## 16 (2) 2021 1-11

## Jurnal Teknologi Pangan dan Hasil Pertanian
http://journals.usm.ac.id/index.php/jtphp
Penetapan Kadar Aflatoksin B1, B2, G1, dan G2 pada Olahan Kacang Tanah dengan Metode HPLC
Andalusia Trisna Salsabila  , Rike Maya Wardhani, Ary Chodijayanti, Puryani, Damat, Rista Anggriani
Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Pertanian Perternakan, Universitas Muhammadiyah Malang, Indonesia
DOI : http://dx.doi.org/10.26623/ jtphp.v16i1
Info Artikel ___________________ Sejarah Artikel:
Disubmit Direvisi Disetujui ___________________ Keywords: Aflatoxin; peanut; immunoaffinity; HPLC _______________________ Abstrak ____________________________________________________________ Kacang  tanah  ( Arachis  hypogaea L)  memiliki  banyak  manfaat  seperti  mencegah peningkatan kadar kolesterol, pencegahan keriput, kandungan serat tinggi, sumber energi dan pencegahan kanker. Akan tetapi jika dalam proses pemanenan, penyimpanan serta pengolahannya  yang  tidak  sesuai,  maka  kacang  tanah  terkontaminasi  aflatoksin  yang berbahaya bagi kesehatan. Batas kadar cemaran aflatoksin pada kacang tanah dan hasil olahannya  diatur  dalam  Peraturan  Badan  POM  Nomor  18  Tahun  2018.  Penelitian  ini bertujuan  menetapkan  kadar  kontaminasi  aflatoksin  B1,  B2,  G1  dan  G2  pada  olahan kacang  tanah  dengan  prinsip  ekstraksi  menggunakan immunoaffinity  column dengan instrumen High  Performance  Liquid  Cromatogram (HPLC)  detektor  fluoresen.  Hasil menunjukkan bahwa kromatogram baku kerja Aflatoksin G1, G2, B1, dan B2 berturut- turut  menunjukkan  respon  terbentuknya peak pada  waktu  retensi  6,966  menit,  8,395 menit,  12,806  menit  dan  10,395  menit. Hasil  kromatogram  sampel  yang  diuji  tersebut memberikan  respon  terbentuknya peak pada  waktu  retensi  yang  berbeda  dengan  baku aflatoksin.  Sehingga  kedua  sampel  tersebut  dapat  disimpulkan  tidak  terdeteksi mengandung  aflatoksin  B1,  B2,  G1  dan  G2  dengan  nilai  LOD  aflatoksin  G1  sebesar 0,8311 ng/mL, aflatoksin G2 sebesar 0,0941 ng/mL, aflatoksin B1 sebesar 0,3046 ng/mL dan aflatoksin B2 sebesar 0,3143 ng/mL.

## Abstract
____________________________________________________________ Peanuts  (Arachis  hypogaea L)  have  many  benefits  such  as  cholesterol  maintenance, prevention of  wrinkles, high fiber content, energy source and cancer prevention. In the other hand, peanuts can contain allergens for some people, and could be contaminated with  dangerous  aflatoxins.  Aflatoxin  contamination  in  peanuts  and  their  processed products  is  regulated  in  the  Regulation  of  Indonesian  FDA  Number  18  of  2018.  The purpose  of  this  study  is  to  determined  aflatoxin  B1,  B2,  G1  and  G2  contamination  in processed  peanuts  using  an  immunoaffinity  column  extraction  by  High  Performance Liquid Chromatogram (HPLC) instrument with fluorescent detector. The results showed that the standard chromatograms of Aflatoxin G1, G2, B1, and B2 respectively showed a response  to  peak  formation  at  retention  times  of  6,966  minutes,  8,395  minutes,  12,806 minutes and 10,395 minutes. The results of the chromatogram of the tested samples gave a response to the formation of peaks at different retention times with aflatoxin standards. So that the two samples were not detected to contain aflatoxins B1, B2, G1 and G2 with a LOD value of aflatoxin G1 of 0,8311 ng/mL, aflatoxin G2 of 0,0941 ng/mL, aflatoxin B1 of 0,3046 ng/mL and aflatoxin B2. of 0,3143 ng/mL.
 Alamat Korespondensi: Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Pertanian Perternakan, Universitas Muhammadiyah Malang, Indonesia E-mail: andalusia.t.salsabila@gmail.com p-ISSN 1693-9115 e-ISSN 2580-846X

## PENDAHULUAN
Kacang  tanah  ( Arachis  hypogaea L)  adalah  polong-polongan  atau  legum  dari  famili Leguminosae. Setelah kedelai, kacang tanah merupakan bahan baku terpenting kedua di Indonesia. Sebagai tanaman pangan, kacang tanah dipanen menjadi biji kemudian diolah dengan cara direbus, digoreng, atau dipanggang. Kacang tanah kaya akan lemak dan protein. Selain itu, kacang tanah juga mengandung zat besi, vitamin E dan kalsium, vitamin B kompleks, dan fosfor (Raespati et al., 2013). Perkembangan  produk  olahan  kacang-kacangan  dewasa  ini  dan  masa  yang  akan  datang memfokuskan pada pemanfaatan komponen aktif yang terkandung dalam kacang-kacangan sebagai sumber pangan fungsional. Komponen- komponen yang saat ini sudah dikembangkan baru terbatas diperoleh  dari  kedelai  yaitu  protein  dan  isoflavon,  komponen  lain  yang  berpotensi  untuk dikembangkan  adalah  oligosakarida, phytate ,  saponin,  dan trypsin inhibitor . Komponen- komponen aktif  yang  terkandung  dalam  kacang-kacangan  selain  kedelai  belum  banyak  diungkap  (Kanetro, 2018).  Batas  maksimum  cemaran  aflatoksin  pada  kacang  tanah  dan  hasil  olahannya,  telah  diatur dalam Peraturan Badan POM Nomor 18 Tahun 2018, yaitu cemaran aflatoksin B1 maksimum 15 ppb dan total cemaran aflatoksin (G1+G2+B1+B2) adalah sebesar 20 ppb.
Aflatoksin  adalah  mikotoksin  yang  dihasilkan  oleh  kapang Aspergillus  flavus,  Aspergillus parasiticus atau Aspergillus nomius . Ketiga jenis kapang ini dapat tumbuh pada makanan pokok seperti biji-bijian,  kacang-kacangan,  rempah-rempah  dan  kopra.  Bisa  juga  tumbuh  pada  produk  olahan seperti bumbu pecel dan tempe. Ada empat aflatoksin alami yang paling umum dan beracun, yaitu: aflatoksin B1, B2, G1 dan G2 (Winarno, 2008). Aflatoksin B1 merupakan dan karsinogen yang sangat kuat, menyebabkan banyak efek sistemik berbahaya dan efek samping yang mengganggu fungsi organ dan  jaringan,  menghambat  pertumbuhan,  peradangan,  imunosupresi,  dan  kanker  hati  manusia (Wogan et al., 2012). Pengolahan yang tidak tepat dan perubahan iklim dapat menurunkan kualitas bahan  pangan.  Iklim  yang  lembab  dapat  mendorong  pertumbuhan  mikroorganisme  yang  dapat mencemari  bahan  pangan  selama  pra  atau  pasca  panen.  Selain  itu,  proses  penyimpanan  dan pengeringan yang tidak tepat dapat meningkatkan pertumbuhan Aspergillus dalam bumbu, rempah- rempah dan kacang-kacangan (Ozbey & Kabak, 2012).
Pentingnya penetapan kadar aflatoksin didasarkan pada wabah aflatoksin akut di Kenya pada tahun  2004, konsumsi  jagung  yang  terkontaminasi  aflatoksin  tingkat  tinggi,  telah  menelan korban sebanyak  317  kasus,  membunuh  125  kasus.  Pada  tahun  2013  Rumania,  Serbia  dan  Kroasia melaporkan wabah kontaminasi aflatoksin dalam susu di tingkat nasional (Kumar et al., 2017). Kasus serupa dilaporkan terjadi di Indonesia pada tahun 1972, 1974, dan 1977, namun tanpa korban jiwa yang pasti (Broto, 2018). Cemaran aflatoksin di Indonesia  telah diteliti terutama pada bahan baku jagung dan kacang tanah yang sebagian besar berasal dari sentra manufaktur di Jawa dan Sumatera. Kandungan aflatoksin kacang tanah di pasar tradisional dan pedagang kaki lima Kabupaten Pasuruan adalah >10 ppb dari Maret 2005 sampai Juni 2006, sekitar >3.000 ppb (Ra  hmianna  &  Yusnawan, 2015).
Penelitian  Rahmianna  &  Yusnawan  (2015)  menemukan  lebih  dari  10  ppb  kontaminasi aflatoksin pada kacang tanah yang dijual di pasar dan pedagang tradisional, dan lebih dari 3000 ppb menggunakan metode ELISA. Menurut penelitian lain, cemaran aflatoksin kedelai adalah 107,1 ppb dari 100 gram kedelai dalam produksi sari kedelai (Utami et al., 2012).
Pada penelitian  ini  digunakan  alat  HPLC  dengan  menggunakan  detektor  fluoresence untuk mengukur kandungan aflatoksin dengan pretreatment dengan ekstraksi fase padat berupa ekstraksi fase padat.  Ekstraksi  fase  padat  (SPE)  adalah  proses  pemisahan  yang  digunakan  untuk  memisahkan senyawa dari campuran menggunakan sifat fisik dan kimia. SPE merupakan metode ekstraksi yang menggunakan fase padat dan fase cair untuk memisahkan suatu jenis analit dari larutan berdasarkan distribusi  analit  antara  fase  diam  dan  fase  cair.  SPE  biasanya  digunakan  untuk  memekatkan  dan memurnikan  sampel  untuk  analisis.  Selain  itu,  SPE  dapat  digunakan  untuk  memurnikan  sampel
sebelum mengukur jumlah analit dalam sampel SPE menggunakan metode kromatografi atau metode analisis lainnya (Astuti, 2012).
Berdasarkan  latar  belakang  tersebut,  peneliti  ingin  melakukan  penelitian  terkait  dengan kontaminasi aflatoksin pada olahan kacang tanah dengan prinsip yang digunakan berupa ekstraksi pada aflatoksin B1, B2, G1 dan G2 secara spesifik menggunakan immunoaffinity column dan ditetapkan kadarnya  menggunakan  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi  (KCKT)  atau High  Performance  Liquid Chromatogram (HPLC) dengan detektor fluoresence dengan detektor fluoresen.

## METODE Bahan
Sampel  pangan  kacang  olahan  (berapa  jenis  Kode  Sampel  522  dan  Sampel  2),  baku pembanding aflatoksin B1, B2, G1, dan G2 bersertifikat (LRAC9021.01), KCL, KH 2 PO 4 , Na 2 PO 4, NaCl, HCl, NaOH, immunoaffinity column (IAC) AFLAPREP®, aquades.
Alat
Seperangkat alat HPLC yang dilengkapi dengan kolom C18 (4,8 x 250 mm), ukuran partikel 5 µm., detektor fluoresens, Alat derivatisasi Kobra® Cell, seperangkat pump stand atau vacuum manifold , Vortex, pH meter dan ultrasonic bath.
Pembuatan Larutan PBS (AOAC, 2005 yang telah dimodifikasi) Ditimbang 0,2 gram KH 2 PO 4 , Na 2 PO 4 1,15 gram, dan NaCl 8 gram, kemudian dimasukkan ke  dalam  gelas  ukur  tertutup  1  Liter,  ditambahakan  aquades  900  mL,  lalu  dikocok  hingga  larut, dilakukan penyesuaian pH hingga 7,4 dengan bantuan HCL 1M atau NaOH 1M menggunakan pH meter, ditambahkan aquades hingga volume akhir 1 L.

## Pembuatan Larutan Uji (AOAC, 2005 yang telah dimodifikasi) Ekstraksi
Sampel kacang dihancurkan hingga halus dengan blender, kemudian ditimbang dengan dengan seksama lebih kurang 25 gram, lalu dimasukkan ke dalam botol coklat 100 mL bertutup, ditambahkan 75mL (digunakan pipet volumetrik 50 dan 25 mL) campuran metanol aquades (80:20), dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik dan di alat ultrasonic bath selama 10 menit pada suhu 50 ◦ C, setelah itu botol dibiarkan mencapai suhu ruang, larutan sampel disaring dengan kertas saring, filtrat ditampung dalam wadah coklat bertutup, dipipet 3 mL ke dalam wadah coklat bertutup dan ditambahkan larutan PBS, larutan dihomogenkan dengan alat vortex selama 30 detik.

## Clean Up
Larutan hasil ekstraksi dilewatkan ke dalam IAC pada laju alir 2-3 mL/menit, kemudian wadah dibilas dengan 10 mL aquades dan dilewatkan dalam IAC, setelah itu IAC dibilas ulang dengan 10 mL  aquades,  dilewatkan  udara  ke  dalam  IAC  menggunakan syringe sampai  kering,  analit  dielusi dengan 2 x 0,5 mL metanol pada laju alir 2-3 mL/menit, eluat ditampung dalam vial coklat 5 mL.

## Pembuatan Larutan Baku (AOAC, 2005 yang telah dimodifikasi) Pembuatan Larutan Baku Induk
Baku  induk  aflatoksin  B1,  B2,  G1  dan  G2  bersertifikat  masing-masing  dipipet  1,6  mL  dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian diberi larutan metanol hingga tanda batas, berikut merupakan konsentrasi baku induk masing-masing aflatoksin :
Baku Induk Konsentrasi (ppm) B1 1 B2 0,3 G1 1 G2 0,3
Pembuatan Larutan Baku Antara
Larutan baku induk dipipet 0,05 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian diencerkan dengan metanol hingga tanda, berikut adalah konsentrasi baku antara yang didapatkan :
Baku Antara Volume Pemipetan (mL) Konsentrasi (ppb) B1 0,05 50 B2 0,05 15 G1 0,05 50 G2 0,05 15

## Pembuatan Larutan Baku Kerja
Dibuat  seri larutan  baku  kerja  dalam  campuran  metanol:aquades  (80:20)  dengan  kadar  dan pengenceran seperti yang tertera dalam tabel berikut :
Seri Volume Pemipetan Baku Antara (mL) Volume  Akhir (mL) Kadar Aflatoksin B1 (ppb) B2 (ppb) G1 (ppb) G2 (ppb) 1 0,003 1 0,15 0,045 0,15 0,045 2 0,010 1 0,5 0,150 0,5 0,150 3 0,050 1 2,5 0,750 2,5 0,750 4 0,100 1 5 1,50 5 1,50 5 0,200 1 10 3,00 10 3,00 6 0,300 1 15 4,5 15 4,5 7 0,600 1 30 9,0 30 9,0 8 Baku Antara 1 50 15 50 15
Penetapan Aflatoksin (AOAC, 2005 yang telah dimodifikasi)
Larutan  baku  dan  larutan  uji  masing-masing  disuntikkan  secara  terpisah  dan  dilakukan penetapan  menggunakan High  Performance  Liquid  Chromatography yang  sudah  dikondisikan  sebagai berikut :
Fase gerak : Metanol-Aquades (45:55) Kolom : Zorbax, C18 (4,6 x 100 mm), ukuran partikel 5 µm Derivatisasi : PHRED ( Photochemical Reactor ) Detektor : Fluoresensi, eksitasi 360 nm, emisi 40 nm Laju air : 1 mL/menit Volume Penyuntikan : 100 µg
Interpretasi Aflatoksin B1, B2, G1 dan G2 dalam sampel dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :
Kadar aflatoksin B1/B2/G1/G2 (µg/kg) = 𝐶𝑠𝑝 ×𝐹 𝑤
Keterangan :
Csp : Kadar aflatoksin B1, B2, G1, G2 yang diperoleh dari perhitungan menggunakan persamaan garis y = bx + a (µg/mL)
F : Faktor pengenceran
W : Bobot sampel (gram )

## HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Kesesuaian Sistem
Uji kesesuaian sistem digunakan untuk menentukan apakah sistem kromatografi cocok untuk digunakan  dalam  analisis (Yusransyah  et  al.,  2014).  Uji  kesesuaian  sistem  dilakukan  dengan menyuntikkan baku kerja dengan konsentrasi yang sama sebanyak 6 kali berturut-turut. Syarat uji
kesesuaian sistem menurut Ibrahim (2017) adalah %RSD area < 2%, Tailing factor syarat < 2, Resolusi > 1,5, dan Theoretical Plates minimal memiliki nilai 2000. Tabel 2. Hasil Uji Kesesuaian Sistem Sampel Senyawa %RSD Area Tailing Factor Resolusi Theoretical Plates Aflatoksin G1 1,601 1,089 3,008 7925,056 Aflatoksin G2 1,282 1,110 0,000 6754,840 Aflatoksin B1 1,572 1,068 5,268 10798,970 Aflatoksin B2 1,912 1,07029 4,989 9551,507
Tabel 2 menunjukkan bahwa semua baku kerja yang diidentifikasi memiliki nilai %RSD area <
2%, nilai tailing factor < 2, nilai resolusi > 1,5% serta nilai Theoretical Plates lebih dari 2000. Sehingga dapat disimpulkan bahwa instrumen kromatografi memiliki kondisi yang baik untuk diterapkan dalam analisis. Namun pada aflatoksin G2, memiliki nilai resolusi 0,000. Hal ini dikarenakan baku aflatoksin G2 merupakan analit pertama yang dideteksi oleh instrumen HPLC. Sedangkan pada baku kerja yang lain memiliki nilai > 1,5. Resolusi merupakan nilai yang menyatakan pemisahan peak pada kolom. Jika nilai Resolusi adalah R> 1,5 merupakan harga resolusi ideal, dimana dua puncak terpisah secara sempurna. Bila pada suatu analisis diperoleh R<1,5 maka untuk meningkatkan harga R oleh fase diam dapat dilakukan dengan menggunakan kolom yang lebih panjang sehingga menambah jumlah plat teoritis (Susanti & Dachriyanus, 2015).
Terjadinya  pengekoran  pada  kromatogram  sehingga  membentuk  kromatogram  yang  tidak simetris  disebut  faktor  simetri.  Jika  harga  TF  ( Tailing  Factor )  adalah  sama  dengan  1,  maka kromatogram tersebut simetris. Semakin besar harga TF, maka semakin tidak efisien kolom yang akan dipakai.yang diperlukan utuk mencapai terjadinya satu kali keseimbangan distribusi dinamis molekul analit  dalam  fase  gerak  dan  fase  diam  disebut Theoretical  Plate (Susanti  &  Dachriyanus,  2015). Kromatogram uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada gambar 1.
a) d) b)
e)
c)
Gambar 1. (a) Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 1, (b) Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 2,
(c) Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 3, (d) Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 4, (e)
Kromatogram Uji Kesesuaian Sistem 5

## Uji Linearitas
Uji linearitas dilakukan dengan menyuntikkan larutan baku kerja dengan berbagai konsentrasi. Kurva  linear  dikalibrasi  dan  diperoleh  dengan  mendapatkan  area  puncak  ( peak )  terhadap  masing- masing aflatoksin.
Tabel 3. Uji Linearitas Aflatoksin G1, G2, B1 dan B2 Aflatoksin Persamaan Linear r G1 0,0000976449 X + 0,368233 0,9998 G2 0,0000264032 X + 0,0995231 0,9998 B1 0,0000353127 X + 0,303155 0,9998 B2 0,00000133896  X + 0,0708938 0,9997
Tabel 3  menunjukkan  bahwa  semua aflatoksin  yang  dievaluasi  menunjukkan linearitas  yang baik  dengan  koefisien  korelasi  (r)  >  0,99.  Regresi  linear  yang  didapat  digunakan  untuk  mengukur konsentrasi aflatoksin dalam sampel pangan. Ketetapan aflatoksin dihitung dengan mensubstitusikan nilai  X  pada  persamaan  linear  dengan  nilai area dari  sampel  yang  terdeteksi  oleh  KCKT.  Grafik persamaan linear dapat dilihat pada gambar 2.
a. b. c.
d.
Gambar 2. (a) Grafik Linearitas Aflatoksin G1, (b) Grafik Linearitas Aflatoksin G2, (c) Grafik Linearitas Aflatoksin B1, dan  (d)Grafik Linearitas Aflatoksin B2
Pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda dilakukan untuk mengukur linearitas. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan ( slope ), intersep, dan koefisien korelasinya (Gandjar & Rohman, 2014). Penetapan kadar aflatoksin memiliki nilai koefisien korelasi sebesar 0,99.

## Uji LOD dan LOQ
Batas deteksi ( Limits of Detection ) adalah jumlah terkecil analit yang dapat dideteksi yang masih memberikan  respon  signifikan  dibandingkan  dengan  blanko.  Batas  kuantitasi  ( Limits  of  Quotation ) merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang  masih  dapat  memenuhi  kriteria  cermat  dan  seksama.  Batas  deteksi  biasa  dinyatakan  dalam konsentrasi analit (misal % ppb) dari sampel. Metode non instrumen, batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Sedangkan metode instrumen, batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon  blangko  (Susanti  &  Dachriyanus,  2015).  Penelitian  ini  menggunakan  metode  instrumen (metode Muller ), yaitu menggunakan respon dari blanko terkecil. Hasil perhitungan LOD dan LOQ pada penelitian ini dapat dilihat pada tabel di bawah ini :
Tabel 4. Nilai LOD dan LOQ Aflatoksin G1, G2, B1 dan B2 Senyawa LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL) Aflatoksin G1 0,8311 2,7704 Aflatoksin G2 0,0941 0,3138 Aflatoksin B1 0,3046 1,0153 Aflatoksin B2 0,3143 1,0478
Tabel 4 menunjukkan bahwa aflatoksin G1 memiliki nilai LOD dan LOQ berturut-turut sebesar 0,8311 ng/mL dan 2,7704  ng/mL. Aflatoksin G2 memiliki nilai LOD dan LOQ berturut-turut adalah sebesar 0,0941 ng/mL dan 0,3138 ng/mL. Aflatoksin B1 memiliki nilai LOD dan LOQ berturut- turut adalah  sebesar  0,3046  ng/mL  dan  1,0153  ng/mL.  Aflatoksin  B2  memiliki  nilai  LOQ  dan  LOD berturut-turut sebesar 0,3143 dan 1,0478.

## Penetapan Kadar Aflatoksin
Penetapan kadar aflatoksin pada penelitian ini menggunakan instrumen HPLC. Sampel yang terdeteksi  adanya  aflatoksin,  akan  memberikan  respon  terbentuknya peak pada  kromatogram. Peak tersebut  kemudian  dibandingkan  dengan peak pada  kromatogram  baku,  dengan  memperhatikan munculnya peak pada  waktu  retensi  yang  sama  antara  kromatogram  baku  dengan  kromatogram sampel.
Gambar 3. Kromatogram Baku Aflatoksin G1, G2, B1 dan B2
Gambar 3 menunjukkan kromatogram dari masing-masing baku aflatoksin. Aflatoksin G1, G2, B1,  dan  B2 berturut-turut  menunjukkan  respon  terbentuknya peak pada  waktu retensi  6,966 menit, 8,395  menit,  12,806  menit  dan  10,395  menit.  Waktu  retensi  masing-masing  baku  aflatoksin  yang tercatat dibandingkan dengan waktu retensi yang respon terbentuknya peak pada kromatogram sampel. Jika sampel memiliki respon terbentuknya peak pada waktu retensi yang sama dengan baku aflatoksin G1, G2, B1 atau B2, maka sampel tersebut terindikasi tercemar aflatoksin.
Sampel diuji secara duplo dengan menimbang masing-masing sampel sebanyak dua kali secara seksama, kemudian dilakukan ekstraksi dan clean up. Masing-masing sampel dideteksi adanya cemaran aflatoksin  G1,  G2,  B1  dan  B2  menggunakan  instrumen  HPLC  dengan  detektor  fluoresence.  Hasil kromatogram dari masing-masing sampel dapat dilihat pada gambar 4.
a b c d
Gambar (4). (a) Kromatogram Sampel 552a ; (b) Kromatogram Sampel 552b ; (c) Kromatogram Sampel 594a ; (d) Kromatogram Sampel 594b
Sampel  552a  menunjukan  adanya  respon  terbentuknya peak  pada waktu  retensi  3,5517  dan sampel 552b menunjukan adanya respon terbentuknya peak pada waktu retensi 3,5537. Kromatogram sampel  594a  menunjukan  adanya  respon  terbentuknya peak  pada waktu  retensi  15,280  menit  dan 18,826  menit.  Sedangkan  sampel  594b    menunjukan  adanya  respon  terbentuknya peak  pada waktu retensi 15,273 menit dan 18, 819 menit. Kedua sampel tersebut memberikan respon terbentuknya peak pada  waktu  retensi  yang  berbeda  dengan  baku  aflatoksin.  Sehingga  kedua  sampel  tersebut  tidak terdeteksi mengandung aflatoksin G1, G2, B1 dan B2. Terbentuknya peak tersebut mengindikasikan adanya  matriks  lain  yang  dapat  terpisah  oleh  pelarut  polar  seperti  acetonitrile,  namun  bukan merupakan senyawa aflatoksin G1, G2, B1 dan B2. Perbandingan waktu retensi antara baku aflatoksin G1, G2, B1 dan B2 dengan sampel dapat dilihat pada tabel 5.
Tabel 5. Waktu Retensi Baku Aflatoksin G1, G2,B1, dan
B2 Serta Sampel 594a, 594b, 552a, dan 552b Analit Waktu Retensi (menit) Baku Aflatoksin G1 6,966
Baku Aflatoksin G2 8,395 Baku Aflatoksin B1 10,395 Baku Aflatoksin B2 12,806 594a 15,280 594b 18,826 552a 3,5517 552b 3,5537
Selang  waktu  yang  diperlukan  oleh  analit  mulai  saat  injeksi  sampai  keluar  dari  kolom  dan sinyalnya secara maksimal ditangkap oleh detektor disebut sebagai waktu retensi ( retention time ) atau waktu tambat. Waktu retensi analit yang tertahan pada fase diam dinyatakan dengan Rt (Yusransyah et al., 2014). Faktor-faktor yang mempengaruhi pada retensi adalah sifat alamiah analit, sifat alamiah fase diam (Polar dan Non Polar), komposisi, viskositas dan polaritas fase gerak, daya atau ikatan antar molekul, suhu kolom, serta laju alir fase gerak (Ibrahim, 2017).
Setelah  kromatogram  dari  sampel  didapatkan, maka  dibaca  waktu  retensi  dan  luas  areanya. Luas area yang didapat, disubstitusikan pada persamaan linear dan hitung untuk mendapatkan kadar masing-masing  aflatoksinnya.  Hasil  perhitungan  kadar  aflatoksin  setiap  sampel  dapat  dilihat  pada tabel dibawah ini :
Tabel 6. Kadar Aflatoksin Sampel 552 dan 594 Kadar Aflatoksin (ppb) Total Aflatoksin (ppb) Rata-rata Kadar Aflatoksin (ppb) Sampel G1 G2 B1 B2 Ket. 552 a 0 0 0 0 0 0 MS b 0 0 0 0 0 594 a 0 0 0 0
0
0 MS
b 0 0 0 0 0
*Keterangan : MS (Memenuhi Syarat) ; TMS (Tidak Memenuhi Syarat)
Berdasarkan Peraturan BPOM Nomor 18 Tahun 2018, kadar aflatoksin B1 pada sediaan pangan kacang  dan  bumbu  adalah  tidak  lebih  dari  15  ppb.  Sedangkan  kadar  aflatoksin  total  pada  sediaan pangan kacang dan bumbu adalah tidak lebih dari 20 ppb. Sehingga dapat disimpulkan bahwa cemaran aflatoksin B1, B2, G1 dan G2 pada sampel 552 dan 594 memenuhi syarat (MS).
Pada  penelitian  ini  sampel  diberikan  perlakuan  pendahuluan  berupa Solid  Phase  Extraction (SPE). Hal ini bertujuan untuk memperoleh zat yang ditargetkan lebih maksimal. Solid Phase Extraction atau SPE adalah proses pemisahan yang digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dari suatu campuran,  memanfaatkan  sifat  fisika  dan  kimianya.  SPE  merupakan  metode  ekstraksi  yang menggunakan  fase  padat  dan  fase  cair  untuk  mengisolasi  suatu  tipe  analit  dari  suatu  larutan berdasarkan partisi analit diantara fase diam dan fase cair. SPE digunakan untuk mengkonsentrasikan dan  memurnikan  sampel  untuk  analisis.  Selain  itu  SPE  dapat  digunakan  untuk clean-up sampel sebelum menggunakan metode kromatografi atau metode analisis lainnya untuk mengukur jumlah analit dalam sampel SPE (Astuti, 2012). Penelitian ini menggunakan SPE jenis immunoaffinity column atau kolom  imunoafinitas.  Pemilihan  jenis  SPE  ini  dilakukan  karena  ekstraksi  ini  bersifat  spesifik mengekstraksi berdasarkan interaksi antigen dengan antibodi. Menurut Ganjdar dan Rohma (2010), terdapat  empat  tahap  dalam  melakukan  prosedur  SPE,  yaitu  :  pengkondisian,  pemasukan  sampel
pencucian,  dan  elusi.  Pada  tahap  elusi  diberikan  perlakuan  berupa backflushing. Perlakuan  ini merupakan perlakuan fisik yang berfungsi untuk memaksimalkan hasil ekstrak yang didapat.
Penelitian  ini  menggunakan  instrumen  KCKT  dengan  detektor  fluoresensi.  Detektor fluoresensi dipilih karena analitnya larut dalam komponen fase gerak adalah analit yang memiliki fluoresensi.  Secara  garis  besar  tahapan  analisis  dengan  KCKT  adalah  penyiapan  larutan  uji, penyiapan larutan baku pembanding, penyuntikan, perbandingan kromatogram, serta perhitungan. Penelitian ini menggunakan fase gerak berupa air-metanol-serta asetonitril. Pemilihan  fase gerak ini didasarkan pada senyawa netral dan tidak larut dalam salah satu komponen fase gerak (air , metanol atau asetonitril) (Ibrahim, 2017). Aflatoksin B1 dan B2 memiliki warna fluoresensi berupa warna biru, sedangkan aflatoksin G1 dan G2 memiliki warna hijau (Winarno, 2008).
Beberapa  hal  yang  dapat  memengaruhi  tumbuhnya Aspergillus  flavus pada  kacang  adalah penanganan pasca panen seperti: proses pengeringan, perontokan dan penyimpanan. Kacang tanah sangat  sensitif  terhadap  serangan  jamur,  hama,  dan  rayap.  Sehingga  dalam  penyimpanannya diperlukan  suhu,  kelembaban  dan  kelembaban,  serta  sirkulasi  udara  yang  baik  untuk  mencegah tumbuhnya Aspergillus flavus yang dapat memproduksi mikotoksin berupa aflatoksin (Winarno, 2008). Kondisi penyimpanan yang sesuai untuk penyimpanan kacang tanah menurut Torres et al., (2014), yaitu memiliki kadar air , 7% dengan kondisi suhu 25-27 o C dan RH 56-70%. Selain itu kacang tanah juga  perlu  dikemas  dalam  karung  goni  dan  dirangkap  dengan  kantung  plastik  PE.  Penyimpanan diletakkan dengan cara disusun pada rak yang tidak menempel dengan dinding ruang penyimpanan.

## SIMPULAN
Penetapan aflatoksin B1, B2, G1 dan G2 pada olahan kacang tanah dilakukan dengan prinsip ekstraksi menggunakan immunoaffinity column dengan instrumen High Performance Liquid Cromatogram (HPLC) detektor fluoresen yang telah diuji kesesuaiannya dengan uji kesesuaian sistem, uji linearitas serta  LOD  dan  LOQ.  Penetapan  kadar  aflatoksin  pada  produk  bumbu  instan  dan  kacang  sesuai dengan peraturan Badan POM nomor 8 tahun 2018 menunjukkan bahwa sampel kacang olahan yang diuji,  tidak  mengandung  aflatoksin  G1,  G2,  B1  dan  B2,  sehingga  sampel  sediaan  kacang  tersebut memenuhi syarat (MS).

## DAFTAR PUSTAKA
Astuti, N. M. W. 2012. Solid Phase Extraction. Universitas Udayana. AOAC.  2005.  Official  Method  991.31.  Aflatoxins  In  Corn,  Raw  Peanuts  and  Peanut  Butter Immunoaffinity Column (Aflatest).
BPOM. 2018. Badan Pengawas Obat dan Makanan. Peraturan nomor 8 tahun 2018. Batas Cemaran Aflatoksin  pada  Sediaan  Bumbu  dan  Kacang.  Pusat  Pengujian  Obat  Dan  Makanan  Badan Pengawasan Obat Dan Makanan Republik Indonesia.
Broto, W. 2018. Status Cemaran Dan Upaya Pengendalian Aflatoksin Pada Komoditas Serealia Dan Aneka  Kacang.  Jurnal  Penelitian  Dan  Pengembangan  Pertanian,  37(2),  81. https://doi.org/10.21082/jp3.v37n2.2018.p81-90
Gandjar, G. I., & Rohman, A. 2014. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Belajar.
Ibrahim, S. 2017. Ekstraksi Fase Padat (Solid Phase Extraction). Pelatihan NFRL Mikotoksin. Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional. BPOM-RI.
Kanetro, B. 2018. Teknologi Pengolahan dan Pangan Fungsional Kacang-kacangan. In Journal of Chemical Information and Modeling, 53(9).
Kumar, P., Dipendra, K., Madhu, K., Tapan, K., & Sang, G. K. (2017). Aflatoxins: A Global Concern for Food Safety, Human Health and Their Management. Review: Frontiers in Microbiology, 17. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.02170
Ozbey, F., & Kabak. 2012. Natural Occurence of Aflatoxins and Ochratoxin A in Spices. Journal of Food Control, 28(2), 354 – 361.
Raespati, E., Hasanah, L., Wahyuningsih, S., Sehusman, Manurung, M., Supriyati, Y., & Rinawati. 2013. Buletin Konsumsi Pangan. Pusat Data Dan Sistem Informasi Pertanian, 4(1).
Rahmianna, A., & Yusnawan, E. 2015. Monitoring of aflatoxin contamination at market food chain in East Java. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences, 3(4), 346 – 352.
Susanti,  M.,  &  Dachriyanus.  2015.  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi.  Lembaga  Pengembangan Teknologi Infromasi dan Komunikasi (LPTIK).
Torres, A. M., G.G, B., S.A, P., S.N, C., & P, B. 2014. Review on pre- and post-harvest management of peanuts to minimize aflatoxin contamination. Food Research International, 62, 11 – 19.
Utami, T., Nugroho, F. H. A., Usmiati, S., Marwati, S., & Rahayu, E. S. 2012. Penurunan Kadar Aflatoksin B1 pada Sari Kedelai oleh Sel Hidup dan Sel Mati Lactobacillus acidophilus SNP- 2. Jurnal Teknologi Dan Industri Pangan, XXIII(1), 58 – 63.
Winarno, F. 2008. Keamanan Pangan. PT. Gramedia Pustaka Utama.
Wogan, G. ., Kensler, T. W., & Groopman, J. 2012. Present and future directions of translational research on aflatoxin and hepatocellular carcinoma : a review. Food Addit. Contam Part A Chem., 249 – 257. Yenny. 2006. Aflatoksin dan Aflatoksis pada Manusia. Universa Medica, 25(1), 41 – 52. Yusransyah, Maghfiroh, R., & Rochma, A. 2014. Uji Kesesuaian Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Terbalik Bahan Baku Parasetamol. Far Magazine, 1(2).