IDENTIFIKASI GEN PENYANDI PROTEIN TRANSPORT SEBAGAI KANDIDAT VAKSIN SUBUNIT TERHADAP BAKTERI ESCHERICHIA COLI PENYEBAB DIARE WISATAWAN
Burhannuddin Rasyid 1 , I Wayan Karta 1 , Ni Luh Putu Eka Kartika Sari 2 , I Gusti Ngurah Dwija Putra 2
1 Jurusan Teknologi Laboratorium Medis, Poltekkes Kemenkes Denpasar Denpasar, Indonesia
2 Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Warmadewa Denpasar, Indonesia
e-mail: boerhannuddin@gmail.com

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengisolasi  dan  mengkarakterisasi  gen  penyandi protein  transport  sebagai  kandidat  vaksin  subunit  terhadap E.  coli penyebab  diare wisatawan. Pengambilan sampel feses dilakukan di Ubud Care Clinic pada wisatawan yang melakukan pemeriksaan diare. Sampel dikultur pada media Eosin Metilen Blue , koloni  tersangka  kemudian  diuji  biokimia  untuk  mengkonfirmasi  jenis  bakteri  yang ditemukan.  Isolat  positif E.coli selanjutnya  disubkultur  pada  media Nutrient  Broth , kemudian DNA E.coli diisolasi dengan GeneJET Genomic DNA Purification Kit. DNA hasil  isolasi  selanjutnya  digunakan  sebagai template reaksi  PCR  menggunakan pasangan  primer  yang  mengenali  gen  aidA  penyandi  protein  transport  pada E.coli . Berdasarkan  hasil  kultur  pada  media  EMB  dan  hasil  uji  biokimia  pada  media  TSIA, SIM,  Simon  Citrat  dan  uji  gula-gula  didapatkan  sebanyak  20  (59  %)  dari  34  sampel feses  penderita  diare  wisatawan  positif  bakteri E.  coli .  DNA  dari  20  isolat E.coli berhasil  diisolasi dengan  ukuran  sekitar  12000-13000  bp.  Hasil  PCR  dari  20  sampel DNA bakteri E. coli terdapat 5 sampel positif mengandung gen aidA yang ditunjukkan dengan  adanya  pita  DNA  tunggal  dengan  ukuran  sekitar  585  bp.  Keberadaan  gen aidA  yang  menyandi  protein  transport  menunjukkan  sifat  patogenitas,  yang membedakan antara E.coli pathogen dengan E.coli non-patogen
Kata kunci: Diare Wisatawan, E.coli , Gen Protein Transport

## Abstract
This  study  aims  to  isolate  and  determine  the  characteristics  of  the  transport protein- coding  gene  for  E.coli  bacteria  that  cause  traveler's  diarrhea.  Stool  sampling  was performed  at  the  Ubud  Care  Clinic  for tourists  who  checked  diarrhea.  Samples  were cultured  on  Eosin  Methylene  Blue  media.  Suspect  colonies  on  EMB  media  were tested biochemically to confirm the type of bacteria found. E.coli positive isolates were then  subcultured  on  Nutrient  Broth  media,  then  bacterial  DNA  was  isolated  with  the GeneJET Genomic DNA Purification Kit. The isolated DNA was then used as a PCR reaction  template  using  a  pair  of  primers  that  recognized  the  ai-dA  gene  of  E.  coli. Based  on  the  culture  results  on  the  media  Eosin  Methylene  Blue  (EMB)  and  the results of biochemical tests on TSIA, SIM, Simon Citrate media and sugar tests were obtained as many as 20 (59%) from 34 stool samples of diarrhea patients positive E. coli bacteria
Keywords: Traveler's diarrhea, E. coli, Protein Transport Gene

## PENDAHULUAN
Diare  wisatawan  terus  menjadi masalah  kesehatan  yang  paling  sering dialami oleh wisatawan yang mengunjungi negara-negara berkembang terutama negara  dengan  kondisi  sanitasi  yang buruk  (Olson  et  al.,  2019;  Steffen,  2017). Diare  wisatawan  ditandai  dengan  kondisi tinja  yang  tidak  berbentuk  sebanyak  tiga kali  atau  lebih  per  hari,  yang  disertai dengan  satu  atau  lebih  gejala  enterik seperti  sakit  perut  atau  kram.  Gejala tersebut  dialami  oleh  seseorang  setelah kedatangan  pada  suatu  wilayah  dengan tujuan  perjalanan  wisata  (Connor,  2019). Diare wisatawan me-nyebabkan morbiditas  yang  signifikan  seperti  adanya gejala  sisa,  hilangnya  waktu  per-jalanan, dan berkurangnya pendapatan bagi pelaku  wisata  pada  negara  yang  dikun- jungi (Riddle et al., 2017).
Prevalensi diare wisatawan dilaporkan berkisar dari 30% hingga 70%, tergantung  pada  tujuan  dan  musim perjalanan  yang  dilakukan.  Sekitar  25% wisatawan  mengem-bangkan  diare  dalam 2  minggu  pertama  di  luar  negeri,  dengan tingkat  tertinggi  terjadi  ketika  melakukan perjalanan  ke  Afrika  dan  Asia  Selatan, Tengah  dan  Barat  (Pitzurra et  al .,  2010).
Diare  wisatawan  dapat  terjadi  segera setelah  kembali  dan  dapat  dibedakan menjadi  dua  kategori,  yaitu  akut  dan persisten.  Tipe  akut  sebagian  besar disebabkan oleh bakteri dan virus patogen,  biasanya  ringan  dan  dapat sembuh  tanpa  pengobatan.  Sedangkan tipe  persisten  umumnya  oleh  infeksi parasit  seperti  Giardia  dan  Entamoe-ba (Saussure,  2009).  Praktik  kebersihan yang buruk di restoran lokal kemungkinan merupakan  kontributor  terbesar  terhadap risiko terjadinya diare wisatawan (Connor, 2019)
Tingkat  kejadian  diare  wisatawan khususnya  di  Indonesia  belum  banyak dipub-likasikan.  Hasil  survey  suatu  studi melaporkan  angka  kejadian  diare  pada wisatawan yang mengunjungi rumah sakit di  Bali  adalah  5%  dari  2429  kasus  diare. Masih  ada  kemungkinan  insiden  diare wisatawan meningkat jika survei dilakukan di  semua  klinik  di  Bali.  Tingginya  angka diare  wisatawan  dapat  mempengaruhi jumlah kunjungan wisatawan internasional
dan secara tidak langsung mempengaruhi perekonomian masyarakat setempat, terutama  yang  menggunakan  bidang pariwisata  sebagai  salah  satu  sumber pendapatan (Ani, Suwiyoga, 2016).
Terdapat berbagai faktor yang memengaruhi  kejadian  diare  wisatawan antara  lain  faktor  lingkungan, host, dan agen penyebab. Kondisi lingkungan terutama hotel dan restoran, khususnya di Bali  sebagai  daerah  tujuan  utama  wisata di Indonesia dilaporkan bersih tetapi untuk beberapa  tempat  masih belum  memenuhi syarat kesehatan. Wisatawan juga cenderung mengonsumsi makanan daerah  yang  tidak  higienis  sehingga beresiko  mendapatkan  infeksi  bakteri. Faktor host juga  memengaruhi  kejadian diare  wisatawan  seperti  usia,  kebiasaan makan  dan  minum,  sosial  ekonomi, negara  asal,  daerah  yang  dikunjungi, riwayat  profilaksis  atau  persiapan  lain sebelum kunjungan (Ani, Suwiyoga,
2016).
Agen  penyebab  diare  wisatawan terutama adalah bakteri, virus, dan parasit (Steffen  et  al.,  2015).  Bakteri  menjadi penyebab utama diare wisatawan dengan angka kejadian mencapai 80%, sedangkan  virus  menyebabkan  kira-kira 5%  hingga  10%  kasus.  Statistik  ini bervariasi sesuai dengan lokasi geografis, dapat  naik  mencapai  60%  kasus  jika terjadi infeksi campuran (Steffen, 2018).
Bakteri E.coli merupakan  penyebab utama  diare  endemik  dan  epidemik  di dunia.  Secara  genetik,  bakteri E.  coli bervariasi  dan  dapat  menginfeksi  jutaan orang tiap tahunnya (Tang & Saier, 2014).
E. coli dilaporkan sebagai enteropathogen yang  paling  banyak  diisolasi  dari  sampel feses  penderita  diare  wisatawan  (54,1%) di  Denpasar,  lebih  tinggi  dibandingkan jenis  bakteri  enterik  lainnya  seperti Enterobacter,  Klebsiella  pneumonia,  dan Shigella  sp.  Berdasarkan  type  diare  yang dialami wisatawan, diduga diare wisatawan  tersebut  disebabkan  oleh Enterotoxigenic  E.  coli (ETEC)  dan Enteroaggregative  E.  coli (EAEC).  Kedua strain E.coli tersebut  diketahui  memiliki onset cepat mulai dari 8-48 jam (Masyeni et al., 2017).
ETEC) dan EAEC merupakan penyebab  utama  diare  wisatawan  yang
secara  signifikan  berkontribusi  juga  pada mortalitas  bayi  (Tang  &  Saier,  2014). Bakteri ini dapat mengkontaminasi makanan  dan  menyebabkan  diare  pada wisatawan.
Hasil penelitian
lain menunjukkan  dari  40%  sampel  positif E.coli pada penjamah makanan, sebanyak  31,4%  merupakan  subtipe EAEC;  5,7%  subtipe  ETEC;  dan  3% memiliki  kedua  gen  yaitu  ETEC  dan EAEC. Pen-jamah makanan dapat bertindak sebagai carrier berbagai penyakit  infeksi  seperti  diare  (Gitaswari  & Budayanti,  2019).  Selain  dua  strain tersebut,  tipe E.coli Enteropathogenic (EPEC), Enterohaemorrhagic (EHEC), Enteroinvasive (EIEC),  dan Diffusely Adherent (DAEC) juga
dapat menyebabkan diare (Tang & Saier, 2014).
Patogenesis  dari  berbagai  strain E.coli dipengaruhi  oleh  faktor  virulensi seperti  adhesi,  injeksi  protein  pada  sel host, mekanisme signaling, dan kolonisasi yang mengganggu respon imun, kerusakan  membran  sel  dan  manipulasi sitoskeleton.  Selama  tahap  injeksi, E.coli mensekresikan  molekul  efektor  pada  sel host  yang  menggunakan  satu  atau  lebih system  sekresi  protein  dengan  tujuan menghindari system imun atau mengubah jalur signal sel (Tang & Saier, 2014).
Pemberian  vaksin  merupakan  salah satu  cara  untuk  mencegah  diare  yang diakibatkan  infeksi  bakteri E.coli ,  namum vaksin protektif yang luas terhadap E. coli patogen  saat  ini  belum  tersedia. E.  coli diketahui  memiliki  sifat  yang  kompleks dan  terus  berkembang  dari  isolat  non- virulen  menjadi  strain  yang  sangat patogen  (Nesta  &  Pizza,  2018).  Adanya peningkatan  patogenitas,  virulensi,  dan resistensi terhadap multi-obat meningkatkan perhatian terhadap perawatan  kesehatan  dan  membutuhkan upaya  terus  menerus  dalam  pengawasan epidemiologis dan pemantauan penyakit.
Pengetahuan yang berkembang tentang  mekanisme  patogenesis E.  coli dan  respon  imun  yang  dimediasi  setelah infeksi  atau  vaksinasi,  bersama  dengan kemajuan dalam teknologi "omics", membuka perspektif baru terhadap desain dan  pengembangan  vaksin E.  coli yang efektif dan inovatif. Pengembangan vaksin alternatif  terhadap E.  coli penyebab  diare
perlu terus diupayakan dengan memperhatikan pathogenesis infeksi sehingga bisa menghasilkan proteksi yang lebih  baik  dengan  efek  samping  yang kecil.
Sejumlah  protein  transport  telah diketahui  berperan  dalam  patogenesis diare sehingga pemahaman tentang ekspresi,  lokasi,  dan  regulasi  protein setelah  infeksi  penting  untuk  mendesain terapi  (Das  et  al.,  2018).  Salah  satu  jenis protein  transport  yang  berperan  dalam patogenesis E. coli adalah protein adhesin.  Protein  ini  berperan  memediasi penempelan  bakteri E.  coli pada  sel  host dan  merupakan  salah  satu  mekanisme penting  dalam  proses  infeksi.  Protein adhesin  merupakan  faktor  virulensi  yang signifikan  berperan  dalam  kolonisasi bakteri  pada  usus  dan  pembentukan biofilm.  Protein  adhesin  dikode  oleh  gen aidA  yang  terdapat  pada  genom  bakteri E.coli patogen.  Gen  aidA  pertama  kali diidentifikasi dan dikarakterisasi dari bakteri E.coli penyebab  diare  pada neonatal (Ravi, 2006).
Identifikasi gen aidA dapat dilakukan dari  strain  bakteri E.  coli penyebab  diare dari  berbagai  serotype.  Gen  kemudian dapat diisolasi dan
dikloning menggunakan plasmid untuk dapat diekspresikan  menjadi  protein  adhesin. Saat  ini,  berbagai  macam  protein  yang dihasilkan  oleh  bakteri  dapat  dijadikan protein  rekombinan  dan  dikembangkan sebagai  kandidat  vaksin  sub  unit.  Pada penelitian  ini,  gen  aidA  yang  merupakan penyandi protein adhesin diidentifikasi dan diisolasi dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Penelitian ini merupakan tahap  awal  untuk  pengembangan  protein adhesin  sebagai  vaksin  subunit  terhadap E.coli khususnya penyebab diare wisatawan. Penelitian tentang penggunaan  protein  adhesin  sebagai kandidat  vaksin E.  coli khususnya  di Indonesia belum banyak dilakukan. Penelitian ini diharapkan membuka peluang penemuan vaksin alternatif terhadap  infeksi E.coli pathogen  yang berbasis protein rekombinan.

## METODE

## Jenis Penelitian
Jenis  penelitian  yang  digunakan adalah penelitian deskriptif dengan mengidentifikasi  bakteri E.coli penyebab diare  wisatawan  menggunakan  metode konvensional  dan  molekuler  berdasarkan keberadaan  gen  aidA  pengkode  protein transport.

## Waktu dan tempat
Penelitian dilakukan dari bulan September  2019  -  November  2019. Pengambilan  sampel  feses  dilakukan  di Ubud  Care  Clinic ,  Ubud,  Gianyar  pada wisatawan  yang  melakukan  pemeriksaan diare.  Identifikasi  bakteri E.coli dari sampel  feses  dilakukan  di  Laboratorium Bakteriologi Jurusan Teknologi
Laboratorium  Medis  Poltekkes  Kemenkes Denpasar.  Isolasi  DNA  dan  identifikasi gen aida dengan teknik PCR dilakukan di
Laboratorium  Biologi  Molekuler  Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Warmadewa.

## Sampel Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  sampel feses  yang  diperoleh  dari  34  wisatawan yang  melakukan  pemeriksaan    diare  di Ubud Care Clinic , Gianyar.

## Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu biosafety  cabinet (Biobase), inkubator (T01892-Esco), mesin  PCR  (Biometra),  alat  elektroforesis (Biometra),  alat  pembacaan  UV  Solo (Sientra BD), magnetic dan stirrer (Jisico), autoclave (SX-500, TOMY), oven (wagtech), micropipet
50- 500
μl (Socorec),  neraca  analitik  (Radwag), vortex, dan water bath.
Bahan-bahan yang digunakan yaitu media  NB  (Oxoid),  tabung  eppendorf, pasangan  primer  spesifik  Aida1-  F ACAGTATCATATGGAGCCA  dan  Aida1- R TGTGCGCCAGAACTATTA, buffer TAE,  proteinase  K,  RNAse  A solution , etanol  50%,  bubuk  agarosa,  GenJet Genomic  DNA Purification  Kit ( Thermo scientific ),  loading  dye,  PCR  Mix,  dan ddH 2 O.

## Prosedur Kerja
Sampel  feses  dikoleksi  dari  34 wisatawan  yang  melakukan  pemeriksaan diare  di Ubud  Care  Clinic ,  Gianyar. Sampel dikultur pada media selektif Eosin Metilen Blue (EMB)  yang  diinkubasi  pada suhu  37  oC  selama  24  jam.  Koloni tersangka E.coli pada media EMB dikonfirmasi  dengan  uji  biokimia  pada media  TSIA,  SIM,  simon  citrat,  dan  gula- gula  dengan E.coli ATCC  25922  sebagai standar kuman.  Koloni yang teridentifikasi E.coli dikultur  pada  media  Nutrien  Broth pada suhu inkubasi 37o C selama 24 jam. DNA E.coli diisolasi  dari  hasil  kultur  pada media  Nutrien  Broth  dengan  GeneJET Genomic DNA Purification Kit . DNA E.coli hasil  isolasi  digunakan sebagai  template  untuk  reaksi  PCR dengan  menggunakan  pasangan  primer gen
Aida,
yaitu Forward-
ACAGTATCATATGGAGCCA dan Revers-
TGTGCGCCAGAACTATTA.  Reaksi  PCR dilakukan  dengan  mencampur-kan  25  ul PCR Mix, 2 μl primer Forward , 2 μl primer Revers ,  5  μl  DNA Template ,  dan  16  μl nuclease  free  water .  Campuran  reaksi kemudian  dimasukkan  ke  dalam  mesin PCR thermo cycle r dengan suhu
Predenaturasi (94°C,15 menit), Denaturasi    (94  °C,  45  s),  Anealing    (57 °C,  30),  Ekstensi  (72  °C,  45  s),  Post ekstensi  (  72  °C,  10  menit)  dengan  35 Siklus. Hasil PCR dielektroforesis menggunakan  gel  agarose  1.5  %  selama 45  menit,  kemudian  pita  DNA  dibaca menggunakan UV gel documentation

## Metode Pengumpulan Data
Data dikumpulkan melalui
pemeriksaan laboratorium terhadap sampel, hasil isolasi bakteri E.coli dengan metode  kultur,  isolasi  DNA  total  dengan GeneJet  Genomic  DNA Purification  Kit , dan isolasi gen aidA dengan teknik PCR.

## Analisis Data
Analisis data yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  analisis  deskriptif, dengan menggambarkan dan mengkarakterisasi  gen  pengkode  protein transport  yang  diisolasi  dari  bakteri E.coli penyebab diare wisatawan

## HASIL DAN PEMBAHASAN HASIL PENELITIAN
Isolasi  Bakteri  E.coli  dari  Penderita Diare Wisatawan
Berdasarkan  hasil  kultur  pada  media Eosin  Metilen  Blue  (EMB)  dan  hasil  uji
biokimia  pada  media  TSIA,  SIM,  Simon Citrat  dan  uji  gula-gula  didapatkan sebanyak 20 (59 %) dari 34 sampel feses penderita  diare  wisatawan  positif  bakteri E.coli (Tabel 1).
Tabel 1. Hasil Pemeriksaan Bakteri E.coli dari sampel feses penderita diare No Hasil Pemeriksaan Jumlah Sampel % 1 Positif Escherichia coli 20 59 2 Negatif Escherichia coli 14 41 TOTAL 34 100 Bakteri E.coli pada  media  Eosin Metilen  Blue  memilki  ciri  khas  yaitu berwarna hijau Metalik dengan permukaan  rata  dan  terdapat  bintik  hitam di  tengah  koloni.  Hasil  subkultur  bakteri
E.coli pada  media  EMB  ditunjukkan  pada gambar di bawah ini (Gambar 1).
Gambar 1. Hasil isolasi Bakteri E.coli pada media EMB
Hasil  Isolasi  DNA  Bakteri  Escherichia coli
Isolat  bakteri E.coli yang  didapatkan sesuai hasil pemeriksaan di atas selanjutnya  digunakan  sebagai  sumber untuk  mengisolasi  DNA  bakteri E.coli . Masing-masing  isolat  diremajakan  pada media Nutrient  Broth selama  24  jam
kemudian  DNA  bakteri  diisolasi  dengan GeneJET  Genomic  DNA  Purification  Kit. DNA dari 20 sampel E.coli penyebab diare wisatawan berhasil diisolasi dengan ukuran  pita  DNA  sekitar  12.000-13.000 bp.  Hasil  isolasi  DNA  ditunjukkan  pada Gambar 2 di bawah ini :
Gambar 2 Hasil isolasi DNA dari isolat bakteri Escherichia coli Ket  : M (Marker 100 bp), S1-S20 (Sampel 1-20)
M    S1    S2    S3    S4    S5    S6   S7    S8    S9   S10 M    S11  S12   S13   S14   S15  S16   S17   S18  S19   S20
Hasil Amplifikasi Gen Pengkode Protein Tranport E.coli dengan Teknik

## PCR
Reaksi  PCR  dalam  penelitian  ini menggunakan pasangan  primer Forward - ACAGTATCATATGGAGCCA dan Revers - TGTGCGCCAGAACTATTA  yang  spesifik mengenali  gen  aidA  pengkode  protein adhesin  pada  bakteri E.coli .  Hasil  PCR
menunjukkan 5 dari 20 sampel DNA E.coli penyebab  diare  wisatawan  memiliki  gen aidA  pengkode  protein  adhesin  dengan ukuran  pita  DNA  sekitar  585  bp.  Hasil PCR  dari  masing-masing  sampel  DNA E. coli penyebab diare wisatawan ditunjukkan pada Gambar 3 di bawah ini :
Gambar 3. Hasil PCR gen aidA pada bakteri E. coli penyebab diare wisatawan Ket  : M (Marker 100 bp), S1-S20 (Sampel 1-20)

## PEMBAHASAN
E.  coli penyebab  diare  wisatawan pada  penelitian  ini  diisolasi  pada  media EMB.  Media  EMB  merupakan  media selektif dan diferensial untuk menumbuhkan bakteri E. coli. Pada media ini,  bakteri E.  coli memfermentasi  laktosa dan  memproduksi  asam.  Suasana  asam pada media menyebabkan indikator warna asam  bekerja  dan  mengubah  warna media  menjadi  kehijauan  (Gambar  1). EMB secara selektif menumbuhkan
bakteri enterik gram negatif dan
menghambat  pertumbuhan  bakteri  gram positif  termasuk  pertumbuhan  yeast. Media  ini  mengandung  zat  pewarna metilen  blue  yang  bersifat  toksik  pada mikroorganisme  tersebut  kecuali  pada kelompok  bakteri  enterik.  Bakteri E.  coli pada media ini menunjukkan warna koloni yang  khas  yaitu  hijau  metalik  (Antony  et al.,  2016).  Ciri  ini  membedakan E.  coli dengan  bakteri  enterik  lain  yang  tumbuh pada media EMB.

## M      S1      S2      S3     S4     S5      S6      S7    S8      S9    S10   S11
M       S12      S13    S14    S15     S16     S17    S18     S19     S20
500 bp 500 bp
Koloni  yang  berwarna  hijau  metalik kemudian diuji biokimia untuk mengkonfirmasi  hasil  pemeriksaan  yang didapatkan. Berdasarkan hasil uji biokimia yang telah dilakukan, koloni-koloni tersebut menunjukkan hasil yaitu memfermentasi  ketiga  gula  pada  media TSIA,  motilitas  positif,  indol  positif,  uji pada  media  gula-gula  (glukosa,  laktosa, sukrosa,  manitol,  maltosa)  positif,  dan negatif pada uji sitrat. Hasil uji biokimia ini sesuai  dengan  karakteristik  biokimiawi bakteri E.  coli (Lupindu,  2017;  Hidayati et al . 2016)
Bakteri E. coli merupakan jenis bakteri yang  menjadi  penyebab  umum  kejadian diare.  Penelitian  oleh  Masyeni et  al . (2017)  mendapatkan  sebanyak  54,1  % kasus  diare  wisatawan  di  Denpasar disebabkan  oleh E.  coli .  Hasil  yang  tidak jauh  berbeda  didapatkan  pada  penelitian ini,  yaitu  sebanyak  59  %  kejadian  diare wisatawan  di  wilayah  Ubud  disebabkan oleh E.coli. Penelitian lain oleh Ericsson et al .  (2007)  menunjukkan E.coli merupakan enteropatogen yang paling sering diidentifikasi  dalam  kultur  tinja  sebelum pengobatan  pada  kasus  diare  wiatawan. Enterotoxigenic  E.coli diidentifikasi  pada 109 (36%) dari 306 sampel yang diuji, dan enteroaggregative E.coli , terdeteksi dalam  50  (16%)  dari  306  sampel.  Vila et al .,  (2001)  sebelumnya  telah  melaporkan isolat Enteroaggregative  E.coli sebagai penyebab  diare  perjalanan  pada  50  (9%) dari 517 pasien dan menunjukkan adanya peningkatan
resistensi
terhadap quinolone.
Bakteri
E.coli penyebab
diare wisatawan dalam penelitian ini merupakan jenis E.coli patogen yang dapat dibedakan dengan E.coli tipe  komensal  berdasarkan faktor  virulensi  yang  dimiliki.  Jenis E.coli patogen memiliki daya tahan dan berbagai faktor virulensi yang meningkatkan
patogenitasnya
sehingga dapat menimbulkan  diare  pada  wisatawan. Menurut  Gebisa et  al. (2019)  beberapa strain E.coli patogen menyebabkan penyakit diare dan dikategorikan ke dalam kelompok  spesifik  berdasarkan  sifat  viru- lensi,  mekanisme  patogenisitas,  sindrom klinis,  dan  serogrup  O:H  yang  berbeda. Beberapa  faktor  virulensi  paling  penting dari E.coli antara  lain  yaitu  resistensi
terhadap asam; keberadaan berbagai tipe protein  adhesi  seperti  fimbriae,  fibrillae, curli dan protein membran luar; penggunaan  sistem  sekresi  tipe  III  untuk mengubah  jalur  pensinyalan  sel  dengan menyuntikkan  protein  yang  virulen  ke dalam sitoplasma sel inang seperti protein alkaline phosphatase yang dikodekan oleh gen  Pho  dan  berbagai  jenis  toksin  yang meningkatakan  virulensi E.coli di  dalam sel inang.
Selain  faktor  adanya  virulensi E.coli yang meningkatkan kerentanan
wisatawan terhadap diare, berbagai faktor lain  dapat  menyebabkan  terjadinya  diare wisatawan.  Bakteri E.coli merupakan indikator  sanitasi  lingkungan  yang  dapat mengkontaminasi  air,  makanan,  atau minuman.  Wisatawan  dapat  mengalami intoleransi  makanan  atau  malabsorpsi karena kebersihan makanan atau minuman  yang  tidak  memadai  (Wahyuni et  al .,  2019).  Faktor  risiko  lain  yang menjadi  penyebab  diare  perjalanan  pada wisatawan  asing  di  Bali  meliputi  usia wisatawan,  lama  tinggal,  dan  perilaku mencuci  tangan  (Ani,  Suwiyoga,  2016). Diare  wisatawan  biasanya  terjadi  di daerah  dengan  keadaan  sanitasi  dan higienitas  masih  kurang  (Steffen,  2017). Wahyuni et al . (2019) dalam penelitiannya melaporkan  konsumsi  makanan  jalanan dan  makanan  tradisional  hasil  olahan daging  babi  ditemukan  terkait  dengan kejadian diare pada wisatawan asing saat berkunjung  ke  Bali.  Menurut  Bauch  and DuPon  (2011)  faktor  genetik  juga  dapat memengaruhi kerentanan wisatawan terhadap  diare.  Individu  dapat  mengalami variasi  kerentanan  karena  predisposisi genetik  yang  muncul  akibat  adanya polimorfisme  nukleotida  tunggal.  Variasi ini  mengakibatkan  perbedaan  dalam regulasi ekspresi protein penanda inflamasi yang terkait diare .
DNA E. coli diisolasi sebagai template untuk  reaksi  PCR  gen  aidA  pengkode protein  transport E.coli .  DNA  bakteri E.coli berhasil  diisolasi  yang  ditunjukkan dengan  adanya  pita  DNA  tunggal  pada hasil pembacaan elektroforesis gel agarosa pada Uvdoc (Gambar 2). Elektroforesis gel agarosa berperan sebagai sirkuit elektrik untuk memisahkan fragmen-fragmen
DNA berdasarkan
jumlah  nukleotida  penyusunnya.  Semakin kecil  ukuran  pasang  basa  nukleotidanya, akan  semakin  mudah  bermigrasi  dan berada  di  bagian  gel  yang  dekat  dengan anoda  (Radji et  al .,  2010).  DNA  pada  gel agarosa  akan  berpendar  saat  disinari dengan  cahaya  UV  karena  pada  gel terdapat  staining  gel.  Senyawa  ini  akan berinterkalasi  diantara  struktur  molekul asam nukleat dan menyebabkan timbulnya pendaran berupa pita DNA saat disinari UV. Setelah dibandingkan dengan marker,  band  yang  muncul  memiliki genom  DNA  berukuran  lebih  dari  10.000 bp yakni berkisar antara 12.000-13.000bp.
Isolasi DNA dengan prosedur menggunakan  GenJet  Genomic  DNA Purification  Kit dalam  penelitian  ini menunjukkan  kualitas  hasil  yang  cukup baik.  Prosedur  ekstraksi  yang  dikerjakan relatif lebih sederhana dan cepat dibandingkan  prosedur  ekstraksi  standar. Pita  DNA  yang  didapatkan  berupa  pita tunggal,  tampak  tebal  dan  jelas,  serta tidak  tampak  smear  yang  menandakan rendahnya  kontaminasi  baik  oleh  RNA maupun  protein.  Kemurnian  DNA  yang akan  digunakan  sebagai template sangat penting untuk meningkatkan efisiensi saat reaksi  PCR.  Ammazzalorso et  al .  (2015) dengan  kit  ekstraksi  DNA  yang  sama mendapatkan  kualitas  DNA  paling  tinggi dan hasil PCR yang konsisten dibandingkan esktraksi DNA menggunakan prosedur
standar.
Ravintheran et  al .  (2019)    menggunakan prosedur  ekstraksi  yang  sama  untuk mengisolasi genom bakteri Sphingomonas paucimobilis untuk  tujuan  sekuensing. Sedangkan  Juhas  and  Ajioka  (2016) menggunakan prosedur ini untuk mendapatkan  genom Bacillus  subtilis untuk tujuan rekayasa genetika.
Reaksi  PCR  dalam  penelitian  ini menggunakan pasangan  primer Forward - ACAGTATCATATGGAGCCA dan Revers - TGTGCGCCAGAACTATTA  yang  spesifik mengenali  gen  aidA  pengkode  protein adhesin  pada  bakteri E.coli .  Hasil  PCR menunjukkan  5  dari  20  sampel E.coli penyebab  diare  wisatawan  memiliki  gen aidA  pengkode  protein  adhesin  dengan ukuran  pita  DNA  sekitar  585  bp  (Gambar 3).
Keberadaan gen aidA pengkode protein  transport  pada  sampel  tersebut menun-jukkan  sifat  patogenitas,  yang membedakan antara E.coli patogen dengan E.coli non-patogen.  Pada E.coli patogen  memiliki  system  sekresi  yang akan  melepaskan  protein  ke  permukaan sel  atau  menginjeksikan  suatu  protein efektor ke dalam sel inang (Tang & Saier, 2014).  Beberapa  strain E.coli telah dikarakterisasi sebagai agen etiologi diare baik  pada  anak-anak  maupun  orang dewasa,  antara  lain    Enteropathogenic E.coli (EPEC),  Verocytotoxigenic E.coli (VTEC),  Enterotoxigenic E.coli (ETEC),
Enteroaggre-gative E.coli (EAEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) dan
Diffusely Adherent E.coli (DAEC) (Zhang et al., 2016).
Pasangan  primer  yang  digunakan dalam  reaksi  PCR  ini  memiliki  sekuen yang spesifik terhadap gen aidA pengkode  protein  adhesin E.coli .  Gen aidA  secara  alami  ditemukan  pada  strain Enteroaggregative E.coli (EAEC)
O126:H127  yang  menyebab-kan  penyakit diare  pada  anak  (Sherlock  et  al.,  2004). Strain  Enteroaggregative E.coli (EAEC) saat ini diketahui menjadi penyebab diare persisten pada anak, diare pada wisatawan,  dan  diare  terkait  penyakit AIDS  di  negara  berkembang  dan  industri (Zhang et al., 2016).
Protein  aidA  merupakan  salah  satu type protein adhesin yang berperan dalam penempelan bakteri E.coli pada permukaan  sel  manusia.  Protein  aidA termasuk  jenis  auto-transporter  protein yang terkait dengan faktor virulensi E.coli . Protein ini memuat semua informasi yang diperlukan  untuk  proses  transfer  molekul dalam sistem mem-bran bakteri (Sherlock et  al.,  2004).  Protein  ini  juga  digunakan untuk tampilan per-mukaan enzim, sebagai  inhibitor  enzim,  antigen  yang potensial  untuk  perkembangan  vaksin, dan berbagai aplikasi lainnya (Gustavsson et al., 2011).
Pada  penelitian  ini  gen  aidA  berhasil diisolasi  dari  DNA E.coli penyebab  diare wisatawan  dengan  ukuran  pita  DNA sekitar 585 bp. Gen aidA pada penelitian- penelitian sebelumnya berhasil
diidentifikasi  pada E.coli penyebab  diare pada ternak. Ravi, (2006) dalam
penelitiannya  berhasil  mengisolasi  gen aidA dari E.coli penyebab diare pada babi dengan  ukuran  DNA  sesuai  dengan  hasil penelitian  ini.  Kanengoni  et  al.  (2017) juga  menemukan  strain E.coli penyebab diare  pada  babi  yang  positif  mengandung gen  aidA  berdasarkan  hasil  PCR  dengan ukuran  585  bp.  Torres  et  al.  (2005) melaporkan  bahwa  protein  aidA  berperan sebagai  faktor  adhesi E.coli pada permukaan  sel  HeLa  manusia.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  gen  aidA  bersifat virulen dan mengekspresikan protein yang terkait dengan pathogenesis E.coli penyebab  diare  baik  pada  manusia maupun hewan ternak.
Berdasarkan hasil PCR dalam penelitian  ini,  terdapat  5  sampel  yang mengindikasikan  adanya  strain E.coli patogen  penyebab  diare  wisatawan  di wilayah  Ubud.  Sampel E.coli dengan hasil  negatif  dapat  berasal  dari  strain E.coli pathogen lainnya yang juga mampu menimbulkan  diare  pada  wisatawan. Identifikasi  lebih  lanjut  ter-hadap  sampel- sampel  tersebut  perlu  dilakukan  dengan menggunakan primer yang secara spesifik mengenali  strain-strain E.coli pathogen penyebab diare wisatawan

## SIMPULAN Kesimpulan
Sebanyak  20  (59  %)  dari  34 penderita  diare  wisatawan  di  wilayah Ubud  disebabkan  oleh  bakteri E.coli . DNA E.coli penyebab  diare  wisatawan berhasil diisolasi dengan ukuran pita DNA 12000-13000 bp. Hasil pemeriksaan dengan  PCR  didapatkan  5  isolat E.coli memiliki  gen  aidA  pengkode  protein transport dengan ukuran DNA sekitar 585 bp.

## Saran
Perlu  diidentifikasi  lebih  lanjut  strain E.coli penyebab diare wisatawan dengan menggunakan  primer  terhadap  gen-gen pengkode  protein  transport  lainnya.  Gen aidA  pengkode  protein  transport E.coli yang  didapatkan  perlu  dikarakterisasi lebih  lanjut  sebelum  dilakukan  kloning menggunakan plasmid yang sesuai dalam rangka pengembangannya sebagai kandidat  vaksin  sub-unit  terhadap E.coli penyebab diare wisatawan.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Kami mengucapkan terimakasih kepada  Poltekkes  Kemenkes  Denpasar yang mendanai penelitian ini dengan surat kontrak penelitian No.
DP.02.02/PPK/5376/2019  dan  atas  izin menggunakan fasilitas penelitian di laboratorium  Bakteriologi  Jurusan  Analis Kesehatan.  Kami  juga  mengucapkan terimakasih  kepada  Ubud  Care  Clinic, Gianyar  atas  izin  pengambilan  sampel penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Ammazzalorso,  A.  D.,  Zolnik,  C.  P.,  & Daniels, T. J. 2015. To beat or not to beat  a  tic k :  comparison  of  DNA extraction methods for ticks ( Ixodes scapularis ). PeerJ, 1 –14.
Ani,  L.  S.,  &  Suwiyoga,  K.  2016.  Traveler ’s  diarrhea  risk  factors  on  foreign tourists  in  Denpasar  Bali-Indonesia. 5(1), 152 –156. Antony,  A.  C.,  Paul,  M.  K.,  Silvester,  R.,
Aneesa, P. A., Suresh, K., Divya, P. S.,  Paul,  S.,  Fathima,  P.  A.,  & Abdulla,  M.  H.  2016.  Comparative Evaluation of EMB Agar and
Hicrome E . coli Agar for Differentiation  of  Green  Metallic Sheen  Producing  Non  E  .  coli  and Typical  E  .  coli  Colonies  from  Food and Environmental Samples. Journal of  Pure  and  Aplied  Microbiologu, 10(4).
Bauch,  J.  de  la  C.,  &  DuPon,  H.  L.  2011. New  Developments  in  Traveler ’s Diarrhea.Gastroenterology&Hepatol ogy, 7(2), 88 –95.
Connor,  B.  A.  2019 .  Travelers’  Diarrhea. In  Yellow  Book.  National  Center  for Emerging  and  Zoonotic  Infectious Diseases  (NCEZID),  Division  of Global  Migration  and  Quarantine (DGMQ).
https://wwwnc.cdc.gov/travel/yellowb ook/2020/preparing-international- travelers/travelers-diarrhea .
Das,  S.,  Jayaratne,  R.,  &  Barrett,  K.  E. 2018.  The  Role  of  Ion  Transporters in  the  Pathophysiology  of  Infectious Diarrhea.  Cellular  and  Molecular Gastroenterology  and  Hepatology, 6(1).
Ericsson, C. D., Ke, S. H. I., Huang, D. B., Dupont,  M.  W.,  Adachi,  J.  A.,
Cabada, F. J. D. E. L. A., Taylor, D.
N.,  Jaini,  S.,  &  Sandoval,  F.  M.
(2007).  Treatment  of  Travelers’ Diarrhea: Randomized Trial Comparing Rifaximin, Rifaximin Plus Loperamide, and Loperamide Alone. CLINICAL  GASTROENTEROLOGY
AND HEPATOLOGY, 5, 451 –456.
Gebisa, E. S., Gerasu, M. A., & Leggese,
D.  T.  2019.  A  Review  on  Virulence Factors  of  Escherichia  Coli. Animal and  Veterinary  Sciences .  7(3).  83 – 93.
Gitaswari,  D.  A.  I.,  &  Budayanti,  S.  2019.
Identifikasi  Subtipe  Enterotoxigenic Escherichia coli dan Enteroaggregative  Escherichia  coli dari Spesimen Usap Dubur Penjamah  Makanan  di  Denpasar Menggunakan  Polymerase  Chain
Reaction. E-Jurnal Medika Udayana . 8(1). 7 –11.
Gustavsson, M., Bäcklund, E., & Larsson, G.  2011.  Optimisation  of  surface expression using the AIDA autotransporter. Microbial Cell Factories . 10(72). 1 –10.
Juhas,  M.,  &  Ajioka,  J.  W.  (2016).
Integrative bacterial artificial chromosomes  for  DNA  integration into the Bacillus subtilis chromosome. Journal of
Microbiological Methods . 125. 1 –7.
Kanengoni,  A.  T.,  Thomas,  R.,  Gelaw,  A.
K., & Madoroba, E. 2017. Epidemiology and characterization of Escherichia  coli  outbreak  on  a  pig farm in South Africa. FEMS Microbiology Letters . 364(3). 1 –7.
Lupindu,  A.  M.  2017.  Isolation  and
Characterization  of  Escherichia  coli from Animals,
Humans, and Environment. Licensee InTech. Masyeni, S., Sukmawati,
H.,
Paramasatiari,  L.,  Aryastuti,  S.  A., Somia,  K.  A.,  Kambayana,  G., Astika,  N.,  Duarsa,  R.,  &  Merati,  T. P. 2017. Diarrhea Among International Travelers in BaliIndonesia: Clinical and Microbiological Finding. International
Journal  of  Travel  Medicine  and Global Health . 5(3). 84 –88.
Nesta,  B.,  &  Pizza,  M.  2018.  Vaccines Against  Escherichia  Coli. Curr  Top Microbiol Immunol , 416, 213 –242.
Olson, S., Hall, A., Riddle, M. S., & Porter, C.  K.  2019 .  Travelers  ’  diarrhea : update  on  the  incidence  ,  etiology and  risk  in  military  and  similar populations –  1990-2005  versus 2005 – 2015 , does a decade make a  difference? Trop  Dis  Travel  Med Vaccines . 5(1). 1 –15.
Pitzurra,  R.,  Steffen,  R.,  Tschopp,  A.,  & Mutsch,  M.  2010.  Diarrhoea  in  a large prospective cohort of European travellers to
resource-limited destinations. BMC Infect Dis . 10(231). 1 –9. Radji, M., Puspaningrum, A., & Sumiati, A. 2010. Deteksi Cepat
Bakteri Escherichia  coli  dalam  Sampel  Air dengan  Metode  Polymerase  Chain Reaction Menggunakan Primer 16E1 dan 16E2. Makara Sains . 14(1). 39 – 43.
Ravi,  M.  B.  2006.  Pathogenesis  and clinical significance of AIDA-I- positive  E  .  coli  in  diarrhea  of  pigs. University of Saskatchewan.
Ravintheran,  S.  K.,  Sivaprakasam,  S., Loke,  S.,  Lee,  S.  Y.,  Manickam,  R., Yahya,  A.,  Croft,  L.,  &  Millard,  A. 2019.  Complete  genome  sequence of Sphingomonas paucimobilis AIMST  S2  ,  a  xenobiotic-degrading bacterium.  Scientific  Data,  6(280),
1 –6.
Riddle, M. S., Connor, B. A., Beeching, N. J.,  Dupont,  H.  L.,  Hamer,  D.  H., Kozarsky,  P.,  Libman,  M.,  Steffen, R., Taylor, D., Tribble, D. R., Vila, J., Zanger,  P.,  &  Ericsson,  C.  D.  2017. Guidelines  for  the  prevention  and treatment  of  travelers  ’  diarrhea :  a graded  expert  panel  report. Journal of Travel Medicine , 24(1), 63 –68.
Saussure, P. P. H. De. 2009.
Management of the Returning
Traveler  with  Diarrhea. Therap  Adv Gastroenterol . 2(6). 367 –375.
Sherlock,  O.,  Schembri,  M.  A.,  Reisner, A.,  &  Klemm,  P.  2004.  Novel  Roles for the AIDA Adhesin from Diarrheagenic  Escherichia  coli :  Cell Aggregation  and  Biofilm  Formation.
Journal  of  Bacteriology .  186(23). 8058 –8065.
Steffen, R. 2017. Epidemiology of Travellers’  Diarrhea. Journal  of Travel Medicine . 24(1). 2 –5.
Steffen,  R.  2018.  Emerging  Options  for the  Management  of  Travelers’ Diarrhea. Gastroenterology & Hepatology . 14(12). Steffen,  R.,  Hill,  D.  R.,  &  DuPont,  R.  L. 2015 . Traveler’s Diarrhea: A Clinical
Review. JAMA . 313(1). 71 –80.
Tang,  F.,  &  Saier,  M.  H.  2014.  Transport proteins  promoting  Escherichia  coli pathogenesis. Microb  Pathog .  41 –
55.
Torres,  A.  G.,  Zhou,  X.,  &  Kaper,  J.  B. 2005.  Adherence  of  Diarrheagenic
Escherichia  coli  Strains  to  Epithelial Cells. Infection And Immunity . 73(1).18 –29.
Vila,  J.,  Vargas,  M.,  Ruiz,  J.,  Espasa,  M., &  Pujol,  M.  2001.  Susceptibility patterns of enteroaggregative Escherichia  coli  associated  with traveller ’ s diarrhoea : emergence of quinolone
resistance. J Med Microbiol . 50. 996 –1000.
Wahyuni,  N.  W.  M.  S.,  Wirawan,  I.  M.  A., &  Hendrayana,  M.  A.  2019.  Risks factors for diarrhea among travellers visiting  Bali. Public  Health  and Preventive Medicine Archive (PHPMA) , 7(2), 121 –126.
Zhang,  R.,  Gu,  D.,  Huang,  Y.,  Chan,  E. W.,  Chen,  G.,  &  Chen,  S.  2016.
Comparative genetic characterization of Enteroaggregative  Escherichia  coli strains  recovered  from  clinical  and non-clinical settings.
Nature Publishing Group . 1 –9.