## KEMAMPUAN WHOLE CELL HELICOBACTER PYLORI DALAM MENGINDUKSI  DEGRADASI KOLAGEN TIPE IV MELALUI PENINGKATAN AKTIVITAS MAKROFAG

## Yuly Peristiowati
Helicobacter  pylori  (H.  pylori)  an  assosiation  with  acute  myocardial  infraction  and cronic  coronary  disease.  Bacteri  cytotoxin  can  induce  inflamatory  of  IL1- β  and  TNFα cytokine produce,and it can acitivated MMP-9 proteolotic enzyme, and it caused collogen degradation in plague atherosclerosis. This research aim to provit the whole cell H.pylori can  induce  the  degradasi  of  collagen  type  IV  by  increase  macrophage  activity.  It  were seen from TNF α and IL1-β level use ELISA methode. Anova statistic analyse result show significan  defferent  (0,000)  bettwen  group  control  with    macrophage  induce    whole  cell H.pylori. Enzyme MMP-9 production detected with the gelatine zymography continued by western  blotting  with molecule weight 93 kDa. Collogen fragmentation result of molecule weight  which  fragment  61,2  kDa  and  29  kDa.  It  concluded  that  whole  cell  H.Pylori  can induce  the  degradation  of  collagen  type  IV,  by  increase  macrophageag  activity.  So,  the result of this research can support the patomekanism myocardial infract disease.
Keyword : whole cell H.pylori, Macrophage, collagen Type IV

## LATAR BELAKANG
Helicobacter  p  ylori  (H.pylori) merupakan  bakteri  utama  penyebab gastritis  kronis  pada  manusia  dan banyak    dijumpai  di  seluruh  dunia.
H.pylori juga dikaitkan dengan penyakit ,antara lain penyakit kardiovaskuler, khususnya strain yang lebih  virulen. Pada  saat  ini H.  pylori merupakan salah satu bakteri penyebab penyakit kardiovaskuler.Diyakini bahwa penyakit  inflamasi  mempunyai  peran yang  penting  terhadap  patogenesis penyakit kardiovaskuler (Amieva, 2002). Dari  hasil  pemeriksaan  serologi penderita IMA terhadap infeksi mikroorganisme, diketahui bahwa
77,77  %  disebabkan  oleh    infeksi H.pylori. Cytotoxin    dari  bakteri tersebut  dapat  menginduksi  produksi sitokin IL-1- β  dan  TNFα,  yang selanjutnya mengaktivasi vaskuler endothelium (Romanelli, 1999). Aterosklerosis  merupakan  salah satu penyakit inflamasi yang
berhubungan  dengan  reaksi  imun
(Kalela, 2002). Pada lesi aterosklerotik,  ditemukan  makrofag dan  limfosit  dalam  jumlah  banyak,  sel mast  serta  sel  B.  Pada  proses inflamasi, sel-sel radang yang teraktivasi akan meningkatkan produksi proenzim, diantaranya Matrix Metalloprotease atau MMPs. Proenzim  ini  dapat  diubah  menjadi enzim aktif yang menyebabkan lisisnya  kolagen  (Hansson,  2001).
Apabila proses ini terjadi pada permukaan  plak  aterosklerotik  maka serabut  kolagen  yang  melindungi  plak akan mengalami lisis sehingga menjadi  tipis  dan  akhirnya  mudah ruptur. Kolagen tipe-IV merupakan komponen  utama  dari membran  basal vaskular  yang  mudah  rusak  oleh aktivitas  proteolitik  enzim  MMP. Outer membrane H.Pylori berisi phospholipids dan lipopolysacharide (LPS).  Antigen  O  dari  LPS  mungkin fucosylated  dan  seperti  kelompok antigen dalam darah  pada endotelium gaster  (Abbas,  2001).  Pada  outer membran
H.Pylori juga berisi cholesterol  glucosides,  dimana  LPS
pada  OMP H.Pylori diduga  juga merupakan endotoksin dapat menimbulkan  efek  sistemik  pada  host sehingga  mempengaruhi  fungsi  lokal sel-sel  dinding  vaskular,  menurunkan sistem resistensi vaskuler, mengaktifkan endotelium yang sehubungan dengan evolusi dan pembentukan  ateroma  yang  pada akhirnya menyebabkan disrupsi plak. Penelitian  ini  bertujuan  untuk membuktikan apakah whole cell H.pylori mampu menginduksi degradasi  kolagen  tipe  IV  melalui peningkatan aktivitas makrofag.

## METODE PENELITIAN
Helicobacter  pylori didapatkan dari  laboratorium  sentral  Biomedik Rumah Sakit Umum Mataram kemudian dilakukan uji biokimia  untuk mengidentifikasi H.pylori meliputi  Uji
Pewarnaan  Gram,  Uji  Urease,  Uji Oksidase, Uji Katalase, Uji Gula-Gula Isolasi monosit dengan menggunakan metode Histopaque (Sigma - Leukocyte separation ).
Monosit  diisolasi  dari buffy  coat Peripheral  blood individu  sehat sebanyak  50  ml.  Sel  mononukleus yang terdapat pada buffy coat diperoleh menggunakan prosedur pemisahan dengan Ficol-Hypaque dan selanjutnya  dicuci  dengan  medium RPMI  yang  mengandung  HEPES  25 mM,  1,5  ml  L-glutamin,  10  mg/ml gentamycine,fetal bovine serum  10%. Sel  diinkubasi    selama  2  jam  pada suhu 37°C , dengan tekanan CO 2 5%. Sel  dicuci  lagi  sebanyak  2x  dengan serum  free.  Sel  dikultur  diatas glass coverslip ,  pada plat-titermikro 24
sumuran  dengan  kepadatan  25x10 3
sel/sumuran.  Kemudian  ditambahkan medium  komplet  yang  berisi  FBS 10%,  PMA  10 -7 ( pharbol  12-myristate 13-acetate ).  Selanjutnya  sel    monosit
diinkubasi  selama  7  hari  sampai berdeferensisi menjadi makrofag.
H  pylori dalam  medium  cair sebelum  diinduksikan  pada  makrofag dihitung konsentrasinya dengan menggunakan Spektrofotometri. Untuk menentukan  konsentrasi  10 8 sel/mL sampai  mencapai  OD  1.  Bila  OD  1 maka  untuk  menginduksikan  bakteri dengan  makrofag  diperlukan  300 μL H.pylori. Selanjutnya  bakteri  dalam medium  dipipet  dan  diambil  2 mL  dan dimasukkan  kedalam  falcon  15  mL. Kemudian  sentrifuge  3000  rpm,RT  10 menit.  Pelet  diambil  dan  supernatan disisihkan.  Kemudian  pelet  di  cuci menggunakan RPMI atau PBS. Selanjutnya  sentrifuge lagi 3500 rpm, RT  10  menit.  Pelet  diambil,  dan supernatan dibuang. Pelet ditambahkan  medium  komplet  (tanpa antibiotik).  Bakteri  siap  diinduksikan pada makrofag.
Peningkatan  aktivitas  makrofag yang  diinduksi  dengan whole  cell H. pylori yang  dilihat  dari  peningkatan kadar   TNF α dan IL1-β yang diperiksa menggunakan metode ELISA. Selanjutnya  aktivitas  makrofag    dilihat dari produksi MMP-9 yang dihasilkan. Enzim MMPs diuji dengan menggunakan metode gelatin zymography .    Gel  polyacrylamide 7,5%  berisi    gelatin  2  mg/ml  substrat yang diduga berisi enzym berasal dari supernatan  yang  diinfeksi  makrofag. Gel  polyacrylamide running dengan tris-glysine  SDS  running  buffer ,  dan running pada  kondisi  voltase  konstan (120  V),  kuat  arus  (awal:  30 –  40 mA/gel  dan  akhir:  8 –  12  mA/gel)
dalam 90 menit. Gel dilakukan
renaturasi pada Zymogram  renaturing buffer pada  suhu  ruang  selama  30 menit sambil diagitasi. Gel dipindahkan  ke Zymogram  developing buffer pada suhu ruang dengan agitasi lembut selama 30 menit kemudian gel dimasukan pada Zymogram developing buffer yang baru kemudian
diinkubasi  pada  37°C  semalam  (24 jam).  Gel  dilakukan staining dengan comassie  brilliant  blue  R-250. .  Untuk mendeteksi MMP-9 dilanjutkan dengan  uji western  blotting .  Enzim MMP-9    mempunyai  berat  molekul  93
kDa.
Supernatan  yang  berasal  dari makrofag  yang  diinduksi H.  pylori diyakini berisi komponen colagenolytic seperti MMP-9 yang selanjutkan direaksikan  dengan  kolagen  tipe  IV (sigma) 50 μg/ml dengan perbandingan 1:1, kemudian diinkubasi  pada  suhu  37°C  dalam waterbath. Sebelum
direaksikan dengan  supernatan  kolagen  tipe  IV
didialisa dulu selama 3 hari.
Substrat  kolagen  tipe  IV  dilabel dengan  biotin  ( biotinylated  collagen substrate )  kemudian  didialisa  selama 3  hari.  Kolagen  yang  sudah  berbiotin ditambahkan pada supernatan (MMPs dari    whole  cell H.pylori dan  protein, kemudian diinkubasikan selama semalam dalam waterbath. Supernatan  yang  sudah  bercampur kolagen tipe IV dilihat profile degradasinya  dengan  menggunakan metode ligan  blotting dengan  SDS  - PAGE 12%. Hasil elektroforesis degradasi kolagen tipe IV dipindahkan ke  membran  NC  menggunakan  alat semi  dry  blotter buatan  Biorad. Membran  NC  direndam  dalam    5% skim-milk  selama  24  jam  pada    4°C. Cuci  dengan  TBS-T  3x  5  menit, inkubasi SA-HRP 1 jam. Membran NC
direndam dengan TMB substrat selama  10 –30  menit  pada  ruang gelap.  Membran  NC  dibilas  dengan akuades
dan dikeringanginkan.
Kemudian hasilnya di analisa.

## HASIL
Helicobacter  pylori yang  didapat dari  Laboratorium  Sentral  Biomedik Rumah Sakit Umum Mataram.
Dari  hasil  uji  ulang  secara biokimiawi H.pylori dengan  metode Microbact System 24E yang dilakukan di  laboratorium  Mikrobiologi  Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya didapatkan  :  uji  oksidase,  motility, nitrat, glukose, manitol, xylose, ONPG, indole,  urease,  malonate,  sorbitol, rhamnose,  lactose,  arabinose,  arginin semuanya positif. Dari hasil uji biokimia  tersebut  dapat  disimpulkan bahwa  isolat  bakteri      tersebut  adalah Helicobacter pylori (Gambar 1)
Gambar 1. Hasil Uji biIokimia H.pylori
Selanjutnya  isolat  bakteri  dilihat dibawah mikroskop dengan pewarnaan  gram  didapatkan  hasil  : H.pylori berbentuk  batang  yang  dapat dilihat pada gambar 1
Gambar 2 Bakteri H.pylori gram negatif dengan pewarnaan gram
(pembesaran  >1000 kali)
Sel berbentuk bulat, tepi rata, permukaan mengkilat, besarnya seragam (Gambar 3A). Untuk menginduksi diferensiasi monosit menjadi  makrofag,  pada  medium ditambahkan  PMA  10 -7 mM.  Setelah 7 hari  monosit  dikultur  ,    maka  akan berubah menjadi makrofag yang ditunjukkan pada gambar 3B.
b
omp whole kontrol perlakuan 1200.00 1000.00 800.00 600.00 400.00 200.00 0.00 Mean IL1- Beta Error bars: 95,00% CI Kadar IL-1 Betha A B
Gambar 3. A ) Kultur monosit hari ke-1. Sel berbentuk bulat, tepi rata , permukaan mengkilat dan kompak, besar seragam B)
Kultur monosit hari ke-7. monosit mengalami multiplikasi menjadi lebih banyak memenuhi dasar flask . Tanpa pewarnaan (pembesaran 400 kali)
Kemampuan Aktivitas Makrofag dilihat dari  peningkatan  Produksi  Sitokin TNF- α dan IL-1β
Gambar 4. Diagram Batang Hasil ELISA IL1- β makrofag yang dipapar dengan Whole dan OMP H.pylori
Dari  tabel  diatas  dapat  dilihat ada  perbedaan  yang  bermakna  kadar IL1- β  pada  ketiga  perlakuan.  Secara statistik  (ANOVA  satu  arah, α=0.05), produksi  IL1- β  pada  ketiga  perlakuan terdapat  perbedaan  secara  bermakna antara  perlakuan  dengan Whole  cell H.pylori ,  dan  kelompok  kontrol dengan  tingkat  kemaknaan  0,000. Kemudian  dilanjutkan  dengan  uji  post hoc  antara  kontrol  dengan  whole  nilai signifikannya 0,000.
Gambar 5 Diagram Batang Hasil ELISA TNF- α makrofag yang dipapar dengan Whole dan OMP H.pylori
Dari  tabel  diatas  dapat  dilihat terjadinya  peningkatan  kadar  TNF α
tertinggi  pada  induksi Whole  cell H.pylori. Secara statistik (ANOVA satu arah,  α=0.05),  produksi  TNFα  pada ketiga  kelompok  terdapat  terdapat perbedaan  secara  bermakna  antara kelompok  perlakuan  dengan Whole cell  H.pylori dan  kelompok  kontrol dengan  tingkat  kemaknaan  0,000. Kemudian  dilanjutkan  dengan  uji post hoc didapatkan  antara  kontrol  dengan whole  cell nilai  signifikannya  0,000, Berarti ada perbedaan yang bermakna. Deteksi  aktivitas MMP-9. Hasil gelatine zymography menunjukkan  bahwa  makrofag  yang dipapar  dengan whole  cell  H.pylori dan  protein  62  kDa  pada outer membrane H.pylori memberikan gambaran  jumlah  produksi  enzim dengan  berat  molekul  yang  sama
(Gambar 6)
Pada gambar 6 diatas menunjukkan pada sumur 3-6 merupakan supernatan dari  makrofag yang  diinduksi Whole cell H.pylori terdapat  pita  berwarna  putih  tebal dengan  berat  molekul  93  kDa  dan  62 kDa.  Sedangkan  pada  sumur  1  yang merupakan  medium  dari  makrofag yang  tidak  diinduksi  bakteri  tidak terlihat  adanya  gambaran  pita  putih.
Hal  ini  menunjukkan  bahwa  aktifitas MMPs hanya terdapat pada supernatan dari makrofag yang diinduksi oleh whole cell H.pylori .
omp whole kontrol perlakuan 4000.00 3000.00 2000.00 1000.00 0.00 Mean TN F-al fa Error bars: 95,00% CI Kadar TNF Alpha
Kemudian hasil SDS-PAGE 7,5% gelatin dilanjutkan dengan Western  blotting yang  menggunakan antibodi  anti  MMP-9.  Hasil Western blotting dapat  mengenali  enzim  MMP- 9 pada gambar 7.
93 k Da 72 kDa 55 kDa 43 kDa 34 kDa 26 kDa

## M      K (-)   S1-S3  S4-S6
Gambar 7 : Hasil Western blotting
Reaktifitas antibody anti MMP-9 yang dapat mengenai enzim MMP yang dihasilkan oleh makrofag karena induksi whole H.pylori .
Keterangan : M :  Marker  /protein  penanda  low marker merk Sigma S1 : Medium pada makrofag S2-S3  :  MMP-9  dari  induksi  Whole
H.pylori pada makrofag S4-S6  :  MMP-9    dari  induksi  OMP H.pylori pada makrofag
: BM Protein
Pada  gambar  7  menunjukkan  hasil Western  blotting dimana  antibodi  anti MMP-9 yang diberikan sebagai antibodi primer terlihat dapat mengikat enzim  MMP-9  pada  berat  molekul  93 kDa Pada gambar 8 merupakan hasil
degradasi  kolagen  tipe  IV  dengan menggunakan elektroforesis SDS-
PAGE  12,5  %  dengan  pewarnaan
Comasie brilliat blue.
Gambar 8. Hasil Elektroforesis degradasi kolagen tipe IV
Keterangan : M : Protein penanda  Low marker S1-S2  : Kolagen tipe IV S3 :  Supernatan OMP H.pylori S4 : Supernatan Whole cell H.pylori S5-S6  : Fragmen kolagen tipe IV oleh
MMPs OMP H.pylori
S7-S9  : Fragmen kolagen tipe IV oleh
MMPs Whole cell H.pylori : Pita yang menunjukkan  hasil degradasii kolagen tipe IV.
Berdasarkan  hasil  SDS-PAGE
12,5  %  dengan  pewarnaan  Comasie brilliat  blue  pada  gambar  5.8  diatas pada  kolagen  hasil  fragmentasi    oleh MMPs  dari  whole  cell H.pylori pada berat molekul 61,2 kDa dan 29 kDa.

## PEMBAHASAN
Kemampuan  Whole  cell  H.pylori  dan protein  62  kDa  pada  outer  membrane H.pylori  dalam meningkatkan aktivitas makrofag  melalui  peningkatan  Kadar TNF α dan IL1-β.
Pada produksi IL1- β oleh makrofag yang dipapar dengan Whole cell H.pylori,  dan kelompok  kontrol yaitu  makrofag  yang  tidak  diinduksi
H.pylori , menunjukkan perbedaan yang  signifikan.  Dari  hasil  uji  Anova satu  arah  , α  =0,05    didapatkan  nilai signifikan 0,000.
Kadar    TNF α  oleh  makrofag yang  diinduksi  dengan Whole  cell H.pylori, dan  kelompok  kontrol  yaitu makrofag  yang  tidak  diinduksi H.pylori menunjukkan perbedaan yang signifikan.  Dari  hasil  uji  Anova  satu arah  , α  =0,05    didapatkan  nilai signifikan 0,000. Sesuai dengan teori yang dikemukaan Abbas et al ,2007  bahwa imunitas alami terhadap bakteri intraseluler terutama diperantarai oleh sel  fagosit  dan natural  killer (NK). Imunitas  alami    tersebut  aktif  sejak awal  sampai  dengan  7  hari  infeksi patogen. Neutrofil mengawali
fagositosis  dan  diikuti  oleh  makrofag, akan tetapi bakteri intraseluler
patogenik umumnya resisten terhadap degradasi  oleh sel-sel fagosit.  Sel  NK yang  teraktivasi  memproduksi  IFN- ﻻ untuk  mengaktifkan  makrofag  dalam membunuh bakteri intraseluler. Apabila  sel-sel  imunitas  alami  tidak mampu mengeliminasi bakteri tersebut, maka pada hari ke-7 imunitas adaptif akan berperan. Makrofag yang teraktivasi akan memproduksi berbagai substansi seperti fagositik oksidase, iNOS,sitokin (TNF- α, IL1-β, IL-12) dan enzim proteolitik.
TNF- α,  IL1-β  bekerja  pada imunitas  alami  dan  inflamasi.  Sumber utama  kedua  sitokin  tersebut  adalah fagosit  mononuklear  yang  teraktivasi. Interleukin-1  diproduksi  oleh  fagosit mononuklear  yang  teraktivasi    karena adanya induksi produk bakterial seperti LPS dan oleh beberapa sitokin lainnya  seperti  TNF- α.  TNF-α  tidak hanya  diproduksi  oleh  makrofag  , tetapi  juga  oleh  neutrofil,  sel  epitel seperti  keratinosit  dan  sel  endotel (Amieva, 2002).
Makrofag  yang  teraktivasi  akan menstimulasi terjadinya inflamasi melalui  sekresi    sitokin  (terutama TNF- α dan IL1-β), kemokin dan short- lived  lipid  mediator  (platelet  activating factor /PAF, prostaglandin, leukotrien).
Kerja kolektif dari macrophage- derived  cytokine dan lipid  mediator adalah  menginduksi  inflamasi  lokal yang  banyak  mengandung  neutrofil yang akan memfagositosis dan menghancurkan  patogen.  Selain  itu  , makrofag  yang  teraktivasi  (bersama neutrofil) memfagositosis jaringan yang mati dan memfasilitasi perbaikan jaringan akibat infeksi (Amieva, 2002). Ekspresi  MMP-9  diinduksi  oleh pemicu yang adekuat. Diketahui monosit, neutrofil, sel dendritik,
limfosit,  sel  endothelial,  sel  epitel  dan
osteoblast dapat memproduksi gelatinase B (Visse, 2003).
Mediator  inflamasi  yang  penting pada  proses  ruptur  plak  antara  lain TNF- α  dan  IL1-β,  sedang  IFN-ﻻ menghambat  berbagai  sintesis  MMP. Pada  plak  aterosklerotik  mengandung ketiga sitokin tersebut. Terjadi ekspresi  CD40  dari  SMC  dan  CD40L dari  limfosit  T  pada  lesi  aterosklerotik manusia.  Ligasi  CD40L  sel  limfosit  T dengan  CD40  SMC  menginduksi MMP-1,  MMP-2,  MMP-3  dan  MMP-9 oleh  SMC  dan  ligasi  dengan  CD40 monosit manusia menginduksi ekspresi MMP-9 (Visse, 2003). Penelitian  tentang  sitokin  dan  peran makrofag pada degradasi ECM, menunjukkan  hasil  bahwa  92  kDa gelatinase (MMP-9) makrofag
meningkat  (2-15  kali  ;rerata  5  Kali) karena  induksi  oleh  TNF- α dan IL1-β, sedang    IFN- ﻻ  menghambat  produksi 92 kDa gelatinase. Gelatinase 92 kDa mendegradasi ECM, terutama membran basalis (Egeblat, 2002). Peningkatan TNF- α yang merupakan  respon  dari  inflamatori pada lesi aterosklerotik juga dikemukakan oleh Ameriso, et.al(8, 24), bahwa  ekspresi  dari  molekul adesin  dalam  endotel  dan  sel  otot polos merupakan komponen kunci dari respon inflamasi dalam lesi aterosklerotik.  Peningkatan  aktivitas inflamatori endotel menyebabkan peningkatan  ekspresi  molekul  adesi (ICAM-1)  dan  TNF- α  pada  orang dengan plak aterosklerosis.
Teori  lain  menyebutkan  bahwa sitokin inflamatori dan faktor pertumbuhan  yang  dihasilkan  selama terjadi aterosklerosis dapat mengaktifkan  ekspresi  MMP.  MMP yang aktif selama aterosklerosis antara  lain  dari  kelompok  stromelysin- 1 (MMP-3), gelatinase-B (MMP-9) dan collagenase  (MMP-1  dan  MMP-8) (Sulistia, 2005).
Disini  jelas  bahwa  dalam  proses terjadinya aterosklerosis dan pembentukan plak aterosklerosis diawali  dengan  adanya  proses infeksi.
Dimana  adanya  respon  inflamasi tersebut akan meningkatkan beberapa sitokin  yang  terkait  termasuk  TNF- α dan IL1- β. Dimana dengan peningkatan  sitikin  tersebut  akan mengaktifkan  ekspresi  dari  enzim MMP  terutama  MMP-9  yang  paling berberan pada patogenesis aterosklerosis. Produksi enzim MMP-9 yang dihasilkan  dari  induksi  makrofag  oleh Whole cell H.pylori Pada hasil penelitian ini didapatkan  bahwa  terdapat  aktivitas enzim  MMPs  pada  kultur  makrofag yang  telah  dipapar  dengan whole  cell H.pylori. Pada Hasil gelatine zymography menunjukkan bahwa makrofag yang dipapar dengan whole cell H.pylori memberikan  gambaran jumlah  produksi  enzim  dengan  berat molekul  93  kDa  dan  62  kDa  di tunjukkan  dengan  adanya  gambaran pita  putih  tebal.  Kemudian    dari  hasil gelatine
zymography
dilanjutkan dengan  uji Western  Blotting untuk membuktikan  bahwa  aktivitas  enzym tersebut  merupakan  aktivitas  dari enzim  MMP-9.  Dari  uji Western Blotting didapatkan    berat  molekul MMP-9  93 kDa.
Salah  satu  enzim  MMP  yang diduga  berperan  dalam  patobiologi IMA  adalah  gelatinase  B  atau  yang dikenal  sebagai  MMP-9  mempunyai berat  molekul  92  kDa.  Sedangkan pada  penelitian  ini    didapatkan  enzim MMP-9    pada  berat  molekul  93  kDa. Hal  ini  dapat  dikarenakan  adanya pergeseran  pada  saat  perhitungan berat  molekul.  Atau    dapat  juga dikarenakan  gambaran  pita  protein yang kurang jelas (Worthly, 2001).
Sedangkan menurut hasil penelitian  Worthly et al (2001), bahwa
beberapa enzim terlibat dalam destruksi  ECM    (Misal  MMP-1  dan MMP-3)  tetapi  hanya  MMP-9  yang mempunyai  hubungan  erat  terhadap terjadinya  ruptur  plak  aterosklerosis. MMP-9  merupakan  MMP  yang  paling banyak  dihasilkan  oleh  makrofag  dan bersama dengan MMP yang
dihasilkan  oleh  SMC  berperan  pada rupturnya  plak  secara  akut  ( acut syndrome ) (Pasceri, 1998).
Pada H.pylori terdapat  protein yang  disebut Neutrophil  activating protein (NAP merupakan protein yang terdapat pada permukaan Helicobacter  pylori dengan  berat  150 kDa  yang  berkontribusi  untuk  aktivasi fagosit  (Loftus,  2003).  Bentuk  ini mempunyai  berbagai  fungsi  antara lain  dapat  bertindak  sebagai  adhesin yang memediasi pengikatan ke mukus,  merupakan  faktor  kemotaktik untuk neutrofil dan monosit, meningkatkan  adesi  netrofil  ke  sel endotel,  menginduksi  netrofil  untuk menghasilkan Reactive Oxygen Radical (ROS),  dapat  mengaktivasi sel mast dengan melepaskan cytokine proinflamatori  dan  berperan  pada penyerapan  iron  oleh Helicobacter pylori (iron  adalah  nutrien  esensial untuk bakteri) (Mudyawati, 2008).
H.pylori juga
menghasilkan Heat-shock  protein  60  atau  Hsp60 yang  mempunyai  berat  molekul  60 kDa  dan  dapat  menginduksi  respon inflamasi melalui jalur Toll-like reseptor atau TLR. Jalur signaling yang digunakan dengan TLR ini mengaktivasi  NF- κB  yang  akhirnya mengekspresikan gen-gen yang mengkode protein yang penting dalam berbagai  komponen  respon  immun non-spesifik  yang  meliputi  sitokin inflamatori  (TNF- α,  IL-1  dan  IL-12) (Gibbs, 1999).
Berdasarkan penelitian yang dilakukan  oleh  Benagiano , et  al.
(2005)  bahwa  sel  endotel  arteri  yang mengalami
aterosklerosis
memperlihatkan  ekspresi  HSP60,  hal ini  diduga  karena  adanya molecular mimicry dari  mikroorganisme  yang menjadi target sel T autoreaktif dan sel T cross-reactive terhadap  HSP60 mikroba  melalui molecular  mimicry tersebut.
Melihat dari hasil penelitian disini dapat  dilihat  bahwa  enzim  MMPs dapat  diyang  diaktifkan  oleh whole cell H.pylori, yang  ditunjukkan  dengan hasil gelatine zymography dan dilanjutkan dengan uji Western Bloting. Pada whole  cell H.pylori terdapat  komponen  protein –protein seperti  NAP    ( Neutrophil  activating protein )  dan Heat-shock  protein  60 atau Hsp60. Sedangkan outer membrane H.Pylori berisi phospholipids dan lipopolysacharide (LPS. Dimana LPS merupakan produk mikrorganisme dapat berperan sebagai  aktivator  sel-sel  inflamatori. LPS  ini  mungkin  dapat  berkurang karena  proses  isolasi  dari outer membrane itu sendiri dengan menggunakan SDS.
Identifikasi Berat molekul pita fragment kolagen  tipe  IV  hasil  degradasi  enzim MMP-9.
Dari  hasil  penelitian  penelitian didapatkan  bahwa  enzim  MMP-9 dapat  mendegradasi  kolagen  tipe  IV. Berdasarkan  hasil  SDS-PAGE  12,5  % dengan  pewarnaan  comasie  brilliant blue  pada  gambar  8  didapatkan kolagen  yang  terfragmentasi    oleh MMPs  dari whole  H.pylori pada  berat molekul : 170 kDa,  100 kDa, 68 kDa. MMP  dapat  diaktifkan  oleh  tiga mekanisme  yaitu  aktivasi stepwise , aktivasi  intraseluler  dan  aktivasi  pada permukaan  sel.  Walaupun  semua MMP  mempunyai  keluarga  protease, struktur  dan  fungsi  yang  sama,  tetapi
MMP dapat diaktifkan dengan mekanisme yang berbeda (Opdenaker, 2001). Awal  pembelahan  terjadi  dari dalam propeptida dan kemudian dipindahkan oleh fragmentasi intramolekular melalui beberapa itermrdit (Schoenbeck, 1997). Salah  satu  enzim  proteolitik yang dihasilkan oleh sel-sel inflamatori adalah enzim Matrix Metalloproteases (MMPs). Enzim MMP ini dapat mendegradasi extracellular  matrix atau  ECM.  Salah satu enzim MMP yang diduga berperan dalam patobiologi IMA
adalah gelatinase B atau yang dikenal sebagai  MMP-9  mempunyai  berat molekul  92  kDa  dan  diidentifikasi sebagai  suatu gelatin-binding  protein yang  disintesis  oleh  sel-sel    leukosit (Gibbs, 1999).
Menurut hasil penelitian Worthly et al (2001) bahwa meskipun beberapa enzim terlibat dalam
destruksi  ECM  (misalnya  MMP-1  dan MMP-3),  tetapi  hanya  MMP-9  yang mempunyai  hubungan  kuat  terhadap terjadinya  ruptur  plak  aterosklerotik hingga terjadinya IMA. Dikatakan pula bahwa  MMP-9  mampu  mendegradasi komponen  matriks  yang  tidak  mampu didegradasi  oleh  enzim  proteolitik lainnya. Sehubungan dengan kemampuan MMP-9 dalam mendegradasi komponen matrik maka pada  penelitian  ini  pula  dilakukan  uji degradasi  kolagen  tipe  IV  oleh  MMPs yang  diperoleh  dari  makrofag  yang dipapar  dengan Whole cell H.pylori dan  protein  62  kDa outer  membrane H.pylori. Berdasarkan  hasil  SDS- PAGE  yang  kemudian  dilanjutkan dengan uji Ligan Blotting.
Pada  proses  inflamasi,  sel-sel radang yang teraktivasi akan meningkatkan prosuksi proenzim, diantaranya Matrix Metalloprotese atau  MMP.  Proenzim  ini  dapat  diubah menjadi  enzim  yang  aktif    yang menyebabkan lisisnya kolagen (Opdenaker, 2001 dan Fong, 2000).
Apabila  proses  ini  terjadi  pada plak  aterosklerosis  maka  serabut kolagen  yang  melindungi  palk  akan mengalami lisis sehingga menjadi tipis dan akhirnya mudah ruptur.
Gelatinase  B  atau  yang  dikenal sebagai  MMP-9  mempunyai  berat molekul  92  kDa  dan  diidentifikasi sebagai  suatu gelatin-binding  protein yang  disintesis  oleh  sel-sel    leukosit (Schoenbeck, 1997).
Ekspresi  MMP-9  dapat  diinduksi oleh  pemicu  yang  adekuat.  Diketahui monosit, neutrofil , sel dendrit, limfosit, sel  endotel,  sel  epitel  dan  osteoblas dapat  memproduksi  gelatinase  B (Rajagapalan, 1996).
Degradasi  kolagen  tipe  IV  dapat terjadi  secara  langsung  oleh  protease yang  dihasilkan  oleh  mikroorganisme atau  bila  terdapat  inflamasi  yang signifikan, akan terjadi degradasi lebih besar  oleh  aktivitas  MMP  (Yoshio, 2002 dan Falk, 1995).
Diketahui  pada  struktur  MMP-2 dan  MMP-9  mempunyai  tiga  daerah yang  sama  dari  fibronektin  tipe  II  di dalam  daerah  heliknya,  diduga  pada waktu  MMP-9  aktif  maka  3  daerah yang  sama  dari  fibronektin  tipe  II  ini akan berinteraksi dengan Kolagen tipe IV, selain itu C-terminal hemopexin like domain yang dimiliki MMP-9
digunakan    untuk  membelah  bentuk kolagen  yang  triple  heliks  (Dostal, 2005 dan Lee, 1997)

## KESIMPULAN
Dari  penelitian  ini  dapat  disimpulkan bahwa : 1. Whole cell H.pylori mampu meningkatkan  aktivitas  makrofag melalui  peningkatan  kadar    TNFα  ,
IL1- β  dan  Produksi    MMP-9  pada
berat molekul 93 kDa. 2. Whole cell H.pylori mampu menginduksi degradasi kolagen
tipe IV melalui peningkatan aktivitas makrofag.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbas  A.K.  and  Licthman  A.H.,    1991. Cellular    and  Moleculer  Imunology , Fifth  edition.  The  curtis  center  ,
Philadelphia. P.296-349. Amieva  M.R.;  Salama  N.R.;  Tompkins L.S. and Falkov S.,2002. Helicobacter pylori enter and Survive Within Multivesiculer Vacuoles of Ephithelial Cells .
Cellular Mikrobiology.4 (10): 677.
Cimpean    S.,  Caloianu  M,    1997. Matrix Metalloproteinases    with  Role  in Collagen Biodegradation . Romanian J. Biol. Scu, 1 (2), p.1
Dostal  ,  D.E.  2005. Matrix  and    Cell Adhesion  Mediated  Signaling  . Divioson    of  Moleculer    Cardiology .
October 10, 2006
Egeblad  M and Werb  Z.  2002.
New Functions for the matrix metalloproteinases in cancer progession .  NT Rev Cancer  2 (3):
161- 174.
Falk , E., Shah P.K.,  Fuster  , V., 1995. Coronary Plaque Disruption . Circulation 92, 657-671. Fong,  I.W.  2000 . Emerging Relations Betweeen  infectious    Disease    and Coronary  artery Desease  and ath. CMAJ;  13 (1) : 49-56
Gibbs  D.F.  Warner  R.L.  ,  Weiss  S.  J., Johnson    K.J.,  Varani  J.  1999. Characterization of Matrix Metalloproteinases    Products    by Rat  Alveolar    macrophages .  Am.J. Respir. Cell Moll . Biol. 20(6), 1136- 1144. Hansson, G.K. 2001. Immune Mechanisms in atherosclerosis. Atherosclerosis  .  Thrombosis ,  and vascular  Biology 21, 1876- 1915
Janeway , C.A. Travers, P ., Walport M ., Capra,  J.D.,    1999.    Immuno Biology,    The Immune    system  in health  and  disease ,  4  ed.  USA  ;
Current Biology Publisher, 299-302.
Kalela,  A. 2002. Factor Affecting Serum
Matrix  Metalloproteinase  -9  with special  Reference  to  atheroslerosis . Universwity of Tampere , Tampere.
Lee    R.T.  and  P.  Libby  1997. The
Unstable  Atheroma  .  Atherislerosis Thrombosis  and  Vascular  Biology . (17): 1859-1867.
Loftus,  I.M.  :  Naylor  R,;  Goodal  S  . Crowther  M, : Jones L. ; Bell P.R.F.
;  Thompson  M.M.  2003. Increased Matrix  Metalloproteinase -9 Activity in  Unstble  Carotid  Plaques.  Stroke J, : 31 (40).
Mudyawati, 2008. Peran LPS Helicobacter pylori dalam mendegradasi  kolagen  tipe-IV  pada neutrofil penderita IMA. Opdenaker  G, Van den Sten PE & Van
Damme  J  (2001 )  Gelatinase    B  ;  a tuner    and  amplifier    of  immune function. Trends  Immunol  22(10): 571-579.
Ortega  N  .  and  Z  Werb  2002. New
Functional    Roles    For    Non- collagenous  Domains  of Basement Membrane    Collagens .  Journal  of Cell Science   (115) ; 4201-4214.
Pasceri  V.;  G  .  Cammarota  ;  L.  Fatti  ; G.Cuoca; A.  Gasbarrini  ; R.L.  Grillo ;  G.  Fedeli;  G.  Gasbirrini  and A.Maseri  ,    1998  . Association    of Virullent  Helicobacter    pylor  strains with  ischemic    Herart  Disease .  J.
Circulation (97) ; 1675-1679. Rajagapalan  S,;  X.P.  Meng  ;  S. Ramasamy;  D.G.  Harrison    and Z.S. Galis 1996. Reactive oxygen        Species  Produced    by Macrophage    Derived    foam  cells regulate  the  Activity  ofv  Vascular
matrix    Metalloproteinases    in  vitro; implication for atheroslerosis Plaque  Stability .    J.Clin.  Invest.  98
(11) :2572-2579.
Romanelli  R. ; S . Mancini; C.Laschinger ;    Overall;  sodek    and  C.A.G.    Mc Culloch  1999  . Activation    of Neutrophil    Collagenase      in Periodontitis. Infection dan Immunity . 69 (5): 2319-2326. Schoenbeck  ,  U  .,    Mach,  F.,  Sukhova, G.K.,  Murphy,  C.,  Bonnefoy,  J-Y., Fabunmi,  R.P.,  Libby,  P.,  1997. Regalations of matrix metalloproteinase  expressions    in Human  Vascular    Smooth  Muscle Cells. by T Lymphocytes, A Role for
CD 40 Signaling in Plaque  Rupture . Circulation Research.81, 448-454.
Sulistia,Y.2005. Deteksi  Protein  Spesifik Helicobacter  pylori  Penderita  Infark Miokard  Akut  Yang  Terkait  Infeksi Helicobacter pylori. Universitas Brawijaya Malang . Visse  R  and  Nagase    H  ,(2003) Matrix metalloproteinase and tissue inhibitiors  of  metalloproteinase  s; structure , function, and biochemistry .  Circ  Res  92  (8)  827-
839. Worthly  ,  S.G.  ;  J.I.  Osende  ;  G.  Helft;
J.J. Badimon; V.Fuster. 2001. Coronary Artery disease ; Pathogenesis    and  Acute  Coronary Syndrome . The Mount.
Yoshio Yamaoka, Dong H. Kwon,  David Y.  Graham  2002, A  Mr  34,000 proinflammatory  outer  membrane protein (oipA) of Helicobacter pylori, Department  of  Medicine,  Veterans Affairs  Medical  Center  and  Baylor College of Medicine.