## PENGARUH VARIASI ZAT PENGATUR TUMBUH IAA, BAP, KINETIN TERHADAP METABOLIT SEKUNDER KALUS SIRIH HITAM
( Piper betle L. Var Nigra)
Junairiah Junairiah 1* , Nurul Sofi Amalia 1 , Y. Sri Wulan Manuhara 1 , Ni’matuzzahroh Ni’matuzahroh 1 , Lilis Sulistyorini 2
1 Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga
2 Fakultas Kesehatan Masyarakat, Universitas Airlangga
* email : alip.jun1@gmail.com
Received 1 October 2019
Accepted 31 December 2019

## Abstrak
Piper  betle L.  var  Nigra  (sirih  hitam)    merupakan  salah  satu  jenis  tanaman  obat  yang berpotensi  untuk  dikembangkan  dengan  metode  kultur  jaringan.  Penelitian  ini  bertujuan untuk mengetahui pengaruh variasi zat pengatur tumbuh Indole Acetic Acid (IAA), Benzyl Amino Purine (BAP), Kinetin terhadap senyawa metabolit sekunder  yang terdapat kalus sirih  hitam.  Eksplan  daun  dari  sirih  hitam  ditanam  pada  medium  Murashige  dan  Skoog dengan  4  perlakuan  kombinasi  (I1,0K1,0;  I1,0K1,5;  I1B1,5;  I0,5B0,5).  Kalus  dipelihara selama 8 minggu. Simplisia kalus sirih hitam di maserasi menggunakan pelarut metanol dan diidentifikasi  menggunakan Gas  Chromatography  Mass  Spectra (GCMS).  Berdasarkan analisis  GCMS  menunjukkan  bahwa  senyawa  metabolit  sekunder  dengan  presentase tertinggi terdapat pada masing- masing perlakuan yaitu senyawa gamma sitosterol (14,88%) pada  perlakuan  I 1,0 K 1,0  ; senyawa 14-Beta  H  Pregna (15,94%)  pada  perlakuan  I1,0K1,5 serta senyawa beta-d-glucopyranoside (15,54%) pada perlakuan I 0 , 5 B 0,5; dan senyawa beta- d-glucopyranoside (5,63%) pada perlakuan I 1,0 B 1,5 .
Katakunci : Kalus, Piper betle L. var Nigra, senyawa metabolit sekunder

## Abstract
Piper betle L. Var Nigra (black betel) is one type of medicinal plant that has the potential to be developed by tissue culture method. This study was aims to determine the effect of variations in growth regulator Indole Acetic Acid (IAA), Benzyl Amino Purine (BAP), and Kinetin on secondary metabolite compounds contained in black betel callus. The explant of black  betel’s  leaf  was  cultured  on  Murashige  and  Skoog  medium  with  four  combination treatments  (I1.0K1.0;  I1.0K1.5;  I1B1.5;  I0.5B0.5).  The  callus  was  maintained  for  eight weeks.  Simplisia  of  black  betel’s  callus  was  macerated  using  methanol  solvent  and identified using Gas Chromatography Mass Spectra (GCMS). GCMS analysis showed that secondary metabolites with the highest percentage in each treatment were gamma sitosterol compound  (14.88%)  in  treatment  I1.0K1.0; 14-Beta  H  Pregna compound  (15.94%)  in I1.0K1.5 treatment and beta-d-glucopyranoside compound (15.54%) in I0.5B0.5 treatment; and beta-d-glucopyranoside compound (5.63%) in I1.0 B1.5 treatment.
Keywords: Callus, Piper betle L. Var Nigra, secondary metabolite compounds

## Pendahuluan
Salah satu jenis tanaman yang memiliki khasiat sebagai  obat  adalah tanaman sirih hitam  ( Piper  betle L.  var  Nigra).  Sirih hitam termasuk ke dalam famili Piperaceae yang  berpotensi  sebagai  antioksidan, antikanker, antidiabetik, dan antiinflamasi yang  dapat  menyembuhkan  berbagai penyakit. Menurut Hutapea (2000), tanaman  sirih  mengandung  metabolit sekunder  berupa  saponin,  flavonoid, polifenol,  dan  minyak  atsiri  triterpenoid, minyak  atsiri  (yang  terdiri  atas  khavikol, chavibetol, karvakrol, eugenol, monoterpena, estragol), seskuiterpen, gula dan pati.
Secara  umum  daun  sirih  mengandung minyak atsiri sampai 4,2% (Kartasapoetra 1992), senyawa fenil propanoid, dan tanin (Mahendra  2005).  Senyawa  ini  bersifat antimikroba  dan  antijamur  yang  dapat menghambat beberapa jenis bakteri antara lain Staphylococcus  aureus,  Escherichia coli,  Salmonella  sp,  Pasteurella  sp, Klebsiella  sp, dan  dapat  menghambat pertumbuhan Candida  Albicans (Agusta 2000,  Hariana  2007).  Menurut  Rija’i (2015)  sirih  hitam (Piper  betle  L.) mengandung  metabolit  sekunder  berupa alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tannin, steroid, triterpenoid, dan polifenolat.
Banyaknya  manfaat  dari  sirih  hitam karena  kandungan  bioaktif  di  dalamnya maka  perlu  dilakukan  suatu  penelitian yang  mengarah  kepada  pencarian  metode yang efektif dan efisien untuk penyediaan bahan  bahan  aktif  bermanfaat  dari  sirih hitam  dalam  jumlah  lebih  banyak  dengan waktu  yang  lebih  singkat,  yaitu  dengan kultur  jaringan.  Salah  satu  metode  kultur jaringan adalah kultur kalus, hal ini karena kalus memiliki multiplikasi tinggi, dengan kata  lain  dimana  sel  sel  kalus  dapat dipisahkan dan diinduksi untuk berdiferensiasi  menjadi  embrio  somatik sehingga mudah diperbanyak dan menghasilkan  sifat  yang  sama  sesuai dengan  induknya.  Selain  itu  juga  dapat digunakan sebagai bahan awal dilakukannya kultur protoplas dan
suspensi sel. Kultur kalus sering digunakan  untuk  memperoleh  tanaman bebas  virus,  embriogenesis  somatik, regenerasi varian genetika, dan menghasilkan senyawa metabolit sekunder (Zulkarnain, 2009).
Auksin merupakan zat pengatur tumbuh yang berfungsi untuk perpanjangan sel dan pembesaran  jaringan,  pembelahan  sel, pembentukan akar adventif dan menghambat  pembentukan  tunas  aksiler dan adventif (Sutriana et al , 2012). Auksin pada  konsentrasi  rendah  menyebabkan pembentukan akar adventif lebih dominan dan  pada  konsentrasi  tinggi dapat merangsang pembentukan kalus (Pierik et al , 1987). Sitokinin berpengaruh terhadap pembelahan sel, proliferasi kalus, morfogenesis  dengan  menginisiasi  akar, dan  pembentukan  tunas  apikal  maupun lateral dan berperan dalam perkembangan kloroplas (Wattimena, 1988).
Pembentukan  kalus  pada  eksplan, secara fisiologi dipengaruhi oleh perubahan  genetik  pada  sel  tanaman  oleh auksin.  Sel  yang  merespon  auksin  akan menyebabkan  dediferensiasi  dan  memacu pembelahan  sel  (George et  al., 2008). Salah  satu  jenis  auksin  yang  digunakan dalam kultur jaringan adalah Indole Acetic Acid (IAA).  Senyawa  IAA  merupakan auksin  alami  pada  tumbuhan  yang disintesis dari triptofan di primordial daun, daun  muda,  dan  biji  yang  sedang berkembang. IAA digunakan untuk mendorong pemanjangan sel serta menambah kemampuan sel dalam menyerap air, sehingga dapat meningkatkan  potensial  air  jaringan akibatnya sel akan mengalami pemanjangan.
Penelitian mengenai induksi kalus sirih hitam  pernah  dilakukan,  diantaranya Izdihar (2016) menyatakan bahwa induksi kalus  yang  optimal  untuk  eksplan  daun Piper  betle L.  var  Nigra  adalah  dengan kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  IAA  1,0 mg/L dan kinetin  1,5 mg/L kalus  tumbuh pada  hari  ke  10  (lama  waktu  tercepat)
dengan  berat  basah  dan  berat  kering tertinggi. Zuraidassanaaz (2016) mengungkapkan bahwa
pemberian kombinasi  zat  pengatur  tumbuh  IAA  dan BAP 0,5 mg/L menghasilkan berat kering tertinggi  sedangkan  untuk  berat  basah tertinggi  adalah  dengan  kombinasi  zat pengatur  tumbuh  IAA  1,0  mg/L  dan  1,5 mg/L.  Hasil  tercepat  terbentuknya  kalus adalah dengan lama waktu 8,5 hari dengan
kombinasi  IAA  0,5  mg/L  dan  BAP  2,0 mg/L.
Mengacu  pada  penelitian-penelitian tersebut  maka  penelitian  ini  bertujuan untuk mengetahui jenis senyawa metabolit sekunder  pada  kalus  sirih    hitam  ( Piper betle L.  var  Nigra)  dengan  penambahan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA, Kinetin dan BAP.

## Metode Penelitian

## Alat dan bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  adalah Laminar  Air  Flow (LAF), autoklaf,  oven,  timbangan  analitik,  botol kultur,  cawan  petri,  gelas  ukur, beaker glass , erlenmeyer , pipet, magnetic stirrer , aluminium foil , plastic wrap , kertas coklat, kertas pH, pinset, scalpel, bunsen, gunting, kompor  listrik,  pengaduk,  penyemprot alkohol  ( hand  sprayer ),  cawan  porselin, mortar.
Bahan yang digunakan dalam peneltian ini adalah daun kedua hingga  keempat dari pucuk tanaman sirih hitam ( Piper betle L. ). Bahan-bahan  kimia  yang  digunakan meliputi bahan penyusun media Murashige dan Skoog (MS),  zat  pengatur tumbuh Indole Acetic Acid (IAA), Benzyl Amino  Purin  ( BAP),  Kinetin,  spiritus, larutan HCI 1N dan KOH 1N, clorox 10%, alkohol 70%, akuades, metanol.

## Pembuatan media
Pembuatan  media Murashige dan Skoog (MS)  dengan  volume  1000  ml. unsur  makronutrien  yang  telah  ditimbang dilarutkan  kedalam erlenmeyer 1000  ml yang  berisi  500  ml  akuades  dan  di homogenkan menggunakan magnetic stirrer . Setelah semua terlarut, ditambahkan  stok  mikronutrien,  stok  zat besi, stok vitamin, kemudian ditambahkan 100 g myo-inositol dan 30 g sukrosa. Zat pengatur  tumbuh  IAA  ditambahkan  pada media sesuai konsentrasi yang diinginkan. pH media diukur dengan kertas pH dengan pH  optimal  berkisar  5,6-5,8.  Apabila
terlalu  asam  atau  terlalu  basa  bisa  di tambahkan  KOH  atau  HCL,  kemudian ditambahkan akuades hingga volume akhir 1000 ml. Dalam keadaan cair media di bagi dalam  botol  kultur  masing  masing sebanyak 20 ml/botol. Botol kultur ditutup dengan aluminium  foil dan  diberi  label sesuai perlakuan. Setelah media memadat, botol  kultur  di  sterilisasi  dalam  autoklaf pada suhu 121 ° C dengan tekanan 1,2 atm selama  15  menit.  Kemudian  media  yang sudah steril disimpan di ruang penyimpanan pada suhu kamar.

## Penamaan eksplan
Proses  penanaman  eksplan  dilakukan secara  aseptis  dalam laminar  air  flow (LAF).  Sebelum  LAF  digunakan  meja kerja  yang  ada  didalamnya  di  bersihkan terlebih  dahulu  menggunakan  kain  lap bersih  yang  sudah  disemprotkan  alkohol 70%.  Seluruh  alat  dan  bahan  yang  akan digunakan  untuk  menanam  eksplan  juga disemprot alkohol 70% dan dimasukkan ke dalam  LAF.  Alat  dan  bahan  tersebut diantaranya  botol  kultur  berisi  media, pinset,  skalpel,  mata  pisau,  cawan  petri, gelas  ukur, erlenmeyer ,  daun  sirih  hitam yang  sebelumnya  telah  dicuci  dengan deterjen, clorox 10%,  akuades  steril, plastic  wrap ,  bunsen.  Selanjutnya  lampu ultra violet yang ada di dalam laminar air flow dinyalakan  selama  15-20  menit. Setelah 20 menit lampu UV dimatikan dan lampu neon serta blower dinyalakan, maka ruang kerja siap digunakan.
Sebelum  ditanam  eksplan  di  sterilisasi menggunakan clorox 10% dalam erlenmeyer dan  digojok  selama  7  menit, kemudian  larutan clorox dibuang  dan dibilas menggunakan akuades sebanyak 3 kali. Eksplan daun steril kemudian diambil dengan pinset dan dipotong dengan ukuran kurang  lebih  1 × 1  cm  diatas  cawan  petri yang  dialasi  dengan  kertas  saring. Kemudian  dimasukkan  ke  dalam  botol kultur  yang  berisi  media.  Pinset  dan skalpel harus selalu dipanaskan dengan api bunsen  untuk  memastikan  tetap  steril, sebelum di gunakan untuk mengambil atau memasukkan  eksplan.  Botol  yang  telah berisi  eksplan  ditutup  menggunakan aluminium foil dan dilapisi dengan plastic wrap . Kemudian botol yang berisi eksplan tersebut  diletakkan  di  dalam  ruang inkubator  dengan  suhu  25 ° C  dengan cahaya neon 20 watt secara terus menerus.

## Ekstraksi kalus sirih hitam
Kalus yang terbentuk dari eksplan daun sirih hitam selama masa inkubasi dikeringkan  dalam  oven.  Kalus  kering tersebut dihaluskan dalam cawan porselin menggunakan  mortar  hingga  menjadi serbuk. Serbuk diekstraksi dengan metode maserasi  menggunakan  pelarut  metanol. Proses  maserasi  dilakukan  dengan  cara merendaman  serbuk  kalus  dengan  pelarut metanol  selama  48  jam,  kemudian dipisahkan ampas dan larutan dengan cara disaring  menggunakan  kertas  saring.
Larutan  tersebut kemudian  dikering anginkan,  sehingga  terbentuklah  ekstrak kalus sirih hitam.
Analisis Gas Chromatography-Mass
Spectrometry (GC-MS)
Ekstrak  kalus  sirih  hitam  di  analisis dengan  GCMS-Agilent  19091S-105.  Gas helium  digunakan  sebagai  gas  pembawa dengan  kecepatan  1  ml/min,  ukuran sampel 1µL yang diinjeksikan menggunakan  kapiler  silika  kolom  HP-5 (60  m  ×  200  µm  ×  0,33  µm).  Suhu  oven 40 ° C selama 5 menit, kemudian dinaikkan hingga  mencapai  250 ° C  dengan  laju 2 °C /menit.  Total  running  time  GC  adalah 130 menit. Spektrum massa dari senyawa tersebut  dibandingkan  dengan  standar yang  ada  pada  data  base  Library  Willey. Library  Willey  merupakan  perpustakaan senyawa-senyawa yang digunakan sebagai standar untuk mencocokkan senyawa yang teridentifikasi pada sampel.
Hasil  maserasi  pada  masing-masing perlakuan  kalus,  selanjutnya  dilakukan identifikasi  senyawa-senyawa  metabolit sekunder  dengan  menggunakan  GC-MS. Hasil  maserasi  yang  berupa  ekstrak diinjeksikan pada alat Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC- MS).  Setelah  itu  akan  didapatkan  profil keseluruhan  senyawa  yang  terekam  pada komputer. Data pada komputer menunjukkan  jumlah  dan  jenis  senyawa ekstrak kalus sirih hitam.

## Hasil dan Pembahasan
Hasil  analisis  senyawa  dalam  ekstrak metanol  kalus  sirih  hitam  pada  perlakuan I 1,0 K 1,0 mengandung  26  jenis  senyawa ( Tabel  1 ).  Dari  semua  jenis  senyawa tersebut, 5 jenis senyawa dengan presentase  luas  area  terbesar  adalah Hexadecanoic  acid (20,69%); Oleic  Acid (15,2%); Gamma sitosterol (14,88%); dan Linoelaidic  Acid (12,73%); Beta  -H- Pregna (7,44%). Gamma  sitosterol dan Beta-H-Pregna merupakan senyawa metabolit  sekunder  golongan  steroid, sedangkan Hexadecanoic acid, Oleic Acid,
dan Linoelaidic Acid merupakan senyawa metabolit  primer  golongan  asam  lemak. Senyawa Linoelaidic  acid atau  dapat disebut  juga  asam  linoleat  merupakan rantai panjang lemak tak jenuh ganda yang mengandung  omega  6  (Diana,  2012). Asam  linoleat  memiliki  aktivitas  anti histaminic ,  anti coronary ,  anti acne, anti bakteri,  anti  jamur,  anti  arthritis,  dan  anti inflamasi  (Dineskumar,  2015).  Menurut Wu et  al. (2010)  asam  linoleat  juga memiliki aktivitas seperti hepatoprotective dan  hypocholestrolemic.  Asam  linoleat
juga  dapat  ditemukan  dalam  analisis
GCMS terhadap
ekstrak etanol Pleiospermium  alatum ,  dengan  luas  area sebesar  8,36%  (Parthipan,  2015),  juga dalam ekstrak Fluggea leucopyrus dengan luas  area  5,78  %  (Sudha,  2013),  serta dalam  ekstrak  daun Marsilea  quadrifolia
dengan  luas  area sebesar  12,96  % (Gopalakrishnan,  2014).  Pada  extract metanol kalus Justicia gendarussa kombinasi  IAA  dan  BAP,  teridentifikasi secara  GCMS  dengan  luas  area  sebesar 0,88 % (Wahyuni, et al 2017).
Tabel 1. Hasil identifikasi kandungan senyawa ekstrak metanol kalus sirih hitam perlakuan I 1,0 K 1,0
No Waktu Retensi (menit) Luas area (%) Nama Senyawa 1 8,840 0,42 Pyridine 2 11,621 0,52 Pyrazine 3 12,125 0,31 2-Furancarboxaldehyde 4 19,483 0,93 5-Methyl furfural 5 36,895 0,80 1-Pyrrolidineethanamine 6 37,124 0,95 Cyclopentamine 7 49,953 3,38 L-Proline, 5-oxo-, Methyl ester 8 68,034 0,49 Benzyl methyl ether 9 71,690 0,52 Tetradecanoid acid 10 71,845 0,01 Beta D-Glucopyranoside 11 81,941 20,69 Hexadecanoic acid 12 86,035 0,17 1-Octadecene 13 87,014 5,71 1-Octadecanol 14 88,324 1,26 Benzyl methyl ether 15 89,629 12,73 Linoelaidic acid 16 89,921 15,26 Oleic Acid 17 95,809 1,52 Cyclohexadecane 18 100,119 7,44 Beta -H-Pregna 19 100,598 0,11 Octatriacontyl pentafluoropropionate 20 100,621 0,13 Cyclooctacosane 21 103,573 0,26 Dotriacontyl heptafluorobutyrate 22 110,211 0,26 Hentriacontane 23 113,043 0,97 Tetratriacontyl pentafluoropropion 24 117,483 1,53 Squalene 25 119,738 0,10 1-Bromo-11-iodoundecane 26 127,800 14,88 Gamma sitosterol
Pada Tabel  2 pada  perlakuan    I 1,0 K 1,5 menunjukkan  bahwa  terdapat  32  jenis  senyawa fitokimia yang diprediksi terkandung dalam ekstrak kalus dengan perlakuan I 1,0 K 1,5 dalam retensi  waktu  1  hingga  122  menit.  Masing-masing  senyawa  memiliki  luas  area  yang berbeda-beda. Lima senyawa dengan  presentase luas area tertinggi di antaranya 14-Beta- H-Pregna (15,94  %) ;  Oleic  acid (10,86%) ;  L-proline,  5-oxo,  methyl  ester (7,86%) ; Hexadecanoic acid (7,25%) ; dan Dotriacontyl heptafluorobutyrate (3,77%).
Tabel 2. Hasil identifikasi kandungan senyawa ekstrak metanol kalus sirih hitam perlakuan I 1,0 K 1,5
No Waktu Retensi (menit) Luas area (%) Nama Senyawa 1 6,815 0,26 Butanal 2 7,307 0,41 Silane, dimethoxymethyl 3 8,840 0,23 Pyridine 4 11,564 0,13 Pyrazine 5 12,050 0,10 2-furancarboxaldehyde 6 16,290 0,14 Oxirane, 2-ethyl-2-methyl 7 19,357 0,44 Methyl furfural 8 27,711 0,25 2-Pyrrolidinone 9 29,222 0,26 Oxcalic acid 10 35,470 0,52 Formyl glutamine 11 48,368 1,03 2-piperidinecarboxcylic acid 12 48,717 0,97 4-methylproline methyl ester 13 50,176 7,86 L-proline, 5-oxo, methyl ester 14 51,973 0,68 Piperidinemethanol 15 78,831 0,11 1-Glutamic acid 16 81,898 7,25 Hexadecanoic acid 17 86,997 3,72 1- Octadecane 18 89,617 4,19 Linoelaidic acid 19 89,892 10,86 Oleic acid 20 90,819 1,27 Octadecanoic acid 21 100,152 0,08 Cyclohexadecane 22 105,433 0,94 Celidoniol deoxy 23 106,537 0,90 9-Eicosene 24 107,098 1,07 Octatriacontyl pentafluoropropionate 25 108,591 15,94 14-Beta-H-Pregna 26 110,176 1,94 Propionic acid, 3-iodo, octadecylester 27 110,325 1,31 Aspidospermidin 28 111,304 1,52 1-octadecanol 29 113,192 3,77 Dotriacontyl heptafluorobutyrate 30 114,050 0,59 Hexatriacontyl pentafluoropropiona 31 117,466 3,75 Squalene 32 122,627 3,09 Silane, trichlorooctadecyl
Pada Tabel  3 pada  perlakuan  I 1,0 B 1,5 menunjukkan  bahwa  terdapat  26  jenis senyawa  fitokimia  yang  di  prediksi terkandung  dalam  ekstrak  kalus  dengan perlakuan  I 1,0 B 1,5 dalam  retensi  waktu  1
hingga 127 menit. Masing-masing
senyawa memiliki luas area yang berbeda-
beda.  Lima  senyawa  dengan  presentase luas area tertinggi di antaranya Hexadecanoid acid (18,75%) ; Linoelaidic acid (17,07%) ; Oleic acid (16,13 %) ; Beta,
D-Glucopyranoside, methyl (15,54%) ; dan Heptanoic acid (3,05%).
Tabel 3. Hasil identifikasi kandungan senyawa ekstrak metanol kalus sirih hitam perlakuan I 1,0 B 1,5
No Waktu Retensi (menit) Luas area (%) Nama Senyawa 1 6,678 0,39 Butanal 2 8,823 0,42 Pyridine 3 11,558 0,56 2-methyl pyrazine 4 12,045 0,89 2-furan-carboxadehyde 5 14,671 0,24 Protoanemonine 6 16,394 0,15 Piperazine 7 19,352 1,17 5-methyl furfural 8 37,290 1,53 Glutamine 9 50,382 1,77 Methyl 5-oxo-2-pyrrolidinecarboxylate 10 71,776 1,26 Tetradecanoic acid 11 73,527 15,54 Beta, D-Glucopyranoside, methyl 12 74,540 3,05 Heptanoic acid 13 79,638 0,84 Hexadecanoic acid, methyl ester 14 82,110 18,75 Hexadecanoid acid 15 86,276 0,55 Trans-2-tridecenal 16 86,985 0,97 1-Octadecene 17 89,881 17,07 Linoelaidic acid 18 90,144 16,13 Oleic acid 19 95,797 0,32 5-Eicosene 20 106,063 0,35 Acetic acid 21 107,813 0,33 2,6,10-dodecatrienal, 3,7,11 trimethyl 22 109,490 0,60 Glycine 23 110,171 0,28 1-Octadecanol 24 113,020 0,64 14 beta H- Pregna 25 117,461 1,07 Squalene 26 127,028 2,21 gamma sitosterol
Pada Tabel  4 pada  perlakuan  I 05 B 0,5 menunjukkan  bahwa  terdapat  25  jenis senyawa  fitokimia  yang  di  prediksi terkandung  dalam  ekstrak  kalus  dengan perlakuan  I 05 B 0,5 dalam  retensi  waktu  1
hingga 127 menit. Masing-masing senyawa memiliki luas area yang berbeda-
beda.  Lima  senyawa  dengan    presentase luas area tertinggi diantaranya Linoelaidic acid (28,52%) ; Hexadecanoic acid
(22,30%) ; Beta.-D-Glucopyranoside,
methyl (5,63%) ;  Gamma  -  sitosterol (4,30%) dan Octadecanoic acid (3,95%).
Tabel  4. Hasil  identifikasi  kandungan  senyawa  ekstrak  metanol  kalus  sirih  hitam  pada perlakuan I 05 B 0,5 No Waktu Retensi (menit) Luas area (%) Nama Senyawa 1 8,783 0,42 Pyridine 2 11,507 0,85 Pyrazine metyl 3 11,982 0,62 Furfural 4 14,637 0,40 Protoanemonine 5 19,266 0,84 5-Methyl furfural 6 24,622 0,18 Benzeneacetaldehyde 7 29,411 0,62 2-Pyrrolidinone 8 37,279 0,47 L-Glutamine 9 47,504 0,37 2-methoxy-3-methylhydroquinon 10 50,657 1,81 DL-Proline, 5-oxo-methhyl ester 11 71,805 0,42 Tetradecanoic acid 12 75,301 5,63 Beta.-D-Glucopyranoside, methyl 13 76,022 0,83 Heptanoic Acid 14 80,714 2,01 Pentadecanoic acid 15 82,190 22,30 Hexadecanoic acid 16 87,008 2,83 1-Octadecanol 17 90,201 28,52 Linoelaidic acid 18 91,037 3,95 Octadecanoic acid 19 95,809 0,53 1-Hexadecane 20 106,068 0,35 Acetic acid 21 110,188 0,56 Linoleic acid ethyl ester 22 114,783 0,22 7-Pentadecyne 23 115,035 1,30 14-beta-H- Pregna 24 117,461 1,64 Squalene 25 127,222 4,30 Gamma  sitosterol Senyawa Hexadecanoic acid atau dapat disebut  juga  asam  palmitat  memiliki  efek anti bakteri dan kolestrolemik (Dineshkumar, 2015). Menurut Jegadeeswari et  al (2012)  Senyawa hexadecanoic  acid atau  asam  palmitat memiliki aktifitas sebagai antioksidan, anti androgenik,  anti  fungal,  anti  tumor,  anti bacterial, hemolytic, pesticide, dan lubricant.  Pada  extract  metanol  kalus Justicia  gendarussa perlakuan  kombinasi IAA  dan  BAP,  teridentifikasi  secara
GCMS  dengan  luas  area  sebesar  2,69  % (Wahyuni, et al 2017). Senyawa Hexadecanoic  acid juga  dapat  ditemukan dalam  analisis  GCMS  terhadap  ekstrak etanol Pleiospermium alatum , dengan luas area sebesar 6,11% (Parthipan, 2015), juga dalam  ekstrak  daun Marsilea  quadrifolia dengan  luas  area sebesar  17,47  % (Gopalakrishnan,  2014). Hexadecanoic acid sebesar  1,61  %  juga  teridentifikasi dengan  GCMS  pada  ekstrak  kalus Solanum melongena (Vanitha, 2016).
Senyawa gamma sitosterol selain pada perlakuan I 1,0 K 1,0 juga teridentifikasi pada perlakuan I 05 B 0,5 dengan luas area 4,30 % dan I 1,0 B 1,5 dengan luas area 2,21%, luas area terbesar  yaitu 14,88 % terdapat pada perlakuan I 1,0 K 1,5 . Senyawa gamma sitosterol berperan  dalam  mengurangi hiperglikemia dan
penghambatan glikogenesis,  sehingga  dapat  digunakan dalam pengobatan diabetes melitus, senyawa gamma sitosterol juga ditemukan pada analisis GCMS terhadap ekstrak daun Girardinia  heterophylla (Tripathi,  2013). Menurut  Balamurugan  (2011), gamma sitosterol dapat  dipertimbangkan  untuk menjadi  obat  anti  diabetic.  Dalam penelitian  Anand, et  al (2018)  dalam ekstrak  metanol  kalus  Ampelicissus latifolia  teridentifikasi  secara  GCMS senyawa  gamma  sitosterol  dengan  luas area sebesar 9,19 %, senyawa ini memiliki aktivitas  anti  microbial,  anti  inflamatory, anti kanker, dan anti oksidan.
Selanjutnya senyawa 14 Beta H Pregna juga  ditemukan  pada  semua  perlakuan (I 1,0 K 1,5 ;  I 1,0 B 1,5 ;  I 05 B 0,5 ).  Perlakuan dengan  luas  area  terbesar  adalah  I 1,0 K 1,5 dengan  luas  area  15,94  %  dan  luas  area terendah  sebesar  0,64  %  pada  perlakuan I 1,0 B 1,5 .  Senyawa 14  Beta  H  Pregna memiliki sifat anti diabetik, seperti halnya dalam  penelitian  ini  senyawa 14  Beta  H Pregna juga  ditemukan  dalam Urginea indica sebesa r 0,50 % (Prabakaran, 2016). Hasil  analisis  senyawa  dari  ekstrak metanol  kalus  sirih  hitam  pada  perlakuan I 1,0 K 1,5 mengandung  32  jenis  senyawa. Dari semua jenis senyawa tersebut, 5 jenis senyawa  dengan  presentase  luas  area terbesar  adalah  Senyawa 14  Beta  H Pregna dengan  waktu  retensi  108,59 menit,  luas  area  15,94  %. Oleic  acid dengan  waktu  retensi  89,89  menit,  luas area  10,86  %. L-proline-5-oxo-methyl ester dengan  waktu  retensi  50,17  menit, luas  area  7,86  %. Hexadecanoic  acid dengan  waktu  retensi  81,89  menit,  luas area  7,25  %. Linoelaidic  acid dengan waktu retensi 89,1 menit, luas area 4,19 %. L-proline-5-oxo-methyl  ester merupakan
senyawa  metabolit  sekunder  golongan alkaloid. Selain teridentifikasi pada perlakuan  I 1,0 K 1,5 L-proline-5-oxo-methyl ester juga  dapat  ditemukan  pada  semua perlakuan  (I 1,0 K 1,5 ;  I 1,0 B 1,5 ;  I 05 B 0,5 ).  Luas area  terbesar  terdapat  pada  perlakuan I 1,0 K 1,5 sebesar 7,8 %, sedangkan luas area terendah  terdapat  pada  perlakuan  I 1,0 B 1,5 sebesar 1,77 %.
Senyawa oleic  acid selain  pada perlakuan I 1,0 K 1,5 dengan luas area 10,8 % juga  terdapat  dalam  perlakuan  I 1,0 B 1,5 dengan  luas  area  terbesar  yaitu  16,13  %. Senyawa oleic acid atau dapat disebut juga asam oleat merupakan rantai panjang asam lemak tak jenuh tunggal yang mengandung omega 9 memiliki aktivitas anti tumor dan anti  inflammatory,  menurut  Romero (2007)  asam  oleat  memiliki  memiliki aktifitas bakterisidal terhadap Helicobacter pylori, yang merupakan agen penyebab ulkus lambung. Konsumsi asam oleat yang tinggi dapat mengurangi resiko perkembangan  kanker,  terutama  kanker payudara  dan  prostat  (Campos,  2013). Menurut  Teres  (2008),  asam  oleat  dapat menghambat perkembangan adrenoleukodystrophy  (ALD)  penyakit fatal  yang  mempengaruhi  otak  dan kelenjar  adrenal. Asam oleat juga bertanggung  jawab  untuk  mengurangi tekanan darah. Dalam penelitian Parthipan et  al (2015)  asam  oleat  ditemukan  dalam analisis  GCMS  terhadap  ekstrak  etanol Pleiospermium  alatum ,  dengan  luas  area sebesar 5,88%.
Hasil  analisis  senyawa  dari  ekstrak metanol  kalus  sirih  hitam  pada  perlakuan I 1,0 B 1,5 mengandung  26  jenis  senyawa (Tabel  4.8).  Dari  semua  jenis  senyawa tersebut, 5 jenis senyawa dengan presentase  luas  area  terbesar  adalah Hexadecanoic  acid dengan  waktu  retensi 82,11  menit,  luas  area  18,75  %. Linoelaidic  acid dengan  waktu  retensi 89,88 menit, luas area 17,07 %. Oleic acid dengan  waktu  retensi  90,14  menit,  luas area  16,13  %. Beta  D-glucopyranoside methyl dengan waktu retensi 73.52 menit, luas area 15,54 %. Heptanoic acid dengan
waktu  retensi  74,54  menit,  luas  area  3,05 %. Beta D-glucopyranoside methyl merupakan  senyawa  metabolit  sekunder golongan  flavonoid,  selain  teridentifikasi dalam  perlakuan  I 1,0 B 1,5 dengan  luas  area terbesar  yaitu  15,54  %, Beta  D- glucopyranoside  methyl juga  terdapat dalam  perlakuan  I 1,0 B 1,5 dengan  luas  area 5,63%.
Senyawa
Heptanoic acid juga teridentifikasi  pada  perlakuan  I 05 B 0,5 dengan  luas  area  0,83  %.  Luas  area terbesar  yaitu  3,05  %  terdapat  pada perlakuan  I 1,0 B 1,5 .  Senyawa Heptanoic acid tidak  ditemukan  dalam  perlakuan IAA-Kinetin,  hal  ini  sejalan  dengan penelitan  Wahyuni  menggunakan  ekstrak metanol daun Justicia gendarussa dengan analisis  GCMS  teridentifikasi  senyawa Heptanoic acid pada ekstrak metanol kalus Justicia  gendarussa  sebesar  1,68  %  pada perlakuan  NAA-Kinetin,  namun  tidak teridentifikasi pada perlakuan IAA- Kinetin. Heptanoic acid memiliki aktivitas anti inflamasi.
Dalam  penelitian  Kala  (2018)  ekstrak metanol kalus daun Biophytum sensitivum teridentifikasi  senyawa octadecanic  acid sebesar  5,25  %. Octadecanic  acid terdiri dari  antihipertensi,  meningkatkan  HDL dan  menurunkan  Kolesterol  LDL.  Asam Oktadekanoat  adalah  asam  lemak  jenuh, dan  menunjukkan  penurunan  tingkat Kolesterol LDL yang lebih Rendah. Asam lemak tak jenuh penting untuk pertumbuhan  normal,  terutama  pembuluh darah  dan  saraf  untuk  menjaga  kulit  dan jaringan lain agar tetap muda dan sehat. Di sisi  lain  asam  oktadekanoat  memiliki aktivitas  antibakteri  dan  anti  fungal (Gopalakrishna,  2014).  Dalam  penelitian
Wahyuni  (2017)  menggunakan  ekstrak metanol daun Justicia gendarussa dengan analisis  GCMS  teridentifikasi  senyawa octadecanoic  acid sebesar  6,41  %,  luas area  tersebut  terdapat  pada  kombinasi perlakuan  IAA  dan  BAP.  Sedangkan dalam  penelitian  ini  ditemukan  senyawa octadecanoic  acid dengan  luas  area  lebih kecil  yaitu,  sebesar  3,95  %.  Senyawa octadecanoic  acid juga  mengandung  anti oksidan  (Wahyuni, 2016). Senyawa gamma sitosterol , 14-beta-h-pregna , beta- d-glucopyranoside ,  dan L-proline-5-oxo- methyl  ester merupakan  senyawa  baru yang  di  temukan  pada  ekstrak  kalus  sirih hitam  kombinasi  IAA,  BAP,  kinetin,  dan senyawa  tersebut  tidak  ditemukan  pada ekstrak  daun  sirih  hitam  (Junairiah, et  al 2018).

## Kesimpulan
Senyawa  metabolit  sekunder  dengan jumlah  tertinggi  pada  ekstrak  metanol perlakuan I 1,0 K 1,0 adalah senyawa gamma sitosterol (14,88%); ekstrak metanol pada perlakuan I 1 K 1,5 adalah senyawa 14-beta- h-pregna (15,94 %); ekstrak metanol pada perlakuan I 0 , 5 B 0,5 adalah senyawa beta-d- glucopyranoside (15,54%);  dan  ekstrak metanol  pada  perlakuan  I 1,0 B 1,5 adalah senyawa beta-d-glucopyranoside (5,63%).

## Ucapan Terima Kasih
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada Kementerian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi yang memberikan dana penelitian melalui hibah penelitian PTUPT (Penelitian  Terapan  Unggulan  Perguruan Tinggi).

## Daftar Pustaka
Agusta, A. 2000. Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika  Indonesia .  Bandung:  ITB
Press.
Anand, D. C., Meena, R., & Patni, V. 2018. In  Vitro  Callus  Induction  and Comparative  GC-MS  Analysis  of Methanolic Extract of Callus and Leaf Samples  of Ampelocissus  latifolia (Roxb) Planch. International  Journal of  Pharmacy  and  Pharmaceutical Science, 10(9), 68-72.
Balamurugan,  R.,  Duraipandiyan,  V.,  & Ignacimuthu,  S.  2011.  Antidiabetic Activity of  γ-Sitosterol Isolated from Lippia  nodiflora L.  in  Streptozotocin Induced  Diabetic  Rats. European Journal Pharmacology , 667, 410-418. Campos,  H.  E.,  Peghini,  B.  C.,  Souza,  P. R., & Silva, J. S. 2012. An Overview of  the  Modulatory  Effect  of  Oleic Acid  in  Health  and  Disease. Mini- Reviews in Mdicinal Chemistry, 13(2), 1-7.
Dineshkumar,  G.  And  Rajakumar,  R.
2015. GC-MS Evaluation of Bioactive Molecules  from  the  Methanolic  Leaf Extract  of Azadirachta  indica . Asian Journal of Pharmaceutical Science & Technology , 5(2), 64-69.
Diana,  F,  M.  2012.  Omega  6. Jurnal Kesehatan Masyarakat , 7(1), 26-31. George,  E.  F  &  P.  D.  Sherington.  1984. Plant Propagation by Tissue Culture. England: Handbook and Directory of Comercial Laboratories, Easter Press.
Gopalakrishna, N. K., & Udayakumar, R.
2014. GC-MS Analysis of Phytocompounds of Leaf and Stem of Marsilea quadrifolia (L.). International Journal of Biochemistry Research & Review , 4(6), 517-526. Hariana,  A.  2007. Tumbuhan  Obat  dan
Khasiatnya . Jakarta: Penebar Swadaya.
Hutapea, Johnny, Ria, dkk. 2000.
Inventaris  Tanaman  Obat  Indonesia
III .  Jakarta:  Badan  Penelitian  dan
Pengembangan Kesehatan.
Jegadeeswari,
P., Nishanthini, A., Muthukumaraswamy,  S.,  Mohan,  V. R.  2012.  GC-MS  Analysis  of Bioactive Components of Aristolochia krysagathra
(Aristolochiaceae). Journal Chemical Pharmaceutical Science , 2, 226-236. Junairiah, Ni’matuzahroh, & Sulistyorini,
L. 2018. GCMS Analysis of Bioactive Compounds  in  n-Hexane,  Ethyl Acetate,  and  Methanol  Extract  of Piper  betle  L.  var.  Nigra. Bioscience Research , 15(3), 1472-1479. Kartsapoetra, G. 1992. Budidaya Tanaman Berkhasiat  Obat .  Jakarta:  Rineka Cipta.
Mahendra,  B. 2005. Jenis  Tanaman Obat Ampuh . Jakarta: Penebar Swadaya. Parthipan,  B.,  Suky,  M.  G.  T.,  &  V.  R. Mohan.  2015.  GC-MS  Analysis  of Phytocomponents  in Pleiospermium alatum (Wall.  ex  Wight  &  Arn.) Swingle,  (Rutaceae). Journal  of Farmcognosy  and  Phytochemistry , 4(1), 216-222.
Prabakaran,  R.,  Joseph,  B.,  &  Pradeep  P.
N. 2016. Phyto Medicinal Compounds from Urginea  indica Kunth:  A Synthetic Drugs Potential Alternative. British  Journal  of  Pharmaceutical Research , 11(5), 1-9.
Pierik,  R.  I. M. 1987. In Vitro Culture of Higher  Plants :  119.  Netherlands: Martinus Nijhoff Publishers.
Romero,  C.,  Medina,  E.,  Vargas,  J., Brenes, M., & De Castro, A. 2007. In Vitro Activity of Olive Oil Polyphenols  Against Helicobacter pylori . Journal  Agricultural  Food Chemical , 55, 680-686
Sudha,  T.,  Chidambarampillai,  S.,  &
Mohan, V. R. 2013. GC-MS Analysis of  Bioactive  Components  of  Aerial Parts  of Fluggea  leucopyrus Willd. (Euphorbiaceae). Journal  of  Applied Pharmaceutical  Science , 3(5),  126- 130.
Sutriana,  S.,  Jumin,  H.  B.,  &  Gultom,  H. 2012.  Interaksi  BAP  (Benzil  Amino Purin) dan  IAA (Indole  Acetic Acid) pada  Eksplan Anthurium    sp. dalam Kultur Jaringan. Dinamika Pertanian ,
XXVII (3), 131-140.
Teres, S., Barcelo-Coblijn, G., Benet, M.,
Alvarez, R., Bressani, R., & Halver, J. E.  2008.  Oleic  Acid  Content  is Responsible  for  the  Reduction  in Blood Pressure Induced by Olive Oil. Pro. Natl Acad Sci USA , 105, 13811- 13816.
Tripathi, N., Kumar, S., Rakesh S., Singh,
C.J.,  Prashant,  S.,  &  V.K.Varshne. 2013. Isolation and Identification of γ- Sitosterol by GC-MS from the Leaves of Girardinia heterophylla. The Open Bioactive Compounds Journal , 4, 25- 27.
Vanitha,  A.,  Kalimuthu,  K.,  Chinnadurai,
V., Sharmila Juliet., Y., & Prabakaran R. 2016. GCMS Analysis of Leaf and
Salt  Stress  Callus  of  Eggplant ( Solanum  melongena L). British Journal of Pharmaceutical Research , 14(6), 1-11.
Wahyuni,  D.  K,  Ansori,  A.  N.  M., Vidiyanti,  F.  2017.  GC-MS  Analysis of  Phytocomponents  in  Methanolic Extract  of  Leaf-Derived  Callus  of
Justicia gendarussa Burm.f. Bioscience Research , 14(3), 668-677.
Wattimena, Gunawan, L.W., & Armini A. N.  1992. Bioteknologi  Tanaman . Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Pusat Antar Spesies IPB.
Wu, L., Gao, H., Wang, X., Ye, J., Lu, J., &  Liang,  Y.  2010.  Analysis  of
Chemical Composition of Chrysanthemum  indicum Flowers  by GC/MS and HPLC. Journal Medicinal Plants Research , 4(5), 421- 426. Zulkarnain. 2011. Kultur Jaringan Tanaman . Jakarta: Bumi Aksara.
.