## Pengembangan instrumen pendukung identifikasi protein berbasis
molecularly imprinted polymer melalui imprinted PMAA-BSA
(Development of supported instrument protein identification based on molecularly imprinted polymer with imprinted PMAA-BSA)

## Annisa Fillaeli dan Marfuatun
Jurusan Pendidikan Kimia FMIPA UNY

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk memudahkan identifikasi protein atau turunannya dalam matriks yang kompleks dengan molecularly imprinted polymer (MIP) yaitu imprinted PMAA-BSA.  PMAA-BSA disintesis dengan  Asam  Metakrilat  (MAA)  sebagai  monomer,  Etilen  Glikol  Dimetakrilat  (EDMA)  sebagai cross- linker ,  BSA  ( Bovine  Serum  Albumin )  sebagai templat e  pencetak  molekul  protein  dengan  benzoil peroksida  (dalam  kloroform  dan  benzena)  dengan  metode  polimerisasi bulk secara  termal. Imprinted PMAA-BSA terbentuk setelah tahap  ekstraksi template BSA dari PMAA-BSA dilakukan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa PMAA-BSA berhasil disintesis dengan komposisi MAA : EDMA : BSA (20 mg/ml) = 5 : 1 : 1 (mol) dengan konsentrasi benzoil peroksida sebesar 0.5 mg/ml.  PMAA-BSA memiliki BM 3440 g/mol, meleleh pada 131,73 0 C, dan terdegradasi secara termal pada 374,98 0 C dengan kehilangan berat hingga 69,78%. Pada spektra IR PMAA-BSA terdapat pita serapan penciri gugus amida sekunder, pada 1634  cm -1 ,  sedangkan  spektra  IR  PMAA  tidak  menunjukkan  profil  tersebut.  Pita  serapan  penciri  amida sekunder pada spektra IR imprinted PMAA-BSA menunjukkan masih ada penciri amida sekunder dengan intensitas  yang  lebih  rendah.    Pengukuran  filtrat  BSA  pada  tahap  pembentukan imprinted PMAA-BSA dan tahap ekstraksinya menunjukkan recovery dan reproducibility terbaik 94,85% dan 8,029% .
Kata kunci: polimer, MIP, BSA

## Abstract
This  research  aimed  at  simplifying  protein  identification  or  its  derivate  in  complex  matrices  by molecularly imprinted polymer (MIP).  The MIP was imprinted PMAA-BSA.  PMAA-BSA were synthesized with MAA as monomer, EDMA as cross-linker, BSA as template, and initiated with benzoyl peroxide (in chloroform and benzene) by using thermally bulk polimerisation method.  The results showed that PMAA- BSA was successfully synthesized with MAA:EDMA:BSA (20 mg/ml) 5:1:1 (mole) composition.  Benzoyl peroxide  concentration  best  performance  was  at  0.5  mg/ml.  The  PMAA-BSA  profile  has  a  molecular weight 3440 g/mol, melting point at 131.73 0 C, and thermal degradation at 374.98 0 C with weight loss up to 69.78%.    IR  spectra  of  PMAA-BSA  showed  the  characteristic  band  as  secondary  amide  group  at  1634 cm -1 while the spectra of pure PMAA has no the band. The band was still found in imprinted PMAA-BSA spectra and indicated that secondary amide character still bound to the polymer although in less intensity. BSA filtrate was measured  while imprinted PMAA-BSA was  synthesized and the extraction showed that recovery and reproducibility were 94.85% and 8.029% respectively.
Key words: polymer, MIP, BSA

## Pendahuluan
Setiap molekul memiliki ciri khas.  Ciri khas  suatu  molekul  jika  dijadikan  sebagai cetakan  pada  suatu  material  maka  akan terbentuk  rongga  komplemen  yang  dapat digunakan untuk mengidentifikasi keberadaaan molekul tersebut dengan cara memerangkapnya  ketika  berada  di  dalam campuran.    Menggunakan  suatu  molekul sebagai  pencetak  merupakan  dasar  bagi pembuatan molecularly  imprinted  polymer (MIP).  MIP  merupakan  teknologi  yang memudahkan kita untuk mensintesis material  dengan  sisi  reseptor  yang  sangat spesifik  terhadap  molekul  target,  karena polimer  tersebut  disiapkan  dengan  adanya molekul  target  sebagai  cetakan  (templat) [1].
Keunggulan  dari  MIP  ini  adalah  lebih mudah dikarakterisasi dan memiliki pendekatan  desain  yang  rasional  [2]. Rasionalisasi  penggunaan  MIP  ini  terletak pada  sensor  yang  berasal  dari  zat  yang akan  ditentukan  kandungannya  di  dalam sampel,  stabilitas  teknis  dan  kimia  yang baik, berbiaya murah dan mudah preparasinya.  Kombinasi  dari  kemampuan MIP  yang  spesifik,  selektif,  stabil,  murah dan  mudah  preparasinya  merupakan  nilai tambah  yang  diinginkan  dalam  analisis kimia.
Penggambaran  pengenalan  molekul secara  spesifik  dan  selektif    tersebut merupakan  proses  dasar  yang  dapat dikembangkan  untuk  mengontrol  langkah pemisahan  pada  material  biologi.    Untuk sampel  biologi,  secara  umum  teknik  MIP akan  efektif  pada  molekul  target  yang  kecil (Mr <1500), sementara teknik untuk molekul yang  lebih  besar  seperti  protein  lebih  sulit [3].
Usaha  sintesis  MIP  untuk  pemisahan protein telah dilakukan dengan menggunakan HSA ( Human Serum
Albumin )  sebagai  sarana  mediasi  untuk membantu  menyeleksi  molekul  target  yang mengandung  protein  atau  turunan  protein dalam  sampel  darah  dengan  bantuan material  berpori.  Pembuatan MIP  ini membutuhkan standar protein (HSA)
sebagai  molekul template ,  suatu  monomer (Akrilamid  atau  Aam)  dan cross-linker (Metilen bisakrilamid) dengan metode
polimerisasi suspensi secara termal menggunakan pengemban silika [4]. Namun demikian, MIP dapat dibuat secara polimerisasi bulk [5]. Polimerisasi bulk dengan  radikal  bebas  merupakan  cara paling  sederhana,  tidak  membutuhkan keahlian  dan  instrumentasi  khusus  untuk membuat MIP [6].
Selain HSA, penggunaan BSA ( Bovine  Serum  Albumin )  juga  umum digunakan sebagai standar protein.
Dengan  karakter  yang  sama,  penelitian  ini menitikberatkan  pada  penggunaan  BSA sebagai  standar  template  untuk  sintesis MIP. Polimer yang akan dicetak menggunakan BSA adalah poli(asam metakrilat)  (PMAA)  dengan  MAA  sebagai monomer  fungsional  dan  EDMA  sebagai cross-linker dalam pendekatan non kovalen melalui proses polimerisasi bulk . MAA dapat berperan  baik  sebagai  donor  maupun akseptor  ikatan  hidrogen  [7],  membentuk ikatan  yang  kuat  dengan  pelarut  yang dipilih, sehingga dapat meningkatkan kapasitas  dan  homogenitas  rongga  yang terbentuk  [8].    PMAA  juga  telah  digunakan untuk MIP guna mengenali ion uranil [9].

## Metode Penelitian
Methacrylic  Acid (MAA) ,  Etilen  Glycol
Dimethacrylate (EDMA) dan Benzoyl
Peroxide dari Merck, Bovine Serum Albumin (BSA) ,  chloroform,  benzene,  reagen  biuret dan akuades dalam  grade  pro  analisa. Penentuan BM dengan viscometer Ostwald, Spektrometer IR digunakan untuk penentuan  gugus  fungsi,  TGA/DTA  untuk profil  termal  polimer,  dan  Spektronik  D-20 untuk  kuantifikasi  kadar  protein.    Sintesis MIP  dimulai  dengan  mencampurkan  MAA dan BSA (dalam  akuades dan buffer fosfat) dengan  perbandingan  1:1,  dihomogenkan dengan  EDMA  dan  benzoil  peroksida (dalam  pelarut  kloroform  dan  benzene dengan  konsentrasi  0,1-1  mg/ml)  dengan perbandingan 1:1 secara berurutan. Proses polimerisasi  dilakukan  dengan  waterbath pada  suhu  37 0 C  selama  20  jam.    Polimer yang  terbentuk  dicuci dengan akuades dan buffer  pospat  hingga  protein  tak  terdeteksi. Kadar  BSA  diukur  menggunakan  metode
biuret  pada  panjang  gelombang  520  nm pada  filtrate  polimerisasi  dan  proses ekstraksi.  Kontrol  dibuat  dengan  cara  yang sama namun tanpa menambahkan BSA.

## Hasil dan Diskusi
Ada  tiga  macam  polimer  yang dipelajari  dalam  penelitian  ini.    Yang pertama  adalah  PMAA,  kemudian  PMAA- BSA  dan  yang  terakhir  adalah imprinted PMAA-BSA  yang  merupakan  bentuk  akhir dari  MIP.    PMAA  dipelajari  sebagai  kontrol polimer  tanpa  penambahan  BSA.    PMAA- BSA  merupakan  polimer  yang  disintesis bersama  antara  MAA,  EDMA  dan  BSA.
Sehingga,  dalam  PMAA-BSA,  diharapkan karakter  BSA  Nampak  sebagai  wujud  dari keberhasilan  memasukkan  templat  BSA  ke dalam  polimer.    Proses  ekstraksi  yang dilakukan  pada  PMAA-BSA  dimaksudkan untuk  menghilangkan  BSA  dari  badan polimer,  sehingga  akan  diperoleh imprinted PMAA-BSA. Karakter polimer yang dipelajari untuk menggambarkan terbentuknya  PMAA-BSA  dalam  studi  ini dilakukan dengan menggunakan cara Ostwald menggunakan pelarut DMF. Keberhasilan  sintesis  PMAA-BSA  ditandai dengan  berat  molekul  yang  terbentuk sebesar  sebesar  23440  g/mol.    Profil  sifat termal  PMAA-BSA  dipelajari  menggunakan DTA-TGA.    Termogram  DTA-TGA  dapat dilihat pada gambar 1.
Termogram PMAA-BSA menunjukkan  titik  leleh  polimer  pada temperatur 131,73 0 C dan mengalami degradasi  termal  pada  374,98 0 C.    Pada 71,50 0 C  polimer  mengalami  kehilangan berat sebesar 10,89%, yang mengindikasikan  adanya  reaksi  dehidrasi. Pada (100 – 300) 0 C PMAA-BSA
menunjukkan kestabilan relatif untuk aplikasi PMAA-BSA. Degradasi termal yang ditandai  kehilangan  berat  kembali  teramati dalam  jumlah  besar  mulai  338,10 0 C-380 0 C sebesar  60,22%.    Setelah  itu  menurun secara  gradual  hingga  suhu  pengamatan terakhir yaitu 550 0 C berat polimer tertinggal sebesar 2,44%.
Studi MIP melalui PMAA-BSA dapat diinisiasi  melalui  2  tahapan  dasar,  yaitu
proses  pencetakan  ( imprinting )  melalui penambahan molekul template saat polimerisasi,  dan  proses  ekstraksi  molekul template dari badan polimer yang terbentuk. Pencetakan  molekul  dapat  dilakukan  pada suatu  bidang  permukaan  yang  telah tersedia  untuk  membentuk  karakter  baru pada  permukaan  tersebut.    Jika  bidang permukaan tersebut berongga atau merupakan sisi suatu rongga, maka molekul pencetak  akan  mempengaruhi  rongga tersebut baik secara fisika maupun kimia.
Proses pencetakan dilakukan melalui  interaksi template secara  langsung dengan monomer. Interaksi antara monomer  dan  molekul template pada  cara ini membuka kemungkinan adanya interaksi gugus  aktif  dari  monomer  maupun  molekul
Gambar 1 . Profil DTA-TGA PMAA-BSA (laju pemanasan 5 0 C/min)
template yang saling terhubung silang.  Hal ini  berarti  molekul template diharapkan memiliki  interaksi  yang  lebih  kuat  terhadap polimer  yang  terbentuk.    Profil  petunjuk adanya interaksi hubung silang terlihat pada hasil  spektra  IR  untuk polimer    yang  masih mengandung  protein  (PMAA-BSA),  yaitu adanya  vibrasi stretching gugus  OH  yang menandakan adanya ikatan hidrogen.
Potensi  ikatan  hidrogen  dapat  berasal  dari hubung  silang  gugus  utama  polimer  dari monomer asam metakrilat, maupun interaksi  antara  polimer  dengan  protein, karena gugus ujung protein juga memungkinkan adanya ikatan hidrogen.
Spektra  polimer  PMAA,  PMAA-BSA dan imprinted PMAA-BSA  dapat  dilihat pada gambar 2.
Ada  beberapa  spektra  utama  pola spektra  IR  BSA  [10]  yang  dijadikan perhatian  yaitu  pada  bilangan  gelombang 3430,  3062,  1715,  dan  1595  cm -1 yang masing-masing bersesuaian  dengan  vibrasi stretching  gugus  OH,  vibrasi  stretching gugus  amida  A  (NH  utama),  vibrasi stretching untuk C=O, dan pasangan vibrasi bending  NH  dan  vibrasi  stretching  CN gugus  amida  II.    Pada  gambar  1  terdapat pita  tajam  pada  1701  cm -1 sebagai  penciri gugus C=O karbonil.  Pita lebar pada 3484 cm -1 timbul  dari  rentangan  OH.  Pita  pada bilangan  gelombang  di  atas  3400  dan  di bawah  3600  cm -1 menandakan  bahwa gugus OH dengan ikatan hidrogen.
Terdapat  pita  penciri  C=C  pada  1634  cm -1 dengan frekuensi sedang.   Terdapat penciri serapan  CH 3 pada  1452  cm -1 .    Pita  pada 2361  cm -1 menunjukkan  adanya  ikatan rangkap  3,  namun  terlalu  lemah  untuk menunjukkan  adanya  gugus  nitril  atau asetilen  tersubstitusi  tunggal,  karena  tidak terdapat  pita  tajam  pada  3300  cm -1 untuk CH  tunggal  dari  gugus –  C  ≡  C  –  H.    Pita
kuat  di  daerah  1200 –  1000  cm -1 menunjukkan
jika pita tersebut
mengindikasikan  adanya  eter.  Hal  ini menunjukkan  system  pelarut  eter  dari monomer dan cross-linker.
Tahap  ke-2  pencetakan  molekul dalam  polimer  menghendaki  pembersihan molekul templat dalam rongga polimer agar modifikasi  rongga  terjejak  molekul  templat yang komplemen.
Rongga  tersebut
selanjutnya dapat digunakan untuk memerangkap  molekul  identik  dengan molekul  templat.      Total  protein  terekstrak dari dalam rongga polimer yang dimulai dari perhitungan  filtrate  BSA  tahap  sintesis PMAA-BSA dan filtrate BSA tahap ekstraksi BSA  dari  PMAA-BSA  sebagai  tahap  ke-2 sintesis untuk mencapai terbentuknya imprinted PMAA-BSA  tidak  menampakkan adanya  penghilangan  total  protein  dalam polimer. Hal ini mengindikasikan terbentuknya kopolimer protein-PMAA, karena  BSA  itu  sendiri  merupakan  protein globular  dengan  berat  molekul  besar  yang merupakan  polimer.    Didukung  pula  oleh hasil  spektra  IR  B(2)  yang  menunjukkan
6 6 9 ,8 3 6 9 8 ,7 2 1 0 0 0 ,9 0 1 0 3 7 ,4 3 1 1 7 7 ,1 7 1 2 2 6 ,4 9 1 3 9 1 ,3 9 1 4 5 1 ,9 1 1 4 8 6 ,9 6 1 7 1 7 ,2 3 1 7 5 9 ,0 5 1 7 8 4 ,8 6 2 3 6 0 ,4 4 3 4 6 5 ,6 2 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 % T ra n s m it ta n c e 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 W avenumbers (c m-1)
Gambar 2 .A.Spektra IR PMAA; B(1). Spektra IR PMAA-BSA; B(2). Spektra IR imprinted PMAA-BSA
A
B 1 2
bahwa  proses  ekstraksi  BSA  dari  polimer hanya menurunkan intensitas spektra penciri  BSA.    Artinya,  dugaan  atas  relasi hubung  silang  yang  kuat  antara template- polimer  ditunjukkan  oleh  spektra  tersebut, dengan masih adanya penciri BSA sebagai pita  amida  sekunder  pada  1634  cm -1 dengan  pergeseran  pengaruh  matriks. Hasil  kuantifikasi  BSA  dalam  filtrat  yang dapat dilihat pada tabel 1 juga menunjukkan masih adanya protein dalam polimer setelah
ekstraksi  ke-4,  yang  tidak  dapat  diperoleh kembali (recovery) hingga 100%, melainkan paling besar hingga 94,85% pada imprinted PMAA-BSA dengan inisiator benzoil peroksida  dalam  pelarut  kloroform.    Jika dibandingkan dengan profil imprinted PMAA-BSA dengan inisiator benzoil peroksida  dalam  pelarut  benzene,  maka benzoil  peroksida  dalam  kloroform  memiliki recovery yang lebih baik. Tabel 1. Profil filtrat tahap sintesis dan tahap ekstraksi Sistem pelarut BP* Kadar BSA   Filtrate  BSA tahap sintesis Filtrat  BSA  tahap  ekstraksi ke- (mg/ml) Total  BSA terekstrak Recovery  Reproduci bility I II III IV Kloroform 20 mg/ml 7,91 mg/ml 7,17 1,74 1,78 0,37 18,97 94,85% 8,029% Benzene  20 mg/ml 6.19  mg/ml 0,68 0,35 0,16 0,90 8,28 41.4% 11,32% Tabel 1 menunjukkan bahwa
imprinted PMAA-BSA  dalam  BP-kloroform memiliki  performa  recovery  yang  lebih  baik karena memiliki angka di atas 90%, namun kurang reproducible karena  menunjukkan angka reproducibility 8,029%  yang  berarti lebih dari 5,6% untuk orde konsentrasi  10 -3 dengan  metode  standar.  Namun  demikian hasil  ini  juga  mengindikasikan  bahwa  MIP yang  disintesis  menggunakan  molekul besar seperti protein sebagai templat dapat digunakan  untuk  memodifikasi  rongga protein, sehingga jalan menuju sintesis MIP dengan  recovery  dan  reproducibility  yang lebih baik semakin terbuka.

## Kesimpulan
Studi  pengembangan  instrumen pengidentifikasi  protein  melalui  sintesis imprinted PMAA-BSA  berhasil  dilakukan dengan  komposisi  MAA:EDMA:BSA  (20 mg/ml) = 5:1:1 (mol) dengan konsentrasi BP sebesar  0.5  mg/ml  (dalam  kloroform  dan benzena).  Karakter polimer yang dihasilkan adalah  BM  sebesar  3440  g/mol,  terdapat penciri  amida  sekunder  pada  PMAA-BSA dan  mengalami  degradasi  termal  pada 374,98%.    Recovery  dan  reproducibility
sintesis imprinted PMAA-BSA terbaik sebesar 94,85% dan 8,029%.

## Ucapan Terima Kasih
Penelitian  ini  didanai  oleh  DIPA UNY  dalam  skim  penelitian  Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam dosen yunior.

## Pustaka
[1].  C.M.  Lok,  R.  Son.  International  Food Research Journal 16(2009) 127-140.
[2].  Huang Yong-xing, Lian Hui-ting, Sun Xiang-ying and Liu Bin. Chem. Res. Chinese Universities 2011, 27(1), 28 — 33
[3].  Turner,  N.W.,  Christopher  W.  Jeans, Keith  R.  Brain, Christopher  J.  Allender, Vladimir  Hlady,  and  David  W.  Britt. Biotechnol  Prog .  2006;  22(6):  1474 – 148.
[4].  Ali  Nematollahzadeh,  Wei  Sun,  Carla S.A.  Aureliano,  Dirk  Lutkemeyer,  Jorg Stute,  Mohammad  J.  Abdekhodaie, Akbar  Shojaei,  and  Borje  Sellergren. Angewandte Chemie International Edition 50(2011) 495-498.
[5].  Pérez-Moral,N dan Mayes, A.G.
Analytica Chimica Acta 504 (2004) 15 –
21.
[6].  Hongyuan  Yan  dan  Kyung  Ho  Row. Characteristic  and  Synthetic  Approach of Molecularly Imprinted Polymer. Int. J. Mol. Sci. 2006,7, 155-178.
[7].  Patrick  T.Valano,  Vincent  T.Remcho. Journal  of  Chromatography  A , 887 (2000) 125-135.
[8].  Christine  Widstrand,  Ecevit  Yilmaz, Brian Boyd, Johan Billing, dan Anthony
Rees.  American  Laboratory  News.
October 2006. [9].  Galiya  S.  Azhgozhinova,Olgun  Güven, Nursel Pekel, Artem V. Dubolazov,Grigoriy A. Mun, Zauresh S. Nurkeeva.  Journal  of  Colloid  and
Interface Science 278 (2004) 155 –159.
[10].  J.  Grdadolnik,  Bull.  Chem.  Technol. Macedonia. 21(2002) 23-24.