## KELAS DAN POPULASI BAKTERI ICE NUCLEATION ACTIVE PENYEBAB LUKA BEKU PADA DAUN JERUK KEPROK SOE DI DATARAN TINGGI MUTIS
Hildegardis Missa 1  , Anselmus Boy Baunsele 2
1 Program Studi Pendidikan Biologi, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Katolik Widya Mandira, Jl. Jend Achmad Yani 50-52 Kupang 85225 , Nusa Tenggara Timur, Indonesia;
2 Program Studi Pendidikan Kimia, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Katolik Widya Mandira, Jl. Jend Achmad Yani 50-52 Kupang 85225 , Nusa Tenggara Timur, Indonesia.
 Email korespondens: hildegardismissa17@gmail.com
Abstract. Research on ice nucleation-active bacteria the causal agent of  frost injury from tropical  areas has not been  widely  published.  The  purpose  of  this  study  was  to  determine  the  population  of  Ice  Nucleation-Active Bacteria  on  Soe  tangerines  leaves  and  the  class  of  Ice  Nucleation-Active  bacteria  based  on  Ice  formation temperatures.  The  collecting  of    Soe  tangerine  leaves  used  the  purpose  sampling  method.  Leaves  with  frost blotches were collected from three stages at altitudes of 1500, 1800, and 2000 meters above sea level (m  asl). Bacterial isolation was carried out by the spread plate method on Nutrien Agar 2,5 % glycerol (NAG)  media. Ice  Nucleation  activity  of  the  bacteria  was  determined  by  the  tube  nucleation  test  method.  Estimation  of  INA bacterial  population  was  conducted  by  the  multiple-tube  nucleation  test  with  Thomas  series  .3.3.3.  The  result showed that the highest INA bacterial population was 6.9x10 4 which was found in leaves samples collected from stations 2000 m asl, and the lowest population i.e. 5,4x10 3 on leaf samples from station 1500 m asl. Based on the temperature of ice formation, it was known that INA bacteria that attack the Soe tangerines leaves Mutis plateau are the INA bacteria class B and C.
Keywords :  Ice  Nucleation-Active  bacteria,  Frost  Injury,  Ice  Nucleation-Active  protein  class,  Soe  Tangerine, Mutis plateau.
Abstrak. Penelitian  tentang  bakteri  luka  beku  dari  daerah  tropis  belum  banyak  dipublikasikan.  Tujuan  dari penelitian ini adalah untuk mengetahui populasi bakteri ice nucleation active (INA) pada daun jeruk keprok soe, dan  mengetahui  kelas  bakteri  INA  berdasarkan  suhu  pembentukan  es.  Pengambilan  sampel  daun  jeruk  keprok soe  menggunakan  metode  purposive  sampling.  Daun  yang  menunjukkan  bercak  luka  beku  diambil  dari  tiga stasiun pada ketinggian 1.500 mdpl, 1.800 mdpl dan 2.000 mdpl. Isolasi bakteri dilakukan dengan metode spread plate pada media NA 2,5% gliserol (NAG). Aktivitas nukleasi es ditentukan dengan metode tube nucleation test. Estimasi  populasi  bakteri  INA  dilakukan  dengan  metode  multiple-tube  nucleation  test  formula  Thomas  seri 3.3.3.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  populasi  bakteri  INA  tertinggi  adalah  sebesar  6,9  x  10 4 yang ditemukan pada sampel daun jeruk yang dikumpulkan dari stasiun 2.000 m dpl, dan populasi terendah 5,4 x 10 3 pada  sampel  daun  dari  stasiun  1.500  m  dpl.  Berdasarkan  suhu  pembentukan  es,  diketahui  bahwa  bakteri  INA yang menyerang daun Jeruk keprok soe yang tumbuh di Dataran Tinggi Mutis adalah bakteri INA kelas protein B dan C.
Kata kunci: Bakteri Ice Nucleation, Luka beku, Kelas Protein Ice Nucleation, Jeruk keprok soe, Dataran Tinggi

## PENDAHULUAN
Di  Pulau  Timor  (Indonesia),  jeruk keprok  (Citrus  reticulata  Blanco)  dikenal dengan  nama  jeruk  keprok  soe.  Jenis  jeruk ini  banyak  tumbuh  di  Dataran  Tinggi  Mutis yang  merupakan  daerah  terbasah  dan terdingin  di  Pulau  Timor.  Temperatur  di Dataran Tinggi  Mutis  berkisar  antara  14 o C– 29 o C,  dan  pada  kondisi  ekstrim  dapat  turun hingga 9 o C (Adar et al., 2013). Jeruk keprok soe  hanya  bisa  bertahan  hidup  dan  berbuah selama  kemarau  panjang  dengan  suhu  14- 29 o C.  Namun,  sejak  tahun  2010  terjadi perubahan  iklim  yang  cukup  signifikan  di
daerah  ini.  Hujan  turun  hampir  setiap  bulan sepanjang  tahun,  menyebabkan  banyak tanaman jeruk keprok soe di Dataran Tinggi Mutis mengalami kerusakan pada kulit, daun dan batang, sehingga menyebabkan sebagian besar tanaman ini mati. Salah satu penyebab kerusakan  tersebut adalah  luka  beku ( frost injury )  yang  ditandai  dengan  gejala bercak,  dapat  berwarna  coklat,  kuning, hitam,  daun  dengan  cincin  klorosis  yang mengelilinginya  (Hardiyanto et  al., 2017). Luka  beku  umumnya  teramati  muncul  di Dataran  Tinggi  Mutis  pada  bulan  Juli  atau Agustus. Pada saat itu, temperatur di tempat ini  dapat  mencapai  nol  derajat  Celsius  dan
bahkan  bisa  mencapai  -8 o C  mengakibatkan Jeruk  keprok  soe  sering  mengalami  luka beku  dan  pada  akhirnya  menyebabkan kematian tanaman.
Luka  beku  disebabkan  oleh  spesies bakteri ice  nucleation  active (INA)  yang hidup di permukaan daun tanaman di dataran tinggi dengan suhu  yang rendah  (Rostami et al . 2018). Bakteri INA yang telah ditemukan antara lain Pseudomonas syringae, Pseudomonas viridiflava, Pseudomonas Fluorescens, Erwinia hericola, dan Xantomonas campestris (Atlas n.d.). Bakteri-bakteri  ini  mampu  mengkatalis pembekuan  es  pada  suhu  -1,5 o C  sampai  - 10 o C,  bahkan  pada  suhu  di  atas  5 o C,  yang dapat  menyebabkan  terjadinya  luka  beku  di permukaan  daun  (Minsavage  and  Stall 2017).
Keberadaan bakteri INA pada permukaan  daun  mampu  meningkatkan kemungkinan  terbentuknya  luka  beku  pada suhu  di  atas  5ºC.  (Failor et  al .  2017) menyatakan  bahwa  sebagian  dari  bakteri INA  secara  potensial  memainkan  peranan dalam  pembentukan  salju,  perubahan  cuaca, dan  pembentukan  inti  es  di  awan  serta menstimulasi  terjadinya  hujan.  Bakteri  INA berpartisipasi  dalam  siklus  biopresipitasi yaitu  membantu  pembentukan  awan  dan hujan  (Morris et  al., 2004).    Berdasarkan
uraian  di  atas,  perlu  dilakukan  penelitian keragaman bakteri  INA  penyebab luka beku pada  tanaman  jeruk  keprok  soe  di  Dataran Tinggi Mutis.

## METODE Pengambilan Sampel
Sampel  daun  jeruk  diambil  dari Dataran  Tinggi  Mutis  pada  tiga  titik ketinggian berbeda yaitu: 1.500 m dpl, 1.800 m  dpl  dan  2.000  m  dpl,  peta  pengambilan sampel  tersaji  pada  gambar  1.  Pengambilan sampel  dalam  penelitian  ini  menggunakan metode purposive sampling yaitu pengambilan  sampel  dengan  pertimbangan seperti penentuan  skala  atau scoring keparahan penyakit daun jeruk keprok soe.
Dalam  penelitian  ini  pengambilan sampel  tidak  menggunakan  plot  ( plotless ) artinya  sampel  diambil  berdasarkan  tingkat keparahan  luka  pada  daun  jeruk  keprok  soe pada titik ketinggian yang sudah ditentukan.
Bahan  tanaman  yang  diambil  yaitu berupa  daun  sebanyak  5-10  gr,  dimasukkan di  dalam  kantong  kertas  yang  diberi  label berisi  informasi  ketinggian  dan    sampel tersebut  dibawa  ke  laboratorium  dan disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5°C.
Gambar 1. Peta Wilayah Dataran Tinggi Mutis
Estimasi dan Populasi Bakteri INA Perhitungan populasi bakteri dilakukan dengan  metode multiple  tube  nucleation yaitu  suatu  metode  untuk  mengestimasi
jumlah  inti  es  dari  suspensi  bakteri  maupun populasi  bakteri  INA  pada  bagian  tanaman (Murie et  al., 2013).  Estimasi  populasi bakteri INA dilakukan dengan menggunakan
uji tabung untuk menentukan jumlah bakteri pembentuk  inti  es  yang  didasarkan  pada jumlah  tabung  yang  membeku  pada  setiap seri  pengenceran  (Minsavage  and  Stall 2017). Suhu optimum yang digunakan untuk uji estimasi populasi bakteri INA adalah 5 o C hal  ini  didukung  oleh  penelitian  yang dilakukan oleh (Susilowati, 2018) yaitu pada suhu  5 o C  sudah cukup  peka  untuk mendeteksi aktivitas pembekuan inti es oleh bakteri INA.
Estimasi  populasi  dilakukan  dengan menggunakan tabung tes berdiameter 18 mm yang  berisi  9  mL  bufer  fosfat  steril didinginkan  pada  suhu  -10°C  selama  30 menit,  tabung  tersebut  dikocok  dan  semua tabung yang mengalami pembekuan dipisahkan.  Tabung  yang  tidak  membeku dihangatkan  pada  suhu  5°C.  Sampel  daun sebanyak  2  g  dihomogenkan  dalam  20  mL bufer fosfat  pH 7.0  dan 0,1% peptone meat , kemudian  diambil  sebanyak  1  mL  dan dimasukkan dalam tabung reaksi berisi 9 mL bufer  fosfat  steril.  Selanjutnya  dilakukan  3 seri  pengenceran  yaitu  10 -1 ,  10 -2 ,  10 -3 menggunakan  tabung  berisi  bufer  fosfat yang tidak membeku. Setiap seri pengenceran dilakukan sebanyak tiga ulangan  sehingga  didapatkan  pengenceran seri  3  tabung.  Setiap  tabung  berisi  bufer fosfat  yang  tidak  membeku  dan  sampel tumbuhan yang telah dihomogenkan dimasukkan  ke  dalam circulating  alcohol bath selama  10  menit  sehingga  suhunya mencapai  -3°C  sampai  -9°C.  Jumlah  tabung reaksi  yang  membeku  dihitung  untuk  setiap pengenceran. Bakteri INA yang ada dipermukaan  daun  diestimasi  dengan  cara menghitung  jumlah  tabung  yang  membeku pada tiap pengenceran kemudian dicocokkan pada  tabel  MPN  menggunakan  formula Thomas seri 3.3.3.

## Isolasi Bakteri INA
Sampel  tumbuhan  sebanyak  5  g dipotong  dengan  ukuran  5  cm  dan dimasukkan dalam tabung  erlenmeyer berisi 200  mL  0,1  M  buffer  fosfat  pH  7,0  dengan
0,1%  pepton  (Difco)  (Susilowati, et  al ., 2018).  Tabung  erlenmeyer  yang  berisi larutan  buffer  fosfat  dan  sampel  daun digoyang  pada  rotary shaker  dengan kecepatan 150 rpm selama 2 jam, kemudian Sampel  diambil  sebanyak  1  mL  dan dimasukkan dalam tabung reaksi berisi 9 mL akuades  steril  dan  dilakukan  3  seri pengenceran,  yaitu  10 -1 ,  10 -2 ,  dan  10 -3 .  Dari tiap  pengenceran  diambil  sebanyak  0,1  mL kemudian  disebar  pada  media  NA  yang mengandung  2,5%  gliserol  (NAG)  dengan teknik  cawan  sebar.  Masing-masing  seri pengenceran  disebar  pada  dua  cawan  petri, selanjutnya  dibungkus  dengan  kertas  dan diinkubasi  pada  suhu  37°C  selama  4  x  24 jam dengan posisi terbalik (Missa, 2016).
Koleksi  kultur  murni  diperoleh  dari bakteri  berbeda  yang  tumbuh  pada  media NAG,  dipindahkan  dengan  menggunakan jarum  ose  dan  digoreskan  kembali  pada media  NAG  miring  yang  sudah  diberi  label yang  menunjukan  tempat  pengambilan sampel, stasiun penelitian, nama peneliti dan nomor  isolat.  Dalam  hal  ini  simbol  huruf A menunjukan  tempat  penggambilan  sampel dengan titik ketinggian 1.500 m dpl, huruf B untuk titik ketinggian 1.800 m dpl, dan huruf C  untuk  titik  ketinggian  2.000  m  dpl. selanjutnya  Huruf  H  merupakan  huruf pertama  nama  peneliti,  dan  No  1  sampai  20 untuk nomor isolat.

## Uji Aktivitas Pembentukan Inti Es
Aktivitas pembentukan inti es dilakukan  dengan  metode multiple  tube nucleation  test dengan  cara  koloni  bakteri berumur  4-6  hari  pada  media  agar  miring dipindahkan dengan jarum ose dan disuspensikan  dalam  400  l  bufer  phospat steril  dan  diuji  aktivitas  nukleasi  es  pada suhu  -5 o C,  -7 o C  dan  -10 o C  menggunakan circulating  alcohol  bath selama  10  menit. Pengujian dilakukan pada suhu yang berbeda karena  berdasarkan  aktivitasnya,  protein INA terbagi atas tiga kelas utama yaitu kelas A,  aktif  membentuk  inti  es  pada  suhu  -2 o C hingga -5 o C, Kelas B, aktif pada suhu ≥ -5 o C
hingga –7 o C dan Kelas C aktif pada suhu ≥ - 7 o C  hingga  -10 o C  (Rostami et  al.,  2018) (Minsavage and Stall 2017). Hasil uji positif ditandai  jika  bufer  fosfat    yang  ditetesi suspensi  bakteri  membeku  dalam  waktu  30 detik  pada  suhu  -5 o C,  -7 o C  dan  -10 o C  dan dapat  dianggap  bahwa  koloni  mengandung inti es aktif atau terdapat bakteri INA (Murie et al., 2013).

## Karakterisasi Isolat Bakteri INA
Karakterisasi  isolat  bakteri  dilakukan dengan  pengamatan  morfologi  sel  yaitu bentuk dan jenis gram yang dapat dilihat dari hasil  pewarnaan  gram.  Pewarnaan  gram  ini dilakukan  dengan  fiksasi  yaitu  meletakan massa  bakteri  ke  gelas  objek,  kemudian diteteskan  pewarna  kristas  violet,  lugol, alcohol 96% pada massa bakteri. Selanjutnya  massa  bakteri  dibilas  dengan menggunakan  safranin,  dan  diamati  bentuk dan  jenis  gram  menggunakan  mikroskop (Missa et al ., 2020).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Estimasi Populasi Bakteri INA Penyebab Luka Beku ( Frost  Injury ) Pada Daun

## Jeruk keprok soe di Dataran Tinggi Mutis
Pada  penelitian  yang  dilakukan  di masing-masing  stasiun  pengambilan  sampel ditemukan  adanya  tabung  yang  menunjukan positif  beku,  hal  ini  menunjukan  bahwa tabung  yang  beku  mengandung  paling sedikit  satu  inti  es.  Berdasarkan  uji  yang dilakukan, pada stasiun pengambilan 1 yaitu 1.500  m  dpl,  didapat  jumlah  tabung  positif dengan  kombinasi  3-2-2  kemudian  dikocok dengan MPN menggunakan formula Thomas seri  3.3.3  dan  dilakukan  perhitungan menunjukan  hasil  5,4  x  10 3 MPN/gram. Pada  stasiun  pengambilan  2  yaitu  1.800  m dpl,  didapat  jumlah  tabung  positif  beku dengan  kombinasi  3-3-3  kemudian  dikocok pada  tabel  MPN  menggunakan  formula Thomas  seri  3.3.3  menunjukan  hasil  6,3  x 10 4 MPN/gram. Pada stasiun pengambilan 3 yaitu  2000  m  dpl,  didapat  jumlah  tabung positif  beku  dengan  kombinasi  3-3-3 kemudian  dicocokan  dengan  tabel  MPN menggunakan  formula  Thomas  seri  3.3.3 menunjukan  hasil  6,9  x  10 4 MPN/gram. (tabel 1). (Susilowati et al., 2018) menyatakan  bahwa  populasi  bakteri  INA dapat mencapai 10 2 -10 7 sel/g jaringan tanaman. Tabel 1. Estimasi populasi bakteri berdasarkan tabel MPN Stasiun Pengambilan Sampel ketinggian Skala Bercak Populasi bakteri/g sampel daun 1.500 m dpl 1 5,4 x 10 3 1.800 m dpl 2 6,3 x 10 4 2000 m dpl 3 6,9 x 10 4
Keterangan : Skala bercak 1=  luka beku pada permukaan daun 10% Skala bercak 2 = luka beku pada permukaan daun 11-30% Skala bercak 3= luka beku pada permukaan daun  31-50%
Rata-rata  populasi  bakteri  INA  pergram sampel  daun  jeruk  keprok  soe  di  Dataran Tinggi Mutis dikatakan tinggi, jika dibandingkan  dengan  populasi  bakteri  INA pergram  sampel  daun  kentang  di  kecamatan Batur, dataran tinggi Dieng, dengan
ketinggian 1800 m dpl total populasi bakteri INA  yang  ditemukan  adalah  1,44  x  10 -2 , pada  ketinggian  2000  m  dpl,    total  populasi bakteri  INA  yang  ditemukan  adalah  3,00  x 10 -3 (Rajasa  2015).  Perbedaan  jumlah populasi  bakteri  INA  tergantung  pada
perbedaan ketinggian tempat, waktu pengambilan  sampel,  ketersediaan  air  hujan dan  udara.  Keberadaan  bakteri  INA  dalam air  hujan  dan  udarah  memainkan  peran penting dalam proses nukleasi yang diperlukan untuk induksi hujan (STEPHANIE and WATURANGI 2012).

## Luka Beku Pada Tanaman Jeruk Keprok Soe Di Dataran Tinggi Mutis
Analisis  luka  beku  pada  daun  jeruk keprok  soe  dilakukan  dengan  menghitung korelasi  antara  besarnya  bercak  luka  beku daun  yang  bervariasi  pada  tiga  stasiun pengambilan  sampel  dengan  menggunakan metode  skala  atau scoring keparahan penyakit  (Manandhar et  al .  2008).  Dari perhitungan  korelasi  antar  besarnya  bercak luka  beku  pada  daun  diperoleh  skala  bercak tertinggi  yakni  skala  3  dengan  luas  bercak berkisar  31-50%  sedangkan  skala  terendah yakni  skala  1  dengan  luas  bercak  sekitar 10%.  Hasil  korelasi  antara  populasi  bakteri
INA dengan skala bercak pada daun tanaman Jeruk  keprok  soe  berdasarkan  data  pada tabel  1  dianalisis  menggunakan  SPSS dengan  uji Correlation  Bevariate disajikan pada tabel 2 .
Uji pearson  cotrelation  bivariate mengasumsikan  bahwa  jika  nilai  r  yaitu korelasi > 0,05 maka terdapat korelasi antara kedua variabel, dan jika nilai sig (1-tailed) < 0,05  maka  kedua  variabel  tersebut  memiliki korelasi  yang  signifikan  (Hirano et  al ., 2008). Hasil uji dari penelitian ini menunjukkan  nilai  r  0,866  artinya  0,866  > 0,05,  maka  terdapat  korelasi  antara  kedua variabel,  dan  nilai  signifikan  0,033  <  0,05 artinya  korelasi  antara  populasi  bakteri  dan skala bercak tersebut signifikan.
(Govindarajan and Lindow 2006) Menyatakan  bahwa  jika  nilai  korelasi berkisar    0,80  sampai  1,000  maka  terdapat hubungan  yang  kuat  antara  kedua  variabel tersebut.

## Tabel 2. Analisis Korelasi Estimasi bakteri dengan Skala bercak menggunakan
Uji Corelation bivariate Populasi Bakteri/daun jeruk keprok soe yang terinfeksi luka beku Skala Bercak/daun jeruk keprok soe yang terinfeksi luka beku Populasi Bakteri Pearson Correlation 1 .866 Sig. (2- tailed) .033 N 3 3 Skala Bercak Pearson Correlation .866 1 Sig. (2- tailed) .033 N 3 3
Isolasi Bakteri Ice Nuclation Active (INA) Daun Jeruk keprok soe  Dataran Tinggi Mutis
Sampel daun jeruk keprok soe diambil pada  3  stasiun  yang  berbeda  berdasarkan ketinggian  tempat  dengan  pengulangan  2
kali,  dan  setiap  pengulangan  dilakukan  3 kali  pengenceran  sehingga  didapatkan  18 biakan  pada  media  NAG  di  dalam  cawan petri.  Dari  18  biakan  pada  cawan  petri, diperoleh 64 isolat disajikan pada tabel 3.
Pengujian aktivitas nukleasi es
dilakukan  pada  64  isolat  yang  didapat,  dan hasil  pengujian    aktivitas  nukleasi  es terhadap seluruh isolat, didapat 8 isolat yang
mengalami  pembekuan.  Hasil  pengujian tersaji pada gambar 2.
Tabel 3. Isolat bakteri yang didapat dari setiap desa Stasiun Pengambilan Sampel Jumlah isolat yang didapat Jumlah Isolat yang membeku Kode Isolat 1.500 m dpl 21 2 AH1 AH6 1.800 m dpl 23 2 BH3 BH5 2.000 m dpl 20 4 CH2 CH3 CH5 CH7
Gambar  2.  Es  yang  terbentuk  dari  aktivitas  bakteri  INA  pada  daun  Jeruk  keprok  soe  dalam microtube. Keterangan:  Kode  Isolat (a) dan (e)  Kontrol,  (b) AH1, (c) AH6, (d) BH3, (f) BH5, (g) CH2, dan (h) CH3 Sampel  yang  mengalami  pembekuan diduga  akibat  dari  aktivitas  bakteri  INA, hasil  ini  menunjukan  bahwa  Koloni  yang dapat  dikategorikan  sebagai  positif  bakteri INA  adalah  koloni  yang  memiliki  aktivitas nukleasi  es.  Aktivitas  nukleasi  es  dapat terlihat  ketika  suspensi  bakteri  yang  berada di  dalam microtube membeku  setelah  diuji pada  suhu  -5 o C  selama  3  menit.  Hal  ini menunjukan microtube yang  berisi  suspensi tersebut terdapat bakteri INA  yang memiliki protein tunggal sebagai penginisiasi pembentukan  inti  es  (Hill et  al .  2014). Sebaliknya,  jika  suspensi  bakteri  tersebut tidak  membeku,  maka  suspensi  tersebut dikategorikan  sebagai  negatif  bakteri  INA.
Berdasarkan  hasil  diatas  maka  dapat  dilihat bahwa isolat yang positif bakteri INA paling banyak  dari  stasiun  3  dengan  ketinggian 2000 m dpl.
Aktivitas  nukleasi  dapat  diketahui ketika suspensi bakteri diuji pada suhu yang berbeda  yaitu  -5 o C,  -7 o C  dan  -10 o C. pengujian  pada  suhu  berbeda  dilakukan karena  tidak  semua  sampel  pada  masing- masing stasiun mengalami aktivitas pembekuan pada suhu yang sama (Susilowati et  al., 2018).  Perbedaan  suhu tersebut disebabkan karena adanya perbedaan  aktivitas  pada  masing-masing suspensi  bakteri  yang  dilakukan  pengujian. Hal  tersebut  tergantung  pada  aktivitas
protein  dari  bakteri  INA  yang  hidup  pada daun. Hal tersebut menunjukan bahwa dalam setiap  stasiun  pengambilan  sampel  terdapat beberapa  bakteri  yang  memiliki  aktivitas yang berbeda-beda, bahkan dalam 1 stasiun.
Pada uji aktivitas nukleasi es yang dilakukan didapatkan  hasil  yaitu  2  sampel  mengalami pembekuan  pada  suhu  -7 o C,  sedangkan  6 sampel membeku pada suhu -10 o C (Tabel 4).
Tabel 4. Klasifikasi bakteri INA berdasarkan perbedaan suhu aktivitas nukleasi es
Kode Isolat Suhu Pembekuan Kelas Protein INA BH5 -7 o C B CH3 -7 o C B AH1 -10 o C C AH6 -10 o C C BH3 -10 o C C CH2 -10 o C C CH5 -10 o C C CH7 -10 o C
C
Keterangan: Kelas Protein INA B: Bakteri aktif pada suhu ≥ -5 o C hingga -7 o C Kelas Protein INA C: Bakteri aktif pada suhu ≥-7 o C hingga -10 o C Berdasarkan  uji  yang  dilakukan terdapat  aktivitas  nukleasi  es  dari  isolat bakteri,  ditemukan  bahwa  dua  isolat  bakteri tergolong  dalam  kelas  B  kedua  isolat  ini terdapat  pada  stasiun  pengambilan  sampel dengan  ketinggian  1800.  m  dpl  dan  2000  m dpl,  sedangkan  enam  isolat  bakteri  lainya merupakan  kelas  C  dengan  ketinggian stasiun  pengambilan  sampel  1500  m  dpl, 1800  m  dpl  dan  2000  m  dpl.  Jika dibandingkan  dengan  penelitian  (Rajasa, 2015)  yang  memperoleh  6  Isolat  bakteri positif  bakteri  INA  dengan  kelas  Protein INA  1  isolat  bakteri  kelas  B  terdapat  pada stasiun pengambilan sampel dengan ketinggian  1800  m  dpl  dan  5  Isolat  bakteri kelas C dengan ketinggian stasiun pengambilan sampel 1800 m dpl sebanyak 2 isolat,  2000  m  dpl  sebanyak  2  isolat  dan 2500  m  dpl  sebanyak  2  isolat.  Hal  ini menunjukan bahwa penelitian yang dilakukan di Dataran Tinggi Mutis menunjukan  aktivitas  bakteri  INA  yang tinggi.

## Karakter isolat yang Diperoleh
Pengamatan mikroskopik isolat
bakteri  berupa  pengamatan  morfologi  sel dan  jenis  gram  yang  dapat  dilihat  dari  hasil pewarnaan  gram  dari  8  isolat  bakteri  yang dilakukan menunjukan semua isolat merupakan  bakteri  Gram  negatif  yang ditandai  dengan  terbentuknya  warna  merah pada  sel  bakteri  serta  morfologi  bentuk  sel berupa batang.
Bakteri gram negatif memiliki komposisi  dinding  sel  yang  sebagian  besar tersusun  dari  lapisan  glikolipid  yang  sangat tipis,  sehingga  pada  saat  pewarnaan,  kurang dapat  mempertahankan  zat  warna  utama ketika  dicuci  dengan  alkohol,  akibatnya kelompok bakteri ini memberikan kenampakan warna merah merupakan warna dari zat  warna safranin  (Murie et  al., 2013). Hal ini sejalan dengan pendapat (Minsavage and  Stall  2017),  (Morris, et  al .,  2004)yang menyatakan  bahwa  aktivitas  pembentukan inti  es  jelas  terbatas  pada  spesies  bakteri gram  negatif,  namun  kehadiran  spesies- spesies  ini  pada  tanaman  dan  habitat  alami yang lain merupakan suatu fenomena umum yang menarik.

## SIMPULAN
Penelitian  dapat  disimpulkan  bahwa semakin tinggi tempat penggambilan pengambilan sampel, semakin banyak populasi bakteri yang didapat yaitu pada titik ketinggian  2000  m  dpl  diperoleh  populasi bakteri  sebesar  6,9  x  10 4 ,  pada  ketinggian 1800 m dpl banyaknya populasi bakteri yang ditemukan  sebesar  6,3  x  10 4 dan  pada ketinggian  1500  m  dpl  jumlah  populasi sebesar  5,4  x  10 3 .  Dan  berdasarkan klasifikasi  bakteri  INA  terhadap  perbedaan suhu  aktivitas  es,  diketahui  bahwa  bakteri INA yang menyerang daun Jeruk keprok soe yang  ditemukan  di  Dataran  Tinggi  Mutis adalah  bakteri  INA  kelas  protein  B  yang mempunyai  aktivitas  pada  suhu  -7 o C  dan  C pada suhu 10 o C.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Disampaikan  kepada  Kementerian Riset,  Teknologi,  dan  Pendidikan  Tinggi Republik  Indonesia  yang  telah  mendanai Penelitian  ini  pada  bidang  Penelitian  Dosen Pemula dengan nomor kontrak
0915/L8/KM/2019  dan  Lembaga  Penelitian dan Pengabdian
Masyarakat (LPPM) Universitas  Katolik  Widya  Mandira  yang telah mendukung kelancaran penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
A  Susilowati1,  L  Y  Oktiningtiyas  and  R Setyaningsih.  2018.  “Enumeration  of
Ice  Nucleation  Active  Bacteria  and Severity of Frost Injury ( Embun Upas) on  Potato  in  Enumeration  of  Ice Nucleation Active Bacteria and Severity of Frost Injury ( Embun Upas) on  Potato  in  Wonosobo  ,  Dieng Plateau.” 4th  International  Conference on Agricultural and Biological Sciences : 185.
Adar,  D.,  M.  Bano,  E.S.  Woods,  Wei,  R. Mason,  dan  S.  Singgih.  2013.  “Selera Konsumen Terhadap  Jeruk  Keprok  Soe Di  Beberapa  Kota  Di  Indonesia.”
Prosiding Seminar
Nasional
Komunikasi  Hasil-hasil  Penelitian  dan Pengkajian Pengembangan Jeruk keprok soe. Nusa Tenggara Timur : 210– 17.
Atlas,
Ronald M. Handbook of
MICROBIOLOGICAL  MEDIA  Fourth Edition .
Failor, K C, D G Schmale Iii, B A Vinatzer, and C L Monteil. 2017. “Ice Nucleation Active  Bacteria  in  Precipitation  Are Genetically  Diverse  and  Nucleate  Ice by  Employing  Different  Mechanisms.” 11(12):
2740–53. http://dx.doi.org/10.1038/ismej.2017.12
4.
Govindarajan,  A.  G.,  and  S.  E.  Lindow. 2006. “Size of Bacterial Ice-Nucleation Sites  Measured  in  Situ  by  Radiation Inactivation  Analysis.” Proceedings  of the  National  Academy  of  Sciences 85(5): 1334–38.
Hardiyanto,  C.  Martasari,  dan  H.  Mulyanto.
2017.  “Analisis  Keragaman  Jeruk Keprok Indonesia Menggunakan Primer RAPD.” Jurnal  Hortikultura 3:  3:239- 246.
Hill, Thomas C. J. et al. 2014. “Measurement of Ice Nucleation-Active Bacteria  on  Plants  and  in  Precipitation by  Quantitative  PCR.” Applied  and
Environmental Microbiology 80(4): 1256–67.
Hirano, S. S., L. S. Baker, and C. D. Upper. 2008.  “Ice  Nucleation  Temperature  of Individual  Leaves  in  Relation  to Population  Sizes  of  Ice  Nucleation Active Bacteria and Frost Injury.” Plant Physiology 77(2): 259–65.
Manandhar,  D  N  et  al.  2008.  “Nutritional
Assessment of Patients under Hemodialysis in Nepal Medical College Teaching  Hospital.” Nepal  Medical College journal : NMCJ 10(3): 164–69. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1 9253860.
Minsavage, G V, and R E Stall.  2017. “Ice- Nucleation-Active Bacteria on Citrus in Florida.” Plant Pathogenic Bacteria pp
994-1004 4(23): 994–95.
Missa,  Hildegardis  et  al.  “ACTIVE  PADA JERUK KEPROK SOE DI DATARAN TINGGI MUTIS.” : 403–7.
MISSA,  HILDEGARDIS.  2016.  “Diversity and Phylogenetic Relationship of Cellulolytic  Bacteria  from  the  Feces  of Bali Cattle in South Central Timor, East Nusa Tenggara, Indonesia.”
Biodiversitas,  Journal  of  Biological Diversity 17(2): 614–19.
Morris, C E, D G Georgakopoulos, and D C Sands.  2004.  “Ice  Nucleation  Active Bacteria  and  Their  Potential  Role  in Precipitation.” 121: 87–103.
Murie  l  J,  Attard  E,  Sancelme  M, Deguillaume  L, Guilbaud C, Morr is  C E, Amato P and Delort A M. 2013. “Ice Nucleation Activity of Bacteria Isolated from  c  Loud  Water.” J.  Atmospheric Envir 70: 392–400.

## Rajasa, A.K. 2015. “Isolasi Dan  Identifikasi
Bakteriice Nucleationactive (INA) Penyebab  Embun  Upas  (Frost  Injury) Pada Daun Tanaman Kentang (Solanum Tuberosuml.)  Di  Kecamatan  Batur,
Dataran  Tinggi  Dieng.” Skripsi.  UNS-
FMIPA Jur. Biologi-M0411009 : M0411009.
Rostami,  Mahdieh,  Nader  Hasanzadeh, Pejman  Khodaygan,  and  Ali  Riahi- Madvar.  2018.  “Ice  Nucleation  Active Bacteria  from  Pistachio  in  Kerman Province , Iran.” : 51–58.
STEPHANIE,  and  DIANA  ELIZABETH WATURANGI.  2012.  “Distribution  of Ice  Nucleation-Active  (INA)  Bacteria from  Rain-Water  and  Air.” HAYATI Journal  of  Biosciences 18(3):  108–12. http://dx.doi.org/10.4308/hjb.18.3.108.