## PERBEDAAN INDIKATOR-INDIKATOR PENYEMBUHAN LUKA TIKUS WISTRAR NON DIABETIK DAN DIABETIK PADA PEMBERIAN CURCUMIN TOPIKAL
Tejo Jayadi, Arum Krismi

## Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Duta Wacana

## ABSTRAK
Latar Belakang: Di dunia dan Indonesia, penderita diabetes melitus akan meningkat, diperkirakan dua kali. Hal ini menyebabkan peningkatan jumlah penderita ulkus diabetikum, pada akhirnya dapat menyebabkan amputasi. Banyak faktor pertumbuhan berperan dalam penyembuhan luka, diantaranya TGF beta1 dan p63. Pada luka kronik, ekspresi TGF beta 1 menurun, sementara peran utama p63 adalah pertumbuhan epidermis. Curcumin memperbaiki penyembuhan luka.
Tujuan Penelitian: Tujuan penelitian adalah untuk mengenali efek kurkumin pada penyembuhan luka tikus wistar
dan dengan menilai !"#$!""%! dermis.
Metode Penelitian: Penelitian dikerjakan dengan metode quasi eksperimental dengan desain post-test only control group design pada 64 hewan coba, dengan 16 tikus non diabetik diterapi curcumin (A), 16 hewan coba diabetik tanpa curcumin (B), 16 tikus diabetik tanpa curcumin (C), 16 tikus diabetik diterapi salep curcumin (D).
Hasil dan Diskusi: Pada uji #$ $%
A terhadap sampel B adalah p= 0,166, level ekspresi TGF beta1 nilai p= 0,03, pembentukan jaringan granulasi p= 0,317, penutupan dermis nilai p 0,317 (p= 0,05), % &'!''* +$ $"   #$   %/% ekspresi TGF beta1 yang cenderung mempercepat proses penyembuhan luka pada hewan coba non diabetes. Uji
sampel C dan D menunjukkan #$ % & '!28! $ " "% & '!*9!  " penutupan dermis sampel D p= 0,083, ekspresi TGF beta1 p= 0,884, ekspresi p63 p= 0,025. Curcumin meningkatkan ekspresi p63, tetapi tidak mempercepat proses penyembuhan luka.
Kata Kunci: $!  <! ! %/% #$!   $%! waktu penyembuhan luka

## THE DIFFERENCES OF WOUND HEALING INDICATORS IN NON DIABETIC AND DIABETIC WISTAR RAT IN TOPICAL APPLICATION OF CURCUMIN
Tejo Jayadi, Arum Krismi Medical Faculty of Duta Wacana Christian University
+

## ABSTRACT
Background:
! "          ! #
Research Purpose: $ "    !  "   %   &
Research Methods: ' "     ( " )*+ ),+     )#+ )-+
Result and Discussion: "
! "       "
Keywords: !  % &

## PENDAHULUAN
Prevalensi penderita DM pada orang dewasa di dunia menurut * -   * (ADA) berkisar 8,7 % pada tahun 2002 sebagian besar tergolong diabetes tipe 2. ./ 0$ (WHO) memprediksi akan terjadi kenaikan jumlah pasien dari 8,4 juta pada tahun 2000 menjadi 21,3 juta pada tahun 2030. Diabetes Melitus di Indonesia diduga belum terdiagnosis sekitar 50 %. Prevalensi DM di Manado mencapai 6 %, di Kotamadya Surabaya 4,16 %. Di Desa Sangsit Buleleng Bali prevalensi DM 7,5 %. 1 Penderita diabetes sering mengalami komplikasi ulserasi kaki, infeksi, neuropati perifer, yang sering menyebabkan amputasi pada ekstremitas yang terkena, sehingga cara penatalaksanaan dan perawatan luka baik dan benar adalah strategi pencegahan yang tepat. 2
Diabetes melitus dapat menimbulkan ulserasi kronik, disebabkan karena rendahnya bioaviabilitas faktor-faktor pertumbuhan !  ?$ @ protein-protein matrik yang tidak normal, hilangnya kapasitas proliferasi sel-sel di dalam lokasi luka, dan gangguan perfusi. 3 Sel-sel punca epidermis berada pa da daerah tonjolan folikel rambut,
, kelenjar sebasea dan didapatkan juga pada sel-sel mononuklear dalam darah perifer. Sel-sel punca keratinosit ter sebut berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi sel dewasa, dapat dideteksi dengan 1 p63, di mana p63 juga merupakan faktor transkripsi. 4,5 Ekspresi L<NQ meningkat pada ulkus kaki diabetik dibandingkan dengan jaringan kulit penderita diabetik dan yang sehat. Kurangnya <N ulkus kaki diabetes menjelaskan
gang guan penyembuhan luka kronik ini. 6 TGF-N %R $% terpenting untuk sintesis kolagen dan proteoglikan serta mencegah kerusakan matrik ekstraseluler, mendorong migrasi keratinosit dan reepitelisasi pada luka 1 hewan coba tikus. 7
Reepitelisasi diorkestrai oleh pro liferasi dan migrasi keratinosit yang berkorelasi dengan ekspresi p63, suatu marker dari sel-sel tidak terdiferensiasi yang berproliferasi, dan pertumbuhan dari epitel bertingkat. 8 Pada pasien dengan epidermis sehat, p63 menjaga potensial sel progenitor dengan menjaga kemampuannya untuk membelah, ber tanggung jawab memproteksi fenotipe epitelial dari deplesi karena sel-selnya bermigrasi. 9 Penurunan ekspresi p63 pada pasien dengan ulserasi / $$% @ protein  un tuk perawatan autoregenerasi dan pembelahan berkesinambungan, kedua nya dibutuhkan untuk menunjang migrasi sel-sel tersebut. Disimpulkan adanya peranan p63 dalam regulasi $R   @%" dari ulserasi kronik vena tungkai. Pada penelitian dengan hewan coba tikus dengan perlakuan luka bakar dan di aplikasikan curcumin secara topikal didapatkan peningkatan ekspresi di dalam jaringan kulit dari hewan coba yang diberi apilikasi curcumin. 10
Masalah dalam penelitian ini ada dua yaitu mencari perbedaan ekspresi <N!     $R luka dinilai dari indikator faktor-faktor histopatologi yaitu penutupan luka, #$     $! " diinduksi oleh curcumin dibandingkan dengan , pada penyembuhan luka tikus wistar non diabetik dan diabetik dan mencari perbedaan ekspresi <N!     $R luka dinilai dengan indikator faktor-
faktor histopatologi, pada proses penyembuhan luka tikus wistar non diabetik dibandingkan diabetik, yang diinduksi curcumin.

## METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini dikerjakan dengan metode penelitian quasi eksperimental dengan model , di mana pengujian dilakukan setelah perlakuan dengan kelompok kontrol sebagai pembandingnya.
Populasi pada penelitian ini adalah tikus wistar usia 12-16 bulan dengan berat 250-300 gram dari penangkaran LPPT IV UGM. Sampel penelitian diambil dari jaringan lokasi luka dan %@$ histopatologi dan imunohistokimia di Instalasi Patologi Anatomi RS DR. Sardjito/Bagian Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada.
Kriteria inklusi: Tikus wistar laki- laki, kondisi sehat (bergerak dengan aktif) berusia 12-16 bulan dengan berat 250-300 gram. Kriteria eksklusi: Tikus wistar laki-laki menunjukkan perubahan perilaku (aktivitasnya tampak lemah dan malas).
Pembuatan salep curcumin dilakukan di Fakultas Farmasi UGM dan LPPT 1 UGM.  Curcumin diperoleh dengan cara mengekstrak metabolit sekunder dari kunyit ( # ) kemudian difraksinasi dengan etil asetat.
Sejumlah empat hewan coba tikus wistar jantan tanpa perlakuan baik non diabetik dan diabetik dikerjakan eksisi pada hari ke 30 dan dilanjutkan pemeriksaan histopatologi dan imunohistokimia. Lima belas hewan coba tikus wistar jantan dengan perlakuan non diabetik dilakukan insisi berdasarkan prosedur, kemudian
diberikan salep curcumin satu hari sekali untuk sampel A dan placebo untuk sampel B, dan dilakukan pengambilan tiga sampel sesuai prosedur setiap hari ke-1, 3, 12, 18 dan 30. 11 Tiga puluh tikus wistar diabetik dikerjakan injeksi streptozotocin sesuai prosedur untuk menginduksi diabetes. Lima belas hewan coba tikus wistar jantan dengan perlakuan diabetik dilakukan insisi berdasarkan prosedur, kemudian diberikan placebo satu hari sekali untuk sampel C dan salep curcumin untuk sampel D, dilakukan pengambilan tiga sampel sesuai prosedur setiap hari ke- 1, 3, 12, 18 dan 30. Sampel A, B, C, D dikerjakan pemeriksaan histopatologi dengan pewarnaan H&E dan pengecatan imunohistokimia TGF-beta1 dan p63.
Kelompok diabetik diinjeksi dengan Streptozotocin 40mg/kgBB dosis tunggal untuk menginduksi diabetes. Sepuluh hari setelah kadar glukosa darah mencapai dua kali dari level gula darah awal,  tikus wistar digunakan sebagai hewan coba.
Insisi dilakukan dengan anestesi umum menggunakan ketalar 2 mg intra- peritoneal. Setelah hipoestesia tercapai, rambut pada regio tulang belakang di punggung paling atas dicukur, kemudian dilakukan insisi sepanjang 2 cm sampai seluruh ketebalan kulit (epidermis sampai hipodermis) terpisah. 12,13 Luka dibiarkan terbuka, tidak ditutup dengan penutup apapun. 14
Pengambilan jaringan luka dilakukan dengan mengorbankan hewan co ba menggunakan eter. Setelah efek tercapai, dilakukan eksisi pada bagi an luka yang paling luas dengan mengikutsertakan jaringan kulit normal, $  @ %$
10% untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi dan imunohistokimia.
Penghitungan densitas ekspresi TGF beta 1 dengan cara semiquantitatif.
Intensitas ekspresi diskor 4:0 bila tidak ada ekspresi pada sel; 1) bila pewarnaan lemah; 2) bila pewarnaan sedang; 3) bila pewarnaan kuat. Persentasi sel yang terwarnai diskor: 0 bila tidak ada ekspresi pada sel; 1 bila < 33% ekspresi pada sel; 2 bila 33-66% ekspresi pada sel, 3 bila >66% ekspreasi pada sel. Dihitung pada 100 sel pada daerah hot spot. Kemudian dijumlah bila skor 0-1: negatif, 2: positif lemah, 3-4: positif sedang, 5-6: positif kuat. 15
Ekspresi TGF beta 1 diekspresikan pada @%!@%!%$!%%$ dan makrofag. 16,17 Pada penelitian ini @% yang dihitung dan diekspresikan pada sitoplasma dan membran sitoplasma.
Penghitungan ekspresi p63 secara kuantitatif pada sel-sel basal dan suprabasal epidermis serta pada sel-sel folikel rambut : 0 bila tidak ada ekspresi pada sel;  +1 bila <10% ekspresi sel positif; +2 bila 10-50% ekspresi pada sel; +3 bila >50% ekspresi pada sel. Intensitas diskor 0 bila tidak ada ekspresi pada sel; +1 bila ekspresi lemah; +2 bila ekspresi sedang; +3 bila ekspresi kuat. Dihitung pada 100 sel dari daerah hot spot. Kemudian dijumlah bila skor 0-1: negatif, 2: positif lemah, 3-4: positif sedang, 5-6: positif kuat. 18
Variabel penelitian adalah: variabel bebas: placebo ( 2 ), salep curcumin 0,1%; dan variabel tergantung: <N!! %!"#$! dermal. Waktu penutupan luka merupakan waktu yang dibutuhkan untuk terbentuknya jaringan granulasi dengan baik (100%).
Jaringan granulasi dianggap terbentuk dengan baik setelah parameter berikut ini terpenuhi: (a) lapisan yang kontinu dari jaringan granulasi sepanjang kedalaman luka, (b) lapisan jaringan granulasi memenuhi
seluruh kedalaman luka. Bila polanya setempat-setempat, dianggap negatif. {#$ %R$%%"$ yaitu: (a) sebukan leukosit yang padat di tempat gap luka (>200 sel dalam area tertentu, dengan pembesaran 200X), (b) banyak leukosit dalam pembuluh darah pada gap luka, dan (c) abses pada gap luka (Braiman-Wiksman et al., 2007). Luka dikategorikan sangat #$ %   } $ dalam gap luka. Penutupan dermal dilihat menggunakan pewarnaan H&E (Braiman-Wiksman et al., 2007), dengan  mengukur penutupan gap luka menggunakan ukuran mikrometer pada mikroskop binokuler (Olympus CX21) dengan pembesaran 40X. Luka dengan gap kurang dari 2 mm antara dua tepi dermal dianggap telah menutup. Penghitungan jarak celah ditentukan dengan cara mengkonfersi 3 % 5 mikrometer dengan skala yang ada pada program
4556 . Dengan perbesaran 100% pada 4556 , satu kotak kecil = 1,875 mm. Bila 5mikrometer = 76 kotak kecil, maka hasil konfersi adalah 142,5 mm.
~    <N! p63, dan faktor-faktor histopatologi dianalisa menggunakan uji non parametric dan

## 1 7 .

## ANALISA DAN DISKUSI
Penyembuhan luka bukanlah proses linier yang sederhana, di mana faktor-faktor pertumbuhan secara simultan mencetuskan pertumbuhan sel, tetapi merupakan suatu integrasi dari proses interaktif yang dinamik melibakan banyak sel, matrik ekstraseluler dan mediator- mediator terlarut. 19 Salah satu faktor pertumbuhan yang mempunyai peran utama dalam proses tersebut adalah
<N <N % %R $!@%!%$!%%$!
$"   @% 20 TGF beta1 $ "%  #$ pada luka. 21,22  <N %$ fase proliferasi adalah mens timulasi angiogenesis dan deposit kolagen dan mendorong migrasi keratinosit dan reepitelisasi. 23,24 Dalam tahap %  $R! <N menginhibisi proliferasi berbagai sel dan tetap mengontrol komponen- komponen matrik ekstraseluler, bukan saja untuk mendorong produksinya tetapi juga untuk mengontrol substansi- substansi yang merusak matrik ekstra- seluler. 25   <N pada tahap lanjut menginduksi keratinosit mengekspresikan integrin yang memfasilitasi komponen migrasi keratinosit yang mempercepat reepitelisasi. 26  <N " merupakan inhi bitor endogen yang poten bagi proliferasi dan diferensiasi limfosit T dan B. 27,28,29,30
 % #$ sampel luka kulit ketiga hewan coba Non - tanpa pemberian salep kurkumin (B) di hari pertama dan ke-3, masing- $"  $% #$ $%   #$! dan pada hari ke-12, ke-18, dan ke-30 #$  %R pada tabel 1. Bila dilihat level ekspresi <N R  LQ   % }! penelitian ini mendukung teori di atas bahwa didapatkan hu bungan antara %/%  <N  " #$    $R %! $<N " meningkat di hari ketiga dan melemah pada hari ke-12, ke-18 dan ke-30. Pada uji korelasi 1 9 ! % @ korelasinya adalah 0,648 dengan nilai "@ '!'} L"@ '!'*Q! sehingga dapat disimpulkan terdapat korelasi dan hubungan bermakna
#$   %/% <N  %  <N berperan dalam mencetuskan fase #$  " $ @% awalnya dan kemudian makrofag serta @% $    %$ % % yang terjadi pada hari pertama sampai ke-3. Pada fase proliferasi, maturasi dan <N! R <N  %$ " granulasi yang diproduksi oleh leukosit,
$"!@%"$ bukti stimulasi angiogenesis, proliferasi @%!   $@% deposisi matrik ekstraseluler. 31,32,33,34
Pembentukan jaringan granulasi sampel luka kulit (B) pada hari pertama sudah mulai terbentuk tetapi belum matang, hanya menunjukkan pembentukan pembuluh darah, baru di hari ke-3 dua sampel tertutup sempurna oleh jaringan granulasi yang matang dengan jumlah pembuluh darah yang sedikit dibandingkan sampel luka kulit yang belum tertutup sempurna oleh jaringan granulasi. Pada uji korelasi : 9 tau antara pembentukan jaringan "% "%/%<N! % @ % '!9  " "@ '!'}   statistik tidak berkorelasi, tetapi hasil ini sesuai dengan teori diatas bahwa <N $$ R"  " pembentukan jaringan granulasi, di $ <N $  < tumbuhan bagi angiogenesis dan serta
" @%    #$ ekspresinya mulai menurun pada saat fase proliferasi. Penutupan dermal pada sampel luka kulit (B) belum terjadi pada hari ke-3, dermis menutup sempurna pada hari ke 12, di mana jaringan granulasi sudah terisi penuh oleh "  @  % dimulai pada hari ke-4 diikuti dengan mulai terbentuknya ja ringan granulasi
sampai hari ke-7 dan maturasi jaringan granulasi dari hari ke-8 sampai ke-12. Jaringan granulasi telah digantikan sempurna oleh jaringan ikat kolagen pada hari ke-18 dan diikuti sampai hari ke-30. Pada penelitian ini <N$R  %/% yang rendah dari hari ke-12 sampai R <'  <N $$ peranan yang dinamis, di mana fase % <N   %$ %" %R @% berperan mendorong produksi matrik ekstraseluler dan fase <N
$"R$ <
substansi yang merusak matrik ekstraseluler. Meskipun demikian pada uji : 9 % @ % <'! " "@ '!*2'! sehingga didapatkan hubungan linear terbalik tetapi tidak bermakna.
Curcumin telah lama digunakan untuk mempercepat penyembuhan luka, dengan regenerasi epidermis lebih baik yaitu: pembentukan dan diferensiasinya; menunjukkan peningkatan jumlah @%! $"!   @% meningkatkan pembentukan jaringan granulasi sehingga lebih padat disertai $%R  R $%R @< blas lebih banyak dan kandungan kolagen lebih besar; serta mempercepat % %R $@%
menghambat kerusakan akibat " pada keratinosit dan @% 35,36,37,38,39 Pemberian curcumin secara topikal mencegah kerusakan jaringan oleh radikal bebas. 40 Densitas pembuluh darah terpadat pada hari ke-4 setelah luka, peningkatan pembuluh darah ini bukannya tidak terkontrol, karena densitasnya menurun pada hari ke-7, sehingga dapat disimpulkan curcumin memperbaiki kemampuan ja- "  @%" $$ penyembuhan, karena proliferasi pembuluh darah yang tidak terkontrol
hanya mengakibatkan pembentukan " "%  <N merupakan bagi neu- @% @%" "% mengontrol angiogenesis. 41
Pada penelitian ini, derajat #$   $% % " hewan coba Non DM pemberian salep curcumin (A) pada hari pertama dan < $"<$"  #$ !   $% #$! pada hari ke-12, ke-18 dan ke-30, hanya satu sampel pada hari ke-18 $ #$! %R $% % %   #$ Data ini dapat dilihat pada tabel 1. <NRLQ % 2, pada hari pertama semua sampel menunjukkan ekspresi kuat, pada hari ke-3 dua sampel ekspresinya kuat dan satu sampel ekspresinya sedang, hari ke-12 dua sampel ekspresinya kuat satu sampel ekspresinya sedang, hari ke-18 dua sampel ekspresinya kuat satu sampel negatif, hari ke-30 ketiga sampel ekspresinya sedang. Pembentukan jaringan granulasi pada sampel luka kulit hewan coba (A), pada hari pertama belum terbentuk jaringan granulasi matang, hanya menunjukkan pembuluh darah baru yang banyaknya berhubungan dengan " #$    R ke-3 dan seterusnya, ketiga sampel kulit sudah tertutup sempurna oleh jaringan granulasi matang. Penutupan dermal belum terjadi pada hari ke-3, dermis menutup sempurna pada hari ke 12, di mana jaringan granulasi sudah terisi R%R"@
Pada penelitian ini, pemberian salep kurkumin meningkatkan derajat #$   %/%  <N pada luka insisi seluruh ketebalan kulit tikus wistar non diabetik (A) dibandingkan tanpa pemberian salep curcumin (B). Perbedaan ini konsisten,
terjadi mulai hari pertama, ke-3, ke- 12, ke-18 dan hari ke-30. Pada uji #$ sampel A terhadap sampel B adalah p= '! L&'!'*Q! %/%  <N sampel A terhadap B didapatkan nilai p= 0,03 (p=0,05). Pada penelitian ini pembentukan jaringan granulasi yang menjadi indikator penutupan luka, menunjukkan pemberian curcumin pada ketiga sampel luka kulit (A) telah menutup dibandingkan sampel luka kulit (B) hanya dua sampel yang telah menutup pada hari ketiga, dengan uji didapatkan nilai p= 0,317 (p=0,05). Pada penutupan dermis, satu sampel (A) telah menutup pada hari ke 3 dan sampel (B) baru menutup pada hari ke 12, dengan uji
didapatkan nilai p 0,317 (p= 0,05). Hasil penelitian ini sesuai dengan teori di atas bahwa $$" #< $   %/%  <N " cenderung mempercepat proses pe- nyembuhan luka pada hewan coba non diabetes. Pada beberapa penelitian lain $!  @% monosit pada ;! sehingga <N "  R! reduksi pembentukan jaringan granulasi dan mempercepat proses penyembuhan dan bahwa curcumin me nu runkan @% @%    " penurunan indeks & 3 secara kuantitatif, serta curcumin menunjukkan efek apoptosis @%!R""R%% ini tidak sama dengan penelitian tersebut. 42,43,44
Sel-sel epidermis yang mengekspresikan p63 merupakan sel yang belum berdiferensiasi, berperan dalam proliferasi dan migrasi sel-sel epidermis dalam proses penyembuhan luka, menentukan diferensiasi epidermis, adesi sel dan pembentukan
membran basal. 45,46 Saat sel-sel punca basal men capai suprabasal, ekspresi p63 sel-sel epidermis menurun, sehingga proliferasi berhenti, di mana
(TA) 1 akan berdiferensiasi menjadi sel-sel epidermis di suprabasal dan tidak mempunyai potensi proliferasi. 47 Pada penelitian yang dilakukan oleh Waligora dan Noszczyk 2007, untuk mengetahui tingkat pembelahan sel-sel epidermis, peneliti tersebut menghitung tingkat ekspresi p63. 48 Pada hari pertama dan ke dua, tidak ada perubahan ek- spresi p63 epidermis di tepi luka tampak seperti kulit sehat. Pada hari 9 $"   @ sel-sel epidermis mulai terlihat dan ekspresi p63 mulai meningkat. Pa- da hari ke 5 banyaknya sel yang mengekspresikan p63 mencapai jumlah tertinggi. Setelah itu peningkatannya "@ R8$ ke 14 sel-sel epidermis telah menutup seluruh permukaan jaringan granulasi di mana sel-sel epidermis dominan mengekspresikan p63. Pada hari ke 20 ekspresi p63 turun setingkat dengan epidermis pada kulit sehat. Pada hari ke 28, ekspresinya sedikit meningkat.
Pada penelitian ini ekspresi p63 sampel B menunjukkan hari pertama ketiga sampel menunjukkan ekspresi sedang, hari ke-3 ekspresi satu sampel sedang, satu sampel lemah, satu sampel negatif, hari ke-12 ketiga sampel ekspresi sedang, hari ke 18 satu sampel ekspresi kuat dua sampel ekspresi sedang, hari ke-30 ketiga sampel ekspresi kuat. Pada sampel A ekspresi p63 adalah semua sampel dari hari pertama sampai ke-30 terekspresi kuat. Penelitian ini curcumin meningkatkan ekspresi p63 pada sel-sel punca epitel epidermis. Pembentukan jaringan granulasi menjadi pijakan untuk migrasi %<%% $<N$$%
peranan pembentukan miRNA dalam nukleus, di mana miRNA memfosforilasi p63 se hingga proliferasi melambat dan dilan jutkan diferensiasi. 49
Keadaan hiperglikemia pada diabetes melitus, menyebabkan fase #$%$ !$"
produksi (AGEs)
yang menginduksi produksi molekul #$   %   {< 50 Molekul tersebut menginduksi dan $$" #$! $ #$!
$ #$ " "! mengganggu sintesis kolagen. 51,52
Penyembuhan luka terjadi sebagai respon seluler terhadap cedera melibatkan keratinosit, sel endotelial, makrofag dan trombosit. Luka kronik pada diabetes memiliki ciri khas penurunan ekspresi <N    <N tipe II. 53 <N" %$"% keseimbangan proliferasi, diferensiasi dan menonaktifkan sel-sel progenitor endotelial dari sumsum tulang.
Pada penelitian ini ketiga sampel +#$ R$ dan satu sampel pada hari ke tiga dan $% R   #$! sisa sampel hari ke tiga, ke-12, ke-18, <'   #$ $ jaringan granulasi ketiga sampel C pada hari pertama dan satu sampel hari ke-3 luka belum tertutup jaringan granulasi, sisa sampel hari ke-3, hari ke-12, hari ke- 18, hari ke-30 sudah tertutup jaringan granulasi. Penutupan dermis pada sampel C, ke tiga sampel hari pertama dan hari ke-3 belum menutup, dermis menutup pada semua sampel pada hari ke-12, ke-18, ke-30. Bila dibandingkan " $% ! " #$ sampel C lebih tinggi, meskipun tidak bermakna secara statistik, dengan uji 0,225 (p<0,05). Pembentukan jaringan granulasi sampel C cenderung lebih lambat
dibanding sampel B tetapi tidak bermakna secara statistik, dengan uji
0,564 (p=
0,05). Pembentukan dermis sampel C dibanding sampel B tidak menunjukkan
/%
<N sampel C ketiga sampel hari pertama terekspresi kuat, satu sampel ekspresi sedang, dua sampel ekspresi negatif pada hari ke-3, ketiga sampel ekspresi negatif pada hari ke-12, ketiga sampel ekspresi kuat pada hari ke-18 dan ke-30. Pada uji <N sampel B dan sampel C didapatkan nilai 0,025 (p=0,05), sehingga dapat $%  <N $% B dan sampel C didapatkan perbedaan ekspresi yang bermakna, dimana <N $% + %R dibandingkan sampel B. Hasil penelitian ini, luka pada hewan coba diabetes $  #$ %R lama bila dibandingkan  non diabetes, dan menunjukkan sesuai dengan teori di atas, yaitu di mana semakin %$ %<% #$     % luka menyebabkan cenderung lebih lambatnya pembentukan jaringan granulasi, meskipun demikian, pem- bentukan jaringan dermis pada hewan coba diabetes dan non diabetes tidak ada perbedaan. Pada penelitian ini level <N R lebih kuat dibandingkan non diabetes, kondisi ini tidak sesuai dengan penelitian yang dikerjakan oleh Brunner et al., 2004, tetapi sependapat dengan hasil penelitian yang menyatakan R%/%<N %$$ R $%     %/% <N jaringan ulkus sampel diabetes lebih tinggi dibandingkan non diabetes. 54,55,56 "" %/%  <N hewan coba diabetik, cenderung $$R"#$!$ pada uji 1 7 9 korelasi "@'!9}L'!'*Q!
dan menyebabkan perlambatan proses penyembuhan, dapat dilihat dari kecenderugan melambatnya proses pembentukan jaringan granulasi dengan uji 1 7 9 masing- $" <N & '!}'}   #$ = 0,089. Dapat disimpulkan tingginya %/%  <N  %$ " dan serum darah merupakan faktor penting dalam pembetukan luka kronik pada diabetes melitus. Penelitian ini sependapat dengan teori di atas dan sependapat dengan penelitian yang dikerjakan oleh Werner S dan Grose ~!     @%   $ pada ;! , terjadi reduksi $ " #$ mempercepat proses penyembuhan. 57
Pada telaah artikel oleh Gupta et al, tahun 2012 dan dipertegas dalam artikel oleh Chitragari et al, tahun 2013, menyebutkan mempercepat penyembuhan luka dengan menekan #$!  " $" R @%   $"   % kaki diabetes memproduksi radikal bebas dan protease yang meningkatkan
#$ $ penyembuhan luka. 58,59 #
$$%@%R berbagai gram negatif dan positif yaitu ;   < dan = yang merupakan organisme tersering ditemukan pada ulkus kaki diabetik. Pada hari ke-7 dan ke-11, luka diabetes yang diolesi menunjukkan jaringan granulasi padat, peningkatan migrasi berbagai %  @%   $@%! peningkatan jumlah pembuluh darah dan peningkatan kandungan kolagen. 60
Pada penelitian yang dikerjakan oleh Dwivedi dan Chau dhary tahun 2012, luka pa da tikus diabetik diterapi dengan
*$
dan # , tidak didapatkan debris @% R<9
# meningkatkan reepitelisasi, memperbaiki neovaskularisasi, dan meningkatkan migrasi berbagai sel pada penyembuhan luka kulit, disebabkan "%/%<N 61,62
Pada hewan coba dibetik diterapi salep
yaitu sampel D, pada R $  $% #$ $%#$!R<
" $% #$ ! R <}  $% #$ $%#$! R ke-18 dan ke-30 semua sampel tidak #$ $ " granulasi sampel D, pada hari pertama ketiga sampel belum menutup, hari ke- 3, ke-12, ke-18, ke-30 semua sampel telah menutup. Pembentukan dermis pada sampel D hari ke-1, ke-3, ke-12 semua sampel belum mununjukkan penutupan dermis, hari ke-18 dan ke- 30 semua sampel telah menunjukkan $  <N sampel D hari pertama menunjukkan dua sampel terekspresi kuat satu sampel negatif, hari ke 3 dua sampel terekspresi kuat satu sampel terekspresi sedang, hari ke 12 dua sampel terekspresi kuat satu sampel terekspresi sedang, hari ke 18 dua sampel terkespresi kuat satu sampel negatif, hari ke 30 satu sampel terekspresi kuat dua sampel negatif.
Penelitian ini tidak sesuai dengan $#$ cenderung lebih berat dibandingkan sampel C tanpa terapi curcumin, meskipun tidak bermakna secara statistik uji
0,197, pem bentukan jaringan granulasi sam pel D cenderung lebih lambat diban dingkan sampel C meskipun tidak bermakna secara statistik dengan uji 0,564, sedang penutupan dermis sampel D lebih lama dibandingkan sampel C dengan uji 0,083 dan hal ini % "<N$%
D cenderung lebih tinggi dibandingkan sampel C meskipun tidak didapatkan perbedaan dengan uji 0,884.
Pada luka kulit kronik karena diabetes melitus sel-sel punca yang mengekspresikan p63 menurun. Bila dihubungkan dengan miRNA-203 dimana peningkatan regulasinya menu runkan ekspresi p63 sehingga pro liferasi epitel epidermis menurun dilanjutkan diferensiasi menjadi (TA) 1 . Pada hewan coba tikus diabetes diinduksi dengan streptozotocin, regulasi miR-203 meningkat 2 kali pada hari ke-3 dan menurun 0,8 kali pada hari ke 10 dibandingkan sebelum hari pertama. Bila dibandingkan dengan hewan coba tikus normal, sebelum hari per tama regulasinya menurun 0,7, ada peningkatan miR-203 1,5 kali pada hari ke-3, dan menurun 0,6 kali pada hari ke-10. Karena itu pada hewan coba diabetes, penyembuhan luka akan terganggu karena fase proliferasi yang seharusnya diinisiasi pada 24 jam pertama setelah perlukaan, lambat.
Pada penelitian ini sampel C dua ekpresi p63 hari pertama satu sampel ekspresi kuat dua sampel ekspresi sedang, hari ke-3 satu sampel ekspresi kuat dua sampel ekspresi sedang, hari ke-12 dua sampel ekspresi kuat satu sampel ekspresi sedang, hari ke-18 dua sampel ekspresi kuat satu sampel ekspresi sedang, hari ke-30 ketiga sampel ekspresi kuat. Bila dibandingkan
dengan hasil baik. 42 Sampel B, ekspresi p63 pada hewan coba diabetes lebih kuat dengan uji 0,025. Hasil penelitian ini tidak sesuai dengan teori di atas. Penelitian ini sesuai dengan penelitian yang dikerjakan oleh Usui et al., 2008. 41 Penelitian tersebut menyatakan bahwa sel-sel epitel yang berada ditepi luka kronik dengan diabetes mellitus, proliferasinya meningkat. Protein p63 meningkatkan proliferasi sel-sel punca epidermis,
" @$ "
pengecatan
(PCNA), yang akhirnya akan mempercepat penutupan luka meskipun <N   % penyembuhan menghambat proliferasi sel-sel punca epidermis, tetapi pada akhir proses penyembuhan meningkatkan proliferasi sel-sel punca. Pemberian curcumin meningkatkan reepitelisasi. Pada penelitian ini pemberian salep curcumin meningkatkan ekspresi p63 semua pada semua sediaan eksisi kulit tikus wistar baik non diabetik maupun diabetik, meskipun demikian waktu penyembuhan luka dan penutupan dermis pada kedua kelompok tidak menunjukkan perbedaan secara bermakna, hal ini dimungkinkan karena adanya infeksi pada luka kulit tikus wistar. Curcumin dapat memodulasi sel punca epitel epidermis, di mana terapi modulasi sel-sel punca sendiri maupun telah berdiferensiasi * (TA) 1 , mempercepat proses penyembuhan.
%{#$ "R$R%
"#$ 1/1/3/1 1/1/1/3 0/0/0/1 0/0/0/0 0/0/0/0 #$ 2/0/0/2 2/0/0/0 0/0/0/2 1/0/0/0 0/0/0/0 #$ 0/2/0/0 0/2/2/0 3/3/3/0 2/3/3/3 3/3/3/3 A&B/ C&D p- tidak bisa dinilai B&C p= 0,625 Hari ke 1 Hari ke 3 Hari ke 12 Hari ke 18 Hari ke 30
Keterangan tabel 1 dan 2:  A/B/C/D. A: Non DM kurkumin (+), B: Non DM kurkumin (-), C: DM kurkumin  (-), D: DM kurkumin (+)
%}<N "R$R% Ekspresi kuat 3/1/3/2 2/1/0/2 2/0/0/2 2/0/3/2 0/0/3/1 Ekspresi sedang 0/0/0/0 1/0/1/1 1/0/0/1 0//0/0/0 3/0/0/0 Ekspresi lemah 0/0/0/0 0/2/0/0 0/2/0/0 0/3/0/0 0/2/0/0 Negatif 0/2/0/1 0/0/2/0 0/1/3/0 1/0/0/1 0/1/0/2 A&B p= 0,136 C&D p= 0,342 Hari 1 Hari 3 Hari 12 Hari 18 Hari 30 Tabel 3. Jaringan granulasi dengan hari penyembuhan Luka sudah menutup 0/0/0/0 0/2/2/3 3/3/3/3 3/3/3/3 3/3/3/3 Luka belum menutup 3/3/3/3 3/1/1/0/ 0/0/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 A&B p=0,500 C&D p=0,500 B&C p= 1,000 Hari 1 Hari 3 Hari 12 Hari 18 Hari 30

## Tabel 4. Penutupan dermis dengan hari penyembuhan luka
Sudah menutup 0/0/0/0 0/0/0/0 3/3/3/0 3/3/3/3 3/3/3/3 Belum menutup 3/3/3/3 3/3/3/3 0/0/0/3 0/0/0/0 0/0/0/0 A&B p= 1,000 C&D p= 0,250 B&C p= 1,000 Hari 1 Hari 3 Hari 12 Hari 18 Hari 30
Keterangan tabel 3 dan 4. A/B/C/D. A: Non DM kurkumin (+), B: Non DM kurkumin (-), C: DM kurkumin (-), D: DM kurkumin (+)

## Tabel 5. Ekspresi p63 dengan hari penyembuhan luka
Ekspresi sedang 0/3/2/0 0/1/2/0 0/3/1/0 0/2/1/0 0/0/0/0 Ekpresi kuat 3/0/1/3 3/0/1/3 3/0/2/3 3/1/2/3 3/3/3/3/ Ekspresi lemah 0/0/0/0 0/1/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 Negatif 0/0/0/0 0/1/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 A&B/C&D p-tidak bisa dinilai A&D p= 0,870 Hari 1 Hari 3 Hari 12 Hari 18 Hari 30
Keterangan tabel 3 dan 4. A/B/C/D. A: Non DM kurkumin (+), B: Non DM kurkumin (-), C: DM kurkumin (-), D: DM kurkumin (+)
Keterangan tabel 1 dan 2:  A/B/C/D. A: Non DM kurkumin (+), B: Non DM kurkumin (-), C: DM kur- kumin (-), D: DM kurkumin (+)

## KESIMPULAN DAN SARAN
Pada penelitian ini, ekspresi <N R"  " penyembuhan luka normal. Curcumin dalam ekstrak etanol # @ %  $" <N   " mempercepat proses penyembuhan luka $%<N % diabetik lebih rendah dibandingkan diabetik, dengan disertai perburukan proses penyembuhan luka dengan me nunjukkan peningkatan tingkat #$   %    penelitian ini, pemberian curcumin pada luka diabetik berhubungan dengan ekspresi p63, tidak berhubungan "<N
Luka kronik menjadi dapat men- jadi salah satu lesi prakanker, dengan $"  <N %R curcumin pada luka kronik akan me- nyebabkan berhentinya pertum buh- an sel-sel epitel epidermis secara berlebihan dan proses ini juga dapat terjadi pada kanker stadium awal. Terapi modulasi sel-sel punca maupun yang telah berdiferensiasi merupakan cara untuk mempercepat proses penyembuhan dengan hasil yang baik, sehingga # menjadi salah satu herbal yang mampu memodulasi penyembuhan luka.
Peneliti menyarankan penelitian dengan jumlah sampel yang lebih besar dan tertuju pada satu kondisi klinis, sehingga khasiat curcumin pada proses penyembuhan luka dapat benar-benar diketahui.
Kelemahan penelitian ini adalah didapatkan beberapa sediaan yang ti dak dapat dinilai baik potongan yang rusak saat proses pengecatan imuno histokimia, pengecatan imuno his tokimia dengan 1 , analisa histopatologi dan imunohistokimia dikerjakan satu orang.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Yasa IWP, Suastika K, Djelantik AAGS, Astawa IYM. Hubungan positif antara ulkus kaki diabetic dengan presentase sel bermarka CD4+ pembawa malondialdehid. Journal of Internal Medicine 2009 Januari; 10(1): 1-21
2.  Clayton W, Elasy TA, 2009.  A Review of the Pathophysiology, +%@! $ Ulcers in Diabetic Patients. Clinical Diabetes, volume 27, number 2: 52-
8.
3.  Demidova-Rice TN, Durham JT, Herman IM, 2012.Wound Healing Angiogenesis: Inovation and Challenges in Acute and Chronic Wound Healing. Advances In Wound Care, volume 1, number 1, doi: 10.1089/wound.2011.0308.
4.  Jude EB, Blakytny R, Bulmer J, Boulton AJ, Ferguson MW, 2002.
4! -Diabet. Med. -; 19(6); 440-7.
5. Nair RP, Krishnan LK, 2013. { @ + keratinocyte progenitor cells in circulation and their matrix-directed differentiation to epithelial cells. Stem Cell Research & Therapy, 4: 38.
6.  Bascom CC, Wolfshohl JR, Coffey Jr RJ, Madisen L, Webb NR, Purchio AR, Derynck R, Moses HL; 1989. Complex regulation of transforming growth factor beta1, beta2, beta3 $~$@% and keratinocyte by transforming factor beta1 and beta2. Molecular and Cellular Biology, volume 9, no12: 5508-15.
7.  Barui A, Banerjee P, Das RK, Basu SK, Dhara S, Chatterjee J, 2011. Immunohistochemical Evaluation of p63, E-Chaderin, Collagen I
and III Expression in Lower Limb Wound Healing under Honey. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, volume 2011, Article ID 239864, 8 pages.
8.  Kulac M, Aktas C, Tulubas F, Uygur R, Kanter M, Erboga M, Ceber M, Topcu B, Ozen OA, 2013. The effects of topical tratment with curcumin in burn wound healing in rats. Journal of Molecular Histology, 44 (1): 83- 90.
9. Braiman-Wiksman L, Solomonik I, Spira R, Tennenbaum T; 2007. Novel insight into wound healing sequence of events. Toxicologic Pathology, 35: 767-79.
10. Lima MHM, Caricilli AM, de Abreu LL, Araujo EP, Pelegrinelli FF, Thirone ACP, Tsukumo DM, Pessoa AFM, dos Santos FM, de Moraes
MA, Carvalheira JBC, Velloso LA, Saad MJA, 2012. Topical insulin accelerates wound healing in diabetes by enhancing the AKT and ERK pathway: Adoouble-blind placebe-controlled clinical trial. PLoS ONE 7(5): e36974.
11. Mani H, Sidhu GS, Kumari R, Gaddipati JP, Seth P, Maheshwari RK, 2002. Curcumin differentially
"% <N! and nitric oxide synthase during impaired wound healing. BioFactors 16; 29-43.
12. Culhaci N, Sagol O, Karademir S, Astarcioglu H, Astarcioglu I, Soyturk M et al 2005. Expression of transforming growth factor beta-1 and p27 Klp I in pancreatic adeno carcinoma: relation with cell-cycle associated proteins and clinicopathologic characteristics. Bos ton Medical Center Cancer,
5:98.
13. Brandes ME, Mai UE, Ohura K, Wahi SM, 1991. Type I transforming
factor-beta receptors on neutrophil mediate chemotaxis to transforming growth factor beta; Journal of Immunology, 147(5): 1600-6.
14. Epivatianos A, Andreadis D,
{   ! }' @% and Transforming Growth Factor- Beta 1 in Reactive Gingival Overgrowths. Journal of Oral & Maxil lofacial Research, vol.4, no 1, e3.
15. Das RK, Venkatraghavan V, Sheet D, Chakraborty C, Ray AK, Chatterjee J, 2010. Evaluation of p63 Expression in Oral Sub- mukus Fibrosis. Proceedings of 2010 International Conference on Systems in Medicine and Biology.
16. Crowe M, Doetschman T, Greenhalgh DG, 2000. Delayed
 %"{$$ @ <NR% of Investigative Dermatology. Vol.
115, No. 1.
17.  Werner S, Grose R, 2003. Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines. Physiol Rev, 83: 835-870.
18. Valluru M, Staton CA, Reed MWR, Brown NJ, 2011. Transforming "R <N
"%
signaling orchestrate wound healing. Frontiers in physiology, volume 2, article 89.
19. Guo S, DiPietro LA, 2010. Factors Affecting Wound Healing. Critical Review in Oral Biology  Medicine. Journal of Dental Research, 89 (3) 219-229.
20. Brunner G, Blakytny R, 2004. %%% "%  <N activity in wound repair: growth factor latency as a sensor mechanism for injury. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 92: 253-61.
21. Shah M, Foreman DM, Ferguson
MWJ, 1995. Neutralisation of
<N   <N} <N reduces scarring. Journal of Cell Science 108: 985-1002.
22. Ashcroft GS, Yang X, Glick AB, Weinstein M, Letterio JJ, Mizel DE, Anzano M, Greenwell-Wild T, Wahl SM, Deng C, Roberts AB, 1999. Mice lacking Smad3 show accelerated wound healing and an impaired %%#$$ Cell Biology, volume 1: 260-66.
23.  Yang L, Chan T, Demare J, Iwashina T, Ghahary A, Scott PG, Tredget EE, 2001. Healing of Burn Wounds in Transgenic Mice Overexpressing Transforming Grwoth Factor- ȕ 1 in the Epidermis. American Journal of Pathology, Volume 159, No. 6: 2147-57.
24. Sidhu GS, Mani H, Gaddipati JP, Singh AK, Seth P, Banaudha KK, Patnaik GK, Maheshwari RK, 1999. Curcumin enhances wound healing in streptozotocin induced diabetic rats and genetically diabetic mice. Wound Repair and Regeneration, volume 7, Issue 5; 362-74.
25. Singer AJ, McClain SA, Romanov A, Rooney J, Zimmerman T, 2007. Curcumin Reduces Burn Pro gression in Rats. Academic Emergency Medicine, Volume 14,
No.12: 1125-29.
26. Chitragari G, Sumpio BJ, Sumpio BE, 2013. Indian Spices for the Managemen of Diabetic Foot Complications. Review Article. Angiology: Open Access, Volume 1,
Issue 2, 1000114.
27. Gopinath D, Ahmed MR, Gomathi K, Chitra K, Sehgal PK, Jayakumar R, 2004. Dermal pwund healing processes with curcumin incor- %%"@%$$%!
2 (10): 1911-7.
28. Chereddy KK, Coco R, Memvanga PB, Ucakar B, des Rieux A, Vandermeulen G, Preat V, 2013. Combined effect of PLGA and curcumin on wound healing activity. Journal of Controlled Release, 171: 208-15.
29. Jacob A, Wu R, Zhou M, Wang P, 2007. Mechanism of the Anti- #$$   +$ ~< / ~/ %
Hindawi Publishing Corporation, Volume 2007, Article ID 89369. 30. Waligora J, Noszczyk B, 2007. Proliferation and ability for epidermal autogeneration in patiens with chronic lower leg venous ulcerations. Polski Przeglad Chirurgiczny, 79, 2: 113: 19.
31.  Mills SJ, Cowin AJ, 2012. MicroRNAs and their roles in wound repair and regeneration. Wound Practice Research, Volume 21 Number 1.
32. Tsourdi E, Barthel A, Rietzsch H, Reichel A, Bornstein SR, 2013.Current Aspects in the Pathophysiology and Treatment of Chronic Wounds in Diabetes Melitus. Biomed Research International, Volume 2013, Article ID 285641.
33. Tellechea A, Leal E, Veves A, +/%R ! }'' {#$$ and Angiogenic Abnormalities in Dia betic Wound Healing: Role of Neuropeptides and therapeutic Perspectives. The Open Circulation and Vascular Journal, 3: 43-55.
34.  Werner S, Grose R, 2003 Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines. Physiological Review; 83; 3: 83-70.
35. Bhatwadekar AD, Guerin EP, Jarajapu YPR, Caballero S, Sheridan C, Kent D, Kennedy L, Lansang MC, Ruscetti FW, Pepine CJ, Higgins PJ, Bartelmez SH, Grant MB, 2010. Transient Inhibition of Transforming
R <N $ Diabetic CD34 + Cells Enhances Vascular Reparative Functions. Diabetes, Volume 9: 2010-19.
36. Brem H, Tomic-Canis M, 2007. Cellular and molecular basis of wound healing in diabetes. The Journal of Clinical Investigation, Volume 117, Number: 1219-22.
8 #!R$R%!R R< Marra N, Beckert S. Wound Fluid Diagnostics in Diabetic Food ulcers. Dalam Dinh T, editor, 2011.
Global Perspective on Diabetic Foot Ulcerations. InTech, Croatia.
38. Gupta SC, Patchva S, Koh W, Aggarwal BB, 2012. Discovery of Curcumin, a Component of the Golden Spice, and Its Miraculous Biological Activities. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 39 (3): 283-99.
39. Dwivedi VK, Chaudhary M, 2012.
+$/ R%"@ of ampucare and becaplermin in diabetic rat. African Journal of Pharmacy dan Pharmacology, Volume 6 (12): 883-92.
40. Zhang DW, Fu M, Gao SH, Liu JL, 2013.Curcumin and Diabetes: Asystemic Review. Review Article. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Volume 2013, Article ID 636053.
41. Usui ML, Mansbridge JN, Carter WG, Fujita M, Olerud JE, 2008. Keratinocyte Migration, Proliferation, and Differentiation in Chronic Ulcers From Patients With Diabetes and Normal Wounds. Joournal & Histochemistry, Volume
6 (7): 687-96.
42. Senoo M, 2013. Epidermal Stem Cells in Homeostasis and Wound Repair of the Skin. Advances in Wound Care, Volume 2, Nuber 6:
1 2
Gambar 1. Jaringan granulasi mengisi gap luka, dan jumlah leukosit pmn di dalam jaringan granulasi lebih dari 200 sel bila dilihat dengan perbesaran 400 kali pada beberapa daerah hot spot. Daerah di %$%"$ $}"@%R$"%R R dermis.
3
4
$  < N    %$ @% $ 9      % epitel epidermis.