Sinimulang ipinta ni Leonardo Da Vinci ang Mona Lisa noong 1503 o 1504 sa Florence, Italya. Bagama't pinagdidiinan ng Museyo ng Louvre na ""walang dudang ginawa ni Leonardo ang larawan sa taóng 1503 hanggang 1506. Ang historyador pansining na si Martin Kemp ay naniniwalang may mga kahirapan kung paano matukoy ang saktong panahon kung kailan ginawa ang Mona Lisa. Ayon rin kay Giorgio Vasari, ""matapos ang apat na taon iniwanang hindi tapos ni Leonardo ang kaniyang gawa"". May mga nagsabi rin na, bago mamatay si Leonardo sinabi nitong pinagsisihan niya na wala man lamang syang natapos na gawang maayos.