## SKRINING DAN IDENTIFIKASI BAKTERI TERMOFILIK PENGHASIL SELULASE DAN AMILASE DARI SUMBER AIR PANAS BUKIT KILI SOLOK SUMATERA BARAT DENGAN ANALISIS GEN 16S rRNA

## Zona Octarya, Sumaryati Syukur, Endang Purwati RN
Program Studi Pendidikan Kimia, Fakultas Tarbiyah dan Keguruan, Universitas Islam Negeri Sultan Syarif Kasim Riau.
Program Studi Kimia, FMIPA, Universitas Andalas. Program Studi Nutrisi Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Andalas.
Departemen Fisika, Institut Pertanian Bogor

## ABSTRAK
Enzim  termostabil  dari  bakteri  termofilik  merupakan  enzim  yang  sangat  potensial  untuk  mengatasi  kendala  teknis industri  yang  berhubungan  dengan  proses  pada  suhu  tinggi.  Salah  satu  sumber  enzim  adalah  mikroorganisme termofilik  yang  banyak  terdapat  pada  sumber  air  panas.  Indonesia  merupakan  negara  kepulauan  yang  banyak mempunyai  sumber  air  panas,  salah  satunya  adalah  Kabupaten  Solok.  Penelitian  ini  mencakup  skrining  dan identifikasi  bakteri  penghasil  enzim  termostabil  selulase  dan  amilase  dari  sumber  air  panas  Bukit  Kili  Ketek  di Kabupaten  Solok.  Suhu  air  panas  adalah  52°C  pada  bulan  Juni  2009  dan  pH  air  adalah  8.  Kultur  murni  yang diperoleh adalah sebanyak 22 kultur Dari hasil pewarnaan gram, diperoleh sebagian besar bakteri air panas adalah jenis bakteri streptobacilli (basilus) gram positif, hanya dua isolat yang merupakan gram negatif yaitu isolat S1B dan S5B.  S2A  adalah  isolat  yang  mempunyai  aktifitas  selulase  paling  tinggi  dibandingkan  dari  isolat  yang  lain  karena mempunyai indeks zona bening selulase lebih tinggi yaitu 2,6. Isolat S2A juga menghasilkan amilase tinggi dengan indeks  zona  bening  2,5.  Persen  identitas  bakteri  air  panas  S2A  yang  diperoleh  adalah  97%  dengan  Anoxybacillus flavithermus strain AE3.
Kata Kunci : Enzim, Bakteri, termofilik, Selulase, Amilase, Anoxybacillus

## 1. PENDAHULUAN
Enzim  adalah  protein  yang  mengkatalisis reaksi-reaksi  biokimia.  Sejumlah  enzim  dapat digunakan  untuk  membantu  proses  industri. Keunggulan  utama  penggunaan  enzim  pada proses  industri  adalah  kespesifikan  enzim terhadap  substrat  dan  enzim  mampu  mengurangi konsumsi energi, enzim juga mampu mengurangi konsumsi  air  dan  produk  limbah  selama  proses industri berlangsung. Keunggulan enzim tersebut akan  meminimalkan  resiko  atau  dampak  proses industri bagi kehidupan manusia dan lingkungan.
Keunggulan  enzim  dalam  aplikasinya  di industri  menyebabkan  kebutuhan  enzim  dunia semakin  meningkat sekitar 7,6% setiap tahunnya (Puspaningsih,  2007).  Peningkatan  kebutuhan enzim terutama dipicu oleh makin meningkatnya penggunaan  enzim  dalam  bidang  farmasi, kesehatan,  dan  industri  kimia.  Beberapa  contoh jenis  enzim  telah  diaplikasikan  untuk  tujuan komersial  terutama  penggunaannya  di  industri, yaitu;  selulase,  hemiselulase,  xilanase,  amilase, protease, dan lipase.
Penggunaan enzim dalam industri mengalami kendala  berhubungan  dengan  suhu  yang  tinggi dalam proses industri sehingga dibutuhkan enzim yang  stabil  dan  mempunyai  aktifitas  yang  tinggi pada  suhu  yang  tinggi  (enzim  termostabil). Enzim  termostabil  yang  ada  di  pasaran kebanyakan  berasal  dari  bakteri  mesofilik  dan jamur.  Enzim  termostabil  dari  bakteri  termofilik merupakan  enzim  yang  sangat  potensial  untuk mengatasi  kendala  teknis  industri.  Kendala  lain adalah dalam hal produksi enzim termostabil dari mirkoorganisme  termofilik  yang  sangat  rendah. Untuk mengatasi kendala itu, beberapa pendekatan yang telah ditempuh adalah pencarian sumber baru enzim termostabil dari mikroorganisme  termofilik  yang  tumbuh  pada habitat  yang  unik,  suhu  yang  sesuai  untuk menghasilkan  enzim  termostabil  dan  rekayasa genetika  untuk  menghasilkan  enzim  termostabil dengan ekspresi tinggi (Nyoman et al 2007).
Pendekatan  dengan  mencari  sumber-sumber enzim baru dari mikroorganisme termofilik yang diisolasi  dari  lingkungan  unik  merupakan
langkah  yang  paling  memungkinkan  untuk dilakukan,  karena  Indonesia  memiliki  banyak sumber  air  panas  yang  potensial  dan  unik. Sumber  air  panas  yang  ada  di  Kabupaten  Solok sudah  dikembangkan  sebagai  objek  wisata  dan tempat  pemandian,  namun  belum  digali  sebagai sumber  mikroorganisme  termofilik.  Kabupaten Solok  adalah  daerah  Propinsi  Sumatera  Barat yang  dilalui  oleh  Pegunungan  Bukit  Barisan. Gunung  Talang  adalah  salah  satu  gunung  berapi di  Kabupaten  Solok  yang  banyak  dijumpai sumber  air  panas.  Lingkungan  ini  merupakan habitat  semua  bakteri  termasuk  diantaranya bakteri  termofilik.  Beberapa  sumber  air  panas yang  ada  di  daerah  Solok  berpotensi  untuk diketahui keanekaragaman hayati bakteri termofiliknya. Selanjutnya keanekaragaman jenis bakteri  termofilik  tersebut  perlu  digali  sifat-sifat dan  potensi  kegunaannya  bagi  kehidupan manusia  terutama  dalam  bidang  teknologi  dan industri.  Dalam  hal  ini  yang  sangat  penting adalah  untuk  mengetahui  jenis  bakteri  yang potensial tersebut dan upaya untuk mengeksplorasinya.
Belum  ada  yang  melaporkan  penelitian mikroorganisme  termofilik  sumber  air  panas  di Kabupaten  Solok,  sedangkan  sumber  air  panas sangat  banyak  di  Kabupaten  Solok,  diantaranya yaitu Sumber Air Panas Bukit Kili Barat, Sumber Air  Panas  Bukit  Kili,  Sumber  Air  Panas  Sapan dan  Sumber  Air  Panas  Bukik  Gadang.  Semua sumber  air  panas  tersebut  mempunyai  potensi sebagai  sumber  mikroorganisme  termofilik.  Air Panas Bukit Kili Ketek adalah salah satu sumber air  panas  yang  belum  ada  digali  potensi mikroorganismenya.
Dari  penelitian  sebelumnya,  telah  diisolasi dan  diidentifikasi  bakteri  termofilik  isolat  lokal Rimbo  Panti  (Sevante,  2002)  dengan  penentuan urutan  dan  analisis  Gen  16S  rRNA.  Hasil perbandingan dengan program BLAST pada situs NCBI  (GenBank)  berhasil  menunjukkan  persen kemiripan  terbesar  isolat  Rimbo  Panti  dengan Geobacillus  Subterraneus  strain  K (98%), Geobacillus  Steraneus (98%)  dan Bacillus thermodinitrificans (97%). Isolasi bakteri termofilik aerob yang mempunyai sifat fisik yang unik  telah  diisolasi  dari  sumber  air  panas
Savusavu  di  Fiji.  Produksi  enzim  hidrolitik  dan ekstraseluler  (amilase,  lipase  dan  gelatinase) bakteri tersebut  diskrining  dengan  metoda  kultur streak  bakteri  termofilik  murni  pada  nutrient starch agar (NSA),  nutrient gelatine agar (NGA), dan nutrient lipid agar (NLA) melalui pengukuran  zona  bening  (Narayan et  al 2008). Produktifitas enzim termostabil yang berasal dari isolat  bakteri  yang  lebih  potensial  dipengaruhi oleh  pH,  konsentrasi  substrat,  sumber  karbon, sumber  nitrogen,  vitamin  dan  asam  amino (Bayoumi et al 2007).
Isolasi  dan  karakterisasi  bakteri  termofilik baru  juga  telah  dilakukan  dari  sumber  air  panas di  Jordania.  Sistem  identifikasi  yang  digunakan adalah  karakteristik  biokimia,  morfologi  dan kondisi  pertumbuhan  optimal.  Hasil  analisa sekuens  gen  16S  rRNA  isolat  baru  yang ditemukan  menunjukkan  bahwa  isolat  adalah kelompok baru dari genus Bacillus (Elnasser et al 2007). Salah satu target isolasi bakteri termofilik yang  telah  dilakukan  tersebut  adalah  untuk memproduksi enzim termostabil.
Nora  (2004)  mengemukakan  bahwa  amilase dan  selulase  semakin  banyak  digunakan  sebagai bahan  aditif  pada  makanan  ternak.  Tujuan utamanya  adalah  memperbaiki  nutrisi  ternak dengan  cara  mendegradasi  kandungan  seratnya, hal  ini  sangat  penting  bagi  ternak  berusia  muda yang  belum  mempunyai  kemampuan  enzim dengan  aktifitas  tinggi  untuk  mengolah  serat. Berdasarkan  alasan  komersial,  amilase  banyak digunakan  sebagai food  additive, sedangkan selulase mempunyai harga mahal sehingga jarang digunakan  sebagai food  additive .  Dengan  alasan ini  maka  sangat  penting  sekali  mencari  sumber enzim  selulase  dari  bakteri  termofilik  dan mengolahnya menjadi bahan pencampur makanan  ternak.  Hipotesis  untuk  melakukan penelitian ini adalah bahwa akan ditemukan jenis bakteri  baru  pada  sumber  air  panas  Bukit  Kili Ketek  di  Kabupaten  Solok  yang  mempunyai kemampuan ekstraseluler enzimatis.
Masih  belum  digalinya  potensi  sumber  air panas di Kabupaten Solok, khususnya Sumber air panas Bukit Kili Ketek sebagai salah satu habitat mikroorganisme termofilik. Belum ada penelitian yang  memaparkan  jenis  bakteri  apa  saja  yang
terkandung  di  dalamnya.  Sumber  air  panas merupakan  kekayaan  alam  yang  sangat  penting karena
berpotensi
sebagai sumber mikroorganisme  termofilik  penghasil  enzim termostabil  ekstraseluler.  Indonesia  banyak mempunyai  sumber  air  panas  yang  merupakan tempat  hidup  bakteri  termofilik  dan  mempunyai potensial  besar  untuk  menghasilkan  enzim termostabil tersebut.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengskrining dan mengidentifikasi bakteri termofilik  pada  sumber  air  panas  Bukit  Kili Ketek  di  Kabupaten  Solok  yang  mempunyai aktifitas  enzimatis  ekstraseluler  (selulase  dan amilase)  dengan  analisis  Gen  16S  rRNA  serta melakukan karakterisasi molekuler enzim ekstraselulernya.

## 2. METODOLOGI PENELITIAN
Peralatan  yang  digunakan  adalah:  petridish, hoki  stik,  jarum  ose,  alat-alat  gelas,  inkubator, autoklav,  pipet  mikro,  timbangan  digital,  water bath,  chemical  hood,  pengaduk  magnet,  hotplate stirrer,  tabung  sentrifugasi,  Eppendorf,  alat elektrophoresis (Mupid exu), perangkat dokumentasi, freezer , Thermal  Cycler  PCR system ,  mikrosentrifus,  mikrosentrifus  dingin, vortex dan alat-alat gelas laboratorium.
Bahan-bahan yang digunakan adalah: Agarose (Iwai AG 5994), Aquadest, HCl, NaOH (Merck),  Bacto  agar  (Himedia),  Tryptone,  Beef extract,  NaCl,  Peptone,  Yeast  extract  (Himedia), EDTA,  Etanol  pa  (Merck),  Etidium  bromida, Sodium  dodesil  sulfat  (SDS),  Isopropanol, Tris base ,  Buffer  TBE  (Tris  Boric  acid  EDTA) (Takara), Nutrient Broth, Nutrient Agar (Himedia), CTAB ( Hexadecyltrimethyl ammonium Bromide ) Gram staining solution dari Merck  (larutan  kristal  violet,  Safranin,  lugol, larutan decolourizing ),  (NH 4 ) 2 SO 4 2  g,  MgSO 4 - 7H 2 O  0.2  g,  KH 2 PO 4 14  g,  K 2 HPO 4 6  g, Trisodium  sitrat  1,0  g,  pati  (Merck),  CMC (Carboxymethil  Cellulosa)  (Merck),  Congo  red, TE  (10mMTris–HCl,  1Mm  EDTA,  pH  7.6), Lysozyme  (60mg/Ml),  Commasie  blue,  Larutan destaining  (5%  metanol  dan  7%  asam  asetat), Primer  universal  8F  dan  1541R  (Zainal,  2009),
ddH 2 O  (DW),  Deoksi  Nucleotide  Triposphate (dNTPs), taq Polymerase, 10 x buffer PCR.

## Isolasi Bakteri Termofilik
Sampel  air  panas  dikoleksi  dari  sumber  air panas  yang  ada  di  Kabupaten  Solok,  yaitu  Air Panas Bukit Kili Ketek yang berukuran 2 m x 1,5 m  dengan  menggunakan  botol  10  mL  beserta tutupnya  dan  dimasukkan  ke  dalam thermal containers (termos)  untuk  mempertahankan suhunya selama perjalanan ke laboratorium untuk analisa selanjutnya pada hari yang sama. Sampel diambil  pada  kedalaman  40  cm  di  bawah permukaan  air,  agak  jauh  dari  pinggir.  Suhu  air panas  pada  saat  diambil  adalah  52°C  dengan  pH 8.  Sampel  diambil  lebih  dekat  ke  mata  air  agar dapat mewakili suhu yang paling tinggi di kolam air  panas  tersebut.  Bakteri  termofilik  diisolasi, dikayakan  dalam  Nutrient Broth  dan  dimurnikan menggunakan  metoda  gores  pada  media  NA. Suhu  inkubasi  yang  digunakan  adalah  52  C selama 24 jam (Nunes dan Martin, 2001).

## Uji Gram
Karakter morfologi bakteri ditentukan dengan  menggunakan  kultur  bakteri  murni  yang berumur  18 jam  di  dalam Nutrient  Agar .  Hal ini mencakup  preparasi  kultur  basah  menggunakan mikroskop cahaya. Satu koloni bakteri ditotolkan pada  kaca  objek  yang  sebelumnya  telah diteteskan NaCl, kemudian diratakan dengan ose membentuk  bulatan.  Kaca  objek  dipanaskan sampai  NaCl  yang  telah  mengandung  koloni bakteri  kering.  Diteteskan crystal  violet pada objek  dan  dibiarkan  1  menit,  dicuci  dan  dikover dengan  larutan  lugol  iodin  selama  1  menit. Kemudian  dicuci  dengan  larutan decolorizing 4 (aseton)  atau  3  (etanol)  sampai  tidak  ada  lagi warna ungu yang tersisa. Dicuci dengan aquadest steril  selama  5  detik.  Kemudian  dikover  dengan safranin  selama  1  menit  dan  dicuci  dengan aquadest  steril  selama  5  detik.  Kaca  objek dikeringkan  dan  dilihat  di  bawah  mikroskop dengan perbesaran 100 kali (Prescot et al , 1990).

## Uji Amilase
Hidrolisis  pati  diuji  di  dalam  medium nutrient  agar  yang  mengandung  1%  pati.  Plate
diinkubasi  pada  suhu  52°C  selama  24  jam. Adanya  daerah  bening  disekitar  koloni  setelah penambahan  Lugol  iodin  menunjukkan  bahwa adanya  aktifitas  amilase  (Elnasser  dan  Maraqa, 2007).

## Uji  Hidrolisis  Karboksimetil  Selulosa (CMCase/ Selulase)
Untuk  menentukan  selulosa  ekstraseluler ditentukan  di  dalam  medium  thermus  agar  plate (0,5%  NaCl,  0,5%  pepton,  0,4%  beef  extract, 0,2%  yeast  extract  dan  2%  agar)  yang mengandung  0,5%  (w/v)  karboksimetil-selulosa (pH  6,5).  Kultur  diinkubasi  24  jam  pada  suhu 52°C.  Aktifitas  selulase  dideteksi  dengan  Congo red  0,1%  dan  NaCl  1M.  Daerah  bening  di sekeliling  bakteri  yang  tumbuh  yang  berlatar merah  menunjukkan  hasil  yang  positif  (Elnasser dan Maraqa, 2007).

## Isolasi DNA Bakteri Termofilik
Pelet bakteri diperoleh dari sentrifugasi 3 ml kultur DNA yang telah ditumbuhkan semalam di dalam Nutrient Broth cair pada suhu 52°C. Untuk mendapatkan  pelet,  1  ml  kultur  disentrifugasi dengan  kecepatan  13.000  rpm  (4°C)  5  menit. Pelet ditambahkan 500µl TE, ditambahkan 40µL Lysozyme .  Kemudian  larutan  diinkubasi  pada 37°C  selama  1  jam.  Larutan  ditambah  200  µl 10%  SDS,  100  µl  of  NaCl  5M  dan  80  µl  of CTAB  10%,  dipanaskan  dalam  waterbath  68°C selama 30 menit dan dibolak balik tiap 10 menit. Larutan  ditambah  chloroform  1:1  (v:v)  dan disentrifus  13.000  rpm  selam  10  menit. Supernatan diambil dan dipindahkan ke Eppendorf baru dan ditambah 0,6 X Isopropanol. Larutan  disentrifus  13.000  rpm  selama  5  menit untuk memperoleh pelet. Pelet dicuci dengan 100 µL  etanol  70%.  Pelet  dikering  anginkan  dan kemudian  diresuspensi  dengan  30  µl  DW  yang mengandung  0.1  mg/mL  RNase  dan  disimpan pada -20°C (Sambrook et al , 1989).

## Reaksi PCR
Gen  16S  rRNA  dari  genomik  DNA  yang diisolasi  dari  koloni  bakteri  murni  diamplifikasi dengan PCR. Reaksi amplifikasi DNA dilakukan dalam thermocycler dengan menggunakan primer
8F  (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)  dan 1541R  (5’AAGGAGGTGATCCAGCC).  DNA templat  yang  digunakan  adalah  3  µl  dan dimasukkan  ke  dalam  Eppendorf.  Bahan-bahan untuk satu sampel dalam reaksi PCR adalah 39,5 µl ddH 2 O, primer F dan R masing-masing 0,5 µl dan  1  µl  10  mM  dNTPs, taq  polymerase 0,5  µl dan  10  x  buffer  5  µl  dibuat  dalam  tube  1,5  ml. Sebanyak  47  µl  bahan  di  atas  ditambahkan  ke dalam  Eppendorf  DNA  templat.  Reaksi  PCR adalah sebanyak 35 siklus PCR (denaturasi 96°C selama  5  menit,  denaturasi  berikutnya  96°C selama  1  menit,  annealing  55°C  selama  1  menit, ekstensi 72°C selama 3 menit dan final extension 72°C  selama  7  menit).  Produk  PCR  dianalisa pada  gel  agarose  1%  dan  divisualisasi  dengan ultraviolet illumination setelah ditambah ethidium bromide. Pita DNA yang diperoleh pada agar  dipotong  dan  dipurifikasi  dengan  Promega Kit Protocol (Zainal, 2009).

## Purifikasi  DNA  dengan  Promega  Kit Protocol
Pita  DNA  dipotong  dari  gel  agarose, dimasukkan  gel  ke  dalam  tube  dan  ditambah  3 kali volume membrane binding solution terhadap volume  gel.  Campuran  diinkubasi  pada  50°C selama  10  menit.  Campuran  dimasukkan  pada kolom  QIAquick  dan  disentrifugasi  10.000  rpm selama  1  menit  pada  suhu  ruang.  Ditambahkan 759 µl membrane wash solution dan disentrifugasi  10.000  rpm  selam  1  menit  pada suhu  ruang.  Ditambahkan  lagi  500  µl membrane wash solution dan disentrifugasi lagi 10.000 rpm selama  1  menit  pada  RT.  Kolom  QIAquick dipindahkan  ke  dalam  Eppendorf  1,5  baru  dan ditambahkan  30-50  µl  buffer  elusi  pada  bagian tengah  kolom  QIAquick.  Ditunggu  1  menit  dan kemudian  disentrifugasi  10.000  rpm  selama  1 menit (Promega Kit Protocol).

## Analisis Data Sekuensing
Analisis  data  sekuensing  dilakukan  dengan menggunakan  program software DNA  star. Untuk  analisa sequence  alignment ,  dilakukan dengan  membandingkan  sekuens  yang  diperoleh (query)  dengan  yang  telah  ada  pada  GeneBank menggunakan  BLAST  (Basic  Local  Alignment
Search Tool) pada situs
http:/www.ncbi.nl.nih.gov/. Phylogenetic  tree dari  isolat  yang  diperoleh  dibuat  dengan menggunakan ClustalW.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Bakteri Termofilik
Air  diambil  sebagai  sampel  dari  sumber  air panas  Bukit  Kili  di  Kabupaten  Solok.  Suhu  air panas adalah 52°C pada bulan Juni 2009 dan pH air  adalah  8.  Pengambilan  sampel  diambil mendekati mata air, yaitu yang  mempunyai suhu paling  tinggi  pada  kolam  air  panas.  Hal  ini bertujuan untuk mendapatkan bakteri yang hidup disekitar mata air panas dan mempunyai aktifitas enzimatis pada suhu kolam air panas.
Setelah  sampel  diisolasi  dengan  metoda pengenceran bertingkat dan diinkubasi selama 24 jam, muncul koloni-koloni bakteri pada plate 10 - 1 ,  10 -2 ,  10 -3 ,  10 -4 ,  10 -5 dan  10 -6 (Tabel  3).  Dari Tabel 3 dapat diketahui bahwa pada pengenceran 10 -4 ,  10 -5 dan  10 -6 koloni-koloni  bakteri  telah dapat  dihitung  karena  sudah  terpisah  dengan baik,  sedangkan  pada  pengenceran  10 -7 bakteri tidak  ada  yang  tumbuh  lagi.  Untuk  menghitung Colony  Forming  Unit (CFU)  bakteri  termofilik diambil  data  pada  pengenceran  10 -4 karena memenuhi syarat untuk dihitung yaitu mempunyai  jumlah  lebih  dari  30  koloni.  Jumlah bakteri  termofilik  total  sumber  air  panas  Bukit Kili  Ketek  yang  ditemukan  adalah  7,9  x  10 5 CFU’s/mL.
Tabel 3. Jumlah koloni bakteri Termofilik.
Keterangan: TNTC ( Too Numerous to Count ), SPC ( Standard Plate Count )
Jumlah  koloni  bakteri  yang  ditemukan  ini lebih banyak dibandingkan dengan yang ditemukan  oleh  Narayan  (2008)  di  sumber  air
panas  Savusavu  Fiji  yaitu  2,2  x  10 4 CFU’s/mL. Abdelnasser  (2007)  menemukan  jumlah  koloni bakteri  pada  sumber  air  panas  Haman  Mesir  2  x 10 4 CFU’s/mL  dan  tidak  ada  satupun  bakteri yang  mampu  menghasilkan  selulase  dengan metoda  langsung  ( direct  plating  method ). Produksi  selulase  ditemukan  setelah  dilakukan pengayaan  sampel  ( enrichment  step )  dengan selulosa  selama  4  minggu.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  sumber  air  panas  Bukit  Kili  Solok mempunyai lebih banyak mikroorganisme termofilik  dan  berpotensi  menghasilkan  enzim ekstraseluler.  Jatuhan  daun,  ranting  dan  batang dari  pohon  sekitar  sumber  air  panas  merupakan sumber  bahan  organik  yang  dapat  dimanfaatkan mikoorganisme sebagai sumber karbon, sehingga mikroorganisme yang hidup akan lebih banyak.
Gambar 6. Bentuk koloni bakteri air panas pada pengenceran 10 -4 (A) dan 10 -5 (B)
Pada  gambar  6,  terlihat  koloni  bakteri  air panas  yang  sudah  tumbuh  terpisah  dengan  baik. Bentuk koloni bulat, ukuran bervariasi, berwarna putih dan ada yang putih kekuningan. Pada kultur murni  bakteri  hanya  terdapat  satu  jenis  bentuk koloni  bakteri.  Kultur  murni  yang  diperoleh adalah  sebanyak  22  kultur.  Perbedaan  dari  22 macam  isolat  tersebut  dibedakan  berdasarkan pengamatan morfologi koloni bakteri.
Morfologi  koloni  bakteri  yang  ditemukan setelah  dimurnikan  sangat  beragam,  bentuknya ada yang sirkular dan iregular, elevasi bakteri ada yang  cembung  dan  datar,  permukaannya  ada yang  halus  dan  ada  yang  mengkilap.  Bentuk pinggir  atau  marginnya  ada  yang  bulat  penuh (entire), lobate dan  berombak-ombak  (undulate).
Ukuran koloni bakteri ada yang sedang, kecil dan besar.
Untuk  mengetahui  jenis  bakteri  air  panas yang  diperoleh,  karakterisasi  yang  kedua  setelah pengamatan  morfologi  adalah  dengan  uji  gram.
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 SPC Ket
TN TC TN TC TN TC 79  12  3 - 7,9 x 10 5 TNTC >300 12 dan 3 < 30
Pada  prinsipnya,  uji  gram  adalah  untuk mengelompokkan  bakteri  berdasarkan  reaksi kimia.  Uji  gram  mengelompokkan  bakteri menjadi  dua,  yaitu  bakteri  gram  positif  dan bakteri  gram  negatif.  Uji  gram  yang  dilakukan adalah  dengan  larutan  pewarna  gram  (Gram Stainning).  Pada  saat  sel  bakteri  ditambahkan pewarna  kristal  violet,  maka  sel  bakteri  akan menyerap  pewarna,  interaksi  antara  sel  bakteri dengan  kristal  violet  akan  semakin  kuat  dengan ditambahkan  larutan  iodin.  Pada  saat  dicuci dengan  etanol,  bakteri  gram  positif  akan  tetap mengikat  kompleks  kristal  violet-iodin  sehingga menjadi  berwarna  ungu,  sedangkan  bakteri  gram negatif  akan  kehilangan  kompleks  kristal  violet- iodin  karena  mempunyai  dinding  sel  yang  lebih tipis  dan  menjadi  tidak  berwarna.  Ketika ditambahkan  pewarna  safranin,  maka  bakteri gram  negatif  akan  menyerapnya  dan  berwarna merah muda sedangkan bakteri gram positif tidak akan menyerap pewarna lagi. Kultur bakteri yang digunakan  untuk Gram  staining adalah  kultur muda yang berumur lebih kurang 18 jam (Prescot et al 1990).
Hasil  pewarnaan  gram  menunjukkan  bahwa sebagian  besar  bakteri  air  panas  dari  Air  Panas Bukit  Kili  Ketek  ini  adalah  jenis  bakteri streptobacilli (basilus)  gram  positif,  hanya  dua isolat  yang  merupakan  gram  negatif  yaitu  isolat S1B  dan  S5B.  Salah  satu  isolat  air  panas  S2A jenis  basilus,  gram  positif  dari  hasil  pewarnaan gram  bakteri  yang  berwarna  ungu  ada  pada Gambar 7.
Gambar 7. Foto pewarnaan gram bakteri air panas isolat S2A
Skrining Bakteri Penghasil
Enzim

## Ekstraseluler
Pada  saat  semua  isolat  bakteri  ditumbuhkan dalam  medium nutrient  starch  agar ,  hanya  7 isolat  yang  tumbuh  dengan  menghasilkan  zona bening  setelah  disiram  larutan  iodin,  yaitu  S1A, S2A,  S4A,  S5A,  S6A,  48A  dan  48B.  Hal  ini menunjukkan bahwa 7 isolat tersebut menghasilkan enzim ekstraseluler amilase (Gambar  8).  Isolat  S1A  dan  S2A  menghasilkan indeks  zona  bening  amilase  paling  tinggi,  yaitu 2,5.  Molekul  pati  terdiri  dari  polimer  glukosa yang dihubungkan oleh ikatan α 1-4 dan kadang- kadang  mempunyai  ikatan α  1-6,  ikatan  tersebut dapat dihidrolisis oleh amilase untuk menghasilkan  dekstrin,  glukosa  dan  maltosa. Larutan  iodin  bisa  digunakan  sebagai  indikator ada  tidaknya  molekul  pati  karena  iodin  akan membentuk  kompleks  berwarna  biru  kehitaman dengan  pati.  Munculnya  zona  bening  di  sekitar koloni  bakteri  karena  molekul  pati  telah  dipecah oleh  amilase  sehingga  larutan  iodin  tidak membentuk kompleks lagi dengan pati.

## Gambar 8. Isolasi bakteri termofilik penghasil amilase (A) dan selulase (B) yang diinkubasi pada suhu 52°C selama 24 jam
Semua  isolat  bakteri  yang  ditanam  dalam medium  CMC  menunjukkan  aktifitas  selulase, karena  munculnya  zona  bening  di  sekitar  koloni bakteri  setelah  plate  disiram  dengan  congo  red dan dicuci dengan NaCl 1 M (Gambar 8). Congo red  dapat  dijadikan  sebagai  indikator  adanya selulosa  karena  dapat  berikatan  secara  non kovalen  dengan  serat  selulosa  (Abdelnasser  dan Ahmed,  2007).  Dari  hasil  uji  dengan  CMC menunjukkan  bahwa  semua  isolat  bakteri  yang berhasil diisolasi mempunyai kemampuan menghasilkan selulase. 8 isolat yang mempunyai indeks  zona  bening  paling  tinggi  adalah  S1A,
S2A,  S3A,  S2A,  S5A,  S6A,  48A  dan  48B.  Hal inilah yang menjadi alasan penelitian selanjutnya yaitu  untuk  mencari  isolat  bakteri  yang mempunyai aktifitas selulase paling tinggi.
Selulase adalah enzim yang dapat menghidrolisis  selulosa.  Homopolimer  selulosa disusun oleh anhydro-D-glucosa yang dihubungkan  oleh  ikatan  ß-1,4  dan  merupakan biopolymer yang  paling  banyak  di  alam. Degradasi selulosa menjadi glukosa membutuhkan  gabungan  atau  aksi  kerjasama  3 enzim,  yaitu; endo-1,4ß-glucanase , exo-1,4ß- glucanase dan ß-glucosidase . CMC (Carboxymethyl  cellulose)  adalah  substrat  untuk mengetahui  aksi  enzim endo-1,4ß-glucanase (Bhat  and  Bhat  1997).  Oleh  karena  itu,  bakteri yang  menghasilkan  zona  bening  pada  medium CMC  tersebut  menghasilkan  enzim endo-1,4ß- glucanase (CMCase).  S2A  adalah  isolat  yang mempunyai  aktifitas  selulase  paling  tinggi dibandingkan  dari  7  isolat  yang  lain  karena mempunyai  indeks  zona  bening  selulase  lebih tinggi  yaitu  2,6.  Disamping  itu,  isolat  S2A  juga menghasilkan amilase tinggi dengan indeks zona bening amilase 2,5.

## Identifikasi Bakteri Air Panas S2A dengan Analisis Gen 16S rRNA
Identifikasi  isolat  S2A  sebagai  isolat  pilihan adalah  berdasarkan  pada  sekuen  Gen  16S Ribosomal RNA. Gen 16S sRNA adalah subunit ribosom  yang  dapat  digunakan  sebagai  penanda, pembeda  dan  sebagai evolutionary  marker pada bakteri.
Gambar 9. Isolasi DNA Genomik Isolat S2A
DNA  bakteri  yang  diperoleh  dijadikan templat  untuk  reaksi  PCR.  Primer  yang digunakan  untuk  mengamplifikasi  DNA  adalah:
8F  (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)  dan 1541R (5’AAGGAGGTGATCCAGCC).
Kedua primer ini telah digunakan oleh Liang dan Lungisa (2009) untuk mengamplifikasi DNA bakteri  jenis  basilus  dan  menghasilkan  produk 1450  bp.  Selain  itu  primer  ini  juga  telah digunakan  oleh  Youseuf  dan  kawan-kawan (2009)  untuk  mengamplifikasi  Gen  16S  rRNA strain  basilus.  Hasil  amplifikasi  PCR  gen  16S rRNA  isolat  bakteri  air  panas  S2A  dengan menggunakan primer 8F dan 1541R adalah 1500 bp (Gambar 9 nomor 4).
Hasil  penggabungan  sekuensing  8F  dan 1541R  dibandingkan  dengan  data  GeneBank melalui program BLAST. Persen identitas bakteri air panas S2A yang diperoleh adalah 97% dengan Anoxybacillus flavithermus strain AE3, Anoxybacillus sp. SW, Bacillus sp YMY1010 dan Anoxybacillus flavithermus  strain  B dengan  E value  0,0.  Berdasarkan  persen  identitas  dan  E value  yang  diperoleh  maka  untuk  identifikasi isolat  S2A  diambil  yang  mempunyai  persen identitas  yang  lebih  besar  dan  mempunyai  nilai harapan  (E  value)  nol  dan query  coverage yang lebih besar, maka isolat S2A adalah mirip dengan Anoxybacillus  flavithermus  strain  AE3 .  Isolat  ini ditemukan  pada  Air  Panas  Geotermal  Tunisia (2010) dengan jumlah basa 1524 bp.
Gambar 10. Filogenetik Isolat Bakteri Air Panas S2A

## 4. KESIMPULAN
Dari  penelitian  yang  telah  dilakukan  dapat disimpulkan bahwa:
1. Isolat  bakteri  air  panas  S2A  adalah  jenis isolat baru yang mempunyai kemiripan 97%
dengan Anoxybacillus  flavithermus  strain AE3 .
2. Isolat  bakteri  air  panas  S2A  mempunyai kemampuan menghasilkan enzim
ektraseluler  selulase  dan  amilase  dengan
indeks  zona  bening  masing-masingnya  2,6 dan 2,5.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
Abdelnasser,  Ahmed,  2007. Isolation  and Identification  of  New  Cellulases  Producing Thermophilic  Bacteria  from  an  Egyptian Hot  Springs  and  Some  Properties  of  the Crude  Enzyme .  Australian  Journal  of  Basic and Applied Science, 1(4). 473-478. Bayoumi.  Ra,  Loubodey,  2007. Production,
Purification and Characterization of Thermophilic Lipase for Application in Bio-
Detergent  Industry .  Journal  of  Applied Sciences Research, 3(12): 1752-1765. Bhat,  MK  dan  S.  Bhat,  1997. Cellulose Degrading  Enzymes  and  Their  Potential Industrial Application . Biotechnol. Adv. 15:
583-620. Elnasser  Ziad,  Maraqa  A,  2007. Isolation  and Characterization of New ThermophilicBacteria in Jordan . The
Internet  Journal  of  Microbiology.  Vol  3. No.2.
Nora.S et  al ,  2004. Cellulase  Fermentation  an  a novel  substrate  and  Subsequent  Utilization of Home-Produced
Cellulase and Commercial  Amylase  I  Rabbit  Feeding
Trial . Science Direct. Vol 20. Issue 1. 49-57.
Nunes.  A,  Martin,  2001. Isolation,  Properties and  Kinetics  of  Growth  of  Thermophilic Bacillus. Brazillian Journal of Microbiology. 32: 271-275.
Nyoman  Tika,  Redhana,  Ristiati,  2007.  Isolasi enzim  Lipase  Termostabil  dari  Bakteri Termofilik  Isolat  Air  Panas  Banyu  Wedang Kecamatan  Gerogak  Buleleng  Bali.  Akta Kimia. Vol 2.No: 109-112.
Prescot,  Harley,  Klein,  1990. Microbiology .
Second edition. WCB Publisher. England.
Puspaningsih N, 2007. Enzim Fibrolitik: Manfaat dan  Prospek  Pengembangannya .  FMIPA. UNAIR.
Sambrook.  J,  Fritsch,  Maniatis,  1989. Molecular Cloning . A Laboratory Manual.Edisi Kedua. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sevante  Arreneuz,  2002. Identifikasi  Bakteri Termofilik  Isolat  Rimbo  Panti  dengan Penentuan  Urutan  dan  Analisis  Gen  16S rRNA . Jurusan Kimia. Program Pascasarjana Universitas Andalas.
Yoseuf  K,  Khodadady,  Ganjidoust,  Badkoubi,
Amoozegar, 2009. Isolation and
Characterization of a Novel Native Bacillus Strain  Capable  of  Degrading  Diesel  Fuel . International  Journal  of  Environment  and Science Technology. 6(3): 435-444.