Morfologi, fisiologi, preservasi sel sperma ikan betok,
Anabas testudineus Bloch 1792 dan ketahanannya terhadap kejut listrik [Morphology, physiology, preservation of climbing perch Anabas testudineus Bloch 1792 sperm and the endurance to electric shock]
Fajar Maulana 1 , Alimuddin 2 , M. Zairin Junior 2
1 Program Studi Ilmu Akuakultur, SPs IPB Jln. Agatis Kampus IPB Dramaga Bogor 16680
2 Departemen Budi Daya Perairan, FPIK-IPB Jln. Agatis Kampus IPB Dramaga Bogor 16680
Diterima: 6 Juli 2014; Disetujui: 30 September 2014

## Abstrak
Kualitas  sperma  yang  baik  dan  dalam  keadaan  tak  aktif  selama  proses  elektroporasi  sangat  menentukan  keberhasilan transgenesis. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi karakter morfologis dan fisiologis sel sperma, serta menge- valuasi efek voltase dan jumlah  kejut  listrik berbeda terhadap motilitas dan viabilitas sperma ikan  betok. Pengamatan karakter  morfologi dilakukan pada mikroskop dengan pembesaran 400x, karakter fisiologi dengan berbagai parameter yakni tingkat osmolaritas, volume, pH, kepadatan dan total sperma.  Hasil penelitian menunjukkan bahwa sperma ikan betok terdiri atas tiga bagian, yakni kepala yang berbentuk oval, bagian tengah, dan ekor sperma. Viabilitas sperma ikan betok dalam air adalah selama 116±34 detik. Induksi ovaprim dapat meningkatkan volume sperma, pH, kepadatan dan total sperma (p<0,05).  Tingkat osmolaritas tubuh dan testis ikan  betok  (390-405 mOsmol  kg -1 ). Penyimpanan sperma yang diencerkan dengan larutan NaCl 1,3% hanya dapat bertahan maksimum selama 60 menit pada suhu ruang (26˚C) dan  suhu  dingin  (4˚C),  sedangkan  tanpa  pengenceran  dapat  bertahan  selama  360  menit.  Derajat  pembuahan  dan kelangsungan hidup larva hingga 10 hari pascatetas menggunakan sperma dari testes cacah sama dengan pemijahan se- mi alami. Elektroporasi sperma ikan betok dengan pengencer larutan NaCl 1,3% berhasil dilakukan menggunakan lama kejut 0,5 milidetik, dan jeda antar kejut 0,1 detik. Peningkatan voltase dan jumlah kejut yang diberikan saling berinter- aksi  menurunkan  motilitas  dan  viabilitas  sperma  (p<0,05).  Metode  kejut  listrik  tersebut  berpotensi  digunakan  untuk menghasilkan ikan betok transgenik dengan metode elektroporasi.
Kata penting: elektroporasi, fisiologis, ikan betok, morfologi, sperma

## Abstract
Good  sperm  quality  and  inactive  condition  during  the  electroporation process  determines  the  success  of  transgenesis. The study aims to observe the  morphology and physiology of sperm, and evaluate the effects of different voltage and number of electric shocks on motility and viability of climbing perch sperm. Observation of morphological characters by microscope with a magnification of 400X, physiological character with various parameters, such as the level of os- molarity, volume, pH, density and total of sperm. The climbing perch sperm consisted of three parts, namely the ovoid head,  middle,  and tail. Sperm  viability  in  the  water  was  116±34 seconds.  Sperm  quantity,  volume  of  semen,  pH,  and sperm density were increased after ovaprim injection (p<0.05).  Osmolarity levels of body and testes of climbing perch ranged at 390-405 mOsmol kg -1 . Sperm diluted in 13 g L -1 NaCl solution could be kept for a maximum of 60 minutes at room temperature (26˚C) and cold temperature (4˚C), while without NaCl solution could be 360 minutes. Fertilization and hatching rates of eegs fertilized by sperm form the minced testes,  and larval survival up to 10 days post-hatching were similar with semi-natural spawning. Electroporation of climbing perch sperm diluted in 13 g/L NaCl solution was successfully performed using a program  with a  long shock of 0.5  milliseconds and  the interval shock  of 0.1 seconds. Increasing  the  voltage  and  number  of  shock  decreased  motility  and  viability  of  sperm  (p<0.05).  Those  electric  shock parameters can potentially be used to generate climbing perch transgenic by electroporation method.
Keywords: electroporation, physiology, climbing perch, morphology, sperm

## Pendahuluan
Ikan  betok  ( Anabas  testudineus Bloch 1924)  merupakan  ikan  asli  perairan  Indonesia yang  memiliki  potensi  untuk  dikembangkan.
Ikan  ini  termasuk  ke  dalam  jenis  ikan  ekonomis tinggi  di  daerah  Kalimantan,  khususnya  Kali- mantan Selatan dan Kalimantan Tengah.
Dalam rangka pemenuhan permintaan da- ri produksi budi daya ikan betok, metode pembe- nihannya  telah  berhasil  dikembangkan  (Widodo
 Penulis korespondensi Alamat surel: maulanafajarbdpipb@gmail.com
et  al. 2007).  Namun  demikian,  kendala  berikut- nya  yang  perlu  dipecahkan  adalah  pertumbuhan ikan betok relatif lambat. Berbagai metode dapat diterapkan  untuk  menghasilkan  induk  dan  benih dengan  pertumbuhan  lebih  cepat,  di  antaranya transgenesis.  Prasyarat  transgenesis  adalah  pe- nguasaan metode pemijahan buatan yang terkon- trol,  teknik  preservasi  sperma  yang  baik,  serta pengetahuan terkait sel gamet ikan uji.
Transgenesis  memiliki  kelebihan  diban- dingkan  dengan  metode  lainnya,  di  antaranya adalah  waktu  yang  diperlukan  untuk  mencapai efek  perbaikan  genetik  yang  diinginkan  adalah lebih cepat (Yaskowiak et al. 2006), dan tingkat perbaikan  kualitas  genetik  lebih  tinggi  daripada metode pemuliaan lainnya. Telur ikan betok rela- tif kecil sehingga metode mikroinjeksi agak sulit diterapkan.  Altenatifnya  adalah  metode  elektro- porasi  pada  sperma,  kemudian  sperma  tersebut digunakan  untuk  membuahi  telur  (Inoue et  al.
1990  dan  Lu et  al. 2002).  Faktor  utama  penentu keberhasilan  transgenesis  ke  sel  sperma  adalah keberhasilan  mempertahankan sperma dalam  ke- adaan  tak  aktif,  dan  mampu  membuahi  telur. Sperma  ikan  betok  dapat  dikeluarkan  dari  tubuh induk jantan melalui pengalinan ( stripping ), teta- pi dalam praktiknya sperma yang dikeluarkan pa- da  proses  pengalinan telah  aktif  dikarenakan keluarnya cairan urin bersamaan dengan sperma. Penggunaan  larutan  fisiologis  yang  sesuai  akan mendukung  keberhasilan  transgenesis  pada  ikan betok. Oleh karena itu, kesesuaian antara larutan bufer  DNA  dan  larutan  fisiologis  ikan  merupa- kan  suatu  parameter  yang  harus  diketahui  terle- bih dahulu sebelum melakukan elektroporasi.
Motilitas  sperma  pascaelektroporasi  dipe- ngaruhi oleh kuat medan listrik, panjang kejutan, jumlah  kejutan,  dan  kekuatan  ionik  bufer (Symonds et  al. 1994).  Berdasarkan  penelitian Cheng et  al. (2002),  motilitas  sperma  ikan  ayu
( Plecoglossus altivelis ) menurun hingga 50% pa- da 120 detik setelah diberi kejutan dengan volta- se  9  kV.  Symonds et  al. (1994)  juga  mengemu- kakan  bahwa  aktivitas  sperma  ikan chinook  sal- mon ( Oncorhynchus  tshawytscha ) menurun  dari 82%  menjadi  2%  setelah  sperma  dielektroporasi dengan voltase yang meningkat dimulai dari 625 V  cm -1 sampai  1000  V  cm -1 .  Dengan  demikian voltase yang sesuai untuk sperma ikan yang akan dibuat  menjadi  transgenik  perlu  diketahui  agar pembuahan  dan  persentase  ikan  transgenik  yang dihasilkan menjadi tinggi. Dalam rangka pembu- atan ikan betok transgenik, pada penelitian ini di- lakukan eksplorasi karakter morfologis dan fisio- logis  sel  sperma  ikan  betok,  serta  penentuan  pa- rameter elektroporasi yang mendukung motilitas, viabilitas, dan fertilitas sperma pada telur.

## Bahan dan metode

## Pengamatan morfologis sperma
Parameter  morfologi  sperma  yang  diukur meliputi panjang dan lebar kepala, panjang bagi- an tengah dan ekor sperma. Sampel sperma diko- leksi dari empat ekor ikan betok jantan (panjang 10±2 cm; bobot tubuh 20±5 gram). Sperma diko- leksi  dengan  cara  melakukan  pengalinan  pada bagian  perut  ikan,  kemudian  sperma  diencerkan menggunakan  larutan  eosin  0,2%  sebanyak  10 kali  pengenceran.  Parameter  morfologis  diukur dengan  bantuan  mikroskop  Olympus  CX31  ter- sambung dengan kamera Sony ( Color Video Ca- mera ), dan komputer yang dilengkapi dengan pe- rangkat  lunak  OptiLab image  raster versi  1.3.2.
Pengamatan dilakukan pada pembesaran 400 dan 1000 kali.

## Pengukuran osmolaritas
Pengukuran  tingkat  osmolaritas  tubuh ikan betok dilakukan pada bagian tubuh ikan to- tal dan gonad dengan cara: ikan uji yang diguna-
kan  dicacah  sampai  halus,  lalu  diambil  hasil  ca- cahan  sebanyak  1  gram  kemudian  dicampur  de- ngan  larutan  Na-sitrat  (3,8%)  sebanyak  3  ml (Marlina 2011). Campuran tersebut diambil seba- nyak 1,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung mikro, dan  disentrifugasi selama  5  menit  dengan  kece- patan  6000  rpm.  Supernatan  yang  terbentuk  di- ambil  sebanyak  1  ml,  diencerkan  dengan  akua- bides sebanyak 15 ml, lalu nilai osmolaritas hasil pengenceran  diukur  menggunakan Osmometer tipe Osmotat 030, Gonotec (Germany). Nilai os- molaritas  tubuh  dan  gonad  dihitung  mengguna- kan rumus:

## 𝑉1  × 𝑁1 = 𝑉2  × 𝑁2
Keterangan: V1=  volume larutan daging dengan Nat- rium  Sitrat  3,8%  (ml),  N1=  konsentrasi  cairan  tubuh ikan yang  dinyatakan dalam DHL (mS cm -1 ), V2= vo- lume  larutan  campuran  supernatant  dengan  akuabides (ml),  N2=  konsentrasi  cairan  tubuh/gonad  ikan  serta pelarut  antikoagulan  dan  akuabides  yang  dinyatakan dalam Osmolaritas (mOsmol kg -1 ).

## Pengukuran volume dan pH semen, spermatokrit, dan jumlah sperma
Sperma  dikoleksi  dengan  pengalinan  in- duk  jantan,  dikumpulkan  di  dalam  tabung  mikro berukuran 200 µL. Volume semen diukur meng- gunakan  pipet  mikro.  Penentuan  volume  semen pada  ikan  betok  tanpa  perlakuan  penyuntikan hormon ovaprim dilakukan  secara  kumulatif dengan  mengumpulkan  cairan  sperma  dari  3-4 ekor  ikan  dengan  total  16  ekor,  sedangkan  pada ikan  yang  telah  diinjeksi  hormon  dilakukan  un- tuk setiap ekor ikan uji lainnya sebanyak 16 ekor. Metode  pengukuran  spermatokrit  dan  kepadatan sperma  merujuk  pada  metode  Tvedt  (2001).
Pengukuran  nilai  pH  cairan  sperma,  dilakukan menggunakan  kertas  uji  pH  (Darmstadt,  Germa- ny). Sebanyak 10 µL cairan sperma hasil koleksi dipaparkan  ke  atas  kertas  pH  tersebut,  selanjut- nya kertas pH disandingkan pada gambar pH in- dikator.

## Penentuan larutan fisiologis, lama waktu dan suhu penyimpanan
Penentuan  larutan  fisiologis  (NaCl)  yang sesuai  untuk  sperma  ikan  betok  dilakukan  de- ngan  mengamati  motilitasnya. Konsentrasi larut- an  NaCl,  lama  waktu  dan  suhu  penyimpanan yang diuji disajikan pada Tabel 1. Perangsangan spermiasi ikan  jantan  yang  telah  matang  gonad dilakukan  menggunakan ovaprim (Ovaprim, Syntex  USA)  dengan  dosis  0,5  ml  kg -1 bobot ikan  pada  bagian  intramuskuler (Widodo et  al .
2007).  Tindakan  ini  dilakukan  dengan  tujuan penyeragaman  pematangan  sel  gamet  ikan.  Pro- ses  induksi  dilakukan  10-12  jam  sebelum  ikan dibedah  untuk  koleksi  sel  gamet.  Gamet  dibagi ke  masing-masing  tabung  mikro  dan  ditambah- kan  larutan  fisiologis.  Setelah  3  hingga  5  detik, dilakukan  pengujian  tingkat  motilitas  sperma  di bawah  mikroskop  dengan  pembesaran  400  kali. Guna  memastikan  bahwa  sperma  belum  aktif, maka  sperma  dicampur  dengan  air  untuk  meng- aktifkannya.  Penilaian  motilitas  sperma  didasar- kan pada banyaknya sperma  yang aktif bergerak maju (progresif) dengan penilaian mengikuti me- tode Guest et al . (1976).

## Pengujian pemijahan ikan betok dengan metode berbeda
Pemijahan  ikan  betok  dilakukan  menggu- nakan  tiga  metode  berbeda,  yaitu  pemijahan  se- mi-alami,  pemijahan  buatan  dengan  pengalinan induk, dan metode pemijahan buatan mengguna- kan sperma hasil preservasi. Setiap metode pemi- jahan  tersebut  dicobakan  menggunakan  tiga  set induk ikan betok. Satu set adalah 1 ekor betina : 3 ekor jantan.
Sebanyak  500  butir  embrio  hasil  pemija- han  ikan  betok  pada  masing-masing  metode  di- koleksi, dan ditempatkan pada wadah plastik ber- volume  0,5  L.  Pengamatan  derajat  pembuahan
Tabel 1. Perlakuan dalam pengujian fisiologis sel sperma ikan betok
Konsentrasi larutan fisiologis (NaCl, %) Lama penyimpanan (menit) Suhu penyimpanan 0; 0,9; 1,0; 1,1; dan 1,2 0, 3, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 180, 360, 720, dan 1440 Suhu kamar (26 ˚C), suhu dingin (4 ˚C)
dilakukan  setelah  12  jam  pascapembuahan.  Pe- ngamatan derajat penetasan dilakukan setelah 30 jam pascapembuahan. Larva yang berhasil mene- tas  kemudian  dipindahkan  ke  dalam  akuarium berisi  air  10  L,  dan  dipelihara  selama  10  hari. Derajat  kelangsungan  hidup  dihitung  pada  hari terakhir pemeliharaan.

## Evaluasi viabilitas sel sperma pascakejut listrik
Pemberian  kejut  listrik  terhadap  sel  sper- ma ikan betok dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama  adalah  penentuan  batas  voltase  maksi- mum yang diberikan pada sperma, dan tahap ke- dua  adalah  penentuan  jumlah  kejut  listrik  yang optimal.  Kejut  listrik  dilakukan  menggunakan elektroporator Gene Pulser II (Biorad, USA) de- ngan  tipe  kejut square  wave .  Tipe  kejut square wave diketahui  memberikan  efek  lebih  baik  dan lebih efisien bila dibandingkan dengan tipe expo- nential ;  tingkat  efektivitas  transfernya  mencapai 3-10  kali  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  tipe exponential (Takahashi et  al. 1991).  Program pengujian kejut listrik disajikan pada Tabel 2.
Viabilitas  sperma  hasil  elektroporasi  di- amati  dengan  metode  pewarnaan eosin 0,2%
(Hafez  1987).  Satu  tetes  sperma  diteteskan  de- ngan  menggunakan  mikropipet  di  atas  gelas obyek dan ditambahkan pewarna eosin 0,2% de- ngan  perbandingan  1:1,  kemudian  kedua  larutan tersebut  dicampurkan  secara  merata.  Penilaian
viabilitas sperma didasarkan pada perbedaan kri- teria kepala sperma yang bewarna transparan dan aktif  bergerak  (hidup),  sedangkan  sperma  yang mati akan bewarna merah muda buram dan tidak bergerak serta mengembang.

## Parameter uji dan analisis statistik
Parameter  yang  diamati  meliputi  panjang kepala,  lebar  kepala,  panjang  bagian  tengah, panjang  ekor,  panjang  total  sperma,  pH  cairan sperma, motilitas sperma (MS), viabilitas sperma (VS), derajat pembuahan (DP), derajat penetasan (DT),  dan  tingkat  kelangsungan  hidup  larva (Khl).  Data  dianalisis  menggunakan  statistik non-parametrik dengan membandingkan nilai ra- taan pada parameter morfologi sperma, MR, dan nilai  osmolaritas  tubuh  ikan  diolah  dengan  ban- tuan  program  Microsoft  Excel  2013.  Parameter volume sperma, spermatokrit, kepadatan sperma, jumlah total sperma, DP, DT, Khl, dan VS  hasil elektroporasi  dianalisis  menggunakan  analisis sidik ragam (ANOVA), dan jika terdapat penga- ruh nyata dilanjutkan dengan uji Duncan dengan bantuan program SPSS versi 17.0.

## Hasil

## Morfologi dan durasi viabilitas sperma
Sperma ikan betok terdiri atas tiga bagian utama,  yaitu  kepala  berbentuk  oval,  bagian  te- ngah, dan bagian ekor (Gambar 1). Panjang total,
Tabel 2. Program pengujian kejut listrik terhadap sperma ikan betok
Voltase Kejut (V) Jumlah kejut Lama kejut (milidetik) Jeda waktu kejut (detik) 0 1, 3,  dan 5 0,5 0,1 50 1, 3,  dan 5 0,5 0,1 125 1, 3,  dan 5 0,5 0,1 250 1, 3,  dan 5 0,5 0,1 500 1, 3,  dan 5 0,5 0,1
Gambar 1. Sperma ikan betok (a. kepala sperma, b. bagian tengah, c. ekor sperma)
panjang kepala, panjang bagian tengah, dan pan- jang  ekor  sperma  berturut-turut  35,54±4,66; 1,83±0,20; 0,93±0,23; 33,05±1,40 µm. Lebar ke- pala sebesar 1,48±0,21 µm. Total estimasi durasi pergerakan sperma adalah 116±34 detik.

## Efek induksi hormon
Penyuntikan  induk  jantan  ikan  betok  de- ngan  hormon ovaprim memberikan  perbedaan yang  signifikan  (p<0,05)  pada  semua  parameter uji  (Tabel  3). Pada  ukuran  induk  yang  sama,  in- duksi ovaprim meningkatkan volume semen ikan sekitar 11 kali  lipat, dan kepadatan sperma  seki- tar 58% daripada yang tidak diinduksi.

## Larutan fisiologis NaCl untuk ikan betok
Konsentrasi dan motilitas sperma sebelum dan  pascapengaktifan  ditunjukkan  pada  Tabel  4. Konsentrasi  NaCl  1,3%  adalah  yang  terbaik  se- bagai  media  pelarut  dalam  proses  penyimpanan sperma,  sedangkan  konsentrasi  NaCl  yang  lebih
rendah  menyebabkan  sperma  aktif  bergerak. Oleh  karena  itu  dapat  dikatakan  bahwa  larutan NaCl  1,3%  yang  digunakan  bersifat  isotonis  ter- hadap  cairan  sperma  ikan  betok.  Osmolaritas  la- rutan NaCl 1,3% adalah 407 mOsmol kg -1 . Nilai tersebut  relatif  sama  dengan  osmolaritas  tubuh ikan betok, berkisar 390-405 mOsmol kg -1 . Nilai osmolaritas gonad relatif sama dengan osmolari- tas tubuh, sebesar 390 mOsmol kg -1 .

## Motilitas sperma pascasimpan pada suhu ruang dan suhu dingin
Seperti  ditunjukkan  pada  Tabel  5,  preser- vasi  sperma  menggunakan  NaCl  1,3%  dapat mempertahankan  kualitas  sperma  pada  kondisi maksimal  (skala  5)  dalam  waktu  60  menit,  baik pada  suhu  dingin  maupun  suhu  ruang.  Penyim- panan pada suhu dingin mengakibatkan penurun- an  kualitas  sperma  yang  lebih  cepat  bila  diban- dingkan  dengan  suhu  ruang,  sedangkan  sperma yang  disimpan  tanpa  pengencer  dapat  bertahan hingga 360 menit pascakoleksi.

## Derajat pembuahan, derajat penetasan, dan kelangsungan hidup larva
Derajat  pembuahan,  derajat  penetasan, dan  kelangsungan  hidup  larva  ikan  betok  disaji- kan  pada  Gambar  2.  Derajat  pembuahan  telur menggunakan sperma dari testis cacah untuk pe- mijahan  buatan  adalah  sama  dengan  pemijahan semi alami (p>0,05), sedangkan yang mengguna- kan sperma dari pengalinan lebih rendah. Daya t
Tabel 3. Bobot induk dan karakteristik fisiologis cairan sperma ikan betok jantan
Parameter Non induksi Induksi hormonal Bobot induk (gram) 19,76±7,06 a 20,00±6,66 a Volume semen (µL) 9,33±2,21 b 102,78±22,78 a pH sperma 7-8 a 9-10 b Spermatokrit (%) 53,42±12,17 a 46,45±11,84 b
Kepadatan sperma (x10 9 mL -1 ) 16,95±9,71 b 26,78±9,91 a
Keterangan: Induksi hormonal menggunakan ovaprim 0,5 mL kg -1 induk. Huruf tika atas berbeda pada lajur yang sama menunjukkan nilai yang berbeda nyata (p<0,05).
Tabel 4. Konsentrasi larutan NaCl dan motilitas sperma sebelum dan pascapengaktifan dengan air
Konsentrasi larutan NaCl (%) Motilitas sebelum pengaktifan Kondisi osmotik Motilitas pascapengaktifan - 0 (Tidak aktif) - 5 (Aktif bergerak) 0 5 (Aktif bergerak) Hipo-osmotik 5 (Aktif bergerak) 0,9 3 (Banyak bergerak) Hipo-osmotik 5 (Aktif bergerak) 1,0 3 (Banyak bergerak) Hipo-osmotik 5 (Aktif bergerak) 1,1 1 (Bergetar sedikit) Hipo-osmotik 5 (Aktif bergerak) 1,2 1 (Bergetar sedikit) Hipo-osmotik 5 (Aktif bergerak) 1,3 0 (Diam) Iso-osmotik 5 (Aktif bergerak) 1,4 0 (Diam) Hiper-osmotik 4 (Banyak bergerak) 1,5 0 (Diam) Hiper-osmotik 3 (Banyak bergerak)
Keterangan: Motilitas sebelum pengaktifan menunjukkan aktivitas sperma pascacampur larutan NaCl;  Motilitas pasca- pengaktifan menunjukkan motilitas sperma pascacampur dengan air. Penilaian berdasarkan Guest et al . (1976).
Tabel 5. Motilitas sperma pascasimpan pada suhu ruang dan suhu dingin, dengan pengencer larutan NaCl
1,3%
Penyimpanan Waktu (menit) 0 3 5 10 15 30 45 60 120 150 180 240 360 720 Suhu ruang 26 ˚C 5 5 5 5 5 5 5 5 4 1 0,5 0,5 0,5 0 Suhu 4 ˚C 5 5 5 5 5 5 5 5 4 3 1 0,5 0 0 Kontrol 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0
Keterangan: Kontrol merupakan sperma tanpa pengenceran yang ditempatkan pada suhu ruang 26 ˚ C.
Gambar 2. Derajat pembuahan (DP), derajat penetasan (DT), dan kelangsungan hidup larva pada 10 hari pascatetas (Khl) ikan betok menggunakan berbagai sperma dengan cara koleksi berbeda.
etas  telur  dan  kelangsungan  hidup  larva  hingga 10  hari  pascatetas  adalah  sama  pada  semua  per- lakuan.

## Viabilitas sperma pascakejut listrik
Viabilitas  sperma  ikan  betok  pascakejut listrik disajikan pada Gambar 3.  Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  viabilitas  sperma  menurun
seiring dengan meningkatnya voltase dan jumlah kejut  listrik  yang  diberikan.  Selain  itu,  terdapat interaksi  antara  faktor  voltase  dan  jumlah  kejut terhadap viabilitas sperm, semakin tinggi voltase dan  jumlah  kejut  maka  semakin  rendah  tingkat viabilitas  sperma  (p<0,05).  Viabilitas  sperma perlakuan 50 volt dan jumlah kejut 1 kali adalah sama dengan kontrol.
0 20 40 60 80 100 DP DT Khl P ers en ( % )
Pemijahan semi-alami Pengalinan sperma
Testis cacah
Gambar 3. Viabilitas sperma ikan betok setelah diberi kejut listrik dengan voltase dan jumlah kejut berbeda. Angka 1,3, dan 5 menunjukkan jumlah kejut listrik yang diberikan, kontrol merupakan sperma tanpa kejut listrik.

## Pembahasan

## Morfologi dan fisiologi
Pada  penelitian  ini  diketahui  bahwa  mor- fologi  sperma  ikan  betok  sama  halnya  dengan sperma  ikan  pada  umumnya,  yakni  terdiri  atas kepala,  bagian  tengah,  dan  ekor  (Mattei  1991), tetapi berbeda bila dibandingkan dengan kerabat- nya  pada  subordo  Anabantoidei  yaitu  ikan  gura- mi  ( Osphronemus  gouramy )  yang  hanya  memi- liki  kepala  dan  ekor  sperma  (Hardita  2010).  Ke- pala  sperma  ikan  betok  berbentuk  oval  (Gambar 2), hal ini berbeda serta berukuran lebih kecil di- bandingkan  dengan  sperma  ikan  gurami  yang berbentuk  bulat  berdiameter  4,8±1,53  µm  (Har- dita  2010).  Ukuran  dan  bentuk  kepala  sperma ikan  betok  mirip  dengan  sperma  ikan European perch ( Perca fluviatilis ) yang berukuran panjang kepala  1,87  µm  dan  lebar  kepala  1,78  µm (Lahnsteiner  &  Patzner  1995),  ikan Barbus  bar- buda (Teleostei:  Cyprinidae)  berukuran  panjang kepala sperma 1,80±0,06 µm (Alavi et al . 2008), ikan Atlantic  halibut ( Hippoglossus  hippoglos- sus )  dengan  panjang  kepala  1,43±0,01  µm  dan lebar kepala 1,55±0,01 µm (Alavi et al . 2011). Panjang  bagian  tengah  (0,93±0,23  µm) dan  ekor  (33,05±1,40  µm)  sperma  ikan  betok mendekati  ukuran  panjang  bagian  tengah  ikan
European  perch sebesar  0,87  µm  dan  panjang ekor  30-35  µm.  Ukuran  panjang  total  sperma ikan European  perch sebesar  30,4-32,4  µm (Lahnsteiner  &  Patzner  1995)  juga  hampir  sama dengan  panjang  total  sperma  ikan  betok  (35,54 ±4,66  µm).  Ukuran  panjang  bagian  tengah  dan ekor  sperma  ikan  betok  juga  mendekati  ukuran sperma  ikan Northern  pike ( Esox  lucius )  yang berukuran berturut-turut 1,04±0,32 µm dan 30,12 ±4,08 µm (Alavi et al . 2009). Panjang ekor sper- ma ikan betok lebih pendek daripada ikan gurami (42,8±5,60 µm).
Bagian  tengah  dan  bagian  ekor  sperma merupakan bagian yang mengatur kecepatan dan lama  waktu  pergerakan  sperma.  Total  estimasi durasi pergerakan sperma ikan betok pada pene- litian ini adalah selama 116±34 detik, lebih lama daripada  sperma  ikan  gurami  (103,67±2,52  de- tik),  dan  sperma  ikan Northern  pike (90  detik).
Perbedaan lama waktu pergerakan sperma diduga terkait  dengan  perbedaan  jumlah  mitokondria dan  panjang  ekor.  Hal  tersebut  sejalan  dengan pernyataan  Bacceiti et  al .  (1984)  bahwa  lama waktu pergerakan sperma dapat dikaitkan dengan panjang ekor serta jumlah mitokondria yang ber- ada pada bagian tengah sperma. Jumlah mitokon- dria ikan ordo Perciformes dari jenis famili Ana-
[CELLRANGE] [CELLRANGE]
[CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] [CELLRANGE] 0 20 40 60 80 100 Awal 0 50 125 250 500 V iab ili tas S pe rm a (%) Voltase (Volt) 1 3
5 0
bantoidei sebanyak dua buah (Mattei 1991). De- ngan  ukuran  sperma  yang  hampir  sama,  sperma ikan betok dan ikan gurami memiliki lama waktu pergerakan yang lebih panjang bila dibandingkan dengan sperma ikan Northern pike . Jumlah mito- kondria  ikan Northern  pike adalah  satu  buah (Alavi et al . 2009).
Volume  cairan  sperma  ikan  betok  pada penelitian  diketahui  meningkat  secara  signifikan (p<0,05) akibat induksi ovaprim yang diberikan.
Hal yang sama telah dilaporkan oleh Kowalski et al .  (2012)  pada  ikan European  smelt ( Osmerus eperlanu ) bahwa  volume  semen  dan  kepadatan sel sperma meningkat sangat drastis pascainduksi ovaprim , yaitu sebesar 13 kali lipat. Penyuntikan induk  ikan  gurami  menggunakan ovaprim de- ngan dosis 0,7 mL kg -1 bobot induk juga terbukti meningkatkan  volume  sperma  dari  0,013±0,01 mL  kg -1 menjadi  0,184±0,13  mL  kg -1 bobot  tu- buh, atau meningkat sebesar 14 kali lipat (Hardi- ta  2010).  Induksi ovaprim pada  ikan  mas  yang dipelihara  pada  wadah  terkontrol  serta  di  alam bebas  memberikan  peningkatan  sebesar  12  kali lipat dan 10 kali lipat terhadap perlakuan kontrol (Seifi et  al .  2011).  Peningkatan  volume  semen tersebut  merupakan  efek  induksi  spermiogene- sis.  Hal  tersebut  sejalan  dengan  pernyataan Nagahama  (1994)  bahwa  hormon  gonadotropin akan  merangsang  sintesis  testosteron  dan  11- ketotestosteron  yang  mengakibatkan  spermato- genesis dan spermiogenesis. Selain itu, Sukuma- savin  (2007)  mengemukakan  bahwa  17a-20ß- dihidroprogesteron  yang  berasal  dari  rangsangan LH,  menyebabkan  sperma  dihidrasi  oleh  larutan seminal  yang  menghasilkan larutan sperma  yang disebut  cairan  semen,  sehingga  volume  semen meningkat.
Peningkatan pH  yang terjadi  pada peneli- tian  ini  adalah  sebesar  2  satuan.  pH  cairan  sper-
ma  ikan  tanpa  induksi  sebesar  7-8,  dan  mening- kat  menjadi  9-10  pascainduksi.  Peningkatan  pH diduga  terjadi  akibat  perubahan  pengaturan  hor- mon  di  dalam  testis.  Hasil  yang  sama  juga  dila- porkan  oleh  Alavi  &  Cosson  (2005)  bahwa  pH sperma  ikan  salmon  meningkat  dari  7,5  menjadi 8,0  saat  disalurkan  dari  testis  menuju  saluran sperma  yang  diakibatkan  oleh  pengaruh  hormo- nal. Peningkatan pH yang signifikan (p<0,01) ju- ga  terjadi  pada  ikan  mas  pascainduksi  dengan ovaprim dan ekstrak pituitari (Seifi et al . 2011).
Induksi ovaprim pada induk ikan betok ti- dak  mengubah  nilai  spermatokrit  (Tabel  3).  Hal yang sama juga ditemukan pada ikan gurami pas- cainduksi ovaprim (Hardita  2010)  dan  ikan Atlantic  halibut ( Hippoglossus  hippoglossus ) yang  diberi  perlakuan  implantasi  GnRH(a)  Ova- plant (Tvedt et al . 2001). Nilai spermatokrit ikan gurami  (6%)  lebih  rendah  bila  dibandingkan  de- ngan  nilai  spermatokrit  ikan  betok.  Hal  yang sebaliknya  terjadi  pada  ikan Brycon  amazonicus yang  menunjukkan  penurunan  nilai  spermatokrit pascainduksi  ekstrak  pituitari  ikan  mas  dan  hor- mon  sintesis  (GnRH-a)  (Pardo-Carrasco et  al . 2006).  Perbedaan tersebut diduga terkait dengan perbedaan  respons  ikan  terhadap  hormon  yang diberikan.
Tingkat  kepadatan  dan  jumlah  total  sper- ma  ikan  betok  meningkat  1,6  dan  1,8  kali  lipat dibandingkan  dengan  ikan  tanpa  induksi ova- prim .  Peningkatan  kepadatan  dan  jumlah  total sperma  juga  terjadi  pada  ikan  gurami  akibat  in- duksi ovaprim yang  diberikan,  yaitu  sebesar  1,2 kali  lipat  (Hardita  2010).  Hal  serupa  juga  telah dilaporkan  pada  ikan Greenback  flounder ( Rhomboselea  tapirina )  (Lim et  al. 2004),  ikan European  sea  bass ( Dicentrarchus  labrax ) (Schiavone et al. 2006) dan ikan bawal air tawar Colossoma macropomum (Maria et al . 2010).

## Larutan fisiologis ikan betok
Osmolaritas semen ikan betok lebih tinggi dibandingkan  dengan  osmolaritas  ikan  air  tawar pada umumnya, seperti ikan mas koki Carassius auratus (317±11  mOsmol  kg -1 ),  ikan  mas  (254± 16,7 mOsmol kg -1 ) (Morisawa 1985), ikan Tinca tinca (230±82  mOsmol  kg -1 )  (Psenicka et  al .
2006),  ikan Northern  pike (283,88±33,05
mOsmol kg -1 ) (Alavi et al . 2009), dan ikan muja- ir  ( Oreochromis  mossambicus )  yang  diaklimati- sasi  pada  air  laut  (351  mOsmol  kg -1 ) (Linhart et al. 1999).  Nilai  osmolaritas  pada  penelitian  ini mendekati  nilai  osmolaritas  ikan  air  laut  seperti ikan European sea bass (400 mOsmol kg -1 ), dan ikan Atlantic  cod ( Gadus  morhua )  (414±30 mOsmol  kg -1 )  (Litvak  &  Trippel  1998).  Tingkat osmolaritas  tubuh  dan  gonad  ikan  betok  yang tinggi  diakibatkan  oleh  kandungan  dan  kompo- sisi  biokimiawi  di  dalam  cairan  sperma.  Hal  ini sejalan dengan Billard et al . (1995) dan Alavi et al .  (2007).  Secara  umum  komposisi  ion-ion  di dalam  semen  meliputi  Na + ,  Ca 2+ ,  K + ,  Cl - dan lainnya, dengan tingkat osmolaritas sebesar 300- 350 mOsmol kg -1 (Perez et al . 2003, Asturiano et al . 2004, dan Morisawa 2001, 2008).
Tingkat  osmolaritas  yang  tepat  untuk mempertahankan  sperma  ikan  betok  dalam  kea- daan diam seperti di dalam gonad adalah pada la- rutan fisiologis NaCl 1,3% atau setara pada ting- kat osmolaritas 407 mOsmol/kg (Tabel 4). Ting- kat osmolaritas tersebut mendekati tingkat osmo- laritas  tubuh  dan  gonad  ikan  betok,  sehingga sperma  terbukti  dapat  dipertahankan  dalam  ke- daan  diam  atau  tidak  aktif.  Hal  ini  seperti  yang diungkapkan  oleh  Cosson  (2004)  bahwa  sperma ikan pada umumnya bersifat tidak aktif atau diam saat berada di dalam testis dan cairan sperma pa- da banyak spesies. Penggunaan larutan fisiologis dengan konsentrasi NaCl lebih rendah dari 1,3% menyebabkan  sperma  masih  aktif  dan  bergerak.
Hal ini menunjukkan bahwa larutan tersebut ber- sifat  hipo-osmotik  terhadap  cairan  sperma  dan merangsang sperma untuk aktif dan bergerak.
Penggunaan  larutan  fisiologis  dengan konsentrasi  yang  lebih  tinggi,  yaitu:  1,4  dan 1,5% bersifat hiper-osmotik dapat mempertahan- kan sperma dalam keadaan diam atau tidak aktif. Namun demikian, konsentrasi NaCl tersebut ber- dampak pada penurunan tingkat motilitas sperma ikan  betok  (Tabel  4).  Hal  ini  dapat  diakibatkan oleh rusaknya sperma ikan betok karena pemapa- ran  sperma  pada  larutan  NaCl  yang  melebihi tingkat  osmolaritas  tubuh.  Dampaknya  adalah sperma  terangsang  untuk  mengembang  atau  ter- jadi  pembengkakan,  gangguan  ini  terjadi  pada membran  plasma  diakibatkan  oleh  perubahan osmotik  yang  sangat  tinggi.  Tingkat  osmolaritas pada  kadar  NaCl  1,4%  (425  mOsmol  kg -1 )  dan
1,5  %  (445  mOsmol  kg -1 )  lebih  tinggi  daripada osmolaritas  tubuh  dan  gonad  ikan  betok.  Hal yang  sama juga ditemukan pada sperma ikan air tawar  lainnya.  Sperma  bergerak  dalam  waktu singkat  atau  bahkan  mati  saat  terpapar  larutan dengan  osmolaritas  melebihi  450  mOsmol  kg -1
(Cosson  2004).  Alasan  lain  adalah  karena  ion
Na + dan Cl - yang bersifat toksik pada sperma, se- hingga  berakibat  pada  sistem  biologis  sperma. Salinitas  merupakan  salah  satu  parameter  kimia- wi air yang keberadaannya dapat bersifat mema- tikan  jika  nilainya  berada  di  luar  batas  toleransi ( masking factor ) (Affandi & Tang 2002).
Penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  peng- gunaan larutan  fisiologis NaCl 1,3% sebagai pe- larut proses preservasi sperma ikan betok berha- sil mempertahankan sperma pada kualitas skor 5 (Guest et  al. 1976)  dengan  maksimal  selama waktu penyimpanan 60  menit, baik  yang dilaku- kan  pada  suhu  dingin  4˚C  maupun  suhu  ruang 26˚C.  Durasi  penyimpanan  sperma  ikan  betok yang  singkat  dapat  diakibatkan  oleh  berbagai
faktor,  di  antaranya  adalah  ketidakcocokan  me- dia  pelarut  sebagai  media  penyimpanan  sperma, yaitu terkait aspek pH dan tingkat osmolaritasnya (Bobe  &  Labbe  2010),  perbandingan  jumlah  pe- larut  dan  sperma,  dan  suhu  inkubasi  yang  opti- mum.  Berbeda  dengan  hasil  pada  penelitian  ini, penyimpanan  sperma  dalam  suhu  dingin  telah sukses  dilakukan  pada  kebanyakan  jenis  ikan, bahkan sperma dapat disimpan selama 2-3 ming- gu  menggunakan  metode  sederhana  (Kang et  al.
2004). Namun demikian, Labbe et al. (1997) me-
nyatakan  berapapun  suhu  penetasan  embrio,  pe- nanganan sperma pada suhu 0-4˚C lebih tepat di- gunakan untuk menurunkan laju metabolisme sel sperma,  karena  kebanyakan  sperma  ikan  tidak terlalu  sensitif  terhadap  suhu,  sehingga  tidak akan  mengakibatkan  kerusakan  yang  berbahaya. Sementara  itu,  penyimpanan  sperma  tanpa  pela- rut  yang  dilakukan  pada  penelitian  ini  dapat mempertahankan  sperma  ikan  betok  dengan kualitas  yang  sama  pada  suhu  ruang  hingga  360 menit.  Hal  ini  sudah  cukup  lama  untuk  mendu- kung pemijahan buatan pada ikan betok.

## Pengaruh metode pembuahan
Nilai DP telur  pada perlakuan pangalinan sperma  lebih  rendah  daripada  perlakuan  lainnya (Gambar  2).  Nilai  DP  yang  rendah  tersebut  dia- kibatkan oleh menurunnya kualitas sperma (ting- kat  motilitasnya)  sebelum  mencapai  telur,  se- hingga jumlah telur yang berhasil dibuahi menja- di rendah. Motilitas yang menurun adalah akibat pengaktifan sperma oleh cairan  urin  yang  keluar bersamaan dengan sperma, sehingga kemampuan jelajah dan waktu hidup sperma menurun. Hal ini sesuai  dengan  pernyataan  Trippel  (2003)  bahwa kemampuan fertilisasi induk jantan terhadap telur sangat dipengaruhi oleh kualitas sperma.
Nilai  kelangsungan  hidup  yang  didapat dalam  penelitian  ini  (37,21-51,96%)  lebih  tinggi
dibandingkan  hasil  penelitian  Sembiring  (2011) sebesar  28,47%  pada  umur  pengamatan  13  hari. Tingkat  kelangsungan  hidup  yang  rendah  pada penelitian  ini  dapat  diakibatkan  oleh  faktor  eks- ternal, yaitu ketersediaan pakan yang berkualitas bagi  larva  untuk  perkembangan  organ  tubuh yang  masih  sederhana  menuju  kesempurnaan (Effendi 2004), dan kualitas air berupa suhu, sa- linitas,  kandungan  oksigen,  pH,  cahaya,  kadar karbondioksida, dan amonia (Lagler et al . 1977).

## Pengaruh kejut listrik
Viabilitas  sperma  tertinggi  didapat  pada perlakuan  kontrol,  selanjutnya  menurun  dengan meningkatnya  voltase  dan  jumlah  kejut,  serta voltase  dan  jumlah  kejut  yang  diberikan  saling berinteraksi  menurunkan  tingkat  motilitas  dan viabilitas  sperma  (p<0,05).  Hal  tersebut  serupa dengan pernyataan Sin et al. (2000) yang menya- takan  bahwa  motilitas  sperma  ikan  merupakan ukuran  kelangsungan  hidup  sperma  akibat  elek- troporasi,  semakin  tinggi  tegangan  dan  lama waktu  papar  kejutan  akan  menurunkan  motilitas sperma. Pada penelitian ini perlakuan  voltase 50 volt dan jumlah kejut satu kali tidak memberikan perbedaan  yang  signifikan  terhadap  perlakuan kontrol  pada  parameter  motilitas  dengan  nilai skor  5  dan  viabilitas  sperma  sebesar  99,00± 0,00%.
Keberhasilan  fertilisasi  telur  oleh  sperma pascakejut  sangat  dipengaruhi  oleh  kemampuan motilitas  sperma  tersebut.  Terdapat  korelasi  po- sitif  terkait  kemampuan  DNA  asing  masuk  dan berintegrasi  dengan  inti  sperma  dengan  kualitas semen  dan  tingkat  motilitas  sperma.  Untuk  itu diperlukan  progresivitas  sperma  paling  tidak 80% dan tidak boleh lebih kecil dari 65% (Lavi- trano et  al. 2006).  Selain  itu  sperma  dalam  kon- disi  motil  akan  lebih  mampu  mengikat  DNA asing  yang ditransfer  hingga  mencapai 30% dari
keseluruhan sperma (Sin et al. 2000). Dengan de- mikian, perlakuan voltase dan jumlah kejut yang didapat  pada  penelitian  ini  berpeluang  untuk  di- gunakan  dalam    memproduksi  ikan  betok  trans- genik.  Setidaknya  ada  dua  parameter  penting yang  harus  optimal  dalam  teknik  transgenesis melalui  mediasi  sperma  agar  lebih  efisien,  yaitu keberhasilan  proses  preservasi  sperma,  kualitas sperma yang baik serta keberhasilan proses pem- buahan  telur  oleh  sperma.  Proses  ini  sangat  di- pengaruhi  oleh  viabilitas  dan  motilitas  sperma yang tinggi.

## Simpulan
Penelitian  ini  telah  berhasil  mengidentifi- kasi karakter morfologi dan fisiologi sperma ikan betok. Sperma ikan betok terdiri  atas tiga bagian utama  dengan  ukuran  panjang  total,  panjang  ke- pala,  panjang  bagian  tengah,  dan  panjang  ekor adalah  berturut-turut  35,54±4,66  µm;  1,83±0,20 µm; 0,93±0,23 µm; dan 33,05±1,40 µm, sedang- kan  lebar  kepala  sebesar  1,48±0,21  µm.  Lama gerak  sperma  dalam  air  adalah  116±34  detik. Tingkat  osmolaritas  tubuh  dan  testis  ikan  betok berkisar antara 390-405  mOsmol  kg -1 ,  setara de- ngan  osmolaritas  larutan  NaCl  1,3%  (407 mOsmol  kg -1 ).  Larutan  fisiologis  NaCl  1,3% efektif  dalam  preservasi  sperma  jangka  pendek (maks  60  menit)  pada  suhu  ruang  dan  suhu  di- ngin,  sedangkan  penyimpanan  yang  dilakukan tanpa  pengenceran  dapat  bertahan  selama  360 menit  pada  suhu  ruang.  Viabilitas  dan  motilitas sperma  ikan  betok  sangat  dipengaruhi  oleh  volt- ase,  dan  jumlah  kejut  listrik  yang  diberikan,  ke- dua  faktor  saling  berinteraksi.  Voltase  50  volt dan  jumlah  kejut  satu  kali  berpotensi  digunakan sebagai metode kejut listrik terhadap sperma ikan betok untuk memperoleh ikan transgenik melalui metode elektroporasi.

## Daftar pustaka
Affandi R, Tang UM. 2002. Fisiologi hewan air . Unri Pers, Pekanbaru, Riau. 213 hlm.
Alavi  SMH,  Butts  IAE,  Hatef  A,  Mommens  M, Trippel  EA,  Litvak  MK,  Babiak  I.  2011. Sperm  morphology,  ATP  content,  and  ana- lysis  of  motility  in  Atlantic  halibut Hippo- glossus  hippoglossus . Canadian  Journal  of Zoology , 89(3):219-228.
Alavi  SMH,  Cosson  J.  2005.  Sperm  motility  in fishes.  I.  Effects  of  temperature  and  pH:  A review. Cell  Biology  International ,  29(2): 101-110.
Alavi  SMH,  Linhart  O,  Coward  K,  Rodina  M. 2007.  Fish  spermatology:  implications  for aquaculture  management. In :  Alavi  SMH,
Cosson JJ, Coward K, Raﬁee G, (ed.). Fish spermatology .  Alpha  Science  Ltd.  Oxford. pp. 397-460.
Alavi  SMH,  Psenicka  M,  Policar  T,  Linhart  O.
2008.  Morphology  and  ﬁne  structure  of
Barbus  barbus Teleostei:  Cyprinidae  sper- matozoa. Journal  of  Applied  Ichthyology , 24(4):378-381.
Alavi  SMH,  Rodina  M,  Viveiros  ATM,  Cosson J, Gela D, Boryshpolets S, Linhart O. 2009. Effects of osmolality on sperm morphology, motility  and  flagellar  wave  parameter  in Northern pike Esox lucius L. Theriogenolo- gy , 72(1):32-43.
Asturiano  JF,  Pérez  L,  Garzón  DL,  Marco- Jiménez  F,  Peñaranda  DS,  Vicente  JS,  Jo- ver  M.  2004.  Physio-chemical  characteris- tics  of  seminal  plasma  and  development  of media and methods for the cryopreservation of  European  eel  sperm. Fish  Physiology and Biochemistry , 30(3-4):283-293.
Baccetti B, Burrini  AG,  Callaini G, Gibertini G,
Mazzini  M,  Zerunian  S.  1984.  Fish  germi- nal  cells.  I.  Comparative  spermatology  of seven  cyprinid  species. Gamete  Research , 10(4):373-396.
Billard R, Cosson J, Crim LW, Suquet M. 1995. Sperm physiology and quality. In : Bromage NR,  Roberts  RJ,  (ed.). Brood  stock  mana- gement  and  egg  and  larval  quality .  Black- well Science, Amsterdam. pp. 25-52.
Bobe J, Labbe C. 2008. Chilled storage of sperm and eggs. In : Cabrita E,  Robles V, Herraez P  (editors). Methods  in  reproductive  aqua- culture : Marine  and  freshwater  species .
CRC Press, Taylor and Francis Group, Lon- don (UK). pp. 219-235.
Cheng CA,  Lu KL, Lau EL, Yang TY, Lee CY, Wu  JL,  Chang  CY.  2002.  Growth  promo- tion in ayu ( Plecoglossus altivelis ) by  gene transfer  of  the  rainbow  trout  growth  hor- mone  gene. Zoological  Studies ,  41(3):303- 310.
Cosson  J.  2004.  The  ionic  and  osmotic  factors controlling  motility  of  ﬁsh  spermatozoa. Aquaculture International , 12(1):69-85.
Effendi  I.  2004. Pengantar  akuakultur .  Penebar Swadaya, Jakarta. 192 hlm.
Guest  WC,  Avault  JW,  Rousel  JA.  1976.  Sper- matogeny study of chanel catfish ( Ictalurus punctatus ). Transactions  of  the  American Fisheries Society , 105(5):463-468.
Hafez  ESE.  1987.  Semen  evaluation. In Hafez ESE  (Ed.). Reproduction  in  farm  animals , Lea and Febiger. Philadelphia. pp. 287-297.
Hardita  AG.  2010.  Evaluasi  kualitas  dan  kuan- titas  sperma  ikan  gurame Osphronemus gouramy dengan penyuntikan ovaprim pada tingkatan dosis yang berbeda. Skripsi . Insti- tut Pertanian Bogor. Bogor. 56 hlm.
Inoue K, Yamashita S, Hata J, Kabeno S, Asada S,  Nagahisa  E,  Fujita  T.  1990  Electropora- tion  as  a  new  technoloque  for  producing transgenic fish. Cell Differentiation and De- velopment , 29(2):123-128.
Kang  KH,  Shao  MY,  Kho  KH,  Zhag  ZF.  2004. Short-term  storage  and  cryopreservation  of Urechis  unicinctus (Echlua:  Urechidae) sperm. Aquaculture  Research, 35(13): 1195-1201.
Kowalski RK, Hliwa P, Cejko BI, Krol J, Stabin- ski  R,  Ciereszko  A.  2012.  Quality  and quantity  of  smelt  ( Osmerus  eperlanus L.) sperm  in  relation  to  time  after  hormonal stimulation. Society  for  Biology  of  Repro- duction , 12(2): 231-246.
Labbe C,  Crowe LM, Crowe  JH. 1997. Stability of the lipid component of trout sperm plas- ma  membrane  during  freeze–thawing.
Cryobiology , 34(2): 176–182.
Lahnsteiner  F,  Patzner  RA.  2007.  Sperm  mor- phology and ultrastructure in fish. In : Alavi
SMH, Cosson J, Coward K, Rafiee G (Edi- tors). Fish spermatology . Alpha Science In- ternational Ltd, Oxford. pp. 1–61.
Lim  HK,  Pankhurst  NW,  Fitzgibbon  QP.  2004. Effects of slow release gonadotropin releas- ing  hormone  analog  on  milt  characteristics and  plasma  levels  of  gonadal  steroids  in
greenback  flounder Rhombosolea  tapirina . Aquaculture , 240(1-4):505-516.
Linhart O, Walford J, Sivaloganathan B, Lam TJ. 1998. Effects of osmolarity and ions on the motility  of  stripped  and  testicular  sperm  of freshwater-  and  sea-water-acclimated  tila- pia, Oreochromis  mossambicus . Journal of Fish Biology , 55(6):1344-1358.
Litvak  MK,  Trippel  EA.  1998.  Sperm  motility patterns of Atlantic cod ( Gadus morhua ) in relation  to  salinity:  effects  of  ovarian  and egg  presence. Canadian  Journal  of  Fish- eries  and  Aquatic  Sciences ,  55(8):1871- 1877.
Lavitrano  M,  Marcho  B,  Maria  GC,  Roberto  G,
Stefano  M,  Alessia.  2006.  Sperm  mediated gene  transfer. Reproduction,  fertility  and development , 18(1-2):19-23.
Lu JK, Fu BH, Wu JL, Chen TT. 2002. Produc- tion  of  transgenic  silver  sea  bream  ( Sparus sarba )  by  different  gene  transfer  methods.
Marine Biotechnology , 4(3):328-337.
Maria  AN,  Azevedo  HC,  Santos  JP,  Carneiro PCF. 2012. Hormonal induction and semen characteristics  of  tambaqui  Colossoma macropomum. Zygot e, 20(1):39-43
Marlina  E.  2011.  Optimasi  osmolaritas  media dan hubungannya dengan respons fisiologis benih  ikan  baung  ( Hemibagrus  nemurus ).
Tesis .  Institut  Pertanian  Bogor.  Bogor.  108 hlm.
Mattei X. 1991. Spermatozoon ultrastructure and its systematic implication in fishes. Canadi- an Journal of Zoology , 69(12):3038-3055.
Morisawa    M.  1985.  Initiation  mechanism  of sperm motility at spawning in teleosts. Zoo- logical Science , 2:605-615.
Morisawa  M.  2008.  Adaptation  and  strategy  for fertilization  in  the  sperm  of  teleost  fish.
Journal  of  Applied  Ichthyology ,  24(4):362- 370.
Morisawa S. 2001. Ultrastructural studies of late- stage  spermatids  and  mature  spermatozoa of the pufferﬁsh, Takifugu niphobles (Tetra- odontiformes) and the effects of osmolality on  spermatozoan  structure. Tissue  &  Cell , 33(1):78-85.
Nagahama  Y.  1994.  Endocrine  regulation  of  ga- metogenesis  in  fish. International  Journal of Developmental Biology , 38(2):217-229.
Pardo-Carrasco  SC,  Zaniboni-Filho  E,  Arias- Castellanos J, Suarez-Mahecha H, Atencio- Garcia  VJ,  Cruz-Casallas  PE.  2006.  Evalu- ation  of  milt  quality  of  the  yamu Brycon
amazonicus under  hormonal  induction. Re- vista  Colombiana  de  Ciencias  Pecuarias , 19(2):134-139.
Pérez,  L,  Asturiano  JF,  Martínez  S,  Tomás  A, Olivares  L, Mocé E,  Lavara  R, Vicente JS,
Jover M. 2003. Ionic composition and phy- sio-chemical  parameters  of  the  European eel  ( Anguilla  anguilla )  seminal  plasma.
Fish  Physiology  and  Biochemistry ,  28(1): 221-222.
Psenicka M, Rodina M, Nebesarova J, Linhart O. 2006. Ultrastructure of spermatozoa of tech Tinca tinca observed by means of scanning and transmission electron microscopy. The- riogenology , 66(5):1355-1363.
Schiavonea  R,  Zillia  L,  Vilellaa  S,  Fauvelb  C. 2006.  Human  chorionic  gonadotropin  in- duces  spermatogenesis  and  spermiation  in 1-year-old  European  sea  bass Dicentrar- chus  labrax :  Assessment  of  sperm  quality. Aquaculture , 255(1-4):522-531.
Seifi  T,  Imanpoor  MR,  Golpour  A.  2011.  The effect  of  different  hormonal  treatment  on semen  quality  parameter  in  cultured  and wild carp. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences , 11(4):595-602.
Sembiring APV. 2011. Pertumbuhan dan kelang- sungan hidup larva ikan betok ( Anabas tes- tudineus )  pada  pH  4,  5,  6,  dan  7. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor. 39 hlm.
Sin  FYT,  Walker  SP,  Symonds  JE,  Mukherjee UK,  Khoo  JGI,  Sin  IL.  2000.  Electropora- tion of salmon sperm for gene transfer: effi- ciency,  reliability,  and  fate  of  transgene.
Molecular Reproduction and Development , 56(52):285-288.
Sukumasavin N. 2007. Fish reproduction. Advan- ced  Freshwater  Aquaculture:  Fish  Repro- duction , 5(4):132-159.
Symonds  JE,  Walker  SP,  Sin  FYT.  1994.  Deve- lopment  of  mass  gene  transfer  method  in chinook salmon: optimization of gene trans- fer  by  electroporated  sperm. Molecul- ar   Marine  Biology  and  Biotechnology ,  3: 104-111.
Takahashi  M,  Furukawa  T,  Saitoh  H,  Aoki  A, Koike  T,  Moriyama  Y,  Shibata  A.  1991. Gene  transfer  into  human  leukemia  cell lines  by  electroporation:  Experience  with exponentially  decaying  and  square  wave pulse . Leukimia Research , 15(6):507-513.
Trippel  EA.  2003.  Estimation  of  male  reproduc- tive  success  of  marine  ﬁshes. Journal  of Northwest  Atlantic  Fishery  Science, 33:81- 113.
Tvedt  HB.  Benfey  TJ.  Martin-Robichaud  DJ.
Power  J.  2001.  The  relationship  between sperm density, spermatocrit, sperm motility and  fertilization  success  in  halibut, Hippo- glossus  hippoglossus . Aquaculture ,  194(1- 2):192-200.
Widodo  P,  Bunasir,  Fauzan  G,  Syafrudin.  2007. Kaji  terap  pembesaran  ikan  papuyu ( Ana- bas  testudineus Bloch) dengan  pemberian kombinasi  pakan  pelet  dan  keong  mas  da- lam  jaring  tancap  di  perairan  rawa .  Balai Budidaya  Air  Tawar  Mandiangin.  Direkto- rat  Jenderal  Perikanan  Budidaya.  Departe- men  Kelautan  dan  Perikanan.  Banjarmasin. 26 hlm.
Yaskowiak  ES,  Shears  MA,  Agarwal-Mawal  A, Fletcher  GL.  2006.  Characterization  and multi-generational  stability  of  the  growth hormone transgene (EO-1α) responsible for enhanced  growth  rates  in  Atlantic  Salmon. Transgenic Research , 15(4):465-480.