PERKEMBANGAN KULTUR IN VITRO PADA TANAMAN KARET ( Hevea brasiliensis , Müell. Arg.) MELALUI EMBRIOGENESIS SOMATIK DI CIRAD PERANCIS
Development of  In vitro Culture of  Rubber (Hevea brasiliensis, Müell. Arg.) by Somatic Embryogenesis in CIRAD France
Ari Fina Bintarti Balai Penelitian Sembawa, Jl. Raya Palembang-Betung, Km. 29 PO Box: 1127, Palembang 30001, Indonesia E-mail: arifinabintarti@gmail.com
Diterima tanggal 8 Desember 2014/Direvisi tanggal 11 Maret 2015/Disetujui tanggal 18 Maret 2015

## Abstrak
Embriogenesis  somatik  menjadi  alternatif perbanyakan klonal pada tanaman karet untuk mendapatkan  bahan  tanam  dengan  sistem perakaran  sendiri  dan  identik  dengan induknya. Penelitian mengenai embriogenesis somatik  pada  tanaman  karet  sudah  banyak dilakukan  oleh  lembaga  penelitian  di  dunia, salah  satunya  adalah  lembaga  penelitian swasta  CIRAD  Perancis.  Berbagai  penelitian dalam  upaya  pengembangan  metode embriogenesis  somatik  tanaman  karet  telah diteliti  mulai  tahun  1970-an,  meliputi E m b r i o g e n e s i s   S o m a t i k   P r i m e r , Embriogenesis Somatik Jangka Panjang atau, dan Embriogenesis Somatik Sekunder. Selain itu, tim peneliti di CIRAD juga telah berhasil mengembangkan  teknologi  kriopreservasi atau  penyimpanan  jangka  panjang  di  dalam nitrogen  cair  yang  dikaitkan  dengan Embriogenesis  Somatic  Sekunder  untuk menyeleksi dan menetapkan galur-galur kalus yang  mempunyai  kapasitas  embriogenik  dan regenerasi  tinggi.  Walaupun  begitu,  teknik e m b r i o g e n e s i s   s o m a t i k   b e l u m   b i s a diaplikasikan  secara  luas  untuk  perbanyakan tanaman karet secara massal, karena beberapa kendala.  Lebih  jauh,  teknik  embriogenesis somatik dan kriopreservasi dapat mendukung p r o g r a m   p e mu l i a a n   t a n a m a n   u n t u k menciptakan  tanaman  karet  transgenik dengan  sifat-sifat  agronomis  unggul  seperti
toleran  terhadap  stress  abiotik  dan  produksi lateks tinggi.
Kata  kunci: Hevea  brasiliensis ,  embriogenesis somatik, CIRAD, kriopreservasi

## Abstract
Somatic  embryogenesis  become  an  alternative method for clonal micropropagation of  rubber tree to produce  self-rooted  and  true-to-type  planting materials.  Study  on  somatic  embryogenesis  of rubber tree has been conducted by a lot of  research teams  over  the  world,  one  of   them  is  a  private research  institute  in  France  CIRAD.  Various  of study  in  order  to  develop  the  efficiency  of   somatic embryogenesis  method  in  rubber  tree  had  been conducted  from  1970s  including  Primary  Somatic Embryogenesis,  long-term  or  Maintained  Somatic Embr yogenesis,  and  Secondar y  Somatic Embryogenesis.  Beside,  the  research  team  of CIRAD  was  successfully  developing  the cryopreservation  technique  in  order  to  long-term preserve  of   high  embryogenic  callus  lines  in ultralow-temperature  of   liquid  nitrogen.  This technique was collaborated with secondary somatic embryogenesis  as  an  efficient  srategy  to  select  and establish of  high embryogenic callus lines. However, micropropagation by somatic embryogenesis has not been able to be applied as a mass propagation method of   rubber  tree  because  of   some  limitations. Furthermore,  both  somatic  embryogenesis  and cryopreservation technique is a technology package
to  support  plant  breeding  program  to  produce transgenic  planting  materials  that  provide agronomically  beneficial  properties  by  introducing of   genes  of   interest  such  as  abiotic  stress  tolerance and high-latex productivity.
K e y w o r d s :   H e v e a   b r a s i l i e n s i s ,   s o m a t i c embryogenesis, CIRAD, cryopreservation

## Pendahuluan
Perbanyakan  tanaman  karet  ( Hevea brasiliensis ,  Müell.  Arg.)  melalui  okulasi mempunyai  beberapa  kekurangan.  Tanaman hasil  okulasi  mempunyai  batang  bawah  dari biji  sehingga  memiliki  heterogenisitas i n t r a k l o n a l   ya n g   t i n g g i .   S e l a i n   i t u , inkompatibilitas antara batang atas dan batang bawah juga dapat menurunkan kejaguran dan produktivitas  tanaman.  Oleh  karena  itu, perbanyakan  mikro  melalui  kultur in  vitro , seperti  embriogenesis  somatik  (ES)  menjadi alternatif   untuk  mendapatkan  bahan  tanam klonal dengan yang identik dengan induknya.
Embriogenesis somatik pada tanaman karet telah  berhasil  dilakukan  oleh  beberapa lembaga  penelitian  di  dunia  dengan menggunakan  berbagai  jenis  eksplan diantaranya  anter,  integumen  biji  muda, kotiledon,  dan  fragmen  dari  embrio  somatik primer.  Kultur in  vitro anter  pertama  kali dilakukan oleh peneliti dari Rubber Research Institute of  Ceylon (sekarang Sri Lanka) dari k l o n   R R I C   5 2   d a n   K H   4 4 0   u n t u k menghasilkan tanaman haploid, namun tidak terjadi  diferensiasi  sel  (Satchuthananthavale dan  Irugalbandara,  1972).  Kultur  anter  yang dilakukan oleh Wang et al . (1980) dari Rubber Research  Institute  of   Chinese  Academy  of Tropical  Agricultural  Sciences (CATAS) menggunakan  klon  Haiken  1,  Haiken  2,  dan SCATC  88-13  berhasil  menghasilkan  137 planlet  normal.  Tim  peneliti  di International Centre  on  Ag riculture  Research  for Development (CIRAD)  menggunakan eksplan  integumen  biji  muda  dan  fragmen embrio  somatik  primer  untuk  proses embriogenesis  somatik  (Carron et  al .,  1989; Lardet et al ., 2009) .
Merupakan  suatu  lembaga  penelitian  di Montpellier,  Perancis  dan  anggota  dari I n t e r n a t i o n a l   Ru b b e r   Re s e a r c h   a n d Development  Board  (IRRDB).  Tim  peneliti Cell  Biology  of   the  Response  to  Abiotic  and Biotic Stress in Perennial Species (BURST) di CIRAD  merupakan  tim  penelitian  khusus yang mempelajari tanaman karet. Tim ini telah berhasil  melakukan  perbanyakan  klonal tanaman karet melalui embriogenesis somatik.
Penelitian embriogenesis somatik tanaman karet  di  CIRAD  meliputi,  Embriogenesis Somatik  Primer  (ESP),  Embriogenesis Somatik  Jangka  Panjang  (ESJP)  atau Maintained  Somatic  Embryogenesis,  dan Embriogenesis  Somatik  Sekunder  (ESS). Mereka juga mempelajari berbagai faktor yang dapat  mempengaruhi  embriogenesis  somatik pada  tanaman  karet  seperti  zat  pengatur tumbuh,  sumber  karbon,  dan  berbagai  jenis mineral  yang  digunakan  untuk  media  kultur. Berbagai  percobaan  lapangan  terhadap tanaman  hasil  embriogenesis  somatik  juga telah  mereka  lakukan  di  berbagai  negara seperti  di  Nigeria,  Thailand,  dan  Pantai Gading.  Saat  ini  tim  BURST  telah menggunakan  teknik  ESS  untuk  mendukung program pemuliaan melalui rekayasa genetika. Gen-gen  tertentu  ditransformasikan  pada kalus-kalus embriogenik yang dihasilkan dari ESS  untuk  menghasilkan  tanaman  karet transgenik  yang  resisten  terhadap  cekaman biotik  dan  abiotik.  Penelitian  mengenai tanaman  karet  transgenik  ini  tidak  lepas  dari teknik ESS yang telah berhasil mereka kuasai dengan baik.
Tulisan  ini  membahas  perkembangan metode  perbanyakan  mikro  tanaman  karet melalui  embriogenesis  somatik  di  CIRAD mulai  dari  penelitian  awal  embriogenesis somatik.

## Embriogenesis Somatik Primer
Penelitian  ESP  pada  tanaman  karet  di Perancis  pertama  kali  dilakukan  oleh  The Institute de Recherche sur le Caoutchouc pada tahun 1979 dengan menghasilkan kalus yang mempunyai  kapasitas  embriogenik  yang
berasal  dari  eksplan  integumen  biji  muda (Carron et  al .,  1989).  Penelitian  ESP menggunakan  eksplan  integumen  juga dilakukan oleh Carron et al . (1995), penelitian terdiri dari lima tahapan utama, dimana setiap tahapan memerlukan waktu 25 hari. Tahapan tersebut meliputi inisiasi kalus, induksi embrio, pengembangan embrio, maturasi embrio, dan regenerasi embrio menjadi planlet.
1.  Inisiasi kalus
Kalus diinisiasi dari eksplan integumen biji muda  yang  berumur  8  sampai  dengan  10 minggu  setelah  penyerbukan.  Integumen digunakan  sebagai  sumber  eksplan  karena jaringan  tersebut  paling  responsif   terhadap kultur in vitro (Montoro, komunikasi pribadi), secara genetik identik dengan tanaman induk, tersusun  oleh  banyak  sel  parenkim,  dan tervaskularisasi (Carron et al ., 1995). Lardet et al .  (2008)  juga  mengatakan  bahwa  eksplan yang  mempunyai  kompetensi  embriogenesis somatik  tinggi  pada  umumnya  berasal  dari organ reproduktif  seperti anter, integumen biji, dan embrio zigotik Media kultur untuk inisasi . kalus  adalah  MH  ( Medium  for  Hevea )  yang dikembangkan oleh Carron et al . (1989). Media ini diperkaya dengan 30 µM AgNO , 234 mM 3 sukrosa,  serta  masing-masing  4.44  µM  3.4-D dan Kinetin (Carron et al ., 1995; Montoro et al ., 2012a). Kalus akan terinisiasi dari proliferasi sel-sel  perivaskuler  di  sekitar  area  sayatan integumen (Carron et al ., 1995).
2.  Induksi embrio
Tahap  kedua  adalah  induksi  embrio  yang merupakan  tahapan  yang  sangat  aktif.  Kalus dikulturkan  pada  media  dasar  yang  sama dengan penambahan 1.35 µM 3.4-D dan BAP, 50  µM  spermidin,  dan  5  nM  Asam  Absisat (ABA).
3.  Pengembangan embrio Tahap ketiga adalah pengembangan embrio dimana  kalus  dikulturkan  pada  media  yang sama dengan penambahan 1.8 µM 3.4-D, 0.9 µM  Benzil  Amino  Purin  (BAP)  sebagai pengganti  Kinetin  serta  tanpa  penambahan AgNO . 3

## 4.  Maturasi embrio
Proembrio  yang  dihasilkan  kemudian dikulturkan pada media maturasi yaitu media MS  ( Murashige  &  Skoog )  yang  mengandung 30%  makroelemen  dan  200%  mikroelemen,
-1 vitamin  MH,  351  mM  sukrosa,  500  mgL arang aktif, dan 1 µM ABA.
5.  Regenerasi embrio
Embrio yang telah siap kemudian diisolasi dan dipindahkan pada media perkecambahan yang  sama  dengan  media  dasar  maturasi dengan penambahan 146 mM sukrosa dan 8.7 µM GA  (Carron et  al ., 1995; Montoro et  al ., 3 2012a).
Embriogenesis  somatik  primer  telah berhasil  dikembangkan  untuk  klon  PB  260, dan  selanjutnya  diaplikasikan  pada  klon  PR 107,  RRIM  600,  PB  235,  RRIM  703,  IRCA 109,  PB  254,  dan  PB  310  di  laboratorium CIRAD  (Tabel  1).  Percobaan  lapangan tanaman hasil ESP telah dilakukan di Pantai Gading, Nigeria, dan Thailand (yang bekerja sama  dengan  CIRAD).  Hasil  percobaan tersebut menunjukkan bahwa tanaman in vitro hasil ESP klon PB 254, BPM 24, dan PR 107 mempunyai laju pertumbuhan masing-masing 140, 123, dan 103 % terhadap tanaman hasil okulasi. Produksi karet tanaman in vitro hasil ESP klon PB 260 dan BPM 24 pada tahun ke-5 sampai  dengan  ke-7  masing-masing  sebesar 141 dan 137 % terhadap tanaman hasil okulasi (Montoro et al ., 2012a).
Tanaman in  vitro hasil  ESP  mempunyai karakteristik  juvenil  yaitu  tajuk  mengerucut dan kejaguran yang baik. Oleh karena itu, ESP dapat  dikombinasikan  dengan microcutting untuk perbanyakan tanaman karet yang efektif dan efisien (Montoro et al ., 2012a). Teknik ESP belum  bisa  diaplikasikan  sebagai  metode perbanyakan  massal  tanaman  karet  karena terbatasnya  jumlah  tanaman  yang  dihasilkan per  eskplan  dan  kurangnya  ketersediaan sumber  eksplan.  Selain  itu,  kemampuan eksplan untuk menginisiasi kalus embriogenik sangat  tergantung  pada  genotipe  tanaman induk  dengan  frekuensi  kurang  dari  1  %  per eksplan (Lardet et al ., 2009). Biaya tenaga kerja yang  tinggi  untuk  produksi  tanaman in  vitro
Perkembangan kultur in vitro pada tanaman karet ( Hevea brasiliensis , Müell. Arg.) melalui embriogenesis somatik di CIRAD Perancis
juga menjadi kendala untuk aplikasi teknologi embriogenesis  somatik  ke  masyarakat (Montoro et al ., 2012b).

## Embriogenesis Somatik Jangka Panjang
Embriogenesis  somatik  jangka  panjang (ESJP) atau Maintained Somatic Embryogenesis dilakukan  dengan  cara  mengontrol  siklus multiplikasi  dan  regenerasi  kalus  remah melalui  subkultur  rutin  selama  beberapa bulan.  Teknik  ini  dilakukan  untuk mengatasi rendahnya  laju  regenerasi  embrio  menjadi planlet pada ESP. Teknik ESJP dikembangkan o l e h   C a i l l o u x e t   a l .   ( 1 9 9 6 )   d e n g a n menggunakan  media  semi  padat,  karena kultur  dalam  media  cair  menyebabkan  kalus kelebihan  air  dan  menurunkan  kejaguran tanaman in  vitro yang  dihasilkan.  Beberapa peneliti  mempelajari  karakteristik  kalus  dan pengar uh  komposisi  media  terhadap embriogenesis somatik tanaman karet dengan menggunakan  teknik  ESJP.  Montoro et  al . (1993)  mempelajari  pengaruh  komposisi spesifik media terhadap keremahan kalus dan proses  embriogenesis  somatik  beberapa  klon karet.  Berdasarkan  penelitian  tersebut diketahui  bahwa  peningkatan  konsentrasi kalsium 9 sampai dengan 12 mM dan sukrosa 351 mM akan meningkatkan keremahan dan kapasitas  embriogenik  kalus.  Penurunan konsentrasi  auksin  dan  sitokinin  juga meningkatkan  keremahan  kalus,  namun menurunkan  kapasitas  embriogeniknya. Selain  itu,  penelitian  tersebut  menunjukkan bahwa kalus remah dan embriogenik terbentuk pada klon RRIM 600 dan PR 107, sedangkan kalus kompak terbentuk pada klon PB 260, PB 235, dan GT 1.
Montoro et al . (2012a) menyatakan bahwa kalus remah dan embriogenik sangat penting untuk  induksi  embrio.  Pernyataan  tersebut mendukung  penelitian  yang  dilakukan  oleh Montoro et  al .  (1993)  tentang  perbedaan kapasitas  embriogenik  antara  kalus  kompak dan  remah  berdasarkan  uji  histologi.  Pada kalus kompak, daerah meristem terpusat pada bagian  periferal,  sedangkan  bagian  tengah kalus  tersusun  oleh  sel-sel  parenkim  yang
jenuh  dengan  polifenol.  Struktur  seperti  itu akan memicu pencokelatan sel secara perlahan hingga keseluruhan kalus akan terdegenerasi, sedangkan kalus remah mempunyai kapasitas embriogenik yang lebih baik karena sel-selnya terpisah satu sama lain, sehingga pencokelatan pada  salah  satu  sel  tidak  mempengaruhi  sel yang  lain.  Oleh  karena  itu,  kalus  remah merupakan material yang sangat sesuai untuk embriogenesis  somatik  jangka  panjang menggunakan media semi-padat maupun cair. Blanc et  al .  (1999)  mempelajari  pengaruh beberapa  sumber  karbohidrat  berbeda (sukrosa,  maltosa,  glukosa,  dan  fruktosa) terhadap  induksi  embriogenesis  somatik. Maltosa terbukti paling efektif  meningkatkan produksi embriogenesis somatik klon PB 260. Di antara beberapa penelitian yang dilakukan, teknik  ESJP  telah  diaplikasikan  pada  enam klon tanaman karet , yaitu PB 260, PR 107, GT 1, RRIM 600 (CIRAD), RII 105 (RRII), dan Reyan 88-13 (CATAS) (Tabel 1) (Montoro et al ., 2012a).
Kelemahan teknik ESJP adalah proliferasi kalus  remah  melalui  kultur  jangka  panjang mengakibatkan  hilangnya  kompetensi regenerasi  kalus  (Blanc et  al .,  2006)  dan meningkatkan  resiko  variasi  somaklonal (Lardet et al ., 2007). Hasil percobaan lapangan tanaman hasil ESJP klon PB 260 pada tahun 19952002 menunjukkan bahwa pertumbuhan tanaman in  vitro lebih  rendah  dibandingkan tanaman  hasil  okulasi.  Tanaman in  vitro tersebut  menunjukkan  struktur  kanopi, percabangan,  bentuk,  dan  warna  daun  yang abnormal  serta  rentan  terhadap  infeksi penyakit  (Carron et  al .,  2009).  Berbagai abnormalitas tersebut menyebabkan kejaguran menurun dan lilit batang tanaman hanya 5089 %, lebih kecil jika dibandingkan tanaman hasil okulasi (Montoro et al ., 2012a). Oleh sebab itu, teknik  ESJP  tidak  sesuai  untuk  metode perbanyakan  tanaman  karet  skala  besar. Penelitian  selanjutnya  terus  dilakukan  untuk mendapatkan  kalus  remah  dan  embriogenik dengan mempersingkat dan mengontrol waktu p r o l i f e r a s i   d a n   m u l t i p l i k a s i   k a l u s menggunakan teknik kriopreservasi.

## Embriogenesis Somatik Sekunder
Embriogenesis  somatik  sekunder  (ESS) pada tanaman karet pertama kali dilakukan di C I R A D   o l e h   L a r d e t e t   a l .   ( 2 0 0 9 ) . Embriogenesis  somatik  sekunder  di  CIRAD terdiri  dari  empat  tahap  utama  meliputi produksi embrio somatik primer melalui ESP, inisiasi  kalus  remah  dari  fragmen  embrio, kriopreservasi dan perbanyakan kalus remah, dan  regenerasi  embrio  menjadi  planlet menggunakan  sistem  RITA  ( Recipient  for A u t o m a t e d   T e m p o r a r y   I m m e r s i o n ) . Embriogenesis  somatik  sekunder  pada tanaman karet yang dilakukan oleh Lardet et al .  (2009)  mengkonfirmasi  bahwa  embrio sekunder  terbentuk  setelah  inisiasi  kalus sehingga disebut ESS tidak langsung ( Indirect Secondary  Somatic  Embryogenesis ).  Pada  ESS, kalus  remah  embriogenik  akan  terbentuk  23 bulan setelah kultur, lebih cepat daripada ESP yang  memerlukan  waktu  612  bulan  setelah kultur  dan  ESJP  yang  membutuhkan  waktu 1018  bulan  setelah  kultur  dengan  frekuensi terbentuk eksplan kurang dari 1% (Lardet et al ., 2009; Montoro et al ., 2012a). Oleh karena itu teknik  ESS  berpotensi  untuk  diaplikasikan sebagai  metode  perbanyakan  mikro  tanaman karet secara massal karena dapat mengurangi waktu  kultur  sehingga  mengurangi  resiko variasi somaklonal.
Embriogenesis  somatik  jangka  panjang menggunakan  eksplan  integumen  atau  anter untuk mendapatkan kalus remah embriogenik, sedangkan ESS menggunakan fragmen embrio somatik  primer  sebagai  sumber  eksplannya. Hal  ini  berdasarkan  asumsi  bahwa  ESP mampu menghasilkan tanaman in vitro dengan kualitas  yang  baik  sehingga  embrio  yang dihasilkan  dari  ESP  dapat  menjadi  sumber eksplan yang baik pula (Montoro et al ., 2012a). Lardet et  al .  (2009)  telah  berhasil  melakukan ESS  pada  klon  PB  260,  PB  217,  dan  RRIM 703.  Selain  itu  ESS  juga  telah  diaplikasikan pada klon IRCA 109 dan RRIM 600 (Tabel 1) (Montoro et al ., 2012a).
Teknik  ESS  merupakan  penyempurnaan dari  ESJP  yang  bertujuan  untuk  mengurangi resiko  variasi  somaklonal  dan  hilangnya kompetensi  regenerasi  kalus  dengan mengurangi  waktu  subkultur  dan  proliferasi kalus. Hal ini dapat diatasi dengan menyimpan kalus untuk jangka panjang di dalam nitrogen cair. Kumpulan kalus yang berasal dari eksplan integumen klon tertentu dipisahkan dan diberi kode  sebagai  penanda  galur,  kemudian dilakukan  seleksi.  Tim  BURST  di  CIRAD menggabungkan  teknik  kriopreservasi  dalam proses ESS untuk menyeleksi dan menetapkan galur-galur  kalus  remah  dengan  kapasitas regenerasi  yang  tinggi  (Gambar  1).  Kalus remah  embriogenik  yang  telah  berproliferasi
Tabel 1. Daftar klon tanaman karet ( H. brasiliensis ) yang berhasil diperbanyak secara in vitro melalui ESP, ESJP, dan ESS di CIRAD, Perancis.
Teknik yang digunakan Klon Sumber eksplan Referensi ESP PB 260, PR 107, RRIM 600, PB 235 Integumen dalam Carron et al . (1995) ESP RRIM 703, IRCA 109, PB 254, BPM 24, PB 310 Integumen dalam Tidak diterbitkan ESJP PB 260, PR 107, GT 1 Integumen dalam Montoro et al . (1994) ESJP PB 260 Integumen dalam Carron et al . (1998) Lardet et al . (2007) ESJP RRIM 600 Fragmen embrio somatik primer Tidak diterbitkan ESS PB 260, PB 217, RRIM 703 Fragmen embrio somatik primer Lardet et al . (2009)
Sumber: Montoro et al ., 2012a.
Perkembangan kultur in vitro pada tanaman karet ( Hevea brasiliensis , Müell. Arg.) melalui embriogenesis somatik di CIRAD Perancis
dengan  baik  dikriopreservasi,  kemudian dibuat  stok  untuk  penyimpanan  dan pengujian. Pengujian yang dilakukan meliputi regenerasi,  aklimatisasi,  dan  karakterisasi kesesuaian  klonal.  Setiap  galur  terpilih kemudian  diperbanyak  dan  dikriopreservasi kembali  sebagai  stok  kerja.  Kalus-kalus tersebut  kemudian  digunakan  untuk percobaan  lapangan  serta  digunakan  sebagai material transformasi genetik untuk membuat tanaman karet transgenik.
Teknik kriopreservasi kalus tanaman karet di  CIRAD  pada  awalnya  dilakukan  oleh E n g e l m a n e t   a l .   ( 1 9 9 7 ) ,   k e m u d i a n disempurnakan  oleh  Lardet et  al .  (2007). Teknik  ini  meliputi  dua  tahapan,  yaitu perlakuan  krioprotektif   dan  pembekuan. Krioprotektif  bertujuan untuk melindungi sel- sel kalus dari perlakuan pembekuan tiba-tiba. Pada  perlakuan  krioprotektif,  kalus  remah embriogenik dimasukkan ke dalam media cair yang mengandung sukrosa tinggi yaitu media
ENT1Ca1 yang ditambah dengan sukrosa 1 M -1 (1 ml g  kalus). Selanjutnya ditambah dengan Dimethylsulphoxide (DMSO)  secara  bertahap setiap  6  menit  hingga  mencapai  konsentrasi akhir  10  %.  Kalus  kemudian  dimasukkan  ke dalam tabung krio sebanyak 1 ml per tabung. Tahap selanjutnya adalah pembekuan, dimana tabung  krio  dimasukkan  ke  dalam  80  C deep freezer dan  dibekukan  sampai  40  C.  Setelah mencapai  suhu  tersebut,  tabung-tabung  krio berisi  kalus  beku  segera  disimpan  dalam nitrogen cair (Gambar 2).
Kriopreservasi  merupakan  teknologi penyimpanan  plasma  nutfah  dalam  jangka waktu  lama  dengan  ruang  dan  perawatan minimal. Secara teori, sel tanaman akan tetap stabil  untuk  jangka  waktu  yang  tak  terbatas karena temperatur ultralow nitrogen cair sangat e f i s i e n   u n t u k   m e n g h e n t i k a n   p r o s e s metabolisme sel (Mikula et al ., 2011). Dalam kultur in  vitro tanaman  karet,  kriopreservasi dapat  menghambat  proliferasi  jaringan
Integumen Biji Muda  Dari Klon

## Unggul
1. Sertifikasi klon
2. Embriogenesis Somatik Primer
Embrio Somatik Primer
3. Embriogenesis Somatik Sekunder
D -Galur Kalus Remah
4. Kriopreservasi (stok kecil)
Y Beku
5. Uji Regenerasi Tanaman
D -Galur Kalus Remah Embriogenik Terpilih
6. Kriopreservasi (stok besar)
Y! [ Ü{  BEKU
Uji lapangan Tanaman in vitro Transformasi Genetik Optimalisasi Kondisi kultur Perbanyakan Massal Fase 1 Fase 2 Fase 3
Gambar  1.  Strategi  seleksi  dan  penetapan  galur-galur  kalus  remah  dengan  kapasitas embriogenik tinggi pada tanaman karet ( H. brasiliensis ) di CIRAD menggunakan ESP, ESS, dan kriopreservasi  (Sumber: Montoro et al ., 2012a).
s e h i n g g a   m e n g u r a n g i   r e s i k o   va r i a s i somaklonal  dan  hilangnya  kompetensi  kalus untuk  menginduksi  embrio  (Piyatrakul et  al ., 2012; Lardet et al ., 2007). Meskipun demikian, berbagai  perlakuan  kriopreservasi  dan pelelehan  ( thawing )  dapat  menginduksi  stres sel dan mengakibatkan perubahan morfogenik atau genetik kalus. Untuk mengatasi masalah tersebut, Lardet et al . (2007) meneliti tentang pengaruh  konsentrasi  CaCl   eksogenus 2 t e r h a d a p   p e m u l i h a n   k a l u s   p a s k a k r i o p r e s e r va s i .   H a s i l   p e n e l i t i a n n ya menunjukkan  bahwa  penurunan  konsentrasi CaCl dari 9 mM menjadi 1 mM pada media 2 pre  kultur  dapat  meningkatkan  pemulihan kalus  dan  kemampuan  regenerasi  embrio pasca  kriopreservasi.  Penelitian  tersebut  juga memperlihatkan  bahwa  tidak  ada  perubahan kapasitas  morfogenetik  sebelum  dan  sesudah kriopreservasi pada 14 galur dari 39 galur kalus klon PB 260 yang diuji.

## Regenerasi Tanaman
Berdasarkan  kapasitas  embriogenik  dan kemampuan  regenerasinya,  Charbit et  al . (2004) dan Lardet et al . (2007) membagi galur kalus  remah  ke  dalam  tiga  kelompok,  yaitu galur  kalus  embriogenik  teregenerasi ( embryogenic regeneranting  line ),  embriogenik tidak teregenerasi ( embryogenic non-regenerating line ),  dan  non-embriogenik  ( non-embryogenic line ).  Kalus  embriogenik  teregenerasi  adalah kalus  yang  dapat  terinduksi  menjadi  kalus embrionik  serta  dapat  diregenerasikan menjadi  planlet.  Kalus  embriogenik  tidak
teregenerasi adalah kalus yang dapat diinduksi menjadi  kalus  embrionik  tetapi  tidak  bisa teregenerasi  menjadi  planlet.  Kalus  non- embriogenik  adalah  kalus  yang  tidak  bisa menginduksi  embrio.  Kalus  embriogenik teregenerasi  mempunyai  warna  kuning  yang lebih  cerah,  kalus  embriogenik  tidak teregenerasi  berwarna  kuning  keruh  dengan sedikit  pencokelatan,  sedangkan  kalus  non- embriogenik mempunyai struktur yang basah, berair,  dan  warna  yang  lebih  putih  (Gambar 3A, B, dan C).
Perkembangan embrio pada ESS dilakukan m e n g g u n a k a n   s i s t e m   R I T A   y a n g dikembangkan  oleh  CIRAD.  Sistem  ini diadopsi dari Temporary Immersion System (TIS) yaitu  sistem  pengaturan  aliran  media  secara otomatis untuk mencegah terendamnya kultur kalus  di  dalam  media  secara  terus  menerus s e k a l i g u s   m e m b e r i k a n   a e r a s i   d a n pencampuran  nutrisi  yang  cukup.  Sistem  ini didesain untuk perbanyakan massal tanaman melalui  embriogenesis  somatik  (Pérez  et al ., 2013)  dan  banyak  digunakan  untuk optimalisasi kultur embrio serta meningkatkan kuantitas  dan  kualitas  embrio  somatik  pada tanaman  karet  ( H.  brasiliensis )  (Lardet et  al ., 2009).  Etienne  dan  Berthouly  (2002) mengatakan  bahwa  waktu  perendaman  pada media saat perkembangan embrio merupakan parameter  yang  sangat  penting  untuk mencegah kelebihan air pada kalus. Selain itu, sistem RITA juga memperbaiki kualitas bahan tanam  yang  dihasilkan  melalui  peningkatan kejaguran tunas dan frekuensi embrio nomal. Penggunaan  sistem  RITA  akan  mengurangi
A B C D E
Gambar  2.  Proses  kriopreservasi  kalus  remah  embriogenik  (galur  TS24T2  A.6  dan  A.10)  di  CIRAD: subkultur kalus pada media ENT1Ca1 (A), seleksi kalus untuk kriopreservasi (B), perlakuan krioprotektif  (C), pembekuan (D), dan penyimpanan pada nitrogen cair (E).
Perkembangan kultur in vitro pada tanaman karet ( Hevea brasiliensis , Müell. Arg.) melalui embriogenesis somatik di CIRAD Perancis
biaya  produksi  termasuk  efisiensi  kerja, efisiensi  tempat  kultur,  dan  hasil  kultur  yang lebih baik.
Perkembangan kalus remah embriogenik di dalam  sistem  RITA  diawali  dengan  proses pencokelatan  diikuti  oleh  pembentukan  dan maturasi  embrio.  Embrio  dewasa  akan terbentuk  setelah  delapan  minggu  inkubasi. Piyatrakul et  al .  (2012)  membagi  embrio b e r d a s a r k a n   m o r f o l o g i   d a n mengelompokkannya  menjadi  tiga  kelas. Kelas  1  merupakan  embrio  normal  dengan kualitas  baik  yang  dicirikan  dengan  adanya satu badan embrionik dan dua kotiledon yang berkembang  sempurna  (simetri  bilateral) (Gambar  4.A).  Embrio  kelas  2  mempunyai satu  badan  embrionik  dengan  satu  atau  dua kotiledon yang asimetris (Gambar 4.B & 4.C). Kedua kelas embrio ini bisa digunakan untuk regenerasi planlet. Sedangkan embrio kelas 3 m e r u p a k a n   e m b r i o   a b n o r m a l   y a n g mempunyai struktur anomali, cenderung bulat dengan  dua  atau  tidak  ada  badan  embrionik dan  embrio  dari  kelas  ini  tidak  memenuhi kualitas  untuk  regenerasi  planlet  (Gambar 4.D).
Embrio normal akan beregenerasi menjadi planlet yang berkualitas baik dan begitu pula
sebaliknya.  Planlet  dari  embrio  normal mempunyai  sistem  perakaran,  batang,  dan daun  yang  berkembang  sempurna  dalam waktu satu bulan (Gambar 5). Hasil penelitian Piyatrakul et  al .  (2012)  menunjukkan  bahwa galur  kalus  embriogenik  tidak  teregenerasi CI04106  hanya  menghasilkan  19.5  embrio somatik per gram kalus, sedangkan galur kalus embriogenik  teregenerasi CI07060  mampu menghasilkan  590  embrio  somatik  per  gram kalus. Persentase embrio abnormal dari kedua galur  kalus  tersebut  masing-masing  93.54  % dan  82.71  %.  Dari  102  embrio  normal  yang dihasilkan dari galur kalus CI07060, sebanyak 53 embrio berkembang menjadi planlet.
Secara teori, teknik ESS dan kriopreservasi bisa digunakan untuk perbanyakan klon-klon yang  responsif   terhadap  ESP  untuk menghasilkan  bahan  tanam  dengan  kualitas yang  baik  dan  stabil  dalam  jangka  panjang. CIRAD  telah  berhasil  menghasilkan  galur kalus  teregenerasi  CI07060  dari  klon  PB  260 yang  digunakan  sebagai  galur  kontrol  dan merupakan  cikal  bakal  galur-galur  kalus transgenik untuk menciptakan tanaman karet transgenik.  Lebih  dari  3000  planlet  telah dihasilkan dari galur kalus ini dan digunakan untuk  berbagai  penelitian  lanjutan  (Lardet et
A
B C
Gambar  3.  Berbagai  galur  kalus  remah  di  CIRAD  pada  media  EXP  untuk  induksi  embrio:  galur kalus embriogenik  teregenerasi  (A),  embriogenik  tidak  teregenerasi  (B),  dan  non-embriogenik  (C) (Sumber: Piyatrakul et al ., 2012).
A B C D
Gambar 4. Berbagai tipe embrio somatik yang berkembang di dalam sistem RITA.
(Sumber: Piyatrakul et al ., 2012)
al ., 2007; Montoro et  al ., 2012a). Kelemahan ESS  adalah  kesuksesan  teknik  ini  sangat bergantung  pada  jenis  klon  dan  kapasitas e m b r i o   s e r t a   s i f a t   t a n a m a n   y a n g diregenerasikan  beragam.  Selain  itu, percobaan lapang skala luas untuk tanaman in vitro hasil  ESS  masih  harus  dilakukan  untuk dapat  menetapkan  ESS  sebagai  metode perbanyakan tanaman karet secara massal.

## Kesimpulan
Embriogenesis somatik merupakan metode perbanyakan mikro yang sangat penting untuk mendapatkan  tanaman  karet  yang  identik dengan tanaman induk dan mempunyai sistem perakaran sendiri. Tim BURST CIRAD yang terus  konsisten  dan  memiliki  komitmen  kuat d a l a m   m e n g e m b a n g k a n   p e n e l i t i a n perbanyakan klonal tanaman karet.
Teknik embriogenesis somatik belum dapat diaplikasikan  secara  luas  untuk  perbanyakan tanaman karet secara massal karena berbagai keterbatasan.  Namun  demikian  teknik embriogenesis  somatik  sangatlah  penting dalam  program  pemuliaan  tanaman  karena merupakan  alat  efisien  untuk  menciptakan tanaman  karet  transgenik  dengan  sifat-sifat unggul seperti toleransi terhadap stress abiotik dan produksi lateks tinggi.

## Daftar Pustaka
Blanc, G., N. Michaux-Ferrière, C. Teisson, L. Lardet, and M.P. Carron. 1999. Effects of carbohydrate addition on the induction of somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis.
Plant Cell Tissue Organ Cult 59:103-112. Blanc, G., C. Baptiste, G. Oliver, F. Martin, and P. Montoro. 2006. Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated  transformation  of embryogenic  calli  and  regeneration  of Hevea  brasiliensis Müell  Arg.  plants.  Plant Cell Rep 24(12):724-733.
Cailloux,  F.,  J.  Julien-Guerrier,  L.  Linossier, and A. Coudret. 1996. Long-term somatic embryogenesis and maturation of  somatic embryos  in Hevea  brasiliensis. Plant  Sci 120:185-196.
Carron,  M.  P,  F.  Enjalric,  L.  Lardet,  and  A. Deschamps. 1989. Rubber ( Hevea brasiliensis Muëll.Arg.).  In:  YPS  Bajaj  (ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry, vol.5. Trees II. Springer, Berlin, Heidelberg New York, pp 222-245.
Carron,  M.  P,  H.  Etienne,  N.    Michaux- Ferriére,  and  P.  Montoro.  1995.  Somatic embryogenesis  in  rubber  tree  ( Hevea brasiliensis Muëll.-Arg.). In: YPS Bajaj (ed.), Somatic embryogenesis and synthetic seed. 1, vol.30. Biotechnology in Agriculture and Forestry.  Springer,  Berlin,  Germany,  pp 353-369.
A B
Gambar 5. Embrio dari galur kalus embriogenik teregenerasi CI07060 yang berkembang menjadi planlet pada media perkecambahan (A) dan planlet dengan sistem perakaran, batang, dan daun yang berkembang sempurna (B).
Perkembangan kultur in vitro pada tanaman karet ( Hevea brasiliensis , Müell. Arg.) melalui embriogenesis somatik di CIRAD Perancis
Carron, M. P, L. Lardet, F.  Granet, J.  Julien, K. Teerawatanasuk, J.   Keli, B. G. Dea, A. Leconte, and P. Montoro. 2009. Field trials network  emphasizes  the  improvement  of g r o w t h   a n d   y i e l d   t h r o u g h micropropagation  in  rubber  tree  ( Hevea brasiliensis .Müll.ARG.).  Acta  Hor t.
812:485-492.
Charbit,  E.,  T.  Legavre,  L.  Lardet,  E. Bourgeois, N.  Michaux-Ferriére, and M. P. C a r r o n .   2 0 0 4 .   I d e n t i f i c a t i o n   o f differentially  expressed  cDNA  sequences and  histological  characteristics  of Hevea brasiliensis calli  in  relation  to  their embryogenic  and  regenerative  capacities. Plant Cell Rep 22:539-548.
Engelmann, F., M. Lartaud, N. Chabrillange, M.  P.  Carron,  and  H.  Etienne.  1997. Cryopreservation  of   embryogenic  calluses of   two  commercial  clones  of Hevea brasiliensis. Cryo Let 18: 107-116.
Etienne,  H.  and  M.  Berthouly.  2002.
Temporary  immersion  systems  in  plant micropropagation. Plant Cell Tissue Organ Cult 69:215–231.
Lardet,  L.,  F.  Martin,  F.  Dessaily,  M.  P. Carron,  and  P.  Montoro.  2007.  Effect  of exogenous  calcium  on  post-thaw  growth recovery and subsequent plant regeneration of   cryopreserved  embryogenic  calli  of Hevea  brasiliensis (Müll.  Arg.).  Plant  Cell Rep 26(5): 559-569.
Lardet,  L.,  F.  Dessaily,  M.  P.  Carron,  P. Montoro,  and  O.  Monteuuis.  2008. Influences of  aging and cloning methods on the capacity for somatic embryogenesis of  a mature Hevea  brasiliensis genotype.  Tree Physiol 29:291-298. Lardet, L., F. Dessailly, M. P. Carron, M. A. Rio, N. Michaux-Ferriére, and P. Montoro. 2009. Secondary somatic embryogenesis in
Hevea brasiliensis (Mull. Arg.): an alternative
p r o c e s s   f o r   l o n g - t e r m   s o m a t i c e m b r y o g e n e s i s .   J   R u b b e r   R e s 12(4):215–228.
Mikula, A., K. Tomiczak, and J. J. Rybczy ń ski. 2 0 1 1 .   C r yo p r e s e r va t i o n   e n h a n c e s embryogenic  capacity  of Gentiana  cruciata (L.) suspension culture and maintains (epi) genetic  uniformity  of   regenerants.  Plant Cell Rep 30: 565-574.
Montoro, P., H. Etienne, N. Michaux-Ferrière, and  M.  P.  Carron.  1993.  Callus  friability and  somatic  embryogenesis  in Hevea brasiliensis. Plant  Cell  Tissue  Organ  Cult 33(3): 331-338.
Montoro,  P.,  M.  P.  Carron,  L.  Lardet,  A.
Clément-Demange,  and  J.  Leclercq.  2010. Biotechnologies  in  rubber  tree  ( Hevea brasiliensis ).  AsPac  J  Mol  Biol  Biotechnol 18(1): 81-83.
Montoro,  P.,  M.  P.  Carron,  F.  Granet,  L. L a r d e t ,   a n d   J.   L e c l e r c q .   2 0 1 2 a . Development  of   new  varietal  types  based on rejuvenation by somatic embryogenesis and  propagation  by  conventional  budding or  microcutting  in Hevea  brasiliensis .  Acta Hort 961:547.
Montoro,  P.,  M.  P.  Carron,  F.  Granet,  L. L a r d e t ,   a n d   J.   L e c l e r c q .   2 0 1 2 b. Development   of  new varietal types based on rejuvenation by somatic embryogenesis and  propagation  by  conventional  budding or microcutting   in Hevea brasiliensis . CIBA workshop 22-24 October 2012.
Pérez,  M.,  M.  A.  Bueno,  M.  Escalona,  P. Toorop,  R.  Rodríguez,  and  M.  J.  Cañal. 2013.  Temporary  immersion  systems (RITA)  for  the  improvement  of   cork  oak somatic  embryogenic  culture  proliferation and somatic embryo production. Trees DOI 10.1007/s00468-013-0876-y.
Piyatrakul, P., R. A. Putranto, F. Martin, M. Rio, F. Dessailly, J. Leclercq, J. F. Dufayard, L.  Lardet,  and  P.  Montoro.  2012.  Some ethylene biosynthesis and AP2/ERF genes reveal  a  specific  pattern  of   expression during  somatic  embryogenesis  in Hevea brasiliensis . BMC Plant Biol 12:244.
Satchuthananthavale,  R.  And  Z.  E. Irugalbandara. 1972. Propagation of  callus from  Hevea  anthers.  Q  J  Rubb  Res  Ins Ceylon 49:65-68.
Wang, Z., C. Zeng, C. Chen, H. Wu, Q. Li, G. Fan, and W. Lu. (1980). Induction of  rubber plantlets  from  anther  of Hevea  brasiliensis Muell.  Arg.  Chinese  J  Tropic  Crops  1:25- 26.