Peran Protein Pili 38,6 kDa Klebsiella pneumoniae sebagai Protein Hemaglutinin dan Adhesin yang Berfungsi sebagai Faktor Virulensi
The Role of Pili Protein 38,6 kDa Klebsiella pneumoniae as a Hemagglutinin and Adhesin Protein which Serves as a Virulence Factor
Regina Finka Dita 1 , Dini Agustina 2 , Dwita Aryadina Rachmawati 3 , Enny Suswati 2 , Diana Chusna Mufida 2 , Mohammad Ali Shodikin 2
1 Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Jember
2 Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember
3 Laboratorium Ilmu Kesehatan Masyarakat Fakultas Kedokteran Universitas Jember e-mail korespondensi : reginafinkadita@gmail.com

## Abstrak
Klebsiella pneumoniae merupakan bakteri penyebab infeksi pada berbagai bagian tubuh. Adanya protein pada pili yang  akan  berikatan  dengan  reseptor  permukaan  sel  (protein  adhesin)  dan  molekul  gula  membran  sel  (protein hemaglutinin)  menjadi  faktor  yang  sangat  berpengaruh  terhadap  kemampuan K.  pneumoniae untuk  masuk  ke dalam tubuh manusia. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui peran protein pili 38,6 kDa K. pneumoniae sebagai protein  hemaglutinin  dan  adhesin  yang  berfungsi  sebagai  faktor  virulensi.  Jenis  penelitian  ini  adalah  penelitian eksperimental  murni  dengan  metode  elektroforesis  (SDS-PAGE)  untuk  mendapatkan  protein.  Protein  yang diperoleh  kemudian  diuji  hemaglutinasi  dan  uji  adhesi  dengan  menggunakan  sel  eritrosit  dan  enterosit  mencit BALB/C untuk mengetahui perannya sebagai protein hemaglutinin dan adhesin. Kesimpulan penelitian ini protein pili 38,6 kDa Klebsiella pneumoniae berperan sebagai protein  hemaglutinin dan adhesion yang berfungsi sebagai faktor virulensi.
Kata kunci: Klebsiella pneumoniae, Protein 38,6 kDa, Hemaglutinin, Adhesin

## Abstract
Klebsiella pneumoniae is an infectious bacteria in various parts of the body. The presence of proteins in pili that will bind to cell surface receptors (adhesin proteins) and cell membrane sugar molecules (hemagglutinin proteins) is a very influential factor in the ability of K. pneumoniae to enter the human body. The purpose of this study was to determine the role of pili 38.6 kDa K. pneumoniae protein as a hemagglutinin and adhesin protein which functions as a virulence factor. This type of research is pure experimental research using the electrophoresis method (SDS- PAGE)  to  obtain  protein.  The  protein  obtained  was  then  tested  for  hemagglutination  and  adhesion  test  using erythrocyte cells and enterocytes of BALB / C mice to determine their role as hemagglutinin and adhesin proteins. Conclusion of this study pili protein 38.6 kDa Klebsiella pneumoniae acts as a hemagglutinin and adhesion protein which functions as a virulence factor.
Keywords : Klebsiella pneumonia, 38,6 kDa Protein, Hemagglutinin, Adhesin

## Pendahuluan
Klebsiella  pneumoniae merupakan  bakteri  Gram negatif  dari  famili Enterobactericeae ,  non-motil, berbentuk  batang  pendek  dan  bersifat  fakultatif anaerob  (Brooks et  al .,  2003). K.  pneumoniae menjadi  penyebab  infeksi  pada  berbagai  organ tubuh  diantaranya  20,1%  infeksi  intraabdominal  di Cina  (Zhang et  al .,  2017),  29%  pneumonia  di beberapa  Rumah  Sakit  di  Indonesia  (Perhimpunan Dokter  Paru  Indonesia,  2014),  serta  18,1%  Infeksi Saluran Kemih (ISK) di RSUD dr Soetomo  (Sutandhio et  al .,  2015).  Angka  kejadian  ISK  akibat K. pneumoniae di  RSD  Soebandi  Jember  mengalami peningkatan  dari  5%  pada  tahun  2016  menjadi 11,7% pada tahun 2017 (Syahputra, 2018).
K.  pneumoniae telah  dilaporkan  mengalami resistensi  terhadap  beberapa  jenis  antibiotik (Kazimoto et  al .,  2018).  Oleh  karena  itu,  faktor virulensi K.  pneumoniae yang  dapat  menyebabkan bakteri  ini  mampu  menginvasi  sel  inang  dan menimbulkan  patogenitas  perlu  diketahui. K. pneumoniae memiliki  beberapa  faktor  virulensi, salah satunya yaitu pili (Li et al ., 2014). Pili berperan dalam  tahap  awal  perlekatan K.  pneumonia pada permukaan sel inang. Hal ini karena pili mengandung protein  yang  dapat  berikatan  dengan  molekul  gula penyusun  membran  sel  inang,  yang  disebut  dengan protein  hemaglutinin  serta  protein  yang  dapat berikatan  dengan  reseptor  permukaan  sel  inang yang disebut dengan protein adhesin (Savage, 2003; Khater et al ., 2015).
Protein  yang  bersifat  imunogenik  memiliki  berat molekul  10-100  kDa  (Parslow et  al .,  2001).  Hasil elektroforesis  studi  pendahuluan  diketahui  protein pili  38,6  kDa  memiliki  pita  paling  tebal  yang menunjukkan  bahwa  konsentrasi  protein  dengan berat  molekul  tersebut  paling  tinggi  diantara  berat molekul  lainnya.  Selain  itu,  peran  protein  pili  38,6 kDa K.  pneumoniae belum  ada  yang  melaporkan. Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  peran  protein  pili  38,6  kDa K. pneumoniae sebagai  protein  hemaglutinin  dan adhesin yang berfungsi sebagai faktor virulensi.

## Metode

## Sampel Bakteri
Sampel  penelitian  ini  adalah K.  pneumoniae yang terdapat  di  Laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas Kedokteran Universitas Jember serta sel eritrosit dan
sel  enterosit  mencit  strain  BALB/C  usia  6-8  minggu dengan berat 25 gram dan dalam kondisi sehat.

## Identifikasi Bakteri
Koloni  bakteri  yang  didapat  kemudian  diperiksa karakterisasi morfologi koloni pada media MacConkey agar    kemudian  diinkubasi  selama  24 jam  pada  suhu  37°C  dan  dilanjutkan  dengan pewarnaan  Gram  dan  uji  biokimia  (Ling et  al .,  1988 dalam Khan et al ., 2018).

## Kultur Bakteri
Isolasi  bakteri  dengan  menggunakan  metode  Ehara yaitu  biakan  yang  tumbuh  pada  media  MacConkey agar  diambil  kemudian  dimasukkan  kedalam  botol yang  telah  diisi  dengan  BHI  sebanyak  1000  ml  lalu dikocok kuat selama 30 menit pada waterbath suhu 37°C. Suspensi bakteri diambil 10 ml dan dimasukkan ke media TCG dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 48  jam  (Ehara et  al .,  1987  dalam  Sumarno et  al ., 2015).

## Isolasi Pili K. pneumoniae
Bakteri ditambahkan TCA sampai konsentrasi 3% lalu dikocok rata dan diletakkan pada suhu kamar selama 1 jam dengan pengulangan kocokan setiap 15 menit. Selanjutnya  disentrifugasi  dengan  kecepatan  6000 rpm  selama  10  menit  pada  suhu  4°C.  Pelet  diambil dan  diresuspensi  dengan  PBS  pH  7,4  dengan perbandingan  1:10.  Pemotongan  pili  menggunakan pili cuter ( mixer ).  Pili  bakteri  dipotong  selama  30 detik  dengan  kecepatan  5000  rpm  pada  suhu  4°C, dan diulangi sampai supernatan jernih dengan masa istirahat  setiap  pengulangan  yaitu  1  menit.  Hasil pemotongan  pili  disentrifugasi  dengan  kecepatan 12.000  rpm  pada  suhu  4°C  selama  30  menit, kemudian diambil supernatannya (Ehara et al ., 1987 dalam Sumarno et al ., 2015).

## Isolasi Protein Pili K. pneumoniae
Identifikasi berat molekul protein pili K. pneumoniae dilakukan  dengan  menggunakan  SDS-PAGE  dari metode  penelitian  Laemmli.  Sampel  protein dipanaskan  selama  5  menit  pada  suhu  100°C  dalam larutan  penyangga  yang  mengandung  5  mM  pH  6,8 Tris  HCL,  2- mercapto  ethanol 5%, sodium  dodecyl sulfate 2,5%,  gliserol  10%,  dengan  warna  pelacak
bromophenol  blue .  Isolasi  protein  ini  menggunakan mini slab gel 12,5% dengan stacking gel 4%. Voltase yang  digunakan  125  mV  dengan  waktu running 90 menit.  Pewarna  yang  digunakan  yaitu coomasive brilliant blue dan molekul standar pre stained broad range (Laemmli, 1970 dalam Podmirseg et al ., 2016).

## Pemurnian Protein Pili K. pneumoniae
Proses  pemurnian  protein  pili  ini  menggunakan metode  Thomas,  gel  hasil  SDS-PAGE  dipotong melintang  dan  dimasukkan  pada dialise  tube yang berisi larutan buffer. Selanjutnya dilakukan elektroelusi pada electroelusion chamber yang berisi larutan buffer dengan tegangan 20 V dan arus 0,3 A selama  2  jam.  Hasilnya  kemudian  didialisis  dengan memasukkannya  ke  dalam beaker  glass berisi akuades  steril  pada magnetic  stirrer dalam refrigerator  selama  24  jam.  Proses  diulang  dengan menggunakan beaker  glass yang  berisi  cairan  PBS steril  selama  24  jam.  Protein  yang  diperoleh ditampung pada eppendrof dan ditambahkan etanol absolut dingin dan didiamkan selama 1 malam pada refrigerator .  Proses  selanjutnya  yaitu  protein disentrifugasi  dengan  kecepatan  6000  rpm  selama 10  menit  pada  suhu  4°C,  supernatan  yang  berisi etanol  dibuang  dengan  cara tapping dalam refrigerator sampai etanol habis menguap. Hasil dari proses ini adalah Crude protein yang dapat disimpan dalam deep freze dengan larutan buffer Tris HCL 0,5 M pH 6,8  (Thomas et al ., 1989 dalam  Dos Santos et al ., 2017).

## Uji Hemaglutinasi
Uji  ini  merujuk  pada  metode  yang  digunakan  pada penelitian  Li  yaitu  pengenceran  sampel  dibuat  pada microplate U  dengan  volume  50  μl.  Suspensi  darah mencit  dengan  konsentrasi  0,5%  dimasukkan  pada setiap  sumur microplate U    lalu  digoyangkan menggunakan rotator  plate selama  1  menit. Kemudian  didiamkan  pada  suhu  kamar  selama  1 jam.  Sampel  yang  diuji  adalah Crude protein  dan protein  pili K.  pneumoniae. Darah  yang  digunakan adalah  darah  mencit.  Besar  titer  ditentukan  dengan mengamati  adanya  penggumpalan  eritrosit  pada pengenceran  terendah  (Li et  al .,  1999  dalam Norsworthy dan Pearson, 2017).

## Isolasi Sel Enterosit Mencit
Mencit yang digunakan adalah mencit strain BALB/C betina,  usia  6-8  minggu,  berat  25  gram,  dan  dalam kondisi  sehat.  Isolasi  ini  menggunakan  metode Weisser  Honda.  Mencit  dianastesi  dan  diambil bagian usus halusnya, selanjutnya dicuci menggunakan  PBS  pH  7,4  yang  mengandung  1  mM dithiothretiol pada  suhu  4°C.  Kemudian  usus  halus tersebut dimasukkan ke dalam cairan yang berisi PBS pH 7,4 dan diinkubasi pada shaking incubator selama 15  menit  pada  suhu  37°C.  Supernatan  dibuang  dan jaringan dimasukkan ke dalam cairan yang berisi 1,5 mM  EDTA  dan  0,5  mM dithiothretiol dan  dikocok kuat selama 5 menit pada suhu 37°C dan supernatan dibuang, hasilnya dicuci dengan PBS dan disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit  dan  dilakukan  pengulangan  sebanyak  3  kali. Enterosit  diisolasi  dengan  melakukan  suspensi  PBS steril sampai konsentrasi 10 6 /ml (Honda et al ., 1988 dalam Baker-Austin et al ., 2017).

## Uji Adhesi
Metode yang digunakan adalah modifikasi Honda. K. pneumoniae dibiakkan  pada  media lactose  broth dengan  suhu  37°C.  Kemudian  dipanen  dengan melakukan  sentrifugasi  pada  kecepatan  6000  rpm dengan suhu 4°C selama 10 menit. Suspensi endapan dengan  PBS.  Kandungan  bakteri  dibuat  10 8 /ml menggunakan  spektrofotometer  dengan  panjang gelombang  600  nm.  Selanjutnya  sebanyak  500  μl suspensi  bakteri  diambil  untuk  masing-masing  dosis protein pili. Protein pili 38,6 kDa dibuat pengenceran 1/10000,  1/20000,  1/40000,  1/80000,  1/160000, 1/32000  serta  kontrol  negatif  yang  tidak  diberi protein.  Setiap  dosis  tersebut  ditambahkan  500  μl suspensi  enterosit  mencit.  Homogenat  tersebut diinkubasi  pada waterbath dengan  digoyang  pelan pada  suhu 37°C selama 30 menit, lalu disentrifugasi dengan  kecepatan  1000  rpm  selama  5  menit  dan proses sentrifugasi diulangi sebanyak 2 kali. Suspensi diambil sebanyak 10 μl dengan dua kali pengulangan dan  dilakukan  preparasi  dan  pewarnaan  gram. Kemudian  dilakukan  penghitungan  indeks  adhesi menggunakan  mikroskop (Honda et al ., 1988 dalam Baker-Austin et al ., 2017).

## Hasil
Identifikasi Bakteri
Sampel  diidentifikasi  dengan  pengecatan  Gram untuk  mengetahui  morfologi  bakteri.  Hasilnya didapatkan bakteri berwarna merah yang menunjukkan  ciri  bakteri  Gram  negatif  serta berbentuk batang pendek (Gambar 1 (a)). Selain itu, bakteri  juga  dikultur  pada  media MacConkey untuk mengetahui  karakteristik  dan  sifat  koloni  bakteri. Sampel  bakteri  mampu  hidup  pada  media MacConkey dengan karakteristik koloni yang mukoid (Gambar 1 (b)).
Gambar  1.  Hasil  Identifikasi  Bakteri.  (a)  Pengecatan  Gram dilihat  dengan  mikroskop  perbesaran  1000x  yang menunjukkan  bakteri  berwarna  merah  dan  berbentuk batang pendek; (b) Lingkaran menunjukkan koloni mukoid pada kultur pada media MacConkey.
Identifikasi bakteri secara biokimia dilakukan dengan menggunakan  uji  IMViC  ( Indol,  Methyl  Red,  Voges- Proskauer,  Simmon’s  Citrate )  serta  uji Tripel  Sugar Iron  Agar (TSIA).  Hasil  uji  biokimia  sampel  dapat dilihat pada Tabel 1 (Gambar tidak disertakan).
Tabel 1 Hasil Uji Biokimia Klebsiella pneumoniae Nama Uji Biokimia Hasil Uji Indol - Uji Methyl Red - Uji Voges-Proskauer +
Uji Simmon’s Citrate +
TSIA ( Tripel Sugar Iron Agar ) Asam/Asam, gas (+), H2S (-)

## Isolasi Protein Pili K. pneumoniae
Hasil  pemotongan  pili  kemudian  dielektroforesis (SDS-PAGE) untuk mendapatkan profil protein pili K. pneumoniae (Gambar 2).
Gambar  2  Profil  subunit  protein  pili K.  pneumoniae hasil elektroforesis  (SDS-PAGE).(1)  protein  marker prestained broad  range  nacalai  tesque ;  (2)    sel  utuh K.  pneumoniae ; (3)  potongan  pili  pertama;  (4)  potongan  pili  kedua;  (5) potongan  pili  ketiga;  (6)  potongan  pili  keempat;  (7) potongan  pili  kelima;  (8)  bakteri  yang  telah  dipotong pilinya. Tanda panah menunjukkan protein pili 38,6 kDa

## Uji Hemaglutinasi
Protein  yang  telah  dielektroelusi  dan  dialisis, kemudian dilakukan pengecekan konsentrasi protein dengan  menggunakan  spektrofotometri,  didapatkan konsentrasi  sampel  4,70  mg/ml.  Selanjutnya dilakukan  uji  hemaglutinasi  dengan  menggunakan eritrosit mencit untuk mengetahui titer hemaglutinasi.  Konsentrasi  protein  pili  38,6  kDa K. pneumoniae diencerkan  secara  dilusi  bertingkat pada sumuran 3-12. Pada  menit ke-62, pengamatan uji hemaglutinasi dapat dibaca dan diintrepertasikan. Hasilnya diperoleh uji hemaglutinasi protein pili 38,6 kDa K.  pneumoniae positif  yang  ditandai  oleh  tidak terbentuknya  cincin  merah  pada  dasar  sumuran dengan titer tertinggi yaitu ½. Hasil uji hemaglutinasi dapat dilihat pada Gambar 3.

## Gambar 3 Hasil Uji Hemaglutinasi

## Uji Adhesi
Protein  adhesin  membuat K.  pneumoniae mampu melekat  pada  permukaan  sel  inang,  untuk mengetahui  kemampuan  protein  pili  38,6  kDa K. pneumoniae maka  dilakukan  uji  adhesi  dengan menggunakan  sel  enterosit  mencit.  Uji  adhesi
a
b
48 kDa
35 kDa 25 kDa 1       2       3     4      5      6     7 8
dilakukan  pada  kelompok  kontrol  yaitu  kelompok yang tidak diberi protein pili 38,6 kDa K. pneumoniae dan  pada  kelompok  perlakuan  yang  diberikan protein pili 38,6 kDa dengan pengenceran 1/10.000, 1/20.000,  1/40.000,  1/80.000,  1/16.000,  serta 1/32.000 (Gambar 4).
Gambar  4  Hasil  Uji  adhesi  protein  pili  38,6  kDa K. pneumoniae dengan berbagai pengenceran dilihat dengan mikroskop Olympus® pada perbesaran 1000x.
Berdasarkan  pengamatan  dengan  menggunakan mikroskop  perbesaran  1000x  terhadap  uji  adhesi protein  pili  38,6  kDa K.  pneumoniae pada  berbagai pengenceran  (Gambar  4)  dan  berdasarkan  hasil penghitungan  indeks  adhesi  (Tabel  3),  didapatkan hasil  bahwa  semakin  tinggi  konsentrasi  protein  pili 38,6 K.  pneumoniae yang  diberikan  maka  indeks adhesi akan semakin rendah.
Tabel  3  hasil  Indeks  Adhesi  Protein  Pili  38,6  kDa K. pneumonia
Titer Pengenceran Rerata 1/10000 240 1/20000 332,333 1/40000 336,333 1/80000 373,333 1/160000 578 1/320000 594,667 0 1784,667

## Analisis Data
Data  yang  diperoleh  diolah  dengan  menggunakan Statistical Package for Social Science (SPSS) 25.0 dan diuji  dengan  menggunakan  korelasi  Spearman. Hasilnya diperoleh nilai p-value yaitu 0,000 (p < 0,05) sehingga  titer  pengenceran  dengan  indeks  adhesi memiliki  hubungan  yang  bermakna  signifikan, dengan koefisien korelasi -0,964 yang berarti indeks adhesi  dan  titer  pengenceran  memiliki  kekuatan hubungan  sangat  kuat  dengan  arah  hubungan  yang negatif  (Dahlan,  2015).  Data  kemudian  diuji  dengan
menggunakan  uji  regresi,  didapatkan  nilai  R  0,508 yang  menunjukkan  kekuatan  hubungan  antar variabel sedang, serta nilai R 2 (koefisien determinasi) adalah  25,79%  (Dahlan,  2015).  Persamaan  regresi yang diperoleh yaitu y = -7. 10 6 x + 808.560.

## Pembahasan
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  sampel  yang digunakan merupakan K. pneumoniae yang memiliki morfologi  batang  pendek  dan  berwarna  merah. Warna merah merupakan karakteristik bakteri Gram negatif  pada  pengecatan  Gram.  Sampel  mampu hidup  pada  media MacConkey dengan  karakteristik koloni  mukoid.  Hasil  ini  memperkuat  bukti  bahwa sampel  mampu  memfermentasi  laktosa  (Brooks et al ., 2003); Juwita et al ., 2005).
Uji biokimia sampel penelitian dilakukan
menggunakan  uji  IMViC  dan  TSIA.  Uji Voges- Proskauer didapatkan  hasil  positif  karena  terbentuk warna  merah  saat  ditetesi  dengan  reagen Voges- Proskauer .  Selain  itu,  uji Cimmon’s  Citrate juga bernilai positif karena terdapat perubahan agar dari hijau  menjadi  biru.  Uji  TSIA  menunjukkan  sifat asam/asam, bagian bawah agar terdapat gelembung udara  yang  menunjukkan  bakteri  menghasilkan  gas dan tidak terdapat perubahan warna menjadi hitam yang menunjukkan tidak terbentuknya  H2S  (Leboffe and Pierce,  2011).  Karakteristik  hasil  uji  biokimia yang  didapatkan  menunjukkan  bahwa  sampel penelitian  ini  merupakan K.  pneumoniae (Brooks et al ., 2003).
Bakteri  yang  telah  diidentifikasi  kemudian  dipotong pilinya  dengan  menggunakan pili  cutter sebanyak  5 kali  pengulangan  pemotongan.  Hasil  pemotongan tersebut  kemudian  dielektroforesis  dengan  metode SDS-PAGE yang hasilnya  dapat dilihat  pada  lajur 3-7 (Gambar  2).  Hasil  tersebut  memperlihatkan  bahwa potongan  pili  ke-1  (lajur  3)  lebih  tampak  warnanya dibandingkan  dengan  potongan  pili  lainnya  (lajur  4- 7).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  konsentrasi  protein potongan pili  ke-1 lebih tinggi dibandingkan dengan potongan  pili  lainnya  (Elfita,  2014).  Pada  potongan pili  ke-1  dapat  dilihat  bahwa  protein  dengan  berat molekul  38,6  kDa  memiliki  warna  yang  lebih  gelap dibandingkan  dengan  berat  molekul  lainnya  yang menunjukkan  bahwa  konsentrasi  protein  tersebut lebih  tinggi  daripada  yang  lainnya.  Hal  ini memungkinkan  bahwa  protein  38,6 kDa merupakan protein  yang  paling  berperan  dalam  patogenitas yang ditimbulkan oleh pili K. pneumoniae . Selain itu
protein  pili  38,6  kDa K.  pneumoniae juga  memiliki berat molekul diantara 10-100 kDa, sehingga protein ini memiliki sifat imunogenik (Parslow et al ., 2001).
Potongan  pili  yang  diperoleh  diprediksikan  benar- benar merupakan pili bakteri K. pneumoniae karena dari  hasil  SDS-PAGE  dapat  dibandingkan  beberapa pita  protein  termasuk  protein  pili  38,6  kDa  yang tampak pada potongan pili juga terdapat pada whole cell (lajur  2)  akan  tetapi  tidak  terdapat  pada  sel bakteri  yang  telah  dipotong  pilinya  (lajur  8). Pemeriksaan  pasti  bahwa  bagian  yang  dipotong merupakan  pili  bakteri K.  pneumoniae dapat dilakukan dengan menggunakan mikroskop elektron dan  metode western  blot .  Namun,  berdasarkan penelitian  sebelumnya  yang  menggunakan  metode serupa, prediksi dengan pengamatan pada hasil SDS- PAGE sudah mencukupi (Hidayati, 2010; Agustina et al .,  2012;  Agustina et  al .,  2014).  Jenis  pili  dalam penelitian ini kemungkinan merupakan tipe 1 atau 3 karena kedua tipe tersebut merupakan tipe pili yang paling  berperan  penting  dalam  patogenitas K. pneumoniae .  Akan  tetapi  perlu  pemeriksaan  lebih lanjut  untuk  memastikan  hal  tersebut  dengan menggunakan colony immunoblotting untuk mengidentifikasi gen yang khas dimiliki oleh masing- masing tipe pili (Di Martino et al ., 2003).
Menurut  Merchant  dan  Packer,  pembacaan  titer hemaglutinasi  dimulai  pada  saat  eritrosit  yang terdapat  di  sumuran  kontrol  negatif  (K)  telah mengendap. Adanya  protein  yang berikatan dengan reseptor  permukaan  eritrosit  akan  membuat eritrosit  mampu  mengikat  eritrosit  lainnya  sehingga mencegah eritrosit  tersebut  mengendap pada  dasar sumuran mikroplate U.  Pada  kontrol  negatif  tidak terdapat  protein  sehingga  eritrosit  yang  terdapat pada  sumuran  kontrol  negatif  akan  mengendap terlebih  dahulu  (Fitrawati et  al .,  2015).  Pada penelitian  ini  pembacaan  titer  dapat  dibaca  pada menit  ke-62  dengan  titer  HA  tertinggi  yaitu  ½ (Gambar  3).  Hasil  ini  membuktikan  bahwa  protein pili  38,6 K.  pneumoniae merupakan  protein hemaglutinin  yang  mampu  berikatan  dengan reseptor permukaan sel eritrosit mencit yang berupa molekul  glukosa.  Uji  hemaglutinasi  yang  positif berguna  sebagai  identifikasi  kemampuan  adhesi molekul  protein  (Darmawati et  al .,  2018).  Pada penelitian  sebelumnya  telah  membuktikan  bahwa protein hemaglutinin berperan dalam adhesi bakteri pada  sel.  Protein  hemaglutinin Salmonella  thypi dengan berat molekul 36 kDa yang diperoleh dari pili bakteri  tersebut  terbukti  memiliki  kekuatan  adhesi pada  permukaan  sel  vena  umbilikal  manusia
(Soemarno  d et  al .,  2002).  Selain  itu  protein hemaglutinin Salmonella thypi dengan berat molekul 49,8  kDa  juga  mampu  melekat  pada  permukaan  sel enterosit  mencit  (Agustina e  al .,  2012).  Sedangkan pada  penelitian  sebelumnya  didapatkan  bahwa protein  hemaglutinin  pili  12,8  kDa K.  pneumoniae juga  berperan  dalam  adhesi  pada  sel  enterosit mencit (Agustina et  al ., 2014). Sehingga hasil positif protein pili 38,6 kDa K. pneumoniae pada penelitian ini  menunjukkan  bahwa  protein  hemaglutinin  ini berperan  dalam  adhesi  pada  sel.  Oleh  karena  itu dilakukan  uji  adhesi  untuk  menguatkan  hasil tersebut.
Hasil  Gambar  4  menunjukkan  bahwa  pola  adhesi sampel K.  pneumoniae pada  penelitian  ini merupakan  pola  adhesi  difus  yaitu  koloni  melekat pada  seluruh  bagian  sel  inang  sesuai  dengan  hasil penelitian  (Agustina et  al .,  2014).  Pada  lapang pandang  tampak K.  pneumoniae yang  tidak menempel  pada  epitel  sel  enterosit.  Jumlah K. pneumoniae yang  tidak  menempel  ini  dapat dikurangi  dengan  proses  pencucian  homogenat sebelum preparasi. Pencucian dengan menggunakan PBS  sebelum  preparasi  dengan  pewarnaan  Gram dapat  dilakukan  2-4  kali  pengulangan.  Apabila jumlah pengulangan yang terlalu sedikit maka lapang pandang  akan  dipenuhi  oleh K.  pneumoniae yang tidak  menempel  pada  sel  enterosit.    Sedangkan jumlah  pengulangan  yang  terlalu  banyak  akan semakin  meningkatkan  kemungkinan  hilangnya epitel sel enterosit. Keadaan ini akan tampak seakan- akan  tidak  ada  bakteri  yang  menempel  pada  sel enterosit.  Sehingga  ketepatan  pemilihan  jumlah pengulangan pencucian diperlukan untuk memperoleh hasil yang maksimal (Letourneau et al ., 2011).
Uji  adhesi  berfungsi  untuk  menguatkan  pembuktian bahwa protein hemaglutinin pili 38,6 K. pneumoniae berperan  dalam  adhesi K.  pneumoniae pada permukaan  sel  inang.  Pada  penelitian  ini  digunakan sel  enterosit  mencit  yang  berfungsi  sebagai  sel inang.  Selanjutnya  penghitungan  indeks  adhesi dilakukan  pada  100  sel  enterosit  dengan  3  kali pengulangan  perhitungan  oleh  orang  yang  berbeda untuk  mengurangi  subjektifitas.  Hasil  perhitungan kemudian  diolah  secara  statistik.  Diperoleh  hasil bahwa  semakin  tinggi  kadar  protein  yang  diberikan maka  indeks  adhesi  akan  semakin  rendah.  Hal  ini dikarenakan reseptor permukaan sel enterosit telah dipenuhi  oleh  protein  pili  38,6  kDa K.  pneumoniae sehingga bakteri K. pneumoniae tidak dapat melekat pada permukaan sel enterosit. Hasil ini
membuktikan bahwa protein pili 38,6 K. pneumoniae merupakan  protein  adhesin  yang  berperan  dalam perlekatan K.  pneumoniae pada  permukaan  sel inang.  Setelah  melekat  pada  sel  inang, K. pneumoniae akan  mampu  membentuk  koloni  dan menimbulkan  patogenitas  (Berne et  al .,  2015). Protein  pili  38,6  kDa K.  pneumoniae berdasarkan berat  proteinnya  dapat  diketahui  bahwa  protein tersebut  bersifat  imunogenik,  akan  tertapi  perlu pembuktian  yang  lebih  lanjut.  Jika  hasilnya dibuktikan bahwa protein tersebut bersifat imunogenik,  selanjutnya  dapat  dikembangkan antibodi  yang  dapat  melawan  sifat  tersebut  untuk pengembangan pencegahan infeksi oleh K. pneumoniae .

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan, didapatkan  kesimpulan  yaitu  protein  pili  dengan berat  molekul  38,6  kDa K.  pneumoniae merupakan protein  hemaglutinin  dan  protein  adhesin  yang berfungsi sebagai faktor virulensi K. pneumoniae .

## Daftar Pustaka
Agustina  D,  Prawiro  SR,  As  N.  2014.  Inhibition  of bacterial  adhesion  on  mice  enterocyte  by  the hemagglutinin pili protein 12 , 8 kda klebsiella pneumoniae  antibody. The  Journal  of  Tropical life Science . 4(1):19–25.
Agustina W, Fitri LE, Raras TYM, Siswanto B, Prawiro SR.  2012.  Antibody  protein  hemagglutinin subunit  pili  with  mw  49  ,  8  kda  shigella dysenteriae  can  inhibit  shigella  dysenteriae adhesion  on  mice  enterocyte. IOSR  Journal  of Pharmacy . 2(5):13–20.
Baker-Austin  C,  Trinanes  J,  Gonzalez-Escalona  N, Martinez-Urtaza  J.  2017.  Non-cholera  vibrios: the  microbial  barometer  of  climate  change. Trends in Microbiology . 25(1):76–84.
Berne  C,  Adrien  D,  Hardy  GG,  dan  Yves  BV.  2015. Adhesins  involved  in  attachment  to  abiotic surface  by  gram-negative  bacteria. Microbiol Spectr . 3(4):1–45.
Brooks BW, Foran CM, Richards S, Weston J, Turner PK, Stanley JK, Solomon K, Slattery M, Point L. 2003. Jawetz,  Melnick  &  Adelberg’s  Medical Microbiology . Edisi 25. San Francisco: McGraw Hill. / Chemosphere .
Dahlan  MS.  2015. Statistik  Untuk  Kedokteran  Dan Kesehatan . Edisi 6th. Jakarta: salemba medica.
Darmawati S, Santosa B, Indonesia D. 2018. Aktivitas hemaglutinasi  protein  pilli  salmonella  typhi terhadap  eritrosit  manusia  dan  domba.
Prosiding Seminar Nasional Mahasiswa
Unimus . 1:86–90.
Di Martino P, Cafferini N, Joly B, Darfeuille-michaud A.  2003.  Klebsiella  pneumoniae  type  3  pili facilitate  adherence  and  biofilm  formation  on abiotic  surfaces. Research  in  Microbiology . 154:9–16.
Dos  Santos  R,  Carvalho  AL,  Roque  ACA.  2017.
Renaissance  of  protein  crystallization  and precipitation in biopharmaceuticals purification. Biotechnology Advances . 35(1):41–50.
Ehara  M,  Ishibashi  M,  Ichinose  Y,  Iwanaga  M, Shimotori  S,  Naito  T.  1987.  Purification  and partial  characterization  of  fimbriae  of  vibrio cholerae o1. Butterworth & Co . 5(December):283–288.
Elfita L. 2014. Analisis profil protein dan asam amino sarang  burung  walet  (  collocalia  fuchiphaga  ) asal painan. Valensi . 4(1):61–69.
Fitrawati F, Wibowo MH, Amanu S, Sutrisno B. 2015.
Isolasi dan identifikasi egg drop syndrome virus dengan  uji  hemaglutinasi  dan  hemaglutinasi inhibisi. Sain Veteriner . 33(1):59–68.
Hidayati  DYN.  2010.  Identifikasi  molekul  adhesi  pili pseudomonas aeruginosa pada human umbilical  vein  endothelial  cells  (  huvecs  ) culture. J.Exp. Life Sci . 1(1):7–14.
Honda  T,  Ni  Y,  dan  Miwatani  T.  1988.  Purification and  characterization  of  a  hemolysin  produced by a clinical isolate of kanagawa phenomenon- negative  vibrio  parahaemolyticus  and  related to the thermostable direct hemolysin. Infection and Immunity . 56(4):961–965.
Juwita U, Haryani Y, dan Jose C. 2005. Jumlah bakteri coliform  dan  deteksi  escherichia  coli  pada daging  ayam  di  pekanbaru. JOM  FMIPA . 1(2):48–55.
Kazimoto  T,  Abdulla  S,  Bategereza  L,  Juma  O, Mhimbira F, Weisser M, Utzinger J, von Müller L,  Becker  SL.  2018.  Causative  agents  and antimicrobial  resistance  patterns  of  human skin  and  soft  tissue  infections  in  bagamoyo,
tanzania. Acta Tropica . 186:102–106.
Khan  LB,  Swift  S,  Kamal  T,  Read  HM.  2018.  Tips  & tools simulation of microbact strip assay using colored  liquids  to  demonstrate  identification of unknown gram-negative organisms. Journal of Microbiology & Biology Education . 19(2):19– 22.
Khater  FD,  Balestrino  D,  Charbonnel  ,  Dufayard  JF,
Brisse S, dan Forestier C. 2015. In silico analysis of  usher  encoding  genes  in  klebsiella pneumoniae and characterization of their role in  adhesion  and  colonization. PLoS  ONE . 10(3):1–24.
Laemmli  UK.  1970.  Cleavage  of  structural  proteins during  the  assembly  of  the  head  of bacteriophage t4. Nature . 227:680–685.
Leboffe  MJ  and  Pierce  BE.  2011. A  Photographic Atlas  for  The  Microbiology  Laboratory .  Edisi 4th. USA: Morton Publishing Company.
Letourneau J, Levesque C, Berthiaume F, Jacques M, Mourez  M.  2011.  In  vitro  assay  of  bacterial adhesion  onto  mammalian  epithelial  cells. Journal of Visualized Experiments . 1(51):3–6.
Li B, Zhao Y, Liu C, Chen Z, Zhou D. 2014. Molecular pathogenesis  of  klebsiella  pneumoniae.  - pubmed - ncbi. Future Microbiol . 9:1071–1081.
Li XIN, Johnson DE, Mobley HLT. 1999. Requirement of  mrph  for  mannose-resistant  proteus  -like fimbria-mediated hemagglutination by proteus mirabilis. Infection  and  Immunity .  67(6):2822– 2833.
Ling JM, Hut YW, French GL. 1988. Evaluation of the microbact-24e bacterial identification system. J Clin Pathol . 41(March):910–914.
Norsworthy  AN,  Pearson  MM.  2017.  From  catheter to kidney stone: the uropathogenic lifestyle of proteus  mirabilis. Trends  in  Microbiology . 25(4):304–315.
Parslow TG, Stites DP, Terr AI, dan Imboden J. 2001. Medical  Immunology .  Edisi  10th.  USA:  Mc Graw Hill.
Perhimpunan
Dokter Paru Indonesia. 2014. Pneumonia  Komunitas .  Edisi  2.  Jakarta:
Medicine Faculty of Indonesia University.
Podmirseg  SR,  Jäkel  H,  Ranches  GD,  Kullmann  MK, Sohm B, Villunger A, Lindner H, Hengst L. 2016. Caspases  uncouple  p27kip1  from  cell  cycle regulated degradation and abolish its ability to stimulate cell migration and invasion. Oncogene . 35(35):4580–4590.
Savage GP. 2003. Hemagglutinins (haemagglutinins) .
Academic Press
Soemarno,  Yanuhar  U,  Widodo  M,  Sumitra  B.  2002.
Molecular  Weight  of  Reseptor  Salmonella Thyphosa  at  Culture  of  Human  Umbilical  Vein Endothelial  Cells  (HUVEC).  Malang:  Maj. Kedok. Unibraw. April 2002. Halaman 9–13.
Sumarno RP,  Avanita AS, Winarsih S, Hidayat S, dan Nurhidayati  DY.  2015.  Haemaglutination  of shigella  dysentriae  subunit  pili  protein  with anti-haemaglutination of  s. dysentriae subunit pili  protein  as  a  molecule  adhesion  in  mouse enterocyte. Applied and Environmental
Microbiology . 54(5):1275–1276. Sutandhio  S,  Alimsardjono  L,  Lusida  MI.  2015. Distribusi dan Pola Kepekaan Enterobactericeae dari Spesimen Urin  di RSUD DR.  Soetomo  Surabaya  Periode  Januari  –  Juni
2015
Syahputra  RRI.  2018.  Pola  Kepekaan  Bakteri Terhadap  Antibiotik  Pada  Pasien  Infeksi Saluran  Kemih  Di  RSD  DR.  Soebandi  Jember. Jember University.
Thomas  DH,  Rob  A,  Rice  DW.  1989.  A  novel  dialysis procedure  for  the  crystallization  of  proteins. Protein Engineering . 2(6):489–491.
Zhang  H,  Yang  Q,  Liao  K,  Ni  Y,  Yu  Y,  Hu  B,  Sun  Z, Huang W, Wang Y, Wu A, Feng X, Luo Y, Chu Y, Chen S, Cao B, Su J, Duan Q, Zhang S, Shao H, Kong  H,  Gui  B,  Hu  Z,  Badal  R,  Xu  Y.  2017. Update  of  incidence  and  antimicrobial susceptibility  trends  of  escherichia  coli  and klebsiella  pneumoniae  isolates  from  chinese intra-abdominal  infection  patients. BMC Infectious Diseases . 17(1):1–9.