## TINGKAT PATOGENISITAS BAKTERI Vibrio sp. STRAIN IS8 YANG DIINFEKSI PADA KERANG BATIK (Ruditapes philippinarum) MENGGUNAKAN METODE IN VITRO
Pathogenicity level of Vibrio sp. strain IS8 bacteria infected to Manila Clam (Ruditapes philippinarum) using In Vitro Assays
Ciptaning Weargo Jati *1 , Huriyatul Fitriyah Noor 1 , Juli Nursandi 2 , Rahma Mulyani 3
1 Aquaculture Department, Universitas Lampung, Lampung, Indonesia
2 Aquaculture Department, Politeknik Negeri Lampung, Lampung, Indonesia
3 Fish Culture Department, Universitas PGRI Palembang, Palembang, Indonesia
* Corresponding author : ciptaning.jati@fp.unila.ac.id

## ABSTRAK
Kerang,  khususnya  jenis Ruditapes philippinarum,  memiliki  nilai  ekonomis  tinggi  di Prancis dan banyak wilayah lainnya. Meskipun teknologi budidaya dan pengendalian penyakit berkembang pesat, penyakit musiman seperti Brown Ring Disease (BRD) atau penyakit cincin coklat tetap menjadi tantangan dalam budidaya R. philippinarum . Penyakit ini disebabkan oleh Vibrio  tapetis ,  yang  memiliki  dampak  patogenik  yang  signifikan  pada  kerang.  Penelitian ini fokus  pada  pengujian  tingkat  patogenisitas V.  tapetis strain  IS8  pada  kerang  batik  (R. philippinarum). Melalui uji aderensi dan fagositosis, kami mengevaluasi kemampuan bakteri ini  untuk  menyebabkan efek aderen  pada  hemosit  kerang  dan  aktivitas  fagositosis.  Hasilnya menunjukkan  bahwa V.  tapetis  strain  IS8  memiliki  tingkat  patogenisitas  yang  sangat  tinggi, dengan  kemampuan  aderensi  dan  aktivitas  fagositosis  yang  lebih  tinggi  dari  kontrol  positif. Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa V. tapetis strain IS8 mampu menginduksi penyakit cincin coklat pada kerang batik dan memiliki dampak patogenik yang signifikan. Pengetahuan lebih  lanjut  tentang  mekanisme  infeksius  bakteri  ini  diperlukan  untuk  meningkatkan pemahaman tentang peran mereka dalam budidaya kerang di masa depan.
Kata kunci : Penyakit Cincin Coklat, Vibrio tapetis, Kerang Batik, Ruditapes philippinarum

## ABSTRACT
Clams, particularly Ruditapes philippinarum, hold significant economic value in France and  various  other  regions.  Despite  rapid  advancements  in  culture  technology  and  disease control, seasonal diseases such as Brown Ring Disease (BRD) continue to pose a challenge in the  cultivation  of  R.  philippinarum.  This  ailment  is  attributed  to  Vibrio  tapetis,  exhibiting  a substantial pathogenic impact on clams. This study concentrates on assessing the pathogenicity level  of  V.  tapetis  strain  IS8  in  the  Manila  clam  (R.  philippinarum).  Through  adhesion  and phagocytosis assays, we evaluate the capability of V. tapetis strain IS8 to induce adhesion effects on clam hemocytes and phagocytic activity. The results demonstrate that V. tapetis strain IS8 exhibits  a  remarkably  high  level  of  pathogenicity,  surpassing  the  positive  control  in  both adhesion and phagocytosis assays. In conclusion, this research establishes that V. tapetis strain IS8  can  induce  Brown  Ring  Disease  in  Manila  clams,  showcasing  a  significant  pathogenic
Jurnal Ilmu-ilmu Perikanan dan Budidaya Perairan Volume 18, Nomor 2, Desember 2023: 170-180 https://jurnal.univpgri-palembang.ac.id/index.php/ikan
impact. Further comprehension of the infectious mechanisms of this bacterium is essential for enhancing our understanding of their role in clam cultivation in the future.
Keywords: Brown Ring Disease, Vibrio Tapetis, Manila Clam, Ruditapes philippinarum
PENDAHULUAN Kerang merupakan komoditas
bernilai  ekonomis  tinggi  (Bald  dan  Borja, 2002; Becker et al. 2008; Chen et al., 2021). Baik  di  Asia  maupun  Benua  Eropa, komoditas  budidaya  ini  memiliki  peminat yang  tinggi.  Salah  satunya  di  negara
Prancis. Kerang jenis Ruditapes philippinarum telah banyak dibudidayakan di Prancis (Jensen et al., 2004, Chiesa et al., 2017).  Perkembangan  pembudidayaan R. philippinarum diawali  pada  kisaran  tahun 1970,  kala  awal  kerang  ini  diintroduksi untuk  pertama  kali  (Bodoy et al.,  1982; Flassch dan Leborgne, 1992; Paillard et al .; 1994, Chiesa et al ., 2016).
Perkembangan  teknik  dan  teknologi budidaya berlangsung dengan pesat karena kerang  ini  tinggi  peminat  serta  mudah dibudidayakan  (Caill-Milly et  al., 2004; Bald et  al., 2009,  Xing et  al., 2014).
Walaupun
perkembangan teknologi budidaya dan pengendalian penyakit sudah sangat  maju,  namun  permasalahan  dengan penyakit masih terus dihadapi dalam proses budidaya R. Philippinarum (Paillard, 2004). Salah  satu  penyakit  musiman  yang  kerap menyerang kerang budidaya adalah Brown Ring  Disease (BRD)  atau  penyakit  cincin coklat (Paillard et al ., 1994; Paillard et al., 2014).
Penyakit cincin coklat ini disebabkan oleh  salah  satu  jenis Vibrio sp.  yang diidentifikasi sebagai Vibrio tapetis. Jenis V. tapetis ini  diketahui  sudah  menyerang berbagai  jenis  organisme  laut.  Selain menyerang R.  philippinarum ,  dilaporkan bahwa  bakteri  ini  juga  menyerang  kerang jenis Venerupis philippinarum (Paillard and Maes, 1990;  Paillard  and  Maes, 1994; Borrego et  al ., 1996;  Paillard et  al., 2014)
dan  kerang Polititapes  aureus (Borrego et al ., 1996).  Selain  jenis  kekerangan, V, tapetis juga  dilaporkan  menyerang  ikan sebelah Hippoglossus hippoglossus (Reid et al .,  2003),  dan  ikan  kakatua Symphodus melops (Jensen et al ., 2003).
Agensia  penyakit  cincin  coklat, V. tapetis ini pertama kali diisolasi di Finister Utara,  Prancis.  Pada  awal  pengisolasian bakteri  ini  diberi  nama  VP1  atau Vibrio Predominant 1  (Paillard  dan  Maes,  1990). Laporan  mengenai  keberadaan  virus  ini tidak  hanya  di  Eropa,  namun  juga ditemukan di Amerika Utara (Quayle, 1964; Utting  dan  Spencer,  1992;  Cordero, et  al., 2017),  Perairan  Inggris  (Flassch  dan Leborgne,  1992;  Humphreys et  al., 2015), serta  daerah  Asia,  utamanya  di  Jepang (Ponurovsky dan Yakovlev, 1992; Matsuyama et al., 2010, Kitada et al., 2013). Virus ini sangat patogen pada kerang. Selain  persebarannya  yang  cepat,  sangat umum  ditemukan  adanya  kematian  pada kerang  yang  disebabkan  oleh V.  tapetis. Bakteri ini memiliki karakterisasi fermentatif,  gram-negatif,  non-sporulasi, tumbuh dengan baik pada suhu 4°C hingga 22°C. Pada suhu yang lebih tinggi dari 22°C tidak  ditemukan  adanya  pertumbuhan  dari spesies ini (Paillard dan Maes, 1990; Allam et al., 2014). Tingkat  kematian  sangat  tinggi  yang disebabkan  oleh V.tapetis pada  kerang bukan  berarti  bahwa  kerang  tidak  mampu untuk  bertahan  dari  penyakit  jenis  ini (Paillard et  al., 2004;  Rodrigues et  al., 2015b). Selain itu, masih banyak strain dari V. tapetis yang masih perlu untuk dilakukan pengecekan  apakah  bersifat  virulen  atau tidak,  baik  menggunakan  metode in  vitro maupun in  vivo. Karena  perbedaan  jenis
kerang  maupun  strain  dari V,  tapetis akan menghasilkan  kemampuan  yang  berbeda baik  dari  patogenisitas  bakteri  juga kekebalan  kerang  (Trinkler et  al., 2011; Rodrigues et al., 2015b). Kami melaporkan hasil riset pengujian patogenisitas secara In Vitro bakteri V.  tapetis strain  IS8  yang memiliki  kemampuan  untuk  menginfeksi kerang  batik  dan  menyebabkan  penyakit cincin coklat pada jurnal ini.

## MATERI DAN METODE Waktu dan Tempat Pelaksanaan
Penelitian  aktivitas  viruensi  bakteri Vibrio  tapetis strain  IS8  menggunakan metode in  vitro dilaksanakan  selama  4 Bulan dari bulan Februari hingga Mei. Riset dilakukan di  Laboratoire  des  Sciences  de L’énvironnement  Marin (Lemar), Institute Universitaire Europeén de la Mer (IUEM), Plouzané, Prancis.

## Sampel atau Hewan Uji
Hewan  uji  yang  digunakan  adalah kerang batik dewasa dengan anteroposterior antara  15-20mm.  sampel  yang  diujikan didapatkan dari pembudidaya kerang batik di  daerah  Marennes,  Prancis. Aklimatisasi dilakukan pada kerang selama satu minggu sebelum riset dilakukan. Proses aklimatisasi dengan memelihara kerang batik menggunakan  sirkulasi  air  laut  murni  dan diberikan  aerasi.  Air  laut  yang  digunakan selama  proses  aklimatisasi  memiliki salinitas 34ppt dan suhu 13°C.

## Bakteri
Bakteri  yang  diujikan  pada  riset  ini didapatkan dari hasil isolasi ikan dan kerang yang  terjangkit  penyakit cincin  coklat  dari waktu dan tempat yang bervariasi. Bakteri Vibrio strain IS8 yang diujikan merupakan bakteri yang diisolasi dari cangkang kerang yang  terjangkit  cincin  coklat.  Kontrol normal  yang  digunakan  adalah  air  laut steril.  Sebagai  kontrol  positif  penyakit
cincin  coklat  digunakan  Vibrio  strain CECT4600  (Paillard  &  Maes,  1990), sementara  jenis Vibrio  splendidus (ATCC 25914) (Choquet, 2004) digunakan sebagai kontrol negatif (Jati et al., 2023).
Sel  yang  diuji  ditumbuhkan  pada media  Zobell  (Zobell,  1941)  dalam  suhu 18°C  dan  dikultur overnight. Sentrifugasi selama  10  menit  pada  kecepatan  2500rpm dan  suhu  4°C  dilakukan  untuk  memanen bakteri  yang  telah  dikultur  selama  satu malam.  Proses  bilas  dilakukan  sebanyak tiga kali menggunakan air laut steril. Proses penghitungan bakteri menggunakan spektofotometer  pada  492nm optical density .  Pengenceran  bakteri  dilakukan dengan  menggunakan  air  laut  steril  untuk mendapatkan  rasio  bakteri  25x  dari  total hemolim,

## Uji Aderensi
Pengulangan tiga kali dilakukan pada tiap  uji  aderensi.  100μl  larutan  bakteri diinkubasi pada 100μl hemolim di 24-well microplates menggunakan metode Choquet et  al., (2003).  Inkubasi  dilakukan  pada kondisi  gelap  dan  suhu  18°C  selama  180 menit. Pemberhentian pertumbuhan bakteri dilakukan  dengan  cara  menambahkan larutan  Formalin  6%  pada  larutan  dengan perbandingan yang sama (v/v), supernatant larutan  dipindahkan  ke cytometry  tube . Penghitungan  jumlah  hemosit  bakteri menggunakan flow  cytometry .  Hasil  yang didapat  berupa  rasio  sel  yang  non-aderen. Jumlah  bakteri  non-aderen  dibagi  dengan jumlah  sel  yang  diinkubasi  menggunakan air laut steril. Nilai rasio sel > 1 (lebih besar dari  satu)  menunjukkan  adanya  aktivitas sitotoksik  pada  bakteri  uji.  Penghitungan nilai  rata-rata  dilakukan  setelah  dilakukan percobaan sebanyak 3 kali ulangan.

## Uji Fagositosis
Uji  fagositosis  dilakukan  sebanyak tiga ulangan per sampel dengan fluorescent
latex beads ((TM Fluoresbrite plain YG 2.0- microns  microspheres  2.5%  solids-latex (Polysciences,  Inc.,  Warrington,  PA 18976)).  Perbandingan  Lateks  beads  yang ditambahkan pada larutan hemolim bakteri sebanyak  9:10:1  (lateks  beads:  larutan hemolim: larutan bakteri).
Metode  yang  digunakan  merujuk pada metode Delaporte et al. (2003). Pada uji  yang  dilakukan,  control  dipelihara menggunakan air laut steril yang diinkubasi pada  suhu  18°C  selama  120  jam.  Uji fagositosis dilakukan dengan memindahkan larutan  pada flow  cytometry .  Pengaturan yang digunakan pada FSC ( Forward Light Scatter )  adalah  pada  118,  sementara  SSC ( Side Light Scatter ) pada 300. Distribusi sel diplotkan  menggunakan  plot  titik.  Basis ukuran  sel  diekspresikan  FSC  sementara kompleksitas  dan  granulitas  diekspresikan SSC. Penghitungan  hasil  tiga  kali  ulangan
dilakukan  untuk  menemukan  rerata  nilai dari uji yang dilakukan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Aderensi
Uji  aderensi  dimaksudkan  untuk mencari  nilai  aderen  sel  pada  hemosit kerang  yang  disebabkan  oleh  bakteri  yang menginfeksi  hemosit.  Jika  nilai  rasio  pada hasil  uji  yang  disajikan  pada  Gambar  1 dibandingkan  dengan  kontrol  normal  (air laut  steril)  adalah  <1  itu  artinya  tidak ditemukan efek aderen pada hemosit kerang yang disebabkan oleh bakteri uji. Sementara apabila ditemukan nilai >1 pada nilai rasio yang dibandingkan dengan kontrol normal, dapat  diindikasikan  bahwa  ditemukan adanya efek aderen disebabkan oleh bakteri uji.  Rata-rata  nilai  dari  uji  aderensi  yang dilakukan disajikan pada Gambar 1 berikut:
Gambar 1. Hasil Uji Aderensi
Berdasarkan  hasil  uji  aderensi  pada Gambar  1, V.  tapetis strain  CECT4600
(kontrol  positif)  menunjukkan  nilai  rasio 1,70 dibandingkan dengan kontrol normal.
Nilai  rata-rata  rasio  yang  lebih  tinggi  dari kontrol  normal  dapat  diartikan  bahwa ditemukan  efek  aderen  pada  hemosit R.
philippinarum yang diinfeksi oleh 1,00 1,70 0,89 1,88 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60 1,80 2,00 Kontrol Normal Kontrol Positif Kontrol Negatif Vibrio IS8 RA TI O OF HEM OL YM PH C OL LEC TED STRAIN Hasil Uji Aderensi
CECT4600 (Paillard, 2004). Efek aderensi yang  tinggi  ini  menunjukkan  adanya kemampuan  dari V.  tapetis strain CECT4600  untuk  menginduksi  penyakit cincin  coklat  pada  kerang  batik  (Paillard, 2004;  Dias et  al., 2018;  Rahmani et  al. , 2019).
Nilai  rata-rata  dari  uji  aderensi  pada kontrol negatif, V. splendidus menunjukkan nilai  0,88  dibandingkan  dengan  kontrol normal.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa tidak ditemukannya  efek  aderen  pada  hemosit kerang  batik  yang  disebabkan  oleh V. splendidus. Hal  ini  menunjukkan  bahwa peran  yang  dimiliki  oeh  hemosit  kerang yang  diserang  oleh V.  splendidus tidak terganggu  (Jati, et  al., 2023).  Sehingga V. splendidus tidak  mampu  menginduksi Brown  Ring  Disease (BRD)  pada  kerang batik (Jensen et al. 2003; Jati et al., 2023). Rerata hasil uji bakteri V. tapetis strain IS8  yang  dibandingkan  dengan  kontrol normal menunjukkan nilai 1,88. Nilai yang bahka  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan kontrol positif, V. tapetis strain CECT4600. Hal  ini  menggambarkan  bahwa V.  tapetis strain IS8 mampu memberikan efek aderen yang  lebih  tinggi  dan  berbahaya  bagi hemosit kerang (Lane dan Birkbeck, 2000; Smits et al., 2020). Efek aderen yang sangat tinggi ini menunjukkan tingkat
patogenisitas bakteri yang sangat tinggi dan berbahaya bagi kerang batik (Paillard, 2004; Rodrigues et al., 2015a; Jati et al ., 2023). Efek  aderen  yang  disebabkan  oleh serangan  oleh  bakteri  akan  menyebabkan hemosit kerang yang juga berperan sebagai sel  darah  terganggu  fungsinya  (Lane  & Birkbeck,  1999).  Efek  aderen  yang ditemukan pada hemosit kerang batik akan
berpengaruh pada sistem pertahanan tubuh kerang  batik  (Lane  dan  Birkbeck,  2000). Bila  pertahanan  tubuh  kerang  batik  tidak berfungsi  dengan  baik,  hal  tersebut mengindikasikan  bahwa  strain  vibrio tersebut  mampu  menginduksi  penyakit cincin coklat pada cangkang kerang (Maes, 1992;  Smits et  al., 2020).  Untuk mengurangi risiko kematian, preventif yang bisa diberikan adalah dengan memeberikan immunostimulan  maupun  vaksin  (Jati, 2023; Noor et al., 2023) Berdasarakan hasil uji aderensi, dapat disimpulkan  bahwa V.  tapetis strain  IS8 mampu  memberikan  efek  aderen  pada hemosit. Kemampuan ini mengindikasikan strain  IS8  mampu  membuat  hemosit kehilangan  kemampuan  aderen  dengan melakukan destrukturisasi sitoskeleton dan menyebabkan sel berbentuk bulat (Paillard,
2004b; Rahmani et al. , 2019)

## Uji Fagositosis
Nilai dari uji fagositosis berupa nilai dari M3% Gated Mean yang mengekspresikan  tingkat  fagositosis  dari lateks beads hemosit kerang yang terinfeksi bakteri uji. Nilai kontrol normal menunjukkan  jumlah  lateks  beads  hemosit kerang  tanpa  bakteri  uji.  Nilai  yang  lebih tinggi dari kontrol normal mengindikasikan adanya  aktivitas  fagositosis  hemosit  oleh bakteri  uji.  Sementara,  nilai  M3%  Gated Mean yang lebih rendah dari kontrol normal mengindikasikan adanya kemampuan hemosit  untuk  bertahan  dari  aktivitas fagositosis oleh bakteri uji. Hasil rata-rata 3 ulangan  uji  fagositosis  yang  dilakukan disajikan pada Gambar 2:
Gambar 2 . Hasil Uji Fagositosis
Berdasarkan  nilai  yang  diperoleh, V. tapetis strain  CECT4600  menunjukkan aktivitas  fagositosis  yang  lebih  tinggi  dari kontrol  normal.  Hal  ini  menunjukkan aktivitas  infeksius  dari  strain  CECT4600 tinggi  terhadap  hemosit  kerang.  Tinkat lateks  beads  hemosit  yang  tinggi dibandingkan  dengan  kontrol  normal mengindikasikan aktivitas fagositosis yang tinggi  oleh  bakteri  strain  CECT4600 (Paillard,  2004b;  Rodrigus et  al., 2015b). Aktivitas  fagositosis  yang  tinggi  akhirnya akan  menyebabkan  hemosit  tidak  dapat bertahan  yang  menyebabkan  bakteri  akan memiliki  kemampuan  untuk  menginduksi penyakit cincin coklat pada kerang (Allam dan Paillard, 1998; Rodrigues et al., 2015a). Nilai uji fagositosis yang didapat dari kontrol negatif, V. splendidus menunjukkan hasil  yang  lebih  rendah  dibandingkan dengan kontrol normal. Nilai uji fagositosis yang  lebih  rendah  dari  kontrol  normal mengindikasikan proses pertahanan diri dan kemampuan  homeostasis  dari  hemosit kerang  yang  diinfeksi  oleh  bakteri  uji (Jensen  et  al.  2003).  Proses  homeostasis
hemosit menunjukkan kemampuan bertahan  hemosit  dari  infeksi  bakteri V. splendidus .  Kondisi  lingkungan  serta  pH sangat mempengaruhi kondisi ini
(Rahmani, et al., 2020) Pada bakteri uji V. tapetis strain IS8, didapatkan data rata-rata nilai M3% Gated Mean lebih tinggi dari kontrol normal dan kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa selain ditemukan aktivitas fagositosis yang tinggi,  bahkan  lebih  tinggi  dari  kontrol positif. Tingginya aktivitas fagositosis yang tinggi
mengindikasikan tingkat patogenisitas dari V. tapetis strain IS8 sangat tinggi. Semua aktivitas fagositosis menyebabkan perubahan tatanan dari actin sitoskleton  (May  dan  Machesky,  2001; Smits et al., 2020).
Aktivitas  fagositosis  yang  tinggi menyebabkan  hemosit  kerang  tidak  dapat melakukan homeostasis yang dapat berakhir pada  kematian  kerang.    Selain  dapat menyebabkan  penyakit  cincin  coklat, aktivitas  fagositosis  yang  dihasilkan  oleh strain  IS8  ini  menunjukkan  patogenisitas yang dapat menyebabkan kematian massal
76,33 76,92 74,83 77,13 72,00 73,00 74,00 75,00 76,00 77,00 78,00 Kontrol Normal Kontrol Positif Kontrol Negatif Vibrio IS8 M 3% GA TED M EA N STRAIN Hasil Uji Fagositosis
pada  budidaya  kerang  yang  dilakukan (Allam et al., 2000; Jati et al., 2023). Selain berfungsi  sebagai  pertahanan  tubuh, hemosit  pada  kerang  berperan  pada mekanisme  fisiologis  antara  lain  transport nutrient, perbaikan jaringan tubuh, pemurnian  diri  dari  polutan  biotik  dan abiotik (Donaghy et al., 2009; Huang et al., 2019).

## KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Bakteri V.  tapetis strain  IS8  yang diujikan  pada  penelitian  ini  menunjukkan tingkat  patogenisitas  yang  sangat  tinggi. Hasil  pengujian  aderensi  dan  fagositosis yang  dilakukan  menunjukkan  nilai  yang lebih tinggi dari kontrol positif. IS8 mampu memberikan  efek  aderen  pada  hemosit kerang yang akan mempengaruhi kemampuan pertahanan diri kerang. Selain itu, aktivitas fagositosis yang sangat tinggi didapat dari uji fagositosis yang dilakukan.
Aktivitas fagositosis sangat tinggi disebabkan oleh V. tapetis strain IS8 dapat menyebabkan  aktivitas  fisiologis  hemosit terganggu  bahkan  terhenti.  Berdasarkan
pengujian  yang  dilakukan  dapat  diambil kesimpulan  bahwa  bakteri V,  tapetis strain IS8  memiliki  kemampuan  menginduksi penyakit  cincin  coklat  di  kerang  batik  ( R. philippinarum )  serta  sangat  patogen terhadap kerang.

## Saran
Pemahaman yang lebih komprehensif perlu  dilakukan  mengingat  strain  dari V. tapetis yang  menyerang  kekerangan maupun  ikan  sangat  bangat.  Pengetahuan yang  mendalam  dan  luas  untuk  proses evaluasi dan mekanisme infeksius bakteri V. tapetis akan  berperan  besar  pada  proses budidaya kerang di masa depan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  secara  khusus  memberikan penghargaan  tertinggi  untuk  Christine PAILLARD (Laboratoire  des  Sciences  de l’Environnement
Marin (LEMAR),
Plouzané,  Prancis),  Alain  DUFOUR ( Laboratoire  de  Biotechnologie  et  Chimie Marines (LBCM),  Lorient,  Prancis),  dan Gaëlle  RICHARD  atas  dukungan  dan bimbingan di penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Allam B, Paillard C (1998) Defense factors in clam extrapallial fluids. Dis Aquat Org 33:123–128.
Allam  B,  Paillard  C,  Auffret  M  (2000) Alterations  in  hemolymph  and extrapallial  fluid  parameters  in  the Manila clam, Ruditapes philippinarum ,  challenged  with  the pathogen Vibrio  tapetis .  J  Invertebr Pathol 76:63–69.
Allam,  B.,  Espinosa,  E.  P.,  Tanguy,  A.,
Jeffroy, F., Le Bris, C., & Paillard, C. (2014).  Transcriptional  changes  in Manila clam ( Ruditapes philippinarum ) in response to Brown
Ring  Disease. Fish  &  shellfish immunology , 41 (1), 2-11.
Bald, J., and Borja, A. (2002). “Modelling the  management  of  clam  ( Ruditapes decussatus )  exploitation  in  the Plentzia  estuary  (Basque  Country, Northern  Spain),”  in  Proceedings  of the  20th  International.  Conference. System.  Dynamic.  Soc  (Northern Spain), 1–26.
Bald, J., Sinquin, A., Borja, A., Caill-Milly, N.,  Duclercq,  B.,  Dang,  C.,  et  al.
(2009). A system dynamics model for the management of the Manila clam, Ruditapes philippinarum (Adams and
Reeve, 1850) in the Bay of Arcachon (France). Ecol.  Modell .  220,  2828– 2837. Becker, P., Barringer. C. & Dan C. Marelli (2008) Thirty Years of Sea Ranching Manila Clams ( Venerupis philippinarum ): Successful  Techniques  and  Lessons Learned, Reviews in Fisheries Science, 16:1-3, 44-50. Bodoy, A.,  Maitre-Allain, T.,  and  Riva, A. (1981).  Croissance  comparée  de  la palourde européene ( Ruditapes decussatus )  et  de  la  palourde japonaise  ( Ruditapes  philippinarum )
dans un écosystème artificiel méditerranéen. Vie Mar . 2, 39–51.
Borrego  J.  J.,  Luque  A.,  Castro  D.,
Santamaría J. A., Martínez- Manzanares  E.  (1996). Virulence factors  of  Vibrio  P1,  the  causative agent  of  brown  ring  disease  in  the Manila clam, Ruditapes philippinarum . Aquat.
Living Resour . 9, 125–136. Caill-Milly,  N.,  de  Casamajor,  M.-N., Lissardy, M., Sanchez, F., Morandeau, G., (2003). Evaluation du stock  de  palourdes  du  bassin d'Arcachon  –  Campagne  2003. IFREMER, pp. 1–44.
Chen, L., Yu, F., Sun, S., Liu, X., Sun, Z.,
Cao,  W.,  ...  &  Xue,  C.  (2021).
Evaluation  indicators  of  Ruditapes philippinarum nutritional quality. Journal of Food Science and Technology , 58 , 2943-2951.
Chiesa, S., Lucentini, L., Freitas, R., Nonnis Marzano, F., Breda, S., Figueira, E., ...
&  Argesse,  E.  (2016).  Mapping  the
stranger:  genetic  diversity  of  Manila clam in European coastal lagoons. Bulletin  of  Japan  Fisheries Research  and  Education  Agency , 42 , 55-65.
Chiesa,  S.,  Lucentini,  L.,  Freitas,  R., Marzano,  F.  N.,  Breda,  S.,  Figueira, E., ... & Argese, E. (2017). A history of invasion: COI phylogeny of Manila clam  Ruditapes  philippinarum  in Europe. Fisheries  Research , 186 ,  25-
35.
Choquet  G.,  Soudant  P.,  Lambert  C., Nicolas  J.L.,  and  Paillard  C.  (2003) Reduction  of  adhesion  properties  of Ruditapes  philippinarum hemocytes exposed to Vibrio tapetis. Dis. Aquat. Org. , 57, 109–116.
Choquet  G.  (2004)  Pathogénie  de  Vibrio tapetis,  bactérie  responsable  de  la maladie  de  l’anneau  brun  chez  la palourde  :  Approche  cellulaire  et moléculaire.  Thèse  de  doctorat. Université de Brest.
Cordero, D., Delgado, M., Liu, B., Ruesink, J., & Saavedra, C. (2017). Population genetics  of  the  Manila  clam (Ruditapes philippinarum) introduced in North America and Europe. Scientific Reports , 7 (1), 39745.
Delaporte M., Soudant P., Moal J., Lambert C., Quere C., Miner P., and Samain J. (2003) Effect of a mono-specific algal diet  on  immune  functions  in  two bivalve  species-- Crassostrea  gigas and Ruditapes philippinarum . Journal Of Experimental Biology, 17, 3053.
Dias,  G.  M.,  Bidault, A.,  Le  Chevalier,  P., Choquet,  G.,  Der  Sarkissian,  C.,
Orlando, L., ... & Paillard, C. (2018). Vibrio  tapetis  displays  an  original type  IV  secretion  system  in  strains pathogenic for Bivalve molluscs. Frontiers in microbiology , 9 , 227.
Donaghy  L.,  Lambert  C.,  Choi  K.S.,  and Soudant  P.  (2009)  Hemocytes  of  the carpet shell clam (Ruditapes decussatus)  and  the  Manila  clam (Ruditapes  philippinarum):  current knowledge  and  future  prospects. Aquaculture, 297, 10-24.
Flassch,  J.  &  Leborgne,  Y.  (1992) Introduction in Europe, from 1972 to 1980,  of  the  Japanese  Manila  clam .
ICES mar. Sci. Symp 194, 92–96.
Huang,  J.,  Xie,  L.,  &  Zhang,  R.  (2019). Shell  repair  and  the  potential microbial causal in a shell disease of the pearl oyster Pinctada fucata. Fish &  Shellfish  Immunology , 86 ,  934- 941.
Humphreys, J., Harris, M. R., Herbert, R. J., Farrell, P., Jensen, A., & Cragg, S. M. (2015).  Introduction,  dispersal  and naturalization  of  the  Manila  clam Ruditapes  philippinarum in  British estuaries,  1980–2010. Journal  of  the marine  biological  Association  of  the United Kingdom , 95 (6), 1163-1172.
Jati, C. W. (2023). EFEKTIVITAS VAKSIN
INAKTIF  Aeromonas  salmonicida Terhadap Total Leukosit dan Aktifitas Fagositosis  PADA  IKAN  KOI (Cyprinus carpio). Jurnal Lemuru , 5 (2), 313-319.
Jati,  C. W.,  Noor,  H.  F.,  &  Putriani,  R.  B.
(2023). Karakterisasi Tingkat Virulensi  Bakteri Vibrio  Splendidus
pada  Kerang  Manila  ( Ruditapes
philippinarum )  Menggunakan  Tes In Vitro . Jurnal  Bahari  Papadak , 4 (1), 298-303.
Jensen  S.,  Samuelsen  O.,  Andersen  K.,
Torkildsen  L.,  Lambert  C.,  Choquet G. (2003). Characterization of strains of Vibrio splendidus and V. tapetis isolated from corkwing wrasse Symphodus  melops suffering vibriosis. Dis. Aquat.  Organ . 53,  25– 31.
Jensen,  A.C.,  Humphreys,  J.,  Caldow, R.W.G., Grisley, C., Dyrynda, P.E.J., (2004).  Naturalization  of  the  Manila clam  (Ruditapes  philippinarum),  an allien species, and establishment of a clam  fishery  within  Poole  Harbour, Dorset. J. Mar. Biol. Assoc. U. K. 84, 1069–1073.
Kitada, S., Fujikake, C., Asakura, Y., Yuki,
H., Nakajima, K., Vargas, K. M., ... & Kishino,  H.  (2013).  Molecular  and morphological evidence of hybridization between native Ruditapes  philippinarum  and  the introduced Ruditapes form in Japan. Conservation Genetics , 14 , 717-733.
Lane  E,  Birkbeck  HT  (1999)  Toxicity  of bacteria  towards  haemocytes  of Mytilus  edulis. Aquat  Living  Resour 12: 343–350. Lane  E,  Birkbeck  HT  (2000)  Species specificity of some bacterial pathogens  of  bivalve  molluscs  is correlated  with  their  interaction  with bivalve  haemocytes.  J  Fish  Dis 23:275–279.
May RC, Machesky LM (2001) Phagocytosis and the actin
cytoskeleton.  J  Cell  Sci  114:1061– 1077.
Noor,  H.  F.,  &  Jati,  C.  W.  (2023). EFEKTIFITAS  VAKSIN  INAKTIF Aeromonas salmonicida TERHADAP IKAN  MAS  Cyprinus  carpio. Jurnal Bahari Papadak , 4 (1), 32-37.
Paillard C., Maes P. (1990). Etiologie de la maladie  l'anneau  brun  chez Tapes philippinarum :  pathogenicite  d'un Vibrio sp. Comptes rendus l'Académie des Sci . 310, 15–20. Paillard  C.,  Maes  P.  (1994). Brown  ring disease in the Manila clam Ruditapes philippinarum :  establishment  of  a classification  svstem. Dis.  Aquat. Organ . 19, 137–146.
Paillard C. (2004) A short-review of Brown Ring  Disease,  a  vibriosis  affecting clams, Ruditapes  philippinarum and Ruditapes decussatus. Aquatic Living Resources, 17, 467-475. Paillard C. (2004b). Rôle de l’environnement dans les interactions hôtes-pathogènes; développement d’un  modèle  de  vibriose  chez  les bivalves. Habilit.  À  Dir.  Rech.  HDR Univ.  Bretagne  Occident.  Brest 180, 1–180.
Paillard  C.,  Allam  B.,  Oubella  R..  (2004) Effect  of  temperature  on  defense parameters in Manila clam Ruditapes philippinarum challenged with Vibrio tapetis . Disease of Aquatic Organisms , 59, 249–262.
Paillard, C., Jean, F., Ford, S. E., Powell, E. N., Klinck, J. M., Hofmann, E. E., & Flye-Sainte-Marie,  J.  (2014).  A theoretical individual-based model of
Brown Ring Disease in Manila clams, Venerupis  philippinarum. Journal  of
Sea Research , 91 , 15-34.
Paillard  C.  Maes  P,  Oubella  R.,  (1994) Brown  ring  disease  in  clams .  Annu Rev Fish Dis , 4, 219–240.
Ponurovsky, S. K. & Yakovlev, Y. M. (1992) The  reproductive  biology  of  the Japanese littleneck, Tapes philippinarum.  J.  Shellfish  Res.  11, 265–277.
Rahmani A., Corre E., Richard G., Bidault A.,  Lambert  C.,  Oliveira  L.,  et  al. (2019).  Transcriptomic  analysis  of clam  extrapallial  fluids  reveals immunity and cytoskeleton alterations in  the  first  week  of  Brown  Ring Disease  development. Fish  Shellfish Immunol. 93, 940–948.
Rahmani, A.,  Mathien,  C.,  Bidault, A.,  Le Goïc, N., Paillard, C., & Pichereau, V. (2020).  External  pH  modulation during  the  growth  of  Vibrio  tapetis, the  aetiological  agent  of  brown  ring disease. Journal of Applied
Microbiology , 129 (1), 3-16.
Rodrigues,  S.,  Paillard,  C.,  Dufour, A.,  & Bazire,  A.  (2015a).  Antibiofilm activity  of  the  marine  bacterium Pseudoalteromonas  sp.  3J6  against Vibrio tapetis, the causative agent of brown  ring  disease. Probiotics  and antimicrobial proteins , 7 , 45-51.
Rodrigues, S., Paillard, C., Le  Pennec, G., Dufour,  A.,  &  Bazire,  A.  (2015b). Vibrio tapetis , the causative agent of Brown Ring Disease, forms biofilms with spherical components. Frontiers in Microbiology , 6 , 1384.
Reid  H.  I.,  Duncan  H.  L.,  Laidler  L.  A., Hunter D., Birkbeck T. H. (2003). Isolation of Vibrio tapetis from cultivated Atlantic halibut ( Hippoglossus hippoglossus L.). Aquaculture 221,
65–74.
Smits,  M.,  Artigaud,  S.,  Bernay,  B., Pichereau,  V.,  Bargelloni,  L.,  &
Paillard, C. (2020). A proteomic study of resistance to Brown Ring disease in the Manila clam, Ruditapes philippinarum . Fish & shellfish immunology , 99 , 641-653.
Trinkler  N.,  Bardeau  J.-F.,  Marin  F., Labonne  M.,  Jolivet A.,  Crassous  P., Paillard  C.,  (2011)  Mineral  phase  in shell repair of Manila clam Ruditapes philippinarum affected  by  Brown Ring  Disease. Disease  of  Aquatic
Organisms , 93, 149–162.
Utting,  S.  D.  &  Spencer,  B.  E.  (1992) Introductions  of  marine  bivalve molluscs into the United Kingdom for commercial  culture-  case  histories. ICES Mar. Sci. Symp . 194, 84–91.
Quayle,  D.  B.  (1964)  Distribution  of introduced marine mollusca in British Columbia waters . J. Fish. Res. Board Canada 21, 1155–1181.
Xing,  K.,  Gao,  M.  L.,  &  Li,  H.  J.  (2014).
Genetic differentiation between natural  and  hatchery  populations  of Manila clam ( Ruditapes philippinarum ) based on
microsatellite  markers. Genet.  Mol. Res , 13 (1), 237-245.
Zobell  C.  (1941).  Studies  on  marine bacteria. I. The cultural requirements of  heterotrophic  aerobes. J.  Mar. Res. 4, 41–75.