BIOTROPIKA Journal of Tropical Biology
https://biotropika.ub.ac.id/
Vol. 9   |   No. 1   |   2021  |   DOI: 10.21776/ub.biotropika.2021.009.01.09

## PENENTUAN JENIS DAN STATUS KONSERVASI PARI LAYANG-LAYANG YANG DIDARATKAN DI TPI GUNUNG LINGKAS KOTA TARAKAN DENGAN PENDEKATAN MOLEKULER

## SPECIES IDENTIFICATION AND CONSERVATION STATUS EVALUATION OF BUTTERFLY RAY LANDED AT THE TPI GUNUNG LINGKAS, TARAKAN CITY WITH MOLECULAR METHODE
Syamsidar Gaffar 1) , Sumarlin 1)* , M. Gandri Haryono 1) , Harisna Pidar 1)

## ABSTRAK
Pari  yang  diperdagangkan  di  Tempat  Penampungan  Ikan  (TPI)  Tarakan  perlu diketahui jenisnya. Hal ini merupakan langkah awal agar jenis pari yang tergolong dilindungi  atau  populasinya  telah  berkurang  di  alam  dapat  dihindari  untuk diperdagangkan.  Penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  untuk  mengungkap spesies  pari  layang-layang  yang  diperdagangkan  dari  TPI  Gunung  Lingkas, Tarakan,  Kalimantan  Utara,  dengan  menggunakan  metode  pengidentifikasian secara  molekuler  (DNA  barcoding)  dan  menentukan  status  konservasinya. Berdasarkan  hasil  BLAST,  sampel  teridentifikasi  memiliki  kemiripan  99,80% dengan  spesies  Aetoplatea  zonura  isolate  GZON2.  Hasil  BOLD-IDS  juga memberikan persentase kemiripan sebesar 99,8% dengan spesies Gymnura zonura (sinonim A. zonura). Nilai kemiripan >98% menjelaskan bahwa homologi sekuen berada  pada  tingkat  spesies  sehingga  sampel  yang  diidentifikasi  merupakan  G. zonura. Hasil analisis filogenetik dengan menggunakan tiga metode analisis yaitu NJ,  ML,  dan  ME  menempatkan  sampel  ray-T2,  G.  zonura,  dan  G.  cf  zonura konsisten berada pada kelompok yang sama (monofiletik). Artinya, sampel ray-T2 berkerabat  dekat  dengan  G.  zonura.  Status  konservasi  G.  zonura  terkategori vulnerable (vu) di laman IUCN yang berarti spesies ini sedang menghadapi risiko kepunahan  di  alam  sedangkan  status  pada  CITES  masih  dalam  posisi  belum terevaluasi.
Kata kunci : DNA barcoding, pari, Gymnura zonura, Tarakan, Kalimantan Utara

## ABSTRACT
It is crucial that the species traded at the Tarakan TPI be revealed to avoid fetching any species whose population is listed as endangered or on the CITES Appendices. This research aimed to uncover the species of butterfly ray traded from TPI Gunung Lingkas,  Tarakan,  North  Kalimantan,  deploying  the  molecular  method  (DNA barcoding)  and  its  current  conservation  status.  Based  on  the  BLAST  result,  the sample  identified  was  99.80%  corresponding  to  the  Aetoplatea  zonura  isolate GZON2. The BOLD-IDS result also affirmed a similarity percentage of 99.8% with the  species  Gymnura  zonura  (synonym  A.  zonura).  The  similarity  value  >98% explains that the sequences' homology is at the species level; hence we conclude the sample identified are G. zonura. The phylogenetic analysis results with three analytical methods, namely NJ, ML, and ME, place a sample of ray-T2, G. zonura, and  G.  cf  zonura  consistently in the  same  group  (monophyletic)  that  verified the sample is closely related to G. zonura. The conservation status of G. zonura is fit into  the  vulnerable  (vu)  category  on  the  IUCN  website,  which  means  that  this species is at a chance of extinction in nature. Meanwhile, the status of G. zonura at CITES is remaining not evaluated.
Keywords: DNA barcoding, ray, Gymnura zonura, Tarakan, North Kalimantan

## PENDAHULUAN
Pari  (Kelas  Elasmobranchii)  terdistribusi secara luas di berbagai perairan, namun tingkat keanekaragaman yang paling tinggi terdapat di
perairan tropis dan Indo-Pasifik [1]. Pari biasa ditangkap  untuk  keperluan  komersil,  artisanal, maupun  aktivitas  wisata  perikanan  namun jumlah  tangkapan  yang  paling  tinggi  sebagai hasil  sampingan  adalah  berasal  dari  perikanan
Diterima   : 18 November 2020
Disetujui   : 19 Maret 2021

## Afiliasi Penulis:
1) Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu Kelautan. Universitas Borneo Tarakan, Kalimantan Utara,
Indonesia

## Correspondence email:
*sumarlin@borneo.ac.id
Cara Sitasi:
Gaffar S, Sumarlin, M.G.
Haryono, H. Pidar. 2021. Penentuan jenis dan status konservasi  Pari  Layang-Layang yang didaratkan di TPI   Gunung Lingkas  Kota  Tarakan  dengan pendekatan molekuler . Journal of Tropical Biology 9 (1): 80-87.
komersil.  Pari  sangat rentan  terhadap  kegiatan penangkapan  berlebih  dan  degradasi  habitat karena termasuk organisme dengan karakteristik  fekunditas  yang  rendah,  usia produksi yang lama, dan lifespan yang panjang [2].  Akibat  penangkapan  yang  berlebih  dan dijadikan  sebagai  target  sampingan,  populasi predator  puncak  ini  di  alam  telah  berkurang dengan signifikan [3].
Perhatian  terhadap  dampak  penangkapan populasi Elasmobranchii (pari) semakin meningkat sehingga banyak penelitian dilakukan untuk mengembalikan dan melindungi  kelompok  pari,  salah  satunya adalah  melalui  perencanaan  pengelolaan  yang berkelanjutan  [2].  Pengidentifikasian  spesies yang akurat merupakan hal yang sangat penting dalam  rangka  mendesain  rencana-rencana pengelolaan  dan  konservasi  perikanan  [4]. Namun,  dari  identifikasi  di  lapangan  pada beberapa pari yang memiliki kekerabatan dekat, seperti pada kelompok Batoidea seringkali sulit untuk  diidentifikasi  sehingga  menyebabkan kesalahan dalam pelaporan mengenai komposisi dan keanekaragaman spesies [5].
DNA barcoding adalah  suatu  metode molekuler identifikasi spesies secara cepat dan akurat  [6]  pada  semua  fase  hidup,  dengan menggunakan  urutan  nukleotida,  contohnya Cytochrome  Oxidase I  (COI)  mitokondria.  [7] menunjukkan bahwa gen COI dapat membedakan  spesies  hewan  yang  memiliki kekerabatan  yang  dekat.  Pendekatan  ini  telah berhasil  dalam  membedakan  spesies  ikan  air tawar  dan  laut  [8].  [9]  telah  membarcode  210 spesies hiu dan pari dari perairan Australia. Hal ini  menunjukkan  kehandalan  pendekatan  ini dalam membantu mengatasi masalah taksonomi dan  penemuan  spesies  baru.  Penelitian- penelitian  taksonomi  terkini  yang  dipadukan dengan  penanda  molekuler  pada  spesies Chondrichtyes  di  berbagai perairan  (Australia, Indonesia,  Taiwan,  dan  Argentina)  juga  telah menyelesaikan  masalah  yang  pelik  terkait dengan  spesies  kompleks,  sekaligus  dapat menemukan beberapa spesies baru [10].
Pari  dari  perairan  Kalimantan  Utara  yang didaratkan di Tempat Penampungan Ikan (TPI) Kota  Tarakan  masih  dapat  ditemukan  dan diperjualbelikan tanpa melalui
pengidentifikasian  yang  akurat  mengenai kategori  spesiesnya.  Selama  ini,  proses pengidentifikasian pari umumnya masih dilakukan berdasarkan karakteristik morfologinya.  Jika  hanya  mengandalkan karakter  morfologi,  maka  akan  membuka peluang  ketidakakuratan  pengidentifikasian,
terlebih  jika  ditemukan  spesies  pari  yang memiliki  kekerabatan  yang  dekat  dengan morfologi  yang  mirip,  seperti  pada  spesies stingray dan skate [11] dan diidentifikasi bukan oleh ahli taksonomi pari. Jika perdagangan pari masih  berlangsung  tanpa  mempertimbangkan keberadaan populasinya di alam, salah satunya akibat ketidaktepatan dalam pengidentifikasian, maka  lambat  laun  dapat  mengurangi  populasi pari di alam. Padahal, sudah ada 77 spesies pari yang masuk dalam database IUCN (2013), yang terdiri atas enam spesies yang telah dikategorikan  terancam  keberadaanya,  satu spesies  dalam  kondisi  kritis,  11  spesies  dalam kondisi  rentan,  dan  delapan  spesies  dalam kondisi  beresiko  rendah.  Oleh  karena  itu, penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui spesies pari layang-layang yang didaratkan dari salah  satu  TPI  Tarakan  yaitu  melalui  metode molekuler.  Melalui  penelitian  ini  diharapkan dapat digunakan dalam rangka mengontrol dan menghindari  misidentifikasi  spesies  pari  ke depannya.

## METODE PENELITIAN
Sampel  pari  diperoleh  dari  TPI  Gunung Lingkas  Kota  Tarakan,  Kalimantan  Utara (Gambar  1)  pada  bulan  September  2020. Sampel yang digunakan berupa potongan kecil sirip pari layang-layang (Gambar 2). Isolasi dan amplifikasi  sekuen  mtDNA  COI  dilakukan  di Laboratorium  Genetika  PT.  Genetika  Science Indonesia  dan  proses  sekuensing  dilakukan pada  perusahaan  jasa  genetika  1 st Base Singapore.
Ekstraksi dan amplifikasi DNA. Ekstraksi mtDNA  sampel  menggunakan  metode ZR Tissue & Insect DNA Miniprep Kit [12]. Ekstrak DNA  berasal  dari  potongan  kecil  tubuh  pari. Jaringan  otot  dihancurkan  kemudian  dilisis menggunakan lysis solution 750 µL. Pemisahan dan  pemurnian  DNA  dari  bahan  organik  lain selanjutnya  mengikuti  petunjuk Quick-DNA Tissue/Insect  Miniprep  Kit [12].  Amplifikasi gen  COI  dari  genom  mitokondria  kemudian diamplifikasi  menggunakan  empat  primer cocktail berdasarkan Canadian Center for DNA Barcoding (CCDB), 2006 (Tabel 1).
Gambar 1 . Lokasi penelitian
Gambar 2 . Ikan Pari Layang-layang
Tabel 1. Primer rekomendasi Canadian Center for DNA Barcoding (CCDB), 2006
DNA  diamplifikasi  menggunakan  metode PCR dengan pereaksi 2x MyTaq HS Red Mix (Bioline). Total volume yang digunakan untuk amplifikasi yaitu 25 μl, yang terdiri atas 9,5 μl ddH 2 O, 12,5 μl 2x MyTaq Red Mix, 1 μl DNA sampel dan 0,5 μl volume dari masing-masing
primer  10  μM.  Sekuen  mtDNA  target diamplifikasi  menggunakan thermal  cycle (Agilent  Surecycler  8800)  dengan  kondisi reaksi  sebagai  berikut  1  siklus  predenaturasi pada suhu 95 ºC selama 1 menit, 35 siklus untuk (masing-masing)  denaturasi  pada  suhu  95  ºC selama  15  detik, annealing pada  suhu  52  ºC selama  15  detik  elongasi  pada  suhu  72  ºC selama  45  detik,  dan  1  siklus  perpanjangan akhir pada suhu 72 ºC selama 2 menit kemudian didiamkan  pada  suhu  4  ºC  selama  5  menit. Metode  elektroforesis  gel  agarosa  1%  b/v digunakan  untuk  menentukan  keberhasilan reaksi  PCR  dengan  mengambil  3  µL  sampel hasil PCR dan 3 µL DNA ladder (marker) 100 pb dimasukkan ke dalam sumur yang terbentuk dari  sisir  dan  dijalankan  dalam  buffer  TBE (Tris-Boric Acid-EDTA) 1x pada tegangan 120 V  selama  20  menit  yang  dilanjutkan  dengan visualisasi  pada  alat  UV  Transiluminator  (Gel Doc) [13].
Penentuan  urutan  dan  analisis  data sekuen  mtDNA  COI  sampel. Produk  PCR disekuensing  dengan  metode  Sanger  ( bi- directional  sequencing )  dengan  menggunakan jasa  perusahaan  genetika  1 st Base  Singapore. Data  hasil  sekuensing  gen  mtDNA  COI  pari yang  diperoleh  kemudian  dianalisis  dengan menggunakan aplikasi Sequence scanner v.2.0. Sekuen yang berkualitas buruk kemudian diedit dan  di-trim  dengan  menggunakan  aplikasi MEGA  versi  X [14, 15]. Hasil  sekuen dengan primer  reverse dilakukan  proses reverse and complement untuk  dipadukan  dengan  hasil sekuen primer forward . Spesies pari ditentukan berdasarkan  informasi  sekuen  basa  nukleotida melaui dua database publik yaitu Bank Gen dan BOLD (Barcode of Life Database). Pada Bank Gen  dilakukan  analisis  BLAST  (Basic  Local Alignment Search Tool) yaitu membandingkan sekuen mtDNA  CO1  sampel  dengan database sekuens  DNA  yang  terdapat  pada  Bank  Gen dengan mengakses
www.blast.ncbi.nlm.nih.gov.  Indikator  hasil BLAST  yang  digunakan  dalam  menentukan sekuen paling mirip, yaitu: Query Coverage dan Ident  mendekati  100%,  e-value  mendekati  0, serta  Max  Score  dan  Total  Score  sama  pada setiap  database  [16].  Persentase  tertinggi  hasil analisis  BLAST  kemudian  dibandingkan dengan  skor  persentasi  kemiripan  pada  hasil pencarian  BOLD-IDS  (BOLD  Identification System) [17].
Kontruksi  pohon  filogenetik  dibuat  dengan mengambil  data  sekuen  yang  memiliki kemiripan  paling  tinggi  dari  dua database tersebut  kemudian  disejajarkan  ( alignment )
dengan  sekuen  sampel.  Penjajaran  sekuen dilakukan  dengan  menggunakan  program CLUSTAL-W  yang  terintegrasi  di  dalam aplikasi  MEGA-X. Taeniura  lynma (genbank accession ID: NC 026210.1) digunakan sebagai outgroup .  Konsistensi  hasil  pohon  filogenetik diukur  dengan  tiga  metode  analisis  yaitu Neighbor-Joining (NJ)  [14,  18,  19,  20], Maximum  Likelihood (ML)  [14,  20],  dan Minimum  Evolution (ME)  [14,  18-22]  dengan boostrap  test masing-masing  1000  kali pengulangan dan jarak evolusi dihitung dengan metode  Kimura-2-parameter  (K2P).  Jarak diversitas genetik juga dihitung dengan metode K2P  yang  telah  terintegrasi  dalam  aplikasi MEGA versi X [23]. Status konservasi pari ray- T2 ditentukan secara online dengan mengakses website  IUCN  (International  Union  for Conservation of Nature and Natural Resources) pada situs http://www.iucnredlist.org/. Demikian  juga trade  status ditentukan  secara online  dengan  mengakses website CITES (Convention on International Trade in Endangered Species) pada situs http://www.cites.org/ [11].

## HASIL DAN PEMBAHASAN
DNA barcoding memerlukan  urutan  DNA sebagai  basis  data  analisisnya  sehingga diperlukan  proses  isolasi  DNA  sampel. Penelitian  ini  menggunakan  sampel  jaringan sirip ikan pari yang diberi kode Ray T2. Ekstrak DNA  yang  diperoleh  kemudian  dikuantifikasi menggunakan  nanodrop spectrophotometer pada panjang gelombang 230, 260 dan 280 nm. Tingkat  kemurnian  ekstrak  DNA  dapat ditentukan  melalui  rasio  A 260/280 dan  rasio A 260/230 dengan  nilai  mendekati  angka  2  dan konsentrasi >5 ng/µl. Nilai ini merupakan nilai acuan  untuk  berlangsungnya  reaksi  PCR dengan baik. Hasil kuantifikasi ekstrak sampel telah  memenuhi  nilai  standar  yang  diperlukan dalam  reaksi  PCR  seperti  yang  ditampilkan pada Tabel 2 [15].
Tabel  2. Data  kuantitatif  hasil  ekstraksi  gen mtDNA sampel
Kode Sampel Konsentrasi (ng/µl) A 260/280 A 260/230 Ray- T2 191.0 2.00 2.21
Produk  PCR  yang  diperoleh  terkonfirmasi adanya pita tunggal. Pita DNA yang diperoleh berukuran  ~700  pasang  basa/ base  pair (bp).
Nilai ini diperoleh dengan membandingkan pita
DNA  sampel  dengan  DNA marker yang  telah diketahui ukuran pita DNA-nya [24].
Gambar 2. Visualisasi produk amplifikasi PCR
Produk  amplifikasi  PCR  yang  diperoleh kemudian  dianalisis  lanjut  dengan  melakukan pembacaan  urutan  sekuen  gen  mtDNA  COI dengan metode Sanger bi-sequencing . Adapun urutan  sekuen  gen  mtDNA  CO1  Ray-T2 ditampilkan pada Tabel 3. Dari hasil sekuensing diperoleh panjang basa sekitar 558 bp, hasil ini telah sesuai dengan ukuran pita DNA hasil PCR pada Gambar 2. Selisih pasang basa antara hasil sekuensing  dengan  pita  DNA  disebabkan adanya proses trimming dalam pengolahan data hasil sekuensing.
Penentuan  jenis  ikan  target  dilakukan dengan  membandingkan  sekuen  mtDNA  COI sampel  dengan  dua database gen  COI  yaitu dengan  menggunakan  program The  BOLD Identification  System (IDS)  pada database BOLD
(https://www.boldsystems.org/index.php/IDS_
IdentificationRequest)  dan  BLAST  pada  data Bank Gen
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).  Hasil analisis  BLAST  dan  IDS  ditampilkan  pada Tabel  4  dan  5.  Terdapat  perbedaan  hasil pencocokan  sekuen  COI  dari  kedua  program ini. Pencocokan yang sama hanya terdapat pada Gymnura (sinonim dari Aetoplatea ) zonura dan Gymnura sp.,  hanya  saja  pada Gymnura sp. memberikan  nilai  similaritas  yang  berbeda. Sedangkan  hasil  lainnya  tidak  sama.  Namun dari  hasil  pencocokan  ini  dapat  disimpulkan bahwa  sampel  memiliki  kemiripan  99.80% dengan G. zonura , sehingga dapat disimpulkan bahwa  sampel  berjenis Gymnura zonura .  Hal ini sesuai penjelasan dari [17] yang mengemukakan  bahwa  nilai  kemiripan  pada rentang  98%  -  100%  menjelaskan  tentang homologi sekuen pada tingkat spesies.
Berdasarkan  analisis  filogenetik  dengan menggunakan  metode Neighbor-Joining (NJ),
Ket: 1. DNA marker 2. Sampel Ray T2
Maximum  Likelihood (ML),  dan Minimum Evolution (ME) diperoleh hasil sampel Ray T2 konsisten berkerabat dekat (monofiletik) dengan G. ( Aetoplatea ) zonura, dan G. cf zonura dengan dukungan nilai bootstrap (1000 pengulangan)  masing-masing  mencapai  100% (Gambar 3). Ketiga hasil analisis filogenetik ini memberikan  hasil  yang  baik  karena  konsisten memisahkan  antar  spesies  pada clade yang berbeda.  Bahkan outgroup Taeniura  lynma secara jelas terpisah jauh dari genus Gymnura . Konsistensi  pengelompokan  Ray  T2, G. ( Aetoplatea ) zonura, dan G. cf zonura didukung
pula oleh nilai jarak genetik yang paling rendah yaitu 0.002 ± 0.002 (Tabel 6). Artinya, perbedaan  basa  DNA  antara  Ray  T2  terhadap dua kerabat terdekatnya yaitu 2 basa dari 1000 basa. Jarak genetik terjauh terletak pada Ray T2 dengan Taeniura  lymma yaitu  0.199 ± 0.024. Hal  ini  dikarenakan  perbedaan  pada  level family .  Hasil  analisis  filogenetik  dan  jarak genetik  ini  memperkuat  kesimpulan  bahwa sampel  Ray  T2  merupakan G. ( Aetoplatea ) zonura .
Tabel 3 . Sekuen mtDNA COI sampel Ray T2
Tabel 4. Hasil analisis BLAST DNA sampel
Organisme Query cover e-value % kemiripan No. akses Aetoplatea zonura isolate GZON2 100% 0.0 99.80% KM073031.1 Gymnura poecilura 99% 0.0 90.93% KU936200.1 Gymnura cf. poecilura veraval 99% 0.0 90.73% KU821573.1 Gymnura cf. poecilura mumbai 99% 0.0 90.52% KU821574.1 Gymnura sp. 96% 8e-156 87.73% KF899450.1 Tabel 5. Hasil penelurusan dengan BOLD-IDS Family Genus Species Similarity Status Gymnuridae Gymnura zonura 99.8 Published Gymnuridae Gymnura japonica 99.8 Published Gymnuridae Gymnura cf zonura 99.8 Published Gymnuridae Gymnura sp. 99.59 Published
Gambar  3 .  Hasil  analisis  filogenetik  menggunakan  metode:  (a)  NJ  (b)  ML  (c)  ME.  Jarak  evolusi dihitung  menggunakan  metode  Kimura  2-parameter  dan  dalam  satuan  jumlah  substitusi basa per situs
(a) (b) (c)
Ket:  angka  berwarna  biru  (diagonal  atas)  merupakan  estimasi nilai standar eror yang diperoleh melalui prosedur bootstrap 1000 ulangan.  Analisis  jarak  genetik  menggunakan  model  Kimura-2- parameter.
1. Ray-T2
2. KM073031.1 Aetoplatea_zonura
3. KU936200.1 Gymnura poecilura
4. KU821573.1 Gymnura cf. poecilura Veraval 1
5. KU821574.1 Gymnura cf. poecilura Mumbai_1
6. IRREK629-08|Gymnura cf._zonura|COI-5P
7. FOAF572-07|Gymnura_japonica|COI-5P|EU398801
8. KF899450.1 Gymnura sp.
9. NC026210.1 Taeniura lymma
Informasi  dari database BOLD  dilaporkan terdapat  26  data  sekuen G.  zonura yang tersimpan  di  dalam  sistem,  15  di  antaranya bersifat  publik  dan  sisanya  bersifat  pribadi ( unpublished ). Dari 15 data, 10 data berasal dari Indonesia  dengan  sebaran:  enam  data  sekuen bersumber  dari  Jawa  Tengah,  dan  empat sisanya dilaporkan dari Bali.
Berdasarkan IUCN, spesies G. zonura yang muncul  sebagai  sinonim A.  zonura di  laman IUCN  terkategori vulnerable artinya  status konservasi  diberikan  kepada  spesies  yang sedang  menghadapi  risiko kepunahan  di  alam. Selanjutnya  masih  dalam  penjelasan  IUCN, spesies  ini  relatif  cukup  tinggi  menjadi tangkapan dari alat tangkap gillnet di Indonesia, khususnya di perairan Jawa Tengah dan Selatan Bali  sehingga  populasi,  utamanya  dari  spesies dewasa, memiliki tren yang menurun dari tahun ke  tahun.  Kategori G.  zonura pada  CITES masih dalam posisi belum terevaluasi.

## KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sampel  pari  layang-layang  yang  diidentifikasi dari TPI Gunung Lingkas, Tarakan, Kalimantan Utara  dengan  menggunakan  pendekatan  DNA barcoding adalah spesies Gymnura (Aetoplatea)  zonura.  G.  zonura terkategori vulnerable (vu)  di  laman  IUCN  yang  berarti spesies ini sedang menghadapi risiko kepunahan  di  alam.  Kategori G.  zonura pada CITES masih dalam posisi belum terevaluasi.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  diucapkan  kepada  Dr. Muhammad  Firdaus  atas  diskusinya  selama
penulisan  manuskrip,  Azwar  Amiruddin  atas bantuannya  dalam  mendesain  peta  lokasi penelitian, dan Universitas Borneo Tarakan atas dukungan  finansialnya  melalui  Dana  DIPA PNBP Universitas Borneo Tarakan tahun 2020.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Cedrola  PV,  González  AM,  Chiaramonte GE,  Pettovello  AD  (2012)  Bycatch  of sharks (Elasmobranchii) in the Patagonian red shrimp Pleoticus muelleri (Bate, 1888) fishery. Rev. del Mus. Argentino Ciencias Nat. Nueva Ser . 14: 349–356.
[2] Dulvy  NK,  Fowler  SL,  Musick  JA, Cavanagh  RD,  Kyne  PM,  Harrison  LR, Carlson JK, Davidson LNK, Fordham SV, Francis  MP,  Pollock  CM,  Simpfendorfer CA, Burgess GH, Carpenter KE,
Compagno  LJV,  Ebert  DA,  Gibson  C, Heupel  MR,  Livingstone  SR,  Sanciangco JC,  Stevens  JD,  Valenti  S,  White  WT (2014) Extinction risk and conservation of the world’s sharks and rays. Elife 3: 1–34.
[3] Graham  RT,  Witt  MJ,  Castellanos  DW, Remolina  F,  Maxwell  S,  Godley  BJ, Hawkes  LA (2012)  Satellite  tracking  of manta  rays  highlights  challenges  to  their conservation. PLoS One 7 (5): e36834.
[4] White WT, Last PR (2012) A review of the taxonomy  of  chondrichthyan  fishes:  A modern perspective. J. Fish Biol . 80: 901– 917.
[5] Veríssimo  A,  Cotton  CF,  Buch  RH, Guallart  J,    Burgess  GH  (2014)  Species diversity  of  the  deep-water  gulper  sharks (Squaliformes: Centrophoridae: Centrophorus)  in  North  Atlantic  waters  - current status and taxonomic issues. Zool. J. Linn. Soc. 172: 803–830.
[6] Hebert  PDN,  Cywinska  A,  Ball  SL, DeWaard JR (2003) Biological identifications  through  DNA  barcodes. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 270: 313–321.
[7] Hebert  PDN,  Penton  EH,  Burns  JM, Janzen  DH,  Hallwachs  W  (2004)  Ten species  in  one:  DNA  barcoding  reveals cryptic  species  in  the  neotropical  skipper butterfly  Astraptes  fulgerator.  Proc.  Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 14812–14817.
[8] Hubert  N,  Hanner  R,  Holm  E,  Mandrak NE, Taylor E, Burridge M, Watkinson D, Dumont P, Curry A, Bentzen P, Zhang J, April  J,  Bernatchez  L  (2008) Identifying Canadian  freshwater  fishes  through  DNA barcodes. PLoS ONE 3(6): e2490.
[9] Ward  RD,  Holmes  BH,  White  WT,    Last
PR  (2008)  DNA  barcoding  Australasian chondrichthyans:  Results  and  potential uses  in  conservation.  Mar.  Freshw.  Res.
59: 57–71.
[10] Ruocco  NL,  Lucifora  LO, Astarloa  JMD. De  Mabragaña  E,  Delpiani  SM  (2012) Morphology and DNA barcoding reveal a new  species  of  eagle  ray  from  the Southwestern  Atlantic.  Zool.  Stud.  51: 862–873.
[11] Madduppa H, Ayuningtyas RU, Subhan B, Arafat DP (2016) Exploited but Unevaluated:  DNA  barcoding  reveals skates and stingrays (Chordata,
Chondrichthyes)  species  landed  in  the Indonesian  Fish  Market.  ILMU  Kelaut. Indones. J. Mar. Sci. 21: 77.
[12] Zymo Research D. Quick - DNA TM Tissue / Insect Miniprep Kit. 0–4.
[13] Sulistiowati  S,  Madduppa  H  (2020) Identifikasi Scatophagus  argus yang dipasarkan di Jakarta berdasarkan analisis morfologi dan DNA barcoding. J. Kelaut. Trop . 23: 373–380.
[14] Kumar  S,  Stecher  G,  Li  M,  Knyaz  C, Tamura  K  (2018)  MEGA  X:  Molecular evolutionary  genetics  analysis  across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 35:
1547–1549.
[15] Gaffar  S,  Sumarlin  S  (2020)  Analisis sekuen mtDNA COI Pari Totol Biru yang didaratkan  di  Tempat  Pendaratan  Ikan Kota Tarakan. J. Harpodon Borneo 13: 80–
89.
[16] Tindi  M,  Mamangkey  NGF,  Wullur  S (2017)  The  DNA  barcode  and  molecular phylogenetic  analysis  several  Bivalve species from North Sulawesi Waters based on  COI  gene.  J.  Pesisir  dan  Laut  Trop.  1
(2): 32–38.
[17] Bhattacharjee  MJ,  Laskar  BA,  Dhar  B, Ghosh  SK  (2012)  Identification  and  re- evaluation of freshwater catfishes through DNA barcoding. PLoS One 7: e49950.
[18] Saitou  N,  Nei  M  (1987)  The  neighbor- joining  method:  a  new  method  for reconstructing  phylogenetic  trees.  Mol. Biol. Evol. 4: 406–425.
[19] Felsenstein J (1985) Confidence limits on phylogenies:  an  approach  using  the bootstrap. Evolution (N.Y) 39: 783.
[20] Kimura  MA  (1980)  Simple  method  for estimating  evolutionary  rates  of  base substitutions  through  comparative  studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16:
111–120.
[21] Rzhetsky  A,  Nei  MA  (1992)  Simple
method  for  estimating  and  testing minimum-evolution trees. Mol. Biol. Evol . 9: 945–967.
[22] Nei  M,  Kumar  S  (2000)  Molecular evolution  and  phylogenetic s .  Oxford University Press. Oxford.
[23] Ude GN, Igwe DO, Brown C, Jackson M, Bangura A, Ozokonkwo-Alor O, Ihearahu OC,  Chosen  O,  Okoro  M,  Ene  C,  Chieze V,  Unachukwu  M,  Onyia  C,  Acquaah  G, Ogbonna J, Das A (2020) DNA barcoding for  identification  of  fish  species  from freshwater  in  Enugu  and  Anambra  States of  Nigeria.  Conserv.  Genet.  Resour.  12: 643–658.
[24] Sumarlin  S,  Yovilan  Moq  C,  Gaffar  S, Haryono  MG  (2020)  Amplifikasi  gene mtDNA CO1 Muraenesocidae dari perairan Kota Tarakan dengan teknik PCR. J. Harpodon Borneo 13 (2): 54-60.