Tersedia  online  di:  http://ejournal-balitbang.kkp.go.id/index.php/jra
# Korespondensi:  Balai  Uji  Standar  Karantina  Ikan  Pengendalian Mutu  dan  Keamanan  Hasil  Perikanan.  Jalan  Raya  Setu  No.  1, Setu  Cipayung,  RT.  3/RW.  3,  Setu,  Jakarta  Timur  13880, Indonesia Tel.  +  62  813  41970042 E-mail:  rhomes2011@yahoo.com

## DETEKSI Vibrio parahaemolyticus MENGGUNAKAN MARKA GEN PirA PADA UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei) DENGAN REAL TIME PCR
Ronald  Kriston  Sauttua  Nainggolan *)# ,  Munti  Yuhana **) ,  Sukenda **) ,  dan  Woro  Nur  Endang  Sariati *)
*) Balai Uji Standar Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Jalan Raya Setu No. 1, Setu Cipayung, RT. 3/RW. 3, Setu, Jakarta Timur 13880
**) Institut Pertanian Bogor Kampus  IPB Dramaga, Jl. Raya Dramaga, Babakan, Dramaga, Babakan, Kec.  Dramaga, Bogor, Jawa Barat 16680
(Naskah diterima: 26 Februari 2019; Revisi final: 8 Agustus 2019; Disetujui publikasi: 8 Agustus 2019)

## ABSTRAK
Pengujian validitas deteksi Vibrio parahaemolyticus strain AHPND pada udang vaname (Litopenaeus vannamei) dengan metode real time PCR dilakukan melalui tahapan pengujian yang mencakup spesifisitas, sensitivitas, repitabilitas, reproduktivitas, dan uji lapang pada tambak-tambak udang vaname di Indonesia. Uji performa analitik menunjukkan bahwa metode real time PCR dengan penciri gen VpPirA spesifik dalam mendeteksi V. parahaemolyticus strain AHPD dan memiliki sensitivitas hingga 10 kopi µ L -1 . Nilai cut off metode qPCR primer VpPirA adalah di Ct 39. Metode real time PCR dengan primer spesifik VpPirA juga memiliki nilai repitabilitas dan reproduktivitas yang baik dalam mendeteksi V.  parahaemolyticus strain AHPND. Semua pengujian performa analitik metode qPCR telah memenuhi syarat keberterimaan dan dapat digunakan sebagai metode pengujian untuk mendeteksi V. parahaemolyticus strain AHPND. Hasil uji lapang untuk seluruh sampel yang berasal dari tambak  udang  vaname  menunjukkan  hasil  negatif  terinfeksi V.  parahaemolyticus  strain  AHPND.  Studi  ini menyarankan bahwa metode real time PCR efektif dan valid dalam mendeteksi V. parahaemolyticus strain AHPND.
KATA KUNCI: Vibrio parahaemolyticus strain AHPND; Litopenaeus vannamei; real time PCR; deteksi
ABSTRACT: Detection of Vibrio parahaemolyticus using PirA gen mark in whiteleg shrimp, Litopenaeus vannamei with real-time PCR. By: Ronald Kriston Sauttua Nainggolan, Munti Yuhana, Sukenda, and Woro Nur Endang Sariati
Testing the validity of Vibrio parahaemolyticus AHPND (Vp AHPND) strain detection in whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei) by real-time PCR method was carried out through several stages including specificity, sensitivity, repeatability, reproducibility, and sampling field tests in shrimp ponds in Indonesia. Analytical performance test showed that the use of real-time PCR method with VpPirA primer was effective in detecting Vp AHPND strain and had a sensitivity of up to 10 copies µL -1 . The cut off value qPCR method of the primer VpPirA is at Ct 39. The real-time PCR method using VpPirA primer also has good repeatability and reproducibility values in detecting Vp AHPND strain. All analytical performance testings of the qPCR method meet the standard requirements to detect Vp AHPND strain. The result of field tests for all whiteleg shrimp samples from the shrimp ponds revealed negative infection of Vp AHPND. This study suggests that the real time PCR is effective and valid in detecting V. parahaemolyticus AHPND strain.
KEYWORDS: Vibrio parahaemolyticus AHPND strain; Litopenaeus vannamei; real-time PCR; detection

## PENDAHULUAN
Udang adalah produk perikanan andalan Indonesia yang menjadi komoditas ekspor, salah satu jenis yang paling dominan untuk diekspor adalah udang vaname.
Pada  tahun  2009  di  Negara  Cina,  budidaya  udang vaname  (L.  vannamei)  menghadapi  kendala  dengan munculnya kasus kematian dini yang menyerang udang sekitar  hari  ke-30  setelah  penebaran  pada  kolam pemeliharaan yang ditandai dengan kerusakan pada hepatopankreas  (nekrosis  hepatopankreatik  akut). Awalnya penyakit ini disebut sindrom kematian dini (EMS/early  mortality  syndrome),  tetapi  setelah ditemukannya  Vibrio  parahaemolyticus  strain  unik penyebab  dari  penyakit  ini,  nama  penyakit  dirubah
menjadi nekrosis hepatopankreatik akut atau disebut dengan acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) (Sirikharin et al., 2015; Tran et al., 2013). Oleh karena itu, spesies Vibrio spp. penyebab penyakit AHPND pada udang  vaname  disebut  V.  parahaemolyticus  strain AHPND. V. parahaemolyticus strain AHPND pada udang vaname memiliki kelompok gen tdh dan trh yang dapat menghasilkan toksin Pir A/B penyebab kerusakan pada hepatopankreas  dan mengakibatkan  kematian  pada udang.
Real time PCR adalah sebuah metode yang mengikuti konsep  PCR  konvensional  namun  dapat  melakukan pengukuran produk PCR secara langsung saat proses terjadi.  Metode  ini  biasa  digunakan  untuk  deteksi patogen  baik  dalam  penelitian  atau  proses mendiagnosis. Real time PCR menggabungkan bahan- bahan kimia PCR dengan fluorescent probe atau pewarna DNA  seperti  sybr  green,  sehingga  memungkinkan visualisasi produk yang dapat dilihat secara langsung (real time). Metode real time PCR memberikan tingkat sensitivitas  dan  spesifisitas  tinggi,  dan  kemudahan dan  kecepatan  dalam  proses  perancangan  dan penyiapan  qPCR  menjadikannya  sebagai  metode  uji kuantitatif yang efisien dan efektif. Amplifikasi qPCR dilakukan dalam kondisi tertutup sehingga mengurangi kemungkinan kontaminasi (Walters, 2012). Pada awal penggunaan metode biomolekular untuk mendeteksi AHPND hanya dengan PCR konvensional yaitu dengan primer AP1 dan AP2 (Flegel  Lo, 2013) dan kemudian primer AP3 (Sirikharin et al., 2014). Han et al. (2015) membuat terobosan mendesain primer VpPirA real time PCR untuk mendeteksi AHPND dan membandingkannya dengan primer AP3 single step pada PCR konvensional, yang hasilnya primer VpPirA real time PCR lebih sensitif, spesifik, dan efisien daripada primer AP3 single step PCR konvensional. Dangtip et al. (2015) mendesain primer baru AP4 nested PCR konvensional untuk mendeteksi AHPND yang lebih baik dari primer AP3  single  step.  Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan penelitian untuk menguji validitas primer VpPirA real time PCR.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan  Uji
Genom DNA V. parahaemolyticus strain AHPND yang digunakan  merupakan  hasil  ekstraksi  dari  reference material sampel uji profisiensi Australian Animal Health Laboratory berupa fiksatif jaringan yang di-spike bakteri V.  parahaemolyticus  strain  AHPND.  Proses  ekstraksi DNA untuk pengujian dilakukan sesuai protokol Qiagen Dneasy  Blood  and  Tissue  Kit  Extraction  (Qiagen, Singapura).  Pengujian  spesifisitas  menggunakan  V. parahaemolyticus  non  AHPND  ATCC  (American  Type
Culture Collection) 17802, V. alginolyticus ATCC 33782, V.  harveyi  ATCC  43515,  dan  Vibrio  vulnificus  ATCC 27562.  Uji spesifisitas  juga menggunakan  beberapa patogen pada udang vaname, yaitu white spot syndrome virus (WSSV),  infectious  hypodermal and  hematopoietic necrosis  virus  (IHHNV),  infectious  myonecrosis  virus (IMNV), enterocytozoon hepatopenaei (EHP), dan Sacbrood virus  (SBV).

## Deteksi  V.  parahaemolyticus  dengan  PCR Konvensional
Deteksi  V.  parahaemolyticus  menggunakan  PCR konvensional dengan primer AP4 yang terdiri atas dua tahapan (Dangtip  et  al.,  2015),  yaitu  tahap  pertama dengan formulasi bahan amplifikasi menggunakan Go taq  green TM Master  Mix 12,5  µL; primer  AP4-F1  (52 ­ATGAGTAACA  A  T  A  TAAAACATGAAAC-3 2);  dan primer  AP4-R1  (52 ­ATGAGTAACAA T  A  T  A  A AACATGAAAC-32 ) masing-masing sebanyak 1 µL, DNA template 3  µL,  dan nuclease-free  water  (NFW)  hingga volume  total  reaksi  25  µL.  Profil  termal  amplifikasi menggunakan suhu denaturasi awal 94°C selama dua menit, kemudian diikuti dengan 30 siklus yang terdiri atas suhu denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 55°C  selama  30  detik,  dan  elongasi  72°C  selama  90 detik.
Formulasi PCR konvensional AP4 tahap dua adalah dengan  mereaksikan  Go  taq  green TM Master  Mix sebanyak 12,5 µL; primer AP4-F2 (52 -TTGAGAATACGG GACGTGGG-32)  dan  primer  AP4-R2  (52  - GTTAGTCATGTGAGCACCTTC-32)  masing-masing sebanyak 1 µL, DNA template (yang merupakan amplikon tahap  pertama)  sebanyak  3  µL,  dan  NFW  hingga volume  total  reaksi  25  µL.  Profil  termal  amplifikasi tahap kedua adalah menggunakan suhu denaturasi awal 94°C selama dua menit, kemudian diikuti dengan 30 siklus yang terdiri atas suhu denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 55°C selama 30 detik, dan elongasi 72°C selama 90 detik.

## Deteksi V.  parahaemolyticus dengan  Real  Time PCR
Formulasi  bahan amplifikasi  real time  PCR  untuk volume total 25 µL (Han et al., 2015) adalah Qiagen master mix DNA probe 12,5 µL; primer VpPirA-F (52 - TTGGACTGTCGAACCAAACG-32)  dan  VpPirA-R  (52  - GCACCCCATTGGTAT  TGAATG-32)  masing-masing dengan  volume  0,5  µL;  Vp PirA  probe  (52  -6FAM- AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGA-TAMRA-32) 0,5  µL ;  DNA  template 2  µL,  dan  NFW.  Profil  termal amplifikasi adalah 20 detik inkubasi pada suhu 95°C diikuti dengan 45 siklus yang terdiri atas denaturasi 95°C selama tiga detik, annealing 60°C selama 30 detik, elongasi 72°C selama 60 detik.

## Spesifisitas  Analitik
Spesifitas  analitik  dilakukan  pada  contoh  uji jaringan  udang  vaname  yang  negatif  gen  penyandi toksin  PirA,  beberapa  spesies  bakteri  seperti  Vibrio parahaemolyticus  non  AHPND,  V.  alginolyticus,  V. vulnificus,  V.  harveyi,  WSSV,  IHHNV,  IMNV,  EHP,  dan SBV.  Spesifisitas  analitik  juga  dinilai  dengan mendeteksi  plasmid  DNA  V.  parahaemolyticus  strain AHPND sebanyak 100 µL yang telah di- spike dengan 0,02  g  spesimen  hepatopankreas  dan  saluran pencernaan udang vaname.

## Sensitivitas  Analitik
Sensitivitas analitik dilakukan dengan menguji lima seri  pengenceran  plasmid  DNA  V.  parahaemolyticus strain AHPND, yaitu 10 1 kopi µL -1 sampai dengan 10 5 kopi µL -1 . Setiap pengenceran dilakukan pengulangan sebanyak tiga kali, dan pengujian dilakukan dengan metode qPCR dan PCR konvensional. Hasil pengujian LoD dan kurva standar digunakan sebagai acuan dalam menentukan nilai cut off (Caraguel et al., 2011).

## Keterulangan  (Repeatability)  dan  Ketertiruan (Reproducibility)
Penentuan  variabilitas  repitabilitas  dilakukan dengan  cara,  tiga  konsentrasi  plasmid  DNA mengandung gen penyandi toksin PirA (10 6 kopi µL -1 ; 10 4 kopi  µL -1 ;  dan  10 3 kopi  µL -1 )  diuji  duplicate menggunakan  PCR  konvensional  dan  qPCR  dalam waktu  yang  bersamaan  (intra  assay).  Pengujian reprodusibilitas dilakukan dengan menggunakan tiga konsentrasi  plasmid  DNA  yang  mengandung  gen penyandi toksin PirA (10 6 kopi µL -1 ; 10 4 kopi µL -1 ; dan 10 3 kopi  µL -1 )  diuji  oleh  enam  analisis  berbeda menggunakan  PCR  konvensional  dan  qPCR  dalam perbedaan jangka waktu dua hari (inter assay).

## Uji  Lapang
Evaluasi  performa  dan  realibilitas  metode pengujian  terhadap  spesimen  klinis,  sebanyak  69 sampel  udang  diambil  dari  sentral  tambak  udang vaname di Provinsi Jawa Barat (14 sampel), Lampung (19  sampel),  Sumatera  Utara  (lima  sampel),  Nusa Tenggara  Barat  (lima  sampel),  Sulawesi  Selatan  (12 sampel), Pekan Baru (lima sampel), Jawa Timur (empat sampel),  uji  profisiensi  AAHL  (tiga  sampel),  dan  uji profisiensi Arizona (dua sampel). Data hasil pengujian qPCR  dimasukkan  ke  dalam  perhitungan  diagnostic specificity (DSp) dan diagnostic sensitivity (DSe) sesuai pada Tabel 1.

## Analisis  Data
Data  yang  diperoleh  merupakan  data  deskriptif dengan melihat persentase koefisien varians (CV%).

## HASIL DAN BAHASAN

## Pembuatan  Kontrol  Positif  dan  Kurva  Standar
Pengujian validitas dalam mendeteksi gen penyandi toksin PirA dengan menggunakan metode real time PCR diawali dengan pembuatan kontrol positif berupa plas- mid  DNA  V.  parahaemolyticus  strain  AHPND.  Kontrol positif berupa plasmid DNA V. parahaemolyticus strain AHPND  mempunyai  konsentrasi  33,5  ng/µL  ±  STD 0,7616 (Tabel 2), kemudian konsentrasi plasmid DNA dikonversi ke dalam jumlah kopi yang akan digunakan sebagai kontrol positif adalah 6 x 10 9 kopi µL -1 . Tujuan pembuatan  plasmid  DNA  adalah  untuk  membuat konsentrasi DNA menjadi stabil, sesuai dengan Banu Prasad (2017) yang menyatakan bahwa fragmen DNA yang disisipkan ke dalam plasmid dengan kompabilitas antar keduanya akan menyebabkan kestabilan terhadap plasmid  DNA  yang  terbentuk.  Kontrol  positif digunakan  dalam  membuat  kurva  standar  untuk kuantifikasi pengujian qPCR primer VpPirA dan sebagai acuan dalam melakukan tahapan-tahapan pengujian performa analitikal.
Linearitas  dan  efisiensi reaksi  qPCR  berdasarkan kurva  standar  pada  pengenceran  plasmid  DNA  V. parahaemolyticus strain AHPND menunjukkan hubungan linear lima logaritma pengenceran dari 6 x 10 5 kopi µL -1 sampai dengan 6 x 10 1 kopi µL -1 . Persamaan kurva standar  deteksi  gen  penyandi  toksin  PirA  metode qPCR adalah Ct = -3.472*log (konsentrasi) + 42.714, nilai efisiensi amplifikasi (E) sebesar 0,9409; dan nilai koefisien  korelasi  (R 2 )  sebesar  0,99857.  Hasil pembentukan  kurva  standar  meode  qPCR  primer VpPirA  sesuai  dengan  Bustin  et  al.  (2009)  yang menyatakan  bahwa  efisiensi  pengujian  qPCR ditentukan  dari  kemiringan  kurva  regresi  linear dengan nilai maksimum satu atau setara dengan 100%, dan Scholtens et al. (2010) yang menyatakan bahwa nilai kemiringan  antar Ct pada metode  qPCR primer PirA  adalah  -3,472;  menunjukkan  tingkat  efisiensi tinggi yang sesuai dengan kriteria kemiringan Ct yang berkisar  antara  -3,1  sampai  -3,6.  Pembuatan  kurva standar  metode  qPCR  dibutuhkan  untuk memperkirakan  konsentrasi  sampel  yang  diuji sehingga dapat digunakan untuk menentukan tingkat infeksi suatu patogen (Muniesa et al., 2014).

## Spesifisitas  Analitikal
Pengujian  performa  analtikal  dimulai  dengan penilaian  spesifisitas  metode qPCR  mendeteksi  gen penyandi toksin PirA. Hasil uji spesifisitas qPCR primer PirA terhadap spesimen jaringan udang vaname sehat adalah 100% negatif (Gambar 1) dan hasil 100% positif terhadap udang yang di-spike dengan plasmid DNA V. parahaemolyticus  strain  AHPND  (Gambar  2),
menunjukkan  bahwa  metode  qPCR  primer  VpPirA bersifat  selektif  karena  tidak  bereaksi  terhadap matriks sampel berupa DNA atau RNA udang. Sesuai dengan  OIE  (2018) yang  menyatakan  suatu  metode dikatakan  selektif  apabila  secara  akurat  dapat mendeteksi  target  dalam  kehadiran  komponen matriks (inang) dan penghambat reaksi (reagen).
Deteksi  gen  penyandi  toksin  VpPirA  dengan metode qPCR dan PCR konvensional pada beberapa spesies Vibrio spp. dan penyakit udang vaname lainnya memperoleh hasil negatif (Gambar 3), menunjukkan bahwa  metode  qPCR  primer  VpPirA  tidak  bereaksi silang (cross reactive) terhadap berbagai spesies Vibrio spp.  dan  penyakit  udang  vaname  lainnya,  sehingga bersifat  spesifik.  Sesuai  dengan  OIE  (2018)  yang menyatakan bahwa seuatu metode dikatakan eksklusif apabila dapat mendeteksi analit atau sekuen genomik organisme target, dan tidak bereaksi silang terhadap
analit  atau  sekuen  organisme  non-target  (seperti patogen lain yang berada pada inang yang sama). Hasil penilaian  spesifisitas  metode qPCR  mendeteksi  gen penyandi  toksin  VpPirA  telah  memenuhi  syarat keberterimaan  sebagai  suatu  metode  uji,  sehingga dilakukan  penilaian  performa  analitik  berikutnya berupa  sensitivitas.

## Sensitivitas  Analitikal
Performa sensitivitas analitik metode qPCR primer VpPirA  dinilai  berdasarkan  penentuan  limit  deteksi (limit of detection, LoD), yaitu konsentrasi plasmid DNA terendah yang dapat dideteksi oleh qPCR (Shrivastava Gupta, 2015). Hasil LoD metode qPCR adalah 6 x 10 1 kopi µL -1 dan dengan metode PCR konvensional adalah  6  x  10 2 kopi  µL -1 (Gambar  4).  Hasil  LoD menunjukkan  bahwa  qPCR  dengan  primer  VpPirA mampu  mendeteksi  konsentrasi  DNA  yang  lebih
Tabel 1. Perhitungan estimasi diagnostic sensitivity (DSe) dan diagnostic specificity (DSp)

## dari hasil contoh uji udang vaname
Table 1. Estimation  of  diagnostic-test  sensitivity  (Dse)  and  specificity  (DSp)  of  whiteleg shrimp test samples
Tabel 2. Hasil  pengukuran  konsentrasi  kontrol  positif  berupa  plasmid  DNA
V. parahaemolyticus strain AHPND menggunakan GeneQuant®
Table 2. Results  of  measurement  of  positive  control  concentrations  in  the  form  of  DNA plasmid of V. parahaemolyticus AHPND strain using GeneQuant®
Ulangan Repeat Konsentrasi plasmid DNA DNA plasmid concentration  (ng µL -1 ) 1 33.7 2 34.9 3 32.8 4 33.3 5 33.4 6 32.9 x̄ 33.5 STD 0.761577311 Positif Positive Diketahui negatif Known negative Hasil pengujian Test result Positif (Positive ) Benar positif True positive  (TP) Tidak benar positif False positive  (FP) Negatif (Negative ) Tidak benar negatif False negative  (FN) Benar negatif True negative  (TN) Sensitivitas diagnostik Diagnostic sensitivity  (DSe) Spesifisitas diagnostik Diagnostic specificity  (DSp) TP/(TP + FN) TN/(TN + FP) Jumlah contoh uji referensi yang dibutuhkan
Number of reference test samples needed
rendah dibandingkan dengan PCR konvensional primer AP4.  Sensitivitas  qPCR  mendeteksi  gen  penyandi toksin PirA sesuai dengan Bustin et al. (2009); Kralik Ricchi  (2017)  yang  menyatakan  nilai  LoD  dengan metode qPCR dapat mendeteksi hingga 10 kopi µL -1 DNA, namun beberapa faktor yang dapat memengaruhi dalam  penentuan  LoD  di  antaranya  jumlah  ulangan pengujian, persiapan asam nukleat, dan mesin qPCR.
Kurva standar qPCR primer VpPirA memperoleh nilai Ct  terkecil  pada  pengenceran  10 1 kopi  µL -1 sebesar 36,  demikian  pula  dengan  hasil  pengukuran  limit deteksi  (LoD)  diperoleh  nilai  Ct  terkecil  pada pengenceran  yang  sama  sebesar  36.  Mengacu  pada pedoman  penentuan  nilai  cut  off,  maka  nilai  cut  off untuk  deteksi  gen  penyandi  toksin  PirA  dengan metode real time PCR adalah 39. Mengacu pada OIE
Gambar 1. Hasil qPCR primer PirA (a) dan PCR konvensional primer AP4 (b) pada spesimen jaringan udang vaname sehat.
Figure 1. Results of qPCR primer PirA testing (a) and conventional PCR primer AP4 (b) testing on healthy vannamei shrimp tissues. Keterangan: Kontrol positif (1), kontrol negatif (2), spesimen jaringan hepatopankreas dan saluran  pencernaan  (3-11)  udang  vaname  yang  berasal  dari  tambak  udang Pamanukan, Jawa Barat
Note: Positive  control  (1),  negative  control  (2),  hepatopancreas  tissue  and  digestive  tract (3-11)  of  whiteleg  shrimps  originating  from  Pamanukan  shrimp  ponds,  West  Java
Gambar 2. Hasil test qPCR primer PirA (a) dan PCR konvensional primer AP4 (b) pada spesimen jaringan udang yang di-spike plasmid DNA V. parahaemolyticus strain AHPND.
Figure 2. Results  of qPCR  primer  PirA testing  (a)  and conventional  PCR  primer AP4  (b) testing  on  shrimp tissues spiked with plasmid DNA of V. parahaemolyticus AHPND strain.
Keterangan: Kontrol negatif (-), kontrol positif (+), spesimen jaringan (1-5) udang vaname tambak udang  Pamanukan,  yang di-spike plasmid  DNA  V.  parahaemolyticus strain  AHPND Note: Negative  control  (-),  positive  control  (+),  whiteleg  shrimp  tissues  (1-5)  from Pamanukan  shrimp  ponds  spiked  with  plasmid  DNA  of  V.  parahaemolyticus AHPND strain
N o rm . f lu o ro Threshold 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 5     10    15    20    25    30    35    40 Cycle (a)                                           (b) Cycle N o rm . f lu o ro . 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 5     10     15    20    25     30     35    40 Threshold
(a)                                              (b)
(2014), maka untuk hasil pengujian dengan nilai Ct 39  dinyatakan  positif,  sedangkan  nilai  Ct    39 dinyatakan negatif,  dan apabila  nilai Ct  = 39  maka pengujian  harus  diulang.  Performa  sensitivitas analitikal  metode  qPCR  mendeteksi  gen  penyandi toksin  PirA  telah  memenuhi  syarat  keberterimaan, kemudian dilanjutkan dengan penilaian repitabilitas dan reprodusibilitas.

## Keterulangan  (Repeatability)  dan  Ketertiruan
(Reproducibility)
Metode  real  time  PCR  menunjukkan  hasil repitabilitas dan reprodusibilitas yang baik. CV untuk repitabilitas  berkisar  0,635  sampai  dengan  1.718; sedangkan CV untuk reprodusibilitas berkisar 1.618 sampai dengan 1.977 (Tabel 3). Metode qPCR primer VpPirA  menunjukkan  hasil  repitabilitas  dan
Keterangan: Kontrol positif (+), kontrol negatif(-), fragmen DNA WSSV (1-2), fragmen DNA IHHNV (3-4), fragmen DNA IMNV (5-6), fragmen DNA EHP (7-8), fragmen DNA
SBV (9-10)
Note: Positive control (+), negative control (-), WSSV DNA fragments (1-2), IHHNV DNA fragments (3-4), IMNV DNA fragments (5-6), EHP DNA fragments (7-8), SBV DNA fragments  (9-10)
Gambar 3. Pengujian metode: qPCR primer PirA (a) dan PCR konvensional primer AP4 pada beberapa spesies Vibrio spp. (b), qPCR primer PirA (c) dan PCR konvensional  primer  AP4 (d);  pada  beberapa patogen  selain bakteri pada udang vaname.
Figure 3. Test results of PCR methods: qPCR primer PirA (a) and conventional PCR primer AP4 on several Vibrio spp. species (b), qPCR primer PirA (c) and conventional PCR primer AP4 (d); on several non-bacterial pathogens of whiteleg shrimp.
(a)                                           (b) 5     10    15    20     25    30     35   40 Cycle 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 N o rm . f lu o ro Threshold 5     10    15    20    25    30     35   40 Cycle Threshold N o rm . f lu o ro 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 (c)                                              (d)
Keterangan: Kontrol positif  (+), kontrol negatif (-),  isolat  V.  parahaemolyticus non  AHPND (1-2), isolat V. alginolyticus (3-4), isolat V. vulnificus (5-6), isolat V. harveyi (7-8)
Note: Positive  control  (+),  negative  control  (-),  non-AHPND  V.  parahaemolyticus  isolate (1-2), V. alginolyticus isolate (3-4), V. vulnificus isolate (5-6), V. harveyi isolate (7-8)
reprodusibilitas yang baik, sesuai Ebentier et al. (2013) yang  menyatakan  nilai  maksimum  persentase koefisien varian (CV%) untuk repitabilitas (intra assay) adalah  5%,  sedangkan  nilai  maksimum  CV%  untuk reprodusibilitas (inter assay) adalah 10%. Nilai CV inter assay  pada  metode  qPCR  primer  VpPirA  lebih  tinggi dari  intra  assay,  dikarenakan  faktor  analis  yang berbeda-beda  akan  berpengaruh  terhadap  hasil pengujian. Seluruh performa analitikal metode qPCR primer VpPirA telah memenuhi syarat keberterimaan, sehingga dilakukan uji lapang untuk menilai kelayakan metode qPCR terhadap sampel uji udang vaname.

## Uji  Lapang
Hasil  deteksi  gen  penyandi  toksin  PirA  terhadap 69 sampel dengan metode qPCR diperoleh perkiraan sensitivitas diagnostic (DSe) adalah 100%, dan perkiraan spesifisitas diagnostik (DSp) adalah 98,46%. Penilaian hasil  uji  lapang  berupa  perhitungan  sensitivitas diagnostik  (DSe)  dan  spesifisitas  diagnostik  (DSp) menunjukkan performa diagnostik yang sangat baik di  atas  95%,  sehingga  metode  real  time  PCR  primer VpPirA sangat sensitif dan spesifik dalam mendeteksi gen  penyandi  toksin  PirA  pada  udang  vaname  (OIE, 2014; Bustin et al., 2009).
Keterangan: Kontrol negatif (-1-2), plasmid DNA VpAHPND 10 0 kopi µL -1 (01-02), plasmid DNA VpAHPND 10 1 kopi µL -1 (11-12), plasmid DNA VpAHPND 10 2 kopi µL -1 (21-22), plasmid DNA VpAHPND 10 3 kopi µL -1 (31-32), plasmid DNA VpAHPND 10 4 kopi µL -1 (41-42), plasmid DNA VpAHPND 10 5 kopi µL -1 (51-52)
Note:
Negative control (-1-2), VpAHPND DNA plasmids 10 0 copies µL -1 (01-02), VpAHPND DNA plasmids 10 1 copies µL -1 (11-12), VpAHPND DNA plasmids 10 2 copies µL -1 (21-22), VpAHPND DNA plasmids 10 3 copies µL -1 (31-32), VpAHPND DNA plasmids 10 4 copies µL -1 (41-42), VpAHPND DNA plasmids 10 5 copies µL -1 (51-52) Cycle (a)                                                    (b) 5       10      15       20      25       30      35     40 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 N o rm . f lu o ro
Gambar 4. LoD metode qPCR primer PirA 6 x 10 1 kopi µL -1 (a) dan PCR konvensional primer AP4 6 x 10 2 kopi µL -1 (b).
Figure 4. LoD method qPCR primer PirA 6 x 10 1 copies µL -1 (a) and conventional PCR primer AP4 6 x 10 2 copies µL -1 (b).
Tabel 3. Nilai persen koefisien varian  (CV%) pengujian repitabilitas (intra assay)  dan reprodusibilitas (inter assay) dengan qPCR primer PirA
Table 3. Percentage of coefficient variance (CV%) repeatability testing (intra-assay) and re- producibility testing (inter-assay) using qPCR primer PirA Konsentrasi DNA DNA concentration Variabilitas  intra assay Intra assay variability Variabilitas  inter assay Inter assay variability
10 6 kopi µL -1 (10 6 copy µL -1 ) CV% = 1.064 CV% = 1.977 10 4 kopi µL -1 (10 4 copy µL -1 ) CV% = 0.635 CV% = 1.618 10 3 kopi µL -1 (10 3 copy µL -1 ) CV%= 1.718 CV% = 1.744
Hasil uji lapang juga menyatakan bahwa tambak- tambak tempat  pengambilan sampel  udang vaname tidak terdeteksi adanya Vibrio parahaemolyticus strain AHPND.

## KESIMPULAN
Metode  real  time  qPCR  dengan  menggunakan spesifik  primer  VpPirA  telah  divalidasi  dan  dapat digunakan  sebagai  metode  uji  dalam  mendeteksi keberadaan  gen  penyandi  toksin  PirA  pada  udang vaname  (Litopenaeus  vannamei).  Hasil  deteksi  Vibrio parahaemolyticus  strain  AHPND  pada  sampel  udang vaname dari sampel udang tambak tidak terinfeksi Vp AHPND.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  dan  penghargaan  kepada PUSDIK  KP  yang  telah  mendanai  penelitian  ini  dan kepada Balai Uji Standar KIPM yang telah memfasilitasi sebagai tempat penelitian ini dilaksanakan.

## DAFTAR  ACUAN
Banu,  H.    Prasad,  K.P.  (2017).  Role  of  plasmids  in microbiology.  Journal  of  Aquaculture  Research  and Development, 8(1), 1-8.
Bustin,  S.A.,  Benes,  V.,  Garson,  A.,  Hellemans,  J., Hugget,  J.,  Kubista,  M.,  Mueller,  R.,  ....., Wittwer,  C.T.  (2009).  The  MIQE  minimum  infor- mation  for  publication  of  quantitative  real-time PCR  experiments.  Clinical  Chemistry,  55(4), 611-622.
Caraguel, C.G.B., Stryhn, H., Gagne, N., Dohoo, I.R.,
Hammell, K.L. (2011). Selection of a cut off value for  real-time  polymerase  chain  reaction  results to fit a diagnostic purpose: Analytical and epide- miologic  approaches.  Journal  of  Veterinary  Diagn Invest, 23, 2-15.
Dangtip, S., Sirikharin, R., Sanguanrut, P., Thitamadee,
S.,  Sritunyalucksana,  K.,  Taengchaiyaphum,  S.,
Tabel 4. Hasil sampel uji lapang mendeteksi gen penyandi toksin PirA dengan metode qPCR Table 4. Results of field-test samples for detecting PirA toxin encoding genes using qPCR method
Mavichak,  R.,  .....,    Flegel,  T.W.  (2015).  AP4 method  for  two-tube  nested  PCR  detection  of AHPND isolates of Vibrio parahaemolyticus. Aqua- culture Reports, 2, 158-162.
Ebentier,  D.L.,  Hanley,  K.T.,  Cao,  Y.,  Badgley,  B.D., Boehm,  A.B.,  Ervin,  J.S.,  Goodwin,  K.D.,  ....., Sadowsky, M.J. (2013). Evaluation of the repeat- ability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial  source  tracking  methods.  Sciverse Science Direct, 47, 6839-6848.
Flegel, T.W.  Lo, C.F. (2013). Free release of primers for  specific  detection  of  bacterial  isolates  that cause  acute  hepatopancreatic  necrosis  disease (AHPND). Network of Aquaculture Centres in Asia and the Pasific. Thailand.
Han,  J.E.,  Kathy,  F.J.T.,  Carlos,  R.P.,  Brenda  L.W., Lightner, D.V. (2015). qPCR assay for detecting and quantif ying  a  virulence  plasmid  in  acute hepatopancreatic  necrosis  disease  (AHPND)  due to pathogenic Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture, 442, 12-15.
Kralik,  P.    Ricchi,  M.  (2017).  A  basic  guide  to  real time  PCR  in  microbial  diagnostics:  Definitions, parameters,  and  everything.  Frontiers  in  Micro- biology, 8, 1-8.
OIE. (2014). Validation guidelines: Development and optimisation  of  nucleic  acid  detection  assays. Validation Guideline, 3.6.3. OIE Publisher.
OIE. (2018). Manual of diagnostic test for aquatic ani- mals:  Acute  hepatopancreatic  necrosis  disease. Chapter 2.2.1. OIE Publisher.
OIE.  (2018).  Principle  and  methods  of  validation  of diagnostic assays for infectious disease. Chapter 1.1.1. OIE Publisher.
Scholtens,  I.M.J.,  Kok,  E.J.,  Hougs,  L.,  Molenaar,  B., Thissen, J.T.N.M.,  Voet, H.V.D. (2010). Increased efficacy for  in-house validation  of real-time  PCR GMO  detection  methods.  Anal.  Bioanal.  Chem., 396, 2213-2227.
Positif Positive (4) Negatif Negative (65) Positif (Positive ) 4 1 Negatif (Negative ) 0 64 Total 4 65 Deteksi gen penyandi toksin PirA  metode qPCR pasangan primer VpPirAF/R Detection of PirA toxin encoding gene qPCR method in primary pair VpPirAF/R
Nilai benar True value
Shrivastava, A.  Gupta, V.B. (2015). Methods for the determination  of limit  of  detection  and limit  of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists, 2(1), 21-25.
Sirikharin, R., Taengchaiyaphum, S., Sritunyalucksana, K.,  Thitamadee,  S.,  Flegel,  T.,  Mavichak,  R., Proespraiwong,  P.  (2014).  A  new  and  improved PCR  method  for  detection  of  AHPND  bacteria. Published by the Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific, Bangkok, Thailand.
Sirikharin,  R.,  Taengchaiyaphum,  S.,  Sanguanrut,  P., Chi,  T.D.,  Mavichak,  R.,  Proespraiwong,  P., Nuangsaeng, B., .....,  Sritunyalucksana, K. (2015). Characterization  and  PCR  detection  of  binary,
pir-like  toxins  from  Vibrio  parahaemolyticus isolates that cause acute hepatopancreatic necro- sis  disease  (AHPND)  in  shrimp.  Plos  One,  10(5). DOI: 10.1371/journal.pone.0126987.
Tran,  L.,  Linda,  N.,  Rita,  M.R.,  Leone,  L.M.,  Carlos, R.P.,  Kevin,  F.,    Lightner,  D.V.  (2013).  Determi- nation  of  the  infectious  nature  of  the  agent  of acute  hepatopancreatic  necrosis  syndrome affecting  penaeid  shrimp.  Diseases  of  Aquatic Organisms,105, 45-55.
Walters,  S.S.  (2012).  Real-time  PCR  in  clinical diagnostic  settings.  Medical  Microbiology Diagnosis, 1(3). DOI: 10.4172/2161-0703.1000e106.