顧名思義，DNA連接酶的功能便是在黏合斷裂的DNA，而細胞內只有DNA複製與DNA修復的反應牽涉到DNA斷裂的合成，因此DNA連接酶就是在上述的兩個機制扮演重要的角色。除了細胞內的黏合反應，隨著分子生物學的進展，幾乎大多數的分子生物實驗室都會利用DNA連接酶來進行重組DNA的實驗或許這也可以被規類為其另一著重要的功能。