AKTIVITAS FRAKSI ETANOL DAUN SIRSAK ( Annona muricata Linn.) SEBAGAI PENGHAMBATASETILKOLINESTERASE
Antonius Padua Ratu 1,2) , Siswa Setyahadi 3) , Partomuan Simanjuntak 4) 1 Program Studi Magister Ilmu Kefarmasian Fakultas Farmasi Universitas Pancasila Jakarta email :antoniuspaduaratu@gmail.com
2 Sekolah Tinggi Teknologi Industri dan Farmasi Bogor-16151 3 Pusat Teknologi Bioindustri, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi, Laptiab, Kawasan Puspitek, Serpong-15314
4 Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong, Bogor- 16912

## Abstrak
Alzheimer Disease (AD) adalah jenis penyakit yang umum dari dimensia yang menggambarkan kondisi ketika sel-sel saraf (neuron) di otak mati dan tidak lagi berfungsi normal. Kematian dan kerusakan neuron menyebabkan perubahan memori, perilaku dan kemampuan berpikir jernih.Penhambatan asetilkolinesetrase (AChE) dapat dinaikkan jumlah neurotransmitter dan fungsinya. Ini menjadi dasar bahwa peningkatan ketersediaan asetilkolin (ACh) di reseptor acetilkolin dalam otak, menyebabkan neuron mudah ditranspor sehingga meningkatkan fungsi kognitif. Penelitian aktivitas dari fraksi aktif daun sirsak in vitro sebagai penghambat AChE dan kinetika penghambatannya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui mempunyai aktivitas penghambatan AChE dan kinetikannya dalam pengobatan AD.Pengujian aktivitas penghambatan AChE dilakukan berdasarkan metode Ellman.Metode ini menggunakan prinsip hidrolisis reaksi substrat ATCh oleh AChE dengan DNTB yang memberikan warna kuning dan diukur serapannya pada panjang gelombang 410  5 nm. Hasil pengujian penghambatanAChE menunjukkan bahwa Fr.Etanol dari daun Annona muricata Linn. memberikanpenghambatan tertinggi dengan nilai IC 50 sebesar 69.927 mg/L. Hasil fraksinasi
Fr.Etanol.1.2.1 mempunyai nilai penghambatan AChE tertinggi dengan nilai IC 50 3.651 mg/L. Sementara itu, positif kontrol donepezil HCl dengan nilai IC 50 sebesar 0.016 mg/L. Kinetika Fr.Etanol.1.2.1 terhadap penghambatan AChEadalah kompetitif.
Kata kunci : Alzheimer, Annona muricata Linn., Asetilkolin, Asetilkolinesterase, Kinetika
1. Pendahuluan Alzheimer Disease (AD) adalah jenis penyakit yang umum dari dimensia yang menggambarkan kondisi ketika sel-sel saraf (neuron) di otak mati dan tidak lagi berfungsi normal. Kematian dan kerusakan neuron menyebabkan perubahan memori, perilaku dan kemampuan berpikir jernih. Dalam AD, otak mengalami perubahan yanga pada akhirnya mengganggu kemampuan individu untuk menjalankan fungsi tubuh dasar seperti berjalan dan menelan, serta akhirnya berakibat fatal [1]. Pada kondisi AD, hidrolisis neuron kolinergik menyebabkan defisitnya jumlah neurotransmitter, asetilkolin (ACh) [2].Enzim asetilkolinesetrase (AChE) yang menghidrolisis ACh, dihambat maka neurotransmitter dapat dinaikkan jumlah dan fungsinya [3]. Ini menjadi didasarkan asumsi bahwa peningkatan ketersediaan asetilkolin (ACh) di reseptor asetilkolin dalam otak, menyebabkan neuron mudah ditranspor sehingga meningkatkan fungsi kognitif. Saraf kolinergik, dapat ditemukan dalam sistem saraf baik di pusat (SSP) maupunsistem saraf perifer pada jaringan tubuh yang berbeda [4]. Obat sintetik yang disetujui oleh FDA telah digunakan dalam pengobatan AD seperti tacrine , rivastigmine dan donepezil dengan tingkat keberhasilan sampai batas tertentu dalam memperlambat neurodegeneration pada pasien AD, dengan efek samping yang meliputi gangguan di saluran pencernaan, toksisitas hati terkait,
agresi dan depresi [5].Semua keterbatasan ini mendesak untuk mencari senyawa baru dari berbagai sumber termasuk produk alami berbasis tanaman, dimana berbagai kandungan kimianya telah dilaporkan memiliki aktivitas penghambatan kolinesterase (ChE)[6]. Sampaio et al melakukan penelitian terhadap aktivitas penghambatan AChE dari familia Annonacea, yaitu dari biji buah sirsak ( Anonna muricata Linn). Hasil pengujjian penghambatan AChE dengan metode Ellman menunjukkkan bahwa ekstrak heksana dan etanol biji sirsak menunjukkan adanya penghambatan AChE [7]. Kandungan senyawa kimia yang sama baik di biji buah maupun di daun sirsak yaitu asetogenin, alkaloid, asetogenin, dan fenol[8]. Berdasarkan data penelitian tersebut maka perlu dilakukan penelitian aktivitas dari fraksi aktif daun sirsak in vitro sebagai penghambatan AChE dan kinetika penghambatannya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui mempunyai aktivitas penghambatan AChE dan kinetikannya dalam pengobatan AD.

## 2. Metode Penelitian
 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian
ini adalah simplisia daun sirsak; n -heksan; etil asetat; etanol 96% ; akuades; metanol, dikolorometana, kloroform, well microplate; DNTB (5,5’-ditiobis-(asam 2-nitrobenzoat); ATCh (asetiltiokolin); AChE; akuabides; plat KLT GF 254 ; H 2 SO 4 ; serium sulfat.
 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary evaporator , sepktrofotometer UV-VIS microplate reader ; peralatan gelas; peralatan micro pipet; oven; dan kromatografi kolom  Pembuatan Ekstrak
Pada penelitian ini, proses ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi dengan beberapa pelarut dan infudasi dengan air (infusa air). Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi daun sirsak
berturut-turut n - heksana, etil asetat, etanol 96% dan air. Filtrat yang diperoleh diuapkan dan
dipekatkan untuk dihitung rendemennya. Adapun skema alur penelitian keselurahan tersaji seperti pada gambar 1 berikut
Gambar 1 . Skema penelitian
 Fraksinasi Ekstrak Etanol
Ekstrak Etanol daun sirsak difraksinasi dengan kromatografi kolom (silika gel, diklorometana dan metanol = 20 : 1 sampai 1 : 1; metanol) diperoleh 6 fraksi (Fr.Etanol.1 - Fr.Etanol.6).Fraksi Fr.Etanol.1 difraksinasikan kembali dengan kromatografi kolom (SiO 2 , n -heksana dan etil asetat = 10 : 1 sampai 1 : 1) memberikan 4 fraksi (Fr.Etanol.1.1 - Fr.Etanol.1.4). Kemudian Fr.Etanol.1.2 dimurnikan dengan KLT preparatif ( n - heksana dan etil asetat = 1 : 1). Isolat hasil KLT preparatif dilakukan pengujian kinetika penghambatan AChE  Pengujian Aktivitas PenghambatanAChE Pengujian aktivitas penghambatan AChE dengan Metode Ellman. Pengujian ekstrak dan fraksi mengunakan substart
ATCh , indikator warna DTNB, dan enzim AChE. Sebagai pembanding digunakan donepezil HCl. Absorbansi warna hasil reaksi tersebut diukur pada menit ke 30 dengan panjang gelombang 410 nm [9].  Pengujian Kinetika Penghambatan AChE Fraksi F.EtOH.1.2.1 dibuat tiga konsentrasi berbeda dan tiga konsentrasi substrat yang beda.Sampel pengujian diinkubasi selama 10 sampai 30 menit pada suhu kamar, terlindung dari cahaya.Pengukuran serapan dilakukan pada panjang gelombang 410 nm.Persamaan dibuat dengan sumbu x sebagai 1/Kecepatan (1/V) dan sumbu y sebagai 1/Konsentrasi Substrat (1/[S]) dari masing-masing konsentrasi larutan uji.Titik potong persamaan tersebut menenukan kinetika AChE-I. Titik potong persamaan dengan sumbu x adalah -1/K m . Titik potong persamaan dengan sumbu y adalah 1/V maks [10,11,12].

## 3. Hasil dan Pembahasan
 Rendemen Ekstrak Hasil maserasi simplisia daun Annona muricata Linn dengan pelarut n -heksana, etil asetat, etanol 96% dan air diperoleh rendemen sebesar 2.87%, 3.40%, 3.59%, 1.07%. Infusa air diperoleh rendemen sebesar 3.15%. Pemilihan pelarut tersebut bertujuan untuk memperoleh senyawa non polar, semipolar dan polar. Pemilihan infudasi bertujuan untuk memperoleh senyawa yang polar yang larut dalam suhu infudasi.  Skrining Fitokimia
Hasil skrining fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol, air dan infudasi memiliki kandungan komponen senyawa flavonoid, tanin dan saponin. Hal ini terjadi karena pelarut etanol dan air bersifat polar yang dapat menarik komponen senyawa polar seperti flavonoid, tanin dan saponin serta dapat menarik senyawa steroid yang kurang polar.Berdasarkan penelitian lain diketahui bahwa ekstrak etanol daun sirsak mengandung tanin, flavonoid, saponin, triterpenoid dan alkaloid [13]. Penelitian lain juga diketahui bahwa ekstrak etanol
daun sirsak menunjukkan adanya flavonoid, steroid dan triterpenoid [14]. Hasil uji penapisan fitokimia ditampilkan pada Tabel 1berikut: Tabel 1. Hasil skrining fitokimia Kandunga n senyawa Ekstrak
Infusa air n - heks ana etil asetat etan ol 96 % ai r Alkaloida - + + - - Flavonoid - + + + + Terpenoid - - + - - Tanin - - + + + Saponin - - + + + Steroid + + + - -  Pengujian Aktivitas Penghambatan AChE Pengujian aktivitas penghambatanAChE dilakukan dengan menggunakan microplate . Hasil pengujian aktivitas penghambatan AChEoleh ekstrak ditunjukkan pada Tabel 2 berikut: Tabel 2 . Hasil uji aktivitas penghambatan AChE oleh ekstrak Sampel uji Nilai IC 50 (mg/L) Donepezil HCl 0.014 Ekstrak n -heksana 319.655 Ekstrak etil asetat 237.549 Ekstrak etanol 69.927 Esktrak air 419.783 Infusa air 472.736 Pada tabel 2, Satuan standar yang digunakan adalah IC 50 untuk menentukan aktivitas penghambatanekstrak, fraksi maupun senyawa dapat dijadikan sebagai obat Alzheimer. Pada penelitian ini ekstrak yang dipilih untuk dimurnikan adalah ekstrak etanol 96% (Fr.Etanol) dipilih karena mempunyai nilai IC 50 terkecil yaitu sebesar 69.927 mg/L.  Pengujian Aktivitas Penghambatan AChE oleh Hasil Fraksinasi Kromatografi Kolom Hasil pengujianpenghambatan AChE oleh fraksi hasil kromatografi kolom I (Fr.Etanol.1-Fr.Etanol.6) ditunjukkan pada Tabel 3 berikut:
Tabel 3 .Hasil pengujianaktivitas penghambatan AChEoleh fraksi hasil kromatografi kolom I terhadap Sampel uji Nilai IC 50 (mg/L) Donepezil HCl 0.013 Fr. Etanol.1 13.650 Fr. Etanol.2 167.575 Fr. Etanol.3 172.488 Fr. Etanol.4 177.186 Fr. Etanol.5 90.907 Fr. Etanol.6 179.647 Pada tabel 3 bahwa Fr.Etanol.1 adalah fraksi yang paling aktif karena mempunyai nilai IC 50 terkecil yaitu sebesar 13.650 mg/L.
Sedangkan Subfraksi yang dipilih berdasarkan hasil uji aktivitas 4 subfraksi terhadap penghambatan AChE. Hasil pengujian penghambatan AChE oleh sub fraksi hasil kromatografi kolom II (4 subfraksi) ditunjukkan pada Tabel 4 berikut: Tabel 4 .Hasil uji aktivitas penghambatanAChE oleh subfraksi hasil kromatografi kolom II Sampel uji Nilai IC 50 (mg/L) Donepezil HCl 0.019 Fr. Etanol.1.1 119.741 Fr. Etanol.1.2 2.427 Fr. Etanol.1.3 7.235 Fr. Etanol.1.4 50.834 Data pada tabel 4 menunjukkan bahwa Fr.Etanol.1.2 dari hasil fraksinasi kromatografi kolom II yang mempunyai aktivitas penghambatan AChE terbesar dengan nilai IC 50 terkecil yaitu sebesar 2.427 mg/L dan dilakukan pemisahan lebih lanjut dengan KLT preparatif untuk mendapatkan senyawa yang lebih murni. Pemurnian Fr.Etanol.1.2 dengan kromotagrafi lapis tipis preparatif. Fase diam yang digunakan adalah silika gel
GF 254 dan fase gerak yang digunakan adalah n -heksana dan etil asetat dengan perbandingan 1 : 1. Hasil KLT preparatif diperoleh 4 spot , berdasarkan visual UV 254 nm pada KLT. Empat spot yang diperoleh kemudian dilakukan pengujian aktivitas penghambatanAChE. Sub subfraksi yang dipilih berdasarkan hasil uji aktivitas penghambatan AChE oleh 4 sub subfraksi. Hasil pengujian aktivitas penghambatan AChE oleh sub subfraksi hasil KLT preparatif ditunjukkan pada tabel 5 berikut:
Tabel 5. Hasil pengujian aktivitas penghambatan AChE oleh hasil KLT preparatif Fr.Etanol.1.2 Sampel uji Nilai IC 50 (mg/L) Donepezil HCl 0.018 Fr.Etanol.1.2.1 3.651 Fr.Etanol.1.2.2 4.292 Fr.Etanol.1.2.3 7.685 Fr.Etanol.1.2.4 6.353 Hasil pengujian aktivitas penghambatan AChE oleh Fr.Etanol.1.2.1 dengan nilai
IC 50 sebesar 3.651 mg/L dan IC 50 donepezil HCl sebesar 0.018 mg/L. sedangkan hasil kromatogramnya seperti pada gambar 2 berikut:
Gambar 2 .Kromatogram lapis tipis preparatif subfraksi 2 (Fr.Etanol.1.2) pada UV 254 nm. Berdasarkan hasil kromatogram Gambar 2 menunjukkan spot yang terdapat pada setiap sub subfraksi jumlahnya semakin sedikit dibandingkan kromatogram sub fraksi hasil kromatografi kolom sebelumnya, hal ini menunjukkan sub subfraksi yang diperoleh semakin murni.
 Pengujian Kinetika Penghambatan AChE oleh Fr.Etanol.1.2.1
Pengujian kinetika penghambatan AChE oleh Fr.Etanol.1.2.1 menunjukkan aktivitas penghambatan adalah kompetitif. Aktivitas penghambatan ini tersaji seperti pada Gambar 3 berikut:
Gambar 3 .Kinetika penghambatan AChE oleh Fr.Etanol.1.2.1
Sedangkan hasil Pengujian kinetika penghambatan AChE oleh Fr.Etanol.1.2.1 untuk harga Harga K m dan V maks Kinetika penghambatan AChE oleh Fr.Etanol.1.2. tersaji seperti pada tabel 6 berikut: Tabel 6 . Harga K m dan V maks Kinetika penghambatan AChE oleh Fr.Etanol.1.2. Konsentrasi Fr.Etanol.1.2.1 (mg/L) K m (nM) V maks (nM/menit) 0 0.0052 0.0150 2 0.0102 0.0158 6 0.0139 0.0158 10 0.0170 0.0146 Pada gambar 3 menunjukkan titik potong keempat kinetika enzim berada di sumbu y sehingga nilai V maks sama dan K m berbeda-beda seperti pada Tabel 6. Kompetitif berarti senyawa-senyawa yang terdapat dalam Fr.Etanol.1.2.1 mengikat enzim secara kompetitif bersaing dengan substrat. Ketika konsentrasi senyawa berkurang maka ikatan dengan enzim berkurang. Penghambatan enzim juga
berkurang makan enzim akan mudah mengubah substrat [10,11,12].
4. Kesimpulan Fr.Etanol.2.1 mempunyai aktivitas penghambatan AChE sebesar IC 50 3.651 mg/L dengan kontrol positif donepezil HCl sebesar IC 50 0.016 mg/L. Kinetika penghambatan AChE oleh Fr.Etanol.1.2.1 terhadap adalah kompetitif. 5. Daftar Pustaka [1]. Alzheimer’s Association. 2013. Alzheimer’s Association Report 2013 Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimer’s & Dementia . 9: 208-45. [2]. Wenk, GL. 2006. Neuropathologic changes in Alzheimer's disease: potential targets for treatment. J Clin Psychiatry. 67 (3) : 3-7.[5]. Nordberg, A., dan Svensson, A.L. 1998 Cholinesterase inhibitors in the treatment of Alzheimers disease (A comparison of tolerability and pharmacology). Drug safety . 19(6): 465-80.
[3]. Wu, C.K., Thal, L., Pizzo, D., Hansen, L., Masliah, E., dan Geula, C. 2005. Apoptotic signals within the basal forebrain cholinergic neurons in Alzheimer's disease. Experimental Neurology .195 : 484 - 96[4]. Silman, I., dan Sussman, J.L. 2005. Acetylcholinesterase: ‘classical’ and ‘non-classical’ functions and pharmacology. Current Opinion in Pharmacology . 5:293-302. [6]. Mukherjeea, P.K., Kumarb, V., Malb, M., dan Houghtona, P.J. 2007. Acetylcholinesterase inhibitors from plants. Phytomedicine. 14 : 289–300. [7]. Sampaio, C.G., Trevisan, M.T.S., Brito, E.S., Santiago, G.M.P., Feitosa, C.M., Carvalho, J.I.X., et.al. 2008. Screening for acetylcholinesterase inhibitor from seeds to treat Alzheimer’s. Proceeding 4 th Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry Disease, Division of Medicinal
Chemistry, Brazilian Chemical Society (SBQ). BrazMedChem. [8]. Moghadamtousi, S.Z. , Fadaeinasab, M., Nikzad, S., Mohan, G., Ali, H.M., Kadir, H.A. 2015. Annona muricata (Annonaceae): A Review of its traditional uses, isolated acetogenins and biological activities. International Journal of Molecular Sciences. 16:15625-58. [9]. Ellman, G.L., Courtney, K.D., Andres, V., dan Featherstone, R.M. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase inhibitor activity. Biochemical Pharmacology. 7: 88-95. [10].Rhee, I.K., van de Meent, M., Ingkaninan, K., dan Verpoorte, R. 2001. Screening for acetylcholinesterase inhibitors from Amaryllidaceae using silica gel thin- layer chromatography in combination with bioactivity staining. Journal of Chromatography A .915 : 217-23.
[11]. Silverman, R.B. 2002. The Organic Chemistry of Enzyme Catalysed Reaction. Academic Press.h 563-84.
[12]. Wetwitayaklung, P., Limmatvapirat, C., Phaechamud, T., dan Keokitichai, S. 2007. Kinetics of acetylcholinesterase inhibition of Quisqualis indica Linn.flower extract. Silpakorn University Scienceand Technology Journal. 1(2): 20-7.
[13].Usunobun, U., Okolie, N.P., Anyanwu,
O.G., dan Adegbegi, A.J. 2014.Phytochemical screening and proximate composition of Annona muricata leaves. European Journal of Botany Plant Science and Pathology . 2(8): 18-28.
[14]. Torres, R.C., Manalo, C.O., Walde, R.Z.M.L., dan Garbo AG. 2015. Characterization of the Leaf Extract of Annona muricata and Larvicidal Activity against Aedes aegypti. Time Journals of Biological Sciences and Technology . 2(3):33-40.