Laktoyyliglutationilyaasin substraatteja ovat muun muassa glyoksaali, metyyliglyoksaali, fenyyliglyoksaali, hydroksipyruvaldehydi ja 4,5-dioksovaleriaanahappo. Nämä muodostavat ilman entsyymikatalyysiä glutationin kanssa hemitioasetaalin, jonka entsyymi isomeroi. Entsyymiä esiintyy erityisesti mitokondrioissa niin eläimissä, kasveissa, sienissä kuin baktteereissakin. Eläinten, kasvien ja mikrobien entsyymi on kahdesta samanlaisesta yksiköstä koostuva dimeeri ja sienten laktoyyliglutationilyaasit ovat monomeereja. Ihmisen laktoyyliglutationilyaasin molekyylimassa on 46 kDa. Entsyymi vaatii toimiakseen koentsyymikseen sinkki-ionin, mutta myös eräät muut kahdenarvoiset ionit kuten koboltti- ja nikkeli-ionit voivat toimia koentsyymeinä, mutta tällöin entsyymin aktiivisuus on alhaisempi.