Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 232-240 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902

## UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN
RAMBUSA DAN DAUN KARAMUNTING TERHADAP Streptococcus
mutans
Muhammad Priyadi 1 *, Nurul Chusna 2 , Guntur Satrio Pratomo 2
1 Program Studi S1 Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Palangka Raya
2 Program Studi D3 Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Palangkaraya
*Email: muhammad.priyadi@mipa.upr.ac.id
Artikel diterima: 31 Januari 2022; Disetujui: 1 Oktober 2022 DOI: https://doi.org/10.36387/jiis.v7i2.875

## ABSTRAK
Secara  empiris  telah  banyak  bahan  alam  digunakan  dalam  perawatan pencegahan  hingga  pengobatan  gangguan  gigi  dan  mulut.  Kondisi  kronis  pada gigi dengan munculnya plak dan kerusakan gigi  disebut sebagai  karies gigi yang ditandai dengan sakit gigi hingga mengganggu aktivitas sehari-hari. Streptococcus mutans diketahui  sebagai  bakteri  yang  paling  sering  menyebabkan  karies  gigi.
Tanaman  karamunting  dan  rambusa  cukup  memiliki  potensi  sebagai  antibakteri karena telah banyak penelitian yang mengemukakan potensi aktivitasnya sebagai antibakteri.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  mengetahui  aktivitas  antibakteri ekstrak etil asetat daun karamunting dan ekstrak etil asetat daun rambusa terhadap bakteri Streptococcus  mutans .  Uji  aktivitas  antibakteri  menggunakan  metode difusi  sumuran  dengan  mengukur  nilai  diameter  zona  hambat.  Hasil  penelitian menunjukkan  ekstrak  etil  asetat  daun  karamunting  1%,  5%,  10%,  15%,  20% memiliki diameter  zona hambat  masing-masing yaitu 4,6 mm; 4,1 mm; 0 mm, 0 mm, 0 mm sedangkan ekstrak etil asetat daun rambusa 1%, 5%, 10%, 15%, 20% memiliki  diameter  zona  hambat  masing-masing  yaitu  4.4  mm;  8,7  mm;  9,4  mm; 5,3  mm;  8,8  mm.  Ekstrak  etil  asetat  daun  karamunting  dan  rambusa  diketahui memiliki aktivitas antibakteri yang lemah dengan kategori resistant .
Kata kunci: Antibakteri, Rambusa, Karamunting, Streptococcus mutans

## ABSTRACT
Empirically, many natural ingredients have been used in preventive care for the  treatment  of  dental  and  oral  disorders.  Chronic  conditions  on  the teeth  with the appearance of plaque and tooth decay are referred to as dental caries which are  characterized  by  toothache  and  also  digestive  disorders.  Streptococcus mutans  is  known  as  the  bacteria  that  most  often  causes  dental  caries. Karamunting  and  rambusa  plants  have  enough  potential  as  antibacterials because  there  have  been  many  studies  that  have  shown  their  potential  as antibacterial  activities.  The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the antibacterial activity of ethyl acetate extract of karamunting leaves and rambusa
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 232-240 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
leaves  against  Streptococcus  mutans.  Antibacterial  activity  test  using  well diffusion  method  by  measuring  the  diameter  of  the  inhibition  zone.  The  results showed that the ethyl acetate extract of karamunting leaves 1%, 5%, 10%, 15%, 20%  had  inhibition  zone  diameters  of  4.6  mm,  4.1  mm,  0  mm,  0  mm,  0  mm, respectively while rambusa leaves 1%, 5%, 10%, 15%, 20% had inhibition zone diameters  of  4.4  mm,  8.7mm,  9.4  mm,  5.3mm and  8.8mm  respectively.  The  ethyl acetate  extract  of  karamunting  and  rambusa  leaves  is  known  to  have  weak antibacterial activity in the resistant category.
Keywords: Antibacterial, Rambusa, Karamunting, Streptococcus mutans

## PENDAHULUAN
Produk dari bahan alam merupakan  satu  dari  sekian  banyak alternatif  yang  dapat  digunakan sebagai  obat  dengan  berbagai  khasiat yang  telah  terbukti  (Rajkumar  et  al., 2012). Penggunaan bahan alam seperti  tanaman  untuk  obat  dapat dilakukan  dengan  proses  ekstraksi dengan  teknik  dan  pelarut  yang optimal untuk menarik banyak senyawa  kimia  (Zhang  et  al.,  2018). Terdapat  ratusan  bahkan  ribuan senyawa  pada  tanaman  yang  perlu diekstraksi dan diidentifikasi sehingga  perlu  diketahui  senyawa berkhasiat  yang  memiliki  potensi secara  farmakologi  termasuk  dalam upaya  penanganan  karies  gigi  yang hampir  pernah  dialami  oleh  setiap orang.
Karies  gigi  dapat  menimbulkan berbagai efek merugikan seperti sakit gigi, infeksi atau gangguan
pencernaan, dan mengganggu aktivitas  fisik  seseorang  (Yadav  & Prakash,  2016).  Bakteri  penyebab karies  gigi  yang  paling  dominan penyebab karies gigi adalah Streptococcus  mutans (El-sherbiny, 2014).
Penggunaan  terapi  beberapa jenis  antibiotik  pada  karies  gigi beresiko mengalami resistensi sehingga  dapat  dilakukan  pendekatan lain  melalui  obat-obatan  herbal  (El- sherbiny, 2014). Bahan tanaman yang berpotensi dapat dikembangkan dalam  pengobatan  karies  gigi  adalah tanaman  karamunting  ( Melastoma malabathricum L.)  dan  rambusa ( Passiflora foetida L.).
Tanaman karamunting dan rambusa  banyak  ditemukan  tumbuh liar  di  Daerah  Kalimantan  Tengah seperti  di  Kota  Palangka  Raya. Karamunting  dan  rambusa  diketahui memiliki  aktivitas  antibakteri  seperti
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 232-240 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
pada S.  Aureus dan E.  coli (Y  et  al.,
2014; Arifa & Periadnadi, 2018).
Telah  banyak  studi  literatur tentang aktivitas farmakologi tanaman  karamunting  dan  rambusa terhadap bakteri lain. Oleh karena itu, menarik  untuk  mengetahui  potensi senyawa yang diekstraksi menggunakan  pelarut  etil  asetat melalui uji aktivitas sebagai antibakteri  terhadap Streptococcus mutans penyebab karies gigi.

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  toples  kaca, timbangan,  batang  pengaduk,  corong kaca,  erlenmeyer,  rotary  evaporator, cawan  porselen,  waterbath,  oven, autoklaf,  cawan  petri,  jarum  ose,  lidi kapas  steril,  erlenmeyer,  gelas  ukur, inkubator,  pembuat  sumuran,  jangka sorong,  hotplate,  lampu  spiritus, Laminar  Air  Flow  (LAF),  lemari pendingin, oven, pinset, tabung reaksi, dan vial.
Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah daun
karamunting,  daun  rambusa,  kertas saring, Nutrient  Agar (NA), Brain
Heart  Infuse (BHI),  Mueller  Hinton Agar  (MHA),  Media  McFarland, aquadest,  etil  asetat,  etanol  96%, etanol  70%,  kain,  kapas  dan  bakteri Streptococcus mutans .
Penyiapan Simplisia dan Ekstraksi Daun  Karamunting  dan  Daun Rambusa segar diperoleh dari wilayah sekitar Kota Palangka Raya. Determinasi  tanaman  karamunting (No. 074/491/102.7-A/2021) dan rambusa  (No.  074/492/102.7-A/2021) dilakukan  di  UPT  Materia  Medica Kota  Batu,  Jawa  Timur.  Masing- masing sebanyak 5 Kg daun karamunting  dan  daun  rambusa  yang telah  dipotong-potong  dikeringkan  di bawah sinar matahari langsung hingga diperoleh simplisia kering dan diserbuk hingga halus. Masing- masing serbuk simplisia daun karamunting  (1,2  Kg)  dan  simplisia daun  rambusa  (0,8  Kg)  dimaserasi menggunakan  pelarut  etil  asetat sebanyak 5 liter dan disimpan selama 3 x 24 jam dengan sesekali dilakukan pengadukan.  Hasil  maserasi  disaring hingga diperoleh filtrat dan dilakukan penguapan pelarut menggunakan rotary evaporator dengan suhu 50 o C.
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 232-240 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902

## Uji Aktivitas Antibakteri
Metode  pengujian  antibakteri yang  digunakan  yaitu  metode  difusi sumuran dengan sumuran berdiameter 6 mm. Media
pertumbuhan  yang  digunakan  adalah Nutrient  Agar (NA).  Kelompok sampel uji terdiri dari  masing-masing ekstrak daun karamunting dan ekstrak daun  rambusa  (1%,  5%,  10%,  15% dan 20%) dan kontrol negatif menggunakan  etanol  96%.  Setelah itu,  dilakukan  inkubasi  pada  suhu 37 o C  selama  24  jam  dengan  4 pengulangan (replikasi). Zona hambat antibakteri diukur berdasarkan ukuran diameter  zona  bening  yang  diukur pada masing-masing kelompok uji.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Ekstraksi
Hasil  ekstraksi  dengan  metode maserasi  menggunakan  pelarut  etil asetat  diperoleh  ekstrak  etil  asetat karamunting sebanyak 80 g (rendemen  6,7%)  dan  ekstrak  etil asetat  rambusa  sebanyak  77,4  g (rendemen  9,7%).  Hasil  ekstrak berupa  cairan  kental  yang  memiliki warna warna coklat kehitaman.
Banyak penelitian yang menunjukkan
bahwa maserasi dapat menarik senyawa  dari  bahan  alam  (Pandey  & Tripathi,  2014).  Etil  asetat  mampu menarik lebih spesifik senyawa kimia yang  memiliki  aktivitas  farmakologi tertentu pada suatu tanaman (Handayani et al., 2018).
Tanaman karamunting dan rambusa  merupakan  tanaman  yang sudah  umum  dijumpai  disekitar lingkungan  seperti  di  pinggir  jalan, daerah  hutan  hingga  daerah  berpasir. Berdasarkan lingkungan tempat hidup maka  karamunting  juga  cenderung tumbuh  secara  berdampingan  dengan rambusa.  Oleh  karena  itu,  sangat berpotensi untuk mengetahui berbagai senyawa  metabolit  sekunder  pada setiap bagian tanaman serta khasiatnya.  Karamunting  diketahui mengandung sejumlah golongan senyawa  seperti  alkaloid,  flavonoid, saponin, tannin, terpenoid (Sari et al., 2018).  Sedangkan  tanaman  rambusa diketahui mengandung senyawa seperti flavonoid, fenol, alkaloid, dan steroid  (Y  et  al.,  2014).  Kandungan senyawa kimia berkhasiat dan aktivitas  farmakologis  yang  dimiliki oleh  tanaman  karamunting  maupun rambusa
borpotensi dapat
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 232-240 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
dikembangkan  lebih  lanjut  sebagai tanaman berkhasiat obat. Kelimpahan jumlah  sampel  tanaman  karamunting dan  rambusa  juga  sangat  banyak  dan berpotensi untuk dapat dibudidayakan menjadi tanaman obat bahkan menjadi  bahan  aktif  dalam  formulasi sediaan sediaan antibakteri.

## Uji Aktivitas Antibakteri
Pada  penelitian  ini  dilakukan pengujian  antibakteri  menggunakan difusi  sumuran.  Hal  ini  menjadi pertimbangan  karena  penelitian  Sari &  Febriawan  (2021)  dan  (Nurhayati et  al.  (2020)  menjelaskan  bahwa metode difusi sumuran mampu menunjukkan  aktivitas  antibakteri suatu  sampel  lebih  dapat  terlihat  dan memberikan  pengaruh  terhadap  nilai diameter  zona  hambat  karena  secara langsung terjadi kontak dengan media pertumbuhan bakteri.
Hasil pengukuran diameter daya hambat bakteri pada Tabel 1 menunjukkan  bahwa  baik  ekstrak daun  karamunting  maupun  rambusa memiliki  nilai  diameter  zona  hambat yang  relatif  kecil  dengan  kategori resistant berdasarkan  kategori  dari Clinical  and  Laboratory  Standards Institute (2015).
Tabel 1. Uji Antibakteri Karamunting
dan Rambusa Kelompok Uji Diameter Zona Hambat (mm) ± SD Kategori Karamunting 1% 4,6 ± 1,7 Resistant Karamunting 5% 4,1 ± 1,0 Resistant Karamunting 10% - Resistant Karamunting 15% - Resistant Karamunting 20% - Resistant Rambusa 1% 4.4 ± 1,8 Resistant Rambusa 5% 8,7 ± 0,5 Resistant Rambusa 10% 9,4 ± 0,5 Resistant Rambusa 15% 5,3 ± 1,4 Resistant Rambusa 20% 8,8 ± 1,5 Resistant Kontrol Negatif - Resistant
Hasil  uji  aktivitas  antibakteri menunjukkan bahwa ektrak etil asetat daun  karamunting  dan  daun  rambusa tidak begitu efektif dalam
menghambat  langsung  pertumbuhan bakteri
Streptococcus mutans . Beberapa  studi  literatur menunjukkan bahwa  penggunaan  bagian  tanaman, pelarut untuk ektraksi dan konsentrasi ekstrak dapat mempengaruhi aktivitas antibakteri tanaman karamunting maupun  rambusa  terhadap  bakteri Streptococcus mutans .
Aktivitas antibakteri pada karamunting  dapat  bersifat  spesifik pada  bagian  tanaman  tertentu  dan bakteri  tertentu  seperti  pada  bakteri Staphylococcus aureus dan
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 232-240 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
Escherichia coli (Arifa & Periadnadi,
2018)  hingga  bakteri Salmonela  typi
(Handayani  et  al,  2017).  Selain  itu, konsentrasi yang kecil dapat mempengaruhi  aktivitas  antibakteri karena  semakin  tinggi  konsentrasi sampel  maka  aktivitas  antibakteri semakin  kuat  (Nurhayat  et  al.,  2020). Uji  ekstrak  etanol  daun  karamunting pada beberapa bakteri terlihat
pengaruh konsentrasi terhadap aktivitas  antibakterinya  (Widowati  et al.,  2021).  Kemudian,  perbedaan pelarut  dalam  proses  ekstraksi  juga dapat mempengaruhi aktivitas ekstrak terhadap  bakteri  karena  hanya  sedikit senyawa spesifik pada tanaman karamunting  yang  dapat  sensitif  dan efektif  menghambat  pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans (Azizan et  al.,  2020).  Artinya  metabolit  yang ada  di  dalam  ekstrak  etanol  tidak mampu  menembus  maupun  merusak dinding  sel  bakteri.  Dalam  penelitian Fajar  et  al.  (2020)  daun  karamunting memiliki aktivitas menghambat enzim glukosiltransferase bakteri
Streptococcus
mutans pada
konsentrasi  ekstrak  yang cukup  besar yaitu  20%  dan  dapat  terjadi  fluktuasi
aktivitas seiring perbedaan konsentrasi ekstrak.
Bagian  tertentu  dari  tanaman rambusa  seperti  buah  rambusa  yang diekstraksi  dengan  etanol  cukup efektif dalam menghambat pertumbuhan  bakteri Streptococcus mutans (Dewi  &  Afsari,  2017).
Kemungkinan  terbesar  adalah  ekstrak etil  asetat  hanya  dapat  menghambat pertumbuhan bakteri seperti Salmonella  typi , Staphyloccus  aureus dan Bacillus subtilis sedangkan aktivitas  pada  bakteri Streptococcus mutans pada  ekstrak  etanol  (Emelda et  al.,  2015).  Hal  ini  juga  dikuatkan dari  penelitian  Gloria  et  al.  (2019) tentang  penggunaan  pelarut  etanol dan semakin tinggi konsentrasi ektrak etanol  maka  daya  hambat  terhadap bakteri Streptococcus mutans semakin besar.
Streptococcus  mutans diketahui memiliki kemampuan untuk melindungi  diri  sehingga  terdapat terjadi  resistensi.  Karakteristik  dan asal  kultur  bakteri  menjadi  hal  yang sangat  menentukan  kemampuan  jenis bakteri  dalam  mencegah  kerusakan sel oleh antibakteri.
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 232-240 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
Selanjutnya  dapat  dilakukan penelitian lanjutan terhadap karamunting maupun rambusa dengan bagian tanaman dan metode ekstraksi
yang berbeda, pelarut hingga konsentrasi  yang  lebih  besar  dan beragam  serta  metode  uji  aktivitas antibakteri yang lainnya.

## KESIMPULAN
Kesimpulan  dari  penelitian  ini adalah  ekstrak  etil  asetat  daun karamunting  dan  ekstrak  etil  asetat daun  rambusa  memiliki  aktivitas antibakteri yang lemah dengan kategori resistant .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Kami  ucapkan  terima  kasih kepada  Lembaga  Penelitian  dan
Pengabdian Masyarakat (LP2M) Universitas Muhammadiyah Palangkaraya  yang telah  memberikan pendanaan guna pelaksanaan
penelitian  dapat  berjalan  dengan lancar.

## DAFTAR PUSTAKA
Arifa,  N.,  &  Periadnadi,  P.  (2018). Antimicrobial  Activity  Of  Fresh Extract  Sikaduduak  ( Melastoma malabathricum Linn.).
Metamorfosa: Journal of Biological  Sciences , Volume 5 (2), 165–170.
Azizan,  F.  F.,  Hanafiah,  R.  M.,
Msarah,  M.  J.,  Norefrina,  N.  S., Ibrahim,  N.,  &  Aqma,  W.  S. (2020). Antibacterial and antibiofilm analyses of Melastoma malabathricum leaves extract against Streptococcus  mutans  on  tooth surfaces. Malaysian  Journal  of Microbiology , Volume  16 (6), 454–460.
Clinical  and  Laboratory  Standards Institute. (2015). M02-A12 Performance Standards for Antimicrobial Disk. In Clsi ( Vol.
32 ). USA.
Dewi,  S.  T.  R.,  &  Afsari,  Y.  (2017). Uji  Aktivitas  Ekstrak  Buah Rambusa  (Passiflora  foetida  L.) Terhadap Kerusakan Gigi Penyebab  Bakteri  Streptococcus mutans. Journal  of  Chemical Information and Modeling ,
Volume 13 (2), 92–96.
El-sherbiny, G. M. (2014). Control of growth  Streptococcus  mutans isolated  from  saliva  and  dental caries. International  Journal  of
Current
Microbiology and
Applied  Sciences , Volume  3 (10), 1–10.
Emelda,  A.,  Arman,  Yuliana,  D.,  &
Amin,  A.  (2015).  Antimicrobial Potency  Of  Passiflora  Foetida
Linn  From  South  Sulawesi
Indonesia  Against  Bacteria  In Vitro. International  Journal  Of Pharmacy & Technology ,
Volume 7 (3), 9562–9566.
Fajar,  F.  J.,  Kania,  D.,  Putri,  T.,  &
Sukmana, B. I. (2020). Effect Of
Jurnal Ilmiah Ibnu Sina, 7(2), Oktober 2022, 232-240 p-ISSN: 2502-647X; e-ISSN: 2503-1902
Karamunting Leaf Extract (Melastoma  malabathricum  L.) On  Glucosyltransferase  Enzyme Of Streptococcus mutans. DENTINO JURNAL KEDOKTERAN  GIGI , Volume V (2), 110–114.
Gloria,  Y.,  Delfina,  D.,  &  Bachtiar, Y. (2019). Uji efektifitas antibakteri daun senggani (Melastoma  candidum)  terhadap bakteri  Streptococcus  mutans. Biosains , Volume 5 (1), 31–37. Handayani,  M.,  Lambui,  O.,  &
Suwastika,  I.  N.  (2017).  Potensi Tumbuhan Melastoma malabathricum L. Sebagai Bahan Antibakteri Salmonellosis. Natural  Science:  Journal  of Science and Technology ,
Volume 6 (2), 165-174. Handayani, S., Mursiti, S., & Wijayati, N. (2018). Uji Aktivitas  Antibakteri  Senyawa Flavonoid  dari  Rimpang  Temu Kunci  (Kaempferia  pandurata
Roxb.)  terhadap  Streptococcus mutans. Indonesian  Journal  of Chemical  Science , Volume 7 (2), 146–152.
Nurhayat, N., Yuliar, Y., & Marpaung, M. P. (2020). Analisis Efek Konsentrasi Ekstrak  Etanol  Daun  Senggani (Melastoma  malabathricum  L.) sebagai Antibakteri Staphylococcus  aureus. Jurnal Kesehatan  Poltekkes  Kemenkes
Ri  Pangkalpinang , Volume  8 (1), 17-26.
Nurhayati,  L.  S.,  Yahdiyani,  N.,  & Hidayatulloh, A. (2020). Perbandingan Pengujian Aktivitas Antibakteri Starter
Yogurt  dengan  Metode  Difusi Sumuran  dan  Metode  Difusi
Cakram. Jurnal  Teknologi  Hasil Peternakan , Volume 1 (2), 41.
Pandey,  A.,  &  Tripathi,  S.  (2014).
Concept of standardization, extraction and pre phytochemical screening strategies for herbal drug.
Journal  of  Pharmacognosy  and Phytochemistry , Volume  2 (5), 115–119.
Rajkumar, V., Guha, G., & Kumar, R. A. (2012). Isolation and bioactivity  evaluation  of  two metabolites  from  the  methanolic extract  of  Oroxylum  indicum stem bark. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine , Volume S7–S11.
Sari,  N.  M.,  Kuspradini,  H.,  Amirta, R.,  &  Kusuma,  I.  W.  (2018). Antioxidant activity of an invasive plant, Melastoma
malabathricum  and  its  potential as  herbal  tea  product. IOP Conference  Series:  Earth  and Environmental  Science , Volume 144 (1).
Sari,  Z.  A.  A.,  &  Febriawan,  R. (2021).  Perbedaan  Hasil  Uji Aktivitas  Antibakteri  Metode Well  Diffusion  dan  Kirby  bauer Terhadap  Pertumbuhan  Bakteri. Jurnal Medika Hutama , Volume
2 (04), 1156–1162.
Widowati,  R.,  Handayani,  S.,  &  Al
Fikri, A. R. (2021). Phytochemical  Screening  and Antibacterial Activities of Senggani (Melastoma malabathricum  L.)  Ethanolic Extract  Leaves. Jurnal  Ilmu
Pertanian Indonesia , Volume 26
(4), 562–568.
Y,  N.,  Pasaribu,  S.  P.,  &  Tarigan,  D.
(2014). Uji Fitokimia, Toksisitas
Dan Aktivitas Antibakteri Terhadap Ekstrak ETANOL Daun Rambusa (Passiflora foetida  L.)  Terhadap  Bakteri Staphylococcus aureus Dan
Escherichia  coli. Jurnal  Kimia Mulawarman , Volume  12 (1), 31–36.
Yadav,  K.,  &  Prakash,  S.  (2016).
Dental Caries : A Review. Asian Journal  of  Biomedical  and Pharmaceutical Sciences ,
Volume 6 (53), 1–7.
Zhang,  Q.  W.,  Lin,  L.  G.,    Ye,  W. C. (2018). Techniques for extraction and isolation of natural products : a comprehensive  review. Chinese
Medicine , Volume  13 (20),  1–
26.