Menara Perkebunan , 2008, 76(2), 74-82
Optimisasi dan pemurnian IAA yang dihasilkan Rhizobium sp. dalam medium serum lateks  dengan suplementasi triptofan dari pupuk kandang
Optimization and purification of IAA produced by Rhizobium sp . in latex serum media supplemented with tryptophan from chicken manure
Irma KRESNAWATY 1) , Syeda ANDANAWARIH 2) ,
SUHARYANTO 1) & TRI-PANJI 1) *)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Bogor 16151, Indonesia
2) Departemen Biokimia, Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor, Indonesia

## Summary
Concentrated  latex  effluent  had  not  been economically  utilized,  consequently  it  had become source of environmental pollution and conflicts with surrounding community. Whereas, the  concentrated  latex  effluent  could be  used  as  substrate  for  microbes  growth media  due  to  its  high  concentration  of  carbon and nitrogen. One of the economical benefits of growing Rhizobium sp.  in  this  waste  is  the production  of    indole  acetic  acid  (IAA)  that can  be  used  for  plant  promotion  growth.  The aims  of  this  research  were  to  get  the  optimal IAA production of Rhizobium sp. by optimizing its tryptophan supplementation through hydrolysis of chicken manure and to purify IAA produced  using  chromatographic  method.  The use  of  chicken  manure  directly  caused  the browning  effect,  therefore  these  experiments were  carried  out  the  variation  of  NaOH  2  N hydrolysis  treatments  to  reduce  the  effect. Direct  hydrolysis  as  the  first  media    was obtained  by  mixing  latex  serum  and  manure, and  then  this  mixture  was  hydrolyzed. Meanwhile,  separated  hydrolysis  was  done  by adding water to manure, being hydrolyzed, and divided to become second and third media. The second  media    was  made  by  mixing  manure hydrolysate  and  latex  serum  directly,  whereas in  third  media,  hydrolisate  was  added  with alum as coagulating agent. Rhizobium sp. was then inoculated to all media and incubated for
24,  48,  and  72  hours  in  27-30 o C.  IAA  was analyzed  by  spectrophotometric  method  with Salkowsky reagent and Thin Layer Chromatography (TLC). IAA was then extracted  with  ethyl  acetate  and  purified  with silica  gel  column  chromatography.  The separated  hydrolysis  without  coagulation (second  media)  produced  the  highest  IAA concentration,  that  is  14.40 µ g/mL,  whereas IAA produced by direct hydrolysis (first media) was  14.13 µ g/mL  and  0.90 µ g/mL  for  third media    during  48  hours.  The  fractionation result    for  each  mediums  showed  that  the highest IAA distribution in first media  was the 12 th fraction  (38.70%),  meanwhile  in  second media    was  the  15 th fraction  (50.25%)  and  in the third  media was the 13 th fraction (26.16%).
[ Keywords : IAA, Rhizobium sp, latex effluent, tryptophan, chicken manure]

## Ringkasan
Limbah  lateks  pekat  saat  ini  belum  di- manfaatkan  secara  ekonomis,  bahkan  menjadi sumber  pencemaran  lingkungan  dan  konflik dengan masyarakat sekitarnya. Padahal limbah lateks  pekat  dapat  digunakan  sebagai  substrat pertumbuhan mikroba karena memiliki kandungan  karbon  dan  nitrogen  yang  cukup tinggi.  Salah  satu  nilai  ekonomis yang dapat
*)penulis korespondensi
Kresnawaty et al.
diperoleh  dengan  ditumbuhkannya Rhizobium sp.  pada  limbah  tersebut,  yaitu  dihasilkannya asam indol asetat ( indol acetic acid /IAA) yang dapat  digunakan  untuk  memacu  pertumbuhan tanaman.  Penelitian  ini  bertujuan  memperoleh produksi IAA optimal yang dihasilkan Rhizobium sp.  dengan  asupan  triptofan  dari hidrolisis  pupuk  kandang  dan  memurnikan IAA  yang  dihasilkan  tersebut  dengan  metode kromatografi.  Penggunaan  pupuk  kandang secara  langsung  menyebabkan  efek  pen- cokelatan,  maka  dilakukan  variasi  perlakuan hidrolisis dengan NaOH 2 N untuk mengurangi efek  tersebut.  Hidrolisis  langsung  sebagai medium pertama diperoleh dengan mencampur serum  lateks  dan  pupuk  kandang,  sedangkan hidrolisis terpisah dilakukan dengan menambah  pupuk  kandang  dengan  air,    dan dibagi  menjadi  medium  kedua  dan  ketiga. Medium  kedua  dibuat  dengan  cara    langsung mencampur  hidrolisat  dan  serum  lateks, sedangkan  pada  medium  ketiga,  hidrolisat diendapkan  dengan  alum  sebagai  bahan pengendap.    Kemudian  ke  dalam  masing- masing medium diinokulasi Rhizobium sp. dan diinkubasi  selama  24  ,48,  dan  72  jam  pada suhu  27-30 o C.  Analisis  IAA  dilakukan  secara spektrofotometri  dengan  metode  Salkowski dan  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT).  IAA diekstraksi  menggunakan  etil  asetat  dan dimurnikan  dengan  kromatografi  kolom  silika gel.  Hidrolisis  terpisah  tanpa  pengendapan (medium  kedua)  menghasilkan  IAA  tertinggi, yaitu  14,40 µ g/mL,  sedangkan  hidrolis langsung  (medium  pertama)  menghasilkan IAA  sebesar  14,13 µ g/mL  dan  medium  ketiga sebesar  0,90 µ g/mL  selama  48  jam.  Hasil fraksinasi untuk masing-masing medium menunjukkan  sebaran  IAA  tertinggi  pada medium  pertama  berada  pada  fraksi  ke-12 (38,70%), sedangkan pada medium kedua pada fraksi  ke-15  (50,25%),  dan  pada  medium ketiga ialah fraksi ke-13 (26,16%).

## Pendahuluan
Limbah  cair  pengolahan  lateks  pekat yang  berupa  serum  lateks  skim  memiliki nilai  COD    lebih  dari  25.000  ppm  dan
kandungan  nitrogen  total  lebih  dari 4.000  ppm  yang  menjadi  sumber  pen- cemaran  lingkungan  dan  konflik  dengan masyarakat  di  sekitar  pabrik  pengolahan lateks (Tri  Panji et al .,  1995).  Kandungan karbon  dan  nitrogen  yang  tinggi  dalam limbah  cair  lateks  pekat  dapat  digunakan oleh  mikroba  penghasil  asam  indol  asetat ( indole  acetic  acid /IAA)  sebagai  substrat pertumbuhan, sehingga meningkatkan nilai tambah limbah tersebut.
IAA  termasuk    fitohormon  golongan auksin  alami  dan  berperan  sebagai  zat pemacu  pertumbuhan  tanaman  karena dapat  meningkatkan  sintesis  DNA  dan RNA,  serta  meningkatkan  pertukaran proton  (Aslamsyah,  2002).  Biosintesis IAA  oleh  mikroba  dapat  ditingkatkan dengan  penambahan  triptofan  eksogenus sebagai  prekursor  (Arshad et  al. dalam
Arkhipchenko, 2004). Penelitian Gusnaniar  (2007)  membuktikan  bahwa bakteri  tanah  yang  memproduksi  IAA tertinggi  ialah Rhizobium sp.  sebesar 51,08  µg/mL  dengan  menambahkan  asam amino  L-triptofan  sebagai  prekursor. Karena tingginya harga triptofan komersial,  diperlukan  eksplorasi  sumber triptofan alami yang tersedia dalam jumlah banyak  dan  mudah  diperoleh,  serta  relatif murah.  Salah  satu  sumber  triptofan  yang ekonomis  ialah  pupuk  kandang.  Menurut Arkhipchenco et  al. (2006),  limbah kotoran  ayam  mengandung  triptofan sebesar 460,1±5,9 µg/g.
Hasil  penelitian  Gusnaniar  (2007) menunjukkan bahwa produksi IAA meng- gunakan  serum  lateks  dengan  suplemen- tasi triptofan langsung dari pupuk kandang masih  rendah  karena  triptofan  masih terikat  dengan  asam  amino  lain,  sehingga tidak  dapat  digunakan  sebagai  prekursor produksi  IAA.  Di  samping  itu  juga menyebabkan  warna  cokelat  akibat  reaksi
Optimisasi dan pemurnian IAA yang dihasilkan Rhizobium sp....
browning non  enzimatis  yang  meng- ganggu pembacaan absorban pada penentuan  konsentrasi  IAA.  Karena  itu, perlu  pemecahan  protein  pada  pupuk kandang  menjadi  bentuk  asam  amino bebas  dengan  cara  hidrolisis.  Efek browning dapat  dikurangi  dengan  cara hidrolisis tidak langsung, sehingga kesalahan  pembacaan  absorban  dalam analisis  IAA  dapat  ditekan.  Penelitian  ini bertujuan  menetapkan  kondisi  optimum produksi  IAA  oleh Rhizobium sp.  dengan mengatur  asupan  triptofan  dari  pupuk kandang dengan variasi perlakuan hidrolisis  dan  mengisolasi  IAA,  serta memurnikan  IAA  dari  medium  serum lateks  untuk  mendapatkan  IAA  yang relatif  murni.

## Bahan dan Metode

## Bahan
Serum lateks pekat Hevea brasiliensis hasil  penggumpalan  spontan  diperoleh dari Kebun Jalupang PTPN VIII- Subang, kotoran  ayam  kering  (pupuk  kandang), dan  kultur Rhizobium sp.  R6  koleksi BPBPI Bogor.
Penyiapan inokulum
Rhizobium sp . R6  dikulturkan  dalam medium  cair Yeast  Extract  Mannitol (YEM)  yang  mengandung  0,125  g K 2 HPO 4 ;  0,05  g  MgSO 4 ;  0,025  g  NaCl;
0,25  g yeast extract ,  5  g  agar-agar, 250 mL akuades, dan 2,5 g  glukosa (Rao, 1981)  dan  diinkubasi  pada  suhu  27-30 o C selama  tiga  hari.  Suspensi Rhizobium sp.. dalam medium digunakan sebagai inokulum sebanyak 5% v/v pada hidrolisis langsung dan tidak langsung.

## Hidrolisis protein pupuk kandang
Triptofan  sebagai  prekursor  IAA diperoleh  dari  hidrolisis  protein  pupuk kandang menggunakan basa kuat. Hidrolisis  langsung  dilakukan  dengan mereaksikan  sebanyak  37,5  g  pupuk kandang  dan  40  g  NaOH  yang  langsung dicampurkan dalam 500 mL serum lateks. Campuran  dipanaskan  pada  suhu  100°C selama  empat  jam  lalu  disaring  meng- gunakan  kapas  dan  kain  kasa.  Filtrat dikumpulkan  dan  digunakan  sebagai medium kesatu untuk pertumbuhan Rhizobium sp.  Hidrolisis  tak  langsung dilakukan  dengan  mereaksikan  sebanyak 75 g pupuk kandang ditambah 100 mL air dan 8  g  NaOH  dan  dipanaskan  pada  suhu 100°C  selama  empat  jam  lalu  disaring, kemudian  larutan  dibagi  dua.  Filtrat  yang pertama digunakan sebagai medium kedua untuk pertumbuhan Rhizobium sp. dengan dicampurkan  ke  dalam  500  mL  serum lateks.  Filtrat  kedua,  digunakan  untuk medium  ketiga.  Filtrat  tersebut    ditambah senyawaan  alum  (K2SO4.Al2(SO4)3.24 H2O)  0,5%  b/v,  lalu  supernatan  hasil pengendapan  dicampurkan  ke  dalam 500 mL serum lateks.
Larutan  dari  ketiga  medium  tersebut masing-masing  ditambahkan  0,5  mL  Cu 2+ dan    Zn 2+ 0,05  mM  untuk  stimulasi biosintesis  IAA  (Bhattacharyya  &    Pati, 2000),  pH  diukur    dan  dinetralkan  hingga menunjukkan  kisaran  6,3-6,4  dan  ditepat- kan  hingga  1  L  dan  disterilisasi  dengan outoklaf  pada  suhu  121 o C  tekanan 1,2  kg/cm 2 .  Ketiga  medium  selanjutnya disebut  medium  serum  lateks.  Ke  dalam masing-masing medium dimasukkan
suspensi inokulum
Rhizobium sp. sebanyak  5%  v/v  dan  diguncang  di  atas shaker dalam suhu 27-30 o C.

## Kresnawaty et al.

## Analisis kuantitatif dan identifikasi IAA
Produksi  IAA  diukur  secara  spektro- fotometri pada jam ke-24, 48, dan 72 jam. Sebanyak  5  mL  sampel  masing-masing medium  ditambahkan  asam  trikloro  asetat (TCA)  10%  untuk  menjernihkan  larutan dan  dibiarkan  beberapa  menit.  Sebanyak masing-masing  1  mL  supernatan  hasil pengendapan digunakan untuk pengukuran konsentrasi IAA.
Analisis  spektrofotometri  dilakukan dengan  metode  Salkowski  (Fletcher  & Saul,  1963).  Sebanyak  2  mL  suspensi dalam  medium  fermentasi  diambil  lalu disentrifugasi  pada 11.000 rpm  selama 10 menit.  Supernatannya  sebanyak  1  mL ditambah  2  mL  pereaksi  Salkowski. Larutan  lalu  ditambah  akuades  hingga volumenya  6  mL,  dihomogenkan  dengan vortex, didiamkan  selama  30  menit  untuk pengembangan  warna,  kemudian    diukur absorbannya    pada  panjang  gelombang 530  nm.  Serapan  IAA  dibaca  dengan mengurangi  nilai  absorban  sampel  yang ditambah  reagen  Salkowski  dengan  nilai densitas optik sebelumnya.
Identifikasi  IAA  dengan  metode kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  dilakukan dengan  meneteskan  10  µL  kultur  di  atas lempeng  silika  gel  60  F  254  panjang 20 cm dan lebar 10 cm dengan jarak 1 cm. Setelah  dikeringkan  pada  suhu  ruang, lempeng dimasukkan dalam chamber KLT yang telah diisi eluen etil asetat: kloroform :  asam  format  (55  :  35  :  10  v/v).  Elusi dilakukan  hingga  eluen  mencapai  garis batas yang ditentukan. Lempeng dikeringkan  pada  suhu  ruang  dan  noda dilihat pada sinar UV 366 nm (Gusnaniar, 2007).  Hasil  noda  disesuaikan  dengan standar Rf IAA.

## Ekstraksi  IAA
Sebanyak  40  mL  medium  serum lateks  disentrifugasi  dengan  kecepatan 10.000  rpm  selama  30  menit.  Supernatan diasamkan  dengan  HCl  1  N  hingga  pH akhir 2,5-3,0 kemudian diekstraksi dengan etil  asetat  dua  kali.  Lapisan  etil  asetat tersebut  lalu  diuapkan  dengan rotary evaporator pada  suhu  40  °C  (Ahmad et al., 2004).

## Pemurnian IAA
Sebanyak  10  mL  fraksi  etil  asetat hasil  ekstraksi  IAA  dimasukkan  dalam kolom  kromatografi  padat  cair.  Tinggi kolom  20  cm  dan  diameter  2,5  cm.  Fase diamnya  adalah  silika  gel.  Sebanyak  8  g silika  gel  ditimbang  dan  disuspensikan dengan  eluen  lalu  dituang  dengan  pipet secara  hati-hati  agar  tidak  terbentuk rongga udara. Tinggi fase diam 10 cm dan eluen  yang  digunakan  terdiri  atas  etil asetat : kloroform : asam format = 7 : 2 : 1 (v/v).  Setiap  2  mL  eluat  yang  keluar ditampung,  setelah  sampel  habis  lalu dilakukan KLT dan diuji konsentrasi IAA. Eluat  lalu ditambah reagen Salkowski dan diukur absorbannya pada panjang gelombang  530  nm.  Konsentrasi  IAA diperoleh  dengan  memasukkan  nilai absorban pada kurva standar (Rubio et al., 2000).

## Hasil dan Pembahasan

## Optimisasi produksi  IAA
Triptofan  yang  terkandung  pada kotoran  ayam  masih  berada  dalam  bentuk polipeptida,  sehingga  untuk  memperoleh konsentrasi triptofan yang  tinggi  diperlu-
Optimisasi dan pemurnian IAA  yang dihasilkan Rhizobium sp....
kan  hidrolisis  untuk  menjadi  bentuk monomer  bebas.  Hidrolisis  yang  diguna- kan  adalah  hidrolisis  basa  dan  menyebab- kan  semua  asam  amino  yang  dihasilkan rusak kecuali triptofan, sehingga hidrolisis ini  spesifik  untuk  triptofan  yang  dibutuh- kan  sebagai  prekursor  IAA  (AOAC, 1999).
Produksi  IAA  pada  ketiga  medium (Gambar  1)  menunjukkan  bahwa  pada inkubasi  selama  24  jam,  IAA  yang dihasilkan Rhizobium sp.  ialah  sebagai berikut:  6,73  µg/mL  pada  medium pertama,    7,42  µg/mL  pada  medium kedua,  dan  0,39  µg/mL  pada  medium ketiga.  Produksi  IAA  pada  48  jam mengalami  peningkatan,  yaitu:  14,13; 14,40;  dan  0,90  µg/mL  untuk  masing- masing medium. Sedangkan produksi IAA pada  72  jam  mengalami  penurunan menjadi sebesar: 2,62; 1,38; dan 0,73  µg/mL  berturut-turut  untuk  medium kesatu, kedua dan ketiga. Hasil uji Duncan (p<0,05)  membuktikan  antara  medium kesatu dan kedua tidak berbeda nyata. Hal tersebut  menunjukkan  bahwa  produksi IAA tidak berpengaruh pada cara hidrolisis  baik  langsung  maupun  terpisah. Hasil uji Duncan (p<0,05) medium kesatu
dan kedua terhadap medium ketiga adalah berbeda  nyata.  Hal  tersebut  menunjukkan bahwa  penambahan  alum  berpengaruh terhadap  produksi  IAA  dalam  hal  ini menyebabkan  penurunan  produksi  IAA Rhizobium sp..  Kadar  logam  yang  tinggi akibat  penambahan  alum  diindikasikan menginhibisi  enzim-enzim  pada Rhizo- bium sp.  sehingga  mengurangi  produksi IAA.  Selain  itu  juga  diindikasikan  bahwa sebagian triptofan ikut terendapkan akibat penambahan alum.
Produksi IAA tertinggi diperoleh pada waktu  inkubasi  selama  48  jam.  Hal tersebut  sesuai  dengan  hasil  penelitian Gusnaniar (2007) yang menyatakan produksi  IAA  oleh Rhizobium sp.  R6 tertinggi  terjadi  pada  waktu  inkubasi 48  jam.  Pada  periode  inkubasi  48  jam Rhizobium sp.  R6  memasuki  fase  akhir logaritmik,  sehingga  IAA  yang  dihasilkan cukup  tinggi.  Konsentrasi  IAA  yang dihasilkan  masih  lebih  rendah  dari  yang dihasilkan  menggunakan  triptofan  sintetik yang  dilakukan  oleh  Gusnaniar  (2007). Hal  ini  dapat  disebabkan  karena  triptofan yang  dihasilkan  dari  hidrolisis  kotoran ayam memiliki kadar dan tingkat kemurnian yang masih rendah.
Gambar 1. IAA yang dihasilkan oleh Rhizobium sp. dalam medium kesatu, kedua dan ketiga.
Figure 1.   IAA produced by Rhizobium sp.in the first, second and third media.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 24 48 72 Waktu inkubasi (jam ) Incubation time (hours)
Medium kesatu ( 1 st Media ) Medium  kedua ( 2 sd Media ) Medium ketiga ( 3 rd Media ) K o n se n tr as i IA A ( µ g / m L )
IA A c o n c e n tr a ti o n ( µ g /m L )
Kresnawaty et al.
Hasil  uji  statistik konsentrasi  IAA yang  dihasilkan  terhadap  masing-masing waktu  inkubasi  24,  48,  dan  72  jam menunjukkan perbedaan yang nyata. Pada 24 jam, IAA yang dihasilkan lebih sedikit karena masih berada dalam fase logaritmik dan  juga  kandungan  enzim-enzim  untuk mengubah  triptofan  menjadi  IAA  masih rendah.  Sedangkan  pada  waktu  inkubasi 48 jam, IAA yang dihasilkan paling tinggi karena Rhizobium sp . berada  pada  fase akhir  logaritmik  dan  kandungan  enzim- enzim  yang  digunakan  dalam  biokonversi triptofan  menjadi  IAA,  seperti  triptofan monooksigenase,  IAM  hidrolase,  indol- piruvat dekarboksilase dan IAAld dehidro- genase, dihasilkan cukup banyak dan aktif sejalan  dengan  laju  pertumbuhan.  Pada waktu  inkubasi  72  jam Rhizobium sp. telah  memasuki  fase  kematian,  sehingga produksi  IAA  menurun  tajam.  Menurut Bhattacharyya  &  Basu dalam Sridevi  & Mallailah  (2007)  menyatakan  bahwa penurunan  produksi  IAA  pada  72  jam karena  adanya  pelepasan  enzim  pen- degradasi  IAA  seperti  IAA  oksidase  dan peroksidase.
Pembacaan  absorban  pada  ketiga medium  cukup  sulit  akibat  reaksi  pen- cokelatan,  untuk  itu  dilakukan  penam- bahan  TCA  yang  dapat  mengendapkan makromolekul seperti protein, DNA, RNA dalam serum lateks. Penambahan pereaksi Salkowski  berwarna  kuning  muda  meng- hasilkan  warna  merah  kecokelatan  yang menunjukkan adanya IAA (Gambar 2).
Produksi  IAA  tertinggi  terdapat  pada medium  kedua  dengan  hidrolisis  yang terpisah  sebesar  14,40  µg/mL.  Hal  ter- sebut  disebabkan  dalam  hidrolisis  ter- pisah,  kandungan  serum  lateks  yang digunakan  untuk  pertumbuhan Rhizobium sp. tidak  mengalami  kerusakan  akibat hidrolisis dalam NaOH pada  suhu   tinggi, sehingga dapat  digunakan  secara  optimal
Gambar 2. Warna medium setelah penambahan TCA.    1)   Ditambahkan      reagen Salkowski, 2) Sebelum ditambah- kan Salkowski dan 3) TCA.
Figure  2.  The  colour  of  media  :  1)  After addition  of  Salkowski  reagent,  2) Before addition of Salkowski reagent, and 3) TCA.
oleh Rhizobium sp. sebagai sumber nutrisi untuk  tumbuh  dan  berkembang . Berbeda dengan  medium  kesatu  yang  langsung mengalami  hidrolisis  sehingga  kandungan serum lateks tersebut mengalami kerusak- an sebelum digunakan oleh Rhizobium sp..

## Ekstraksi dan pemurnian IAA
Ekstraksi  IAA  dalam  serum  lateks menggunakan pelarut semipolar etil asetat dipilih  dengan  alasan  murah,  aman  peng- gunaannya,  dan  memiliki  struktur  yang mirip  dengan  IAA,  yaitu  adanya  gugus asetat,  sehingga  dapat  melarutkan  IAA ( like  dissolved  like ).  Pendeteksian  IAA dilakukan  secara  kualitatif  menggunakan KLT. Medium sebelum ekstraksi memiliki Rf yang  tidak  sejajar  dengan  standar  IAA (Gambar  3).  Hal  tersebut  disebabkan medium masih tercampur dengan pengotor yang  lain  sehingga  sedikit  meningkatkan kepolaran  IAA.  Setelah  diekstraksi,  noda pada masing-masing medium  (S1, S2 dan S3)    sejajar    dengan  standar  (Std)  nilai R f 0,44.

## 1          2            3
Optimisasi dan pemurnian  IAA  yang dihasilkan Rhizobium sp....
Gambar 3.  Noda hasil KLT IAA sebelum ekstraksi (kiri), setelah ekstraksi dengan etil asetat (kanan.)
Figure  3.   TLC of  IAA spots before extraction (left), after extraction using ethyl acetate(right).
Menurut  Kuraishi  &  Muir  (1963),  R f IAA  berada  di  antara  0,4  hingga  0,5. Residu hasil ekstraksi juga dilakukan KLT untuk  mengetahui  masih  terdapat  IAA dalam residu atau tidak. Hasil KLT mem- buktikan  dalam  residu  (R1,R2  dan  R3) tidak  terkandung  IAA  karena  tidak  ter- dapat noda (Gambar 3). Pemisahan meng- gunakan etil asetat menghasilkan senyawa IAA yang lebih murni dan ditandai dengan makin berkurangnya tailing akibat adanya pengotor lain yang terlalut dalam medium sebelum terekstraksi.
Pemurnian IAA dilakukan mengguna- kan kromatografi kolom silika gel dengan pelarut etil asetat: kloroform : asam format = 7:2:1 (v/v). Dari hasil fraksinasi medium kesatu  diperoleh  12  fraksi  dengan  fraksi yang mengandung IAA pada fraksi 10, 11, dan  12  dengan  jumlah  1,53 µ g/mL (27,97%);  1,82 µ g/mL  (33,33%);  dan 2,12 µ g/mL (38,70%) ( Gambar 4A). IAA terdeteksi  pada  fraksi  12  yang  menunjuk- kan  bahwa  IAA  masih  terikat  kuat  pada gugus hidrofil pada silika gel dalam hal ini atom  oksigen  atau  nitrogen  pada  IAA membentuk  ikatan  hidrogen  dengan  silika gel.
Fraksinasi  medium  kedua  menghasil- kan 15 fraksi (Gambar 4B) yang mengan- dung  IAA  ialah  fraksi  13,  14,  dan  15, yaitu masing-masing: 1,19 µ g/mL (26,75%);  1,03 µ g/mL  (23,00%);  dan
2,24 µ g/mL (50,25%). Noda yang dihasil- kan  berada  pada  fraksi  13,  14,  dan  15 dengan  nilai  R f 0,44  yang  sama  dengan nilai  R f standar  IAA . Fraksi  1-12  tidak memunculkan  noda,  hal  ini  disebabkan material  yang  keluar  masih  berupa  eluen. Fraksinasi  medium  ketiga  menghasilkan 13  fraksi  dan  menunjukkan  sebaran  IAA yang  bervariasi  (Gambar  4C).  Terbentuk- nya dua puncak diduga disebabkan adanya Difusi  Eddie.  Difusi  Eddie  muncul  dari penggandaan  lintasan  untuk  suatu  aliran gas  melalui  suatu  kolom  yang  berisi partikel-partikel  dengan  berbagai  ukuran dan bentuk yang tidak beraturan. Besarnya kontribusi difusi Eddie dari pelebaran pita bergantung  pada  ukuran  fasa  diam, bentuk,  dan keseragaman  distribusi dalam kolom  tersebut  (Day  &  Underwood, 1998).  Fraksi  yang  memiliki  kandungan IAA  ialah  fraksi  9,  10,  12  dan  13  dengan kandungan IAA berturut-turut ialah 1,86 µ g/mL  (  23,99%);  1,82 µ g/mL (23,45%),  1,45 µ g/mL  (18,59%);  dan
2,03 µ g/mL (26,16%).
Fraksi  9,  10,  12,  dan  13  memiliki noda  yang  sejajar  dengan  standar  IAA dengan  nilai  R f 0,44  yang  sama  dengan nilai  R f standar  IAA.  Fraksi  11  memiliki nilai  R f yang  lebih  kecil  dari  standar sebesar  0,1875  yang  menunjukkan  bahwa dalam  fraksi  tersebut  tidak  terkandung IAA.
Rf sama  dengan standar Rf the same standard
Rf berbeda  dengan standar
Rf different of standard
Kresnawaty et al. C A Penampakan noda Spots profile K o n se n tra si IA A (µ g /m L ) IA A c o n ce n tr a ti o n ( µ g /m L ) 2,5 2,0 1,5 1,0 5 0,5 0 2,5 2,5 2,5

## Fraksi hasil pemurnian
Fractionation of purification result 8          9         10         11        12        13         14 1,4462 0,6076 2,0332 1,8236
A Penampakan noda Spots profile K o n se n tr as i IA A ( µ g /m L ) IA A c o n ce n tr a ti o n ( µ g /m L ) Fraksi hasil pemurnian Fractionation of purification result 9               10               11               12              13 2,5 1,0 0 2,0 1,5 0,5 2,1172 1,8236 1,5302
B Penampakan noda Spots profile 0 1.0 2,0 2,5 Fraksi hasil pemurnian Fractionation of purification result 12               13                 14              15                16 1,5 0,5 K o n se n tr as i IA A ( µ g /m L ) IA A c o n ce n tr a ti o n ( µ g /m L ) 2,243 1,027
Gambar 4. Konsentrasi  IAA dan penampakan  noda   fraksionasi medium   kesatu ( A ),   kedua ( B ) dan ketiga ( C )   hasil elusi dari kolom kromatografi.
Figure 4.  The IAA  concentration and   spots   profile of   the first ( A) , second ( B ) and third medium ( C ) fractionation   eluted   from   chromatographic column.
Optimisasi dan pemurnian IAA  yang dihasilkan Rhizobium sp....

## Kesimpulan
Produksi IAA optimal dari Rhizobium sp.  dalam  medium  serum  lateks  diperoleh dengan  cara  suplementasi  pupuk  kandang sebagai  sumber triptofan yang dihidrolisis menggunakan  NaOH  2  N  yang  dilakukan terpisah  dengan  serum  lateks  dan  tanpa pengendapan  menggunakan  alum.  Kon- sentrasi IAA yang diperoleh, yaitu sebesar 14,40 µ g/mL  pada  medium  kedua, sedangkan  hidrolisis  langsung  (medium kesatu)  menghasilkan  IAA  sebesar  14,13 µ g/mL  dan  medium  ketiga  sebesar
0,90 µ g/mL  selama  48  jam.  IAA  yang dihasilkan  dapat  diisolasi  dengan  cara ekstraksi  dengan  etil  asetat  dan  fraksinasi dengan  kolom  kromatografi  silika  gel dengan eluen etil asetat : kloroform : asam format = 7 : 2 : 1 (v/v).

## Daftar Pustaka
AOAC  Official  (1999). Analysis  of  AOAC
International: Food
Composition, Additive, Natural Contaminant. Ed ke-16, Vol  2.  Maryland,  Gaitunsburg.  Bab  45, hlm 66.
Ahmad,  F.,  I  Ahmad  &  M.  S.  Khan  (2004). Indole  acetic  acid  production  by  the indigenous  isolates  of Azotobacter and fluorescent Pseudomonas in  the  presence and  absence  of  tryptofan. Turky  J.  Biol., 29 , 29-34.
Arkhipchenko,  I.A.,  Shaposhnikov  A.  I  & Kravcheno L.V. (2006). Triptophan concentration of animal waste and organic fertilizers. Elsevier .  http://  www.science direct.com. [5 Feb 2008].
Aslamsyah,  S.  (2002). Peranan  Hormon Tumbuh  dalam  Memacu  Pertumbuhan Alga .  http://tumoutou.net/702_05123/  siti aslamyah.htm. [15 Mar 2008].
Bhattacharyya,  R.  N.  &    B.R  Pati  (2000). Growth  behaviour  and  indole  acetic  acid (IAA) production by a Rhizobium isolated from root nodules of Alysicarpus
vaginalis DC. Acta Microbiol. Immunology Hungaria , 47 (1), 41-51.
Bhattacharyya,  R.  N.  &  P.  S.  Basu  (1990). Studies of the root nodules of leguminous plants IV: production of indole acetis acid Bradyrhizobium sp. from the root nodules of  a  legominous  shrub, Crotalaria  retusa L. Acta Biotechnol., 11 , 439-447.
Day, R.A. & A. L. Underwood (1998). Analisis Kimia  Kuantitatif .  Edisi  ke-6.  Jakarta, Universitas Indonesia Press.
Fletcher, R.  A.  &  Z.  Saul  (1963).  Quantitative spectrophotometric determination of indol-3-acetic acid. Nature, 199, 903-904.
Gusnaniar (2007). Produksi IAA oleh
Rhizobium spp ,  Pseudomonas spp , dan Azotobachter sp.  dalam  medium  sintetik dan serum lateks Hevea brasiliensis Muel.
Arg dengan suplementasi triptofan
Skripsi .  Yogyakarta,  Fakultas  Biologi,
Universitas Gajah Mada.
Kuraishi,  S.  &  Muir  R.  M.  (1963). Paper Chromatograpy Study of Diffusible Auxin.
Tokyo,  Biological  Institute,  University  of Tokyo.
Rao, N.S.S. (1981). Biofetilizer in Agriculture. New Delhi, Oxford & IBH Publ. CO.
Rubio,  M.G.T,  S.A.V  Plata,  J.B  Castillo  &
P.M Nieto (2000). Isolation of Enterobacteria , Azobacter sp, and Pseudomonas sp. producers  of  indole-3-
cetic acid and siderophores from Colombian  Rice  Rhizosphere. Revista Latinoamericana de Microbiologia 42 ,171-176.
Sridevi M & K.V Mallailah (2007). Production of  indole-3-acetic  acid  by Rhizobium isolates  from Sesbania species. African  J.
Microbiol. Res., 1 (7), 125-128.
Tri-Panji, Suharyanto, Erry Rakayan & Hasim.
(1995).  Penggunaan  serum  lateks  skim sebagai  media  produksi  protein  sel tunggal  oleh Spirulina  platensis, Menara Perkebunan , 63 (3), 114-122.