Bacillus sp . SEBAGAI AGENSIA PENGURAI DALAM PEMELIHARAAN
Brachionus rotundiformis YANG MENGGUNAKAN IKAN MENTAH SEBAGAI

## SUMBER NUTRISI
( Bacillus sp . As a Decomposition Agent in The Maintenance of Brachionus rotundiformis Which Uses Raw Fish As a Source of Nutrition)
Hatopan G. Napitupulu ¹*, Inneke F. M. Rumengan¹*, Stenlly Wullur¹*, Elvy L. Ginting¹, Joice R. T. S. L. Rimper¹, Boyke H. Toloh²
¹ Program Studi Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas
Sam Ratulangi, Manado 95115 .
haganana45@gmail.com
* Author Correspondent: e-mail : innekerumengan@unsrat.ac.id ; stenlywullur@unsrat.ac.id
² Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan, Universitas Sam Ratulangi, Manado 95115 .

## ABSTRACT
The research was conducted at the Laboratory of Marine Molecular Biology and  Pharmacy,  Faculty  of  Fisheries  and  Marine  Sciences,  Sam  Ratulangi University. This research aims to isolate and analyze the morphology and molecular types of bacteria associated in rotifer’s culture media that use fisheries waste. The  research  was  begin  by  culturing  bacteria  in rotifer maintenance  media  using Nutrient  Broth  media.  After  bacterial  isolates  were  obtained,  morphological characterization  and  DNA  extraction  was  carried  out.  extraction  was  done  using DNeasy  Blood  and  Tissue  Kit  (Qiagen).  After  DNA  was  obtained,  DNA  was amplified through the Polymerase Reaction Chain (PCR) machine using a 16S RNA primer,  followed  by  the  separation  of  PCR  products  through  electrophoresis  and detection through UV Transluminator. The target PCR product was determined by comparing  the  100  bp  ladder  DNA,  with  a  yield  of  around  1400  bp,  which  was measured  using  ladder  DNA  available  in  the  laboratory.  The  DNA  that  was successfully amplified was sent to be sequenced to determine the species of each microbe obtained.
Based  on  the  results  of  the  research  conducted,  obtained Bacillus sp . bacteria associated with rotifer maintenance media.
Keywords: Bacteria, Culture Media, DNA Extraction, PCR, Sequencing

## ABSTRAK
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium  Biologi  Molekuler  dan  Farmasetika Laut, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Sam Ratulangi.  Penelitian ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  dan  menganalisis  morfologi  dan  molekuler  jenis- jenis  bakteri  yang  berasosiasi  dalam  media  pemeliharaan  rotifer  yang menggunakan limbah perikanan.
Penelitian  dilakukan  dengan  cara  mengkultur  bakteri  yang  ada  pada  media pemeliharaan  rotifer  menggunakan  media Nutrient  Broth .  Setelah  isolat  bakteri didapatkan,  dilakukan  karakterisasi  morfologi  dan  dilakukan  ekstraksi  DNA. ekstraksi dilakukan menggunakan DNeasy Blood and Tissue Kit ( Qiagen) .  Setelah DNA  didapatkan,  DNA  diamplifikasi  melalui  mesin Polymerase  Reaction  Chain (PCR)  menggunakan  primer  16S  RNA,  diikuti  dengan  pemisahan  produk  PCR melalui electrophorisis dan deteksi melalui UV Transluminator. Produk PCR target
ditentukan dengan membandingkan ladder DNA 100 bp, dengan hasil sekitar 1400 bp,  yang  diukur  menggunakan ladder  DNA yang  tersedia  di  laboratorium.    DNA yang berhasil diamplifikasi, dikirim untuk dilakukan sekuensing untuk mengetahui spesies  dari  setiap  mikroba  yang  didapatkan.   Berdasarkan  hasil  penelitian  yang dilakukan, diperoleh bakteri Bacillus sp . yang berasosiasi pada media pemeliharaan rotifer.
Kata Kunci: Bakteri,  Media Pemeliharaan, Ekstraksi DNA, PCR, Sekuensing

## PENDAHULUAN
Indonesia merupakan negara yang memiliki biodiversitas yang sangat tinggi  dengan  sumberdaya  hayati  dan non-hayati yang sangat beragam.
Kekayaan alam tersebut, sangat berlimpah  baik  di  darat  maupun  di perairan  laut.    Pada  wilayah  laut, kekayaan  alam  berupa  organisme- organisme laut sangat berpotensi untuk diteliti  dan  dimanfaatkan.    Salah  satu organisme  yang  sangat  berpotensi untuk diteliti adalah rotifer.
Berdasarkan  berbagai  laporan, dikatakan  bahwa  rotifer  mampu  hidup pada  kondisi  perairan  yang  kotor.    Hal tersebut  didukung  dengan  pernyataan dari  Redjeki  (1999)  yang  mengatakan bahwa  rotifer  akan  melimpah  pada kondisi  perairan  yang  mengandung banyak detritus dan nanoplankton.  Hal tersebut juga didukung dengan penelitian yang dilakukan oleh Sumarno dan Subari (2013) yang memanfaatkan rotifer sebagai salah satu mikroorganisme yang mampu mengurai bahan  organik  pada  tangki  pengurai. Dikatakan bahwa pada proses penjernihan air limbah secara bioteknologi,  rotifer  akan  timbul  ketika air  limbah  sudah  mengandung  banyak oksigen (Sugiharto, 1987 dalam Sumarno dan Subari, 2013). Selain berfungsi sebagai
bioremediator,  karakteristik  yang  unik juga  dimiliki  oleh  rotifer,  dimana  rotifer mampu  menghasilkan  telur  dorman. Telur  dorman  merupakan  telur  yang berada pada fase tidak aktif dikarenakan mengalami metabolisme basal. Sehingga, telur dorman tersebut mampu untuk bertahan tanpa adanya air dalam waktu  yang  lama  (Rumengan et  al.,
2017).  Selain  karakteristiknya,  rotifer juga  memiliki  peran  penting  sebagai konsumen primer dalam rantai makanan.    Sebagai  penyedia  nutrient bagi larva biota laut, rotifera mengandung  banyak  asam  amino, lemak  tak  jenuh  tingkat  tinggi,  mineral, vitamin, dan antibiotik tanpa menyebabkan  efek  samping  bagi  larva (Rumengan,  1997 dalam Fembri et  al., 2017). Selain itu, rotifer juga mengandung senyawa kitin dan kitosan. Dari  bimoassa  seberat  5 –  48  gram, rendemen  kitin  dapat  diekstrak  sekitar 4,6%  dan  kitosan    didapatkan  dengan melakukan  deasetilasi  kitin  sebesar 52,7%  (Rumengan et  al., 2014 dalam Rumengan 2017).
Karena  tingginya  potensi  yang dimiliki  oleh  rotifer  baik  dalam  segi sediaan  bahan  obat  maupun  dalam pemanfaatannya  di  bidang  budidaya laut, sejumlah penelitian telah dilakukan dalam  upaya  untuk  mengkultur  massal rotifer  dengan  cara  yang  sederhana. Dalam hal ini, rotifer yang diteliti adalah spesies B.  rotundiformis .    Penelitian terhadap B. rotundiformis telah dilakukan  sejak  tahun  1995  dan pengembangan  metode  kultur  rotifer tersebut  telah  dikembangkan  dengan cara  pemberian  ikan  mentah  pada media kultur rotifer tersebut (Rumengan et  al., 2017).    Adapun  dengan  adanya ikan mentah yang dimasukkan ke dalam media  kultur  rotifer,  pasti  akan  terjadi proses penguraian bangkai ikan tersebut  menjadi  bahan-bahan  organik yang dilakukan oleh bakteri.
Salah  satu  bakteri  yang  berperan dalam penguraian unsur organik adalah Bacillus sp.  Bakteri ini tergolong dalam bakteri  probiotik  yang  dapat  ditemukan pada  perairan  tawar  dan  laut  serta
terdapat  di  dalam  sistem  pencernaan hewan  (Hong et  al., 2005).  Beberapa laporan  mengatakan  bahwa  bakteri Bacillus sp. dapat dimanfaatkan sebagai sumber  nutrisi  dalam  pemeliharaan rotifer.    Menurut  Murillo  dan  Vilamil (2011), penambahan bakteri Bacillus ke dalam media pemeliharaan rotifer dapat meningkatkan  jumlah  rotifer.    Hal tersebut dapat dikaitkan dengan kemampuan Bacillus sp. untuk menghasilkan bakteriosin sehingga pertumbuhan bakteri patogen terhambat.  Selain itu, Bacillus sp. juga mengandung  enzim  dan  nutrisi  yang dapat meningkatkan pencernaan rotifer. Sejauh  ini,  kajian  tentang  jenis-jenis bakteri  yang  terlibat  dalam  proses penguraian  limbah  perikanan  tersebut sehingga menjadi sumber nutrisi rotifer, belum  banyak  diketahui.    Padahal, kajian dan data menyangkut keberadaan  mikroba  ini  menjadi  acuan penting dalam memahami proses pasokan  nutrisi  dalam  system  rantai makanan  dalam  pemeliharaan  rotifer sebagai  sumber  nutrisi  dalam  industri pembenihan ikan laut.

## METODE PENELITIAN

## Lokasi Penelitian
Penelitian  dilakukan  sejak  bulan Mei  2018  sampai  Oktober  2018.
Adapun penelitian
dilakukan di Laboratorium  Biologi  Molekuler  dan Farmasitika  Laut,  Fakultas  Perikanan dan  Ilmu  Kelautan,  Universitas  Sam Ratulangi,  Manado.    Sampel  rotifer
Brachionus
rotundiformis yang digunakan  diambil  dari Balai  Perikanan Budidaya  Laut  di  Ambon,  Maluku. Sampel  tersebut  memiliki  kepadatan awal 100 individu/ml.

## Pembuatan Media Kultur Rotifer
Media  pemeliharaan  rotifer  dalam penelitian  ini  dibuat  berdasarkan  pada metode yang sudah dikembangkan oleh Rumengan et al., (2017) dengan nomor paten P00201609066 dan Wullur et al.,
(2018) dengan nomor paten
P14201802692.    Media  merupakan  air laut  artificial  dengan  salinitas  25  ppt yang  diberikan  ikan  mentah  dengan komposisi 2 gr/ 10 liter.  Air laut tersebut dibuat dengan melarutkan garam sebanyak  875  gram  dalam  35  liter  air sumur.    Larutan  kemudian  diaduk menggunakan  pengaduk  hingga garam terlarut  secara  sempurna  di  dalam  air. Ukuran  pembuatan  air  garam  dengan salinitas 25 ppt menggunakan rumus:
𝑁1 𝑉1 = 𝑁2 𝑉2
Keterangan:
N1:  Jumlah  garam  dalam  salinitas  25 ppt N2:  Jumlah  garam  yang  diperlukan untuk  membuat  media  bersalinitas  25 ppt
V1: Volume air dalam salinitas 25 ppt V2:  Volume  air  yang  diperlukan  untuk membuat media bersalinitas 25 ppt Dari rumus tersebut, didapatkan persamaan sebagai berikut:
1. 25 𝑔𝑟
1 𝑙 = 𝑥 35 𝑙 2. 1𝑥 = 25 𝑔𝑟 𝑥 35 𝑙
3. 𝑥 = 875 𝑔𝑟
Setelah  air  garam  dilarutkan, diberikan ikan mentah sebagai penyediaan  sumber  nutrisi  bagi  rotifer. Metode  yang  diterapkan  menggunakan acuan  dari  metode  pembuatan  media rotifer sederhana yang sudah dipatenkan  oleh  Rumengan et  al., (2017) dengan nomor paten P00201609066 dan Wullur et al., (2018) dengan  nomor  paten  P14201802692. Pada  metode  yang  telah  dipatenkan tersebut,  perbandingan  ikan  mentah dengan  volume  media  pemeliharaan rotifer  sebesar  250 –  300  gram  ikan mentah : 1000 liter media pemeliharaan rotifer. Pertama-tama disiapkan ikan mentah dari jenis Euthynnus affinis satu ekor. Kemudian ikan digiling menggunakan  alat  penggiling.    Ikan yang sudah digiling kemudian ditimbang
sebanyak  2  gram  untuk  media  kultur rotifer.    Ikan  yang  sudah  ditimbang diletakkan ke dalam potongan kain kecil yang  berisi  batu  kecil  di  dalamnya kemudian  diikat  menggunakan  benang woll.    Penambahan  batu  berfungsi sebagai pemberat pakan agar tenggelam ke dasar media.

## Kultur Rotifer
Sebelum  dilakukan  pengkulturan rotifer menggunakan media yang diberikan ikan mentah, dilakukan penghitungan kepadatan rotifer kembali. Hal  ini  bertujuan  untuk  memeriksa apakah  rotifer  masih  bertahan  hidup pada  media  yang  sebelumnya  atau tidak. Dari hasil penghitungan kepadatan  rotifer,  diketahui  bahwa kepadatan  rotifer  masih  berjumlah  100 individu/ml.    hal  tersebut  menunjukkan bahwa rotifer masih bertahan hidup dan bisa dilakukan pengkulturan.
Pada  tahap  pengkulturan,  ikan
seberat  2  gr  yang  sudah  dibungkus dengan potongan kain berpori dimasukkan  ke  dalam  10  liter  media pemeliharaan  rotifer.    Setelah  pakan dimasukkan,  dituangkan  media  awal rotifer  sebanyak  7,5  liter  ke  dalam ember  berukuran  70  liter.   Rotifer  yang dikultur diberikan aerasi selama 24 jam. Kemudian,  dilakukan  sampling  media kultur  rotifer  sebanyak  1  ml  untuk diilakukan  isloasi  bakteri  pada  media tersebut.

## Pembuatan Media Kultur Bakteri
Setelah  rotifer  berhasil  dikultur pada media yang diberikan ikan mentah, tahap  selanjutnya  adalah  pengkulturan bakteri  yang  berasosiasi  pada  media kultur rotifer tersebut. Sebelum dilakukan  kultur  bakteri,  disiapkan terlebih  dahulu  media  bakteri  tersebut. Adapun  media kultur  bakteri  terdiri  dari dua jenis, yaitu media nutrient agar dan media nutrient broth .
Media Nutrient Agar (NA)
Media nutrient agar dibuat dengan tujuan  sebagai  media  kultur  isolat
bakteri.    Sebelum  membuat  media nutrient  agar ,  dilakukan sterilisasi petry disk di dalam autoclave selama ± 1 jam dengan suhu 121ºC.  Setelah itu, bahan media agar dibuat dengan mencampurkan  2  gram nutrient  broth (1%),  dan  4  gram  agar  (2%)  ke  dalam 200 ml air garam dan diaduk menggunakan magnetic steerer . Setelah bahan teraduk secara sempurna, erlenmeyer ditutup
menggunakan kapas dan alumunium foil dan disterilkan menggunakan autoclave dengan  suhu  121ºC  selama  ±  1  jam. Media  yang  sudah  steril  kemudian dituang  secara  aseptik  ke  dalam petry disk steril hingga permukaan petry disk tertutup dengan media agar. Selanjutnya,  media  agar  didiamkan hingga mengeras dan ditutup menggunakan Cling  Wrap agar  tidak terkontaminasi.    Media  agar  digunakan sebagai  media  tumbuh  dan  isolasi bakteri.
Media Cair Nutrient Broth (NB)
Media  cair  dibuat  dengan  tujuan sebagai  media  kultur  bakteri  sebelum bakteri  diisolasi  DNAnya.    Pertama, Nutrient Broth sebanyak 0,5 gram (1%) dilarutkan  di  dalam  50  ml  air  garam. Larutan kemudian dituangkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 9  ml  dan  ditutup  dengan  kapas  dan aluminum foil agar tidak terkontaminasi.
Media cair kemudian disterilkan menggunakan autoclave dengan  suhu 121ºC  selama  ±  1  jam.    Setelah  steril, media nutrient  broth didinginkan  pada Laminar Air Flow kemudian disimpan di dalam  kulkas. Nutrient  broth yang sudah  dibuat  akan  dipakai  pada  tahap sebelum isolasi DNA bakteri.

## Isolasi  Bakteri  Dari  Media  Kultur Rotifer
Setelah  media  agar  sudah  siap  di petry disk, selanjutnya dilakukan pengkulturan bakteri dari media pemeliharaan  rotifer.    Pengkulturan bakteri  dilakukan  pada  media nutrient agar .    Pengkulturan  dilakukan  dengan
tujuan  untuk  mendapatkan  isolat-isolat bakteri  yang  terdapat  pada  media pemeliharaan  rotifer.    Sebelum  sampel dikultur pada media agar, pertama-tama dilakukan pengenceran sampel pada air garam  steril.   Tujuan  dari  pengenceran tersebut  adalah  untuk  mendapatkan isolat bakteri murni yang terdapat pada media pemeliharaan rotifer.
Sebanyak 1 ml sampel diambil dari media kultur rotifer kemudian dicampurkan  ke  dalam  9  ml  air  garam steril  yang  ada  pada  tabung  reaksi kemudian  dilanjutkan  ke  tabung  kedua hingga tabung ketiga kemudian diberikan label pada setiap tabung untuk menunjukkan  pengenceran  pertama hingga  ketiga.    Selanjutnya,  campuran pada  tabung  reaksi  ketiga  dipindahkan sebanyak  100  µl  ke  dalam  media nutrient agar .  Semua tahapan dilakukan secara aseptik.  Sampel yang ada pada nutrient agar akan diinkubasi selama 24- 48  jam  pada  suhu  37ºC.    Bakteri  yang berhasil  dikultur  akan  diidentifikasi secara morfologi dengan melihat bentuk koloninya.      Isolat-isolat  bakteri  yang didapat  dikarakterisasi  morfologinya berdasarkan  acuan  Leboffe  (2012) kemudian diekstrak untuk mendapatkan DNA bakteri target.

## Karakterisasi Morfologi Bakteri
Setelah  isolat  -  isolat  bakteri didapatkan, tahap selanjutnya dilakukan karakterisasi  morfologi  bakteri  yang bertujuan  untuk  melihat  ciri-ciri  dari bakteri  secara  fisik.  Hasil  karakterisasi morfologi  bakteri  digambarkan  dalam bentuk tabel berdasarkan ukuran, warna, margin , elevation, dan  bentuk koloni.    Morfologi  bakteri  tersebut ditentukan  berdasarkan  bentuk  koloni bakteri dari Leboffe (2012).
Pada tahap pertama dalam karakterisasi  morfologi  bakteri, Petry disk yang berisi media padat dan isolat bakteri  di  dalamnya  diletakkan  di  atas kain  berwarna  hitam.    Kain  hitam tersebut  berfungsi  untuk  memperjelas penampakan  dari  isolat  bakteri  ketika difoto.    Setelah  diletakkan  di  atas  kain
hitam,  isolat  bakteri  yang  didapatkan diamati  dan  dibedakan  berdasarkan perbedaan  ukuran,  warna,  bentuk  tepi, pertumbuhan  koloni,  dan  bentuk  koloni secara keseluruhan menggunakan patokan karakteristik bakteri dari Leboffe (2012). Isolat-isolat  bakteri  yang  telah dikarakterisasi selanjutnya dikultur kembali  pada  media nutrient  broth dan diinkubasi  selama  24  jam.    Setelah  24 jam,  DNA  dari  isolat-isolat  tersebut diisolasi  agar  dapat  dianalisa  secara molekuler.

## Isolasi DNA Bakteri
Sebelum  DNA  bakteri  diisolasi, dilakukan  penyegaran  bakteri  pada media nutrient broth selama 24-48 jam.
Sampel bakteri yang berhasil bertumbuh pada  media nutrient  broth dipindahkan ke  dalam  4  tube eppendorf sebanyak 1,5  µl  setiap  tubenya.    Setelah  itu, semua tube disentrifuge dengan kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit.
Supernatan hasil sentrifuge dibuang dan pellet  yang  ada  di  4  tube  disatukan  ke dalam  tube eppendorf baru.    Setelah disatukan,  sampel  disentrifuge  kembali agar  supernatan  dan  pellet  terpisah lebih sempurna.  Setelah itu supernatan dibuang kembali.
Setelah preparasi, dilakukan isolasi  DNA  bakteri  menggunakan metode yang sudah dikembangkan oleh perusahaan Qiagen Inc.  Pertama-tama, Ditambahkan 180 µl buffer ATL dan 20 µl  proteinase  K  ke  dalam  sampel kemudian  divortex.    Kemudian,  sampel diinkubasi  selama  1  jam  dan  dilakukan vortex setiap 15 menit sekali.  Setelah 1 jam, sampel ditambahkan dengan 200 µl buffer AL, kemudian di vortex.  Setelah itu,  sampel  diinkubasi  selama  10  menit dengan  suhu  70ºC  lalu  ditambahkan 200 µl etanol 100%.
Sampel  kemudian  dipindahkan pada spin filter yang berada di atas 2 ml collection  tube .    Setelah  dipindahkan, dilakukan sentrifuge  dengan kecepatan 12.000  rpm  selama  3  menit.    Cairan akan  terpindah  ke collection  tube
kemudian  dibuang.    Setelah  cairan dibuang,  ditambahkan  500  µl buffer AW1  kemudian  disentrifuge  kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit  dan  cairan  yang  terpindah  ke collection tube dibuang kembali. Selanjutnya,  ditambahkan  kembali  500 µl buffer AW2  dan  disentrifuge  dengan kecepatan  14.000  rpm  selama  3 menityang dilanjutkan dengan membuang kembali cairan yang terkumpul di collection tube . Selanjutnya, spin filter dipindahkan ke atas collection tube baru
dan  ditambahkan  sebanyak  200  µl buffer AE, dilanjutkan dengan menginkubasi  selama  1  menit  pada suhu  ruangan.    Setelah  diinkubasi, dilakukan sentrifugasi dengan
kecepatan  8.000  rpm  selama  1  menit. DNA  template  yang  sudah  dikoleksi pada collection tube selanjutnya diamplifikasi menggunakan
PCR. Apabila  DNA  belum  diamplifikasi,  DNA template disimpan di kulkas. Amplifikasi DNA Bakteri Amplifikasi  DNA  bakteri dilakukan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR).    Amplifikasi  dilakukan dengan  tujuan  untuk  memperbanyak
DNA  dari  bakteri.    Sebelum  dilakukan amplifikasi,  dibuat  campuran  5  µl  5x
Hotfirepool, 17 µl ddH2O, 1 µl Primer 8F 10x,  1  µl  Primer  1492R  10x,  dan  1  µl sampel. Campuran tersebut dimasukkan  ke  dalam tube  eppendorf khusus  untuk  PCR  dengan  total campuran  25  µl.    Setelah  campuran dibuat, sampel dirunning di PCR dengan siklus: (1) 95ºC selama 6 menit; (2) 95ºC selama  30  detik;  (3)  52ºC  selama  30 detik; (4) 72ºC selama 30 detik; (5) 72ºC selama  10 menit.   Siklus  PCR tersebut dilakukan sebanyak 35 siklus.
Proses  amplifikasi  dilakukan  terhadap gen 16S  rRNA.    Gen  tersebut merupakan gen yang banyak digunakan dalam  identifikasi  filogeni,  keragaman antar spesies bakteri serta menunjukkan hubungan  evolusi  antar  organisme melalui pendekatan molekuler (Cai H et al., 2003 dalam Rinanda,  2011). Sebagian  besar  organisme  prokariotik memiliki 3 jenis rRNA, yaitu 5s, 16s dan 23s.    Akan  tetapi,  gen  16s  rRNA  yang paling  ideal  untuk  digunakan  dalam sekuens  karena  memiliki  sekitar  1550 pasang  basa.    Pada  500  pasang  basa paling  ujung  sekuens,  terdapat  daerah hypervariable region yang membedakan antar  organisme.    Dengan  demikian, organisme yang disekuens akan memiliki  suatu  ciri  khas  yang  berbeda dengan  organisme  lainnya  (Rinanda,
2011).
Tabel 1 . Urutan Basa Sekuens Primer 8F dan 1492R gen 16sRNA Nama Primer Sequence (5’ – 3’) 8F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Sumber: Eden et al., 1991 dan James 2018

## Elektroforesis Gel
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan DNA yang sudah diamplifikasi menggunakan PCR. Sebelum dilakukan running
elektroforesis gel, dilakukan pembuatan agarose  dengan  melarutkan  0,5  gram agarose dan 5 ml TBE ke dalam 45 ml ddH2O.    Kemudian  larutan  dipanaskan hingga  mendidih.    Setelah  mendidih, larutan didiamkan selama 10 menit dan ditambahkan  1  µl Green  I  Nucleic  Acid
Gel  Strain  10.000x  Concentrate  in DMSO .  Setelah itu, agarose dituang ke dalam cetakan dan dibiarkan membeku selama 30 menit. Setelah agar membeku, selanjutnya dituang TBE buffer
sebanyak  500  ml  ke  dalam  wadah elektroforesis.    Agarose  yang  sudah membeku  diletakkan  de  dalam  wadah tersebut hingga terendam secara menyeluruh.
Sampel  sebanyak  4  µl  diambil menggunakan micropipette
dan kemudian  dicampurkan  dengan  1  µl Loading  Dye .    Didapatkan  campuran sampel  sebanyak  5  µl  dan  kemudian dimasukkan  ke  dalam  sumur  yang  ada di  agarose  gel.    Setelah  sampel dimasukkan, Ladder sebanyak  2  µl dimasukkan  ke  dalam  sumur  agarose yang ada di paling pertama menggunakan micropipette . Setelah  sampel  dan Ladder dimasukkan, wadah elektroforesis ditutup  dan dirunning selama  30  menit dengan tegangan 80V.  Hasil amplifikasi DNA  bakteri  yang  didokumentasikan pada gel agarose diuraikan berdasarkan ada  atau  tidaknya  pita  DNA  ( band ) menggunakan UV Transluminator.

## Analisis Hasil Sekuens
Analisis  hasil  sekuens  dilakukan dengan  tujuan  untuk  mengidentifikasi spesies bakteri yang berhasil diamplifikasi DNAnya.  Analisis tersebut dilakukan dengan mengkonstruksi pasangan basa DNA yang sudah diubah ke dalam bentuk file software dan dapat digunakan pada aplikasi MEGA X.
Pertama,  file  DNA  dari  bakteri (forward dan reverse) dalam bentuk AB1 file  diinput  ke  dalam  aplikasi  MEGA  X. setelah  itu,  urutan  basa  DNA  beserta dengan  panjang  gelombangnya  akan muncul  di  tampilan  layar  monitor komputer.    Pada  urutan  basa  reverse, dilakukan reverse complement sequence agar  urutan  basa  DNA forward dan reverse menjadi  sama.
Setelah  itu,  dilakukan alignment pada urutan  basa  DNA forward dan reverse dengan  cara  mengklik  pilihan Add Unmasked  Sequence  To  Alignment Explorer kemudian  klik  pilihan muscle . Aplikasi  akan  mencocokkan  urutan- urutan  basa  DNA  hingga  cocok  satu sama lain.
Tahap selanjutnya adalah
memeriksa  dan  mencocokkan  basa yang  ada  pada  urutan forward dan reverse .    Apabila  terdapat  perbedaan basa,  basa  akan  ditentukan  dengan cara membandingkan tinggi gelombang
basa yang mengalami perbedaan tersebut. Setelah DNA selesai dikonstruksi,  data  disimpan  dalam bentuk  FASTA  file  dan  akan  diproses pada https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
untuk  diidentifikasi  keragaman  spesies bakterinya.
DNA  yang  sudah  disimpan  dalam bentuk FASTA, kemudian dibuka menggunakan  aplikasi notepad .    Pada notepad akan muncul hasil urutan DNA yang  sudah  dikonstruksi  sebelumnya.
Data  tersebut  dicopy,  kemudian  di BLAST pada website https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.    Data yang sudah terbaca akan menampilkan keragaman spesies bakteri yang memiliki  kecocokan  dengan  DNA  yang sudah  diolah.    Hasil sequencing DNA bakteri digambarkan dalam bentuk tabel berdasarkan  spesies  dan  urutan  basa DNA bakteri tersebut.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Karakteristik Morfologi Bakteri
Setelah  dilakukan  isolasi  bakteri dari  media  kultur  rotifer.    Dilakukan identifikasi  morfologinya  berdasarkan warna,  ukuran, elevation , margin ,  dan bentuk  koloninya  menggunakan  acuan pada Leboffe (2012).  Adapun hasil dari identifikasi  tersebut  didapatkan  bakteri Bacillus sp. yang dapat dilihat ciri-cirinya pada Tabel.2 dan Gambar.1 di bawah.
Berdasarkan  uraian  pada  Tabel.2 dapat  dilihat  bahwa  isolat  bakteri  F0-0- 3-1  yang  berukuran  sedang  dan  isolat bakteri F0-0-3-3 berukuran kecil.  Selain itu, bakteri Bacillus sp. pada bakteri F0- 0-3-1  memiliki  warna  putih  susu sedangkan  bakteri  F0-0-3-3  memiliki warna putih kekuningan.  Bentuk elevasi dari sampel F0-0-3-1 berbentuk umbonate , sedangkan sampel F0-0-3-3 berbentuk raised  margin .    Adapun bentuk margin dari  sampel  F0-0-3- 3berbentuk smooth , dan sampel bakteri F0-0-3-1  berbentuk erose .    Sedangkan bentuk  koloni secara keseluruhan ( whole colony ) dari semua isolat bakteri dapat dilihat berbentuk round .
Pada  umumnya,  bentuk  koloni bakteri  berbentuk round,  irregular, filamenthous, dan rhizoid .    Elevasi berbentuk raised, covex, flat, umbonate, plateau, spreading edge, raised margin, dan growth  into  medium. Sedangkan tepian  memiliki  bentuk smooth,  rhizoid, irregular,  lobate, dan filamenthous (Leboffe, 2012).
Menurut Fitri dan Yasmin (2011),
isolat bakteri yang berasal dari kawasan laut  rata-rata  memiliki  bentuk  koloni
bulat.    Kisaran  ukuran  koloni  berkisar dari  1  mm –  3,5  mm.    seluruh  isolat berwarna  putih  susu  dan  selnya berbentuk basil.  Lay (1994) dalam Fitri dan  Yasmin  (2011)  menambahkan, dengan  adanya  data  ciri-ciri  morfologi koloni  bakteri  dapat  dilakukan  proses identifikasi  jenis-jenis  mikroorganisme yang lebih lanjut baik dengan menggunakan uji biokimia atau menggunakan analisis molekuler.
Tabel 2. Morfologi Bakteri Berdasarkan Warna, Ukuran, Elevation , Margin , dan Bentuk Koloni Kode Bakteri Ukuran Warna Elevation Margin Whole Colony F0-0-3-1 Sedang Putih Susu Umbonate Erose Round F0-0-3-3 Kecil Putih Kekuningan Raised Margin Smooth Round
Gambar 1 . Penampakan Bakteri Bacillus sp. Pada Media Agar

## Hasil Sekuens DNA Bakteri
Setelah  karakteristik  dari  isolat bakteri F0-0-3-1 dan F0-0-3-3 didapatkan, isolat-isolat tersebut diidentifikasi  secara  molekuler.    DNA dari isolat-isolat bakteri tersebut diekstrak  menggunakan  Qiagen  DNA kit, kemudian diamplifikasi menggunakan PCR dan DNA dipisahkan menggunakan Elektroforesis.    DNA  yang  berhasil
terdeteksi pada gel elektroforesis selanjutnya  akan  disekuens  untuk melihat klasifikasi sampel bakteri target. Berdasarkan  hasil  BLAST  dari  sampel bakteri F0-0-3-1 dan F0-0-3-3 teridentifikasi bakteri dari genus
Bacillus. Pada  Tabel.3  dapat  dilihat beberapa  laporan  dari  genbank  yang menunjukkan  bahwa  sampel  F0-0-3-1 dan sampel F0-0-3-3 memiliki kemiripan dengan  beberapa  hasil  sekuens  yang ada di database genbank.
Tabel. 3 Data Kemiripan Hasil Sekuens Sampel F0-0-3-1 dan F0-0-3-3 Pada Database Genbank Kode Bakteri Accession Number Total Score Query Coverage (%) E. Value Identity (%) Spesies Bakteri F0-0-3-1 MG371991.1 1731 100 0,0 98 B. cereus F0-0-3-3 MG020095.1 1609 85 0,0 96 B. jeotgali

## Elektroforesis Gel
Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan DNA yang sudah diamplifikasi menggunakan PCR. Sebelum dilakukan running elektroforesis gel, dilakukan pembuatan agarose  dengan  melarutkan  0,5  gram agarose dan 5 ml TBE ke dalam 45 ml ddH2O.
Adapun  klasifikasi  dari  bakteri Bacillus sp.  sudah  diatur  oleh  International Committee on Bacteriological
Nomenclature  pada  tahun  1947  dan ditetapkan  dalam  Bergey’s  Manual  of Determinative Bacteriology, 8 th Editions (Hadioetomo,  1985 dalam Hatmanti,
2000).    Klasifikasi  bakteri Bacillus ditetapkan sebagai berikut:
Kingdom : Procaryotae Filum : Bacteria
Kelas : Schizomycetes Ordo : Eubacteriales
Famili : Bacillaceae
Genus : Bacillus Jenis : Bacillus sp.
Berdasarkan data pada Tabel.3 di atas  dapat  dilihat  bahwa Accession
Number menunjukkan  kode  data  pada genbank yang memiliki kemiripan tertinggi  dengan  hasil  sekuens  dari masing-masing  sampel  bakteri. Total Score menunjukkan keselarasan semua segmen  dari  urutan  database  yang cocok  dengan  nukleotida.    Semakin tinggi Total  Score yang  didapatkan, maka  semakin  tinggi  juga  tingkat kemiripan  hasil  sekuens  dengan  data pada  genbank. Query  Coverage
menunjukkan presentasi panjang nukleotida  yang  selaras. Identity menunjukkan presentasi kemiripan hasil sekuens  dengan  data  pada  genbank (Miller, 1990). Expect Value
menunjukkan nilai dugaan.  Apabila nilai Expect  Value menunjukkan  angka  0,0 menandakan  bahwa  kedua  sekuens identik (Claverie, 2003).
Bakteri  genus Bacillus memiliki morfologi  yaitu:  berwarna  putih  susu,
bentuk koloni keseluruhan bulat, memiliki tepian yang keriput.  Bentuk sel batang dan lurus dengan ukuran 0,5-2,5 µm  x  1,2-10  µm. Bacillus sering berpasangan  atau  membentuk  rantai dan memiliki ujung bundar atau persegi empat.    Hidup  optimal  pada  suhu  30- 37ºC  dan  tumbuh  baik  pada  NaCl dengan konsentrasi 1-3% (Feliatra et al. , 2004).    Mampu  melakukan  mobilitas menggunakan flagel peritrichous.
Memiliki  endospora  berbentuk  bundar atau silinder dan hanya ada satu spora pada  satu  sel.    Dapat  ditemukan  di bermacam-macam habitat karena sangat  resisten  pada  kondisi  ekstrim; dan  sedikit  spesies  bersifat  patogen pada hewan invertebrata dan vertebrata.    Memiliki  tingkat  kepekaan yang  tinggi  terhadap  panas,  pH,  dan salinitas. Mampu melakukan kemoorganotrof menggunakan metabolisme  fermentasi  (Holt et  al. ,
1994 dalam Feliatra,  2004).    Menurut Chang  dan  Liu,  (2002) dalam Feliatra,
(2004),  dikatakan  bahwa Bacillus  toyoi mampu menekan bakteri patogen pada hewan ternak.
Dari  hasil  analisis  DNA  yang diapatkan, Bacillus sp.  yang  berhasil dikultur  merupakan  bakteri  halofilik. Bakteri halofilik merupakan bakteri yang hidup  pada  lingkungan  yang  memiliki kadar  garam.    Bakteri  ini  tergolong dalam  famili Halobacteriacea. Bakteri halofilik  pada  umumnya  tahan  dalam kondisi  lingkungan  bersalinitas  tinggi sehingga  mampu  mendegradasi  bahan organik.    Selain  itu,  bakteri  halofilik memiliki  toleransi  yang  tinggi  terhadap pencemar (Nilawati et al., 2015).
Dalam pemeliharaan rotifer, salah satu  bakteri  yang  memiliki  manfaat penting bagi pertumbuhan rotifer adalah Bacillus sp.    Hal  tersebut  dikarenakan Bacillus sp. mampu  menghasilkan
senyawa antimikroba alami yang mampu  mengurangi  jumlah  bakteri patogen  seperti Vibrio sp.  (Gatesoupe, 1999 dalam Zink,  2011).    Selain  itu, Bacillus sp. juga dapat bermanfaat bagi pertumbuhan  populasi  rotifer  karena memproduksi vitamin B12 dan
mengurangi  konsentrasi  amonia  (Chen dan Chen, 2001 dalam Zink, 2011). Sahandi et  al., 2012  mengatakan bahwa  dengan  menambahkan  bakteri Bacillus sp. ke  dalam  biokapsul  rotifer mampu  meningkatkan  mortalitas  larva ikan Hypophthalmichthys molitrix
sekalipun hasilnya tidak seefisien dengan  penambahan  langsung  bakteri Bacillus sp. ke dalam air pemeliharaan.
Rotifer  yang  ditambahkan  dengan bakteri Bacillus sp. juga dikatakan dapat membantu  sistem  pencernaan  dari H. molitrix karena  mengandung  enzim pencernaan dan nutrisi penting tertentu sehingga dapat mendorong pertumbuhan  larva  yang  lebih  baik (Rosovitz et  al., 1998;  Farzanfar,  2006 dalam Sahandi, 2012).
Contohnya B.  cereus dan B. subtilis yang mampu melakukan aktivitas  enzimatik  yang  penting  dari esterase
lipase (C8), leucine arylamidase,  dan  asam  fosfat  yang memiliki  efek  positif  dalam  pencernaan
lipid.    Selain  itu,  produksi  β  1,3 glukanase  dari  bakteri B.  clausii juga memberikan potensi untuk menghidrolisis  β  1-3  glukan.    Produksi enzim-enzim tersebut dapat meningkatkan efisiensi penyerapan nutrisi  yang  sangat  bermanfaat  bagi rotifer (Murillo dan Villamil, 2011).

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah  dilakukan,  dapat  disimpulkan bahwa:
1. Hasil  isolasi  bakteri  dari  media kultur  bakteri,  diperoleh  isolat bakteri F0-0-3-1 dan F0-0-3-3 yang memiliki ciri-ciri berbeda berdasarkan ukuran, warna, elevation , margin ,  dan  bentuk koloninya.
2. Hasil  analisis  molekuler  dengan primer  16sRNA  terhadap  sampel bakteri F0-0-3-1 dan F0-0-3-3 yang didapatkan  menunjukan  bahwa jenis-jenis  bakteri  ini  tergolong dalam genus Bacillus sp.

## Saran
1. Perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut untuk memanfaatkan bakteri
Bacillus sp. yang  ada  pada  media kultur  rotifer  yang  diberikan  ikan mentah.
2. Perlu  dilakukan  perbanyakan  bagi bakteri Bacillus sp. yang menguntungkan  pada  kegiatan budidaya rotifer.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi
Republik  Indonesia  dan  Universitas Sam  Ratulangi,  Manado  yang  telah membiayai  penelitian  ini  dalam  skema penelitian Kerjasama Luar Negeri (KLN) tahun  anggaran  2018;  ucapan  terima kasih  kepada  Prof.  Dr.  Ir.  Inneke  F.  M. Rumengan  dan  Stenly  Wullur,  S.Pi, M.Sc, Ph.D atas bimbingan dan arahan
baik  selama  penelitian maupun  setelah penelitian;  juga  ucapan  terima  kasih kepada  Letha,  Asriel,  Herlin,  Ade,  dan Debhy mahasiswa Ilmu Kelautan, Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan UNSRAT atas bantuan teknisnya selama penelitian berlangsung di laboratorium.

## DAFTAR PUSTAKA
Andika,  Z.P.;  A.  Sulistyarsi.  (2017). Isolasi  dan  Karakterisasi  Bakteri Proteolitik Pada Limbah Air Cucian Ayam  Potong  dan  Cucian  Ikan Sebagai  Penyusun  Modul  Biologi SMA Kelas X .  Prosiding Seminar Nasional  SIMBIOSIS  II,  Madiun, 30 September 2017. ISSN: 9772599121008 Claverie,  J.  M.;  C.  Notredame.  (2003). Bioinformatics for Dummies . Indianapolis (US) : Wiley
Publishing.
Feliatra;  I.  Efendi;  E.  Sruyadi.  (2004).
Isolasi  dan  Identifikasi  Bakteri Probiotik  dari  Ikan  Kerapu  Macan (Ephinephelus  fuscogatus)  dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan .
Jurnal Natur Indonesia 6(2): 75-80
(2004).  ISSN 1410-9379.
Felix,  F.;  T.  T.  Nugroho;  S.  Silalahi;  Y. Octavia.  (2011). Screening  of Indonesian Original Bacteria Vibrio sp. As a Cause of Shrimp Disease
Based  on  16S  Ribosomal  DNA- Technique . Jurnal Ilmu dan Teknologi  Kelautan  Tropis  Vol.3, No.2. ISSN: 2087-9423.
Fembri,  F.  I.  K;  E.  Kaligis;  I.  F.  M. Rumengan.  (2017). Karakteristik Pertumbuhan Populasi
Rotifer
(Brachionus  rotundiformis)  Tanpa
Pemberian  Aerasi  dan  Mikroalga Sebagai Pakan Pada Media Kadar Garam  Berbeda .    Jurnal  Pesisir dan Laut Tropis Vol. 1 No.1 tahun 2017. Fitri,  L.;  Y.  Yasmin.  (2011). Isolasi  dan Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri  Kitinolik .  Jurnal  Ilmiah Pendidikan Biologi, Biologi Edukasi  Vol.  3,  No.  2,  Desember 2011, hlm. 20-25 Hatmanti, A. (2000). Pengenalan
Bacillus  spp. Oseana,  Vol.  XXV, No. 1, 2000 : 31 - 41 Leboffe,  M.  J  dan  B.  E. Pierce. (2012).
Brief  Microbiology.    Laboratory Theory  &  Application  2 nd Edition. Englewood:  Morton Publishing. Miller,  G;  R.  Beckwith;  C.  Fellbaum;  D.
Gross; K. Miller. (1990). WordNet: An  On-Line  Lexical  Database. International Journal of Lexicography. Murillo, I. dan L. Villamil. (2011). Bacillus cereus  and  Bacillus  subtilis  Used as Probiotics in Rotifer (Brachionus  plicatilis)  Cultures . Journal  of  Aquaculture  Research and  Development  S1:007.  DOI  :
10.4172/2155-9546.S1-007. Nilawati;  Marihati;  Susdawanita;  N.  I. Setianingsih. (2015). Kemampuan Bakteri Halofilik Untuk Pengolahan Limbah Industri Pemindangan Ikan . Jurnal Riset Teknologi Pencegahan Pencemaran Industri Vol. 5, No. 2, November 2014. Hal 23-28 Raharja,  E.;  S.  B.  Prayitno;  Sarjito.
(2016). Pengaruh Konsentrasi
Konsorsium  Bakteri  K7,  K8,  dan K9  Terhadap  Status  Kesehatan Rumput Laut (Eucheuma cottonii) . Journal of Aquaculture Management and Technology Vol. 5,  No.  1,  Tahun  2016.  Hal.  108- 115.
Redjeki,  S.  (1999). Budidaya  Rotifera (Brachionus  plicatilis) .    Oseana,
Volume XXIV, No. 2, 1999 : 27-43. Rinanda, T. (2011). Analisis Sekuensing 16s  rRNA  di  Bidang  Mikrobiologi . Jurnal  Kedokteran  Syiah  Kuala
Vol. 11 No. 3 Desember 2011.
Rumengan,  I.  F.  M;    E.  Kaligis;    V.
Warouw;    S.  Wullur.  (2017). Karakteristik Morfologi Telur Dorman Rotifer (Brachionus rotundiformis)  Hasil  Kultur  Masal .
Ethos  (Jurnal  Penelitian  dan Pengabdian  Pada  Masyarakat).
240 – 246.
Rumengan,  I.  F.  M;  M.  Sulung;    Z. Lantiunga;    J.  Kekenusa.  (2007).
Morfometri Rotifer Brachionus rotundiformis  Strain  SS  Asal Tambak  Minanga  Dan  Tambak Watuliney  Sulawesi  Utara  yang Dikultur  Pada  Salinitas  Berbeda .
Jurnal Riset Akuakultur Vo.2 No.2
Tahun 2007.
Rumengan,  I.  F.  M;    E.  Suryanto;    R. Modaso;    S.  Wullur;    T.  E.  Tallei; D. Limbong. (2013). Karakteristik
Struktur  Kitin  Dan  Kitosan  Yang
Diisolasi  Dari  Biomassa  Rotifer Brachionus  rotundiformis  Hasil
Kultur .    Seminar  Tahun  Ke-2  & Workshop  Bioteknologi  Kelautan dan  Perikanan  Serta  Kongres Forum Biofarmasi Kelautan Indonesia. Rumengan,  I.  F.  M;  Budiyanto;  R. Modaso; D. Dewanto; D. Limbong. (2012). Mekanisme Sistem Panen Pada Kultur Massal Rotifer, Brachionus  rotundiformis .  Jurnal Riset  Akuakultur  Vol.  7  No.  1
Tahun 2012.
Rumengan,  I.  F.  M;  S.  Wullur.  (2017). Pemeliharaan  Rotifer  Berbasis
Penguraian  Ikan  Mentah  Sebagai Sumber  Nutrisi .    Berita  Resmi Paten Seri-A. No. BRP564/XI/2017. November 2017. Sahandi, J.; H. Jafariyan; R.
Roozbehfar; S. Babaei; M. Dehestani. (2012). The Use of Two Enrichment  Forms  (Brachionus plicatilis  Enrichment  and  Rearing Water  Enrichment)  With  Probiotic Bacilli  Spore  on  Growth  and Survival of Silver Carp (Hypophthalmichthys molitrix) . Iranian  Journal  of  Veterinary Research,  Shiraz  University,  Vol.
13, No. 4, Ser.No. 41, 2012.
Ahmed, S.; A. M. Nour; T. M. Srour; S. S. Assem; H. A. Ibrahim; H. S. El- Sayed. (2015). Greenwater, Marine Bacillus subtilis HS1 Probiotic  and  Synbiotic  Enriched Artemia  and  Rotifers  Improved European  Seabass  Dicentrarchus labrax  Larvae  Early  Weaning Length  Growth,  Survival,  Water, and Bacteriology Quality . American Journal of Life Sciences 2015; 3(6-1): 45-52. Solis  BioDyne.  (2018). 100  bp  DNA Ladder Ready to Load . https://www.sbd.ee/EN/products/d na_ladders/100_bp_dna_ladder_.
Diakses  pada tanggal  16  Oktober 2018.
Sumarno,  E  dan  Subari.  (2013).
Perencanaan  In  Take  Air  Limbah Rumah  Tangga  Dengan  Sistem Pengelolaan  Bio  Teknologi  Pada Perumahan  Citra  Gran  Cibubur . Jurnal  Bentang  Vol.  1  No.  2  Juli
2013. Solis  BioDyne.  (2018). 100  bp  DNA Ladder Ready to Load . https://www.sbd.ee/EN/products/d na_ladders/100_bp_dna_ladder_.
Diakses  pada tanggal  16  Oktober 2018.
Sumarno,  E  dan  Subari.  (2013).
Perencanaan  In  Take  Air  Limbah Rumah  Tangga  Dengan  Sistem Pengelolaan  Bio  Teknologi  Pada Perumahan  Citra  Gran  Cibubur . Jurnal  Bentang  Vol.  1  No.  2  Juli 2013. Supriyati,  D. (2009). Stappia aggregate G1 dan Alteromonas sp.G2 Bakteri Pendegradasi  Phenantrene  yang Diisolasi  dari  Lingkungan  Laut . Berita Biologi 9(6). Wulur,  S.;  I.  F.  M.  Rumengan;  V. Warouw; M. Ompi. (2018). Metode
Pembuatan  Pakan  Dari  Limbah Perikanan  Yang  Telah  Di  Kemas Kedap Udara Dalam Kondisi Beku Untuk Pemeliharaan Rotifer . Paten No. P14201802692. Zink, I. C.; P. A. Douillet; D. D. Benetti.
(2011). Improvement  of  Rotifer Brachionus  plicatilis  Population Growth Dynamics With Inclusion of Bacillus spp. Probiotics. Aquaculture  Research,  2011,  1 – 12. DOI : 10.1111/j.1365- 2109.2011.03023.x