Jurnal Farmasi,  e-ISSN: 2655-0814 Vol. 3 No.2 Edisi November 2020 - April 2021 http://ejournal.medistra.ac.id/index.php/JFM
============================================================================================ Received: 12 April 2021 :: Accepted: 30 April 2021 :: Published: 30 April 2021
Identifikasi Bakteri Escherichia coli O157:H7 Pada Feses Penderita Diare dengan Metode Kultur dan PCR
Vincentia Ade Rizky 1 , Sa’adah Siregar 1 , Visensius Krisdianilo 1 , Asvia Rahayu 1 , Suventi Syafrina Ginting 1 , Kartini 1
Fakultas Farmasi, Institut Kesehatan Medistra lubuk Pakam, Jalan Sudirman No. 38 Lubuk Pakam e-mail: vincentiarizky@gmail.com DOI 10.35451/jfm.v3i2.615

## Abstract
Escherichia  coli  O157:  H7  is  the  main  cause  of  foodborne  disease  in  several countries, one of which is diarrhea. The problem that often occurs in Indonesia that  requires  treatment  and  study  from  various  aspects  is  Diarrhea.  The conventional method of laboratory examination such as culture is a method that is  often  carried  out,  but  in  making  the  diagnosis  requires  a  long  time,  the number  of  samples  is  large,  and  the  results  are  less  accurate  because contamination can occur. Another more accurate technique for detection E. coli O157: H7 is the PCR technique. This study aims to identify the Escherichia coli O157:  H7  bacteria  by  culture  method  and  PCR.  The  results  showed  that  the culture method and PCR of 8 isolated samples 4 showed positive results for the bacteria E. coli O157: H7. However, the PCR method is more selective and the time used is faster than the culture method.
Keywords: Escherichia coli O157:H7, PCR, Culture method

## 1. PENDAHULUAN
Infeksi merupakan penyebab utama  penyakit  di  dunia  terutama  di daerah tropis, seperti Indonesia (Hermayudi  &  Ayu,  2017).  Agen penyebab  infeksi  antara  lain  bakteri Escherichia coli yang merupakan bakteri komensal atau flora normal di peritoneum  atau  usus  bagian  bawah (Elliott et a l., 2013). Bakteri E. coli akan bersifat patogen apabila berada ditempat yang bukan habitatnya (Brooks et al ., 2005).
Bakteri E. coli dapat mengeluarkan racun  sehingga  menjadi  patogen  dan
menyebabkan  penyakit.  Bakteri  E.coli dapat  memproduksi  racun  yang  dapat menimbulkan penyakit, salah satu racun yang paling sering teridentifikasi adalah Shiga  Toxinproducing  Escherichia  coli (STEC)  yaitu  pada  bakteri E.  Coli serotype O157:H7. (Jawetz et al., 2010;
Rananda et al. , 2016).
Bakteri E. coli O157:H7 merupakan penyebab utama foodborne disease
di beberapa negara.
Berdasarkan  laporan  dari  CDC  tentang insiden infeksi Escherichia coli O157:H7 menyatakan  bahwa  8.598  kasus  pada 49  negara  terserang  wabah  penyakit
Jurnal Farmasi,  e-ISSN: 2655-0814 Vol. 3 No.2 Edisi November 2020 - April 2021 http://ejournal.medistra.ac.id/index.php/JFM
============================================================================================ Received: 12 April 2021 :: Accepted: 30 April 2021 :: Published: 30 April 2021
yang  disebabkan  oleh  bakteri  ini. Sebanyak 1.493 (17%) kasus, penderit masuk rumah sakit, 254 (4%) penderita teridentifikasi mengalami
HUS
( Hemolytic  Uremic  Syndrome) ,  dan  40
(0,5%)  kasus  penderita  meninggal. Selain itu di negara Prancis, terdapat 69 orang terinfeksi bakteri E. coli O157:H7 dan  17  orang  menderita  HUS.  Kasus HUS  di  Argentina  berhubungan  dengan infeksi  bakteri E.  coli O157:H7  yang mencapai  400  kasus  per  tahunnya. Penelitian sebelumnya oleh Sartika et al. (2005)  yang  menunjukkan  bahwa daging  sapi  (100%)  dan  susu  sapi (73%)  terkontaminasi  oleh  bakteri E. coli
O157:H7 yang
kemudian dikonsumsi  oleh  manusia  sehingga menyebabkan penyakit diare.
Pada  manusia,  infeksi  akibat bakteri  jenis  ini  ada  yang  tidak menimbulkan gejala (asimtomatis) ataupun  timbul  gejala  berupa  diare berdarah  ataupun  diare  tanpa  darah (Dutta et al., 2011; Peter et al., 2011). Pemeriksaan laboratorium metode konvensional  seperti  kultur  merupakan metode  yang  sering  dilakukan,  akan tetapi  dalam  menegakan  diagnosa butuh  waktu  dan  umlah  sampel  yang banyak,  serta  hasil  kurang  akurat karena  dapat  terjadi  kontaminasi. Teknik  lain  yang  lebih  akurat  untuk mendeteksi  E.  coli  O157:H7  adalah dengan teknik PCR.
Penelitian sebelumnya Bakri et al .,
(2010)  menyatakan  bahwa  pasien  ana (0-14 tahun) yang menderita diare dari kultur  teridentifikasi  sebanyak  21,42% bakteri E.coli  O157:H7 dan  46,43% menggunakan  PCR. Maka  dari  itu peneliti  ingin  meneliti  kembali  tentang deteksi bakteri E. coli O157:H7 metode kultur dan PCR.

## 2. METODE PENELITIAN
Jenis penelitian ini adalah Penelitian  Experimental yang  dilakukan di  Lab.  Mikrobiologi  dan  Biologi Molekuler  Institut  Kesehatan  Medistra Lubuk  Pakam  pada  bulan  November 2020.  Sampel  penelitian  ialah  feses penderita diare .
Alat - alat yang digunakan antara lain  tabung  reaksi,  Erlenmeyer,  gelas ukur,  cawan  petri,  batang  ose,  rak tabung,  bunsen,  kapas  steril,  Laminal Air  Flow,  timbangan  analitik,  neraca analitik, kulkas, perangkat uv, elektroforesis,  PCR,  spin  colomn,  mini cup, dll. Bahan - bahan yang digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  spesimen medium transport Cary-Blair, BHIB, NA, SSA,  Sorbitol  Mac  Conkey  Agar,  media Peptone  Water  (indol),  media  Methyl Red-Voges  Proskauer,  media  simons citrate, reagen kit QIAmp, dll.

## Kultur Bakteri
Sampel  dalam  medium  transport Carry-Blair  diinokulasikan  ke  medium pengaya  (media  BHIB)  dan  diinkubasi pada suhu 37˚ C selama 18-24 jam.
Selanjutnya  sebanyak  1  ose kemudian  diinokulasikan  ke  dalam cawan petri yang berisi media NA, SSA, Sorbitol  Mac  Conkey  Agar  (SMCA) selanjutnya dinkubasi ±18-24 jam pada suhu 37 ˚ C kemudian diamati pertumbuhannya.
Bakteri  yang  telah  tumbuh  pada media isolasi yaitu dengan pemeriksaan secara mikroskopis untuk menentukan  sifat  atau  ciri  hasil  kultur pada  media  bakteri  dan  dilanjutkan dengan uji biokimia.

## Uji Mikroskopis
Jurnal Farmasi,  e-ISSN: 2655-0814 Vol. 3 No.2 Edisi November 2020 - April 2021 http://ejournal.medistra.ac.id/index.php/JFM
============================================================================================ Received: 12 April 2021 :: Accepted: 30 April 2021 :: Published: 30 April 2021
Identifikasi  mikroskopis  dengan  cara membuat  sediaan  kemudian  dilakukan pewarnaan  gram.  Bakteri  berwarna merah  merupakan  Bakteri  Gram  (-) serta  bakteri  berwarna  ungu  adalah bakteri Gram (+).

## Uji Biokimia
Identifikasi  bakteri  dilanjutkan  dengan tes biokimia IMVIC yaitu pengujian pada media  Indol  Metil  Red  (MR),  Vogas Proskauer (VP), dan uji sitrat. Media ini ditanam  bakteri  kemudian  dinkubasi pada suhu 37 ˚ C ±18-24 jam.
Kemudian  dilakukan  identifikasi  bakteri untuk  lebih  memastikan  bahwa  yang tumbuh  adalah  bakteri  tersebut,  dan pengamatannya  disesuaikan  dengan rujukan buku.

## Identifikasi Molekuler
Sebanyak  100  µl  isolate  bakteri E. coli positif pada media cair dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf sebanyak 2 mL  kemudian  dilakukan  centrifugasi pada  kecepatan  5.000  rpm  selama  5 menit  pada  suhu  5˚ C.  Massa  sel  yang diperoleh  selanjutnya  ditambahkan  TE buffer  pH  8,  dan  dilakukan  pelisisan dengan  menggunakan  larutan  yang mengandung 1% Triton X-100 (Sigma) dalam  buffer  TE  pH  8.  Proses  ini dilakukan  dengan  pemanasan  pada  air mendidih  selama  15  menit  dan selanjutnya  dibekukan  dengan  cara disimpan pada  suhu  20˚ C  selama  15 menit. Lakukan proses Pemanasan dan pembekuan
sebanyak
3
kali pengulangan.  Primer  yang  digunakan adalah shiga like toxin tipe I (Stx1): LP- 30:  CAG  TTA  ATG  TGG  TGG  CGA  AGG dan LP-31: CAC CAG ACA ATG TAA CCG CTG:  shiga  like  toxin  tipe  II  (Stx2) dengan pasangan primer LP43: ATC CTA TTC CCG GGA GTT TACG dengan LP-44: GCG  TCA  TCG  TAT  ACA  CAG  GAG  C
dengan  ukuran  produk  PCR  yang  akan dihasilkan  untuk  gen  stx1  dan  stx2 berturut-turut 348bp dan 584bp. Proses PCR  diperoleh  dari  larutan  dengan volume  total  12,5  µl  yang  terdiri  dari dNTPs 10 mM, primer forward sebanyak 25 nmol dan reserve 25 nmol, Buffer II 1x, MgCl 2 75 mM, Amplitaq 0,45 U dan DNA sebanyak 1 µl. Tahapan amplifikasi meliputi  1x  Siklus  pada  suhu  94˚ C selama  5  menit,  lalu  40x  Siklus  suhu 94˚ C selama 30 detik, dan 48˚ C selama 30  detik  dan  72 ˚ C  selama  30  detik. Terakhir 1x Siklus 72 ˚ C selama 5 ment. Hasil dari amplifikasi PCR selanjutna dilakukan  elektroforesis  menggunakan 1% agarose dan TAE Buffer. Kemudian ditambahkan pewarna EtBr. Selanjutnya divisualisasikan dengan sinar UV illuminator dan didokumentasikan.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan  hasil  penelitian yang dilakukan secara kultur, didapatkan  bahwa  dari  ke-8  sampel yang dilakukan pemeriksaan didapatkan hasil  positif Escherichia  coli O157:H7 sebanyak 4 sampel. Hal ini ditunjukkans pada  tabel  1  dari  hasil  pemeriksaan mikroskopis dan biokimia yang selanjutnya  dibandingkan  dalam  buku
Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology .
Tabel 1. Hasil Pemeriskaan Mikroskopis dan Biokimia
Sampe l Mikroskopi s SMCA Uji Biokimia Indo l M R V P S C
F2 Gram (-) Bacil (+) Jernih (tidak Berwarna ) + + - - F3
Gram (-) Bacil (+) Jernih (tidak Berwarna ) + + - -
F4 Gram (-) Bacil (+) Jernih (tidak Berwarna ) + + - -
============================================================================================ Received: 12 April 2021 :: Accepted: 30 April 2021 :: Published: 30 April 2021
F5 Gram (-) Bacil (+) Jernih (tidak Berwarna ) + + - - F6
Gram (-) Bacil (+) Berwarna Merah Muda - - + +
F7 Gram (-) Bacil (+) Berwarna Merah Muda + - + - F8
Gram (-) Bacil (+) Berwarna Merah Muda - - - +
F9 Gram (-) Bacil (+) Berwarna Merah Muda + + - -
Identifikasi  secara  mikroskopis  yang ditunjukkan  pada  gambar  1  ditemukan bakteri gram (-) bacil (+) yang artinya bakteri  berbentuk  batang  pendek  lurus (cocobacil)  berwarna  merah.  Hal  ini dinyatakan pula dalam penelitian Jaipah et  al .,  (2017)  bahwa  bakteri eschericia coli adlah  bakteri  gram  (-)  berbentuk batang  pendek  lurus  atau  disebut  juga dengan  kokobasil.  Pada  saat  dilakukan pewarnaan  gram,  bakteri E.  coli tidak menyerap warna kristal
violet,
melainkan menyerap warna merah dari safranin (Rizky, 2018).
Gambar 1. Hasil Mikroskopis Sampel F2
Pemeriksaan  mikroskopis  tidak  cukup untuk mengidentifikasi bakteri
Escherichia coli O157:H7, maka dari itu dilakukan  uji  SMCA  dan  biokimia sebagai  uji  konfirmasi.  Berdasarkan hasil penelitian uji biokimia (gambar 2) dan  SMCA  terdapat  4  sampel  yang
menunjukan  bahwa  sampel  tersebut teridentifikasi  bakteri E.  coli O157:H7. Hal ini didasarkan pada hasil peneltiian uji  biokimia  dan  SMCA  yang  secara berturut menunjukkan hasil : Indol (+), MR (+), VP (-), Simons citrate (-), dan SMCA  jernih.    Hasil  dari  media  SMCA menunjukkan  koloni  berwarna  jernih yang  menandakan  bahwa  bakteri tersebut  tidak  dapat  memfermentasi sorbitol  dan  bersifat  motil  (O157:H7). Kultur  SMCA  merupakan  media  yang digunakan untuk mengidentifikasi E. coli serotiper  O157:H7.  Sorbitol  digunakan sebagai  penanda  atau  media  isolasi utama  dalam  mendeteksi  bakteri  jenis ini (Hidayati et al ., 2018)
Gambar 2. Hasil Uji Biokimia Sampel F2 yang secara berurut: a) Uji Indol; b) Uji Methyl Red (MR); c) Uji Voges Proskauer (VP); d) Uji Simon’s Citrate
Hasil uji PCR pada pita fragmen dengan ukuran  123  bp  menunjukkan  bahwa sampel F2,F3,F4 dan F5 terdapat bakteri Escherichia  coli O157:H7,  sedangkan pada sampel yang lain tidak ditemukan bakteri ini (Gambar 3).
Jurnal Farmasi,  e-ISSN: 2655-0814 Vol. 3 No.2 Edisi November 2020 - April 2021 http://ejournal.medistra.ac.id/index.php/JFM
============================================================================================ Received: 12 April 2021 :: Accepted: 30 April 2021 :: Published: 30 April 2021
Gambar 3. Hasil Pemeriksaan Elektroforesis yang menunjukkan
amplifikasi  DNA  multipleks  PCR  yang telah  diekstraksi,  secara  berurut:  Jalur 1&13  Marker  DNA  123-bp;  Jalur  2-9 Sampel;  Jalur  10  Positif  kontrol  strain Escherichia  coli O157:H7;  Jalur  11 Negatif  kontrol Escherichia  coli ATCC 25922.
Hasil  pemeriksaan  PCR  telah terbukti  spesifik  dalam  mendeteksi bakteri E. coli serotipe O157:H7. Metode PCR  merupakan  salah  satu  metode molekuler  yang  telah  banyak  menjadi pilihan  klinis  beberapa  tahun  terakhir.
Metode  ini  memiliki  tingkat  sensivitas yang  sama  atau  lebih  besar  dari pemeriksaan kultur.  Pada  penelitian  ini metode  PCR  dengan  menggunakan primer Escherichia coli O157:H7 mampu mendekteksi  keberadaan  bakteri  ini dengan  waktu  yang  lebih  cepat  yaitu selama 1 hari, sedangkan metode kultur membutuhkan  waktu  yang  cukup  lama yaitu  sekitar  5-6  hari.  Hal  ini  sejalan dengan penelitian  yang telah dilakukan Morin et  al., (2004)  yang  melaporkan bahwa  deteksi  bakteri Escherichia  coli O157:H7, Vibrio Cholera dan Salmonella typhi menggunakan metode PCR mampu mendeteksi dan
mengidentifikasi  bakteri  pathogen  baik pada  sampel  klinik,  air,  maupun makanan (Jayanti, 2018).

## 4. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dan dibandingkan  dengan  penelitian  lain dapat disimpulkan bahwa teknik
identifikasi  bakteri Escherichia  coli O157:H7  dalam  feses  penderita  diare dengan menggunakan metode molekuler yaitu PCR sudah terbukti lebih sensitif  dan  hasil  yang  dikeluarkan relative cepat namun dengan biaya yang
mahal jika dibandingkan dengan metode  konvensional.  Oleh  karena  itu dapat direkomendasikan dan digunakan oleh tenaga kesehatan dalam mendeteksi dini sehingga akan membantu  penegakan  diagnosa  lebih cepat  dan  menentukan  pengobatan secara lebih efektif.

## DAFTAR PUSTAKA
Bakri  Z,  Hatta  M  &  Nasrum  M. (2010).
DETEKSI KEBERADAAN BAKTERI  ESCHERICHIA  COLI O157:H7 PADA FESES PENDERITA  DIARE  DENGAN
METODE KULTUR DAN PCR. JST Kesehatan ; (5), 2:184-192 Brooks GF, Butel JS, Morse SA (2005).
Mikrobiologi Kedokteran Jawetz,  Melnick,  dan  Adelberg. Edi  Nugroho  (alih  bahasa). Jakarta : Salemba Medika Dutta T.K., Roychoudhury S.P.,
Bandyopadhyay Wani S.A., and I. Hussain. (2011). DETECTION AND  CHARACTERIZATION  OF SHIGA  TOXIN  PRODUCING ESCHERICHIA  COLI  (STEC)  & ENTEROPATHOGENIC ESCHERICHIA  COLI  (EPEC)  IN POULTRY
BIRDS WITH
DIARRHOEA. Indian  J.  Med. Res; 133: 541-545.
Elliott T, Worthington T, Osman H, Gill M
(2013).
Mikrobiologi
Kedokteran  &  Infeksi  Edisi  4 . Jakarta : EGC
Hermayudi  dan  Ayu,  P.A.  (2017).
Penyakit daerah tropis .
Yogyakarta: 2017.
Hidayatu  W.,  Temaja  I.G.R.M.,  dan
Fatmawati N.N.D. (2018). KARAKTERISTIK FENOTIP
ISOLAT  KLINIK ESCHERICHIA COLI O157:H7  PADA  MEDIA SORBITOL  MAC  CONKEY  AGAR (SMAC). J.  Agric.Sci.  and Biotechnol, 7 (1). Jaipah N, Saraswati I, Hapsari R (2017).
UJI EFEKTIFITAS ANTIMIKROBA  EKSTRAK  BIJI
============================================================================================ Received: 12 April 2021 :: Accepted: 30 April 2021 :: Published: 30 April 2021
PEPAYA  ( CARICA  PAPAYA  L .) TERHADAP PERTUMBUHAN ESCHERICHIA COLI SECARA IN VITRO. Jurnal Kedokteran Diponegoro, ISSN  :  2540 − 8844, 6 (2)
Jawetz,  M.  A.  (2010). Mikrobiologi Kedokteran.  (25  ed). (G.  F. Brooks,  K.  C.  Carroll,  J.  S. Butel,  S.  A.  Morse,  T.  A. Mietzner,  Penyunt,  A.  W. Nugroho,  D.  Ramadhani,  H. Santasa,  N.  Yasdelita,  &  K.  W. Nimala, penerj). New York: Mc Graw Hill. Jayanti,  D.  D.  (2018).  DETEKSI
ESCHERICHIA COLI O157 PADA
BERBAGAI  AIR  MINUM  DI
KELURAHAN SEKARAN GUNUNG  PATI  SEMARANG. Universitas Negeri Semarang Morin  NJ,  Gong  Z  &  Li  XF.  2004. REVERSE TRANSCRIPTION- MULTIPLEX  PCR  ASSAY  FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF  ESCHERICHIA  COLI  O157: H7, VIBRIO CHOLERAE OI, AND SALMONELLA  TYPHI. Clinical
Chemistry . 50(11): 2037-2044. Peter  C.H.,  Councell  F.T.,  Keys  C.,  and Monday S.R. (2011). VIRULENCE CHARACTERIZATION OF SHIGA-TOXIGENIC ESCHERICHIA  COLI  ISOLATES FROM  WHOLESALE  PRODUCE.
Appl. Environ. Microbiol. 77 (1):
343-345.
Rananda  RM,  Djamal  A,  Julizar.  2016.
IDENTIFIKASI BAKTERI ESCHERICHIA  COLI  O157:H7 DALAM  DAGING  SAPI  YANG BERASAL DARI RUMAH POTONG HEWAN LUBUK BUAYA. Jurnal Kesehatan Andalas , 5(3): 614-617 Rizky,  V.  A.  (2018).  PERBEDAAN JUMLAH KOLONI

## BAKTERI
ESCHERICHIA COLI PADA PENANAMAN  MENGGUNAKAN TEKNIK SENGKELIT (CALIBRATED LOOP) DAN MIKROPIPET  (PIPET  DILUTION METHOD)  METODE  SPREAD PLATE. UKMC Palembang
Sartika,
Indrawani, dan Sudiarti. (2005). ANALISIS
MIKROBIOLOGI  ESCHERICHIA COLI  O157:H7  PADA  HASIL OLAHAN  HEWAN  SAPI  DALAM PROSES  PRODUKSINYA. Jurnal Makara  Kesehatan ,  9  (1):  23- 28.
Vos, P. et al. (2009). BERGEY’S MANUAL
OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY. 2nd edn, Springer-Verlag New York . 2nd edn. Springer-Verlag New York.
doi:
10.1007/978-0-387- 68489-5.