Jurnal Hasil Penelitian Bidang Ilmu Akuakultur ISSN 2503-4766 (Print) ISSN 2597-8837 (Online) DOI 10.33087/akuakultur.v8i2.168

## Pengaruh Logam Berat Kadmium (Cd) Terhadap Ekspresi GEN cGnRH-II Pada Ikan Nilem ( Osteochilus hasselti C.V ) Jantan
Effect Of The Heavy Metal Cadmium (Cd) On cGnRH-II Gene Expression In Male Nilem (Osteochilus hasselti C.V)
1 Norman Ari Prayogo, 1 Asrul Siregar, 1 Heri Wijaya, 2 Purnama Sukardi, dan *2 Ren Fitriadi 1 Program Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Jenderal Soedirman.
2 Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Jenderal Soedirman, Jl. Dr Soeparno, Purwokerto Utara, Banyumas 53122, Jawa Tengah, Indonesia
*1 e-mail korespondensi : renfitriadi@yahoo.com
Abstract. The heavy metal cadmium in waters generally has toxic properties and is harmful to living organisms, although some of them are needed in small amounts. Cd is a very dangerous heavy metal because it cannot be destroyed (non-degradable) by living organisms and can accumulate into the organism's body through the food chain. The purpose of this study was to determine the effect of Cd on the reproduction of male nilem fish (Osteochilus hasselti C.V). The procedure was for the test animals to be kept in four fiber tubs containing Cd levels (0 mg/L [control]; 2 mg/L [low]; 4 mg/L [medium]; 6 mg/L [high]) for 4 weeks. The impact of Cd on nilem reproduction was evaluated by the level of expression of the cGnRH-II gene. The results showed that the effect of cadmium treatment for 4 weeks on the expression value of the cGnRH-II gene had an average range between 0.0036 - 0.3470. The effect  of  treatment  during  weeks  2  and  4  did  not  have  a  significant  effect  (P>0.05)  in  reducing  the  value  of  cGnRH-II  gene expression in male nilem, along with increasing cadmium concentration and length of exposure time.
Keywords : Cadmium, cGnRH-II Gene Expression, Male Nilem Fish
Abstrak. Logam  berat  kadmium  di  perairan  pada  umumnya  mempunyai  sifat  toksik  dan  berbahaya  bagi  organisme  hidup, walaupun beberapa diantaranya diperlukan dalam jumlah kecil. Cd merupakan logam berat yang sangat berbahaya karena tidak dapat dihancurkan (non-degradable) oleh organisme hidup dan dapat terakumulasi ke tubuh organisme melalui rantai makanan. Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  mengetahui  pengaruh  Cd  pada  reproduksi  ikan  nilem  (Osteochilus  hasselti  C.V)  jantan. Prosedurnya hewan uji disimpan di empat bak fiber yang mengandung Cd dengan kadar (0 mg/L [kontrol]; 2 mg/L [rendah]; 4 mg/L [sedang]; 6 mg/L [tinggi]) selama 4 minggu. Dampak dari Cd terhadap reproduksi ikan nilem dievaluasi dengan tingkat ekspresi  gen  cGnRH-II.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pengaruh  perlakuan  kadmium  selama  4  minggu  terhadap  nilai ekspresi gen cGnRH-II memiliki kisaran rata-rata antara 0,0036 - 0,3470. Pengaruh perlakuan selama minggu ke-2 dan ke-4 tidak memberikan pengaruh yang signifikan (P>0,05) dalam menurunkan nilai ekspresi gen cGnRH-II pada ikan nilem jantan, seiring dengan meningkatnya konsentrasi kadmium serta lamanya waktu pemaparan.
Kata kunci : Kadmium, Ekspresi Gen cGnRH-II, Ikan Nilem Jantan.

## PENDAHULUAN
Logam  berat  di  perairan  pada  umumnya  mempunyai  sifat  toksik  dan  berbahaya  bagi  organisme  hidup, walaupun  beberapa  diantaranya  diperlukan  dalam  jumlah  kecil  (Supriatno  dan  Lelifajri,  2009).  Peningkatan  kadar logam  berat  dalam  perairan  akan  mengakibatkan  logam  berat  yang  semula  dibutuhkan  untuk  berbagai  proses metabolisme akan berubah menjadi racun bagi organisme. Logam berat juga akan terakumulasi dalam sedimen dan biota melalui proses gravitasi, biokonsentrasi, bioakumulasi dan biomagnifikasi oleh biota air (Priyanto et al., 2008). Pencemaran logam berat di perairan perlu diperhatikan agar lingkungan dan biota didalamnya tetap terjaga. Beberapa sungai  di  Banyumas  rawan  terjadi  pencemaran  karena  adanya  pembuangan  limbah  industri  serta  banyaknya penggunaan pestisida pada pertanian (Rahmawati, 2018). Laporan pengujian kualitas air dan sumber air Kabupaten Banyumas  tahun  2010,  kegiatan  industri,  pertanian,  dan  penambangan  liar  merupakan  sumber  utama  pencemaran logam berat di sepanjang Sungai Serayu (Suwarsito dan Sarjanti, 2014).
Pencemar logam berat yang ada di perairan salah satunya adalah Kadmium (Cd). Cd merupakan logam berat yang sangat berbahaya karena tidak dapat dihancurkan (non-degradable) oleh organisme hidup dan dapat terakumulasi ke  lingkungan,  terutama  mengendap  di  dasar  perairan  membentuk  senyawa  kompleks  bersama  bahan  organik  dan anorganik  secara  adsorbsi  dan  kombinasi  (Rumahlatu,  2012).  Penyebarannya  luas  serta  memiliki  waktu  paruh (biological life) yang panjang dalam tubuh organisme hidup yaitu sekitar 10-30 tahun karena tidak dapat didegradasi (Rumahlatu, 2012). Logam berat Cd masuk ke perairan dapat mengakibatkan terganggunya kehidupan biota seperti ikan (Priyanto et al., 2008). Logam berat yang ada di air akan mengendap di dasar dengan lumpur seiring berjalannya proses sedimentasi (Siregar et al., 2019). Menurut Hedianto dan Setyadewi (2003), secara umum penyerapan logam
Norman Ari Prayogo,  Asrul Siregar, Heri Wijaya, Purnama Sukardi dan Ren Fitriadi. Pengaruh Logam Berat Kadmium (Cd) Terhadap Ekspresi GEN cGnRH-II Pada Ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V) Jantan
berat  seperti  Cd  oleh  ikan  adalah  melalui  air,  pakan,  dan  sedimen.  Dampak  dari  Cd  diantaranya  pengaruh  lethal disebabkan gangguan pada saraf pusat sehingga menyebabkan kematian. Pengaruh sublethal terjadi pada organ-organ tubuh,  menyebabkan  kerusakan  pada  hati,  penurunan  jumlah  darah,  mengurangi  potensi  untuk  reproduksi, pertumbuhan dan sebagainya (Prayogo et al., 2016).
Kadmium yang ada diperairan masuk melalui insang kemudian terbawa ke dalam sistem pernafasan sampai akhirnya akan menembus sel epitel endothelial kapiler darah untuk masuk ke dalam darah lalu ke otak ikan. Cd yang masuk ke otak dapat mengganggu kinerja dari GnRH (gonadotropin-releasing hormone). Jenis GnRH pada ikan nilem yaitu  cGnRH-II  berperan  dalam  pematangan  gonad  dan  neuromodulator  (neuron  penghantar  sinyal),  sedangkan sGnRH hanya sebagai neuromodulator (Andersen dan Klungland. 1993). Kedua hormon tersebut berperan penting dalam proses reproduksi ikan (Kang et al., 2011). Logam berat dapat menghambat proses transkripsi saat ekspresi gen cGnRH-II dan dapat meniru efek hormon androgen pada ikan. Selain itu dapat menurunkan LH (luteinizing hormone) sehingga menurunkan kadar testosterone (Prayogo et al., 2016). Proses reproduksi pada ikan akan terganggu akibat masuknya logam berat seperti pematangan seksual dan spermatogenesis (Dietrich et al., 2011).
Ikan nilem (Osteochilus hasselti) adalah salah satu ikan spesies asli yang masih banyak ditemukan di perairan umum seperti Kabupaten Banyumas. Ikan ini juga digunakan sebagai ikan konsumsi, sehingga banyak petani ikan yang membudidayakan ikan nilem (Prayogo et al., 2016). Akan tetapi, berdasarkan penelitian Susanto dan Fadlilah (2017) rasio kelamin ikan nilem jantan dan betina tidak seimbang, jumlah ikan nilem jantan diperairan Banyumas lebih sedikit  dibandingkan  dengan  ikan  betina.  Hal  tersebut  perlu  diperhatikan  agar  populasi  ikan  nilem  tetap  terjaga. Menurut penelitian sharifuddin (2010), menyatakan bahwa saat penelitian ditemukan jumlah ikan betina lebih banyak dari jantan. Hal ini diduga karena sifat ikan betina yang cenderung bergerombol pada saat musim pemijahan. Penelitian tentang pengaruh logam berat Cd terhadap ekspresi gen cGnRH- II pada ikan nilem jantan masih sangat terbatas. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui efek logam berat Cd terhadap ekspresi gen cGnRH- II pada ikan nilem jantan. Informasi ini sekiranya dapat digunakan di dalam usaha mengkonservasi ikan nilem sebagai ikan.

## METODOLOGI PENELITIAN

## Rancangan Percobaan
Pada penelitian ini digunakan metode eksperimental dengan menggunakan desain penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan yaitu PK (0 ppm), P1 (2 ppm), P2 (4 ppm), dan P3 (6 ppm). Konsentrasi tersebut ditentukan dari sekitar 0%; 30%; 60%; dan 90% dari nilai LC 50 pada penelitian Shah dan Altindag (2005) dengan nilai LC 50 sebesar 6,5 ppm untuk melihat efek sublethal dari logam berat kadmium. Masing-masing perlakuan terdiri dari 60 ekor ikan nilem. Perlakuan dilakukan selama 4 minggu dengan pengambilan sampel setiap 2 minggu sekali, dan diambil sebanyak 3 ikan dari masing-masing perlakuan. Variabel yang diamati adalah aktivitas hipofisis pada ikan nilem  jantan. Aktivitas  hipofisis  diukur  dengan  mengukur  ekspresi  gen  cGnRH-II  pada  ikan  uji  dengan  berbagai perlakuan pemberian kadmium selama 4 minggu.

## Parameter Penelitian
Parameter utama penelitian ini adalah ekspresi gen cGnRH-II pada ikan nilem jantan. Parameter pendukung adalah kualitas air pada setiap perlakuan dilakukan setiap pengambilan sampel. Parameter kualitas air yang diukur adalah suhu, pH, dan kandungan oksigen terlarut.

## Prosedur Penelitian Persiapan Penelitian
Bak percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah 4 buah bak fiber bundar dengan 1 buah bak untuk kontrol (tanpa perlakuan logam berat) dan 3 buah bak untuk perlakuan kadmium. Masing-masing bak diisi dengan 300 L air dan dilengkapi dengan sistem resirkulasi tertutup untuk menjamin ketersediaan oksigen di dalam air. Ikan yang digunakan sebagai hewan uji adalah ikan nilem berumur 4 bulan yang berukuran 4-5 cm dan berasal dari 1 induk. Pertama, disiapkan ikan nilem sebanyak 240 ekor. Kemudian ikan diaklimasi dalam bak fiber selama 1 hari. Lalu ikan dipindahkan ke bak fiber yang sudah disiapkan masing-masing sebanyak 60 ekor ikan.

## Pemberian Perlakuan
Selama  masa  percobaan  pemaparan  kadmium,  media  bak  fiber  yang  digunakan  untuk  penelitian  diberikan kadmium dengan dosis yang berbeda. Percobaan dilakukan pada 4 buah bak fiber, yaitu bak pertama sebagai kontrol tidak diberikan perlakuan kadmium, bak kedua diberikan perlakuan kadmium sebanyak 2 ppm, bak ketiga diberikan perlakuan kadmium sebanyak 4 ppm, dan bak keempat diberikan perlakuan kadmium sebanyak 6 ppm. Rumus pengenceran kadmium menurut Suparjo (2010) yaitu:
Norman Ari Prayogo,  Asrul Siregar, Heri Wijaya, Purnama Sukardi dan Ren Fitriadi. Pengaruh Logam Berat Kadmium (Cd) Terhadap Ekspresi GEN cGnRH-II Pada Ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V) Jantan
N 1 . V 1 = N 2 . N 2 Keterangan : N 1 = konsentrasi kadmium dalam larutan stok N 2 = konsentrasi kadmium yang diinginkan dalam media air V 1 = volume larutan stok yang akan diambil
V 2 = volume media air perlakuan yang diinginkan
Pemberian pakan sebanyak 1 kali sehari yaitu sore hari.

## Pengambilan Sampel
Perlakuan diberikan selama 4 minggu dengan pengambilan sampel setiap 2 minggu. Pada setiap pengambilan data,  diambil  3  ekor  ikan  jantan  pada  masing-masing  perlakuan.  Pengambilan  hipotalamus  ikan  nilem  jantan  dari masing-masing perlakuan dilakukan setiap 2 minggu sekali selama 4 minggu. Pengambilan hipotalamus dilakukan dengan cara membedah kepala ikan. Setelah didapatkan sampel hipotalamus harus segera disimpan dalam tube 1,5 mL dan dimasukkan ke dalam ice box . Kemudian sampel hipotalamus disimpan di dalam pendingin dengan suhu -80°C sampai dilakukan pengukuran aktivitas penghasil gen cGnRH-II.

## Isolasi RNA
Isolasi RNA menggunakan produk dari Geneaid yaitu Total RNA Mini-Kit . Isolasi RNA dilakukan dengan cara mengambil  seluruh  hipotalamus  ikan,  kemudian  sampel  ditambah  400  µL  RB Buffer dan  diberi  4  µL β- Mercaptoethanol di dalam 1,5 mL lalu otak dihancurkan dengan Micropestle . Setelah itu dihomogenkan menggunakan vortex , diamkan selama 3 menit di dalam suhu ruang. Suspensi dipindahkan ke Filter Column dan 600 µL Collection Tube yang disatukan. Lalu c entrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Setelah sampel larutan tersaring, larutan yang berada di Collection Tube diberi 400 µL alkohol 70%, lalu dihomogenkan dengan vortex (Geneaid, 2017). Sampel dipindahkan ke RB Column menyatu dengan 2 ml Collection Tube , centrifuge selama 2 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Larutan yang berada di Collection Tube dibuang, lalu pasang kembali dengan RB Column, ditambahkan 400 µL W1 Buffer ke RB Column, lalu centrifuge kembali selama 1 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Larutan  yang  berada  di Collection  Tube dibuang,  pasang  kembali  dengan  RB  Column. Wash  Buffer 600  µL ditambahkan, lalu centrifuge kembali selama 1 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Larutan yang berada di Collection Tube dibuang, pasang kembali dengan RB Column. Ditambahkan 600 µL Wash Buffer , lalu centrifuge kembali selama 1 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Larutan yang berada di Collection Tube dibuang, pasang kembali dengan RB Column. Kemudian centrifuge kering selama 3 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. RB Column dipasangkan dengan 1,5  ml,  lalu tambahkan  50  µL RNase-Free Water ditengah matrix  column ,  didiamkan  selama  2  menit  memastikan RNase-Free Water diserap oleh matrix, lalu centrifuge selama 2 menit dengan kecepatan 13.000 rpm untuk mengelusi RNA murni (Geneaid, 2017).

## RNA di DNAse Treatment
Tabel 1. Komponen DNAse Treatment
Komponen Jumlah RNA 1 µL 10X reaction buffer with MgCl 2 1 µL DNase I, Rnase- free (#EN0521) 1 µL DEPC- treated Water (#R0601) to 10 µL
DNAse Treatment menggunakan produk dari Thermo Scientific yaitu DNA free™ Thermo Scientific-Kit . DNAse Treatment dilakukan dengan menambahkan semua komponen DNAse ke tabung. Diinkubasi pada suhu 37°C selama 30  menit,  pemanasan  suhu  37°C  dilakukan  dengan  menggunakan  kompor  yang  diukur  dengan  termometer.  Lalu, ditambahkan 1 mL 50 mM EDTA dan diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit. RNA siap dipakai sebagai template untuk reverse transcriptase , kemudian sampel di RT-PCR (Thermo Scientific, 2016).

## Pengukuran Konsentrasi RNA
Pengukuran konsentrasi RNA menggunakan Nano Spectrophotometer merek IMPLEN. Pertama alat tersebut dinyalakan tekan tombol on/off, kemudian dilakukan pemilihan pengaturan untuk mengukur konsentrasi RNA. Dipilih dengan menekan tombol ok, dengan ketentuan Lid Factor 10 lalu unit dalam satuan mg/mL. Setelah selesai dengan pengaturan alat, lalu dimulai pengukuran yang sebelumnya diteteskan blanko (akuabides) menggunakan mikropipet sebanyak 4 µL pada kuvet, tombol sample (berwarna hijau) ditekan. Kemudian pada layar setelah menunjukkan semua nilai 0, kuvet dibersihkan dengan tisu. Siapkan sampel diambil dengan mikropipet sebanyak 4 µL, lalu diteteskan ke kuvet,  ditekan  tombol  sample  (berwarna  hijau).  Setelah  dilayar  muncul  nilai  konsentrasi,  dicatat  kemudian  kuvet
Norman Ari Prayogo,  Asrul Siregar, Heri Wijaya, Purnama Sukardi dan Ren Fitriadi. Pengaruh Logam Berat Kadmium (Cd) Terhadap Ekspresi GEN cGnRH-II Pada Ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V) Jantan
kembali dibersihkan dengan tisu beserta penutup kuvet. Dilanjutkan sampel berikutnya. Setelah semua sampel diukur, dipilih tombol escape sampai kembali pada menu awal. Tombol on/off ditekan kembali (IMPLEN, 2011).

## Pengambilan dan Pengukuran Parameter Penelitian
Pengukuran Ekspresi Gen cGnRH-II menggunakan KAPA ™ SYBR® FAST One-Step qRT-PCR Kit. Sampel RNA  dari  masing-masing  perlakuan  kadmium  yang  berbeda  selama  4  minggu  kemudian  dievaluasi  ekspresi  gen penyandi cGnRH-II dengan menggunakan KAPA™ SYBR® FAST One-Step qRT-PCR Kit ( Tabel 2 ).

## Pembuatan Master Mix qPCR
Tabel 2. Komponen Master Mix qPCR Komponen Konsentrasi Akhir 20 µL r x n Nuklease bebas air hingga 20 µL Sebagaimana diisyaratkan KAPA TM SYBR® FAST One-Step qRT-PCR (2X) 1x 10 µL Forward Primer (10 M) 200 nM 0,4 µL Reverse Primer (10 M) 200 nM 0,4 µL dUTP (10 mM) 200 nM 0,4 µL ROX Low Lihat prosedur 0,4 µL KAPA RT Mix (50x) 1x 0,4 µL RNA Template 1 µg 5 µL

## Pengaturan One Step qPCR
Pengaturan One Step qPCR dimulai dari mensintesis cDNA pada suhu 42 o C selama 5 menit, lalu menonaktifkan RT pada suhu 95 o C selama 2-5 menit. Selanjutnya proses denaturasi pada suhu 95 o C selama 3 detik dan aneling pada suhu 60 o C selama ≥ 20 detik sebanyak 40 siklus. Langkah terakhir adalah proses ekstensi selama 5 menit. Primer yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan primer real time yang spesifik mengamplifikasi gen GnRH pada ikan nilem. Primer yang digunakan untuk menguji ekspresi GnRH adalah F2 dan R2. Sedangkan untuk house keeping gene menggunakan primer Beta actin yaitu FA dan RA (KAPABIOSYSTEM, 2017).
Tabel 3. Desain Primer yang digunakan dalam Real Time PCR (Prayogo et al., 2016)
No Nama/Kode Primer Sekuens Komplemen DNA (primer) Tm Produk PCR 1. Forward Real Time cGnRH-II (F2) CATCTGCAGGCTGTTTGTGG 62,81 75 bp 2. Reverse Real Time cGnRH-II (R2) TGCTGAGAGCTGGCAAACTG 62,83 3. Forward β-actin (FA) GAGCTATGAGCTCCCTGACGG 58,3 53 bp 4. Forward β-actin (RA) AAACGCTCATTGCCAATGGT 55,6
Keterangan: A=Adenine; T=Thymine; C=Cytosine; G=Guanine.
Hasil amplifikasi menggunakan Real Time PCR kemudian digunakan untuk membandingkan jumlah molekul DNA  hasil  amplifikasi  gen  penyandi  cGnRH-II  dengan  hasil  amplifikasi  gen  β-actin.  Nilai  perbandingan  yang didapatkan kemudian akan dibandingkan kembali dengan kelompok ikan perlakuan berbagai konsentrasi kadmium menurut Forlenza et al . (2012) dengan rumus: ΔΔCT = (Ct cGnRH-II –Ct actin ) sampel – (Ct cGnRH-II –Ct actin ) Kalibrator , R cGnRH-II = 2 - Δ Δ CT
Keterangan: ΔΔCt
= Siklus Threshold Ct cGnRH sampel = nilai Ct cGnRH-II sampel ke-i Ct β-actin sampel
= nilai Ct β-actin sampel ke-i Ct cGnRH-II kalibrator = nilai Ct cGnRH-II sampel dengan β-actin tertinggi Ct β-actin kalibrator = nilai Ct β-actin terendah hasil amplifikasi R cGnRH-II = Tingkat ekspresi gen cGnRH-II

## Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan November 2019-Januari 2020 di Laboratorium Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, dan Laboratorium Genetika dan Molekuler, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman.

## Analisis Data
Adapun  data  kuantitatif  berupa  ekspresi  gen  penghasil  cGnRH-II  pada  masing-masing  perlakuan.  Pengaruh kadmium terhadap ekspresi gen cGnRH-II pada ikan nilem ( Osteochilus hasselti C.V) jantan dilakukan dengan analisis deskriptif komparatif. One Way ANOVA untuk mengetahui konsentrasi kadmium yang dapat mengganggu ekspresi gen
Norman Ari Prayogo,  Asrul Siregar, Heri Wijaya, Purnama Sukardi dan Ren Fitriadi. Pengaruh Logam Berat Kadmium (Cd) Terhadap Ekspresi GEN cGnRH-II Pada Ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V) Jantan
cGnRH-II pada ikan nilem ( Osteochilus hasselti C.V) jantan, apabila berbeda nyata maka akan dilanjutkan dengan uji BNT apabila berbeda nyata.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekspresi gen merupakan proses transkripsi materi genetika (DNA) di dalam sel menjadi RNA dan selanjutnya ditranslasi menjadi polipeptida  yang spesifik (Madigan et al., 2009). Menurut Dorland (2002), menyatakan bahwa ekspresi  gen  adalah  proses  aliran  informasi  genetik  dalam  penentuan  sifat  suatu  individu  melalui  mekanisme transkripsi dan translasi. Transkripsi yaitu proses penyalinan kode genetik yang ada pada DNA menjadi molekul RNA, sedangkan translasi yaitu proses penerjemahan urutan nukleotida yang ada pada molekul mRNA menjadi rangkaian asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein (Ilmanafia, 2018). Salah satu gen yang terekspresi dalam tubuh ikan yaitu GnRH. GnRH pada ikan umumnya dibagi menjadi 2 macam yaitu cGnRH II ( chicken gonadotropin- releasing hormone II), sGnRH ( salmon gonadotropin-releasing hormone ) (Yorio et al. , 2019). Pada ikan air tawar ditemukan 2 macam  GnRH  yaitu cGnRH-II dan sGnRH, keduanya berperan dalam  menstimulasi pelepasan LH di kelenjar hipofisis. Hasil pengamatan menyatakan bahwa peran cGnRH-II lebih besar dibandingkan dengan sGnRH dalam proses reproduksi. Gen cGnRH-II terekspresi sejak 4 hari setelah penetasan, sedangkan sGnRH terekspresi sejak 7 hari setelah penetasan (Fornies, et al., 2003).
Ekspresi gen dapat dianalisis dengan menggunakan Real Time PCR atau qPCR. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk memperbanyak DNA suatu organisme (Pertiwi, et al. 2015). Pengukuran nilai ekspresi gen cGnRH-II pada ikan nilem jantan yang terpapar logam berat kadmium dapat dilihat dari nilai R cGnRH-II yang diperoleh dari hasil perhitungan rumus delta CT (Prado, et al., 2013). Menurut Rahardianti dan Nur (2017), menyatakan bahwa gen kontrol yang digunakan dalam qPCR adalah gen housekeeping yang terekspresi secara konstitutif, seperti β-aktin. Perlakuan pemaparan kadmium dilakukan selama 4 minggu dan terdiri dari empat perlakuan dengan  masing-masing perlakuan kontrol (PK)  mengandung 0 ppm, perlakuan 1 (P1) mengandung 2 ppm, perlakuan 2 (P2) mengandung 4 ppm, dan perlakuan 3 (P3) mengandung 6 ppm. Hasil pengukuran nilai ekspresi gen cGnRH-II pada ikan nilem jantan yang telah diberikan perlakuan logam berat kadmium dapat dilihat pada Tabel 4 .
Tabel 4. Nilai Ekspresi Gen cGnRH-II pada Ikan Nilem Jantan yang Terpapar Kadmium
Waktu Pemaparan Nilai Ekspresi Gen cGnRH-II PK (0 ppm) P1 (2 ppm) P2 (4 ppm) P3 (6 ppm) M0 0,2517 0,2517 0,2517 0,2517 M2 0,0515 0,1904 0,0057 0,3470 M4 0,0162 0,0036 0,0067 0,0163
Berdasarkan tabel diatas nilai ekspresi gen cGnRH-II selama 4 minggu pemaparan dengan logam berat kadmium memiliki kisaran rata-rata 0,0036-0,3470. Hasilnya dapat dilihat bahwa pada minggu ke-0 nilai ekspresi gen cGnRH- II rata-rata sebesar 0,2517. Pada minggu ke-2 nilai ekspresi gen cGnRH-II rata-rata berkisar antara 0,0057-0,3470. Pada minggu ke-4 nilai ekspresi gen rata-rata berkisar antara 0,0036-0,0163. Pada setiap perlakuan, nilai gen cGnRH- II terekspresi selama pemberian perlakuan sampai minggu ke-4. Hal tersebut menunjukkan bahwa gen cGnRH-II tetap diproduksi  setiap  minggu.  Menurut  Fornies et  al. (2003),  menyatakan  bahwa  gen  cGnRH-II  pada  ikan  mulai terekspresi sejak 4 hari setelah penetasan. Kemudian, Gen cGnRH-II tetap terekspresi pada hipofisis ikan yang belum matang gonad meskipun kadarnya sangat rendah.

## Ekspresi Gen cGnRH-II Ikan Nilem Jantan yang Terpapar Cd
Fluktuasi nilai ekspresi gen cGnRH-II dari ikan nilem pada setiap perlakuan, mulai dari minggu ke-0, minggu ke-2, dan minggu ke-4 dapat dilihat pada G ambar 5 .
Norman Ari Prayogo,  Asrul Siregar, Heri Wijaya, Purnama Sukardi dan Ren Fitriadi. Pengaruh Logam Berat Kadmium (Cd) Terhadap Ekspresi GEN cGnRH-II Pada Ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V) Jantan
Gambar  1. Tingkat  mRNA  cGnRH-II  (±SD)  Ikan  Nilem  yang  Dipelihara  pada  Media  Mengandung  Logam  Berat Kadmium Selama 4 Minggu
Berdasarkan G ambar 1 , menunjukkan adanya fluktuasi nilai ekspresi gen cGnRH-II ikan nilem, pada setiap perlakuan  mulai  dari  minggu  ke-0  sampai  minggu  ke-4.  Perbedaan  nilai  ekspresi  gen  cGnRH-II  pada  ikan  nilem didasarkan  pada  besarnya  konsentrasi  logam  berat  kadmium  yang  digunakan  dan  jangka  waktu  pemaparan.  Pada minggu  ke-0  menunjukkan  bahwa  nilai  ekspresi  gen  cGnRH-II  ikan  nilem  jantan  memiliki  nilai  yang  sama  yaitu 0,2517. Hal ini disebabkan karena pada minggu ke-0, belum diberikan perlakuan logam berat kadmium. Sehingga nilai ekspresi gen cGnRH-II pada ikan nilem jantan sama pada setiap perlakuan dan tidak terjadi fluktuasi. Pada minggu ke-0 ikan masih dapat tumbuh dengan baik karena tidak ada bahan toksik yang menghambat metabolisme tubuhnya (Rahayu et al ., 2017).
Pada  minggu  ke-2,  nilai  ekspresi  gen  cGnRH-II  pada  perlakuan  kontrol  (PK)  hingga  perlakuan  3  (P3) menunjukkan  tidak  berbeda  nyata  (P>0,05).  Berdasarkan  hasil  tersebut,  dapat  diketahui  bahwa  pada  minggu  ke-2 pemberian  perlakuan  logam  berat  kadmium  belum  memberikan  pengaruh  yang  signifikan  terhadap  fluktuasi penurunan ekspresi gen cGnRH-II. Faktor yang mempengaruhi kadmium terhadap ekspresi gen yaitu umur hewan uji, konsentrasi  yang  rendah,  dan  waktu  pemaparan  yang  singkat.  Selain  itu,  dimungkinkan  karena  ikan  nilem  telah beradaptasi dengan logam berat kadmium yang diberikan selama waktu pemaparan (Prayogo et al ., 2016). Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Foran et al. (2002) yaitu menggunakan ikan medaka ( Oryzias latipes ) sebagai hewan uji. Konsentrasi kadmium yang digunakan sebesar 0-10 ppb dengan waktu pemaparan selama 2 minggu. Tujuannya yaitu untuk mengetahui pengaruh pemaparan kadmium terhadap fungsi endokrin dan reproduksi. Pemaparan selama 2  minggu  dengan  konsentrasi  kadmium  0-10  ppb  hasilnya  tidak  berbeda  nyata.  Hal  tersebut  menandakan  bahwa konsentrasi  kadmium  sebesar  0-10  ppb  dengan  pemaparan  selama  2  minggu  tidak  berpengaruh  terhadap  fungsi endokrin dan reproduksi pada ikan.
Jenis dan umur hewan uji juga sangat menentukan pengaruh ekspresi gen cGnRH-II pada ikan. Pada penelitian Foran et al. (2002), dijelaskan bahwa ikan yang digunakan sebagai hewan uji yaitu ikan medaka dewasa. Sehingga tingkat perubahan hormon  yang berperan dalam sistem endokrin dan reproduksi tidak terganggu akibat pemaparan kadmium karena lebih toleran. Selain itu tingginya hormon steroid pada ikan menyebabkan metabolisme ikan tetap berjalan. Hal tersebut menyebabkan ekspresi gen cGnRH-II yang berfungsi dalam sistem reproduksi tidak terpengaruh oleh  pemaparan  kadmium.  Menurut  Pait  dan  Nelson  (2002),  menyatakan  bahwa  waktu  pemaparan  logam  berat kadmium  selama  2  minggu  dengan  konsentrasi  kadmium  yang  sangat  rendah  belum  memberikan  pengaruh  yang signifikan.
Pada  minggu  ke-4,  nilai  ekspresi  gen  cGnRH-II  pada  perlakuan  kontrol  (PK)  hingga  perlakuan  3  (P3) menunjukkan  tidak  berbeda  nyata  (P>0,05).  Berdasarkan  hasil  tersebut,  dapat  diketahui  bahwa  pada  minggu  ke-4 pemberian perlakuan logam berat kadmium belum memberikan pengaruh yang signifikan terhadap tingkat ekspresi gen  cGnRH-II.  Hal  ini  memungkinkan  bahwa  ikan telah  beradaptasi  dengan lingkungan  yang  mengandung  logam berat. Akumulasi kadmium dalam tubuh ikan dipengaruhi oleh jenis hewan uji, jenis logam berat, konsentrasi, dan waktu pemaparan dari logam berat tersebut (Vinodhini dan Narayan, 2009). Penelitian yang dilakukan oleh Kozak et al. (2018) dengan menggunakan salah satu jenis ikan mas. Konsentrasi kadmium yang digunakan yaitu sebesar 0,4 ppm dan 4 ppm dengan pemaparan selama 1-5 bulan. Tujuannya adalah untuk mengetahui efek kadmium terhadap reproduksi dan pematangan gonad pada ikan mas. Pada bulan pertama dengan pemaparan kadmium sebesar 0,4 ppm
a a a a a a a a a a a a 0,00000 0,10000 0,20000 0,30000 0,40000 0,50000 0,60000 0,70000 0,80000 0,90000 1,00000 M0 M2 M4 Ti ngk at m RNA c G nRH -II Waktu Pemaparan PK (0 ppm) P1 (2 ppm) P2 (4 ppm) P3 (6 ppm)
Norman Ari Prayogo,  Asrul Siregar, Heri Wijaya, Purnama Sukardi dan Ren Fitriadi. Pengaruh Logam Berat Kadmium (Cd) Terhadap Ekspresi GEN cGnRH-II Pada Ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V) Jantan
hasilnya yaitu tidak berbeda nyata (P>0,05). Hal tersebut menandakan bahwa kadmium tidak mempengaruhi ekspresi gen GnRH karena sistem reproduksi dan pematangan gonad pada ikan tidak terpengaruh. Pada penelitian ini akumulasi kadmium dalam otak hanya sedikit, karena konsentrasi kadmium yang digunakan rendah.
Tingkat konsentrasi, waktu pemaparan, dan jenis logam berat sangat menentukan pengaruh terhadap ekspresi gen cGnRH-II pada ikan. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Prayogo et al. (2016), menggunakan ikan nilem sebagai hewan uji. Logam berat yang digunakan yaitu HgCl dengan konsentrasi 0 ppm; 0,025 ppm; 0,05 ppm; dan 0,1 ppm dan waktu pemaparan selama 8 minggu. Berdasarkan penelitian tersebut hasilnya yaitu berbeda nyata (P<0,05), karena  pada  minggu  ke  2,  4,  6,  dan  8 terjadi  penurunan  ekspresi gen  cGnRH-II.  Pada  penelitian ini  menunjukkan bahwa jenis logam berat HgCL dengan berbagai konsentrasi dan waktu pemaparan berpengaruh pada ekspresi gen ikan nilem. Menurut Murtini et al . (2008), menyatakan bahwa urutan toksisitas logam berat dari yang tertinggi ke yang paling rendah terhadap ikan pada lingkungan yang tercemar yaitu Hg 2+ > Cd 2+ > Ag 2+ > Ni 2+ > Pb 2+ > As 2+ > Zn 2+ . Dapat disimpulkan bahwa logam berat Hg lebih toksik dibandingkan dengan Cd.
Keberadaan logam berat kadmium di sekitar perairan Banyumas seperti di Sungai Serayu memiliki kisaran kadar logam berat kadmium sebesar 0,045-0,079 ppm (Suwarsito dan Sarjanti, 2014). Kadar logam berat kadmium di sungai tersebut sudah melewati batas baku mutu air yang sudah ditentukan menurut PP No. 82 tahun 2001 yaitu sebesar 0,01 ppm. Air yang digunakan oleh masyarakat untuk budidaya ikan di Banyumas bersumber dari sungai-sungai yang ada di sekitarnya. Berdasarkan hal tersebut, air yang digunakan untuk budidaya ikan sudah tercemar logam berat kadmium. Hal tersebut dapat menyebabkan ikan yang ada di Banyumas sudah beradaptasi dengan lingkungannya sehingga ikan tidak  terpengaruh  terhadap  perlakuan  logam  berat  kadmium  yang  diberikan  pada  saat  penelitian  (Suwarsito  dan Sarjanti, 2014).

## KESIMPULAN
Logam  berat  kadmium  tidak  memberikan  pengaruh  terhadap  ekspresi  gen  cGnRH-II  pada  ikan  nilem (Osteochilus hasselti C.V) jantan. Berbagai konsentrasi logam berat kadmium tidak mengganggu terhadap ekspresi gen cGnRH-II pada ikan nilem (Osteochilus hasselti C.V) jantan.

## DAFTAR PUSTAKA
Andersen, O., and Klungland, H. 1993. The Salmon GnRH Encoding Gene in Teleost Fish. International Riview of Cytology, 147: 165-191.
Dietrich, M.A., Grzegorz, D.J., Hilwa, P., Ciereszko, A. 2011. Carp Transferrin Can Protect Spermatozoa Against Toxic Effects of Cadmium Ions. Comparative Biochemistry and Physiology, 153(4): 422-429.
Dorland. 2002. Kamus Kedokteran. EGC. Jakarta.
Foran,  C.M.,  Peterson,  B.N.,  Benson, W.H.  2002.  Influence  of  parental  and  developmental  cadmium  exposure  on endocrine and reproductive function in Japanese medaka (Oryzias latipes). Comparative Biochemistry and Physicology, 133(3): 345-354.
Forlenza, M., Kasier, T., Savelkuol, H.F.J., Wiegertjes, G.F. 2012. The Use of Real-Time Quantitative PCR for the Analysis of Cytokine mRNA Levels. Cytokine Protocol, 7-23.
Fornies, M.A, Carrillo, M., Mananos, E., Sorbera, L.A., Zohar, Y., Zanuy, S. 2003. Relative potency of the forms of GnRH and their analogs on LH release in sea bass. Journal of Fish Biology, 63 (1): 73-89.
Geneaid. 2017. Total RNA Mini Kit Protocol. Geneaid Biotech Ltd. New Taipei, Taiwan.
Hedianto, S., dan Setyadewi, N.M. 2003. Analisis Kandungan Logam Berat Dari Beberapa Jenis Ikan Hasil Budidaya Karamba Sebagai Sumber Olahan Pangan. Majalah Blam, 10(1): 8-15.
Ilmanafia. 2018. Transkripsi dan Translasi. https://www.slideshare.net/ ilmanafia13/ transkripsi-translasi. Diakses pada tanggal  20 Agustus  2020.  IMPLEN.  2011.  NanoPhotometer®  P-Class  User  Manual  P  300/P  330/P  360 Version 2.1. Implen Inc, Los Angeles Country, USA. 1-70p.
Kang, K.S., Shimizu, K., Azuma, M., Ui, Y., Nakamura, K. 2011. Gonadotropin- Releasing Hormone II (GnRH II) Mediates  the Anorexigenic Actions  Of  αMelanocyte-Stimulating  Hormone  (αMSH) And  Corticotrophin- Releasing Hormone (CRH) In Goldfish. Peptides, 32(1): 31-35. KAPABIOSYSTEM. 2017. KAPA SYBR® FAST  One-Step  qRT-PCR  Master  Mix  (2X)  Kit  protocol.  Manufacturing,  R&amp;D  Cape  Town,  South Africa.
Kozak, E.D., Socha, M. Gosiewski, G., Trojnar, E.L., Chyb, J., Popek, W. 2018. Protective effect of melatonin on cadmium-induced  changes  in  some  maturation  and  reproductive  parameters  of  female  Prussian  carp (Carassius gibelio B.). Environmental Science and Pollution Research, 25(10): 9915-9927.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. 2009. Biology of Microorganisms. 12th ed. Prentice Hall International. New York.
Murtini,  J.T.,  Kurniawan,  A.D.,  Dewi,  E.N.  2008.  Pengaruh  Waktu  Perendaman  dan  Konsentrasi  Karboksimetil Kitosan  untuk  Menurunkan  Kandungan  Logam  Berat  Hg,  Cd,  dan  Pb  pada  Kerang  Hijau  (Perna Viridis Linn.). Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, 3(1): 37-44.
Norman Ari Prayogo,  Asrul Siregar, Heri Wijaya, Purnama Sukardi dan Ren Fitriadi. Pengaruh Logam Berat Kadmium (Cd) Terhadap Ekspresi GEN cGnRH-II Pada Ikan Nilem (Osteochilus hasselti C.V) Jantan
Pait, A.S and J.O. Nelson. 2002. Endocrine Distruption in Fish an Assesment of Recent Research and Result. NOAA Tech Memo. Silver Spring MD. Center For Coastal Monitoring and Assessment 55pp.
Pertiwi, N.P.D., Mahardika, I.G.N.K., Watiniasih, N.L. 2015. Optimasi Amplifikasi DNA Menggunakan Metode PCR (Polymerase  Chain  Reaction)  pada  Ikan  Karang  Anggota  Famili  Pseudochromidae  (Dottyback)  untuk Identifikasi Spesies secara Molekular. Jurnal Biologi, 19(2): 53-57.
Prado, M., Boix, A., Holst, C.V. 2013. Development of A Real-Time PCR Method for The Simultaneous Detection of Mackerel and Horse Mackerel. Food Control, 34 : 19-23.
Prayogo, N.A., Hidayati, A., Siregar, A.S., Yunasfi. 2016. Uji Toksisitas Letal dan Subletal Logam Berat Merekuri (Hg) Terhadap Ikan Nilem (Osteochilus hasselti). OmniAkuatika, 12(1): 86-94.
Prayogo, N.A., Siregar, A.S., Sukardi, P. 2016. The Disruptive Effect Mercurychloride (HgCl) on Gene Expression of cGnRH-II, sGnRH, and Estradiol Level in Silver Sharkminnow (Osteochillus hasseltii C.V.). Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 16(4): 1003-1009.
Priyanto, N., Dwiyitno, Ariyani, F. 2008. Kandungan Logam Berat (Hg, Pb, Cd, Dan Cu) Pada Ikan, Air, dan Sedimen Di Waduk Cirata, Jawa Barat. Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, 3(1): 69-78. Rahardianti, R., dan Nur, E.M. 2017. Akurasi Metode Real PCR Untuk Analisis Ekspresi Gen PmVRP15. Prosiding Pertemuan Teknis Teknisi Litkayasa Lingkup BBPBAP Jepara. Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau Jepara. 166 hal.
Rahayu,  N.I.,  Rosmaidar,  Hanifah,  M.,  Karmil,  T.F.,  Helmi,  T.Z.,  Daud,  R.  2017.  Pengaruh  Paparan  Timbal  (Pb) terhadap Laju Pertumbuhan Ikan Nila (Oreochromis niloticus). JIMVET, 01(4): 658-665.
Rahmawati, R.F. 2018. Kajian Tingkat Pencemaran Air Sungai Logawa di Kabupaten Banyumas. Skripsi. Universitas Muhammadiyah Purwokerto. Purwokerto.
Rumahlatu, D. 2012. Biomonitoring: Sebagai Alat Asesemen Kualitas Perairan Akibat Logam Berat Kadmium Pada Invertebrata Perairan. Saintis, 1(1): 10-34.
Shah, L.S., and Altindag, A. 2005. Effect of Heavy Metal Accumulation on The 96-h LC 50 Values in Tench Tinca tinca L., 1758. Turk J Vet Anim Sci, 29: 139-144.
Sharifuddin,  B.A.O.  2010.  Aspek  Reproduksi  Ikan  Nilem,  Osteochilus  vittatus  (Valenciennes,  1842)  di  Danau Sidenreng, Sulawesi Utara. Jurnal Iktiologi Indonesia, 10(2): 111-122.