二战期间，芝大在曼哈顿计划中扮演了重要角色。这一时期，大量物理学家聚集芝大，奠定了芝大在自然科学界的地位。费密（Enrico Fermi 1901-1954）及其助手们于1942年12月2日在芝加哥大学建成世界上第一座可控原子核裂变链式反应堆，使它达到临界状态，产生可控的核裂变链式反应。这一成就是原子能时代的一个重要里程碑，为两年后的原子弹诞生奠定了基础，芝加哥大学也因此被称为「原子能诞生地」。Albert Abraham Michelson（1907年诺贝尔物理奖得主）首先进行光速的测量，并发展了同位素年代测定法。