ISOLASI  ASAM- 9Z,12Z,15Z -OKTADEKATRIENOAT
DARI BIJI SELASIH  ( Ocimum basilicum)
A. Ghanaim Fasya 1, , Rurini Retnowati 2 , M. Farid Rahman 2 , Suleman Duengo 3 dan Warsito 2
UIN  Maulana Malik  Ibrahim  Malang Jurusan Kimia,  Fakultas Sains dan Teknologi, ) 1 (
(2) Jurusan Kimia,  Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya,  Malang
(3) Jurusan Kimia,  Universitas Negeri Gorontalo Corresponding author : agfasya.uinmalang@gmail.com / 081331087496

## ABSTRACT
The  α-linolenic  acid  (9,12,15-octadecatrieonic  acid)  is  omega-3  fatty  acid  that  more  active  than  other fatty  acids  to  inhibit  cell  membrane  damages,  formation  and  growth  of  brain  functions,  antiinflamatory  and prevent several cronic deseases like lung desease and arthryt is. Some research explain that geometri of omega-3 fatty acids had effect on its bioactivity. This research purpose was to isolate α-linolenic acid with geometry Z,Z,Z ( 9Z,12Z,15Z -oktadekatrienoat). O.  basilicum seeds  oil  was  isolated  from O.  basilicum seeds  using  Soxhlet  extraction  with  n-hexane, then hidrolized by 12 % solution of KOH in aquadest. The  α-linolenic acid was separated from other fatty acids by  urea  inclusion  methods.  The  optimum  condition  of  urea  inclusion  was  determined  in  various  temperature (+ 5,  + 3,  + 1, + (-1),  + (-3),  + (-5)) 0 C and ratio of fatty acid : urea 1:1;  1:1,5;  1:2;  1:2,5;  1:3;  1:3,5;  1:4. From  this research, extraction of O. basilicum seeds oil with n-hexane as solvent resulted clear yellow- brown  oil  with  refractive  indeks  1,466  and  density  0,855  g/mL.  Gas  Chromatography  (GC)  analysis  of  fatty acids  hidrolyzed  from O.  basilicum oil  showed  peak  at  t R =  19,949  minutes  with  relative  percentage 70,72 %. Base  on  Mass  Spectrum  (MS),  the  fragmentation  of this compound, with   t R = 19,949 minutes, was identic with 9Z,12Z,15Z -oktadecatrienoic  acid.  Isolation  of  α-linolenic  acid  from  other  fatty  acids  using  urea  inclusion  at temperature  0-2 0 C  dan  rasio  fatty  acid:  urea  1:1,5  showed  nonadduct  fraction  contains  compound  with  t R = 19,980  minutes  and  relative  percentage  88,51  %.  Base  on  Mass  Spectrum  (MS),  the  fragmentation  o f  this compound, with t R = 19,980  minutes, was identic with 9Z,12Z,15Z -oktadecatrienoic acid.
Key  words  : conjugated double bond, methyl linolenate, O.basilicum seeds, toxicity

## ABSTRAK
Asam  α-linolenat  (asam  9,12,15-oktadekatrienoat)  merupakan  asam  lemak  omega-3  yang  diketahui mempunyai  khasiat  yang  lebih  baik  dibanding  asam-asam  lemak  yang  lain dalam mencegah rusaknya membran sel,  berperan  dalam  pembentukan  dan  pertumbuhan  fungsi  otak,  mengurangi  pembengkakan,  serta  membantu mencegah  berbagai  penyakit  kronis  seperti  jantung  d an  arthritis.  Beberapa  penelitian  menyebutkan  geometri asam  lemak  omega-3  mempunyai efek terhadap bioaktivitasnya.  Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi asam α-linolenat dengan geometri Z,Z,Z ( 9Z,12Z,15Z -oktadekatrienoat).
Isolasi  minyak  dari  biji  selasih  dilakukan  dengan  metode  ekstraksi  Soxhlet  menggunakan  pelarut  n - heksan.  Minyak  biji  selasih  selanjutnya  dihidrolisis  dengan  larutan  KOH  12  %  dalam  aquades  untuk mendapatkan  asam-asam  lemaknya.  Pemisahan  asam  α-linolenat  dari  asam-asam  lemak  yang  lain  dilakukan dengan  metode  inklusi  urea.  Kondisi  optimum inklusi urea dilakukan dengan  variasi temperatur (+ 5, + 3, + 1, + (-1),  + (-3)  dan + (-5)) 0 C serta variasi rasio asam lemak:urea  1:1;  1:1,5;  1:2;  1:2,5;  1:3;  1:3,5;  1:4. Dari  hasil  penelitian,  diperoleh  minyak  biji  selasih  berwarna  kuning  kecoklatan  dengan  indeks  bias 1,466  dan  densitas  0,855  g/mL.  Hasil  analisis  Kromatografi  Gas  (KG)  terhadap  asam  lemak  hasil  hidrolisis minyak  biji  selasih  menunjukkan  puncak  utama  pada  t R =  19,949  menit  dengan  persen  relative  70,72  %. Berdasarkan  Spektra  Massa  (SM),  pola  fragmentasi  senyawa  dengan    t R =  19,949  menit  tersebut  mempunyai kemiripan dengan spektra massa asam 9Z,12Z,15Z -oktadekatrienoat. Hasil analisis KG terhadap hasil pemisahan asam-asam  lemak  minyak  biji  selasih  dengan  metode  inklusi  urea  pada  temperatur  0-2 0 C  dengan  rasio  asam lemak:  urea  1:1,5  menunjukkan  puncak  utama  pada  t R =  19,980  menit  dengan  persen  relatif  88,51  %. Berdasarkan  Spektra  Massa  (SM),  pola  fragmentasi  senyawa  d engan    t R =  19,980  menit  tersebut  mempunyai kemiripan  dengan spektra massa asam 9Z,12Z,15Z -oktadekatrienoat.
Kata  kunci : ik atan rangk ap terk onjugasi, metil linolenat, biji O.basilicum, tok sisitas

## I. PENDAHULUAN
Asam  linolenat  merupakan  asam lemak  esensial,  yaitu  asam  lemak  yang tidak  dapat  dibentuk  dalam  tubuh,  sehingga harus dikonsumsi melalui makanan
(Harrison, 2006). Asam linolenat
merupakan  asam  lemak  tak  jenuh  jamak ( polyunsaturated  fatty  acid ,  PUFA)  rantai lurus  yang  tersusun  dari  18  atom  karbon. Memiliki  dua  bentuk  isomer,  yaitu α- linolenic  acid (ALA) dan γ -linolenic  acid (GLA),  yang  keduanya  memiliki  kerangka karbon  mengandung  ikatan  rangkap  yang belum  terkonjugasi.  Secara  IUPAC  nama struktur  kimia  dari  ALA  adalah  asam 9,12,15-oktadekatrienoat,  sedangkan  GLA adalah  asam  6,9,12-oktadekatrienoat.
Asam  α-linolenat  (ALA),  adalah asam lemak omega-3 yang dikenal memiliki  khasiat  lebih  daripada  asam-asam lemak  lain,  khususnya  dalam  mencegah rusaknya  membran  sel.  Selain  berguna untuk  pertumbuhan  normal,  omega  3  juga mempunyai peranan yang  kritis  dalam pembentukan  dan  pertumbuhan  fungsi  otak. Penelitian yang lebih mendalam juga menemukan  bahwa  asam  lemak  omega  3 bisa mengurangi pembengkakan dan membantu  mencegah  beberapa  penyakit kronis  seperti  penyakit  jantung  dan  arthritis (Muhsin,  2007).
Asam  α-linolenat  dapat  diisolasi  dari minyak  yang  kaya  akan  asam  linolenat, seperti  halnya  minyak  biji  selasih  ( Ocimum basilicum ).  Minyak  biji  selasih  memiliki kandungan  asam  lemak  tidak  jenuh  yang cukup tinggi yaitu rata-rata 89 %. Kandungan  asam  lemak  dalam  minyak  biji selasih  yaitu:  asam  α-linolenat  (43,8  –  64,8 %),  asam  linoleat  (17,8  –  31,3  %),  dan asam  oleat    (8,5  –  13,3  %)  serta  beberapa asam  lemak  jenuh  yaitu  asam  palmitat  (6,1 –  11,0  %)  dan  asam  stearat  (2,0  –  4,0  %) (Angers, et al ., 1996).
Asam  α-linolenat  pada  minyak  biji selasih  dapat  diisolasi  dengan  berbagai metode.
Salah satunya menggunakan metode kristalisasi pada temperatur bertingkat,  yaitu  ±  3,  ±  (-13),  dan  ±  (-25)
0 C.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa pada  temperatur  -25 0 C  diperoleh  asam  α- linolenat  dengan  kemurnian  91,3957  %, densitas  0,9  g/mL,  indeks  bias  1,47  serta rendemen    72,38  %  (Dewi,  2009).  Metode lain yang  digunakan  untuk  mengisolasi asam  α-linolenat  adalah  inklusi  urea  ( urea inclusion ).  Inklusi  urea  merupakan  metode isolasi  yang  dilakukan  dengan  penambahan urea  yang  mampu  membentuk  kisi-kisi kristal  yang  mempunyai  ruang  yang  cukup besar  untuk  dimasuki  suatu  molekul  yang akan  dipisahkan.  Pada  inklusi  urea  asam lemak  tertentu  akan  membentuk  kompleks dengan  urea  sehingga  pengendapan  asam lemak  akan  terjadi  pada  temperatur  yang lebih  tinggi . Metode  inklusi  urea  tidak memerlukan  pendinginan  pada  temperatur yang  ekstrim  (Ohlan, et al., 2008).
Isolasi  asam  lemak  menggunakan inklusi urea telah dilakukan pada pemurnian  asam  dokosaheksaenoat  (DHA) dari  mikroalga Crypthrcodinium  cohnii . Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  fraksi dengan  proporsi  DHA  paling  tinggi  (99,2  % dari  total  asam  lemak  dengan  hasil  6,2  %) adalah pada temperatur 4 0 C dan perbandingan urea:asam lemak 3,5:1
(Mendes, et al., 2006). Sedangkan
Grandgirard  (1987)  telah  melakukan  inklusi urea  pada  asam  lemak  minyak  biji  rami ( linseed oil ) dengan perbandingan urea:asam  lemak  2:1  pada  temperatur  4 0 C menghasilkan  pemisahan  antara  asam  α- linolenat  dan  asam  non  linolenat.  Asam- asam  lemak  non  linolenat  terperangkap dalam  kristal  urea  seperti  asam  palmitat 99,1  %,  asam  palmitoleat  62,5  %,  asam heptadekanoat  100  %,  asam  heptadekaenoat 75  %,  asam  stearat  99,4  %,  asam oleat 89,8 %,  asam  linoleat  (18:2 Z,E dan E,Z )  83  % dan  (18:2 Z,Z )  34,9  %.  Hanya  sedikit  asam α-lonolenat  (18:3 Z,Z,Z )  yang  terperangkap, yakni  sekitar  27,1  %  dan  sisanya  tetap berada dalam  filtrat.

## II. METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  terdiri  dari  tiga  tahap. Tahap  pertama,  Ekstraksi  minyak  dari  biji
selasih  ( Ocimum  basilicum ).  Tahap  kedua, hidrolisis minyak biji selasih untuk memperoleh  asam-asam  lemak  minyak  biji selasih.  Tahap  ketiga,  isolasi  asam  α- linolenat dengan
geometri
Z,Z,Z (9Z,12Z,15Z-oktadekatrienoat)
dengan metode  inklusi  urea (urea  inclusion).

## Ekstraksi Minyak Biji  Selasih
Sebanyak  200  g  serbuk  biji  selasih ditimbang  dan  dimasukkan  ke  dalam  kertas saring yang telah dibentuk tabung. Selanjutnya dimasukkan ke dalam ekstraktor  Soxhlet  dan  diekstraksi  dengan pelarut n-heksana sebanyak 800  mL. Ektraksi dilakukan sebanyak 12 kali sirkulasi  hingga  pelarut  yang  merendam sampel terlihat jernih. Ekstrak yang berwarna kekuningan dipekatkan
menggunakan rotary evaporator  dengan pengurangan tekanan. Ekstrak pekat dipindahkan  ke  dalam  botol  dan  dialiri  gas N 2 ,  kemudian  ditutup,  dan  disimpan  pada temperatur  dingin.  Minyak  yang  berwarna kekuningan  diukur  berat  jenis  dan  indeks biasnya.

## Hidrolisis  Minyak Biji  Selasih
Sebanyak  50  g  minyak  biji  selasih dimasukkan  ke  dalam  labu  alas  bulat  leher tiga  yang  dirangkai  dengan  penangas  air dan  kondensor.  Selanjutnya  ditambahkan 100  mL  metanol  dan  larutan  KOH 12 % (12 g  dilarutkan  dalam  100  mL  air).  Campuran direfluks  pada  temperatur  60 0 C  sambil diaduk  menggunakan  stirer  selama  90  menit (cairan  tampak  kuning  jernih).  Cairan  hasil refluks  dipindahkan  ke  dalam  corong  pisah dan  ditambahkan  250  mL  air  dan  62,5  mL n-heksana. Kemudian larutan dikocok dengan kuat dan didiamkan hingga terbentuk  dua  lapisan,  yaitu  lapisan  organik di  bagian  atas  dan  lapisan  air  di  bagian bawah. Lapisan air dipisahkan dan ditambahkan  asam  sulfat  1  M  sampai  pH  1 (pH  diukur  dengan  indikator  universal). Kemudian  cairan  dikocok  dengan  kuat  dan didiamkan  hingga  terbentuk  dua  lapisan, yaitu  lapisan  organik  di  bagian  atas  dan lapisan  air  di  bagian  bawah.  Lapisan  atas yang  mengandung  asam-asam  lemak  bebas
dipisahkan dari lapisan bawah dan dipekatkan  dengan  mengalirkan  gas  N 2 . Selanjutnya,  asam-asam  lemak  bebas  yang diperoleh  dipisahkan  dengan  inklusi  urea untuk  memperoleh  asam  α-linolenat  yang terpisah dengan asam-asam lemak nonlinolenat.
Isolasi  Asam  Linolenat  dengan  Inklusi Urea
Optimasi  Inklusi  Urea  dengan  Variasi Temperatur
Sebanyak  2,5  g  asam  lemak  biji selasih  dicampurkan  pada  larutan  urea dalam  metanol  hangat  (5  g  urea/  20  mL metanol). Setelah dialiri gas N 2 ,
didinginkan semalam pada variasi temperatur + 5 0 C, + 3 0 C, + 1 0 C, + (-1) 0 C, +  (-3) 0 C  dan  +  (-5) 0 C.  Asam  lemak  yang terendapkan  bersama  urea  dan  asam  lemak yang  tidak  terendapkan  dipisahkan  dengan penyaringan.  Kristal  (residu)  dibilas  dengan n-heksan  dingin.  Filtrat  dituang  ke  dalam corong  pisah,  ditambah  35  mL  aquades  dan 0,5  mL  HCl  6  N.  Selanjutnya  di  ekstrak dengan  n-heksan  sebanyak  2  x  10  mL.  Fase organik  dipisahkan  dari  fase  air  untuk selanjutnya  dipekatkan  dengan  aliran  gas N 2 . Asam linolenat yang diperoleh diesterifikasi untuk selanjutnya diidentifikasi dengan kromatografi gas (GC).

## Optimasi  Inklusi  Urea  dengan  Variasi Rasio Urea:Asam lemak
Sebanyak  2,5  g  asam  lemak  biji selasih  dicampurkan  pada  larutan  urea dalam  metanol  hangat  [variasi  berat  urea (2,5;  3,75; 5; 6,25; 7,7; 8,75; 10) g]. Setelah dialiri  gas  N 2 ,  didinginkan  semalam  pada temperatur  optimum  inklusi.  Asam  lemak yang  terendapkan  bersama  urea  dan  asam lemak  yang  tidak  terendapkan  dipisahkan dengan  penyaringan.  Kristal  (residu)  dibilas dengan  n-heksan  dingin.  Filtrat  dituang  ke dalam  corong  pisah,  ditambah  35  mL aquades  dan  0,5  mL  HCl  6  N.  Selanjutnya di  ekstrak  dengan  n-heksan  sebanyak  2  x 10 mL.  Fase  organik  dipisahkan  dari  fase  air untuk  selanjutnya  dipekatkan  dengan  aliran
gas  N 2 .  Asam  linolenat  yang  diperoleh diesterifikasi
untuk selanjutnya
diidentifikasi dengan kromatografi gas (GC).
Isolasi  Asam  Linolenat  pada  Kondisi Optimum  Inklusi
Isolasi  asam  α-linolenat  dengan inklusi  urea  dilakukan  secara  bertahap  (tiga tahap) pada kondisi optimum yang diperoleh  dari  penelitian  sebelumnya,  yaitu pada  temperatur  0  –  2 0 C  dan  rasio  asam lemak:urea  1:1,5.
Sebanyak  15  g  asam  lemak  biji selasih  dimasukkan  ke  dalam  botol  berisi larutan  urea  dalam  metanol  (22,5  g  urea/  90 mL  metanol)  dengan  temperatur        40 0 C dan  diaduk  sampai  tercampur.  Setelah dialiri  gas  N 2 ,  campuran  didinginkan  dan didiamkan  semalam  pada  temperatur  0  –  2 0 C.  Asam  lemak  yang  mengendap  bersama urea  dan  asam  lemak  yang  tidak  mengendap dipisahkan dengan penyaringan menggunakan  kertas  saring  Whatman  no.1. Residu  (endapan)  dibilas  dengan  n-heksana dingin  (0  –  2 0 C).  Filtrat  yang  diperoleh  dari hasil  penyaringan  dituang  ke  dalam  corong pisah,  ditambah  112,5  mL  aquades  dan  2,25 mL  HCl  6  N.  Setelah  dikocok,  campuran diekstrak  dengan  n-heksana  sebanyak  2  x 20 mL. Fase organik (lapisan  atas) dipisahkan  dari  fase  air  (lapisan  bawah) untuk  selanjutnya  dipekatkan  menggunakan rotary evaporator dengan pengurangan tekanan.  Ekstrak  pekat  dipindah  ke  dalam botol,  dialiri  gas  N 2 ,  kemudian  ditutup  dan disimpan  pada  temperatur  dingin.  Cairan pekat yang diperoleh  diinklusi  dengan prosedur  yang  sama  (inklusi  tahap  II  dan III).
Cairan pekat yang diperoleh diesterifikasi untuk sebagian dianalisis dengan kromatografi gas-spektroskopi massa  (KG-SM).

## III. HASIL  DAN PEMBAHASAN
1. Hasil Isolasi Minyak Biji Selasih
Minyak biji selasih merupakan trigliserida yang larut dalam pelarut nonpolar. Isolasi minyak biji selasih
dilakukan  dengan  cara  ekstraksi  Soxhlet dengan  pelarut  n-heksana.  Ekstraksi  dengan ekstraktor  Soxhlet  merupakan  cara  ekstraksi minyak  yang  efisien  karena  pelarut  dapat digunakan  secara  berulang-ulang,  sehingga tidak  membutuhkan  pelarut  dalam  jumlah yang banyak. Pelarut n-heksana  yang ditempatkan  pada  labu  alas  bulat  akan menguap  dan  mengembun  ke  dalam  tabung ekstraktor yang berisi sampel yang terbungkus  kertas  saring  sehingga  terjadi proses ekstraksi. Pelarut berinteraksi dengan  sampel  sampai  volume  tertentu, campuran pelarut dan minyak yang terekstrak  di  dalamnya  akan  turun  ke  labu alas bulat dan mengalami pemanasan kembali  sehingga  pelarut  akan  menguap dan  mengembun  lagi  ke  dalam  tabung ekstraktor.  Proses  ekstraksi  terjadi  berkali- kali  sampai  beberapa  kali  sirkulasi.  Selama berlangsungnya ekstraksi, ekstrak yang turun  ke  labu  alas  bulat  semakin  jernih sedangkan  ekstrak  dalam  labu  alas  bulat semakin pekat warnanya
yang mengindikasikan  minyak  yang  terekstrak semakin banyak. Dalam  penelitian  ini, proses ektraksi berlangsung secara maksimal  pada  sirkulasi  ke-12  ditandai warna  campuran  yang  sudah  jernih  dan diasumsikan semua minyak yang terkandung  dalam  sampel  biji  selasih  sudah terekstrak  semua.
Sebelum  proses  ekstraksi,  sampel biji selasih dikeringkan dan  diperkecil ukurannya terlebih dahulu. Hal ini dimaksudkan untuk memudahkan dan memaksimalkan  proses  ekstraksi.  Apabila sampel  masih  basah,  selain  memperlambat proses  ekstraksi,  air  dapat  turun  ke  labu  alas bulat sehingga akan mempengaruhi kemurnian minyak biji selasih yang diperoleh.  Biji  selasih  dipanaskan  dalam oven  pada  temperatur  110 0 C  untuk mengurangi/  menghilangkan  kadar  air  di dalamnya. Pemanasan  dilakukan  selama kurang  lebih  2  jam,  didinginkan  dalam desikator  dan  ditimbang.  Perlakuan  ini dilakukan  sampai  diperoleh  berat konstan. Ekstraksi  minyak  biji  selasih  dilakukan dengan  memasukkan  200  g  serbuk  biji
selasih  ke  dalam  kertas  saring  yang  telah dibentuk  tabung,  selanjutnya  dimasukkan ke  dalam  ekstraktor  Soxhlet  dan  diekstraksi dengan  pelarut  n-heksana  sebanyak  800 mL.  Ekstraksi  dilakukan  sebanyak  12  kali sirkulasi.  Setiap  sirkulasi  rata-rata  terjadi selama  15  menit.  Ekstrak  yang  diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator dengan  pengurangan  tekanan.  Ekstrak  pekat yang  diperoleh  dimasukkan  ke  dalam  botol, dialiri  gas  N 2 untuk  selanjutnya  ditutup  dan dibungkus  alumunium  foil  serta  disimpan pada  temperatur  dingin.  Hasil  ekstraksi minyak biji selasih ditunjukkan pada Gambar  1.
Gambar 1. Rendemen Ekstraksi Minyak Biji Selasih
Gambar  1  menunjukkan  rendemen hasil
isolasi minyak
biji selasih menggunakan  ekstraktor  Soxhlet  dengan pelarut n-heksana. Hasil
penelitian menunjukkan  pada  ekstraksi  biji  selasih diperoleh  minyak  dengan  rendemen  rata- rata  24,16  %.    Minyak  biji  selasih  yang diperoleh  dari  hasil  percobaan  memiliki indeks  bias  rata-rata  1,4661  dan  berat  jenis 0,8553.  Sedangkan  menurut  Angers, et  al. (1996),  minyak  yang  diperoleh  dari  biji selasih  memiliki  indeks  bias  sebesar  1,474 dengan  rendemen  24  %.  Berdasarkan  nilai indeks  bias,  terlihat  bahwa  kualitas  minyak biji  selasih  hasil  isolasi  mendekati  kualitas minyak  hasil  isolasi  yang  dilakukan  oleh Angers et  al. (1996).  Adanya  sedikit perbedaan  pada  indeks  bias  minyak  biji selasih dimungkinkan karena  perbedaan daerah  asal  biji  selasih  yang  digunakan, sehingga sedikit mempunyai perbedaan pada  komposisi  asam-asam  lemak  yang terkandung  di  dalamnya.  Untuk  mengetahui komposisi asam-asam lemak yang terkandung di dalamnya, minyak biji
selasih dihidrolisis untuk mendapatkan asam-asam  lemaknya.

## 2. Hasil Hidrolisis  Minyak Biji  Selasih
Minyak  biji  selasih  yang  merupakan trigliserida  akan  terhidrolisis  menjadi  asam- asam  lemak  dan  gliserol.  Hidrolisis  minyak biji  selasih  dilakukan  dengan  katalis  basa (KOH)  dan  pelarut  metanol.  Dalam  hal  ini KOH yang digunakan  dibuat  berlebih dengan perhitungan trigliserida yang bereaksi  adalah  gliseril  trilinolenat.  Reaksi hidrolisis minyak berkatalis basa
berlangsung  melalui  mekanisme  serangan nukleofilik  yang  terdiri  dari  dua  tahap. Tahap  pertama,  yang    berjalan  lambat,  yaitu adisi  OH - pada  gugus  karbonil.  Sedangkan tahap  kedua  yaitu  eliminasi  gugus  OR’  dan transfer proton yang berjalan cepat. Mekanisme  reaksi  hidrolisis  pada  trigliseril linolenat  dapat dijelaskan  pada Gambar  2.

## Gambar 2. Mekanisme Reaksi Hidrolisis Trigliseril  Linolenat  berkatalis Basa
Hasil hidrolisis berupa garam (sabun)  kalium  yang  larut  dalam  air  yang ditandai terbentuknya busa pada saat ekstraksi  dengan  corong  pisah.  Untuk
0.00 10.00 20.00 30.00 0 2 4 6 %
In te n s ita s memperoleh asam lemak dilakukan penambahan  asam  sulfat  pada  lapisan  air hingga  pH  1  untuk  memastikan  semua garam  berubah  menjadi  asam  lemak.  Asam lemak
bebas diekstrak dengan menggunakan n-heksana. Fasa organik dipekatkan  dengan  mengalirkan  gas  N 2 sehingga  diperoleh  asam-asam  lemak  bebas yang berwarna kuning jernih agak kecoklatan.  Selanjutnya  diukur  berat  jenis dan  indeks  biasnya.  Hidrolisis  minyak  biji selasih  menghasilkan  campuran  asam-asam lemak  dengan  rendemen  sebanyak  77,90  %, recovery 81,81  %,  indeks  bias  1,4593,  dan berat  jenis  0,8853.  Dengan  kata  lain,  dari 100  g  minyak  diperoleh  77,90  g  asam lemak  yang  merupakan  81,81  %  dari  asam lemak  teoritis  dengan  asumsi  minyak  biji selasih mengandung gliseril trilinolenat.
Sebagian  asam  lemak  diesterifikasi  untuk selanjutnya  dianalisis  dengan  kromatografi gas-Spektroskopi  Massa  (KG-SM).  Gambar 3.  dan  Tabel  1  menunjukkan  kromatogram KG metil  ester asam  lemak  hasil  hidrolisis.

## Gambar 3. Kromatogram KG Metil Ester Asam Lemak Hasil Hidrolisis
Tabel  1.  Waktu  Retensi  dan  Persen  Area Puncak-Puncak  Kromatogram  KG  Metil  Ester
Asam Lemak Biji Selasih Peak t R (menit) Luas Puncak Senyawa 1 16,691 4,98  % asam  palmitat  (asam heksadekanoat) 2 18,724 2,02  % asam stearat (asam oktadekanoat) 3 18,907 6,46  % asam oleat (asam oktadeka-11-enoat) 4 19,334 15,83  % asam  linoleat  (asam 9E,12E- oktadekadienoat) 5 19,949 70,72  % asam  α-linolenat  (asam
9Z,12Z,15Z- oktadekatrienoat)
Tabel 1 menunjukkan bahwa minyak  biji  selasih  terdiri  dari  beberapa asam  lemak  yang  ditunjukkan  adanya  5 puncak  pada  kromatogram  KG.  Puncak pertama  dengan  waktu  retensi  16,691 memiliki luas area 4,98 % diduga merupakan asam palmitat (asam
heksadekanoat). Puncak kedua dengan waktu  retensi  18,724  memiliki  luas  area 2,02  %  diduga  merupakan  asam  stearat (asam oktadekanoat) karena memiliki spektra  massa  yang  sesuai  dengan  spektra massa metil oktadekanoat dari WILLEY7.LIB dengan nomor entry 209846  dan  tingkat  kemiripan  87  %. Puncak  ketiga  dengan  waktu  retensi  18,907 memiliki luas area 6,46 % diduga merupakan  asam  oleat  (asam  oktadeka-11- enoat)  karena  memiliki  spektra  massa  yang sesuai dengan spektra massa metil oktadeka-11-enoat dari WILLEY7.LIB
dengan  nomor entry 207875  dan  tingkat kemiripan  91  %.  Puncak  keempat  dengan waktu  retensi  18,334  memiliki  luas  area 15,83  %  diduga  merupakan  asam  linoleat
(asam 9E,12E- oktadekadienoat) karena memiliki  spektra  massa  yang  sesuai  dengan spektra massa metil 9E,12E- oktadekadienoat dari WILLEY7.LIB dengan  nomor entry 205807  dan  tingkat kemiripan  96 %.
Senyawa dengan puncak paling tinggi  (puncak  V)  dengan  waktu  retensi 19,949  menit  yang  diperkirakan  sebagai asam  α-linolenat  memiliki  persen  area sebesar  70,72.  Spektra  massa  komponen utama metil ester asam lemak hasil hidrolisis (t R = 19,949) menghasilkan puncak  ion  fragmen  pada  m/z:  39,  41,  55, 67,  79,  93,  108,  121,  135,  149 , 163,  173, 191, 203, 217, 236, 249, 261, 277, dan 292. Fragmen  dengan  m/z  292  merupakan  ion molekul metil linolenat yang memiliki rumus molekul CH 3 CH 2 (CH=CHCH 2 ) 3 (CH 2 ) 6 COOH. Spektra  puncak  kelima  dengan  t R =  19,949 memiliki  kemiripan  dengan  spektra  massa ( Z,Z,Z )-metil linolenat atau metil 9Z,12Z,15Z -oktadekatrienoat dari WILLEY229.LIB dengan nomor entry
( 10 6 )
14197  dan  tingkat  kemiripan  95  %  (Gambar
5.4).  Kedua  spektra  memiliki  kesamaan pada  ion  fragmen  pada  m/z:  39,  41,  55,  67, 79,  93,  108,  121,  135,  149, dan  memiliki base peak pada m/z: 79. Sehingga disimpulkan  bahwa  kandungan  asam  α- linolenat  hasil  hidrolisis  minyak  biji  selasih sebesar 70,72 %.
Berdasarkan data-data tersebut
disimpulkan  bahwa  asam  lemak  utama  pada minyak biji selasih adalah asam 9Z,12Z,15Z -oktadekatrienoat  atau  asam  α- linolenat  dengan  geometri Z,Z,Z .  Asam- asam  lemak  hasil  hidrolisis  selanjutnya dipisahkan dengan inklusi urea untuk mendapatkan asam α-linolenat  dengan kemurnian  yang  lebih  tinggi.
Gambar 4. Struktur asam 9Z,12Z,15Z - oktadekatrienoat
Hasil  Isolasi  Asam  α - Linolenat  dengan Inklusi  Urea
Urea  merupakan  salah  satu  molekul induk  yang  sering  digunakan  dalam  inklusi. Biasanya  kristal  urea  berbentuk  tetragonal, tetapi  apabila  ada  molekul  tamu,  urea  akan mengkristal  dalam  bentuk  heksagonal  yang mengandung  molekul  tamu  di  dalamnya. Kisi-kisi  heksagonal  dapat  terbentuk  hanya apabila  terdapat  molekul  tamu  dimana stabilitas  strukturnya  dipengaruhi  gaya van der  Waals antara  molekul  induk  dan molekul  tamu.
Kisi-kisi  urea  memiliki  diameter  5  Å yang  terbentuk  oleh  ikatan-ikatan  hidrogen. Bagian dalam bersifat kurang polar dibandingkan bagian luar, sehingga molekul  organik  nonpolar  akan  terpisah  dan berada  di  dalam  kisi-kisi  kristal  (Smith  dan March,  2001).  Selain  itu,  ukuran  molekul juga  berpengaruh  pada  pemisahan  molekul- molekul organik dengan inklusi urea. Molekul  yang  terlalu  besar  karena  tidak akan  cocok  dengan  kisi-kisi  kristal  sehingga tidak  dapat  masuk  ke  dalam  kisi-kisi  kristal, namun  apabila  molekul  organik  tersebut terlalu  kecil  maka  molekul  tersebut  akan keluar  melalui  lubang  bawah.
Asam-asam  lemak  hasil  hidrolisis minyak  biji  selasih  merupakan  campuran berbagai  asam  lemak,  baik  jenuh  maupun tak  jenuh.  Menurut  Anger, et  al. (1996) minyak  biji  selasih  memiliki  kandungan asam  lemak  tak  jenuh  rata-rata  89  %,  yaitu asam  α-linolenat  (43,8  –  64,8  %),  asam linoleat  (17,8  –  31,3  %),  dan  asam  oleat (8,5  –  13,3  %).  Sedangkan  kandungan beberapa  asam  lemak  jenuhnya  yaitu  asam palmitat  (6,1  –  11,0  %)  dan  asam  stearat (2,0 –  4,0 %).
Ikatan  rangkap  bersifat  lebih  polar daripada  ikatan  tunggal.  Asam  lemak  tak jenuh  bersifat  lebih  polar  daripada  asam lemak jenuh. Semakin banyak ikatan rangkap  dalam  asam  lemak,  semakin  besar pula  sifat  kepolarannya.  Hal  inilah  yang mendasari pemisahan asam lemak menggunakan  inklusi  urea.  Asam  lemak jenuh  yang  bersifat  kurang  polar  akan  lebih mudah  terjebak  dalam  kisi-kisi  kristal  urea daripada  asam  lemak  tak  jenuh.  Demikian pula  asam  lemak  tak  jenuh  yang  memiliki satu  ikatan  rangkap  (asam  oleat)  akan mudah  terjebak  dalam  kisi-kisi  kristal  urea daripada  asam  linoleat  (mengandung  dua ikatan  rangkap)  dan  asam  linolenat  yang mengandung  tiga  ikatan  rangkap,  sehingga asam linolenat dapat dipisahkan atau dimurnikan  dengan  inklusi  urea.
Selain berdasarkan kepolaran,
pemisahan  asam  lemak  dengan  inklusi  urea juga dipengaruhi oleh ukuran atau konformasi asam lemak yang akan dipisahkan.  Asam  lemak  jenuh  akan  lebih mudah  masuk  (terjebak)  dalam  kisi-kisi kristal  urea  dibanding  asam  lemak  tak jenuh. Asam lemak jenuh hanya mengandung  rantai  karbon  dengan  ikatan tunggal  yang  dapat  mengalami  perputaran ( rotasi )  pada  ikatan-ikatannya,  sehingga bentuk molekul dan ukurannya lebih fleksibel.  Sedangkan  asam  lemak  tak  jenuh memiliki  bentuk  molekul  yang  lebih  kaku ( rigid )  pada  ikatan  rangkapnya.  Ikatan rangkap  tidak  dapat  mengalami  perubahan konformasi  seperti  pada  ikatan  tunggal, sehingga  akan  lebih  terhalang  untuk  masuk ke dalam  kisi-kisi  kristal  urea.
Pemisahan asam-asam lemak dengan inklusi urea juga dipengaruhi jumlah  ikatan  rangkap  dan  geometri  dari asam-asam  lemak  tersebut.  Asam  lemak dengan  satu  ikatan  rangkap  (monoena),  dua ikatan  rangkap  (diena),  dan  tiga  ikatan rangkap  (triena),  serta  asam  lemak  dengan geometri E atau Z akan  mengalami  interaksi yang  berbeda  dengan  kristal  urea,  sehingga dapat mengalami pemisahan. Penelitian yang  dilakukan  oleh  Grandgirard  (1987) mengenai  inklusi  urea  pada  asam  lemak minyak  biji  rami  ( linseed  oil )  dengan perbandingan  urea:asam  lemak  2:1  pada temperatur  4 0 C  menghasilkan  pemisahan antara  asam  α-linolenat  dan  asam  non linolenat.  Asam-asam  lemak  non  linolenat terperangkap  dalam  kristal  urea.  Asam palmitat  terperangkap  sebanyak  99,1  %, asam palmitoleat
62,5 %, asam heptadekanoat  100  %,  asam  heptadekaenoat
75  %,  asam  stearat  99,4  %,  asam oleat 89,8
%,  asam  linoleat  (18:2 Z,E dan E,Z )  83  %, dan  (18:2 Z,Z )  34,9  %.  Hanya  sedikit  asam α-lonolenat  (18:3 Z,Z,Z )  yang  terperangkap, yakni  sekitar  27,1  %  sedangkan  sisanya tetap berada dalam  filtrat.
Hasil  pemisahan  dengan  inklusi  urea dipengaruhi oleh temperatur dan perbandingan  (rasio)  urea  dan  asam  lemak yang  akan  dipisahkan.  Pada  penelitian  ini, dilakukan  variasi  temperatur  dan  rasio  asam lemak: urea untuk mencari kondisi optimum inklusi yang selanjutnya
digunakan  pada  saat  proses  purifikasi  asam α-linolenat campuran hasil hidrolisis minyak  biji  selasih.

## Optimasi  Inklusi  Urea  dengan  Variasi Temperatur
Optimasi  inklusi  urea  dengan  variasi temperatur  dilakukan  pada  temperatur  +  5 0 C, + 3 0 C, + 1 0 C, + (-1) 0 C, + (-3) 0 C dan +  (-5) 0 C  dengan  perbandingan  asam  lemak urea  1:2.  Asam  lemak  yang  terendapkan bersama  urea  dan  asam  lemak  yang  tidak terendapkan dipisahkan dengan penyaringan. Asam lemak yang tidak terendapkan (filtrat) dipekatkan dengan
aliran  gas  N 2 kemudian  diesterifikasi  untuk selanjutnya diidentifikasi dengan
kromatografi  gas  (GC)  untuk  mengetahui temperatur  inklusi  yang  menghasilkan  asam α-linolenat  dengan  kandungan  yang  paling tinggi.  Hasil  variasi  temperatur  inklusi  urea ditunjukkan  pada Gambar  5.

## Gambar 5. Pengaruh Variasi Temperatur Inklusi Terhadap Kadar Asam Linolenat
Kadar asam linolenat pada temperatur  1 0 C  lebih  besar  daripada  kadar asam  linolenat  pada  temperatur  5 0 C  dan  3 0 C.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  semakin banyak  asam  lemak  jenuh  atau  yang  hanya mengandung  satu  dan  dua  ikatan  rangkap dua  yang  terjebak  dalam  kisi-kisi  urea  dan mengendap sehingga dapat dipisahkan dengan  asam  linolenat  yang  masih  berada dalam  filtrat.  Namun,  apabila  temperatur diturunkan  lagi  menjadi  (-1) 0 C,  (-3) 0 C  dan (-5) 0 C  kadar  asam  linolenat  semakin menurun  karena  sebagian  asam  linolenat juga  mengalami  pengendapan.
Dari  Gambar  5  diketahui  bahwa temperatur  optimum  inklusi  urea  adalah  0-2 0 C.  Pada  temperatur  tersebut  kadar  asam linolenat  hasil  inklusi  sebesar  98,81  % dengan rendemen sebesar 34,26 %.
Temperatur  inilah  yang  digunakan  dalam optimasi  inklusi  urea  dengan  variasi  rasio asam  lemak:urea.

## Optimasi  Inklusi  Urea  dengan  Variasi Rasio Asam lemak:  Urea
Optimasi  inklusi  urea  dengan  variasi temperatur dilakukan pada temperatur optimum
inklusi hasil
penelitian sebelumnya,  yaitu  0-2 0 C,  dengan  variasi
80 85 90 95 100 -10 -5 0 5 10 % A sa m L in o le n at Temperatur
In te n s ita s In te n s ita s In te n s ita s
rasio  asam  lemak  urea  1:1;  1:1,5;  1:2;  1:2,5; 1:3;  1:3,5;  1:4.  Asam  lemak  yang  tidak terendapkan (filtrat) dipekatkan dengan aliran  gas  N 2 kemudian  diesterifikasi  untuk selanjutnya diidentifikasi
dengan
kromatografi  gas  (GC)  untuk  mengetahui rasio  asam  lemak:urea  yang  menghasilkan asam  α-linolenat  dengan  kandungan  yang paling  tinggi.  Hasil  variasi  rasio  asam lemak:  urea ditunjukkan  pada Gambar  6.
Kadar  asam  linolenat  paling  tinggi diperoleh  pada  rasio  asam  lemak:urea  1:1,5 yaitu sebesar 93,79 %. Hal ini
menunjukkan  semakin  banyak  asam  lemak jenuh  atau  monoena  dan  diena  yang terjebak dalam kisi-kisi urea dan mengendap sehingga dapat dipisahkan dengan  asam  linolenat  yang  masih  berada dalam  filtrat.  Pada  rasio  asam  lemak:urea 1:1  kadar  asam  linolenat  lebih  kecil  karena jumlah urea tidak mencukupi untuk membentuk  kompleks  klatrat  dengan  semua asam  lemak  non  linolenat,  sehingga  masih ada  asam  lemak  nonlinolenat  yang  tidak mengendap.  Pada  rasio  asam  lemak:urea 1:3,5 dan 1:4 kadar asam linolenat mengalami  peningkatan,  namun  kadar  asam linolenat semakin menurun dengan bertambahnya rasio asam lemak:urea karena sebagian asam linolenat juga mengalami  pengendapan.
Gambar 6. Pengaruh rasio asam lemak:urea terhadap kadar asam linolenat
Dari  Gambar  6  diketahui  bahwa rasio  asam  lemak:urea  optimum  inklusi urea  adalah  1:1,5.  Pada  rasio  tersebut  kadar asam  linolenat  hasil  inklusi  sebesar  93,79  % dengan  rendemen  dan  recovery  sebesar 23,51  %  dan  20,00 %. Temperatur dan rasio asam  lemak:urea  inilah  yang  digunakan
dalam  pemurnian  (isolasi)  α-linolenat  biji selasih.
Isolasi  Asam  Linolenat  pada  Kondisi Optimum  Inklusi
Isolasi  asam  α-linolenat  biji  selasih dilakukan  pada  kondisi  optimum  inklusi yang  diperoleh  dari  percobaan  sebelumnya, yaitu  pada  temperatur  0  –  2 0 C  dan  rasio asam  lemak:urea  1:1,5.  Inklusi  dilakukan tiga  tahap,  hasil  dari  inklusi  pertama diinklusi  lagi  dengan  kondisi  yang  sama, kemudian hasilnya diinklusi lagi untuk ketiga  kalinya.  Kemurnian  asam  α-linolenat yang  diperoleh  ditentukan  dari  hasil  analisis dengan kromatografi gas-spektroskopi massa  (KG-SM).  Kromatogram  KG  hasil inklusi  ditunjukkan  Gambar  7.

## Gambar 7. Kromatogram KG Metil Ester Asam Lemak Hasil Inklusi  Urea
Dari  data  KG  diketahui  bahwa komponen  utama  pada  hasil  inklusi  I,  II, dan  III  memiliki  nilai  waktu  retensi  yang sama yaitu 19,980 menit. Komponen tersebut  meningkat  dari  inklusi  I,  inklusi  II, dan  inklusi  III,  yaitu  sebesar  79,39  %,  85,00 %  dan  88,51  %  (Tabel  2).  Hal  ini menunjukkan tingkat kemurnian yang meningkat  pula.  Dengan  kata  lain,  semakin bagus  pemisahan  asam  linolenat  dengan asam  lemak  nonlinolenat.
50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 0 2 4 6 % A sa m L inol e na t Rasio  Urea : Asam Lemak ( 10 6 ) Tahap  I t R (menit) t R (menit) t R (menit) Tahap  II Tahap  III

## Tabel.2.  Persentase  Komponen  Utama  Hasil Inklusi  Urea
N o Inklusi Waktu Retensi (menit) % asam linolenat 1  Tahap I 19,980 79,39 2  Tahap II 19,980 85,00 3  Tahap III 19,980 88,51
Komponen utama hasil inklusi diperkirakan  merupakan  asam  α-linolenat. Hal  ini  didukung  hasil  analisis  Spektra massa  pada Gambar  8.
Gambar 8. Spektra Massa Metil Ester Asam Lemak Hasil Inklusi  Urea (t R = 19,980)
Spektra  massa  metil  ester  hasil inklusi  menghasilkan  puncak  ion  fragmen pada  m/z:  39,  41,  55,  67,  79,  93,  108, 121, 135,  149 , 163,  173,  191,  203,  217,  236, 249,  261,  277  dan  292. Spektra  tersebut memiliki  kemiripan  dengan  spektra  massa ( Z,Z,Z )-metil
linolenat atau metil 9 Z, 12 Z ,15 Z -oktadekatrienoat  (Gambar  3). Kedua  spektra  memiliki  kesamaan pada  ion  fragmen  pada  m/z:  39,  41,  55,  67, 79,  93,  108,  121,  135,  149  dan  memiliki base  peak pada  m/z:  79 . Berdasarkan  data- data  tersebut  disimpulkan  bahwa  asam lemak  utama  hasil  inklusi  adalah  asam 9Z,12Z,15Z -oktadekatrienoat  atau  asam  α- linolenat  dengan  geometri Z,Z,Z .
Hasil  spektra  massa  didukung  hasil analisis  dengan  spektroskopi  UV.  Gambar 10 menunjukkan panjang gelombang maksimum  pada  panjang  gelombang  210 dan  230  nm.  Serapan  pada  panjang gelombang
maksimum 230 nm
mengindikasikan  adanya  asam  lemak  yang mengandung dua ikatan
rangkap terkonjugasi. Hal ini sesuai dengan perhitungan  panjang  gelombang  maksimum kromofor  induk  diena  terkojugasi  dengan aturan Woodward-Fischer. Sedangkan serapan  pada  panjang  gelombang  210  nm
dimungkinkan  asam  lemak  dengan  ikatan rangkap  yang  tidak  terkonjugasi.
Berdasarkan nilai absorbansinya,
puncak dengan panjang gelombang
maksimum  210  nm  memiliki  absorbansi yang  lebih  besar,  yaitu  3,356.  Hal  ini menunjukkan banyaknya asam lemak dengan ikatan rangkap yang tidak terkonjugasi. Apabila dikaitkan dengan kandungan  asam  lemak  hasil  hidrolisis  dari biji  selasih,  asam  lemak  yang  paling  banyak adalah  asam  linolenat,  dapat  disimpulkan bahwa  asam  lemak  tersebut  adalah  asam  α- linolenat  (asam  9,12,15-oktadekatrienoat).

## Gambar 9. Spektra UV Asam Lemak Hasil Inklusi  Urea
Sedangkan senyawa  campurannya adalah  asam  lemak  yang  memiliki  dua ikatan rangkap terkonjugasi (memiliki absorbansi  UV  pada  230  nm)  dan  sejumlah kecil  asam  lemak  jenuh.  Adapun  rendemen hasil  inklusi  tahap  I,  tahap  II,  dan  tahap  III disajikan  pada Tabel.  3.

## Tabel. 3. Hasil Inklusi  Urea
N o Inklusi Berat Sampel  (g) Berat Hasil (g) Rendemen (%) 1  Tahap I 75 16,30 22,17 75 13,30 17,73 75 13,58 18,11 Rerata 19,95 2  Tahap II 15 6,97 46,47 15 6,81 45,40 15 6,75 45,00 Rerata 45,62 3  Tahap III 6,75 2,35 34,81 6,75 2,22 32,89 6,75 2,09 30,96 Rerata 32,89 Ket :  temperatur 0 – 2 0 C dan rasio asam lemak urea 1:1,5
210,1 230,0
Dari  Tabel  3.  diketahui  bahwa  rendemen rata-rata  inklusi  pertama  adalah  sebesar 19,95  %,  inklusi  kedua  45,62  %,  dan  inklusi ketiga  32,89  %.  Pada  inklusi  pertama rendemen  agak  rendah  karena  banyak  asam lemak nonlinolenat yang masih harus dipisahkan,  sedangkan  pada  inklusi  kedua tinggal  sedikit  asam  lemak  nonlinolenat yang terpisahkan  sehingga  rendemennya cukup besar. Pada inklusi ketiga dimungkinkan  sebagian  asam  linolenat  ikut terendapkan  bersama  kristal  urea  sehingga rendemennya  kembali  menurun.

## IV. KESIMPULAN
Asam- 9Z,12Z,15Z -oktadekatrienoat dari  biji  selasih  ( ocimum  basilicum) dapat diisolasi  dengan  beberapa  tahap.  Tahap pertama, isolasi minyak biji selasih dilakukan dengan ekstraksi Soxhlet
menggunakan  pelarut  n-heksana.  Minyak biji  selasih  yang  diperoleh  dari  hasil  isolasi mempunyai  indeks  bias  rata-rata  1,4661 dan  berat  jenis  0,8553.  Tahap  kedua, hidrolisis minyak biji selasih dengan merefluks  dengan  KOH  12  %  pada temperatur 60 0 C  selama  90  menit. Hidrolisis  minyak  biji  selasih  menghasilkan campuran asam-asam lemak dengan rendemen  sebanyak  77,90  %, recovery 81,81  %,  indeks  bias  1,4593, dan berat jenis 0,8853.  Asam-asam  lemak  minyak  biji selasih  terdiri  dari  asam  palmitat  (4,98  %), asam  stearat  (2,02  %),  asam  oleat  (6,46  %), asam  linoleat  (15,83  %),  dan  asam  α- linolenat  (70,72  %).  Asam  α-linolenat  dapat diisolasi  dengan  metode  inklusi  urea  pada tetemperatur  optimum  inklusi  0-2 0 C  dan rasio  asam  lemak  :  urea    1,5:1.  Hasil pemisahan  dengan  inklusi  urea  tiga  tahap menghasilkan  asam- 9Z,12Z,15Z oktadeka trienoat  dengan  kemurnian  88,51%.

## V. DAFTAR PUSTAKA
Angers,  P.,  M.R.  Morales,  and  J.E.  Simon.
1996.  Basil  seed  oils,  p. 598-601. In: J.  Janick  (ed.).  Progress  in  new crops. ASHS Press. Arlington.  VA.
Dewi,  S.P.  2009.  Isolasi  Asam  α-linolenat dalam Biji Selasih ( Ocimum basilicum L . .) Menggunakan Metode Perbedaan Titik Beku, Skripsi FMIPA. Universitas Brawijaya.  Malang Harrison,  K.  2006.  Linolenic  Acid  (LA), http://www.3dchem.com/magesofm olecules/linolenic- acid.jpg&imgrefurl. diakses 18 Oktober 2008
Mendes,  A.,  T.S.  da  Silva,  and  A.  Reis.
2006. DHA Concentration and
Purification from the Marine Heterotropic Microalga Crypthecodinium  cohnii CCMP 316 by Winterization and Urea Complexation, Food Tchnol. Biotechnol. 45 (1):  38-44 Choi,Y., Park,Y., Pariza,M.W., and
Ntambi,J.M.  2001.    Regulation  of Stearoyl-CoA Desaturase  Activity by  the trans 10, cis 12  Isomer  of
Conjugated Linolenic Acid in
HepG2  Cells, Biochem.  Biophys. Res. Commun. 284. 289-293 Muhsin  B.  2007.  Kenali  Omega  3  dan Omega 6 Lebih  Banyak  Lagi, http://www.nutrisibalitacerdas.com/ module.php?act=article&mode=read &articleID=26&categoryID=7 , diakses  19 Mei  2008 Ohlan,  R.,  B.  Narashimhan,  S.Ohlan,  R.
Narang and V. Judge. 2008. Synthesis and Antimocrobial Evaluation of Urea Inclusio
Complexes, Org.  Commun .  1(2)  : 24-32