Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology Journal Homepage : http://jurnal.unpad.ac.id/ijpst/

## UNPAD

## Molecular Dynamics Simulation of Estrogen Receptor Alpha Against Andrografolid as Anti Breast Cancer
Doni Dermawan 1* , Riyadi Sumirtanurdin 2 , Deti Dewantisari 2
1 Program Studi Profesi Apoteker Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran 2 Program Studi Sarjana Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran
Submitted 6 August 2018; Revised 7 December 2019; Accepted 22 January 2019; Published 27 June 2019 *Corresponding author: donidermawan07@gmail.com
Abstract
Breast cancer is the most common cancer suffered by women with 1.67 million new cases in the world by 2012 with a mortality rate of 12.9%. Tamoxifen is a standard therapy for breast cancer but can cause endometrial and thromboembolic cancer. Andrografolid is an active compound from Andrographis paniculata which has antiproliferation activity of MCF-7 breast cancer cells with IC 50 was 61.11 μM. The purpose of this study was to design andrographolide modification structures as human estrogen receptor alpha (hER-α) antagonists. Molecular docking simulation results showed that the andrographolide and AND5 have free binding energy (ΔG) values of -9.65 kcal/mol and -12.43 kcal/mol, respectively, and hydrogen bonds were formed with Gly521, Asp351, and Met343. The ΔG value of ANDS was lower than tamoxifen (-11.40 kcal/ mol). Pharmacophore modeling results showed that andrographolide and AND5 had a high pharmacophore- fit value of 46.39% and 63.47%, respectively. Molecular dynamics simulation showed that the hERα-AND5 system has a value of ΔG TOTAL = -50.52 kcal/mol compared to the hERα-estradiol system with a value of ∆G TOTAL = -40.86 kcal/mol. These results suggested that AND5 has better affinity for hERα compared to estradiol so that AND5 is a very promising anti breast cancer agent.
Keywords: Andrographolide, Breast cancer, Estrogen receptor alpha, Molecular docking, Molecular dynamics.

## Simulasi Dinamika Molekular Reseptor Estrogen Alfa dengan Andrografolid sebagai Anti Kanker Payudara

## Abstrak
Kanker  payudara  merupakan  kanker  yang  paling  banyak  diderita  oleh  perempuan  dengan  jumlah  1,67 juta kasus baru di dunia pada tahun 2012 dengan tingkat kematian 12,9%. Tamoxifen merupakan terapi standar untuk kanker payudara namun dapat menyebabkan kanker endometrium dan tromboemboli. Andrografolid merupakan senyawa aktif dari daun sambiloto ( Andrographis paniculata ) yang memiliki aktivitas antiproliferasi sel kanker payudara MCF-7 dengan nilai IC 50  61,11  µM.  Tujuan  penelitian  ini adalah untuk mendesain struktur modifikasi andrografolid sebagai antagonis reseptor estrogen alfa (hER-α). Hasil simulasi penambatan molekular menunjukkan bahwa nilai energi bebas ikatan (∆G) andrografolid dan AND5 masing-masing −9,65 kkal/mol dan −12,43 kkal/mol, serta terbentuk ikatan hidrogen dengan Gly521, Asp351,  dan  Met343.  Nilai  ∆G AND5  lebih  rendah  dari  tamoxifen  (−11,40  kkal/mol).  Hasil pemodelan farmakofor menunjukkan bahwa andrografolid dan AND5 memiliki nilai pharmacophore-fit sebesar 46,39% dan 63,47%. Hasil simulasi dinamika molekular menunjukan bahwa sistem hERα−AND5 memiliki nilai ∆G TOTAL = −50,52 kkal/mol dibanding sistem hERα−estradiol dengan nilai ∆G TOTAL = −40,86 kkal/mol. Hal  ini menunjukkan  bahwa AND5  memiliki afinitas yang lebih baik terhadap kantung aktif hERα dibanding estradiol sehingga AND5 merupakan agen antikanker payudara yang sangat menjanjikan. Kata Kunci: Andrografolid, Dinamika molekular, Kanker payudara, Penambatan Molekular, Reseptor estrogen alfa

## 1.  Pendahuluan
Kanker payudara merupakan kanker yang paling umum di kalangan wanita di wilayah Asia Pasifik, menyumbang 18% dari semua kasus kanker, dan merupakan penyebab paling umum keempat dari kematian terkait kanker. 1 Di  Indonesia  selama  tahun  2014, kanker payudara menduduki peringkat pertama penyakit kanker yang menyerang wanita,  yaitu  48.998  kejadian,  jauh  di  atas kanker serviks (20.928 kejadian) dan kanker kolorektum  (11.787  kejadian). 2 Kasus kematian  akibat  kanker  pun  sangat  tinggi, tercatat 92.200 wanita Indonesia meninggal akibat  kanker  dan  21,4%  diantaranya diakibatkan oleh kanker payudara. 3 Sel payudara normal dan kebanyakan sel kanker payudara memiliki reseptor yang menempel pada sirkulasi estrogen dan progesteron. Kanker payudara memiliki reseptor estrogen dan progesteron positif (yaitu, ER + dan PR +) yang lebih menanggapi terapi hormonal dan memiliki prognosis yang lebih baik daripada kanker dengan reseptor negative. 4,5 Obat yang sering digunakan dalam terapi kanker adalah tamoxifen yang dikonsumsi  secara  oral  sebagai  tablet,  obat ini mengganggu aktivitas estrogen. Namun tamoxifen juga memiliki efek samping yang  berbahaya  mencakup  tromboemboli, penyakit  hati  berlemak  non-alkoholik,  dan dapat mengakibatkan peningkatan proliferasi karsinoma endometrium. 6,7 Saat  ini,  pendekatan  pemodelan molekuler yang didorong oleh perkembangan kimia  komputasi  yang  meningkat  cepat, memegang peran penting dalam perancangan obat dan penemuan mekanisme baru obat berbasis struktur. Metode ini telah menjadikan banyak penelitian menghasilkan penemuan obat dengan sukses. 8 Senyawa penuntun unggulan untuk pemodelan obat baru pada terapi kanker payudara adalah andrografolid, yang telah menunjukkan aktivitas anti- proliferasi yang luas pada berbagai lini sel kanker termasuk kanker payudara. 9,10 Andrografolid merupakan senyawa yang berasal dari tanaman sambiloto ( Andrographis paniculata ), tanaman ini banyak ditemukan di
Asia tropis dan subtropis termasuk Indonesia. Pada  tahun  2013  produksi  sambiloto mencapai  2.257.368  kg  dengan  total  luas panen  mencapai  1.897.377  m 2 . 11 Banyaknya ketersediaan sambiloto di Indonesia dan senyawa aktif andrografolid yang terbukti memiliki aktivitas dalam pengendalian sel kanker payudara menjadi potensi besar dalam pengembangan obat kanker payudara dengan pendekatan molekular menggunakan senyawa penuntun andrografolid untuk mendapatkan obat baru yang lebih baik dan efektif dibandingkan obat yang sudah ada.

## 2.  Metode
Penelitian ini menggunakan metode in silico untuk merancang kandidat obat yakni andrografolid beserta modifikasi strukturnya sebagai senyawa antagonis reseptor estrogen alfa.
2.1.  Alat Perangkat keras yang digunakan adalah personal computer dengan spesifikasi Intel® Core™  i5-6600 CPU @ 3,90 GHz (4CPUs), GPU Nvidia Geforce GTX 970 4 Gigabyte OC Edition, dan RAM 8 Gigabyte DDR4. Adapun pada pengujian secara in silico menggunakan perangkat lunak yang dapat diunduh secara gratis bagi akademisi. Perangkat lunak yang digunakan meliputi: 1. Program
ChemOffice 2010 dan
ChemDraw Ultra 12.0 (PerkinElmer Inc, diunduh  di  http://www.cambridgesoft. com/) untuk menggambar struktur 2D dan mengonversinya menjadi struktur 3D.
2. Program  LigandScout  4.0  (Wolber  and Inte:Ligand  GmbH)  untuk  melakukan pemodelan farmakofor.
3.  Program AutoDock 4.2.6 dan
AutoDockTools  1.5.6  ( The Scripps Research Institute , diunduh di http://www. autodock.scripps.edu/)  untuk  melakukan simulasi penambatan molekular.
4. Program BIOVIA Discovery Studio 2017 yang  diunduh  di  http://www.accelrys. com/ untuk memvisualisasikan kompleks pdb,  ikatan  antara  ligan  dengan human estrogen receptor (hER)-α,  optimasi geometri,  dan overlay pada proses
validasi.
5. Program  AMBER  14  ( University of California, San Francisco ,  diunduh di  http://www.ambermd.org/)  untuk melakukan simulasi dinamika molekular.
2.2.  Bahan Bahan yang digunakan meliputi struktur tiga dimensi hER-α yang diunduh dari Protein Data Bank (PDB)  (http://www.rscb.org/) dengan kode ID 3ERT (hER-α yang mengikat tamoxifen)  serta  struktur  tiga  dimensi andrografolid dan struktur turunannya yang telah digambarkan menggunakan perangkat lunak ChemOffice 2010.
2.3. Tahapan Penelitian Tahapan penelitian mencakup: 1)  Preparasi  reseptor;  dimana  struktur reseptor estrogen alfa yang digunakan pada penelitian ini diunduh dari situs Protein Data Bank (PDB) yang kemudian dipisahkan dengan ligan dan air serta ditambahkan muatan.
2) Preparasi ligan; dimana ligan standar tamoxifen diperoleh dari hasil pemisahan dengan reseptor estrogen alfa sedangkan andrografolid  dan  modifikasinya  didesain dengan bantuan perangkat lunak yang selanjutnya dilakukan optimisasi. Desain modifikasi  andrografolid  didasarkan  pada aturan Lipinski’s Rule of Five (RO5). 3) Validasi metode komputasi; dimana meliputi validasi metode penambatan molekul yang berdasarkan pada nilai Root Mean Square Deviation (RMSD)  hasil penambatan ulang ( re-docking ) ligan standar dan validasi metode pemodelan farmakofor yang berdasarkan pada nilai AUC 100% kurva Receiver Operating Characteristic (ROC) hasil skrining 626 actives set dan  20.773 decoys set . 4)  Pemodelan  farmakofor;  dilakukan untuk melihat tingkat kemiripan antara andrografolid dan modifikasinya dengan ligan standar tamoxifen dimana dilakukan skrining virtual  menggunakan  model  3D  farmakofor berbasis struktur yang telah tervalidasi dan memanfaatkan bantuan dari perangkat lunak. Tingkat kemiripan tiap strukturnya
diperlihatkan melalui nilai pharmacophore- fit.
5)  Simulasi  penambatan  molekul ( docking simulation) , dimana dilakukan pada pusat dari sisi aktif dari reseptor dengan koordinat  (x  =  30.010,  y  =  -1.913,  dan  z =  24.207)  dan  volume  ruang  40x40x40 titik. Parameter docking berdasarkan pada Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) dengan jumlah runs 100 kali, ukuran populasi 150,  energi  evaluasi  2.500.000,  laju  mutasi gen 0,02, dan laju crossover 0,8. Konformasi hasil simulasi penambatan molekul dikluster dengan menggunakan tolereansi RMSD  1.0 Å. Konformasi ligan dengan energi ikatan terendah (∆G) dari kluster terbaik digunakan untuk tahap analisis selanjutnya. Kompleks ligan-reseptor yang terbentuk divisualisasikan dengan bantuan perangkat lunak.
6)  Simulasi  dinamika  molekul, diawali tahapan parameterisasi ligan dengan menambahkan  medan  gaya  ff14SB  dan dilanjutkan dengan penentuan koordinat awal sistem dan minimisasi sistem. Tahapan penentuan koordinat terdiri atas penambahan ion dan dolvasi sisten dengan air secara eksplisit  model  air  TIP3P.  Selanjutnya dilakukan ekuilibrasi sistem memalui pemanasan  bertahap  0  hinga  310 O K yang disertai penurunan daya tahan dan pergantian dengan tahanan konstan. Simulasi dinamika molekul dijalankan pada suhu konstan 310 O K selama 5 tahapan dengan masing-masing 10 ns.
3.  Hasil 3.1. Hasil Preparasi Struktur Reseptor Estrogen Alfa (ERα) Struktur  makromolekul  (reseptor) yang digunakan pada penelitian ini adalah reseptor estrogen alfa (hERα) yang diunduh dari situs Protein Data Bank (PDB) melalui http://www.rcsb.org/ dengan kode ID PDB 3ERT  yang  merupakan  ERα  pada  manusia yang terkompleks dengan ligan antagonisnya (tamoxifen) yang diperoleh dari difraksi sinar X dengan resolusi 1,9 Å dan diunduh dengan format berkas .pdb.
Rancangan modifikasi struktur andrografolid dan tamoxifen sebagai ligan
Table 1. Struktur Tamoxifen dan Andrografolid serta Modifikasi Strukturnya
Nama Struktur Lipinski's rule Tamoxifen MW   : 388.531 HBD : 2 HBA : 2
LogP : 4.285
Andrographolide (AND)
MW   : 354.487 HBD : 3
HBA : 4 LogP : 2.122
Modifikasi AND1 MW  : 408.696
HBD : 4
HBA : 6 LogP : 3.264 Modifikasi AND2
MW   : 434.427 HBD : 4 HBA : 5
LogP : 1.898 Modifikasi AND3
MW   : 471.438 HBD : 3 HBA : 4 LogP : 2.886 Modifikasi AND4 MW    : 445.576 HBD : 3 HBA : 4 LogP : 1.221 Modifikasi AND5 MW   : 495.538 HBD : 3 HBA : 5
LogP : 4.665
standar dapat dilihat pada Tabel 1. Konsiderasi pada  tahapan  modifikasi  struktur  ini  adalah dengan tidak mengubah farmakofor dari struktur andrografolid itu sendiri. Dari Tabel 1. diketahui bahwa ligan andrografolid beserta modifikasi strukturnya telah memenuhi aturan Lipinski.
3.2. Hasil Validasi Metode Komputasi Validasi metode komputasi dilakukan untuk membuktikan dan memastikan bahwa metode yang digunakan memenuhi syarat validitas dan dapat digunakan untuk pengujian
molekul lainnya serta dapat meminimalisir kesalahan. Hasil re-docking tamoxifen menghasilkan nilai energi bebas ikatan (∆G) sebesar  −11.40  kkal/mol  dan  membentuk ikatan hidrogen dengan residu asam amino Glu353 dan Arg394 yang dapat dilihat pada Gambar 1.
3.3. Hasil Pemodelan Farmakofor
Pemodelan farmakofor memiliki tujuan untuk dapat mengidentifikasi bagian esensial dari senyawa andrografolid yang bertanggung jawab atas aktivitas farmakologis. Hasil
Gambar 1. Interaksi Tamoxifen pada Kantung Aktif Reseptor Estrogen Alfa
Keterangan : panah (dan bulatan) merah merepresentasikan donor ikatan hidrogen, panah (dan bulatan) hijau merepresentasikan akseptor ikatan hidrogen, bulatan kuning merepresentasikan daerah hidrofobik.

## pemodelan farmakofor andrografolid dapat
dilihat  pada  Gambar  2  hasil  pemodelan farmakofor andrografolid. Hasil pengujian pharmacophore-fit andrografolid dan modifikasi  strukturnya  terhadap  tamoxifen menunjukkan  bahwa  kelima  modifikasi struktur dari andrografolid memiliki kemiripan dengan tamoxifen lebih dari 50% dan lebih baik dari andrografolid dasarnya (Tabel 2).
3.4. Hasil Simulasi Penambatan Molekular ( Docking Simulation )
Metode penambatan molekul bertujuan
untuk melihat interaksi antara ligan yakni andrografolid dengan reseptor targetnya yakni hERα. Hasil tahapan ini adalah nilai ∆G, Ki, jumlah klaster, dan jenis ikatan terhadap residu asam amino. Hasil docking andrografolid dan modifikasi  strukturnya  beserta  tamoxifen terhadap  hERα  dapat  dilihat  pada  Tabel  3. Interaksi yang terbentuk antara andrografolid dengan hERα dapat dilihat pada Gambar 3.
3.5. Hasil Simulasi Dinamika Molekular Analisis yang dilakukan terhadap hasil simulasi dinamika molekul dilakukan pada tiga aspek yakni Root Mean Square
Tabel 2. Hasil Pharmacophore-fit Andrographolide dan Modifikasinya
No Nama Molekul Pharmacophore-fit (%) 1 Andrographolide (AND) 46,39 2 Modifikasi AND1 56,03 3 Modifikasi AND2 62,76 4 Modifikasi AND3 64,07 5 Modifikasi AND4 62,39 6 Modifikasi AND5 63,47 Tabel 3 .  Hasil  Simulasi  Docking Andrographolide  dan  Modifikasi  Strukturnya  Beserta Tamoxifen terhadap ERα
No Nama Molekul ΔG kkal/ mol Jumlah Klaster Ki (nM) Interaksi dengan Asam Amino Ikatan Hidrogen van der Waals (Hidrofobik) 1 Tamoxifen −11.40 99 1.92 Arg394, Glu353 Gly521,His524,Glu419, Thr347,Leu384,Asp351, Trp383,Phe404 His524,Met421,Ile424,  Leu4 28,Leu391,Arg394,Glu353,Tr p383,Thr347, Leu540 Asp351,Arg394,Glu419, Ile424, Leu428,Val418,Trp383 Arg394,Gly420,Ile424, Leu346, Leu536,Trp383 Arg394,Asp351,Glu353 ,Gly420,Ile424,Leu354, Leu391,Phe404 2 Andrographolide (AND) −9.65 47 243.1 Gly521 3 Modifikasi (AND1) −8.95 22 421.81 Gly521 4 Modifikasi (AND2) −10.05 39 43.25 Gly521, Met343 5 Modifikasi (AND3) −8.79 63 361.17 Gly521, Met343 6 Modifikasi (AND4) −8.95 55 277.10 Gly521, Asp351, Met421 Arg394,Glu353,Ile421, Leu384, Leu428,Leu536 7 Modifikasi (AND5) −12.43 68 1.08 Gly521, Asp351, Met343 Cys530,Leu349,Leu384, Leu387,Phe404,Val533
Deviation (RMSD),  Root  Mean  Square Fluctuation (RMSF), dan perhitungan energi ikatan metode Molecular Mechanics-Poisson Boltzmann Surface Area (MM-PBSA).
3.6. Root Mean Square Deviation (RMSD) Analisis hasil simulasi dinamika molekular dilakukan dengan menggunakan perangkat  lunak  AMBER14. Root Mean Square Deviation (RMSD)  merupakan suatu nilai deviasi yang merepresentasikan perbandingan antara konformasi ligan- reseptor pada proses simulasi berlangsung dengan konformasi ligan-reseptor awal. Secara keseluruhan, sistem mencapai kondisi stabil setelah mencapai waktu simulasi 50 ns dan grafik RMSD, ditunjukkan Gambar 4.
3.7. Root Mean Square Fluctuation (RMSF) Nilai Root Mean Square Fluctuation
(RMSF) menunjukkan fluktuasi residu asam amino penyusun reseptor selama proses simulasi sehingga dapat merepresentasikan fleksibilitas residu. Ligan AND5 menunjukkan fluktuasi  yang  lebih  tinggi  dibandingkan dengan struktur dasar andrografolid dan estradiol seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5.
3.8.  Perhitungan  Energi  Ikatan  Metode

## MM-PBSA
Tabel 4 menunjukkan bahwa kompleks hERα−AND5  memiliki  nilai  energi  bebas ikatan  total  (∆G TOTAL )  yang  lebih  rendah dibandingkan dengan sistem hERα−estradiol sebagai kompleks agonis dan dapat diketahui bahwa  interaksi  Van  der  Waals  (VdW) merupakan komponen energi yang paling besar memberikan pengaruhnya terhadap sistem.
Gambar 3. Interaksi Andrographolide pada Kantung Aktif Reseptor Estrogen Alfa

## 4.  Pembahasan
4.1.  Preparasi  Struktur  Reseptor  Estrogen Alfa (ERα) Struktur  hERα  ini  selain  terkompleks dengan ligan juga mengikat molekul air. Molekul air dapat menyebabkan proses penambatan  molekul  ( docking )  terjadi lebih kompleks dikarenakan persamaan matematika nya lebih banyak dan juga dapat memungkinkan terjadinya ikatan hidrogen dengan ligan sehingga molekul air perlu dipisahkan menggunakan perangkat lunak BIOVIA Discovery Studio sebelum dilakukan docking . Hasil dari proses ini disimpan dalam berkas dengan format .pdb. Pada struktur makromolekul ditambahkan muatan Kollman agar sesuai dengan lingkungan docking dan dapat dilakukan kalkulasi yang tepat.
4.2. Preparasi Ligan
Tamoxifen sebagai ligan standar diperoleh dari proses pemisahannya dari struktur ERα menggunakan perangkat lunak BIOVIA Discovery Studio . Sedangkan ligan uji yakni andrografolid dibuat dan dimodelkan struktur 2D nya dengan perangkat lunak ChemDraw Ultra dan dioptimasi geometri strukturnya  menjadi  3D  menggunakan Chem3D lalu disimpan dalam bentuk berkas .pdb. Optimasi ligan dilakukan dengan penambahan muatan Gasteiger dengan menggunakan perangkat lunak AutoDock Tools kemudian dilakukan merge non-polar sehingga hanya atom hidrogen polar yang muncul. Sebelum ligan ditambatkan pada reseptor  perlu  adanya  identifikasi  kantung aktif ikatannya terlebih dahulu pada reseptor
Gambar 5 . Nilai RMSF Sistem Simulasi
Tabel 3 .  Hasil  Simulasi  Docking Andrographolide  dan  Modifikasi  Strukturnya  Beserta Tamoxifen terhadap ERα
Komponen Energi (kkal/mol) Sistem hERα − Estradiol hERα – AND5 Interaksi Van der Waals (VdW) −44,87 −57,92 Energi Elektrostatik (EEL) 1,16 −9,67 Kontribusi Elektrostatik terhadap Energi Bebas Solvasi (EGB) 7,39 19,56 Kontribusi Non-polar terhadap Energi Bebas Solvasi (ESURF) −4,54 −5,54 ∆Ggas (VdW + EEL) −43,71 −67,54 ∆Gsolv (EGB + ESURF) 2,85 14,02 ∆GTOTAL (VdW + EEL + EGB + ESURF) −40,86 −50,52
melalui parameter grid . Ligand-binding  domain (LBD)  yang dikenal  sebagai  sisi  ikatan  ligan  pada  ERα didominasi oleh daerah hidrofobik yang menyusun  helix  3,6,7,8,11,  dan  12  dimana yang merupakan penentu aktivitas ligan apakah bertindak sebagai agonis atau antagonis terhadap reseptor adalah helix 12.12 Upaya desain obat baru perlu memperhatikan Lipinski’s Rule of Five (RO5) dimana aturan ini menentukan dan mengevaluasi senyawa dengan aktivitas tertentu dapat menembus membran atau tidak bila diberikan secara oral. Aturan ini terdiri atas bobot molekul ≤  500;  donor  ikatan  hidrogen  ≤  5;  akseptor ikatan  hidrogen  ≤  10,  nilai  LogP  ≤  5,  dan reaktivitas  molar  pada  rentang  40-130.13 Rancangan modifikasi struktur andrografolid dan tamoxifen sebagai ligan standar dapat dilihat pada Tabel 1.
4.3. Validasi Metode Penambatan Molekul ( Docking )
Validasi metode penambatan molekul ( docking )  dilakukan  dengan  menambatkan ulang ligan standar yang sudah dipisahkan dari reseptornya atau dikenal dengan istilah re-docking dimana pada penelitian ini ligan standarnya yakni tamoxifen dan reseptornya adalah hERα. Optimasi koordinat jarak perlu dilakukan untuk menentukan nilai Root Mean Square Deviation (RMSD)  terbaik dan  memenuhi  pesyaratan  yakni  <  2Å.14 Penentuan grid box (daerah ikatan) dilakukan untuk membatasi ruang pencarian konformasi ligan  pada  proses  docking.  Grid  box  yang dihasilkan melalui re-docking tamoxifen terhadap  ERα  adalah  x=30,282;  y=-1,1913; z=24,207  dengan  volume  ruang  40x40x40 titik dengan nilai RMSD yakni 1,01Å maka dapat dikatakan metode penambatan molekul valid dikarenakan nilai RMSD < 2Å serta berada di kategori close pose dalam hal reprodusibilitas pose ligan awal. 15 Dua  residu  asam  amino  pada  Gambar 1,  merupakan  bagian  dari  beberapa  asam amino krusial yang terdapat pada sisi aktif dari  estrogen  alfa,  yaitu    Glu353,  Arg394, Gly521,  His524,  Asp351,  dan  Leu346. Residu asam amino Arg394 dan Glu353 dari
estrogen alfa diketahui masing- masingnya memperlihatkan satu ikatan hidrogen dengan gugus hidroksil pertama dari ligan alami steroid  estradiol,  sedangkan  gugus  hidroksil kedua dari steroid estradiol membentuk ikatan  hidrogen  dengan  sisi  polar  His524 pada estrogen alfa. Adanya interaksi antara tamoxifen dengan sisi muatan positif Arg394 dan  sisi  muatan  negatif  Glu353  ini  yang membuat interaksi tamoxifen-estrogen alfa memiliki nilai energi bebas ikatan (∆G)  yang rendah. 16 4.4. Validasi Metode Pemodelan Farmakofor Validasi metode pemodelan dan skrining farmakofor pada perangkat lunak  LigandScout  4.1  dilakukan  dengan menggunakan test set yang terdiri dari actives set  (kumpulan  ligan  aktif  pada  reseptor tertentu)  dan  decoys  set  (ligan  yang  mirip secara struktur dengan actives set namun tidak aktif terhadap reseptor).
Total senyawa yang digunakan pada validasi pemodelan farmakofor yakni 21.399 senyawa terdiri dari 626 actives set dan 20.773 decoys set yang diperoleh dari Database of Useful Decoys (DUDe). Hasil yang diperoleh 8.464  hit  (kumpulan  ligan  terbaik)  dengan nilai  AUC100%  adalah  tepat  1,00  maka dikatakan valid. Kurva Receiver Operating Characteristic (ROC)  pada  validasi  metode pemodelan farmakofor memiliki sumbu x yakni laju senyawa decoy dan sumbu y adalah laju senyawa aktif.

## 4.5. Pemodelan Farmakofor
Pemodelan farmakofor memiliki tujuan untuk dapat mengidentifikasi bagian esensial dari senyawa andrografolid yang bertanggung jawab atas aktivitas farmakologis.
Pemodelan farmakofor juga dapat digunakan untuk melihat tingkat kemiripan senyawa  andrografolid  dan  modifikasi strukturnya dengan ligan standarnya yakni tamoxifen. Tingkat kemiripan dilihat dari  fitur  dan  gugus  kimia  yang  dimiliki oleh ligan sehingga jika nilai kemiripan (pharmacophore-fit)  lebih  dari  50%  maka dapat diasumsikan bahwa aktivitasnya terhadap  reseptor  ERα  adalah  sama. Berdasarkan hasil pengujian pharmacophore-
fit andrografolid  dan  modifikasi  strukturnya terhadap tamoxifen menunjukkan bahwa kelima modifikasi struktur dari andrografolid memiliki kemiripan dengan tamoxifen lebih dari 50% dan lebih baik dari andrografolid dasarnya  (Tabel  2).  Oleh  karena  itu,  kelima ligan ini dapat dinyatakan memeliki tingkat afinitas yang baik terhadap reseptor estrogen alfa.
4.6. Simulasi Penambatan Molekular ( Docking Simulation )
Metode penambatan molekul bertujuan untuk melihat interaksi antara ligan yakni andrografolid dengan reseptor targetnya yakni hERα. Hasil tahapan ini adalah nilai ∆G, Ki, jumlah klaster, dan jenis ikatan terhadap residu asam amino. Hasil docking andrografolid dan modifikasi  strukturnya  beserta  tamoxifen terhadap hERα dapat dilihat pada Tabel 3. Berdasarkan hasil penambatan molekul, modifikasi  AND2  dan  AND5  menunjukkan nilai  ∆G  yang  lebih  kecil  dibandingkan dengan andrografolid dasar sehingga tingkat afinitas  terhadap  hERα  semakin  tinggi dikarenakan energi yang dibutuhkan untuk berikatan dengan reseptor lebih rendah. Bahkan  modifikasi  AND5  memiliki  ∆G yang lebih kecil dari tamoxifen sebagai ligan standarnya sehingga menjadi kandidat yang menjanjikan sebagai terapi kanker payudara positif  ERα.  Jumlah  klaster  yang  lebih banyak menunjukkan bahwa pose informasi yang dihasilkan lebih stabil. Nilai Ki (konstanta inhibisi) berbanding lurus dengan nilai  ∆G  sehingga  semakin  kecil  nilai  Ki maka konsentrasi yang dibutuhkan senyawa tersebut lebih kecil untuk menghasilkan efek inhibisi terhadap reseptor target. Interaksi yang terbentuk antara andrografolid dengan hERα dapat dilihat pada Gambar 3.
Interaksi dengan kantung aktif pun  perlu  untuk  diidentifikasi  karena menunjukkan ikatan apa saja yang terjadi antara ligan dan reseptornya. Pada penelitian ini yang perlu diperhatikan adalah ikatan hidrogen antara ligan dengan asam amino His524  dikarenakan  dapat  menentukan sifat suatu ligan apakah bertindak sebagai agonis atau antagonis dimana ketika ligan
berikatan dengan His524 pada helix-11 dapat menyebabkan helix-12 terbuka dan berikatan dengan koaktivator sehingga ligan bersifat agonis begitu pula sebaliknya. Ligan akan bersifat antagonis ketika tidak membentuk ikatan  hidrogen  dengan  His524. 17,18 Hasil penelitian menunjukkan bahwa andrografolid dan modifikasi strukturnya tidak membentuk ikatan hidrogen dengan asam amino His524 sehingga dapat dikatakan memiliki aktivitas antagonis seperti halnya tamoxifen yang juga tidak membentuk ikatan hidrogen dengan asam amino His524 pada helix-11.
4.7. Simulasi Dinamika Molekular Analisis yang dilakukan terhadap hasil simulasi dinamika molekul dilakukan pada tiga aspek yakni Root Mean Square Deviation (RMSD), Root Mean Square Fluctuation (RMSF), dan perhitungan energi ikatan metode Molecular Mechanics-Poisson Boltzmann Surface Area (MM-PBSA). Secara  keseluruhan,  sistem  mencapai kondisi stabil setelah mencapai waktu simulasi 50 ns dan grafik RMSD, ditunjukkan Gambar 4, memperlihatkan bahwa kompleks hERα−AND5  memiliki  nilai  RMSD  yang lebih tinggi (2,5 – 3,0 Å) yang dibandingkan dengan  hERα−estradiol  (1,5  –  2,5  Å). 19,20 Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  hERα memiliki fleksibilitas yang lebih tinggi ketika berinteraksi dengan AND5 dan struktur protein hERα dapat terbuka.

## 4.8. Root Mean Square Fluctuation (RMSF)
Residu asam amino yang memiliki fluktuasi  tinggi  pada  Gambar  5  yakni Pro333,  Thr371,  Ser463  pada  semua  ligan pada  penelitian  ini,  namun  hanya  Lys416 dan  Glu419  yang  memiliki  fluktuasi  tinggi akibat AND5.  Kristal  PDB  3ERT  diketahui memiliki rangkaian ikatan hidrogen yang terbentuk antara Glu419 dengan Lys531 dan Glu419  dengan  His524. 21 Pada kompleks AND5 terganggunya ikatan hidrogen yang terbentuk  pada  Lys419-Glu419,  dengan terjadi fluktuasi yang meningkat pada residu tersebut sehingga dapat diinterpretasikan bahwa AND5 memiliki aktivitas sebagai
antagonis hERα.
4.9.  Perhitungan  Energi  Ikatan  Metode MM-PBSA Metode perhitungan Molecular Mechanics-Poisson Boltzmann Surface Area (MM-PBSA) merupakan suatu metode kalkulasi energi bebas ikatan sistem ligan- reseptor yang paling representatif pada simulasi dinamika molekul. 22 Tabel  4 menunjukkan bahwa kompleks hERα−AND5 memiliki nilai energi bebas ikatan total (∆GTOTAL) yang lebih rendah dibandingkan dengan  sistem  hERα−estradiol  sebagai kompleks agonis dan dapat diketahui bahwa interaksi  Van  der  Waals  (VdW)  merupakan komponen energi yang paling besar memberikan pengaruhnya terhadap sistem.
Kontribusi energi dari interaksi VdW yang besar  terhadap sistem mengindikasikan bahwa residu asam amino penyusun kantung aktif    protein  hERα  didominasi  oleh  residu dengan sifat hidrofobik. Nilai total energi bebas  ikatan  (∆G)  pada  sistem  hERα− AND5  yang  lebih  rendah  (−50,52  kkal/ mol)  menunjukkan  bahwa  tingkat  afinitas AND5  (antagonis)  terhadap  hERα  lebih baik dibandingkan dengan estradiol sebagai agonis dengan nilai total ∆G sebesar −40,86 kkal/mol .
5.  Simpulan Penelitian ini menunjukkan bahwa andrografolid  dan  modifikasi  struktur terbaiknya  (AND5)  memiliki  aktivitas antagonis  terhadap  reseptor  hERα  dengan membentuk ikatan hidrogen dengan Gly521, Asp351,  Met343  dan  tidak  terbentuknya ikatan hidrogen dengan His524.
Pengujian potensi aktivitas antikanker payudara dari modifikasi struktur andrografolid dilakukan melalui simulasi penambatan molekul, pemodelan farmakofor, dan simulasi dinamika molekular. Hasil simulasi penambatan molekul menunjukkan bahwa  nilai  energi  bebas  ikatan  (∆G) andrografolid dan AND5 sebesar −9,65 kkal/ mol  dan  −12,43  kkal/mol,  secara  berurutan. Nilai  ∆G AND5  lebih  rendah  dibandingkan dengan  ∆G  tamoxifen  yaitu  sebesar  −11,40
kkal/mol.  Hasil  pemodelan  farmakofor menunjukkan bahwa andrografolid dan AND5 memiliki nilai pharmacophore- fit  yang  cukup  tinggi  sebesar  46,39%  dan 63,47%, secara berurutan. Berdasarkan hasil simulasi dinamika molekular menggunakan metode  kalkulasi  MM-PBSA,  diketahui bahwa  sistem  hERα−AND5  memiliki  nilai ∆GTOTAL=  −50,52  kkal/mol  dibandingkan dengan  sistem  hERα−estradiol  dengan nilai  ∆GTOTAL=  −40,86  kkal/mol.  Hal  ini menunjukkan bahwa AND5 memiliki afinitas yang lebih baik terhadap kantung aktif hERα dibandingkan dengan estradiol sehingga AND5 merupakan agen antikanker payudara yang sangat menjanjikan.

## 6.  Saran
Perlu dilakukannya sintesis senyawa modifikasi  terbaik  dari  andrografolid  yakni senyawa AND5 yang kemudiaan dikonfirmasi dengan uji in vitro dan in vivo untuk memastikan aktivitas senyawa AND5 sebagai antikanker payudara dengan mekanisme sebagai antagonis reseptor estrogen alfa (hERα).
Daftar Pustaka 1. Ferlay  J,    Soerjomataram  I,  Ervik M,  Dikshit  R,  Eser  S,  Mathers  C. GLOBOCAN  2012  v1.0,  Cancer Incidence  and  Mortality  Worldwide: IARC CancerBase No. 11. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2013.
2.  Kementerian Kesehatan RI. Data Dan Informasi  Profil  Kesehatan  Indonesia 2016. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta; 2017.
3.  WHO.  Cancer  country  profiles  2014. Tersedia  online  di  http://www.who.int/ cancer/country-profiles/en/; 2017.
4.  Mathew, Alex J. and  Nixon RN. Docking Studies on Anticancer Drugs for Breast Cancer Using Hex. Proceedings of the International MultiConference of Engineers and Computer Scientists 2009 Vol I IMECS 2009. Hongkong; 2009.
5. Nelson  E,  Chang  C,  and    McDonnell D. Cholesterol and Breast Cancer
Pathophysiology.  Trends  Endocrinology and Metabolism. 2014;25(12):649-55.
6. Crew  K.  et  al.  How  Do  We  Increase Uptake of Tamoxifen and Other Anti- Estrogens for Breast Cancer Prevention? NPJ Breast Cancer. 2017;3(1): 20–7.
7. Gu W, Xu W, Sun X, Bubing Z, Shuangjie W. et al. Anordrin Eliminates Tamoxifen Side  Effects  without  Changing  Its Antitumor  Activity.  Nature  Scientific Reports. 2017;7(7): 1–9.
8. Ruyck  J,  Brysbaert  R,  Blossey  R,  and Lensink M. Molecular docking as a popular tool in drug design, an in silico travel. Adv Appl Bioinform Chem. 2016; 9(1):1–11.
9. Geethangili  YK,  Rao  SH,  Fang  YM, Tzeng. 2008. Cytotoxic constituents from Andrographis paniculata induced cell cycle arrest in Jurkat cells. Phytother Res. 2008; 22(10):1336-41.
10. Ahmad MS, Ahmad S, Arshad M, Afzal M. Andrographia paniculata a miracle herbs for cancer treatment: In vivo and in vitro studies against aflatoxin B1 toxicity. Egyptian  Journal  of  Medical  Human Genetics. 2014;15(2):163-71.
11. Kementerian  Pertanian.  2014.  Statistik Produksi Hortikultura Tahun 2013. Dirjen Hortikultura .Jakarta; 2014.
12. Leeuw R, Jacques N, Rob M. A Role for Estrogen  Receptor  Phosphorylation  in the Resistance to Tamoxifen. Int J Breast Cancer. 2011; 2011: 232-35.
13. Lipinski  C.  Lead  Profiling  Lead-  and Drug-like Compounds : The Rule-of- Five Revolution. Drug Discovery Today: Technologies. 2004;1(4): 337–41.
14. Puratchikody A, Dharmaraj S, Umamaheswari  A,  and  Irfan  N.  3-D structural  interactions  and  quantitative structural toxicity studies of tyrosine derivatives intended for safe potent inflammation  treatment.  Chem  Cent  J. 2016; 10(24) : 1-19.
15. Bajda M, Jonczyk J, Malawska B, Filipek
S. Application of Computational Methods for  the  Design  of    BACE-1  Inhibitors: Validation of in Silico Modelling. Int. J. Mol. Sci. 2014; (15): 5128-39 16. Josh  M,  Pradeep  S,  Adarshc  VK, Vijayalekshmi A, Sudha DR,
Balachandrand  S,  Sreejithc  MN,  Abdul Jaleelc  UC,  Benjamina  S.  In  silico evidences for the binding of phthalates onto  human  estrogen  receptor  α,  β subtypes and human estrogen-related receptor  γ.  Molecular  Simulation.  2014; 40(5):408-17.
17. Muchtaridi M, Syahidah HN, Subarnas A,
Yusuf M, Bryant SD, Langer T. Molecular Docking
and 3D-Pharmacophore Modeling to Study the Interactions of Chalcone  Derivatives  with  Estrogen Receptor Alpha. Pharmaceuticals. 2017;10(4):1-12.
18. Ramachandran B, Kesavan, S., Rajkumar, T. Molecular modeling and docking of small molecule inhibitors against NEK2. Biomed Informatics. 2016;12(2):62–8.
19. Maiorov VN dan Gordon C. Significance of  root-mean-square  deviation  in comparing three-dimensional structures of  globular  proteins.  J  Mol  Biol.  1994; 235(1):625–34.
20. Shaw  DE.  et  al.  Atomic-level characterization of the structural dynamics of  proteins.  Science.  2010;330(1):341– 46.
21. Celik L, Lund J, Schiott B. Conformational dynamics of the estrogen reseptor alpha: molecular dynamics simulations on the  influence  of  binding  site  structure on protein dynamics. Biochemistry. 2007;46(1): 1743-58.
22. Abroshan  H,  Akbarzadeh  H,  Parsafar A. Molecular Dynamics Simulation and MM-PBSA Calculations of Sickle Cell Hemoglobin in Dimer Form with Val, Trp, or Phe at the Lateral Contact. Journal of Physical  Organic  Chemistry.2010;23(9): 866–77.