Dzimis Krakovas brīvpilsētā, kā devītais bērns vienpadsmit bērnu ģimenē. Tēvs bija čehu izcelsmes skolotājs, bet māte - jauktas poļu - vācu izcelsmes. Skolā Jana Matejko sekmes bija visai pieticīgas, izņemot zīmēšanu, tāpēc, par spīti vājajām sekmēm, viņš tika uzņemts Krakovas mākslas akadēmijā. Vēlāk papildinājās Minhenē un Vīnē, bet vēlāk atgriezās Krakovā, kur nodzīvoja līdz sava mūža galam. Džives sākumā būdams visai trūcīgs, kopš 1865. gada, kad Matejko ieguva zelta medaļu Parīzes salonā, viņa finansiālais stāvoklis būtiski uzlabojās. Janvāra sacelšanās laikā Matejko finansiāli atbalstīja nemierniekus.