Ekspresi VEGF Jaringan Hati Tikus 2AAF/CCl4

## Artikel Penelitian
Ekspresi VEGF di Jaringan Hati Tikus Pasca Induksi 2AAF/CCl 4
Isabella K. Liem 1* , Radietya Alvarabie 1,2,3 , Fanny Oktorina 1 , Firda A Husna 1 , Puspita E. Wuyung 4,5 , Ria Kodariah 4
1 Departemen Anatomi, 2 Program Magister Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta
3 Departemen Anatomi, Fakultas Kedokteran Militer, Universitas Pertahanan, Bogor
4 Departemen Patologi Anatomi, 5 Animal Research Facilities IMERI, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta
* Penulis korespondensi: bellajo04@gmail.com Diterima 13 Juni 2022; Disetujui:26 Mei 2023 doi.10.23886/ejki.11.406.33
Abstrak Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) merupakan sebuah faktor angiogenik poten yang terpicu ekspresinya jika jaringan hati mengalami cedera. Pada cedera hati kronis, VEGF diduga dapat berperan sebagai faktor  pro-fibrotik  atau  anti-fibrotik.  Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  peningkatan  ekspresi  VEGF  di jaringan hati tikus model dengan cedera hati kronis 2AAF/CCl 4 (2-acetylaminofluorene dan carbon tetrachloride). Penelitian menggunakan desain eksperimental dan dilakukan sejak Oktober 2019- April 2021 di laboratorium Patologi Anatomi dan Departemen Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.  Dua belas ekor tikus Wistar dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok kontrol (normal; n=6) dan kelompok perlakuan (diinduksi dengan 2AAF/CCl 4 ; n=6). Dilakukan pemeriksaan morfologi hati dengan pewarnaan hematoxylin eosin dan Masson’s trichrome dengan skoring NAFLD activity score (NAS) dan pengukuran kadar VEGF menggunakan pewarnaan imunohistokimia. Semua tikus kelompok perlakuan mengalami kerusakan hati dan fibrosis, dengan kerusakan hati terbanyak mencapai derajat 5 (5 dari 6) dan fibrosis hati terbanyak mencapai derajat 2 (4 dari 6). Sedangkan pada kelompok kontrol, semua  tikus menunjukkan morfologi hati dalam kondisi normal (derajat 0). Skor ekspresi VEGF pada kelompok perlakuan (median [min-max] = (115 [97-141]) tidak meningkat bermakna (uji Mann-Whitney U; p=0,688) dibandingkan kelompok kontrol (112 [94-129]).  Disimpulkan bahwa pada jaringan hati tikus model cedera hati yang diinduksi oleh 2AAF/CCl 4 terdapat peningkatan VEGF namun tidak bermakna secara statistik.
Kata kunci : VEGF, 2AAF/CCl 4 , cedera hati, kerusakan hati, fibrosis hati,

## VEGF Expression of the Rat Liver Tissue After 2AAF/CCl4 Induction

## Abstract
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) is a potential angiogenic factor whose expression is triggered when liver tissue is injured. In chronic liver injury, VEGF is thought to act as a pro-fibrotic or anti-fibrotic factor. This study was conducted to determine the increase of VEGF expression in the liver tissue of a rat model with chronic liver injury 2AAF/CCl 4 (2-acetylaminofluorene and carbon tetrachloride). The research used experimental design and was carried out from October 2019 to April 2021 at the Anatomical Pathology Laboratory and The Anatomy Department of the Faculty of Medicine Universitas Indonesia.  Twelve male Wistar rats were divided into two groups, i.e. control group (normal; n=6) and the treatment group (2AAF/CCl 4- induced; n=6). Examination of liver morphology by staining with hematoxylin eosin and Masson’s trichrome by scoring using NAFLD activity score (NAS) and measuring VEGF levels using Immunohistochemical staining. All treatment groups had liver damage and fibrosis, with the most liver damage reaching grade 5 (5 of 6) and the most liver fibrosis reaching grade 2 (4 of 6). Whereas, in the control group, all rats showed normal liver morphology (degree 0). The VEGF expression score in the treatment group (median [min- max]= (115 [97-141]) did not increase significantly (Mann- Whitney U test; p= 0.688)  compared to the control group (112 [94-129]). The liver of rat liver injury model induced by 2AAF/ CCl 4 showed an increase in VEGF but not statistically significant.
Keywords: VEGF, 2AAF/CCl 4 , liver injury, liver damage, liver fibrosis.
Isabella K Liem, et al
eJKI Vol. 11, No. 1, April 2023

## Pendahuluan
Fibrosis merupakan suatu proses penyembuhan cedera hati yang meliputi inflamasi, deposisi  molekul  matriks  ekstraseluler,  dan neovaskularisasi patologis. Di tahap awal fibrosis bersifat reversibel. Jika kerusakan hati berlanjut dan tidak tertangani, proses akan masuk ke tahap akhir,  yaitu  sirosis  hati  yang  bersifat  irreversibel yang ditandai dengan perubahan nodular dan rekapilarisasi parenkim sinusoid hati. 1 Proses kerusakan hati yang berlanjut atau cedera hati kronis dapat pula berkembang menjadi suatu keganasan atau karsinoma hati. 2 Proses dalam jaringan  hati  akibat  cedera,  yaitu  kerusakan hepatosit, perbaikan dan remodeling jaringan hati terkait erat dengan angiogenesis. 1 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) merupakan suatu faktor angiogenik yang poten dan pada awalnya dideskripsikan sebagai faktor pertumbuhan yang penting untuk sel endotel vaskular 3 serta telah menjadi salah satu kandidat target protein untuk penanganan cedera hati. 1 Angiogenesis di hati yang mengalami cedera terjadi melalui kaskade sinyal Epidermal Growth Factor ( EGF). Dalam tersebut VEGF mempunyai peran  ganda,  yaitu  pembentukan  dan  resolusi fibrosis. 4 Pada  kondisi  hipoksia  persisten, pembuluh darah baru yang dibentuk oleh VEGF dapat mempertahankan kondisi peradangan kronis dengan  mengirimkan  sel-sel  inflamatori,  molekul- molekul  pro-inflamatorik,  dan  angiogenik  ke  area yang  mengalami  cedera.  Sitokin  proinflamatori selanjutnya memicu sel stelata ( hepatic stellate cells /HSC) untuk memproduksi sejumlah kemokin dan  merekrut  sel-sel  inflamatori.  Hal  ini  akan menstimulasi deposisi matriks ekstraseluler dan meningkatkan  fibrosis.  Namun  demikian,  VEGF sebenarnya juga berperan dalam pemulihan sel endotel sinusoid ( liver sinusoidal endothelial cells /LSEC)  yaitu  normalisasi  penetrasi  dan  fungsi, serta inaktivasi dan apoptosis HSC. Merujuk pada hal tersebut terapi anti-angiogenik dengan mentargetkan reseptor VEGF (VEGFR2 atau VEGFR2 dan VEGFR1) dapat menjadi suatu strategi pengendalian fibrosis pada kasus cedera hati. 1 Proses  fibrosis  pada  cedera  hati  melibatkan HSC  dan  sel-sel  non-parenkim  lain,  misalnya  sel Kupffer  dan  LSEC.  HSC  merupakan  sel  utama yang memproduksi VEGF dan reseptornya. Selain itu,  VEGF  juga  diproduksi  oleh  hepatosit  melalui jalur autokrin dan parakrin, terjadi kaskade sinyal VEGF dan reseptornya, terutama reseptor tyrosine
kinase VEGFR2 ( kinase insert domain receptor or fetal liver kinase; KDR/Flk-1 ) 1,4,5 yang memodulasi aktivitas  pro-fibrogenik  HSC  dan  LSEC. Selanjutnya,  angiopoietin-1  (ANGPT)  diproduksi dan  mengaktivasi  Tie-2 tyrosine-protein kinase receptors (epidermal growth factor homology-2 ) di membran sel LSEC sehingga terjadi stabilitas pembuluh darah dan proses angiogenesis. Peran LSEC dalam perkembangan penyakit hati berhubungan erat dengan VEGF yang disekresikan oleh hepatosit dan HSC. 4
Peran  ganda  VEGF  dalam  proses  fibrosis hati ini menimbulkan pertanyaan dalam pengembangan strategi penanganan fibrosis hati. 1 Apakah peningkatan ataukah penghambatan ekspresi VEGF yang merupakan penanda baik dalam proses regenerasi jaringan hati. Pada penelitian sebelumnya oleh Liem et al 6 telah dikembangkan sebuah model hewan cedera hati kronis,  yaitu  tikus  Wistar  yang  diinduksi  dengan 2AAF/CCl 4 . Kombinasi pemberian CCl 4 selama 12 minggu dan dosis tinggi 2AAF selama 2 minggu dapat  menyebabkan  kerusakan  hati  dan  fibrosis luas, sehingga tikus 2AAF/CCl 4 ini dapat menjadi kandidat model tikus cedera hati kronis. 6 Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah pada cedera hati kronis terjadi peningkatan ekspresi VEGF  atau  tidak,  pada  tikus  model  cedera  hati kronis tersebut dilakukan observasi ekspresi VEGF pada jaringan hati dengan teknik imunohistokimia. Penelitian ini akan membawa manfaat pada penelitian selanjutnya terkait patogenesis cedera hati kronis dan dapat diaplikasikan dalam strategi penanganan kasus fibrosis hati.

## Metode
Subyek dan Desain Penelitian Penelitian ini menggunakan desain penelitian eksperimental dengan jaringan hati tikus ( Rattus norvegicus )  galur  Wistar  jantan.  Tikus  melalui proses  adaptasi,  induksi,  perawatan,  dan pembedahan  di Klaster Animal Research Facilities (ARF) IMERI Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (FKUI) sesuai dengan metode yang dilakukan pada penelitian Liem et al. 6 Sedangkan pembuatan  blok  parafin,  pemotongan  jaringan, pewarnaan hematoxylin eosin (HE) untuk observasi morfologi hati dan kerusakan jaringan hati,  Masson’s  trichrome  (MT)  untuk  observasi fibrosis,  dan  imunohistokimia  (IHK)    terhadap VEGF dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi FKUI. Penelitian dilakukan pada bulan Oktober
Ekspresi VEGF Jaringan Hati Tikus 2AAF/CCl4
eJKI Vol. 11, No. 1, April 2023
2019 hingga April 2021. Penelitian telah lolos kaji etik dari Komite Etik FKUI dengan nomor 1040/ UN2.F1/ETIK/2018.
Pembuatan Model Hewan Cedera Hati Kronis dan Pengelolaan Sediaan Histopatologi Metode induksi 2AAF/CCl 4 dilakukan selama 12 minggu sesuai dengan metode Liem et al 6
terhadap 12 ekor tikus yang dibagi menjadi dua kelompok penelitian, yaitu Kelompok Kontrol (1) dan Kelompok Perlakuan (2) (Tabel 1). 6 Jumlah sampel yang digunakan merujuk pada persamaan “ E= total jumlah hewan- total jumlah kelompok” , dengan nilai E= 10 atau 20, sehingga diperoleh rentang sampel yang dapat digunakan untuk masing- masing kelompok yakni 6 sampai 11 sampel. 7
Observasi kerusakan dan fibrosis jaringan hati, serta ekspresi VEGF dilakukan dengan bantuan mikroskop  cahaya  (tipe  Leica  DM750)  perbesaran 400x pada lima lapang pandang. Kriteria kerusakan dan fibrosis jaringan hati pada sediaan jaringan hati yang diwarna HE dan ME merujuk pada kriteria NAFLD activity score (NAS),  yang  dikembangkan oleh Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network (NASH  CRN)  seperti  pada  Tabel  2  dan 3. 8 Pengukuran  ekspresi  VEGF,  melalui  pulasan imunohistokimia menggunakan antibodi primer VEGF ([C-1]: sc-7269 Santa Cruz) dan mengikuti
Tabel 1. Perlakuan Subyek Penelitian Kelompok n Usia awal (minggu) Usia dekapitasi (minggu) Perlakuan 1 6 8 20 Injeksi 2 ml minyak zaitun subkutan (s.c.) dan normal saline intragastric selama 12 minggu. 2 6 8 20 Injeksi CCl 4 (dalam minyak zaitun 1:1) 2 mL/kgBB s.c., diberikan 2x seminggu (selama delapan minggu). CCl 4 + minyak zaitun (3:7) s.c. (selama empat minggu). Awal minggu ke-9 diberi 2AAF 10 mg/kgBB dalam polyethylene glycol (PEG) intragastrik setiap hari.
protokol sesuai data sheet. Pengukuran ekspresi VEGF dengan menghitung jumlah sel positif yang mengekspresikan VEGF per 100 sel hepatosit setiap lapang pandang. Ekspresi VEGF pada sitoplasma hepatosit dan sinusoid ditunjukkan dengan warna coklat. Intensitas warnanya dibagi menjadi tiga kategori, yakni coklat tua untuk positif kuat, coklat untuk positif sedang, dan coklat muda untuk positif lemah. Rumus penilaian ekspresi VEGF mengikuti formulasi skor VEGF = (Jumlah sel positif kuat x 3) + (jumlah sel positif sedang x 2) + (jumlah sel positif lemah x 1) + (jumlah sel negatif x 0). 9
Tabel 2. Skoring Derajat Kerusakan Hati Berdasarkan Kriteria NAS 8 Jenis Kerusakan Kriteria Skor* Steatosis <5% (minimal) 0 5-33% (ringan) 1 34-66% (sedang) 2 >66% (berat) 3 Inflamasi 0 (tidak ada) 0 <2 foci 1 2-4 foci 2 >4 foci 3 Ballooning 0 (tidak ada) 0 Sedikit 1 Banyak (nyata) 2
*Derajat kerusakan dihitung dengan menjumlahkan skor ketiga jenis kerusakan dengan rentang nilai 0-8. Derajat 0: tidak ada kerusakan, 1-3: kerusakan ringan, 4-5: kerusakan sedang, 6-8: kerusakan berat
Gambar 1.   Jaringan hati tikus dengan pulasan HE. a dan b adalah Kelompok 1 (Kontrol). a. Morfologi hati normal. Hepatosit (H) terdistribusi radier di sekeliling vena sentral (CV), b. Hepatosit (H) berjajar erat menghadap lumen sinusoid. c dan d adalah Kelompok 2 (Perlakuan). c. Tampak sel radang sebagai tanda suatu reaksi inflamasi (kotak dengan garis putus-putus). d. ballooning (panah hitam). PV: vena porta, garis skala: 200µm.

## Analisis statistik
Derajat  kerusakan  dan  fibrosis  jaringan  hati dilaporkan secara deskriptif sesuai dengan kriteria NAS (Tabel 2 dan 3). Apabila distribusi skor VEGF tidak  normal,  maka  analisis  perbedaan  ekspresi VEGF antara kelompok 1 dan 2 diuji dengan uji Mann  Whitney,  menggunakan  piranti  lunak  IBM SPSS 23.0. Hasil yang diperoleh dilanjutkan dengan  uji  korelasinya,  antara  ekspresi  VEGF dengan derajat kerusakan hati dan fibrosis hati.

## Hasil
Kerusakan dan Fibrosis Hati Seluruh kelompok kontrol memperlihatkan morfologi  jaringan  hati  normal,  yakni  pola  lobular klasik. Hepatosit terdistribusi radial mengelilingi vena sentral dipisahkan oleh sinusoid-sinusoid
Tabel 3. Derajat Fibrosis Jaringan Hati Berdasarkan NAS 8 Derajat Fibrosis Skor* Tidak ada fibrosis 0 Fibrosis ringan pada zona 3 1a Fibrosis sedang pada zona 3 1b Fibrosis pada portal/periportal 1c Fibrosis pada zona 3 dan portal/periportal 2 Bridging fibrosis 3 Sirosis 4
* Untuk kepentingan pengolahan data, skor 1a, 1b, 1c dikategorikan menjadi skor 1
(Gambar  1).  Trias  porta  juga  tampak  di  perifer lobulus hati (tidak diperlihatkan). Sedangkan kelompok perlakuan memperlihatkan tanda-tanda kerusakan hati yaitu pola lobulus tidak teratur dengan hepatosit tampak mengecil berinti piknotik. Tampak pula gambaran inflamasi, steatosis dan ballooning (Gambar 1). Gambaran kerusakan hati ini tampak di  seluruh  sampel  kelompok  2,  terdiri  atas  derajat 4 (5 dari 6 sampel) dan 6 (1 dari 6 sampel) dengan cakupan area ( coverage area ) mencapai 70% dari seluruh lapangan pandang yang diperiksa. Fibrosis tampak di seluruh sampel kelompok 2 (Gambar 2), mencapai derajat fibrosis 2 atau fibrosis pada zona 3 dan porta/periportal pada sebagian besar sampel (4 dari 6), dengan cakupan area sebesar 30%  dan 2 sampel dengan derajat fibrosis 1. Semua sampel kelompok 1 tidak mengalami fibrosis.
Gambar 2.   Jaringan hati tikus dengan pulasan MT. a dan b adalah Kelompok 1 (Kontrol). Serat kolagen tampak di sekitar  vena  porta  (PV).  c  dan  d  adalah  Kelompok  2  (perlakuan).  c.  Tampak  fibrosis  (panah)  di  sekitar vena sentral (CV), dan d. Tampak reaksi duktular (D) di antara serat-serat kolagen (fibrosis; panah) dalam parenkim hati. Garis skala bar: 10 µm.
Gambar 3.   Jaringan hati tikus dengan pulasan IHK VEGF. a dan b adalah Kelompok 1 (Kontrol). Tampak hepatosit (H), endotel dan sinusoid positif lemah hingga sedang (panah). c dan d. adalah Kelompok 2. Tampak densitas warna coklat lebih nyata dan terdistribusi lebih luas dan merata pada hepatosit, endotel dan lumen sinusoid (panah). CV: vena sentral (CV), garis skala bar: 10 µm.

## Ekspresi VEGF
VEGF  tampak  terekspresi  pada  hepatosit, endotel,  dan  lumen  sinusoid  sampel  di  kelompok 1 dan 2 namun ekspresi dengan densitas lebih tinggi tampak di kelompok 1(Gambar 3). Median
skor VEGF kelompok 1 sebesar 112   94-129) sedangkan  kelompok  2    sebesar  115  ((min-max: 97-141).  Namun  demikian,  skor  ekspresi  kedua kelompok tersebut tidak berbeda secara signifikan (uji Mann-Whitney U; p=0,688).
Isabella K Liem, et al
Uji Korelasi Ekspresi VEGF dengan Kerusakan Hati dan Derajat Fibrosis Hasil yang telah diperoleh dilanjutkan pengujiannya untuk mengetahui hubungan antara ekspresi VEGF dengan kerusakan hati dan derajat fibrosis.  Setelah  dilakukan  uji  korelasi  Pearson diperoleh bahwa tidak terdapat hubungan korelasi antara ekspresi VEGF dengan skor kerusakan hati (p=  0,809;  r=  0,078)  dan  derajat  fibrosis  hati  (p= 0,847; r= 0,063)
Diskusi Hasil penelitian memperlihatkan bahwa seluruh jaringan hati kelompok 2 yang diinduksi dengan 2AAF/CCl 4 mengalami kerusakan dan fibrosis  dibandingkan  dengan  kelompok  1  yang memperlihatkan morfologi jaringan hati normal. Pada kelompok  2,  sebagian  besar  sampel  mengalami kerusakan  derajat  5  (sedang)  dengan  cakupan luas, yaitu mencapai 70%. Kerusakan hati ini diikuti dengan reaksi duktular yang mengimplikasikan terjadinya aktifasi sel progenitor hati endogen (sel oval). Kondisi ini khas untuk model tikus cedera hati 2AAF/CCl 4 , karena pada model cedera hati ini proliferasi hepatosit dihambat oleh 2AAF. 6,10-12 Hasil penelitian ini sejalan dengan penelitian sebelumnya yang menyebutkan bahwa kelompok yang diinduksi oleh senyawa hepatotoksik menunjukkan karakteristik kerusakan hati yang ditandai dengan adanya  inflamasi,  steatosis,  dan ballooning . 13,14
Fibrosis pada kelompok perlakuan sebagian besar mencapai derajat 2 (fibrosis pada zona 3 dan porta/ periporta) dengan cakupan area 30%, artinya proses cedera hati belum mencapai tahap akhir ( end state ) atau sirosis hati. 8 Fibrosis pada model 2AAF/CCl 4 juga mengindikasikan bahwa kerusakan hepatosit terjadi berkelanjutan dan sedang berlangsung, yang kemudian  diikuti  oleh  fibrosis.  Dengan  demikian, model hewan pada penelitian ini dapat mewakili kondisi cedera hati kronis luas.
Penelitian-penelitian  pada  pasien  cedera  hati, yakni  kasus-kasus  hepatitis  akut,  hepatitis  kronis, sirosis, dengan atau tanpa HCC, dan dengan atau tanpa hipertensi porta menunjukkan kadar VEGF yang  berbeda,  bergantung  pada  proses  yang sedang  berlangsung.  Pada  penelitian  ini,  telah dilakukan penelusuran proses angiogenesis melalui penanda VEGF 1,3,15 dan diketahui bahwa produksi VEGF pada Kelompok Perlakuan tidak berbeda dengan  Kelompok  Kontrol.  Walaupun  demikian, tampak adanya tendensi peningkatan produksinya pada Kelompok Perlakuan. Jika data penelitian
dilanjutkan dengan analisis korelasi juga tidak memperlihatkan adanya korelasi antara kadar VEGF dengan derajat kerusakan hati. Beberapa penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa kadar VEGF pada kasus cedera hati berbeda signifikan dibandingkan dengan kondisi normal (kontrol). Penelitian Atta et al 2 pada 90 subyek dengan hepatitis C kronis tanpa karsinoma hepatoseluler (non-HCC) dan dengan HCC memperlihatkan bahwa rerata kadar VEGF plasma pada kedua kasus lebih tinggi secara bermakna dibandingkan dengan kontrol (pasien tanpa hepatitis). Kadar VEGF pada hepatitis C kronis non-HCC 1,4 kali dan hepatitis C kronis dengan HCC 3,6  kali  lebih  tinggi  dibandingkan  kontrol. 2 Sejalan dengan penelitian ini,  Kwon et al 16 yang melakukan penelitian pada 168 orang pasien mendapati bahwa pasien hepatitis kronis memang memiliki kadar VEGF lebih rendah dibandingkan dengan pasien sirosis hati dan HCC. 16 Sedikit  berbeda,  Assy  et al 17 pada penelitiannya terhadap 53 pasien dengan hepatitis  C,  hepatitis  B  dan  sirosis  hati  mendapati bahwa  kadar  VEGF  lebih  tinggi  secara  signifikan pada kasus hepatitis akut dan lebih rendah pada kondisi sirosis. Selain itu, didapati juga bahwa pada kondisi tanpa hipertensi porta kadar VEGF akan lebih tinggi dibandingkan kondisi dengan hipertensi porta. 17 Berbeda  dari  penelitian-penelitian  di  atas, Husen et al 18 mendapati bahwa kadar VEGF serum tidak berkorelasi dengan derajat fibrosis, walaupun ada kecenderungan peningkatan kadar VEGF serum pada fibrosis berat (F3; pemeriksaan dengan teknik  elastografi). 18 Walaupun  tidak  ada  korelasi kadar VEGF serum, Franchitto et al, 19 menunjukkan hasil adanya peningkatan ekspresi VEGF dari biopsi hati pada kondisi sakit  serta menyebutkan peran penting VEGF yang mendukung perluasan relung HPC melalui efek autokrin dan parakrin sel tetangga yang merangsang proliferasi HPC dan sel endotel. Aspek-aspek ini dapat memiliki implikasi penting dalam  proses  fibrogenik  dan  karsinogenesis. 19 Kesimpulan sementara yang dapat diambil adalah kadar VEGF tidak berhubungan dengan kerusakan hati dan derajat fibrosis. Ekspresi VEGF di jaringan tampaknya  merefleksikan  peningkatan  hipertensi porta, penurunan aktivitas regenerasi atau kombinasi keduanya,  juga  ada  tidaknya  perkembangan kerusakan hati menuju ke arah keganasan. 2
Kesimpulan Tikus  yang  diinduksi  dengan  2AAF/CCl 4 selama 12 minggu mengalami kerusakan hati luas derajat  sedang,  serta  fibrosis  sedang  derajat  2. Sehingga dapat digunakan sebagai model hewan
Ekspresi VEGF Jaringan Hati Tikus 2AAF/CCl4
eJKI Vol. 11, No. 1, April 2023
coba cedera hati kronis. Pada jaringan hati tikus model cedera hati 2AAF/CCl 4 terdapat peningkatan ekspresi VEGF namun tidak berbeda bermakna.

## Ucapan Terima Kasih
Terima  kasih  kepada  Departemen  Anatomi FKUI, Departemen Patologi Anatomi FKUI, Animal Research Facilities IMERI  FKUI,  dan  Kepala Program Magister Ilmu Biomedik FKUI. Penelitian dilaksanakan atas dukungan hibah Penelitian Dasar Unggulan Perguruan Tinggi (PDUPT).

## Daftar Pustaka
1. Park S, Kim JW, Kim JH, Lim CW, Kim B. Differential roles of angiogenesis in the induction of fibrogenesis and  resolution  of  fibrosis  in  liver.  Biol  Pharm  Bull. 2015;38:980-5. doi:10.1248/bpb.b15-00325
2. Atta MMEA, Atta HM, Gad MAM, Rashed LA, Said EM,  Hassanien  SESA,  and  Kaseb  AO.  Clinical significance  of  vascular  endothelial  growth  factor in hepatitis C related hepatocellular carcinoma in Egyptian patients.  J Hepatocell Carcinoma. 2016;6:19-24. doi:10.2147/JHC.S86708
3. Duffy  AM,  Bouchier-Hayes  DJ,  and  Hermey  JH. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its roles in non-endothelial cells: autocrine signalling by VEGF. In: Madame Curie Bioscience Database [Internet].  Austin  (TX):  Landes  Bioscience;  2013 [cited 2021 May 29]. Available from: https://www. ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6482/
4.  Ramirez-Pedraza M and Fernandez M. Interplay between macrophages and angiogenesis: a double- edged sword in liver disease. Front Immunol. 2019;10:1-12. Available from: https://www.frontiersin. org/articles/10.3389/fimmu.2019.02882/full
5. Shibuya M. VEGF-VEGFR signals in health and disease.  Biomol  Ther.  2014;22:1-9.  doi:10.4062/ biomolther.2013.113
6. Liem  IK,  Zakiyah  Z,  Oktavina  R,  Deraya  IE, Kodariah R, Krisnuhoni E, Wuyung PE. Comparison of two methods of 2AFF/CCl4 exposure to induce severe liver injury. eJKI. 2020;8:164171. https://doi/ org/10.23886/ejki.8.12368.
7. Charan, J., & Kantharia, N. How to calculate sample size in animal studies?. J Pharmacol Pharmacother. 2013;4:303-6. doi:10.4103/0976-500X.119726
8. Kleiner DE, Brunt EM, Natta MV, Behling C, Contos MJ,  Cummings  OW,  et  al.  Design  and  validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty  liver  disease.  Hepatology.  2005;41:1313-21. doi:10.1002/hep.20701
9. Varghese  F,  Bukhari  AB,  Malhotra  R,  De  A. IHC  Profiler:  an  open  source  plugin  for  the quantitative evaluation and automated scoring of immunohistochemistry images of human tissue samples. PLoS One. 2014;9:1-10. doi:10.1371/ journal.pone.0096801
10. Petersen BE, Zajac VF, Michalopoulos GK. Hepatic oval cell activation in response to injury following chemically induced periportal or pericentral damage in rats. J Hepatol. 1998;27:1030–38. doi:10.1002/ hep.510270419
11. Pritchard  MT,  Apte  U.  Models  to  study  liver regeneration. Liver regeneration. Cambridge: Elsevier  Inc.  2015:15-40.  https://doi.org/10.1016/
B978-0-12-420128-6.00002-6
12. Tan EK, Shuh M, and Cohen AJ. Liver injury models for induction of hepatic oval cells in rodents. J Liver Res  Disord  Ther.  2015;1:15-27.  doi:  10.15406/ jlrdt.2015.01.00005
13. Tanaka  M,  Miyajima  A.  Liver  regeneration  and fibrosis  after  inflammation.  Inflamm  Regen. 2016;36:1–6. doi:10.1186/s41232-016-0025-2
14. Bria A, Marda J, Zhou J, Sun X, Cao Q, Petersen BE, et al. Hepatic progenitor cell activation in liver repair. Liver Res. 2017;1:81-7. doi:10.1016/j. livres.2017.08.002
15.  Elpek GO. Angiogenesis and Liver Fibrosis. World J Hepatol. 2015;7:377-91. doi:10.4254/wjh.v7.i3.377
16. Kwon SH, Jeong SW, Jang JY, Lee JE, Lee SH, Kim SG et al. Cyclooxygenase-2 and vascular endothelial growth  factor  in  chronic  hepatitis,  cirrhosis  and hepatocellular carcinoma. Clin Mol Hepatol.
2012;18:287-94. doi:10.3350/cmh.2012.18.3.287
17. Assy N, Paizi M, Gaitini D, Baruch Y and Spira G. Clinical implication of VEGF serum levels in cirrhotic patients with or without portal hypertension.  World J Gastroenterol.. 1999;5:296-300. doi: 10.3748/wjg. v5.i4.296
18. Husen L, Siregar GA, dan Lubis M. The difference of  hypoxic  inducible  factor-1,  vascular  endothelial growth  factor,  and  transforming  growth  factor-ß1 based  on  liver  fibrosis  severity  in  patients  with chronic hepatitis B. Open Access Maced J Med Sci.  2021;9:91-5.  doi: https://doi.org/10.3889/ oamjms.2021.5639
19. Franchitto  A,  Onori  P,  Renzi  A,  Carpino  G, Mancinelli  R,  Alvaro  D,  Gaudio  E,  Expression of vascular endothelial growth factors and their receptors by hepatic progenitor cells in human liver diseases.  Hepatobiliary  Surg  Nutr.  2013;2:68-77. doi: 10.3978/j.issn.2304-3881.2012.10.11