## Isolasi, Seleksi dan Karakterisasi Bakteri Mannolitik yang berasal dari Serasah Tanaman Sawit

## Ike Apriani
* E-mail: ike.apriani@gmail.com

## ABSTRACT
Mananase  enzyme  used  to  hydrolyze  manan  in  producing  simple  sugars,  such  as  mannose  and monooligosakarida  which  will  be  utilized  in  the  industry.  Mananase  enzymes  produced  by  microbes  more attractive  to  industry  because  it  is  more  economical,  higher  productivity  and  amore  controlled  production conditions.  Mannolitic  bacteria  isolated  from  soil  containing  palm  litter.  Isolation  is  done  by  using  selective media locus bean gum. The result showed 6 bacterial isolates that have the ability mannolitic. Isolate 6 has the highest mannolitic index of 0.85. Isolates 6 were characterized morphologically, showed that this isolate motile, cocci, and gram-negative. Physiological characterization showed that this isolate utilize peptone as a source of energy that is supported by VP and H2S test results were positive.

## Keywords: Manan; Mananaseenzyme; Locus bean gum; Palmlitter.

## PENDAHULUAN
Enzim  mananase  merupakan  salah  satu  enzim yang dibutuhkan dalam industri pakan, pangan, pulp dan  kertas,  farmasi,  serta pre-treatment biomassa lignoselulosa dalam produksi biofuel. Lebih tepatnya,  industri  yang  membutuhkan  konversi substrat  dari limbah agroindustri  (Sigres  & Sutrisno 2015).Enzim mananase digunakan untuk menghidrolisis manan, yang merupakan polisakarisa yangterdapat  pada  komponen  utama  hemiselulosa. Sumber  manan  di  alam  sangat  melimpah,  terutama padakopi,  kopra,bungkil  sawit  maupun  umbi  jenis Amorphopalus(Ooi & Kikuchi, 1995).
Hasil  hidrolisis  manan  akan  menghasilkan gula sederhana, berupa manosa dan monooligosakarida  yang  akan  dimanfaatkan  dalam industri(Sigres & Sutrisno 2015).Penggunaan enzim untuk  proses  hidrolisis  di  bidang  industri  lebih meningkat  karena  penerapannya  lebih  efisien  dan ramah lingkungan. Enzim mananase dapat dihasilkan  oleh  beberapa  mikroorganisme  seperti fungi,  yeast  dan  bakteri  (Dekker  &  Richards  1979). Produksi mananase dari mikroba lebih
menguntungkan, karena lebih ekonomis, produktivitas lebih tinggi dan kondisi produksi lebih terkontrol.
Mikroorganisme  yang  menghasilkan  enzim mananase  umumnya  terdapat  di  tanah,  kompos  atau rumen  hewan.  Tanah  diketahui  merupakan  sumber isolasi  terbaik  bagi  mikroba-mikroba  karena pertumbuhan  mikroba  secara  luas  diketahui  berada di dalam tanah (Brock 1984). Beberapa bakteri yang diketahui  menghasilkan  enzimmananase  adalah Bacillus  pumilus DYP  2  (Aurora  2003), Bacillus subtilis WY34(Jiang et  al .  2006), Bacillus
stearothermophilus (Talbot  &  Sygusch  1990), Bacillus  licheniformis (Zhang et  al .  2000)  dan Steptomyce s sp. Galur 451-3 (Ambarawati 2005). Menurut Yopi et al. (2006) manan merupakan sumber  biomassa  pada  limbah  perkebunan  sawit. Manan  merupakan  komponen  hemiselulosa  pada kayu  lunak  ( soft  woods )  pada  gymnospermae  dan banyak  terdapat  pada  saat  pembengkakan  biji  yang terjadi pada proses  germinasi(Marga  1996). Dengan demikian,  tanah  yang  mengandung  serasah  sawit dimungkinkan  mengandung  bakteri  potensial  yang mampu menghidrolisis manan, sehinggaperlu dilakukan isolasi bakteri mananolitik.

## BAHAN DAN METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitiandilakukan pada Oktober  hingga Desember 2010 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi FMIPA IPB, Bogor.

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  terdiri  dari  sentrifuse, shaker, waterbath, spektrofotometer, hot plate, pipet volumetrik,  pipet  mikro,  dan  peralatan  umum Laboratorium Mikrobiologi.
Bahan  yang  digunakan  adalahsampel  tanah yang  berasal  dari  area  sekitar  tanaman  sawit  di Sumatera  Selatan.  Media  yang  digunakan  yaitu Lokus Bean Gum (LBG) 0.3%  dengan penambahan pepton  0.075%,  ekstak  khamir  0.05%,  KNO 3 0.2%, MgSO 4 .7H 2 O  0.05%,  NaCl  0.05%,  FeSO 4 0.001%, CaCO 3 0.3%,  dan  agar  2%.  Reagen  untuk  uji fisiologis yaitu Reagen Kovac, Metil Red, dan Barit Metode
Isolasi bakteri penghasil Mananase
Sampel tanah diambil 1 gram dilarutkan dalam 9  ml  larutan  garam  fisiologis  0.85%  dan  di  vortex agar  sampel  tersuspensi  dengan  baik.  Selanjutnya, dilakukan pengenceran serial dalam garam fisiologis hingga  10 -5 .  Sebanyak  100  µl  suspensi  dengan pengenceran  10 -4 dan  10 -5 disebar  dalam  media cawan  agar  Locus  Bean  Gum.  Selanjutnya  bakteri dinkubasi selama 3 hari.
Koloni  bakteri  yang  tumbuh  disiram  dengan Merah congo 0.1% dan dibilas menggunakan larutan NaCl  5  M.  Isolat  yang  memiliki  zona  bening terbesar  merupakan  isolat  potensial  penghasil mananase.  Selanjutnya,  isolat  tersebut  dimurnikan dengan  metode  kuadran  dan  diremajakan  pada media agar miring Locust Bean Gum.

## Karakterisasi Morfologi dan Fisiologis
1. Karakterisasi Morfologi
Karakterisasi  morfologi  dilakukan  dengan  uji motilitas  dan  pewarnaan  Gram.  Uji  motilitas dilakukan  dengan  cara  mengamati  pergerakan bakteri  dibawah  mikroskop.  Sedangkan  pewarnaan gram  dilakukan  dengan  membuat  lekapan  kering pada  kaca  objek.  Lekapan  kering  bakteri  diteteskan dengan  pewarna  ungu  kristal  dan  genangi  selama  1 menit,  lalu  dibilas  dengan  akuades.  Selanjutnya genangi  iodin  gram  selama  2  menit,  lalu  dibilas kembali.  Kemudian  dipucatkan  dengan  meneteskan alkohol  95%  keatas  lekapan  bakteri  tersebut  hingga sisa  pewarna  ungu  krital  larut.  Berikutnya,  teteskan dengan  pewarna  safranin  selama  30  detik  lalu dibilas.  Lekapan  yang  telah  diwarnai  tersebut diamati pada mikroskop dengan perbesaran 1000x.

## 2. Karakterisasi fisiologis
Karakterisasi  fisiologis  bakteri  penghasil mananase dilakukan melalui uji fermentasi karbohidrat, simmon sitrat, H 2 S, MR/ VP, urea, dan produksi indol.Sebanyak 1 lup biakan bakteri murni berusia  24  jam  dikulturkan  pada  masing-masing media  uji.  Untuk  menguji  kemampuan  bakteri menggunakan  sitrat  dan  menghasilkan  H 2 S,  bakteri digoreskan  berturut-turut  pada  media  simmon  sitrat dan  H 2 S.  Pengamatan  hasil  uji  fisiologis  dilakukan setelah diinkubasi selama 24 jam.
a. Fermentasi karbohidrat
Media  NB  yang  ditambah  dengan Brom  Tyymol Blue (BTB)  sebagai  indikator  dimasukkan kedalam  tabung  reaksi,  lalu  ditambahkan  bakteri sebanyak  1  lup.  Tabung  durham  dimasukkan  ke dalam tabung reaksi tersebut, kemudian disterilkan  setelah  steril  diinokulasi  masing- masing isolat bakteri kemudian diinkubasi selama 24  jam  pada  suhu  37 o C.  Indikator  pembentukan asam  laktat  apabila  terjadi  perubahan  warna medium  dari  hijau  menjadi  kuning  tanpa
pembentukan  gas  pada  tabung  durham.  Uji  akan bersifat fermentasi asam campuran apabila warna medium  berubah  dan  diikuti  pembentukan  gas pada  tabung  durham  dan  uji  akan  bersifat fermentasi  alkohol  apabila  terbentuk  gas  pada tabung  durham  tanpa  diikuti  perubahan  warna medium.
b. Simmon sitrat
Isolat diinokulasi pada medium Simmon’s Citrate agar dalam  tabung  reaksi  secara  vertikal, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  24 jam  dan  diamati  perubahan  yang  terjadi.  Uji bernilai  positif  bila  terjadi  perubahan  warna medium  dari hijau menjadi  biru  yang merupakan indikasi  bahwa  bakteri  mampu  menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber energi.
c. H 2 S
Inokulasi  biakan  pada  tabung  reaksi  yang  telah berisi  media  TSIA  7  mL  dengan  cara menusukkan jarum ose ke dalam media kemudian baru  diinokulasi  pada  bagian slant TSIA. Inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Diamati pertumbuhannya pada bagian Butt dan Slant (Lay, 1994).
d. MR/ VP
- Uji Methyl Red
Isolat  bakteri  diinokulasi  pada  medium  MR-VP, kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  24 jam,  tiap-tiap  tabung  ditambahkan  3-4  tetes indikator  metil  merah.  Bila  warna  medium berubah menjadi merah, artinya terbentuk asam. - Uji Voges Proskauer
Biakan ditanam pada medium MR-VP, kemudian diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  24  jam, masing-masing  tabung  ditambahkan  10  tetes barrit A dan barrit B. Tabung dikocok selama 20- 30  detik.  Uji  akan  bernila  positif  jika  terbantuk warna  merah  muda  yang  merupakan  indikasi bahwa bakteri mampu memfermentasikan glukosa  dan  membentuk  asam  hingga  pH  media menjadi  5  atau  lebih  rendah.  Jika  selama  20-30 detik  medium  belum  berubah  warna,  maka  hasil pengamatan dilakukan selama 15 menit.
e. Urea
Media ini digunakan untuk mengetahui kemampuan  bakteri  dalam  menguraikan  urea (oleh  enzim  urease  yang  dihasilkan  bakteri). Dalampenguraian  urea  ini  akan  menghasilkan residu  berupa  amoniak,  sehinggaakan  mengubah warna indikator neutral red menjadi lebih ungu.
f. Produksi indol.
Media  yang  digunakan  adalah  media Tryptofan Broth ,  media  ini  digunakan  untuk  mengetahui adanya produksi enzim triptofanase dari bakteri
yang  memecah  triptofan  menjadi  asam  piruvat dan  hasil  sampingnya  berupa  amoniak  dan indol,  untuk  itu  media  dilengkapi  dengan  asam amino  triptofan,Jika  bakteri  mampu  memecah asam  amino  triptofan  dan  menghasilkan  indol maka dapat diditeksi dengan meneteskan reagen Kovac’s  atau  reagen  Erlich  yang  mengandung Para  Amino  Benzoic  Acid (PABA)  melalui dinding  tabung,  dan  akan  terjadi  ikatan  antara indol  dengan  PABA  yang  membentuk  cincin merah.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi    dan  seleksi  kemampuan  bakteri mannolitik
Isolasi mikroorganisme dilakukan dengan cara menumbuhkan sampel di media selektif ( Locus Bean Gum )yang  mengandung  manan.  Manan  merupakan bahan  penginduksi  atau  induser  terbaik  untuk menghasilkan  mananase  pada  isolat  mananolitik
yang diujinya (Araujo & Ward, 1990). Kemampuan mananolitik isolate dapat dilihat dengan terbentuknya  zona  bening  disekitar  koloni.    Dari hasil  penelitian,  didapatkan  6  isolat  yang  dapat membentuk  zona  bening  (Tabel  1).  Menurut Priest(1984)  zona  bening  terbentuk  karena  adanya difusi  enzim  ekstraseluler  ke  medium  agar disekeliling  koloni.  Zona  bening  dapat  terlihat  jelas dengan penambahan merah congo . Menurut Sumardi (20017) merah congoakan berikatan dengan polisakarida  manan  yang  memiliki  ikatan  β-1.4-D- manopiranosil  dalam  media  agar  sehingga  media akan  berwarna  merah.  Sebaliknya  hasil  hidrolisis enzim  mananase  berupa  monosakarida  (tidak memiliki ikatan β-1.4-D-Manopiranosil) dan oligosakarida  (memiliki  sedikit  ikatan  β-1.4-D- Manopiranosil)  yang  ada  disekitar  koloni  akan berwarna  bening  setelah  pembilasan  dengan  NaCl 1%.
Tabel 1 Seleksi bakteri mannolitik Isolat Nilai indeks mannolitik (IM) 1 2 3 4 5 6 0.22 0.09 0.42 0.67 0.014 0.85
Indek  Mananolitik  (IM)  tertinggi  pada  isolate  6 sebesar 0.85 dan yang terendah pada isolat 5 sebesar 0.014  (Tabel  1).  Isolate  dengan  zona  bening  yang tinggi  diduga  memiliki  aktivitas  yang  tinggi. Menurut  Seftiono  &Hermawan  (2008)  zona  bening yang  dihasilkan  berbanding  lurus  dengan  aktivitas enzim yang dihasilkan isolat.

## Karakterisasi Morfologi Isolat
Isolat 6 merupakanisolat yang menghasilkanindeks  mananolitik  (IM)  yang  tinggi sehingga  dilakukan  uji  karakteristik,  baik  morfologi maupun  fisiologi.  Pengujian  morfologi  dilakukan dengan  pengujian  motilitas  dan  pewarnaan  gram.
Dari  hasil  pengujian  didapatkan  bahwa  isolat  6 berkarakteristik motil, kokus dan berwarna merah.Hasil  pewarnaan  gram  yang  menghasilkan bakteri  berwarna  merah  berarti  tergolong  bakteri gram  negatif.  Menurut  Pelczar  (2008)  bakteri  gram negatif  akan  kehilangan  ungu  kristal  ketika  dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi warna tandingan dengan warna merah safranin akan tampak berwarna merah.

## Karakterisasi FisiologiIsolat
Uji  fisologis  yang  dilakukan  yaitu  uji fermentasi  karbohidrat,  simmon  sitrat,  H 2 S,  MR/ VP,  urea,  dan  produksi  indol.  Hasil  uji  fisiologis pada isolat 6 disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Karakter bakteri isolat 6 berdasarkan uji fisiologi Media uji Hasil uji Keterangan 1. Fermentasi karbohidrat -                               Merah 2. Urea -                               Merah muda 3. Simmon sitrat -                               Hijau 4. H 2 S +                               Kuning 5. MR -                               Tetap 6. Indol -                               Tidak ada cincin merah 7. VP +                               Merah
Keterangan:
(+)  uji positif          (-)  uji negatif
Hasil  uji  fisiologis  menunjukkan  bahwa  mikroba isolat  6  tidak  memanfaatkan  sitrat  sebagai  sumber energi, tidak mendegradasi urea, tidak mendegradasi asam  amino  triptofan  dan  tidak  memfermentasi karbohidrat dengan hasil uji negatif.  Sumber energi bagi pertumbuhan bakteri dapat berasal dari pepton. Terdapat  0.075%  pepton  yang  ditambahkan  pada media  LBG.  Hal  ini  didukung  dengan  hasil  uji  H 2 S yang positif. Hasil ini menunjukkan bahwa mikroba dapat  menghasilkan  hidrogen  sulfida  dari  substrat asam  amino  bersulfur  melalui  reduksi  (hidrogenasi) enzimatik  terhadap  sulfur  organik  menjadi  sistein, suatu  komponen  pepton.  Komponen  ini    dapat didegradasi  menjadi  asam  amino  yang  akan dikonversi secara enzimatik oleh deaminasi oksidatif menjadi asam ketoamino. Substrat akan dimetabolisme  lanjut  melalui  siklus  krebs  untuk produksi  energi.  Reaksi  akan  melepas  ammonia yang terakumulasi dalam media membentuk NH 4 OH sehingga  lingkungan  bersifat  basa  (Sunatmo, 2009).Didukung  dengan  uji  MR  yang  menunjukkan hasil  negatif  berarti  tidak  ada  asam  yang  dihasilkan dalam reaksi tersebut. Sedangkan uji VP menunjukkan hasil positif, menurut Sunatmo (2009) organisme  akan  menghasilkan  substansi  non  asam atau  produk  akhir  netral  seperti  asetilmetilkarbinol dari  asam  organik  sebagai  hasil  metabolisme glukosa.

## KESIMPULAN
Isolasi bakteri dari sampel tanah yang berasal dari area sekitar tanaman sawit menghasilkan 6isolat yang  memiliki  kemampuan  mananolitik.  Isolat  6 memiliki  nilai  Indeks  mananolitik    tertinggi  sebesar 0.85 cm. Isolat 6 berbentuk kokus, gram negatif dan motil.  Hasil  uji  fisiologis  menunjukkan  bahwa bakteri  ini  memanfaatkan  pepton  sebagai  sumber energi  yang  didukung  dengan  hasil  uji  VP  dan  H 2 S yang positif.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Ambarawati D. ( 2005 ). Karakterisasi Mananase  Streptomyces  sp.  Galur  451-3 [skripsi].  Bogor:  Fakultas  Matematika  dan Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Institut  Pertanian Bogor.
[2] Araujo  P,  Ward  OP.(1990).  Extracellular Mananase  and  Galactanases  from  Selected Fungi. J. Ind. Microbiol , 6: 171-178.
[3] Aurora DD. (2003). Isolasi dan Karakterisasi Enzim  Mananase  Bacillus  pumilus  DYP  2
[skripsi].  Bogor:  Fakultas  Matematika  dan
Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Institut  Pertanian Bogor.
[4] Brock TD. (1984). Biotechnology: A
Textbook  of  Industrial  Microbiology .  Science
Tech. Inc.: New York. [5] Dekker RFH, Richards GN. (1979). Hemicellulase: their Occurrence, 14
Purification,  Properties,  and  Mode  of  Action.
Adv Ca rbohydr Chem Biochem 32:277-352.
[6] Jiang Z et al . (2006). High-Level Production, Purification,  and  Characterization  of  A Thermostable-mannanase  from  the  Newly Isolated Bacillus subtilis WY34. Carbohydrate Polymers, 30:1-9.
[7]
Marga F, Ghakis C, Morosoli R, Kleupfel D.
(1996).  Improved  production  of  mananase  by Streptomyces lividans. Appl Environ Microbiol, 62(12): 4656-4658.
[8] Ooi T, D. Kikuchi. (1995). Purification and Some Properties of β-Mananase from Bacillus sp. World J Microbiol Biotechnol , 11: 310-314
[9] Pelczar, M.J. and E.C.S. Chan.(1988). Dasar- dasar  Mikrobiologi  II .  Universitas  Indonesia Press. Jakarta. 192.
[10] Priest  FG.(1984). Extracellular  Enzymes. Van Nostrand Reinhold, England.
[11] Seftiono, Hermawan. (2008). Pemurnian dan Karakterisasi Mananase dari Streptacidiphilus luteoalbus . Skripsi. Bogor. IPB
[12] Sigres,  D.P  &  Sutrisno,A.  (2015).  Enzim mananase  dan  aplikasi  di  bidang  industri. Jurnal  Pangan  dan  Agroindustri, 3(3):  899- 908.
[13] Sumardi. (2007). Isolasi dan Karakterisasi Mananase Ekstraseluler dari Fusarium
oxysporum. J. Sains MIPA , 13(1): 43-48 [14] Sunatmo, T.I. (2009). Eksperimen Mikrobiologi  dalam  Laboratorium. Ardy Regency: Jakarta. [15] Talbot G, Sygusch J. (1990). Purification and Characterization
of Thermostable ß- mannanase  and-galactosidase  from Bacillus stearothermophilus . Appl Environ Microbiol, 56:3505-3510. [16] Yopi et  al .  (2006).  Preparasi  Manan  dan Mananase  Kasar  dari  Bungkil  Kelapa  Sawit. Jurnal Teknologi, 4: 312-319.
[17] Zhang J, He Z, Hu K. (2000). Purification and Characterization of ß-mannanase from Bacillus licheniformis for Industrial use.
Biotechnology Letters, 22:1375-1378.