## SKRINING FITOKIMIA DAN KADAR FLAVONOID TOTAL EKSTRAK ASETON DAN ETIL ASETAT BIJI BUAH BISBUL

## ( Diospyros discolor ) TUMBUHAN ENDEMIK BOGOR
Dian Arrisujaya, Devy Susanty, Resha Ratna Kusumah Program Studi Kimia, Universitas Nusa Bangsa Email: arrisujaya@unb.ac.id

## ABSTRAK
Beberapa  bagian  dari Diospiros  discolor (tanaman  Bisbul)  telah  dilaporkan  memiliki berbagai  khasiat  terkait  dengan  kandungan  flavonoid  pada  masing-masing  bagian tanaman  tersebut.  Biji  buah  bisbul  belum  dilaporkan  dan  diduga  mempunyai  kandungan yang  sama  dengan  bagian  lain.  Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  kandungan metabolit sekunder dan kadar flavonoid total pada ekstrak biji bisbul. Pada penelitian ini, biji buah bisbul diekstrak menggunakan pelarut aseton dan etil asetat. Ekstraksi dilakukan dengan  metode  maserasi  selama  4×24  jam  dengan  penggantian  pelarut.  Rendemen ekstrak  aseton  dan  etil  asetat  biji  buah  bisbul  yaitu  30,12%  dan  28,14%.  Kandungan metabolit  sekunder  pada  masing-masing  ekstrak  diketahui  melalui  skrining  fitokimia. Hasil  Uji  fitokimia  menunjukkan  kedua  ekstrak  mengandung  alkaloid,  flavonoid, saponin,  Triterpenoid/Steroid,  dan  Tanin.  Analisis  kadar  flavonoid  total  pada  kedua ekstrak dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Kadar flavonoid total ekstrak etil asetat lebih tinggi dari ekstrak aseton yaitu masing-masing 423,60 ± 2,68  dan 377,03 ± 1,50 mg Ekuivalen Katekin/ g ekstrak.
Kata Kunci: Flavonoid, Fitokimia, Diospyros discolor , Aseton, Etil Asetat

## ABSTRACT
Some  parts  of  Diospiros  discolor  (Bisbul  plant)  have  been  reported  to  have  various properties related to the flavonoid content in each part of the plant. Bisbul seeds have not been reported and are thought to have the same content as other parts. This research was conducted  to  determine  the  content  of  secondary  metabolites  and  total  flavonoids  in extract of Bisbul seeds. In this study, Bisbul seeds were extracted using acetone and ethyl acetate. Extraction was carried out by maceration method for 4 × 24 hours with solvent replacement. The yield of acetone extract and ethyl acetate of Bisbul seeds were 30.12% and  28.14%.  The  content  of  secondary  metabolites  in  each  extract  was  known  through phytochemical  screening.  Phytochemical  Test  Results  show  that  both  extracts  contain alkaloids,  flavonoids,  saponins,  Triterpenoids  /  Steroids,  and  tannins.  Analysis  of  total flavonoid  was  performed  using  a  UV-VIS  spectrophotometer.  Total  flavonoids  of  ethyl acetate extract were higher than acetone extract, respectively 423.60 ± 2.68 and 377.03 ± 1.50 mg catechins equivalent/g extract.
Keywords: Flavonoids, Phytochemicals, Diospyros discolor, Acetone, Ethyl Acetate

## LATAR BELAKANG
Diospyros discolor berasal dari  Filipina dan buahnya dibudidayakan secara komersial (Hung, Chen, dan Roan 2015). Di Indonesia, Diospiros discolor dikenal dengan  nama  tanaman  bisbul  dan  dilaporkan  hanya  tumbuh  atau  endemik  di daerah Bogor. Khasiat dari tanaman ini sudah banyak dilaporkan diantaranya kulit pohon secara tradisional digunakan untuk pengobatan batuk, demam, disentri, dan diare.  Buahnya  digunakan  untuk  mengobati  luka  dan  sebagai  obat  kumur  pada kasus sariawan atau stomatitis aftosa (Lee et al. , 2012).
Buah  bisbul  mengandung  senyawa  flavonoid  sebagai  antioksidan,  namun manfaat ini kurang diketahui oleh sebagian masyarakat karena rasanya yang pahit dan  sepat.  Daun  buah  bisbul  memiliki  aktivitas  antioksidan  dengan  nilai  IC 50 sebesar 15,06 μg/mL (Howlader et al ., 2012) sedangkan Menurut Rahmawan dan Dwiyatmaka  (2013), fraksi etil  asetat sari buah  bisbul  memiliki daya antioksidan sangat  kuat  dengan  nilai  IC 50 sebesar  30,0  μ g/mL.  Nilai  flavonoid  total  untuk buah bisbul matang sebesar 0,56% dan untuk buah bisbul mentah sebesar 0,55%. (Sukmana, Lukmayani, dan Kodir, 2017).
Biji buah bisbul belum dilaporkan dan diduga mempunyai kandungan yang sama  dengan  bagian  lain  yang  telah  dilaporkan.  Kandungan  flavonoid  dan antioksidan pada biji buah bisbul dapat diukur dari ekstrak simplisianya. Ekstraksi dilakukan dengan teknik maserasi dan menggunakan dua pelarut, yaitu aseton dan etil  asetat  dengan  perbandingan  (1:3).  Pengujian  total  flavonoid  menggunakan standar  katekin  yang  dijadikan  kompleks  berwarna  sehingga  dapat  dibaca  oleh spektrofotometri UV-VIS.

## BAHAN DAN METODE PENELITIAN Bahan dan Alat
Bahan-bahan  yang  digunakan  adalah  biji  buah  bisbul  ( Diospyros  discolor ) yang  diperoleh  dari  Pasar  Tradisonal  Bogor,  aseton  pro  analisis,  etil  asetat  pro analisis,  katekin,  asam  klorida  pro  analisis,  reagen  mayer,  serbuk  magnesium, kloroform,  asetat  anhidrida,  asam  sulfat  pro  analisis,  besi  (III)  klorida,  natrium nitrit, alumunium (III) klorida anhidrat, natrium hidroksida.
Alat  yang  digunakan  adalah  spektrofotometer  UV-VIS  (Agilent,  US), spektrofotometer UV-VIS (Optizen, Korea), mesin grinder, neraca analitik digital (Sartorius),  oven  (Memmert),  desikator/dry  box  (Ailite),  magnetic  stirrer  (Ficher Scientific), ayakan mesh 100, kertas saring no. 41 (Whatman) dan peralatan gelas laboratorium.
Metode
1. Pembuatan Serbuk Simplisia Biji Buah Bisbul
Biji buah bisbul dibersihkan dari kotoran yang menempel, kemudian dicuci dengan  air  bersih  dan  dijemur  di  udara  terbuka.  Setelah  kering,  biji  bisbul dihaluskan  dengan  cara  digrinding  dengan  mesin  dan  diayak  dengan  ayakan  100 mesh.
2. Pembuatan Ekstrak Biji Buah Bisbul
Simplisia  biji  buah  bisbul  sebanyak  150  gram  diekstraksi  dengan  pelarut aseton  dan  etil  asetat  sebanyak  450  mL  menggunakan  teknik  maserasi. Perendaman  dilakukan  selama  4×24  jam  dengan  penggantian  pelarut  dan penyaringan setiap 1×24 jam. Ekstrak dievaporasi  dengan rotary evaporator pada suhu  60˚C  sampai  diperoleh  ekstrak  kental. Ekstrak  kental  kemudian  ditimbang.
Rendemen  ekstrak  dinyatakan  dalam  persen  dihitung  dengan  menggunakan persamaan sebagai berikut:
% Rendemen = Bobot Ekstrak Biji Buah Bisbul (g)
Bobot Simplisia Awal (g) ×100% (1)

## 3. Skrining Fitokimia

## Identifikasi Alkaloid
Ekstrak  kental  biji  bisbul  sebanyak  1  mL  dimasukkan  ke  dalam  tabung reaksi  ditambahkan  2  mL  etanol  70%  kemudian  diaduk,  ekstrak  ditambahkan  5 mL  HCl  2  N  kemudian  dipanaskan  pada  penangas  air.  Setelah  dingin,  campuran disaring dan filtrate ditambahkan beberapa tetes reagen Mayer. Sampel kemudian diamati hingga keruh atau ada endapan (Mojab et al ., 2003).

## Identifikasi Flavonoid
Ekstrak  kental  biji  bisbul  sebanyak  1  mL  dipanaskan  dipenangas  air  dan disaring,  kemudian  filtrat diambil sebanyak 0,5 mL  dan ditambahkan 5  mL NH3 encer,  kemudian  ditambahkan  H 2 SO 4 pekat  beberapa  tetes,  jika  larutan  berubah menjadi kuning maka sampel mengandung flavonoid (Supriyanto et al ., 2017)

## Identifikasi Saponin
Ekstrak  kental  biji  bisbul  sebanyak  1mL  dimasukkan  kedalam  tabung reaksi, ditambahkan 2 mL etanol 70% kemudian diaduk, ditambahkan dengan 20 mL akuabides dan dikocok. Jika terbentuk busa  yang stabil menunjukkan adanya saponin (Mojab et al., 2011).

## Identifikasi Triterpenoid/Steroid
Ekstrak  kental  biji  bisbul  sebanyak  1  mL  dimasukkan  kedalam  tabung reaksi, ekstrak ditambahkan 2 mL etanol 70% kemudian diaduk, dan ditambahkan 1  mL  kloroform.  Ekstrak  ditambahkan  1  mL  asetat  anhidrida  lalu  didinginkan. Setelah  dingin,  ekstak  ditambahkan  H 2 SO 4 pekat.  Jika  terjadi  warna  kemerahan, menunjukkan adanya triterpenoid, pembentukan cincin warna merah menunjukkan adanya steroid .

## Tanin
Ekstrak  kental  biji  bisbul  sebanyak  1mL  dimasukkan  kedalam  tabung reaksi, lalu ditambahkan 2 mL etanol 70% kemudian diaduk, ekstrak ditambahkan FeCl3 sebanyak 3tetes, jika menghasilkan biru karakteristik, biru-hitam, hijau atau biru-hijau dan endapan.
4. Kadar Flavonoid Total (Do et al., 2014) (Modifikasi)

## Pembuatan Larutan uji
Ekstrak  masing-masing  ditimbang  sebanyak  10  mg  kemudian  dilarutkan dengan metanol hingga 10 mL (Konsentrasi larutan 1.000 μg/mL). Ekstrak dipipet sebanyak  5  mL  larutan  uji  kemudian  ditambahkan  metanol  hingga  10  mL (konsentrasi larutan 500 μg/mL).

## Pembuatan Larutan Standar
Katekin  ditimbang  sebanyak  10  mg  kemudian  dilarutkan  dengan  metanol hingga 10 mL (Konsentrasi larutan 1.000 μg/mL) kemudian dipipet 0,2 - 3 mL ke dalam labu ukur dan ditambah metanol hingga 10 mL dan didapatkan konsentrasi 20 - 300 μg/mL.

## Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Larutan  deret  standar  katekin  200 μg/mL  dimasukkan  sebanya k  1  mL  ke dalam  vial  yang  sebelumnya  sudah  ditambahkan  4  mL  akuades  dan  0,3  mL
larutan  NaNO 2 5%,  kemudian  didiamkan  selama  5  menit.  Selanjutnya  larutan ditambahkan dengan 0,3 mL AlCl 3 10% dan didiamkan selama 6 menit, kemudian ditambahkan  2  mL  NaOH  1M,  dan  2,4  mL  akuades,  kemudian  dihomogenkan. Setelah itu absorbansinya diukur pada panjang gelombang 300-700 nm.

## Pengukuran Serapan Dengan Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis
Masing-masing  deret  standar  dan  larutan  uji  sebanyak  1  mL  ke  dalam  vial yang  sebelumnya  sudah  ditambahkan  4  mL  akuades  dan  0,3  mL  larutan  NaNO 2 5%,  kemudian  didiamkan  selama  5  menit.  Selanjutnya  larutan  ditambahkan dengan 0,3 mL AlCl 3 10% dan didiamkan selama 6 menit, kemudian ditambahkan 2  mL  NaOH  1M,  dan  2,4  mL  akuades,  kemudian  dihomogenkan.  Setelah  itu absorbansinya diukur pada panjang gelombang maksimum.  Kandungan flavonoid total  dalam  mg ekivalen katekin per  gram ekstrak  (mg EK/g  ekstrak)  didapatkan dengan menggunakan rumus berikut:
Flavonoid Total= C×V×FP m (2)
Diamana, C merupakan konsentrasi ekstrak (mg/L), V merupakan volume sampel (L), FP merupakan factor pengenceran dan m adalah bobot sampel (g).

## Analisa data
Hasil  analisis  dinyatakan  sebagai  rerata  ±  standar  deviasi  (SD)  dari  tiga ulangan pengukuran. Ada tidaknya perbedaan yang signifikan (p < 0,05) diantara hasil  yang  diperoleh  menggunakan  analisis independent  sample t-Test dengan program Microsoft Excel 2010.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Biji Buah Bisbul
Hasil  ekstraksi  biji  buah  bisbul  dari  pelarut  aseton  dan  etil  asetat  dapat dilihat pada Tabel 1 berikut:
Tabel 1. Hasil Ekstraksi Biji Buah Bisbul Tahapan Ekstraksi Besaran Aseton Etil Asetat Simplisia biji buah bisbul 150 g 150 g Ekstrak kental 45,18 g 42,21 g Rendemen ekstrak 30,12 % 28,14%
Ekstrak dari pelarut aseton memiliki persen rendemen yang lebih besar jika dibandingkan  ekstrak  pelarut  etil  asetat.  Hal  ini  dikarenakan  karena  perbedaan dalam  polaritas,  dispersibilitas  dan  penetrasi,  dan  secara  selektif  mengekstrak fitokimia yang berbeda (Zhang, 2015). Aseton merupakan pelarut semi polar dan etil asetat lebih  cenderung tergolong kedalam pelarut non polar. Proses ekstraksi terjadi  dengan  mengalirnya  bahan  pelarut  kedalam  sel  yang  menyebabkan protoplasma  membengkak,  dan  bahan  didalam  sel  terlarut  sesuai  dengan kelarutannya  (Voight,  1995).  Kepolaran  pelarut  akan  saling  berkaitan  dengan kepolaran senyawa yang diekstrak.
Rendemen  hasil  ekstrak  metanol  biji  bisbul  dilaporkan  lebih  besar  yaitu 38,67  %  (Resha  Ratna  Kusumah,  komunikasi  pribadi,  6  Agustus  2019),  karena
perolehan  senyawa  berdasarkan  pada  kesamaan  sifat  kepolaran  terhadap  pelarut. Tingkat polaritas diantara ketiga pelarut yaitu metanol > aseton > etil asetat.

## Skrining Fitokimia
Skrining  fitokimia  merupakan  tahap  awal  yang  dilakukan  pada  saat pengujian,  dimana  dalam  uji  ini  dapat  melihat  golongan  senyawa  yang  terdapat dalam bahan yang akan diuji. Hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Biji Buah Bisbul
Skrining  fitokimia  ekstrak  biji  buah  bisbul  menunjukkan  hasil  yang  sama diantara kedua pelarut yaitu positif terhadap kelima uji. Positif senyawa alkaloid dengan  menggunakan  pereaksi  Mayer  ditunjukkan  terbentuknya  endapan  putih. Uji flavonoid dangan menggunakan NH 3 encer terbentuk warna kuning. Senyawa saponin  positif  dengan  terbentuknya  busa.  Uji  triterpenoid  dan  steroid  akan membentuk  merah  kecoklatan  dan  cincin  merah.  Sedangkan  senyawa  tannin positif jika terbentuk warna biru dongker.

## Uji Kadar Flavonoid Total
Pengujian  total  flavonoid  pada  biji  buah  bisbul  dilakukan  pada  dua  hasil ekstrak, yaitu ekstrak aseton dan etil asetat dengan menggunakan standar katekin. Hasil  pengukuran  standar  katekin  dapat  dilihat  pada  Gambar  1.  Penentuan  kadar flavonoid  total  menggunakan  metode  kolorimetri  AlCL 3 dengan  sedikit modifikasi.  Penentuan  kadar  flavonoid  total  didasarkan  pada  kurva  kalibrasi  y  = 0,0022x – 0,0026 dengan R 2 = 0,9982, dimana  y adalah absorbansi dan x adalah konsentrasi  dari  katekin.  Hasil  rerata  pengukuran  total  flavonoid  dapat  dilihat pada Tabel 3.
Golongan Senyawa Ekstrak Biji Bisbul Aseton Etil Asetat Metanol* Alkaloid ++ ++ ++ Flavonoid + + ++ Saponin +++ + ++ Triterpenoid/Steroid + ++ + Tanin ++++ ++++ ++++
Keterangan: Tanda (+) menunjukkan reaksi positif, *(Resha Ratna Kusumah, komunikasi pribadi, 6 Agustus, 2019)

## Gambar 1. Kurva Standar Katekin
Tabel 3. Perbandingan Kadar Flavonoid Total Ekstrak Biji Buah Bisbul
Jenis Pelarut Flavonoid Total (mg EK/g ekstrak) Ref. Metanol 335.40 ± 8.62 (Resha Ratna Kusumah, komunikasi pribadi, 6 Agustus, 2019) Aseton 377.03 ± 1.50 Sekarang Etil asetat 423.60 ± 2.68 Sekarang Keterangan:
Nilai yang dilaporkan merupakan nilai rerata ± SD dari tiga kali ulangan
Kadar flavonoid total ekstrak biji buah bisbul dengan pelarut etil asetat lebih besar mencapai 423,60 ± 1,50 mg EK/g ekstrak) jika dibandingkan ekstrak dengan pelarut  aseton.  Hasil  ini  berbanding  terbalik  dengan  persen  rendemen  yang dihasilkan  lebih  tinggi  ekstrak  dengan  pelarut  aseton.  Hubungan  antara  kadar flavonoid dan persen rendemen  menunjukkan perbedaan  yang nyata dengan nilai p  <  0,05.  Persen  rendemen  ekstrak  yang  besar  tidak  selalu  menunjukkan  kadar flavonoid total yang besar juga.
Senyawa  flavonoid  merupakan  bahan  metabolit  sekunder  yang  ada  pada tanaman.  Senyawa  flavonoid  termasuk  kedalam  golongan  senyawa  fenolik  yang diketahui  mempunyai  kemampuan  antioksidan.  Kadar  flavonoid  total  biji  buah bisbul antara pelarut aseton dan etil asetat berkisar 17,03 – 17,85 %, cukup tinggi dan  berpotensi  sebagai  bahan  antioksidan.  Hasil  ini  juga  menunjukkan  fakta bahwa selain bagian lain tanaman Diospyros discolor berkhasiat (Lee et al . 2012), bagian biji buah bisbul ini juga mempunyai potensi yang sangat tinggi jika dilihat dari kandungan flavonoid totalnya.

## SIMPULAN DAN SARAN Simpulan
Rendemen  ekstrak  aseton  dan  etil  asetat  biji  buah  bisbul  yaitu  30,12%  dan 28,14%.  Kandungan  metabolit  sekunder  kedua  ekstrak  yaitu  alkaloid,  flavonoid, saponin, Triterpenoid/Steroid, dan Tanin. Kadar flavonoid total ekstrak etil asetat
lebih tinggi dari ekstrak aseton yaitu masing-masing 423,60 ± 2,68  dan 377,03 ± 1,50 mg Ekuivalen Katekin/ g ekstrak.

## Saran
Perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  mengenai  identifikasi  senyawa flavonoid  yang  terdapat  didalam  biji  buah  bisbul,  sehingga  dapat  diaplikasikan sesuai peruntukkannya.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  didanai  dengan  program  Penelitian  Kompetitif  Nasional dengan  Skim  Penelitian  Dosen  Pemula  (PDP)  tahun  pelaksanaan  2019  sesuai kontrak nomor:  2656/L4/PP/2019 tanggal 19  Maret 2019 oleh  Kementrian Riset, Teknologi dan Pendidikan Tinggi Republik Indonesia.

## DAFTAR PUSTAKA
Do, Q. D., Angkawijaya, A. E., Tran-Nguyen, P. L., Huynh, L. H., Soetaredjo, F. E.,  Ismadji,  S.,  dan  Ju,  Y.  H.  2014.  Effect  of  Extraction  Solvent  on  Total Phenol  Content,  Total  Flavonoid  Content,  and  Antioxidant  Activity  of Limnophila  Aromatica. Journal  of  Food  and  Drug  Analysis 22  (3):  296 – 302.
Howlader, M. S. I., Rahman, M. M., Khalipa, A. B. R., Ahmed, F., & Rahman, M. M. (2012). Antioxidant and Antidiarrheal Potentiality of Diospyros blancoi . International Journal of Pharmacology 5: 403-409.
Hung,  S.  F.,  Chen,  I.  Z.  dan  Roan,  S.  F.  2015.  Preliminary  Results  of  Fruit Selection  and  Induced  Parthenocarpy  of  Mabolo  (Diospyros  Blancoi  A. DC.). Genetic Resources and Crop Evolution 62 (8): 1127 – 1134.
Lee,  K.  Y.,  Jung,  J.  Y.,  Lee,  M.  Y.,  Jung,  D.,  Cho,  E.  S.,  dan  Son,  H.  Y.  2012. Diospyros  Blancoi  Attenuates  Asthmatic  Effects  in  a  Mouse  Model  of Airway Inflammation. Inflammation 35 (2): 623 – 32.
Mojab,  F.,  Kamalinejad,  M.,  Ghaderi,  N.,  dan  Vahidipour,  H.  R.  2003. Phytochemical  screening  of  some  species  of  Iranian  plants. Iranian Journal of Pharmaceutical Research 2 (2): 77-82.
Rahmawan,  J.  B.  Y.  dan  Dwiyatmaka,  Y.  2013.  Penetapan  Kandungan  Fenolat Total  dan  Uji  Aktivitas  Antioksidan  Menggunakan  Radikal  DPPH  Fraksi Etil  Asetat  Sari  Buah  Apel  Beludru  ( Diospyros  blancoi A.  DC.). Jurnal Farmasi Sains dan Komunitas 10 (2): 101 – 110.
Sukmana,  I.  K.,  Lukmayani,  Y.,  dan  Kodir,  R.  A.  2017.  Penetapan  Kadar Flavonoid  Total  dan  Polifenol  Total  dari  Ekstrak  Etanol  Buah  Bisbul ( Diospyros  blancoi A.  DC.)  dengan  Perbedaan  Kematangan. Prosiding Farmasi 3 (2): 421 – 425.
Supriyanto, Simon, B.W., Rifa’I, M., Yunianta. 2017. Uji Fitokimia dan Aktivitas Antioksidan  Ekstrak  Daun  Mimba  ( Azaradiracta  indica Juss). Prosiding SNATIF ke-4 : 523 – 529 .
Voight,   R.   1995. Buku   Pelajaran   Teknologi Farmasi Edisi  5.  Gadjah  Mada University Press, Yogyakarta
Zhang,  Q.  2015.  Effects  of  Extraction  Solvents  on  Phytochemicals  and Antioxidant Activities of Walnut ( Juglans regia L.) Green Husk Extracts.
European Journal of Food Science and Technology 3 (5): 15 – 21.