Optimasi Suhu Annealing qRT-PCR Gen WRKY45 Sebagai Deteksi Gen Ketahanan Terhadap Infeksi
Xanthomonas oryzae pv. oryzae pada Padi Hitam Cempo Ireng
Optimization of qRT-PCR Annealing Temperature of WRKY45 Gene for Detection of Resistance Genes Against Xanthomonas oryzae pv. oryzae on Black Rice Cempo Ireng
Triyaningsih 1 , Tri Rini Nuringtyas 1,2*) , Yekti Asih Purwestri 1,2 , Alfino Sebastian 2 1 Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada 2 Pusat Studi Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada
* E-mail: tririni@ugm.ac.id

## ABSTRACT
Plant  pathogens  constrain  the  development  of  black  rice  farming.  One  of  these  pathogens  is Xanthomonas oryzae pv. oryzae ( Xoo ), causing a bacterial leaf blight disease. The disease disrupts crop growth and reducing yields. Cempo ireng is a local pigmented rice cultivar from Yogyakarta, Indonesia, which is reported for its high resistance to Xoo. One of the rice resistance mechanisms to Xoo infection is a molecular defense employing plant resistance genes such as WRKY45 . Comparing the expression of resistance-related genes of the resistant cultivar to the susceptible ones is needed to elucidate the resistance mechanism of the black rice to Xoo . For this purpose, the expression of WRKY45 gene  at  the  level  of  mRNA  can  be  performed  using  qRT-PCR.  The  success  of  qPCR analysis  is  greatly  influenced  by  the  accuracy  of  the  annealing  primer  temperature  of  the corresponding gene. This study aimed to optimize the primer's annealing temperature for WRKY45 gene.  The  optimization  was  done  by  a  temperature  gradient  PCR.  Determination  of  the  optimal annealing temperature was selected based on the profile of the amplification curve, melt curve, melt temperature and the Ct value obtained. The annealing temperature gradient used in this study was ranging from 52°C to 60°C. The results showed that the best annealing temperature for WRKY45 gene primers is 58.3°C based on the amplification curve, melt curve, melt peak and Ct value of 29.21.
Keywords: Xoo, Cempo ireng , qRT-PCR, primer optimization, annealing temperature.

## PENDAHULUAN
Pertanian padi hitam di Indonesia mulai banyak diminati  setelah  diketahui  bahwa  beras  hitam memiliki  kandungan  gizi  yang  lebih  baik daripada  beras  putih.  Budidaya  padi  hitam sedang  gencar  dilakukan  untuk  dikembangkan sebagai  pangan  fungsional.  Pengembangan budidaya padi hitam, sebagaimana halnya padi putih, masih terkendala oleh berbagai patogen. Salah satu patogen yang sering menyerang padi adalah Xanthomonas  oryzae pv. oryzae ( Xoo ), penyebab  penyakit  hawar  daun  ( bacterial  leaf blight) . Xoo dapat  menginfeksi  tanaman  padi pada  tahap  anakan hingga  masa  reproduktif. Selain dapat menganggu pertumbuhan tanaman, penyakit  ini  dapat  memengaruhi  kualitas  biji dengan  mengganggu  proses  pemasakan  dan akhirnya menyebabkan penurunan hasil (Niño- Liu et al ., 2006) Pengendalian  penyakit  hawar  daun menggunakan bakterisida dan antibiotik dalam jangka  waktu  lama  menimbulkan  resistensi terhadap infeksi Xoo dan  dapat  menyebabkan
pencemaran  lingkungan  yang  membahayakan kesehatan  manusia (Rodríguez et  al ., 1997) Salah  satu  upaya  alternatif  yang  lebih  ramah lingkungan  dan  ekonomis  yaitu  dengan mengembangkan kultivar tahan terhadap hawar daun.  Cempo  Ireng  merupakan  padi  hitam kultivar  lokal  Yogyakarta  yang  dilaporkan memiliki ketahanan yang tinggi terhadap hawar daun (Sutrisno et al ., 2018). Untuk menunjang pengembangan  kultivar  padi  tahan  patogen, maka  perlu  diketahui  mekanisme  ketahanan padi  Cempo  Ireng  ini  terhadap Xoo. Studi ketahanan padi Cempo Ireng secara molekular dapat  dilakukan  melalui  ekspresi  gen  yang berkaitan  dengan  sistem  pertahanan  tanaman. Salah satu gen pertahanan terhadap Xoo adalah gen WRKY45 ,  yang  memiliki  peran  sebagai faktor  transkripsi  yang  mengatur  pertahanan tanaman terhadap berbagai cekaman biotik dan abiotik (Tao et  al ., 2009). Deteksi  molekuler ekspresi gen WRKY45 dapat dilakukan dengan quantitative  Real  Time-Polymerase  Chain Reaction (qRT-PCR).  Faktor  penting  untuk mengukur  kualitas ekspresi  gen  dengan  qRT-
PCR  adalah  memperhatikan  kualitas template untuk transkripsi terbalik (mRNA) dan template untuk PCR (cDNA) (Hewajuli & Dharmayanti 2014).   Metode qRT-PCR memiliki kelebihan yaitu  sensitivitas  dan  spesifisitas  yang  tinggi, dan high dynamic range sehingga cocok untuk tindakan  kuantifikasi  (Schwarzenbach et  al., 2014, Kartika, 2018).  Selain  memiliki sensitivitas  lebih  tinggi,  kelebihan  pengujian qRT-PCR  jika  dibandingkan  dengan  PCR konvensional  adalah  lebih  dinamis,  resiko kontaminasi  silang  lebih  sedikit,  kemampuan aplikasi penggunaannya  untuk pengujian lebih banyak (Black et al ., 2020). Pada metode real- time PCR , produk langsung dapat diukur pada setiap siklus melalui deteksi floresen.
Penggunaan  qRT-PCR  sangat  memerlukan optimasi  penggunaan  untuk  mendapatkan kondisi  optimum (Raymaekers et  al ., 2009).
Optimasi diperlukan untuk memastikan bahwa pengujian  cukup  sensitif  dan  spesifik  pada target  yang  diinginkan.  Terdapat  sejumlah faktor yang dapat dilakukan untuk mendapatkan kinerja pengujian yang optimal sehingga dapat meningkatkan  sensitivitas,  spesifisitas  dan presisi,  yaitu  konsentrasi  primer,  suhu annealing, dan konsentrasi cDNA (Zhao et al ., 2021). Suhu annealing merupakan faktor utama yang  perlu  diperhatikan  dalam analisis  qRT- PCR.  Penentuan  suhu annealing yang  tepat penting  untuk  mengetahui  seberapa  efisien primer menempel pada template, dan mencegah annealing nonspesifik dan pembentukan dimer (Taylor et al ., 2010). Jika suhu annealing tidak sesuai terlalu rendah atau tinggi, reaksi menjadi tidak  spesifik  sehingga  diperoleh  produk amplifikasi  DNA  lebih  dari  satu  target. Referensi  suhu annealing untuk  gen WRKY45 sudah  banyak  dipublikasi  namun  belum  ada yang  spesifik  untuk  varietas  Cempo  Ireng. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan kondisi  suhu annealing primer  yang  optimal untuk  deteksi  gen WRKY45 ,  sehingga pengukuran ekspresi gen WRKY45 sensitif dan tepat.

## METODE
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperimental pra-analitik  studi.  Sampel  daun  padi  menggunakan daun padi Cempo Ireng umur 21 hari setelah pindah tanam  yang  telah  diinfeksi Xoo. Padi  Cempo  Ireng ditumbuhkan  dalam green  house, Pusat  Studi Bioteknologi, Universitas Gadjah Mada.
Isolasi RNA Isolasi  RNA  total  dilakukan  dengan  menggunakan RNA Favoprep TM Plant Total RNA Purification Mini
Kit .  Prosedur  isolasi  RNA  total  yang  digunakan dalam penelitian ini mengacu pada petunjuk protokol kit dengan modifikasi. Sampel daun sebanyak 100 mg digerus dengan  mortar  dan  nitrogen  cair.  Setelah menjadi  serbuk,  sampel    dimasukkan  dalam microtube 1,5  ml  yang  berisi  500  µl  buffer  FARB (sudah  ditambahkan β-mercaptoetanol). Sampel dihomogenisasi dan  didiamkan  pada  suhu  ruang selama  5  menit  kemudian  sampel  dipindahkan  ke dalam filter  column yang  telah  ditempatkan  pada tabung koleksi berukuran 1,5 ml. Selanjutnya tabung disentrifugasigasi selama 2 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Supernatant yang terbentuk dipindahkan ke tabung 1,5 ml baru, dan ditambahkan EtOH 70% sebanyak  1  volume supernatant- nya . Sampel dihomogenisasi  selama  5-10  detik  dan  dipindahkan ke  dalam FARB  column yang  telah  ditempatkan dalam  tabung  koleksi  ukuran  1,5  ml.  Selanjutnya sampel  disentrifugasi  selama  30  detik  dengan kecepatan 13.000 rpm. Cairan yang terbentuk dalam tabung  koleksi  dibuang  dan FARB  column dipasangkan dengan microtube baru. Sebanyak 500 µl wash buffer 1 ditambahkan ke dalam kolom yang sama dan disentrifugasigasi selama 1 menit 30 detik pada kecepatan 13.000 rpm. Cairan yang terbentuk di dalam tabung koleksi dibuang.
Sebanyak 700 µl Wash buffer II ditambahkan ke dalam kolom, dan disentrifugasi selama 1 menit 30 detik  dengan  kecepatan  12.000  rpm.  Cairan  yang terbentuk  di  dalam  tabung  koleksi  dibuang. FARB column dan  pasangan  koleksi  tube  disentrifugasi selama  1  menit  30  detik  dengan  kecepatan  12.000 rpm. FARB column dipindahkan ke tube 1,5 ml baru dan  ditambahkan  40  µl  buffer RNAse  Free  Water. Tube kembali  disentifus  selama  1  menit  30  detik dengan  kecepatan  13.000  rpm.  Sebanyak  40  µl larutan pada koleksi tube diambil dan dikembali ke FARB  column untuk  dilakukan  sentrifugasiulang. Cairan  yang  terbentuk  mengandung  RNA  hasil isolasi.  Kualitas  RNA  dievaluasi  dengan  mengukur konsentrasi  dan  kemurniannya  menggunakan spektrofotometer  nanodrop.  Sampel  RNA  hasil isolasi kemudian disimpan pada suhu -80 o C.
Sintesis cDNA Complementary  DNA (cDNA)  disintesis dengan menggunakan  kit ReverTraAce ® qPCR  RT  Master Mix with gDNA Remover (Toyobo) . Sebelum Reagen 4χ  DN  Master  Mix  digunakan,  reagen  tersebut ditambahkan gDNA  Remover dengan  perbandingan 88 µl 4χ DN Master Mix dan 1,8 µl gDNA Remover. Template RNA ditambahkan dengan 4χ DN Master Mix  dan nuclease  free  water dengan  komposisi seperti pada Tabel 1. ke dalam tube PCR. Tube PCR kemudian  disentrifugasi  dan  diinkubasi  pada  suhu 37 o C  selama  5  menit.  Komponen  pada tube PCR ditambahkan reagen 5χ RT Master Mix II sebanyak 2 µl  sehingga  total  komponen  menjadi  10  µl  dan dilakukan spin-down .    Kemudian  tube  dinkubasi kembali selama 15 menit pada suhu 37 o C. Inkubasi dilanjutkan  pada  suhu  50 o C  selama  5  menit  dan dipanaskan pada suhu 98 o C selama 5 menit dengan
menggunakan  mesin  PCR  dengan  jumlah  satu  kali siklus.
Tabel 1. Komposisi mix DNase treatment Komponen 1 x reaksi 4× DN Master Mix 2 µl RNA template 5 µl Nuclease-free water (NFW) 1 µl Total 8 µl Setelah  sintesis  cDNA  selesai,  sampel  cDNA dicek kualitasnya dengan melakukan amplifikasi gen Ubiquitin ( Ubq ) sebagai housekeeping  gene menggunakan  PCR.  Sekuen  Primer Ubq adalah forward 5’CQCAGGCQCCGTGGTGGTATAG3’, reverse 5’GTGATAGTTTTCCCAGTCAAC GTC3’. Hasil PCR dievaluasi dengan elektroforesis pada  gel  agarosa  1,2  %.    Marker  yang  digunakan adalah marker 100 bp.

## Optimasi Primer qRT-PCR
Proses  pencampuran  bahan  qPCR  dilakukan  tanpa menggunakan  pencahayaan  yang  tinggi  dan  dalam suhu rendah. Exceltaq TM 2χ Fast Q-PCR Mater mix (SYBR, no ROX) diambil sebanyak 5 μL dalam tube q-PCR. Primer forward WRKY45 5’TTTAAGCQGCAGACATGCQA3’  ditambahkan sebanyak  1  μL,  kemudian  ditambah  dengan  primer reverse WRKY45 dengan  sekuens  5’  CQTCQC QTGCQTGTCACACA  3’  sebanyak  1  μL.  cDNA template yang telah digabungkan dari setiap sampel ditambahkan  sebanyak  1  μL.  Terakhir,  NFW ditambahkan  sebanyak  2  μL,  selanjutnya dihomogenisasi dan spindown . Tube PCR  strip  yang  berisi  mix  sampel dimasukkan dalam mesin Biorad CFX 96 . Program q- PCR  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  mengikuti protokol Exceltaq TM 2X  Fast  Q-PCR  Master  mix (SYBR, no ROX) optimasi suhu bertingkat pada tahap annealing (Tabel.2)  sebanyak  39  siklus.  Data  yang telah didapatkan dianalisis melalui kurva amplifikasi. Optimalitas  reaksi  ditentukan  dengan  mengamati nilai  Ct  yang  dihasilkan  dari  masing-masing  suhu. Untuk  memperkuat  hasil  nilai  Ct,  dilakukan eletroforesis sampel hasil qPCR menggunakan agar 1,2%. Tabel 2. Program qRT-PCR optimasi suhu WRKY45 Tahapan Suhu ( o C) Durasi Pre-denaturasi 95 2 (menit) Denaturasi 95 15 (detik) Annealing 52 53,9 56,3 58,3 59,4 60 1 (menit)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Tahapan  optimasi  suhu annealing primer  gen WRKY45 dilakukan  dengan  isolasi  RNA, sintesis  cDNA,  dan  analisis  profil  suhu
annealing hasil qRT-PCR. RNA bersifat sangat mudah rusak dan membutuhkan ketelitian yang tinggi  dalam  pengerjaanya,  sehingga  pada penelitian  ini  mRNA  diubah  menjadi  cDNA terlebih dahulu sebelum dianalisis dengan qRT- PCR. Hasil  isolasi  RNA  disintesis  menjadi cDNA  dengan  metode Reverse Transcriptase PCR.  Hasil  cDNA  dievaluasi  dengan amplifikasi house  keeping  gen Ubq mengggunakan  PCR  kovensional.  Hasil  PCR Ubq pada  setiap  sampel  teramplifikasi  dengan ukuran 200 bp pada semua sampel (Gambar 1). Salah  satu  faktor  penting yang  memengaruhi keberhasilan  proses  qRT-PCR  adalah  suhu annealing .    Suhu annealing yang  sesuai diperoleh  melalui  optimasi  menggunakan gradien  suhu  dengan  rentang  yang  ditentukan. Hal  yang  diperhatikan  dalam  optimasi  primer adalah  profil  suhu annealing meliputi  kurva amplifikasi, melt curve , melt peak, nilai Ct dan hasil visualisasi menggunakan elektroforesis.
Gambar 1. Hasil elektroforesis gen Ubq untuk uji  kualitas  cDNA  pada  Cempo Ireng,  Gen Ubq terdeteksi  pada semua  sampel  dengan  ukuran  200 bp. Keterangan:  notasi  huruf sebagai  ulangan  biologis,  notasi angka  sebagai  ulangan  teknik ukuran marker 100 bp.
Profil  optimasi  suhu  annealing  harus memiliki  pola melt  curve dan melt  peak yang sama,  dan  membentuk  satu peak yang menandakan  spesifisitas  target. Jika  terjadi double  peak ,  maka  akan  dihasilkan  dua  target dalam  satu  cDNA  yang  diartikan  primer  tidak dapat  mengenali  spesifik template (Kartika, 2018). Optimasi  primer  untuk  mendapatkan suhu annealing yang sesuai pada qRT-PCR gen WRKY45 menunjukkan hasil suhu terbaik pada 58,3 o C.  Kurva  amplifikasi    optimasi  suhu annealing pada  suhu  52 o C  menunjukkan kenaikan  amplifikasi  setelah  siklus  ke  30, sedangkan  suhu  lainnya  menunjukkan  titik kenaikan  amplifikasi  kurang  dari  30  siklus (Gambar  2A.).  Profil  kurva  amplifikasi  akan berkaitan  dengan  nilai  Ct  pada  qRT-PCR, semakin  rendah  siklus  kenaikan  pada  kurva, maka menghasilkan nilai Ct yang lebih rendah, seperti nilai Ct pada Tabel 3. Profil melt curve dan melt  peak seragam  untuk  semua  suhu
optimasi. Melting  temperature primer  pada semua  sampel  menunjukkan  nilai melting temperature yang  sama  pada  suhu  78 o C (Gambar  2B.). Melt  peak yang  terbentuk menunjukkan  hasil  yang  spesifik,  satu puncak/ peak dan  semua  kurva  melebihi  nilai threshold (Gambar 2C.)
Gambar 2. Profil optimasi suhu annealing qRT- PCR  gen WRKY45.
(A).  Kurva amplifikasi,  (B). Melt  curve ,  (C).
Melt peak
Tabel 3. Nilai Ct hasil optimasi suhu pada qRT- PCR
Suhu annealing ( o C) Nilai Ct 52 34,44 53,9 29,52 56,3 29,14 58,3 29,21 59,4 29,23 60 29,41 Optimasi suhu annealing dengan menggunakan  qRT-PCR  dikonfirmasi  dengan elektroforesis  untuk  mengetahui  primer memiliki ukuran target yang diharapkan. Primer
spesifik  ditunjukkan  dengan  pita  tunggal  pada kisaran 166 bp (Gambar 3.) dan tidak ada primer dimer pada hasil visualisasi. Gambar  3.  Elektroforesis  hasil  optimasi  suhu annealing primer WRKY45 . marker: 100 bp Nilai Ct ( Threshold cycle ) diartikan sebagai Jumlah siklus yang diperlukan untuk mencapai threshold. Nilai  Ct  merupakan  prinsip  dasar dari  qRT-PCR dan sebagai bagian yang sangat penting  untuk  memperoleh  data  yang  akurat (Higuchi et al ., 1993). Nilai Ct qRT-PCR sangat berkorelasi dengan kuantitas urutan DNA target (Giglio et al ., 2003, Hewajuli & Dharmayanti, 2014). Penentuan  nilai  Ct  dapat  dilihat  dari profil  kurva  amplifikasi  yang  dihasikan  pada optimasi  primer.  Profil  kurva  amplifikasi optimasi  suhu
annealing pada  suhu  52 o C dengan  40  siklus  menunjukkan  titik  kenaikan amplifikasi lebih dari siklus ke 30, yang artinya amplifikasi  tidak  efisien  pada  suhu  52 o C, sehingga primer memerlukan waktu lebih lama untuk dapat mengamplifikasi produk.
Sedangkan  pada  suhu  53,9 o C,  56,3 o C,  58,3 o C, 59,4 o C,  dan  60 o C  menunjukkan  titik  kenaikan amplifikasi kurang dari 30 siklus, yang artinya pada  kelima  suhu  tersebut  primer  mampu mengamplifikasi lebih efisien pada silkus yang lebih pendek, seperti pada Gambar 1A. Berdasarkan  nilai  Ct  yang  dihasilkan  pada masing-masing suhu annealing dengan rentang 34,44  sampai  29,41  (Tabel  3),  kurva  yang memiliki  rentang  nilai  Ct  yang  terlalu  jauh menandakan  bahwa  pada  suhu  tersebut annealing tidak  dapat  dilakukan  secara optimum. Nilai Ct pada penelitian ini pada suhu 53,9 o C, 56,3 o C, 58,3 o C, 59,4 o C, dan 60 o C secara berurut memiliki nilai Ct  34,44, 29,52, 29,14, 29,21,  29,23,  dan  29,41.  Semakin  rendah  Ct artinya  semakin  cepat  terjadinya  amplifikasi untuk dapat melewati threshold (Siswanto et al. 2019).  Berdasarkan  nilai  Ct,  dua  suhu  dengan nilai  Ct  terendah  yaitu  suhu  56,3 o C  memiliki nilai  Ct terendah  yaitu 29,14 dan suhu 58,3 o C dengan nilai Ct 29,21. Selain nilai Ct, melt curve dan melt  peak hasil  optimasi  primer  menjadi penentu  lain  dalam  pemilihan  suhu annealing yang  sesuai.  Berdasarkan melt  curve dan melt
52 o C 53,9 o C 56,3 o C 58,3 o C 59.4 o C 60 o C A B C 52 o C 53,9 o C 56,3 o C 58,3 o C 59,4 o C 60 o C 52 o C 53,9 o C 56,3 o C 58,3 o C 59,4 o C 60 o C 52 o C 53,9
o C 56,3 o C 58,3 o C 59,4 o C 60 o C 166 bp
peak yang terbentuk pada optimasi suhu 58,3 o C memiliki melt melt curve dan melt peak tertinggi dibandingkan dengan suhu 56,3 o C (Gambar 2B dan 2C). Berdasarkan nilai Ct, melt curve dan melt  peak hasil  optimasi  menunjukkan  bahwa suhu annealing 58,3 o C  sebagai  suhu  optimal primer  gen WRKY45 pada  qRT-PCR  padi Cempo Ireng. Setelah memperoleh nilai Ct, melt curve dan melt peak, dilakukan konfirmasi hasil optimasi suhu annealing untuk mengetahui primer yang memiliki  target  spesifik  atau  tidak.  Uji konfirmasi  dilakukan  dengan  menggunakan elektroforesis. Berdasarkan hasil elektroforesis diperoleh band tunggal dan sejajar pada kisaran 109  bp (Gambar  3),  menandakan  bahwa optimasi yang dilakukan dapat memiliki target yang  spesifik  tanpa  ada  bias smear dan kontaminasi lainnya.

## KESIMPULAN
Optimasi  suhu  annealing  primer  gen WRKY45 sebagai  deteksi ketahanan  padi  Cempo  Ireng terhadap  infeksi Xoo menggunakan  qRT-PCR dengan  gradien  suhu annealing ,  menunjukkan suhu annealing terbaik  yang  dapat  digunakan untuk analisis ekspresi gen adalah suhu 58,3 o C berdasarkan kurva amplifikasi, melt curve , melt peak dan nilai Ct yang diperoleh.

## DAFTAR PUSTAKA
Black, E. M., Lowings, J. P., Smith, J., Heaton, P.  R  &  Mcelhinney,  L.  M.  2020.  A Rapid RT-PCR Method  to Differentiate Six Established Genotypes  of Rabies  and Rabies-related Viruses Using  TaqMan™ Technology. Journal  of  Virological Methods. 105 : 25-35
Giglio,  S.,  Monis,  P.  T  &  Saint,  C.  P.  2003.
Demonstration  of Preferential Binding  of
SYBR Green I to Specific DNA Fragments in Real-time Multiplex PCR. Nucleic Acids
Research , 31 (22): 1-5. Hewajuli, D. A & Dharmayanti, N. 2014. The Advance  of  Technology  of  Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction in Identifying the Genome of Avian Influenza and  Newcastle  Diseases. Indonesian Bulletin of Animal and Veterinary Sciences ,
24 (1): 16-29.
Kartika,  A. I.  2018.  Optimasi  Annealing
Temperature Primer mRNA RECK dengan Metode One Step qRT-PCR. Jurnal Labora
Medika Vol ,
2 (1): 22-33. Niño-Liu, D. O., Ronald, P. C & Bogdanove, A.
J.  2006. Xanthomonas Oryzae Pathovars: Model Pathogens  of A Model Crop. Molecular Plant Pathology , 7 (5): 303-324. Raymaekers,  M.,  Smets,  R.,  Maes,  B  &
Cartuyvels,  R.  2009.  Checklist For Optimization  and Validation  of Real-time PCR Assays. Journal of Clinical Laboratory Analysis , 23 (3): 145-151. Rodríguez,  H.,  Aguilar,  L  & Lao,  M.  1997. Variations  in Xanthan Production  by Antibiotic-resistant Mutants of Xanthomonas Campestris. Applied Microbiology  and  Biotechnology , 48 (5):
626-629.
Siswanto, Y. P., Merdekawati, F., Ernawati, E., Hardiana,  A.  T  &  Kurniawan,  E.  2019. Optimasi Suhu Annealing Dan Konsentrasi Primer  Untuk  Deteksi Brugia  malayi
Menggunakan  Real-Time Pcr. Jurnal Riset Kesehatan  Poltekkes  Depkes  Bandung ,
11 (1): 314.
Sutrisno,  Susanto,  F.  A.,  Wijayanti,  P., Retnoningrum,  M.  D.,  Nuringtyas,  T.  R.,
Joko, T & Purwestri, Y. A. 2018. Screening of Resistant Indonesian Black Rice Cultivars Against Bacterial Leaf Blight. Euphytica , 214 (11): 199-211. Tao, Z., Liu, H., Qiu, D., Zhou, Y., Li, X., Xu, C & Wang, S. 2009. A Pair of Allelic WRKY Genes Play Opposite Roles in Rice-Bacteria Interactions. Plant Physiology , 151 (2): 936- 948.
Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M  &  Nguyen,  M.  2010.  A Practical Approach  to  RT-qPCR-Publishing Data That Conform  to The  MIQE Guidelines. Methods , 50 (4): 1-5005 Zhao, F., Maren, N. A., Kosentka, P. Z., Liao, Y.-Y.,  Lu,  H.,  Duduit,  J.  R.,  Huang,  D.,
Ashrafi, H., Zhao, T., Huerta, A. I., Ranney, T.  G  &  Liu,  W.  2021.  An Optimized Protocol For Stepwise Optimization of Real- time  RT-PCR Analysis.
Horticulture
Research , 8 (1): 1-21.