## AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK  TEMPE TERHADAP  BAKTERI Bacillus subtilis DAN Staphylococcus aureus
[Antibacterial Activity of Tempe Extracts on Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus]
D. Elysa Putri Mambang 1) *, Rosidah 1) dan Dwi Suryanto 2)
1) Program Studi  Magister  Farmasi  Fakultas  Farmasi,  Universitas  Sumatera  Utara, Medan
2) Departemen  Biologi Fakultas  Matematika  dan Ilmu Pengetahuan  Alam,  Universitas  Sumatera  Utara, Medan
Diterima  13 Agustus 2013  / Disetujui  05 Februari  2014

## ABSTRACT
Tempe is a soybean fermented product by  Rhizopus oligosporus  which contains high amounts of bioactive compounds including antibacterial compounds. The aim of this research  is to observe the antibacterial activity of  tempe extract  against Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. The results of this research broadens the current knowledge  of  tempe as functional food.  Samples of commercial tempe were obtained from  a traditional market of Pringgan Medan, Sumatera Utara. Tempe samples were then extracted using three solvents with different polarity: ethanol, n- hexane and ethyl acetate, each at three levels of concentration i.e. 300 mg/mL (30%), 400 mg/mL (40%) and 500 mg/mL (50%). The antibacterial activity test  of tempe extracts was carried out  using disc difussion method  on Mueller Hinton Agar (MHA), and incubation was  conducted at 36- 37°C for 24 hrs. The obtained data  were tested statistically  with Analysis of Variant (ANOVA) p>0.05. The ethanol and ethyl acetate extracts of tempe inhibited the  growth of  B. subtilis and S. aureus. Meanwhile, the ethyl acetate  extract of tempe at concentration  of 500  mg/mL had the highest inhibition  against S. aureus as shown by inhibition diameters of 15.50±0.44 mm (p>0.05), and B. subtilis at 14.13±0.21 mm (p>0.05). No inhibition  observed  with the n-hexane  extracts of tempe  against the above  bacteria.
Keywords: antibacterial  activity, Bacillus  subtilis, Staphylococcus aureus,  tempe extract

## ABSTRAK
Tempe  adalah  produk  fermentasi  kedelai  oleh  kapang Rhisopus  oligosporus yang  mengandung  komponen  bioaktif  dalam  jumlah  tinggi termasuk di dalamnya komponen antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri tempe terhadap bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus . Hasil penelitian ini bermanfaat  untuk pengembangan  tempe sebagai makanan fungsional.  Tempe yang  digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  tempe  komersial  yang  diperoleh  dari  pasar  tradisional  Pringgan,  Medan,  Sumatera  Utara.  Proses  ekstraksi  tempe dilakukan dengan menggunakan  3 jenis pelarut yang berbeda kepolarannya yaitu etanol,  etil  asetat dan  n-heksana  dengan  tingkat konsentrasi yang berbeda yaitu 300 mg/mL (30% ), 400 mg/mL (40% ) dan 500 mg/mL (50% ). Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi menggunakan  kertas  cakram  pada  media Mueller  Hinton  Agar (MHA),  dan  inkubasi  dilakukan  pada  suhu  36-37°C  selama  24  jam.  Data  yang diperoleh diuji secara statistik menggunakan metode Analisa Varian (ANOVA) p >0.05. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol tempe dan ekstrak etil asetat tempe memiliki daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri Gram positif B. subtilis dan S. aureus. Ekstrak etil asetat tempe 500 mg/mL memiliki daya hambat paling besar terhadap S. aureus yaitu sebesar 15.50±0.44 mm ( p >0.05) dan B. subtilis sebesar 14.13±0.21 mm ( p >0.05). Ekstrak n-heksana  tempe  tidak memiliki  daya hambat  terhadap  bakteri  tersebut.
Kata kunci: aktivitas antibakteri, Bacillus  subtilis, ekstrak  tempe, Staphylococcus aureus

## PENDAHULUAN
1
Tempe  kedelai  adalah  produk  fermentasi  dari  kacang kedelai  yang  berasal  dari  Indonesia.  Mikroba  yang  berperan dalam  pembuatan  tempe  merupakan  kultur  campuran  yang kompleks,  yaitu  kapang,  kamir,  bakteri  asam  laktat  dan beberapa  jenis  bakteri  lainnya. Rhizophus merupakan  kapang yang paling berperan dalam pembuatan tempe (Nout dan Kiers, 2005).
Proses  fermentasi  kedelai  menyebabkan  terjadinya perubahan  sifat  fungsional  akibat  dari  proses  hidrolisis  yang meliputi hidrolisis protein  menjadi asam amino dan peptida oleh
 Penulis Korespondensi:
Email: ely saputri_mambang@yahoo.co.id
enzim proteolitik; hidrolisis oligosakarida menjadi monosakarida; serta degradasi asam  fitat  menjadi pospat anorganik (Pablo et al. 2010). Perubahan ini menjadikan tempe kedelai memiliki nilai gizi yang  tinggi  karena jumlah protein  terlarut  dari kedelai akan meningkat  menjadi  empat  kali  lipat  (Bintari et  al. 2008), mengubah flavor langu  kedelai  menjadi flavor tempe  yang disukai, memiliki senyawa bioaktif untuk kesehatan (Nakajima et al. 2005); serta  terdapat  kemungkinan  menurunkan zat anti gizi seperti  asam  fitat  dan polifenol  (Cueves-Rodriquez et al. 2004). Kapang Rhizopus memproduksi  antibiotik  yang  melawan beberapa  mikroba  penyebab  penyakit  (Roubus-van  den  Hil et al. 2010 a ).  Orang  Indonesia  yang  mengonsumsi  tempe  secara terus-menerus  akan  terhindar  dari  disentri  dan  gangguan pencernaan  (Babu et  al. 2009).  Kasus  diare  pada  anak  babi yang  diberi  diet  tempe  lebih  rendah  daripada  anak  babi  yang
diberi biji kedelai yang dipanggang (Kiers et al . 2003). Efek anti diare  tempe  ini  berhubungan  dengan  karakteristik  antibakteri- nya.  Penelitian  tentang  antibakteri  dari  tempe  sudah  banyak dilakukan,  yaitu  terhadap Bacillus  subtilis,  Escherichia  coli, Lactobacillus acidophilus dan Lactoacillus paracasei (Kuligowski et  al. 2013), Bacillus  cereus (Roubus-van  den  Hil et  al. 2009; Roubus-van den Hil et al. 2010 a ).
Isolasi  komponen  bioaktif  dapat  dilakukan  melalui  proses ekstraksi  menggunakan pelarut  dan  jenis  pelarut yang  diguna- kan  tergantung  pada  sifat  alami  dan  kelarutan  dari  komponen yang  akan  diekstraksi  (Sultana et  al. 2009).  Pelarut,  metode ekstraksi  dan  konsentrasi  pelarut  merupakan  faktor  ekstrinsik yang  penting  dalam  menentukan  sifat  antibakteri  yang  di- ekstraksi dari suatu bahan (Thomas et al. 2012). Pelarut organik seperti  etanol,  aseton,  dan  metanol  sering  digunakan  untuk mengekstraksi  komponen  bioaktif,  tetapi  etanol  merupakan pelarut yang paling banyak digunakan oleh industri obat-obatan herbal  karena  produk  akhir  yang  diperoleh  aman  digunakan untuk  pengobatan  internal  (Low,  2009).  Berdasarkan  hal tersebut  maka  perlu  dilakukan  penelitian  terhadap  aktivitas antibakteri  tempe  menggunakan  pelarut  organik  sehingga  di- peroleh senyawa sesuai dengan  sifat kepolarannya yang mem- berikan efek optimum dalam  menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  jenis  dan konsentrasi  larutan  pengekstrak  terhadap  kemampuan antimikroba  tempe  yang  diuji  pada Bacillus  subtilis dan Staphylococcus  aureus .

## BAHAN  DAN METODE

## Bahan
Bahan penelitian yang digunakan ialah  tempe yang diambil dari  Pasar  Tradisional  Pringgan,  Medan,  Sumatera  Utara. Bakteri  uji  berupa Bacillus  subtilis ATCC  6633  dan Staphylococcus  aureus ATCC  29737  diperoleh  dari Laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas  Farmasi  USU.
Pembuatan ekstrak tempe (Saraswaty et al. 2002) Pembuatan  ekstrak  tempe  dilakukan  dengan  cara  me- memarkan  300g  tempe  dengan  lumpang.  Kemudian  bahan dimaserasi  di  dalam  wadah  kaca  berwarna  gelap  masing- masing  dengan  pelarut  etanol  (E-Merck)  96% ,  n-heksana  (E- Merck)  dan  etil  asetat  (E-Merck)  sampai  seluruh  tempe terendam,  ditutup  dan  disimpan  pada  suhu  kamar  (27±2°C) selama  5  hari,  sambil  sesekali  diaduk.  Kemudian  larutan tersebut disaring  sehingga didapat  maserat. Maserat didiamkan selama  2  hari  untuk  menguapkan  sisa  pelarut,  lalu  filtrat dipekatkan  dengan  bantuan  alat rotary  evaporator (Buchi  461) pada  suhu  tidak  lebih  dari  50°C  sampai  diperoleh  ekstrak kental,  kemudian  dikeringkan  dengan freeze  dryer (Modulio). Masing-masing ekstrak  etanol (E-Merck), n-heksana (E-Merck) dan  etil  asetat  (E-Merck)  tempe  ditimbang  sebanyak  5  g menggunakan  neraca  analitik  (Vibra  AJ)  kemudian  dilarutkan dalam dimetilsulfoksida (E-Merck) sampai  larut dan dicukupkan dengan  etanol  (E-Merck)  pada  labu  ukur  10  mL  sehingga diperoleh konsentrasi 500 mg/L selanjutnya dibuat pengenceran dengan konsentrasi  400 dan 300 mg/mL.

## Pembuatan suspensi bakteri uji (NCCLS, 2003)
Bakteri yang digunakan ialah bakteri  Gram positif ( Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Staphylococcus aureus ATCC 29737). Stok  kultur  dibuat  dengan  cara  menumbuhkan  masing-masing bakteri  uji  pada  media  NA  (Oxoid)  miring  dengan  cara menggores,  kemudian  diinkubasi  dalam  inkubator  ( Fischer Scientific ) pada suhu 36-37°C selama 18-24 jam. Koloni bakteri diambil  dari  stok  kultur  dengan  jarum  ose  steril  lalu  di- suspensikan  dalam  tabung  reaksi  yang  berisi  10  mL  larutan Nutrient  Broth (Oxoid),  sambil  diukur  kekeruhannya  pada panjang  gelombang  580  nm  dengan  spektrofotometer  visibel (Dynamica),  sampai  diperoleh  transmitan  25%   (konsentrasi bakteri  1.0x10 6 CFU/mL).

## Pengujian antibakteri (NCCLS, 2003)
Pengujian antibakteri dilakukan  terhadap ekstrak  etanol (E- Merck),  ekstrak  n-heksana  (E-Merck),  ekstrak  etil  asetat  (E- Merck) dengan metode difusi agar menggunakan kertas cakram (Oxoid).  Inokulum  bakteri  diambil  sebanyak  0.1  mL  meng- gunakan pipet mikro (Eppendorf) dicampur homogen dengan 15 mL  Mueller  Hinton  Aga r (MHA)  (Oxoid)  di  cawan  petri  steril, kemudian dibiarkan sampai  media  memadat. Pada  media yang telah padat diletakkan kertas cakram (oxoid) yang sudah berisi masing-masing  ekstrak  berbagai  konsentrasi,  dan  untuk pembanding  kontrol  positif  dipakai  kertas  cakram  yang  sudah berisi  antibiotik  amoksisilin  30  µg/mL  (Oxoid).  Kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 36-37°C selama 18-24 jam.  Selanjutnya  diameter  daerah  bening  di  sekitar  kertas cakram diukur  menggunakan  jangka sorong. Ekstrak yang diuji dibuat dalam 3 ulangan, dan pengujian  masing-masing ekstrak dilakukan  dengan duplo.

## Analisis data (Steel dan Torrie, 1993)
Analisis  data  dilakukan  dengan  statistik  non  parametrik menggunakan program komputer SPSS versi 14. Data diameter hambat  dari  masing-masing  bahan  uji  dianalisis  dengan menggunakan  uji  Kolmogorov-Smirnov  untuk  melihat  apakah data  terdistribusi  normal  atau  tidak  normal.  Selanjutnya  uji dilanjutkan  dengan  menggunakan  uji Homogeneity  of  Varian untuk  mengetahui apakah varian dari data homogen  atau  tidak homogen.  Jika  data  yang  diperoleh  terdistribusi  tidak  normal, dilakukan  analisis  menggunakan  uji  Kruskal-Wallis  yang dilanjutkan  dengan uji beda rata-rata  Mann-Whitney.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Daya  antibakteri  ekstrak  etanol,  etil  asetat  dan  n-heksana tempe  terhadap Bacillus  Subtilis dan Staphylococcus aureus
Tabel  1  menunjukkan  hasil  pengujian  antibakteri  ekstrak etanol, etil asetat dan n-heksana  tempe  terhadap bakteri Gram positif B.  Subtilis dan S.  aureus. Penghambatan  bakteri  Gram positif B.  Subtilis dan S.  aureus oleh  ekstrak  etanol  dan  etil asetat  terjadi  pada  ekstrak  dengan  konsentrasi  50,  40,  dan 30% , sedangkan ekstrak n-heksana  tempe  tidak  memiliki daya hambat  terhadap  kedua  bakteri  yang  diuji.  Uji  normalitas dengan  uji  Kolmogorov-Smirnov  menunjukkan  adanya
perbedaan yang nyata ( p <0.05) pada diameter hambat ekstrak dengan  pelarut  yang  berbeda.  Diameter  hambat  ekstrak  etil asetat,  etanol  dan  n-heksana tempe  terhadap Bacillus  subtilis homogen  dengan  nilai  signifikansi  0.083.  Diameter  hambat ekstrak  etil  asetat,  etanol  dan  n-heksana  tempe  terhadap Staphylococcus  aureus tidak  homogen,  sehingga  tidak memenuhi  kriteria  parametrik,  oleh  sebab  itu  digunakan  uji Kruskal-Wallis  yang  menunjukkan  nilai  signifikansi  sebesar 0.001  ( p <0.05,  taraf  kepercayaan  95% ),  berarti  terdapat  per- bedaan antar kelompok  bahan uji.
Tabel  1.  Diameter  hambat  ekstrak  etil  asetat,  etanol  dan  n-heksana terhadap B. subtilis dan S. aureus
Keterangan: a) SD  =  Standar  Deviasi;  EEAT  =  Ekstrak  etil  asetat  tempe,  EET  = ekstrak  etanol  tempe,  En-HT  = ekstrak  n-heksana  tempe b) Diameter kertas 6 mm c) Angka yang  diikuti  dengan  huruf y ang sama  pada  kolom y ang sama berbeda  tidak  nyata  pada  taraf  kepercayaan  95%  ( p >0.05)  dengan  uji Kruskal-Wallis
Komponen  bioaktif  tempe  dengan  aktivitas  antibakteri  ter- bentuk  selama  fermentasi  kedelai  (Roubus-van  den  Hil  dan Nout, 2011). Hasil penelitian  Bintari, et al. (2008)  menunjukkan selama  fermentasi  tempe  oleh Rhizopus  sp .  dihasilkan  zat antibakteri  berupa  glikoprotein,  sehingga  pertumbuhan  bakteri Gram  positif Micrococcus  luteus yang  merupakan  salah  satu kontaminan  pada  tempe  terhambat.  Senyawa  glikoprotein (Bintari et  al. 2008),  golongan  protein  (amina)  yang  telah diisolasi  dari  media  yang  diinokulasikan  biakan R . oligosporus (Saraswaty et  al. 2002)  dan  senyawa  flavonoid  (isoflavon) merupakan  beberapa  senyawa  golongan  antimikroba  yang terdapat  pada tempe.
Tabel  1  menunjukkan  daya  hambat  yang  diberikan  oleh ekstrak etil asetat pada konsentrasi 30,  40, dan 50%  terhadap B.  subtilis dan S.  aureus lebih  besar  dari  daya  hambat amoksisilin  0.030  mg/mL.  Daya  hambat  ekstrak  tempe  baik ekstrak  etil  asetat  maupun  ekstrak  etanol  terhadap  bakteri B. subtilis lebih rendah daripada daya hambatnya terhadap bakteri S.aureus ,  sebaliknya  daya  hambat  amoksisilin  terhadap B. subtilis lebih  besar  daripada  daya  hambatnya  terhadap S. aureus .  Daya  hambat  ekstrak  etil  asetat  tempe  terhadap S. aureus cenderung  lebih  tinggi  daripada  daya  hambat amoksisilin,  meskipun  secara  statistik  berbeda  tidak  nyata kecuali  pada  konsentrasi  ekstrak  50% .  Daya  hambat  ekstrak etanol  tempe  terhadap B.  subtilis dan S.  aureus lebih  rendah daripada  daya  hambat  amoksisilin.  Hasil  ini  menunjukkan bahwa S. aureus cenderung memiliki resistensi yang lebih tinggi
terhadap antibakteri daripada B. subtilis . Adanya sifat kepolaran yang  hampir  sama  dari  golongan  senyawa  kimia  yang  ter- kandung  di  dalam  ekstrak  etil  asetat  terhadap  sifat  lapisan membran  luar  bakteri  Gram  positif  menyebabkan  ekstrak  etil asetat  lebih  mudah  masuk  ke  dalam  membran  dinding  sel bakteri Gram positif, sehingga efek antibakteri ekstrak etil asetat lebih besar daripada ekstrak  etanol.
Bakteri Gram positif memiliki kandungan peptidoglikan yang tinggi  dan  lipid  yang  lebih  rendah  dibandingkan  bakteri  Gram negatif  (Pratiwi,  2008),  hal  ini  menyebabkan  Gram  positif menjadi  lebih bersifat polar. Etil asetat  memiliki  kepolaran yang lebih rendah daripada etanol. Ekstraksi yang dilakukan  dengan maserasi  menggunakan  pelarut  etanol  akan  menarik  senyawa yang  bersifat  polar,  sedang  ekstraksi  dengan  maserasi  meng- gunakan  pelarut  etil  asetat  menarik  senyawa  yang  bersifat semipolar  dan  dan  senyawa  dengan  tingkat  kepolaran  yang rendah.  Hasil  ini  juga  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etil  asetat memiliki  kepolaran  yang  hampir  sama  dengan  lapisan  luar dinding sel bakteri Gram positif sehingga  daya hambatnya lebih besar  daripada  ekstrak  etanol.  Bakteri  Gram  positif  seperti B. subtilis dan S.  aureus memiliki  struktur  dinding  sel  yang  ber- lapis,  sedangkan  bakteri  Gram  negatif  mempunyai  satu  lapis yang  tebal.  Salah  satu  mekanisme  antibiotik  ialah  merusak struktur  dinding  sel  pada  membran  plasma  sehingga kemampuan  membran  plasma  sel  bakteri  sebagai  penghalang ( barrier ) osmosis menjadi berkurang dan mengganggu sejumlah proses  biosintesis  yang  diperlukan  dalam  me mbran  (Brogden, 2005).
Tabel  1  juga  menunjukkan  bahwa  aktivitas  antibakteri  dari ekstrak  tempe  baik  dengan  menggunakan  pelarut  etil  asetat, etanol,  maupun  n-heksana  hampir  sama  pada  kisaran konsentrasi  300-500  mg/ml.  Aktivitas  antibakteri  yang  hampir sama  pada  kisaran  konsentrasi  terendah  dan  tertinggi  me- nunjukkan bahwa pengaruh berat molekul dan laju difusi melalui media  agar  lebih  besar  daripada  konsentrasi  ekstrak  tempe. Diameter  hambat  yang  besar  berhubungan  dengan  berat molekul yang rendah dan laju difusi dari komponen  antibakteri yang cepat pada media agar (Thomas et al. 2012). Pada proses fermentasi  tempe, beberapa strain dari kapang Rhizopus men- degradasi  makromolekul yang menghasilkan komponen bioaktif (Roubus  van  den  Hill et  al. 2010 b ).  Penelitian  Roubus et  al. (2010 a ) menunjukkan komponen antibakteri dari R. oligosporus pada  substrat  tempe  kedelai  adalah  berupa  molekul  peptida dengan berat molekul  < 3 kDa.
Tabel 1 menunjukkan ekstrak n-heksana tidak memiliki daya hambat  terhadap  bakteri  Gram  positif  ( B . subtilis dan S . aureus ).  n-heksana  merupakan  pelarut  bersifat  non  polar sehingga  menarik senyawa non polar dalam jumlah lebih besar dari  pada  yang  terdapat  dalam  ekstrak  etanol  dan  etil  asetat. Bakteri Gram positif  memiliki  lapisan  membran  luar ( outer  wall layer ) yang  terdiri  dari lapisan peptidoglikan dan bersifat polar. Perbedaan kepolaran antara senyawa kimia yang ditarik pelarut n-heksana  dengan  dinding  sel  bakteri  Gram  positif  ( B . subtilis dan S . aureus ),  menyebabkan  ekstrak  n-heksana  tempe  tidak dapat  mempengaruhi  per meabilitas  membran  sel  bakteri  gram positif  yang bersifat  polar.
Perlakuan Diameter Hambat (mm) ± SD a) B. subtilis S. aureus EEAT 500 mg/mL 14.13 ± 0.21 a 15.50 ± 0.44 a EEAT 400 mg/mL 12.10 ± 0.30 b 14.87 ± 0.21 a EEAT 300 mg/mL 11.43 ± 0.15 c 13.27 ± 0.25 a EET 500 mg/mL 9.93 ± 0.15 d 10.87 ± 0.35 a EET 400 mg/mL 8.83 ± 0.15 e 9.30 ± 0.20 a EET 300 mg/mL 8.27 ± 0.15 f 8.27 ± 0.25 a En-HT 500 mg/mL 6 g 6 b En-HT 400 mg/mL 6 g 6 b En-HT 300 mg/mL 6 g 6 b Kontrol (-) 6 g 6 b Amoksisillin 0.030 mg/mL 12.03 ± 0.06 b 11.45 ± 0.09 a

## KESIMPULAN
Ekstrak  etanol  dan  etil  asetat  tempe  bersifat  antibakteri terhadap  bakteri  Gram  positif Bacillus  subtilis dan Staphylococcus  aureus pada  konsentrasi  500,  400,  dan  300 mg/mL.  Ekstrak  etil  asetat  tempe  500  mg/mL  memiliki  daya hambat  paling  besar  terhadap S.  aureus sebesar  15.50±0.44 mm ( p >0.05) dan B. subtilis sebesar 14.13±0.21  mm ( p >0.05). Ekstrak  n-heksana  tempe  tidak  memiliki daya hambat  terhadap bakteri B. subtilis dan S. aureus .

## DAFTAR  PUSTAKA
Babu  PD,  Bhakyaraj  R,  Vidhyalakshmi  R.  2009.  A  low  cost nutritious  ”Tempe”  –  A  Review.  World  J  Dairy  Food  Sci  4: 22-27.
Bintari  SH,  Anisa  DP,  Veronika  EJ,  Rivana  CR.  2008.  Efek inokulasi bakteri Micrococcus  luteus terhadap pertumbuhan jamur  benang  dan  kandungan  isoflavon  pada  proses pengolahan tempe.  Biosaintifika  1: 1-8.
Brogden  KA.  2005.  Antimicrobial  peptides:  Pore  formers  or metabolic  inhibitors  in bacteria?. Nat Rev Microbiol 3: 238- 250. DOI: 10.1038/nrmicro1098.
Cuevas-Rodriguez  EO,  Milan-Carrilli  J,  Mora-Escobedo  R, Cardenas-Valenzuela  OG,  Reyes-Moreno  C.  2004.  Quality protein  maize ( Zea mays L)  tempe  flour  through solid  state fermentation  process.  LWT-Food  Sci  Technol  37:  54-67. DOI: 10.1016/S0023-6438(03)0013.
Kiers  JL,  Nout  MJR,  Rombouts  FM,  Nabuurs  MJA,  van  der Meulen  J.  2003.  Effect  of  fermented  soya  beans  on diarrhoea  and  feed  efﬁciency  in  weaned  piglets.  J  Appl Microbiol  95:  545–552.  DOI:  10.1046/j.1365-2672.2003. 02011.x.
Kuligowski  M,  Jasinska-Kuligowska  I,  Nowak  J.  2013. Evaluation  of  bean  and  soy  tempe  influence  on  intestinal bacteria  and  estimation  of  antibacterial  properties  of  bean tempe.  Pol J Microbiol  62: 189-194.
Low  DT.  2009.  Smart  talk  on  supplements  and  botanicals.
Alternative  Complementary  Therapies  15:  101-102.  DOI: 10.1089/act.2009.15106.
Nakajima  N,  Nozaki  N,  Ishihara  K,  Ishikawa  A,  Tsuji  H.  2005.
Analysis  of  isoflavone  content  in  tempe,  a  fermented soybean  and  preparation  of  a  new  isoflavone-enriched tempe.  J  Biosci  Bioeng  100:  685-687.  DOI:  10.1263/jbb. 100.685.
[NCCLS] National Committee for Clinical Laboratory Standards.
2003.  Performance  Standards  for  Antimicrobial  Disk Susceptibility  Tests.  6 th Ed M2-M8, Wayne, PA.
Nout MJR,  Kiers JL. 2005. Tempe fermentation, innovation and functionality:  update  into  the  third  millennium.  J  Appl Microbiol  98:  789-805.  DOI:  10.1111/j.1365-2672.2004. 02471.x.
Pablo  DR,  Gabriela  TP,  Maria  CA,  Alberto  EL.  2010. Optimization of additive combination for improved soy-wheat bread  quality.  Food  Bioprocess  Techl  3:  395-405.  DOI: 10.1007/s11947-008-0080-z.
Pratiwi  ST. 2008. Mikrobiologi  Farmasi. Jakarta:  Erlangga. Roubos-van den HPJ, Nout MJR. 2011. Anti-Diarrhoeal aspects of  fermented  soya beans, soybean and health. El-Shemy H (Ed.),  ISBN:  978-953-307-535-8,  In  Tech.  DOI:  10.5772/ 17997.
Roubus-van  den  HPJ,  Dalmas  E,  Nout  MJR,  Abee  T.  2010 a . Soya bean tempe ex tracts show antibacterial activity against Bacillus cereus cells and spores. J Appl Microbiol 109: 137- 145. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2009.04637.x.
Roubos-van den HPJ, Nout MJR, van der Meulen J, Gruppen H.
2010 b . Bioactivity of  tempe by inhibiting  adhesion of ETEC to  intestinal  cells, as  influenced by  fermentation and starter pure  cultures.  Food  Microbiol 27:  638-644.  DOI:  10.1016/ j.fm.2010.02.008.
Roubus-van den Hil PJ, Nout MJR, Beumer RR, van der Meulen J,  Zwietering  JH.  2009.  Fermented  soya  bean  (tempe) extracts reduce adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to intestinal epithelial cells. J App Microbiol 106: 1013–1021. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2008.04068.x.
Saraswaty  V,  Zainal  A,  Dewi  R.  2002.  Uji  Aktivitas  Antibakteri dari Medium Sabouraud Cair yang diperkaya dengan Infus Kacang  Kedelai  dan  telah  Diinokulasikan  dengan  Jamur Tempe Rhizopus  sp .  Prosiding  Seminar  Tantangan Penelitian  Kimia.  Hal. 67-74.
Steel  RGD,  Torrie  JH.  1993.  Prinsip  dan  Prosedur  Statistika: Suatu  Pendekatan  Biometrik.  Gramedia  Pustaka  Utama, Jakarta.  p.633-648.
Sultana  B,  Anwar  F,  Ashraf  M.  2009.  Effect  of  extraction solvent/technique  on  the  antioxidant  activity  of  selected medicinal  plant  ex tracts.  Molecules  14:  2167-2180.  DOI: 10.3390/molecules14062167.
Thomas  BT,  Effedua  HI,  Agu  GC,  Akinduti  PA,  Ejilude  O, Efuntoye  MO,  Ayodele  AE,  Oluwadun  A.  2012.   Extrinsic factors  influencing  antibacterial  activities  of Tapinanthus bangwensis against  diarrheal  causing  organisms.  Int  J Microbiol  Res  3:  33-37.  DOI:  10.5829/idosi.ijmr.2012.3.1. 56210.