## ISOLASI BAKTERI ASAM LAKTAT ASAL JUS NANAS SEBAGAI KANDIDAT PROBIOTIK

## [Isolation of Lactic Acid Bacteria from Pineapple Juice as Probiotic Candidates]
Cynthia Rizka Riani 1) , Lilis Nuraida 2,3) , dan Anja Meryandini 4,5) *
1) Program Studi Mikrobiologi, Sekolah Pascasarjana, IPB University, Bogor
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB University, Bogor
3) Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center, IPB University, Bogor,
4) Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB University, Bogor
5) Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB University, Bogor
Diterima 12 Desember 2019 / Disetujui 20 Juli 2020

## ABSTRACT
Lactic  acid  bacteria  (LAB)  are  the  main  group  of  probiotic  bacteria  that  widely  used  in  fruit  juice fermentation products. Fruit juice contains antioxidants that can prevent free radicals. The objective of this study  was  to  identify  LAB  isolated  from  pineapple  juice  that  possess  probiotic  properties  and  to  analyze the antioxidant activity of pineapple juice after being fermented with the LAB. LAB isolates from pineapple juice  were  evaluated  for  their  probiotic  properties  (tolerance  to  acidic  conditions  and  bile  salts, antimicrobial  activity  against  pathogenic  bacteria,  and  sensitivity  to  antibiotics)  and  their  adherence properties  (autoaggregation,  coaggregation,  and  hydrophobicity).  The  best  isolates  obtained  are  then inoculated into pineapple juice. From 5 types of pineapple juice, 5 isolates with LAB characteristics were obtained,  i.e  NHC6,  NHC7,  NHC8,  NHC9,  and  NPC1.  Isolate  NHC6  had  a  good  tolerance  to  acidic conditions (pH 2) and 0,5% bile salt, had antimicrobial activity, was sensitive to ampicillin, showed the best adherance properties and was identified as Lactobacillus plantarum. L. plantarum NHC6  was then added to  pineapple  juice.  Addition  of  L.  plantarum  NHC6  to  pineapple  juice  reduced  the ᵒBrix  and  pH  values during  incubation.  After  24  hours  of  incubation,  the  antioxidant  activity  was  89,05%,  with  LAB  growth  of 8,33 log CFU/mL, thus 24 hours incubation was considered the best fermentation time for pineapple juice.
Keywords: antioxidants, fermentation, Lactobacillus plantarum, pineapple juice, probiotics

## ABSTRAK
1
Bakteri  asam  laktat  (BAL)  merupakan  kelompok  utama  bakteri  probiotik  yang  banyak  digunakan pada  produk  fermentasi  jus  buah.  Jus  buah  mengandung  antioksidan  yang  berfungsi  menangkal  radikal bebas. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi BAL hasil isolasi dari jus nanas yang memiliki sifat probiotik  dan  melihat  aktivitas  antioksidan  jus  nanas  setelah  difermentasi  oleh  BAL.  Isolat  BAL  asal  jus nanas diuji sifat probiotik (toleransi terhadap kondisi asam dan garam empedu, aktivitas antimikroba, serta kepekaan  terhadap  antibiotik)  serta  sifat  penempelannya  (autoagregasi,  koagregasi,  dan  hidrofobisitas). Isolat terbaik yang diperoleh kemudian diinokulasi ke dalam jus nanas. Hasil isolasi dari 5 jenis jus nanas diperoleh  5  isolat  dengan  karakter  BAL  yaitu  NHC6,  NHC7,  NHC8,  NHC9,  dan  NPC1.  Berdasarkan pengujian  sifat  probiotiknya,  NHC6  memiliki  toleransi  yang  baik  pada  kondisi  asam  dan  0,5%  garam empedu, memiliki aktivitas antimikroba, sensitif terhadap ampisilin, menunjukkan sifat penempelan terbaik dan  diidentifikasi  sebagai Lactobacillus  plantarum . L.  plantarum NHC6  kemudian  digunakan  sebagai inokulum  awal  pada  proses  fermentasi  jus  nanas.  Penambahan L.  plantarum NHC6  pada  jus  nanas mampu  menurunkan  nilai  °Brix  dan  pH  selama  inkubasi.  Setelah  24  jam  inkubasi,  diperoleh  aktivitas antioksidan sebesar 89,05%, dengan pertumbuhan BAL sebesar 8,33 log CFU/mL, sehingga pada jam ke- 24 inkubasi dianggap sebagai waktu inkubasi terbaik pada jus nanas.
Kata kunci: antioksidan, fermentasi, jus nanas, Lactobacillus plantarum , probiotik
*Penulis Korespondensi: E-mail: ameryandini@apps.ipb.ac.id

## PENDAHULUAN
Makanan fungsional merupakan makanan yang mengandung  satu  atau  lebih  senyawa  seperti  pro- biotik, prebiotik, serat, dan antioksidan yang menye- diakan fungsi penting bagi kesehatan. Makanan pro- biotik  mewakili  60-70%  dari  makanan  fungsional (Perricone et  al., 2015).  Kelompok  bakteri  probiotik yang  sering  ditemui  pada  produk  makanan  adalah bakteri  asam  laktat  (BAL)  seperti Lactobacillus dan Bifidobacterium (Sornplang  dan  Piyadeatsoontorn, 2016).  BAL  sebagai  probiotik  harus  memiliki  kriteria yang  perlu  dipertimbangkan  sehingga  dapat  mem- berikan pengaruh positif bagi inangnya. Karakteristik probiotik  yang  harus  dimiliki  oleh  BAL  adalah  tidak bersifat  patogen,  dapat  menyesuaikan  diri  dengan lingkungan  saluran  pencernaan  (tahan  terhadap asam dan garam empedu), memiliki sifat antagonis- tik terhadap bakteri enterik, peka terhadap antibiotik, mampu  menempel  dan  berkolonisasi  pada  usus manusia,  serta  dapat  mempertahankan  jumlah  sel hidupnya  pada  saluran  pencernaan  manusia (Perricone et al., 2015; Panjaitan et al., 2018).
BAL dapat diperoleh dari berbagai macam sum- ber seperti buah dan produk-produk fermentasi. Be- berapa  spesies Lactobacillus diperoleh  dari  hasil isolasi  pulp  buah  tropis,  seperti L.  plantarum,  L. brevis,  L.  delbrueckii dengan  beberapa  sifat  probio- tik seperti tahan terhadap asam dan garam empedu, kemampuan  menempel  pada  usus  dan  aktivitas antimikroba (Garcia et al., 2016). Phong et al. (2017) juga berhasil mengisolasi L. acidophilus Y1 asal jus nanas dengan ketahanan terhadap asam. Selain itu, penambahan  BAL  dengan  sifat probiotik  pada  buah juga diketahui mampu menjaga aktivitas antioksidan buah,  termasuk  pada  jus  nanas  (Ferreira et  al., 2016).  Bakteri  probiotik  menyediakan  sifat  antioksi- dan  dengan  menghasilkan  metabolit  dengan  aktivi- tas antioksidan seperti glutathion (GSH), butirat, dan folat (Budiari et al., 2019). Namun, belum ada kajian lebih  lanjut mengenai  hasil  isolasi  BAL  dengan  sifat probiotik  lain  yang  harus  dimiliki  oleh  BAL  asal  jus nanas  sebagai  probiotik  dan  aktivitas  antioksidan pada  jus  nanas  setelah  difermentasi  dengan  BAL tersebut.  Oleh  karena  itu,  tujuan  dari  penelitian  ini adalah  untuk  mendapatkan  BAL  hasil  isolasi  jus nanas  yang  memiliki  karakteristik  sebagai  probiotik serta melihat aktivitas antioksidan jus nanas setelah penambahan BAL.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Buah  nanas  diperoleh  dari  pasar  lokal  di  kota Bogor  (Honi),  Jambi,  Subang,  dan  Palembang. Bakteri  patogen  yang  digunakan  adalah Salmonella typhimurium ATCC  14028, Staphylococcus  aureus ATCC  25923,  dan Escherichia  coli ATCC  25922 yang  diperoleh  dari  Laboratorium  Bioteknologi  He- wan dan Biomedis (PPSHB) IPB University. BAL di- tumbuhkan pada media mann rogosa sharpe (MRS) (Merck,  Jerman)  dan  bakteri  patogen  ditumbuhkan pada media nutrient broth (NB) (Merck, Jerman).

## Persiapan jus nanas
Nanas  yang  digunakan  adalah  nanas  yang matang  sempurna,  tidak  busuk,  dan  berwarna kuning  oranye.  Buah  nanas  dikupas  dan  dicuci bersih  menggunakan  air  destilasi,  lalu  diekstraksi dengan  menggunakan  jus  ekstraktor  (WFA-4000, China).

## Isolasi dan identifikasi BAL asal jus nanas
Isolasi  dan  identifikasi  BAL  asal  jus  nanas dilakukan  berdasarkan  metode  Phong et  al. (2017). Ekstrak jus nanas dimasukkan ke dalam gelas steril dan diinkubasi pada suhu 37°C hingga 48 jam. Hasil inkubasi  ekstrak  jus  nanas  sebanyak  1  mL  diinoku- lasikan  pada  tabung  yang  berisi  media  MRS broth, lalu  diinkubasi  kembali  pada  suhu  37°C  selama  24 jam.  Bakteri  yang  tumbuh  kemudian  digores  pada MRS  padat.  Identifikasi  genus  dilakukan  dengan beberapa  pengujian  seperti  pewarnaan  Gram,  uji katalase dan CaCO 3 0,3% (b/v).

## Uji toleransi BAL terhadap kondisi asam
Pengujian  toleransi  BAL  terhadap  pH  rendah berdasarkan metode  Panjaitan et al. (2018)  dengan modifikasi.  MRS broth disesuaikan  pHnya  menjadi pH  2  menggunakan  HCl  37%  (Merck,  Jerman)  dan diinokulasikan  dengan  1%  (6,0  log  CFU/mL)  kultur BAL  lalu  selama  2  jam  diinkubasi  pada  suhu  37°C. Ketahanan  terhadap  pH  2  dihitung  berdasarkan selisih  unit  log  jumlah  koloni  yang  tumbuh  pada waktu inokulasi awal (T 0 ) dan 2 jam setelah inokulasi (T 2 ).

## Uji toleransi BAL terhadap garam empedu
Toleransi  BAL  terhadap  garam  empedu  ber- dasarkan  Panjaitan et  al. (2018).  MRS broth yang mengandung  0,5%  garam  empedu  (b/v)  (Himedia)
diinokulasikan  dengan  kultur  BAL  berumur  24  jam dan  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  5  jam. Ketahanan  terhadap  0,5%  garam  empedu  (b/v) dihitung  berdasarkan  selisih  unit  log  jumlah  koloni yang  tumbuh  pada  waktu  inokulasi  awal  (T 0 )  dan  5 jam setelah inokulasi (T 5 ).

## Uji aktivitas antimikroba
Aktivitas  antimikroba  dievaluasi  berdasarkan Kos et  al. (2003)  dengan  modifikasi.  Kultur  bakteri patogen  uji  dan  BAL  berumur  24  jam  disentrifugasi (Tomy  MRX-152,  USA)  pada  kecepatan  7000  rpm selama  10  menit  untuk  memperoleh  supernatan bebas  sel  atau cell-free  supernatant (CFS).  CFS disterilkan  dengan  menggunakan  membran  filter (ukuran  pori  0,22  µm)  (Millex-HV).  CFS  yang diperoleh  dibagi  menjadi  3  bagian,  yaitu  CFS  tanpa perlakuan,  CFS  yang  dinetralkan  (pH  6,5)  dengan penambahan NaOH 1 N (Merck, Jerman), dan CFS pH  6,5  yang  dipekatkan.  Pengujian  aktivitas  anti- mikroba  CFS  tanpa  perlakuan  dan  CFS  yang  di- netralkan  (pH  6,5)  menggunakan  metode  difusi cakram,  sedangkan  CFS  pH  6,5  yang  dipekatkan menggunakan metode difusi agar (sumuran). Cawan petri berisi nutrient agar (NA) (Merck, Jerman) sebe- lumnya  diinokulasikan  dengan  200  µl  masing- masing  bakteri  patogen  untuk  setiap  perlakuan supernatan.  Kertas  cakram  steril  (Oxoid,  UK)  di- letakkan  pada  permukaan  agar  dan  ditambahkan masing-masing  sebanyak  20  µl  supernatan  bebas sel (tanpa perlakuan dan pH 6,5). Pada CFS pH 6,5 yang  dipekatkan,  cawan  petri  berisi  NA  padat  yang telah  disiapkan  dibuat  sumuran  menggunakan  pipet steril.  CFS  pH  6,5  yang  telah  dipekatkan  dima- sukkan  ke  dalam  tiap  sumur  dengan  konsentrasi yang  berbeda-beda  (25,  50,  75,  dan  100  µl) kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  48 jam, lalu diukur zona bening yang terbentuk.

## Uji kepekaan terhadap antibiotik
Kepekaan  BAL  terhadap  antibiotik  dilakukan dengan menggunakan metode Lee et al. (2014) dan Haque et  al. (2014).  Antibiotik  yang  digunakan adalah  kloramfenikol  (50  µg)  dan  ampisilin  (10  µl). Larutan antibiotik disterilkan menggunakan membran  filter  (ukuran  pori  0,22  µm).  Cawan  petri yang  berisi  MRS  padat sebelumnya  telah  di- inokulasikan dengan 200 µl (10 7 -10 8 CFU/mL) kultur BAL.  Kertas  cakram  steril  diletakkan  di  atas  per- mukaan agar dan ditambahkan 20 µl masing-masing larutan  antibiotik,  lalu  diinkubasi  pada  suhu  37°C selama  24  jam.  Diameter  zona  bening  yang  ter- bentuk diukur dan diinterpretasikan.

## Uji autoagregasi dan koagregasi
Kemampuan  autoagregasi  dan  koagregasi dilakukan  berdasarkan  metode  Panjaitan et  al. (2018). Kultur BAL berumur 18 jam disentrifugasi se- lama  20  menit  pada  kecepatan  3500  rpm.  Pelet yang diperoleh dicuci 2 kali dengan  PBS dan disus- pensikan  kedalam  PBS  baru  hingga  mencapai  10 8 CFU/mL.  Nilai  autoagregasi  ditentukan  oleh  pengu- kuran nilai absorbansi jam ke-0 dan absorbansi jam ke-5 setelah inkubasi pada suhu ruang. Pengukuran absorbansi  dilakukan  dengan  mengambil  0,1  mL bagian  atas  suspensi  dan  dimasukkan  kedalam  3,9 mL PBS  yang kemudian  diukur dengan spektrofoto- meter (Jenway 7205, UK)  pada  panjang gelombang 600  nm.  Persentase  autoagregasi  dihitung  dengan rumus:
o ( )
A t adalah  nilai  absorbansi  jam  ke-5  dan  A 0 adalah nilai absorbansi jam ke-0 inkubasi.
Persiapan  kultur  BAL  pada  pengujian  koagre- gasi  dilakukan  sama  seperti  autoagregasi,  namun ditambahkan  dengan  sel  bakteri  patogen.  Masing- masing  suspensi  BAL  dan  bakteri  patogen  diambil sebanyak  2  mL  dan  dicampurkan  ke  dalam  tabung kosong.  Tabung  kontrol  berisi  4  mL  masing-masing suspensi  sel  bakteri  patogen  yang  digunakan.  Pe- nentuan  koagregasi  dilakukan  sama  seperti  auto- agregasi.  Persentase  koagregasi  dihitung  dengan menggunakan rumus:
o (( ) )
A x adalah  absorbansi  suspensi  isolat  BAL,  A y adalah absorbansi suspensi isolat patogen, dan A x+y adalah  absorbansi  campuran  suspensi  isolat  BAL dan patogen.

## Penentuan sifat hidrofobisitas
Penentuan  sifat  hidrofobisitas  BAL  dilakukan dengan menggunakan metode microbial adhesion to solvents (MATS)  (Kos et  al., 2003).  Kultur  BAL  ber- umur 16-18 jam disentrifugasi selama 20 menit pada 3500  rpm.  Pelet  yang  diperoleh  dicuci  2  kali  meng- gunakan  bufer phosphate  urea  magnesium (PUM) dan disuspensikan ke dalam bufer PUM baru hingga mencapai jumlah 10 8 CFU/mL. Suspensi yang diper- oleh  kemudian  diukur  absorbansinya  pada  panjang
gelombang  600  nm  sebagai  nilai  absorbansi  awal (A 0 ).  Suspensi  sel  pada  bufer  PUM  diambil  seba- nyak 5 mL lalu dipindahkan ke dalam tabung kosong dan ditambahkan 1 mL hidrokarbon (xilena, etil ase- tat,  dan  kloroform)  (Merck,  Jerman)  lalu  divorteks (Gemmy  VM-300,  Taiwan)  selama  1  menit.  Tabung tersebut  didiamkan  selama  1  jam  pada  suhu  37°C agar  terjadi  pemisahan  fase.  Fase aqueous yang terbentuk  dipindahkan  dan  diukur  absorbansinya pada 600 nm sebagai nilai absorbansi akhir (A 1 ). Pe- nurunan  nilai  absorbasi  dinyatakan  sebagai  nilai hidrofobisitas dengan rumus:

## o o ( )

## Identifikasi molekular BAL asal jus nanas
Isolat  BAL  asal  jus  nanas  kandidat  probiotik diidentifikasi  secara  molekuler  menggunakan  gen 16S  rRNA  mengikuti  prosedur  Presto TM Mini  gDNA Bacteria Kit.  Gen  16S  rRNA  diamplifikasi  menggu- nakan  mesin  PCR  T1 -Thermarcycler .  Primer  yang n k n     l h  p  m     n v    l  6 F   5’-CAG GCC  TAA  CAC  ATG  CAA  GTC- ’     n    87R   5’- GGG  CGG  WGT  GTA  CAA  GGC- ’    Marchesi et al., 1998).  Kondisi  PCR  sebanyak  35  siklus  terdiri atas  pre-denaturasi  pada  94°C  selama  5  menit, denaturasi pada 94°C selama 30 detik, penempelan pada  55°C  selama  45  detik,  pemanjangan  pada 72°C selama 1 menit 30 detik, setelah pemanjangan pada  72°C selama 10 menit, dan pendinginan  pada suhu  4°C.  Produk  PCR  kemudian  dikirim  pada  jasa sekuensing 1 st Base Malaysia untuk memperoleh ru- nutan  basa  nukleotida.  Hasil  runutan  basa  nukleo- tida  dianalisis  menggunakan  program nucleotide basic  local  alignment  search  tool (BLAST-n).  Pem- bentukan  pohon  filogenetik  menggunakan  program Mega  6.0,  metode neighbor  joining (NJ)  dengan bootstrap 1000x,  dan  model  pohon  Kimura-2-para- meter.
Fermentasi jus nanas dan uji kapasitas antioksi- dan
Fermentasi  jus  nanas  dilakukan  menggunakan metode Phong et al. (2017) dengan modifikasi. Eks- trak jus  nanas  sebanyak  36  mL  dipasteurisasi  pada suhu  80°C  selama  15  menit  dan  diinokulasikan  se- banyak  4  mL  kultur  BAL  (10 7 CFU/mL)  berumur  24 jam dengan sifat probiotik terbaik. Sampel diinkubasi pada  suhu  37°C  selama  24  jam  dan  diambil  seba- nyak  2%  (v/v),  setelah  itu  diinokulasikan  pada  eks- trak jus nanas terpasteurisasi yang baru dan diinku- basi  72  jam  pada  suhu  37°C.  Nilai  pH,  °Brix,  densi-
tas  BAL,  densitas  khamir,  dan  aktivitas  antioksidan dihitung  setiap  0,  24,  48,  dan  72  jam.  Jus  nanas yang  terpasteurisasi  tanpa  diinokulasikan  BAL  di- inkubasi dibawah kondisi yang sama sebagai kontrol non-fermentasi.
Hasil  fermentasi  jus  nanas  dan  jus  nanas  non- fermentasi  kemudian  diuji  aktivitas  antioksidannya berdasarkan metode Li et al. (2018). Pengujian akti- vitas  antioksidan  dilakukan  dengan  mencampurkan 1 mL sampel hasil fermentasi jus nanas dan kontrol pada  2  mL  larutan  metanolik  DPPH  (1,1-difenil-2- pikrilhidrazil)  (Merck,  Jerman)  0,045  mg/mL.  Cam- puran sampel divorteks dan diinkubasi dalam keada- an  gelap  selama  30  menit,  lalu  dihitung  absorban- sinya pada 517 nm. Persentase aktivitas antioksidan dihitung menggunakan rumus:
k  v      n  ok    n ( )
A 0 adalah nilai absorbansi DPPH tanpa sampel dan A s adalah nilai absorbansi sampel.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolat BAL dari jus nanas
Hasil  isolasi kelima jus nanas diperoleh  28 iso- lat bakteri. Bakteri yang diperoleh memiliki morfologi koloni berwarna putih hingga krem, berbentuk bulat, elevasi  cembung,  dan  struktur  permukaan  yang  ha- lus.  Berdasarkan  karakterisasi  BAL,  dari  28  isolat bakteri hanya diperoleh 5 isolat bakteri. Kelima isolat bakteri  yang  diduga  memiliki  karakter  sebagai  BAL yaitu  NHC6,  NHC7,  NHC8,  NHC9,  dan  NPC1.  Ke- lima  isolat  tersebut  membentuk  zona  bening  pada saat  ditumbuhkan  pada  media  CaCO 3 0,3%  (b/v), tidak  memiliki  katalase,  dan  tergolong  bakteri  Gram positif.

## Toleransi BAL terhadap kondisi asam
Toleransi  terhadap  kondisi  asam  merupakan karakteristik penting yang harus dimiliki BAL sebagai probiotik.  Ketahanan  BAL  asal  jus  nanas  terhadap pH  2  menunjukkan  toleransi  yang  berbeda-beda (Tabel 1). NHC6 mengalami peningkatan jumlah sel sebesar  0,4  log  CFU/mL,  sedangkan  penurunan jumlah  sel  diperoleh  keempat  isolat  lainnya  yang mencapai  1,78  log  CFU/mL.  Kemampuan  BAL  asal jus  nanas  terhadap  kondisi  asam  juga  telah  diuji oleh  Phong et  al. (2017)  pada  pH  2,5  dengan peningkatan  jumlah  sel  BAL  yang  mencapai  5,4  log CFU/mL  setelah  2  jam  inkubasi.  Sebaliknya, penu- runan  jumlah  sel  isolat  NHC7,  NHC8,  NHC9,  dan
NPC1 (Tabel 1) sesuai dengan hasil yang diperoleh Garcia et al. (2016) pada kelima isolat Lactobacillus hasil  isolasi pulp buah  tropis  yang  hanya  dapat mempertahankan viabilitas sel <2 log CFU/mL pada pH 2 selama 2 jam inkubasi.
Tabel 1.  Densitas  BAL  pada  pH  2  setelah  2  jam
waktu inkubasi Isolat BAL Densitas BAL (log CFU/mL) Jam ke-0 Inkubasi (T 0 ) Jam ke-2 Inkubasi (T 2 ) NHC 6 6,31±0,03 6,76±0,64 NHC 7 6,65±0,10 4,88±0,11 NHC 8 5,34±0,14 5,04±0,06 NHC 9 6,09±0,28 5,02±0,30 NPC 1 6,20±0,57 5,25±0,19
Peningkatan jumlah sel dapat dikaitkan dengan kemampuan  sel  bakteri  dalam  meregulasi  homeo- statis  pH  intraseluler  (Panjaitan et  al., 2018).  Seba- liknya,  penurunan  jumlah  sel  terjadi  akibat  reaksi oksidasi  HCl  terhadap  sel  bakteri,  sehingga  menye- babkan  asidifikasi  sitoplasma,  kerusakan  alat transport  pada  membran , dan  penurunan  aktivitas enzim seluler (Hamida et al., 2015).

## Toleransi BAL terhadap garam empedu
Toleransi  terhadap  garam  empedu  merupakan salah satu kriteria seleksi untuk isolat bakteri probio- tik  agar  dapat  bertahan  hidup  pada  usus  kecil (Panjaitan et  al., 2018).  Semua  isolat  BAL  kandidat probiotik  asal  jus  nanas  memiliki  ketahanan  terha- dap 0,5% garam empedu (b/v) yang ditunjukkan de- ngan peningkatan jumlah sel (Tabel 2).
Peningkatan  jumlah  sel  berkisar  0,42  log  CFU/ mL  hingga  1,4  log  CFU/mL  selama  5  jam  inkubasi. Kelima isolat ini lebih baik dibandingkan dengan pe- nelitian  Hamida et  al. (2015)  yang  melaporkan Pe- diococcus pentosaceus E5, E7, dan E8 asal fermen- tasi jagung mengalami penurunan viabilitas sel men- capai  0,64  log  CFU/mL  pada  kondisi  0,5%  garam empedu  setelah  2  jam  inkubasi.  BAL  menghasilkan
enzim bile  salt  hydrolase (BHS) yang  dapat  men- detoksifikasi  asam  empedu  yang  terkonjugasi menjadi  dekonjugasi,  sehingga  tidak  bersifat  toksik bagi sel bakteri (Begley et al., 2006).
Tabel 2.  Densitas BAL setelah 5 jam waktu inkubasi pada media 0,5% garam empedu Isolat BAL Densitas BAL (log CFU/mL) Jam ke-0 inkubasi (T 0 ) Jam ke-5 Inkubasi (T 5 ) NHC 6 7,42±0,09 7,85±0,02 NHC 7 6,76±0,04 7,84±0,04 NHC 8 6,36±0,30 7,76±0,22 NHC 9 6,89±0,25 7,86±0,26 NPC 1 6,79±0,17 8,00±0,05

## Aktivitas antimikroba
Empat  dari  lima  CFS  tanpa  perlakuan  dan  pH 6,5 memiliki aktivitas antimikroba yang beragam ter- hadap tiga bakteri patogen uji (Tabel 3). CFS NPC1 pada  semua  perlakuan  tidak  menunjukkan  aktivitas antimikroba  terhadap  ketiga  patogen  uji.  Aktivitas antimikroba  supernatan  bebas  sel  tanpa  perlakuan dan  pH  6,5  ditunjukkan  dari  zona  bening  yang  ter- bentuk  dengan  diameter  8,7-10,7  mm  dan  8,2-9,9 mm  (Tabel  3).  Keempat  isolat  BAL  asal  jus  nanas (NHC6, NHC7, NHC8, dan NHC9) memiliki aktivitas antimikroba  yang  lebih  baik  dibandingkan  isolat  ge- nus Lactobacillus dari pulp buah tropis yang memiliki diameter zon     n n   ≥   mm  (Garcia et  al., 2016). Aktivitas antimikroba yang dihasilkan pada superna- tan  bebas  sel  tanpa  perlakuan  dapat  berasal  dari asam organik yang dihasilkan oleh BAL sebagai ha- sil  metabolismenya,  seperti  asam  laktat  yang  bersi- fat bakterisidal terhadap bakteri Gram positif dan ne- gatif  (Panjaitan et  al., 2018).  Aktivitas  antimikroba pada  perlakuan  supernatan  bebas  sel  yang  di- netralkan  (pH  6,5)  dapat  berasal  senyawa  organik yang  dihasilkan  BAL  seperti  bakteriosin,  diasetil, asam  format,  dan  enzim  yang  bersifat  bakteriolitik (Garcia et al., 2016).
Tabel 3.  Aktivitas  antimikroba  pada  supernatan  bebas  sel  tanpa  perlakuan  dan  pH  6,5  terhadap  bakteri patogen uji
Supernatan BAL Diameter Zona Hambat (mm) Tanpa Perlakuan pH 6,5 S. typhimurium S.aureus E. coli S. typhimurium S.aureus E. coli NHC6 10,6±0,18 8,7±0,62 9,4±0,53 8,8±0,45 9,5±0,71 9,6±0,18 NHC7 10,3±0,35 9,3±0,27 9,4±1,15 9,9±0,09 9,5±0,71 9,1±0,18 NHC8 10,7±0,26 10,3±0,35 9,3±0,35 8,5±0,00 8,2±0,21 8,6±0,18 NHC9 10,4±0,18 9,5±0,35 9,8±1,68 9,6±0,53 9,3±0,35 9,5±0,71 NPC1 - - - - - -
2,89 3,78 1,86 4,5 3,12 0 20 40 60 80 100 NHC6 NHC7 NHC8 NHC9 NPC1 Is o la t BA L
Autoagregasi (%)
Hasil pembentukan zona bening pada superna- tan  bebas  sel  pH  6,5  yang  dipekatkan  terhadap  ke- tiga  bakteri  patogen  menunjukkan  NHC6  memiliki hasil  yang  paling  baik.  NHC6  mampu  menghambat S.  aureus , S.  typhimurium , dan E.  coli pada  kon- sentrasi  75  µl  dan  100  µl  (Tabel  4) . NHC7,  NHC8, dan NHC9 tidak menghasilkan zona bening pada S. aureus sesuai dengan hasil yang diperoleh Garcia et al. (2016)  pada L.  plantarum 111  dan L.  brevis 59 yang  tidak  dapat  menghambat S.  aureus. Garcia et al. (2016)  mengelompokkan  peringkat  sensitifitas terhadap  patogen  bawaan  makanan  adalah S. Typhimurium>E. coli>S. aureus , sesuai dengan hasil yang  diperoleh  pada  perlakuan  supernatan  bebas sel pH 6,5 yang dipekatkan.
Tabel 4.  Aktivitas  antimikroba  pada  supernatan  be- bas  sel  pH  6,5  hasil  pemekatan  terhadap bakteri patogen uji
Supernatan BAL dan Patogen Diameter Zona (mm) 5 μl 5  μl 75 μl μl NHC6+ S. typhimurium - 0,04± 0,02 0,13± 0,04 0,24± 0,01 NHC6+ S. aureus - - 0,21± 0,02 0,20± 0,07 NHC6+ E. coli - - 0,21± 0,02 0,25± 0,07 NHC7+ S. typhimurium - 0,04± 0,01 0,16± 0,02 0,14± 0,02 NHC7+ S. aureus - - - - NHC7+ E. coli - 0,06± 0,02 0,21± 0,02 0,18± 0,04 NHC8+ S. typhimurium - - 0,05± 0,04 0,14± 0,02 NHC8+ S. aureus - - - - NHC8+ E. coli - - 0,05± 0,00 0,09± 0,02 NHC9+ S. typhimurium - - - 0,04± 0,02 NHC9+ S. aureus - - - - NHC9+ E. coli - - 0,01± 0,02 0,04± 0,02 NPC1+ S. typhimurium - - - - NPC1+ S. aureus - - - - NPC1+ E. coli - - - -

## Kepekaan terhadap antibiotik
Isolat  NHC6,  NHC7,  NHC8,  dan  NHC9  sensitif terhadap  ampisilin,  sedangkan  NPC1  menunjukkan sifat resisten. Garcia et al. (2016) melaporkan 4 dari 5 isolat Lactobacillus asal fermentasi pulp buah sen- sitif terhadap ampisilin. Berdasarkan pengkategorian sifat kepekaan  terhadap  antibiotik  oleh  Haque et al. (2014),  NHC6, NHC7,  NHC9,  dan  NPC1  menunjuk- kan  sifat  resisten,  sedangkan  NHC8  menunjukkan sifat  intermediet  terhadap  kloramfenikol.  BAL  resis- ten  terhadap  kloramfenikol  terkait  dengan  adanya
pengkode gen resisten cat (Haque et al., 2014) . BAL dengan sifat resisten terhadap antibiotik dapat digu- nakan  sebagai  probiotik  karena  bersifat  interinsik dan  tidak  dapat  ditransferkan  ke  mikroflora  usus (Garcia et al., 2016).

## Autoagregasi dan koagregasi
Sifat agregasi bakteri merupakan salah satu ka- rakteristik utama bakteri probiotik. Autoagregasi me- rupakan  kemampuan  bakteri  beragregat  terhadap sesamanya,  sedangkan  koagregasi  adalah  kemam- puan  bakteri  dalam  membentuk  agregat  dengan bakteri lain seperti bakteri  patogen (Panjaitan et al., 2018). Empat dari lima isolat BAL menunjukkan nilai autoagregasi  diatas  40%  setelah  diinkubasi  selama 5 jam (Gambar 1). NHC6 memiliki kemampuan auto- agregasi  tertinggi  sebesar  94,73%.  Nilai  autoagre- gasi  NHC6  lebih  baik  dibandingkan Enterococcus durans K08  hasil  isolasi  buah  pisang  yang  hanya memiliki  nilai  autoagregasi  76,5%  setelah  5  jam inkubasi (Divisekera et al., 2019).
Keterangan:  Hasil  direpresentasikan  sebagai  nilai  rata- rata  ±  SD  pengulangan. Error  bar mewakili  standar deviasi
Gambar 1.  Kemampuan  autoagregasi  (%)  BAL  asal jus nanas pada 5 jam inkubasi
Kemampuan  koagregasi  terkuat  setelah  5  jam inkubasi  ditemukan  pada  NHC6  terhadap S. typhimurium yaitu  sebesar  35,63%  (Tabel  5).  Nilai koagregasi  dapat  dikategorikan  sebagai  koagregasi kuat  jika  memiliki  nilai  >30%.  Nilai  koagregasi  yang diperoleh  ini  lebih  baik  dibandingkan L.  fermentum S21209  terhadap S.  typhimurium dengan  nilai
 NHC6
MH571418 1 Lactobacillus plantarum CIP103151 LC258153 1 Lactobacillus plantarum subsp argentoratensis JCM 16169 CIP103151 KX886789 1 Lactobacillus pentosus JCM 1556T  NHC8 LC071808 1 Lactobacillus pentosus JCM 1558  NHC9
MH544641 1 Lactobacillus plantarum JCM 1149
LC064896 1 Lactobacillus plantarum subsp plantarum JCM 1149 LC383832 1 Lactobacillus paraplantarum JCM 12533 NR 025447 1 Lactobacillus paraplantarum DSM 10667 NR 029133 1 Lactobacillus pentosus 124-2 NR 104573 1 Lactobacillus plantarum CIP 103151 NR 104573 1 Lactobacillus plantarum NBRC 15891 NR 125561 1 Lactobacillus mudanjiangensis 11050 NR 145899 1 Lactobacillus berbarium TCF032-E467 NR 113339 1 Lactobacillus fabifermentans DSM 21115
NR 136785 1 Lactobacillus plajomi NB53 LC145563 1 Lactobacillus koreensis JCM 16448 NR 0369221 1 Enterococcus durans 98D AB1907194 1 Lactobacillus xiangfangensis NBRC 108914 99 57 37 56 99 59 0,01
0 ,0 6 0 ,0 2 0 ,0 6 0 ,0 4 0 ,0 0 0 ,1 2 0 ,0 2 0 ,0 0 0 ,0 2 0 ,0 5 0 ,0 1 2 0 ,1 6 0 ,0 9 0 ,0 9 0 ,0 4 0 20 40 60 80 100 NHC6 NHC7 NHC8 NHC9 NPC1 Afi n ita s (% ) Isolat BAL Xilena Kloroform
Etil Asetat
32,72%  setelah  5  jam  inkubasi  (Panjaitan et  al.,
2018).
Tabel 5.  Kemampuan  koagregasi  (%)  BAL  asal  jus nanas terhadap tiga patogen uji
Isolat BAL S. typhimurium S. aureus E. coli NHC6 35,6±0,19 7,2±0,04 10,9±0,01 NHC7 29,8±0,27 15,8±0,15 16,6±0,18 NHC8 24,9±0,16 0,1±0,02 21,6±0,12 NHC9 31,6±0,06 7,1±0,11 27,8±0,13 NPC1 11,7±0,06 3,9±0,05 7,7±0,08

## Hidrofobisitas
Metode  MATS  digunakan  untuk  mengevaluasi sifat  permukaan  sel  hidrofobik  bakteri  untuk  pe- nempelan.  Hasil  pengujian  ini  menunjukkan  NHC8 dan  NHC9  memiliki  sifat  hidrofobik  (30,34  dan 23,45%)  (Gambar  2)  dengan  afinitas  sedang  (20- 30%)  terhadap  xilena  berdasarkan  katagori  hidro- fobik  oleh  Panjaitan et  al. (2018).  NHC8  dan  NHC9 menunjukkan  afinitas  yang  kuat  terhadap  etil  asetat (31,74 dan 28,21%), sehingga permukaan sel NHC8 dan  NHC9  bersifat  sebagai  pendonor  elektron.  Etil asetat  merupakan  pelarut  yang  bersifat  basa  dan menunjukkan permukaan sel bakteri sebagai peneri- ma elektron (Panjaitan et al., 2018). Hasil ini serupa dengan penelitian Xu et al. (2018) yaitu L. mesente- roides B-25  memiliki  sifat  hidrofobik  dengan  afinitas kuat terhadap etil asetat (36,4%). NHC6, NHC7, dan NPC1  memiliki  sifat  hidrofilik  karena  menunjukkan afinitas yang kuat terhadap etil asetat (Gambar 2).
Keterangan:  Hasil  direpresentasikan  sebagai  nilai  rata- rata  ±  SD  pengulangan. Error  bar mewakili  standar deviasi

## Gambar 2.  Afinitas isolat BAL terhadap ketiga hidro- karbon uji

## Hasil identifikasi molekular BAL asal jus nanas
Berdasarkan  pengujian  sifat  probiotik,  hanya NHC6,  NHC7,  NHC8,  dan  NHC9  yang  memenuhi kriteria  sebagai  probiotik  dan  memiliki  kekerabatan dengan L. plantarum , L. pentosus , dan L. Paraplan- tarum (Gambar 3).
 NHC7
0,21 0,37 1,02 0,64 3,59 1,55 0,05 0,69 70 75 80 85 90 95 100 0 24 48 72 AKti v ita s An ti o k s id a n (% ) Waktu Fermentasi (Jam) Kontrol (Tidak difermentasi)
Fermentasi L. plantarum NHC6
Ketiga spesies bakteri tersebut masih termasuk ke  dalam  kelompok L.  plantarum karena  menunjuk- kan  kemiripan  fenotip  yang  tinggi  (Pisano et  al., 2010). L.  plantarum merupakan  kelompok  bakteri Gram  positif  yang  banyak  ditemui  pada  buah (Kachouri et  al., 2015).  Keempat  isolat  asal  jus nanas  memiliki  kekerabatan  dekat  dengan L.  plan- tarum ,  sehingga  isolat  dengan  karakter  probiotik yang  paling  baik  yaitu  NHC6  dilanjutkan  untuk  pe- ngujian selanjutnya.
Hasil  fermentasi  jus  nanas  dan  kapasitas  anti- oksidan
Inkubasi jus nanas  dengan L. plantarum NHC6 dilakukan  dengan  melihat  nilai  °Brix,  pH,  densitas BAL,  densitas  khamir,  dan  aktivitas  antioksidannya untuk  dapat  mengetahui  kemampuan  hidup  terbaik, hasil  tersebut  tersaji  pada  Tabel  6.  Inkubasi L. plantarum NHC6 pada jus nanas selama 72 jam me- nunjukkan  penurunan  nilai  °Brix  dan  pH.  Terjadinya penurunan  disebabkan  karena  penggunaan  gula menjadi asam laktat oleh L. plantarum NHC6. Penu- runan  °Brix  mencapai  0,9%  (b/v)  dengan  pH  2,95 selama  72  jam  inkubasi  dengan  densitas L. plantarum NHC6  mencapai  9,27  log  CFU/mL.  Hasil ini  lebih  baik  dibandingkan  dengan  penambahan konsorsium L.  casei PTCC1608  dan L.  acidophilus DSM  pada  fermentasi  campuran  jus barberry dan blackcherry yang  hanya  mencapai  8  log  CFU/mL pada 72 jam inkubasi (Shisheh et al., 2014). Penambahan L.  plantarum NHC6  pada  jus nanas  selama  72  jam  inkubasi  menunjukkan  penu- runan  aktivitas  antioksidan  (Tabel  6).  Aktivitas  anti- oksidan  yang  diperoleh  menurun  dari  90,64%  (jam ke-0 inkubasi) menjadi 81,28% (jam ke-72 inkubasi) (Gambar  4).  Hasil  serupa  juga  diperoleh  Li et  al. (2018), fermentasi jus apel dengan L. plantarum FAJ mengalami  penurunan  aktivitas  antioksidan  bahkan mencapai  43,95%  pada  jam ke-72.  Penurunan  akti- vitas  antioksidan  dapat  terjadi  karena  kandungan antioksidan yang terdapat pada jus nanas dapat ter- oksidasi  selama  inkubasi  (Ferreira et  al., 2016). Terjadinya  kenaikan  dan  penurunan  aktivitas  anti-
oksidan  juga  tergantung  pada  jenis  bakteri  probiotik yang  digunakan  selama  fermentasi  (Budiari et  al., 2019).
Gambar 4.  Aktivitas antioksidan (%) jus nanas sela- ma waktu inkubasi
Penambahan L.  plantarum NHC6  pada  jus nanas  tidak  menunjukkan  pertambahan  aktivitas antioksidan,  sehingga  aktivitas  antioksidan  yang  di- peroleh  merupakan  antioksidan  alami  yang  berasal dari  nanas.  Nanas  mengandung  antioksidan  seperti fenol,  karotenoid,  dan  vitamin  C,  akan  tetapi  kan- dungan antioksidan ini dapat teroksidasi selama pro- ses fermentasi (Ferreira et al., 2016).
Densitas  khamir  terlihat  pada  jam  ke-72  inku- basi mencapai 2,93 log CFU/mL. Pertumbuhan kha- mir  ini  dapat  berasal  dari  jus  nanas  yang  berperan dalam pembusukan buah. Keberadaan khamir pada buah  dapat  berasal  dari  kontaminan  pasca  panen (selama  penyimpanan,  pemindahan,  dan  pemro- sesan).  Beberapa  spesies  khamir  yang  sering  di- temukan  pada  buah  nanas  adalah Debaryomyces polymorphus , C. pulcherrima , dan Pichia spp.
Tabel 6. Nilai °Brix, pH, densitas BAL, dan densitas khamir jus nanas selama waktu inkubasi
Waktu Inkubasi (Jam) °Brix (%) pH Densitas BAL (log CFU/mL) Densitas Khamir (log CFU/mL) L. plantarum NHC6 Kontrol L. plantarum NHC6 Kontrol L. plantarum NHC6 Kontrol L. plantarum NHC6 Kontrol 0 13,8±0,00 14,0±0,00 3,5±0,00 3,5±0,00 6,41±0,01 <1 <1 <1 24 13,5±0,14 13,9±0,00 3,25±0,07 3,5±0,00 8,33±0,19 <1 <1 <1 48 13,3±0,14 13,85±0,07 3,05±0,07 3,5±0,00 8,81±0,61 <1 <1 <1 72 12,9±0,14 13,3±0,14 2,95±0,07 3,35±0,07 9,27±0,32 <1 2,92±0,35 3,64±0,63
L. plantarum
Berdasarkan  Tabel  6,  tidak  adanya  pertum- buhan  khamir  pada  waktu  inkubasi  24  jam  serta densitas  BAL  telah  mencapai  8,33  log  CFU/mL. Densitas BAL  yang diperoleh sesuai  dengan jumlah bakteri  yang  diperlukan  pada  produk  minuman  fer- mentasi  yaitu  minimal  7  log  CFU/mL  (Perricone et al., 2015).  Selain  itu,  aktivitas  antioksidan  hanya mengalami  sedikit  penurunan  (89,05%)  dibanding- kan  pada  jam ke-72  inkubasi  (81,28%)  (Gambar  4). Berdasarkan  data  tersebut,  jam  ke-24  inkubasi  di- pertimbangkan  sebagai  waktu  inkubasi  paling  baik pada jus nanas dibandingkan dengan waktu inkuba- si lainnya.

## KESIMPULAN
NHC6  merupakan  BAL  asal  jus  nanas  yang berpotensi sebagai  bakteri  probiotik. NHC6 memiliki kekerabatan  dekat  dengan Lactobacillus  plantarum . Aktivitas  antioksidannya  mencapai  89,05%  dengan densitas  BAL  mencapai  8,33  log  CFU/mL  pada waktu inkubasi 24 jam. Oleh karena itu, L. plantarum NHC6  merupakan  isolat  BAL  asal  jus  nanas  yang paling  potensial  yang  dapat  diaplikasikan  pada produk makanan probiotik.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didukung  oleh  dana  hibah penelitian  tesis  dari  Kementerian  Riset,  Teknologi dan  Pendidikan  Tinggi  (4395/IT3.L1/PN/2019)  atas nama Anja Meryandini.

## DAFTAR PUSTAKA
Begley M, Hill C, Gahan CGM. 2006. Bile salt hydro- lase  activity  in  probiotics.  Appl  Environ  Micro- biol  72:  1729-1738.  DOI:  10.1128/AEM.72.3.17 29-1738.2006.
Budiari  S,  Maryati  Y,  Susilowati  A,  Mulyani  H,  Lotu- lung  PDN.  2019.  The  effect  of  lactic  acid  fer- mentation  in  antioxidant  activity  and  total  poly- phenol  contents  of  the  banana  ( Musa  acumi- nate  Linn )  juice.  AIP  Conf  Proc  2175.  DOI: 10.1063/1.5134588.
Divisekera  DMWD,  Samarasekera  JKRR,  Hettia- rachchi C, Gooneratne J, Choudhary MI, Gopa- lakrishnan  S.  2019.  Isolation  and  identification of  lactic  acid  bacteria  with  probiotic  potential from  fermented  flour  of  selected  banana  va-
rieties grown in Sri Lanka. J Natl Sci Found Sri 47: 3-16. DOI: 10.4038/jnsfsr.v47i1.8922.
Ferreira  EA,  Siquera  HE,  Boas  EVV,  Hermes  VS, Rios ADO. 2016. Bioactive compounds and an- tioxidant  activity  of  pineapple  fruit  of  different cultivars.  Rev  Bras  Frutic 38:  1-7.  DOI:  10.159
0/0100-29452016146.
Garcia  EF,  Luciano  WA,  Xavier  DE,  da  Costa  WC, Oliviera  KD,  Franco  OL,  Júnior  MAD,  Lucena BTL,  Picão  RC,  Magnani  M,  Saarela  M,  de Souza  EL.  2016.  Identification  of  lactic  acid bacteria in fruit pulp processing by products and potential  probiotic  properties  of  selected Lacto- bacillus strains.  Front  Microbiol 7:  1-11.  DOI: 10.3389/fmicb.2016.01371.
Hamida  F,  Wiryawan  KG,  Meryandini  A.  2015.  Se- lection of lactic acid bacteria as probiotic candi- date  for  chicken.  Media  Peternakan 38:  138- 144. DOI: 10.5398/medpet.2015.38.2.138.
Haque  KMF,  Yusof  RM,  Huq  AKO,  Khaleque  HN.
2014. Antibiotic susceptibility  of lactic acid bac- teria and Bifidobacteria. J Microbiol and Virol 4: 7-14.
Kachouri  F,  Ksontini  H,  Kraiem  M,  Setti  K,  Mach- meche M, Hamdi M. 2015. Involvement of anti- oxidant  activity  of Lactobacillus  plantarum on functional  properties  of  olive  phenolic  com- pounds.  J  Food  Sci  Technol 52:  7924-7933. DOI: 10.1007/s13197-015-1912-2.
Kos B, Š škov ć J, V kov ć S, Š mp     M, Frece J, M  oš ć  S.  2003.  Adhesion  and  aggregation ability  of  probiotic  strain Lactobacillus  acido- phillus M92. J Appl Microbiol 94: 981-987. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2003.01915.x.
Lee  KW,  Park  JY,  Sa  HD,  Jeong  JH,  Jin  DE,  Heo HJ, Kim JH. 2014. Probiotic properties of Pedio- coccus strains isolated from jeotgals, salted and fermented korean sea-food. Anaerobe 28:  199- 206. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2014.06.013.
Li  Z,  Teng  J,  Lyu  Y,  Hu  X,  Zhao  Y, Wang  Z.  2018.
Enhanced antioxidant activity for apple juice fer- mented  with Lactobacillus  plantarum ATCC14 917.  Molecules 24:  1-12.  DOI:  10.3390/molecu les24010051.
Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC,  Hiom  SJ,  Wade  WG.  1998.  Design  and evaluation  on  useful  bacterium-spesific  PCR primers  that  amplify  genes  coding  for  bacterial 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 64: 795-799. DOI: 10.1128/AEM.64.2.795-799.1998.
Panjaitan  R,  Nuraida  L,  Hariyadi  RD.  2018.  Seleksi isolat  bakteri  asam  laktat  asal  tempe  dan  tape sebagai  kandidat  probiotik.  J  Teknol  Industri Pangan 29:  175-184.  DOI:  10.6066/jtip.2018. 29.2.175.
Perricone  M,  Bevilacqua  A,  Altieri  C,  Sinigaglia  M,
Corbo  MR.  2015.  Challenge  for  the  production of  probiotic  fruit  juices.  Beverages 1:  95-103. DOI: 10.3390/beverages1020095.
Phong HX, Quyen MT, Thanh NN, Long BHD, Dung NTP.  2017.  Selection  of  high  acid  producing lactic  acid  bacteria  and  potential  application  in pineapple juice fermentation. Bioprocess Eng 1: 58-64.
Shisheh  S,  Hashemiravan  M,  Jaktaji  RP.  2014.
Production  of  probiotic  mixture  of  barberry  and black  cherry  juice  by  lactic  acid  bacteria.  Bull Env Pharmacol Life Sci 3: 53-61.
Sornplang  P,  Piyadeatsoontorn  S.  2016.  Probiotic isolates  from  unconventional  sources.  J  Anim Sci Technol 52: 6112-6124. DOI: 10.1186/s407 81-016-0108-2.
Pisano  MB,  Patrignani  F,  Cosentino  S,  Guerzoni ME,  Franz  CMAP,  Holzapfel  WH.  2010.  Diver- sity  and  functional  properties  of Lactobacillus plantarum -group  strains  isolated  from  Italian cheese  product.  Dairy  Sci  Technol  91:  65-76. DOI: 10.1051/dst/2010037.
Xu  X,  Luo  D,  Bao  Y,  Liao  X,  Wu  J.  2018.  Charac- terization  of  diversity  and  probiotic  efficiency  of the autochthonous lactic acid bacteria in the fer- mentation  of  selected  raw  fruit  and  vegetable juices.  Front  Microbiol  9:  2539.  DOI:  10.3389/f micb.2018.02539.