
Keterangan:  (R1) Replikasi 1; (R2) Replikasi 2; (R3) Replikasi 3; (-)  Tidak Ada Pertumbuhan Bakteri (+) Ada Pertumbuhan Bakteri
Hasil  KHM  diamati  dengan  melihat kekeruhan  pada  tabung.  Kekeruhan  pada  tabung dikarenakan adanya pertumbuhan bakteri uji. Hasil pengamatan  menunjukkan  keruh  pada  konsentrasi 0,1%;  0,2%;  0,4%;  0,8%;  1,4%,  3,125%;  6,25%;, pengujian  dilanjutkan  dengan  menginokulasikan pada  konsentrasi  1,4%  -  50%  hasil  dilusi  pada medium VJA. Berdasarkan data pada tabel 13 dapat terlihat  bahwa  KHM  fraksi  etil  asetat  daun  gamal ada  di  konsentrasi  6,25%.  Hasil  inokulasi  dengan metode gores digunakan untuk menetapkan KBM.
Hasil  uji  KBM  dengan  metode  gores  di media padat fraski n-heksan pada konsentrasi 6,25% -  50%  masih  ada  pertumbuhan  bakteri.  Pada  hasil KBM  fraksi  etil  asetat  dari  konsentrasi  12,5%-50% tidak  ada  pertumbuhan  bakteri,  sedangkan  pada hasil KBM uji fraksi air hanya konsentrasi 50% tidak ada  pertumbuhan  bakteri.  Kontrol  negatif  pada penelitian  ini  adalah  bakteri  pada  media  BHI. Kontrol  negatif  digunakan  untuk  mengetahui adanya  bakteri  yang  tumbuh  dalam  media  yang digunakan.

## Tabel 3. Hasil Uji KBM Fraksi-Fraksi Daun Gamal
No. Konsentrasi (%) Fraksi n-heksana Fraksi etil asetat Fraksi air R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 1 50 % + + + - - - - - - 2 25 % + + + - - - + + + 3 12,5 % + + + - - - + + + 4 6,25 % + + + + + + + + + 5 1,4% + + + + + + + + + 6 Tetrasiklin (+) - - - 7 Kontrol media (BHI) + + +
Keterangan: (-) Tidak Ada Pertumbuhan Bakteri; (+) Ada Pertumbuhan Bakteri
2 1
Kontrol  positif  pada  uji  antibakteri  adalah antibiotik tetrasiklin. Tetrasiklin digunakan sebagai pembanding  pada  pengujian  aktivitas  antibakteri karena  mekanisme  kerja  dengan  mencegah sintesis protein  di  ribosom  bakteri.  Difusi  pasif  dan transportasi aktif adalah dua cara tetrasiklin masuk ke  dalam  bakteri.  Setelah  masuk  ke  ribosom,  ia berikatan dengan ribosom selama 30s dan mencegah kompleks t-RNA-asam amino masuk ke asam amino sehingga  proses  sintesis  protein  tidak  dapat berlangsung,  yang  berarti  bakteri  tidak  dapat bermetabolisme (Tariq et al ., 2018).
Berdasarkan  hasil  penelitiannya,  fraksi  etil asetat  yang  teraktif  cenderung  mempunyai  aktivitas Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM). Perihal tersebut dikarenakan  dalam  fraksi  etil  asetat  daun  gamal terkandung  zat  flavonoid,  alkaloid,  serta  tanin. Senyawa  flavonoid  mempunyai  aktivitas  antibakteri melalui  pemberian  efek  bakteriolitik,  melakukan penghambatan terhadap sintesis DNA, protein, RNA, serta  memicu  rusaknya  permeabilitas  membran  sel (Dzoyem et al. , 2013).
Berdasarkan  Wu et  al. ,  (2013) flavonoid mempunyai aktivitas antibakteri dikarenakan mampu berinteraksi  dengan  membran  sel  serta  berpengaruh pada  bioaktivitas  membran  sel  serta  flavonoid  juga dapat  menekan  fluiditas  membran  sel  bakteri  yang berkaitan  dengan  kerusakan  membran  sitoplasma secara  langsung  ataupun  kerusakan  tak  langsung lewat autolisis atauapun pelemahan dinding sel serta berakibat pada lisis osmotik.
Tannin  adalah  polifenol  yang  memiliki kemampuan untuk mengendapkan protein dilaporkan bahwa  tannin  dapat  menghentikan  pertumbuhan mikroorganisme melalui pengendapan protein mikroba  serta  memicu  tak  bisa  diaksesnya  protein nutrisi  oleh  bakteri  (Prasad et  al .,  2008).  Senyawa alkaloid  memiliki  aktivitas  antibakteri  dengan mekanisme  kerja  terkait  penggangguan  komponen yang  bertugas  menyusun  peptidoglikan  dalam dinding  sel  bakteri  serta  menjadi  akselerator  pada enzim topoisomerase terkait penghambatan DNA sel bakteri  (Wu et  al. ,  2013  dalam  simanjuntak  2020). Alkaloid mampu menjadi penghambat pembentukan protein,  respirasi  sel,  serta  merusak  komponen  yang menyusun  peptidoglikan  dan  dengan  demikian komponennya  tak  bisa  secara  sempurna  terbentuk (Balsundram al. , 2006).
Hasil  pengamatan  perubahan  morfologi bakteri S.  aureus ATCC  25923  menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM) yang telah diberi perlakuan  fraksi  etil  asetat  daun  gamal  adalah adanya perubahan bentuk sel bakteri (Gambar 4). Sel bakteri  dengan  perlakuan  mengalami  perubahan bentuk  pada  membran  sel  dibandingkan  dengan bakteri tanpa perlakuan, pada gambar 1 menunjukkan  morfologi  bakteri S.  aureus dengan membran  sel  yang  utuh,  sementara  gambar  2 menunjukkan  bakteri  yang  mengalami  lisis  karena ketidakstabilan  membran  sel  yang  mengganggu metabolisme bakteri.
Gambar 4. Marfologi bakteri S aureus ATCC 25923 dengan pengamatan SEM (10.000) (1) tanpa perlakuan, (2) setelah perlakuan fraksi etil asetat. Tanda panah pada 1A menunjukan permukaan membran sel bakteri masih utuh,
sedangkan tanda panah pada 2B menunjukkan membran sel bakteri mengkerut dan mengalamai
perubahan bentuk semulanya.
Pemberian fraksi etil asetat kerusakan dalam membran  sel  bisa  diobservasi  dengan  cara microskopis  melalui  SEM,  dengan  tanda-tanda permukaan sel yang mengerut. Senyawa aktif pada daun  gamal  tunggal  memiliki  sifat  amfifatik,  yang
memungkinkan  melewati  membran  luar  sel  yang lipopolisakarida  (LPS)  selimuti  memiliki  sifat amfifatik.  Tannin dapat mengkerutkan membran sel bakteri  menghentikan  bakteri  untuk  berfungsi  dan menghentikan  pertumbuhannya  (Tula et  al .,  2012).
1 2 B A
Setelah membran bakteri rusak, senyawa flavonoid mampu  memasuki  bagian  seluler  bakteri  serta memicu rusaknya inti bakteri. Selain itu, peningkatan permeabilitas  membran menyebabkan komponen penyimpanan
hilang yang
mengakibatkan  bentuk  sel  menipis  atau  area permukaan sel yang kosong.
Pengamatan  kebocoran  ion  logam  Ca2+ bakteri S.  aureus dengan  penambahan  fraksi  etil asetat  dapat  menyebabkan  peningkatan  kocboran ion. Ion Ca2+ berfungsi menghubungkan lipopollisakrida  pada  dinding  sel  bakteri  gram positif  sebagaimana  terdapat  pada  Gambar  5 berikut.
Gambar 5. Grafik Kebocoran Ion Ca 2+
Park et  al. ,  (2003)  menyebutkan  komponen isi  sel  yang  mengalami  kebocoran  bisa  dilakukan pengukuran  di  panjang  gelombang  260  nm  ialah DNA  diantaranya  ialah  pirimidin,  ribonukleotida, purin,  dan  untuk  panjang  gelombang  280  nm mampu  dibuat  dalam  melakukan  pengukuran triptopan  serta  tirosin.  Penelitian  yang  dilakukan oleh  (Ezzudin  &  Rabeta  (2018) flavonoid  memiliki kemampuan  untuk  mempengaruhi  dinding  sel bakteri,  ini  terjadi  karena  ion  Ca 2+ merupakan komponen dinding sel dan menghalangi permeabilitas membran sel.
Sitoplsma yang mengandung DNA, protein, kalsium  bocor  menyebabkan  kerusakan  membran sel  dari  penyebab  kematian  bakteri  (Budiman  & Aulifa, 2020). Hasil penelitian menunjukkan bahwa
peningkatan  kadar  ion  logam  Ca 2+ di  luar  sel menunjukkan kerusakan permeabilitas membran sel bakteri  (Syarifuddin  &  Sulistyani,  2018).  Adanya mekanisme  kerja  senyawa  tanin  adalah  dengan menghancurkan  dinding  polipeptida  sel  bakteri. Rusaknya  membran  polipeptida  sel  bakteri menyebabkan  pembentukan  membran  sel  bakteri tidak sempurna serta bakteri akan mati (Dwiningsih, 2016). Perihal ini karena dinding sel senantiasa utuh namun  isi  selnya  keluar  karena  membran  selnya rusak.
Menggunakan  alat  Elisa  yang  berpanjang gelombang 595 nm, dilakukan maksimalisasi waktu pembentukan  biofilm Staphylococcus  aureus ,  yang mencapai 72 jam (Tabel 4).
Tabel 4. Hasil Waktu Optimasi Pembentukan Biofilm S. aureus No. Absorbansi 24 jam 48 jam 72 jam 1 0,138 0,223 0,397 2 0,155 0,241 0,389 3 0,186 0,271 0,395 4 0,167 0,267 0,412 5 0,166 0,283 0,395 6 0,197 0,261 0,392 7 0,186 0,192 0,396 8 0,112 0,204 0,389 9 0,141 0,285 0,399 10 0,128 0,212 0,392 Rata-rata 0,158 ± 0,028 0,234 ± 0,032 0,396 ± 0,007
2,312 6,192 0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 Kontrol Negatif (-) Fraksi Etil Asetat Ion Ca2+ m g/L Perlakuan Kebocoran Ion Logam Ca2+
Waktu  inkubasi  72  jam, S.  aureus mampu membentuk  biofilm  terbaik  serta  paling  efektif, seperti  yang  ditunjukkan  oleh  hasil  pada  tabel tersebut.  Pambayun et  al. ,  (2008) menyebutkan pertumbuhan  bakteri S.  aureus meliputi  sejumlah fase  yang  diantaranya  lag,  log,  stasioner,  serta kematian. Fase stasioner timbul sewaktu pertumbuhannya  ada  di  angka  120  jam,  serta  fase kematian muncul sesudah 20 jam.
Hasil  optimasi  waktu  terkait  terbentuknya biofilm  bisa  diamati  di  tabel  4.    Merujuk  kepada penelitian  Tobi et  al. ,  (2022)  panjang  gelombang  saat membaca  biofilmnya  ialah  595  nm.  Panjang gelombang tersebut adalah panjang gelombang paling optimal  terkait  pembacaan  biofilm  ialah  595  nm, diperlihatkan  melalui  nilai  absorbansi  (OD)  terbesar dari  tiga  variasi  panjang  gelombang  yang  lain  yakni 595 nm, 490 nm, dan juga 655 nm. Panjang gelombang tersebut  dipergunakan  pada  pembacaan  biofilm bakteri uji dalam microplate reader.
Hasil  optimasi  waktu  dalam  terbentuknya biofilm  bakteri S.  aureus bernilai  absorbansi  rata-rata dalam  inkubasi  24  jam  yakni  0,158  ±  0,028;  dalam inkubasi 48 jam yakni 0,254 ± 0,032; dalam inkubasi 72 jam yakni 0,396 ± 0,007. Hasil nilai absorbansi  paling besar  bisa  dilihat  saat  inkubasi  hari  ketiga.  Nampak pula S.  aureus mempunyai  waktu  pertumbuhan optimal saat hari ke-3 yang bernilai rerata OD 0,396 ± 0,007.  Waktu  ini  merupakan  waktu  paling  optimal dalam  pertumbuhan  biofilm  yang  selanjutnya dimanfaatkan  menjadi  rujukan  masa  inkubasi  saat menguji  aktivitas  penghambatan  pembentukan biofilm serta degradasi biofilm di setiap sample bakteri S. aurues.
Terbentuknya  biofilm  diawali  sewaktu bakteri  menempel  pada  kondisi  permukaan  lewat
molekul  organik.  Tingkatan  lekatan  sel  mikroba mendapatkan  pengaruh  dari  beberapa  faktor diantaranya  kondisi  permukaan,  sifat  permukaan, hidrodinamika,  serta  karakteristik  media  cair, beragam  karakteristik  permukaan  sel  mikroba, kuorum  sensing,  serta  regulasi  gen  (Mahami  & Gyamfi, 2011).
Biofilm  mampu  membentuk  di  berbagai jenis  permukaan  serta  keadaan  lingkungan  bakteri kondisi  film  dipengaruhi  berdasarkan  adanya bakteri, molekul anorganik serta organik permukaan.  Substrat  anorganik  serta  organik menuju  permukaan  bersamaan  mikroorganisme lewat  metode  difusi  ataupun  melalui  aliran  cairan. Biofilm  memiliki  transfer  nutrisi  yang  lebih  baik dibandingkan  fase  cair  (Riemann  &  Cliver,  2006). Keadaan  media  cair,  misalnya  nutrisi,  pH,  suhu, serta kekuatan ion juga kemungkinan memengaruhi tingkat perlekatan mikroba. Polimer organik media yang  terendam  pada  permukaan  memengaruhi kekuatan  serta  tingkatan  perlekatan  mikroba.  Film terbentuk  pada  beberapa  menit  pemaparan  serta senantiasa  mengalami  perkembangan  di  beberapa jam ke depan.
Pengujian aktivitas penghambatan pembentukan biofilm dilaksanakan dengan memasukkan  ekstrak  dan  fraksi  daun  gamal  ke dalam mikroplate dengan konsentrasi yang berbeda. Kemudian, media dan suspensi bakteri ditambahkan  ke  dalam  tiap  sumuran  ( wells )  yang kemudian  diinkubasi.  Mikroplate  yang  telah diinkubasi  kemudian  diwarnai  dengan  larutan kristal  violet.  Kristal  violet  dibersihkan  dengan  air mengalir. Kristal violet akan menempel pada biofilm membuat cincin berwarna ungu pada mikroplate.
Tabel 5. Hasil Persentase Rata-Rata Penghambatan Pembentukan Biofilm Ekstrak Dan Fraksi Daun Gamal
No. Konsentrasi (%) Ekstrak (%) Fraksi n- heksan (%) Fraksi etil asetat (%) Fraksi air (%) Tetrasiklin 0,00125% 1 12,5 29,33 ± 2,92 22,42 ± 2,00 30,87 ± 3,36 20,51 ± 0,71 2 25 31,38± 2,24 25,57 ± 4,15 35,52 ± 3,00 25,23 ± 2,95 49,35 ± 2,64 3 50 37,51 ± 3,15 28,93 ± 3,63 40,69 ± 3,19 30,20 ± 2,07
Bakteri S.  aureus ATCC  25923  termasuk bakteri  gram  positif  yang  bersifat  patogen  dalam manusia  dan  memiliki  kemampuan  menyebakan penyakit infeksi (Peeters et al ., 2008). Biofilm pada S. aureus akan  membentuk  suatu  mikrokoloni  yang terbungkus  oleh  matriks  polisakarida.  Matrik tersebut  tersusun  atas  beberapa  komponen  seperti DNA  ekstraseluler,  polisakarida  dan  beberapa protein (Schwartz et al ., 2012).
Pembentukan  biofilm  lewat S.  aureus ini menjadi penyebab berbagai penyakit infeksi seperti osteomielitis,  endokkarditis,  dan  infeksi  pada  alat- alat  implan.  Biofilm  pada  bakteri  akan  membuat bakteri  tersebut  lebih  tahan  terhadap  antibiotik sehingga terkadang untuk membunuhnya dilakukan  ditingkatkan  konsentrasi/dosis  dari antibiotik (Boles & Horswill, 2011).
Hasil  persentase  dalam  menghambat pembentukan  biofilm  memperlihatkan  tetrsiklin
mempunyai  rerata  penghambatan  pembentukan biofilm sebanyak 49,35% atau hampir setara dengan rerata  penghambatan  pembentukan  biofilm  dalam fraksi  etil  asetat  dengan  konsentrasi  50%  yaitu sebesar  40,69%.  Penggunaan  tetrasiklin  sebagai kontrol positif dalam pengujian ini bertujuan untuk membandingkan  aktivitas  sampel  bahan  alam dengan sediaan antibiotik yang beredar dimasyarakat.
Hasil  pengujiannya  mendapatkan  hasil tetrasiklin  memiliki  aktivitas  yang  paling  besar daripada fraksi etil asetat, ekstrak etanol air, serta , fraksi  n-heksan  daun  gamal  dalam  menghambat pembentukan  biofilm.  Tetrasiklin  ialah  antibiotik yang  tergolong  mampi  menjadi  penghambat pertumbuhan biofilm bakteri S. aureus (Dewi, 2013) . Tetrasiklin  mempunyai  aktivitas  menghambat quorum sensing sewaktu tahap terbentuknya biofilm (Deryabin & Inchagova, 2018).
Prinsip quorum  sensing (QS)  bahwa sewaktu  sel  tunggal  bakteri  melepas  autoinducer menuju lingkungan, konsentrasi autoinducer terlampau  sulit  terdeteksi  dikarenakan  sudah terencerkan  pada  lingkungan  di  dalamnya. Konsentrasi  autoinducer  cenderung  mengalami peningkatan  bila  populasi  bakteinya  banyak  serta mampu  menyentuh  konsentrasi  ambang  sewaktu berbagai  sel  bakteri  mampu  mendeteksinya  ulang serta melakukan pengaktifan ekspresi berbagai gen target  dengan  cara  yang  bersamaan  (De  Kievit  & Iglewski,  2000).  Terhambatnya quorum  sensing disebakan  karena  penghambatan  sintesis  enzim yang  bertanggung  jawab  menghasilkan  molekul pemberi  sinyal  atau  protein  reseptor  memodulasi penginderaan kuorum (Donlan, 2011).
Proses  senyawa  dalam  menghambat pembentukan biofilm yakni melalui penghambatan perlekatan  mikroba  pada  permukaan  dan  dengan demikian akan mengganggu perkembangan biofilm yang selanjutnya memberi pengaruh pada struktur biofilm  terkait  peningkatan  pertahanan  atas antimikroba.  Di  samping  menghambat  perlekatan mikroba, senyawa dapat memicu rusaknya matriks ekstraseluler  (EPS)  biofilm,  perihal  tersebut cenderung  menjadi  penyebab  terputusnya  jalur komunikasi  dari  nutrisi  serta  sel  dengan  mikroba dan  dengan  demikian  mikrobanya  cenderung  mati ataupun lisis dikarenakan nutrisi yang diperolehnya hilang (Hamzah et al. , 2021).
Akumulasi  biofilm  dalam  permukaan padat  akan  melewati  2  tahapan.  Tahap  pertama yakni pertumbuhan Extracellular
Polymeric Substances (EPS)  serta  sel,  sehingga  sel  biofilm menjadi  terakumulasi.  Tahapan  keduanya  ialah
dapat  dijumpai  penempelan  ataupun  pelepasan kembali. Bakteri mempergunakan beragam organel protein serta ekstraseluler dalam penginderaan serta menempel  di  permukaan,  tak  terkecuali  fimbriae, flagel  pili,  protein  luar  membran,  serta  serat  curli (Thomas et al., 2004).
Dalam melakukan penghambatan ekspresi gen  icaA  serta  icaD  menjadi  penyebab  munculnya flavonoid  serta  tanin  yang  menjadi  penghambat adhesi  sel  bakteri,  baik  perlekatan  antar  bakteri ataupun  perlekatan  bakteri  dengan  substrat,  di mana  adhesi  menjadi  faktor  paling  utama  untuk membentuk biofilm (Nuryastuti, 2010). Gen tersebut mampu  menghasilkan Polysaccharide  Intercellular Adhesion (PIA),  yang  mengatur  pembentukan  EPS dan  agregasi  sel.  PIA  juga  memilik  peran  atas terbentuknya biofilm bakteri S. aureus (Archer et al. , 2011).  Kemampuan  penghambatan  biofilm  dari suatu  senyawa  dalam  ekstrak  mapun  fraksi  terkait kemampuan  penetrasi  senyawa  tersebut  menuju biofilm,  yakni  mampu  berpenetrasi  pada  lapisan (EPS)  maupun  lapisan  lendir  penyelubung  bakteri (Yosephine et al ., 2013).
Berdasarkan  hasil  uji  antibiofilm  fraksi- fraksi serta ekstrak daun gamal terbukti mempunyai aktivitas menghambat pembentukan biofilm biofilm pada S.  aureus ATCC  25923.  Untuk  perbedaan kemaknaan  nilai  penghamatan    sampel  uji  dengan kontrol  negatif  pada S.  aureus ATCC  25923,  maka dilakukan analisis statistik di uji normalitas dengan hasilnya  terdistribusi  normal,  maka  dilanjutkan  uji homogenitas menunjukan homogen penghambatan biofilm  hasilnya  homogen  yang  bernilai  p>0,05. Datanya kemudian diuji one way ANOVA satu jalur diperoleh  hasil  yakni  ditemukan  perbedaan signifikan  bermakna  (0,00  (p<0,05)).  Data  hasil persentase  penghambatan  biofilm  masing-masing konsentrasi  ekstrak  dan  fraksi-fraksi  daun  gamal 12,5%; 25% dan 50%, kemudian diuji menggunakan SPSS versi 26 untuk melihat perbedaan ekstrak dan fraksi-fraksi  daun  gamal  pada  tiap  konsentrasi dengan  kontrol  positif  terkait  penghambatan pembentukan biofilm S.aureus ATCC 25923.
Hasil  perhitungan  statistik  diperoleh  data aktivitas ekstrak dan fraksi-fraksi daun gamal terkait penghambatan biofilm S. aureus ATCC 25923 untuk konsentrasi 12,5%; 25% dan 50% terdapat perbedaan signifikan dimana nilai p>0,05 berbeda secara nyata dengan kontrol positif. Di konsentrasi 50% fraksi etil asetat ada perbedaan signifikan dengan konsentrasi 12,5%, 25% fraksi air dan fraksi n-heksan.
Uji degradasi biofilm dimulai dengan bakteri S.  aureus dibuat  menghasilkan  biofilm  terlebih dahulu, selanjutnya larutan pada plate dicuci untuk
selanjutnya  diberi  perlakuan  ekstrak  serta  fraksi daun  gamal  melalui  beragam  variasi  konsentrasi. Hasil  nilai  absorbansi  yang  didapat  selanjutnya dihitung  persentase  degradasi  biofilm  sesuai  Tabel 6.
Hasil  persentase  degradasi  biofilm  terlihat yang  tertinggi  adalah  fraksi  etil  asetat  dengan konsentrasi  50%  yaitu  sebesar  37,27%,  selanjutnya diikuti  dengan  ekstrak  yang  bernilai  34,55%,  fraksi air  yang  bernilai  31,77%,  fraksi  n-heksan  yang bernilai  30,05%.  Kontrol  positifnya  ialah  antibiotik menunjukkan aktivitas dengan nilai sebesar 51,66 %. Sejumlah  mekanisme  terkait  penghancuran  biofilm
diantaranya  ialah  pendegradasian  matriks  biofilm, mati  ataupun  bocornya  sel.  Senyawa  kimia  yang terkandung pada ektrak dan fraksi daun gamal ialah flavonoid,  tanin,  alkaloid,  saponin  serta  terpenoid. Senyawa  flavonoid  mempunyai  aktivitas  dalam menghancurkan  biofilm.  Mekanisme  flavonoid dalam menghancurkan biofilm dengan cara struktur flavonoid  yaitu  gugus  hidroksil  memiliki  ikatan dengan  protein  pada  biofilm  serta  melakukan pembentukan senyawa kompleks sehingga mengakibatkan biofilm terjadi denaturasi (Winarsih et al ., 2019).
Tabel 6. Hasil Persentase Rata-Rata Degradasi Biofilm Ekstrak Dan Fraksi Daun Gamal No. Konsentrasi ( %) Ekstrak (%) Fraksi n-heksana (%) Fraksi etil asetat (%) Fraksi air (%) Tetrasiklin 0,00125% 1 12,5 26,95 ± 3,51 21,20 ± 2,89 29,48 ± 3,36 23,30 ± 3,92 2 25 31,00 ± 3,95 25,42 ± 5,54 32,19 ± 2,51 25,42 ± 3,74 51,66 ± 2,47 3 50 34,55 ± 3,94 30,05 ± 3,21 37,27 ± 2,51 31,77 ± 3,53
Senyawa  tanin  merusak  biofilm  bakteri dengan  cara  melakukan  pengikatan  ion  besi  yang bakteri butuhkan dala menjaga matriks biofilm yang berakibat  pada  menurunnya  kekekentalan  bakteri serta ikatan matriks biofilmnya. Tanin mampu pula berpengaruh  pada Extracelluler  Polymeric  Substance (EPS),  melalui  pengurangan  jumlah  EPS  dalam biofilm bakteri (Aini et al. , 2016). Mekanisme saponin terkait  perusakan  biofilm  melalui  pemberian pengaruh padai matriks polimer ekstraseluler pada matriks  biofilm  bakteri  dan  dengan  demikian terjadilah  pengurangan  zat  polimer  serta  merubah integritas  membran  sel  bakteri  sebagai  penyebab terjadinya penuruan stabilitas dinding sel bakterinya (Andrade et al. , 2019).
Terpenoid  terkait  pendegradasian  biofilm mampu  meminimalkan  oembentukan  biofilm  serta membunuh  bakteri.  Senyawa  triterpenoid  mampu membuat membran sel bakteri rusak  serta menjadi penyebab  bocornya  sel  bakteri  (Khameneh et  al. , 2019).  Berbagai  senyawa  ini  menjadi  penghambat serta  penghancur  biofilm  dikarenakan  memiliki mekanisme  yang  mampu  menjadi  penyebab terdegradasinya  matriks  biofilm,  mati  serta bocornya  sel.  Kemampuan  degradasi  biofilm  pada sebuah  zat  berkaitan  erat  dengan  kemampuan penetrasi  senyawa  menuju  biofilm,  yaitu  dengan melakukan penetrasi menuju lapisan (EPS) ataupun lapisan  lendir  penyelubung  bakteri.  Di  samping perihal  tersebut,  kemampuan  senyawa  terkait pendegradasian  biofim  ialah  melalui  penghilangan EPS dalam biofilm (Ardani et al. , 2010)
Analisis  statistik  penghancuran  biofilm diawali  uji  normalitas  hasilnya  menunjukan  data
persentase  degradasi/penghancuran  biofilm S. aureus ATCC 25923 terdistribusi normal. Kemudian dilanjutkan uji homogenitas menunjukan persentase degradasi/penghancuran biofilm hasilnya homogen yang  bernilai  p>0,05.  Datanya  kemudian  diuji one way ANOVA  satu  jalur  yang  didapat  hasil  berupa perbedaan  signifikan  bermakna  yang  bernilai signifikan  0,00  (p<0,05).  Nilai  signifikan  antar perlakuan  menunjukan  bahwa  ada  perbedaan signifikan pada ekstrak dan fraksi

## KESIMPULAN
Ekstrak dan fraksi n-heksan, air daun gamal, serta  etil  asetat  memiliki  aktivitas  antibakteri  serta antibiofilm  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus ATCC  29523.  Fraksi  teraktif  daun  gamal  yang memiliki aktivitas antibakteri pada konsentrasi 50% uji  dilusi  KHM  dan  KBM  adalah  fraksi  etil  asetat memperlihatkan  tak  ditemukan  pertumbuhan bakteri, sedangkan aktivitas penghambatan pembentukan  biofilm  dengan  nilai  40,69%  dan degradasi biofilm dengan nilai 37,27%

## DAFTAR PUSTAKA
Agustina,  S,,  Wiraningtyas,  A,,  &  Bima,  K.  (2016).
Skrining  Fitokimia  Tanaman  Obat  di Kabupaten Bima.
Ahn, K., Baik, B., E., J., Yun, C., H.Han, & H, S. (2018). Lipoteichoic  acid  inhibits  Staphylococcus aureus  biofilm  formation.  Frontiers  in Microbiology, 9.
Akharaiyi, F. C., Boboye, B., & Adetuyi, F. C. (2012).
Antibacterial, phytochemical and antioxidant
activities  of  the  leaf  extracts  of  Gliricidia sepium  and  Spathodea  campanulata.  World Applied Sciences Journal, 16(4), 523–530.
Archer, N. K., Mazaitis, M. J., Costerton, J. W., Leid,
J.  G.,  &  Powers,  M.E.,  dan  Shirtliff,  M.  E.
(2011).  Staphylococcus  aureus  biofilms: properties,  regulation,  and  roles  in  human disease. Virulence, 5.
Ardani, M., Pratiwi, S.U.T., Hertiani, T. 2010. (2010). Efek Campuran Minyak Atsiri Daun Cengkeh dan  Kulit  Batang  Kayu  Manis  sebagai Antiplak  Gigi.  Majalah  Farmasi  Indonesia2, 21(3), 191–201.
Boles,  B.  R.  (2011).  Staphylococcal  biofilm disassembly.
Budiman,  A.  &  Aulifa,  D.  .  (2020).  A  Study
Comparing Antibacterial Activity of
Ageratum  Conyzoides  L.  Extract  and  Piper betle L. Extract in Gel Dosage Forms Against Staphylococcus  aureus.  S.  Pharmacognosy Journal, 12(3), 473-477
Courtney, A. (2012). Formularies. Pocket Handbook of  Nonhuman  Primate  Clinical  Medicine.  -, 213–218.
Dermawan,  S.  (2021).  Formulasi  gel  ekstrak  etanol daun  binahong  (  Anredera  cordifolia  (Ten) Steenis) dan uji aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus epidermidis. Universitas Perintis Indonesia, 4.Ezzudin, Muhammad R dan Rabeta, M. . (2018). A Potential of Telang Tree  (Clitoria  Ternatea)  in  Human  Health. Food Research, 2(5), . 415-420.
Hamzah, H., Hertiani, T., Utami Tunjung Pratiwi, S., Nuryastuti, T., (2021). Efek Saponin Terhadap
Penghambatan Planktonik Dan Mono-Spesies
Biofilm  Candida  albicans  ATCC  10231  Pada
Fase Pertengahan, Pematangan Dan Degaradasi. Majalah Farmaseutik, 17(2), 198–
205.
Kamal,  S.  E.  (2020).  Uji  Efektivitas  Antibakteri
Ekstrak  Etano  Daun  Gamal  (Gliricidia sepium)  Dalam  Menghambat  Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus. Jurnal Farmasi Sandi Karsa, 6(1), 99–104.
Katrin,  D.,  Idiawati,  N.,  &  Sitorus,  B.  (2015).  Uji aktivitas antibakteri dari ekstrak daun malek (Litsea  graciae  Vidal)  terhadap  bakteri Stapylococcus  aureus  dan  Escherichia  coli. Jurnal Kimia Khatulistiwa, 1.
Khan, A. A., Mudassir, J., Mohtar, N., & Darwis, Y.
(2013).  Advanced  drug  delivery  to  the
lymphatic system:
Lipid-based
nanoformulations.  International  Journal  of Nanomedicine, 8, 2733–2744.
Kining E, Falah S, N. N. (2016). Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Air Daun Pepaya (Carica papaya L.) terhadap  Bakteri  Pseudomonas  aeruginosa Secara In Vitro. Current Biochemistry
Luh, N., Artaningsih, B., Habibah, N., & Mastra, N. (2018).  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Etanol Daun  Gamal  (Gliricidia  sepium)  pada Berbagai Konsentrasi terhadap Pertumbuhan Bakteri Streptococcus mutans secara In-Vitro. 9 (November), 336–345.
Nuryastuti  T.  (2010).  Enviromental  signals  afecting ica-expression in Staphylococcus epidermidis biofilm.  Thesis.  University  Medical  Center Groningen. Netherlands.
Peeters, E,, nelis, H, j.,  and C. (2008). Comparison of multiple  methods  for  quanfication  of microbial biofilms grown in microtiter plates. Microbial Methods.
Pelczar  MJ,  C.  E.  2010.  (2010).  Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Jilid 1. Elements Of Microbiology.
Saptarini  O,  R.  I.  2021.  (2021).  Pengaruh  minyak atsiri  daun  jeruk  purut  (Citrus  Hystrix) terhadap  dinding  sel  bakteri  Staphylococcus aureus.  Berita  Biologi  Jurnal  Ilmu-Ilmu Hayati.
Saptarini  O,  R.  I.  2021.  (2021).  Pengaruh  minyak atsiri  daun  jeruk  purut  (Citrus  Hystrix) terhadap  dinding  sel  bakteri  Staphylococcus aureus.  Berita  Biologi  Jurnal  Ilmu-Ilmu Hayati.
Susanty,  &  Yudhistirani,  S.  A.  (2018).  Pengaruh
Waktu  Ekstraksi  Daun  Binahong  (Anredera cordifolia (Tenore) Steenis) Terhadap Kemampuan Daya Hambat Bakteri
Escherichia  coli  untuk  Pembuatan  Hand Sanitizer. Jurnal Konversi, 1, 1–10.
Satria,  R.,  Hakim,  A.  R.,  &  Darsono,  P.  V.  (2020). Penetapan Kadar Flavonoid Total Dari Fraksi n-Heksana Ekstrak Daun Gelinggang dengan Metode  Spektrofotometri  UV-Vis. Journal  of Engineering, Technology, and Applied Science, 1 , 33–46.
Syarifuddin,  A.,  &  Sulistyani,  N.  (2018).  Aktivitas Antibiotik  Isolat  Bakteri  Kp13  dan  Analisa Kebocoran Sel Bakteri Escherichia coli. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 16(2), 137–144.
Tobi, C. H. B., Saptarini, O., & Rahmawati, I. (2022).
Alktivitas  Antibiofilm  Ekstrak  dan  Fraksi- Fraksi Biji Pinang (Areca catechu L.) Terhadap Staphyococcus aureus ATCC 25923. Journal of Pharmaceutical Science and Clinical Research, 7(1), 56.
Ulfa, N. K., Fridayanti, A., Maulidya, V., & Rijai, L.
(2016).  Identifikasi  Metabolit  Sekunder,  Uji
Toksisitas  Dan  Uji  Aktivitas  Antioksidan Ekstrak Daun Gamal (Gliricidia sepium). 20– 21.
Wu T, Mengying H, Xixi Z, Ying Z, Tianfu Q, Siyi P, X. X. (2013). A Structure Activity Relationship Study of Flavonoids As Inhibitors of E. coli By Membran  Interaction  Effect.  Biochimica  et Biophysica Acta.
Yosephine, Wulanjati, Saifullah, D., & Astuti. (2013). Mouthwash formulation of basil oil (Ocimum basilicum  L.)  and  in  vitro  antibacterial  and antibiofilm  activities  against  Streptococcus mutans. 18(2), 95–102.