ISSN 2085-2916  e-ISSN 2337-3652 Tersedia daring http://jai.ipb.ac.id J. Agron. Indonesia, Desember 2018, 46(3):223-230 DOI: https://dx.doi.org/10.24831/jai.v46i3.19445 Optimasi Konsentrasi Asetosiringon dan Higromisin dalam Transformasi Genetik Padi Fatmawati dengan Perantaraan Agrobacterium tumefaciens
Optimation of Acetosyringone and Hygromycin on Genetic Transformation of Rice cv. Fatmawati Mediated by Agrobacterium tumefaciens
Atmitri Sisharmini 1,2 , Bambang Sapta Purwoko 3* , Nurul Khumaida 3 , dan Kurniawan Rudi Trijatmiko 2
1 Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor 2 Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jl. Tentara Pelajar No. 3A, Bogor 16111
3 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (Bogor Agricultural University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
Diterima 9 Januari 2018/Disetujui 10 Agustus 2018

## ABSTRACT
Protocols  for  genetic  transformation  of  rice  have  been  widely  developed,  however  the  protocols  are  not  universal and inapplicable for all types of rice plants directly. Transformation protocol on rice cv. Fatmawati needs to be developed to generate transgenic lines. The present research was carried out to optimize genetic transformation protocol in rice cv. Fatmawati  mediated  by  Agrobacterium  tumefaciens  harboring  pCambia1301  construct  using  immature  embryo  as  an explant. The experiment was arranged in a completely randomized design. Factors influencing efficiency of transformation, i.e., sensitivity of callus to hygromycin antibiotic, acetosyringone concentration used in cultivation medium, hygromycin concentration for transformant selection were optimized. The results showed that genetic transformation of rice cv. Fatmawati mediated by A. tumefaciens using immature embryos have been successfully carried out with several parameters. Addition of 100 µM acetosyringone in co-cultivation medium and 30 mg L -1 hygromycin for transformant callus selection were optimal for genetic transformation of rice cv. Fatmawati mediated by A. tumefaciens. Transformation efficiency was found to be 7.84% based on the lines carrying the hpt gene. This result would be a valuable reference in genetic transformation of rice cv. Fatmawati using target genes.
Keywords: immature embryo, Oryza sativa, pCambia1301, transformation efficiency

## ABSTRAK
Protokol transformasi genetik tanaman padi telah banyak dihasilkan, namun protokol tersebut bersifat tidak universal dan tidak dapat diadopsi untuk semua jenis tanaman padi secara langsung. Studi transformasi pada padi Fatmawati perlu dipelajari  untuk  memperbesar  peluang  didapatkannya  tanaman  transgenik.  Eksplan  embrio  muda  merupakan  eksplan yang paling responsif untuk ditransformasi. Penelitian ini dilakukan untuk mengoptimasi metode transformasi genetik padi Fatmawati yang dimediasi Agrobacterium tumefaciens yang membawa plasmid pCambia1301 dengan menggunakan embrio muda sebagai eksplan. Rancangan percobaan menggunakan rancangan acak lengkap. Faktor yang mempengaruhi efisiensi transformasi pada padi yaitu tingkat kepekaan kalus padi terhadap higromisin, konsentrasi asetosiringon yang digunakan dalam media kokultivasi, dan konsentrasi antibiotik higromisin untuk seleksi kalus transforman dioptimasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa transformasi genetik padi Fatmawati yang dimediasi dengan Agrobacterium tumefaciens menggunakan eksplan embrio muda telah berhasil dilakukan dengan beberapa parameter. Penggunaan senyawa asetosiringon 100 µM pada media kokultivasi dan antibiotik higromisin 30 mg L -1 untuk menyeleksi kalus transforman merupakan konsentrasi yang terbaik  untuk  transformasi  genetik  padi  Fatmawati  menggunakan A.  tumefaciens.  Efisiensi  transformasi  yang  diperoleh adalah sebesar 7.84% yang didasarkan pada galur yang positif mengandung gen hpt. Hasil penelitian ini dapat menjadi acuan dalam transformasi genetik padi Fatmawati menggunakan gen target.
Kata kunci: efisiensi transformasi, embrio muda, Oryza sativa, pCambia1301

## PENDAHULUAN
Rekayasa  genetik  tanaman  telah  menjadi  salah  satu strategi penting dalam pemuliaan tanaman modern berbasis bioteknologi.  Produksi  tanaman  transgenik  merupakan proses  rutin  yang  telah  dilakukan  dan  diterapkan  pada beberapa  spesies  tanaman.  Gen-gen  yang  diintroduksikan ke  tanaman  menyandikan  sifat-sifat  penting  seperti perbaikan kualitas tanaman, ketahanan terhadap hama dan penyakit. Upaya perbaikan dalam mengembangkan metode transformasi  yang  baru  dan  lebih  efisien  sudah  banyak dilakukan (Ozawa, 2009; Saika dan Toki, 2010; Sahoo et al ., 2011; Cho et al ., 2015).
Regenerasi  tunas  transforman  merupakan  kendala utama  dalam  transformasi  genetik  padi  sehingga memerlukan  sistem  kultur  jaringan  yang  efisien  dan optimal (Sahoo et al ., 2011). Ketersediaan jaringan target yang  kompeten,  metode  introduksi  DNA  ke  dalam  sel, prosedur  dalam  menyeleksi  dan  meregenerasikan  sel-sel transforman  merupakan  faktor-faktor  yang  penting  dalam sistem transformasi (Sah et al., 2014).  Kombinasi antara protokol regenerasi dan transformasi yang tepat dan optimal akan menentukan keberhasilan mendapatkan tanaman padi transgenik.  Protokol  regenerasi  dan  transformasi  genetik tanaman  padi  telah  banyak  dihasilkan,  namun  protokol tersebut  bersifat  tidak  universal  dan  tidak  dapat  diadopsi untuk semua jenis tanaman padi secara langsung (Hiei dan Komari, 2008; Tie et al ., 2012). Kemampuan regenerasi dan efisiensi  transformasi  genetik  pada  padi  dipengaruhi  oleh genotipe, umur dan jenis eksplan, media dasar, kombinasi hormon  tumbuh,  periode  dan  kondisi  kultur  (Sahoo dan  Tuteja,  2012;  Vennapusa et  al .,  2015).  Oleh  karena kemampuan  regenerasi  tanaman  dipengaruhi  genotipe, sehingga  kadang-kadang  memerlukan  manipulasi in  vitro yang berbeda untuk genotipe yang berbeda. Metode kultur jaringan  dari  sel-sel  non  transforman  merupakan  syarat utama  didapatkannya  protokol  transformasi  yang  efisien, sehingga  dapat  digunakan  sebagai  acuan  dalam  optimasi transformasi genetik tanaman (Hiei et al .,  2014). Diantara  teknologi  transformasi  genetik  lainnya, transformasi  yang  dimediasi  oleh Agrobacterium lebih banyak  dipilih  karena  tekniknya  relatif  lebih  mudah dan    murah.  Sistem  transformasi  padi  yang  dimediasi Agrobacterium  tumefaciens merupakan  transformasi  yang paling  umum  digunakan,  karena    mempunyai  jumlah salinan  gen  yang  relatif  rendah  dan  stabil  dengan  sedikit pengaturan  kembali  jika  dibandingkan  dengan  metode transfer DNA secara langsung seperti penembakan partikel (Nyaboga et al ., 2014). Embrio muda merupakan eksplan yang mempunyai kompetensi regenerasi dan efisiensi yang tinggi dalam transformasi padi (Hiei dan Komari, 2008).
Fatmawati  merupakan  varietas  padi  unggul  tipe baru  yang  dilepas  oleh  Balitbangtan  pada  tahun  2003. Karakteristik  padi  Fatmawati  adalah  mempunyai  hasil tinggi  sekitar  7.5  ton  ha -1 .  Agak  tahan  terhadap  wereng coklat biotipe 2 dan 3, tahan terhadap hawar daun bakteri strain III dan agak tahan terhadap strain IV.  Kelemahan padi Fatmawati adalah tidak tahan blas dan mempunyai sterilitas spikelet yang tinggi (≥50% gabah hampa) (Abdullah et al .,
2008). Pengembangan padi ini menjadi varietas baru dengan karakter-karakter  yang  lebih  unggul  mempunyai  potensi yang sangat tinggi melalui rekayasa genetik.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  mendapatkan  metode transformasi tanaman padi Fatmawati dengan menggunakan embrio  muda  sebagai  eksplan.  Beberapa  faktor  yang mempengaruhi  efisiensi  transformasi  dipelajari  dalam transformasi  padi  Fatmawati,    yaitu  mengenai  pengujian tingkat  kepekaan  kalus  padi  terhadap  higromisin, konsentrasi  asetosiringon  yang  digunakan  dalam  media kokultivasi  dan  konsentrasi  higromisin  minimal  untuk seleksi  kalus  transforman.  Dengan  mempelajari  faktor- faktor yang mempengaruhi transformasi diharapkan kondisi transformasi  yang  optimal  untuk  padi  Fatmawati  dapat diperoleh  sehingga  protokol  ini  dapat  digunakan  untuk transformasi selanjutnya dengan menggunakan gen target.

## BAHAN DAN METODE

## Penyiapan Eksplan
Penelitian dilakukan di laboratorium Biologi Molekuler, Balai  Besar  Penelitian  dan  Pengembangan  Bioteknologi dan  Sumberdaya  Genetik  Pertanian  pada  tahun  2016. Bahan  penelitian  yang  digunakan  adalah Agrobacterium tumefaciens strain  LBA4404  yang  mengandung  konstruk pCAMBIA1301  dan  tanaman  padi  varietas  Fatmawati sebagai  sumber  eksplan.  Metode  transformasi  yang digunakan  dalam  penelitian  ini  mengacu  pada  protokol Slamet-Loedin et al . (2014) dengan menggunakan embrio muda sebagai eksplan (Gambar 1).
Embrio muda diisolasi dari biji-biji muda padi (berumur 8-12  hari  setelah  pembungaan)  yang  telah  dibuang  kulit gabahnya dan disterilisasi dengan 70% ethanol selama 5-10 detik dan larutan 1% sodium hypochlorite selama 5 menit. Embrio muda diisolasi dari biji menggunakan pinset.
Pengujian  Tingkat  Kepekaan  Kalus  Padi  Fatmawati terhadap Higromisin
Percobaan  pendahuluan  dilakukan  untuk  menguji tingkat kepekaan kalus terhadap higromisin. Bahan berupa kalus yang berumur 7 hari yang ditumbuhkan pada media induksi  kalus.  Media  induksi  kalus  yang  digunakan adalah  media dasar makro N6 (Chu et al ., 1975) dengan penambahan  mikro B5 dan  vitamin B5 (Gamborg et al ., 1968), casamino  acid 500  mg  L -1 ,  L-prolin  500  mg  L -1 , sukrosa 30 g L -1 , 2.4-D 2 mg L -1 , BAP 1 mg L -1 dan NAA 2 mg L -1 . Kalus yang berumur 7 hari diseleksi pada media seleksi  yaitu  media  induksi  kalus  yang  ditambah  dengan antibiotik higromisin.
Rancangan  percobaan  yang  digunakan  adalah rancangan acak lengkap. Perlakuan yang diberikan adalah perbedaan konsentrasi higromisin yang ditambahkan pada media induksi kalus yaitu 0, 10, 20, 30, 40, dan 50 mg L -1 . Jumlah  kalus  yang diuji adalah 20 kalus untuk masing- masing perlakuan dengan empat ulangan. Data persentase kalus  hidup  pada  media  seleksi  diuji  menggunakan  sidik ragam.  Perbedaan  antar  perlakuan  ditentukan  dengan  uji
beda  nyata  terkecil  pada  taraf  uji  0.01.  Analisis  statistik menggunakan program R versi 3.0.1.
Pengamatan dilakukan setelah kalus berumur 3 minggu di  media  seleksi.  Kalus  yang  berwarna  coklat  kehitaman menunjukkan  adanya  penghambatan  pertumbuhan  kalus. Kalus  hidup  ditunjukkan  dengan  warna  kalus  putih kekuningan  dan  masih  segar.  Persentase  kalus  hidup dihitung dari jumlah kalus yang hidup dibagi dengan jumlah kalus yang ditanam pada media seleksi dan dikalikan 100%. Kisaran  konsentrasi  higromisin  terpilih  digunakan  untuk menyeleksi kalus-kalus pada transformasi padi Fatmawati.

## Pengaruh  Perbedaan  Konsentrasi  Asetosiringon  pada Transformasi Padi Fatmawati
Transformasi genetik padi Fatmawati dilakukan dengan cara menetesi eksplan embrio muda yang diletakkan pada media ko-kultivasi padat dengan 5 µl media ko-kultivasi cair yang  berisi  kultur Agrobacterium .  Bakteri Agrobacterium tumefaciens sebelumnya ditumbuhkan selama 3 hari pada media AB  (Chilton et  al .,  1974)  dengan  penambahan  50 mg L -1 kanamisin  pada suhu 28 o C. Kultur bakteri di media AB  dipanen  dan  ditumbuhkan  pada  media  ko-kultivasi cair.  Suspensi  ini  yang  digunakan  untuk  infeksi  embrio muda padi. Perlakuan yang diberikan adalah penambahan
asetosiringon (AS) pada media ko-kultivasi cair dan padat (Tabel 1) dengan perlakuan tanpa AS (0), 100, dan 200 µM AS  dan  kerapatan  bakteri  pada  OD  =  0.3.  Embrio  yang telah diinfeksi bakteri diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu 25 o C selama 7 hari dan selanjutnya dikulturkan pada media resting (Tabel  1).  Eksplan  dipindahkan  ke  media seleksi  tahap  pertama  (Tabel  1)  dan  dikulturkan  selama 10  hari  dengan  3  kali  periode  subkultur.  Kalus-kalus tahan  dipindahkan  ke  media  pre-regenerasi  (Tabel  1)  dan diinkubasi selama 10 hari. Kalus-kalus yang berproliferasi dengan  spot  hijau  dikulturkan  pada  media  regenerasi yang  mengandung  30  mg  L -1 higromisin  dan  250  mg  L -1 cefotaksim.  Tunas  yang    muncul  dikulturkan  pada  media perakaran yang mengandung 40 mg L -1 (Gambar 2). Planlet yang terbentuk selanjutnya diaklimatisasi dan dipindahkan ke pot berisi media tanah dan ditumbuhkan sampai panen di rumah kaca.
Rancangan  percobaan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  rancangan  acak  lengkap.  Perlakuan yang diberikan adalah perbedaan konsentrasi asetosiringon yaitu tanpa penambahan AS (0), 100, dan 200 µM. Jumlah embrio  muda  yang  diuji  adalah  32  buah  untuk  masing- masing perlakuan dengan empat ulangan. Data persentase pembentukan kalus hidup di media induksi di lakukan uji sidik ragam. Perbedaan antar perlakuan ditentukan dengan
Gambar 1. Bagan tahapan metode transformasi padi Fatmawati dengan perantaraan Agrobacterium tumefaciens
Bahan tanaman Ko-kultivasi Padi Fatmawati
Embrio muda
8-12 hari setelah pembungaan Ko-kultivasi cair, OD = 0.3 berisi
Agrobacterium LBA4404 mengandung pCambia1301 Ko-kultivasi padat 7 hari Resting Seleksi I 5 hari AS 0, 100, 200  µM Seleksi II Seleksi III 10 hari 10 hari 10 hari Seleksi Regenerasi Pre-regenerasi Perakaran Higromisin 30, 40, 50 mg L -1 10 hari 10 hari 10 hari Aklimatisasi
uji beda nyata terkecil pada taraf uji 0.01. Analisis statistik menggunakan program R versi 3.0.1.
Variabel lain yang diamati pada perlakuan ini  adalah jumlah  embrio  muda  yang  ditransformasi,  jumlah  kalus yang  tumbuh  pada  media  ko-kultivasi  padat  (persentase dihitung  dari    jumlah  kalus  yang  tumbuh  di  media  ko- kultivasi  padat  dibagi  jumlah  embrio  yang  ditransformasi dikalikan  100%),  jumlah  kalus  yang  tahan  higromisin (kalus berwarna putih kekuningan) di media seleksi tahap ketiga  (persentase  dihitung  dari  jumlah  kalus  yang  tahan higromisin  di  media  seleksi  tahap  ketiga  dibagi  dengan jumlah  embrio  yang  ditransformasi  kemudian  dikalikan 100%),  jumlah  kalus  yang  tumbuh  spot  hijau  (persentase dihitung dari jumlah kalus yang tumbuh spot hijau dibagi dengan jumlah   kalus tahan   higromisin di media seleksi ketiga),  efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi yang dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Efisiensi transformasi = Jumlah event mengandung gen higromisin x 100% Jumlah embrio yang ditransformasi Efisiensi  regenerasi  = Jumlah kalus yang beregenerasi x 100% Jumlah kalus yang lolos seleksi antibiotik
Pengaruh Konsentrasi Higromisin terhadap Seleksi Kalus Padi Fatmawati
Perlakuan  konsentrasi  higromisin  untuk  menyeleksi kalus  transforman  terdiri  atas  tiga  taraf  konsentrasi  yaitu 30,  40,  dan  50  mg  L -1 .  Variabel  yang  diamati    meliputi jumlah  embrio  muda  yang  ditransformasi,  jumlah  kalus tahan  higromisin  (warna  kalus  putih  kekuningan)  yang dihitung  dari  jumlah  kalus  yang  hidup  di  media  seleksi tahap ke tiga, jumlah kalus dengan spot hijau yang dihitung
dari jumlah kalus yang muncul spot-spot hijaunya, jumlah kalus  beregenerasi  yang  dihitung  dari  jumlah  kalus yang  dapat  beregenerasi  menghasilkan  tunas,  efisiensi regenerasi, efisiensi transformasi dan jumlah galur positif PCR  yang    dihitung  dari  jumlah  galur  independen  yang positif  mengandung  gen  ketahanan  antibiotik hygromicyn phosphotransferase ( hpt )  ketika  dideteksi  dengan  teknik PCR.
Analisis  Molekuler  Galur  Padi  Putatif  Transgenik Menggunakan Teknik PCR
Analisis  molekuler  dengan  PCR  dilakukan  untuk mendeteksi keberadaan gen pada tanaman padi transforman. Isolasi DNA genom padi dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (Murray dan Thompson, 1980). Analisis PCR dilakukan  dengan  menggunakan  sepasang  primer  spesifik untuk gen marka seleksi hpt (Apriana et al ., 2011). Reaksi PCR  dilakukan  pada  volume  total  20  ul  yang  terdiri  atas ddH2O, 1 x  buffer PCR (10 x), 200 µM dNTPs (10mM), 0.25 µM primer Forward (5 µM), 0.25 µM primer Reverse (5 µM), 1 U Taq DNA Pol (5U µL -1 ), dan cetakan DNA. Program PCR yang digunakan ialah tahap denaturasi awal pada  suhu  94 o C  selama  5  menit,  kemudian  dilanjutkan dengan  35  siklus  yang  terdiri atas denaturasi pada suhu 94 o C    selama    60    detik,      annealing    pada  suhu    60 o C selama 45  detik  dan  elongasi  pada  suhu 72 o C selama 60 detik. Hasil PCR kemudian diseparasi pada gel  agarose 1%  dengan  voltase  100  watt  selama  1  jam  dan  diwarnai dengan ethidium bromida. Pengamatan dilakukan di bawah sinar UV dengan bantuan perangkat chemidoc. Pengamatan hasil PCR berdasarkan ada atau tidaknya pita DNA. PCR memberikan hasil positif jika pita DNA amplikon berukuran sama dengan kontrol plasmid.
Media Komposisi
Kokultivasi cair  AA dengan penambahan 876 mg L -1 L-glutamin, 260 mg L -1 aspartic acid, 174 mg L -1 arginin, 0.086 g L -1 glisin, 500 mg L -1 casamino acid, 20 g L -1 sukrosa dan 10 g L -1 glukosa, pH 5.4. Kokultivasi padat NB dengan penambahan  500 mg L -1 casamino acid, 500 mg L -1 L-prolin,     20 g L -1 sukrosa, 10 g L -1 glukosa, 2 mg L -1 2.4-D, 1 mg L -1 BAP, 2 mg L -1 NAA, 5.5 g L -1 Agarose tipe I, pH 5.4. Resting NB dengan penambahan 500 mg L -1 casamino acid, 500 mg L -1 L-prolin, 300 mg L -1 glutamin, 36 g L -1 manitol, 20 g L -1 maltose, 1 mg L -1 2.4-D, 1 mg L -1 NAA, 0.2 mg L -1 BAP, 250 mg L -1 cefotaksim, 100 mg L -1 vancomisin, gelrite 5 g L -1 , pH 5.8. Seleksi Resting + 30 mg L -1 higromisin Pre regenerasi MS dengan penambahan 30 g L
-1 maltose, 20 g L -1 sorbitol, 10 g L -1 agarose tipe I, 2 mg L -1 kinetin, 5 mg L -1 NAA, 250 mg L -1 cefotaksim, 100 mg L -1 vancomisin, 30 mg L -1 higromisin, pH 5.8. Regenerasi MS dengan penambahan 30 g L -1 sukrosa, 2 mg L -1 kinetin, 1 mg L -1 NAA, 250 mg L -1 cefotaksim, 100 mg L -1 vancomisin, 30 mg L -1 higromisin, 3 g L -1 gelrite, pH 5.8. Perakaran MS dengan penambahan 30 g L -1 sukrosa, 1 mg L -1 IBA, 2 g L -1 gelrite, 30 mg L -1 higromisin, pH 5.8.
Tabel 1. Komposisi media yang digunakan untuk transformasi genetik padi Fatmawati (Slamet-Loedin et al ., 2014)
Keterangan: AA = media asam amino; NB = media dasar N6 dengan penambahan mikro dan vitamin B5; MS =  media dasar Murashige dan Skoog

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengujian  Tingkat  Kepekaan  Kalus  Padi  terhadap Higromisin
Gen  yang  menyandi  ketahanan  terhadap  antibiotik higromisin  ( hpt )  merupakan  marka  seleksi  yang  efisien digunakan  dalam  transformasi  padi  (Hiei  dan  Komari, 2008).  Tingkat  kepekaan  kalus  terhadap  higromisin dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi lethal minimum higromisin  terhadap  kalus  transforman.  Informasi  ini sangat  berguna  untuk  menentukan  konsentrasi  higromisin yang  ditambahkan  pada  media  untuk  menyeleksi  kalus transforman.  Konsentrasi  lethal  minimum  agen  seleksi mungkin berbeda di antara genotipe tanaman. Menurut Tran dan  Mishra  (2015),  efektivitas  seleksi  dengan  antibiotik tergantung  pada  spesies  tanaman,  kultivar,  jenis  jaringan, organ maupun perbedaan tahapan perkembangan tanaman pada spesies tanaman yang sama.
Hasil  uji  tingkat  kepekaan  kalus  yang  berasal dari  embrio  muda  padi  Fatmawati  terhadap  antibiotik higromisin  menunjukkan  bahwa  kalus  masih  mampu tumbuh  baik  mencapai  100%  dan  belum  menunjukkan adanya  penghambatan  pertumbuhan  kalus  pada  perlakuan tanpa higromisin dan 10 mg L -1 higromisin. Kalus sedikit mengalami  penghambatan  pertumbuhan  dengan  jumlah kalus yang tahan higromisin sebesar  87.5% pada konsentrasi 20  mg  L -1 higromisin.  Pertumbuhan  kalus  menunjukkan adanya  penghambatan  sebesar  93.75%  pada  konsentrasi 30  mg  L -1 higromisin.  Penghambatan  pertumbuhan  kalus 100%  atau  tidak  ada  kalus  yang  mampu  bertahan  hidup pada media seleksi ditunjukkan pada konsentrasi 40 mg L -1 dan 50 mg L -1 higromisin (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi lethal minimum higromisin pada embrio muda padi Fatmawati terjadi pada konsentrasi 30 mg L -1 , karena    pada    konsentrasi  ini  sudah  mulai  menunjukkan penghambatan pertumbuhan kalus dan hanya sekitar 6.25% kalus  yang  mampu  bertahan  hidup.  Berdasarkan  hasil
tersebut, maka konsentrasi higromisin yang dapat digunakan untuk  menyeleksi  kalus-kalus  padi  transforman  adalah berkisar antara 30-50 mg L -1 . Kalus-kalus yang mempunyai ketahanan  terhadap  higromisin  saja  yang  nantinya  akan mampu  bertahan  hidup  pada  media  dengan  penambahan 30-50 mg L -1 higromisin.

## Transformasi  dengan  Perlakuan  Perbedaan  Konsentrasi Asetosiringon
Penambahan  asetosiringon  pada  media  ko-kultivasi diperlukan  untuk  menginduksi  gen-gen  vir  dalam Agrobacterium yang berfungsi untuk memindahkan T-DNA ke  dalam  sel  tanaman  dan  meningkatkan  efisiensi  infeksi (Nakano et al ., 2017). Konsentrasi asetosiringon yang tepat dapat berfungsi untuk meningkatkan efisiensi transformasi (Jia et  al .,  2015).  Namun,  konsentrasi  asetosiringon  yang terlalu tinggi menyebabkan terjadinya nekrotik pada jaringan sehingga  menyebabkan  rendahnya  efisiensi  transformasi (Sah et al ., 2014).
Hasil  pengujian  menunjukkan  bahwa  perbedaan konsentrasi  asetosiringon  mempengaruhi  persentase pembentukan  kalus,  kalus  tahan  higromisin,  efisiensi regenerasi  dan  transformasi  (Gambar  3).  Persentase pembentukan  kalus  menunjukkan  hasil  yang  sama  antara perlakuan tanpa dan penambahan 100 µM AS, sedangkan pada  perlakuan  200  µM  AS  menunjukkan  persentase pembentukan  kalus  yang  lebih  sedikit.  Persentase  kalus tahan  higromisin,  efisiensi  regenerasi  dan  efisiensi transformasi  menunjukkan  hasil  yang  lebih  tinggi  pada konsentrasi asetosiringon 100 µM dibandingkan pada media tanpa asetosiringon maupun pada konsentrasi asetosiringon 200 µM (Gambar 3). Hal ini diduga bahwa asetosiringon berperan  penting  dalam  proses  transformasi  tetapi  pada konsentrasi yang tinggi (200 µM) bersifat nekrotik pada sel- sel  tanaman  sehingga  mempengaruhi  pembentukan  kalus. Pada konsentrasi 200 µM, perkembangan kalus terhambat dan  pertumbuhan  bakteri  terlalu  lebat  menyelimuti  kalus, sehingga  kalus  menjadi  coklat  ( browning )  dan  akhirnya mati. Menurut  Tripathi et  al .  (2010)  asetosiringon mempunyai  peranan  penting  dalam  proses  transformasi. Konsentrasi asetosiringon yang digunakan pada transformasi genetik  padi  berbeda-beda  tergantung  genotipe  padi  yang digunakan. Konsentrasi asetosiringon 350 µM menunjukkan frekuensi transformasi paling tinggi setelah analisis uji GUS pada padi Pusa Basmati, sedangkan efisiensi transformasi yang tinggi didapatkan pada konsentrasi asetosiringon 150 µM  pada  padi  IR64  (Sahoo  dan  Tuteja,  2012).  Efisiensi transformasi  padi  Fatmawati  menunjukkan  persentase yang  lebih  tinggi  pada  konsentrasi  asetosiringon  100  µM dibandingkan  dengan  asetosiringon  200  µM  maupun tanpa asetosiringon. Konsentrasi asetosiringon yang tinggi menyebabkan  rendahnya  frekuensi  regenerasi  karena berkaitan dengan efek nekrotik dari senyawa tersebut (Sah et al .,  2014).
Konsentrasi higromisin (mg L -1 ) Jumlah kalus yang diuji Persentase jumlah kalus yang hidup pada media dengan higromisin (%) 0 20 100.00a 10 20 100.00a 20 20 87.50b 30 20 6.25c 40 20 0.00d 50 20 0.00d Tabel  2.  Tingkat  ketahanan  kalus  embrio  muda  padi Fatmawati  tanpa  ditransformasi  terhadap higromisin
Keterangan: Angka pada satu kolom yang dikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda pada taraf  1% menurut uji beda nyata terkecil
Pengaruh  Perbedaan  Konsentrasi  Higromisin  terhadap Kalus Padi Fatmawati Setelah Transformasi
Persentase sel-sel pada kalus yang dapat ditransformasi (menerima  DNA  asing)  relatif  rendah,  oleh  karena  itu sangatlah penting untuk menghambat perkembangan dari se- sel non transforman (Zhu dan Wu, 2008). Penghambatan sel- sel non transforman dilakukan dengan antibiotik higromisin yang  telah  diketahui  konsentrasi  penghambatannya  pada kalus   padi   Fatmawati  yaitu  pada  konsentrasi  30,  40  dan 50 mg L -1 (Tabel 2). Ketiga konsentrasi higromisin tersebut digunakan  untuk  menyeleksi  kalus-kalus  transforman  dan melihat pengaruhnya terhadap efisiensi transformasi. Hasil menunjukkan  bahwa  konsentrasi  30  mg  L -1 higromisin menghasilkan efisiensi transformasi yang lebih tinggi yaitu sebesar  7.84%  ketika  dibandingkan  dengan  konsentrasi higromisin 40 dan 50 mg L -1 (Tabel 3).
Seleksi kalus transforman pada 30 mg L -1 higromisin menunjukkan  bahwa  semua  tunas  yang  tahan  ternyata juga  mengandung  gen hpt setelah  dianalisis  PCR  (Tabel 3). Hal ini memberi indikasi bahwa higromisin 30 mg L -1 merupakan    konsentrasi    terbaik    untuk  menyeleksi  kalus transforman.  Tanaman  yang  diregenerasikan  dari  kalus yang  menunjukkan  positif  dalam  analisis  molekulernya merupakan sistem seleksi yang efektif (Htwe et al ., 2014). Konsentrasi  higromisin  yang  lebih  tinggi  menunjukkan efisiensi  transformasi  yang  lebih  rendah  diduga  karena pada  konsentrasi  tersebut  tingkat  seleksi  terhadap  kalus transforman  terjadi  dengan  ketat  sehingga  kemungkinan kalus-kalus  yang  mengandung  gen  ketahanan  higromisin juga ikut terseleksi atau mati. Higromisin yang terlalu tinggi juga menghambat pertumbuhan dan perkembangan kalus- kalus  transforman  sehingga  pada  akhirnya  kalus  tersebut mati. Tran  dan  Mishra  (2015)  menyatakan  bahwa  adanya
Gambar 2. Tahapan transformasi padi Fatmawati menggunakan eksplan embrio muda dengan perantaraan Agrobacterium. Eksplan biji muda padi yang akan diisolasi embrio mudanya (A), Embrio muda padi yang sudah diisolasi dan ditempatkan di media ko kultivasi (B), Embrio muda padi yang dikokultivasi dengan suspensi Agrobacterium , 7 hari di media ko-kultivasi (C), Kalus- kalus transforman yang tumbuh di media seleksi ketiga dengan higromisin 30 mg L -1 (D), Kalus transforman dengan spot hijau (E), Tunas transforman yang tumbuh dari kalus yang tahan higromisin (F), Planlet transforman di media perakaran (G) A E D C B F G
Gambar 3. Pengaruh Asetosiringon (AS) terhadap persentase pembentukan kalus, kalus yang tahan higromisin di media seleksi, efisiensi regenerasi dan efisiensi transformasi
a a b - 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Pembentukan kalus % 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Kalus tahan higromisin di media seleksi Efisiensi regenerasi Efisiensi transformasi % 0 AS 100 AS 200 AS
antibiotik  pada  level  yang  tinggi  tidak  hanya  mematikan sel-sel  non  transforman  tetapi  juga  akan  menghambat pertumbuhan  sel-sel  transforman  sehingga  akan mempengaruhi  regenerasinya.  Penelitian  Mulyaningsih et al. (2010) menggunakan konsentrasi higromisin 25 mg L -1 untuk menyeleksi kalus-kalus padi Batutegi dan Kasalath. Hal  ini  memberi  indikasi  bahwa  perbedaan  konsentrasi higromisin untuk menyeleksi kalus transforman diduga juga bersifat tergantung genotipe.

## Analisis  Molekuler  Galur  Padi  Transgenik  dengan Menggunakan Teknik PCR
Galur-galur  putatif  padi  transgenik  yang  dihasilkan dianalisis  secara  molekuler  dengan  teknik  PCR  untuk mengetahui  apakah  konstruk  pCAMBIA1301  berhasil
diintroduksikan ke padi Fatmawati. Tanaman padi  putatif transgenik  yang  dihasilkan  pada  penelitian  ini  ialah  14 galur. Ke-14 galur tersebut kemudian diisolasi DNAnya dan dilakukan analisis PCR dengan menggunakan primer untuk gen hpt . Hasil  analisis    PCR  dari  14  galur  tanaman  padi Fatmawati  putatif  transgenik  yang  dihasilkan  dari transformasi,  menunjukkan  positif  mengandung  gen hpt (Gambar 4). Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya amplikon dari gen hpt yang berukuran 500 bp, ukuran ini sama dengan amplikon dari kontrol plasmid CAMBIA1301. Hasil  uji  PCR  menunjukkan  bahwa  semua  planlet  yang lolos seleksi higromisin dengan konsentrasi 30-50 mg L -1 ternyata    juga  positif  mengandung  gen hpt yang  terdapat pada konstruk pCAMBIA1301.

## KESIMPULAN
Varietas padi Fatmawati dapat ditransformasi dengan perantaraan Agrobacterium menggunakan  eksplan  berupa embrio muda. Penggunaan asetosiringon 100 µM pada media kokultivasi  dan  higromisin  30  mg  L -1 untuk  menyeleksi kalus  transforman  merupakan  konsentrasi  yang  optimal untuk  transformasi  genetik  padi  Fatmawati  menggunakan A. tumefaciens dengan efisiensi transformasi sebesar 7.84%. Metode  transformasi  genetik  padi  Fatmawati  ini  dapat digunakan  sebagai  acuan  dalam  transformasi  selanjutnya dengan menggunakan gen target.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdullah, B., S. Tjokrowijoyo, Sularjo. 2008. Perkembangan dan prospek perakitan padi tipe baru di Indonesia. J. Litbang Pertanian 27:1-5.
Apriana,  A.,  A.  Sisharmini,  W.  Enggarini,  Sudarsono, N.  Khumaida,  K.R.  Trijatmiko.  2011.  Introduksi konstruk  over  ekspresi  kandidat  gen  OsWRKY76 melalui  Agrobacterium  tumefaciens  pada  tanaman padi Nipponbare. J. Agrobiogen 7:19-27.
Konsentrasi higromisin (mg L -1 ) Jumlah EM yang ditransformasi 1) (A) Jumlah kalus tahan higromisin (B) Jumlah kalus dengan spot hijau Jumlah kalus beregenerasi/ galur independen (D) Efisiensi regenerasi (%) 2) Jumlah galur/planlet positif PCR (C) Efisiensi transformasi (%) 3) 30 153 43 36 12 27.9 12 7.84 40 98 12 9 2 16.7 2 2.04 50 120 10 8 1 10.0 1 0.83
Tabel 3. Pengaruh perbedaan konsentrasi higromisin untuk seleksi kalus terhadap efisiensi regenerasi dan transformasi
Keterangan: 1) Embrio  muda, 2) Dihitung  dari  perbandingan  antara  jumlah  kalus  yang  beregenerasi  dengan  jumlah,  kalus  yang  tahan higromisin (D/B) dikalikan 100%, 3) Dihitung dari perbandingan antara jumlah planlet dengan jumlah EM yang ditransformasi (C/A) dikalikan 100%
Gambar 4. Hasil analisis PCR menggunakan primer gen hpt dari galur-galur tanaman padi Fatmawati putatif transgenik. 1 kb ladder (M), galur padi Fatmawati putatif transgenik (1-14), kontrol wild type (WT), kontrol plasmid CAMBIA1301 (P)

## M    1     2     3     4     5     6     7     8     9   10   11   12   13   14   WT   P
500 pb 1000 pb 850 pb 650 pb
500 pb 100 pb

## M       1       2        3        4        5        6         7       8       9      10     11     12      13      14      WT     P
Chilton,  M.D., T.C.  Currier,    S.K.  Farrand, A.J.  Bendich,
M.P.  Gordon,  E.W.  Nester.  1974. Agrobacterium DNA  and  PS8  bacteriophage  DNA  not  detected in  crown  gall  tumors.  Proc.  Natl. Acad.  Sci.  USA. 71:3672-3676.
Chu, C.C., C.C. Wang, C.S. Sun, C. Hus, K.C. Yin, C.Y. Chu. 1975. Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Sci. Sinica 18:659-668.
Cho,  A.R.,  D.K.  Lee,  K.M.  Kim.  2015.  High  frequency plant  regeneration  from  transgenic  rice  expressing Arabidopsis thaliana bax inhibitor (At BI-1) tissue cultures. J. Plant Biotechnol. 42:83-87.
Gamborg,  O.L.,  R.A.  Miller,  K.  Ojima.  1968.  Nutrient requirement of suspensions cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151.
Hiei,  Y.,  T.  Komari.  2008. Agrobacterium -mediated transformation  of  rice  using  immature  embryo  or calli induced from mature seed. Nat. Protoc. 3:824- 834.
Hiei,  Y.,  Y.    Ishida.  T,  T.  Komari.  2014.  Progress  in cereal  transformation  technology  mediated  by Agrobacterium tumefaciens . Front Plant Sci. 5:1-11.
Htwe,  W.W.,  H.C.  Ling,  F.Q.  Zaman,  M.  Maziah.  2014.
Plant  genetic  transformation  efficiency  of  selected Malaysian rice based on selection marker gen ( hptII ). Pak. J. Biol. Sci. 17:472-481.
Jia, Y.,  X. Yao,  M. Zhao, Q. Zhao, Y. Du, C. Yu, F. Xie. 2015.  Comparison  of  soybean  transformation efficiency and plant factors affecting transformation during  the Agrobacterium infection  process.  Int.  J. Mol. Sci. 16:18522-18543.
Mulyaningsih  E.S.,  H.   Aswidinnoor,  D.  Sopandie,  P.B.F. Ouwerkerk, I.H. Slamet- Loedin. 2010. Transformasi padi  indica  kultivar  Batutegi  dan  Kasalath  dengan gen regulator HD-Zip untuk perakitan varietas toleran kekeringan. J. Agron. Indonesia 38:1-7.
Murray,  M.G.,  W.F.  Thompson.  1980.  Rapid  isolation  of high-molecular-weight  plant  DNA.  Nucleic  Acid Res. 8:4321-4325.
Nakano, Y. 2017. Effect of acetosiringone on Agrobacterium - mediated  transformation  of  Eustoma  grandiflorum leaf disks. JARQ. 51:351-355.
Nyaboga, E., J.N. Tripathi, R. Manoharan, L. Tripathi. 2014. Agrobacterium -mediated  genetic  transformation  of yam  ( Dioscorea  rotundata )  :  an  important  tool  for
functional  study  of  genes  and  crop  improvement. Front. Plant Sci. doi:10.3389/fpls.2014.00463.
Ozawa,  K.  2009.  Establishment  of  a  high  efficiency Agrobacterium mediated  transformation  system  of rice ( Oryza sativa L.). Plant Sci. 176:522-527.
Sahoo, K.K., A.K. Tripathi, A. Pareek, S.K. Sopory, S.L.S. Pareek.  2011.  An  improved  protocol  for  efficient transformation  and  regeneration  of  diverse  indica rice cultivar. Plant Methods 7:49.
Sahoo,  R.K.,  Tuteja,  N.  2012.  Development  of Agrobacterium -mediated  transformation  technology for mature seed-derived callus tissue of Indica rice cultivar  IR64.  GM  Crop  and  Food  Biotechnol.  in Agricult. Food Chain 3:123-128.
Sah, S.K., A. Kaur, G. Kaur, G.S. Cheema. 2014. Genetic transformation  of  rice:  problem,  progress  and prospects. J. Rice Res. 3:132.
Saika, H., S. Toki. 2010. Mature seed derived callus of the model indica rice variety Kasalath is highly competent in Agrobacterium mediated  transformation.  Plant Cell Rep. 29:1351-1364.
Slamet-Loedin,  I.H.,  P.  Chadha-Mohanty,  L.  Torrizo. 2014. Agrobacterium -mediated  transformation:  rice transformation. Methods Mol. Biol . 1099 : 261-71.
Tie, W., F. Zhao, L. Wang, W. Xie, H. Chen, X. Li, Y. Lin. 2012.  Reason  for  lower  transformation  efficiency in  indica  rice  using Agrobacterium  tumefaciens - mediated transformation : lessons from transformation assays and genome-wide expression profiling. Plant Mol. Biol. 78:1-18.
Tran, N.T., N.S. Mishra. 2015. Effect of antibiotic on callus regeneration  during  transformation  of  IR64  rice. Biotechnol.  Rep. 7:143-149.
Tripathi,  R.M.,  H.S.  Bisht,  R.P.  Singh.  2010.  Effect  of acetosyringone and callus age on transformation for scutellum-derived callus of rice. Int. J. Pharma Bio Sci. 1:163-171.
Vennapusa, A.R., R.S. Vemanna, R. Reddy, K.C. Babitha, K. Kiranmai, A. Nareskhumar, C. Sudhakar. 2015. An efficient  callus  induction  and  regeneration  protocol for a drought tolerant rice indica genotype AC39020. J. Plant Sci. 3:248-254.
Zhu, Z., R. Wu. 2008. Regeneration of transgenic rice plants using  high  salt  for  selection  without  the  need  for antibiotics or herbicides. Plant Sci. 174:519-523.