## IDENTIFIKASI BAKTERI PATOGEN PADA PRODUK PERIKANAN DENGAN TEKNIK MOLEKULER
Dwiyitno *)

## ABSTRAK
Kasus  infeksi  dan  keracunan  produk  perikanan  sering  terjadi  akibat  mengkonsumsi  makanan yang telah terkontaminasi, baik oleh mikroba patogen penyebab infeksi  maupun mikroba promotor toksin (intoksikasi). Beberapa jenis bakteri patogen  yang sering ditemukan pada  produk  perikanan antara  lain:  Vibrio  parahaemolyticus  dan  jenis  Vibrio  lainnya,  Escherichia  coli,  Aeromonas  spp., Salmonella  spp.,  Staphylococcus  aureus,  Listeria  monocytogenes,  Clostridium  botulinum,  C. perfringens,  dan  Shigella  spp.  Isolasi  dan  identifikasi  mikroba  patogen  pada  produk  perikanan sering  sulit  dilakukan  karena  beragamnya  jenis  bakteri  kontaminan  dan  indigenous,  sementara konsentrasi  bakteri  patogen  relatif  sedikit.  Selama  3  dasawarsa  terakhir,  telah  berkembang sejumlah  metode  baru  dalam  identifikasi  mikroba  patogen  pada  produk  pangan,  khususnya dengan  teknik  molekuler,  bahkan  beberapa  telah  diterima  sebagai  standar  internasional  seperti teknik  reaksi  polimerase  berantai  (polymerase  chain  reaction/PCR)  dan  turunannya.  Terlepas dari  k elemahannya,  metode  identifik asi  bakteri  patogen  dengan  tek nik   molekuler  telah menawarkan  beberapa  keuntungan  untuk  dijadikan  metode  identifikasi  alternatif,  baik  pada analisis  rutin  maupun  untuk  keperluan  skrining  bakteri  pada  produk  perikanan.
ABSTRACT: Molecular-based identification for fish and seafood pathogenic bacteria. By: Dwiyitno
Food  infection  and  intoxication  of  fish  products  are  common  due  to  consumption  of  food exposed  by either pathogenic  or toxin  promoter  bacteria.  A number of pathogenic bacteria  have been identified  related to  fish and seafood such as Vibrio parahaemolyticus and other Vibrios, Escherichia  coli,  Aeromonas  spp.,  Salmonella  spp.,  Staphylococcus  aureus,  Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, C. perfringens, and Shigella spp. However, isolation and  identification  of  pathogenic  bacteria from  fish  and  seafood  are  often difficult  due  to the  high number  of  contaminating  and  indigenous  bacteria,  while  numbers  of  pathogenic  bacteria  are relatively low. In the last 3 decades, several molecular methods have been developed and adopted as  official  standard  to  supplement  classical  method,  such  as  polymerase  chain  reaction  (PCR) and  its  applications.  Besides  its  limitation,  molecular  based  identification  offers  advantages  as routine  or screening  analytical  protocol  for  pathogenic  bacteria  in fish  and seafood  products.
KEYWORDS: pathogenic bacteria, fish, DNA molecular, PCR

## PENDAHULUAN
Kasus infeksi/keracunan produk perikanan sering terjadi  akibat mengkonsumsi  makanan yang  telah terkontaminasi, baik oleh mikroba patogen penyebab inf eksi   m aupun  m ikroba  penghasil  tok sin (intoksikasi). Beberapa jenis produk perikanan yang sering  menyebabkan  keracunan  antara  lain  ikan kembung, tongkol, salem, dan siput dengan gejala mulai dari mata merah, muntah-muntah, perut mual, kepala pusing, badan lemas, hingga beberapa korban meninggal  dunia  (Anon.,  2010a;b;c;d).  Sejumlah salmon  beku  juga  pernah  ditarik  dari  pasaran  di Kanada dan New York karena terindikasi tercemar Listeria  monocytogenes  (Anon.,  2008a;b).  Namun demikian,  catatan  frekuensi  kejadian  keracunan makanan  sulit  ditelusuri  karena  kasusnya  banyak yang tidak dilaporkan, kecuali terhadap kasus-kasus
yang luar biasa.  Hal ini karena kebanyakan kasus keracunan  berupa  gangguan  pencernaan  dengan gejala yang tidak berlangsung lama, bahkan sering tidak terlihat pada individu dengan kondisi kekebalan/ imunitas yang baik (Novotny et al., 2004).
Beberapa  spesies  bakteri  patogen  yang  sering ditemukan pada ikan dan produk perikanan antara lain: Vibrio  parahaemolyticus  dan  jenis  Vibrio  lainnya, Escherichia coli, Aeromonas spp., Salmonella spp., Staphylococcus  aureus,  Listeria  monocytogenes, Clostridium botulinum, C. perfringens, dan Shigella spp. (Feldhusen, 2000; Novotny et al., 2004). Adapun beberapa  jenis  bakteri  tertentu  berperan  sebagai pemicu pembentukan toksin pada produk perikanan misalnya histamin pada ikan-ikan scombroid seperti tuna (Thunnus sp.), mahi-mahi (Coryphaena hippurus), sardin (Sardinella pilchardus) dan makerel (Scomber scombrus)  (Lipp  & Rose,  1997;  Kim  et  al.,  2001).
Jenis bakteri pemicu pembentukan histamin antara lain: Proteus spp., Morganella morganii, Clostridium spp.,  Escherichia  spp.,  Salmonella  spp.,  Shigella spp., dan Vibrio harveyii (Kim et al., 2001).
Isolasi  dan  identifikasi  mikroba  patogen  pada produk  perikanan  sering  sulit  dilakukan  karena beragamnya  jenis  bakteri  kontaminan  termasuk bakteri  indigenous,  sementara  jumlah/konsentrasi bakteri  patogennya  relatif   sedikit.  Sehingga kebanyakan  metode  konvensional  menggunakan metode pengkayaan (enrichment) selektif, bahkan bila perlu melalui tahap pra-pengkayaan (pre-enrichment) yang dianggap kurang efektif dan efisien (Olsen, 2000). Oleh  karena  itu  diperlukan  metode  isolasi  dan identifikasi yang lebih efektif, cepat, dan akurat.
Selama 3 dasawarsa terakhir, telah berkembang sejumlah metode baru dalam identifikasi  mikroba patogen pada produk pangan. Contoh metode-metode identif ikasi  yang  telah  dikem bangkan  untuk meningkatkan  kemampuan  identifikasi  bakteri patogen seperti terlihat pada Tabel 1. Beberapa teknik tersebut pada awalnya diperuntukkan bagi keperluan mikrobiologi medis/klinis, seperti PCR dan ELISA. Teknik PCR sendiri telah diterima sebagai standar internasional untuk identifikasi bakteri patogen pada produk pangan sejak beberapa tahun terakhir (ISO 22174:2005).
Tulisan  ini  menjelaskan  secara  lebih  spesifik mengenai  aplikasi  metode  isolasi  dan  identifikasi bakteri  patogen  pada  produk  pangan,  termasuk
produk perikanan,  berdasarkan  metode  molekuler DNA. Penjelasan lebih detail difokuskan pada teknik PCR  yang  merupakan  inti  teknik  molekuler  DNA. Meskipun belum banyak digunakan untuk kegiatan analisis rutin, teknik molekuler, seperti metode non- konv ensional  lainnya,  telah  banyak  mendapat perhatian untuk digunakan sebagai metode alternatif dalam  analisis  mikroba  patogen  karena  bersifat spesifik spesies serta memiliki beberapa keuntungan yang juga akan dijelaskan pada tulisan ini.
IDENTIFIKASI  BERDASARKAN  PROFIL  DNA (GENOMIK)
Informasi genetik mikroorganisme pada umumnya dapat digunakan untuk keperluan identifikasi maupun pengelompokannya. Dibandingkan dengan metode biokimia dan  imunokimia, identifikasi berdasarkan profil  genetik  dianggap  lebih  akurat  karena  tidak dipengaruhi  oleh  faktor  internal  seperti  tahap pertumbuhan  maupun  faktor  eksternal  seperti lingkungan tempat tumbuh/hidup (Scheu et al., 1998).
Seperti  m etode  identifikasi  genom ik  pada kebanyakan  organisme,  pada  metode  identifikasi mikroorganisme juga harus ditentukan fragmen DNA yang akan menjadi target identifikasi. Karena sifatnya yang unik dan spesifik, gen penghasil toksin sering dipilih sebagai gen target untuk identifikasi bakteri patogen, seperti verotoksin, enterotoksin, haemolisin, neurotoksin, dan sitotoksin. Sejumlah metode juga
No Prinsip metode Jenis metode a.    Plate count  spiral b.    Grid-membran hidrofobik c.    Teknik filtrasi a.    Teknik filter epifluoresen langsung (DEFT) b.    Flow sitometri c.    Fluoresen antibodi 3 Aktivitas metabolisme Asai ATP a.   Aglutinasi lateks b.   Separasi imunomagnetik c.   Biosensor resonansi plasma d.   Enzyme linked immunosorbent assay  (ELISA) a.   Hibridisasi DNA b.   Array Oligonukleotida (chip-DNA)
c.   Reaksi polimerase berantai (PCR)
4 Reaksi antibodi/antigen 5 Molekuler DNA 1 Viable count  otomatis 2 Teknik mikroskopi
Sumber: Novotny et al. (2004); Waswa et al. (2007)
Tabel 1. Beberapa metode terkini untuk isolasi dan identifikasi bakteri patogen pada makanan

## Dwiyitno
menggunakan gen plasmida yang berkaitan dengan virulensi  maupun  pengatur  enzim  tertentu  seperti termonuklease,  B-galaktosidase,  B-glukuronidase, dan  sistin  proteinase.  Adapun  gen  RNA  ribosom (rRNA)  merupakan  gen  target  universal  karena terdapat pada semua mikroorganisme serta memiliki profil  filogeni  yang  spesifik.  Pada  prakteknya, beberapa penelitian juga melakukan identifikasi bakteri tidak  berdasarkan  gen  spesif ik,  seperti  pada Salmonella (Olsen et al., 1991; Yasmin et al., 2007). Namun demikian karena gen non-spesifik ini umumnya belum diketahui peranan, stabilitas maupun variasi genetiknya, maka identifikasi dengan gen non-spesifik tidak banyak dilakukan.
Metode identifikasi berdasarkan profil genomik berkembang  pesat  sejak  ditemukan  instrumen- instrumen biologi molekuler,  khususnya instrumen PCR (thermal cycler). PCR yang ditemukan oleh Kary Mullis, peneliti di sebuah perusahaan bioteknologi The Cetus  Corporation-California,  pada  tahun  1983, menjadikan proses penggandaan fragmen DNA target (amplifikasi)  menjadi  lebih  cepat  dan  sederhana. Teknik  ini sekaligus  mampu menggantikan  teknik- teknik molekuler sebelumnya yang banyak digunakan yaitu DNA hibridisasi.
a. Teknik Hibridisasi DNA
Pada teknik hibridisasi DNA, identifikasi dilakukan dengan bantuan penanda (probe) yang berupa fragmen nukleotida. Teknik ini mulai dikenal sejak tahun 1969. Probe dapat dibuat dengan dua cara, yaitu kloning atau amplifikasi DNA dari organisme target maupun melalui sintesis kimiawi, baik dalam bentuk DNA untai tunggal,  DNA  untai  ganda,  maupun  RNA,  dengan panjang bervariasi antara 15 sampai 1000 basa. Melalui inkubasi pada suhu titik lelehnya (T m ), akan terjadi hibridisasi/amplifikasi  antara  probe  dengan  DNA komplemen dari organisme/sampel target. Selanjutnya hibridisasi antara probe dengan DNA sampel target dapat dilihat visualisasinya dengan bantuan film sinar- X, mikroskop fluoresen maupun mikroskop elektron, tergantung  jenis  label  yang  digunakan  (Du  Sart  & Choo, 1998).
Pada awalnya, label probe berupa isotop radioaktif seperti 3 H, 35 S,   dan 32 P.   Nam un  pada perkembangannya  label  radioatif  tidak  banyak digunakan karena beberapa alasan. Di samping tidak cukup aman, penggunaan label radioaktif dianggap kurang  efektif  karena  memiliki  resolusi  rendah, memerlukan  waktu  visualisasi  yang  lama  serta radioaktif yang digunakan memiliki waktu kadaluarsa yang pendek, terutama 32 P dan 35 S (Du Sart & Choo, 1998). Saat ini label non-radioaktif yang lebih aman, cepat, dan memiliki resolusi lebih tinggi dari radioaktif banyak digunakan seperti digoksigenin, fluoresin, dan
biotin  (Scheu  et  al.,  1998).  Salah  satu  produk komersial teknik hibridisasi adalah Gene Trak® yang diperuntukkan  bagi  identifikasi  bakteri  Salmonella spp.,  L.  monocytogenes,  E.  coli,  S.  aureus, Campylobacter  spp.,  dan  Y.  enterolitica®  (Anon., 2010e). Waktu analisis dengan Gene Trak®  sekitar 2  jam  (setelah  40–48  jam  kultivasi)  dengan  limit deteksi  antara  1–5  CFU/25g,  meskipun  beberapa penelitian menyatakan sulit untuk mencapai limit ini (Olsen,  2000).  Beberapa  contoh  probe  DNA  yang digunakan untuk identifikasi bakteri patogen seperti pada Tabel 2.
Pada prakteknya, teknik hibridisasi lebih sering digunakan untuk keperluan uji skrining mikroba dari pada untuk identifikasi mikroba patogen. Hal ini karena teknik ini memerlukan sampel dalam bentuk cair yang harus dioleskan pada permukaan lempeng. Padahal tidak semua media kultivasi dalam bentuk cair, atau bisa saja mikroba diperoleh  langsung dari sampel padat tanpa melalui proses kultivasi. Sehingga pada kasus  seperti  ini  sampel  harus  diencerkan  dan biasanya limit deteksi mencapai lebih dari 10 CFU/ 25 g. Dengan teknik ini skrining sejumlah besar media kultivasi  (broth)  dapat  dilakukan  pada  satu  atau beberapa buah lempeng (Olsen et al., 2000). Teknik hibridisasi DNA juga telah meletakkan landasan yang penting bagi berkembangnya teknik-teknik lain seperti sandwich  hybridization  dan  chip-DNA,  termasuk makro/mikro-array maupun chip-DNA sekuensing.

## b. Array Oligonukleotida (chip-DNA)
Teknologi chip-DNA (DNA array) merupakan salah satu  cara  yang  efektif  untuk  mempelajari  fungsi genom, terutama melalui ekspresi  gen.  Chip-DNA bekerja berdasarkan prinsip pasangan basa nitrogen. Sebuah chip DNA merupakan lempengan, baik berupa kaca maupun silikon, yang mengandung cDNA dari berbagai organisme yang telah diketahui identitasnya. cDNA atau probe ini diperoleh melalui sintesis mRNA dengan  enzim  transkriptase.  Probe  dapat  berupa potongan  oligonukleotida  (untai  tunggal)  yang dilekatkan pada chip-DNA, maupun berupa molekul DNA (untai ganda) yang integrasikan pada sebuah robot untuk membantu aplikasi sampel, terutama bila jumlahnya  cukup  banyak.  Seperti  pada  teknik hibridisasi,  probe  ini  selanjutnya  akan  mengenali susunan  basa nitrogen mRNA  sampel target yang telah diberi label fluoresen melalui proses amplifikasi. Sebuah chip-DNA dapat menampung hingga puluhan juta probe, yang memungkinkan peluang terjadinya hibridisasi menjadi besar.
Pada  aplikasinya,  chip-DNA  berbeda  dengan teknik hibridisasi karena menggunakan sampel asam nukleat  berupa  mRNA.  mRNA  yang  diisolasi  dari organisme  target  kemudian  diberi  label  dengan
Tabel 2. Beberapa contoh probe DNA yang digunakan untuk identifikasi bakteri patogen pada produk pangan
fluoresen.  Sampel  tersebut  kemudian  diinkubasi bersama-sama dalam chip-DNA untuk memungkinkan terjadinya  amplifikasi  (hibridisasi)  antara  mRNA sampel target dan probe. Bagian sampel yang susunan basanya  berbeda  tidak  akan  terikat  probe  dan dipisahkan  dengan  pencucian,  chip  selanjutnya dipapar dengan sinar laser atau ultraviolet. Probe yang terikat  dengan  sampel  mRNA  ditunjukkan  dengan adanya pendaran fluoresen. Selanjutnya, perpendaran fluoresen  dapat  divisualisasikan  dengan  bantuan scaner fluoresen konfokal atau scaner mikroskop.
c. Reaksi Polimerase Berantai (PCR)
Teknik  amplifikasi  in  vitro  dianggap  memiliki sensitifitas  yang  lebih tinggi  dibandingkan  dengan metode hibridisasi probe. Terdapat beberapa metode amplifikasi in vitro yaitu amplifikasi Q-beta replikase, reaksi ligase berantai, amplifikasi asam nukleat dan PCR.  Kecuali  PCR,  metode  amplifikasi  umumnya terbatas  pada  kegiatan monitoring  produk  pangan maupun tingkat higinitasnya (Scheu et al., 1998). Oleh karena itu, pembahasan akan difokuskan pada metode identifikasi  dengan  teknik  PCR  serta  teknik-teknik turunannya seperti real time PCR, sidik jari (finger printing) dan sekuensing.
Tek nik  P CR  m em ungk inkan  identif ik asi mikroorganisme  secara  spesifik  dan  cepat  pada berbagai jenis sampel bahan/produk pangan. Dengan
instrumen thermal cycler, amplifikasi fragmen gen spesifik  dilakukan  dalam  tiga  tahapan,  yaitu  (1) denaturasi DNA untai ganda menjadi untai tunggal; (2)  amplifikasi  DNA  untai  tunggal  dengan  primer spesifik;  dan  (3)  ekstensi  primer  dengan  enzim polymerase. Proses ini menghasilkan fragmen DNA target  secara  eksponensial  sesuai  dengan  jumlah pengulanganan/cycle  yang dilakukan.  Selanjutnya fragmen DNA target hasil PCR dianalisis baik dengan sekuensing maupun dengan teknik-teknik sidik jari seperti DGGE, RFLP, RAPD, PFGE, dan lain-lain. Sementara  itu  real  time  PCR  merupakan  metode alternatif identifikasi yang lebih praktis dan efisien. Gambaran tahapan identifikasi dengan teknik PCR seperti pada Gambar 1.
Sensitifitas metode identifikasi mikroba dengan PCR tidak hanya ditentukan oleh kondisi reaksi PCR, melainkan juga oleh bentuk matriks sampel maupun metode  ekstraksi  DNA  yang  digunakan.  Sebagai contoh limit deteksi kultur murni L. monocytogenes adalah 1–10 sel/mL, tetapi pada sampel keju limit deteksi bakteri tersebut menjadi 1–10 6 sel/mL (Scheu et al., 1998). Pada prinsipnya, isolasi DNA bakteri dapat diperoleh langsung dari sampel (ikan) tanpa melalui tahap kultivasi. Namun untuk memperoleh jumlah mikroba sesuai dengan yang diinginkan, tahap pengkayaan terhadap sampel bisa dilakukan, baik dengan menggunakan media universal maupun media

## Dwiyitno
No Je nis ba kte ri Gen ta rge t Rujuka n a. DNA kriptik Taylor & Hiratsuka (1990) b. 16S rRNA Romaniuk & Trust (1989) 2 Clostridium perfringens - Fosfolipase C van Damme-Johgsten et al . (1990) a. Gen LT dan ST Moseley et al . (1980) b. Gen verotoksin Thomas et al . (1991) c. Faktor adhesi plasmid born Nataro et al . (1985) d. Faktor adherent Jerse et al . (1990) a. Gen hemolis in Chenevert et al . (1989) b. Gen invasi Bohnert et al . (1992) a. DNA kriptik Olsen et al . (1991) b. Protein invasi A Germini et al . (2009) 6. Staphylococcus aureus - Enterotoksin A, B, C, E Ewald et al . (1990) 7. Vibrio cholerae - Toksin kolera sub unit A W achsmut et al . (1993) 8. V. vulnific us - Sitotoksin A W right et al . (1992) 9. V. parahaemolyticus - Gen hemolisin Espineira et al . (2010)
1 Campylob acter jejuni
3 Escherichia coli
4. Listeria monocytogenes
5. Salmonella  spp.
spesifik. Tahap pengkayaan sekaligus penting untuk mengurangi kesalahan identifikasi yang berasal dari sel-sel mikroba yang telah mati, atau yang dikenal dengan  false  positive.  Kultiv asi  mikroba  dapat dilakukan baik dengan media padat maupun media cair.
Secara umum proses isolasi DNA bakteri terdiri atas empat tahap, yaitu (1) lisis sel, (2) pemisahan DNA dari kontaminan/pengotor, (3) presipitasi DNA dari pelarut, dan (4) bila diperlukan tahap pemurnian/ purifikasi dapat dilakukan untuk memperoleh kualitas DNA yang lebih baik. Pada ekstraksi DNA langsung dari sampel ikan, sekitar 10 g daging dicampur dengan larutan pepton (1:10) untuk dihomogenkan dengan stomacher.  Selanjutnya  ekstraksi  DNA  dilakukan terhadap sampel yang telah homogen sesuai dengan metode ekstraksi  yang dipilih.  Untuk sampel yang memerlukan tahap pengkayaan, sampel yang telah homogen dikultivasi pada media universal seperti TSB (tryptose soy broth) atau TSBYE (tryptic soy broth yeast extract), maupun media spesifik sesuai jenis bakteri  target,  misalnya  deoxycholate  hydrogen sulphide lactose agar untuk Salmonella, E. coli agar untuk E. coli, dan tiosulfate-citrate-bilesucrose agar (TCBS) untuk Vibrio sp. (Espineira et al., 2010).
Beberapa metode dapat digunakan untuk isolasi DNA mikroba, termasuk bakteri patogen, mulai dari yang  sederhana  sampai  dengan  yang  kompleks. Metode  isolasi  DNA  yang  dipilih  harus  mampu memisahkan kontaminan/impuritis dari DNA dengan baik. Lisis yang bertujuan untuk membuka/merusak dinding  sel  bakteri  dapat  dilakukan  dengan  cara mekanik (pembekuan/pelelehan atau freeze/thaw dan
maserasi dengan N 2 cair), kimiawi (sodium dodecyl sulfate/SDS,  cetyl  trimethyl  ammonium  bromide/ CTAB, guanidine isothiocyanate/GuSCN, sarkosyl, NP-40, dan tritonX-100) maupun enzimatis (lisozim, mutanolisin, proteinase dan RNAse) (Bartlet & Stirling, 2003; Maciel et al., 2009).
Yang  perlu  diperhatikan  dalam  ekstraksi  DNA adalah adanya ion-ion deterjen seperti sodium dodecyl sulphate (SDS),  sodium  deoxycholate  (SDC),  dan sarkosil  serta  komponen  produk  pangan  (protein, lemak,  karbohidrat, garam) pada  isolat DNA yang dapat mempengaruhi sensitifitas PCR. Salah satu cara yang digunakan untuk mengatasi hal tersebut adalah dengan sentrifugasi kultur sebelum isolasi DNA guna  memisahkan  sel  bakteri  dengan  medianya. Untuk  pemisahan  DNA  dari  kontaminan/pengotor dapat menggunakan campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol. Sementara itu untuk presipitasi DNA biasa  digunakan  etanol  atau  isopropil  alkohol. Beberapa  kit  kom ersial  juga  tersedi a,  yang memungkinkan ekstraksi DNA lebih cepat dan praktis, seperti DNAzol (Invitrogen), Plasmid Mini Kit (Bioline), Wizard SV96 System (Promega), Macherey-Nagel Nuc leospin  ( ABgene),  P repM an ® ( Appli ed Biosystems),  serta  Chelex ® 100    dan  Instagene (Biorad).
Seperti  apli kasi  PCR  pada  um um nya, keberhasilan amplifikasi PCR sangat ditentukan oleh spesifikasi primer yang digunakan. Disain primer harus dibuat sedemikian rupa untuk mengenali fragmen DNA yang menjadi target dengan mudah. Oleh karena itu primer harus spesifik, memiliki temperatur leleh (T m ) setara  antara  primer  depan  dan  primer  belakang dengan komposisi basa G-C tidak kurang dari basa
Gambar 1. Tahapan proses identifikasi mikroba dengan teknik PCR.
Elektroforesis (+30 menit) Kultivasi (+4-6 jam)/ Tanpa kultivasi (0 jam) Sidik jari (+2-10 jam) Sekuensing (+2 jam) Ekstraksi DNA (+1 jam) Profil Tm Real time PCR (+1-1,5 jam) PCR (+2 jam) Analisis produk PCR Elektroforesis (+30 menit) Kultivasi (+4-6 jam)/ Tanpa kultivasi (0 jam) Sidik jari (+2-10 jam) Sekuensing (+2 jam) Ekstraksi DNA (+1 jam) Profil Tm Real time PCR (+1-1,5 jam) PCR (+2 jam) Analisis produk PCR Kultivasi (+4-6 jam)/ Tanpa kultivasi (0 jam) Kultivasi (+4-6 jam)/ Tanpa kultivasi (0 jam) Sidik jari (+2-10 jam) Sidik jari (+2-10 jam) Sekuensing (+2 jam) Sekuensing (+2 jam) Ekstraksi DNA (+1 jam) Ekstraksi DNA (+1 jam) Profil Tm Real time PCR (+1-1,5 jam) Profil Tm Profil Tm Real time PCR (+1-1,5 jam) PCR (+2 jam) PCR (+2 jam) Analisis produk PCR Analisis produk PCR
A–T.  Beberapa  contoh  primer  spesifik  yang  telah digunakan untuk identifikasi mikroba patogen pada produk pangan, termasuk perikanan adalah seperti pada Tabel 3. Beberapa jenis bakteri patogen telah berhasil  diidentifikasi  dengan  teknik  PCR  pada sejumlah produk perikanan antara lain filet salmon, udang segar dan olahan, ikan sebelah, nuget patin, scallop, kerang, oyster, dan mahi-mahi (Wang et al., 1997; Yasmin et al., 2007)
Penggunaan primer spesifik (seperti pada Tabel 3)  memberikan  keuntungan  yaitu  identitas  bakteri patogen dapat ditentukan berdasarkan hasil PCR yang divisualisasikan melalui gel elektroforesis. Munculnya sebuah pita dengan panjang fragmen sesuai fragmen DNA target mengindikasikan hasil PCR positif, dan sebaliknya apabila tidak terdapat pita berarti hasil PCR negatif .   Nam un  dem i kian  pada  praktek nya kemungkinan munculnya pita yang tidak diinginkan dapat  terjadi,  seperti  adanya  pita  tambahan,  pita ganda  maupun  pita  non-target  akibat  kurang spesifiknya primer yang digunakan. Oleh karena itu, untuk memastikan pita tunggal yang diperoleh benar- benar fragmen DNA target, kadang-kadang dilakukan
konfirmasi  lebih  lanjut,  baik  dengan  sekuensing maupun  teknik-teknik  sidik  jari  yang  relatif  lebih sederhana.
c. 1. Sekuensing
Sekuensing DNA  merupakan  teknik paling akurat dan lengkap untuk identifikasi spesies. Sekuensing DNA merupakan  modifikasi  dari  amplifikasi DNA pada PCR. Yang membedakan adalah penggunaan dideoksinukleotida (ddNTPs) berlabel untuk elongasi DNA. Sebelum dilakukan sekuensing, produk PCR dimurnikan    untuk    menghilangkan    kontaminan berupa sisa pereaksi PCR maupun primer. Hasil dari proses  sekuensing  berupa  kromatogram  dari nukleotida  fragmen  DNA  target.  Analisis  terhadap kromatogram  sekuens  dapat  dilakukan  dengan bantuan  perangkat  lunak  seperti  Bionumerics, ChromasPro    dan    BioEdit    untuk    menentukan fragmen  DNA  yang  diinginkan.  Indeks  kemiripan (similarity index)  selanjutnya  dievaluasi  dengan cara membandingkannya  terhadap  sekuens  pembanding (library) dari database yang tersedia  secara online seperti melalui GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) dan
Tabel 3. Beberapa primer yang digunakan untuk identifikasi mikroba patogen pada produk perikanan
Dwiyitno
275bp;
Sal-3
TAT CGC CAC GTT CGG GCA A inv A Sal-4 TCG CAC CGT CAA AGG AAC C 610bp; Shi-1 CTT GAC CGC CTT TCC GAT AC Sethabutr et al.  (1993) Ipah Shi-2 CAG CCA CCC TCT GAG AGT A 361bp; O157-3 GTA GGG AAG CGA ACA GAG hly A O157-4 AAG CTC CGT GTG CCT GAA LT-1 GAG ACC GGT ATT ACA GAA ATC LT-2 GAG GTG CAT GAT GAA TCC AG 381bp; VIP-1 GAA TTC GAT AGG GTG TTA ACC DNA genom VIP-2 ATC CTT GAA CAT ACG CAG C 383bp; VV-1 CTC ACT GGG GCA GTG GCT Sitolisin VV-2 CCA GCC GTT AAC CGA ACC A YE-1 CTG TCT TCA TTT GGA GCA TTC YE-2 GCA ACA TAC ATC GCA GCA ATC SA-1 GCG ATT GAT GGT GAT ACG GTT SA-2 CAA GCC TTG ACG ACT AAA GC LM-1 CGG AGG TTC CGC AAA AGA TG LM-2 CCT CCA GAG TGA TCG ATG TT BC-1 CTG TAG CGA ATC GTA CGT ATC BC-2 TAC TGC TCC AGC CAC ATT AC
Rujukan Samonella  spp. 40 Rahn et al . (1992) Jenis bakteri Ge n target Nam a prim er
Se kuens  (5’-3’) Se nsitivitas
(sel) Shigella  spp. 5x10 4 Escherichia coli 2 Wang et al . (1997) E. coli 117bp; enterotoksin 40 Victor et al.  (1991) Vib rio parahaemolyticus 4 Lee et al.  (1995) V. vulnificus 100 Brauns et al.  (1991) Yersinia enterocolitica 159bp; enterotoxin 4 Ibrahim et  al . (1992) Staphylococcus aureus 276bp; nuklease 20 Brakstad et al . (1992) Listeria monocytogenes 234bp; hemolisin 20 Furer et al . (1991) Bacillus cereus 185bp; hemolisin 500 Wang et al.  (1997)
EMBL (www.ebi.ac.uk) dengan teknik BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
Sekuensing  mampu  mengidentifikasi  spesies tanpa  memerlukan  contoh  pembanding  apabila sekuens pembanding tersedia pada basis data online, seperti GenBank  dan EMBL. Data base sekuens dari bakteri-bakteri patogen pada produk pangan umumnya telah  tersedia  pada  kedua  data  bank  tersebut. Sebanyak 30 bakteri (patogen dan non patogen) pada halibut (Hyppoglossus hyppoglossus) yang disimpan dengan  teknik  modifikasi  atmosfer  berdasarkan fragmen  16S  rDNA  teridentifikasi  dengan  indeks kemiripan antara 83–100% (Hovdaa, 2007). Fragmen 16S  rDNA  sering  digunakan  untuk  keperluan identifikasi/skrining bakteri patogen karena gen ini bersifat  universal  serta  banyak  terdapat  pada  sel mikroorganisme.
c. 2. Teknik sidik jari (Fingerprinting)
Beberapa teknik sidik jari telah berkembang yang memungkinkan identifikasi organisme menjadi relatif lebih  m urah  dan  lebih  cepat.  Teknik -tek nik fingerprinting yang biasa digunakan untuk identifikasi bakteri patogen antara lain Denaturing/Temperature Gradient  Gel  Electrophoresis  (DGGE/TGGE), Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), dan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).
Teknik  DGGE  memanfaatkan  gel  poliakrilamid dengan  denat uran  (urea-f orm am i d)  y ang konsentrasinya dibuat gradien tertentu, sesuai dengan suhu yang diinginkan, untuk memisahkan fragmen DNA target berdasarkan suhu leleh/meltingnya. Pada prinsipnya,  fragmen  DNA  dengan  sekuens  yang berbeda akan menghasilkan profil pita yang berbeda pula, karena pasangan basa “GC” bersifat lebih stabil dan  memiliki  suhu  leleh  lebih  tinggi  dibandingkan dengan pasangan basa “AT”. Pada teknik ini, sebanyak 15–30 basa GC (GC clamp) ditambahkan pada sisi 5’ salah satu primer untuk mencegah fragmen DNA meleleh menjadi 2 buah oligonukleotida. Sementara itu pada teknik TGGE, fungsi denaturan digantikan oleh gradien suhu disesuaikan dengan suhu melting f ragm en  DNA  target.  Beberapa  penelit ian menyebutkan  limit  deteksi  metode  DGGE  untuk bakteri pada makanan antara 10 2 -10 5 cfu/mL (Wilson, 1997; Silvestri et al., 2007). Apabila diperlukan, pita pada gel DGGE/TGGE dapat diisolasi untuk keperluan sekuensing. Teknik DGGE pernah digunakan pada identifikasi  bakteri  pada  penyimpanan  halibut (Hyppoglossus hyppoglossus) berdasarkan fragmen 16S rDNA (Hovdaa et al., 2007).
PCR-RFLP merupakan teknik sidik jari yang cukup banyak digunakan untuk identifikasi spesies. Teknik
ini mengandalkan kinerja enzim-enzim endonuklease tertentu untuk memotong fragmen DNA target pada kombinasi  nukleotida  tertentu/spesifik.  Sebagai contoh, enzim endonuklease EcoRI bersifat spesifik terhadap kombinasi nukleotida “GAATTC”. Enzim- enzim  endonuclease  yang  biasa  digunakan  pada teknik RFLP antara lain AluI, EcoRI, HaeIII, HindIII, dan SmaI.
Pada teknik ini teknik lain sidik jari adalah Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP). DNA untai ganda ditambahkan dengan larutan denaturan formamid, bromfenol biru dan xilen sianol agar terbuka menjadi DNA untai tunggal. Kemudian masing-masing DNA untai tunggal ini dibiarkan membentuk DNA untai ganda kembali. Perbedaan bentuk DNA untai ganda yang dihasilkan mengakibatkan perbedaan mobilitas pada gel elektroforesis. Pada teknik RAPD, sebuah primer  universal  digunakan  untuk  menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang spesifik untuk spesies yang berbeda. Shabarinath et al. (2006) melakukan identifikasi Salmonella pada produk perikanan dengan teknik RAPD pada gen invA. Pada  umumnya limit deteksi teknik RAPD sekitar 5x10 2 CFU/PCR, bila dengan kultur murni. Namun demikian, kedua teknik ini kurang populer karena memiliki tingkat akurasi yang rendah serta memerlukan sampel pembanding.
c. 3. PCR-multipleks
Beberapa jenis bakteri patogen dapat diidentifikasi pada saat yang bersamaan dengan menggunakan teknik  PCR-multipleks,  sehingga  memungkinkan waktu  identifikasi  lebih  cepat  dengan  biaya  lebih murah. Pada teknik PCR-multipleks, amplifikasi PCR dilakukan dengan beberapa pasangan primer sesuai jumlah bakteri yang diidentifikasi. Meskipun panjang fragmen gen target antar jenis bakteri berbeda, namun suhu annealing primer-primer yang digunakan harus seragam.  Hal  ini  untuk  memperoleh  optimalisasi amplifikasi PCR pada suhu annealing yang diinginkan. Reaksi positif ditandai oleh munculnya pita sesuai panjang  fragmen  yang  diinginkan.  Metode  PCR- multipleks telah banyak digunakan untuk identifikasi bakteri  patogen  pada  produk  perikanan.  Sebagai contoh, 13 bakteri patogen pada ikan, krustasea, dan moluska berhasil diidentifikasi dengan PCR universal (Wang et  al.,  1997). PCR-multipleks juga berhasil digunakan  untuk  identifikasi  E.  coli,  L.  mono- cytogenes, dan S. enteritidis secara sekaligus pada sampel udang (Yasmin et al., 2007) dan berbagai jenis produk pangan lainnya (Kawasaki et al., 2009).

## c. 4. Real time PCR
Real time PCR (RT-PCR) menawarkan beberapa keuntungan untuk deteksi cepat bakteri patogen. Di
samping membutuhkan waktu analisis lebih cepat, RT-PCR  dianggap  lebih  spesif ik  dan  sensitif dibandingkan PCR biasa. Kemungkinan kontaminasi silang  dapat  dihindari  karena  tidak  memerlukan analisis  pasca-PCR.  Pada  RT-PCR,  data  dan informasi fragmen DNA hasil PCR dapat diperoleh langsung  (on-line)  berdasarkan  kromatogram  dari fluoresen  DNA  hasil  amplifikasi.  Hal  ini  karena pereaksi RT-PCR dilengkapi dengan probe berfluoresen yang akan terikat pada setiap DNA untai ganda hasil amplifikasi. Dengan bantuan detektor Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), probe tersebut akan  diubah  menjadi  sinyal  kromatografi  yang intensitasnya akan berkorelasi dengan konsentrasi DNA hasil amplifikasi. Beberapa jenis probe RT-PCR yang tersedia antara lain TaqMan ® Probes (Applied Biosystems),  Molecular  Beacons ® (Stratagene), Scorpions ® (DxL Ltd), dan SYBR ® Green (Roche).
Dalam   waktu  1-1,5  jam ,  RT-PCR  m am pu melakukan analisis sebanyak 96 sampel pada sebuah mikropelat. Adanya bakteri lain yang tidak menjadi target ditunjukkan oleh adanya kromatogram dengan temperatur leleh (T m ) yang berbeda dengan bakteri target. Dari sebuah penelitian pada B. cereus, RT- PCR mampu mengidentifikasi bakteri pada bahan pangan meski hanya 1 CFU/g, namun memerlukan kultivasi selama 4-6 jam terlebih dahulu. Sementara itu pada konsentrasi yang lebih tinggi (10 1 -10 3 CFU/ g) dapat diidentifikasi langsung tanpa melalui kultivasi terlebih dahulu (Fricker et al., 2007). Penelitian lain oleh Rahn et al. (1992) menunjukkan limit deteksi Salmonella spp. dengan teknik RT-PCR pada ikan salmon adalah 2,5 CFU/25 g. Selanjutnya identifikasi Salmonella pada produk pangan dengan RT-PCR yang dilakukan  oleh  Bohaychuk  et  al.  (2007)  yang m enggunakan  gen  target  inv A  m enunjukkan sensitiv itas  97,1–100%  dengan  efisiensi  biaya mencapai  62%  dibandingkan  identifikasi  cara konvensional dengan kultivasi.
c. 5. Kit PCR komersial
Beberapa perusahaan telah mengembangkan kit komersial dengan teknik molekuler untuk identifikasi bakteri patogen pada produk pangan. Pada umumnya kit-kit yang berkembang dibuat untuk memudahkan pekerjaan-pekerjaan  preparasi  sampel  maupun reagen, baik untuk bakteri patogen tunggal maupun kolektif. Satu seri kit GeneGen yang diproduksi oleh SY-LAN Gerate GmbH-Austria misalnya, terdiri atas GeneGen Salmonella untuk identifikasi Salmonella spp., dan GeneGen Listeria untuk genus Listeria/L. monocytogenes.  Adapun  GeneGen  MFP  bersifat universal  dengan  teknik  multipleks-PCR  untuk Salmonella spp, E. coli O157, L. monocytogenes dan Campylobacter spp. yang memiliki limit deteksi 5µL
(Vollenhofer-Schrumpf & Wei β, 2007). Sementara itu MicroSEQ(R) Salmonella (Applied Biosystems) telah diadopsi oleh lembaga riset AOAC untuk identifikasi bakteri Salmonella spp.
Sebuah  perusahaan  dari  Jerman  (BIOTECON Diagnostics GmbH) telah mengembangkan kit untuk identifikasi bakteri patogen berdasarkan teknik RT- PCR. Kit  RT-PCR yang  diproduksi perusahaan  ini mampu membedakan 6 spesies Campylobacter (C. jejuni, C. coli, C. lari, C. fetus, C. hyointestinalis dan C.  upsaliensis)  dengan  LightCycler®  foodproof Campylobacter Detection Kit (Grönewald, 2005). Pada Gambar 2 terlihat profil temperatur leleh dari 4 spesies Campylobacter. Hal yang sama untuk membedakan 6  spesies  Listeria  dengan  LightCycler®  foodproof Listeria Genus Detection Kit. Identifikasi L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. monocytogenes, dan L. whelshimeri dapat dilakukan selama tidak lebih dari 2 hari (termasuk kultivasi) dengan limit deteksi 10 2 sel/mL. Padahal dengan metode konvensional dapat memakan waktu hingga 4 hari (Dorries et al., 2004).  S em entara  it u  Bio- Rad  juga  telah mengembangkan  kit  berdasarkan  teknik  RT-PCR untuk  identifikasi  bakteri  Salmonella,  E.  coli  dan Listeria  monocytogenese  dengan  alat  yang  diberi nama IQ-Check TM dan  telah divalidasi  oleh AOAC maupun AFNOR.

## KEUNGGULAN  DAN  KELEMAHAN  T EKNIK MOLEKULER
Pada umumnya identifikasi bakteri dengan teknik PCR memiliki tingkat sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan teknik konvensional melalui cara kultivasi. Hal ini karena identifikasi bakteri dilakukan menggunakan  target  gen  spesifik  bakteri.  Hasil penelitian Aabo  et  al.  (1995)  menunjukkan  bahwa sensitivitas metode identifikasi dengan PCR sebesar 92%, sedangkan dengan metode konvensional hanya 50%. Bahkan pada teknik PCR-multipleks, identifikasi beberapa bakteri yang berbeda dapat dilakukan pada saat  yang  bersam aan,  m em ungkinkan  waktu identifikasi  lebih cepat dengan  biaya lebih murah. Identifikasi  molekuler  juga  memungkinkan  seleksi antara bakteri potensial virulent dengan non virulent pada spesies yang sama melalui teknik hibridisasi.
Di  antara  kelemahan  identifikasi  bakteri  pada produk pangan dengan teknik PCR adalah adanya komponen pengganggu baik yang berasal dari matriks sampel, media kultivasi maupun media ekstraksi DNA. Untuk mengatasinya, pra-perlakuan dengan teknik separasi imunomagnetik (IMS) sering dilakukan untuk memisahkan bakteri dari medianya. Sementara itu kontaminan yang berasal dari sel-sel bakteri yang mati atau rusak dapat diatasi dengan cara kultivasi bakteri

## Dwiyitno
pada  media  spesifik.  Identifikasi  bakteri  patogen dengan  teknik  P CR  kadang-k adang  m asih memerlukan uji patogenitasnya. Hal ini karena reaksi positif yang dihasilkan dari PCR hanya menunjukkan adanya bakteri patogen, tanpa memberikan tingkat patogenitasnya.  Untuk  mengatasi  kelemahan  ini, kontrol internal biasanya digunakan dari bakteri yang sudah diketahui patogenitasnya. Keterbatasan biaya dan  fasilitas  merupakan  salah  satu  kendala  pada penerapan teknik identifikasi bakteri patogen secara m ol ekuler.  Ol eh  karena  itu  pada  beber apa laboratorium, teknik molekuler baru terbatas digunakan untuk kebutuhan verfikasi metode guna melengkapi teknik  identifikasi  konvensional  maupun  biokimia (Sudian, 2008).

## PENUTUP
Seiring  dengan  tuntutan  akan  hasil  analisis keamanan produk pangan termasuk produk perikanan yang semakin cepat dan akurat, identifikasi mikroba patogen khususnya dengan teknik molekuler menjadi alternatif bagi laboratorium-laboratorium pengujian. Hal ini karena teknik  molekuler telah diterima sebagai standar  internasional  seperti  teknik  PCR  dan turunannya.  Secara  umum  metode  identifikasi molekuler  memiliki  ef ektiv itas,  efisiensi,  dan sensitifitas lebih tinggi jika dibandingkan dengan teknik identifikasi konvensional.
Pada prakteknya, metode identifikasi molekuler berkembang mulai dari yang murah dan sederhana seperti teknik sidik jari hingga yang lebih mahal dan canggih seperti sekuensing dan real-time PCR. Alat pengganda DNA (thermal cycler) yang menjadi kunci metode ini pun kini sudah tidak lagi menjadi barang yang langka dan mahal. Banyak laboratorium lembaga riset  maupun  perguruan  tinggi  di  Indonesia  telah
dil engk api  P CR,  t erm asuk  RT-PCR.  Hanya ketersediaan sekuenser yang masih relatif terbatas pada lembaga riset maupun perguruan tinggi tertentu. Di pasaran, kit-kit komersial juga telah tersedia yang menjadikan analisis menjadi lebih mudah, praktis, dan cepat.
Terlepas dari kelemahannya, metode identifikasi bakteri patogen dengan teknik PCR khususnya, telah menawarkan beberapa keuntungan untuk dijadikan metode identifikasi alternatif, baik pada analisis rutin maupun untuk keperluan skrining bakteri. Pemilihan jenis  m etode  sebaiknya  disesuaikan  dengan kebutuhan analisis, kemampuan laboratorium serta ketersediaan finansial.

## DAFTAR PUSTAKA
Aabo, S., Andersen, J. K., and Olsen, J. E. 1995. Detection of  Salmonella  in  minced  meat  by  the  polymerase chain  reaction  method.  Letters  Appl.  Microbiol.  21: 180–182.
Anonymous.  2008a.  Some  frozen  salmon  recalled  in Canada. http://www.upi.com/Science_News/ 2008/09/ 15/Some-frozen-salmon-recalled-in-Canada.6/24/ 2010.  Diakses  pada  tanggal  2 Agustus  2010.
Anonymous.  2008b.  New  York:  Fish  brand  smoked salmon is recalled. http://www.upi.com/ Science_News/2008/09/30/NY-Fish-brand-smoked- salmon-is-recalled.6/24/2010.  Diakses  pada  tanggal 2 Agustus  2010.
Anonim. 2010a. Korban keracunan ikan di Sultra meluas. http://www.solopos.com/2010/channel/  nasional/ korban-keracunan-ikan  di  Sultra  meluas.  Diakses pada  tanggal  2  Agustus  2010.
Anonim.  2010b.  Korban  keracunan  ikan  meluas.  http:// www.banjarmasinpost.co.id/read/artikel/  2010/8/2/ 52224/k orban-k eracunan-ik an-meluas.  Diak ses pada  tanggal  2  Agustus  2010.
Anonim.  2010c.  Korban  k eracunan  ikan  di  Baubau bertambah.  http://www.metrotvnews.com/  index.php/
Gambar 2. Contoh profil temperatur leleh (T m ) beberapa jenis Campylobacter dengan kit RT-PCR (Grönewald, 2005).
metromain/news/2010/08/03/.  Diakses  pada  tanggal 2 Agustus  2010.
Anonim.  2010d.  Sekeluarga  keracunan  ikan  kembung, balita  tewas.  http://www.detiknews.com/index.php/ detik.read/tahun/2008/bulan/03/tg.  Diakses  pada tanggal  2  Agustus  2010.
Anonymous. 2010e. AOAC. 990.13 Salmonella in foods, colorimetric   deoxyribonuc leic   acid  hybridization (GENE-TRAK  Salmonella  Assay)  screening  method (Neogen Corp., 620 Lesher Place, Lansing, MI 48912 USA)
Bartlett, J.M.S. and Stirling, D. 2003. Methods in Molecular
Biology,  Vol.226:  PCR  Protocols,  Second  Edition. Humana  Press  Inc.,  Totowa,  NJ.
Bohaychuk,  V.,  Gensler,  G.,  McFallk,  M.,  King,  R.,  and Renter,  D.  2007.  A  real-time  PCR  assay  for  the detection of Salmonella in a wide variety of food and food-animal  matrices.  J.  Food  Protect.  70:  1080– 1087.
Bohnert,  M.,  Dilasser,  F.,  Dalet,  C.,  Mengaud,  J.,  and Cossart,  P.  1992.  Use  of  specific  oligonucleotides for  direct  enumeration  of  Listeria  monocytogenes  in food  samples  by  colony  hybridization  and  rapid detection  by  PCR. Res. Microbiol. 143:  271–280.
Brakstad,  O.G.,  Aasbakk,  K.,  and  Maeland,  J.A.  1992.
Detection  of  Staphylococcus  aureus  by  polymerase chain  reaction  amplification  of  the  nuc  gene.  J  Clin Microbiol.  30  (7):  1654–60.
Brauns, L.A., Hudson, M.C. and Oliver, J.D. 1991. Use of the  polym erase  c hain  reac tion  in  detec tion  of culturable  and  nonculturable  Vibrio  vulnificus  cells. Appl  Environ  Microbiol.  57  (9):  2651–2655.
Chenevert, J., Mengaud, J., Gormley, E. and  Cossart, P. 1989. A DNA probe specific for L. monocytogenes in the genus Listeria. Int. J Food Microbiol. 8 (4): 317– 319.
Dorries,  H.,  Kiehne,  M.,  Kurth,  B.,  Grönewald,  C.,  and Berghof-Jager,  K.  2004.  Listeria  genus  detection  in food  samples  using  LightCycler®  foodproof  Listeria genus  Detection  Kit.  Biochemica.  3:  1–2.
Du  Sart,  D.  and  Choo,  K.H.A.  1998.  Polymerase  chain reac tion.  In  Rapley,  R.  and  W alk er,  J .M.  eds. Molecular Biomethods Handbook. Human Press Inc. New  Jersey. p.  697–720.
Espineira,  M.,  Atanassova,  M.,  Vieites,  J.M.,  and
Santaclara, F.J.  2010.  Validation  of  a  method  for  the detection  of  five  species,  serogroups,  biotypes  and virulence  factors  of  Vibrio  by  multiplex  PCR  in  fish and  seafood.  Food  Microbiol.  27:  122–131.
Ewald,  S.,  Heuvelman,  C.J.,  and  Notermans,  S.  1990.
The  use  of  DNA  probes  for  conforming  enterotoxin production by Staphylococcus aureus and micrococci. Int. J.  Food Microbiol. 1: 251–257.
Feldhusen,  F.  2000.  The  role  of  seafood  in  bacterial foodborne diseases. Microbes  &  Infection., 2:  1651– 1660.
Fricker, M., Messelhaußer, U., Busch, U., Scherer, S. and Ehling-Schulz,  M.  2007.  Diagnostic  Real-Time  PCR assays  for  the  detection  of  emetic  Bacillus  cereus strains  in  foods  and  recent  food-borne  outbreaks. Appl.  Environ.  Microbiol.  73  (6):1892–1898.
Furrer,  B.,  Candrian,  U.,  Hoefelein,  C.,  and  Luethy,  J. 1991.  Detec tion  and  identific ation  of  Lis teria monocytogenes  in  cooked sausage  products  and  in milk  by  in  vitro  amplification  of  haemolysin  gene fragments. J  Appl Bacteriol.  70  (5):  372–9.
Germini,  A.,  Masola,  A.,  Carnevali,  P.  and  Marchelli,  R.
2009.  Simultaneous  detection  of  Escherichia  coli O175:H7, Salmonella spp., and Lis teria monocytogenes by multiplex PCR. Food Control, 20:
733–738.
Grönewald,  C.  2005.  Detection  of  Campylobacter  spp. in  food  samples  using  the  New  LightCyc ler® foodproof  Campylobacter  detection  kit.  Biochemica. 4: 1–2.
Hovd aa,  M.B.,  Sivertsvik a,  M.,  Lunestadb,  B.T., Lorentzenc ,  G.,  and  Rosnesa,  J .T.  2007. Charac terisation  of  the  dominant  bac terial population  in  modified  atmosphere  pac k aged farmed  halibut  (Hippoglossus  hippoglossus)  based on 16S rDNA-DGGE. Food Microbiol. 24:  362–371. Ibrahim,  A.,  Liesack,  W.  and  Stackebrandt,  E.  1992.
Polymerase  chain  reaction-gene  probe  detection system  specific  for  pathogenic  strains  of  Yersinia enterocolitica.  J.  Clin  Microbiol.  30  (8): 1942–1947.
ISO  22174:2005.  Mic robiology  of  food  and  animal feeding stuffs  - Polymerase chain reaction  (PCR) for the  detection  of  food-borne  pathogens:  General requirements  and  definitions.  International  Standard Organization.
Jerse, A. E., Martin, W. C., Galen, J. E., and Kaper, J. B. 1990.  Oligonucleotide  probe  for  detection  of  the enteropathogenic   Es cherichia  c oli  (EPEC) adherence factor of  localized  adherent EPEC. J Clin Microbiol.  28:  2842–2844.
Kawasaki,  S., Fratamico, P.M.,  Horikoshi,  N., Okada, Y.,
Takeshita,  K.,  Sameshima,  T.  and  Kawamoto,  S. 2009.  Evaluation  of  a  multiplex  PCR  system  for simultaneous  detection  of  Salmonella  spp.,  Listeria monocytogenes,  and  Escherichia  coli  O157:H7  in foods  and  in  food  subjected  to  freezing.  Foodborne Pathog. & Dis. 6 (1): 82–89.
Kim, S.H., Field, K.G., Chang, D.S., Wei, C.I. and An, H.
2001.  Identification  of  bacteria  crucial  to  histamine accumulation  in  pacific  mackerel  during  storage.  J. Food Protect. 64: 1556–1564.
Lee, C.Y., Pan, S.F. and Chen, C.H. 1995. Sequence of a cloned  pR72H  fragment  and  its  use  for  detection  of Vibrio  parahaemolyticus  in  shellfish  with  the  PCR. J. Environ.  Microbiol.   61  (4):1311–1317.
Lipp,  E.K.,  and  Rose,  J.B.  1997  The  role  of seafood  in foodborne  diseases  in  the  United  States  of America. Rev. Sci. Tech. 16: 620–640.
Maciel,  B.M.,  Santos, A.C.F.,  Dias,  J.C.T.,  Vidal,  R.O., Dias,  R.J .C.,  Gross,  E.,  Casc ardo,  J .C.M.  and Rezende, R.P. 2009. Simple DNA extraction protocol for a  16S rDNA study of bacterial diversity in tropical landfarm  soil  used  for  bioremediation  of  oil  waste. Genet. & Molec. Res. 8(1): 375–388.
Moseley, S.L., Huq, I., Alim, A.R.M. A., So, M., Samadpour- Motalebi,  M.,  and  Falkow,  S.  1980.  Detection  of enterotoxigenic  Escherichia  coli  by  DNA  colony hybridization. J. Infec Dis. 42: 892–898.

## Dwiyitno
Nataro, J.P., Scaletsky, I.C.A.,  Kaper, J.B.,  Levine, M.M., and  Trabulsi,  L.R.  1985.  Plasmid-mediated  factors c onferring  difuse  and  localized  adherenc e  of enteropathogenic  E.  coli.  Infec.  &  Immun.  48:  378– 383.
Novotny,  L.,  Dvorska.  L.,  Lorencova, A.,  Beran,  V.,  and Pavlik,  I.  2004.  Fish:  a  potential  source  of  bacterial pathogens for human beings. Vet. Med. – Czech. 49 (9):  343–358.
Olsen,  J.E., Aabo,  S.,  Nielsen,  E.O.,  and  Nielsen,  B.B. 1991.  Isolation  of  a  Salmonella-spec ific   DNA hybridization probe.  APMIS.  9:  114–120.
Olsen,  J.E.  2000.  DNA-based  methods  for  detection  of food-borne  bacterial  pathogens.  Food  Res.  Int.  33: 257–266.
Rahn, K., De Grandis, S.A. Clarke, R.C., McEwen,  S.A., Galan, J.E., Ginocchio, G., Curtiss, R. and Gyles C.L. 1992.  Amplification  of  an  invA  gene  sequence  of Salmonella  ty phimurium  by  polymerase  chain reac tion  as  a  specific  method  of  detec tion  of Salmonella.  Mol.  Cell.  Probes.  6:  271–279.
Romaniuk, P.J.  and Trust, T.J. 1989. Rapid identification of  Campylobacter  species  using  oligonucleotide probe  to  16S  ribosomal  RNA.  Mol.  Cell.  Probes. 3:133–142.
Scheu, P.M., Berghof, K., and Stahl, U. 1998. Detection of pathogenic  and  spoilage  micro-organisms  in  food with  the  polymerase  chain  reaction.  Food  Microbiol. 15:13–31.
Sethabutr, O., Venkatesan, M., Murphy, G.S., Eampokalap, B., and Hoge, C.W. 1993. Detection of Shigellae and enteroinvasive Escherichia coli by amplification of the invasion  plasmid  antigen  H  DNA  sequence  in patients  with dysentery.  J. Infect  Dis.  167:  458–461. Shabarinath,  S.,  Kumar,  H.,  Khushiramani,  R.,
Karunasagar, I., and Karunasagar, I. 2006.  Detection and  characterization  of  Salmonella  associated  with tropical  seafood.  Int.  J.  Food  Microbiol.  114:  227– 233.
Silvestri,  G.,  Santarelli,  S.,  Aquilanti,  L.,  Beccaceci,  A.,
Osimani,  A.,  Tonucci,  F.,  and  Clementi,  F.  2007. Investigation  of the  microbial ecology  of  Ciauscolo,  a traditional  Italian  salami,  by  c ulture-dependent techniques and  PCR-DGGE. Meat  Science  77: 413- 423.
Sudian,  S.  2008.  Penguj ian  mik robiologi  pangan.
InfoPOM. 9(2): 1–9.
Taylor,  D.E.  and  Hiratsuk a,  K.  1990.  Use  of  non- radioac tive  DNA  probes  for  detec tion  of Campylobacter  jejuni  and  Campylobacter  coli  in stool  specimens.  Mol  &  Cell  Probes.  4:  261–271. Thomas, A.,  Smith,  H.R.,  W illshaw,  G.A.,  and  Rowe,  B. 1991.  Non-radioactively  labelled  polynucleotide  and oligonucleotide  DNA  probes,  for selectively  detecting Es cherichia  c oli  strains  produc ing  Verotoxin cytotoxins  VT1,  VT2  and  VT2  variant.  Mol  &  Cell Probes.  5:  129–135.
van  Damme-J ohgsten,  M.,  Haagsma,  J .,  and Notermans,  S.  1990.  Synthitic  DNA  probes  for detection  of  enterotoxigenic  Clostridium  perfringens strains  isolated  from  outbreaks  of  food  poisoning.  J Clin  Microbiol.  28:  131–133.
Victor,  T.,  du  Toit,  R.,  van  Zyl,  J.,  Bester, A.J.,  and  van Helde,  P.D.  1991.  Improved  method  for  the  routine identification  of  toxigenic  Escherichia  coli  by  DNA amplification  of a  conserved  region  of  the  heat-labile toxin A subunit. J  Clin Microbiol. 29  (1):  158–161.
Vollenhofer-Schrumpf,  S.  and  Wei β ,  N.  2007.  Reliable detection  of  pathogenic  microorganisms  in  food samples  commercial  kits  and  the  Mastercycler  ep gradient S. Appl.  Note. 153: 1–5.
Wachsmuth,  I.K.,  Evins,  G.M.,  Fields,  P.I.,  Olsvik,  E., Popovic,  T.,  Bopp,  C.A.,  Wells,  J.G.,  Carillo,  C.,  and Blake,  P.A.  1993.  The  molecular  epidemiology  of cholera in Latin America. J. Infec. Dis. 167: 621–626.
Wang, R.F., Cao, W.W., Cerniglia, C.E. 1997. A universal protocol  for  detection  of  13  species  of  foodborne pathogens in foods. J. Appl. Mirobiol. Vol.83:727-736.
Waswa,  J.,  Irudayaraj,  J.,  and  Debroy,  C.  2007.  Direct detection of E. coli O157:H7 in selected food systems by  a  surface  plasmon  resonance  biosensor.  LWT. 40:  187–192.
W ilson,  I.G.  1997.  Inhibition  and  facilitation  of  nucleic acid amplification. Appl. Environ. Microbiol. 63: 3741– 3751.
Wright, A.C.,  Guo,  Y.,  Johnson,  J.A.,  Nataro,  J.P.,  and Morris,  J.G.J.  1992.  Development  and  testing  of  a non-radioactive  DNA  oligonucleotide  probe  that  is specific for V. cholerae cholera toxin. J. Clin. Microbiol. 30:  2302–2306.
Yasmin,  M.,  Kawasaki,  S.  and  Kawamoto,  S.  2007. Evaluation of multiplex PCR  system for  simultaneous detection  of  Esc herichia  coli  O157:H7,  Listeria monocytogenes and Salmonella enteritidis in  shrimp samples.  Bangladesh  J.  Microbiol.  24  (1):  42–46.

## INFORMASI PUBLIKASI PERPUSTAKAAN BALAI BESAR RISET PENGOLAHAN PRODUK DAN BIOTEKNOLOGI KELAUTAN DAN PERIKANAN

## BUKU BARU
1. Food  Processing  Operations  Modeling: Design and Analysis. 2009. Ed by Soojin Jun; Joseph M. Irudayaraj. Boca Raton: CRC Press.
2. Plastics Packaging: Properties, Processing, Applications, and Regulations. 2004. Susan E.M Selke; John D. Cutler; Ruben Hernandez. Munich: Hansen Publications.
3. Principles  of  Biochemistry:  third  editon. 2004. Donald  Voet;  Judith  G. Voet; Charlotte W. Pratt. Hoboken: John Wiley and Sons.
4. Microbiology: Seven edition. 2008. Jacquelyn G. Black. Virginia: John Wiley and Sons.
5. Dietary  Fibre:  Bio-active  Carbohydrates  for  Food  and  Feed. 2004.Ed by J.W. van Der Kamp. Den Haag: Wageningen Academic Publishers.
6. Analytical  Method  Validation  and  Instrument Performance Verification. 2004. Ed by Chung Chow Chan; Y.C Lee; Herman Lam; Xue-Ming Zhang. New Jersey: John Wiley and Sons.
7. Analisis  Sensori:  untuk  Industri  Pangan  dan  Agro. 2010. Dwi Setyaningsih; Anton Apriyantono; Maya Puspita Sari. Bogor: IPB Press.
8. Fisiologi  Ikan:  Dasar  Pengembangan  Teknik  Perikanan. 2008. Yushinta Fujaya. Jakarta: Rineka Cipta.
9. Pengelolaan Sumberdaya Perikanan Laut. 2008. Johanes Widodo; Suadi. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.
10. Usaha Ikan Konsumsi di Lahan 100 m². 2010. Cahyo Saparinto. Jakarta: Penebar Swadaya.
11. Pengolahan dan Pengawetan Ikan. 2008. Rabiatul Adawyah. Jakarta: Bumi Aksara.
12. Principles of Food Toxicology. 2008. Tonu Pussa. Boca Raton: CRC Press.
13. Process Induced  Food  Toxicents: Occurrence, Formation,  Mitigation,  and  Health Risks. 2009. Ed by Richard H. Stadler; David R. Lineback. New Jersey: John Willey.
14. Molecular Cloning  Vol. I: A Laboratory  Cloning Sambrook and Russell. 2001. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
15. Molecular Cloning Vol. II: A Laboratory  Cloning Sambrook and Russell.2001.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
16. Molecular Cloning Vol. III: A Laboratory  Cloning Sambrook and Russell.2001.  New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
17. Fundamentals of Molecular Spectroscopy. 2008. Colin N. Banwell; Elaine M. McCash. Mc Graw Hill.
18. Engineering Statistics. 2004. Montgomery; Runger; Hubele. Hoboken: John Wiley and Sons.
19. Peraturan Presiden Republik Indonesia No.54 Tahun 2010 tentang Pengadaan Barang Jasa Pemerintah Jakarta: Mini Jaya Abadi.