Opik Taupiqurrohman 1 ; Muhammad Yusuf 2 ; Sukma Nuswantara 1,3 dan Toto Subroto 1,2,*
1 Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Universitas Padjadjaran, Bandung 2 Departemen Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Padjadjaran, Sumedang 3 Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor *Korespondensi: t.subroto@unpad.ac.id
Abstrak. Sampai  saat  ini  vaksinasi  dianggap  sebagai  cara  yang  efektif  dalam  mencegah  penyakit menular.  Semua  proses  vaksinasi  bekerja  dengan  menampilkan  antigen  asing  terhadap  sistem  imun agar  respon  sistem  imun  bangkit.  Bahan  aktif  vaksin  dapat  berbentuk  patogen  utuh  (bakteri  atau virus) yang dilemahkan, atau komponen patogen yang imunogenik dan telah dimurnikan. Pendekatan konvensional dalam pengembangan vaksin membutuhkan biakan mikroorganisme patogen dan diseksi dengan  menggunakan  teknik  biokimia,  imunologi,  dan  metode  mikrobiologi  dalam  mengidentifikasi komponen penting terhadap sistem imunitas. Metode ini telah berhasil dalam berbagai kasus, namun gagal  memberikan  solusi  bagi  banyak  patogen  yang  belum  dapat  dibuatkan  vaksinnya.  Dewasa  ini, dimungkinkan  menggunakan  informasi  genomik  untuk  mempelajari  perancangan  vaksin  secara  in silico,  tanpa  perlu  membiakan  mikroorganisme  patogen.  Pendekatan  yang  telah  diberi  nama 'vaksinologi terbalik' ini dapat mengurangi waktu yang dibutuhkan untuk identifikasi kandidat vaksin dan  memberikan  solusi  baru  bagi  vaksin-vaksin  yang  selama  ini  sulit  dikembangkan.  Meningkatnya pemahaman  mengenai  pengenalan  antigen  pada  tingkat  molekul,  telah  berdampak  pada pengembangan desain rasional vaksin berbasis peptida atau epitop. Konsep vaksin peptida didasarkan pada  identifikasi  dan  sintesis  kimia  epitop  sel-B  dan  sel-T  yang  imunodominan,  yang  dapat menginduksi  respon  imun  spesifik.  Perkembangan  yang  cepat  dari  teknik  bioinformatika  dan aplikasinya  dengan  sejumlah  besar  data  eksperimen  telah  melahirkan  bidang  baru,  disebut imunoinformatika.  Imunoinformatika  adalah  cabang  dari  bioinformatika  yang  berkaitan  dengan analisis  in  silico  serta  pemodelan  data  imunologi  dan  masalahnya.  Kajian  ini  bertujuan  untuk merancang vaksin virus papilloma manusia berbasis epitop berbantukan imunoinformatika.
Kata Kunci: vaksin, virus papilloma manusia, bioinformatika, imunoinformatika, epitope

## PENDAHULUAN
Kanker serviks memiliki tingkat prevalensi  tertinggi  di  dunia  (Bruni et  al., 2015), termasuk Indonesia (Andrijono, 2008). Jumlah penderita dan jumlah kematian akibat kanker  serviks  di  Indonesia  mengalami peningkatan setiap tahun (Kementrian
Kesehatan,  2015).  Kanker  serviks  juga memiliki  tingkat  mortalitas  yang  tinggi (Mzibri, et  al. ,  2012) dan  cenderung menyerang  wanita  dengan  usia  produktif (Hidayati  dkk,  2009).  Vaksin  merupakan sarana  penanggulangan  dan  pencegahan kanker serviks yang paling efektif (Andrijono, 2008; Rappouli, 2000).
Kanker  serviks  disebabkan  oleh  infeksi Human  papillomavirus  (HPV)  (Hidayati  dkk, 2009).  Di  antara  semua  tipe,  HPV  tipe  16 merupakan penyebab utama kanker serviks di Indonesia (60%) dan di dunia (45,5%) (Bruni et  al., 2015).  Oleh  karena  itu,  HPV  tipe  16 merupakan target utama dalam pengembangan vaksin kanker serviks. Kondisi
saat  ini,  vaksin  kanker  masih  belum  bisa terjangkau  oleh  kebanyakan  masyarakat Indonesia.  Pemerintah  Indonesia  belum mampu memberikan subsidi untuk penggunaan  vaksin  kanker  serviks  (Adhi, 2016). Salah satu sebab tingginya harga vaksin adalah lamanya proses pengembangan vaksin yang  bisa  mencapai  5-15  tahun  (Vita et  al., 2014). Oleh karena itu, efisiensi dalam proses pengembangan  vaksin  perlu  dilakukan.  Saat ini,  telah  berkembang  penemuan  kandidat vaksin  menggunakan  pendekatan  imuno- informatika,  yang  dapat  mengefisiensikan tahapan  analisis  genomik  sampai  penemuan kandidat  vaksin  menjadi  1-2  tahun  saja (Rappouli,  2000).  Telah  dilaporkan  beberapa keberhasilan imunoinformatika dalam menemukan  peptida  sebagai  kandidat  vaksin secara in  vitro dan in  vivo (Rappouli,  2000; Fatima and Desu, 2014; Li, et al. , 2015). Imunoinformatika  merupakan  kajian multidisiplin yang melibatkan beberapa aspek keilmuan,  diantaranya  bioinformatika  dan
imunologi.  Imunoinformatika  berkembang dengan  pesat  seiring  dengan  melimpahnya keterbukaan  akses  terhadap  data  genom, diantaranya IEDB ( immunoepitope database ) (Vita et al. , 2014) dan Vaxign (Xiang and He,
2009). Metode ini dapat membantu penemuan  vaksin  peptida,  yaitu  vaksin  yang terdiri  dari  bagian  minimal  antigen  (8-15 asam amino)  yang dapat menginduksi sistem imun  (Toth et  al. ,  2008).  Vaksin  peptida memiliki  keunggulan  dibandingkan  vaksin konvensional  dari  segi  spesifisitas  penyakit, kemurnian,  kapasitas  produksi,  dan  efisiensi biaya  produksi  (Toth et  al. ,  2008).  Saat  ini hampir  seluruh  genom  HPV  sudah  dapat diakses  di  IEDB.  Genom  HPV  terbagi  dalam tiga  kategori,  yaitu  regulator  (10%), early (50%) dan late (40%) (Morshed et al., 2014). Gen onkoprotein E6 dan E7 merupakan target yang  menarik  dalam  pengembangan  vaksin HPV  karena  perannya  yang  penting  dalam inisiasi  dan  proliferasi  sel  kanker  serviks. Mekanisme vaksin peptida dalam menginduksi  respon  imun  adalah  melalui interaksi dengan suatu protein transport yang bertugas  membawa  antigen  spesifik  internal atau  eksternal  menuju  sel  T,  yang  disebut Major  Histocompatibility  Complex (MHC) (Sompayrac, 2008).
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk menemukan  kandidat  vaksin  HPV  tipe  16 berbasis
peptida/epitop menggunakan pendekatan  imunoinformatika  dengan  fokus utama potensi afinitas peptida terhadap MHC I  yang  diprediksi  menggunakan  IEDB-AR
( Immune Epitope Database Analysis
Resource ).  Kemudian,  interaksi  molekular antara  peptida  kandidat  vaksin  dan  MHC  I diprediksi  dengan  metode  doking  molekular. Penelitian  ini  diharapkan  dapat  membantu proses  penemuan  kandidat  vaksin  kanker serviks yang lebih efektif dan efisien.

## METODE
Analisis homologi gen HPV tipe 16 terhadap genom manusia
Urutan  gen  HPV  tipe  16,  yang  telah ditranslasikan menjadi urutan asam aminonya, diperoleh dari Uniprot (http://www.uniprot.org/). Kemudian analisis homologi  urutan  asam  aminonya  terhadap genom manusia dilakukan dengan menggunakan program TFASTY (Wang et al., 2010).
Prediksi  afinitas  peptida  terhadap Major Histocompatibility Complex (MHC)
Urutan  asam  amino  yang  tidak  homolog dengan genom manusia, diprediksi afinitasnya terhadap MHC menggunakan program IEDB- AR  (Vita et  al., 2014).  Varian  MHC  yang digunakan  untuk  prediksi  afinitas  peptida terhadap MHC I adalah alel HLA-A*02:01.
Prediksi  interaksi  molekular  antara  peptida kandidat vaksin dan MHC
Doking  molekular  dilakukan  dengan menggunakan  program  Cabsdock  (Kurcinski et  al., 2015). Validasi  metode  dan  parameter Cabsdock  dilakukan  dengan  doking ulang enam struktur kristal kompleks MHC-peptida yang diperoleh dari PDB ( Protein Data Bank ). Pada tahapan penyiapan struktur MHC, asam amino  selain  sisi  aktif  protein  tidak dimasukkan  dalam  perhitungan  doking molekular.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis  homologi  gen  HPV  tipe  16  terhadap genom manusia
Analisis  homologi  menunjukkan  bahwa E1,  E6,  dan  L2  memiliki  persentase keidentikan  sebesar  28,57%,  28,91%,  dan 25,71% dengan genom manusia. Sehingga, gen E1, E6, dan L2 diprediksi dapat menimbulkan respon  autoimun  apabila  digunakan  sebagai komponen vaksin peptida (epitop).  Autoimun adalah  sebuah  kelainan  respon  imun  spesifik yang  menyerang  sel  diri  sendiri,  sehingga apabila  vaksin  epitop  yang  bersumber  dari protein  yang  mirip  dengan  manusia  diduga akan  menimbulkan  respon  tersebut.  Respon autoimun biasanya diinduksi oleh sel T dan sel B  masing-masing,  atau  bisa  juga  oleh keduanya.  Pada  beberapa  kasus  autoimun dapat mengakibatkan hilangnya fungsi jaringan tubuh (Bellone, 2005). Diantara gen- gen  HPV  tipe  16  yang  tidak  homolog  dengan genom  manusia,  E7  dipilih  untuk  dikaji  lebih lanjut  sebagai  komponen  vaksin  peptida.  E7 diketahui sebagai salah satu onkoprotein yang penting  dalam  pertumbuhan  sel  kanker melalui  interaksinya  dengan  pRb  (Yim  and Park, 2005).
Prediksi  peptida  yang  dapat  mengikat Major Histocompatibility Complex (MHC) I
Prediksi peptida (epitop) dari gen E7 yang dapat  mengikat  MHC  I  pada  penelitian  ini dilakukan  dengan  menggunakan  program IEDB-AR  (Vita et  al., 2014).  Dalam  hasil analisis,  peptida  dengan  peringkat  persentil ( percentile  rank )  yang  kecil  diprediksi memiliki  afinitas  yang  baik  dengan  MHC  I.
Peringkat  persentil  mengacu  pada  persentase skor  yang  sama  atau  kurang  dari  nilai  IC 50 peptida  yang  terprediksi.  IC 50 adalah konsentrasi  peptida  yang  menyebabkan  50% MHC  terinhibisi.  Pengklasifikasian  afinitas hasil  prediksi  ikatan  peptida-MHC  pada program  IEDB-AR  adalah  sebagai  berikut:
tinggi  (IC 50 <50  nM),  menengah  (<500  nM) dan  rendah  (<5000  nM)  (Vita et  al .,  2014). Analisis  epitop  MHC  I  dengan  IEDB-AR menghasilkan  lima  peptida  dengan  nilai peringkat  persentil  terbaik,  yang  ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1 . Hasil prediksi afinitas peptida terhadap MHC I Gen HPV Alel Posisi Residu Panjang Peptida Peringkat Persentil Nilai IC 50 (nM)* Awal  Akhir E7 HLA- A*02:01 11 19 9 YMLDLQPET 0,4 5 E7 HLA- A*02:01 82 90 9 LLMGTLGIV 0,8 19 E7 HLA- A*02:01 7 15 9 TLHEYMLDL 2,1 48 E7 HLA- A*02:01 85 93 9 GTLGIVCPI 4,4 155 E7 HLA- A*02:01 66 74 9 RLCVQSTHV 4,7 781
Prediksi  interaksi  molekular  peptida  kandidat vaksin dengan MHC I
Prediksi  epitop  MHC  I  berbasis  sekuen asam  amino  telah  dilakukan  menggunakan program  IEDB-AR,  menghasilkan  urutan peptida  YMLDLQPET.  Interaksi  molekular antara  peptida  ini  dengan  MHC  dianalisis lebih  lanjut  menggunakan  metode  doking molekular.  Kemampuan  program  doking dalam  menentukan  konformasi  peptida  pada MHC  dievaluasi  dengan  melakukan  doking ulang  struktur  peptida  yang  telah  ditentukan melalui  eksperimen  kristalografi.  Suatu program  doking  dikatakan  baik  apabila mampu menghasilkan konformasi peptida
dengan  nilai  simpangan  ( root  mean  square deviation ,  RMSD)  kurang  dari  3  Å  terhadap struktur referensinya (struktur kristal peptida) (Kurcinski et  al. ,  2015).  Hasil  doking  ulang struktur  kristal  menunjukkan  bahwa  nilai RMSD  program  Cabsdock  untuk  enam struktur  kristal  peptida-MHC  berada  pada rentang antara 0,85 sampai 2,61 Å. Gambar 1 menunjukkan bahwa konformasi peptida hasil doking  berada  di binding  groove yang  sama dengan  peptida  hasil  eksperimen  sinar-X, dengan  nilai  simpangan  struktur  (RMSD) sebesar  0,85  Å.  Hal  ini  menunjukan  bahwa parameter  dan  metode  Cabsdock  yang dilakukan memiliki kualitas yang baik.
Gambar 1 . Hasil doking ulang peptida-MHC (warna merah) dibandingkan dengan struktur kristal difraksi sinar-X (warna hijau) menggunakan Cabsdock.
Setelah  metode  dan  parameter  Cabsdock terevaluasi baik, selanjutnya dilakukan doking peptida kandidat vaksin terhadap struktur
MHC  I  (kode  PDB  1I4F).  Interaksi  molekular antara peptida kandidat vaksin dengan MHC I hasil doking pada Gambar 2 dan Tabel 2.
Gambar 2. Interaksi molekular antara peptida YMLDLQPET dan MHC I (kode PDB 1I4F).
Tabel 2. Interaksi non-kovalen antara asam amino peptida YMLDLQPET dan MHC I
No Asam Amino Jenis Interaksi No Asam Amino Jenis Interaksi Peptida MHC I Peptida  MHC I 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
8.
9.
10. 11.
12. 13. 14. D185 D185 Y182 Y182 L184 L184 Y182 Q187 L184 Q187 M183 Y182 M183 M183 K66 R97 D63 Y7 R97 R97 Y99 Y116 Y99 H70 H70 Y7 K66 V67 Elektrostatik Elektrostatik Elektrostatik Ikatan Hidrogen Ikatan Hidrogen Ikatan Hidrogen Ikatan Hidrogen Ikatan Hidrogen Ikatan Hidrogen Ikatan Hidrogen Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. L186 P188 L184 L186 L184 L184 M183 M183 L184 P188 P188 L184 Y182 Y182 V152 V152 L156 L156 L160 C164 Y7 Y99 Y99 H114 W147 Y159 V34 M45 Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Hidrofobik Gambar 2 menunjukkan interaksi molekular  peptida  kandidat  vaksin  terhadap MHC  I  dalam  rentang  jarak  5  Å.  Diprediksi terdapat  tujuh  ikatan  hidrogen  dan  delapan belas  interaksi  hidrofobik  (Tabel  2).  Ikatan hidrogen  konvensional  terbentuk  antara  Y7- Y182,  R97-L184,  Y99-Y182  dan  Q187-Y116. Sementara  ikatan  hidrogen  yang  melibatkan donor  elektron  Pi  terbentuk  antara  residu L184-Y99 dan Q187-H70. Interaksi hidrofobik yang  melibatkan  gugus  alkil  terbentuk  di antara  residu  K66-M183,  V67-M183,  V152- L186,  V152-P188,  L156-L184,  L156-L186, L160-L184,  dan  C164-L184.  Interaksi  lainnya yang melibatkan orbital sigma-Pi maupun Pi- Pi  dibentuk  oleh  residu  H70-M183,  Y7-Y182, Y7-M183,  Y99-M183,  Y99-L184,  H114-P188, W147-P188, Y159-L184, Y182-V34, dan  Y182- M45. Energi ikatan antara peptida
YMLDLQPET  dengan  MHC  I  hasil  doking diprediksi sebesar -165,80. Nilai ini lebih
rendah  dari  energi  ikatan  antara  peptida kristal  dan  MHC  I  (kode  PDB  1I4F),  yaitu  - 112,00.  Sehingga,  diprediksi  bahwa  peptida YMLDLQPET  memiliki  afinitas  yang  baik dengan MHC I.
Imunoinformatika sangat berpotensi untuk  dimanfaatkan  dalam  pengembangan vaksin  baru,  karena  saat  ini  data  genom patogen  sudah  tersedia  secara  meluas  dan terbuka.  Selain  itu,  kebanyakan  program imunoinformatika  juga  dapat  diakses  secara gratis. Bagaimanapun, imunoinformatika hanyalah  alat  atau  instrumen.  Pemahaman yang  baik  dan  mendalam  terhadap  karakter patogen sangatlah diperlukan untuk melakukan  prediksi  gen  melalui  imuno- informatika. Pengetahuan lain mengenai ilmu biokimia, struktur kimia, sifat fisikokimia, dan energetika juga diperlukan dalam menganalisis hasil prediksi imunoinformatika.

## KESIMPULAN
Protein E7 dipilih untuk dikaji lebih lanjut karena  merupakan  salah  satu  onkoprotein yang  penting dalam  pertumbuhan  sel  kanker. Berdasarkan prediksi afinitas peptida terhadap  MHC  I,  urutan  epitop  yang  dapat dijadikan kandidat vaksin berbasis protein E7 adalah  YMLDLQPET.  Kajian  interaksi  epitop E7  dan  MHC  melalui  doking  molekular menunjukkan bahwa YMLDLQPET diprediksi memiliki  afinitas  baik  terhadap  MHC  I  dan berpotensi untuk digunakan sebagai kandidat vaksin HPV tipe 16.

## Ucapan Terima Kasih
Kami  mengucapkan  terima  kasih  kepada IEDB  (www.iedb.org)  yang  telah  menyediakan akses  terbuka  untuk  database  genom  HPV  tipe 16 dan program analisis imunoinformatika yang digunakan dalam penelitian ini, serta kepada Dr. Tri Cahyanto, M.Si. dan Dr. Opik Taufikurrahman  selaku  Ketua  Jurusan  Biologi dan  Dekan  Fakultas  Sains  dan  Teknologi  UIN Sunan  Gunung  Djati  Bandung  yang  telah memberikan izin kepada Opik Taupiqurrohman untuk melakukan studi lanjut.

## DAFTAR PUSTAKA
Adhi,  2016.  Perawat  pun  antusias  vaksinasi. [diunduh  Maret  2016].  Tersedia  dari http://health.kompas.com/read/2011/08 /26/13281899/Perawat.Pun.Antusias.Vak sinasi
Andrijono,  2008.  Vaksinasi  HPV  merupakan pencegahan  primer  kanker  serviks. Maj Kedokt Indon , 57 :153-158. Bellone,  M.  2005.  Autoimmune  Disease: Pathogenesis. John Wiley & Sons , Italy. Bruni, L., Barrionuevo, R.L., Albero, G., Aldea,
M.,  Serrano,  B.,  Valencia  S,  et  al.  2015. Human  Papillomavirus  and  Related Diseases  in  Indonesia.  ICO  HPV Information  Center.  [diperbaharui  20 Maret  2015;  disitasi  27  Desember  2015]. Tersedia dari http://www.hpvcentre.net/statistics/repo rts/IDN.pdf. Fatima,  S.S.,  &  Desu,  J.  2014.  Proteome analysis  and  antigenic  peptide  prediction of  beta  corona  cirus,  A  cause  of  MERS. Helix , 5 :590-583.
Hidayati,  A.N.,  Evy,  E.,  &  Hans,  L.  2009. Human  Papillomavirus  (HPV)  Tipe  16 pada  lesi  genital  wanita  penderita kondilomata akuminata. Berkala Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin , 21 :25-30.
Kementrian Kesehatan. 2015. Jakarta: Kementrian Kesehatan. [diunduh Oktober 2015]. Kurcinski, M., Michal, J., Maciej, B., Andrzej,
K., & Sebastian, K. 2015. CABS-dock web server for the flexible docking of peptides to proteins without prior knowledge of the binding site. Nucleic Acids Research , 43 :
W419-W424.
Li, B., Xianfang, Z., Chuancui, H., & Yunxia, C. 2015.  Human  Papillomavirus  genome- wide  identification  of  T-Cell  epitopes  for peptide  vaccine  development  against cervical  cancer:  An  integration  of computational  analysis  and  experimental assay. Journal  of  Computation  Biology , 22 :962-974.
Morshed,  K.,  Dorota,  P.,  Marcin,  S.,  & Małgorzata, P. 2014. Human Papillomavirus (HPV)– Structure, epidemiology and patogenesis. Otolaryngologi  apolska. Elsevier ,  213- 219.
Mzibri,  M.E.M.,  Attaleb,  R.,  Ameziane,  E.l., Hassani,  M.,  Khyatti,  L.,  Benbacer,  M., Ennaji,  et  al.  2012.  Evaluation  of  p53, p16INK4a  and  E-Cadherin  status  as biomarkers  for  cervical  cancer  diagnosis.
Intechopen publisher , 195-214. Rappuoli,  R.  2000.  Reverse  vaccinology. Current Opinion in Microbiology , 3 :445-
450. Sompayrac,  L.  2008.  How  the  Immune System Works. 3 ed Edition. Well
Publishing, Massachussetts.
Toth,  I.,  Simerska,  P.,  &  Fujita,  Y.  2008. Recent  advances  in  design  and  synthesis of  self-adjuvanting  lipopeptide  vaccines.
Int. J. Pept. Res. Ther , 14: 333–340. Vita,  R.,  Overton,  J.A.,  Greenbaum,  J.A.,
Ponomarenko,  J.,  Clark,  J.D.,  Cantrell, J.R.,  et  al.  2014.  The  immune  epitope database  (IEDB)  3.0. Nucleic  Acids  Res , 43 :D405-D412. Wang, P., Sidney, J., Kim, Y., Sette, A., Lund, O.,  Nielsen,  M.,  et  al.  2010.  Peptide binding predictions  for HLA DR,  DP  and DQ molecules. BMC Bioinformatics , 11 :1- 12.
Xiang, Z., & He, Y. 2009. Vaxign: a web-based vaccine target design program for reverse Vaccinology. Elsevier . 1: 23-29.
Yim, Eun-Kyoung, & Park, J.S. 2005. The Role of  Hpv  E6  and  E7  Oncoproteins  in  Hpv- Associated Cervical Carcinogenesis. Cancer Res Treat , 37 :319-324.