## Identification of Indigenous Bacteria from Dumai Sea Waters Using 16S rRNA Method
Esa Buana Fatwa 1* , Dessy Yoswaty 1 , Irwan Effendi 1
1 Department of Marine Science, Faculty of Fisheries and Marine Universitas Riau Corresponding Author: esabuanafatwa@gmail.com
Diterima/Received: 22 Agustus 2021; Disetujui/Accepted: 09 September 2021

## ABSTRACT
Indigenous bacteria are bacteria that naturally live freely in nature and have a variety of benefits for  humans.  These  bacteria  also  have  the  potential  to  degrade  pollution  bacteria  in  the  water.  This research was conducted in November-December 2020. The purpose of this study was to and identify indigenous bacteria from dumai sea waters using the PCR method of 16S rRNA sequence technique. Based  on  the  results  of  the  study  based  on  the  analysis  of  16S  rRNA  it  is  known  that  isolate  10 belongs  to  the  bacterium  genus  Bacillus  and  has  a  homological  rate  of  93%  with Bacillus paramycoides bacteria.  Based  on  the  phylogenic  tree  of  isolate  bacteria  10  does  not  have  nodes associated with ten bacteria contained in NCBI. This suggests that phylogenically indigenous bacteria ISL  10  have  no  species  similarity  to  the  ten  bacterial  isolates  in  the  phylogenetic  tree,  but  have  a similarity of base order of 93% to B. paramycoides .
Keywords: Indigenous bacteria, 16S rRNA, Phylogenic, B.paramycoides .

## 1. PENDAHULUAN
Bakteri  indigenous  merupakan  bakteri yang  pada  saat  ini  memberikan  banyak mamfaat  pada  pelbagai  bidang  kehidupan manusia.  Bakteri  Indigenous  adalah  bakteri yang  dapat  hidup  secara  bebas  di  alam  dan biasanya  merupakan  bakteri  asli  dari  daerah tersebut.  Salah  satu  peranan  dari  bakteri indigenous  adalah  dalam  hal  pencemaran (Tanasupawat et al., 2016).
Beberapa penelitian sebelumnya menyebutkan  bahwa  bakteri  indigenous  cukup efektif  dijadikan  agen  bioremediasi  dalam  hal penguraian limbah (Rochman et al. , 2016). Hal ini  dikarenakan  bakteri  indigenous  merupakan bakteri  pengurai  serat  yang  cukup  resisten terhadap  bahan  bahan  pencemar  seperti  logam berat, tumpahan minyak, dan juga mikroplastik. Dalam  proses  metabolismenya  bakteri  akan memanfaatkan  bahan  bahan  pencemar  tersebut sebagai  sumber  karbon  dan  nutrisi  untuk kehidupannya  menggunakan  bantuan  enzim yang berbeda pada masing masing bakteri.
Untuk itu dibutuhkan suatu metode untuk mengetahui  dan  mengidentifikasi  bakteri- bakteri  indigenous  lainnya  secara  cepat  dan akurat  agar  bakteri  ini  dapat  dimanfaatkan secara  maksimal  terutama  dalam  dunia  ilmu pengetahuan  dan  teknologi  (iptek)  (Reimena , 2016).
Perkembangan  ilmu  pengetahuan  dan teknologi telah mengantarkan banyak kemudahan  bagi  kehidupan  manusia,  salah satunya  dalam  hal  mengidentifikasi  jenis  suatu mikroorganisme  yaitu  bakteri.  Saat  ini  metode yang  paling  banyak  digunakan  adalah  metode analisis  urutan  DNA  yang  menyandi  ge  16S rRNA.  Metode  ini  biasanya  digunakan  untuk mengetahui  kebaharuan  isolat  bakteri  yang ditemukan di alam.
Berdasarkan  uraian  tersebut,  penulis tertarik  untuk  melakukan  penelitian  tentang identifikasi  bakteri  indigenous  dari  perairan laut  Dumai  menggunakan  metode  16S  rRNA agar didapatkan hasil idetifikasi yang tepat dan akurat.

## 2. METODE PENELITIAN

## Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilakukan  pada  bulan November-Desember 2020. Untuk
pengambilan  sampel  air  dilakukan  di  perairan laut  Dumai  dan  PCR  serta  sekuensing dilakukan  di  PT.  Genetika  Science  Indonesia Jakarta Barat.

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  metode survey yaitu  secara  langsung  melakukan observasi di lapangan yang bertujuan

## Identification of Indigenous Bacteria from Dumai Sea Water

## mendapatkan data primer.

## Prosedur Penelitian Isolasi DNA
Isolat  bakteri  yang  telah  diremajakan menggunakan  media Nutrient  Broth (NB) diambil sebanyak 1,5 ml kemudian dimasukkan kedalam tube yang berukuran 1,5 ml kemudian di  sentrifuge  dengan  kecepatan  13.000  rpm selama  60  detik.  Selanjutnya  ditambahkan  200 µl buffer  gram dan  dipanaskan  dengan  suhu 37 0 C  selama  30  menit  dan  dibolak  balik, kemudian  dipanaskan  kembali  dengan  suhu 60 0 C selama 10 menit dan ditambahkan 200 µl GB buffer  gram dan  dipanaskan  dengan  suhu 60 0 C selama 10 menit (Sogandi, 2018).
Setelah  itu  supernatan  dipindahkan  ke tube  baru  dan  ditambahkan  dengan  etanol absolute  sebanyak  200µl.  Kemudian  cairan dipindahkan  ke  GDc  dan  disentifus  kembali selama 2 menit, lalu GDc dipindahkan kedalam CT  ( collection  tube )  berukuran  2  ml  dan ditambahkan  400  µl  W1 buffer lalu  disentrifus kembali selama 30 detik.
Selanjutnya  supernatan  dibuang  dan ditambahkan 600 µl wash buffer dan disentrifus selama 30 detik, kemudian pasang kembali  CT ke  GDc  dan  disentrfus  selama  3  menit  untuk mengeringkan  matriks  lalu  GDc  dipindahkan ke tube 1,5 µl yang baru dan ditambahkan 60 µl elution  buffer  dibiarkan  dalam  suhu  ruang selama  5  menit  dan  disentrifus  kembali  selam 60 detik

## Amplifikasi
Amplifikasi PCR volume 50 µl dilakukan  dengan  menggunakan  primer  B27F: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’ dan UI1492R: 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’  dengan  cara  DNA  diambil  sebanyak  1  µl lalu dipindahkan kedalam tabung PCR berukuran  0,2  ml  kemudian  dimasukkan kedalam  thermocycler  PCR.  Proses  pra  PRC dijalankan  pada  suhu  940C  selama  3  menit. Dalam  proses  amplifikasi  terbagai  menjadi tahapan  denaturasi,  penempelan  primer  dan reaksi polimerasi (Rizaldi et al., 2018).

## Elektroforesis DNA
Metode  elektroforesis  yang  digunakan yaitu  dengan  gel  agar  rose,  yang  dilakukan dengan tiga tahapan, yaitu: pertama, persiapkan gel  agarose  yang  disesuaikan  dengan  ukuran DNA  fragmen  yang  dipisahkan  ;  kedua,  DNA sampel dimasukkan kedalam lubang gel dan gel
diletakkan  dibak  elektroforesis  yang  dialiri listrik  sehingga  menghasilkan  pemisahan  yang baik ; ketiga, gel direndam dengan larutan TBE ( Tris  Borate EDTA)  1x  yang  telah  digunakan pada  gel  penyangga  elektroforesis.  Selanjutnya dilakukan pengamatan band yang terbentuk.

## Purifikasi Gel
Kegiatan  purifikasi  gel  akan  dilakukan menggunakan beberapa tahapan, yaitu:
Pemisahan  Gel. Pertama  ambil  bagian dari  gel  agarose  yang  berisis  fragmen  DNA hasil PCR, dan buang kelebihan gel yang tidak mengandung  DNA.  Kemudian  sebanyak  ± 300mg  gel  agarose  berisi  fragmen  DNA tersebut  dimasukkan  kedalam  mikrosentrifuge 1,5 ml. Kemudia 500 µl ditambahkan ke dalam mikrosentrifuge,  lalu  dihmogenkan  campuran tersebut  menggunakan  vortex.  Setelah  itu diinkubasi  pada  suhu  55 0 C  selama  15  menit. Selama  diinkubasi  tube  dibalikkan  setiap  2-3 menit  setelah  itu  campuran  sampel  dibiarkan dingin pada suhu ruang (Waluyo, 2007).
DNA Binding . Tempatkan  kolom DF ke dalam  tube  2  µl  lalu  pindahkan  ±  700  µl campuran  sampel  dari  tahap  pemisahan  gel kedalam kolum DF. Kemudian 30 µl DF buffer ditambahkan  lalu  disentrifuse  selama  30  detik. Setelah  itu  caran  dari  tube  dibuang  dan disimpan  kembali  pada  tube  2  µl.  Jika campuran  sampel  lebih  dari  800  µl,  maka langkan akan diulangi kembali.
Pencucian  ( Wash ). Di  dalam  kolum  DF tersebut  ditambahkan  400  µl  W1 Buffer, lalu disentrifuse    selama  30  detik.  Kemudian ditempatkan  kembali  kolum  tersebut  pada  tube 600 µl wash buffer (yang ditambahkan etanol), lalu  dibiarkan  selama  1  menit.  Setelah  itu dilakukan  sentrifugasi  terhadap  kolum  DF tersebut  yang  masih  terpasang  pada  tube  2  µl selama  30  detik  14000-16000x.  Kolum  DF ditempatkan  pada  tube  2  µl  baru,  lalu disentrifugasi  lagi  14000x  selama  3  menit untuk mengeringkan mantriks.
Elusi  DNA. Setelah  kolum  DF  tadi dikeringkan,  kolum  DF  ditempatkan  pada mikrosentrifus  1,5  mm  yang  baru.  Setelah  itu, kedalam  kolum  DF,  ditambahkan  TE  (Tris EDTA)  buffer  20-50  µlpada  bagian  tengah kolam  matriks.  Setelah  itu,  dibiarkan  selama  2 menit  sampai  TE  terserap  sempurna  kedalam matriks,  lalu  disentrifugasi  14000-16000x selama 2 menit untuk elusi DNA murni.

## Analisis Sekuens
Data  yang  diperoleh  dari  hasil sequenc e dianalisis  menggunakan  teknik  BLAST  ( Basic Local Allignment Search Tool ) yaitu mencocokkan sequence DNA  bakteri  uji dengan sequence DNA  bakteri  yang  ada  di website  NCBI dengan  aplikasi  MEGA  6  dan Bioedit .

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Elektroforesis DNA
Hasil esktraksi DNA total di elektroforesis dengan menggunakan Gel agarose  0,8%  dan  larutan  TBE  1x  untuk menunjukkan  DNA  kromosomal  yang  telah dimurnikan  yang  diberi  kode  ISL  10.  Hasil Elektroforesis  DNA  ditunjukkan  pada  Gambar 1.

## Gambar 1. Hasil Elektroforesis DNA
Berdasarkan  (Gambar  1.)  terlihat  bahwa isolat  10  (no.  3)  memiliki  pita  agak  tebal  dan tunggal.  Tebalnya  pita  menandakan  bahwa isolat  tersebut  memiliki  1500  bp,  besarnya ukuran  ini  sesuai  dengan  yang  diharapkan  dari gen-gen  16S  rRNA.  Amplifikasi  isolat  bakteri yang    memiliki  pita  tunggal  menunjukkan bahwa  primer  yang  digunakan  adalah  primer spesifik  untuk  menganplifikasi  gen  16S  rRNA pada bakteri.

## Sekuensing DNA
Dalam  penelitian  ini  isolat  yang  dilakukan proses sekuensing yaitu  ISL  10. Sekuensing adalah proses pengurutan basa nitrogen dengan menggunakan  mesin  ABI  3130 Genetic Analizer .  Bentuk  dari  hasil  sekuensing  ISL  10 dalam  bentuk  elektrogram  dengan  siklus
terpisah   ( forward dan reverse ). Pasangan basa yang  telah  diperoleh  selanjutnya  digabungkan serta  dirapikan  dengan  menggunakan  software BioEdit 7.0 (Waluyo, 2018).

## Analisis BLAST dan Pohon Filogenetik
Berdasarkan hasil analisis BLAST dengan  merujuk  pada Gen  Bank melalui  situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov
menunjukkan bahwa  ISL  10  memiliki  nilai  homologi  antara 92-93%  terhadap  jenis  bakteri  yang  terdapat didalam GenBank .  Menurut  Drancourt et  al.
(2000)  berdasarkan  dari  urutan  gen  16S  rRNA homologi ≤97% dapat dinyatakan bahwa isolat yang  dibandingkan  berada  pada  genus  yang sama. Sedangkan nilai homologi antara 89-92% menunjukkan  famili  yang  berbeda  dan  apabila memiliki kemiripan (homologi) basa nukleotida <70% bakteri bisa dikatakan spesies baru.
Pendapat  yang  serupa  juga  dijelaskan oleh  Hagstrom et  al.  Dalam Feliatra  (2011) bahwa  isolat  yang  mempunyai  persamaan homologi  lebih  dari  97%  dapat  mewakili  pada tingkat spesies yang sama. Persamaan homologi  antara  93-97%  dapat  mewakili identitas pada tingkat genus tetapi berbeda pada tingkat  spesies,  sedangkan  jika  dibawah  93% kemungkinan  merupakan  spesies  baru  yang urutan  basa  nitrogennya  belum  terdapat  dalam data GenBank .
Isolat  10  (ISL  10)  memiliki  nilai homologi sekitar 93% terhadap bakteri Bacillus paramycoides .  Hal  ini  berarti  dilihat  dari tingkat  homologinya  ISL  10  masih  berada dalam satu genus dengan bakteri B.
paramycoides , yakni dari genus Bacillus.
Pohon  filogenetik  pada  (Gambar  3.) diperoleh  dengan  metode neighbor-joining dengan  Bootstrap  1000  kali  ulangan  dalam program  MEGA  ( Molecular  Evolutionary Genetics  Analysis )  software  versi  6.0  (Tamura et  al., 2013).  Berdasarkan  hasil  pada  pohon filogentik  (Gambar  3.)  menunjukkan  bahwa bakteri  indigenous  ISL  10  tidak  berada  pada cabang  atau node yang  sama  dengan  bakteri- bakteri  yang  ada  didalam  pohon  filogenetik. Bakteri  ISL  10  mempunyai  cabang  tersendiri yang  terpisah  dari  kesepuluh  bakteri  yang  ada dalam  pohon  filogentik,  tetapi  didalam  tabel homologi BLAST (Tabel 1).
Diketahui  bahwa  ISL  10  mempunyai homologi  sekuensing  16S  rRNA  yang  paling dekat  dengan B.  paramycoides .  Hal  tersebut menunjukkan  bahwa  secara  filogenetik  bakteri indigenous  ISL 10 tidak mempunyai kesamaan

## Identification of Indigenous Bacteria from Dumai Sea Water
spesies  dengan  kesepuluh  isolat  bakteri  di dalam  pohon  filogenetik,  tetapi  mempunyai
kemiripan  urutan  basa  sebesar  93%  dengan B. paramycoides
Gambar 2. Elektroforegram DNA Bakteri ISL 10
Tabel 1. Hasil BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool )
Kode NCBI Nama Spesies Panjang Sekuen (bp) Persentase Homologi - ISL 10 1492 100% NR_157734.1 Bacillus paramycoides 1509 93% NR_157736.1 Bacillus tropicus 1509 92% NR_157732.1 Bacillus nitratireducens 1509 92% NR_157730.1 Bacillus luti 1509 92% NR_157729.1 Bacillus albus 1509 92% NR_115526.1 Bacillus cereus 1486 92% NR_074540.1 Bacillus cereus ATCC 14579 1512 92% NR_115714.1 Bacillus cereus 1535 92% NR_112630.1 Bacillus cereus 1476 92% NR_113266.1 Bacillus cereus 1474 92%

## Gambar 3. Pohon Filogenetik Bakteri ISL 10

## 4. KESIMPULAN DAN SARAN
Hasil  identifikasi  dengan  menggunakan
analisis  16S  rRNA  diketahui  bahwa  bakteri indigenous  ISL  10  yang  berasal  dar  perairan
laut  Dumai  memiliki  kemiripan  urutan  basa (homologi) sebesar 93%
dengan
B.paramycoides sehingga  dapat  dikatakan masih berada dalam satu genus yang sama yaitu Bacillus.
Pada  penelitian  selanjutnya  disarankan untuk  melanjutkan  penelitian  mengenai  enzim apa  yang  terdapat  pada  bakteri  indigenous tersebut  melalui  analisis  zimografi  sehingga diketahui  manfaat  lebih  lanjut  dari  bakeri indigen yang ditemukan.

## DAFTAR PUSTAKA
Drancourt, M. A. Carlioz., C. Bollet dan D. Roult. (2000). 16S Ribosomal DNA Sequene Analysis of a  Large  Collection  of  Enviromental  and  Clinic  Unidentifiable  Bacterial  Isolates. J.  Clin Microbial . 38: 3623-3630
Feliatra,  F.,  T.  Nugroho,  T.  Silalahi,  dan  S.Y.  Oktavia.  (2011).  Skrining  Bakteri Vibrio sp  Asli Indonesia  sebagai  Penyenbab  Penyakit  Udang  Berbasis  Teknik  16S  Ribosomal  DNA. Jurnal Ilmu dan Teknologi Kelautan Tropis . 3(2): 85-99.
Reimena,  R.  (2016).  Isolasi  dan  Identifikasi  Bakteri  Asam  Laktat  genus Pediocoocus sp  dari  Feses Orang Sumatra ( Pongo abelii ). Skripsi . Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Syiah Kuala.
Rizaldi, R., W. H. Setyantini dan Sudarno. (2018). Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Proteolitik yang Berasosiasi  dengan  Lamun  ( Enhalus  acoroides )  di  Pantai  Bama,  Taman  Nasional  Baluran, Situbondo,  Jawa  Timur.  Departemen  Manajemen  Kesehatan  Ikan  dan  Akuakultur,  Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga. 10 (1).
Rochman, C.M., A. Tahir, S.L. Williams, D.V. Baxa, R. Lam, dan J.T. Miller. (2016). Anthropogenic debris  in  seafood:  Plastic  debris  and  fibers  from  textiles  in  fish  and  bivalves  sold  for  human consumption. J. Nature . 15(32): 77-97.
Sogandi. (2018). Biologi Molekuler Identifikasi Secara Molekuler . Jakarta: Garuda
Tamura,  K.,  A.  Filipski,  D.  Peterson,  G.  Stecher,  dan  S.  Kumar.  (2013).  MEGA  ( Molecular Evolutionary Genetics Analysis ) software versi 6.0: Mol. Bio and Evol . 30:2725-2729.
Tanasupawat,  M.  K.,  M.  Shahnawaz,  dan  A.  B.  Ade.  (2016).  A  Review  on  Biodegradation  of Polythene: The Microbial Approach. J Bioremed Biodeg . 3(10): 1-9.
Waluyo, L. (2007). Mikrobiologi Umum . Penerbit Universitas Muhammadiyah. Press Malang.
Waluyo, L. (2018). Teknik Metode Dasar dalam Mikrobiologi. Penerbit Universitas Muhammadiyah. Press Malang