## PENENTUAN KONSENTRASI OPTIMUM GLUTARALDEHID UNTUK AMOBILISASI ENZIM  -AMILASE DARI
Bacillus Subtilis ITBCCB148

## PADA KITOSAN
Arum Widyasmara Politeknik AKA Bogor Jl. Pangeran Sogiri No 283, Bogor, Indonesia

## Abstrak
Pada  penelitian  ini  telah  dilakukan  amobilisasi  enzim  α-amilase  dari Bacillus  subtilis ITBCCB148  melalui metode  ikatan  silang  pada  matriks  kitosan.    Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  penentuan  konsentrasi glutaraldehid  untuk  amobilisasi  enzim  α-amilase  dari Bacillus  Subtilis ITBCCB148  pada  kitosan.  Tahap penelitian ini meliputi proses produksi, isolasi, pemurnian, dan penentuan kadar glutaraldehid untuk amobilisasi. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  aktivitas  spesifik  enzim  α-amilase  hasil  pemurnian  hingga  tahap  dialisis adalah  4.504,15  U  mg -1 dan  kemurniannya  meningkat  4,87  kali  dibandingkan  dengan  ekstrak  kasar  enzim. Aktivitas unit tertinggi enzim α-amilase hasil amobilisasi pada matriks kitosan dengan penambahan konsentrasi glutaraldehid 0,4 %.
Kata kunci :   α-amilase, amobilisasi, Bacillus subtilis ITBCCB148, glutaraldehid, kitosan.

## Abstract
In this study, the  α-amylase enzyme  from Bacillus  subtilis  ITBCCB148 was immobilized through crosslinking method  on  chitosan  matrix.  The  aims  of  this  study  were  to  determine  the  glutaraldehyde  concentration  to immobilizing  α-amylase  enzyme  from Bacillus  Subtilis ITBCCB148  on  chitosan.  The  steps  of  this  study  were done  as  following:  production  process,  isolation,  purification,  and  determinate  glutaraldehid  concentration  to immobilization. The results showed that the specific activity of the purified α-amylase enzyme after the dialysis stage  was  4504.15  U  mg -1 and  its  purity  increased  4.87  times  than  the  crude  extract  enzyme.  The  highest  unit activity of immobilized α-amylase on chitosan is reached by added 0,4 % of concentration glutaraldehyde.
Key Words : α-amylase, Bacillus subtilis ITBCCB148, chitosan, glutaraldehyde, immobilization

## PENDAHULUAN
Hidrolisis  pati  yang  memiliki  bobot molekul  rendah  dikatalisis  oleh  -amilase yang  merupakan  enzim  komersial  yang paling penting. Produk hasil hidrolisis telah diaplikasikan  secara  luas  pada  industri makanan,  kertas  dan  tekstil.  -amilase merupakan endoamilase yang mengkatalisis reaksi hidrolisis internal  ikatan pada  -1,4- glikosida  dalam  tepung  secara  acak (Konsula et.al. , 2004).
Dalam industri pangan, hidrolisis pati untuk menghasilkan  gula  pereduksi  umumnya berlangsung  pada  reaksi  secara batch , dimana  secara  ekonomis  merugikan  karena enzim hanya digunakan sekali. Agar enzim dapat  digunakan  berulang,  amobilisasi enzim telah digunakan di beberapa industri. Saat  ini,  -amilase telah  diamobilisasi secara  kovalen  pada  mikrospore poly (hydroxyethylmethacrylate ), poly ( methylmethacrylate  –  acrylic  acid )  dan
membran  zirconium.  -amilase  juga  telah digunakan  pada  penyangga  umum,  seperti membran  nitroselular  dan  manik  kitosan secara  fisik  dan  adsorpsi ion-exchange (Bayramoglu et.al., 2004).
Proses  amobilisasi  -amilase dari  isolat bakteri  lokal B.subtilis ITBCCB148  telah sukses  meningkatkan  stabilitas  enzim  pada suhu  tinggi  dengan Diethylaminoethyl Cellulosa (DEAE- Cellulosa ) meskipun stabilitas    suhunya  hanya  meningkat  1,5 kali.  Penggunaan  berulang  pada  enzim amobil  juga  lebih  baik  dari  enzim  murni (Yandri dkk, 2010b).
Kitosan dapat digunakan sebagai
penyangga  untuk  enzim  maupun  sel  utuh.
Kitosan  [ poly-  (1  4)-2-amino-2-deoxy- D-glucose )  merupakan  produk  deasetilasi dari kitin yang dihasilkan dari kerangka luar family  crustacea yang  memiliki  kelarutan dalam  larutan  asam  lebih  tinggi  dari  kitin. Kitosan  merupakan  senyawa  yang  murah, inert, hidrofilik, penyangga yang biokompatibel,  sehingga  menarik  untuk digunakan sebagai penyangga dalam amobilisasi  enzim.  Kehadiran  gugus  amin memfasilitasi  ikatan  kovalen  pada  enzim (Cetinus et.al., 2003).
Ada  beberapa  metode  yang  digunakan untuk  amobilisasi  enzim  pada  kitosan. Antara  lain  metode  penguapan  pelarut, metode  netralisasi,  metode  ikatan  silang, dan  metode  gelasi  ionotropik.  Metode
ikatan  silang  menggunakan  glutaraldehid sebagai  media  ikatan  silang  kitosan. Glutaraldehid  memiliki  dua  gugus  aldehid yang  dapat  berikatan  dengan  asam  amino bebas  pada  kitosan  dan  protein  enzim (Krajewska, 2004)
Berdasarkan hasil-hasil yang telah dilaporkan  tersebut,  maka  pada  penelitian ini dilakukan penentuan konsentrasi glutaraldehid  untuk  amobilisasi  enzim  α- amilase  dari Bacillus  Subtilis ITBCCB148 pada kitosan.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Mikroorganisme  yang  digunakan  pada penelitian  ini  adalah  bakteri Bacillus subtilis ITBCCB148.    Bahan  bahan  kimia yang  digunakan  adalah:  ekstrak  ragi,  pati, agar  NA,  KH 2 PO 4 ,  KCl,  FeSO 4 ,  CaCl 2 , (NH 4 ) 2 SO 4 ,  Na 2 CO 3 ,  NaOH,  CuSO 4. 5H 2 O, I 2, KI,  NaH 2 PO 4, Na 2 HPO 4 ,  Na 2 SO 3 ,  fenol, Na-K  tartrat,  pereaksi  Folin  Ciocalteu, NaHCO 3 ,  asam  dinitrosalisilat  dan  bahan kimia  lain  dengan  derajat  proanalisis. Untuk  pemurnian  enzim  dilakukan  dialisa dengan  menggunakan  kantong  selofan  dan buffer  fosfat  pH  6,5.    Untuk  amobilisasi digunakan kitosan produksi Sigma-Aldrich. Untuk  preparasi  amobilisasi  digunakan glutaraldehid produksi Sigma-Aldrich. Protein  standar  untuk  penentuan  kadar
protein  digunakan  bovin  serum  albumin diperoleh dari E. Merck.
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah:    Sentrifuga  Beckman,  J2-21, Gyrotory shaker New Brunswick Scientific Co.  Inc.  Edison  N.  J.  USA  610; Spektrofotometer  UV-Visible  Shimadzu; Mikropipet  Socorex;    Oven  Memmert- Germany;    Neraca  analitis  Sartorius- Germany;    pH  meter  Fisher-Canada; pengaduk magnet NUOVA II-USA;
Autoclave model  N25X;  pipet  Eppendorf; peralatan gelas (gelas kimia; tabung reaksi; Erlenmeyer dan peralatan gelas lainnya).

## Metode penelitian
Produksi Enzim  -amilase
Amilase  diproduksi  pada  media  fermentasi yang  mengandung:  pati  0,5%;  ekstrak  ragi 0,5%;  KH 2 PO 4 0,05%;  MgSO4.7H2O 0,02%  dan  CaCl 2 2H 2 O  0,01%  dengan  pH 6,5. Suhu fermentasi 32  C; dan lama waktu fermentasi 72 jam (Yandri dkk, 2010a).
Isolasi  -amilase
 -Amilase dalam media fermentasi dipisahkan  dari  sel  bakteri  lokal B. subtilis
ITBCCB148 dengan sentrifuga dingin pada laju  5000  rpm  selama  20  menit  sehingga diperoleh ekstrak kasar enzim (Yandri dkk, 2010a).

## Pemurnian  -amilase
Pemurnian enzim dilakukan bertahap, yaitu: fraksinasi  ekstrak  kasar  enzim  dengan garam  amonium  sulfat  berbagai  tingkat kejenuhan    dan  dialisa  sehingga  diperoleh enzim  hasil  pemurnian  (Yandri et  al ., 2010a).
a. Fraksinasi dengan ammonium sulfat Ekstrak kasar enzim yang telah diperoleh selanjutnya  diendapkan  dari  larutannya dengan  amonium  sulfat  ((NH 4 ) 2 SO 4 ) pada  berbagai  derajat  kejenuhan  yaitu (0-15)%;    (15-30)%;    (30-45)%;    (45- 60)%;   (60-75)% dan (75-90)%.
Endapan  protein  enzim  yang  didapatkan pada  tiap  fraksi  kejenuhan  amonium sulfat,  dipisahkan  dari  filtratnya  melalui sentrifugasi  pada  kecepatan  5000  rpm selama  20  menit.    Endapan  yang diperoleh dilarutkan dengan buffer fosfat 0,1  M  pH  6,5  dan  diuji  aktivitasnya dengan  metode  Fuwa  dan  diukur  kadar proteinnya dengan metode Lowry. Filtrat yang  diperoleh  dari  fraksi  (0-15)%  akan digunakan  kembali  untuk  diendapkan dengan  fraksi  kejenuhan  (15-30)%  dan seterusnya.
b. Dialisis
Enzim  hasil  fraksinasi  dengan  aktivitas tertinggi  kemudian  dimurnikan  melalui dialisis  pada  membran  semipermeabel
(kantong  selofan).    Endapan  tersebut dimasukkan  ke  dalam  kantong  selofan dan didialisis menggunakan buffer fosfat 0,01 M pH 6,5 selama 24 jam pada suhu dingin.    Selama  dialisis,  dilakukan pergantian  buffer  selama  4  jam  agar konsentrasi  ion-ion  di  dalam  kantong dialisis dapat dikurangi (Feraliana, 2011). Selanjutnya  dilakukan  uji  aktivitas dengan  metode  Fuwa  dan  diukur  kadar proteinnya dengan metode Lowry.
Uji Aktivitas  -amilase
Pengujian  aktivitas  -amilase  dilakukan dengan  metode  Fuwa  (Fuwa,  1954)  dan Mandels ( Mandel et.al., 1976).
a.  Metode Fuwa Aktivitas  -amilase  ditentukan  dengan metode  iodin  (Fuwa,  1954).    Enzim  yang telah diencerkan dengan tepat sebanyak 250  L  ditambahkan  ke  dalam  250  L  larutan pati 0,2% dalam 0,1 mol/L bufer fosfat  pH 6,0  dan  diinkubasi  pada  suhu  60  C  selama 10  menit.    Reaksi    dihentikan    dengan menambahan    250  L  HCl  1  N  dan kemudian  ditambahkan  250  L  pereaksi iodin  (I 2 0,2%  dan  KI  2%),  dan  4  mL  air suling  ke  dalam  campuran  reaksi.    Setelah campuran  diaduk  rata  serapannya  diukur pada  600 nm. Kontrol dibuat dengan cara
yang  sama,  hanya  menggunakan  250  L enzim yang sudah diinaktifkan.
Aktivitas  enzim  -amilase  ditentukan sebagai berikut:
(OD kontrol – OD sampel) Aktivitas Unit =   2  4  FP OD kontrol

## b.  Metode Mandels
Berdasarkan glukosa yang terbentuk. Sebanyak  0,5  mL  enzim,  0,5  mL  larutan pati  0,1%  dalam  bufer  sitrat  pH  6,0 dicampur,  lalu  diinkubasi  selama  30  menit pada suhu 60  C.  Setelah itu ditambahkan 2 mL pereaksi asam dinitrosalisilat, dididihkan  selama  10  menit  pada  penangas air  dan  didinginkan.    Setelah  dingin serapannya diukur pada panjang gelombang 510  nm.    Kadar  glukosa  yang  terbentuk ditentukan  dengan  menggunakan  kurva standar glukosa.
Pereaksi  asam  dinitrosalisilat  (Mandels et al .,  1976)  terdiri  dari:  asam  dinitrosalisilat 1%, fenol 0,2%, Na 2 SO 3 0,05%, NaOH 1%, garam  Rochel  (NaK-tartrat)  40%  1mL. Campurkan  semua  zat  dan  cukupkan volume hingga 100 mL.
Penentuan konsentrasi glutaraldehid optimal pada amobilisasi enzim
Sebanyak 0,25 g serbuk kitosan dimasukkan  ke  dalam  tabung  sentrifus  lalu distabilkan  menggunakan  buffer  fosfat  0,1
M  pH  6,5.  Kemudian  matriks  dipisahkan dari  larutannya  melalui  sentrifugasi  lalu ditambahkan  0,25  mL  enzim  hasil  dialisis dan  0,25  mL  glutaraldehid  dengan  variasi konsentrasi  yaitu  0%;  0,2%;  0,4%;  0,6%;
0,8%  dan  1%.    Campuran  tersebut  diaduk pada suhu ruang selama  +  30 menit,  dicuci dengan  buffer  fosfat  0,1  M  pH  6,5. Kemudian  dipisahkan  melalui  sentrifugasi. Filtrat  dipipet  0,25  mL  sebagai  kontrol pengujian  mendels  dan  sisa  filtrat  dibuang. Endapan enzim kitosan ditambahkan dengan  substrat  amilum  0,1  %  0,5  mL  dan diinkubasi pada suhu 60 o C selama 30 menit sambil  diaduk  tiap  10  menit.  Campuran tersebut  dipisahkan  melalui  sentrifugasi. Filtrat  dipipet  sebanyak  0,5  mL  ke  dalam tabung reaksi ditambahkan 1,0 mL pereaksi DNS  dan  dilakukan  pengujian  aktivitas enzim  menggunakan  metode  Mandels. Konsentrasi glutaraldehid yang dapat memberikan aktivitas enzim tertinggi ditetapkan sebagai konsentrasi glutaraldehid optimum (Krajewska, 1990).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi dan isolasi enzim  -amilase
Ekstrak  kasar  enzim  α-amilase  yang diperoleh  dari  fermentasi  pada  suhu  32 o C, pH  6,5,  selama  72  jam  memiliki  aktivitas unit  dan  aktivitas  spesifik  berturut-turut
yaitu  98,20  U/mL  dan  925,75  U/mg  yang dapat dilihat pada tabel 1.
Pemurnian  -amilase
Ekstrak  kasar  enzim  α-amilase  yang diperoleh kemudian dimurnikan.
Pemurnian  enzim  yang  dilakukan  meliputi beberapa  tahap  yaitu  fraksinasi  dengan garam amonium sulfat dan dialisis.

## 1. Fraksinasi dengan amonium sulfat
Fraksinasi  bertujuan  untuk  memisahkan enzim  dari  sebagian  besar  air  dan  protein lain.    Protein  (enzim)  α-amilase  akan mengendap pada tingkat kejenuhan amonium  sulfat  tertentu.    Penambahan senyawa  elektrolit  ke  dalam  larutan  enzim akan  menyebabkan  menurunnya  kelarutan enzim,  sehingga  terbentuk  endapan  dari protein  (enzim).    Jika  suatu  garam  dengan kelarutan  dalam  air  yang  besar  seperti amonium  sulfat  ditambahkan  ke  dalam larutan  protein,  maka  terjadi  kompetisi antara  garam  dan  protein  untuk  dapat  larut dalam  air.    Molekul  amonium  sulfat  yang lebih  kecil  akan  lebih  mudah  larut  dengan menarik  molekul  air  yang  menghidrasi molekul  protein  sehingga  molekul-molekul protein  saling  berinteraksi  membentuk agregat.
Fraksinasi  enzim  α-amilase  dilakukan dengan  menambahkan  garam  amonium sulfat  dengan  berbagai  tingkat  kejenuhan, yaitu  (0-15)%,  (15-30)%,  (30-45)%,  (45-
60)%,  (60-75)%,  dan  (75-90)%  ke  dalam 100  mL  ekstrak  kasar  enzim  untuk penentuan pola fraksinasi pertama. Kemudian endapan enzim dilarutkan dengan  5  mL  buffer  fosfat  0,1  M  pH  6,5. Hubungan  antara  kejenuhan  amonium sulfat  (0-100)%  dengan  aktivitas  spesifik enzim α-amilase dari B. subtilis

## ITBCCB148 dapat dilihat pada Gambar 1
Gambar 1 .  Hubungan antara kejenuhan amonium sulfat (0-90)% dengan aktivitas spesifik enzim α- amilase dari B. subtilis ITBCCB148.
Berdasarkan  Gambar  1,  aktivitas  spesifik tertinggi enzim α-amilase ditunjukkan pada fraksi (45-60)%  yaitu sebesar 19326 U/mg. Namun,  dapat  dilihat  pula  bahwa  pada fraksi  (30-45)%  dan  (60-75)%  masih memiliki  aktivitas  spesifik  cukup  tinggi, yaitu  16795,37  dan  17506,52  U/mg.    Oleh karena  itu,  proses  fraksinasi  selanjutnya hanya  dibagi  menjadi  dua  pola  fraksi  yaitu (0-30)%  dan  (30-90)%.    Hal  ini  bertujuan untuk menambah rendemen protein (enzim) sehingga  tidak  kehilangan  banyak  enzim selama  proses  pemurnian  dan  aktivitas  α- amilase  yang  diperoleh  cukup  besar.
Hubungan  antara  kejenuhan  amonium sulfat  (0-30)%  dan  (30-90)%  dengan aktivitas  spesifik  enzim  α-amilase  dari B. subtilis ITBCCB148  dapat  dilihat  pada Gambar 2.
Gambar 2 .  Hubungan antara kejenuhan amonium sulfat (0-30)% dan  (30-90)% dengan aktivitas spesifik enzim α-amilase dari B. subtilis ITBCCB148.
Berdasarkan  Gambar  2,  Fraksi  (0-30)% memiliki  aktivitas  spesifik  yang  sangat rendah  dibandingkan  fraksi  (30-90)%. Oleh  karena  itu,  fraksi  (0-30)%  tidak digunakan pada proses pemurnian selanjutnya  karena  pada  fraksi  tersebut endapan  enzim  α-amilase  yang  dihasilkan sangat  sedikit  sekali  sehingga  hanya  enzim fraksi (30-90)% yang digunakan pada tahap pemurnian  selanjutnya.    Adapun  aktivitas unit  dan  aktivitas  spesifik  enzim  α-amilase pada  fraksi  (30-90)%  berturut-turut  yaitu 923,97 U/mg dan 4315,31 U/mg.  Aktivitas spesifik  tersebut  menunjukkan  bahwa enzim  hasil  fraksinasi  memiliki  kemurnian lebih  tinggi  hingga  4,66 kali  dibandingkan dengan  ekstrak  kasar  enzim  dengan perolehan 27.61% (Tabel 1).

## 2. Dialisis
Larutan  enzim  dari  fraksi  (30-90)% selanjutnya  dimurnikan  melalui  dialisis selama 24 jam.  Larutan enzim dimasukkan hingga  setengah  volume  kantong  selofan, kemudian  didialisis  menggunakan  buffer fosfat  0,01  M  pH  6,5.    Proses  dialisis  ini bertujuan  untuk  memisahkan  enzim  dari ion-ion  garam  dan  ion  anorganik  lain  yang dapat mengganggu kestabilan enzim sehingga diperoleh enzim dengan kemurnian  dan  aktivitas  yang  tinggi. Dialisis  didasarkan  pada  difusi  partikel  di dalam dan di luar membran semipermeabel (kantong  selofan)  oleh  adanya  perbedaan tekanan  osmotik.    Tekanan  osmotik  di dalam membran yang lebih besar menyebabkan  keluarnya  molekul-molekul kecil  pada  larutan  protein  (enzim)  seperti ion-ion garam.  Keluarnya molekul tersebut menyebabkan distribusi ion di dalam dan di luar  membran  tidak  seimbang.    Untuk
memperkecil pengaruh ini digunakan buffer dengan  konsentrasi  rendah  di  luar  kantong selofan.
Selama  proses  dialisis  berlangsung,  perlu dilakukan  pergantian  buffer  setiap  4  jam sekali  agar  konsentrasi  ion-ion  di  dalam kantong  dialisis  dapat  dikurangi  sehingga tercapai  kesetimbangan  osmotik (Feraliana, 2011).    Buffer diaduk  menggunakan magnetic stirrer untuk mempercepat kesetimbangan osmotik.  Dialisis dilakukan pada suhu dingin untuk mencegah denaturasi  enzim.    Enzim  α-amilase  hasil dialisis  memiliki  aktivitas  unit  dan  spesifik berturut-turut  sebesar  498,75 U/mL  dan 4504  U/mg.    Enzim  hasil  dialisis  memiliki kemurnian  lebih  tinggi  hingga  4,87 kali dibandingkan  ekstrak  kasar  enzim  dengan perolehan 24,38% (Tabel 1).
Berikut ini merupakan rangkuman hasil dari rangkaian tahapan pemurnian dari enzim α- amilase dari B. subtilis ITBCCB148.
Tabel 1.  Pemurnian enzim α-amilase dari B. subtilis ITBCCB148
Tahap Volume Enzim (mL) Aktivitas
Unit
(U/mL) Aktivitas Total (U) Kadar
Protein
(mg/mL) Aktivitas Spesifik (U/mg) Tingkat Kemurnian (kali) Perolehan (%) Ekstrak Kasar 2500.00 98.20 245487.60 0.11 925.75 1.00 100.00 Hasil Fraksi (45-90%) ammonium sulfat 90.00 753.10 67779.38 0.17 4315.31 4.66 27.61 Hasil Dialisis 120.00 498.75 59849.89 0.11 4504.15 4.87 24.38
Pada  Tabel  1  di  atas,  dapat  dilihat  bahwa enzim  α-amilase  mengalami  peningkatan aktivitas spesifik yang menunjukkan adanya  peningkatan  kemurnian  enzim  dari setiap  tahap  pemurnian.    Hal  ini  didukung oleh penurunan kadar protein dan perolehan (%) enzim yang menunjukkan bahwa enzim telah bebas dari protein lain, sebagian besar air, dan ion-ion anorganik lainnya.
Aktivitas  unit  dan  aktivitas  spesifik  enzim α-amilase  pada  hasil  fraksinasi  ammonium sulfat berturut-turut  yaitu 923,97 U/mg dan 4.315,31  U/mg.    Aktivitas  spesifik  tersebut menunjukkan  bahwa  enzim  hasil  fraksinasi memiliki  kemurnian  lebih  tinggi  hingga 4,66 kali  dibandingkan  dengan  ekstrak kasar enzim dengan perolehan 27,61%. Enzim  α-amilase  hasil  dialisis  memiliki aktivitas  unit  dan  spesifik  berturut-turut sebesar  498,75 U/mL  dan  4.504  U/mg. Enzim  hasil  dialisis  memiliki  kemurnian lebih  tinggi  hingga  4,87 kali  dibandingkan ekstrak  kasar  enzim  dengan  perolehan 24,38%
Penentuan konsentrasi glutaraldehid optimal pada amobilisasi enzim
Penentuan konsentrasi glutaraldehid
optimal untuk proses amobilisasi dilakukan dengan  mengikatkan  enzim  α-amilase  hasil pemurnian pada pH 7,0 dengan menambahkan  glutaraldehid  dengan  variasi konsentrasi  yaitu  0%;  0,2%;  0,4%;  0,6%;
0,8%  dan  1%.    Setelah  ditambahkan substrat,  campuran  enzim  amobil  dan substrat  diinkubasi  pada  suhu  60 o C  selama 30  menit.      Gambar  3  menunjukkan  bahwa aktivitas  unit  tertinggi  enzim  α-amilase hasil  amobilisasi  pada  matriks  kitosan dengan penambahan konsentrasi glutaraldehid  0,4  %  yaitu  sebesar  1,31 U/mL.
Gambar  3.  Aktivitas unit enzim α-amilase pada berbagai konsentrasi glutaraldehid yang ditambahkan .
Glutaraldehid digunakan karena memiliki  2  gugus  aldehid  yang  dapat berikatan  dengan  asam  amino  bebas  pada kitosan dan protein. Gambar 4 menunjukkan  reaksi  yang  terjadi  antara kitosan dan glutaraldehid.
Gambar 4. Pembentukan ikatan kovalen antara kitosan dan glutaraldehid (Krajewska et.al.,
1990)
Sedangkan ikatan kovalen antara komplek  kitosan-glutaraldehid  dan  enzim ditunjukkan pada gambar 5.
Gambar 5. Pembentukan ikatan kovalen antara komplek kitosan glutaraldehid dan enzim (Krajewska et.al., 1990)
Dari  gambar  tersebut,  menunjukkan  bahwa enzim  diamobilisasi  pada  kitosan  oleh glutaraldehid  dengan  mekanisme  adsorpsi sederhana. Sehingga reaksi dengan glutaraldehid  dapat  mengubah  struktur enzim  sehingga  aktivitasnya  berkurang (Krajewska et.al. ,1990).

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa: 1. Aktivitas  spesifik  enzim  α-amilase  hasil pemurnian  hingga  tahap  dialisis  adalah 4504,15  U  mg -1 dan  kemurniannya meningkat hingga 4,87 kali dibandingkan  dengan  ekstrak  kasar enzim dengan perolehan 24,38%.
2. Aktivitas  unit  tertinggi  enzim  α-amilase hasil  amobilisasi  pada  matriks  kitosan didapatkan dengan penambahan konsentrasi glutaraldehid 0,4 %.

## DAFTAR PUSTAKA
Bayramoglu,  G.,  M.  Yilmaz,  M.Y.  Arica.
2004. Immobilization of a thermostable  -amylase  onto  reactive membranes:  kinetics  characterization and  application  to  continuous  starch
hydrolysis. Food Chemistry , 84: 591-
599.
Cetinus S.A. and H. Nursevin Oztop. 2003. Immobilization of catalase into chemically
Feraliana.  2011.  Amobilisasi  Enzim  α- Amilase dari Bacillus subtilis ITBCCB148  dengan  menggunakan Karboksi  Metil  Sephadex  C-50  (CM- Sephadex  C-50). Skripsi .  Jurusan Kimia  Fakultas  MIPA  Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Fuwa,  H.  1954.  A  new  method  for microdetermination of amylase activity  by  the  use  of  amylose  as  the substrat. The Journal of Biochemistry,
41 (3): 583-603
Konsula,  Z.,  M.  Liakopoulou-Kyriakides.
2004.  Hydrolysis  of  starches  by  the action of an  -amylase from Bacillus subtilis . Process  Biochemistry , 39:
1745-1749.
Krajewska,  B.,  M.  Leszko,  W.  Zaborska.
1990. Urease Immobilized on
Chitosan  Membrane  :  Preparation and  Properties .  Journal  of  Chemical Technology Biotechnology, 48 : 337-
350.
Lowry,  O.H.,  N.J.  Rosebrough,  A.L.  Farr,
R.J. Randall. 1951. Protein measurment  with  the  Folin  phenol reagent, Journal of Biological Chemistry : 193-265.
Mandels, M., R. Andreotti, C. Roche. 1976.
Measurement of saccarifying cellulase.
Biotechnology
Bioenginering 6: 21-33.
Yandri,  T.  Suhartati,  S.  Hadi.  2010a.
Purification  and  Characterization  of
Extracellular  -Amilase Enzyme from  Locale  Bacteria  Isolate Bacillus subtilis ITBCCB148, European Journal  of    Scientific  Research , 39
(1): 64-67.
Yandri,  T.  Suhartati,  S.  Hadi.  2010b. Immobilization  of  -amylase  from locale bacteria isolate Bacillus subtilis ITBCCB148  with  diethylaminoethyl cellulose (DEAE-Cellulose). Material Science Researh India , 7(1): 123-128.