## POTENSI LACTOBACILLUS YANG DIISOLASI DARI AIR SUSU IBU UNTUK MENCEGAH DIARE
[ Potential of Lactobacillus Isolated from Breast Milk to Prevent Diarrheae ]
Lilis Nuraida 1, 2) *, Hana 1, 2) , Apriliana W. Hartanti 2) dan Endang Prangdimurti 1, 2)
1) South East Asian Food and Agriculture Science and Technology (SEAFAST) Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 09 Desember 2011 / Disetujui 03 Desember 2012

## ABSTRACT
Some of Lactobacillus species isolated from breast milk are known to have antimicrobial activities, including against Escherichia coli. The aims of this study were to evaluate the antimicrobial activity of Lactobacillus species isolated from breast milk against enteropathogenic Escherichia coli strain K1.1 and the effectiveness of the Lactobacillus isolates to prevent diarrhea on rats (Sprague Dawley). The infective dose of E. coli K1.1 to induce diarrhea without causing death were also determined. Based on  the antimicrobial activity there were  three isolates of Lactobacillus  that exhibited good inhibition againts E. coli K1.1, i.e. Lactobacillus rhamnosus R14, L. rhamnosus R23, and L. rhamnosus B16. Determination of E. coli infective dose showed that 10 8 CFU of E. coli K1.1 was sufficient to induce diarrhea on rat without causing death. The number of diarrhea rats and severity  level  in  group  treated  with  L.  rhamnosus  were  lower  than  groups  untreated  with  the  Lactobacilli.  This  study  showed  that  the  three  L. rhamnosus isolated from breast milk were able to prevent diarrhea due to infection of E. coli K1.1 when the Lactobacillus was regularly introduced prior to infection. L. rhamnosus R23 showed the best capabilities of preventing diarrhea in rats as compared to two other isolates of Lactobacillus. The  incidence  of  diarrhea  correlated  with  the  number  of  lactobacilli  in  the  feces.  However  when  the  period  of  diarrhea  ceased,  there  were  no difference  in  total  lactobacilli  and  E.  coli  in  the  caecum,  colon  and  feces  between  rats  treated  with  L.  rhamnosus  and  the  control.  This  finding revealed the L. rhamnosus isolated from breast milk were potential for prevention of diarrhea when consumed regularly.
Keywords: antimicrobial activity, breast milk, diarrhea, E. coli, Lactobacillus rhamnosus

## ABSTRAK
Beberapa spesies Lactobacillus yang diisolasi dari air susu ibu (ASI) diketahui memiliki aktivitas antimikroba, termasuk terhadap Escherichia coli .  Tujuan  penelitian  ini  adalah  mengevaluasi  aktivitas  antimikroba  spesies Lactobacillus asal  ASI  terhadap Escherichia  coli enteropatogenik strain K1.1 dan  efektivitas Lactobacillus rhamnosus untuk mencegah  diare pada tikus ( Sprague  Dawley ). Dosis infeksi E. coli K1.1 yang dapat menginduksi  diare  tanpa  menyebabkan  kematian  juga  ditentukan.  Berdasarkan  aktivitas  antimikroba,  diperoleh  tiga  isolat Lactobacillus yang memiliki  penghambatan  yang  baik  terhadap E.  coli K1.1,  yaitu Lactobacillus  rhamnosus R14, L. rhamnosus R23,  dan L.  rhamnosus B16. Penentuan dosis infeksi oleh E. coli menunjukkan bahwa sebanyak 10 8 CFU E. coli K1.1 merupakan jumlah yang cukup untuk menginduksi diare pada tikus tanpa menyebabkan kematian. Jumlah tikus yang mengalami diare dan keparahannya pada tikus yang diberi L. rhamnosus lebih rendah dibandingkan dengan tikus yang tidak diberi L. rhamnosus namun diinfeksi dengan E. coli K1.1. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa tiga L. rhamnosus asal ASI mampu menghambat diare karena E. coli K1.1 jika Lactobacillus tersebut diberikan secara reguler sebelum terjadinya infeksi. L. rhamnosus R23 merupakan isolat dengan kemampuan yang paling baik dalam mencegah diare dibandingkan dengan dua isolat L. rhamnosus lainnya. Jumlah tikus yang mengalami diare berkorelasi dengan jumlah laktobasili di dalam feses. Akan tetapi jika periode diare telah berhenti, tidak ada perbedaan jumlah total laktobasili dan E. coli dalam sekum, kolon dan feses antara tikus yang diberi L. rhamnosus dan kontrol. Penelitian ini menunjukkan bahwa L. rhamnosus asal ASI berpotensi untuk mencegah diare jika dikonsumsi secara reguler.
Kata kunci: aktivitas antimikroba, air susu ibu, diare, E. coli , Lactobacillus rhamnosus

## PENDAHULUAN
1
Diare  dan  gastroentritis  karena  infeksi  tertentu  menjadi urutan  pertama  penyebab  rawat  inap  di  rumah  sakit  di Indonesia,  bahkan  pada  tahun  2006  penyakit  ini  menempati urutan ketiga penyakit utama penyebab kematian di rumah sakit di Indonesia setelah stroke dan perdarahan intrakranial (Depkes RI, 2008). Baik di negara berkembang, maupun di negara maju penyebab  diare  yang  utama  pada  anak-anak  adalah
*Korespondensi Penulis : E-mail : lilis@seafast.org; lilis@nuraida.com; Hp: 081-1118583
Escherichia  coli ,  Rotavirus, Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter  jejuni , Entamoeba  histolytica dan Giardia lamblia (Mandomando et  al. ,  2007;  Allen et  al .,  2010) . E.  coli enteropatogenik diketahui sebagai penyebab utama diare pada anak-anak berumur kurang dari dua tahun (Yatsuyanagi et al., 2003).  Mikroba  probiotik  telah  terbukti  dapat  mencegah  atau menyembuhkan  diare  yang  diakibatkan  oleh  infeksi  patogen, virus  maupun  diare  yang  disebabkan  oleh  konsumsi  antibiotik (Heyman  dan  Menard,  2002;  de  Vrese  dan  Marteau,  2007; Zanini et al ., 2007). Penggunaan probiotik untuk mencegah atau mengobati diare merupakan fungsi probiotik yang paling umum diaplikasikan (Reid et al., 2003; de Vrese dan Marteau, 2007).
Pemberian  probiotik  dapat  mengurangi  durasi  dan  keparahan diare (de Vrese dan Marteau, 2007; Allen et al., 2010).
Air  susu  ibu  (ASI)  telah  dilaporkan  oleh  beberapa  peneliti mengandung  bakteri  asam  laktat  yang  berpotensi  sebagai probiotik. Bifidobacterium  longum adalah  bakteri  asam  laktat (BAL) yang paling umum ditemukan dalam ASI, diikuti oleh B. animalis , B.  bifidum ,  dan B.  catenulatum (Gueimonde et  al ., 2007).  Keberadaan  laktobasili  pada  ASI  yaitu L.  gasseri , L. fermentum dan L. salivarius dilaporkan oleh Martin et al . (2005). Isolat ini berpotensi sebagai probiotik yang sama dengan strain yang telah digunakan secara konvensional (Martin et al. , 2005). Hartanti (2010) menunjukkan dari 19 isolat  BAL asal ASI yang memiliki ketahanan terhadap asam dan atau garam empedu, 5 isolat yaitu L. rhamnosus R14, R21, R23, B16 dan Lactobacillus sp. R25 dapat menurunkan E. coli K1.1 sebesar >2 log CFU/mL ketika  ditumbuhkan  secara  bersama-sama  pada  media  susu. Isolat Lactobacillus yang  memiliki  kemampuan  menghambat pertumbuhan E.  coli K.1.  secara in  vitro diharapkan  mampu mencegah  diare  secara in  vivo .  Sebagaimana  dipersyaratkan FAO/WHO (2002), dalam pengembangan bakteri probiotik, studi mengenai  karakterisasi  sifat  fungsional  bakteri  asam  laktat harus  dilakukan  pada  hewan  percobaan  terlebih  dahulu. Pemberian Lactobacillus  casei I-5  dilaporkan  efektif  untuk mencegah  infeksi  karena E.  coli pada  tikus  (Ishida-Fujii et  al., 2007).  Sementara  itu  Oyetayo  (2004)  menunjukkan  tikus  yang diberi Lactobacillus  acidophilus dan  diinfeksi E.  coli ,  tidak mengalami  diare  seperti  yang  dialami  oleh  tikus  yang  hanya diberi E.  coli .  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Astawan et  al. (2011) menunjukkan bahwa pemberian BAL yang diisolasi dari daging  segar  dapat  menekan  tingkat  keparahan  diare  pada tikus  akibat  infeksi E.  coli enteropatogenik.  Pada  penelitian tersebut  paparan E.  coli dilakukan  selama  tujuh  hari  berturut- turut  dengan  jumlah E.  coli sebanyak  10 6 CFU/mL  per  hari. Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  efektivitas  isolat Lactobacillus asal  ASI  untuk  mencegah  diare  pada  tikus percobaan  yang  dinfeksi  dengan E.  coli K1.1.  Pada  penelitian ini infeksi oleh E. coli K1.1. dilakukan dengan paparan tunggal dengan dosis yang dapat menyebabkan diare. Paparan secara tunggal  dilakukan  untuk  menghindari  terjadinya  imunitas  pada tikus yang digunakan terhadap E. coli , karena paparan terhadap mikroorganisme  yang  berkali-kali  dapat  memicu  terjadinya imunitas.

## BAHAN DAN METODE
Bahan Lima isolat Lactobacillus asal ASI yaitu L. rhamnosus (R14, R21,  R23,  dan  B16)  dan Lactobacillus  sp. R25  dari  koleksi SEAFAST  Center  IPB  digunakan  dalam  penelitian  ini.  Bakteri yang  digunakan  untuk  menginduksi  diare  adalah Escherichia coli enteropatogenik strain K1.1 yang berasal dari Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis Pusat Penelitian Bioteknologi IPB  dan  tikus  percobaan Sprague-Dawley jantan  dari  Pusat Studi  Biofarmaka  IPB.  Bahan-bahan  yang  digunakan  adalah bahan  penyusun  ransum  modifikasi  AIN-76  (AIN,  1977)  dan media untuk uji mikrobiologi. Alat-alat yang dipergunakan dalam
penelitian ini adalah peralatan untuk pengujian mikrobiologi dan pemeliharaan hewan percobaan.
Pengujian  aktivitas  antimikroba Lactobacillus terhadap E. coli K1.1 secara in vitro Pengujian aktivitas antibakteri Lactobacillus terhadap E. coli K1.1 dilakukan dengan metode kontak. Kultur Lactobacillus dan E. coli disegarkan masing-masing ke dalam medium MRSB dan NB  dan  diinkubasi  selama  24  jam.  Isolat Lactobacillus dan kultur E.  coli kemudian  ditambahkan  ke  dalam  tabung  berisi larutan  susu  skim  10%  sehingga  susu  mengandung  10 8 CFU/mL Lactobacillus dan 10 5 CFU/mL E. coli, s elanjutnya di- inkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Susu dipilih sebagai medium dalam pengujian ini karena kedua bakteri dapat tumbuh dengan  baik.  Total Lactobacillus dan E.  coli sebelum  dan sesudah inkubasi dihitung  dengan metode agar tuang  masing- masing menggunakan media MRSA dan EMBA.
Penentuan dosis E. coli K1.1 yang menyebabkan diare pada tikus (modifikasi Oyetayo, 2004)
Protokol  penggunaan  tikus  dalam  penelitian  ini  telah mendapat  persetujuan  dari  Komisi  Etik  Penelitian  Kesehatan Badan  Litbang  Kesehatan  Kemenkes  (No.  Lb.03.04/KE/6224 /2010).  Uji  dosis  dilakukan  dengan  pemberian E.  coli pada beberapa konsentrasi sehingga tikus menjadi diare. Pada uji ini digunakan  20  ekor  tikus  yang  terbagi  dalam  empat  kelompok, yaitu  satu  kelompok  kontrol  yang  hanya  diberikan  larutan fisiologis  (NaCl  0,85%)  dan  tiga  kelompok  tikus  yang  diberi E. coli dengan  berbagai  konsentrasi  (10 8 ,  10 7 dan  10 6 CFU/mL). Sebelum  pemberian E.  coli tikus  diadaptasikan  dahulu  selama dua  minggu  dengan  pemberian  ransum  standar  AIN-76  (AIN, 1977) yang telah dimodifikasi secara ad libitum dan air minum dalam  kemasan. E.  coli K1.1  ditumbuhkan  pada  medium  NB selama  24  jam  pada  suhu  37°C,  kemudian  disentrifuse  dan pelet  sel  disuspensikan  pada  larutan  garam  fisiologis  serta  di- encerkan sesuai dengan jumlah sel yang diinginkan. Pemberian suspensi E.  coli sebanyak  1  mL  sesuai  dengan  konsentrasi  di atas  dilakukan  dengan  cara  dicekok  (dengan  alat  sonde intragastrik).  Pemberian E.  coli hanya  dilakukan  sekali.  Tikus kelompok kontrol dicekok dengan 1 mL larutan fisiologis (NaCl 0,85%). Pengamatan feses tikus dilakukan sebelum pemberian E. coli K1.1 (H0/hari ke 0) dan setiap hari setelah pemberian E. coli sampai lima hari (H5/hari ke 5).
Pengujian potensi isolat Lactobacillus asal ASI untuk men- cegah diare
Pada uji aktivitas antidiare 30 ekor tikus dibagi menjadi lima kelompok,  yaitu  kelompok  tikus  yang  tidak  diintervensi L. rhamnosus maupun E.  coli (kontrol  negatif),  kelompok  tikus yang  diintervensi E.  coli tetapi  tidak  diintervensi  isolat L. rhmnosus (kontrol E. coli ), dan tiga kelompok tikus yang diinter- vensi E.  coli dan L.  rhamnosus sebagaimana  disajikan  pada Tabel 1 . Jumlah E. coli yang diberikan adalah 10 8 CFU sesuai dengan  dosis  yang  menyebabkan  diare  dan  jumlah L. rhamnosus yang diberikan adalah 10 9 CFU. Isolat Lactobacillus ditumbuhkan dalam MRSB pada suhu 37°C selama 24 jam, lalu disentrifus dan pelet  sel disuspensikan dalam larutan fisiologis (NaCl  0,85%).  Pemberian L.  rhamnosus dan E.  coli dilakukan
-3.01 -3.06
-2.79 -2.93 -2.79 -3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 B16 R14 R21 R23 R25 Pe nu ru na n Ju m la h E. co li (lo g C FU /m L) Isolat Lactobacillus
dengan cara dicekok. Tikus kelompok kontrol yang tidak diberi E. coli maupun Lactobacillus, dicekok dengan larutan fisiologis. Pengamatan dilakukan terhadap berat badan tikus (setiap  dua hari),  konsumsi  ransum  (setiap  hari),  konsistensi  dan  warna feses  (setiap  hari),  serta  jumlah  total Lactobacillus dan E.  coli pada  feses  sebelum  diintervensi L.  rahmnosus (H0/hari  ke  0), setelah intervensi L. rhamnosus pada H1, H3, H7 dan  setelah intervensi E. coli pada H8, H9, H10, H11, dan H12. Pada H12, setelah  terjadi  penyembuhan  diare,  tikus  diterminasi  dengan teknik dislokasi tulang aksis ( cervicalis dislocation) . Jumlah total Lactobacillus dan E. coli pada kolon dan sekum tikus selanjut- nya  dihitung  dan  analisis  dengan  program  SPSS  13,0  dan  uji beda lanjut dengan uji Duncan. Pengamatan kolon tikus dengan menggunakan  SEM  ( Scanning  Electron  Microscope )  dilakukan pada pengamatan H12.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas  antimikroba  isolat Lactobacillus terhadap E.  coli K.1.1 secara in vitro Hasil pengujian aktivitas antimikroba isolat Lactobacillus ter- hadap E.  coli K1.1  dengan  menggunakan  metode  kontak  me- nunjukkan  bahwa  tiga  isolat  yaitu L.  rhamnosus R14, L. rhamnosus R23,  dan L.  rhamnosus B16  (Gambar  1)  memiliki peng-hambatan  lebih  tinggi  atau  menurunkan  jumlah E.  coli yang  lebih  besar  dari  2  isolat  lainnya.  Hasil  penelitian  ini  me- nunjukkan bahwa sifat antimikroba tergantung pada strain. Hal yang sama terjadi pada Lactobacillus asal  ASI yang dilakukan oleh peneliti terdahulu (Olivares et al., 2006). Ketiga isolat ter- sebut  selanjutnya  digunakan  untuk  pengujian  secara in  vivo potensi Lactobacillus rhamnosus asal ASI sebagai antidiare.
Dosis E. coli K1.1 yang menyebabkan diare pada tikus Hasil pengujian menunjukkan pemberian dosis E. coli K1.1 sebesar  10 8 CFU  menyebabkan  4  dari  5  tikus  diare  sehari setelah  pemberian E.  coli (Tabel  2).  Semakin  menurun  dosis yang  diberikan  jumlah  tikus  yang  diare  pada  hari  pertama semakin kecil. Pada umumnya tikus mengalami diare selama 2 hari,  lalu  sembuh  pada  hari-hari  berikutnya.  Pada  pemberian dosis 10 6 CFU, terjadi keterlambatan terjadinya diare  yang ter- lihat  dari  tidak  adanya  tikus  yang  diare  sehari  setelah  pem- berian E. coli . Pada hari kedua baru terjadi diare pada 1 dari 5 tikus, lalu meningkat menjadi 3 dan turun kembali pada hari-hari berikutnya  yang  menunjukkan  terjadinya  penyembuhan.  Pola yang tidak teratur diamati pada pemberian dosis 10 7 CFU. Untuk penelitian  pada  tahap  selanjutnya  digunakan  dosis  10 8 CFU
yang  merupakan  dosis E.  coli K1.1  yang  dapat  menimbulkan diare terbanyak pada tikus tanpa menimbulkan kematian.
Dosis E.  coli K1.1  sebesar  10 6 CFU  belum  menyebabkan diare dalam waktu sehari setelah pemberian E. coli . Diare baru terjadi  ketika  digunakan  dosis  10 7 atau  10 8 CFU.  Dosis  tinggi yang  dibutuhkan  pada  penelitian  ini  kemungkinan  disebabkan karena  tikus  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  bukan  tikus bebas mikroba ( germ free ) atau gnotobiotik, yaitu hewan  yang mengandung mikroba yang diketahui jenisnya atau spesiesnya (Zhang et al. , 2008). Respon imun terhadap infeksi pada hewan gnotobiotik lebih rendah daripada hewan yang dipelihara secara konvensional (Zhang et al. , 2008). Tikus yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus yang dipelihara secara konvensional sehingga  kemungkinan  sudah  terpapar  berbagai  jenis  bakteri, sebagai akibatnya dosis untuk menyebabkan sakit menjadi lebih tinggi. Ishida-Fujii et al. (2007) menggunakan dosis tinggi yaitu 3x10 7 - 1x10 8 sel E. coli untuk pengujian pencegahan infeksi E. coli pada tikus oleh Lactobacillus casei I-5.
Gambar 1.  Penurunan  jumlah E.  coli K1.1  setelah  dikompetisikan dengan 5 isolat Lactobacillus asal ASI secara in vitro
Tabel 2. Hasil  pengujian  dosis E.  coli K1.1  yang  menyebabkan  tikus diare
Dosis E. coli K1.1 per hari Jumlah Tikus Diare/Jumlah Seluruh Tikus Setelah Pemberian E. coli K1.1 Selama: 1 Hari 2 hari 3 Hari 4 Hari 5 hari Kontrol 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 10 6 CFU 0/5 1/5 3/5 2/5 1/5 10 7 CFU 2/5 0/5 1/5 0/5 2/5 10 8 CFU 4/5 2/5 0/5 0/5 0/5
Tabel 1. Perlakuan tikus pada pengujian potensi isolat L. rhamnosus asal ASI untuk mencegah diare karena E. coli K1.1
Kelompok Perlakuan Periode (Hari ke) Adaptasi* (H-14 s.d. H0) Perlakuan 1 (H1 s.d. H6) Perlakuan 2 (H7)
Perlakuan 3 (H8 s.d. H12)
Kontrol negatif
ransum standar ransum standar ransum standar ransum standar
Kontrol E. coli ransum standar + E. coli K1.1. 10 8 CFU
L. rhamnosus R14
ransum standar + L. rhamnosus 10 9 CFU ransum standar + E. coli K1.1. 10 8 CFU + L. rhamnosus 10 9 CFU
ransum standar + L. rhamnosus 10 9 CFU L. rhamnosus R23 L. rhamnosus B16 Keterangan: *) Dilakukan selama dua minggu dari H-14 sampai H0
Pengaruh  pemberian  asupan  isolat Lactobacillus asal  ASI terhadap kejadian diare akibat infeksi E. coli K1.1 Selama masa pengujian aktivitas antidiare berat badan tikus terus meningkat dan tidak terjadi penurunan berat badan walau- pun sudah diinfeksi dengan E. coli K1.1. Berdasarkan penam- pakan feses, diare yang ditimbulkan tidak mengakibatkan tikus banyak  kekurangan  cairan,  sehingga  berat  badan  tikus  masih mengalami peningkatan selama perlakuan.
Hasil pengujian (Tabel 3) menunjukkan bahwa ketiga isolat L. rhamnosus memiliki kemampuan untuk mencegah diare. Hal ini  terlihat  dari  jumlah  tikus  yang  mengalami  diare,  tingkat keparahan  diare,  dan  waktu  munculnya  diare  tersebut.  Diare pada tikus kelompok kontrol E. coli terjadi segera setelah pem- berian E. coli K1.1 (tiga dari enam tikus mengalami diare pada H8). Sedangkan diare pada tikus kelompok L. rhamnosus R14 baru  terjadi  pada  H10  (satu  dari  enam  tikus  mengalami  diare pada hari ke 10). Kelompok tikus yang diberi L. rhamnosus B16 juga  mengalami  diare  segera  setelah  diberi E.  coli K1.1  (H8), akan tetapi jumlah tikus yang diare lebih sedikit (dua dari enam tikus). Disamping itu, keparahan diare antara kelompok kontrol E.  coli dengan  kelompok  yang  diberi L.  rhamnosus berbeda. Tikus  kelompok  kontrol E.  coli mengalami  diare  yang  lebih parah, yaitu ditunjukkan dengan penampakan feses yang tidak berbentuk,  sangat  lembek  dan  berlendir  (tipe  6  berdasarkan Bristol Stool Chart (Lewis dan Heaton, 1997)). Sedangkan tikus yang  diberi L.  rhamnosus R14  dan L.  rhamnosus B16  me- ngalami diare yang lebih ringan, yaitu fesesnya lembek namun masih berbentuk (tipe 5 berdasarkan Bristol Stool Chart (Lewis dan  Heaton,  1997)).  Pada  umumnya  tikus  menderita  diare hanya  selama  1-2  hari  (Tabel  3),  sehingga  setelah  5  hari  dari pemberian E.  coli (H12),  tidak  ada  lagi  tikus  yang  diare. Kelompok  tikus  yang  diberi  isolat L.  rhamnosus R23  tidak mengalami  diare  selama  pengujian  berlangsung,  Hal  ini  me- nunjukkan bahwa L. rhamnosus R23 memiliki kemampuan yang paling baik dalam mencegah diare. Kemampuan probiotik untuk mencegah  diare  karena  bakteri  atau  virus  tergantung  pada strain dan dosis yang digunakan (Allen et al., 2010). E.  coli enteropatogenik  memiliki  plasmid  yang  mengkode pembentukan pili untuk penempelan bakteri pada sel epitel dan produksi  protein  yang  diperlukan  untuk  menyebabkan  luka
( lesion )  (Nguyen et  al., 2006). Budiarti  dan  Mubarik  (2007) menunjukkan E. coli K1.1 dapat menghasilkan enzim protease ekstra seluler yang dapat mendegradasi mucin sehingga dapat melekat  pada  sel  epitel  usus  dan  menimbulkan  diare  pada inang.  Michail  dan  Abernathy  (2002)  menguji  efek  peng- hambatan L. plantarum terhadap E. coli dan respon sekretori sel epitel  usus  menggunakan  model  sel  Caco-2.  Paparan L. plantarum diberikan sebelum, bersamaan dan setelah infeksi E. coli .
Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan  bahwa L.  plantarum mengurangi perubahan respon sekretori terhadap infeksi E. coli , kemungkinan  melalui  penghambatan  pengikatan E.  coli enteropatogenik pada sel epitel. L. plantarum juga mengurangi pengikatan E. coli pada sel Caco-2. Penelitian lebih lanjut me- nunjukkan  bahwa L.  plantarum menghambat  migrasi  neutrofil sehingga  menghambat  respon  inflamasi  karena  infeksi E.  coli enteropatogenik (Michail dan Abernity, 2003). Akan tetapi efek ini  hanya  dapat  terjadi  jika  probiotik  tersebut  telah  diberikan sebelum  infeksi E.  coli (preventif).  Sherman et  al. (2005)  me- nunjukkan L.  acidophilus dan L.  rhamnosus mencegah  terjadi- nya luka pada sel epitel karena infeksi E. coli.
Pengaruh  pemberian  asupan  isolat Lactobacillus asal  ASI dan E. coli K1.1 terhadap jumlah E. coli dalam feses Jumlah E. coli pada tikus selama pengujian disajikan pada Gambar  2.  Pada  kelompok  kontrol  negatif  (selama  pengujian seluruh  tikus  hanya  diberikan  larutan  fisiologis),  jumlah E.  coli cenderung stabil. Kelompok kontrol E. coli (kelompok tikus yang diberi E.  coli K1.1  tanpa  diberi L.  rhamnosus )  menunjukkan kenaikan jumlah E. coli pada feses yang cukup tinggi, yaitu 0,83 log  CFU/g  feses  (Tabel  4)  sehari  setelah  pemberian E.  coli (pengamatan H8). Hal ini berkorelasi dengan jumlah tikus yang mengalami diare pada  pengamatan H8 yang berjumlah 3 ekor dari  6  ekor  tikus  (Tabel  4).  Penelitian  Oyetayo et  al. (2003) menunjukkan  pemberian L.  acidophilllus dan L.  casei yang  di- isolasi dari susu sapi selama 3 hari berturut-turut, menurunkan jumlah  enterobacteriacea  dalam  feses  tikus.  Pemberian L. acidophillus juga  mencegah  terjadinya  diare  pada  tikus (Oyetayo, 2004).
Tabel 3. Pengaruh pemberian isolat Lactobacillus asal ASI terhadap kejadian diare akibat infeksi E. coli K1.1
Kelompok Tikus Jumlah Tikus Diare/Jumlah Seluruh Tikus Pemberian Asupan Lactobacillus (Hari ke) H0 H1 H3 H7 H8 H9 H10 H11 H12 Kontrol negatif 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Kontrol E. coli 0/6 0/6 0/6 0/6 3/6 (a) 1/6 (a) 0/6 0/6 0/6 L. rhamnosus R14 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 1/6 (b) 2/6 (b) 0/6 L. rhamnosus R23 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 L. rhamnosus B16 0/6 0/6 0/6 0/6 2/6 (b) 0/6 0/6 0/6 0/6
Keterangan :
(a) = feses tidak berbentuk, berwarna agak kecoklatan, sangat lembek, berlendir (tipe 6 berdasarkan Bristol Stool Chart) (b) = feses berbentuk bulat atau lonjong, berwarna hitam, tidak padat, lembek (tipe 5 berdasarkan Bristol Stool Chart)
Infeksi E. coli K1.1
6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 H0 H1 H3 H7 H8 H9 H10 H11 H12 Ju m la h E. c oli (lo g C FU /g fe se s) Periode Pemberian Lactobacillus Kontrol negatif Kontrol E. coli
R14
R23 B16 Pemberian E. coli K1.1
Tabel 4. Jumlah tikus diare dan perubahan jumlah E. coli dan Lactobacillus pada feses setelah pemberian E. coli K1.1
Kelompok Perlakuan Setelah 1 Hari (H8) Setelah 2 Hari (H9) Setelah 3 Hari (H10) Setelah 4 Hari (H11) Setelah 5 Hari (H12) FD ΔEC ΔLB FD ΔEC ΔLB FD ΔEC ΔLB FD ΔEC ΔLB FD ΔEC ΔLB Kontrol negatif 0/6 0,21 0,16 0/6 0,02 0,20 0/6 -0,58 -0,16 0/6 -0,35  -0,47  0/6  -0,58  -0,53 Kontrol E. coli 3/6 (a) 0,83 -1,29 1/6 (a) 0,59 -1,71 0/6 0,32 -1,42 0/6 0,11 -0,97  0/6 -0,4 -0,88 L. rhamnosus R14 0/6 0,44 -0,07 0/6 0,43 0,31 1/6 (b) -0,42 0,39 2/6 (b) -0,12 0,19 0/6  -0,22 0,34 L. rhamnosus R23 0/6 -0,13 -0,09 0/6 -0,57 0,38 0/6 -1,00 -0,19 0/6 -1,3 -0,10  0/6  -1,53 0,30 L. rhamnosus B16 2/6 (b) 0,36 -0,07 0/6 0,43 0,07 0/6 0,11 -0,11 0/6 -0,47  -0,15  0/6  -0,52 0,08 Keterangan :
FD   = frekuensi kejadian diare (jumlah tikus diare/jumlah seluruh tikus) ΔEC   = selisih jumlah E. coli dalam feses (log CFU/g) pada hari tersebut dibandingkan dengan sebelum paparan terhadap E. coli K1.1 (H7) ΔLB   = selisih jumlah Lactobacillus dalam feses (log CFU/g) pada hari tersebut dibandingkan dengan sebelum paparan terhadap E. coli K1.1 (H7)
(a) = feses tidak berbentuk, berwarna agak kecoklatan, sangat lembek, berlendir (tipe 6 berdasarkan Bristol Stool Chart)
(b) = feses berbentuk bulat atau lonjong, berwarna hitam, tidak padat, lembek (tipe 5 berdasarkan Bristol Stool Chart)
Pada  kelompok  tikus  yang  diberi L.  rhamnosus R14  me- nunjukkan  sedikit  kenaikan  jumlah E.  coli sehari  setelah  pem- berian E. coli K1.1, yaitu sebesar 0,44 log CFU/g feses (Tabel 4),  tetapi  kemudian  turun  kembali  setelah  3  hari  (pada  pe- ngamatan  H10).  Hal  ini  berkorelasi  dengan  tidak  adanya  tikus yang  mengalami  diare  pada  pengamatan  H8  meskipun  pada pada H10 dan H11 terdapat masing-masing seekor dan 2 ekor tikus  yang  mengalami  diare,  tetapi  gejala  diare  yang  tampak hanya  feses  yang  sedikit  lembek  dengan  bentuk  normal  atau tipe 5 berdasarkan Bristol Stool Chart (Tabel 4). Pada kelompok tikus  yang  diberi L.  rhamnosus R23  menunjukkan  sedikit penurunan jumlah E. coli sehari setelah pemberian E. coli K1.1 (pengamatan  H8),  yaitu  turun  sebesar  0,13  log  CFU/g  feses (Tabel 4) dan terus mengalami penurunan sampai H12. Hal ini berkorelasi  dengan  tidak  adanya  satu  ekor  tikuspun  yang  me- ngalami diare setelah diberi E. coli K1.1. Pada kelompok tikus yang  diberi  asupan L.  rhamnosus B16  menunjukkan  sedikit kenaikan  jumlah E.  coli sehari  setelah  intervensi E.  coli K1.1 (pengamatan H8), yaitu sebesar 0,36 log CFU/g feses (Tabel 4), tetapi kemudian mengalami penurunan hingga H12. Hal ini ber- korelasi  dengan  adanya  2  ekor  tikus  yang  mengalami  diare pada  H8  tetapi  gejala  diare  yang  tampak  hanya  feses  yang sedikit  lembek  dengan  bentuk  normal  atau  tipe  5  berdasarkan Bristol Stool Chart sama seperti diare pada kelompok tikus yang diberi  asupan L.  rhamnosus R14  (Tabel  4).  Pada  H12  atau setelah 5 hari pemberian E. coli K1.1, tidak ada lagi tikus yang mengalami  diare.  Pada  H12  jumlah E.  coli pada  feses  tikus berkisar  antara  7,07-7,90  log  CFU/g  feses,  dengan  jumlah E. coli yang  lebih  rendah  pada  kelompok  tikus  yang  diberi L. rhamnosus (Gambar  2) , yaitu  7,07-7,35  log  CFU/g  feses, dibandingkan dengan kedua kontrol yaitu sebesar 7,78 dan 7,90 log CFU/g feses.
Pengaruh  pemberian  asupan  isolat Lactobacillus asal  ASI dan E. coli K1.1 terhadap jumlah Lactobacillus dalam feses tikus
Jumlah Lactobacillus pada tikus selama pengujian disajikan pada  Gambar  3.  Pada  kelompok  kontrol  negatif  jumlah Lactobacillus cenderung  stabil,  sedangkan  pada  kelompok kontrol E.  coli terjadi  penurunan  jumlah Lactobacillus yang sangat  drastis  setelah  pemberian E.  coli K1.1,  yaitu  sebesar 1,29 log CFU/g feses pada pengamatan H8 dan turun sebesar 1,71  log  CFU/g  pada  H9  (Tabel  4),  meskipun  kemudian
mengalami  kenaikan  kembali  hingga  H12  dimana  tikus  telah sembuh dari diare (Gambar 3 dan Tabel 4). Hal ini menunjukkan bahwa  pemberian E.  coli 10 8 CFU  pada  tikus  menyebabkan terjadinya  gangguan  keseimbangan  mikrobiota  usus  ditandai dengan  penurunan  jumlah Lactobacillus karena  terjadinya kompetisi dalam kolonisasi sel epitel usus pada tikus yang tidak diberi asupan L. rhamnosus .
Gambar 2.  Jumlah E.  coli pada  feses  tikus  pada  kelompok  kontrol negatif,  kontrol E.  coli ,  dan  kelompok  tikus  yang  diberi L. rhamnosus R14, L.  rhamnosus R23,  dan L.  rhamnosus B16
Jumlah Lactobacillus pada  kelompok  tikus  yang  diberi asupan L.  rhamnosus cenderung  stabil  selama  periode  pe- ngujian (Gambar 3). Sehari setelah pemberian E. coli K1.1 (H8) tidak  terjadi  penurunan  jumlah Lactobacillus pada  feses kelompok tikus yang diberi L. rhamnosus (Tabel 4). Hal tersebut menunjukkan  bahwa  pemberian L.  rhamnosus mampu  mem- pertahankan  jumlah Lactobacillus dalam  saluran  pencernaan walaupun  dilakukan  pemberian E.  coli K1.1.  Walapun  terjadi diare pada kelompok tikus yang diberi L. rhamnosus R14 dan L. rhamnosus B16,  tetapi  tidak  parah.  Probiotik  dapat  mencegah infeksi  bakteri  enterik  dengan  berkompetisi  dengan  patogen untuk  berikatan  dengan  sel  epitel  dan  meningkatkan  respon imun,  baik  spesifik  maupun  non-spesifik  (Reid et  al .,  2003; Zanini et  al., 2007;  Allen et  al ., 2010).  Selain  itu,  proteksi  dari probiotik  dalam  menghambat  bakteri  patogen  karena  probiotik
6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 H0 H1 H3 H7 H8 H9 H10 H11 H12 Ju m la h La ct ob ac illu s (lo g C FU /g fe se s) Periode Pemberian Lactobacillus
Kontrol negatif Kontrol E. coli R14 R23 B16 Pemberian E. coli K.1.1
menciptakan lingkungan yang tidak sesuai bagi bakteri patogen dan berkompetisi terhadap substrat (Olivares et al. , 2006).
Gambar 3.  Jumlah Lactobacillus pada  feses  tikus  pada  kelompok kontrol  negatif,  kontrol E.  coli ,  dan  kelompok  tikus  yang diberi L.  rhamnosus R14, L.  rhamnosus R23,  dan L. rhamnosus B16
Jumlah E.  coli dan Lactobacillus pada  sekum,  kolon  dan feses tikus setelah penyembuhan diare Jumlah E. coli pada sekum, kolon, dan feses setelah tikus melalui  masa  penyembuhan  diare,  hampir  sama  untuk  semua perlakuan, yaitu pada sekum antara 7,31-7,94 log CFU/g, pada kolon 7,45-7,72 log CFU/g dan pada feses 7,07-7,90 log CFU/g. Hal yang sama pada jumlah Lactobacillus dalam sekum, kolon dan feses, setelah tikus sembuh dari diare juga tidak menunjuk- kan  perbedaan  yang  signifikan  (P>0,05)  antar  perlakuan. Setelah  tikus  sembuh  dari  diare  jumlah Lactobacillus pada sekum pada kisaran 8,40-8,64 log CFU/g, pada kolon 8,16-8,56 log  CFU/g  dan  pada  feses  8,16-8,90  log  CFU/g.  Namun demikian,  feses kelompok tikus  yang diberi L. rhamnosus R14 dan L. rhamnosus R23 mengandung Lactobacillus yang sedikit lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  kontrol,  yaitu  8,9  log  CFU/g untuk L.  rhamnosus R14  dan  8,67  log  CFU/g  untuk L. rhamnosus R23  dibandingkan  dengan  kontrol  negatif  sebesar 8,16  log  CFU/g  dan  kontrol E.  coli sebesar  8,34  log  CFU/g feses.  Sebaliknya,  kandungan E.  coli lebih  rendah  dari  pada kontrol yaitu 7,35 log CFU/g untuk kelompok L. rhamnosus R14 dan  7,12  log  CFU/g  untuk  kelompok L.  rhamnosus R23 dibandingkan  dengan  kontrol  negatif  sebesar  7,90  log  CFU/g dan kontrol E. coli sebesar 7,78 log CFU/g feses.
Hasil  pengamatan  permukaan  kolon  tikus  setelah diterminasi  disajikan  pada  Gambar  4.  Pada  permukaan  kolon tikus  yang  diberi L.  rhamnosus R23  dan  R14,  tampak  cukup banyak  bakteri  batang  pendek  yang  diduga Lactobacillus , sementara  pada  kelompok  tikus  yang  hanya  diberi E.  coli di- dominasi oleh bakteri batang panjang. Berdasarkan pengamat- an  dengan  menggunakan  mikroskop,  morfologi Lactobacillus berupa batang pendek.
Keterangan :  Bagian gambar yang berada dalam lingkaran putih merupakan bakteri yang diduga sebagai Lactobacillus. R14: L. rhamnosus R14 , R23: L. rhamnosus R23 , B16: L. rhamnosus B16
Gambar 4.  Kondisi mikrobiota kolon tikus pada akhir masa pengujian aktivitas  antidiare  dengan canning  Electron  Microscope Model –JSM 5310 LV menggunakan perbesaran 10000x

## KESIMPULAN
Lactobacillus  rhamnosus R14, L.  rhamnosus R23,  dan L. rhamnosus B16  asal  ASI  menunjukkan  aktivitas  antimikroba yang  baik  terhadap E.  coli enteropatgenik  K1.1.  Pemberian ketiga isolat Lactobacillus secara reguler berpotensi untuk men- cegah  terjadinya  diare  karena  infeksi E.  coli K1.1.  Dari  ketiga isolat Lactobacillus tersebut L. rhamnosus R23 memiliki potensi terbaik  untuk  mencegah  diare  dibandingkan  kedua  isolat L. rhamnosus lainnya. L.  rhamnosus R23  juga  mampu  menekan jumlah E. coli pada feses segera setelah tikus diberi asupan E. coli K1.1.  Ketika  tikus  sudah  mengalami  masa  penyembuhan dari diare, jumlah E. coli dan Lactobacillus pada kelompok tikus yang  diberi  asupan L.  rhamnosus maupun  kontrol,  tidak  ber- beda nyata.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis menyampaikan terimakasih kepada pihak Direktorat Jenderal  Pendidikan  Tinggi  Departemen  Pendidikan  Nasional yang  telah  mendanai  penelitian  ini  melalui  program  Hibah Kompetitf  Penelitian  Sesuai  Prioritas  Nasional  Batch  II  Tahun Anggaran  2009.  Penulis  juga  menyampaikan  terimakasih
Kontrol Negatif Kontrol E. coli E. coli + R14 E. coli +R23
E. coli +R23
kepada  Dr.  dr.  Sri  Budiarti  dari  Laboratorium  Bioteknologi Hewan  dan  Biomedis  Pusat  Sumberdaya  Hayati  dan  Bio- teknologi  LPPM  IPB,  yang  telah  memberikan  koleksi  isolat E. coli enteropatogenik  strain  K1.1  sebagai  bakteri  uji  pada penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[AIN]  American  Institute  of  Nutrition.  1977.  Report  of  the American  Institute  of  nutrition  ad  hoc  committee  on standards for nutritional studies. J Nutr 107: 1340-1348.
Allen SJ, Martinez EG, Gregorio GV, Dans LF. 2010. Probiotics for treating acute infectious diarrhoea. Cochrane Database of  Systematic  Reviews, Issue  11.  Art.  No.CD003048. DOI: 10.1002/14651858.CD003048.pub3.
Astawan  M,  Wresdiyati  T,  Arief  II,  Febiyanti  D.  2011.  Potensi bakteri  asam  laktat  probiotik  indigenus  sebagai  antidiare dan imunomodulator. J Teknol dan Industri Pangan 22: 11- 16.
Budiarti S, Mubarik NR. 2007. Extracelluler protease activity of enteropathogenic Escherichia  coli on  mucin  substrate. Hayati J Biosciences 14: 36-38.
De  Vrese  M,  Marteau  PR.  2007.  Probiotics  and  prebiotics: effects on diarrhea. J Nutr 137: 803S–811S.
[Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2008. Profil  Kesehatan  Indonesia  2007 . Departemen  Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, Indonesia.
[FAO/WHO]  Food  and  Agricultural  Organization/World  Health Organization.  2002.  Guidelines  for  The  Evaluation  of Probiotics in Food. London, Ontario, Kanada.
Gueimonde M, Laitinen K, Salminen S, Isolauri E. 2007 . Breast milk:  A  source  of  Bifidobacteria  for  infant  gut  development and  maturation?  Neonat  92:  64-66. DOI:  10.1159/ 000100088.
Hartanti  WH.  2010.  Evaluasi  Aktivitas  Antidiare  Isolat Lactobacillus dari  Air  Susu  Ibu.  [Tesis].  Sekolah  Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
Heyman M, Menard S. 2002. Probiotic microorganism: how they affect intesinal pathophysiology. Cell Mol Life Sci 59: 1-15. DOI: 10.1007/s00018-002-8494-7.
Ishida-Fuji  K,  Sato  R,  Goto  S,  Yang  XP,  Kuboki  H,  Hirano  SI, Sato  M.  2007.  Prevention  of  pathogenic Escherichia  coli infection in mice and stimulation of macrophage activation in rats by an oral adminstration of probiotic Lactobacillus casei I-5.  Biosci  Biotechnol  Biochem  71:  866-873. DOI:  10.1271 /bbb.60464.
Lewis SJ, Heaton KW. 1997. Stool form scale as a useful guide to  intestinal  transit  time.  Scand  J Gastroenterol  32:  920– 924. DOI: 10.3109/00365529709011203.
Mandomando IM, Macte EV, Sanz S, Abacassamo F, Valles X, Sacarlal J, Navia MM, Alonso P, Gascon J. 2007. Etiology of diarrhea in children younger tahn 5 years of age admitted in a rural hospital of southern Mozambique. Am J Trop Med Hyg 76: 522-527.
Martin  R,  Olivares  M,  Marin  LM,  Fernandez  L.  2005.  Probiotic potential of 3 Lactobacilli Strains Isolated from Breast Milk, J of Hum Lactat 21: 18-17. DOI: 10.1177/0890334404272393.
Michail S, Abernathy F. 2002. Lactobacillus plantarum reduces the in vitro secretory response of intestinal epithelial cells to enteropathogenic Escherichia  coli infection.  J  Pediatr Gastroenterol  Nutr  35:  350-5. DOI:  10.1097/00005176- 200209000-00021.
Michail  S,  Abernathy  F.  2003. Lactobacillus  plantarum inhibits the  intestinal  epithelial  migration  of  neutrophils  induced  by enteropathogenic Escherichia  coli. J  Pediatr  Gastroenterol Nutr 36: 385–391. DOI:  10.1097/00005176-200302000- 00018.
Nguyen RN, Taylor LS, Tauschek M, Robins-Browne RM. 2006. Atypical  enteropathogenic Escherichia  coli infection  and prolonged  diarrhea  in  children.  Emerg  Infect  Dis  12:  597- 603. DOI: 10.3201/eid1204.051112.
Olivares M, Diaz-Ropero MP, Martin R, Rodriguez JM, Xaus J. 2006.  Antimicrobial  potential  of  four Lactobacillus strains isolated from breast milk. J Appl Microbiol 101: 72-79. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2006.02981.x.
Oyetayo  VO,  Adetuyi  FC,  Akinyosoye  FA.  2003.  Safety  and protective  effect  of Lactobacillus  acidophilus and Lactobacillus casei used as probiotic agent in vivo. Afr J of Biotechnol 2: 448-452.
Oyetayo  VO.  2004.  Performance  of  rats  orogastrically  dosed with  faecal  strains  of Lactobacillus  acidophillus and challenged with Escherichia coli . Afr J of Biotechnol 3: 409- 411.
Reid  G,  Jass  J,  Sebulsky  MT,  McCormick  JK.  2003.  Potential Uses  of  Probiotics  in  Clinical  Practice.  Clinical  Microbiol. Rev 16: 658-672. DOI: 10.1128/CMR.16.4.658–672.2003.
Sherman PM, Johnson-Herry KC, Yeung HP, Ngo PSC, Goulet J,  Tompkins  TA.  2005.  Probiotics  reduce  entero- hemorrhagic Escherichia  coli O157:H7-  and  entero- pathogenic E.  coli O127:H6-Induced  changes  in  polarized T84  epithelial  cell  monolayers  by  reducing  bacterial adhesionand  cytoskeletal  rearrangements.  Infection  and Immunity  73:  5183-5188. DOI:  10.1128/IAI.73.8.51835188. 2005.
Yatsuyanagi  J,  Saito  S,  Miyajima  Y,  Amano,  K,  Enomoto,  E. 2003.  Characterization  of  atypical  enteropathogenic Escherichia  coli strains  harboring  the astA gene  that  were associated with a waterborne outbreak of diarrhea in Japan. J Clinical Microbiol 41: 2033-2039. DOI: 10.1128/JCM.41.5. 2033–2039.2003.
Zanini  K,  Marzotto  M,  Castellazzi  A,  Borsari  A,  Dellaglio  F, Torriani S. 2007. The effects of fermented milks with simple and complex probiotic mixtures on the intestinal microbiota and  immune  response  of  healthy  adults  and  children.  Int Dairy J 17: 1332–1343. DOI: 10.1016/j.idairyj.2007.01.017.
Zhang  W,  Azevedo  MSP,  Gonzalez  AM,  Saif  LJ,  Nguyen  TV, Wen  K,  Yousef  AE,  Lijuan  Yuan  L.  2008.  Influence  of probiotic  Lactobacilli  colonization  on  neonatal  B  cell responses  in  a  gnotobiotic  pig  model  of  human  rotavirus infection  and  disease.  Vet  Immunol  Immunopathol  122: 175–181. DOI: 10.1016/j.vetimm.2007.10.003.