## Pengaruh Lioprotektant Terhadap Karakteristik Nanopartikel Artesunat-Kitosan Yang Dibuat Dengan Gelasi Ionik-Pengeringan Beku
Abhimata Paramanandana, Retno Sari*, Pawahid, Erika A. Novarinandha & Widji Soeratri Fakultas Farmasi Universitas Airlangga Surabaya
*Corresponding author : retno-s@ff.unair.ac.id

## Abstract
Background: Nanoparticles  are  particles  with  a  diameter  range  between  1  -  1000  nm.  Artesunate-chitosan nanoparticles made using ionic gelation-freeze dry method intended to protect the drug from degredation during the  manifacturing  process.  To  obtain  an  excelent  freeze  dried  product,  it  is  necessary  to  optimize  the  use  of lioprotektant. Objective: The aim of this study is to learn the physical characterization of freeze dried artesunat- chitosan  nanoparticles  prepared  using  three  different  lyoprotectant:  sucrose,  trehalose  and  maltodextrin. Methods:  Nanoparticles  were  prepared  by  ionic  gelation  method  using  tripolyphosphate  as  crosslinker.  Dried nanoparticles  evaluated  for  its  morphology,  physical  state,  infrared  spectra  and  redispersability.  Results: Deferential  thermal  analysis  (DTA)  thermogram  showed  that  by  adding  lyoprotectants,  artesunate  remain entrapped  in  chitosan  nanoparticle  system,  while  without  lyoprotectants  no  artesunat  were  entraped  in  the chitosan  matrix.  The  morphological  observations  using  scanning  electron  microscopy  (SEM)  showed  that artesunate-chitosan  nanoparticles  with  2.5%  maltodextrin  have  smooth  surface  and  spherical  structure.  In addition,  maltodextrin  shows  better  protection  during  freeze  drying,  slower  particle  precipitation  and  better particle  redispersibility  compared  to  particles  with  sucrose  and  trehalose.  Lyoprotectants  with  large concentration indicates better redispersabilty of artesunate-chitosan nanoparticles.  Conclusions:  Based on the results,  it  can  be  concluded  that  the  addition  of  lyoprotectant  affect  the  characteristics  of  artesunate-chitosan nanoparticles.
Keywords: nanoparticles, artesunate, lyoprotectant, ionic gelation, freeze dry

## Abstrak
Latar  belakang:  Nanopartikel  merupakan  partikel  dengan  rentang  ukuran  diameter  antara  1  -  1000  nm. Nanopartikel  Artesunat-Khitosan  diformulasikan  menjadi  nanopartikel  menggunakan  metode  gelasi  ionik- pengering  beku  ditujukan  untuk  melindungi  bahan  obat  dari  peruraian  selama  proses  pembuatan.  Untuk memperoleh produk dari pengeringan beku  yang baik, optimasi  lioprotektan sangat diperlukan. Tujuan: Tujuan dari  penelitian  ini  adalah  untuk  mempelajari  karakteristik  fisik  nanopartikel  Artesunat-Khitosan  yang diformulasikan  dengan  tiga  lioprotektan  yang  berbeda:  sukrosa,  trihalosa  dan  maltodekstrin  menggunakan metode  pengeringan  beku.  Metode:  Pembuatan  nanopartikel  dilakukan  menggunakan  gelasi  ionik  dengan tripolifosfat  sebagai crosslinker. Evaluasi  nanopartikel  kering  meliputi:  morfologi,  sifat  fisik,  spektrum inframerah  dan  redispersabilitas.  Hasil:  Data deferential  thermal  analysis (DTA)  menunjukkan,  penambahan lioprotektan  menjebak  artesunat  dalam  sistem  nanopartikel  chitosan,  dimana  formula  tanpa  penambahan lioprotektan  tidak  ditemukan  artesunat  di  dalam  matriks  chitosan.  Pemeriksaan  morfologi  menggunakan scanning electron microscopy (SEM) menunjukkan nanopartikel dengan 2,5% maltodextrin memiliki permukaan yang halus dan bentuk yang speris. Selain itu, maltodextrin menunjukkan efek perlindungan selama pengeringan beku, laju pengendapan yang lebih lambat dan kemampuan untuk redipersi yang lebih baik dibandingkan dengan sukrosa  dan  trehalosa.  Lioprotektan  dengan  konsentrasi  tinggi  menunjukkan  redispersibilitas  nanopartikel artesunat-chitosan  yang  lebih  baik.  Kesimpulan:  Berdasarkan  hasil  penelitian  ini,  dapat  disimpulkan  bahwa dengan penambahan lyoprotectant mempengaruhi karakterisitik nanopartikel artesunat-chitosan.
Kata kunci: nanopartikel, artesunat, lioprotektan, gelasi ionic, pengeringan beku

## PENDAHULUAN
Nanopartikel  merupakan  partikel  dengan  rentang ukuran  diameter  antara  1  -  1000  nm.  Matriks nanopartikel terdiri dari polimer dapat berasal baik dari polimer  alam  maupun  polimer  sintesis  (Abdelwahed dkk.,  2006;  Bernard  &  Stainmesse,  2007).  Salah  satu polimer  yang  berasal  dari  alam,  kitosan,  memiliki gugus  amino  bebas  yang  bermuatan  positif.  Interaksi elektrostatik  dapat  terbentuk  antara  gugus  amino kitosan  dengan  penyambung  silang  anion  multivalent tripolifosfat  (TPP)  melalui  metode  gelasi  ionic (Tiyaboonchai,  2003).  Penambahan  polivinil  alkohol (PVA)  sebagai  stabilisator  dapat  meningkatkan stabilitas  koloid  nanopartikel  (Hasan,  2012)  dengan cara  mencegah  agregasi  melalui  pembentukan  lapisan polimer  pada  permukaan  partikel  serta  meningkatkan ketahanan  pembekuan  pada  saat  pengeringan  beku (Darwin  dkk . ,  2007;  Hirsjärvi,  2008;  Date,  Samad  & Devarajan, 2010).
Pengeringan  beku  bertujuan  dilakukan  untuk meningkatkan  stabilitas  jangka  panjang  dari  koloid nanopartikel.  Pengeringan  beku  dapat  menghasilkan beberapa  tekanan  yang  dapat  menyebabkan  koloid nanopartikel  menjadi  tidak  stabil,  khususnya  tekanan saat  pembekuan  (Abdelwahed et  al. ,  2006;  Bernard  & Stainmesse,  2007).  Faktor  yang  berpengaruh  pada karakteristik  dan  porositas  nanopartikel  pada  proses pengeringan  yaitu  suhu  dan  waktu  pembekuan,  suhu dan waktu pengeringan,  jenis dan  jumlah  lioprotektan, dan  volume  air  yang  ditambahkan  (Abdelwahed  dkk . , 2006; Bernard & Stainmesse, 2007; Garg dkk ., 2011). Lioprotektan memiliki kemampuan untuk melindungi  nanopartikel dari tekanan saat pembekuan. Kelompok  gula  seperti  sukrosa,  trihalosa  dan maltodekstrin  memiliki  mekanisme  perlindungan  yang berasal  dari  matriks  amorf  yang  terbentuk  oleh  gula seiring  dengan  hilangnya  air  pada  saat  pengeringan. Mekanisme  perlindungan  gula  terdiri  atas  mekanisme vitrifikasi  dan  mekanisme  penggantian  air  ( water replacement ),  yaitu  dengan  cara  membentuk  ikatan hidrogen  pada  nanopartikel  untuk  menghambat kerusakan  nanopartikel  oleh  kristal  es  (Corveleyn  &
Remon,  1996;  Chang  dkk ., 2005;  Abdelwahed  dkk . , 2006;  Bernard  &  Stainmesse,  2007;  Varshosaz  & Karimzadeh,  2007;  Amorij  dkk . ,  2008;  Akhilesh, Faishal & Kamath, 2012).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh lioprotektan sukrosa, trehalosa dan maltodekstrin  terhadap  karakteristik  fisik  nanopartikel kitosan  dengan  bahan  aktif  artesunat.  Nanopartikel dibuat  dengan  metode  gelasi  ionik  menggunakan tripolifosfat sebagai penyambung silang, yang kemudian  dikeringbekukan  dengan  penambahan  tiga jenis lioprotektan (sukrosa, trehalosa, dan maltodekstrin)  dengan  berbagai  jumlah.  Nanopartikel kering  dievaluasi  meliputi  pemeriksaan  morfologi, jarak  lebur,  spektrum  inframerah,  dan  kemampuan pendispersian partikel.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Artesunat  (Goldliloo  Pharmaceutical,  China), maltodekstrin (Sorini Agro Asia Corporindo);  sukrosa, trehalose;  kitosan pharmaceutical  grade (Biotech Surindo);  sodium  trifosfat  pentabasic practical  grade (Nacalai  Tesque);  asam  asetat pro  analisis ;  etanol proanalysis ; aquadest.
Alat
Freeze Dryer (Christ R Beta 1-8 K); Neraca analitik (Electronic  Balance  Chyo  JP-160);  Spektrofotometer inframerah (Jasco FT-IR 5300);  Mettler  Toledo FP-65 DTA  P-900  Thermal;  Brookfield  Viscosimeter  DV-II; Hettich  Rotofix  32A  Benchtop  Centrifuge;  mikroskop optik (Olympus IX71 Inverted Fluorescent Microscope); magnetic  stirrer (DRAGONLAB  MS- Pro) Scanning Electro Microscope (Inspect S50 tipe TP 2017/12).

## Metode

## Rancangan formula
Dalam  penelitian  ini,  nanopartikel  kitosan  dibuat dengan  metode  gelasi  ionik  dan  menggunakan  proses pengeringan  beku  dengan  menambahkan  sukrosa, trihalosa dan maltodekstrin sebagai lioprotektan.
Tabel 1. Rancangan formula nanopartikel artesunat-kitosan dengan lioprotektan sukrosa (S), trihalosa (T) dan maltodekstrin (M)

## Pembuatan nanopartikel kitosan
Nanopartikel kitosan dibuat dengan  metode gelasi ionik dengan perbandingan kitosan:TPP = 10:8 dengan cara:
Sejumlah kitosan didispersikan secara merata ke dalam larutan  asam  asetat  0,15%  sambil  diaduk  dengan kecepatan  500  rpm  menggunakan  magnetik  stirer sampai  larut  (larutan  kitosan  0,1%  b/v).  Selanjutnya kedalam  larutan  kitosan  dimasukkan  larutan  TPP  dan diaduk  pada  500  rpm  selama  dua  jam.  Setelah terbentuk koloid, dilakukan sentrifus untuk memisahkan  antara  padatan  koloid  dan  filtrat.  Setelah proses  pemisahan  padatan,  selanjutnya  dilakukan pengeringan  beku  dengan  dan  tanpa  penambahan lioprotektan  pada  berbagai  kadar  sesuai  rancangan formula  pada  Tabel  1  menggunakan Freeze  Dryer (Christ R Beta  1  -  8  K)  selama  24  jam  sehingga didapatkan partikel kering.

## Evaluasi karakterisasi partikel kitosan Morfologi permukaan nanopartikel
Sampel diletakkan diatas holder yang telah dilapisi karbon, selanjutnya  holder diletakkan di dalam  sputter cooter  untuk  dilapisi  dengan gold  palladium selama ±120  detik.  Morfologi  partikel  diamati  dengan scanning  electron  microscopy (SEM)  FEI  Inspect  S50 pada  beberapa  perbesaran  dan  dilakukan  pengukuran terhadap beberapa partikel.

## Spektrum inframerah dari nanopartikel
Spektrum  Inframerah  nanopartikel  kitosan  dibuat dengan  metode  cakram  KBr.  Sampel  diamati  dengan panjang gelombang 4000 - 400 cm -1 .

## Jarak lebur
Penentuan  jarak  lebur  nanopartikel  kitosan menggunakan  alat Diferrential  Thermal  Apparatus (DTA). Diambil ±5 mg nanopartikel kitosan, kemudian dimasukkan ke dalam crusible pan tertutup. Pemeriksaan  dilakukan  pada  suhu  50  C  -  300  C dengan kecepatan kenaikan suhu 10  C per menit.

## Redispersabilitas dan waktu pengendapan
Redispersi  partikel  dilakukan  dengan  cara,  20  mg sampel  dilarutkan  dalam  2  mL  aquadest,  kemudian dikocok biasa selama 10 detik. Dan selanjutnya, waktu pengendapan kembali dicatat.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemeriksaan  spektrum  inframerah  nanopartikel dilakukan  untuk  melihat  interaksi  antara  kitosan dengan  lioprotektan  (maltosa,  trehalosa  dan  sukrosa). Kitosan  memiliki  ikatan  amida  pada  panjang gelombang 1655 cm -1 . Dengan pernambahan lioprotektant,  ikatan  amida  pada  bilangan  gelombang 1655  cm -1 hilang  (Bhumkar  &  Pokharkar,  2006).  Hal ini  disebabkan  oleh  tergantinya  ikatan  amida  dengan ikatan  hidrogen  antara  kitosan  dengan  lioprotektan (Gambar 1. F, G dan H; Panah biru) yang tidak terlihat pada  campuran  fisik  (Gambar  1.  E;  Panah  biru).  Pada Gambar  2  menunjukkan  hasil  pemeriksaan  jarak  lebur nanopartikel.  Pola  termogram  dengan  satu  puncak endotermik  pada  semua  formula  menunjukkan  bahwa artesunat  terjerap  dalam  sistem  nanopartikel  kitosan, kecuali  pada  formula  kontrol  tanpa  penambahan lioprotektan. Pada formula menunjukkan pola termogram yang berbeda disebabkan sistem nanopartikel tidak stabil pada proses pengeringan beku sehingga  artesunat  terlepas  dari  sistem  nanopartikel. Dari  hasil  ini  dapat  dikatakan  bahwa  sistem nanopartikel  dengan  penambahan  lioprotektan  dapat melindungi  sistem  nanopartikel  selama  pengeringan beku.
Dari  hasil  pengamatan  jarak  lebur  menggunakan DTA  pada  nanopartikel  artesunat-kitosan  tanpa penambahan  lioprotektan  dan  nanopartikel  artesunat- kitosan  dengan  penambahan  lioprotektan  dapat  dilihat peran  lioprotektan  yang  dapat  menstabilkan  koloid nanopartikel  pada  proses  pengeringan  beku.  Hal  ini terlihat  dari  hilangnya  termogram  kristalin  artesunat
Nama bahan Formula K* S1 S2 S3 M1 M2 M3 T1 T2 T3 T4 Artesunat (mg) 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 Kitosan (mg) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 TPP (mg) 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 PVA (mg) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Sukrosa (%) - 2,5 5 10 - - - - - - - Maltodekstrin (%) - - - - 2,5 5 10 - - - - Trehalosa (%) 2,5 3,5 7,5 10 *K = Kontrol (tanpa penambahan lioprotektan)
yang seharusnya suhu lebur +130°C (Gambar 2. Panah merah) membentuk termogram amorf. Sedangkan pada
nanopartikel  dengan  lioprotektan  hanya  tampak  suhu lebur  kitosan  pada  +150°C  (Gambar  2.  panah  biru).
Gambar 1 . Hasil pemeriksaan spektrum inframerah, kitosan(A), sukrosa (B), maltosa (C), trehalosa (D), partikel kitosan tanpa lioprotektan  (kontrol) (E),  partikel kitosan + trehalosa 2,5% (F), partikel kitosan + sukrosa 2,5% (G), dan partikel kitosan + maltosa 2,5%(H)
Gambar 2 . Termogram DTA dari artesunat (A), kitosan (B), partikel artesunat-kitosan tanpa lioprotektan (C), partikel artesunat-kitosan dengan lioprotektan sukrosa 2,5% (D), trehalosa 2,5% (E) dan maltodektrin 2,5% (F)
Berdasarkan  pemeriksaan  ukuran  dan  morfologi nanopartikel  artesunat-kitosan  menggunakan Scanning Electron  Microscope (SEM)  antara  formula  dengan penambahan  sukrosa  dan  maltodekstrin  tampak beberapa  perbedaan  antara  keduanya.  Pada  formula dengan  menggunakan  lioprotektan  sukrosa  terlihat bentukan  partikel  yang  beragregasi.  Sedangkan nanopartikel  formula  (T1)  dilakukan  pengamatan dengan  menggunakan  SEM,  dan  diperoleh  bentukan nanopartikel  yang  beragregasi  dan  belum  didapatkan gambaran partikel berbentuk sferis.
(Gambar  3B,  panah  merah).  Pada  nanopartikel artesunat-kitosan pada formula K didapatkan gambaran partikel  yang  beragregasi  dengan  permukaan  yang kasar  dibandingkan  dengan  nanopartikel  artesunat- kitosan dengan penambahan lioprotektan (Gambar 3A). Hal  ini  disebabkan  oleh  proses  pembekuan  pada pengeringan  beku  dapat  menyebabkan  kerusakan  pada produk  karena  proses  pengeringan  beku  menghasilkan berbagai tekanan selama pembekuan dan pengeringan.
Pendispersian  partikel  dalam  media  air  dan selanjutnya  dilakukan  pengamatan  terhadap  waktu partikel  untuk  mengendap,  hasil  pengamatan  disajikan dalam  Tabel  2.  Pengamatan  pada  semua  formula menunjukkan bahwa formula dengan jumlah lioprotektan  lebih  besar  menunjukkan  pendispersian
yang  lebih  mudah  dibandingkan  dengan  formula lainnya. Setelah redispersi, partikel dengan lioprotektan maltodekstrin lebih stabil dibandingkan partikel dengan lioprotektan  sukrosa  dan  trehalosa.  Gambar  hasil dispersi  dari  evaluasi  redispersabilitas  dapat  dilihat pada Gambar 4.
Gambar 3 . Foto mikrograf Scanning Electron Microscope dari partikel artesunat-kitosan tanpa lioprotektan (A), partikel artesunat-kitosan dengan lioprotektan maltodektrin 2,5% (B), trehalosa 2,5% (C) dan sukrosa 2,5% (D) (pembesaran 2500 x)
Tabel 2. Hasil evaluasi redispersabilitas dan waktu pengendapan nanopartikel artesunat-kitosan dengan dan tanpa penambahan lioprotektan pada berbagai kadar
Formula Pengamatan Visual Waktu Pengendapan (s) K Mudah terdispersi, membentuk cairan berkabut 595 S1 Mudah terdispersi, membentuk larutan berkabut 432 S2 Mudah terdispersi, membentuk cairan berkabut 156 S3 Mudah terdispersi, membentuk cairan berkabut 14 T1 Mudah terdispersi  dan membentuk larutan berkabut 164 T2 Mudah terdispersi  dan membentuk larutan berkabut 41 M1 Mudah terdispersi, membentuk cairan berkabut 1441 M2 Mudah terdispersi, membentuk cairan berkabut 1415 M3 Mudah terdispersi, membentuk cairan berkabut 785
Gambar 4 . Hasil evaluasi redispersabilitas nanopartikel artesunat-kitosan tanpa lioprotektan (K) dan dengan lioprotektan: trehalose (T), maltodekstrin (M) dan sukrosa (S) pada berbagai kadar.  Kondisi padatan (A), kondisi setelah ditambah air (B), kondisi setelah dikocok (C).

## KESIMPULAN
Nanopartikel  dengan  penambahan  maltodekstrin menunjukkan bentukan partikel sferis dengan permukaan  halus.  Sedangkan  pada  nanopartikel artesunat-kitosan  dengan  trehalosa  sudah  didapatkan struktur permukaan partikel yang halusakan tetapi tidak memperoleh  bentuk  yang  sferis.  Analisa  termal menggunakan  DTA  menunjukkan  formula  dengan penambahan  lioprotektan  sukrosa  dan  maltodekstrin mampu  melindungi  sistem  nanopartikel,  dibandingkan dengan  formula  tanpa  penambahan  lioprotektan. Penambahan  lioprotektan  pada  nanopartikel  artesunat- kitosan  mempengaruhi kemampuan redispersi partikel. Dengan  penambahan  konsentrasi  lioprotektan  semakin memperbaiki kemampuan redispersi nanopartikel.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdelwahed, W. Degobert, G., Stainmesse, S. & Fessi, H.  (2006).  Freeze-drying  of nanoparticles: Formulation,  process  and  storage  considerations. Advanced  Drug  Delivery  Reviews ; 58 (15);  1688– 1713.
Akhilesh,  D.,  Faishal,  G.  &  Kamath,  J.  V.  (2012). Review  Article:  Comparative  Study  of  Carriers Used  in  Proniosomes. International  Journal  of Pharmaceutical  and  Chemical  Sciences ; 1 (1); 164–173.
Amorij,  J.  P.,  Huckriede,  A.,  Wilschut,  J.,  Frijlink.  H.
&  Hinrichs,  W.  (2008).  Development  of  stable influenza vaccine powder formulations: Challenges  and  possibilities. Pharmaceutical
Research ; 25 (6); 1256–1273.
Bernard, C. & Stainmesse, S. (2007). Freeze-Drying of
Nanoparticles:  Formulation,  Process  and  Storage Considerations  Freeze-drying  of  nanoparticles: Formulation, process.
Bhumkar, D. R. & Pokharkar, V. B. (2006). Studies on effect  of  pH  on  cross-linking  of  chitosan  with sodium  tripolyphosphate:  A  technical  note. AAPS PharmSciTech ; 7 (2); E138–E143.
Chang,  L.,  Shepherd,  D., Sun,  J., Ouellette,  D., Grant, K.  L., Tang,  X.  C.  & Pikal,  M.  J.  (2005). Mechanism  of  protein  stabilization  by  sugars during  freeze-drying and  storage:  Native  structure preservation, specific interaction, and/or immobilization  in  a  glassy  matrix?. Journal  of Pharmaceutical Sciences ; 94 (7); 1427–1444.
Corveleyn, S. & Remon, J. P. (1996). Maltodextrins as lyoprotectants  in  the  lyophilization  of  a  model protein,  LDH. Pharmaceutical  Research ;  146– 150.
Darwin,  M. et  al. (2007).  The  Science  of  Cryonics.
History .
Date,  P.  V.,  Samad,  A.  &  Devarajan,  P.  V.  (2010).
Freeze  Thaw:  A  Simple  Approach  for  Prediction
of  Optimal  Cryoprotectant  for  Freeze  Drying. AAPS PharmSciTech ; 11 (1); 304–313.
Garg,  A.,  Visht,  S.,  Kumar,  P.,  Sharma  &  Kumar. (2011). Formulation, Characterization and Application  on  Nanoparticle:  A  Review. Pelagia Research Library; 2 (2); 17–26.
Hasan,  M.  I.  (2012).  Modifikasi  Nanopartikel  Perak dengan  Polivinil  Alkohol  untuk  Meningkatkan Selektivitas  dan  Stabilitas  Indikator  Logam Tembaga  (Cu):  Uji  Coba  pada  Makroalga  Merah (Kappaphycus alvarezii). Skripsi ; Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia, Depok.
Hirsjärvi,  S.  (2008).  Preparation  and  Characterization of Poly ( Lactic Acid ) Nanoparticles.
Tiyaboonchai,  W.  (2003).  Chitosan  Nanoparticles :  A Promising  System  for  Drug  Delivery; 11 (3);  51– 66.
Varshosaz,  J.  &  Karimzadeh,  S.  (2007).  Development of  cross-linked  chitosan  films  for  oral  mucosal delivery of lidocaine. Research in Pharmaceutical Sciences ; 2; 43–52.
http://www.rps.mui.ac.ir/index.php/jrps/article/vie w/26.