## PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE DARI BAKTERI PATOGEN Pseudomonas aeruginosa
[Purification and Characterization of Protease from Pathogenic Bacteria Pseudomonas aeruginosa ]
Ace Baehaki 1) , Maggy T.Suhartono 2) , Nurheni Sri Palupi 2) dan Tati Nurhayati 3)
1) Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya
2) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor
3) Departemen Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor
Diterima   28 Juli   2007 / Disetujui  30  Juni  2008

## ABSTRACT
In the  last  decade,  concern  on  protease  as  medical  target  for  overcoming    bacterial  diseases  and  viral  diseases  has  been rapidly increased because of the obvious involvement of this enzyme in the molecular of the  diseases. The purpose of this research was to  purify  and  characterize  protease  from  pathogenic  bacteria  Pseudomonas  aeruginosa.  The  bacteria  were  grown  in  media  containing triptone 1%, NaCl 1% and Yeast extract 0,5%. Protease of P.aeruginosa was purified using column chromatography with Sephadex G-100 gel. There were  three peaks of  enzyme protein, which were detected  on fractions 14, 17 and 30. The  optimum pH  of the extracelluler protease    from  P.  aeruginosa  was  8.  The  optimum  temperature  of  P.aeruginosa  protease  was  30 0 C.    Fe 3+ (1dan  5  mM)  was  strong activator and Co 2+ was strong inhibitor. Study on the effect of metals ion and spesific inhibitors indicated that protease from  P. aeruginosa was serin metaloprotease. The apparent moleculer weights, as determined by SDS-PAGE and zymogram technique, 36 kD and 42 kD.
Key words :  Protease,  characterization, purification,  patogenic bacteria P.aeruginosa

## PENDAHULUAN
Bakteri patogen menghasilkan berbagai enzim yang pada dasarnya tidak toksik tetapi berperan penting dalam  proses  infeksi.  Beberapa  bakteri  patogen memproduksi  enzim  hidrolitik  seperti    protease  dan hialuronidase,  yang  mendegradasi    komponen  matrik ekstraseluler  sehingga  dapat  merusak  struktur  jaringan inang.  Enzim  hidrolitik  ini  digunakan  oleh  bakteri  untuk memperoleh  sumber  karbon  dan  energi  dengan menghancurkan  polimer  inang  menjadi  gula  sederhana dan asam amino (Salyers dan Whitt, 1994).
Pseudomonas aeruginosa patogen mensekresikan  metaloprotease  ekstraseluler,  elastase dan  alkalin  protease  yang  berkolerasi  dengan patogenisitasnya.  Elastase  merupakan  metaloprotease yang    mengandung  seng,    mempunyai    kemampuan mendegradasi    substansi  biologi  penting  yaitu  elastin, laminin,  fibrin,  kolagen  manusia  dan  immunoglobulin (Hase dan Finkelstein, 1993). Keterlibatan enzim bakteri patogen  ini  dalam  mekanisme  molekuler  timbulnya berbagai  penyakit  memungkinkan  untuk  mencari  dan mendesain  inhibitor  protease  dalam  rangka  mencari peluang  penemuan  obat  yang  berhubungan  dengan penyakit tersebut.  Potensi yang besar pada mikroba dan sumber  hayati  lainnya  sebagai  penghasil  inhibitor protease  menyebabkan  para  peneliti  mengkaji  aspek tersebut.  Dalam pencarian/penapisan inhibitor protease informasi  karakteristik  protease  sebagai  target  menjadi
sangat  penting.    Untuk  itu,  aspek  yang  perlu  diteliti adalah  produksi,  pemurnian  dan  karakteristik  dari protease patogen target.

## METODOLOGI
Bahan  penelitian Bahan utama adalah isolat bakteri patogen yaitu antara  lain P.aeruginosa yang  diperoleh  dari  koleksi Rumah Sakit Pertamina Jakarta.

## Produksi protease
Galur  bakteri  patogen  diinokulasi  sebanyak  1-2 lup pada media Luria Broth (LB). Proses diawali dengan penentuan umur prekultur (dalam media LB) yang tepat untuk keperluan produksi enzim.  Pengamatan dilakukan dengan mengukur optical density (OD) sampai nilai OD = 0,8  pada  λ  =  620  nm.    Media  (LB)  yang  sudah mempunyai  OD  =  0,8  diambil  10%  kemudian ditambahkan pada media LB yang baru.  Pada media LB ini  diukur  nilai  OD  dan  aktivitas  protease  setiap  8  jam selama  56  jam  dengan  kecepatan  120  rpm  pada  suhu 37 0 C.
Pengukuran  aktivitas  protease  dan  kadar protein Aktivitas  protease  diukur  dengan  metode Bergmeyer (1983) dengan menggunakan substrat kasein Hammerstein  2%  (b/v).    Satu  unit  aktivitas  protease
didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang  dapat menghasilkan  satu  μmol  produk  tirosin  per  menit  pada kondisi  pengukuran.  Kadar  protein  ditentukan  dengan metode  Bradford  (1976)  menggunakan  Bovine  Serum Albumin Fraction V sebagai standar protein.

## Pemurnian protease
Pemurnian  dilakukan  dengan  menggunakan kromatografi filtrasi gel menggunakan Sephadex G-100. Sebelum dilakukan pemurnian terlebih dahulu dilakukan pengendapan  dengan  amonium  sulfat  teknis  70%  yang dilanjutkan dengan dialisis menggunakan kantong dialisis cut-off 10 kD (Sigma).
Sebanyak  0,75  gram  Sephadex  G-100  (Sigma) dibasahkan  dengan  75  ml  air  bebas  ion  kemudian dipanaskan  90 0 C  sambil  diaduk  perlahan  selama  90 menit  dan  dibiarkan  sampai  dingin,  untuk  selanjutnya disimpan  dalam  ruangan  4 0 C  semalam.    Larutan didekantasi  lalu  supernatan  diganti  dengan  buffer  Tris- HCl  0,1  M  pH  8  sambil  diaduk  perlahan.    Larutan protease  sebanyak  1  ml  dimasukkan  dengan  pipet secara  perlahan  ke  dalam  kolom  tepat  di  atas permukaan  gel.    Kolom  diisi  dengan  pengelusi  yaitu buffer  Tris-HCl  10  mM  pH  8.  Selanjutnya  setiap  fraksi Diambil  masing-masing  70  tetes  (2  ml)  dan  ditampung dalam fraction collector (Redifrac, Pharmacia-Biotech).

## Karakterisasi  protease ekstrak kasar
Uji  karakterisasi  protease  meliputi  pengaruh  pH (6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 8,5; 9), suhu (30 0 C; 40 0 C; 50 0 C; 60 0 C;  70 0 C),  ion  logam  (Na + ;  K + ;  Ca 2+ ;  Mn 2+ ;  Co 2+ ;  Zn 2+ ; Ba 2+ dan Fe 2+ ) dan  inhibitor spesifik (EDTA dan PMSF). SDS PAGE dan Zimogram
Penentuan berat molekul dilakukan menggunakan SDS PAGE (Laemmli, 1970),  sedangkan zimogram  menggunakan  modifikasi  metode  Choi  et  al.,
(2001).  Pada  penentuan  berat  molekul  dengan  SDS PAGE  setelah  elektroforesis  dilakukan  pewarnaan dengan silver  staining, tahapannya  adalah  sebagai berikut: gel direndam dalam larutan fiksasi (25% metanol dan 12% asam asetat) selama 1 jam kemudian direndam dalam 50% etanol selama 20 menit. Selanjutnya diganti dengan  30%  etanol  selama  2  x  20  menit,  selanjutnya larutan enhancer dan  dilanjutkan  dengan  dicuci  dengan akuadestilata.  Setelah  dicuci  ditambahkan  larutan  silver nitrat  selama  30  menit    kemudian  dicuci  lagi  dengan akuadestilata  2  x  20  detik  serta  ditambahkan  larutan campuran  Na 2 CO 3 dan  formaldehida  serta  diakhiri dengan  larutan  fiksasi.  Pada  pembuatan  zimogram  gel akrilamid  8%  dikopolimerisasi  dengan  substrat  kasein 2%.  Setelah  dilakukan  elektroforesis,  gel  direndam dengan  Triton  X-100  2,5%  selama  1  jam  selanjutnya diinkubasi dalam buffer Tris-Cl 10 mM, pH 8 selama 24 jam.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Produksi protease
Produksi  protease  dilakukan  pada  media luria broth (LB)  setelah  sebelumnya  dikultur  dalam  medium yang  sama  hingga  mencapai  OD=0,8  pada  suhu  37 0 C dan  kecepatan  120  rpm.    Enzim  yang  telah  dihasilkan oleh  bakteri  dipisahkan  dari  sel  bakteri  menggunakan sentrifugasi.    Dengan  teknik  ini,  sel  akan  mengendap oleh  adanya  gaya  gravitasi  sedangkan  enzim  tetap terdapat  pada  supernatan.    Sentrifugasi  dilakukan  pada suhu 4 0 C untuk mencegah terjadinya kerusakan struktur enzim,  selanjutnya  dilakukan  pengujian  aktivitas protease,  sedangkan  pertumbuhan  bakteri  diamati melalui optical density (OD) pada λ= 620 nm.  Hasilnya menunjukkan bahwa produktivitas protease optimum dari bakteri patogen ini  dapat dilihat pada   Gambar  1.
0 0.5 1 1.5 2 0 8 16 24 36 48 56 Jam ke OD 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 A k ti v ita s OD

## Aktivitas
Gambar 1.   Waktu produksi optimum protease P. aeruginosa
Protease P.aeruginosa memiliki  aktivitas tertinggi  0,243  IU/ml  setelah  diinkubasi  selama  48  jam dalam  media  LB.  Protease  diproduksi  seiring  dengan pertumbuhan sel dan mencapai  aktivitas tertinggi   pada fase  stasioner  (Gambar  1).  Hal  ini  menunjukkan  bakteri ini  memerlukan  protease  sebagai  strategi  dalam mempertahankan  hidupnya.  Penelitian  tentang  produksi optimum  protease  yang  dilakukan  oleh  Fawzya  (2002) menunjukkan  bahwa  isolat  bakteri  asal  ikan  hiu ( Carcharhinus  limbatus )  menghasilkan  protease  optimal pada  jam  ke-24,  pada  saat  pertumbuhan  bakteri  mulai mencapai  fase  stasioner.  Selain  itu,  dilaporkan  pula bahwa protease yang dihasilkan oleh Vibrio proteolyticus memiliki  produksi  yang  optimal  pada  fase  stasioner (Durham, 1990).

## Pemurnian protease
Pemurnian  protease P.aeruginosa dilakukan dengan kromatografi filtrasi gel  menggunakan Sephadex G-100 sebagai matriks, dan bufer Tris-HCl 0,05 M, pH 8 sebagai  pengelusinya.  Sebelum  dilakukan  pemurnian dengan  kromatografi  gel,  terlebih  dahulu  dilakukan pengendapan  dengan  amonium  sulfat  70%  yang dilanjutkan dengan dialisis.  Setiap fraksi yang keluar dari
kolom  diukur  aktivitas  protease  dan  kadar  protein. Hasilnya  tertera  pada  Gambar  2.  Hasil  kromatografi menunjukkan  terdapat  tiga  puncak  fraksi  yang  memiliki aktivitas tertinggi yaitu fraksi 14, 17 dan 30.
Data  pada  Tabel  1  menunjukkan  terjadi peningkatan  derajat  kemurnian  enzim.  Dengan pengendapan  amonium  sulfat  derajat  kemurnian  relatif menjadi  1,66  kali  dan,    dengan  dialisis    menjadi  2,26. Dengan  kromatografi  kolom  ini  terjadi  peningkatan kemurnian  menjadi  2,42  kali  untuk  fraksi  14,  1,81  kali untuk.    fraksi  17.  Untuk  fraksi  30  derajat  kemurniannya menurun, hal ini kemungkinan  aktivitasnya sangat kecil Protease yang telah dimurnikan dengan filtrasi gel menggunakan Sephadex G-100 mempunyai aktivitas spesifik  dan  tingkat  kemurnian  yang  lebih  tinggi  dari tahap sebelumnya.  Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa  Sephadex  G-100  dapat  digunakan  untuk memisahkan  protein  yang  dikhendaki  yaitu  enzim  dari senyawa-senyawa lain sebagai pengotor.  Ekstrak kasar protein  umumnya  tercampur  dengan  asam  nukleat, karbohidrat dan garam organik.  Logam berat dan asam nukleat  biasanya  mengganggu  kerja  enzim,  sehingga dapat  menghilangkan  kontaminan  tersebut  terjadi peningkatan aktivitas enzim (Haris dan Angal, 1989).
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01 1 2 3 4 5 6 7 8 91011 121314 151617 1819 202122 232425262728 293031 3233 343536 373839 Fraksi A k ti v ita s Pr o te a s e 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 ka d a r Pro te in (A-2 8 0 ) aktivitas protease Kadar Protein (A-280)
Gambar 2.  Kromatogram P. aeruginosa dengan Sephadex G-100
Tabel 1.  Tahapan  pemurnian protease Pseudomonas aeruginosa Tahapan pemurnian Aktivitas Protease (IU/ml) Kadar protein (mg) Volume (ml) Total aktivitas (IU) Total protein (mg) Aktivitas spesifik (IU/mg) Derajat kemurnian relatif Ekstrak kasar 0,047 0,313 100 4,67 31,3 0,149 1 Pengendapan (NH 4 ) 2 SO 4 0,153 0,617 3 0,459 1,851 0,248 1,66 Dialisis 0,065 0,193 2 0,13 0,386 0,337 2,26 Sephadex G-100 Fraksi 14 Fraksi 17 Fraksi 30 0,009 0,0085 0,0037 0,025 0,032 0,04 2 2 2 0,018 0,017 0,0074 0,05 0,064 0,08 0,36 0,27 0,925 2,42 1,81 0,62

## Karakterisasi protease ekstrak kasar

## pH optimum
Semua  reaksi  enzimatis  dipengaruhi  pH, sehingga  diperlukan  bufer  untuk  mengontrol  pH  reaksi. Pada  umumnya  enzim  bersifat  amfolitik,  yang  berarti enzim mempunyai konstanta disosiasi pada gugus asam maupun  gugus  basanya  terutama  pada  gugus  residu terminal  karboksil  dan  gugus  terminal  aminonya. Diperkirakan perubahan  keaktifan enzim akibat ionisasi pada gugus ionik enzim, pada sisi aktifnya atau sisi lain yang  secara  tidak  langsung  mempengaruhi  sisi  aktif. Gugus  ionik  berperan  dalam  menjaga  konformasi  sisi aktif  dalam  mengikat  substrat  dan  dalam  mengubah substrat  menjadi  produk.    Ionisasi  juga  dapat  dialami oleh  substrat  atau  kompleks  enzim-substrat,  yang  juga berpengaruh  terhadap  aktivitas  enzim  (Muchtadi  et  al., 1996).  Perubahan  pH  yang  kasar  enzim  dapat mengalami  denaturasi  akibat  gangguan  terhadap berbagai interaksi non kovalen yang menjaga kestabilan struktur 3D enzim (Hames dan Hooper, 2000). Gambar 3 memperlihatkan  pH  optimum  aktivitas  protease  ekstrak kasar bakteri patogen P. aeruginosa .
Protease P.  aeruginosa memiliki  pH  optimum pada  pH  8.    Elliott  dan  Cohen  (1986)  melaporkan protease P.  aeruginosa memiliki pH  optimum 8-9 , sedangkan  menurut  Rao  et  al.,  (1998)  protease P.aeruginosa aktif pada pH 7-9.  Diperkirakan perubahan keaktifan enzim diakibatkan sering adanya ionisasi pada gugus ionik enzim, pada sisi aktifnya atau sisi lain yang secara  tidak  langsung  mempengaruhi  sisi  aktif.    Gugus ionik  berperan  dalam  menjaga  konformasi  sisi  aktif dalam mengikat substrat dan dalam mengubah substrat menjadi produk. Ionisasi juga dapat dialami oleh substrat atau  kompleks  enzim-substrat,  yang  juga  berpengaruh terhadap aktivitas enzim (Muchtadi et al., 1996).

## Suhu optimum
Pada  umumnya  setiap  enzim  memiliki  aktivitas maksimum  pada  suhu  tertentu,  aktivitas  enzim  akan semakin meningkat dengan bertambahnya suhu sampai suhu optimum tercapai.  Setelah itu kenaikan suhu lebih lanjut  akan  menyebabkan  aktivitas  enzim  menurun. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease ekstrak kasar P.aeruginosa terdapat pada Gambar 4.
0 20 40 60 80 100 120 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH A k ti v it a s p ro te a s e r e la ti f (% ) Gambar 3. Pengaruh pH terhadap aktivitas protease ekstrak kasar 0 20 40 60 80 100 120 30 40 50 60 70 Suhu (oC) A k ti v ita s p ro te a s e r e la ti f (% )
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 Kontrol NaCl KCl
CaCl2 MnCl2 CoCl2 ZnCl2 BaCl2 FeCl2 Ion Logam A kt iv it as P rot ea se ( U /m l) 1 mM 5 mM
Dari  hasil  pengukuran  aktivitas  enzim  pada berbagai  suhu,  suhu  optimum  protease P.  aeruginosa adalah  dengan  suhu  30 0 C.  Suhu  optimum  protease P.aeruginosa yang dilaporkan oleh  Engel  et al., (1998) adalah 45 0 C.  Suhu mempengaruhi laju reaksi katalisis enzim dengan dua cara.  Pertama, kenaikan suhu akan meningkatkan energi molekul substrat dan pada akhirnya meningkatkan laju reaksi enzim.  Peningkatan suhu juga berpengaruh  terhadap  perubahan  konformasi  substrat sehingga  sisi  aktif  substrat  mengalami  hambatan  untuk memasuki  sisi  aktif  enzim  dan  menyebabkan  turunnya aktivitas  enzim.    Kedua,  peningkatan  energi  termal molekul  yang  membentuk  struktur  protein  enzim  itu sendiri  akan  menyebabkan  rusaknya  interaksi-interaksi non kovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik  dan  interaksi  elektrostatik)    yang  menjaga struktur 3D enzim secara bersama-sama sehingga enzim mengalami  denaturasi.    Denaturasi  menyebabkan
struktur  lipatan  enzim  membuka  pada  bagian permukaannya  sehingga  sisi  aktif  enzim  berubah  dan mengakibatkan  terjadi  penurunan  aktivitas  enzim (Hames dan Hooper, 2000).

## Pengaruh ion logam
Beberapa  enzim  membutuhkan  ion  logam sebagai  kofaktor  untuk  mendukung  efisiensi  katalitik enzim. Logam tersebut membantu reaksi katalitik dengan cara  mengikat  substrat  pada  sisi  pemotongan.    Selain berperan  dalam  pengikatan  enzim  dengan  substrat, beberapa  logam  juga  dapat  mengikat  enzim  secara langsung  untuk  menstabilkan  konformasi  aktifnya  atau menginduksi  formasi  situs  pengikatan  atau  situs  aktif suatu  enzim.  Gambar  5  memperlihatkan  pengaruh  ion logam terhadap aktivitas protease bakteri P. aeruginosa .
Gambar 5. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas protease P.aeruginosa
Aktivator kuat untuk P. aeruginosa adalah Fe 3+ (1 dan 5 mM), ion logam ini dapat meningkatkan aktivitas enzim 2 kali lipat dari kontrol.  Sedangkan inhibitor logam yang kuat terhadap protease P. aeruginosa adalah Co 2+
(5  mM).  Karena  dipengaruhi  ion  logam  maka  protease P. aeruginosa digolongkan metaloprotease.  Fricke et al.,
(1999)  melaporkan    protease P.  aeruginosa termasuk metaloprotease. Protease
dari Pseudomonas pseudomallei juga  digolongkan  sebagai  metaloenzim (Sexton et al.,1994).
Adanya peningkatan keaktifan karena penambahan  logam  tertentu  menunjukkan  bahwa  ion logam  diperlukan  sebagai  komponen  dalam  sisi  aktif enzim.  Mekanisme  ion  logam  dapat  memperbesar aktivitas enzim yaitu (a) menjadi bagian integral dari sisi aktif,  (b)  merubah  konstanta  kesetimbangan  dari  reaksi enzimatis,  (c)  merubah  muatan  listrik,  (d)  mengusir  ion inhibitor,  (e)  menukar  ion  yang  kurang  efektif  pada  sisi aktif enzim atau substrat (Richardson dan Hyslop, 1985).
Sedangkan  penghambatan  ion  logam  terhadap  aktivitas protease  pada  konsentrasi  tertentu  berkaitan  dengan kekuatan  ion,  dimana  kekuatan  ion    itu  sendiri mempengaruhi konformasi atau struktur tiga dimensi dari protein  enzim  atau  protein  substrat  (Suhartono,  1989). Pada  konsentrasi  tertentu  ion  logam  tertentu  dapat bertindak  sebagai  inhibitor,  tetapi  dapat  juga  bertindak sebagai aktivator pada konsentrasi lain (Richardson dan Hyslop, 1985).

## Pengaruh inhibitor spesifik
Protease  memiliki  kemampuan  menghidrolisis substrat,  maka Nomenclature  Commite  of  International Union  of  Biochemistry  and  Moleculer  Biology menggolongkan  enzim  protease  ke  dalam  hidrolase. Sedangkan para ahli menggolongkan protease berbeda- beda.  Berdasarkan  mekanisme  reaksi  yang  dikatalisis, endopeptidase  dapat  dikelompokkan  menjadi  empat
yaitu: protease serin, protease aspartat, protease sistein dan protease logam.
Dalam penelitian ini penggolongan protease hasil produksi  dilakukan  dengan  cara  mereaksikan  dengan senyawa-senyawa  inhibitor  spesifik.    PMSF  ( fenil  metil sulfonil  fluorida )  merupakan  inhibitor  spesifik  untuk protese serin dengan mengubah sisi aktif enzim menjadi derivat fenil metil sulfonil dan EDTA merupakan senyawa pengkelat ion logam. Tabel 2. menunjukkan  EDTA dan PMSF  menghambat  protease P.  aeruginosa sehingga digolongkan sebagai serin metaloprotease.
Tabel 2.  Pengaruh inhibitor spesifik pada protease bakteri
P.aeruginosa Inhibitor Spesifik Aktivitas protease relatif (%) PSMF 1mM 61,3 5 mM 55 EDTA 1mM 63,4 5mM 46,25

## SDS-PAGE  dan Zimogram

## Perkiraan berat molekul protease ekstrak kasar
Penentuan  berat  molekul  dilakukan  dengan teknik  SDS-PAGE  (Sodium  dodesil  sulfat-Poliakrilamida gel elektroforesis), yang merupakan metode yang sudah digunakan  secara  luas.  Pada  penelitian  ini  ada  dua macam gel yang digunakan yaitu gel penahan ( resolving gel )  dan  gel  pemisah  ( stacking  gel )  yang  mengandung akrilamid,  SDS,  APS  dan  TEMED.    Gel  poliakrilamid diperoleh  dengan  cara  polimerisasi  akrilamid  dengan sejumlah cross linking agent metilena bis  akrilamid  dan
amonium  persulfat  (APS)  sebagai  katalisator.  Radikal bebas yang terbentuk dari pelarutan ammonium persulfat dalam  air  akan  bereaksi  dengan  akrilamid  membentuk akrilamid  aktif  yang  dapat  bereaksi  satu  sama  lain membentuk polimer.  Analisis SDS-PAGE pada protease ekstrak  kasar  didapatkan  protease P.  aeruginosa memiliki  4  pita  yang  berat  molekulnya  berkisar  antara 13,5  kD  sampai  dengan  48,5  kD sedangkan  dengan analisis  zimogram  menunjukkan  dua  pita  yang  berberat molekul 36 kD dan 42 kD (Gambar 6). Elliott dan Cohen (1986) melaporkan berat molekul protease P. aeruginosa adalah  30  kD,  sedangkan  menurut  Rao  et  al.,  (1998) berkisar  48-60  kD.    Penelitian  lainnya  adalah  protease Pseudomonas pseudomallei menunjukkan berat molekul yang  sama  dengan  protease P.  aeruginosa yang digunakan dalam penelitian ini yaitu  36 kD (Sexon et al., 1994).

## Perkiraan berat molekul protease hasil pemurniaan
Hasil  kromatografi  kolom  diuji  aktivitasnya dengan  menggunakan  zimogram.    Substrat  yang digunakan  dalam  zimogram  ini  adalah  kasein Hammersten  2%.    Hasil    zimogram  hasil  pemurnian protease P.aeruginosa dapat dilihat pada Gambar 7. Berdasarkan hasil zimogram didapatkan fraksi yang  memiliki  protease  adalah  fraksi  14  sampai  19 dengan berat molekul sekitar 36 kD, sedangkan fraksi 30 menggunakan  zimogram  ini  tidak  didapatkan  zona bening,  hal  ini  ada  hubungannya  dengan  derajat kemurnian yang menurun atau aktivitasnya sangat kecil.

## M              1                             M           1
A
B
Gambar 6. Hasil SDS silver staining (A) dan Zimogram (B) aktivitas Protease  ekstrak kasar (M=Marker, 1= P.aeruginosa )
97,0 KDa 45,0 KDa 30,0 KDa 14,4 KDa 42 KDa 36 KDa
Hasil Penelitian                                                   Jurnal. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XIX No. 1 Th. 2008
Gambar 7. Hasil zimogram  aktivitas protease Pseudomonas aeruginosa hasil kromatografi kolom Sephadex  G-100  (Fraksi 14-19).

## KESIMPULAN
Protease Pseudomonas  aeruginosa memiliki aktivitas  tertinggi  yaitu  0,243  IU/ml  setelah  diinkubasi selama  48  jam  dalam  media  LB,    protease  diproduksi seiring dengan pertumbuhan sel dan mencapai aktivitas tertinggi  pada  fase  stasioner.    Hasil  pemurnian menunjukkan  dengan  pengendapan  amonium  sulfat terjadi  peningkatan  derajat  kemurnian  dari  1  (ekstrak kasar)  menjadi  1,66.    Pada  tahap  pemurnian  dengan kromatografi  sphadex  G-100  didapatkan  3  fraksi  yaitu fraksi 14, 17 dan 30, pada tahap ini terjadi peningkatan derajat  kemurnian  menjadi  2,42  (fraksi  14)  dan  1,81
(fraksi 17), sedangkan fraksi 30 terjadi penurunan derajat kemurniannya.  Karakterisasi  protease Pseudomonas aeruginosa memiliki pH optimum 8, suhu optimum pada suhu  30 0 C,  ion  logam  Fe 3+ (1  dan  5  mM)  merupakan aktivator  kuat  dan  inhibitor  kuat  adalah  Co 2+ (5  mM) serta dihambat oleh inhibitor spesifik (PSMF dan EDTA) sehingga  protease  ini  termasuk  serin  metaloprotease dan  berat  molekul  dengan  menggunakan  SDS-PAGE dan zimogram adalah sekitar 36 kD.

## DAFTAR PUSTAKA
Adnan,  M.1997. Tehnik  Kromatografi  untuk  Analisa Bahan Makanan. Penerbit Andi. Yogyakarta
Bergmeyer  HU,  Bergmeyer  J,    Graβl  M.  1983 . Methods  of  Enzymatic  Analysis.    Vol  2. Weinheim : Verlag Chemie. Halm 1007-1009.
Bradford  MM .  1976.    A  rapid  and  sensitive  method  for quantitation  of  microgram  quantities  of  protein utilizing  the  principle  of  protein  dye-binding. Anal Biochem 72:234-254.
Budiarti  S,  Suhartono  M.T.  1999. Peranan  protease pada bakteri patogen. Makalah
dipresentasikan  Pada  Pertemuan  Ilmiah Tahunan Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia. Padang, 3-4 Agustus 1999.
Choi  NS,  Yoon  KS,  Lee  JY,  Han  KY,  Kim  SH.  2001. Comparision of three substrates (casein, fibrin,
and gelatin) in zimographic gel.  J Biochim Mol Biol 34:531-536.
Durham  D.R.  1990. The  unique  stability  of Vibrio proteolyticus neutral  protease  under  alkaline conditions  afford  a  selective  step  for purification  and  use  in  amino  acid-coupling reaction.    Appl.  Environ.  Microbiol.  56:2277- 2281.
Elliott  BW  Jr,  Cohen  C.    1986 .    Isolation  and characterization  of  a  lysine-specific  protease from Pseudomonas aeruginosa .  J Biol Chem. 261(24):11259-65.
Engel  LS,  Hill  JM,  Caballero  AR,  Green  LC, O'Callaghan RJ. 1998. Protease IV,  a unique extracellular protease and virulence factor from Pseudomonas  aeru ginosa.  J  Biol  Chem. 273(27):16792-7.
Fawzya, Y.N. 2002. Karakterisasi protease ekstraseluler dari  isolat  bakteri  asal  ikan  hiu  atas ( Carcharhinus  limbatus ).    Tesis  Institut Pertanian Bogor.
Fricke  B,  Parchmann  O,  Kruse  K,  Rucknagel  P, Schierhorn A, Menge S. 1999.
Characterization  and  purification  of  an  outer membrane metalloproteinase
from Pseudomonas  aeruginosa with  fibrinogenolytic activity.  Biochim Biophys Acta.    30(3):236-50.
Hames  B.D,  Hooper  N.M.  2000. Biochemistry:  The instant  Notes.  Ed.  Ke-2.  Hongkong:Springer- Verlag. Hal 83-84.
Harris  E.L.V,  S.  Angal.  1989 .  Protein  Purification Methods.    A  Practical  approach.    IRL  Press. Oxford New York Tokyo.
Hase  CC,  R  Finkelstein.  1993. Bacterial  extracelluler zinc-containing  metalloprotease.  Microbiol Reviews. 57(4):823-837.
Henderson  IR,  S  Hicks,  F  Navarro-Garcia,  Fnoriega, JP  Nataro.  1999. Characterization  of  Pic,  a secreted  protease  of Shigella  flexneri and enteroaggregative Escherichia coli .  Infect and Immun.  67(11):5587-5596.
36,0 KD
Jawetz  E,    Melnick    J,  Adelberg  E.  1996 .    Medical Microbiology.    Alih  bahasa  Edi  Nugroho,  R.F. Maulany.  Penerbit Buku Kedokteran.  Jakarta.
Laemmli  UK.  1970. Cleavage  of  structural  protein during  the  assembly  of  the  heat  of bacteriophag T4.  Nature 227:680-685.
Muchtadi  ,  D,  Palupi  NS,  Astawan  M.  1996. Enzim dalam Industri Pangan.  PAU Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.  Bogor.
Qua DV, Simidu U, Taga N. 1981. Purification and some properties of halophilic protease pro DB. duced by a moderately halophilic marine Pseudomonas sp.    Can  J.  Microbiol.  27:505- 510.
Rao  MM,  AM  Tanksale,  MS  Gatge,  VV  Desphande.
1998 .  Molecular and biotechnological aspects of  microbial  proteases.    Microbiol.  And  Mol. Biol. Rev. 62(3):597-635.
Richardson T, DB Hyslop.  1985 .  Enzyme dalam O.R.
Fennema  (Ed).    Food  Chemistry.    Mac  Kerel Bekker, Inc.  New York.
Salyers AA, DD Whitt. 1994. Bacterial Pathogenesis, A Molecular  Approach.    Departement  of
Microbiology.  University of Illinois. ASM Press, Washington D.C.
Sexton  MM,  Jones  AL,  Chaowagul  W,    Woods  DE. 1994. Purification  and  characterization  of protease  from Pseudomonas  pseudomellei . Can  J. of Microbiol. 40(11): 903-910.
Suhartono M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi.   Pusat Antar Universitas IPB-Depdikbud.  Bogor.
Suhartono,  M.T.  2000. Pemahaman  Karakteristik Biokimia  Enzim  Protease  dalam  Menunjang Industri  Berbasis  Bioteknologi.    Orasi  Ilmiah Guru  Besar  Tetap  Dasar-dasar  Biokimia Pangan.  Fateta IPB. Bogor.
Thenawijaya,  M.  1988. Dasar-dasar  Biokimia.    Jilid  I, Penerbit Erlangga.  Jakarta.
Teufel  P,  Gotz  F.  1993. Characterization  of  an extracellular  metalloprotease  with  elastase activity  from Staphylococcus  epidermidis .  J. Bacteriol. 175(13):4218-4224.
Waturangi  DE.  1999. Purifikasi  dan  Karakterisasi Protease Ekstraseluler Enteropatogenik Escherichia  coli .    Tesis    Institut  Pertanian
Bogor.