## PENAPISAN BAKTERI PROTEOLITIK  YANG BERSIMBIOSIS DENGAN
ALGA Gracillaria sp.
( Screening of the Proteolytic Bacteria Symbiont with Algae Gracillaria sp. )
Riorifki Kabense 1 , Elvy L. Ginting 2 , Stenly Wullur 2 , Nickson J. Kawung 2 , Fitje Losung 2 , Jhon L. Tombokan 2
1 Program Studi Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi, Jl. Kampus Unsrat Bahu, Manado 95115 Sulawesi Utara, Indonesia
2 Staf Pengajar pada Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi, Jl. Kampus Unsrat Bahu, Manado 95115, Sulawesi Utara, Indonesia Corresponding Authors: riorifkikabense@gmail.com

## ABSTRACT
Marine  algae  are  abundant  natural  resources  in  Indonesia  but  have  not been optimally utilized. Utilization of seaweed is still limited as food ingredients such as Gracillaria sp. cultivated as an industrial export material. Algae Gracillaria sp. his life is symbiotic with a variety of types of bacteria. The aim of the study was  to  isolate  and  screening  the  protease  activity  of  the  symbionic  bacteria  of Gracillaria sp.  This  study  succeeded  in  isolating  4  different  bacteria  based  on morphological characteristics. The four isolates were S.G.,1,  S.G.2, S.G.3 and S.G.,4. Isolate S.G. 1 had the ability to produce ptotease with a proteolytic index of 1.5.
Keywords : Gracilaria sp., Protease, Symbiont Bacteria

## ABSTRAK
Alga laut merupakan sumberdaya alam yang melimpah di Indonesia tetapi belum optimal dimanfaatkan oleh masyarakat. Pemanfaatan rumput laut masih terbatas sebagai bahan makanan seperti Gracillaria sp. dibudidayakan sebagai bahan ekspor industri karajinan. Alga Gracillaria sp. hidupnya bersimbion dengan beraneka  ragam  jenis  bakteri.  Tujuan  penelitian  adalah  untuk  mengisolasi  dan menguji  aktivitas  protease  bakteri  simbion  alga Gracillaria sp.  Penelitian  ini berhasil mengisolasi 4 bakteri yang berbeda berdasarkan karakteristik morfologi. Keempat bekteri tersebut adalah S.G., 1 S.G., 2 S.G., 3 dan S.G., 4 Isolat bakteri S.G., 1 memiliki kemampuan   menghasilkan ptotease dengan Indeks proteolitik sebesar 1,5.
Kata Kunci  : Bakteri simbion, Gracillaria sp. protease

## PENDAHULUAN
Alga  laut merupakan  sumberdaya alam  yang  melimpah  di  perairan
Indonesia tetapi belum optimal dimanfaatkan oleh masyarakat. Pemanfaatan alga Gracillaria sp. masih sangat  terbatas  dalam  bidang  industri makanan, pupuk  tanaman, bahan pembuatan kertas, cat, bahan kosmetik, produksi  hidrokoloid  seperti  agar  dan alginate,  serat,  bahan  obat-obatan
seperti antibiotik, antikoagulan, antihipertensi,  pengurangan  kolestrol, dan  insektisida  (Kawung et  al., 2017). Alga Gracillaria sp.  sendiri  hidupnya bersimbion  dengan  beraneka  ragam jenis  bakteri  laut    (Chen  dan  Duan, 2000; Gerung, 2004).
Bakteri  berasal  dari  kata  bahasa latin  yaitu  bacterium,  bakteri  memiliki jumlah  spesies  mencapai  ratusan  ribu dibandingkan dengan mahluk hidup lain
di  bumi.  Bakteri  yang  bersimbiosis dengan alga memiliki potensi diantaranya mampu menghasilkan enzim hidrolase seperti protease.
Penelitian  ini  ingin  mengsolasi  bakteri simbion  pada  alga Gracillaria sp.  dan menguji kemampuan dari bakteri tersebut dalam menghasilkan protease.

## METODE PENELITIAN
Alga Gracillari a  sp.  diambil  dari perairan  Tongkaina  Sulawesi  Utara (Gambar  1).  Alga Gracillaria sp. dipotong  lalu  dimasukkan  ke  dalam plastik  yang  berisi  air  laut,  kemudian dibawa ke Laboratorium
Biologi Molekuler  dan  Farmasitika  Laut  FPIK Unsrat untuk dianalisis lebih lanjut.

## Identifikasi Alga Laut
Sampel  alga  yang  telah  diambil kemudian  diidentifikasi  berdasarkan morfologi dengan memperhatikan bentuk dan warna dari sampel tersebut. Identifikasi  dilaksanakan  berdasarkan panduan Oseana, Volume XV, Nomor 4: 147-155.
Pembuatan Media Kultur Media Nutrient Broth (NB) Media  cair  dipreparasi  dengan cara melarutkan 0,3 gram Nutrient Broth ke  dalam  30  ml  aquades  (1%). Kemudian  distribusikan  media  NB  ke dalam  tabung  masing-masing  6  ml.
Media selanjutnya disterilisasi
menggunakan  autoclave  dengan  suhu 121 0 C selama ± 60 menit.
Media Nutrient Agar (NA) Sebanyak  0,5 Nutrient Broth (1%) dan  2 g  agar (2%)  dilarutkan  dalam  25 ml  aquadest  ditambah  25  ml  air  laut kemudian di autoclave pada suhu 121 0 C selama  ±  60  menit.  Secara  aseptik media  dituang  ke  dalam  cawan  petri steril secara merata, kemudian dibiarkan mengeras. Setelah mengeras dan  dingin,  dibungkus  mengunakan plastic  pembungkus  dan  letakan  di inkubator  selama  24 –  48  jam  untuk memastikan tidak terkontaminasi.
Gambar 1. Peta Lokasi Pengambilan Sampel  alga laut
Kultur,  Isolasi  dan  Karakterisasi Bakteri Simbion
Kultur Bakteri pada Media Cair Setiap sampel Alga Gracillaria sp. dicuci  dengan  menggunakan  air  laut steril,  dengan  cara  masukkan  air  laut steril  ke  dalam  cawan  petri  steril
kemudian  ala  laut  dibilas.    Setelah dibilas,  dengan  teknik  aseptik  rumput laut dihomogenisasi dengan mencampurkan  100  ml  air  laut  steril  di dalam  ependorf  kemudian  digerus menggunakan mortar. Sampel kemudian  diinokulasi  ke  dalam  media
NB.  Inokulasi  dilakukan  dengan  cara mengambil satu  lup sampel rumput laut yang  telah  dihomogenesiskan  dan kemudian  dimasukan  kedalam  media. Kemudian  di  inkubasi  pada  suhu  37° selama  ±  24 –  48  jam.  Adanya pertumbuhan bakeri setelah di inkubasi, ditandai dengan kekeruhan dari media.

## Kultur Bakteri pada Media Agar
Bakteri  yang  bertumbuh  pada media NB kemudian diinolulasi ke dalam media Nutrient  Agar (NA)  dengan menggunakan  metode  cawan  gores. Selain  itu,  dilakukan  pengenceran sampel untuk kemudia diinokulasikan ke dalam  media  NA  dengan  metode penyebaran.
Media yang telah diinokulasikan  dengan  bakteri  ataupun sampel hasil pengenceran kemudian di inkubasi pada suhu 37 0 C selama 24-48 jam  .  Damati  pertumbuhan  bakteri  dan dik arakterisasi morfologoi bakteri berhasil  di  isolasi  dengan  mengacu pada bentuk, warna, tepian dan elevasi koloni bakteri (Lebofe, 2012).

## Media Skim Milk.
Media  skim  milk  agar  dipreparasi dengan  melarutkan  1  g Nutrient  Broth (1%), 2 g agar (2%), dan 2 g skim milk (2%)  ke  dalam  100  ml  aquades kemudian  di  sterilisasi  menggunakan autoclave pada  suhu  121 o C  selama  60 menit.  Setelah  disterilisasi,  secara aseptik media dituang ke dalam cawan petri  yang  telah  steril  secara  merata hingga  semua  permukaan  cawan  petri telah dipenuhi media. Setelah itu media didinginkan hingga mengeras, diletakan ke dalam inkubator selama 24 jam untuk memastikan media dalam keadaan steril dan tidak terkontaminasi.

## Uji Aktivitas Protease
Setiap  isolat  bakteri  ditotolkan pada media skim milk . (Susanti, 2003). kemudian diinkubasi selama 24 - 48 jam pada suhu 37 o C. Adanya aktivitas enzim proteae  kemudian  diamati  dengan terbentuknya  zona  bening  disekitar koloni bakteri setelah diinkubasi.
Besarnya kemampuan bakteri dalam  menghasilkan  protease  dapat ditandai  dengan  indeks  proteolitik. indeks  proteolik  yaitu  perbandingan antar  diameter  zona  bening  dengan diameter koloni untuk memperoleh isolat potensial (Dewi, 2008). Indeks proteolik diperolah  dengan  berdasarkan  Suryadi et al. , (2013) sebagai berikut:

## IP = D. Zona Bening
D. Koloni.
Berasarkan  hasil  identifikasi  alga dengan cara membandingkan morfologi dari  alga  laut  dengan  buku  identifikasi Oseana,  Vol.  XV,  No.  4:  147-155 diperoleh  jenis  rumput  laut Gracillaria sp .
Penelitian ini berhasil mengisolasi
4  isolat  bakteri  simbion  alga Gracillaria sp.  Keempat  bakteri  tersebut  memiliki karakteristik yang berbeda berdasarkan bentuk,  warna,  elevasi  dan  tepian. Adapun karakteristik morfologi keempat isolat  bakteri  tersebut  disajikan  pada (tabel  1).  Ginting, dkk (2019)  berhasil mengisolasi  5  isolat  bakteri  dari  alga merah  yang  menyerupai Portieria sp dan  5  isolat  bakteri  dari  alga  merah menyerupai Gracilaria sp.  Empat  isolat bakteri  juga  berhasil  diisolasi  oleh Wantania dkk dari spons Facaplysinopsis sp.  dan  6  isolat  dari spons Agelas sp.  Isolat  bakteri  ini  juga diisolasi berdasarkan karakteristik morfologinya. Kemampuan bakteri dalam menghasilkan  enzim  protease  yang dapat diketahui dengan cara menumbuhkan bakteri pada media susu
Skim  Milk  Agar  (SMA).  Setelah  bakteri ditumbuhkan  pada  media  SMA  selama 24  jam  pada  suhu  37 o C,  zona  bening yang  terbentuk  disekitar  koloni  bakteri diamati.  Penggunaan  suhu  pada  37 o C, dan  waktu  inkubasi  24  jam  tersebut dikarenakan  bakteri  alga Gracillaria sp. termasuk bakteri mesofilik yang mampu tumbuh baik pada kisaran suhu 20 o C - 40 o C  dan  memiliki  suhu  pertumbuhan optimum  37 o C.  Sedangkan  digunakan
waktu  24  jam  karena  keempat  bakteri tersebut  memiliki  pertumbuhan  yang cepat pada media Skim Milk Agar (SMA) sehingga  pada  waktu  24  jam  tersebut diperkirakan bakteri sudah masuk pada
fase eksponensial, selain itu pada waktu inkubasi  diatas  20  jam,  bakteri-bakteri lain  (bakteri  susu)  mulai  muncul  dan terkontaminasi  media,  sehingga  dapat mengganggu penggamatan.
Gambar 2: Alga Gracillaria sp .(Dokumentasi Pribadi, 2019)
Tabel 1. Karakterisasi Morfologi Isolat Bakteri dari Alga Gracillaria sp. Kode Isolat Karakteristik Koloni Bentuk Warna Elevai Tepian S.G.1 Circular Putih Convex Smooth,entire S.G.2 Rhizoid Coklat Convex Lobate S.G.3 Filamentous Putih Plateu Smooth,entire S.G.4 Circular Putih Convex Flat,raised margin Kemampuan bakteri dalam menghasilkan  enzim  protease  yang dapat diketahui dengan cara
menumbuhkan bakteri pada media susu Skim  Milk  Agar  (SMA).  Setelah  bakteri ditumbuhkan  pada  media  SMA  selama 24  jam  pada  suhu  37 o C,  zona  bening yang  terbentuk  disekitar  koloni  bakteri diamati.  Penggunaan  suhu  pada  37 o C, dan  waktu  inkubasi  24  jam  tersebut dikarenakan  bakteri  alga Gracillaria sp. termasuk bakteri mesofilik yang mampu tumbuh baik pada kisaran suhu 20 o C - 40 o C  dan  memiliki  suhu  pertumbuhan optimum  37 o C.  Sedangkan  digunakan waktu  24  jam  karena  keempat  bakteri tersebut  memiliki  pertumbuhan  yang cepat pada media Skim Milk Agar (SMA) sehingga  pada  waktu  24  jam  tersebut diperkirakan bakteri sudah masuk pada fase eksponensial, selain itu pada waktu inkubasi  diatas  20  jam,  bakteri-bakteri lain  (bakteri  susu)  mulai  muncul  dan terkontaminasi  media,  sehingga  dapat mengganggu penggamatan.
Berdasarkan  hasil  pengamatan setelah bakteri ditumbuhkan selama 24 jam,  telah  terberntuk  zona  bening disekitar  koloni  bakteri  yang  tumbuh pada  media  Skim  Milk  Agar  (SMA) menunjukan  bahwa  substrat  protein yang  terdapat  pada  media  susu  skim telah dipecah menjadi peptide sederhana dan asam amino oleh enzim protease. Bakteri menghasilkan protease  ditunjukan  pada  (Gambar  1). Besarnya aktivitas protease yang dihasilkan bakteri simbion alga
Gracillaria sp. di tentukan oleh besarnya indeks  proteolitik  (IP)  indeks  proteolitik yang  diperoleh  dengan  cara  membagi diameter zona bening dengan diameter koloni.
Dari  keempat  isolat  yang  diuji, hanya satu isolat menunjukkan kemampuan  menghasilkan aktivitas protease  yakni  isolat  S.G.,  1  ditandai dengan indeks proteolitik 1, 5 (Tabel 2).
Gambar 3: Penampakan   isolat     bakteri menunjukan adanya zona bening pada media yang mengandung Skim Milk Agar setelah di inkubasi selama 24 jam.
Tabel 2 . Indeks Proteolitik Isolat Bakteri Simbion Alga Gracillaria sp. Kode Isolat Bakteri Diameter Zona Bening Diameter Koloni IP S.G., 1 3 cm 2 cm 1,5 S.G., 2 - - - S.G., 3 - - - S.G., 4 - - -
Berdasarkan Tabel di atas terlihat bahwa  isolat  bakteri  S.G.,  1  memiliki aktivitas  pemecahan  substrat  protein dengan  indeks  IP  sebesar  1,  5  pada dasarnya  semua  bakteri  mempunyai enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua bakteri mempunyai enzim protease  ekstraseluler.  Sebagaimana yang  dimiliki  oleh  bakteri  alga  S.G.,  1 mampu  memecah  protein  kasein  yang terdapat pada media susu skim menjadi peptide-peptida  yang  lebih  sederhana oleh  karena  itu  enzim  protease  disebut juga  peptidase  (Enggel  dan  Natalia, 2004).

## KESIMPULAN
Empat  Isolat  bakteri  berhasil diidolasi  dari  Alga Gracillaria sp. Keempat isolat bakteri tersebut memiliki karakteristik  morfologi  yang  berbeda. Dari keempat isolat tersebut, isolat S.G. 1  memiliki  aktivitas  protease  yang ditandai dengan adanya zona bening di sekitar  koloni  bakteri  yang  tumbuh dengan indeks proteolitik sebesar 1,5.

## DAFTAR PUSTAKA
Chen,  K.Z.  dan  Duan,  Y.,  2000. Competitiveness of Canadian agri- food exports againts competitors in
asia : 1980-97: journal of international Food and Agribussines Marketing, 11(4).19 Dewi, P.2008. Pemisahan Minyak Atsiri Daun Kemangi (olimum basilirum) Secara  KLT  dan  Aktifitasnya Terhadap  Malasezia  Fusfur  in Vitro, Skripsi, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro. Enggel,  J.,  Meriandini,  A.  &  Natalia,  L. 2004. Karakterisasi protease ekstraseluler Clostridium bifermentans R14-1-b. Jurnal Mikrobiologi Indonesia .9 (1): 9 -12.
Ginting, E. L., Rangian, L., Wantania, L.
L., & Wullur, S. (2019). Isolation of Symbiotic Bacteria with Red Algae from  Tongkaina  Waters,  North Sulawesi. JURNAL ILMIAH PLATAX , 7 (2), 394-400. DOI: https://doi.org/10.35800/jip.7.2. 2019.23728
Kawung,  N  J.,  Mangindaan,  R.E.P.,
Rompas,  R.M.,  Chasanah,  M., Kapoyos,  M.,  Abdjul,  B.,  Januar, H.I., Fajarningsih, D, and Sumagando,  A.  2017.Cytotoxic Anticancer  from  New  Compound Unsrat-sinularine of Softcoral Sinularia Sp. from Bunaken Island,
Manado, Indonesia. International
Journal of Drug Development and
Research . 9 (3):01-04.
Leboffe,  M.  J  dan  B.  E. Pierce. (2012). Brief  Microbiology.    Laboratory Theory  &  Application  2 nd Edition.
Englewood:  Morton Publishing.
Moon,  S.H.  and  S.J.  Parulekar.,  1993,
Some  Observation  on  Protease Producing in Continuous Suspention  Cultures  of  Bacillus firmus, Biotech, Bioeng, 41:43-54. Suryadi, Y., T. P. Priyatno, M. Samudra, D. N. Susilowati, N. Lawati dan E. Kustaman.  2013.  J.  Agro  Biogen. 9(2):77-84.
Wantania, L.L., Ginting, E.L., Wullur, S.
2016.    Isolasi  Bakteri  simbion denagn Spons dari Perairan Tongkeina, Sulawesi Utara. Jurnal LPPM Bidang Sains dan Teknologi 3(1): 57-65. 145-152.