Abstrak— Merkuri  merupakan  logam  berat  paling  toksik dibandingkan dengan logam berat lainnya. Beberapa bakteri ada yang resisten  merkuri.  Salah satu genus bakteri resisten merkuri dan  mampu  mengakumulasi  merkuri  yaitu  Azotobacter. Azotobacter  merupakan  bakteri  pemfiksasi  nitrogen  bebas  non simbiotik yang melimpah di daerah rhizosfer lahan pertanian dan merupakan  bakteri  penghasil  EPS  yang  dapat  berfungsi  sebagai pengkhelat  logam.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan isolat  Azotobacter  yang  resisten  terhadap  merkuri  HgCl 2 ,  dan mengukur  kemampuan  bioakumulasinya  terhadap  HgCl 2 .  Isolasi bakteri Azotobacter dilakukan dengan media selektif Azotobacter.  uji  resistensi  HgCl 2 dilakukan  dengan  streak  agar miring  dan  kemampuan  bioakumulasi  diukur  dengan  metode serapan atom serta uji viabilitas menggunakan metode pour plate. Analisis  beda  nyata  dengan  ANOVA  pada  taraf  5%  dilanjutkan dengan  uji  beda  nyata  terkecil  (BNT).  Tiga  isolat  Azotobacter dari  lahan  eco  urban  farming  ITS  resisten  terhadap  HgCl 2 sampai  20  mg/L  yaitu  A5,  A6,  dan  A9.  Efisiensi  bioakumulasi yang  tertinggi  pada  pemaparan  HgCl 2 5  mg/L  yaitu  isolat  A5 (89%) dan A9 (87%).
Kata  Kunci—Azotobacter,  Bioakumulator,  Merkuri,  Uji resistensi.

## I. PENDAHULUAN
ERKURI  merupakan  salah  satu  logam  berat  paling toksik  dan  keberadaannya  di  lingkungan  dapat terakumulasi  pada  berbagai  tingkat  trofik  rantai makanan.  Pencemaran  merkuri  di  lingkungan  telah  menjadi masalah  dunia  karena  tingkat  kontaminasinya  di  lingkungan semakin lama semakin meningkat akibat aktivitas antropogenik dan kegiatan industri yang menggunakan merkuri [1]. Toksisitas merkuri tergantung dari struktur kimianya, rute masuknya  dalam  tubuh  dan  lamanya  pemaparan  [2].  Merkuri dalam bentuk ion (Hg 2+ ) akan terakumulasi di ginjal dan metil merkuri  (CH 3 Hg)  akan  terakumulasi  di  otak  [3].  Kasus keracunan  merkuri  pertama  kali  dilaporkan  di  Minamata Jepang  pada  tahun  1956  yang  kemudian  dinamakan “Minamata  Disease”  dengan  gejala  kerusakan  otak,  gangguan bicara, dan hilangnya keseimbangan [4].
Toksisitas  logam  berat  merkuri  dapat  dikurangi  oleh aktivitas  bakteri.  Beberapa  bakteri  mampu  hidup  pada lingkungan  yang  tercemar  merkuri  disebut  bakteri  resisten merkuri (BRM). Bakteri resisten merkuri biasanya memiliki gen  resisten  merkuri  yang  disebut  gen  mer  operon  [5]. Umumnya struktur mer operon terdiri dari gen metaloregulator (merR), gen transport merkuri (merT, merP, merC, merF), gen merkuri reduktase (merA) dan organomerkuri liase (merB) [6].
Gen merA mengkode merkuri  reduktase yang berfungsi untuk mereduksi  Hg 2+ menjadi    Hg 0 volatil  dan  merB  mengkode organomerkuri  liase  yang  berfungsi  untuk  memutus  ikatan  C- Hg.  Bakteri  resisten  merkuri  dibagi  menjadi  2  tipe  yaitu  (1) bakteri  resisten  merkuri  spektrum  sempit  adalah  bakteri  yang hanya  resisten  terhadap  merkuri  anorganik  dan  (2)  bakteri resisten  merkuri  spektrum  luas  adalah  bakteri  yang  resisten terhadap  merkuri  anorganik  dan  mekuri  organik  [7]. Berdasarkan  penelitian  Zulaika,  dkk.,  Genus  Bacillus, Staphylococcus,  dan  Azotobacter  merupakan  bakteri  resisten merkuri  pada  11  mg/L  HgCl 2 [8].  Azotobacter  adalah  bakteri non  simbiotik  yang  mampu  memfiksasi  nitrogen,  melarutkan fosfat  [9],  dan  banyak  ditemukan  di  rhizosfer  lahan  pertanian [10].  Disamping  itu  bakteri  Azotobacter  juga  merupakan bakteri  resisten  merkuri  dan  dapat  berperan  sebagai bioakumulator  merkuri  [11].  Berdasarkan  penelitian  [12], Azotobacter  yang  telah  diisolasi  dari  tanah  pertanian,  mampu resisten  sampai  dengan  konsentrasi  100  nmol  HgCl 2 dan mampu mereduksi 2,6 mg HgCl 2 dalam 200 ml media Nutrient Broth (NB) yang mengandung HgCl 2 3,3 mg.
Institut  Teknologi  Sepuluh  Nopember  (ITS),  mempunyai lahan  eco  urban  farming  yang  ditanami  sayuran  organik  dan pupuk  yang  digunakan  adalah  pupuk  organik  atau  kompos [13].  Salah  satu  bakteri  yang  berperan  dalam  meningkatkan hara  nitrogen  dalam  kompos  adalah  Azotobacter  [14].  Isolasi bakteri  Azotobacter  di  lahan  eco  urban  farming  ITS,  selain didapatkan bakteri Azotobacter sebagai biofertilizer juga dapat digunakan  sebagai  agen  bioremediasi  lingkungan  tercemar merkuri.  Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan  isolasi  bakteri Azotobacter untuk mengetahui tingkat resistensi dan mengukur kemampuan bioakumulasinya terhadap merkuri HgCl 2 .

## II. METODOLOGI

## A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  dilakukan  pada  bulan  Januari  hingga  bulan  Juni 2014 di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Biologi  FMIPA-ITS.  Analisis  bioakumulasi  logam  merkuri dilakukan  di  Laboratorium  Penelitian  dan  Konsultasi  Industri Surabaya.

## B. Isolasi Azotobacter
Isolsi Azotobacter dilakukan dengan cara sampel tanah dari lahan  eco  urban  farming  ITS  diambil  secara  komposit, ditimbang  sebanyak  10  gram,  dimasukkan  ke  dalam  90  ml akuades steril. Dilakukan pengenceran 10 -1 sampai dengan 10 -7

## Azotobacter sebagai Bioakumulator Merkuri
Kusnul Khotimah dan Enny Zulaika
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS) Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia e-mail: enny@bio.its.ac.id
M
[15].  Masing-masing  pengenceran,  diambil  sebanyak  0,1  ml, ditumbuhkan  pada  media  selektif  Azotobacter  agar  yang mengandung  0,1  mg/L  HgCl 2 dengan  metode  spread  plate. [16].  Inkubasi  dilakukan  pada  suhu  ruang  selama  24  jam. Koloni yang tumbuh diamati karakteristiknya dan dibandingkan  dengan  kontrol  positif  yaitu  Azotobacter chroococcum.  Koloni  Azotobacter  chroococcum  mempunyai ciri  putih  basah  dan  berubah  menjadi  coklat  setelah  3-5  hari inkubasi  [15].  Koloni  yang  diduga  Azotobacter  chroococcum dimurnikan  dengan  metode  16  goresan  pada  media  Nutrient Agar.  Selanjutnya  dilakukan  pengamatan  kemurnian  sel dengan  metode  pewarnaan  methylen  blue  dan  untuk memastikan  bahwa  isolat  tersebut  Azotobacter,  dilakukan pewarnaan Gram dan pewarnaan kista.
C. Uji Resistensi Terhadap HgCl 2 Uji  resistensi  dilakukan  dengan  menumbuhkan  isolat Azotobacter yang didapat dari hasil isolasi pada media selektif Azotobacter slant agar [11], yang mengandung HgCl 2 berbagai konsentrasi  mulai  dari  konsentrasi  0.5  mg/L  dan  seterusnya sampai konsentrasi yang mampu ditoleransi isolat Azotobacter. Inkubasi  dilakukan  selama  24  jam  pada  suhu  ruang,  koloni yang  tumbuh  merupakan  isolat  yang  resisten  terhadap  HgCl 2 . Isolat  yang  digunakan  adalah  isolat  yang  paling  resisten terhadap HgCl 2.

## III. HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Isolasi Azotobacter
Hasil  isolasi  Azotobacter  menghasilkan  10  isolat  dengan kode A1a, A1b, A2, A3, A5, A6, A7, A8, A9, dan A10. Isolat yang  telah  dipurifikasi  kemudian  dilanjutkan  dengan pengamatan  karakteristik  morfologi  koloni,  pewarnaan  Gram dan pewarnaan cysta.

## Tabel 1. Karakteristik morfologi koloni isolat Azotobacter
Pengamatan Isolat Bentuk koloni Elevasi Tepi Warna koloni muda Warna koloni tua (> 1 bln) Ukuran koloni Bentuk sel A1a Irregular Flat Undulate Krem Slimy (berair) Coklat 1 cm Basil pendek A1b Circular Convex Entire Krem bening Slimy (berair) Krem kecoklatan 2 mm Basil pendek A2 Circular Convex Entire Krem kecoklatan Coklat muda 2 mm Coccus A3 Circular Pulvinate Entire Krem bening Slimy (berair) Kuning; pusat koloni: orange 3 mm Basil pendek A5 Circular Convex Undulate Putih susu Kuning kecoklatan 3 mm Basil pendek A6 Circular Convex Erose Putih susu Krem kecoklatan 3 mm Basil pendek A7 Circular Convex Erose Putih susu Krem 2 mm Basil pendek A8 Circular Flat Entire Tranparan Transparan 2 mm Basil pendek A9 Irregular Flat Undulate Putih susu Krem kekuningan 3 mm Basil pendek A10 Irregular Raised Erose Putih susu Krem 5 mm Basil pendek
Pewarnaan  cysta  dilakukan  untuk  memastikan  bahwa  isolat yang  didapatkan  adalah  Azotobacter.  Pembentukan  cysta diinduksi  dengan  cara  menumbuhkan  isolat  Azotobacter  pada media Burk’s dengan butanol sebagai sumber karbon selama 7 hari  [17].  Keberadaan  cysta  merupakan  karakter  kunci  pada genus Azotobacter. Menurut Madigan, dkk., Azotobacter dapat membentuk  struktur  istirahat  (resting  cell)  yang  disebut  cysta dimana  sel  dikelilingi  oleh  dinding  sel  yang  tebal  [18].  Hasil
pewarnaan  Gram  menunjukkan  bahwa  semua  isolat  adalah bakteri Gram (-), dan hasil pewarnaan cysta terlihat ukuran sel menjadi  lebih  kecil  atau  lebih  pendek  dengan  dinding  cysta yang tebal.
Gambar. 1.  Cysta Azotobacter A9

## B. Uji Resistensi Terhadap HgCl
2
Uji  resistensi  dilakukan untuk mengetahui tingkat resistensi isolat  Azotobacter  dan  untuk  mengetahui  range  finding  test perlakuan  selanjutnya  yaitu  uji  bioakumulasi  Hg 2+ .  Hasil pengukuran  sampel  tanah  lahan  eco  urban  farming  ITS, konsentrasi  kandungan  Hg  adalah  0,004  mg/L  dan  sampel  air di  sekitar  lahan  eco  urban  farming  ITS  adalah  0,002  mg/L. Isolat  Azotobacter  yang  diisolasi  menunjukkan  sifat  resistensi yang  lebih  tinggi  dari  konsentrasi  merkuri  dihabitatnya. Menurut  Manampiring  dan  Keppel,  suatu  bakteri  dikatakan resisten  merkuri  apabila  bakteri  tersebut  dapat  bertahan  pada konsentrasi  merkuri  0,01  ppm  [19].  Hasil  uji  resistensi menunjukkan  resistensi  isolat  Azotobacter  terhadap  HgCl 2 bervariasi seperti pada Tabel 2.
Tabel 2. Resistensi Azotobacter terhadap HgCl 2 . Isolat Pertumbuhan isolat Azotobacter pada media
yang mengandung HgCl 2 (mg/L) 0,5 5 10 15 20 A1a +++ +++ ++ - - A1b +++ +++ - - - A2 +++ +++ - - - A3 +++ +++ - - - A5 +++ +++ +++ +++ ++ A6 +++ +++ +++ +++ ++ A7 +++ +++
+++ +++ -
A8 +++ +++ - - - A9 +++ +++ +++ + + A10 +++
+++ +++ ++ -
Ket : +++ (baik), ++ (cukup baik), + (kurang baik).
Berdasarkan pada tabel 2, semua isolat Azotobacter mampu tumbuh  dengan  baik  pada  konsentrasi  0,5  dan  5  mg/L  HgCl 2 kecuali isolat A1a yang yang mampu tumbuh cukup baik pada konsentrasi  5  mg/L  HgCl 2 .  Pada  konsentrasi  10  mg/L  HgCl 2 , hanya  isolat  A5,  A6,  A7,  A9,  dan  A10  yang  mampu  tumbuh dengan baik. Pada konsentrasi 15 mg/L HgCl 2 terdapat 3 isolat (A5,  A6,  A7)  mampu  tumbuh  baik,  dan  pada  konsentrasi  20 mg/L  HgCl 2 hanya  2  isolat  yang    mampu  tumbuh  cukup  baik yaitu A5, dan A6.
Isolat  Azotobacter  yang  berhasil  diisolasi  menunjukkan tingkat  resistensi  terhadap  merkuri  yang  berbeda-beda. Perbedaan  tingkat  resistensi  terhadap  merkuri  HgCl 2 disebabkan  oleh  susunan  gen  mer  operon  yang  berbeda disetiap isolat. Komponen gen mer operon pada setiap spesies adalah  tidak  sama,  terdapat  variasi  komposisi  gen-gen
penyusunnya [20]. Selain itu, perbedaan kemampuan resistensi juga  dipengaruhi  oleh  perbedaan  tingkat  ekspresi  gen  mer operon antara spesies bakteri satu dengan spesies bakteri yang lain [21].
Isolat  yang  digunakan  pada  uji  bioakumulasi  adalah    isolat yang paling resisten dengan morfologi koloni yang mempunyai perbedaan menyolok,  isolat tersebut adalah A1a, A5, dan A9. Pemilihan  ketiga  isolat  tersebut  didasarkan  pada  perbedaan karakteristik  morfologi  koloni  tua  dan  tingkat  resistensinya terhadap  HgCl 2 diatas  10  mg/L.  Isolat  A1a  mempuyai  warna koloni  coklat,  resisten  pada  10  mg/L  HgCl 2, A5  kuning kecoklatan  dan  A9  krem  kekuningan  yang  resisten  terhadap HgCl 2 20 mg/L. Data uji biaokumulasi tidak ditampilkan.

## IV. KESIMPULAN/RINGKASAN
Sepuluh  isolat  Azotobacter  resisten  merkuri  yang  diisolasi dari  lahan  eco  urban  farming  ITS  yaitu  A1a,  A1b,  A2,  A3, A5, A6, A7, A8, A9, dan A10. Semua isolat resisten 0,5 dan 5 mg/L HgCl 2 , dan hanya 3 isolat  yang  resisten sampai dengan konsentrasi 20 mg/L yaitu isolat A5, A6, dan A9.

## UCAPAN TERIMA KASIH
“  K.K  mengucapkan  terima  kasih  kepada  ibu  N.  Dwianita Kuswyasari,  S.Si.,  M.Si,  dan  ibu  Wirdhatul  Muslihatin,  S.Si., M.Si, selaku dosen penguji, atas kritik, saran dan masukannya demi kesempurnaan tugas akhir ini. Penulis juga mengucapkan terima  kasih  dan  penghargaan  yang  tinggi  kepada  ayahanda dan  ibunda,  adik-adik  serta  keluarga  atas  doa  dan  kasih sayangnya.  Penelitian  ini  juga  tidak  lepas  dari  bantuan  dan dukungan  teman-teman  seperjuangan  angkatan  2010,  dan seluruh pihak yang tidak dapat saya sebut satu persatu.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] P.  Keramati,  M.  Hoodaji,  and  A.  Tahmourespour,  “Multi-Metal Resistance Study of Bacteria Highly Resistant to Mercury Isolated from Dental Clinic Effluent,”  African Journal of Microbiology Research, Vol.
3 (2011) 831–837.
[2] Inswiasri,  “Paradigma  Kejadian  Penyakit  Pajanan  Merkuri,“  Jurnal Ekologi Kesehatan,Vol. 7 (2008) 775–785.
[3] E.  Hodgson,  “Texbook  of  Modern  Toxicology,”  3 rd Ed.  New  Jersey  : John Wiley and Sons, Inc (2004) ch. 5.
[4] N.  Hachiya,  “The  History  And  The  Present  Of  Minamata  Disease,”
Japan Medical Association Journal, Vol 49 (2006) 112-118.
[5] N.L.  Brown,  Y.C.  Shih,  C. Leang, K.J.  Glendinning,  J.L. Hobman, and J.R. Wilson, “Mercury  Transport and Resistance,” Biochemical Society
Transactions, Vol 30 (2002) 715-718.
[6] A.M.A.  Nascimento,  and  E.  Chartone-Souza,  “Operon  mer  :  Bacterial Resistance  To  Mercury  And  Potential  For  Bioremidiation  Of Contaminated Environments,” Genetics and Molecular Research, Vol. 2 (2003) 92-101.
[7] H.R. Dash and S. Das,” Bioremediation of Mercury and The Importance of Bacterial mer Genes,” International Biodeterioration and Biodegradation, Vol. 75 (2012) 207-213.
[8] E. Zulaika, A. Luqman, T. Arindah, dan U. Sholikah, “Bakteri Resisten Logam  Berat  yang  Berpotensi  Sebagai  Biosorben  dan  Bioakumulator,” Seminar  Nasional  Waste  Management  for  Sustainable  Urban Development,  Feb.  21  (2012)  Teknik  Lingkungan,  FTSP-ITS Surabaya Indonesia.
[9] I.G.  Rojas,  A.B.T.  Geraldo,  and  N.M.  Sarmiento,  “Optimising  Carbon and  Nitrogen  Sources  for  Azotobacter  chroococcum  Growth,”  African Journal of Biotechnology, Vol. 10 (2011) 2951-2958.
[10] Z. Mazinani, M. Aminafshar, A. Asgharzadeh, and M. Chamani, “Effect of Azotobacter Population On Physico-Chemical Characteristics of Some Soil  Sample  In  Iran,  “Annals  of  Biological  Research,  Vol.  3  (2012) 3120-3125.
[11] E.  Zulaika,  “Eksplorasi  Bakteri  Resisten  Merkuri  (BRM)  Endogenik Kalimas Surabaya Sebagai Kandidatus Agensia Pencemaran Merkuri, “ Disertasi, Univ. Airlangga, Surabaya (2013).
[12] S.  Ray,  R.  Gatchhui,  K.  Pahan,  J.  Chaudhury,  and  A.  Mandal, “Detoxification  or  Mercury  and  Organomercurials  by  Nitrogen-Fixing Soil Bacteria, “Journal Bioscience, Vol. 14 (1989) 173-182.
[13] www.digilib.its.ac.id
[14] Z.H.  Hasibuan,  T.  Sabrina,  dan  M.B.  Sembiring,  “Potensi  Bakteri Azotobacter dan Hijauan Mucuna bracteata Dalam Meningkatkan Hara Nitrogen
Kompos Tandan Kosong Kelapa Sawit, “Jurnal Agroekoteknologi, Vol. 1 (2012) 237-253.
[15] R.  Saraswati,  E.  Husen,  dan  R.D.M.  Simanungkalit,  “Metode  Analisis Biologi Tanah, “Jawa Barat : Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumber Daya Lahan Pertanian (2007) ch 2.
[16] J.P. Harley, and L.M. Prescott, “Laboratory Exercises in Microbiology,” 5 th Ed. USA : The McGraw-Hill Companies (2002).
[17] M.  Stella,  and  M.  Suhaimi, “Selection of Suitable  Growth  Medium For Free-Living  Diazotrophs  Isolated  From  Compost,”  Journal  Tropical Agricultural and Food Science, Vol. 38 (2010) 211-219.
[18] M.T.  Madigan,  J.M  Martinko,  D.A.  Stahl,  and  D.P  Clark,  “Brock Biology  of  Microorganisms,”  13 th Ed.  USA  :  Pearson  Education,  Inc.
(2012).
[19] A.E.  manampiring,  dan  B.J.Keppel,  “Studi  Populai  Bakteri  Resisten Merkuri  Di  Daerah  Aliran  Sungai  Tondano,  Kelurahan  Ketang  Baru, Manado,” Jurnal Ilmiah Sains, Vol. 11 (2011) 26-30.
[20] M. Narita, K. Chiba, H. Nishizawa, H. Ishii, C.C. Huang, Z. Kawabata, S. Silver, and G. Endo, “Diversity of Mercury Resistance Determinants Among  Bacillus  Strains  Isolated  From  Sediment  of  Minamata  Bay,” FEMS Microbiology Letters, Vol. 223 (2003) 73-82.
[21] L.  Ranjard,  A.  Richaume,  L.  Jocteur-Monrozier,  and  S.  Nazaret, “Response  of  Soil  Bacteria to Hg(II) in Relation to Soil Characteristics and Cell Location,” FEMS Microbiology, Vol. 24 (1997) 321-331.