Menara Perkebunan , 2006, 74(2), 62-74.
Teknik sambung mikro in vitro kina Cinchona succirubra dengan C. ledgeriana
In vitro micrografting  technique  of Chincona succirubra and C. ledgeriana .
Nurita TORUAN-MATHIUS 1) , LUKMAN 2) & AGUS  - PURWITO 3)
1) SEAMEO BIOTROP, Bogor, Indonesia
2) Fakultas Pertanian, Universitas Malikussaleh , Lhokseumawe, Banda Aceh, Indonesia
3) Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor,  Bogor, Indonesia

## Summary
In  vitro micrografting  is  a  technique  for grafting  scions  to  rootstocks  of  plantlets  from tissue  culture. In  vitro micrografting  of Cinchona plant  has  never  been  carried  out. The objective of this research was to obtain the best  method  of in  vitro micrografting,  medium for micrografted plantlets, and acclimatization for Cinchona plantlets  from    micrografting. The  research  consisted  of  (i)  optimization  of micrografting  method,  (ii)  optimization  of medium  for  growing  plantlets,  and  (iii) acclimatization of micrografted plantlet. Plantlets  of  four-month-old  of C.  ledgeriana
QRC  clone  were  used  as    scions,  while  of
C.  succirubra as    rootstocks.  Each  of experiments  was  arranged  according  to Completely  Randomized  Design,  consisted  of combination of scion and rootstock and type of micro-grafting  with  10  replicates.  Parameters measured  were    the  percentage  of  survived plantlet,  leaf  number,  and  callus  productions on  union  area,  and  percentage  of  survived plantlet.  The  results  show  that  V  type  of micrografting  was  the  best  for  Cinchona micrografting. MS medium with the addition of 3  mg/L  IBA  was  the  best  medium  for  growing of  micrografted  plantlet.  Husk  charcoal  mixed with  top  soil  (1  :  1)  was  the  best  medium  for acclimatization.  Acclimatization  consisted  of two steps: preaclimatization  in a culture room with 12- hour
photoperiod at temperature 25 – 27 o C  for two weeks,    followed  by  aclimatization  in a  plastic house with  70% reduced light intensity for one month. Using this method, 90% of the seedlings were  survived.  It  is  concluded  that in  vitro micrografting  can  be  used  as  a  technique  for clonal propagation of Cinchona sp.
[ Keywords: Micrografting  type,  micrografting medium, acclimatization].

## Ringkasan
Teknik sambung mikro (mikrografting) in vitro adalah  teknik  penyambungan  potongan batang  atas  pada  batang  bawah  dalam  kultur jaringan.    Pada  tanaman  kina  teknik  sambung mikro in vitro belum pernah dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah  menetapkan tipe sambung mikro,  medium  terbaik  untuk  planlet  hasil sambung    mikro,  dan  perbanyakan  tanaman kina  dengan  sambung  mikro.  Pelaksanaan percobaan  meliputi  (i)  optimasi  tipe  sambung, (ii)  optimasi    medium,  dan  (iii)  aklimatisasi planlet  hasil  sambung  mikro.  Bahan  tanaman yang  digunakan  sebagai  batang  atas  adalah planlet Cinchona  ledgeriana klon  QRC, sedangkan  sebagai  batang  bawah  digunakan planlet C.  succirubra ,  berumur  empat  bulan. Masing-  masing  percobaan  disusun  dengan Rancangan Acak Lengkap terdiri dari dua taraf
1) Penulis korespondensi  e-mail: toruan@biotrop.org
Toruan-Mathius et al.
yaitu    kombinasi  batang  bawah  dengan  batang atas  bentuk  sambung  tipe  V  dan  L  dilakukan dengan  10  ulangan.  Peubah  yang  diukur meliputi  persentase  planlet  yang  bertahan hidup,    jumlah  daun,    berkalus  atau  tidak berkalus pada daerah pertautan, dan persentase planlet  yang  bertahan  hidup.  Hasil  yang diperoleh menunjukkan bahwa tipe V merupakan cara sambung  mikro  yang terbaik. Medium MS dengan penambahan 3 mg/L IBA adalah medium terbaik untuk pertumbuhan dan perakaran  planlet  hasil  sambung  mikro. Aklimatisasi planlet dilakukan dengan medium tumbuh  arang  sekam  :  tanah  (1  :  1)  yang disterilkan.  Tahapan  aklimatisasi  adalah  pre- aklimatisasi  dalam  ruang  kultur    suhu  25  - 27 o C dengan pencahayaan 12 jam per hari dan diikuti  dengan  aklimatisasi  di  rumah  plastik bernaungan  70%  paranet.  Dengan  metode aklimatisasi  ini    90%  dari  bibit  mampu bertahan  hidup.  Kesimpulan  dari  penelitian  ini menunjukkan  bahwa  teknik  sambung  mikro dapat  digunakan  untuk  perbanyakan  klonal Cinchona sp.

## Pendahuluan
Kina  ( Cinchona  succirubra dan C. ledgeriana ) merupakan tanaman industri    penghasil  senyawa  alkaloid  yang dapat  digunakan  dalam  industri  farmasi, kosmetik,  industri  makanan  dan  minuman serta  agrokimia  lainnya  (Widayat,    2000). Empat  jenis  alkaloid  utama  tanaman  kina adalah  kinin,  kinidin,  sinkonin  dan sinkonidin. Kinin digunakan sebagai bahan tonik  perantara  senyawa  pembuat  vitamin B dan obat anti malaria, sedangkan kinidin digunakan  sebagai  obat  pengatur  irama denyut jantung (Dayrit et al ., 1994).
Indonesia merupakan penghasil alkaloid  kina  berupa  garam  kina.  Akan tetapi  sampai  saat  ini  hasil  tersebut masih  belum  mencukupi  kebutuhan karena  penanaman  masih  terbatas. Usaha  untuk  pemenuhan  kebutuhan
garam  kina  adalah  melalui  perluasan areal  dan  peremajaan  tanaman.  PTPN VIII  merencanakan  untuk  melakukan perluasan  areal  hingga  tahun  2008  men- capai  10.000  Ha  (Santoso  &  Wibowo, 2000). Sehubungan  dengan  hal  itu  di- perlukan  penyediaan  bibit  yang  ber- kualitas  dengan  kandungan  kinin  tinggi dan  tahan  terhadap  penyakit  akar    dalam jumlah  yang  banyak.  Sampai  saat  ini penyediaan bahan tanaman kina dilaku- kan  dengan  teknik  semai  sambung  dan setek sambung.
Semai  sambung  dan  setek  sambung adalah  penyambungan  yang  dilakukan  di lapang  dimana  sebagai  batang  bawah  di- gunakan C. succirubra berumur 15 bulan, sedangkan    batang  atas  digunakan C. ledgeriana berumur 8-12 bulan. Kedua teknik  tersebut  banyak  kelemahannya antara  lain  tingginya  tingkat  inkompa- tibilitas,  rendahnya  persentase  tanaman yang  berhasil  hidup  dengan  baik,  sulit mendapatkan  bahan  sambung  dalam jumlah yang banyak, dan persiapan bahan tanaman membutuhkan waktu yang lama. Bibit  siap  dipindah  ke  lapang    setelah berumur  2,5  tahun  (Santoso  &  Wibowo, 2000).
Salah  satu  cara  untuk  mengatasi masalah  di  atas  adalah  dengan  meng- gunakan  teknologi  sambung  mikro in vitro, yang  selanjutnya  disebut  sambung mikro. Sambung mikro adalah perbanyak- an vegetatif yang dilakukan dalam kondisi aseptik  dengan  menggunakan  teknik kultur in  vitro yang  bertujuan  untuk menggabungkan  keunggulan  sifat  batang bawah  dan  batang  atas.  Keunggulan penggunaan  sambung  mikro  adalah  dapat mempersingkat  waktu  penyediaan  bibit sambung,  menghasilkan  tanaman  bebas penyakit,  tanaman  lebih  seragam,  dan
Teknik sambung mikro in vitro kina .....
dapat  diproduksi  dalam  jumlah  yang banyak  serta  rendahnya  inkompatibilitas (Mariska,  1985;  Pasquale et  al .,  1999; Estrada-Luna et al., 2002; Turnbull et al ., 2002;  Kala et  al .,  2002).  Di  samping  itu dapat  mengetahui  secara  dini  hasil sambung mikro yang kompatibel atau yang tidak kompatibel (Errea et al ., 2001).
Raghothama (1999) menyatakan bahwa  pada  sambung  mikro Arabidopsis yang  kompatibel    hubungan  timbal  balik antara  batang  bawah  dan  batang  atas terjadi  secara  normal.  Holbrook et  al. (2002)  juga  menyatakan  hubungan  antara batang  bawah  dan  batang  atas    mem- pengaruhi    keragaman  dalam  pola  distri- busi  hara,  kemampuan  hara  untuk  ber- gerak  melintasi  bagian  penyatuan  sam- bungan, dan regulasi transpor hormon.
Salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi keberhasilan  sambung  mikro  adalah  tipe penyambungan  batang  bawah  dan  batang atas  yang  digunakan.  Metode  sambung umumnya  tergantung  pada  spesies  tanaman yang  disambung.  Beberapa  tipe  penyam- bungan yang umum digunakan adalah tounge approach  grafting, penyambungan  dengan penyisipan,  penyambungan  dengan  pemo- tongan,  penyambungan  dengan  pemotongan miring,  horizontal,  dan  penyambungan dengan  bantuan  selang  plastik.  Di  samping itu  ada  juga  penyambungan  berbentuk  V dan L  (Oda, 1995; Lee et al .,1998;  Suzuki et  al., 1998).  Lukman et  al .  (2005) menyatakan  bahwa  keberhasilan  sambung mikro  antara  manggis  dan  mundo  tipe  V mencapai  76 %, dan bentuk sambung tipe V  lebih  baik  dari  yang  lainnya.  Estrada- Luna et  al .  (2002)  berhasil  melakukan sambung mikro tipe V dan mendatar pada kaktus.
Kala et al . (2002) menyatakan bahwa medium  merupakan  faktor  utama  dalam penentuan  keberhasilan  perakaran  sam- bung  mikro.  Induksi  perakaran  pada
planlet  sambung  mikro  perlu  dirangsang dengan  menggunakan  IBA.  Sebanyak IBA  10  µM  IBA  merupakan  konsentrasi terbaik  untuk  perakaran  jambu  mete (Bogetti et  al .,  2001),  dan  2  mg/L    untuk planlet kina (Santoso et al ., 2004). Yunita (2002)  melaporkan  bahwa  perendaman planlet  melinjo  dalam    500  mg/L  IBA sebelum  diaklimatisasi  dapat  merangsang perakaran  pada  tahap  aklimatisasi.  Per- tumbuhan  akar  yang  baik  pada  saat  peng- kulturan  planlet  sangat  penting  untuk mempertahankan  kemampuan  hidup  yang tinggi pada aklimatisasi dan pasca aklima- tisasi.
Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui  (i)    tipe  sambung  sambung mikro  yang  terbaik,  (ii)  medium  yang terbaik untuk planlet hasil sambung mikro, dan  (iii)    teknik  aklimatisasi  planlet  hasil sambung mikro .

## Bahan dan Metode
Penelitian  ini    dilaksanakan  di  Labo- ratorium  Kultur  Jaringan  dan  Biomole- kuler Tanaman, Balai Penelitian Biotekno- logi  Perkebunan  Indonesia  (BPBPI), Bogor.    Penelitian  ini  terdiri  atas  tiga percobaan yaitu (a) optimasi tipe sambung antara  batang  bawah  dan  batang  atas,  (b) optimasi  medium,  dan  c)  aklimatisasi planlet hasil  sambung in vitro mikro .

## Optimasi  tipe sambung  mikro
Eksplan  yang  digunakan  adalah C.  succirubra dan  sebagai  batang  atas C. ledgeriana klon QRC205 hasil kultur in vitro berumur  tiga  bulan  (Santoso et  al ., 2004).    Tipe  sambung  yang  diuji  adalah tipe  V  dan  tipe  L  (Gambar  1).  Bagian planlet  yang  digunakan  untuk  batang
Toruan-Mathius et al.
bawah  dipotong  sepanjang  dua  buku  dari pangkal batang bawah, sedangkan sebagai batang  atas  dipotong  dua  buku  dari  tajuk. Batang  bawah  yang  dipersiapkan  harus seragam  yaitu  memiliki  diameter  yang sama  atau  sedikit  lebih  besar  dari  batang atas.  Bagian  tajuk  batang  bawah  dipang- kas  kemudian  dibuat  sayatan  sesuai perlakuan  yaitu  tipe  V  dan  tipe  L  sepan- jang  1  cm  dengan  menggunakan  pisau skalpel.  Sayatan  batang  atas  dibuat  sesuai dengan sayatan batang bawah, baik bentuk maupun  ukurannya.  Selanjutnya  batang atas ditancapkan pada batang bawah yang sudah  disayat.  Untuk  memperkokoh sambungan  eksplan  diikat  dengan  meng- gunakan  alumunium  foil  yang  sudah disterilkan,  kemudian  dikulturkan  pada medium  sambung  mikro.  Selanjutnya kultur  diinkubasi  di  ruang  inkubasi  pada suhu  25-27 o C  dengan  pencahayaan 12 jam per hari.
Percobaan  dilaksanakan  mengguna- kan  Rancangan  Acak  Lengkap  faktor tunggal  (RAL)  dengan  dua  taraf  yaitu kombinasi  batang  bawah  dengan  batang atas  tipe  V  dan  kombinasi  batang  bawah dengan  batang  atas  tipe  L  dengan  10
ulangan,  setiap  ulangan  terdiri  dari  satu botol  dan  setiap  botol  terdiri  dari  tiga planlet.  Peubah  yang  diukur  meliputi persentase  planlet  yang  bertahan  hidup, jumlah  eksplan  yang  berkalus,  jumlah daun.  Pengamatan  dilakukan  sampai minggu  kedelapan    dengan  selang  penga- matan  satu  minggu  setelah    sambung mikro.
Untuk  menetapkan  pengaruh  per- lakuan  tipe  sambung  akibat  sambung mikro  antara  batang  bawah  dan  batang atas,  maka  data  hasil  pengamatan  ditrans- formasi  dengan 5 , 0 + X .  Data  hasil transformasi dianalisis sidik ragam dan uji beda Duncan dengan menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) versi 6,12.

## Medium  sambung mikro
Medium  yang  digunakan  adalah Murashige  &  Skoog  (1962)  dengan penambahan  1,  2,  3,  dan  4  mg/L  IBA. Percobaan  disusun  dengan  Rancangan Acak  Lengkap  faktor  tunggal  (RAL)

## (a)                              (b)
Gambar 1. Tipe sambung mikro batang atas C. ledgeriana dengan batang bawah C. succirubra (a) tipe V dan (b) tipe L.
Figure 1. Type of  micrografting  scion C. ledgeriana and rootstock C. succirubra (a) V and (b) L  types.
Teknik sambung mikro in vitro kina .....
dengan  empat  taraf    konsentrasi  IBA masing-masing percobaan diulang 10 kali, setiap  ulangan  terdiri  dari  satu  botol  dan berisi  tiga  planlet.  Eksplan  yang    diguna- kan  adalah  planlet C.  succirubra sebagai batang  bawah  dan  planlet C.  legderiana sebagai batang atas, berumur empat bulan sesudah dikulturkan  dengan tipe sambung yang  terbaik  pada  percobaan  sebelumnya. Planlet  hasil  sambung  mikro    selanjutnya dikulturkan  pada  medium  perakaran  dan diinkubasi di ruang inkubasi, serta peubah yang  diukur  dan  analisis  data  dilakukan dengan menggunakan metode seperti pada percobaan sebelumnya.

## Aklimatisasi
Medium  yang  digunakan  adalah medium  yang  terbaik  berdasarkan  metode Santoso et  al .  (2004)  yaitu  arang  sekam  : tanah  (1  :  1).  Aklimatisasi  dilakukan dalam  dua  tahap,  yaitu  (1)  aklimatisasi  di ruang  kultur  ber  AC  pada  suhu  25-27 o C dengan pencahayaan 12 jam per hari,  dan (2)  aklimatisasi  di  rumah  plastik  ber- naungan paranet 70%.
Medium  aklimatisasi  dimasukkan  ke dalam  gelas  plastik  setinggi  9  cm.  Dalam setiap    gelas  yang  berisi  medium  ditanam satu  planlet  dan  diberi  sungkup  plastik transparan.  Selanjutnya  planlet  ditempat- kan di ruang kultur,  setelah satu  minggu sungkup  dibuka    satu  jam  per  hari,  dan setelah minggu kedua dan ketiga sungkup dibuka  selama  dua  jam  per  hari.  Setelah minggu  keempat  planlet  dipindah  ke rumah  plastik  bernaungan  paranet  70%. Medium yang digunakan pada aklimatisasi di  lapang  sama  dengan  medium  pada aklimatisasi  dalam  ruang  kultur.    Untuk menjaga  kelembaban  dilakukan  penyung- kupan  secara  kolektif.  Pada  umur  tiga minggu  sungkup  dibuka  secara  bertahap mulai 30 menit  perhari, satu jam per hari
hingga  sungkup  dapat  dibuka  seluruhnya. Percobaan ini dilakukan selama dua bulan. Peubah  yang  diukur  adalah  persentase planlet yang  dapat  bertahan  hidup  dengan baik.

## Hasil  dan Pembahasan

## Tipe  sambung mikro
Hasil percobaan pengaruh tipe sambung  mikro  dengan  batang  bawah C.  succirubra (CS)  dan  batang  atas C.  ledgeriana (CL)  terhadap  kecepatan pertumbuhan  planlet  kina,    menunjukkan bahwa  pertumbuhan  planlet  dari  hasil sambung  tipe  L  baru  terjadi  pada  minggu kedua  setelah  mikrografting,  dan  mening- kat  pada  minggu  ketiga,  pertumbuhan planlet  mulai  serempak  mencapai  100% pada  minggu  keempat.  Pada  bentuk sambung  tipe  V  planlet  mulai  tumbuh pada  minggu  kedua  dan  pertumbuhan planlet  mulai  serempak    (100%)  pada minggu  ketiga  (Tabel  1).  Dapat  di- simpulkan  bahwa  kecepatan  pertumbuhan planlet  dari  hasil  sambung  tipe  V  lebih cepat  satu  minggu  dibandingkan  dengan pertumbuhan planlet dengan sambung tipe L.    Pengaruh  bentuk  sambung  tipe  L  dan tipe V terhadap jumlah daun planlet  pada minggu pertama hingga minggu kedelapan menunjukkan  terjadi  perbedaan  yang nyata dimana bentuk sambung tipe V lebih baik  dari  bentuk  sambung  tipe  L    kecuali pada minggu pertama (Tabel 2). Perbedaan pertumbuhan planlet yang tidak nyata  pada  minggu  pertama  diduga  di- sebabkan    planlet  sedang  dalam    tahap inisiasi  kalus  untuk  penyembuhan  luka akibat perlakuan sambung mikro. Keadaan ini  akan  berakhir  setelah  terjadinya pertautan antara jaringan kambium batang
Toruan-Mathius et al.
Tabel  1.   Pengaruh kombinasi batang atas/batang bawah dan tipe sambung terhadap persentase planlet yang hidup  umur satu sampai lima minggu .
Table 1.  The effect of stock-scion combination on percentage of survived  plantlets at one to five week- old.

## Planlet yang bertahan hidup pada minggu ke
Plantlet survival in weeks (%) Kombinasi batang bawah/ batang atas dan tipe sambungan Rootstock/scion combination and micrografting type 1 2 3 4 5 CS/CL-L 0 2 56 100 100 CS/CS-L 0 16 60 100 100 CL/CL-L 0 0 52 100 100 Rata-rata   ( Average) 0 6 56 100 100 CS/CS-V 0 64 100 100 100 CS/CL-V 0 76 100 100 100 CL/CL-V 0 50 100 100 100 Rata-rata ( Average) 0 63 100 100 100
bawah dan batang atas dengan sempurna.
Menurut    Hartmann et  al. (1997) dalam  proses  penyembuhan  pada  planlet yang  terluka  masing-masing  sel  baik planlet  batang  bawah  dan  batang  atas membentuk  jaringan  kalus  berupa  sel-sel parenkim.  Sel-sel  parenkim  dari  batang bawah  dan  batang  atas  saling  kontak, menyatu dan membaur,  sel-sel parenkima yang  terbentuk  dan  terdiferensiasi  mem- bentuk  kambium  sebagai  lanjutan  dari lapisan  kambium  batang  bawah  dan batang  atas  yang  lama.  Dari  lapisan kambium  akan  terbentuk  jaringan  pem- buluh  sehingga  proses  translokasi  hara dari  batang  bawah  ke  batang  atas  atau sebaliknya  hasil  fotosintesis  dari  batang atas  ke  batang  bawah  berlangsung sebagaimana mestinya.
Kala et  al .  (2002)  melaporkan  bahwa sambung  mikro  pada  planlet  karet  mulai tumbuh    dengan  baik  pada  berumur  tiga minggu  setelah  perlakuan. Proses  pe- nyembuhan  luka  pada  planlet  akibat sambung  berbeda-beda  tergantung  dari jenis  dan  karakter  dari  planlet  yang  diuji.
Rifa’i-Faiz  (2003)  melaporkan  bahwa pada  tanaman  duku  perkembangan  kalus masih  terjadi  hingga  planlet  sampai  ber- umur  tiga bulan setelah sambung.
Pada  percobaan  ini  bentuk  sambung tipe V  menghasilkan pertumbuhan planlet lebih  cepat  satu  minggu  dan  lebih serempak  dibandingkan  dengan  bentuk sambung tipe L.  Hal ini disebabkan  pada sambungan  tipe  V  posisi  kambium  antara batang bawah dan batang atas berada pada posisi  pertautan  yang  tepat  dan  kokoh. Kondisi  tersebut  menyebabkan  eksplan tidak  mudah  bergeser  dan  jaringan  ikatan pembuluh xilem serta floem dan kambium antar  kedua  planlet  dengan  sangat  mudah akan  menyatu.  Pada  perlakuan    sambung mikro  tipe  L  diduga  posisi  pertautan jaringan  sel  kambium  batang  bawah  dan batang  atas  kurang  tepat  atau  bergeser pada saat perlakuan, sehingga perlu waktu lebih  lama  untuk  menyembuhkan  luka akibat perlakuan.
Dari  kedua  tipe  sambung  mikro  yang dalam  metode  sambung  mikro  planlet kina.  Estrada-Luna et  al. (2002)  me-
Teknik sambung mikro in vitro kina .....
Tabel 2.   Pengaruh kombinasi batang atas dan  bawah  serta tipe sambung terhadap jumlah daun planlet kina umur satu sampai delapan minggu.
Table 2.  Effect of stock-scion combination and micrografting type on leaves number of one to eight- week-old chincona plantlet.
Umur planlet (minggu ) Plantlet age (weeks)
Kombinasi dan tipe sambung Combination and type of micrograft 1 2 3 4 5 6 7 8 CS/CL –V 0,00 a   0,4a 1,56a 2,28a 3,00a 3,88a 4,56a 5,08a CS/CL-L 0,00a   0,00b   1,12b   2,00b 2,52b 3,38b 4,08b 4,52b CS/CS-V 0,00a   1,28a   2,24a 3,00a 3,84a 4,08a 4,92a 5,48a CS/CS-L 0,00a  0,32b   1,20b   2,08b 2,84b 3,52b 4,2b 4,84b CL/CL-V 0,00a   1,00a   2,00a 2,60a 3,52a 4,00a 4,68a 5,32a CL/CL-L 0,00a   0,00b   1,04b   2,00b 2,40b 3,24b 4b,00 4,48b
Keterangan  : Angka-angka yang diikuti oleh  huruf  yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata menurut uji jarak Duncan P < 0,05
Explanation :   Means in the same column followed by the same letters are not significantly different at P < 0.05 according to Duncan’s multiple range test.
nyatakan  posisi  jaringan  planlet  batang bawah  yang  dengan  tepat  mengenai jaringan  batang  atas  dapat  mempercepat proses  penyembuhan  akibat  sambung mikro.   Lukman et al . (2005) melaporkan bahwa  sambung  mikro  pada  dua  spesies yang  berbeda  (mundo  dan  manggis) dengan  model  sambung  tipe  V  tingkat keberhasilannya  mencapai  76%.  Oda (1995) menyebutkan bahwa pada penyam- bungan  dengan  menggunakan  bentuk sambung  tipe  V  pertautan  antara  batang bawah  dengan  batang  atas  dapat  terjadi dengan  cepat  dan  kokoh,  sedangkan penyambungan  yang  dilakukan  dengan menggunakan bentuk sambung tipe L dan tipe  datar  menyebabkan  pertumbuhan lebih lambat.
Kala et  al .  (2002)  melaporkan  bahwa tipe  penyambungan  pada  sambungan mikro in vitro tanaman Hevea brasiliensis yang  terbaik  adalah  berbentuk  pelana  (/). Sebagai  batang  bawah  digunakan  kecam- bah yang dikulturkan secara in vitro dalam
medium  Murashige  dan  Skoog  (1962) dengan  penambahan  2,0  mg/L  BA  dan 1,0  mg/L  thidiazuron.  Tanaman  yang diperoleh  dapat  tumbuh  baik  setelah diaklimatisasi.
Tirtawinata (2003) menjelaskan posisi kambium  batang  bawah  dengan  batang atas  sangat  menentukan  perkembangan planlet  selanjutnya.  Kontak  kambium yang  tidak  tepat  atau  sebagian  dapat mengakibatkan  pertautan  jaringan  pem- buluh antara batang bawah dengan batang atas  tidak  sempurna,  dan  selanjutnya  ber- akibat  pada  translokasi  senyawa-senyawa penting  untuk  metabolisme  pertumbuhan planlet  seperti  translokasi  nutrisi  dan  air dapat  berlangsung  secara  lancar  dari bawah  ke  atas  atau  translokasi  hasil  foto- sintesis dari batang atas ke seluruh bagian planlet.  Dengan  demikian  semua  aspek dalam  penyambungan  baik  fisik,  mekanis maupun fisiologis perlu diusahakan dalam kondisi  seoptimal  mungkin  sehingga keberhasilan lebih terjamin.
Toruan-Mathius et al.

## Medium sambung  mikro  planlet  kina
Penambahan  IBA  pada  medium  MS sangat  berpengaruh  terhadap  perakaran sambung  mikro  planlet  kina.  Pada perlakuan  kontrol  yang  tidak  diberikan IBA  terlihat  bahwa  tidak  satupun  planlet berakar,  akan  tetapi  pada  penambahan IBA yang bertingkat (1, 2, 3 dan 4 mg/L) pertumbuhan akar  semakin banyak  (Tabel 3). Penambahan  IBA  terhadap  perakaran sambung mikro  planlet kina tidak  berpe- ngaruh  nyata,  akan  tetapi  penambahan IBA  seperti  perlakuan  pertumbuhan  akar cenderung  meningkat.  Jumlah  akar  yang paling  banyak  diperoleh  dari    konsentrasi 3  dan    4  mg/L    IBA  (Tabel  4).  Dapat disimpulkan  bahwa  penambahan  3  mg/L IBA    pada  medium  MS  adalah  yang terbaik  untuk  sambung  mikro  planlet kina.    Kala et  al .  (2002)  menyatakan bahwa  medium  merupakan  faktor  utama dalam  penentuan  keberhasilan  sambung mikro.    Oda  (1995),  Bogetti et  al. (2001) dan    De-Klerk et  al. (2001)    menyatakan
bahwa IBA berpengaruh terhadap pertumbuhan akar pada kultur in vitro . Bogetti et  al. (2001)  menemukan bahwa  10  mg/L  IBA  meningkatkan pertumbuhan  akar  planlet Anacardium occidentale .  Sedangkan    Agustiansyah (2002)  melaporkan  bahwa  pemberian 5  mg/L IBA  meningkatkan  jumlah  akar planlet strowberi.

## Aklimatisasi
Rata-rata  planlet  yang  dapat  bertahan hidup  setelah  dilakukan  aklimatisasi secara  bertahap  sebagai  berikut  :  aklima- tisasi  dalam  ruangan    pada  suhu  25 o C dengan  medium  arang  sekam  yang dicampur  dengan  tanah  steril  dengan perbandingan  (1:1)  dilakukan  selama  satu bulan,  seluruh  planlet  dapat  bertahan hidup dengan baik (100%). Sebanyak 90% planlet  dapat  bertahan  hidup  setelah planlet  dipindah  ke  rumah  plastik  ber- naungan  dengan  komposisi  medium  tum- buh yang sama (Tabel 5). Vigor   tanaman sangat   baik, dengan  pertumbuhan  relatif
Tabel 3.   Pengaruh konsentrasi IBA dalam medium MS terhadap persentase  planlet kina  berakar umur delapan minggu setelah penyambungan.
Table 3.  The effect  of  IBA concentrations   in  MS  medium  on  rooting of  eight-week- old   chincona plantlet after micrografting.

## Konsentrasi IBA
IBA concentration mg/L
Kombinasi dan tipe sambung Combination and  type of micrograft 0 1 2 3 4 CS/CL-V 0 60 80 80 80 CS/CS-V 0 60 70 80 80 CL/CL-V 0 50 70 80 80 Rata-rata ( Average) 0 56,7 73,3 80 80 CS/CL-L 0 60 00 80 80 CS/CS-L 0 60 80 80 80 CL/CL-L 0 50 70 80 80 Rata-rata ( Average) 0 56,7 73,3 80 80
Teknik sambung mikro in vitro kina .....
Tabel  4. Pengaruh   IBA   pada  perakaran planlet dengan berbagai kombinasi batang bawah dan batang atas pada umur delapan minggu.
Table 4. The effect of IBA on  root growth of eight-week-old plantlet  with several combinations of root stock and scion.
Kombinasi Combination Konsentrasi  IBA IBA Concentration (mg/L ) 0 1 2 3 4 CS/CL 0 2 3,10 4 4 CS/CS 0 2 2,81 3 3 CL/CL 0 2 2,50 3 3
Gambar 2.   Pengaruh   IBA   terhadap  perakaran   planlet  kina  hasil  sambung  mikro umur  delapan minggu   setelah     dikultur.  (a)  kontrol, (b)  dengan  konsentrasi  1 mg/L ,   (c)  2 mg/L , (d) 3 mg/L , dan (e) 4 mg/L IBA.
Figure 2.    The effect  of IBA on  root  growth  of  plantlet  from   micrografting,  eight-week-old  after cultured . (a)  control,   (b)   with   the   concentration  1 mg/L , (c)  2 mg/L ,   (d) 3 mg/L , and (e) 4 mg/L IBA.
a
b
c d e
Toruan-Mathius et al.
cepat  sehingga  pada  umur  tiga  bulan setelah  diakliamatisasi  tinggi  tanaman sudah mencapai 40-50 cm (Gambar 3).
Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan bahwa  penyesuaian  planlet  terhadap suhu  luar  perlu  dilakukan  secara  ber- tahap,  yaitu  melalui  pre-aklimatisasi dalam  ruang  kultur  (suhu  25-  27 o C) pencahayaan  12  jam  per  hari  diikuti dengan  aklimatisasi  di  bawah  naungan paranet  70%.  Diduga  bahwa  pada  pre- aklimatisasi  sudah  terjadi  penebalan lapisan  lilin  pada  daun,  akar  sudah berfungsi  dengan  baik  dan  fotosintesis juga sudah berjalan dengan baik.
Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan bahwa  planlet  kina  hasil  mikrografting yang  ditumbuhkan  pada  kondisi    hete- rotrof    dapat  ditanam  pada  kondisi  yang autotrof setelah mendapat perlakuan adap- tasi  pada  suhu  rendah.  Hal  ini  dilakukan karena  persyaratan  hidup  planlet  kina membutuhkan  suhu  13,5-21,1 o C,  pH  ber- kisar  antara  4,5-6,5,  ketinggian  900- 3000  m  di  atas  permukaan  laut,  curah hujan  antara   2000-3500 mm/tahun    se- panjang  tahun  dan  kelembaban  udara
antara 69-97%   (Pusat Penelitian Teh dan Kina,1995).
Gunawan  (1992)  dan  Posposilova et al. (1996) menyatakan  bahwa sifat-sifat planlet  hasil  kultur in  vitro yang  kurang menguntungkan  antara  lain  lapisan  lilin/ kutikula  tidak  berkembang  dengan  baik, lignifikasi  batang  kurang,  sel-sel  palisade daun  sedikit,  jaringan  pembuluh  dari  akar ke pucuk kurang berkembang, dan stomata sering tidak berfungsi (tidak menutup pada penguapan  tinggi)  sehingga  pucuk  sangat peka  terhadap  evapotranspirasi,  serangan cendawan  dan  bakteri  tanah,  dan  cahaya dengan  intensitas  tinggi.  Oleh  sebab  itu diperlukan  aklimatisasi  sebelum  memin- dahkan planlet  ke lapang.
Onay et  al .  (2003)  melakukan sambung  mikro in  vivo dan in  vitro tanaman Pistacia  vera, dengan  tipe penyambungan  bentuk  V . Diperoleh bahwa keberhasilan sambung mikro dipengaruhi  oleh  umur  batang  atas  yang digunakan,  dan  terbaik  adalah  yang berasal  dari  tanaman  berumur  satu  tahun. Setelah dilakukan aklimatisasi hanya 50% tanaman  hasil in  vitro sambung  mikro
Tabel 5.    Persentase  planlet hasil sambung mikro yang mampu bertahan  hidup dalam aklimatisasi setelah satu bulan dalam ruang kultur dan dua  bulan di rumah plastik.
Table 5.    Percentage of survived  plantlet after acclimatization one month in room temperature and two months in plastic house.
Kombinasi dan tipe sambung Combination and type of grafting Dalam ruangan pada suhu 25 o C In a room  temperature 25 o C Di rumah plastik In plastic house CS/CL-V 100 (30/30)* 93 (28/30) CS/CS-V 100 (30/30) 90 (27/30) CL/CL-V 100 (30/30) 90 (27/30) CS/CL-L 100 (30/30) 90 (27/30) CS/CS-L 100 (30/30) 86 (26/30) CL/CL-L 100 (30/30) 90 (27/30) Rata-rata ( Average ) 100 90
Keterangan :  *. Angka dalam kurung adalah perbandingan planlet yang hidup. Explanation : * Means in brackets is a comparison of survived plantlet.
Teknik sambung mikro in vitro kina .....
Gambar 3. Tanaman  kina  hasil  mikrografting (a) aklimatisasi  dalam  ruang kultur  bercahaya; (b) satu bulan  setelah  diaklimatisasi  di  bawah paranet, (c) tiga bulan setelah aklimatisasi.
Figure 3.  Cinchona plants from micrografting (a) acclimatization in a light culture room, (b) one month after   acclimatization   under  paranet, (c) three   months  after  acclimatization.
yang  mampu  bertahan  hidup,  sedang in vivo mikrografting  mencapai  100%  pada medium tanah.
Nas  &  Read  (2004)  melakukan  sam- bung  mikor vitro American  chesnut, hazelnut hibrid  dan  anggur  dikulturkan secara in  vitro dalam  medium  Nas  dan Read.  Akar    diinduksi  dengan  mencelup- kan  batang  bawah  ke  dalam  larutan 1000  mg/L  IBA.  Setelah  dua  bulan aklimatisasi  dalam  Jiffi  pot American chesnut,  hazelnut hibrid  dan  anggur  yang berhasil  tumbuh  masing-masing  80%, 70% dan 50%.

## Kesimpulan
Dari  hasil  percobaan  yang  diperoleh dapat disimpulkan bahwa :
1. Bentuk  tipe  V  adalah  penyambungan yang terbaik untuk sambung mikro in vitro tanaman kina.
2. Medium  MS  dengan  penambahan IBA 3 mg/L merupakan medium yang
terbaik untuk pertumbuhan dan perakaran  planlet  kina  hasil  sambung mikro in vitro . 3. Aklimatisasi  planlet  hasil  sambung mikro in vitro dilakukan  secara  ber- tahap, yaitu  dalam ruang kultur pada suhu  25–27 o C  diikuti  dengan  di rumah  plastik  bernaungan  paranet 70%.    Teknik  ini  menghasilkan  lebih dari  90%  planlet  yang  mampu  ber- tahan  hidup.  Teknik  sambung  mikro in  vitro dapat  digunakan  untuk  mem- perbanyak tanaman kina secara klonal.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  Kepala  Balai  Penelitian  Biotekno- logi  Perkebunan  Indonesia,  Bogor  atas fasilitas penelitian yang diberikan. Terima kasih  juga  diucapkan  kepada  Direktur Pusat  Penelitian  Teh  dan  Kina  atas bantuan  dan  izin  pengadaan  benih C. succirubra dan C. ledgeriana yang di- gunakan dalam penelitian ini.
a
b c
Toruan-Mathius et al.

## Daftar Pustaka
Agustiansyah  (2002).  Studi  perbanyakan tanaman  Strowberi  ( Fragaria  ananassa Duch)  secara  i n  vitro. Tesis. Bogor, Sekolah  Pascasarjana,  Institut  Pertanian Bogor.
Bogetti,  B.,  K.  Jasik &  S.  H.  Mantell  (2001).
In  vitro root  formation  in Anacardium occidentale microshoots. Biol. Plant., 44 (2), 175-179 .
Dayrit,  F.M.,  A.Guldotea,  M.L.Generalao  &
C.  Serna  (1994).  Determination  of  the quinine  content  in  the  bark  of  the Cinchona  tree  grown  in  Mt.  Kitangland, Bukindon. Philippine  J.  Sci., 123, (3), 52-57.
De-Klerk,  G.J.,  J.  Hanecakova    &  J.  Jasik (2001). The Role of cytokinins in rooting of stem slices cut from apple microcuttings. Plant Biosystem ., 135 (1), 79-84.
Errea,  P.,  L.  Garay    &  A.J.Marin  (2001). Early detection of graft incompatibility in Apricot  ( Prunus  armeniaca )  using in vitro techniques. Physiol.  Plant., 112, 135-141.
Estrada-Luna,  A.A.,  C.  Lopez-Peralpa  & E.  Cardenas-Soriano  (2002). In  vitro micrografting  and  the  histology  of  graft union  formation  of  selected  species  of prikly  pear  cactus  ( Opuntia spp.). Sci. Hort., 92, 317-327.
Gunawan,  L.W.  (1992). Teknik  Kultur Jaringan  Tumbuhan. Bogor,  Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor.
Hartmann, H.T. & D.E. Kester, F.T.Davies  (1997). Plant  Propagation, Principles  and  Practice .  Sixth  Edition. New  Jersey , Practice  Hall  International, Inc. 770p.
Holbrook, N.M.,  V.R.  Shashidhar,  R.A.  James &  R.  Munns  (2002).  Stomatal  control  in
tomato with ABA-deficient roots: response  of  grafted  plants  to  soil  drying. J. Exp. Bot., 53, 1503-1514 .
Kala,  R.G.,  M.P.  Asokan,  K.P.  Jayasree, S.  Sobha,  R.  Jayasree,  K.  Rekha  & Thulaseedharan  (2002).    Optimization  of conditions  for in  vitro micrografting  in rubber  ( Hevea  brasiliensis ). Indian J. Nat. Rub. Res., 15 (2),  165-171.
Lee,  Yung-Myung,  Hae-Jeen,  Bang  &  Hyun- Sook,  Ham  (1998).  Grafting  vegetables
J.  Japan.  Soc.  Hort.  Sci ., 67 (6),1098- 1104.
Lukman,  R.,  L.  W.  Gunawan,  A.  S.  Abidin, R.  Megia  &  T.N.  Praptosuwiryo  (2005).
Interspecific Micrografting Between Garcinia mangostana and  Garcinia dulcis:  Biology  and  Physiology  Point  of
View . Bogor, Seameo Biotrop, ( in press ).
Mariska,  I.  (1985).  Mikrografting  pada tanaman  jeruk. Dalam . Simposium  Kultur Jaringan  -  Jakarta  26  September,  1985 . Bogor, Balitro.
Murashige,  T.  &  F.  Skoog  (1962).  A  revised medium  for  rapid  growth  and  bioassay with  tobacco  tissue  culture. Physiol. Plant ., 15 , 473-497.
Nas,  M.N.  &  P.E.  Read  (2004).  Simultaneous micrografting,  rooting  and  acclimatization of  micropropagated  American  chestnut, grapevine  and  hybrid  hazelnut. European J.  Hort. Science . 6 ,1-2.
Oda,  M.  (1995).  New  grafting  methods  for fruit-bearing  vegetables  in  Japan. JARQ,
29, 187-194.
Onay, A., V. Pirinc, F. Adiyaman, C. Isikalan, E. Tilkat & D. Basaran (2003). In vivo and in  vitro micrografting  of  Pistachio, Pistacia  vera L.cv.”Siirt”. Turk  J.  Biol .,
27 , 95-100.
Pasquale,  F.D.,  S.Guiffrida  &  F.  Carimi (1999).  Minigrafting  of  shoot,  roots, inverted roots, and somatic embryos for
Teknik sambung mikro in vitro kina .....
rescue  of in  vitro Citrus  r egenerant. J. Amer. Soc.Hort. Sci. , 124 (2),152-157. Posposilova,  J.,  J.  Catsky  &  Sestak  (1997). Photosynthesis  in  plant  cultivated in vitro. In. Pessarakli,  M.  (ed.): Handbook of  Photosynthesis .  New  York,  Marcel Deker, 1997. p. 525-540.
Pusat Penelitian Teh dan Kina (1995). Petunjuk Kultur  Teknis  Tanaman  Kina .  Bandung, Asosiasi  Penelitian  dan  Pengembangan Perkinaan Indonesia.
Raghothama, K.G. (1999). Phosphate acquisition. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50, 665-693.
Rifa’i-Faiz  (2003).  Pengaruh  batang  bawah dan jenis bibit serta studi anatomi bidang penyambungan  pada  bibit  grafting  duku ( Lansium  domesticum Corr). Skrips i Bogor,  Jurusan  Budidaya  Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Santoso,  J.,  N.  Toruan-Mathius,      U.  Sastra- prawira,  G.  Suryatmana  &  D.  Saodah (2004). Perbanyakan tanaman kina
Cinchona ledgeriana Meons, dan C, succirubra Pavon melalui penggandaan tunas  aksilar. Menara  Perkebunan, 72 ( 1),11-27.
Santoso,  J.  &  S.  Wibowo  (2000). Usaha Memperpendek Umur Bibit Semai Sambung Kina di Pembibitan. Gambung,
Pusat Penelitian Teh dan Kina Gambung.
Suzuki, M., S. Sasaya & Kobayashi (1998). Present  status  of  vegetable  grafting system. JARQ, 32 , 105-112.
Tirtawinata,  M.R.  (2003).  Kajian  anatomi  dan fisiologi  sambung  bibit  manggis  dengan beberapa  anggota  kerabat  Clusiaceae. Disertasi. Bogor,  Fakultas  Pascasarjana,
Institut Pertanian Bogor.
Turnbull,  C.  G.  N.,  J.  P.  Booker  & H.M.O.  Leyser  (2002).  Micrografting techniques  for  testing  long-distance signalling  in Arabidopsis.  The  Plant  J.,
32, 255-262.
Widayat,  W.  (2000).  Peluang  pasar  dan perkembangan  kina  Indonesia. Dalam
Seminar  Sehari  Pengembangan  Kina Nasional .  3  Agustus  2000.  Bandung,  Pusat Penelitian Teh dan Kina.
Yagishita,  N.,    N.  Hirata,  H.  Mizukami,
H.  Ohashi  &  K.  Yamashita  (1990)
Genetic  nature  of  low  capsicum  in  the variant  strains  induced  by  grafting  in
Capsicum  annum  L.  Euphytica, 46, 249- 252.
Yunita,  R.  (2002).  Perbanyakan  dan  trans- formasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens pada tanaman melinjo ( Gnetum gnemon L) dengan  teknik kultur jaringan. Tesis. Bogor, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.