ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (1) (2017) : 5 – 8
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Studi Pendahuluan tentang Enkapsulasi Vitamin C dalam Liposom Kelapa ( Cocos nucifera L. )
Dwi Hudiyanti a,* , Desita Triana a , Parsaoran Siahaan a
a Physical Chemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang 50275
* Corresponding author: dwi.hudiyanti@live.undip.ac.id A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords:
Coconut Liposomes, Cholesterol, Encapsulation efficiency and
Leakage of liposome
The encapsulation of vitamin C in coconut liposomes ( Cocos nucifera L.) was studied. The efficiency of encapsulation of coconut liposomes was 80.76%. The addition of cholesterol to  the  liposome membrane  affects  the  amount  of  encapsulation  efficiency.  Addition  of cholesterol  by  30%  increased  the  efficiency  of  encapsulation  to  92.71%.  Temperature affects the ability of coconut liposomes to store vitamin C in 8 days. Storage at 5°C lowers the leakage of coconut liposomes.

## A b s t r a k
Kata kunci:
Liposom kelapa, Kolesterol, Efisiensi Enkapsulasi, dan Kebocoran liposom Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari enkapsulasi vitamin C dalam liposom kelapa ( Cocos  nucifera L.).  Efisiensi  enkapsulasi  liposom  kelapa  diperoleh  sebesar  80,76%. Penambahan  kolesterol  pada  membran  liposom  mempengaruhi  besarnya  efisiensi enkapsulasi.  Penambahan  kolesterol  sebesar  30%  meningkatkan  efisiensi  enkapsulasi menjadi  sebesar  92,71%.  Suhu  mempengaruhi  kemampuan  liposom  kelapa  untuk menyimpan vitamin C dalam 8 hari. Penyimpanan pada suhu 5°C menurunkan kebocoran liposom kelapa.

## 1. Pendahuluan
Liposom adalah struktur self-assembly yang saat ini banyak diteliti sebagai pembawa bahan aktif pada bidang farmasi  dan  pangan.  Liposom  tersusun  dari  fosfolipida baik alami maupun sintetik. Dalam penelitian terdahulu [1-3]  liposom  yang  terbuat  dari  fosfolipida  kelapa digunakan  untuk  mengenkapsulasi  senyawa  polar  5- carboxyfluorescein dan  diketahui  hanya  mampu menyimpan  10%  bahan  aktifnya  setelah  17  jam penyimpanan.
Efisiensi  enkapsulasi  dan  kebocoran  pada  liposom dipengaruhi  oleh  komposisi  penyusun  pada  membran bilayer  fosfolipid.  Komposisi  membran  ini  akan mempengaruhi  permeabilitas  dan  fluiditas  membran. Penambahan  zat  aditif  seperti  kolesterol  mampu meningkatkan  efisiensi  enkapsulasi  dan  menurunkan kebocoran  [1,  4].  Penambahan  kolesterol  pada konsentrasi  tertentu  dapat  mengurangi  mobilitas
molekul  sehingga  membran  menjadi  rigid.  Membran bilayer fosfolipid yang rigid menyebabkan permeabilitas serta  fluiditas  membran  menurun  sehingga  efisiensi enkapsulasi meningkat dan kebocoran berkurang.
Vitamin  C  merupakan  senyawa  yang  memiliki beragam  manfaat  bagi  manusia,  antara  lain  berperan dalam menghambat pembentukan senyawa karsinogenik,  stimulan  untuk  sintesis  kolagen, menghambat penuaan, antioksidan, dan berperan dalam imunitas  tubuh  terhadap  penyakit  berbahaya  seperti kanker,  penyakit  jantung,  dan  penyakit  lainnya  [5]. vitamin C mudah sekali teroksidasi akibat pengaruh suhu maupun  logam  berat,  reaktif  dialam  dan  berinteraksi dengan komponen makanan lainnya sehingga menyebabkan manfaat vitamin C menjadi berkurang [5- 7].
Vitamin C perlu dienkapsulasi untuk melindunginya dari  proses  teroksidasi  maupun  interaksinya  dengan senyawa  lain  selama  waktu  penyimpanan.  Dalam
penelitian  ini,  akan  dipelajari  kemampuan  liposom kelapa  dalam  mengenkapsulasi  vitamin  C.  Liposom kelapa  dimodifikasi  dengan  menambahkan  kolesterol dengan  konsentrasi  0%,  10%,  20%,  30%,  dan  40% (w/w).  Selain  itu  akan  diamati  pengaruh  kolesterol terhadap  efisiensi  enkapsulasi  dan  kebocoran  liposom kelapa setelah 8 hari penyimpanan dalam suhu 5°C, 25°C, dan  37°C.  Sebagai  pembanding,  digunakan  fosfolipid kedelai yang telah banyak digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat liposom dalam berbagai aplikasi [6, 7].

## 2. Metode Penelitian

## Bahan dan Alat
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah fosfolipida kelapa ( Cocos nucifera L. ) hasil isolasi in house , Kloroform p.a, methanol p.a, NaCl p.a, n-Heksan, aquades,  alkohol  96%, DI  water ,  Na 2 HPO 4 ∙2H 2 O, NaH 2 PO 4∙ 2H 2 0,  vitamin  C  (uncoated),  kolesterol  dari Sigma  Aldrich,  lesitin  kedelai  dari  Sigma  Aldrich,  Fast Blue B Salt dari Sigma Aldrich, EDTA p.a, NaOH p.a dan Asam asetat 99 % dari Merck.
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini meliputi  blender  Maspion  MT-1206,  corong  pisah dengan  kran  teflon,  timbangan  (Kern  ALS  220-4N), kertas saring whattman 1442-090 Grade No.42:90mm- 100/pk, magnetic  stirrer Thermolyne  Cimarec, rotary evaporator,  shaker,  ultrasonic  cleaner (Krisbow) , timbangan,  vortex  mixer  (VM-300), centrifuge (Hettich EBA  20).  Instrumentasi  untuk  analisis  adalah Fourier Transform  Infrared (FTIR)  dengan  merk  prestige-21 Shimadzu, Gas  Chromatography-Mass  Spectrometri (GCMS)  QP2010S-Shimadzu,  dan  Spektrometer  UV-Vis Spectroquant Pharo 300.

## Metode

## Enkapsulasi Vitamin C dalam Liposom Kelapa
Campuran fosfolipid dan kolesterol diformulasikan dengan perbandingan sebagai berikut:

## Tabel 1. Campuran fosfolipid dan kolesterol

## Kadar kolesterol
(b k /(b f +b k )) Massa bahan (mg) Fosfolipid Kolesterol 0 74 - 10 66,6 7,4 20 59,2 14,8 30 51,8 22,2 40 44,4 29,6
b k : berat kolesterol, b f : berat fosfolipida
Campuran  fosfolipid  dan  kolesterol  dilarutkan dalam 100 mL kloroform sehingga diperoleh larutan baku fosfolipid dengan konsentrasi kolesterol 0 %, 10%, 20 %, 30 %, dan 40 %. Kloroform merupakan pelarut semipolar sehingga  dapat  melarutkan  fosfolipid  dan  kolesterol yang cenderung semipolar.
Pembuatan  liposom  dilakukan  menurut  metode yang diberikan  oleh Hudiyanti, dkk [1,  2]. Larutan baku fosfolipida dengan konsentrasi 100 ppm sebanyak 75 ml dimasukan  ke  dalam  tabung  reaksi.  Selanjutnya  dialiri gas nitrogen hingga terbentuk lapis tipis. Vitamin C 100 ppm  dalam  buffer  fosfat  ditambahkan  ke  dalam  lapis tipis. Selanjutnya dilakukan freeze thawing (pendinginan pada  suhu  5°C,  pemanasan  pada  suhu  50°C  dan pengocokan  dengan  vortex  mixer)  dan  dilanjutkan dengan sonikasi.

## Efisiensi Enkapsulasi
Penentuan  efisiensi  enkapsulasi  dilakukan  sesuai dengan  metode  Yang ,  dkk. [7],  sebanyak  4  mL  larutan liposom yang telah siap dianalisis disentrifugasi selama 30  menit  dengan  kecepatan  6000  rpm.  Supernatan larutan  yang  mengandung  vitamin  C  bebas  diambil sebanyak  1  mL  kemudian  ditambahkan  0,3  mL  EDTA (0,25 M), 0,5 mL asam asetat (0,5 M), dan 1,25 mL garam fast blue B (2 g/L) secara berurutan. Setelah itu campuran diencerkan  sampai  10  mL  dengan DI  water .  Larutan kemudian
diukur
absorbansinya dengan spektrofotometer  UV-Vis  pada  panjang  gelombang  420 nm. Nilai efisiensi enkapsulasi vitamin C ( EE vit.C ) didapat dengan  menghitung  konsentrasi  vitamin  C  tidak terenkapsulasi  (C sisa )  dan  dibandingkan  dengan konsentrasi  vitamin  C  sebelum  dienkapsulasi  (C awal ), sesuai dengan persamaan:
𝐸𝐸 𝑉𝑖𝑡.𝐶 = [1 − (𝐶 𝑠𝑖𝑠𝑎 /𝐶 𝑎𝑤𝑎𝑙 )] × 100%

## Kebocoran Liposom
Untuk  menentukan  daya  simpan  liposom  kelapa sebagai  penghantar dalam  sistem  penghantaran  obat, dilakukan analisis kebocoran. Sampel liposom yang telah siap  dianalisis  disimpan  selama  8  hari  dalam  tiga  suhu yang  berbeda,  yaitu  suhu  dingin  (5°C),  suhu  ruang (25°C),  dan  suhu  inkubator  (37°C).  Kebocoran  pada liposom  ditentukan  dengan  menghitung  konsentrasi vitamin C yang terlepas dari sistem liposom setelah 8 hari penyimpanan.  Pengujian  kebocoran  liposom  sama dengan prosedur pengujian efisiensi enkapsulasi.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Enkapsulasi Vitamin C dalam Liposom
Gambar 1. Nilai Efisiensi Enkapsulasi liposom kelapa dan kedelai
Enkapsulasi  vitamin  C  dalam  liposom  dilakukan dalam  medium  buffer  fosfat  pH  74.  Penggunaan buffer
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 20 (1) (2017) : 5 – 8
fosfat  pH  7,4  sesuai  dengan  pH  fisiologis  dalam  tubuh.
Proses enkapsulasi dilakukan melalui proses pendinginan, kemudian pemanasan pada suhu 50°C, dan pengadukan  dengan vortex  mixer .  Pada  proses  ini  lapis tipis pada dinding tabung akan terangkat dan terdispersi sempurna  sebagai  liposom  [3].  Saat  lapis  tipis  telah terdispersi  seluruhnya,  dispersi  akan  menjadi  keruh. Keruhnya  dispersi  ini  menandakan  liposom  yang terbentuk termasuk dalam kategori Multilamellar Vesicle (MLV)  [1,  8].  Dispersi  liposom  selanjutnya  disonikasi untuk  memperkecil  ukuran  partikelnya.  Semakin  lama disonikasi, maka partikel yang terbentuk akan semakin kecil  yang  ditandai  dengan  dispersi  yang  menjadi  lebih jernih.

## Analisis Efisiensi Enkapsulasi Vitamin C
Sruktur  liposom  yang  tersusun  oleh  membran fosfolipida  dalam  bentuk  bola  ( sphere )  memungkinkan liposom  untuk  mengenkapsulasi  bahan  aktif  bersifat polar  di  dalam  rongga  ( core )  strukturnya  [3].  Dalam penelitian ini vitamin C yang bersifat polar dienkapsulasi dalam liposom dari fosfolipida kelapa. Analisis efisiensi enkapsulasi  bertujuan  untuk  mengetahui  kemampuan liposom kelapa dalam mengenkapsulasi vitamin C pada berbagai  konsentrasi  kolesterol.  Sebagai  pembanding, dilakukan analisa efisiensi enkapsulasi pada liposom dari fosfolipid  kedelai  karena  liposom  kedelai  telah  banyak digunakan dalam bidang farmasi.
Nilai efisiensi enkapsulasi keduanya disajikan dalam gambar 1. Secara keseluruhan efisiensi enkapsulasi pada liposom  kelapa  lebih  rendah  dibandingkan  efisiensi enkapsulasi pada liposom kedelai. Hal ini dimungkinkan karena  perbedaan  jenis  rantai  asam  dalam  fosfolipida penyusun  liposomnya.  Rantai  asam  lemak  penyusun fosfolipid kelapa adalah C8:0 dan C12:0, sedangkan rantai asam lemak penyusun fosfolipid kedelai yaitu C16:0 dan C18:2  [1].  Menurut  Maherani ,  dkk. [9]  efisiensi enkapsulasi  liposom  bergantung  pada  kekakuan membran  bilayer  liposomnya.  Panjang  rantai  asil  akan mempengaruhi ketebalan dan interaksi antar rantai asil di dalam membran. Fosfolipida dengan rantai asil yang panjang akan memberikan interaksi yang lebih kuat serta menambah  ketebalan,  sehingga  membran  menjadi kurang  cair  atau  kaku.  Bilayer  liposom  kelapa  tersusun atas  rantai  asil  yang  pendek,  sehingga  interaksi  antar rantai  asil  kurang  kuat  dan  membran  menjadi  kurang kaku dibandingkan liposom kedelai. Hal ini menyebabkan liposom kelapa lebih sulit mengenkapsulasi  vitamin  C  dari  pada  liposom  kedelai sehingga efisiensi enkapsulasinya menjadi lebih rendah.
Liposom  kelapa  menunjukkan  nilai  efisiensi enkapsulasi  tertinggi  pada  konsentrasi  kolesterol  30% yang  bernilai  92,71%.  Nilai  efisiensi  enkapsulasi  ini meningkat  sebanyak  11,95%  dibandingkan  liposom kelapa  tanpa  penambahan  kolesterol.  Sementara  itu, nilai efisiensi enkapsulasi tertinggi pada liposom kedelai dengan konsentrasi kolesterol 10% yaitu bernilai 92,81%. Nilai  efisiensi  enkapsulasi  ini  meningkat  sebanyak 7,85%.  Penambahan  kolesterol  meningkatan  nilai efisiensi  enkapsulasi  pada  liposom  kelapa  lebih  besar dibandingkan  liposom  kedelai.  Data  ini  menunjukkan
bahwa  kolesterol  berinteraksi  lebih  baik  pada  bilayer fosfolipida  kelapa  dibandingkan  dengan  fosfolipida kedelai.  Fosfolipida  kelapa  memiliki  rantai  asil  pendek dengan interaksi antar rantai yang kurang kuat sehingga kolesterol  lebih  mudah  menempatkan  dirinya  di  dalam membran fosfolipida tersebut. Akibatnya kolesterol akan memperkuat  interaksi  antar  rantai  asilnya  sehingga enkapsulasi  vitamin  C  dalam  liposom  kelapa  menjadi lebih maksimal.

## Analisis Kebocoran pada Liposom
Pada  penelitiannya  Hudiyanti ,  dkk. [1]  telah mengetahui  bahwa  liposom  kelapa  mengalami kebocoran ketika digunakan untuk menyimpan senyawa polar  5-carboxyfluorescein  selama  17  jam.  Dalam penelitian  itu  pula  diketahui  bahwa  kolesterol  secara efektif  dapat  mengurangi  kebocoran  tersebut.  Pada penelitian  ini  liposom  digunakan  untuk  menyimpan vitamin  C  dalam  3  suhu  yang  berbeda  yaitu  suhu  5°C, 25°C,  dan  37°C  selama  8  hari.  Secara  keseluruhan pengujian  kebocoran  pada  liposom  kelapa  dilakukan dengan  menghitung  konsentrasi  vitamin  C  bebas  pada setiap  supernatannya.  Profil  kebocoran  liposom  kelapa dapat  dilihat  pada  gambar  2.  Profil  tersebut memggambarkan bahwa suhu penyimpanan mempengaruhi  kebocoran  liposom  kelapa.  Pada  suhu penyimpanan  5°C  kebocoran  liposom  kelapa  terlihat paling rendah.
Konsentrasi vitamin C dalam supernatan dipengaruhi oleh adanya kebocoran dari dalam liposom serta  proses  degradasi  dari  vitamin  C  karena  adanya reaksi  oksidasi  [10].  Proses  kebocoran  akan  menambah jumlah  vitamin  C  pada  supernatan  sedangkan  proses degradasi  akan  menurunkan  konsentrasinya.  Oleh karenanya  apabila  konsentrasi  vitamin  C  bebas  yang diperoleh  menunjukkan  peningkatan  maka  artinya proses kebocoran lebih dominan. Sementara itu apabila konsentrasi  yang  diperoleh  menurun  maka  proses degradasi lebih menentukan.
Secara  keseluruhan  data  pada  gambar  2 menunjukkan  bahwa  pada  umumnya  konsentrasi vitamin C bebas pada supernatan mengalami penurunan setelah  8  hari  penyimpanan.  Sehingga  dapat  diartikan proses degradasi vitamin C dalam sampel lebih dominan daripada  proses  kebocoran  dari  dalam  liposom. Selanjutnya jika diasumsikan bahwa kecepatan degradasi pada  suhu  yang  sama  adalah  konstan  maka  besarnya perubahan  konsentrasi  vitamin  C  setelah  penyimpanan (8  hari)  terhadap  konsentrasi  awal  (0  hari)  sebanding dengan  besarnya  kebocoran.  Dengan  demikian  maka dapat  diketahui  dari  data  tersebut  bahwa  perubahan konsentrasi  kolesterol  mempengaruhi  kebocoran vitamin C.
a. b. c.
Gambar 2. Kebocoran Vitamin C pada penyimpanan (a) 5°C, (b) 25°C, dan (c) 37°C

## 4. Kesimpulan
Efisiensi  enkapsulasi  liposom  kelapa  diperoleh sebesar 80,76%. Penambahan kolesterol pada membran liposom  mempengaruhi  besarnya  efisiensi  enkapsulasi. Penambahan  kolesterol  sebesar  30%  meningkatkan efisiensi  enkapsulasi  menjadi  sebesar  92,71%.  Suhu mempengaruhi  kemampuan  liposom  kelapa  untuk menyimpan  vitamin  C.  Penyimpanan  pada  suhu  5°C menurunkan kebocoran liposom kelapa.

## 5. Ucapan terima kasih
Penulis mengucapkan terima kasih kepada dana dari Hibah Penelitian Fundamental PNBP Undip 2015

## 6. Daftar Pustaka
[1]  Dwi  Hudiyanti,  Tri  Joko  Raharjo,  Narsito,  Sri Noegrohati, Study on Leakage of Sesame (Sesamum indicum  L.)  and  Coconut  (Cocos  nucifera  L.) Liposomes,  Oriental  Journal  of  Chemistry,  31,  1, (2015) 435-439 http://dx.doi.org/10.13005/ojc/310152 [2]  Dwi Hudiyanti, Tri Joko Raharjo, Narsito Narsito, Sri Noegrohati, Isolasi dan Karakterisasi Lesitin Kelapa dan  Wijen,  Agritech,  32,  1,  (2012)  23-26 https://doi.org/10.22146/agritech.9652
[3]  Dwi Hudiyanti, Tri Joko Raharjo, Narsito Narsito, Sri Noegrohati,  Investigation  on  the  morphology  and properties  of  aggregate  structures  of  natural phospholipids  in  aqueous  system  using  cryo-tem, Indonesian Journal of Chemistry, 12, 1, (2012) 57-61
[4]  Maria-Lucia  Briuglia,  Chiara  Rotella,  Amber McFarlane,  Dimitrios  A.  Lamprou,  Influence  of cholesterol on liposome stability and on in vitro drug release, Drug Delivery and Translational Research, 5, 3, (2015) 231-242 10.1007/s13346-015-0220-8
[5]  Shabbar Abbas, Chang Da Wei, Khizar Hayat, Zhang Xiaoming,  Ascorbic  Acid:  Microencapsulation Techniques  and  Trends — A  Review,  Food  Reviews International, 28, 4, (2012) 343-374 10.1080/87559129.2011.635390
[6]  Lan Chang, Yongsheng Zhao, Studies on Preparation and  Properties  of  Vc  Nano  Liposomes,  Journal  of Applied  Science  and  Engineering  Innovation,  1,  4, (2014) 234-240
[7]  Shuibing  Yang,  Wei  Liu,  Chengmei  Liu,  Weilin  Liu, Guihong  Tong,  Huijuan  Zheng,  Wei  Zhou, Characterization  and  Bioavailability  of  Vitamin  C Nanoliposomes  Prepared  by  Film  Evaporation- Dynamic High Pressure Microfluidization, Journal of Dispersion  Science  and  Technology,  33,  11,  (2012) 1608-1614 10.1080/01932691.2011.629511
[8]  Arkadiusz  Kozubek,  Jerzy  Gubernator,  Ewa Przeworska, Maria Stasiuk, Liposomal drug delivery, a  novel  approach:  PLARosomes,  Acta  Biochimica Polonica, 47, 3, (2000) 639-649
[9]  B.  Maherani,  E.  Arab-Tehrany,  M.  R.  Mozafari,  C. Gaiani,  M.  Linder,  Liposomes:  A  Review  of Manufacturing Techniques and Targeting Strategies, Current  Nanoscience,  7,  3,  (2011)  436-452 10.2174/157341311795542453
[10] Gerald F. Combs Jr, James P. McClung, Chapter 10 - Vitamin  C,  in:    The  Vitamins  (Fifth  Edition), Academic Press, 2017, pp. 267-295.