## Indonesian Journal of Health Science

## SELEKSI SPERMATOZOA PADA FERTILISASI IN VITRO (IVF)
Amalia Shari amaliashari.hermina@gmail.com, Politeknik Kesehatan Hermina

## ABSTRACT
In  Vitro  Fertilization    (IVF)  is  the  penetration  of  ovum  cells  by  spermatozoa  in  a  culture  system  and  is  a reproductive  technique  that  is  useful  for  increasing  the  efficiency  of  sperm  and  ovum  utilization.  In  vitro fertilization is applied to overcome the problem of infertility and prevent of birth defects. This review article aims to summarize as well as analyze the beginning process in vitro fertilization is spermatozoa selection. The method used in writing this article is  literature review study on the PubMed Central (PMC), Springer, and Open Access Science Direct databases. Journal articles that are in accordance with the theme of the review are then reviewed by paraphrasing the core and common threads of the research. The conclusion from this article review is that the success of IVF is determined by the quality of the spermatozoa. In order to fulfill this, it is necessary to select spermatozoa.  Currently,  the  selection  of  spermatozoa  can  be  reviewed  by  measuring  the  DNA  damage  to spermatozoa, in addition to the selection of spermatozoa based on morphology, motility, and concentration. Keywords: spermatozoa selection, IVF, morphology, motility, DNA sperm.

## Abstrak
Fertilisasi in vitro ( In Vitro Fertilization ) merupakan penyatuan sel ovum dengan spermatozoa dalam suatu sistem kultur dan merupakan salah satu teknik reproduksi yang bermanfaat untuk meningkatkan efisiensi pemanfaatan spermatozoa  serta  ovum.  Fertilisasi  in  vitro  (IVF)  diterapkan  untuk  mengatasi  persoalan  infertilitas  serta pencegahan terhadap kelahiran bayi cacat .Penulisan artikel ini bertujuan untuk merangkum sekaligus menganalisa awal mula seleksi spermatozoa pada fertilisasi in vitro. Metode yang dilakukan dalam penulisan artikel ini dengan cara  studi    literatur  pada  database  PubMed  Central  (PMC),  Springer,  dan  Open  Access  ScienceDirect.  Artikel jurnal  yang  sesuai  dengan  tema  review  kemudian ditelaah  dengan  cara  memparafrasa  kembali  inti  dan benang merah dari penelitian tersebut.  Hasil penelitian adalah keberhasilan IVF salah  satunya ditentukan oleh kualitas spermatozoa,  dalam  rangka  memenuhi  hal  tersebut  perlu  dilakukan  seleksi  spermatozoa,  saat  ini  seleksi spermatozoa  dapat  ditinjau  dengan  pengukuran  kerusakan  DNA  sepermatozoa,  disamping  seleksi  spermatozoa berdasarkan morfologi, motilitas, dan konsentrasi.
Kata kunci : seleksi spermatozoa, IVF, morfologi, motilitas, DNA sperma.

## PENDAHULUAN
Bersatunya  spermatozoa  dengan  ovum  dinamakan  peristiwa  fertilisasi.  Spermatozoa dan ovum berasal dari dua individu yang berbeda, kedua sel ini harus melalui perjalanan yang relatif  panjang.  Spermatozoa  dan  ovum  mengalami  berbagai  macam  proses  persiapan  dan daerah  pertemuan  juga  harus  memenuhi  syarat  agar  spermatozoa  dan  ovum  dapat  dengan mudah bertemu dan bersatu (Respati, 2015).
In  Vitro  Fertilization (IVF)  merupakan  salah  satu  teknik  reproduksi  berbantu  pada manusia yang sedang berkembang.  IVF merupakan  suatu  teknik  penembusan sel  ovum  oleh spermatozoa  dalam  suatu  sistem  kultur  dan  merupakan  salah  satu  teknik  reproduksi  yang berguna untuk meningkatkan efisiensi pemanfaatan sperma dan ovum. Spermatozoa dan ovum dipertemukan  di  dalam  sebuah  tabung  atau  cawan  petri  dengan  diberikan  perlakuan  khusus terlebih dahulu sehingga dapat terjadi fertilisasi, In vitro fertilisasi diterapkan untuk mengatasi masalah infertilitas dan pencegahan terhadap kelahiran bayi cacat (Respati, 2015).
Produksi  embrio  secara  IVF  melalui  tiga  tahap,  yaitu  pematangan  oosit,  pembuahan oosit,  dan  kultur  embrio.  Faktor  keberhasilan  IVF  dengan  indeks  prediksi  tertinggi  yaitu kualitas spermatozoa terdiri dari morfologi, motilitas dan persentase sperma dengan akrosom
utuh. Dalam rangka memenuhi hal tersebut perlu dilakukan seleksi spermatozoa, spermatozoa berkualitas baik dipisahkan dari total populasinya (Walters, A.H dkk, 2004).
Menurut WHO spermatozoa yang berkualitas yaitu spermatozoa yang mempunyai daya hidup  tinggi,  morfologi  yang  normal  dan  motilitas  yang  progresif.  Motilitas  merupakan kemampuan  gerak  maju  spermatozoa  di  dalam  lingkungan  zat  cairnya.  Pergerakan  tersebut penting untuk  membantu  spermatozoa menembus sel-sel  pelindung yang  mengelilingi  ovum (Sujoko dkk, 2009 & Tomsu dkk, 2002). Penulisan ini bertujuan untuk merangkum sekaligus menganalisa  awal  mula  seleksi  spermatozoa  pada  fertilisasi  in  vitro  dan  mengetahui  kriteria sperma dengan kualitas yang baik untuk menunjang proses fertilisasi in vitro.

## METODE
Artikel  review  ini  bertujuan  untuk  merangkum  literatur-literatur  yang  berhubungan dengan  seleksi  spermatozoa  untuk  proses  IVF.  Penulisan  artikel  review  dilakukan  dengan metode  literatur  review  dengan  cara  merangkum  sekaligus  menganalisis  metode  seleksi spermatozoa  untuk  proses  IVF.  Artikel  yang  ditelaah  diperoleh  dengan  cara  pencarian  pada jurnal-jurnal internasional berbahasa inggris pada PubMed Central (PMC), Springer, dan Open Access ScienceDirect. Pencarian dilakukan dengan kata kunci “ Spermatozoa Selection”, “In Vitro  Fertilization”,  “Morphology  spermatozoa”,  “Motility  of  spermatozoa”, dan “DNA spermatozoa”.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Sejarah Mikro Injeksi
Pada awal abad ke-20 beberapa teknik manipulasi mikro yang secara ekslusif diterapkan pada sel hidup telah berkembang. Seorang ilmuan yang bernama Kite pada tahun 1911, telah berhasil memisahkan pronukleus yang baru terbentuk pada zigot menggunakan jarum mikro. Selanjutnya Kite berpikir tentang apa yang akan terjadi bila spermatozoa diinjeksikan secara langsung  ke  dalam  sel  ovum.  Kemudian  Pemikiran  tersebut  diwujudkan  dengan menginjeksikan dua hingga dua belas spermatozoa ke sebuah sel ovum namun tak satupun sel ovum terbuahi (Saili dkk, 2005).
Beberapa alat yang menunjang untuk pengerjaan manipulasi mikro telah berhasil dibuat antara  lain  joystick  oleh  Emmerson  pada  tahun  1928,  secara  langsung  dapat  mengatur pergerakan alat manipulasi mikro sesuai keinginan operator. Alat ini selanjutnya dikembangkan oleh De Fonbrune pada tahun 1928 menggunakan prinsip hidrolik. Selain itu De Fonbrune pada tahun  1934  juga  menciptakan  alat microforge yang  masih  tetap  dipergunakan  oleh  banyak peneliti  hingga  sekarang.  Teknik  manipulasi  mikro  telah  berkermbang  secara  bertahap  lebih dari  satu  abad  dan  sudah  mencapai  tingkat  keberhasilan  hingga  para  peneliti  telah  mampu memotong sebuah kromosom tunggal (Saili dkk, 2005).

## Spermatogenesis
Reproduksi  pria  menghasilkan  sel  spermatozoa.  Sel  tersebut  mempunyai  bentuk spesifik yang terdiri atas kepala, leher dan ekor. Spermatozoa adalah sel hasil maturasi dari sel epitel  germinal  yang  disebut  spermatogonia.  Spermatogonia  terletak  dalam  dua  sampai  tiga sepanjang  lapisan  batas  luar  epitel  tubulus.  Proses  perkembangan  spermatogonia  menjadi

## Indonesian Journal of Health Science
spermatozoa  disebut  spermatogenesis.  Proses  spermatogenesis  terjadi  di  dalam  tubulus seminiferus selama kehidupan seksual aktif. Proses tersebut terjadi akibat dari rangsangan oleh hormon gonadotropin yang dihasilkan oleh hipofisis anterior dan dimulai rata-rata pada usia 13 tahun dan berlangsung sepanjang hidup (Wododo dkk, 2005).
Pada tahap pertama dari spermatogenesis, spermatogonia primitif berkumpul  tepat  di tepi membran basal dari epitel germinativum, disebut spermatogonia tipe A, membelah empat kali untuk membentuk 16 sel yang lebih berdiferensiasi, yaitu spermatogonia tipe B. Pada tahap ini,  spermatogonia  bermigrasi  ke  arah  sentral  di  antara  sel-sel  Sertoli.  Sel-sel  Sertoli mempunyai membran yang sangat kuat berlekatan satu sama lain pada bagian dasar dan bagian sisi, sehingga dapat membentuk suatu lapisan pertahanan yang mencegah dari peneterasi dari kapiler-kapiler  yang  mengelilingi  tubulus.  Namun  spermatogonia  yang  sudah  dipersiapkan untuk menjadi spermatozoa dapat menembus lapisan pertahanan tersebut (Wododo dkk, 2005).
Proses  berikutnya  ialah  pembelahan  secara  meiosis.  Dalam  waktu  24  hari,  setiap spermatogonium  yang masuk ke dalam lapisan sel-sel  sertoli  dimodifikasi  secara berangsur- angsur dan membesar untuk membentuk suatu spermatosit primer. Pada akhir hari ke-24, setiap spermatosit  membelah  menjadi  dua  spermatosit  sekunder.  Pembelahan  ini  disebut  sebagai pembelahan meisosis pertama. Pada tahap awal pembelahan meiosis ini, semua DNA dalam 46 kromosom bereplikasi. Dalam proses ini, masing-masing 46 kromosom menjadi dua kromatid yang tetap berikatan bersama pada sentromer, kedua kromatid memiliki gen-gen duplikat dari kromosom  tersebut.  Pada  waktu  ini,  spermatosit  primer  membelah  menjadi  dua  spermatosit sekunder,  yang  setiap  kromosom  berpisah  sehingga  ke-23  kromosom,  yang  masing-masing memiliki dua kromatid, pergi ke salah satu spermatosit sekunder sementara 23 kromosom yang lain pergi ke spermatosit sekunder lainnya. Dalam dua sampai tiga hari, pembelahan meiosis kedua terjadi, di mana kedua kromatid dari 23 kromosom berpisah pada sentromer, membentuk dua pasang 23 kromosom, satu pasang terdapat dalam satu spermatid dan satu pasang yang lain terdapat pada spermatid kedua (Wododo dkk, 2005).
Beberapa  minggu  berikutnya  setelah  tahap  pembelahan  meiosis,  setiap  spermatid kembali dimodifikasi oleh sel-sel sertoli secara mengubah spermatid perlahan lahan menjadi suatu  spermatozoa  dengan  cara  menghilangkan  beberapa  sitoplasmanya,  mengatur  kembali bahan kromatin dari inti spermatid untuk membentuk satu kepala spermatozoa yang padat, dan mengumpulkan  sisa  sitoplasma  dan  membran  sel  pada  salah  satu  ujung  dari  sel  untuk membentuk ekor. Bentuk akhir spermatozoa terdiri atas kepala, dan ekor (Wododo dkk, 2005).

## Gambar 1. Proses spermatogenesis (Sherwood, 2012)

## Seleksi Spermatozoa
Seleksi  spermatozoa  dapat  dilakukan  dengan  mengetahui  kualitas  spermatozoa  dan kerusakan DNA sperma.

## Kualitas spermatozoa
Ciri-ciri spermatozoa yang berkualitas, yaitu mempunyai daya hidup tinggi, morfologi normal dan motilitas progresif. Spermatozoa normal memiliki tiga bagian yaitu kepala, leher, dan  ekor.  Bila  salah  satu  bagian  tersebut  tidak  ada  atau  bentuknya  abnormal  menyebabkan kemampuan sel sperma untuk membuahi sel ovum menjadi menurun. Sperma dianggap normal jika bentuk sperma normal sekitar 30% dari tiap ejakulat (Respati, 2015).
Volume 2 No. 1, 2022
Gambar 2. Morfologi spermatozoa dewasa (WHO Guideline, 2010 ) Motilitas merupakan kemampuan gerak maju spermatozoa di dalam lingkungan zat cair. Pergerakan tersebut penting dalam membantu spermatozoa menembus sel-sel pelindung yang mengelilingi  sel  ovum. Jenis  motilitas  spermatozoa  tergantung  dari  gerakan  ekor,  kemajuan, arah, dan kecepatan spermatozoa (Sujoko, 2009).
WHO  2010  manual,  merekomendasikan  penggunaan  sistem  yang  sederhana  untuk pengelompokan motilitas yang membedakan spermatozoa dengan motilitas progresif atau non progresif  dari  yang  bersifat  immotil.  Motilitas  setiap  spermatozoa  dapat  dikelompokkan sebagai  berikut:  (1)  Motilitas  progresif  (PR):  spermatozoa  bergerak  aktif,  baik  secara  linear atau dalam lingkaran besar, terlepas dari kecepatan spermatozoa itu sendiri; (2) Motilitas non- progresif (NP): semua pola lain dari motilitas dengan ketiadaan progresif, misalnya berenang di lingkaran kecil atau ketika flagella hanya bergetar yang dapat diamati; (3) Immotility (IM): tidak ada gerakan (Franken dkk, 2012).
Motilitas  spermatozoa  dapat  dipertahankan  dengan  adanya  hormon  prolaktin  PRL. Munculnya  hormon  ini  tidak  hanya  menekan  kapasitasi  tapi  juga  memperpanjang  motilitas spermatozoa  (Pujianto  dkk,  2010).  Motilitas  spermatozoa  sangat  rentan  dengan  perubahan kondisi lingkungan. Sewaktu penampungan harus diperhatikan agar ejakulat tidak mengalami penurunan  suhu  secara  mendadak  ( cold  shock) yang  sangat  mempengaruhi  motilitas spermatozoa.  Panas  yang  berlebih-lebihan  dan  bahan-bahan  kimia  atau  benda  asing  lainnya juga dapat menurunkan motilitas spermatozoa (Widodo dkk, 2005). Syarat minimal konsentrasi spermatozoa untuk  IVF adalah 1 juta sel/ml, motilitas progresif 40%, spermatozoa hidup 40% dan abnormalitas kurang dari 14% (Sujoko dkk, 2009).

## Tes Kerusakan DNA sperma
Penyebab  kerusakan  DNA  sperma  ini  sebagian  besar  tidak  diketahui,  meskipun  ada bukti yang menunjukkan bahwa cacat genetik mungkin mendasari beberapa kerusakan DNA sperma. Berbagai tes telah dikembangkan untuk mengukur kerusakan DNA sperma, seperti tes pewarnaan acridine  orange ,  SCSA ,  Comet dan  TUNEL assay.  Comet dan  TUNEL assays , mendeteksi  kerusakan  DNA  yang  sebenarnya.  Pendekatan  lain  mengukur  kerentanan denaturasi  DNA,  yaitu  pembentukan  DNA  beruntai  tunggal  dari  DNA  beruntai  ganda. Pendekatan  ini  tergantung  pada  fakta  bahwa  DNA  yang  terdenaturasi  lebih  mudah  daripada DNA beruntai ganda. Beberapa tes bergantung pada pengikatan pewarna yang berbeda untuk DNA beruntai tunggal dan DNA beruntai ganda (Zini dkk, 2009).
Comet  assay mengukur  kerusakan  DNA  dengan  kuantifikasi single-stranded dan double-stranded  breaks yang  dikaitkan  dengan  kerusakan  DNA.  Dalam  pengujian  ini, spermatozoa  yang  diwarnai  dengan  pewarna fluorescent DNA-binding .  Gambar  yang dihasilkan  menyerupai  “komet”,  yang  diukur  setelah  pewarnaan  untuk  menentukan  tingkat kerusakan DNA. Karakteristik yang telah digunakan untuk analisis meliputi diameter  nucleus dan  panjang  komet.  Salah  satu  prinsip  dari comet  assay adalah  bahwa  potongan double- stranded DNA cenderung untuk tetap berada di kepala komet, sedangkan fragmen pendek dari potongan DNA double-stranded dan single-stranded pindah ke area ekor. Dengan demikian, spermatozoa  dengan  tingkat  tinggi  dari  DNA strand  breaks akan  menunjukkan  peningkatan
intensitas fluorescent ekor komet dan panjang ekor komet. Namun, ambang batas yang berguna belum ditetapkan untuk comet assay (Agarwal, 2003).
In-situ nick translation (NT) assay mengkuantifikasi penggabungan biotinylateddeoxyuridine trifosfat (dUTP) pada single-stranded DNA breaks dalam reaksi yang dikatalisis oleh enzim template-dependent , DNA polimerase I. NT assay akan mengidentifikasi spermatozoa yang mengandung kadar cukup dan variabel endogen kerusakan DNA. Nilai klinis dari NT assay sangat terbatas karena tidak ada korelasi yang telah terbukti dengan fertilisasi selama di-vivo, dan karena kurangnya sensitivitas dibandingkan dengan tes lainnya (Agarwal, 2003).
TUNEL assay mengkuantifikasi  penggabungan  deoxyuridine  trifosfat  (dUTP)  pada single-stranded dan double-stranded DNA breaks dalam  reaksi  yang  dikatalisis  oleh  enzim template-independent , terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT). dUTP yang telah digabung diberi label sehingga DNA breaks bisa diukur dengan flow cytometri , mikroskop fluorescent atau mikroskop cahaya (Agarwal, 2003).
SCSA merupakan flow cytometric assay yang bergantung pada fakta kromatin sperma abnormal yang sangat rentan terhadap induksi fisik dari denaturasi DNA parsial in situ . Tingkat denaturasi DNA setelah perlakuan panas atau asam, ditentukan dengan mengukur pergeseran metachromatic dari fluoresensi hijau ( acridine orange diselingi menjadi double-stranded asam nukleat)  menjadi  fluoresensi  merah  ( acridine  orange terkait  dengan  DNA single-stranded ). Parameter  yang  paling  penting  dari  SCSA  adalah  fragmentasi  DNA  index  (%  DFI),  yang mewakili populasi sel dengan kerusakan DNA (Agarwal, 2003).
Acridine  orange  test (AOT)  diperkenalkan  sebagai  metode  mikroskopis  sederhana seperti    SCSA  yang  tidak  memerlukan  peralatan flow  cytometry mahal  dan  teknisi  SCSA terlatih. Hal ini bergantung pada interpretasi visual dari fluorescing spermatozoa dan butiran yang  jatuh  ke  dalam  berbagai  warna  di  bawah  pemeriksaan  mikroskopis.  Warna  tidak  jelas, pelebaran  fluoresensi  secara  cepat  memudar  dan  pewarnaan  bergeser  secara  heterogen memperburuk  masalah  dengan  interpretasi.  Kondisi  tersebut  menghalangi  penggunaan  AOT untuk  diagnosis  klinis  kritis  dan  prognosis  dari  sampel  semen,  karena  AOT  dapat  mengenal banyak  sumber  variasi.  Meskipun  beberapa  laboratorium  telah  menggunakan  AOT  dalam upaya untuk  meningkatkan evaluasi  fertilitas laki-laki, nilai  prediktif dari  tes untuk  fertilitas manusia masih kontroversi. Namun, dalam kaitannya dengan signifikansi klinis pengujian ini, terdapat korelasi positif yang kuat antara AOT dan tes TUNEL. Selain itu, AOT berkorelasi negatif dengan motilitas sperma (Agarwal, 2003).
Sperm  chromatin  dispersion  (SCD)  test ,  uji  ini  baru-baru  ini  digambarkan  sebagai sebuah metode yang sederhana dan murah untuk analisis fragmentasi DNA sperma. Tes SCD didasarkan  pada  prinsip  bahwa  sperma  dengan  DNA  terfragmentasi  gagal  menghasilkan karakteristik  halo  bila  dicampur  dengan  aqueous  agarose  berikut  denaturasi  asam  dan penghapusan protein nuklear (Agarwal, 2003).
Meskipun  setiap  tes  mengukur  kerusakan  DNA  secara  berbeda,  pada  umumnya berkorelasi baik dengan satu sama lain (terkecuali tes pewarnaan orange acridine) dan tes itu juga umumnya berkorelasi terbalik dengan konsentrasi sperma. Secara umum, kerusakan DNA signifikan  jarang  ditemukan  pada  laki-laki  fertil,  dan  insidensi  kerusakan  DNA  lebih  tinggi
pada pria infertil. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa tingkat kerusakan DNA sperma dapat memprediksi kemungkinan keguguran berulang (Dolores, 2010).
Sejumlah  penelitian  telah  menguji  pengaruh  integritas  DNA  sperma  pada  tingkat kehamilan  setelah  IVF  standar.  Sebuah  tinjauan  sistematis  dan  meta-analisis  IVF  penelitian menunjukkan bahwa kerusakan DNA sperma dikaitkan dengan tingkat kehamilan IVF rendah dengan gabungan OR 1,57 (95% CI, 1,18-2,07, P, 05). (Zini, 2009).

## PENUTUP
Saat  ini fertilisasi  in  vitro (IVF) dijadikan salah  satu  cara untuk  mengatasi  persoalan infertilitas. Keberhasilan IVF salah satunya ditentukan oleh kualitas spermatozoa, maka dari itu  dalam  rangka  memenuhi  hal  tersebut  perlu  dilakukan  seleksi  spermatozoa.  Seleksi spermatozoa  dilakukan  dengan  cara  memisahkan  spermatozoa  berkualitas  baik  dari  total populasi. Kualitas spermatozoa dilihat dari morfologi spermatozoa, motilitas spermatozoa dan konsentrasi  spermatozoa. Seleksi  spermatozoa dapat  ditinjau juga menggunakan pengukuran kerusakan DNA sepermatozoa. Saat ini pengukuran kerusakan DNA telah berkembang, seperti dengan teknik tes pewarnaan acridine orange, SCSA, Comet, serta TUNEL assay.

## DAFTAR PUSTAKA
Agarwal,  A.  and  Tamer  M.Said.  (2003).  Role  of  sperm  chromatin  abnormalities  and  DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update . 9(4): 331-345.
Franken, D.R., Sergio O. (2012). Semen Analysis and Sperm Function Testing. Asia Journal of Andrology . 14: 6-13.
Lamb,  Dolores  J.  (2010).  Semen  Analysis  in  21 st Century  Medicine:  The  Need  for  Sperm Function Testing. Asia Journal of Andrology . 12: 64-70.
Pujianto, D.A., Curry, B.J., and Aitken, R.J. (2010). Prolactin Exerts a Prosurvival Effect on Human  Spermatozoa  via  Mechanisms  that  Involve  the  Stimulation  of  Akt Phosphorilation and Supression of Caspase Activation and Capacitation. Endocrinology . 151(3): 1269-1279.
Respati, Giri. (2015). Keberhasilan Program Fertilisasi In Vitro di Klinik Infertilitas FK Undip- RS  Dr.  Kariadi  dan  RS  Telogorejo  Semarang  [tesis].  Semarang:  Pendidikan  Dokter Spesialis Obstetri dan Ginekologi.  Universitas Diponegoro.
Saili,  T.,  et.al.  (2005).  Intracytoplasmic  Sperm  Injection  (ICSI)  as  an  Advanced  Assisted Reproductive Technology. J.Sain.Vet . 1: 53-59.
Sherwood, L. (2012). Fisiologi Manusia. Edisi 6, EGC : Jakarta, Halaman 211-224
Sujoko, H., Setiadi, M.A., and Boediono, A. (2009). Selection of Garut Sheep Sperms Using Percoll Density Gradient Centrifugation Method. Veteriner . 10(3): 125-132.
Tomsu, M., Sharma, V., and Miller, D. (2002). Embryo Quality and IVF Treatment Outcomes may  Correlate  with  Different  Sperm  Comet  Assay  Parameters. Human  Reproduction . 17(7): 1856-1862.
Walters,  A.H.,  et.al.  (2004).  Sperm  Morphology  and  Preparation  Method  Affect  Bovine Embryonic Development. Journal of Andrology . 25(4): 554-563.
WHO. (2010). WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen,
5 th ed. Switzerland: WHO Press.
Widodo, F.T. (2005). Hubungan Antara Jumlah Leukosit Dengan Motilitas Sperma pada Hasil Analisa  Sperma  Pasien  Infertilitas  Di  RSUP  Dr  Kariadi  Semarang  [laporan  akhir penelitian].  Semarang:  Program  Pendidikan  Sarjana  Fakultas  Kedokteran  Universitas Diponegoro.
Zini, Armand, and Mark Sigman. (2009). Review Are Tests of Sperm DNA Damage Clinically Useful? Pros and Cons. Journal of Andrology . 30(3): 219-229.