16

## PLANTROPICA Journal of Agricultural Science. 2016. 1(2): 16-22

## KONFIRMASI GEN YANG MENCIRIKAN EKSPRESI ANTOSIANIN
PADA BUNCIS ( Phaseolus vulgaris L.)
GENE CONFIRMATION THAT CHARACTERIZE ANTHOCYANIN EXPRESSION IN COMMON BEAN ( Phaseolus vulgaris L.)
Freta Kirana Balladona *) , Darmawan Saptadi dan Andy Soegianto
Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Brawijaya Jl. Veteran, Malang 65145, Indonesia
*) E-mail: fretaballadona@gmail.com

## ABSTRAK
Peningkatan  permintaan  buncis  dari  luar negeri  membuat  beberapa  varietas  lokal tersisih  karena  varietas  introduksi  yang berasal  dari  luar  negeri  tersebut  memiliki kandungan  gizi  lebih  banyak  dari  varietas lokal.  Salah  satu  cara  meningkatkan kualitas  buncis  lokal  adalah  persilangan antara  varietas lokal  dan  varietas introduksi Namun identifikasi secara fenotipik memiliki beberapa  kelemahan.  Maka  dari  itu,  perlu dilakukan  identifikasi  molekuler  pada  tetua dan  hasil  persilangan  buncis  tersebut. Tujuan:  mengonfirmasi  keberadaan  gen antosianin  pada  beberapa  aksesi  buncis berdasarkan penanda gen antosianin melalui pendekatan tetua dengan keturunan berikutnya.  Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  10  isolat  DNA  buncis persilangan  lokal  dan  introduksi  dan  3 primer  SSR  (MdMYB9,  MdMYB12  dan MdMYB17).  Penelitian  ini  dilaksanakan pada bulan Februari-Mei 2015 di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya. Berdasarkan hasil amplifikasi terlihat bahwa ketiga  primer  tersebut  bersifat  polimorfis. Hal  ini  membuktikan  bahwa  primer  spesifik antosianin tersebut dikonfirmasi pada buncis. Berdasarkan panjang pita DNA yang ditinjau  pada Purple  Queen dan Gogo Kuning (tertua,) sama dengan keturunannya GK  x PQ,  PQ  x GK, PQ  x GI, GI  x  PQ dan GK x CS.
Kata  kunci:  SSR,  Polimorfisme,  Gen, Antosianin.

## ABSTRACT
The  increase  in  demand  for  introduction variety  of  common  beanhas  made  some local varieties becoming unfavorable. Therefore,  one  of  the  ways  to  improve  the quality of local varieties is by creating a new variety  such  as  crossing  between  local varieties and introduction varieties. However,  phenotypic  identification  has some weaknesses. Therefore, it is necessary  to  identify  the  molecular  to  the parental  and  its  line  of  common  bean crossing.  The  purpose:  to  confirm  some primers  of anthocyanin  polymorphism, which  can  be  used  as  marker  gene anthocyanin  through  parental  approach. Materials  used:  the  12  isolates  DNA introduction varieties bean plants crossbreeding with local varieties Surakarta, three specific microsatellite primer anthocyanins  (MdMYB9,  MdMYB12  and
MdMYB17).  This  research  was  held  in  the Laboratory  of  Biotechnology,  Faculty  of Agriculture, Brawijaya University in February-May 2015. Based on the amplification  result,  it  shows  that  the  three primers  are  polymorphic.  This  proves  that the  specific  primers  anthocyanin  can  be confirmed on the common beans. Based on the  size  of  DNA  band  under  review  is whether the size at Purple Queen and Gogo Kuning (parental) equal to the line GK x PQ, PQ x GK, PQ x GI, GI x CS, PQ and GK.
Keywords  :  SSR,  Polymorphism,  Gene, Anthocyanin.
Freta Kirana Balladona , et al : Konfirmasi Gen yang Mencirikan Ekspektasi Antosianin..................

## PENDAHULUAN
Menurut data statistik produksi tanaman  sayuran  buncis  di  Indonesia  pada tahun  2012-2013  berkisar  322.145-327.378 ton dan rata-rata hasil sayuran buncis pada tahun  2013  meningkat  5,23  ton  (BPS, 2014). Akan tetapi, peningkatan permintaan buncis  dari  luar  negeri  membuat  beberapa varietas  lokal  tersisih  karena  varietas introduksi  yang  mana  berasal  dari  luar negeri  tersebut  memiliki  kandungan  gizi yang  lebih  banyak  seperti  kandungan antosianin (Rubyogo et al., 2007). Maka dari itu,  salah  satu  cara  untuk  meningkatkan kualitas  varietas  lokal  tersebut  adalah dengan  menciptakan  suatu  varietas  baru yang mengandung antosianin, untuk melengkapi varietas lokal yang telah ada. Persilangan  antara  varietas  lokal  dan varietas  introduksi  (Purple  Queen)  yang dilakukan oleh Oktarisna et al . (2013). Pada identifikasi awal secara fenotipik persilangan tersebut memiliki hasil
perbandingan nisbah 3:1 yang menunjukkan adanya gen tunggal dominan yang mengendalikan karakter warna polong pada hasil  persilangan  tanaman  buncis.  Namun identifikasi secara fenotipik memiliki beberapa kelemahan yaitu terdapat beberapa  gen  yang  belum  terekspresi, seperti: beberapa hasil persilangan tersebut tidak  memiliki  warna  ungu  seperti  yang diharapkan.  Maka  dari  itu,  perlu  dilakukan identifikasi  molekuler  pada  tetua  dan  hasil persilangan  buncis  tersebut.  Salah  satu metode  penanda  molekuler  adalah  dengan menggunakan metode SSR (Simple
Sequence Repeat).
SSR  memiliki  beberapa  kelebihan, yaitu: SSR memiliki susunan yang kodominan, dapat digunakan untuk multialel dan  dapat  dilakukan  dalam  penelitian  di laboraturium  melalui  primer  sequence  yang telah dipublikasikan (Hale, 2003). Dalam hal ini, primer produksi antosianin spesifik untuk buncis  belum  ditemukan,  sehingga  perlu adanya  penelitian  dan  pengembangan penanda DNA gen atosianin pada buncis.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan  Februari  2013  hingga  Mei  2015  di laboratorium
bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya. Ektraksi DNA Bahan yang digunakan dalam ekstraksi  DNA  adalah  10  isolat  DNA tanaman buncis persilangan varietas introduksi  dengan  varietas  lokal  Surakarta, yaitu:  1.  Gogo  Kuning  (Ungu),  2.  Cherokee Sun  (Kuning),  3.  Purple  Queen  (Ungu),  4. Gilik  Ijo  (Hijau),  5.  Mantili  (Hijau),  6.  GK  x PQ (Ungu), 7. PQ x GK, (Ungu), 8. PQ x GI (Ungu),  9.  GI  x  PQ  (Ungu),  10.  GK  x  CS (Ungu), tris, HCl, ethanol 70 %, EDTA, H 2 O, NaCl, dan kloroform.
Ekstraksi  DNA  dilakukan  dengan mengacu  pada  protokol  ekstraksi  CTAB Doyle dan Doyle (1990).

## Pelaksanaan PCR
Bahan yang  digunakan dalam proses PCR  adalah  Taq  polimerase,  dd  H 2 O,  3 primer  dan  DNA  template  dari  masing- masing  galur.3  primer  mikrosatelit  spesifik antosianin (MdMYB9, MdMYB12 dan MdMYB17).  Alat  yang  digunakan  adalah mesin PCR, tube PCR, tip dan micropipet.Pelaksanaan PCR dimulai dengan  pre-denaturasi  2  menit  dan  suhu 94 o C  dengan  35  siklus.  Lalu  dilanjutkan dengan  denaturasi  dengan  suhu  94 o C selama  30  detik.  Annealing  dengan  suhu 49 o C  selama  30  detik  dan  elongasi  dengan suhu  72 o C  selama  1  menit. Final  extension dengan suhu 72 o C selama 1 menit.

## Elektroforesis
Bahan yang digunakan dalam elektroforesis  adalah  DNA  marker,  sampel DNA  hasil  amplifikasi,  gel  agarosa  1%  (0,4 gram),  larutan buffer TAE  1x  yang  telah diencerkan, loading  dye ,  dan  larutan Etidium Bromid (EtBr) sebagai pewarna. Alat yang digunakan dalam elektroforesis  adalah  timbangan,  spatula, gelas  ukur,  labu  erlenmeye,  sarung  tangan,
oven, seperangkat mikropipet beserta tipnya,  kertas  parafilm,  cetakan  agarose,

## 18
Freta Kirana Balladona , et al : Konfirmasi Gen yang Mencirikan Ekspektasi Antosianin..................
sisir  agarose,  baki  elektroforesis, gel  doc , dan kamera digital.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi DNA
Di  dalam  penelitian  ini,  teknik  isolasi DNA menggunakan teknik CTAB berdasarkan  penelitian  Doyle  dan  Doyle
(1990)  dan  pengecekan  kualitas  DNA menggunakan  gel  elektroforesis  1%.  Hasil elektroforesis  dari  seluruh  genom  tersebut terlihat bahwa DNA yang diperoleh merupakan  DNA  yang  utuh  (Gambar  1). DNA  yang  utuh  ditandai  dengan  tidak adanya  smear  DNA  yang  dielektroforesis. Hal ini menjadi penting karena pada proses PCR,  DNA  yang  masih  utuh  akan  lebih memberikan hasil yang relatif lebih akurat.
Pita genom DNA yang bersih mengindikasikan tingkat kemurnian DNA
yang  baik  (DNA  tidak  tergradasi  dan terkontaminasi).
Kontaminasi  oleh  fenol  dan  bahan organik  lainnya  seperti  polisakarida  dan metabolit  sekunder  seperti  tanin,  pigmen, alkaloid  dan  flavonoid  dapat  dilihat  dengan munculnya  latar  belakang  yang  smear disepanjang  jalur  pergerakan  pita  genom DNA.  Jika  ditemukan  adanya  kontaminasi RNA  maka  ditandai  dengan  adanya  pita yang  kabur  pada  posisi  berat  molekul  yang rendah (Tenriulo et al ., 2001).
Hal  diatas  dapat  dihindari  dengan penggunaanPVP dan mercaptoethanol akan mereduksi  senyawa-senyawa  fenolik  yang keberadaannya  dapat  merusak  kualitas DNA.  Selain  itu  penggerusan  secara langsung sampel segar tanpa penyimpanan selama semalam (Syafaruddin dan Santoso,
2011
Gambar  1 Hasil  Pengecekan  Kualitas  DNA  Buncis  dengan  gel  elektroforesis  1%,  (1)  Gogo Kuning (GK), (2) Cherokee Sun (CS), (3) Purple Queen (PQ), (4) Gilik Ijo (GI), (5) Mantili (M), (6) GK x PQ, (7) PQ x GK, (8) PQ x GI,  (9) GI x PQ,  (10) GK x CS, aksesi P . vulgaris L.
Freta Kirana Balladona , et al : Konfirmasi Gen yang Mencirikan Ekspektasi Antosianin..................
Amplifikasi  Gen  MdMYB9,  MdMYB12, MdMYB17
Pada  tahap  selanjutnya,  setelah memiliki  hasil  isolasi  DNA  yang  baik, pemilihan marka (penanda) yang digunakan juga penting. Tingkat keberhasilan amplifikasi  dari  teknologi  marka  (penanda) tergantung  dari  tersedianya  dalam  jumlah yang besar tingkat polimorfisme yang tinggi, di  dalam  pautan  (lingkage)  yang  mendekati antara  lokus  kandidat  marka  dengan  gen yang diinginkan dan juga kemudahan dalam penggunaan  marka  tersebut  (Yu et  al ., 2000).  Primer  yang  digunakan  dalam mendeteksi  kandungan  antosianin  pada buncis  di  dalam  penelitian  ini  adalah beberapa  kandidat  gen  MYB  yang  telah
ditemukan motif pengulangan penanda SSR pada apel.
Primer yang digunakan dalam mendeteksi  kandungan  antosianin  pada buncis  di  dalam  penelitian  ini  adalah beberapa  kandidat  gen  MYB  yang  telah ditemukan motif pengulangan penanda SSR pada  apel.  MYB  merupakan  protein  yang mengatur  flavonoid  pathway  biosintesis khususnya  antosianin  di  berbagai  macam tanaman  (Faramzi et  al., 2014)  dan komponen  kunci  dalam  mengaktivasi  gen- gen  sintesa antosianin  seperti  gen  produksi antosianin, aktivator atau inhibitor antosianin  (PAP1/MYB75,  MYB9,  MYB12
dan  MYB17)  (Takos et  al .,  2006).(Gambar
2)
Gambar  2 Representasi  hasil  amplifikasi  PCR  menggunakan  gel  elektroforesis  1% menggunakan  primer  (A)  MdMYB9,  (B)  MdMYB12  dan  (C)  MdMYB17  pada tanaman  buncis:  (1)  Gogo  Kuning  (GK),  (2)  Cherokee  Sun  (CS),  (3)  Purple Queen(PQ), (4) Gilik Ijo (GI), (5) Mantili (M), (6) GK x PQ, (7) PQ x GK, (8) PQ x GI,  (9) GI x PQ,  (10) GK x CS, aksesi P . vulgaris L.
A C B

## 20
Freta Kirana Balladona , et al : Konfirmasi Gen yang Mencirikan Ekspektasi Antosianin..................
Berdasarkan  hasil  amplifikasi  terlihat bahwa  dari  ketiga  primer  tersebut  bersifat polimorfis  dan  ada  beberapa  yang  memiliki lebih  dari  satu  alel.  Hal  ini  membuktikan bahwa  primer  spesifik  SSR  antosianin tersebut  dapat  dikonfirmasi  pada  buncis. Namun, tidak hanya melihat dari kesesuaian marka  yang  digunakan  melainkan  juga kesesuaian  dengan  kemunculan  alel  pada aksesi buncis tersebut. Primer yang diinginkan  merupakan  primer  yang  hanya terkonfimasi  pada  aksesi  buncis  Gogo
Kuning, Purple Queen, GK x PQ, PQ x GK, PQ  x  GI,  GI  x  PQ  dan  GK  x  CS  karena berwarna  ungu  yang  mencirikan  adanya kandungan antosianin,. Sedangkan
kesesuaian  primer  pada  hasil  amplifikasi tersaji dalam (Tabel 1), dibawah ini: Di  dalam  Tabel  1  terlihat  bahwa primer  yang  dapat  digunakan  sebagai penanda gen antosianin adalah primer yang telah  dikonfirmasi  melalui  polimorfisme  pita DNA  pada  seluruh  aksesi  buncis  dan kecenderungan  monomorfisme  pada  tetua buncis  Purple  queen  dan  keturunannya serta kesesuaian panjang pita DNA tersebut.  Jika  dibandingan  dengan  ketiga
primer tersebut, primer yang sesuai dengan kriteria  adalah  primer  MdMYB9  yang  mana primer  tersebut  merupakan  primer  gen produksi  antosianin  (Chagne et  al., 2007). Jika  ditinjau  melalui  keberadaan  alel,  gen MdMYB9 menunjukkan bahwa hanya buncis  yang  berpolong  ungu  yang  dapat menunjukkan pita DNA. Hal ini berarti hanya pada buncis yang berpolong ungu ditemukan gen produksi antosianin. Sedangkan  primer  yang  lain,  buncis  yang tidak  berpolong  ungu  ada  beberapa  yang dapat  menunjukkan  pita  DNA.  Pada  primer MYB12,  pada  buncis  Gilik  Ijo  muncul  satu alel  karena  gen  MYB12  yaitu  aktivator antosianin (Chagne et al., 2007) terkonfirmasi  pada  buncis  berwarna  hijau, sehingga  berpotensi  adanya  MdMYB12 yaitu  aktivator  antosianin  selain  dari  pada buncis  yang  memiliki  polong  berwarna ungu.  Pada  primer  MdMYB17  juga  muncul satu  alel  pada  buncis  Cherokee  Sun  yaitu memiliki warna kuning sehingga gen MYB17 yaitu  sebagai  gen  inhibitor  antosianin (Chagne et  al., 2007)  berpotensi  muncul pada  buncis  selain  dari  pada  warna  ungU.
Tabel 1 Amplifikasi pada Masing-Masing Primer
Nama Aksesi Warna Polong MYB9 MYB12 MYB17 Alel Panjang (bp) Alel Panjang (bp) Alel Panjang (bp) Gogo Kuning (GK) Ungu + 150 + 250 + 300 Cherokee Sun (CS) Kuning - - - - + 300 Purple Queen (PQ) Ungu ++ 200 dan >1500 + 300 + 350 Gilik Ijo (GI) Hijau - - + 300 - - Mantili (M) Hijau - - - - - - GK x PQ Ungu ++ 200 dan >1500 + 300 + 350 PQ x GK Ungu + 200 + 300 + 350 PQ x GI Ungu ++ 200 dan >1500 + 300 + 350 GI x PQ Ungu ++++ 200, 400, 900 dan >1500 ++ 300 dan 250 + 350 GK x CS Ungu ++ 200 dan >1500 - - + 350 Keterangan: +     = keberadaan dan jumlah alel. - = null allel (tidak ada alel).
Freta Kirana Balladona , et al : Konfirmasi Gen yang Mencirikan Ekspektasi Antosianin..................
Kemudian,  ditinjau  dari  panjang  pita DNA  menunjukkan  bahwa  tidak  ada  alel yang  menunjukkan  panjang  yang  sesuai informasi  yang  tertera  pada  (Chagne et  al., 2007).  Hal  ini  dikarenakan  informasi  primer pada penelitian tersebut berasal dari aksesi apel.  Sedangkan  ditinjau  dari  kekerabatan antara  apel  dan  buncis  sangat  jauh. Sehingga,  tidak  dapat  dikonfirmasi  dengan tepat  panjang  alel  gen  antosianin  tersebut. Penggunaan  SSR  antar  spesies  tidak menutup kemungkinan karena telah dibuktikan  melalui  penelitian  Saptadi et  al. (2011),  namun  pada  tingkat  keberhasilan pada  penggunaan  primer  tersebut  lebih tinggi  jika  jarak  kekerabatan  tanaman tersebut  semakin  dekat.  Sehingga  dalam penelitian  ini,  berdasarkan  panjang  pita DNA  yang  ditinjau  adalah  panjang  pada Purple  Queen  dan  Gogo  Kuning  (tertua) sama dengan keturunannya GK x PQ, PQ x GK,  PQ  x  GI,  GI  x  PQ  dan  GK  x  CS. Panjang  pita  DNA  yang  paling  sesuai  dan mendekati  antara  tetua  dan  keturunannya adalah  pada  primer  MYB9.  Ada  beberapa asumsi  penyebab  ketidaksesuaian  panjang primer  dan  jumlah  alel  dengan  informasi yang  tersedia  yaitu  perbedaan  aksesi  yang dipakai  dan  tersedia  maupun  tidak  tersedia gen  produksi,  aktivator  dan  inhibitor  pada tanaman buncis tersebut.
Menurut  penelitian  Reddy  (1996) mengenai  genetik  dan  analisis  molekuler jalur  pigmen  antosianin  menyatakan  bahwa interaksi  gen  nonallelik  mengarah  ke modifikasi  dari  rasio  fenotip  F2.  Sistem pigmen  antosianin  gen  terdiri  dari  terutama tiga gen dasar: C (chromogen), A (aktivator),  dan  P  (distributor).  Gen  yang telah dikenal dapat dikelompokkan ke dalam gen  struktural  sementara  dan  gen  pengatur (regulator).  Di  antara  gen  struktural:  gen  C, A,  Rc,  dan  Rd  dapat  mengkodekan  enzim dari  jalur  sedangkan  gen  pengatur:  P  dan Pl, dengan alel yang beragam, menentukan regulasi  temporal  dan  spasial  pigmentasi. Selain itu,  dominan inhibitor  nonallelik  pada lokus  telah  ditemukan.  Pola  pigmentasi antosianin  dalam  tanaman  padi  dengan demikian  ditentukan  terutama  oleh  status alel  gen  individu  dan  interaksi  yang kompleks di antara mereka. Pada penampilan  fenotip  gen  struktural  dan
regulator  dapat  ditemukan  beragam  alel yang  mengaktivasi  gen  tersebut  dan  ada juga  kemunculan  null  allele  atau  tidak  ada alel.

## KESIMPULAN
Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa dijumpai  gen  yang  mencirikan ekspresi  gen antosianin  pada  seluruh  aksesi  tanama buncis  dari  ketiga  primer  yang  diujikan  dan berdasarkan  jumlah  dan  panjang  alel  pada beberapa  tetua  buncis  yaitu  Purple  Queen dan  Gogo  Kuning  hampir  sama  dengan galur-galur keturunannya .

## DAFTAR PUSTAKA
BPS.  2014 .  Produksi  sayuran  Indonesia, 1997-2013.
http://www.bps.go.id/tab_sub/view.ph p?kat=3&tabel=1&daftar=1&id_subye k=55&notab=70. Diakses pada
tanggal 1 November 2014.
Chagné, D., C. M. Carlisle, C. Blond, R. K. Volz,  C.  J.  Whitworth,  N.  C. Oraguzie,  R.  N.  Crowhurst,  A.  C. Allan, R. V. Espley, R. P. Hellensand  S.  E.  Gardiner.  2007. Mapping a candidate gen (MdMYB10) for  red  flesh  and  foliage  colour  in apple. BMC Genomic 1(8): 212-223. Doyle,  J.J.  dan  J.L.  Doyle.  1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus (12): 13-15.
Hale,  A.  L.  2003. Screening  potato genotypes  for  antoxidant  activity, identification of the responsible compunds,  and  differentiaying  russet norkotah  strains  using  AFLP  and microsatelite marker
analysis.
Desertation.  Texas  A&M  University.
USA
Oktarisna,  F.  A.,  A.  Soegianto,  A.  N. Sugiharto.  2013. Pola  pewarisan sifat warna polong pada hasil persilangan tanaman buncis (Phaseolus vulgaris L.) varietas introduksi dengan varietas lokal mantili. Jurnal  Produksi  Tanaman . 2(1): 81-89.
Reddy,  A.  R.  1996. Genetic  and  molecular analysis of the anthocyanin

## 22
Freta Kirana Balladona , et al : Konfirmasi Gen yang Mencirikan Ekspektasi Antosianin..................
pigmentation pathway in rice. Proceding  of  International  Third  Rice
Genetics Symposium p.p.341-352.
Rubyogo, J.C., L. Sperling dan T. Assefa.
2007. Pendekatan baru guna memfasilitasi  akses  petani  pada benih buncis. Artikel. Ethiopian Institute  Agriculture  Addis  Ababa.
Penerjemah Salam. Ethiopia. Saptadi,  D.,  R.R.S.  Hartati.  A.  Setiawan, B.  Heliyanto  dan  Sudarsono.  2011. Pengembangan marka simple sequence repeat untuk Jatropha spp.
Jurnal Littri 17(4): 140 – 149.
Syafaruddin  dan  T.  J.  Santoso.  2011. Optimasi  teknik  isolasi  dan  purifikasi DNA  yang  efisien  dan  efektif  pada kemiri  sunan  ( Reutalis  trisperma (Blanco)  Airy  Shaw). Jurnal  Littri 17 (1): 11-17.
Takos,  A.  M.,  F.  W.  Jeffé,  S.  R.  Jacob,  J. Bogs,  S.  P.  Robinson  dan  A.  R. Walker. 2006. Light-induced expression  of  a  MYB  gene  regulates anthocyanin biosynthesis in red apples. Journal  of  Plant  Physiology
(142): 1216-1232.
Tenriulo,  A.,  E.  Suryati,  A.  Parenrengi dan  Rosmiat.  2001. Ekstraksi  DNA rumput  laut  kappaphycus  alvarezii dengan metode fenol  kloroform.
Marina Chimica Acta 2(2): 6-10. Yu, K., S. J. Park, V. Poysa dan P. Gepts. 2000. Integration  Simple  Sequence Repeat (SSR) markers into molecular lingkage  map  of  common  bean (Phaseolus  vulgaris  L.). Journal  of Heredity 91 (6): 429-434.