Jurnal Teknik Kimia Vol. 29, No. 2, 2023, 95-103
e-ISSN: 2721-4885 DOI: https://doi.org/10.36706/jtk.v29i2.1421
Online at http://ejournal.ft.unsri.ac.id/index.php/jtk

## cellulase
Pilandari Lembono 1 , Mei-Jywann Syu 2 ,*
1 Calvin Institute of Technology, Jakarta - Indonesia
2 National Cheng Kung University, Tainan - Taiwan
* Email: syumj@mail.ncku.edu.tw

## Abstrak
Bioetanol sebagai renewable energy dapat diproduksi dari glukosa. Glukosa untuk bioetanol dapat diproduksi dari beberapa  sumber,  generasi  pertama  adalah  dari  bahan  pangan  berupa  pati,  gula  tebu  hanya  saja  menyebabkan kenaikan  harga  bahan  mentah  karena  bersaing  dengan  produk  pangan.  Generasi  kedua  adalah  dari  biomass a lignoselulosa seperti serbuk gergaji, pupuk, rumput yang sulit untuk diproses karena kandungan lignin yang tinggi sehingga menyebabkan biaya proses yang tinggi. Alternatif sumber glukosa adalah dari mikroalga yang memiliki produktivitas  biomassa  yang  tinggi  dan  kandungan  selulosa  yang  potensial  untuk  dikonversi  menjadi  glukosa. Selulosa  dalam  biomassa  dapat  dikonversi  menjadi  glukosa  dengan  reaksi  hidrolisis  enzimatik  menggunakan enzim cellulase . Penelitian ini bertujuan menentukan parameter-parameter optimal dalam mengkonversi selulosa menjadi glukosa, antara lain konsentrasi enzim, temperatur, dan waktu reaksi. Biomassa diperoleh dari kultivasi mikroalga Chlorella, sp . dalam media bernutrisi, dengan aliran gas karbon dioksida dan radiasi sinar UV. Reaksi hidrolisis dilakukan dengan variasi konsentrasi enzim cellulase 1,25 – 5 mg/ml, temperatur reaksi 40-70  C, dan waktu reaksi 8 – 60 jam. Uji kandungan glukosa dilakukan menggunakan reagen DNS dan pembacaan absorbansi oleh  Spektrofotometer  UV-Vis.  Hasil  penelitian  menunjukkan  konsentrasi  glukosa  yang  tertinggi  sebesar  3,07 g/L diperoleh pada reaksi hidrolisis dengan konsentrasi enzim cellulase 5 mg/ml, temperatur reaksi 55  C, dan waktu reaksi 58 jam.
Kata Kunci : Chlorella sp ., reaksi hidrolisis, enzim cellulase , glukosa

## Abstract
Bioethanol, as a renewable energy source, can be produced from glucose. Glucose for bioethanol can be obtained from several sources. The first generation is derived from food sources such as starch and sugarcane, which can lead to an increase in raw material prices due to competition with food products. The second generation is derived from lignocellulosic biomass such as sawdust, manure, and grass, which are difficult to process due to their high lignin content, resulting in high processing costs. An alternative source of glucose is microalgae, which have high biomass productivity and potential cellulose content that can be converted into glucose. Cellulose in biomass can be converted into glucose through enzymatic hydrolysis using cellulase enzymes. This study aims to determine the optimal  parameters  for  converting  cellulose  into  glucose.  The  biomass  was  obtained  from  the  cultivation  of Chlorella sp. microalgae in nutrient media, with carbon dioxide gas flow and UV radiation. Hydrolysis reactions were performed with variations in cellulase enzyme concentration (1.25 - 5 mg/ml), reaction temperature (40 - 70°C),  and  reaction  time  (8  -  60  hours).  Glucose  content  was  measured  using  DNS  reagent  and  absorbance readings by UV-Vis Spectrophotometer. The results showed that the highest glucose concentration of 3.07 g/L was obtained in the hydrolysis reaction with a cellulase enzyme concentration of 5 mg/ml, reaction temperature of 55°C, and reaction time of 58 hours.
Keywords: Chlorella sp., hydrolysis reaction, cellulase enzyme, glucose

## Produksi glukosa dari mikroalga chlorella, sp. melalui hidrolisis oleh enzim

## Sugar production from microalgae chlorella, sp. via hidrolysis by cellulase enzyme

## 1.   PENDAHULUAN
Biofuel yang  umum  digunakan  adalah bioetanol  dan  biodiesel,  terutama  bioetanol  yang dapat  diproduksi  dari  suplai  biomassa  yang melimpah  yang  mengandung  pati  dan  selulosa (Chandel,  dkk.,  2018).  Berdasarkan  sumbernya, bioetanol  dikategorikan  menjadi  tiga  tipe:  generasi pertama  adalah  bioetanol  dari  pati  atau  gula  tebu. Pada generasi ini, proses hidrolisis lebih sederhana tetapi  harga  bahan  mentah  lebih  mahal , karena berkompetisi dengan suplai bahan pangan. Generasi kedua  adalah  bioetanol  dari  biomass  lignoselulosa seperti: sisa panen, serbuk gergaji kayu, pupuk, dan rumput. Bioetanol tipe ini memiliki perolehan yang rendah  karena  kandungan  lignin  dalam  biomassa sangat sulit untuk didegradasi maupun difermentasi (Nigam  dan  Singh,  2010).  Hal  ini  menyebabkan bioetanol  tipe  ini  memerlukan  konsentrasi  enzim yang  tinggi  dan  berujung  pada  mahalnya  biaya pemrosesan (Chandel, dkk. 2018).
Generasi  ketiga  adalah  produksi  etanol  dari alga,  yang  diprediksi  dapat  mengatasi  kekurangan pada  generasi  pertama  dan  kedua  (Vasic,  dkk., 2021). Salah satu jenis mikroalga adalah Chlorella, sp . dengan kandungan pati dan glikogen yang tinggi, lebih  dari  50  %  berat  kering  dan  mengandung selulosa  (Arad  dan  Levy-Ontman,  2013).  Selulosa dalam  biomassa  dapat  dikonversi  menjadi  glukosa dengan reaksi hidrolisis enzimatik, dimana glukosa kemudian  dapat  digunakan  untuk  memproduksi etanol (Jugwanth, dkk., 2020).
Beberapa  faktor  seperti  jenis-jenis  mikroalga yang  luas,  jumlah  yang  besar,  kandungan karbohidrat dan pati, dinding sel yang tipis, dan laju fotosintesis  yang  tinggi  telah  meningkatkan observasi  pemanfaatan  biomassa  alga  untuk pembuatan etanol (Tsarpali, dkk., 2021).
Informasi  taksonomi  menunjukkan  terdapat 300.000 jenis mikroalga, tetapi hanya sekitar 30.000 jenis  yang  mampu  beradaptasi  dalam  lingkungan yang ekstrim (kadar garam, temperatur, nutrisi, dan lain-lain (Low, dkk., 2014).
Mikroalga  yang  paling  banyak  dikenal  dan digunakan  adalah Spirulina ,  kemudian Chlorella vulgaris , Dunaliella  salina ,  dan Haematococcus pluvialis (Reshma, dkk., 2021). Biomass mikroalga dapat  memproduksi  rentang  produk  yang  luas, meliputi  klorofil,  karotenoid,  karbohidrat,  lemak, protein, asam nukleat, dan nutraceutical (Mutanda, dkk., 2020).

## 1.1 Kultivasi Mikroalga
Mikroalga  memiliki  laju  reproduksi  yang sangat  cepat,  dapat  melipatgandakan  biomassa dalam  waktu  24  jam,  bahkan  dalam  fasa pertumbuhan  eksponensial  dapat  berlipat  ganda dalam 3,5 jam (Rubio, 2002). Chlorella, sp. adalah salah  satu  jenis  alga  hijau  yang  memiliki  laju perkembangbiakkan  yang  cepat.  Mikroalga  dapat
dikultivasi  dalam  media  air  tawar  maupun  air  laut (Becker, 1994).
Nutrisi yang diperlukan oleh mikroalga untuk pertumbuhan  sama  dengan  tumbuhan  lain,  yaitu nitrogen dan fosforus dalam jumlah sekitar 10-20 % dari  biomassa  alga.  Makronutrien  yang  lain  adalah karbon, sulfur, kalium, dan magnesium. Unsur lain yang  diperlukan  dalam  jumlah  sedikit  adalah  besi dan mangan, dan unsur esensial lain yang diperlukan dalam  jumlah  sangat  sedikit  adalah cobalt,  zinc , tembaga, boron, molybdenum (Nagao, dkk., 2019). EDTA (Ethylene  Diamine  Tetraacetic  Acid ) ditambahkan  untuk  meningkatkan  kelarutan  unsur- unsur  tersebut.  Beberapa  senyawa  lain  seperti vitamin, hormon, dan komponen organik ditambahkan sebagai faktor pemicu pertumbuhan. Media  kultur  untuk  alga  dapat  dibuat  secara sintetis, dari air yang ditambahkan mineral-mineral maupun buangan limbah cair (Becker, 1994). Pada umumnya,  untuk  mikroalga  laut  menggunakan  air laut  yang  ditambahkan  nitrat  komersial  dan  fosfat dan  beberapa  nutrient  mikro  (Molina,  dkk.,  1999). Air laut merupakan pilihan media yang baik karena dapat  meningkatkan  output  produk,  misalnya meningkatkan  kandungan  lipid  dan  senyawa- senyawa  lain  di  dalam  biomassa  mikroalga (Chandrasekhar,  dkk.,  2022).  Selain  itu  juga menurunkan  biaya  produksi  apabila  menggunakan air laut sesungguhnya.
Alga  mengkonversi  air  dan  CO 2 dari lingkungan  menjadi  biomassa  melalui  proses fotosintesis  dengan  menggunakan  cahaya  sebagai sumber  energi  dan  CO 2 sebagai  sumber  karbon (Bhattacharya  dan  Goswami,  2020).  Mikroalga biasa  dikembangkan  di  bak/kolam  terbuka  pada pengembangan skala besar karena biayanya murah, tetapi  rentan  terhadap  kontaminasi.  Sebagai alternatif  dapat  digunakan  fotobioreaktor,  yaitu reaktor  yang  disinari  cahaya  (Barten,  dkk.,  2021). Sumber  cahaya  dan  intensitas  cahaya  memberikan dampak yang relevan terhadap laju fotosintesis dan laju pertumbuhan alga (Aravantinou dan Manariotis, 2016).
Nutrisi  yang  esensial  (N,  P,  K)  dan  kondisi kultivasi  seperti  pH  (6-8),  temperatur  (20-30  C), oksigen,  suplai  cahaya,  CO 2 ,  merupakan  hal  yang dibutuhkan  mikroalga  seperti  tumbuhan  pada umumnya  (Nagao,  dkk.,  2019).  Mikroalga  mampu menyerap  gas  CO 2 secara  efektif  karena  memiliki efektifitas  fotosintesis  yang  lebih  besar  20  % dibandingkan  tanaman  lain  seperti  minyak  bunga matahari,  minyak  kedelai  dan  kanola  (Xu,  dkk., 2021).  Kandungan  karbondioksida  di  udara  sangat rendah  (0,03  %)  dan  kelarutan  di  dalam  air  yang sangat  rendah  (1,45  g/L  pada  25  C,  100  kPa) menyebabkan  pembiakan  alga  pada  salinitas  yang rendah  dan  pH  netral  memerlukan  suplai  gas  CO 2 tambahan  untuk  mempercepat  laju  pertumbuhan. Pengadukan yang intensif juga dapat meningkatkan penyerapan gas CO 2 dari udara ke media kultivasi.
Pertumbuhan  mikroalga  memerlukan  rentang pH  yang  optimal.  pH  Media  kultivasi  yang  terlalu tinggi  maupun  terlalu  rendah  dapat  menyebabkan laju  pertumbuhan  yang  rendah  dan  fasa  lag  yang panjang (Kim, dkk., 2009). Chlorella vulgaris yang dikultivasi pada pH 7-9 memiliki laju pertumbuhan yang  konstan  dan  mencapai  pertumbuhan  terbaik pada  pH  7.  Sementara Chlorella  vulgaris yang dikultivasi pada pH 5 dan 10 tidak menunjukkan laju pertumbuhan  yang  baik,  sebaliknya  menunjukkan fasa lag yang panjang (Kim, dkk., 2009). Penelitian lain menunjukkan Chlorella vulgaris yang dikultivasi  pada  pH  7,5  menunjukkan  konsentrasi alga dan klorofil yang lebih tinggi dari pH 9,5 karena pH  9,5  menurunkan  pengikatan  alga  terhadap  CO 2 bebas (Azov, Y., 1982).
Jumlah  energi  cahaya  yang  diterima  dan disimpan  oleh  sel  mempengaruhi  pengikatan  CO 2 , produktivitas  biomassa,  dan  pertumbuhan  sel. Mikroalga  yang  dikultivasi  dengan  penyinaran cahaya  yang  terbatas  akan  memanfaatkan  karbon untuk  mensintesis  asam  amino  dan  komponen  sel lainnya,  sementara  dalam  penyinaran  cahaya  yang sampai  jenuh,  akan  terjadi  pembentukan  gula  dan pati (Zak, dkk., 2001). Sementara penyinaran cahaya yang  berlebihan  akan  menyebabkan  fotoinhibisi atau terhambatnya fotosintesis (Molina, dkk., 1999).
Pada umumnya mikroalga mengandung protein (6-52 %), lemak (7-23 %), dan karbohidrat (5-23  %)  tergantung  species  masing-masing (Brown,  dkk.,1997).  Karbohidrat  terdapat  dalam lebih dari setengah berat kering biomassa mikroalga dan  sebagai  struktur  molekul  biomassa  pada umumnya (Arad dan Levy-Ontman, 2013). Karbohidrat  tersebut  tersimpan  sebagai  cadangan, sebagian  besar  dalam  dinding  sel  sebagai  selulosa, pektin,  polisakarida.  Sekalipun  begitu  kandungan pati  dan  selulosa  juga  dapat  bervariasi  tergantung jenis  alga.  Sebagian  besar  karbohidrat  dari  alga berada dalam bentuk pati dan selulosa  yang sangat potensial  untuk  produksi  bioetanol  (Maia,  dkk., 2020).
Kandungan  selulosa  di  dalam  alga  air  tawar (termasuk Chlorella,  sp. )  sekitar  7  %  dengan kandungan  lignin  yang  lebih  rendah,  yaitu  1,5  %. Sementara  kandungan  selulosa  dalam  alga  air  laut sekitar  6  %  (Ververis,  dkk.,  2007).  Kandungan selulosa  di  dalam  rumput  laut  merah Gelidium amansii (makroalga)  lebih  tinggi,  sekitar  15-25  % dalam bentuk fibrin (Yoon, dkk., 2010). Kandungan lignin  yang  rendah  di  dalam  mikroalga  dapat menyederhanakan  proses  hidrolisis  dengan  cara menghilangkan proses pretreatment untuk menghilangkan  lignin.  Lignin  sangat  sulit  untuk didegradasi  secara  biologis  dan  tidak  dapat difermentasi (Yoon, dkk., 2010).

## 1.2 Reaksi Hidrolisis oleh Enzim Cellulase
Biomassa  dari  agrikultur  pada  umumnya diproses  awal  dengan  bantuan  enzim,  ragi,  asam,
maupun  basa  untuk  mengkonversi  pati  menjadi glukosa  (Chandrasekhar,  dkk.,  2022).  Hidrolisis enzimatik memiliki beberapa keunggulan dibandingkan  hidrolisis  oleh  asam  dalam  hal: perolehan  glukosa  lebih  tinggi  dan  hidrolisis  dapat dilakukan  pada  temperatur  rendah.  Hal  ini  tidak menyebabkan korosi pada peralatan reaksi sehingga biaya  utilitas  jauh  lebih  rendah  dibandingkan hidrolisis dalam kondisi asam atau basa (Taherzadeh dan Karini, 2008).
Enzim cellulase dapat  dihasilkan  dari  bakteri dan  jamur  untuk  melakukan  hidrolisis  material lignoselulosa.  Tetapi  bakteri  anaerob  memerlukan kondisi pertumbuhan anaerob dan laju pertumbuhan yang rendah sehingga riset untuk produksi cellulase komersial  menggunakan  jamur  (Duff  and  Murray, 1996).  Beberapa  jamur  yang  memproduksi  enzim cellulase antara  lain: Sclerotium  rolfsii ,  P. chrysosporium , spesies Aspergillus , Schizophyllum , Penicillium ,  dan Trichoderma . Trichoderma sp adalah  jenis  yang  paling  banyak  dipelajari  untuk menghasilkan  enzim cellulase (Duff  dan  Murray, 1996). Enzim cellulase mentah dapat diperoleh dari jamur genus Trichoderma yang mampu mendegradasi dinding sel tumbuhan (Rosyida, dkk., 2015).
Penelitian yang dilakukan oleh Puspawati, dkk.
(2015)  melakukan  reaksi  hidrolisis  glukosa  oleh enzim cellulase dari Trichoderma sp  pada temperatur 40-50  C, pada biomassa rumput laut 10 gram dan konsentrasi enzim cellulase 1–2,73  mg/ml selama 24 jam menunjukkan hasil yang terbaik pada konsentrasi 1 mg/ml, 50  C selama 12 jam. Hal ini disebabkan  mold  dari  jenis Trichoderma  sp tidak dapat tahan pada temperatur yang terlalu tinggi.
Konsentrasi enzim cellulase dapat ditingkatkan  untuk  menaikkan  laju  reaksi  dan meningkatkan  perolehan  glukosa,  tetapi  akan meningkatkan biaya proses secara signifikan karena harga enzim cellulase yang mahal (Liu, dkk. 2019). Pada  konsentrasi  substrat  yang  rendah,  laju  dan perolehan  reaksi  hidrolisis  akan  meningkat  seiring dengan  kenaikan  konsentrasi  substrat  (Cheung  and Anderson,  1997).  Tetapi  pada  konsentrasi  substrat yang tinggi dapat terjadi inhibisi oleh substrat yang menurunkan  laju  reaksi  hidrolisis,  dan  besarnya inhibisi  dipengaruhi  oleh  rasio  antara  substrat  dan enzim (Penner and Liaw, 1994).
Substrat,  aktivitas  enzim cellulase ,  kondisi reaksi  (temperatur,  pH,  dan  parameter  lain) mempengaruhi  hasil  reaksi  hidrolisis  selulosa. Karena  itu  penelitian  ini  bertujuan  menentukan kondisi proses yang optimal, antara lain temperatur, waktu  reaksi,  dan  konsentrasi  enzim  untuk menghasilkan perolehan glukosa tertinggi.

## 2.   METODOLOGI PENELITIAN
2.1. Media Kultivasi
Mikroalga Chlorella,  sp. dikultivasi  pada media cair selama 7 hari kemudian diperbarui setiap minggu.  Media  cair  yang  digunakan  adalah  media Walne .  Media  yang  digunakan  ditampilkan  dalam Tabel 1 sampai Tabel 4.
Tabel 1. Komposisi media kultivasi chlorella, sp .
Komposisi Jumlah (ml) Larutan Nutrien 1 Larutan Vitamin 0,1 Larutan Urea 1 Air laut steril 1000 Buffer KH 2 PO 4 dan K 2 HPO 4 0.1 M,
pH 8.0 5 Tabel 2. Komposisi larutan nutrien (volume satu liter) Senyawa Jumlah (g) FeCl 3 .6H 2 O 1,3
MnCl 2 .4H 2 O/MnSO 4 .5H 2 O 0,36 H 3 BO 3 33,6 EDTA 45 NaH 2 PO 4 20 Larutan TMS 1 ml *
Tabel 3. Komposisi trace metal solution (tms) volume seratur mililiter Senyawa Jumlah (g) ZnCl 2 2,1 CoCL 2 .6H 2 O 2 (NH 4 )6Mo 7 O 24 .4H 2 O 0,9 CuSO 4 .5H 2 O 2 Tabel 4. Komposisi larutan vitamin (volume seratus mililiter) Senyawa Jumlah (mg) Cyanocobalamin 10 Thiamine 10 Biotin 200
Larutan Urea dibuat dari 100 gram  urea  yang dilarutkan  dalam  satu  liter  air  demineralisasi.  Air untuk  pembuatan stock  solutions (larutan  TMS, larutan nutrient, larutan urea, larutan vitamin) harus diproses terlebih dahulu. Sebanyak 20 liter air hasil reverse  osmosis  ditambahkan  0,4  ml  NaOCl, kemudian  diaduk  selama  12  jam,  setelah  itu ditambahkan 0,4 gram Na 2 S 2 O 3 dan diaduk selama 5-10 menit.
Semua stock solutions kecuali larutan vitamin disterilisasi  pada  121  °C,  1,2 kg/cm 2 selama  20 menit  kemudian  didinginkan  sampai  temperatur ruang.
Vitamin  tidak  disterilisasi  karena  temperatur yang  sangat  tinggi  dapat  mendegradasi  senyawa organik  dalam  larutan  vitamin.  Karena  itu  larutan vitamin  disaring  menggunakan  pori  20  mikron  di dalam ruang steril untuk menghilangkan kontaminan.  Larutan  nutrien  dan  TMS  disimpan pada  temperatur  ruang,  sementara  larutan  vitamin dan larutan urea disimpan pada suhu 4  C.
Air  laut  buatan  dibuat  dengan  menambahkan 33,3  gram  garam  laut  ke  dalam  satu  liter  air demineralisasi  (RO).  Kemudian  difiltrasi  secara vakum  lalu  disterilisasi  pada  121  °C,  1,2  kg/cm 2 selama  20  menit,  kemudian  didinginkan  sampai temperatur ruang.
Buffer  pH  8,0  disiapkan  dengan  mencampur K 2 HPO 4 and  KH 2 PO 4 (masing-masing  0,1  M) dengan  rasio  volume  8:1.  Buffer  ditambahkan  di awal pembuatan media untuk menjaga pH di rentang 7,5–8,0.  Di  tengah-tengah  proses  kultivasi  apabila pH turun sampai di bawah 7,5, Larutan NaOH 0,1 M ditambahkan  sebanyak  0,5  –  1  ml.  Semua  larutan tersebut  (NaOH,  KH 2 PO4,  and  K 2 HPO4)  juga disterilisasi  pada  121  °C,  1,2  kg/cm 2 selama  20 menit dan didinginkan sampai temperatur ruang.

## 2.2. Kultivasi Mikroalga Chlorella, sp
Mikroalga yang digunakan pada penelitian ini diperoleh  dari  kultivasi  beberapa  batch.  Kultivasi dilakukan  pada  bioreaktor  berukuran  1  –  2,5  L dimana mikroalga Chlorella, sp . dengan kandungan 20  %  volume  dimasukkan  ke  dalam  media  kultur yang  telah  disterilisasi.  Selama  kultivasi,  reaktor disuplai  oleh  aliran  gas  CO 2 ,  dengan  laju  alir  1 L/menit  per  1  liter  larutan,  dan  intensitas  cahaya sebesar  100-250  mol/m 2 .s.  Intensitas  tersebut diperoleh  dari  2  buah  lampu  neon  dengan  daya masing-masing  18  W  dipasang  menghadap  reaktor (gambar  peralatan  kultivasi  mikroalga  ditunjukkan pada  Gambar  1).  Reaktor  kemudian  diaduk  secara kontinyu  pada  kecepatan  120-300  rpm  untuk menghasilkan  homogenasi  udara  di  dalam  reaktor. Temperatur  dalam  reaktor  dipertahankan  pada  25  C.  Larutan  NaOH  ditambahkan  secara  berkala setiap  24  jam  untuk  menjaga  kestabilan  pH  pada rentang 7,5 - 8, dengan penambahan NaOH sebesar 0,5 – 1 ml. Kultivasi dilakukan selama 13 – 25 hari. Proses  prekultivasi  dilakukan  mendahului kultivasi mikroalga, dengan menambahkan 20-30 % volume Chlorella, sp. ke dalam larutan media 1 liter. Proses  memasukkan  mikroalga  ke  dalam  media kultur  dilakukan  dalam  kondisi  steril  (di sterile chamber ), kemudian diperbarui setiap 7 hari dengan cara memindahkan 20-30 % volume prekultivasi ke dalam media kultur yang baru.
Gambar 1. Peralatan kultivasi mikroalga

## 2.3. Reaksi Hidrolisis Selulosa oleh Enzim
Cellulase
Reaksi hidrolisis dilakukan
dengan mereaksikan Chlorella. sp . dengan enzim cellulase dari Trichoderma longibrachiatum (Sigma) pada pH 6,0  pada  beberapa  variasi  suhu  (50  –  70  C)  dan waktu  (8  -  72  jam).  Biomass  mikroalga  disiapkan dari 5 ml konsentrat yang disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit. Larutan buffer fosfat pH 6,0 dibuat dengan mencampur 0,1 M K 2 HPO 4 dan 0,1 M KH 2 PO 4 dengan rasio volume 2:25. Enzim cellulase ditambahkan  ke  dalam  2  ml larutan  buffer  fosfat,  diaduk  sampai  homogen, kemudian  dicampur  dengan  mikroalga  di  dalam tabung  reaksi  dalam  kondisi  tertutup.  Reaksi hidrolisis  dilakukan  pada waterbath dengan kecepatan putaran 200 rpm. Hasil reaksi kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan alga dari cairan, kemudian lapisan  atas  (cairan)  dipisahkan  dan  dilakukan analisa  kandungan  glukosa  menggunakan  reagen DNS.
Jumlah enzim cellulase divariasikan dari 2,5 – 10  mg  dalam  2  ml  larutan  buffer  fosfat  pH  6,0, sehingga rentang konsentrasi enzim menjadi 1,25 – 5 mg/ml.

## 2.4. Metode Analisa
Analisa  yang  dilakukan  dalam  penelitian  ini adalah  konsentrasi  glukosa  hasil  reaksi  hidrolisis. Konsentrasi  glukosa  yang  dihasilkan  dianalisa menggunakan  metode  DNS  (Miller,  1959).  Kurva kalibrasi  larutan  standar  glukosa  dibuat  pada konsentrasi  1  sampai  10  g/L  glukosa  dengan menggunakan  glukosa  anhidrat  yang  dilarutkan dalam  air  demin.  Sebanyak  0,3  ml  reagen  DNS ditambahkan  ke  dalam  0,1  ml  larutan  glukosa  di dalam tabung reaksi, kemudian dipanaskan selama 5 menit  pada  suhu  air  mendidih  (menggunakan waterbath),  kemudian  didinginkan  seketika  dengan mengalirkan air keran sampai mencapai temperatur ruang.  Kemudian 18 ml air demin ditambahkan ke larutan yang telah dingin. Pendinginan sampai suhu ruang  sangat  penting  karena  akan  mempengaruhi
pembacaan  absorbansi.  Absorbansi  larutan  diukur menggunakan  spektrofotometer  UV-Vis  pada panjang gelombang 500 nm.
Prosedur  yang  sama  digunakan  untuk  blanko berupa  air  demin  untuk  mendapatkan  pengukuran absorbansi pada titik nol. Dari kurva kalibrasi akan diperoleh  korelasi  antara  konsentrasi  glukosa (ordinat)  terhadap  absorbansi  (absis).  Korelasi tersebut  kemudian  digunakan  untuk  mengukur konsentrasi  glukosa  pada  sampel  hasil  reaksi. Pengukuran  sampel  hasil  reaksi  dilakukan  dengan metode  yang  sama  dengan  larutan  standar.  Reagen DNS yang digunakan ditunjukkan pada Tabel 5.
Tabel 5. Komposisi reagen DNS Komposisi Konsentrasi % (b/v) Asam Dinitrosalisilat 1 NaOH 1 Rochelle salt 20 Fenol 0,2 Sodium sulfat 0,05

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Perolehan  reaksi  hidrolisis  dipengaruhi  oleh konsentrasi  enzim,  temperatur  reaksi,  dan  waktu reaksi.  Pada  awalnya  reaksi  hidrolisis  dilakukan dengan menggunakan 15 mg/ml enzim cellulase (30 mg enzim dalam 2 ml larutan buffer pH 6,0) selama 8  jam,  pada  temperatur  60  C  dan  70  C.  Hasil penelitian ditunjukkan pada Tabel 6.
Tabel 6. Perbandingan reaksi hidrolisis pada temperatur 60  C dan 70  C T(°C) Glukosa (g/L) 60 6,18 70 3,29
Hasil  penelitian  menunjukkan  glukosa  yang dihasilkan lebih tinggi pada temperatur 60  C (Tabel 6). Hal ini disebabkan mold dari jenis Trichoderma sp tidak  dapat  tahan  pada  temperatur  yang  terlalu tinggi  sehingga  aktivitas  hidrolisis  menurun  pada suhu 70  C, ditunjukkan dengan konsentrasi glukosa yang  menurun  (Puspawati,  dkk.,  2015).  Pada umumnya  semakin  tinggi  temperatur,  reaksi  akan semakin cepat, tetapi temperatur yang terlalu tinggi dapat  menyebab  enzim cellulase terdenaturasi sehingga  laju  reaksi  hidrolisis  menurun  (Han,  dkk. 2012).  Selain  itu,  reaksi  hidrolisis  sendiri  bersifat eksotermik,  yang  dapat  menyebabkan  kenaikan temperatur reaksi hidrolisis. Hasil ini menjadi acuan untuk  variasi  berikutnya,  dimana  reaksi  dilakukan pada temperatur di bawah 60  C.
Jumlah enzim cellulase kemudian divariasikan antara 1,25 – 5 mg/ml (2,5 – 10 mg enzim cellulase dalam 2 ml larutan buffer fosfat ). Dengan penurunan jumlah  enzim,  secara  teoritis  glukosa  yang
dihasilkan akan berkurang. Sebagai konsekuensinya, waktu reaksi dinaikkan sampai 24 jam untuk meningkatkan produk glukosa. Hasil dari variasi tersebut ditunjukkan pada Tabel 7.
Tabel 7. Perolehan glukosa pada variasi konsentrasi enzim cellulase Cellulase (mg/ml) Waktu reaksi (jam) Glukosa (g/L) Glukosa (g/g alga) 1,25 12 1,08 0,1 1,25 16 1,08 0,1 2,5 8 1,65 0,15 2,5 12 1,71 0,16 2,5 16 1,58 0,14 5 12 2,19 0,2 5 16 2,34 0,21 5 24 2,69 0,25
Hasil  penelitian  menunjukkan  semakin  tinggi konsentrasi  enzim,  perolehan  glukosa  semakin tinggi,  karena  aktivitas  hidrolisis  semakin  tinggi. Pada  konsentrasi  enzim  1,25  mg/ml  tidak  terjadi perubahan glukosa baik pada reaksi 12 jam maupun 16  jam,  sama-sama  menghasilkan  glukosa  sebesar 1,08  g/L.  Hal  ini  menunjukkan  konsentrasi  enzim pada  jumlah  tersebut  tidak  mencukupi  untuk melakukan reaksi hidrolisis.
Pada konsentrasi enzim 2,5 mg/ml, konsentrasi glukosa  hanya  naik  sedikit  dari  1,65  g/L  menjadi 1,71 g/L Ketika  waktu reaksi dinaikkan dari  12 ke 16  jam,  dan  bahkan  konsentrasi  glukosa  turun menjadi 1,58 g/L setelah 16 jam reaksi. Hal ini juga menunjukkan  konsentrasi  enzim  masih  belum mencukupi  untuk  mengkonversi  selulosa  menjadi glukosa.
Pada konsentrasi enzim yang lebih tinggi, yaitu 5  mg/ml,  konsentrasi  glukosa  yang  dihasilkan menunjukkan tren kenaikan yang konsisten bahkan masih  meningkat  setelah  24  jam  reaksi.  Hal  ini menunjukkan bahwa konsentrasi tersebut merupakan  konsentrasi  yang  terbaik  dari  rentang 1,25 – 5 mg/ml untuk mengkatalisis reaksi hidrolisis sehingga perolehan produk terus meningkat selama 24 jam reaksi.
Dari  perbandingan  hasil  pada  Tabel  6  dan  7 dapat dilihat, dengan menggunakan 15 mg/ml enzim cellulase ,  glukosa  yang  dihasilkan  cukup  tinggi yaitu sebesar 6,18 g/L, sementara pada konsentrasi enzim  5  mg/ml  hanya  sebesar  2,69  g/L.  Tetapi apabila mempertimbangkan skala industri, konsumsi enzim yang terlalu tinggi dapat menaikkan biaya produksi secara signifikan, sehingga dipikirkan  untuk  mengurangi  jumlah  enzim cellulase .
Karena  itu  variasi  berikutnya  kemudian dieksplorasi lebih lanjut untuk konsentrasi enzim 5 mg/ml  dengan  waktu  reaksi  24  –  72  jam,  pada
beberapa  variasi  temperatur:  50  C,  55  C,  60  C. Hasil ditunjukkan pada Tabel 8.
Tabel 8. Perolehan glukosa pada konsentrasi enzim cellulase 5 mg/ml Waktu Reaksi (jam) Glukosa (g/L) 50 °C 55 °C 60 °C 24 1,83 1,97 1,27 36 1,91 - 1,31 48 - 2,91 1,47 54 2,3 2,06 - 56 - 2,58 - 58 - 3,07 - 60 2,12 2,36 1,33 72 2,15 - -
Pada  reaksi  dengan  temperatur  60  C, konsentrasi  glukosa  masih  meningkat  selama  24 sampai 48 jam reaksi kemudian menurun pada jam ke-60. Hal ini menunjukkan bahwa pada temperatur tersebut reaksi hidrolisis tidak dapat dilakukan untuk waktu  reaksi  yang  lama  karena  temperatur  yang tinggi  menghambat  aktivitas  enzim cellulase (Puspawati,  dkk.,  2015).  Pada  temperatur  50  C, dilakukan  reaksi  dengan  durasi  antara  48–60  jam, hasil terbaik diperoleh setelah 54 jam reaksi dengan perolehan glukosa sebesar 2,3 g/L.
Reaksi  hidrolisis  pada  temperatur  55  C menghasilkan  perolehan  glukosa  yang  tertinggi dibandingkan  pada  temperatur  50  C  dan  60  C. Hasil  tersebut  dijabarkan  secara  terperinci  pada Tabel 9.
Tabel 9. Perolehan glukosa pada konsentrasi enzim 5 mg/ml dan temperatur reaksi 55  C Waktu reaksi (jam) Glukosa (g/L) Glukosa per massa alga (g/g) 24 1,97 0,16 48 2,91 0,23 56 2,58 0,21 58 3,07 0,25 60 2,36 0,19 Konsentrasi glukosa meningkat seiring naiknya  waktu  reaksi,  dimana  hasil  maksimal ditunjukkan  pada  waktu  reaksi  58  jam,  kemudian menurun  setelah  60  jam.  Hal  ini  dapat  disebabkan oleh 2 hal. Pertama, konsentrasi glukosa hasil reaksi setelah  60  jam  menghambat  aktivitas  enzim sehingga  menurunkan  perolehan  glukosa.  Kedua, konsentrasi  substrat  sangat  rendah  setelah  60  jam, sehingga  glukosa  hasil  hidrolisis  dikonsumsi  oleh enzim cellulase sebagai  sumber  karbon.  Hal  yang sama  ditunjukkan  oleh  hasil  penelitian  Ashriyani (2009).  Ashriyani  (2009)  yang  mempelajari pembuatan  bioetanol  dari  hidrolisis  rumput  laut
Eucheuma  cottonii menggunakan  enzim cellulase , menunjukkan  trend  perolehan  yang  sama.  Proses hidrolisis  menghasilkan  glukosa  terus  meningkat sampai 48 jam kemudian menurun.
Konsentrasi glukosa yang tertinggi pada reaksi hidrolisis dengan temperatur 55  C diperoleh setelah 58 jam reaksi hidrolisis, yaitu 3,07 g/L, dengan rasio glukosa/alga sebesar 0,25.
Penelitian  serupa  dilakukan  oleh  Puspawati dkk  (2015),  dimana  reaksi  hidrolisis  glukosa  oleh enzim cellulase dari Trichoderma sp pada biomassa rumput laut 10 g dan konsentrasi enzim cellulase 1– 2,73 mg/ml memberikan hasil yang maksimal pada temperatur  50  C  pada  pH  5  selama  12 jam. Penelitian  lain  yang  melakukan  reaksi  hidrolisis pada  batang  gandum  dengan  enzim cellulase dari Penicillium  waksmanii memperoleh  hasil  glukosa tertinggi  pada  kondisi  temperatur  55  C,  pH  5,0 selama  waktu  reaksi  30  jam  (Han,  dkk.,  2012). Temperatur  optimal  untuk  reaksi  hidrolisis  dengan enzim cellulase dapat  berbeda-beda  bergantung pada sumber enzim cellulase tersebut.
Gambar  2  dan  3  menunjukkan  kondisi mikroalga  sebelum  dan  sesudah  dilakukan  reaksi hidrolisis.
Gambar 2. Kondisi mikroalga sebelum reaksi hidrolisis
Gambar 3. Kondisi mikroalga setelah reaksi hidrolisis
Hasil  penelitian  menunjukkan  semakin  tinggi konsentrasi  enzim,  semakin  tinggi  perolehan glukosa.  Pada  skala  industri,  semakin  tinggi konsentrasi  enzim cellulase akan  menyebabkan kenaikan  biaya  operasional  yang  juga  semakin tinggi,  sehingga  perlu  ditentukan  optimasi  rasio antara  jumlah  enzim  dengan  biomassa  (mikroalga) yang  terendah  yang  mampu  menghasilkan  produk reaksi yang tertinggi.

## 4.   KESIMPULAN
Mikroalga  dengan  kandungan  selulosa  di dalamnya  merupakan sumber  yang potensial  untuk menghasilkan  glukosa.  Selulosa  dalam  biomassa dapat  dikonversi  menjadi  glukosa  dengan  reaksi hidrolisis  enzimatik,  dimana  glukosa  kemudian dapat digunakan untuk memproduksi etanol. Reaksi
hidrolisis dalam penelitian ini dilakukan pada 5 ml konsentrat  biomassa Chlorella,  sp. dengan  variasi- variasi konsentrasi enzim cellulase 1,25 – 5 mg/ml, temperatur reaksi 40-70  C, dan waktu reaksi 8 – 60 jam.
Reaksi  hidrolisis  terbaik  yang  menghasilkan konsentrasi glukosa yang tertinggi sebesar 3,07 g/L diperoleh pada konsentrasi enzim cellulase 5 mg/ml,
temperatur reaksi 55  C, dan waktu reaksi 58 jam.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  ditujukan  kepada  Prof. Syu Mei Jywann yang telah membimbing penelitian dan  menyediakan  semua  fasilitas  di  Laboratorium Biomaterials and Biosensors, National Cheng Kung University,  Taiwan.  Ucapan  terima  kasih  juga ditujukan  kepada  Prof.  Wu  Wen-Teng,  Prof.  Lee Wen-Chien  untuk  bimbingan  dan  saran  selama penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Arad,  S.  and  Levy-Ontman,  O.,  2013.  Sulfated polysaccharides  in  the  cell  wall  of  red microalgae,  in:  Thomas,  S.,  Durand,  D., Chassenieux, C.  and Jyotishkumar, P. (Eds.), Handbook  of  Biopolymer-Based  Materials: From  Blends  and  Composites  to  Gels  and Complex  Networks,  Wiley‐VCH  Verlag GmbH & Co. KGaA, pp. 351–370.
Aravantinou, A.F., Manariotis, I.D., 2016. Effect of operating  conditions  on  Chlorococcum  sp. growth and lipid production. J. Environ. Chem. Eng., 4(1): 1217–1223.
Ashriyani,  A.  2009.  Pembuatan  Bioetanol  Dari Substrat  Makroalga  Genus  Eucheuma  dan Gracilaria. Skripsi .  Jurusan  Kimia,  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam, Universitas Indonesia.
Azov,  Y.,  1982.  Effect  of  pH  on  inorganic  carbon uptake  in  algal  cultures.  Applied  and Environmental  Microbiology,  43(6):  1300- 1306.
Barten,  R.,  Djohan,  Y.,  Evers,  W.,  Wijffels,  R., Barbosa,  M.  2021.  Towards  industrial production of microalgae without temperature control:  The  effect  of  diel  temperature fluctuations on microalgal physiology. Journal of Biotechnology 336(1): 56-63.
Becker,  E.W.  (1994)  Microalgae:  Biotechnology and  Microbiology.  Cambridge  University Press, Cambridge.
Bhattacharya,  M.  and  Goswami,  S.,  2020. Microalgae –  A  green  multi-product biorefinery  for  future  industrial  prospects. Biocatal. Agric. Biotechnol., 25: 101580.
Brown,  M.,  Jeffrey,  S.,  Volkman,  J.  and  Dunstan, G., 1997. Nutritional properties of microalgae for mariculture. Aquac. , 151(1-4): 315-331.
Chandel,  A.K.,  Garlapati,  V.  K.,  Singh,.  A.K.,
Antunes,  F.A.P.,  Silva,  S.S.  2018.  The  path forward  for  lignocellulose  biorefineries: Bottlenecks,  solutions,  and  perspective  on commercialization.  Bioresource  Technology, 264(1): 370-381.
Chandrasekhar, K., Raj, T., Ramanaiah, S., Kumar, G., Banu, J., Varjani, S., Sharma: , Pandey, A., Kumar,  S.  and  Kim,  S.,  2022.  Algae biorefinery: A promising approach to promote microalgae  industry  and  waste  utilization. J. Biotechnol. , 345: 1-16. Cheung,  S.  and  Anderson,  B.,  1997.  Laboratory investigation  of  ethanol  production  from municipal primary wastewater solids. Bioresour. Technol. , 59(1): 81-96. Duff,  S.  and  Murray,  W.,  1996.  Bioconversion  of forest  products  industry  waste  cellulosics  to fuel  ethanol:  A  review. Bioresour.  Technol. , 55(1): 1-33.
Han,  L.,  Feng,  J.,  Zhang,  S.,  Ma,  Z.,  Wang,  Y., Zhang,  X.  2012.  Alkali  pretreated  of  wheat straw and its enzymatic hydrolysis.
Brazilian Journal of Microbiology, vol. 43(1): 53-61.
Huang, X. and Penner, M., 1991. Apparent substrate inhibition of  the Trichoderma reesei cellulase system.  Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry, 39(11): 2096-2100.
Jugwanth,  Y.,  Sukai,  Y.S.,  Kana,  E.B.G.  2019.
Valorization  of sugarcane  bagasse for bioethanol  production  through  simultaneous saccharification and fermentation: Optimization  and  kinetic  studies.  Fuel, 262:116552.
Kim, J., Lee, J. Y., Keener, T. 2009. Growth kinetic study  of  Chlorella  vulgaris.  Department  of Chemical and Materials Engineering, University of Cincinnati.
Klassen,  V.,  Blifernez-Klassen,  O.,  Wobbe,  L., Schlüter, A., Kruse, O., Mussgnug, J.H., 2016. Efficiency  and  biotechnological  aspects  of biogas production from  microalgal  substrates.
J. Biotechnol ., 234(1):
7–26. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2016.07.015x u
Liu,  C.G.,  Xiao,  Y.,  Xia,  X.X.,  Zhao,  X.Q.,  Peng, L.C.,  Srinophakun,  P.,  Bai,  F.W.  2019. Cellulosic  ethanol  production:  Progress, Challenges  and  strategies  for  solutions. Biotechnology Advances, vol. 37(3): 491-504. Low,  S.,  Ong,  S.  and  Ng,  H.,  2014.  Biodiesel production  by  microalgae  cultivated  using permeate  from  membrane  bioreactors  in continuous system. Water Sci. Technol ., 69(9): 1813-1819.
Maia, J., Cardoso, J., Mastrantonio, D., Bierhals, C., Moreira,  J.,  Costa,  J.  and  Morais,  M.,  2020. Microalgae  starch:  A  promising  raw  material for  the  bioethanol  production.  International
Journal  of  Biological  Macromolecules,  165: 2739-2749.
Molina Grima, E., Fernández, F., Garcı ́a Camacho,
F. and Chisti, Y., 1999. Photobioreactors: light regime,  mass  transfer,  and  scaleup. J. Biotechnol. , 70(1-3): 231-247.
Mutanda, T., Naidoo, D., Bwapwa, J.K., Anandraj, A.,  2020.  Biotechnological  applications  of microalgal  oleaginous  compounds:  current trends  on microalgal  bioprocessing  of products. Front. Energy Res., 8(1): 299.
Nagao, R., Ueno, Y., Akita, F., Suzuki, T., Dohmae, N., Akimoto, S., Shen, J.R., 2019. Biochemical characterization  of  photosystem  I  complexes having  different  subunit  compositions  of fucoxanthin  chlorophyll  cyanin  the  diatom Chaetoceros gracilis. Photosynth. Res., 140(1): 141–149.
Nigam  and  Singh,  A.,  2011.  Production  of  liquid biofuels from renewable resources. Progress in Energy and Combustion Science, 37(1): 52-68. Penner,  M.  H.,  Liaw,  E.-T.,  1994.  Kinetic consequences  of  high  ratios  of  substrate  to enzyme  saccharification  systems  based  on Trichoderma  cellulose,  In:  Himmel,  M.  E., Baker, J. O., Overend, R. P., (Eds.), Enzymatic conversion  of  biomass  for  fuels  production. American  Chemical  Society,  Washington, DC., pp. 363-371.
Puspawati,  S.,  Wagimana  ,  Ainuri,  M.,  Nugraha, D.A.,  Haslianti.  2015.  The  Production  of Bioethanol  Fermentation  Substrate  from Eucheuma cottonii Seaweed through Hydrolysis  by  Cellulose  Enzyme,  ICoA Agriculture and Agricultural Science Procedia, vol. 3, pp: 200 – 205.
Ren,  Q.,  Wang,  Y.,  Lin,  Y.,  Zhen,  Z.,  Cui,  Y.  and Qin, S., 2021. The extremely large chloroplast genome  of  the  green  alga  Haematococcus pluvialis:  Genome  structure,  and  comparative analysis. Algal Research, 56: 102308.
Reshma,  R.,  Chitra  Devi,  K.,  Dinesh  Kumar,  S., Santhanam:  ,  Perumal:  ,  Krishnaveni,  N., Begum,  A.,  Pragnya,  M.,  Arthikha,  R., Dhanalakshmi, B., Kim, M.K., 2021.
Enhancement  of  pigments  production  in  the green microalga Dunaliella salina (PSBDU05) under  optimized  culture  condition.  Bioresour. Technol. Rep., 14: 100672.
Rosyida,  V.,  Indrianingsih,  A.,  Maryana,  R.  and Wahono, S., 2015. Effect of Temperature and Fermentation  Time  of  Crude Cellulase Production  by  Trichoderma  Reesei  on  Straw Substrate. Energy Procedia, 65: 368-371.
Rubio,  F.,  Camacho,  F.,  Sevilla,  J.,  Chisti,  Y.  and
Grima,  E.,  2002.  A  mechanistic  model  of photosynthesis  in  microalgae. Biotechnol. Bioeng. , 81(4): 459-473.
Taherzadeh, M. and Karimi, K., 2008. Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: A Review. International  Journal  of  Molecular  Sciences, 9(9): 1621-1651.
Tsarpali,  M.,  Arora,  N.,  Kuhn,  J.N.,  Philippidis, G.P., 2021. Lipid-extracted algae as a source of biomaterials for algae biorefineries. Algal Res. 57(1): 102354. https://doi.org/ 10.1016/j.algal.2021.102354.
Vasic,  K.,  Knez,  Z.,  Maja,  L.,  2021.  Bioethanol Production  by  Enzymatic  Hydrolysis  from Different Lignocellulosic Sources. Molecules., 26(3): 753.
Ververis,  C.,  Georghiou,  K.,  Danielidis,  D., Hatzinikolaou,  D.,  Santas:  ,  Santas,  R.  and Corleti,  V.,  2007.  Cellulose,  hemicelluloses, lignin  and  ash  content  of  some  organic materials and their suitability for use as paper pulp supplements. Bioresour. Technol. , 98(2): 296-301.
Xu, K., Zou, X., Chang, W., Qu, Y. and Li, Y., 2021. Microalgae harvesting technique using ballasted  flotation:  A  review.  Separation  and Purification Technology, 276: 119439.
Yoon, J., Kim, Y., Kim, S., Ryu, H., Choi, J., Kim, G.  and  Shin,  M.,  2010.  Production  of Polysaccharides  and  Corresponding  Sugars from  Red  Seaweed.  Advanced  Materials Research, 93-94: 463-466.
Zak,  E.,  Norling,  B.,  Maitra,  R.,  Huang,  F., Andersson,  B.  and  Pakrasi,  H.,  2001.  The initial  steps  of  biogenesis  of  cyanobacterial photosystems  occur  in  plasma  membranes. Proceedings  of  the  National  Academy  of Sciences, 98(23): 13443-13448.