EISSN: 2407-7690 https://ejournal3.undip.ac.id/index.php/jmr
Optimasi Substrat Dan Pemilihan Co-Substrat Media Kultur Yang Sesuai Terhadap Pertumbuhan Dan Aktivitas Protease Ektraseluler Bakteri Bacillus Firmus Dari Perairan Nusa Lembongan Bali, Indonesia
Muhammad Zainuddin 1,2,3 , Delianis Pringgenies 4. *, Ocky Karna Radjasa 4,5 , Haeruddin 6 , Aninditia Sabdaningsih 1 , Vivi Endar Herawati 7
1 Program Doktor Manajemen Sumber Daya Pantai, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia
2 Marine Science Techno Park Universitas Diponegoro Jl. UNDIP, Desa Teluk Awur, Tahunan, Telukawur, Jepara, Jawa Tengah 59427 Indonesia
3 Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Sains dan Teknologi Unisnu Jepara Jl. Taman Siswa, Pekeng, Tahunan Jepara, Jawa Tengah 59451 Indonesia
4 Departemen Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia
5 Badan Riset dan Inovasi Nasional Republik Indonesia Jl. M.H. Thamrin No. 8, Jakarta Pusat 10340 Indonesia
6 Departemen Manajemen Sumber Daya Pantai, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro
7 Departemen Budidaya Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. H. Soedarto S.H, Tembalang, Semarang, Jawa Tengah 50275 Indonesia *Corresponding author e-mail: pringgenies@yahoo.com
ABSTRAK: Udang  merupakan  sumber  protein  hewani  yang  banyak  diminati  masyarakat  karena citarasa  enak  dan  bergizi.  Udang  merupakan  komoditas  perikanan  ekspor.  Upaya  pemenuhan kebutuhan ekspor  udang saat ini telah dilakukan budidaya intensif.  Budidaya intensif telah terjadi pemberian pakan yang berlebih sehingga terbentuk limbah organik di dasar tambak. Limbah pakan mengakibatkan terbentuknya senyawa nitrit dan amoniak yang toksik bagi udang. Komponen utama limbah ini adalah protein. Protein harus di dekomposisi menjadi asam amino oleh bakteri proteolitik. Salah  satu  bakteri  yang  memiliki  aktivitas  proteolitik  adalah  bakteri  Bacillus  Firmus  dari  simbion sponge  Chalinula  Pseudomolitba.  Tujuan  penelitian  adalah  melakukan  optimasi  substrat  dan pemilihan  co-substrat  media  kultur  yang  sesuai  terhadap  pertumbuhan  dan  aktivitas  protease ektraseluler  Bacillus  Firmus.  Penelitian  menggunakan  metode  eksperimen  laboratoris.  Penelitian terdiri dari uji optimasi substrat, pemilihan Co-substrat C dan N. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri  Bacillus  firmus  memiliki  laju  pertumbuah dan  aktivitas  protease terbaik  pada  media  kultur dengan subtrat susu skim 1% dengan nilai 0,110 c/jam dan 12,566 c IU/ml. Sumber C terbaik adalah glukosa  dengan  nilai  0,124  c/jam dan  16,094  cIU/ml.  Sumber  N  terbaik  adalah  amonium  nitrat dengan nilai sebesar 0,137 c/jam dan 19,046 c IU/ml.
Kata Kunci: bakteri; simbion; sponge; pertumbuhan; protease
Substrate Optimization and Selection of Co-Substrate for Culture Media Appropriate to growth and activity of extracellular protease bacteria Bacillus Firmus
From the waters of Nusa Lembongan Bali, Indonesia
ABSTRACT: Shrimp is a source of protein and have good taste. Shrimp is an export commodity. Shrimp cultivation is developing to be intensive. Intensive cultivation uses large amounts of feed. not all of the feed is eaten. leftover feed becomes waste.  Feed waste produces nitrite and ammonia. Ammonia  is  toxic.  Feed  waste  must  be  cleaned.  Decomposition  process  by  proteolytic  bacteria. Bacillus Firmus is a proteolytic bacterium from the symbiont sponge Chalinula Pseudomolitba. The research aims to optimize the substrate and select the co-substrate. The study used a laboratory experimental  method.  The  research  consisted  of  a  substrate  optimization  test,  selection  of  Co- substrate C and N. The results showed that Bacillus Firmus had the best growth rate and protease activity  on  1%  skimmed milk  substrate  with  values  of  0.110  c/hour  and 12,566  c IU/ml.  The  best
source of C is glucose with a value of 0.124 c/hour and 16,094 c IU/ml. The best source of N as ammonium nitrate with values of 0.137 c/hour and 19,046 c IU/ml.

## Keywords: bacteria, symbionts, sponges, growth, proteases

## PENDAHULUAN
Udang vannamei merupakan salah satu komuditas perikanan yang memiliki nilai ekspor yang tinggi.  Pemenuhan  kebutuhan  ekspor  udang  vannamei  telah  dilakukan  budidaya  secara  intensif. Budidaya  udang  secara  intensif  memiliki  biaya  pengeluaran  yang  besar  dari  sektor  pakan. Pemberian pakan yang berlebihan dalam budidaya udang intensif telah menimbulkan permasalahan akumulasi  sisa  pakan  di  dasar  tambak  menjadi  limbah  organik.  Limbah  organik  pakan  ini  di manfaatkan oleh bakteri secara anaerob sebagai sumber karbon dan nitrogen pertumbuhan. Produk samping dari proses anaerob tersebut adalah senyawa amonia dan nitrit yang bersifat racun bagi udang (El-Saadony et al. , 2021). Limbah organik yang tinggi di perairan tambak akan menurunkan DO  (dissolved  oxygen)  dan  meningkatnya  BOD  (biologycal  oxygen  demand).  Hal  ini  dapat mengganggu  ketahanan  udang,  menurunkan  laju  pertumbuhan  bahkan  dapat  menyebabkan  laju kematian (Holt et al. , 2021).
Limbah organik pakan ini harus didekomposisi agar tidak merusak kualitas media budidaya udang.  Proses dekomposisi dilakukan oleh bakteri penghasil enzim protease ekstraseluler. Salah satu bakteri yang memiliki aktivitas proteolitik tersebut adalah bakteri Bacillus firmus. Bakteri Bacillus firmus  merupakan  bakteri  yang  bersimbiosis  dengan  sponge  Chalinula  pseudomolitba.  sponge Chalinula  pseudomolitba  hidup  di  perairan  pantai  dengan  adanya  Ekosistem  Lamun.  Sponge  ini didapatkan di perairan Nusa Lembongan Bali – Indonesaia. Bakteri Bacillus firmus memiliki potensi untuk dikembangkan menjadi produk probiotik secara komersil. Bakteri probiotik yang diaplikasikan pada  media  budidaya  tambak  udang  dengan  fungsi  sebagai  bioremediasi  limbah  organik  pakan. Upaya mendapatkan biomassa bakteri yang cukup untuk aplikasi maka diperlukan teknologi kultur yang optimal. Peningkatan produksi biomassa sel memerlukan serangkaian optimasi dalam kultur, diantaranya  penggunaan  sumbstrat  dan  co-substrat.  Optimasi  substrat  media  merupakan  faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan dan biomassa sel bakteri (Zárate-Chaves et al. , 2013; Oh et al. , 2007). Nitrogen dalam media kultur sangat diperlukan untuk pertumbuhan sel, sedangkan unsur karbon media kultur digunakan untuk meningkatkan energi biosintesis (Rashmi and Gayathri, 2017). Penelitian ini memiliki tujuan mendapatkan kondisi substrat optimal dan pemilihan co-substrat yang  tepat  dalam  kultur  bakteri  Bacillus  firmus  untuk  meningkatkan  pertumbuhan  dan  ektivitas produksi enzim protease ekstraseluler.

## MATERI DAN METODE
Materi dalam penelitian ini adalah isolat bakteri Bacillus firmus.  Bakteri Bacillus firmus yang bersimbiosis  dengan  sponge  Chalinula  pseudomolitba.  Sponge  Chalinula  pseudomolitba  yang didapatkan dari perairan pantai dengan adanya Ekosistem Lamun. Sponge ini didapatkan di perairan Nusa Lembongan Bali – Indonesaia.

## Peremajaan Isolat
Biakan murni stok dilakukan peremajan pada media Nutrient Agar (NA). Sebanyak satu ose koloni digores dengan metode kuadran pada media Nutrient Agar (NA) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C (Pringgenies et al. , 2021; Wijaya et al ., 2021). Bakteri yang tumbuh siap untuk digunakan.

## Preparasi Inokulum
Satu  ose  biakan miring diinokulasikan  ke  dalam  20  ml medium  zobell  221E  cair,  kemudian diinkubasi pada suhu 30 o C selama 24 jam. Dilakukan scale up ke dalam medium zobell 221E cair
200 ml dalam erlenmeyer 500 ml, dan diinkubasi dengan suhu 30 o C dan diseker 150 rpm selama 24 jam (Ayuningtyas et al. , 2021; Pringgenies et al. , 2020).

## Uji Optimasi Substrat
Optimasi  konsentrasi  substrat  dilakukan  pada  kultur  di  media  zobell    2216E  broth  yang diperkaya  substrat  susu  skim  dengan  konsentrasi  1%,  3%  dan  6%,  ditambahkan  inokulum  1% dengan  OD  0,01  pada  A600,  pH  8,  salinitas  30  ppt,  dan  inkubasi  pada  suhu  ruang.  Dilakukan inkubasi  jam  ke-  0,  2,  4,  6,  12,  18,  24,  30,  36,  42,  dan  48  dilakukan  pengamatan  terhadap petumbuhan bakteri, aktivitas protease ekstraseluler dan kadar protein (Setyati et al. , 2015).

## Pemilihan Ko-Substrat Sumber Karbon Dan Nitrogen
Sumber  karbon  yang  diseleksi  adalah  glukosa,  fruktosa  dan  molase  sebanyak  1  %  pada medium zobell 2216E. Sumber nitrogen yang diseleksi adalah amonium klorida, amonium nitrat, dan urea  sebanyak  0,2%  dalam  medium  zobell  2216E.  Seleksi  sumber  karbon  dan  sumber  nitrogen dilakukan kultur menggunakan erlenmeyer berkapasitas 1 liter dengan volume kerja 200 ml. Kondisi dari  kultur  yaitu  media  zobell    2216E  broth  diperkaya  dengan  susu  skim  konsentrasi  optimum, konsentrasi inokulum 1% dengan OD 0,01 pada A600, pH8, salinitas 30 ppt, inkubasi pada suhu ruang.  selanjutnya  pada  inkubasi  jam  ke-  0,  2,  4,  6,  12,  18,  24,  30,  36,  42,  dan  48  dilakukan pengamatan  terhadap  petumbuhan  bakteri,  aktivitas  protease  ekstraseluler  dan  kadar  protein (Jacek et al. , 2021; Stylianou et al. , 2021). Data petumbuhan bakteri, aktivitas protease ekstraseluler dan kadar protein masing-masing perlakuan kemudian digunakan sebagai dasar melakukan seleksi sumber karbon dan nitrogen yang tepat untuk kultur.

## Pengukuran Turbiditas Bakteri
Pengukuran  pertumbuhan  bakteri  dilakukan  dengan  cara  sebanyak  10  ml  sampel disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan di buang dan natan yang didapatkan  dilarutkan  dengan  larutan  PBS  sebanyak  10  ml  lalu  di  divortex.  Diamati  nilai  OD-nya dengan  spektrofotometer  pada  panjang  gelombang  600  nm  (Setyati et  al. ,  2014).  Data  hasil pengukuran OD pada A600 kemudian di konversi dengan persamaan standart Mc Farland menjadi satuan sel/ml. nilai sel/ml tersebut digunakan untuk menghitung jumlah generasi (g), waktu generasi (Tg) dan laju pertumbuhan (µ) bakteri.

## Pengukuran Aktivitas Enzim Protease Dan Kadar Protein
Substrat  yang  digunakan adalah kasein 1%  dilarutkan  ke dalam  buffer fosfat  (50 mM,  pH 8).  1 ml  substrat  direaksikan  dengan 1 ml sampel selama  10  menit pada  suhu  awal  37 o C. Reaksi  dihentikan  dengan  penambahan 1 ml trichloroacetic acid (TCA) 10% lalu inkubasi selama
10 menit pada suhu 37 o C. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Sebanyak  1  ml  supernatan  di  tambahkan  Na 2 CO 3 0,5  M  dan  pereaksi  folin  ciocalteus  (1:2), campuran diinkubasi 30 menit pada suhu 37 o C. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 660 nm (Setyati et al. , 2015).
Data  absorbansi  protease  konversi  ke  satuan  mM  dengan  menggunakan  persamaan kurva standar tirosin. Setelah di ketahui nilai mM selanjutnya dilakukan perhitungan AP (aktivitas protease) dengan  satuan  (IU/ml)  dan  T.AP  (total  protease)  dengan  satuan  (IU).  Kadar  protein  ditentukan dengan metode Bradford (1976) dengan menggunakan bovin serum albumin (BSA) sebagai protein standar pada kisaran 0.01- 0.1 mg/mL dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang (λ) = 595 nm.
Data absorbansi protein digunakan untuk penentuan nilai KP (kadar protein) satuan (gram/ml) dengan  menggunakan  persamaan  standart  BSA.  Dilakukan  penentuan  nilai  TP  (total  protein) dengan  satuan  gram.  Berdasarkan  data  aktivitas  protease  (U/ml)  dan  kadar  protein  (gram/ml) tersebut berikutnya dilakukan penghitungan AS (IU/mg).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi  substrat  dilakukan  terhadap  substrat  susu  skim  dengan  perlakuan  perbedaan konsetrasi yaitu 1%, 3% dan 6%. Pengamatan yang dilakukan adalah pertumbuhan bakteri, aktivitas protease,  kadar  protein  media  dan  aktivitas  spesifik  protease.  Berdasarkan  hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  perlakuan  perbedaan  konsentrantrasi  substrat  berpengaruh  signifikan  (α  < 0,05)  terhadap  pertumbuhan  bakteri  Bacillus  firmus.  Pengaruh  perlakuan  konsentrasi  terhadap respon pola polynomial pertumbuhan bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah skim 6%, 3% dan 1%, dengan nilai kepadatan bakteri pada puncak polynomial sebesar 0,473; 1,025 dan 1,358 x 10 8 sel/ml (Gambar 2). Perlakuan skim 1 % adalah yang terbaik terhadap pertumbuhan dengan pola polynomial y = -0,0015x 2 + 0,0875x + 0,054; R 2 = 0,955; R = 0,977.
Perlakuan skim 1%, 3% dan 6% tidak berpengaruh signifikan terhadap pertumbuhan mutlak bakteri yaitu dengan nilai 1,299 a, 0,948 a dan 0,415 a x 10 8 sel/ml. Perlakuan skim 1%, 3% dan 6% berpengaruh  signifikan  terhadap  laju  pertumbuhan,  jumlah  generasi  dan  waktu  generasi  bakteri. Nilai laju pertumbuhan bakteri secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah skim 6%, 3% dan 1%, dengan nilai 0,076 a, 0,092 b dan 0,110 c. Nilai jumlah generasi secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah skim 6%, 3% dan 1%, dengan nilai  3,099 a, 3,727 b dan 4,454 c.  Nilai waktu generasi secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah skim 1%, 3% dan 6% dengan nilai 6,322 a, 7,521 b dan 9,091 c.
Berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  perlakuan  perbedaan  konsentrantrasi substrat berpengaruh signifikan (α < 0,05) terhadap aktivitas protease, kadar protein dan aktivitas spesifik  protease  bakteri  Bacillus  firmus.  Pengaruh  perlakuan  konsentrasi  terhadap  respon  pola polynomial aktivitas protease bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah skim 6%, 3% dan 1%, dengan nilai aktivitas protease pada puncak polynomial sebesar 8,873 a, 10,482 b dan 12,566 c IU/ml. Perlakuan skim 1 % adalah yang terbaik terhadap aktivitas protease dengan pola  polynomial  y  =  -0,0073x 2 +  0,5224x  +  1,0258;  R 2 =  0,905;  R  =  0,951.  Pengaruh  perlakuan konsentrasi terhadap respon pola polynomial kadar protein bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah skim 1%, 3% dan 6%, dengan nilai kadar protein pada inkubasi jam ke- 30 sebesar 11,224 a, 12,492 ab dan 14,176 b mg/ml. Perlakuan skim 1 % adalah yang terbaik terhadap kadar protein dengan pola polynomial y = 0,0023x 2 - 0,2358x + 16,314; R 2 = 0,980; R = 0,990. Pengaruh perlakuan konsentrasi terhadap respon pola polynomial aktivitas spesifik protease bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah skim 6%, 3% dan 1%, dengan nilai aktivitas spesifik protease pada puncak polynomial sebesar  0,627 a, 0,841 b dan 1,127 c IU/mg. Perlakuan skim 1 % adalah yang terbaik terhadap aktivitas spesifik protease dengan pola polynomial y  =  -0,0006x 2 +  0,0455x  +  0,0147;  R 2 =  0,914;  R  =  0,956.  Berdasarkan  penelitian  perlakuan konsentrasi substrat maka dapat disimpulkan bahwa perlakuan skim 1% adalah yang terbaik dalam kultur bakteri Bacillus firmus.
Pemilihan ko-substrat sumber C dilakukan terhadap perbedaan jenis sumber C yaitu glukosa, fruktosa dan molase. Pengamatan yang dilakukan adalah pertumbuhan bakteri, aktivitas protease,
kadar  protein  media  dan  aktivitas  spesifik  protease.  Berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  perlakuan  perbedaan  jenis  sumber  C  berpengaruh  signifikan  (α  <  0,05)  terhadap pertumbuhan  bakteri  Bacillus  firmus.  Pengaruh  perlakuan  perbedaan  jenis  sumber  C  terhadap respon pola polynomial pertumbuhan bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah molase,  fruktosa  dan  glukosa  dengan  nilai  kepadatan  bakteri  pada  puncak  polynomial  sebesar 0,800; 0,851 dan 1,937 x 10 8 sel/ml. Perlakuan penambahan glukosa adalah yang terbaik terhadap pertumbuhan dengan pola polynomial y = -0,0020x 2 + 0,121x - 0,17040; R 2 = 0,9210; R = 0,960. Perlakuan  pemberian  glukosa,  fruktosa  dan  molase  tidak  berpengaruh  signifikan  terhadap pertumbuhan mutlak bakteri yaitu dengan nilai 1,877 a, 0,793 a dan 0,723 a x 10 8 sel/ml. Perlakuan perbedaan jenis sumber C berpengaruh signifikan terhadap laju pertumbuhan, jumlah generasi dan waktu generasi bakteri. Nilai laju pertumbuhan bakteri secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah molase, fruktosa dan glukosa dengan nilai 0,083 a, 0,095 b dan 0,124 c. Nilai jumlah generasi secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah molase, fruktosa dan glukosa dengan nilai 3,374 a,  3,856  b  dan  5,023  c.  Nilai  waktu  generasi  secara  berurutan  dari  terendah  ke  tertinggi  adalah glukosa, fruktosa dan molase dengan nilai 5,602 a, 7,268 b dan 8,306 c.
Gambar 2. Optimasi substrat terhadap Polynomial pertumbuhan, aktivitas proteasen kadar protein dan aktivitas spesifik protease bakteri Bacillus firmus
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 0 6 12 18 24 30 36 42 48 K ep ad ata n ba kteri ( x 10 ⁸ sel /m l) Waktu pengamatan (jam ke-) 1% 3% 6% 2 4 6 8 10 12 14 0 6 12 18 24 30 36 42 48 A k ti v itas protea s e (IU/m l) Waktu pengamatan (jam ke-) 1% 3% 6% 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 0 6 12 18 24 30 36 42 48 K a d a r p ro te in ( m g /m l) Waktu pengamatan (jam ke-) 1% 3% 6% 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0 6 12 18 24 30 36 42 48 A k ti v itas s pe s if ik ( IU/m g) Waktu pengamatan (jam ke-) 1% 3% 6%
Tabel 1. Optimasi substrat terhadap pertumbuhan, aktivitas protease dan aktivitas spesifik
Konsentrasi Pm µ g Tg Aktivitas protease Kadar protein Aktivitas spesifik (x 10⁸ sel/ml)  (jam ⁻ ¹) (generasi) (jam) (IU/ml) (mg/ml) (IU/mg) 1% 1,299 a 0,110 c 4,454 c 6,322 a  12,566 c  11,224 a 1,127 c 3% 0,948 a 0,092 b 3,727 b 7,521 b  10,482 b  12,492 ab 0,841 b 6% 0,415 a 0,076 a 3,099 a 9,091 c 8,873 a 14,176 b 0,627 a
Berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  perlakuan  perbedaan  jenis  sumber  C berpengaruh signifikan (α < 0,05) terhadap aktivitas protease, kadar protein dan aktivitas spesifik protease bakteri Bacillus firmus. Pengaruh perlakuan perbedaan jenis sumber C terhadap respon pola polynomial aktivitas protease bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah fruktosa, molase dan glukosa dengan nilai aktivitas protease pada puncak polynomial sebesar 9,965 a,  12,432  b  dan  16,094  c  IU/ml.  Perlakuan  penambahan  glukosa  adalah  yang  terbaik  terhadap aktivitas protease dengan pola polynomial y = -0,0139x 2 + 0,8658x - 0,0523; R 2 = 0,8742; R = 0,935. Pengaruh  perlakuan  perbedaan  jenis  sumber  C  terhadap  respon  pola  polynomial  kadar  protein bakteri  dari  yang  terendah  ke  tertinggi  secara  berurutan  adalah  glukosa,  fruktosa  dan  molase dengan nilai kadar protein pada inkubasi jam ke- 30 sebesar 8,983 a, 11,260 b dan 10,332 b mg/ml. Perlakuan penambahan glukosa adalah yang terbaik terhadap kadar protein dengan pola polynomial y = 0,0058x 2 - 0,4567x + 17,030; R 2 = 0,9346; R = 0,967.
Pengaruh  perlakuan  perbedaan  jenis  sumber  C  terhadap  respon  pola  polynomial  aktivitas spesifik protease bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah fruktosa, molase dan glukosa dengan nilai aktivitas spesifik protease pada puncak polynomial sebesar 0,884 a, 1,205 b dan 1,798 c IU/mg. Perlakuan penambahan glukosa adalah yang terbaik terhadap aktivitas spesifik protease  dengan  pola  polynomial  y  =  -0,0014x 2 +  0,0982x  -  0,1806;  R 2 =  0,8900;  R  =  0,943. Berdasarkan  penelitian  perbedaan  jenis  sumber  C  maka  dapat  disimpulkan  bahwa  perlakuan penambahan glukosa adalah yang terbaik dalam kultur bakteri Bacillus firmus.
Hal ini dimungkinkan karena proses glikolisis, glukosa akan dirombak menjadi asam piruvat. Sedangkan  fruktosa,  harus  dirombak  menjadi  glukosa  terlebih  dahulu  kemudian  baru  masuk  ke proses glikolisis. Begitu juga dengan molase, sehingga glukosa akan lebih baik dibandingkan yang lainnya. Sumber karbon yang berbeda-beda akan menghasilkan jumlah metabolit atau enzim yang berbeda pula (Prajapati et al ., 2022).
Beberapa dari spesies Bacillus sp., seperti Bacillus cereus memanfaatkan glukosa, fruktosa, maltosa dan sukrosa untuk menghasilkan hidrogen dan produk asam. Bacillus subtilis tidak dapat menggunakan laktosa, galaktosa, dan xylose  sebagai sumber karbon (Amin, 2018). Glukosa dipilih karena  merupakan  sumber  karbon  yang  sederhana  dan  dapat  digunakan  oleh  sebagian  besar bakteri  sebagai  sumber  karbon  untuk  pertumbuhan  bakteri.  Glukosa  merupakan  sumber  karbon terbaik  dari  enam  jenis  karbon  yang  diujikan  untuk  mendegradasi  fenol  yaitu  glukosa,  galaktosa, maltose, xylose, fruktosa, dan sukrosa pada konsentrasi 0,5-2,5 g/L (Sathishkumar et al. , 2021) Pemilihan ko-substrat sumber N dilakukan terhadap perbedaan jenis sumber N yaitu Amonium klorida, amonium nitrat dan urea. Pengamatan yang dilakukan adalah pertumbuhan bakteri, aktivitas protease,  kadar  protein  media  dan  aktivitas  spesifik  protease.  Berdasarkan  hasil  penelitian menunjukkan  bahwa  perlakuan  perbedaan  jenis  sumber  N  berpengaruh  signifikan  (α  <  0,05) terhadap pertumbuhan bakteri Bacillus firmus.
Pengaruh  perlakuan  perbedaan  jenis  sumber  N  terhadap  respon  pola  polynomial pertumbuhan bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah Amonium klorida, urea dan amonium nitrat dengan nilai kepadatan bakteri pada puncak polynomial sebesar 0,825, 1,773 dan  4,324  x  10 8 sel/ml.  Perlakuan  penambahan  amonium  nitrat  adalah  yang  terbaik  terhadap pertumbuhan dengan pola polynomial y = -0,0049x 2 + 0,2944x - 0,7643; R 2 = 0,9039; R = 0,951.
Journal of Marine Research Vol 11, No.2 Mei 2022, pp. 327-336
Perlakuan perbedaan jenis sumber N berpengaruh signifikan terhadap pertumbuhan mutlak, laju  pertumbuhan, jumlah  generasi  dan  waktu  generasi  bakteri.  Nilai  pertumbuhan mutlak  bakteri secara  berurutan  dari  terendah  ke  tertinggi  adalah  Amonium  klorida,  urea  dan  amonium  nitrat dengan  nilai  0,748  a,  1,676  b  dan  4,242  b  x  10 8 sel/ml.  Nilai  laju  pertumbuhan  bakteri  secara berurutan dari terendah ke tertinggi adalah Amonium klorida, urea dan amonium nitrat dengan nilai 0,085  a,  0,104  b  dan  0,137  c.  Nilai  jumlah  generasi  secara  berurutan  dari  terendah  ke  tertinggi adalah Amonium klorida, urea dan amonium nitrat dengan nilai 3,471 a, 4,203 b dan 5,572 c. Nilai waktu  generasi  secara  berurutan  dari  terendah  ke  tertinggi  adalah  amonium  nitrat,  urea  dan Amonium klorida dengan nilai 5,068 a, 6,666 b dan 8,124 c.
Gambar 3. Perbedaan  sumber  C  terhadap  Polynomial  pertumbuhan,  aktivitas  proteasen  kadar protein dan aktivitas spesifik protease bakteri Bacillus firmus
Tabel 2. Sumber C terhadap pertumbuhan, aktivitas protease dan aktivitas spesifik
Konsentrasi Pm µ g Tg Aktivitas protease Kadar protein Aktivitas spesifik (x 10⁸ sel/ml)  (jam ⁻ ¹)  (generasi) (jam) (IU/ml) (mg/ml) (IU/mg) Glukosa 1,877 a 0,124 c 5,023 c 5,602 a 16,094 c 8,983 a 1,798 c Fruktosa 0,793 a 0,095 b 3,856 b 7,268 b 9,965 a 11,260 b 0,884 a Molase 0,723 a 0,083 a 3,374 a 8,306 c 12,432 b 10,332 b 1,205 b
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 6 12 18 24 30 36 42 48 K ep ad ata n ba kteri ( x 10 ⁸ sel /m l) Waktu pengamatan (jam ke-) Glu Fruk Mol 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 6 12 18 24 30 36 42 48 A k ti v itas protea s e (IU/m l) Waktu pengamatan (jam ke-) Glu Fruk Mol 6 8 10 12 14 16 18 0 6 12 18 24 30 36 42 48 K ad ar protei n (m g/m l) Waktu pengamatan (jam ke-) Glu Fruk Mol 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 A k ti v itas s pe s if ik ( IU/m g) Waktu pengamatan (jam ke-) Glu Fruk Mol
Gambar 4. Perbedaan  sumber  N  terhadap  Polynomial  pertumbuhan,  aktivitas  proteasen  kadar protein dan aktivitas spesifik protease bakteri Bacillus firmus
Tabel 3 . Sumber N terhadap pertumbuhan, aktivitas protease dan aktivitas spesifik
Konsentrasi Pm µ g Tg Aktivitas protease Kadar protein Aktivitas spesifik (x 10⁸ sel/ml)  (jam ⁻ ¹) (generasi) (jam) (IU/ml) (mg/ml) (IU/mg) Amonium Klorida 0,748 a 0,085 a 3,471 a 8,124 c  14,803 b  10,404 a 1,428 b Amonium Nitrat 4,242 b 0,137 c 5,572 c 5,068 a  19,046 c  10,043 a 1,918 c Urea 1,676 b 0,104 b 4,203 b 6,666 b  10,526 a 9,346 a 1,127 a
Berdasarkan  hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  perlakuan  perbedaan  jenis  sumber  N berpengaruh signifikan (α < 0,05) terhadap aktivitas protease dan aktivitas spesifik protease bakteri Bacillus firmus.  Pengaruh perlakuan perbedaan jenis sumber  N terhadap respon pola polynomial aktivitas protease bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah urea, amonium klorida,  dan  amonium  nitrat.  Nilai  aktivitas  protease  pada  puncak  polynomial  sebesar  10,526  a, 14,803 b dan 19,046 c IU/ml. Perlakuan penambahan amonium nitrat adalah yang terbaik terhadap aktivitas protease dengan pola polynomial y = -0,0175x 2 + 1,0394x + 0,0665; R 2 = 0,8366; R = 0,915. Pengaruh perlakuan perbedaan jenis sumber N terhadap respon pola polynomial kadar protein bakteri dari yang terendah ke tertinggi secara berurutan adalah urea, amonium nitrat, dan amonium klorida. Nilai kadar protein pada inkubasi jam ke- 30 sebesar 9,346 a, 10,043 a dan 10,404 a mg/ml.
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 K ep ad ata n ba kteri ( x 10 ⁸ sel /m l) Waktu pengamatan (jam ke-) AmK AmN Ur 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 6 12 18 24 30 36 42 48 A k ti v itas protea s e (IU/m l) Waktu pengamatan (jam ke-) AmK AmN Ur 8 10 12 14 16 18 0 6 12 18 24 30 36 42 48 K ad ar protei n (m g/m l) Waktu pengamatan (jam ke-) AmK AmN Ur 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 6 12 18 24 30 36 42 48 A k ti v itas s pe s if ik ( IU/m g) Waktu pengamatan (jam ke-) AmK AmN Ur
Perlakuan  penambahan  amonium  nitrat  adalah  yang  terbaik  terhadap  kadar  protein  dengan  pola polynomial y = 0,0037x 2 - 0,3167x + 16,0150; R 2 = 0,8910; R = 0,944.
Pengaruh  perlakuan  perbedaan  jenis  sumber  N  terhadap  respon  pola  polynomial  aktivitas spesifik  protease  bakteri  dari  yang terendah  ke tertinggi  secara  berurutan  adalah  urea,  amonium klorida, dan amonium nitrat. Nilai aktivitas spesifik protease pada puncak polynomial sebesar 1,127 a, 1,428 b dan 1,918 c IU/mg. Perlakuan penambahan amonium nitrat adalah yang terbaik terhadap aktivitas spesifik protease dengan pola polynomial y = -0,0016x 2 + 0,1035x - 0,1302; R 2 = 0,8291; R =  0,911.  Berdasarkan  penelitian  perbedaan  jenis  sumber  N  maka  dapat  disimpulkan  bahwa perlakuan penambahan amonium nitrat adalah yang terbaik dalam kultur bakteri Bacillus firmus.
Hal  ini  dimungkinkan  karena  gugus  nitrat  pada  amonium  nitrat  merupakan  sumber  nutrien untuk mikroorganisme. Sedangkan gugus klorida pada amonium klorida bukan merupakan sumber nutrien untuk mikroorganisme, sehingga amonium klorida harus melakukan proses nitrifikasi terlebih dahulu  untuk  menghasilkan  gugus  nitrat  sebagai  sumber  nutrien,  demikian  pula  dengan  urea. Amonium nitrat ((NH) 4 NO 4 ) merupakan sumber nitrogen anorganik yang diperlukan oleh  Bacillus sp untuk meningkatkan aktifitas bakteri dalam medium produksi yang akan memberikan kecepatan eksponensial  pertumbuhan  sehingga  meningkatkan  produksi  protease  alkali.  Sumber  nitrogen digunakan  mikroorganisme  untuk  mempercepat  pertumbuhan  sel  dalam  fermentasi  (Jacek et  al. , 2021).
Konsentrasi  dan  sumber  nitrogen  akan  mempengaruhi  nilai  ph  medium,  pertumbuhan  dan aktivitas mikroorganisme dalam proses fermentasi (Kohram et al. , 2021). Beberapa sumber nitrogen dan  sumber  karbon  berlebih  dapat  menyebabkan  penghambatan  oleh  substrat.  Apabila dihubungkan    dengan    model    monod    dalam  kondisi  konsentrasi  substrat  rendah,  penambahan konsentrasi  substrat  akan  menambah  laju  pertumbuhan  spesifik,  namun  pada  batas  tertentu konsentrasi substrat tidak berpengaruh nyata terhadap laju pertumbuhan spesifik,  sehingga  laju pertumbuhan  sel  konstan,  dan  dapat terjadi penghambatan oleh substrat itu sendiri (Zagrodnik at al ., 2021).

## KESIMPULAN
Penelitian telah berhasil melakukan uji optimasi pertumbuhan dan aktivitas enzim protease ektraseluler  bakteri  bacillus  firmus  simbion  sponge  chalinula  pseudomolitba.  Hasil  penelitian menunjukkan bahwa bakteri bacillus firmus memiliki laju pertumbuah dan aktivitas protease terbaik pada kondisi kultur dengan subtrat susu skim 1% dengan nilai 0,110 c dan 12,566 c IU/ml. Sumber C glukosa bernilai 0,124 c dan 16,094 c IU/ml. Sumber N amonium nitrat sebesar 0,137 c dan 19,046 c IU/ml.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti mengucapkan terima kasih kepada DIKTI yang telah memberikan beasiswa program doktor BPPDN dan dana penelitian sekema PDD. Peneliti mengucapkan terima kasih atas dukungan fasilitas penelitian dari Laboratorium Prodi Budidaya Perairan UNISNU Jepara, Laboratorium MSTP Undip Jepara, BBPBAP Jepara.

## DAFTAR PUSTAKA
Amin, M. 2018. Marine protease-producing bacterium and its potential use as an abalone probiont. Aquaculture Reports , 12:30 –35. DOI: 10.1016/j.aqrep.2018.09.004.
Ayuningtyas, E.P., Sibero, M.T., Hutapea, N.B., Frederick, E.H., Murwani, R., Zilda, D.S., Wijayanti, D.P., Sabdono, A., Pringgenies, D. & Radjasa, O.K. 2021. Screening of Extracellular Enzyme from  Phaeophyceae-Associated  Fungi. IOP  Conference  Series:  Earth  and  Environmental Science , 750(1):p.012005. DOI: 10.1088/1755-1315/750/1/012005.
El-Saadony, M.T., Alagawany, M., Patra, A.K., Kar, I., Tiwari, R., Dawood, M.A., Dhama, K. & Abdel- Latif,  H.M.  2021.  The  functionality  of  probiotics  in  aquaculture:  An  overview. Fish  and Shellfish Immunology , 117:36 –52. DOI: 10.1016/j.fsi.2021.07.007.
Pringgenies,  D.,  Girsang,  P.H.,  Yudiati,  E.  &  Santosa,  G.W.  2020.  Exploration  of  Sea  Cucumber Intestinal Symbiont Microbe As Probiotic Microbe Candidate in Healthcare Products. Journal of Fisheries and Marine Research , 4(1):27 –34. DOI: 10.21776/ub.jfmr.2020. 004.01.4. Holt,  C.C.,  Bass,  D.,  Stentiford,  G.D.  &  van  der  Giezen,  M.  2021.  Understanding  the  role  of  the shrimp gut microbiome in health and disease. Journal of Invertebrate Pathology , 186:1 –14. DOI: 10.1016/j.jip.2020.107387.
Jacek,  P.,  da  Silva,  F.A.S.,  Dourado,  F.,  Bielecki,  S.  and  Gama,  M.,  2021.  Optimization  and characterization  of  bacterial  nanocellulose  produced  by  Komagataeibacter  rhaeticus  K3. Carbohydrate Polymer Technologies and Applications , 2:p. 100022. DOI: 10.1016/j.carpta. 2020.100022.
Kohram,  M.,  Vashistha,  H.,  Leibler,  S.,  Xue,  B.  &  Salman,  H.  2021.  Bacterial  Growth  Control Mechanisms  Inferred  from  Multivariate  Statistical  Analysis  of  Single-Cell  Measurements. Current Biology , 31(5):955-964.e4. DOI: 10.1016/j.cub.2020.11.063. Oh,  Y.J.,  Jo,  W.,  Yang,  Y.  &  Park,  S.  2007.  Influence  of  culture  conditions  on  Escherichia  coli O157:H7 biofilm formation by atomic force microscopy. Ultramicroscopy , 107:869 –874. DOI: 10.1016/j.ultramic.2007.01.021.
Prajapati, D., Bhatt, A. & Gupte, A. 2022. Production, optimization, partial-purification and pyrolysis kinetic studies of exopolysaccharide from a native brown-rot fungi Fomitopsis meliae AGDP- 2. Bioresource Technology Reports , 17:p.100948. DOI: 10.1016/j.biteb.2022.100 9 48. Pringgenies,  D.,  Setyati,  W.A.,  Djenaedi,  A.,  Pramesti,  R.,  Rudiyanti,  S.  &  Ariyanto,  D.  2021. Exploration  of  antimicrobial  potency  of  mangrove  symbiont  against  multi-drug  resistant bacteria. Jurnal  Ilmiah  Perikanan  dan  Kelautan ,  13(2):222 –232.  DOI:  10.20473/jipk.v13i2. 26199.
Rashmi,  B.  &  Gayathri, D.  2017.  Evaluation  and  Optimization  of  Extracellular  Digestive  Enzymes from  Bacillus  spp.  Isolated  from  Curds. Maternal  and  Pediatric  Nutrition ,  03:118.  DOI: 10.4172/2472-1182.1000118.
Sathishkumar, R., Kannan, R., Jinendiran, S., Sivakumar, N., Selvakumar, G. & Shyamkumar, R., 2021.  Production  and  characterization  of  exopolysaccharide  from  the  sponge-associated Bacillus  subtilis  MKU  SERB2  and  its  in-vitro  biological  properties. International  Journal  of Biological Macromolecules , 166:1471 –1479. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2020.11.026. Setyati,  W.A., Martani, E.,  Triyanto,  Subagiyo  &  Zainuddin,  M.  2014.  Selection,  Identification  and Optimization  of  the  Growth  Water  Probiotic  Consortium  of  Mangrove  Ecosystems  as Bioremediation  and  Biocontrol  in  Shrimp  Ponds, Jurnal  Pengolahan  Hasil  Perikanan Indonesia , 17(3):243 –253. DOI: 10.17844/jphpi.v17i3.8913
Setyati, W.A., Martani, E. & Zainuddin, M. 2015. Kinetika Pertumbuhan dan Aktivitas Protease Isolat 36k  dari  Sedimen  Ekosistem  Mangrove,  Karimunjawa,  Jepara. Ilmu  Kelautan:  Indonesian Journal of Marine Sciences , 20(3):163 –169.
Stylianou, E., Pateraki, C., Ladakis, D., Vlysidis, A. & Koutinas, A. 2021. Optimization of fermentation medium  for  succinic  acid  production  using  Basfia  succiniciproducens. Environmental Technology and Innovation , 24:p101914. DOI: 10.1016/j.eti.2021.101914. Wijaya,  P.  A.,  Pringgenies,  D.  &  Yudiati,  E.  2021.  Antibacteria  Activity  of  Gastropod  Association Bacteria From Mangrove Ecosystem Against Bacillus Cereu s and Escherichia Coli and It’S Potency of Application for Belanak Fish (Mugil Subviridis). Journal of Fisheries and Marine Research , 5(1):15 –21. DOI: 10.21776/ub.jfmr.2021.005.01.3.
Zagrodnik, R., Duber, A. & Seifert, K. 2021. Hydrogen production during direct cellulose fermentation by  mixed  bacterial  culture:  The  relationship  between  the  key  process  parameters  using response  surface  methodology. Journal  of  Cleaner  Production ,  314:p.127971.  DOI: 10.1016/j.jclepro.2021.127971.
Zárate-Chaves,  C.A.,  Romero-Rodríguez,  M.C.,  Niño-Arias,  F.C.,  Robles-Camargo,  J.,  Linares- Linares,  M.,  Rodríguez-Bocanegra,  M.X.  &  Gutiérrez-Rojas,  I.  2013.  Optimizing  a  culture medium  for  biomass  and  phenolic  compounds  production  using Ganoderma  lucidum . Brazilian  Journal  of  Microbiology ,  44(1):215 –223.  DOI:  10.1590/S1517-83822013005000 032.