## UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI KULIT BUAH JERUK
KALAMANSI ( Citrus microcarpa Bunge.) TERHADAP BAKTERI
Staphylococcus aureus Dan Escherichia coli .
Giovani Debora Kindangen 1) Widya Astuty Lolo 1) , Paulina V. Y. Yamlean 1)
1) Program Studi Farmasi FMIPA Unsrat Manado, 95115

## ABSTRACT
Kalamansi orange  (Citrus  microcarpa  Bunge.)  was  used  as  a  food  ingredient  by  the  community but  its  efficacy  as  an  antibacterial  is  unknown.  Based  on  the  literature,  the  main  content  of  citrus  fruit skin  is  essential  oil.  Essential  oils  can  inhibit  or  kill  bacterial  growth.  The  aim  of  this  study  was  to determine  the  antibacterial  activity  of  essential  oils  of  citrus  peel  against  the  bacteria  Staphylococcus aureus  and  Escherichia  coli.  Antibacterial  activity  testing  used  the  diffusion  agar  method  by  means  of wells, with extract concentrations of 5%, 25%, 50%, and 100%. The results showed that essential oils of citrus  fruit  peel  had  a  diameter  of  up  to  11.16  mm  against  Staphylococcus  aureus  and  13.33  against Escherichia coli.
Keywords : Kalamansi Orange, Antibacterial, Essential Oils, Staphylococcus aureus, Escherichia coli

## ABSTRAK
Jeruk kalamansi ( Citrus microcarpa Bunge.) digunakan sebagai bahan makanan oleh masyarakat tetapi belum diketahui khasiatnya sebagai antibakteri. Berdasarkan literatur, kandungan utama kulit buah jeruk  kalamansi  ialah  minyak  atsiri.  Kandungan  minyak  atsiri  dapat  menghambat  atau  membunuh pertumbuhan  bakteri.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas  antibakteri  minyak  atsiri  kulit buah  jeruk  kalamansi  terhadap  bakteri Staphylococcus  aureus dan Escherichia  coli .  Pengujian  aktivitas antibakteri  digunakan  metode  difusi  agar  dengan  cara  sumuran,  dengan  konsentrasi  ekstrak  5%,  25%, 50%, dan 100%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa minyak atsiri kulit buah jeruk kalamansi memiliki diameter hingga rata-rata 11,16 mm pada bakteri Staphylococcus aureus dan 13,33 pada Escherichia coli .
Kata Kunci : Jeruk Kalamansi, Antibakteri, Minyak Atsiri, Staphylococcus aureus , Escherichia coli

## PENDAHULUAN
Pemanfatan  kekayaan  alam  di  Indonesia khususnya
tumbuh-tumbuhan telah dilakukan  dalam  bentuk  pembuatan  bumbu masak, bahan kerajinan dan obat tradisional. Sebagian  besar  tanaman  berpotensi  sebagai obat,  namun  beberapa  diantaranya  belum diketahui  dengan  pasti  karena  belum terbukti secara klinis. Pengembangan tanaman obat telah banyak dilakukan karena mudah  diperoleh  dan  mempunyai  harga lebih  ekonomis  serta  efek  samping  yang relatif  lebih  kecil  bahkan  dibandingkan dengan  obat  sintetik.  Jeruk  kalamansi ( Citrus  microcarpa Bunge.)  digunakan sebagai  bahan  makanan  oleh  masyarakat tetapi  belum  diketahui  khasiatnya  sebagai antibakteri. Berdasarkan literatur, kandungan utama kulit buah jeruk kalamansi ialah  minyak  atsiri.  Kandungan  utama  kulit buah  jeruk  ialah  pektin  dan  minyak  atsiri. Kandungan  pektin  dalam  kulit  buah  jeruk berkisar  15  –  25%  dari  berat  kering. Kandungan  minyak  atsiri  dalam  kulit  buah jeruk  sekitar  70  –  92%  (Prabasari,  2009). Bagian  kulit  buah  jeruk  mengandung minyak  atsiri  yang  terdiri  dari  berbagai komponen  seperti  terpen,  sesquiterpen, aldehida, ester dan sterol (Copriady, 2005).
Minyak  atsiri  beberapa  tanaman  telah diketahui  memiliki  aktivitas  antibakteri (Inouye et  al .,  2001;  Pouvova et  al ,  2008). Aktivitas antibakteri minyak atsiri disebabkan karena minyak atsiri
mengandung senyawa yang dapat menghambat  atau  membunuh  pertumbuhan bakteri.  Komponen  minyak  atsiri  yang mengandung  gugus  fenol  seperti  carvacrol berpotensi sebagai antibakteri (Yuksel et  al , 2006).

## METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia  dan  Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Program Studi Farmasi Universitas Sam Ratulangi Manado pada bulan Juni – Desember 2016. Alat yang digunakan dalam penelitian ialah seperangkat alat Destilasi Uap Air,
Erlenmeyer ( Approx ),  gelas  ukur  ( Pyrex ),
gelas  kimia  ( Approx ),  tabung  reaksi,  rak tabung reaksi, pipet tetes, penangas air, kaca arloji,  timbangan  analitik  ( Kern ),  batang pengaduk, stirer ,  cawan  petri  ( Normax ), jarum  ose,  pinset,  inkubator, laminair  air flow  (Biotek) ,  pencadang, autoklaf (ALP), mikropipet  ( Ecopipette ),spritus    dan  mistar berskala.  Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ialah  Kulit  buah  jeruk  kalamansi ( Citrus  microcarpa .  Bunge ), bakteri  uji ( Staphylococcus  aureus ATCC  2592  dan Escherichia  coli ATCC  25922)  yang diperoleh  dari  Laboratorium  Mikrobiologi Balai  Besar POM Manado, Carboxy Methyl Cellulose (CMC),  aquades  steril,  tablet Ciprofloxacin  500  mg, Nutrient  Agar (NA), H 2 SO 4 1%, BaCl 2 .2H 2 O 1,175%, NaCl 0,9%, kertas  label  dan aluminium  foil .  Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratorium, dimana dibuat 6 perlakuan dan setiap perlakuan terdiri atas 3 ulangan.  Perlakuan  dalam  penelitian  ini adalah  pemberian  konsentrasi  minyak  atsiri 5%,  25%,  50%  dan  100%,  kontrol  positif (Ciprofloxacin)  dan  kontrol  negatif  (CMC). Metode yang digunakan  ialah  metode difusi agar, dengan cara sumuran.

## Pengambilan dan Penyiapan Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini yaitu  Kulit  Buah  Jeruk  Kalamansi  ( Citrus microcarpa Bunge.) yang diambil dari Pasar
Karombasan Kecamatan Wanea Kota Manado.  Sampel  sebanyak  1  kg  buah  jeruk kalamansi  dibersikan  dan  dicuci  terlebih dahulu  menggunakan  air  sampai  bersih. Jeruk kalamasi segar dikupas diambil bagian kulit  kemudian  dipotong  kecil-kecil  untuk proses isolasi minyak atsiri. Kulit buah jeruk kalamasi  yang  telah  dipotong  kecil-kecil kemudian  dimasukkan  kedalam  wadah destilasi,

## Isolasi Minyak Atsiri
Kulit  buah  jeruk  kalamansi  yang  telah dipotong-potong  dimasukkan  ke  dalam wadah  alat  destilasi  uap  air.  Ditambahkan aquades  steril  ke  dalam  wadah  destilasi sampai sampel terendam. Destilasi dihentikan  jika  volume  minyak  atsiri  pada wadah  penampung  tidak  bertambah  selama 30-45  menit,  warna  minyak  atsiri  yang diperoleh  berupa  bening  jernih  berbau  dan khas kulit jeruk kalamansi.

## Sterilisasi Alat
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian aktivitas antibakteri ini disterilkan terlebih  dahulu.  Alat-alat  gelas  dan  media disterilkan  dalam  autoklaf  pada  suhu  121 o C selama  15-20  menit  sedangkan  untuk  jarum ose  dan  pinset  disterilisasikan  dengan  cara dibakar  diatas  api  langsung  menggunakan spritus (Lay dan Hastowo, 1992).

## Pembuatan Larutan Kontrol Negatif
Kontrol  negatif  dibuat  dari  CMC  ( Carboxy Methyl  Cellulose) 1%  dengan  cara  : ditimbang  1  gram  serbuk  CMC  kemudian dilarutkan  dalam  aquades  steril  panas  100 ml.  Selanjutnya  masukkan  dalam  labu  takar 100  ml  dan  dikocok  sampai  larutan homogen.
Pembuatan Larutan Kontrol Positif
Larutan  kontrol  positif  dibuat  dari  sediaan obat  tablet  Ciprofloxacin  500  mg.    Satu tablet  Ciprofloxacin  digerus  lalu  ditimbang 0,05  g,  kemudian  dilarutkan  dalam  50  ml CMC. Diambil 1 ml dari larutan tersebut dan ditambahkan aquades sampai 10 ml sehingga  diperoleh  larutan  Ciprofloxacin dengan  konsentrasi  5μg/50μl.  Konsentrasi ini digunakan sebagai kontrol positif.

## Pembuatan Larutan Uji
a. Perlakuan 1 : Dibuatan larutan uji 5% v/v dengan cara 0,5 ml minyak atsiri kulit buah jeruk kalamansi dilarutkan dalam 9,5 ml CMC dan dicukupkan volumenya hingga tanda batas.
b. Perlakuan 2 : Dibuatan larutan uji 25% v/v dengan cara 2,5 ml minyak atsiri kulit buah jeruk kalamansi dilarutkan dalam 7,5 ml CMC dan dicukupkan volumenya hingga tanda batas.
c. Perlakuan 3 : Dibuatan larutan uji 50% v/v dengan cara 5 ml minyak atsiri kulit buah jeruk kalamansi dilarutkan dalam 5 ml CMC dan dicukupkan volumenya hingga tanda batas.
d. Perlakuan 4 : Dibuatan larutan uji 100% v/v dengan cara 10 ml minyak atsiri kulit buah jeruk kalamansi.

## Pembuatan Media
a. Agar Miring
Nutrient  Agar (NA)  sebanyak  0,4
gram  dilarutkan  dalam  20  ml  aquades (20 g/1000 ml) menggunakan erlenmeyer.  Dihomogenkan  dengan stirer diatas  penangas  air  sampai mendidih.  Sebanyak  5  ml  dituangkan
masing-masing  pada  2  tabung  reaksi steril  dan  ditutup  dengan aluminium
foil .  Media  tersebut  disterilkan  dalam autoklaf  pada  suhu  121 o C  selama  15 menit,  kemudian  dibiarkan  pada  suhu ruangan  selama  ±  30  menit  sampai media  memadat  pada  kemiringan  30 o .
Media  Agar  miring  digunakan  untuk inokulasi bakteri (Lay, 1994).
b. Media Dasar
Nutrient  Agar (NA)  sebanyak  4  gram
dilarutkan  dalam  200  ml  aquades (20g/1000 ml) menggunakan erlenmeyer.  Dihomogenkan  dengan stirer diatas  penangas  air  sampai
mendidih. Media yang sudah dihomogenkan  ini  disterilkan  dalam autoklaf  pada  suhu  121ºC  selama  15
menit,  kemudian  didinginkan  sampai suhu ± 45-50ºC. Media dasar digunakan  dalam  pembuatan  media pengujian  sebagai  lapisan  dasar  (Lay, 1994).
c. Media Pembenihan Nutrient  Agar (NA)  sebanyak  5  gram dilarutkan  dalam  250  ml  aquades
(20g/1000 ml) menggunakan erlenmeyer.  Dihomogenkan  dengan
stirer diatas  penangas  air  sampai mendidih. Media yang sudah homogen ini  disterilkan  dalam  autoklaf  pada suhu 121ºC selama 15 menit,
kemudian  didinginkan  sampai  suhu  ± 45-50ºC. Media pembenihan digunakan  dalam  pembuatan  media pengujian sebagai  lapisan kedua (Lay, 1994).

## Uji Mikrobiologi
a. Inokulasi  Bakteri  pada  Media  Agar
Miring
Bakteri  uji  diambil  dengan  jarum ose  steril,  lalu  ditanamkan  pada  media  agar miring  dengan  cara  menggores.  Selanjutnya diinkubasi  dalam  inkubator  pada  suhu  37ºC selama  24  jam.  Perlakuan  yang  sama dilakukan pada setiap jenis bakteri uji.
b. Pembuatan  Standar  Kekeruhan  Larutan (Larutan Mc. Farland)
Larutan  H 2 SO 4 1%  sebanyak  9,95 ml dicampurkan dengan larutan BaCl 2 .2H 2 O 1,175%  sebanyak  0,5  ml  dalam  erlenmeyer. Kemudian dikocok sampai terbentuk larutan yang  keruh.  Kekeruhan  ini  dipakai  sebagai standar  kekeruhan  suspensi  bakteri  uji (Bresson dan Borges, 2004).
c. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Bakteri  uji  yang  telah  diinokulasi diambil  dengan  kawat  ose  steril  lalu disuspensikan kedalam tabung  yang berisi 2 ml  larutan  NaCl  0,9%  hingga  di  peroleh kekeruhan  yang  sama  dengan  standar kekeruhan  larutan Mc.  Farland .  Perlakuan yang  sama  dilakukan  pada  setiap  jenis bakteri uji.
d. Pembuatan Media Pengujian
Media  uji  dibuat  menggunakan metode  difusi  agar  dengan  cara  tuangkan NA    10  mL  kedalam  6  cawan  petri  untuk lapisan  dasar  setelah  lapisan  pertama memadat  pada  permukaan  lapisan  dasar diletakkan  6  pencadang  (sumuran)  yang diatur sedemikian rupa jaraknya agar daerah pengamat tidak saling bertumbuh, kemudian suspensi    bakteri  dicampurkan  ke  dalam media  pembenihan  NA,  setelah  itu  di
tuangkan 25 mL NA pada setiap cawan petri untuk lapisan kedua. Selanjutnya pencadang (sumuran)  diangkat  secara  aseptik  dari cawan  petri,  sehingga  terbentuklah  sumur  – sumur yang akan digunakan dalam pengujian antibakteri.
e. Pengamatan dan Pengukuran
Pengamatan dilakukan setelah 1x24
jam masa inkubasi. Daerah bening merupakan petunjuk kepekaan bakteri
terhadap  antibiotik  atau  bahan  antibakteri
lainnya  yang  digunakan  sebagai  bahan  uji yang dinyatakan dengan lebar diameter zona hambat  (Vandepitte et  al. ,  2005).  Diameter zona hambat diukur dalam  satuan  milimeter (mm)  menggunakan  mistar  berskala  dengan cara diameter keseluruhan dikurangi diameter sumuran 7 mm. Kemudian diameter zona hambat tersebut dikategorikan kekuatan  daya  antibakterinya  berdasarkan penggolongan Davis and Stout (1971).

## HASIL
Tabel 1 . Diameter Zona Hambat Minyak Atsiri Kulit Buah Jeruk Kalamansi ( Citrus microcarpa Bunge.) terhadap bakteri Staphylococcus aureus
Tabel 2 . Diameter Zona Hambat Minyak Atsiri Kulit Buah Jeruk Kalamansi( Citrus microcarpa Bunge.) terhadap bakteri Escherichia coli ( Citrus microcarpa Bunge.) terhadap bakteri Escherichia coli
Perlakuan
Diameter Zona Hambat (mm)
Rata-rata Kategori Kekuatan Daya Antibakteri P1 P2 P3 5% 5 5,5 5 5,16 Sedang 25% 6 6 6,5 6,16 Sedang 50% 7,5 8 8 7,38 Sedang 100% 11 10,5 12 11,16 Kuat Kontrol (+) 13 15 16,5 14,83 Kuat Kontrol (-) 0,00 0,00 0,00 0,00 Lemah Perlakuan Diameter Zona Hambat (mm) Rata-rata Kategori Kekuatan Daya Antibakteri P1 P2 P3 5% 6,5 7 7 6,83 Sedang 25% 8,5 9 8,5 8,66 Sedang 50% 9,5 11 10,5 10,33 Sedang 100% 13 13,5 13,5 13,33 Kuat Kontrol (+) 19 20,5 19,5 19,66 Kuat Kontrol (-) 0,00 0,00 0,00 0,00 Lemah

## PEMBAHASAN
Uji aktivitas antibakteri ini bertujuan  untuk  mengetahui  kemampuan minyak atsiri dari kulit buah jeruk kalamansi pada  dua  bakteri  uji  yaitu  bakteri  Gram positif Staphylococcus  aureus dan  bakteri Gram negatif Escherichia coli yang merupakan  bakteri  bersifat  patogen  pada manusia.  Konsentrasi  minyak  atsiri  kulit buah  jeruk  kalamansi  yang  digunakan  pada pengujian ini dilakukan pada kosentrasi 5%, 25%,  50%  dan  100%  untuk  melihat  adanya zona  bening  sebagai  aktivitas  antibakteri. Komponen minyak atsiri memiliki kandungan senyawa kimia diantaranya yaitu phenyl  ethyl  alcohol,  geraniol,  eugenol  dan beberapa  senyawa  lainnya  yang  terkandung dalam kulit buah jeruk kalamansi berpotensi memiliki  aktivitas  antibakteri.  Aktivitas antibakteri  terlihat  dari  terbentuknya  zona bening  disekitar  sumuran  pada  media  NA yang telah terdapat bakteri uji dan diperoleh hasil  bahwa  aktivitas  antibakteri  kulit  buah jeruk  kalamansi  berbeda-beda  pada  setiap seri konsentrasi.
Kategori  kekuatan  daya  antibakteri Davis  and  Stout  (1971),  kulit  buah  jeruk kalamansi  terhadap  pertumbuhan  memiliki daya  antibakteri  sedang  sampai  kuat  pada kedua bakteri uji. Konsentrasi 5%, 25% dan 50%, mempunyai daya antibakteri tergolong sedang,  kosentrasi  100%  tergolong  kuat pada bakteri Staphylococcus aureus .
Konsentrasi  5%  dan  25%  mempunyai  daya antibakteri  tergolong  sedang,  konsentrasi 50%  dan  100%  tergolong  kuat  pada  bakteri Escherichia  coli. Aktivitas  antibakteri  dari minyak atsiri tergantung pada komposisi dan konsentrasi  minyak  atsiri  juga  tipe  dan
konsentrasi  dari  mikroorganisme  target (Kan, 2006).
Semakin besar konsentrasi zat yang terdapat  pada  cakram  akan  memperbesar kemampuan  difusi  zat  tersebut  pada  media sehingga mempermudah penetrasi zat dalam menghambat  pertumbuhan  bakteri,  menurut Plezar  and  Chan  (1986).  Namun  perbedaan aktivitas antibakteri minyak atsiri kulit buah jeruk  kalamansi  pada  bakteri  Gram  positif lebih  kecil  dibandingkan  dengan  bakteri gram  negatif.  Hal  ini  terjadi  karena perbedaan permeabilitas struktur dinding sel pada bakteri Gram positif dan  bakteri Gram negatif yang menyebabkan perbedaan aktivitas antibakteri.

## KESIMPULAN
Berdasarkan penelitian
yang dilakukan, maka dapat disimpulkan :
1. Minyak  atsiri  dari  kulit  buah  jeruk kalamansi    ( Citrus  microcarpa Bunge.)  memiliki  aktivitas  sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
2. Semakin  tinggi  konsentrasi  minyak atsiri dari kulit buah jeruk kalamansi,  semakin  besar  aktivitas antibakteri yang dihasilkan.

## SARAN
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut untuk mengetahui kandungan senyawa  spesifik,  yang  memiliki  aktivitas antibakteri pada kulit buah Jeruk Kalamansi ( Citrus microcarpa Bunge.)

## DAFTAR PUSTAKA
Bresson,  W.,  dan  M.T  Borges.  2004. Delivery  Methods  for  Introducing Endophitic  Bacteria  into  Maize. Biocontrol 49 : 351-322 Copriady,  J.,  E.Yasmi  dan  Hidayati,  2005.
Isolasi  dan  Karakterisasi  Senyawa
Kumarin  dari  Kulit  Buah  Jeruk
Purut  (Citrus  hystrix  DC.). Jurnal Biogenesis . 2(1) : 13-15.
Davis,  W.W  and  T.R.  Stout.  1971.  Disc
Plate  Mathods  of  Micobiological Antibiotic  Assay. Microbiology .
22(4) : 659-665
Inouye,  S.,  Takizawa,  T.,  dan  Yamaguchi,
H.,  2001.  Antibacterial  activity  of essential  oil and  their  major
constituents  against  respiratory  by gaseous contact. Journal of Antimicrobial Chemoterapy, 47:565-573.
Kan  Yuksel.,  Uçan,  Uçkun  Sait.,  Kartal,
Murat.,  Altun,  M.L.,  Aslan,  S., Sayar,  E.,  Ceyhan,  T.  2006.  GC- MS  Analysis  and  Antibacterial Activity  of  Cultivated  Satureja cuneifolia Ten. Essential Oil.
Turkey Journal Chemitry 30, 253 – 259. Lay, B.W dan Hastowo, S. 1992. Mikrobiologi. IPB, Bogor. Lay,  B.W.  1994. Analisis  Mikroba  di Laboratorium . Edisi 1. Raja Grafindo Persada, Jakarta. Pauvova,  D.,  Kokoskova,  B.,  Pavela,  R., 2008.  Effectivity  of  Plant  Essential Oils Against Clavibacter michiganensis, in Vitro. Zemdirbyste-Agriculture,  vol.  95, No 3: 440–446. Pelczar, M. J., Chan. E. C. S, Pelczar, M. F., Penerjemah: Hadioetomo, R, S.Dkk. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi ,  Jilid  I.  Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. Prabasari. 2009. Pektin Jeruk. http://www2.umy.ac.id/2009/02/pec tin-perlu-di-kembangkan- indonesia.umy [Diakses  12    Juli 2017]
Yuksel,  Ucan  S.U.,  Kartal  M.,  Altun  L.M.,
Aslan  S,  Sayar  E,  dan  Ceyhan  T,
2006. GC-MS Analysis and
Antibacterial  Activity of Cultivated
Satureja  cuneifolia  Ten  Essential Oil. Turk J Chem, 30 : 253 – 259.