## Eksplorasi Bakteri Selulolitik yang Berpotensi Sebagai Agen Biofertilizer dari Tanah Perkebunan Apel Kota Batu, Jawa Timur
Restu Nugraha 1) , Tri Ardyati 2) , Suharjono 3)
1),2),3) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
1) restunugraha10@gmail.com , 2) tri_ardyati@yahoo.com dan 3) calitus@ub.ac.id

## ABSTRAK
Biofertilizer  adalah  pupuk  yang  berasal  dari  biomassa  berbagai  mikroorganisme  tanah,  berfungsi sebagai penyedia hara dalam tanah, sehingga mudah diserap oleh tanaman. Bakteri selulolitik telah banyak dimanfaatkan sebagai salah satu  agen  biofertilizer.  Penelitian ini bertujuan untuk  menguji aktivitas bakteri selulolitik  yang  berasal  dari  tanah  perkebunan  apel  di  Kota  Batu,  Jawa  Timur  yang  berpotensi  sebagai biofertilizer  didasarkan  pada  kemampuan  selulolitik,  fiksasi  nitrogen,  dan  pelarut  fosfat.  Sampel  tanah diambil dari tanah perkebunan apel yang terletak di Dusun Junggo, Desa Tulungrejo, Kecamatan Bumiaji, Kota  Batu.  Isolasi  dilakukan  dengan  metode  serial  dilution  kemudian  ditumbuhkan  pada  media  C-NFMM (Cellulose Nitrogen Free Mineral Media) agar. Uji aktivitas selulolitik isolat bakteri menggunakan pewarnaan Congo  red  0,1%  yang  ditandai  dengan  terbentuknya  zona  bening.  Uji  kuantitatif  aktivitas  selulolitik dilakukan dengan DNS (dinitrosaly-cylic acid). Uji kemampuan pemfiksasi nitrogen menggunakan media N- Free Semisolid Malate dilanjutkan dengan Visocolor Alpha Ammonium Detection Kit. Deteksi aktivitas pelarut fosfat menggunakan media Pikovskaya agar. Hasil isolasi didapatkan 13 isolat kemudian dilakukan screening hingga  didapatkan  3  isolat  bakteri  yang  potensial,  yaitu  isolat  SL4,  SL5,  dan  SL7.  Aktivitas  selulolitik tertinggi adalah isolat SL4 pada jam ke-24 yaitu sebesar 0,05 ± 0,002 U/ml, sedangkan isolat SL7 pada jam ke-72  sebesar  0,05  ±  0,001  U/ml.  Uji  potensi  sebagai  agen  biofertilizer  berdasarkan  kemampuan  selulolitik, pemfiksasi nitrogen, dan pelarut fosfat didapatkan 3 isolat potensial yaitu SL4, SL5, dan SL7.
Kata kunci : biofertilizer, fosfat, nitrogen, selulolitik, tanah

## ABSTRACT
Biofertilizer is one kind of fertilizer that is derived from biomass of various microorganisms soil that provide  nutrient  in  the  soil.  Cellulolytic  bacteria  has  been  widely  utilized  as  a  biofertilizer  agent.  The objective  of  this  study  was  used  cellulolytic  bacteria  from  soil  of  apple  plantations  in  Batu  City,  East  Java which potentially as biofertilizer based on cellulolytic activity, nitrogen fixation, and phosphate solubility. Soil samples taken from the apple plantation land in the Junggo, Tulungrejo Village, Bumiaji, Batu City. Isolation was performed with serial dilution method then grown on C-NFMM (Cellulose Nitrogen Free Mineral Media) agar. Cellulolytic activity of isolated bacteria was assayed using Congo red 0.1 % staining, then characterized by  the  formation  of  a  clear  zone.  Quantitative  assay  of  cellulolytic  activity  performed  by  DNS  (dinitrosaly- cylic  acid)  method.  Nitrogen  fixation  ability  was  assayed  using  Nitrogen-Free  Semisolid  Malate  media continued  by  Visocolor  Ammonium  Alpha  Detection  Kit.  Detection  phosphate  solubility  activity  was  done using Pikovskaya agar. The highest cellulolytic activity was isolate SL4 at 24 hours was 0.05 ± 0.002 U/ml and isolates  SL7  at  72  hours  0.05  ±  0.001  U/ml.  Three  isolates,  SL4,  SL5  and  SL7  possible  to  be  used  as biofertilizer agent based on cellulolytic activity, nitrogen-fixing, and phosphate solubility.
Keywords : biofertilizer, cellulolytic, nitrogen, phosphate, soil

## PENDAHULUAN
Bidang  pertanian  merupakan  salah  satu bidang yang menjadi tumpuan Indonesia sebagai negara  agraris.  Berbagai  usaha  telah  dilakukan pemerintah dan masyarakat untuk meningkatkan pertanian  di  Indonesia  baik  dari  segi  kuantitas
maupun kualitas produk. Salah satu upaya  yang dilakukan adalah pembuatan biofertilizer. Biofertilizer  adalah  pupuk  yang  berasal  dari biomassa  berbagai  mikroorganisme  tanah  yang berfungsi  sebagai  penyedia  hara  dalam  tanah, sehingga  mudah  diserap  oleh  tanaman  [1].
Untuk  dapat  menciptakan  biofertilizer  yang bersumber dari mikroorganisme, harus digunakan  kelompok  mikroorganisme  unggul yang  dapat  berperan  baik  bagi  tumbuhan. Sumber  yang  potensial  sebagai  penyedia biofertilizer  adalah  bakteri  selulolitik  atau bakteri pemecah selulosa yang mampu mengikat nitrogen  serta  melarutkan  fosfat.  Kombinasi kemampuan  bakteri  ini  dapat  membuat  unsur- unsur  hara  penting  bagi  tanaman  dapat  diserap lebih mudah.
Bakteri  selulolitik  mampu  menghidrolisis kompleks senyawa selulosa menjadi oligosakarida  yang  lebih  sederhana  misalnya glukosa  yang digunakan sebagai sumber karbon dan  nutrisi  bagi  pertumbuhannya  [2].  Bakteri selulolitik  juga  banyak  dimanfaatkan  sebagai biofertilizer karena kemampuannya dalam memecah  selulosa.  Bersamaan  dengan  semakin berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi,  bakteri  selulolitik  telah  banyak dimanfaatkan salah satunya sebagai  biofertilizer dalam  bidang  pertanian.  Penelitian  ini  akan menguji aktivitas bakteri selulolitik yang berasal dari  tanah  perkebunan  apel  di  Batu,  Malang, Jawa  Timur  yang  berpotensi  sebagai  agen biofertilizer  didasarkan  kemampuan  selulolitik, fiksasi nitrogen, dan pelarut fosfat.

## METODE PENELITIAN
Pengambilan  sampel  tanah.  Sampel tanah diambil dari tanah perkebunan apel Dusun Junggo,  Desa  Tulungrejo,  Kecamatan  Bumiaji, Kota  Batu,  Jawa  Timur.  Tanah  diambil  pada kedalaman  ±  0-10  cm  dari  permukaan  tanah pada beberapa titik yang berbeda dengan metode komposit,  dan  hanya  digunakan  tanah  dari pertanian  organik.  Pada  waktu  yang  sama, dilakukan  juga  pengukuran  faktor  fisik  dan kimia tanah seperti temperatur tanah, ketinggian, letak koordinat, kecerahan, dan pH tanah.

## Isolasi  bakteri.  Sampel  tanah  seberat  25
gram dimasukkan dalam larutan garam fisiologis 225  ml.  Setelah  itu  dilakukan  metode  dilusi hingga  didapatkan  seri  pengenceran  10 -7 . Selanjutnya,  media  Cellulose-Nitrogen  Free Mineral  Medium  (C-NFMM)  agar  dituang  ke dalam  masing-masing  cawan  petri  yang  berisi sampel  dari  masing-masing  seri  pengenceran.
Media tersebut kemudian diinkubasi dalam suhu 30  °C  selama  5  hari.  Setelah  isolat  tumbuh, dilakukan  inokulasi  koloni  tunggal  pada  dalam media  C-NFMM  baru  dengan  metode  quadrant streak  untuk  mendapatkan  isolat  murni.  Stok bakteri disimpan pada media Nutrient Agar pada suhu -4 °C.
Uji  kualitatif  aktivitas  selulolitik.  Isolat bakteri  yang  telah  disubkultur  pada  media  agar miring  diinokulasikan  ke  dalam  media  CMC (Carboxymethyl  Cellulose)  agar  dengan  metode totol  dan  diinkubasi  selama  4-5  hari  (±  96  jam) pada  30  °C.  Zona  bening  di  sekitar  koloni dideteksi dengan menggenangkan reagen Congo red  (0.1  %)  selama  15  menit,  kemudian  dibilas dengan larutan NaCl 1 M. Hasil (+) ditunjukkan dengan  adanya  zona  bening  akibat  adanya degradasi  selulosa  oleh  bakteri  selulolitik. Indeks  zona  bening  merupakan  rasio  antara diameter zona bening dengan diameter koloni.
Uji  kuantitatif  aktivitas  selulolitik.  Uji kuantitatif  dilakukan  dengan  metode  DNS (Dinitrosalicyclic  Acid).  Sebelumnya  dibuat kurva standar glukosa, sebagai dasar perhitungan  aktivitas  enzim.  Absorbansi  larutan diukur  menggunakan  spektrofotometer  pada λ
540  nm.  Perhitungan  aktivitas  didasarkan  pada rumus yang didapat dari kurva standar glukosa.
Uji kemampuan fiksasi nitrogen. Kultur bakteri  ditumbuhkan  dalam  media  N-Free Semisolid  Malate  dengan  metode  dilusi  hingga pengenceran  10 -3 .  Isolat  diinkubasi  pada  suhu ruang  selama 2-5 hari. Hasil positif ditunjukkan dengan  adanya  perubahan  warna  dari    pada media. Uji lanjut kemampuan bakteri pemfiksasi nitrogen, digunakan Visocolor Alpha Ammonium Detection  Kit.  Perubahan  warna  yang  terjadi pada  sampel  dapat  menjadi  acuan  adanya kandungan  unsur  nitrogen  dalam  bentuk Ammonium (NH 4 + ).
Uji  kemampuan  pelarut  fosfat.  Isolat murni  dalam  media  NA  ditumbuhkan  dalam media Pikovskaya agar dengan metode totol dan diinkubasi  pada  suhu  30  °C  selama  48  jam. Hasil  (+)  ditunjukkan  dengan  adanya  zona bening  yang  mengindikasikan  bahwa  isolat
bakteri  mampu  melarutkan  fosfat.  Indeks  zona bening kemudian diukur.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi  dan  Seleksi  Bakteri  Selulolitik.
Isolasi  bakteri  selulolitik  dari  sampel  tanah didapatkan  13  isolat  yaitu SL1,  SL2,  SL3,  SL4, SL5,  SL6,  SL7,  SL8,  SL9,  SL10,  SL11,  SL12, dan SL13. Ketigabelas isolat tersebut dibedakan berdasarkan morfologi koloninya. Isolat kemudian dilakukan screening
aktivitas selulolitik  secara  kualitatif  dengan  pewarnaan Congo  red  0,1  %  pada  media  CMC,  kemudian dibilas dengan larutan NaCl 1M.
Gambar  1.  Hasil  pewarnaan  dengan  Congo  red isolat  bakteri  selulolitik  (inkubasi  30 °C 96 jam)  a. SL4, b. SL5, c. SL13, d. SL 7, e. SL9, f. SL10
Selulosa  yang  terhidrolisis  pada  medium agar  jika  digenangi  oleh  Congo  red  akan menghasilkan zona bening karena adanya reaksi antara  Congo  red  dan  ikatan β -1,4-glikosidik yang  terkandung  dalam  polimer  selulosa. Selulosa  sendiri  terhidrolisis  karena  aktivitas enzim  selulolitik  yang  dihasilkan  oleh  bakteri [3].  Pembilasan  dengan  larutan  NaCl  1  M bertujuan  untuk  melunturkan  pewarna  Congo red  yang  terdapat  di  daerah  sekitar  koloni  yang sehingga zona bening lebih terlihat [4].
Isolat  bakteri  selulolitik  menghasilkan diameter zona bening yang berbeda antara isolat satu  dengan  lainnya.  Hal  ini  dapat  disebabkan oleh  beberapa  faktor,  salah  satunya  adalah karena  ukuran  koloni  yang  berbeda  antara  satu isolat  dengan  yang  lainnya.  Hal  ini  merupakan kelemahan  metode  totol  dimana  koloni  isolat bakteri yang dihasilkan tidak sama besarnya. Uji
dengan pengamatan diameter zona bening dapat juga  dilakukan  dengan  metode  lain  seperti menggunakan  sumuran  maupun  metode  dengan menggunakan kertas cakram [5].

## Gambar 2. Indeks selulolitik isolat dengan pewarnaan Congo red
Berdasarkan  hasil  perhitungan  indeks selulolitik  yang  dihasilkan  oleh  masing-masing isolat, didapatkan bahwa isolat SL4 mempunyai aktivitas  selulolitik  tertinggi,  diikuti  oleh  isolat SL7.  Semakin  besar  indeks  selulolitik  yang terbentuk, semakin tinggi pula aktivitas selulolitik yang dihasilkan [6]. Indeks selulolitik terbesar adalah isolat SL4 sebesar 2,36 dan SL7 sebesar 2,23.
Uji  kuantitatif  aktivitas  selulolitik.  Uji kuantitatif  dipilih  berdasarkan  isolat  yang mempunyai indeks selulolitik terbesar berdasarkan  uji  kualitatif,  yaitu  isolat  SL4  dan SL7. Aktivitas selulolitik dihitung dengan satuan Unit/ml. Hasil uji menunjukkan bahwa  aktivitas selulolitik  tertinggi  isolat  SL4  dengan  aktivitas terbesar  pada  jam  ke-24  sebesar  0,051  ±  0,002 U/ml,  sedangkan  isolat  SL7  sebesar  0,051  ± 0,001 U/ml  pada jam ke-72.
Gambar  3.  Aktivitas  selulolitik  isolat  SL4  dan  SL7 pada media CMC broth
Aktivitas selulolitik dalam satuan unit per milliliter  (U/ml)  didefinisikan  sebagai  aktivitas
b ab ab ab a a 0 2 4 SL4 SL5 SL13 SL7 SL9 SL10 In d e k s S e lu lo li ti k Isolat a c b c abc A A B C BC 0 0.02 0.04 0.06 0 24 48 72 96 a k ti v it a s e n zi m (U n it /m l) inkubasi (jam) SL4 SL7 a. d. e. f. b. c.
isolat  bakteri  yang  menghasilkan  glukosa, sebagai monomer selulosa, tiap menit [6].
Aktivitas selulolitik
kedua isolat, termasuk  dalam  kategori  kecil.  Hal  ini  dapat dibandingkan  dengan  penelitian  lain  tentang aktivitas selulolitik. Berdasarkan  penelitian oleh Garg & Neelakantan (1982) didapatkan aktivitas selulolitik  yang  cukup  tinggi  yaitu  1,1  dan  0,09 U/ml  pada  isolat  uji  Aspergillus  terreus  [7].
Aktivitas  selulolitik  pada  Cellvibrio  japonicas berdasarkan  penelitian  oleh  Jarallah  dan  Ali (2013) adalah sebesar 0.152 U/ml [8].

## Uji  kemampuan  fiksasi  nitrogen.  Isolat
SL4,  SL5,  SL7,  SL9,  SL10,  SL13  diuji kemampuan  fiksasi  nitrogennya.  Uji  dilakukan pada media N-Free Semisolid Malate. Berdasarkan  hasil  yang  didapat,  semua  isolat mempunyai kemampuan fiksasi nitrogen, ditunjukkan  dengan  perubahan  warna  dari  hijau menjadi kebiruan.

## Gambar 4. Uji kemampuan fiksasi nitrogen

## Perubahan warna yang terjadi pada media
N-Free  Semisolid  Malate  terjadi  karena  adanya indikator  berupa  Bromothymol  blue  yang berubah menjadi biru pada pH yang lebih tinggi, akibat aktivitas nitrogenase [9].
Uji  dilanjutkan  menggunakan  Visocolor
Alpha Ammonium Detection Kit untuk
mendapatkan  kisaran  kemampuan  isolat  bakteri fiksasi  nitrogen.  Uji  dilakukan  pada  3  isolat yang mempunyai aktivitas selulolitik yaitu isolat SL4,  SL5,  dan  SL7.  Berdasarkan  pengamatan, isolat SL5 mempunyai kandungan ion ammonium  (NH 4 + )  tertinggi  yaitu  sebesar  2 mg/L, isolat SL4 sebesar 1 mg/L, dan isolat SL7 sebesar  0,5  mg/L.  Unsur  nitrogen  di  udara  (N 2 ) tidak  dapat  langsung  diserap  oleh  tanaman, sehingga tanaman memanfaatkan ion ammonium  (NH 4 + )  dalam  proses  yang  disebut fiksasi  nitrogen.  Fiksasi  nitrogen  terjadi  karena aktivitas enzim nitrogenase mempunyai
keefektifan yang berbeda-beda antara satu isolat dengan isolat lainnya.
Uji  kemampuan  pelarut  fosfat.  Uji dilakukan  pada  6  isolat  yang  mempunyai kemampuan  selulolitik  yaitu  SL4,  SL5,  SL7, SL9, SL10, dan SL13.
Gambar  5.  Uji  kemampuan  pelarut  fosfat  dengan

## medium Pikovskaya agar
Hasil menunjukkan bahwa hanya terdapat tiga isolat yang menghasilkan zona bening pada media Pikovskaya agar setelah  inkubasi 48 jam, yaitu  isolat  SL4,  SL5,  dan  SL7.  Terbentuknya zona  bening  dapat  terjadi  karena  isolat  bakteri yang  tumbuh  pada  media  Pikovskaya  mampu melarutkan  fosfat,  yang  terdapat  dalam  media yaitu  Ca 3 (PO 4 ) 3 OH.  Kemampuan  bakteri  dalam melarutkan  fosfat  pada  media  Pikovskaya  agar dapat  dilihat  dengan  terbentuknya  zona  bening di  sekitar  koloni  bakteri,  akibat  aktivitas  enzim fosfatase [10].

## Gambar 6. Indeks zona bening isolat bakteri pelarut fosfat
Analisis indeks zona bening yang dihasilkan  oleh  ketiga  isolat  didapatkan  bahwa isolat  SL5  mempunyai  indeks  zona  bening terbesar  yaitu  sebesar  1,18  ±  0,04,  isolat  SL7 sebesar 1,08 ± 0,01, dan isolat SL4 sebesar 1,06 ± 0,01. Zona bening yang terbentuk menunjukkan besar kecilnya kemampuan bakteri
a b a 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 SL4 SL5 SL7 In d e k s zo n a b e n in g Isolat
dalam  melarutkan  unsur  fosfor  [11].  Bakteri pelarut fosfat mampu mengubah unsur fosfor (P) menjadi  H 2 PO 4 - ,  agar  dapat  diserap  oleh tanaman dalam bentuk fosfat terlarut.

## KESIMPULAN
Hasil isolasi bakteri selulolitik menunjukkan  bahwa  isolat  SL4  dan  SL7 mempunyai  kemampuan  selulolitik  terbesar didasarkan  pada  indeks  zona  bening  yang dihasilkan,  SL4  sebesar  2,36  dan  SL7  sebesar 2,23.  Aktivitas  selulolitik  tertinggi  pada  isolat SL4 berada pada jam ke-24 yaitu sebesar 0,05 ± 0,002 U/ml, sedangkan isolat SL7 pada  jam ke- 72  sebesar  0,05  ±  0,001  U/ml.  Uji  potensi sebagai agen biofertilizer, didapatkan isolat SL4, SL7,  dan SL5  yang  mempunyai potensi sebagai agen  biofertilizer  karena  ketiganya  mempunyai kemampuan  selulolitik,  fiksasi  nitrogen,  dan pelarut fosfat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  diucapkan  kepada Dr.  Suharjono,  dalam  proyek  penelitian  yang didanai  oleh  DPP/SPP,  sehingga  penelitian  ini dapat terselesaikan dengan baik.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Simanungkalit,
R.D.M., D.A.
Suriadikarta.,  R.  Saraswati.,  D.  Setyorini
& W. Hartatik. 2006. Pupuk Organik  dan Pupuk  hayati.  Balai  Besar  Penelitian  dan Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian. Bogor.
[2] Ibrahim,  A.S.S.,  &  El-diwany.  2007. Isolation  and  identification  of  new cellulases producing thermophilic bacteria from  an  Egyptian  hot  spring  and  some properties of the crude enzyme. J Appl Sci 1:473-478.
[3] Steensma,  D.P.  2001.  Congo  red  out  of Africa:  archives  of  pathology and laboratory medicine 125:250-252.
[4] Sumardi. 2004.  Isolasi, Karakterisasi,  dan Produksi  Î²-mananase  Ekstraseluler  dari Geobacillusstrearothermophilus.  Program
Pascasarjana,  Institut  Pertanian  Bogor. Bogor.
[5] Mulyadi, M., Wuryanti & P.S. Ria. 2013. Konsentrasi  Hambat  Minimum  (KHM) Kadar  Sampel  Alang-Alang  (Imperata cylindrica)  dalam  Etanol  melalui  Metode Difusi  Cakram.  Universitas  Diponegoro, Kimia. Semarang.
[6] Apun, K., B.C. Jong & M.A. Salleh. 2000. Screening  and  Isolation  of  A  Cellulolytic and  Amylolytic  Bacillus  from  Sago  Pith Waste.  J.  Gen.  Appl.  Microbiol.  46:  263- 267.
[7] Garg,  S.K.  &  Neelakantan.  1982.  Effect of  Nutritional  Factors  on  Cellulase Enzyme and Microbial Protein Production by Aspergillus terreus and Its Evaluation. Dairy  Microbiology  Division,  National Dairy Research Institute. India.
[8] Jarallah,  E.  M.  &  Ali.  2013.  Cellulolytic Activity  of  Cellvibrio  japonicus  and Complete  Cellulase  System.  Biology Department, College of Science, University of Babylon. Iraq.
[9] Harran, S. & N. Ansori. 1992. Bioteknologi  Pertanian.  Bogor.  Pusat Antar  Universitas  Bioteknologi.  Institut Pertanian Bogor. Bogor.
[10]   Purwaningsih,  S.  2003.  Isolasi,  Populasi, dan  Karakterisasi  Bakteri  Pelarut  Fosfat pada  Tanah  dari  Taman  Nasional  Bogani Nani Wartabone. Sulawesi Utara.
[11]   Rachmiati,  Y.  1995.  Bakteri  Pelarut Fosfat  dari  Rizozfer  Tanaman  dan Kemampuannya dalam Melarutkan
Fosfat.  Proseding  Kongres  Nasional  VI HITI. Jakarta.