## PERBANDINGAN TOTAL RENDEMEN DAN SKRINING ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH HIJAU ( Piper betle L .) SECARA MIKRODILUSI
Rissa Laila Vifta 1* , Muhammad Andri Wansyah P. 2 , Anita Kumala Hati 3 Program Studi Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Ngudi Waluyo Jalan Gedongsongo, Candirejo, Ungaran Barat

## Abstract:
The  optimization  of  extraction  procces  for  Green  betel  leaves  (Piper  betle  L.)  have  been  attempted. The aim of the research was to knowing the influence and the ratio of total yield on two different methods, that was using maceration and reflux method and followed by microbial antibacterial by microdilution test to show  the  qualitative  value  of  MIC  percentage  of  Green  betel  leaves  extract  against  Escherichia  coli  and Staphylococcus aureus bacteria. The analysis was conducted descriptively for subsequent use as a basis to determined MIC percentage quantitatively.
The result of extraction with two methods showed that the highest yield was yielded in reflux process with  18.5%  rendement  value  with  the  weight  ratio  of  1:  5  to  the  maceration  process.  Phytochemical screening  shows  the  ethanol  extract  of  Green  betel  leaves  contains  flavonoid,  saponins,  and  tannins compounds  that  have  activated  as  antibacterial.  The  results  of  microbial  antibacterial  testing  showed  that Green  betel  leaves  extract  had  broad  spectrum  antibacterial  activity  which  showed  by  MIC  percentage  in Staphylococcus aureus and Escherichia coli both reflux and maceration extract. The test results indicate that Green betel leaves (Piper betle L.) have potential as an antibacterial candidate.
Keyword : Green betel, reflux, maceration, antibacterial, microdilution

## 1. Pendahuluan
Penemuan obat penyakit infeksi khususnya infeksi bakteri merupakan hal yang banyak dikembangkan oleh  para  peneliti  pada  masa  sekarang  ini.  Upaya  penemuan  obat  antibakteri  banyak  difokuskan  dalam bidang-bidang  bioteknologi  pemanfaatan  obat  alam.  Pertimbangan  faktor  ekonomis  dan  keamanan  yang relatif  baik  pada  pemanfaatan  obat-obatan  yang  berasal  dari  alam  merupakan  alasan  yang  paling diperhatikan dalam pelaksanaanya [1].
Sirih Hijau ( Piper betle L.) merupakan salah satu tanaman herbal yang mulai mendapat perhatian ahli untuk diteliti. Sirih Hijau dipercaya memiliki khasiat herbal yang dapat dimanfaatkan oleh masyarakat, salah satunya sebagai antimikroba. Bagian tanaman Sirih Hijau yang diduga memiliki khasiat sebagai antimikroba adalah  bagian  daun.  Beberapa  penelitian  menyebutkan  bahwa  daun  Sirih  Hijau  dapat  digunakan  sebagai obat batuk, obat cacing, serta antiseptik luka [2]. Daun Sirih Hijau mengandung senyawa metabolit sekunder seperti  saponin,  tannin,  flavonoid,  terpenoid,  polifenol,  serta  steroid  yang  diduga  memiliki  aktifitas  sebagai antibakteri [2]. Beberapa langkah optimasi telah dilakukan sebagai upaya mengkaji efektifitas senyawa aktif yang  berpotensi  sebagai  antibakteri.  Salah  satu  langkah  optimasi  yang  dilakukan  adalah  memilih  metode penyarian yang sesuai dengan sifat fisik dan kimia Daun Sirih Hijau tersebut.
Metode penyarian senyawa aktif tanaman atau yang lebih dikenal dengan metode ekstraksi terdiri dari dua  proses,  yakni  ekstraksi  panas  dan  ekstraksi  dingin  [3]/2.  Salah  satu  metode  ekstraksi  yang  banyak dikembangkan  karena  faktor  kemudahan  adalah  maserasi.  Penelitian  lain  menyebutkan  bahwa  penyarian dengan metode refluks dapat meminimalkan penggunaan pelarut dengan hasil rendemen yang baik [4, 5, 6].
Berdasarkan  latar  belakang  tersebut,  peneliti  melakukan  optimasi  ekstraksi  herbal  Sirih  Hijau menggunakan  dua  metode  yang  berbeda  dengan  tujuan  memperoleh  hasil  rendemen  dan  pelarutan senyawa aktif yang optimal. Selanjutnya, ekstrak yang dihasilkan dilakukan uji mikrodilusi untuk menetapkan hasil kualitatif ekstrak sebagai kandidat antibakteri.

## 2. Metode Penelitian
1. Alat dan Bahan

## Alat
Alat untuk ekstraksi Daun Sirih Hijau antara lain seperangkat alat refluks, Eppendorf Reference 200 µ L, neraca analitik And GR-300, rotary evaporator Ryela N-1000, ultrasonic cleaner WT-600-40, dan waterbath Eyela SB-1000.

## Bahan
Bahan uji yang digunakan adalah daun sirih hijau ( Piper betle L. ) dengan spesifikasi warna hijau dari Desa  Sumurrejo  Kecamatan  Gunungpati  Kota  Semarang  Jawa  Tengah  yang  sebelumnya  telah  dilakukan determinasi.
Bahan  kimia  yang  digunakan  antara  lain  DMSO, AlCl 3 ,  NaOH  0,5  N,  FeCl 3 1%,  pereaksi dragendorff, pereaksi Mayer, HCl p.a, HCl 2 N, H 2 SO 4 p.a, H 2 SO 4 1 M, Magnesium, NaCl 10%, FeCl 3 1%, amoniak 25%, n- heksan, etil asetat, etanol 96%, CMC Na 0.3% dari Merck, Aquades dari CV. Bratachem.

## 2. Prosedur Penelitian
Determinasi Tanaman Sirih Hijau ( Piper betle L.) Tanaman Sirih Hijau ( Piper betle L . ) dideterminasi di Laboratorium Ekologi dan Biosistematik Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Diponogoro Semarang.
Ekstraksi Daun Sirih Hijau ( Piper betle L . ) dengan Metode Maserasi
Ekstraksi  dengan  metode  maserasi  diawali  dengan  sortasi  bahan  dengan  tujuan  untuk  memisahkan kotoran-kotoran  atau  bahan-bahan  asing  sehingga  dapat  mengurangi  jumlah  pengotor  yang  ikut  terbawa dalam bahan uji, selanjutnya dibuat simplisia. Simplisia daun sirih hijau ( Piper betle L . ) sebanyak 500 gram dimaserasi selama 5 hari dalam ruangan yang terlindung cahaya matahari dan dilakukan pengadukan 1x24 jam. Maserat diuapkan menggunakan rotary evaporator dengan suhu 45°C.
Ekstraksi Daun Sirih Hijau ( Piper betle L . ) dengan Metode Refluks
Ekstraksi refluks merupakan suatu metode yang sering digunakan untuk mendapatkan suatu senyawa dari tumbuhan dengan penguapan pada suhu tinggi. Proses ekstraksi ini menggunakan refluks dari semula bahan serbuk kering daun sirih hijau 100 gram direfluks sebanyak 3 kali dengan perbandingan 1:6 selama 3-4 jam. Hasil yang diperoleh diuapkan untuk menghilangkan pelarut [7].

## Penapisan Fitokimia
Penapisan  fitokimia  dilakukan  untuk  mengidentifikasi  senyawa  flavonoid,  tanin,  dan  saponin  pada ekstrak etanol Daun Sirih Hijau [8].
1) Identifikasi Flavonoid
Identifikasi flavonoid dilakukan dengan metode Wilsttater Cyanidin.
2) Identifikasi Saponin
Identifikasi saponin dilakukan dengan uji Forth
3) Identifikasi Tanin
Identifikasi tanin dilakukan dengan metode Ferri Klorida
4) Uji Bebas Etanol
Uji bebas etanol dilakukan dengan prinsip esterifikasi. Ekstrak Daun Sirih Hijau ( Piper betle Linn.) diuji bebas etanol 70% dengan penambahan asam asetat dan asam sulfat pekat dan dengan pemanasan. Ekstrak dinyatakan bebas etanol bila tidak ada bau ester yang khas etanol.

## Pembuatan Larutan Ciprofloxacin
Pembuatan  stok  awal  ciprofloxacin  1  mg  yang  setara  dengan  konsentrasi  1000 µ g/ml.  Kemudian dibuat pengenceran untuk masing-masing bakteri.

## Uji Antibakteri Dengan Metode Mikrodilusi
Uji  aktivitas  antibakteri  dengan  metode  cara  mikrodilusi  dilakukan  untuk  mengetahui  MIC  (Minimum Inhibitor  Concentration)  atau  Kadar  Hambat  Minimum  (KHM)  ekstrak  Daun  Sirih  Hijau  ( Piper  bettle L) terhadap  bakteri Eschericia  coli dan Staphylococcus  aureus .  MIC/KHM  merupakan  konsentrasi  terendah dari  suatu  senyawa  antibakteri  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan  mikroba  tertentu.  MIC/KHM digunakan  sebagai  ukuran  sensitifitas  mikroba  terhadap  suatu  suatu  senyawa  antibakteri  [9].  Pengujian dilakukan  secara  kualitatif  menggunakan mikroplate dengan  pengamatan  kekeruhan.  Standar  kekeruhan bakteri  dibandingkan  dengan  larutan Mcfarland  standar nomor  1  yang  setara  dengan  3  x  10 8 cfu/ml, kemudian dilakukan pengenceran seri 10 --2 sehingga diperoleh suspensi dengan jumlah bakteri 3x10 6 sel/ml [9]. Konsentrasi ekstrak dibuat ke dalam tiga konsentrasi yang berbeda, yakni 1%, 3%, dan 5%. Indikator %
MIC ditentukan berdasarkan timbulnya warna jernih pada mikroplate yang sudah diisi dengan Ekstrak Daun Sirih Hijau pada berbagai konsentrasi.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 1. Determinasi Tanaman Sirih Hijau
Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah tanaman Sirih Hijau  ( Piper  betle Linn)  karena  mempunyai  ciri  fisik  yang  sesuai.  Tanaman  Sirih  Hijau  ( Piper  betle Linn) memiliki batang panjang 5-15 m, daun berseling atau tersebar, bertangkai, pangkal daun berbentuk jantung dan  ujung  meruncing  [10,11].  Determinasi  dilakukan  dengan  tujuan  untuk  mengidentifikasi  tumbuhan  yang akan  diteliti  berdasarkan  ciri-ciri  fisik  sehingga  kesalahan  dalam  pengambilan  tanaman  yang  akan  diteliti dapat dihindari.
Adapun klasifikasi tanaman sirih hijau dijelaskan sebagai berikut :
Kingdom
: Plantae (Tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (Berpembuluh) Superdivisio   : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisio : Magnoliophyta (Berbunga) Kelas : Dicotylodoneae Sub-kelas : - Ordo : Piperales Family : Piperaceae Genus : Piper Spesies : Piper betle L. (Sirih, Sirih Hijau)
Gambar 1. Morfologi Daun Sirih Hijau ( Piper betle L.) [11]

## 2. Penapisan Fitokimia
Pengujian senyawa aktif Ekstrak Etanol Daun Sirih Hijau ( Piper betle Linn) dilakukan secara kualitatif untuk  mengidentifikasi  adanya  kandungan  flavonoid,  tanin,  dan  saponin  yang  memiliki  potensi  sebagai antibakteri. Hasil penapisan fitokimia disajikan pada Tabel 1.
Zat aktif Identifikasi Hasil uji Keterangan Flavonoid 0,1 sampel + metanol, sampai terendam ! dipanaskan, filtrat + H 2 SO 4 Merah +
Tabel 1. Hasil uji identifikasi senyawa aktif Ekstrak Etanol Daun Sirih Hijau
Hasil  penapisan  fitokimia  menunjukkan  bahwa  ekstrak  Daun  Sirih  Hijau  mengandung  senyawa flavonoid,  saponin,  dan  tanin.  Adanya  senyawa  flavonoid  diidentifikasi  dengan  uji  wilstater  sianidin  yang menunjukkan  adanya  perubahan  warna  dari  kuning  kehijauan  menjadi  warna  merah  yang  menandakan terjadinya  pembentukan  senyawa  kalkon.  Senyawa  kalkon  diidentifikasi  mempunyai  aktivitas  sebagai antibakteri, antiinflamasi, dan antioksidan [12].
Adanya senyawa saponin dalam ekstrak etanol Daun Sirih Hijau ( Piper betle Linn) diidentifikasi dengan uji  forth.  Hasil  positif  ditandai  dengan  terbentuknya  buih  yang  merupakan  karakteristik  saponin  [13,14]. Senyawa  tanin  diidentifikasi  dengan  pereaksi  FeCl 3 yang  menunjukkan  hasil  positif  warna  hitam  yang menandakan pembentukan tanin terhidrolisis.
Uji  bebas  etanol  dilakukan  sebagai  upaya  pemastian  tidak  adanya  pelarut  etanol  pada  ekstrak  yang dihasilkan.  Keberadaan  etanol  dapat  mempengaruhi  pengujian  antibakteri  dikarenakan  gugus  aktif  pada etanol sendiri bersifat toksik terhadap bakteri.

## 3. Perhitungan Total Rendemen
Hasil perhitungan total rendemen memberikan hasil yang berbeda pada dua metode ekstraksi yang dilakukan terhadap daun Sirih Hijau. Rendemen ekstrak diperoleh berdasarkan perbandingan berat ekstrak yang diperoleh denggan berat simplisia yang digunakan dikalikan dengan 100% sesuai yang dicantumkan pada persamaan (1)
Rendemen = !
(1)
Perhitungan total rendemen kedua metode ekstraksi disajikan pada Tabel 2. Hasil rendemen ekstrak daun Sirih Hijau yang diekstraksi dengan metode refluks diperoleh sebanyak 18.5 gram dari 100 gram bobot simplisia awal (18.5%). Hasil ini lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak hasil maserasi (14.16%) dengan presentase  bobot  simplisia  pada  proses  refluks  sebesar  seperlima  bagian  bobot  simplisia  pada  metode maserasi.

## Tabel 2. Hasil perhitungan total rendemen ekstrak etanol Daun Sirih Hijau
Besar  kecilnya  nilai  rendemen  merupakan  parameter  yang  menentukan  keberhasilan  suatu  proses ekstraksi.    Besarnya  rendemen  yang  diperoleh  pada  proses  ekstraksi  juga  menggambarkan  jumlah penarikan senyawa aktif pada zat. Efektifitas proses ekstraksi dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain jenis pelarut, ukuran partikel, metode ekstraksi, dan lama proses ekstraksi [15]. Metode refluks melibatkan pemanasan pada prosesnya, sehingga penyarian senyawa aktif menjadi lebih optimal. Semakin tinggi suhu ekstraksi,  proses  penyerapan  pelarut  ke  dalam  bahan  menjadi  semakin  mudah,  sehingga  sampel  akan terekstrak  semakin  banyak  [5].  Selain  adanya  penambahan  suhu,  pada  proses  refluks  pelarut  yang digunakan  tetap  segar  sehingga  tidak  terjadi  kejenuhan,  sehingga  kemampuan  pelarut  dalan  menarik senyawa aktif daun Sirih Hijau meningkat [16].

## Hasil Uji Antibakteri Dengan Metode Mikrodilusi
Uji  aktifitas  antibakteri  dilakukan  menggunakan  metode  mikrodilusi  sesuai  standar  CLSI.  Pengujian dilakukan terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan tiga kali perulangan dengan tujuan  memperoleh  rerata  yang  optimal.  Kontrol  positif  menggunakan  ciprofloxacin  dan  kontrol  negatif menggunakan  DMSO.  Penentuan  MIC  dilakukan  secara  visual  kualitatif  sebagai  skrining  awal  pengujian antibakteri  dan  hasilnya  digunakan  sebagai  dasar  dalam  penentuan  MBC  (mínimum  bactericidal
Saponin Ekstrak + air, gojog ! buih + HCl pekat Berbuih + Tanin Ekstrak + FeCl 3 1% Hitam kuat + Bebas etanol 70% Ekstrak + H 2 SO 4 pekat + CH 3 COOH, dipanaskan
Tidak tercium bau ester yang khas
+
% 100 ) ( ) ( x isia BobotSimpl ak BobotEkstr Metode Ekstraksi
Bobot Simplisia Bobot Ekstrak Kental Rendemen Maserasi 500 g 70,8 g 14,16% Refluks 100 g 18.5 g 18.5 %
concentration) secara kuantitatif dengan metode TPC (Total Plate Count). Hasil uji antibakteri ekstrak etanol daun Sirih Hijau terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil pegujian antibakteri ekstrak etanol Daun Sirih Hijau pada Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
Keterangan :
Tanda positif (+) : Menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri Tanda negatif (-) : Menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri Kontrol  M : Media Kontrol (+) : Ciprofloxacin Kontrol (-) : DMSO
Hasil  uji  antibakteri  yang  diperoleh  dari  pengamatan  kekeruhan  menunjukkan  bahwa  ekstrak  hasil refluks menunjukkan zona jernih pada konsentrasi 5% untuk Staphylococcus aureus , serta konsentrasi 3% dan  5%  untuk Escherichia  coli (Gambar  2).  Berbeda  dengan  ekstrak  hasil  refluks,  daun  Sirih  Hijau  yang diekstrak  dengan  maserasi  memberikan  sedikit  zona  jernih  pada  konsentrasi  5%  untuk Staphylococcus aureus, serta zona jernih penuh pada konsentrasi 5% untuk Escherichia coli.
Gambar 2. Hasil pengamatan visual uji antibakteri ekstrak etanol daun Sirih Hijau dengan metode mikrodilusi
Jenis Ekstraksi No Tabung Konsentrasi Staphylococcus aureus Escherichia coli Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3 Refluks 1 1% + + + + + + 2 3% + + + + + - 3 5% + - - - - - 4 Kontrol M + + + + + + 5 Kontrol Positif - - - - - - 6 Kontrol Negatif + + + + + + Jenis Ekstraksi No Tabung Konsentrasi Staphylococcus aureus Escherichia coli Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3 Maserasi 1 1% + + + + + + 2 3% + + + + + + 3 5% + + - - - - 4 Kontrol M + + + + + + 5 Kontrol Positif - - - - - - 6 Kontrol Negatif + + + + + +
S. aureus E. coli 5% S 3% 1% 5% S 3% 1%
Refluks Maserasi

## Journal of Science and Applicative Technology  Vol.I No.2 2017
Perbedaan  hasil  uji  antibakteri  pada  kedua  ekstrak  daun  Sirih  Hijau  menunjukkan  adanya  pengaruh metode  penyarian  pada  aktifitas  penghambatan  bakteri.  Penarikan  senyawa  aktif  yang  dilakukan  secara refluks  menunjukkan  nilai  MIC  (mínimum  inhibitor  concentration)  yang  lebih  kecil  dibandingkan  maserasi. Adanya penambahan suhu yang tinggi pada proses refluks dapat meningkatkan desorpsi senyawa aktif dari tanaman,  sehingga  senyawa  yang  tertarik  lebih  banyak  dan  aktifitas  antibakteri  meningkat  [16].  Hasil  uji antibakteri pada Tabel 3 juga menunjukkan bahwa ekstrak daun Sirih Hijau dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus (gram positif) dan Escherichia coli (gram negatif). Hasl tersebut menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun Sirih Hijau memiliki spektrum yang luas ( broad spectrum ) sebagai penghambat pertumbuhan  bakteri.  Penghambatan  bakteri  terlihat  dari  nilai  MIC  yang  ditunjukkan  kedua  ekstrak  baik dengan metode refluks ataupun maserasi.
Besar kecilnya nilai MIC (mínimum inhibitor concentration) pada ekstrak hasil refluks maupun maserasi dapat  dipengaruhi  oleh  faktor  lain,  yakni  kinerja  senyawa  aktif  dalam  penghambatan  bakteri.  Bakteri  gram positif  dan  negatif  memiliki  struktur  yang  berbeda,  sehingga  proses  penghambatan  yang  terjadi  juga berbeda.  Dinding  sel Staphylococcus  aureus yang  merupakan  bakteri  gram  positif  mengandung  lapisan peptidoglikan yang lebih tebal serta polisakarida yang disebut asam teikoat. Berbeda dengan bakteri gram positif,  dinding  sel Escherichia  coli mengandung  lebih  sedikit  peptidoglikan  serta  memiliki  lapisan lipopolisakarida [17]. Perbedaan struktur inilah yang mempengaruhi perbedaan mekanisme antibakteri pada kedua ekstrak, sehingga nilai MIC atau kadar hambat mínimum yang dihasilkan juga berbeda.
Aktifitas  antibakteri  pada  ekstrak  etanol  Daun  Sirih  Hijau  sangat  dipengaruhi  oleh  keberadaan senyawa  aktif  flavonoid,  saponin,dan  tanin  yang  masing-masing  memiliki  mekanisme  antibakteri  yang berbeda.  Senyawa  flavonoid  menghambat  pertumbuhan  bakteri  dengan  jalan  perusakan  membran  sel melalui  pembentukan  senyala  kompleks  dengan  protein  ektraseluler  [18]. Aktifitas  lain  dari  flavonoid  yang dapat menghambat bakteri adalah melalui jalur metabolisme energi [19].
Senyawa  aktif  lain  yang  berpotensi  sebagai  antibakteri  adalah  saponin.  Saponin  memiliki  jalur  yang berbeda  dalam  penghambatan  bakteri,  yakni  dengan  jalan  mengganggu  kestabilan  sitoplasma  sehingga sitoplasma  bocor  dan  mengakibatkan  kematian  sel  [20].  Berbeda  dengan  flavonoid  dan  saponin,  tanin memiliki  aktifitas  antibakteri  dengan  jalan  menonaktifkan  adhesin  sel  mikroba,  menonaktifkan  enzim,  serta bekerja pada polipeptida dinding sel. Adanya tanin pada dinding sel, dapat mengakibatkan sel bakteri lisis sehingga sel bakteri akan mati [21,20]. Keberadaan metabolit sekunder pada ekstrak etanol Daun Sirih Hijau saling  bekerja  secara  sinergis  sesuai  dengan  mekanisme  kerja  masing-masing  dalam  penghambatan aktifitas bakteri. Sehingga, Daun Sirih Hijau ( Piper betle Linn) berpotensi sebagai kandidat antibakteri.

## 4. Kesimpulan
Penyarian atau proses ekstraksi pada Daun Sirih Hijau ( Piper betle L .) yang dilakukan secara refluks memberikan  hasil  total  rendemen  yang  lebih  signifikan  sebesar  18,5%  dibandingkan  dengan  metode maserasi  tanpa  mempengaruhi  fungsi  dan  hasil  penapisan  senyawa  aktif  pada  Daun  Sirih  Hijau.  Hasil skrining  antibakteri  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  daun  Sirih  Hijau  bersifat broad  spectrum atau memiliki spektrum luas sebagai antibakteri yang ditunjukkan dengan nilai MIC pada kedua ekstrak hasil uji. Ekstrak hasil refluks menunjukkan nilai MIC pada konsentrasi 5% untuk S. aureus serta 3% dan 5% untuk E.coli ,  sedangkan  ekstrak  hasil  maserasi  memberikan  penghambatan  yang  lebih  lemah  dengan  nilai  MIC lebih besar dibandingkan refluks.

## 5. Penghargaan
Ucapan  terima  kasih  disampaikan  kepada  Lembaga  Penelitian  dan  Pengadian  Kepada  Masyarakat (LPPM)  Universitas  Ngudi  Waluyo  yang  telah  memberikan  fasilitas  pendanaan  Internal  demi  tercapainya penelitian ini.

## 6. Daftar Pustaka
[1] A.  Sartinah,  “Isolasi  dan  Identifikasi  Senyawa  Antibakteri  Dari  Daun  Petai  Cina,” Tesis .  Fakultas Farmasi Sains dan Teknologi UGM, Yogyakarta, 2011.
[2]   S.  Kursia,  J.S.Lebang,  B.  Taebe,  A.  Burhan,  Wa  O.R.  Rahim,  Nursamsiar.  ”Uji  Aktifitas  Antibakteri Ekstrak  Etilasetat  Daun  Sirih  Hijau  ( Piper  betle L.)  terhadap  Bakteri Stapylococcus  epidermidis” ,  Ind.  J.  of Pharmaceutical Sci. and Tech.3(2):72-77. 2016.
[3] A. N. Kristianti. Buku Ajar Fitokimia, Airlangga University Press, Surabaya, 2008.
[4] A.  B.  Putra,  N.  W.  Bogoriani,  N.  P.  Diantariani,  N.  L.  U  Sumadewi,”  Ekstraksi  Zat  Warna Alam  Dari Bonggol  Tanaman  Pisang  ( Musa  Paradiasciaca L.)  Dengan  Metode  Maserasi,  Refluks,  Dan  Sokletasi, “Jurusan Kimia Fmipa Universitas Udayana, Bukit Jimbaran, 2013.
[5] E., Pratiwi, “Perbandingan Metode Maserasi, Remaserasi, Perkolasi dan Reperkolasi dalam Ekstraksi Senyawa Aktif Andrographolide dari Tanaman Sambiloto ( Andrographis paniculata (Burm.F.) Nees)” Skripsi, Institut Pertanian Bogor, Bogor, 2010.
[6] M.S.,  Mohan,  Khanam,  B.G.  Shivananda,  “Optimization  of  Extraction  of  Andrographolide  from Andrographis paniculata and its Comparison with Refluxation Extraction Method,” Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry , Vol. 2. 342-348, 2013.
[7] N.  P.  L.,  Laksmiani,  Susanti,  N.M.P.,  Widjaja,  I.  N.  K..,  Rismayanti,  A.  A.  M.  I.,  Wirasuta  IM.A.G. “Pengembangan Metode Refluks untuk Ekstraksi Andrografolid dari Herba Sambiloto
( Andrographis  paniculata (Burm.f.)  Nees).”  Jurusan  Farmasi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam Universitas Udayana, 2011.
[8] J.A.H. Sheela, “Qualitative Analysis Of Secondary Metabolites Of The Plant Clematis Gouriana,” Int. Journal Innovative Research in Sci Eng, and Tech . Vol. 2 (6) : 2356-2358, 2013.
[9] T.  Juwitaningsih,  Y.  M.  Syah,  L.  D.  Juliawaty,  ”Aktifitas Antibakteri  Dari  Ekstrak Alphina  malaccensis (Burm.f) Roxb. Prosiding Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia VI. 495-500, 2014
[10]  Backer  and  V.  D.  Brink.1968. Flora  of  Java  vol.I-III .  Wolters  –  Noordhoff  NV  –  Groningen.  The Netherlands.
[11]  V.,  Dwivedi  and  Tripathi,  S.,  Review  Study  on  Potential  Activity  of Piper  betle L ., Journal  of Pharmacognosy and Phytochemistry. 3(4): 93-98, 2014.
[12]  G.E.  Treas  and  Evans,  W.C.,  Pharmacognosy.  11th  edn.  Brailliar  Tiridel  Can.  Macmillian  publishers. 1989.
[13]  E.  Pelegrini,  Carucci,  M.  G.,  Campanella,  A.,  Lorenzini,  G.,  Nali,  C.,  "Ozone  Stress  In  Melissa officinalis Plants Assessed by Photosynthetic Function”, Environ. Exp.Bot. 73, 94-101. 2011.
[14]  S., Ganiswarna. 1995. Farmakologi dan Terapi, Edisi 4. UI press. Jakarta [15]  N., Salamah, M. Rozak, M. A. Abror, ”Pengaruh Metode Penyarian Terhadap Kadar Alkaloid Total Daun Jembirit  ( Tabernaemontana  sphaerocarpa BL.)  Dengan  Metode  Spektrofotometri  Visibel,  “,  Pharmaciana. Vol. 7 No. 1. 113-122, Mei 2017.
[16]  T.,  Jain.,  Jain  V.,  Pandey,  R.  Vyas,  A.,  Shukla,  S.S.  Microwave  Assisted  Extraction  for Phytoconstituents-An overview. Asian Journal Research Chemistry. 1(2), 19-25, 2009.
[17]  C. Pagliarulo, V.D. Vito, G. Picariello , R. Colicchio, G. Pastore, P. Salvatore, M.G. Volpe, “Inhibitory Effect Of Pomegranate (Punica Granatum L.) Polyphenol Extracts On The Bacterial Growth And Survival Of Clinical  Isolates  Of  Pathogenic Staphylococcus  aureus and Escherichia  coli”, Food  Chem.,  Vol.  190, 824-831, 2016.
[18]  M.C. Nuria,  A. Faizatun., Sumantri, “Uji Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Jarak Pagar ( Jatropha cuircas L)  terhadap  Bakteri Staphylococcus  aureus ATCC  25923, Escherichia  coli ATCC  25922,  dan Salmonella typhi ATCC 1408,” Jurnal Ilmu – ilmu Pertanian . 5: 26 – 37, 2009.
[19]  T.P.T.  Cushnie  and  A.J.  Lamb,  Antimicrobial  Activity  of  Flavonoids.  International  Journal  of Antimicrobial Agents. 26: 343 – 356. 2005.
[20]  S.J. Cavalieri,, I.D. Rankin., R.J. Harbeck., R.S. Sautter., Y.S. McCarter., S.E. Sharp., J.H. Ortez., C.A. Spiegel, Manual of Antimicrobial Susceptibility Testing . American Society for Microbiology, USA, 2005.
[21]  F.P.  Sari,,  dan  S.  M.  Sari,  Ekstraksi  Zat Aktif Antimikroba  dari  Tanaman  Yodium  ( Jatropha  multifida Linn)  sebgai  Bahan  Baku Alternatif Antibiotik Alami,    Fakultas  Teknik  Universitas  Diponegoro,  Semarang, 2011.