ISSN Cetak         : 2087-9423
ISSN Elektronik : 2620-309X
OPTIMASI WAKTU INKUBASI PRODUKSI PROTEASE DAN AMILASE ISOLAT BAKTERI ASAL TERASI IKAN TERI Stolephorus sp.
OPTIMIZATION OF INCUBATION TIME INTHE PRODUCTION OF PROTEASE AND AMYLASE BY BACTERIAL ISOLATES OF ANCHOVY Stolephorus sp. PASTE ORIGIN
Yulia Oktavia 1* , Shanti Dwita Lestari 2 , Susi Lestari 2 , Herpandi 2 , dan Miftahul Jannah 3 1 Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, FIKP-UMRAH, Tanjungpinang
2 Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, FP- UNSRI, Indralaya
3 Alumni Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, FP-UNSRI, Indralaya
* E-mail: shanti.dwita@gmail.com

## ABSTRACT
The  purpose  of  this  research  was  to  know  the  optimization  of  incubation  time  in  the  production  of protease and  amylase  by bacterial isolates of anchovy  Stolephorus sp . paste origin. This research was conducted  in  two  stages,  namely  the  growth  of  bacterial  isolates  measurement  and  determination  the optimum  time  production  of  the  enzyme  protease  and  amylase.  Testing  conducted  include  the  test proteases  and  amylase  enzyme  activity  and  protein  levels  of  each  of  these  enzymes. The  data  will  be analyzed test results are descriptive. There are 4 bacterial isolates, where 2 isolates, which is a protease- producing bacteria isolates that is P2 and P4, and 2 isolates, which is the amylase-producing bacteria that is A2 and A4. The activity of the protease optimum occurs at to-36 hours to isolate P2 of 0.073 U/mL with a specific activity of 1.632 U/mg and isolates P4 that is 0.057 U/mL with a specific activity of 4.91 U/mg.  Whereas amylase activity, optimum occurs at to-36ohours for A2 isolates  of 0.360 U/mL with  a specific  activity  of  7.73  U/mg  and  activity  of  amylase  optimum  on  A4  isolates  of  0.239  U/mL  with  a specific activity of  5.224 U/mg.
Keywords: amylase, anchovy paste, enzyme, microbial, protease

## ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan waktu optimum produksi enzim protease dan amilase isolat bakteri asal terasi ikan teri Stolephorus sp. Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap yaitu pengukuran pertumbuhan  isolat  bakteri  dan  penentuan  waktu  optimum  produksi  enzim  protease  dan  amilase. Pengujian  yang  dilakukan  meliputi  uji  aktivitas  enzim  protease  dan  amilase  dan    kadar  protein  dari tiap-tiap enzim tersebut. Data hasil pengujian dianalisis secara deskriptif. Ada 4 isolat bakteri, 2 isolat merupakan  bakteri  penghasil  protease  yaitu  isolat  P2  dan  P4,  dan  2  isolat  yang  merupakan  bakteri penghasil amilase yaitu A2 dan A4. Aktivitas protease optimum terjadi pada jam ke-36 untuk isolat P2 sebesar  0,073  U/mL  dengan  aktivitas  spesifik  sebesar  1,632  U/mg  dan  isolat  P4  yaitu  0,057  U/mL dengan aktivitas spesifik 4,91U/mg. Aktivitas amilase optimum terjadi pada jam ke-36 untuk isolat A2 sebesar 0,360 U/mL dengan aktivitas spesifik sebesar 7,73 U/mg dan aktivitas amilase optimum pada isolat A4 sebesar 0,239 U/mL dengan aktivitas spesifik 5,24 U/mg.
Kata kunci: amilase, enzim, mikroba, protease, terasi teri

## I. PENDAHULUAN
Mikroorganisme  banyak  dimanfaat- kan  sebagai  sumber  penghasil  enzim komersial  dikarenakan  sifat  fisika  dan biokimianya  serta  kultivasi  yang  mudah untuk  dimanipulasi  (Rodarte et  al .,  2011). Penggunaan  enzim  dalam  bioteknologi
modern  semakin  berkembang  secara  cepat, terutama enzim protease dan amilase. Enzim protease dan amilase telah banyak digunakan dalam  bidang  industri  pangan,  farmasi  dan industri kimia lainnya. Menurut Uddin et al . (2014), enzim protease banyak dimanfaatkan dalam  bidang  bioteknologi  untuk  mem- produksi asam amino dan peptida dari subtrat
bermolekul  tinggi  atau  dalam  industri  kulit, penggunaan  dalam  pengolahan  air  limbah, tekstil,  obat-obatan,  kosmetik,  industri pengolahan  kulit  dan  peternakan  unggas. Menurut  de  Souza et  al .  (2010),  enzim amilase  yang  dihasilkan  dari  mikroba  dapat dimanfaatkan  pada  industri  tekstil,  kertas, deterjen,  konversi  pati,  dan  produksi  bahan bakar  etanol.  Enzim  yang  digunakan  untuk aplikasi  industri  dan  bioteknologi  umumnya berasal  dari  mikroorganisme  seperti  bakteri, fungi dan jamur.
Mikroorganisme adalah sumber enzim  yang  paling  banyak  digunakan dibandingkan  dengan  tanaman  dan  hewan. Mikroorganisme sebagai sumber enzim lebih menguntungkan  karena  pertumbuhannya cepat,  dapat  tumbuh  pada  substrat  yang murah,  lebih  mudah  ditingkatkan  hasilnya melalui pengaturan kondisi pertumbuhan dan rekayasa  genetik.  Adrio  dan  Demain  (2014) menyatakan bahwa pemilihan mikro- organisme  sebagai  produsen  enzim  karena mikroorganisme  mampu  dijadikan  solusi akan  tingginya  permintaan  enzim  yang  me- nuntut adanya produksi yang berkelanjutan.
Adanya  mikroorganisme  yang  unggul merupakan  salah  satu  faktor  penting  dalam usaha produksi enzim. Mikroorganisme yang digunakan  untuk  memproduksi  enzim  yaitu bakteri  amilolitik  dan  proteolitik  yang  telah diisolasi  dari  terasi  ikan  teri Stolephorus sp. Menurut  Arfarita  dan  Chukeatirote  (2015), Terasi  adalah  pasta  padat  hasil  fermentasi udang  dan  ikan  yang  biasanya  difermentasi dalam kondisi kadar garam tinggi.
Enzim-enzim  yang  berperan  dalam perombakan  terasi  secara  garis  besar tergolong  pada  jenis  proteolitik,  amilolitik dan  lipolitik.  Enzim  yang  berasal  dari mikroba  maupun  enzim  alami  pada  bahan baku  akan  merombak  makromolekul  seperti pati,  protein  dan  lemak  menjadi  senyawa yang  lebih  sederhana.  Enzim  protease berfungsi  mengubah  protein  menjadi  asam amino,  amilase  mengubah  pati  menjadi maltosa, dan lipase mengubah lemak menjadi asam  lemak  dan  gliserol  (Kim et  al .,  2011).
Penelitian  aktivitas  enzim  protease  dan amilase  dari  terasi  ikan  teri  perlu  dilakukan untuk  mengetahui  waktu  optimum  produksi enzim  dan  pengujian  aktivitas  enzim  yang dihasilkan  oleh  mikroba  asal  terasi  ikan  teri Stolephorus sp. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan  waktu  optimasi  optimum produksi  enzim  protease  dan  amilase  yang berasal  dari  mikroba  sampel  terasi  ikan  teri Stolephorus sp.

## II. METODE PENELITIAN
2.1.   Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium  Teknologi  Hasil  Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya dan laboratorium  Kimia,  laboratorium  Biologi, Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan Alam,  Universitas  Sriwijaya.  Penelitian  ini dilaksanakan  pada  bulan  Februari  sampai dengan April 2017.

## 2.2.   Alat dan Bahan
Peralatan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  meliputi  erlenmeyer,  tabung reaksi,  labu  takar,  cawan  petri,  gelas  ukur, beker glass, mikro pipet, laminar flow , jarum ose,  spektrofotometer UV-vis, shaker , inkubator dan sentrifugasi.
Bahan  yang  digunakan  antara  lain isolat  bakteri  P2,  P4,  A2,  dan  A4  yang diisolasi  dari  terasi  ikan  teri,  media  SMA ( Skim  Milk  Agar ),  NA  ( Nutrient  Agar ), kasein  2%,  bufer  fospat  pH  7,  TCA, aquadest,  tripton  1%,  NaCl  1%,  yeast, Comassie  Briliant  Blue R-250,  Asam Ortophospat,  fenol,  NaOH,  Natrium  Kalium Tartat,  pepton,  Pati,  Gum  Arab,  CaCl,  DNS (3,5 Dinitrosalycilic Acid), glukosa, Na 2 CO 3 , Pereaksi  Folin  Ciocalteu,  SA  ( Starch  Agar) , akuabides,  NaOH,  HCl  6N,  MgSO 4 ;7H 2 O 0,01%, dan CaCl 2 0,03%.

## 2.3.   Prosedur Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  dalam  dua tahap  yaitu  pengukuran  pertumbuhan  isolat bakteri  dan  penentuan  waktu  optimum
produksi  enzim  protease  dan  amilase. Pengujian  yang  dilakukan  meliputi  uji aktivitas  enzim  protease  dan  amilase  serta kadar  protein  dari  tiap-tiap  enzim  tersebut. Data  hasil  pengujian  dianalisis  secara deskriptif.

## 2.4.   Penentuan Pertumbuhan dan Waktu Optimum Produksi Enzim
Pertumbuhan  dan  waktu  optimum produksi  enzim  protease  dan  amilase ditentukan  berdasarkan  pengukuran  OD ( Optical  Density) dan  selanjutnya  dilakukan pengukuran  aktivitas  tiap-tiap  enzim  pada jam  ke-12,  24,  36,  48,  dan  60.  Ekstraksi enzim  dilakukan  dengan  sentrifugasi  kultur cair.  Supernatan  hasil  sentrifugasi  dianggap sebagai enzim kasar, kemudian diuji aktivitas dan kadar proteinnya.

## 2.5.   Penentuan Pertumbuhan dan Waktu Optimum Produksi Protease
Kultur  murni  isolat  dari  media  NA masing-masing berumur 24 jam dipindahkan ke media Luria Bertani Broth (LB) sebanyak 1  loop.  Produksi  protease  menggunakan media  LB  sebanyak  250  mL  dan  dilakukan pada  suhu  37 o C.  Pengambilan  sampel dilakukan  setiap  12  jam  selama  60  jam. Ekstraksi  enzim  protease  dilakukan  dengan cara  sentrifugasi  media  pertumbuhan  bakteri dengan kecepatan 3.000 rpm selama 15 menit pada  suhu  4 o C.  Dengan  teknik  ini,  sel  akan mengendap  oleh  adanya  gaya  gravitasi sedangkan  enzim  tetap  terdapat  pada supernatan.  Supernatan  sebagai  sampel  diuji aktivitas protease dan kadar proteinnya.

## 2.6.   Penentuan Pertumbuhan dan Waktu Optimum Produksi
Amilolitik Proses  fermentasi α -amilase  di- lakukan dengan membuat medium fermentasi dengan  komposisi  (g/L);  6,0  pepton;  0,5 MgSO 4 , 7H 2 O dan 1,0 pati soluble. Medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 10  mL  kemudian  ditambahkan  kalsium
klorida (CaCl 2 ) 0,03% b/v. Inokulasi medium dilakukan  dengan  memasukkan  inokulum sebanyak 10% (v/v). Inkubasi dilakukan pada suhu kamar 28 o C selama 12, 24, 36, 48 dan 60  jam  pada  shaker  portable  kecepatan  120 rpm.  Media  produksi  disentrifugasi  dengan kecepatan  4.000  rpm  selama  10  menit.  Sel akan  mengendap  oleh  adanya  gaya  gravitasi sedangkan  enzim  tetap  terdapat  pada supernatan.  Supernatan  sebagai  sampel  diuji aktivitas protease dan kadar proteinnya.

## 2.7.   Parameter Pengujian dan Analisis Data
Parameter yang diuji pada penelitian ini meliputi pengukuran aktivitas protease (Bergmeyer et al. , 1983), pengukuran aktivitas amilase  (Miller,  1959),  dan  pengukuran konsentrasi protein (Bradford, 1976).

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1.   Pertumbuhan Isolat Bakteri Penghasil Enzim Protease dan Amilase
Pertumbuhan  pada  bakteri  didefinisi- kan  sebagai  pertambahan  berat  (jumlah)  sel karena  berat  sel  relatif  sama  dengan  siklus sel.  Pertumbuhan  bakteri  dapat  dilihat  dari kerapatan  biomassanya.  Ketika  bakteri bertambah  jumlahnya  atau  semakin  besar ukurannya  dalam  biakan  cair,  terjadi peningkatan  kekeruhan  dalam  biakan.  Peng- ukuran pertumbuhan bakteri dapat dilakukan dengan  2  metode,  yaitu  metode  secara langsung,  menghitung  sel  dengan  meng- gunakan  haemositometer  untuk  mengukur pertumbuhan  bakteri  pada  tanah,  air, makanan  dan  lain-lain.  Metode  tidak langsung  dapat  dilakukan  dengan  cara mengamati kekeruhan dan melihat absorbansi sel  menggunakan  alat  spektrofotometer. Menurut  Zusfahair et  al .  (2016),  fase pertumbuhan  dapat  diukur  dari  kekeruhan bakteri  pada  media  broth  ( Optical  density ) pada panjang gelombang 600 nm.
Ada  empat  isolat  bakteri  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  isolat
bakteri  P2  dan  P4  yang  merupakan  isolat bakteri  penghasil  enzim  protease,  sedangkan isolat  bakteri  A2  dan  A4  yang  merupakan isolat  penghasil  enzim  amilase.  Hasil  dari pengukuran  pertumbuhan  bakteri  penghasil protease  dan  amilase  dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Gambar 1. Pertumbuhan isolat bakteri penghasil enzim protease (P2 dan P4) dan amilase (A2 dan A4).
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang ditampilkan  pada  Gambar  1.  menunjukkan bahwa keempat isolat bakteri mengalami fase adaptasi dimulai antara jam ke-0 sampai jam ke-12  yang  ditandai  oleh  pertumbuhan bakteri  yang  masih  sedikit  karena  bakteri masih  beradaptasi  dengan  lingkungan barunya. Fase  adaptasi  (fase lag)  merupakan suatu  periode  saat  sel  beradaptasi  pada lingkungan  baru  dan  menyiapkan  untuk pertumbuhan  reproduksi,  biasanya  dengan mensintesis komponen sel baru.
Fase  logaritmik  terjadi  di  antara  jam ke-12 hingga jam ke-36 yaitu fase terjadinya peningkatan  jumlah  bakteri.  Hal  ini ditunjukkan  dengan  kenaikan  OD  pada bakteri  protease  yaitu  1,731-2,114  untuk isolat bakteri P2 dan 1,708-2,097 untuk isolat P4.  Nilai  OD  bakteri  amilase  yaitu 1,2841,292  untuk  isolat  bakteri  A2  dan 0,978-1,170  untuk  isolat  A4.  Ini  disebabkan pembelahan  bakteri  yang  meningkat  karena telah beradaptasi dengan lingkungannya serta nutrisi  yang  terdapat  di  dalam  medium mencukupi  bagi  bakteri.  Menurut  Reiny (2012),  fase  logaritmik  menggambarkan  sel
membelah  diri  dengan  laju  yang  konstan, masa menjadi dua kali lipat dengan laju sama dan  aktivitas  metabolisme  konstan.  Setiap mikroorganisme  memiliki  waktu  produksi enzim  yang  berbeda-beda  tergantung  dari jenis  mikroorganisme  tersebut.  Berdasarkan penelitian  Suganthi et  al. (2013), Bacillus licheniformis memiliki waktu optimum untuk memproduksi enzim protease yaitu pada jam ke-24.

## 3.2.    Waktu Optimum Produksi Enzim Protease
Optimasi  waktu  produksi  enzim protease dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim protease tersebut pada selang waktu tertentu. Selang waktu yang digunakan dalam  pengukuran  aktivitas  sama  dengan waktu  pengujian  pertumbuhan  bakteri  yaitu jam ke-12, 24, 36, 48, dan 60. Hasil optimasi waktu  produksi  enzim  dapat  dilihat  pada Gambar 2.
Gambar 2. Optimasi waktu produksi enzim protease.
Gambar  2  menunjukkan  bahwa aktivitas  protease  optimum  terjadi  pada  jam ke-36 dengan nilai aktivitas isolat bakteri P2 yaitu 0,073 U/mL dan isolat bakteri P4 yaitu 0,057  U/mL.  Berdasarkan  penelitian  Pant et al .  (2015),  produksi  protease  asal Bacillus subtilis mengalami peningkatan dari jam ke-0 hingga  jam  ke-36  dengan  aktivitas  optimum yaitu 243,28 U/mL. Substrat yang digunakan untuk  mengukur  aktivitas  protease  yaitu kasein.  Aktivitas  enzim  protease  merupakan kemampuan  enzim  dalam  menghidrolisis
substrat kasein sehingga memutuskan rantai- rantai  polipeptida  pada  kasein.  Substrat kasein  tersebut  akan  terurai  menjadi  peptida dan asam amino. Besarnya aktivitas protease ditentukan  berdasarkan  jumlah  tirosin  yang dihasilkan  dalam  menghidrolisis  kasein. Aktivitas  enzim  diproduksi  seiring  dengan pertumbuhan  sel  dan  mencapai  aktivitas tertinggi  menjelang  fase  stasioner  atau diakhir  fase  eksponensial.  Hal  ini  terjadi karena  adanya  penumpukan  hasil  metabolit yang  digunakan  untuk  pertumbuhan  bakteri. Menurut  Alnahdi  (2012),  kondisi  optimum untuk  memproduksi  enzim  protease  terjadi pada akhir fase eksponensial.

## 3.3.   Optimasi Waktu Produksi Enzim Amilase
Amilase  merupakan  enzim  yang sangat  penting  dalam  industri  pati  untuk menghidrolisis  polisakarida  menjadi  gula sederhana  (Gupta et  al .,  2003).  Aktivitas amilase  diukur  menggunakan  pati  sebagai substrat. Pati merupakan sumber karbon yang baik  untuk  menginduksi  produksi  enzim amilase.  Aktivitas  amilase  diukur  berdasar- kan konsentrasi glukosa yang dihasilkan oleh amilase  dalam  menghidrolisis  pati.  Hasil optimasi  produksi  enzim  amilase  dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Optimasi waktu produksi enzim amilase.
Gambar  3  menunjukkan  bahwa aktivitas optimum amilase baik isolat A2 dan A4  terjadi  pada  jam  ke-36.  Seiring  dengan waktu  pertumbuhan  bahwa  pada  jam  ke-36 diduga  merupakan  awal  fase  stasioner.
Aktivitas amilase yang dihasilkan oleh isolat bakteri A2 yaitu 0,36 U/mL dan isolat bakteri A4 yaitu 0,239 U/mL. Pada jam ke-48 hingga jam  ke-60  terjadi  penurunan  aktivitas  enzim yang disebabkan oleh persediaan nutrisi pada media  berkurang  sehingga  bakteri  tidak  bisa mensekresikan  enzim  lagi.  Menurut  Haq et al. (2010),  penurunan  aktivitas  amilase disebabkan adanya penumpukan sisa metabolisme  bakteri  dan  juga  terjadinya penurunan nutrisi pada media.

## 3.4. Konsentrasi Protein dan Aktivitas Spesifik
Aktivitas spesifik ditentukan oleh dua faktor yaitu aktivitas enzim dan kadar protein enzim  tersebut.  Aktivitas  spesifik  enzim diperoleh  dengan  membandingkan  unit aktivitas  enzim  dengan  kadar  protein  dari tiap-tiap  enzim.  Aktivitas  spesifik  me- nyatakan  jumlah  unit  enzim  per  mg  protein atau besarnya  aktivitas  enzim  per  jumlah protein  yang  terkandung  dalam  campuran enzim  yang  diuji.  Hasil  aktivitas  spesifik protease  dan  amilase  dapat  dilihat  pada Gambar 4.
Gambar 4. Aktivitas spesifik enzim protease (P2 dan P4) dan amilase (A2 dan A4).
Berdasarkan Gambar 4. menunjukkan bahwa  aktivitas  spesifik  protease  tertinggi isolat  P2  dan  P4  terjadi  pada  jam  ke-36. Aktivitas  spesifik  isolat  P2  sebesar  1,632 U/mg  dengan  kadar  protein  0,044  mg/mL dan  isolat  P4  sebesar  1,160  U/mg  dengan kadar protein 0,049 mg/mL.
Aktivitas  spesifik  amilase  tertinggi isolat  A2  dan  A4  terjadi  pada  jam  ke-36. Aktivitas enzim dan kadar protein diproduksi seiring  dengan  pertumbuhan  sel  dan mencapai  aktivitas  tertinggi  menjelang  fase stasioner. Aktivitas spesifik isolat A2 sebesar 7,741  U/mg  dengan  kadar  protein  0,046 mg/mL  dan  isolat  A4  sebesar  5,244  U/mg dengan kadar protein 0,045 mg/mL.

## IV. KESIMPULAN
Aktivitas optimum protease pada jam ke-36  untuk  isolat  P2  sebesar  0,073  U/mL dengan aktivitas spesifik sebesar 1,632 U/mg dan  isolat  P4  yaitu  0,057  U/mL  dengan aktivitas  spesifik  1,160  U/mg.  Sedangkan, aktivitas  optimum  amilase  terjadi  pada  jam ke-36  untuk  isolat  A2  sebesar  0,36  U/mL dengan aktivitas spesifik sebesar 7,741 U/mg dan aktivitas amilase optimum pada isolat A4 sebesar 0,239 U/mL dengan aktivitas spesifik 5,224 U/mg.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  DIPA  Universitas  Sriwijaya  melalui Program Penelitian Sains Teknologi dan Seni Universitas  Sriwijaya  atas  nama  Ketua Peneliti  Yulia  Oktavia,  S.Pi.,  M.Si.  dengan judul  Isolasi  Bakteri  Penghasil  Enzim Protease,  Amilase,  dan  Lipase  dari  Terasi Ikan  Teri Stolephorus sp.  (No  989/UN9.3.1/ PP/2017).

## DAFTAR PUSTAKA
Adrio, J.L. and A.L. Demain. 2014. Microbial enzymes:  Tool  for  biotechnological process. Biomolecules ,  4:117-139. https://doi.org/10.3390/biom4010117. Alnahdi,  H.S.  2012.  Isolation  and screening  of  extracellular  proteases produced  by  new  isolated Bacillus sp.
J.  of  Applied  Pharmaceutical  Science ,
2(09):071-074.  http://dx.doi.org/10.20 546/ijcmas.2016.510.022 .
Arfarita,  N.  dan  E.  Chukeatirote.  2015. Characterization  of  protease-producing bacteria  isolated  from  terasi. J.  of Biological  Researches ,  21(1):18-23. http://dx.doi.org/10.23869/bphjbr.21.1. 20155.
Bergmeyer,  H.U.,  J.  Bergmeyer,  and  M. GraPl.  1983.  Methods  of  Enzymatic Analysis.  2 nd ed.  Weinheim  :  Verlag Chemie.  https://doi.org/10.1002/star. 19850370111.
Bradford,  M.  1976.  Rapid  and  sensitive method  for  the  quantitation  of microgram  quantities  of  protein utilizing  the  principle  dye  binding. Analytical  of  Biochemistry ,  72: 248 − 254.  https://doi.org/10.1016/00 03-2697(76)90527-3.
de  Souza,  P.M.  and  P.O.  Magalhães,  2010.
Application of microbial α -amylase in industry_A review.
Braz J.
Microbiol. ,  41(4):850-861.  http://dx.
doi.org/10.1590/S1517-
83822010000400004.
Gupta,  R.,  P.  Gigras,  H.  Mohapatra,  V.K. Goswami,  and  B.    Chauhan.  2003. Microbial α -amylases:  a  biotechno- logical perspective. Process Biochem . 38:1599-1616. https://doi.org/10. 1016/S0032-9592(03)00053-0. Haq,  H.,  M.A.  Ashaf,  and  J.  Qadeer.  2010. Pearl  millet,  a  source  of α -amylase production  by Bacillus  licheniformis . Bioresour. Technol .,  96:1201-1204. https://doi.org/10.1016/j.biortech.200 4.09.012.
Kim,  W.,  S.  Bae,  K.  Park,  S.  Lee,  W.  Choi,
S.  Han,  dan  Y.  Koh.  2011. Biochemical characterization of digestive enzymes in the black soldier fly, Hermetia  illucens (Diptera: Stratiomyidae). J.  of  Asia  Pacific Entomology ,  14(1):11-14.  http://dx. doi.org/10.20546/ijcmas.2016.510.02
2.
Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal.  Chem .,  31:  426-428.
http://dx.doi.org/10.1021/ac 60147a030.
Pant, G., A. Prakash, J.V.P. Pavani, S. Bera, G.V.N.S.  Deviram,  A.  Kumar,  M. Panchpuri,  and  R.G.  Prasuna.  2015. Production,  optimization  and  partial purification  of  protease from Bacillus subtilis . JTUSCI., 9(1):50-55.  https:// doi.org/10.1016/j.jtusci.2014.04.010.
Reiny,  S.S.  2012.  Potensi Lactobacillus acidophilus ATCC  4796  sebagai biopreservatif  pada  rebusan  daging ikan  tongkol. J.  IJAS. ,  2(2):604–613. https://doi.org/10.24198/ijas.v2i2.273 4.g2370.
Rodarte,  M.P.,  D.R.  Dias,  D.M.  Vilela,  and
R.F.  Schwan.  2011.  Proteolytic activities  of  bacteria,  yeasts  and filamentous fungi isolated from coffee fruit ( Coffea arabica L.). Actasciagron,  33(3):457-464.  http://
dx.doi.org/10.4025/actasciagron.v33i 3.6734. Suganthi, C., A. Margeswari, S. Karthikeyan,
M.  Anbalagan,  A.  Sivakumar,  K.M. Gothandam.   2013.   Screening    and
optimization  of  protease  production from a halotolerant Bacillus
licheniformis isolated  from  saltern sediments. J.  of  Genetic  Engineering and Biotechnology, 11(1)47-52. https://doi.org/10.1016/j.jgeb.2013.02
.002.
Uddin,  Md.E.,  P.  Maitra,  H.  Md.  Faruquee, and Md. F. Alam. 2014. Isolation and characterization  of  proteases  enzyme from  locally  isolated Bacillus sp. American  J.  of  Life  Sciences, 2(6): 338-344.  https://doi.org/10.11648/j. ajls.20140206.12.
Zusfahair, D. R. Ningsih, D. Kartika, and A. Fatoni.  2016.  Amylase  from Bacillus thuringiensis isolated  from  tapioca waste:  isolation,  partial  purification and  characterization. Malaysian  J.  of Fundamental  and  Applied  Sciences , 12(1):22-27.  http://dx.doi.org/10.11
113/mjfas.v12n1.404. Diterima : 07 Desember 2017 Direview : 09 Januari 2018 Disetujui : 29 November 2018