Deteksi Imunoglobulin G dengan Immunoblotting Pasca Imunisasi Subkutan Protein Hemaglutinin Pili Klebsiella pneumoniae 12,8 kDa pada Mencit BALB/C
Immunoblotting Detection of Immunoglobulin G Post Subcutaneous Immunization Of Protein Hemaglutinin Pili Klebsiella pneumoniae 12,8 kDa on Mice BALB / C
Dini Agustina
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jalan Kalimantan No. 37 Kampus Tegalboto, Jember 68121 dini.agustina83@gmail.com

## Abstrak
Klebsiella  pneumoniae menjadi  penyebab  kedua  terbanyak  dari  Infeksi  komunitas  dan  infeksi  nosokomial  akibat bakteri  Gram  negatif.  Bakteri  ini  mampu  menginduksi  timbulnya  respon  imun,  terutama  respon  imun  humoral, imunitas  humoral  berperan  melalui  aktifnya  sel  B  yang  menghasilkan  antibodi.Antibodi,  terutama  IgG  akan menyebabkanbakteri  berkapsul  seperti Klebsiella  pneumoniae dapat  difagositosis  dengan  lebih  baik.  Tujuan penelitian  ini  adalahUntuk  mengetahui  respons  IgG  terhadap  protein  hemaglutinin  pili K.pneumoniae 12,8  kDa . Metode  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  metode Immunoblotting dengan western  blot dan dot  blot . Antibodi primer yang digunakan untuk uji western blot dan dot blot diisolasi dari serum mencit BALB/C yang telah diinduksidengan protein hemaglutinin pili K.pneumoniae 12,8 kDa secara subkutan. Untuk mendapatkan standard dalam  menilai  hasil dot  blot digunakan  program Corel  Photo-paint X6.Hasil  penghitungan dot  blot secara  semi kuantitatif  didapatkan  titer  pengenceran  antibodi  dengan  reaksi  terkuat  adalah  pada  1/100  sedangkan  titer pengenceran antigen pada 1/10.000. Hasil dari western blotting menunjukkan reaksi positif dari subunit protein pili dengan berat molekul 128,1 kDa, 114,4 kDa, 64,9 kDa, 31,1 kDa, 27,7 kDa, 24,8 kDa, 20,9 kDa, 12,8 kDa, dan 10 kDa.  Kesimpulan  penelitian  ini  adalah  pemberian  imunisasi  protein  hemaglutinin  pili K.pneumoniae 12,8  kDa secara subkutan mampu menginduksi pembentukan Immunoglobulin G pada mencit BALB/C
Kata kunci: K. Pneumoniae , IgG, protein hemaglutinin 12,8 kDa

## Abstract
Klebsiella pneumoniae is the second most common cause of community infection and nosocomial infections due to Gram-negative  bacteria.  These  bacteria  are  able  to  induce  the  onset  of  immune  response,  especially  humoral immune  response.Humoral  immunity  acts  through  the  activation  of  B  cells  that  produce  antibodies.  Antibodies, especially  IgG,  will  cause  encapsulated  bacteria  such  as Klebsiella  pneumoniae to  be  better  phagocytosed.  The purpose of this  study was to determine the IgG response  to hemagglutinin protein  pili K. pneumoniae 12.8 kDa. The  method  used  in  this  research  is  Immunoblotting  method  with  western  blot  and  dot  blot.  The  primary antibodies used for the western blot and dot blot tests were isolated from BALB / C mice serum induced with the subcutaneous pili K. pneumoniae 12.8 kDa protein. To get  the standard in assessing the results of dot  blot were used Corel Photo-paint X6. The semi-quantitative result of dot blot was obtained with the strongest reaction of the antibody dilution at 1/100 while the antigen dilution titer at 1 / 10.000. Results from western blotting showed a positive reaction of the pili protein subunit with a molecular weight of 128.1 kDa, 114.4 kDa, 64.9 kDa, 31.1 kDa, 27.7  kDa,  24.8  kDa,  20.9  kDa,  12.8  kDa,  and  10  kDa.  The  conclusion  of  this  study  is  the  immunization  of hemagglutinin pili K. pneumoniae 12.8 kDa subcutaneously capable of inducing the formation of Immunoglobulin G in BALB / C mice.
Keywords : K. Pneumoniae , IgG, hemagglutinin protein 12,8 kDa

## Pendahuluan
Klebsiella  pneumoniae adalah  bakteri  yang  masuk dalam  famili  Enterobactericeae  yang  merupakan bakteri  gram  negatif,  berbentuk  batang,  non-motil, berkapsul  dan  bersifat  fakultatif  anaerob  (Janda  et al, 2006; Murray et al, 2007). K.pneumoniae menjadi penyebab  kedua  terbanyak  dari  Infeksi  komunitas dan  infeksi  nosokomial  akibat  bakteri  Gram  negatif dengan  insiden  27%  merupakan  infeksi  nosokomial, 43% healthcare-associated  community  onset ,  and 30%  komunitas  dengan  angka  morbiditas  20%  dan mortalitas  1.3  per  100,000  (Meatherall  et  al,  2009). K.pneumoniae ini juga banyak dilaporkan mengalami resistensi  antibiotik  sehingga  pengobatan  untuk infeksi  oleh  bakteri  ini  sangat  terbatas  (Carratoli, 2009; Brisse et al, 2009). Faktor penentu patogenitas dari K.pneumoniae diantaranya  faktor  adhesi  yang diperankan  oleh  protein  hemaglutinin  baik  dari  pili maupun  OMP  ( Outer  Membrane  Protein ).  Protein hemaglutinin  pada K.pneumoniae yang  sudah dibuktikan  memiliki  adhesin  adalah  protein  pili  12,8 kDa dan OMP 20 kDa. Adanya adhesin sebagai faktor virulensi secara dapat menginduksi respon imun dari tubuh  (Limbago  et  al,  2011;  Pertiwi  et  al,  2009; Agustina et al, 2014).
Respon  imun  yang  berperan  terhadap  patogenesis dari  bakteri K.pneumoniae yang  merupakan  bakteri ekstraseluler  adalah  respon  imun  humoral  dengan produk  berupa  antibodi  yang  berfungsi  menetralisir dan  mengeliminasi  mikroba  (Abbas  et  al,  2003; Mortellaro  et  al,  2011).  Salah  satu  antibodi  yang berperan  penting  adalah  immunoglobulin  G  (IgG) karena  IgG  merupakan  isotope  antibodi  utama dalam  darah  dan  cairan  ekstraseluler  yang mengontrol  terjadinya  infeksi  pada  jaringan  tubuh dan  memiliki  mekanisme  perlindungan  yang diperankan  melalui  beberapa  cara,  yaitu  proses aglutinasi  yang  menyebabkan  imobilisasi  patogen, proses coating permukaan patogen (opsonisasi) oleh IgG membuat patogen tersebut mampu dikenali dan difagosit  oleh  makrofag  terutama  untuk  eliminasi bakteri  yang  berkapsul  dalam  hal  ini K.pneumoniae , mengaktifkan  jalur  klasik  sistem  komplemen,  serta mampu  mengikat  dan  menetralkan  toksin.  IgG  juga berperan  penting  pada  proses antibodi  dependent cell-mediated  cytotoxicity (ADCC)  dan  proteolisis intraseluler yang diperantarai antibodi (Meduri et al, 1995; Young et al, 1999; Mayer, 2009).
Penelitian  tentang  respons  IgG  terhadap  protein hemaglutinin  pili K.pneumoniae 12,8  kDa  adhesi belum  ada  yang  melaporkan.    Oleh  karena  itu,
penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  respons IgG terhadap protein hemaglutinin pili K.pneumoniae 12,8 kDa.

## Metode Penelitian

## Strain Bakteri
Bakteri didapat dari isolat klinik pasien di ruang ICU RSSA  Malang  yang  diperiksa  karakterisasi  morfologi koloni pada nutrient agar, Brain Heart Infusion (BHI) Broth dan  MacConkey  agar  kemudian  diinkubasi selama  24  jam  pada  suhu  37ºC  dilanjutkan  dengan pewarnaan  Gram.  Identifikasi  bakteri  dilakukan dengan microbact system (Sikarwar et al, 2011; Ling et al, 1988).

## Bahan dan Reagen
Medium MacConkey ,  medium  BHI,  kit Microbact system ,  medium  TCG,  TCA,  PBS,  Tris  HCl  5  mM  pH 6,8,  2- mercapto  etanol 5%, Sodium  Dodecyl  Sulfate 2,5%,  gliserol10%, Bromophenolblue, C ommassie Brilliant  Blue  R-250, etanol  absolut,  membran nitroselulosa,  ponco  2%,  TBE  pH  7,4,  TBE  pH  7,4- Tween  20  0,05%,  H 2 O,  BSA  1%,  TBS  pH  7,4,  TBS  pH 7,4-Tween 20 0,05%, TBS-Skim 5%, antibodi primer, antibodi sekunder, BCIP-NBT (substrat kromogen).

## Hewan coba
Mencit  strain  BALB/C,  betina,  usia  6-8  minggu  (6 ekor) dengan berat badan rata-rata 25g.

## Alat
Tabung  reaksi, plate ,  obyek glass , cover  glass , mikroskop, inkubator, sentrifus, SDS-PAGE elektroforesis, dialisa  tube , Electroelusion  chamber , beaker glass, magnetic stirer, refrigerator, eppendorf,  gunting  pinset, shaker ,  pili cutter , semi dry blotter Biorad.

## Kultur Bakteri
Biakan  yang  tumbuh  pada MacConkey diambil dengan  cara  dikerok,  sebelumnya  dituangkan  PBS steril  pH  7,4  secukupnya.  Suspensi  bakteri  tersebut dimasukkan ke dalam botol yang berisi 1000 ml BHI Broth .  Suspensi  tersebut  dikocok  kuat  selama  30 menit  pada  penangas  air  37ºC.  Suspensi  bakteri diambil  sebanyak  10  ml  dan  dimasukkan  ke  dalam media agar bifasik TCG dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC (Ehara et al, 1987).

## Isolasi Pili
Metode  isolasi  pili  bakteri  ini  merujuk  dari  Ehara, 1987.  Bakteri  yang  dipanen  ditambahkan Tri Chloroacetic  Acid (TCA)  sampai  konsentrasi  3%  dan dihomogenasi,  dilanjutkan  dengan  sentrifugasi kecepatan  6.000  rpm  selama  30  menit  pada  suhu 4ºC.  Pelet  diambil  dan  diresuspensi  dengan  cairan PBS  pH  7,4  disentrifus  kecepatan  6.000  rpm  selama 30  menit  pada  suhu  4ºC.  Pellet  diambil  ditambah cairan  PBS  pH  7,4  kemudian  dicukur  menggunakan mixer ( pili cuter ) dengan kecepatan 5000 rpm selama 30  detik  4ºC,  diulang  sampai  empat  kali.  Hasilnya kemudian disentrifugasi selama 30 menit, kecepatan 12.000  rpm,  pada  suhu  4ºC.  Pili  yang  terletak  pada bagian supernatan diambil (Ehara et al, 1987).
Isolasi Protein Pili K.pneumoniae
Penentuan  berat  molekul  dilakukan  dengan menggunakan SDS-PAGE. Sampel protein dipanaskan 100 o C  selama  5  menit  di  dalam  larutan  penyangga yang mengandung Tris HCl 5 mM pH 6,8, 2- mercapto etanol 5%, Sodium  Dodecyl  Sulfate 2,5%  w/v, gliserol10% v/v dengan warna pelacak Bromophenolblue. Konsentrasi separating  gel yang dipilih adalah 12,5% mini slabgel dengan stacking gel 3%.  Voltase  yang  digunakan  120  mV,  400  mA, dengan waktu running selama 90 menit. C ommassie Brilliant  Blue  R-250 dipilih  sebagai  bahan  pewarna dan  digunakan pre-stained  broad  range sebagai protein marker (Laemli, 1970) . Selanjutnya dilakukan elektroelusi  sehingga  diperoleh  endapan  kering protein yang dimaksud.
Induksi Mencit Protein Pili K.pneumoniae
Untuk  imunisasi  dilakukan  secara  subkutan  dengan dosis 50 µg dari protein adhesin pili yang dilarutkan dengan larutan normal saline dan Freund’s complete adjuvant. Interval antar dosis adalah 7 hari selama 4 minggu,  serum  dipanen  10  hari  setelah  pemberian dosis terakhir (Goetsch et al, 2001; DiGiandomenico et al, 2007; Horzempa  et al, 2008).

## Isolasi Antibodi
Darah  diambil  dari  jantung  mencit.  Darah dikumpulkan  dari  5  mencit  kedalam  tabung  steril dan  disimpan  dalam  inkubator  dengan  suhu  37 o C dengan  posisi  miring  selama  30  menit.  Darah kemudian  disimpan  dalam  kulkas  dengan  suhu  4 o C selama  10  menit,  selanjutnya  disentrifus  dengan kecepatan  10.000  rpm  selama  5  menit.  supernatan yang  terbentuk  diambil  dan  dimasukkan  kedalam tabung  steril  kemudian  disimpan  pada  suhu  -20 o C (Harlow et al, 1988).

## Metode Dot Blot
Metode  ini  dilakukan  dengan  merujuk  pada  Harlow &  Lane,  1988.  Membran  nitroselulose  direndam terlebih  dahulu  dalam  H 2 O  steril  selama  30  menit. Kemudian  dipasang  pada  alat dot  blot .  Melalui lubang  alat,  membran  yang  telah  dibasahi  dengan TBS,  ditetesi  dengan  antigen  50  μl,  diinkubasi semalam  pada  suhu  4°C.  Selanjutnya  dilakukan blocking dengan blocking  buffer TBS,  diinkubasi semalam  pada  suhu  4°C,  larutan blocking dibuang. Membran  ditetesi  antibodi  primer  sebanyak  50  μl, diinkubasikan  selama  2  jam  pada  suhu  ruang  dan diletakkan  di  atas  shaker.  Larutan  dibuang, kemudian  dicuci  3  kali  dengan  TBS-Tween-20  0,05 %. Ditambahkan antibodi sekunder dengan pengenceran  1:500  dalam  larutan  TBS,  diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam, diatas shaker. Dicuci lagi 3 kali dengan TBS Tween-20 0,05 %. Selanjutnya ditambahkan  substrat  berkromogen  dan  diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan  menambahkan  H 2 O.  Hasil  positif  apabila terbentuk  dot-dot  pada  membran  nitroselulose. Kualitas hasil dilihat berdasarkan gradasi warna (21).

## Metode Western Blot
Pemeriksaan western  blot menggunakan  metode dari  Towbin,  1979.  Lembaran  gel  hasil  SDS-PAGE yang  mengandung  pita  protein  dipindahkan  pada kertas  nitrosellulosa  menggunakan  alat semi  dry blotter buatan  Biorad.  Cara  memindahkan  pita protein kepada kertas nitroselulose adalah menggunakan  aliran  listrik  sebesar  100  mA  pada kurun waktu 120 menit (Towbin et al, 1979).

## Hasil Penelitian
Reaksi  Antigen-Antibodi  dengan  Menggunakan Metode Dot Blot
Hasil  reaksi  antigen-antibodi  dengan  menggunakan metode dot  blot dengan  tujuan  untuk  mengetahui titer  pengenceran  dengan  reaksi  terkuat  dapat dilihat  pada  Gambar  1  Protein  yang  berfungsi sebagai  antigen  adalah  protein  pili K.pneumoniae dengan  berat  molekul  12,8  kDa  sedangkan  yang berfungsi  sebagai  antibodi  primer  adalah  serum yang  diambil  dari  mencit  yang  telah  diimunisasi secara  intraperitoneal  dengan  antigen  protein  pili 12,8 kDa (IgG terhadap protein pili 12,8 kDa).
Gambar  1.  Hasil DotBlot antara  Protein  Pili  12,8  kDa  dengan antibodi primer (IgG) terhadap Protein Pili 12,8 kDa.
G1  dan  H1  =  protein  tanpa  pengenceran;  G2  dan  H2  =  antibodi tanpa  pengenceran;  G3  dan  H3  =  protein  dan  antibodi  tanpa pengenceran; G4-G6 = TBS dengan pengenceran 10 -1 – 10 -6 Lingkaran  merah  (D2)  menunjukkan  reaksi  antigen  antibodi terkuat  pada  pengenceran  terendah  (antigen=1/10000,  antibodi 1/100)
Penghitungan  semi  kuantitatif  dari  reaksi  antigen- antibodi  dilakukan  dengan Corel  Photo  Paint , berdasarkan penghitungan semi kuantitatif didapatkan titer pengenceran antibodi dengan reaksi terkuat  adalah  pada  1/100  sedangkan  titer pengenceran antigen pada 1/10.000. titer pengenceran  tersebut  yang  akan  digunakan  pada metode western blot .
Reaksi  Antigen-Antibodi  dengan  Menggunakan Metode Western Blot
Gambar 2. Hasil Western Blot dengan antibodi primer terhadap protein pili 12,8 kDa
A:  protein  marker prestained  broad  range  nacalai  tesque; B: whole  cell 10 8 ; C:  sel  gundul  10 8 ; D:  potongan  pili  pertama;  E: potongan pili keempat
Lingkaran  merah  menunjukkan  band  protein  pili  berat  molekul 12,8 kDa
Untuk  mengetahui  respon  antigen-antibodi  selain menggunakan metode DotBlot dapat juga
menggunakan  metode westernblot .  Profil  protein seperti  pada  Gambar  2  menunjukkan  bahwa  pili terdiri  dari  beberapa  subunit  protein.  Diharapkan dengan  menggunakan  metode westernblot ini  akan tampak  subunit  protein  pili  mana  yang  bereaksi dengan antibodi terhadap protein pili 12,8 kDa.
Hasil  dari western  blotting pada  Gambar  2  diatas menunjukkan  reaksi  positif  dari  subunit  protein  pili dengan  berat  molekul  128,1  kDa,  114,4  kDa,  64,9 kDa,  31,1  kDa,  27,7  kDa,  24,8  kDa,  20,9  kDa,  12,8 kDa, dan 10 kDa.

## Pembahasan
Hasil  dari  penelitian  ini  membuktikan  bahwa K. pneumoniae memiliki  protein  adhesin  yaitu  protein hemaglutinin  pili  dengan  berat  molekul  12,8  kDa yang  menginduksi  timbulnya  respon  dari  IgG. Protein  tersebut  merupakan  salah  satu  faktor virulensi  untuk  melawan  pertahanan  tubuh  hospes selain  kapsul  polisakarida,  lipopolisakarida  (LPS), resistensi  serum  dan  siderophore  (Limbago  et  al, 2011). Protein  pili tersebut  adalah salah satu faktor virulensi  yang  berperan  penting  dalam  infeksi terutama  pada  proses  adhesi/perlekatan.  Setelah terjadi  adhesi  kemudian  bakteri  mengadakan kolonisasi  yang  akhirnya  terjadilah  infeksi,  sebagai contoh  jika  terjadi  pada  pasien  yang  mendapatkan intervensi secara medis seperti pemasangan intubasi dan  kateter  urin,  yang  umumnya  disebut  dengan ventilator-associated bacterial pneumonias (VABPs/VAP)  dan catheter-associated  urinary  tract infections (CAUTIs)  (Frank  et  al,  2009;  Jones  et  al, 2010).  Akibat  terjadinya  infeksi  tersebut  terjadi respon  imun  dari  tubuh  hospes.  Respon  imun tersebut  meliputi  imunitas  alami  dan  imunitas adaptif.  Oleh  karena K.pneumoniae merupakan bakteri ekstraseluler, maka imunitas humoral adalah perlindungan  yang  utama.  Imunitas  humoral berfungsi untuk mengeliminasi bakteri dan menetralisasi toksinnya, melalui mekanisme efektor oleh antibodi (Abbas et al, 2003).
Respon  imun  humoral  dimulai  ketika  sel  B dirangsang melalui B-cell reseptor (BCR) oleh antigen tertentu  (Ag),  diikuti  oleh  diferensiasi  ke  dalam  sel plasma.  Sel  plasma  melepaskan  antibodi  afinitas tinggi yang mengopsonisasi antigen dan menginisiasi penghancurannya oleh makrofag. Profesional
Antigen-Presenting  Cells (APC),  sel  dendritik  yaitu (DC),  diaktifkan  oleh  antigen  yang  terkait  mikroba melalui keterlibatan Pattern Recognition Receptors (PRR). Antigen
intraseluler dan ekstraseluler diproses menjadi peptida oleh APC dan dipresentasikanpada Major
Histocompatibility Complex Class I (MHC I) dan class II (MHC II) masing- masing  antigen  disajikan  kepada  CD8 + dan  CD4 + T sel,.  Aktivasi  DC  juga  menyebabkan  produksi  sitokin dan  kostimulasi  sel  T.  Sel  T- helper menghasilkan beberapa  sitokin  yang  mempromosikan  proliferasi dan aktivasi limfosit lain dan makrofag. Ada tiga jenis sel  T-helper:  sel  Th1,  Th2  dan  Th17.  Sel  Th1 menghasilkan sitokin seperti IFNγ yang mengaktifkan makrofag  untuk  membunuh  sel  yang  mengandung antigen.  Sel  Th2  mengaktifkan  sel  B  untuk memproduksi  antibodi.  Sel  Th17  mensekresikan  IL- 17  yang  mengaktifkan  neutrofil  dan  IL-22  yang menginduksi  sekresi  peptida  antimikroba  oleh  sel epitel. Sedangkan peranan CD8 + sel T sitotoksik (CTL) adalah pengrusakan antigen dengan cara membunuh  sel  secara  langsung  (Mortellaro  et  al, 2011).
Protein  dengan  berat  molekul  antara  10  -  100kDa memiliki  sifat  imunogenik  (Parslow  et  al,  2001), maka  protein  adhesin  pili  12,8  kDa  tersebut selanjutnya diuji kemampuannya dalam menginduksi respon antibodi (IgG) dengan menggunakan metode dot  blot dan western  blot (Gambar  1  dan  2).  Serum yang  mengandung  antibodi  diperoleh  dari  hasil injeksi  protein  pada  mencit  selama  kurang  lebih  1 bulan.  Hasil  dari dot  blot dilakukan  kuantifikasi dengan  program software  Corel  Photo-Paint X6. Intensitas warna yang terlihat menunjukkan kuatnya ikatan  antara  reaksi  antigen  dan  antibodi.  Analisis warna  dari dot  blot dapat  menunjukkan  nilai  rata- rata  reaksi  antigen-antibodi  tersebut  secara kuantitatif.  Semakin  tebal  warnanya  menunjukkan nilai  rata-rata  yang  lebih  rendah,  demikian sebaliknya. Berdasarkan kuantifikasi tersebut diperoleh  hasil  bahwa  protein  pili K.pneumoniae dengan  BM  12,8  kDa  mampu  menginduksi pembentukan  antibodi  (Immunoglobulin  G)  dengan titer  pengenceran  antibodi  yang  memiliki  reaksi terkuat  pada  1/100.  Sedangkan  titer  pengenceran antigen  yang  memiliki  reaksi  terkuat  pada  1/10000. Kemampuan  protein  pili  12,8  kDa  ini  dalam menginduksi  pembentukan  antibodi  selanjutnya dapat  dikembangkan  sebagai  alat  diagnostik  atau sebagai  kandidat  vaksin  untuk  mencegah  infeksi bakteri K.pneumoniae .  Kemampuan  pili  bakteri K.pneumoniae ini  dalam  menginduksi  pembentukan
antibodi  serupa  dengan  penelitian  yang  dilakukan oleh  Agustina  tahun  2012  yang  membuktikan peranan  pili  bakteri Shigella  dysentriae dalam menginduksi pembentukan  antibodi (Agustina  et  al, 2012).  Komponen  OMP  20  kDa  dari K.pneumoniae ini telah dibuktikan mampu menginduksi pembentukan antibodi immunoglobulin A (Pertiwi et al,  2009).  Pada  penelitian  ini,  telah  ditemukan karakterisasi protein adhesin pili K.pneumoniae 12,8 kDa serta kemampuannya menginduksi pembentukan  antibodi  immunoglobulin  G  pada mencit. Dengan melihat hasil tersebut dan mengacu pada  penelitian  Pertiwi et  al ,  perlu  penelitian  lebih lanjut  untuk  membuktikan  apakah  protein  pili  12,8 kDa  ini  dapat  pula  menginduksi  pembentukan antibodi  immunoglobulin  A  pada  mencit  (Pertiwi  et al, 2009).
Hasil dari western blot didapatkan reaksi positif dari subunit protein pili dengan berat molekul 128,1 kDa, 114,4  kDa,  64,9  kDa,  31,1  kDa,  27,7  kDa,  24,8  kDa, 20,9 kDa, 12,8 kDa, dan 10 kDa. Subunit protein pili 12,8  kDa  sebagai  protein  HA,  Subunit  protein  pili 24,8 kDa sebagai dimer HA, Subunit protein pili 64,9 kDa sebagai pentamer HA yang hanya muncul pada whole  cell, potongan  pili  pertama  dan  keempat, sedangkan  pada  sel  gundul  tidak  muncul.  Hasil  ini semakin  memperkuat  prediksi  SDS-PAGE  bahwa yang  diisolasi  adalah  benar-benar  pili  bakteri K.pneumoniae (Huang et al, 2006). Selain itu hasil ini juga  menunjukkan  bahwa  protein  pili  12,8  kDa memilik  sifat  imunogenik.  Munculnya  banyak  band protein  pada  hasil western  blot dapat  disebabkan karena  beberapa  hal.  Jika  yang  muncul  adalah protein  dengan  berat  molekul  yang  lebih  tinggi penyebabnya  kemunkinan  adalah  proses  glikosilasi dan multimer  formation ,  sedangkan  jika  yang muncul  adalah  protein  dengan  berat  molekul  yang lebih  rendah  mungkin  terjadi  degradasi  protein, proses cleavage ,  atau  karena  protein  tersebut memiliki  epitope  yang  sama.  Penyebab  lain  yang paling  mungkin  adalah  penggunaan  antibodi poliklonal sebagai antibodi primer. Untuk menghidari  kejadian  tersebut  dapat  dilakukan dengan  menggunakan  sampel  segar  yang  telah disimpan  di  atas  es,  menggunakan fresh  loading buffer, melakukan  pemanasan  sampel  yang  dapat membantu  untuk  memecahkan  struktur  protein yang  multimer,  serta  menggunakan  antibodi monoklonal  sebagai  antibodi  primer  (Moore,  2009; Mahmood et al, 2012).

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwaPemberian imunisasi protein hemaglutinin pili Klebsiella pneumonia dengan berat molekul 12,8 kDa secara subkutan mampu menginduksi pembentukan Immunoglobulin  G  pada  mencit  BALB/C  sebagai antibodi poliklonal terhadap protein pili tersebut.

## Daftar Pustaka
Abbas,  A.K.,  and  Lichtman,  A.H.,  2003.  Cellular  and Molecular Immunology, fifth edition. Saunders. Philadelphia. p.345-356.
Agustina,  D.,  Sumarno.,  Noorhamdani.  2014.
Inhibition  of  Bacterial  Adhesion  on  Mice Enterocyte  by  theHemagglutinin  Pili  Protein 12,8  kDa Klebsiella  Pneumoniae Antibody.
Journal of Tropical Life Sciences. 4(1): 19-25
Agustina,  W.,  Fitri,  L.E.,  Raras,  T.Y.M.,  Siswanto,  B. and Sumarno. 2012. Antibody protein hemagglutinin  subunit  pili  with  MW  49,8  kDa Shigella dysenteriae  adhesion on mice enterocyte. IOSR  Journal  of Pharmacy. 2(5):13- 20
Brisse,  S.,  Fevre,  C.,  Passet,  V.,  Issenhuth-Jeanjean, S.,  Tournebize,  R.,  Diancourt,  L.,  et  al.  2009. Virulent  Clones  of  Klebsiella  pneumoniae: Identification  and  Evolutionary  Scenario  Based on  Genomic  and  Phenotypic  Characterization.
Plos One. 4(3): e4982
Carratoli,  A.  2009.  Resistance  plasmid  families  in Enterobacteriaceae.  Antimicrobial  Agents  and Chemotherapy. 53(6):2227 – 2238.
DiGiandomenico,  A.,  Rao,  J.,  Harcher,  K.,  Zaidi,  T.S., Gardner, J., Neely, A.N., et al., 2007. Intranasal immunization  with  heterologously  expressed polysaccharide protects against multiple Pseudomonas  aeruginosa  infections.  PNAS. 104(11):4624-4629.
Ehara, M., M. Ishibashi, Y., Ichinose, M., Iwanaga, S., and  Shimotori,  T.N.,  1987.  Purification  and Partial  Characterization  of  Pili  of  Vibrio cholerae O1. Vaccine. 5(4):283-288.
Frank, D. N., Wilson, S. S., St Amand, A. L., and Pace,
N. R., 2009. Culture independent
microbiological  analysis  of  foley  urinary catheter biofilms. PloS One. 4(11):e7811.
Goetsch,  L.,  Plotnicky-Gilquin,  A.G.H.,  Haeuw,  J.F.,
Beck,  A.,  Bonnefoy,  J.Y.,  and  Corvaia,N.,  2001. Targeting of Nasal Mucosa-Associated Antigen- Presenting  Cells  In  Vivo  with  an  Outer Membrane  Protein  A  Derived  from  Klebsiella pneumoniae. Infection and Immunity.
69(10):6434-6444.
Harlow,  E.  and  Lane,  D.,  1988.  Antibodies:  A Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor Laboratory. New York. p: 386.
Horzempa,  J.,  Held,  T.K.,  Cross,  A.S.,  Fusrt,  D.,
Qutyan,  M.,  Neely,  A.N.,  et  al.,  2008. Immunization with a Pseudomonas aeruginosa 1244 Pilin Provides O-Antigen-Specific Protection.  Clinical  And  Vaccine  Immunology.
15(4):590 – 597
Huang  J.,  and  Honda  W.  2006.  CED:  a Conformational  Epitope  Database.    BMC Immunology. 7(7):1471-2172
Janda,  J.  M.,  and  Abbott,  S.  L.,  2006.  The  Genera Klebsiella  and  Raoultella.  The  Enterobacteria. 2nd  ed.  ASM  Press.  Washington,  USA.  Abbott, S. L., 2007. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter,  Serratia,  Plesiomonas,  and  Other Enterobacteriaceae. In P. R.
Jones,  R.N.,  2010.  Microbial  etiologies  of  hospital- acquired  bacterial  pneumonia  and  ventilator- associated bacterial pneumonia. Clinical Infectious Disease. 51(9):81-87
Jones,  R.N.,  2010.  Microbial  etiologies  of  hospital- acquired  bacterial  pneumonia  and  ventilator- associated bacterial pneumonia. Clinical Infectious Disease. 51(9):81-87
Laemli,  U.K.,  1970.  Cleavage  of  structural  protein during  the  assembly  of  the  head  of bacteriophage T4. Nature. 227(5259):680-685
Limbago,  B.M.,  Rasheed,  J.K.,  Anderson,  K.F.,  Zhu, W.,  Kitchel,  B.,  Watz,  N.,  et  al.,  2011.  IMP- Producing  Carbapenem-Resistant  Klebsiella pneumoniae  in  the  United  States.  Journal  of Clinical Microbiology. 49(12):4239-4245.
Ling,  J.M.,  Hui,  Y-W.,  and  French,  G.L.,  1988. Evaluation  of  the  Microbact-24E  bacterial identification  system.  J  Clin  Pathol.  41(8):910- 914
Mahmood,  T.,  and  Ping-Chang,  Y.  2012.  Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. N Am J Med Sci.,  4(9):429 – 434
Mayer,  G.,  2009.  Immunoglobulin-Structure  and Function. In Microbiology and Immunology On- line.  University  Of  South  Carolina.  USA. http://pathmicro.med.sc.edu/book/immunol- sta.htm. html. downloaded on Jan, 10, 2013.
Meatherall,  B.L.,  Gregson,  D.,  Ross,  T.,  Pitout,  J.D., and  Laupland,  K.B.,  2009.  Incidence,  Risk factors, and outcomes of Klebsiella pneumoniae bacteremia. The American journal of medicine. 122; 866-873.
Meduri G.U., and Estes R.J., 1995. The pathogenesis of  ventilator-associated  pneumonia:  II.  The lower  respiratory  tract.  Intensive  Care  Med. 21(5):452-61
Moore  C.  2009.  Introduction  to  western  blotting. www.abdserotec.com/westernblot. html. downloaded on Nov, 5, 2012.
Mortellaro,  A.,  and  Ricciardi-Castagnoli,  P.,  2011. From  vaccine  practice  to  vaccine  science:  the contribution  of  human  immunology  to  the prevention  of  infectious  disease.  Immunology and Cell Biology 89(3):332-339
Murray,  E.  J.  Baron,  J.  H.  Jorgensen,  M.  L.  Landry  &
M.  A.  Pfaller.  Manual  of  Clinical  Microbiology 9th  ed.  ASM  Press.  Washington,  USA.  p.698- 711
Parslow, T.G.,  Stites, D.P., Terr, A.I., and  Imboden, J.B.,  2001.    Medical  Immunology.  10thed.    Mc Graw Hill. USA
Pertiwi,  W.,  Sartono,  T.R.,  Sumarno,  dan  Adi,  S., 2009.  Sensitivitas  dan  spesifisitas  metode  Dot Blot  menggunakan  antigen  outer  membrane protein  Klebsiella  pneumoniae  yang  direspon Secretory-Immunoglobulin A Sputum Penderita Terinfeksi  Klebsiella  pneumoniae.  J  Respir Indones. 29(3). 1-15.
Sikarwar,  A.S.,  and  Batra,  H.V.,  2011.  Identification of Klebsiella Pneumoniae by Capsular Polysaccharide Polyclonal Antibodies. International  Journal  of  Chemical  Engineering and Applications. 2(2):130-134.
Towbin,  H.,  Staehelin,  T.,  and  Gordon,  J.,  1979. Electrophoretic  transfer  of  proteins  from polyacrylamide  gels  to  nitrocellulose  sheets: Procedure  and  some  applications.  Proc.  Natl. Acad. Sci. 76(9):4350-4354.
Young  P.J,  and  Ridley  S.A.,  1999.  Ventilator- associated pneumonia: diagnosis, pathogenesis and prevention.  Anaesthesia. 54(12): 1183-97.