Datasets:

midas

/

pubmed

like 1

Follow

MIDAS Research Laboratory, IIIT-Delhi 17

[ "Estrogen", "receptor", "α", "polymorphisms", "and", "postmenopausal", "breast", "cancer", "risk", "Background", "The", "estrogen", "receptor", "alpha", "-LRB-", "ESR1", "-RRB-", "is", "a", "mediator", "of", "estrogen", "response", "in", "the", "breast", ".", "The", "most", "studied", "variants", "in", "this", "gene", "are", "the", "PvuII", "and", "XbaI", "polymorphisms", ",", "which", "have", "been", "associated", "to", "lower", "sensitivity", "to", "estrogen", ".", "We", "evaluated", "whether", "these", "polymorphisms", "were", "associated", "with", "breast", "cancer", "risk", "by", "means", "of", "an", "association", "study", "in", "a", "population", "of", "Caucasian", "postmenopausal", "women", "from", "the", "Rotterdam", "study", "and", "a", "meta-analysis", "of", "published", "data", ".", "Introduction", "Family", "history", "is", "one", "of", "the", "strongest", "risk", "factors", "for", "breast", "cancer", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "It", "has", "been", "shown", "that", "the", "heritability", "of", "this", "disease", "is", "∼", "30", "%", "-LSB-", "2", "-RSB-", ".", "The", "most", "important", "determinants", "of", "risk", "for", "breast", "cancer", "are", "related", "to", "endogenous", "hormone", "levels", "and", "major", "reproductive", "events", "-LSB-", "3", "-RSB-", ",", "thus", ",", "suggesting", "that", "genes", "in", "the", "estrogen", "pathway", "may", "influence", "breast", "cancer", "risk", ".", "The", "estrogen", "receptor", "alpha", "-LRB-", "ESR1", "-RRB-", "is", "one", "of", "the", "most", "important", "mediators", "of", "hormonal", "response", "in", "estrogen-sensitive", "tissues", "such", "as", "the", "breast", "-LSB-", "4", "-RSB-", "and", "plays", "a", "crucial", "role", "in", "breast", "growth", "and", "differentiation", "as", "well", "as", "in", "the", "development", "of", "cancer", "-LSB-", "5", "-RSB-", ".", "The", "human", "ESR1", "gene", "is", "localized", "on", "chromosome", "6q24-q27", "-LSB-", "6", "-RSB-", ",", "it", "extends", "more", "than", "140", "kb", "and", "includes", "eight", "exons", "-LSB-", "7", "-RSB-", ".", "The", "most", "studied", "variants", "in", "this", "gene", "are", "the", "PvuII", "-LRB-", "C/T", "-RRB-", "and", "XbaI", "-LRB-", "G/A", "-RRB-", "polymorphisms", "in", "intron", "1", ",", "397", "and", "351", "bp", "upstream", "of", "exon", "2", "respectively", "-LSB-", "8", ",", "9", "-RSB-", ".", "These", "variants", "have", "been", "implicated", "in", "gene", "expression", "by", "influencing", "transcription", "-LSB-", "10", "-RSB-", ".", "While", "some", "studies", "have", "found", "an", "increased", "risk", "for", "the", "A", "and", "T", "alleles", "of", "the", "XbaI", "and", "PvuII", "polymorphisms", "-LSB-", "4", ",", "9", ",", "10", "-RSB-", ",", "others", "have", "found", "an", "increased", "risk", "only", "for", "the", "X", "-LRB-", "G", "-RRB-", "allele", "of", "XbaI", "-LSB-", "11", ",", "12", "-RSB-", ".", "In", "addition", ",", "other", "studies", "found", "no", "effect", "at", "all", "for", "either", "of", "these", "polymorphisms", "-LSB-", "4", ",", "13", "-RSB-", ".", "These", "alleles", "were", "correlated", "with", "high", "bone", "mineral", "density", "and", "height", "in", "other", "studies", ",", "including", "one", "performed", "in", "our", "study", "population", ",", "-LSB-", "14", ",", "15", "-RSB-", ",", "suggesting", "a", "stronger", "estrogenic", "effect", "in", "P", "-LRB-", "C", "-RRB-", "and", "X", "-LRB-", "G", "-RRB-", "allele", "carriers", "-LSB-", "14", "-RSB-", ".", "The", "aim", "of", "our", "study", "was", "to", "evaluate", "the", "effect", "of", "these", "polymorphisms", "on", "breast", "cancer", "risk", "by", "performing", "an", "association", "analysis", "in", "a", "population", "based", "study", "of", "Caucasian", "postmenopausal", "women", ".", "Further", ",", "we", "performed", "meta-analyses", "of", "all", "available", "published", "data", "on", "these", "polymorphisms", "and", "the", "risk", "of", "breast", "cancer", ".", "Materials", "and", "methods", "Study", "population", "and", "measurements", "Our", "study", "population", "is", "part", "of", "the", "Rotterdam", "study", "-LSB-", "16", "-RSB-", ".", "Inhabitants", "of", "the", "suburb", "of", "Ommoord", "aged", "55", "or", "older", "were", "invited", "to", "participate", "and", "7983", "agreed", "to", "do", "so", "-LRB-", "response", "rate", "78.1", "%", "-RRB-", ".", "Study", "participants", "signed", "an", "informed", "consent", "and", "the", "Medical", "Ethics", "Committee", "of", "the", "Erasmus", "Medical", "Center", "approved", "the", "study", ".", "Our", "study", "group", "was", "composed", "of", "4,878", "postmenopausal", "women", ".", "Information", "on", "risk", "factors", "such", "as", "age", "at", "entry", ",", "age", "at", "menarche", ",", "age", "at", "menopause", ",", "parity", ",", "body", "mass", "index", "-LRB-", "BMI", "-RRB-", ",", "waist", "hip", "ratio", "-LRB-", "WHR", "-RRB-", "and", "hormone", "replacement", "therapy", "use", "-LRB-", "HRT", "-RRB-", "was", "retrieved", "at", "baseline", "through", "a", "questionnaire", ".", "BMI", "was", "calculated", "by", "dividing", "the", "weight", "in", "kilograms", "by", "the", "height", "-LRB-", "in", "meters", "-RRB-", "squared", "-LSB-", "17", "-RSB-", ".", "Case", "identification", "and", "validation", "Three", "different", "databases", "were", "used", "for", "patient", "identification", ".", "First", ",", "cases", "diagnosed", "by", "general", "practitioners", "in", "the", "research", "area", "-LRB-", "Ommoord", "-RRB-", "were", "collected", "-LRB-", "International", "Classification", "of", "Primary", "Care", "-LRB-", "code", "X76", "-RRB-", "-RRB-", ".", "Second", ",", "the", "Dutch", "National", "Registry", "of", "all", "hospital", "admissions", "-LRB-", "LMR", "-RRB-", "was", "consulted", "to", "detect", "all", "malignancy", "related", "hospital", "admissions", "for", "study", "participants", ".", "Finally", ",", "regional", "pathology", "databases", "were", "linked", "to", "the", "Rotterdam", "Study", "to", "identify", "patients", ".", "Subsequently", ",", "breast", "cancer", "cases", "were", "validated", "by", "a", "physician", "on", "the", "basis", "of", "medical", "records", "of", "the", "general", "practitioner", ",", "discharge", "letters", "and", "pathology", "reports", ".", "Only", "pathologically", "confirmed", "cases", "were", "considered", "in", "the", "analysis", ".", "The", "index", "date", "was", "defined", "as", "the", "earliest", "date", "found", "in", "the", "pathology", "report", ".", "Genotyping", "&", "data", "analysis", "Out", "of", "the", "4,878", "women", "participating", "in", "our", "study", ",", "3,893", "-LRB-", "80", "%", "-RRB-", "were", "successfully", "genotyped", "for", "the", "PvuII", "and", "XbaI", "polymorphisms", ".", "The", "genotyping", "procedures", "have", "been", "described", "previously", "-LSB-", "14", "-RSB-", ".", "Loss", "to", "follow", "up", "was", "assessed", "to", "verify", "it", "was", "independent", "of", "genotype", ".", "Categorical", "variables", ",", "such", "as", "parity", "and", "HRT", ",", "were", "compared", "between", "genotype", "groups", "using", "the", "chi-squared", "test", ".", "Continuous", "variables", ",", "-LRB-", "age", "at", "entry", ",", "age", "at", "menopause", ",", "BMI", "and", "WHR", "-RRB-", "were", "compared", "using", "the", "independent", "sample", "Mann", "--", "Whitney", "test", ".", "We", "used", "logistic", "regression", "to", "study", "the", "risk", "of", "breast", "cancer", "by", "ESR1", "genotype", ".", "This", "analysis", "was", "performed", "using", "SPSS", "version", "11", ",", "since", "there", "is", "no", "clear", "risk", "allele", "from", "the", "literature", ",", "we", "took", "the", "TT", "-LRB-", "PvuII", "-RRB-", "and", "AA", "-LRB-", "XbaI", "-RRB-", "genotypes", "as", "reference", "because", "they", "have", "been", "associated", "to", "lower", "sensitivity", "to", "estrogen", "in", "our", "population", "-LSB-", "14", "-RSB-", ".", "We", "also", "performed", "a", "trend", "test", "to", "evaluate", "if", "the", "number", "of", "risk", "alleles", "carried", "had", "an", "effect", "on", "disease", "risk", ".", "Hardy-Weinberg", "equilibrium", "-LRB-", "HWE", "-RRB-", "was", "assessed", "for", "both", "polymorphisms", "using", "Markov-Chain", "Monte-Carlo", "approximation", "of", "the", "exact", "test", "implemented", "in", "the", "GENEPOP", "package", "V", "3.3", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "Meta-analysis", "We", "searched", "PubMed", "until", "October", "2006", "for", "all", "case-control", "studies", "on", "the", "association", "of", "the", "PvuII", "and", "XbaI", "polymorphisms", "in", "the", "ESR1", "gene", "and", "breast", "cancer", ".", "Our", "search", "strategy", "was", "based", "on", "the", "keyword", "``", "breast", "cancer", "''", "combined", "with", "``", "estrogen", "receptor", "''", "and", "``", "polymorphism", "''", ".", "To", "verify", "that", "all", "studies", "were", "retrieved", ",", "the", "reference", "lists", "of", "all", "publications", "were", "searched", "for", "additional", "studies", ".", "We", "excluded", "studies", "from", "our", "analyses", "if", "the", "genotype", "frequencies", "in", "the", "control", "population", "were", "out", "of", "Hardy-Weinberg", "or", "if", "their", "data", "had", "been", "previously", "used", "in", "another", "study", ".", "To", "quantify", "the", "strength", "of", "association", ",", "pooled", "odds", "ratios", "-LRB-", "ORs", "-RRB-", "and", "95", "%", "confidence", "intervals", "-LRB-", "CI", "-RRB-", "were", "calculated", "using", "the", "random-effects", "model", "of", "the", "DerSimonian", "and", "Laird", "method", "-LSB-", "19", "-RSB-", ".", "The", "degree", "of", "heterogeneity", "between", "the", "study", "results", "was", "tested", "by", "the", "inconsistency", "statistic", "-LRB-", "I2", "-RRB-", ".", "Funnel", "plots", "were", "used", "to", "evaluate", "publication", "bias", "-LSB-", "20", "-RSB-", ".", "Data", "were", "analysed", "using", "Review", "Manager", ",", "version", "4.2", "-LRB-", "Cochrane", "Collaboration", ",", "Oxford", ",", "UK", "-RRB-", ".", "Results", "The", "total", "loss", "of", "follow-up", "for", "the", "genotyped", "participants", "was", "8.4", "%", "and", "it", "was", "not", "dependent", "on", "ESR1", "genotype", "-LRB-", "P", "=", "0.51", "-RRB-", ".", "The", "genotype", "frequencies", "of", "both", "polymorphisms", "were", "in", "HWE", "proportions", "-LRB-", "X2", "P", "=", "0.33", "for", "PvuII", "and", "X2P", "=", "0.31", "for", "XbaI", "-RRB-", ".", "In", "Table", "1", "we", "show", "the", "baseline", "characteristics", "of", "our", "study", "population", ".", "We", "found", "that", "all", "cases", "-LRB-", "incident", "and", "prevalent", "-RRB-", "were", "significantly", "younger", "at", "entry", "than", "controls", "-LRB-", "P", "<", "0.001", "-RRB-", "and", "also", "died", "earlier", "during", "follow-up", "-LRB-", "P", "<", "0.001", "-RRB-", ",", "when", "using", "incident", "cases", "only", "we", "found", "the", "same", "significant", "differences", "-LRB-", "P", "for", "age", "at", "entry", "<", "0.0001", ",", "P", "for", "age", "at", "death", "<", "0.0001", "-RRB-", ".", "We", "also", "found", "that", "cases", "had", "significantly", "fewer", "children", "than", "controls", "-LRB-", "P", "=", "0.04", "-RRB-", ".", "We", "did", "not", "find", "any", "significant", "differences", "in", "these", "baseline", "characteristics", "between", "genotype", "groups", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Table", "1General", "characteristics", "of", "the", "study", "populationCasesControlsTotalTotal", "studied", "-LRB-", "%", "-RRB-", "190", "-LRB-", "4.7", "%", "-RRB-", "3513", "-LRB-", "95.3", "-RRB-", "3703Mean", "age", "of", "entry", "-LRB-", "SD", "-RRB-", "*", "67.80", "-LRB-", "7.7", "-RRB-", "70.36", "-LRB-", "9.6", "-RRB-", "70.24", "-LRB-", "9.6", "-RRB-", "Mean", "age", "at", "death", "-LRB-", "SD", "-RRB-", "*", "77.30", "-LRB-", "8.6", "-RRB-", "84.46", "-LRB-", "8.7", "-RRB-", "84.12", "-LRB-", "8.8", "-RRB-", "Mean", "age", "at", "menarche", "-LRB-", "SD", "-RRB-", "13.57", "-LRB-", "1.7", "-RRB-", "13.68", "-LRB-", "1.8", "-RRB-", "13.67", "-LRB-", "1.8", "-RRB-", "Mean", "age", "at", "menopause", "-LRB-", "SD", "-RRB-", "*", "49.51", "-LRB-", "4.8", "-RRB-", "52.19", "-LRB-", "13.6", "-RRB-", "52.07", "-LRB-", "13.3", "-RRB-", "Mean", "number", "of", "children", "-LRB-", "SD", "-RRB-", "*", "1.77", "-LRB-", "1.6", "-RRB-", "2.12", "-LRB-", "1.7", "-RRB-", "2.10", "-LRB-", "1.7", "-RRB-", "Parity", "-LRB-", "SD", "-RRB-", "-LRB-", "≥", "1", "child", "-RRB-", "*", "121", "-LRB-", "71.6", "-RRB-", "2640", "-LRB-", "79.4", "-RRB-", "2761", "-LRB-", "79", "-RRB-", "Hormone", "replacement", "therapy", "-LRB-", "%", "-RRB-", "27", "-LRB-", "21.1", "-RRB-", "504", "-LRB-", "19.5", "-RRB-", "531", "-LRB-", "19.6", "-RRB-", "Mean", "BMI", "-LRB-", "SD", "-RRB-", "27.10", "-LRB-", "3.9", "-RRB-", "26.67", "-LRB-", "4.1", "-RRB-", "26.69", "-LRB-", "4.1", "-RRB-", "Mean", "WHR", "-LRB-", "SD", "-RRB-", "0.87", "-LRB-", ".09", "-RRB-", "0.87", "-LRB-", ".09", "-RRB-", "0.87", "-LRB-", ".09", "-RRB-", "*", "P-value", "<", "0.05", "There", "were", "38", "women", "with", "previously", "diagnosed", "postmenopausal", "breast", "cancer", "who", "entered", "the", "study", ".", "During", "follow-up", ",", "152", "were", "additionally", "diagnosed", ".", "There", "were", "no", "significant", "differences", "in", "the", "number", "of", "cases", "between", "the", "PvuII", "-LRB-", "P", "=", "0.43", "for", "overall", "cases", "-RRB-", "and", "XbaI", "genotypes", "-LRB-", "P", "=", "0.33", "for", "overall", "cases", "-RRB-", ".", "We", "carried", "out", "a", "logistic", "regression", "analysis", "adjusting", "for", "age", "at", "entry", ",", "age", "at", "menopause", ",", "BMI", ",", "WHR", "and", "HRT", "for", "both", "polymorphisms", "separately", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "Since", "the", "T", "and", "A", "alleles", "of", "these", "polymorphisms", "have", "been", "correlated", "to", "lower", "estrogenic", "effects", ",", "we", "used", "the", "TT", "and", "AA", "genotypes", "as", "our", "reference", "categories", "in", "the", "analyses", ".", "There", "were", "no", "significant", "differences", "in", "risk", "for", "breast", "cancer", "among", "carriers", "of", "the", "different", "genotypes", "of", "the", "PvuII", "or", "XbaI", "polymorphisms", "in", "the", "ESR1", "gene", ".", "There", "was", "a", "non-significant", "tendency", "of", "the", "C", "allele", "of", "PvuII", "-LRB-", "P-for", "trend", "=", "0.22", "-RRB-", "and", "G", "allele", "of", "the", "XbaI", "-LRB-", "P-for", "trend", "0.26", "-RRB-", "to", "be", "over", "represented", "in", "patients", ".", "Table", "2Odds", "ratios", "for", "breast", "cancer", "risk", "for", "PvuII", "and", "XbaI", "genotypesOverallIncidentPrevalentPvuIITTRefRefRefTC0", ".9", "-LRB-", "0.6", "--", "1.4", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "0.6", "--", "1.6", "-RRB-", "0.8", "-LRB-", "0.3", "--", "2.1", "-RRB-", "CC1", ".4", "-LRB-", "0.8", "--", "2.2", "-RRB-", "1.4", "-LRB-", "0.8", "--", "2.5", "-RRB-", "1.2", "-LRB-", "0.4", "--", "3.3", "-RRB-", "XbaIAARefRefRefGA1", ".2", "-LRB-", "0.8", "--", "1.7", "-RRB-", "1.3", "-LRB-", "0.8", "--", "2.0", "-RRB-", "0.8", "-LRB-", "0.4", "--", "1.9", "-RRB-", "GG1", ".3", "-LRB-", "0.7", "--", "2.2", "-RRB-", "1.5", "-LRB-", "0.8", "--", "2.8", "-RRB-", "0.5", "-LRB-", "0.2", "--", "2.4", "-RRB-", "To", "evaluate", "our", "data", "together", "with", "those", "in", "the", "literature", "we", "performed", "meta-analyses", ".", "We", "identified", "nine", "articles", "studying", "the", "relation", "between", "XbaI", "and", "PvuII", "polymorphisms", "and", "the", "risk", "of", "breast", "cancer", "-LSB-", "4", ",", "9", "--", "12", ",", "21", "--", "24", "-RSB-", ".", "We", "excluded", "from", "our", "analyses", "one", "study", "-LSB-", "11", "-RSB-", ",", "since", "the", "data", "was", "used", "in", "another", "study", "-LSB-", "4", "-RSB-", ".", "Furthermore", ",", "two", "studies", "were", "excluded", "since", "genotype", "frequencies", "of", "controls", "were", "out", "of", "HWE", "proportions", "-LSB-", "9", ",", "10", "-RSB-", ".", "Using", "the", "random", "effects", "model", "we", "did", "not", "find", "any", "difference", "in", "risk", "among", "XbaI", "and", "PvuII", "genotypes", "-LRB-", "Figs.", "1", "and", "2", "-RRB-", ".", "High", "inter-study", "heterogeneity", "can", "render", "the", "interpretation", "of", "the", "results", "of", "a", "meta-analysis", "difficult", "and", "although", "we", "found", "high", "heterogeneity", "in", "the", "G/A", "versus", "GG", "comparison", "there", "was", "no", "significant", "heterogeneity", "in", "the", "other", "three", "comparisons", ".", "Additionally", ",", "the", "evaluation", "of", "the", "funnel", "plots", "did", "not", "suggest", "evidence", "for", "publication", "bias", ".", "Fig.", "1Meta-Analyses", "ESR1", "XbaI", "polymorphism", "and", "breast", "cancer", "riskFig", ".", "2Meta", "Analysis", "ESR1", "PvuII", "polymorphism", "and", "breast", "cancer", "risk", "Discussion", "We", "performed", "an", "association", "study", "to", "evaluate", "the", "relationship", "of", "two", "well-studied", "polymorphisms", "in", "the", "ESR1", "gene", "and", "the", "risk", "of", "breast", "cancer", "in", "Caucasian", "postmenopausal", "women", "from", "the", "Rotterdam", "Study", ".", "Using", "logistic", "regression", "analysis", ",", "we", "found", "no", "evidence", "of", "effect", ",", "with", "only", "a", "non-significant", "increase", "in", "breast", "cancer", "risk", "for", "AA", "carriers", "of", "the", "XbaI", "polymorphism", "-LRB-", "overall", "OR", "=", "1.3", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.7", "--", "2.2", "-RRB-", "and", "for", "TT", "carriers", "of", "the", "PvuII", "variant", "-LRB-", "overall", "OR", "=", "1.4", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.8", "--", "2.2", "-RRB-", ".", "Additionally", "we", "performed", "meta-analyses", "of", "published", "data", "to", "examine", "the", "effect", "of", "both", "polymorphisms", ".", "These", "meta-analyses", "also", "suggest", "there", "are", "no", "differences", "in", "risk", "among", "genotype", "groups", "of", "these", "two", "ESR1", "variants", ".", "The", "XbaI", "and", "PvuII", "polymorphisms", "are", "situated", "in", "intron", "1", "and", "their", "functionality", "has", "not", "yet", "been", "demonstrated", ".", "Moreover", ",", "it", "has", "been", "suggested", "their", "effects", "could", "be", "the", "result", "of", "high", "linkage", "disequilibrium", "with", "functional", "variants", "that", "affect", "sensitivity", "to", "estrogen", "-LSB-", "13", "-RSB-", ".", "One", "of", "the", "limitations", "of", "our", "study", "is", "the", "limited", "number", "of", "breast", "cancer", "cases", "present", "in", "our", "population", ".", "Nevertheless", ",", "we", "have", "sufficient", "power", "-LRB-", "β", "=", "0.8", "-RRB-", "to", "detect", "effects", "of", "1.6", "or", "higher", ".", "We", "further", "conducted", "meta-analyses", "off", "all", "studies", "conducted", "to", "date", ".", "Our", "data", "suggests", "that", "these", "two", "polymorphisms", "do", "not", "play", "a", "role", "in", "the", "susceptibility", "of", "breast", "cancer", "in", "elderly", "Caucasian", "women", "." ]

[ "B", "I", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Tight", "blood", "glucose", "control", ":", "a", "recommendation", "applicable", "to", "any", "critically", "ill", "patient", "?", "The", "issue", "of", "tight", "glucose", "control", "with", "intensive", "insulin", "therapy", "in", "critically", "ill", "patients", "remains", "controversial", ".", "Although", "compelling", "evidence", "supports", "this", "strategy", "in", "postoperative", "patients", "who", "have", "undergone", "cardiac", "surgery", ",", "the", "use", "of", "tight", "glucose", "control", "has", "been", "challenged", "in", "other", "situations", ",", "including", "in", "medical", "critically", "ill", "patients", "and", "in", "those", "who", "have", "undergone", "non-cardiac", "surgery", ".", "Similarly", ",", "the", "mechanisms", "that", "underlie", "the", "effects", "of", "high-dose", "insulin", "are", "not", "fully", "elucidated", ".", "These", "arguments", "emphasize", "the", "need", "to", "study", "the", "effects", "of", "tight", "glucose", "control", "in", "a", "large", "heterogeneous", "cohort", "of", "intensive", "care", "unit", "patients", ".", "Until", "the", "end", "of", "the", "past", "millenium", ",", "relatively", "little", "attention", "was", "given", "to", "control", "of", "blood", "sugar", "levels", ".", "In", "critically", "ill", "patients", ",", "hyperglycaemia", "was", "considered", "to", "be", "physiological", "because", "it", "results", "from", "the", "metabolic", "and", "hormonal", "changes", "that", "accompany", "the", "stress", "response", "to", "injury", ".", "In", "most", "intensive", "care", "units", "-LRB-", "ICUs", "-RRB-", ",", "blood", "sugar", "was", "checked", "every", "4", "--", "6", "hours", "and", "hyperglycaemia", "-LRB-", "defined", "as", "blood", "sugar", "levels", ">", "10", "--", "12", "mmol/l", "-LSB-", "180", "--", "216", "mg/dl", "-RSB-", "-RRB-", "was", "corrected", "by", "subcutaneous", "or", "intravenous", "insulin", ".", "The", "presence", "of", "pre-existing", "diabetes", "mellitus", "or", "post-neurosurgical", "status", "often", "prompted", "more", "intense", "control", "of", "hyperglycaemia", ".", "Furthermore", ",", "the", "issue", "of", "glucose", "control", "was", "discussed", "in", "few", "sessions", "or", "satellite", "symposia", "during", "intensive", "care", "meetings", ".", "The", "deleterious", "effects", "of", "hyperglycaemia", "during", "critical", "illness", "have", "been", "characterized", "over", "the", "past", "few", "years", ",", "and", "include", "an", "increased", "susceptibility", "to", "infections", "and", "thromboses", ",", "macrovascular", "and", "microvascular", "changes", ",", "and", "delayed", "wound", "healing", ",", "among", "other", "effects", "-LRB-", "for", "review", "-LSB-", "1", "-RSB-", "-RRB-", ".", "Renewed", "interest", "in", "control", "of", "hyperglycaemia", "in", "critically", "ill", "patients", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", "followed", "the", "publication", "of", "a", "study", "conducted", "by", "Van", "den", "Berghe", "and", "coworkers", "in", "2001", "-LSB-", "2", "-RSB-", ".", "Those", "investigators", "reported", "a", "43", "%", "decrease", "in", "relative", "intensive", "care", "mortality", "as", "well", "as", "consistent", "decreases", "in", "several", "surrogate", "markers", "of", "disease", "severity", "in", "patients", "randomly", "assigned", "to", "tight", "glucose", "control", "by", "intensive", "intravenous", "insulin", "therapy", ".", "A", "post", "hoc", "multivariate", "logistic", "regression", "analysis", "of", "these", "data", "suggested", "that", "control", "of", "hyperglycaemia", "played", "a", "more", "important", "role", "than", "did", "the", "amount", "of", "insulin", "administered", "-LSB-", "3", "-RSB-", ".", "Interestingly", "enough", ",", "at", "least", "two", "recent", "retrospective", ",", "large-scale", "studies", "-LSB-", "4,5", "-RSB-", "confirmed", "that", "outcome", "was", "improved", "in", "patients", "whose", "average", "blood", "glucose", "was", "maintained", "below", "8", "mmol/l", "-LRB-", "144", "mg/dl", ";", "Table", "1", "-RRB-", ".", "Although", "the", "findings", "reported", "by", "Van", "den", "Berghe", "and", "coworkers", "are", "impressive", ",", "some", "concern", "arose", "regarding", "the", "applicability", "of", "these", "results", "to", "other", "types", "of", "patients", ".", "Of", "the", "patients", "studied", ",", "63", "%", "were", "admitted", "for", "follow", "up", "after", "cardiac", "surgery", ";", "this", "high", "proportion", "was", "felt", "to", "be", "consistent", "with", "a", "particular", "benefit", "from", "tight", "glucose", "control", "with", "intensive", "insulin", "in", "these", "patients", ",", "but", "there", "is", "uncertainty", "regarding", "whether", "tight", "glucose", "control", "is", "beneficial", "in", "patients", "who", "have", "not", "undergone", "cardiac", "surgery", ".", "Fear", "of", "life-threatening", "hypoglycaemia", "and", "increased", "workload", "and", "costs", "probably", "underlie", "the", "reluctance", "of", "many", "intensivists", "to", "launch", "systematic", "protocols", "of", "tight", "glucose", "control", ".", "Indeed", ",", "many", "intensivists", "still", "use", "a", "high", "glucose", "threshold", "-LRB-", "10", "mmol/l", "-LSB-", "180", "mg/dl", "-RSB-", "-RRB-", "-LSB-", "6", "-RSB-", ".", "In", "a", "European", "survey", "-LRB-", "unpublished", "data", "-RRB-", "we", "found", "considerable", "variation", "in", "the", "glycaemic", "thresholds", "employed", "in", "ICUs", ",", "which", "ranged", "from", "6", "to", "11.1", "mmol/l", "-LRB-", "108", "--", "200", "mg/dl", "-RRB-", ".", "Some", "arguments", "against", "generalized", "use", "of", "tight", "glucose", "control", "are", "reported", "in", "the", "present", "issue", "of", "Critical", "Care", "by", "Vriesendorp", "and", "coworkers", "-LSB-", "7", "-RSB-", ".", "In", "a", "retrospective", "study", "performed", "at", "one", "centre", "in", "Amsterdam", ",", "those", "authors", "found", "that", ",", "after", "oesophageal", "surgery", "in", "patients", "without", "significant", "cardiovascular", "compromise", "-LRB-", "ASA", "class", "I", "--", "II", "-RRB-", ",", "postoperative", "hyperglycaemia", "was", "not", "a", "risk", "factor", "for", "infectious", "complications", ".", "Only", "by", "univariate", "analysis", "were", "they", "able", "to", "find", "an", "improvement", "in", "patients", "with", "blood", "glucose", "levels", "below", "9.3", "mmol/l", "-LRB-", "167", "mg/dl", "-RRB-", "in", "terms", "of", "length", "of", "ICU", "stay", ".", "These", "findings", "differ", "strikingly", "from", "those", "of", "other", "studies", "-LSB-", "2,4,5", "-RSB-", ".", "Although", "the", "report", "by", "Vriesendorp", "and", "coworkers", "challenges", "the", "concept", "of", "tight", "glucose", "control", ",", "it", "can", "hardly", "be", "considered", "a", "major", "piece", "of", "evidence", "against", "it", ".", "Indeed", ",", "blood", "glucose", "concentrations", "were", "presented", "as", "means", "of", "values", "recorded", "only", "over", "48", "hours", ",", "whereas", "the", "ICU", "stay", "extended", "up", "to", "71", "days", ",", "with", "a", "median", "of", "3", "days", ".", "Insulin", "was", "administered", "to", "only", "9", "%", "of", "the", "patients", "during", "the", "48-hour", "period", "of", "observation", ".", "In", "addition", ",", "patients", "received", "a", "mean", "of", "only", "22.5", "g", "glucose/day", ",", "and", "were", "fed", "early", "after", "surgery", "with", "an", "enteral", "solution", "of", "`", "immunonutrients", "'", "--", "a", "potential", "confounding", "factor", "with", "respect", "to", "infectious", "morbidity", ".", "However", ",", "despite", "these", "limitations", ",", "as", "well", "as", "others", "that", "are", "acknowledged", "by", "the", "authors", ",", "the", "findings", "of", "the", "study", "support", "the", "hypothesis", "that", "tight", "glucose", "control", "could", "be", "of", "greater", "benefit", "to", "patients", "with", "cardiovascular", "disease", "than", "to", "those", "without", ".", "In", "conclusion", ",", "as", "recently", "suggested", "by", "Van", "den", "Berghe", "-LSB-", "8", "-RSB-", ",", "further", "studies", "are", "needed", "to", "confirm", "the", "benefits", "of", "tight", "blood", "glucose", "control", "with", "intensive", "insulin", "therapy", "in", "a", "heterogeneous", "population", "of", "ICU", "patients", ".", "Hence", ",", "a", "large", "randomized", "prospective", "multicentre", "trial", "is", "warranted", ".", "Such", "study", "will", "also", "help", "in", "determining", "the", "physiological", "importance", "of", "the", "effects", "of", "insulin", "and", ",", "more", "importantly", ",", "will", "provide", "intensive", "care", "workers", "with", "key", "information", "for", "guiding", "the", "management", "of", "blood", "glucose", "in", "critically", "ill", "patients", ".", "Abbreviation", "ICU", "=", "intensive", "care", "unit", ".", "Competing", "interests", "The", "author", "-LRB-", "s", "-RRB-", "declare", "that", "they", "have", "no", "competing", "interests", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "The", "spectrum", "of", "ATM", "missense", "variants", "and", "their", "contribution", "to", "contralateral", "breast", "cancer", "Heterozygous", "carriers", "of", "ATM", "mutations", "are", "at", "increased", "risk", "of", "breast", "cancer", ".", "In", "this", "case-control", "study", ",", "we", "evaluated", "the", "significance", "of", "germline", "ATM", "missense", "variants", "to", "the", "risk", "of", "contralateral", "breast", "cancer", "-LRB-", "CBC", "-RRB-", ".", "We", "have", "determined", "the", "spectrum", "and", "frequency", "of", "ATM", "missense", "variants", "in", "443", "breast", "cancer", "patients", "diagnosed", "before", "age", "50", ",", "including", "247", "patients", "who", "subsequently", "developed", "CBC", ".", "Twenty-one", "per", "cent", "of", "the", "women", "with", "unilateral", "breast", "cancer", "and", "17", "%", "of", "the", "women", "with", "CBC", "had", "at", "least", "one", "ATM", "germline", "missense", "variant", ",", "indicating", "no", "significant", "difference", "in", "variant", "frequency", "between", "these", "two", "groups", ".", "We", "have", "found", "that", "carriers", "of", "an", "ATM", "missense", "mutation", ",", "who", "were", "treated", "with", "radiotherapy", "for", "the", "first", "breast", "tumour", ",", "developed", "their", "second", "tumour", "on", "average", "in", "a", "92-month", "interval", "compared", "to", "a", "136-month", "mean", "interval", "for", "those", "CBC", "patients", "who", "neither", "received", "RT", "nor", "carried", "a", "germline", "variant", ",", "-LRB-", "p", "=", "0.029", "-RRB-", ".", "Our", "results", "indicate", "that", "the", "presence", "of", "ATM", "variants", "does", "not", "have", "a", "major", "impact", "on", "the", "overall", "risk", "of", "CBC", ".", "However", ",", "the", "combination", "of", "RT", "and", "-LRB-", "certain", "-RRB-", "ATM", "missense", "variants", "seems", "to", "accelerate", "tumour", "development", ".", "Introduction", "Homozygous", "or", "compound", "heterozygous", "germline", "mutations", "in", "the", "ATM", "gene", "cause", "the", "autosomal", "recessive", "disorder", "ataxia-telangiectasia", "-LRB-", "A-T", "-RRB-", ".", "This", "progressive", "neurological", "childhood", "disease", "is", "characterized", "by", "cerebellar", "degeneration", ",", "immunological", "defects", ",", "extreme", "sensitivity", "for", "ionising", "radiation", "and", "increased", "risk", "for", "cancers", ",", "particularly", "lymphomas", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "ATM", "mutations", "identified", "in", "A-T", "families", "can", "be", "classified", "in", "three", "categories", ";", "truncating", "mutations", ",", "mutations", "that", "lead", "to", "some", "expression", "of", "mutant", "protein", "that", "lacks", "kinase", "activity", "and", "missense", "mutations", "with", "reduced", "kinase", "activity", "-LRB-", "http://chromium.liacs.nk/lovd/", "-RRB-", ".", "Heterozygous", "pathogenic", "ATM", "mutation", "carriers", ",", "∼", "0.5", "--", "1", "%", "of", "the", "general", "population", ",", "do", "not", "display", "the", "symptoms", "observed", "in", "A-T", "patients", ".", "Several", "epidemiological", "studies", "have", "consistently", "shown", "elevated", "rates", "of", "breast", "cancer", "among", "female", "blood", "relatives", "of", "patients", "with", "A-T", "-LSB-", "2", ",", "3", "-RSB-", ".", "Thompson", "et", "al.", "have", "shown", "that", "the", "overall", "relative", "risk", "in", "carriers", "was", "2.23", "-LSB-", "95", "%", "confidence", "interval", "-LRB-", "CI", "-RRB-", "1.16", "--", "4.28", "-RSB-", "compared", "to", "the", "general", "population", "and", "4.95", "-LRB-", "95", "%", "CI", "1.9", "--", "12.9", "-RRB-", "in", "those", "younger", "that", "age", "50", ".", "A", "large", "review", "showed", "that", "ATM", "mutations", "are", "more", "frequent", "in", "breast", "cancer", "patients", "selected", "on", "the", "basis", "of", "a", "family", "history", "of", "breast", "cancer", "than", "in", "unselected", "patients", "-LSB-", "4", "-RSB-", ".", "Besides", "pathogenic", "ATM", "mutations", ",", "a", "large", "number", "of", "ATM", "variants", "-LRB-", "common", "polymorphisms", "and", "unclassified", "variants", "-RRB-", "have", "been", "described", ",", "which", "were", "found", "in", "cancer", "patients", "as", "well", "as", "in", "the", "general", "population", ".", "It", "has", "been", "hypothesized", "that", "the", "cancer", "risk", "among", "ATM", "heterozygotes", "might", "be", "related", "to", "mutation", "type", ",", "suggesting", "that", "particularly", "missense", "mutations", "are", "associated", "with", "an", "increased", "risk", "-LSB-", "5", ",", "6", "-RSB-", ".", "However", ",", "two", "recent", "studies", "by", "Thompson", "et", "al.", "and", "Renwick", "et", "al.", "showed", "that", "pathogenic", "ATM", "mutations", "that", "cause", "A-T", "are", "breast", "cancer", "susceptibility", "alleles", "-LSB-", "2", ",", "7", "-RSB-", ".", "This", "argues", "against", "the", "hypothesis", "that", "missense", "rather", "that", "truncating", "are", "associated", "with", "breast", "cancer", ".", "Women", "with", "breast", "cancer", "have", "in", "general", "a", "three", "to", "fourfold", "increased", "risk", "of", "developing", "a", "new", "primary", "cancer", "in", "the", "opposite", "breast", "-LSB-", "8", "-RSB-", ".", "The", "contralateral", "breast", "cancer", "-LRB-", "CBC", "-RRB-", "risk", "might", "be", "explained", "by", "the", "same", "genetic", "and", "hormonal", "factors", "that", "caused", "the", "first", "breast", "cancer", ".", "Treatment", "related", "factors", ",", "e.g.", "radiotherapy", "for", "primary", "breast", "cancer", ",", "may", "also", "contribute", "to", "the", "development", "of", "cancer", "in", "the", "contralateral", "breast", "-LSB-", "9", "-RSB-", "-LRB-", "our", "own", "data", ",", "manuscript", "under", "review", "-RRB-", ".", "To", "evaluate", "whether", "germline", "ATM", "missense", "variants", "are", "significantly", "associated", "with", "CBC", "risk", "-LRB-", "results", "regarding", "ATM", "truncating", "mutations", "are", "reported", "elsewhere", "-RRB-", "and", "whether", "treatment", "modifies", "this", "risk", ",", "we", "conducted", "a", "case-control", "study", "in", "which", "we", "assessed", "the", "ATM", "missense", "mutation", "spectrum", "and", "frequency", "in", "women", "who", "developed", "their", "first", "breast", "cancer", "before", "age", "50", ",", "with", "and", "without", "a", "second", "primary", "breast", "cancer", ".", "Methods", "Patients", "The", "consecutive", "breast", "cancer", "patients", "included", "in", "this", "study", "were", "all", "selected", "from", "the", "hospital", "tumour", "registries", "of", "The", "Netherlands", "Cancer", "Institute", ",", "Amsterdam", "-LRB-", "NKI-AVL", "-RRB-", "or", "The", "Dr.", "Daniel", "den", "Hoed", "Cancer", "Center/Erasmus", "Medical", "Center", ",", "Rotterdam", "-LRB-", "DDHK", "-RRB-", ".", "Of", "all", "patients", "that", "were", "invited", "to", "participate", "we", "achieved", "an", "80", "%", "response", "rate", ".", "The", "breast", "cancer", "patients", "were", "included", "if", "their", "-LRB-", "first", "-RRB-", "breast", "cancer", "was", "diagnosed", "before", "age", "50", "-LRB-", "n", "=", "443", "-RRB-", ".", "For", "CBC", "we", "required", "an", "interval", "of", "at", "least", "1", "year", "-LRB-", "n", "=", "247", "-RRB-", ".", "The", "unilateral", "breast", "cancer", "patients", "-LRB-", "UBC", "-RRB-", "patients", "all", "had", "to", "be", "disease-free", "-LRB-", "of", "a", "second", "breast", "cancer", "-RRB-", "for", "at", "least", "5", "years", ".", "The", "first", "57", "CBC", "patients", "were", "individually", "age-matched", "-LRB-", "1:3", "-RRB-", "to", "UBC", "controls", ".", "All", "patients", "had", "invasive", "breast", "carcinoma", "and", "were", "treated", "with", "surgery", ".", "Of", "the", "CBC", "patients", "169", "did", "and", "78", "did", "not", "receive", "radiotherapy", "treatment", "for", "their", "primary", "breast", "tumour", ".", "Average", "age", "at", "diagnosis", "for", "the", "first", "breast", "cancer", "in", "the", "RT", "group", "was", "41.2", "/", "41.3", "years", "-LRB-", "mean/median", "-RRB-", "and", "the", "non-exposed", "group", "42.0", "/", "43.2", "years", "-LRB-", "mean/median", "-RRB-", ".", "Detailed", "treatment", "data", ",", "disease", "and", "patient", "characteristics", "were", "obtained", "from", "medical", "records", "and", "risk", "factor", "questionnaires", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", "-LSB-", "10", ",", "11", "-RSB-", ".", "Patients", "were", "asked", "to", "donate", "a", "20", "ml", "blood", "sample", "or", "permission", "for", "use", "of", "paraffin-embedded", "tissue", "blocks", "and", "patients", "gave", "their", "written", "informed", "consent", "for", "mutation", "analysis", ".", "This", "study", "received", "approval", "of", "the", "Medical", "Ethical", "Committees", "of", "NKI-AVL", "and", "DDHK", ".", "Genomic", "DNA", "isolation", "Genomic", "DNA", "was", "either", "isolated", "from", "peripheral", "blood", "lymphocytes", "with", "DNAzol", "-LRB-", "Invitrogen", ",", "Breda", ",", "The", "Netherlands", "-RRB-", "methods", "according", "to", "the", "manufacturer", "'s", "instructions", ",", "or", "from", "three", "10-μm", "paraffin", "embedded", "normal", "tissue", "slides", "according", "to", "standard", "protocols", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "For", "histopathological", "examination", "we", "used", "a", "hematoxylin-eosin", "stained", "slide", ".", "Mutation", "analysis", "The", "complete", "ATM", "Open", "Reading", "Frame", "-LRB-", "ORF", "-RRB-", "was", "analysed", ",", "each", "exon", "-LRB-", "exon", "4-65", "-RRB-", "and", "all", "intron-exon", "boundaries", "were", "screened", "for", "germline", "mutations", "using", "Denaturing", "Gradient", "Gel", "Electrophoresis", "-LRB-", "DGGE", "-RRB-", "identifying", "∼", "90", "%", "of", "all", "ATM", "mutations", "and", "polymorphisms", "-LRB-", "details", "from", "the", "author", "upon", "request", "-RRB-", ".", "All", "aberrations", "were", "confirmed", "with", "genomic", "sequence", "analysis", ",", "performed", "using", "the", "ABI", "PRISM", "BigDyeTerminator", "Cycle", "Sequencing", "Ready", "Reaction", "Kit", "Version", "3.1", "-LRB-", "Applied", "Biosystems", ",", "Nieuwerkerk", "a/d", "yssel", ",", "The", "Netherlands", "-RRB-", ".", "Sequencing", "products", "were", "analysed", "with", "the", "ABI", "PRISM", "3700", "DNA", "Analyzer", "and", "corresponding", "software", ".", "Statistical", "analysis", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "standard", "methods", "for", "analysis", "of", "case-control", "studies", "-LSB-", "13", "-RSB-", ".", "We", "compared", "the", "mutation", "frequency", "between", "UBC", "and", "CBC", "and", "between", "CBC", "cases", "previously", "treated", "with", "RT", "and", "cases", "not-treated", "with", "RT.", ".", "Odds", "ratios", "-LRB-", "ORs", "-RRB-", "and", "95", "%", "CI", "were", "calculated", "to", "evaluate", "the", "association", "between", "mutation", "carriers", "status", "and", "breast", "cancer", "risk", ".", "We", "have", "used", "the", "Mann", "--", "Whitney", "test", "to", "determine", "whether", "the", "difference", "between", "the", "intervals", "between", "the", "two", "breast", "cancers", "of", "the", "CBC", "patients", "was", "significant", ".", "All", "analyses", "were", "performed", "using", "SPSS", "12.0", "-LRB-", "SPSS", "Inc.", ",", "Chicago", ",", "IL", ",", "USA", "-RRB-", ".", "Results", "and", "discussion", "ATM", "germline", "mutations", "In", "the", "present", "study", ",", "we", "have", "used", "the", "DGGE", "method", "to", "screen", "the", "complete", "ATM", "ORF", "to", "obtain", "insight", "in", "the", "ATM", "missense", "mutation", "spectrum", "in", "-LRB-", "contralateral", "-RRB-", "breast", "cancer", "patients", ".", "With", "DGGE", "we", "were", "able", "to", "confirm", "all", "the", "previously", "identified", "truncating", "mutations", ".", "A", "subset", "of", "the", "CBC", "patients", "described", "in", "this", "study", "had", "been", "screened", "in", "the", "past", "for", "ATM", "truncating", "mutations", "with", "the", "Protein", "Truncating", "Test", ",", "revealing", "seven", "ATM", "truncating", "mutations", "-LRB-", "including", "a", "non-sense", "mutation", "and", "small", "insertions", "and", "deletions", ";", "generating", "stop", "codons", "within", "a", "previously", "functional", "protein", "coding", "sequence", "causing", "premature", "termination", "of", "translation", "of", "the", "protein", "-RRB-", "-LSB-", "10", "-RSB-", ".", "Among", "all", "443-breast", "cancer", "patients", "that", "were", "tested", "in", "this", "study", "with", "DGGE", "we", "detected", "a", "large", "number", "of", "ATM", "silent", "mutations", "-LRB-", "presumed", "neutral", "polymorphisms", ",", "data", "not", "shown", "and", "excluded", "from", "all", "analyses", "-RRB-", "and", "missense", "mutations", "-LRB-", "causing", "an", "amino", "acid", "substitution", "in", "the", "coded", "protein", ",", "most", "common", "ones", ";", "i.e.", "D1853N", ",", "not", "included", "in", "further", "analysis", "-RRB-", ".", "ATM", "missense", "mutation", "spectrum", "In", "our", "study", "cohort", "we", "have", "detected", "35", "distinct", "ATM", "missense", "variants", "and", "6", "distinct", "truncating", "mutations", ".", "Several", "of", "the", "detected", "missense", "variants", "have", "been", "reported", "in", "the", "ATM", "database", "as", "being", "detected", "in", "A-T", "patients/or", "as", "polymorphisms", "-LRB-", "Table", "1", "-RRB-", ".", "None", "of", "the", "missense", "variants", "identified", "in", "this", "study", "are", "known", "as", "pathogenic", "A-T", "causing", "missense", "mutations", ".", "Seventeen", "of", "the", "missense", "variants", "have", "not", "been", "reported", "previously", ".", "Eleven", "missense", "variants", "were", "exclusively", "found", "in", "the", "CBC", "group", "and", "10", "exclusively", "in", "the", "UBC", "group", ".", "Whether", "this", "distinction", "in", "the", "spectrum", "indicates", "an", "association", "between", "particular", "variants", "and", "bilateral", "breast", "cancer", "risk", "can", "not", "be", "concluded", "from", "the", "small", "numbers", "obtained", "in", "this", "study", "population", ".", "The", "ATM", "protein", "has", "several", "functional", "domains", "and", "the", "identified", "missense", "variants", "are", "located", "throughout", "the", "ORF", ".", "Potential", "functional", "implications", "of", "the", "newly", "identified", "unclassified", "variants", "remain", "to", "be", "established", ".", "Table", "1ATM", "missense", "variant", "and", "truncating", "mutation", "spectrum", "in", "contralateral", "and", "unilateral", "breast", "cancer", "patientsMissense", "variantsAmino", "acid", "changeCBC", "n", "=", "247UBC", "n", "=", "190Databasea", "or", "literature37C", ">", "TR13C1", "-LSB-", "10", "-RSB-", "146C", ">", "GS49C55database162T", ">", "CY54H21", "-LSB-", "4", "-RSB-", ",", "-LSB-", "14", "-RSB-", "378A", ">", "TD126E1database1009C", ">", "TR337C1Novel1132A", ">", "GS377G1Novel1229T", ">", "GV410A21", "-LSB-", "4", "-RSB-", "1810C", ">", "TP604S1database2119T", ">", "CS707P78database2276G", ">", "A", "S759NNovel2336T", ">", "CM779T1Novel2414G", ">", "AR805Q2Novel2572T", ">", "CF858L43database2650C", ">", "TP884S12650C", ">", "TP884S1Novel2614C", ">", "TP872S", "-LSB-", "15", "-RSB-", "3161C", ">", "GP1054R813database3925G", ">", "AA1309T11", "-LSB-", "16", "-RSB-", "4138C", ">", "TH1380Y1database4258C", ">", "TL1420F54database4324T", ">", "CY1442H2Novel4362A", ">", "CK1454N1database4477C", ">", "GL1493V1Novel4664T", ">", "AL1555H1Novel4722G", ">", "TL1574F1Novel5044G", ">", "TD1682Y1database5071A", ">", "CS1691R22database5557G", ">", "AbD1853N3549database5558A", ">", "TD1853V31database5741A", ">", "GD1914GNovel6067G", ">", "AG2023R1database6820G", ">", "AA2274T1database6919C", ">", "TL2307F1", "-LSB-", "14", "-RSB-", "7446G", ">", "AM2482I1Novel7874A", ">", "GD2625G1Novel8659C", ">", "GH2887D1NovelTruncating", "mutationsIVS10-6T", ">", "G419X12database", "-LSB-", "10", "-RSB-", ",", "-LSB-", "17", "-RSB-", "1563delAG521X1database1660delA554X1NovelIVS14", "+", "2T", ">", "Gdel", "601-6331database2572insTF858X1Novel3115A", ">", "TR1039X1Novela", "http://chromium.liacs.nk/lovd/b Not", "included", "in", "frequency", "analysis", "Despite", "the", "fact", "that", "ATM", "plays", "a", "role", "in", "breast", "cancer", "risk", ",", "the", "role", "of", "most", "distinct", "ATM", "missense", "variants", "remains", "unclear", ".", "Some", "studies", "tried", "to", "predict", "the", "relevance", "of", "each", "particular", "mutation", "on", "basis", "of", "co-segregation", "with", "breast", "cancer", "in", "families", ",", "the", "location", "in", "a", "functional", "domain", "or", "interference", "with", "the", "splicing", "machinery", ".", "Only", "a", "few", "studies", "present", "functional", "analysis", "that", "are", "necessary", "to", "assess", "the", "biological", "impact", "of", "unidentified", "variants", "found", "frequently", "in", "ATM", "-LSB-", "18", "--", "20", "-RSB-", ".", "ATM", "missense", "mutations", "and", "contralateral", "breast", "cancer", "Twenty-one", "per", "cent", "of", "the", "patients", "carried", "at", "least", "one", "ATM", "germline", "variant", "-LRB-", "missense", "and", "truncating", ";", "Table", "2", "-RRB-", ".", "Among", "the", "patients", "with", "CBC", "-LRB-", "n", "=", "247", "-RRB-", "we", "identified", "in", "total", "55", "ATM", "variants", "in", "45", "individuals", "-LRB-", "18", "%", "-RRB-", ";", "51", "missense", "variants", "and", "4", "truncating", "mutations", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "Eight", "CBC", "patients", "had", "multiple", "ATM", "missense", "variants", "and", "2", "patients", "carried", "both", "a", "missense", "and", "a", "truncating", "ATM", "mutation", ".", "In", "the", "women", "with", "UBC", "-LRB-", "n", "=", "196", "-RRB-", "we", "identified", "52", "ATM", "variants", "in", "46", "individuals", "-LRB-", "23", "%", "-RRB-", ";", "48", "missense", "and", "4", "truncating", "mutations", ".", "Three", "UBC", "patients", "carried", "double", "missense", "and", "3", "patients", "both", "a", "truncating", "and", "a", "missense", "variant", ".", "Although", "it", "is", "known", "from", "the", "literature", "that", "ATM", "missense", "variants", "might", "be", "involved", "in", "breast", "cancer", "pathogenesis", ",", "the", "identified", "17", "%", "missense", "variant", "carriers", "among", "the", "CBC", "patients", "compared", "to", "the", "21", "%", "missense", "variants", "among", "the", "UBC", "patients", "indicate", "that", "there", "is", "not", "a", "significantly", "increased", "risk", "for", "bilateral", "breast", "cancer", "among", "ATM", "missense", "variant", "carriers", ",", "OR", "0.77", "-LRB-", "95", "%", "CI", "0.48", "--", "1.24", "-RRB-", ".", "Table", "2ATM", "variant", "frequencies", "in", "all", "breast", "cancer", "patients", "diagnosed", "under", "age", "50", "and", "according", "to", "uni", "-", "or", "contralateral", "breast", "cancerBreast", "cancer", "patients", "withAll", "patients", "n", "=", "443CBC", "n", "=", "247UBC", "n", "=", "196Total", "ATM", "variantsa55", ":", "51", "missense", "and", "4", "truncating52", ":", "48", "missense", "and", "4", "truncatingAt", "least", "one", "ATM", "variant91", "-LRB-", "21", "%", "-RRB-", "45", "-LRB-", "18", "%", "-RRB-", "46", "-LRB-", "23", "%", "-RRB-", "At", "least", "one", "ATM", "missense", "variant85", "-LRB-", "19", "%", "-RRB-", "43", "-LRB-", "17", "%", "-RRB-", "42", "-LRB-", "21", "%", "-RRB-", "Only", "one", "ATM", "truncating", "mutations321One", "truncating", "and", "one", "missense", "variant523Double", "missense", "variants1183a", "Not", "included", "are", "the", "most", "common", "and", "silent", "variants", "Association", "with", "radiation", "treatment", "Women", "at", "high", "risk", "for", "developing", "breast", "cancer", "may", "respond", "differently", "to", "radiation", "exposures", "associated", "with", "screening", "and", "treatment", ",", "than", "the", "general", "population", ".", "Candidate-genes", "like", "ATM", "are", "implicated", "in", "maintenance", "of", "genome", "integrity", ".", "Their", "involvements", "in", "breast", "cancer", "susceptibility", "as", "well", "as", "their", "role", "in", "DNA-damage", "repair", "signalling", "make", "them", "excellent", "candidates", "for", "a", "role", "in", "radiation-induced", "breast", "cancer", "-LSB-", "21", "-RSB-", ".", "Recently", ",", "we", "showed", "that", "women", "with", "a", "pathogenic", "germline", "mutation", "in", "a", "DNA", "repair", "pathway", "gene", "-LRB-", "e.g.", "BRCA1", ",", "BRCA2", ",", "CHEK2", "and", "ATM", "-RRB-", "have", "an", "over", "2-fold", "increased", "risk", "of", "developing", "radiation-associated", "breast", "cancer", "-LRB-", "manuscript", "under", "review", "-RRB-", ".", "Therefore", ",", "we", "now", "investigated", "whether", "exposure", "to", "ionising", "radiation", "had", "a", "greater", "biological", "impact", "on", "certain", "ATM", "genotypes", "than", "on", "others", ".", "We", "did", "not", "detect", "a", "significantly", "increased", "risk", "of", "developing", "radiation-associated", "CBC", "among", "missense", "mutation", "carriers", ".", "Among", "those", "169", "CBC", "patients", "who", "had", "developed", "a", "second", "primary", "breast", "tumour", "following", "radiotherapy", "for", "their", "first", "breast", "tumour", "we", "identified", "19.5", "%", "ATM", "missense", "variants", "carriers", "compared", "to", "13", "%", "among", "those", "CBC", "patients", "who", "did", "not", "receive", "RT", ",", "the", "OR", "from", "this", "case-only", "analysis", "is", "1.65", "-LSB-", "95", "%", "CI", "-LRB-", "0.77", "--", "3.55", "-RRB-", "p", "=", "0.2", "-RSB-", ".", "Furthermore", ",", "we", "have", "observed", "that", "21", "%", "of", "the", "UBC", "patients", ",", "who", "received", "RT", "but", "did", "not", "develop", "a", "CBC", "carried", "an", "ATM", "missense", "variant", ",", "compared", "to", "19.5", "%", "of", "the", "CBC", "patients", "that", "received", "RT", "for", "their", "first", "tumour", "-LSB-", "OR", "0.86", "-LRB-", "95", "%", "CI", "0.52", "--", "1.43", "-RRB-", "-RSB-", ".", "These", "results", "suggest", "that", "RT", "is", "not", "a", "strong", "risk", "factor", "for", "the", "development", "of", "CBC", "among", "carriers", "of", "those", "ATM", "missense", "variants", ".", "It", "has", "however", "been", "shown", "that", "particular", "alterations", "in", "the", "ATM", "gene", "are", "associated", "with", "increased", "radiation", "sensitivity", "-LSB-", "22", "--", "24", "-RSB-", ".", "Gutierrez-Enriquez", "et", "al.", "showed", "that", "lymfoblastoid", "cell", "lines", "carrying", "the", "ATM", "variant", "3161G", "-LRB-", "linked", "to", "2572C", "-RRB-", "was", "associated", "with", "increased", "in", "vitro", "chromosomal", "radio-sensitivity", ",", "perhaps", "by", "interfering", "with", "ATM", "function", "in", "a", "dominant-negative", "manner", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "We", "found", "this", "particular", "variant", "allele", "-LRB-", "3161G/2572C", "-RRB-", "exclusively", "in", "our", "CBC", "group", "exposed", "to", "radiotherapy", "-LRB-", "four", "times", "-RRB-", "and", "not", "in", "the", "non-RT-exposed", "CBC", "group", ".", "This", "finding", "supports", "the", "hypothesis", "that", "particular", "ATM", "variants", "might", "play", "a", "differential", "role", "in", "radiation", "response", ".", "Although", "a", "subset", "of", "the", "missense", "variants", "was", "only", "detected", "in", "the", "RT", "exposed", "subpopulation", ",", "individual", "numbers", "were", "probably", "too", "small", "to", "detect", "a", "significant", "effect", "of", "particular", "mutations", "associated", "with", "treatment", ".", "We", "observed", "that", "CBC", "patients", "with", "an", "ATM", "missense", "variant", "had", "an", "mean", "interval", "between", "the", "first", "and", "second", "breast", "tumour", "of", "∼", "101", "months", ",", "compared", "to", "122", "months", "for", "non-carriers", "CBC", "patients", "-LRB-", "p", "=", "0.085", "-RRB-", ".", "Interestingly", ",", "the", "combination", "of", "radiation", "treatment", "and", "a", "missense", "variant", "resulted", "in", "an", "even", "shorter", "mean", "interval", "of", "a", "92", "months", "in", "the", "CBC", "patients", "compared", "to", "a", "136-month", "interval", "for", "CBC", "patients", "who", "neither", "received", "RT", "nor", "carried", "a", "germline", "variant", "-LRB-", "p", "=", "0.029", "-RRB-", ".", "These", "data", "suggest", "that", "carrier-ship", "of", "an", "ATM", "missense", "variant", "may", "accelerate", "the", "development", "of", "a", "second", "tumour", "and", "decreases", "the", "age", "at", "onset", "of", "the", "second", "breast", "tumour", ",", "especially", "in", "case", "of", "exposure", "to", "RT.", ".", "The", "suggestion", "of", "a", "shorter", "induction", "period", "of", "RT-associated", "breast", "cancer", "in", "patients", ",", "who", "carry", "an", "ATM", "missense", "mutation", ",", "while", "the", "proportion", "of", "patients", "with", "missense", "variants", "was", "similar", "in", "CBC", "and", "UBC", "cases", ",", "might", "be", "attributable", "to", "a", "different", "spectrum", "of", "mutations", "in", "those", "patients", "who", "developed", "CBC", ".", "A", "big", "challenge", "in", "such", "a", "study", "remains", "to", "assess", "which", "particular", "missense", "mutations", "have", "an", "impact", "on", "ATM", "function", ".", "Large", "association", "studies", ",", "as", "performed", "by", "the", "Breast", "Cancer", "Association", "Consortium", "-LRB-", "coordinated", "by", "Doug", "Easton", "and", "Paul", "Pharoah", ",", "Cambridge", "-RRB-", ",", "and", "functional", "studies", "are", "clearly", "necessary", "to", "determine", "the", "importance", "of", "particular", "variants", "and", "their", "contribution", "to", "the", "breast", "cancer", "risk", "." ]

[ "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O" ]

[ "Impact", "of", "the", "population", "at", "risk", "of", "diabetes", "on", "projections", "of", "diabetes", "burden", "in", "the", "United", "States", ":", "an", "epidemic", "on", "the", "way", "Aims/hypothesis", "The", "aim", "of", "this", "study", "was", "to", "make", "projections", "of", "the", "future", "diabetes", "burden", "for", "the", "adult", "US", "population", "based", "in", "part", "on", "the", "prevalence", "of", "individuals", "at", "high", "risk", "of", "developing", "diabetes", ".", "Introduction", "Considerable", "evidence", "has", "been", "presented", "on", "the", "rise", "in", "diabetes", "prevalence", "in", "the", "United", "States", "and", "the", "United", "Kingdom", "-LSB-", "1", ",", "2", "-RSB-", ".", "The", "prevalence", "of", "diabetes", "has", "become", "so", "large", "that", "it", "has", "been", "termed", "an", "epidemic", "-LSB-", "1", ",", "3", "-RSB-", ".", "This", "rise", "is", "particularly", "important", "for", "healthcare", "needs", "in", "the", "US", "because", "almost", "30", "%", "of", "individuals", "with", "diabetes", "are", "currently", "undiagnosed", "and", "diabetes", "is", "disproportionately", "represented", "in", "minority", "populations", "-LSB-", "4", "-RSB-", ".", "Projection", "of", "future", "disease", "prevalence", "helps", "to", "plan", "for", "healthcare", "needs", ".", "An", "understanding", "of", "the", "population", "at", "risk", "of", "developing", "the", "disease", "is", "critical", "when", "projecting", "future", "disease", "burden", ".", "Several", "studies", "have", "projected", "future", "diagnosed", "diabetes", "prevalence", "for", "the", "US", "and", "other", "countries", "-LSB-", "2", ",", "5", "--", "9", "-RSB-", ".", "These", "studies", ",", "however", ",", "did", "not", "consider", "that", "not", "all", "individuals", "are", "equally", "at", "risk", "of", "developing", "diabetes", ",", "thereby", "possibly", "distorting", "estimates", "of", "downstream", "prevalence", ".", "For", "example", ",", "some", "risk", "factors", "for", "diabetes", ",", "e.g.", "obesity", ",", "have", "increased", "substantially", "in", "the", "population", "-LSB-", "10", "--", "12", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "many", "of", "these", "projections", "are", "based", "on", "estimates", "of", "diagnosed", "diabetes", "and", "exclude", "estimates", "of", "total", "diabetes", "-LRB-", "diagnosed", "and", "undiagnosed", "-RRB-", ",", "which", "may", "lead", "to", "serious", "underestimation", "of", "the", "diabetes", "burden", "in", "the", "population", ".", "Major", "risk", "factors", "for", "diabetes", "have", "been", "identified", "and", "are", "currently", "used", "by", "the", "American", "Diabetes", "Association", "to", "guide", "screening", "strategies", ".", "Although", "there", "are", "various", "measures", "for", "assessing", "the", "risk", "of", "having", "undiagnosed", "diabetes", "-LSB-", "13", "--", "17", "-RSB-", ",", "few", "measures", "are", "available", "for", "assessing", "the", "risk", "of", "developing", "diabetes", "-LSB-", "18", ",", "19", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "accounting", "for", "changes", "in", "the", "proportion", "of", "high-risk", "individuals", ",", "particularly", "as", "assessed", "through", "clinical", "indicators", ",", "has", "not", "been", "incorporated", "into", "previous", "projections", "of", "future", "diabetes", "burden", ".", "The", "purpose", "of", "this", "study", "was", "to", "project", "the", "prevalence", "of", "diabetes", "for", "the", "adult", "US", "population", "up", "to", "2031", ",", "using", "models", "based", "on", "data", "contained", "in", "the", "nationally", "representative", "National", "Health", "and", "Nutrition", "Examination", "Survey", "-LRB-", "NHANES", "-RRB-", "II", "mortality", "survey", "-LRB-", "1976", "--", "1992", "-RRB-", ",", "NHANES", "III", "-LRB-", "1988", "--", "1994", "-RRB-", "and", "NHANES", "1999", "--", "2002", ".", "Materials", "and", "methods", "Diabetes", "prevalence", "model", "The", "model", "for", "diabetes", "prevalence", "used", "in", "this", "study", "was", "created", "using", "data", "from", "the", "NHANES", "III", "-LRB-", "1988", "--", "1994", "-RRB-", ",", "and", "then", "fitted", "to", "data", "from", "the", "NHANES", "1999", "--", "2002", "as", "a", "validity", "check", "of", "the", "accuracy", "of", "the", "model", "'s", "projections", ".", "The", "resulting", "model", "was", "then", "used", "to", "project", "the", "number", "of", "individuals", "with", "diabetes", "in", "the", "US", "in", "10-year", "increments", "into", "the", "future", ".", "We", "evaluated", "10-year", "age", "classes", "at", "each", "10-year", "interval", ".", "Our", "model", "has", "the", "following", "components", ":", "Number", "of", "individuals", "with", "diabetesTime", "2", "=", "∑", "-LRB-", "number", "of", "individuals", "with", "diabetesTime", "1i", "+", "incident", "casesi", "−", "mortalityi", "-RRB-", ",", "where", "i", "equals", "each", "10-year", "age", "group", ",", "and", "incident", "cases", "consist", "of", ":", "-LRB-", "1", "-RRB-", "persons", "converting", "from", "a", "disease-free", "state", "to", "having", "diabetes", ";", "-LRB-", "2", "-RRB-", "diabetic", "patients", "immigrating", "to", "the", "United", "States", ";", "and", "-LRB-", "3", "-RRB-", "persons", "with", "diabetes", "moving", "into", "the", "20", "to", "29-year-old", "age", "class.The", "percentage", "of", "persons", "with", "diabetes", ",", "which", "is", "calculated", "thus", ":", "percentage", "diabetesTime", "2", "=", "-LRB-", "number", "of", "individuals", "with", "diabetesTime", "2", "/", "total", "populationTime", "2", "-RRB-", "×", "100", ".", "The", "estimate", "of", "future", "diabetes", "is", "therefore", "based", "on", "this", "equation", ",", "including", "the", "number", "of", "individuals", "with", "diabetes", "in", "the", "previous", "time", "period", ",", "conversion", "to", "diabetes", ",", "migration", ",", "and", "mortality", ",", "rather", "than", "being", "a", "linear", "extrapolation", "of", "the", "change", "in", "diabetes", "prevalence", "from", "the", "known", "values", "of", "1991", "and", "2001", ".", "Data", "sets", "The", "NHANES", "is", "a", "programme", "of", "surveys", "conducted", "by", "the", "National", "Center", "for", "Health", "Statistics", "and", "designed", "to", "assess", "the", "health", "and", "nutritional", "status", "of", "adults", "and", "children", "in", "the", "United", "States", ".", "The", "survey", "is", "unique", "on", "a", "national", "level", "in", "that", "it", "combines", "interviews", "and", "physical", "examinations", ".", "The", "NHANES", "uses", "a", "complex", "multistage", "sampling", "design", ",", "making", "it", "representative", "of", "the", "non-institutionalised", "US", "population", "and", "allowing", "weighted", "estimates", "to", "be", "computed", ".", "For", "this", "study", "we", "used", "several", "of", "the", "NHANES", "data", "sets", ".", "Specifically", ",", "we", "used", "the", "NHANES", "III", "-LRB-", "1988", "--", "1994", "-RRB-", "-LRB-", "unweighted", "n", "=", "4,950", "-RRB-", "and", "the", "NHANES", "1999", "--", "2002", "-LRB-", "unweighted", "n", "=", "3,804", "-RRB-", "to", "estimate", "among", "individuals", "of", "20", "years", "of", "age", "and", "older", "the", "prevalence", "of", "diagnosed", "diabetes", ",", "the", "total", "diabetes", "burden", "-LRB-", "diagnosed", "and", "undiagnosed", "diabetes", "-RRB-", ",", "and", "the", "proportion", "of", "the", "population", "at", "risk", "of", "developing", "diabetes", ".", "Since", "mortality", "within", "the", "population", "affects", "future", "prevalence", "-LSB-", "20", "-RSB-", ",", "we", "also", "used", "the", "cohort", "from", "the", "NHANES", "II", "mortality", "survey", "-LRB-", "1976", "--", "1992", "-RRB-", "-LRB-", "unweighted", "n", "=", "3,916", "-RRB-", "to", "provide", "estimates", "of", "diabetes", "mortality", ".", "Computation", "of", "all", "analyses", "using", "the", "NHANES", "data", "sets", "to", "provide", "nationally", "representative", "estimates", "for", "the", "models", "was", "designed", "to", "account", "for", "the", "complex", "survey", "design", "and", "the", "appropriate", "sample", "weights", ".", "All", "analyses", "were", "conducted", "using", "SUDAAN", "software", "-LRB-", "Research", "Triangle", "Institute", ",", "Research", "Triangle", "Park", ",", "NC", ",", "USA", "-RRB-", ".", "Variables", "used", "in", "models", "Prevalence", "of", "diabetes", "Diabetes", "burden", "was", "assessed", "as", "diagnosed", "diabetes", "plus", "undiagnosed", "diabetes", ".", "Because", "of", "the", "substantial", "proportion", "of", "people", "with", "undetected", "diabetes", ",", "we", "focused", "on", "this", "formula", "for", "total", "diabetes", ",", "rather", "than", "using", "diagnosed", "diabetes", "to", "indicate", "diabetes", "burden", "in", "the", "population", ".", "Moreover", ",", "by", "focusing", "on", "diabetes", "as", "diagnosed", "and", "undiagnosed", "disease", ",", "we", "minimised", "the", "possible", "impact", "on", "future", "diabetes", "prevalence", "of", "changes", "in", "screening", "practices", "for", "diagnosing", "diabetes", "during", "an", "ensuing", "time", "period", ".", "Diagnosed", "diabetes", "was", "assessed", "as", "individuals", "who", "answered", "yes", "to", "a", "question", "of", "whether", "a", "doctor", "had", "told", "them", "they", "had", "diabetes", ".", "Undiagnosed", "diabetes", "was", "estimated", "on", "the", "basis", "of", "individuals", "who", "said", "they", "had", "not", "had", "a", "previous", "diagnosis", "of", "diabetes", ",", "but", "who", "had", "fasting", "plasma", "glucose", "-LRB-", "FPG", "-RRB-", ">", "7.0", "mmol/l", ".", "Although", ",", "the", "diagnostic", "criteria", "for", "diabetes", "during", "the", "time", "between", "the", "NHANES", "II", "and", "the", "NHANES", "III", "changed", "from", "FPG", ">", "7.8", "mmol/l", "to", "FPG", ">", "7.0", "mmol/l", ",", "we", "used", "the", "newer", "criteria", "to", "gain", "an", "awareness", "of", "the", "total", "diabetes", "burden", "at", "each", "point", "in", "time", "using", "the", "same", "criteria", "-LSB-", "21", "-RSB-", ".", "Persons", "converting", "from", "a", "disease-free", "state", "to", "having", "diabetes", "Although", "a", "variety", "of", "diabetes", "risk", "scores", "exist", ",", "most", "have", "been", "created", "from", "cross-sectional", "studies", "and", "have", "as", "their", "aim", "the", "identification", "of", "individuals", "with", "undiagnosed", "diabetes", ".", "Their", "ability", ",", "therefore", ",", "to", "make", "predictions", "on", "development", "of", "diabetes", "is", "unknown", "-LSB-", "13", ",", "14", ",", "16", "-RSB-", ".", "The", "risk", "score", "used", "in", "this", "study", "is", "based", "on", "one", "developed", "for", "the", "Atherosclerosis", "Risk", "in", "Communities", "-LRB-", "ARIC", "-RRB-", "cohort", "study", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "Among", "individuals", "without", "diagnosed", "diabetes", "or", "FPG", ">", "7.0", "mmol/l", ",", "we", "used", "a", "scoring", "strategy", "which", "includes", ":", "high", "waist", "circumference", "-LRB-", ">", "102", "cm", "in", "men", ",", ">", "88", "cm", "for", "women", "-RRB-", ",", "raised", "blood", "pressure", "-LRB-", ">", "130/85", "mmHg", "or", "antihypertensive", "medications", "-RRB-", ",", "low", "HDL-cholesterol", "-LRB-", "<", "1.03", "mmol/l", "for", "men", ",", "<", "1.29", "mmol/l", "for", "women", "-RRB-", ",", "high", "triacylglycerol", "-LRB-", ">", "1.7", "mmol/l", "-RRB-", ",", "BMI", ">", "30", "kg/m2", ",", "and", "hyperglycaemia", ".", "Each", "of", "the", "characteristics", "is", "worth", "1", "point", "except", "for", "hyperglycaemia", ",", "which", "can", "be", "worth", "2", "points", "if", "FPG", "is", ">", "5.6", "mmol/l", "or", "5", "points", "when", "FPG", "is", ">", "6.1", "mmol/l", ".", "A", "score", "of", ">", "4", "puts", "an", "individual", "at", "high", "risk", "of", "developing", "diabetes", ",", "whether", "diagnosed", "or", "undiagnosed", ".", "A", "score", "of", "<", "4", "indicates", "that", "a", "person", "has", "a", "low", "risk", "of", "developing", "diabetes", ".", "This", "particular", "risk", "score", "was", "chosen", "for", "several", "reasons", ".", "First", ",", "it", "has", "moderate", "sensitivity", "-LRB-", "68", "%", "-RRB-", "and", "specificity", "-LRB-", "75", "%", "-RRB-", ".", "Second", ",", "it", "is", "computed", "in", "a", "reasonably", "straightforward", "manner", "without", "having", "to", "use", "coefficients", "from", "the", "ARIC", "cohort", "that", "may", "be", "specific", "to", "that", "cohort", ".", "Third", ",", "data", "and", "results", "provided", "in", "the", "study", "by", "Schmidt", "et", "al.", "-LSB-", "18", "-RSB-", "allowed", "for", "computation", "of", "the", "rate", "of", "development", "of", "diabetes", "in", "both", "the", "high-risk", "group", "and", "the", "low-risk", "group", ".", "The", "ratio", "of", "development", "of", "diabetes", "in", "the", "high-risk", "group", "versus", "the", "low-risk", "group", "was", "4.5:1", ".", "Variables", "needed", "to", "compute", "this", "diabetes", "risk", "score", "are", "available", "only", "in", "the", "NHANES", "III", "and", "the", "NHANES", "1999", "--", "2002", ".", "Although", "the", "ARIC", "diabetes", "risk", "score", "did", "not", "specifically", "consider", "race", "or", "age", "in", "the", "computation", "-LSB-", "18", "-RSB-", ",", "we", "computed", "conversion", "rates", "for", "10-year", "age", "classes", "for", "three", "race/ethnic", "groups", "-LRB-", "non-Hispanic", "Whites", ",", "non-Hispanic", "Blacks", "and", "Hispanic", "individuals", "-RRB-", "by", "fitting", "age", "categories", "for", "the", "data", "from", "1991", "to", "2001", "and", "then", "fitting", "race/ethnicity", "on", "to", "the", "same", "time", "change", ".", "We", "did", "not", "compute", "specific", "sex-specific", "conversion", "rates", "because", "sex", "was", "already", "differentiated", "in", "several", "of", "the", "variables", "in", "the", "ARIC", "diabetes", "risk", "score", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "Migration", "of", "persons", "with", "diabetes", "Migration", "of", "individuals", "with", "or", "without", "diabetes", "into", "the", "population", "can", "also", "affect", "future", "diabetes", "prevalence", ".", "Recent", "projections", "have", "included", "migration", "within", "their", "models", "-LSB-", "5", "-RSB-", ".", "Because", "we", "are", "looking", "at", "changes", "in", "diabetes", "prevalence", "among", "adults", ",", "migration", "of", "adults", ",", "particularly", "from", "ethnic", "minorities", ",", "could", "substantially", "affect", "the", "10-year", "projections", ".", "We", "used", "data", "from", "the", "NHANES", "III", "to", "estimate", "migration", "of", "persons", "with", "diabetes", "in", "the", "20", "years", "and", "older", "age", "groups", ".", "The", "NHANES", "III", "measured", "how", "many", "years", "foreign-born", "immigrants", "had", "been", "in", "the", "US", ".", "Thus", ",", "we", "estimated", "the", "number", "of", "foreign-born", "individuals", "who", "had", "been", "in", "the", "country", "for", "9", "years", "or", "less", "for", "the", "total", "population", "as", "well", "as", "for", "different", "racial/ethnic", "groups", ".", "The", "NHANES", "III", "data", "allowed", "us", "to", "make", "estimates", "for", "non-Hispanic", "Whites", ",", "non-Hispanic", "Blacks", "and", "Hispanic", "individuals", ".", "Persons", "with", "diabetes", "moving", "into", "the", "20", "to", "29-year-old", "age", "class", "For", "2011", ",", "2021", "and", "2031", "the", "total", "number", "of", "persons", "with", "diabetes", "in", "the", "20", "to", "29-year-old", "age", "class", "was", "estimated", "using", "a", "linear", "projection", "of", "the", "NHANES", "III", "and", "NHANES", "1999", "--", "2002", "data", ".", "The", "proportion", "of", "20", "to", "29-year-olds", "with", "diabetes", "in", "each", "race/ethnic", "group", "was", "held", "constant", "at", "the", "proportions", "found", "in", "the", "NHANES", "1999", "--", "2002", "data", "at", "the", "later", "time", "intervals", ".", "Mortality", "among", "individuals", "with", "diabetes", "Diabetes", "mortality", "for", "the", "total", "population", "was", "based", "on", "data", "from", "the", "NHANES", "II", "mortality", "survey", "-LRB-", "1976", "--", "1992", "-RRB-", ".", "This", "population-based", "cohort", "study", "was", "used", "to", "provide", "estimates", "of", "diabetes", "mortality", ",", "since", "mortality", "within", "the", "population", "affects", "future", "prevalence", "-LSB-", "20", "-RSB-", ".", "Diabetes", "mortality", "was", "estimated", "as", "all-cause", "mortality", "among", "individuals", "with", "diabetes", "-LRB-", "either", "diagnosed", "or", "undiagnosed", "-RRB-", "at", "baseline", ",", "rather", "than", "as", "mortality", "with", "diabetes", "listed", "as", "the", "cause", "of", "death", ".", "This", "definition", "is", "more", "consistent", "with", "the", "potential", "impact", "of", "diabetes", "on", "future", "prevalence", ".", "Mortality", "estimates", "were", "computed", "separately", "for", "the", "total", "population", "by", "age", "classes", ".", "The", "NHANES", "II", "mortality", "cohort", "is", "based", "on", "a", "sample", "of", "individuals", "aged", "30", "to", "75", ",", "whereas", "we", "made", "diabetes", "estimates", "on", "individuals", "aged", "20", "years", "and", "older", ".", "Consequently", ",", "we", "assumed", "no", "deaths", "due", "to", "diabetes", "in", "the", "20", "to", "29-year-old", "age", "group", "over", "the", "10-year", "period", ".", "Population", "estimates", "Total", "population", "of", "10-year", "age", "classes", "was", "estimated", "using", "data", "from", "NHANES", "III", "for", "1991", ",", "NHANES", "1999", "--", "2002", "for", "2001", ",", "and", "US", "Census", "Bureau", ",", "Middle", "Series", "projections", "for", "2011", ",", "2021", "and", "2031", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "Total", "population", "of", "race/ethnic", "groups", "was", "also", "determined", "by", "10-year", "age", "classes", "using", "the", "same", "sources", "of", "information", ".", "Analysis", "In", "an", "effort", "to", "provide", "an", "estimate", "of", "future", "trends", "in", "diabetes", "and", "the", "population", "at", "high", "risk", "of", "developing", "diabetes", ",", "we", "employed", "the", "following", "procedure", ".", "We", "used", "the", "NHANES", "III", "data", "to", "fit", "a", "model", "to", "predict", "total", "diabetes", "in", "the", "NHANES", "1999", "--", "2002", ".", "We", "used", "this", "strategy", "prior", "to", "making", "future", "projections", ",", "because", "it", "allowed", "us", "to", "develop", "and", "fit", "the", "model", "to", "an", "existing", "national", "estimate", "of", "diabetes", "prevalence", ".", "Because", "both", "the", "NHANES", "III", "and", "the", "NHANES", "1999", "--", "2002", "are", "based", "on", "multi-year", "data", "collection", ",", "we", "estimated", "a", "mid-point", "of", "1991", "and", "2001", "for", "the", "two", "surveys", ".", "The", "number", "of", "persons", "with", "diabetes", "10", "years", "post-baseline", "was", "calculated", "for", "10-year", "age", "classes", "by", "first", "adding", "baseline", "prevalence", "and", "incidence", "-LRB-", "the", "number", "of", "low-risk", "and", "number", "of", "high-risk", "persons", "who", "developed", "diabetes", "over", "the", "10-year", "interval", "-RRB-", ",", "then", "adding", "persons", "with", "diabetes", "who", "immigrated", "to", "the", "United", "States", ",", "and", "persons", "with", "diabetes", "who", "moved", "into", "the", "20", "to", "29-year-old", "age", "class", ",", "and", "finally", "subtracting", "the", "number", "of", "diabetic", "subjects", "who", "died", ".", "Percentage", "of", "persons", "with", "diabetes", "was", "estimated", "for", "each", "time", "period", "by", "taking", "the", "total", "number", "of", "persons", "with", "diabetes", "and", "dividing", "by", "the", "expected", "total", "population", ",", "then", "multiplying", "by", "100", ".", "Varying", "model", "assumptions", "Our", "initial", "predictions", "of", "future", "diabetes", "burden", "were", "based", "on", "the", "assumption", "of", "a", "constant", "proportion", "of", "individuals", "at", "high", "risk", "of", "diabetes", "at", "the", "levels", "present", "in", "the", "NHANES", "1999", "--", "2002", ".", "To", "account", "for", "potential", "changes", "in", "the", "proportion", "of", "persons", "at", "high", "risk", "of", "diabetes", ",", "we", "also", "evaluated", "increases", "in", "the", "proportion", "of", "persons", "at", "high", "risk", "by", "10", ",", "20", "and", "30", "%", ",", "as", "well", "as", "estimates", "based", "on", "decreases", "in", "the", "proportion", "of", "persons", "at", "high", "risk", "by", "10", ",", "20", "and", "30", "%", ".", "Theoretically", ",", "it", "is", "unlikely", "that", "the", "proportion", "of", "persons", "at", "high", "risk", "will", "remain", "stable", ",", "because", "from", "NHANES", "III", "to", "NHANES", "1999", "--", "2002", "the", "proportion", "at", "high", "risk", "was", "seen", "to", "increase", ".", "Also", ",", "a", "major", "risk", "factor", "for", "diabetes", ",", "obesity", ",", "has", "increased", "substantially", "over", "a", "40-year", "time", "period", "-LSB-", "10", ",", "12", "-RSB-", ".", "We", "evaluated", "the", "effect", "of", "decreasing", "proportions", "at", "high", "risk", ",", "to", "account", "for", "the", "possibility", "that", "interventions", "to", "improve", "lifestyle", "of", "adults", "in", "the", "US", "may", "be", "effective", ".", "In", "addition", ",", "to", "address", "the", "potential", "impact", "on", "mortality", "of", "healthcare", "interventions", "in", "management", "of", "diabetes", ",", "we", "examined", "potential", "reductions", "of", "10", ",", "20", "and", "30", "%", "in", "mortality", "among", "individuals", "with", "diabetes", ".", "Finally", ",", "we", "computed", "a", "model", "examining", "a", "combination", "of", "effects", ",", "assuming", "that", "lifestyle", "interventions", "would", "yield", "a", "10", "%", "decrease", "of", "persons", "at", "high", "risk", "and", "healthcare", "interventions", "would", "yield", "a", "10", "%", "decrease", "in", "mortality", "of", "persons", "with", "diabetes", ".", "Results", "Table", "1", "shows", "estimates", "of", "the", "total", "diabetes", "burden", "from", "the", "NHANES", "III", "and", "the", "NHANES", "1999", "--", "2002", "and", "the", "future", "10-year", "projections", "for", "2011", "through", "to", "2031", ".", "The", "number", "of", "individuals", "at", "high", "risk", "of", "diabetes", "based", "on", "the", "multivariable", "diabetes", "risk", "score", "was", "38.4", "million", "in", "1991", "and", "49.9", "million", "in", "2001", ".", "Using", "our", "model", "to", "predict", "the", "known", "diabetes", "prevalence", "in", "2001", "from", "the", "1991", "data", ",", "results", "were", "satisfactory", "and", "within", "0.2", "%", "of", "the", "actual", "population", "prevalence", "of", "total", "diabetes", ".", "If", "the", "proportion", "of", "individuals", "at", "high", "risk", "within", "the", "adult", "population", "remains", "stable", "at", "2001", "levels", ",", "we", "could", "expect", "55.8", "million", "in", "2011", ",", "60.9", "million", "in", "2021", ",", "and", "66.1", "million", "in", "2031", ".", "As", "can", "be", "seen", ",", "the", "prevalence", "of", "diabetes", "is", "projected", "to", "increase", ".", "The", "diabetes", "prevalence", "of", "6.3", "%", "in", "1991", "and", "8.8", "%", "in", "2001", "is", "projected", "to", "increase", "to", "14.5", "%", "in", "2031", "with", "37.7", "million", "adults", "having", "diagnosed", "or", "undiagnosed", "diabetes", ".", "Assuming", "stability", "in", "the", "population", "proportion", "of", "individuals", "at", "high", "risk", "of", "developing", "diabetes", ",", "the", "rate", "of", "increase", "in", "the", "number", "of", "individuals", "with", "diabetes", "and", "the", "proportion", "with", "diabetes", "tends", "to", "slow", "over", "time", ".", "Among", "individuals", "aged", "30", "to", "39", "years", "who", "are", "not", "currently", "targeted", "for", "screening", "according", "to", "age", ",", "the", "prevalence", "of", "diabetes", "is", "expected", "to", "rise", "from", "3.7", "%", "in", "2001", "to", "5.2", "%", "in", "2031", ".", "Table", "1Number", "of", "people", "-LRB-", "in", "millions", "of", "persons", "-RRB-", "with", "and", "prevalence", "of", "diabetes", "by", "year", "and", "age", "categoryAge", "-LRB-", "in", "years", "-RRB-", "NHANES", "IIINHANES", "1999", "--", "200220112021203120", "--", "29Number0", ".20.40.50.70.9", "Percentage0", ".51.01.31.72.030", "--", "39Number0", ".61.61.82.12.3", "Percentage1", ".43.74.75.05.240", "--", "49Number1", ".53.54.34.34.9", "Percentage4", ".58.110.311.111.250", "--", "59Number2", ".53.96.67.26.9", "Percentage11", ".412.215.617.718.260", "--", "69Number3", ".14.16.59.810.2", "Percentage15", ".319.822.025.126.6", ">", "70Number3", ".24.15.78.412.4", "Percentage16", ".217.420.522.623.9", "TotalNumber11", ".117.525.432.637.7", "Percentage6", ".38.811.513.514.5", "NHANES", "National", "Health", "and", "Nutrition", "Examination", "Survey", "The", "results", "shown", "in", "Electronic", "supplementary", "material", "-LRB-", "ESM", "-RRB-", "Table", "1", "show", "the", "projected", "prevalence", "of", "diabetes", "according", "to", "different", "racial/ethnic", "groups", ".", "Non-Hispanic", "White", "adults", "are", "projected", "to", "continue", "to", "have", "a", "lower", "prevalence", "of", "diabetes", "than", "both", "non-Hispanic", "Black", "and", "Hispanic", "individuals", ".", "By", "2031", ",", "the", "Hispanic", "community", "will", "have", "an", "overwhelming", "diabetes", "burden", ",", "with", "more", "than", "20", "percent", "of", "the", "adult", "population", "having", "diabetes", ".", "The", "projections", "in", "ESM", "Table", "2", "are", "based", "on", "different", "assumptions", "regarding", "changes", "in", "the", "number", "of", "individuals", "who", "are", "at", "high", "risk", "of", "developing", "diabetes", "and", "changes", "in", "mortality", "among", "individuals", "with", "diabetes", ".", "As", "might", "be", "expected", ",", "as", "mortality", "decreases", "the", "prevalence", "of", "diabetes", "increases", "in", "the", "subsequent", "10", "years", ".", "The", "estimate", "for", "2031", "indicates", "that", "potential", "decreases", "in", "mortality", "and", "a", "potential", "decrease", "in", "individuals", "at", "high", "risk", "of", "developing", "diabetes", "yields", "a", "prevalence", "similar", "to", "that", "achieved", "if", "the", "proportion", "at", "high", "risk", "is", "kept", "stable", "from", "2001", ".", "All", "of", "these", "estimates", "indicate", "a", "larger", "diabetes", "burden", "among", "Hispanics", ".", "Discussion", "This", "national", "projection", "of", "diabetes", "prevalence", "for", "the", "US", "is", "the", "first", "to", "model", "the", "projection", "on", "the", "number", "of", "individuals", "at", "high", "risk", "of", "developing", "diabetes", "using", "a", "multivariable", "risk", "assessment", ".", "Projections", "suggest", "a", "rising", "and", "substantial", "diabetes", "burden", "for", "the", "population", ".", "Hispanic", "adults", "will", "be", "most", "affected", ",", "with", "estimates", "suggesting", "that", "by", "2031", "more", "than", "20", "%", "of", "the", "adult", "Hispanic", "community", "will", "have", "diabetes", ".", "These", "results", "are", "particularly", "worrisome", "for", "this", "community", "in", "light", "of", "recent", "evidence", "that", "the", "gap", "in", "healthcare", "quality", "between", "Hispanic", "and", "non-Hispanic", "White", "individuals", "has", "continued", "to", "widen", "-LSB-", "23", "-RSB-", ".", "Many", "previous", "diabetes", "projections", "have", "been", "limited", "to", "estimates", "of", "diagnosed", "diabetes", "and", "thus", "have", "lower", "estimates", "of", "projected", "diabetes", "burden", ",", "and", "have", "not", "incorporated", "an", "evaluation", "of", "the", "population", "at", "high", "risk", "of", "diabetes", ",", "with", "clinical", "indicators", ",", "into", "their", "models", "-LSB-", "5", ",", "9", "-RSB-", ".", "Our", "estimates", "will", "be", "less", "likely", "to", "be", "affected", "by", "changes", "in", "screening", "strategies", ".", "Additionally", ",", "they", "incorporate", "potential", "changes", "in", "the", "level", "of", "risk", "for", "diabetes", "in", "the", "US", "population", ",", "a", "change", "which", "is", "likely", "given", "national", "trends", "in", "obesity", "-LSB-", "3", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "recent", "data", "have", "suggested", "that", "individuals", "with", "undiagnosed", "diabetes", "are", "similar", "to", "those", "with", "diagnosed", "diabetes", "with", "regard", "to", "the", "development", "of", "complications", ";", "thus", "our", "estimates", "are", "more", "robust", "in", "describing", "the", "burden", "of", "disease", "in", "the", "population", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "Comparing", "our", "projections", "with", "those", "from", "other", "studies", ",", "we", "note", "that", "an", "estimate", ",", "published", "in", "2006", ",", "for", "diagnosed", "diabetes", "in", "the", "US", "among", "individuals", "aged", "20", "to", "64", "years", "in", "2030", "is", "16.8", "million", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "Our", "estimates", "are", "based", "both", "on", "diagnosed", "and", "undiagnosed", "diabetes", ",", "and", "our", "projection", "of", "total", "diabetes", "among", "that", "age", "group", "for", "2031", "is", "higher", ",", "namely", "19", "million", ".", "It", "is", "possible", "that", "estimates", "based", "solely", "on", "diagnosed", "diabetes", "could", "become", "more", "consistent", "with", "our", "estimates", ",", "if", "greater", "vigilance", "were", "shown", "for", "screening", "for", "undiagnosed", "diabetes", ".", "However", ",", "not", "accounting", "for", "the", "at-risk", "population", "in", "the", "estimates", "is", "likely", "to", "lead", "to", "inaccurate", "estimates", ".", "A", "comparison", "of", "our", "estimates", "of", "total", "diabetes", "with", "those", "of", "another", "study", "-LSB-", "7", "-RSB-", ",", "which", "projected", "total", "diabetes", "but", "did", "not", "account", "for", "the", "population", "at", "high", "risk", "of", "developing", "diabetes", ",", "reveals", "that", "the", "latter", "'s", "projections", "are", "most", "probably", "underestimates", ".", "Using", "data", "from", "1993", ",", "the", "investigators", "projected", "a", "population", "prevalence", "estimate", "of", "total", "diabetes", "in", "the", "US", "among", "individuals", "aged", "20", "years", "and", "older", "for", "the", "year", "2000", "to", "be", "7.6", "%", ",", "while", "the", "NHANES", "1999", "--", "2002", "yielded", "a", "prevalence", "of", "8.8", "%", ".", "For", "2025", "the", "same", "team", "-LSB-", "7", "-RSB-", "projected", "a", "prevalence", "of", "8.9", "%", "versus", "13.5", "%", "for", "2021", "in", "our", "study", ".", "The", "results", "have", "several", "implications", "for", "the", "delivery", "of", "healthcare", "and", "healthcare", "financing", ".", "First", ",", "we", "estimated", "our", "models", "under", "several", "assumptions", "for", "the", "number", "of", "individuals", "at", "high", "risk", "of", "diabetes", "in", "the", "population", ".", "Regardless", "of", "these", "assumptions", ",", "the", "US", "will", "have", "a", "substantial", "number", "of", "individuals", "at", "high", "risk", "of", "diabetes", "in", "2011", ",", "2021", "and", "2031", ".", "Interventions", "to", "modify", "lifestyle", "are", "critical", "to", "decrease", "the", "number", "of", "individuals", "at", "high", "risk", ",", "and", "consequently", "to", "lower", "the", "expected", "increase", "in", "diabetes", "in", "the", "future", ".", "Although", "some", "of", "the", "diabetes", "estimates", "suggest", "seemingly", "small", "decreases", "in", "future", "prevalence", ",", "based", "on", "decreases", "in", "the", "population", "at", "risk", ",", "the", "actual", "numbers", "are", "substantial", ".", "For", "example", ",", "a", "one-percentage", "point", "drop", "in", "the", "US", "population", "estimate", "of", "diabetes", "among", "individuals", "aged", "20", "and", "older", "in", "2031", "is", "quite", "substantial", "and", "would", "account", "for", "a", "decrease", "in", "prevalence", "of", "diabetes", "equivalent", "to", "2,600,000", "people", ".", "Second", ",", "the", "projection", "that", "a", "substantial", "proportion", "of", "the", "population", "will", "have", "diabetes", "indicates", "greater", "spending", "will", "be", "necessary", "to", "manage", "the", "disease", ".", "This", "will", "include", "spending", "on", "drugs", ",", "ongoing", "monitoring", ",", "and", "treating", "of", "complications", "including", "nephropathy", ",", "retinopathy", ",", "and", "cardiovascular", "disease", ".", "Third", ",", "the", "disproportionate", "impact", "of", "diabetes", "on", "minorities", ",", "particularly", "Hispanics", ",", "demands", "new", "intervention", "strategies", "to", "decrease", "the", "number", "of", "individuals", "at", "high", "risk", "and", "to", "deliver", "care", "to", "individuals", "who", "have", "historically", "had", "poor", "access", "to", "care", ".", "Additionally", ",", "with", "the", "projected", "increase", "in", "diabetes", "prevalence", "among", "30", "to", "39-year-olds", ",", "a", "population", "not", "currently", "targeted", "for", "screening", ",", "a", "re-examination", "of", "current", "public", "health", "policy", "and", "screening", "strategies", "may", "be", "warranted", "-LSB-", "26", "-RSB-", ".", "There", "are", "several", "strengths", "to", "the", "design", "of", "this", "study", ".", "One", "is", "that", "the", "study", "utilised", "multiple", "NHANES", "data", "sets", ",", "which", "have", "the", "advantage", "of", "allowing", "for", "nationally", "representative", "population", "estimates", ".", "Thus", ",", "the", "initial", "data", "used", "to", "fit", "the", "model", "as", "well", "as", "to", "make", "mortality", "estimates", "of", "diabetes", ",", "both", "diagnosed", "and", "undiagnosed", ",", "are", "nationally", "representative", ".", "Another", "strength", "is", "that", "this", "study", "is", "the", "first", "to", "make", "a", "nationally", "representative", "assessment", "of", "the", "at-risk", "population", "for", "development", "of", "diabetes", "and", "then", "use", "that", "assessment", "to", "model", "the", "future", "prevalence", "of", "diabetes", ".", "The", "assessment", "of", "risk", "used", ",", "moreover", ",", "is", "based", "on", "the", "ARIC", "diabetes", "risk", "score", "-LSB-", "18", "-RSB-", ",", "a", "multivariable", "risk", "score", "that", "used", "clinical", "indicators", ".", "When", "interpreting", "our", "results", ",", "however", ",", "several", "limitations", "need", "to", "be", "considered", ".", "Thus", ",", "although", "this", "is", "the", "first", "study", "to", "use", "a", "validated", "diabetes", "risk", "score", "to", "assess", "the", "high-risk", "population", "for", "the", "development", "of", "diabetes", "for", "the", "entire", "US", "population", ",", "potential", "limitations", "exist", "with", "regard", "to", "the", "diabetes", "risk", "score", ".", "The", "ARIC", "diabetes", "risk", "score", "-LSB-", "18", "-RSB-", "was", "based", "on", "a", "cohort", "of", "individuals", "aged", "45", "to", "64", "years", "at", "baseline", "and", "may", "therefore", "be", "limited", "when", "estimating", "diabetes", "development", "among", "individuals", "aged", "20", "years", "and", "older", ".", "However", ",", "we", "estimated", "diabetes", "prevalence", "in", "10-year", "age", "increments", ".", "Moreover", ",", "the", "risk", "score", "'s", "moderate", "sensitivity", "and", "specificity", "may", "cause", "the", "model", "to", "under", "-", "or", "potentially", "overestimate", "future", "prevalence", "projections", ".", "Another", "possible", "limitation", "is", "that", "estimates", "of", "future", "disease", "burden", "are", "based", "on", "assumptions", "about", "the", "number", "at", "risk", "of", "disease", "and", "about", "mortality", "within", "the", "population", ".", "We", "have", "attempted", "to", "address", "this", "limitation", "by", "presenting", "the", "results", "of", "a", "sensitivity", "analysis", ",", "which", "includes", "variations", "in", "the", "proportion", "of", "the", "population", "at", "risk", "and", "in", "mortality", ".", "The", "third", "limitation", "is", "the", "diagnosis", "of", "diabetes", "in", "the", "NHANES", "data", "on", "the", "basis", "of", "a", "single", "FPG", "value", ".", "This", "strategy", ",", "although", "common", "in", "epidemiological", "studies", ",", "could", "potentially", "underestimate", "the", "prevalence", "of", "diabetes", "associated", "with", "isolated", "post-challenge", "hyperglycaemia", ",", "which", "occurs", "more", "commonly", "in", "women", ",", "the", "elderly", ",", "and", "in", "lean", "populations", ".", "It", "could", "also", "overestimate", "diabetes", "prevalence", ",", "because", "a", "clinical", "diagnosis", "of", "diabetes", "in", "asymptomatic", "patients", "requires", "two", "abnormal", "fasting", "glucose", "levels", ".", "In", "summary", ",", "a", "continued", "focus", "on", "effective", "interventions", "for", "lifestyle", "modifications", "to", "decrease", "diabetes", "risk", ",", "as", "well", "as", "vigilant", "ascertainment", "of", "diabetes", ",", "appears", "crucial", "if", "the", "future", "prevalence", "and", "burden", "of", "diabetes", "in", "the", "US", "population", "are", "to", "be", "adequately", "addressed", ".", "This", "is", "especially", "important", "for", "minority", "populations", ",", "particularly", "the", "Hispanic", "community", ",", "which", "is", "projected", "to", "have", "an", "overwhelming", "future", "diabetes", "burden", ".", "Considering", "that", "minorities", "have", "historically", "had", "limited", "access", "to", "healthcare", ",", "these", "findings", "emphasise", "the", "importance", "of", "interventions", "targeting", "these", "populations", ".", "Electronic", "supplementary", "material", "Below", "is", "the", "link", "to", "the", "electronic", "supplementary", "material", ".", "Table", "1", "Projections", "of", "non-Hispanic", "White", ",", "non-Hispanic", "Black", "and", "Hispanic", "persons", "with", "diabetesa", "and", "prevalence", "in", "2011", ",", "2021", ",", "and", "2031", "-LRB-", "43", "kb", "-RRB-", "Table", "2", "Projections", ",", "using", "different", "assumptions", ",", "of", "diabetes", "prevalence", "among", "individuals", "aged", ">", "20", "years", "in", "2031", "-LRB-", "32", "kb", "-RRB-" ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "The", "-1997", "G/T", "and", "Sp1", "Polymorphisms", "in", "the", "Collagen", "Type", "I", "alpha1", "-LRB-", "COLIA1", "-RRB-", "Gene", "in", "Relation", "to", "Changes", "in", "Femoral", "Neck", "Bone", "Mineral", "Density", "and", "the", "Risk", "of", "Fracture", "in", "the", "Elderly", ":", "The", "Rotterdam", "Study", "The", "COLIA1", "Sp1", "polymorphism", "has", "been", "associated", "with", "bone", "mineral", "density", "-LRB-", "BMD", "-RRB-", "and", "fracture", ".", "A", "promoter", "polymorphism", ",", "-1997", "G/T", ",", "also", "has", "been", "associated", "with", "BMD", ".", "In", "this", "study", ",", "we", "examined", "whether", "these", "polymorphisms", "alone", "and", "in", "the", "form", "of", "haplotypes", "influence", "bone", "parameters", "and", "fracture", "risk", "in", "a", "large", "population-based", "cohort", "of", "elderly", "Caucasians", ".", "We", "determined", "the", "COLIA1", "-1997", "G/T", "-LRB-", "promoter", "-RRB-", "and", "Sp1", "G/T", "-LRB-", "intron", "-RRB-", "polymorphisms", "in", "6,280", "individuals", "and", "inferred", "haplotypes", ".", "Femoral", "neck", "BMD", "and", "BMD", "change", "were", "compared", "across", "COLIA1", "genotypes", "at", "baseline", "and", "follow-up", "-LRB-", "mean", "6.5", "years", "-RRB-", ".", "We", "also", "investigated", "the", "relationship", "between", "the", "COLIA1", "polymorphisms", "and", "incident", "nonvertebral", "fractures", ",", "which", "were", "recorded", "during", "a", "mean", "follow-up", "period", "of", "7.4", "years", ".", "Vertebral", "fractures", "were", "assessed", "by", "radiographs", "on", "3,456", "genotyped", "individuals", ".", "Femoral", "neck", "BMD", "measured", "at", "baseline", "was", "3.8", "%", "lower", "in", "women", "carrying", "two", "copies", "of", "the", "T-Sp1", "allele", "-LRB-", "P", "for", "trend", "=", "0.03", "-RRB-", ".", "No", "genotype", "dependent", "differences", "in", "BMD", "loss", "were", "observed", ".", "In", "women", "homozygous", "for", "the", "T", "allele", "of", "the", "Sp1", "polymorphism", ",", "the", "risk", "of", "fragility", "fracture", "increased", "2.3", "times", "-LRB-", "95", "%", "confidence", "interval", "1.4", "--", "3.9", ",", "P", "=", "0.001", "-RRB-", ".", "No", "such", "association", "was", "observed", "with", "the", "promoter", "polymorphism", ".", "In", "men", ",", "no", "association", "with", "either", "the", "Sp1", "or", "the", "-1997", "G/T", "promoter", "polymorphism", "was", "seen", "with", "BMD", "or", "fracture", ".", "High", "linkage", "disequilibrium", "-LRB-", "LD", ";", "D", "′", "=", "0.99", ",", "r2", "=", "0.03", "-RRB-", "exists", "between", "the", "two", "studied", "polymorphisms", ".", "We", "observed", "three", "haplotypes", "in", "our", "population", ":", "haplotype", "1", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "Gintron", "-RRB-", "frequency", "-LRB-", "f", "-RRB-", "=", "69", "%", ",", "haplotype", "2", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "Tintron", "-RRB-", "f", "=", "17.6", "%", ",", "and", "haplotype", "3", "-LRB-", "Tpromoter", "--", "Gintron", "-RRB-", "f", "=", "13.4", "%", ".", "Haplotype", "2", "was", "associated", "with", "a", "2.1-fold", "increased", "risk", "of", "fragility", "fracture", "in", "women", "-LRB-", "95", "%", "confidence", "interval", "1.2", "--", "3.7", ",", "P", "=", "0.001", "-RRB-", ".", "We", "confirm", "that", "the", "COLIA1", "Sp1", "polymorphism", "influences", "BMD", "and", "the", "risk", "of", "fracture", "in", "postmenopausal", "Caucasian", "women", ".", "In", "contrast", ",", "we", "found", "no", "independent", "effect", "of", "the", "-1997", "G/T", "promoter", "polymorphism", "on", "BMD", "or", "fracture", ".", "Introduction", "Osteoporosis", "is", "a", "multifactorial", "disease", "with", "both", "genetic", "and", "environmental", "determinants", ".", "It", "is", "characterized", "by", "a", "reduction", "in", "bone", "mineral", "density", "-LRB-", "BMD", "-RRB-", "and", "microarchitectural", "deterioration", "of", "bone", "tissue", ",", "which", "leads", "to", "an", "increased", "risk", "of", "fracture", "in", "later", "life", "-LSB-", "1", ",", "2", "-RSB-", ".", "Being", "a", "predictor", "of", "bone", "fragility", "and", "susceptibility", "to", "fracture", ",", "BMD", "is", "used", "for", "the", "diagnosis", "of", "osteoporosis", "-LSB-", "3", ",", "4", "-RSB-", ".", "The", "risk", "of", "fracture", "is", "dependent", "not", "only", "on", "BMD", "but", "also", "on", "geometry", ",", "architecture", ",", "material", "properties", ",", "and", "mass", "distribution", "-LSB-", "5", "-RSB-", ".", "The", "skeletal", "determinants", "of", "osteoporotic", "fracture", "risk", "such", "as", "BMD", ",", "bone", "loss", ",", "and", "bone", "geometry", "are", "all", "subject", "to", "strong", "genetic", "influences", "-LSB-", "2", ",", "6", ",", "7", "-RSB-", ".", "It", "has", "been", "estimated", "from", "twin", "studies", "that", "60-80", "%", "of", "the", "variance", "in", "BMD", "is", "attributable", "to", "genetic", "factors", "-LSB-", "8", ",", "9", "-RSB-", ".", "Several", "genes", "are", "thought", "to", "be", "involved", "in", "the", "pathogenesis", "of", "osteoporosis", ".", "Collagen", "type", "I", "alpha", "1", "-LRB-", "COLIA1", "-RRB-", "is", "one", "of", "the", "most", "prominent", "candidate", "genes", ",", "which", "has", "been", "consistently", "associated", "with", "osteoporosis", "in", "different", "populations", "-LSB-", "10", "--", "12", "-RSB-", ".", "COLIA1", "encodes", "the", "alpha", "1", "chain", "of", "collagen", "type", "I", ",", "which", "is", "the", "most", "abundant", "structural", "protein", "in", "the", "bone", "matrix", ";", "rare", "mutations", "in", "this", "gene", "cause", "osteogenesis", "imperfecta", ",", "a", "mendelian", "disorder", "presenting", "with", "moderate", "to", "severe", "bone", "fragility", "-LSB-", "13", ",", "14", "-RSB-", ".", "Previously", ",", "Grant", "et", "al.", "-LSB-", "15", "-RSB-", "identified", "a", "relatively", "common", "guanine", "to", "thymidine", "-LRB-", "G", "→", "T", "-RRB-", "polymorphism", "in", "the", "first", "intron", "of", "COLIA1", ".", "This", "polymorphism", "affects", "one", "of", "the", "binding", "sites", "of", "the", "transcription", "factor", "Sp1", "and", "results", "in", "increased", "expression", "of", "collagen", "type", "I", "alpha", "1", "in", "bone", "matrix", "in", "T", "carriers", "-LSB-", "11", "-RSB-", ".", "We", "and", "others", "have", "shown", "that", "the", "T", "allele", "is", "associated", "with", "osteoporosis", ",", "lower", "BMD", "-LSB-", "10", ",", "15", "-RSB-", ",", "and", "increased", "fracture", "risk", "-LSB-", "10", ",", "12", ",", "16", ",", "17", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "in", "a", "very", "large", "prospective", "meta-analysis", "of", "individual", "data", ",", "we", "observed", "that", "the", "Sp1", "polymorphism", "in", "the", "COLIA1", "gene", "is", "associated", "with", "reduced", "BMD", "and", "incident", "vertebral", "fractures", "independent", "of", "BMD", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "In", "addition", "to", "the", "Sp1", "polymorphism", ",", "Garcia-Giralt", "et", "al.", "-LSB-", "19", "-RSB-", "described", "two", "polymorphisms", "within", "the", "COLIA1", "promoter", "region", ":", "-1997", "G/T", "and", "-1663", "indelT", ".", "The", "study", "showed", "in", "a", "small", "cohort", "of", "postmenopausal", "Spanish", "women", "that", "the", "T", "allele", "of", "the", "-1997", "G/T", "polymorphism", "was", "significantly", "associated", "with", "a", "7.5", "%", "decreased", "lumbar", "spine", "BMD", "and", "a", "12", "%", "decreased", "femoral", "neck", "BMD", ".", "Furthermore", ",", "they", "analyzed", "compound", "genotypes", "including", "three", "polymorphic", "sites", ".", "However", ",", "this", "small", "study", "of", "the", "promoter", "polymorphisms", "in", "women", "investigated", "the", "relation", "in", "form", "of", "compound", "genotypes", ",", "was", "not", "extended", "to", "haplotypes", "of", "promoter", "and", "Sp1", "polymorphisms", ",", "and", "most", "importantly", ",", "did", "not", "analyze", "fractures", ",", "the", "clinically", "most", "relevant", "end", "point", "of", "osteoporosis", ".", "Therefore", ",", "we", "investigated", "the", "influence", "of", "both", "COLIA1", "polymorphisms", "independently", "and", "in", "the", "form", "of", "haplotypes", "in", "relation", "to", "baseline", "femoral", "neck", "BMD", ",", "change", "in", "BMD", "with", "follow-up", ",", "and", "risk", "of", "vertebral", "and", "nonvertebral", "fractures", "in", "a", "large", "population-based", "cohort", "of", "elderly", "Caucasian", "men", "and", "women", ".", "Materials", "and", "Methods", "Study", "Population", "This", "study", "was", "embedded", "in", "the", "Rotterdam", "Study", ",", "a", "population", "--", "based", "cohort", "study", "in", "which", "all", "residents", "of", "the", "Rotterdam", "suburb", "Ommoord", "aged", "55", "years", "and", "older", "were", "invited", "to", "take", "part", ".", "The", "design", "of", "the", "study", "has", "been", "described", "elsewhere", "-LSB-", "20", "-RSB-", ".", "Written", "informed", "consent", "was", "obtained", "from", "all", "participants", ",", "and", "the", "Medical", "Ethics", "Committee", "of", "the", "Erasmus", "Medical", "Center", "approved", "the", "study", ".", "Baseline", "data", "collection", "was", "conducted", "in", "January", "1990", "and", "June", "1993", ",", "while", "two", "follow-up", "assessments", "were", "performed", "between", "July", "1993", "and", "January", "1996", "and", "from", "July", "1996", "until", "December", "1999", ".", "A", "total", "of", "7,983", "subjects", "participated", "in", "the", "study", "-LRB-", "response", "rate", "78", "%", "-RRB-", ",", "and", "for", "the", "present", "study", ",", "we", "examined", "6,280", "individuals", "who", "were", "genotyped", ".", "Study", "Design", "This", "study", "was", "performed", "in", "three", "steps", ".", "In", "the", "first", "step", ",", "we", "performed", "a", "cross-sectional", "analysis", "where", "we", "examined", "the", "relation", "between", "the", "genotype", "and", "baseline", "BMD", "-LRB-", "n", "=", "5,737", "-RRB-", ".", "In", "the", "second", "step", ",", "we", "performed", "a", "longitudinal", "analysis", "to", "study", "change", "in", "BMD", "between", "baseline", "and", "the", "second", "follow-up", "-LRB-", "mean", "6.5", "±", "standard", "deviation", "-LSB-", "SD", "-RSB-", "0.6", "years", ",", "n", "=", "2,670", "-RRB-", ".", "In", "the", "third", "step", ",", "we", "looked", "at", "the", "relation", "between", "COLIA1", "polymorphisms", "and", "the", "risk", "of", "incident", "fracture", ".", "We", "studied", "incidence", "of", "nonvertebral", "fracture", "-LRB-", "mean", "follow-up", "7.4", "±", "3.3", "years", ",", "n", "=", "6,280", "-RRB-", "and", "vertebral", "fractures", "assessed", "by", "radiographs", "both", "at", "baseline", "-LRB-", "1990", "--", "1993", "-RRB-", "and", "at", "follow-up", "visit", "'", "between", "1997", "and", "1999", ",", "thoracolumbar", "radiographs", "of", "the", "spine", "were", "available", "for", "3,469", "individuals", "in", "a", "mean", "follow-up", "of", "6.4", "years", ".", "Measurements", "BMD", "-LRB-", "g/cm2", "-RRB-", "of", "the", "hip", "and", "L2-L4", "of", "the", "lumbar", "spine", "were", "measured", "by", "dual-energy", "X-ray", "absorptiometry", "-LRB-", "DXA", "-RRB-", "using", "a", "Lunar", "DPX", "densitometry", "-LRB-", "DPX-L", "-RRB-", "-LRB-", "Lunar", "Radiation", ",", "Madison", ",", "WI", "-RRB-", "and", "reanalyzed", "with", "DPX-IQ", "software", ",", "under", "standard", "protocols", ".", "Methods", ",", "quality", "assurance", ",", "accuracy", ",", "and", "precision", "issues", "of", "the", "DXA", "measurements", "have", "been", "described", "previously", "-LSB-", "21", "-RSB-", ".", "The", "relative", "change", "of", "BMD", "from", "baseline", "was", "estimated", "as", "the", "difference", "in", "BMD", "between", "assessment", "periods", "divided", "by", "the", "BMD", "at", "baseline", ".", "Height", "-LRB-", "cm", "-RRB-", "and", "weight", "-LRB-", "kg", "-RRB-", "were", "measured", "with", "a", "stadiometer", "at", "the", "initial", "examination", ",", "in", "standing", "position", "wearing", "indoor", "clothes", "without", "shoes", ".", "Body", "mass", "index", "-LRB-", "BMI", "-RRB-", "was", "computed", "as", "weight", "divided", "by", "height", "-LRB-", "kg/cm2", "-RRB-", ".", "Fracture", "Follow-up", "Information", "on", "incident", "nonvertebral", "fractures", "was", "collected", "from", "baseline", "-LRB-", "1990", "--", "1993", "-RRB-", "until", "January", "1", ",", "2002", "-LRB-", "mean", "follow-up", "±", "SD", "7.4", "±", "3.3", "years", ",", "n", "=", "6,280", "-RRB-", ".", "Nonvertebral", "fracture", "events", "were", "retrieved", "from", "computerized", "records", "of", "the", "general", "practitioners", "-LRB-", "GPs", "-RRB-", "in", "the", "research", "area", ".", "Research", "physicians", "regularly", "followed", "participant", "information", "in", "GP", "records", "outside", "the", "research", "area", "and", "made", "an", "independent", "review", ",", "encoding", "all", "reported", "events", ".", "Subsequently", ",", "a", "medical", "expert", "in", "the", "field", "reviewed", "all", "coded", "events", "for", "final", "classification", ".", "We", "excluded", "fractures", "that", "were", "considered", "nonosteoporotic", ",", "i.e.", ",", "caused", "by", "cancer", "and", "high", "trauma", ",", "including", "fractures", "of", "the", "hand", ",", "foot", ",", "skull", ",", "and", "face", ".", "Subsequently", ",", "we", "analyzed", "separately", "``", "fragility", "''", "fractures", ",", "which", "were", "defined", "as", "any", "fracture", "of", "the", "hip", ",", "pelvis", ",", "or", "proximal", "humerus", "that", "had", "occurred", "with", "minimal", "trauma", "at", "older", "age", "-LRB-", "mean", ">", "75", "years", "-RRB-", ".", "Vertebral", "Fracture", "Assessment", "Both", "at", "baseline", "and", "at", "first", "follow-up", ",", "between", "1997", "and", "1999", ",", "thoracolumbar", "radiographs", "of", "the", "spine", "were", "obtained", ".", "The", "follow-up", "radiographs", "were", "available", "for", "3,456", "individuals", ",", "who", "survived", "an", "average", "of", "6.4", "-LRB-", "SD", "=", "0.4", "-RRB-", "years", "after", "the", "baseline", "visit", "and", "who", "were", "still", "able", "to", "come", "to", "our", "research", "center", ".", "All", "follow-up", "radiographs", "were", "scored", "for", "the", "presence", "of", "vertebral", "fracture", "by", "the", "McCloskey/Kanis", "method", ",", "as", "described", "previously", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "Genotyping", "Genomic", "DNA", "was", "extracted", "from", "samples", "of", "peripheral", "venous", "blood", "according", "to", "standard", "procedures", ".", "Genomic", "DNA", "-LRB-", "1", "--", "2", "ng", "-RRB-", "was", "dispensed", "into", "384-well", "plates", "using", "a", "Sciclone", "ALH3000", "pipetting", "robot", "-LRB-", "Caliper", ",", "Mountain", "View", ",", "CA", "-RRB-", ".", "Genotypes", "were", "determined", "using", "the", "Taqman", "allelic", "discrimination", "assay", ".", "The", "Assay-by-Design", "service", "-LRB-", "http://www.appliedbio-systems.com", "-RRB-", "was", "used", "to", "set", "up", "a", "Taqman", "allelic", "discrimination", "assay", "for", "the", "COL1PR-1997", "polymorphism", "-LRB-", "primers", ":", "Fw", ",", "GCCTCCGGAGGGTGTCA", ",", "Rv", ",", "AAGGAGAGCAATTCTTACAGGTGTCT", ";", "probes", ":", "FAM-CCTGAGGGATGGAA-MGB", ",", "VIC-CCTGAAGGATGGAAG-MGB", ".", "The", "polymerase", "chain", "reaction", "-LRB-", "PCR", "-RRB-", "mixture", "included", "1", "--", "2", "ng", "of", "genomic", "DNA", "in", "a", "2", "μL", "volume", "and", "the", "following", "reagents", ":", "FAM", "and", "VIC", "probes", "-LRB-", "200", "nM", "-RRB-", ",", "primers", "-LRB-", "0.9", "μM", "-RRB-", ",", "and", "2", "×", "Taqman", "PCR", "master", "mix", "-LRB-", "ABgene", ",", "Epsom", ",", "UK", "-RRB-", ".", "Reagents", "were", "dispensed", "in", "a", "384-well", "plate", "using", "the", "Deerac", "Equator", "NS808", "-LRB-", "Deerac", "Fluidics", ",", "Dublin", ",", "Ireland", "-RRB-", ".", "PCR", "cycling", "was", "performed", "in", "384-well", "PCR", "plates", "in", "an", "ABI", "9700", "system", "-LRB-", "Applied", "Biosystems", ",", "Foster", "City", ",", "CA", "-RRB-", "and", "consisted", "of", "initial", "denaturation", "for", "15", "minutes", "at", "95", "°C", ",", "40", "cycles", "with", "denaturation", "of", "15", "seconds", "at", "95", "°C", ",", "and", "annealing", "and", "extension", "for", "60", "seconds", "at", "60", "°C", ".", "Results", "were", "analyzed", "by", "the", "ABI", "Taqman", "7900HT", "using", "the", "sequence", "detection", "system", "2.22", "software", "-LRB-", "Applied", "Biosystems", "-RRB-", ".", "To", "confirm", "the", "accuracy", "of", "genotyping", "results", ",", "332", "-LRB-", "5", "%", "-RRB-", "randomly", "selected", "samples", "were", "regenotyped", "with", "the", "same", "method", ".", "No", "inconsistencies", "were", "observed", ".", "For", "Sp1", "-LRB-", "intron1", "-RRB-", "an", "assay", "was", "set", "up", "using", "Primer", "Express", "Software", "version", "2.0", "-LRB-", "Applied", "Biosystems", ",", "Foster", "city", ",", "CA", "-RRB-", ".", "Forward", "and", "reverse", "primer", "sequences", "were", "5", "′", "-", "GTTGTCTAGGTGCTGGAGGTT-3", "′", "and", "5", "′", "-", "GGCGAGGGAGGAGAGAAGG-3", "′", ".", "The", "PCR", "mixture", "included", "5", "ng", "of", "genomic", "DNA", "in", "a", "4", "μL", "volume", "and", "the", "following", "reagents", ":", "FAM-CCCGCCCACATTCCCTGG-MGB", "probes", "-LRB-", "250", "nM", "-RRB-", ",", "TET-CCCGCCCCCATTCCCTGG-MGB", "probe", "-LRB-", "500", "nM", "-RRB-", ",", "primers", "-LRB-", "300", "nM", "-RRB-", ",", "2", "×", "Taqman", "PCR", "master", "mix", "-LRB-", "Applied", "Biosystems", "-RRB-", ".", "PCR", "cycling", "was", "performed", "in", "384-well", "PCR", "plates", "in", "the", "ABI", "9700", "PCR", "system", "and", "consisted", "of", "initial", "denaturation", "for", "15", "minutes", "at", "95", "°C", ",", "40", "cycles", "with", "denaturation", "of", "15", "seconds", "at", "95", "°C", ",", "and", "annealing", "and", "extension", "for", "60", "seconds", "at", "60", "°C", ".", "Results", "were", "analyzed", "by", "the", "ABI", "Taqman", "7900HT", "using", "the", "sequence", "detection", "system", "2.1", "software", "-LRB-", "Applied", "Biosystems", "-RRB-", ".", "To", "confirm", "the", "accuracy", "of", "the", "genotyping", "results", ",", "332", "randomly", "selected", "samples", "were", "genotyped", "for", "a", "second", "time", "with", "the", "same", "method", ".", "All", "polymorphisms", "had", "an", "error", "rate", "lower", "than", "1", "%", ".", "Statistical", "Analysis", "Hardy-Weinberg", "equilibrium", "of", "the", "COLIA1", "polymorphism", "genotypes", "was", "tested", "using", "the", "GENEPOP", "package", "-LSB-", "23", "-RSB-", ".", "Linkage", "disequilibrium", "-LRB-", "LD", "-RRB-", "between", "each", "pair", "of", "alleles", "at", "both", "polymorphic", "loci", "was", "calculated", "as", "D", "′", "and", "r2", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "We", "stratified", "all", "analyses", "by", "gender", ",", "considering", "peak", "bone", "mass", ",", "changes", "in", "BMD", ",", "and", "fractures", ",", "following", "age", "-", "and", "sex-specific", "patterns", ".", "Baseline", "BMD", "and", "BMD", "rate", "of", "change", "were", "compared", "across", "COLIA1", "polymorphisms", "using", "univariate", "analysis", "of", "variance", "-LRB-", "ANOVA", "-RRB-", ".", "Corrections", "were", "made", "for", "age", "and", "BMI", ".", "Trend", "analysis", "assuming", "an", "underlying", "additive", "genetic", "model", "was", "done", "for", "the", "presence", "of", "zero", ",", "one", ",", "or", "two", "copies", "of", "the", "associated", "allele", ",", "incorporating", "the", "genotype", "variable", "as", "a", "continuous", "term", "in", "a", "general", "linear", "regression", "model", ".", "For", "the", "analysis", "of", "nonvertebral", "fracture", "follow-up", "data", ",", "we", "computed", "the", "incidence", "rates", "of", "fracture", "among", "genotypes", "and", "used", "Cox", "'s", "proportional", "hazards", "model", ",", "adjusting", "for", "age", "and", "BMI", "to", "estimate", "risk", "of", "fracture", ".", "For", "vertebral", "fractures", ",", "odd", "ratios", "with", "95", "%", "confidence", "intervals", "-LRB-", "95", "%", "CIs", "-RRB-", "were", "calculated", "using", "logistic", "regression", "models", "since", "no", "data", "on", "the", "exact", "time", "of", "occurrence", "could", "be", "determined", ".", "We", "used", "HaploStats", "-LRB-", "available", "at", "http://www.cran.r-project.org/", "-RRB-", "to", "estimate", "the", "frequency", "of", "inferred", "haplotypes", "and", "investigate", "the", "association", "of", "haplotypes", "with", "BMD", "and", "the", "risk", "of", "fractures", ".", "We", "restricted", "the", "analysis", "to", "haplotypes", "with", "an", "inferred", "frequency", "of", "more", "than", "0.02", ".", "The", "first", "haplotype", ",", "which", "was", "most", "frequent", ",", "was", "used", "as", "reference", ".", "Significant", "P", "values", "were", "0.05", "or", "lower", ".", "Finally", ",", "model", "assumptions", "were", "verified", "and", "model", "residuals", "checked", "for", "goodness-of-fit", ".", "SPSS", "11.0", "-LRB-", "SPSS", ",", "Chicago", ",", "IL", "-RRB-", "was", "used", "for", "the", "analyses", ".", "Results", "Allele", "and", "genotype", "frequencies", "of", "the", "-1997", "G/T", "and", "Sp1", "polymorphisms", "were", "in", "Hardy-Weinberg", "equilibrium", "-LRB-", "P", "=", "0.61", "and", "P", "=", "0.10", ",", "respectively", "-RRB-", ".", "General", "characteristics", "of", "the", "study", "population", "at", "baseline", "and", "follow-up", "are", "shown", "in", "Table", "1", ".", "Table", "1General", "characteristics", "of", "the", "study", "population", "at", "baseline", "and", "second", "follow-upWomenMenBaselineSecond", "follow-upBaselineSecond", "follow-upNumbern", "=", "3,374", "n", "=", "1,724", "n", "=", "2,452", "n", "=", "1,287", "Age", "-LRB-", "years", "-RRB-", "68.3", "±", "8.272.7", "±", "6.867.6", "±", "7.772.2", "±", "6.5", "Height", "-LRB-", "cm", "-RRB-", "161.1", "±", "6.8160.6", "±", "6.4174.6", "±", "6.8174.0", "±", "6.7", "Weight", "-LRB-", "kg", "-RRB-", "69.3", "±", "11.470.3", "±", "12.278.2", "±", "10.879.5", "±", "11.3", "BMI", "-LRB-", "kg/m2", "-RRB-", "26.7", "±", "4.127.2", "±", "4.425.6", "±", "3.026.3", "±", "3.2FN-BMD", "-LRB-", "g/cm2", "-RRB-", "a0", ".83", "±", "0.140.80", "±", "0.130.92", "±", "0.140.90", "±", "0.14", "Lumbar", "spine", "BMD", "-LRB-", "g/cm2", "-RRB-", "1.03", "±", "0.18-1.16", "±", "0.20-FN-BMD", "changen", "=", "1,527", "n", "=", "1,143FN-BMD", "change", "-LRB-", "relative", "%", "of", "baseline", "year", "-RRB-", "b", "−", "0.84", "±", "1.09-Values", "are", "means", "±", "SD", ".", "Anthropometric", "measurement", "based", "on", "5,826", "individuals", "at", "baseline", "and", "3,011", "individuals", "at", "follow-upaBMD", "measurements", "based", "on", "5,737", "individual", "at", "baseline", "and", "2,670", "individual", "at", "second", "follow-upbFemoral", "neck", "-LRB-", "FN", "-RRB-", "BMD", "change", "was", "measured", "between", "second", "follow-up", "and", "baseline", ".", "Second", "follow-up", "measurements", "were", "performed", "on", "average", "6.5", "-LRB-", "SD", "=", "0.6", "-RRB-", "years", "after", "baseline", "Baseline", "BMD", "by", "COLIA1", "Genotypes", "In", "both", "genders", ",", "age", ",", "height", ",", "weight", ",", "and", "BMI", "did", "not", "differ", "significantly", "between", "genotypes", "for", "the", "-1997", "G/T", "and", "Sp1", "polymorphisms", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Table", "2", "shows", "the", "BMD", "values", "according", "to", "COLIA1", "genotypes", "in", "men", "and", "women", ".", "Femoral", "neck", "BMD", "was", "3.8", "%", "lower", "-LRB-", "mean", "difference", "=", "0.03", "g/cm2", ",", "P", "=", "0.09", "-RRB-", "in", "women", "who", "were", "homozygous", "carriers", "of", "the", "Sp1", "T", "allele", "compared", "to", "noncarriers", ",", "with", "evidence", "for", "an", "allele", "dose", "effect", "-LRB-", "P", "for", "trend", "=", "0.03", "-RRB-", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "No", "association", "was", "found", "between", "the", "-1997", "promoter", "polymorphism", "and", "lumbar", "spine", "BMD", "or", "femoral", "neck", "BMD", "in", "men", "or", "women", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "We", "did", "not", "observe", "any", "significant", "association", "between", "the", "Sp1", "and", "-1997", "promoter", "polymorphisms", "with", "changes", "in", "BMD", "during", "follow-up", "in", "men", "or", "women", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "Table", "2BMD", "measurements", "by", "COLIA1", "genotypes", "at", "baseline", "and", "follow-upPromoter", "-1997", "G/TIntron", "1", "Sp1", "G/TGGGTTTP", "*", "GGGTTTP", "*", "Menn", "=", "1,663", "n", "=", "494n", "=", "37n", "=", "1,484", "n", "=", "655n", "=", "55Femoral", "neck", "-LRB-", "g/cm2", "-RRB-", "0.92", "±", "0.130.92", "±", "0.140.90", "±", "0.141.000.92", "±", "0.140.92", "±", "0.140.90", "±", "0.120.45", "Lumbar", "spine", "-LRB-", "g/cm2", "-RRB-", "1.16", "±", "0.191.17", "±", "0.201.15", "±", "0.220.961.17", "±", "0.191.16", "±", "0.201.16", "±", "0.200.91", "Numbern", "=", "668n", "=", "233n", "=", "16n", "=", "606n", "=", "293n", "=", "18FN-BMD", "change", "-LRB-", "relative", "%", "of", "baseline", "year", "-RRB-", "−", "0.46", "±", "0.91", "−", "0.36", "±", "0.93", "−", "0.38", "±", "0.600.62", "−", "0.39", "±", "0.93", "−", "0.56", "±", "0.87", "−", "0.30", "±", "0.820.01", "Womenn", "=", "2,157", "n", "=", "710n", "=", "53n", "=", "1,971", "n", "=", "858n", "=", "91Femoral", "neck", "-LRB-", "g/cm2", "-RRB-", "0.83", "±", "0.140.84", "±", "0.130.85", "±", "0.130", ".", "220.83", "±", "0.130.82", "±", "0.140.80", "±", "0.140.09", "**", "Lumbar", "spine", "-LRB-", "g/cm2", "-RRB-", "1.03", "±", "0.181.04", "±", "0.181.01", "±", "0.180.691.04", "±", "0.181.04", "±", "0.191.01", "±", "0.200.52", "Numbern", "=", "820n", "=", "298n", "=", "24n", "=", "773n", "=", "340n", "=", "29FN-BMD", "change", "-LRB-", "relative", "%", "of", "baseline", "year", "-RRB-", "−", "0.84", "±", "1.11", "−", "0.83", "±", "1.01", "−", "0.78", "±", "1.030.85", "−", "0.85", "±", "1.08", "−", "0.80", "±", "1.04", "−", "0.74", "±", "1.490.55", "Values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Adjustments", "for", "age", "and", "BMI", ".", "Femoral", "neck", "-LRB-", "FN", "-RRB-", "BMD", "change", "was", "measured", "between", "second", "follow-up", "and", "baseline", "*", "P", "for", "ANOVA", ".", "**", "For", "trend", "linear", "regression", ":", "P", "=", "0.03", "Risk", "of", "Fracture", "by", "COLIA1", "Genotypes", "The", "relation", "between", "risk", "of", "fracture", "and", "COLIA1", "Sp1", "polymorphism", "is", "shown", "in", "Table", "3", ".", "Women", "with", "two", "copies", "of", "the", "T", "allele", "of", "the", "Sp1", "polymorphism", "had", "a", "2.3", "times", "higher", "risk", "of", "fragility", "fracture", "-LRB-", "95", "%", "CI", "1.4-3.9", ",", "P", "=", "0.001", "-RRB-", ".", "Adjustment", "for", "femoral", "neck", "BMD", "did", "not", "essentially", "modify", "the", "association", ".", "A", "similar", "association", "was", "observed", "in", "men", "who", "were", "homozygous", "carriers", "of", "the", "Sp1", "T", "allele", ",", "which", "was", "borderline", "significant", "-LRB-", "risk", "ratio", "=", "2.3", ",", "95", "%", "CI", "0.9", "--", "5.8", ",", "P", "=", "0.07", "-RRB-", ".", "For", "the", "-1997", "promoter", "polymorphism", "no", "association", "was", "found", "with", "any", "type", "of", "fracture", "in", "either", "men", "or", "women", "-LRB-", "Table", "3", "-RRB-", ".", "Table", "3Risk", "of", "fractures", "by", "COLIA1", "genotypesCOLIA1", "genotypesTypes", "of", "fractureEvent", "-LRB-", "%", "-RRB-", "Risk", "ratio", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "GGGTTTGG", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "GT", "vs.", "referenceTT", "vs.", "referenceMenPromoter", "-1997", "G/TNonvertebral147/1952", "-LRB-", "7.5", "-RRB-", "49/592", "-LRB-", "8.3", "-RRB-", "1/46", "-LRB-", "2.2", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "3.18", "-LRB-", "0.45", "--", "22.74", "-RRB-", "3.44", "-LRB-", "0.47", "--", "29.94", "-RRB-", "Fragility72/1952", "-LRB-", "3.7", "-RRB-", "14/592", "-LRB-", "2.4", "-RRB-", "1/46", "-LRB-", "1.8", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.46", "-LRB-", "0.20", "--", "10.55", "-RRB-", "0.94", "-LRB-", "0.12.7.14", "-RRB-", "Vertebral100/1056", "-LRB-", "9.5", "-RRB-", "35/340", "-LRB-", "10.3", "-RRB-", "3/28", "-LRB-", "10.7", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.07", "-LRB-", "0.71", "--", "1.61", "-RRB-", "1.23", "-LRB-", "0.36", "--", "4.18", "-RRB-", "Intron", "1", "Sp1", "G/TNonvertebral91/1254", "-LRB-", "7.3", "-RRB-", "39/574", "-LRB-", "6.8", "-RRB-", "4/44", "-LRB-", "9.1", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "0.97", "-LRB-", "0.71", "--", "1.33", "-RRB-", "1.40", "-LRB-", "0.65", "--", "3.00", "-RRB-", "Fragility36/1254", "-LRB-", "2.9", "-RRB-", "14/574", "-LRB-", "2.4", "-RRB-", "2/44", "-LRB-", "4.5", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "0.94", "-LRB-", "0.58", "--", "1.51", "-RRB-", "2.34", "-LRB-", "0.94", "--", "5.85", "-RRB-", "Vertebral68/719", "-LRB-", "9.5", "-RRB-", "31/350", "-LRB-", "8.9", "-RRB-", "2/22", "-LRB-", "9.1", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "0.83", "-LRB-", "0.55", "--", "1.24", "-RRB-", "1.59", "-LRB-", "0.60", "--", "4.22", "-RRB-", "WomenPromoter", "-1997", "G/TNonvertebral528/2721", "-LRB-", "19.4", "-RRB-", "182/879", "-LRB-", "20.7", "-RRB-", "8/63", "-LRB-", "12.7", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.53", "-LRB-", "0.76", "--", "3.09", "-RRB-", "1.66", "-LRB-", "0.82", "--", "3.36", "-RRB-", "Fragility216/2721", "-LRB-", "7.9", "-RRB-", "73/879", "-LRB-", "8.3", "-RRB-", "4/63", "-LRB-", "6.3", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.13", "-LRB-", "0.42", "--", "3.05", "-RRB-", "1.19", "-LRB-", "0.44", "--", "3.26", "-RRB-", "Vertebral159/1320", "-LRB-", "12.0", "-RRB-", "52/445", "-LRB-", "11.7", "-RRB-", "5/35", "-LRB-", "14.3", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "0.98", "-LRB-", "0.70", "--", "1.37", "-RRB-", "1.31", "-LRB-", "0.49", "--", "3.45", "-RRB-", "Intron", "1", "Sp1", "G/TNonvertebral279/1626", "-LRB-", "17.2", "-RRB-", "121/710", "-LRB-", "17.0", "-RRB-", "17/76", "-LRB-", "22.4", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.05", "-LRB-", "0.90", "--", "1.23", "-RRB-", "1.34", "-LRB-", "0.92", "--", "1.23", "-RRB-", "Fragility98/1626", "-LRB-", "6.0", "-RRB-", "42/710", "-LRB-", "5.9", "-RRB-", "10/76", "-LRB-", "13.2", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.01", "-LRB-", "0.78", "--", "1.31", "-RRB-", "2.33", "-LRB-", "1.39", "--", "3.87", "-RRB-", "Vertebral98/891", "-LRB-", "11.0", "-RRB-", "51/401", "-LRB-", "12.7", "-RRB-", "3/34", "-LRB-", "8.8", "-RRB-", "1.0", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.21", "-LRB-", "0.88", "--", "1.65", "-RRB-", "1.37", "-LRB-", "0.56", "--", "3.35", "-RRB-", "Adjustments", "for", "age", "and", "BMI", "Haplotype", "Analysis", "High", "LD", "exists", "between", "the", "-1997", "G/T", "and", "Sp1", "polymorphisms", ",", "as", "assessed", "by", "D", "′", "measure", "-LRB-", "D", "′", "=", "0.99", ",", "r2", "=", "0.03", "-RRB-", ".", "We", "observed", "in", "our", "population", "three", "-1997", "G/T", ",", "Sp1", "G/T", "haplotype", "alleles", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ":", "haplotype", "1", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "GIntron", "-RRB-", ",", "69.0", "%", ";", "haplotype", "2", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "TIntron", "-RRB-", ",", "17.6", "%", ";", "and", "haplotype", "3", "-LRB-", "Tpromoter", "--", "GIntron", "-RRB-", ",", "13.4", "%", ".", "Haplotype", "4", "-LRB-", "Tpromoter", "--", "TIntron", "-RRB-", "was", "not", "present", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "The", "strong", "LD", "between", "the", "-1997", "G/T", "and", "Sp1", "G/T", "polymorphism", "and", "the", "virtual", "nonexistence", "of", "haplotype", "4", "suggests", "there", "is", "absence", "of", "ancestral", "recombination", "in", "the", "region", ".", "We", "observed", "a", "borderline", "significant", "association", "-LRB-", "P", "=", "0.06", "-RRB-", "between", "haplotype", "2", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "TIntron", "-RRB-", "and", "femoral", "neck", "BMD", "in", "women", ".", "Women", "who", "carried", "haplotype", "2", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "TIntron", "-RRB-", "had", "lower", "-LRB-", "−", "0.01", "mg/cm2", "-RRB-", "femoral", "neck", "BMD", "compared", "with", "those", "who", "carried", "haplotype", "1", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "GIntron", "-RRB-", ".", "Fig.", "1Schematic", "representation", "of", "the", "COLIA1", "gene", "with", "the", "structural-1997", "G/T", "polymorphism", "in", "the", "promoter", "region", "and", "G/T", "Sp1", "polymorphism", "at", "binding", "site", ",", "with", "observed", "haplotype", "frequencies", "in", "the", "Rotterdam", "Study", "The", "relation", "between", "risk", "of", "fracture", "and", "COLIA1", "haplotypes", "is", "shown", "in", "Table", "4", ".", "Women", "with", "haplotype", "2", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "TIntron", "-RRB-", "had", "a", "2.1", "times", "higher", "relative", "risk", "of", "fragility", "fracture", "-LRB-", "P", "=", "0.03", "-RRB-", ";", "in", "men", "the", "increase", "in", "risk", "was", "2.0", "-LRB-", "P", "=", "0.31", "-RRB-", ".", "These", "results", "were", "essentially", "unchanged", "after", "adjustment", "for", "femoral", "neck", "BMD", ".", "For", "haplotype", "3", "-LRB-", "Tpromoter", "--", "GIntron", "-RRB-", "we", "found", "no", "association", "with", "any", "type", "of", "fracture", "in", "either", "men", "or", "women", ".", "Table", "4Risk", "of", "fracture", "by", "COLIA1", "haplotypesTypes", "of", "fractureMen", ",", "OR", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "Women", ",", "OR", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "Haplotype", "1Haplotype", "2Haplotype", "3Haplotype", "1Haplotype", "2Haplotype", "3Nonvertebral1", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.29", "-LRB-", "0.55", "--", "3.02", "-RRB-", "0.00", "-LRB-", "0.00", "-", "∞", "-RRB-", "1", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.31", "-LRB-", "0.83", "--", "2.07", "-RRB-", "0.61", "-LRB-", "0.29", "--", "1.29", "-RRB-", "Fragility1", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "2.01", "-LRB-", "0.71", "--", "5.67", "-RRB-", "0.00", "-LRB-", "0.00", "-", "∞", "-RRB-", "1", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "2.12", "-LRB-", "1.23", "--", "3.66", "-RRB-", "0.80", "-LRB-", "0.29", "--", "2.23", "-RRB-", "Vertebral1", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.64", "-LRB-", "0.62", "--", "4.31", "-RRB-", "1.19", "-LRB-", "0.35", "--", "4.00", "-RRB-", "1", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "1.23", "-LRB-", "0.51", "--", "2.95", "-RRB-", "1.31", "-LRB-", "0.50", "--", "3.42", "-RRB-", "Adjustments", "for", "age", "and", "BMI", ".", "Haplotype", "1", ",", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "GIntron", "-RRB-", ";", "haplotype", "2", ",", "-LRB-", "Gpromoter", "--", "TIntron", "-RRB-", ";", "haplotype", "3", ",", "-LRB-", "Tpromoter", "--", "GIntron", "-RRB-", "Discussion", "In", "this", "large", "population-based", "study", ",", "we", "found", "that", "the", "Sp1", "polymorphism", "influences", "the", "risk", "of", "fragility", "fracture", "in", "elderly", "women", ",", "with", "a", "similar", "yet", "not", "significant", "effect", "in", "men", ".", "Similarly", ",", "women", "homozygous", "for", "the", "T", "allele", "had", "3.8", "%", "lower", "BMD", "at", "baseline", ".", "The", "-1997", "G/T", "polymorphism", "showed", "no", "independent", "effect", "on", "fracture", "risk", "or", "BMD", "levels", "in", "both", "genders", ".", "The", "haplotype", "analysis", "showed", "an", "association", "with", "BMD", "and", "fracture", "in", "women", ",", "which", "appeared", "to", "be", "driven", "by", "the", "effect", "of", "the", "Sp1", "polymorphism", ".", "A", "study", "in", "Spain", "-LSB-", "19", "-RSB-", "showed", "that", "the", "-1997", "G/T", "polymorphism", "located", "in", "the", "promoter", "region", "of", "the", "COLIA1", "gene", "was", "associated", "with", "BMD", "in", "postmenopausal", "women", "of", "Spanish", "origin", ".", "In", "addition", ",", "analysis", "of", "compound", "genotypes", "of", "the", "three", "studied", "polymorphisms", "-LRB-", "-1997", "G/T", ",", "Sp1", ",", "and", "-1663", "indelT", "-RRB-", "suggested", "that", "the", "lowest", "value", "for", "BMD", "corresponded", "to", "GG", "homozygous", "at", "-1997", "and", "heterozygous", "at", "the", "other", "two", "loci", ".", "Furthermore", ",", "in", "another", "report", ",", "the", "same", "group", "observed", "a", "possible", "functional", "mechanism", "for", "the", "-1997", "G/T", "polymorphism", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "Our", "population-based", "study", "suggests", "there", "is", "no", "independent", "effect", "of", "the", "-1997", "polymorphism", "on", "BMD", "and", "the", "risk", "of", "fractures", ".", "Recently", ",", "Stewart", "et", "al.", "-LSB-", "26", "-RSB-", "examined", "the", "three", "polymorphisms", "of", "the", "COLIA1", "gene", "in", "forms", "of", "haplotypes", "in", "postmenopausal", "women", ".", "In", "contrast", "with", "our", "study", ",", "they", "observed", "an", "association", "between", "reduced", "BMD", "values", "and", "the", "promoter", "--", "1997G/T", "polymorphism", ".", "Since", "the", "promoter", "-1997", "G/T", "polymorphism", "is", "in", "strong", "LD", "with", "the", "Sp1", "polymorphism", ",", "the", "observed", "association", "of", "haplotype", "2", "is", "driven", "by", "the", "SP1", "polymorphism", ".", "We", "showed", "that", "the", "association", "between", "fragility", "fractures", "and", "Sp1", "polymorphism", "is", "significant", "only", "in", "women", ".", "We", "also", "found", "that", "the", "association", "between", "fragility", "fracture", "and", "the", "Sp1", "polymorphism", "was", "independent", "of", "femoral", "neck", "BMD", ".", "A", "possible", "explanation", "for", "an", "increased", "risk", "of", "fracture", "is", "the", "different", "number", "of", "fractures", "between", "men", "and", "women", ".", "There", "are", "a", "higher", "number", "of", "fractures", "in", "women", "compared", "to", "men", "-LRB-", "13.2", "%", "in", "women", "and", "4.5", "%", "in", "men", "-RRB-", ".", "This", "suggests", "that", "other", "underlying", "biological", "mechanisms", "beyond", "BMD", "levels", ",", "such", "as", "the", "role", "of", "microarchitecture", "and", "composition", "of", "mineral", "crystals", "in", "bone", "tissue", ",", "might", "explain", "the", "increased", "fracture", "risk", "-LSB-", "11", ",", "27", ",", "28", "-RSB-", ".", "Biomechanical", "testing", "of", "bone", "samples", "from", "heterozygous", "individuals", "with", "the", "GT", "genotype", "showed", "reduced", "bone", "strength", "compared", "to", "the", "homozygous", "GG", "genotype", "and", "a", "slight", "reduction", "in", "mineralization", "of", "bone", "-LSB-", "11", "-RSB-", ".", "Presence", "of", "the", "T", "allele", "in", "the", "COLIA1", "Sp1", "binding", "site", "leads", "to", "an", "abnormal", "relative", "level", "of", "COLIA1/COLIA2", ",", "which", "may", "reduce", "bone", "quality", "and", "quantity", "-LSB-", "11", "-RSB-", ".", "Accordingly", ",", "we", "assume", "that", "a", "weaker", "network", "of", "abnormal", "collagen", "cross-linking", "may", "generate", "a", "three-dimensional", "unstable", "condition", "that", "may", "be", "responsible", "for", "its", "relatively", "greater", "risk", "of", "fragility", "fracture", "in", "elderly", "women", "homozygous", "for", "the", "Sp1", "T", "allele", ".", "Similarly", ",", "it", "is", "likely", "that", "the", "Sp1", "polymorphism", "drives", "these", "associations", "since", "evidence", "of", "functionality", "of", "this", "polymorphism", "has", "been", "reported", "previously", ".", "In", "the", "Genetic", "Markers", "for", "Osteoporosis", "-LRB-", "GENOMOS", "-RRB-", "Study", ",", "which", "is", "the", "largest", "study", "examining", "the", "Sp1", "polymorphism", "-LRB-", "n", "=", "20,786", "-RRB-", "in", "relation", "to", "osteoporosis", ",", "an", "association", "between", "the", "Sp1", "polymorphism", "and", "a", "1.3", "times", "incident", "risk", "of", "vertebral", "fractures", "was", "also", "observed", ".", "An", "effect", "of", "the", "-1997", "promoter", "polymorphism", "due", "to", "power", "limitations", "can", "not", "be", "fully", "excluded", "and", "should", "be", "subject", "to", "study", "in", "a", "larger", "population", "like", "that", "of", "GENOMOS", ".", "Our", "present", "study", "has", "some", "limitations", ".", "Survival", "bias", "may", "play", "a", "role", "if", "individuals", "who", "were", "lost", "to", "follow-up", "were", "associated", "to", "genotype", ".", "Considering", "this", "selection", "bias", ",", "a", "possible", "relationship", "of", "the", "COLIA1", "polymorphisms", "with", "changes", "in", "BMD", "can", "not", "be", "fully", "excluded", ".", "In", "conclusion", ",", "we", "observed", "an", "increased", "risk", "of", "fragility", "fractures", "in", "women", "carriers", "of", "the", "COLIA1", "Sp1", "T", "allele", ".", "In", "contrast", ",", "the", "-1997", "G/T", "polymorphism", "by", "itself", "appears", "to", "have", "no", "influence", "on", "fracture", "or", "BMD", "in", "postmenopausal", "women", ",", "though", "the", "role", "of", "power", "limitations", "can", "not", "be", "excluded", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Dietary", "fat", "and", "risk", "of", "colon", "and", "rectal", "cancer", "with", "aberrant", "MLH1", "expression", ",", "APC", "or", "KRAS", "genes", "Objective", "To", "investigate", "baseline", "fat", "intake", "and", "the", "risk", "of", "colon", "and", "rectal", "tumors", "lacking", "MLH1", "-LRB-", "mutL", "homolog", "1", ",", "colon", "cancer", ",", "nonpolyposis", "type", "2", "-RRB-", "repair", "gene", "expression", "and", "harboring", "mutations", "in", "the", "APC", "-LRB-", "adenomatous", "polyposis", "coli", "-RRB-", "tumor", "suppressor", "gene", "and", "in", "the", "KRAS", "-LRB-", "v-Ki-ras2", "Kirsten", "rat", "sarcoma", "viral", "oncogene", "homolog", "-RRB-", "oncogene", ".", "Introduction", "Although", "dietary", "fat", "has", "been", "implicated", "in", "the", "etiology", "of", "colorectal", "cancer", "-LSB-", "1", "-RSB-", ",", "results", "from", "epidemiological", "studies", "are", "inconsistent", "-LSB-", "2", ",", "3", "-RSB-", "and", "often", "do", "not", "support", "an", "association", ",", "as", "observed", "recently", "in", "the", "Women", "'s", "Health", "Study", "-LSB-", "4", "-RSB-", ".", "Fortunately", ",", "current", "molecular", "techniques", "to", "detect", "DNA", "alterations", "on", "a", "large", "scale", "allow", "studying", "molecular", "endpoints", "for", "colorectal", "cancer", ",", "characterized", "by", "acquired", "-LRB-", "epi", "-RRB-", "genetic", "defects", "in", "tumor", "DNA", "-LSB-", "5", "-RSB-", ".", "This", "approach", "may", "improve", "our", "ability", "to", "observe", "associations", "between", "dietary", "factors", "and", "cancer", "that", "may", "otherwise", "remain", "undetected", ".", "A", "multistep", "model", "linking", "sporadic", "colorectal", "carcinogenesis", "to", "molecular", "aberrations", "has", "been", "proposed", "-LSB-", "6", "--", "8", "-RSB-", ",", "with", "DNA", "repair", "genes", ",", "tumor", "suppressor", "genes", "and", "oncogenes", ",", "operating", "in", "multiple", "genetic", "pathways", ".", "About", "10", "--", "20", "%", "of", "sporadic", "colon", "carcinomas", "are", "characterized", "by", "microsatellite", "instability", ",", "predominantly", "due", "to", "promoter", "methylation", "of", "the", "MLH1", "-LRB-", "mutL", "homolog", "1", ",", "colon", "cancer", ",", "nonpolyposis", "type", "2", "-RRB-", "DNA", "mismatch", "repair", "gene", ",", "which", "prevents", "expression", "of", "the", "enzyme", "-LSB-", "9", "-RSB-", ".", "Up", "to", "90", "%", "of", "colon", "and", "rectum", "carcinomas", "are", "chromosomally", "instable", "-LSB-", "10", ",", "11", "-RSB-", "and", "are", "associated", "with", "mutations", "in", "the", "APC", "-LRB-", "adenomatous", "polyposis", "coli", "-RRB-", "and", "TP53", "-LRB-", "tumor", "protein", "53", "-RRB-", "tumor", "suppressor", "genes", "and", "in", "the", "KRAS", "-LRB-", "v-Ki-ras2", "Kirsten", "rat", "sarcoma", "viral", "oncogene", "homolog", "-RRB-", "oncogene", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "However", ",", "simultaneous", "occurrence", "of", "mutations", "in", "these", "three", "genes", "is", "rare", "suggesting", "that", ",", "even", "within", "this", "group", "of", "chromosomally", "instable", "tumors", ",", "different", "genetic", "pathways", "to", "colorectal", "cancer", "exist", "-LSB-", "13", ",", "14", "-RSB-", ".", "Mutations", "in", "the", "APC", "gene", "are", "found", "to", "occur", "relatively", "early", "in", "colorectal", "tumorigenesis", "and", "are", "observed", "in", "up", "to", "80", "%", "of", "both", "adenomas", "and", "carcinomas", "-LSB-", "8", ",", "15", "-RSB-", ".", "Mutations", "in", "the", "KRAS", "gene", "are", "observed", "in", "approximately", "10", "--", "20", "%", "of", "small", "adenomas", "and", "40", "--", "50", "%", "of", "larger", "adenomas", "and", "carcinomas", ",", "suggesting", "it", "to", "be", "an", "important", "event", "in", "the", "progression", "of", "adenoma", "to", "carcinoma", "-LSB-", "15", "-RSB-", ".", "Mutations", "in", "the", "TP53", "gene", "are", "postulated", "to", "affect", "relatively", "late", "stages", "of", "colorectal", "carcinogenesis", "-LSB-", "15", "-RSB-", ".", "Breivik", "et", "al.", "proposed", "that", "the", "type", "of", "genetic", "instability", "in", "cancer", "cells", "reflects", "the", "selection", "pressures", "exerted", "by", "specific", "carcinogens", "-LSB-", "16", "-RSB-", ".", "Bardelli", "et", "al.", "subsequently", "tested", "this", "hypothesis", "in", "immortal", "genetically", "stable", "human", "cells", "and", "concluded", "that", "exposure", "to", "specific", "carcinogens", "can", "indeed", "select", "for", "tumor", "cells", "with", "distinct", "forms", "of", "genetic", "instability", "and", "vice", "versa", "-LSB-", "17", "-RSB-", ".", "Therefore", ",", "DNA", "adducts", "derived", "from", "dietary", "fat", "metabolism", "could", "also", "be", "associated", "with", "colorectal", "tumors", "exhibiting", "chromosomal", "instability", ".", "This", "is", "supported", "by", "the", "observations", "that", "malondialdehyde", "-LRB-", "MDA", "-RRB-", ",", "generated", "during", "lipid", "peroxidation", "and", "arachidonic", "acid", "metabolism", ",", "can", "form", "DNA", "adducts", "and", "induce", "G", "→", "T", "transversions", "and", "G", "→", "A", "transitions", "in", "DNA", "-LSB-", "18", ",", "19", "-RSB-", ".", "In", "addition", ",", "higher", "levels", "of", "MDA-DNA", "adducts", "have", "been", "observed", "in", "colorectal", "tissue", "of", "adenoma", "patients", "than", "in", "tissue", "of", "controls", "-LSB-", "20", "-RSB-", ".", "MDA", "levels", "are", "modulated", "by", "dietary", "factors", ",", "with", "polyunsaturated", "fatty", "acids", ",", "and", "specifically", "ω-6", "polyunsaturated", "fatty", "acids", ",", "presumably", "increasing", "MDA", "levels", "-LSB-", "21", "-RSB-", ".", "This", "is", "in", "line", "with", "our", "previous", "report", "of", "a", "significant", "association", "between", "the", "intake", "of", "linoleic", "acid", ",", "the", "most", "abundant", "ω-6", "polyunsaturated", "fatty", "acid", "in", "the", "diet", ",", "and", "increased", "risk", "of", "colon", "carcinomas", "with", "a", "mutated", "KRAS", "gene", "within", "the", "Netherlands", "Cohort", "Study", "-LRB-", "NLCS", "-RRB-", "on", "diet", "and", "cancer", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "These", "observations", "and", "hypotheses", "prompted", "us", "to", "investigate", "the", "associations", "between", "the", "intake", "of", "total", "fat", "and", "different", "types", "of", "fat", "and", "the", "risk", "of", "colon", "and", "rectal", "tumors", "lacking", "MLH1", "expression", "and", "with", "and", "without", "APC", "gene", "mutations", ",", "two", "early", "events", "in", "colorectal", "tumorigenesis", ",", "independent", "of", "tumors", "harboring", "KRAS", "gene", "mutations", ".", "Materials", "and", "methods", "Study", "population", "The", "prospective", "NLCS", "was", "initiated", "in", "The", "Netherlands", "in", "September", "1986", ".", "The", "study", "design", "has", "been", "described", "in", "detail", "elsewhere", "-LSB-", "23", "-RSB-", ".", "Briefly", ",", "at", "baseline", "a", "total", "of", "58,279", "men", "and", "62,573", "women", ",", "between", "the", "ages", "of", "55", "and", "69", "years", ",", "completed", "a", "self-administered", "food", "frequency", "and", "lifestyle", "questionnaire", ".", "Incident", "cancer", "cases", "are", "identified", "by", "monitoring", "of", "the", "entire", "cohort", "for", "cancer", "occurrence", "through", "annual", "record", "linkage", "to", "the", "National", "Cancer", "Registry", "-LRB-", "NCR", "-RRB-", ",", "consisting", "of", "nine", "regional", "cancer", "registries", "throughout", "The", "Netherlands", ",", "and", "to", "PALGA", ",", "a", "nationwide", "network", "and", "registry", "of", "histo", "-", "and", "cytopathology", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "The", "NCR", "and", "PALGA", "together", "provide", "a", "near", "100", "%", "coverage", "of", "the", "204", "municipalities", "included", "in", "the", "NLCS", ".", "Accumulation", "of", "person-time", "in", "the", "cohort", "was", "estimated", "through", "biennial", "vital", "status", "follow-up", "of", "a", "subcohort", "of", "3,500", "men", "and", "women", "who", "were", "randomly", "selected", "after", "baseline", "exposure", "measurement", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "Cases", "with", "prevalent", "cancer", "other", "than", "non-melanoma", "skin", "cancer", "were", "excluded", "from", "the", "subcohort", ",", "which", "left", "3,346", "men", "and", "women", "for", "analysis", "next", "to", "all", "colorectal", "cancer", "cases", "from", "the", "entire", "cohort", ".", "No", "subcohort", "members", "were", "lost", "to", "follow-up", ".", "A", "flow", "diagram", "of", "subcohort", "members", "and", "patients", "on", "whom", "the", "analyses", "are", "based", "is", "given", "in", "Fig.", "1", ".", "Fig.", "1Flow", "diagram", "of", "the", "number", "of", "subjects", "on", "whom", "the", "final", "statistical", "analyses", "were", "based", ".", "aNetherlands", "Cancer", "Registry", ".", "bPathologisch", "Anatomisch", "Landelijk", "Geautomatiseerd", "Archief", ".", "cPatients", "with", "rectosigmoid", "tumors", "were", "not", "included", "in", "the", "analyses", ".", "dmutL", "homolog", "1", ",", "colon", "cancer", ",", "nonpolyposis", "type", "2", ".", "eAdenomatous", "polyposis", "coli", ".", "fMutation", "cluster", "region", ".", "gv-Ki-ras2", "Kirsten", "rat", "sarcoma", "viral", "oncogene", "homolog", ".", "hPatients", "with", "rectal", "tumors", "were", "not", "included", "in", "the", "analysis", "according", "to", "MLH1", "expression", "The", "first", "2.3", "years", "of", "follow", "up", "were", "excluded", "because", "of", "possible", "preclinical", "disease", "affecting", "exposure", "status", "and", "because", "of", "incomplete", "nationwide", "coverage", "of", "PALGA", "alone", "-LRB-", "i.e.", ",", "not", "in", "combination", "with", "the", "NCR", "-RRB-", "in", "some", "of", "the", "municipalities", "included", "in", "the", "NLCS", ".", "Within", "this", "period", ",", "83", "subcohort", "members", "deceased", "or", "were", "diagnosed", "with", "cancer", "other", "than", "non-melanoma", "skin", "cancer", ",", "leaving", "3,263", "subcohort", "members", "for", "analysis", ".", "From", "1989", "to", "1994", ",", "929", "incident", "cases", "with", "histologically", "confirmed", "colorectal", "cancer", "were", "identified", "within", "the", "entire", "cohort", ",", "of", "whom", "819", "could", "also", "be", "linked", "to", "a", "PALGA", "report", "of", "the", "lesion", ".", "The", "PALGA", "reports", "were", "used", "to", "identify", "and", "locate", "tumor", "tissues", "from", "eligible", "colorectal", "cancer", "patients", "in", "54", "pathology", "laboratories", "throughout", "the", "Netherlands", ".", "Cancers", "were", "classified", "according", "to", "site", "as", "follows", ",", "colon", ":", "cecum", "through", "sigmoid", "colon", "-LRB-", "ICD-O", "codes", "153:0", ",", "153.1", ",", "153.2", ",", "153.3", ",", "153.4", ",", "153.5", ",", "153.6", ",", "153.7", "-RRB-", ",", "proximal", "colon", "-LRB-", "ICD-O", "codes", "153.0", ",", "153.1", ",", "153.4", ",", "153.5", ",", "153.6", "-RRB-", ",", "distal", "colon", "-LRB-", "ICD-O", "codes", "153.2", ",", "153,3", ",", "`", "53.7", "-RRB-", ",", "rectosigmoid", "-LRB-", "ICD-O", "code", "154.0", "-RRB-", ",", "and", "rectum", "-LRB-", "ICD-O", "code", "154.1", "-RRB-", ".", "Tissue", "samples", "Approval", "for", "collection", "of", "archival", "tissue", "samples", "from", "colorectal", "cancer", "patients", "was", "obtained", "from", "the", "Ethical", "Review", "Board", "of", "University", "Maastricht", ",", "the", "NCR", "and", "PALGA", ".", "The", "tissue", "specimen", "collection", "started", "in", "August", "1999", "and", "was", "completed", "in", "December", "of", "2001", ".", "For", "five", "percent", "of", "patients", ",", "tissue", "samples", "could", "not", "be", "retrieved", "-LRB-", "44/819", "-RRB-", "due", "to", "administrative", "inconsistencies", ".", "Of", "775", "available", "tissue", "samples", ",", "737", "-LRB-", "95", "%", "-RRB-", "contained", "sufficient", "tumor", "material", "for", "molecular", "analyses", "of", "MLH1", "expression", "and", "mutations", "in", "APC", "and", "KRAS", "genes", ".", "Since", "the", "rectosigmoid", "can", "be", "considered", "as", "a", "clinically", "applied", "term", "rather", "than", "an", "anatomically", "defined", "transitional", "zone", "between", "the", "colon", "and", "rectum", ",", "the", "85", "patients", "with", "a", "rectosigmoid", "tumor", "were", "excluded", "from", "data", "analysis", ".", "Moreover", ",", "the", "group", "of", "patients", "with", "a", "rectosigmoid", "tumor", "was", "too", "small", "for", "adequate", "stratified", "analysis", ".", "MLH1", "expression", "analysis", "Formalin-fixed", ",", "paraffin-embedded", "tissues", "were", "sectioned", "at", "4", "μm", "and", "contained", "tumor", "tissue", "and", "normal", "adjacent", "mucosa", ".", "Endogeneous", "peroxidase", "activity", "was", "blocked", "with", "3", "%", "H2O2", ".", "Slides", "were", "submitted", "to", "microwave", "antigen", "retrieval", "in", "1mM", "EDTA", "buffer", "-LRB-", "pH", "8.0", "-RRB-", "and", "incubated", "with", "10", "%", "normal", "horse", "serum", "for", "10", "min", "at", "room", "temperature", ".", "Then", ",", "sections", "were", "incubated", "overnight", "at", "4", "°C", "with", "mouse", "monoclonal", "antibodies", "against", "MLH1", "protein", "-LRB-", "clone", "G168", "--", "15", ",", "PharMingen", ",", "San", "Diego", ",", "CA", "-RRB-", "at", "a", "1:100", "dilution", ".", "Antibody", "binding", "was", "detected", "by", "incubating", "the", "sections", "at", "room", "temperature", "with", "the", "peroxidase-labeled", "DAKO", "Envision", "System", "-LRB-", "DAKO", ",", "Carpinteris", ",", "CA", "-RRB-", "and", "using", "DAB", "as", "a", "chromogen", ".", "Sections", "were", "counterstained", "with", "haematoxylin", ".", "Lesions", "were", "considered", "to", "lack", "MLH1", "protein", "expression", "when", "unequivocal", "absence", "of", "nuclear", "staining", "of", "the", "tumor", "epithelial", "cells", "was", "observed", ".", "Nuclear", "staining", "of", "normal", "epithelial", "and", "stromal", "cells", "or", "lymphocytes", "served", "as", "internal", "positive", "control", ".", "Two", "investigators", "reviewed", "the", "immunohistochemical", "staining", "independently", "and", "discrepancies", "were", "re-examined", "and", "discussed", "with", "a", "pathologist", "until", "consensus", "was", "reached", ".", "MLH1", "expression", "status", "was", "determined", "successfully", "in", "98", "%", "of", "samples", ",", "i.e.", ",", "468", "colon", "tumors", "and", "173", "rectum", "tumors", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "APC", "mutation", "analysis", "The", "majority", "of", "somatic", "mutations", "in", "APC", "occur", "within", "the", "mutation", "cluster", "region", ".", "Mutation", "analysis", "of", "the", "mutation", "cluster", "region", "-LRB-", "codons", "1,286", "--", "1,520", "-RRB-", ",", "was", "performed", "on", "archival", "adenocarcinoma", "specimens", ",", "using", "macrodissection", "followed", "by", "extraction", "of", "tumor", "DNA", ".", "Then", "nested", "PCR", "was", "used", "to", "amplify", "the", "mutation", "cluster", "region", "in", "four", "overlapping", "DNA", "fragments", "and", "the", "purified", "fragments", "were", "sequenced", ".", "This", "procedure", "has", "been", "described", "in", "detail", "elsewhere", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "In", "brief", ",", "in", "a", "first", "round", "of", "PCR", ",", "two", "overlapping", "fragments", "were", "generated", ",", "that", "served", "as", "templates", "for", "a", "second", "round", "of", "PCR", "to", "amplify", "four", "overlapping", "biotin-labeled", "PCR", "fragments", "that", "were", "subsequently", "used", "for", "direct", "sequencing", ".", "The", "sequence", "profile", "was", "analyzed", "on", "ALFexpress", "DNA", "Analysis", "System", "using", "ALFwin", "software", "-LRB-", "Amersham", "Biosciences", ",", "Roosendaal", ",", "The", "Netherlands", "-RRB-", ".", "Evaluation", "of", "the", "sequence", "patterns", "and", "data", "entry", "were", "independently", "performed", "by", "two", "observers", ".", "Sensitivity", "and", "specificity", "was", "assessed", "by", "analyzing", "the", "mutational", "status", "of", "APC", "in", "six", "colorectal", "cancer", "cell", "lines", ".", "Both", "sensitivity", "and", "specificity", "were", "regarded", "to", "be", "satisfactory", "since", "specific", "mutations", "in", "the", "mutation", "cluster", "region", "of", "APC", "were", "confirmed", "in", "CaCo2", "cells", ",", "SW480", "cells", "and", "LOVO", "cells", ",", "as", "previously", "described", "-LSB-", "25", ",", "26", "-RSB-", ",", "and", "wild", "type", "sequences", "were", "confirmed", "in", "HCT116", ",", "Colo205", "and", "HT29", ",", "for", "the", "mutation", "cluster", "region", "of", "APC", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "In", "addition", ",", "the", "detection", "limit", "was", "5", "%", "of", "mutated", "DNA", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "Reproducibility", "of", "mutation", "analysis", "was", "regarded", "to", "be", "satisfactory", "since", "85", "%", "of", "duplicate", "analyses", ",", "from", "flank", "PCR", "of", "genomic", "DNA", "to", "sequencing", "of", "the", "four", "fragments", "-LRB-", "i.e.", ",", "61", "out", "of", "72", "fragments", "-RRB-", ",", "revealed", "identical", "mutation", "status", "of", "APC", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "From", "47", "colon", "cancer", "patients", "and", "25", "rectum", "cancer", "patients", ",", "one", "or", "more", "fragments", "of", "the", "APC", "gene", "mutation", "cluster", "region", "could", "not", "be", "amplified", "and", "these", "patients", "were", "not", "included", "in", "this", "study", ",", "leaving", "429", "colon", "and", "151", "rectum", "cancer", "cases", "with", "successful", "analysis", "of", "the", "mutation", "cluster", "region", "of", "the", "APC", "gene", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "KRAS", "mutation", "analysis", "Mutation", "analysis", "of", "the", "exon1", "fragment", "of", "the", "KRAS", "oncogene", ",", "spanning", "codons", "8", "--", "29", ",", "was", "performed", "on", "archival", "adenocarcinoma", "specimens", ",", "using", "nested", "PCR", ",", "followed", "by", "direct", "sequencing", "of", "purified", "fragments", "-LSB-", "27", "-RSB-", ".", "The", "detection", "limit", "was", "5", "%", "mutated", "DNA", ".", "Reproducibility", "was", "regarded", "to", "be", "satisfactory", ",", "since", "88", "%", "of", "duplicate", "analyses", ",", "from", "tissue", "sectioning", "to", "DNA", "sequencing", "-LRB-", "i.e.", ",", "28", "out", "of", "32", "-RRB-", ",", "revealed", "identical", "mutation", "status", "of", "KRAS", "-LSB-", "27", "-RSB-", ".", "Mutation", "analysis", "was", "performed", "with", "success", "on", "476", "colon", "and", "176", "rectum", "cancer", "cases", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "Exposure", "assessment", "The", "150", "--", "item", "semi-quantitative", "food", "frequency", "questionnaire", "concentrated", "on", "habitual", "consumption", "of", "food", "and", "beverages", "during", "the", "year", "preceding", "the", "start", "of", "the", "study", ".", "Mean", "individual", "nutrient", "intakes", "per", "day", "were", "computed", "using", "the", "computerized", "Dutch", "food", "composition", "table", "of", "1986", "-LSB-", "28", "-RSB-", ".", "The", "questionnaire", "was", "validated", "against", "a", "9-day", "diet", "record", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "Crude", "and", "energy-gender-adjusted", "-LRB-", "in", "parentheses", "-RRB-", "correlation", "coefficients", "were", "0.72", "-LRB-", "0.52", "-RRB-", "for", "total", "fat", ",", "0.73", "-LRB-", "0.58", "-RRB-", "for", "saturated", "fat", "and", "0.73", "-LRB-", "0.75", "-RRB-", "for", "polyunsaturated", "fat", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "For", "energy", "intake", "the", "correlation", "coefficient", "was", "0.74", ".", "On", "average", ",", "the", "questionnaire", "covered", "91", "%", "of", "the", "energy", "intake", "assessed", "by", "the", "record", "intake", ".", "Questionnaire", "data", "were", "key-entered", "twice", "and", "processed", "for", "all", "incident", "cases", "in", "the", "cohort", "and", "for", "all", "subcohort", "members", "in", "a", "manner", "blinded", "with", "respect", "to", "case/subcohort", "status", ".", "For", "7", "%", "of", "subjects", "-LRB-", "either", "cases", "or", "subcohort", "members", "-RRB-", ",", "dietary", "data", "were", "incomplete", "or", "inconsistent", ",", "and", "they", "were", "excluded", "from", "the", "analyses", ".", "Questionnaires", "were", "considered", "incomplete", "when", "either", ":", "-LRB-", "1", "-RRB-", "more", "than", "60", "items", "were", "left", "blank", "and", "less", "than", "35", "items", "were", "eaten", "at", "least", "once", "a", "month", ";", "or", "-LRB-", "2", "-RRB-", "one", "or", "more", "item", "blocks", "-LRB-", "groups", "of", "items", ",", "e.g.", ",", "beverages", "-RRB-", "were", "left", "blank", ".", "Additional", "details", "are", "given", "elsewhere", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "This", "resulted", "in", "the", "availability", "of", "3,048", "subcohort", "members", ",", "441", "colon", "cancer", "cases", "for", "whom", "MLH1", "expression", "status", "was", "known", ",", "and", "414", "colon", "and", "136", "rectal", "cancer", "cases", "for", "whom", "APC", "and", "KRAS", "mutation", "status", "was", "known", ".", "No", "data-analyses", "were", "conducted", "for", "lack", "of", "MLH1", "expression", "in", "rectal", "cancer", "cases", "since", "there", "were", "only", "two", "such", "cases", "in", "the", "cohort", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "Intake", "of", "specific", "fatty", "acids", "was", "based", "on", "a", "food", "composition", "database", "with", "specific", "fatty", "acids", "derived", "from", "the", "TRANSFAIR", "study", "-LSB-", "30", "-RSB-", ".", "For", "this", "database", ",", "the", "hundred", "foods", "that", "contributed", "most", "to", "fat", "intake", "in", "the", "Dutch", "dietary", "pattern", "were", "sampled", "and", "analyzed", "as", "methyl", "esters", "of", "the", "fatty", "acids", "present", "in", "the", "foods", ".", "In", "the", "database", ",", "total", "fat", "includes", "triglycerides", "and", "other", "lipids", "such", "as", "phospholipids", "and", "sterols", ".", "The", "percentage", "of", "triglycerides", "in", "total", "fat", "is", "assumed", "to", "be", "93", "%", "on", "average", ",", "but", "varies", "across", "food", "sources", ".", "Daily", "intakes", "of", "total", "fat", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "saturated", "fat", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "monounsaturated", "fat", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "polyunsaturated", "fat", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "and", "linoleic", "acid", "-LRB-", "C18", ":", "2", ",", "C9", ",", "12", "-RRB-", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "and", "linolenic", "acid", "-LRB-", "C18", ":", "3", ",", "C9", ",", "12", ",", "15", "-RRB-", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "as", "the", "main", "constituents", "of", "polyunsaturated", "fat", ",", "were", "used", "as", "exposure", "variables", ".", "Linoleic", "and", "linolenic", "acid", "were", "used", "as", "the", "most", "abundant", "sources", "of", "ω-6", "polyunsaturated", "fatty", "acids", "and", "ω-3", "polyunsaturated", "fatty", "acids", "in", "the", "diet", ".", "In", "all", "analyses", ",", "the", "values", "for", "fat", "intake", "variables", "are", "adjusted", "for", "energy", "intake", "by", "the", "residual", "method", "-LSB-", "31", "-RSB-", ".", "For", "data", "analyses", ",", "quartiles", "of", "the", "intake", "of", "fat", "and", "different", "types", "of", "fats", "were", "computed", "based", "on", "the", "distribution", "of", "subcohort", "members", ".", "Daily", "intake", "of", "dietary", "fiber", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "alcohol", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "fruit", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "vegetables", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "and", "total", "energy", "-LRB-", "kJ/day", "-RRB-", "and", "age", "at", "baseline", "-LRB-", "years", "-RRB-", ",", "sex", "-LRB-", "men/women", "-RRB-", ",", "body", "mass", "index", "-LRB-", "kg/m2", "-RRB-", ",", "non-occupational", "physical", "activity", "-LRB-", "<", "30", "min/day", ",", "30", "--", "60", "min/day", ",", "60", "--", "90", "min/day", ",", ">", "90", "min/day", "-RRB-", ",", "family", "history", "of", "colorectal", "cancer", "-LRB-", "yes/no", "-RRB-", "and", "smoking", "status", "-LRB-", "never/ex/current", "-RRB-", "were", "regarded", "as", "potential", "confounders", ".", "Statistical", "analysis", "Data", "analyses", "were", "based", "on", "study", "participants", "for", "whom", "data", "on", "fat", "intake", "and", "confounding", "variables", "were", "complete", ",", "i.e.", ",", "2,948", "subcohort", "members", ",", "428", "colon", "cancer", "patients", "for", "whom", "MLH1", "expression", "status", "was", "known", ",", "and", "401", "colon", "cancer", "and", "130", "rectal", "cancer", "patients", "for", "whom", "APC", "and", "KRAS", "mutation", "status", "was", "known", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "Data", "analyses", "were", "conducted", "separately", "for", "overall", "colon", "and", "rectal", "cancer", ",", "colon", "cancer", "lacking", "MLH1", "expression", ",", "colon", "and", "rectal", "cancer", "with", "or", "without", "a", "truncating", "APC", "mutation", ",", "described", "here", "as", "APC", "+", "and", "APC", "−", "tumors", "respectively", ".", "Truncating", "APC", "mutations", "lead", "to", "the", "introduction", "of", "a", "stop", "codon", "and", "result", "in", "a", "truncated", "and", "therefore", ",", "inactive", "APC", "protein", ".", "The", "analyses", "with", "truncating", "APC", "mutations", "were", "also", "conducted", "separately", "for", "the", "most", "common", "point", "mutations", "resulting", "in", "the", "introduction", "of", "a", "stop", "codon", ",", "i.e.", ",", "C", ":", "G", "→", "T", ":", "A", "or", "G", ":", "C", "→", "T", ":", "A", "point", "mutations", ".", "As", "indicated", "previously", ",", "associations", "between", "fat", "intake", "and", "KRAS", "mutated", "tumors", "have", "been", "described", "in", "this", "population", "previously", ",", "and", "a", "positive", "association", "between", "the", "intake", "of", "linoleic", "acid", "and", "KRAS", "mutated", "colon", "tumors", "was", "observed", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "Therefore", ",", "when", "-LRB-", "borderline", "-RRB-", "significant", "associations", "were", "observed", "with", "any", "of", "the", "colon", "tumor", "endpoints", ",", "analyses", "were", "repeated", "excluding", "tumors", "harboring", "mutations", "in", "KRAS", ".", "Since", "tumors", "may", "harbor", "multiple", "mutations", "it", "is", "difficult", "to", "assess", "whether", "observed", "associations", "are", "specific", "for", "tumors", "with", "a", "particular", "gene", "defect", ".", "We", "therefore", ",", "conducted", "additional", "analyses", "when", "-LRB-", "borderline", "-RRB-", "significant", "associations", "were", "observed", ".", "In", "these", "analyses", "subgroups", "of", "tumors", "were", "formed", "characterized", "by", "either", "the", "absence", "of", "the", "three", "gene", "defects", ",", "or", "by", "defects", "in", "a", "single", "gene", ",", "i.e.", ",", "either", "only", "lack", "of", "MLH1", "expression", ",", "only", "a", "truncating", "APC", "mutation", "or", "only", "an", "activating", "KRAS", "mutations", ".", "Activating", "KRAS", "mutations", "are", "defined", "as", "mutations", "in", "codons", "12", "and", "13", "of", "the", "KRAS", "gene", "leading", "to", "an", "altered", "amino", "acid", ".", "Mean", "values", "of", "the", "intake", "of", "fat", "variables", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "and", "possible", "confounding", "variables", "including", "age", "at", "baseline", "-LRB-", "years", "-RRB-", ",", "dietary", "fiber", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "alcohol", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "intake", "of", "fruit", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "vegetable", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", ",", "energy", "-LRB-", "kJ/day", "-RRB-", ",", "and", "BMI", "-LRB-", "kg/m2", "-RRB-", ",", "as", "well", "as", "distributions", "of", "the", "variables", "sex", ",", "family", "history", "of", "colorectal", "cancer", "-LRB-", "yes/no", "-RRB-", ",", "smoking", "status", "-LRB-", "never/ex/current", "smoker", "-RRB-", "and", "physical", "activity", "in", "leisure", "time", "-LRB-", "<", "30", ",", "30", "--", "60", ",", "60", "--", "90", ",", ">", "90", "min/day", "-RRB-", "were", "evaluated", "for", "subcohort", "members", ",", "colon", "and", "rectal", "cancer", "patients", "with", "or", "without", "a", "truncating", "APC", "mutation", "and", "colon", "cancer", "patients", "lacking", "MLH1", "expression", ".", "Differences", "in", "mean", "values", "of", "the", "continuous", "variables", "between", "patients", "with", "or", "without", "truncating", "nonsense", "or", "frameshift", "mutations", "in", "the", "mutation", "cluster", "region", "of", "the", "APC", "gene", ",", "and", "between", "patients", "with", "or", "without", "MLH1", "expression", ",", "were", "tested", "using", "the", "Mann", "--", "Whitney-U-test", "since", "the", "variables", "were", "not", "normally", "distributed", "among", "cases", ".", "The", "distributions", "of", "the", "categorical", "variables", "between", "patients", "with", "and", "without", "truncating", "APC", "mutations", "were", "tested", "with", "the", "χ2", "--", "test", ".", "Incidence", "rate", "ratios", "-LRB-", "RR", "-RRB-", "and", "corresponding", "95", "%", "confidence", "intervals", "-LRB-", "CI", "-RRB-", "for", "colon", "and", "rectal", "cancer", "patients", "were", "estimated", "according", "to", "quartiles", "of", "intake", "of", "fat", "variables", ",", "and", "one", "standard", "deviation", "increment", "of", "intake", ",", "using", "Cox", "proportional", "hazards", "regression", "models", ".", "In", "addition", ",", "associations", "were", "estimated", "for", "specific", "molecular", "endpoints", "of", "the", "tumors", ".", "Standard", "errors", "were", "estimated", "using", "the", "robust", "Huber", "--", "White", "sandwich", "estimator", "to", "account", "for", "additional", "variance", "introduced", "by", "sampling", "the", "subcohort", "from", "the", "entire", "cohort", "-LSB-", "32", ",", "33", "-RSB-", ".", "The", "proportional", "hazards", "assumption", "was", "tested", "using", "the", "scaled", "Schoenfeld", "residuals", "-LSB-", "34", "-RSB-", ".", "Tests", "for", "dose", "response", "trends", "over", "the", "different", "quartiles", "and", "categories", "of", "fat", "intake", "were", "estimated", "by", "fitting", "the", "ordinal", "exposure", "variables", "as", "continuous", "variables", "and", "evaluated", "using", "the", "Wald", "test", ".", "The", "covariates", "included", "in", "the", "multivariate", "analyses", "were", "those", "found", "to", "significantly", "-LRB-", "p", "<", "0.05", "-RRB-", "contribute", "to", "the", "multivariate", "model", "for", "colon", "and/or", "rectal", "cancer", "-LRB-", "age", "at", "baseline", ",", "sex", ",", "body", "mass", "index", ",", "family", "history", "of", "colorectal", "cancer", ",", "and", "smoking", "status", "-RRB-", "or", "to", "influence", "the", "RR", "by", "more", "than", "ten", "percent", ",", "as", "well", "as", "energy", "intake", ".", "Results", "Lack", "of", "expression", "in", "MLH1", "was", "observed", "in", "13", "%", "-LRB-", "54", "out", "of", "428", "-RRB-", "of", "tumors", "from", "colon", "cancer", "patients", "-LRB-", "Table", "1", "-RRB-", ".", "APC", "truncating", "mutations", "were", "observed", "in", "tumors", "from", "32", "%", "of", "colon", "cancer", "patients", "-LRB-", "127", "out", "of", "401", "-RRB-", "and", "44", "%", "of", "rectal", "cancer", "patients", "-LRB-", "57", "out", "of", "130", "-RRB-", "-LRB-", "Table", "1", "-RRB-", ".", "C", ":", "G", "→", "T", ":", "A", "transitions", "or", "G", ":", "C", "→", "T", ":", "A", "transversions", "that", "would", "result", "in", "a", "stop", "codon", "were", "observed", "in", "10", "%", "and", "5", "%", "of", "colon", "cancer", "patients", "and", "12", "%", "and", "5", "%", "of", "rectal", "cancer", "patients", ",", "respectively", ".", "These", "figures", "are", "similar", "to", "the", "percentages", "reported", "for", "the", "total", "group", "of", "colon", "and", "rectal", "cancer", "patients", "for", "whom", "APC", "mutation", "status", "was", "available", ",", "but", "for", "whom", "dietary", "intake", "data", "were", "not", "always", "complete", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "Table", "1Baseline", "dietary", "intake", "and", "other", "characteristics", "of", "the", "subcohort", "and", "colon", "and", "rectum", "cancer", "patients", "from", "The", "Netherlands", "cohort", "studySubcohortColon", "cancer", "-LRB-", "n", "=", "428", "-RRB-", "p-valuebColon", "cancer", "-LRB-", "n", "=", "401", "-RRB-", "p-valuebRectal", "cancer", "-LRB-", "n", "=", "130", "-RRB-", "p-valuebMLH1", "expressionaNo", "MLH1", "expressionaAPC", "−", "cAPC", "+", "cAPC", "−", "cAPC", "+", "cN2", ",948374542741277357", "Sex", "-LRB-", "%", "men", "-RRB-", "4856410.0452560.4964670.79", "Age", "-LRB-", "years", "-RRB-", "61.3", "±", "4.263.0", "±", "4.062.8", "±", "4.50.9163.1", "±", "4.062.7", "±", "4.00.3462.2", "±", "4.462.6", "±", "3.50.63", "Fat", "variables", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "d", "Total", "fat83", ".8", "±", "15.885.1", "±", "14.784.1", "±", "17.50.5785.2", "±", "15.084.8", "±", "14.90.8085.1", "±", "14.286.7", "±", "14.80.52", "Saturated", "fat33", ".2", "±", "7.533.5", "±", "6.633.3", "±", "7.60.6433.3", "±", "6.733.5", "±", "7.00.9233.0", "±", "5.835.5", "±", "7.70.05", "MUFAe31", ".4", "±", "7.031.9", "±", "6.531.1", "±", "7.50.4531.8", "±", "6.631.9", "±", "6.60.9831.8", "±", "6.132.8", "±", "6.20.37", "PUFAf17", ".3", "±", "7.517.9", "±", "7.517.4", "±", "6.80.8518.2", "±", "7.317.8", "±", "7.60.4418.6", "±", "8.716.5", "±", "6.90.27", "Linoleic", "acid16", ".0", "±", "7.516.7", "±", "7.516.6", "±", "7.00.7617.0", "±", "7.416.6", "±", "7.70.3617.5", "±", "8.815.2", "±", "7.20.15", "Linolenic", "acid1", ".3", "±", "0.61.2", "±", "0.51.3", "±", "0.60.981.2", "±", "0.51.3", "±", "0.50.571.3", "±", "0.61.3", "±", "0.60.79", "Other", "dietary", "factors", "Fibre", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "27.0", "±", "8.224.5", "±", "8.125.2", "±", "7.10.1326.7", "±", "7.927.9", "±", "8.10.2028.1", "±", "7.028.2", "±", "9.00.78", "Alcohol", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "g10", ".1", "±", "14.111.0", "±", "14.810.7", "±", "17.00.4911.0", "±", "14.911.3", "±", "16.50.8912.2", "±", "14.914.5", "±", "18.10.53", "Fruit", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "177.0", "±", "118.0178.8", "±", "122.1160.5", "±", "137.70.07169.7", "±", "121.9187.5", "±", "132.20.11197.4", "±", "155.1205.0", "±", "118.30.21", "Vegetables", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "193.8", "±", "82.2191.3", "±", "82.3185.4", "±", "73.80.80187.9", "±", "80.7192.7", "±", "85.20.71186.3", "±", "68.5169.0", "±", "122.20.69", "Energy", "-LRB-", "kj/day", "-RRB-", "8,028", "±", "2,1648,080", "±", "2,0597,505", "±", "1,7180.077,845", "±", "1,8998,335", "±", "2,3060.098,433", "±", "1,9248,449", "±", "1,6160.92", "Other", "characteristics", "BMIh", "-LRB-", "kg/m2", "-RRB-", "25.1", "±", "3.125.6", "±", "3.225.6", "±", "3.50.5725.5", "±", "3.2825.8", "±", "3.10.3025.3", "±", "3.125.1", "±", "2.80.92", "Family", "history", "of", "CRCi", "-LRB-", "%", "yes", "-RRB-", "61390.4911110.9810110.86", "Smoker", "-LRB-", "%", "-RRB-", "Never37373336382633", "Ex-smoker35453746434739", "Current", "smoker2818300", ".1218190.8827280.59", "Physical", "activity", "-LRB-", "%", "-RRB-", "g", "<", "30", "min/day21212219261726", "30-60", "min/day32332233282832", "60-90", "min/day21211922182418", ">", "90", "min/day2725370", ".2026270.3132250.43", "aFor", "rectal", "cancer", "there", "were", "only", "two", "patients", "without", "MLH1", "expression", ",", "these", "are", "not", "shown", "separately", "in", "this", "tablebp-value", "for", "the", "difference", "between", "cancer", "patients", "with", "and", "without", "MLH1", "expression", "and", "colon", "and", "rectal", "cancer", "patients", "with", "and", "without", "a", "mutation", "leading", "to", "the", "introduction", "of", "a", "stop", "codon", "in", "APCcAPC", "−", ":", "cancer", "patients", "without", "a", "mutation", "in", "the", "MCR", "of", "the", "APC", "gene", "leading", "to", "a", "stop", "codon", ";", "APC", "+", ":", "cancer", "patients", "with", "a", "mutation", "in", "the", "MCR", "of", "the", "APC", "gene", "leading", "to", "a", "stop", "codondAdjusted", "for", "energy", "intakeeMonounsaturated", "fatfPolyunsaturated", "fatgFor", "alcohol", "intake", "and", "physical", "activity", "the", "mean", "levels", "in", "the", "subcohort", "are", "based", "on", "2,862", "and", "2,915", "subjects", "respectively", ".", "Four", "and", "six", "colon", "cancer", "cases", "had", "missing", "values", "for", "alcohol", "intake", "and", "physical", "activity", "respectively", ".", "Two", "and", "one", "rectal", "cancer", "case", "had", "missing", "values", "for", "alcohol", "intake", "and", "physical", "activity", "respectivelyhBMI", ":", "body", "mass", "indexiCRC", ":", "colorectal", "cancer", "Colon", "and", "rectal", "cancer", "patients", "were", "generally", "older", "and", "more", "frequently", "men", "than", "subcohort", "members", "-LRB-", "Table", "1", "-RRB-", ".", "Colon", "cancer", "patients", "lacking", "MLH1", "expression", "in", "their", "tumor", "were", "significantly", "less", "often", "men", "than", "patients", "with", "expression", "of", "the", "gene", "-LRB-", "41", "%", "vs.", "56", "%", "-RRB-", ".", "There", "were", "no", "striking", "differences", "in", "fat", "intake", "between", "patients", "and", "subcohort", "members", "or", "between", "patients", "with", "or", "without", "MLH1", "expression", "or", "APC", "mutations", "in", "their", "tumors", ".", "Only", "rectal", "cancer", "patients", "with", "a", "tumor", "harboring", "a", "truncating", "APC", "mutation", "had", "a", "higher", "intake", "of", "saturated", "fat", "than", "rectal", "cancer", "patients", "without", "a", "truncating", "APC", "mutation", "-LRB-", "p", "=", "0.05", "-RRB-", ".", "Neither", "total", "fat", "nor", "different", "types", "of", "fat", "appeared", "to", "be", "associated", "with", "overall", "colon", "cancer", "risk", "in", "this", "population", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "For", "different", "subgroups", "of", "colon", "cancer", "based", "on", "absence", "of", "MLH1", "expression", "or", "absence", "or", "presence", "of", "APC", "truncating", "mutations", "in", "their", "tumors", ",", "total", "fat", "intake", "and", "most", "of", "the", "specific", "types", "of", "fat", "intake", "variables", "were", "also", "not", "associated", "with", "risk", ".", "However", ",", "polyunsaturated", "fat", "intake", ",", "and", "especially", "linoleic", "acid", "intake", ",", "appeared", "to", "be", "associated", "with", "an", "increased", "risk", "of", "colon", "tumors", "without", "MLH1", "expression", "and", "with", "colon", "tumors", "without", "APC", "truncating", "mutations", ",", "but", "not", "with", "colon", "tumors", "with", "APC", "truncating", "mutations", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "For", "colon", "tumors", "without", "MLH1", "expression", ",", "the", "RR", "according", "to", "the", "quartiles", "of", "linoleic", "acid", "intake", "were", "increased", ",", "though", "not", "significantly", ",", "for", "all", "the", "categories", "of", "intake", "above", "the", "reference", "-LRB-", "lowest", "quartile", "of", "intake", "-RRB-", ",", "i.e.", ",", "1.66", "-LRB-", "95", "%", "CI", "0.69", "--", "3.98", "-RRB-", ",", "2.14", "-LRB-", "95", "%", "CI", "0.91", "--", "5.00", "-RRB-", "and", "2.02", "-LRB-", "95", "%", "CI", "0.86", "--", "4.76", "-RRB-", "for", "the", "second", "through", "the", "fourth", "quartiles", "respectively", ",", "and", "the", "test", "for", "linear", "trend", "was", "borderline", "significant", "-LRB-", "p", "=", "0.08", "-RRB-", ".", "A", "similar", "trend", "was", "observed", "for", "the", "risk", "of", "colon", "tumors", "without", "APC", "truncating", "mutations", "-LRB-", "RR", "over", "the", "quartiles", "of", "linoleic", "acid", "intake", ":", "1.50", "-LRB-", "95", "%", "CI", "1.02", "--", "2.21", "-RRB-", ",", "1.68", "-LRB-", "95", "%", "CI", "1.15", "--", "2.45", "-RRB-", "and", "1.44", "-LRB-", "95", "%", "CI", "0.99", "--", "2.11", "-RRB-", "respectively", ",", "p-trend", "=", "0.05", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "Additional", "analyses", "for", "subgroups", "of", "colon", "tumors", "with", "specific", "truncating", "point", "mutations", "in", "APC", "did", "not", "show", "any", "associations", "with", "the", "intake", "of", "fat", "or", "different", "types", "of", "fat", "-LRB-", "results", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Table", "2Adjusted", "incidence", "rate", "ratios", "and", "95", "%", "confidence", "intervals", "for", "colon", "cancer", "patients", "overall", ",", "without", "MLH1", "expression", ",", "and", "with", "and", "without", "an", "APC", "mutation", "leading", "to", "a", "stop", "codon", ",", "according", "to", "the", "intake", "of", "fat", "variables", "-LRB-", "The", "Netherlands", "Cohort", "Study", "-RRB-", "Dietary", "fat", "intakeMedian", "intake", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "Person", "yearsbColon", "cancerOverallNo", "MLH1", "expressionAPC", "--", "aAPC", "+", "aMenWomenNumber", "of", "patientsRRc", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "cNumber", "of", "patientsRRc", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "cNumber", "of", "patientsRRc", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "cNumber", "of", "patientsRRc", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "cTotal", "fat", "Q178", ".063.03,5491101.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "111.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "611.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "401.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q290", ".271.43,5561251.09", "-LRB-", "0.82", "--", "1.44", "-RRB-", "171.47", "-LRB-", "0.69", "--", "3.14", "-RRB-", "871.34", "-LRB-", "0.94", "--", "1.90", "-RRB-", "320.80", "-LRB-", "0.49", "--", "1.28", "-RRB-", "Q398", ".577.63,579890.75", "-LRB-", "0.55", "--", "1.01", "-RRB-", "110.94", "-LRB-", "0.40", "--", "2.17", "-RRB-", "550.82", "-LRB-", "0.56", "--", "1.21", "-RRB-", "240.57", "-LRB-", "0.33", "--", "0.96", "-RRB-", "Q4108", ".885.33,5881100.96", "-LRB-", "0.72", "--", "1.28", "-RRB-", "151.30", "-LRB-", "0.59", "--", "2.86", "-RRB-", "711.11", "-LRB-", "0.77", "--", "1.59", "-RRB-", "310.74", "-LRB-", "0.46", "--", "1.20", "-RRB-", "p-valued0.290", ".820.710.13", "1SD", "incremente1", ".00", "-LRB-", "0.88", "--", "1.13", "-RRB-", "1.21", "-LRB-", "0.82", "--", "1.77", "-RRB-", "1.04", "-LRB-", "0.89", "--", "1.22", "-RRB-", "0.93", "-LRB-", "0.76", "--", "1.14", "-RRB-", "Saturated", "fat", "Q128", ".923.93,567991.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "91.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "591.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "331.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q233", ".727.83,5501201.20", "-LRB-", "0.89", "--", "1.61", "-RRB-", "141.48", "-LRB-", "0.63", "--", "3.49", "-RRB-", "841.38", "-LRB-", "0.97", "--", "1.97", "-RRB-", "300.94", "-LRB-", "0.55", "--", "1.61", "-RRB-", "Q338", ".330.93,5831151.11", "-LRB-", "0.82", "--", "1.49", "-RRB-", "191.93", "-LRB-", "0.86", "--", "4.32", "-RRB-", "731.15", "-LRB-", "0.79", "--", "1.66", "-RRB-", "331.01", "-LRB-", "0.60", "--", "1.68", "-RRB-", "Q445", ".836.63,5711000.94", "-LRB-", "0.69", "--", "1.27", "-RRB-", "121.25", "-LRB-", "0.52", "--", "3.00", "-RRB-", "580.90", "-LRB-", "0.62", "--", "1.32", "-RRB-", "310.89", "-LRB-", "0.53", "--", "1.48", "-RRB-", "p-valued0.540", ".480.350.72", "1SD", "incremente0", ".97", "-LRB-", "0.87", "--", "1.08", "-RRB-", "1.12", "-LRB-", "0.82", "--", "1.51", "-RRB-", "0.95", "-LRB-", "0.83", "--", "1.09", "-RRB-", "0.95", "-LRB-", "0.79", "--", "1.14", "-RRB-", "MUFAf", "Q128", ".222.43,546981.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "111.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "561.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "311.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q233", ".226.03,5461221.20", "-LRB-", "0.89", "--", "1.61", "-RRB-", "141.15", "-LRB-", "0.52", "--", "2.53", "-RRB-", "791.33", "-LRB-", "0.92", "--", "1.91", "-RRB-", "361.18", "-LRB-", "0.72", "--", "1.95", "-RRB-", "Q336", ".928.93,5801131.12", "-LRB-", "0.83", "--", "1.52", "-RRB-", "141.15", "-LRB-", "0.52", "--", "2.54", "-RRB-", "761.30", "-LRB-", "0.89", "--", "1.89", "-RRB-", "311.03", "-LRB-", "0.60", "--", "1.77", "-RRB-", "Q442", ".533.13,6001010.99", "-LRB-", "0.73", "--", "1.34", "-RRB-", "151.25", "-LRB-", "0.58", "--", "2.71", "-RRB-", "631.08", "-LRB-", "0.74", "--", "1.57", "-RRB-", "290.90", "-LRB-", "0.54", "--", "1.52", "-RRB-", "p-valued0.790", ".590.800.57", "1SD", "incremente0", ".99", "-LRB-", "0.88", "--", "1.12", "-RRB-", "1.04", "-LRB-", "0.73", "--", "1.46", "-RRB-", "1.01", "-LRB-", "0.87", "--", "1.17", "-RRB-", "0.98", "-LRB-", "0.81", "--", "1.18", "-RRB-", "PUFAg", "Q111", ".68.83,507911.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "81.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "491.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "321.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q216", ".012.43,5621181.37", "-LRB-", "1.02", "--", "1.86", "-RRB-", "162.03", "-LRB-", "0.86", "--", "4.81", "-RRB-", "731.55", "-LRB-", "1.06", "--", "2.28", "-RRB-", "331.13", "-LRB-", "0.68", "--", "1.89", "-RRB-", "Q320", ".916.23,6181131.24", "-LRB-", "0.91", "--", "1.68", "-RRB-", "162.00", "-LRB-", "0.84", "--", "4.76", "-RRB-", "781.57", "-LRB-", "1.07", "--", "2.31", "-RRB-", "300.96", "-LRB-", "0.57", "--", "1.62", "-RRB-", "Q429", ".322.53,5801121.21", "-LRB-", "0.89", "--", "1.63", "-RRB-", "141.75", "-LRB-", "0.72", "--", "4.24", "-RRB-", "741.47", "-LRB-", "1.01", "--", "2.16", "-RRB-", "320.98", "-LRB-", "0.59", "--", "1.63", "-RRB-", "p-valued0.380", ".260.060.79", "1SD", "incremente1", ".03", "-LRB-", "0.94", "--", "1.14", "-RRB-", "1.07", "-LRB-", "0.82", "--", "1.38", "-RRB-", "1.09", "-LRB-", "0.97", "--", "1.23", "-RRB-", "1.00", "-LRB-", "0.84", "--", "1.19", "-RRB-", "Linoleic", "acid", "Q110", ".07.53,509861.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "81.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "491.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "261.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q214", ".811.23,5861221.49", "-LRB-", "1.10", "--", "2.02", "-RRB-", "131.66", "-LRB-", "0.69", "--", "3.98", "-RRB-", "711.50", "-LRB-", "1.02", "--", "2.21", "-RRB-", "401.65", "-LRB-", "0.99", "--", "2.76", "-RRB-", "Q319", ".514.93,5991121.32", "-LRB-", "0.97", "--", "1.79", "-RRB-", "172.14", "-LRB-", "0.91", "--", "5.00", "-RRB-", "821.68", "-LRB-", "1.15", "--", "2.45", "-RRB-", "251.00", "-LRB-", "0.57", "--", "1.76", "-RRB-", "Q428", ".021.23,5741141.30", "-LRB-", "0.96", "--", "1.77", "-RRB-", "162.02", "-LRB-", "0.86", "--", "4.76", "-RRB-", "721.44", "-LRB-", "0.99", "--", "2.11", "-RRB-", "361.35", "-LRB-", "0.80", "--", "2.28", "-RRB-", "p-valued0.200", ".080.050.65", "1SD", "incremente1", ".06", "-LRB-", "0.96", "--", "1.17", "-RRB-", "1.15", "-LRB-", "0.90", "--", "1.48", "-RRB-", "1.12", "-LRB-", "0.99", "--", "1.26", "-RRB-", "1.02", "-LRB-", "0.86", "--", "1.21", "-RRB-", "Linolenic", "acid", "Q10", ".80.63,5181071.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "111.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "681.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "311.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q21", ".20.93,5741040.95", "-LRB-", "0.70", "--", "1.30", "-RRB-", "171.32", "-LRB-", "0.60", "--", "2.89", "-RRB-", "720.99", "-LRB-", "0.68", "--", "1.43", "-RRB-", "240.84", "-LRB-", "0.47", "--", "1.49", "-RRB-", "Q31", ".51.23,5711171.10", "-LRB-", "0.82", "--", "1.48", "-RRB-", "110.91", "-LRB-", "0.40", "--", "2.10", "-RRB-", "620.89", "-LRB-", "0.62", "--", "1.29", "-RRB-", "431.48", "-LRB-", "0.91", "--", "2.40", "-RRB-", "Q42", ".01.63,6041061.01", "-LRB-", "0.76", "--", "1.36", "-RRB-", "151.32", "-LRB-", "0.61", "--", "2.84", "-RRB-", "721.08", "-LRB-", "0.76", "--", "1.53", "-RRB-", "290.97", "-LRB-", "0.57", "--", "1.65", "-RRB-", "p-valued0.680", ".730.820.52", "1SD", "incremente0", ".98", "-LRB-", "0.89", "--", "1.09", "-RRB-", "1.07", "-LRB-", "0.79", "--", "1.44", "-RRB-", "0.97", "-LRB-", "0.85", "--", "1.10", "-RRB-", "1.01", "-LRB-", "0.86", "--", "1.19", "-RRB-", "aAPC", "−", ":", "cancer", "patients", "without", "a", "mutation", "in", "the", "MCR", "of", "the", "APC", "gene", "leading", "to", "a", "stop", "codon", ";", "APC", "+", ":", "cancer", "patients", "with", "a", "mutation", "in", "the", "MCR", "of", "the", "APC", "gene", "leading", "to", "a", "stop", "codonbPerson", "years", "at", "risk", "are", "estimated", "from", "the", "subcohortcIncidence", "rate", "ratios", "-LRB-", "RR", "-RRB-", "and", "95", "%", "confidence", "intervals", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "are", "adjusted", "for", "age", ",", "sex", ",", "body", "mass", "index", ",", "smoking", ",", "energy", "intake", "and", "family", "history", "of", "colorectal", "cancerdp-value", "for", "trend", "over", "the", "quartiles", "of", "intake", "of", "fat", "variableseFor", "1", "standard", "deviation", "of", "intake", "of", "fat", "in", "the", "subcohort", "-LRB-", "see", "Table", "1", "-RRB-", ";", "i.e.", ",", "15.8", "g/day", "for", "total", "fat", ",", "7.5", "g/day", "for", "saturated", "fat", ",", "7.0", "g/day", "for", "monounsaturated", "fat", ",", "7.5", "g/day", "for", "polyunsaturated", "fat", ",", "7.5", "g/day", "for", "linoleic", "acid", "and", "0.6", "g/day", "for", "linolenic", "acidfMonounsaturated", "fatgPolyunsaturated", "fat", "For", "overall", "rectal", "cancer", ",", "associations", "with", "the", "intake", "of", "total", "fat", "or", "different", "types", "of", "fat", "were", "not", "observed", "-LRB-", "Table", "3", "-RRB-", ".", "Also", "after", "taking", "account", "of", "truncating", "APC", "mutations", "in", "rectal", "tumors", ",", "none", "of", "the", "fat", "intake", "variables", "were", "significantly", "associated", "with", "risk", "of", "rectal", "cancer", ".", "Only", "the", "intake", "of", "saturated", "fat", "appeared", "to", "be", "inversely", "associated", "with", "rectal", "tumors", "without", "APC", "truncating", "mutations", "-LRB-", "RR", "for", "the", "highest", "versus", "the", "lowest", "quartile", "of", "intake", ":", "0.46", "-LRB-", "95", "%", "CI", "0.22", "--", "0.97", "-RRB-", ",", "p-trend", "=", "0.07", "-RRB-", "-LRB-", "Table", "3", "-RRB-", ".", "For", "rectal", "tumors", "with", "specific", "types", "of", "APC", "truncating", "mutations", "no", "associations", "were", "observed", "with", "any", "of", "the", "fat", "intake", "variables", "-LRB-", "results", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Table", "3Adjusted", "incidence", "rate", "ratios", "and", "95", "%", "confidence", "intervals", "for", "rectal", "cancer", "patients", "overall", ",", "and", "with", "and", "without", "an", "APC", "mutation", "leading", "to", "a", "stop", "codon", ",", "according", "to", "the", "intake", "of", "fat", "variables", ".", "-LRB-", "The", "Netherlands", "Cohort", "Study", "-RRB-", "Dietary", "fat", "intakeMedian", "intake", "-LRB-", "g/day", "-RRB-", "Person", "yearsbRectal", "cancerOverallAPC", "−", "aAPC", "+", "aMenWomenNumber", "of", "patientsRRc", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "cNumber", "of", "patientsRRc", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "cNumber", "of", "patientsRRc", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "cTotal", "fat", "Q178", ".063.03,549431.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "241.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "151.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q290", ".271.43,556390.89", "-LRB-", "0.56", "--", "1.39", "-RRB-", "170.70", "-LRB-", "0.37", "--", "1.34", "-RRB-", "120.79", "-LRB-", "0.36", "--", "1.70", "-RRB-", "Q398", ".577.63,579330.74", "-LRB-", "0.46", "--", "1.19", "-RRB-", "160.65", "-LRB-", "0.33", "--", "1.26", "-RRB-", "140.91", "-LRB-", "0.43", "--", "1.90", "-RRB-", "Q4108", ".885.33,588380.87", "-LRB-", "0.55", "--", "1.36", "-RRB-", "150.60", "-LRB-", "0.31", "--", "1.16", "-RRB-", "161.06", "-LRB-", "0.51", "--", "2.19", "-RRB-", "p-valued0.420", ".130.80", "1SD", "incremente0", ".91", "-LRB-", "0.76", "--", "1.09", "-RRB-", "0.84", "-LRB-", "0.65", "--", "1.08", "-RRB-", "0.94", "-LRB-", "0.69", "--", "1.28", "-RRB-", "Saturated", "fat", "Q128", ".923.93,567431.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "231.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "141.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q233", ".727.83,550340.80", "-LRB-", "0.49", "--", "1.29", "-RRB-", "180.81", "-LRB-", "0.42", "--", "1.56", "-RRB-", "120.87", "-LRB-", "0.39", "--", "1.91", "-RRB-", "Q338", ".330.93,583441.02", "-LRB-", "0.66", "--", "1.59", "-RRB-", "210.92", "-LRB-", "0.49", "--", "1.73", "-RRB-", "120.86", "-LRB-", "0.40", "--", "1.88", "-RRB-", "Q445", ".836.63,571330.74", "-LRB-", "0.46", "--", "1.18", "-RRB-", "110.46", "-LRB-", "0.22", "--", "0.97", "-RRB-", "191.30", "-LRB-", "0.65", "--", "2.63", "-RRB-", "p-valued0.380", ".070.47", "1SD", "incremente0", ".95", "-LRB-", "0.81", "--", "1.12", "-RRB-", "0.81", "-LRB-", "0.65", "--", "1.02", "-RRB-", "1.16", "-LRB-", "0.89", "--", "1.50", "-RRB-", "MUFAf", "Q128", ".222.43,546441.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "231.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "151.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q233", ".226.03,546310.70", "-LRB-", "0.44", "--", "1.13", "-RRB-", "180.79", "-LRB-", "0.41", "--", "1.49", "-RRB-", "90.62", "-LRB-", "0.27", "--", "1.43", "-RRB-", "Q336", ".928.93,580400.91", "-LRB-", "0.58", "--", "1.44", "-RRB-", "150.67", "-LRB-", "0.34", "--", "1.33", "-RRB-", "201.36", "-LRB-", "0.67", "--", "2.78", "-RRB-", "Q442", ".533.13,600390.88", "-LRB-", "0.56", "--", "1.37", "-RRB-", "170.72", "-LRB-", "0.38", "--", "1.36", "-RRB-", "130.88", "-LRB-", "0.40", "--", "1.90", "-RRB-", "p-valued0.820", ".280.76", "1SD", "incremente0", ".94", "-LRB-", "0.78", "--", "1.12", "-RRB-", "0.85", "-LRB-", "0.67", "--", "1.08", "-RRB-", "1.00", "-LRB-", "0.76", "--", "1.33", "-RRB-", "PUFAg", "Q111", ".68.83,507451.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "171.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "211.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q216", ".012.43,562320.74", "-LRB-", "0.46", "--", "1.18", "-RRB-", "191.17", "-LRB-", "0.60", "--", "2.28", "-RRB-", "100.49", "-LRB-", "0.23", "--", "1.07", "-RRB-", "Q320", ".916.23,618390.86", "-LRB-", "0.55", "--", "1.34", "-RRB-", "160.94", "-LRB-", "0.47", "--", "1.88", "-RRB-", "160.76", "-LRB-", "0.39", "--", "1.48", "-RRB-", "Q429", ".322.53,580380.82", "-LRB-", "0.53", "--", "1.29", "-RRB-", "211.20", "-LRB-", "0.63", "--", "2.29", "-RRB-", "100.47", "-LRB-", "0.22", "--", "1.00", "-RRB-", "p-valued0.530", ".730.11", "1SD", "incremente0", ".98", "-LRB-", "0.83", "--", "1.16", "-RRB-", "1.06", "-LRB-", "0.84", "--", "1.34", "-RRB-", "0.78", "-LRB-", "0.60", "--", "1.03", "-RRB-", "Linoleic", "acid", "Q110", ".07.53,509391.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "181.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "181.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q214", ".811.23,586391.03", "-LRB-", "0.65", "--", "1.64", "-RRB-", "170.98", "-LRB-", "0.50", "--", "1.92", "-RRB-", "140.80", "-LRB-", "0.40", "--", "1.63", "-RRB-", "Q319", ".514.93,599350.90", "-LRB-", "0.56", "--", "1.44", "-RRB-", "160.90", "-LRB-", "0.45", "--", "1.79", "-RRB-", "150.84", "-LRB-", "0.42", "--", "1.68", "-RRB-", "Q428", ".021.23,574411.03", "-LRB-", "0.65", "--", "1.62", "-RRB-", "221.19", "-LRB-", "0.63", "--", "2.24", "-RRB-", "100.54", "-LRB-", "0.25", "--", "1.18", "-RRB-", "p-valued0.950", ".650.15", "1SD", "incremente0", ".99", "-LRB-", "0.84", "--", "1.17", "-RRB-", "1.09", "-LRB-", "0.86", "--", "1.38", "-RRB-", "0.79", "-LRB-", "0.60", "--", "1.04", "-RRB-", "Linolenic", "acid", "Q10", ".80.63,518421.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "181.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "181.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q21", ".20.93,574380.92", "-LRB-", "0.57", "--", "1.48", "-RRB-", "201.16", "-LRB-", "0.58", "--", "2.31", "-RRB-", "100.55", "-LRB-", "0.25", "--", "1.24", "-RRB-", "Q31", ".51.23,571360.87", "-LRB-", "0.55", "--", "1.38", "-RRB-", "150.87", "-LRB-", "0.43", "--", "1.75", "-RRB-", "130.72", "-LRB-", "0.35", "--", "1.48", "-RRB-", "Q42", ".01.63604380.92", "-LRB-", "0.58", "--", "1.44", "-RRB-", "201.13", "-LRB-", "0.60", "--", "2.14", "-RRB-", "160.90", "-LRB-", "0.45", "--", "1.80", "-RRB-", "p-valued0.680", ".930.91", "1SD", "incremente0", ".95", "-LRB-", "0.81", "--", "1.12", "-RRB-", "0.98", "-LRB-", "0.77", "--", "1.24", "-RRB-", "1.03", "-LRB-", "0.81", "--", "1.31", "-RRB-", "aAPC", "−", ":", "cancer", "patients", "without", "a", "mutation", "in", "the", "MCR", "of", "the", "APC", "gene", "leading", "to", "a", "stop", "codon", ";", "APC", "+", ":", "cancer", "patients", "with", "a", "mutation", "in", "the", "MCR", "of", "the", "APC", "gene", "leading", "to", "a", "stop", "codonbPerson", "years", "at", "risk", "are", "estimated", "from", "the", "subcohortcIncidence", "rate", "ratios", "-LRB-", "RR", "-RRB-", "and", "95", "%", "confidence", "intervals", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "are", "adjusted", "for", "age", ",", "sex", ",", "body", "mass", "index", ",", "smoking", ",", "energy", "intake", "and", "family", "history", "of", "colorectal", "cancerdp-value", "for", "trend", "over", "the", "quartiles", "of", "intake", "of", "fat", "variableseFor", "1", "standard", "deviation", "of", "intake", "of", "fat", "in", "the", "subcohort", "-LRB-", "see", "Table", "1", "-RRB-", ";", "i.e.", ",", "15.8", "g/day", "for", "total", "fat", ",", "7.5", "g/day", "for", "saturated", "fat", ",", "7.0", "g/day", "for", "monounsaturated", "fat", ",", "7.5", "g/day", "for", "polyunsaturated", "fat", ",", "7.5", "g/day", "for", "linoleic", "acid", "and", "0.6", "g/day", "for", "linolenic", "acidfMonounsaturated", "fatgPolyunsaturated", "fat", "Additional", "analyses", "were", "conducted", "to", "assess", "whether", "the", "observed", "associations", "of", "polyunsaturated", "fat", "intake", ",", "and", "especially", "linoleic", "acid", "intake", ",", "with", "the", "increased", "risk", "of", "colon", "tumors", "lacking", "MLH1", "expression", "and", "with", "the", "increased", "risk", "of", "colon", "tumors", "without", "APC", "truncating", "mutations", ",", "were", "observed", "because", "of", "an", "underlying", "association", "with", "colon", "tumors", "harboring", "a", "KRAS", "mutation", ",", "as", "previously", "observed", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "Excluding", "tumors", "with", "a", "KRAS", "mutation", "resulted", "in", "the", "absence", "of", "a", "statistically", "significant", "association", "of", "polyunsaturated", "fat", "intake", "and", "linoleic", "acid", "intake", "with", "colon", "tumors", "lacking", "MLH1", "expression", "-LRB-", "p-trend", "=", "0.34", "and", "0.12", ",", "respectively", "-RRB-", "and", "those", "lacking", "APC", "tuncating", "mutations", "-LRB-", "p-trend", "=", "0.77", "and", "0.99", ",", "respectively", "-RRB-", ".", "Intake", "of", "polyunsaturated", "fat", "or", "linoleic", "acid", "was", "neither", "associated", "with", "the", "risk", "of", "colon", "cancer", "without", "any", "of", "the", "three", "gene", "defects", ",", "nor", "with", "the", "risk", "of", "colon", "cancer", "only", "lacking", "MLH1", "expression", ",", "nor", "with", "the", "risk", "of", "colon", "cancer", "with", "only", "truncating", "APC", "mutations", "-LRB-", "Table", "4", "-RRB-", ".", "With", "increasing", "intake", "of", "polyunsaturated", "fat", "and", "of", "linoleic", "acid", ",", "a", "strongly", "increased", "risk", "of", "colon", "cancer", "with", "only", "activating", "KRAS", "mutations", "was", "observed", "-LRB-", "Table", "4", "-RRB-", "-LRB-", "p-trend", "≤", "0.001", "for", "both", "polyunsaturated", "fat", "and", "linoleic", "acid", "intake", "-RRB-", ".", "The", "RRs", "for", "one", "standard", "deviation", "increase", "in", "intake", "were", "1.40", "-LRB-", "95", "%", "CI", "1.17", "--", "1.68", "-RRB-", "and", "1.41", "-LRB-", "95", "%", "CI", "1.18", "--", "1.69", "-RRB-", ",", "respectively", ".", "The", "RRs", "for", "polyunsaturated", "fat", "-LRB-", "not", "shown", "-RRB-", "and", "linoleic", "acid", "intake", "were", "of", "similar", "size", "when", "estimated", "separately", "for", "men", "-LRB-", "1.41", ",", "95", "%", "CI", "1.15", "--", "1.72", "for", "1", "standard", "deviation", "increase", "in", "linoleic", "acid", "intake", "-RRB-", "and", "women", "-LRB-", "1.42", ",", "95", "%", "CI", "0.96", "--", "2.10", "-RRB-", ",", "and", "were", "elevated", "for", "proximal", "-LRB-", "1.23", ",", "95", "%", "CI", "0.99", "--", "1.53", "-RRB-", "and", "distal", "colon", "cancer", "-LRB-", "1.53", ",", "95", "%", "CI", "1.21", "--", "1.95", "-RRB-", ".", "Likewise", ",", "a", "positive", "association", "was", "observed", "for", "all", "colorectal", "cancers", "-LRB-", "1.24", ",", "95", "%", "CI", "1.06", "--", "1.47", "and", "p-trend", "=", "0.01", "-RRB-", ",", "based", "on", "a", "total", "of", "87", "cases", "-LRB-", "i.e.", ",", "including", "the", "rectosigmoid", "-RRB-", ".", "Table", "4Adjusted", "incidence", "rate", "ratios", "and", "95", "%", "confidence", "intervals", "for", "colon", "cancer", "patients", "without", "any", "of", "the", "gene", "defects", "or", "with", "only", "a", "single", "gene", "defect", ",", "i.e.", ",", "either", "lack", "of", "MLH1", "expression", ",", "a", "truncating", "APC", "gene", "mutation", "or", "an", "activating", "KRAS", "gene", "mutation", ",", "according", "to", "the", "intake", "of", "polyunsaturated", "fat", "and", "linoleic", "acid", "intake", "-LRB-", "The", "Netherlands", "Cohort", "Study", "-RRB-", "Dietary", "fat", "intakePerson", "yearseColon", "cancerNo", "gene", "defectsaOnly", "lack", "of", "MLH1", "expressionbOnly", "truncating", "APC", "mutationscOnly", "activating", "KRAS", "mutationsdNumber", "of", "patientsRRf", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "fNumber", "of", "patientsRRf", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "fNumber", "of", "patientsRRf", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "fNumber", "of", "patientsRRf", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "fPUFAgQ13", ",507391.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "61.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "181.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "41.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q23", ",562441.15", "-LRB-", "0.73", "--", "1.81", "-RRB-", "142.48", "-LRB-", "0.94", "--", "6.54", "-RRB-", "211.31", "-LRB-", "0.68", "--", "2.53", "-RRB-", "143.76", "-LRB-", "1.21", "--", "11.69", "-RRB-", "Q33", ",618451.10", "-LRB-", "0.70", "--", "1.73", "-RRB-", "111.89", "-LRB-", "0.69", "--", "5.16", "-RRB-", "150.86", "-LRB-", "0.43", "--", "1.74", "-RRB-", "195.00", "-LRB-", "1.67", "--", "14.99", "-RRB-", "Q43", ",580350.86", "-LRB-", "0.54", "--", "1.38", "-RRB-", "101.72", "-LRB-", "0.61", "--", "4.81", "-RRB-", "130.70", "-LRB-", "0.34", "--", "1.45", "-RRB-", "286.74", "-LRB-", "2.36", "--", "19.51", "-RRB-", "p-valueh0.510", ".480.19", "≤", "0.0011", "SD", "incrementi0", ".96", "-LRB-", "0.82", "--", "1.13", "-RRB-", "1.01", "-LRB-", "0.72", "--", "1.40", "-RRB-", "0.90", "-LRB-", "0.71", "--", "1.14", "-RRB-", "1.40", "-LRB-", "1.17", "--", "1.68", "-RRB-", "Linoleic", "acidQ13", ",509381.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "71.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "141.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "41.00", "-LRB-", "reference", "-RRB-", "Q23", ",586451.20", "-LRB-", "0.77", "--", "1.90", "-RRB-", "101.51", "-LRB-", "0.58", "--", "0.93", "-RRB-", "262.03", "-LRB-", "1.03", "--", "3.99", "-RRB-", "154.06", "-LRB-", "1.32", "--", "12.46", "-RRB-", "Q33", ",599451.15", "-LRB-", "0.73", "--", "1.81", "-RRB-", "142.08", "-LRB-", "0.84", "--", "5.19", "-RRB-", "130.99", "-LRB-", "0.46", "--", "2.13", "-RRB-", "215.61", "-LRB-", "1.88", "--", "16.68", "-RRB-", "Q43", ",574350.90", "-LRB-", "0.56", "--", "1.44", "-RRB-", "101.49", "-LRB-", "0.56", "--", "3.97", "-RRB-", "140.97", "-LRB-", "0.46", "--", "2.06", "-RRB-", "256.02", "-LRB-", "2.09", "--", "17.41", "-RRB-", "p-valueh0.620", ".300.38", "≤", "0.0011", "SD", "incrementi0", ".98", "-LRB-", "0.84", "--", "1.15", "-RRB-", "1.08", "-LRB-", "0.79", "--", "1.49", "-RRB-", "0.91", "-LRB-", "0.73", "--", "1.14", "-RRB-", "1.41", "-LRB-", "1.18", "--", "1.69", "-RRB-", "aColon", "cancer", "patients", "with", "MLH1", "expression", "and", "without", "truncating", "APC", "or", "activating", "KRAS", "gene", "mutationsbColon", "cancer", "patients", "lacking", "MLH1", "expression", "but", "without", "truncating", "APC", "or", "activating", "KRAS", "gene", "mutationscColon", "cancer", "patients", "with", "a", "truncating", "APC", "gene", "mutation", "but", "with", "MLH1", "expression", "and", "without", "activating", "KRAS", "gene", "mutationsdColon", "cancer", "patients", "with", "an", "activating", "KRAS", "gene", "mutations", "but", "with", "MLH1", "expression", "and", "without", "truncating", "APC", "gene", "mutationsePerson", "years", "at", "risk", "are", "estimated", "from", "the", "subcohort.fIncidence", "rate", "ratios", "-LRB-", "RR", "-RRB-", "and", "95", "%", "confidence", "intervals", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "are", "adjusted", "for", "age", ",", "sex", ",", "body", "mass", "index", ",", "smoking", ",", "energy", "intake", "and", "family", "history", "of", "colorectal", "cancer.gPolyunsaturated", "fathp-value", "for", "trend", "over", "the", "quartiles", "of", "intake", "of", "fat", "variablesiFor", "1standard", "deviation", "if", "intake", "of", "fat", "in", "the", "subcohort", "-LRB-", "see", "Table", "1", "-RRB-", ";", "i.e.", ",", "7.5", "g/day", "for", "polyunsaturated", "fat", "and", "7.5", "g/day", "for", "linoleic", "acid", "Likewise", ",", "additional", "analyses", "were", "conducted", "for", "saturated", "fat", "intake", "in", "relation", "to", "risk", "of", "rectal", "cancer", "without", "APC", "truncating", "mutations", ",", "also", "excluding", "individuals", "with", "a", "KRAS", "mutation", "and", "lack", "of", "MLH1", "expression", ".", "The", "association", "did", "not", "change", "substantially", ".", "Again", ",", "only", "the", "highest", "level", "of", "intake", "showed", "a", "significant", "reduced", "risk", "of", "cancer", "compared", "to", "the", "reference", "category", "-LRB-", "RR", "0.40", "95", "%", "CI", "0.14", "--", "1.15", ",", "p-trend", "=", "0.09", "-RRB-", ".", "Discussion", "In", "this", "prospective", "study", ",", "we", "observed", "that", "the", "intake", "of", "total", ",", "saturated", "and", "monounsaturated", "fat", "was", "not", "associated", "with", "the", "risk", "of", "colon", "cancer", ",", "rectal", "cancer", ",", "or", "the", "different", "molecular", "subgroups", "of", "cancer", "based", "on", "lack", "of", "MLH1", "expression", "or", "truncating", "mutations", "in", "the", "APC", "gene", ".", "This", "was", "also", "found", "for", "polyunsaturated", "fat", "intake", "and", "rectal", "cancer", ".", "However", ",", "linoleic", "acid", "showed", "an", "association", "with", "increased", "risk", "of", "colon", "tumors", "with", "only", "an", "activated", "KRAS", "mutation", "and", "no", "additional", "truncating", "APC", "mutation", "or", "lack", "of", "MLH1", "expression", ".", "None", "of", "the", "other", "epidemiological", "studies", "report", "on", "specific", "fatty", "acids", "and", "the", "risk", "of", "molecular", "surrogate", "end-points", "for", "colon", "or", "rectal", "cancer", "or", "adenomas", "-LSB-", "35", "--", "43", "-RSB-", ".", "Some", "of", "these", "studies", "report", "on", "various", "types", "of", "fat", "depending", "on", "saturation", "level", ",", "but", "the", "results", "are", "inconsistent", "across", "the", "studies", "-LSB-", "35", ",", "38", ",", "41", ",", "42", "-RSB-", "including", "the", "current", "study", ".", "Diergaarde", "et", "al.", "observed", "unsaturated", "fat", "intake", "to", "be", "associated", "with", "increased", "colon", "carcinomas", "with", "a", "truncating", "APC", "mutation", "-LSB-", "38", "-RSB-", ".", "No", "distinction", "was", "made", "between", "mono", "-", "and", "polyunsaturated", "fats", ".", "In", "our", "study", ",", "we", "did", "not", "observe", "any", "association", "between", "various", "types", "of", "fat", "intake", "and", "risk", "of", "colon", "or", "rectal", "cancer", "with", "or", "without", "truncating", "APC", "mutations", "after", "patients", "also", "harboring", "a", "KRAS", "mutation", "in", "their", "tumor", "were", "excluded", "from", "the", "analyses", ".", "We", "observed", "a", "possible", "inverse", "association", "between", "saturated", "fat", "intake", "and", "risk", "of", "rectal", "tumors", "without", "a", "truncating", "APC", "mutation", ".", "However", ",", "the", "association", "was", "weak", ",", "did", "not", "increase", "gradually", "according", "to", "the", "quartiles", "of", "intake", "and", "was", "only", "a", "result", "of", "the", "reduced", "risk", "in", "the", "highest", "category", "of", "intake", ".", "Furthermore", ",", "in", "absence", "of", "a", "biological", "explanation", "for", "this", "finding", "and", "considering", "the", "large", "number", "of", "associations", "investigated", ",", "the", "observation", "may", "best", "be", "attributed", "to", "chance", ".", "Slattery", "et", "al.", "observed", "saturated", "and", "monounsaturated", "fats", ",", "but", "not", "polyunsaturated", "fat", ",", "to", "be", "associated", "with", "increased", "risk", "of", "colon", "tumors", "with", "specific", "KRAS", "mutations", ",", "i.e.", ",", "a", "G", "→", "T", "transversion", "at", "codon", "12", "-LSB-", "41", "-RSB-", ".", "No", "distinction", "was", "made", "between", "ω-6", "and", "ω-3", "fatty", "acids", ".", "We", "observed", "an", "association", "between", "polyunsaturated", "fat", "intake", ",", "especially", "linoleic", "acid", ",", "and", "increased", "risk", "of", "colon", "tumors", "with", "a", "KRAS", "mutation", ",", "regardless", "of", "the", "type", "of", "mutations", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "Finally", ",", "Bautista", "et", "al.", "observed", "an", "inverse", "association", "between", "monounsaturated", "fats", ",", "mostly", "derived", "from", "olive", "oil", "in", "the", "Spanish", "diet", ",", "and", "risk", "of", "colon", "cancer", "without", "KRAS", "mutations", "-LSB-", "35", "-RSB-", ".", "Since", "olive", "oil", "was", "rarely", "consumed", "by", "this", "elderly", "Dutch", "population", "in", "the", "years", "preceding", "1986", "-LRB-", "the", "cohort", "baseline", "-RRB-", ",", "this", "could", "explain", "the", "lack", "of", "association", "for", "this", "type", "of", "fat", "in", "our", "study", ".", "However", ",", "a", "recent", "Dutch", "case", "--", "control", "study", "on", "risk", "factors", "for", "colorectal", "adenomas", "showed", "a", "significant", "positive", "association", "between", "monounsaturated", "fats", "and", "adenoma", "risk", "-LSB-", "42", "-RSB-", ".", "Several", "factors", "hamper", "comparisons", "between", "our", "findings", "and", "those", "of", "other", "epidemiological", "studies", "and", "may", "in", "part", "explain", "observed", "inconsistencies", ".", "First", ",", "our", "study", "is", "the", "first", "large", "prospective", "cohort", "study", "incorporating", "molecular", "end-points", "for", "colon", "and", "rectal", "cancer", ".", "One", "of", "the", "other", "studies", "was", "a", "cross-sectional", "case", "--", "case", "comparison", "study", "-LSB-", "40", "-RSB-", ",", "and", "the", "others", "were", "case", "--", "control", "studies", "of", "varying", "size", "-LRB-", "ranging", "from", "108", "to", "1,510", "cases", "-RRB-", "-LSB-", "35", "--", "39", ",", "41", "--", "43", "-RSB-", ".", "Second", ",", "varying", "end-points", "were", "considered", ".", "Three", "of", "the", "other", "studies", "focused", "on", "adenomas", "instead", "of", "carcinomas", "-LSB-", "37", ",", "40", ",", "42", "-RSB-", ",", "and", "three", "studies", "also", "incorporated", "rectal", "tumors", "but", "did", "not", "distinguish", "between", "colon", "and", "rectum", "-LSB-", "35", ",", "37", ",", "42", "-RSB-", ".", "Previously", ",", "we", "reported", "the", "association", "between", "linoleic", "acid", "intake", "and", "increased", "risk", "of", "colon", "tumors", "with", "KRAS", "mutations", "-LRB-", "adjusted", "RR", "for", "one", "standard", "deviation", "of", "increase", "1.22", "-LRB-", "95", "%", "CI", "1.05", "--", "1.42", "-RRB-", "-RRB-", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "Now", ",", "we", "report", "that", "the", "association", "appears", "to", "be", "confined", "to", "those", "colon", "tumors", "with", "activating", "KRAS", "mutations", "and", "an", "otherwise", "intact", "APC", "gene", "and", "with", "MLH1", "expression", ".", "In", "addition", ",", "the", "association", "appears", "to", "be", "robust", "since", "RRs", "clearly", "increase", "over", "the", "quartiles", "of", "linoleic", "acid", "intake", "and", "the", "RRs", "for", "one", "standard", "deviation", "increase", "in", "linoleic", "acid", "intake", "are", "similar", "for", "men", "and", "women", ",", "and", "is", "increased", "for", "proximal", "and", "distal", "colon", "cancer", "as", "well", "as", "for", "overall", "colorectal", "cancer", ",", "including", "the", "rectosigmoid", ".", "The", "activating", "KRAS", "mutations", "at", "codons", "12", "and", "13", "are", "predominantly", "G", "→", "T", "and", "G", "→", "A", "mutations", "-LSB-", "27", "-RSB-", "which", "could", "be", "a", "result", "of", "MDA", "DNA", "adduct", "formation", "-LSB-", "18", ",", "19", "-RSB-", "associated", "with", "increased", "ω-6", "polyunsaturated", "fat", "intake", "-LSB-", "21", "-RSB-", ".", "Therefore", ",", "even", "though", "chance", "can", "not", "be", "ruled", "out", "and", "verification", "by", "others", "is", "warranted", ",", "the", "association", "seems", "quite", "plausible", ".", "Still", "several", "issues", "remain", "puzzling", ".", "First", ",", "why", "is", "the", "observed", "association", "for", "linoleic", "acid", "confined", "to", "colon", "cancer", "and", "not", "rectum", "cancer", "with", "only", "a", "KRAS", "mutation", "?", "The", "multistep", "model", "for", "molecular", "aberrations", "underlying", "colorectal", "carcinogenesis", "is", "likely", "to", "apply", "equally", "for", "both", "tumor", "subsites", "-LSB-", "7", ",", "8", ",", "15", "-RSB-", ".", "However", ",", "lack", "of", "MLH1", "expression", "in", "our", "study", "is", "rare", "among", "rectum", "cancer", "patients", "and", "there", "is", "growing", "evidence", "for", "differences", "in", "the", "etiology", "of", "colon", "and", "rectal", "tumors", "-LSB-", "33", "-RSB-", ".", "Second", ",", "why", "is", "the", "association", "with", "linoleic", "acid", "observed", "for", "KRAS", "and", "not", "for", "truncating", "APC", "gene", "mutations", "?", "It", "is", "unlikely", "that", "adduct", "formation", "selectively", "occurs", "in", "one", "gene", "but", "not", "in", "the", "other", ".", "However", ",", "KRAS", "is", "an", "oncogene", "requiring", "only", "one", "mutation", "for", "the", "gene", "to", "be", "activated", ",", "whereas", "APC", "is", "a", "tumor", "suppressor", "gene", "requiring", "an", "additional", "aberration", "in", "the", "other", "allele", "for", "loss", "of", "function", ".", "In", "addition", ",", "more", "than", "half", "of", "the", "patients", "with", "an", "APC", "mutation", "had", "multiple", "mutations", "in", "this", "gene", "-LSB-", "25", "-RSB-", ",", "complicating", "data", "analyses", "and", "interpretation", ".", "Additional", "analyses", "for", "subgroups", "of", "colon", "tumors", "with", "specific", "truncating", "point", "mutations", "in", "APC", "did", "not", "show", "any", "associations", "with", "the", "intake", "of", "fat", "or", "different", "types", "of", "fat", ".", "This", "still", "does", "not", "satisfy", "our", "third", "query", ",", "i.e.", ",", "why", "are", "the", "associations", "specifically", "confined", "to", "this", "subgroup", "of", "colon", "cancer", "patients", "whose", "tumors", "are", "characterized", "by", "activating", "KRAS", "mutations", ",", "and", "not", "truncating", "APC", "mutations", "or", "lack", "of", "MLH1", "expression", "?", "It", "is", "speculative", ",", "but", "plausible", ",", "that", "when", "KRAS", "is", "the", "only", "one", "of", "the", "three", "genes", "affected", ",", "the", "mutation", "may", "more", "likely", "be", "the", "result", "of", "exogenous", "exposure", ",", "for", "example", "a", "relatively", "high", "linoleic", "acid", "intake", ".", "In", "contrast", ",", "when", "a", "KRAS", "mutation", "co-occurs", "with", "a", "mutation", "in", "APC", "or", ",", "although", "more", "rarely", ",", "in", "addition", "to", "a", "defective", "MLH1", ",", "these", "other", "early", "gene", "defects", "also", "had", "a", "role", "in", "tumor", "formation", "and", "may", "have", "resulted", "in", "a", "mutator", "phenotype", "leading", "to", "mutations", "in", "other", "genes", "-LRB-", "such", "as", "the", "KRAS", "gene", "-RRB-", "irrespective", "of", "exogenous", "factors", ".", "Since", "there", "is", "no", "information", "on", "the", "timing", "of", "genetic", "aberrations", "in", "this", "type", "of", "human", "studies", ",", "we", "can", "not", "verify", "this", "with", "our", "data", ".", "Aberrations", "in", "other", "genes", ",", "not", "available", "for", "this", "study", ",", "but", "possibly", "involved", "in", "early", "tumorigenesis", "of", "colorectal", "cancer", ",", "could", "not", "be", "accounted", "for", "in", "analyses", "and", "may", "have", "influenced", "results", ".", "However", ",", "a", "recent", "systematic", "sequence", "analysis", "of", "13,023", "exons", "in", "individual", "colorectal", "cancers", "showed", "that", "the", "prevalence", "of", "mutations", "other", "than", "in", "APC", ",", "KRAS", "and", "TP53", "is", "rather", "low", "-LSB-", "44", "-RSB-", ",", "and", "mutations", "in", "TP53", "is", "not", "an", "early", "event", "in", "colorectal", "carcinogenesis", ".", "Finally", ",", "results", "are", "based", "on", "relatively", "small", "numbers", "of", "patients", ",", "especially", "in", "the", "reference", "group", "of", "polyunsaturated", "fat", "or", "linoleic", "acid", "intake", "-LRB-", "four", "patients", ",", "see", "Table", "4", "-RRB-", ",", "and", "point", "estimates", "of", "RRs", "for", "quartiles", "of", "intake", "of", "polyunstaturated", "fat", "or", "linoleic", "acid", "should", "therefore", ",", "be", "interpreted", "cautiously", ".", "Nevertheless", ",", "as", "discussed", "previously", ",", "the", "association", "appears", "to", "be", "robust", "when", "regarding", "the", "results", "for", "one", "standard", "deviation", "increase", "in", "linoleic", "acid", "intake", "-LRB-", "based", "on", "a", "total", "of", "65", "patients", "-RRB-", ".", "Therefore", ",", "Breivik", "and", "Glaudernack", "'s", "hypothesis", "for", "distinct", "carcinogens", "to", "exert", "their", "effect", "on", "two", "proposed", "types", "of", "genetic", "instability", ",", "i.e.", ",", "microsatellite", "instability", "and", "chromosomal", "instability", "-LSB-", "16", "-RSB-", ",", "may", "be", "extended", "to", "the", "potential", "effect", "of", "carcinogens", "on", "more", "specific", "genetic", "pathways", "to", "colorectal", "tumorigenesis", ",", "as", "for", "example", "the", "KRAS", "mutated", "pathway", ".", "The", "data", "from", "this", "large", "prospective", "cohort", "study", "suggest", "that", "linoleic", "acid", "intake", "is", "strongly", "associated", "with", "colon", "tumors", "with", "an", "aberrant", "KRAS", "gene", ",", "but", "an", "intact", "APC", "gene", "and", "MLH1", "expression", ".", "Verification", "in", "other", "studies", "is", "warranted", ".", "Possibly", ",", "tumors", "revealing", "the", "involvement", "of", "distinct", "genetic", "pathways", "on", "the", "basis", "of", "specific", "genetic", "aberrations", ",", "may", "have", "a", "unique", "etiology", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "The", "impact", "of", "maternal", "separation", "on", "adult", "mouse", "behaviour", "and", "on", "the", "total", "neuron", "number", "in", "the", "mouse", "hippocampus", "The", "maternal", "separation", "paradigm", "has", "been", "applied", "to", "C57BL/6J", "mice", "as", "an", "animal", "developmental", "model", "for", "understanding", "structural", "deficits", "leading", "to", "abnormal", "behaviour", ".", "A", "maternal", "separation", "-LRB-", "MS", "-RRB-", "model", "was", "used", "on", "postnatal", "day", "-LRB-", "PND", "-RRB-", "9", ",", "where", "the", "pups", "were", "removed", "from", "their", "mother", "for", "24", "h", "-LRB-", "MS24", "-RRB-", ".", "When", "the", "pups", "were", "10", "weeks", "old", ",", "the", "level", "of", "anxiety", "and", "fear", "was", "measured", "with", "two", "behavioural", "tests", ";", "an", "open", "field", "test", "and", "an", "elevated", "plus", "maze", "test", ".", "The", "Barnes", "platform", "maze", "was", "used", "to", "test", "spatial", "learning", ",", "and", "memory", "by", "using", "acquisition", "trials", "followed", "by", "reverse", "trial", "sessions", ".", "The", "MS24", "mice", "spent", "more", "time", "in", "the", "open", "arms", "of", "the", "elevated", "plus", "maze", "compared", "to", "controls", ",", "but", "no", "other", "treatment", "differences", "were", "found", "in", "the", "emotional", "behavioural", "tests", ".", "However", ",", "in", "the", "reverse", "trial", "for", "the", "Barnes", "maze", "test", "there", "was", "a", "significant", "difference", "in", "the", "frequency", "of", "visits", "to", "the", "old", "goal", ",", "the", "number", "of", "errors", "made", "by", "the", "MS24", "mice", "compared", "to", "controls", "and", "in", "total", "distance", "moved", ".", "The", "mice", "were", "subsequently", "sacrificed", "and", "the", "total", "number", "of", "neurons", "estimated", "in", "the", "hippocampus", "using", "the", "optical", "fractionator", ".", "We", "found", "a", "significant", "loss", "of", "neurons", "in", "the", "dentate", "gyrus", "in", "MS", "mice", "compared", "to", "controls", ".", "Apparently", "a", "single", "maternal", "separation", "can", "impact", "the", "number", "of", "neurons", "in", "mouse", "hippocampus", "either", "by", "a", "decrease", "of", "neurogenesis", "or", "as", "an", "increase", "in", "neuron", "apoptosis", ".", "This", "study", "is", "the", "first", "to", "assess", "the", "result", "of", "maternal", "separation", "combining", "behaviour", "and", "stereology", ".", "Introduction", "Developing", "an", "animal", "model", "of", "mental", "disorders", "is", "controversial", "due", "to", "the", "human", "nature", "of", "the", "symptoms", "such", "as", "hallucinations", ",", "delusions", "and", "poverty", "of", "speech", ".", "These", "symptoms", "can", "only", "be", "adequately", "assessed", "by", "psychological", "assessments", "and", "therefore", "can", "not", "be", "modulated", "in", "animals", ".", "A", "way", "to", "try", "to", "circumvent", "these", "problems", "is", "studying", "certain", "psychological", "or", "psychophysiological", "aspects", "of", "mental", "disorders", "such", "as", "latent", "inhibition", ",", "prepulse", "inhibition", "or", "P50", "gating", "-LRB-", "Ellenbroek", "and", "Cools", "1990", ",", "1995", ";", "Geyer", "and", "Markou", "1995", ";", "Ellenbroek", "et", "al.", "2004", "-RRB-", ".", "However", ",", "it", "is", "still", "unclear", "how", "-LRB-", "and", "if", "-RRB-", "these", "abnormalities", "are", "linked", "to", "the", "symptoms", "of", "mental", "illness", ".", "In", "rodent", "models", "prepulse", "inhibition", "-LRB-", "PPI", "-RRB-", "of", "the", "acoustic", "startle", "response", "is", "a", "model", "of", "sensorimotor", "gating", "mechanisms", "in", "the", "brain", ",", "while", "an", "equivalent", "reaction", "in", "humans", "is", "eye", "blinking", "-LRB-", "Braff", "et", "al.", "1978", ";", "Ellenbroek", "et", "al.", "1998", "-RRB-", ".", "It", "has", "been", "shown", "that", "rat", "pups", "that", "underwent", "24", "h", "maternal", "separation", "on", "postnatal", "day", "-LRB-", "PND", "-RRB-", "6", "or", "9", "expressed", "reduced", "prepulse", "inhibition", "-LRB-", "PPI", "-RRB-", "on", "postnatal", "day", "69", "and", "had", "hyperactivity", "of", "the", "dopamineric", "system", "involving", "the", "dopamine", "neurotransmitter", "system", "via", "the", "hypothalamic", "--", "pituitary", "--", "adrenal", "-LRB-", "HPA", "-RRB-", "axis", "-LRB-", "Ellenbroek", "and", "Cools", "1995", "-RRB-", ".", "Further", ",", "the", "PPI", "deficits", "could", "be", "reversed", "with", "typical", "antipsychotic", "drugs", "like", "haloperidol", "and", "were", "not", "detected", "prior", "to", "puberty", "-LRB-", "Ellenbroek", "et", "al.", "1998", "-RRB-", ".", "Due", "to", "the", "changes", "seen", "in", "the", "HPA", "axis", ",", "the", "dopamine", "system", ",", "hippocampus", "and", "long-term", "behavioural", "effects", "modelling", "deficits", "seen", "in", "mental", "patients", "has", "lead", "Ellenbroek", "and", "co-workers", "to", "hypothesis", "the", "24-h", "maternal", "deprivation", "model", "to", "be", "a", "``", "schizophrenia-like", "''", "neurodevelopmental", "animal", "model", "-LRB-", "Ellenbroek", "and", "Cools", "1998", ",", "2002", ";", "Ellenbroek", "et", "al.", "1998", ",", "2004", ",", "2005", "-RRB-", ".", "One", "of", "the", "striking", "characteristics", "of", "the", "developing", "neuroendocrine", "stress", "system", "in", "the", "mouse", "and", "rat", "is", "a", "period", "of", "reduced", "stress-responsiveness", ",", "the", "so-called", "stress", "hypo-responsive", "period", "-LRB-", "SHRP", "-RRB-", "-LRB-", "Schapiro", "et", "al.", "1962", ";", "Cirulli", "et", "al.", "1994", ";", "Schmidt", "et", "al.", "2002", "-RRB-", ".", "From", "about", "postnatal", "day", "-LRB-", "PND", "-RRB-", "4", "--", "14", "in", "the", "rat", ",", "and", "PND", "1", "--", "12", "in", "the", "mouse", ",", "the", "animals", "neuroendocrine", "system", "is", "characterized", "by", "a", "low", "basal", "corticosterone", "level", "and", "by", "the", "inability", "of", "a", "mild", "stressor", ",", "e.g.", "exposure", "to", "novelty", ",", "to", "induce", "a", "corticosterone", "response", "-LRB-", "Cirulli", "et", "al.", "1994", ";", "Schmidt", "et", "al.", "2003", "-RRB-", ".", "In", "this", "study", ",", "we", "used", "the", "C57BL/6", "inbred", "mouse", ".", "Due", "to", "a", "similar", "postnatal", "neurodevelopmental", "course", "in", "the", "mouse", "and", "rat", "-LRB-", "Clancy", "et", "al.", "2001", "-RRB-", ",", "we", "used", "PND", "9", "as", "the", "day", "of", "separation", "equivalent", "to", "Ellenbroek", "and", "co-workers", "day", "of", "choice", "in", "the", "rat", ".", "We", "tested", "if", "a", "24-h", "maternal", "separation", "on", "PND", "9", "can", "cause", "an", "adult", "phenotype", "characterized", "by", "altered", "levels", "of", "activity", "and", "anxiety", ",", "learning", "and", "memory", "dysfunction", ",", "deficits", "in", "behavioural", "flexibility", "-LRB-", "reversal", "deficits", "-RRB-", "as", "well", "as", "changes", "in", "number", "of", "neurons", "in", "the", "hippocampus", "and", "its", "subregions", "in", "the", "mouse", "brain", ".", "Material", "and", "methods", "Animals", "The", "offspring", "of", "4", "male", "and", "8", "female", "C57BL/6J", "mice", "-LRB-", "8", "weeks", "old", "-RRB-", "obtained", "from", "Taconic", "Europe", "-LRB-", "Taconic", "Farms", "Inc.", ",", "DK", "-RRB-", "were", "used", "in", "this", "study", ".", "The", "animals", "were", "acclimatized", "to", "the", "animal", "facility", "for", "1", "week", ".", "Multiparous", "females", "were", "used", ",", "since", "there", "is", "a", "higher", "rate", "of", "offspring", "survival", ".", "The", "animals", "were", "housed", "under", "a", "12:12", "h", "light/dark", "cycle", "-LRB-", "lights", "on", "at", "6", "a.m.", "-RRB-", "with", "constant", "temperature", "-LRB-", "21", "±", "2", "°C", "-RRB-", "and", "humidity", "-LRB-", "52", "±", "2", "%", "-RRB-", "in", "Macrolon", "type", "III", "cages", "with", "environmental", "enrichment", "in", "the", "form", "of", "wood", "splints", "bedding", "-LRB-", "aspen", "4HV", "-RRB-", ",", "wood", "shavings", ",", "1", "piece", "of", "Aspen", "Corner", "15", ",", "1", "standard", "mouse", "house", "made", "of", "recycled", "cardboard", ",", "1", "aspen", "chewing", "stick", "size", "medium", ",", "and", "pads", "of", "nesting", "material", "-LRB-", "all", "obtained", "from", "Brogaarden", ",", "DK", "-RRB-", ".", "Food", "-LRB-", "Altromin", "pills", "NR", "1324", "-RRB-", "and", "tap", "water", "were", "available", "ad", "libitum", ".", "Two", "females", "were", "placed", "in", "a", "male", "'s", "cage", "for", "a", "period", "of", "1", "week", "to", "ensure", "conception", ",", "followed", "by", "separation", "of", "the", "two", "females", "to", "their", "own", "cages", ".", "Maternal", "separation", "Pregnant", "females", "were", "checked", "for", "litters", "daily", "at", "09:00", "a.m.", ".", "If", "litters", "were", "found", ",", "the", "day", "of", "birth", "was", "defined", "as", "PND", "0", "for", "that", "litter", ".", "On", "PND", "0", ",", "litters", "were", "randomly", "assigned", "to", "maternal", "separation", "-LRB-", "MS", "-RRB-", "-LRB-", "N", "=", "16", ",", "9", "males", "and", "7", "females", "-RRB-", ",", "or", "to", "standard", "facility", "rearing", "-LRB-", "SFR", "-RRB-", ".", "For", "the", "behavioural", "testing", ",", "16", "MS", "animals", "-LRB-", "4", "males", "and", "6", "females", "-RRB-", "and", "5", "SFR", "animals", "-LRB-", "2", "males", "and", "3", "females", "-RRB-", "were", "included", ",", "while", "12", "of", "the", "MS", "animals", "-LRB-", "2", "males", "and", "10", "females", "-RRB-", "and", "7", "control", "animals", "-LRB-", "2", "males", "and", "5", "females", "-RRB-", "were", "used", "for", "cell", "counting", ".", "Litters", "were", "not", "culled", "or", "sexed", "at", "birth", "to", "minimize", "the", "handling", "of", "the", "pups", ",", "but", "male", "and", "female", "pups", "were", "separated", "at", "weaning", "-LRB-", "PND", "28", "-RRB-", "and", "group", "housed", "with", "their", "siblings", ",", "which", "resulted", "in", "2", "--", "5", "mice", "per", "cage", ".", "The", "environmental", "enrichment", "applied", "to", "the", "mothers", "was", "also", "applied", "to", "the", "MS", "and", "control", "animals", ".", "The", "24-h", "deprivation", "was", "carried", "out", "on", "PND", "9", "starting", "at", "8", "a.m.", ".", "The", "pups", "remained", "in", "the", "home", "cage", "but", "were", "placed", "in", "a", "separate", "room", "with", "the", "same", "temperature", ",", "humidity", "and", "lighting", "conditions", "as", "the", "home", "stable", ".", "The", "cage", "was", "placed", "on", "a", "heating", "pad", ",", "which", "had", "a", "constant", "temperature", "of", "31", "°C", ".", "No", "food", "or", "water", "was", "available", "during", "the", "separation", ".", "The", "dam", "was", "placed", "in", "a", "cage", "with", "similar", "facilities", "as", "the", "home", "cage", "in", "the", "home", "stable", ".", "The", "pups", "were", "checked", "every", "3", "h", ",", "using", "a", "red", "light", "during", "the", "night", ".", "Body", "weights", "were", "recorded", "before", "and", "after", "separation", ".", "Immediately", "after", "24", "h", "the", "dams", "were", "returned", "to", "the", "home", "cage", "and", "reunited", "with", "the", "pups", ".", "Test", "for", "anxiety", "and", "fear", "related", "behaviour", "When", "the", "pups", "reached", "10", "weeks", "of", "age", "they", "were", "subjected", "once", "to", "the", "open", "field", "test", "-LRB-", "Hall", "1934", "-RRB-", "and", "the", "elevated", "plus", "maze", "test", ",", "which", "is", "based", "on", "the", "procedure", "used", "by", "Montgomery", "-LRB-", "1955", "-RRB-", "and", "later", "validated", "by", "Pellow", "et", "al.", "-LRB-", "1985", "-RRB-", ".", "Behaviour", "was", "analysed", "using", "EthoVision", "-LRB-", "Noldus", ",", "Groeningen", ",", "The", "Netherlands", "-RRB-", ".", "All", "behavioural", "testing", "took", "place", "between", "10", "a.m.", "and", "3", "p.m.", "Open", "field", "test", "-LRB-", "OFT", "-RRB-", "The", "open", "field", "consisted", "of", "a", "circular", "wooden", "platform", "-LRB-", "diameter", "90", "cm", "-RRB-", "surrounded", "by", "a", "43", "cm", "high", "wall", "with", "a", "camera", "mounted", "directly", "above", ".", "A", "central", "circle", "of", "31", "cm", "diameter", "was", "defined", "in", "the", "behaviour", "analysis", "software", ".", "Three", "60-W", "light", "bulbs", "illuminated", "the", "arena", ".", "On", "the", "day", "of", "testing", "each", "animal", "was", "transported", "in", "a", "cardboard", "box", "to", "the", "centre", "of", "the", "open", "field", "and", "behaviour", "was", "recorded", "for", "10", "min", ".", "After", "the", "trial", "the", "maze", "was", "cleaned", "with", "a", "solution", "of", "acetic", "acid", "and", "soap", "water", "and", "faecal", "boli", "were", "counted", ".", "The", "following", "parameters", "were", "calculated", ";", "total", "distance", "moved", "-LRB-", "cm", "-RRB-", ",", "time", "spent", "in", "central", "circle", "and", "time", "spent", "in", "peripheral", "zone", "-LRB-", "expressed", "as", "%", "of", "session", "duration", "-RRB-", ".", "Elevated", "plus", "maze", "The", "plus", "maze", "was", "elevated", "50", "cm", "above", "the", "ground", "and", "consisted", "of", "two", "opposing", "open", "arms", "-LRB-", "21", "cm", "×", "8", "cm", "-RRB-", "connected", "by", "a", "central", "square", "-LRB-", "8", "cm", "×", "8", "cm", "-RRB-", "to", "two", "opposing", "enclosed", "arms", "of", "the", "same", "size", "with", "32", "cm", "high", "walls", ".", "A", "video", "camera", "placed", "above", "the", "maze", "recorded", "the", "animals", "'", "behaviour", ".", "On", "the", "day", "of", "testing", ",", "the", "animal", "was", "placed", "in", "the", "centre", "of", "the", "maze", "and", "behaviour", "was", "recorded", "for", "10", "min", ".", "Between", "trials", "the", "maze", "was", "cleaned", "as", "described", "for", "the", "OFT", ".", "The", "following", "parameters", "were", "calculated", ";", "total", "duration", "-LRB-", "s", "-RRB-", "in", "open", "and", "closed", "arms", ",", "the", "number", "of", "entries", "into", "the", "open", "and", "closed", "arms", "and", "the", "total", "distance", "moved", "-LRB-", "cm", "-RRB-", ".", "From", "these", "parameters", "the", "ratio", "of", "entries", "into", "the", "open", "arms", "to", "the", "total", "number", "of", "arm", "entries", ",", "and", "the", "ratio", "of", "time", "spent", "in", "the", "open", "arms", "to", "time", "spent", "in", "both", "open", "and", "closed", "arms", "was", "calculated", ".", "Test", "for", "spatial", "memory", ";", "Barnes", "maze", "The", "Barnes", "maze", "-LRB-", "Barnes", "1975", "-RRB-", "consisted", "of", "a", "circular", ",", "white-coated", "platform", "90", "cm", "in", "diameter", "and", "elevated", "50", "cm", "over", "the", "ground", ".", "Sixteen", "5", "cm", "wide", "holes", "were", "evenly", "distributed", "around", "the", "perimeter", ",", "2.5", "cm", "from", "the", "edge", ".", "A", "pair", "of", "rails", "was", "placed", "under", "two", "opposing", "holes", "to", "hold", "the", "hidden", "escape", "box", ".", "The", "escape", "box", "was", "a", "dark", "plastic", "storage", "box", "with", "a", "5", "cm", "diameter", "hole", "in", "the", "lid", ".", "A", "dark", "cylindrical", "cardboard", "tube", "-LRB-", "7.5", "cm", "×", "7", "cm", "high", "-RRB-", "with", "a", "lid", "was", "used", "as", "the", "transport", "and", "start", "chamber", ".", "Three", "60-W", "bulbs", "illuminating", "the", "maze", "and", "high", "irregular", "rock", "and", "techno", "music", "played", "from", "a", "computer", "in", "a", "random", "manner", "provided", "the", "aversive", "stimuli", ".", "As", "with", "the", "previous", "test", ",", "a", "digital", "video", "camera", "mounted", "above", "the", "maze", "recorded", "animal", "'s", "behaviours", ".", "Shaping", "For", "2", "days", "before", "testing", "commenced", ",", "the", "animals", "were", "trained", "to", "enter", "the", "hidden", "escape", "box", ".", "Using", "the", "transport", "cylinder", ",", "the", "mouse", "was", "placed", "near", "the", "edge", "of", "the", "target", "hole", "with", "the", "hidden", "escape", "box", "underneath", ".", "Two", "cardboard", "walls", "blocked", "entry", "to", "adjacent", "holes", ".", "Only", "dim", "lightning", "and", "no", "noise", "was", "used", "during", "this", "phase", "of", "the", "experiment", ".", "The", "animal", "was", "allowed", "5", "min", "to", "enter", "the", "escape", "box", "and", "if", "this", "failed", ",", "it", "was", "placed", "manually", "inside", ".", "When", "the", "animal", "entered", "the", "box", "it", "was", "quickly", "carried", "to", "the", "home", "cage", ".", "Acquisition", "trials", "Six", "consecutive", "trials", "were", "given", ",", "one", "per", "day", ".", "The", "animal", "was", "placed", "in", "the", "transport", "cylinder", ",", "oriented", "in", "a", "random", "direction", ",", "in", "the", "centre", "of", "the", "maze", ".", "The", "aversive", "stimuli", "were", "turned", "on", "and", "the", "cylinder", "removed", ".", "Recording", "in", "the", "behaviour-observation", "software", "began", "immediately", "after", "the", "experimenter", "had", "left", "the", "room", ".", "The", "trial", "ended", "after", "5", "min", "or", "when", "the", "animal", "entered", "the", "hidden", "escape", "box", ".", "If", "the", "animal", "failed", "to", "enter", "the", "box", "or", "re-entered", "the", "maze", "after", "recording", "was", "stopped", ",", "the", "aversive", "stimuli", "were", "turned", "back", "on", "and", "the", "animal", "was", "allowed", "5", "min", "more", "to", "enter", "the", "escape", "box", ".", "If", "that", "also", "failed", ",", "the", "animal", "was", "manually", "placed", "in", "the", "box", ".", "After", "completion", "of", "each", "trial", ",", "the", "box", "was", "placed", "in", "the", "home", "cage", ".", "Reversal", "trials", "Three", "days", "after", "acquisition", "trials", ",", "the", "escape", "box", "was", "placed", "underneath", "the", "hole", "opposite", "to", "the", "hole", "that", "had", "been", "the", "target", "during", "acquisition", "training", ".", "Reversal", "training", "was", "conducted", "for", "seven", "consecutive", "days", "as", "described", "above", ".", "Parameters", "Each", "of", "the", "16", "escape", "holes", "in", "the", "Barnes", "maze", "was", "defined", "as", "a", "separate", "zone-of-interest", "in", "the", "behaviour", "analysis", "software", ".", "The", "following", "parameters", "were", "analysed", ":", "latency", "to", "target", "-LSB-", "time", "from", "start", "of", "the", "trial", "to", "first", "entry", "into", "the", "target", "hole", "zone", "-LRB-", "s", "-RRB-", "-RSB-", ",", "total", "distance", "moved", "-LRB-", "cm", "-RRB-", "and", "error", "frequency", "-LRB-", "number", "of", "visits", "to", "other", "holes", "than", "the", "target", "hole", "-RRB-", ".", "During", "reversal", "training", "two", "additional", "parameters", "were", "analysed", ":", "the", "mean", "number", "of", "visits", "to", "the", "old", "target", "hole", "over", "the", "seven", "trials", "-LRB-", "the", "hole", "where", "the", "escape", "box", "was", "located", "during", "acquisition", "training", "-RRB-", "and", "the", "mean", "number", "of", "visits", "to", "the", "two", "holes", "adjacent", "to", "the", "old", "target", "hole", ".", "Three", "different", "search", "strategies", "could", "be", "distinguished", "and", "were", "scored", "manually", ".", "The", "random", "search", "strategy", "is", "characterized", "by", "a", "non-systematic", "exploration", "of", "the", "maze", "with", "many", "centre", "maze", "crossings", "and", "some", "perseverations", ".", "Perseverations", "were", "defined", "as", "repeatedly", "searching", "the", "same", "hole", "or", "two", "adjacent", "holes", "-LRB-", "Bach", "et", "al.", "1995", "-RRB-", ".", "Secondly", ",", "there", "is", "the", "serial", "search", "strategy", ",", "defined", "as", "systematic", "consecutive", "hole", "searching", "in", "a", "clockwise", "or", "counter", "clockwise", "manner", "and", "finally", "a", "spatial", "search", "strategy", ",", "defined", "as", "searching", "less", "than", "three", "holes", "from", "the", "location", "of", "the", "goal", "-LRB-", "Barnes", "1979", ";", "Bach", "et", "al.", "1995", ";", "Inman-Wood", "et", "al.", "2000", ";", "Zhang", "et", "al.", "2002", ";", "Raber", "et", "al.", "2004", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "Fig.", "1Three", "different", "search", "strategies", "could", "be", "applied", ":", "Random", ",", "a", "pattern", "that", "include", "many", "hole", "examinations", "in", "a", "random", "manner", ";", "Serial", ",", "a", "relative", "systematic", "search", "either", "clockwise", "or", "counterclockwise", ";", "Spatial", ",", "a", "pattern", "where", "the", "target", "box", "is", "found", "within", "relative", "short", "time", "and", "with", "high", "accuracy", "Fixation", "and", "embedding", "Approximately", "1", "week", "after", "all", "tests", "were", "concluded", ",", "the", "animals", "were", "scarified", "by", "CO2", "asphyxiation", "and", "within", "1", "h", "the", "brains", "were", "dissected", "out", "and", "placed", "in", "a", "37", "%", "formalin", "solution", "-LRB-", "Fixatin", "-RRB-", ".", "The", "brains", "were", "split", "through", "corpus", "callosum", ",", "separating", "the", "two", "hemispheres", ".", "After", "systematic", "random", "assignment", "of", "left", "or", "right", "hemisphere", "they", "were", "coloured", "on", "the", "outer", "surface", "to", "preserve", "a", "coded", "sequence", "and", "embedded", "in", "paraffin", "with", "an", "automatic", "vacuum", "tissue", "processor", "-LRB-", "Leica", "ASP300", "-RRB-", ".", "The", "hemispheres", "were", "then", "mounted", "horizontally", "balancing", "on", "needles", "and", "embedded", "in", "a", "paraffin", "block", "with", "up", "to", "four", "hemispheres", "in", "one", "block", "Sectioning", "The", "whole", "hemisphere", "was", "cut", "horizontally", "with", "a", "Leica", "-LRB-", "model", "SM", "2400", "-RRB-", "microtome", "with", "a", "microtome", "setting", "of", "40", "μm", "thickness", ".", "All", "sections", "were", "mounted", "on", "silicone-coated", "glass", "-LRB-", "Frost", "+", "-RRB-", ".", "After", "a", "minimum", "of", "24", "h", "in", "a", "40", "°C", "heating", "cupboard", ",", "the", "sections", "were", "sampled", "systematic", "uniformly", "randomly", "-LRB-", "SURS", "-RRB-", ".", "The", "first", "section", "was", "randomly", "selected", "from", "a", "random", "number", "table", ",", "hereafter", "every", "6th", "section", "was", "sampled", "systematically", "for", "staining", "and", "counting", ".", "This", "provided", "a", "total", "of", "8", "--", "10", "sections", "containing", "the", "hippocampus", "per", "specimen", ".", "To", "be", "able", "to", "account", "for", "block", "advance", "-LRB-", "BA", "-RRB-", "the", "block", "height", "was", "measured", "for", "every", "100th", "section", ".", "The", "BA", "determines", "the", "hitting", "probability", "of", "the", "particles", "within", "the", "block", "-LRB-", "see", "later", "for", "calculation", "-RRB-", ".", "Furthermore", ",", "the", "paraffin", "shrinkage", "effect", "was", "calculated", "and", "amounted", "to", "about", "70", "%", ".", "The", "sections", "were", "stained", "with", "a", "modified", "Vogt", "'s", "Cresyl", "violet", "acetate", "-LRB-", "Armed", "forces", "-RRB-", ".", "Optical", "design", "equipment", "The", "optical", "design", "equipment", "consisted", "of", "an", "Olympus", "BH-2", "microscope", "with", "an", "oil", "immersion", "100", "×", "objective", "of", "high", "numerical", "aperture", "-LRB-", "NA", "=", "1.40", "-RRB-", ",", "which", "allows", "focusing", "in", "a", "thin", "focal", "plane", "inside", "a", "thick", "section", ".", "A", "camera", "transmits", "the", "image", "to", "a", "computer", "screen", "where", "a", "counting", "frame", "is", "superimposed", "using", "the", "computer-assisted", "stereological", "-LRB-", "CAST", "-RRB-", "-", "Grid", "software", "-LRB-", "Visiopharm", ",", "Hørsholm", ",", "DK", "-RRB-", ".", "A", "motorized", "automatic", "stage", "was", "used", "to", "control", "movement", "in", "the", "x", ",", "y", "-", "plane", "via", "a", "connected", "joystick", ".", "Movement", "in", "the", "z-axis", "was", "controlled", "manually", "with", "the", "focus", "button", "on", "the", "microscope", "and", "the", "distance", "between", "the", "upper", "and", "lower", "surfaces", "of", "the", "sections", "was", "measured", "with", "a", "Heidenhein", "microcator", "-LRB-", "Heidenhain", ",", "Germany", "-RRB-", "with", "a", "precision", "of", "0.5", "μm", ".", "Definitions", "and", "divisions", "of", "the", "hippocampus", "The", "hippocampus", "was", "subdivided", "into", "five", "regions", ";", "the", "dentate", "gyrus", "-LRB-", "DG", "-RRB-", ",", "the", "hilus", "of", "the", "dentate", "gyrus", "-LRB-", "CA4", "-RRB-", ",", "regio", "inferior", "-LRB-", "CA3/2", "-RRB-", ",", "region", "superior", "-LRB-", "CA1", "-RRB-", "and", "subiculum", ".", "Neurons", "were", "counted", "manually", "in", "the", "sub-sampled", "sections", "containing", "the", "hippocampus", ",", "using", "the", "optical", "disector", "design", ".", "The", "layers", "comprising", "the", "hippocampus", "were", "defined", "consistently", "in", "all", "sections", "using", "the", "terminology", "of", "Blackstad", "-LRB-", "1956", "-RRB-", ".", "It", "was", "not", "considered", "too", "difficult", "to", "differentiate", "the", "neuronal", "layers", "in", "horizontal", "sections", "-LRB-", "Fig.", "2", "-RRB-", ".", "The", "granule", "cell", "layer", "and", "the", "pyramidal", "cell", "layers", "also", "contain", "the", "cell", "bodies", "of", "basket", "cells", "and", "glial", "cells", ".", "The", "glial", "cells", "can", "be", "easily", "identified", "and", "counted", "separately", ",", "but", "the", "basket", "cells", "are", "so", "similar", "in", "appearance", "to", "the", "granule", "and", "pyramidal", "cells", "that", "they", "are", "included", "in", "the", "estimates", ".", "It", "was", "previously", "shown", "that", "they", "comprise", "less", "than", "1", "%", "of", "the", "neurons", "in", "these", "layers", "-LRB-", "review", "West", "et", "al.", "1991", "-RRB-", ".", "Fig.", "2A", "schematic", "drawing", "of", "the", "hippocampus", "with", "the", "five", "subregions", "identified", "in", "this", "study", ".", "Dg", ",", "the", "granule", "cell", "layer", "of", "the", "dentate", "gyrus", ";", "h/CA4", ",", "hilus", "of", "the", "dentate", "gyrus", ";", "ri", ",", "regio", "inferior", ";", "CA3/2", ",", "rs", ",", "region", "superior", ";", "CA1", ",", "s", ",", "subiculum", "Stereological", "equations", "Estimation", "of", "the", "total", "neuron", "number", ",", "N", "For", "the", "estimation", "of", "total", "neuron", "numbers", ",", "neurons", "were", "counted", "in", "optical", "disectors", "and", "sampled", "according", "to", "the", "so-called", "fractionator", "principles", ".", "In", "a", "fractionator", ",", "cells", "are", "counted", "directly", "in", "a", "known", "fraction", "of", "the", "different", "hippocampal", "subdivisions", "and", "the", "total", "neuron", "number", ",", "N", ",", "is", "estimated", "by", "multiplying", "the", "number", "of", "particles", "counted", "with", "the", "reciprocal", "sampling", "fractions", ":", "where", "ssf", "is", "the", "section", "sampling", "fractions", ",", "asf", "the", "area", "sampling", "fraction", ",", "and", "hsf", "the", "height", "sampling", "fraction", ".", "The", "bilateral", "cell", "number", "is", "estimated", "by", "multiplying", "the", "unilateral", "number", "∑", "Q", "−", "by", "2", ".", "This", "is", "admissible", "when", "the", "right", "or", "left", "hippocampus", "is", "sampled", "systematically", "randomly", ".", "The", "asf", "is", "known", "as", "the", "area", "of", "the", "counting", "frame", "of", "the", "disector", "relative", "to", "the", "area", "associated", "with", "each", "x,y-step", "movement", "of", "the", "disector", ":", "After", "having", "ascertained", "that", "the", "cell", "density", "was", "constant", "within", "the", "disector", "height", ",", "the", "height", "sampling", "fraction", "was", "defined", "as", ":", "is", "the", "q", "−", "weighted", "mean", "section", "thickness", "-LRB-", "Gundersen", "et", "al.", "1988", ";", "Dorph-Petersen", "2001", "-RRB-", ".", "Estimation", "of", "total", "volume", "--", "the", "Cavalieri", "estimator", "Besides", "estimating", "total", "neuron", "numbers", ",", "it", "was", "also", "decided", "to", "estimate", "total", "volume", "of", "the", "different", "compartments", "of", "the", "hippocampus", "although", "the", "main", "purpose", "was", "estimation", "of", "cell", "numbers", ".", "Estimates", "of", "volume", "were", "obtained", "according", "to", "the", "principles", "of", "Cavalieri", "'s", "basic", "estimator", "-LRB-", "Gundersen", "and", "Jensen", "1987", "-RRB-", "and", "corrected", "for", "shrinkage", ".", "Notice", "that", "these", "volumes", "were", "not", "used", "for", "the", "estimation", "of", "total", "neuron", "number", ".", "The", "estimates", "of", "total", "neuron", "number", "obtained", "by", "the", "fractionator", "design", "are", "independent", "of", "the", "containing", "volume", ".", "Further", ",", "when", "total", "number", "and", "volume", "is", "estimated", ",", "the", "density", ",", "NV", "-LRB-", "cells/mm3", "-RRB-", "can", "be", "obtained", "as", "well", "without", "extra", "work", ".", "Error", "predictions", "The", "precision", "of", "the", "two", "different", "estimates", "-LRB-", "neuron", "number", "and", "volume", "-RRB-", "can", "be", "expressed", "by", "the", "coefficient", "of", "error", ",", "CE", ".", "The", "CE", "for", "the", "Cavalieri", "estimation", "of", "volume", "was", "first", "formulated", "and", "described", "by", "Gundersen", "and", "Jensen", "-LRB-", "1987", "-RRB-", "revised", "in", "Gundersen", "et", "al.", "-LRB-", "1999", "-RRB-", ".", "Table", "1", "gives", "an", "example", "of", "how", "CE", "for", "both", "volume", "and", "neuron", "estimates", "are", "calculated", "in", "this", "study", "-LRB-", "see", "also", "Gundersen", "et", "al.", "1999", "-RRB-", ".", "Table", "1Example", "of", "how", "the", "CE", "is", "calculated", "for", "neuron", "number", "and", "volume", "respectivelySectionQj", "−", "A", ":", "Qi", "×", "QiB", ":", "Qi", "×", "Qi", "+", "1C", ":", "Qi", "×", "Qi", "+", "2SectionPj", "−", "A", ":", "Pi", "×", "PiB", ":", "Pi", "×", "Pi", "+", "1C", ":", "Pi", "×", "Pi", "+", "21111216162311242282563,1361,1761,0642111214433321441399378341612124193613425743993518324541985393963933486113371112117616573996816256240352839615915225330909241081022484132", "--", "1052520", "--", "11636", "--", "--", "11416", "--", "--", "Sum1985", ",5143,4982,583", "Sum4122313897", "When", "an", "appropriate", "number", "of", "sections", "have", "been", "chosen", "-LRB-", "10", "or", "a", "little", "less", "-RRB-", ",", "it", "is", "the", "number", "of", "points", "counted", "-LRB-", "the", "noise", "-RRB-", "which", "decides", "the", "precision", "of", "the", "estimate", ".", "To", "count", "about", "200", "points", "per", "sample", "is", "usually", "enough", "to", "obtain", "a", "CE", "around", "5", "--", "8", "%", ",", "unless", "the", "object", "is", "very", "irregular", "-LRB-", "Gundersen", "and", "Jensen", "1987", ";", "Gundersen", "et", "al.", "1988", ";", "West", "and", "Gundersen", "1990", "-RRB-", ".", "When", "CE", "is", "estimated", "for", "the", "cell", "counting", ",", "Noise", "is", "equal", "to", "∑", "Q", "−", ".", "Statistical", "analyses", "All", "data", "were", "analysed", "with", "the", "statistical", "software", "packages", "SPSS", "-LRB-", "Statistical", "Package", "for", "the", "Social", "Sciences", ",", "version", "14.00", "-RRB-", "or", "SigmaStat", "-LRB-", "version", "2.0", "-RRB-", ".", "If", "Levene", "'s", "test", "for", "equality", "of", "variances", "did", "not", "fail", ",", "a", "t", "test", "was", "applied", "to", "test", "for", "differences", "between", "the", "two", "experimental", "groups", ".", "For", "data", "where", "normality", "tests", "failed", ",", "the", "non-parametric", "tests", "Mann", "--", "Whitney", "U", "test", "and", "Kruskal", "--", "Wallis", "test", "were", "applied", ".", "The", "animals", "performance", "over", "the", "six", "acquisition", "trials", "and", "the", "seven", "reversal", "trials", "in", "the", "Barnes", "maze", "was", "analysed", "by", "mixed-model", "analysis", "of", "variance", "with", "trial", "as", "within-subject", "factor", "and", "experimental", "group", "as", "between-subjects", "factor", ".", "Homogeneity", "of", "the", "variance-difference", "scores", "was", "determined", "by", "Mauchly", "'s", "test", "of", "sphericity", "-LSB-", "SPSS", "Inc.", ".", "Chicago", ",", "IL", ",", "USA", ".", "SPSS", "Base", "version", "11.5", "User", "Manual", ";", "2004", "-RSB-", ".", "When", "the", "assumption", "of", "sphericity", "was", "violated", ",", "degrees", "of", "freedom", "were", "adjusted", "with", "the", "Huynh", "--", "Feldt", "correction", ".", "Group", "differences", "in", "strategy", "selection", "in", "the", "Barnes", "maze", "were", "analysed", "with", "the", "likelihood-ratio", "chi-square", "test", "for", "each", "trial", "separately", ".", "Group", "differences", "were", "considered", "significant", "when", "P", "<", "0.05", ".", "Results", "Only", "significant", "behavioural", "results", "are", "depicted", "and", "statistically", "elaborated", ".", "Body", "weights", "A", "significant", "weight", "loss", "was", "found", "in", "the", "pups", "after", "separation", "-LRB-", "P", "=", "0.019", ",", "paired", "t", "test", "-RRB-", ".", "However", ",", "8", "weeks", "after", "separation", "the", "body", "weights", "of", "MS", "and", "SFR", "animals", "were", "similar", "-LRB-", "P", "=", "0.61", ",", "unpaired", "t", "test", "-RRB-", ".", "Open", "field", "test", "Both", "experimental", "groups", "spent", "more", "time", "in", "the", "periphery", "of", "the", "open", "field", "than", "the", "centre", "-LRB-", "P", "<", "0.001", ",", "t", "test", "-RRB-", ".", "There", "was", "no", "significant", "difference", "between", "MS", "and", "SFR", "groups", "in", "either", "distance", "moved", "or", "frequency", "of", "visits", "to", "and", "time", "spent", "in", "the", "centre", "or", "periphery", "of", "the", "open", "field", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Elevated", "plus", "maze", "The", "MS", "animals", "spent", "more", "time", "in", "the", "open", "arms", "than", "the", "SFR", "animals", "and", "allotted", "a", "greater", "percentage", "of", "time", "spent", "in", "both", "open", "and", "closed", "arms", "to", "the", "open", "arms", "-LRB-", "P", "=", "0.035", "and", "P", "=", "0.046", ",", "t", "test", ",", "respectively", ";", "Fig.", "3", "-RRB-", ".", "Fig.", "3The", "mean", "-LRB-", "+", "SEM", "-RRB-", "time", "spent", "in", "both", "the", "open", "and", "closed", "arms", ".", "*", "There", "was", "a", "significant", "difference", "between", "MS", "24", "-LRB-", "N", "=", "16", "-RRB-", "and", "SFR", "24", "-LRB-", "N", "=", "5", "-RRB-", "in", "time", "spent", "in", "open", "arms", "-LRB-", "P", "<", "0.05", ",", "ANOVA", "-RRB-", ".", "**", "Time", "spent", "in", "closed", "arms", "compared", "with", "time", "spent", "in", "open", "arms", "-LRB-", "P", "<", "0.001", ",", "t", "test", "-RRB-", "In", "trial", "progress", "there", "was", "a", "significant", "difference", "in", "both", "frequency", "and", "duration", "in", "closed", "and", "open", "arms", "-LSB-", "Closed", "arms", "frequency", ":", "-LRB-", "F", "-LRB-", "9,171", "-RRB-", "=", "3.544", ",", "P", "<", "0.0001", "-RRB-", "and", "duration", ":", "-LRB-", "Wilk", "'s", "λ", "F", "-LRB-", "9,11", "-RRB-", "=", "6.045", ",", "P", "=", "0.004", "-RRB-", ",", "Open", "arms", "frequency", ":", "-LRB-", "Wilk", "'s", "λ", "F", "-LRB-", "9,11", "-RRB-", "=", "8.086", ",", "P", "=", "0.001", "-RRB-", "and", "duration", ":", "-LRB-", "F", "-LRB-", "9,171", "-RRB-", "=", "6.253", ",", "P", "<", "0.0001", "-RRB-", "-RSB-", ".", "There", "was", "no", "significant", "difference", "in", "any", "of", "the", "other", "parameters", "analysed", ".", "Barnes", "maze", "Acquisition", "trials", "Latency", "to", "reach", "the", "target", "hole", ",", "total", "distance", "moved", "on", "the", "maze", ",", "and", "error", "frequency", "all", "decreased", "significantly", "over", "the", "course", "of", "the", "six", "acquisition", "trials", "-LRB-", "F", "-LRB-", "4.3,77.4", "-RRB-", "=", "3.88", ",", "P", "=", "0.005", ";", "F", "-LRB-", "5,90", "-RRB-", "=", "2.56", ",", "P", "=", "0.033", ";", "F", "-LRB-", "3.9,70.1", "-RRB-", "=", "2.49", ",", "P", "=", "0.05", ";", "respectively", "-RRB-", ",", "indicating", "that", "the", "animals", "indeed", "learned", "the", "task", ".", "There", "was", ",", "however", ",", "no", "significant", "difference", "between", "the", "two", "experimental", "groups", ".", "Reversal", "trials", "Latency", "to", "reach", "the", "new", "target", "hole", "-LRB-", "Fig.", "4", "left", "-RRB-", "total", "distance", "moved", "on", "the", "maze", "-LRB-", "Fig.", "5", "-RRB-", ",", "and", "error", "frequency", "-LRB-", "Fig.", "6", "-RRB-", "all", "decreased", "significantly", "over", "the", "course", "of", "the", "seven", "reversal", "trials", "-LRB-", "F", "-LRB-", "3.1", ";", "55.95", "-RRB-", "=", "3.08", ",", "P", "<", "0.05", ";", "F", "-LRB-", "1.85", ";", "33.41", "-RRB-", "=", "16.24", ",", "P", "<", "0.001", ";", "F", "-LRB-", "3.43,61.68", "-RRB-", "=", "18.79", ",", "P", "<", "0.001", ",", "respectively", "-RRB-", ".", "The", "MS24", "animals", "made", "significantly", "more", "errors", "over", "the", "course", "of", "reversal", "training", "-LRB-", "F", "-LRB-", "1", ",", "18", "-RRB-", "=", "4.79", ",", "P", "<", "0.05", ";", "Fig.", "6", "-RRB-", "and", "travelled", "longer", "distances", "-LRB-", "Fig.", "5", ";", "P", "=", "0.008", ",", "Mann", "--", "Whitney", "U-test", "-RRB-", ".", "This", "might", "indicate", "that", "the", "MS", "animals", "did", "not", "learn", "the", "reversal", "task", "as", "fast", "as", "the", "controls", ".", "Fig.", "4Left", ":", "Mean", "-LRB-", "±", "SEM", "-RRB-", "latency", "to", "``", "Goal", "''", ".", "There", "was", "a", "significant", "difference", "in", "Trial", "progress", "and", "a", "significant", "Trial", "x", "Group", "interaction", "-LRB-", "P", "<", "0.05", "-RRB-", ".", "Right", ":", "Mean", "-LRB-", "±", "SEM", "-RRB-", "frequency", "of", "visits", "to", "``", "Old", "Goal", "''", ".", "There", "was", "*", "a", "significant", "difference", "between", "the", "two", "groups", "-LRB-", "P", "<", "0.05", ",", "Mann", "--", "Whitney", "U", "test", "-RRB-", "and", "a", "significant", "decrease", "over", "time", "-LRB-", "P", "<", "0.05", ",", "RM", "ANOVA", "-RRB-", ".", "MS", "24", "-LRB-", "N", "=", "16", "-RRB-", "and", "SFR", "-LRB-", "N", "=", "5", "-RRB-", "Fig.", "5Mean", "-LRB-", "±", "SEM", "-RRB-", "distance", "moved", "in", "reverse", "trials", ".", "There", "was", "a", "significant", "decrease", "over", "time", "-LRB-", "P", "<", "0.05", ",", "RM", "ANOVA", "-RRB-", "and", "*", "a", "significant", "difference", "between", "the", "two", "treatment", "groups", "-LRB-", "P", "<", "0.05", ",", "Mann", "--", "Whitney", "U", "test", "-RRB-", "but", "no", "significant", "Trial", "x", "Group", "interaction", ".", "MS", "24", "-LRB-", "N", "=", "16", "-RRB-", "and", "SFR", "-LRB-", "N", "=", "5", "-RRB-", "Fig.", "6Mean", "-LRB-", "±", "SEM", "-RRB-", "frequency", "of", "errors", "in", "MS", "24", "-LRB-", "N", "=", "16", "-RRB-", "and", "SFR", "-LRB-", "N", "=", "5", "-RRB-", "*", "there", "was", "a", "significant", "difference", "between", "the", "two", "treatment", "groups", "and", "a", "significant", "decrease", "in", "Trial", "progress", "-LRB-", "P", "<", "0.05", "-RRB-", ".", "MS", "24", "-LRB-", "N", "=", "16", "-RRB-", "and", "SFR", "-LRB-", "N", "=", "5", "-RRB-", "The", "MS24", "animals", "made", "significantly", "more", "visits", "to", "the", "old", "target", "hole", "-LRB-", "Fig.", "4", "right", "-RRB-", "and", "the", "two", "adjacent", "holes", "over", "the", "course", "of", "the", "seven", "reversal", "trials", "-LRB-", "t", "-LRB-", "17.5", "-RRB-", "=", "3.72", ",", "P", "<", "0.01", ";", "t", "-LRB-", "17.5", "-RRB-", "=", "4.34", ",", "P", "<", "0.001", "-RRB-", ".", "This", "tendency", "to", "venture", "to", "the", "old", "goal", "and", "the", "adjacent", "holes", "could", "be", "an", "indication", "of", "perseveration", ",", "a", "behavioural", "pattern", "also", "found", "in", "other", "animal", "models", "and", "in", "schizophrenic", "patients", "-LRB-", "Bleuler", "1950", ";", "Bach", "et", "al.", "1995", ";", "review", "Crider", "1997", "-RRB-", "Search", "strategies", "The", "animal", "'s", "search", "pattern", "evolved", "over", "time", "-LRB-", "Fig.", "7", "-RRB-", ".", "The", "usual", "behaviour", "sequence", "was", "a", "progression", "from", "a", "random", "to", "a", "serial", ",", "and", "finally", "to", "a", "spatial", "search", "strategy", ".", "This", "sequence", "indicates", "that", "the", "animals", "became", "more", "accurate", "and", "more", "efficient", "in", "locating", "the", "correct", "hole", ".", "Likelihood-ratio", "chi-square", "tests", "showed", "that", "the", "experimental", "groups", "differed", "in", "their", "choice", "of", "search", "strategy", "on", "days", "2", "and", "3", "of", "acquisition", "training", "-LRB-", "χ", "-LRB-", "2", "-RRB-", "=", "10.5", ",", "P", "<", "0.01", ";", "χ", "-LRB-", "2", "-RRB-", "=", "6.6", ",", "P", "<", "0.05", ",", "respectively", "-RRB-", ".", "Already", "at", "this", "early", "time", "the", "SFR", "animals", "adopted", "a", "serial", "search", "strategy", "while", "the", "MS", "animals", "maintained", "a", "random", "search", "strategy", ".", "On", "all", "other", "acquisition", "and", "reversal", "training", "days", "the", "two", "experimental", "groups", "did", "not", "differ", "significantly", "with", "respect", "to", "their", "choice", "of", "search", "strategy", ".", "Fig.", "7Overview", "of", "mean", "-LRB-", "%", "-RRB-", "search", "strategies", "applied", "in", "the", "acquisition", "and", "reverse", "trial", "sessions", ".", "The", "search", "pattern", "evolved", "over", "time", "from", "a", "random", "to", "a", "serial", ",", "and", "finally", "to", "a", "spatial", "search", "strategy", ".", "From", "acquisition", "days", "2", "and", "3", ",", "the", "SFR", "animals", "adopted", "a", "serial", "search", "strategy", ",", "while", "the", "MS", "animals", "maintained", "a", "random", "search", "strategy", ".", "On", "all", "other", "acquisition", "and", "reversal", "training", "days", "the", "two", "experimental", "groups", "did", "not", "differ", "significantly", "with", "respect", "to", "their", "choice", "of", "search", "strategy", ".", "SFR", "-LRB-", "N", "=", "5", "-RRB-", "animals", "to", "the", "left", "and", "MS", "-LRB-", "N", "=", "16", "-RRB-", "animals", "to", "the", "right", "Neuron", "number", "The", "stereological", "sampling", "is", "shown", "in", "Table", "2", ".", "Table", "2Overview", "of", "the", "stereological", "sampling", "used", "in", "this", "studySubiculumCA4CA1CA3DGMS", "-LRB-", "maternal", "separated", "-RRB-", "Area", "-LRB-", "frame", "-RRB-", "-LRB-", "μm2", "-RRB-", "770", "--", "1,160710", "--", "1,100259259259", "Z", "depth", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "2020202020X", "and", "Y", "step", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "17580100100170", "∑", "Q", "−", "208", "±", "36.5140", "±", "23.8254", "±", "15.7193", "±", "10.3205", "±", "15.4", "Mean", "section", "thickness", ",", "tq", "−", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "39.5", "±", "0.240.0", "±", "0.3039.0", "±", "0.338.9", "±", "0.3039.3", "±", "0.30", "Height", "sampling", "fraction", ",", "hsf1", ".97", "±", "0.012.00", "±", "0.011.95", "±", "0.021.95", "±", "0.011.96", "±", "0.02", "Area", "sampling", "fraction", ",", "asf57", ".4", "±", "11.516.8", "±", "4.0638.7", "±", "0.0030.7", "±", "0.01111", "±", "0.00", "Section", "sampling", "fraction", "-LRB-", "k", "-RRB-", ",", "ssf66666Guard", "zone", ",", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "5.5", "--", "75.5", "--", "75.5", "--", "75.5", "--", "75.5", "--", "7SFR", "-LRB-", "Control", "-RRB-", "Area", "-LRB-", "frame", "-RRB-", "-LRB-", "μm2", "-RRB-", "1,222", "±", "61.61,388", "±", "34.7197", "±", "0.1240", "±", "6.2197", "±", "0.1", "Z", "depth", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "2020202020X", "and", "Y", "step", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "20095100100170", "∑", "Q", "−", "245", "±", "14.7190", "±", "14.4215", "±", "13.6188", "±", "11.8201", "±", "7.5", "Mean", "section", "thickness", ",", "tq", "−", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "39.0", "±", "0.6039.1", "±", "0.538.5", "±", "0.638.2", "±", "0.438.6", "±", "0.4", "Height", "sampling", "fraction", ",", "hsf1", ".95", "±", "0.031.95", "±", "0.021.93", "±", "0.031.91", "±", "0.021.93", "±", "0.02", "Area", "sampling", "fraction", ",", "asf33", ".3", "±", "1.626.46", "±", "0.2950.9", "±", "0.0342.0", "±", "1.28147", "±", "0.07", "Section", "sampling", "fraction", "-LRB-", "k", "-RRB-", ",", "ssf66666Guard", "zone", ",", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "5.5", "--", "75.5", "--", "75.5", "--", "75.5", "--", "75.5", "--", "7", "There", "was", "no", "significant", "difference", "in", "the", "total", "bilateral", "neuron", "number", "in", "hippocampus", "-LRB-", "Table", "3", "-RRB-", ".", "However", ",", "in", "the", "five", "subregions", "of", "hippocampus", ",", "there", "was", "a", "significant", "difference", "in", "the", "dentate", "gyrus", "-LRB-", "P", "=", "0.029", ",", "Students", "t", "test", "-RRB-", ",", "but", "none", "in", "the", "four", "other", "regions", "-LRB-", "see", "Fig.", "8", ";", "Table", "3", "-RRB-", ".", "The", "neuron", "loss", "in", "the", "dentate", "gyrus", "is", "equivalent", "to", "a", "20", "%", "reduction", "in", "the", "maternal", "separated", "animals", "compared", "with", "controls", ".", "The", "results", "should", "be", "interpreted", "with", "caution", "due", "to", "the", "low", "number", "of", "subjects", ".", "Table", "3Total", "estimated", "neuron", "number", "in", "five", "subregions", "of", "the", "hippocampusMaternally", "separated", "-LRB-", "MS", "-RRB-", "N", "=", "12SexSubiculumCA4CA1CA3DGTotalSubjectNeurons", "-LRB-", "103", "-RRB-", "CENeurons", "-LRB-", "103", "-RRB-", "CENeurons", "-LRB-", "103", "-RRB-", "CE", "Neurons", "-LRB-", "103", "-RRB-", "CE", "Neurons", "-LRB-", "103", "-RRB-", "CENeurons", "-LRB-", "103", "-RRB-", "CEFemale3310", ".0842.90.132920.061900.076720.071.5290.09", "Female2640", ".1034.80.132430.061890.075760.071.3070.09", "Female3710", ".0818.60.183030.062260.064740.081.3930.09", "Female1070", ".0821.20.081420.081120.093340.107160.09", "Female1480", ".0723.10.072130.071440.083540.108820.08", "Female1320", ".0720.60.082620.061740.076650.071.2540.07", "Female1380", ".0720.20.071550.081630.085520.071.0280.07", "Female1890", ".1267.90.132020.071340.084600.081.0530.10", "Female1440", ".0523.10.072300.071710.075970.071.1660.07", "Female1970", ".0520.90.072290.072030.074840.091.1350.07", "Male2370", ".1067.20.122570.061910.074870.091.2390.09", "Male2420", ".1037.40.132240.061860.077880.061.4880.09", "Mean2080", ".0833.20.112290.071740.075380.081.1820.08", "CVcontrol", "-LRB-", "SFR", "-RRB-", "N", "=", "70.500.360.280.210.260.25", "Female1860", ".0726.30.072850.071750.088040.071.4760.07", "Female1760", ".0730.20.092400.071910.086580.081.2960.08", "Female1690", ".0731.50.072730.072050.076550.081.3330.07", "Female1940", ".0525.30.091820.081860.076170.061.2040.08", "Female1620", ".0834.10.092780.071990.087250.071.3970.05", "Male1570", ".0820.30.092060.081150.096130.091.1120.07", "Male2210", ".0628.00.072850.071910.076440.091.3680.07", "Mean1810", ".0727.90.082500.071800.086740.081.3120.08", "CV0", ".070.120.170.060.110.08", "Student", "'s", "t", "testP", "=", "0.41", "P", "=", "0.46", "P", "=", "0.37", "P", "=", "0.65", "P", "=", "0.02", "*", "P", "=", "0.20", "*", "P", "<", "0.05", "Fig.", "8The", "total", "neuron", "number", "for", "the", "two", "treatment", "groups", "in", "five", "sub-regions", "of", "the", "mouse", "hippocampus", "for", "the", "pooled", "data", "in", "MS", "-LRB-", "N", "=", "12", "-RRB-", "and", "SFR", "-LRB-", "N", "=", "7", "-RRB-", ".", "*", "MS", "≠", "SFR", ",", "P", "<", "0.05", ",", "Student", "'s", "t", "test", "in", "the", "dentate", "gyrus", ".", "filled", "circle", "MS", ";", "open", "circle", "SFR", ";", "Sub", "Subiculum", ",", "CA", "4", "Hilus", ",", "DG", "Dentate", "Gyrus", "Volume", "After", "Cavalieri", "estimation", "of", "volume", "and", "correction", "for", "shrinkage", "-LRB-", "67.7", "%", "-RRB-", "a", "Student", "'s", "t", "test", "did", "not", "show", "any", "significant", "difference", "in", "either", "the", "total", "hippocampal", "volume", "or", "in", "the", "five", "subregions", "of", "the", "hippocampus", "between", "groups", "-LRB-", "Table", "4", "-RRB-", ".", "Table", "4Total", "estimated", "volume", "in", "five", "subregions", "of", "the", "hippocampusMaternally", "separated", "-LRB-", "MS", "-RRB-", "N", "=", "12SexSubiculumCA4CA1CA3DGTotalSubjectVolume", "mm2CEVolume", "mm2CEVolume", "mm2CEVolume", "mm2CEVolume", "mm2CEVolume", "mm2CEFemale4", ".330.050.690.081.460.051.520.051.800.039.790.05", "Female3", ".380.050.690.061.140.061.390.051.230.047.840.05", "Female4", ".250.050.590.071.540.051.720.041.180.049.290.05", "Female1", ".660.120.600.070.520.091.000.061.060.044.840.08", "Female2", ".400.090.860.060.790.081.260.051.290.046.590.07", "Female1", ".730.120.650.071.070.061.390.051.330.036.170.07", "Female2", ".260.100.690.060.680.091.420.051.220.046.260.07", "Female2", ".290.071.040.081.000.061.260.051.120.066.710.06", "Female2", ".150.070.790.060.910.071.450.051.130.036.430.06", "Female3", ".000.060.740.060.980.071.470.051.130.067.320.06", "Male2", ".980.061.010.061.070.061.390.051.150.057.000.06", "Male3", ".310.050.910.051.220.061.630.042.180.039.250.05", "Mean2", ".810.080.770.071.030.071.410.051.320.047.340.06", "CVContol", "-LRB-", "SFR", "-RRB-", "N", "=", "70.320.200.290.130.250.20", "Female2", ".970.080.780.071.260.061.690.041.560.038.250.06", "Female2", ".290.090.910.071.010.061.220.051.450.036.880.07", "Female2", ".510.090.870.061.160.061.880.041.380.047.820.06", "Female2", ".550.090.520.090.850.071.300.050.730.046.050.07", "Female2", ".100.110.860.070.980.071.480.051.300.046.730.07", "Male2", ".320.100.520.101.030.071.190.051.730.056.780.08", "Male2", ".830.080.700.071.170.051.460.051.580.047.720.06", "Mean2", ".510.090.750.081.070.051.460.051.390.047.180.07", "CV0", ".120.190.130.170.230.11", "Student", "'s", "t", "testP", "=", "0.40", "P", "=", "0.79", "P", "=", "0.76", "P", "=", "0.62", "P", "=", "0.66", "P", "=", "0.79", "Discussion", "In", "the", "present", "study", ",", "24", "h", "maternal", "separation", "on", "PND", "9", "in", "mice", "pups", "resulted", "in", "a", "20", "%", "neuron", "decrease", "in", "the", "dentate", "gyrus", "and", "behavioural", "perseverations", "in", "the", "Barnes", "maze", ".", "The", "anxiety", "and", "thus", "stress", "related", "behavioural", "tests", "conducted", "did", "not", "show", "any", "indications", "of", "an", "elevated", "anxiety", "level", ".", "On", "the", "contrary", ",", "the", "MS", "mice", "showed", "a", "reduced", "sign", "of", "anxiety", ",", "since", "they", "ventured", "more", "often", "onto", "the", "open", "arms", "than", "the", "equivalent", "control", "group", ".", "This", "could", "indicate", "that", "the", "SHRP", "was", "not", "repressed", ",", "in", "spite", "of", "our", "expectations", ".", "The", "results", "were", "thus", "surprising", "and", "contradicted", "some", "but", "not", "all", "other", "findings", "-LRB-", "Pihoker", "et", "al.", "1993", ";", "Plotsky", "and", "Meany", "1993", ";", "Cirulli", "et", "al.", "1994", ";", "Wigger", "and", "Neuman", "1999", ";", "Boccia", "and", "Pedersen", "2001", ";", "Parfitt", "et", "al.", "2004", "-RRB-", ".", "A", "study", "by", "Lehman", "et", "al.", "-LRB-", "1999", "-RRB-", "found", "that", "MS", "24", "at", "PND", "9", "did", "not", "result", "in", "the", "anxiety/fear", "response", "predicted", "by", "the", "group", "-LRB-", "Lehmann", "et", "al.", "1999", "-RRB-", ".", "Others", "have", "also", "found", "that", "effects", "of", "a", "manipulation", "of", "the", "HPA", "axis", "can", "not", "always", "be", "used", "to", "predict", "effects", "of", "the", "same", "manipulation", "of", "fear/anxiety", "expression", "at", "the", "behavioural", "level", "-LRB-", "see", "Lehmann", "et", "al.", "1999", ";", "Parfitt", "et", "al.", "2004", "-RRB-", ".", "Furthermore", ",", "Parfitt", "et", "al.", "-LRB-", "2004", "-RRB-", "reported", "that", "maternally", "separated", "C57BL/6", "male", "mice", "had", "a", "prolonged", "increase", "in", "plasma", "CORT", "after", "an", "acute", "stressor", ",", "but", "in", "adulthood", "showed", "no", "increased", "fear/anxiety", "behavioural", "response", "-LRB-", "Parfitt", "et", "al.", "2004", "-RRB-", ".", "The", "lack", "of", "fear", "response", "does", "evidently", "not", "necessarily", "mean", "that", "the", "corticosterone", "plasma", "level", "is", "not", "elevated", "in", "MS", "animals", "but", "since", "the", "corticosterone", "level", "was", "not", "measured", "this", "question", "remains", "unanswered", ".", "Finally", ",", "a", "study", "by", "Francis", "et", "al.", "-LRB-", "2002", "-RRB-", "concluded", "that", "MS", "rats", "subjected", "to", "an", "enriched", "environment", "could", "reverse", "the", "effect", "from", "MS", "on", "the", "HPA", "function", "and", "anxiety", "behaviour", "-LRB-", "Francis", "et", "al.", "2002", "-RRB-", ".", "In", "conclusion", ",", "we", "found", "that", "the", "MS", "mice", "in", "our", "study", "did", "not", "show", "behavioural", "indications", "on", "a", "repressed", "SHRP", ",", "which", "might", "be", "explained", "by", "the", "enriched", "environment", "the", "mice", "were", "kept", "in", ".", "The", "corticosterone", "plasma", "level", "was", "not", "measured", ".", "In", "the", "data", "presented", "for", "the", "Barnes", "maze", ",", "there", "were", "no", "significant", "differences", "between", "the", "two", "treatment", "groups", "during", "the", "acquisition", "period", ".", "Latency", "to", "reach", "the", "target", "hole", ",", "total", "distance", "moved", "on", "the", "maze", ",", "and", "error", "frequency", "all", "decreased", "significantly", "over", "the", "course", "of", "the", "six", "acquisition", "trials", "and", "seven", "reversal", "trials", ",", "indicating", "that", "the", "animals", "were", "able", "to", "learn", "the", "task", "with", "time", ",", "which", "is", "in", "agreement", "with", "other", "studies", "-LRB-", "e.g.", "Pompl", "et", "al.", "1999", "-RRB-", ".", "One", "consequence", "of", "hippocampal", "dysfunction", "is", "perseveration", "-LRB-", "Devenport", "et", "al.", "1988", "-RRB-", ".", "For", "the", "MS", "animals", "the", "group", "differences", "in", "the", "number", "of", "errors", "made", ",", "the", "goal", "parameter", "and", "the", "distance", "moved", "were", "therefore", "of", "interest", ".", "The", "differences", "found", "in", "the", "parameter", "``", "Close", "to", "Old", "Goal", "''", "the", "significantly", "higher", "frequency", "of", "``", "Errors", "''", "and", "visits", "to", "``", "Old", "Goal", "''", "by", "the", "MS", "24", "animals", "indicate", "that", "the", "MS", "animals", "were", "more", "perseverant", "which", "could", "point", "to", "a", "hippocampal", "lesion", "-LRB-", "Devenport", "et", "al.", "1988", ";", "Bach", "et", "al.", "1995", "-RRB-", ".", "However", ",", "since", "perseveration", "is", "also", "a", "feature", "of", "prefrontal", "cortical", "dysfunction", "and", "there", "was", "no", "hippocampal", "dysfunction", "in", "the", "acquisition", "trials", ",", "we", "can", "only", "conclude", "that", "the", "behaviour", "in", "reversal", "trial", "may", "be", "related", "to", "hippocampus", ",", "but", "we", "can", "not", "exclude", "that", "it", "is", "was", "caused", "by", ",", "e.g.", "a", "prefrontal", "cortical", "deficit", ".", "One", "of", "the", "advantages", "of", "the", "Barnes", "maze", "is", "its", "ability", "to", "reveal", "the", "search", "strategies", "applied", "by", "the", "mice", ".", "The", "search", "strategies", "can", "be", "an", "indication", "of", "how", "well", "the", "cognitive", "abilities", "in", "the", "mice", "are", "due", "to", "the", "use", "of", "extra-maze", "cues", "-LRB-", "Barnes", "1979", ";", "Holmes", "et", "al.", "2002", "-RRB-", ".", "In", "this", "study", ",", "an", "overall", "search", "pattern", "evolved", "with", "time", ".", "On", "initial", "trials", "the", "mice", "tended", "to", "use", "a", "random", "pattern", "and", "explore", "many", "incorrect", "holes", ",", "often", "returning", "to", "the", "centre", "after", "investigating", "the", "edge", "of", "the", "platform", ".", "With", "more", "experience", "the", "number", "of", "centre", "crossings", "decreased", "and", "a", "more", "systematic", "search", "was", "applied", ".", "Thus", "in", "later", "trials", "many", "mice", "went", "directly", "to", "the", "correct", "hole", "or", "one", "or", "two", "holes", "away", "before", "locating", "the", "hidden", "box", ".", "The", "mice", "learned", "the", "task", "better", "after", "a", "previous", "introduction", "to", "the", "platform", "and", "used", "the", "``", "Spatial", "''", "search", "strategy", "earlier", ".", "Furthermore", ",", "the", "SFR", "mice", "used", "the", "search", "strategy", "``", "Serial", "''", "significantly", "faster", "than", "the", "MS", "mice", "in", "the", "acquisition", "trials", ",", "but", "this", "was", "not", "true", "in", "the", "reversal", "trials", ".", "The", "serial", "search", "strategy", "requires", "the", "mouse", "to", "use", "the", "multiple", "relationships", "among", "extra-maze", "stimuli", "to", "find", "the", "escape", "tunnel", "-LRB-", "Barnes", "1979", ";", "Bach", "et", "al.", "1995", "-RRB-", ".", "So", "apparently", "the", "MS", "mice", "needed", "more", "time", "to", "acquire", "to", "the", "spatial", "search", "strategy", "when", "learning", "the", "task", ",", "which", "could", "indicate", "a", "learning", "disability", ".", "However", ",", "since", "the", "MS", "mice", "did", "not", "show", "difficulties", "in", "using", "the", "spatial", "search", "strategy", "in", "the", "reverse", "trials", ",", "no", "firm", "conclusions", "can", "be", "made", "on", "this", "point", ".", "Over", "85", "%", "of", "granule", "cell", "neurogenesis", "are", "previously", "described", "to", "occur", "postnatally", "in", "the", "rodent", "with", "peak", "neurogenesis", "between", "PND", "5", "and", "7", "and", "total", "cell", "number", "increasing", "throughout", "the", "first", "year", "and", "continuing", "throughout", "life", "-LRB-", "Altman", "and", "Das", "1965", ";", "Schlessinger", "et", "al.", "1975", ";", "Bayer", "et", "al.", "1982", ";", "Kuhn", "et", "al.", "1996", ";", "Kempermann", "et", "al.", "1998", "-RRB-", ".", "Much", "research", "has", "focused", "on", "the", "neurogenesis", "in", "both", "the", "adult", "and", "newborn", "hippocampus", "of", "mammals", "-LRB-", "Kempermann", "et", "al.", "1997", ";", "Gould", "et", "al.", "1997", ";", "Eriksson", "et", "al.", "1998", ";", "Tanapat", "et", "al.", "1998", ",", "2001", ";", "Gould", "et", "al.", "1999", ";", "Lemaire", "et", "al.", "2000", ";", "Malberg", "et", "al.", "2000", ";", "Raber", "et", "al.", "2004", ";", "Mirescu", "et", "al.", "2004", ";", "Greisen", "et", "al.", "2005", "-RRB-", "but", "only", "a", "few", "of", "these", "studies", "have", "used", "modified", "stereological", "methods", "-LRB-", "Kempermann", "et", "al.", "1997", ";", "Eriksson", "et", "al.", "1998", ";", "Gould", "et", "al.", "1999", ";", "Lemaire", "et", "al.", "2000", ";", "Malberg", "et", "al.", "2000", ";", "Greisen", "et", "al.", "2005", "-RRB-", ".", "None", "of", "these", "previous", "studies", "have", "quantified", "the", "total", "cell", "numbers", "in", "the", "hippocampus", "using", "stereology", "in", "early", "trauma", "animal", "models", "or", "in", "humans", ".", "The", "model", "can", "apparently", "induce", "a", "neuron", "change", "in", "the", "hippocampus", "but", "whether", "the", "lower", "neuron", "number", "is", "a", "decrease", "due", "to", "a", "neuron", "loss", "or", "because", "neurogenesis", "has", "been", "affected", "in", "the", "peak", "period", "could", "not", "be", "determined", "in", "this", "study", ".", "Secondly", ",", "the", "impact", "of", "the", "neuron", "loss", "is", "not", "immediately", "linked", "to", "a", "possible", "memory", "deficit", ".", "Even", "though", "the", "MS", "animals", "had", "a", "reduced", "emotional", "responds", "in", "the", "elevated", "plus", "maze", "and", "showed", "perseverance", "in", "the", "Barnes", "maze", ",", "the", "cognitive", "deficits", "could", "just", "as", "well", "be", "due", "to", "a", "prefrontal", "damage", "and", "thus", "not", "a", "result", "of", "the", "decreased", "neuron", "numbers", "in", "DG", ".", "We", "tested", "if", "a", "24-h", "maternal", "separation", "on", "PND", "9", "can", "cause", "an", "adult", "phenotype", "characterized", "by", "altered", "levels", "of", "activity", "and", "anxiety", ",", "learning", "and", "memory", "dysfunction", ",", "deficits", "in", "behavioural", "flexibility", "-LRB-", "reversal", "deficits", "-RRB-", "as", "well", "as", "changes", "in", "number", "of", "neurons", "in", "the", "hippocampus", "and", "its", "subregions", "in", "the", "mouse", "brain", ".", "We", "found", "that", "a", "single", "24", "h", "maternal", "separation", "on", "PND", "9", "could", "elicit", "a", "reduced", "stress", "response", "in", "the", "elevated", "plus", "maze", "and", "induce", "perseveration", "behaviour", "in", "the", "Barnes", "maze", ".", "Further", ",", "a", "20", "%", "reduction", "in", "total", "neuron", "numbers", "was", "found", "in", "the", "dentate", "gyrus", "of", "the", "hippocampus", ".", "Ethics", "The", "experiment", "was", "carried", "out", "in", "accordance", "with", "the", "European", "Communities", "Council", "Directive", "of", "24", "November", "1986", "-LRB-", "86/609/EEC", "-RRB-", "and", "the", "Danish", "legislation", "regulating", "animal", "experiments", "-LRB-", "Animal", "care", "and", "housing", "BEK", "nr", "687", "from", "25/07/2003", "-RRB-", ".", "The", "Danish", "Animal", "Experiments", "Inspectorate", "approved", "the", "protocols", "-LRB-", "Journal", "No.", "2003/561", "--", "781", "-RRB-", "." ]

[ "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Microsurgical", "third", "ventriculocisternostomy", "as", "an", "alternative", "to", "ETV", ":", "report", "of", "two", "cases", "Objective", "To", "describe", "a", "microsurgical", "alternative", "to", "endoscopic", "third", "ventriculocisternostomy", ".", "Introduction", "In", "the", "last", "two", "decades", ",", "endoscopic", "third", "ventriculocisternostomy", "-LRB-", "ETV", "-RRB-", "via", "a", "precoronal", "burr", "hole", "and", "transfrontal", "approach", "became", "a", "good", "therapeutic", "alternative", "to", "shunt", "placing", "and", "in", "non-communicating", "hydrocephalus", ",", "ETV", "has", "become", "the", "first", "choice", "of", "treatment", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "Also", ",", "ETV", "is", "more", "and", "more", "offered", "to", "patients", "with", "shunt", "at", "the", "time", "of", "shunt", "malfunction", "or", "in", "case", "of", "slit-ventricle", "syndrome", "-LRB-", "SVS", "-RRB-", "as", "a", "means", "to", "become", "shunt", "independent", ".", "However", ",", "in", "a", "subpopulation", "of", "patients", ",", "ETV", "is", "technically", "not", "feasible", "due", "to", "small", "ventricular", "system", "or", "slit", "ventricles", ".", "Patients", "with", "such", "small", "ventricles", "and", "multiple", "shunt", "malfunctions", "possess", "a", "highly", "therapeutic", "challenge", ".", "Other", "means", "of", "internal", "shunting", ",", "as", "an", "alternative", "to", "ventriculoperitoneal", "or", "ventriculoatrial", "shunting", ",", "have", "been", "described", "in", "the", "decades", "before", "ETV", "became", "a", "routine", "procedure", ".", "Third", "ventriculocisternostomy", "-LRB-", "TVS", "-RRB-", "has", "been", "performed", "by", "subtemporal", "craniotomy", "-LSB-", "5", "-RSB-", ",", "anterior", "subfrontal", "approach", "-LSB-", "6", ",", "7", ",", "24", "-RSB-", ",", "Torkildsen", "ventriculocisternostomy", "-LSB-", "26", ",", "27", "-RSB-", ",", "microsurgical", "ventriculocisternostomy", "-LSB-", "17", ",", "20", "-RSB-", ",", "stereotactic", "ventriculocisternostomy", "-LSB-", "4", ",", "13", ",", "19", "-RSB-", ",", "fluoroscopic", "ventriculocisternostomy", "-LSB-", "10", "--", "12", "-RSB-", ",", "microsurgical", "opening", "of", "the", "lamina", "terminalis", "-LSB-", "21", "-RSB-", ",", "reconstruction", "of", "or", "stent", "placement", "in", "the", "aqueduct", "-LSB-", "15", "-RSB-", ",", "and", "endoscopic", "aqueductoplasty", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "TVS", "by", "lamina", "terminalis", "fenestration", "is", "still", "a", "routine", "procedure", "in", "aneurysm", "surgery", "for", "subarachnoid", "hemorrhage", ",", "especially", "in", "case", "of", "anterior", "communicating", "artery", "aneurysms", ".", "However", ",", "the", "possibility", "of", "a", "microsurgical", "TVS", "-LRB-", "MTV", "-RRB-", "for", "obstructive", "hydrocephalus", "seems", "to", "be", "lost", "to", "oblivion", "by", "the", "widespread", "use", "of", "ETV", ".", "In", "this", "report", ",", "we", "describe", "two", "patients", "in", "whom", "an", "ETV", "could", "not", "be", "performed", "because", "of", "slit", "ventricles", "and", "who", "became", "shunt", "independent", "after", "MTV", "by", "a", "minimally", "invasive", "supraorbital", "approach", ".", "Case", "reports", "Case", "1", "This", "eight-year-old", "boy", "was", "born", "with", "an", "occipital", "meningocele", "and", "a", "thoracolumbar", "myelomeningocele", ".", "Both", "of", "these", "congenital", "abnormalities", "were", "operated", "upon", "1", "day", "after", "birth", ".", "Within", "several", "days", ",", "the", "patient", "developed", "a", "hydrocephalus", "which", "was", "treated", "with", "a", "ventriculoperitoneal", "shunt", ".", "One", "month", "later", ",", "a", "Chiari", "type", "II", "malformation", "was", "treated", "by", "a", "suboccipital", "craniotomy", "and", "a", "duraplasty", ".", "Since", "then", ",", "the", "patient", "experienced", "multiple", "drain", "infections", "and", "both", "proximal", "and", "distal", "drain", "dysfunctions", ".", "Ventriculoperitoneal", "shunting", "and", "ventriculoatrial", "shunting", "with", "different", "types", "of", "valves", "were", "implanted", "but", "none", "of", "them", "led", "to", "problem-free", "shunting", ",", "largely", "due", "to", "stiff", "slit", "ventricles", ".", "In", "March", "2003", ",", "the", "patient", "experienced", "another", "drain", "dysfunction", "with", "an", "intracranial", "pressure", "-LRB-", "ICP", "-RRB-", "of", "50", "cm", "H2O", "while", "maintaining", "slit", "ventricles", "followed", "by", "infection", "necessitating", "external", "ventricular", "drainage", "and", "antibiotics", "treatment", ".", "In", "search", "for", "a", "more", "definitive", "treatment", "of", "his", "recurrent", "drain", "dysfunctions", ",", "we", "considered", "to", "perform", "an", "ETV", ".", "However", ",", "the", "very", "narrow", "slit-like", "lateral", "ventricles", "and", "third", "ventricle", "did", "not", "allow", "a", "safe", "execution", "of", "this", "procedure", "-LRB-", "Fig.", "1a", "--", "c", "-RRB-", ".", "As", "an", "alternative", ",", "a", "microsurgical", "fenestration", "of", "the", "lamina", "terminalis", "and", "Liliequist", "'s", "membrane", "was", "performed", "via", "a", "right-sided", "eyebrow", "incision", "and", "a", "small", "supraorbital", "craniotomy", "-LRB-", "Fig.", "2", "-RRB-", ".", "The", "postoperative", "course", "was", "uneventful", ".", "The", "patient", "did", "not", "experience", "any", "symptoms", "suspect", "for", "hydrocephalus", "or", "raised", "intracranial", "pressure", "during", "a", "follow-up", "of", "3", "years", ".", "MRI", "control", "examination", "did", "not", "reveal", "a", "significant", "increase", "in", "the", "size", "of", "the", "ventricular", "system", "-LRB-", "Fig.", "1d", "--", "f", "-RRB-", ".", "Fig.", "1Case", "report", "1", ".", "a", ",", "b", "Axial", "T1", "MRI", "depicting", "very", "small", "slit-like", "lateral", "and", "third", "ventricles", ",", "c", "sagittal", "T2", "MRI", "showing", "small", "third", "ventricle", "and", "lamina", "terminalis", ",", "d", ",", "e", "postoperative", "axial", "T1", "MRI", "showing", "minimal", "increase", "in", "size", "of", "the", "lateral", "ventricles", ";", "f", "postoperative", "sagittal", "T2", "MRI", "shows", "a", "minimal", "increase", "of", "the", "third", "ventricle", ",", "but", "no", "flow", "void", "phenomenon", "at", "the", "lamina", "terminalisFig", ".", "2Postoperative", "photograph", "of", "case", "1", "showing", "the", "hardly", "visible", "scar", "of", "the", "eyebrow", "incision", "Case", "2", "This", "16-year-old", "boy", ",", "born", "with", "a", "lumbosacral", "meningocele", "and", "shunt", "dependent", "from", "birth", "on", ",", "developed", "with", "13", "years", "of", "age", "an", "increasing", "overdrainage", "syndrome", "with", "positional", "headaches", ".", "In", "another", "hospital", ",", "many", "valve", "revisions", "were", "performed", "in", "order", "to", "solve", "this", "problem", "and", "to", "rule", "out", "underdrainage", ".", "The", "original", "differential", "pressure", "valve", "was", "exchanged", "over", "a", "period", "of", "3", "years", "for", "several", "different", "Delta", "valves", "and", "a", "Codman", "Medos", "programmable", "valve", ",", "with", "which", "practical", "all", "settings", "were", "tried", ".", "Also", ",", "a", "shunt", "explantation", "was", "tried", "but", "after", "initial", "improvement", ",", "this", "led", "to", "a", "secondary", "increase", "of", "headaches", "and", "papilledema", "within", "several", "weeks", ",", "after", "which", "again", ",", "a", "Codman", "Medos", "valve", "was", "inserted", ".", "From", "this", "procedure", ",", "we", "obtained", "the", "security", "that", "the", "patient", "was", "still", "shunt", "dependant", "at", "that", "age", ".", "A", "new", "ICP", "monitoring", "was", "performed", "in", "the", "other", "hospital", "which", "showed", "negative", "intracranial", "pressures", "in", "upright", "sitting", "position", "and", "an", "ICP", "of", "5", "--", "10", "cm", "H2O", "in", "the", "supine", "position", ".", "The", "headache", "continued", ",", "even", "seemed", "to", "increase", "and", "became", "also", "chronic", "with", "positional", "increase", "of", "headaches", "in", "the", "upright", "position", ".", "The", "largest", "problem", ",", "however", ",", "became", "the", "frequent", "absenteeism", "from", "school", "because", "of", "these", "headaches", ".", "Chronic", "consultation", "of", "a", "pediatric", "neurologist", "and", "conservative", "treatment", "measures", "did", "not", "alter", "the", "symptoms", "either", ".", "At", "this", "time", ",", "he", "was", "referred", "to", "our", "department", ".", "As", "a", "first", "measure", ",", "a", "PaediGav", "9/29", "gravitational", "valve", "was", "applied", "because", "we", "had", "gained", "good", "experience", "with", "this", "type", "of", "valve", "but", "without", "any", "positive", "effect", "on", "the", "headaches", ".", "Although", "the", "patient", "did", "not", "improve", "after", "many", "shunt", "upgrading", ",", "it", "was", "felt", "that", "his", "headaches", "most", "likely", "were", "to", "be", "attributed", "to", "chronic", "overdrainage", ".", "Therefore", ",", "we", "sought", "for", "a", "means", "to", "have", "the", "patient", "shunt", "independent", "-LRB-", "after", "proven", "shunt", "dependency", "at", "the", "time", "-RRB-", ".", "Because", "an", "ETV", "was", "considered", "to", "be", "impossible", ",", "a", "right", "supraorbital", "craniotomy", "with", "a", "lamina", "terminalis", "fenestration", "and", "fenestration", "of", "Liliequist", "'s", "membrane", "was", "executed", "and", "the", "shunt", "was", "completely", "removed", ",", "except", "for", "the", "ventricular", "catheter", "that", "was", "fixated", "and", "therefore", "left", "behind", ".", "Again", ",", "no", "significant", "change", "of", "the", "headache", "could", "be", "observed", ".", "A", "24-h", "continuous", "ICP", "monitoring", ",", "performed", "after", "6", "weeks", "because", "of", "unchanged", "symptoms", ",", "revealed", "a", "normal", "ICP", "in", "supine", "and", "upright", "positions", "with", "a", "maximum", "nightly", "increase", "to", "13", "mm", "Hg", ".", "Two", "years", "after", "surgery", ",", "the", "patient", "is", "still", "shunt", "independent", "with", "chronic", "headaches", ",", "no", "papilledema", "-LRB-", "contrary", "to", "the", "first", "shunt", "explantation", "before", "MTV", "-RRB-", ",", "and", "in", "a", "rehabilitation", "program", ".", "A", "computed", "tomography", "-LRB-", "CT", "-RRB-", "scan", "1.5", "years", "after", "surgery", "shows", "a", "minimal", "increase", "in", "the", "size", "of", "the", "ventricles", "-LRB-", "Fig.", "3", "-RRB-", ".", "Fig.", "3Case", "report", "2", ".", "a", ",", "b", "Preoperative", "CT", "scan", "depicting", "slit-like", "ventricles", ";", "c", ",", "d", "postoperative", "CT", "scan", "with", "minimal", "increase", "of", "ventricle", "size", "and", "a", "residual", "ventricular", "catheter", "that", "could", "not", "be", "removed", "Discussion", "There", "are", "many", "complications", "related", "to", "shunt", "dependency", ".", "In", "10.9", "--", "29", "%", "of", "cases", "complications", "-LRB-", "other", "than", "mechanical", "obstruction", "-RRB-", "occur", ",", "the", "majority", "of", "which", "is", "a", "shunt", "infection", "-LSB-", "9", ",", "14", ",", "18", "-RSB-", ".", "Mechanical", "complications", "in", "shunts", "including", "late", "shunt", "malfunction", "may", "even", "occur", "in", "up", "to", "45.9", "%", "in", "the", "first", "postoperative", "year", "and", "up", "to", "81", "%", "of", "patients", "at", "12", "years", "follow-up", "-LSB-", "8", ",", "9", ",", "18", "-RSB-", ".", "Also", ",", "the", "long-term", "shunt-related", "mortality", "rate", "of", "the", "shunt-treated", "patient", ",", "despite", "many", "improvements", "in", "shunt", "technique", ",", "diagnostics", ",", "and", "follow-up", ",", "remains", "high", "-LRB-", "2.9", "%", "to", "12.4", "%", "at", "10", "years", "follow-up", "-RRB-", "-LSB-", "10", ",", "16", ",", "30", "-RSB-", ".", "Therefore", ",", "the", "ultimate", "goal", "in", "hydrocephalus", "therapy", "is", "to", "get", "the", "patient", "shunt", "free", ".", "Since", "the", "first", "experience", "by", "Guiot", "-LSB-", "10", "-RSB-", ",", "transcortical", "or", "transventricular", "endoscopic", "third", "ventriculocisternostomy", "has", "proved", "to", "be", "a", "valid", "alternative", "in", "the", "treatment", "of", "obstructive", "hydrocephalus", ".", "Also", ",", "several", "studies", "have", "shown", "that", "ETV", "is", "an", "effective", "treatment", "in", "patients", "with", "obstructive", "hydrocephalus", "who", "had", "undergone", "previous", "shunting", "procedures", "-LSB-", "1", ",", "23", ",", "25", "-RSB-", ".", "It", "can", "provide", "a", "definitive", "cure", "for", "patients", "with", "difficult-to-manage", "shunt", "dysfunction", ".", "The", "potential", "advantages", "of", "ETV", "over", "conventional", "shunting", "are", "clear", ".", "However", ",", "ETV", "requires", "a", "certain", "degree", "of", "lateral", "and", "third", "ventricle", "dilatation", "to", "be", "performed", "safely", ".", "In", "case", "of", "small", "ventricles", ",", "the", "potential", "risks", "of", "this", "procedure", "-LRB-", "injuring", "fornix", ",", "thalamostriate", "or", "internal", "cerebral", "veins", ",", "hypothalamus", "-RRB-", "outweigh", "the", "advantages", ".", "One", "might", "consider", "to", "enlarge", "the", "ventricles", "and", ",", "thus", ",", "to", "facilitate", "an", "ETV", ".", "This", "has", "been", "safely", "and", "successfully", "performed", "by", "Butler", "and", "Khan", "-LSB-", "2", "-RSB-", "with", "an", "external", "ventricular", "drain", "and", "by", "Chernov", "et", "al.", "-LSB-", "3", "-RSB-", "by", "using", "a", "programmable", "valve", "of", "which", "the", "pressure", "was", "increased", "in", "a", "stepwise", "fashion", ".", "In", "our", "department", ",", "we", "have", "practised", "both", "techniques", "for", "ventricular", "dilatation", "successfully", ",", "but", "we", "also", "encountered", "serious", "complications", "from", "this", "strategy", ".", "In", "both", "cases", "described", "here", ",", "we", "already", "knew", "from", "previous", "shunt", "malfunctions", "that", "the", "ventricles", "hardly", "dilate", "with", "increased", "intracranial", "pressure", ".", "A", "shunt", "revision", "in", "case", "1", "for", "proximal", "catheter", "obstruction", "only", "several", "months", "before", "the", "MTV", "revealed", "an", "intracranial", "pressure", "of", "50", "cm", "H2O", "with", "only", "minimal", "ventricular", "dilatation", ".", "Therefore", ",", "in", "our", "two", "patients", ",", "we", "opted", "to", "perform", "an", "open", "microsurgical", "TVS", "by", "opening", "the", "lamina", "terminalis", "via", "a", "small", "supraorbital", "craniotomy", "and", "did", "not", "consider", "achieving", "ventricular", "expansion", ".", "Both", "patients", "became", "shunt", "independent", ".", "Open", "surgical", "TVS", "once", "was", "a", "popular", "therapeutic", "technique", "for", "the", "treatment", "of", "obstructive", "hydrocephalus", "before", "the", "advent", "of", "VP", "shunt", "systems", ".", "The", "idea", "of", "third", "ventricular", "communication", "into", "the", "chiasmatic", "cisterns", "was", "initially", "proposed", "by", "Dandy", "-LSB-", "7", "-RSB-", "in", "1922", "as", "a", "surgical", "procedure", "to", "alleviate", "obstructive", "hydrocephalus", ".", "It", "was", "first", "performed", "by", "Dandy", "via", "a", "subfrontal", "approach", "and", "frequently", "required", "the", "sacrifice", "of", "one", "optic", "nerve", "and", "elevating", "the", "chiasm", ".", "Later", ",", "Dandy", "-LSB-", "5", "-RSB-", "described", "the", "alternative", "subtemporal", "approach", ".", "In", "1936", ",", "Stookey", "and", "Scarff", "-LSB-", "24", "-RSB-", "described", "a", "subfrontal", "anterior", "approach", "for", "TVS", "through", "the", "lamina", "terminalis", "and", "the", "hypothalamus", "to", "the", "lumen", "of", "the", "third", "ventricle", ".", "Scarff", "-LSB-", "21", "-RSB-", "published", "a", "review", "of", "527", "patients", "subjected", "to", "this", "operation", "by", "both", "the", "subfrontal", "and", "subtemporal", "procedures", ",", "as", "reported", "by", "many", "authors", ".", "The", "over-all", "operative", "mortality", "was", "15", "%", "and", "the", "permanent", "arrest", "of", "the", "hydrocephalus", "was", "obtained", "in", "70", "%", "of", "the", "survivors", ".", "Open", "surgical", "TVS", "for", "obstructive", "hydrocephalus", "was", "then", "abandoned", "due", "to", "better", "and", "reliable", "shunting", "systems", "and", "because", "the", "advent", "of", "endoscopic", "techniques", "of", "this", "procedure", "is", "not", "reported", "to", "be", "in", "widespread", "use", ".", "Nevertheless", ",", "it", "remained", "a", "routine", "procedure", "during", "aneurysm", "surgery", "in", "order", "to", "get", "more", "slack", "ventricles", "and", "to", "prevent", ",", "or", "decrease", "the", "number", "of", ",", "posthemorrhagic", "hydrocephalus", ".", "To", "the", "best", "of", "our", "knowledge", ",", "MTV", ",", "by", "opening", "the", "lamina", "terminalis", "for", "the", "treatment", "of", "hydrocephalus", ",", "was", "last", "reported", "in", "1988", ".", "In", "this", "report", "from", "Reddy", "et", "al.", "-LSB-", "17", "-RSB-", ",", "five", "shunted", "patients", "with", "aqueduct", "stenosis", "and", "slit", "ventricle", "syndrome", "described", "are", "treated", "successfully", "with", "MTV", "via", "opening", "of", "the", "lamina", "terminalis", ".", "The", "lamina", "terminalis", "was", "approached", "in", "all", "patients", "via", "a", "classic", "pterional", "craniotomy", ".", "Since", "then", ",", "reports", "on", "ETV", "dominate", "the", "literature", ".", "Operative", "technique", "Many", "neurosurgeons", "consider", "craniotomy", "and", "MTV", "too", "large", "and", "risky", "a", "procedure", ".", "However", ",", "the", "procedure", "described", "in", "this", "report", "is", "a", "truly", "minimally", "invasive", "procedure", ".", "The", "operation", "time", "is", "about", "1", "h", ",", "the", "wound", "and", "scar", "are", "minimal", ",", "recuperation", "is", "very", "fast", ",", "and", "the", "potential", "risks", "are", "very", "low", ".", "One", "might", "even", "suggest", "that", "this", "procedure", "is", "safer", "than", "an", "ETV", "because", "it", "has", "an", "extracerebral", "approach", ",", "in", "contrast", "to", "ETV", ",", "and", "that", "surgery", "is", "better", "controlled", "with", "more", "opportunities", "for", "hemostasis", ".", "The", "supraorbital", "craniotomy", "with", "eyebrow", "incision", "has", "been", "described", "previously", "-LSB-", "28", "-RSB-", ".", "The", "Sylvian", "fissure", "needs", "not", "to", "be", "dissected", ".", "The", "ipsilateral", "optic", "nerve", "and", "the", "optic", "chiasm", ",", "the", "ICA", "and", "the", "ipsilateral", "ACA", "as", "well", "as", "the", "ACoA", "are", "exposed", "after", "which", "the", "lamina", "terminalis", "is", "reached", ".", "Lamina", "terminals", "fenestration", "is", "a", "standard", "procedure", "easily", "performed", "with", "the", "bipolar", "forceps", "or", "an", "arachnoid", "diamond", "knife", ".", "This", ",", "however", ",", "is", "not", "sufficient", ".", "It", "is", "essential", "to", "open", "Liliequist", "'s", "membrane", "to", "allow", "free", "and", "sufficient", "CSF", "communication", "between", "the", "posterior", "fossa", "and", "the", "suprasellar", "and", "frontobasal", "cisterns", ".", "Recovery", "of", "this", "operative", "procedure", "is", "fast", "and", "without", "major", "side-effects", ".", "Usually", ",", "hospitalization", "time", "is", "2", "to", "3", "days", ".", "Conclusion", "In", "conclusion", ",", "open", "microsurgical", "third", "ventriculocisternostomy", "by", "opening", "the", "lamina", "terminalis", "should", "be", "kept", "in", "mind", "as", "an", "alternative", "technique", "for", "treating", "patients", "with", "multiple", "shunt", "failures", "and", "small", "ventricles", "not", "accessible", "for", "an", "endoscopic", "approach", "in", "an", "effort", "to", "make", "these", "patients", "shunt", "independent", "." ]

[ "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Letrozole", "as", "upfront", "endocrine", "therapy", "for", "postmenopausal", "women", "with", "hormone-sensitive", "breast", "cancer", ":", "BIG", "1-98", "The", "BIG", "1-98", "trial", "is", "a", "large", ",", "randomized", ",", "independently", "conducted", "clinical", "trial", "designed", "to", "compare", "the", "efficacy", "of", "upfront", "letrozole", "versus", "tamoxifen", "monotherapy", "and", "to", "compare", "sequential", "or", "up-front", "use", "of", "letrozole", "and/or", "tamoxifen", "as", "an", "early", "adjuvant", "therapy", "for", "patients", "with", "early", "breast", "cancer", ".", "We", "report", "on", "the", "results", "from", "the", "primary", "core", "analysis", "of", "the", "BIG", "1-98", "trial", "of", "8,010", "patients", ",", "which", "compares", "monotherapy", "with", "letrozole", "versus", "tamoxifen", ".", "This", "pre-planned", "core", "analysis", "allowed", "the", "use", "of", "patient", "data", "from", "the", "monotherapy", "arms", "of", "letrozole", "and", "tamoxifen", "and", "from", "the", "sequential", "arms", "prior", "to", "the", "drug", "switch", "point", ".", "Patients", "randomized", "to", "letrozole", "had", "a", "19", "%", "improved", "disease-free", "survival", "-LRB-", "hazard", "ratio", "-LSB-", "HR", "-RSB-", "=", "0.81", ";", "P", "=", "0.003", "-RRB-", ",", "due", "especially", "to", "reduced", "distant", "metastases", "-LRB-", "HR", "=", "0.73", ";", "P", "=", "0.001", "-RRB-", ".", "A", "14", "%", "risk", "reduction", "of", "fatal", "events", "in", "favor", "of", "letrozole", "was", "also", "observed", "-LRB-", "P", "=", "NS", "-RRB-", ".", "The", "results", "from", "the", "monotherapy", "arms", "alone", "confirmed", "the", "findings", "from", "the", "primary", "core", "analysis", ".", "Based", "on", "the", "results", "from", "this", "trial", ",", "the", "aromatase", "inhibitor", "letrozole", "-LRB-", "Femara", "®", "-RRB-", "is", "currently", "recommended", "as", "a", "part", "of", "standard", "adjuvant", "therapy", "for", "postmenopausal", "women", "with", "endocrine-responsive", "breast", "cancer", "and", "has", "recently", "been", "approved", "in", "the", "early", "adjuvant", "setting", "in", "both", "Europe", "and", "the", "United", "States", ".", "A", "subsequent", "analysis", "after", "additional", "follow-up", "will", "address", "the", "question", "of", "monotherapy", "versus", "sequential", "therapy", ".", "Introduction", "and", "rationale", "During", "the", "last", "century", "the", "management", "of", "primary", "breast", "cancer", "has", "evolved", "from", "gross", "surgical", "intervention", "to", "a", "sophisticated", "approach", "involving", "surgical", ",", "radiotherapeutic", ",", "hormonal", ",", "chemotherapeutic", ",", "and", "targeted", "biologic", "strategies", ".", "Currently", ",", "pharmacologic", "treatment", "is", "tailored", "according", "to", "disease", "and", "patient", "characteristics", ",", "including", "tumor", "size", ",", "histologic", "grade", ",", "lymph-node", "involvement", ",", "hormone", "receptor", "-LRB-", "HR", "-RRB-", "status", ",", "and", "human", "epidermal", "growth", "factor", "receptor-2", "-LRB-", "HER2", "-RRB-", "overexpression", ".", "The", "benefits", "from", "adjuvant", "chemotherapy", ",", "adjuvant", "hormonal", "therapy", ",", "and", "adjuvant", "therapy", "with", "trastuzumab", "have", "been", "well-established", "-LSB-", "1", ",", "2", "-RSB-", ".", "Patients", "with", "early", "breast", "cancer", "presenting", "with", "estrogen", "receptor", "-LRB-", "ER", "-RRB-", "-", "positive", "and/or", "progesterone", "receptor", "-LRB-", "PgR", "-RRB-", "-", "positive", "tumors", "typically", "receive", "adjuvant", "hormonal", "therapy", ".", "Adjuvant", "therapy", "with", "tamoxifen", ",", "a", "selective", "estrogen", "receptor", "modulator", "-LRB-", "SERM", "-RRB-", ",", "significantly", "reduces", "the", "risk", "of", "breast", "cancer", "recurrence", "-LSB-", "1", "-RSB-", ";", "the", "Early", "Breast", "Cancer", "Trialists", "Collaborative", "Group", "reported", "that", "5", "years", "of", "tamoxifen", "reduces", "the", "annual", "breast", "cancer", "death", "rate", "by", "31", "%", "and", "is", "significantly", "more", "effective", "than", "just", "1", "--", "2", "years", "of", "tamoxifen", "in", "ER-positive", "breast", "cancer", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "However", ",", "intrinsic", "estrogenic", "activity", "-LSB-", "3", "--", "5", "-RSB-", "and", "increased", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "-LSB-", "6", "-RSB-", "and", "thromboembolism", "-LSB-", "7", ",", "8", "-RSB-", "have", "emerged", "as", "disadvantages", "when", "using", "tamoxifen", ".", "Based", "on", "current", "published", "data", ",", "extending", "the", "course", "of", "adjuvant", "tamoxifen", "beyond", "5", "years", "is", "not", "beneficial", "-LSB-", "9", "-RSB-", "despite", "the", "persistent", "risk", "of", "relapse", "in", "patients", "with", "HR", "+", "breast", "cancer", "-LSB-", "10", "-RSB-", ".", "In", "the", "first-line", "treatment", "of", "advanced", "breast", "cancer", ",", "the", "third-generation", "aromatase", "inhibitors", "-LRB-", "AIs", "-RRB-", "have", "shown", "superior", "or", "equivalent", "efficacy", "compared", "with", "tamoxifen", "-LSB-", "11", "--", "15", "-RSB-", ".", "Letrozole", "demonstrated", "significant", "superiority", "in", "time", "to", "progression", "and", "overall", "response", "rate", "-LSB-", "12", "-RSB-", "and", ",", "in", "addition", ",", "an", "early", "survival", "benefit", "-LSB-", "11", "-RSB-", ".", "This", "indicates", "that", "a", "subset", "of", "the", "breast", "tumors", "is", "inherently", "less", "sensitive", "to", "tamoxifen", "-LSB-", "16", "-RSB-", "and", "that", "resistance", "to", "tamoxifen", "is", "acquired", "more", "quickly", "-LSB-", "17", "-RSB-", ".", "This", "superiority", "of", "letrozole", "over", "tamoxifen", "in", "the", "advanced", "setting", "led", "to", "the", "hypothesis", "that", "this", "AI", "may", "also", "be", "superior", "to", "tamoxifen", "when", "administered", "in", "the", "adjuvant", "setting", ".", "The", "Breast", "International", "Group", "-LRB-", "BIG", "-RRB-", "1-98", "was", "designed", ",", "coordinated", ",", "analyzed", ",", "and", "reported", "by", "an", "independent", "academic", "group", "and", "currently", "is", "the", "largest", "ongoing", "adjuvant", "trial", "in", "breast", "cancer", "investigating", "the", "role", "of", "an", "AI", ".", "This", "review", "summarizes", "the", "design", "and", "results", "from", "the", "primary", "core", "analysis", "of", "the", "BIG", "1-98", "trial", ",", "which", "compared", "monotherapy", "with", "letrozole", "to", "monotherapy", "with", "tamoxifen", "and", "identified", "letrozole", "as", "a", "better", "alternative", "to", "tamoxifen", "in", "this", "setting", ".", "It", "also", "summarizes", "some", "of", "the", "additional", "published", "research", "using", "the", "BIG", "1-98", "database", ".", "Trial", "design", "and", "patients", "BIG", "1-98", "was", "a", "randomized", ",", "phase", "III", ",", "double-blind", "trial", "with", "two", "randomization", "options", ":", "two-arms", "-LRB-", "A", "or", "B", "-RRB-", "and", "four-arms", "-LRB-", "A", ",", "B", ",", "C", "or", "D", "-RRB-", "-LRB-", "see", "Fig.", "1", "-RRB-", "for", "women", "with", "operable", "invasive", "HR", "+", "-LRB-", "ER", "+", "and/or", "PgR", "+", "-RRB-", "breast", "cancer", ".", "The", "treatment", "arms", "were", ":", "-LRB-", "A", "-RRB-", "initial", "therapy", "with", "tamoxifen", "for", "5", "years", ",", "-LRB-", "B", "-RRB-", "initial", "therapy", "with", "letrozole", "for", "5", "years", ",", "-LRB-", "C", "-RRB-", "initial", "therapy", "with", "tamoxifen", "for", "2", "years", "followed", "by", "letrozole", "for", "3", "years", ",", "or", "-LRB-", "D", "-RRB-", "initial", "therapy", "with", "letrozole", "for", "2", "years", "followed", "by", "tamoxifen", "for", "3", "years", ".", "The", "doses", "administered", "were", "2.5", "mg/day", "of", "letrozole", "and", "20", "mg/day", "of", "tamoxifen", ".", "Fig.", "1BIG-98", "trial", "design", "Between", "March", "1998", "and", "March", "2000", ",", "1,835", "women", "were", "randomly", "assigned", "to", "arms", "A", "or", "B", ",", "and", "between", "April", "1999", "and", "May", "2003", "a", "further", "6,193", "were", "assigned", "to", "arms", "A", ",", "B", ",", "C", ",", "or", "D", ".", "The", "primary", "core", "analysis", "compared", "treatment", "effects", "of", "patients", "randomized", "to", "receive", "letrozole", "initially", "-LRB-", "arms", "B", "and", "D", "-RRB-", "and", "those", "assigned", "to", "receive", "tamoxifen", "initially", "-LRB-", "arm", "A", "and", "C", "-RRB-", ".", "In", "the", "sequential", "treatment", "groups", "-LRB-", "arms", "C", "and", "D", "-RRB-", ",", "only", "events", "that", "occurred", "up", "to", "30", "days", "after", "switching", "treatments", "were", "included", "in", "the", "analysis", ".", "In", "total", ",", "8,010", "patients", "were", "included", "in", "the", "primary", "core", "analysis", ":", "4,003", "in", "the", "initial", "letrozole", "group", "-LRB-", "arms", "B", "and", "D", "-RRB-", "and", "4,007", "in", "the", "initial", "tamoxifen", "group", "-LRB-", "arms", "A", "and", "C", "-RRB-", "-LRB-", "see", "Fig.", "2", "-RRB-", ".", "Patient", "characteristics", "were", "similar", "in", "the", "two", "treatment", "groups", ".", "Overall", ",", "the", "trial", "included", "41.3", "%", "node-positive", "and", "57.3", "%", "node-negative", "women", ",", "while", "1.4", "%", "had", "unknown", "nodal", "status", ".", "Positive", "HR", "status", "was", "an", "eligibility", "criterion", ".", "The", "majority", "of", "patients", "-LRB-", "63.1", "%", "-RRB-", "had", "both", "ER", "+", "and", "PgR", "+", "tumors", ".", "A", "total", "of", "25.3", "%", "of", "women", "received", "adjuvant", "or", "neoadjuvant", "chemotherapy", ".", "Fig.", "2CONSORT", "-LRB-", "Consolidated", "Standards", "of", "Reporting", "Trials", "-RRB-", "flowchart", "of", "the", "BIG", "1-98", "trial", ".", "The", "primary", "core", "analysis", "includes", "all", "8,010", "assessable", "patients", ",", "but", "events", "and", "follow-up", "in", "the", "sequential", "treatment", "groups", "-LRB-", "L", "→", "T", "and", "T", "→", "L", "-RRB-", "are", "truncated", "at", "30", "days", "after", "switching", "to", "the", "other", "treatment", ".", "L", "denotes", "letrozole", "and", "T", "tamoxifen", ".", "Reprinted", "from", "-LSB-", "18", ",", "Supplementary", "Appendix", "-RSB-", "End", "points", "The", "primary", "end", "point", "of", "the", "trial", "was", "disease-free", "survival", "-LRB-", "DFS", "-RRB-", ",", "defined", "as", "the", "time", "from", "randomization", "to", "first", "occurrence", "of", ":", "invasive", "recurrence", "in", "ipsilateral", "breast", ",", "chest", "wall", ",", "regional", "site", "-LRB-", "internal", "mammary/axilla", "-RRB-", ",", "or", "distant", "site", "-LRB-", "including", "ipsilateral", "supraclavicular", "-RRB-", ";", "contralateral", "breast", "cancer", "-LRB-", "invasive", "-RRB-", ";", "second", "malignancy", "-LRB-", "non-breast", "-RRB-", ";", "or", "death", "without", "prior", "cancer", "event", ".", "Protocol-specified", "secondary", "end", "points", "in", "the", "BIG", "1-98", "trial", "were", ":", "overall", "survival", "-LRB-", "OS", "-RRB-", ",", "defined", "as", "time", "from", "randomization", "to", "death", "from", "any", "cause", ";", "systemic", "DFS", ",", "defined", "as", "time", "from", "randomization", "to", "distant", "recurrence", ";", "second", "non-breast", "malignancy", "or", "death", "from", "any", "cause", "-LRB-", "ignoring", "local", "and", "contralateral-breast", "events", "-RRB-", ";", "and", "safety", ".", "Three", "additional", "end", "points", "were", "defined", "in", "the", "statistical", "analysis", "plan", ":", "-LRB-", "1", "-RRB-", "DFS", "excluding", "second", ",", "non-breast", "malignancies", ";", "-LRB-", "2", "-RRB-", "time", "to", "recurrence", ",", "defined", "as", "time", "from", "randomization", "to", "first", "breast", "cancer", "recurrence", "-LRB-", "excluding", "second", ",", "non-breast", "cancers", "and", "censoring", "data", "on", "patients", "who", "died", "without", "a", "prior", "cancer", "event", "-RRB-", ";", "and", "-LRB-", "3", "-RRB-", "time", "to", "distant", "recurrence", ",", "defined", "as", "the", "time", "from", "randomization", "to", "the", "first", "breast", "cancer", "recurrence", "at", "a", "distant", "site", ".", "Efficacy", "analyses", "Primary", ",", "secondary", ",", "and", "additional", "end", "points", "At", "25.8", "months", "of", "follow-up", ",", "letrozole", "improved", "DFS", "by", "19", "%", "-LRB-", "P", "=", "0.003", "-RRB-", ".", "The", "cumulative", "incidence", "of", "breast", "cancer", "relapse", "was", "significantly", "reduced", "with", "letrozole", "compared", "with", "tamoxifen", "-LRB-", "see", "Fig.", "3", "-RRB-", ".", "The", "difference", "was", "evident", "from", "1", "year", "after", "randomization", "and", "at", "5", "years", "was", "10.3", "%", "in", "the", "letrozole", "group", "compared", "with", "13.6", "%", "in", "the", "tamoxifen", "group", "-LRB-", "P", "<", "0.001", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "letrozole", "significantly", "improved", "systemic", "DFS", "compared", "with", "tamoxifen", "-LRB-", "hazard", "ratio", "0.83", ";", "95", "%", "CI", "0.72", "--", "0.97", "-RRB-", ".", "There", "was", "significant", "improvement", "with", "letrozole", "compared", "with", "tamoxifen", "for", "the", "additional", "end", "point", "of", "DFS", "excluding", "second", "non-breast", "cancers", "-LRB-", "hazard", "ratio", "0.79", ";", "95", "%", "CI", "0.68", "--", "0.92", "-RRB-", ".", "Letrozole", "was", "particularly", "effective", "in", "decreasing", "the", "risk", "of", "distant", "recurrence", "by", "27", "%", "compared", "with", "tamoxifen", "-LRB-", "hazard", "ratio", "0.73", ";", "95", "%", "CI", "0.60", "--", "0.88", ";", "P", "=", "0.001", "-RRB-", "-LRB-", "see", "Fig.", "4", "-RRB-", ".", "A", "non-significant", "14", "%", "improvement", "in", "OS", "was", "observed", "in", "patients", "receiving", "letrozole", ".", "Thus", ",", "166", "deaths", "-LRB-", "4.1", "%", "-RRB-", "were", "observed", "in", "the", "letrozole", "group", "compared", "with", "192", "deaths", "-LRB-", "4.8", "%", "-RRB-", "in", "the", "tamoxifen", "group", ".", "Fig.", "3Cumulative", "incidence", "of", "a", "breast", "cancer", "relapse", "in", "the", "BIG", "1-98", "trial", ".", "Reprinted", "from", "-LSB-", "18", "-RSB-", "with", "permission", "from", "the", "Massachusetts", "Medical", "SocietyFig", ".", "4Cox", "proportional-hazards", "model", "of", "data", "from", "the", "BIG", "1-98", "trial", ".", "The", "size", "of", "the", "boxes", "is", "inversely", "proportional", "to", "the", "standard", "error", "of", "the", "hazard", "ratio", ".", "The", "dashed", "vertical", "shows", "the", "hazard-ratio", "estimate", "for", "the", "overall", "analysis", "of", "the", "primary", "study", "end", "point", "-LRB-", "disease-free", "survival", "-RRB-", ".", "Reprinted", "from", "-LSB-", "18", "-RSB-", "with", "permission", "from", "the", "Massachusetts", "Medical", "Society", "Subgroup", "analyses", "Prospectively", "planned", "subgroup", "analyses", ",", "using", "the", "Cox", "proportional-hazards", "model", ",", "for", "primary", ",", "secondary", ",", "and", "additional", "end", "points", "are", "summarized", "in", "Fig.", "4", ".", "Subgroup", "analysis", "showed", "that", "the", "beneficial", "effect", "of", "letrozole", "on", "DFS", "was", "seen", "in", "ER", "+", "tumors", "irrespective", "of", "PgR", "receptor", "status", "or", "patient", "age", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "The", "role", "of", "ER", "and", "PgR", "in", "trials", "comparing", "AIs", "with", "tamoxifen", "remains", "an", "area", "of", "continued", "research", "-LSB-", "19", ",", "20", "-RSB-", ".", "To", "explore", "this", "further", ",", "a", "central", "assessment", "of", "ER", ",", "PgR", ",", "and", "HER2", "was", "recently", "completed", "for", "6,500", "patients", "in", "BIG", "1-98", ".", "Results", "from", "the", "first", "3,533", "patients", "on", "the", "two", "monotherapy", "arms", "with", "ER", "+", "tumors", "-LRB-", "by", "central", "assessment", "-RRB-", "and", "centrally", "assessed", "PgR", "and", "HER2", "confirmed", "the", "results", "reported", "above", "from", "the", "local", "assessment", "of", "receptor", "status", "-LSB-", "18", ",", "21", "-RSB-", ",", "indicating", "that", "PgR", "status", "in", "ER", "+", "tumors", "does", "not", "predict", "responsiveness", "to", "letrozole", "when", "compared", "with", "tamoxifen", ".", "The", "small", "group", "of", "patients", "with", "HER2", "overexpression/amplification", "in", "the", "tumor", "had", "a", "higher", "rate", "of", "recurrence", "with", "both", "treatments", ",", "but", "the", "superiority", "of", "letrozole", "over", "tamoxifen", "was", "similar", "irrespective", "of", "HER2", "status", "-LSB-", "21", "-RSB-", ".", "For", "the", "primary", "end", "point", "of", "DFS", ",", "the", "relative", "risk", "reductions", "for", "letrozole", "compared", "with", "tamoxifen", "were", "29", "%", "in", "patients", "with", "node-positive", "tumors", "-LRB-", "hazard", "ratio", "0.71", ",", "95", "%", "CI", "0.59", "--", "0.85", "-RRB-", ",", "24", "%", "in", "patients", "with", "tumors", ">", "2", "cm", "-LRB-", "hazard", "ratio", "0.76", ",", "95", "%", "CI", "0.63", "--", "0.92", "-RRB-", ",", "and", "30", "%", "in", "patients", "with", "prior", "chemotherapy", "-LRB-", "hazard", "ratio", "0.70", ",", "95", "%", "CI", "0.54", "--", "0.92", "-RRB-", ".", "An", "additional", "logistic", "regression", "analysis", "of", "BIG", "1-98", "was", "performed", "to", "retrospectively", "identify", "clinical", "and", "pathological", "factors", "predictive", "of", "early", "breast", "cancer", "recurrence", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "The", "final", "model", ",", "based", "on", "5,980", "patients", "from", "the", "four-arm", "option", "and", "212", "events", ",", "identified", "the", "following", "significant", "factors", ":", "tumor", "size", "-LRB-", "P", "<", "0.001", "-RRB-", ",", "ER/PgR", "status", "-LRB-", "P", "<", "0.001", "-RRB-", ",", "node", "positivity", "-LRB-", "P", "<", "0.001", "-RRB-", ",", "and", "tumor", "grade", "-LRB-", "P", "<", "0.001", "-RRB-", ".", "There", "was", "a", "significant", "interaction", "between", "node", "positivity", "and", "treatment", "-LRB-", "P", "=", "0.003", "-RRB-", ".", "Patients", "with", "the", "greatest", "risk", "of", "recurrence", "had", "≥", "4", "positive", "nodes", ",", "tumors", "≥", "5", "cm", ",", "ER", "+", "/", "PgR", "−", "tumors", ",", "and", "grade", "3", "tumors", ".", "The", "increase", "in", "risk", "associated", "with", "increased", "node", "positivity", "was", "greater", "for", "patients", "randomized", "to", "tamoxifen", "than", "to", "letrozole", "-LSB-", "22", "-RSB-", ".", "Letrozole-only", "versus", "tamoxifen-only", "arms", "The", "superiority", "of", "letrozole", "was", "confirmed", "in", "a", "protocol-defined", "supplementary", "analysis", ",", "which", "was", "restricted", "to", "the", "4,922", "patients", "randomized", "to", "the", "monotherapy", "tamoxifen", "or", "letrozole", "arms", ".", "At", "a", "median", "follow-up", "of", "51", "months", ",", "letrozole", "provided", "a", "significant", "benefit", "for", "the", "end", "points", "DFS", "-LRB-", "P", "=", "0.007", "-RRB-", ",", "DFS", "excluding", "secondary", "malignancy", "-LRB-", "P", "=", "0.01", "-RRB-", ",", "time", "to", "recurrence", "-LRB-", "P", "=", "0.004", "-RRB-", ",", "and", "time", "to", "distant", "recurrence", "-LRB-", "P", "=", "0.03", "-RRB-", "-LRB-", "see", "Table", "1", "-RRB-", "-LSB-", "23", "-RSB-", ".", "Table", "1Efficacy", "end", "points", "in", "patients", "randomized", "to", "treatment", "with", "letrozole", "-LRB-", "n", "=", "2,463", "-RRB-", "or", "tamoxifen", "-LRB-", "n", "=", "2,459", "-RRB-", "for", "5", "years", "in", "the", "BIG", "1-98", "trial", "-LSB-", "23", "-RSB-", "End", "pointEvents", "Hazard", "ratio95", "%", "CIP-valueLetTamDFS", "-LRB-", "primary", "protocol", "definition", "-RRB-", "3524180.820.71", "--", "0.950.007", "Overall", "survival1942110", ".910.75", "--", "1.110.35", "Systemic", "DFS3313740", ".870.75", "--", "1.010.07", "DFS", "-LRB-", "ignoring", "second", "non-breast", "cancer", "-RRB-", "3073640.830.71", "--", "0.960.01", "Time", "to", "recurrence2312910", ".780.65", "--", "0.920.004", "Time", "to", "distant", "recurrence1932340", ".810.67", "--", "0.980.03", "DFS", "disease-free", "survival", ",", "Let", "letrozole", ",", "Tam", "tamoxifen", ",", "CI", "confidence", "interval", "Safety", "All", "adverse", "events", "were", "graded", "according", "to", "the", "Common", "Toxicity", "Criteria", "of", "the", "National", "Cancer", "Institute", "-LRB-", "version", "2", "-RRB-", ".", "Predefined", "adverse", "events", "were", "specifically", "asked", "and", "documented", "at", "each", "study", "visit", ".", "Furthermore", ",", "the", "IBCSG", "Coordinating", "Center", "conducted", "a", "medical", "review", "-LRB-", "reviewers", "were", "blinded", "to", "randomization", "-RRB-", "of", "all", "grade", "3", "--", "5", "cardiovascular", "events", "and", "other", "grade", "3", "--", "5", "adverse", "events", "that", "were", "considered", "clinically", "relevant", "but", "whose", "cause", "was", "unclear", ",", "and", "all", "deaths", "of", "women", "in", "whom", "there", "was", "no", "prior", "cancer-related", "event", ".", "The", "results", "of", "BIG", "1-98", "showed", "that", "letrozole", "was", "well-tolerated", "and", "had", "a", "safety", "profile", "different", "from", "tamoxifen", "-LRB-", "see", "Table", "2", "-RRB-", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "A", "more", "detailed", "analysis", "of", "cardiovascular", "side", "effects", ",", "including", "baseline", "risk", "factors", "and", "cholesterol", "values", "over", "time", ",", "has", "recently", "been", "presented", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "Table", "2Cardiovascular", "adverse", "events", "and", "significant", "other", "adverse", "events", "among", "patients", "included", "in", "the", "BIG", "1-98", "safety", "analysis", "-LSB-", "18", "-RSB-", "Adverse", "event", "Incidence", "of", "any", "grade", "-LRB-", "%", "-RRB-", "P-valueLetrozole", "-LRB-", "n", "=", "3,975", "-RRB-", "Tamoxifen", "-LRB-", "n", "=", "3,988", "-RRB-", "Cerebrovascular", "accident", "or", "transient", "ischemic", "attack1", ".01.00.91", "Thromboembolic", "event1", ".53.5", "<", "0.001", "Cardiac", "event4", ".13.80.61", "Other", "cardiovascular", "event0", ".50.20.04", "Vaginal", "bleeding3", ".36.6", "<", "0.001", "Hot", "flashes33", ".538.0", "<", "0.001", "Night", "sweats13", ".916.20.004", "Fracture5", ".74.0", "<", "0.001", "Arthralgia20", ".312.3", "<", "0.001", "Tamoxifen", "compared", "with", "letrozole", "was", "associated", "with", "an", "increased", "risk", "of", "thromboembolism", ",", "vaginal", "bleeding", ",", "and", "more", "endometrial", "biopsies", "-LRB-", "9.1", "%", "vs.", "2.3", "%", ",", "respectively", ";", "P", "<", "0.001", "-RRB-", ",", "with", "a", "higher", "incidence", "of", "invasive", "endometrial", "cancers", "-LRB-", "0.3", "%", "vs.", "0.1", "%", ",", "respectively", ";", "P", "=", "0.18", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "tamoxifen", "was", "associated", "with", "a", "higher", "incidence", "of", "hot", "flushes", "-LRB-", "38.0", "%", "vs.", "33.5", "%", ",", "respectively", ";", "P", "<", "0.001", "-RRB-", "and", "night", "sweats", "-LRB-", "16.2", "%", "vs.", "13.9", "%", ";", "respectively", ";", "P", "=", "0.004", "-RRB-", ".", "There", "was", "a", "higher", "incidence", "of", "arthralgia", "and", "skeletal", "events", "with", "letrozole", "compared", "with", "tamoxifen", ",", "including", "a", "higher", "rate", "of", "fractures", "-LRB-", "5.7", "%", "vs.", "4.0", "%", ",", "respectively", ";", "P", "<", "0.001", "-RRB-", "and", "a", "shorter", "time", "to", "first", "fracture", ".", "Hypercholesterolemia", "was", "among", "the", "adverse", "events", "listed", "on", "the", "case-report", "forms", "and", "was", "graded", "at", "each", "study", "visit", "during", "treatment", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "A", "total", "of", "43.6", "%", "of", "letrozole-treated", "and", "19.2", "%", "of", "patients", "in", "the", "tamoxifen", "group", "had", "hypercholesterolemia", ",", "reported", "at", "least", "once", "during", "treatment", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "Nevertheless", ",", "more", "than", "80", "%", "of", "reported", "hypercholesterolemia", "was", "grade", "1", ",", "and", "thus", "of", "uncertain", "clinical", "significance", ".", "In", "addition", ",", "serum", "total", "cholesterol", "values", "remained", "stable", "throughout", "the", "trial", "in", "the", "letrozole", "arm", "but", "decreased", "in", "the", "tamoxifen", "arm", "by", "approximately", "13", "%", ",", "which", "is", "consistent", "with", "the", "known", "lipid-lowering", "effect", "of", "tamoxifen", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "Thus", ",", "median", "changes", "in", "cholesterol", "values", "from", "baseline", "were", "0", ",", "0", ",", "and", "−", "1.8", "%", "at", "6", ",", "12", ",", "and", "24", "months", "in", "the", "letrozole", "group", "and", "−", "12.0", ",", "−", "13.5", ",", "and", "−", "14.1", "%", "in", "the", "tamoxifen", "group", ".", "The", "overall", "incidence", "of", "cardiovascular", "events", "was", "similar", "for", "the", "letrozole", "and", "tamoxifen", "groups", ".", "Although", "there", "were", "higher", "incidences", "of", "grade", "3", "--", "5", "cardiac", "events", "and", "cardiac", "failure", "in", "the", "letrozole", "arm", ",", "the", "incidences", "were", "low", "in", "both", "groups", "-LRB-", "2.1", "%", "vs.", "1.1", "%", ";", "P", "<", "0.001", "and", "0.8", "%", "vs.", "0.4", "%", ",", "P", "=", "0.01", ",", "respectively", "-RRB-", "in", "this", "older", "patient", "population", "at", "competing", "risk", "for", "cardiovascular", "events", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "Discussion", "Clinical", "implications", "of", "BIG", "1-98", "The", "results", "of", "the", "primary", "core", "analysis", "-LSB-", "18", "-RSB-", ",", "which", "included", "all", "available", "data", "from", "patients", "randomly", "assigned", "to", "the", "monotherapy", "arms", "and", "data", "from", "the", "sequential", "therapy", "arms", "censored", "at", "the", "time", "of", "the", "therapy", "switch", ",", "as", "well", "as", "the", "results", "from", "a", "recently", "published", "analysis", "limited", "to", "patients", "randomly", "assigned", "to", "the", "continuous", "therapy", "arms", "-LSB-", "23", "-RSB-", ",", "demonstrate", "a", "significant", "benefit", "of", "letrozole", "over", "tamoxifen", ".", "Letrozole", "is", "at", "least", "as", "well-tolerated", "as", "tamoxifen", ",", "offering", "patients", "and", "physicians", "a", "true", "alternative", ".", "However", ",", "bone", "metabolism", "is", "differently", "affected", "by", "letrozole", "and", "tamoxifen", ".", "Patients", "receiving", "AIs", "are", "at", "increased", "risk", "for", "bone", "loss", "and", "osteoporosis", "and", "should", "therefore", "receive", "appropriate", "monitoring", "and", "medical", "intervention", "as", "part", "of", "daily", "practice", ".", "As", "a", "result", "of", "the", "findings", "from", "BIG", "1-98", ",", "letrozole", "was", "approved", "both", "in", "Europe", "and", "the", "United", "States", "as", "an", "early", "adjuvant", "treatment", "for", "postmenopausal", "women", "with", "HR", "+", "breast", "cancer", ".", "The", "2007", "St.", "Gallen", "international", "consensus", "guidelines", "-LSB-", "26", "-RSB-", "and", "updated", "National", "Comprehensive", "Cancer", "Network", "-LRB-", "NCCN", "-RRB-", "guidelines", "-LSB-", "27", "-RSB-", "recommend", "letrozole", "as", "an", "option", "for", "adjuvant", "treatment", "of", "early", "breast", "cancer", ".", "In", "the", "2007", "St.", "Gallen", "Guidelines", ",", "use", "of", "an", "AI", "is", "considered", "as", "an", "alternative", "to", "tamoxifen", "for", "postmenopausal", "women", "with", "low", "-", ",", "intermediate", "-", ",", "or", "high-risk", "tumors", "that", "are", "classified", "as", "endocrine-responsive", "or", "endocrine", "response", "uncertain", "-LSB-", "26", "-RSB-", ".", "Similarly", ",", "in", "the", "NCCN", "guidelines", ",", "letrozole", "is", "a", "recommended", "adjuvant", "hormonal", "therapy", "for", "all", "postmenopausal", "women", "with", "hormone-responsive", "tumors", ",", "regardless", "of", "HER2", "status", "-LSB-", "27", "-RSB-", ".", "The", "current", "guidelines", "do", "not", "recommend", "one", "AI", "over", "another", "but", "emphasize", "that", "treatment", "should", "be", "selected", "on", "the", "basis", "of", "clinical", "trial", "evidence", "in", "specific", "settings", "-LSB-", "27", "-RSB-", ",", "nor", "do", "the", "guidelines", "provide", "recommendations", "as", "concerns", "the", "optimal", "use", "of", "the", "AIs", "as", "upfront", "monotherapy", "or", "sequenced", "with", "tamoxifen", ".", "Results", "from", "the", "Arimidex", ",", "Tamoxifen", ",", "Alone", "or", "in", "Combination", "-LRB-", "ATAC", "-RRB-", "trial", "provided", "evidence", "for", "superior", "DFS", "with", "anastrozole", "versus", "tamoxifen", "used", "as", "initial", "adjuvant", "hormonal", "therapy", "in", "postmenopausal", "women", "with", "HR", "+", "breast", "cancer", "-LSB-", "28", ",", "29", "-RSB-", ".", "At", "a", "median", "follow-up", "of", "68", "months", ",", "no", "survival", "advantage", "has", "been", "observed", "in", "the", "ATAC", "trial", ",", "and", "it", "remains", "an", "open", "question", "whether", "the", "DFS", "advantage", "observed", "in", "AI", "trials", "will", "translate", "into", "an", "OS", "advantage", ".", "Both", "letrozole", "and", "anastrozole", "have", "demonstrated", "superiority", "over", "tamoxifen", "as", "initial", "adjuvant", "therapy", "-LSB-", "18", ",", "28", "-RSB-", ",", "but", "a", "direct", "comparison", "of", "letrozole", "with", "anastrozole", "awaits", "the", "results", "of", "a", "randomized", "head-to-head", "trial", "-LRB-", "Femara", "Anastrozole", "Clinical", "Evaluation", "-LSB-", "FACE", "-RSB-", "-RRB-", "-LSB-", "30", ",", "31", "-RSB-", ".", "The", "adjuvant", "FACE", "trial", "compares", "upfront", "therapy", "with", "letrozole", "2.5", "mg", "with", "anastrozole", "1", "mg", "daily", "for", "up", "to", "5", "years", "in", "postmenopausal", ",", "HR", "+", ",", "node-positive", "breast", "cancer", "patients", ".", "In", "addition", ",", "recruitment", "of", "a", "direct", "comparison", "of", "anastrozole", "and", "exemestane", "-LRB-", "MA", ".27", "-RRB-", "has", "been", "completed", "recently", ".", "Other", "trials", "demonstrated", "better", "disease", "control", "when", "an", "AI", "was", "given", "after", "2", "--", "3", "years", "of", "adjuvant", "tamoxifen", "-LSB-", "32", "-RSB-", ",", "but", "so", "far", ",", "no", "trial", "has", "reported", "on", "a", "regimen", "of", "an", "AI", "given", "2", "--", "3", "years", "before", "tamoxifen", ".", "Initial", "treatment", "with", "the", "``", "gold", "standard", "''", "tamoxifen", "followed", "by", "an", "AI", "may", "be", "a", "logical", "long-term", "strategy", "because", "of", "the", "lack", "of", "complete", "cross-resistance", "between", "these", "hormonal", "strategies", ".", "On", "the", "other", "hand", ",", "the", "greater", "anti-estrogenic", "potency", "and", "higher", "anti-tumor", "activity", "of", "AIs", "over", "tamoxifen", ",", "as", "demonstrated", "in", "preclinical", "models", "and", "randomized", "clinical", "trials", "-LSB-", "12", ",", "17", ",", "33", ",", "34", "-RSB-", ",", "may", "suggest", "that", "it", "is", "preferable", "to", "use", "an", "AI", "upfront", "to", "avoid", "early", "relapses", "that", "may", "occur", "while", "on", "tamoxifen", "therapy", ".", "Thus", ",", "the", "key", "question", ",", "``", "should", "AIs", "be", "given", "as", "initial", "therapy", "or", "used", "sequentially", "after", "tamoxifen", "?", "''", "is", "as", "yet", "unanswered", ".", "Physicians", "often", "extrapolate", "data", "from", "switch", "trials", ",", "e.g.", ",", "the", "Intergroup", "Exemestane", "Study", "-LSB-", "35", ",", "36", "-RSB-", "or", "the", "MA", ".17", "trial", "-LSB-", "33", ",", "37", "-RSB-", "to", "sequential", "trials", "-LRB-", "e.g.", ",", "BIG", "1-98", ",", "Austrian", "Breast", "and", "Colorectal", "Cancer", "Study", "Group", "-LSB-", "ABCSG", "-RSB-", "8", "-LSB-", "38", "-RSB-", "-RRB-", ".", "In", "these", "sequential", "trials", ",", "events", "are", "included", "in", "the", "analysis", "from", "treatment", "start", "and", "not", "from", "point", "of", "switch", "after", "2", "--", "3", "years", "of", "tamoxifen", ".", "Sequential", "and", "switch", "trials", "investigate", "obviously", "the", "same", "intervention", "but", "are", "conducted", "in", "different", "patient", "groups", ",", "thus", ",", "results", "are", "expected", "to", "be", "different", "and", "are", "different", "indeed", ".", "Best", "use", "of", "AIs", "remains", "an", "open", "question", ",", "at", "least", "until", "results", "of", "BIG", "1-98", "from", "the", "sequential", "use", "of", "letrozole", "and", "tamoxifen", ",", "in", "comparison", "with", "continuous", "monotherapy", ",", "as", "well", "as", "from", "the", "Tamoxifen", "and", "Exemestane", "Adjuvant", "Multicenter", "trial", "investigating", "exemestane", "monotherapy", "versus", "tamoxifen", "followed", "by", "exemestane", "-LSB-", "39", "-RSB-", "and", "from", "an", "updated", "analysis", "of", "ABCSG-8", ",", "become", "available", ".", "Conclusions", "BIG", "1-98", "has", "shown", "that", "the", "AI", "letrozole", "results", "in", "better", "disease", "control", "than", "tamoxifen", "when", "given", "as", "initial", "endocrine", "therapy", "for", "postmenopausal", "women", "with", "hormone-responsive", "early", "breast", "cancer", ".", "Letrozole", "significantly", "reduced", "the", "risk", "of", "recurrence", "and", "of", "distant", "recurrence", "and", "has", "a", "reasonable", "safety", "profile", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "The", "comparison", "between", "the", "monotherapy", "and", "the", "sequential", "treatment", "arms", "within", "the", "BIG", "1-98", "trial", "are", "eagerly", "awaited", "and", "are", "expected", "to", "have", "an", "important", "impact", "on", "the", "management", "of", "breast", "cancer", "." ]

[ "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O" ]

[ "Alcohol", "consumption", ",", "cigarette", "smoking", ",", "and", "endometrial", "cancer", "risk", ":", "results", "from", "the", "Netherlands", "Cohort", "Study", "Objective", "To", "examine", "the", "association", "between", "alcohol", "consumption", ",", "cigarette", "smoking", ",", "and", "endometrial", "cancer", ".", "Introduction", "Endometrial", "cancer", "is", "the", "most", "frequently", "diagnosed", "gynecologic", "cancer", "in", "Europe", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "The", "development", "of", "endometrial", "cancer", "has", "been", "related", "to", "exposure", "to", "estrogens", "unopposed", "by", "progestagens", "-LSB-", "2", "-RSB-", ".", "Many", "studies", "have", "shown", "a", "positive", "association", "between", "alcohol", "ingestion", "and", "estrogen", "levels", "in", "postmenopausal", "women", ".", "For", "instance", ",", "cross-sectional", "data", "from", "the", "European", "Prospective", "Investigation", "into", "Cancer", "and", "Nutrition", "-LRB-", "EPIC", "-RRB-", "suggested", "that", "elevated", "blood", "levels", "of", "estrone", "are", "observed", "with", "increasing", "alcohol", "consumption", "in", "postmenopausal", "women", "-LSB-", "3", "-RSB-", ".", "Thus", ",", "alcohol", "could", "be", "expected", "to", "increase", "endometrial", "cancer", "risk", "by", "elevating", "estrogen", "levels", ".", "An", "important", "determinant", "of", "estrogen", "levels", "in", "women", "is", "use", "of", "unopposed", "hormone", "replacement", "therapy", "-LRB-", "HRT", "-RRB-", ".", "Accordingly", ",", "use", "of", "unopposed", "HRT", "is", "consistently", "associated", "with", "an", "increased", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "-LSB-", "4", "--", "6", "-RSB-", ".", "Furthermore", ",", "it", "has", "been", "suggested", "that", "alcohol", "consumption", "increases", "estradiol", "levels", "in", "particular", "in", "postmenopausal", "women", "who", "are", "on", "HRT", "-LSB-", "7", ",", "8", "-RSB-", ".", "However", ",", "previous", "studies", "have", "indicated", "that", "alcohol", "consumption", "is", "either", "weakly", "or", "not", "associated", "with", "a", "reduced", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "and", "no", "significant", "interaction", "with", "use", "of", "HRT", "has", "been", "found", "-LSB-", "9", "-RSB-", ".", "Although", "several", "studies", "have", "analyzed", "the", "association", "between", "alcohol", "consumption", "and", "endometrial", "cancer", "risk", "-LSB-", "10", "--", "22", "-RSB-", ",", "only", "few", "studies", "have", "examined", "the", "risk", "associated", "with", "various", "measures", "of", "alcohol", "consumption", "-LRB-", "e.g.", ",", "amount", "and", "type", "of", "alcohol", "-RRB-", "including", "only", "one", "comprehensive", "prospective", "cohort", "study", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "In", "contrast", "to", "alcohol", ",", "smoking", "has", "been", "hypothesized", "to", "exert", "anti-estrogenic", "effects", "-LSB-", "23", "-RSB-", "and", "to", "lower", "the", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "in", "this", "way", ".", "Also", ",", "an", "effect", "modification", "by", "use", "of", "HRT", "seems", "reasonable", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "Furthermore", ",", "it", "has", "been", "suggested", "that", "body", "mass", "index", "-LRB-", "BMI", "-RRB-", "and", "age", "at", "menopause", "might", "mediate", "part", "of", "the", "inverse", "association", "between", "smoking", "and", "endometrial", "cancer", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "Earlier", "prospective", "studies", "-LSB-", "22", ",", "25", "--", "29", "-RSB-", "have", "generally", "suggested", "that", "smoking", "is", "associated", "with", "a", "slight", "to", "moderate", "protection", "against", "endometrial", "cancer", ".", "However", ",", "to", "date", ",", "only", "the", "largest", "and", "most", "recent", "prospective", "cohort", "study", "has", "reported", "a", "significantly", "reduced", "risk", "in", "both", "current", "and", "past", "smokers", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "this", "large", "study", "explored", "the", "relationship", "between", "HRT", "and", "smoking", "and", "found", "no", "effect-modification", ",", "and", "also", "found", "that", "the", "association", "between", "smoking", "and", "endometrial", "cancer", "was", "not", "confounded", "by", "alcohol", "use", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "The", "evidence", "from", "other", "epidemiological", "studies", "with", "regard", "to", "an", "effect-modification", "by", "use", "of", "HRT", "is", "ambiguous", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "As", "many", "case", "--", "control", "-LSB-", "24", "-RSB-", ",", "but", "only", "a", "few", "cohort", "studies", "have", "reported", "on", "the", "association", "between", "smoking", "and", "endometrial", "cancer", "-LSB-", "22", ",", "25", "--", "29", "-RSB-", ",", "the", "International", "Agency", "for", "Research", "on", "Cancer", "concludes", "that", "prospective", "cohort", "studies", ",", "in", "which", "selection", "and", "recall", "bias", "are", "minimized", ",", "are", "scarce", "-LSB-", "30", "-RSB-", ".", "Only", "two", "cohort", "studies", "have", "explored", "the", "association", "between", "smoking", "and", "endometrial", "cancer", "comprehensively", "by", "examining", "the", "risk", "associated", "with", "all", "common", "quantitative", "smoking", "measures", "-LRB-", "e.g.", ",", "smoking", "duration", ",", "time", "since", "cessation", "-RRB-", "-LSB-", "28", ",", "29", "-RSB-", ".", "Since", "only", "few", "prospective", "cohort", "studies", "have", "investigated", "the", "association", "between", "alcohol", "consumption", ",", "cigarette", "smoking", ",", "and", "endometrial", "cancer", "comprehensively", ",", "important", "features", "of", "this", "relationship", "are", "under-explored", ".", "Hence", ",", "we", "aim", "to", "provide", "additional", "evidence", "based", "on", "prospective", "data", ".", "Moreover", ",", "we", "intend", "to", "elucidate", "the", "hormonal", "mechanisms", "underlying", "endometrial", "carcinogenesis", "by", "investigating", ",", "first", ",", "whether", "BMI", "and", "age", "at", "menopause", "might", "act", "as", "intermediary", "variables", "in", "the", "association", "between", "smoking", "and", "endometrial", "cancer", "and", "by", "examining", ",", "second", ",", "whether", "there", "is", "evidence", "regarding", "a", "potential", "effect", "modification", "by", "HRT", "use", ".", "Materials", "and", "methods", "The", "Netherlands", "Cohort", "Study", "-LRB-", "NLCS", "-RRB-", "started", "in", "September", "1986", "when", "62,573", "women", "aged", "55", "--", "69", "years", "were", "enrolled", "in", "the", "cohort", ".", "Ethical", "approval", "was", "obtained", "from", "the", "ethics", "committee", "of", "the", "University", "Hospital", "Maastricht", ".", "All", "women", "were", "presumed", "to", "be", "postmenopausal", ".", "At", "baseline", ",", "data", "on", "dietary", "habits", "and", "other", "risk", "factors", "-LRB-", "such", "as", "alcohol", "consumption", ",", "smoking", "history", ",", "reproductive", "history", ",", "and", "anthropometry", "-RRB-", "were", "collected", "by", "means", "of", "a", "self-administered", "questionnaire", ".", "Data", "analysis", "was", "conducted", "according", "to", "the", "case", "--", "cohort", "approach", ".", "In", "this", "approach", ",", "cases", "are", "derived", "from", "the", "cohort", "-LRB-", "providing", "numerator", "information", "for", "the", "incidence", "rates", "-RRB-", ",", "while", "the", "accumulated", "person-years", "at", "risk", "of", "the", "cohort", "are", "estimated", "from", "a", "random", "sample", "from", "the", "cohort", ",", "i.e.", ",", "the", "subcohort", "-LRB-", "providing", "denominator", "information", "for", "the", "incidence", "rates", "-RRB-", ".", "Following", "this", "approach", ",", "a", "subcohort", "of", "2,589", "women", "was", "sampled", "after", "the", "baseline", "exposure", "measurement", ".", "The", "subcohort", "has", "been", "followed", "up", "biennially", "by", "mail", "for", "vital", "status", "information", ".", "The", "vital", "status", "of", "subcohort", "members", ",", "who", "did", "not", "respond", "was", "completed", "by", "contacting", "the", "municipal", "population", "registers", ".", "Incident", "cases", "occurring", "in", "the", "entire", "cohort", "were", "detected", "by", "annual", "record", "linkages", "to", "the", "Netherlands", "Cancer", "Registry", "and", "the", "nationwide", "network", "and", "registry", "of", "histopathology", "and", "cytopathology", "in", "the", "Netherlands", "-LRB-", "PALGA", "-RRB-", ".", "Further", "details", "on", "the", "design", "of", "the", "study", "and", "methods", "of", "follow-up", "have", "been", "presented", "elsewhere", "-LSB-", "31", ",", "32", "-RSB-", ".", "The", "present", "analysis", "is", "restricted", "to", "cancer", "incidence", "in", "the", "11.3-year", "follow-up", "period", "from", "September", "1986", "to", "December", "1997", ".", "The", "completeness", "of", "cancer", "follow", "up", "was", "estimated", "to", "be", "at", "least", "96", "%", "-LSB-", "33", "-RSB-", ",", "and", "no", "subcohort", "members", "were", "lost", "to", "follow", "up", ".", "Three", "hundred", "and", "twenty-seven", "incident", ",", "microscopically", "confirmed", ",", "invasive", ",", "primary", "endometrial", "carcinomas", "were", "detected", "after", "a", "follow-up", "period", "of", "11.3", "years", ".", "Cases", "were", "excluded", "from", "analysis", "if", "they", "had", "been", "diagnosed", "with", "non-epithelial", "tumors", "-LRB-", "n", "=", "12", "-RRB-", ",", "and", "if", "information", "on", "either", "alcohol", "consumption", "or", "cigarette", "smoking", "was", "incomplete", "-LRB-", "n", "=", "35", "-RRB-", ".", "Women", "were", "eligible", "for", "the", "subcohort", "if", "they", "did", "not", "report", "at", "baseline", "that", "they", "had", "undergone", "hysterectomy", ".", "Application", "of", "this", "inclusion", "criterion", "yielded", "a", "subcohort", "of", "2,229", "members", ".", "Individuals", "were", "excluded", "from", "the", "analysis", "if", "they", "had", "been", "diagnosed", "with", "cancer", "other", "than", "skin", "cancer", "at", "baseline", "-LRB-", "n", "=", "151", "-RRB-", "and", "if", "information", "on", "either", "alcohol", "consumption", "or", "cigarette", "smoking", "was", "missing", "-LRB-", "n", "=", "177", "-RRB-", ".", "After", "these", "exclusions", ",", "280", "cases", "and", "1,901", "subcohort", "members", "remained", "available", "for", "analysis", ".", "Questionnaire", "data", "Consumption", "of", "alcoholic", "beverages", "during", "the", "year", "preceding", "the", "baseline", "interview", "was", "assessed", "by", "consumption", "frequency", "questions", "on", "beer", ",", "red", "wine", ",", "white", "wine", ",", "sherry", ",", "other", "fortified", "wine", ",", "liqueur", ",", "and", "liquor", ".", "Categories", "ranked", "from", "`", "never", "'", "to", "`", "6", "--", "7", "times", "per", "week", "'", "and", "information", "on", "the", "number", "of", "glasses", "per", "consumption", "day", "was", "also", "requested", ".", "Questionnaire", "data", "of", "all", "cases", "and", "subcohort", "members", "were", "key", "entered", "twice", "and", "processed", "in", "a", "manner", "blinded", "with", "regard", "to", "case/subcohort", "status", "in", "order", "to", "minimize", "observer", "bias", "in", "the", "coding", "and", "interpretation", "of", "data", ".", "The", "questionnaire", "has", "been", "validated", "against", "a", "nine-day", "diet", "record", "-LSB-", "34", ",", "35", "-RSB-", ".", "The", "Pearson", "correlation", "coefficient", "between", "the", "mean", "daily", "ethanol", "intake", "assessed", "by", "the", "questionnaire", "and", "that", "estimated", "by", "the", "nine-day", "record", "was", "0.86", "for", "all", "subjects", "and", "0.78", "for", "users", "of", "alcoholic", "beverages", "-LSB-", "34", "-RSB-", ".", "Respondents", "that", "reported", "to", "drink", "alcohol", "less", "than", "once", "per", "month", "were", "considered", "non-drinkers", ".", "Four", "items", "from", "the", "questionnaire", "-LRB-", "red", "wine", ",", "white", "wine", ",", "sherry", ",", "and", "liqueur", "-RRB-", "were", "combined", "into", "one", "single", "wine", "variable", "since", "these", "items", "were", "highly", "correlated", "and", "separate", "analysis", "would", "have", "resulted", "in", "small", "numbers", "of", "subjects", "within", "each", "stratum", ".", "Mean", "daily", "alcohol", "consumption", "was", "calculated", "using", "the", "Dutch", "food", "composition", "table", "-LSB-", "36", "-RSB-", ".", "Based", "on", "data", "from", "a", "pilot", "study", ",", "standard", "glasses", "were", "defined", "as", "follows", ":", "200", "ml", "for", "beer", ",", "105", "ml", "for", "wine", ",", "80", "ml", "for", "sherry", ",", "and", "45", "ml", "for", "both", "liqueur", "and", "liquor", ",", "corresponding", "to", "8", "g", ",", "10", "g", ",", "11", "g", ",", "7", "g", ",", "and", "13", "g", "of", "alcohol", ",", "respectively", ".", "Smoking", "was", "addressed", "at", "baseline", "by", "questions", "on", "age", "at", "first", "exposure", "to", "smoking", ",", "age", "at", "last", "exposure", "to", "smoking", ",", "smoking", "frequency", ",", "and", "smoking", "duration", "of", "cigarette", ",", "cigar", ",", "and", "pipe", "smokers", ".", "As", "the", "vast", "majority", "of", "smoking", "subcohort", "members", "was", "cigarette", "smokers", ",", "analyses", "were", "restricted", "to", "that", "particular", "group", ".", "Based", "on", "the", "questionnaire", "data", ",", "the", "following", "cigarette", "smoking", "variables", "were", "constructed", ":", "cigarette", "smoking", "status", "-LRB-", "never", "versus", "ever", "and", "never", "versus", "former", "or", "current", "-RRB-", ",", "frequency", "-LRB-", "number", "of", "cigarettes", "per", "day", "-RRB-", ",", "duration", "-LRB-", "years", "-RRB-", ",", "age", "at", "first", "exposure", "-LRB-", "years", "-RRB-", ",", "and", "time", "since", "cessation", "-LRB-", "years", "-RRB-", ".", "Time", "since", "cessation", "was", "calculated", "as", "`", "age", "at", "baseline", "'", "minus", "`", "age", "at", "smoking", "cessation", "'", ".", "Concerning", "the", "use", "of", "HRT", ",", "women", "were", "asked", "whether", "they", "had", "ever", "used", "HRT", "because", "of", "complaints", "related", "to", "the", "menopause", ".", "We", "can", "assume", "that", "all", "members", "of", "our", "cohort", "were", "postmenopausal", "in", "1986", ",", "when", "the", "baseline", "questionnaires", "were", "completed", ",", "and", "that", "possible", "treatment", "with", "HRT", "took", "place", "prior", "to", "1986", "in", "most", "women", ".", "Based", "on", "information", "regarding", "HRT", "prescription", "in", "the", "Netherlands", "in", "the", "past", "-LSB-", "37", "--", "39", "-RSB-", ",", "we", "assume", "that", "all", "HRT", "users", "enrolled", "in", "the", "NLCS", "were", "treated", "with", "unopposed", "oral", "estrogens", ".", "Data", "analysis", "A", "variable", "was", "considered", "a", "confounder", "if", "-LRB-", "I", "-RRB-", "it", "was", "associated", "with", "endometrial", "cancer", "risk", ",", "if", "-LRB-", "II", "-RRB-", "it", "was", "associated", "with", "alcohol", "consumption", "or", "cigarette", "smoking", ",", "and", "if", "-LRB-", "III", "-RRB-", "age-adjusted", "hazard", "ratios", "changed", "by", "more", "than", "10", "%", "after", "adjustment", "for", "the", "potentially", "confounding", "factor", ".", "Based", "on", "the", "literature", "-LSB-", "40", "-RSB-", "and", "previous", "analyses", ",", "we", "considered", "the", "following", "variables", "as", "potential", "confounders", ":", "age", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "age", "at", "menarche", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "use", "of", "oral", "contraceptives", "-LRB-", "ever", "versus", "never", "-RRB-", ",", "duration", "of", "oral", "contraceptive", "use", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "age", "at", "first", "child", "birth", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "parity", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "age", "at", "menopause", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "use", "of", "postmenopausal", "hormones", "-LRB-", "ever", "versus", "never", "-RRB-", ",", "duration", "of", "postmenopausal", "hormone", "use", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "non-occupational", "physical", "activity", "-LRB-", "categorized", "-RRB-", ",", "BMI", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "height", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "energy", "intake", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "total", "fat", "intake", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "intake", "of", "saturated", "fat", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "intake", "of", "carbohydrates", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "intake", "of", "dietary", "fiber", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "intake", "of", "vegetables", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "intake", "of", "fruits", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "coffee", "consumption", "-LRB-", "yes", "versus", "no", "-RRB-", ",", "education", "-LRB-", "categorized", "-RRB-", ",", "diagnosis", "of", "hypertension", "-LRB-", "yes", "versus", "no", "-RRB-", ",", "diagnosis", "of", "diabetes", "mellitus", "-LRB-", "yes", "versus", "no", "-RRB-", ",", "family", "history", "of", "endometrial", "cancer", "-LRB-", "yes", "versus", "no", "-RRB-", ",", "and", "if", "applicable", ":", "total", "alcohol", "consumption", "per", "day", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "type", "of", "alcoholic", "beverage", "-LRB-", "categorized", "-RRB-", ",", "current", "smoking", "-LRB-", "yes", "versus", "no", "-RRB-", ",", "number", "of", "cigarettes", "smoked", "per", "day", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ",", "and", "duration", "of", "smoking", "-LRB-", "continuous", "-RRB-", ".", "Incidence", "rate", "ratios", "-LRB-", "RR", "-RRB-", "and", "corresponding", "95", "percent", "confidence", "intervals", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "for", "endometrial", "cancer", "were", "estimated", "in", "the", "age-adjusted", "and", "multivariate", "case", "--", "cohort", "analyses", "with", "categorized", "and", "continuous", "alcohol", "and", "cigarette", "smoking", "variables", ",", "using", "the", "Cox", "proportional", "hazards", "model", "-LSB-", "41", "-RSB-", "processed", "with", "the", "Stata", "statistical", "software", "package", "-LSB-", "42", "-RSB-", ".", "Standard", "errors", "were", "estimated", "using", "the", "robust", "Hubert", "--", "White", "sandwich", "estimator", "to", "account", "for", "additional", "variance", "introduced", "by", "sampling", "from", "the", "cohort", ".", "This", "method", "is", "equivalent", "to", "the", "variance", "--", "covariance", "estimator", "by", "Barlow", "-LSB-", "43", "-RSB-", ".", "The", "proportional", "hazards", "assumption", "was", "tested", "using", "the", "scaled", "Schoenfeld", "residuals", "-LSB-", "44", "-RSB-", ".", "Tests", "for", "dose-response", "trends", "in", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "were", "assessed", "by", "fitting", "ordinal", "exposure", "variables", "as", "continuous", "terms", ".", "Tests", "for", "interaction", "were", "performed", "by", "using", "the", "Wald", "test", ".", "Two-sided", "p", "values", "are", "reported", "throughout", "the", "paper", ".", "Results", "The", "percentage", "of", "women", "reporting", "alcohol", "consumption", "was", "similar", "among", "cases", "and", "subcohort", "members", "-LRB-", "67.5", "%", "and", "66.9", "%", ",", "respectively", "-RRB-", ",", "as", "was", "the", "mean", "alcohol", "consumption", "per", "day", "among", "users", "in", "both", "groups", "-LRB-", "7.7", "g", "with", "standard", "deviation", "-LRB-", "sd", "-RRB-", "=", "10.8", ",", "and", "8.5", "g", "-LRB-", "sd", "=", "10.4", "-RRB-", ",", "respectively", "-RRB-", ".", "Current", "smoking", "was", "less", "prevalent", "among", "cases", "than", "among", "subcohort", "members", "-LRB-", "15.4", "%", "vs.", "21.8", "%", "-RRB-", ",", "but", "the", "number", "of", "cigarettes", "smoked", "per", "day", "did", "not", "differ", "considerably", "between", "smokers", "in", "both", "groups", "-LRB-", "13.6", "-LRB-", "sd", "=", "8.4", "-RRB-", "and", "13.2", "-LRB-", "sd", "=", "8.1", "-RRB-", ",", "respectively", "-RRB-", ".", "Drinkers", "reported", "a", "slightly", "higher", "age", "at", "menopause", "and", "a", "higher", "prevalence", "of", "both", "oral", "contraceptive", "use", "and", "current", "cigarette", "smoking", "than", "non-drinkers", "-LRB-", "see", "Table", "1", "-RRB-", ".", "With", "regard", "to", "smoking", "status", ",", "former", "and", "current", "smokers", "were", "slightly", "leaner", "and", "had", "fewer", "children", "than", "never-smokers", ".", "On", "average", ",", "current", "smokers", "reported", "having", "reached", "menopause", "1", "year", "earlier", "than", "former-smokers", "and", "never-smokers", ".", "The", "prevalence", "of", "both", "oral", "contraceptive", "use", "and", "alcohol", "use", "was", "higher", "among", "smokers", "than", "among", "never-smokers", ".", "Also", ",", "average", "alcohol", "consumption", "was", "approximately", "twice", "as", "high", "among", "smokers", "as", "among", "never-smokers", "-LRB-", "see", "Table", "1", "-RRB-", ".", "Table", "1Means", "-LRB-", "standard", "deviation", "-RRB-", "and", "distribution", "-LRB-", "n", "-RRB-", "of", "potential", "confounders", "according", "to", "alcohol", "consumption", "and", "cigarette", "smoking", "status", "among", "subcohort", "members", ",", "the", "Netherlands", "Cohort", "Study", "-LRB-", "1986", "--", "1995", "-RRB-", "CharacteristicUnitAlcohol", "consumption", "statusCigarette", "smoking", "statusNo", "-LRB-", "n", "=", "630", "-RRB-", "Yes", "-LRB-", "n", "=", "1,271", "-RRB-", "Never", "-LRB-", "n", "=", "1,100", "-RRB-", "Former", "-LRB-", "n", "=", "387", "-RRB-", "Current", "-LRB-", "n", "=", "414", "-RRB-", "Mean", "-LRB-", "sd", "-RRB-", "Mean", "-LRB-", "sd", "-RRB-", "Mean", "-LRB-", "sd", "-RRB-", "Mean", "-LRB-", "sd", "-RRB-", "Mean", "-LRB-", "sd", "-RRB-", "AgeYears61", ".8", "-LRB-", "4.3", "-RRB-", "61.4", "-LRB-", "4.3", "-RRB-", "62.0", "-LRB-", "4.3", "-RRB-", "61.1", "-LRB-", "4.4", "-RRB-", "60.7", "-LRB-", "4.1", "-RRB-", "Body", "Mass", "Indexkg/m225", ".4", "-LRB-", "3.9", "-RRB-", "24.9", "-LRB-", "3.4", "-RRB-", "25.3", "-LRB-", "3.5", "-RRB-", "24.7", "-LRB-", "3.3", "-RRB-", "24.6", "-LRB-", "3.8", "-RRB-", "ParityNumber", "of", "children2", ".8", "-LRB-", "2.4", "-RRB-", "2.7", "-LRB-", "2.2", "-RRB-", "3.0", "-LRB-", "2.4", "-RRB-", "2.5", "-LRB-", "1.8", "-RRB-", "2.5", "-LRB-", "2.1", "-RRB-", "Age", "at", "1st", "child", "birthYears22", ".0", "-LRB-", "11.2", "-RRB-", "21.9", "-LRB-", "11.3", "-RRB-", "22.2", "-LRB-", "11.2", "-RRB-", "22.3", "-LRB-", "11.3", "-RRB-", "20.8", "-LRB-", "11.3", "-RRB-", "Age", "at", "menopauseYears48", ".3", "-LRB-", "4.8", "-RRB-", "49.2", "-LRB-", "4.3", "-RRB-", "49.1", "-LRB-", "4.4", "-RRB-", "49.2", "-LRB-", "4.1", "-RRB-", "48.1", "-LRB-", "4.8", "-RRB-", "Total", "energy", "intake", "-LRB-", "including", "alcohol", "-RRB-", "kcal1", ",628", "-LRB-", "415", "-RRB-", "1,724", "-LRB-", "386", "-RRB-", "1,694", "-LRB-", "393", "-RRB-", "1,676", "-LRB-", "406", "-RRB-", "1,705", "-LRB-", "406", "-RRB-", "Alcohol", "consumption", "G/day0", "-LRB-", "0", "-RRB-", "8.5", "-LRB-", "10.4", "-RRB-", "5.7", "-LRB-", "7.8", "-RRB-", "10.4", "-LRB-", "11.2", "-RRB-", "12.5", "-LRB-", "12.8", "-RRB-", "CigarettesNo", ".", "/", "day13", ".0", "-LRB-", "8.8", "-RRB-", "11.1", "-LRB-", "8.1", "-RRB-", "0", "-LRB-", "0", "-RRB-", "9.8", "-LRB-", "8.0", "-RRB-", "13.2", "-LRB-", "8.1", "-RRB-", "n", "-LRB-", "%", "-RRB-", "an", "-LRB-", "%", "-RRB-", "an", "-LRB-", "%", "-RRB-", "an", "-LRB-", "%", "-RRB-", "an", "-LRB-", "%", "-RRB-", "aOral", "contraceptive", "useEver124", "-LRB-", "20.0", "-RRB-", "336", "-LRB-", "26.7", "-RRB-", "223", "-LRB-", "20.6", "-RRB-", "127", "-LRB-", "32.9", "-RRB-", "110", "-LRB-", "26.8", "-RRB-", "Physical", "activity", ">", "30", "min/day425", "-LRB-", "69.1", "-RRB-", "975", "-LRB-", "77.8", "-RRB-", "796", "-LRB-", "74.1", "-RRB-", "306", "-LRB-", "79.5", "-RRB-", "298", "-LRB-", "72.9", "-RRB-", "Diagnosis", "of", "hypertensionYes198", "-LRB-", "31.4", "-RRB-", "351", "-LRB-", "27.6", "-RRB-", "339", "-LRB-", "30.8", "-RRB-", "107", "-LRB-", "27.7", "-RRB-", "103", "-LRB-", "24.9", "-RRB-", "Diagnosis", "of", "diabetesYes33", "-LRB-", "5.2", "-RRB-", "40", "-LRB-", "3.2", "-RRB-", "48", "-LRB-", "4.4", "-RRB-", "13", "-LRB-", "3.4", "-RRB-", "12", "-LRB-", "2.9", "-RRB-", "Hormone", "replacement", "therapyEver62", "-LRB-", "10.0", "-RRB-", "152", "-LRB-", "12.1", "-RRB-", "107", "-LRB-", "9.9", "-RRB-", "58", "-LRB-", "15.1", "-RRB-", "49", "-LRB-", "12.0", "-RRB-", "Family", "history", "of", "endometrial", "cancerYes20", "-LRB-", "3.2", "-RRB-", "32", "-LRB-", "2.5", "-RRB-", "23", "-LRB-", "2.1", "-RRB-", "16", "-LRB-", "4.1", "-RRB-", "13", "-LRB-", "3.1", "-RRB-", "Alcohol", "usersYes", "--", "--", "663", "-LRB-", "60.3", "-RRB-", "312", "-LRB-", "80.6", "-RRB-", "296", "-LRB-", "71.5", "-RRB-", "Currently", "smoking", "cigarettesYes118", "-LRB-", "18.7", "-RRB-", "296", "-LRB-", "23.3", "-RRB-", "--", "--", "--", "a", "The", "percentage", "reported", "for", "some", "variables", "does", "sometimes", "not", "correspond", "with", "the", "numbers", "per", "smoker", "stratum", "since", "part", "of", "the", "information", "for", "these", "variables", "was", "missing", "Based", "on", "the", "literature", "and", "based", "on", "the", "methodological", "criteria", "specified", "above", ",", "we", "found", "the", "following", "confounders", ":", "age", ",", "BMI", ",", "parity", ",", "oral", "contraceptive", "use", ",", "non-occupational", "physical", "activity", ",", "hypertension", ",", "age", "at", "first", "child", "birth", ",", "and", "age", "at", "menopause", ".", "Alcohol", "consumption", "and", "cigarette", "smoking", "status", "were", "found", "to", "confound", "each", "other", "'s", "association", "with", "endometrial", "cancer", ".", "We", "controlled", "for", "all", "these", "confounders", "in", "multivariate", "analyses", ".", "In", "additional", "analyses", ",", "we", "mutually", "controlled", "the", "age-adjusted", "risk", "estimates", "regarding", "qualitative", "smoking", "measures", "for", "the", "other", "smoking", "measures", ".", "The", "multivariate", "risk", "estimates", "did", "not", "change", "substantially", "when", "oral", "contraceptive", "use", "-LRB-", "ever/never", "-RRB-", "was", "replaced", "by", "duration", "of", "oral", "contraceptive", "use", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Accordingly", ",", "we", "considered", "it", "sufficient", "to", "control", "only", "for", "oral", "contraceptive", "use", "-LRB-", "ever/never", "-RRB-", ".", "Table", "2", "shows", "the", "results", "for", "the", "association", "between", "alcohol", "consumption", "and", "endometrial", "cancer", ".", "The", "multivariate", "adjusted", "RR", "associated", "with", "alcohol", "consumption", "was", "1.06", "-LRB-", "95", "%", "CI", "=", "0.78", "--", "1.43", "-RRB-", ".", "The", "multivariate", "RRs", "of", "endometrial", "cancer", "for", "women", "who", "consumed", "up", "to", "4", ",", "5", "--", "14", ",", "15", "--", "29", ",", "and", "30", "or", "more", "gram", "of", "alcohol", "per", "day", "versus", "non-drinkers", "were", "1.09", "-LRB-", "95", "%", "CI", "=", "0.78", "--", "1.52", "-RRB-", ",", "0.95", "-LRB-", "95", "%", "CI", "=", "0.62", "--", "1.45", "-RRB-", ",", "0.94", "-LRB-", "95", "%", "CI", "=", "0.52", "--", "1.69", "-RRB-", ",", "and", "1.78", "-LRB-", "95", "%", "CI", "=", "0.88", "--", "3.60", "-RRB-", ",", "respectively", ".", "No", "significant", "trend", "was", "observed", "-LRB-", "ptrend", "=", "0.62", "-RRB-", ".", "Table", "2Rate", "ratios", "of", "endometrial", "cancer", "according", "to", "baseline", "alcohol", "consumption", "in", "the", "Netherlands", "Cohort", "Study", ",", "1986", "--", "1997Alcohol", "consumption", "-LRB-", "g", "/", "day", "-RRB-", "Age", "adjustedMultivariate", "adjustedCategorical", "medianCasesPerson-years", "in", "subcohortRR", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "aCasesPerson-years", "in", "subcohortRR", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "bTotal", "alcohol", "No0916", ",6411", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "825,8371", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "Yes4", ".018913,7461.01", "-LRB-", "0.77", "--", "1.32", "-RRB-", "17212,1371.06", "-LRB-", "0.78", "--", "1.43", "-RRB-", "0.1", "--", "41.61147,5991.10", "-LRB-", "0.82", "--", "1.48", "-RRB-", "1056,6431.09", "-LRB-", "0.78", "--", "1.52", "-RRB-", "5", "--", "149.1473,6400.94", "-LRB-", "0.65", "--", "1.37", "-RRB-", "393,2790.95", "-LRB-", "0.62", "--", "1.45", "-RRB-", "15", "--", "2920.9171,8220.69", "-LRB-", "0.40", "--", "1.18", "-RRB-", "171,5750.94", "-LRB-", "0.52", "--", "1.69", "-RRB-", "≥", "3037.3116841.20", "-LRB-", "0.62", "--", "2.34", "-RRB-", "116391.78", "-LRB-", "0.88", "--", "3.60", "-RRB-", "p", "trend0", ".490.62", "Alcohol", "from", "wine", "Yes3", ".218213,0091.06", "-LRB-", "0.81", "--", "1.37", "-RRB-", "16611,5071.13", "-LRB-", "0.84", "--", "1.52", "-RRB-", "0.1", "--", "41.51258,0721.17", "-LRB-", "0.88", "--", "1.55", "-RRB-", "1127,1131.16", "-LRB-", "0.84", "--", "1.59", "-RRB-", "5", "--", "148.9383,1460.91", "-LRB-", "0.61", "--", "1.36", "-RRB-", "352,7841.07", "-LRB-", "0.68", "--", "1.67", "-RRB-", "≥", "1521.8191,7910.80", "-LRB-", "0.48", "--", "1.35", "-RRB-", "191,6111.11", "-LRB-", "0.64", "--", "1.93", "-RRB-", "p", "trend0", ".430.64", "Alcohol", "from", "beer", "Yes1", ".14291,8731.15", "-LRB-", "0.76", "--", "1.74", "-RRB-", "261,6291.30", "-LRB-", "0.82", "--", "2.07", "-RRB-", "Alcohol", "from", "liquor", "Yes3", ".7342,6480.93", "-LRB-", "0.64", "--", "1.37", "-RRB-", "312,3491.11", "-LRB-", "0.73", "--", "1.68", "-RRB-", "aRR", "=", "rate", "ratios", ";", "CI", "=", "confidence", "interval", ";", "n.a.", "=", "not", "applicablebRate", "ratios", "adjusted", "for", "age", "-LRB-", "years", "-RRB-", ",", "body", "mass", "index", "-LRB-", "kg/m2", "-RRB-", ",", "parity", "-LRB-", "number", "of", "children", "-RRB-", ",", "use", "of", "oral", "contraceptives", "-LRB-", "ever", "versus", "never", "-RRB-", ",", "non-occupational", "physical", "activity", "-LRB-", "low", ",", "moderate", ",", "active", ",", "very", "active", "-RRB-", ",", "hypertension", "-LRB-", "yes", "versus", "no", "-RRB-", ",", "age", "at", "first", "child", "birth", "-LRB-", "years", "-RRB-", ",", "age", "at", "menopause", "-LRB-", "years", "-RRB-", ",", "and", "current", "cigarette", "smoking", "-LRB-", "yes", "versus", "no", "-RRB-", "The", "multivariate", "RR", "of", "endometrial", "cancer", "for", "wine-consumers", "versus", "non-consumers", "was", "slightly", ",", "but", "non-significantly", ",", "elevated", "-LRB-", "RR", "=", "1.13", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.84", "--", "1.52", "-RRB-", ".", "The", "RRs", "were", "also", "slightly", ",", "but", "non-significantly", "elevated", "when", "calculated", "according", "to", "different", "levels", "of", "wine", "consumption", "and", "no", "significant", "trend", "was", "observed", "-LRB-", "ptrend", "=", "0.64", "-RRB-", ".", "The", "multivariate", "RR", "of", "endometrial", "cancer", "associated", "with", "drinking", "beer", "equaled", "1.30", "-LRB-", "95", "%", "CI", "=", "0.82", "--", "2.07", "-RRB-", "and", "the", "RR", "for", "drinking", "liquor", "was", "1.11", "-LRB-", "95", "%", "CI", "=", "0.73", "--", "1.68", "-RRB-", ".", "Regarding", "smoking", ",", "age-adjusted", "analysis", "revealed", "an", "inverse", "association", "between", "ever-smoking", "and", "endometrial", "cancer", "risk", "-LRB-", "RR", "=", "0.70", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.54", "--", "0.92", ",", "see", "Table", "3", "-RRB-", ".", "We", "observed", "significant", "inverse", "trends", "of", "endometrial", "cancer", "risk", "with", "all", "quantitative", "smoking", "measures", ".", "However", ",", "these", "trends", "became", "non-significant", "when", "never-smokers", "were", "excluded", ".", "Some", "of", "these", "age-adjusted", "risk", "estimates", "changed", "substantially", "after", "additional", "adjustment", "for", "current", "smoking", "status", ",", "smoking", "frequency", "and", "smoking", "duration", "-LRB-", "see", "Table", "3", "-RRB-", ".", "Table", "3Rate", "ratios", "of", "endometrial", "cancer", "according", "to", "baseline", "cigarette", "smoking", "features", "in", "the", "Netherlands", "Cohort", "Study", ",", "1986", "--", "1997Cigarette", "smoking", "featuresCategorical", "medianAdjusted", "for", "ageAdjusted", "for", "age", ",", "current", "smoking", "status", ",", "frequency", "and", "duration", "of", "smokingAdjusted", "for", "all", "confoundersCasesPerson-years", "in", "subcohortRR", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "aCasesPerson-years", "in", "subcohortRR", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "bCasesPerson-years", "in", "subcohortRR", "-LRB-", "95", "%", "CI", "-RRB-", "cSmoking", "status", "Neverdn.a", ".18711,8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "--", "--", "--", "16910,3301", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "Ever", "smokers938", ",5160.70", "-LRB-", "0.54", "--", "0.92", "-RRB-", "--", "--", "--", "857,6440.71", "-LRB-", "0.53", "--", "0.95", "-RRB-", "Neverd18711", ",8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "--", "--", "--", "16910,3301", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "Former", "smokersn.a504", ",1810.77", "-LRB-", "0.55", "--", "1.07", "-RRB-", "--", "--", "--", "473,7570.83", "-LRB-", "0.58", "--", "1.20", "-RRB-", "Current", "smokersn.a434", ",3340.64", "-LRB-", "0.45", "--", "0.91", "-RRB-", "--", "--", "--", "383,8880.59", "-LRB-", "0.40", "--", "0.88", "-RRB-", "p", "trend0", ".010.01", "Frequency", "-LRB-", "cigarettes/day", "-RRB-", "Neverd018711", ",8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "18711,8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "16910,3301", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "0.1", "--", "9", "4383,7190.65", "-LRB-", "0.45", "--", "0.95", "-RRB-", "373,5690.86", "-LRB-", "0.49", "--", "1.50", "-RRB-", "333,2231.07", "-LRB-", "0.58", "--", "1.98", "-RRB-", "10", "--", "19", "12282,4380.74", "-LRB-", "0.48", "--", "1.14", "-RRB-", "272,4151.02", "-LRB-", "0.54", "--", "1.92", "-RRB-", "252,2141.28", "-LRB-", "0.66", "--", "2.46", "-RRB-", "20", "+20222,0140.70", "-LRB-", "0.44", "--", "1.12", "-RRB-", "222,0141.03", "-LRB-", "0.46", "--", "2.29", "-RRB-", "211,7981.31", "-LRB-", "0.56", "--", "3.03", "-RRB-", "p", "trend0", ".040.750.43", "Duration", "-LRB-", "years", "-RRB-", "Neverd018711", ",8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "18711,8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "16910,3301.0", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "0.1", "--", "19", "10.5232,0090.74", "-LRB-", "0.47", "--", "1.17", "-RRB-", "221,9910.71", "-LRB-", "0.42", "--", "1.18", "-RRB-", "211,8480.77", "-LRB-", "0.43", "--", "1.39", "-RRB-", "20", "--", "3930524,2740.79", "-LRB-", "0.57", "--", "1.10", "-RRB-", "514,1200.80", "-LRB-", "0.47", "--", "1.34", "-RRB-", "473,6900.89", "-LRB-", "0.51", "--", "1.56", "-RRB-", "40", "+411319700.42", "-LRB-", "0.23", "--", "0.75131,8870.44", "-LRB-", "0.19", "--", "1.02", "-RRB-", "111,6970.37", "-LRB-", "0.15", "--", "0.90", "-RRB-", "p", "trend0", ".000.100.13", "Age", "at", "first", "exposure", "-LRB-", "years", "-RRB-", "Neverdn.a18711", ",8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "18711,8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "16910,3301", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "<", "1917343,0980.71", "-LRB-", "0.48", "--", "1.05", "-RRB-", "322,9470.78", "-LRB-", "0.34", "--", "1.80", "-RRB-", "282,7240.91", "-LRB-", "0.37", "--", "2.23", "-RRB-", "19", "--", "2420212,5240.53", "-LRB-", "0.33", "--", "0.86", "-RRB-", "202,3710.60", "-LRB-", "0.29", "--", "1.27", "-RRB-", "202,1020.88", "-LRB-", "0.38", "--", "2.02", "-RRB-", "25", "+30312,6910.73", "-LRB-", "0.49", "--", "1.09", "-RRB-", "312,5960.82", "-LRB-", "0.47", "--", "1.46", "-RRB-", "282,3251.00", "-LRB-", "0.53", "--", "1.87", "-RRB-", "p", "trend0", ".010.470.94", "Time", "since", "cessation", "-LRB-", "years", "-RRB-", "Neverdn.a18711", ",8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "18711,8721", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "16910,3301", "-LRB-", "ref", ".", "-RRB-", "20", "+", "e26", ".5201,1421.11", "-LRB-", "0.68", "--", "1.84", "-RRB-", "171,0410.80", "-LRB-", "0.41", "--", "1.57", "-RRB-", "179431.12", "-LRB-", "0.52", "--", "2.41", "-RRB-", "10", "--", "19e14141", ",4590.62", "-LRB-", "0.35", "--", "1.09", "-RRB-", "141,4160.38", "-LRB-", "0.14", "--", "1.03", "-RRB-", "131,2700.50", "-LRB-", "0.17", "--", "1.45", "-RRB-", "0.1", "--", "9e5131", ",3920.60", "-LRB-", "0.33", "--", "1.08", "-RRB-", "131,3470.32", "-LRB-", "0.10", "--", "1.06", "-RRB-", "121,2570.50", "-LRB-", "0.12", "--", "2.00", "-RRB-", "p", "trend0", ".030.060.26", "aRR", "=", "rate", "ratios", ";", "CI", "=", "confidence", "interval", ";", "n.a.", "=", "not", "applicablebRRs", "were", "adjusted", "for", "age", "-LRB-", "years", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "frequency", "was", "adjusted", "for", "current", "smoking", "status", "-LRB-", "yes/no", "-RRB-", "and", "duration", "-LRB-", "years", "-RRB-", ";", "duration", "was", "adjusted", "for", "current", "smoking", "status", "and", "frequency", "-LRB-", "cigarettes/day", "-RRB-", ";", "age", "at", "first", "exposure", "was", "adjusted", "for", "current", "smoking", "status", ",", "frequency", ",", "and", "duration", ";", "time", "since", "cessation", "was", "adjusted", "for", "frequency", "and", "durationcRRs", "were", "adjusted", "as", "mentioned", "under", "footnote", "b", "and", "additionally", "for", "body", "mass", "index", "-LRB-", "kg/m2", "-RRB-", ",", "parity", "-LRB-", "number", "of", "children", "-RRB-", ",", "use", "of", "oral", "contraceptives", "-LRB-", "ever", "versus", "never", "-RRB-", ",", "non-occupational", "physical", "activity", "-LRB-", "low", ",", "moderate", ",", "active", ",", "very", "active", "-RRB-", ",", "hypertension", "-LRB-", "yes", "versus", "no", "-RRB-", ",", "age", "at", "first", "child", "birth", "-LRB-", "years", "-RRB-", ",", "age", "at", "menopause", "-LRB-", "years", "-RRB-", ",", "and", "alcohol", "consumption", "-LRB-", "gram", "/", "day", "-RRB-", "dNever", "smoked", "cigars", ",", "pipe", ",", "or", "cigaretteseEx-smokers", "only", "When", "we", "adjusted", "for", "all", "confounders", ",", "multivariate", "analysis", "showed", "a", "statistically", "significant", "29", "%", "reduced", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "for", "ever-smokers", "when", "contrasted", "with", "never-smokers", ".", "When", "considered", "separately", ",", "the", "risk", "reduction", "appeared", "to", "be", "stronger", "among", "current", "smokers", "-LRB-", "RR", "=", "0.59", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.40", "--", "0.88", "-RRB-", "than", "among", "former", "smokers", "-LRB-", "RR", "=", "0.83", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.58", "--", "1.20", "-RRB-", ".", "Tests", "for", "trends", "were", "not", "significant", "for", "any", "of", "the", "quantitative", "smoking", "variables", "when", "these", "were", "adjusted", "for", "age", "and", "additional", "confounders", ".", "The", "strongest", "reduction", "in", "risk", ",", "which", "could", "be", "observed", "in", "both", "univariate", "and", "multivariate", "models", ",", "was", "associated", "with", "a", "smoking", "history", "of", "40", "or", "more", "years", "compared", "with", "having", "never", "smoked", "-LRB-", "RR", "=", "0.37", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.15", "--", "0.90", "-RRB-", ".", "Moreover", ",", "we", "observed", "a", "non-significant", "50", "%", "reduction", "in", "risk", "in", "women", "that", "quit", "smoking", "either", "nine", "or", "less", "years", "ago", "or", "that", "quit", "10", "--", "19", "years", "ago", ".", "The", "data", "indicated", "no", "association", "between", "age", "at", "first", "smoking", "exposure", "and", "endometrial", "cancer", ".", "Omitting", "age", "at", "menopause", "and", "BMI", "from", "the", "multivariate", "models", "either", "separately", "or", "simultaneously", "did", "not", "cause", "meaningful", "changes", "in", "the", "corresponding", "estimates", ".", "No", "interactions", "in", "determining", "endometrial", "cancer", "risk", "could", "be", "observed", "between", "alcohol", "consumption", "and", "HRT", "use", "-LRB-", "p", "=", "0.43", "-RRB-", ",", "BMI", "-LRB-", "p", "=", "0.38", "-RRB-", ",", "age", "at", "menopause", "-LRB-", "p", "=", "0.39", "-RRB-", ",", "or", "current", "cigarette", "smoking", "-LRB-", "p", "=", "0.83", "-RRB-", ".", "When", "we", "stratified", "multivariate", "alcohol", "analyses", "according", "to", "smoking", "status", ",", "we", "observed", "a", "non-significantly", "lower", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "among", "alcohol", "consumers", "that", "have", "ever", "smoked", "-LRB-", "RR", "=", "0.91", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.52", "--", "1.58", "-RRB-", "than", "among", "alcohol", "consumers", "that", "have", "never", "smoked", "-LRB-", "RR", "=", "1.16", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.81", "--", "1.67", "-RRB-", ".", "Concerning", "smoking", "and", "HRT", "use", ",", "the", "interaction", "term", "was", "not", "statistically", "significant", "-LRB-", "p", "=", "0.11", "-RRB-", ".", "In", "this", "subset", "analysis", ",", "current", "smoking", "was", "associated", "with", "a", "reduced", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "in", "women", "not", "using", "HRT", "-LRB-", "RR", "=", "0.54", ",", "95", "%", "CI", "=", "0.35", "--", "0.84", "-RRB-", ".", "In", "current", "smokers", "that", "did", "use", "HRT", ",", "the", "RR", "was", "1.32", "-LRB-", "95", "%", "CI", "=", "0.57", "--", "3.04", "-RRB-", ".", "Numbers", "were", "very", "small", "however", ":", "only", "28", "women", "were", "current", "smokers", "and", "used", "HRT", "and", "only", "eight", "women", "were", "current", "smokers", "and", "did", "not", "use", "HRT", ".", "Discussion", "Our", "results", "do", "not", "suggest", "a", "meaningful", "association", "between", "alcohol", "consumption", "and", "endometrial", "cancer", "risk", ".", "Current", "smoking", "is", "associated", "with", "a", "reduced", "risk", "of", "endometrial", "cancer", ".", "This", "inverse", "relationship", "is", "neither", "mediated", "by", "BMI", "nor", "by", "age", "at", "menopause", ".", "Regarding", "the", "biological", "mechanism", "underlying", "endometrial", "carcinogenesis", ",", "the", "so-called", "``", "unopposed", "estrogen", "hypothesis", "''", "is", "widely", "accepted", "-LSB-", "2", "-RSB-", ".", "According", "to", "this", "hypothesis", "endometrial", "cancer", "develops", "when", "the", "endometrium", "is", "exposed", "to", "high", "levels", "of", "unopposed", "endogenous", "or", "exogenous", "estrogens", "for", "a", "long", "period", "of", "time", ".", "This", "exposure", "results", "in", "elevated", "mitotic", "proliferation", "of", "endometrial", "cells", "which", ",", "in", "turn", ",", "increases", "the", "risk", "of", "DNA", "replication", "errors", "and", "DNA", "mutations", "which", "can", "lead", "to", "endometrial", "cancer", "-LSB-", "2", "-RSB-", ".", "Although", "female", "alcohol", "consumers", "could", "be", "expected", "to", "be", "at", "increased", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "due", "to", "their", "hormonal", "profile", ",", "we", "have", "not", "detected", "significant", "associations", "between", "alcohol", "consumption", "and", "endometrial", "cancer", "risk", ".", "This", "finding", "is", "consistent", "with", "the", "vast", "majority", "of", "previous", "studies", "-LSB-", "13", ",", "15", "--", "18", "-RSB-", ".", "However", ",", "in", "the", "EPIC", "study", ",", "significantly", "elevated", "blood", "estrone", "levels", "were", "found", "only", "in", "postmenopausal", "women", "who", "consumed", "more", "than", "25", "g", "of", "alcohol", "per", "day", "compared", "to", "non-drinkers", "-LSB-", "3", "-RSB-", ".", "Thus", ",", "possibly", ",", "a", "marked", "increase", "in", "estrone", "concentrations", ",", "and", "ultimately", "in", "endometrial", "cancer", "risk", ",", "can", "only", "be", "observed", "in", "women", "who", "consume", "more", "than", "moderate", "amounts", ".", "This", "notion", "might", "be", "supported", "by", "our", "data", "as", "we", "have", "observed", "an", "-LRB-", "non-significantly", "-RRB-", "elevated", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "in", "women", "who", "reported", "to", "drink", "more", "than", "30", "g", "of", "alcohol", "per", "day", ".", "Based", "on", "literature", "reviews", "-LSB-", "7", ",", "8", "-RSB-", ",", "we", "hypothesized", "that", "we", "might", "find", "a", "positive", "association", "between", "alcohol", "consumption", "and", "endometrial", "cancer", "risk", "in", "particular", "among", "HRT", "users", ".", "However", ",", "our", "findings", "do", "not", "support", "the", "hypothesis", "of", "an", "effect-modification", "by", "HRT", "use", ";", "neither", "did", "most", "of", "the", "previous", "epidemiological", "studies", "-LSB-", "13", ",", "17", ",", "18", "-RSB-", ".", "Concerning", "smoking", ",", "an", "anti-estrogenic", "effect", "has", "been", "suggested", "-LSB-", "23", "-RSB-", ",", "which", "should", "lower", "the", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "according", "to", "the", "unopposed", "estrogen", "hypothesis", ".", "Accordingly", ",", "our", "data", "indicated", "a", "significant", "risk", "reduction", "in", "current", "smokers", ",", "just", "like", "the", "Nurses", "'", "Health", "Study", "did", ",", "which", "has", "reported", "a", "RR", "of", "0.72", "-LRB-", "95", "%", "CI", "=", "0.57", "--", "0.90", "-RRB-", "for", "current", "smokers", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "In", "contrast", ",", "other", "cohort", "studies", "have", "observed", "non-significant", "associations", "-LSB-", "25", ",", "26", ",", "28", "-RSB-", ".", "We", "found", "that", "the", "inverse", "association", "between", "smoking", "and", "endometrial", "cancer", "was", "more", "pronounced", "among", "current", "smokers", "than", "among", "former", "smokers", ".", "These", "findings", "are", "in", "line", "with", "the", "evidence", "from", "several", "case", "--", "control", "-LSB-", "17", ",", "45", "--", "47", "-RSB-", "and", "two", "cohort", "studies", "-LSB-", "26", ",", "28", "-RSB-", "and", "they", "suggest", "that", "the", "degree", "of", "protection", "might", "partly", "depend", "on", "the", "time", "since", "smoking", "cessation", ".", "Although", "not", "statistically", "significant", ",", "our", "prospective", "data", "support", "this", "notion", ",", "because", "we", "observed", "that", "endometrial", "cancer", "risk", "is", "possibly", "higher", "in", "women", "that", "quit", "smoking", "20", "or", "more", "years", "ago", "compared", "to", "the", "risk", "in", "women", "that", "quit", "19", "years", "ago", "or", "less", ".", "In", "the", "epidemiological", "literature", ",", "a", "few", "studies", "presented", "data", "on", "time", "since", "cessation", "-LSB-", "17", ",", "28", ",", "29", ",", "48", "--", "50", "-RSB-", ",", "but", "only", "one", "of", "them", "found", "a", "significantly", "lowered", "risk", "among", "women", "that", "quit", "smoking", "less", "than", "10", "years", "ago", "-LSB-", "48", "-RSB-", ".", "Considering", "the", "risk", "associated", "with", "duration", "of", "smoking", ",", "we", "have", "observed", "a", "reduction", "in", "risk", "with", "a", "long", "smoking", "history", ",", "just", "like", "previous", "studies", "-LSB-", "17", ",", "29", ",", "47", ",", "48", "-RSB-", ".", "With", "regard", "to", "smoking", "intensity", ",", "we", "have", "found", "that", "smoking", "20", "or", "more", "cigarettes", "per", "day", "is", "associated", "with", "a", "non-significantly", "elevated", "risk", "of", "endometrial", "cancer", ".", "Though", "one", "needs", "to", "bear", "in", "mind", "that", "the", "corresponding", "confidence", "intervals", "were", "large", ",", "these", "point", "estimates", "are", "possibly", "not", "in", "line", "with", "the", "majority", "of", "previous", "studies", ",", "which", "generally", "indicated", "that", "a", "high", "smoking", "intensity", "-LRB-", "e.g.", ",", "smoking", "20", "or", "more", "cigarettes", "per", "day", "-RRB-", "is", "associated", "with", "a", "decreased", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "-LSB-", "17", ",", "22", ",", "28", ",", "29", ",", "45", ",", "47", ",", "48", ",", "51", "-RSB-", ".", "This", "inconsistency", "could", "be", "explained", "by", "the", "lack", "of", "adjustment", "for", "other", "smoking", "variables", "in", "earlier", "studies", ":", "only", "one", "-LSB-", "29", "-RSB-", "out", "of", "six", "-LSB-", "22", ",", "25", "--", "29", "-RSB-", "prospective", "cohort", "studies", "has", "adjusted", "its", "smoking", "frequency", "estimates", "for", "the", "potentially", "confounding", "effects", "of", "smoking", "duration", ".", "When", "we", "omitted", "smoking", "duration", "from", "our", "multivariate", "models", ",", "the", "RRs", "for", "smoking", "frequency", "also", "suggested", "an", "inverse", "association", "with", "endometrial", "cancer", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Our", "results", "do", "not", "indicate", "any", "important", "association", "between", "the", "age", "at", "starting", "smoking", "and", "endometrial", "cancer", "risk", ".", "Four", "previous", "studies", "-LSB-", "26", ",", "28", ",", "47", ",", "49", "-RSB-", "found", "a", "-LRB-", "non-significant", "-RRB-", "risk", "reduction", "with", "young", "age", "at", "first", "exposure", ",", "that", "is", ",", "starting", "to", "smoke", "between", "age", "15", "-LSB-", "28", "-RSB-", "or", "age", "20", "or", "earlier", "-LSB-", "49", "-RSB-", ",", "but", "none", "of", "these", "studies", "has", "reported", "a", "significant", "trend", ".", "It", "has", "been", "hypothesized", "that", "smoking", "might", "lower", "the", "levels", "of", "estrogens", "partly", "by", "reducing", "the", "amount", "of", "fat", "tissue", "or", "by", "decreasing", "the", "age", "at", "menopause", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "In", "our", "cohort", ",", "smokers", "were", "slightly", "leaner", "than", "non-smokers", "-LRB-", "24.6", "kg/m2", "vs.", "25.3", "kg/m2", "-RRB-", ".", "Moreover", ",", "on", "average", ",", "current", "smokers", "appeared", "to", "have", "reached", "menopause", "1", "year", "earlier", "than", "never-smokers", "and", "former", "smokers", "-LRB-", "48.1", "years", "vs.", "49.1", "years", "-RRB-", ".", "However", ",", "in", "conclusion", ",", "our", "analyses", "indicated", "that", "BMI", "and", "age", "at", "menopause", "are", "no", "mediating", "factors", ".", "In", "contrast", "to", "smoking", ",", "use", "of", "unopposed", "HRT", "increases", "endometrial", "cancer", "risk", "in", "postmenopausal", "women", ".", "Although", "an", "interaction", "between", "smoking", "and", "HRT", "use", "seems", "biologically", "plausible", ",", "the", "small", "numbers", "in", "our", "analysis", "did", "not", "allow", "to", "draw", "firm", "conclusions", "regarding", "a", "possible", "effect", "modification", "by", "HRT", "use", ".", "Moreover", ",", "we", "had", "no", "precise", "information", "on", "what", "type", "of", "HRT", "women", "in", "the", "NLCS", "have", "used", ".", "If", "we", "could", "have", "included", "such", "information", "in", "our", "analysis", ",", "results", "might", "differ", "according", "to", "type", "of", "HRT", "used", ".", "Another", "potential", "drawback", "of", "our", "study", "might", "be", "misclassification", "of", "self-reported", "alcohol", "consumption", "and/or", "self-reported", "cigarette", "smoking", ".", "However", ",", "these", "misclassifications", "might", "be", "non-differential", "owing", "to", "the", "prospective", "study", "design", ".", "Consequently", ",", "the", "risk", "estimates", "would", "probably", "be", "biased", "towards", "no", "effect", ".", "Moreover", ",", "the", "correlation", "between", "the", "alcohol", "consumption", "measured", "by", "the", "NLCS", "questionnaire", "and", "the", "measurement", "in", "a", "nine-day", "record", "was", "high", "due", "to", "the", "large", "variation", "in", "alcohol", "consumption", "-LSB-", "34", "-RSB-", ".", "An", "important", "strength", "of", "our", "study", "is", "that", "the", "exposures", "were", "assessed", "prior", "to", "the", "diagnosis", "of", "endometrial", "cancer", ".", "Therefore", ",", "our", "findings", "can", "not", "be", "influenced", "by", "recall", "bias", ".", "Moreover", ",", "selection", "bias", "is", "unlikely", "as", "the", "follow-up", "of", "subcohort", "members", "and", "cases", "was", "almost", "complete", "-LSB-", "33", ",", "52", "-RSB-", ".", "Another", "strength", "is", "the", "way", "alcohol", "consumption", "and", "cigarette", "smoking", "was", "assessed", "in", "the", "NLCS", ".", "The", "detailed", "assessment", "enabled", "us", "to", "evaluate", "associations", "between", "endometrial", "cancer", "and", "various", "measures", "of", "both", "exposures", ".", "Furthermore", ",", "we", "were", "able", "to", "control", "for", "confounding", "by", "the", "most", "important", "risk", "factors", "of", "endometrial", "cancer", "-LSB-", "40", "-RSB-", ".", "To", "sum", "up", "our", "major", "findings", ",", "we", "found", "that", "alcohol", "consumption", "is", "not", "associated", "with", "endometrial", "cancer", ".", "Current", "smoking", "was", "associated", "with", "a", "reduced", "risk", "of", "endometrial", "cancer", "in", "postmenopausal", "women", ".", "This", "association", "was", "probably", "not", "mediated", "by", "a", "decreased", "BMI", "or", "by", "an", "earlier", "age", "at", "menopause", ".", "Larger", "prospective", "studies", "with", "information", "on", "the", "type", "of", "HRT", "are", "needed", "in", "order", "to", "investigate", "possible", "effect", "modification", "by", "different", "types", "of", "HRT", ".", "Possibly", ",", "the", "incidence", "of", "endometrial", "cancer", "could", "be", "reduced", "if", "smoking", "was", "more", "common", "in", "female", "populations", ";", "however", ",", "such", "a", "reduction", "would", "be", "overshadowed", "by", "a", "dramatically", "increasing", "incidence", "of", "many", "other", "chronic", "diseases", ".", "Thus", ",", "individuals", "should", "still", "be", "encouraged", "to", "quit", "or", "not", "to", "start", "smoking", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O" ]

[ "Effect", "of", "Raloxifene", "Treatment", "on", "Osteocyte", "Apoptosis", "in", "Postmenopausal", "Women", "Increased", "osteocyte", "apoptosis", ",", "as", "the", "result", "of", "estrogen", "deficiency", ",", "could", "play", "a", "role", "in", "the", "decrease", "of", "bone", "mass", "and", "bone", "strength", "seen", "in", "postmenopausal", "osteoporosis", ".", "We", "investigated", "whether", "treatment", "with", "raloxifene", "of", "postmenopausal", "women", "with", "osteoporosis", "affects", "osteocyte", "apoptosis", ".", "Transiliac", "bone", "biopsies", "were", "obtained", "from", "26", "osteoporotic", "women", "at", "baseline", "and", "after", "2", "years", "of", "treatment", "with", "placebo", "or", "raloxifene", ".", "Immunohistochemical", "detection", "of", "cleaved", "caspase-3", "was", "performed", "on", "sections", "from", "nondecalcified", "bone", "biopsies", "to", "visualize", "apoptosis", ".", "In", "the", "trabecular", "bone", "total", "osteocytes", ",", "positively", "stained", "osteocytes", "and", "empty", "lacunae", "were", "counted", "and", "percent", "positive", "cells", "and", "percent", "empty", "lacunae", "determined", ".", "Statistical", "evaluation", "was", "performed", "by", "Wilcoxon", "'s", "paired", "t-test", "and", "Spearman", "'s", "rank", "correlations", ".", "There", "was", "no", "significant", "difference", "in", "percentage", "positive", "osteocytes", "between", "baseline", "and", "follow-up", "biopsies", "in", "both", "the", "placebo", "and", "the", "raloxifene", "groups", ".", "The", "percentage", "empty", "lacunae", "increased", "significantly", "in", "the", "placebo", "group", "-LRB-", "11.20", "±", "1.43", "vs.", "9.00", "±", "2.25", ",", "P", "=", "0.014", "-RRB-", "but", "not", "in", "the", "raloxifene", "group", ".", "At", "baseline", "in", "both", "groups", "combined", ",", "there", "was", "a", "negative", "correlation", "between", "indices", "of", "bone", "remodeling", "and", "the", "percentage", "positive", "osteocytes", "-LRB-", "bone", "formation", "rate/bone", "volume", "r", "=", "−", "0.67", ",", "P", "=", "0.001", "-RRB-", ".", "We", "found", "no", "direct", "evidence", "for", "an", "effect", "of", "raloxifene", "treatment", "on", "osteocyte", "apoptosis", ",", "but", "small", "effects", "of", "raloxifene", "treatment", "can", "not", "be", "excluded", ".", "The", "percent", "of", "apoptotic", "osteocytes", "was", "dependent", "on", "the", "level", "of", "bone", "remodeling", "in", "an", "individual", ".", "Osteocytes", "play", "a", "key", "role", "in", "the", "maintenance", "of", "bone", "mass", "and", "structure", ".", "The", "main", "function", "of", "osteocytes", "is", "to", "sense", "mechanical", "stress", "in", "the", "bone", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "Osteocytes", "respond", "to", "this", "with", "the", "production", "of", "nitric", "oxide", ",", "prostaglandins", ",", "and", "other", "factors", "which", "are", "believed", "to", "restrain", "osteoclastic", "bone", "resorption", "or", "promote", "bone", "formation", "-LSB-", "2", ",", "3", "-RSB-", ".", "A", "putative", "second", "role", "of", "osteocytes", "is", "to", "direct", "bone", "remodeling", "to", "foci", "of", "microdamage", ".", "Osteocyte", "apoptosis", "around", "the", "site", "of", "microdamage", "attracts", "bone", "remodeling", "cells", ",", "which", "resorb", "the", "damaged", "bone", "and", "replace", "it", "with", "new", "mechanically", "competent", "bone", "-LSB-", "4", ",", "5", "-RSB-", ".", "Postmenopausal", "osteoporosis", "generally", "results", "in", "a", "decrease", "in", "bone", "mineral", "density", "-LRB-", "BMD", "-RRB-", "and", "a", "higher", "susceptibility", "for", "osteoporotic", "fractures", ".", "It", "is", "characterized", "by", "high", "bone", "remodeling", ",", "with", "bone", "resorption", "exceeding", "bone", "formation", ".", "Estrogen", "deficiency", "results", "in", "an", "increase", "in", "the", "recruitment", "and", "activity", "of", "both", "osteoblasts", "and", "osteoclasts", ".", "It", "also", "leads", "to", "increased", "osteoclast", "survival", ",", "while", "the", "life", "span", "of", "the", "osteoblast", "is", "decreased", "-LSB-", "6", ",", "7", "-RSB-", ".", "Recently", "it", "has", "been", "shown", "both", "in", "humans", "and", "in", "rats", "that", "estrogen", "deficiency", "also", "leads", "to", "increased", "osteocyte", "apoptosis", "-LSB-", "8", ",", "9", "-RSB-", ".", "The", "resulting", "decrease", "in", "osteocyte", "number", "could", ",", "in", "time", ",", "impair", "the", "response", "of", "bone", "to", "mechanical", "stress", "and", "lead", "to", "an", "accumulation", "of", "microdamage", ".", "Therefore", ",", "it", "would", "be", "of", "interest", "to", "know", "whether", "therapies", "aimed", "at", "reducing", "postmenopausal", "bone", "loss", "affect", "the", "survival", "of", "osteocytes", ".", "Raloxifene", "is", "a", "selective", "estrogen", "receptor", "modulator", "-LRB-", "SERM", "-RRB-", "that", "can", "bind", "to", "the", "estrogen", "receptors", "ERα", "and", "ERβ", ".", "It", "has", "been", "shown", "to", "increase", "BMD", "and", "reduce", "vertebral", "fracture", "risk", "in", "women", "with", "postmenopausal", "osteoporosis", "-LSB-", "10", ",", "11", "-RSB-", ".", "In", "vitro", "studies", "suggest", "that", "raloxifene", "exerts", "its", "effect", ",", "like", "estrogen", ",", "through", "modulation", "of", "the", "number", "and", "activity", "of", "both", "osteoclasts", "and", "osteoblasts", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "Kousteni", "et", "al.", "-LSB-", "13", "-RSB-", "have", "recently", "shown", ",", "using", "in", "vitro", "experiments", ",", "that", "raloxifene", "does", "not", "inhibit", "etoposide-induced", "apoptosis", "of", "rat", "calvarial", "osteoblasts", ";", "but", "no", "clinical", "studies", "have", "examined", "the", "effect", "of", "raloxifene", "on", "osteocyte", "apoptosis", "in", "postmenopausal", "women", ".", "In", "this", "study", ",", "we", "investigated", "whether", "treatment", "of", "postmenopausal", "women", "with", "raloxifene", "for", "2", "years", "would", "change", "osteocyte", "survival", "in", "trabecular", "bone", "and", "whether", "the", "level", "of", "osteocyte", "apoptosis", "would", "be", "associated", "with", "the", "level", "of", "bone", "remodeling", ".", "Materials", "and", "Methods", "Study", "Outline", "All", "women", "in", "the", "study", "were", "participants", "in", "the", "Multiple", "Outcomes", "of", "Raloxifene", "Evaluation", "-LRB-", "MORE", "-RRB-", "trial", ".", "This", "was", "a", "placebo-controlled", ",", "double-blind", ",", "multicenter", "trial", "to", "test", "the", "efficacy", "of", "raloxifene", ".", "Details", "of", "this", "study", "have", "already", "been", "published", "elsewhere", "-LSB-", "10", "-RSB-", ".", "Briefly", ",", "7,705", "women", "were", "at", "least", "2", "years", "postmenopausal", "and", "had", "osteoporosis", "as", "defined", "by", "a", "BMD", "of", "at", "least", "2.5", "standard", "deviations", "-LRB-", "SDs", "-RRB-", "below", "the", "young", "adult", "mean", "and/or", "one", "or", "more", "vertebral", "fractures", ".", "They", "were", "randomly", "assigned", "to", "one", "of", "the", "following", "three", "treatment", "groups", ":", "placebo", ",", "60", "mg/day", "raloxifene", ",", "and", "120", "mg/day", "raloxifene", ".", "Additionally", ",", "all", "women", "received", "daily", "vitamin", "D", "-LRB-", "400", "--", "600", "IU", "-RRB-", "and", "calcium", "-LRB-", "500", "mg", "-RRB-", ".", "Among", "the", "exclusion", "criteria", "for", "this", "study", "were", "the", "use", "of", "androgen", ",", "calcitonin", ",", "or", "bisphosphonates", "within", "the", "previous", "6", "months", ";", "oral", "estrogen", "within", "the", "previous", "2", "months", ";", "fluoride", "therapy", "for", "more", "than", "3", "months", "during", "the", "previous", "2", "years", ";", "or", "systemic", "glucocorticoid", "therapy", "for", "more", "than", "1", "month", "within", "the", "past", "year", ".", "During", "the", "study", "the", "women", "received", "no", "therapy", "with", "respect", "to", "their", "osteoporosis", "other", "than", "the", "study", "drugs", ".", "The", "use", "of", "other", "prescription", "drugs", "and", "over-the-counter", "drugs", "such", "as", "sedatives", ",", "antibiotics", ",", "and", "paracetamol", "was", "equally", "distributed", "in", "the", "placebo", "and", "raloxifene", "groups", ".", "In", "this", "study", ",", "bone", "biopsies", "were", "obtained", "at", "baseline", "and", "after", "2", "years", "from", "26", "women", "who", "were", "enrolled", "in", "the", "European", "centers", "of", "the", "MORE", "trial", ".", "These", "women", "were", "part", "of", "the", "bone", "histomorphometry", "substudy", "of", "the", "MORE", "trial", "that", "included", "65", "women", "from", "two", "centers", "in", "the", "United", "States", "and", "two", "centers", "in", "Europe", ".", "Bone", "biopsies", "from", "the", "other", "39", "women", "were", "not", "available", "for", "sectioning", ".", "All", "women", "had", "given", "their", "informed", "consent", ",", "and", "the", "study", "was", "approved", "by", "the", "institutional", "ethics", "review", "boards", ".", "Markers", "of", "bone", "turnover", "that", "were", "measured", "were", "serum", "osteocalcin", ",", "bone-specific", "alkaline", "phosphatase", "-LRB-", "BSAP", "-RRB-", ",", "and", "urinary", "type", "1", "collagen", "C-telopeptide", "corrected", "for", "creatinine", "-LRB-", "CTX-I", "-RRB-", ".", "Data", "are", "from", "the", "baseline", "and", "24-month", "evaluations", ".", "Bone", "Biopsies", "The", "women", "received", "two", "doses", "of", "tetracycline", "with", "a", "12-day", "interval", ".", "Transverse", "biopsy", "specimens", "were", "taken", "from", "the", "anterior", "iliac", "crest", ",", "the", "2-year", "biopsy", "being", "on", "the", "opposite", "side", "from", "the", "baseline", "biopsy", ".", "The", "bone", "biopsies", "were", "immediately", "fixed", "in", "cold", "4", "%", "phosphate-buffered", "formaldehyde", ",", "dehydrated", "in", "graded", "ethanol", ",", "and", "embedded", "in", "methylmethacrylate", "-LRB-", "MMA", ";", "BDH", "Chemicals", ",", "Poole", ",", "England", "-RRB-", "supplemented", "with", "20", "%", "plastoid-N", "-LRB-", "Röhm", "und", "Haas", ",", "Darmstadt", ",", "Germany", "-RRB-", ",", "2.0", "g/L", "benzoylperoxide", "-LRB-", "Merck", ",", "Darmstadt", ",", "Germany", "-RRB-", ",", "and", "N,N-dimethylaniline", "-LRB-", "Merck", "-RRB-", "-LSB-", "14", "-RSB-", ".", "Sections", "of", "5", "μm", "were", "cut", "with", "a", "Jung", "-LRB-", "Nussloch", ",", "Germany", "-RRB-", "K", "Polycut", "microtome", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "Goldner", "'s", "trichrome", "method", ".", "Static", "and", "dynamic", "histomorphometric", "measurements", "were", "performed", "as", "previously", "reported", "-LSB-", "15", ",", "16", "-RSB-", ".", "Histomorphometric", "indices", "used", "for", "this", "study", "included", "the", "percentage", "of", "bone", "surface", "covered", "by", "osteoid", "-LRB-", "osteoid", "surface", ",", "OS/BS", "-RRB-", "and", "the", "amount", "of", "mineralized", "bone", "formed", "per", "year", "on", "a", "given", "bone", "area", "-LRB-", "bone", "formation", "rate/bone", "volume", ",", "BFR/BV", "-RRB-", "as", "bone", "formation", "indices", "and", "the", "percentage", "of", "bone", "surface", "covered", "by", "osteoclasts", "or", "appearing", "eroded", "-LRB-", "eroded", "surface", ",", "ES/BS", "-RRB-", "and", "the", "number", "of", "osteoclasts", "per", "bone", "area", "-LRB-", "osteoclast", "number", ",", "Ocl.N", "/", "B.Ar", "-RRB-", "as", "bone", "resorption", "indices", "-LSB-", "17", ",", "18", "-RSB-", ".", "Histomorphometric", "data", "and", "immunohistochemical", "data", "were", "obtained", "from", "the", "same", "biopsies", ".", "Immunohistochemistry", "Apoptotic", "cells", "were", "visualized", "by", "immunohistochemical", "detection", "of", "activated", "caspase-3", ".", "The", "antibody", "against", "cleaved", "caspase-3", "specifically", "stains", "apoptotic", "cells", ".", "Unlike", "the", "terminal", "deoxynucleotidyl", "transferase-mediated", "deoxyuridine", "triphosphate", "nick", "end", "labeling", "-LRB-", "TUNEL", "-RRB-", "method", ",", "there", "is", "no", "staining", "of", "necrotic", "cells", "or", "cells", "with", "DNA", "damage", ".", "For", "optimal", "accuracy", "of", "the", "method", ",", "immunohistochemistry", "was", "performed", "on", "four", "5", "μm", "sections", "of", "each", "biopsy", ",", "which", "were", "obtained", "with", "an", "interval", "of", "30", "μm", ".", "Sections", "were", "cut", "and", "transferred", "to", "poly-l-lysine-coated", "slides", ".", "After", "deplastification", "and", "rehydration", ",", "sections", "were", "decalcified", "for", "10", "minutes", "with", "1", "%", "acetic", "acid", ".", "Antigen", "retrieval", "was", "performed", "by", "30-minute", "incubation", "with", "0.5", "%", "saponin", "-LRB-", "Sigma", ",", "St.", "Louis", ",", "MO", "-RRB-", "in", "phosphate-buffered", "saline", "-LRB-", "PBS", "-RRB-", "and", "10-minute", "incubation", "with", "3.5", "μg/mL", "DNAse", "II", "-LRB-", "Sigma", "-RRB-", "in", "25", "mM", "Tris", "+", "10", "mM", "MgSO4", ".", "Sections", "were", "incubated", "with", "3", "%", "H2O2", "in", "methanol", "to", "block", "endogenous", "peroxidase", "and", "with", "5", "%", "normal", "goat", "serum", "in", "PBS", "+", "0.05", "%", "Tween", "to", "block", "nonspecific", "binding", "sites", ".", "Incubation", "with", "primary", "antibody", "was", "performed", "overnight", "at", "4", "°C", "with", "1/100", "rabbit-anticleaved", "caspase-3", "antibody", "-LRB-", "Cell", "Signaling", "Technology", ",", "Beverly", ",", "MA", "-RRB-", "in", "PBS", "+", "0.05", "%", "Tween", ".", "Sections", "were", "then", "incubated", "for", "1", "hour", "with", "1/100", "biotin-labeled", "goat-anti-rabbit", "immunoglobulin", "G", "-LRB-", "Vector", "Labs", ",", "Burlingame", ",", "CA", "-RRB-", "in", "PBS", "+", "0.05", "%", "Tween", ".", "The", "sections", "were", "incubated", "for", "30", "minutes", "with", "the", "ABC", "kit", "-LRB-", "Vector", "Labs", "-RRB-", "and", "developed", "for", "10", "minutes", "with", "3,3", "′", "-", "diaminobenzidine", "with", "nickel", "enhancement", ".", "Sections", "were", "counterstained", "with", "0.025", "%", "toluidine", "blue", "in", "H2O", ",", "dehydrated", ",", "and", "sealed", "in", "DEPEX", "mounting", "medium", "-LRB-", "BDH", "-RRB-", ".", "Random", "quality-control", "sections", "were", "measured", "in", "each", "assay", ".", "Sections", "of", "human", "ileum", "were", "tested", "as", "a", "positive", "control", "for", "apoptotic", "cells", ".", "Cell", "Counting", "The", "identity", "of", "the", "sections", "was", "blinded", ",", "and", "they", "were", "randomly", "numbered", ".", "In", "each", "section", ",", "the", "total", "trabecular", "bone", "area", "was", "measured", "using", "Osteomeasure", "software", "-LRB-", "Osteometrics", ",", "Atlanta", ",", "GA", "-RRB-", ".", "In", "the", "entire", "trabecular", "bone", "area", ",", "the", "total", "number", "of", "osteocytes", ",", "the", "number", "of", "cleaved", "caspase-3-positive", "osteocytes", ",", "and", "the", "number", "of", "empty", "lacunae", "were", "counted", "with", "x200", "magnification", ".", "Artefacts", ",", "such", "as", "areas", "where", "bone", "marrow", "obscured", "the", "trabeculae", "or", "where", "trabeculae", "were", "crossed", ",", "were", "avoided", ".", "All", "sections", "were", "analyzed", "by", "the", "same", "investigator", ".", "From", "these", "data", "we", "calculated", "the", "following", "parameters", ":", "percentage", "of", "positive", "osteocytes", "per", "total", "osteocytes", "-LRB-", "Pos.Ot.N", "/", "Tt.Ot.N", "-RRB-", "percentage", "of", "empty", "lacunae", "per", "total", "lacunae", "-LRB-", "EL.N", "/", "Tt.L.N", "-RRB-", "empty", "lacunae", "per", "bone", "area", "-LRB-", "EL.N", "/", "B.Ar", "-RRB-", "total", "lacunae", "per", "bone", "area", "-LRB-", "Tt.L.N", "/", "B.Ar", "-RRB-", "Calculations", "from", "the", "four", "sections", "per", "biopsy", "were", "averaged", ".", "The", "variation", "in", "the", "method", "was", "assessed", "by", "calculating", "the", "average", "standard", "deviation", "from", "all", "the", "quadruplicates", "according", "to", "the", "following", "formula", ":", "in", "which", "n", "is", "number", "of", "subjects", ",", "k", "is", "number", "of", "measurements", "per", "subject", ",", "nj", "is", "number", "of", "measurements", "in", "subject", "j", ",", "Xij", "is", "score", "measurement", "i", "in", "subject", "j", ",", "and", "is", "mean", "score", "in", "subject", "j.", "Statistics", "All", "values", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Differences", "in", "the", "calculated", "parameters", "between", "the", "2-year", "biopsies", "and", "the", "baseline", "biopsies", "within", "groups", "were", "tested", "using", "a", "nonparametric", "paired", "t-test", "-LRB-", "Wilcoxon", "signed", "rank", "test", "-RRB-", ".", "Differences", "between", "the", "treatment", "groups", "in", "the", "percent", "change", "after", "2", "years", "of", "treatment", "were", "tested", "with", "a", "nonparametric", "t-test", "-LRB-", "Mann-Whitney", "signed", "rank", "test", "-RRB-", ".", "Correlations", "between", "the", "calculated", "parameters", "and", "histomorphometric", "indices", "or", "biochemical", "markers", "were", "assessed", "with", "Spearman", "'s", "rank", "correlations", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "SPSS", "-LRB-", "Chicago", ",", "IL", "-RRB-", "12.0", "software", ".", "Results", "The", "data", "presented", "here", "are", "derived", "from", "26", "patients", "who", "attended", "the", "European", "centers", "of", "the", "MORE", "trial", ".", "Therefore", ",", "this", "study", "covers", "only", "part", "of", "the", "group", "of", "patients", "on", "which", "histomorphometry", "data", "were", "published", "earlier", "-LSB-", "16", "-RSB-", ".", "Of", "the", "26", "women", "in", "this", "study", ",", "11", "received", "placebo", ",", "ten", "received", "60", "mg/day", "raloxifene", ",", "and", "five", "received", "120", "mg/day", "raloxifene", ".", "Because", "the", "number", "of", "women", "in", "the", "120", "mg/day", "raloxifene", "group", "was", "small", "and", "no", "difference", "in", "results", "between", "the", "two", "raloxifene", "treatment", "groups", "was", "detected", ",", "as", "tested", "using", "the", "Mann-Whitney", "signed", "rank", "test", ",", "data", "from", "the", "two", "raloxifene", "groups", "were", "combined", "for", "further", "analysis", ".", "The", "average", "age", "of", "the", "women", "in", "the", "placebo", "group", "was", "67.9", "±", "6.1", "years", ";", "in", "the", "raloxifene", "group", "the", "average", "age", "was", "67.1", "±", "6.7", "years", ".", "Staining", "for", "cleaved", "caspase-3", "clearly", "identified", "apoptotic", "osteocytes", "-LRB-", "Fig.", "1a", "-RRB-", ";", "in", "the", "negative", "control", "no", "cells", "showed", "any", "staining", ".", "Figure", "1b", "shows", "an", "example", "of", "an", "empty", "lacuna", ".", "In", "the", "human", "ileum", "sections", ",", "clear", "positive", "staining", "of", "intestinal", "epithelial", "cells", "was", "seen", "at", "the", "luminal", "surface", "of", "the", "villi", "while", "the", "negative", "control", "showed", "no", "staining", "-LRB-", "Fig.", "1c", ",", "d", "-RRB-", ".", "Table", "1", "shows", "the", "baseline", "and", "follow-up", "results", "of", "the", "calculated", "parameters", "in", "the", "placebo", "group", "and", "the", "raloxifene", "group", "and", "the", "average", "standard", "deviation", "of", "the", "parameters", ".", "Direct", "comparison", "of", "the", "follow-up", "biopsy", "with", "the", "baseline", "biopsy", "revealed", "no", "difference", "in", "the", "percentage", "of", "positive", "osteocytes", "-LRB-", "Pos.Ot.N", "/", "Tl.Ot.N", "-RRB-", "in", "either", "the", "placebo", "group", "or", "the", "raloxifene", "group", ".", "Fig.", "1Immunohistochemical", "staining", "of", "bone", "biopsy", "sections", "and", "human", "ileum", "sections", "for", "cleaved", "caspase-3", ".", "Human", "bone", "biopsy", "sections", "stained", "with", "cleaved", "caspase-3", "-LRB-", "a", ",", "b", "-RRB-", ".", "Arrows", "indicate", "apoptotic", "osteocyte", "-LRB-", "a", "-RRB-", "or", "empty", "lacuna", "-LRB-", "b", "-RRB-", ".", "Human", "ileum", "sections", "stained", "with", "cleaved", "caspase-3", "-LRB-", "c", "-RRB-", "or", "no", "first", "antibody", "-LRB-", "d", "-RRB-", ".", "Arrows", "indicate", "apoptotic", "cellsTable", "1Results", "of", "baseline", "and", "follow-up", "biopsies", "for", "the", "calculated", "parametersParameter", "-LRB-", "average", "standard", "deviation", "-RRB-", "aTime", "pointPlacebo", "-LRB-", "n", "=", "11", ",", "mean", "±", "SD", "-RRB-", "Raloxifeneb", "-LRB-", "n", "=", "15", ",", "mean", "±", "SD", "-RRB-", "Pos.Ot.N", "/", "Tt.Ot.N", "-LRB-", "%", "-RRB-", "-LRB-", "1.28", "-RRB-", "Baseline6", ".66", "±", "5.285.30", "±", "3.51Follow-up6.82", "±", "5.274.99", "±", "2.29", "EL.N", "/", "Tt.L.N", "-LRB-", "%", "-RRB-", "-LRB-", "2.43", "-RRB-", "Baseline9", ".00", "±", "2.259.11", "±", "2.88Follow-up11.20", "±", "1.43", "c9", ".74", "±", "1.91", "EL.N", "/", "B.Ar", "-LRB-", "n/mm2", "-RRB-", "-LRB-", "6.29", "-RRB-", "Baseline21", ".2", "±", "6.1321.0", "±", "6.49Follow-up24.5", "±", "3.6822.5", "±", "4.67", "Tt.L.N", "/", "B.Ar", ".", "-LRB-", "n/mm2", "-RRB-", "-LRB-", "22.34", "-RRB-", "Baseline233", ".9", "±", "28.2231.5", "±", "22.9Follow-up219.5", "±", "27.3231.1", "±", "19.6", "a", "Average", "standard", "deviation", "calculated", "from", "all", "quadruplicatesb", "The", "60", "mg/day", "and", "120", "mg/day", "raloxifene", "groups", "were", "combinedc", "Statistically", "significant", "difference", "-LRB-", "P", "=", "0.014", "-RRB-", "from", "baseline", "value", "As", "empty", "lacunae", "are", "the", "result", "of", "osteocyte", "apoptosis", "and", "are", "only", "removed", "by", "bone", "remodeling", ",", "changes", "in", "the", "number", "of", "empty", "lacunae", "could", "be", "indicative", "of", "changes", "in", "osteocyte", "apoptosis", ".", "In", "the", "placebo", "group", ",", "the", "percentage", "of", "empty", "lacunae", "-LRB-", "EL.N", "/", "Tt.L.N", "-RRB-", "increased", "significantly", "after", "2", "years", "-LRB-", "also", "shown", "in", "Fig.", "2", "-RRB-", ".", "The", "empty", "lacunar", "density", "-LRB-", "EL.N", "/", "B.Ar", "-RRB-", "showed", "a", "parallel", "change", ",", "but", "this", "was", "not", "significant", ".", "In", "the", "raloxifene", "group", ",", "the", "percentage", "of", "empty", "lacunae", "and", "the", "empty", "lacunar", "density", "did", "not", "increase", "significantly", ".", "The", "average", "standard", "deviation", ",", "calculated", "from", "the", "quadruplicate", "analysis", ",", "showed", "that", "the", "variation", "in", "the", "method", "was", "comparable", "to", "the", "variation", "between", "individuals", ",", "except", "for", "the", "measurement", "of", "percent", "positive", "cells", ",", "where", "the", "variation", "between", "the", "individuals", "was", "much", "higher", ".", "Fig.", "2Change", "in", "percentage", "empty", "lacunae", "after", "treatment", "for", "2", "years", "with", "either", "placebo", "-LRB-", "A", "-RRB-", "or", "raloxifene", "-LRB-", "B", "-RRB-", ".", "Empty", "lacunae", "and", "total", "lacunae", "were", "counted", "in", "each", "biopsy", ".", "The", "increase", "in", "the", "placebo", "group", "was", "significant", "-LRB-", "P", "=", "0.014", "-RRB-", "Associations", "of", "bone", "remodeling", "parameters", "with", "osteocyte", "apoptosis", "and", "empty", "lacunae", "are", "shown", "in", "Table", "2", ".", "At", "baseline", ",", "in", "the", "placebo", "group", "and", "the", "raloxifene", "group", "combined", ",", "there", "was", "a", "negative", "correlation", "of", "the", "histomorphometric", "indices", "-LRB-", "BFR/BV", ",", "OS/BS", ",", "ES/BS", ",", "and", "Ocl.N", "/", "B.Ar", "-RRB-", "with", "the", "percent", "positive", "osteocytes", "-LRB-", "Pos.Ot.N", "/", "Tt.Ot.N", "-RRB-", ".", "Histomorphometric", "indices", "were", "not", "correlated", "with", "empty", "lacunae", ".", "The", "regression", "lines", "for", "BFR/BV", "with", "percent", "apoptotic", "osteocytes", "and", "percent", "empty", "lacunae", "are", "shown", "in", "Figure", "3", ".", "Correlations", "between", "biochemical", "indices", "-LRB-", "BSAP", ",", "osteocalcin", ",", "and", "CTX-1", "-RRB-", "and", "percent", "apoptotic", "osteocytes", "or", "percent", "empty", "lacunae", "were", "not", "found", ".", "Table", "2Association", "of", "histomorphometric", "indices", "and", "biochemical", "indices", "of", "bone", "remodeling", "with", "osteocyte", "apoptosis", "-LRB-", "Pos.Ot.N", "/", "Tt.Ot.N", "-RRB-", "and", "empty", "lacunae", "-LRB-", "E.L.N", "/", "Tt.L.N", "-RRB-", "Histomorphometric", "indicesOS/BSBFR/BVES", "/", "BSOcl.N", "/", "B.Ar", "%", "Positive", "osteocytes", "-LRB-", "Pos.Ot.N", "/", "Tt.Ot.N", "-RRB-", "r", "=", "−", "0.64", "r", "=", "−", "0.67", "r", "=", "−", "0.48", "r", "=", "−", "0.43", "P", "=", "0.0004", "aP", "=", "0.001", "aP", "=", "0.01", "aP", "=", "0.03", "a", "%", "Empty", "lacunae", "-LRB-", "E.L.N", "/", "Tt.L.N", "-RRB-", "r", "=", "0.03", "r", "=", "0.10", "r", "=", "0.05", "r", "=", "0.48", "P", "=", "0.87", "P", "=", "0.67", "P", "=", "0.80", "P", "=", "0.02", "aBiochemical", "indicesOsteocalcinBSAPCTX", "%", "Positive", "osteocytes", "-LRB-", "Pos.Ot.N", "/", "Tt.Ot.N", "-RRB-", "r", "=", "−", "0.35", "r", "=", "−", "0.43", "r", "=", "−", "0.40", "P", "=", "0.13", "P", "=", "0.05", "P", "=", "0.09", "%", "Empty", "lacunae", "-LRB-", "E.L.N", "/", "Tt.L.N", "-RRB-", "r", "=", "0.10", "r", "=", "0.13", "r", "=", "0.31", "P", "=", "0.66", "P", "=", "0.56", "P", "=", "0.19", "aStatistically", "significant", "-LRB-", "P", "<", "0.05", "-RRB-", "Fig.", "3Relationship", "between", "BFR/BV", "and", "osteocyte", "apoptosis", "at", "baseline", "in", "the", "placebo", "and", "raloxifene", "groups", "combined", ".", "-LRB-", "A", "-RRB-", "Association", "between", "BFR/BV", "and", "percent", "positive", "osteocytes", ".", "Correlation", "is", "significant", "for", "placebo", "and", "raloxifene", "groups", "combined", "-LRB-", "P", "=", "0.001", "-RRB-", ".", "-LRB-", "B", "-RRB-", "Association", "between", "BFR/BV", "and", "percentage", "empty", "lacunae", ".", "No", "significant", "correlation", "-LRB-", "P", "=", "0.67", "-RRB-", ".", "●", ",", "placebo", "group", ";", "▴", ",", "raloxifene", "group", "No", "changes", "in", "the", "histomorphometric", "indices", "between", "baseline", "and", "follow-up", "were", "found", ",", "nor", "were", "there", "any", "differences", "between", "the", "placebo", "and", "raloxifene", "groups", ".", "All", "three", "biochemical", "markers", "showed", "a", "significant", "decrease", "at", "follow-up", "compared", "to", "baseline", "in", "the", "raloxifene", "group", "but", "not", "in", "the", "placebo", "group", "-LRB-", "Table", "3", "-RRB-", ".", "Table", "3Results", "of", "baseline", "and", "follow-up", "biopsies", "for", "histomorphometric", "indices", "and", "biochemical", "markers", "of", "bone", "remodelingParameterTime", "point", "%", "changePlacebo", "-LRB-", "n", "=", "11", ",", "mean", "±", "SD", "-RRB-", "Raloxifenea", "-LRB-", "n", "=", "15", ",", "mean", "±", "SD", "-RRB-", "OS/BS", "-LRB-", "%", "-RRB-", "Baseline10", ".2", "±", "6.89.9", "±", "5.4Follow-up7.5", "±", "3.211.6", "±", "4.6", "BFR/BV", "-LRB-", "%", "/", "year", "-RRB-", "Baseline28", ".8", "±", "20.335.3", "±", "18.6Follow-up19.8", "±", "8.723.3", "±", "12.6", "ES/BS", "-LRB-", "%", "-RRB-", "Baseline5", ".3", "±", "2.66.3", "±", "2.9Follow-up5.3", "±", "2.46.3", "±", "2.4", "Ocl.N", ".", "/", "B.Ar", "-LRB-", "n/mm2", "-RRB-", "Baseline0", ".6", "±", "0.30.8", "±", "0.4Follow-up0.6", "±", "0.30.6", "±", "0.3", "BSAP", "-LRB-", "μg/L", "-RRB-", "Baseline14", ".9", "±", "7.314.4", "±", "4.6Follow-up12.2", "±", "5.610.0", "±", "2.5", "bOsteocalcin", "-LRB-", "ng/mL", "-RRB-", "Baseline22", ".9", "±", "10.625.5", "±", "9.1Follow-up18.2", "±", "3.816.1", "±", "3.1bCTX-1", "-LRB-", "μg/mmol", "creatinine", "-RRB-", "Baseline283", ".9", "±", "267.0277.4", "±", "198.2Follow-up137.7", "±", "63.8132.3", "±", "53.0", "baThe", "60", "mg/day", "and", "120", "mg/day", "groups", "were", "combinedbSignificantly", "different", "from", "baseline", "-LRB-", "P", "<", "0.05", "-RRB-", "Discussion", "We", "investigated", "the", "effect", "of", "treatment", "with", "raloxifene", "for", "2", "years", "of", "postmenopausal", "osteoporotic", "women", "on", "osteocyte", "apoptosis", "as", "measured", "by", "activated", "caspase-3", "immunohistochemistry", "in", "iliac", "crest", "bone", "biopsies", ".", "Direct", "comparison", "of", "follow-up", "with", "baseline", "in", "the", "placebo", "and", "raloxifene", "groups", "did", "not", "show", "differences", "in", "the", "percent", "positive", "osteocytes", ".", "This", "suggests", "that", "raloxifene", "has", "little", "or", "no", "influence", "on", "osteocyte", "apoptosis", ".", "We", "did", "find", "a", "significant", "increase", "in", "the", "percentage", "of", "empty", "lacunae", "at", "2", "years", "in", "the", "placebo", "group", ",", "while", "there", "was", "no", "change", "in", "the", "raloxifene", "group", ".", "This", "lack", "of", "accumulation", "of", "empty", "lacunae", "in", "the", "raloxifene", "group", "could", "be", "the", "consequence", "of", "an", "inhibitory", "effect", "of", "raloxifene", "on", "osteocyte", "apoptosis", ".", "At", "baseline", ",", "histomorphometric", "indices", "of", "bone", "remodeling", "were", "inversely", "correlated", "with", "apoptotic", "osteocytes", "but", "not", "with", "empty", "lacunae", ".", "Biochemical", "markers", "of", "bone", "remodeling", "were", "not", "correlated", "with", "apoptotic", "osteocytes", "or", "empty", "lacunae", ".", "This", "is", "the", "first", "study", "to", "investigate", "the", "effect", "of", "antiresorptive", "treatment", "on", "osteocyte", "apoptosis", "in", "human", "bone", "biopsies", ".", "So", "far", ",", "the", "effect", "of", "raloxifene", "on", "osteoblast", "or", "osteocyte", "apoptosis", "has", "only", "been", "studied", "in", "in", "vitro", "studies", ".", "Kousteni", "et", "al.", "-LSB-", "13", "-RSB-", "studied", "the", "effect", "of", "raloxifene", "on", "etoposide-induced", "apoptosis", "of", "rat", "calvarial", "osteoblasts", "and", "did", "not", "find", "protection", "against", "apoptosis", ".", "On", "the", "other", "hand", ",", "Olivier", "et", "al.", "-LSB-", "19", "-RSB-", "found", "that", "raloxifene", "protected", "the", "osteoblast-like", "cell", "line", "MC3T3-E1", "against", "apoptosis", "induced", "by", "a", "high", "concentration", "of", "nitric", "oxide", ".", "Comparable", "clinical", "studies", "with", "hormone", "replacement", "therapy", "or", "bisphosphonates", "have", "not", "been", "published", ",", "but", "in", "vitro", "studies", "-LSB-", "20", ",", "21", "-RSB-", "and", "studies", "with", "mice", "-LSB-", "22", ",", "23", "-RSB-", "have", "shown", "that", "both", "these", "treatments", "have", "an", "inhibiting", "effect", "on", "osteocyte", "apoptosis", "induced", "by", "glucocorticoids", "or", "etoposide", ".", "The", "difference", "between", "the", "raloxifene", "group", "and", "the", "placebo", "group", "in", "percent", "empty", "lacunae", "provides", "some", "evidence", "for", "an", "inhibitory", "effect", "of", "raloxifene", "on", "osteocyte", "apoptosis", ",", "although", "this", "effect", "was", "not", "reflected", "in", "the", "empty", "lacunar", "density", ".", "The", "fact", "that", "apoptotic", "osteocytes", "and", "empty", "lacunae", "change", "differently", "in", "response", "to", "raloxifene", "treatment", "could", "be", "explained", "by", "the", "comparatively", "short", "time", "that", "apoptosis", "can", "be", "detected", ".", "It", "has", "been", "shown", "that", "nonviable", "osteocytes", "are", "detectable", "for", "up", "to", "16", "weeks", "-LSB-", "24", "-RSB-", ",", "although", "remnants", "of", "apoptotic", "cells", ",", "such", "as", "apoptotic", "bodies", ",", "might", "exist", "a", "little", "longer", ".", "Therefore", ",", "the", "cleaved", "caspase-3-positive", "osteocytes", "that", "were", "detected", "are", "cells", "that", "became", "apoptotic", "in", "the", "last", "16", "weeks", "of", "the", "treatment", "period", ".", "Moderate", "changes", "due", "to", "treatment", "with", "raloxifene", "are", "probably", "not", "detectable", "in", "such", "a", "short", "period", ".", "Empty", "lacunae", "remain", "in", "bone", "until", "bone", "remodeling", "will", "remove", "them", ",", "and", "this", "period", "is", "longer", "then", "the", "16", "weeks", "that", "an", "apoptotic", "osteocyte", "is", "detectable", ".", "Changes", "in", "bone", "remodeling", "could", "have", "influenced", "the", "percentage", "of", "apoptotic", "osteocytes", "and", "empty", "lacunae", "that", "we", "found", ".", "The", "inverse", "correlation", "between", "bone", "remodeling", "indices", "and", "osteocyte", "apoptosis", "at", "baseline", "indicates", "that", "the", "level", "of", "osteocyte", "apoptosis", "is", "indeed", "associated", "with", "the", "level", "of", "bone", "remodeling", ".", "In", "our", "opinion", ",", "the", "explanation", "for", "this", "association", "is", "that", "with", "high", "bone", "remodeling", "the", "chance", "that", "apoptotic", "osteocytes", "are", "removed", "and", "replaced", "by", "new", "osteocytes", "is", "also", "high", "and", ",", "therefore", ",", "the", "percentage", "of", "detected", "apoptotic", "osteocytes", "is", "low", ".", "With", "low", "bone", "remodeling", "the", "chance", "that", "apoptotic", "osteocytes", "are", "removed", "and", "replaced", "by", "new", "osteocytes", "is", "also", "low", "and", ",", "therefore", ",", "the", "resulting", "percentage", "of", "observed", "apoptotic", "osteocytes", "is", "high", ".", "In", "this", "way", ",", "bone", "remodeling", "partly", "defines", "the", "percentage", "of", "apoptotic", "osteocytes", ",", "a", "mechanism", "which", "has", "already", "been", "suggested", "by", "Dunstan", "et", "al.", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "This", "dependence", "of", "the", "level", "of", "osteocyte", "apoptosis", "on", "the", "level", "of", "bone", "remodeling", "complicates", "the", "detection", "of", "an", "effect", "of", "a", "treatment", "on", "osteocyte", "apoptosis", "if", "that", "treatment", "also", "has", "an", "effect", "on", "bone", "remodeling", ".", "In", "this", "study", ",", "there", "were", "no", "significant", "effects", "of", "raloxifene", "on", "bone", "remodeling", "parameters", "both", "in", "the", "placebo", "group", "and", "in", "the", "raloxifene", "group", ";", "however", ",", "changes", "in", "individual", "women", "over", "the", "2-year", "treatment", "period", "could", "have", "influenced", "the", "level", "of", "osteocyte", "apoptosis", "found", "at", "follow-up", ".", "This", "could", "have", "obscured", "detection", "of", "a", "possible", "effect", "of", "raloxifene", "on", "osteocyte", "apoptosis", ".", "The", "inverse", "correlation", "between", "osteocyte", "apoptosis", "and", "bone", "remodeling", "seems", "to", "be", "in", "contrast", "with", "the", "hypothesis", "put", "forward", "by", "several", "investigators", "-LSB-", "5", ",", "26", "-RSB-", "that", "viable", "osteocytes", "inhibit", "bone", "remodeling", "and", "that", "lack", "of", "viable", "osteocytes", ",", "e.g.", ",", "near", "sites", "of", "microdamage", ",", "attracts", "bone", "remodeling", ".", "We", "believe", "that", "our", "results", "do", "not", "contradict", "this", "hypothesis", ".", "Attraction", "of", "osteoclasts", "by", "dead", "osteocytes", "or", "by", "lack", "of", "osteocytes", "is", "probably", "a", "local", "process", ".", "If", "the", "occurrence", "of", "dead", "osteocytes", "and", "empty", "lacunae", "stimulates", "bone", "remodeling", ",", "the", "lacunae", "are", "more", "quickly", "removed", "and", "replaced", "with", "viable", "osteocytes", ".", "The", "percent", "empty", "lacunae", "was", "not", "correlated", "to", "histomorphometric", "indices", "of", "bone", "remodeling", ".", "This", "suggests", "that", "the", "empty", "lacunae", "for", "a", "large", "part", "exist", "and", "increase", "in", "number", "in", "bone", "that", "is", "not", "participating", "in", "remodeling", ".", "In", "two", "studies", ",", "Qiu", "et", "al.", "-LSB-", "27", ",", "28", "-RSB-", "have", "made", "the", "distinction", "between", "superficial", "bone", "and", "deep", "bone", ",", "i.e.", ",", "bone", "at", "the", "surface", "of", "trabeculae", "and", "bone", "in", "the", "center", "of", "trabeculae", ".", "They", "postulated", "that", "deep", "bone", "is", "remodeled", "much", "more", "slowly", "than", "superficial", "bone", ".", "In", "this", "study", ",", "we", "did", "not", "make", "a", "distinction", "between", "superficial", "bone", "and", "deep", "bone", ",", "but", "it", "is", "possible", "that", "the", "increase", "in", "empty", "lacunae", "that", "we", "found", "primarily", "occurred", "in", "deep", "bone", ".", "Biochemical", "markers", "of", "bone", "formation", "and", "resorption", "were", "not", "correlated", "with", "osteocyte", "apoptosis", "or", "with", "empty", "lacunae", ".", "Biochemical", "markers", "reflect", "bone", "remodeling", "in", "the", "whole", "skeleton", ",", "both", "in", "trabecular", "bone", "and", "in", "cortical", "bone", ".", "Correlations", "between", "such", "general", "markers", "and", "parameters", "measured", "locally", "in", "trabecular", "bone", "of", "the", "iliac", "crest", "are", "possibly", "more", "difficult", "to", "find", ".", "The", "major", "limitation", "of", "our", "study", "is", "the", "small", "number", "of", "patients", ".", "The", "percentage", "of", "apoptotic", "osteocytes", "varied", "considerably", "between", "individuals", ",", "and", "this", "makes", "it", "difficult", "to", "find", "significant", "differences", "between", "such", "small", "groups", ".", "The", "variation", "was", "not", "caused", "by", "variation", "in", "the", "method", ",", "as", "shown", "by", "the", "low", "average", "standard", "deviation", ",", "indicating", "that", "the", "percentage", "of", "apoptotic", "osteocytes", "has", "to", "be", "an", "individual", "characteristic", ".", "Detection", "of", "cleaved", "caspase-3", ",", "a", "key", "protease", "in", "the", "apoptotic", "process", ",", "is", "an", "established", "method", "for", "measuring", "apoptosis", "-LSB-", "29", ",", "30", "-RSB-", ";", "and", "it", "has", "recently", "been", "used", "on", "bone", "tissue", "-LSB-", "31", "-RSB-", ".", "In", "the", "latter", "study", ",", "comparison", "between", "the", "TUNEL", "method", "and", "the", "cleaved", "caspase-3", "method", "showed", "no", "significant", "differences", ".", "We", "confirmed", "the", "specificity", "of", "the", "detection", "of", "cleaved", "caspase-3", "in", "sections", "of", "human", "ileum", ".", "In", "these", "sections", ",", "only", "the", "cells", "which", "are", "expected", "to", "be", "apoptotic", "-LSB-", "32", "-RSB-", "were", "stained", "by", "our", "method", ".", "Necrotic", "death", "of", "osteocytes", "might", "also", "occur", "in", "bone", ";", "however", ",", "we", "expect", "that", "necrotic", "cell", "death", "is", "low", "and", "not", "responsive", "to", "interventions", "such", "as", "estrogen", ",", "glucocorticoids", ",", "or", "mechanical", "loading", ".", "The", "average", "percentage", "apoptotic", "osteocytes", "we", "found", "was", "somewhat", "lower", "than", "what", "Tomkinson", "et", "al.", "-LSB-", "8", "-RSB-", "found", "in", "their", "study", "in", "young", "women", "who", "had", "received", "gonadotropin-releasing", "hormone", "analogue", "therapy", ".", "This", "could", "reflect", "differences", "in", "age", "and", "in", "treatment", "between", "the", "two", "studies", ".", "The", "number", "of", "empty", "lacunae", "that", "we", "observed", "could", "be", "an", "overestimation", "caused", "by", "sectioning", "artefacts", "or", "the", "decalcification", "step", "in", "the", "immunohistochemistry", "method", ".", "We", "do", "not", "know", "to", "what", "extent", "this", "occurs", ",", "but", "this", "would", "be", "equal", "in", "all", "biopsies", ".", "Goldner-stained", "sections", "showed", "more", "sectioning", "artefacts", ",", "and", "therefore", ",", "empty", "lacunae", "in", "these", "sections", "were", "not", "counted", ".", "Inconsistency", "between", "the", "change", "in", "percent", "empty", "lacunae", "and", "empty", "lacunar", "density", "in", "the", "placebo", "group", "is", "probably", "also", "related", "to", "the", "small", "number", "of", "patients", "studied", ".", "In", "this", "study", ",", "we", "did", "not", "find", "clear", "evidence", "that", "treatment", "with", "raloxifene", "influences", "osteocyte", "apoptosis", ".", "No", "change", "in", "the", "percentage", "of", "apoptotic", "osteocytes", "was", "detected", ",", "while", "the", "changes", "in", "the", "empty", "lacunae", "were", "inconclusive", "and", "at", "best", "indirect", "evidence", "that", "osteocyte", "apoptosis", "had", "been", "changed", "by", "raloxifene", ".", "Compared", "to", "estrogen", ",", "raloxifene", "treatment", "shows", "a", "similar", "reduction", "of", "vertebral", "fractures", "-LRB-", "but", "not", "nonvertebral", "fractures", "-RRB-", "-LSB-", "10", ",", "33", "-RSB-", "but", "has", "less", "potent", "positive", "effects", "on", "bone", "quality", "assessed", "by", "BMD", "measurement", "and", "bone", "histomorphometry", "-LSB-", "34", ",", "35", "-RSB-", ".", "It", "is", "conceivable", "that", "the", "weaker", "effect", "of", "raloxifene", "on", "bone", "is", "related", "to", "only", "a", "weak", "antiapoptotic", "effect", "or", "lack", "of", "antiapoptotic", "action", ".", "This", "is", ",", "however", ",", "difficult", "to", "measure", "in", "a", "study", "with", "such", "a", "small", "number", "of", "subjects", ".", "It", "would", "be", "of", "interest", "to", "compare", "the", "effects", "of", "different", "antiresorptive", "treatments", "on", "osteocyte", "apoptosis", "in", "larger", "clinical", "studies", "and", "to", "compare", "the", "mechanisms", "by", "which", "they", "exert", "their", "effect", ".", "In", "conclusion", ",", "we", "did", "not", "find", "evidence", "for", "an", "effect", "of", "raloxifene", "treatment", "on", "osteocyte", "apoptosis", "in", "postmenopausal", "women", ",", "but", "small", "effects", "of", "raloxifene", "treatment", "on", "osteocyte", "apoptosis", "can", "not", "be", "excluded", ".", "The", "percent", "of", "apoptotic", "osteocytes", "was", "dependent", "on", "the", "level", "of", "bone", "remodeling", "in", "an", "individual", "." ]

[ "O", "O", "B", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Leg", "blood", "flow", "measurements", "using", "venous", "occlusion", "plethysmography", "during", "head-up", "tilt", "We", "tested", "whether", "venous", "occlusion", "plethysmography", "-LRB-", "VOP", "-RRB-", "is", "an", "appropriate", "method", "to", "measure", "calf", "blood", "flow", "-LRB-", "CBF", "-RRB-", "during", "head-up", "tilt", "-LRB-", "HUT", "-RRB-", ".", "CBF", "measured", "with", "VOP", "was", "compared", "with", "superficial", "femoral", "artery", "blood", "flow", "as", "measured", "by", "Doppler", "ultrasound", "during", "incremental", "tilt", "angles", ".", "Measurements", "of", "both", "methods", "correlated", "well", "-LRB-", "r", "=", "0.86", "-RRB-", ".", "Reproducibility", "of", "VOP", "was", "fair", "in", "supine", "position", "and", "30", "°", "HUT", "-LRB-", "CV", ":", "11", "%", "--", "15", "%", "-RRB-", ".", "This", "indicates", "that", "VOP", "is", "an", "applicable", "tool", "to", "measure", "leg", "blood", "flow", "during", "HUT", ",", "especially", "up", "to", "30", "°", "HUT", ".", "Introduction", "The", "main", "mechanism", "responsible", "for", "maintaining", "blood", "pressure", "during", "orthostatic", "stress", "is", "arteriolar", "vasoconstriction", "-LSB-", "6", "-RSB-", ".", "In", "order", "to", "quantify", "the", "response", "in", "vascular", "resistance", "to", "postural", "stress", ",", "in", "particular", "in", "the", "leg", ",", "it", "is", "necessary", "to", "measure", "leg", "blood", "flow", "accurately", ".", "Venous", "occlusion", "plethysmography", "-LRB-", "VOP", "-RRB-", "is", "a", "well-established", "method", "to", "measure", "calf", "blood", "flow", ",", "which", "has", "been", "used", "in", "a", "variety", "of", "conditions", ",", "i.e.", "exercise", "-LSB-", "13", "-RSB-", "and", "reactive", "hyperaemia", "-LSB-", "17", "-RSB-", ".", "However", ",", "its", "use", "for", "measuring", "leg", "blood", "flow", "in", "standing", "or", "head-up", "tilt", "-LRB-", "HUT", "-RRB-", "position", "remains", "controversial", ",", "since", "an", "empty", "venous", "system", "has", "been", "suggested", "to", "be", "requisite", "for", "this", "method", "-LSB-", "3", ",", "4", ",", "12", "-RSB-", ".", "Since", "in", "the", "upright", "posture", "veins", "are", "already", "distended", ",", "due", "to", "an", "increase", "in", "hydrostatic", "pressure", ",", "further", "collection", "of", "blood", "may", "be", "defined", "by", "venous", "compliance", "rather", "than", "arterial", "inflow", ".", "This", "may", "question", "the", "validity", "of", "measuring", "blood", "flow", "using", "VOP", "in", "dependent", "limbs", "or", "in", "the", "upright", "posture", ".", "Although", "VOP", "has", "been", "used", "during", "HUT", ",", "accuracy", "or", "reproducibility", "of", "this", "method", "has", "not", "been", "reported", "-LSB-", "22", "--", "24", "-RSB-", ".", "Therefore", ",", "the", "purpose", "of", "this", "study", "was", "to", "assess", "the", "applicability", "and", "reproducibility", "of", "VOP", "for", "blood", "flow", "measurements", "in", "the", "calf", "-LRB-", "CBF", "-RRB-", "during", "HUT", "at", "different", "tilt", "angles", "-LRB-", "0", "°", ",", "30", "°", ",", "45", "°", ",", "and", "70", "°", "-RRB-", ".", "In", "a", "subgroup", "CBF", "measurements", "by", "VOP", "were", "compared", "with", "blood", "flow", "measurements", "using", "Doppler", "ultrasound", ".", "To", "assess", "reproducibility", "of", "VOP", ",", "measurements", "were", "performed", "twice", ".", "Materials", "and", "methods", "Subjects", "In", "total", "eighteen", "healthy", ",", "normotensive", "subjects", "aged", "21", "--", "30", "years", "volunteered", "to", "participate", "in", "this", "study", ".", "In", "eight", "subjects", "blood", "flow", "measurements", "using", "VOP", "were", "compared", "with", "blood", "flow", "measurements", "using", "Doppler", "ultrasound", "-LRB-", "DU", "-RRB-", ".", "In", "nine", "other", "subjects", "the", "VOP", "measurements", "were", "repeated", "within", "two", "weeks", "to", "assess", "reproducibility", ".", "Baseline", "subject", "characteristics", "are", "illustrated", "in", "Table", "1", ".", "None", "of", "the", "subjects", "used", "cardiovascular", "medication", "or", "suffered", "from", "cardiovascular", "disease", ".", "All", "were", "non-smokers", "and", "had", "no", "history", "of", "syncope", ".", "All", "volunteers", "refrained", "from", "caffeine", "and", "alcohol", "for", "at", "least", "eighteen", "hours", "and", "from", "food", "intake", "for", "three", "hours", "prior", "to", "testing", ".", "The", "local", "medical", "ethical", "committee", "approved", "the", "study", ".", "All", "subjects", "gave", "their", "written", "informed", "consent", ".", "Table", "1Subject", "characteristicsMean", "±", "SDAge", ",", "years25", "±", "4Length", ",", "cm187", "±", "9Body", "mass", ",", "kg80", "±", "11Calf", "circumference", ",", "cm38", "±", "2Systolic", "blood", "pressure", ",", "mmHg125", "±", "12Diastolic", "blood", "pressure", ",", "mmHg74", "±", "5Heart", "rate", ",", "bpm64", "±", "10", "Measurements", "The", "subjects", "lay", "in", "supine", "position", "on", "a", "manually", "driven", "tilt", "table", "and", "were", "supported", "by", "a", "saddle", ".", "The", "venous", "occlusion", "cuff", "was", "placed", "around", "the", "right", "thigh", "and", "connected", "to", "a", "rapid", "cuff", "inflator", "-LRB-", "Hokanson", "Stopler", "E-20", ",", "Bellevue", ",", "WA", "98005", ",", "USA", "-RRB-", ".", "The", "mercury-in-silastic", "strain", "gauge", "was", "placed", "around", "the", "thickest", "part", "of", "the", "calf", "and", "was", "connected", "to", "the", "plethysmograph", ".", "Red", "blood", "cell", "velocities", "and", "systolic", "and", "diastolic", "vessel", "diameter", "of", "the", "right", "superficial", "femoral", "artery", "were", "measured", "with", "a", "pulsed-colour", "Doppler", "device", ",", "which", "is", "described", "in", "detail", "elsewhere", "-LSB-", "8", "-RSB-", ".", "Reproducibility", "of", "DU", "in", "the", "superficial", "femoral", "artery", "was", "1.5", "%", "for", "diameter", ",", "14", "%", "for", "blood", "flow", "-LSB-", "9", "-RSB-", ".", "Protocol", "Supine", "blood", "flow", "measurements", "using", "DU", "and", "VOP", "were", "performed", "after", "subjects", "were", "30", "minutes", "quietly", "in", "supine", "position", ".", "When", "the", "subject", "was", "2", "minutes", "into", "30", "°", "HUT", ",", "DU", "measurements", "started", "until", "3.5", "minutes", "where", "after", "CBF", "continued", "for", "another", "3.5", "minutes", ".", "The", "venous", "occlusion", "pressure", "was", "adjusted", "to", "the", "hydrostatic", "pressure", "column", ",", "which", "is", "derived", "from", "the", "vertical", "distance", "heart", "level", "--", "thigh", "level", "and", "was", "calculated", "as", "the", "sinus", "of", "the", "tilt", "angle", "*", "actual", "distance", "heart", "--", "thigh", ",", "and", "was", "75", "mmHg", "during", "30", "°", "HUT", ".", "The", "same", "procedure", "was", "repeated", "for", "45", "°", ",", "and", "70", "°", "HUT", "using", "a", "venous", "occlusion", "pressure", "of", "87", ",", "and", "105", "mmHg", ",", "respectively", ".", "Data", "analysis", "CBF", "in", "ml", "·", "100", "ml", "−", "1", "·", "minute", "−", "1", "was", "calculated", "as", "described", "previously", "-LSB-", "25", "-RSB-", "and", "values", "from", "minute", "3.5", "until", "7", "were", "averaged", "to", "calculate", "CBF", "for", "each", "HUT", "position", ".", "Doppler", "ultrasound", "measurements", "were", "analyzed", "as", "described", "before", "-LSB-", "8", "-RSB-", "to", "obtain", "superficial", "femoral", "artery", "blood", "flow", ".", "To", "compare", "CBF", "measurements", "with", "superficial", "femoral", "artery", "blood", "flow", ",", "CBF", "measurements", "in", "ml", "·", "100", "ml", "−", "1", "minutes", "−", "1", "were", "multiplied", "by", "lower", "leg", "volume", "-LRB-", "ml", "-RRB-", "as", "measured", "by", "water", "displacement", ".", "Statistics", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "standard", "deviation", "-LRB-", "SD", "-RRB-", ".", "The", "results", "of", "each", "method", "were", "correlated", "and", "agreement", "evaluated", "according", "to", "the", "method", "described", "by", "Bland", "and", "Altman", "-LSB-", "5", "-RSB-", ".", "The", "limits", "of", "agreement", "are", "defined", "as", "the", "mean", "of", "the", "relative", "differences", "between", "the", "two", "methods", "±", "2", "SD", ".", "Student", "'s", "t-test", "was", "used", "to", "test", "for", "systemic", "differences", "between", "the", "two", "methods", ".", "Reproducibility", "of", "the", "CBF", "was", "assessed", "by", "calculating", "the", "coefficient", "of", "variance", "-LRB-", "CV", "-RRB-", "from", "two", "measurements", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "To", "determine", "whether", "hemodynamic", "responses", "were", "dependent", "on", "the", "angle", "of", "tilt", "one-way", "repeated", "measures", "ANOVA", "'s", "were", "applied", ".", "If", "significant", "effects", "of", "tilt", "were", "observed", "post-hoc", "paired", "t-tests", "with", "Bonferroni", "correction", "for", "multiple", "testing", "were", "used", ".", "A", "P-value", "of", "<", "0.05", "was", "considered", "to", "indicate", "significance", ".", "Results", "In", "five", "volunteers", ",", "CBF", "could", "not", "be", "measured", "during", "70", "°", "head-up", "tilt", "-LRB-", "HUT", "-RRB-", ",", "due", "to", "a", "poor", "plethysmography", "signal", "or", "near", "fainting", "of", "the", "subject", ".", "Hemodynamic", "responses", "to", "HUT", "-LRB-", "Figure", "1", "-RRB-", "CBF", "and", "superficial", "femoral", "artery", "blood", "flow", "-LRB-", "BF", "SFA", "-RRB-", "decreased", "significantly", "from", "supine", "to", "30", "°", "with", "no", "further", "decrease", "with", "increasing", "tilt", "angle", "-LRB-", "Figure", "1", "-RRB-", ".", "The", "relative", "decrease", "in", "CBF", "-LRB-", "46", "%", "±", "11", "%", "-RRB-", "from", "supine", "to", "30", "°", "was", "significantly", "larger", "than", "the", "decrease", "in", "BF", "SFA", "-LRB-", "40", "%", "±", "12", "%", "-RRB-", "-LRB-", "P", "<", "0.001", "-RRB-", ".", "Fig.", "1Absolute", "values", "of", "calf", "blood", "flow", "-LRB-", "CBF", "-RRB-", "measured", "with", "venous", "occlusion", "plethysmography", "and", "superficial", "femoral", "artery", "blood", "flow", "-LRB-", "BF", "SFA", "-RRB-", ",", "heart", "rate", "-LRB-", "HR", "-RRB-", "and", "mean", "arterial", "pressure", "-LRB-", "MAP", "-RRB-", "during", "supine", "position", ",", "30", "°", ",", "45", "°", ",", "and", "70", "°", "HUT", ".", "One-way", "repeated", "measures", "ANOVA", "showed", "a", "significant", "effect", "of", "tilt", "for", "all", "parameters", ".", "*", "P", "<", "0.05", "and", "indicates", "significantly", "different", "from", "the", "position", "before", ".", "■", "=", "supine", ";", "=", "30", "°", "HUT", ";", "=", "45", "°", "HUT", ";", "□", "=", "70", "°", "HUT", "Agreement", "VOP", "and", "DU", "The", "Pearson", "correlation", "between", "the", "two", "methods", "was", "0.86", "-LRB-", "P", "<", "0.001", "-RRB-", "for", "all", "data", "points", "-LRB-", "Figure", "2", "-RRB-", ".", "The", "agreement", "between", "the", "two", "methods", "was", "evaluated", "by", "plotting", "the", "relative", "difference", "in", "each", "measurement", "against", "the", "mean", "for", "all", "data", "points", "and", "separated", "for", "the", "different", "tilt", "angles", "-LRB-", "Figure", "3", "-RRB-", ".", "The", "relative", "mean", "difference", "-LRB-", "-LRB-", "VOP", "--", "DU", "-RRB-", "/", "DU", "-RRB-", "was", "−", "14", "%", "±", "22", "%", "for", "all", "data", "points", "in", "supine", "position", "and", "HUT", "indicating", "that", "overall", "CBF", "-LRB-", "VOP", "-RRB-", "is", "lower", "than", "BF", "SFA", "-LRB-", "DU", "-RRB-", ";", "for", "supine", "position", "the", "relative", "mean", "difference", "between", "VOP", "and", "DU", "was", "1.5", "%", "±", "24", "%", ";", "for", "30", "°", ":", "−", "13", "%", "±", "23", "%", ";", "for", "45", "°", ":", "−", "23", "%", "±", "19", "%", ";", "for", "70", "°", ":", "−", "23", "%", "±", "15", "%", ".", "Limits", "of", "agreement", "for", "all", "data", "points", "in", "supine", "position", "and", "during", "HUT", "were", "−", "58", "%", "to", "31", "%", "and", "became", "smaller", "during", "HUT", ".", "The", "limits", "of", "agreement", "are", "reasonable", ",", "although", "CBF", "during", "HUT", "is", "lower", "than", "BF", "SFA", ".", "Fig.", "2Blood", "flow", "in", "the", "superficial", "femoral", "artery", "-LRB-", "BF", "SFA", "-RRB-", "measured", "by", "Doppler", "ultraound", "during", "different", "angles", "of", "head-up", "tilt", "versus", "calf", "blood", "flow", "-LRB-", "CBF", "-RRB-", "measured", "by", "venous", "occlusion", "plethysmography", "corrected", "for", "lower", "leg", "volume", ".", "Pearson", "correlation", "coefficient", "is", "0.86", "Fig.", "3Relative", "difference", "between", "the", "blood", "flow", "measured", "by", "venous", "occlusion", "plethysmography", "-LRB-", "VOP", "-RRB-", "and", "the", "superficial", "femoral", "artery", "blood", "flow", "measured", "by", "Doppler", "ultrasound", "-LRB-", "DU", "-RRB-", "versus", "the", "mean", "of", "both", "flow", "for", "each", "individual", "subject", "at", "different", "tilt", "angles", "Reproducibility", "of", "VOP", "during", "head-up", "tilt", "The", "coefficient", "of", "variation", "-LRB-", "CV", "-RRB-", "of", "CBF", "ranged", "between", "8.7", "%", "and", "15.0", "%", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "In", "70", "°", "HUT", ",", "the", "CV", "for", "both", "parameters", "was", "calculated", "over", "four", "subjects", "only", ".", "Table", "2Values", "of", "calf", "blood", "flow", "-LRB-", "n", "=", "9", "-RRB-", "SubjectSupine30", "°", "HUT45", "°", "HUT70", "°", "HUT", "-LRB-", "n", "=", "4", "-RRB-", "test", "1test", "2test", "1test", "2test", "1test", "2test", "1test", "2Mean", "±", "SD2", ".6", "±", "0.62.6", "±", "0.81.3", "±", "0.31.3", "±", "0.3", "1.1", "±", "0.31.1", "±", "0.21.1", "±", "0.2", "n", "=", "41.2", "±", "0.2", "n", "=", "4", "%", "change", "±", "SD", "−", "45", "±", "11", "−", "49", "±", "12", "−", "54", "±", "11", "−", "57", "±", "13", "−", "44", "±", "17", "−", "44", "±", "14CV15", ".0", "%", "-LRB-", "CI", "10.1", "--", "29.1", "-RRB-", "11.0", "%", "-LRB-", "CI", "7.4", "--", "21.3", "-RRB-", "14.9", "%", "-LRB-", "CI", "10.0", "--", "28.9", "-RRB-", "8.7", "%", "-LRB-", "CI", "4.9", "--", "33.2", "-RRB-", "Values", "of", "calf", "blood", "flow", "in", "ml", "·", "100", "ml", "−", "1", "·", "minute", "−", "1", "and", "mean", "absolute", "and", "relative", "data", "±", "SD", "in", "supine", "position", ",", "30", "°", ",", "45", "°", ",", "and", "70", "°", "head-up", "tilt", "-LRB-", "HUT", "-RRB-", "for", "the", "first", "and", "second", "test", ".", "Coefficients", "of", "Variation", "-LRB-", "CV", "-RRB-", ".", "Missing", "data", "in", "70", "°", "HUT", "are", "due", "to", "near", "fainting", "or", "a", "poor", "plethysmography", "signal", ".", "Discussion", "Calf", "blood", "flow", "-LRB-", "CBF", "-RRB-", "measured", "with", "VOP", "correlates", "well", "with", "superficial", "femoral", "artery", "blood", "flow", "-LRB-", "BF", "SFA", "-RRB-", "measured", "with", "DU", ",", "and", "can", "be", "measured", "reproducibly", "during", "HUT", ".", "Since", "the", "most", "profound", "changes", "in", "blood", "flow", "with", "both", "techniques", "were", "already", "measured", "in", "30", "°", "HUT", ",", "and", "the", "increase", "in", "hydrostatic", "and", "venous", "pressure", ",", "and", "concomitant", "technical", "difficulties", "are", "smallest", "from", "supine", "to", "30", "°", "HUT", "we", "recommend", "to", "use", "VOP", "for", "leg", "blood", "flow", "measurements", "during", "HUT", "up", "to", "30", "°", ".", "The", "decrease", "in", "leg", "blood", "flow", "assessed", "with", "VOP", "and", "DU", ",", "is", "comparable", "to", "tilt-induced", "blood", "flow", "changes", "in", "other", "studies", "using", "DU", "-LRB-", "33", "%", "--", "59", "%", "-RRB-", "-LSB-", "2", ",", "7", ",", "10", ",", "11", "-RSB-", ".", "The", "strong", "relationship", "between", "VOP", "and", "DU", "blood", "flow", "measurements", "in", "the", "present", "study", "is", "in", "line", "with", "previous", "studies", "reporting", "correlation", "coefficients", "varying", "from", "0.57", "to", "0.99", "at", "rest", "and", "during", "exercise", "-LSB-", "14", ",", "16", ",", "27", "-RSB-", ".", "Head-up", "tilt", "affects", "muscle", "blood", "flow", "more", "than", "skin", "blood", "flow", "-LSB-", "21", ",", "28", "-RSB-", ".", "Since", "skin", "blood", "flow", "contributes", "more", "to", "superficial", "femoral", "blood", "flow", "than", "to", "calf", "blood", "flow", ",", "this", "may", "explain", "the", "observed", "discrepancy", "between", "the", "decrease", "in", "CBF", "-LRB-", "∼", "48", "%", "-RRB-", "versus", "the", "decrease", "in", "superficial", "femoral", "artery", "blood", "flow", "-LRB-", "∼", "40", "%", "-RRB-", "in", "response", "to", "HUT", ".", "Reproducibility", "of", "baseline", "CBF", "-LRB-", "15.0", "%", "-RRB-", "is", "in", "range", "with", "other", "studies", "using", "similar", "techniques", "to", "measure", "leg", "blood", "flow", "-LSB-", "1", ",", "18", ",", "25", "-RSB-", ".", "The", "coefficient", "of", "variation", "of", "CBF", "during", "HUT", "was", "even", "better", "-LRB-", "11.0", "%", "--", "17.9", "%", "-RRB-", ",", "which", "indicates", "that", "VOP", "is", "a", "reproducible", "tool", "to", "measure", "tilt-induced", "vasoconstriction", "repetitively", ".", "The", "low", "coefficients", "of", "variation", "of", "CBF", "during", "70", "°", "-LRB-", "8.7", "%", "--", "8.9", "%", "-RRB-", "are", "not", "representative", "since", "these", "coefficients", "of", "variation", "were", "calculated", "over", "no", "more", "than", "4", "subjects", ".", "Not", "all", "subjects", "were", "able", "to", "abstain", "from", "moving", "their", "legs", "in", "70", "°", "HUT", "position", ",", "and", "some", "subjects", "fainted", "in", "this", "position", ".", "Moreover", ",", "the", "quality", "of", "the", "plethysmographic", "tracing", "became", "worse", "at", "70", "°", "HUT", "whereas", "at", "the", "lower", "tilt", "angles", "the", "plethysmography", "signal", "is", "of", "good", "quality", "indicated", "by", "the", "volume", "pulsations", "in", "the", "plethysmographic", "tracing", "for", "the", "period", "of", "venous", "occlusion", ".", "Our", "data", "and", "previous", "studies", "-LSB-", "15", ",", "19", ",", "20", ",", "26", "-RSB-", "show", "that", "at", "30", "°", "HUT", "peripheral", "vascular", "responses", "are", "accomplished", "to", "a", "large", "extent", ".", "The", "increase", "in", "hydrostatic", "pressure", "and", "concomitant", "increase", "in", "venous", "pressure", "is", "low", "at", "30", "°", ".", "From", "Figure", "4B", "it", "can", "be", "concluded", "that", "at", "30", "°", "HUT", "venous", "compliance", "is", "still", "at", "the", "steep", "portion", "of", "the", "venous", "compliance", "curve", "whereas", "during", "45", "°", ",", "and", "70", "°", "HUT", "the", "venous", "compliance", "has", "shifted", "to", "the", "non-linear", "part", ".", "At", "30", "°", "HUT", "increase", "of", "the", "plethysmography", "signal", "during", "venous", "occlusion", "is", "linear", "while", "at", "45", "°", "and", "70", "°", "HUT", ",", "venous", "distensibility", "is", "reduced", "and", "consequently", "results", "in", "a", "non-linear", "increase", "in", "leg", "volume", "during", "inflation", "of", "the", "venous", "occlusion", "cuffs", ",", "which", "is", "illustrated", "in", "Figure", "5", ".", "We", "therefore", "recommend", "using", "VOP", "at", "30", "°", "HUT", ".", "For", "studies", "focussing", "on", "syncope", "at", "the", "endpoint", "of", "HUT", ",", "which", "requires", "larger", "tilt", "angles", ",", "other", "techniques", "to", "measure", "leg", "blood", "flow", "should", "be", "used", ".", "Fig.", "4", "-LRB-", "A", "-RRB-", "Pressure-Volume", "curve", "and", "-LRB-", "B", "-RRB-", "Pressure", "Compliance", "curve", "based", "on", "data", "of", "a", "similar", "group", "of", "volunteers", "measured", "by", "venous", "occlusion", "plethysmography", "at", "different", "cuff", "occlusion", "pressures", "-LRB-", "for", "method", "and", "protocol", "see", "de", "Groot", "et", "al.", ",", "Journal", "of", "applied", "Physiology", ",", "2005", "-RRB-", ".", "The", "increases", "in", "calf", "volume", "in", "response", "to", "30", "°", ",", "45", "°", ",", "and", "70", "°", "HUT", "are", "marked", "by", "the", "dotted", "lines", "in", "the", "pressure", "volume", "curve", "-LRB-", "A", "-RRB-", ".", "The", "different", "tilting", "angles", "correspond", "with", "different", "venous", "pressures", "-LRB-", "x-axis", "-RRB-", ".", "Transferring", "these", "venous", "pressures", "into", "the", "pressure-compliance", "curve", "-LRB-", "B", "-RRB-", "clearly", "demonstrate", "that", "during", "30", "°", "HUT", "venous", "compliance", "is", "still", "on", "the", "steep", "linear", "part", "of", "the", "curve", ",", "whereas", "during", "45", "°", ",", "and", "70", "°", "HUT", "the", "venous", "compliance", "is", "compromisedFig", ".", "5Typical", "plethysmographic", "tracing", "of", "one", "individual", "subject", "during", "a", "complete", "experiment", ".", "Blood", "flow", "measurements", "at", "30", "°", "HUT", "start", "when", "the", "plethysmography", "signal", "does", "not", "change", "anymore", ",", "meaning", "that", "venous", "volume", "reached", "a", "steady", "state", "situation", ".", "Besides", ",", "looking", "at", "a", "typical", "VOP", "tracing", "at", "30", "°", "HUT", ",", "the", "increase", "in", "venous", "volume", "is", "linear", "during", "the", "first", "5", "seconds", "of", "cuff", "inflation", ",", "indicating", "that", "blood", "flow", "measurements", "using", "VOP", "during", "30", "°", "HUT", "are", "not", "compromised", "by", "a", "decrease", "in", "venous", "compliance", "Limitation", "Using", "VOP", ",", "blood", "flow", "is", "defined", "as", "limb", "volume", "changes", "over", "time", ".", "During", "HUT", ",", "when", "the", "leg", "is", "below", "heart", "level", ",", "volume", "changes", "can", "still", "be", "measured", "using", "VOP", ",", "however", ",", "the", "physiological", "determinants", "of", "these", "volume", "changes", "are", "complex", "and", "it", "is", "no", "longer", "possible", "to", "say", "with", "reasonable", "certainty", "that", "a", "change", "in", "volume", "over", "time", ",", "which", "most", "likely", "reflects", "flow", ",", "is", "determined", "by", "resistance", "vessel", "tone", ".", "For", "example", ",", "limb", "blood", "flow", "measured", "using", "VOP", "in", "HUT", "position", "can", "decrease", "due", "to", "an", "increase", "in", "venous", "pressure", ",", "as", "a", "result", "of", "venous", "congestion", "and", "the", "associated", "fall", "in", "arterio-venous", "pressure", "gradient", ",", "without", "any", "increase", "in", "resistance", "at", "the", "arteriolar", "level", ".", "In", "conclusion", ",", "this", "study", "demonstrates", "that", "CBF", "measured", "by", "VOP", "during", "HUT", "is", "suitable", "and", "reproducible", ".", "The", "method", "is", "easy", "applicable", "and", "recommended", "in", "tilt", "angles", "equal", "to", "30", "°", "to", "avoid", "high", "hydrostatic", "and", "leg", "venous", "pressures", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Pten", "-LRB-", "phosphatase", "and", "tensin", "homologue", "gene", "-RRB-", "haploinsufficiency", "promotes", "insulin", "hypersensitivity", "Aims/hypothesis", "Insulin", "controls", "glucose", "metabolism", "via", "multiple", "signalling", "pathways", ",", "including", "the", "phosphatidylinositol", "3-kinase", "-LRB-", "PI3K", "-RRB-", "pathway", "in", "muscle", "and", "adipose", "tissue", ".", "The", "protein/lipid", "phosphatase", "Pten", "-LRB-", "phosphatase", "and", "tensin", "homologue", "deleted", "on", "chromosome", "10", "-RRB-", "attenuates", "PI3K", "signalling", "by", "dephosphorylating", "the", "phosphatidylinositol", "3,4,5-trisphosphate", "generated", "by", "PI3K", ".", "The", "current", "study", "was", "aimed", "at", "investigating", "the", "effect", "of", "haploinsufficiency", "for", "Pten", "on", "insulin-stimulated", "glucose", "uptake", ".", "Introduction", "Type", "2", "diabetes", "mellitus", "is", "a", "multifactorial", "disease", "with", "a", "complex", "pathophysiology", "that", "includes", "defects", "in", "insulin", "production", "and", "a", "failure", "in", "peripheral", "tissues", "to", "take", "up", "glucose", "in", "response", "to", "insulin", ".", "Signalling", "via", "phosphatidylinositol", "3-kinase", "-LRB-", "PI3K", "-RRB-", "is", "a", "key", "pathway", "in", "the", "regulation", "of", "glucose", "uptake", "by", "insulin", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "Activation", "of", "PI3K", "via", "insulin", "receptor", "substrate-1", "causes", "PI3K", "to", "phosphorylate", "inositol-containing", "phospholipids", "at", "the", "3", "′", "-", "position", "of", "the", "inositol", "ring", ",", "increasing", "the", "levels", "of", "the", "lipid", "messenger", "phosphatidylinositol", "3,4,5-trisphosphate", "-LRB-", "PIP3", "-RRB-", ",", "among", "others", ".", "PIP3", "activate", "a", "phosphoinositide", "kinases", ",", "which", "in", "turn", "phosphorylate", "and", "activate", "protein", "kinase", "B", "-LRB-", "PKB", "-RRB-", ",", "also", "known", "as", "Akt", ",", "a", "key", "effector", "kinase", "for", "many", "of", "the", "downstream", "metabolic", "effects", "initiated", "by", "insulin", "via", "PI3K", ".", "The", "phosphatase", "and", "tensin", "homologue", "-LRB-", "PTEN", "-RRB-", "is", "a", "phosphatase", "which", "recognises", "both", "protein", "and", "lipid", "substrates", ".", "As", "a", "lipid", "phosphatase", ",", "PTEN", "dephosphorylates", "PIP3", "at", "the", "3", "′", "-", "position", "of", "the", "inositol", "ring", ",", "thereby", "acting", "as", "an", "antagonist", "to", "PI3K", "signalling", "-LSB-", "2", ",", "3", "-RSB-", ".", "PTEN", "was", "originally", "identified", "as", "a", "tumour", "suppressor", "gene", ",", "and", "is", "one", "of", "the", "most", "commonly", "mutated", "genes", "in", "human", "cancer", "-LSB-", "4", "--", "6", "-RSB-", ".", "Mutation", "or", "deletion", "of", "PTEN", "has", "been", "identified", "in", "many", "cancers", "including", "prostate", ",", "brain", ",", "breast", ",", "endometrium", "and", "skin", "-LSB-", "4", "--", "8", "-RSB-", ".", "As", "many", "of", "the", "metabolic", "outcomes", "of", "insulin", "are", "achieved", "through", "recruitment", "of", "PI3K", "and", "the", "subsequent", "rise", "in", "PIP3", "levels", ",", "PTEN", "may", "have", "a", "critical", "role", "in", "modulating", "sensitivity", "to", "insulin-stimulated", "glucose", "uptake", ".", "Recent", "studies", "in", "which", "Pten", "was", "ablated", "specifically", "in", "liver", ",", "adipose", "tissue", "and", "muscle", "in", "mice", "by", "Cre", "recombinase-based", "strategies", "have", "shown", "a", "role", "for", "Pten", "in", "the", "regulation", "of", "insulin", "sensitivity", "in", "those", "organs", ",", "and", "highlighted", "the", "contributions", "of", "those", "organs", "to", "glucose", "homeostasis", "of", "the", "whole", "animal", "-LSB-", "9", "--", "11", "-RSB-", ".", "However", ",", "the", "effect", "of", "global", "reduction", "of", "Pten", "levels", "on", "glucose", "uptake", "and", "metabolism", "has", "not", "yet", "been", "shown", "in", "an", "in", "vivo", "mouse", "model", ".", "Unfortunately", ",", "experimental", "genetic", "inactivation", "of", "both", "Pten", "alleles", "-LRB-", "Pten", "−", "/", "−", "-RRB-", "results", "in", "early", "embryonic", "lethality", "-LSB-", "6", ",", "12", "-RSB-", ".", "Thus", "mice", "harbouring", "inactivation", "of", "one", "Pten", "allele", "-LRB-", "haploinsufficiency", ",", "Pten", "+", "/", "−", "-RRB-", "are", "an", "important", "experimental", "model", "for", "studying", "the", "role", "of", "Pten", "in", "vivo", ".", "Haploinsufficiency", "for", "Pten", "has", "important", "consequences", "for", "cell", "proliferation", "and", "tumorigenesis", "in", "mice", "-LSB-", "6", ",", "12", "--", "14", "-RSB-", ".", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "exhibit", "defective", "apoptosis", "in", "T", "cells", ",", "B", "cells", "and", "macrophages", "and", "spontaneous", "neoplasms", "in", "various", "tissues", "including", "prostate", ",", "liver", ",", "endometrium", "and", "others", "-LSB-", "12", "--", "14", "-RSB-", ".", "Here", "we", "show", "that", "Pten", "haploinsufficiency", "results", "in", "insulin", "hypersensitivity", "and", "enhanced", "insulin-mediated", "glucose", "uptake", ".", "Materials", "and", "methods", "Experimental", "animals", "All", "laboratory", "animals", "were", "cared", "for", "and", "used", "according", "to", "guidelines", "of", "the", "Canadian", "Council", "on", "Animal", "Care", ".", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "were", "generated", "by", "R.", "Parsons", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "These", "mice", "were", "backcrossed", "with", "C57BL6", "mice", "for", "more", "than", "ten", "generations", ".", "The", "genotypes", "of", "the", "mice", "were", "determined", "as", "described", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "Blood", "glucose", "determination", "For", "determination", "of", "blood", "glucose", "levels", ",", "glucose", "levels", "in", "blood", "samples", "taken", "from", "tail", "vein", "were", "determined", "using", "a", "One", "Touch", "Ultra", "blood", "glucose", "monitor", "-LRB-", "LifeScan", "Inc.", ",", "Milpitas", ",", "CA", ",", "USA", "-RRB-", ".", "For", "the", "glucose", "tolerance", "test", ",", "mice", "were", "fasted", "overnight", "-LRB-", "15", "h", "-RRB-", "prior", "to", "i.p.", "injection", "of", "glucose", "-LRB-", "2", "mg/g", "body", "weight", "-RRB-", ".", "Blood", "glucose", "levels", "were", "then", "determined", "at", "the", "indicated", "time-points", "following", "glucose", "injection", ".", "For", "the", "insulin", "challenge", "test", ",", "mice", "were", "fasted", "for", "15", "h", "prior", "to", "i.p.", "injection", "of", "0.6", "mU", "insulin/g", "body", "weight", ".", "Blood", "glucose", "levels", "were", "then", "determined", "at", "the", "indicated", "time-points", "following", "insulin", "injection", ".", "Determination", "of", "insulin", "in", "plasma", "Mice", "were", "fasted", "for", "15", "h", ",", "then", "approximately", "100", "μl", "of", "blood", "was", "collected", "from", "the", "tail", "vein", "using", "pipette", "tips", "precoated", "with", "heparin", ".", "The", "mice", "were", "then", "injected", "i.p.", "with", "2", "mg", "glucose/g", "body", "weight", ",", "and", "a", "second", "blood", "sample", "was", "obtained", "15", "min", "following", "injection", ".", "The", "blood", "samples", "were", "centrifuged", "at", "805", "g", "in", "a", "table-top", "centrifuge", ",", "and", "insulin", "in", "the", "plasma", "fraction", "was", "determined", "using", "an", "insulin", "ELISA", "system", "-LRB-", "ALPCO", "Diagnostics", ",", "Salem", ",", "NH", ",", "USA", "-RRB-", "according", "to", "the", "manufacturer", "'s", "instructions", ".", "Isolation", "of", "pancreatic", "islets", "and", "glucose-stimulated", "insulin", "release", "Islets", "were", "isolated", "from", "pancreata", "of", "mice", "as", "described", "-LSB-", "15", "-RSB-", ".", "Pancreata", "from", "three", "mice", "were", "pooled", ".", "After", "24", "h", "in", "culture", ",", "islets", "were", "preincubated", "in", "Krebs", "--", "Ringer", "bicarbonate", "buffer", "plus", "0.1", "%", "BSA", "-LRB-", "KRBB-BSA", "-RRB-", "and", "1.67", "mmol/l", "glucose", ".", "The", "islet", "cells", "were", "incubated", "for", "1", "h", "in", "1", "ml", "KRBB-BSA", "containing", "the", "desired", "concentration", "of", "glucose", "-LRB-", "1.67", "or", "16.7", "mmol/l", "-RRB-", ".", "The", "incubation", "medium", "was", "then", "collected", ",", "and", "centrifuged", "and", "the", "supernatant", "fractions", "were", "used", "for", "assay", "of", "insulin", "content", "by", "ELISA", ".", "Total", "extractable", "insulin", "in", "islets", "was", "determined", "by", "adding", "0.5", "ml", "lysis", "buffer", "-LRB-", "1", "mol/l", "acetic", "acid", "with", "0.1", "%", "BSA", "-RRB-", "to", "the", "islet", "pellet", ".", "Cell", "debris", "was", "pelleted", "by", "centrifugation", ",", "and", "the", "supernatant", "fraction", "was", "used", "for", "insulin", "assay", ".", "Fluorescent", "immunohistochemistry", "of", "pancreatic", "islets", "Immunocytochemistry", "has", "been", "described", "-LSB-", "16", "-RSB-", ".", "Pancreata", "from", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "were", "embedded", "in", "paraffin", ".", "Five-micron", "sections", "were", "incubated", "for", "1", "h", "at", "room", "temperature", "with", "guinea-pig", "anti-insulin", "antibody", "-LRB-", "1:100", "dilution", ";", "Dako", ",", "Mississagua", ",", "ON", ",", "Canada", "-RRB-", "and", "rabbit", "anti-glucagon", "antibody", "-LRB-", "Dako", ";", "1:75", "dilution", "-RRB-", ".", "Sections", "were", "visualised", "by", "incubation", "with", "Alexa", "--", "Fluor", "488", "goat", "anti-guinea-pig", "-LRB-", "Invitrogen", ",", "Molecular", "Probes", ",", "Burlington", ",", "ON", ",", "Canada", ";", "1:100", "dilution", "-RRB-", "and", "Texas", "Red", "donkey", "anti-rabbit", "antibodies", "-LRB-", "Jackson", "ImmunoResearch", "Laboratories", ",", "West", "Grove", ",", "PA", ",", "USA", ";", "1:100", "dilution", "-RRB-", ".", "Sections", "were", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Beta", "cell", "mass", "calculation", "Following", "insulin", "immunostaining", ",", "pancreatic", "sections", "were", "captured", "under", "an", "FITC", "filter", "using", "a", "Zeiss", "Axioplan", "2", "microscope", "equipped", "for", "epifluorescence", "and", "Pathvysion", "imaging", "software", ".", "The", "insulin", "immunopositive", "area", "-LRB-", "as", "a", "proportion", "of", "pancreatic", "area", "-RRB-", "was", "determined", "in", "at", "least", "six", "fields", "per", "section", "using", "Zeiss", "AxioVision", "software", ",", "performed", "on", "eight", "pancreatic", "sections", "per", "mouse", ".", "Beta", "cell", "mass", "was", "calculated", "as", "pancreatic", "mass", "times", "the", "percent", "beta", "cell", "area", "for", "each", "mouse", ".", "2", "-", "-LSB-", "18F", "-RSB-", "fluoro-2-deoxyglucose", "uptake", "and", "microPET", "scanning", "Mice", "were", "fasted", "for", "15", "h", "prior", "to", "i.p.", "injection", "with", "0.6", "mU", "insulin/g", "body", "weight", ".", "Twenty", "minutes", "after", "insulin", "injection", ",", "mice", "were", "injected", "with", "2", "-", "-LSB-", "18F", "-RSB-", "fluoro-2-deoxyglucose", "-LRB-", "18FDG", "-RRB-", "-LRB-", "4.1", "MBq", "-RRB-", "via", "the", "tail", "vein", ",", "and", "whole-body", "distribution", "of", "18FDG", "was", "monitored", "by", "positron", "emission", "tomography", "-LRB-", "PET", "-RRB-", "using", "a", "microPET", "R4", "tomograph", "-LRB-", "Concorde", "Microsystems", ",", "Knoxville", ",", "TN", ",", "USA", "-RRB-", ".", "The", "image", "data", "were", "attenuation-corrected", "using", "a", "68Ge", "rod", "source", ".", "Wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "were", "positioned", "side-by-side", "and", "scanned", "simultaneously", "for", "60", "min", "after", "18FDG", "injection", ".", "Data", "were", "analysed", "using", "the", "manufacturer", "'s", "software", ",", "ASIPro", "VM", "5.0.1.0", ".", "For", "data", "analysis", ",", "regions", "of", "interest", "-LRB-", "ROIs", "-RRB-", "were", "specified", "in", "the", "coronal", "section", "of", "a", "hindlimb", "for", "each", "mouse", ".", "The", "18FDG", "activities", "in", "each", "ROI", "were", "summed", "across", "all", "coronal", "planes", ",", "and", "expressed", "as", "a", "proportion", "of", "18FDG", "in", "the", "whole", "mouse", "-LRB-", "total", "18FDG", "activity", "was", "also", "taken", "as", "the", "sum", "of", "activity", "across", "coronal", "planes", "-RRB-", ".", "Primary", "myocyte", "culture", "Primary", "myocytes", "were", "cultured", "from", "fore", "-", "and", "hindlimbs", "from", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "according", "to", "a", "protocol", "adapted", "from", "Springer", "et", "al.", "-LSB-", "17", "-RSB-", ".", "Skeletal", "muscle", "was", "excised", "and", "minced", "and", "then", "incubated", "at", "37", "°C", "for", "2", "h", "with", "2.4", "units/ml", "dispase", "II", ".", "Dispase", "digestion", "was", "halted", "by", "addition", "of", "10", "ml", "F-10-based", "myocyte", "medium", "-LRB-", "400", "ml", "F-10", "nutrient", "mixture", ",", "100", "ml", "fetal", "bovine", "serum", ",", "25", "μg", "basic", "fibroblast", "growth", "factor", ",", "penicillin/streptomycin", "-RRB-", ".", "The", "tissue", "slurry", "was", "then", "strained", "through", "a", "fine", "metal", "mesh", "and", "centrifuged", "at", "500", "g", "for", "5", "min", ".", "The", "supernatant", "fraction", "was", "removed", "to", "a", "fresh", "centrifuge", "tube", "and", "the", "pellet", "was", "resuspended", "and", "plated", "to", "a", "5-cm", "collagen-coated", "culture", "dish", "in", "a", "total", "of", "4", "ml", "F-10-based", "medium", ".", "The", "supernatant", "fraction", "was", "re-centrifuged", "and", "the", "pellet", "was", "pooled", "with", "the", "first", ".", "The", "cells", "were", "passaged", "when", "they", "reached", "70", "--", "80", "%", "confluence", ".", "To", "enrich", "for", "myocytes", ",", "the", "old", "medium", "was", "removed", "by", "aspiration", ",", "the", "cells", "washed", "with", "PBS", ",", "then", "incubated", "in", "a", "film", "of", "this", "buffer", "for", "15", "min", ".", "Myocytes", "were", "loosened", "from", "the", "dish", "by", "striking", "the", "dish", "several", "times", "sharply", "on", "the", "bench", "top", ".", "Cells", "were", "washed", "from", "the", "dish", "with", "PBS", ".", "The", "PBS", "incubation", "was", "repeated", "and", "the", "cells", "were", "pooled", ".", "Cells", "kept", "in", "culture", "for", "more", "than", "5", "--", "6", "days", "began", "to", "exhibit", "the", "elongated", "morphology", "typical", "of", "myotubes", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "Cells", "in", "these", "older", "cultures", "also", "exhibited", "spontaneous", "twitching", ".", "All", "experiments", "were", "performed", "with", "cells", "on", "days", "2", "--", "3", "of", "culture", ".", "2-Deoxy", "-LSB-", "3H", "-RSB-", "glucose", "uptake", "Experiments", "were", "performed", "on", "wild-type", "or", "Pten", "+", "/", "−", "cells", "from", "passage", "two", "to", "eight", ",", "grown", "on", "24-well", "-LRB-", "1-cm", "diameter", "wells", "-RRB-", "plates", ".", "Cells", "were", "preincubated", "in", "serum-free", "medium", "for", "12", "h", "prior", "to", "experiments", ".", "The", "cells", "were", "washed", "twice", "with", "HEPES-buffered", "saline", "-LRB-", "140", "mmol/l", "NaCl", ",", "20", "mmol/l", "HEPES", ",", "2.5", "mmol/l", "MgSO4", ",", "1", "mmol/l", "CaCl2", ",", "5", "mmol/l", "KCl", ",", "pH", "7.4", "-RRB-", ",", "then", "incubated", "with", "10", "μmol/l", "2-deoxy", "-LSB-", "3H", "-RSB-", "glucose", "-LRB-", "0.037", "MBq/ml", "-RRB-", "for", "5", ",", "10", ",", "20", "or", "30", "min", ",", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "0.1", "μmol/l", "insulin", ".", "At", "the", "end", "of", "the", "incubation", "period", ",", "the", "radioactive", "substrate", "was", "removed", ",", "and", "the", "cells", "were", "washed", "three", "times", "with", "ice-cold", "20", "mmol/l", "glucose", ".", "Cells", "were", "lysed", "with", "0.2", "ml", "2", "%", "SDS", ",", "and", "the", "lysates", "were", "used", "for", "scintillation", "counting", ".", "Non-specific", "diffusion", "of", "2-deoxy", "-LSB-", "3H", "-RSB-", "glucose", "was", "determined", "by", "incubating", "cells", "in", "the", "presence", "of", "2-deoxy", "-LSB-", "3H", "-RSB-", "glucose", "and", "10", "μmol/l", "cytochalasin", "B", ",", "a", "specific", "inhibitor", "of", "glucose", "uptake", "-LSB-", "19", "-RSB-", ".", "Determination", "of", "cell-surface", "GLUT1", "and", "GLUT4", "levels", "Primary", "myocytes", "were", "grown", "in", "10-cm", "culture", "dishes", ".", "The", "cells", "were", "rinsed", "with", "PBS", ",", "and", "incubated", "with", "0.5", "mg/ml", "sulpho-NHS-LC-biotin", "-LRB-", "Pierce", "Biotechnology", ",", "Rockford", ",", "IL", ",", "USA", "-RRB-", "in", "PBS", "for", "20", "min", ".", "Cells", "are", "impermeable", "to", "this", "reagent", "and", "it", "labels", "the", "amine", "groups", "of", "cell-surface", "proteins", ".", "Following", "the", "incubation", ",", "the", "cells", "were", "washed", "three", "times", "with", "PBS", ",", "then", "lysed", "with", "0.5", "ml", "lysis", "buffer", "-LRB-", "1", "%", "NP-40", ",", "150", "mmol/l", "NaCl", ",", "50", "mmol/l", "Tris", "pH", "7.5", ",", "including", "protease", "and", "phosphatase", "inhibitors", "-RRB-", ".", "Protein", "was", "quantified", "with", "a", "BCA", "protein", "assay", "kit", "-LRB-", "Pierce", "-RRB-", ".", "Streptavidin-agarose", "beads", "-LRB-", "Pierce", "-RRB-", "were", "pre-blocked", "by", "incubation", "with", "2", "%", "BSA", "in", "lysis", "buffer", ".", "Each", "sample", "-LRB-", "1.2", "mg", "protein", "-RRB-", "was", "incubated", "with", "the", "streptavidin", "beads", "-LRB-", "100", "μl", ",", "50", "%", "bead", "slurry", "-RRB-", "for", "1", "h", "at", "room", "temperature", ".", "The", "beads", "were", "washed", "five", "times", ",", "for", "30", "--", "60", "min", "each", "wash", ",", "using", "lysis", "buffer", "containing", "0.1", "%", "SDS", ".", "After", "the", "final", "wash", ",", "50", "μl", "SDS", "sample-loading", "buffer", "were", "added", ",", "and", "heated", "at", "95", "°C", "for", "10", "min", ",", "then", "vortexed", "to", "elute", "the", "biotinylated", "proteins", ".", "The", "proteins", "in", "the", "supernatant", "fractions", "were", "analysed", "by", "SDS-PAGE", ",", "then", "transferred", "to", "nitrocellulose", ".", "Proteins", "were", "probed", "using", "polyclonal", "antibodies", "against", "GLUT1", "and", "GLUT4", "-LRB-", "also", "known", "as", "SCLA2A1", "and", "SCLA2A4", ",", "respectively", "-RRB-", ".", "Western", "immunoblotting", "for", "PKB", ",", "phospho-PKB", "and", "phospho-glycogen", "synthase", "kinase", "3", "-LRB-", "GSK3", "-RRB-", "-", "α/β", "Total", "protein", "extracts", "of", "primary", "myocytes", "were", "prepared", "by", "lysing", "cells", "in", "NP-40-based", "lysis", "buffer", ".", "Thirty", "to", "fifty", "micrograms", "of", "protein", "per", "sample", "were", "analysed", "by", "SDS-PAGE", ",", "then", "transferred", "to", "nitrocellulose", ".", "Rabbit", "polyclonal", "anti-PKB", ",", "anti-phospho-PKB", "-LRB-", "Ser473", "-RRB-", "and", "anti-phospho-GSK3-α", "/", "β", "-LRB-", "Ser21/9", "-RRB-", "antibodies", "were", "obtained", "from", "Cell", "Signaling", "Technology", "-LRB-", "Beverly", ",", "MA", ",", "USA", "-RRB-", ".", "Mouse", "monoclonal", "anti-vinculin", "antibody", "was", "obtained", "from", "Sigma", "-LRB-", "St", "Louis", ",", "MO", ",", "USA", "-RRB-", ".", "Horseradish", "peroxidase-conjugated", "secondary", "antibodies", "were", "obtained", "from", "Dako", ".", "Protein", "bands", "were", "visualised", "using", "an", "enhanced", "chemiluminescence", "system", "and", "autoradiography", "by", "exposure", "to", "X-ray", "film", ".", "Statistical", "analysis", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "Student", "'s", "t", "test", ".", "Significance", "was", "assessed", "at", "the", "95", "%", "confidence", "level", ".", "Results", "As", "glucose", "metabolism", "may", "be", "altered", "due", "to", "a", "change", "in", "insulin", "sensitivity", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", ",", "blood", "glucose", "levels", "in", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "were", "determined", ".", "Slight", "but", "statistically", "significant", "hypoglycaemia", "was", "observed", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "during", "ad", "libitum", "feeding", "-LRB-", "11.3", "%", "lower", "blood", "glucose", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "-RRB-", "-LRB-", "Table", "1", "-RRB-", ".", "Fasting", "caused", "a", "drop", "in", "glucose", "levels", "in", "both", "groups", ",", "with", "slight", "but", "significant", "hypoglycaemia", "in", "the", "Pten", "+", "/", "−", "group", "-LRB-", "10.8", "%", "lower", "blood", "glucose", "-RRB-", "relative", "to", "wild-type", "mice", ".", "An", "insulin", "challenge", "test", "revealed", "hypersensitivity", "to", "insulin", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "-LRB-", "Fig.", "1a", "-RRB-", ".", "Following", "i.p.", "insulin", "injection", "-LRB-", "0.6", "mU/g", "body", "weight", "-RRB-", ",", "blood", "glucose", "levels", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "remained", "depressed", "at", "all", "time-points", "measured", "-LRB-", "up", "to", "120", "min", "-RRB-", ".", "In", "contrast", ",", "wild-type", "mice", "started", "to", "recover", "after", "30", "min", ",", "and", "glucose", "levels", "returned", "to", "fasting", "levels", "120", "min", "after", "injection", ".", "A", "glucose", "tolerance", "test", "showed", "that", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "had", "greater", "glucose", "tolerance", "than", "wild-type", "mice", "-LRB-", "Fig.", "1b", "-RRB-", ".", "After", "i.p.", "glucose", "injection", ",", "blood", "glucose", "levels", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "returned", "to", "fasting", "levels", "in", "less", "than", "60", "min", ",", "approximately", "twice", "as", "rapidly", "as", "in", "wild-type", "mice", ".", "Table", "1Blood", "glucose", "levels", "in", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "during", "ad", "libitum", "feeding", "and", "after", "a", "15-h", "fast", "Mean", "blood", "glucose", "±", "SD", "-LRB-", "mmol/l", "-RRB-", "p", "value", "-LRB-", "independent", "Student", "'s", "t", "test", "-RRB-", "Wild-typePten", "+", "/", "−", "Ad", "libitum", "feeding7", ".1", "±", "0.4", "-LRB-", "n", "=", "5", "-RRB-", "6.3", "±", "0.2", "-LRB-", "n", "=", "4", "-RRB-", "0.006", "Fasting6", ".5", "±", "0.3", "-LRB-", "n", "=", "5", "-RRB-", "5.8", "±", "0.3", "-LRB-", "n", "=", "5", "-RRB-", "0.008", "Fig.", "1Insulin", "hypersensitivity", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", ".", "a", "Insulin", "challenge", "test", ".", "Mice", "were", "fasted", "for", "15", "h", "prior", "to", "i.p.", "injection", "of", "insulin", "-LRB-", "0.6", "mU/g", "body", "weight", "-RRB-", ".", "Blood", "glucose", "levels", "were", "determined", "at", "the", "indicated", "times", ".", "Means", "±", "SEM", "for", "six", "wild-type", "mice", "-LRB-", "white", "circles", "-RRB-", "and", "six", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "-LRB-", "black", "circles", "-RRB-", ".", "b", "Glucose", "tolerance", "test", ".", "Mice", "were", "fasted", "for", "15", "h", "prior", "to", "i.p.", "injection", "of", "glucose", "at", "2", "mg/g", "body", "weight", ".", "Means", "±", "SEM", "for", "six", "wild-type", "mice", "-LRB-", "white", "circles", "-RRB-", "and", "seven", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "-LRB-", "black", "circles", "-RRB-", "The", "observed", "difference", "in", "ability", "to", "normalise", "blood", "glucose", "levels", "could", "be", "due", "to", "differences", "in", "insulin", "sensitivity", "or", "islet", "function", "and", "insulin", "production", ".", "We", "therefore", "investigated", "insulin", "levels", "in", "the", "mice", ",", "as", "well", "as", "properties", "of", "pancreatic", "cell", "morphology", "and", "function", ".", "Fasting", "plasma", "insulin", "levels", "were", "slightly", "but", "significantly", "lower", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ",", "which", "is", "consistent", "with", "increased", "peripheral", "insulin", "sensitivity", ".", "Fifteen", "minutes", "after", "i.p.", "glucose", "administration", "-LRB-", "2", "mg", "glucose/g", "body", "weight", "-RRB-", ",", "similar", "increases", "in", "plasma", "insulin", "were", "observed", "in", "the", "two", "groups", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ",", "suggesting", "that", "there", "is", "no", "marked", "difference", "in", "insulin", "production", "in", "the", "Pten", "+", "/", "−", "mice", ".", "Insulin", "released", "from", "islets", "isolated", "from", "Pten", "+", "/", "+", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "was", "also", "examined", ".", "Islets", "were", "cultured", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", ",", "and", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "low", "-LRB-", "1.67", "mmol/l", "-RRB-", "or", "high", "-LRB-", "16.7", "mmol/l", "-RRB-", "glucose", ".", "Insulin", "released", "into", "the", "medium", "was", "determined", "by", "ELISA", "and", "calculated", "as", "percentage", "of", "total", "insulin", "content", "in", "the", "islets", ".", "Per", "cent", "of", "total", "insulin", "release", "-LRB-", "presented", "as", "mean", "value", "±", "SD", "-RRB-", "was", "similar", "under", "conditions", "of", "low", "glucose", "-LRB-", "Pten", "+", "/", "+", ",", "3.3", "±", "0.4", "%", "vs", "Pten", "+", "/", "−", ",", "2.8", "±", "0.3", "%", ";", "p", ">", "0.05", "no", "significant", "difference", ",", "n", "=", "3", "per", "group", "-RRB-", "and", "high", "glucose", "-LRB-", "Pten", "+", "/", "+", ",", "4.2", "±", "0.7", "%", "vs", "Pten", "+", "/", "−", ",", "3.7", "±", "0.2", "%", ";", "p", ">", "0.05", "no", "significant", "difference", ",", "n", "=", "3", "per", "group", "-RRB-", ".", "Table", "2Plasma", "insulin", "levels", "in", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "after", "fasting", ",", "and", "15", "min", "after", "i.p.", "glucose", "administration", "-LRB-", "2", "mg", "glucose/g", "body", "weight", "-RRB-", "Mean", "plasma", "insulin", "±", "SD", "-LRB-", "ng/ml", "-RRB-", "p", "value", "-LRB-", "independent", "Student", "'s", "t", "test", "-RRB-", "Wild-type", "-LRB-", "n", "=", "7", "-RRB-", "Pten", "+", "/", "−", "-LRB-", "n", "=", "6", "-RRB-", "Fasting0", ".50", "±", "0.040.36", "±", "0.100.05Post-glucose", "challenge1", ".8", "±", "0.52.4", "±", "0.4", ">", "0.05", "-LRB-", "not", "significant", "-RRB-", "Immunofluorescence", "of", "pancreatic", "sections", "revealed", "similar", "morphology", "of", "islets", "of", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "-LRB-", "Fig.", "2", "-RRB-", ",", "suggesting", "Pten", "haploinsufficiency", "has", "no", "marked", "effect", "on", "islet", "morphology", ".", "Accordingly", ",", "beta", "cell", "mass", "was", "not", "found", "to", "be", "significantly", "different", "between", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "-LRB-", "Table", "3", "-RRB-", ".", "Fig.", "2Pancreatic", "islet", "morphology", "and", "immunohistochemistry", "for", "insulin", "-LRB-", "green", "-RRB-", "and", "glucagon", "-LRB-", "red", "-RRB-", "in", "wild-type", "-LRB-", "a", "-RRB-", "and", "Pten", "+", "/", "−", "-LRB-", "b", "-RRB-", "mice", ".", "Pancreatic", "sections", "were", "immunostained", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", "and", "visualised", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Original", "magnification", "×", "40Table", "3Pancreatic", "beta", "cell", "mass", "of", "Pten", "+", "/", "+", "and", "Pten", "+", "/", "−", "littermates", "Mean", "beta", "cell", "mass", "±", "SE", "-LRB-", "mg", "-RRB-", "Pten", "+", "/", "+1.24", "±", "0.30", "-LRB-", "n", "=", "3", "-RRB-", "Pten", "+", "/", "−", "1.29", "±", "0.15", "-LRB-", "n", "=", "3", "-RRB-", "Skeletal", "muscle", "is", "an", "important", "tissue", "involved", "in", "insulin-stimulated", "glucose", "uptake", "-LSB-", "10", ",", "20", "-RSB-", ".", "In", "vivo", "glucose", "uptake", "was", "assessed", "by", "monitoring", "distribution", "of", "18FDG", "into", "muscles", "in", "real-time", "by", "PET", ".", "18FDG", "is", "transported", "into", "cells", "by", "glucose", "transporters", "and", "is", "phosphorylated", "by", "hexokinase", ",", "but", "is", "not", "a", "substrate", "for", "further", "metabolism", "in", "the", "glycolytic", "pathway", "-LSB-", "21", "-RSB-", ".", "To", "compare", "insulin-stimulated", "glucose", "uptake", "in", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", ",", "the", "mice", "were", "fasted", "for", "15", "h", ",", "then", "injected", "i.p.", "with", "insulin", "-LRB-", "0.6", "mU/g", "body", "weight", "-RRB-", "20", "min", "prior", "to", "injection", "with", "18FDG", "via", "the", "tail", "vein", ".", "Mice", "were", "imaged", "for", "18FDG", "uptake", "into", "the", "hindlimb", "for", "60", "min", "-LRB-", "Fig.", "3a", "-RRB-", ".", "18FDG", "activity", "in", "hindlimbs", "was", "analysed", "as", "a", "proportion", "of", "total", "body", "activity", ",", "and", "was", "found", "to", "be", "higher", "in", "Pten", "+", "/", "−", "than", "in", "wild-type", "mice", "at", "all", "time-points", "-LRB-", "Fig.", "3b", "-RRB-", ".", "Fig.", "3Insulin-stimulated", "uptake", "of", "18FDG", "in", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", ".", "Mice", "were", "fasted", "for", "15", "h", "prior", "to", "i.p.", "injection", "of", "0.6", "mU", "insulin/g", "body", "weight", ".", "Twenty", "minutes", "after", "insulin", "injection", ",", "mice", "were", "injected", "with", "18FDG", "via", "a", "tail", "vein", ",", "and", "whole-body", "distribution", "of", "18FDG", "was", "monitored", "by", "microPET", "for", "60", "min", ".", "The", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", "with", "similar", "results", ".", "Typical", "results", "are", "shown", ".", "a", "--", "f", "Imaging", "of", "18FDG", "distribution", "in", "coronal", "section", ";", "wild-type", "mouse", "is", "on", "the", "left", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mouse", "is", "on", "the", "right", "-LRB-", "a", "5", "min", ";", "b", "15", "min", ";", "c", "25", "min", ";", "d", "35", "min", ";", "e", "45", "min", ";", "f", "55", "min", "-RRB-", ".", "Hindlimb", "muscles", "were", "highlighted", "as", "regions", "of", "interest", ",", "and", "18FDG", "activity", "in", "each", "region", "of", "interest", "quantified", "across", "coronal", "planes", "at", "each", "time-point", ",", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", ".", "g", "Graphical", "representation", "of", "relative", "18FDG", "activity", ".", "Data", "are", "shown", "as", "proportion", "of", "18FDG", "activity", "in", "hindlimbs", "relative", "to", "activity", "in", "whole", "body", "for", "wild-type", "mice", "-LRB-", "circles", "-RRB-", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "-LRB-", "triangles", "-RRB-", "-LRB-", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", "per", "point", "-RRB-", "Tissues", "from", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "exhibited", "slightly", "reduced", "levels", "of", "Pten", "protein", "relative", "to", "wild-type", "mice", "-LSB-", "14", ",", "22", "--", "24", "-RSB-", ".", "In", "order", "to", "examine", "cellular", "glucose", "uptake", "and", "intracellular", "signalling", "events", ",", "primary", "myocytes", "were", "cultured", "from", "hindlimb", "muscle", "of", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "mice", ".", "In", "the", "absence", "of", "insulin", ",", "cells", "from", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "showed", "increased", "2-deoxy", "-LSB-", "3H", "-RSB-", "glucose", "uptake", "at", "all", "time-points", "measured", ",", "to", "a", "maximum", "increase", "of", "twofold", "relative", "to", "wild-type", "cells", "at", "the", "3", "h", "time-point", "-LRB-", "Fig.", "4a", "-RRB-", ".", "This", "result", ",", "together", "with", "the", "lower", "fasting", "glucose", "level", "of", "Pten", "+", "/", "−", "mice", ",", "suggest", "that", "the", "PI3K/PKB", "pathway", "was", "chronically", "activated", "in", "Pten", "+", "/", "−", "animals", ".", "In", "the", "presence", "of", "insulin", ",", "Pten", "+", "/", "−", "cells", "exhibited", "a", "further", "increase", "in", "glucose", "uptake", ",", "up", "to", "threefold", "greater", "than", "wild-type", "cells", ".", "This", "observation", "is", "consistent", "with", "the", "above", "results", "of", "the", "insulin", "and", "glucose", "challenge", "tests", "and", "18FDG", "uptake", "experiment", "in", "showing", "a", "hypersensitivity", "to", "insulin", "due", "to", "Pten", "haploinsufficiency", ".", "Fig.", "4a", "2-Deoxy", "-LSB-", "3H", "-RSB-", "glucose", "uptake", "in", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "myocytes", ".", "Myocytes", "were", "serum-starved", "for", "12", "h", "prior", "to", "incubation", "with", "10", "μmol/l", "2-deoxy", "-LSB-", "3H", "-RSB-", "glucose", "-LRB-", "0.037", "MBq/μmol/l", "-RRB-", "for", "the", "indicated", "times", "with", "0", "or", "1", "μmol/l", "insulin", ".", "Following", "incubation", "cells", "were", "lysed", "and", "aliquots", "of", "lysates", "were", "taken", "for", "determination", "of", "radioactivity", "by", "scintillation", "counting", ".", "Means", "±", "SD", "for", "three", "separate", "determinations", ".", "White", "circles", ",", "wild-type", "cells", "0", "μmol/l", "insulin", ";", "black", "circles", ",", "wild-type", "cells", "1", "μmol/l", "insulin", ";", "white", "triangles", ",", "Pten", "+", "/", "−", "cells", "0", "μmol/l", "insulin", ";", "black", "triangles", ",", "Pten", "+", "/", "−", "cells", "1", "μmol/l", "insulin", ".", "b", "Cell-surface", "GLUT1", "and", "GLUT4", "levels", ".", "Levels", "of", "cell-surface", "GLUT1", "and", "GLUT4", "proteins", "in", "wild-type", "-LRB-", "WT", "-RRB-", "and", "Pten", "+", "/", "−", "cells", "were", "determined", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", "Glucose", "transport", "into", "skeletal", "muscle", "occurs", "by", "a", "facilitated", "diffusion", "process", "mediated", "primarily", "by", "the", "glucose", "transporter", "proteins", ",", "GLUT1", "and", "GLUT4", ".", "The", "level", "of", "GLUT4", "at", "the", "plasma", "membrane", "is", "tightly", "regulated", "by", "insulin", ",", "whereas", "GLUT1", "is", "found", "constitutively", "on", "the", "cell", "surface", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "Since", "2-deoxy", "-LSB-", "3H", "-RSB-", "glucose", "uptake", "was", "elevated", "in", "Pten", "+", "/", "−", "cells", "even", "in", "the", "absence", "of", "insulin", "-LRB-", "Fig.", "4a", "-RRB-", ",", "we", "analysed", "cell-surface", "GLUT4", "and", "GLUT1", "by", "western", "immunoblot", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", "-LRB-", "Fig.", "4b", "-RRB-", ".", "This", "analysis", "showed", "increased", "GLUT4", "at", "the", "cell", "surface", "in", "Pten", "+", "/", "−", "cells", ",", "while", "similar", "GLUT1", "levels", "were", "observed", "in", "the", "two", "cell", "types", ".", "As", "PKB", "is", "a", "key", "effector", "kinase", "that", "mediates", "many", "of", "the", "downstream", "cellular", "events", "induced", "by", "the", "PI3K", "signalling", "pathway", ",", "including", "insulin-stimulated", "glucose", "uptake", "-LSB-", "26", ",", "27", "-RSB-", ",", "we", "determined", "the", "phosphorylation", "status", "of", "PKB", "in", "wild-type", "and", "Pten", "+", "/", "−", "myocytes", ".", "Little", "to", "no", "phosphorylation", "was", "observed", "in", "the", "absence", "of", "insulin", ",", "and", "phosphorylation", "at", "Ser473", "was", "observed", "upon", "addition", "of", "insulin", "-LRB-", "Fig.", "5", "-RRB-", ".", "Whereas", "PKB", "phosphorylation", "started", "to", "decrease", "after", "4", "h", "in", "wild-type", "cells", "in", "the", "presence", "of", "insulin", ",", "phosphorylation", "was", "sustained", "in", "Pten", "+", "/", "−", "cells", "during", "the", "course", "of", "the", "experiment", "-LRB-", "up", "to", "6", "h", "-RRB-", ".", "Immunoblotting", "for", "total", "PKB", "protein", "showed", "that", "PKB", "levels", "were", "consistent", "in", "Pten", "+", "/", "−", "and", "Pten", "+", "/", "+", "cells", "-LRB-", "Fig.", "5", "-RRB-", ".", "Immunoblotting", "for", "vinculin", "was", "included", "as", "a", "protein-loading", "control", ".", "An", "immediate", "downstream", "substrate", "of", "PKB", "is", "GSK3β", ".", "This", "enzyme", "becomes", "inactivated", "upon", "phosphorylation", "by", "PKB", ",", "in", "turn", "allowing", "its", "substrate", ",", "glycogen", "synthase", ",", "to", "mediate", "glycogen", "synthesis", "and", "thus", "promote", "glucose", "storage", ".", "Consistent", "with", "the", "observed", "enhancement", "of", "PKB", "phosphorylation", "in", "Pten", "+", "/", "−", "cells", ",", "these", "cells", "also", "exhibited", "a", "higher", "degree", "of", "GSK3β", "phosphorylation", "in", "comparison", "with", "Pten", "+", "/", "+", "cells", "-LRB-", "Fig.", "5", "-RRB-", ".", "Fig.", "5Phosphorylation", "of", "PKB", "and", "GSK3β", ".", "Myocytes", "were", "serum-starved", "for", "12", "h", "prior", "to", "incubation", "with", "1", "μmol/l", "insulin", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cell", "lysates", "were", "prepared", ",", "and", "proteins", "were", "separated", "by", "PAGE", "followed", "by", "western", "immunoblot", "analysis", "for", "vinculin", ",", "total", "PKB", ",", "phospho-PKB", "-LRB-", "p-PKB", "S473", "-RRB-", "and", "phospho-GSK3β", "-LRB-", "p-GSK3β", "-RRB-", "as", "indicated", ".", "This", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", "with", "typical", "results", "shown", ".", "WT", ",", "wild-type", "Discussion", "Recent", "studies", "utilising", "tissue-specific", "deletion", "of", "Pten", "in", "liver", ",", "adipose", "and", "muscle", "have", "shown", "that", "these", "organs", "make", "important", "contributions", "to", "the", "glucose", "homeostasis", "of", "the", "animal", "and", "clearly", "establish", "Pten", "as", "a", "negative", "regulator", "of", "insulin", "signalling", "in", "vivo", "-LSB-", "9", "--", "11", "-RSB-", ".", "In", "a", "separate", "report", ",", "in", "vivo", "antisense", "treatment", "resulted", "in", "90", "%", "reduction", "of", "Pten", "levels", "in", "the", "liver", "of", "diabetic", "mice", ",", "normalising", "blood", "glucose", "levels", "and", "improving", "performance", "in", "an", "insulin", "tolerance", "test", "-LSB-", "28", "-RSB-", ".", "While", "the", "above", "studies", "focused", "on", "the", "role", "of", "Pten", "in", "specific", "tissues", ",", "the", "current", "work", "defines", "the", "effects", "of", "partial", "systemic", "reduction", "of", "Pten", "on", "the", "regulation", "of", "insulin", "sensitivity", "in", "the", "context", "of", "the", "whole", "animal", ".", "PTEN", "expression/activity", "is", "tightly", "regulated", "by", "a", "complex", "mechanism", "that", "is", "currently", "poorly", "understood", ".", "PTEN", "is", "transcriptionally", "regulated", "by", "transcription", "factors", "such", "as", "p53", ",", "Egr-1", ",", "NFκB", "and", "SMADs", ",", "while", "protein", "levels", "and", "activity", "are", "modulated", "by", "phosphorylation", ",", "oxidation", ",", "subcellular", "localisation", ",", "phospholipid", "binding", "and", "protein", "stability", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "Previous", "studies", "showed", "that", "Pten", "haploinsufficiency", "results", "in", "only", "a", "15", "--", "50", "%", "reduction", "in", "Pten", "protein", ",", "leaving", "a", "substantial", "amount", "of", "Pten", "protein", "remaining", "in", "the", "tissues", "examined", "-LSB-", "14", ",", "22", "--", "24", ",", "30", "-RSB-", ".", "In", "our", "hands", ",", "western", "blot", "analysis", "indicated", "similar", "decreases", "in", "tissue", "Pten", "levels", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "The", "present", "study", "provides", "the", "first", "evidence", "that", "Pten", "haploinsufficiency", "leads", "to", "insulin", "hypersensitivity", "in", "vivo", ",", "suggesting", "that", "even", "small", "changes", "in", "Pten", "levels", "or", "activity", "can", "lead", "to", "dramatic", "effects", "on", "insulin", "responses", ".", "Thus", "partial", "systemic", "inhibition", "of", "PTEN", "activity", "may", "represent", "a", "novel", "strategy", "to", "ameliorate", "the", "pathology", "of", "type", "2", "diabetes", ".", "The", "PI3K/PKB", "signalling", "axis", "is", "central", "to", "maintenance", "of", "normal", "glucose", "homeostasis", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "Pten-deficient", "cells", "typically", "have", "elevated", "levels", "of", "intracellular", "PIP3", "-LSB-", "31", ",", "32", "-RSB-", ".", "The", "sustained", "phosphorylation", "of", "PKB/Akt", "and", "a", "downstream", "effector", ",", "GSK3β", ",", "observed", "in", "the", "current", "study", "is", "consistent", "with", "previous", "reports", "of", "elevated", "PKB/Akt", "activation", "as", "a", "result", "of", "impaired", "desensitisation", "of", "PI3K-dependent", "signals", "under", "conditions", "of", "Pten", "inactivation", "or", "inhibition", "-LSB-", "9", "--", "11", ",", "28", "-RSB-", ".", "A", "subtle", "reduction", "of", "Pten", "in", "the", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "appears", "sufficient", "to", "achieve", "a", "prolonged", "and", "robust", "insulin", "signal", ".", "The", "roles", "of", "PIP3", "and", "PKB/Akt", "in", "insulin-mediated", "glucose", "uptake", "have", "been", "well-established", ";", "therefore", ",", "our", "data", "collectively", "suggest", "that", "sustained", "PI3K/PKB/Akt", "/", "GSK3", "signalling", "may", ",", "in", "part", ",", "contribute", "to", "insulin", "hypersensitivity", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", ".", "However", ",", "other", "PKB/Akt-independent", "signalling", "pathways", ",", "as", "well", "as", "additional", "signals", "delivered", "by", "the", "protein", "phosphatase", "and/or", "adaptor", "functions", "of", "Pten", "may", "also", "contribute", "to", "the", "insulin", "hypersensitivity", "phenotype", "manifested", "by", "Pten", "haploinsufficiency", ".", "GLUT1", "glucose", "transporters", "are", "constitutively", "present", "at", "the", "cell", "surface", ",", "while", "GLUT4", "cycles", "between", "intracellular", "vesicles", "and", "the", "cell", "surface", "in", "a", "manner", "controlled", "by", "insulin-mediated", "signalling", "mechanisms", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "In", "unstimulated", "fat", "and", "muscle", "cells", ",", "the", "majority", "of", "GLUT4", "exists", "in", "intracellular", "compartments", ",", "while", "the", "insulin", "signal", "stimulates", "the", "exocytosis", "of", "GLUT4", "to", "the", "cell", "surface", ".", "Studies", "involving", "PKB/Akt-null", "animals", "and", "silencing", "of", "PKB/Akt", "by", "RNA", "interference", "have", "demonstrated", "that", "PKB/Akt", "is", "of", "primary", "importance", "in", "GLUT4", "translocation", "-LSB-", "33", "--", "36", "-RSB-", ".", "In", "the", "current", "study", ",", "we", "observed", "an", "enhancement", "of", "2-deoxyglucose", "uptake", "in", "Pten", "+", "/", "−", "cells", "even", "in", "the", "absence", "of", "insulin", "stimulation", ",", "which", "was", "consistent", "with", "our", "observation", "of", "increased", "biotinylation", "of", "GLUT4", "at", "the", "cell", "surface", ",", "while", "GLUT1", "levels", "were", "unaffected", ".", "However", ",", "we", "detected", "no", "increase", "in", "phosphorylation", "of", "PKB/Akt", "in", "the", "absence", "of", "insulin", "in", "Pten", "+", "/", "−", "cells", ".", "Consistent", "with", "these", "observations", ",", "a", "recent", "study", "in", "which", "Pten", "was", "specifically", "knocked", "down", "by", "RNA", "interference", "reported", "slight", "but", "significant", "enhancement", "of", "deoxyglucose", "uptake", "in", "adipocytes", ",", "but", "no", "apparent", "increase", "in", "phosphorylation", "of", "PKB/Akt", "-LSB-", "37", "-RSB-", ".", "These", "results", "could", "reflect", "a", "mechanism", "-LRB-", "s", "-RRB-", "affecting", "glucose", "transport", "involving", "Pten/PIP3", "but", "independent", "of", "PKB/Akt", ".", "Such", "a", "mechanism", "could", "involve", "the", "atypical", "protein", "kinases", "C-λ", "and", "-", "ζ", "-LRB-", "PKC-λ", "and", "PKC-ζ", "-RRB-", ",", "which", ",", "like", "PKB/Akt", ",", "are", "subject", "to", "control", "by", "PI3K", "via", "PIP3", "and", "3-phosphoinositide-dependent", "protein", "kinase-1", "-LRB-", "PDK-1", "-RRB-", "-LSB-", "38", "--", "40", "-RSB-", ".", "A", "number", "of", "studies", "have", "implicated", "PKC-λ/ζ", "in", "insulin-stimulated", "glucose", "transport", "and", "GLUT4", "translocation", "-LSB-", "38", ",", "41", "--", "43", "-RSB-", ".", "These", "studies", "indicate", "a", "role", "for", "PKC-λ/ζ", "which", "appears", "to", "be", "complementary", "or", "parallel", "to", "that", "of", "PKB/Akt", ".", "The", "importance", "of", "the", "PI3K", "pathway", "in", "insulin", "signalling", "has", "raised", "interest", "in", "developing", "pharmaceutical", "antagonists", "targeting", "PIP3", "phosphatases", "such", "as", "PTEN", "or", "Sh2-containing", "inositol", "5", "′", "-", "phosphatase", "2", "-LRB-", "SHIP2", ";", "also", "known", "as", "Inppl1", "-RRB-", "in", "an", "effort", "to", "enhance", "insulin", "responsiveness", "in", "type", "2", "diabetes", "-LSB-", "44", "-RSB-", ".", "While", "a", "study", "on", "Ship2-null", "mice", "initially", "implicated", "Ship2", "as", "a", "key", "regulator", "of", "glucose", "uptake", "-LSB-", "45", "-RSB-", ",", "it", "was", "subsequently", "recognised", "that", "these", "mice", "also", "had", "deleted", "a", "neighbouring", "gene", ",", "Phox2a", ",", "which", "may", "have", "contributed", "to", "the", "observed", "phenotype", "-LRB-", "corrigendum", "appears", "in", "Nature", "vol", ".", "431", ",", "p.", "878", "-RRB-", ".", "A", "new", "gene-targeted", "mouse", "has", "since", "been", "generated", "in", "which", "only", "the", "gene", "encoding", "Ship2", "is", "deleted", "-LSB-", "46", "-RSB-", ".", "Interestingly", ",", "this", "mouse", "does", "not", "exhibit", "insulin", "hypersensitivity", "but", "is", "protected", "against", "diet-induced", "obesity", ",", "-LSB-", "46", ",", "47", "-RSB-", ".", "In", "the", "light", "of", "these", "new", "findings", ",", "our", "observations", "of", "dramatic", "enhancement", "of", "insulin", "sensitivity", "and", "glucose", "uptake", "resulting", "from", "Pten", "haploinsufficiency", "suggests", "that", "PTEN", "plays", "a", "role", "in", "the", "desensitisation", "of", "insulin", "signalling", ",", "and", "strengthens", "the", "hypothesis", "that", "PTEN", "is", "a", "key", "regulator", "of", "insulin-stimulated", "glucose", "uptake", ".", "Type", "2", "diabetes", "is", "associated", "with", "insulin", "deficiency", "and", "resistance", "to", "insulin", "signalling", "-LSB-", "48", ",", "49", "-RSB-", ".", "The", "current", "study", "provides", "further", "support", "for", "PTEN", "as", "a", "candidate", "for", "drug", "intervention", "in", "treating", "type", "2", "diabetes", ".", "However", ",", "enthusiasm", "for", "systemic", "PTEN", "inhibitors", "as", "a", "therapeutic", "approach", "for", "treating", "type", "2", "diabetes", "is", "tempered", "by", "the", "potential", "side-effects", "of", "such", "agents", ".", "Most", "notably", ",", "a", "modest", "reduction", "of", "Pten", "in", "Pten", "+", "/", "−", "mice", "promotes", "tumour", "formation", "in", "a", "wide", "variety", "of", "tissue", ",", "suggesting", "that", "long-term", "chronic", "administration", "of", "systemic", "PTEN", "inhibitors", "may", "lead", "to", "enhanced", "cancer", "development", "and", "progression", ".", "Furthermore", ",", "the", "PI3K", "pathway", "is", "an", "important", "regulator", "of", "numerous", "normal", "cellular", "processes", "and", "systemic", "PTEN", "inhibition", "may", "cause", "dysfunction", "of", "many", "cells", "and", "tissues", ",", "leading", "to", "alterations", "in", "liver", ",", "kidney", ",", "brain", "function", ",", "etc.", ".", "For", "example", ",", "hepatocyte-specific", "Pten-deficient", "mice", "exhibit", "hepatomegaly", "and", "liver", "steatosis", "-LSB-", "9", "-RSB-", ".", "Systemic", "inhibition", "of", "PTEN", "may", "therefore", "be", "unacceptable", "clinically", "because", "of", "these", "inherent", "potential", "toxicities", "-LSB-", "44", "-RSB-", ".", "However", ",", "targeted", "delivery", "of", "PTEN", "antagonists", "to", "muscle", "cells", "or", "adipocytes", "may", "overcome", "these", "limitations", "and", "they", "hold", "promise", "as", "clinically", "viable", "agents", "in", "treatment", "of", "type", "2", "diabetes", "-LSB-", "44", "-RSB-", ".", "This", "study", "shows", "that", "partial", "inhibition", "of", "Pten", "is", "sufficient", "to", "enhance", "insulin", "sensitivity", ".", "This", "observation", "is", "important", "from", "a", "therapeutic", "standpoint", ",", "as", "most", "drugs", "are", "unlikely", "to", "completely", "inhibit", "enzyme", "activity", "in", "vivo", ",", "nor", "would", "complete", "inhibition", "be", "desirable", "given", "the", "potential", "for", "cancer", "development", "resulting", "from", "chronic", "or", "overactivation", "of", "the", "PI3K/PKB", "pathway", "-LSB-", "12", ",", "14", ",", "23", "-RSB-", ".", "In", "conclusion", ",", "Pten", "haploinsufficiency", "results", "in", "insulin", "hypersensitivity", ",", "which", "underscores", "the", "importance", "of", "PTEN", "in", "attenuating", "insulin", "signals", ",", "and", "suggests", "that", "small-molecule", "drugs", "that", "antagonise", "PTEN", "activity", "may", "represent", "a", "novel", "class", "of", "insulin-sensitising", "agents", "and", "targeted", "delivery", "of", "these", "agents", "to", "muscle", "cells", "or", "adipocytes", "may", "have", "potential", "clinical", "utility", "in", "treating", "insulin", "resistance", "observed", "in", "type", "2", "diabetes", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "I", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Redundancy", "and", "evolution", "of", "GATA", "factor", "requirements", "in", "development", "of", "the", "myocardium", "The", "transcription", "factors", ",", "GATA4", ",", "5", "and", "6", ",", "recognize", "the", "same", "DNA", "sequence", "and", "are", "all", "expressed", "in", "the", "developing", "myocardium", ".", "However", ",", "knockout", "studies", "in", "the", "mouse", "have", "indicated", "that", "none", "of", "them", "are", "absolutely", "required", "for", "the", "specification", "of", "the", "myocardium", ".", "Here", "we", "present", "evidence", "for", "redundancy", "in", "this", "family", "for", "the", "first", "time", ".", "Using", "morpholinos", "in", "both", "Xenopus", "and", "zebrafish", "embryos", ",", "we", "show", "that", "GATA4", "knockdown", ",", "for", "example", ",", "only", "affects", "cardiac", "marker", "expression", "in", "the", "absence", "of", "either", "GATA5", "or", "GATA6", ".", "A", "similar", "situation", "pertains", "for", "GATA5", "in", "Xenopus", "whereas", ",", "in", "zebrafish", ",", "GATA5", "-LRB-", "faust", "-RRB-", "plays", "a", "major", "role", "in", "driving", "the", "myocardial", "programme", ".", "This", "requirement", "for", "GATA5", "in", "zebrafish", "is", "for", "induction", "of", "the", "myocardium", ",", "in", "contrast", "to", "the", "GATA6", "requirement", "in", "both", "species", ",", "which", "is", "for", "differentiation", ".", "This", "early", "role", "for", "GATA5", "in", "zebrafish", "correlates", "with", "its", "earlier", "expression", "and", "with", "an", "earlier", "requirement", "for", "BMP", "signalling", ",", "suggesting", "that", "a", "mutual", "maintenance", "loop", "for", "GATA", ",", "BMP", "and", "Nkx", "expression", "is", "the", "evolutionarily", "conserved", "entity", ".", "Introduction", "The", "GATA", "factors", "are", "zinc", "finger", "transcriptional", "activators", "that", "bind", "to", "the", "consensus", "DNA", "sequence", "-LRB-", "A/T", "-RRB-", "GATA", "-LRB-", "A/G", "-RRB-", ".", "They", "have", "been", "identified", "throughout", "eukaryotes", "and", "been", "shown", "to", "play", "critical", "roles", "in", "both", "haematopoiesis", "and", "cardiogenesis", "in", "vertebrates", "and", "Drosophila", "-LRB-", "Fossett", "and", "Schulz", ",", "2001", ";", "Nemer", "and", "Nemer", ",", "2001", "-RRB-", ".", "Of", "the", "six", "evolutionarily", "conserved", "GATA", "genes", "in", "vertebrates", ",", "GATA4", ",", "5", "and", "6", "are", "expressed", "in", "the", "heart", "as", "it", "develops", ".", "Loss", "and", "gain", "of", "function", "studies", "in", "P19", "embryonal", "carcinoma", "cells", "indicated", "a", "requirement", "for", "GATA4", "in", "the", "differentiation", "of", "cardiac", "restricted", "cells", "to", "beating", "cardiomyocytes", "-LRB-", "Grepin", "et", "al.", ",", "1997", ",", "1995", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "overexpression", "of", "GATA4", "in", "Xenopus", "embryos", "and", "explants", "resulted", "in", "expression", "of", "cardiac", "differentiation", "markers", "and", "in", "some", "cases", "spontaneously", "beating", "tissue", "-LRB-", "Jiang", "and", "Evans", ",", "1996", ";", "Latinkic", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "However", ",", "in", "the", "GATA4", "null", "mouse", ",", "normal", "amounts", "of", "myocardial", "tissue", "appeared", "to", "be", "formed", "-LRB-", "Holtzinger", "and", "Evans", ",", "2005", ";", "Kuo", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Molkentin", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Narita", "et", "al.", ",", "1996", "-RRB-", ".", "Thus", ",", "even", "though", "cardia", "bifida", "and", "defects", "in", "looping", "morphogenesis", "were", "observed", "in", "the", "null", "mouse", "embryos", ",", "specification", "of", "the", "myocardium", "appeared", "to", "take", "place", "normally", ".", "A", "suggested", "explanation", "for", "this", "was", "the", "elevated", "expression", "of", "GATA6", "-LRB-", "Holtzinger", "and", "Evans", ",", "2005", ";", "Kuo", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Molkentin", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Narita", "et", "al.", ",", "1996", ";", "Pu", "et", "al.", ",", "2004", "-RRB-", ".", "Consistent", "with", "this", "proposed", "redundancy", "of", "function", "within", "the", "family", ",", "GATA5", "and", "6", "are", "also", "active", "in", "the", "P19", "cell", "line", "and", "Xenopus", "explant", "assays", "described", "above", ".", "Thus", ",", "it", "appears", "that", "each", "of", "these", "three", "GATA", "family", "members", "possesses", "the", "capability", "of", "inducing", "cardiac", "differentiation", "in", "gain-of-function", "assays", ",", "however", "demonstration", "that", "they", "exhibit", "such", "redundancy", "in", "vivo", "awaits", "combinatorial", "loss-of-function", "assays", ".", "The", "GATA5", "null", "mouse", "shows", "no", "cardiac", "phenotype", ",", "however", "it", "may", "not", "be", "a", "true", "knockout", "due", "to", "the", "potential", "formation", "of", "a", "truncated", "protein", "containing", "the", "DNA", "binding", "domain", "-LRB-", "Nemer", "and", "Nemer", ",", "2002", "-RRB-", ".", "In", "the", "zebrafish", ",", "a", "critical", "role", "for", "GATA5", "in", "specification", "of", "the", "myocardium", "has", "been", "demonstrated", "by", "loss", "and", "gain", "of", "function", "assays", "-LRB-", "Reiter", "et", "al.", ",", "1999", "-RRB-", ".", "The", "fausttm236", "mutant", "shows", "a", "severe", "reduction", "in", "expression", "of", "cardiac", "markers", "and", "injection", "of", "GATA5", "RNA", "induces", "ectopic", "expression", "of", "the", "same", "markers", ".", "However", ",", "GATA4", "expression", "in", "the", "zebrafish", "fausttm23", "mutant", "is", "significantly", "reduced", "and", "overexpression", "of", "GATA5", "results", "in", "ectopic", "expression", "of", "GATA4", ".", "Thus", ",", "these", "studies", "raise", "the", "possibility", "that", "the", "GATA5", "knockdown", "phenotype", "is", "due", "to", "the", "combined", "loss", "of", "GATA4", "and", "5", ".", "The", "GATA6", "null", "mouse", "is", "an", "embryonic", "lethal", "due", "to", "an", "extra-embryonic", "defect", "and", "chimeras", "have", "indicated", "that", "GATA6", "is", "not", "required", "for", "specification", "of", "the", "myocardium", "-LRB-", "Kabrun", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Koutsourakis", "et", "al.", ",", "1999", ";", "Kuo", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Molkentin", ",", "2000", ";", "Molkentin", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Morrisey", "et", "al.", ",", "1997", "-RRB-", ".", "However", ",", "we", "have", "presented", "evidence", "that", "GATA6", "is", "required", "for", "the", "maintenance", "and", "differentiation", "of", "cardiac", "progenitors", "in", "zebrafish", "and", "Xenopus", "embryos", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "The", "likely", "resolution", "of", "these", "apparently", "contradictory", "data", "is", "that", "the", "major", "consequence", "of", "lost", "GATA6", "function", "is", "non-cell", "autonomous", "and", "can", "therefore", "be", "rescued", "by", "surrounding", "wild", "type", "cells", "in", "mouse", "chimeras", ".", "The", "likely", "non-cell", "autonomous", "target", "for", "GATA6", "is", "BMP", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "However", ",", "this", "requirement", "for", "GATA6", "is", "for", "differentiation", "of", "cardiac", "progenitors", "and", "not", "for", "their", "initial", "specification", ".", "In", "this", "study", "we", "use", "antisense", "morpholinos", "in", "Xenopus", "and", "zebrafish", "embryos", "to", "deplete", "combinations", "of", "GATA4", ",", "5", "and", "6", "for", "the", "first", "time", ".", "This", "has", "allowed", "us", "to", "provide", "the", "first", "experimental", "support", "for", "redundancy", "in", "vivo", ".", "In", "addition", ",", "we", "show", "that", "the", "strong", "dependence", "of", "zebrafish", "on", "GATA5", "is", "not", "mirrored", "in", "Xenopus", ",", "where", "this", "GATA", "factor", "plays", "only", "a", "redundant", "role", ",", "like", "GATA4", "in", "both", "species", ".", "The", "requirement", "for", "GATA5", "in", "the", "zebrafish", "is", "for", "the", "induction", "of", "the", "myocardial", "programme", ",", "whereas", "in", "Xenopus", ",", "GATA", "activity", "is", "only", "required", "for", "differentiation", ".", "We", "propose", "that", "the", "primary", "function", "for", "GATA", "factors", "in", "development", "of", "the", "myocardium", "is", "in", "creating", "a", "sub-circuit", "of", "the", "regulatory", "network", ",", "involving", "another", "critical", "transcription", "factor", ",", "Nkx", ",", "and", "a", "crucial", "signalling", "pathway", ",", "BMP", ".", "This", "mutually", "supportive", "sub-network", "is", "evolutionarily", "stable", ",", "even", "though", "where", "the", "network", "is", "initiated", "appears", "to", "be", "more", "flexible", ".", "Materials", "and", "methods", "In", "situ", "hybridisation", "of", "whole-mounted", "and", "sectioned", "embryos", "Xenopus", "and", "zebrafish", "were", "maintained", "and", "embryos", "were", "raised", "and", "staged", "using", "standard", "conditions", "-LRB-", "Nieuwkoop", "and", "Faber", ",", "1967", ";", "Westerfield", ",", "1993", "-RRB-", ".", "In", "situ", "hybridisations", "on", "whole-mounted", "and", "sectioned", "embryos", "were", "carried", "out", "as", "previously", "described", "-LRB-", "Ciau-Uitz", "et", "al.", ",", "2000", ";", "Jowett", ",", "2001", ";", "Walmsley", "et", "al.", ",", "1994", "-RRB-", ".", "All", "RNA", "probes", "used", "were", "labelled", "with", "digoxigenin", "-LRB-", "DIG", "-RRB-", "except", "for", "MyoD", "and", "Krox20", "which", "were", "used", "in", "double", "in", "situ", "hybridisations", "and", "labelled", "with", "fluorescein", ".", "Detection", "of", "the", "antibody", "--", "alkaline", "phosphatase", "was", "done", "using", "BM", "purple", "-LRB-", "Roche", "-RRB-", "or", "Fast", "red", "-LRB-", "Sigma", "-RRB-", ".", "After", "in", "situ", "hybridisation", ",", "embryos", "were", "re-fixed", "in", "4", "%", "paraformaldehyde", ",", "zebrafish", "embryos", "were", "transferred", "into", "75", "%", "glycerol", "to", "be", "photographed", ".", "Cryostat", "sections", "were", "performed", "after", "in", "situ", "hybridisation", ",", "embryos", "were", "fixed", "as", "above", "and", "washed", "in", "30", "%", "sucrose", ".", "Embryos", "were", "transferred", "into", "embedding", "chambers", "in", "O.C.T", "Compound", "-LRB-", "Tissue-Tek", "-RRB-", "and", "30", "μm", "sections", "were", "cut", "on", "a", "Leica", "CM3050S", ".", "Morpholino", "-LRB-", "MO", "-RRB-", "injection", "The", "GATA4/5/6", "antisense", "morpholinos", "were", "designed", "and", "manufactured", "by", "Genetools", ".", "Morpholino", "sequences", ":", "Xenopus", "GATA4", "MO", "5", "′", "ctggcaactcaatccacaaaatcca3", "′", "-LRB-", "data", "shown", "here", "-RRB-", ",", "a", "second", "morpholino", "designed", "against", "the", "same", "pseudo-allele", "as", "described", "by", "Afouda", "et", "al.", "-LRB-", "2005", "-RRB-", "-LRB-", "data", "not", "shown", ",", "5", "′", "agctatactctgatacatcctgatc3", "′", "-RRB-", ",", "and", "a", "third", "GATA4", "MO", "designed", "to", "block", "both", "pseudo-alleles", "-LRB-", "a", "kind", "gift", "from", "Todd", "Evans", "-RRB-", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", "gave", "the", "same", "results", ".", "Zebrafish", "GATA4", "MO", "5", "′", "gccatcgttacaccttgatacatat3", "′", "or", "a", "second", "splice", "morpholino", "as", "described", "by", "Holtzinger", "and", "Evans", "-LRB-", "2005", "-RRB-", ".", "For", "Xenopus", "GATA5", "MO", "5", "′", "gctacaaacctcacagctcc3", "′", "see", "Afouda", "et", "al.", "-LRB-", "2005", "-RRB-", ".", "Zebrafish", "splice", "GATA5", "MO", "5", "′", "tgttaagatttttacctatactgga3", "′", ".", "For", "Xenopus", "and", "zebrafish", "GATA6", "MOs", "see", "Peterkin", "et", "al.", "-LRB-", "2003", "-RRB-", ".", "MOs", "were", "diluted", "in", "deionised", "water", "and", "injected", "as", "described", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "For", "zebrafish", ",", "25", "ng", "GATA4", "MO", ",", "25", "ng", "GATA5", "MO", "and/or", "5", "ng", "GATA6", "MO", "were", "injected", "into", "single-cell", "embryos", "individually", "and", "in", "combination", ".", "For", "Xenopus", "embryos", ",", "a", "total", "of", "20", "ng", "of", "GATA4", "MO", "or", "GATA5", "MO", "and", "10", "ng", "of", "GATA6", "MO", "were", "injected", "individually", "or", "in", "combination", ".", "Results", "GATA6", "is", "the", "only", "essential", "GATA", "activity", "in", "Xenopus", "myocardium", "We", "have", "reported", "previously", "that", "GATA6", "is", "required", "for", "the", "maintenance", "and", "maturation", "of", "cardiomyocytes", "in", "Xenopus", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "The", "phenotypes", "consequential", "upon", "depletion", "of", "GATA4", "or", "5", "in", "Xenopus", ",", "however", ",", "have", "not", "been", "previously", "reported", ".", "In", "the", "case", "of", "GATA5", ",", "the", "need", "to", "know", "is", "made", "greater", "because", "of", "its", "major", "contribution", "in", "zebrafish", ",", "and", "the", "inability", "to", "determine", "if", "this", "is", "a", "general", "requirement", "in", "vertebrates", "by", "comparison", "with", "the", "mouse", "knockout", ",", "because", "the", "reported", "mutation", "in", "the", "mouse", "appears", "not", "to", "be", "a", "null", "-LRB-", "Nemer", "et", "al.", ",", "1999", "-RRB-", ".", "Therefore", ",", "before", "examining", "depletion", "of", "combinations", "of", "GATA", "factors", ",", "we", "examined", "the", "individual", "loss", "of", "GATA4", "and", "5", "in", "comparison", "to", "the", "already", "known", "GATA6", "phenotype", ".", "The", "design", "and", "quality", "control", "of", "MOs", "against", "Xenopus", "GATA4", ",", "5", "and", "6", "have", "been", "reported", "previously", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", ";", "Afouda", "et", "al.", ",", "2005", "-RRB-", ".", "For", "GATA4", ",", "as", "well", "as", "the", "MO", "reported", "previously", ",", "two", "other", "MOs", ",", "one", "against", "both", "pseudo-alleles", "-LRB-", "Todd", "Evans", ",", "personal", "communication", "-RRB-", ",", "were", "tested", "and", "gave", "the", "same", "results", ".", "For", "GATA5", "and", "6", ",", "MOs", "were", "designed", "to", "target", "both", "pseudo-alleles", "of", "the", "Xenopus", "laevis", "genes", ".", "The", "optimal", "amount", "of", "each", "MO", "injected", "was", "determined", "by", "titration", "to", "ensure", "that", "the", "maximum", "dose", "without", "non-specific", "effects", "was", "used", ".", "The", "extent", "of", "knockdown", "by", "these", "ATG", "MOs", "was", "determined", "by", "co-injection", "of", "tagged", "reporter", "RNAs", "followed", "by", "Western", "blotting", "-LRB-", "Afouda", "et", "al.", ",", "2005", ";", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "Very", "little", "residual", "protein", "was", "detected", "in", "each", "case", ".", "When", "MOs", "against", "individual", "GATA", "factors", "were", "injected", "separately", "into", "the", "presumptive", "heart", "field", ",", "the", "dorsolateral", "marginal", "zone", ",", "of", "4-cell", "Xenopus", "embryos", ",", "cardia", "bifida", "was", "induced", "in", "each", "case", "-LRB-", "Fig.", "1A", ",", "visualised", "by", "staining", "the", "cells", "for", "expression", "of", "Myosin", "Light", "Chain", "2", "-LRB-", "MLC", "-RRB-", "-RRB-", ".", "Cardia", "bifida", "has", "been", "reported", "previously", "for", "the", "GATA4", "knockout", "mouse", "-LRB-", "Kuo", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Molkentin", "et", "al.", ",", "1997", "-RRB-", ",", "the", "GATA5", "mutant", "zebrafish", ",", "faust", "-LRB-", "Reiter", "et", "al.", ",", "1999", "-RRB-", ",", "and", "GATA6", "morphant", "Xenopus", "and", "zebrafish", "embryos", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ",", "but", "this", "is", "the", "first", "direct", "comparison", "in", "a", "single", "species", "showing", "that", "all", "three", "GATA", "factors", "are", "required", "for", "the", "timely", "migration", "of", "cardiac", "precursors", "to", "the", "midline", "for", "fusion", "of", "the", "heart", "tube", ".", "This", "is", "in", "contrast", "to", "requirements", "in", "the", "differentiation", "of", "the", "myocardium", "-LRB-", "see", "below", "-RRB-", ",", "where", "only", "one", "member", "of", "the", "family", "is", "essential", ".", "It", "seems", "likely", "that", "the", "requirement", "for", "GATA4", ",", "5", "and", "6", "in", "midline", "migration", "of", "myocardial", "precursors", "is", "actually", "in", "the", "underlying", "endoderm", ",", "where", "they", "are", "all", "expressed", "and", "which", "has", "been", "shown", "to", "be", "essential", "in", "mouse", "and", "zebrafish", "for", "heart", "tube", "fusion", "-LRB-", "Afouda", "et", "al.", ",", "2005", ";", "Alexander", "et", "al.", ",", "1999", ";", "Molkentin", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Narita", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Reiter", "et", "al.", ",", "1999", ";", "Weber", "et", "al.", ",", "2000", "-RRB-", ".", "To", "determine", "the", "effects", "of", "the", "GATA", "MOs", "on", "programming", "of", "the", "myocardial", "cells", ",", "as", "opposed", "to", "their", "morphological", "movements", ",", "the", "levels", "of", "expression", "of", "the", "transcription", "factors", ",", "Nkx2", ".5", "and", "Tbx5", ",", "and", "of", "the", "contractile", "machinery", "genes", ",", "cardiac", "actin", "-LRB-", "CA", "-RRB-", ",", "and", "MLC", ",", "were", "monitored", "by", "whole", "mount", "in", "situ", "hybridisation", ".", "In", "contrast", "to", "the", "GATA6", "MO", ",", "which", "causes", "a", "profound", "reduction", "in", "the", "expression", "of", "these", "genes", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "1D", "-RRB-", ",", "GATA4", "and", "GATA5", "MOs", "had", "minimal", "effects", "-LRB-", "Figs.", "1B", ",", "C", ";", "for", "all", "three", "MOs", "and", "for", "each", "marker", "n", "was", "30", "--", "50", "-RRB-", ".", "Despite", "the", "cardia", "bifida", "at", "tailbud", "stages", "-LRB-", "stages", "28", "--", "32", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "1A", "-RRB-", ",", "the", "gross", "morphology", "of", "the", "hearts", "at", "later", "stages", "-LRB-", "stage", "43", "-RRB-", "in", "GATA4", "and", "GATA5", "morphants", "looked", "similar", "to", "those", "in", "wild", "type", "embryos", ",", "i.e.", "the", "cardia", "bifida", "was", "only", "transient", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "In", "contrast", ",", "as", "previously", "described", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ",", "little", "or", "no", "cardiac", "tissue", "was", "observed", "in", "embryos", "depleted", "of", "GATA6", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Thus", ",", "it", "would", "appear", "that", ",", "apart", "from", "the", "transient", "bifida", ",", "the", "loss", "of", "GATA4", "or", "GATA5", "has", "little", "effect", "on", "cardiogenesis", "in", "Xenopus", ".", "To", "ensure", "that", "the", "GATA4", "and", "5", "morpholinos", "were", "properly", "functional", ",", "they", "were", "injected", "vegetally", "at", "the", "single-cell", "stage", ",", "and", "were", "shown", "to", "reduce", "the", "expression", "of", "Sox17α", "during", "gastrulation", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", "-LRB-", "Afouda", "et", "al.", ",", "2005", "-RRB-", ".", "Furthermore", ",", "the", "gut", "of", "GATA5", "morphants", "failed", "to", "coil", "properly", ",", "as", "previously", "reported", "-LRB-", "Afouda", "et", "al.", ",", "2005", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "for", "these", "and", "several", "of", "the", "combination", "experiments", "described", "below", ",", "all", "three", "GATA4", "MOs", "gave", "the", "same", "results", ".", "We", "therefore", "conclude", "that", "for", "development", "of", "the", "myocardium", "in", "Xenopus", "embryos", ",", "GATA6", "is", "the", "only", "essential", "GATA", "factor", ".", "GATA", "factor", "redundancy", "in", "Xenopus", "myocardium", "On", "the", "basis", "of", "slightly", "increased", "expression", "of", "GATA6", "in", "GATA4", "knockout", "mice", ",", "redundant", "roles", "for", "the", "GATA", "factors", "in", "the", "myocardium", "have", "been", "suggested", "-LRB-", "Kuo", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Molkentin", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Narita", "et", "al.", ",", "1996", ";", "Watt", "et", "al.", ",", "2004", "-RRB-", ".", "In", "Xenopus", ",", "expression", "of", "neither", "GATA5", "nor", "GATA6", "was", "significantly", "increased", "in", "GATA4", "MO", "injected", "embryos", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Similarly", ",", "in", "GATA5", "and", "GATA6", "MO", "injected", "embryos", ":", "in", "neither", "case", "was", "an", "increase", "in", "expression", "of", "the", "other", "two", "GATA", "factors", "observed", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "However", ",", "redundancy", "does", "not", "necessarily", "depend", "on", "an", "increase", "in", "expression", "of", "the", "redundant", "family", "member", ":", "continued", "expression", "could", "suffice", ",", "and", "that", "is", "what", "we", "see", "in", "all", "three", "cases", ".", "Therefore", "to", "formally", "test", "redundancy", "within", "the", "GATA", "family", ",", "we", "injected", "combinations", "of", "MOs", "into", "the", "presumptive", "heart", "field", "of", "4-cell", "Xenopus", "embryos", ",", "and", "monitored", "MLC", "and", "Nkx2", ".5", "expression", "by", "whole", "mount", "in", "situ", "hybridisation", "-LRB-", "Fig.", "2", "-RRB-", ".", "Embryos", "were", "classified", "as", "unaffected", "-LRB-", "wild", "type", ",", "+", "-RRB-", ",", "mildly", "-LRB-", "−", "-RRB-", "or", "strongly", "-LRB-", "−", "−", "-RRB-", "down", "regulated", ",", "or", "displaying", "no", "expression", "at", "all", "-LRB-", "−", "−", "−", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "2A", "-RRB-", ".", "Numbers", "of", "embryos", "in", "each", "category", "were", "scored", "and", "the", "results", "displayed", "in", "histograms", "-LRB-", "n", "=", "31", "--", "94", "-RRB-", "-LRB-", "Figs.", "2B", ",", "C", "-RRB-", ".", "The", "greater", "effects", "of", "the", "GATA6", "MO", "are", "immediately", "apparent", ",", "with", "clear", "increases", "in", "the", "affected", "categories", "at", "the", "expense", "of", "the", "wild", "type", "category", "compared", "to", "both", "control", "embryos", "and", "also", "to", "GATA4", "or", "GATA5", "MO", "injected", "embryos", ".", "When", "combinations", "of", "two", "MOs", "were", "injected", ",", "evidence", "for", "redundancy", "was", "revealed", "-LRB-", "Figs.", "2B", ",", "C", "-RRB-", ".", "Despite", "having", "little", "effect", "on", "their", "own", ",", "both", "GATA4", "and", "GATA5", "MOs", "made", "the", "phenotype", "of", "GATA6", "MO", "injected", "embryos", "more", "severe", "when", "injected", "with", "it", ".", "Furthermore", ",", "the", "phenotype", "observed", "when", "GATA4", "and", "5", "MOs", "were", "injected", "in", "combination", "was", "significantly", "worse", "than", "either", "alone", ",", "suggesting", "that", "the", "minimal", "phenotype", "for", "the", "single", "injections", "relied", "on", "the", "continued", "presence", "of", "the", "other", "GATA", "factor", ".", "When", "all", "three", "MOs", "were", "injected", "together", ",", "the", "phenotype", "was", "the", "most", "extreme", "of", "all", "with", "the", "vast", "majority", "of", "embryos", "having", "no", "expression", "of", "MLC", "at", "all", ".", "We", "therefore", "conclude", "that", ",", "while", "GATA6", "is", "the", "only", "individually", "essential", "player", "in", "driving", "the", "myocardial", "programme", "in", "Xenopus", ",", "the", "other", "two", "GATA", "factors", "are", "responsible", "for", "the", "residual", "expression", "of", "cardiac", "genes", ".", "Furthermore", ",", "in", "the", "absence", "of", "GATA6", ",", "their", "roles", "are", "increased", ".", "This", "is", "evident", "from", "their", "significantly", "greater", "effects", "on", "embryo", "phenotypes", "when", "combined", "with", "GATA6", "MO", "compared", "to", "on", "their", "own", ".", "GATA", "activity", "is", "required", "for", "differentiation", "but", "not", "induction", "of", "the", "myocardium", "in", "Xenopus", "We", "have", "shown", "previously", "that", "GATA6", "is", "required", "for", "the", "maintenance/maturation", "of", "the", "myocardium", "rather", "than", "its", "induction", "in", "both", "Xenopus", "and", "zebrafish", "embryos", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "As", "expected", ",", "based", "on", "the", "absence", "of", "a", "late", "phenotype", ",", "embryos", "injected", "with", "GATA4", "or", "GATA5", "MOs", "had", "no", "effect", "on", "early", "Nkx2", ".5", "expression", ",", "as", "seen", "for", "GATA6", "MO", "-LRB-", "n", "=", "60", ",", "72", ",", "and", "89", ",", "respectively", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "3A", "-RRB-", ".", "In", "order", "to", "determine", "if", "the", "lack", "of", "an", "early", "effect", ",", "even", "for", "GATA6", "which", "has", "a", "strong", "late", "phenotype", ",", "was", "the", "result", "of", "redundancy", "within", "the", "GATA", "family", ",", "we", "examined", "Nkx2", ".5", "expression", "at", "neurula", "stages", "in", "embryos", "injected", "with", "all", "three", "MOs", "-LRB-", "n", "=", "102", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "3A", "-RRB-", ".", "Expression", "was", "unaffected", ",", "as", "seen", "with", "each", "of", "the", "MOs", "on", "their", "own", ".", "Although", "Nkx2", ".5", "is", "also", "expressed", "in", "the", "underlying", "endoderm", "at", "this", "time", ",", "we", "showed", "by", "examining", "sections", "that", "the", "signal", "in", "the", "cardiac", "mesoderm", "is", "unaffected", "-LRB-", "Fig.", "3B", ",", "territory", "delineated", "by", "dashed", "lines", "-RRB-", ".", "Furthermore", ",", "a", "similar", "result", "was", "obtained", "for", "Nkx2", ".3", "-LRB-", "n", "=", "55", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "3C", "-RRB-", ",", "which", "is", "not", "expressed", "or", "is", "very", "weak", "in", "the", "endoderm", "at", "this", "time", "-LRB-", "Fig.", "3D", "-RRB-", ".", "The", "expression", "of", "eHAND", "was", "also", "unaffected", "at", "this", "stage", "-LRB-", "Fig.", "3E", ",", "territory", "delineated", "by", "dashed", "lines", "-RRB-", ".", "We", "therefore", "conclude", "that", ",", "despite", "their", "earlier", "expression", ",", "GATA", "factors", "are", "not", "required", "for", "induction", "of", "the", "myocardial", "programme", "in", "Xenopus", ",", "as", "seen", "by", "the", "continued", "expression", "of", "the", "other", "early", "regulators", ",", "Nkx2", ".5", ",", "Nkx2", ".3", "and", "eHAND", ",", "and", "their", "own", "continued", "expression", ",", "but", "rather", "for", "its", "maintenance/maturation", ".", "GATA4", "is", "not", "essential", "for", "induction", "or", "differentiation", "of", "zebrafish", "myocardium", "GATA5", "-LRB-", "faust", "-RRB-", "mutant", "zebrafish", "have", "profound", "defects", "in", "the", "myocardium", ",", "displaying", "reduced", "expression", "of", "several", "myocardial", "genes", "-LRB-", "Reiter", "et", "al.", ",", "1999", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "GATA6", "has", "been", "shown", "to", "be", "required", "for", "maintenance/maturation", "of", "the", "myocardial", "programme", "in", "zebrafish", "as", "seen", "in", "Xenopus", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "In", "order", "to", "determine", "the", "relative", "effects", "of", "these", "two", "GATA", "factors", ",", "and", "to", "determine", "the", "contribution", "of", "GATA4", ",", "we", "separately", "injected", "into", "zebrafish", "embryos", "MOs", "against", "each", "of", "these", "GATA", "factors", ".", "The", "GATA4", "MO", "was", "shown", "to", "specifically", "block", "translation", "of", "a", "co-injected", "GATA4", "RNA", "and", "not", "GATA5", "or", "GATA6", "RNAs", "-LRB-", "Supplementary", "Figs.", "1A", ",", "B", ",", "C", "-RRB-", ".", "The", "GATA5", "MO", "was", "designed", "to", "block", "splicing", "between", "exons", "1", "and", "2", "of", "the", "GATA5", "gene", ",", "which", "was", "confirmed", "in", "injected", "embryos", "by", "RT", "--", "PCR", "-LRB-", "Supplementary", "Figs.", "1D", ",", "E", "-RRB-", ".", "This", "splice", "blocking", "morpholino", "was", "designed", "upstream", "of", "the", "exons", "encoding", "the", "zinc", "fingers", "to", "prevent", "any", "protein", "produced", "binding", "DNA", ".", "However", ",", "the", "creation", "of", "a", "dominant", "negative", "GATA5", "via", "splicing", "from", "an", "upstream", "cryptic", "site", "is", "formally", "possible", "-LRB-", "see", "Supplementary", "Fig.", "1D", "-RRB-", "but", "the", "ability", "of", "GATA4", "and", "6", "morpholinos", "to", "enhance", "the", "cardiac", "phenotype", "in", "combinations", "-LRB-", "see", "below", "-RRB-", "makes", "this", "unlikely", ".", "Furthermore", ",", "the", "GATA5", "morphant", "heart", "phenotype", "was", "indistinguishable", "from", "that", "seen", "in", "the", "faust", "mutant", ",", "both", "in", "single", "and", "combination", "experiments", "-LRB-", "Supplementary", "Fig.", "1F", "and", "see", "below", "-RRB-", ".", "The", "GATA6", "MO", "has", "been", "reported", "previously", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "The", "effects", "of", "the", "three", "MOs", "injected", "separately", "into", "zebrafish", "embryos", "were", "determined", "by", "monitoring", "expression", "of", "the", "transcription", "factor", ",", "nkx2", ".5", ",", "and", "the", "contractile", "machinery", "genes", ",", "ventricular", "myosin", "heavy", "chain", "-LRB-", "vmhc", "-RRB-", "and", "cardiac", "myosin", "light", "chain", "2", "-LRB-", "cmlc2", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "4", "-RRB-", ".", "GATA5", "and", "6", "MOs", "induced", "cardia", "bifida", "as", "described", "previously", "for", "the", "faust", "mutant", "and", "the", "GATA6", "MO", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", ";", "Reiter", "et", "al.", ",", "1999", "-RRB-", ".", "In", "contrast", ",", "in", "GATA4", "MO", "injected", "embryos", ",", "the", "myocardial", "cells", "appeared", "to", "have", "migrated", "and", "fused", "normally", "at", "the", "midline", ".", "We", "therefore", "conclude", "that", ",", "in", "zebrafish", ",", "only", "GATA5", "and", "6", "are", "required", "for", "the", "proper", "migration", "of", "cardiac", "precursors", ".", "In", "contrast", "to", "mice", "and", "Xenopus", ",", "GATA4", "appears", "to", "be", "uninvolved", "in", "this", "process", ".", "The", "previously", "reported", "effects", "on", "myocardial", "gene", "expression", "of", "GATA5", "or", "GATA6", "knockdown", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", ";", "Reiter", "et", "al.", ",", "1999", "-RRB-", "were", "immediately", "evident", "in", "these", "MO", "injected", "embryos", "-LRB-", "Fig.", "4", "-RRB-", ".", "GATA5", "MO", "injection", "led", "to", "substantially", "reduced", "expression", "of", "nkx2", ".5", "-LRB-", "19/19", "-RRB-", ",", "vmhc", "-LRB-", "42/43", "-RRB-", "and", "cmlc2", "-LRB-", "40/41", "-RRB-", ",", "as", "seen", "for", "the", "faust", "mutant", ".", "GATA6", "MO", "injection", "also", "resulted", "in", "reduced", "expression", "of", "these", "markers", "-LRB-", "6/6", ",", "60/60", "and", "42/44", "-RRB-", "but", "to", "a", "lesser", "extent", ".", "In", "contrast", ",", "GATA4", "MO", "injection", "had", "little", "or", "no", "effect", "on", "cardiac", "marker", "gene", "expression", "levels", "-LRB-", "n", "=", "28", ",", "69", "and", "53", "-RRB-", ".", "Spatially", "the", "expression", "of", "the", "markers", "in", "the", "GATA4", "morphants", "looks", "altered", "compared", "with", "the", "controls", "due", "to", "defects", "in", "late", "cardiac", "morphogenesis", ",", "consistent", "with", "those", "described", "by", "Holtzinger", "and", "Evans", "-LRB-", "2005", "-RRB-", ".", "We", "therefore", "conclude", "that", "for", "laying", "down", "the", "myocardial", "programme", "in", "zebrafish", ",", "GATA5", "has", "the", "greatest", "effect", "with", "a", "significant", "contribution", "from", "GATA6", ".", "In", "contrast", ",", "GATA4", "makes", "little", "or", "no", "contribution", ",", "at", "least", "to", "the", "expression", "of", "the", "markers", "tested", ".", "GATA", "factor", "redundancy", "in", "zebrafish", "myocardium", "To", "determine", "if", ",", "as", "in", "Xenopus", ",", "there", "is", "redundancy", "within", "the", "GATA", "family", "in", "zebrafish", ",", "we", "injected", "the", "MOs", "in", "combinations", "-LRB-", "Fig.", "4", "-RRB-", ".", "Morphant", "embryos", "were", "classified", "into", "three", "types", ",", "unaffected", "-LRB-", "type", "+", "-RRB-", ",", "down", "regulated", "-LRB-", "type", "−", "-RRB-", "or", "absent", "-LRB-", "type", "−", "−", "-RRB-", ".", "Both", "the", "GATA5", "and", "the", "GATA6", "MO", "phenotypes", "were", "made", "worse", "by", "the", "co-injection", "of", "the", "GATA4", "MO", "-LRB-", "Figs.", "4B", ",", "D", "and", "F", "-RRB-", ",", "as", "seen", "in", "Xenopus", ",", "and", "despite", "the", "fact", "that", "the", "GATA4", "MO", "had", "little", "or", "no", "effect", "when", "injected", "on", "its", "own", "-LRB-", "n", "=", "18", "--", "39", "-RRB-", ".", "We", "therefore", "conclude", "that", "a", "significant", "proportion", "of", "the", "residual", "cardiac", "gene", "expression", "in", "GATA5", "or", "GATA6", "MO", "injected", "embryos", "is", "driven", "by", "GATA4", ",", "even", "though", "the", "consequences", "of", "its", "loss", "in", "the", "presence", "of", "GATA5", "or", "GATA6", "are", "minimal", ".", "Thus", ",", "redundancy", "within", "the", "GATA", "family", "is", "apparent", "in", "the", "zebrafish", "myocardium", "as", "in", "Xenopus", ".", "The", "level", "of", "residual", "cardiac", "marker", "expression", "in", "the", "GATA4", "and", "5", "MO", "combination", "or", "the", "GATA4", "and", "6", "MO", "combination", "at", "26", "hpf", "was", "very", "low", "-LRB-", "Fig.", "4", "-RRB-", ".", "The", "level", "for", "the", "GATA5", "and", "GATA6", "MO", "combination", "was", "undetectable", "with", "100", "%", "of", "the", "embryos", "losing", "expression", ",", "suggesting", "that", ",", "while", "GATA4", "can", "cover", "for", "the", "absence", "of", "either", "GATA5", "or", "GATA6", ",", "it", "can", "not", "cover", "for", "the", "absence", "of", "both", ",", "which", "seems", "unlikely", ".", "We", "therefore", "monitored", "the", "expression", "of", "GATA4", "in", "flat-mounted", "-LRB-", "Fig.", "5A", "-RRB-", "MO", "injected", "10-somite", "embryos", "to", "determine", "if", "it", "was", "still", "expressed", "-LRB-", "Fig.", "5C", "-RRB-", ".", "We", "found", "that", "GATA5", "MO", "on", "its", "own", "caused", "a", "reduction", "in", "GATA4", "expression", "-LRB-", "22/36", "embryos", "-RRB-", ",", "and", "residual", "expression", "was", "removed", "completely", "by", "the", "addition", "of", "the", "GATA6", "MO", "-LRB-", "n", "=", "35", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "5C", "-RRB-", ".", "The", "GATA4", "expression", "seen", "in", "GATA4", "morphants", "reflects", "the", "use", "of", "a", "translation-blocking", "morpholino", "rather", "than", "a", "splice-blocker", ".", "In", "the", "same", "experiment", "the", "expression", "of", "nkx2", ".5", "was", "affected", "in", "the", "same", "way", "as", "already", "described", "-LRB-", "Fig.", "5B", "-RRB-", ".", "We", "therefore", "conclude", "that", "the", "complete", "absence", "of", "cardiac", "marker", "expression", "in", "GATA5", "plus", "GATA6", "MO", "injected", "embryos", "results", "from", "the", "simultaneous", "absence", "of", "GATA4", "expression", ".", "Thus", ",", "as", "seen", "for", "Xenopus", "embryos", ",", "the", "absence", "of", "all", "three", "GATA", "factors", "completely", "abolished", "cardiac", "marker", "expression", ".", "GATA", "activity", "is", "required", "for", "induction", "of", "the", "myocardial", "programme", "in", "zebrafish", "We", "have", "shown", "that", "GATA", "activity", "is", "only", "required", "for", "the", "maintenance/maturation", "of", "the", "myocardial", "programme", "in", "Xenopus", ".", "While", "we", "have", "shown", "that", "the", "GATA6", "requirement", "in", "zebrafish", "is", "also", "late", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ",", "nkx2", ".5", "expression", "at", "6", "somites", "has", "been", "shown", "to", "be", "affected", "in", "zebrafish", "faust", "mutants", "-LRB-", "Reiter", "et", "al.", ",", "1999", "-RRB-", ",", "suggesting", "that", "an", "additional", "difference", "between", "the", "species", "might", "be", "the", "timing", "of", "requirements", "for", "GATA", "activity", ".", "We", "therefore", "tested", "this", "earlier", "requirement", "with", "more", "markers", "and", "to", "determine", "if", "it", "is", "subject", "to", "redundancy", ".", "Firstly", ",", "we", "examined", "nkx2", ".5", "expression", "in", "MO", "injected", "embryos", "at", "5", "somites", "when", "it", "is", "first", "expressed", "-LRB-", "Fig.", "6A", "-RRB-", ".", "For", "the", "GATA5", "MO", ",", "we", "found", "a", "major", "reduction", "in", "expression", "totally", "consistent", "with", "the", "reductions", "seen", "later", "and", "with", "those", "reported", "for", "the", "faust", "mutant", "-LRB-", "Reiter", "et", "al.", ",", "1999", "-RRB-", ".", "We", "also", "observed", "very", "little", "effect", "for", "the", "GATA4", "or", "6", "MOs", "on", "their", "own", ",", "but", "both", "made", "the", "GATA5", "MO", "phenotype", "more", "severe", ",", "consistent", "with", "their", "back-up", "roles", "being", "active", "at", "this", "early", "stage", ".", "Similar", "observations", "were", "made", "for", "GATA4", "and", "hrt", "expression", "in", "5-somite", "embryos", "and", "for", "tbx5", "expression", "in", "10-somite", "embryos", "-LRB-", "tbx5", "expression", "is", "first", "detected", "at", "∼", "7", "somites", "-RRB-", "-LRB-", "Figs.", "6B", ",", "C", ",", "D", "-RRB-", ".", "In", "contrast", ",", "nkx2", ".7", "expression", "was", "unaffected", "even", "by", "triple", "knockdown", "-LRB-", "Fig.", "6E", "-RRB-", ".", "We", "therefore", "conclude", "that", ",", "for", "the", "markers", "studied", "and", "in", "contrast", "to", "Xenopus", ",", "establishing", "the", "full", "early", "myocardial", "programme", "in", "zebrafish", "depends", "on", "GATA", "activity", ".", "The", "continued", "presence", "of", "cells", "expressing", "nkx2", ".7", "suggested", "that", "apoptosis", "had", "not", "yet", "occurred", ",", "and", "this", "was", "confirmed", "by", "TUNEL", "and", "acridine", "orange", "assays", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Furthermore", ",", "re-specification", "to", "more", "anterior", "or", "more", "posterior", "mesodermal", "fates", "was", "not", "observed", ",", "as", "judged", "by", "the", "domains", "of", "expression", "of", "anterior", "lateral", "plate", "and", "pronephric", "markers", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "We", "therefore", "conclude", "that", "in", "the", "absence", "of", "GATA", "activity", ",", "the", "cells", "remain", "undifferentiated", "at", "least", "up", "to", "the", "10-somite", "stage", ".", "Discussion", "Redundancy", "GATA4", ",", "5", "and", "6", "are", "an", "example", "of", "a", "gene", "family", "co-expressed", "in", "a", "specific", "tissue", ",", "in", "this", "case", "the", "myocardium", ".", "Although", "some", "differences", "in", "their", "binding", "site", "preferences", "have", "been", "detected", "-LRB-", "Sakai", "et", "al.", ",", "1998", "-RRB-", ",", "all", "three", "bind", "to", "canonical", "GATA", "sites", "with", "high", "affinity", ".", "Because", "of", "this", "and", "the", "relatively", "mild", "phenotypes", "generated", "in", "loss", "of", "function", "experiments", ",", "they", "have", "been", "suggested", "to", "act", "redundantly", "-LRB-", "Jiang", "et", "al.", ",", "1998", ";", "Kuo", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Molkentin", "et", "al.", ",", "1997", ";", "Narita", "et", "al.", ",", "1996", ";", "Watt", "et", "al.", ",", "2004", "-RRB-", ".", "Here", "for", "the", "first", "time", "we", "present", "evidence", "in", "support", "of", "this", "with", "respect", "to", "laying", "down", "the", "genetic", "programme", "of", "the", "myocardium", ".", "The", "redundancy", "is", "particularly", "striking", "for", "GATA4", ",", "whose", "individual", "loss", "has", "essentially", "no", "effect", "on", "induction", "or", "maturation", "of", "the", "myocardium", "in", "either", "zebrafish", "or", "Xenopus", ",", "in", "contrast", "to", "assumptions", "of", "its", "importance", "in", "much", "of", "the", "literature", ".", "For", "this", "member", "of", "the", "family", ",", "its", "contribution", "is", "only", "revealed", "in", "the", "absence", "of", "GATA5", "or", "6", ",", "thereby", "constituting", "a", "formal", "demonstration", "of", "redundancy", ".", "Similar", "demonstrations", "are", "evident", "for", "both", "Xenopus", "GATA5", "and", "in", "early", "heart", "induction", "for", "zebrafish", "GATA6", ",", "where", "they", "are", "not", "the", "essential", "players", ".", "These", "redundant", "GATA", "activities", "thus", "most", "likely", "account", "for", "the", "residual", "expression", "of", "cardiac", "markers", "in", "the", "absence", "of", "the", "essential", "GATA", "factor", ".", "Indeed", "little", "change", "was", "observed", "in", "expression", "of", "the", "remaining", "GATA", "factor", "in", "double", "morphant", "embryos", "compared", "to", "wild", "type", "siblings", "in", "either", "zebrafish", "or", "Xenopus", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "The", "one", "exception", "was", "GATA5", "and", "6", "double", "morphant", "zebrafish", "embryos", "where", "the", "complete", "loss", "of", "GATA4", "was", "used", "to", "effect", "a", "triple", "knockout", "-LRB-", "Fig.", "5C", "-RRB-", ".", "GATA", "factors", "are", "an", "ancient", "family", "and", "in", "vertebrates", "have", "existed", "with", "three", "family", "members", "in", "the", "heart", "at", "least", "since", "fish", "-LRB-", "Patient", "and", "McGhee", ",", "2002", "-RRB-", ".", "Thus", ",", "the", "redundancy", "reported", "here", "would", "appear", "to", "be", "evolutionarily", "very", "stable", ".", "Maynard", "Smith", "and", "colleagues", "have", "developed", "simple", "genetic", "models", "to", "analyse", "selection", "pressures", "on", "redundant", "genes", "and", "have", "concluded", "that", "evolutionary", "stability", "can", "be", "achieved", "if", "the", "two", "-LRB-", "or", "more", "-RRB-", "genes", "perform", "the", "same", "function", ",", "but", "with", "slightly", "different", "efficacies", ",", "as", "seen", "here", "-LRB-", "Nowak", "et", "al.", ",", "1997", "-RRB-", ".", "The", "less", "efficient", "family", "member", "comes", "into", "its", "own", "when", "paired", "with", "a", "mutant", "form", "of", "the", "more", "efficient", "family", "member", ".", "Another", "evolutionarily", "stable", "model", "can", "be", "achieved", "where", "two", "-LRB-", "or", "more", "-RRB-", "genes", "perform", "more", "than", "one", "function", ":", "the", "redundancy", "occurring", "only", "with", "respect", "to", "one", "specific", "function", ".", "GATA4", ",", "5", "and", "6", "have", "an", "ever-growing", "list", "of", "functions", "in", "other", "tissues", ",", "so", "this", "scenario", "is", "more", "than", "adequately", "satisfied", "as", "well", "-LRB-", "Afouda", "et", "al.", ",", "2005", ";", "Capo-Chichi", "et", "al.", ",", "2005", ";", "Ketola", "et", "al.", ",", "2004", ";", "Molkentin", ",", "2000", ";", "Yang", "et", "al.", ",", "2002", "-RRB-", ".", "The", "evolutionary", "stability", "of", "this", "model", "depends", "on", "random", "mutations", "being", "more", "likely", "to", "render", "the", "genes", "inactive", "for", "all", "functions", "rather", "than", "just", "for", "one", "of", "their", "functions", ".", "Finally", ",", "yet", "another", "model", "suggests", "that", "redundancy", "should", "be", "more", "common", "in", "genes", "displaying", "specific", "spatio-temporal", "expression", "patterns", "during", "development", ",", "as", "is", "the", "case", "for", "GATA4", ",", "5", "and", "6", ".", "For", "this", "model", ",", "the", "developmental", "error", "rates", "applicable", "to", "these", "genes", "need", "to", "be", "higher", "than", "their", "germ", "line", "mutation", "rates", ":", "a", "requirement", "that", "is", "currently", "unknown", ".", "The", "primary", "GATA", "factor", "An", "unexpected", "finding", "was", "that", "the", "member", "of", "the", "family", "whose", "loss", "has", "the", "biggest", "effect", "differs", "between", "Xenopus", "and", "zebrafish", ".", "For", "single", "knock", "downs", ",", "GATA6", "has", "the", "strongest", "effect", "on", "myocardial", "gene", "expression", "in", "Xenopus", "whereas", "GATA5", "does", "so", "in", "zebrafish", ".", "Although", "at", "first", "glance", "this", "might", "suggest", "a", "switch", "in", "roles", "for", "GATA5", "and", "6", ",", "a", "consideration", "of", "the", "timing", "of", "their", "actions", "suggests", "an", "alternative", "view", ".", "The", "action", "of", "GATA6", "in", "Xenopus", "is", "after", "the", "initial", "expression", "of", "other", "early", "markers", "such", "as", "Nkx2", ".5", ",", "suggesting", "a", "role", "in", "differentiation", "of", "the", "myocardium", "-LRB-", "Peterkin", "et", "al.", ",", "2003", "-RRB-", ".", "GATA6", "knockdown", "in", "zebrafish", "has", "a", "very", "similar", "effect", ".", "Thus", ",", "in", "both", "organisms", ",", "knockdown", "of", "GATA6", "leaves", "early", "marker", "expression", "initially", "intact", "but", "decaying", "with", "time", ",", "whereas", "when", "GATA5", "was", "knocked", "down", "in", "zebrafish", ",", "expression", "of", "Nkx2", ".5", "and", "other", "early", "markers", "was", "compromised", "from", "the", "outset", "-LRB-", "Reiter", "et", "al.", ",", "1999", ";", "this", "study", "-RRB-", ".", "The", "difference", "between", "the", "two", "organisms", "therefore", "can", "be", "characterised", "as", "the", "gain", "or", "loss", "of", "an", "early", "function", "for", "GATA5", ".", "The", "early", "role", "for", "GATA", "activity", "in", "zebrafish", "appears", "not", "to", "be", "masked", "by", "redundancy", "in", "Xenopus", "because", "even", "triple", "knockdown", "of", "GATA4", ",", "5", "and", "6", "leaves", "early", "expression", "of", "myocardial", "markers", "intact", ".", "The", "role", "of", "GATA5", "in", "myocardial", "induction", "in", "mouse", "and", "chick", "embryos", "is", "currently", "unclear", ".", "Although", "in", "P19", "embryonal", "carcinoma", "cells", "induced", "to", "differentiate", "into", "cardiomyocytes", ",", "GATA5", "up-regulation", "occurs", "after", "Nkx2", ".5", ",", "precluding", "an", "early", "function", "during", "induction", "-LRB-", "Alexandrovich", "et", "al.", ",", "2006", "-RRB-", ",", "the", "mouse", "knockout", "of", "GATA5", "retained", "the", "capacity", "to", "synthesise", "a", "truncated", "form", "of", "the", "protein", "containing", "both", "zinc", "fingers", ",", "which", "would", "likely", "have", "significant", "activity", ",", "preventing", "a", "definitive", "conclusion", "-LRB-", "Nemer", "and", "Nemer", ",", "2002", "-RRB-", ".", "Likewise", ",", "the", "attempts", "to", "date", "to", "knock", "down", "GATA5", "activity", "in", "the", "chick", "were", "only", "partial", "and", ",", "in", "addition", ",", "attempted", "after", "induction", "of", "the", "myocardium", "-LRB-", "Jiang", "et", "al.", ",", "1998", "-RRB-", ".", "It", "is", "therefore", "not", "yet", "clear", "if", "the", "early", "role", "for", "GATA5", "has", "been", "acquired", "by", "zebrafish", "or", "lost", "by", "Xenopus", ".", "In", "Drosophila", ",", "the", "GATA", "factor", ",", "pannier", ",", "is", "required", "both", "upstream", "and", "downstream", "of", "the", "Nkx2", ".5", "homologue", ",", "tinman", "-LRB-", "Gajewski", "et", "al.", ",", "2001", ";", "Klinedinst", "and", "Bodmer", ",", "2003", "-RRB-", ".", "In", "the", "nematode", ",", "the", "GATA", "factors", ",", "Med1", "and", "2", ",", "are", "expressed", "in", "the", "mesendodermal", "precursor", "to", "the", "mesoderm", "giving", "rise", "to", "part", "of", "the", "pharynx", ",", "an", "organ", "that", "has", "homologies", "to", "the", "heart", ",", "and", "upstream", "of", "the", "Nkx2", ".5", "homologue", ",", "ceh22", ",", "suggesting", "that", "an", "early", "role", "for", "GATA", "factors", "may", "be", "ancestral", "-LRB-", "Broitman-Maduro", "et", "al.", ",", "2006", ";", "Maduro", "et", "al.", ",", "2001", ";", "Rodaway", "and", "Patient", ",", "2001", "-RRB-", ".", "Mesendodermal", "expression", "is", "seen", "for", "both", "GATA5", "and", "GATA6", "in", "zebrafish", ",", "while", "in", "Xenopus", ",", "mesendodermal", "expression", "is", "seen", "for", "GATA4", "and", "6", "-LRB-", "Fletcher", "et", "al.", ",", "in", "press", ";", "Rodaway", "et", "al.", ",", "1999", ";", "J.", "Broadbent", ",", "A.", "Gibson", "and", "R.", "Patient", ",", "unpublished", "observations", "-RRB-", ".", "Thus", ",", "the", "early", "role", "for", "GATA5", "in", "zebrafish", "may", "reflect", "its", "early", "expression", "in", "the", "lineage", "of", "cells", "leading", "to", "the", "myocardium", "whereas", ",", "in", "Xenopus", ",", "early", "expression", "of", "GATA5", "is", "restricted", "to", "the", "endoderm", ",", "appearing", "in", "the", "cardiac", "mesoderm", "at", "a", "later", "stage", "-LRB-", "Weber", "et", "al.", ",", "2000", "-RRB-", ".", "That", "GATA6", "is", "also", "expressed", "early", "in", "this", "lineage", "in", "both", "species", ",", "and", "GATA4", "likewise", "in", "Xenopus", ",", "and", "yet", "neither", "plays", "a", "role", "in", "induction", "of", "the", "myocardium", ",", "suggests", "that", "GATA5", ",", "at", "least", "in", "zebrafish", ",", "is", "alone", "in", "containing", "the", "requisite", "amino", "acid", "sequence", "for", "this", "function", ".", "All", "three", "GATA", "factors", "recognise", "the", "same", "DNA", "sequence", "therefore", ",", "in", "the", "absence", "of", "known", "binding", "site", "preferences", "for", "GATA5", ",", "activities", "specific", "to", "GATA5", "are", "likely", "to", "include", "protein", "--", "protein", "interactions", ".", "Thus", ",", "GATA5", "may", "be", "more", "suited", "to", "the", "necessary", "interactions", "in", "the", "early", "mesendoderm", "than", "either", "GATA4", "or", "6", ".", "Feedback", "loops", "and", "timing", "Genetic", "regulatory", "networks", "-LRB-", "GRNs", "-RRB-", "consist", "of", "functionally", "linked", "regulatory", "genes", "encoding", "transcription", "factors", "and", "their", "controlling", "extra-cellular", "signals", "-LRB-", "Davidson", "et", "al.", ",", "2002", "-RRB-", ".", "They", "contain", "motifs", ",", "or", "recurring", "wiring", "patterns", ",", "which", "occur", "with", "frequencies", "far", "greater", "than", "in", "randomised", "networks", "-LRB-", "Lee", "et", "al.", ",", "2002", ";", "Milo", "et", "al.", ",", "2002", ";", "Shen-Orr", "et", "al.", ",", "2002", "-RRB-", ".", "One", "such", "motif", "is", "a", "feedback", "loop", ".", "Mathematical", "modelling", "of", "positive", "feedback", "loops", "indicate", "that", "they", "promote", "the", "persistence", "of", "signals", "and", "have", "the", "potential", "to", "store", "information", ",", "such", "that", ",", "for", "example", ",", "signalling", "can", "readily", "flip", "the", "system", "from", "one", "state", "to", "another", "-LRB-", "Bhalla", "and", "Iyengar", ",", "1999", "-RRB-", ".", "The", "observation", "in", "Drosophila", "that", "pannier", "is", "both", "upstream", "and", "downstream", "of", "tinman", ",", "raises", "the", "possibility", "that", "the", "establishment", "of", "a", "mutual", "regulatory", "loop", "for", "these", "two", "key", "regulators", "is", "critical", "evolutionarily", "-LRB-", "Gajewski", "et", "al.", ",", "2001", ";", "Klinedinst", "and", "Bodmer", ",", "2003", "-RRB-", ".", "Evidence", "for", "a", "similar", "feedback", "loop", "exists", "in", "mice", ",", "where", "a", "cardiac", "GATA", "gene", "has", "been", "shown", "to", "be", "Nkx", "dependent", "and", "vice", "versa", "-LRB-", "Brewer", "et", "al.", ",", "2005", ";", "Davis", "et", "al.", ",", "2000", ";", "Lien", "et", "al.", ",", "1999", ";", "Molkentin", "et", "al.", ",", "2000", "-RRB-", ".", "Davidson", "and", "Erwin", "have", "recently", "proposed", "that", "regulatory", "motifs", "of", "this", "type", "are", "evolutionarily", "stable", "components", "of", "GRNs", ",", "which", "they", "called", "kernels", "-LRB-", "Davidson", "and", "Erwin", ",", "2006", "-RRB-", ".", "They", "highlight", "a", "heart-field", "specification", "kernel", ",", "which", "is", "conserved", "from", "Drosophila", "to", "vertebrates", ".", "Strikingly", "the", "Nkx2", ".5", "/", "tinman", "GATA/pannier", "feedback", "loop", "is", "central", "to", "this", "kernel", ".", "Our", "work", "supports", "this", "hypothesis", "and", "further", "suggests", "that", "the", "establishment", "of", "this", "kernel", "is", "more", "critical", "in", "evolution", "than", "where", "the", "loop", "is", "initiated", ".", "Thus", ",", "GATA", "activity", "is", "required", "to", "initiate", "Nkx2", ".5", "expression", "in", "zebrafish", "but", "not", "in", "Xenopus", ",", "nevertheless", "both", "establish", "the", "loop", "-LRB-", "Fig.", "7A", "-RRB-", ".", "Interestingly", ",", "as", "seen", "for", "GATA", "activity", ",", "the", "requirement", "for", "BMP", "signalling", "differs", "between", "zebrafish", "and", "Xenopus", ".", "Thus", ",", "in", "zebrafish", ",", "BMP", "signalling", "is", "required", "to", "initiate", "expression", "of", "cardiac", "markers", "including", "GATA5", "-LRB-", "Reiter", "et", "al.", ",", "2001", "-RRB-", ",", "whereas", "in", "Xenopus", ",", "it", "is", "only", "required", "for", "their", "maintenance", "-LRB-", "Walters", "et", "al.", ",", "2001", "-RRB-", ".", "In", "view", "of", "the", "links", "between", "BMP", "and", "GATA", "factors", "in", "several", "different", "tissues", ",", "including", "the", "myocardium", ",", "it", "seems", "likely", "that", "the", "early", "requirement", "for", "GATA", "activity", "in", "zebrafish", "is", "linked", "to", "the", "early", "requirement", "for", "BMP", ",", "and", "likewise", "the", "later", "requirement", "in", "Xenopus", "-LRB-", "Fig.", "7B", "-RRB-", "-LRB-", "Peterkin", ",", "2003", "-RRB-", ".", "The", "cascade", "of", "events", "in", "Drosophila", "predicts", "that", "the", "Drosophila", "BMP", "signal", ",", "Decapentaplegic", "-LRB-", "Dpp", "-RRB-", ",", "activates", "tinman", ",", "and", "they", "then", "act", "in", "concert", "to", "initiate", "the", "expression", "of", "pannier", ".", "Subsequently", "tinman", "and", "pannier", "maintain", "each", "other", "'s", "expression", ",", "whilst", "pannier", "-LRB-", "in", "the", "ectoderm", "-RRB-", "maintains", "Dpp", "expression", ".", "Dpp", "signalling", "feeds", "back", "to", "maintain", "expression", "of", "tinman", "and", "pannier", "thus", "completing", "the", "loop", "-LRB-", "Fig.", "7C", ";", "for", "review", "see", "Sorrentino", "et", "al.", ",", "2005", "-RRB-", ".", "Thus", ",", "in", "summary", ",", "the", "data", "imply", "that", "the", "initiating", "factor", "and", "the", "direction", "in", "which", "the", "loop", "flows", "are", "not", "important", ".", "Ultimately", "it", "is", "the", "establishment", "of", "the", "loop", "that", "is", "essential", "and", "failure", "to", "do", "so", "leads", "to", "the", "loss", "of", "differentiated", "myocardium", "." ]

[ "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Analysis", "of", "the", "Tribolium", "homeotic", "complex", ":", "insights", "into", "mechanisms", "constraining", "insect", "Hox", "clusters", "The", "remarkable", "conservation", "of", "Hox", "clusters", "is", "an", "accepted", "but", "little", "understood", "principle", "of", "biology", ".", "Some", "organizational", "constraints", "have", "been", "identified", "for", "vertebrate", "Hox", "clusters", ",", "but", "most", "of", "these", "are", "thought", "to", "be", "recent", "innovations", "that", "may", "not", "apply", "to", "other", "organisms", ".", "Ironically", ",", "many", "model", "organisms", "have", "disrupted", "Hox", "clusters", "and", "may", "not", "be", "well-suited", "for", "studies", "of", "structural", "constraints", ".", "In", "contrast", ",", "the", "red", "flour", "beetle", ",", "Tribolium", "castaneum", ",", "which", "has", "a", "long", "history", "in", "Hox", "gene", "research", ",", "is", "thought", "to", "have", "a", "more", "ancestral-type", "Hox", "cluster", "organization", ".", "Here", ",", "we", "demonstrate", "that", "the", "Tribolium", "homeotic", "complex", "-LRB-", "HOMC", "-RRB-", "is", "indeed", "intact", ",", "with", "the", "individual", "Hox", "genes", "in", "the", "expected", "colinear", "arrangement", "and", "transcribed", "from", "the", "same", "strand", ".", "There", "is", "no", "evidence", "that", "the", "cluster", "has", "been", "invaded", "by", "non-Hox", "protein-coding", "genes", ",", "although", "expressed", "sequence", "tag", "and", "genome", "tiling", "data", "suggest", "that", "noncoding", "transcripts", "are", "prevalent", ".", "Finally", ",", "our", "analysis", "of", "several", "mutations", "affecting", "the", "Tribolium", "HOMC", "suggests", "that", "intermingling", "of", "enhancer", "elements", "with", "neighboring", "transcription", "units", "may", "constrain", "the", "structure", "of", "at", "least", "one", "region", "of", "the", "Tribolium", "cluster", ".", "This", "work", "lays", "a", "foundation", "for", "future", "studies", "of", "the", "Tribolium", "HOMC", "that", "may", "provide", "insights", "into", "the", "reasons", "for", "Hox", "cluster", "conservation", ".", "Introduction", "Hox", "clusters", "arose", "near", "the", "origins", "of", "the", "animal", "kingdom", "-LRB-", "Larroux", "et", "al.", "2007", ";", "Ryan", "et", "al.", "2007", "-RRB-", ".", "The", "last", "common", "ancestor", "of", "the", "protostomes", "and", "deuterostomes", "is", "thought", "to", "have", "had", "a", "cluster", "of", "at", "least", "seven", "genes", "characterized", "by", "a", "common", "transcriptional", "orientation", "and", "by", "colinearity", "in", "the", "order", "of", "the", "genes", "and", "their", "expression", "domains", "along", "the", "anterior", "--", "posterior", "axis", "-LRB-", "reviewed", "in", "Garcia-Fernandez", "2005", "-RRB-", ".", "In", "various", "metazoan", "lineages", ",", "Hox", "clusters", "have", "gained", "or", "lost", "genes", "by", "duplication", "and", "deletion", "but", "often", "have", "maintained", "their", "chromosomal", "order", ",", "transcriptional", "orientation", ",", "and", "both", "spatial", "and", "temporal", "colinearity", "of", "expression", "patterns", "-LRB-", "reviewed", "in", "Ferrier", "and", "Minguillon", "2003", "-RRB-", ",", "suggesting", "that", "Hox", "cluster", "organization", "has", "been", "subject", "to", "strong", "constraints", "during", "evolution", ".", "Classical", "model", "systems", ",", "such", "as", "Drosophila", "and", "Caenorhabditis", "elegans", ",", "have", "provided", "many", "important", "insights", "into", "the", "developmental", "functions", "of", "Hox", "genes", "but", "do", "not", "provide", "particularly", "good", "examples", "of", "Hox", "cluster", "conservation", ".", "The", "Hox", "cluster", "of", "Drosophila", "melanogaster", "is", "split", "into", "two", "parts", "-LRB-", "the", "Antennapedia", "-LRB-", "ANTC", "-RRB-", "and", "bithorax", "-LRB-", "BXC", "-RRB-", "complexes", "-RRB-", ",", "shows", "changes", "in", "transcriptional", "orientation", "of", "some", "genes", ",", "and", "includes", "interspersed", "genes", "of", "independent", "origin", "as", "well", "as", "Hox-derived", "genes", "that", "have", "evolved", "novel", "developmental", "roles", "-LRB-", "reviewed", "in", "Ferrier", "and", "Minguillon", "2003", "-RRB-", ".", "These", "alterations", "suggest", "that", "the", "constraints", "keeping", "the", "Hox", "cluster", "intact", "may", "have", "been", "lost", "in", "the", "lineage", "leading", "to", "Drosophila", ".", "Additional", "Hox", "cluster", "rearrangements", "-LRB-", "breaks", ",", "microinversions", ",", "and", "gene", "transpositions", "-RRB-", "have", "been", "found", "in", "other", "Drosophila", "species", "-LRB-", "Negre", "et", "al.", "2003", ";", "Negre", "and", "Ruiz", "2007", ";", "Von", "Allmen", "et", "al.", "1996", "-RRB-", "as", "well", "as", "in", "the", "silk", "moth", "Bombyx", "mori", "-LRB-", "Yasukochi", "et", "al.", "2004", "-RRB-", ".", "The", "Hox", "genes", "of", "C.", "elegans", "-LRB-", "reviewed", "in", "Aboobaker", "and", "Blaxter", "2003", "-RRB-", "and", "the", "tunicate", "Oikopleura", "dioica", "-LRB-", "Seo", "et", "al.", "2004", "-RRB-", "have", "undergone", "even", "more", "extreme", "loss", "and", "rearrangement", "such", "that", "none", "of", "their", "remaining", "Hox", "genes", "are", "clustered", ".", "In", "most", "cases", ",", "the", "Hox", "genes", "of", "these", "organisms", "still", "show", "spatial", "but", "not", "temporal", "colinearity", ".", "Rapid", "development", "seems", "to", "be", "the", "common", "denominator", "among", "most", "of", "these", "organisms", ",", "perhaps", "making", "temporal", "colinearity", "of", "Hox", "genes", "unnecessary", ",", "or", "even", "undesirable", "-LRB-", "Ferrier", "and", "Holland", "2002", ";", "Ferrier", "and", "Minguillon", "2003", ";", "Negre", "et", "al.", "2005", "-RRB-", ".", "While", "studies", "of", "disrupted", "Hox", "clusters", "have", "provided", "some", "insights", "into", "Hox", "cluster", "maintenance", ",", "a", "more", "complete", "understanding", "will", "require", "analysis", "of", "organisms", "where", "they", "are", "still", "intact", ".", "Studies", "of", "vertebrate", "Hox", "clusters", "have", "uncovered", "several", "potential", "mechanisms", "that", "may", "promote", "temporal", "colinearity", "and", "therefore", "constrain", "the", "organization", "of", "these", "clusters", "-LRB-", "reviewed", "in", "Kmita", "and", "Duboule", "2003", "-RRB-", ".", "These", "include", "progressive", "changes", "in", "chromatin", "state", "along", "the", "length", "of", "the", "cluster", ",", "varying", "affinity", "of", "regulatory", "elements", "to", "a", "gradient", "of", "signal", ",", "and", "the", "presence", "of", "global", "enhancer", "elements", "outside", "the", "cluster", "that", "regulate", "multiple", "genes", "within", "the", "cluster", ".", "However", ",", "it", "is", "not", "clear", "whether", "these", "mechanisms", "apply", "to", "other", "organisms", ".", "Duboule", "-LRB-", "2007", "-RRB-", "has", "suggested", "that", "the", "modern", "vertebrate", "Hox", "clusters", "are", "actually", "more", "organized", "than", "the", "ancestral", "cluster", ".", "Some", "of", "the", "mechanisms", "constraining", "the", "organization", "of", "vertebrate", "Hox", "clusters", "likely", "evolved", "concomitant", "with", "the", "co-option", "of", "Hox", "genes", "for", "functions", "such", "as", "limb", "development", "-LRB-", "Duboule", "2007", ";", "Kmita", "and", "Duboule", "2003", "-RRB-", "and", ",", "therefore", ",", "may", "not", "be", "applicable", "to", "other", "lineages", ".", "Based", "on", "this", "model", ",", "we", "might", "expect", "to", "gain", "a", "better", "understanding", "of", "the", "ancestral", "constraints", "on", "Hox", "clusters", "by", "studying", "a", "less", "organized", "but", "still", "intact", "cluster", ".", "Such", "clusters", "have", "been", "described", "in", "organisms", "as", "diverse", "as", "the", "cephalochordate", "amphioxus", "-LRB-", "Garcia-Fernandez", "and", "Holland", "1994", ";", "Minguillon", "et", "al.", "2005", "-RRB-", ",", "sea", "urchins", "-LRB-", "Cameron", "et", "al.", "2006", "-RRB-", ",", "and", "the", "insects", "Apis", "-LRB-", "Honey", "Bee", "Genome", "Sequencing", "Consortium", "2006", ";", "Dearden", "et", "al.", "2006", "-RRB-", "and", "Anopheles", "-LRB-", "Holt", "et", "al.", "2002", ";", "Negre", "and", "Ruiz", "2007", "-RRB-", ".", "Evidence", "also", "suggests", "that", "the", "red", "flour", "beetle", ",", "Tribolium", "castaneum", ",", "has", "an", "intact", "Hox", "cluster", ".", "Conventional", "cloning", "and", "sequencing", "of", "the", "portion", "of", "the", "cluster", "corresponding", "to", "the", "Drosophila", "Antennapedia", "complex", "has", "shown", "that", "this", "region", "of", "the", "homeotic", "complex", "-LRB-", "HOMC", "-RRB-", "is", "intact", "in", "Tribolium", "-LRB-", "Brown", "et", "al.", "2002", "-RRB-", ".", "Genetic", "mapping", "also", "suggests", "that", "the", "integrity", "of", "the", "Tribolium", "Hox", "cluster", "has", "been", "maintained", "-LRB-", "Beeman", "1987", "-RRB-", ".", "Moreover", ",", "the", "genetic", "methodologies", "possible", "with", "Tribolium", ",", "as", "well", "as", "the", "application", "of", "RNAi", ",", "have", "provided", "a", "comprehensive", "description", "of", "the", "full", "repertoire", "of", "Hox", "genes", "and", "their", "functions", "-LRB-", "e.g.", ",", "Beeman", "et", "al.", "1993", ";", "Beeman", "et", "al.", "1989", ";", "Brown", "et", "al.", "2000", ";", "Shippy", "et", "al.", "2000", ";", "Shippy", "et", "al.", "2006", ";", "Stuart", "et", "al.", "1991", ";", "Stuart", "et", "al.", "1993", ";", "Tomoyasu", "et", "al.", "2005", "-RRB-", ".", "The", "Tribolium", "genome", "has", "recently", "been", "sequenced", ",", "giving", "us", "the", "opportunity", "to", "explore", "the", "structure", "of", "its", "Hox", "cluster", "in", "detail", ".", "Here", ",", "we", "present", "an", "analysis", "of", "several", "Hox", "mutations", "along", "with", "the", "transcriptional", "profile", "of", "the", "cluster", "during", "embryonic", "development", ".", "We", "discuss", "these", "results", "with", "respect", "to", "potential", "mechanisms", "of", "Hox", "cluster", "organization", "and", "constraint", ".", "Materials", "and", "methods", "Sequence", "and", "transposable", "element", "analysis", "Sequence", "analysis", "was", "performed", "using", "Vector", "NTI", "Advance", "10", "-LRB-", "Invitrogen", "-RRB-", ".", "Basic", "Local", "Alignment", "Search", "Tools", "-LRB-", "BLASTs", "-RRB-", "against", "Tribolium", "genome", "sequence", "-LRB-", "Tcas_2.0", "-RRB-", "were", "performed", "at", "http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/blast/blast.cgi?organism=", "Tcastaneum", "or", "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=", "7070", ",", "and", "subsequent", "analysis", "was", "performed", "using", "Genboree", "-LRB-", "http://www.genboree.org/java-bin/login.jsp", "-RRB-", "or", "NCBI", "Map", "Viewer", "-LRB-", "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/", "-RRB-", ".", "The", "entire", "HOMC", "sequence", "was", "used", "as", "a", "BLASTn", "query", "against", "a", "collection", "of", "expressed", "sequence", "tags", "-LRB-", "ESTs", "-RRB-", "provided", "by", "Dr.", "Yoonseong", "Park", "-LRB-", "Department", "of", "Entomology", ",", "Kansas", "State", "University", ",", "Manhattan", ",", "KS", ",", "USA", "-RRB-", ".", "Transposable", "elements", "were", "identified", "and", "classified", "using", "Censor", "to", "search", "the", "arthropod", "subset", "of", "Repbase", "-LRB-", "Kohany", "et", "al.", "2006", "-RRB-", ".", "Array", "design", "and", "probe", "synthesis", "Sequence", "for", "the", "Tribolium", "HOMC", "was", "taken", "from", "the", "Tcas_2.0", "Baylor", "HSGC", "assembly", ".", "The", "tiled", "region", "consists", "of", "∼", "810,000", "bases", "from", "LG2", "-LRB-", "2,290,000", "to", "301,000", "-RRB-", "stretching", "between", "the", "two", "non-Hox", "genes", "flanking", "the", "complex", ".", "NimbelGen", "designed", "∼", "50", "mer", "oligos", "covering", "this", "region", "at", "two", "densities", ":", "-LRB-", "1", "-RRB-", "one", "feature", "per", "91", "bp", "and", "-LRB-", "2", "-RRB-", "one", "feature", "per", "70", "bp", ".", "An", "additional", "region", "spanning", "5", "kb", "on", "either", "side", "of", "the", "putative", "homolog", "of", "dme-miR-iab-4", "was", "tiled", "at", "a", "higher", "density", "of", "one", "feature", "every", "10", "bp", ".", "Visualization", "and", "scaling", "of", "tiling", "data", "was", "performed", "using", "Integrated", "Genome", "Browser", "-LRB-", "Affymetrix", ",", "http://www.affymetrix.com/support/developer/tools/download_igb.affx", "-RRB-", ".", "Tribolium", "0", "--", "72-h-old", "embryos", ",", "grown", "at", "30", "°C", "in", "standard", "media", ",", "were", "collected", "by", "sieving", ",", "dechorionated", "for", "2", "min", "in", "100", "%", "bleach", ",", "and", "homogenized", "in", "200", "μl", "of", "Trizol", "using", "a", "teflon", "pestle", ".", "Total", "RNA", "was", "then", "extracted", "using", "the", "standard", "Trizol", "protocol", "-LRB-", "Invitrogen", "-RRB-", ".", "dsDNA", "was", "prepared", "from", "∼", "10", "μg", "of", "total", "RNA", "with", "random", "hexamers", "according", "to", "Kapranov", "et", "al.", "-LRB-", "2002", "-RRB-", ",", "with", "the", "following", "modifications", ".", "Primers", "were", "annealed", "using", "a", "20-min", "ramp", "to", "15", "°C", ",", "and", "the", "first", "strand", "reaction", "was", "not", "subdivided", "for", "second", "strand", "synthesis", ".", "The", "resulting", "cDNA", "was", "used", "as", "template", "by", "NimbelGen", "for", "labeling", "and", "hybridization", "-LRB-", "Squazzo", "et", "al.", "2006", "-RRB-", ".", "Fluorescent", "in", "situ", "hybridization", "Probe", "labeling", ",", "embryo", "fixation", ",", "and", "RNA", "FISH", "were", "performed", "according", "to", "Kosman", "et", "al.", "-LRB-", "2004", "-RRB-", "with", "the", "following", "modifications", ".", "Tribolium", "embryos", "were", "dechorionated", "in", "100", "%", "bleach", "for", "2", "min", "and", "agitated", "for", "45", "min", "to", "1", "h.", "Embryos", "were", "devitellinized", "by", "alternating", "1", "min", "vortexing", "with", "1", "min", "shaking", "for", "5", "min", "after", "the", "addition", "of", "cold", "methanol", ",", "followed", "by", "passage", "through", "an", "18-gauge", "syringe", "three", "to", "five", "times", ".", "Primers", "used", "for", "making", "the", "TcNC-1", "and", "iab-4", "probes", "are", "as", "follows", ":", "TcNC5", "′", ":", "AGATAAGATATAATGAGGTGTAGAGTTG", ",", "TcNC3", "′", ":", "TGATTAACATGGACGGCTTCATTAG", ",", "iab-45", "′", ":", "CATCCTATGCACATGCGTTC", ",", "iab-43", "′", ":", "CGTTTTAATGGGTGCATCGT", ".", "Dig-labeled", "RNA", "probes", "were", "detected", "using", "sheepαDIG", "-LRB-", "Roche", "-RRB-", "primary", "and", "donkeyαsheep", "Alexa", "Fluor", "555", "-LRB-", "Molecular", "Probes", "-RRB-", "secondary", "antibodies", ".", "Genetics", "Beetles", "were", "cultured", "at", "30", "°C", "on", "whole", "wheat", "flour", "supplemented", "with", "5", "%", "brewer", "'s", "yeast", "as", "described", "by", "Beeman", "et", "al.", "-LRB-", "1989", "-RRB-", ".", "Strains", "used", "were", ":", "Ga-1", "and", "Ga-2", "-LRB-", "wild", "type", "-RRB-", ";", "mxpDch-3", "/", "Ey", ";", "Cx6/AEs", ";", "ptlKT76", "/", "+", ";", "Cx61/AEs", ";", "ptlD60/Ey", "and", "Dfd1/AEs", ".", "Eyeless", "-LRB-", "Ey", ";", "Beeman", "et", "al.", "1996", "-RRB-", "and", "AbdominalExtra", "sclerite", "-LRB-", "AEs", ";", "Beeman", "et", "al.", "1989", "-RRB-", "are", "dominantly", "marked", "balancer", "chromosomes", "that", "suppress", "crossing", "over", "within", "the", "HOMC", ".", "Cuticle", "preparations", "were", "performed", "as", "described", "by", "Shippy", "et", "al.", "-LRB-", "2000", "-RRB-", ".", "For", "documentation", ",", "cuticles", "were", "placed", "in", "9:1", "lactic", "acid/ethanol", "on", "a", "depression", "slide", "and", "covered", "with", "a", "coverslip", ".", "Images", "were", "captured", "at", "several", "focal", "planes", "using", "a", "Nikon", "DXM1200F", "digital", "camera", "and", "combined", "into", "a", "single", "image", "using", "Auto-Montage", "software", "-LRB-", "Syncrosopy", "-RRB-", ".", "RNAi", "Parental", "RNAi", "for", "ptl/Tc-Antp", "was", "performed", "by", "injection", "of", "dsRNA", "into", "the", "abdomens", "of", "female", "pupae", ".", "Eggs", "were", "collected", "from", "injected", "females", "at", "3-day", "intervals", ",", "aged", "to", "hatching", ",", "and", "subjected", "to", "cuticle", "preparation", ".", "Analysis", "of", "ptlD60", "breakpoints", "Eggs", "were", "collected", "after", "overnight", "incubation", "at", "30", "°C", "and", "allowed", "to", "develop", "for", "3", "days", ".", "Genomic", "DNA", "was", "isolated", "from", "individual", "ptlD60", "homozygous", "larvae", "as", "described", "by", "Gloor", "et", "al.", "-LRB-", "1993", "-RRB-", ".", "Polymerase", "chain", "reaction", "-LRB-", "PCR", "-RRB-", "surveys", "of", "the", "HOMC", "were", "used", "to", "identify", "likely", "breakpoint", "positions", ",", "and", "fragments", "spanning", "these", "putative", "breakpoints", "were", "amplified", "using", "universal", "PCR", "-LRB-", "Beeman", "and", "Stauth", "1997", ";", "Sarkar", "et", "al.", "1993", "-RRB-", ".", "PCR", "products", "were", "cloned", "and", "sequenced", "at", "the", "Kansas", "State", "University", "DNA", "Sequencing", "Center", ".", "The", "resulting", "sequences", "were", "compared", "to", "the", "Tribolium", "genome", "sequence", "to", "characterize", "the", "breakpoints", ".", "GenBank", "accession", "numbers", "for", "these", "sequences", "are", "as", "follows", ":", "ptlD60", "A", "-LRB-", "EF591668", "-RRB-", "and", "ptlD60", "B", "-LRB-", "EF591669", "-RRB-", ".", "Analysis", "of", "mxpDch-3", "breakpoints", "Tribolium", "genomic", "DNA", "was", "isolated", "from", "mxpDch-3", "/", "Ey", ",", "AEs/Ey", ",", "and", "Ga-1", "pupae", "as", "described", "by", "Brown", "et", "al.", "-LRB-", "1990", "-RRB-", ",", "with", "the", "exception", "that", "DNA", "was", "not", "purified", "on", "a", "CsCl", "gradient", ".", "Digested", "DNAs", "were", "separated", "on", "a", "0.7", "%", "agarose", "gel", "by", "field", "inversion", "gel", "electrophoresis", "and", "transferred", "to", "GeneScreen", "nylon", "membrane", "-LRB-", "NEN", "Life", "Sciences", "-RRB-", ".", "To", "look", "for", "restriction", "fragment", "length", "polymorphisms", "associated", "with", "mxpDch-3", ",", "the", "blot", "was", "probed", "with", "pBmxp2", ".1", ",", "a", "5.2", "kb", "HindIII", "fragment", "containing", "the", "5", "′", "end", "of", "the", "mxp/Tc-pb", "coding", "region", ".", "Inverse", "PCR", "-LRB-", "Ochman", "et", "al.", "1988", "-RRB-", "was", "used", "to", "clone", "breakpoints", "associated", "with", "mxpDch-3", ".", "mxpDch-3", "/", "Ey", "genomic", "DNA", "was", "digested", "with", "a", "restriction", "enzyme", "-LRB-", "EcoRI", ",", "HindIII", ",", "and", "RsaI", "for", "breakpoint", "fragments", "A", ",", "B", ",", "and", "C", ",", "respectively", "-RRB-", ".", "After", "circularization", "of", "the", "fragments", ",", "two", "rounds", "of", "PCR", "were", "performed", "with", "primers", "designed", "from", "known", "sequence", ".", "Resulting", "fragments", "were", "cloned", "using", "the", "TOPO-TA", "Cloning", "Kit", "-LRB-", "Invitrogen", "-RRB-", ",", "sequenced", ",", "and", "submitted", "to", "GenBank", "under", "the", "following", "accession", "numbers", ":", "Dch3", "A", "-LRB-", "EF591670", "-RRB-", ",", "Dch3", "B", "-LRB-", "EF591671", "-RRB-", ",", "Dch3", "C", "-LRB-", "EF591672", "-RRB-", ".", "Sequences", "were", "compared", "to", "the", "Tribolium", "genome", "sequence", "to", "determine", "the", "location", "of", "breakpoints", ".", "Analysis", "of", "ptlKT76", "transposon", "insertion", "site", "The", "ptlKT76", "piggyBac-insertion", "site", "was", "amplified", "by", "vectorette", "PCR", "as", "described", "by", "Lorenzen", "et", "al.", "-LRB-", "2007", "-RRB-", ".", "The", "resulting", "product", "was", "sequenced", "by", "Elim", "Biopharmaceuticals", ",", "Inc.", "-LRB-", "Hayward", ",", "CA", ",", "USA", "-RRB-", "and", "the", "sequence", "was", "submitted", "to", "GenBank", "as", "accession", "number", "EU056827", ".", "Results", "The", "Tribolium", "Hox", "cluster", "has", "retained", "an", "ancestral", "organization", "Several", "bacterial", "artificial", "chromosome", "-LRB-", "BAC", "-RRB-", "clones", "encompassing", "the", "ANTC-like", "region", "of", "the", "Tribolium", "Hox", "cluster", "were", "previously", "sequenced", "and", "annotated", "-LRB-", "Brown", "et", "al.", "2002", "-RRB-", ".", "Using", "the", "newly", "assembled", "Tribolium", "genome", "sequence", ",", "we", "have", "performed", "a", "similar", "analysis", "of", "the", "BXC-like", "portion", "of", "the", "cluster", "and", "find", "that", "this", "region", "contains", "the", "Tribolium", "orthologs", "of", "Ultrabithorax", "-LRB-", "Ubx", ";", "Bennett", "et", "al.", "1999", "-RRB-", ",", "abdominal-A", "-LRB-", "abd-A", ";", "Shippy", "et", "al.", "1998", "-RRB-", "and", "Abdominal-B", "-LRB-", "Abd-B", "-RRB-", ".", "As", "in", "Drosophila", ",", "the", "transcription", "units", "in", "this", "part", "of", "the", "complex", "are", "larger", "than", "those", "of", "the", "ANTC-like", "portion", "due", "to", "the", "presence", "of", "longer", "introns", ".", "As", "expected", "from", "previous", "molecular", "and", "genetic", "studies", "-LRB-", "Beeman", "1987", ";", "Brown", "et", "al.", "2002", "-RRB-", ",", "all", "of", "the", "Tribolium", "Hox", "genes", "map", "to", "a", "single", "cluster", "on", "LG2", ".", "This", "cluster", "spans", "approximately", "756", "Kb", "within", "a", "single", "scaffold", "of", "the", "assembled", "genome", "sequence", ".", "A", "few", "small", "sequencing", "gaps", "are", "present", "in", "the", "assembly", ",", "but", "more", "than", "half", "can", "be", "filled", "by", "other", "available", "sequences", "-LRB-", "i.e.", ",", "the", "three", "BAC", "clones", "previously", "sequenced", "for", "the", "ANTC-like", "portion", "of", "the", "cluster", "and", "four", "BACs", "from", "the", "BXC-like", "region", "sequenced", "for", "verification", "of", "the", "shotgun", "genome", "assembly", ";", "Tribolium", "Genome", "Consortium", "2008", "-RRB-", ".", "The", "total", "length", "of", "the", "filled", "gaps", "is", "approximately", "2,635", "bp", "-LRB-", "mismatches", "in", "the", "sequence", "flanking", "the", "gaps", "lead", "to", "some", "ambiguity", "-RRB-", ",", "which", "is", "only", "slightly", "longer", "than", "the", "estimated", "total", "length", "of", "these", "gaps", "-LRB-", "1,938", "bp", "-RRB-", ".", "Thus", ",", "estimation", "of", "sequencing", "gaps", "in", "the", "HOMC", "region", "appears", "to", "be", "quite", "accurate", ".", "Two", "of", "these", "gaps", "are", "immediately", "adjacent", "to", "transposable", "element", "insertion", "sites", "and", "may", "result", "from", "difficulties", "in", "assembling", "repetitive", "DNA", ".", "These", "two", "sites", "account", "for", "about", "1,300", "bp", "of", "the", "total", "gaps", "in", "the", "HOMC", ".", "In", "two", "other", "cases", ",", "gaps", "in", "the", "genome", "assembly", "are", "associated", "with", "tandem", "duplications", "that", "are", "not", "present", "in", "the", "BAC", "assemblies", ":", "an", "approximately", "160-bp", "duplication", "between", "Tc-Deformed", "-LRB-", "Tc-Dfd", "-RRB-", "and", "Tc-zen1", "and", "an", "approximately", "8.5-kb", "duplication", "between", "prothoraxless/Tc-Antennapedia", "-LRB-", "ptl/Tc-Antp", "-RRB-", "and", "Tc-fushi", "tarazu", "-LRB-", "Tc-ftz", "-RRB-", ".", "We", "designed", "primers", "to", "amplify", "across", "the", "regions", "in", "question", "using", "Ga-2", "genomic", "DNA", "-LRB-", "the", "same", "inbred", "strain", "that", "was", "used", "for", "the", "Tribolium", "genome", "sequence", "-RRB-", ".", "In", "both", "cases", ",", "the", "size", "of", "the", "resulting", "fragment", "is", "consistent", "with", "that", "predicted", "from", "the", "BAC", "sequence", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ",", "suggesting", "that", "these", "gaps", "and", "duplications", "are", "artifacts", "of", "the", "genome", "assembly", "process", ".", "It", "is", "important", "to", "note", "that", "these", "artifacts", "affect", "only", "a", "small", "fraction", "of", "the", "HOMC", "sequence", ",", "but", "they", "underscore", "the", "increased", "quality", "of", "finished", "versus", "draft", "sequences", ".", "The", "single", "Tribolium", "Hox", "cluster", "contains", "orthologs", "of", "all", "eight", "Drosophila", "Hox", "genes", ",", "as", "well", "as", "orthologs", "of", "the", "Hox-derived", "genes", ",", "fushi", "tarazu", "and", "zerknüllt", "-LRB-", "zen", ";", "Tribolium", "Genome", "Consortium", "2008", "and", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "-LRB-", "In", "the", "case", "of", "zen", ",", "Tribolium", "has", "two", "paralogs", "apparently", "resulting", "from", "a", "recent", "duplication", "in", "the", "beetle", "lineage", ",", "independent", "of", "the", "zen", "duplication", "that", "occurred", "in", "the", "Drosophila", "lineage", "-LRB-", "Brown", "et", "al.", "2002", "-RRB-", "-RRB-", ".", "These", "genes", "are", "arranged", "in", "the", "same", "order", "on", "the", "chromosome", "as", "their", "counterparts", "in", "other", "insects", ".", "As", "in", "Apis", "-LRB-", "Dearden", "et", "al.", "2006", ";", "Negre", "and", "Ruiz", "2007", "-RRB-", ",", "but", "in", "contrast", "to", "Drosophila", "and", "Anopheles", "-LRB-", "Negre", "and", "Ruiz", "2007", "-RRB-", ",", "the", "Hox", "and", "Hox-derived", "genes", "in", "the", "Tribolium", "cluster", "are", "all", "oriented", "in", "the", "same", "direction", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "the", "two", "miRNA", "genes", "-LRB-", "miR-10", "and", "miR-iab-4", "-RRB-", "that", "have", "been", "described", "in", "other", "insect", "Hox", "clusters", "are", "found", "at", "conserved", "positions", "in", "the", "Tribolium", "HOMC", "-LRB-", "Tanzer", "et", "al.", "2005", "and", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "Fig.", "1Embryonic", "transcription", "across", "the", "complete", "Tribolium", "Hox", "complex", ".", "The", "tiling", "array", "consists", "of", "∼", "50,000", "50", "bp", "probes", "that", "estimate", "degree", "of", "transcription", ".", "Relative", "intensities", "for", "each", "probe", "are", "represented", "as", "peaks", "correlated", "with", "a", "consensus", "annotation", "of", "the", "Tribolium", "Hox", "complex", "-LRB-", "below", "-RRB-", ".", "Peak", "height", ",", "shown", "as", "Percentile", "Probe", "Intensity", "-LRB-", "PPI", "-RRB-", ",", "corresponds", "to", "the", "level", "of", "transcription", "for", "a", "particular", "probe", ".", "The", "nucleotide", "position", "for", "each", "segment", "is", "displayed", "in", "the", "upper", "left", "and", "right", "corners", "of", "the", "panel", "-LRB-", "numbers", "correspond", "with", "linkage", "group", "2", ",", "release", "Tcas_2.0", "-RRB-", ".", "New", "ESTs", "-LRB-", "cyan", "-RRB-", "are", "displayed", "in", "the", "annotation", "track", "along", "with", "transposable", "elements", "-LRB-", "gray", "-RRB-", ".", "For", "annotated", "genes", "and", "ESTs", ",", "the", "arrow", "indicates", "the", "direction", "of", "transcription", ".", "Red", "arrows", "indicate", "the", "location", "of", "two", "RNA-FISH", "probes", "The", "ANTC", "and", "BXC", "clusters", "of", "Drosophila", "melanogaster", "contain", "a", "number", "of", "non-Hox", ",", "protein-coding", "genes", ".", "In", "contrast", ",", "there", "is", "no", "evidence", "for", "non-Hox", ",", "protein-coding", "genes", "in", "the", "Tribolium", "HOMC", "-LRB-", "The", "Tribolium", "Genome", "Consortium", "2008", "-RRB-", ".", "Here", ",", "we", "corroborate", "those", "findings", "by", "using", "several", "methods", "to", "address", "whether", "unrelated", "genes", "might", "be", "interspersed", "among", "the", "Tribolium", "Hox", "genes", ".", "First", ",", "we", "searched", "the", "Tribolium", "genome", "for", "orthologs", "of", "genes", "that", "are", "located", "within", "the", "D.", "melanogaster", "clusters", "and", "determined", "that", "none", "of", "these", "genes", "are", "located", "within", "the", "Tribolium", "HOMC", ".", "Second", ",", "we", "analyzed", "predicted", "proteins", "within", "the", "region", "to", "determine", "whether", "any", "of", "them", "have", "recognizable", "orthologs", "in", "other", "species", ".", "Other", "than", "the", "Hox", "and", "Hox-derived", "genes", ",", "we", "found", "no", "evolutionarily", "conserved", "proteins", "among", "either", "the", "GLEAN", "predictions", "or", "the", "GNOMON", "ab", "initio", "predictions", "that", "map", "to", "the", "Hox", "cluster", ".", "Third", ",", "we", "searched", "a", "collection", "of", "Tribolium", "ESTs", "for", "expressed", "sequences", "within", "the", "HOMC", ".", "By", "this", "approach", ",", "we", "identified", "three", "non-Hox", "EST", "clusters", "that", "appear", "to", "represent", "noncoding", "transcripts", "as", "well", "as", "evidence", "for", "a", "mariner", "transposase", "gene", "-LRB-", "see", "below", "-RRB-", ",", "but", "no", "other", "protein-coding", "genes", "were", "found", ".", "Finally", ",", "we", "analyzed", "the", "embryonically", "transcribed", "sequences", "identified", "by", "a", "tiling", "array", "to", "determine", "if", "any", "were", "likely", "to", "encode", "proteins", ".", "Again", ",", "we", "found", "no", "evidence", "of", "non-Hox-related", "protein-coding", "genes", "other", "than", "those", "within", "transposable", "elements", ".", "Although", "there", "are", "caveats", "to", "these", "analyses", "-LRB-", "e.g.", ",", "gene", "prediction", "methods", "are", "imperfect", ",", "the", "tiling", "array", "represents", "only", "the", "embryonic", "transcriptome", "and", "EST", "coverage", "is", "incomplete", "-RRB-", ",", "our", "results", "strongly", "suggest", "that", "the", "protein-coding", "genes", "in", "the", "Tribolium", "Hox", "complex", "-LRB-", "excluding", "genes", "within", "transposable", "elements", "-RRB-", "are", "all", "either", "Hox", "or", "Hox-derived", "genes", ".", "Comparison", "of", "transposable", "element", "density", "in", "the", "Hox", "complexes", "of", "various", "animals", "has", "led", "to", "the", "suggestion", "that", "higher", "abundance", "of", "transposable", "elements", "in", "Hox", "clusters", "is", "correlated", "with", "loss", "of", "structural", "integrity", ".", "Mammalian", "Hox", "complexes", "have", "a", "reduced", "number", "of", "transposons", "compared", "to", "other", "regions", "of", "the", "genome", "-LRB-", "Ferrier", "and", "Minguillon", "2003", "-RRB-", ".", "Moreover", ",", "when", "transposons", "are", "present", ",", "they", "seem", "to", "be", "preferentially", "inserted", "into", "nontranscribed", "regions", "of", "the", "clusters", "-LRB-", "Mainguy", "et", "al.", "2007", "-RRB-", ".", "In", "contrast", ",", "transposons", "occur", "fairly", "frequently", "in", "the", "split", "Drosophila", "clusters", "-LRB-", "Fried", "et", "al.", "2004", "-RRB-", ".", "Though", "the", "prediction", "of", "three", "transposable", "elements", "in", "the", "Tribolium", "Hox", "complex", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", "may", "be", "an", "underestimate", ",", "the", "same", "method", "predicts", "fivefold", "more", "in", "the", "Drosophila", "Hox", "clusters", ".", "Additionally", ",", "only", "three", "transposable", "elements", "-LRB-", "all", "mariners", "-RRB-", "have", "been", "found", "in", "the", "larger", "but", "intact", "Apis", "Hox", "complex", "-LRB-", "Dearden", "et", "al.", "2006", "-RRB-", ".", "These", "numbers", "are", "consistent", "with", "the", "apparent", "inverse", "correlation", "between", "transposon", "number", "and", "the", "level", "of", "Hox", "cluster", "organization", ".", "Taken", "together", ",", "these", "observations", "suggest", "that", "with", "respect", "to", "gene", "content", ",", "order", ",", "and", "orientation", ",", "the", "Tribolium", "Hox", "cluster", "closely", "resembles", "the", "putative", "ancestral", "Hox", "cluster", "-LRB-", "Garcia-Fernandez", "2005", "-RRB-", ".", "Thus", ",", "the", "constraints", "preserving", "the", "integrity", "of", "the", "Hox", "cluster", "may", "still", "be", "in", "force", "in", "Tribolium", ".", "To", "determine", "whether", "these", "constraints", "extend", "outside", "the", "Tribolium", "Hox", "cluster", ",", "we", "examined", "synteny", "beyond", "the", "cluster", "itself", ".", "As", "previously", "described", ",", "Tc-chaoptic", "partially", "overlaps", "the", "3", "′", "UTR", "of", "Tc-labial", "-LRB-", "Tc-lab", "-RRB-", "on", "the", "opposite", "strand", "-LRB-", "Nie", "et", "al.", "2001", "-RRB-", ".", "Working", "outward", ",", "the", "first", "gene", "on", "the", "same", "strand", "as", "the", "Hox", "genes", "is", "Tc_00927", ",", "a", "dolichyl", "glycosyltransferase", "orthologous", "to", "D.", "melanogaster", "CG4542", ".", "Beyond", "the", "Tc-Abd-B", "locus", "is", "a", "cluster", "of", "putative", "serine", "carboxypeptidase", "genes", "-LRB-", "Tc_00887", ",", "Tc_00664", ",", "Tc_00665", ",", "and", "Tc_00666", "-RRB-", "and", "the", "ortholog", "of", "D.", "melanogaster", "CG3909", "-LRB-", "Tc_00886", "-RRB-", ".", "We", "identified", "the", "orthologs", "of", "these", "genes", "in", "D.", "melanogaster", ",", "Anopheles", "gambiae", ",", "and", "Apis", "mellifera", "and", "determined", "their", "map", "positions", ".", "None", "of", "these", "genes", "map", "near", "the", "Hox", "cluster", "in", "any", "of", "the", "other", "insects", ".", "Likewise", ",", "orthologs", "of", "the", "genes", "adjacent", "to", "lab", "and", "Abd-B", "in", "D.", "melanogaster", "do", "not", "map", "near", "the", "Hox", "clusters", "of", "the", "other", "three", "insects", ".", "These", "results", "suggest", "that", "the", "constraints", "preserving", "the", "Hox", "cluster", "act", "only", "on", "the", "Hox", "genes", "themselves", "and", "not", "the", "surrounding", "region", ".", "The", "Tribolium", "Hox", "cluster", "produces", "numerous", "noncoding", "transcripts", "We", "developed", "a", "tiling", "microarray", "covering", "the", "Tribolium", "Hox", "complex", "to", "identify", "the", "transcription", "units", "active", "during", "a", "broad", "window", "of", "Tribolium", "embryonic", "development", ".", "Tiling", "array", "signal", "intensity", "profiles", "were", "compared", "with", "previously", "described", "Hox", "cDNA", "structures", ".", "Though", "the", "tiling", "density", "is", "not", "fine-scaled", "enough", "to", "effectively", "resolve", "intron", "--", "exon", "boundaries", ",", "there", "is", "a", "near-perfect", "correlation", "between", "tiling", "array-predicted", "transcription", "and", "the", "position", "of", "exons", "in", "the", "well-characterized", "Hox", "genes", ".", "The", "only", "caveat", "is", "that", "the", "5", "′", "exons", "of", "maxillopedia/Tc-proboscipedia", "-LRB-", "mxp/Tc-pb", "-RRB-", "and", "Tc-Abd-B", "exhibit", "weaker", "signals", "than", "the", "other", "exons", "of", "these", "genes", ".", "The", "most", "likely", "explanation", "is", "that", "the", "5", "′", "exon", "is", "present", "only", "in", "a", "small", "subset", "of", "the", "transcripts", "derived", "from", "the", "gene", "-LRB-", "i.e.", ",", "a", "minor", "spliceoform", "-RRB-", ".", "During", "the", "first", "3", "days", "of", "development", ",", "numerous", "regions", "of", "the", "Hox", "complex", ",", "including", "intergenic", "and", "intronic", "noncoding", "regions", ",", "are", "actively", "transcribed", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "Interestingly", ",", "neither", "of", "the", "two", "most", "likely", "noncoding", "candidates", ",", "the", "previously", "described", "miRNAs", ",", "is", "robustly", "identified", "on", "the", "tiling", "array", ".", "Transcription", "at", "the", "tca-miR-10", "locus", "is", "not", "detected", ",", "and", "transcription", "at", "the", "tca-miR-iab-4", "locus", "is", "weak", ".", "It", "may", "be", "that", "tca-miR-10", "is", "not", "expressed", "during", "the", "stages", "examined", ",", "whereas", "in", "situ", "hybridization", "assays", "show", "that", "tca-miR-iab-4", "is", "strongly", "expressed", "during", "part", "of", "the", "developmental", "window", "examined", "-LRB-", "Fig.", "2b", "-RRB-", ".", "Fig.", "2Expression", "pattern", "of", "two", "HOMC", "noncoding", "transcripts", "in", "Tribolium", "embryos", ".", "Probe", "positions", "are", "shown", "in", "Fig.", "1", ".", "a", "Expression", "pattern", "from", "a", "1-kb", "probe", "located", "∼", "86", "kb", "5", "′", "of", "the", "start", "of", "ptl/Tc-Antp", ".", "b", "The", "expression", "pattern", "of", "the", "Tribolium", "homolog", "of", "the", "iab-4", "miRNA", "-LRB-", "tca-miR-iab-4", "-RRB-", "The", "most", "intense", "hybridization", "signals", "are", "detected", "in", "the", "central", "250", "kb", "of", "the", "Hox", "complex", ",", "encompassing", "the", "ptl/Tc-Antp", "and", "Ultrathorax/Tc-Ultrabithorax", "-LRB-", "Utx/Tc-Ubx", "-RRB-", "genes", ".", "Strikingly", ",", "transcription", "in", "this", "region", "is", "almost", "equally", "intense", "for", "coding", "and", "noncoding", "loci", ",", "and", "for", "both", "the", "introns", "and", "exons", "of", "the", "protein-coding", "genes", ".", "There", "are", "hundreds", "of", "discrete", "regions", "-LRB-", "500", "bp", "or", "longer", "-RRB-", "where", "signal", "intensity", "is", "many", "times", "greater", "than", "for", "verified", "Hox", "gene", "exons", ".", "It", "is", "not", "possible", "to", "determine", "from", "the", "single", "time", "point", "we", "have", "analyzed", "if", "any", "of", "these", "discrete", "regions", "are", "part", "of", "larger", "transcripts", ".", "To", "verify", "that", "the", "observed", "signals", "in", "the", "tiling", "array", "represent", "authentic", "transcription", ",", "RNA", "fluorescent", "in", "situ", "hybridization", "-LRB-", "FISH", "-RRB-", "was", "performed", "with", "a", "representative", "1-kb", "region", "between", "ptl/Tc-Antp", "and", "Utx/Tc-Ubx", "-LRB-", "TcNC-1", "in", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "This", "region", "is", "expressed", "in", "a", "Hox-like", "pattern", "with", "distinct", "anterior", "and", "posterior", "borders", "in", "the", "posterior", "region", "of", "the", "elongating", "germ", "band", "-LRB-", "Fig.", "2a", "-RRB-", ".", "Interestingly", ",", "signal", "is", "detected", "primarily", "in", "two", "spots", "per", "nucleus", ",", "presumably", "at", "the", "sites", "of", "nascent", "transcription", ".", "This", "suggests", "either", "rapid", "degradation", "or", "processing", "of", "a", "primary", "transcript", "as", "would", "be", "seen", "for", "a", "pri-miRNA", "or", "an", "intron", ".", "In", "our", "search", "for", "additional", "genes", "within", "the", "Tribolium", "Hox", "cluster", ",", "we", "identified", "three", "ESTs", "that", "appear", "to", "represent", "noncoding", "transcripts", ".", "One", "seems", "to", "be", "a", "chimeric", "artifact", ",", "arising", "from", "the", "fusion", "of", "a", "tca-miR-10", "precursor", "and", "part", "of", "a", "28s", "rRNA", "gene", ".", "The", "second", ",", "represented", "by", "two", "independent", "cDNAs", ",", "maps", "between", "ptl/Tc-Antp", "and", "Utx/Tc-Ubx", "while", "the", "third", "is", "located", "within", "the", "first", "intron", "of", "Utx/Tc-Ubx", ".", "The", "last", "two", "are", "transcribed", "from", "the", "strand", "opposite", "the", "Hox", "genes", "and", "are", "correlated", "with", "regions", "of", "strong", "signal", "in", "the", "tiling", "array", "analysis", ".", "The", "mxpDch-3", "mutation", "affects", "regulation", "of", "both", "mxp/Tc-pb", "and", "Cx/Tc-Scr", "Because", "complex", "regulatory", "regions", "may", "act", "as", "a", "constraining", "force", "keeping", "Hox", "clusters", "intact", ",", "we", "analyzed", "the", "mxpDch-3", "mutation", ",", "which", "was", "shown", "to", "have", "unusual", "effects", "on", "the", "expression", "of", "mxp/Tc-pb", "-LRB-", "Shippy", "et", "al.", "2000", "-RRB-", ";", "mxpDch-3", "homozygotes", "lack", "most", ",", "if", "not", "all", ",", "normal", "mxp/Tc-pb", "expression", ",", "but", "both", "heterozygotes", "and", "homozygotes", "display", "strong", "ectopic", "mxp/Tc-pb", "expression", "in", "a", "pattern", "reminiscent", "of", "Cephalothorax/Tc-Sex", "combs", "reduced", "-LRB-", "Cx/Tc-Scr", "-RRB-", "expression", "-LRB-", "albeit", "with", "an", "apparent", "posterior", "shift", "of", "some", "domains", "-RRB-", ".", "This", "ectopic", "expression", "is", "sufficient", "to", "rescue", "some", "aspects", "of", "mxp/Tc-pb", "function", "so", "mxpDch-3", "is", "not", "an", "mxp/Tc-pb", "null", "-LRB-", "Shippy", "et", "al.", "2000", "-RRB-", ".", "Interestingly", ",", "we", "find", "that", "mxpDch-3", "fails", "to", "complement", "a", "null", "allele", "of", "Cx/Tc-Scr", "-LRB-", "and", ",", "in", "fact", ",", "appears", "to", "be", "null", "for", "Cx/Tc-Scr", "-RRB-", "but", "complements", "null", "alleles", "of", "Tc-Dfd", "and", "ptl/Tc-Antp", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "To", "better", "understand", "this", "complex", "mutation", ",", "we", "characterized", "the", "breakpoints", "associated", "with", "mxpDch-3", ".", "mxpDch-3", "is", "associated", "with", "a", "chromosomal", "rearrangement", "involving", "at", "least", "four", "breakpoints", ".", "Although", "we", "have", "not", "ruled", "out", "the", "presence", "of", "additional", "breakpoints", ",", "the", "simplest", "interpretation", "of", "our", "data", "is", "that", "a", "fragment", "of", "the", "HOMC", "-LRB-", "including", "Tc-zen1", ",", "Tc-zen2", ",", "Tc-Dfd", ",", "Cx/Tc-Scr", ",", "and", "Tc-ftz", "-RRB-", "has", "been", "removed", "from", "the", "HOMC", "and", "inserted", "between", "a", "fragment", "of", "LG9", "and", "a", "non-HOMC", "fragment", "of", "LG2", "-LRB-", "Fig.", "3a", "-RRB-", ".", "This", "scenario", "is", "consistent", "with", "previously", "reported", "pseudo-linkage", "of", "LG2", "and", "LG9", "associated", "with", "mxpDch-3", "-LRB-", "Beeman", "et", "al.", "1996", "-RRB-", "and", "provides", "an", "explanation", "for", "the", "mid-embryonic", "lethality", "of", "the", "mxpDch-3", "homozygotes", "-LRB-", "Shippy", "et", "al.", "2000", "-RRB-", ".", "That", "is", ",", "non-HOMC", "breakpoints", "interrupt", "both", "the", "TFIIA-L", "ortholog", ",", "which", "is", "a", "component", "of", "the", "transcriptional", "machinery", "-LRB-", "Yokomori", "et", "al.", "1993", "-RRB-", ",", "and", "a", "homolog", "of", "groucho", ",", "which", "is", "an", "important", "transcriptional", "corepressor", "in", "Drosophila", "-LRB-", "Jimenez", "et", "al.", "1997", ";", "Paroush", "et", "al.", "1994", "-RRB-", ".", "We", "conclude", "that", "the", "breakpoint", "between", "Tc-ftz", "and", "ptl/Tc-Antp", "is", "likely", "to", "account", "for", "the", "loss", "of", "Cx/Tc-Scr", "function", "associated", "with", "mxpDch-3", ",", "probably", "by", "separating", "the", "Cx/Tc-Scr", "transcription", "unit", "from", "some", "or", "all", "of", "its", "regulatory", "units", ".", "The", "rearrangement", "probably", "juxtaposes", "these", "regulatory", "elements", "with", "the", "mxp/Tc-pb", "transcription", "unit", ",", "providing", "a", "likely", "explanation", "for", "the", "Cx/Tc-Scr-like", "expression", "of", "mxp/Tc-pb", "in", "mxpDch-3", "embryos", ".", "Fig.", "3Rearrangements", "of", "the", "HOMC", ".", "In", "these", "schematic", "diagrams", ",", "the", "positions", "of", "cloned", "breakpoint", "fragments", "are", "underlined", ".", "Wild-type", "chromosomal", "position", "-LRB-", "not", "to", "scale", "-RRB-", "on", "LG2", "-LRB-", "purple", "-RRB-", "is", "indicated", "by", "a", "gradient", "of", "color", "to", "illustrate", "the", "effects", "of", "inversions", ".", "a", "In", "the", "mxpDch-3", "rearrangement", ",", "an", "approximately", "150-kb", "fragment", "of", "the", "HOMC", "has", "been", "transposed", "between", "fragments", "of", "LG9", "and", "LG2", ".", "b", "The", "ptlD60", "mutation", "is", "a", "large", "inversion", "that", "splits", "the", "Hox", "cluster", "into", "two", "parts", ".", "Small", "fragments", "at", "each", "end", "of", "the", "inversion", "appear", "to", "have", "been", "deleted", ",", "including", "part", "of", "the", "ptl/Tc-Antp", "locus", "Cx/Tc-Scr", "regulatory", "elements", "map", "near", "or", "within", "ptl/Tc-Antp", "Beeman", "et", "al.", "-LRB-", "1993", "-RRB-", "observed", "that", "mutations", "in", "Cx/Tc-Scr", "and", "ptl/Tc-Antp", "often", "partially", "fail", "to", "complement", "one", "another", ".", "Because", "this", "is", "precisely", "the", "type", "of", "genetic", "interaction", "that", "would", "be", "predicted", "if", "the", "separation", "of", "Hox", "genes", "has", "deleterious", "effects", ",", "we", "decided", "to", "analyze", "ptlD60", ",", "an", "allele", "of", "ptl/Tc-Antp", "that", "shows", "such", "effects", ".", "The", "ptlD60", "mutation", ",", "which", "results", "in", "transformation", "of", "the", "larval", "legs", "toward", "antennae", "as", "well", "as", "reductions", "of", "some", "labial", "and", "thoracic", "tissue", ",", "has", "been", "proposed", "to", "be", "a", "null", "allele", "of", "ptl/Tc-Antp", "-LRB-", "Beeman", "et", "al.", "1993", "-RRB-", ".", "However", ",", "adults", "transheterozygous", "for", "ptlD60/ptlD2", "have", "a", "very", "different", "phenotype", "from", "that", "produced", "by", "larval", "ptl/Tc-Antp", "RNAi", "-LRB-", "Tomoyasu", "et", "al.", "2005", "-RRB-", "and", ",", "instead", ",", "resemble", "adults", "in", "which", "both", "ptl/Tc-Antp", "and", "Cx/Tc-Scr", "have", "been", "knocked", "down", "-LRB-", "Tomoyasu", ",", "personal", "communication", "-RRB-", ".", "This", "result", "raises", "the", "possibility", "that", "the", "ptlD60", "mutation", "affects", "the", "function", "of", "both", "genes", ".", "To", "address", "this", "issue", ",", "we", "performed", "parental", "RNAi", "with", "ptl/Tc-Antp", "and", "found", "that", "the", "resulting", "larvae", "-LRB-", "Fig.", "4b", "-RRB-", "show", "a", "phenotype", "almost", "identical", "to", "that", "of", "ptlD60", "homozygotes", "-LRB-", "Fig.", "4c", "-RRB-", ",", "suggesting", "that", "the", "ptlD60", "mutation", "primarily", "affects", "the", "function", "of", "ptl/Tc-Antp", "during", "embryonic", "development", ".", "However", ",", "there", "is", "a", "subtle", "difference", "between", "the", "ptlD60", "and", "ptl/Tc-Antp", "RNAi", "phenotypes", "in", "the", "positioning", "of", "the", "T1", "appendages", ",", "which", "are", "located", "near", "the", "ventral", "midline", "in", "the", "RNAi", "larvae", "but", "more", "laterally", "in", "the", "mutants", ".", "This", "difference", "is", "likely", "attributable", "to", "partial", "loss", "of", "Cx/Tc-Scr", "function", "in", "ptlD60", "because", "Cx/Scr", "is", "responsible", "for", "the", "midline", "position", "of", "the", "labial", "appendages", "in", "Tribolium", "-LRB-", "Shippy", "et", "al.", "2006", "-RRB-", "and", "other", "insects", "-LRB-", "Hughes", "and", "Kaufman", "2000", ";", "Pattatucci", "et", "al.", "1991", ";", "Rogers", "et", "al.", "1997", "-RRB-", ".", "Thus", ",", "ptlD60", "appears", "to", "be", "not", "only", "a", "null", "allele", "of", "ptl/Tc-Antp", "but", "also", "a", "hypomorphic", "allele", "of", "Cx/Tc-Scr", ".", "Fig.", "4Cuticle", "and", "enhancer", "trap", "phenotypes", "of", "ptl/Tc-Antp", "mutations", ".", "The", "antennae", "-LRB-", "ant", "-RRB-", "and", "the", "labial", "-LRB-", "lab", "-RRB-", "and", "thoracic", "-LRB-", "T1", "--", "T3", "-RRB-", "segments", "are", "denoted", "where", "relevant", ".", "a", "--", "e", "Cuticle", "preps", "displaying", "the", "phenotypes", "of", "wild-type", "-LRB-", "Ga-1", ";", "a", "-RRB-", ",", "ptl/Tc-Antp", "RNAi", "-LRB-", "b", "-RRB-", ",", "ptlD60/ptlD60", "-LRB-", "c", "-RRB-", ",", "ptlKT76/ptlKT76", "-LRB-", "d", "-RRB-", ",", "and", "ptlKT76/ptlD60", "-LRB-", "e", "-RRB-", "first", "instar", "larvae", ".", "Enhancer", "trap-driven", "EGFP", "expression", "in", "a", "ptlKT76", "embryo", "-LRB-", "f", "-RRB-", "appears", "in", "a", "very", "similar", "pattern", "to", "Cx/Tc-Scr", "expression", "-LRB-", "purple", "-RRB-", "in", "a", "wild-type", "embryo", "-LRB-", "g", "-RRB-", ".", "A", "ptlKT76", "larva", "-LRB-", "h", "-RRB-", "and", "pupa", "-LRB-", "i", "-RRB-", "also", "display", "EGFP", "enhancer", "trap", "expression", "in", "parts", "of", "the", "labial", "and", "first", "thoracic", "segments", "To", "understand", "why", "the", "ptlD60", "mutation", "affects", "both", "ptl/Tc-Antp", "and", "Cx/Tc-Scr", ",", "we", "characterized", "its", "mutant", "lesion", "-LRB-", "s", "-RRB-", ".", "We", "found", "that", "ptlD60", "is", "associated", "with", "an", "inversion", "of", "about", "6.6", "Mb", ",", "with", "breakpoints", "in", "ptl/Tc-Antp", "and", "a", "distant", "region", "of", "LG2", "-LRB-", "Fig.", "3b", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "there", "are", "small", "deletions", "at", "each", "end", "of", "the", "inversion", "-LRB-", "approximately", "3.1", "kb", "of", "the", "ptl/Tc-Antp", "transcription", "unit", "including", "all", "of", "exon", "2", "and", "approximately", "1.5", "kb", "at", "the", "other", "end", "-RRB-", ".", "Consistent", "with", "this", "conclusion", ",", "we", "find", "that", "ptlD60", "can", "act", "as", "a", "crossover", "suppressor", "for", "LG2", ",", "reducing", "recombination", "between", "Reindeer", "-LRB-", "a", "mutation", "near", "one", "end", "of", "LG2", "-RRB-", "and", "the", "HOMC", "from", "its", "normal", "value", "of", "35", "--", "40", "cM", "-LRB-", "Beeman", "et", "al.", "1996", "-RRB-", "to", "approximately", "20", "cM", ".", "These", "results", "suggest", "that", "breakpoints", "within", "the", "ptl/Tc-Antp", "gene", "affect", "the", "function", "of", "both", "ptl/Tc-Antp", "and", "Cx/Tc-Scr", ",", "probably", "by", "disrupting", "the", "function", "of", "Cx/Tc-Scr", "regulatory", "elements", "-LRB-", "see", "``", "Discussion", "''", "-RRB-", ".", "Additional", "evidence", "for", "the", "presence", "of", "Cx/Tc-Scr", "regulatory", "elements", "in", "the", "vicinity", "of", "ptl/Tc-Antp", "comes", "from", "a", "piggyBac-insertion", "line", "recovered", "during", "an", "insertional", "mutagenesis", "project", ".", "The", "KT076", "line", "carries", "a", "homozygous", "lethal", "insertion", "in", "the", "last", "intron", "of", "ptl", "-LRB-", "Fig.", "5", "-RRB-", ".", "Crosses", "between", "KT076", "heterozygotes", "produce", "a", "class", "of", "embryos", "-LRB-", "putative", "homozygotes", "-RRB-", "with", "the", "T1", "and", "T2", "legs", "partially", "transformed", "toward", "antennae", "-LRB-", "Fig.", "4d", "-RRB-", ",", "a", "phenotype", "consistent", "with", "partial", "loss", "of", "Ptl/Tc-Antp", "function", ".", "However", ",", "individuals", "carrying", "the", "insertion", "display", "an", "embryonic", "enhancer", "trap", "expression", "pattern", "-LRB-", "Fig.", "4f", "-RRB-", "very", "similar", "to", "the", "expression", "pattern", "of", "Cx/Tc-Scr", "-LRB-", "Curtis", "et", "al.", "2001", ";", "Fig.", "4g", "-RRB-", ",", "despite", "the", "fact", "that", "the", "insertion", "site", "is", "about", "87", "kb", "upstream", "of", "Cx/Tc-Scr", ".", "KT076", "larvae", "and", "pupae", "also", "show", "weak", "enhancer", "trap", "patterns", "consistent", "with", "predicted", "Cx/Tc-Scr", "domains", "-LRB-", "Fig.", "4h", "--", "i", "-RRB-", ".", "As", "expected", "from", "the", "phenotype", "of", "homozygotes", ",", "KT076", "fails", "to", "complement", "ptlD60", "as", "assayed", "by", "adult", "viability", ",", "and", "crosses", "of", "KT076", "to", "ptlD60", "heterozygotes", "produce", "embryos", "with", "a", "phenotype", "similar", "to", ",", "but", "slightly", "weaker", "than", ",", "that", "of", "ptlD60", "homozygotes", "-LRB-", "Fig.", "4e", "-RRB-", ".", "In", "contrast", ",", "KT076", "fully", "complements", "both", "the", "embryonic", "phenotype", "and", "the", "adult", "viability", "of", "Cx61", ",", "a", "null", "allele", "of", "Cx/Tc-Scr", "-LRB-", "Shippy", "et", "al.", "2006", "-RRB-", ",", "indicating", "that", "Cx/Tc-Scr", "function", "is", "not", "compromised", "by", "the", "insertion", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "These", "results", "suggest", "that", "KT076", "is", "a", "hypomorphic", "allele", "of", "ptl/Tc-Antp", ",", "and", "it", "will", ",", "hereafter", ",", "be", "referred", "to", "as", "ptlKT76", ".", "Together", "with", "the", "data", "from", "the", "mxpDch-3", "and", "ptlD60", "mutations", ",", "the", "Cx/Tc-Scr-like", "enhancer", "trap", "phenotype", "of", "ptlKT76", "provides", "strong", "evidence", "that", "Cx/Tc-Scr", "regulatory", "elements", "are", "located", "near", ",", "and", "probably", "within", ",", "ptl/Tc-Antp", ".", "Although", "additional", "experiments", "will", "be", "necessary", "to", "pinpoint", "the", "location", "of", "regulatory", "elements", "and", "verify", "this", "conclusion", ",", "it", "is", "intriguing", "to", "think", "that", "overlap", "of", "regulatory", "elements", "of", "one", "Hox", "gene", "with", "the", "transcription", "unit", "of", "another", "Hox", "gene", "might", "be", "an", "important", "mechanism", "of", "Hox", "cluster", "constraint", ".", "Fig.", "5Overlap", "of", "Cx/Tc-Scr", "regulatory", "elements", "with", "the", "ptl/Tc-Antp", "locus", ".", "The", "gene", "structure", "of", "ptl/Tc-Antp", "-LRB-", "coding", "sequence", "is", "shaded", "gray", "-RRB-", "and", "the", "positions", "of", "mutant", "lesions", "are", "shown", "in", "the", "diagram", ".", "The", "inferred", "positions", "of", "Cx/Tc-Scr", "regulatory", "elements", "in", "the", "ptl/Tc-Antp", "region", "are", "indicated", "below", "the", "diagram", "Discussion", "The", "Hox", "clusters", "of", "several", "insects", "have", "now", "been", "completely", "sequenced", ".", "While", "breaks", "in", "the", "cluster", "seem", "to", "have", "occurred", "several", "times", "in", "the", "Drosophila", "lineage", ",", "the", "clusters", "of", "Apis", ",", "Anopheles", ",", "and", "Tribolium", "are", "intact", ".", "This", "suggests", "that", "many", "insect", "clusters", "are", "still", "subject", "to", "constraints", "to", "maintain", "their", "organization", ".", "Of", "the", "insects", "with", "intact", "clusters", ",", "Tribolium", "is", ",", "by", "far", ",", "the", "most", "genetically", "tractable", "and", "has", "a", "strong", "history", "of", "Hox", "gene", "studies", ",", "thus", "offering", "the", "best", "system", "for", "understanding", "the", "constraints", "acting", "on", "an", "intact", "insect", "Hox", "cluster", ".", "Below", ",", "we", "discuss", "insights", "provided", "by", "our", "analysis", "of", "the", "Tribolium", "HOMC", "into", "mechanisms", "that", "might", "be", "responsible", "for", "Hox", "cluster", "integrity", ".", "Temporal", "colinearity", "Among", "organisms", "for", "which", "both", "Hox", "cluster", "sequence", "and", "expression", "data", "are", "available", ",", "the", "presence", "of", "an", "intact", "cluster", "appears", "to", "be", "correlated", "with", "temporal", "colinearity", "of", "Hox", "gene", "expression", ",", "while", "disrupted", "clusters", "are", "associated", "with", "lack", "of", "temporal", "colinearity", "-LRB-", "Monteiro", "and", "Ferrier", "2006", "-RRB-", ".", "This", "observation", "has", "pushed", "temporal", "colinearity", "to", "the", "forefront", "of", "discussions", "about", "Hox", "cluster", "maintenance", ".", "However", ",", "several", "questions", "remain", "to", "be", "answered", ".", "Does", "temporal", "colinearity", "really", "require", "an", "intact", "Hox", "cluster", "?", "Is", "temporal", "colinearity", "required", "for", "proper", "Hox", "gene", "function", "in", "organisms", "with", "intact", "clusters", "?", "If", "temporal", "colinearity", "is", "a", "key", "constraint", "on", "Tribolium", "Hox", "cluster", "integrity", ",", "we", "might", "expect", "rearrangements", "to", "affect", "the", "function", "of", "most", "or", "all", "Hox", "genes", ".", "However", ",", "our", "analysis", "of", "Tribolium", "Hox", "cluster", "mutations", "provides", "no", "evidence", "for", "such", "global", "effects", ".", "The", "ptlD60", "inversion", "splits", "the", "complex", "into", "two", "parts", "but", "all", "of", "the", "Hox", "genes", "except", "ptl/Tc-Antp", "and", "Cx/Tc-Scr", "appear", "to", "function", "normally", ".", "In", "addition", ",", "the", "mxpDch-3", "rearrangement", "results", "in", "the", "translocation", "of", "several", "HOMC", "genes", "-LRB-", "Tc-zen", ",", "Tc-Dfd", ",", "Cx/Tc-Scr", ",", "and", "Tc-ftz", "-RRB-", "to", "a", "new", "chromosomal", "location", ".", "At", "least", "one", "of", "these", "genes", ",", "Tc-Dfd", ",", "is", "functional", "because", "mxpDch-3", "fully", "complements", "a", "Tc-Dfd", "null", "allele", ".", "Likewise", ",", "the", "genes", "remaining", "in", "the", "HOMC", "-LRB-", "with", "the", "exception", "of", "mxp/Tc-pb", "-RRB-", "apparently", "function", "normally", ".", "These", "limited", "effects", "of", "Hox", "cluster", "rearrangements", "are", "similar", "to", "what", "has", "been", "reported", "for", "Drosophila", "-LRB-", "e.g.", ",", "Abbott", "and", "Kaufman", "1986", ";", "Pultz", "et", "al", "1988", "-RRB-", ".", "Although", "additional", "experiments", "will", "be", "required", "to", "determine", "whether", "Tribolium", "Hox", "genes", "exhibit", "temporal", "colinearity", ",", "our", "results", "suggest", "that", "constraints", "on", "the", "Tribolium", "HOMC", "are", "more", "likely", "to", "act", "locally", ".", "Regulatory", "elements", "The", "reported", "breaks", "and", "transposition", "sites", "in", "the", "Hox", "clusters", "of", "Drosophila", "species", "are", "all", "located", "in", "intergenic", "regions", "near", "the", "3", "′", "end", "of", "a", "gene", "-LRB-", "Negre", "et", "al.", "2005", ";", "Negre", "and", "Ruiz", "2007", "-RRB-", "and", ",", "thus", ",", "are", "presumably", "less", "likely", "to", "separate", "a", "gene", "from", "its", "regulatory", "elements", ",", "which", "are", "predominantly", "located", "5", "′", "of", "each", "Drosophila", "Hox", "gene", ".", "Interestingly", ",", "the", "one", "exception", "to", "this", "rule", "is", "the", "region", "between", "abd-A", "and", "Abd-B", ",", "which", "contains", "regulatory", "regions", "for", "both", "genes", "and", "is", "not", "split", "in", "any", "of", "the", "Drosophila", "species", "examined", "so", "far", "-LRB-", "Negre", "and", "Ruiz", "2007", "-RRB-", ".", "These", "observations", "led", "to", "the", "conclusion", "that", "Drosophila", "Hox", "clusters", "have", "a", "modular", "organization", "-LRB-", "with", "each", "gene", "and", "its", "regulatory", "elements", "representing", "a", "separate", "module", "-RRB-", "and", "that", "Drosophila", "Hox", "genes", "are", "still", "partially", "clustered", "simply", "because", "the", "regulatory", "regions", "are", "so", "large", "that", "there", "are", "relatively", "few", "positions", "where", "breaks", "can", "occur", "without", "disturbing", "a", "module", ".", "That", "is", ",", "most", "of", "the", "remaining", "linkage", "in", "Drosophila", "Hox", "clusters", "-LRB-", "with", "the", "possible", "exception", "of", "abd-A", "and", "Abd-B", "-RRB-", "is", "due", "to", "``", "phylogenetic", "inertia", ",", "''", "and", ",", "given", "enough", "time", ",", "the", "clusters", "will", "completely", "disperse", "-LRB-", "Negre", "and", "Ruiz", "2007", "-RRB-", ".", "The", "question", "naturally", "arises", "whether", "phylogenetic", "inertia", "could", "also", "be", "the", "reason", "for", "the", "intact", "Hox", "clusters", "of", "insects", "like", "Tribolium", ".", "Lewis", "et", "al.", "-LRB-", "2003", "-RRB-", "suggested", "that", "unusual", "features", "of", "recombination", "-LRB-", "Ranz", "et", "al.", "2001", "-RRB-", "may", "make", "drosophilids", "more", "tolerant", "of", "Hox", "cluster", "rearrangements", "than", "are", "most", "insects", ".", "If", "this", "is", "the", "case", ",", "intact", "clusters", "may", "just", "be", "the", "consequence", "of", "slower", "rates", "of", "chromosomal", "rearrangement", "-LRB-", "Negre", "and", "Ruiz", "2007", "-RRB-", ".", "Alternatively", ",", "constraints", "on", "Hox", "cluster", "maintenance", "may", "still", "be", "functional", "in", "Tribolium", ".", "Our", "analysis", "of", "mutant", "breakpoints", "in", "the", "ptl/Tc-Antp", "region", "indicates", "that", ",", "in", "at", "least", "one", "case", ",", "Tribolium", "Hox", "genes", "are", "not", "modular", ".", "That", "is", ",", "at", "least", "some", "of", "the", "regulatory", "elements", "controlling", "Cx/Tc-Scr", "expression", "are", "apparently", "located", "within", "the", "pt/Tc-Antp", "gene", "-LRB-", "Fig.", "5", "-RRB-", ".", "Most", "embryonic", "enhancers", "of", "Cx/Tc-Scr", "are", "predicted", "to", "lie", "between", "the", "mxpDch-3", "and", "ptlD60", "breakpoints", "because", "the", "mxpDch-3", "allele", "appears", "to", "lack", "all", "Cx/Tc-Scr", "function", ",", "while", "ptlD60", "has", "almost", "normal", "embryonic", "Cx/Tc-Scr", "function", ".", "This", "conclusion", "is", "further", "supported", "by", "the", "expression", "of", "mxp/Tc-pb", "in", "a", "Cx/Tc-Scr-like", "pattern", "in", "mxpDch-3", "mutants", ",", "presumably", "due", "to", "juxtaposition", "of", "the", "mxp/Tc-pb", "transcription", "unit", "with", "sequence", "between", "Tc-ftz", "and", "ptl/Tc-Antp", ".", "Adult", "Cx/Tc-Scr", "regulatory", "elements", "are", "likely", "located", "within", ",", "or", "5", "′", "of", ",", "ptl/Tc-Antp", "because", "the", "ptlD60", "rearrangement", "seems", "to", "have", "a", "stronger", "effect", "on", "the", "adult", "functions", "of", "Cx/Tc-Scr", ".", "The", "presence", "of", "Cx/Tc-Scr", "regulatory", "elements", "near", ",", "or", "within", ",", "ptl/Tc-Antp", "is", "supported", "by", "the", "observation", "that", "a", "piggyBac", "insertion", "within", "the", "ptl/Tc-Antp", "transcription", "unit", "-LRB-", "ptlK76", "-RRB-", "shows", "an", "enhancer", "trap", "phenotype", "that", "appears", "to", "be", "driven", "by", "Cx/Tc-Scr", "regulatory", "elements", ".", "In", "Drosophila", ",", "elements", "which", "drive", "Scr-like", "expression", "patterns", "have", "been", "found", "in", "the", "region", "between", "ftz", "and", "Antp", "-LRB-", "Gorman", "and", "Kaufman", "1995", "-RRB-", ".", "However", ",", "these", "elements", "are", "apparently", "redundant", "because", "breakpoints", "in", "this", "region", "only", "slightly", "reduce", "Scr", "expression", "levels", "within", "its", "normal", "domain", ".", "Moreover", ",", "a", "deficiency", "which", "removes", "most", ",", "if", "not", "all", ",", "of", "the", "Antp", "transcription", "unit", "has", "no", "effect", "on", "embryonic", "Scr", "expression", ".", "Thus", ",", "it", "is", "possible", "that", "the", "modularity", "of", "the", "Drosophila", "Hox", "cluster", "is", "a", "recent", "innovation", "resulting", "from", "changes", "in", "the", "position", "of", "cis-regulatory", "elements", ".", "This", "newly", "acquired", "modularity", "might", "have", "allowed", "breaks", "in", "the", "Hox", "cluster", "in", "the", "Drosophila", "lineage", ".", "In", "contrast", ",", "overlap", "of", "regulatory", "elements", "with", "neighboring", "genes", "might", "still", "act", "as", "a", "constraint", "on", "the", "integrity", "of", "the", "Hox", "cluster", "in", "Tribolium", ".", "Noncoding", "transcripts", "Although", "noncoding", "transcripts", "within", "Hox", "clusters", "have", "been", "recognized", "for", "many", "years", "-LRB-", "Cumberledge", "et", "al.", "1990", ";", "Lipshitz", "et", "al.", "1987", ";", "Sanchez-Herrero", "and", "Akam", "1989", "-RRB-", ",", "there", "has", "recently", "been", "renewed", "interest", "in", "these", "enigmatic", "RNAs", ".", "At", "least", "two", "of", "these", "ncRNAs", ",", "miR-196", "and", "miR-iab-4", ",", "can", "have", "homeotic", "function", "and", "attenuate", "the", "actions", "of", "protein-coding", "Hox", "genes", "-LRB-", "Hornstein", "et", "al.", "2005", ";", "Ronshaugen", "et", "al.", "2005", "-RRB-", ".", "In", "addition", "to", "the", "miRNAs", ",", "numerous", "long", "noncoding", "RNAs", "have", "been", "identified", "within", "the", "Hox", "clusters", "of", "both", "flies", "and", "mammals", "-LRB-", "Bae", "et", "al.", "2002", ";", "Rinn", "et", "al.", "2007", "-RRB-", ".", "ncRNAs", "are", "implicated", "in", "a", "vast", "array", "of", "processes", ",", "including", "regulation", "of", "transcription", ",", "translation", ",", "epigenetic", "control", "of", "chromatin", ",", "mono-allelic", "expression", ",", "dosage", "compensation", ",", "and", "silencing", "-LRB-", "reviewed", "in", "Mattick", "and", "Makunin", "2006", "-RRB-", ".", "In", "the", "Drosophila", "BXC", ",", "these", "transcripts", "have", "been", "implicated", "in", "the", "control", "of", "Hox", "gene", "expression", ",", "although", "there", "is", "some", "controversy", "as", "to", "whether", "they", "promote", "-LRB-", "Sanchez-Elsner", "et", "al.", "2006", "-RRB-", "or", "repress", "-LRB-", "Petruk", "et", "al.", "2006", "-RRB-", "Hox", "gene", "transcription", ".", "Mainguy", "et", "al.", "-LRB-", "2007", "-RRB-", "found", "evidence", "for", "extensive", "noncoding", "transcription", "in", "the", "mammalian", "Hox", "clusters", "and", "proposed", "that", "polycistronic", "and", "antisense", "transcription", "might", "play", "a", "role", "in", "keeping", "Hox", "genes", "clustered", ".", "Our", "transcriptional", "profiling", "data", "demonstrates", "that", "Tribolium", "also", "shows", "considerable", "noncoding", "transcription", "in", "the", "Hox", "complex", ".", "While", "the", "tiling", "array", "has", "provided", "a", "revealing", "snapshot", "of", "transcription", "levels", "during", "embryonic", "development", ",", "much", "additional", "work", "will", "be", "necessary", "to", "characterize", "the", "actual", "transcripts", ".", "For", "example", ",", "the", "high", "levels", "of", "transcription", "in", "the", "ptl/Tc-Antp", "and", "Utx/Tc-Ubx", "regions", "could", "be", "the", "result", "of", "several", "individual", "transcripts", "or", "one", "long", "transcript", ".", "Interestingly", ",", "dicistronic", "transcripts", "spanning", "the", "Antp", "and", "Ubx", "orthologs", "have", "been", "reported", "in", "crustaceans", "-LRB-", "Shiga", "et", "al.", "2006", "-RRB-", "and", "centipedes", "-LRB-", "Brena", "et", "al.", "2006", "-RRB-", ".", "If", "such", "transcripts", "have", "an", "important", "function", ",", "they", "might", "constrain", "linkage", "in", "at", "least", "some", "parts", "of", "the", "Hox", "cluster", ".", "The", "data", "available", "thus", "far", "indicate", "that", "noncoding", "transcripts", "are", "prevalent", "in", "both", "intact", "and", "broken", "Hox", "clusters", ".", "However", ",", "it", "is", "not", "clear", "whether", "these", "transcripts", "perform", "the", "same", "functions", "in", "all", "organisms", ".", "Perhaps", ",", "noncoding", "RNAs", "play", "a", "different", "or", "more", "critical", "role", "in", "organisms", "with", "intact", "clusters", ".", "Future", "studies", "in", "this", "area", "are", "likely", "to", "provide", "important", "insights", "into", "Hox", "gene", "function", "and", "possibly", "into", "Hox", "cluster", "conservation", ".", "Conclusions", "The", "results", "presented", "here", "provide", "a", "foundation", "for", "further", "studies", "of", "the", "constraints", "acting", "on", "Hox", "clusters", ".", "While", "it", "is", "important", "to", "keep", "in", "mind", "that", "multiple", "factors", "may", "have", "contributed", "to", "the", "maintenance", "of", "Hox", "clusters", "during", "evolution", "-LRB-", "Kmita", "and", "Duboule", ",", "2003", "-RRB-", ",", "the", "intact", "structure", "of", "the", "Tribolium", "Hox", "cluster", "and", "the", "suite", "of", "tools", "now", "available", "for", "this", "insect", "makes", "it", "an", "ideal", "candidate", "for", "such", "research", "." ]

[ "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Expression", "of", "alternansucrase", "in", "potato", "plants", "Alternan", ",", "which", "consists", "of", "alternating", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "3", "-RRB-", "/", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "6", "-RRB-", "-", "linked", "glucosyl", "residues", ",", "was", "produced", "in", "potato", "tubers", "by", "expressing", "a", "mature", "alternansucrase", "-LRB-", "Asr", "-RRB-", "gene", "from", "Leuconostoc", "mesenteroides", "NRRL", "B-1355", "in", "potato", ".", "Detection", "of", "alternan", "was", "performed", "by", "enzyme-linked", "immunosorbent", "assay", "in", "tuber", "juices", ",", "revealing", "a", "concentration", "between", "0.3", "and", "1.2", "mg", "g-1", "fresh", "wt", ".", "The", "Asr", "transcript", "levels", "correlated", "well", "with", "alternan", "accumulation", "in", "tuber", "juices", ".", "It", "appeared", "that", "the", "expression", "of", "sucrose-regulated", "starch-synthesizing", "genes", "-LRB-", "ADP-glucose", "pyrophosphorylase", "subunit", "S", "and", "granule-bound", "starch", "synthase", "I", "-RRB-", "was", "down-regulated", ".", "Despite", "this", ",", "the", "physico-chemical", "properties", "of", "the", "transgenic", "starches", "were", "unaltered", ".", "These", "results", "are", "compared", "to", "those", "obtained", "with", "other", "transgenic", "potato", "plants", "producing", "mutan", "-LSB-", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "3", "-RRB-", "-", "linked", "glucosyl", "residues", "-RSB-", "and", "dextran", "-LSB-", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "6", "-RRB-", "-", "linked", "glucosyl", "residues", "-RSB-", ".", "Introduction", "Production", "of", "novel", "polymers", "in", "plants", "by", "genetic", "modification", "is", "a", "great", "opportunity", "to", "obtain", "plants", "with", "unique", "properties", "that", "can", "not", "be", "generated", "by", "conventional", "breeding", "-LRB-", "Kok-Jacon", "et", "al.", "2003", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "modifications", "of", "native", "polymers", "in", "planta", "could", "also", "generate", "crops", "with", "added", "nutritional", ",", "environmental", "or", "commercial", "value", ".", "For", "instance", ",", "production", "of", "biodegradable", "plastics", "in", "crops", "such", "as", "flax", "offers", "new", "perspectives", "for", "the", "replacement", "of", "oil-derived", "plastics", "-LRB-", "Wróbel", "et", "al.", "2004", "-RRB-", ".", "Another", "example", "is", "the", "production", "of", "a", "freeze-thaw-stable", "potato", "starch", "exhibiting", "novel", "physicochemical", "properties", ",", "thereby", "increasing", "the", "number", "of", "industrial", "applications", "-LRB-", "Jobling", "et", "al.", "2002", "-RRB-", ".", "Alternan", "is", "a", "unique", "polymer", "which", "is", "produced", "by", "three", "Leuconostoc", "mesenteroides", "strains", ":", "NRRL", "B-1355", ",", "NRRL", "B-1498", "and", "NRRL", "B-1501", "-LRB-", "Jeanes", "et", "al.", "1954", "-RRB-", ".", "Alternan", "synthesized", "by", "L.", "mesenteroides", "NRRL", "B-1355", "is", "mediated", "by", "the", "alternansucrase", "ASR", "-LRB-", "EC", "2.4.1.140", "-RRB-", "which", "is", "a", "large", "glucansucrase", "of", "2,057", "amino-acids", "-LRB-", "Argüello-Morales", "et", "al.", "2000", "-RRB-", ".", "Its", "C-terminal", "domain", "-LRB-", "also", "referred", "to", "as", "glucan-binding", "domain", "or", "GBD", "-RRB-", "exhibits", "short", "repeats", "specific", "for", "ASR", ",", "which", "could", "contribute", "to", "its", "distinct", "features", "-LRB-", "Janeček", "et", "al.", "2000", "-RRB-", ".", "The", "resulting", "polymer", "has", "a", "unique", "structure", "with", "alternating", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "3", "-RRB-", "/", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "6", "-RRB-", "-", "linked", "glucose", "residues", ",", "present", "for", "46", "%", "and", "54", "%", ",", "respectively", ".", "Due", "to", "this", "structure", ",", "alternan", "is", "a", "highly", "soluble", "and", "low", "viscous", "polymer", ",", "which", "is", "resistant", "to", "microbial", "and", "mammalian", "enzymes", "making", "it", "suitable", "for", "the", "production", "of", "ingredients", "for", "functional", "foods", "such", "as", "prebiotics", "-LRB-", "Côté", "1992", "-RRB-", ".", "Also", ",", "novel", "industrial", "applications", "were", "investigated", "by", "hydrolyzing", "native", "alternan", "polymers", "with", "isolates", "of", "Penicillium", "bacterial", "strains", ",", "creating", "potential", "replacers", "of", "commercial", "gum", "arabic", "-LRB-", "Leathers", "et", "al.", "2002", ";", "2003", "-RRB-", ".", "Furthermore", ",", "ASR", "is", "an", "attractive", "enzyme", "because", "of", "its", "efficiency", "in", "bond", "formation", ",", "which", "is", "higher", "than", "that", "of", "the", "dextransucrase", "-LRB-", "DSRS", "-RRB-", "-LRB-", "Richard", "et", "al.", "2003", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "mutated", "ASR", "enzymes", "showed", "a", "high", "efficiency", "in", "glucosylating", "acceptor", "molecules", "-LRB-", "cellobiose", ",", "α-alkylglucosides", "-RRB-", "in", "comparison", "to", "native", "ASR", "and", "DSRS", "enzymes", ",", "which", "might", "enable", "novel", "industrial", "applications", "-LRB-", "Argüello-Morales", "et", "al.", "2001", ";", "Richard", "et", "al.", "2003", ";", "Luz", "Sanz", "et", "al.", "2006", "-RRB-", ".", "In", "this", "work", ",", "we", "describe", "the", "production", "of", "alternan", "in", "potato", "tubers", "by", "expressing", "ASR", ".", "Modification", "of", "starch", "structure", "was", "envisaged", "with", "ASR", ",", "because", "of", "its", "high", "acceptor", "reaction", "efficiency", ".", "The", "effect", "of", "ASR", "on", "starch", "biosynthesis", "was", "studied", "at", "the", "microscopical", ",", "molecular", "and", "biochemical", "level", ",", "and", "compared", "to", "the", "effects", "of", "the", "dextransucrase", "-LRB-", "DSRS", "-RRB-", "and", "mutansucrase", "-LRB-", "GTFI", "-RRB-", ",", "producing", "less", "soluble", "polymers", ",", "such", "as", "dextran", "and", "mutan", "that", "are", "mainly", "composed", "of", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "6", "-RRB-", "and", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "3", "-RRB-", "-", "linked", "glucose", "residues", ",", "respectively", "-LRB-", "Kok-Jacon", "et", "al.", "2005a", ",", "b", "-RRB-", ".", "Materials", "and", "methods", "Construction", "of", "binary", "plant", "expression", "vector", "containing", "the", "Asr", "gene", "An", "expression", "cassette", "containing", "the", "patatin", "promoter", "-LRB-", "Wenzler", "et", "al.", "1989", "-RRB-", ",", "the", "chloroplastic", "ferredoxin", "signal", "peptide", "-LRB-", "FD", "-RRB-", "from", "Silene", "pratensis", "-LRB-", "Pilon", "et", "al.", "1995", "-RRB-", "fused", "to", "the", "NOS", "terminator", "was", "cloned", "into", "the", "pBluescript", "SK", "-LRB-", "pBS", "SK", "-RRB-", "plasmid", ",", "resulting", "in", "pPF", "that", "was", "used", "as", "starting", "material", "for", "cloning", "the", "alternansucrase", "-LRB-", "Asr", "-RRB-", "gene", ".", "A", "mature", "Asr", "gene", "from", "L.", "mesenteroides", "NRRL", "B-1355", "-LRB-", "Argüello-Morales", "et", "al.", "2000", ";", "AJ250173", "-RRB-", "was", "ligated", "in", "frame", "between", "the", "signal", "peptide", "FD", "and", "the", "NOS", "terminator", ".", "The", "mature", "Asr", "gene", "was", "amplified", "by", "PCR", ",", "with", "a", "forward", "primer", "containing", "a", "SmaI", "restriction", "site", "-LRB-", "5", "′", "-", "CATCAGGGCCCCGGGGATACAAAT-3", "′", "-RRB-", "and", "a", "reverse", "primer", "containing", "a", "NruI", "restriction", "site", "-LRB-", "5", "′", "-", "CTCCTTTCGCGAATCCTTCCCTTA-3", "′", "-RRB-", "using", "the", "proofreading", "Pfu", "turbo", "DNA", "polymerase", "-LRB-", "2.5", "units/μl", ";", "Stratagene", ",", "UK", "-RRB-", "and", "cloned", "into", "the", "SmaI/NruI", "restriction", "sites", "of", "pPF", ",", "resulting", "in", "pPFAsr", ".", "FD", "and", "the", "fused", "Asr", "gene", "were", "completely", "sequenced", "in", "one", "direction", "by", "Baseclear", "-LRB-", "The", "Netherlands", "-RRB-", "to", "verify", "the", "correctness", "of", "the", "construct", ".", "pPFAsr", "was", "digested", "with", "SacI", "and", "SalI", "and", "subsequently", "ligated", "into", "a", "pBIN20", "binary", "vector", "-LRB-", "Hennegan", "and", "Danna", "1998", "-RRB-", ",", "resulting", "in", "pPFA", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "Fig.", "1Schematic", "representation", "of", "pPFA", "binary", "vector", "used", "for", "potato", "plant", "transformation", "Transformation", "and", "regeneration", "of", "potato", "plants", "pPFA", "was", "transformed", "into", "Agrobacterium", "tumefaciens", "strain", "LBA", "4404", "using", "electroporation", "-LRB-", "Takken", "et", "al.", "2000", "-RRB-", ".", "Internodal", "stem", "segments", "from", "the", "tetraploid", "potato", "genotype", "-LRB-", "cv", ".", "Kardal", "-LRB-", "KD", "-RRB-", "-RRB-", "were", "used", "for", "Agrobacterium-mediated", "transformation", ",", "which", "was", "performed", "as", "described", "by", "Kok-Jacon", "et", "al.", "-LRB-", "2005a", "-RRB-", ".", "Starch", "isolation", "Potato", "tubers", "were", "peeled", "and", "homogenized", "in", "a", "Sanamat", "Rotor", "-LRB-", "Spangenberg", ",", "The", "Netherlands", "-RRB-", ".", "The", "resulting", "homogenate", "was", "allowed", "to", "settle", "overnight", "at", "4", "°C", "and", "the", "potato", "juice", "was", "decanted", "and", "stored", "at", "−", "20", "°C", "for", "characterization", "of", "soluble", "alternan", ".", "The", "starch", "pellet", "was", "washed", "three", "times", "with", "water", ",", "air-dried", "at", "room", "temperature", "for", "at", "least", "three", "days", "and", "stored", "at", "room", "temperature", ".", "Immunological", "detection", "of", "alternans", "in", "tuber", "juices", "and", "gelatinized", "starches", "Presence", "of", "alternans", "was", "investigated", "with", "enzyme-linked", "immunosorbent", "assay", "-LRB-", "ELISA", "-RRB-", "as", "described", "by", "Kok-Jacon", "et", "al.", "-LRB-", "2005a", "-RRB-", ",", "using", "monoclonal", "anti-α", "-", "-LRB-", "1", "→", "6", "-RRB-", "dextran", "antibodies", "-LRB-", "45.21.1", "-LRB-", "groove-type", ";", "IgA/Kappa", "-RRB-", "and", "16.4.12", "EBI", "-LRB-", "cavity-type", ";", "IgA/Kappa", "-RRB-", "-RRB-", "-LRB-", "Wang", "et", "al.", "2002", "-RRB-", "with", "tuber", "juices", "and", "gelatinized", "starches", ".", "The", "monoclonal", "anti-α", "-", "-LRB-", "1", "→", "6", "-RRB-", "dextran", "antibodies", "detect", "structures", "containing", "both", "internal", "and", "terminal", "epitopes", "of", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "6", "-RRB-", "dextran", "which", "can", "be", "applicable", "for", "the", "detection", "of", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "6", "-RRB-", "linked", "glucose", "residues", "present", "in", "alternan", "-LRB-", "Sharon", "et", "al.", "1982", ";", "Dr", "Denong", "Wang", ",", "personal", "communication", "-RRB-", ".", "Expression", "analysis", "of", "Asr", "and", "genes", "involved", "in", "starch", "biosynthesis", "using", "semi-quantitative", "and", "real-time", "quantitative", "RT-PCR", "analysis", "RNA", "was", "isolated", "from", "3", "g", "-LRB-", "fresh", "weight", "-RRB-", "of", "potato", "tuber", "material", "from", "selected", "transgenic", "lines", "according", "to", "Kuipers", "et", "al.", "-LRB-", "1994", "-RRB-", ".", "Semi-quantitative", "and", "real-time", "quantitative", "RT-PCR", "'s", "were", "performed", "as", "described", "by", "Kok-Jacon", "et", "al.", "-LRB-", "2005a", "-RRB-", ".", "AsrRT", "primers", ",", "5", "′", "-", "ACCGGTTCCATCAACTAATAAT-3", "′", "and", "5", "′", "-", "GACATCTCGGAAGGATCCC-3", "′", "-LRB-", "Tm", "=", "55", "°C", ",", "35", "cycles", "-RRB-", "were", "based", "on", "the", "Asr", "gene", "sequence", "-LRB-", "Argüello-Morales", "et", "al.", "2000", "-RRB-", ".", "RNA", "sample", "from", "Karnico", "potato", "tubers", "expressing", "a", "sense/antisense", "GBSSI", "cDNA", "inverted-repeat", "construct", "referred", "to", "as", "RVT34-77", "-LRB-", "Heilersig", "2005", "-RRB-", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ",", "because", "its", "GBSSI", "expression", "level", "was", "completely", "down-regulated", ".", "Determination", "of", "morphological", "and", "physicochemical", "starch", "properties", "Analysis", "of", "starch", "granule", "morphology", "was", "performed", "by", "light", "microscopy", "and", "scanning", "electron", "microscopy", "-LRB-", "SEM", "-RRB-", "as", "described", "by", "Kok-Jacon", "et", "al.", "-LRB-", "2005a", "-RRB-", ".", "Median", "values", "of", "the", "granule", "size", "distribution", "-LRB-", "d50", "-RRB-", ",", "gelatinization", "analysis", ",", "amylose", "content", ",", "starch", "content", ",", "chain", "length", "distributions", "-LRB-", "HPSEC", ",", "HPAEC", "-RRB-", "were", "determined", "as", "described", "by", "Kok-Jacon", "et", "al.", "-LRB-", "2005a", "-RRB-", ".", "Results", "Detection", "of", "alternan", "in", "transgenic", "potato", "juices", "To", "enable", "plastidic", "protein", "targeting", ",", "the", "mature", "Asr", "gene", "was", "fused", "to", "the", "ferredoxin", "-LRB-", "FD", "-RRB-", "signal", "peptide", "-LRB-", "Gerrits", "et", "al.", "2001", "-RRB-", ".", "The", "resulting", "gene", "fusion", "was", "inserted", "between", "the", "patatin", "promoter", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", "allowing", "high-tuber", "expression", "-LRB-", "Wenzler", "et", "al.", "1989", "-RRB-", "and", "the", "Nos", "terminator", "sequence", ".", "At", "the", "FD", "▲", "Asr", "fusion", ",", "two", "mutations", "were", "present", "because", "a", "SmaI", "restriction", "site", "was", "engineered", "at", "this", "position", "-LRB-", "VTAM", "↓", "ATYKVTLITK", "▲", "ADT", "became", "VTAM", "↓", "ATYKVTLITP", "▲", "GDT", ",", "in", "which", "↓", "represents", "the", "splice", "site", "for", "amyloplast", "entry", "and", "▲", "the", "gene", "fusion", "-RRB-", ".", "Furthermore", ",", "differences", "from", "the", "published", "ASR", "sequence", "-LRB-", "Argüello-Morales", "et", "al.", "2000", "-RRB-", "were", "found", "at", "three", "positions", "-LRB-", "Y208H", ",", "D221G", "and", "G1092S", "-RRB-", ",", "but", "these", "did", "not", "affect", "conserved", "residues", ".", "After", "Agrobacterium-mediated", "plant", "transformation", ",", "thirty", "independent", "transgenic", "potato", "clones", "were", "obtained", "using", "the", "Kardal", "-LRB-", "KD", "-RRB-", "genotype", ".", "Five", "plants", "of", "each", "transgenic", "clone", "were", "grown", "in", "the", "greenhouse", "from", "which", "the", "tubers", "were", "pooled", "for", "further", "characterization", ".", "KDAxx", "referred", "to", "the", "transformed", "potato", "plant", "serie", "in", "which", "A", "represents", "the", "Asr", "gene", "and", "xx", "the", "clone", "number", ".", "The", "untransformed", "genotype", "is", "referred", "to", "as", "KD-UT", ".", "Detection", "of", "alternan", "was", "performed", "by", "analyzing", "tuber", "juices", "of", "the", "transformants", "with", "ELISA", "using", "anti-dextran", "antibodies", "-LRB-", "Wang", "et", "al.", "2002", "-RRB-", ".", "Alternan", "was", "detected", "in", "4", "out", "of", "29", "tubers", "-LRB-", "about", "14", "%", "-RRB-", "in", "a", "concentration", "ranging", "from", "0.3", "to", "1.2", "mg", "g", "−", "1", "fresh", "wt", "-LRB-", "Fig.", "2", "-RRB-", "in", "the", "transformants", "KDA16", ",", "KDA19", ",", "KDA27", "and", "KDA13", ".", "As", "expected", ",", "no", "alternan", "was", "found", "in", "KD-UT", "plants", ".", "According", "to", "the", "tuber", "juice", "results", ",", "the", "KDA", "transformants", "were", "divided", "in", "three", "classes", ":", "-LRB-", "−", "-RRB-", ",", "-LRB-", "+", "-RRB-", "and", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", ",", "representing", "no", ",", "intermediate", "-LRB-", "≤", "1", "mg", "g", "−", "1", "FW", "-RRB-", "and", "high", "-LRB-", ">", "1", "mg", "g", "−", "1", "FW", "-RRB-", "levels", "of", "alternan", ",", "respectively", ".", "All", "the", "transformants", "containing", "alternan", "and", "two", "from", "the", "-LRB-", "−", "-RRB-", "class", "were", "selected", "for", "further", "characterization", ":", "KDA13", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", ",", "KDA16", "-LRB-", "+", "-RRB-", ",", "KDA19", "-LRB-", "+", "-RRB-", ",", "KDA27", "-LRB-", "+", "-RRB-", ",", "KDA1", "-LRB-", "−", "-RRB-", "and", "KDA24", "-LRB-", "−", "-RRB-", ".", "RNA", "was", "isolated", "from", "potato", "tubers", "and", "subjected", "to", "RT-PCR", "analysis", ".", "The", "expression", "levels", "were", "determined", "for", "the", "Asr", "and", "Ubi3", "genes", ",", "of", "which", "the", "latter", "is", "used", "as", "a", "control", "because", "of", "its", "constitutive", "expression", "-LRB-", "Garbarino", "and", "Belknap", "1994", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "3", "-RRB-", ".", "Heterologous", "Asr", "gene", "expression", "was", "detected", "in", "the", "expressers", "KDA13", ",", "KDA16", ",", "KDA19", ",", "KDA27", ".", "No", "Asr", "mRNA", "was", "detected", "in", "the", "-LRB-", "−", "-RRB-", "class", "transformants", "and", "in", "the", "KD-UT", "plants", ".", "The", "Asr", "expression", "levels", "correlated", "well", "with", "the", "ELISA", "results", "described", "above", ".", "Fig.", "2Detection", "of", "alternans", "accumulated", "in", "potato", "juices", "by", "ELISA", "using", "anti-dextrans", "antibodies", ".", "Based", "on", "the", "alternan", "concentration", "-LSB-", "in", "mg", "g", "−", "1", "fresh", "wt", "-LRB-", "FW", "-RRB-", "-RSB-", ",", "three", "categories", "of", "transformants", "were", "made", ",", "where", "-LRB-", "−", "-RRB-", ",", "-LRB-", "+", "-RRB-", "and", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", "represent", "no", ",", "intermediate", "and", "high", "alternan", "accumulation", ",", "respectively", ".", "Transgenic", "clones", "indicated", "with", "grey", "bars", "were", "selected", "for", "further", "characterizationFig", ".", "3RT-PCR", "analysis", "of", "the", "selected", "KDA", "transformants", "and", "KD-UT", "tuber", "RNA", ".", "The", "upper", "panel", "shows", "the", "PCR", "products", "using", "the", "primers", "designed", "on", "the", "Asr", "sequence", ".", "The", "lower", "panel", "shows", "the", "PCR", "products", "using", "the", "primers", "designed", "on", "the", "Ubi3", "sequence", "that", "served", "as", "an", "internal", "control", ".", "pPFAsr", "plasmid", ":", "positive", "control", "Alternan", "accumulation", "does", "not", "interfere", "with", "plant", ",", "tuber", "and", "starch", "morphologies", "Asr", "expressing", "plants", "-LRB-", "green", "parts", "and", "tubers", "-RRB-", "did", "not", "exhibit", "any", "morphological", "changes", "in", "comparison", "to", "KD-UT", "plants", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "starch", "morphology", "of", "Asr", "expressing", "plants", "was", "quite", "similar", "to", "that", "of", "KD-UT", ".", "With", "SEM", ",", "a", "rough", "surface", "was", "present", "on", "some", "of", "the", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", "class", "transformant", "granules", "-LRB-", "Fig.", "4B", ",", "F", "-RRB-", ",", "but", "was", "considered", "as", "not", "significant", "when", "compared", "to", "dextran", "-", "-LRB-", "Fig.", "4C", ",", "G", "-RRB-", "and", "mutan", "-", "-LRB-", "Fig.", "4D", ",", "H", "-RRB-", "accumulating", "plants", ".", "In", "general", ",", "starch", "granules", "from", "the", "-LRB-", "+", "-RRB-", "and", "-LRB-", "−", "-RRB-", "class", "transformants", "were", "similar", "to", "those", "of", "the", "KD-UT", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Starch", "granules", "comparable", "to", "those", "illustrated", "in", "Fig.", "4", "-LRB-", "F", "-RRB-", "were", "scored", "by", "analyzing", "a", "population", "of", "100", "granules", "in", "triplicate", "for", "each", "selected", "transformant", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "KDA13", ",", "belonging", "to", "the", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", "class", "transformant", ",", "exhibited", "-LRB-", "12", "%", "±", "1.0", "-RRB-", "of", "altered", "starch", "granules", ",", "followed", "by", "the", "-LRB-", "+", "-RRB-", "class", "transformant", "-LSB-", "KDA19", "-LRB-", "9.3", "%", "±", "0.6", "-RRB-", ";", "KDA27", "-LRB-", "8.3", "%", "±", "0.6", "-RRB-", "-RSB-", ".", "For", "the", "-LRB-", "−", "-RRB-", "class", "transformant", "and", "KD-UT", ",", "the", "frequency", "of", "altered", "granules", "was", "lower", ",", "which", "was", "around", "the", "7", "%", ".", "Fig.", "4SEM", "analysis", "of", "starch", "granules", "-LRB-", "×", "350", ":", "upper", "panel", "-RRB-", "and", "-LRB-", "×", "1,000", ":", "lower", "panel", "-RRB-", "from", "KD-UT", "-LRB-", "A", ",", "E", "-RRB-", "compared", "to", "that", "of", "selected", "transformants", "producing", "foreign", "polymers", "with", "decreasing", "water-solubility", "-LRB-", "KDA13", "that", "produces", "alternan", "-LRB-", "B", "and", "F", ";", "+", "+", ":", "highly", "soluble", "-LRB-", "S", "-RRB-", "-RRB-", ",", "KDD30", "that", "produces", "dextran", "-LRB-", "C", "and", "G", ";", "+", ":", "soluble", "-LRB-", "L", "-RRB-", "-RRB-", "and", "KDIC15", "that", "produces", "mutan", "-LRB-", "D", "and", "H", ";", "−", ":", "insoluble", "-LRB-", "I", "-RRB-", "-RRB-", ".", "Degrees", "of", "polymer", "solubility", "were", "defined", "according", "to", "Robyt", "-LRB-", "1996", "-RRB-", "in", "which", "class", "S", "=", "more", "soluble", "referring", "to", "glucans", "precipitated", "by", "40", "--", "44", "%", "-LRB-", "v/v", "-RRB-", "ethanol", ",", "L", "=", "less", "soluble", "referring", "to", "glucans", "precipitated", "by", "34", "--", "37", "%", "ethanol", "and", "I", "=", "water-insoluble", "The", "physicochemical", "properties", "and", "starch", "content", "of", "KDA", "transformants", "remain", "unchanged", "Median", "granule", "size", "-LRB-", "d50", "-RRB-", ",", "gelatinization", "characteristics", "-LRB-", "T0", "and", "ΔH", "-RRB-", ",", "amylose", "and", "starch", "content", "measurements", "were", "performed", "on", "selected", "transformants", "-LRB-", "Table", "1", "-RRB-", ".", "From", "these", "results", ",", "it", "can", "be", "seen", "that", "no", "consistent", "changes", "were", "detected", "for", "the", "different", "classes", "of", "transformants", ".", "Furthermore", ",", "chain", "length", "distribution", "experiments", "-LRB-", "HPSEC", "and", "HPAEC", "-RRB-", "were", "also", "done", ",", "particularly", "because", "ASR", "exhibits", "a", "high", "acceptor", "reaction", "efficiency", ".", "After", "complete", "debranching", "of", "starch", "with", "isoamylase", ",", "no", "consistent", "changes", "were", "found", "with", "HPSEC", "and", "HPAEC", "in", "comparison", "to", "KD-UT", "starches", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "debranched", "starches", ",", "which", "were", "further", "treated", "with", "α-amylase", ",", "were", "analyzed", "with", "HPAEC", "in", "order", "to", "detect", "the", "presence", "of", "novel", "structural", "elements", "on", "starch", "molecules", "such", "as", "alternating", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "3", "-RRB-", "/", "α", "-", "-LRB-", "1", "→", "6", "-RRB-", "linkages", ".", "Again", ",", "no", "consistent", "changes", "were", "detected", "with", "HPAEC", "in", "comparison", "to", "KD-UT", "starches", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Table", "1Summary", "of", "granule", "size", "-LRB-", "d50", "-RRB-", ",", "gelatinization", "characteristics", "-LRB-", "To", ",", "ΔH", "-RRB-", ",", "amylose", "and", "starch", "content", "measurements", "of", "starches", "from", "the", "selected", "transformants", "and", "KD-UT", ".", "Data", "-LRB-", "±", "SD", "-RRB-", "are", "the", "average", "of", "two", "or", "three", "independent", "measurementsTransformantsd50", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "*", "T0", "-LRB-", "°C", "-RRB-", "†", "ΔH", "-LRB-", "kJ/g", "-RRB-", "‡", "Amylose", "content", "-LRB-", "%", "-RRB-", "Starch", "content", "-LRB-", "mg/g", "FW", "-RRB-", "KD-UT26.5", "-LRB-", "±", "0.3", "-RRB-", "67.9", "-LRB-", "±", "0.1", "-RRB-", "14.5", "-LRB-", "±", "0.1", "-RRB-", "22.3", "-LRB-", "±", "0.2", "-RRB-", "214.8", "-LRB-", "±", "117.5", "-RRB-", "KDA1", "-LRB-", "−", "-RRB-", "24.4", "-LRB-", "±", "0.2", "-RRB-", "68.1", "-LRB-", "±", "0.1", "-RRB-", "17.0", "-LRB-", "±", "0.1", "-RRB-", "22.2", "-LRB-", "±", "0.2", "-RRB-", "103.4", "-LRB-", "±", "66.3", "-RRB-", "KDA24", "-LRB-", "−", "-RRB-", "25.0", "-LRB-", "±", "0.2", "-RRB-", "68.0", "-LRB-", "±", "0.1", "-RRB-", "16.3", "-LRB-", "±", "1.2", "-RRB-", "21.3", "-LRB-", "±", "0.4", "-RRB-", "86.7", "-LRB-", "±", "41.9", "-RRB-", "KDA16", "-LRB-", "+", "-RRB-", "24.9", "-LRB-", "±", "0.3", "-RRB-", "67.9", "-LRB-", "±", "0.2", "-RRB-", "16.4", "-LRB-", "±", "1.3", "-RRB-", "22.2", "-LRB-", "±", "0.1", "-RRB-", "140.0", "-LRB-", "±", "88.2", "-RRB-", "KDA19", "-LRB-", "+", "-RRB-", "27.9", "-LRB-", "±", "0.2", "-RRB-", "67.7", "-LRB-", "±", "0.0", "-RRB-", "15.2", "-LRB-", "±", "0.1", "-RRB-", "23.0", "-LRB-", "±", "0.2", "-RRB-", "137.1", "-LRB-", "±", "38.2", "-RRB-", "KDA27", "-LRB-", "+", "-RRB-", "22.8", "-LRB-", "±", "0.7", "-RRB-", "67.7", "-LRB-", "±", "0.2", "-RRB-", "16.2", "-LRB-", "±", "0.5", "-RRB-", "22.2", "-LRB-", "±", "0.4", "-RRB-", "289.3", "-LRB-", "±", "39.7", "-RRB-", "KDA13", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", "24.0", "-LRB-", "±", "0.1", "-RRB-", "67.8", "-LRB-", "±", "0.1", "-RRB-", "16.0", "-LRB-", "±", "0.7", "-RRB-", "22.2", "-LRB-", "±", "0.5", "-RRB-", "107.2", "-LRB-", "±", "49.4", "-RRB-", "*", "Median", "value", "of", "the", "granule", "size", "distribution", "†", "Temperature", "of", "onset", "of", "starch", "gelatinization", "‡", "Enthalpy", "released", "Expression", "levels", "of", "AGPase", "and", "GBSSI", "genes", "are", "down-regulated", "in", "the", "-LRB-", "+", "-RRB-", "and", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", "KDA", "class", "The", "expression", "levels", "of", "key", "genes", "involved", "in", "starch", "biosynthesis", "such", "as", "sucrose", "synthase", "-LRB-", "SuSy", "-RRB-", ",", "ADP-glucose", "pyrophosphorylase", "subunit", "S", "-LRB-", "AGPase", "-RRB-", ",", "starch", "synthase", "III", "-LRB-", "SSIII", "-RRB-", ",", "starch", "branching", "enzyme", "I", "-LRB-", "SBEI", "-RRB-", "and", "granule-bound", "starch", "synthase", "I", "-LRB-", "GBSSI", "-RRB-", "were", "monitored", "by", "real-time", "quantitative", "RT-PCR", "-LRB-", "Fig.", "5", "-RRB-", ".", "All", "these", "genes", "seemed", "to", "be", "down-regulated", ",", "particularly", "the", "AGPase", "and", "GBSSI", "genes", ".", "In", "most", "cases", ",", "the", "extent", "of", "AGPase", "and", "GBSSI", "down-regulation", "corresponded", "well", "with", "the", "amount", "of", "alternan", "that", "was", "accumulated", "in", "the", "potato", "tubers", ".", "However", ",", "AGPase", "down-regulation", "did", "not", "correlate", "with", "a", "reduction", "in", "starch", "content", "for", "the", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", "transformants", "-LRB-", "107.2", "±", "49.4", "mg", "g", "−", "1", "FW", "-RRB-", "when", "compared", "to", "KD-UT", "-LRB-", "214.8", "±", "117.5", "mg", "g", "−", "1", "FW", "-RRB-", ".", "Concerning", "GBSSI", ",", "the", "down-regulation", "was", "about", "20", "times", "less", "than", "for", "the", "transformant", "RVT34-77", "in", "which", "GBSSI", "is", "completely", "inhibited", ".", "Typically", ",", "no", "reduction", "in", "amylose", "content", "was", "observed", "for", "the", "KDA", "transformants", "-LRB-", "Table", "1", "-RRB-", ",", "irrespective", "of", "their", "GBSSI", "messenger", "RNA", "level", ".", "Thus", ",", "the", "observed", "reduction", "in", "GBSSI", "expression", "for", "the", "-LRB-", "+", "-RRB-", "and", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", "KDA", "classes", "were", "significant", "within", "the", "selected", "transformants", ",", "but", "relatively", "small", "with", "respect", "to", "the", "RVT34-77", "transformant", ".", "Fig.", "5Real-time", "quantitative", "RT-PCR", "analysis", "of", "KDA24", "-LRB-", "−", "-RRB-", ",", "KDA27", "-LRB-", "+", "-RRB-", "and", "KDA13", "-LRB-", "+", "+", "-RRB-", "transformants", "and", "KD-UT", "tuber", "RNA", "using", "the", "following", "specific", "primers", ":", "SuSy", ",", "sucrose", "synthase", ";", "AGPase", ",", "ADP-glucose", "pyrophosphorylase", "subunit", "S", ";", "SSIII", ",", "starch", "synthase", "III", ";", "SBEI", ",", "starch", "branching", "enzyme", "I", ";", "GBSSI", ",", "granule-bound", "starch", "synthase", "I.", "RNA", "levels", "for", "each", "gene", "were", "expressed", "relative", "to", "the", "amount", "of", "Ubi3", "RNA", ",", "as", "described", "in", "materials", "and", "methods", ".", "RNA", "sample", "from", "Karnico", "potato", "tubers", "expressing", "a", "sense/antisense", "GBSSI", "cDNA", "construct", "exhibiting", "a", "complete", "GBSSI", "down-regulation", "-LRB-", "RVT34-77", "-RRB-", ",", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "Discussion", "This", "report", "is", "the", "first", "study", "on", "the", "production", "of", "alternan", "in", "potato", "tubers", ".", "Their", "presence", "in", "potato", "juices", "was", "demonstrated", "by", "ELISA", "using", "anti-dextran", "antibodies", ".", "Expression", "of", "ASR", "did", "not", "interfere", "with", "plant", "growth", "and", "development", ",", "and", "tuber", "and", "starch", "yield", "penalties", "were", "not", "observed", ".", "These", "results", "were", "similar", "to", "those", "obtained", "with", "the", "dextransucrase", "-LRB-", "DSRS", "-RRB-", "expression", "-LRB-", "Kok-Jacon", "et", "al.", "2005a", "-RRB-", ",", "but", "not", "to", "those", "obtained", "with", "the", "mutansucrase", "-LRB-", "GTFI", "-RRB-", "expression", "in", "which", "the", "tuber", "phenotype", "was", "significantly", "affected", "-LRB-", "Kok-Jacon", "et", "al.", "2005b", "-RRB-", ".", "The", "amount", "of", "alternan", "accumulated", "in", "potato", "tubers", "-LRB-", "1.2", "mg", "g", "−", "1", "fresh", "wt", "-RRB-", "was", "lower", "than", "that", "of", "dextran", "-LRB-", "1.7", "mg", "g", "−", "1", "fresh", "wt", "-RRB-", "-LRB-", "Kok-Jacon", "et", "al.", "2005a", "-RRB-", ".", "It", "might", "be", "possible", "that", "the", "large", "size", "of", "the", "mature", "ASR", "-LRB-", "2,057", "amino-acids", "-LRB-", "a.a", "-RRB-", "when", "compared", "to", "DSRS", "with", "only", "1,527", "a.a.", "-RRB-", "might", "reduce", "the", "efficiency", "with", "which", "the", "enzyme", "is", "transported", "through", "the", "amyloplast", "membrane", ".", "However", ",", "such", "explanation", "needs", "to", "be", "approached", "with", "caution", "because", "the", "presence", "of", "alternansucrase", "in", "the", "amyloplast", "was", "not", "directly", "evidenced", ",", "as", "no", "ASR", "antibodies", "were", "available", "to", "us", ".", "Interestingly", ",", "it", "has", "been", "shown", "that", "the", "size", "of", "ASR", "can", "be", "reduced", "-LRB-", "by", "removal", "82", "%", "-LRB-", "632/767", "a.a.", "-RRB-", "of", "the", "C-terminal", "GBD", "-RRB-", "without", "compromising", "its", "activity", "-LRB-", "Joucla", "et", "al.", "2006", "-RRB-", ".", "If", "the", "size", "of", "the", "protein", "is", "indeed", "a", "critical", "factor", ",", "than", "this", "truncated", "variant", "may", "be", "a", "useful", "tool", "to", "enhance", "alternan", "synthesis", "in", "the", "amyloplast", ".", "Such", "an", "approach", "was", "already", "employed", "successfully", "for", "the", "Streptococcus", "downei", "mutansucrase", "GTFI", "-LRB-", "Kok-Jacon", "et", "al.", "2005b", "-RRB-", ".", "We", "have", "directed", "a", "mature", "and", "a", "GBD-truncated", "GTFI", "protein", "to", "potato", "amyloplasts", ",", "and", "found", "that", "the", "truncated", "form", "synthesized", "a", "larger", "amount", "of", "mutan", ",", "with", "much", "more", "pronounced", "effect", "on", "starch", "granule", "morphology", ".", "Although", "ASR", "is", "known", "to", "be", "efficient", "in", "catalyzing", "acceptor", "reactions", "-LRB-", "Richard", "et", "al.", "2003", ";", "Côté", "and", "Sheng", "2006", "-RRB-", ",", "no", "evidence", "was", "found", "for", "the", "covalent", "attachment", "of", "novel", ",", "alternan-based", "structural", "elements", "to", "starch", "molecules", ".", "Also", "with", "dextransucrase", "and", "mutansucrase", "we", "have", "not", "been", "able", "to", "introduce", "different", "glycosyl", "linkage", "patterns", "in", "starch", "-LRB-", "Kok-Jacon", "et", "al.", "2005a", ",", "b", "-RRB-", ".", "To", "this", "end", ",", "acceptor", "reactions", "of", "glucansucrases", "with", "starch", "or", "maltodextrins", "are", "not", "studied", "in", "much", "detail", ".", "It", "has", "been", "observed", "that", "the", "efficiency", "of", "acceptor", "reaction", "decreases", "with", "increasing", "length", "of", "maltodextrins", "-LRB-", "reviewed", "in", "Kok-Jacon", "et", "al.", "2003", "-RRB-", ".", "We", "had", "anticipated", "that", "the", "nascent", "starch", "polymers", "would", "be", "poor", "acceptors", "for", "the", "glucansucrases", ".", "However", ",", "during", "starch", "biosynthesis", "potential", "acceptors", "-LRB-", "small", "maltodextrins", "-RRB-", "are", "thought", "to", "be", "generated", "through", "the", "action", "of", ",", "for", "instance", ",", "debranching", "enzymes", "-LRB-", "or", "isoamylases", "-RRB-", ".", "If", "such", "a", "small", "acceptor", "is", "mutanylated", ",", "alternanylated", ",", "or", "dextranylated", "at", "the", "non-reducing", "end", ",", "then", "these", "novel", "structures", "might", "be", "incorporated", "into", "starch", "polymers", "through", "the", "action", "of", "certain", "transferases", "such", "as", ",", "for", "instance", ",", "branching", "enzyme", ".", "Apparently", ",", "this", "does", "not", "happen", ",", "or", "at", "a", "very", "low", "-LRB-", "undetectable", "-RRB-", "frequency", ",", "but", "the", "reason", "for", "this", "is", "unclear", ".", "Starch", "morphology", "in", "the", "ASR", "transformants", "was", "not", "significantly", "altered", "in", "comparison", "to", "that", "of", "dextran", "and", "mutan-accumulating", "plants", "-LRB-", "Fig.", "4", "-RRB-", ".", "This", "might", "be", "related", "to", "the", "fact", "that", "alternan", "is", "more", "water-soluble", "than", "dextran", "and", "mutan", ".", "An", "indication", "of", "the", "water-solubility", "of", "the", "three", "polysaccharides", "is", "given", "in", "Fig.", "4", ";", "the", "more", "ethanol", "is", "required", "for", "precipitation", ",", "the", "higher", "the", "water-solubility", ".", "The", "water-solubility", "decreases", "in", "the", "order", "of", "alternan", ",", "dextran", "and", "mutan", ".", "We", "hypothesize", "that", "the", "co-synthesis", "of", "water-insoluble", "mutan", "and", "starch", "leads", "to", "co-crystallization", "of", "the", "two", "polymers", ",", "as", "a", "result", "of", "which", "the", "granule", "is", "packed", "in", "a", "less", "orderly", "fashion", ".", "This", "comparison", "should", "be", "approached", "with", "caution", ".", "For", "alternan", "and", "dextran", ",", "the", "observed", "differences", "in", "starch", "morphology", "may", "also", "be", "related", "to", "the", "fact", "that", "more", "dextran", "than", "alternan", "was", "accumulated", "in", "the", "potato", "tubers", ";", "for", "mutan", ",", "we", "have", "not", "been", "able", "to", "quantify", "the", "amount", "accumulated", "in", "the", "tubers", ".", "Therefore", ",", "it", "can", "not", "be", "excluded", "that", "the", "observed", "effects", "are", "related", "to", "the", "amount", "of", "foreign", "polymer", "produced", ".", "Interestingly", ",", "co-synthesis", "of", "levan", ",", "a", "water-soluble", "fructosyl-based", "polymer", ",", "and", "starch", "resulted", "in", "a", "dramatically", "altered", "starch", "granule", "morphology", "-LRB-", "Gerrits", "2000", "-RRB-", ".", "However", ",", "it", "should", "be", "noted", "that", "much", "higher", "levels", "of", "levan", ",", "which", "were", "estimated", "to", "be", "66", "mg", "g", "−", "1", "fresh", "wt", "-LRB-", "Gerrits", "et", "al.", "2001", ";", "Cairns", "2003", "-RRB-", ",", "were", "produced", "in", "comparison", "with", "alternan", "-LRB-", "1.2", "mg", "g", "−", "1", "fresh", "wt", "-RRB-", "or", "dextran", "-LRB-", "1.7", "mg", "g", "−", "1", "fresh", "wt", "-RRB-", ",", "and", "that", "the", "starch", "granules", "contained", "approximately", "5", "%", "of", "levan", ".", "This", "result", "contrasts", "with", "that", "of", "alternan", "-", "and", "dextran-accumulating", "plants", "in", "which", "foreign", "polymers", "were", "only", "found", "in", "the", "stroma", ".", "Taking", "together", "the", "results", "of", "potato", "transformants", "expressing", "glucan", "-", "or", "levansucrases", "in", "amyloplasts", ",", "it", "seems", "that", "the", "site", "of", "accumulation", "of", "the", "foreign", "polymer", "-LRB-", "granule", "or", "stroma", "-RRB-", ",", "the", "solubility", "of", "the", "foreign", "polymer", ",", "and", "the", "amount", "of", "foreign", "polymer", "that", "is", "actually", "produced", "are", "important", "factors", "in", "determining", "starch", "granule", "morphology", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "Nuclear", "morphometric", "features", "in", "benign", "breast", "tissue", "and", "risk", "of", "subsequent", "breast", "cancer", "Certain", "nuclear", "morphometric", "features", "measured", "in", "breast", "tumor", "tissue", "have", "been", "shown", "to", "predict", "the", "prognosis", "of", "breast", "cancer", "patients", ".", "However", ",", "the", "application", "of", "these", "features", "to", "predicting", "risk", "of", "breast", "cancer", "development", "has", "received", "little", "attention", ".", "We", "conducted", "a", "case-control", "study", "to", "evaluate", "nuclear", "morphometric", "features", "in", "benign", "breast", "tissue", "in", "association", "with", "subsequent", "breast", "cancer", "risk", ".", "The", "study", "was", "nested", "within", "a", "cohort", "of", "4,888", "women", "with", "a", "histopathologic", "diagnosis", "of", "benign", "breast", "disease", "-LRB-", "BBD", "-RRB-", "and", "involved", "61", "cases", "and", "71", "controls", ",", "amongst", "whom", "there", "were", "53", "matched", "case-control", "sets", ".", "Conditional", "logistic", "regression", "models", "were", "fitted", "to", "assess", "various", "measurements", "of", "nuclear", "size", "and", "nuclear", "shape", "factors", "in", "relation", "to", "subsequent", "breast", "cancer", "risk", ".", "In", "multivariate", "analysis", ",", "subsequent", "breast", "cancer", "risk", "was", "positively", "associated", "with", "a", "nuclear", "shape", "factor", "that", "takes", "the", "shortest", "nuclear", "axis", "and", "the", "longest", "nuclear", "axis", "into", "consideration", "simultaneously", "-LRB-", "highest", "quartile", "versus", "lowest", "3", "quartiles", ":", "odds", "ratio", "=", "3.07", ",", "95", "%", "confidence", "limits", "=", "1.61", ",", "5.84", "-RRB-", ".", "In", "contrast", ",", "there", "was", "no", "alteration", "in", "subsequent", "breast", "cancer", "risk", "in", "association", "with", "nuclear", "size", "features", "and", "other", "shape", "factors", ".", "In", "conclusion", ",", "our", "study", "results", "suggest", "that", "the", "shape", "factor", "that", "takes", "both", "the", "shortest", "nuclear", "axis", "and", "the", "longest", "nuclear", "axis", "into", "consideration", "might", "be", "of", "value", "to", "predict", "subsequent", "development", "of", "breast", "cancer", "among", "women", "with", "BBD", ".", "Introduction", "Benign", "breast", "disease", "-LRB-", "BBD", "-RRB-", ",", "in", "addition", "to", "certain", "hormonal", ",", "anthropometric", ",", "and", "lifestyle", "factors", ",", "is", "a", "well-established", "risk", "factor", "for", "breast", "cancer", "-LSB-", "1", ",", "2", "-RSB-", ".", "However", ",", "BBD", "comprises", "a", "broad", "spectrum", "of", "histological", "entities", "-LSB-", "3", "-RSB-", ".", "Both", "epidemiologic", "and", "experimental", "studies", "suggest", "that", "non-atypical", "and", "atypical", "proliferative", "changes", "represent", "successive", "steps", "preceding", "the", "development", "of", "in", "situ", "cancer", "and", "then", "invasive", "carcinoma", "of", "the", "breast", "-LSB-", "4", "-RSB-", ".", "However", ",", "only", "a", "small", "fraction", "of", "women", "will", "eventually", "develop", "breast", "cancer", "after", "their", "diagnosis", "of", "BBD", "-LSB-", "5", "-RSB-", ".", "Therefore", ",", "it", "is", "important", "to", "differentiate", "BBD", "patients", "with", "a", "high", "risk", "of", "subsequent", "development", "of", "breast", "cancer", "from", "those", "with", "a", "low", "risk", ".", "Our", "understanding", "regarding", "this", "issue", ",", "however", ",", "is", "rather", "limited", ",", "although", "previous", "studies", "have", "suggested", "that", "factors", "such", "as", "type", "of", "histological", "subtype", "-LRB-", "e.g.", ",", "atypical", "hyperplasia", "-RRB-", ",", "menopausal", "status", ",", "and", "family", "history", "of", "breast", "cancer", ",", "might", "modify", "breast", "cancer", "risk", "among", "women", "with", "BBD", "-LSB-", "6", "-RSB-", ".", "Computerized", "image", "analysis", "and", "morphometry", "can", "quantify", "a", "number", "of", "nuclear", "morphometric", "features", "such", "as", "nuclear", "size", ",", "nuclear", "shape", ",", "and", "chromatin", "texture", "-LSB-", "7", "-RSB-", ".", "The", "evaluation", "of", "these", "features", "may", "facilitate", "the", "diagnosis", "and", "management", "of", "breast", "cancer", "patients", "-LSB-", "8", "--", "10", "-RSB-", ".", "Indeed", ",", "certain", "nuclear", "morphometric", "features", "measured", "in", "breast", "tumor", "tissue", "have", "been", "shown", "to", "predict", "the", "prognosis", "of", "breast", "cancer", "patients", "-LSB-", "11", "--", "15", "-RSB-", ".", "Furthermore", ",", "a", "study", "by", "Mommers", "et", "al.", "-LSB-", "16", "-RSB-", "observed", "that", "normal", "breast", "tissue", "or", "usual", "ductal", "hyperplasia", "harbored", "nuclear", "morphometric", "changes", "that", "might", "be", "used", "to", "predict", "subsequent", "development", "of", "breast", "cancer", ".", "In", "the", "study", "reported", "here", ",", "we", "conducted", "a", "nested", "case-control", "study", "to", "evaluate", "whether", "nuclear", "morphometric", "features", "as", "evaluated", "in", "tissue", "sections", "of", "BBD", "may", "be", "related", "to", "the", "risk", "of", "subsequent", "breast", "cancer", "among", "patients", "with", "BBD", ".", "Methods", "Study", "population", "The", "present", "investigation", "was", "undertaken", "using", "histological", "sections", "from", "a", "previous", "case-control", "study", "nested", "within", "the", "cohort", "of", "4,888", "women", "in", "the", "Canadian", "National", "Breast", "Screening", "Study", "-LRB-", "NBSS", "-RRB-", "who", "were", "diagnosed", "histopathologically", "with", "BBD", "during", "the", "active", "follow-up", "phase", "of", "the", "NBSS", "-LSB-", "17", "-RSB-", ".", "The", "NBSS", "is", "a", "multi-center", "randomized", ",", "controlled", "trial", "of", "screening", "for", "breast", "cancer", "among", "89,835", "women", "aged", "40", "--", "59", "years", "at", "recruitment", ".", "The", "design", "of", "the", "NBSS", "and", "population", "characteristics", "have", "been", "described", "in", "detail", "elsewhere", "-LSB-", "18", ",", "19", "-RSB-", ".", "Recruitment", "took", "place", "between", "1980", "and", "1985", ",", "and", "study", "subjects", "were", "followed", "actively", "until", "1988", ".", "Eligibility", "for", "the", "study", "was", "restricted", "to", "women", "with", "no", "history", "of", "breast", "cancer", "-LRB-", "in", "situ", "or", "invasive", "-RRB-", ".", "The", "NBSS", "was", "approved", "by", "the", "appropriate", "Institutional", "Review", "Boards", ",", "and", "the", "study", "described", "here", "involved", "the", "analysis", "of", "material", "and", "data", "from", "that", "study", "in", "accordance", "with", "the", "approved", "study", "design", ".", "Informed", "consent", "was", "obtained", "from", "all", "study", "participants", ".", "Diagnosis", "of", "BBD", "In", "the", "NBSS", ",", "women", "who", "had", "clinical", "or", "radiologic", "evidence", "of", "breast", "lesion", "underwent", "either", "a", "needle", "aspiration", "or", "a", "biopsy", ".", "Diagnosis", "of", "BBD", "was", "performed", "by", "a", "reference", "pathologist", ".", "Our", "study", "was", "restricted", "to", "women", "who", "had", "no", "evidence", "of", "either", "in", "situ", "or", "invasive", "breast", "cancer", "on", "their", "initial", "surgical", "biopsy", ".", "Women", "with", "a", "history", "of", "BBD", "were", "not", "excluded", "from", "the", "analyses", ".", "During", "the", "follow-up", "period", ",", "we", "identified", "4,888", "women", "with", "a", "histopathologic", "diagnosis", "of", "BBD", ",", "who", "were", "followed", "up", "for", "the", "subsequent", "development", "of", "breast", "cancer", ".", "Selection", "of", "cases", "and", "controls", "Incident", "cases", "of", "breast", "cancer", "were", "ascertained", "by", "record", "linkage", "with", "the", "provincial", "cancer", "registries", ",", "and", "death", "clearance", "was", "performed", "by", "linkage", "to", "the", "Canadian", "National", "Mortality", "Database", "-LSB-", "18", ",", "19", "-RSB-", ".", "The", "dates", "of", "the", "linkages", "varied", "by", "province", ",", "ranging", "from", "late", "1988", "to", "early", "1991", ".", "A", "total", "of", "16", "subjects", "with", "ductal", "carcinoma", "in", "situ", "and", "76", "subjects", "with", "invasive", "carcinoma", "were", "ascertained", "among", "the", "cohort", "of", "women", "with", "BBD", ".", "Potential", "control", "subjects", "were", "women", "with", "BBD", "who", "had", "not", "developed", "breast", "cancer", "-LRB-", "but", "were", "alive", "at", "-RRB-", "by", "the", "date", "of", "diagnosis", "of", "the", "corresponding", "case", "subject", ".", "Five", "controls", "were", "selected", "randomly", "-LRB-", "with", "replacement", "-RRB-", "for", "each", "case", "from", "those", "non-cases", "available", "within", "strata", "defined", "by", "screening", "center", ",", "NBSS", "study", "arm", ",", "year", "of", "birth", "-LRB-", "if", "possible", "to", "the", "nearest", "year", ",", "and", "mostly", "within", "2", "years", "-RRB-", ",", "and", "age", "at", "diagnosis", "of", "BBD", ".", "For", "the", "study", "reported", "here", ",", "61", "case", "subjects", "and", "71", "control", "subjects", "-LRB-", "including", "53", "matched", "case-control", "sets", "-RRB-", "were", "included", ".", "Questionnaire", "Upon", "enrollment", "in", "the", "NBSS", ",", "all", "participants", "completed", "a", "questionnaire", "that", "sought", "information", "on", "demographic", "characteristics", "and", "risk", "factors", "for", "breast", "cancer", ",", "including", "menstrual", "and", "reproductive", "histories", "and", "family", "history", "of", "breast", "cancer", ".", "Morphometry", "Morphometric", "measurements", "were", "performed", "on", "H&E", "stained", "slides", ",", "using", "the", "QPRODIT", "interactive", "video-overlay", "system", "-LRB-", "Leica", ",", "Cambridge", ",", "UK", "-RRB-", ".", "About", "50", "nuclei", "were", "selected", "in", "the", "most", "representative", "areas", "of", "the", "slide", "-LRB-", "selected", "by", "a", "breast", "pathologist", "-RRB-", ",", "and", "their", "contours", "were", "traced", "manually", "using", "a", "100", "×", "objective", "-LRB-", "final", "magnification", "about", "3,000", "×", "-RRB-", "-LSB-", "20", "-RSB-", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "of", "nuclear", "area", ",", "perimeter", ",", "diameter", ",", "shortest", "axis", ",", "longest", "axis", ",", "and", "axis", "ratio", "were", "calculated", ",", "as", "well", "as", "different", "shape", "factors", ".", "The", "shape", "factors", "were", "calculated", "by", "the", "following", "formulas", ":", "Form_AR", "=", "-LRB-", "1/4", "-RRB-", "*", "pi", "*", "longest", "axis", "*", "shortest", "axis", ";", "Form_PE", "=", "4", "*", "pi", "*", "area", "/", "-LRB-", "perimeter", "squared", "-RRB-", ";", "Form_NCI", "=", "perimeter/sqrt", "-LRB-", "area", "-RRB-", ";", "Contour", "ratio", "=", "perimeter", "squared/4", "*", "pi", "*", "area", ";", "and", "Roundness", "=", "perimeter", "/", "-LRB-", "2", "*", "sqrt", "-LRB-", "pi", "*", "area", "-RRB-", "-RRB-", ".", "All", "morphometric", "assessments", "were", "performed", "by", "one", "observer", "without", "knowledge", "of", "patient", "outcome", ".", "Statistical", "analysis", "Morphometric", "measurements", "were", "first", "compared", "between", "cases", "and", "controls", "using", "Student", "'s", "t-test", ".", "Subsequently", ",", "the", "measurements", "were", "categorized", "by", "quartiles", "and", "then", "odds", "ratios", "-LRB-", "OR", "-RRB-", "and", "95", "%", "confidence", "limits", "-LRB-", "CLs", "-RRB-", "were", "calculated", "for", "the", "risk", "of", "breast", "cancer", "for", "those", "in", "the", "highest", "quartile", "level", "compared", "to", "that", "for", "those", "in", "the", "lowest", "3", "quartile", "levels", "using", "conditional", "logistic", "regression", ".", "In", "multivariate", "analyses", ",", "we", "controlled", "for", "age", "at", "menarche", "-LRB-", "<", "13", ",", "13", ",", "14", "+", "-RRB-", ",", "age", "at", "first", "live", "birth", "-LRB-", "nulliparous", ",", "<", "23", ",", "23", "--", "26", ",", "27", "+", "-RRB-", ",", "menopausal", "status", "-LRB-", "pre", "-", ",", "peri", "-", ",", "post", "-", "-RRB-", ",", "oral", "contraceptive", "use", "-LRB-", "ever", "versus", "never", "-RRB-", ",", "postmenopausal", "estrogen", "use", "-LRB-", "ever", "vs.", "never", "-RRB-", ",", "body", "mass", "index", "-LRB-", "<", "25", ",", "25", "+", "-RRB-", ",", "family", "history", "of", "breast", "cancer", ",", "and", "the", "presence", "of", "hyperplasia", "in", "the", "benign", "tissue", ".", "All", "statistical", "analyses", "were", "performed", "in", "SAS", "9.1", "-LRB-", "SAS", "Institute", ",", "Cary", ",", "NC", "-RRB-", ".", "P-values", "were", "two-sided", ".", "Results", "Table", "1", "summarizes", "the", "distribution", "of", "selected", "characteristics", "among", "the", "cases", "and", "controls", ".", "Overall", ",", "few", "differences", "between", "the", "cases", "and", "controls", "were", "observed", "for", "age", "at", "menarche", ",", "age", "at", "first", "live", "birth", ",", "menopausal", "status", ",", "oral", "contraceptive", "use", ",", "postmenopausal", "estrogen", "use", ",", "body", "mass", "index", ",", "family", "history", "of", "breast", "cancer", ",", "and", "the", "presence", "of", "hyperplasia", "in", "benign", "tissue", ".", "Table", "1", ".", "Distribution", "of", "selected", "characteristics", "among", "breast", "cancer", "cases", "and", "non-cases", "N", "-LRB-", "%", "-RRB-", "P-valueCasesControlsAge", "at", "menarche", "<", "1330", "-LRB-", "49", "-RRB-", "26", "-LRB-", "37", "-RRB-", "0.291313", "-LRB-", "21", "-RRB-", "22", "-LRB-", "31", "-RRB-", "14", "+18", "-LRB-", "30", "-RRB-", "23", "-LRB-", "32", "-RRB-", "Age", "at", "first", "live", "birthNulliparous11", "-LRB-", "18", "-RRB-", "9", "-LRB-", "13", "-RRB-", "0.84", "<", "2322", "-LRB-", "36", "-RRB-", "29", "-LRB-", "41", "-RRB-", "23", "--", "2619", "-LRB-", "31", "-RRB-", "23", "-LRB-", "32", "-RRB-", "27", "+9", "-LRB-", "15", "-RRB-", "10", "-LRB-", "14", "-RRB-", "Menopausal", "statusPre-30", "-LRB-", "49", "-RRB-", "31", "-LRB-", "44", "-RRB-", "0.71Peri-9", "-LRB-", "15", "-RRB-", "14", "-LRB-", "20", "-RRB-", "Post-22", "-LRB-", "36", "-RRB-", "26", "-LRB-", "36", "-RRB-", "Ever", "used", "oral", "contraceptivesYes35", "-LRB-", "57", "-RRB-", "42", "-LRB-", "60", "-RRB-", "0.76", "No26", "-LRB-", "43", "-RRB-", "28", "-LRB-", "40", "-RRB-", "Missing01Ever", "used", "postmenopausal", "estrogensYes15", "-LRB-", "25", "-RRB-", "15", "-LRB-", "22", "-RRB-", "0.70", "No46", "-LRB-", "75", "-RRB-", "54", "-LRB-", "78", "-RRB-", "Missing02Body", "mass", "index", "-LRB-", "kg/m2", "-RRB-", "<", "2532", "-LRB-", "53", "-RRB-", "41", "-LRB-", "58", "-RRB-", "0.4225", "--", "<", "3027", "-LRB-", "44", "-RRB-", "25", "-LRB-", "35", "-RRB-", "30", "+2", "-LRB-", "3", "-RRB-", "5", "-LRB-", "7", "-RRB-", "Family", "history", "of", "breast", "cancerYes23", "-LRB-", "38", "-RRB-", "28", "-LRB-", "39", "-RRB-", "0.84", "No38", "-LRB-", "62", "-RRB-", "43", "-LRB-", "61", "-RRB-", "Hyperplasia", "in", "benign", "tissueAbsent34", "-LRB-", "59", "-RRB-", "47", "-LRB-", "68", "-RRB-", "0.27", "Present24", "-LRB-", "41", "-RRB-", "22", "-LRB-", "32", "-RRB-", "Missing32", "There", "was", "little", "difference", "between", "the", "cases", "and", "controls", "with", "respect", "to", "nuclear", "morphometric", "features", "including", "mean", "area", ",", "standard", "deviation", "-LRB-", "SD", "-RRB-", "of", "area", ",", "perimeter", ",", "diameter", ",", "shortest", "axis", ",", "and", "longest", "axis", ",", "as", "well", "as", "such", "shape", "factors", "as", "Form_PE", ",", "Form_NCI", ",", "contour", ",", "and", "roundness", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "In", "contrast", ",", "the", "shape", "factor", "Form_AR", "was", "greater", "among", "cases", "than", "among", "controls", ".", "Furthermore", ",", "subjects", "with", "hyperplasia", "had", "greater", "measures", "of", "some", "nuclear", "size", "features", "including", "mean", "area", ",", "SD", "of", "area", ",", "perimeter", ",", "diameter", ",", "and", "longest", "axis", ",", "and", "the", "shape", "factor", "Form_AR", "than", "did", "subjects", "without", "hyperplasia", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Table", "2", ".", "Comparison", "of", "nuclear", "morphometric", "features", "in", "benign", "breast", "tissue", "between", "breast", "cancer", "cases", "and", "non-casesMorphometric", "measurementsMean", "-LRB-", "standard", "deviation", "-RRB-", "P-valueCases", "-LRB-", "n", "=", "61", "-RRB-", "Controls", "-LRB-", "n", "=", "71", "-RRB-", "Mean", "nuclear", "area", "-LRB-", "μm2", "-RRB-", "26.8", "-LRB-", "7.5", "-RRB-", "25.3", "-LRB-", "7.2", "-RRB-", "0.25", "SD", "of", "nuclear", "area", "-LRB-", "μm2", "-RRB-", "5.2", "-LRB-", "1.8", "-RRB-", "5.0", "-LRB-", "1.6", "-RRB-", "0.43", "Nuclear", "perimeter", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "19.7", "-LRB-", "2.7", "-RRB-", "19.3", "-LRB-", "2.7", "-RRB-", "0.37", "Nuclear", "diameter", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "5.8", "-LRB-", "0.8", "-RRB-", "5.6", "-LRB-", "0.8", "-RRB-", "0.23", "Shortest", "nuclear", "axis", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "4.8", "-LRB-", "0.7", "-RRB-", "4.6", "-LRB-", "0.7", "-RRB-", "0.16", "Longest", "nuclear", "axis", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "7.1", "-LRB-", "1.0", "-RRB-", "7.0", "-LRB-", "1.0", "-RRB-", "0.53", "Axis", "ratio1", ".5", "-LRB-", "0.1", "-RRB-", "1.6", "-LRB-", "0.2", "-RRB-", "0.15", "Form_AR0", ".984", "-LRB-", "0.005", "-RRB-", "0.981", "-LRB-", "0.007", "-RRB-", "0.0089", "Form_PE0", ".844", "-LRB-", "0.037", "-RRB-", "0.831", "-LRB-", "0.045", "-RRB-", "0.083", "Form_NCI3", ".874", "-LRB-", "0.095", "-RRB-", "3.909", "-LRB-", "0.122", "-RRB-", "0.071", "Contour1", ".198", "-LRB-", "0.061", "-RRB-", "1.221", "-LRB-", "0.080", "-RRB-", "0.068", "Roundness1", ".093", "-LRB-", "0.027", "-RRB-", "1.103", "-LRB-", "0.034", "-RRB-", "0.071", "Quartile", "analyses", "revealed", "that", "subsequent", "breast", "cancer", "risk", "was", "increased", "in", "association", "with", "the", "shape", "factor", "Form_AR", ",", "but", "not", "with", "the", "other", "nuclear", "morphometric", "measurements", "-LRB-", "Table", "3", "-RRB-", ".", "Compared", "to", "BBD", "subjects", "with", "Form_AR", "equal", "to", "or", "less", "than", "0.986", ",", "subjects", "with", "Form_AR", "greater", "than", "0.986", "had", "a", "more", "than", "three-fold", "increased", "risk", "of", "developing", "breast", "cancer", "subsequently", "-LRB-", "OR", "=", "3.07", ",", "95", "%", "CL", "=", "1.61", ",", "5.84", "-RRB-", ".", "When", "the", "analyses", "were", "repeated", "using", "unconditional", "logistic", "regression", ",", "which", "enabled", "all", "the", "available", "cases", "and", "controls", "to", "be", "included", ",", "the", "results", "did", "not", "change", "substantially", ".", "Table", "3", ".", "Risk", "of", "Subsequent", "development", "of", "breast", "cancer", "in", "association", "with", "nuclear", "morphometric", "featuresaMorphometric", "measurementsCut-off", "valueOR", "-LRB-", "95", "%", "CL", "-RRB-", "Model", "1bModel", "2cMean", "nuclear", "area", "-LRB-", "μm2", "-RRB-", "31.21.28", "-LRB-", "0.73", ",", "2.25", "-RRB-", "0.94", "-LRB-", "0.50", ",", "1.78", "-RRB-", "SD", "of", "nuclear", "area", "-LRB-", "μm2", "-RRB-", "6.11.33", "-LRB-", "0.76", ",", "2.31", "-RRB-", "1.11", "-LRB-", "0.59", ",", "2.07", "-RRB-", "Nuclear", "perimeter", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "21.41.14", "-LRB-", "0.70", ",", "1.93", "-RRB-", "0.85", "-LRB-", "0.47", ",", "1.55", "-RRB-", "Nuclear", "diameter", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "6.31.29", "-LRB-", "0.73", ",", "2.27", "-RRB-", "0.95", "-LRB-", "0.50", ",", "1.79", "-RRB-", "Shortest", "nuclear", "axis", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "5.21.62", "-LRB-", "0.92", ",", "2.86", "-RRB-", "1.18", "-LRB-", "0.62", ",", "2.26", "-RRB-", "Longest", "nuclear", "axis", "-LRB-", "μm", "-RRB-", "8.01.34", "-LRB-", "0.75", ",", "2.39", "-RRB-", "0.95", "-LRB-", "0.50", ",", "1.81", "-RRB-", "Axis", "ratio1", ".60.59", "-LRB-", "0.30", ",", "1.17", "-RRB-", "0.71", "-LRB-", "0.33", ",", "1.54", "-RRB-", "Form_AR0", ".9862.45", "-LRB-", "1.42", ",", "4.22", "-RRB-", "3.07", "-LRB-", "1.61", ",", "5.84", "-RRB-", "Form_PE0", ".8671.22", "-LRB-", "0.71", ",", "2.08", "-RRB-", "1.57", "-LRB-", "0.83", ",", "2.97", "-RRB-", "Form_NCI3", ".9351.07", "-LRB-", "0.58", ",", "1.98", "-RRB-", "1.18", "-LRB-", "0.61", ",", "2.27", "-RRB-", "Contour1", ".2361.13", "-LRB-", "0.61", ",", "2.10", "-RRB-", "1.22", "-LRB-", "0.63", ",", "2.35", "-RRB-", "Roundness1", ".1101.07", "-LRB-", "0.58", ",", "1.98", "-RRB-", "1.18", "-LRB-", "0.61", ",", "2.27", "-RRB-", "a", "Analyses", "were", "conducted", "among", "53", "matched", "case-control", "sets", "by", "comparing", "the", "highest", "quartile", "versus", "the", "lowest", "3", "quartiles", "in", "conditional", "logistic", "regression", "modelsb", "Adjusted", "for", "matching", "variablesc", "Adjusted", "for", "matching", "variables", ",", "age", "at", "menarche", "-LRB-", "<", "13", ",", "13", ",", "14", "+", "-RRB-", ",", "age", "at", "first", "live", "birth", "-LRB-", "nulliparous", ",", "<", "23", ",", "23", "--", "26", ",", "27", "+", "-RRB-", ",", "menopausal", "status", "-LRB-", "pre", "-", ",", "peri", "-", ",", "post", "-", "-RRB-", ",", "oral", "contraceptive", "use", "-LRB-", "ever", "vs.", "never", "-RRB-", ",", "postmenopausal", "estrogen", "use", "-LRB-", "ever", "versus", "never", "-RRB-", ",", "body", "mass", "index", "-LRB-", "<", "25", ",", "25", "+", "-RRB-", ",", "family", "history", "of", "breast", "cancer", ",", "and", "the", "presence", "of", "hyperplasia", "in", "the", "benign", "tissue", "Discussion", "We", "found", "that", "breast", "cancer", "risk", "in", "women", "with", "BBD", "was", "positively", "associated", "with", "the", "shape", "factor", "Form_AR", ",", "a", "measurement", "that", "takes", "the", "shortest", "nuclear", "axis", "and", "the", "longest", "nuclear", "axis", "into", "consideration", "simultaneously", ".", "In", "contrast", ",", "there", "was", "no", "alteration", "in", "risk", "in", "association", "with", "nuclear", "area", ",", "SD", "of", "nuclear", "area", ",", "nuclear", "perimeter", ",", "nuclear", "diameter", ",", "shortest", "nuclear", "axis", ",", "longest", "nuclear", "axis", ",", "and", "other", "shape", "factors", ".", "Although", "subjects", "with", "hyperplasia", "had", "greater", "measures", "of", "Form_AR", "than", "did", "subjects", "without", "hyperplasia", ",", "we", "adjusted", "for", "hyperplasia", ",", "suggesting", "that", "the", "association", "with", "Form_AR", "is", "independent", "of", "that", "due", "to", "the", "presence", "of", "hyperplasia", ".", "Shape", "is", "one", "of", "the", "factors", "that", "pathologists", "use", "in", "assessing", "nuclear", "atypicality", ".", "Shape", "factors", "have", "been", "shown", "to", "have", "prognostic", "value", "in", "breast", "cancer", "-LSB-", "21", "--", "23", "-RSB-", ",", "renal", "cell", "cancer", "-LSB-", "24", "-RSB-", ",", "colorectal", "cancer", "-LSB-", "25", "-RSB-", ",", "squamous", "cell", "carcinoma", "of", "the", "larynx", "-LSB-", "26", "-RSB-", ",", "melanoma", "-LSB-", "27", "-RSB-", ",", "and", "rhabdomyosarcoma", "-LSB-", "28", "-RSB-", ".", "Apparently", ",", "alterations", "in", "nuclear", "shape", "can", "already", "be", "present", "at", "the", "earliest", "stages", "of", "carcinogenesis", ".", "This", "has", "in", "the", "breast", "also", "been", "shown", "for", "nuclear", "chromatin", "patterns", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "To", "date", ",", "only", "one", "study", "has", "been", "published", "that", "assessed", "morphometric", "features", "in", "association", "with", "subsequent", "development", "of", "breast", "cancer", "among", "women", "with", "BBD", "-LSB-", "16", "-RSB-", ".", "That", "study", "found", "positive", "associations", "for", "mean", "nuclear", "area", ",", "nuclear", "diameter", ",", "nuclear", "perimeter", ",", "and", "the", "longest", "nuclear", "axis", ",", "but", "no", "associations", "for", "SD", "of", "the", "nuclear", "area", "and", "the", "shortest", "nuclear", "axis", ";", "shape", "factors", "were", "not", "evaluated", ".", "However", ",", "potential", "confounding", "factors", "were", "not", "controlled", "for", ".", "In", "contrast", "to", "these", "findings", ",", "nuclear", "size", "features", "were", "not", "associated", "with", "risk", "in", "the", "present", "study", ",", "which", "may", "perhaps", "be", "explained", "by", "differences", "in", "tissue", "processing", "procedures", ".", "Our", "case-control", "study", "was", "nested", "in", "a", "cohort", "of", "patients", "with", "histopathologically", "confirmed", "BBD", "and", "our", "findings", "are", "likely", "to", "be", "internally", "valid", ".", "Biased", "measurement", "of", "the", "study", "exposures", "was", "not", "likely", "a", "source", "of", "error", ",", "given", "that", "the", "morphometric", "features", "were", "assessed", "without", "knowledge", "of", "the", "patient", "outcome", "status", ".", "Our", "study", "power", ",", "however", ",", "was", "limited", "by", "the", "relatively", "small", "sample", "size", ",", "due", "to", "which", "we", "were", "not", "able", "to", "evaluate", "modifying", "effects", "by", "well-documented", "risk", "factors", "of", "breast", "cancer", ".", "Moreover", ",", "residual", "confounding", "might", "still", "exist", ",", "although", "to", "minimize", "confounding", "we", "controlled", "for", "menstrual", "and", "reproductive", "history", ",", "exogenous", "estrogen", "use", ",", "body", "mass", "index", ",", "and", "family", "history", "of", "breast", "cancer", "in", "multivariate", "analyses", ".", "In", "conclusion", ",", "our", "study", "results", "suggest", "that", "the", "shape", "factor", "that", "takes", "both", "shortest", "nuclear", "axis", "and", "longest", "nuclear", "axis", "into", "consideration", "might", "be", "of", "value", "to", "predict", "subsequent", "development", "of", "breast", "cancer", "among", "patients", "with", "BBD", ".", "Given", "the", "limitations", "of", "our", "study", ",", "larger", "studies", "are", "warranted", "to", "confirm", "our", "study", "results", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "The", "type", "2C", "phosphatase", "Wip1", ":", "An", "oncogenic", "regulator", "of", "tumor", "suppressor", "and", "DNA", "damage", "response", "pathways", "The", "Wild-type", "p53-induced", "phosphatase", "1", ",", "Wip1", "-LRB-", "or", "PPM1D", "-RRB-", ",", "is", "unusual", "in", "that", "it", "is", "a", "serine/threonine", "phosphatase", "with", "oncogenic", "activity", ".", "A", "member", "of", "the", "type", "2C", "phosphatases", "-LRB-", "PP2Cδ", "-RRB-", ",", "Wip1", "has", "been", "shown", "to", "be", "amplified", "and", "overexpressed", "in", "multiple", "human", "cancer", "types", ",", "including", "breast", "and", "ovarian", "carcinomas", ".", "In", "rodent", "primary", "fibroblast", "transformation", "assays", ",", "Wip1", "cooperates", "with", "known", "oncogenes", "to", "induce", "transformed", "foci", ".", "The", "recent", "identification", "of", "target", "proteins", "that", "are", "dephosphorylated", "by", "Wip1", "has", "provided", "mechanistic", "insights", "into", "its", "oncogenic", "functions", ".", "Wip1", "acts", "as", "a", "homeostatic", "regulator", "of", "the", "DNA", "damage", "response", "by", "dephosphorylating", "proteins", "that", "are", "substrates", "of", "both", "ATM", "and", "ATR", ",", "important", "DNA", "damage", "sensor", "kinases", ".", "Wip1", "also", "suppresses", "the", "activity", "of", "multiple", "tumor", "suppressors", ",", "including", "p53", ",", "ATM", ",", "p16INK4a", "and", "ARF", ".", "We", "present", "evidence", "that", "the", "suppression", "of", "p53", ",", "p38", "MAP", "kinase", ",", "and", "ATM/ATR", "signaling", "pathways", "by", "Wip1", "are", "important", "components", "of", "its", "oncogenicity", "when", "it", "is", "amplified", "and", "overexpressed", "in", "human", "cancers", ".", "Introduction", "Cellular", "DNA", "is", "constantly", "exposed", "to", "various", "environmental", "and", "endogenous", "mutagenic", "insults", ".", "To", "maintain", "genomic", "integrity", "and", "prevent", "cancer", "in", "the", "face", "of", "these", "potentially", "mutagenic", "events", ",", "cells", "have", "evolved", "a", "sophisticated", "array", "of", "damage", "sensors", ",", "signaling", "molecules", ",", "and", "repair", "functions", ".", "Among", "the", "key", "sensors", "of", "DNA", "damage", "are", "the", "phosphoinositide-3-kinase-related", "kinase", "-LRB-", "PIKK", "-RRB-", "family", ",", "that", "include", "ATM", "-LRB-", "ataxia-telangiectasia", "mutated", "-RRB-", ",", "ATR", "-LRB-", "ataxia-telangiectasia", "and", "Rad3-related", "-RRB-", ",", "and", "DNA-PKcs", "-LRB-", "DNA", "dependent", "protein", "kinase", "catalytic", "subunit", "-RRB-", "-LSB-", "1", ",", "2", "-RSB-", ".", "Most", "PIKKs", "are", "serine/threonine", "kinases", "that", "are", "conserved", "from", "yeast", "to", "humans", "and", "phosphorylate", "key", "target", "proteins", "in", "various", "DNA", "damage", "response", "pathways", "-LSB-", "3", ",", "4", "-RSB-", ".", "The", "direct", "importance", "of", "the", "ATM/ATR-initiated", "damage", "response", "pathways", "in", "cancer", "prevention", "has", "recently", "been", "demonstrated", "by", "two", "groups", "-LSB-", "5", ",", "6", "-RSB-", ".", "Human", "pre-neoplastic", "lesions", "from", "a", "variety", "of", "different", "human", "cancers", "were", "shown", "to", "express", "markers", "of", "an", "activated", "DNA", "damage", "response", ",", "including", "activated", "and", "phosphorylated", "ATM", ",", "Chk2", ",", "p53", ",", "and", "H2AX", "-LSB-", "5", ",", "6", "-RSB-", ".", "Interestingly", ",", "late", "stage", "tumors", "often", "showed", "loss", "of", "these", "DNA", "damage", "response", "markers", ",", "suggesting", "that", "the", "disabling", "of", "DNA", "damage", "response", "pathways", "is", "an", "important", "prerequisite", "for", "cancer", "progression", "-LSB-", "5", ",", "6", "-RSB-", ".", "In", "studies", "of", "the", "DNA", "damage", "response", ",", "most", "attention", "has", "been", "focused", "on", "the", "activation", "and", "execution", "of", "that", "response", ".", "Less", "attention", "has", "been", "given", "to", "the", "reversal", "of", "the", "response", ".", "Once", "cell", "division", "has", "been", "halted", "and", "the", "DNA", "damage", "has", "been", "repaired", ",", "how", "does", "the", "cell", "return", "to", "its", "normal", "pre-stress", "state", "and", "re-enter", "cell", "division", "?", "Since", "activation", "of", "the", "damage", "response", "often", "occurs", "through", "phosphorylation", "of", "key", "downstream", "targets", "of", "ATM/ATR", ",", "phosphatases", "are", "obvious", "candidates", "as", "homeostatic", "regulators", "of", "the", "DNA", "damage", "response", ".", "In", "this", "review", "we", "will", "discuss", "the", "evidence", "that", "the", "Wild-type", "p53-induced", "phosphatase", "1", ",", "or", "Wip1", ",", "is", "a", "major", "homeostatic", "regulator", "of", "the", "ATM/ATR-initiated", "DNA", "damage", "response", ".", "In", "addition", "to", "its", "homeostatic", "role", "in", "the", "DNA", "damage", "response", ",", "we", "will", "also", "describe", "how", "Wip1", "downregulates", "important", "tumor", "suppressor", "molecules", ".", "Wip1", "has", "been", "shown", "to", "inhibit", "p53", "by", "multiple", "mechanisms", "and", "to", "downregulate", "p38", "MAP", "kinase", "through", "dephosphorylation", "-LSB-", "5", ",", "7", "--", "11", "-RSB-", ".", "Expression", "of", "p16INK4a", "and", "p14ARF", "have", "also", "been", "shown", "to", "be", "suppressed", "in", "some", "contexts", "by", "Wip1", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "The", "inhibition", "of", "these", "tumor", "suppressors", "is", "likely", "to", "be", "a", "major", "component", "of", "the", "oncogenic", "activity", "of", "this", "phosphatase", ".", "Discovery", "and", "initial", "characterization", "of", "Wip1", "Appella", "and", "colleagues", "originally", "identified", "the", "human", "Wip1", "gene", "by", "screening", "for", "genes", "induced", "in", "a", "p53-dependent", "manner", "in", "response", "to", "ionizing", "radiation", "-LRB-", "IR", "-RRB-", "in", "WMN", "Burkitt", "lymphoma", "cells", "-LSB-", "13", "-RSB-", ".", "Using", "mRNA", "differential", "display", "methodology", ",", "they", "identified", "a", "novel", "p53-induced", "gene", ".", "The", "Wip1", "transcript", "was", "induced", "by", "ultraviolet", "-LRB-", "UV", "-RRB-", "and", "IR", "in", "a", "p53-dependent", "manner", "-LSB-", "13", "-RSB-", ".", "Tumor", "cell", "lines", "with", "wild-type", "p53", "consistently", "showed", "IR-induced", "increases", "in", "Wip1", "mRNA", "while", "p53-deficient", "cell", "lines", "showed", "little", "or", "no", "induction", "of", "Wip1", "expression", "following", "radiation", "treatment", ".", "Cellular", "fractionation", "and", "indirect", "immunofluorescence", "indicated", "that", "the", "61", "kDa", "Wip1", "protein", "localizes", "to", "the", "nucleus", "-LSB-", "13", "-RSB-", ".", "The", "605", "amino", "acid", "human", "Wip1", "protein", "sequence", "can", "be", "subdivided", "into", "two", "major", "domains", ",", "a", "highly", "conserved", "N-terminal", "phosphatase", "domain", "from", "amino", "acids", "1", "--", "375", ",", "and", "a", "less", "conserved", "non-catalytic", "domain", "extending", "from", "amino", "acids", "376", "--", "605", ".", "This", "C-terminal", "domain", "of", "Wip1", "may", "facilitate", "nuclear", "localization", ".", "However", ",", "although", "this", "domain", "contains", "two", "putative", "nuclear", "localization", "signals", ",", "mutation", "of", "these", "motifs", "failed", "to", "prevent", "nuclear", "localization", "-LSB-", "14", "-RSB-", ".", "In", "addition", ",", "the", "C-terminal", "domain", "shows", "high", "conservation", "among", "mammalian", "Wip1s", "and", "limited", "conservation", "with", "non-mammalian", "Wip1", "molecules", ",", "but", "little", "or", "no", "similarity", "with", "other", "phosphatases", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "The", "phosphatase", "domain", "of", "Wip1", "shows", "the", "highest", "levels", "of", "similarity", "to", "the", "type", "2C", "family", "of", "serine/threonine", "protein", "phosphatases", "-LRB-", "PP2C", "-RRB-", ",", "consistent", "with", "its", "observed", "biochemical", "activities", "-LRB-", "Fig.", "1", "-LRB-", "b", "-RRB-", "-RRB-", "-LSB-", "13", ",", "15", "-RSB-", ".", "Fig.", "1Protein", "sequence", "alignment", "of", "human", "Wip1", "and", "human", "PP2Cα", ".", "-LRB-", "a", "-RRB-", "The", "overall", "structures", "of", "Wip1", "-LRB-", "top", "-RRB-", "and", "PP2Cα", "-LRB-", "bottom", "-RRB-", "show", "significant", "similarity", ".", "The", "conserved", "type", "2C", "phosphatase", "domain", "is", "shaded", "in", "Wip1", ".", "The", "regions", "of", "more", "highly", "conserved", "sequences", "labeled", "I", ",", "II", ",", "and", "III", "are", "shown", "as", "black", "blocks", ".", "The", "C-terminal", "non-catalytic", "domain", "that", "is", "present", "only", "in", "Wip1", "molecules", "-LRB-", "and", "is", "also", "well", "conserved", "among", "mammalian", "Wip1", "orthologues", "-RRB-", "is", "indicated", "by", "the", "white", "block", ".", "A", "putative", "nuclear", "localization", "signal", "-LRB-", "NLS", "-RRB-", "is", "also", "indicated", "near", "the", "C-terminus", "of", "Wip1", ".", "-LRB-", "b", "-RRB-", "Primary", "amino", "acid", "sequence", "alignment", "between", "human", "Wip1", "and", "human", "PP2Cα", "phosphatase", "domains", "is", "shown", ".", "Identical", "amino", "acids", "are", "highlighted", "with", "a", "black", "background", "while", "conservative", "amino", "acid", "substitutions", "are", "indicated", "with", "a", "gray", "background", ".", "The", "phosphatase", "domains", "of", "the", "two", "molecules", "show", "30", "%", "identity", "and", "45", "%", "similarity", "Using", "the", "human", "Wip1", "cDNA", "as", "a", "probe", ",", "our", "laboratory", "isolated", "the", "murine", "Wip1", "gene", "and", "mapped", "it", "to", "mouse", "chromosome", "11", "-LSB-", "16", "-RSB-", ".", "The", "human", "Wip1", "gene", "is", "located", "on", "chromosome", "17q22/q23", "-LSB-", "17", "-RSB-", ".", "The", "murine", "Wip1", "protein", "contains", "598", "amino", "acids", "and", "migrates", "at", "approximately", "66", "kDa", "on", "a", "SDS-PAGE", "gel", "-LSB-", "16", "-RSB-", ".", "The", "murine", "and", "human", "Wip1", "protein", "sequences", "have", "an", "overall", "identity", "of", "83", "%", "and", "an", "overall", "similarity", "of", "86", "%", ".", "RT-PCR", "and", "Northern", "blot", "analyses", "revealed", "that", "the", "Wip1", "mRNA", "is", "ubiquitously", "expressed", "in", "all", "mouse", "embryonic", "and", "adult", "tissues", ",", "with", "a", "very", "high", "level", "of", "expression", "in", "the", "testis", ".", "Wip1", "mRNA", "levels", "fluctuate", "during", "development", "-LSB-", "16", "-RSB-", ".", "Wip1", "is", "a", "type", "2C", "phosphatase", "Wip1", "is", "a", "member", "of", "the", "magnesium-dependent", "serine/threonine", "protein", "phosphatase", "-LRB-", "PPM", "-RRB-", "family", "-LSB-", "18", ",", "19", "-RSB-", ".", "This", "is", "a", "large", "and", "varied", "family", "of", "protein", "phosphatases", "present", "in", "both", "prokaryotes", "and", "eukaryotes", ",", "whose", "defining", "member", "is", "PP2Cα", "-LSB-", "20", ",", "21", "-RSB-", ".", "To", "date", ",", "18", "human", "PPM/PP2C", "genes", "have", "been", "identified", "-LSB-", "19", "-RSB-", ".", "In", "prokaryotes", "and", "eukaryotes", ",", "the", "PPM/PP2C", "family", "of", "phosphatases", "plays", "a", "role", "in", "regulating", "stress", "response", "pathways", "-LSB-", "18", ",", "20", ",", "21", "-RSB-", ".", "Like", "other", "PPM/PP2C", "family", "members", ",", "Wip1", "is", "a", "monomeric", "enzyme", "that", "requires", "divalent", "cations", ",", "mainly", "Mg2", "+", "or", "Mn2", "+", ",", "for", "catalytic", "efficacy", "and", "is", "insensitive", "to", "okadaic", "acid", ",", "a", "potent", "inhibitor", "of", "the", "PP1", "and", "PP2A", "phosphatases", "-LSB-", "18", ",", "20", ",", "21", "-RSB-", ".", "Using", "a", "BLAST", "search", "of", "the", "sequence", "database", ",", "human", "Wip1", "shows", "an", "overall", "identity", "of", "30", "%", "and", "an", "overall", "similarity", "of", "45", "%", "to", "human", "PP2Cα", "and", "PP2Cβ", "-LRB-", "Fig.", "1", "-LRB-", "b", "-RRB-", "-RRB-", ".", "Like", "PP2Cα", "and", "PP2Cβ", ",", "Wip1", "also", "negatively", "regulates", "the", "stress", "responsive", "p38", "mitogen-activated", "protein", "kinase", "-LRB-", "MAPK", "-RRB-", "pathway", "by", "directly", "inactivating", "p38", "through", "dephosphorylation", "of", "phosphothreonine", "180", "of", "the", "regulatory", "pTXpY", "motif", "found", "in", "the", "activation", "loop", "of", "the", "kinase", "-LSB-", "11", ",", "22", ",", "23", "-RSB-", ".", "Based", "on", "the", "sequence", "homology", "between", "Wip1", "and", "PP2Cα", ",", "β", ",", "and", "γ", ",", "Yamaguchi", "et", "al.", "-LSB-", "15", "-RSB-", "developed", "a", "structural", "model", "for", "the", "catalytic", "domain", "of", "Wip1", ".", "From", "these", "studies", ",", "Arg76", "of", "human", "Wip1", "-LRB-", "Arg69", "of", "mouse", "Wip1", "-RRB-", "aligned", "with", "Arg33", "of", "PP2Cα", ",", "suggesting", "that", "Arg76", "of", "human", "Wip1", "performs", "the", "same", "role", "as", "the", "catalytic", "Arg33", "of", "PP2Cα", ".", "Substrate", "specificity", "studies", "indicated", "that", "peptides", "containing", "pSXpY", "inhibit", "Wip1", ",", "while", "pTXpY", "peptides", "are", "Wip1", "substrates", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "Sequences", "on", "either", "side", "of", "the", "pTXpY", "motif", "did", "not", "greatly", "affect", "Wip1", "activity", ",", "but", "the", "residue", "-LRB-", "X", "-RRB-", "lying", "between", "the", "two", "conserved", "phospho-acceptors", "affected", "Wip1", "affinity", "and", "correlated", "with", "selectivity", "for", "MAP", "kinases", ".", "From", "these", "studies", "a", "specific", "Wip1", "inhibitor", "was", "developed", ",", "and", "using", "simulations", "with", "the", "proposed", "structural", "model", "of", "Wip1", ",", "the", "phospho-Ser", "of", "the", "inhibitor", "was", "shown", "to", "be", "in", "contact", "with", "the", "proposed", "catalytic", "Arg76", ",", "thus", "blocking", "its", "interaction", "with", "potential", "targets", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "While", "the", "specificity", "of", "Wip1", "for", "pTXpY", "motifs", "is", "clear", "from", "biochemical", "and", "cell", "biology", "studies", "-LSB-", "11", ",", "15", ",", "24", ",", "25", "-RSB-", ",", "the", "recent", "identification", "of", "targets", "in", "which", "Wip1", "dephosphorylates", "sites", "modified", "by", "ATM/ATR", "indicates", "an", "additional", "specificity", ".", "ATM", "and", "ATR", "phosphorylate", "pS/pTQ", "sites", "in", "over", "700", "proteins", "in", "the", "cell", "-LSB-", "4", "-RSB-", "and", "Wip1", "has", "been", "shown", "to", "dephosphorylate", "pS/pTQ", "sites", "in", "vitro", "and", "in", "vivo", "on", "at", "least", "five", "proteins", ",", "ATM", ",", "Chk1", ",", "Chk2", ",", "p53", ",", "and", "Mdm2", "-LRB-", "see", "Fig.", "2", "-RRB-", "-LSB-", "7", "--", "9", ",", "26", "-RSB-", ".", "Identification", "of", "Wip1", "targets", "reveals", "it", "to", "be", "a", "homeostatic", "regulator", "of", "the", "DNA", "damage", "response", "Wip1", "dephosphorylates", "DNA", "damage", "response/repair", "proteins", "at", "TXY", "motifs", "Once", "Wip1", "was", "shown", "to", "be", "a", "serine/threonine", "phosphatase", ",", "it", "was", "clear", "that", "its", "functional", "roles", "might", "best", "be", "understood", "by", "identifying", "Wip1", "target", "proteins", "and", "dephosphorylation", "sites", ".", "Since", "the", "discovery", "of", "Wip1", ",", "at", "least", "seven", "Wip1", "dephosphorylation", "targets", "have", "been", "definitively", "identified", ".", "These", "are", "listed", "in", "Table", "1", ".", "Note", "that", "on", "the", "seven", "target", "proteins", ",", "two", "distinct", "motifs", "appear", "to", "be", "dephosphorylated", "by", "Wip1", ",", "pTXpY", "and", "pS/pTQ", ".", "One", "key", "commonality", "is", "their", "importance", "in", "the", "cellular", "DNA", "damage/repair", "response", ".", "Wip1", "acts", "as", "an", "inhibitor", "or", "homeostatic", "regulator", "of", "the", "DNA", "damage", "response", ",", "facilitating", "the", "return", "of", "the", "cell", "to", "a", "normal", "pre-stress", "state", "following", "repair", "of", "the", "DNA", "damage", ".", "As", "indicated", "in", "Table", "1", ",", "five", "of", "the", "seven", "identified", "dephosphorylation", "targets", "are", "phosphorylated", "by", "the", "PIKKs", "ATM", "and", "ATR", ",", "which", "are", "key", "sensor", "proteins", "that", "activate", "numerous", "components", "of", "the", "DNA", "damage", "response", "pathways", "in", "the", "cell", ".", "We", "hypothesize", "that", "Wip1", "serves", "as", "a", "major", "off", "switch", "for", "the", "ATM/ATR-initiated", "DNA", "damage", "signaling", "cascade", "-LSB-", "7", ",", "26", "-RSB-", ".", "Note", "also", "that", "six", "of", "the", "seven", "Wip1", "targets", "are", "important", "regulators", "of", "p53", "function", ".", "The", "four", "kinases", "p38", ",", "Chk1", ",", "Chk2", ",", "and", "ATM", "all", "phosphorylate", "p53", "and", "promote", "its", "activation", "-LSB-", "27", "--", "30", "-RSB-", ".", "Wip1", "dephosphorylation", "of", "these", "p53", "kinases", "decreases", "their", "intrinsic", "activity", ".", "Dephosphorylation", "of", "p53", "at", "serine", "15", "by", "Wip1", "also", "contributes", "to", "p53", "degradation", ",", "as", "does", "dephosphorylation", "of", "Mdm2", ",", "which", "stabilizes", "Mdm2", ",", "an", "E3", "ubiquitin", "ligase", "specific", "for", "p53", "-LSB-", "31", "-RSB-", ".", "Thus", ",", "Wip1", "appears", "to", "be", "a", "critical", "inhibitor", "of", "p53", "function", "and", "such", "effects", "are", "likely", "to", "play", "a", "major", "role", "in", "Wip1", "oncogenicity", "-LRB-", "see", "below", "-RRB-", ".", "In", "this", "section", ",", "we", "will", "describe", "the", "proteins", ",", "which", "have", "been", "identified", "as", "targets", "for", "dephosphorylation", "by", "Wip1", "and", "how", "Wip1", "regulates", "the", "function", "-LRB-", "s", "-RRB-", "of", "these", "proteins", ".", "Table", "1Identified", "Wip1", "dephosphorylation", "targetsProteinSiteaMotifKinaseProtein", "functionWip1", "effectsp53", "effect?Referencep38", "MAPKT180TXYMKK3/6Stress", "responseDec", ".", "kinase", "activityYes", "-LRB-", "dec.", "-RRB-", "Takekawa", "et", "al.", "-LSB-", "11", "-RSB-", "UNG2T6TXY?Base", "excision", "repairDec", ".", "uracil", "excisionNoLu", "et", "al.", "-LSB-", "25", "-RSB-", "Chk1S345S/TQATRDNA", "damage", "responseDec", ".", "kinase", "activityYes", "-LRB-", "dec.", "-RRB-", "Lu", "et", "al.", "-LSB-", "10", "-RSB-", "p53S15S/TQATMDNA", "damage", "responseDec", ".", "apoptosisYes", "-LRB-", "dec.", "-RRB-", "Lu", "et", "al.", "-LSB-", "10", "-RSB-", "Chk2T68bS/T/QATMDNA", "damage", "responseDec", ".", "kinase", "activityYes", "-LRB-", "dec.", "-RRB-", "Fujimoto", "et", "al.", "-LSB-", "9", "-RSB-", "ATMS1981S/TQATMcDNA", "damage", "responseDec", ".", "kinase", "activityYes", "-LRB-", "dec.", "-RRB-", "Shreeram", "et", "al.", "-LSB-", "7", "-RSB-", "Mdm2S395S/TQATMp53", "regulationDec", ".", "p53", "levelsYes", "-LRB-", "dec.", "-RRB-", "Lu", "et", "al.", "-LSB-", "8", "-RSB-", "aListed", "sites", "are", "from", "the", "human", "proteins", ";", "mouse", "sites", "-LRB-", "e.g.", "p53", "S18", "or", "ATM", "S1987", "-RRB-", "may", "be", "at", "different", "amino", "acid", "codonsbAlso", "sites", "Ser19", ",", "Ser33/35", ",", "Thr68", ",", "and", "Thr432cActivated", "ATM", "autophosphorylates", "itself", "at", "S1981", ";", "S367", "also", "dephosphorylated", "by", "Wip1", "TXY", "motif", ":", "p38", "The", "first", "identified", "target", "of", "Wip1", "was", "the", "p38", "mitogen-activated", "protein", "kinase", "-LRB-", "p38", "MAP", "kinase", "-RRB-", "-LSB-", "11", "-RSB-", ".", "Genotoxic", "stress", "such", "as", "UV", "radiation", "causes", "activation", "of", "p38", "MAP", "kinase", "by", "dual", "phosphorylation", "on", "Thr180", "and", "Tyr182", "-LSB-", "32", ",", "33", "-RSB-", ".", "The", "phosphorylated", "p38", ",", "in", "turn", ",", "phosphorylates", "p53", "on", "Ser15", ",", "Ser33", ",", "Ser46", "and", "Ser392", "and", "increases", "p53", "activities", ",", "including", "gene", "transcription", "and", "apoptosis", "-LSB-", "28", ",", "34", ",", "35", "-RSB-", ".", "p38", "was", "shown", "to", "interact", "with", "Wip1", "and", "to", "be", "dephosphorylated", "by", "Wip1", "on", "its", "Thr180", "residue", "-LSB-", "11", "-RSB-", ".", "Wip1", "dephosphorylation", "of", "p38", "was", "associated", "with", "reduced", "nuclear", "localization", "of", "p38", "and", "reduced", "kinase", "activity", "towards", "Ser33", "and", "Ser46", "of", "p53", "-LSB-", "11", "-RSB-", ".", "Dephosphorylation", "of", "Ser33", "and", "Ser46", "on", "p53", "was", "accompanied", "by", "reduced", "p53", "transcriptional", "activation", "activity", "and", "reduced", "p53-mediated", "apoptotic", "function", "following", "UV", "irradiation", ".", "Thus", ",", "Wip1", "inhibits", "UV-induced", "phosphorylation", "of", "p53", "on", "Ser33", "and", "Ser46", "via", "p38", "downregulation", ",", "functioning", "as", "a", "mediator", "in", "a", "p53", "negative", "feedback", "regulatory", "loop", ".", "TXY", "motif", ":", "UNG2", "Uracil", "is", "a", "common", "DNA", "lesion", "formed", "by", "deamination", "of", "cytosine", "or", "misincorporation", "of", "dUMP", ",", "leading", "to", "transition", "mutations", "or", "generation", "of", "AP", "sites", "-LRB-", "apurinic/apyrimidinic", "sites", "-RRB-", "in", "the", "genome", ".", "Such", "lesions", "are", "repaired", "by", "base", "excision", "repair", "-LRB-", "BER", "-RRB-", "that", "is", "initiated", "by", "a", "uracil", "DNA", "glycosylase", "-LSB-", "36", "-RSB-", ".", "At", "least", "four", "different", "mammalian", "uracil", "DNA", "glycosylases", "have", "been", "identified", ".", "Of", "these", ",", "the", "nuclear", "UNG2", "encoded", "by", "the", "UNG", "gene", "is", "the", "major", "enzyme", "responsible", "for", "removing", "uracil", "and", "creating", "an", "apyrimidinic", "site", "for", "further", "repair", "processing", "-LSB-", "36", "-RSB-", ".", "To", "identify", "Wip1", "interacting", "proteins", ",", "our", "laboratory", "performed", "bacterial", "two-hybrid", "assays", "with", "Wip1", "bait", "constructs", "and", "we", "repeatedly", "pulled", "down", "UNG2", "as", "a", "major", "interactor", ".", "In", "vitro", "and", "in", "vivo", "interaction", "studies", "by", "us", "and", "global", "human", "interactome", "screens", "by", "others", "confirmed", "that", "UNG2", "is", "a", "Wip1", "interacting", "protein", "-LSB-", "25", ",", "37", "-RSB-", ".", "Analysis", "of", "the", "UNG2", "sequence", "revealed", "two", "TXY", "motifs", "at", "Thr6", "and", "Thr126", ",", "which", "show", "similarities", "to", "the", "Wip1", "target", "site", "on", "p38", "MAP", "kinase", ".", "We", "utilized", "UNG2", "phosphothreonine", "6", "and", "126", "specific", "antibodies", "generated", "by", "the", "Appella", "laboratory", "to", "show", "that", "UV", "irradiation", "induced", "UNG2", "phosphorylation", "at", "both", "Thr", "residues", "and", "that", "this", "enhances", "UNG2", "enzymatic", "activity", ".", "Of", "these", "two", "target", "residues", ",", "only", "Thr6", "was", "dephosphorylated", "by", "Wip1", "in", "cells", ".", "Dephosphorylation", "of", "UNG2", "by", "Wip1", "resulted", "in", "reduced", "uracil-associated", "DNA", "incision", "activity", ",", "a", "critical", "step", "in", "BER", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "we", "were", "able", "to", "show", "that", "human", "cell", "lines", "overexpressing", "a", "Wip1", "expression", "construct", "exhibited", "reduced", "global", "BER", "activity", ",", "while", "the", "same", "cells", "transfected", "with", "Wip1", "siRNA", "exhibited", "enhanced", "global", "BER", "activity", ",", "indicating", "Wip1", "inhibits", "base", "excision", "repair", ",", "in", "part", "by", "dephosphorylating", "UNG2", "-LSB-", "25", ",", "38", "-RSB-", ".", "Wip1", "dephosphorylates", "DNA", "damage", "response", "proteins", "at", "S/TQ", "motifs", "S/TQ", "motif", ":", "Chk1", ",", "Chk2", "The", "checkpoint", "kinases", "Chk1", "and", "Chk2", "are", "evolutionarily", "conserved", "kinases", "which", "play", "a", "crucial", "role", "in", "regulating", "DNA", "damage", "responses", "-LSB-", "39", "-RSB-", ".", "In", "response", "to", "DNA", "damage", "or", "replicative", "stress", ",", "Chk1", "is", "phosphorylated", "on", "Ser317", "and", "Ser345", "mainly", "by", "the", "ATR", "kinase", "-LSB-", "40", "-RSB-", ".", "The", "phosphorylation", "on", "these", "two", "serine", "residues", "is", "a", "critical", "event", "for", "Chk1", "activation", "in", "that", "mutants", "of", "Chk1", "in", "which", "Ser317", "and", "Ser345", "residues", "were", "replaced", "with", "alanine", "showed", "poor", "kinase", "activity", ".", "Following", "activation", ",", "Chk1", "phosphorylates", "and", "inactivates", "Cdc25", "phosphatase", "family", "members", "to", "facilitate", "cell", "cycle", "arrest", "-LSB-", "41", "-RSB-", ".", "Chk2", "activation", "is", "a", "multistep", "process", "initiated", "by", "phosphorylation", "on", "Thr68", "mainly", "by", "ATM", "in", "response", "to", "DNA", "damage", "-LSB-", "42", ",", "43", "-RSB-", ".", "Although", "Thr68", "phosphorylation", "is", "not", "the", "only", "requirement", "for", "full", "activation", "of", "Chk2", ",", "the", "T68A", "mutation", "significantly", "reduced", "Chk2", "kinase", "activity", "-LSB-", "44", "-RSB-", ".", "Activated", "Chk2", "targets", "a", "variety", "of", "proteins", "involved", "in", "cell", "cycle", "control", ",", "DNA", "repair", "and", "apoptosis", ",", "including", "p53", ",", "BRCA1", ",", "PML", ",", "E2F-1", ",", "and", "the", "Cdc25", "phosphatase", "family", ".", "Notably", ",", "ATR-Chk1", "and", "ATM-Chk2", "pathways", "are", "not", "strictly", "separated", "but", "rather", "highly", "connected", "and", "coordinated", "as", "evidenced", "by", "ATM-dependent", "phosphorylation", "of", "Chk1", "in", "response", "to", "ionizing", "radiation", "-LSB-", "45", "-RSB-", ",", "ATM-independent", "activation", "of", "Chk2", "-LSB-", "46", "-RSB-", ",", "and", "ATR", "activation", "regulated", "by", "ATM", "-LSB-", "47", ",", "48", "-RSB-", ".", "The", "identification", "of", "Chk1", "as", "a", "Wip1", "target", "followed", "co-immunoprecipitation", "experiments", "in", "our", "laboratory", "that", "showed", "that", "Wip1", "consistently", "bound", "Chk1", "in", "cells", "-LSB-", "10", "-RSB-", ".", "In", "vitro", "phosphatase", "assays", "showed", "that", "Wip1", "dephosphorylated", "Chk1", "at", "Ser345", ",", "but", "not", "Ser317", ".", "In", "vivo", "assays", "demonstrated", "that", "overexpressed", "Wip1", "suppressed", "UV-induced", "phosphorylation", "of", "Chk1", "Ser345", "while", "Wip1", "siRNA", "enhanced", "Chk1", "Ser345", "phosphorylation", "compared", "to", "controls", ".", "Importantly", ",", "dephosphorylation", "of", "Chk1", "at", "Ser345", "resulted", "in", "reduced", "Chk1", "kinase", "ability", "on", "Chk1", "targets", "such", "as", "Cdc25C", ".", "Since", "Chk1", "is", "an", "important", "cell", "cycle", "checkpoint", "protein", ",", "we", "also", "assessed", "the", "effects", "of", "either", "increasing", "or", "decreasing", "Wip1", "expression", "on", "G2/M", "and", "intra-S", "phase", "checkpoints", ".", "As", "expected", ",", "increased", "levels", "of", "Wip1", "abrogated", "G2/M", "and", "intra-S", "phase", "checkpoints", ",", "while", "decreased", "levels", "of", "Wip1", "enhanced", "G2/M", "and", "intra-S", "phase", "checkpoints", "induced", "by", "both", "UV", "and", "IR", "treatment", "of", "cells", "-LSB-", "10", "-RSB-", ".", "Because", "Chk1", "phosphorylates", "and", "activates", "p53", ",", "the", "inhibition", "of", "Chk1", "by", "Wip1", "also", "places", "Wip1", "in", "a", "negative", "feedback", "regulatory", "loop", "for", "p53", "-LRB-", "Fig.", "2", "-RRB-", "-LSB-", "26", "-RSB-", ".", "Fig.", "2Wip1", "inhibits", "p53", "activity", "by", "multiple", "mechanisms", ".", "When", "a", "cell", "is", "stressed", "by", "DNA", "damage", ",", "ATM", ",", "ATR", ",", "and", "p38", "MAP", "kinase", "can", "phosphorylate", "p53", "directly", "or", "through", "intermediary", "proteins", "such", "as", "Chk1", "and", "Chk2", ".", "Phosphorylated", "p53", "localizes", "to", "the", "nucleus", "and", "transactivates", "a", "battery", "of", "anti-proliferative", "genes", ".", "In", "addition", ",", "two", "p53", "autoregulatory", "genes", "are", "activated", ",", "Mdm2", "and", "Wip1", ".", "Mdm2", "is", "an", "E3", "ubiquitin", "ligase", "that", "promotes", "p53", "degradation", ".", "However", ",", "early", "after", "the", "DNA", "damage", "response", "ATM", "-LRB-", "and", "possibly", "ATR", "-RRB-", "phosphorylate", "Mdm2", "and", "this", "promotes", "Mdm2", "degradation", "and", "prevents", "Mdm2", "mediated", "p53", "degradation", ".", "Activated", "p53", "also", "upregulates", "Wip1", "expression", "and", "after", "DNA", "damage", "is", "repaired", ",", "the", "accumulated", "Wip1", "phosphatase", "inhibits", "a", "battery", "of", "proteins", "that", "activate", "p53", ".", "Wip1", "dephosphorylates", "the", "upstream", "kinases", "that", "phosphorylate", "p53", "-LRB-", "ATM", ",", "p38", ",", "Chk1", ",", "Chk2", "-RRB-", "and", "p53", "itself", "-LRB-", "at", "Ser15", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "Wip1", "dephosphorylates", "Mdm2", "at", "Ser395", "and", "this", "results", "in", "Mdm2", "stabilization", "and", "Mdm2", "mediated", "p53", "degradation", ".", "Finally", ",", "increased", "Wip1", "levels", "suppresses", "ARF", "which", "in", "turn", "results", "in", "increased", "Mdm2", "activity", "and", "p53", "proteolysis", ".", "The", "resulting", "destabilization", "of", "p53", "helps", "return", "the", "normal", "cell", "to", "a", "pre-stress", "state", "after", "cellular", "damage", "is", "repaired", ".", "However", ",", "if", "Wip1", "becomes", "amplified", "or", "overexpressed", "during", "tumor", "cell", "progression", ",", "this", "could", "result", "in", "chronic", "suppression", "of", "p53", "activity", "and", "promote", "tumorigenesis", ".", "In", "the", "figure", ",", "proteins", "are", "indicated", "by", "circles", "or", "octagons", "and", "genes", "are", "indicated", "by", "rectangles", ".", "Small", "circles", "marked", "with", "P", "indicate", "phosphorylation", "sites", ".", "Black", "lines", "indicate", "early", "events", "in", "the", "DNA", "damage", "response", "and", "gray", "lines", "show", "later", "homeostatic", "events", "in", "the", "damage", "response", "Chk2", "was", "also", "shown", "to", "directly", "interact", "with", "Wip1", "in", "vitro", "and", "in", "vivo", "by", "Fujimoto", "et", "al.", "-LSB-", "9", "-RSB-", ".", "These", "investigators", "showed", "that", "Thr68", ",", "which", "is", "phosphorylated", "by", "ATM", "after", "IR", "treatment", ",", "is", "dephosphorylated", "efficiently", "by", "Wip1", ".", "Moreover", ",", "Wip1", "also", "dephosphorylated", "several", "other", "S/TQ", "sites", "within", "Chk2", ".", "Overexpression", "of", "Wip1", "was", "shown", "to", "suppress", "Chk2", "kinase", "activity", "towards", "its", "substrate", "Cdc25C", ",", "while", "inhibition", "of", "Wip1", "resulted", "in", "both", "increased", "and", "prolonged", "Chk2", "kinase", "activity", "following", "IR", ".", "Interestingly", ",", "treatment", "of", "gamma-irradiated", "cells", "with", "Wip1", "siRNA", "enhanced", "IR-induced", "apoptosis", ",", "suggesting", "that", "Wip1", "negatively", "regulates", "irradiation-induced", "apoptosis", "by", "dephosphorylating", "and", "inactivating", "Chk2", ".", "Several", "laboratories", "have", "corroborated", "the", "inhibition", "of", "Chk2", "activity", "by", "Wip1", "and", "have", "shown", "that", "cancer", "cells", "with", "amplified", "Wip1", "show", "reduced", "Chk2", "activity", "-LSB-", "14", ",", "49", "--", "51", "-RSB-", ".", "S/TQ", "motif", ":", "p53", "The", "tumor", "suppressor", "p53", "is", "a", "central", "node", "in", "the", "DNA", "damage", "response", "and", "mediates", "an", "array", "of", "responses", ",", "including", "the", "activation", "of", "multiple", "cell", "cycle", "checkpoints", ",", "DNA", "repair", "and", "apoptosis", "-LSB-", "52", "-RSB-", ".", "The", "importance", "of", "p53", "in", "cancer", "prevention", "is", "supported", "by", "the", "observation", "that", "about", "half", "of", "all", "human", "cancer", "patients", "harbor", "p53", "mutations", "-LSB-", "53", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "p53", "deficient", "mice", "are", "highly", "susceptible", "to", "early", "onset", "spontaneous", "tumors", "-LSB-", "54", "-RSB-", ".", "In", "unstressed", "cells", ",", "p53", "is", "maintained", "at", "low", "levels", "as", "a", "result", "of", "Mdm2-mediated", "ubiquitination", "and", "degradation", "-LSB-", "55", "-RSB-", ".", "When", "cells", "are", "confronted", "by", "genotoxic", "stress", ",", "ATM", ",", "ATR", "and", "Chk1/2", "kinases", "phosphorylate", "p53", ".", "This", "phosphorylation", ",", "along", "with", "modifications", "of", "other", "residues", ",", "blocks", "the", "p53-Mdm2", "interaction", ",", "leading", "to", "p53", "stabilization", "and", "an", "increase", "in", "p53", "activity", "-LSB-", "56", "-RSB-", ".", "We", "investigated", "whether", "Wip1", "dephosphorylated", "p53", "at", "Ser15", ".", "In", "fact", ",", "both", "p53", "phosphopeptides", "containing", "phosphoserine", "15", "and", "intact", "immunopurified", "p53", "were", "efficiently", "dephosphorylated", "at", "Ser15", "by", "purified", "Wip1", "in", "vitro", "-LSB-", "10", "-RSB-", ".", "UV-irradiated", "cells", "exhibited", "reduced", "p53", "Ser15", "phosphorylation", "in", "the", "presence", "of", "overexpressed", "Wip1", "and", "greatly", "augmented", "and", "sustained", "p53", "Ser15", "phosphorylation", "in", "the", "presence", "of", "Wip1", "siRNA", ".", "As", "expected", ",", "increased", "Ser15", "phosphorylation", "correlated", "with", "increased", "p53", "protein", "levels", "in", "irradiated", "Wip1", "siRNA", "treated", "cells", ".", "S/TQ", "motif", ":", "Mdm2", "The", "decreased", "stability", "of", "p53", "in", "the", "presence", "of", "high", "Wip1", "levels", "led", "us", "to", "investigate", "whether", "or", "not", "the", "effects", "of", "Wip1", "on", "p53", "stability", "are", "mediated", "by", "Mdm2", ".", "Mdm2", "is", "an", "E3", "ubiquitin", "ligase", "that", "specifically", "targets", "p53", "for", "destruction", "-LSB-", "55", "-RSB-", ".", "Mdm2", "binds", "to", "p53", "and", "mediates", "its", "polyubiquitination", "as", "a", "prelude", "to", "its", "transport", "to", "the", "26S", "proteosome", "and", "proteolytic", "degradation", ".", "Importantly", ",", "DNA", "damage", "results", "in", "ATM", "phosphorylation", "of", "Mdm2", "at", "Ser395", "and", "this", "phosphorylation", "is", "associated", "with", "Mdm2", "destabilization", "-LSB-", "31", "-RSB-", ".", "Phosphorylation", "at", "this", "site", "also", "inhibits", "Mdm2", "interactions", "with", "p53", ".", "Thus", ",", "p53", "is", "stabilized", ".", "We", "had", "noted", "that", "reduction", "of", "Wip1", "levels", "corresponded", "with", "increased", "sustained", "p53", "protein", "levels", "and", "increased", "p53", "transcriptional", "activity", "after", "IR-induced", "DNA", "damage", "-LSB-", "8", ",", "49", "-RSB-", ".", "One", "explanation", "for", "these", "observations", "was", "that", "Wip1", "was", "affecting", "p53", "stability", "through", "effects", "on", "Mdm2", ".", "To", "assess", "this", "possibility", ",", "we", "examined", "Wip1", "interactions", "with", "Mdm2", "and", "found", "that", "endogenous", "Wip1", "and", "endogenous", "Mdm2", "could", "form", "protein-protein", "interactions", "-LSB-", "8", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "Wip1", "was", "shown", "to", "dephosphorylate", "Mdm2", "at", "Ser395", "both", "in", "vitro", "and", "in", "vivo", ".", "Dephosphorylation", "of", "Mdm2", "by", "Wip1", "was", "associated", "with", "decreased", "Mdm2", "self-polyubiquitination", "and", "increased", "Mdm2", "stability", ".", "Prevention", "of", "Mdm2", "Ser395", "dephosphorylation", "by", "Wip1", "siRNA", "treatment", "destabilized", "Mdm2", "following", "irradiation", "-LSB-", "8", "-RSB-", ".", "As", "expected", ",", "Wip1", "overexpression", "increased", "Mdm2", "interaction", "with", "p53", "and", "increased", "p53", "polyubiquitination", ",", "facilitating", "p53", "proteolytic", "degradation", ".", "Thus", ",", "a", "primary", "role", "of", "Wip1", "is", "to", "inhibit", "p53", "stability", "in", "part", "through", "augmenting", "Mdm2", "stability", "as", "a", "consequence", "of", "Mdm2", "Ser395", "dephosphorylation", "-LRB-", "Fig.", "2", "-RRB-", ".", "S/TQ", "motif", ":", "ATM", "ATM", "is", "a", "sensor", "kinase", "that", "is", "rapidly", "activated", "by", "DNA", "double", "strand", "breaks", "in", "part", "through", "autophosphorylation", "at", "Ser1981", "-LRB-", "or", "Ser1987", "in", "the", "mouse", "-RRB-", ".", "Activated", "ATM", "then", "phosphorylates", "a", "diverse", "array", "of", "effector", "molecules", "that", "induce", "cell", "cycle", "arrest", ",", "DNA", "repair", ",", "DNA", "replication", ",", "and", "apoptosis", ".", "Activated", "ATM", "phosphorylates", "its", "targets", "at", "S/TQ", "sites", "and", "it", "has", "recently", "been", "shown", "by", "Elledge", "and", "colleagues", "in", "a", "global", "proteomic", "screen", "that", "ATM/ATR", "phosphorylates", "over", "700", "protein", "targets", "with", "widely", "different", "functions", "-LSB-", "4", "-RSB-", ".", "Bulavin", "and", "colleagues", "have", "demonstrated", "that", "Wip1", "null", "mouse", "embryo", "fibroblasts", "-LRB-", "MEFs", "-RRB-", "treated", "with", "IR", "exhibit", "higher", "levels", "of", "Ser1987", "phosphorylation", ",", "indicating", "higher", "levels", "of", "ATM", "activity", "-LSB-", "7", "-RSB-", ".", "Wip1", "was", "shown", "to", "directly", "interact", "with", "ATM", "and", "its", "overexpression", "resulted", "in", "decreased", "levels", "of", "Ser1981", "phosphorylation", "following", "IR", "treatment", ".", "Conversely", ",", "downregulation", "of", "Wip1", "using", "siRNA", "resulted", "in", "increased", "Ser1981", "phosphorylation", ".", "Moreover", ",", "immunopurified", "ATM", "was", "efficiently", "dephosphorylated", "at", "Ser1987", "by", "purified", "Wip1", ",", "as", "was", "a", "phosphopeptide", "derived", "from", "this", "part", "of", "ATM", ".", "More", "recently", ",", "Shreeram", "et", "al.", "-LSB-", "57", "-RSB-", "have", "also", "shown", "that", "Wip1", "dephosphorylates", "human", "ATM", "at", "Ser367", "as", "well", "as", "Ser1981", ".", "The", "authors", "concluded", "that", "Wip1", "was", "important", "in", "resetting", "ATM", "phosphorylation", "after", "repair", "of", "DNA", "damage", ".", "Wip1", "is", "an", "oncogene", "While", "a", "significant", "number", "of", "tyrosine", "phosphatases", "are", "associated", "with", "cancer", "initiation", "or", "development", "-LSB-", "58", "-RSB-", ",", "few", "serine/threonine", "phosphatases", "have", "been", "directly", "associated", "with", "oncogenesis", ".", "The", "only", "well", "characterized", "serine/threonine", "phosphatase", "involved", "in", "oncogenic", "signaling", "is", "the", "phosphatase", "PP2A", ".", "PP2A", "has", "tumor", "suppressor", "activity", "and", "its", "inactivation", "has", "been", "associated", "with", "transformation", "of", "human", "primary", "cells", "-LSB-", "59", "-RSB-", ".", "It", "has", "also", "been", "shown", "to", "be", "either", "mutated", "or", "downregulated", "in", "some", "human", "cancers", ".", "Among", "the", "type", "2C", "phosphatases", ",", "Wip1", "appears", "to", "be", "the", "only", "one", "described", "so", "far", "with", "bona", "fide", "oncogenic", "function", ".", "The", "regulatory", "functions", "of", "Wip1", "in", "the", "ATM-CHK1", "/", "2-p53", "and", "p38", "MAPK-ARF/p16INK4A", "signaling", "pathways", "would", "argue", "that", "this", "protein", "may", "possess", "major", "oncogenic", "potential", ".", "The", "first", "evidence", "of", "an", "oncogenic", "role", "for", "Wip1", "was", "published", "in", "a", "pair", "of", "papers", "by", "Bulavin", "et", "al.", "-LSB-", "17", "-RSB-", "and", "Li", "et", "al.", "-LSB-", "60", "-RSB-", ".", "Bulavin", "et", "al.", "used", "tissue", "microarray", "profiling", "to", "show", "that", "37", "of", "326", "primary", "breast", "tumors", "-LRB-", "11.3", "%", "-RRB-", "had", "Wip1", "gene", "amplification", ".", "Similarly", ",", "Li", "et", "al.", ",", "using", "DNA", "microarray", "analysis", ",", "showed", "that", "Wip1", "was", "amplified", "at", "least", "2.5", "fold", "in", "27", "of", "164", "-LRB-", "16", "%", "-RRB-", "primary", "breast", "cancers", ".", "Both", "laboratories", "demonstrated", "that", "overexpression", "of", "Wip1", "mRNA", "correlated", "well", "with", "Wip1", "gene", "amplification", ".", "Interestingly", ",", "only", "one", "of", "eight", "tumors", "with", "Wip1", "amplification", "examined", "by", "Bulavin", "et", "al.", "had", "a", "p53", "mutation", ".", "The", "infrequent", "nature", "of", "p53", "mutations", "in", "tumors", "with", "Wip1", "amplification", "suggests", "that", "Wip1", "may", "promote", "human", "tumors", "through", "its", "ability", "to", "inhibit", "p53", ",", "circumventing", "selective", "pressure", "to", "mutate", "p53", "during", "tumor", "progression", ".", "Wip1", "amplification", "in", "this", "context", "is", "reminiscent", "of", "tumors", "with", "Mdm2", "amplification", ",", "where", "Mdm2", "promotes", "degradation", "of", "p53", "and", "few", "of", "these", "tumors", "exhibit", "p53", "mutations", "-LSB-", "61", "-RSB-", ".", "Since", "these", "initial", "reports", ",", "other", "groups", "have", "confirmed", "amplification", "and", "overexpression", "of", "the", "Wip1", "gene", "in", "breast", "cancers", "-LSB-", "62", ",", "63", "-RSB-", ".", "Rauta", "et", "al.", "-LSB-", "62", "-RSB-", "showed", "Wip1", "gene", "was", "amplified", "in", "11", "%", "of", "breast", "cancers", "and", "this", "amplification", "was", "highly", "associated", "with", "ErbB2", "amplification", ".", "Moreover", ",", "these", "investigators", "observed", "that", "breast", "cancers", "with", "Wip1", "amplification", "had", "a", "significantly", "poorer", "prognosis", "than", "those", "without", "Wip1", "amplification", ",", "though", "a", "breast", "cancer", "study", "by", "Yu", "et", "al.", "-LSB-", "63", "-RSB-", "failed", "to", "detect", "an", "effect", "of", "Wip1", "overexpression", "on", "prognosis", ".", "In", "addition", "to", "breast", "cancers", ",", "Wip1", "amplification", "and", "overexpression", "have", "been", "observed", "in", "ovarian", "clear", "cell", "adenocarcinomas", "-LSB-", "64", "-RSB-", ",", "neuroblastomas", "-LSB-", "65", "-RSB-", ",", "pancreatic", "adenocarcinomas", "-LSB-", "66", "-RSB-", ",", "gastric", "carcinomas", "-LSB-", "51", "-RSB-", ",", "and", "medulloblastomas", "-LSB-", "67", "--", "69", "-RSB-", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "As", "shown", "in", "Table", "2", ",", "where", "it", "was", "examined", ",", "tumors", "with", "Wip1", "amplification", "rarely", "contained", "p53", "mutations", "and", "often", "exhibited", "poorer", "prognosis", "than", "their", "counterparts", "with", "normal", "Wip1", ".", "Since", "only", "a", "handful", "of", "tumor", "types", "have", "been", "reported", ",", "it", "remains", "to", "be", "seen", "whether", "Wip1", "amplification", "and", "overexpression", "occurs", "in", "most", "tumor", "types", "or", "only", "in", "a", "subset", ".", "Certainly", ",", "tumors", "with", "a", "low", "frequency", "of", "p53", "mutations", "might", "circumvent", "p53", "mutation", "or", "loss", "by", "Wip1", "functional", "inactivation", "of", "p53", "and", "these", "tumors", "would", "be", "good", "candidates", "for", "further", "investigation", ".", "Table", "2Human", "tumors", "with", "Wip1", "gene", "amplification", "and/or", "overexpressionOrgan/TypeDNA/RNA", "increasep53", "mutationPrognosisaReferenceBreast", "adenocarcinoma", "-LRB-", "11", "%", "CNGb", ";", "ECGc", "-RRB-", "1/8", "Bulavin", "et", "al.", "-LSB-", "17", "-RSB-", "-LRB-", "16", "%", "CNG", ";", "ECG", "-RRB-", "Li", "et", "al.", "-LSB-", "62", "-RSB-", "-LRB-", "11", "%", "CNG", ";", "ECG", "-RRB-", "1/10PoorerRauta", "et", "al.", "-LSB-", "64", "-RSB-", "-LRB-", "35", "%", "Od", "-RRB-", "Yu", "et", "al.", "-LSB-", "65", "-RSB-", "Ovarian", "clear", "cell", "adenocarcinoma", "-LRB-", "40", "%", "CNG", ";", "ECG", "-RRB-", "PoorerHirasawa", "et", "al.", "-LSB-", "66", "-RSB-", "Neuroblastoma", "-LRB-", "92", "%", "CNG", ";", "28", "%", "O", "-RRB-", "2/32PoorerSaito-Ohara", "et", "al.", "-LSB-", "67", "-RSB-", "Medulloblastoma", "-LRB-", "51", "%", "CNG", ";", "88", "%", "O", "-RRB-", "PoorerMendrzyk", "et", "al.", "-LSB-", "70", "-RSB-", "-LRB-", "37", "%", "CNG", ";", "27", "%", "O", "-RRB-", "Ehrbrecht", "et", "al.", "-LSB-", "69", "-RSB-", "Gastric", "carcinoma", "-LRB-", "74", "%", "O", "-RRB-", "Fuku", "et", "al.", "-LSB-", "53", "-RSB-", "Pancreatic", "adenocarcinoma", "-LRB-", "36", "%", "CNG", "-RRB-", "PoorerLoukopoulos", "et", "al.", "-LSB-", "68", "-RSB-", "aPrognosis", ":", "``", "Poorer", "''", "indicates", "individuals", "with", "tumors", "with", "increased", "Wip1", "copy", "number", "and/or", "expression", "have", "significantly", "poorer", "prognosis", "than", "all", "individuals", "with", "that", "type", "of", "tumorbCNG", ":", "Wip1", "DNA", "copy", "number", "gain", "-LRB-", "compared", "to", "DNA", "in", "normal", "tissues", "-RRB-", "cECG", ":", "increased", "Wip1", "RNA", "expression", "significantly", "correlates", "with", "copy", "number", "gaindO", ":", "percentage", "of", "tumors", "with", "Wip1", "RNA", "overexpression", "In", "their", "papers", "describing", "the", "initial", "discovery", "of", "Wip1", "amplification", "and", "overexpression", "in", "breast", "cancers", ",", "Bulavin", "et", "al.", "-LSB-", "17", "-RSB-", "and", "Li", "et", "al.", "-LSB-", "60", "-RSB-", "were", "also", "able", "to", "show", "that", "Wip1", "can", "collaborate", "with", "known", "oncogenes", "such", "as", "Ras", ",", "Myc", "and", "Neu", "to", "transform", "rodent", "wild", "type", "primary", "fibroblasts", "and", "induce", "anchorage-independent", "growth", "in", "soft", "agar", ".", "It", "was", "also", "shown", "by", "both", "groups", "that", "overexpression", "of", "Wip1", "could", "abrogate", "Ras-induced", "senescence", "of", "primary", "cells", "and", "could", "prevent", "apoptosis", "induced", "by", "serum", "starvation", ".", "Interestingly", ",", "transformation", "assays", "on", "p53", "null", "MEFs", "showed", "that", "while", "Ras", ",", "Neu", "and", "Myc", "oncogenes", "could", "individually", "transform", "these", "cells", ",", "Wip1", "could", "not", "-LSB-", "17", "-RSB-", ".", "These", "results", "argued", "that", "Wip1", "is", "primarily", "oncogenic", "as", "a", "result", "of", "its", "ability", "to", "inhibit", "p53", "signaling", ".", "In", "later", "studies", ",", "our", "laboratory", "was", "able", "to", "show", "that", "Wip1", "transformation", "of", "primary", "rat", "embryo", "fibroblasts", ",", "in", "conjunction", "with", "the", "adenoviral", "E1A", "oncogene", ",", "was", "dependent", "on", "the", "phosphatase", "activity", "of", "Wip1", "-LSB-", "49", "-RSB-", ".", "In", "contrast", "to", "wild-type", "Wip1", ",", "the", "phosphatase-dead", "mutant", "Wip1", "-LRB-", "D307A", "-RRB-", "failed", "to", "transform", "primary", "fibroblasts", ".", "To", "further", "demonstrate", "that", "Wip1", "is", "oncogenic", "in", "an", "in", "vivo", "context", ",", "Demidov", "et", "al.", "-LSB-", "70", "-RSB-", "overexpressed", "Wip1", "as", "a", "transgene", "in", "the", "mouse", "mammary", "gland", ".", "While", "the", "Wip1", "transgenic", "mice", "did", "not", "develop", "spontaneous", "mammary", "tumors", ",", "the", "appearance", "of", "mammary", "tumors", "was", "accelerated", "when", "these", "animals", "were", "crossed", "with", "mammary", "tumor", "susceptible", "ErbB2", "transgenic", "mice", ".", "Interestingly", ",", "the", "tumor", "promoting", "effects", "of", "the", "Wip1", "transgene", "in", "the", "ErbB2", "transgenics", "could", "be", "lost", "by", "further", "crossing", "in", "a", "constitutively", "activated", "MKK6", "transgene", "-LSB-", "70", "-RSB-", ".", "MKK6", "activates", "p38", "MAP", "kinase", "and", "thus", "nullifies", "the", "effects", "of", "Wip1", "dephosphorylation", "of", "p38", ",", "demonstrating", "the", "importance", "of", "Wip1", "in", "regulating", "p38", "signaling", "as", "well", "as", "p53", "signaling", "in", "this", "particular", "model", ".", "Mechanisms", "of", "Wip1", "oncogenicity", "Wip1", "overexpression", "in", "MEFs", "and", "in", "transgenic", "mice", "promotes", "cell", "transformation", "and", "accelerated", "cancer", "progression", "-LSB-", "17", ",", "49", ",", "60", ",", "70", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "a", "number", "of", "human", "cancers", "contain", "amplified", "and", "overexpressed", "Wip1", "-LRB-", "Table", "2", "-RRB-", ".", "Generally", ",", "these", "tumors", "do", "not", "contain", "p53", "mutations", ",", "suggesting", "that", "overexpressed", "Wip1", "inhibits", "p53", "during", "tumor", "progression", ",", "consistent", "with", "the", "fact", "that", "Wip1", "suppresses", "p53", "activity", "in", "the", "normal", "cellular", "context", "-LRB-", "Fig.", "2", "-RRB-", ".", "As", "an", "alternative", "approach", "to", "assess", "Wip1", "function", "in", "promoting", "tumorigenesis", ",", "Wip1-deficient", "mice", "were", "generated", "in", "our", "laboratory", ".", "Wip1", "null", "mice", "are", "viable", "but", "show", "some", "postnatal", "abnormalities", ",", "including", "variable", "male", "runting", ",", "male", "reproductive", "organ", "atrophy", ",", "reduced", "male", "fertility", ",", "and", "reduced", "male", "longevity", "-LSB-", "71", "-RSB-", ".", "The", "Wip1", "null", "mice", "also", "showed", "increased", "susceptibility", "to", "pathogens", "and", "diminished", "T", "-", "and", "B-cell", "function", ".", "Fibroblasts", "derived", "from", "Wip1", "null", "embryos", "showed", "reduced", "growth", "rates", ",", "reduced", "colony", "forming", "ability", ",", "and", "premature", "senescence", "compared", "to", "their", "wild-type", "counterparts", "-LSB-", "12", ",", "71", "-RSB-", ".", "In", "addition", ",", "Wip1", "null", "MEFs", "exhibited", "an", "enhanced", "G1", "checkpoint", "response", "to", "ionizing", "radiation", ".", "Bulavin", "et", "al.", "-LSB-", "12", "-RSB-", "showed", "that", "Wip1", "null", "fibroblasts", "were", "significantly", "more", "resistant", "to", "transformation", "by", "various", "combinations", "of", "oncogenes", "compared", "to", "wild-type", "MEFs", ".", "Hras1", "plus", "the", "adenoviral", "E1A", "oncogene", "transformed", "Wip1", "−", "/", "−", "MEFs", "displayed", "increased", "expression", "of", "p53", "and", "cyclin", "dependent", "kinase", "inhibitors", "p21", ",", "p16INK4A", ",", "and", "p19ARF", "compared", "to", "Wip1", "+", "/", "+", "MEFs", ".", "In", "addition", ",", "the", "p38", "MAP", "kinase", "showed", "increased", "phosphorylation", "in", "Wip1", "−", "/", "−", "MEFs", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "Increases", "in", "p53", ",", "p21", ",", "and", "phosphorylated", "p38", "MAP", "kinase", "in", "Wip1", "null", "MEFs", "are", "supported", "by", "the", "fact", "that", "Wip1", "directly", "dephosphorylates", "p38", "and", "p53", "and", "regulators", "of", "p53", "-LRB-", "ATM", ",", "Chk1", ",", "Chk2", "-RRB-", ".", "Since", "p21", "is", "transcriptionally", "upregulated", "by", "p53", ",", "the", "increase", "in", "its", "levels", "is", "attributable", "to", "p53", "activation", ".", "One", "interesting", "result", "in", "these", "transformed", "Wip1", "null", "MEF", "studies", "was", "the", "increase", "in", "p19ARF", "and", "p16INK4a", "levels", ".", "Wip1", "regulation", "of", "these", "cyclin", "dependent", "kinase", "inhibitors", "appears", "to", "be", "at", "the", "transcriptional", "level", ",", "as", "transformed", "Wip1", "null", "MEFs", "showed", "a", "three", "-", "to", "fourfold", "enhancement", "of", "transfected", "p16", "promoter", "driven", "luciferase", "expression", "and", "p19", "promoter", "driven", "CAT", "expression", "when", "compared", "to", "wild-type", "MEFs", ".", "Bulavin", "et", "al.", "-LSB-", "12", "-RSB-", "further", "showed", "that", "oncogene", "transformed", "p53", "null", "MEFs", "produce", "tumors", "when", "transplanted", "into", "nude", "mice", ",", "while", "transformed", "doubly", "null", "p53", "and", "Wip1", "MEFs", "were", "resistant", "to", "tumors", ".", "Thus", ",", "Wip1", "must", "regulate", "other", "pathways", "in", "addition", "to", "p53", "to", "promote", "tumorigenesis", ",", "at", "least", "in", "this", "MEF", "model", "system", ".", "In", "contrast", "to", "p53", "−", "/", "−", "Wip1", "−", "/", "−", "MEFs", ",", "MEFs", "from", "Cdkn2a", "−", "/", "−", "-LRB-", "null", "for", "both", "p16", "and", "p19", ",", "encoded", "from", "the", "same", "locus", "-RRB-", "Wip1", "−", "/", "−", "mice", "readily", "formed", "nude", "mouse", "tumors", "after", "oncogene", "transformation", ".", "This", "indicated", "that", "p16", "or", "p19", "or", "both", "genes", "were", "responsible", "for", "the", "Wip1", "null", "MEF", "resistance", "to", "tumors", ".", "Subsequent", "experiments", "showed", "that", "much", "-LRB-", "though", "not", "all", "-RRB-", "of", "the", "transformation", "resistance", "was", "provided", "by", "p19ARF", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "Bulavin", "et", "al.", "-LSB-", "12", "-RSB-", "also", "tested", "the", "effects", "of", "Wip1", "deficiency", "on", "tumorigenesis", "in", "an", "in", "vivo", "context", ".", "Three", "mammary", "tumor", "susceptible", "models", ",", "MMTV", "promoter", "driven", "ErbB2", ",", "Hras1", ",", "and", "Wnt1", "transgenic", "mice", "were", "crossed", "to", "Wip1", "deficient", "mice", "and", "oncogene", "driven", "mammary", "tumorigenesis", "was", "examined", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "Wip1", ".", "Wip1", "female", "null", "mice", "were", "considerably", "more", "resistant", "to", "mammary", "tumors", "in", "the", "presence", "of", "the", "MMTV-HRas1", "and", "MMTV-ErbB2", "transgenes", "than", "were", "their", "Wip1", "wild-type", "counterparts", ".", "However", ",", "Wip1", "female", "null", "mice", "with", "the", "MMTV-Wnt1", "transgene", "developed", "mammary", "cancers", "at", "the", "same", "rate", "as", "transgenic", "Wip1", "wild-type", "females", ".", "Interestingly", ",", "the", "Wip1", "null", "MMTV-ErbB2", "tumors", "displayed", "a", "reduced", "mitotic", "index", "and", "an", "increased", "apoptotic", "cell", "index", "compared", "to", "the", "Wip1", "wild-type", "MMTV-ErbB2", "tumors", ".", "Moreover", ",", "p16INK4a", "protein", "levels", "in", "the", "Wip1", "null", "tumors", "were", "low", "or", "absent", ",", "suggesting", "that", "loss", "or", "inactivation", "of", "high", "p16", "expression", "-LRB-", "probably", "by", "p16", "promoter", "methylation", "-RRB-", "is", "a", "likely", "prerequisite", "for", "tumor", "progression", "in", "this", "model", ".", "It", "was", "also", "observed", "that", "these", "Wip1", "null", "mammary", "tumors", "also", "contained", "high", "levels", "of", "activated", "p38", "MAP", "kinase", "-LRB-", "as", "indicated", "by", "increased", "levels", "of", "phosphorylated", "p38", "-RRB-", ".", "Inhibition", "of", "p38", "in", "the", "MMTV-ErbB2", "Wip1", "null", "mice", "by", "repeated", "injection", "of", "the", "inhibitor", "SB203580", "resulted", "in", "the", "accelerated", "development", "of", "mammary", "tumors", "compared", "to", "water", "injected", "mice", "of", "the", "same", "genotype", ".", "Thus", ",", "constitutive", "activation", "of", "p38", "MAP", "kinase", "in", "the", "absence", "of", "Wip1", "may", "contribute", "to", "tumor", "resistance", "in", "the", "Wip1", "−", "/", "−", "MMTV-ErbB2", "mice", ".", "In", "another", "transgenic", "mouse", "model", "Shreeram", "et", "al.", "-LSB-", "57", "-RSB-", "examined", "lymphoma", "incidence", "in", "Wip1", "+", "/", "+", ",", "Wip1", "+", "/", "−", "and", "Wip1", "−", "/", "−", "mice", "bearing", "the", "Eμ-myc", "transgene", "in", "which", "Myc", "overexpression", "is", "restricted", "to", "B", "lymphocytes", ".", "Wip1", "+", "/", "−", "and", "Wip1", "−", "/", "−", "mice", "exhibited", "a", "significant", "delay", "in", "Eμ-Myc-induced", "B", "cell", "lymphoma", "incidence", ".", "The", "median", "lifespan", "of", "Wip1", "+", "/", "+", "Eμ-Myc", "mice", "was", "77", "days", "compared", "to", "107", "days", "for", "Wip1", "+", "/", "−", "Eμ-Myc", "mice", "and", "138", "days", "for", "Wip1", "−", "/", "−", "Eμ-Myc", "mice", "-LSB-", "14", "-RSB-", ".", "Subsequent", "crosses", "of", "the", "Wip1-deficient", "Eμ-Myc", "transgenic", "mice", "to", "p53", ",", "p19ARF", ",", "and", "ATM-deficient", "mice", "showed", "that", "Wip1", "deficiency", "suppressed", "Eμ-Myc-induced", "lymphomagenesis", "in", "an", "ATM", "and", "p53-dependent", ",", "but", "ARF-independent", "manner", "-LSB-", "57", "-RSB-", ".", "Thus", ",", "overexpression", "of", "Wip1", "in", "an", "oncogenic", "context", "could", "contribute", "to", "tumor", "promotion", "by", "inhibiting", "both", "p53", "and", "ATM", "functions", ".", "In", "addition", "to", "delaying", "oncogene-induced", "tumors", ",", "we", "found", "that", "Wip1", "absence", "also", "resulted", "in", "far", "fewer", "spontaneous", "cancers", "than", "in", "mice", "with", "normal", "levels", "of", "Wip1", "-LSB-", "49", "-RSB-", ".", "Lifelong", "monitoring", "of", "Wip1", "+", "/", "+", "mice", "recorded", "a", "45", "%", "incidence", "of", "spontaneous", "cancers", ",", "while", "Wip1", "+", "/", "−", "and", "Wip1", "−", "/", "−", "mice", "had", "a", "cancer", "incidence", "of", "25", "%", "and", "10", "%", ",", "respectively", ".", "These", "differences", "in", "tumor", "incidence", "between", "the", "Wip1", "+", "/", "+", "and", "Wip1", "−", "/", "−", "mice", "were", "significant", "-LRB-", "P", "=", "0.016", "-RRB-", ".", "These", "results", "suggest", "that", "the", "absence", "of", "Wip1", "confers", "a", "significant", "degree", "of", "resistance", "to", "cancer", "development", "over", "the", "lifespan", "of", "the", "mouse", ".", "Part", "of", "the", "cancer", "resistance", "phenotypes", "of", "the", "Wip1", "null", "mice", "may", "have", "been", "due", "to", "an", "enhanced", "DNA", "damage", "response", "in", "Wip1", "−", "/", "−", "tissues", ".", "Following", "whole", "body", "irradiation", "with", "5", "Gy", ",", "Wip1", "−", "/", "−", "tissues", "often", "exhibited", "increased", "phosphorylation", "of", "the", "DNA", "damage", "response", "proteins", "p53", "-LRB-", "Ser15", "-RRB-", ",", "Chk1", "-LRB-", "Ser345", "-RRB-", ",", "Chk2", "-LRB-", "Thr68", "-RRB-", ",", "and", "p38", "-LRB-", "Thr180", "-RRB-", "compared", "to", "similar", "Wip1", "+", "/", "+", "tissues", "-LSB-", "49", "-RSB-", ".", "These", "results", "suggested", "that", "an", "enhanced", "DNA", "damage", "response", "might", "be", "one", "mechanism", "for", "the", "cancer", "resistance", "of", "Wip1", "null", "mice", ",", "consistent", "with", "recent", "findings", "that", "the", "DNA", "damage", "response", "may", "be", "an", "important", "early", "failsafe", "system", "in", "preventing", "cancer", "progression", "-LSB-", "5", ",", "6", "-RSB-", ".", "In", "summary", ",", "the", "studies", "described", "in", "this", "section", "and", "the", "previous", "section", "provide", "compelling", "evidence", "that", "Wip1", "is", "a", "human", "oncogene", ".", "Table", "3", "recapitulates", "some", "of", "the", "evidence", "provided", "above", "in", "support", "of", "Wip1", "oncogenic", "function", ".", "Its", "amplification", "and", "overexpression", "in", "human", "tumors", ",", "its", "clear", "effects", "on", "transformation", "of", "cells", "in", "culture", "and", "effects", "on", "tumorigenesis", "in", "animal", "models", ",", "and", "its", "ability", "to", "inhibit", "the", "activity", "of", "multiple", "tumor", "suppressors", "clearly", "define", "it", "as", "an", "oncogene", ".", "Perhaps", "the", "most", "important", "tumor", "suppressor", "modulated", "by", "Wip1", "is", "the", "p53", "protein", ".", "As", "shown", "in", "Fig.", "2", ",", "Wip1", "inhibits", "upstream", "kinase", "activators", "of", "p53", "-LRB-", "ATM", ",", "p38", ",", "Chk1", ",", "Chk2", "-RRB-", ",", "dephosphorylates", "p53", "itself", "at", "Ser15", ",", "stabilizes", "a", "key", "mediator", "of", "p53", "degradation", ",", "Mdm2", ",", "and", "inhibits", "the", "ARF", "upstream", "activator", "of", "p53", ".", "Its", "inhibition", "of", "p16INK4a", "levels", "also", "suggests", "Wip1", "activity", "in", "suppressing", "retinoblastoma", "-LRB-", "Rb", "-RRB-", "tumor", "suppressor", "regulated", "pathways", ".", "Table", "3Evidence", "that", "the", "Wip1", "gene", "is", "an", "oncogeneEvidenceReferences1", ".", "Wip1", "specifically", "inhibits", "p53", "signaling", "by", "multiple", "mechanisms", "-LSB-", "8", "--", "12", ",", "17", "-RSB-", "2", ".", "Wip1", "inhibits", "the", "activity", "of", "other", "tumor", "suppressors", "-LRB-", "ARF", ",", "p16INK4A", "-RRB-", "-LSB-", "12", "-RSB-", "3", ".", "Wip1", "abrogates", "DNA", "damage", "response", "pathways", "and", "cell", "cycle", "checkpoints", "-LSB-", "10", ",", "25", ",", "51", "-RSB-", "4", ".", "Wip1", "can", "transform", "primary", "rodent", "fibroblasts", "in", "conjunction", "with", "other", "oncogenes", "-LSB-", "17", ",", "51", ",", "62", "-RSB-", "5", ".", "Wip1", "accelerates", "tumorigenesis", "in", "a", "mammary", "tumor", "susceptible", "model", "-LSB-", "72", "-RSB-", "6", ".", "Wip1", "is", "amplified", "and", "overexpressed", "in", "multiple", "types", "of", "human", "tumors", "-LSB-", "17", ",", "62", ",", "64", "--", "71", "-RSB-", "7", ".", "Wip1", "amplification", "and", "overexpression", "is", "often", "associated", "with", "poorer", "prognosis", "-LSB-", "64", ",", "66", ",", "67", ",", "68", ",", "70", "-RSB-", "8", ".", "Wip1", "null", "primary", "embryo", "fibroblasts", "are", "resistant", "to", "transformation", "by", "oncogenes", "-LSB-", "12", "-RSB-", "9", ".", "Wip1", "null", "mice", "are", "resistant", "to", "spontaneous", "and", "oncogene-induced", "tumors", "-LSB-", "12", ",", "51", ",", "59", "-RSB-", "Wip1", "as", "a", "target", "for", "cancer", "chemotherapeutic", "approaches", "Because", "Wip1", "inhibits", "so", "many", "tumor", "suppressor", "molecules", "-LRB-", "p53", ",", "ATM", ",", "p16INK4A", ",", "p14/p19ARF", "-RRB-", ",", "targeting", "Wip1", "function", "in", "cancer", "cells", "may", "be", "an", "effective", "way", "to", "enhance", "tumor", "suppressor", "function", ",", "resulting", "in", "enhanced", "cancer", "cell", "arrest", "and/or", "apoptosis", ".", "A", "number", "of", "laboratories", "have", "begun", "to", "experiment", "with", "this", "approach", "by", "developing", "and", "characterizing", "inhibitors", "of", "Wip1", "phosphatase", "activity", ".", "Yamaguchi", "et", "al.", "-LSB-", "24", "-RSB-", "have", "developed", "a", "series", "of", "substituted", "linear", "and", "circular", "phosphopeptides", "that", "variably", "inhibited", "Wip1", "activity", ".", "Optimization", "experiments", "resulted", "in", "two", "thioether", "cyclic", "phosphopeptides", "with", "a", "pSIpY", "core", "motif", "with", "essentially", "100", "%", "inhibition", "of", "recombinant", "Wip1", "phosphatase", "activity", ".", "Molecular", "modeling", "experiments", "indicated", "close", "interaction", "of", "the", "cyclic", "inhibitor", "with", "the", "key", "postulated", "catalytic", "residues", "-LRB-", "R76", "and", "K238", "-RRB-", "in", "Wip1", ".", "Moreover", ",", "the", "inhibitor", "was", "specific", "for", "Wip1", "and", "did", "not", "inhibit", "PP2A", "or", "PP2Cα", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "Another", "approach", "was", "taken", "by", "Bulavin", "and", "colleagues", "who", "screened", "a", "diversity", "set", "library", "of", "1990", "compounds", "and", "identified", "14", "that", "could", "completely", "inhibit", "Wip1", "phosphatase", "activity", "-LSB-", "72", "-RSB-", ".", "Two", "of", "these", "compounds", "were", "highly", "effective", "at", "concentrations", "as", "low", "as", "0.5", "μM", "and", "most", "of", "these", "hits", "did", "not", "inhibit", "PP2Cα", "and", "PP2A", ".", "When", "transformed", "MEFs", "were", "incubated", "with", "each", "of", "the", "14", "Wip1", "inhibitors", "and", "tested", "for", "p38", "MAPK", "phosphorylation", "-LRB-", "the", "prototype", "Wip1", "target", "-RRB-", ",", "only", "5", "of", "the", "compounds", "increased", "phosphorylation", "of", "p38", ".", "The", "most", "effective", "of", "these", "-LRB-", "compound", "M", "-RRB-", "was", "tested", "on", "various", "breast", "cancer", "cell", "lines", "and", "found", "to", "reduce", "cell", "viability", "by", "30", "--", "50", "%", "in", "some", "lines", "and", "could", "also", "potentiate", "the", "anti-proliferative", "effects", "of", "the", "anti-cancer", "drug", "doxorubicin", ".", "Finally", ",", "compound", "M", "was", "injected", "into", "both", "mammary", "tumor", "susceptible", "MMTV-Neu", "mice", "and", "mouse", "xenograft", "models", "and", "was", "effective", "in", "reducing", "both", "tumor", "cell", "proliferation", "and", "tumor", "volume", "-LSB-", "72", "-RSB-", ".", "Another", "large", "high", "throughput", "screen", "of", "65,500", "compounds", "by", "Rayter", "et", "al.", "-LSB-", "73", "-RSB-", "identified", "six", "compounds", "that", "demonstrated", "strong", "inhibition", "of", "Wip1", "phosphatase", "activity", ".", "However", ",", "only", "two", "of", "these", "compounds", "showed", "growth", "inhibitory", "activity", "on", "cancer", "cell", "lines", ".", "Of", "these", ",", "one", "specifically", "inhibited", "the", "growth", "of", "cells", "overexpressing", "Wip1", ",", "an", "effect", "that", "was", "lost", "in", "the", "presence", "of", "the", "p38", "MAP", "kinase", "inhibitor", "SB203580", ".", "This", "indicated", "that", "suppression", "of", "p38", "signaling", "by", "Wip1", "is", "likely", "to", "be", "an", "important", "component", "of", "tumor", "promotion", "in", "some", "Wip1", "overexpressing", "human", "cancer", "cells", ".", "The", "identification", "of", "novel", "Wip1", "small", "molecule", "inhibitors", "is", "an", "encouraging", "advance", "and", "suggests", "that", "this", "approach", "merits", "further", "consideration", "for", "testing", "in", "human", "cancer", "patients", ".", "Other", "Wip1", "biological", "functions", "Aside", "from", "its", "clear", "importance", "in", "DNA", "damage", "response", "signaling", "and", "oncogenesis", ",", "the", "phenotypes", "observed", "in", "Wip1", "knockout", "mice", "revealed", "other", "key", "physiological", "roles", "for", "Wip1", ".", "The", "Wip1", "knockout", "mice", "display", "a", "range", "of", "abnormalities", ",", "including", "variable", "male", "runting", ",", "male", "reproductive", "organ", "atrophy", "with", "reduced", "male", "fertility", "as", "well", "as", "modestly", "diminished", "male", "longevity", "-LSB-", "71", "-RSB-", ".", "The", "reproductive", "defects", "of", "the", "Wip1", "−", "/", "−", "mice", "are", "only", "seen", "in", "older", "males", "and", "are", "presumably", "related", "to", "the", "abnormal", "seminiferous", "tubules", "and", "epididymi", "with", "a", "small", "number", "of", "mature", "spermatozoa", "that", "arise", "in", "these", "animals", ".", "The", "mechanisms", "of", "runting", "and", "reduced", "longevity", "seen", "in", "the", "null", "males", "may", "be", "a", "result", "of", "hormone", "level", "imbalance", "or", "deficient", "steroid", "receptor", "activation", ".", "Proia", "et", "al.", "-LSB-", "74", "-RSB-", "did", "demonstrate", "a", "rather", "unexpected", "regulatory", "effect", "of", "Wip1", "on", "the", "progesterone", "receptor", ".", "This", "study", "showed", "that", "overexpression", "of", "Wip1", "stimulates", "steroid", "receptor", "activity", ",", "by", "enhancing", "the", "intrinsic", "activity", "of", "p160", "coactivators", "such", "as", "steroid", "receptor", "coactivator-1", ".", "One", "result", "of", "this", "activation", "is", "that", "Wip1", "positively", "regulates", "the", "activity", "of", "estrogen", ",", "progesterone", ",", "and", "androgen", "receptors", ".", "This", "function", "appears", "to", "be", "independent", "of", "p38", "MAPK", "because", "SB202190", "-LRB-", "a", "potent", "p38MAPK", "inhibitor", "-RRB-", "is", "unable", "to", "reverse", "the", "inhibition", "of", "the", "progesterone", "receptor", "activity", "elicited", "by", "reducing", "Wip1", "expression", "in", "MCF-7", "cells", ".", "Mice", "lacking", "Wip1", "also", "showed", "immunological", "defects", ".", "The", "Wip1", "null", "mice", "occasionally", "exhibited", "ulcerated", "skin", "lesions", ",", "disorganized", "and", "hyperplastic", "lymphoid", "organs", ",", "and", "increased", "inflammation", "in", "normal", "organs", ".", "B", "and", "T", "lymphocytes", "from", "Wip1", "−", "/", "−", "mice", "displayed", "a", "variety", "of", "unbalanced", "and", "ineffective", "responses", "to", "antigenic", "and", "mitogenic", "stimulation", "-LSB-", "71", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "Wip1", "null", "mice", "were", "more", "likely", "to", "die", "from", "influenza", "virus", "infection", "than", "their", "normal", "counterparts", ".", "Schito", "et", "al.", "-LSB-", "75", "-RSB-", "in", "a", "more", "extended", "analysis", "of", "immune", "defects", "in", "the", "Wip1", "null", "mice", ",", "showed", "that", "Wip1", "is", "vital", "during", "the", "double", "negative", "to", "double", "positive", "T", "cell", "transition", ".", "Young", "Wip1", "null", "mice", "had", "fewer", "splenic", "T", "cells", "and", "their", "thymi", "were", "smaller", "with", "fewer", "double", "positive", "-LRB-", "DP", "-RRB-", "and", "single", "positive", "-LRB-", "SP", "-RRB-", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "T", "cells", ".", "A", "partial", "block", "in", "transition", "from", "double", "negative", "-LRB-", "DN", "-RRB-", "to", "double", "positive", "T", "cells", "was", "noted", "and", "this", "correlates", "with", "a", "peak", "in", "Wip1", "mRNA", "expression", "in", "the", "late", "DN", "stages", "of", "T", "cell", "maturation", ".", "DP", "T", "cells", "that", "did", "mature", "were", "found", "to", "have", "cell", "cycle", "abnormalities", "and", "increased", "apoptotic", "rates", ".", "Importantly", ",", "when", "the", "Wip1", "null", "mice", "were", "crossed", "into", "a", "p53", "null", "strain", ",", "many", "of", "the", "thymic", "and", "T", "cell", "deficiencies", "were", "rescued", ",", "indicating", "that", "a", "major", "component", "of", "the", "Wip1", "−", "/", "−", "T", "cell", "phenotypes", "were", "likely", "to", "be", "due", "to", "increased", "p53", "activity", ".", "Conclusions", ",", "future", "prospects", "Since", "the", "discovery", "of", "Wip1", "by", "the", "Appella", "laboratory", "in", "1997", "there", "have", "been", "many", "advances", "in", "our", "understanding", "of", "how", "this", "p53-induced", "phosphatase", "functions", ".", "Yet", "in", "the", "decade", "or", "so", "since", "its", "discovery", ",", "there", "have", "been", "fewer", "than", "50", "papers", "associated", "with", "the", "study", "of", "Wip1", ",", "indicating", "that", "we", "have", "only", "scratched", "the", "surface", "in", "terms", "of", "gaining", "a", "complete", "understanding", "of", "the", "biological", "role", "of", "this", "protein", ".", "We", "have", "learned", "that", "Wip1/PPM1D", "is", "an", "oncogene", "that", "functions", "in", "part", "by", "suppressing", "major", "tumor", "suppressors", "that", "include", "p53", ".", "It", "also", "plays", "a", "homeostatic", "role", "in", "reversing", "the", "effects", "of", "the", "ATM/ATR-initiated", "DNA", "damage", "response", "pathway", ".", "This", "homeostatic", "role", "is", "generally", "benign", "until", "somehow", "the", "Wip1", "gene", "becomes", "amplified", "and", "upregulated", ".", "Why", "and", "how", "this", "abnormal", "Wip1", "alteration", "occurs", "in", "tumors", "is", "unclear", ",", "but", "should", "be", "of", "much", "interest", "in", "future", "studies", ".", "Many", "important", "questions", "remain", "to", "be", "answered", ".", "The", "structure", ",", "catalytic", "activities", "and", "functional", "domains", "of", "Wip1", "are", "still", "poorly", "understood", ".", "What", "does", "the", "C-terminal", "non-catalytic", "domain", "do", "?", "Are", "pTXpY", "and", "pS/pTQ", "the", "only", "target", "motifs", "recognized", "by", "Wip1", "or", "are", "there", "others", "?", "And", "what", "are", "the", "other", "target", "proteins", "?", "The", "best", "guess", "is", "that", "there", "are", "likely", "to", "be", "hundreds", "of", "targets", ",", "if", "not", "more", ".", "Does", "Wip1", "have", "other", "undiscovered", "functions", "?", "And", "perhaps", "most", "importantly", ",", "from", "a", "disease", "perspective", ",", "how", "many", "human", "cancers", "exhibit", "Wip1", "overexpression", ",", "what", "are", "the", "mechanisms", "for", "Wip1-mediated", "oncogenesis", ",", "and", "how", "can", "our", "knowledge", "of", "these", "mechanisms", "assist", "us", "in", "designing", "novel", "therapies", "to", "fight", "cancer", "?", "The", "answers", "to", "these", "questions", "in", "the", "coming", "years", "should", "result", "in", "increased", "interest", "in", "this", "heretofore", "little", "studied", "protein", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "The", "CIMT-monitoring", "panel", ":", "a", "two-step", "approach", "to", "harmonize", "the", "enumeration", "of", "antigen-specific", "CD8", "+", "T", "lymphocytes", "by", "structural", "and", "functional", "assays", "The", "interpretation", "of", "the", "results", "obtained", "from", "immunomonitoring", "of", "clinical", "trials", "is", "a", "difficult", "task", "due", "to", "the", "variety", "of", "methods", "and", "protocols", "available", "to", "detect", "vaccine-specific", "T-cell", "responses", ".", "This", "heterogeneity", "as", "well", "as", "the", "lack", "of", "standards", "has", "led", "to", "significant", "scepticism", "towards", "published", "results", ".", "In", "February", "2005", ",", "a", "working", "group", "was", "therefore", "founded", "under", "the", "aegis", "of", "the", "Association", "for", "Immunotherapy", "of", "Cancer", "-LRB-", "``", "CIMT", "''", "-RRB-", "in", "order", "to", "compare", "techniques", "and", "protocols", "applied", "for", "the", "enumeration", "of", "antigen-specific", "T-cell", "responses", ".", "Here", "we", "present", "the", "results", "from", "two", "consecutive", "phases", "of", "an", "international", "inter-laboratory", "testing", "project", "referred", "to", "as", "the", "``", "CIMT", "monitoring", "panel", "''", ".", "A", "total", "of", "13", "centers", "from", "six", "European", "countries", "participated", "in", "the", "study", "in", "which", "pre-tested", "PBMC", "samples", ",", "synthetic", "peptides", "and", "PE-conjugated", "HLA-tetramers", "were", "prepared", "centrally", "and", "distributed", "to", "participants", ".", "All", "were", "asked", "to", "determine", "the", "number", "of", "antigen-specific", "T-cells", "in", "each", "sample", "using", "tetramer", "staining", "and", "one", "functional", "assay", ".", "The", "results", "of", "the", "first", "testing", "round", "revealed", "that", "the", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", "was", "the", "most", "important", "determinant", "for", "the", "sensitive", "detection", "of", "antigen-specific", "CD8", "+", "T-cells", "by", "tetramer", "staining", ".", "Analysis", "by", "ELISPOT", "was", "influenced", "by", "a", "combination", "of", "cell", "number", "and", "a", "resting", "phase", "after", "thawing", "of", "peripheral", "blood", "mononuclear", "cells", ".", "Therefore", ",", "the", "experiments", "were", "repeated", "in", "a", "second", "phase", "but", "now", "the", "participants", "were", "asked", "to", "change", "their", "protocols", "according", "to", "the", "new", "guidelines", "distilled", "from", "the", "results", "of", "the", "first", "phase", ".", "The", "recommendations", "improved", "the", "number", "of", "antigen-specific", "T-cell", "responses", "that", "were", "detected", "and", "decreased", "the", "variability", "between", "the", "laboratories", ".", "We", "conclude", "that", "a", "two-step", "approach", "in", "inter-laboratory", "testing", "allows", "the", "identification", "of", "distinct", "variables", "that", "influence", "the", "sensitivity", "of", "different", "T-cell", "assays", "and", "to", "formally", "show", "that", "a", "defined", "correction", "to", "the", "protocols", "successfully", "increases", "the", "sensitivity", "and", "reduces", "the", "inter-center", "variability", ".", "Such", "``", "two-step", "''", "inter-laboratory", "projects", "could", "define", "rational", "bases", "for", "accepted", "international", "guidelines", "and", "thereby", "lead", "to", "the", "harmonization", "of", "the", "techniques", "used", "for", "immune", "monitoring", ".", "Introduction", "In", "the", "last", "two", "decades", ",", "more", "than", "200", "clinical", "trials", "of", "different", "anti-tumor", "vaccines", "aiming", "to", "induce", "tumor-specific", "immunity", "in", "cancer", "patients", "have", "been", "described", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "Most", "of", "these", "trials", "primarily", "assessed", "safety", "and", "immunogenicity", "while", "reporting", "partial", "or", "complete", "clinical", "responses", "in", "a", "minority", "of", "patients", "-LSB-", "2", ",", "3", "-RSB-", ".", "Despite", "the", "fact", "that", "the", "low", "fraction", "of", "clinical", "responders", "still", "precludes", "the", "establishment", "of", "a", "direct", "correlation", "between", "clinical", "efficacy", "and", "T-cell", "reactivity", ",", "it", "has", "become", "clear", "from", "animal", "models", "and", "clinical", "observations", "that", "naturally-occurring", "or", "vaccine-induced", "CD8", "+", "or", "CD4", "+", "T-cells", "play", "an", "important", "role", "in", "the", "control", "and", "regression", "of", "tumors", "-LSB-", "4", "--", "9", "-RSB-", ".", "Therefore", ",", "the", "number", "of", "subjects", "that", "mount", "a", "vaccine-induced", "T-cell", "response", "as", "well", "as", "the", "strength", "of", "a", "detected", "T-cell", "response", "represent", "important", "surrogate", "markers", "for", "vaccine", "efficacy", ".", "The", "enzyme-linked", "immunospot", "-LRB-", "ELISPOT", "-RRB-", "assay", "-LSB-", "10", ",", "11", "-RSB-", ",", "staining", "with", "HLA-peptide", "multimers", "-LSB-", "12", "-RSB-", "and", "intracellular", "cytokine", "staining", "-LRB-", "ICS", "-RRB-", "-LSB-", "13", ",", "14", "-RSB-", "are", "technologies", "used", "commonly", "for", "the", "monitoring", "of", "antigen-specific", "immune", "responses", ".", "For", "these", "three", "assays", ",", "a", "huge", "variety", "of", "different", "protocols", "are", "available", "worldwide", ".", "This", "heterogeneity", ",", "together", "with", "the", "fact", "that", "the", "sensitivity", "of", "the", "individual", "protocols", "can", "vary", "significantly", ",", "makes", "a", "comparison", "of", "the", "results", "obtained", "in", "different", "trials", "a", "difficult", "task", ".", "Moreover", ",", "an", "increasing", "number", "of", "new", "technologies", "are", "constantly", "being", "introduced", "to", "the", "field", ",", "which", "makes", "interpretations", "even", "more", "complex", "-LSB-", "15", "--", "25", "-RSB-", ".", "Current", "data", "and", "opinion", "support", "the", "use", "of", "a", "functional", "assay", "like", "the", "ELISPOT", "or", "ICS", "in", "combination", "with", "a", "phenotyping", "assay", "like", "HLA-multimers", "-LSB-", "26", ",", "27", "-RSB-", ",", "but", "recognized", "international", "standards", "for", "all", "these", "methodologies", "are", "still", "lacking", ".", "The", "main", "aim", "of", "the", "``", "CIMT", "monitoring", "panel", "''", "is", "to", "harmonize", "and", "optimize", "the", "monitoring", "of", "antigen-specific", "T-cells", "among", "the", "participating", "laboratories", ",", "based", "on", "objective", "rationales", "with", "respect", "to", "the", "testing", "procedure", ",", "the", "analysis", "and", "the", "interpretation", "of", "results", ".", "Important", "requirements", "for", "an", "immunological", "test", "are", "sensitivity", ",", "applicability", "to", "large", "amounts", "of", "clinical", "material", "and", "feasibility", "at", "reasonable", "cost", ".", "The", "results", "generated", "by", "the", "tests", "should", "be", "reproducible", "and", "sensitive", ",", "independently", "of", "the", "place", "where", "they", "have", "been", "performed", ".", "After", "the", "first", "meeting", "of", "the", "working", "group", ",", "a", "series", "of", "inter-laboratory", "testing", "projects", "was", "initiated", ",", "in", "which", "individual", "laboratories", "could", "compare", "their", "performance", ",", "express", "their", "needs", "and", "exchange", "experience", "in", "order", "to", "improve", "their", "local", "assays", ".", "Here", "we", "report", "the", "results", "of", "the", "first", "two", "phases", "of", "the", "CIMT", "monitoring", "panel", ",", "with", "13", "participating", "centers", "from", "six", "European", "countries", ".", "Materials", "and", "methods", "Preparation", "and", "screening", "of", "PBMC", "samples", "Buffy", "coats", "from", "HLA-typed", "healthy", "volunteers", "were", "kindly", "provided", "from", "the", "Blood", "Bank", "of", "the", "University", "Mainz", ".", "HCMV", "sero-status", "was", "known", ".", "PBMC", "were", "isolated", "by", "Ficoll", "density", "gradient", "separation", "-LRB-", "Pharmacia", ",", "Uppsala", ",", "Sweden", "-RRB-", ",", "washed", "two", "times", "in", "RPMI", "1640", "-LRB-", "GIBCO", "BRL", ",", "Grand", "Island", ",", "NY", ",", "USA", "-RRB-", "containing", "10", "mM", "Hepes", "buffer", ",", "l-arginine", "-LRB-", "116", "mg/ml", "-RRB-", ",", "l-glutamine", "-LRB-", "216", "mg/ml", "-RRB-", ",", "penicillin", "-LRB-", "10", "IU/ml", "-RRB-", ",", "streptomycin", "-LRB-", "100", "mg/ml", "-RRB-", "and", "10", "%", "FCS", "-LRB-", "GIBCO", "BRL", "-RRB-", ",", "counted", "and", "frozen", "at", "10", "to", "20", "×", "106", "cells", "per", "cryovial", "in", "1", "ml", "of", "FCS", "90", "%", "+", "DMSO", "10", "%", "at", "−", "80", "°C", "in", "freezing-boxes", "filled", "with", "iso-propanol", ".", "After", "20", "h", ",", "all", "cryovials", "were", "transferred", "to", "liquid", "nitrogen", "and", "stored", "until", "distribution", "to", "the", "participating", "laboratories", ".", "Pre-screening", "and", "selection", "of", "the", "PBMC", "donors", "for", "influenza", "-", "and", "CMV", "-", "T-cell", "reactivities", "were", "performed", "by", "a", "central", "lab", "using", "the", "IFNγ", "ELISPOT", "assay", "following", "a", "local", "protocol", "as", "described", "previously", "-LSB-", "38", "-RSB-", ".", "Five", "donors", "were", "selected", "for", "the", "first", "phase", "of", "the", "panel", "and", "eight", "for", "the", "second", "phase", ".", "One", "HLA-A", "*", "0201-negative", "donor", "was", "included", "in", "each", "phase", "-LRB-", "negative", "control", "-RRB-", ",", "all", "other", "samples", "were", "HLA-A", "*", "0201-positive", ".", "Synthetic", "peptides", "and", "HLA-tetramers", "Peptides", "were", "synthesized", "using", "standard", "Fmoc", "chemistry", ",", "dissolved", "at", "10", "mg/ml", "in", "DMSO", ",", "aliquotted", "and", "stored", "at", "−", "80", "°C", ".", "The", "purity", "was", "checked", "by", "reverse-phase", "HPLC", "and", "was", "found", "to", "be", ">", "80", "%", ".", "Two", "known", "HLA-A", "*", "0201", "T-cell", "epitopes", "were", "used", ":", "influenza", "MP", "58", "--", "66", "GILGFVFTL", "and", "HCMV", "pp65", "495", "--", "503", "NLVPMVATV", "-LRB-", "http://www.syfpeithi.de", "-RRB-", ".", "Biotinylated", "recombinant", "HLA-A", "*", "0201", "monomers", "folded", "with", "the", "influenza", "MP", "58", "--", "66", "or", "the", "HMCV", "pp65", "peptides", "were", "produced", "essentially", "as", "described", ",", "purified", "by", "gel", "filtration", "and", "stored", "as", "aliquots", "at", "−", "80", "°C", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "Fluorescent", "multimers", "were", "obtained", "by", "incubation", "with", "streptavidin-PE", "-LRB-", "Molecular", "Probes", ",", "Leiden", ",", "The", "Netherlands", "-RRB-", ",", "then", "frozen", "as", "aliquots", "after", "addition", "of", "0.5", "%", "BSA", "and", "16", "%", "glycerol", ".", "HLA-concentrations", "of", "influenza-tetramer", "and", "HCMV-tetramers", "were", "700", "and", "350", "μg/ml", ",", "respectively", ".", "Both", "tetramers", "were", "checked", "by", "HPLC", "and/or", "validated", "by", "staining", "of", "a", "specific", "CD8", "+", "T-cell", "line", "-LRB-", "Influenza", "-RRB-", "or", "PBMC", "from", "HLA-A2-negative", "and", "HLA-A2-positive", "CMV", "seronegative", "donors", "-LRB-", "CMV", "-RRB-", ".", "Such", "tetramers", "are", "stable", "at", "4", "°C", "for", "at", "least", "1", "month", "-LRB-", "personal", "observation", "-RRB-", "and", "participants", "were", "asked", "to", "perform", "all", "tests", "within", "this", "time", "period", ".", "Participating", "centers", "Twelve", "centers", "from", "five", "European", "countries", "participated", "in", "the", "first", "phase", "of", "the", "monitoring", "panel", ".", "As", "one", "of", "the", "investigators", "moved", "to", "another", "institution", "during", "the", "study", "a", "13th", "center", "from", "a", "6th", "European", "country", "was", "added", "to", "the", "group", "in", "the", "second", "phase", "of", "the", "panel", ".", "Participation", "in", "the", "panel", "was", "open", "to", "all", "interested", "laboratories", "with", "a", "focus", "on", "T-cell", "monitoring", ",", "independently", "of", "membership", "in", "the", "Association", "for", "Immunotherapy", "of", "Cancer", ".", "Reagent", "distribution", "and", "assay", "guidelines", "Coded", "PBMC", "samples", ",", "synthetic", "peptides", "and", "HLA-A", "*", "0201", "tetramers", "were", "shipped", "on", "dry", "ice", "to", "the", "participants", ".", "Additionally", ",", "guidelines", "for", "the", "two", "T-cell", "assays", "were", "distributed", "for", "each", "phase", ":", "Phase", "I/2005", ".", "A", "protocol", "for", "tetramer", "staining", "was", "included", ".", "Briefly", ",", "1", "×", "106", "PBMC", "per", "test", "were", "transferred", "directly", "after", "thawing", "into", "one", "well", "of", "a", "96", "well", "u-bottom", "plate", "and", "washed", "in", "FACS", "buffer", "consisting", "of", "PBS", ",", "2", "%", "FCS", ",", "2", "mM", "EDTA", ",", "0.02", "%", "azide", ".", "Incubation", "with", "5", "μg/ml", "HLA-tetramer", "was", "then", "performed", "in", "FACS", "buffer", "with", "50", "%", "FCS", "for", "30", "min", "at", "room", "temperature", "in", "the", "dark", ".", "After", "one", "wash", "in", "FACS", "buffer", ",", "mAb", "for", "T-cell", "staining", "were", "added", "for", "20", "min", "at", "4", "°C", ".", "Finally", ",", "cells", "were", "washed", "twice", "before", "fixing", "in", "FACS", "buffer", "containing", "1", "%", "formaldehyde", "solution", ".", "Three", "mAb", "combinations", "were", "proposed", ",", "CD8", "alone", ",", "CD3", "plus", "CD8", ",", "or", "CD4", "plus", "CD8", ".", "Each", "lab", "could", "choose", "here", "the", "antibody", "clones", ",", "fluorescent", "dye", "and", "concentrations", "used", ".", "Stainings", "were", "performed", "in", "duplicate", ".", "For", "the", "functional", "assays", ",", "synthetic", "peptides", "were", "diluted", "at", "1", "mg/ml", "in", "PBS", "as", "a", "stock", "solution", ".", "Concentrations", "in", "further", "tests", "were", "1", "--", "10", "μg/ml", ",", "left", "to", "the", "choice", "of", "the", "participants", ".", "There", "were", "no", "recommendation", "which", "functional", "test", "should", "be", "performed", ",", "so", "that", "each", "group", "could", "choose", "the", "test", "either", "routinely", "used", ",", "or", "to", "be", "implemented", "for", "its", "own", "needs", ".", "In", "this", "first", "phase", ",", "11/12", "laboratories", "chose", "the", "IFNγ", "ELISPOT", "assay", ",", "one", "lab", "-LRB-", "Z10", "-RRB-", "a", "FACS-based", "intracellular", "IFNγ", "staining", "and", "one", "lab", "performed", "both", "assays", "-LRB-", "Z7", "-RRB-", ".", "Spot", "counting", "was", "performed", "locally", ".", "Phase", "II/2006", ".", "Following", "the", "results", "obtained", "in", "the", "first", "testing", "phase", ",", "requirements", "were", "introduced", "and", "participants", "were", "asked", "to", "apply", "exactly", "these", "new", "criteria", "-LRB-", "two", "for", "the", "tetramer", "staining", ",", "and", "four", "for", "the", "ELISPOT", ",", "see", "``", "Results", "''", "section", "-RRB-", ".", "The", "assay", "guidelines", "were", "modified", "accordingly", ".", "However", ",", "in", "order", "to", "reduce", "the", "variability", "in", "the", "FACS", "analysis", "of", "the", "13", "laboratories", ",", "a", "figure", "showing", "exemplary", "dot-plots", ",", "settings", "of", "gates", "and", "quadrants", ",", "and", "statistical", "analysis", "was", "provided", ".", "All", "laboratories", "were", "now", "required", "to", "perform", "an", "IFNγ", "ELISPOT", "as", "the", "functional", "test", ",", "with", "a", "fixed", "peptide", "concentration", "of", "1", "μg/ml", ".", "Participants", "were", "encouraged", "to", "use", "a", "distributed", "model", "protocol", "but", "were", "allowed", "to", "use", "their", "local", "protocol", ",", "provided", "that", "they", "applied", "the", "four", "new", "requirements", "introduced", "in", "the", "second", "phase", ".", "Collection", "and", "analysis", "of", "results", "After", "performing", "the", "required", "tests", "in", "each", "phase", ",", "participants", "returned", "a", "completed", "report", "form", "containing", "all", "relevant", "information", ".", "Number", "of", "cells", "recovered", "after", "thawing", "was", "included", "to", "assess", "viability", "after", "transport", ".", "For", "the", "tetramer", "staining", "experiments", ",", "mAb", "clone", ",", "manufacturer", ",", "amount", ",", "cytometer", "type", "and", "number", "of", "lymphocytes", "and/or", "CD8", "+", "cells", "analyzed", "were", "noted", ".", "Results", "were", "expressed", "as", "percentage", "of", "tetramer-positive", "cells", "among", "CD8", "+", ",", "CD3", "+", "CD8", "+", ",", "or", "CD4", "−", "lymphocytes", ",", "depending", "on", "which", "mAb", "combination", "was", "used", "for", "the", "staining", ".", "Additionally", ",", "FACS", "dot-plots", "containing", "all", "gates", ",", "quadrants", "and", "deduced", "statistical", "analysis", "were", "collected", ".", "For", "the", "functional", "test", ",", "medium", "and", "thawing", "procedure", "-LRB-", "e.g.", "addition", "of", "DNAse", ",", "of", "a", "resting", "phase", ",", "etc.", "-RRB-", "had", "to", "be", "described", ",", "as", "well", "as", "the", "number", "of", "cells", "per", "test", ",", "the", "antibodies", "used", "-LRB-", "clone", ",", "manufacturer", ",", "concentration", "-RRB-", ",", "the", "final", "peptide", "concentration", "and", "the", "incubation", "times", ".", "For", "the", "ELISPOT", "assay", ",", "the", "type", "of", "plate", ",", "the", "enzymatic", "visualization", "system", "and", "the", "spot", "reader", "were", "also", "noted", ".", "Absolute", "spot", "numbers", "were", "given", "by", "each", "participant", ",", "and", "filter", "plates", "were", "kept", "for", "possible", "second", "analysis", ".", "All", "results", "from", "both", "phases", "were", "collected", "and", "centrally", "analyzed", ".", "For", "the", "tetramer", "stainings", ",", "the", "number", "of", "lymphocytes", ",", "number", "of", "CD8", "+", "T-cells", "and", "frequencies", "of", "tetramer-positive", "cells", "were", "calculated", "on", "the", "basis", "of", "the", "stainings", "and", "statistics", "provided", "by", "the", "participants", ".", "Apart", "from", "these", "calculated", "frequencies", ",", "a", "``", "visual", "evaluation", "''", "was", "necessary", "-LRB-", "see", "``", "Results", "''", "-RRB-", ".", "For", "the", "ELISPOT", ",", "analysis", "was", "performed", "based", "on", "the", "spot", "numbers", "reported", "by", "the", "participants", ",", "followed", "by", "a", "student", "t", "test", ".", "Results", "were", "accepted", "as", "positive", "reaction", "only", "when", "the", "numbers", "of", "antigen-specific", "spots", "exceeded", "the", "number", "of", "spots", "in", "the", "background", "wells", "by", "atleast", "a", "factor", "two", ".", "The", "coefficients", "of", "variation", "-LRB-", "CV", "-RRB-", "were", "calculated", "for", "all", "results", "-LRB-", "CV", "=", "SD/mean", "×", "100", "-RRB-", "and", "are", "shown", "in", "supplementary", "Tables", "S1a", ",", "b", ".", "The", "raw", "data", "from", "both", "panel", "phases", "will", "be", "provided", "to", "interested", "readers", "upon", "request", ".", "Results", "Phase", "I/2005", "of", "the", "interlaboratory", "testing", "project", "--", "general", "aspects", "Coded", "PBMC", "samples", "from", "four", "HLA-A", "*", "0201-positive", "and", "one", "HLA-A", "*", "0201-negative", "healthy", "donor", "-LRB-", "D1", "--", "D5", "-RRB-", "were", "included", "in", "this", "first", "testing", "phase", ".", "The", "thawing", "procedure", "for", "PBMC", "samples", "in", "the", "test", "centers", "was", "not", "standardized", "and", "the", "recovery", "of", "viable", "cells", "varied", "greatly", "between", "45", "and", "102", "%", "-LRB-", "mean", "73", "%", "-RRB-", "in", "the", "12", "labs", ".", "However", ",", "the", "number", "of", "cells", "recovered", "was", "in", "all", "cases", "sufficient", "to", "perform", "the", "required", "analyses", ".", "When", "all", "the", "data", "from", "the", "tetramer", "staining", "and", "functional", "tests", "were", "combined", "it", "became", "clear", "that", "subjects", "D1", "and", "D5", "had", "responded", "to", "the", "HLA-A", "*", "0201", "restricted", "CMV-derived", "peptide", ",", "consistent", "with", "their", "CMV", "seropositive-status", ",", "and", "that", "subjects", "D1", ",", "D2", ",", "D3", ",", "and", "D5", "had", "responded", "to", "influenza", ".", "In", "total", ",", "each", "laboratory", "should", "in", "theory", "have", "been", "able", "to", "measure", "six", "positive", "-LRB-", "2", "×", "CMV", "and", "4", "×", "influenza", "-RRB-", "responses", ".", "Detection", "of", "antigen-specific", "T-cells", "by", "tetramer", "staining", "and", "IFNγ", "ELISPOT", "The", "protocol", "required", "that", "all", "PBMC", "samples", "should", "be", "analyzed", "by", "the", "12", "participants", "for", "the", "presence", "of", "HLA-A", "*", "0201-restricted", "CMV-specific", "and", "influenza-specific", "CD8", "+", "T-cells", "using", "centrally-prepared", "tetramers", ".", "The", "indicated", "frequencies", "of", "antigen-specific", "CD8", "+", "cells", "generally", "represent", "the", "mean", "of", "two", "separate", "stainings", "with", "CD3", "Ab/CD8", "Ab/tetramer", ",", "except", "for", "centers", "Z1", "-LRB-", "CD8/tetramer", "-RRB-", ",", "Z7", "-LRB-", "CD3/CD4/CD8", "/", "tetramer", "-RRB-", ",", "Z5", "and", "Z10", "-LRB-", "one", "staining", "CD3/CD8/tetramer", "and", "one", "staining", "CD3/CD4/tetramer", "-RRB-", "and", "are", "based", "on", "the", "analysis", "and", "dot", "plots", "provided", "by", "each", "participant", ".", "As", "illustrated", "in", "Fig.", "1", ",", "the", "absolute", "numbers", "of", "tetramer-positive", "T-cells", "were", "influenced", "by", "the", "individual", "decision", "of", "where", "to", "set", "the", "gates", "and", "quadrant", "markers", "for", "the", "analysis", ".", "For", "example", ",", "the", "inclusion", "of", "the", "subset", "of", "T", "lymphocytes", "expressing", "CD8", "at", "a", "low", "density", "influenced", "the", "number", "of", "CD8", "+", "and", "consequently", "the", "frequency", "of", "tetramer", "+", "cells", ".", "Moreover", ",", "non-specific", "binding", "of", "the", "tetramer", "-LRB-", "as", "seen", "on", "the", "CD8-negative", "subset", "-RRB-", "also", "varied", "between", "the", "different", "laboratories", ".", "For", "these", "reasons", ",", "not", "only", "the", "frequencies", ",", "but", "also", "the", "appearance", "of", "the", "tetramer-positive", "populations", "was", "carefully", "examined", ".", "Two", "parameters", "were", "chosen", "for", "validation", "of", "``", "positive", "''", "results", ":", "-LRB-", "1", "-RRB-", "a", "clustered", ",", "but", "not", "diffuse", ",", "tetramer", "binding-population", ",", "and", "-LRB-", "2", "-RRB-", "strong", "intensity", "of", "tetramer", "staining", ",", "especially", "marked", "for", "the", "CMV-tetramer-binding", "population", "-LRB-", "Fig.", "1", "-RRB-", ".", "Table", "1", "shows", ":", "-LRB-", "I", "-RRB-", "the", "minimum", ",", "mean", "and", "maximum", "frequencies", "of", "antigen-specific", "CD8", "+", "T-cells", ",", "-LRB-", "II", "-RRB-", "the", "results", "obtained", "from", "the", "individual", "centers", "Z1", "--", "Z12", ",", "and", "-LRB-", "III", "-RRB-", "the", "number", "and", "percentage", "of", "centers", "that", "detected", "a", "response", ".", "The", "high", "frequencies", "of", "CMV-specific", "CD8", "+", "T-cells", "in", "donors", "D1", "and", "D5", "were", "readily", "detected", "by", "all", "participants", "-LRB-", "mean", "of", "1", "per", "141", "CD8", "±", "113", "in", "D1", "and", "mean", "of", "1", "per", "80", "CD8", "±", "24", "in", "D5", ",", "respectively", "-RRB-", ".", "For", "influenza-specific", "CD8", "+", "T-cells", ",", "the", "results", "were", "more", "variable", ".", "Influenza-tetramer", "+", "cells", "in", "donor", "D3", "were", "detected", "by", "all", "participants", "with", "a", "mean", "frequency", "of", "one", "cell", "in", "1014", "CD8", "+", "T-cells", "±", "355", ".", "In", "Donor", "D5", ",", "11", "of", "12", "laboratories", "detected", "a", "mean", "of", "one", "tetramer", "binding", "cell", "per", "1106", "CD8", "+", "T-cells", "±", "508", ".", "Influenza-specific", "cells", "were", "less", "numerous", "in", "healthy", "subjects", "D1", "and", "D2", "and", "were", "only", "detected", "by", "five", "and", "eight", "laboratories", ",", "respectively", ".", "No", "false", "positive", "reactivity", "was", "reported", "by", "any", "of", "the", "participants", ".", "Fig.", "1Example", "of", "tetramer", "staining", "results", "as", "provided", "by", "four", "selected", "participating", "centers", "Z5", ",", "Z12", ",", "Z8", "and", "Z1", ".", "All", "stainings", "were", "performed", "on", "donor", "D1", "from", "phase", "I/2005", "who", "showed", "reactivity", "with", "both", "of", "the", "tested", "tetramers", ".", "Cells", "were", "gated", "either", "on", "the", "lymphocyte", "population", "-LRB-", "Z1", "-RRB-", ",", "or", "the", "subsets", "of", "CD3", "+", "CD8", "+", "-LRB-", "Z5", "-RRB-", "or", "CD3", "+", "-LRB-", "Z8", ",", "Z12", "-RRB-", ",", "according", "to", "the", "Ab", "combination", "used", "by", "each", "lab", ".", "The", "upper", "panel", "shows", "results", "for", "tests", "with", "the", "CMV-tetramer", ",", "the", "lower", "panel", "shows", "results", "for", "tests", "with", "the", "influenza-tetramer", ".", "In", "all", "dot-plots", ",", "the", "tetramer", "staining", "is", "displayed", "on", "the", "y-axis", "and", "anti-CD8-staining", "on", "the", "x-axis", ".", "Number", "of", "counted", "CD8", "+", "T-cells", "and", "percentage", "of", "tetramer-positive", "cells", "among", "the", "CD8", "subset", "are", "indicatedTable", "1Overview", "of", "the", "tetramer", "results", "from", "phase", "I/2005", "of", "the", "CIMT", "monitoring", "panelD1", "CMVD1", "FluD2", "FluD3", "FluD5", "CMVD5", "FluMin44820", ",0006,6671,8181061,786", "-LRB-", "I", "-RRB-", "Mean1418", ",0951,9091,014801,106", "Max353", ",77452659526588", "Z11293", ",774635870106758", "-LRB-", "II", "-RRB-", "Z2112", "--", "--", "1,818701,770", "Z3n.d", "--", "--", "701n", ".", "d", "--", "Z497", "--", "--", "8541061,342", "Z5161", "--", "--", "90988606Z61396", ",8961,3161,00091651", "Z744820", ",0006,6671,266821,724", "Z81005", ",12854559587877", "Z9n.d", "--", "1,3161,274", "n.d1", ",786", "Z1094", "--", "2,5971,360861,439", "Z11994", ",6751,66787758588", "Z1235", "--", "52664526625Detected", "by10/105/128", "/", "1212/1210/1011", "/", "12", "-LRB-", "III", "-RRB-", "Detected", "%", "100426710010092", "-LRB-", "I", "-RRB-", "Minimum", ",", "mean", "and", "maximum", "frequencies", "of", "antigen-specific", "T-cells", "-LRB-", "II", "-RRB-", "Results", "obtained", "from", "the", "individual", "centers", "Z1", "--", "Z12", ".", "All", "frequencies", "are", "indicated", "as", "1", "per", "x", "counted", "CD8", "+", "T-cells", "-LRB-", "III", "-RRB-", "Number", "and", "percentage", "of", "centers", "which", "detected", "a", "given", "reactivity", "in", "donors", "D1", ",", "D2", ",", "D3", "and", "D5", "Eleven", "laboratories", "analyzed", "the", "five", "PBMC", "samples", "for", "the", "presence", "of", "HLA-A", "*", "0201-restricted", "CMV-specific", "and", "influenza-specific", "IFNγ-producing", "T-cells", "by", "ELISPOT", "assay", ".", "Only", "one", "group", "-LRB-", "Z10", "-RRB-", "used", "an", "intracellular", "cytokine", "staining", "as", "a", "functional", "test", "-LRB-", "data", "not", "shown", "because", "no", "comparison", "with", "other", "groups", "possible", "-RRB-", ".", "Table", "2", "shows", "-LRB-", "I", "-RRB-", "the", "minimum", ",", "mean", "and", "maximum", "frequencies", "of", "antigen-specific", "cells", ",", "-LRB-", "II", "-RRB-", "the", "results", "obtained", "from", "the", "individual", "centers", "Z1", "--", "Z12", ",", "and", "-LRB-", "III", "-RRB-", "the", "number", "and", "percentage", "of", "centers", "that", "detected", "each", "reactivity", ".", "As", "described", "in", "the", "``", "Materials", "and", "methods", "''", ",", "results", "of", "spot-forming", "cells", "per", "seeded", "PBMC", "were", "accepted", "as", "a", "positive", "reaction", "only", "when", "passing", "statistical", "testing", "and", "when", "the", "number", "of", "antigen-specific", "spots", "exceeded", "the", "number", "of", "spots", "in", "the", "background", "wells", "by", "at", "least", "a", "factor", "of", "two", ".", "IFNγ-producing", "cells", "reactive", "against", "CMV", "were", "detected", "by", "10", "of", "the", "11", "laboratories", "in", "donor", "D1", "-LRB-", "mean", "reactivity", "was", "1", "per", "1,855", "PBMC", "±", "825", "-RRB-", "but", "only", "by", "8", "of", "11", "in", "donor", "D5", "-LRB-", "mean", "reactivity", "was", "1", "per", "4,405", "PBMC", "±", "3,762", "-RRB-", ".", "The", "influenza-specific", "T-cells", "present", "in", "subject", "D3", "were", "detected", "by", "six", "laboratories", ",", "while", "the", "responses", "in", "the", "healthy", "subjects", "with", "markedly", "lower", "numbers", "of", "peripheral", "specific", "T-cells", "-LRB-", "D1", ",", "D2", "and", "D5", "-RRB-", "were", "detected", "by", "three", "laboratories", "only", ".", "Table", "2Overview", "of", "the", "IFNγ", "ELISPOT", "results", "from", "phase", "I/2005", "of", "the", "CIMT", "monitoring", "panelD1", "CMVD1", "FluD2", "FluD3", "FluD5", "CMVD5", "FluMin3", ",06162,50055,55533,33311,42850,000", "-LRB-", "I", "-RRB-", "Mean1", ",85538,14143,58917,5474,40530,811", "Max88810", ",25630,7698,5711,03914,705", "Z11", ",006", "--", "--", "8,571", "--", "--", "-LRB-", "II", "-RRB-", "Z22", ",439", "--", "--", "--", "2,816", "--", "Z31", ",29562,500", "--", "22,7271,41227,727", "Z41", ",312", "--", "--", "10,9091,980", "--", "Z5", "--", "--", "--", "--", "--", "--", "Z6233", "*", "--", "--", "1,960", "*", "253", "*", "--", "Z71", ",89510,25644,44433,33311,42850,000", "Z83", ",061", "--", "--", "--", "6,896", "--", "Z988841", ",66655,55512,1951,03914,705", "Z10NDNDNDNDNDNDZ111", ",769", "--", "30,769", "--", "--", "--", "Z123", ",030", "--", "--", "--", "5,263", "--", "Detected", "by10/113/113", "/", "116/118/113", "/", "11", "-LRB-", "III", "-RRB-", "Detected", "%", "912727557327", "-LRB-", "I", "-RRB-", "Minimum", ",", "mean", "and", "maximum", "frequencies", "of", "antigen-specific", "cells", "-LRB-", "II", "-RRB-", "Results", "obtained", "from", "the", "individual", "centers", "Z1", "--", "Z12", ".", "All", "frequencies", "are", "indicated", "as", "1", "per", "x", "seeded", "PBMC", "except", "for", "Z6", "*", "where", "it", "is", "indicated", "as", "1", "per", "x", "seeded", "CD8", "+", "T-cellsResults", "from", "Z6", "were", "not", "included", "for", "calculation", "of", "the", "mean", "frequency", "of", "antigen-specific", "T-cells", "in", "D1", ",", "D3", "and", "D5", "-LRB-", "III", "-RRB-", "Number", "and", "percentage", "of", "centers", "that", "detected", "a", "given", "response", "in", "donors", "D1", ",", "D2", ",", "D3", "and", "D5ND", "not", "determined", "Subgroup", "analysis", "reveals", "that", "the", "number", "of", "CD8", "+", "T-lymphocytes", "analyzed", "affects", "the", "sensitivity", "of", "the", "tetramer", "staining", "Although", "the", "tetramer", "stainings", "were", "performed", "with", "centrally", "prepared", "reagents", "following", "set", "guidelines", ",", "centers", "were", "left", "free", "to", "select", "several", "parameters", "according", "to", "their", "own", "protocols", ",", "and", "this", "could", "have", "influenced", "the", "test", "results", "-LRB-", "see", "``", "Materials", "and", "methods", "''", "-RRB-", ".", "Most", "of", "the", "participants", "used", "monoclonal", "antibodies", "specific", "for", "CD3", "and", "CD8", "to", "co-stain", "the", "cells", ".", "There", "were", "no", "obvious", "differences", "in", "the", "performance", "of", "the", "centers", "depending", "on", "which", "antibody", "clones", ",", "antibody", "combinations", "or", "cytometer", "were", "used", "-LRB-", "data", "not", "shown", "-RRB-", ".", "There", "was", "a", "high", "degree", "of", "variability", "in", "the", "number", "of", "CD8", "+", "cells", "which", "were", "analyzed", "per", "staining", ",", "ranging", "from", "only", "0.5", "×", "104", "to", "about", "19", "×", "104", "-LRB-", "inter-center", "variation", "-RRB-", ".", "In", "addition", ",", "a", "non-negligible", "intra-center", "variation", "was", "observed", "for", "the", "number", "of", "counted", "CD8", "+", ".", "We", "therefore", "analyzed", "each", "individual", "staining", "independently", "of", "the", "center", "that", "performed", "it", "and", "focused", "on", "the", "number", "of", "CD8", "+", "T-cells", "that", "had", "been", "counted", ".", "For", "the", "six", "different", "antigen-specific", "populations", "detectable", ",", "a", "total", "of", "68", "tests", "was", "performed", "by", "the", "group", "-LRB-", "see", "Table", "1", "-RRB-", ".", "Overall", ",", "antigen-specific", "T-cell", "reactivities", "were", "reported", "in", "82", "%", "of", "the", "tests", "-LRB-", "56/68", ",", "mean", "of", "duplicate", "stainings", "-RRB-", ".", "When", "less", "than", "30,000", "CD8", "+", "T-cells", "were", "counted", ",", "only", "70", "%", "of", "all", "responses", "were", "found", ".", "In", "contrast", ",", "89", "%", "of", "all", "responses", "were", "manifest", "when", "more", "than", "30,000", "CD8", "+", "T-cells", "were", "counted", "-LRB-", "Fig.", "2a", "-RRB-", ".", "When", "antigen-specific", "T-cells", "were", "present", "at", "high", "frequency", ",", "the", "number", "of", "cells", "counted", "did", "not", "influence", "the", "result", ",", "because", "CMV-specific", "T-cells", "from", "donors", "D1", "and", "D5", "were", "detected", "irrespective", "of", "the", "number", "of", "CD8", "+", "T-cells", "in", "the", "test", ".", "However", ",", "for", "the", "influenza-specific", "cells", ",", "positivity", "was", "registered", "in", "only", "75", "%", "of", "all", "tests", "performed", "-LRB-", "36", "of", "48", "tests", "-RRB-", ".", "Strikingly", ",", "we", "observed", "a", "marked", "difference", "for", "the", "results", "derived", "from", "those", "tests", "involving", "less", "than", "30,000", "CD8", "+", "T-cells", "-LRB-", "56", "%", "success", "in", "detection", "-RRB-", "as", "compared", "to", "tests", "performed", "with", "more", "than", "30,000", "CD8", "+", "T-cells", "-LRB-", "84", "%", "-RRB-", ".", "Fig.", "2a", "Subgroup", "analysis", "of", "tetramer", "results", "from", "phase", "I/2005", ".", "Bars", "indicate", "the", "percentage", "of", "positives", "that", "could", "be", "detected", "by", "tetramer", "staining", ".", "The", "first", "group", "of", "bars", "shows", "the", "results", "for", "all", "of", "the", "six", "detectable", "positives", ",", "the", "second", "group", "shows", "results", "from", "stainings", "with", "the", "CMV-tetramer", "and", "the", "third", "group", "of", "columns", "shows", "results", "from", "stainings", "with", "the", "influenza-tetramer", ".", "The", "open", "bars", "in", "each", "group", "represent", "all", "tests", "performed", ",", "grey", "bars", "represent", "results", "obtained", "in", "tests", "that", "were", "performed", "on", "more", "than", "3", "×", "104", "CD8", "+", "T-cells", "and", "black", "bars", "represent", "results", "obtained", "in", "tests", "that", "were", "performed", "on", "less", "than", "3", "×", "104", "CD8", "+", "T-cells", ".", "The", "boxes", "within", "each", "bar", "indicate", "the", "fraction", "of", "tests", "with", "a", "positive", "result", ".", "The", "asterisk", "indicates", "a", "P-value", "<", "0.05", "by", "Chi-square", "analysis", ".", "b", "Subgroup", "analysis", "of", "ELISPOT", "results", "from", "phase", "I/2005", ".", "The", "bars", "indicate", "the", "percentage", "of", "positive", "reactivities", "detected", "by", "IFNγ", "ELISPOT", "assays", ".", "The", "open", "bar", "shows", "the", "percentage", "of", "all", "reactivities", "detected", "by", "all", "11", "centers", "that", "performed", "the", "ELISPOT", "assay", "as", "the", "functional", "test", ".", "Criteria", "for", "division", "of", "centers", "into", "two", "subgroups", "were", "based", "on", "the", "following", "requirements", ":", "do", "not", "use", "allo-APC", "-LRB-", "first", "subgroup", "analysis", "-RRB-", ",", "use", "a", "resting", "time", "-LRB-", "second", "subgroup", "analysis", "-RRB-", "or", "use", "equal", "or", "more", "than", "400,000", "PBMC", "per", "well", "-LRB-", "third", "subgroup", "analysis", "-RRB-", ".", "Grey", "bars", "always", "represent", "centers", "that", "were", "in", "conformity", "with", "the", "indicated", "minimum", "requirement", ",", "black", "bars", "show", "results", "from", "centers", "that", "did", "not", "fulfil", "that", "requirement", ".", "The", "boxes", "within", "each", "column", "indicate", "the", "fraction", "of", "centers", "in", "each", "category", ".", "The", "asterisks", "indicate", "a", "P-value", "<", "0.05", "in", "Chi-square", "analysis", "In", "conclusion", ",", "the", "ability", "to", "detect", "antigen-specific", "T-cell", "reactivities", "by", "tetramer", "staining", "was", "mainly", "affected", "by", "the", "number", "of", "CD8", "+", "T-cells", "stained", "and", "analyzed", ",", "especially", "when", "the", "antigen-specific", "T-cells", "were", "present", "at", "low", "or", "moderate", "frequencies", ".", "We", "therefore", "modified", "our", "guidelines", "for", "the", "tetramer", "assay", "and", "recommended", "staining", "at", "least", "1", "×", "106", "PBMC", "and", "analyzing", "all", "cells", "in", "the", "tube", ".", "In", "addition", ",", "we", "provided", "an", "example", "of", "how", "optimal", "cell", "gates", "and", "dot-plot", "quadrants", "could", "be", "selected", ".", "ELISPOT", "assays", "are", "heterogeneous", "and", "require", "standardization", "The", "ELISPOT", "analyses", "were", "performed", "according", "to", "11", "more", "or", "less", "different", "protocols", ".", "The", "most", "discernible", "differences", "that", "were", "observed", "in", "these", "protocols", "concerned", "-LRB-", "1", "-RRB-", "the", "different", "types", "of", "multi-screen", "plates", ",", "-LRB-", "2", "-RRB-", "the", "serum", "origin", ",", "-LRB-", "3", "-RRB-", "the", "use", "of", "duplicates", ",", "triplicates", "or", "quadruplicates", ",", "-LRB-", "4", "-RRB-", "the", "use", "of", "allogeneic", "APC", ",", "-LRB-", "5", "-RRB-", "the", "inclusion", "of", "a", "resting", "phase", "after", "thawing", "the", "PBMC", ",", "-LRB-", "6", "-RRB-", "the", "number", "of", "PBMC", "per", "well", ",", "-LRB-", "7", "-RRB-", "the", "type", "of", "antibodies", "used", ",", "-LRB-", "8", "-RRB-", "the", "type", "of", "spot-reader", ",", "and", "the", "-LRB-", "9", "-RRB-", "enzyme", "and", "substrate", "for", "staining", "of", "the", "spots", ".", "Each", "center", "also", "used", "a", "different", "plate", "protocol", "-LRB-", "distribution", "of", "the", "wells", ",", "number", "of", "replicates", ",", "control", "tests", "-RRB-", ".", "The", "influence", "of", "each", "of", "these", "parameters", "on", "the", "number", "of", "positive", "responses", "was", "studied", "by", "further", "analysis", "in", "which", "the", "laboratories", "were", "divided", "into", "two", "subgroups", ".", "As", "a", "result", ",", "several", "criteria", "were", "identified", "which", "could", "help", "to", "improve", "the", "sensitivity", "and", "comparability", "of", "detection", ".", "All", "data", "sets", "-LRB-", "duplicates", ",", "triplicates", "or", "quadruplicates", "-RRB-", "were", "first", "analyzed", "by", "Student", "t", "test", "for", "unpaired", "samples", "-LRB-", "``", "Materials", "and", "methods", "''", "-RRB-", ".", "In", "our", "panel", ",", "one", "center", "used", "quadruplicates", ",", "nine", "centers", "used", "triplicates", "and", "one", "center", "performed", "the", "ELISPOT", "analysis", "in", "duplicates", ".", "Due", "to", "the", "variety", "in", "the", "replicates", ",", "responses", "measured", "by", "duplicate", "wells", "failed", "to", "pass", "the", "Student", "t", "test", "more", "often", "as", "compared", "to", "triplicates", ".", "Overall", ",", "the", "11", "centers", "were", "able", "to", "detect", "50", "%", "of", "all", "possible", "reactivities", "in", "this", "panel", "phase", "-LRB-", "Table", "2", ";", "Fig.", "2b", "-RRB-", ".", "In", "a", "subgroup", "of", "three", "laboratories", "-LRB-", "Z5", ",", "Z6", "and", "Z8", "-RRB-", ",", "an", "allogeneic", "APC", "population", "-LRB-", "T2", "or", "K562-A", "*", "0201", "cells", "-RRB-", "was", "added", "for", "binding", "and", "presentation", "of", "the", "synthetic", "peptides", ".", "The", "three", "centers", "that", "used", "allo-APC", "detected", "only", "28", "%", "of", "all", "responses", ",", "while", "the", "other", "centers", "detected", "58", "%", "of", "all", "responses", ".", "In", "five", "laboratories", "-LRB-", "Z3", ",", "Z4", ",", "Z7", ",", "Z8", ",", "and", "Z9", "-RRB-", "PBMC", "were", "thawed", ",", "and", "then", "incubated", "in", "culture", "medium", "at", "37", "°C", ".", "After", "this", "resting", "phase", "of", "2", "--", "20", "h", ",", "living", "cells", "were", "washed", ",", "counted", "and", "seeded", "into", "ELISPOT", "plates", ".", "Laboratories", "using", "a", "resting", "phase", "detected", "73", "%", "of", "the", "positive", "reactivities", "-LRB-", "22", "out", "of", "30", "potentially", "positive", "tests", "-RRB-", ".", "No", "significant", "difference", "in", "the", "ability", "to", "detect", "antigen-specific", "T", "cells", "was", "found", "using", "shorter", "or", "longer", "resting-times", ".", "In", "contrast", ",", "the", "laboratories", "that", "did", "not", "use", "a", "resting", "procedure", "detected", "only", "30", "%", "of", "all", "positives", "-LRB-", "Fig.", "2b", "-RRB-", ".", "Finally", ",", "the", "number", "of", "cells", "seeded", "per", "well", "differed", "considerably", "between", "all", "participants", "and", "ranged", "from", "1", "to", "6", "×", "105", "PBMC", ".", "We", "divided", "the", "laboratories", "arbitrarily", "into", "two", "groups", ",", "those", "using", "either", "more", "than", "4", "×", "105", "PBMC", "-LRB-", "Z4", ",", "Z7", ",", "Z8", ",", "and", "Z9", "-RRB-", "or", "less", "than", "4", "×", "105", "PBMC", "-LRB-", "Z1", ",", "Z2", ",", "Z3", ",", "Z11", "and", "Z12", "-RRB-", ".", "The", "first", "group", "detected", "71", "%", "of", "all", "positive", "samples", ",", "whereas", "the", "second", "group", "was", "able", "to", "detect", "only", "43", "%", "of", "all", "positives", "-LRB-", "Fig.", "2b", "-RRB-", ".", "Centers", "Z5", "and", "Z6", "used", "a", "defined", "number", "of", "separated", "CD8", "+", "T-cells", "in", "the", "ELISPOT", "and", "were", "therefore", "not", "included", "in", "this", "subgroup", "analysis", ".", "None", "other", "of", "the", "nine", "depicted", "protocol", "variables", "had", "any", "obvious", "impact", "on", "the", "detection", "of", "specific", "T-cells", ".", "As", "a", "conclusion", "from", "these", "results", ",", "four", "minimum", "requirements", "were", "formulated", "for", "the", "ELISPOT", "protocol", ":", "-LRB-", "1", "-RRB-", "perform", "triplicates", "for", "each", "test", "antigen", "-LRB-", "2", "-RRB-", "do", "not", "use", "allo-APC", "-LRB-", "3", "-RRB-", "add", "a", "resting", "time", "to", "increase", "the", "proportion", "of", "living", "cells", "seeded", "and", "-LRB-", "4", "-RRB-", "use", "a", "minimum", "number", "of", "4", "×", "105", "PBMC", "per", "well", ".", "Phase", "II/2006", "of", "the", "interlaboratory", "testing", "project", "--", "general", "aspects", "To", "formally", "prove", "that", "the", "requirements", "formulated", "for", "tetramer", "staining", "and", "ELISPOT", "analysis", "increase", "the", "ability", "of", "the", "participants", "to", "detect", "antigen-specific", "CD8", "+", "T-cells", "and", "reduce", "the", "inter-center", "variability", ",", "we", "decided", "to", "repeat", "the", "analysis", "in", "a", "second", "phase", "of", "the", "panel", ",", "with", "the", "same", "participants", "-LRB-", "phase", "II/2006", "-RRB-", ".", "In", "this", "round", ",", "all", "groups", "were", "asked", "to", "follow", "our", "modified", "guidelines", "for", "the", "tetramer", "-", "and", "the", "ELISPOT-assays", ".", "Again", ",", "all", "PBMC", "samples", "were", "prepared", "and", "pre-tested", "in", "one", "central", "lab", "and", "peptide", "antigens", "and", "PE-conjugated", "tetramers", "were", "also", "provided", "from", "one", "source", ".", "As", "one", "investigator", "had", "meanwhile", "moved", "to", "another", "lab", ",", "we", "added", "a", "13th", "center", "to", "the", "group", ".", "PBMC", "from", "seven", "selected", "healthy", "HLA-A", "*", "0201-positive", "donors", "and", "1", "HLA-A", "*", "0201-negative", "donor", "-LRB-", "D3", "-RRB-", "were", "required", "to", "be", "analyzed", "for", "the", "presence", "of", "HLA-A", "*", "0201-restricted", "CMV-specific", "T", "cells", "and", "for", "influenza-specific", "T-cells", ".", "The", "mean", "number", "of", "recovered", "cells", "after", "thawing", "was", "sufficient", "to", "perform", "the", "tests", ".", "When", "all", "the", "data", "were", "combined", ",", "it", "became", "clear", "that", "subjects", "D2", ",", "D5", "and", "D8", "possessed", "CMV-specific", "CD8", "+", "T-cell", "subsets", ",", "and", "D1", ",", "D2", ",", "D4", ",", "D6", "and", "D7", "possessed", "influenza-specific", "CD8", "+", "T-cells", ".", "Therefore", ",", "each", "laboratory", "could", "theoretically", "have", "measured", "eight", "positives", "-LRB-", "3", "×", "CMV", "and", "5", "×", "Influenza", "-RRB-", "in", "this", "second", "phase", ".", "Analysis", "of", "CD8", "+", "T-cell", "tetramer", "binding", "using", "the", "new", "guidelines", "In", "the", "second", "phase", ",", "a", "total", "of", "104", "tests", "were", "performed", "to", "detect", "the", "eight", "possible", "tetramer", "reactivities", ".", "Following", "the", "modified", "guidelines", "for", "tetramer", "staining", ",", "the", "mean", "number", "of", "CD8", "+", "T-cells", "that", "were", "counted", "in", "each", "separate", "test", "increased", "markedly", "-LRB-", "+36", "%", "-RRB-", ":", "a", "mean", "of", "about", "49,000", "CD8", "+", "cells", "were", "analyzed", "in", "the", "phase", "I", "-LRB-", "n", "=", "68", "tests", "-RRB-", "and", "a", "mean", "of", "67,000", "CD8", "+", "T-cells", "in", "phase", "II", "-LRB-", "n", "=", "104", "tests", "-RRB-", ".", "The", "number", "of", "cells", "per", "test", "ranged", "from", "12,000", "to", "467,000", "CD8", "+", ".", "In", "81", "%", "-LRB-", "84", "of", "104", "-RRB-", "of", "the", "tests", ">", "30,000", "CD8", "+", "were", "counted", "-LRB-", "compared", "to", "66", "%", "of", "all", "relevant", "tests", "in", "the", "first", "phase", "-RRB-", ".", "Table", "3", "shows", "-LRB-", "I", "-RRB-", "the", "minimum", ",", "mean", "and", "maximum", "frequencies", "of", "antigen-specific", "T-cells", ",", "-LRB-", "II", "-RRB-", "the", "results", "obtained", "from", "the", "individual", "centers", "Z1", "--", "Z13", ",", "and", "-LRB-", "III", "-RRB-", "the", "number", "and", "percentage", "of", "centers", "that", "detected", "each", "T-cell", "specificity", ".", "Donors", "D2", ",", "D5", "and", "D8", "showed", "very", "strong", "reactivities", "with", "the", "CMV-tetramer", ",", "with", "mean", "frequencies", "of", "1/45", "CD8", "+", "T-cells", ",", "1/37", "CD8", "+", "T-cells", ",", "and", "1/19", "CD8", "+", "T-cells", ",", "respectively", ".", "All", "13", "laboratories", "were", "able", "to", "detect", "these", "populations", "-LRB-", "Table", "3", "-RRB-", ".", "All", "but", "one", "center", "detected", "the", "influenza-specific", "cells", "present", "at", "high", "frequencies", "in", "donors", "D6", "-LRB-", "1/1116", "CD8", "+", "T-cells", "-RRB-", "and", "D7", "-LRB-", "1/347", "CD8", "+", "T-cells", "-RRB-", ".", "Donors", "D1", ",", "D2", "and", "D4", "possessed", "fewer", "specific", "cells", "-LRB-", "1/3", ",739", ",", "1/3", ",573", "and", "1/5", ",278", "CD8", "+", "T-cells", "-RRB-", "which", "were", "found", "by", "12", ",", "9", "and", "9", "centers", ",", "respectively", ".", "Three", "laboratories", "also", "reported", "influenza", "tetramer-binding", "CD8", "+", "cells", "in", "D5", "or", "D8", ".", "According", "to", "the", "results", "of", "the", "other", "centers", "as", "well", "as", "from", "the", "ELISPOT", "-LRB-", "see", "below", "-RRB-", ",", "these", "stainings", "were", "considered", "as", "false", "positive", "-LRB-", "not", "shown", "-RRB-", ".", "One", "center", "-LRB-", "Z13", "-RRB-", "was", "not", "able", "to", "detect", "any", "of", "the", "influenza-specific", "CD8", "+", "T-cell", "reactivities", ".", "Finally", ",", "no", "tetramer", "+", "cells", "were", "described", "in", "the", "HLA-A", "*", "0201-negative", "donor", "-LRB-", "D3", "-RRB-", ".", "Table", "3Overview", "of", "tetramer", "results", "from", "phase", "II/2006", "of", "the", "CIMT", "monitoring", "panelD1", "FluD2", "CMVD2", "FluD4", "FluD5", "CMVD6", "FluD7", "FluD8", "CMVMin7", ",1437710,00010,000603,33386942", "-LRB-", "I", "-RRB-", "Medium3", ",739453,5735,278371,11634719", "Max1", ",538281,2502,500305712028", "Z13", ",333", "453,3335,0003976929410", "-LRB-", "II", "-RRB-", "Z24", ",000303,3335,000301,10025021", "Z34", ",00047", "--", "5,0004558827020", "Z41", ",538712,8576,6663376926342", "Z56", ",666542,500", "--", "431,42837724", "Z65", ",00077", "--", "10,000601,66686927", "Z72", ",857473,3336,6663883329022", "Z82", ",000353,3333,333316662448", "Z93", ",3333110,0003,333323,33362520", "Z103", ",333282,222", "--", "3095220213Z111", ",666361,2502,5003257121515", "Z127", ",41337", "--", "--", "357142608Z13", "--", "53", "--", "--", "34", "--", "--", "20Detected", "by12/1313/139", "/", "139/1313/1312", "/", "1312/1313/13", "-LRB-", "III", "-RRB-", "Detected", "%", "9210069691009292100", "-LRB-", "I", "-RRB-", "Minimum", ",", "mean", "and", "maximum", "frequencies", "of", "antigen-specific", "T-cells", "-LRB-", "II", "-RRB-", "Results", "obtained", "from", "the", "individual", "centers", "Z1", "--", "Z13", ".", "All", "frequencies", "are", "indicated", "as", "1", "per", "x", "counted", "CD8", "+", "T-cells", "-LRB-", "III", "-RRB-", "Number", "and", "percentage", "of", "centers", "that", "detected", "each", "of", "the", "eight", "possible", "responses", "Analysis", "of", "CD8", "+", "T-cell", "responses", "by", "ELISPOT", "following", "the", "introduction", "of", "a", "set", "of", "four", "rules", "In", "this", "second", "phase", ",", "all", "laboratories", "performed", "ELISPOT", "analysis", "following", "local", "protocols", ",", "all", "of", "which", "conformed", "to", "the", "newly", "introduced", "minimum", "requirements", ".", "Table", "4", "shows", "-LRB-", "I", "-RRB-", "the", "minimum", ",", "mean", "and", "maximum", "frequencies", "of", "antigen-specific", "cells", ",", "-LRB-", "II", "-RRB-", "the", "results", "obtained", "from", "the", "individual", "centers", "Z1", "--", "Z13", ",", "and", "-LRB-", "III", "-RRB-", "the", "number", "and", "percentage", "of", "centers", "that", "detected", "the", "response", ".", "High", "frequency", "T-cell", "responses", "against", "CMV", "could", "readily", "be", "detected", "by", "all", "13", "centers", "in", "donors", "D5", "and", "D8", "and", "by", "12", "of", "13", "in", "donor", "D2", ".", "Failure", "of", "center", "Z4", "to", "detect", "the", "CMV", "reactivity", "in", "donor", "D2", "was", "due", "to", "a", "very", "high", "background", "of", "the", "medium", "control", ".", "The", "number", "of", "spots", "representing", "IFNγ-producing", "cells", "after", "influenza-peptide", "stimulation", "was", "generally", "lower", ",", "and", "consequently", ",", "the", "influenza-specific", "T-cell", "responses", "in", "subjects", "D1", ",", "D2", ",", "D4", "and", "D6", "were", "detected", "by", "fewer", "laboratories", "-LRB-", "four", "centers", "for", "D1", ",", "three", "centers", "for", "D2", ",", "two", "centers", "for", "D4", "and", "ten", "centers", "for", "D6", "-RRB-", ".", "The", "high", "numbers", "of", "influenza-specific", "T-cells", "present", "in", "D7", "were", "detected", "by", "all", "13", "laboratories", "-LRB-", "Table", "4", "-RRB-", ".", "Table", "4Overview", "of", "IFNγ", "ELISPOT", "results", "from", "phase", "II/2006", "of", "the", "CIMT", "monitoring", "panelD1", "FluD2", "CMVD2", "FluD4", "FluD5", "CMVD6", "FluD7", "FluD8", "CMVMin44", ",1181,79133,80358,8241,74548,38714,7201,698", "-LRB-", "I", "-RRB-", "Medium28", ",8231,08816,39549,96099914,2654,6691,023", "Max10", ",3453961,23141,0963914,4581,706269", "Z144", ",118596", "--", "--", "59648,38714,720318", "-LRB-", "II", "-RRB-", "Z2", "--", "1,732", "--", "--", "1,7454,7392,2221,698", "Z3", "--", "1,333", "--", "--", "1,117", "--", "2,9821,292", "Z4", "--", "--", "--", "--", "774", "--", "2,273447", "Z5", "--", "997", "--", "--", "1,15717,6473,8271,209", "Z610", ",3451,03114,151", "--", "1,006", "--", "1,7061,005", "Z7", "--", "1,317", "--", "--", "1,06110,0006,0001,661", "Z832", ",258396", "--", "58,8243914,4583,623269", "Z928", ",571966", "--", "41,09691214,4238,9551,081", "Z10", "--", "8471,231", "--", "8067,4263,052696", "Z11", "--", "1,04433,803", "--", "1,08720,3393,6701,273", "Z12", "--", "1,791", "--", "--", "1,38710,6193,0571,583", "Z13", "--", "1,008", "--", "--", "9494,6154,615770", "Detected", "by4/1312/133", "/", "132/1313/1310", "/", "1313/1313/13", "-LRB-", "III", "-RRB-", "Detected", "%", "3192231510077100100", "-LRB-", "I", "-RRB-", "Minimum", ",", "mean", "and", "maximum", "frequencies", "of", "antigen-specific", "cells", "-LRB-", "II", "-RRB-", "Results", "obtained", "from", "the", "individual", "centers", "Z1", "--", "Z13", ".", "All", "frequencies", "are", "indicated", "as", "1", "per", "x", "seeded", "PBMC", "-LRB-", "III", "-RRB-", "Number", "and", "percentage", "of", "centers", "that", "detected", "each", "of", "the", "eight", "possible", "responses", "Comparison", "of", "the", "results", "obtained", "in", "both", "phases", "When", "the", "mean", "frequencies", "of", "all", "T-cell", "responses", "in", "both", "testing", "rounds", "were", "compared", ",", "it", "became", "clear", "that", "there", "was", "a", "difference", "in", "the", "distribution", "of", "reactivities", "-LRB-", "Fig.", "3", "-RRB-", ".", "In", "the", "tetramer", "assay", ",", "the", "mean", "T-cell", "frequency", "of", "the", "six", "possible", "positives", "in", "the", "first", "phase", "was", "1", "per", "2,083", "CD8", "+", "T-cells", ".", "This", "value", "was", "1", "per", "1,769", "CD8", "+", "T-cells", "for", "the", "eight", "possible", "positives", "in", "the", "second", "phase", ".", "Similarly", ",", "the", "mean", "T-cell", "frequency", "of", "the", "responses", "detected", "in", "IFNγ", "ELISPOT", "was", "1", "per", "22,369", "PBMC", "for", "Phase", "I/2005", "but", "1", "per", "14,653", "PBMC", "for", "Phase", "II/2006", ".", "To", "allow", "a", "comparison", "of", "the", "overall", "performance", "in", "both", "phases", "of", "the", "panel", ",", "we", "therefore", "decided", "to", "define", "theoretical", "thresholds", "for", "high", ",", "moderate", "and", "low", "T-cell", "responses", "and", "then", "to", "compare", "data", "of", "the", "participating", "laboratories", "within", "these", "groups", ".", "Fig.", "3Distribution", "of", "antigen-specific", "T-cell", "frequencies", "in", "the", "two", "testing", "phases", "as", "obtained", "by", "tetramer", "staining", "-LRB-", "a", "-RRB-", "and", "IFNγ", "ELISPOT", "assays", "-LRB-", "b", "-RRB-", ".", "The", "figure", "shows", "the", "six", "reactivities", "-LRB-", "filled", "circle", "-RRB-", "and", "the", "calculated", "mean", "of", "all", "reactivities", "from", "phase", "I/2005", "-LRB-", "filled", "line", "-RRB-", "as", "well", "as", "the", "eight", "reactivities", "-LRB-", "open", "circle", "-RRB-", "and", "calculated", "mean", "of", "all", "reactivities", "from", "phase", "II/2006", "-LRB-", "open", "line", "-RRB-", ".", "The", "frequency", "of", "antigen-specific", "T-cells", "is", "indicated", "on", "the", "y-axis", "as", "1", "per", "x", "counted", "CD8", "+", "T-cells", "for", "the", "tetramer", "test", "and", "as", "1", "per", "x", "seeded", "PBMC", "for", "the", "ELISPOT", "assay", "In", "order", "to", "define", "such", "thresholds", "for", "low", ",", "medium", "and", "high", "T-cell", "responses", ",", "we", "first", "displayed", "the", "probability", "of", "detecting", "each", "of", "the", "14", "different", "reactivities", "as", "a", "value", "in", "a", "coordinate", "system", "and", "inserted", "a", "trendline", ".", "For", "both", "the", "tetramer", "assay", "and", "the", "ELISPOT", "assay", ",", "we", "observed", "a", "clear", "correlation", "between", "the", "frequencies", "of", "antigen-specific", "T-cells", "and", "the", "number", "of", "participating", "centers", "that", "were", "able", "to", "detect", "these", "populations", ".", "We", "then", "calculated", "the", "theoretical", "frequencies", "at", "which", "90", "%", "-LRB-", "y", "=", "90", "-RRB-", "and", "50", "%", "-LRB-", "y", "=", "50", "-RRB-", "of", "all", "participants", "could", "detect", "a", "given", "response", "-LRB-", "Fig.", "4a", ",", "b", "-RRB-", "and", "used", "these", "two", "thresholds", "to", "divide", "all", "reactivities", "into", "three", "distinct", "classes", "of", "T-cell", "responses", "-LRB-", "``", "high", "''", ",", "``", "moderate", "''", "and", "``", "low", "''", "-RRB-", ".", "Fig.", "4Probability", "of", "detecting", "a", "reactivity", "by", "a", "tetramer", "staining", ",", "or", "b", "IFNγ", "ELISPOT", "assay", ".", "A", "trendline", "was", "inserted", "on", "the", "basis", "of", "results", "from", "all", "14", "reactivities", "from", "both", "phases", "of", "the", "panel", ".", "The", "figure", "shows", "the", "six", "reactivities", "from", "phase", "I/2005", "-LRB-", "filled", "squares", "-RRB-", "and", "the", "eight", "reactivities", "from", "phase", "II/2006", "-LRB-", "open", "squares", "-RRB-", ".", "The", "frequency", "of", "antigen-specific", "T-cells", "is", "shown", "on", "the", "x-axis", "in", "1", "per", "x", "counted", "CD8", "+", "T-cells", "for", "the", "tetramer", "assay", "-LRB-", "a", "-RRB-", "or", "1", "per", "x", "seeded", "PBMC", "for", "the", "ELISPOT", "assay", "-LRB-", "b", "-RRB-", ".", "X-values", "for", "y", "=", "90", "%", "and", "y", "=", "50", "%", "are", "indicated", "by", "the", "broken", "lines", "For", "the", "tetramer", "assay", ",", "T-cell", "frequencies", "exceeding", "1", "per", "1,200", "CD8", "+", "T-cells", "were", "therefore", "classified", "as", "``", "high", "''", ",", "whereas", "frequencies", "of", "less", "than", "1", "per", "7,650", "CD8", "+", "were", "classified", "as", "``", "low", "''", "-LRB-", "Fig.", "4a", "-RRB-", ".", "Following", "the", "same", "rules", "for", "the", "ELISPOT", "assay", ",", "T-cell", "responses", "of", "at", "least", "one", "IFNγ", "spot", "per", "2,850", "PBMC", "can", "be", "considered", "as", "``", "high", "''", "and", "T-cell", "responses", "of", "less", "than", "one", "spot", "per", "19,000", "PBMC", "as", "``", "low", "''", "-LRB-", "Fig.", "4b", "-RRB-", ".", "With", "these", "calculated", "assay-specific", "thresholds", "for", "high", ",", "moderate", "and", "low", "T-cell", "responses", ",", "we", "compared", "the", "results", "obtained", "in", "the", "two", "phases", ".", "For", "the", "tetramer", "assay", ",", "the", "ability", "to", "detect", "high", "frequency", "T-cells", "-LRB-", ">", "1", "per", "1,200", "CD8", "+", "-RRB-", "did", "not", "differ", "in", "the", "two", "phases", ",", "and", "was", "not", "influenced", "by", "the", "number", "of", "CD8", "+", "analyzed", ",", "as", "previously", "seen", "for", "each", "of", "the", "two", "phases", "separately", "-LRB-", "Fig.", "5a", "-RRB-", ".", "However", ",", "for", "moderate", "and", "low", "T-cell", "frequencies", ",", "we", "found", "that", "they", "could", "be", "successfully", "detected", "in", "only", "54", "%", "of", "cases", "in", "the", "first", "phase", "but", "this", "improved", "to", "77", "%", "in", "the", "second", "phase", ".", "Moreover", ",", "here", ",", "the", "number", "of", "cells", "counted", "did", "have", "an", "impact", "on", "the", "ability", "to", "detect", "low", "frequency", "T-cells", ".", "In", "the", "first", "phase", ",", "only", "14", "%", "were", "detected", "when", "less", "than", "30,000", "CD8", "+", "were", "counted", ",", "as", "compared", "to", "71", "%", "when", "more", "than", "30,000", "CD8", "+", "T-cells", "were", "counted", ".", "The", "same", "trend", "was", "observed", "in", "phase", "II/2006", ",", "but", "in", "this", "case", "40", "%", "of", "assays", "with", "less", "than", "30,000", "CD8", "+", "successfully", "detected", "the", "moderate", "to", "low", "T-cell", "frequencies", "compared", "to", "83", "%", "counting", "more", "than", "30,000", "CD8", "+", "-LRB-", "Fig.", "5a", "-RRB-", ".", "Fig.", "5a", "Percentage", "of", "reactivities", "actually", "detected", "by", "tetramer", "staining", ".", "The", "first", "two", "groups", "of", "bars", "show", "the", "detection", "rate", "for", "the", "nine", "high", "reactivities", "-LRB-", ">", "1", "per", "1,200", "CD8", "+", "T-cells", "-RRB-", "in", "phase", "I/2005", "and", "phase", "II/2006", ".", "The", "next", "two", "groups", "of", "bars", "show", "the", "detection", "rate", "for", "five", "moderate", "to", "low", "reactivities", "-LRB-", "<", "1", "per", "1,200", "CD8", "+", "-RRB-", "in", "phase", "I/2005", "-LRB-", "third", "group", "-RRB-", "or", "phase", "II/2006", "-LRB-", "fourth", "group", "-RRB-", ".", "The", "open", "bars", "represent", "all", "tests", "performed", ",", "grey", "bars", "represent", "results", "obtained", "in", "tests", "that", "were", "performed", "on", "more", "than", "3", "×", "104", "CD8", "+", "T-cells", "and", "filled", "bars", "represent", "results", "obtained", "in", "tests", "that", "were", "performed", "on", "less", "than", "3", "×", "104", "CD8", "+", "T-cells", ".", "b", "Percentage", "of", "reactivities", "detected", "in", "IFNγ", "ELISPOT", "assays", ".", "The", "first", "two", "groups", "of", "bars", "show", "the", "rate", "of", "detection", "of", "the", "four", "high", "reactivities", "-LRB-", ">", "1", "per", "2,850", "PBMC", "in", "phase", "I/2005", "and", "phase", "II/2006", ".", "The", "next", "two", "groups", "of", "columns", "show", "the", "rate", "of", "detection", "for", "the", "ten", "moderate", "to", "low", "reactivities", "-LRB-", "<", "1", "per", "2,850", "PBMC", "-RRB-", "in", "phase", "I/2005", "and", "phase", "II/2006", ".", "The", "open", "bars", "represent", "the", "performances", "of", "all", "centers", "in", "the", "respective", "panel", "phase", ",", "grey", "bars", "represent", "results", "obtained", "from", "the", "five", "centers", "that", "already", "fulfilled", "at", "least", "three", "of", "the", "four", "minimum", "criteria", "in", "phase", "I/2005", "and", "filled", "bars", "represent", "results", "obtained", "from", "centers", "that", "fulfilled", "less", "than", "three", "of", "the", "four", "minimum", "criteria", "in", "phase", "I/2005", "We", "then", "analyzed", "the", "capacity", "of", "the", "laboratories", "to", "measure", "either", "high", "T-cell", "responses", "-LRB-", ">", "1", "per", "2,850", "PBMC", "-RRB-", "or", "low", "to", "moderate", "T-cell", "responses", "-LRB-", "<", "1", "per", "2,850", "PBMC", "-RRB-", "in", "the", "ELISPOT", "assay", ".", "This", "analysis", "was", "performed", "for", "two", "defined", "subgroups", "of", "participants", ".", "The", "first", "subgroup", "included", "those", "five", "centers", "-LRB-", "Z3", ",", "Z4", ",", "Z7", ",", "Z8", "and", "Z9", "-RRB-", "that", "already", "fulfilled", "three", "or", "four", "of", "the", "requirements", "in", "the", "first", "phase", "of", "the", "panel", ".", "These", "five", "centers", "did", "not", "have", "to", "introduce", "any", "change", "or", "at", "least", "no", "major", "changes", "to", "their", "protocol", "for", "the", "repetition", "of", "the", "experiments", "in", "phase", "II", ".", "The", "second", "subgroup", "included", "the", "new", "center", "Z13", "-LRB-", "led", "by", "a", "colleague", "that", "had", "been", "in", "a", "laboratory", "that", "only", "fulfilled", "one", "of", "four", "requirements", "in", "phase", "I", "-RRB-", "and", "all", "others", "that", "had", "fulfilled", "only", "one", "or", "two", "of", "the", "four", "requirements", "in", "the", "first", "phase", ".", "All", "laboratories", "in", "this", "second", "group", "had", "to", "introduce", "marked", "changes", "to", "their", "locally", "established", "protocols", ".", "Similar", "to", "the", "tetramer", "analysis", ",", "the", "new", "requirements", "were", "not", "necessary", "to", "detect", "antigen-specific", "responses", "among", "the", "category", "of", "high", "T-cell", "frequencies", "in", "either", "the", "first", "or", "second", "phases", "-LRB-", "Fig.", "5b", "-RRB-", ".", "However", ",", "applying", "the", "set", "of", "rules", "defined", "in", "phase", "I", "markedly", "improved", "the", "capacity", "of", "centers", "to", "detect", "the", "low", "to", "moderate", "T-cell", "responses", ".", "The", "first", "subgroup", "detected", "a", "total", "of", "68", "%", "of", "the", "low", "to", "moderate", "reactivities", "in", "phase", "I", ",", "whereas", "the", "second", "subgroup", "detected", "only", "20", "%", "-LRB-", "Fig.", "5b", "-RRB-", ".", "After", "harmonization", "of", "the", "protocols", ",", "both", "subgroups", "performed", "equally", "well", ".", "In", "addition", ",", "the", "inter-group", "variability", "in", "detecting", "positive", "responses", "was", "reduced", "in", "phase", "II", "-LRB-", "percentage", "of", "detected", "responses", "ranged", "from", "38", "to", "88", "%", "with", "a", "mean", "of", "67", "±", "16", "%", "-RRB-", "as", "compared", "to", "phase", "I", "-LRB-", "percentage", "of", "detected", "responses", "ranged", "from", "0", "to", "100", "%", "with", "a", "mean", "of", "55", "±", "33", "%", "-RRB-", ".", "Experience", "does", "not", "equal", "performance", "Among", "the", "13", "centers", "that", "had", "participated", "in", "phase", "II", ",", "tetramer", "stainings", "had", "been", "performed", "for", "1", "--", "8", "years", ".", "Similarly", ",", "the", "experience", "in", "the", "ELISPOT", "technology", "varied", "between", "1", "and", "10", "years", ".", "For", "both", "techniques", ",", "we", "could", "not", "find", "any", "correlation", "between", "the", "years", "of", "experience", "and", "the", "ability", "to", "detect", "T-cell", "responses", ",", "not", "even", "among", "the", "subgroups", "of", "moderate", "or", "low", "T-cell", "responses", "-LRB-", "not", "shown", "-RRB-", ".", "Discussion", "Whenever", "new", "techniques", "are", "introduced", "to", "the", "scientific", "community", ",", "they", "are", "first", "only", "available", "to", "a", "small", "group", "of", "expert", "laboratories", ".", "If", "these", "assays", "are", "robust", "and", "applicable", "for", "specific", "research", "or", "routine", "applications", ",", "they", "spread", "to", "the", "international", "community", ".", "In", "general", ",", "the", "``", "original", "''", "protocol", "then", "undergoes", "several", "adaptations", "in", "order", "to", "meet", "specific", "needs", ".", "On", "the", "one", "hand", ",", "changes", "can", "be", "beneficial", "and", "result", "in", "the", "improvement", "of", "protocols", ".", "On", "the", "other", ",", "this", "evolutionary", "process", "leads", "to", "employment", "of", "many", "different", "protocol", "variants", ",", "limiting", "comparison", "of", "the", "study", "results", "obtained", "by", "different", "laboratories", ".", "Thus", ",", "standardization", "approaches", "should", "be", "omitted", "during", "the", "initial", "development", "but", "are", "absolutely", "required", "when", "assays", "have", "become", "firmly", "established", ".", "In", "recent", "years", ",", "several", "activities", "aiming", "at", "the", "harmonization", "of", "techniques", "used", "to", "monitor", "the", "presence", "of", "antigen-specific", "T-cells", "have", "been", "initiated", "for", "ELISPOT", "-LSB-", "28", "--", "31", "-RSB-", ",", "tetramer", "staining", "-LSB-", "32", "-RSB-", "and", "ICS", "-LSB-", "33", "--", "36", "-RSB-", ".", "While", "these", "studies", "showed", "the", "feasibility", ",", "general", "applicability", "and", "the", "diversity", "of", "performance", "among", "participants", ",", "they", "were", "not", "designed", "to", "either", "systematically", "investigate", "the", "influence", "of", "distinct", "protocol", "variables", "nor", "to", "test", "whether", "changes", "to", "these", "parameters", "can", "lead", "to", "a", "global", "improvement", "of", "the", "group", ".", "The", "CIMT", "monitoring", "panel", "is", "the", "first", "initiative", "that", "has", "now", "introduced", "the", "two-step", "approach", "proposing", "a", "strategy", "where", "technical", "variables", "that", "influence", "the", "performance", "of", "a", "defined", "assay", "are", "first", "systematically", "identified", "-LRB-", "``", "first", "step", "''", "-RRB-", "followed", "by", "a", "new", "testing", "phase", "where", "resultant", "protocol", "changes", "are", "validated", "under", "controlled", "conditions", "within", "the", "same", "group", "of", "investigators", "-LRB-", "``", "second", "step", "''", "-RRB-", ".", "As", "soon", "as", "a", "number", "of", "protocol", "variables", "that", "might", "have", "influenced", "the", "sensitivity", "and", "the", "quality", "of", "the", "tests", "were", "identified", "in", "the", "first", "phase", "of", "our", "study", ",", "it", "was", "decided", "to", "validate", "this", "finding", "in", "a", "second", "phase", ".", "Because", "this", "two-step", "approach", "was", "not", "initially", "foreseen", ",", "the", "second", "phase", "was", "performed", "with", "PBMC", "samples", "obtained", "from", "different", "donors", "than", "those", "used", "in", "the", "first", "round", ".", "The", "distribution", "and", "the", "frequencies", "of", "detectable", "T-cell", "responses", "directed", "against", "the", "chosen", "model", "antigens", "were", "different", "in", "the", "first", "and", "second", "group", "of", "donors", "-LRB-", "Fig.", "3", "-RRB-", "precluding", "a", "direct", "comparison", "of", "the", "results", "obtained", "in", "both", "phases", "of", "the", "panel", ".", "To", "circumvent", "this", "problem", ",", "two", "assay-specific", "frequency", "thresholds", "were", "introduced", "that", "allowed", "us", "to", "distinguish", "classes", "of", "T-cell", "responses", "-LRB-", "low", ",", "moderate", "and", "high", "-RRB-", "-LRB-", "Fig.", "4a", ",", "b", "-RRB-", ".", "Clearly", ",", "high-frequency", "T-cell", "responses", "were", "detected", "irrespective", "of", "the", "protocol", "used", "and", "as", "such", "did", "not", "allow", "the", "identification", "of", "factors", "that", "exert", "a", "strong", "influence", "on", "the", "sensitivity", "and", "variability", "of", "the", "protocols", "used", ".", "Relevant", "parameters", "could", "only", "be", "detected", "when", "the", "comparison", "was", "focused", "on", "the", "detection", "of", "T-cells", "that", "are", "present", "at", "low", "to", "moderate", "frequencies", "in", "PBMC", ".", "This", "finding", "should", "be", "taken", "into", "account", "when", "selecting", "model", "antigens", "for", "use", "in", "monitoring", "panels", "-LSB-", "37", "-RSB-", ",", "in", "particular", "by", "laboratories", "that", "are", "interested", "in", "the", "detection", "of", "peripheral", "tumor-specific", "T-cells", ",", "which", "are", "often", "present", "at", "low", "frequencies", ",", "even", "after", "vaccination", ".", "Although", "our", "experiments", "do", "not", "specifically", "address", "the", "question", "of", "detection", "limits", "for", "the", "ELISPOT", "and", "tetramer", "assays", ",", "we", "could", "detect", "a", "high", "variability", "in", "the", "sensitivity", "of", "protocols", "used", "by", "the", "different", "participants", ".", "The", "majority", "of", "labs", "-LRB-", "y", "=", "90", "%", "-RRB-", "is", "able", "to", "detect", "responses", "with", "a", "frequency", "above", "1", "per", "1,200", "CD8", "+", "T", "cells", "in", "the", "tetramer", "assay", "or", "responses", "with", "a", "frequency", "above", "1", "per", "2,859", "PBMC", "in", "the", "ELISPOT", ".", "Note", "that", "some", "of", "the", "centers", "could", "reliably", "detect", "a", "response", "with", "a", "frequency", "of", "about", "1", "per", "8,000", "CD8", "+", "T", "cells", "in", "the", "tetramer", "assay", "and", "about", "1", "per", "40,000", "PBMC", "in", "the", "ELISPOT", "assay", ".", "These", "low", "frequencies", "are", "in", "the", "range", "of", "that", "is", "commonly", "reported", "as", "the", "detection", "limit", "for", "internally", "validated", "protocols", "for", "both", "technologies", "-LSB-", "39", ",", "40", ",", "own", "unpublished", "observations", "-RSB-", ".", "Another", "important", "task", "of", "standardization", "efforts", "should", "be", "to", "decrease", "the", "variation", "of", "results", "obtained", "in", "a", "group", "of", "several", "laboratories", "down", "to", "the", "stable", "and", "low", "values", "-LRB-", "15", "--", "30", "%", "-RRB-", "that", "can", "be", "reproducibly", "found", "within", "single", "labs", ".", "In", "order", "to", "quantify", "the", "variation", "of", "results", "among", "laboratories", "we", "calculated", "the", "coefficient", "of", "variation", "for", "all", "14", "reactivities", "of", "the", "two", "panel", "phases", ".", "The", "CVs", "were", "determined", "on", "the", "base", "of", "centers", "that", "were", "able", "to", "detect", "the", "respective", "T", "cell", "response", "and", "the", "results", "are", "shown", "in", "supplementary", "Tables", "S1a", ",", "b", ".", "As", "expected", ",", "the", "CVs", "we", "found", "in", "our", "inter-laboratory", "testing", "project", "were", "higher", "than", "those", "reported", "from", "intra-center", "analysis", "-LSB-", "39", ",", "40", "-RSB-", ".", "In", "the", "ELISPOT", "assay", ",", "the", "background", "spot", "numbers", "obtained", "by", "the", "different", "participants", "varied", "greatly", ",", "but", "we", "were", "unable", "to", "correlate", "this", "finding", "to", "a", "distinct", "variable", ".", "Since", "the", "spontaneous", "cytokine", "secretion", "impacts", "significantly", "on", "the", "sensitivity", "of", "this", "assay", ",", "factors", "that", "especially", "influence", "the", "non-specific", "spot", "production", ",", "possibly", "the", "medium", "type", "or", "serum", "source", ",", "will", "need", "to", "be", "systematically", "analyzed", "in", "a", "separate", "study", ".", "The", "main", "conclusions", "from", "our", "study", "have", "been", "drawn", "on", "the", "basis", "of", "subgroup", "analyses", ".", "Although", "the", "CIMT", "panel", "in", "general", "-LRB-", "13", "centers", "in", "this", "initial", "action", "-RRB-", ",", "and", "consequently", "the", "subgroups", "formed", "during", "the", "analysis", "were", "rather", "small", ",", "we", "could", "already", "identify", "statistically", "significant", "differences", "in", "the", "ability", "to", "detect", "positive", "responses", ".", "We", "concluded", "that", "the", "number", "of", "counted", "CD8", "+", "T-cells", "is", "the", "most", "influential", "crucial", "factor", "for", "the", "tetramer", "assay", "and", "that", "the", "combination", "of", "a", "resting-time", "and", "a", "high", "number", "of", "PBMC", "leads", "to", "increased", "sensitivity", "in", "the", "ELISPOT", "assay", ".", "This", "suggests", "that", "the", "impact", "of", "the", "identified", "technical", "variables", "on", "the", "quality", "of", "the", "assays", "is", "high", ".", "In", "order", "to", "identify", "those", "protocol", "variables", "that", "lead", "to", "more", "subtle", "differences", ",", "a", "larger", "group", "of", "participants", "would", "be", "needed", ".", "In", "addition", "to", "the", "systematic", "identification", "of", "variables", "that", "correlate", "with", "sensitivity/insensitivity", "of", "various", "assays", ",", "inter-laboratory", "testing", "projects", "also", "allow", "the", "rapid", "evaluation", "of", "individual", "performance", "among", "a", "group", ".", "Interestingly", ",", "the", "finding", "that", "experienced", "laboratories", "did", "not", "perform", "better", "than", "laboratories", "which", "recently", "applied", "these", "techniques", "strongly", "suggests", "that", "non-optimal", "protocols", ",", "once", "established", "in", "a", "lab", ",", "can", "commonly", "be", "maintained", "for", "several", "years", ".", "Periodic", "comparison", "of", "local", "protocols", "with", "those", "of", "other", "centers", "is", "recommended", ".", "Even", "if", "a", "new", "staff", "member", "uses", "an", "established", "protocol", ",", "it", "is", "recommended", "to", "have", "them", "participate", "in", "inter-laboratory", "testing/teaching", "exercise", ".", "Regular", "participation", "in", "multi-center", "comparisons", "could", "thereby", "help", "to", "optimize", "and", "validate", "participants", "'", "performance", "over", "time", "and", "to", "maintain", "sensitive", "protocols", "or", "minimal", "standards", ".", "This", "is", "of", "great", "importance", "when", "material", "from", "expensive", "clinical", "trials", "has", "to", "be", "analyzed", ".", "All", "data", "from", "the", "CMV-serology", ",", "from", "the", "pre-testing", "experiments", "and", "from", "the", "results", "generated", "by", "the", "participating", "laboratories", "in", "ELISPOT", "and", "tetramer", "staining", "were", "taken", "together", "for", "each", "donor", "in", "order", "to", "qualitatively", "validate", "the", "presence", "of", "CMV", "-", "and", "influenza-specific", "T-cells", ".", "To", "estimate", "the", "quantity", ",", "i.e.", "the", "frequency", "of", "specific", "T-cells", "in", "each", "donor", ",", "we", "calculated", "the", "average", "of", "all", "qualitatively", "positive", "results", ",", "as", "well", "as", "the", "standard", "deviations", ".", "This", "procedure", "constitutes", "only", "an", "approximation", "of", "the", "real", "number", "of", "antigen-specific", "cells", "present", "in", "a", "given", "sample", ",", "and", "can", "not", "be", "taken", "as", "a", "method", "for", "determining", "absolute", "T-cell", "frequencies", ".", "Cell", "samples", "that", "contain", "pre-defined", "numbers", "of", "antigen-specific", "T-cells", "-LRB-", "e.g.", "spiked", "T-cell", "clones", "-RRB-", ",", "especially", "tumor-reactive", "T-cells", ",", "are", "not", "easily", "available", "for", "use", "in", "multi-center", "comparisons", ",", "although", "such", "standard", "samples", "are", "urgently", "needed", ".", "We", "see", "this", "as", "one", "major", "bottle-neck", "for", "the", "optimization", "and", "standardization", "of", "immunomonitoring", "techniques", ".", "Methods", "to", "generate", "such", "standard", "samples", "for", "broader", "use", "will", "therefore", "be", "elucidated", "with", "high", "priority", "in", "the", "near", "future", "for", "the", "next", "phases", "of", "this", "international", "collaboration", ".", "Another", "big", "challenge", "will", "be", "to", "define", "accepted", "rules", "for", "the", "settings", "of", "the", "equipment", "used", "in", "these", "analyses", "-LRB-", "flow", "cytometer", "or", "ELISPOT", "reader", "-RRB-", "in", "order", "to", "uniformly", "process", "and", "analyze", "the", "raw", "data", ".", "Ten", "from", "eleven", "laboratories", "that", "performed", "the", "ELISPOT", "assay", "in", "the", "first", "phase", "used", "an", "ELISPOT", "reader", "for", "spot", "counting", ".", "It", "is", "known", "that", "spot", "counts", "between", "centers", "can", "differ", "significantly", "and", "this", "may", "be", "explained", "by", "the", "use", "of", "different", "reading", "machines", ",", "different", "settings", "for", "the", "same", "type", "of", "machine", "or", "by", "the", "experience", "of", "the", "operator", ".", "Within", "this", "group", ",", "four", "different", "commercially", "available", "reading", "systems", "were", "used", "-LRB-", "supplementary", "Table", "S2", "-RRB-", ".", "We", "were", "not", "able", "to", "identify", "differences", "between", "the", "types", "of", "ELISPOT", "readers", ".", "A", "new", "ELISPOT", "panel", "phase", "is", "currently", "in", "preparation", ",", "that", "will", "specifically", "focus", "on", "the", "performances", "of", "different", "ELISPOT", "readers", "and", "try", "to", "introduce", "tools", "to", "control", "inter", "center", "variation", ".", "In", "addition", ",", "none", "of", "the", "participant", "reported", "on", "the", "use", "of", "live/dead", "cell", "discrimination", "on", "thawed", "PBMC", "samples", "for", "the", "FACS-based", "experiments", ".", "Whether", "the", "combination", "of", "staining", "with", "Ab/HLA-tetramers", "and", "vital", "dyes", "or", "with", "a", "resting", "phase", "is", "beneficial", "for", "increasing", "the", "sensitivity", "of", "the", "tetramer", "staining", "assay", "could", "be", "addressed", "in", "future", "testing", "actions", ".", "Results", "from", "a", "proficiency", "panel", "of", "36", "laboratories", "from", "nine", "different", "countries", "in", "which", "the", "ELISPOT", "assay", "was", "validated", "are", "now", "also", "being", "reported", "-LSB-", "41", "-RSB-", ".", "This", "initiative", ",", "conducted", "under", "the", "aegis", "of", "the", "Cancer", "Vaccine", "Consortium", "-LRB-", "CVC", "-RRB-", ",", "was", "mainly", "designed", "to", "offer", "an", "external", "validation", "to", "the", "participating", "laboratories", "but", "the", "in", "depth", "analysis", "of", "the", "obtained", "data", "sets", "lead", "to", "similar", "findings", "and", "recommendations", "as", "the", "CIMT", "monitoring", "panel", ".", "It", "confirmed", "that", "a", "resting", "phase", "of", "cells", "prior", "to", "addition", "to", "the", "ELISPOT", "plates", "is", "advantageous", "and", "should", "therefore", "be", "generally", "recommended", ".", "Furthermore", ",", "a", "long", "year", "experience", "in", "a", "technology", "did", "not", "guarantee", "for", "a", "sensitive", "test", "and", "failure", "to", "detect", "specific", "T", "cell", "responses", "concentrated", "on", "the", "weak", "responses", ".", "The", "fact", "that", "two", "independent", "initiatives", "come", "to", "similar", "findings", "is", "surely", "notable", "and", "shows", "the", "necessity", "to", "carry", "on", "running", "proficiency", "panels", ".", "Last", "but", "not", "least", ",", "we", "would", "like", "to", "stress", "that", "even", "the", "best", "guidelines", "and", "protocols", "alone", "can", "not", "guarantee", "good", "performance", ".", "Monitoring", "of", "antigen-specific", "T-cell", "responses", "requires", "skills", "as", "well", "as", "experience", ".", "Participation", "in", "immunomonitoring", "panels", "can", "not", "compensate", "for", "the", "need", "to", "constantly", "educate", "and", "train", "staff", "and", "to", "develop", "specific", "expertise", "for", "covering", "individual", "needs", ".", "Nevertheless", ",", "we", "strongly", "believe", "that", "by", "organizing", "further", "two-step", "inter-laboratory", "testing", "projects", ",", "the", "CIMT", "monitoring", "panel", "will", "be", "able", "to", "improve", "the", "sensitivity", "of", "the", "assays", "used", "for", "immunomonitoring", "as", "well", "as", "to", "actively", "participate", "in", "the", "harmonization", "of", "these", "assays", ",", "which", "is", "required", "to", "enable", "the", "comparison", "of", "immunotherapeutic", "trials", "performed", "in", "different", "centers", ".", "Electronic", "supplementary", "material", "Below", "is", "the", "link", "to", "the", "electronic", "supplementary", "material", ".", "ESM", "-LRB-", "PPT", "82", "kB", "-RRB-" ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O" ]

[ "The", "Future", "of", "Biologic", "Agents", "in", "the", "Treatment", "of", "Sjögren", "'s", "Syndrome", "The", "gain", "in", "knowledge", "regarding", "the", "cellular", "mechanisms", "of", "T", "and", "B", "lymphocyte", "activity", "in", "the", "pathogenesis", "of", "Sjögren", "'s", "syndrome", "-LRB-", "SS", "-RRB-", "and", "the", "current", "availability", "of", "various", "biological", "agents", "-LRB-", "anti-TNF-α", ",", "IFN", "-", "α", ",", "anti-CD20", ",", "and", "anti-CD22", "-RRB-", "have", "resulted", "in", "new", "strategies", "for", "therapeutic", "intervention", ".", "In", "SS", ",", "various", "phase", "I", "and", "II", "studies", "have", "been", "performed", "to", "evaluate", "these", "new", "strategies", ".", "Currently", ",", "B", "cell-directed", "therapies", "seem", "to", "be", "more", "promising", "than", "T", "cell-related", "therapies", ".", "However", ",", "large", ",", "randomized", ",", "placebo-controlled", "clinical", "trials", "are", "needed", "to", "confirm", "the", "promising", "results", "of", "these", "early", "studies", ".", "When", "performing", "these", "trials", ",", "special", "attention", "has", "to", "be", "paid", "to", "prevent", "the", "occasional", "occurrence", "of", "the", "severe", "side", "effects", ".", "Introduction", "Sjögren", "'s", "syndrome", "-LRB-", "SS", "-RRB-", "is", "a", "chronic", "lymphoproliferative", "autoimmune", "disease", "with", "disturbances", "of", "T", "lymphocytes", ",", "B", "lymphocytes", ",", "and", "exocrine", "glandular", "cells", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "SS", "can", "be", "primary", "-LRB-", "pSS", "-RRB-", "or", "secondary", "SS", "-LRB-", "sSS", "-RRB-", ",", "the", "latter", "being", "associated", "with", "another", "autoimmune", "disease", "-LSB-", "e.g.", ",", "rheumatoid", "arthritis", ",", "systemic", "lupus", "erythematosus", "-LRB-", "SLE", "-RRB-", "-RSB-", ".", "Lymphocytic", "infiltrates", "are", "a", "characteristic", "histopathological", "finding", "in", "SS", ".", "These", "infiltrates", "consist", "of", "T", "and", "B", "cells", ".", "The", "expression", "of", "different", "cytokines", ",", "such", "as", "tumor", "necrosis", "factor-α", "-LRB-", "TNF-α", "-RRB-", "and", "interferon-α", "-LRB-", "IFN-α", "-RRB-", ",", "during", "the", "formation", "and", "proliferation", "of", "these", "infiltrates", "has", "been", "investigated", ".", "There", "is", "an", "overexpression", "of", "TNF-α", ",", "which", "is", "secreted", "by", "CD4", "+", "T", "lymphocytes", ",", "mononuclear", "cells", ",", "and", "epithelial", "cells", "-LSB-", "2", "-RSB-", ".", "The", "intraglandular", "synthesis", "of", "TNF-α", "causes", "destruction", "of", "acini", "by", "up-regulation", "of", "Fas", "at", "the", "surface", "of", "the", "glandular", "epithelial", "cells", ",", "stimulation", "of", "secretion", "of", "type", "2", "and", "9", "matrix", "metalloproteases", "by", "epithelial", "cells", ",", "and", "overexpression", "of", "different", "chemokines", "-LSB-", "3", "--", "5", "-RSB-", ".", "IFN-α", "is", "produced", "by", "activated", "plasmacytoid", "dendritic", "cells", "in", "primary", "SS", "-LRB-", "pSS", "-RRB-", ",", "and", "numerous", "IFN-α-producing", "cells", "have", "been", "detected", "in", "labial", "salivary", "glands", "-LSB-", "6", "-RSB-", ".", "IFN-α", "promotes", "the", "autoimmune", "process", "by", "increasing", "autoantibody", "production", "and", "through", "the", "formation", "of", "endogenous", "IFN-á", "inducers", ".", "IFNs", "have", "potent", "immunomodulating", "properties", "and", "are", "thought", "to", "trigger", "a", "systemic", "biological", "response", "-LSB-", "7", "-RSB-", ".", "Besides", "the", "presence", "of", "proinflammatory", "cytokines", ",", "described", "in", "the", "previous", "paragraph", ",", "recent", "studies", "have", "shown", "an", "important", "role", "for", "B", "cells", "in", "the", "pathogenesis", "of", "SS", ".", "Presence", "of", "autoantibodies", "and", "hypergammaglobulinemia", "are", "both", "considered", "to", "reflect", "B", "cell", "hyperactivity", ".", "Systemic", "complications", "of", "SS", "are", "associated", "with", "this", "B", "cell", "hyperactivity", "-LSB-", "8", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "about", "5", "%", "of", "SS", "patients", "develop", "malignant", "B", "cell", "lymphoma", "-LSB-", "9", "-RSB-", ".", "B", "cell", "activating", "factor", "-LRB-", "BAFF", "-RRB-", ",", "also", "known", "as", "B", "lymphocyte", "stimulator", "-LRB-", "BLyS", "-RRB-", ",", "is", "an", "important", "factor", "in", "local", "and", "systemic", "autoimmunity", "-LSB-", "1", "-RSB-", ".", "Dysregulated", "BAFF", "expression", "is", "implicated", "in", "disease", "progression", "and", "perpetuation", "of", "humoral", "autoimmunity", ".", "Overproduction", "of", "BAFF", "in", "transgenic", "mice", "has", "been", "shown", "to", "result", "in", "B", "cell", "proliferation", "and", "antibody", "production", "resulting", "in", "inflammation", "and", "destruction", "of", "the", "salivary", "glands", ",", "as", "well", "as", "kidney", "failure", "similar", "to", "observations", "seen", "in", "SLE", "-LSB-", "10", "-RSB-", ".", "In", "humans", ",", "circulating", "BAFF", "levels", "are", "increased", "in", "patients", "with", "pSS", "and", "correlate", "with", "disease", "activity", "-LSB-", "11", "-RSB-", ".", "Recent", "insights", "in", "the", "cellular", "mechanisms", "of", "T", "and", "B", "lymphocyte", "activity", "in", "the", "pathogenesis", "of", "SS", "and", "the", "current", "availability", "of", "various", "biological", "agents", "have", "resulted", "in", "new", "strategies", "for", "therapeutic", "intervention", ".", "The", "use", "of", "these", "biological", "agents", "in", "the", "treatment", "of", "SS", "will", "be", "discussed", "in", "this", "review", ".", "Biological", "Agents", "Currently", ",", "biological", "agents", "have", "been", "introduced", "in", "various", "systemic", "autoimmune", "diseases", ",", "as", "rheumatoid", "arthritis", "and", "SLE", ".", "Biological", "agents", "most", "frequently", "applied", "in", "autoimmune", "diseases", "are", "monoclonal", "antibodies", ",", "soluble", "receptors", ",", "and", "molecular", "imitators", "-LSB-", "12", "-RSB-", ".", "These", "biological", "agents", "enhance", "or", "replace", "conventional", "immunosuppressive", "therapy", ".", "In", "contrast", "to", "rheumatoid", "arthritis", "and", "SLE", ",", "no", "biological", "agent", "has", "been", "approved", "yet", "for", "the", "treatment", "of", "SS", ",", "but", "several", "phase", "II", "and", "III", "studies", "have", "been", "or", "are", "currently", "conducted", ".", "The", "biological", "agents", "used", "in", "SS", "trials", "are", "IFN-α", "and", "agents", "targeting", "TNF-α", "and", "B", "cells", "-LRB-", "anti-CD20", ",", "anti-CD22", "-RRB-", ".", "Although", "no", "trials", "have", "been", "performed", "yet", "with", "BAFF", "antagonists", ",", "this", "might", "be", "a", "promising", "therapy", "-LSB-", "13", "-RSB-", "and", "will", "be", "discussed", "in", "this", "review", ",", "as", "well", ".", "Anti-TNF-α", "Monoclonal", "Antibodies", "There", "are", "three", "main", "biological", "agents", "targeting", "TNF-α", ":", "the", "chimeric", "monoclonal", "IgG1", "antibody", "infliximab", ",", "the", "receptor", "fusion", "protein", "etanercept", ",", "and", "the", "fully", "humanized", "monoclonal", "antibody", "adalimumab", ".", "In", "an", "open-label", "study", ",", "short-term", "treatment", "with", "infliximab", "was", "reported", "to", "be", "very", "effective", "in", "active", "pSS", "over", "a", "3-month", "period", "-LSB-", "14", "-RSB-", ".", "Sixteen", "patients", "received", "three", "infusions", "-LRB-", "3", "mg/kg", "-RRB-", "at", "weeks", "0", ",", "2", ",", "and", "6", ",", "which", "led", "to", "significant", "improvement", "in", "all", "clinical", "and", "functional", "parameters", ",", "including", "global", "assessments", ",", "erythrocyte", "sedimentation", "rate", ",", "whole", "salivary", "flow", "rate", ",", "tear", "secretion", "-LRB-", "Schirmer", "test", "-RRB-", ",", "tender", "joint", "count", ",", "fatigue", "score", ",", "and", "sensation", "of", "dry", "eyes", "and", "dry", "mouth", ".", "Three", "patients", ",", "all", "with", "short", "disease", "duration", "-LRB-", "<", "3", "years", "-RRB-", ",", "were", "considered", "to", "be", "in", "complete", "remission", "up", "till", "1", "year", ".", "In", "10", "out", "of", "the", "16", "patients", ",", "SS", "symptoms", ",", "particularly", "mouth", "dryness", ",", "relapsed", "after", "a", "median", "of", "9", "weeks", ".", "In", "a", "follow-up", "study", ",", "a", "maintenance", "regimen", "of", "one", "infusion", "every", "12", "weeks", "was", "evaluated", "in", "these", "10", "patients", ".", "Retreatment", "induced", "an", "improvement", "of", "signs", "related", "to", "SS", "that", "was", "comparable", "with", "the", "effects", "from", "the", "three", "loading", "infusions", "-LSB-", "15", "-RSB-", ".", "To", "confirm", "these", "promising", "results", "from", "an", "uncontrolled", "study", ",", "the", "Trial", "of", "Remicade", "In", "Primary", "Sjögren", "'s", "Syndrome", "study", "was", "designed", ".", "In", "this", "multicenter", ",", "double-blinded", ",", "placebo-controlled", ",", "randomized", "clinical", "trial", ",", "103", "patients", "with", "active", "pSS", "were", "included", "and", "treated", "with", "infliximab", "infusions", "-LRB-", "5", "mg/kg", "-RRB-", "or", "placebo", "at", "weeks", "0", ",", "2", ",", "and", "6", ".", "Follow-up", "was", "22", "weeks", ".", "Primary", "endpoint", "was", "an", "improvement", "of", ">", "30", "%", "of", "two", "of", "three", "VAS", "scores", "measuring", "joint", "pain", ",", "fatigue", ",", "and", "dry", "eyes", ".", "There", "were", "several", "secondary", "endpoints", "of", "which", "one", "was", "the", "basal", "salivary", "flow", "rate", ".", "In", "contrast", "to", "the", "previously", "mentioned", "uncontrolled", "studies", ",", "no", "evidence", "of", "efficacy", "of", "infliximab", "treatment", "on", "all", "clinical", "and", "functional", "parameters", "could", "be", "demonstrated", "in", "this", "randomized", "controlled", "clinical", "trial", "-LSB-", "2", "-RSB-", ".", "A", "trial", "on", "15", "pSS", "patients", "-LRB-", "mean", "disease", "duration", "3.6", "years", "-RRB-", "with", "25-mg", "etanercept", ",", "subcutaneously", "twice", "a", "week", "for", "12", "weeks", ",", "did", "not", "reveal", "a", "reduction", "in", "sicca", "symptoms", "and", "signs", ",", "neither", "did", "the", "repeated", "treatment", "for", "up", "to", "26", "weeks", ".", "Only", "in", "the", "subset", "of", "four", "patients", "with", "severe", "fatigue", "a", "decrease", "in", "fatigue", "was", "observed", "-LSB-", "16", "-RSB-", ".", "Another", "trial", "evaluating", "subcutaneous", "administration", "of", "etanercept", "vs", "placebo", "for", "12", "weeks", "-LRB-", "28", "patients", "-RRB-", "also", "showed", "no", "clinical", "efficacy", "-LSB-", "17", "-RSB-", ".", "No", "trials", "of", "adalimumab", "treatment", "in", "pSS", "have", "been", "reported", "in", "the", "literature", "yet", ".", "In", "conclusion", ",", "TNF-targeting", "treatment", "could", "not", "be", "proven", "to", "be", "of", "benefit", "in", "reducing", "the", "complaints", "of", "pSS", "patients", ".", "IFN-α", "IFNs", "are", "proteins", "with", "antiviral", "activity", "and", "potent", "immunomodulating", "properties", ".", "SS", "patients", "have", "an", "activated", "type", "I", "IFN", "system", "-LSB-", "6", "-RSB-", ".", "Such", "a", "role", "for", "IFN-α", "appears", "to", "contradict", "the", "reports", "described", "below", ",", "that", "low", "doses", "of", "IFN-α", "administered", "via", "the", "oromucosal", "route", "increase", "the", "unstimulated", "salivary", "output", ".", "However", ",", "it", "is", "hypothesized", "that", "oral", "IFN-α", "treatment", "may", "act", "by", "increasing", "saliva", "secretion", "by", "up-regulation", "of", "aquaporin", "5", "transcription", "without", "significantly", "influencing", "the", "underlying", "autoimmune", "process", "-LSB-", "6", ",", "7", "-RSB-", ".", "In", "a", "phase", "II", "study", ",", "treatment", "of", "pSS", "patients", "with", "IFN-α", "administered", "via", "the", "oromucosal", "route", "-LRB-", "by", "dissolving", "lozenges", "-RRB-", "was", "demonstrated", "to", "be", "effective", "-LRB-", "improvement", "of", "salivary", "output", ",", "decreased", "complaints", "of", "xerostomia", "-RRB-", "and", "safe", "-LSB-", "18", "-RSB-", ".", "Based", "on", "these", "promising", "results", ",", "a", "randomized", ",", "parallel", "group", ",", "double-blinded", ",", "placebo-controlled", "clinical", "trial", "-LRB-", "497", "pSS", "patients", "-RRB-", "was", "designed", ".", "Patients", "were", "randomized", "into", "two", "groups", "and", "received", "a", "24-week", "daily", "treatment", "with", "either", "450", "IU", "IFN-α", "-LRB-", "150", "IU", "three", "times", "per", "day", "-RRB-", "or", "placebo", "in", "a", "ratio", "3:2", ",", "administered", "by", "the", "oromucosal", "route", ".", "This", "randomized", ",", "controlled", "clinical", "trial", "failed", "to", "demonstrate", "a", "significant", "effect", "on", "the", "primary", "endpoints", "-LRB-", "VAS", "score", "for", "oral", "dryness", "and", "stimulated", "whole", "salivary", "flow", "-RRB-", "in", "the", "IFN-α", "group", "relative", "to", "the", "placebo", "group", ".", "There", "was", "a", "significant", "increase", "in", "unstimulated", "whole", "saliva", "in", "the", "patients", "treated", "with", "IFN-α", ",", "which", "correlated", "positively", "and", "significantly", "with", "improvement", "in", "seven", "of", "eight", "symptoms", "associated", "with", "oral", "and", "ocular", "dryness", ".", "No", "adverse", "events", "were", "observed", "-LSB-", "7", "-RSB-", ".", "In", "conclusion", ",", "no", "clinical", "evidence", "for", "the", "efficacy", "of", "IFN-á", "treatment", "in", "pSS", "patients", "has", "been", "shown", "yet", ";", "however", ",", "an", "improvement", "of", "unstimulated", "whole", "saliva", "was", "observed", ".", "Further", "research", "is", "needed", "to", "objectify", "the", "effect", "of", "IFN-á", "on", "salivary", "gland", "tissue", ".", "Anti-CD20", "Monoclonal", "Antibodies", "Anti-CD20", "-LRB-", "rituximab", "-RRB-", "is", "a", "chimeric", "humanized", "monoclonal", "antibody", "specific", "for", "the", "B", "cell", "surface", "molecule", "CD20", ",", "which", "is", "expressed", "on", "the", "surface", "of", "normal", "and", "malignant", "pre-B", "and", "mature", "B", "lymphocytes", ".", "CD20", "mediates", "B", "cell", "proliferation", "and", "differentiation", ".", "This", "antibody", "has", "been", "demonstrated", "to", "prevent", "B", "cells", "from", "proliferating", "and", "to", "induce", "lysis", "of", "B", "cells", "by", "complement-dependent", "and", "antibody-dependent", "cytotoxicity", "mechanisms", "as", "well", "as", "by", "direct", "induction", "of", "apoptosis", "-LSB-", "19", "-RSB-", ".", "Rituximab", "is", "currently", "used", "for", "the", "treatment", "of", "low-grade", "B", "cell", "lymphomas", "-LSB-", "20", "-RSB-", ".", "In", "controlled", "studies", ",", "it", "was", "shown", "to", "be", "safe", "and", "effective", "in", "the", "treatment", "of", "rheumatoid", "arthritis", "-LSB-", "21", "--", "23", "-RSB-", ".", "Moreover", ",", "open-label", "studies", "in", "SLE", "patients", "are", "promising", "-LSB-", "24", "-RSB-", ".", "In", "an", "open-label", "phase", "II", "study", ",", "15", "patients", "with", "pSS", "were", "treated", "with", "4", "infusions", "of", "rituximab", "-LRB-", "375", "mg/m2", "once", "weekly", "-RRB-", "and", "followed", "up", "for", "a", "3-month", "period", ".", "Eight", "of", "the", "15", "patients", "were", "early", "pSS", "patients", "-LRB-", "mean", "disease", "duration", "28", "months", ",", "all", "had", "residual", "salivary", "gland", "function", "at", "baseline", "-RRB-", ",", "and", "7", "patients", "had", "a", "concomitant", "mucosa-associated", "lymphoid", "tissue", "-LRB-", "MALT", "-RRB-", "lymphoma", "-LRB-", "mean", "disease", "duration", "79", "months", "-RRB-", ".", "In", "the", "early", "pSS", "patients", ",", "rituximab", "treatment", "resulted", "in", "significant", "improvement", "of", "subjective", "symptoms", "and", "an", "increase", "in", "salivary", "gland", "function", ".", "All", "patients", "showed", "a", "rapid", "depletion", "of", "peripheral", "B", "cells", "within", "a", "few", "weeks", ",", "accompanied", "by", "a", "decrease", "in", "IgM-RF", "levels", "-LSB-", "8", "-RSB-", ".", "Repeated", "parotid", "gland", "biopsies", "in", "five", "of", "the", "early", "patients", "after", "treatment", "showed", "redifferentation", "of", "the", "lymphoepithelial", "duct", "lesions", "into", "normal", "striated", "ducts", ",", "possibly", "indicating", "regeneration", "of", "salivary", "gland", "tissue", "-LRB-", "unpublished", "data", "-RRB-", ".", "Five", "of", "the", "eight", "pSS", "patients", "without", "a", "MALT", "lymphoma", "received", "a", "second", "course", "of", "rituximab", "-LRB-", "after", "9", "--", "11", "months", "-RRB-", "due", "to", "recurrence", "of", "symptoms", ".", "Retreatment", "resulted", "in", "the", "same", "significant", "improvement", "of", "the", "salivary", "flow", "rate", "and", "subjective", "symptoms", "compared", "to", "the", "results", "of", "the", "first", "treatment", ",", "together", "with", "a", "decrease", "in", "B", "cells", "and", "IgM-RF", "levels", ".", "Six", "of", "the", "seven", "MALT/pSS", "patients", "were", "initially", "effectively", "treated", "with", "rituximab", ".", "The", "remaining", "MALT/pSS", "patient", "had", "progressive", "MALT", "disease", "and", "severe", "extraglandular", "SS", "disease", "within", "3", "months", "after", "the", "start", "of", "rituximab", "treatment", ".", "Cyclophosphamide", "was", "added", ",", "which", "led", "to", "stable", "disease", "of", "both", "MALT", "and", "SS", ".", "One", "of", "the", "six", "patients", "initially", "responding", "had", "a", "recurrence", "of", "MALT", "lymphoma", "after", "9", "months", "and", "was", "successfully", "retreated", "with", "rituximab", ".", "The", "other", "patients", "are", "still", "in", "remission", "-LRB-", "unpublished", "data", "-RRB-", ".", "In", "another", "open-label", "study", ",", "16", "pSS", "patients", "received", "only", "two", "weekly", "rituximab", "infusions", "-LRB-", "375", "mg/m2", "-RRB-", ",", "with", "a", "follow-up", "of", "36", "weeks", ".", "Again", ",", "treatment", "resulted", "in", "rapid", "complete", "depletion", "of", "peripheral", "B", "cells", ".", "At", "week", "12", ",", "a", "significant", "improvement", "of", "VAS", "scores", "for", "fatigue", "and", "dryness", "was", "recorded", ",", "and", "at", "week", "36", ",", "a", "significant", "improvement", "for", "VAS", "scores", "for", "global", "disease", ",", "fatigue", ",", "dry", "mouth", ",", "dry", "eyes", ",", "and", "dry", "vagina", ",", "but", "also", "in", "the", "number", "of", "tender", "joint", "and", "tender", "joint", "counts", "was", "seen", "-LSB-", "25", "-RSB-", ".", "Both", "in", "the", "study", "of", "Pijpe", "et", "al.", "-LSB-", "8", "-RSB-", "and", "the", "study", "of", "Devauchelle-Pensec", "et", "al.", "-LSB-", "25", "-RSB-", ",", "patients", "with", "a", "short", "disease", "duration", "showed", "more", "improvements", "than", "patients", "with", "longer", "disease", "duration", ".", "Two", "trials", "retrospectively", "evaluated", "the", "effect", "of", "rituximab", "-LRB-", "four", "infusions", "of", "375", "mg/m2", "-RRB-", "in", "18", "pSS", "patients", "-LRB-", "mean", "disease", "duration", "10", "years", "-RRB-", "with", "systemic", "features", ".", "Self-reported", "dryness", "improved", "in", "six", "patients", "-LRB-", "VAS", "scores", "not", "known", "for", "three", "patients", ",", "no", "improvement", "in", "the", "other", "nine", "patients", "-RRB-", ".", "Both", "studies", "reported", "good", "efficacy", "of", "the", "treatment", "on", "systemic", "features", "-LSB-", "26", ",", "27", "-RSB-", ".", "In", "conclusion", ",", "in", "phase", "II", "trials", ",", "it", "has", "been", "shown", "that", "rituximab", "seems", "to", "be", "effective", "for", "at", "least", "6", "--", "9", "months", "in", "pSS", "patients", "with", "active", "disease", ",", "improving", "both", "subjective", "and", "objective", "complaints", ".", "Retreatment", "with", "rituximab", "resulted", "in", "a", "similar", "good", "clinical", "response", ".", "In", "pSS", "patients", "with", "longer", "disease", "duration", ",", "without", "residual", "salivary", "gland", "function", ",", "rituximab", "treatment", "seems", "to", "be", "effective", "for", "systemic", "features", ".", "To", "confirm", "these", "promising", "results", ",", "randomized", "placebo-controlled", "clinical", "trials", "are", "needed", ".", "Anti-CD22", "Monoclonal", "Antibodies", "Epratuzumab", "is", "a", "fully", "humanized", "monoclonal", "antibody", "specific", "for", "the", "B", "cell", "surface", "molecule", "CD22", ".", "CD22", "is", "expressed", "on", "the", "surface", "of", "normal", "mature", "and", "malignant", "B", "lymphocytes", ".", "CD22", "appears", "to", "be", "involved", "in", "the", "regulation", "of", "B", "cell", "activation", "through", "B", "cell", "receptor", "signaling", "and", "cell", "adhesion", "-LSB-", "28", "-RSB-", ".", "In", "an", "open-label", "phase", "I/II", "study", ",", "safety", "and", "efficacy", "of", "epratuzumab", "were", "investigated", "in", "16", "pSS", "patients", ".", "Follow-up", "was", "6", "months", ".", "These", "pSS", "patients", "received", "four", "doses", "of", "360", "mg/m2", "epratuzumab", "intravenously", ".", "Mean", "disease", "duration", "before", "therapy", "was", "2.9", "years", ",", "and", "none", "of", "the", "patients", "had", "received", "prior", "B", "cell-targeted", "therapy", ".", "Most", "improvements", "occurred", "in", "the", "Schirmer", "test", ",", "unstimulated", "whole", "salivary", "flow", "and", "the", "VAS", "score", "for", "fatigue", ".", "The", "new", "developed", "disease", "activity", "score", "consisted", "of", "the", "four", "domains", ":", "dryness", "of", "the", "eyes", ",", "dryness", "of", "the", "mouth", ",", "fatigue", ",", "and", "laboratory", "parameters", ".", "Based", "on", "this", "score", ",", "53", "%", "achieved", "at", "least", "20", "%", "improvement", "in", "at", "least", "two", "domains", "at", "6", "weeks", ".", "Corresponding", "rates", "for", "10", ",", "18", ",", "and", "32", "weeks", "are", "53", ",", "47", ",", "and", "67", "%", ".", "Remarkably", ",", "the", "number", "of", "responders", "was", "higher", "6", "months", "after", "the", "treatment", "administration", "than", "earlier", ".", "Peripheral", "B", "cells", "decreased", "with", "a", "median", "decrease", "of", "54", "and", "39", "%", "at", "6", "and", "18", "weeks", ",", "respectively", ".", "In", "conclusion", ",", "epratuzumab", "seems", "to", "be", "an", "effective", "treatment", ".", "Randomized", ",", "placebo-controlled", "clinical", "trials", "are", "needed", "before", "epratuzumab", "can", "be", "advised", "for", "general", "treatment", "in", "pSS", "patients", "-LSB-", "29", "-RSB-", ".", "Anti-BAFF", "BAFF", "is", "a", "B", "cell-activating", "factor", "that", "acts", "as", "a", "positive", "regulator", "of", "B", "cell", "function", "and", "expansion", ".", "BAFF", "levels", "were", "found", "elevated", "in", "serum", "and", "saliva", "in", "SS", "patients", ",", "but", "no", "correlation", "could", "be", "shown", "between", "serum", "and", "saliva", "levels", "-LSB-", "30", "-RSB-", ".", "However", ",", "circulating", "levels", "of", "BAFF", "in", "pSS", "patients", "were", "shown", "to", "be", "a", "marker", "for", "disease", "activity", "-LSB-", "11", "-RSB-", ".", "To", "the", "best", "of", "our", "knowledge", ",", "no", "trials", "have", "been", "performed", "with", "anti-BAFF", "treatment", "in", "SS", "yet", ",", "but", "such", "an", "approach", "might", "be", "considered", "for", "future", "trials", ".", "Currently", ",", "two", "human", "BAFF", "antagonists", "have", "been", "developed", ",", "a", "human", "antibody", "-LRB-", "anti-BLyS", "-RRB-", "that", "binds", "to", "soluble", "BAFF", "and", "a", "fusion", "protein", "of", "one", "of", "the", "BAFF", "receptors", "-LSB-", "31", ",", "32", "-RSB-", ".", "Especially", ",", "SS", "patients", "with", "elevated", "BAFF", "levels", ",", "hypergammaglobulinemia", ",", "elevated", "levels", "of", "autoantibodies", ",", "and", "associated", "B", "cell", "lymphoma", "might", "be", "candidates", "for", "anti-BAFF", "treatment", "-LSB-", "33", "-RSB-", ".", "Safety", "and", "Tolerability", "of", "Biological", "Agents", "The", "most", "important", "side", "effects", "of", "treatment", "with", "biological", "agents", "are", "direct", "mild", "infusion", "reactions", ".", "Several", "patients", "developed", "a", "serum", "sickness-like", "disease", "a", "few", "days", "after", "the", "second", "infusion", "that", "might", "be", "related", "to", "the", "formation", "of", "antibodies", "against", "the", "biological", "agent", "-LSB-", "human", "anti-chimeric", "antibodies", "-LRB-", "HACAs", "-RRB-", "or", "human", "anti-human", "antibodies", "-RSB-", ".", "A", "few", "patients", "developed", "infections", "during", "treatment", "with", "a", "biological", "agent", ";", "however", ",", "some", "patients", "concomitantly", "used", "other", "immunosuppressive", "therapies", ".", "Therefore", ",", "the", "direct", "relation", "between", "the", "biological", "agent", "and", "the", "infection", "is", "unsure", ".", "All", "adverse", "events", "reported", "in", "the", "trials", "described", "in", "this", "review", "are", "reported", "in", "Table", "1", ".", "According", "to", "this", "table", ",", "the", "most", "frequent", "side", "effects", "of", "treatment", "with", "biological", "agents", "are", "mild", "infusion", "reactions", ".", "The", "most", "severe", "side", "effect", "of", "the", "various", "treatments", "used", "in", "SS", "patients", "was", "the", "development", "of", "a", "serum", "sickness-like", "disease", ".", "This", "adverse", "effect", "of", "treatment", "occurred", "in", "16", "%", "-LRB-", "8", "of", "49", "-RRB-", "of", "the", "patients", "treated", "with", "rituximab", ".", "HACA", "formation", "was", "observed", "in", "patients", "developing", "a", "serum", "sickness-like", "disease", "and", "occurred", "only", "in", "patients", "receiving", "low-dose", "corticosteroids", "and", "no", "other", "immunosuppressive", "drugs", ".", "It", "is", "assumed", "that", "higher", "doses", "of", "corticosteroids", "during", "treatment", "might", "prevent", "the", "occurrence", "of", "serum", "sickness", ".", "Table", "1Adverse", "events", "after", "treatment", "with", "biological", "agents", "in", "SS", "Agent/doseNumber", "of", "patients", "in", "trial", "-LRB-", "number", "treated", "with", "the", "agent", "-RRB-", "Premedication/concomitant", "immunosuppressive", "therapyInfusion", "reactionInfectionsSerum", "sicknessHACA/HAHA", "formationOtherAnti-TNF-α", "monoclonal", "antibodiesSteinfeld", "-LSB-", "14", "-RSB-", "Infliximab", "intravenous", ",", "3", "mg/kg16", "-LRB-", "16", "-RRB-", "n.r.", "/", "no1", "-LRB-", "6", "%", "-RRB-", "2", "-LRB-", "13", "%", "-RRB-", "-LRB-", "respiratory", "tract", "-RRB-", "--", "n.r.", "--", "Steinfeld", "-LSB-", "15", "-RSB-", "Infliximab", "intravenous", ",", "3", "mg/kg10", "-LRB-", "10", "-RRB-", "n.r.", "/", "no4", "-LRB-", "40", "%", "-RRB-", "2", "-LRB-", "20", "%", "-RRB-", "-LRB-", "enteritis", ",", "tonsillitis", "-RRB-", "--", "n.r.", "--", "Marriette", "-LSB-", "2", "-RSB-", "Infliximab", "intravenous", ",", "5", "mg/kg103", "-LRB-", "54", "-RRB-", "n.r.", "/", "continuation", "of", "hydroxychloroquine", "and", "corticosteroids", "-LRB-", "≤", "15", "mg/day", "-RRB-", "2", "-LRB-", "4", "%", "-RRB-", "2", "-LRB-", "4", "%", "-RRB-", "-LRB-", "1", "cutaneous", ",", "1", "respiratory", "tract", "-RRB-", "--", "n.r.", "2", "-LRB-", "breast", "cancer", ",", "auto-immune", "hepatitis", "-RRB-", "aZandbelt", "-LSB-", "16", "-RSB-", "Etanercept", "subcutaneously", ",", "25", "mg15", "-LRB-", "15", "-RRB-", "n.r.", "/", "pilocarpine", "at", "a", "constant", "dose", "--", "1", "-LRB-", "7", "%", "-RRB-", "-LRB-", "parotitis", "-RRB-", "--", "n.r.", "--", "Sankar", "-LSB-", "17", "-RSB-", "Etanercept", "subcutaneously", ",", "25", "mg28", "-LRB-", "14", "-RRB-", "n.r.", "/", "allowed", "to", "use", "long-term", "medication1", "-LRB-", "7", "%", "-RRB-", "1", "-LRB-", "7", "%", "-RRB-", "-LRB-", "skin", "lesion", "-RRB-", "b", "--", "n.r.", "--", "IFN-αShip", "-LSB-", "18", "-RSB-", "IFN-α", "oromucosal", ",", "150", "IU", ",", "450", "IU109", "-LRB-", "87", "-RRB-", "n.r.", "/", "non.a", ".", "--", "--", "n.r.", "--", "cCummins", "-LSB-", "7", "-RSB-", "IFN-α", "oromucosal", ",", "450", "IU497", "-LRB-", "300", "-RRB-", "n.r.", "/", "non.a", ".", "--", "--", "--", "23", "-LRB-", "7.7", "%", "-RRB-", "d", "-LRB-", "34", "%", "gastrointestinal", ",", "25", "%", "musculoskeletal", "-RRB-", "Anti-CD20Pijpe", "-LSB-", "8", "-RSB-", "Rituximab", "intravenous", ",", "375", "mg/m215", "-LRB-", "15", "-RRB-", "25", "mg", "prednisolon", "intravenously/patients", "with", "severe", "extraglandular", "manifestations", "-LRB-", "n", "=", "3", "-RRB-", "received", "immunosuppressive", "therapy2", "-LRB-", "13", "%", "-RRB-", "1", "-LRB-", "7", "%", "-RRB-", "-LRB-", "zoster", "-RRB-", "4", "-LRB-", "27", "%", "-RRB-", "e4", "-LRB-", "27", "%", "-RRB-", "--", "Devauchelle-Pensec", "-LSB-", "25", "-RSB-", "Rituximab", "intravenous", ",", "375", "mg/m216", "-LRB-", "16", "-RRB-", "n.r.", "/", "no", "--", "--", "1", "-LRB-", "6", "%", "-RRB-", "n.r.", "--", "Gottenberg", "-LSB-", "26", "-RSB-", "Rituximab", "intravenous", ",", "375", "mg/m26", "-LRB-", "6", "-RRB-", "n.r.", "/", "hydroxychloroquine", "-LRB-", "n", "=", "1", "-RRB-", ",", "methylprednisolone", "-LRB-", "n", "=", "3", "-RRB-", "1", "-LRB-", "17", "%", "-RRB-", "--", "1", "-LRB-", "17", "%", "-RRB-", "n.r.", "--", "Seror", "-LSB-", "27", "-RSB-", "Rituximab", "intravenous", ",", "375", "mg/m212", "-LRB-", "12", "-RRB-", "n.r.", "/", "cyclophosphamide", "-LRB-", "n", "=", "1", "-RRB-", ",", "hydroxychloroquine", "-LRB-", "n", "=", "1", "-RRB-", ",", "leflunomide", "-LRB-", "n", "=", "1", "-RRB-", "1", "-LRB-", "8", "%", "-RRB-", "--", "2", "-LRB-", "17", "%", "-RRB-", "n.r.", "--", "Anti-CD22Steinfeld", "-LSB-", "29", "-RSB-", "Epratuzumab", "intravenous", ",", "360", "mg/m216", "-LRB-", "16", "-RRB-", "0.5", "--", "1", "g", "acetominophen", ",", "25", "--", "50", "mg", "antihistamine", ".", "/", "no2", "-LRB-", "13", "%", "-RRB-", "2", "-LRB-", "13", "%", "-RRB-", "-LRB-", "sinusitis", ",", "dental", "abscess", "-RRB-", "--", "3", "-LRB-", "19", "%", "-RRB-", "6", "-LRB-", "38", "%", "-RRB-", "-LRB-", "TIA", ",", "osteoporotic", "fracture", ",", "diarrhea", ",", "dyspepsia", ",", "palpitations", ",", "paresthesia", "-RRB-", "n.a.", "Not", "applicable", ",", "n.r.", "not", "reported", ",", "HACA", "human", "anti-chimeric", "antibodies", ",", "HAHA", "human", "anti-human", "antibodiesaOne", "patient", "in", "the", "placebo", "group", "developed", "benign", "lymph", "node", "enlargementbOne", "patient", "in", "the", "placebo", "group", "developed", "a", "prolonged", "upper", "respiratory", "tract", "infectioncIn", "this", "study", ",", "there", "were", "mild", "adverse", "events", ";", "however", ",", "there", "were", "no", "significant", "differences", "between", "the", "groups", ".", "Adverse", "events", "were", "not", "specified.dEight", "patients", "-LRB-", "4.1", "%", "-RRB-", "in", "the", "placebo", "group", "developed", "adverse", "eventseOne", "of", "these", "4", "patients", "developed", "serum", "sickness", "after", "retreatment", "-LSB-", "8", "-RSB-", "Future", "Perspectives", "Biological", "agents", "are", "promising", "therapies", "for", "SS", ".", "Randomized", "studies", "failed", "to", "show", "a", "clinical", "effect", "of", "anti-TNF-α", "and", "IFN-α", "in", "the", "treatment", "of", "SS", ".", "Notwithstanding", "the", "unfortunate", "results", "of", "anti-TNF-α", "and", "IFN-α", ",", "B", "cell", "depletion", "-LRB-", "both", "anti-CD20", "and", "anti-CD22", "-RRB-", "seems", "very", "promising", ".", "Again", ",", "this", "promising", "effect", ",", "as", "was", "previously", "also", "assumed", "for", "anti-TNF-α", "and", "IFN-α", ",", "must", "be", "confirmed", "in", "larger", "randomized", "controlled", "clinical", "trials", ".", "HACAs", "have", "been", "reported", "to", "occur", "at", "a", "higher", "rate", "in", "patients", "with", "an", "autoimmune", "disease", ".", "It", "seems", "that", "monoclonal", "antibodies", "are", "more", "immunogenic", "in", "active", "autoimmune", "disease", ",", "independent", "of", "the", "type", "of", "disease", ".", "Additional", "use", "of", "immunosuppressive", "therapy", "in", "these", "patients", "might", "be", "mandatory", "to", "prevent", "serious", "side", "effects", ".", "These", "unwanted", "side", "effects", "might", "also", "be", "prevented", "by", "the", "use", "of", "fully", "humanized", "antibodies", ".", "The", "currently", "available", "humanized", "antibodies", "are", "promising", ",", "but", "need", "further", "study", ".", "Moreover", ",", "there", "is", "still", "a", "need", "for", "improved", "assessment", "parameters", "to", "monitor", "treatment", "effects", ",", "both", "subjectively", "and", "objectively", ".", "For", "studies", "on", "intervention", "of", "SS", ",", "evaluation", "of", "the", "parotid", "gland", "might", "be", "of", "use", "because", "function", ",", "composition", "of", "saliva", ",", "and", "histology", "can", "be", "evaluated", "on", "the", "same", "gland", "at", "different", "time", "points", ".", "Activity", "scores", "are", "currently", "under", "development", "by", "Bowman", "and", "Vitali", "-LSB-", "34", ",", "35", "-RSB-", ".", "Finally", ",", "as", "soon", "as", "effective", "intervention", "treatments", "have", "been", "established", ",", "the", "cost-effectiveness", "of", "these", "currently", "very", "expensive", "antibodies", "needs", "to", "be", "analyzed", "to", "select", "those", "patients", "that", "might", "benefit", "the", "most", "from", "this", "kind", "of", "treatment", "." ]

[ "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "I", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B", "O" ]