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id int32 0 5.48k	corpus stringlengths 176 110k	category stringclasses 24 values	sentence_ls listlengths 1 830	metadata dict
5,300	<p>WeelA와 Wee1B는 거의 동인한 효소 활성 도메인을 가졌음에도 불구하고, 인산화 과정과 분해 가정이 다르게 진행되므로, 각각의 효소의 어느 부위가 이러한 조절 기작에 관여 하는지를 관찰하고자, 각각의 아미노 도메인과 카르복신 도 메인은 상호 치환한 키메라(chimcra) 단백질은 제조하고(Fig.5), 이를 Hek293 세포에 형질전환한 후 그 발현을 확인하였다. 발현이 확인된 각각의 construct를 이용하여 mRNA를 합성하고, 각각을 발톱개구리의 난자에 주입한 후 progester- one은 처리하여 이동도 감소에 의한 인산화 정도, 그리고 단백질 양의 감소 정도를 측정하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 WeelA의 아미노 도메인이 존재하는 경우 SDS-PAGE상에서 많은 이동도 감소를 관찰할 수 있었고, 또한 내부분의 단백질이 분해되는 것은 관찰 할 수 있었다. 이러한 결과는 WeelA의 아미노 도메인이 단백질의 인산화와 안징성 조절에 관여한다는 사실을 제시한다. 단백질의 조절은 여러 가지 기작에 의해 일어나지만 최근의 연구 결과들은 단백질의 활성 조절 기작으로 기존에 주로 연구되어 오던 인산화와 통한 분해 정도에 많은 관심은 쏟고 있다. 이러한 단백질의 안정성의 조절에는 많은 신호전달체계가 동시에 작용한다. 단백질에 uniqitin을 연결하는 uniqitin ligase (E3)는 주로 특이한 아미노산 서열을 인식하는데, 특히 보존된 아미노산 서열의 인산화된 형태를 인식하는 경우가 많다. Fig. 2에서 보듯 WeelA는 세포주기가 진행 됨에 따라 SDS-PAGE 상에서 크기가 증가하고, 또한 양이 줄어드는 것으로 보아 인산화와 ubiqitination 과정을 거쳐 분해가 되는 것으로 생각되어진다. 최근의 연구 결과 체세포 분열에서는 인간의 Wee1A가 SCF \( \beta \) - TrCP에 의해 ubiquitination 되는 것으로 알려져 있다. 반면, Wee1B의 아미노 도메인을 포함하는 대부분의 키메라 단백질은 단백질의 인산화에 관여하였으나 적은 이동도 변화를 보였고, 대부분의 단백진이 분해되지 않은 체 남아있었다. 이러한 사실은 Wee1B의 아미노산 도메인이 다른 인산화 효소에 의해 인산화되나, 이 부위가 단백질의 안정화와 분해 과정에는 관여하지 않는다는 것을 암시한다.</p><p>키매라 단백질의 활성 측정을 위하여 각각의 키메라의 mRNA를 합성 후 발톱개구리 난자에 주입하고 progesterone 처리 후 새포주기의 재개 정도를 측정하였다(Fig. 6).</p><p>Wee1 인산화요소는 Cdc2/cyclinB를 인산화하여 그활성을 억제하므로, Wee1 인산화효소의 활성이 클수록 세포주기의 제개가 억제된다. 동일한 양의 mRNA를 주사한 결과 WeelB 의 아미노 도메인과 WeelA의 카르복실 도메인을 갖는 두 개의 키메라 (Wee1B-CA (BCA), WeelA-NB (ANB))가 가장 잘 세포주기를 억제하는 것으로 보아 WeelB의 아미노 도메인과 Wee1A의 카르복실 도메인이 활성화를 조절하거나, 반대로 Wec1B의 카르복신 도메인과 Wec1A의 아미노 도메인의 인산화효소의 활성화를 억제하는 역할을 하는 것으로 생각된다./<p><p>본 연구에서는 세포 주기를 조절하는 단백질인 Wee1인 산화호소들의 특성읕 다양한 키메라 단백질을 유전자 제조 합 방법을 이용하여 제조하여 비교 분석하였다. 결과적으로 두 Wee1 인선화효소의 각각 아미노, 카르복실 도메인의 역할을 규명하였고, 인산화와 효소의 활성에 관여하는 여러 연관 인산화효소의 작용기작을 밝히는 기초를 마련하였다. 이러한 결과들은 두 개의 Wee1 인산화효소가 각각 다른 조직과 다른 종류의 세포에 존재하고, 각각 채세포 분열과 감수 분열에서 특이적인 역할을 하는 이유를 잘 설명해준다. 각각의 Wee1 kinase를 인산화시키는 효소와 그에 의한 활성의 변화, 그리고 단백질의 안정성 변화에 미치는 영향 등은 추 후에 자세히 연구되어야 할 것이다.</p> <h1>요 약</h1><p>Wee1 인산화효소는 세포주기 조절의 핵심 단백질인 \( \mathrm{cdc} 2 / \mathrm{cyclinB} \) 복합체를 인산화하여 활성을 억제, 조절하는 주요한 효소이다. 지금까지 포유동물에서는 Wee1A, Wee1B 그리고 Myt1의 세 가지 효소가 발견되었다. Wee1 인산화효소의 조절기작을 연구하기 위하여 생쥐의 Wee1A와 Wee1B를 발톱개구리의 난자에 주사한 후 단백질의 변형을 관찰하였다. 이 세포주기 과정에서 두 효소는 모두 인산화 되었으며, Wee1A 단백질은 분해되는 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 세포의 인산화 방법을 통하여 Wee1A가 PKA와 Akt에 의해 인산화됨을 확인하였다. 이러한 Wee1 인산화효소의 인산화와 단백질 안정성에 영향을 미치는 단백질 내의 부위를 살펴보고자, Wee1A와 Wce1B의 아미노 도메인과 카르복실 도메인을 서로 치환한 단백질을 제조하여 개구리 난자에 주사하고 인산화 정도와 단백질의 안정성을 조사하였을 때, Wee1A의 아미노 도메인이 단백질의 인산화와 안정화에 중요하 영향을 미친다는 것을 규명하였다. 그리고. Wee1B의 아미노 도메인과 Wee1A의 카르복실 도메인은 효소의 활성을 조절하는 역할을 한다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><p>지금까지 포유동물에는 Wee1A, Wee1B 그리고 Myt1, 3 가지 종류의 Weel kinase가 존재한다고 알려져 있다. 생쥐의 Wee1A 단백질과 Wee1B 단백질은 \( 26 \% \)의 아미노 도메인 상동성을 갖고, \( 38 \% \)의 카로복실 도메인, kinase 활성을 갖는 중간 도메인은 매우 높은 \( 73 \% \)의 상동성을 갖는다. 그러나 Myt1 인산화효소는 kinase 도메인을 제외하고는 다른 Wacl kinase들과 거의 상동성을 나타내지 않는다(Fig. 1). V5가 달린 Wee1A, B 그리고 Myt1 kinase를 Hek293 세포에 형질전환 시킨 후 세포내의 위치를 관찰하였을 때, Wee1A와 Wee1B는 핵 내에 주로 존재하는 반면에 Myt1 kinasc는 주로 핵 외부의 ER부위에 존재하였다(Fig. 2). 이는 Wee1A와 Wee1B에만 nuclear localization signal (NLS)로 추정되는 아미노산 서열이 존재하고 Myt1에는 존재하지 않는다는 사실과 일치한다. 그러므로 본 연구에서는 주로 Wee1A와 Wee1B를 비교하여 그들의 차이점을 규명하고자 하였다.</p><p>Wee1A와 Wee1B의 차이점을 규명하고자 각각의 유전자를 in vitro에서 mMessage mMachine \( { }^{\mathrm{TM}} \)을 이용하여 mRNA로 전사한 후, 일정량의 mRNA를 발톱개구리의 stage IV 난자에 미세 주사하였다. 개구리의 난자는 세포주기가 G2의 마지막 상태에 정지 되어있는데, 분리된 난자에 progesterone, insulin 또는 insulin like growth factor(IGF)를 처리하면 세포주기가 재개된다. 개구리 난자의 세포주기 재개는 동물극쪽에 생성되는 백색 반점의 유무로 관찰할 수 있다. 각각 다양한 양의 Wee1A 또는 Wee1B mRNA를 주사한 후 단백질이 합성되고 축적될 수 있도록 16시간을 배양하였다. 그 후 각자의 난자에 \( 500 \mathrm{ng} \)의 progesterone을 처리하고, 8 시간 후 난자를 채집하여 단백질의 양을 Westem blot을 이용하여 분석하였다(Fig. 3). Wee1 인산화효소는 세포주기 억제 호소이므로, Wee1A나 Wee1B를 주사한 경우 progestereon에 의해 유도되는 난자세포주기의 재개가 주사한 mRNA의 농도에 비례하여 지연됨을 확인 할 수 있었다(data not shown). 비록 동일양의 mRNA블 주사하였지만 단백질의 발현 정도에는 차이가 있었다. 동일한 vector에 동일한 promotor, 그리고 동일한 3' untranslated region을 이용하여 클로닝을 하였으므로, 이러한 효과는 발현의 차이라는 보다는 발현된 후 단백질의 안정성의 문제라고 사료되었다. 특히 Wee1A의 경우 progesterone 처리 후(세포주기가 재개된 후) 대부분의 단백질이 분해되었고, 일부 단백질은 SDS-PAGE상에서 이동도가 감소하여 더 커다란 크기로 나타나는 것을 볼 수 있다. 이러한 단낵질의 SDS-PAGE상에서의 이동도의 감소 현상은 주로 단백질의 인산화 또는 단백질 분해를 위한 ubiquitina-tion에 의해 일어난다. 단백질의 인산화 정도를 측정하기 위해서 각각의 단백질을 과발현한 후 V5 항체를 이용하여 면역침전법을 수행하였다. 그 후 세포주기 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PKA와 [ \( \left.\gamma^{32} \mathrm{P}\right] \)ATP를 이용하여 PKA에 의한 인산화 정도를 측정하였다(Fig. 4A). 기존에 Wee1B는 PKA에 의해 인산화된다는 보고가 있었으므로 PKA에 의한 Wee1A의 인산화를 관찰하였다. Weel 인산화효소는 자기인산화활성(autophosphorylation activity)을 가지고 있으므로, PKA를 첨가하지 않은 경우에도 Wee1A가 인산화가 됨을 볼 수 있었으나(Fig, 4A, 5,6,8 lanc), PKA를 첨가한 경우 인산화가 증가함을 관찰할 수 있었다.(Fig. 4A, 7 lane). 이러한 인산화는 잘 알려져 있는 PKA의 억제제인 H89를 처리하면 관찰할 수 없었으므로(Fig. 4A, 8 lanc), Wee1A의 인산화는 PKA에 특이적임을 알 수 있다. 이를 확인하기 위하여 in vitro 전사, 해독을 통하여 \( S^{35} \)-Methione이 함유된 단백질을 합성하고 여기에 PKA를 첨가하여 인산화 반응을 시켰을 경우, SDS-PAGE상에서 Wee1A와 Wee1B 단백질의 이동도가 감소함을 관찰 할 수 있었다(data not shown). 이러한 결과는 PKA에 의해 Wee1A와 Wee1B가 인산화될 수 있음을 증명하는 것이다. 그러나 Wee1A의 PKA에 의한 인산화정도가 미비하므로 다른 인산화효소가 작용하는지를 관찰하였다.</p><p>Wee1A의 경우 세포주기 조절에 관여한다고 알려진 polo like kinase (plk)에 의하여 인산화된다는 것이 보고된 바 있으며, 또한 음성되먹임작용(negative feedback)에 의하여 WeelA의 기질인 \( \mathrm{Cdc} 2 / \mathrm{cyclinB} \) 복합체에 의해 인산화된다는 것이 알려져있다. 이에 본 연구에서는 세포 주기, 세포 증식에 관여한다고 알려진 Akt와 AuroraA 인산화효소 \( [6,9] \)에 의한 Wee1의 인산화를 측정하였다. 이를 위하여 Wee1A 와 Wee1B를 Hek293 세포에 형질전환하고 Akt 유전자를 동시형질전환한 후, 면역침전법을 수행하였다. 분리된 면역침전법을 SDS-PAGE상에서 분리한 후, Akt substrate specific 항체를 이용하여 인산화 정도를 측정하였다. 그림 3B에서 보이는 것처럼 Akt는 Wee1A들 인산화시키고 Wee1B는 인산화시키지 못하였다. 이러한 결과는 Wee1A와 Wee1B의 인산화에 의한 조절 기작이 상이함을 나타낸다. 그러나 Aurora A kinase는 Wee1A, Wee1B 모두를 인산화시키지 않았다 (date not shown).</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>\([\gamma\)-\(^{3} \) P]ATP는 New England Nuclear Science Inc. (Boston, MA)에서, ECL Western blot detention kit는 GE Healthcare (Piscataway, NJ)에서, DMEM과 fetal bovine serum은 Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)에서 구입하였다. mMessage mMachine \( ^{\mathrm{IM}} \)은 Ambion Inc. (Austin, TX)에서 구입하여 사용하였고, 특별한 언급이 없는 한 모든 시약은 Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>개구리 난자에 mRNA의 미세주사</h2><p>PMSG를 주사한 발톱개구리의 난소를 채취한 후, collagenase \( (2.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 처리하여 Stage VI 의 난자를 얻은 후, mMessage mMachine을 이용하여 합성한 일정량의 mRNA를 IM300 micromanipulator (Narishige USA Inc., Long Island, NY)를 이용하여 미세주사 하였다. 12 또는 16 시간 후 난자에 \( 500 \mathrm{nM} \)의 progesterone을 처리하여 세포주기를 재개시켰다. 세포주기의 재개는 동물극 쪽의 백색 반점의 생성유무로 확인하였다. 각 난자 당 \(5 \mu l \)의 Tris buffer ( \( 250 \mathrm{mM} \) sucrose, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-HCl (pH 8.0), \( 0.0.1 \% \) NP40, \( 0.1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 0.2 \mathrm{mM} \) EGTA, \( 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 10 \mathrm{mM} \mathrm{NaF}, 10 \mathrm{mM} \) sodium pyrophosphate, \( 5 \mathrm{mM} \beta \)-mercaptoethanol, \( 1 \mu \mathrm{M} \) microcystin, \( 4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 0.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) pepstatin, \( 0.2 \) \( \mathrm{mM} \mathrm{PMSF} \), and \( 0.5 \mathrm{gg} / \mathrm{ml} \) leupeptin)를 처리하여 파쇄한 후 원심 분리히여 중간층을 SDS PAGE에 사용하였다.</p><h2>세포내에서의 Wee1 단백질의 위치 관찰</h2><p>Hek293 세포에 Wee1A, Wee1B 또는 Myt1을 형질전환한 후 16시간 배양하었다. 세포는 미토콘드리아의 염색을 위해 Mito-Tracker로 1시간 처리하였고, \( 4 \% \) paraformaldehyde를 이용하여 고정시켰다. 핵 부위는 \( 1 \mathrm{~ul} \)의 4'6-Diamidino-2- phenylindole (DAPI) 용액 \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)으로 염색하였다. V5 향체(Invitrogen Corp. Carlsbad, CA)를 \( 1 / 1,000 \)로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고, 다시 FITC가 결함된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)를 \(1:1,000\) 비율로 회석하여 1 시간 반응시킨 후, 형광 현미경 Axio Vision 3.1 (Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.</p><h2>Chimeric construct의 제조</h2><p>WeelA의 1번에서 289번 아미노산과 Wee1B의 1번에서 199번 아미노산을 아미노 도메인으로 명명하고 아미노산이 바뀌지 않도록 redundant codon을 이용하여 PCR 방법으로 Nhel 자리를 생성하여 연결하였다. 사용한 primer는 WeelA: ctgaaagcaacatggctagccggtatacaactgaattc, ctaatatgoctagccgctat gaaaaagaat, Wee1B: attcttttcatagcggctagocatattag, ctaatatggc tagocgctatgaaaagaat이다. 카르복실 쪽은 WeelA의 569, Wee1B의 482 아미노산 이후를 Bfrl 자리를 이용하여 연결하였다. 사용한 primer는 WeelA: caggatgaatcatgaccttangcaactctgtcac, gtgacagagttgcttaaggtcatgattcatcctg. Wee1B: tatggtcta cttaagaatgatccaccc, gtggatcattcttaagtagaccataaaag이다.</p><h2>In vitro kinase assay와 Western blot</h2><p>Hek 293세포를 \(10 \% \) FBS를 포함하는 DMEM (Invitrogen Corp.)에서 \( 70 \% \)가 되도록 배양한 후 Lipofectamine \( 2000^{\text {IM }} \) (Invitrogen Corp.)을 이용하여 Wee1A와 Wee1B를 형질전환하였다. 24시간 후 세포를 Tris-NP40 lysis buffered solution (50 mM Tris \( (\mathrm{pH} 7.6), 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}, 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \(0.01 \% \) \( \mathrm{NP40}, 4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 0.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) pepstatin, \( 0.2 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 1 \mu \mathrm{M} \) microcystin-LR, \( 1 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaVO}_{4} \), and \( 1 \mathrm{mM} \mathrm{NaF} \) )에서 파쇄한 후, 원심분리로 상충액을 분리하였다. \( 1 \mu \mathrm{g} \)의 anti-V5 항체를 이용하여 면역침전한 후 면역침전체를 phosphorylation buffered solution (50 \( \mathrm{mM} \) Tris-HC (pH 7.6), \( 5 \mathrm{mM} \mathrm{MgCl} 21 \mathrm{mM} \mathrm{ATP}, 4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) aprotinin, \( 0.7 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) pepstatin, \( 0.2 \mathrm{mM} \) PMSF, \( 0.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, and \( 500 \mu \mathrm{Ci} / \mathrm{ml}\left[\gamma^{3}{ }^{3} \mathrm{P}\right] \mathrm{ATP}(3,000 \mathrm{Ci} / \mathrm{mmol} \), New England Nuclear Science Inc., Boston, MA)에서 PKA catalytic subunit (Promega Corp., Madison, WI)을 첨가하여 30분간 반응시켰다. 반응물을 \( 8 \% \) SDS-PAGE을 이용하여 분리한 후 필름에 노출시켜 인산화 정도를 측정하였다. Western blot을 위해서는 면역침전물을 SDS-PAGE 후 membrane에 옮겨 V5 항체나 anti-phospho Akt substrate 항체 (Cell Signaling, Danvers, MA)를 2시간 동안 처리하고, \( 1: 5,000 \) 비율로 horseradish peroxidase가 붙은 2차 항체(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 1시간 처리한 후, ECL 방법으로 단백질을 확인하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>Maturation-promoting factor (MPF)로도 불리는 cell division cycle 2 kinase ( cdc2)/cyclinB 복합체는 체세포 분열과 감수 분열의 핵심 조절자로서, 여러 세포주기 조절 신호들을 취합하여, 다양한 단백질을 인산화시킴으로써 세포주기를 조절한다. MPF의 활성은 활성촉진단백질인 cyclin의 결합, 활성억제단백질인 \( \mathrm{p} 27^{k \mathrm{i} p}, \mathrm{p} 21^{\mathrm{dp}} \)등의 결합에 의해 조절되어 지거나, 여러 효소에 의한 인산화, 탈인산화 기작으로 조절되어 진다. CDK activating kinase (CAK)는 MPF를 인산화하여 활성을 촉진하는 반면, Weel, Myt1, Mik 인산화효소는 활성을 억제하고, 반대로 Cdc25 탈인산화요소는 MPF를 활성화시킨다. Weel 인산화효소는 cdc2/cyclinB 복합체의 아미노산서열 중 중간에 잘 보존되어 있는 Tyr15변을 인산화하고, Myt1은 Thr14와 Tyr15를 인산화함으로써 효소 합성을 억제시킨다. 이로 인해 세포는 G2에서 M주기로의 세포 주기 이행이 정지된다. 발톱개구리(Xenopus lacvis)외 난자에는 모계유래의 matemal Xenopus Wee1 (XeWeelA)가 존재하지만, 수정 후에는 집합제 유래의 zygotic WeelB (XeWeelB)가 존재하여 세포주기를 조절한다고 알려져 있다. 이러한 두 개의 인산화화소는 발생단계 특이적, 조직 특이적 발현 양상을 보이는데, WeelA는 난자의 제2감수분열 중기(MII)에서 발현되어 초기 발생단계에 관여하고, Wee1B는 gastrulation 이후의 시기에서부터 발현되어 체세포 분열에 관여한다. 반면에 Myt1 인산화효소는 세포의 발달 과정과 상관없이 발생초기부터 계속적으로 발현된다. Wee1 인산화효소는 또한 Crk화의 결합을 통하여 apoptosis에도 관여한다고 알려져 있다. 포유동물에서는 WeelA가 모든 조직에서 발현됨이 확인되었고, 최근에 발견된 인간 WeelB, 생쥐 WeelB는 주로 난자에서 발현되는 것으로 보아 발톱개구리의 WeelA의 ortholog로 생각되어진다. 이러한 여러 결과들은 Wee1 인산화효소들이 서로 다른 기작에 의해 조절될 것이라는 사실을 암시한다. 특히 WeelA와 WeelB는 효소 활성을 나타내는 kinase 도메인은 높은 서열상동성을 갖지만 아미노 도메인과 카르복실 도메인은 상동성이 떨어진다. 이러한 사실은 Weel 인산화효소의 아미노, 카르복실 도메인에 의한 조절이 두 Wee1 인산화효소의 특징을 결정한다는 추측을 가능케 한다. 그러므로 본 연구에서는 생주 WeelA와 WeelB의 난자 세포주기 조절 능력을 조사하고, PKA와 Akt 인산화효소에 의한 Weel의 인산화 유무를 측정하였으며, 각각의 아미노, 카르복실 도메인을 치환한 chimera 단백질을 제조하여 각 도메인이 효소의 인산화, 효소 단백질 안정성에 미치는 영향을 조사하였다.</p>	생명과학	[ "<p>WeelA와 Wee1B는 거의 동인한 효소 활성 도메인을 가졌음에도 불구하고, 인산화 과정과 분해 가정이 다르게 진행되므로, 각각의 효소의 어느 부위가 이러한 조절 기작에 관여 하는지를 관찰하고자, 각각의 아미노 도메인과 카르복신 도 메인은 상호 치환한 키메라(chimcra) 단백질은 제조하고(Fig.5), 이를 Hek293 세포에 형질전환한 후 그 발현을 확인하였다.", "발현이 확인된 각각의 construct를 이용하여 mRNA를 합성하고, 각각을 발톱개구리의 난자에 주입한 후 progester- one은 처리하여 이동도 감소에 의한 인산화 정도, 그리고 단백질 양의 감소 정도를 측정하였다.", "Fig.", "5에서 보는 바와 같이 WeelA의 아미노 도메인이 존재하는 경우 SDS-PAGE상에서 많은 이동도 감소를 관찰할 수 있었고, 또한 내부분의 단백질이 분해되는 것은 관찰 할 수 있었다.", "이러한 결과는 WeelA의 아미노 도메인이 단백질의 인산화와 안징성 조절에 관여한다는 사실을 제시한다.", "단백질의 조절은 여러 가지 기작에 의해 일어나지만 최근의 연구 결과들은 단백질의 활성 조절 기작으로 기존에 주로 연구되어 오던 인산화와 통한 분해 정도에 많은 관심은 쏟고 있다.", "이러한 단백질의 안정성의 조절에는 많은 신호전달체계가 동시에 작용한다.", "단백질에 uniqitin을 연결하는 uniqitin ligase (E3)는 주로 특이한 아미노산 서열을 인식하는데, 특히 보존된 아미노산 서열의 인산화된 형태를 인식하는 경우가 많다.", "Fig.", "2에서 보듯 WeelA는 세포주기가 진행 됨에 따라 SDS-PAGE 상에서 크기가 증가하고, 또한 양이 줄어드는 것으로 보아 인산화와 ubiqitination 과정을 거쳐 분해가 되는 것으로 생각되어진다.", "최근의 연구 결과 체세포 분열에서는 인간의 Wee1A가 SCF \\( \\beta \\) - TrCP에 의해 ubiquitination 되는 것으로 알려져 있다.", "반면, Wee1B의 아미노 도메인을 포함하는 대부분의 키메라 단백질은 단백질의 인산화에 관여하였으나 적은 이동도 변화를 보였고, 대부분의 단백진이 분해되지 않은 체 남아있었다.", "이러한 사실은 Wee1B의 아미노산 도메인이 다른 인산화 효소에 의해 인산화되나, 이 부위가 단백질의 안정화와 분해 과정에는 관여하지 않는다는 것을 암시한다.", "</p><p>키매라 단백질의 활성 측정을 위하여 각각의 키메라의 mRNA를 합성 후 발톱개구리 난자에 주입하고 progesterone 처리 후 새포주기의 재개 정도를 측정하였다", "(Fig. 6).", "</p><p>Wee1 인산화요소는 Cdc2/cyclinB를 인산화하여 그활성을 억제하므로, Wee1 인산화효소의 활성이 클수록 세포주기의 제개가 억제된다.", "동일한 양의 mRNA를 주사한 결과 WeelB 의 아미노 도메인과 WeelA의 카르복실 도메인을 갖는 두 개의 키메라 (Wee1B-CA (BCA), WeelA-NB (ANB))가 가장 잘 세포주기를 억제하는 것으로 보아 WeelB의 아미노 도메인과 Wee1A의 카르복실 도메인이 활성화를 조절하거나, 반대로 Wec1B의 카르복신 도메인과 Wec1A의 아미노 도메인의 인산화효소의 활성화를 억제하는 역할을 하는 것으로 생각된다.", "/<p><p>본 연구에서는 세포 주기를 조절하는 단백질인 Wee1인 산화호소들의 특성읕 다양한 키메라 단백질을 유전자 제조 합 방법을 이용하여 제조하여 비교 분석하였다.", "결과적으로 두 Wee1 인선화효소의 각각 아미노, 카르복실 도메인의 역할을 규명하였고, 인산화와 효소의 활성에 관여하는 여러 연관 인산화효소의 작용기작을 밝히는 기초를 마련하였다.", "이러한 결과들은 두 개의 Wee1 인산화효소가 각각 다른 조직과 다른 종류의 세포에 존재하고, 각각 채세포 분열과 감수 분열에서 특이적인 역할을 하는 이유를 잘 설명해준다.", "각각의 Wee1 kinase를 인산화시키는 효소와 그에 의한 활성의 변화, 그리고 단백질의 안정성 변화에 미치는 영향 등은 추 후에 자세히 연구되어야 할 것이다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>Wee1 인산화효소는 세포주기 조절의 핵심 단백질인 \\( \\mathrm{cdc} 2 / \\mathrm{cyclinB} \\) 복합체를 인산화하여 활성을 억제, 조절하는 주요한 효소이다.", "지금까지 포유동물에서는 Wee1A, Wee1B 그리고 Myt1의 세 가지 효소가 발견되었다.", "Wee1 인산화효소의 조절기작을 연구하기 위하여 생쥐의 Wee1A와 Wee1B를 발톱개구리의 난자에 주사한 후 단백질의 변형을 관찰하였다.", "이 세포주기 과정에서 두 효소는 모두 인산화 되었으며, Wee1A 단백질은 분해되는 것을 관찰 할 수 있었다.", "또한 세포의 인산화 방법을 통하여 Wee1A가 PKA와 Akt에 의해 인산화됨을 확인하였다.", "이러한 Wee1 인산화효소의 인산화와 단백질 안정성에 영향을 미치는 단백질 내의 부위를 살펴보고자, Wee1A와 Wce1B의 아미노 도메인과 카르복실 도메인을 서로 치환한 단백질을 제조하여 개구리 난자에 주사하고 인산화 정도와 단백질의 안정성을 조사하였을 때, Wee1A의 아미노 도메인이 단백질의 인산화와 안정화에 중요하 영향을 미친다는 것을 규명하였다.", "그리고. Wee1B의 아미노 도메인과 Wee1A의 카르복실 도메인은 효소의 활성을 조절하는 역할을 한다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><p>지금까지 포유동물에는 Wee1A, Wee1B 그리고 Myt1, 3 가지 종류의 Weel kinase가 존재한다고 알려져 있다.", "생쥐의 Wee1A 단백질과 Wee1B 단백질은 \\( 26 \\% \\)의 아미노 도메인 상동성을 갖고, \\( 38 \\% \\)의 카로복실 도메인, kinase 활성을 갖는 중간 도메인은 매우 높은 \\( 73 \\% \\)의 상동성을 갖는다.", "그러나 Myt1 인산화효소는 kinase 도메인을 제외하고는 다른 Wacl kinase들과 거의 상동성을 나타내지 않는다(Fig. 1).", "V5가 달린 Wee1A, B 그리고 Myt1 kinase를 Hek293 세포에 형질전환 시킨 후 세포내의 위치를 관찰하였을 때, Wee1A와 Wee1B는 핵 내에 주로 존재하는 반면에 Myt1 kinasc는 주로 핵 외부의 ER부위에 존재하였다", "(Fig. 2).", "이는 Wee1A와 Wee1B에만 nuclear localization signal (NLS)로 추정되는 아미노산 서열이 존재하고 Myt1에는 존재하지 않는다는 사실과 일치한다.", "그러므로 본 연구에서는 주로 Wee1A와 Wee1B를 비교하여 그들의 차이점을 규명하고자 하였다.", "</p><p>Wee1A와 Wee1B의 차이점을 규명하고자 각각의 유전자를 in vitro에서 mMessage mMachine \\( { }^{\\mathrm{TM}} \\)을 이용하여 mRNA로 전사한 후, 일정량의 mRNA를 발톱개구리의 stage IV 난자에 미세 주사하였다.", "개구리의 난자는 세포주기가 G2의 마지막 상태에 정지 되어있는데, 분리된 난자에 progesterone, insulin 또는 insulin like growth factor(IGF)를 처리하면 세포주기가 재개된다.", "개구리 난자의 세포주기 재개는 동물극쪽에 생성되는 백색 반점의 유무로 관찰할 수 있다.", "각각 다양한 양의 Wee1A 또는 Wee1B mRNA를 주사한 후 단백질이 합성되고 축적될 수 있도록 16시간을 배양하였다.", "그 후 각자의 난자에 \\( 500 \\mathrm{ng} \\)의 progesterone을 처리하고, 8 시간 후 난자를 채집하여 단백질의 양을 Westem blot을 이용하여 분석하였다", "(Fig. 3).", "Wee1 인산화효소는 세포주기 억제 호소이므로, Wee1A나 Wee1B를 주사한 경우 progestereon에 의해 유도되는 난자세포주기의 재개가 주사한 mRNA의 농도에 비례하여 지연됨을 확인 할 수 있었다", "(data not shown).", "비록 동일양의 mRNA블 주사하였지만 단백질의 발현 정도에는 차이가 있었다.", "동일한 vector에 동일한 promotor, 그리고 동일한 3' untranslated region을 이용하여 클로닝을 하였으므로, 이러한 효과는 발현의 차이라는 보다는 발현된 후 단백질의 안정성의 문제라고 사료되었다. 특히 Wee1A의 경우 progesterone 처리 후(세포주기가 재개된 후) 대부분의 단백질이 분해되었고, 일부 단백질은 SDS-PAGE상에서 이동도가 감소하여 더 커다란 크기로 나타나는 것을 볼 수 있다. 이러한 단낵질의 SDS-PAGE상에서의 이동도의 감소 현상은 주로 단백질의 인산화 또는 단백질 분해를 위한 ubiquitina-tion에 의해 일어난다. 단백질의 인산화 정도를 측정하기 위해서 각각의 단백질을 과발현한 후 V5 항체를 이용하여 면역침전법을 수행하였다. 그 후 세포주기 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PKA와 [ \\( \\left.\\gamma^{32} \\mathrm{P}\\right] \\)ATP를 이용하여 PKA에 의한 인산화 정도를 측정하였다(Fig. 4A). 기존에 Wee1B는 PKA에 의해 인산화된다는 보고가 있었으므로 PKA에 의한 Wee1A의 인산화를 관찰하였다. Weel 인산화효소는 자기인산화활성(autophosphorylation activity)을 가지고 있으므로, PKA를 첨가하지 않은 경우에도 Wee1A가 인산화가 됨을 볼 수 있었으나(Fig, 4A, 5,6,8 lanc), PKA를 첨가한 경우 인산화가 증가함을 관찰할 수 있었다.(Fig. 4A, 7 lane). 이러한 인산화는 잘 알려져 있는 PKA의 억제제인 H89를 처리하면 관찰할 수 없었으므로(Fig. 4A, 8 lanc), Wee1A의 인산화는 PKA에 특이적임을 알 수 있다. 이를 확인하기 위하여 in vitro 전사, 해독을 통하여 \\( S^{35} \\)-Methione이 함유된 단백질을 합성하고 여기에 PKA를 첨가하여 인산화 반응을 시켰을 경우, SDS-PAGE상에서 Wee1A와 Wee1B 단백질의 이동도가 감소함을 관찰 할 수 있었다(data not shown). 이러한 결과는 PKA에 의해 Wee1A와 Wee1B가 인산화될 수 있음을 증명하는 것이다. 그러나 Wee1A의 PKA에 의한 인산화정도가 미비하므로 다른 인산화효소가 작용하는지를 관찰하였다.</p><p>Wee1A의 경우 세포주기 조절에 관여한다고 알려진 polo like kinase (plk)에 의하여 인산화된다는 것이 보고된 바 있으며, 또한 음성되먹임작용(negative feedback)에 의하여 WeelA의 기질인 \\( \\mathrm{Cdc} 2 / \\mathrm{cyclinB} \\) 복합체에 의해 인산화된다는 것이 알려져있다. 이에 본 연구에서는 세포 주기, 세포 증식에 관여한다고 알려진 Akt와 AuroraA 인산화효소 \\( [6,9] \\)에 의한 Wee1의 인산화를 측정하였다. 이를 위하여 Wee1A 와 Wee1B를 Hek293 세포에 형질전환하고 Akt 유전자를 동시형질전환한 후, 면역침전법을 수행하였다. 분리된 면역침전법을 SDS-PAGE상에서 분리한 후, Akt substrate specific 항체를 이용하여 인산화 정도를 측정하였다. 그림 3B에서 보이는 것처럼 Akt는 Wee1A들 인산화시키고 Wee1B는 인산화시키지 못하였다. 이러한 결과는 Wee1A와 Wee1B의 인산화에 의한 조절 기작이 상이함을 나타낸다. 그러나 Aurora A kinase는 Wee1A, Wee1B 모두를 인산화시키지 않았다 (date not shown).</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>\\([\\gamma\\)-\\(^{3} \\) P]ATP는 New England Nuclear Science Inc. (Boston, MA)에서, ECL Western blot detention kit는 GE Healthcare (Piscataway, NJ)에서, DMEM과 fetal bovine serum은 Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)에서 구입하였다. mMessage mMachine \\( ^{\\mathrm{IM}} \\)은 Ambion Inc. (Austin, TX)에서 구입하여 사용하였고, 특별한 언급이 없는 한 모든 시약은 Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.</p><h2>개구리 난자에 mRNA의 미세주사</h2><p>PMSG를 주사한 발톱개구리의 난소를 채취한 후, collagenase \\( (2.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}) \\)를 처리하여 Stage VI 의 난자를 얻은 후, mMessage mMachine을 이용하여 합성한 일정량의 mRNA를 IM300 micromanipulator (Narishige USA Inc., Long Island, NY)를 이용하여 미세주사 하였다. 12 또는 16 시간 후 난자에 \\( 500 \\mathrm{nM} \\)의 progesterone을 처리하여 세포주기를 재개시켰다. 세포주기의 재개는 동물극 쪽의 백색 반점의 생성유무로 확인하였다. 각 난자 당 \\(5 \\mu l \\)의 Tris buffer ( \\( 250 \\mathrm{mM} \\) sucrose, \\( 10 \\mathrm{mM} \\) Tris-HCl (pH 8.0), \\( 0.0.1 \\% \\) NP40, \\( 0.1 \\mathrm{mM} \\) EDTA, \\( 0.2 \\mathrm{mM} \\) EGTA, \\( 150 \\mathrm{mM} \\mathrm{NaCl}, 10 \\mathrm{mM} \\mathrm{NaF}, 10 \\mathrm{mM} \\) sodium pyrophosphate, \\( 5 \\mathrm{mM} \\beta \\)-mercaptoethanol, \\( 1 \\mu \\mathrm{M} \\) microcystin, \\( 4 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) aprotinin, \\( 0.7 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) pepstatin, \\( 0.2 \\) \\( \\mathrm{mM} \\mathrm{PMSF} \\), and \\( 0.5 \\mathrm{gg} / \\mathrm{ml} \\) leupeptin)를 처리하여 파쇄한 후 원심 분리히여 중간층을 SDS PAGE에 사용하였다.</p><h2>세포내에서의 Wee1 단백질의 위치 관찰</h2><p>Hek293 세포에 Wee1A, Wee1B 또는 Myt1을 형질전환한 후 16시간 배양하었다. 세포는 미토콘드리아의 염색을 위해 Mito-Tracker로 1시간 처리하였고, \\( 4 \\% \\) paraformaldehyde를 이용하여 고정시켰다. 핵 부위는 \\( 1 \\mathrm{~ul} \\)의 4'6-Diamidino-2- phenylindole (DAPI) 용액 \\( (1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\), Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)으로 염색하였다.", "V5 향체(Invitrogen Corp.", "Carlsbad, CA)를 \\( 1 / 1,000 \\)로 희석하여 상온에서 2시간 반응시키고, 다시 FITC가 결함된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)를 \\(1:1,000\\) 비율로 회석하여 1 시간 반응시킨 후, 형광 현미경 Axio Vision 3.1 (Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.", "</p><h2>Chimeric construct의 제조</h2><p>WeelA의 1번에서 289번 아미노산과 Wee1B의 1번에서 199번 아미노산을 아미노 도메인으로 명명하고 아미노산이 바뀌지 않도록 redundant codon을 이용하여 PCR 방법으로 Nhel 자리를 생성하여 연결하였다.", "사용한 primer는 WeelA: ctgaaagcaacatggctagccggtatacaactgaattc, ctaatatgoctagccgctat gaaaaagaat, Wee1B: attcttttcatagcggctagocatattag, ctaatatggc tagocgctatgaaaagaat이다.", "카르복실 쪽은 WeelA의 569, Wee1B의 482 아미노산 이후를 Bfrl 자리를 이용하여 연결하였다.", "사용한 primer는 WeelA: caggatgaatcatgaccttangcaactctgtcac, gtgacagagttgcttaaggtcatgattcatcctg.", "Wee1B: tatggtcta cttaagaatgatccaccc, gtggatcattcttaagtagaccataaaag이다.", "</p><h2>In vitro kinase assay와 Western blot</h2><p>Hek 293세포를 \\(10 \\% \\) FBS를 포함하는 DMEM (Invitrogen Corp.)에서 \\( 70 \\% \\)가 되도록 배양한 후 Lipofectamine \\( 2000^{\\text {IM }} \\) (Invitrogen Corp.)을 이용하여 Wee1A와 Wee1B를 형질전환하였다.", "24시간 후 세포를 Tris-NP40 lysis buffered solution (50 mM Tris \\( (\\mathrm{pH} 7.6), 150 \\mathrm{mM} \\mathrm{NaCl}, 1 \\mathrm{mM} \\) EDTA, \\(0.01 \\% \\) \\( \\mathrm{NP40}, 4 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) aprotinin, \\( 0.7 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) pepstatin, \\( 0.2 \\mathrm{mM} \\) PMSF, \\( 0.5 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) leupeptin, \\( 1 \\mu \\mathrm{M} \\) microcystin-LR, \\( 1 \\mathrm{mM} \\) \\( \\mathrm{NaVO}_{4} \\), and \\( 1 \\mathrm{mM} \\mathrm{NaF} \\) )에서 파쇄한 후, 원심분리로 상충액을 분리하였다. \\", "( 1 \\mu \\mathrm{g} \\)의 anti-V5 항체를 이용하여 면역침전한 후 면역침전체를 phosphorylation buffered solution (50 \\( \\mathrm{mM} \\) Tris-HC (pH 7.6), \\( 5 \\mathrm{mM} \\mathrm{MgCl} 21 \\mathrm{mM} \\mathrm{ATP}, 4 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) aprotinin, \\( 0.7 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) pepstatin, \\( 0.2 \\mathrm{mM} \\) PMSF, \\( 0.5 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) leupeptin, and \\( 500 \\mu \\mathrm{Ci} / \\mathrm{ml}\\left[\\gamma^{3}{ }^{3} \\mathrm{P}\\right] \\mathrm{ATP}(3,000 \\mathrm{Ci} / \\mathrm{mmol} \\), New England Nuclear Science Inc., Boston, MA)에서 PKA catalytic subunit (Promega Corp., Madison, WI)을 첨가하여 30분간 반응시켰다.", "반응물을 \\( 8 \\% \\) SDS-PAGE을 이용하여 분리한 후 필름에 노출시켜 인산화 정도를 측정하였다.", "Western blot을 위해서는 면역침전물을 SDS-PAGE 후 membrane에 옮겨 V5 항체나 anti-phospho Akt substrate 항체 (Cell Signaling, Danvers, MA)를 2시간 동안 처리하고, \\( 1: 5,000 \\) 비율로 horseradish peroxidase가 붙은 2차 항체(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 1시간 처리한 후, ECL 방법으로 단백질을 확인하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>Maturation-promoting factor (MPF)로도 불리는 cell division cycle 2 kinase ( cdc2)/cyclinB 복합체는 체세포 분열과 감수 분열의 핵심 조절자로서, 여러 세포주기 조절 신호들을 취합하여, 다양한 단백질을 인산화시킴으로써 세포주기를 조절한다.", "MPF의 활성은 활성촉진단백질인 cyclin의 결합, 활성억제단백질인 \\( \\mathrm{p} 27^{k \\mathrm{i} p}, \\mathrm{p} 21^{\\mathrm{dp}} \\)등의 결합에 의해 조절되어 지거나, 여러 효소에 의한 인산화, 탈인산화 기작으로 조절되어 진다.", "CDK activating kinase (CAK)는 MPF를 인산화하여 활성을 촉진하는 반면, Weel, Myt1, Mik 인산화효소는 활성을 억제하고, 반대로 Cdc25 탈인산화요소는 MPF를 활성화시킨다.", "Weel 인산화효소는 cdc2/cyclinB 복합체의 아미노산서열 중 중간에 잘 보존되어 있는 Tyr15변을 인산화하고, Myt1은 Thr14와 Tyr15를 인산화함으로써 효소 합성을 억제시킨다.", "이로 인해 세포는 G2에서 M주기로의 세포 주기 이행이 정지된다.", "발톱개구리(Xenopus lacvis)외 난자에는 모계유래의 matemal Xenopus Wee1 (XeWeelA)가 존재하지만, 수정 후에는 집합제 유래의 zygotic WeelB (XeWeelB)가 존재하여 세포주기를 조절한다고 알려져 있다.", "이러한 두 개의 인산화화소는 발생단계 특이적, 조직 특이적 발현 양상을 보이는데, WeelA는 난자의 제2감수분열 중기(MII)에서 발현되어 초기 발생단계에 관여하고, Wee1B는 gastrulation 이후의 시기에서부터 발현되어 체세포 분열에 관여한다.", "반면에 Myt1 인산화효소는 세포의 발달 과정과 상관없이 발생초기부터 계속적으로 발현된다.", "Wee1 인산화효소는 또한 Crk화의 결합을 통하여 apoptosis에도 관여한다고 알려져 있다.", "포유동물에서는 WeelA가 모든 조직에서 발현됨이 확인되었고, 최근에 발견된 인간 WeelB, 생쥐 WeelB는 주로 난자에서 발현되는 것으로 보아 발톱개구리의 WeelA의 ortholog로 생각되어진다.", "이러한 여러 결과들은 Wee1 인산화효소들이 서로 다른 기작에 의해 조절될 것이라는 사실을 암시한다.", "특히 WeelA와 WeelB는 효소 활성을 나타내는 kinase 도메인은 높은 서열상동성을 갖지만 아미노 도메인과 카르복실 도메인은 상동성이 떨어진다.", "이러한 사실은 Weel 인산화효소의 아미노, 카르복실 도메인에 의한 조절이 두 Wee1 인산화효소의 특징을 결정한다는 추측을 가능케 한다.", "그러므로 본 연구에서는 생주 WeelA와 WeelB의 난자 세포주기 조절 능력을 조사하고, PKA와 Akt 인산화효소에 의한 Weel의 인산화 유무를 측정하였으며, 각각의 아미노, 카르복실 도메인을 치환한 chimera 단백질을 제조하여 각 도메인이 효소의 인산화, 효소 단백질 안정성에 미치는 영향을 조사하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "생쥐 Wee1 인산화효소들의 각 도메인의 역할에 관한 연구", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-aa4f4048-ea95-48ae-9c81-6fd8f795ee2d", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "한승진" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", 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5,301	<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주, 플라스미드와 배양조건</h2><p>실험에 사용한 균주와 플라스미드는 Table 1에 나타내었다. Escherichia coli균은 플라스미드의 형질전환을 위한 donor로 사용되었다. B. bronchiseptica의 액체배양을 위해 Luria-Bertani(LB)배지를 사용하였고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24시간 배양하였다. 고체배양은 LB 배지에 \( 1.5 \%\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) agar를 함유하는 평판배지에서 수행하였다. B. bronchiseptica의 야생형의 alcaligin siderphore 생합성 정도를 확인하기 위해서는 Chrome Azurol S (CAS)배지를 사용하였다. 사용된 CAS배지는 Stainer-Scholte (SS) basal medium (sodium glutamate \( 10.72 \mathrm{~g} \), L-proline \( 0.24 \mathrm{~g} \),\( \mathrm{NaCl} 2.50 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} 0.50 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{KCl} \) \(0.20 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.10 \mathrm{g} \), \( \mathrm{CaCl}_{2} 0.02 \mathrm{~g} \), Tris \( \left.1.52 \mathrm{~g} / 1000 \mathrm{ml} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}\right) \) 와 SS vitamins (100배 농축 stock: L-cystine \( 0.4 \mathrm{~g}\), \(\mathrm{FeSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\) \(0.1 \mathrm{~g} \), ascorbic acid \( 0.2 \mathrm{~g} \), nicotinamide \( 0.04 \mathrm{~g} \), glutathione \( 1.00 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{ml} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O} \) )을 첨가한 배지로서 자세한 제조법은 선행 연구에서 이용된 방법을 사용하였다. CAS 배지에 사용되는 모든 초자기구들은 \( 4 \mathrm{M} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 로 세척을 한 후 3차 증류수로 세척을 행하여 철 성분을 제거하였다.</p><p>Allelic exchange 방법에 의한 돌연변이주를 구축하기 위해서 \( 5 \% \) sucrose가 첨가된 LB agar 배지를 사용하였고, 실험의 단계에 따라 선택적으로 ampicillin (Ap), tetracycline (Tet), diaminopimelic acid (DAP)을 각각 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(15 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 씩 배지에 첨가하여 사용하였다.</p><h2>유전자 조작</h2><p>유전자 조작은 Sambrook et al.의 방법으로 실시하였다. E. coli로의 형질 전환은 calcium chloride 방법 또는 electroporation법으로 실시하였다. Nucleotide sequencing은 ABI 373 automatic sequencer (PE Applied Biosystems)에 의해 실시되었다.</p><p>B. bronchiseptica의 염색체 DNA를 template로 하여 AccuPower HL PCR premix (Bioneer) \( 20 \mu \mathrm{l} \) 에 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR은 Applied Biosystems (Gene Amp PCR System 2700)를 사용하였고, PCR조건은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 pre-denaturation시킨 후 denaturation은 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, annealing 은 \( 55^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분, extension은 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1분으로 30 cycle을 수행하고 마지막 chain extension을 위해 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분간 반응하였다. 얻어진 PCR 산물은 TAE \( (40 \mathrm{mM} \) Tris acetate, \( 1 \mathrm{mM} \) EDTA, \(\mathrm{pH} 8.0\)) buffer를 사용한 \(0.8\%\) agarose gel 상에서 전기영동을 통해 확인하였다. PCR에 사용된 oligonucleotide primers는 Bioneer Co. (Cheongwon, Korea)에서 주문 제작하였고, 사용된 oligonucleotide들의 염기서열은 Table 2에 나타내었다.</p><h2>pHS1과 pHS2의 구축</h2><p>Alcaligin 생합성에 관여하는 alc operon을 함유하고 있는 PCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 alcA 부위의 각종 DNA를 증폭시키기 위하여 각 부위에 특이적인 primer(Table 2)들을 제작하였다.</p><p>alcA 결손 돌연변이주를 구축하기 위하여 pCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 primer sF와 aR를 이용해서 alcA 의 5'-flanking DNA fragment를 PCR법으로 증폭하였고 얻어진 산물을 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 sub-cloning하고 이를 pHS1이라 명명하였다. 동일한 방법으로 pCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 primer s1F와 a1R를 이용해서 alcA의 3'-flanking DNA fragment를 PCR법으로 증폭하여 얻어진 산물을 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 subcloning한 후 제한효소 BamHI 과 SacI 를 처리하여 얻어진 3'-flanking DNA를 동일한 제한효소로 처리된 pHS1 플라스미드에 cloning하여 플라스미드 pHS2을 구축하였다.</p><h2>재조합 플라스미드 pDM1의 구축</h2><p>Allelic exchange 방법에 의한 alcA 유전자 결손 돌연변이 균주를 얻기 위하여 suicide vector인 pDMS197 plasmid를 사용하여 recombinant suicide vector plasmid pDM1을 구축하였다. 제한효소 KpnI과 SacI 으로 처리된 pDMS197 DNA vector에 pHS2를 KpnI / SacI 으로 처리하여 얻어진 5'- 및 3'-flanking을 포함하는 DNA fragment를 ligation한 후 E. coli \(\chi\) 7213으로 형질전환하여 recombinant suicide vector pDM1을 구축하였다.</p><h2>Allelic exchange에 의한 alcaligin siderophore을 생합성하는 유전자의 불활성화 돌연변이체 선발</h2><p>pDM1을 포함하는 E. coli \(\chi\)7213으로부터 수용체인 B. bronchiseptica로 접합에 의해 suicide plasmid를 도입하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 분광 광도기를 이용하여 \( 660\mathrm{nm} \) 에서 흡광도 \(0.8\sim1.0\) 정도까지 배양한 후 donor:recipient 를 \(4:1\)의 비율로 하여 \( 12,000 \mathrm{rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}\), 5분간 원심분리한 후 pellet을 얻었다. 얻어진 pellet을 LB broth \( 1 \mathrm{ml} \) 에 완전히 resuspension 시킨 후, \( 12,000 \mathrm{rpm}\), \(4^{\circ} \mathrm{C}\), 5분간 원심분리하여 pellet을 얻는 과정을 3회 반복한 후 각각의 pellet을 LB broth \( 30 \mu \mathrm{l} \) 에 녹여 donor와 recipient를 잘 혼합하여 DAP을 함유하는 LB 고체 배지에 접종한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 18시간 배양하여 mating하였다. Single crossover가 이루어진 돌연변이 균주를 tetracycline을 함유하는 LB 액체배지에서 선택배양하여 \(5\%\) sucrose가 첨가된 LB 고체평판배지에 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 정도 도말한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 18 시간 배양하여 선별하였다. Counter-selection을 위해 \(5\%\) sucrose를 함유하는 LB 고체평판배지와 tetracycline을 함유하는 LB 고체평판배지에서 replica method로 균을 toothpicking하여 \(5\%\) sucrose를 함유하는 평판배지에서는 집락을 이루고 tetracycline 배지에서는 생육하지 않는 colony를 선별하였다. 선별된 균의 염색체 DNA를 추출해서 alcA mutant identification primer(Table2)들을 사용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 대조군으로 B. bronchiseptica 야생형을 동일한 primer들을 사용하여 DNA의 크기를 비교함으로서 alcA 유전자의 결손여부를 확인하였다.</p><h2>CAS 활성에 의한 alcaligin siderophore의 검출</h2><p>alcA 유전자가 결손된 B. bronchiseptica H1로부터 alcaligin siderophore의 생합성을 검출하기 위해서 CAS agar 배지에 도말을 통한 실험을 실시하였다. CAS agar 배지에는 iron이 결핍된 최소배지 M9을 사용하였고, alcaligin siderophore의 활성도는 clear zone의 생성 여부를 육안으로 관찰하였다.</p><h2>alcA 유전자의 complementation assay</h2><p>pCP1.11 플라스미드 DNA가 가지고 있는 alcA 유전자로부터 complementation primer들인 primer-F와 primer-R를 이용해서 PCR을 실시하여 alcA promoter 부위가 포함된 부위부터 alcA를 완전히 포함하는 DNA fragment를 증폭하였고, 이 PCR 산물을 broad-host 영역 플라스미드인 pRK415 vector에 제한효소 BamHI와 HindⅢ를 처리하여 ligation을 실시하였다. 제작된 재조합 플라스미드의 complementation 능력을 확인하기 위하여 플라스미드를 alcA 결손 돌연변이주에 도입하였다. 플라스미드의 형질전환을 확인하기 위해 tetracycline이 첨가된 LB 고체평판배지에서 선별하였고, alcaligin siderphore의 형성 능력은 CAS 고체평판배지상에서 확인하였다.</p> <h1>요 약</h1><p>돼지 위축성 비염과 개의 kennel cough의 원인균인 B. bronchiseptica는 각 숙주의 상부 호흡기관의 점막에 집락을 형성하는 병원균으로서 철이 부족한 환경에서 hydroxamate type의 alcaligin이라는 siderophore를 생산한다. Alcaligin의 생합성에 관련하는 구조유전자 중 alcA 유전자의 기능을 밝히고자 alcA 결손돌연변이주 구축을 통하여 확인하였다. alcA 유전자 결손 돌연변이를 위해 \( 0.6 \mathrm{~kb} \) alcA 5' flanking DNA와 \( 0.7 \mathrm{~kb} \) alcA 3' flanking DNA fragment들을 pCP1.11을 주형으로 하여 PCR법으로 증폭한 후, 5' flanking과 3' flanking DNA가 연결된 재조합 suicide vector pDM1을 구축하여 세포 접합을 통해 B. bronchiseptica로 도입시켰다. 도입된 pDM1으로부터 allelic exchange법에 의해 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주 B. bronchiseptica H1을 얻을 수 있었다. B. bronchiseptica H1은 야생형인 B. bronchiseptica에 비하여 alcaligin siderophore를 거의 생성하지 못하였다. alc 오페론 중 promoter와 alcA 유전자만을 가지는 재조합 플라스미드를 B. bronchiseptica H1에 도입하였을 때. alcaligin siderophore의 생산이 회복됨을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 alcA 유전자가 alcaligin 생합성에서 매우 중요한 역할을 수행하는 것을 알 수 있었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>alcA 유전자가 결손된 재조합 suicide plasmid 구축을 위한 subcloning</h2><p>B. bronchiseptica의 alcaligin siderphore 생합성에 관여하는 효소인 ornithine decarboxylase 유전자의 결손 돌연변이주를 활용한 연구에서 alcaligin 생합성의 필수 전구체로 putrescine이 관여한다는 사실은 이미 밝혀져 있다. 이에 alcA 유전자를 결손시키기 위해 먼저 alcaligin 생합성에 관여하는 5 개의 유전자를 함유하는 alc operon을 가지는 pCP1.11 플라스미드 DNA를 주형가닥으로 해서 primer sF와 aR을 이용해서 pHS1의 구축을 위한 실험을 실시하였다. PCR 법으로 얻어진 \( 0.6 \mathrm{~kb} \) alcA 5'-flanking DNA와 pGEM-T easy vector을 ligation시킨 후 E. coli 숙주에 형질전환시켰다. 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 KpnI, KpnI / BamHI을 처리하였을 때 \( 3.6 \mathrm{~kb} \) 및 \( 3.0 \mathrm{~kb} / 0.6 \mathrm{~kb} \) 의 DNA 크기를 확인함으로서 cloning 산물을 확인할 수 있었다(data not shown). pCP1.11 플라스미드 DNA를 주형가닥으로 해서 primer s1F와 a1R을 이용해서 \( 0.7 \mathrm{~kb} \) 의 alcA 3'-flanking DNA를 증폭하였다. 5'-flanking DNA를 함유하고 있는 pHS1 DNA vector에 primer s1F와 a1R을 사용하여 PCR을 통해 획득한 \( 0.7 \mathrm{~kb}\) 3'-flanking DNA를 각각 제한효소 BamHI/Sacl으로 처리하여 ligation시켜 재조합 플라스미드 pHS2를 구축하였다. 플라스미드 pHS2 DNA를 제한효소 SacI, SacI/BamHI을 처리하였을 때 \( 4.3 \mathrm{~kb} \) 와 \( 3.0 \) \( \mathrm{kb} / 1.3 \mathrm{~kb} \) 의 DNA 크기를 확인함으로서 원하는 형태의 재조합 DNA가 구축되었음을 확인할 수 있었다(data not shown).</p><h2>alcA 유전자의 결손돌연변이주 구축</h2><p>alcA의 5'-과 3'-flanking DNA가 연결되어 alcA 유전자가 결손된 재조합 DNA를 함유하고 있는pHS2로부터 이 DNA fragment를 suicide vector pDMS197로 옮기는 실험을 하였다. pHS2에 제한효소 KpnI / SacI 을 처리하여 원하는 재조합 DNA fragment를 잘라내고 동일 제한효소로 처리된 pDMS197과 ligation한 후 \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 방법으로 DAP 요구주인 E. coli \(\chi\)7213에 형질전환하여 alcA 유전자 결손을 위한 재조합 suicide 플라스미드를 제작하였다. 목적 재조합 suicide 플라스미드를 제한효소 KpnI, KpnI/SacI의 처리와 PCR로서 해당 유전자의 크기를 \( 6.9 \mathrm{~kb}, 5.6 \mathrm{~kb} / 1.3 \mathrm{~kb} \) 그리고 \( 1.3 \mathrm{~kb} \) 로 확인하였다(data not shown). 생성된 재조합 suicide 플라스미드를 pDM1으로 명명하였다.</p><p>B. bronchiseptica와 E. coli \(\chi\)7213/pDM1을 \(4:1\)의 비율로서 혼합하여 DAP을 함유한 LB 평판배지상에서 pDM1 plasmid DNA를 접합에 의해 B. bronchiseptica로 전달하였다. 데트라사이클린이 첨가된 LB 고체평판배지상에서 single crossover가 이루어진 균을 일차적으로 선택한 후 double crossover가 일어나서 alcA 유전자가 결손된 mutant을 구축하기 위해 다음 과정을 진행하였다. 일차적으로 선택된 colony를 LB 액체배지에서 2일간 배양하고, \(5\%\) sucrose와 Tet이 첨가된 LB 고체한천배지상에서 tooth picking하여 counter-selection을 실시하였다. \( 5 \% \) sucrose 배지에서만 성장하는 colony를 염색체 DNA를 분리하여 PCR 방법으로 확인한 후 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주를 B. bronchiseptica H1 이라고 명명하였다. alcA 유전자가 결손된 돌연변이주와 야생형에 대해서 CAS 배지상의 alcaligin siderophore의 활성을 비교하였다. B. bronchiseptica H1은 B. bronchiseptica의 야생형과 비교하였을 때 현저히 낮은 alcaligin siderophore의 활성을 나타내었다. 이상의 유전적, 생화학적 실험결과를 통하여 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주를 확인하였으며 B. bronchiseptica H1이라 명명하였다.</p><h2>alcA 유전자의 complementation assay</h2><p>alcA가 결손된 돌연변이주인 Bordetella bronchiseptica H1의 alcA 유전자의 complementation assay을 위해 pCP1.11의 DNA에서 alcA 유전자의 promoter 부위를 포함한 alcA 유전자를 증폭하기 위한 primer로 primer-F와 primer-R을 합성하였다. pCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 promoter를 포함한 alcA 유전자를 증폭시킨 후 pRK 415 벡터에 DNA 단편을 ligation시킨 후 E.coli에 형질전환시켰다. alcA가 재조합된 플라스미드는 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주인 B. bronchiseptica H1에 electroporation법으로 형질전환되었다. alcA 유전자의 활성이 complementation 되었는지 CAS 배지에서 확인하였다. Fig. 5에서 나타나는 바와 같이 alcA 유전자가 결손된 B. bronchiseptica H1은 낮은 alcaligin siderophore의 활성을 보인 반면, 야생형과 alcA 유전자의 complementation이 이루어진 B. bronchiseptica H1/pCalcA은 높은 활성을 보였다. 그러나 B. bronchiseptica H1/pCalcA이 야생형에 비교하여 약간 불완전하게 활성의 회복을 보였는데 그 이유는 명확하게 알 수가 없었다.</p><p>이상의 결과를 종합하면 alcA 유전자는 B. bronchiseptica의 alcaligin siderophore 생합성에 직접적으로 관여한다는 것을 알 수 있었으며, 본 연구에서 구축된 B. bronchiseptica 돌연변이주나 pCalcA 플라스미드는 앞으로 진행 될 AlcA 단백질의 생화학적인 기능 분석에 유용하게 사용될 것으로 사료된다.</p> <h1>서 론</h1><p>Bordetella속의 세균은 사람을 포함한 다양한 동물의 호흡기관에 병을 일으키는 병원성 세균으로서, 그 중에서 Bordetella pertussis는 인간에게 백일해를 유발시키는 원인균이고, Bordetella bronchiseptica는 포유동물의 호흡기관에 집락을 형성하여 질병을 유발한다.</p><p>B. pertussis와 B. bronchiseptica는 호흡기의 점액성 표면에 감염을 일으키지만 혈류를 통해서 다른 조직으로 전이되지 않는 특징을 가진다. 이들 병원균이 감염을 이루게 되는 데는 여러 요소들이 관여하는데 그 중에서 철(iron)이 중요한 요인으로 작용한다. 철은 모든 세포에서 필수 영양소로 작용하는데 진핵 숙주세포 내에서는 단백질에 결합한 형태로 존재하므로 병원성 세균이 획득할 수 있는 자유로운 철(free iron)은 제한적이다. 따라서 병원성 세균들이 감염을 이루는데 있어서 제한된 조건에서 철을 이용할 수 있는 메커니즘을 가동시키는 것이 필수적이다. 또한 철은 세균들에 독성인자로서의 역할도 한다.</p><p>세균은 일반적으로 철을 획득하기 위한 두 가지의 시스템을 이용한다. 그 중 하나는 iron-chelating soluble siderophore로 철에 대한 높은 친화성을 이용하는 방법이고, 다른 하나는 숙주 단백질로부터 세포표면에 있는 transferrin이나 lactoferrin과 같은 특정 수용체를 통해 직접적으로 철을 획득하는 것이다. B. pertussis와 B. bronchiseptica는 putrescine을 전구체로 하여 alcaligin이라는 hydroxamate 형태의 siderophore를 생산하는데 macrocyclic dihydroxamate siderophore alcaligin의 분자구조인 1,8(s),11,8(s)-tetrahydroxy-1,6,11,16-tetraazacycloeicosane-2,5,12,15-tetrone (molecular formula, \( \mathrm{C}_{16} \mathrm{H}_{28} \mathrm{~N}_{4} \mathrm{O}_{8} \); molecular weight, 404)으로 확인되었다.</p><p>Alcaligin의 생합성에는 alcA, alcB, alcC, alcD, alcE 유전자들이 관여하며, 이들 유전자에 대한 Alc-LacZ fusion proteins 연구에서 이 alc 유전자들은 alcA 유전자의 상류 105bp부분에 위치하고 있는 alc promoter의 조절을 받는 operon으로 이루어져 있는 것으로 밝혀졌다. Bordetella에서 추정되는 alcaligin 생합성 경로는 ornithine decarboxylase의 활성에 의해서 putrescine이 생성되고, 만들어진 putrescine이 succinate와 반응하여 succinyl-hydroxy-putrescine이 생성되는 것으로 추정을 하고 있으며, 이 반응은 alcA가 coding하는 AlcA의 아미노산 서열을 바탕으로 유추되는 oxygenase의 활성에 의해 촉매되는 것으로 생각되어지고 있다. 이러한 alcaligine siderophore의 생합성 과정은 여러 측면에서 추정은 되고 있지만 직접적으로 증명된 바는 없다.</p><p>본 연구에서는 alcA 유전자가 B. bronchiseptica의 alcaligin의 생합성에 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위해 alcA 유전자를 결손시킨 B. bronchiseptica의 돌연변이주를 구축한 후 complementation 실험으로 alcaligin siderophore 생합성에 alcA 유전자의 직접적인 관여를 증명하였고 앞으로 행해질 생화학적인 연구를 위한 실험재료를 구축하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주, 플라스미드와 배양조건</h2><p>실험에 사용한 균주와 플라스미드는 Table 1에 나타내었다.", "Escherichia coli균은 플라스미드의 형질전환을 위한 donor로 사용되었다.", "B. bronchiseptica의 액체배양을 위해 Luria-Bertani(LB)배지를 사용하였고 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 24시간 배양하였다.", "고체배양은 LB 배지에 \\( 1.5 \\%\\) \\((\\mathrm{w} / \\mathrm{v}) \\) agar를 함유하는 평판배지에서 수행하였다.", "B. bronchiseptica의 야생형의 alcaligin siderphore 생합성 정도를 확인하기 위해서는 Chrome Azurol S (CAS)배지를 사용하였다.", "사용된 CAS배지는 Stainer-Scholte (SS) basal medium (sodium glutamate \\( 10.72 \\mathrm{~g} \\), L-proline \\( 0.24 \\mathrm{~g} \\),\\( \\mathrm{NaCl} 2.50 \\mathrm{~g}\\), \\(\\mathrm{KH}_{2} \\mathrm{PO}_{4} 0.50 \\mathrm{~g}\\), \\(\\mathrm{KCl} \\) \\(0.20 \\mathrm{~g}\\), \\(\\mathrm{MgCl}_{2} \\cdot 6 \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}\\) \\(0.10 \\mathrm{g} \\), \\( \\mathrm{CaCl}_{2} 0.02 \\mathrm{~g} \\), Tris \\( \\left.1.52 \\mathrm{~g} / 1000 \\mathrm{ml} \\mathrm{~H}_{2} \\mathrm{O}\\right) \\) 와 SS vitamins (100배 농축 stock: L-cystine \\( 0.4 \\mathrm{~g}\\), \\(\\mathrm{FeSO}_{4} \\cdot 7 \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}\\) \\(0.1 \\mathrm{~g} \\), ascorbic acid \\( 0.2 \\mathrm{~g} \\), nicotinamide \\( 0.04 \\mathrm{~g} \\), glutathione \\( 1.00 \\mathrm{~g} / 100 \\mathrm{ml} \\mathrm{~H}_{2} \\mathrm{O} \\) )을 첨가한 배지로서 자세한 제조법은 선행 연구에서 이용된 방법을 사용하였다.", "CAS 배지에 사용되는 모든 초자기구들은 \\( 4 \\mathrm{M} \\mathrm{~H}_{2} \\mathrm{SO}_{4} \\) 로 세척을 한 후 3차 증류수로 세척을 행하여 철 성분을 제거하였다.", "</p><p>Allelic exchange 방법에 의한 돌연변이주를 구축하기 위해서 \\( 5 \\% \\) sucrose가 첨가된 LB agar 배지를 사용하였고, 실험의 단계에 따라 선택적으로 ampicillin (Ap), tetracycline (Tet), diaminopimelic acid (DAP)을 각각 \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}\\), \\(15 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}\\), \\(100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 씩 배지에 첨가하여 사용하였다.", "</p><h2>유전자 조작</h2><p>유전자 조작은 Sambrook et al.의 방법으로 실시하였다.", "E. coli로의 형질 전환은 calcium chloride 방법 또는 electroporation법으로 실시하였다.", "Nucleotide sequencing은 ABI 373 automatic sequencer (PE Applied Biosystems)에 의해 실시되었다.", "</p><p>B.", "bronchiseptica의 염색체 DNA를 template로 하여 AccuPower HL PCR premix (Bioneer) \\( 20 \\mu \\mathrm{l} \\) 에 첨가하여 PCR을 수행하였다.", "PCR은 Applied Biosystems (Gene Amp PCR System 2700)를 사용하였고, PCR조건은 \\( 95^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 5 분간 pre-denaturation시킨 후 denaturation은 \\( 95^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 1분, annealing 은 \\( 55^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 1분, extension은 \\( 72^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 1분으로 30 cycle을 수행하고 마지막 chain extension을 위해 \\( 72^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 7분간 반응하였다.", "얻어진 PCR 산물은 TAE \\( (40 \\mathrm{mM} \\) Tris acetate, \\( 1 \\mathrm{mM} \\) EDTA, \\(\\mathrm{pH} 8.0\\)) buffer를 사용한 \\(0.8\\%\\) agarose gel 상에서 전기영동을 통해 확인하였다.", "PCR에 사용된 oligonucleotide primers는 Bioneer Co. (Cheongwon, Korea)에서 주문 제작하였고, 사용된 oligonucleotide들의 염기서열은 Table 2에 나타내었다.", "</p><h2>pHS1과 pHS2의 구축</h2><p>Alcaligin 생합성에 관여하는 alc operon을 함유하고 있는 PCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 alcA 부위의 각종 DNA를 증폭시키기 위하여 각 부위에 특이적인 primer(Table 2)들을 제작하였다.", "</p><p>alcA 결손 돌연변이주를 구축하기 위하여 pCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 primer sF와 aR를 이용해서 alcA 의 5'-flanking DNA fragment를 PCR법으로 증폭하였고 얻어진 산물을 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 sub-cloning하고 이를 pHS1이라 명명하였다. 동일한 방법으로 pCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 primer s1F와 a1R를 이용해서 alcA의 3'-flanking DNA fragment를 PCR법으로 증폭하여 얻어진 산물을 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 subcloning한 후 제한효소 BamHI 과 SacI 를 처리하여 얻어진 3'-flanking DNA를 동일한 제한효소로 처리된 pHS1 플라스미드에 cloning하여 플라스미드 pHS2을 구축하였다.</p><h2>재조합 플라스미드 pDM1의 구축</h2><p>Allelic exchange 방법에 의한 alcA 유전자 결손 돌연변이 균주를 얻기 위하여 suicide vector인 pDMS197 plasmid를 사용하여 recombinant suicide vector plasmid pDM1을 구축하였다. 제한효소 KpnI과 SacI 으로 처리된 pDMS197 DNA vector에 pHS2를 KpnI / SacI 으로 처리하여 얻어진 5'- 및 3'-flanking을 포함하는 DNA fragment를 ligation한 후 E. coli \\(\\chi\\) 7213으로 형질전환하여 recombinant suicide vector pDM1을 구축하였다.</p><h2>Allelic exchange에 의한 alcaligin siderophore을 생합성하는 유전자의 불활성화 돌연변이체 선발</h2><p>pDM1을 포함하는 E. coli \\(\\chi\\)7213으로부터 수용체인 B. bronchiseptica로 접합에 의해 suicide plasmid를 도입하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 분광 광도기를 이용하여 \\( 660\\mathrm{nm} \\) 에서 흡광도 \\(0.8\\sim1.0\\) 정도까지 배양한 후 donor:recipient 를 \\(4:1\\)의 비율로 하여 \\( 12,000 \\mathrm{rpm}\\), \\(4^{\\circ} \\mathrm{C}\\), 5분간 원심분리한 후 pellet을 얻었다. 얻어진 pellet을 LB broth \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 에 완전히 resuspension 시킨 후, \\( 12,000 \\mathrm{rpm}\\), \\(4^{\\circ} \\mathrm{C}\\), 5분간 원심분리하여 pellet을 얻는 과정을 3회 반복한 후 각각의 pellet을 LB broth \\( 30 \\mu \\mathrm{l} \\) 에 녹여 donor와 recipient를 잘 혼합하여 DAP을 함유하는 LB 고체 배지에 접종한 후 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 배양기에서 18시간 배양하여 mating하였다. Single crossover가 이루어진 돌연변이 균주를 tetracycline을 함유하는 LB 액체배지에서 선택배양하여 \\(5\\%\\) sucrose가 첨가된 LB 고체평판배지에 \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\) 정도 도말한 후 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 배양기에서 18 시간 배양하여 선별하였다. Counter-selection을 위해 \\(5\\%\\) sucrose를 함유하는 LB 고체평판배지와 tetracycline을 함유하는 LB 고체평판배지에서 replica method로 균을 toothpicking하여 \\(5\\%\\) sucrose를 함유하는 평판배지에서는 집락을 이루고 tetracycline 배지에서는 생육하지 않는 colony를 선별하였다. 선별된 균의 염색체 DNA를 추출해서 alcA mutant identification primer(Table2)들을 사용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 대조군으로 B. bronchiseptica 야생형을 동일한 primer들을 사용하여 DNA의 크기를 비교함으로서 alcA 유전자의 결손여부를 확인하였다.</p><h2>CAS 활성에 의한 alcaligin siderophore의 검출</h2><p>alcA 유전자가 결손된 B. bronchiseptica H1로부터 alcaligin siderophore의 생합성을 검출하기 위해서 CAS agar 배지에 도말을 통한 실험을 실시하였다. CAS agar 배지에는 iron이 결핍된 최소배지 M9을 사용하였고, alcaligin siderophore의 활성도는 clear zone의 생성 여부를 육안으로 관찰하였다.</p><h2>alcA 유전자의 complementation assay</h2><p>pCP1.11 플라스미드 DNA가 가지고 있는 alcA 유전자로부터 complementation primer들인 primer-F와 primer-R를 이용해서 PCR을 실시하여 alcA promoter 부위가 포함된 부위부터 alcA를 완전히 포함하는 DNA fragment를 증폭하였고, 이 PCR 산물을 broad-host 영역 플라스미드인 pRK415 vector에 제한효소 BamHI와 HindⅢ를 처리하여 ligation을 실시하였다. 제작된 재조합 플라스미드의 complementation 능력을 확인하기 위하여 플라스미드를 alcA 결손 돌연변이주에 도입하였다. 플라스미드의 형질전환을 확인하기 위해 tetracycline이 첨가된 LB 고체평판배지에서 선별하였고, alcaligin siderphore의 형성 능력은 CAS 고체평판배지상에서 확인하였다.</p> <h1>요 약</h1><p>돼지 위축성 비염과 개의 kennel cough의 원인균인 B. bronchiseptica는 각 숙주의 상부 호흡기관의 점막에 집락을 형성하는 병원균으로서 철이 부족한 환경에서 hydroxamate type의 alcaligin이라는 siderophore를 생산한다. Alcaligin의 생합성에 관련하는 구조유전자 중 alcA 유전자의 기능을 밝히고자 alcA 결손돌연변이주 구축을 통하여 확인하였다. alcA 유전자 결손 돌연변이를 위해 \\( 0.6 \\mathrm{~kb} \\) alcA 5' flanking DNA와 \\( 0.7 \\mathrm{~kb} \\) alcA 3' flanking DNA fragment들을 pCP1.11을 주형으로 하여 PCR법으로 증폭한 후, 5' flanking과 3' flanking DNA가 연결된 재조합 suicide vector pDM1을 구축하여 세포 접합을 통해 B. bronchiseptica로 도입시켰다. 도입된 pDM1으로부터 allelic exchange법에 의해 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주 B. bronchiseptica H1을 얻을 수 있었다. B. bronchiseptica H1은 야생형인 B. bronchiseptica에 비하여 alcaligin siderophore를 거의 생성하지 못하였다. alc 오페론 중 promoter와 alcA 유전자만을 가지는 재조합 플라스미드를 B. bronchiseptica H1에 도입하였을 때. alcaligin siderophore의 생산이 회복됨을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 alcA 유전자가 alcaligin 생합성에서 매우 중요한 역할을 수행하는 것을 알 수 있었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>alcA 유전자가 결손된 재조합 suicide plasmid 구축을 위한 subcloning</h2><p>B. bronchiseptica의 alcaligin siderphore 생합성에 관여하는 효소인 ornithine decarboxylase 유전자의 결손 돌연변이주를 활용한 연구에서 alcaligin 생합성의 필수 전구체로 putrescine이 관여한다는 사실은 이미 밝혀져 있다. 이에 alcA 유전자를 결손시키기 위해 먼저 alcaligin 생합성에 관여하는 5 개의 유전자를 함유하는 alc operon을 가지는 pCP1.11 플라스미드 DNA를 주형가닥으로 해서 primer sF와 aR을 이용해서 pHS1의 구축을 위한 실험을 실시하였다. PCR 법으로 얻어진 \\( 0.6 \\mathrm{~kb} \\) alcA 5'-flanking DNA와 pGEM-T easy vector을 ligation시킨 후 E. coli 숙주에 형질전환시켰다.", "분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 KpnI, KpnI / BamHI을 처리하였을 때 \\( 3.6 \\mathrm{~kb} \\) 및 \\( 3.0 \\mathrm{~kb} / 0.6 \\mathrm{~kb} \\) 의 DNA 크기를 확인함으로서 cloning 산물을 확인할 수 있었다", "(data not shown).", "pCP1.11 플라스미드 DNA를 주형가닥으로 해서 primer s1F와 a1R을 이용해서 \\( 0.7 \\mathrm{~kb} \\) 의 alcA 3'-flanking DNA를 증폭하였다. 5'-flanking DNA를 함유하고 있는 pHS1 DNA vector에 primer s1F와 a1R을 사용하여 PCR을 통해 획득한 \\( 0.7 \\mathrm{~kb}\\) 3'-flanking DNA를 각각 제한효소 BamHI/Sacl으로 처리하여 ligation시켜 재조합 플라스미드 pHS2를 구축하였다. 플라스미드 pHS2 DNA를 제한효소 SacI, SacI/BamHI을 처리하였을 때 \\( 4.3 \\mathrm{~kb} \\) 와 \\( 3.0 \\) \\( \\mathrm{kb} / 1.3 \\mathrm{~kb} \\) 의 DNA 크기를 확인함으로서 원하는 형태의 재조합 DNA가 구축되었음을 확인할 수 있었다(data not shown).</p><h2>alcA 유전자의 결손돌연변이주 구축</h2><p>alcA의 5'-과 3'-flanking DNA가 연결되어 alcA 유전자가 결손된 재조합 DNA를 함유하고 있는pHS2로부터 이 DNA fragment를 suicide vector pDMS197로 옮기는 실험을 하였다.", "pHS2에 제한효소 KpnI / SacI 을 처리하여 원하는 재조합 DNA fragment를 잘라내고 동일 제한효소로 처리된 pDMS197과 ligation한 후 \\( \\mathrm{CaCl}_{2} \\) 방법으로 DAP 요구주인 E. coli \\(\\chi\\)7213에 형질전환하여 alcA 유전자 결손을 위한 재조합 suicide 플라스미드를 제작하였다.", "목적 재조합 suicide 플라스미드를 제한효소 KpnI, KpnI/SacI의 처리와 PCR로서 해당 유전자의 크기를 \\( 6.9 \\mathrm{~kb}, 5.6 \\mathrm{~kb} / 1.3 \\mathrm{~kb} \\) 그리고 \\( 1.3 \\mathrm{~kb} \\) 로 확인하였다", "(data not shown).", "생성된 재조합 suicide 플라스미드를 pDM1으로 명명하였다.", "</p><p>B.", "bronchiseptica와 E. coli \\(\\chi\\)7213/pDM1을 \\(4:1\\)의 비율로서 혼합하여 DAP을 함유한 LB 평판배지상에서 pDM1 plasmid DNA를 접합에 의해 B. bronchiseptica로 전달하였다.", "데트라사이클린이 첨가된 LB 고체평판배지상에서 single crossover가 이루어진 균을 일차적으로 선택한 후 double crossover가 일어나서 alcA 유전자가 결손된 mutant을 구축하기 위해 다음 과정을 진행하였다.", "일차적으로 선택된 colony를 LB 액체배지에서 2일간 배양하고, \\(5\\%\\) sucrose와 Tet이 첨가된 LB 고체한천배지상에서 tooth picking하여 counter-selection을 실시하였다. \\", "( 5 \\% \\) sucrose 배지에서만 성장하는 colony를 염색체 DNA를 분리하여 PCR 방법으로 확인한 후 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주를 B. bronchiseptica H1 이라고 명명하였다.", "alcA 유전자가 결손된 돌연변이주와 야생형에 대해서 CAS 배지상의 alcaligin siderophore의 활성을 비교하였다.", "B. bronchiseptica H1은 B. bronchiseptica의 야생형과 비교하였을 때 현저히 낮은 alcaligin siderophore의 활성을 나타내었다.", "이상의 유전적, 생화학적 실험결과를 통하여 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주를 확인하였으며 B. bronchiseptica H1이라 명명하였다.", "</p><h2>alcA 유전자의 complementation assay</h2><p>alcA가 결손된 돌연변이주인 Bordetella bronchiseptica H1의 alcA 유전자의 complementation assay을 위해 pCP1.11의 DNA에서 alcA 유전자의 promoter 부위를 포함한 alcA 유전자를 증폭하기 위한 primer로 primer-F와 primer-R을 합성하였다.", "pCP1.11 플라스미드 DNA를 template로 하여 promoter를 포함한 alcA 유전자를 증폭시킨 후 pRK 415 벡터에 DNA 단편을 ligation시킨 후 E.coli에 형질전환시켰다.", "alcA가 재조합된 플라스미드는 alcA 유전자가 결손된 돌연변이주인 B. bronchiseptica H1에 electroporation법으로 형질전환되었다.", "alcA 유전자의 활성이 complementation 되었는지 CAS 배지에서 확인하였다.", "Fig.", "5에서 나타나는 바와 같이 alcA 유전자가 결손된 B. bronchiseptica H1은 낮은 alcaligin siderophore의 활성을 보인 반면, 야생형과 alcA 유전자의 complementation이 이루어진 B. bronchiseptica H1/pCalcA은 높은 활성을 보였다.", "그러나 B. bronchiseptica H1/pCalcA이 야생형에 비교하여 약간 불완전하게 활성의 회복을 보였는데 그 이유는 명확하게 알 수가 없었다.", "</p><p>이상의 결과를 종합하면 alcA 유전자는 B. bronchiseptica의 alcaligin siderophore 생합성에 직접적으로 관여한다는 것을 알 수 있었으며, 본 연구에서 구축된 B. bronchiseptica 돌연변이주나 pCalcA 플라스미드는 앞으로 진행 될 AlcA 단백질의 생화학적인 기능 분석에 유용하게 사용될 것으로 사료된다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>Bordetella속의 세균은 사람을 포함한 다양한 동물의 호흡기관에 병을 일으키는 병원성 세균으로서, 그 중에서 Bordetella pertussis는 인간에게 백일해를 유발시키는 원인균이고, Bordetella bronchiseptica는 포유동물의 호흡기관에 집락을 형성하여 질병을 유발한다.", "</p><p>B.", "pertussis와 B. bronchiseptica는 호흡기의 점액성 표면에 감염을 일으키지만 혈류를 통해서 다른 조직으로 전이되지 않는 특징을 가진다.", "이들 병원균이 감염을 이루게 되는 데는 여러 요소들이 관여하는데 그 중에서 철(iron)이 중요한 요인으로 작용한다.", "철은 모든 세포에서 필수 영양소로 작용하는데 진핵 숙주세포 내에서는 단백질에 결합한 형태로 존재하므로 병원성 세균이 획득할 수 있는 자유로운 철(free iron)은 제한적이다.", "따라서 병원성 세균들이 감염을 이루는데 있어서 제한된 조건에서 철을 이용할 수 있는 메커니즘을 가동시키는 것이 필수적이다.", "또한 철은 세균들에 독성인자로서의 역할도 한다.", "</p><p>세균은 일반적으로 철을 획득하기 위한 두 가지의 시스템을 이용한다.", "그 중 하나는 iron-chelating soluble siderophore로 철에 대한 높은 친화성을 이용하는 방법이고, 다른 하나는 숙주 단백질로부터 세포표면에 있는 transferrin이나 lactoferrin과 같은 특정 수용체를 통해 직접적으로 철을 획득하는 것이다.", "B. pertussis와 B. bronchiseptica는 putrescine을 전구체로 하여 alcaligin이라는 hydroxamate 형태의 siderophore를 생산하는데 macrocyclic dihydroxamate siderophore alcaligin의 분자구조인 1,8(s),11,8(s)-tetrahydroxy-1,6,11,16-tetraazacycloeicosane-2,5,12,15-tetrone (molecular formula, \\( \\mathrm{C}_{16} \\mathrm{H}_{28} \\mathrm{~N}_{4} \\mathrm{O}_{8} \\); molecular weight, 404)으로 확인되었다.", "</p><p>Alcaligin의 생합성에는 alcA, alcB, alcC, alcD, alcE 유전자들이 관여하며, 이들 유전자에 대한 Alc-LacZ fusion proteins 연구에서 이 alc 유전자들은 alcA 유전자의 상류 105bp부분에 위치하고 있는 alc promoter의 조절을 받는 operon으로 이루어져 있는 것으로 밝혀졌다.", "Bordetella에서 추정되는 alcaligin 생합성 경로는 ornithine decarboxylase의 활성에 의해서 putrescine이 생성되고, 만들어진 putrescine이 succinate와 반응하여 succinyl-hydroxy-putrescine이 생성되는 것으로 추정을 하고 있으며, 이 반응은 alcA가 coding하는 AlcA의 아미노산 서열을 바탕으로 유추되는 oxygenase의 활성에 의해 촉매되는 것으로 생각되어지고 있다.", "이러한 alcaligine siderophore의 생합성 과정은 여러 측면에서 추정은 되고 있지만 직접적으로 증명된 바는 없다.", "</p><p>본 연구에서는 alcA 유전자가 B. bronchiseptica의 alcaligin의 생합성에 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위해 alcA 유전자를 결손시킨 B. bronchiseptica의 돌연변이주를 구축한 후 complementation 실험으로 alcaligin siderophore 생합성에 alcA 유전자의 직접적인 관여를 증명하였고 앞으로 행해질 생화학적인 연구를 위한 실험재료를 구축하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Bordetella bronchiseptica의 alcaligin siderophore 생합성 유전자인 alcA에 관한 연구", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-9eaefee4-7ace-41e3-add0-311d06d4437a", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2006", "doc_author": [ "황소순", "김영희", "김삼웅", "유종언", "유아영", "강호영", "이태호" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,302	<h1>서 론</h1><p>막걸리는 한국의 민속주의 하나로 발효제와 전분질의 곡물을 이용하여 빚은 발효주로 알코올 함량이 6 ~ 8도인 저 도수의 알코올음료이다. 전통적으로 사용해온 발효제인 누룩은 대량 생산이 어렵고 다양한 microflora에 의해 막걸리의 품질안정성을 확보하는 데 어려움을 가지고 있어 1940년대 이후 발효제의 생산기간이 짧고 위생 및 당화력 등 품질 안정성이 높은 입국, 분국 및 효소제 등으로 발전해오고 있다. 전분질의 곡물은 주로 쌀을 이용하고 있으나 좁쌀, 조, 기장 등도 활용되고 있으며 최근에는 지역의 특산물인 구기자, 문맥동, 감초, 박하, 오미자, 백년초, 홍삼 등을 첨가하여 소비자 기호를 높일 수 있는 다양한 막걸리가 생산되고 있다.</p><p>막걸리는 전분질의 곡물을 이용하여 발효되기 때문에 곡물의 종류에 따라 차이는 있지만 풍부한 탄수화물과 단백질을 포함하고 있으며 특히, 발효미생물인 유산균과 효모의 발효과정에서 생산된 유기산, 아미노산, 비타민, aromatic flavors 등으로 인하여 영양학적인 가치뿐만 아니라 독특한 맛과 향에 대한 특성이 보고되고 있다. 또한 막걸리는 미생물의 발효과정 동안 생산된 산물로부터 항산화, 다양한 생리활성이 밝혀지고 있어 건강식품으로 그 가치가 재평가되고 있다.</p><p>전통적인 미생물학적인 방법의 제한은 선택배지를 이용한 배양방법에 의해 세균, 유산균, 효모 등 미생물 균총의 변화에 한정되어 있으며 막걸리의 발효과정 동안 미생물군집의 구조와 다양성을 특성화하는 데 문제점을 안고 있다. 그러나 지난 수 십년 동안 분자생물학적 기술은 미생물군집의 구조와 다양성을 밝히기 위해 이용되었으며 미생물들은 16S 또는 28S rRNA gene과 같은 분자마커를 이용한 동정을 위해 흔히 사용되어 왔다. 미생물생태학의 연구는 군집구조 연구를 위한 molecular fingerprinting기술을 제공하는 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)와 temperature gradient gel electrophoresis (TGGE)의 도입으로 크나 큰 발전을 가져왔다. DGGE분석에서 16S 또는 28S rRNA gene의 크기는 동일하나 서열이 다른 PCR산물을 분리할 수 있었으며 이 기술은 토양, 해양, 곤충, sludge 등 다양한 환경에서 미생물의 dynamics 연구를 위해 광범위하게 적용되어 왔다. 또한 이러한 방법은 누룩, 김치, 와인, sausage, sourdough, coffee, 치즈와 같은 식품의 발효과정에서 미생물의 다양성 연구를 위해 광범위하게 이용되어 왔다.</p><p>본 연구에서는 국내에서 유일하게 전통방식에 의해 생산되는 금정산성 막걸리의 발효과정에 따른 특성을 조사하였으며 특히, 16S와 28S rRNA 유전자를 이용한 PCR-DGGE분석을 이용하여 전통 막걸리의 발효과정 동안 미생물군집(세균과 진균) 구조와 다양성에 대한 연구를 수행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>막걸리의 제조</h2><p>막걸리의 제조는 (유)금정산성토산주에서 제조하는 금정산성 막걸리의 전통제조방식에 의해 조제하였다. 냉각순환 시스템이 설치된 1,000 1 용량의 스테인레스 용기에 증자된 멥쌀, 전통누룩((유)금정산성토산주 자체생산), 물을 첨가하여 혼합시켰다. 이후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지하여 6일간 발효시켰다. 시료는 0, 1, 2, 3, 5, 6일째에 발효조를 혼합한 후 2 1의 시료를 채취하여 냉장상태로 실험실에 운반한 후 미생물, 이화학 및 DGGE분석을 수행하였다.</p><h2>미생물 계수 및 분리</h2><p>균질화된 막걸리 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 생리식염수 \( 9 \mathrm{ml} \) 에 첨가한 후 연속 희석법에 의해 희석한 후 일반세균은 Plate Count Agar (PCA; Difco, USA)배지에 진균은 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco, USA)배지에 도말하여 접종하였다. 배양은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수행하였으며 PCA는 3 일간 그리고 PDA는 5일간 배양 한 후 성장된 집락(colony)을 계수하였다. 미생물의 분리는 성장된 집락의 모양과 색을 기준으로 동일배지를 이용하여 분리하였으며 순수 분리된 균주는 \( 20 \%(\mathrm{v}/\mathrm{v})\) glycerol용액에 현탁 한 후 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 보존하였다.</p><h2>이화학적 성분분석</h2><p>\( \mathrm{pH} \) 는 \( \mathrm{pH} \) meter (Mettle-Toledo, Switzerland)로 측정하였다. 총산은 \( 1 \% \) phenolphthalein을 지시약으로 하여 \( 0.1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} \) 용액으로 적정하고 적정소비량에 \( 0.009 \) 를 곱하여 시료 중의 산을 lactic acid로 계산하였다. 환원당은 Somogyi 변법에 의해 정량하였고 포도당농도로 환산하였다. 에탄올 함량은 발효액 \( 100 \mathrm{ml} \) 에 증류수 \( 30 \mathrm{ml} \) 을 넣어 증류시켜 증류액 \( 70 \mathrm{ml} \) 에 증류수를 첨가하여 \( 100 \mathrm{ml} \) 로 정용한 후 주정계 (Deakwang Inc., Korea)로 측정하였고 Gay-Lussac 표에 의해 \( 15^{\circ} \mathrm{C} \) 로 보정하여 \(\%(\mathrm{v}/\mathrm{v})\)로 표시하였다.</p><h2>Total genomic DNA 의 추출 및 PCR</h2><p>금정산성 막걸리로부터 세균과 진균의 genomic DNA 추출을 위해 잘 균질화된 \( 30 \mathrm{ml} \) 막걸리는 원심분리(\(15,000\times g\), \(4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 15 \mathrm{~min} \) 한 후 침전물을 회수하여 동결건조하였다. 동결건조된 분말을 막자 사발에 넣어 액체질소를 이용하여 세포파쇄를 하였으며 동일과정을 4회 반복하였다. Genomic DNA의 추출은 권과 손에 기술된 방법에 의해 수행하였다. Genomic DNA를 주형으로 하여 16S rRNA와 28S rRNA gene을 증폭하여 PCR 산물을 획득하였다. 세균은 16S rRNA gene 증폭을 위한 universal primer인 27F primer (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492 R primer (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였다. 진균은 28S rRNA gene의 증폭을 위한 D1/D2영역의 eukaryotic univer-sal primer인 LROR primer (5'-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3')와 LR5 primer (5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3')를 이용하여 증폭하였다. 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다: \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 denaturation 30초, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 annealing 15초, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 extension 1 분 과정을 30 cycle 반복한 후, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5분 동안 post-extension하였다. 반응산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 EtBr로 염색하여 확인 한 다음 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)를 사용해 정제하였다.</p> <h2>초록</h2><p>금정산성 막걸리\(^Ⓡ\)는 전통적인 수제누룩과 쌀로부터 발효된 한국의 전통적인 술이다. 본 연구에서는 막걸리 발효기간 동안 세균과 진균의 다양성을 특성화하기 위해 16S와 28S rRNA 유전차를 목적으로 하는 PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) 분석을 수행하였다. 막걸리 발효기간 동안 PCR-DGGE profile에서 검출된 세균은 16S rRNA 유전자 서열에 기초한 동정결과 Lactdacillus spp. (L. curvatus, L. kisonensis, L. plantarum, L. sakei 및 L. gasseri), Pediococus spp. (P. acidilactici, P. parvulus, P. agglomerans 및 P. pentosaceus), Pantoea spp. (P. agglomerans 및 P. ananatis) 그리고 Citrobacter freundii로 총 12종이었으며, 배양2일 이후 L. curvatus가 주된 우점 종을 형성하였다. 반면 PCR-DGGE profile에서 검출된 진균은 28S rRNA 유전자 서열에 기초한 동정 결과 Pichia kudriavzevii, Saccharomyces crevisiae, Asidia idahoensis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomycopsis fibuligera 및 Torulaspora delbrueckii 6종이었으며 주된 우점 진균은 배양일에서 2 일에 P. kuchiavzevii에서 배양 3일에서 6일에 S. cerevisiae로 전환되었다. 결과적으로 PCR-DGGE분석은 막걸리발효기간 동안 미생물외 구조와 다양성을 이해하는 데 유용한 도구임을 보여주었다.</p> <h2>막걸리 발효에서 PCR-DGGE에 의한 세균 다양성</h2><p>막걸리의 발효기간동안 세균의 다양성을 연구하기 위해 시료로부터 DNA를 추출하여 PCR-DGGE을 수행한 결과를 Fig. 3 에 나타내었다. 발효기간 동안 PCR-DGGE profile상에서 총 22개의 밴드가 검출되었으며, 각 band의 DNA로부터 염기서열을 결정하여 NCBI 의 BLAST search를 통하여 similarity가 가장 높은 종으로 동정하였다. 그 결과 발효기간 동안 PCR-DGGE profile에서 확인된 세균은 유산균군인 Lactobacillus 속 (L. curvatus, L. kisonensis, L. plantarum, L. sakei 및 L. gassert) 이 5종, (Pediococcus 속 P. acidilactici, P. parvulus, P. agglomerans, P. pentosaceus) 이 4종 그리고 Enterobacteriaceae 과에 속하는 Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis와 Citrobacter freundii을 포함하여 총 12 종이 검출되었다. 발효기간 동안 세균의 변화는 발효 2일 전후로 구별되는 차이를 보였다. 즉 \(0 \sim 1\)일째에 band의 밀도를 기준으로 주된 우점종은 P. acidilactici(B7, B14), Pantoea agglomerans(B9), L. gasseri(B15) 및 P. pentosaceus(B11) 였다. 반면 발효 2일째에 주된 우점종은 L. curvatus(B10)와 L. gasseri(B15)로 나타났으며 이후 L. curvatus(B10)는 6일의 막걸리발효 종료까지 주된 우점종을 형성하였다. P. acidilactici(B7, B14), P. pentosaceus(B11), Pantoea agglomerans(B9, B12,B13, B16 \(\sim\)B22)는 발효 2일 이후 band의 밀도가 희미하거나 검출되지 않았다. 발효 2일 이후 우점을 형성하지는 않았지만 검출된 균주는 L. kisonensis(B2), P. parvulus(B3), Citrobacter freundii(B4), L. plantarum(B5, B8)로 나타났다.</p><p>막걸리 발효 및 제품에서 주된 세균군은 유산균으로 알려져 있으며 진 등은 막걸리로부터 103종의 유산균을 분리하여 동정한 결과 7종인 Lactobacillus paracasei, L. arizonensis, L. plantarum, L. harbinensis, L. parabuchneri, L. brevis 및 L. hilgardii을 보고한 바 있다. PCR-DGGE를 이용한 본 연구의 결과와 비교하여 L. plantarum을 제외하고 8종은 처음으로 확인되었다.</p><p>막걸리의 발효제인 누룩으로부터 분리된 유산균은 조와 하에 의해 Leuconostoc mesenteroides 및 L. casei가 보고되었으며 권과 손은 PCR-DGGE분석을 통하여 Lactobacillus mucosae, L. plantarum, Pediococcus pentosaceus 및 Weissella cibaria을 보고한 바 있다. 막걸리 발효과정 동안 주된 우점종인 L. curvatus와 L. gasseri는 bacteriocin을 생성하는 유산균으로 알려져 있다. 김 등은 김치에서 분리된 유산균인 L. curvatus가 생산하는 bacteriocin이 김치발효 중 주된 microflora인 L. delbrueckii, L. fermentum, L. helveticus, L.plantarum, L. monocytogenes 및 P. acidilactici의 성장을 억제하는 것을 보고하였다. 이러한 측면에서 막걸리 발효과정에서 우점종을 형성한 L. curvatus와 L. gasseri는 초기 출현된 균주인 P. acidilactici, Pantoea agglomerans, P. pentosaceus 등의 성장을 제한하였을 가능성을 예측할 수 있다. 따라서 금정산성 막걸리는 L. curvatus와 L. gasseri에 의한 풍부한 유산균에 의해 향과 맛 그리고 식품의 안정성과 보존성 측면에서 타 막걸리와 비하여 그 차별성을 갖는 것으로 사료된다.</p> <h2>막걸리발효에서 PCR-DGGE를 이용한 진균의 다양성</h2><p>막걸리의 발효기간 동안 시료로부터 진균의 변화를 관찰하기 위해 PCR-DGGE기술을 이용한 분석결과를 나타내었다. 발효기간 동안 총 18개의 구별되는band를 확인할 수 있었다. 또한 각 band로부터 DNA는 회수되어 염기서열을 결정하였으며 NCBI의 BLAST search를 통하여 similarity가 가장 높은 종으로 동정하였다. 그 결과 진균의 PCR-DGGE profile에서 확인된 종은 Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae, Asidia idahoensis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomycopsis fibuligera 및 Torulaspora delbrueckii로 6종이었다. 발효기간 동안 진균의 PCR-DGGE profile에서 구별되는 band 변화는 발효 3일 전후로 구분된다. 즉, 발효 0~2일 사이에 우점진균은 P. kudriavzevii (F16, F15, F17,F13)로 점진적으로 밀도가 증가되었으며 그 외 S. cerevisiae(F1, F14)와 A. idahoensis (F11)로 3종이 검출되었다. 발효 3일 이후 P. kudriavzevii (F16)는 급격히 band 밀도가 감소되었으며 반면 S. cerevisiae (F14)는 band밀도가 급격히 증가하여 주된 우점 종을 형성하였다. 이는 Fig 1에서 총 효모성 진균의 변화에서 주된 종의 변화를 PCR-DGGE분석을 통하여 예측할 수 있다. 반면 0일째부터 출현된 A. idahoensis (F11)는 3일부터 band의 밀도가 급격히 감소되었으며 K. marxianus (F4), T. delbrueckii (F2) 및 S. fibuligera (F12)의 band밀도는 약하지만 확인되다. 누룩으로부터 유입된 사상성 진균은 초기에 개체군이 증가하였으나 3일 이후 급격히 감소하는 경향을 나타내었으며 PCR-DGGE분석의 결과, 사상성 진균의 주된 우점 종은 A. idahoensis 로 판단된다. 그러나 배양방법을 통하여 검출되어 분리된 종을 28S rDNA gene서열을 결정하여 NCBI의 BLAST search를 통하여 동정된 균주는 Rhizopus microspores, R. azygosporus, Lichtheimia corymbifera, Mucor racemosus 그리고 Aspergillu oryzae 등이 확인되어(자료 미제시) 배양초기 전분당화에 기여한 것으로 판단된다.</p><p>막걸리의 발효과정 중 배양방법에 의존하여 특정 미생물 군집의 변화만을 관찰할 수 있으나 종의 변화는 관찰할 수 없는 단점을 가지고 있다. PCR-DGGE분석은 막걸리의 발효과정 중 band profile과 각 band로부터 종을 신속하게 동정함으로써 미생물의 구조와 종의 변화를 함께 분석할 수 있는 장점을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 PCR-DGGE분석을 통하여 금정산성 막걸리는 전통누룩으로부터 유입된 총 9종의 유산균이 발효에 관여하며 이중 L. curvatus 가 주된 우점 종을 형성한다는 사실을 알 수 있었으며 이들 유산균에 의해 생산된 풍부한 유기산에 의해 총산이 타막걸리에 비하여 높은 특징을 갖는다는 사실을 확인 할 수 있었다. 발효과정 중 당화를 주도하는 주된 우점균은 A. idahoensis 이며 그 외 다양한 진균을 확인하였다. 또한 알코올발효를 주도하는 균은 S. cerevisiae로 나타났다. 특히, 금정산성 막걸리는 기존 주된 막걸리 제조업체에서 사용하는 발효제인 입국방식이 아닌 전통누룩을 이용한 단발효에 의한 국내 유일의 대표적인 전통 막걸리임을 확인할 수 있었다.</p> <h2>DGGE-PCR</h2><p>DGGE-PCR은 세균과 진균의 경우 모두 16S rRNA와 28S rRNA gene의 증폭산물을 주형으로 nested PCR과 touch down PCR을 병행하여 수행하였다. 16S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp인 338F-GC primer (5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')와 518R primer (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')이었으며 PCR을 위한 조건은 다음과 같다. \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3분 동안 pre-denaturation 한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 denaturation 30초, \( 64 \sim 55^{\circ} \mathrm{C} \) touchdown으로 30초, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 extension 30초 과정을 30 cycle 반복한 후, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 7분 동안 post-extension하였다. 28S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp 인 GCNL-1 primer (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')와 LS-2 primer (5'-ATT AAA CAA CTC GAC TC-3') 이었으며 PCR을 위한 조건은 16S rRNA gene의 경우와 동일하게 수행하였다.</p><h2>DGGE</h2><p>DGGE는 Bio-Rad Dcode \( { }^{\mathrm{TM}} \) universal mutation detection system (Bio-Rad, USA)를 이용하였으며 권과 손에 의해 기술된 방법에 의거하여 수행하였다.</p><h2>DGGE band elution 및 sequencing</h2><p>DGGE profile에서 나타난 band는 절단하여 E-tube에 담은 후 \(100 \mu \mathrm{l}\)의 \(0.1 \times\) TE buffer를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 overnight하였다. 용출된 밴드를 주형DNA로 사용하여 16S rRNA gene은 GC338F와 518R primer로, 26S rRNA gene은 GCNL-1, LS-2 primer를 이용하여 DNA를 증폭 하였다. 증폭된 산물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제 한 뒤 (주)코스모진텍에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.</p><h2>염기서열 분석</h2><p>결정된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool에 등록되어 있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT 운영프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b에 의한 align-ment와 similarity를 통해 sequence data들을 비교하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>미생물학적 요인</h2><p>6일간의 막걸리 발효기간동안 세균과 진균의 수를 계수한 결과는 Fig. 1.과 같다. 세균 수는 초기 \( 3.40 \times 10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 에서 2일째에 \( 1.23 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 로 증가하였으며 5일째에 \( 4.60 \times 10^{10} \) \( \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 수준으로 최고값을 나타내었다. 사상성 진균은 초기 \( 5.67 \times 10^{5} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 에서 2일째에 \( 2.90 \times 10^{7} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 을 유지하였으며 이후 5일째에 \( 10^{5} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 이하로 급격히 감소되었다. 반면 효모의 수는 초기 \( 6.67 \times 10^{4} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 을 시작으로 3일째에 \( 1.01 \times 10^{9} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 수준으로 도달을 하였으며 5일째에 최고치인 \( 3.20 \times 10^{10} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 을 나타내었다. 기존 보고에서 세균과 효모의 최적성장은 대부분 \( 10^{8} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml} \) 수준으로 알려져 있으나, 본 연구의 결과에서 세균과 효모의 수는 기존 보고보다 약 2 order정도 높아 발효속도가 빠른 것으로 판단된다.</p><h2>이화학적 요인</h2><p>막걸리 발효과정 중 \( \mathrm{pH} \), 총산도, 환원당 및 에틸알코올 함량의 변화는 Fig. 2 와 같다. \( \mathrm{pH} \) 는 배양 0일째에 \( \mathrm{pH} 6.5\) 에서 발효 2일째에 \( \mathrm{pH} 4 \) 이하로 감소하였으며 발효종료일까지 \( \mathrm{pH} \) 3.85 4.01을 유지하였다. 총산도는 0일째에 \( 0.01 \% \) 에서 지속적으로 상승하여 발효 6일째에 \( 0.76 \% \) 까지 증가하였다. 환원당은 0일째에 \( 0.31 \% \) 에서 2일째에 최대값인 \( 6.21 \% \) 까지 증가하였으며 그 이후 6일째에 \( 0.8 \% \) 까지 급격히 감소하였다. 에틸알코올 함량은 0일째에 \( 0.48 \% \) 에서 3일째에 \( 2.1 \% \) 까지 서서히 증가하여 5일째에 \( 8.4 \% \) 그리고 6일에 \( 10.8 \% \) 로 급격히 증가하였다.</p><p>상기의 결과로부터 알코올의 생성은 \( \mathrm{pH} \) 감소, 환원당의 증가로 효모의 성장과 알코올생산을 위한 최적조건이 성립된 후 3일 이후 알코올과 총산도의 증가라는 상관관계가 성립됨을 보여주었다. 또한 이러한 경향은 기존의 보고와 일치한다.</p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>막걸리는 한국의 민속주의 하나로 발효제와 전분질의 곡물을 이용하여 빚은 발효주로 알코올 함량이 6 ~ 8도인 저 도수의 알코올음료이다.", "전통적으로 사용해온 발효제인 누룩은 대량 생산이 어렵고 다양한 microflora에 의해 막걸리의 품질안정성을 확보하는 데 어려움을 가지고 있어 1940년대 이후 발효제의 생산기간이 짧고 위생 및 당화력 등 품질 안정성이 높은 입국, 분국 및 효소제 등으로 발전해오고 있다.", "전분질의 곡물은 주로 쌀을 이용하고 있으나 좁쌀, 조, 기장 등도 활용되고 있으며 최근에는 지역의 특산물인 구기자, 문맥동, 감초, 박하, 오미자, 백년초, 홍삼 등을 첨가하여 소비자 기호를 높일 수 있는 다양한 막걸리가 생산되고 있다.", "</p><p>막걸리는 전분질의 곡물을 이용하여 발효되기 때문에 곡물의 종류에 따라 차이는 있지만 풍부한 탄수화물과 단백질을 포함하고 있으며 특히, 발효미생물인 유산균과 효모의 발효과정에서 생산된 유기산, 아미노산, 비타민, aromatic flavors 등으로 인하여 영양학적인 가치뿐만 아니라 독특한 맛과 향에 대한 특성이 보고되고 있다.", "또한 막걸리는 미생물의 발효과정 동안 생산된 산물로부터 항산화, 다양한 생리활성이 밝혀지고 있어 건강식품으로 그 가치가 재평가되고 있다.", "</p><p>전통적인 미생물학적인 방법의 제한은 선택배지를 이용한 배양방법에 의해 세균, 유산균, 효모 등 미생물 균총의 변화에 한정되어 있으며 막걸리의 발효과정 동안 미생물군집의 구조와 다양성을 특성화하는 데 문제점을 안고 있다.", "그러나 지난 수 십년 동안 분자생물학적 기술은 미생물군집의 구조와 다양성을 밝히기 위해 이용되었으며 미생물들은 16S 또는 28S rRNA gene과 같은 분자마커를 이용한 동정을 위해 흔히 사용되어 왔다.", "미생물생태학의 연구는 군집구조 연구를 위한 molecular fingerprinting기술을 제공하는 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)와 temperature gradient gel electrophoresis (TGGE)의 도입으로 크나 큰 발전을 가져왔다.", "DGGE분석에서 16S 또는 28S rRNA gene의 크기는 동일하나 서열이 다른 PCR산물을 분리할 수 있었으며 이 기술은 토양, 해양, 곤충, sludge 등 다양한 환경에서 미생물의 dynamics 연구를 위해 광범위하게 적용되어 왔다.", "또한 이러한 방법은 누룩, 김치, 와인, sausage, sourdough, coffee, 치즈와 같은 식품의 발효과정에서 미생물의 다양성 연구를 위해 광범위하게 이용되어 왔다.", "</p><p>본 연구에서는 국내에서 유일하게 전통방식에 의해 생산되는 금정산성 막걸리의 발효과정에 따른 특성을 조사하였으며 특히, 16S와 28S rRNA 유전자를 이용한 PCR-DGGE분석을 이용하여 전통 막걸리의 발효과정 동안 미생물군집(세균과 진균) 구조와 다양성에 대한 연구를 수행하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>막걸리의 제조</h2><p>막걸리의 제조는 (유)금정산성토산주에서 제조하는 금정산성 막걸리의 전통제조방식에 의해 조제하였다.", "냉각순환 시스템이 설치된 1,000 1 용량의 스테인레스 용기에 증자된 멥쌀, 전통누룩((유)금정산성토산주 자체생산), 물을 첨가하여 혼합시켰다.", "이후 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\)로 유지하여 6일간 발효시켰다.", "시료는 0, 1, 2, 3, 5, 6일째에 발효조를 혼합한 후 2 1의 시료를 채취하여 냉장상태로 실험실에 운반한 후 미생물, 이화학 및 DGGE분석을 수행하였다.", "</p><h2>미생물 계수 및 분리</h2><p>균질화된 막걸리 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 생리식염수 \\( 9 \\mathrm{ml} \\) 에 첨가한 후 연속 희석법에 의해 희석한 후 일반세균은 Plate Count Agar (PCA; Difco, USA)배지에 진균은 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco, USA)배지에 도말하여 접종하였다.", "배양은 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 수행하였으며 PCA는 3 일간 그리고 PDA는 5일간 배양 한 후 성장된 집락(colony)을 계수하였다.", "미생물의 분리는 성장된 집락의 모양과 색을 기준으로 동일배지를 이용하여 분리하였으며 순수 분리된 균주는 \\( 20 \\%(\\mathrm{v}/\\mathrm{v})\\) glycerol용액에 현탁 한 후 \\( -70^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 보존하였다.", "</p><h2>이화학적 성분분석</h2><p>\\( \\mathrm{pH} \\) 는 \\( \\mathrm{pH} \\) meter (Mettle-Toledo, Switzerland)로 측정하였다.", "총산은 \\( 1 \\% \\) phenolphthalein을 지시약으로 하여 \\( 0.1 \\mathrm{~N} \\) \\( \\mathrm{NaOH} \\) 용액으로 적정하고 적정소비량에 \\( 0.009 \\) 를 곱하여 시료 중의 산을 lactic acid로 계산하였다.", "환원당은 Somogyi 변법에 의해 정량하였고 포도당농도로 환산하였다.", "에탄올 함량은 발효액 \\( 100 \\mathrm{ml} \\) 에 증류수 \\( 30 \\mathrm{ml} \\) 을 넣어 증류시켜 증류액 \\( 70 \\mathrm{ml} \\) 에 증류수를 첨가하여 \\( 100 \\mathrm{ml} \\) 로 정용한 후 주정계 (Deakwang Inc., Korea)로 측정하였고 Gay-Lussac 표에 의해 \\( 15^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 로 보정하여 \\(\\%(\\mathrm{v}/\\mathrm{v})\\)로 표시하였다.", "</p><h2>Total genomic DNA 의 추출 및 PCR</h2><p>금정산성 막걸리로부터 세균과 진균의 genomic DNA 추출을 위해 잘 균질화된 \\( 30 \\mathrm{ml} \\) 막걸리는 원심분리(\\(15,000\\times g\\), \\(4^{\\circ} \\mathrm{C} \\), \\( 15 \\mathrm{~min} \\) 한 후 침전물을 회수하여 동결건조하였다.", "동결건조된 분말을 막자 사발에 넣어 액체질소를 이용하여 세포파쇄를 하였으며 동일과정을 4회 반복하였다.", "Genomic DNA의 추출은 권과 손에 기술된 방법에 의해 수행하였다.", "Genomic DNA를 주형으로 하여 16S rRNA와 28S rRNA gene을 증폭하여 PCR 산물을 획득하였다.", "세균은 16S rRNA gene 증폭을 위한 universal primer인 27F primer (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492 R primer (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였다.", "진균은 28S rRNA gene의 증폭을 위한 D1/D2영역의 eukaryotic univer-sal primer인 LROR primer (5'-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3')와 LR5 primer (5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3')를 이용하여 증폭하였다.", "증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다", ": \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 denaturation 30초, \\( 56^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 annealing 15초, \\( 74^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 extension 1 분 과정을 30 cycle 반복한 후, \\( 74^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 5분 동안 post-extension하였다.", "반응산물은 \\( 1.5 \\% \\) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 EtBr로 염색하여 확인 한 다음 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)를 사용해 정제하였다.", "</p> <h2>초록</h2><p>금정산성 막걸리\\(^Ⓡ\\)는 전통적인 수제누룩과 쌀로부터 발효된 한국의 전통적인 술이다.", "본 연구에서는 막걸리 발효기간 동안 세균과 진균의 다양성을 특성화하기 위해 16S와 28S rRNA 유전차를 목적으로 하는 PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) 분석을 수행하였다.", "막걸리 발효기간 동안 PCR-DGGE profile에서 검출된 세균은 16S rRNA 유전자 서열에 기초한 동정결과 Lactdacillus spp.", "(L. curvatus, L. kisonensis, L. plantarum, L. sakei 및 L. gasseri)", ", Pediococus spp.", "(P. acidilactici, P. parvulus, P. agglomerans 및 P. pentosaceus)", ", Pantoea spp.", "(P. agglomerans 및 P. ananatis)", "그리고 Citrobacter freundii로 총 12종이었으며, 배양2일 이후 L.", "curvatus가 주된 우점 종을 형성하였다.", "반면 PCR-DGGE profile에서 검출된 진균은 28S rRNA 유전자 서열에 기초한 동정 결과 Pichia kudriavzevii, Saccharomyces crevisiae, Asidia idahoensis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomycopsis fibuligera 및 Torulaspora delbrueckii 6종이었으며 주된 우점 진균은 배양일에서 2 일에 P. kuchiavzevii에서 배양 3일에서 6일에 S.", "cerevisiae로 전환되었다.", "결과적으로 PCR-DGGE분석은 막걸리발효기간 동안 미생물외 구조와 다양성을 이해하는 데 유용한 도구임을 보여주었다.", "</p> <h2>막걸리 발효에서 PCR-DGGE에 의한 세균 다양성</h2><p>막걸리의 발효기간동안 세균의 다양성을 연구하기 위해 시료로부터 DNA를 추출하여 PCR-DGGE을 수행한 결과를 Fig.", "3 에 나타내었다.", "발효기간 동안 PCR-DGGE profile상에서 총 22개의 밴드가 검출되었으며, 각 band의 DNA로부터 염기서열을 결정하여 NCBI 의 BLAST search를 통하여 similarity가 가장 높은 종으로 동정하였다.", "그 결과 발효기간 동안 PCR-DGGE profile에서 확인된 세균은 유산균군인 Lactobacillus 속 (L.", "curvatus, L.", "kisonensis, L.", "plantarum, L.", "sakei 및 L.", "gassert) 이 5종, (Pediococcus 속 P. acidilactici, P. parvulus, P. agglomerans, P. pentosaceus) 이 4종 그리고 Enterobacteriaceae 과에 속하는 Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis와 Citrobacter freundii을 포함하여 총 12 종이 검출되었다.", "발효기간 동안 세균의 변화는 발효 2일 전후로 구별되는 차이를 보였다.", "즉 \\(0 \\sim 1\\)일째에 band의 밀도를 기준으로 주된 우점종은 P. acidilactici(B7, B14), Pantoea agglomerans(B9), L.", "gasseri(B15) 및 P. pentosaceus(B11) 였다.", "반면 발효 2일째에 주된 우점종은 L.", "curvatus(B10)와 L.", "gasseri(B15)로 나타났으며 이후 L.", "curvatus(B10)는 6일의 막걸리발효 종료까지 주된 우점종을 형성하였다.", "P. acidilactici(B7, B14), P. pentosaceus(B11), Pantoea agglomerans(B9, B12,B13, B16 \\(\\sim\\)B22)는 발효 2일 이후 band의 밀도가 희미하거나 검출되지 않았다.", "발효 2일 이후 우점을 형성하지는 않았지만 검출된 균주는 L.", "kisonensis(B2), P. parvulus(B3), Citrobacter freundii(B4), L.", "plantarum(B5, B8)로 나타났다.", "</p><p>막걸리 발효 및 제품에서 주된 세균군은 유산균으로 알려져 있으며 진 등은 막걸리로부터 103종의 유산균을 분리하여 동정한 결과 7종인 Lactobacillus paracasei, L.", "arizonensis, L.", "plantarum, L.", "harbinensis, L.", "parabuchneri, L.", "brevis 및 L.", "hilgardii을 보고한 바 있다.", "PCR-DGGE를 이용한 본 연구의 결과와 비교하여 L.", "plantarum을 제외하고 8종은 처음으로 확인되었다.", "</p><p>막걸리의 발효제인 누룩으로부터 분리된 유산균은 조와 하에 의해 Leuconostoc mesenteroides 및 L.", "casei가 보고되었으며 권과 손은 PCR-DGGE분석을 통하여 Lactobacillus mucosae, L.", "plantarum, Pediococcus pentosaceus 및 Weissella cibaria을 보고한 바 있다.", "막걸리 발효과정 동안 주된 우점종인 L.", "curvatus와 L.", "gasseri는 bacteriocin을 생성하는 유산균으로 알려져 있다.", "김 등은 김치에서 분리된 유산균인 L.", "curvatus가 생산하는 bacteriocin이 김치발효 중 주된 microflora인 L.", "delbrueckii, L.", "fermentum, L.", "helveticus, L.plantarum, L.", "monocytogenes 및 P. acidilactici의 성장을 억제하는 것을 보고하였다.", "이러한 측면에서 막걸리 발효과정에서 우점종을 형성한 L.", "curvatus와 L.", "gasseri는 초기 출현된 균주인 P. acidilactici, Pantoea agglomerans, P. pentosaceus 등의 성장을 제한하였을 가능성을 예측할 수 있다.", "따라서 금정산성 막걸리는 L.", "curvatus와 L.", "gasseri에 의한 풍부한 유산균에 의해 향과 맛 그리고 식품의 안정성과 보존성 측면에서 타 막걸리와 비하여 그 차별성을 갖는 것으로 사료된다.", "</p> <h2>막걸리발효에서 PCR-DGGE를 이용한 진균의 다양성</h2><p>막걸리의 발효기간 동안 시료로부터 진균의 변화를 관찰하기 위해 PCR-DGGE기술을 이용한 분석결과를 나타내었다.", "발효기간 동안 총 18개의 구별되는band를 확인할 수 있었다.", "또한 각 band로부터 DNA는 회수되어 염기서열을 결정하였으며 NCBI의 BLAST search를 통하여 similarity가 가장 높은 종으로 동정하였다.", "그 결과 진균의 PCR-DGGE profile에서 확인된 종은 Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae, Asidia idahoensis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomycopsis fibuligera 및 Torulaspora delbrueckii로 6종이었다.", "발효기간 동안 진균의 PCR-DGGE profile에서 구별되는 band 변화는 발효 3일 전후로 구분된다.", "즉, 발효 0~2일 사이에 우점진균은 P. kudriavzevii (F16, F15, F17,F13)로 점진적으로 밀도가 증가되었으며 그 외 S.", "cerevisiae(F1, F14)와 A. idahoensis (F11)로 3종이 검출되었다.", "발효 3일 이후 P. kudriavzevii (F16)는 급격히 band 밀도가 감소되었으며 반면 S.", "cerevisiae (F14)는 band밀도가 급격히 증가하여 주된 우점 종을 형성하였다.", "이는 Fig 1에서 총 효모성 진균의 변화에서 주된 종의 변화를 PCR-DGGE분석을 통하여 예측할 수 있다.", "반면 0일째부터 출현된 A. idahoensis (F11)는 3일부터 band의 밀도가 급격히 감소되었으며 K.", "marxianus (F4), T.", "delbrueckii (F2) 및 S.", "fibuligera (F12)의 band밀도는 약하지만 확인되다.", "누룩으로부터 유입된 사상성 진균은 초기에 개체군이 증가하였으나 3일 이후 급격히 감소하는 경향을 나타내었으며 PCR-DGGE분석의 결과, 사상성 진균의 주된 우점 종은 A. idahoensis 로 판단된다.", "그러나 배양방법을 통하여 검출되어 분리된 종을 28S rDNA gene서열을 결정하여 NCBI의 BLAST search를 통하여 동정된 균주는 Rhizopus microspores, R.", "azygosporus, Lichtheimia corymbifera, Mucor racemosus 그리고 Aspergillu oryzae 등이 확인되어(자료 미제시) 배양초기 전분당화에 기여한 것으로 판단된다.", "</p><p>막걸리의 발효과정 중 배양방법에 의존하여 특정 미생물 군집의 변화만을 관찰할 수 있으나 종의 변화는 관찰할 수 없는 단점을 가지고 있다.", "PCR-DGGE분석은 막걸리의 발효과정 중 band profile과 각 band로부터 종을 신속하게 동정함으로써 미생물의 구조와 종의 변화를 함께 분석할 수 있는 장점을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.", "본 연구에서 PCR-DGGE분석을 통하여 금정산성 막걸리는 전통누룩으로부터 유입된 총 9종의 유산균이 발효에 관여하며 이중 L.", "curvatus 가 주된 우점 종을 형성한다는 사실을 알 수 있었으며 이들 유산균에 의해 생산된 풍부한 유기산에 의해 총산이 타막걸리에 비하여 높은 특징을 갖는다는 사실을 확인 할 수 있었다.", "발효과정 중 당화를 주도하는 주된 우점균은 A. idahoensis 이며 그 외 다양한 진균을 확인하였다.", "또한 알코올발효를 주도하는 균은 S.", "cerevisiae로 나타났다.", "특히, 금정산성 막걸리는 기존 주된 막걸리 제조업체에서 사용하는 발효제인 입국방식이 아닌 전통누룩을 이용한 단발효에 의한 국내 유일의 대표적인 전통 막걸리임을 확인할 수 있었다.", "</p> <h2>DGGE-PCR</h2><p>DGGE-PCR은 세균과 진균의 경우 모두 16S rRNA와 28S rRNA gene의 증폭산물을 주형으로 nested PCR과 touch down PCR을 병행하여 수행하였다.", "16S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp인 338F-GC primer (5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')와 518R primer (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')이었으며 PCR을 위한 조건은 다음과 같다. \\", "( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 3분 동안 pre-denaturation 한 후, \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 denaturation 30초, \\( 64 \\sim 55^{\\circ} \\mathrm{C} \\) touchdown으로 30초, \\( 74^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 extension 30초 과정을 30 cycle 반복한 후, \\( 74^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 7분 동안 post-extension하였다.", "28S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp 인 GCNL-1 primer (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')와 LS-2 primer (5'-ATT AAA CAA CTC GAC TC-3') 이었으며 PCR을 위한 조건은 16S rRNA gene의 경우와 동일하게 수행하였다.", "</p><h2>DGGE</h2><p>DGGE는 Bio-Rad Dcode \\( { }^{\\mathrm{TM}} \\) universal mutation detection system (Bio-Rad, USA)를 이용하였으며 권과 손에 의해 기술된 방법에 의거하여 수행하였다.", "</p><h2>DGGE band elution 및 sequencing</h2><p>DGGE profile에서 나타난 band는 절단하여 E-tube에 담은 후 \\(100 \\mu \\mathrm{l}\\)의 \\(0.1 \\times\\) TE buffer를 넣고 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 overnight하였다.", "용출된 밴드를 주형DNA로 사용하여 16S rRNA gene은 GC338F와 518R primer로, 26S rRNA gene은 GCNL-1, LS-2 primer를 이용하여 DNA를 증폭 하였다.", "증폭된 산물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제 한 뒤 (주)코스모진텍에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.", "</p><h2>염기서열 분석</h2><p>결정된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool에 등록되어 있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT 운영프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b에 의한 align-ment와 similarity를 통해 sequence data들을 비교하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>미생물학적 요인</h2><p>6일간의 막걸리 발효기간동안 세균과 진균의 수를 계수한 결과는 Fig. 1.과 같다.", "세균 수는 초기 \\( 3.40 \\times 10^{6} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 에서 2일째에 \\( 1.23 \\times 10^{8} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 로 증가하였으며 5일째에 \\( 4.60 \\times 10^{10} \\) \\( \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 수준으로 최고값을 나타내었다.", "사상성 진균은 초기 \\( 5.67 \\times 10^{5} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 에서 2일째에 \\( 2.90 \\times 10^{7} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 을 유지하였으며 이후 5일째에 \\( 10^{5} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 이하로 급격히 감소되었다.", "반면 효모의 수는 초기 \\( 6.67 \\times 10^{4} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 을 시작으로 3일째에 \\( 1.01 \\times 10^{9} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 수준으로 도달을 하였으며 5일째에 최고치인 \\( 3.20 \\times 10^{10} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 을 나타내었다.", "기존 보고에서 세균과 효모의 최적성장은 대부분 \\( 10^{8} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml} \\) 수준으로 알려져 있으나, 본 연구의 결과에서 세균과 효모의 수는 기존 보고보다 약 2 order정도 높아 발효속도가 빠른 것으로 판단된다.", "</p><h2>이화학적 요인</h2><p>막걸리 발효과정 중 \\( \\mathrm{pH} \\), 총산도, 환원당 및 에틸알코올 함량의 변화는 Fig.", "2 와 같다. \\", "( \\mathrm{pH} \\) 는 배양 0일째에 \\( \\mathrm{pH} 6.5\\) 에서 발효 2일째에 \\( \\mathrm{pH} 4 \\) 이하로 감소하였으며 발효종료일까지 \\( \\mathrm{pH} \\) 3.85 4.01을 유지하였다.", "총산도는 0일째에 \\( 0.01 \\% \\) 에서 지속적으로 상승하여 발효 6일째에 \\( 0.76 \\% \\) 까지 증가하였다.", "환원당은 0일째에 \\( 0.31 \\% \\) 에서 2일째에 최대값인 \\( 6.21 \\% \\) 까지 증가하였으며 그 이후 6일째에 \\( 0.8 \\% \\) 까지 급격히 감소하였다.", "에틸알코올 함량은 0일째에 \\( 0.48 \\% \\) 에서 3일째에 \\( 2.1 \\% \\) 까지 서서히 증가하여 5일째에 \\( 8.4 \\% \\) 그리고 6일에 \\( 10.8 \\% \\) 로 급격히 증가하였다.", "</p><p>상기의 결과로부터 알코올의 생성은 \\( \\mathrm{pH} \\) 감소, 환원당의 증가로 효모의 성장과 알코올생산을 위한 최적조건이 성립된 후 3일 이후 알코올과 총산도의 증가라는 상관관계가 성립됨을 보여주었다.", "또한 이러한 경향은 기존의 보고와 일치한다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "PCR-DGGE를 이용한 막걸리발효에서 미생물 다양성 분석", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a0e4990f-939b-4422-ae1f-89da63dda5e6", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2012", "doc_author": [ "권승직", "안태영", "손재학" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,303	<h1>초록 : Lactobacillus spp. 이용 발효 붉나무의 기능성물질 검색에 대한 연구</h1><p>본 연구에서는 한약재를 Lactobacillus속 균주로 발효시켜 기능성물질을 확인하고자 하였다. 선행연구를 통해 선별한 발효에 사용한 10가지 한약은 \( 100 \% \) methanol로 추출하여 Lactobacillus속 균주와 MRS배지를 첨가하여 사용하였고 발효 후 ethyl acetate로 추출하여 사용하였다. 10가지 중 붉나무를 Lb. brevis KCTC 3498로 발효하고 ethyl acetate로 추출한 추출물에서 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 세포에서 glutamate로 유발된 산화적 손상으로부터 세포 보호효과가 우수했으며, 이는 heme oxygenase-1 단백질 발현에 의한 것임을 밝혔다. 또한, 뇌세포 보호에 heme oxygenase-1 발현의 주요 기전인 Nrf2 핵 내의 전사와 직접적인 연관이 있음을 확인하였다. 붉나무의 발효 전과 후의 항균, 항산화 효과 비교 실험에서는 붉나무를 Lb. plantarum subsp. plantarum KCTC 3108, Lb. fermentum KCTC 3112, Lb. brevis KCTC 3498 균주로 각각 발효한 한약재는 발효 전보다 항산화 활성이 높아지거나 비슷한 수준으로 나타났다. Lb. plantarum subsp. plantarum KCTC 3108, Lb. casei KCTC 3109로 발효한 붉나무 발효액과 ethyl acetate 여액층은 Bacillus subtilis PCI 219, Escherichia coli KCTC 1682, Shigella flexneri KCTC 2517, Vibrio parahaemolyticus KCTC 7471, Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004에 모두 항균활성을 보였다. 붉나무를 Lb. brevis KCTC 3498로 발효하여 ethyl acetate로 추출한 추출물은 B. subtilis PCI 219, E. coli KCTC 1682, S. flexneri KCTC 2517, V. parahaemolyticus KCTC 7471 균주에서 발효한 추출물이 단순 붉나무 추출물보다 높은 항균활성을 보였다.</p>	생명과학	[ "<h1>초록 : Lactobacillus spp.", "이용 발효 붉나무의 기능성물질 검색에 대한 연구</h1><p>본 연구에서는 한약재를 Lactobacillus속 균주로 발효시켜 기능성물질을 확인하고자 하였다.", "선행연구를 통해 선별한 발효에 사용한 10가지 한약은 \\( 100 \\% \\) methanol로 추출하여 Lactobacillus속 균주와 MRS배지를 첨가하여 사용하였고 발효 후 ethyl acetate로 추출하여 사용하였다.", "10가지 중 붉나무를 Lb.", "brevis KCTC 3498로 발효하고 ethyl acetate로 추출한 추출물에서 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 세포에서 glutamate로 유발된 산화적 손상으로부터 세포 보호효과가 우수했으며, 이는 heme oxygenase-1 단백질 발현에 의한 것임을 밝혔다.", "또한, 뇌세포 보호에 heme oxygenase-1 발현의 주요 기전인 Nrf2 핵 내의 전사와 직접적인 연관이 있음을 확인하였다.", "붉나무의 발효 전과 후의 항균, 항산화 효과 비교 실험에서는 붉나무를 Lb.", "plantarum subsp.", "plantarum KCTC 3108, Lb.", "fermentum KCTC 3112, Lb.", "brevis KCTC 3498 균주로 각각 발효한 한약재는 발효 전보다 항산화 활성이 높아지거나 비슷한 수준으로 나타났다.", "Lb.", "plantarum subsp.", "plantarum KCTC 3108, Lb.", "casei KCTC 3109로 발효한 붉나무 발효액과 ethyl acetate 여액층은 Bacillus subtilis PCI 219, Escherichia coli KCTC 1682, Shigella flexneri KCTC 2517, Vibrio parahaemolyticus KCTC 7471, Pseudomonas aeruginosa KCTC 2004에 모두 항균활성을 보였다.", "붉나무를 Lb.", "brevis KCTC 3498로 발효하여 ethyl acetate로 추출한 추출물은 B. subtilis PCI 219, E. coli KCTC 1682, S.", "flexneri KCTC 2517, V.", "parahaemolyticus KCTC 7471 균주에서 발효한 추출물이 단순 붉나무 추출물보다 높은 항균활성을 보였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "", "eng": "Functionality Analysis of Rhus javanica Fermented by Lactobacillus spp." }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a622c0b5-28cf-42cc-8e5e-77a4f0a6ea44", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2013", "doc_author": [ "Dong-Sung Lee", "Min-Su Kang", "Youn-Chul Kim", "Nam-Kyung Im", "Hyun-Su Kim", "Gil-Saeng Jeong" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,304	<h1>결 과</h1><h2>생육특성</h2><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리에 따른 배추의 생육특성인 엽장, 엽폭 및 엽수 등을 조사한 결과를 살펴보면 엽장 및 엽폭은 공히 키토산 1,000배액 처리구에서 가장 높게 나타났다. 전체 엽수에 있어서 외엽수(결구를 형성하고 있지 않은 잎의 수)는 목초액 1,000배액 처리구에서 가장 많았다. 내엽수(결구를 형성하여 식용으로 이용할 수 있는 잎의 수)는 키토산 1,000배액 처리구에서 가장 많았는데 결구배추는 일반적으로 외엽수보다 내엽수가 많은 것이 상품가치가 높다. 내엽수와 외엽수를 합한 총 엽수는 키토산 1,000배액처리구에서 가장 많았다. 이러한 결과로 볼 때 유기농자재 처리농도간에는 100배액 처리보다 1,000배액 처리에서 생육이 비교적 양호하게 나타났는데 이는 엽채류에서 대체적으로 엽면처리 농도가 500~1,000배액을 사용하고 있는데 본 연구에서도 이와 유사한 결과를 보였다. 유기농자재간에는 키토산처리에서, 유기농자재 전 처리구간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 배추의 엽특성이 양호하게 나타났다.</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리에 따른 배추의 생육특성인 주중, 구중, 구고 및 구폭을 조사한 결과를 살펴보면 뿌리를 제외한 포기 전체의 무게인 주중은 키토산 1,000배액 처리구에서 가장 무거웠고, 목초액 100배액 처리구에서는 가장 낮았다. 결구된 부분의 무게인 구중은 키토산 1,000배액 처리구에서 높았고, 결구된 부위의 최대 종경인 구고 및 결구된 부위의 최대 횡경인 구폭은 공히 키토산 1,000배액 처리구에서 가장 높게 나타났다. 이러한 연구결과로 볼 때 처리간에는 무처리구인 대조구에 비해 유기농자재를 사용한 처리구에서 대체적으로 생육이 양호하였으며, 유기농자재간에는 키토산 처리에서 가장 생육이 좋았고, 그 다음으로 EM 활성액 처리, 목초액 처리 순으로 나타났다. 그리고 유기농자재 처리농도간에는 100배액 처리 보다는 1,000배액 처리에서 생육이 좋았고, 유기농자재 전 처리구간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 생육이 양호하였다.</p><p>이상의 결과를 종합하면 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액을 정식 전 토양관주 처리와 정식 후 15일 간격으로 3회 엽면살포하여 배추의 생육특성을 조사한 결과 생육특성에서는 무처리구인 대조구보다 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액을 엽면살포한 처리구에서 다소 생육이 양호하였으며, 유기농자재간에는 키토산이 양호하였고, 전 처리구 간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 배추의 생육이 양호하였다. Jeong 등은 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM의 농도를 각각 100배, 500배 및 1,000배액을 토마토에 엽면살포한 결과 키토산 500배액 처리구에서 초기생육이 양호하였다고 보고하였고, 가지 및 잎상추에서는 키토산과 목초액의 처리농도를 공히 200배액, 400배액 및 800배액으로 처리한 결과 800배액을 엽면처리했을 때 생육이 양호하였다고 하였다. 이런 결과로 볼 때 작물별이나 토질에 따라 다소 차이는 있으나 대체적으로 100배액 처리보다는 500배액 및 1,000배액 처리에서 생육이 양호한 것으로 나타나 본 연구와 유사한 경향을 보였다.</p> <h1>고 찰</h1><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리에 따른 배추의 생육 및 토양 미생물상의 변화에 관한 연구결과를 종합하면 유기농자재 처리에 따른 배추의 생육특성은 대조구에 비해 유기농자재를 엽면살포한 처리구에서 생육이 다소 높게 나타났으며, 유기농자재 간에는 키토산이, 처리농도 간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 엽장, 엽폭, 총 엽수, 주중, 구중, 구고 및 구폭 등이 증가하였는데, 이는 키토산에는 식물 체내의 성장활성제인 Hexosamine의 증가와 키틴, 키토산의 분해 효소인 키티나제, B-13, 글루키나제 작용으로 생리활성이 높아 배추의 생육이 촉진된 것으로 판단된다. Jeong 등은 키토산, 목초액 및 EM의 농도를 각각 100배, 500배 및 1,000배액으로 희석하여 토마토의 초기생육 특성을 조사한 결과 대조구에 비해 유기농자재를 사용한 처리구에서 생육이 양호하였고, 처리간에는 키토산 500배액 처리구에서 초장, 엽면적 및 과중 등이 양호하였다고 보고하였는데 본 시험에서는 500배 엽면살포 농도가 없어 1,000배액 농도에서 생육이 양호하게 나타났는데 이런 결과로 볼 때 100배액보다는 500배액 및 1,000배액 처리에서 생육이 좋아지는 것으로 판단되며, 추후 500배액 및 1,000배액 처리농도에서 작물별, 토성별로 연구가 계속 진행되어야 할 것으로 사료된다. Lee 등은 콩나물 재배시 키토산 처리구가 대조구에 비해 \( 25.4 \% \)의 높은 성장률을 보이고, 중량 또한 \( 8.5 \% \)의 증가를 보인 보고와 Song 등은 Chitosan과 목초액 엽면살포에 의한 감자 플러그 삽목묘의 발근 및 괴경형성효율 시험에서 삽목 10일후부터 4일 간격으로 5회 동안 Chitosan과 목초액을 무처리, \( 500 \mathrm{ppm} \), \( 1,000 \mathrm{ppm} \) 및 \( 2,000 \mathrm{ppm} \) 처리 결과 Chitosan \( 500 \sim 1,000 \mathrm{ppm} \) 및 목초액 \( 2,000 \mathrm{ppm} \)의 농도에서 플러그묘의 초장, 엽수 뿐만 아니라 지상부, 지하부의 묘질이 양호해졌다고 보고와 비슷한 결과를 얻었다.</p><p>토양 미생물상 분설결과 무처리구인 대조구에 비해 유기농자재를 처리한 시험구가 세균, 방선균 및 트리코데마수는 일정한 비율로 증가하였으나 사상균수는 약간 감소한 경향을 보였다. 이러한 결과로 볼 때 토양 중의 생물, 특히 세균의 활성은 주변 토양의 입자나 식물뿌리와 밀접한 관계를 가지고 있으며, 전반적으로 유기농자재 처리가 무처리에 비해 배추의 생육이 좋아졌는데 이는 유기농자재가 배추의 생육촉진에 기여하는 것도 있지만 대부분 토양중의 미생물상에 영향을 미침으로서 토양 미생물수와 양이 증가함으로 근권이 활성화되어 지상부인 작물생육도 다소 양호해지는 것으로 판단된다. 특히 유기농자재를 엽면살포함으로서 세균수는 증대되고, 사상균수는 감소하므로 B/F (Bacteria/Fungi) 비율이 증가하는 것으로 나타나 B/F (Bacteria/Fungi) 비율이 작물생육에 영향을 초래한 것으로 판단된다. Uhm 등은 키토산과 목초액 처리가 고추의 생육 및 양분흡수에 미치는 영향에서 키토산 2,000배액과 목초액 200배액을 경엽살포와 토양관주를 한 후 미생물상을 조사한 결과 사상균수는 관행에 비해 밀도가 감소하는 경향을 보였다고 보고하였는데, 본 시험에서도 희석배수는 상이하였으나 결과는 이와 유사한 경향을 보였다. 일반적으로 키토산는 토양 중 방선균의 밀도를 증가시킴으로서 병원성사상균을 억제시키기 위한 수단으로 사용되어 왔는데, 본 시험의 결과도 이와 비슷한 맥락으로 해석될 수 있다. 따라서 유기농자재의 구성 균종이 배추재배 토양에 안정적으로 정착하여 생존하는 것으로 판단되어 진다.</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM활성액 시험에 있어 처리농도에 따른 작물별, 지역별, 재배조건별 및 토질의 영향에 대한 연구와 체내성분 변화 및 생리 장해현상 에 대한 연구도 앞으로도 계속 수행되어야 할 것으로 본다.</p> <h1>서 론</h1><p>농업에서 그 동안 생산력을 향상시키기 위해 화학비료 및 농약의 무분별한 사용으로 인한 문제점이 부각되기 시작하면서 농업생산의 안전성, 지속성 및 환경보전을 동시에 추구할 수 있는 지속가능하고, 환경친화적인 유기농업에 대한 중요성이 부각되고 있으며, 재배농가도 증가하고 있다. 이와 더불어 최근 국민경제의 상승과 삶의 질적 향상으로 생명, 농산물에 대한 안전 등이 요구되고 있어 친환경농업인 유기농업의 중요성이 높아지고 있다. 유기농업은 농약과 화학비료 대신 각종 유기농자재, 유기질퇴비 등을 사용하여 지력을 증진시킨 후 천적, 미생물농약, 각종 유기농자재를 사용하여 병해충을 예방 · 방제하여 안전하고 영양가치가 높은 농산물을 생산하는 농법을 말한다. 현재 우리나라에서 친환경농산물 생산을 위해 사용 가능한 자재는 크게 토양개량과 작물생육을 위하여 사용이 가능한 자재와 병해충관리를 위하여 사용이 가능한 자재로 나누어 허용하고 있다.</p><p>본 연구는 친환경농산물 생산을 위하여 사용 가능한 자재 중 친환경인증 재배농가에서 많이 사용하고 있는 키토산, 목초액 및 EM (effective microoganism) 활성액을 공시재로로 선정하여 시험을 수행하였다. Chitosan은 게나 가재, 새우 껍데기에 들어 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어낸 키틴의 유도체로서 농업분야에서는 토양개량용 및 병해충방제용으로 사용하고 있는 자재이다. 키토산은 몇가지 식물병원균에 대한 항균활성도 보고되고 있고, 세포의 활성화에 의한 식물체의 생장촉진효과가 있어 작물재배뿐만 아니라 항균활성, 항종양 활성, 콜레스테롤 저하작용 등 임상실험에도 많이 이용되고 있다.</p><p>목초액은 천연목재를 가열하여 탄화하는 과정에서 기화하는 가스를 냉각원리에 의해 기체와 액체로 분리하여 추출한 액제이다. 주로 \( 80 \sim 150^{\circ} \mathrm{C} \)에서 채취되며, 목초액에 함유된 주요산으로서는 초산, 프로피온산, 부틸산 등 6종, 알코올류는 메타놀, 아세톤인 등 10종, 페놀류로서는 크레졸, 에틸페놀 등 12종 및 아세톤이나 에스텔류와 같은 중성물질로 구성되어 있다.</p><p>EM (Effective Microorganisms)은 복합 유용 유기농자재로서 발효 · 정균 · 합성 그리고 항산화물질을 생성하는 미생물 즉 유산균, 효모균, 방선균, 누룩균 및 광합성세균 등 80여 종의 미생물이 포함되어 있는 유기농자재이다. EM은 비옥한 토양속에서 채취한 미생물을 엄선, 합성배양한 것으로 동정결과 Lactobacillus계가 수종이었으며, YM배지에서 Yeast계로 Candida Versatilis가 조사되었다. 그리고 광합성세균으로 Cyanobacteria등이 확인된 미생물제제이다. EM은 지력증진, 병충해방제, 축산 환경과 사료 효율개선 및 수질개선에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.</p><p>따라서 본 연구는 안전한 농산물을 생산하기 위한 기초연구로서, 공시재료는 현재 친환경 재배농가에서 화학비료와 농약 대신 많이 사용하고 있는 유기농자재 중 키토산, 목초액 및 EM 활성액 3종류를 선정하여 우리나라 국민들이 많이 이용하고 있는 엽채류인 배추를 공시작물로 하여 생육 및 토양 미생물상에 미치는 영향에 대해 시험하였다.</p> <h2>토양미생물상 분석</h2><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후 토양을 채취하여 각각의 토양에 존재하는 총 균수와 균종별 미생물수를 조사하여 토양미생물의 구성 및 균들의 수적인 변화를 조사하였는데 본 시험에서는 작물 재배에 가장 중요한 역할을 하는 일반 세균, 곰팡이, 트리코데마 및 방선균의 수를 조사한 결과는 다음과 같다.</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후의 일반 세균수의 변화는 Fig. 1에서 보는 바와 같다. 유기농자재 처리 전 토양의 세균수는 \( 55.67 \times 10^{3} \mathrm{~CFU/g} \)이었으나 토양관주 및 엽면처리를 하고, 배추를 수확한 후의 세균수를 조사한 결과 대조구를 제외한 전 처리구에서 유기농자재 처리 전에 비해 다소 증가하였다. 유기농자재 간에는 키토산 100배액 및 1,000배액 처리구에서 가장 많았으며, 목초액 100배액 처리구에서 \( 60.33 \times 10^{3} \mathrm{~CFU/g} \)로 가장 적었다.</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후의 곰팡이수의 변화는 Fig. 2에서 보는 바와 같다. 처리 전 토양의 곰팡이수는 \( 15.33 \times 10^{3} \mathrm{~CFU/g} \)이였으며, 배추를 수확한 후의 곰팡이 수를 조사한 결과 유기농자재 전 처리구에서 다소 감소한 경향을 보였고, 대조구에서 \( 13.67 \times 10^{3} \mathrm{~CFU/g} \)로 적게 감소하였다.</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후의 트리코데마수의 변화는 Fig. 3에서 보는 바와 같다. 처리 전 토양의 트리코데마수는 \( 20.33 \times 10^{3} \mathrm{~CFU/g} \)이였으며, 처리후에는 대조구를 포함한 전 처리구에서 약간 증가하였으나 일정한 경향은 없었다. 시험결과 키토산 1,000배액 처리구에서 \( 27.33 \times 10^{3} \mathrm{~CFU/g} \)로 가장 많이 증가하였다. 트리코데마는 병원성 곰팡이를 잡아 먹는 천적 곰팡이로서 Rhizoctonia와 같은 난방제성 토양전염성 병해를 일으키는 병원균을 억제하는 효과가 뛰어나다고 알려져 식물병 방제용으로 널리 사용되고 있는 미생물이다.</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후의 토양 미생물 중 방선균의 변화는 Fig. 4에서 보는 바와 같다. 처리 전 토양의 방선균수는 \( 21.08 \times 10^{3} \mathrm{~CFU/g} \)이였으며, 처리 후에 방선균수를 조사한 결과 대조구에서 \( 23.12 \times 10^{3} \mathrm{~CFU/g} \)로 처리 전보다 다소 증가한 경향을 보였으며, 유기농 자재 처리에서도 다소 증가한 경향을 보였다. 유기농자재 처리간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 \( 26.18 \times 10^{3} \mathrm{~CFU/g} \)로 방선균수가 가장 많이 증가하였으나 처리간 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다.</p><p>이상의 결과를 요약하면 세균, 사상균, 트리코데마 및 방선균의 총 미생물수를 조사한 결과 균 종별 구성은 세균이 주종을 이루었고, 사상균의 비율은 대체적으로 낮았다. 이는 자연환경에 존재하는 미생물 상의 일반적인 구성과 미생물 개체수의 변화를 보여 주는 것이다. 유기농자재를 3회 엽면살포하고 배추를 수확한 다음 미생물상을 조사한 결과 유기농자재 처리 전에 비해 세균, 방선균 및 트리코데마수는 일정한 비율로 증가하였고, 사상균수는 약간 감소하였으나 일정한 경향은 없었다. 특히 키토산 1,000배액 처리구에서 세균, 트리코데마 및 방선균이 증가하였고, 사상균이 감소하였는데 이와 같은 결과는 키토산 처리로 토양 중의 방선균 활동이 증가되고 사상균의 활동이 일시적으로 억제되었다는 Lee 등의 보고와 유사한 경향을 보였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><p>본 시험은 2009년 8월부터 동년 12월 10일까지 경남 김해시 대동면 초정리에 소재한 동아대학교 종합농장의 플라스틱 하우스 내에서 수행하였다.</p><h2>시험처리 내용</h2><p>공시재료는 현재 친환경농업 인증농가에서 화학비료와 농약 대용으로 많이 사용하고 있는 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액을 사용하였다.</p><p>시험 재배포장은 8월 23일에 \( 10 \mathrm{~a} \)당 퇴비 \( 1,000 \mathrm{~kg} \)을 기비처리하고, 경운한 다음 처리구를 \( 150 \times 80 \mathrm{~cm} \)로 이랑을 만든 후 8월 27일에 각 처리구에 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액을 공히 100배액으로 동일하게 토양 관주 처리하였으며, 무처리구인 대조구는 농업용수로 토양 관주 처리하였다. 그리고 엽면처리는 키토산, 목초액 EM 활성액의 엽면살포 농도를 각각 100배액 및 1,000배액으로 하여 배추 정식 후 15일 간격으로 3회 엽면살포하였다. 정식은 9월 3일에 하였으며, 처리구당 재식본수는 20주로 하였고, 배추수확은 12월 3일에 실시하였다. 공시품종은 동부한농종묘의 “흑장미(Blackrose)”를 사용하였다. 시험구배치는 난괴법 3반복으로 하였고, 포장관리는 농촌진흥청 작물별 재배기준에 따랐으며, 시험재배 기간 중 농약은 사용하지 않았다.</p><h2>생육특성 조사</h2><p>수확 후 생육조사는 처리구당 평균치가 되는 10주씩을 표본 추출하여 농사시험연구 조사기준에 준하여 실시하였다. 생육조사 항목 중 엽장 및 엽폭은 결구엽 중 가장 길이가 큰 엽을 조사하였다. 그리고 총 엽수, 외엽수(결구를 형성하고 있지 않은 잎의 수), 내엽수(결구를 형성하여 식용으로 이용할 수 있는 잎의 수), 주중(뿌리를 제외한 포기 전체의 무게), 구중(결구된 부분의 무게), 구고(결구된 부위의 최대 종경) 및 구폭(결구된 부위의 최대 횡경) 등을 조사하였다.</p><h2>토양미생물 분석</h2><p>공시작물 재배지 토양의 미생물 조사는 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM활성액을 처리 전.후 토양을 각각 토양 표면으로부터 깊이 \( 10 \mathrm{~cm} \)까지의 흙을 채취한 후, 가는 체(\( 20 \mathrm{~mesh} \))로 쳐서 \( 0.85 \% \) (\(\mathrm{w/v} \)) \( \mathrm{Nacl} \) 멸균수에 현탁시킨 다음 선택배지를 사용하여 유기농자재의 엽면살포 농도 및 균 종류별로 희석법과 한천배지 평판 도말법으로 토양내의 미생물의 종류별 계수를 실시하였다. 실험에 사용한 선택배지의 종류로는 일반 세균을 선별하는 Tryptic Soy Agar (TSA), 방선균을 선별하는 Actinomycetes Isolation Agar (AIA), 일반 곰팡이의 선별에 사용하는 Potato Dextrose Agar (PDA)에 \( 50 ~\mu \mathrm{g/l} \)의 Chloramphenicol을 함께 사용하였으며, 트리코데마를 선별하는데 사용하는 Malt Extract Agar(MEA)에 항생제로 Chlorotetracyclin을 \( 20 ~\mu \mathrm{g/l} \) 첨가한 배지를 사용하였다. 선별배지에 도말한 미생물은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에 6일간 배양하여 형성된 콜로니수를 측정하였다. 총균수는 이들 선택배지를 사용하여 계수된 개별 미생물들의 생균수의 총 합계로 계산하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>결 과</h1><h2>생육특성</h2><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리에 따른 배추의 생육특성인 엽장, 엽폭 및 엽수 등을 조사한 결과를 살펴보면 엽장 및 엽폭은 공히 키토산 1,000배액 처리구에서 가장 높게 나타났다.", "전체 엽수에 있어서 외엽수(결구를 형성하고 있지 않은 잎의 수)는 목초액 1,000배액 처리구에서 가장 많았다.", "내엽수(결구를 형성하여 식용으로 이용할 수 있는 잎의 수)는 키토산 1,000배액 처리구에서 가장 많았는데 결구배추는 일반적으로 외엽수보다 내엽수가 많은 것이 상품가치가 높다.", "내엽수와 외엽수를 합한 총 엽수는 키토산 1,000배액처리구에서 가장 많았다.", "이러한 결과로 볼 때 유기농자재 처리농도간에는 100배액 처리보다 1,000배액 처리에서 생육이 비교적 양호하게 나타났는데 이는 엽채류에서 대체적으로 엽면처리 농도가 500~1,000배액을 사용하고 있는데 본 연구에서도 이와 유사한 결과를 보였다.", "유기농자재간에는 키토산처리에서, 유기농자재 전 처리구간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 배추의 엽특성이 양호하게 나타났다.", "</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리에 따른 배추의 생육특성인 주중, 구중, 구고 및 구폭을 조사한 결과를 살펴보면 뿌리를 제외한 포기 전체의 무게인 주중은 키토산 1,000배액 처리구에서 가장 무거웠고, 목초액 100배액 처리구에서는 가장 낮았다.", "결구된 부분의 무게인 구중은 키토산 1,000배액 처리구에서 높았고, 결구된 부위의 최대 종경인 구고 및 결구된 부위의 최대 횡경인 구폭은 공히 키토산 1,000배액 처리구에서 가장 높게 나타났다.", "이러한 연구결과로 볼 때 처리간에는 무처리구인 대조구에 비해 유기농자재를 사용한 처리구에서 대체적으로 생육이 양호하였으며, 유기농자재간에는 키토산 처리에서 가장 생육이 좋았고, 그 다음으로 EM 활성액 처리, 목초액 처리 순으로 나타났다.", "그리고 유기농자재 처리농도간에는 100배액 처리 보다는 1,000배액 처리에서 생육이 좋았고, 유기농자재 전 처리구간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 생육이 양호하였다.", "</p><p>이상의 결과를 종합하면 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액을 정식 전 토양관주 처리와 정식 후 15일 간격으로 3회 엽면살포하여 배추의 생육특성을 조사한 결과 생육특성에서는 무처리구인 대조구보다 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액을 엽면살포한 처리구에서 다소 생육이 양호하였으며, 유기농자재간에는 키토산이 양호하였고, 전 처리구 간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 배추의 생육이 양호하였다.", "Jeong 등은 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM의 농도를 각각 100배, 500배 및 1,000배액을 토마토에 엽면살포한 결과 키토산 500배액 처리구에서 초기생육이 양호하였다고 보고하였고, 가지 및 잎상추에서는 키토산과 목초액의 처리농도를 공히 200배액, 400배액 및 800배액으로 처리한 결과 800배액을 엽면처리했을 때 생육이 양호하였다고 하였다.", "이런 결과로 볼 때 작물별이나 토질에 따라 다소 차이는 있으나 대체적으로 100배액 처리보다는 500배액 및 1,000배액 처리에서 생육이 양호한 것으로 나타나 본 연구와 유사한 경향을 보였다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리에 따른 배추의 생육 및 토양 미생물상의 변화에 관한 연구결과를 종합하면 유기농자재 처리에 따른 배추의 생육특성은 대조구에 비해 유기농자재를 엽면살포한 처리구에서 생육이 다소 높게 나타났으며, 유기농자재 간에는 키토산이, 처리농도 간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 엽장, 엽폭, 총 엽수, 주중, 구중, 구고 및 구폭 등이 증가하였는데, 이는 키토산에는 식물 체내의 성장활성제인 Hexosamine의 증가와 키틴, 키토산의 분해 효소인 키티나제, B-13, 글루키나제 작용으로 생리활성이 높아 배추의 생육이 촉진된 것으로 판단된다.", "Jeong 등은 키토산, 목초액 및 EM의 농도를 각각 100배, 500배 및 1,000배액으로 희석하여 토마토의 초기생육 특성을 조사한 결과 대조구에 비해 유기농자재를 사용한 처리구에서 생육이 양호하였고, 처리간에는 키토산 500배액 처리구에서 초장, 엽면적 및 과중 등이 양호하였다고 보고하였는데 본 시험에서는 500배 엽면살포 농도가 없어 1,000배액 농도에서 생육이 양호하게 나타났는데 이런 결과로 볼 때 100배액보다는 500배액 및 1,000배액 처리에서 생육이 좋아지는 것으로 판단되며, 추후 500배액 및 1,000배액 처리농도에서 작물별, 토성별로 연구가 계속 진행되어야 할 것으로 사료된다.", "Lee 등은 콩나물 재배시 키토산 처리구가 대조구에 비해 \\( 25.4 \\% \\)의 높은 성장률을 보이고, 중량 또한 \\( 8.5 \\% \\)의 증가를 보인 보고와 Song 등은 Chitosan과 목초액 엽면살포에 의한 감자 플러그 삽목묘의 발근 및 괴경형성효율 시험에서 삽목 10일후부터 4일 간격으로 5회 동안 Chitosan과 목초액을 무처리, \\( 500 \\mathrm{ppm} \\), \\( 1,000 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 2,000 \\mathrm{ppm} \\) 처리 결과 Chitosan \\( 500 \\sim 1,000 \\mathrm{ppm} \\) 및 목초액 \\( 2,000 \\mathrm{ppm} \\)의 농도에서 플러그묘의 초장, 엽수 뿐만 아니라 지상부, 지하부의 묘질이 양호해졌다고 보고와 비슷한 결과를 얻었다.", "</p><p>토양 미생물상 분설결과 무처리구인 대조구에 비해 유기농자재를 처리한 시험구가 세균, 방선균 및 트리코데마수는 일정한 비율로 증가하였으나 사상균수는 약간 감소한 경향을 보였다.", "이러한 결과로 볼 때 토양 중의 생물, 특히 세균의 활성은 주변 토양의 입자나 식물뿌리와 밀접한 관계를 가지고 있으며, 전반적으로 유기농자재 처리가 무처리에 비해 배추의 생육이 좋아졌는데 이는 유기농자재가 배추의 생육촉진에 기여하는 것도 있지만 대부분 토양중의 미생물상에 영향을 미침으로서 토양 미생물수와 양이 증가함으로 근권이 활성화되어 지상부인 작물생육도 다소 양호해지는 것으로 판단된다.", "특히 유기농자재를 엽면살포함으로서 세균수는 증대되고, 사상균수는 감소하므로 B/F (Bacteria/Fungi) 비율이 증가하는 것으로 나타나 B/F (Bacteria/Fungi) 비율이 작물생육에 영향을 초래한 것으로 판단된다.", "Uhm 등은 키토산과 목초액 처리가 고추의 생육 및 양분흡수에 미치는 영향에서 키토산 2,000배액과 목초액 200배액을 경엽살포와 토양관주를 한 후 미생물상을 조사한 결과 사상균수는 관행에 비해 밀도가 감소하는 경향을 보였다고 보고하였는데, 본 시험에서도 희석배수는 상이하였으나 결과는 이와 유사한 경향을 보였다.", "일반적으로 키토산는 토양 중 방선균의 밀도를 증가시킴으로서 병원성사상균을 억제시키기 위한 수단으로 사용되어 왔는데, 본 시험의 결과도 이와 비슷한 맥락으로 해석될 수 있다.", "따라서 유기농자재의 구성 균종이 배추재배 토양에 안정적으로 정착하여 생존하는 것으로 판단되어 진다.", "</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM활성액 시험에 있어 처리농도에 따른 작물별, 지역별, 재배조건별 및 토질의 영향에 대한 연구와 체내성분 변화 및 생리 장해현상 에 대한 연구도 앞으로도 계속 수행되어야 할 것으로 본다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>농업에서 그 동안 생산력을 향상시키기 위해 화학비료 및 농약의 무분별한 사용으로 인한 문제점이 부각되기 시작하면서 농업생산의 안전성, 지속성 및 환경보전을 동시에 추구할 수 있는 지속가능하고, 환경친화적인 유기농업에 대한 중요성이 부각되고 있으며, 재배농가도 증가하고 있다.", "이와 더불어 최근 국민경제의 상승과 삶의 질적 향상으로 생명, 농산물에 대한 안전 등이 요구되고 있어 친환경농업인 유기농업의 중요성이 높아지고 있다.", "유기농업은 농약과 화학비료 대신 각종 유기농자재, 유기질퇴비 등을 사용하여 지력을 증진시킨 후 천적, 미생물농약, 각종 유기농자재를 사용하여 병해충을 예방 · 방제하여 안전하고 영양가치가 높은 농산물을 생산하는 농법을 말한다.", "현재 우리나라에서 친환경농산물 생산을 위해 사용 가능한 자재는 크게 토양개량과 작물생육을 위하여 사용이 가능한 자재와 병해충관리를 위하여 사용이 가능한 자재로 나누어 허용하고 있다.", "</p><p>본 연구는 친환경농산물 생산을 위하여 사용 가능한 자재 중 친환경인증 재배농가에서 많이 사용하고 있는 키토산, 목초액 및 EM (effective microoganism) 활성액을 공시재로로 선정하여 시험을 수행하였다.", "Chitosan은 게나 가재, 새우 껍데기에 들어 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어낸 키틴의 유도체로서 농업분야에서는 토양개량용 및 병해충방제용으로 사용하고 있는 자재이다.", "키토산은 몇가지 식물병원균에 대한 항균활성도 보고되고 있고, 세포의 활성화에 의한 식물체의 생장촉진효과가 있어 작물재배뿐만 아니라 항균활성, 항종양 활성, 콜레스테롤 저하작용 등 임상실험에도 많이 이용되고 있다.", "</p><p>목초액은 천연목재를 가열하여 탄화하는 과정에서 기화하는 가스를 냉각원리에 의해 기체와 액체로 분리하여 추출한 액제이다.", "주로 \\( 80 \\sim 150^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 채취되며, 목초액에 함유된 주요산으로서는 초산, 프로피온산, 부틸산 등 6종, 알코올류는 메타놀, 아세톤인 등 10종, 페놀류로서는 크레졸, 에틸페놀 등 12종 및 아세톤이나 에스텔류와 같은 중성물질로 구성되어 있다.", "</p><p>EM (Effective Microorganisms)은 복합 유용 유기농자재로서 발효 · 정균 · 합성 그리고 항산화물질을 생성하는 미생물 즉 유산균, 효모균, 방선균, 누룩균 및 광합성세균 등 80여 종의 미생물이 포함되어 있는 유기농자재이다.", "EM은 비옥한 토양속에서 채취한 미생물을 엄선, 합성배양한 것으로 동정결과 Lactobacillus계가 수종이었으며, YM배지에서 Yeast계로 Candida Versatilis가 조사되었다.", "그리고 광합성세균으로 Cyanobacteria등이 확인된 미생물제제이다.", "EM은 지력증진, 병충해방제, 축산 환경과 사료 효율개선 및 수질개선에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다.", "</p><p>따라서 본 연구는 안전한 농산물을 생산하기 위한 기초연구로서, 공시재료는 현재 친환경 재배농가에서 화학비료와 농약 대신 많이 사용하고 있는 유기농자재 중 키토산, 목초액 및 EM 활성액 3종류를 선정하여 우리나라 국민들이 많이 이용하고 있는 엽채류인 배추를 공시작물로 하여 생육 및 토양 미생물상에 미치는 영향에 대해 시험하였다.", "</p> <h2>토양미생물상 분석</h2><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후 토양을 채취하여 각각의 토양에 존재하는 총 균수와 균종별 미생물수를 조사하여 토양미생물의 구성 및 균들의 수적인 변화를 조사하였는데 본 시험에서는 작물 재배에 가장 중요한 역할을 하는 일반 세균, 곰팡이, 트리코데마 및 방선균의 수를 조사한 결과는 다음과 같다.", "</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후의 일반 세균수의 변화는 Fig.", "1에서 보는 바와 같다.", "유기농자재 처리 전 토양의 세균수는 \\( 55.67 \\times 10^{3} \\mathrm{~CFU/g} \\)이었으나 토양관주 및 엽면처리를 하고, 배추를 수확한 후의 세균수를 조사한 결과 대조구를 제외한 전 처리구에서 유기농자재 처리 전에 비해 다소 증가하였다.", "유기농자재 간에는 키토산 100배액 및 1,000배액 처리구에서 가장 많았으며, 목초액 100배액 처리구에서 \\( 60.33 \\times 10^{3} \\mathrm{~CFU/g} \\)로 가장 적었다.", "</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후의 곰팡이수의 변화는 Fig.", "2에서 보는 바와 같다.", "처리 전 토양의 곰팡이수는 \\( 15.33 \\times 10^{3} \\mathrm{~CFU/g} \\)이였으며, 배추를 수확한 후의 곰팡이 수를 조사한 결과 유기농자재 전 처리구에서 다소 감소한 경향을 보였고, 대조구에서 \\( 13.67 \\times 10^{3} \\mathrm{~CFU/g} \\)로 적게 감소하였다.", "</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후의 트리코데마수의 변화는 Fig.", "3에서 보는 바와 같다.", "처리 전 토양의 트리코데마수는 \\( 20.33 \\times 10^{3} \\mathrm{~CFU/g} \\)이였으며, 처리후에는 대조구를 포함한 전 처리구에서 약간 증가하였으나 일정한 경향은 없었다.", "시험결과 키토산 1,000배액 처리구에서 \\( 27.33 \\times 10^{3} \\mathrm{~CFU/g} \\)로 가장 많이 증가하였다.", "트리코데마는 병원성 곰팡이를 잡아 먹는 천적 곰팡이로서 Rhizoctonia와 같은 난방제성 토양전염성 병해를 일으키는 병원균을 억제하는 효과가 뛰어나다고 알려져 식물병 방제용으로 널리 사용되고 있는 미생물이다.", "</p><p>유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액 처리 전 · 후의 토양 미생물 중 방선균의 변화는 Fig.", "4에서 보는 바와 같다.", "처리 전 토양의 방선균수는 \\( 21.08 \\times 10^{3} \\mathrm{~CFU/g} \\)이였으며, 처리 후에 방선균수를 조사한 결과 대조구에서 \\( 23.12 \\times 10^{3} \\mathrm{~CFU/g} \\)로 처리 전보다 다소 증가한 경향을 보였으며, 유기농 자재 처리에서도 다소 증가한 경향을 보였다.", "유기농자재 처리간에는 키토산 1,000배액 처리구에서 \\( 26.18 \\times 10^{3} \\mathrm{~CFU/g} \\)로 방선균수가 가장 많이 증가하였으나 처리간 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다.", "</p><p>이상의 결과를 요약하면 세균, 사상균, 트리코데마 및 방선균의 총 미생물수를 조사한 결과 균 종별 구성은 세균이 주종을 이루었고, 사상균의 비율은 대체적으로 낮았다.", "이는 자연환경에 존재하는 미생물 상의 일반적인 구성과 미생물 개체수의 변화를 보여 주는 것이다.", "유기농자재를 3회 엽면살포하고 배추를 수확한 다음 미생물상을 조사한 결과 유기농자재 처리 전에 비해 세균, 방선균 및 트리코데마수는 일정한 비율로 증가하였고, 사상균수는 약간 감소하였으나 일정한 경향은 없었다.", "특히 키토산 1,000배액 처리구에서 세균, 트리코데마 및 방선균이 증가하였고, 사상균이 감소하였는데 이와 같은 결과는 키토산 처리로 토양 중의 방선균 활동이 증가되고 사상균의 활동이 일시적으로 억제되었다는 Lee 등의 보고와 유사한 경향을 보였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><p>본 시험은 2009년 8월부터 동년 12월 10일까지 경남 김해시 대동면 초정리에 소재한 동아대학교 종합농장의 플라스틱 하우스 내에서 수행하였다.", "</p><h2>시험처리 내용</h2><p>공시재료는 현재 친환경농업 인증농가에서 화학비료와 농약 대용으로 많이 사용하고 있는 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액을 사용하였다.", "</p><p>시험 재배포장은 8월 23일에 \\( 10 \\mathrm{~a} \\)당 퇴비 \\( 1,000 \\mathrm{~kg} \\)을 기비처리하고, 경운한 다음 처리구를 \\( 150 \\times 80 \\mathrm{~cm} \\)로 이랑을 만든 후 8월 27일에 각 처리구에 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액을 공히 100배액으로 동일하게 토양 관주 처리하였으며, 무처리구인 대조구는 농업용수로 토양 관주 처리하였다.", "그리고 엽면처리는 키토산, 목초액 EM 활성액의 엽면살포 농도를 각각 100배액 및 1,000배액으로 하여 배추 정식 후 15일 간격으로 3회 엽면살포하였다.", "정식은 9월 3일에 하였으며, 처리구당 재식본수는 20주로 하였고, 배추수확은 12월 3일에 실시하였다.", "공시품종은 동부한농종묘의 “흑장미(Blackrose)”를 사용하였다.", "시험구배치는 난괴법 3반복으로 하였고, 포장관리는 농촌진흥청 작물별 재배기준에 따랐으며, 시험재배 기간 중 농약은 사용하지 않았다.", "</p><h2>생육특성 조사</h2><p>수확 후 생육조사는 처리구당 평균치가 되는 10주씩을 표본 추출하여 농사시험연구 조사기준에 준하여 실시하였다.", "생육조사 항목 중 엽장 및 엽폭은 결구엽 중 가장 길이가 큰 엽을 조사하였다.", "그리고 총 엽수, 외엽수(결구를 형성하고 있지 않은 잎의 수), 내엽수(결구를 형성하여 식용으로 이용할 수 있는 잎의 수), 주중(뿌리를 제외한 포기 전체의 무게), 구중(결구된 부분의 무게), 구고(결구된 부위의 최대 종경) 및 구폭(결구된 부위의 최대 횡경) 등을 조사하였다.", "</p><h2>토양미생물 분석</h2><p>공시작물 재배지 토양의 미생물 조사는 유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM활성액을 처리 전.후 토양을 각각 토양 표면으로부터 깊이 \\( 10 \\mathrm{~cm} \\)까지의 흙을 채취한 후, 가는 체(\\( 20 \\mathrm{~mesh} \\))로 쳐서 \\( 0.85 \\% \\) (\\(\\mathrm{w/v} \\)) \\( \\mathrm{Nacl} \\) 멸균수에 현탁시킨 다음 선택배지를 사용하여 유기농자재의 엽면살포 농도 및 균 종류별로 희석법과 한천배지 평판 도말법으로 토양내의 미생물의 종류별 계수를 실시하였다.", "실험에 사용한 선택배지의 종류로는 일반 세균을 선별하는 Tryptic Soy Agar (TSA), 방선균을 선별하는 Actinomycetes Isolation Agar (AIA), 일반 곰팡이의 선별에 사용하는 Potato Dextrose Agar (PDA)에 \\( 50 ~\\mu \\mathrm{g/l} \\)의 Chloramphenicol을 함께 사용하였으며, 트리코데마를 선별하는데 사용하는 Malt Extract Agar(MEA)에 항생제로 Chlorotetracyclin을 \\( 20 ~\\mu \\mathrm{g/l} \\) 첨가한 배지를 사용하였다.", "선별배지에 도말한 미생물은 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에 6일간 배양하여 형성된 콜로니수를 측정하였다.", "총균수는 이들 선택배지를 사용하여 계수된 개별 미생물들의 생균수의 총 합계로 계산하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "유기농자재인 키토산, 목초액 및 EM 활성액의 처리에 따른 배추의 생육과 토양 미생물상에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-9c4a4b86-0498-4a16-afd5-11389e9f3528", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "정순재", "조미용", "석운영", "이상록", "이형주", "오주성" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,305	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>콩나물의 생육상태 변화</h2><p>인삼 추출물 농도 \( (100,200,300,400 \mathrm{ppm}) \) 에 대한 재배 일수별 \( (2,3,4 \) 일 \( ) \) 콩나물의 무게 및 길이 변화는 콩나물 50개체에 대한 평균값으로 Table 1 과 같다. 콩나물의 무게 변화에서 대조구는 중류수로만 재배한 콩나물로서 2일째 \( 423.2 \mathrm{mg} \), 3일째 \( 526.1 \mathrm{mg}, 4 \) 일째 \( 697.3 \mathrm{mg} \) 으로 재배 일수가 증가할수록 무게도 증가하였다. 각각의 인삼 농도별 모두 시간에 따른 무게의 증가경향을 보였다. 즉, 처리 농도별의 콩나물 무게는 대체로 대조구에 비해 높게 나타났고, 200 \( \mathrm{ppm} \) 처리할 때 2일째 \( 446.5 \mathrm{mg} \), 3일째 \( 624.2 \mathrm{mg} \), 4일째 \( 750.1 \mathrm{mg} \) 으로 가장 뚜렷한 무게 증가를 보였다. 그 정도는 각 재배일수별 대조구에 비해 평균 \( 7.2 \% \) 높은 수치의 결과였다. 재배일수와 한약재 추출물 종류 및 농도에 따른 콩나물 개체당 길이변화는 대즈구인 증류수로만 생육시킨 콩나물의 경우 2일째 \( 4.6 \mathrm{~cm}, 3 \) 일째 \( 10.2 \mathrm{~cm}, 4 \) 일째 \( 17.3 \mathrm{~cm} \) 신장 생장을 하였다. 4 일 이후의 성장속도는 2 일째에서 4 일째까지의 성장속도에 비하여 현저하게 느렸으며, 이것은 콩나물의 무게 변화와 유사한 경향이었다. 인삼 추출물 농도가 \( 100 \mathrm{ppm} \) 에서 \( 200 \mathrm{ppm} \) 으로 갈수록 길이 생육이 종았고 \( 200 \mathrm{ppm} \) 추출물 처리구에서 2 일째 \( 6.1 \mathrm{~cm} \), 3일째 \( 15.2 \) \( \mathrm{cm}, 4 \) 일째 \( 20.4 \mathrm{~cm} \) 로 대조구에 비해 콩나물 평균 \( 32 \% \) 의 신장생장을 촉진시킴을 뚜렷이 관찰할 수 있었다. 특히 그 변화는 3일째의 길이성장이 대조구에 비해 \( 50 \% \) 빨리 됨을 알 수 있었으며, 또한 무게와 길이의 비율은 재배기간이 길어질수록 낮아지는 경향이었다. 결론적으로 인삼추출물의 농도에 따라 콩나물을 재배할 때 무게와 길이의 변화는 인삼 \( 200 \mathrm{ppm} \) 농도에서 대조구에 비해 뛰어난 증가 현상올 나타냈다. 이와 같이 생야재 추출물 중에 인삼 추출물이 비교적 낮은 농도에서 콩 발아 및 생장에 효과적인 것은 인삼 추출물 중의 glucose와 sucrose와 같은 유리당과 각종 유리 아미노산 등 때문이며, 고농도에서 약간 억제현상은 나타내는 것은 열수 추출물에 포함된 각종ginsenoside류, 알칼로이드, 정유, 테르페노이드 및 파이토스테롤류 둥에 의한 것으로 추측한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>콩나물 콩(Glycine max \( \left.\mathrm{L} . \mathrm{M}_{\mathrm{ERILL}}\right) \) 은 경남 거창에서 2002년도 재배된 오리알태 품종으로 콩알이 건실하고 윤가가 있는 햇콩을 사용하였고, 인삼(Panax ginseng)은 시중 한약상에서 건조된 5년근 수삼을 구입하여 사용하였다.</p><h2>생약 발아액의 제조</h2><p>인삼 \( 100 \mathrm{~g} \) 에 수돗물 \( 1 \mathrm{~L} \) 를 첨가하여 heating mantle로 6시간 끓인 후, 가열식 자석 교반장치(CIMAREC \( { }^{\mathrm{TM}} \) Stir-ring Hot Plate)로 증발 농축시킨 시료를 \( 10,000 \mathrm{ppm} \) 로 조제하였으며, 인삼에 서식하는 야생 미생물을 autoclave에서 \( 121^{\circ} \mathrm{C}, 15 \) 분간 고압 멸균하였다. 재배에 적용한 인삼추출물 발아액의 농도는 100, 200, 300 및 \( 400 \mathrm{ppm} \) 으로 하였다.</p><h2>콩나물의 재배</h2><p>선별한 콩 \( 200 \mathrm{~g} \) 을 \( 3 \% \mathrm{NaClO} \) 용액으로 소독한 후 증류수로 세척하였고, 발아액을 각각 \( 1 \mathrm{~L} \) 로 만든 후, 발아액에 세척한 콩을 담은 다음 \( 24 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \) 암실에서 24 시간 발아시켰고, 콩나물 재배기(Hi-Green Culture)에서 시간당 15분씩 증류수를 살포하여 4 일 동안 재배하였다. 재배수는 증류수 \( 2 \mathrm{~L} \) 로 매일 교환하였다.</p><h2>콩나물의 생육상태 측정</h2><p>각 처라농도별로 재배한 콩나물을 재배기의 각 부위에서 무게와 길이측정은 재배시작 후 2 일, 3 일, 4 일이 경과한 후에 무작위로 50 개씩을 채취하여 측정하여 평균값으로 하였다.</p><h2>아미노산 분석</h2><p>콩나물의 줄기부분을 동결건조시킨 다음, 40 메쉬 이하로 분말화시킨 \( 100 \mathrm{mg} \) 을 단백질 분해용 시험관에 넣고 \( 6 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{HCl} 20 \mathrm{~mL} \) 를 가한 후, 질소가스를 충진하여 밀봉시킨다. \( 110^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 동안 가수분해한 후 여과 (Whatman No.2)해서 농축하고, 다시 \( 0.2 \mathrm{M} \mathrm{Na} \)-citrate buffer(pH 2.2) 2 \( \mathrm{mL} \) 를 가하여 용해한 후 여과하여 아미노산 자동분석기 (Biochrom 20)에서 분석하였다. 그. 조건은 column, ul-trapac 11 cation exchange resin; buffer, \( 0.2 \mathrm{M} \mathrm{Na} \)-citrate, buffer flow rate, \( 40 \mathrm{~mL} / \mathrm{hr} \); ninhydrin flow rate, 25 \( \mathrm{mL} / \mathrm{hr} \); colum temp, \( 50 \sim 80^{\circ} \mathrm{C} \) 로 하였다.</p><h2>유리당 분석</h2><p>콩나물 동결건조시킨 분말 \( 100 \mathrm{mg} \) 을 취하여 시험관에 넣고 \( 99 \% \) ethanol \( 3 \mathrm{~mL} \) 와 \( 80 \% \) ethanol \( 3 \mathrm{~mL} \) 를 가하여 혼합시킨 후 20 분간 방치한 후 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온상태에서 \( 80 \% \) ethanol \( 4 \mathrm{~mL} \) 를 더 가하여 정용한 다음, 원심분리( 10,000 \( \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min} \) )하여 상징액을 \( \mathrm{C}_{18} \) Sep-pak cartridge와 \( 0.2 \) \( \mu \mathrm{m} \) membrane filter로서 색소 등의 이물질을 제거한 여과액을 분석용 시료로 사용하였으며, 그 분석은 Valverde 등의 방법에 준하여 HPLC (Shimadzu LC10A, Japan)로 행하였다.</p><h2>유기산 분석</h2><p>시료 \( 100 \mathrm{mg} \) 을 취하여 소형 시험관에 넣고 증류수 10 \( \mathrm{mL} \) 를 가하고 잘 섞은 후 \( 32.4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 incubator에서 1 시간 방치한 후 원심분리 \( (10,000 \mathrm{rpm}, 10 \mathrm{~min}) \) 하여 상징액을 \( \mathrm{C}_{18} \) Sep-pak cartridge와 \( 0.2 \) \( \mu \)m membrane filter로서 색소 등의 이물질을 제거한 여과액을 분석용 시료로 사용하였다. 그 분석은 Buslig 등의 방법에 준하여 HPLC (Shimadzu LC10A, Japan)로 행하였다.</p> <h1>서론</h1><p>콩나물은 콩을 발아시켜 만드는 채소식품의 하나로서 단백질, 무기질 및 비타민류가 풍부한 우리 고유의 전통식품으로서 재배기간이 짧고, 재배가 비교적 손쉬울 뿐만 아니라 가격이 저렴하여 대중적인 식품으로 널리 이용되고 있다. 특히 콩나물은 대두가 발아 - 생장할 때에 콩 속에 없었던 비타민 C가 생성되어 채소공급이 원활하지 못한 겨울철의 비타민 C 공급원으로 뿐만 아니라 아스파라긴산을 포함한 각종 아미노산 및 유기산 등과 더불어 알코올 분해촉진 작용에 의한 숙취제거 및 젖산증가의 억제작용으로 감기·피로회복에 탁월한 효능이 알려저 동양뿐만 아니라 구미에서도 관심이 모아지고 있다.</p><p>최근 콩나물의 경우도 고급화와 기능성 강화를 목적으로 그 발아 - 재배과정에 여러 가지의 식품소재 혹은 식물 추출물들이 많이 사용되고 있는데, 현재까지 콩의 발아 및 콩나물의 생육 톡성에 관한 연구는 주로 이온수, 오존수, 황토지장수, 게르마늄, 키토산, 식물 생장조절제, 에털렌가스, 탈지참깨박 추출물을 포함한 식품첨가제 및 blue 광조사의 처리에 대하여 일부 조사한 보고들이 있다. 그러나 국산 생야재 추출물을 이용하여 발아시킨 콩나물의 생장 및 화학적 성분의 품질 특성에 관한 연구들은 미흡한 실정이다.</p><p>본 연구자들은 숙취해소에 좋은 대표적인 생약재 추출물 5가지를 이용하여 콩나물의 생장촉진과 생리활성 생약재 성분들의 콩나물로 이행도 및 기호적 관능성 등을 조사하기 위한 연구의 일환으로 전보에서 한약재 중에서 국내산으로 쉽게 구할 수 있고, 오래 전부터 민간요법으로 많이 사용되고 있는 몇 가지 국산 한방약재의 추출물을 콩나물의 발아액으로 사용하여 그 생장상태톨 조사하였는데, 인삼이 가장 효과적이라고 보고한 바 있다.</p><p>따라서 본 연구에서는 콩나물 생장에 효과적인 인삼 추출물의 농도를 \( 100,200,300 \) 및 \( 400 \mathrm{ppm} \) 으로 달리하여 발아시킨 콩나물의 재배기간에 따른 생육상태, 아미노산, 유리당 및 유기산 함량의 변화에 대하여 기초적인 조사하였다.</p> <h2>콩나물의 유리당 함량</h2><p>콩나물의 충 유리당 함량 및 조성은 Table 3 과 같다. Table 3에 나타난 바와 같이 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물의 총 유리당 함량은 추출물의 농도에 대해서는 일정한 경향을 나타내질 않았으나 대체로 대조구보다 약간 낮은 함량을 나타내었다. 그러나 재배 3 일째의 추출물 농도 200 \( \mathrm{ppm} \) 에서 총 유리당의 함량은 \( 151.1 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 으로 가장 높았고, 대조구 \( 132.3 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 과 비교하여 \( 14.2 \% \) 나 높았다. 한편 콩나물의 유리당 조성은 ribose, fructose, galactose, su-crose가 검출되었고, 그 중에서 sucrose와 fructose의 함량이 많았으며, 전체 유리당에 대하여 \( 65 \sim 80 \% \) 범위를 차지하였다. 또한 재배일수가 늘어남에 따라 ribose, fructose 및 galactose의 함량은 증가하였으며, sucrose의 합량은 대조구에서 그 함량은 감소하였으나, 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물은 3 일까지는 증가하다가 그 이후는 감소하는 경향을 보였다. Sucrose가 초기에 많은 함량을 보인 것온 sucrose가 stachyose의 분해 대사산물이기 때문이며, 이후 감소는 생육과정 중에서 단당류로 분해되므로 감소한다는것과 일치된다. 그리고 재배일수가 길어짐에 따라 galac-tose의 함량이 증가하는 것은 콩나물 성장 중 세포벽을 구성하는 비섬유 단당류 중 galactose가 많은 함량을 차지한다는 보고와 같다.</p><h2>콩나물의 유기산 함량</h2><p>콩나물의 유기산 함량 및 조성은 Table 4 와 같다. Table4 에 나타난 바와 같이 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물의 총 유기산 함량은 대조구보다 대체로 높앖으며 \( 200 \mathrm{ppm} \) 에서 가장 높았고, 그 이상 농도에서는 농도가 높을수록 감소하였다. 재배일수에서 충 아미노산 함량은 3 일째가 가장 높았고, \( 200 \mathrm{ppm} \) 처리시 3 일째 대조구와 비교하여 \( 50 \% \) 나 높았다. 콩나물의 유기산으로는 oxalic acid, phytic acid, tartaric acid, malonic acid, lactic acid, fumaric acid 및 butyric acid가 검출되었다. 그 함량은 phytic acid가 가장 높았고, butyric acid〉 lactic acid \( \rangle \) malonic acid \( \rangle \) tartaric acid oxalic acid \( \rangle \) fumaric acid 순이었다. 대조구는 phytic acid와 butyric acid의 함량이 전체 유기산 함량의 76.9 ~ \( 80.2 \% \) 범위를 차지하였으며, 재배일수가 길어질수록 유기산의 함량이 다소 증가되었다. 한편 인삼 추출물 처리구의 농도와 재배 일수별로 유기산의 변화는 재배일수 3 일째까지는 증가하지만, 그 이후는 다시 유기산 함량이 감소하는 경향을 보였고, \( 200 \mathrm{ppm} \) 에서 가장 높은 유기산 함량을 보였으며, 그 농도 이상에서는 추출물의 농도가 높을수록 유기산 함량이 감소하였다. 특히 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물 중의 phytic acid 및 butyric acid 함량은 대조구에 비해 크게 증가되었고, 따라서 인삼 추출물이 이들 유기산의 증가에 영향을 미치는 것으로 판단되었다. 한편 phytic acid는 inositol hexaphosphoric acid와 철, 아연, 칼슘, 마그네슙 혹은 칼륨 등과 같은 2 가 혹은 3 가 금속의 킬레이트 염으로 용해도가 낮은 물질로 존재하므로, 이들 무기질의 인체내 홉수를 방해하여 항영양물질로 알려겨 왔다. 그러나 최근에 in-vitro 및 동물 실험을 통하여 콩 및 그 식품에서 인산염 공급원으로 역할과 중금속의 인체내 홉수방지 및 각종 암과 심장병 질환의 예방효과에 대한 잠재적인 가능성이 입중됨에 따라 오히려 생리활성 물질로서 그 관심이 높아지고 있다.</p> <h1>요약</h1><p>인삼추출물(100 400 ppm)로 콩을 발아시켜 4 일간 재배한 콩나물의 생육특성, 아미노산, 유기산 및 유리당 함량의 변화를 조사하였다. 인삼추출물은 콩나물의 길이 및 무게 증가에 효과적이었다. 총 아미노산 함량은 \( 100 \mathrm{ppm} \) 에서 3일간 재배하였을 때가 가장 높았고, 추출물의 농도가 높을수록 그 함량이 많아졌다. 또한 재배일수가 길어질수록 aspartic acid 함량은 증가하지만, glutamic acid 함량은 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 총 유리당은 재배일수가 증가할수록 많아졌으나, 농도별로는 일정한 경향이 나타나지 않았다. Sucrose는 대조구에서 점진적으로 감소하였고, 추출물 처리구는 3 일까지는 증가하다가 그 이후는 감소하였으며, 다른 유리당은 4 일까지 지속적으로 증가하였다. 총 유기산은 인삼추출물 \( 200 \mathrm{ppm} \) 으로 발아시켜 3일 동안 재배한 콩나물이 가장 많은 함량을 나타내었다. 그중에서 phytic acid가 가장 많았으며, 총 유기산의 45 \( 60 \% \) 정도를 차지하였다. 결론적으로 인삼 추출물을 콩의 발아액으로 활용하면, 콩나물의 성장촉진, 아미노산, 유기산 및 유리당 함량의 증진에 효과가 있는 것으로 나타났다.</p> <h2>콩나물의 아미노산 함량</h2><p>인삼추출물로 발아시켜 재배한 콩나물의 총 아미노산 함량 및 조성은 Table 2와 같다. Table 2에 나타난 바와 같이 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물의 총 아미노산 함량은\( 100 \mathrm{ppm} \) 에서 높았고, 농도가 높을수록 감소하였다. 재배일 수에서 충 아미노산 함량은 3 일째가 가장 높았고, \( 100 \mathrm{ppm} \) 처리시 3 일째 대조구와 비교하여 \( 20 \% \) 나 높았다. 콩나물의 아미노산 조성은 aspartic acid \( (12 \sim 32 \mathrm{mg} / \mathrm{g}) \) 와 glutamic \( \operatorname{acid}(5 \sim 13 \mathrm{mg} / \mathrm{g}) \) 가 가장 많았고, 다음으로 leucine, argi-nine, lysine 및 phenylalanine이 3 4 mg/g범위를 나타내었으며, serine, alanine, valine, threonine, isoleucine 및 glycine은 2 3 \( \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 이였는데, methionine은 아주 낮은 함량( \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 이하)을 나타내었는데, 이는 다른 보고자들의 결과와 대체적으로 비숫하였다. Aspartic acid는 대조구에 비하여 콩을 인삼추출물로 발아시키면 그 추출물의 농도가 증가할수록 약간씩 감소하는 경향이었으며, 재배기간이 길어질수록 그 함량은 증가하였다. 그러나 glutamicacid는 대체로 인삼추출물의 농도가 중가할수록 asparticacid와 같이 유사하게 감소하였으나, 재배기간이 길어질수록 aspartic acid와는 다르게 오히려 감스하는 경향이었다. 특히 glutamic acid는 쿵나물국의 구수한 맛을 내는 주성분이고, aspartic acid는 asparagine과 함께 숙취해소에 유용한 물질로서 콩나물의 중요한 식품성분으로 보고되어 있으며, 이들 아미노산은 전체 아미노산 중에 약 42\( 53 \% \) 를 차지하였다. Arginine의 함량은 인삼 추출물의 농도가 높을수록 그 함량은 약간 감소하였으며, 전반적으로 \( 100 \mathrm{ppm} \) 과 \( 200 \mathrm{ppm} \) 에서 대조구보다 많았고, 경시적으로는 2 일 재배한 콩나물에서 많았다. 이는 다른 연구자의 결과와 비교해서 5 배 정도의 높은 경향이었으며, 콩나물 재배시에 인삼 추출물을 저농도의 발아액으로 사용하면 arginine의 함량 변화에 영향을 부여한다고 판단되었다. 또한 arginine은 \( \mathrm{NO} \) 를 생산하는 주체로써 암 억제 물질인 p53, 저산소증유발 및 변이세포를 괴사시키는 HIF-I \( \alpha \) 를 조절하는 인자로 생리학적, 병리학적으로도 우수한 물질이며, 간손상에 따른 free radical 발생을 방지하여 간을 보호하는 기능성 물질로 알려지고 있다.</p>	생명과학	[ "<h1>결과 및 고찰</h1><h2>콩나물의 생육상태 변화</h2><p>인삼 추출물 농도 \\( (100,200,300,400 \\mathrm{ppm}) \\) 에 대한 재배 일수별 \\( (2,3,4 \\) 일 \\( ) \\) 콩나물의 무게 및 길이 변화는 콩나물 50개체에 대한 평균값으로 Table 1 과 같다.", "콩나물의 무게 변화에서 대조구는 중류수로만 재배한 콩나물로서 2일째 \\( 423.2 \\mathrm{mg} \\), 3일째 \\( 526.1 \\mathrm{mg}, 4 \\) 일째 \\( 697.3 \\mathrm{mg} \\) 으로 재배 일수가 증가할수록 무게도 증가하였다.", "각각의 인삼 농도별 모두 시간에 따른 무게의 증가경향을 보였다.", "즉, 처리 농도별의 콩나물 무게는 대체로 대조구에 비해 높게 나타났고, 200 \\( \\mathrm{ppm} \\) 처리할 때 2일째 \\( 446.5 \\mathrm{mg} \\), 3일째 \\( 624.2 \\mathrm{mg} \\), 4일째 \\( 750.1 \\mathrm{mg} \\) 으로 가장 뚜렷한 무게 증가를 보였다.", "그 정도는 각 재배일수별 대조구에 비해 평균 \\( 7.2 \\% \\) 높은 수치의 결과였다.", "재배일수와 한약재 추출물 종류 및 농도에 따른 콩나물 개체당 길이변화는 대즈구인 증류수로만 생육시킨 콩나물의 경우 2일째 \\( 4.6 \\mathrm{~cm}, 3 \\) 일째 \\( 10.2 \\mathrm{~cm}, 4 \\) 일째 \\( 17.3 \\mathrm{~cm} \\) 신장 생장을 하였다.", "4 일 이후의 성장속도는 2 일째에서 4 일째까지의 성장속도에 비하여 현저하게 느렸으며, 이것은 콩나물의 무게 변화와 유사한 경향이었다.", "인삼 추출물 농도가 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 에서 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 으로 갈수록 길이 생육이 종았고 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 추출물 처리구에서 2 일째 \\( 6.1 \\mathrm{~cm} \\), 3일째 \\( 15.2 \\) \\( \\mathrm{cm}, 4 \\) 일째 \\( 20.4 \\mathrm{~cm} \\) 로 대조구에 비해 콩나물 평균 \\( 32 \\% \\) 의 신장생장을 촉진시킴을 뚜렷이 관찰할 수 있었다.", "특히 그 변화는 3일째의 길이성장이 대조구에 비해 \\( 50 \\% \\) 빨리 됨을 알 수 있었으며, 또한 무게와 길이의 비율은 재배기간이 길어질수록 낮아지는 경향이었다.", "결론적으로 인삼추출물의 농도에 따라 콩나물을 재배할 때 무게와 길이의 변화는 인삼 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 농도에서 대조구에 비해 뛰어난 증가 현상올 나타냈다.", "이와 같이 생야", "재 추출물 중에 인삼 추출물이 비교적 낮은 농도에서 콩 발아 및 생장에 효과적인 것은 인삼 추출물 중의 glucose와 sucrose와 같은 유리당과 각종 유리 아미노산 등 때문이며, 고농도에서 약간 억제현상은 나타내는 것은 열수 추출물에 포함된 각종ginsenoside류, 알칼로이드, 정유, 테르페노이드 및 파이토스테롤류 둥에 의한 것으로 추측한다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>콩나물 콩(Glycine max \\( \\left.\\", "mathrm{L} . \\", "mathrm{M}_{\\mathrm{ERILL}}\\right) \\) 은 경남 거창에서 2002년도 재배된 오리알태 품종으로 콩알이 건실하고 윤가가 있는 햇콩을 사용하였고, 인삼(Panax ginseng)은 시중 한약상에서 건조된 5년근 수삼을 구입하여 사용하였다.", "</p><h2>생약 발아액의 제조</h2><p>인삼 \\( 100 \\mathrm{~g} \\) 에 수돗물 \\( 1 \\mathrm{~L} \\) 를 첨가하여 heating mantle로 6시간 끓인 후, 가열식 자석 교반장치(CIMAREC \\( { }^{\\mathrm{TM}} \\) Stir-ring Hot Plate)로 증발 농축시킨 시료를 \\( 10,000 \\mathrm{ppm} \\) 로 조제하였으며, 인삼에 서식하는 야생 미생물을 autoclave에서 \\( 121^{\\circ} \\mathrm{C}, 15 \\) 분간 고압 멸균하였다.", "재배에 적용한 인삼추출물 발아액의 농도는 100, 200, 300 및 \\( 400 \\mathrm{ppm} \\) 으로 하였다.", "</p><h2>콩나물의 재배</h2><p>선별한 콩 \\( 200 \\mathrm{~g} \\) 을 \\( 3 \\% \\mathrm{NaClO} \\) 용액으로 소독한 후 증류수로 세척하였고, 발아액을 각각 \\( 1 \\mathrm{~L} \\) 로 만든 후, 발아액에 세척한 콩을 담은 다음 \\( 24 \\pm 1^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 암실에서 24 시간 발아시켰고, 콩나물 재배기(Hi-Green Culture)에서 시간당 15분씩 증류수를 살포하여 4 일 동안 재배하였다.", "재배수는 증류수 \\( 2 \\mathrm{~L} \\) 로 매일 교환하였다.", "</p><h2>콩나물의 생육상태 측정</h2><p>각 처라농도별로 재배한 콩나물을 재배기의 각 부위에서 무게와 길이측정은 재배시작 후 2 일, 3 일, 4 일이 경과한 후에 무작위로 50 개씩을 채취하여 측정하여 평균값으로 하였다.", "</p><h2>아미노산 분석</h2><p>콩나물의 줄기부분을 동결건조시킨 다음, 40 메쉬 이하로 분말화시킨 \\( 100 \\mathrm{mg} \\) 을 단백질 분해용 시험관에 넣고 \\( 6 \\mathrm{~N} \\) \\( \\mathrm{HCl} 20 \\mathrm{~mL} \\) 를 가한 후, 질소가스를 충진하여 밀봉시킨다. \\", "( 110^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 24 시간 동안 가수분해한 후 여과 (Whatman No.2)해서 농축하고, 다시 \\( 0.2 \\mathrm{M} \\mathrm{Na} \\)-citrate buffer(pH 2.2) 2 \\( \\mathrm{mL} \\) 를 가하여 용해한 후 여과하여 아미노산 자동분석기 (Biochrom 20)에서 분석하였다.", "그. 조건은 column, ul-trapac 11 cation exchange resin; buffer, \\( 0.2 \\mathrm{M} \\mathrm{Na} \\)-citrate, buffer flow rate, \\( 40 \\mathrm{~mL} / \\mathrm{hr} \\); ninhydrin flow rate, 25 \\( \\mathrm{mL} / \\mathrm{hr} \\); colum temp, \\( 50 \\sim 80^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 로 하였다.", "</p><h2>유리당 분석</h2><p>콩나물 동결건조시킨 분말 \\( 100 \\mathrm{mg} \\) 을 취하여 시험관에 넣고 \\( 99 \\% \\) ethanol \\( 3 \\mathrm{~mL} \\) 와 \\( 80 \\% \\) ethanol \\( 3 \\mathrm{~mL} \\) 를 가하여 혼합시킨 후 20 분간 방치한 후 \\( 20^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 의 항온상태에서 \\( 80 \\% \\) ethanol \\( 4 \\mathrm{~mL} \\) 를 더 가하여 정용한 다음, 원심분리( 10,000 \\( \\mathrm{rpm}, 10 \\mathrm{~min} \\) )하여 상징액을 \\( \\mathrm{C}_{18} \\) Sep-pak cartridge와 \\( 0.2 \\) \\( \\mu \\mathrm{m} \\) membrane filter로서 색소 등의 이물질을 제거한 여과액을 분석용 시료로 사용하였으며, 그 분석은 Valverde 등의 방법에 준하여 HPLC (Shimadzu LC10A, Japan)로 행하였다.", "</p><h2>유기산 분석</h2><p>시료 \\( 100 \\mathrm{mg} \\) 을 취하여 소형 시험관에 넣고 증류수 10 \\( \\mathrm{mL} \\) 를 가하고 잘 섞은 후 \\( 32.4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 의 incubator에서 1 시간 방치한 후 원심분리 \\( (10,000 \\mathrm{rpm}, 10 \\mathrm{~min}) \\) 하여 상징액을 \\( \\mathrm{C}_{18} \\) Sep-pak cartridge와 \\( 0.2 \\) \\( \\mu \\)m membrane filter로서 색소 등의 이물질을 제거한 여과액을 분석용 시료로 사용하였다.", "그 분석은 Buslig 등의 방법에 준하여 HPLC (Shimadzu LC10A, Japan)로 행하였다.", "</p> <h1>서론</h1><p>콩나물은 콩을 발아시켜 만드는 채소식품의 하나로서 단백질, 무기질 및 비타민류가 풍부한 우리 고유의 전통식품으로서 재배기간이 짧고, 재배가 비교적 손쉬울 뿐만 아니라 가격이 저렴하여 대중적인 식품으로 널리 이용되고 있다.", "특히 콩나물은 대두가 발아 - 생장할 때에 콩 속에 없었던 비타민 C가 생성되어 채소공급이 원활하지 못한 겨울철의 비타민 C 공급원으로 뿐만 아니라 아스파라긴산을 포함한 각종 아미노산 및 유기산 등과 더불어 알코올 분해촉진 작용에 의한 숙취제거 및 젖산증가의 억제작용으로 감기·피로회복에 탁월한 효능이 알려저 동양뿐만 아니라 구미에서도 관심이 모아지고 있다.", "</p><p>최근 콩나물의 경우도 고급화와 기능성 강화를 목적으로 그 발아 - 재배과정에 여러 가지의 식품소재 혹은 식물 추출물들이 많이 사용되고 있는데, 현재까지 콩의 발아 및 콩나물의 생육 톡성에 관한 연구는 주로 이온수, 오존수, 황토지장수, 게르마늄, 키토산, 식물 생장조절제, 에털렌가스, 탈지참깨박 추출물을 포함한 식품첨가제 및 blue 광조사의 처리에 대하여 일부 조사한 보고들이 있다.", "그러나 국산 생야", "재 추출물을 이용하여 발아시킨 콩나물의 생장 및 화학적 성분의 품질 특성에 관한 연구들은 미흡한 실정이다.", "</p><p>본 연구자들은 숙취해소에 좋은 대표적인 생약재 추출물 5가지를 이용하여 콩나물의 생장촉진과 생리활성 생약재 성분들의 콩나물로 이행도 및 기호적 관능성 등을 조사하기 위한 연구의 일환으로 전보에서 한약재 중에서 국내산으로 쉽게 구할 수 있고, 오래 전부터 민간요법으로 많이 사용되고 있는 몇 가지 국산 한방약재의 추출물을 콩나물의 발아액으로 사용하여 그 생장상태톨 조사하였는데, 인삼이 가장 효과적이라고 보고한 바 있다.", "</p><p>따라서 본 연구에서는 콩나물 생장에 효과적인 인삼 추출물의 농도를 \\( 100,200,300 \\) 및 \\( 400 \\mathrm{ppm} \\) 으로 달리하여 발아시킨 콩나물의 재배기간에 따른 생육상태, 아미노산, 유리당 및 유기산 함량의 변화에 대하여 기초적인 조사하였다.", "</p> <h2>콩나물의 유리당 함량</h2><p>콩나물의 충 유리당 함량 및 조성은 Table 3 과 같다.", "Table 3에 나타난 바와 같이 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물의 총 유리당 함량은 추출물의 농도에 대해서는 일정한 경향을 나타내질 않았으나 대체로 대조구보다 약간 낮은 함량을 나타내었다.", "그러나 재배 3 일째의 추출물 농도 200 \\( \\mathrm{ppm} \\) 에서 총 유리당의 함량은 \\( 151.1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{g} \\) 으로 가장 높았고, 대조구 \\( 132.3 \\mathrm{mg} / \\mathrm{g} \\) 과 비교하여 \\( 14.2 \\% \\) 나 높았다.", "한편 콩나물의 유리당 조성은 ribose, fructose, galactose, su-crose가 검출되었고, 그 중에서 sucrose와 fructose의 함량이 많았으며, 전체 유리당에 대하여 \\( 65 \\sim 80 \\% \\) 범위를 차지하였다.", "또한 재배일수가 늘어남에 따라 ribose, fructose 및 galactose의 함량은 증가하였으며, sucrose의 합량은 대조구에서 그 함량은 감소하였으나, 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물은 3 일까지는 증가하다가 그 이후는 감소하는 경향을 보였다.", "Sucrose가 초기에 많은 함량을 보인 것온 sucrose가 stachyose의 분해 대사산물이기 때문이며, 이후 감소는 생육과정 중에서 단당류로 분해되므로 감소한다는것과 일치된다.", "그리고 재배일수가 길어짐에 따라 galac-tose의 함량이 증가하는 것은 콩나물 성장 중 세포벽을 구성하는 비섬유 단당류 중 galactose가 많은 함량을 차지한다는 보고와 같다.", "</p><h2>콩나물의 유기산 함량</h2><p>콩나물의 유기산 함량 및 조성은 Table 4 와 같다.", "Table4 에 나타난 바와 같이 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물의 총 유기산 함량은 대조구보다 대체로 높앖으며 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 에서 가장 높았고, 그 이상 농도에서는 농도가 높을수록 감소하였다.", "재배일수에서 충 아미노산 함량은 3 일째가 가장 높았고, \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 처리시 3 일째 대조구와 비교하여 \\( 50 \\% \\) 나 높았다.", "콩나물의 유기산으로는 oxalic acid, phytic acid, tartaric acid, malonic acid, lactic acid, fumaric acid 및 butyric acid가 검출되었다.", "그 함량은 phytic acid가 가장 높았고, butyric acid〉 lactic acid \\( \\rangle \\) malonic acid \\( \\rangle \\) tartaric acid oxalic acid \\( \\rangle \\) fumaric acid 순이었다.", "대조구는 phytic acid와 butyric acid의 함량이 전체 유기산 함량의 76.9 ~ \\( 80.2 \\% \\) 범위를 차지하였으며, 재배일수가 길어질수록 유기산의 함량이 다소 증가되었다.", "한편 인삼 추출물 처리구의 농도와 재배 일수별로 유기산의 변화는 재배일수 3 일째까지는 증가하지만, 그 이후는 다시 유기산 함량이 감소하는 경향을 보였고, \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 에서 가장 높은 유기산 함량을 보였으며, 그 농도 이상에서는 추출물의 농도가 높을수록 유기산 함량이 감소하였다.", "특히 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물 중의 phytic acid 및 butyric acid 함량은 대조구에 비해 크게 증가되었고, 따라서 인삼 추출물이 이들 유기산의 증가에 영향을 미치는 것으로 판단되었다.", "한편 phytic acid는 inositol hexaphosphoric acid와 철, 아연, 칼슘, 마그네슙 혹은 칼륨 등과 같은 2 가 혹은 3 가 금속의 킬레이트 염으로 용해도가 낮은 물질로 존재하므로, 이들 무기질의 인체내 홉수를 방해하여 항영양물질로 알려겨 왔다.", "그러나 최근에 in-vitro 및 동물 실험을 통하여 콩 및 그 식품에서 인산염 공급원으로 역할과 중금속의 인체내 홉수방지 및 각종 암과 심장병 질환의 예방효과에 대한 잠재적인 가능성이 입중됨에 따라 오히려 생리활성 물질로서 그 관심이 높아지고 있다.", "</p> <h1>요약</h1><p>인삼추출물(100 400 ppm)로 콩을 발아시켜 4 일간 재배한 콩나물의 생육특성, 아미노산, 유기산 및 유리당 함량의 변화를 조사하였다.", "인삼추출물은 콩나물의 길이 및 무게 증가에 효과적이었다.", "총 아미노산 함량은 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 에서 3일간 재배하였을 때가 가장 높았고, 추출물의 농도가 높을수록 그 함량이 많아졌다.", "또한 재배일수가 길어질수록 aspartic acid 함량은 증가하지만, glutamic acid 함량은 오히려 감소하는 경향을 나타내었다.", "총 유리당은 재배일수가 증가할수록 많아졌으나, 농도별로는 일정한 경향이 나타나지 않았다.", "Sucrose는 대조구에서 점진적으로 감소하였고, 추출물 처리구는 3 일까지는 증가하다가 그 이후는 감소하였으며, 다른 유리당은 4 일까지 지속적으로 증가하였다.", "총 유기산은 인삼추출물 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 으로 발아시켜 3일 동안 재배한 콩나물이 가장 많은 함량을 나타내었다.", "그중에서 phytic acid가 가장 많았으며, 총 유기산의 45 \\( 60 \\% \\) 정도를 차지하였다.", "결론적으로 인삼 추출물을 콩의 발아액으로 활용하면, 콩나물의 성장촉진, 아미노산, 유기산 및 유리당 함량의 증진에 효과가 있는 것으로 나타났다.", "</p> <h2>콩나물의 아미노산 함량</h2><p>인삼추출물로 발아시켜 재배한 콩나물의 총 아미노산 함량 및 조성은 Table 2와 같다.", "Table 2에 나타난 바와 같이 인삼 추출물로 발아시킨 콩나물의 총 아미노산 함량은\\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 에서 높았고, 농도가 높을수록 감소하였다.", "재배일 수에서 충 아미노산 함량은 3 일째가 가장 높았고, \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 처리시 3 일째 대조구와 비교하여 \\( 20 \\% \\) 나 높았다.", "콩나물의 아미노산 조성은 aspartic acid \\( (12 \\sim 32 \\mathrm{mg} / \\mathrm{g}) \\) 와 glutamic \\( \\operatorname{acid}(5 \\sim 13 \\mathrm{mg} / \\mathrm{g}) \\) 가 가장 많았고, 다음으로 leucine, argi-nine, lysine 및 phenylalanine이 3 4 mg/g범위를 나타내었으며, serine, alanine, valine, threonine, isoleucine 및 glycine은 2 3 \\( \\mathrm{mg} / \\mathrm{g} \\) 이였는데, methionine은 아주 낮은 함량( \\( 1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{g} \\) 이하)을 나타내었는데, 이는 다른 보고자들의 결과와 대체적으로 비숫하였다.", "Aspartic acid는 대조구에 비하여 콩을 인삼추출물로 발아시키면 그 추출물의 농도가 증가할수록 약간씩 감소하는 경향이었으며, 재배기간이 길어질수록 그 함량은 증가하였다.", "그러나 glutamicacid는 대체로 인삼추출물의 농도가 중가할수록 asparticacid와 같이 유사하게 감소하였으나, 재배기간이 길어질수록 aspartic acid와는 다르게 오히려 감스하는 경향이었다.", "특히 glutamic acid는 쿵나물국의 구수한 맛을 내는 주성분이고, aspartic acid는 asparagine과 함께 숙취해소에 유용한 물질로서 콩나물의 중요한 식품성분으로 보고되어 있으며, 이들 아미노산은 전체 아미노산 중에 약 42\\( 53 \\% \\) 를 차지하였다.", "Arginine의 함량은 인삼 추출물의 농도가 높을수록 그 함량은 약간 감소하였으며, 전반적으로 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 과 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 에서 대조구보다 많았고, 경시적으로는 2 일 재배한 콩나물에서 많았다.", "이는 다른 연구자의 결과와 비교해서 5 배 정도의 높은 경향이었으며, 콩나물 재배시에 인삼 추출물을 저농도의 발아액으로 사용하면 arginine의 함량 변화에 영향을 부여한다고 판단되었다.", "또한 arginine은 \\( \\mathrm{NO} \\) 를 생산하는 주체로써 암 억제 물질인 p53, 저산소증유발 및 변이세포를 괴사시키는 HIF-I \\( \\alpha \\) 를 조절하는 인자로 생리학적, 병리학적으로도 우수한 물질이며, 간손상에 따른 free radical 발생을 방지하여 간을 보호하는 기능성 물질로 알려지고 있다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "인삼 추출물로 발아시킨 콩나물의 식품성분 변화", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a2b55234-7830-4456-a39d-a91e76b2b385", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2003", "doc_author": [ "최상도", "김윤희", "남상해", "손미예", "최재훈" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,306	<p>가장 많았던 유형은 Sfil 으로 처리한 경우는 E pulsotype으로 39 주중 18 주로 46.2%를 차지하였으며, 그 외 A pulsotype 17.9%, C pulsotype 15.4%, F pulsotype 7.7% 및 B, D, G, H, I, J pulsotype이 각각 2.6% 로 유전적 양상이 다양하였다. NotI으로 처리한 경우는 f pulsotype이 38.5%로 가장 많은 유형을 차지하였으며, 그 외 d pulsotype 20.5%, e pulsotype 17.9%, a pulsotype 10.3%, h pulsotype 7.7% 및 b, c, g pulsotype이 각각 2.6%를 차지하였다.</p> <p>Lee 등이 국내에서 분리한 레지오넬라뉸에 대하여 NotI 처리에 의한 PFGE 패턴 보고에서와는 다른 DNA 절편 양상을 보인 d와 e pulsotype이 분포하고 있어 부산지역에서만 분리되는 유전형이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, Lee 등은 Sfil으로 처리하였을 경우 PEGE 패턴이 서울지역은 41 개의 분리균주를 분석하여 6개, 전북지역은 19개의 분리균주를 분석하여 1개, 강원지역은 14 개의 분리균주를 분석하여 6 개, 부산지역은 20 개의 분리균주를 분석하여 9개의 PFGE 패턴을 보고하여 유전형 양상의 다양함을 보고하였다. 특히 이 보고에서 부산지역에 분포하고 있는 9 개의 유형 중 8 개의 유형이 다른 지역에서는 분포하고 있지 않은 유형으로 알려져, PFGE 패턴이 지역적으로 분포하는 유형이 다름을 보고하였다.</p> <p>레지오넬라균이 분리된 지역별로 PFGE 패턴을 보면 E pulsotype은 부산의 12개 구청 및 경남 진주와 마산에서도 분포하고 있어 지역적으로 널리 분포하고 있는 유형임을 알 수 있었다(Table 2).</p> <p>연도별 PFGE 패턴을 보면 2001년도에는 A, E, F의 3 pulsotype이, 2002년도에는 A, C, D, E, H의 5 pulsotype, 2003년 B, C, E, I, J의 5 pulsotype이 분포하였다(Table 3). E pulsotype은 매년 분리되었으며, 그 외 새로운 유전형이 매년 분리되고 있어 분리균주에 대한 지속적인 PFGE 패턴 분석이 요구되었다.</p> <p>본 연구를 통하여 부산지역에서 분리되는 레지오넬라균에 대한 유전자 유형분석 결과를 데이터베이스화하여, 레지오넬라증의 집단 발생 또는 산발적인 질병 발생이 있을 경우 분자 생물학적 축면에서 사람과 환경에서 분라된 균으로부터 감염원과 감염경로를 규명하는 역학적인 도구로써 이용 가능할 것으로 사료되었다. 또한 전국의 각 시. 도에서 분리되는 레지오넬라균에 대한 PFGE 패턴 분석이 실시된다면 우리나라에 분포하고 있는 레지오넬라균의 지역별 유형분석도 가능할 것으로 사료되었다.</p> <table border><caption>Table \( 2 \). Geographical distribution of molecular type of 39 isolates and reference stain</caption> <tbody><tr><td rowspan=2>Area of origin</td><td rowspan=2>Isolates and reference strain</td><td colspan=2>PFGE</td></tr><tr><td>Sfil</td><td>Notl</td></tr><tr><td rowspan=5>Jung-gu</td><td>JG 0106</td><td>F3</td><td>a2</td></tr><tr><td>JG 0203</td><td>A3</td><td>e4</td></tr><tr><td>JG 0209</td><td>A1</td><td>e3</td></tr><tr><td>JG 0211, JG 0237</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>JG 0322</td><td>C2</td><td>d2</td></tr><tr><td>Seo-gu</td><td>SG 0154</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td rowspan=3>Dong-gu</td><td>DG 0152</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>DG 0160</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>DG 0326</td><td>B</td><td>c</td></tr><tr><td>Yeongdo-gu</td><td>YD 0156</td><td>E1</td><td>h</td></tr><tr><td rowspan=3>Busanjin-gu</td><td>BJ 0101, BJ 0102, BJ 0103, BJ 0107</td><td>A1</td><td>e1</td></tr><tr><td>BJ 0210</td><td>A2</td><td>e2</td></tr><tr><td>BJ 0221</td><td>D</td><td>d3</td></tr><tr><td rowspan=5>Dongnae-gu</td><td>DL 0118</td><td>F2</td><td>a3</td></tr><tr><td>DL 0303</td><td>I</td><td>d1</td></tr><tr><td>DL 0304</td><td>J</td><td>f</td></tr><tr><td>DL 0306</td><td>C3</td><td>d1</td></tr><tr><td>DL 0310</td><td>E2</td><td>g</td></tr><tr><td rowspan=3>Haeundae-gu</td><td>HW 0145, HW 0157, HW 0158, HW 0159, HW 0260</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>HW 0261</td><td>E4</td><td>h</td></tr><tr><td>HW 0325</td><td>C1</td><td>d1</td></tr><tr><td>Saha-gu<td>SH 0214</td><td>H</td><td>a1</td></tr><tr><td rowspan=2>Kumjung-gu</td><td>KJ 0223</td><td>E3</td><td>f</td></tr><tr><td>KJ 0224</td><td>C1</td><td>d1</td></tr><tr><td>Gangseo-gu</td><td>KS 0109</td><td>F1</td><td>a4</td></tr><tr><td>Yeonje-gu</td><td>YJ 0228, YJ 0239</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>Sasang-gu</td><td>SS 0227, SS 0234</td><td>C1</td><td>D1</td></tr><tr><td>the others</td><td>JJ * 0240, MS** 0241</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>Reference strain</td><td>L. pneumophila ATCC 33152</td><td>G</td><td>b</td></tr></tbody></table> <h1>요 약</h1> <p>2001년부터 2003년까지 부산지역의 냉각탑수에서 분리한 L. pneumophila (serogroup 1) 39균주에 대해 제한효소 SfiI 처리한 경우 PFGE 양상은 dice coefficient<65% 의 유사성을 가진 band률 A J로 10 개의 pulsotype으로 나누었고, 가장 많았던 유형은 E pulsotype으로 39주중 18주로 46.2%를 나타내었으며, 그 외 A pulsotype 17.9%, C pulsotype 15.4%, F pulsotype 7.7% 및 B, D, G, H, I, J pulsotype이 각각 2.6% 로 유전적 양상이 다양하였다. 제한효소 NotI 처리한 경우 PFGE 양상은 dice coefficient<60% 의 유사성을 가진 band를 a~h로 8개의 pulsotype으로 나누었고, 가장 많았던 유형은 f pulsotype이 38.5%였으며 그 외 d pulsotype 20.5%, e pulso-type 17.9%, a pulsotype 10.3%, h pulsotype 7.7% 및 b, c, g pulsotype이 각각 2.6%를 차지하였다.</p> <p>본 연구를 통하여 부산지역에서 분리되는 레지오넬라균에 대한 유전자 유형분석 결과를 데이터베이스화하여, 레지오넬라증의 집단 발생 또는 산발적인 질병 발생이 있을 경우 분자학적 측면에서 사람과 환경에서 분리된 균으로부터 감염원과 감염경로를 규명하는 역학적인 도구로써 이용 가능할 것으로 사료되었다.</p> <table border><caption>Table \( 3 \). Distribution of PFGE types of L. pneumophila isolates in 2001-2003.</caption> <tbody><tr><td rowspan=2>Year</td><td rowspan=2>L. pneumophila isolates</td><td colspan=2>PFGE</td></tr><tr><td>Sfil</td><td>Notl</td></tr><tr><td rowspan=8>2001</td><td>BJ 0101, BJ 0102, BJ 0103, BJ 0107</td><td>A1</td><td>e1</td></tr><tr><td>JG 0106</td><td>F3</td><td>a2</td></tr><tr><td>KS 0109</td><td>F1</td><td>a4</td></tr><tr><td>DL 0118</td><td>F2</td><td>a3</td></tr><tr><td>HW 0145, DG 0152, HW 0157, HW 0158, HW 0159</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>SG 0154</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>YD 0156</td><td>E1</td><td>h</td></tr><tr><td>DG 0160</td><td>E4</td><td>h</td></tr><tr><td rowspan=10>2002</td><td>JG 0203</td><td>A3</td><td>e4</td></tr><tr><td>JG 0209</td><td>A1</td><td>e3</td></tr><tr><td>BJ 0210</td><td>A2</td><td>e2</td></tr><tr><td>JG 0211, JG 0237, YJ 0228, YJ 0239, JJ 0240, MS 0241</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>SH 0214</td><td>H</td><td>a1</td></tr><tr><td>BJ 0221</td><td>D</td><td>d3</td></tr><tr><td>KJ 0223</td><td>E3</td><td>f</td></tr><tr><td>KJ 0224, SS 0227, SS 0234</td><td>C1</td><td>d1</td></tr><tr><td>HW 0260</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>HW 0261</td><td>E4</td><td>h</td></tr><tr><td rowspan=7>2003</td><td>DL 0303</td><td>I</td><td>d1</td></tr><tr><td>DL 0304</td><td>J</td><td>f</td></tr><tr><td>DL 0306</td><td>C3</td><td>d1</td></tr><tr><td>DL 0310</td><td>E2</td><td>g</td></tr><tr><td>JG 0322</td><td>C2</td><td>d2</td></tr><tr><td>HW 0325</td><td>C1</td><td>d1</td></tr><tr><td>DG 0326</td><td>B</td><td>c</td></tr></tbody></table> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주</h2> <p>본 연구에 사용한 균주는 2001년부터 2003년까지 부산지역의 냉각탑수에서 분리한 레지오넬라균 중에서 L.pneumophila serogroup 1으로 동정된 것으로 Table 1과 같으며, 표준균주는 L. pneumophila ATCC 33152 (serogroup 1)를 사용하였으며, 기타 경남 마산 및 진주 지역의 냉각탑수에서 분리된 L. pmeum-ophila serogroup 1을 함께 사용하였다. Pulsed-filed gel electro-phoresis 실험은 Lee 등의 방법으로 살시하였다.</p> <h2>균의 분리 및 동정</h2> <p>냉각탑수에서 레지오넬라균의 분리 및 동정은 Park 등의 방법에 따랐다. 냉각탑수 1L를 채수하여 \( 0.2 \mu \mathrm { m } \) 멸균 여과지를 통과시킨 후 여과지를 절단하여 여액 20ml에 부유하여 50℃에서 30 분간 열처리하였다. 열처리한 검체 \( 100 \mu \mathrm { l } \) 를 항생 물질[polymyxin B sulfate 79,200 unit/l, vancomycin 5g/l), cyclohexamide (80g/l), glycine (3g/l) ]과 영양물질 [L-cystei \( \mathrm { n } \cdot \mathrm { HCl } (0.4g/l) \), ferric pyrophosphate (0.25g/l)] 이 첨가된 buffered charchoal yeast extract (BCYE, Difco) 한천배지에 접종하여 90% 습도를 유지한 35℃ 배양기에서 10 일간 배양하였다. 균의 동정은 4 일 후부터 자라나온 회백색의 집락을 BCYE 한천배지와 혈액한천배지에 동시에 접종하여 BCYE 한천배지에서는 자라나 혈액한천배지에서는 자라지 못하는 균 (L-cystein 요구주)을 대상으로 무포자의 그람 음성 간균을 Legionella 속으로 추정하여, 혈청학적으로 동정하였다. 혈청형의 확인은 Legionella antisera (Denka Seiken, Japan)를 사용하여 슬라이드 응집법으로 실시하여, Legionella pneumophila serogroup 1에 응집된 균을 PFGE 분석에 사용하였다.</p> <h2>Gel plug의 준비</h2> <p>레지오넬라균을 BCYE 한천배지에 접종하여 35℃ 에서 48시간 배양한 후 TES buffer ( 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH8.0) 3ml에 균을 현탁하여 bioMerieux Vitek colorimeter 10% 의 투명도로 균 농도를 조절하였다. 균 현탁액을 12,000rpm 에서 10 분간 2회 세척한 후, 균 침전물을 TES buffer \( 300 \mu l \) 로 재 부유한 후, 1.2% Seakem gold agarose (FMC Bio Products, USA) \( 300 \mu l \) 를 첨가하여 plug를 만들어 4℃에서 5 분간 굳혔다. Plug의 lysis는 lysis buffer 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM EDTA (pH 8.0), 1% Sarcosyl, 1mg proteinase K, 1mg lysozyme, \( 20 \mu \mathrm { g } \) RNase A } 를 1ml 씩 첨가하여 50℃ 에서 48 시간 처리하였고, 상온에서 멸균증류수로 5분간 1회, TE buffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)로 5 분간 2회 세척한 후 TE buffer를 첨가하여 사용할 때까지 냉장 보관하였다.</p> <table border><caption>Table \( 1 \). L. pneumophila ATCC 33152 and 39 isolates used in this study</caption> <tbody><tr><td>Year</td><td>Isolates</td><td>Area of origin</td><td>Year</td><td>Isolates</td><td>Area of origin</td></tr><tr><td rowspan = 15>2001</td><td>BJ 0101</td><td>Busanjin-gu</td><td rowspan=12>2002</td><td>BJ 0221</td><td>Busanjin-gu</td></tr><tr><td>BJ 0102</td><td>Busanjin-gu</td><td>KJ 0223</td><td>Kumjung-gu</td></tr><tr><td>BJ 0103</td><td>Busanjin-gu</td><td>KJ 0224</td><td>Kumjung-gu</td></tr><tr><td>JG 0106</td><td>Jung-gu</td><td>SS 0227</td><td>Sasang-gu</td></tr><tr><td>BJ 0107</td><td>Busanjin-gu</td><td>YJ 0228</td><td>Yeonje-gu</td></tr><tr><td>KS 0109</td><td>Gangseo-gu</td><td>SS 0234</td><td>Sasang-gu</td></tr><tr><td>DL 0118</td><td>Dongnae-gu</td><td>JG 0237</td><td>Jung-gu</td></tr><tr><td>HW 0145</td><td>Haeundae-gu</td><td>YG 0239</td><td>Yeonje-gu</td></tr><tr><td>DG 0152</td><td>Dong-gu</td><td>JJ 0240</td><td>Jinju</td></tr><tr><td>SG 0154</td><td>Seo-gu</td><td>MS 0241</td><td>Masan</td></tr><tr><td>YD 0156</td><td>Yeongdo-gu</td><td>HW 0260</td><td>Haeundae-gu</td></tr><tr><td>HW 0157</td><td>Haeundae-gu</td><td>HW 0261</td><td>Haeundae-gu</td></tr><tr><td>HW 0158</td><td>Haeundae-gu</td><td rowspan=7>2003</td><td>DL 0303</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td>HW 0159</td><td>Haeundae-gu</td><td>DL 0304</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td>DG 0160</td><td>Dong-gu</td><td>DL 0306</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td rowspan=5>2002</td><td>JG 0203</td><td>Jung-gu</td><td>DL 0310</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td>JG 0209</td><td>Jung-gu</td><td>JG 0322</td><td>Jung-gu</td></tr><tr><td>BJ 0210</td><td>Busanjin-gu</td><td>HW 0325</td><td>Haeundae-gu</td></tr><tr><td>JG 0211</td><td>Jung-gu</td><td>DG 0326</td><td>Dong-gu</td></tr><tr><td>SH 0214</td><td>Saha-gu</td><td>Reference strain</td><td colspan=2>L. pneumophila ATCC 33152</td></tr></tbody></table>	생명과학	[ "<p>가장 많았던 유형은 Sfil 으로 처리한 경우는 E pulsotype으로 39 주중 18 주로 46.2%를 차지하였으며, 그 외 A pulsotype 17.9%, C pulsotype 15.4%, F pulsotype 7.7% 및 B, D, G, H, I, J pulsotype이 각각 2.6% 로 유전적 양상이 다양하였다.", "NotI으로 처리한 경우는 f pulsotype이 38.5%로 가장 많은 유형을 차지하였으며, 그 외 d pulsotype 20.5%, e pulsotype 17.9%, a pulsotype 10.3%, h pulsotype 7.7% 및 b, c, g pulsotype이 각각 2.6%를 차지하였다.", "</p> <p>Lee 등이 국내에서 분리한 레지오넬라뉸에 대하여 NotI 처리에 의한 PFGE 패턴 보고에서와는 다른 DNA 절편 양상을 보인 d와 e pulsotype이 분포하고 있어 부산지역에서만 분리되는 유전형이 있음을 확인할 수 있었다.", "또한, Lee 등은 Sfil으로 처리하였을 경우 PEGE 패턴이 서울지역은 41 개의 분리균주를 분석하여 6개, 전북지역은 19개의 분리균주를 분석하여 1개, 강원지역은 14 개의 분리균주를 분석하여 6 개, 부산지역은 20 개의 분리균주를 분석하여 9개의 PFGE 패턴을 보고하여 유전형 양상의 다양함을 보고하였다.", "특히 이 보고에서 부산지역에 분포하고 있는 9 개의 유형 중 8 개의 유형이 다른 지역에서는 분포하고 있지 않은 유형으로 알려져, PFGE 패턴이 지역적으로 분포하는 유형이 다름을 보고하였다.", "</p> <p>레지오넬라균이 분리된 지역별로 PFGE 패턴을 보면 E pulsotype은 부산의 12개 구청 및 경남 진주와 마산에서도 분포하고 있어 지역적으로 널리 분포하고 있는 유형임을 알 수 있었다", "(Table 2).", "</p> <p>연도별 PFGE 패턴을 보면 2001년도에는 A, E, F의 3 pulsotype이, 2002년도에는 A, C, D, E, H의 5 pulsotype, 2003년 B, C, E, I, J의 5 pulsotype이 분포하였다", "(Table 3).", "E pulsotype은 매년 분리되었으며, 그 외 새로운 유전형이 매년 분리되고 있어 분리균주에 대한 지속적인 PFGE 패턴 분석이 요구되었다.", "</p> <p>본 연구를 통하여 부산지역에서 분리되는 레지오넬라균에 대한 유전자 유형분석 결과를 데이터베이스화하여, 레지오넬라증의 집단 발생 또는 산발적인 질병 발생이 있을 경우 분자 생물학적 축면에서 사람과 환경에서 분라된 균으로부터 감염원과 감염경로를 규명하는 역학적인 도구로써 이용 가능할 것으로 사료되었다.", "또한 전국의 각 시.", "도에서 분리되는 레지오넬라균에 대한 PFGE 패턴 분석이 실시된다면 우리나라에 분포하고 있는 레지오넬라균의 지역별 유형분석도 가능할 것으로 사료되었다.", "</p> <table border><caption>Table \\( 2 \\).", "Geographical distribution of molecular type of 39 isolates and reference stain</caption> <tbody><tr><td rowspan=2>Area of origin</td><td rowspan=2>Isolates and reference strain</td><td colspan=2>PFGE</td></tr><tr><td>Sfil</td><td>Notl</td></tr><tr><td rowspan=5>Jung-gu</td><td>JG 0106</td><td>F3</td><td>a2</td></tr><tr><td>JG 0203</td><td>A3</td><td>e4</td></tr><tr><td>JG 0209</td><td>A1</td><td>e3</td></tr><tr><td>JG 0211, JG 0237</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>JG 0322</td><td>C2</td><td>d2</td></tr><tr><td>Seo-gu</td><td>SG 0154</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td rowspan=3>Dong-gu</td><td>DG 0152</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>DG 0160</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>DG 0326</td><td>B</td><td>c</td></tr><tr><td>Yeongdo-gu</td><td>YD 0156</td><td>E1</td><td>h</td></tr><tr><td rowspan=3>Busanjin-gu</td><td>BJ 0101, BJ 0102, BJ 0103, BJ 0107</td><td>A1</td><td>e1</td></tr><tr><td>BJ 0210</td><td>A2</td><td>e2</td></tr><tr><td>BJ 0221</td><td>D</td><td>d3</td></tr><tr><td rowspan=5>Dongnae-gu</td><td>DL 0118</td><td>F2</td><td>a3</td></tr><tr><td>DL 0303</td><td>I</td><td>d1</td></tr><tr><td>DL 0304</td><td>J</td><td>f</td></tr><tr><td>DL 0306</td><td>C3</td><td>d1</td></tr><tr><td>DL 0310</td><td>E2</td><td>g</td></tr><tr><td rowspan=3>Haeundae-gu</td><td>HW 0145, HW 0157, HW 0158, HW 0159, HW 0260</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>HW 0261</td><td>E4</td><td>h</td></tr><tr><td>HW 0325</td><td>C1</td><td>d1</td></tr><tr><td>Saha-gu<td>SH 0214</td><td>H</td><td>a1</td></tr><tr><td rowspan=2>Kumjung-gu</td><td>KJ 0223</td><td>E3</td><td>f</td></tr><tr><td>KJ 0224</td><td>C1</td><td>d1</td></tr><tr><td>Gangseo-gu</td><td>KS 0109</td><td>F1</td><td>a4</td></tr><tr><td>Yeonje-gu</td><td>YJ 0228, YJ 0239</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>Sasang-gu</td><td>SS 0227, SS 0234</td><td>C1</td><td>D1</td></tr><tr><td>the others</td><td>JJ * 0240, MS** 0241</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>Reference strain</td><td>L.", "pneumophila ATCC 33152</td><td>G</td><td>b</td></tr></tbody></table> <h1>요 약</h1> <p>2001년부터 2003년까지 부산지역의 냉각탑수에서 분리한 L.", "pneumophila (serogroup 1) 39균주에 대해 제한효소 SfiI 처리한 경우 PFGE 양상은 dice coefficient<65% 의 유사성을 가진 band률 A J로 10 개의 pulsotype으로 나누었고, 가장 많았던 유형은 E pulsotype으로 39주중 18주로 46.2%를 나타내었으며, 그 외 A pulsotype 17.9%, C pulsotype 15.4%, F pulsotype 7.7% 및 B, D, G, H, I, J pulsotype이 각각 2.6% 로 유전적 양상이 다양하였다.", "제한효소 NotI 처리한 경우 PFGE 양상은 dice coefficient<60% 의 유사성을 가진 band를 a~h로 8개의 pulsotype으로 나누었고, 가장 많았던 유형은 f pulsotype이 38.5%였으며 그 외 d pulsotype 20.5%, e pulso-type 17.9%, a pulsotype 10.3%, h pulsotype 7.7% 및 b, c, g pulsotype이 각각 2.6%를 차지하였다.", "</p> <p>본 연구를 통하여 부산지역에서 분리되는 레지오넬라균에 대한 유전자 유형분석 결과를 데이터베이스화하여, 레지오넬라증의 집단 발생 또는 산발적인 질병 발생이 있을 경우 분자학적 측면에서 사람과 환경에서 분리된 균으로부터 감염원과 감염경로를 규명하는 역학적인 도구로써 이용 가능할 것으로 사료되었다.", "</p> <table border><caption>Table \\( 3 \\).", "Distribution of PFGE types of L.", "pneumophila isolates in 2001-2003.</caption> <tbody><tr><td rowspan=2>Year</td><td rowspan=2>L.", "pneumophila isolates</td><td colspan=2>PFGE</td></tr><tr><td>Sfil</td><td>Notl</td></tr><tr><td rowspan=8>2001</td><td>BJ 0101, BJ 0102, BJ 0103, BJ 0107</td><td>A1</td><td>e1</td></tr><tr><td>JG 0106</td><td>F3</td><td>a2</td></tr><tr><td>KS 0109</td><td>F1</td><td>a4</td></tr><tr><td>DL 0118</td><td>F2</td><td>a3</td></tr><tr><td>HW 0145, DG 0152, HW 0157, HW 0158, HW 0159</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>SG 0154</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>YD 0156</td><td>E1</td><td>h</td></tr><tr><td>DG 0160</td><td>E4</td><td>h</td></tr><tr><td rowspan=10>2002</td><td>JG 0203</td><td>A3</td><td>e4</td></tr><tr><td>JG 0209</td><td>A1</td><td>e3</td></tr><tr><td>BJ 0210</td><td>A2</td><td>e2</td></tr><tr><td>JG 0211, JG 0237, YJ 0228, YJ 0239, JJ 0240, MS 0241</td><td>E1</td><td>f</td></tr><tr><td>SH 0214</td><td>H</td><td>a1</td></tr><tr><td>BJ 0221</td><td>D</td><td>d3</td></tr><tr><td>KJ 0223</td><td>E3</td><td>f</td></tr><tr><td>KJ 0224, SS 0227, SS 0234</td><td>C1</td><td>d1</td></tr><tr><td>HW 0260</td><td>E4</td><td>f</td></tr><tr><td>HW 0261</td><td>E4</td><td>h</td></tr><tr><td rowspan=7>2003</td><td>DL 0303</td><td>I</td><td>d1</td></tr><tr><td>DL 0304</td><td>J</td><td>f</td></tr><tr><td>DL 0306</td><td>C3</td><td>d1</td></tr><tr><td>DL 0310</td><td>E2</td><td>g</td></tr><tr><td>JG 0322</td><td>C2</td><td>d2</td></tr><tr><td>HW 0325</td><td>C1</td><td>d1</td></tr><tr><td>DG 0326</td><td>B</td><td>c</td></tr></tbody></table> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>사용 균주</h2> <p>본 연구에 사용한 균주는 2001년부터 2003년까지 부산지역의 냉각탑수에서 분리한 레지오넬라균 중에서 L.pneumophila serogroup 1으로 동정된 것으로 Table 1과 같으며, 표준균주는 L.", "pneumophila ATCC 33152 (serogroup 1)를 사용하였으며, 기타 경남 마산 및 진주 지역의 냉각탑수에서 분리된 L.", "pmeum-ophila serogroup 1을 함께 사용하였다.", "Pulsed-filed gel electro-phoresis 실험은 Lee 등의 방법으로 살시하였다.", "</p> <h2>균의 분리 및 동정</h2> <p>냉각탑수에서 레지오넬라균의 분리 및 동정은 Park 등의 방법에 따랐다.", "냉각탑수 1L를 채수하여 \\( 0.2 \\mu \\mathrm { m } \\) 멸균 여과지를 통과시킨 후 여과지를 절단하여 여액 20ml에 부유하여 50℃에서 30 분간 열처리하였다.", "열처리한 검체 \\( 100 \\mu \\mathrm { l } \\) 를 항생 물질[polymyxin B sulfate 79,200 unit/l, vancomycin 5g/l), cyclohexamide (80g/l), glycine (3g/l) ]과 영양물질 [L-cystei \\( \\mathrm { n } \\cdot \\mathrm { HCl } (0.4g/l) \\), ferric pyrophosphate (0.25g/l)] 이 첨가된 buffered charchoal yeast extract (BCYE, Difco) 한천배지에 접종하여 90% 습도를 유지한 35℃ 배양기에서 10 일간 배양하였다.", "균의 동정은 4 일 후부터 자라나온 회백색의 집락을 BCYE 한천배지와 혈액한천배지에 동시에 접종하여 BCYE 한천배지에서는 자라나 혈액한천배지에서는 자라지 못하는 균 (L-cystein 요구주)을 대상으로 무포자의 그람 음성 간균을 Legionella 속으로 추정하여, 혈청학적으로 동정하였다.", "혈청형의 확인은 Legionella antisera (Denka Seiken, Japan)를 사용하여 슬라이드 응집법으로 실시하여, Legionella pneumophila serogroup 1에 응집된 균을 PFGE 분석에 사용하였다.", "</p> <h2>Gel plug의 준비</h2> <p>레지오넬라균을 BCYE 한천배지에 접종하여 35℃ 에서 48시간 배양한 후 TES buffer ( 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, 100mM NaCl, pH8.0) 3ml에 균을 현탁하여 bioMerieux Vitek colorimeter 10% 의 투명도로 균 농도를 조절하였다.", "균 현탁액을 12,000rpm 에서 10 분간 2회 세척한 후, 균 침전물을 TES buffer \\( 300 \\mu l \\) 로 재 부유한 후, 1.2% Seakem gold agarose (FMC Bio Products, USA) \\( 300 \\mu l \\) 를 첨가하여 plug를 만들어 4℃에서 5 분간 굳혔다.", "Plug의 lysis는 lysis buffer 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM EDTA (pH 8.0), 1% Sarcosyl, 1mg proteinase K, 1mg lysozyme, \\( 20 \\mu \\mathrm { g } \\) RNase A } 를 1ml 씩 첨가하여 50℃ 에서 48 시간 처리하였고, 상온에서 멸균증류수로 5분간 1회, TE buffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)로 5 분간 2회 세척한 후 TE buffer를 첨가하여 사용할 때까지 냉장 보관하였다.", "</p> <table border><caption>Table \\( 1 \\). L. pneumophila ATCC 33152 and 39 isolates used in this study</caption> <tbody><tr><td>Year</td><td>Isolates</td><td>Area of origin</td><td>Year</td><td>Isolates</td><td>Area of origin</td></tr><tr><td rowspan = 15>2001</td><td>BJ 0101</td><td>Busanjin-gu</td><td rowspan=12>2002</td><td>BJ 0221</td><td>Busanjin-gu</td></tr><tr><td>BJ 0102</td><td>Busanjin-gu</td><td>KJ 0223</td><td>Kumjung-gu</td></tr><tr><td>BJ 0103</td><td>Busanjin-gu</td><td>KJ 0224</td><td>Kumjung-gu</td></tr><tr><td>JG 0106</td><td>Jung-gu</td><td>SS 0227</td><td>Sasang-gu</td></tr><tr><td>BJ 0107</td><td>Busanjin-gu</td><td>YJ 0228</td><td>Yeonje-gu</td></tr><tr><td>KS 0109</td><td>Gangseo-gu</td><td>SS 0234</td><td>Sasang-gu</td></tr><tr><td>DL 0118</td><td>Dongnae-gu</td><td>JG 0237</td><td>Jung-gu</td></tr><tr><td>HW 0145</td><td>Haeundae-gu</td><td>YG 0239</td><td>Yeonje-gu</td></tr><tr><td>DG 0152</td><td>Dong-gu</td><td>JJ 0240</td><td>Jinju</td></tr><tr><td>SG 0154</td><td>Seo-gu</td><td>MS 0241</td><td>Masan</td></tr><tr><td>YD 0156</td><td>Yeongdo-gu</td><td>HW 0260</td><td>Haeundae-gu</td></tr><tr><td>HW 0157</td><td>Haeundae-gu</td><td>HW 0261</td><td>Haeundae-gu</td></tr><tr><td>HW 0158</td><td>Haeundae-gu</td><td rowspan=7>2003</td><td>DL 0303</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td>HW 0159</td><td>Haeundae-gu</td><td>DL 0304</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td>DG 0160</td><td>Dong-gu</td><td>DL 0306</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td rowspan=5>2002</td><td>JG 0203</td><td>Jung-gu</td><td>DL 0310</td><td>Dongnae-gu</td></tr><tr><td>JG 0209</td><td>Jung-gu</td><td>JG 0322</td><td>Jung-gu</td></tr><tr><td>BJ 0210</td><td>Busanjin-gu</td><td>HW 0325</td><td>Haeundae-gu</td></tr><tr><td>JG 0211</td><td>Jung-gu</td><td>DG 0326</td><td>Dong-gu</td></tr><tr><td>SH 0214</td><td>Saha-gu</td><td>Reference strain</td><td colspan=2>L.", "pneumophila ATCC 33152</td></tr></tbody></table>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "부산지역에서 분리한 레지오넬라균에 대한 PFGE를 이용한 molecular typing", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a59d3c1f-7b90-40a7-a0b5-f61fb98909cb", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2005", "doc_author": [ "박은희", "김미희", "김정아", "한난숙", "이주현", "민상기", "박연경", "진성현", "정구영", "빈재훈" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,307	<h1>요약</h1><p>본 연구에서 국내 연근해에 서식하는 해면 Sarcotragus sp.(Dictyoceratida 속)에서 분리 추출된 7종의 furanoterpenoid계 화합물[sarcotin A, epi-sarcotin A, ircinin-1, epi-sarcotrine B, sarcotin I, (8E,13Z,20Z)-strobilinin/(7E,13Z, 20Z)-felixinin and (7E,12 E,18R,20Z)-variabilin]의 항암 활성을 비교하기 위하여 A549 인체폐암세포를 대상으로 그들의 세포독성을 조사하였고, 이와 연관된 세포증식 억제 및 apoptosis 유발에 관여할 것으로 예상되는 중요한 유전자 몇 가지의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 조사된 7종의 화합물 모두 처리 농도 의존적으로 A549 폐암세포의 증식을 억제하였는데, 그중 sarcotin A 및 (7E,12 E,18R,20Z)-variabilin이 비교적 높은 세포독성을 나타내었다. 이러한 세포증식의 억제는 종양억제 유전자 p53 의존적 또는 비의존적으로 Bcl-2 유전자에 대한 Bax의 발현 증가와 연관된 apoptosis 유발과 관련이 있었으며, epi-sarcotin A, ircinin-1 및 epi-sarcotrine B 처리군에서 이러한 현상은 두드러지게 관찰되었다. 또한 epi-sarcotin A와 ircinin-1은 COX-1의 발현에는 아무런 영향을 미치지 않았으나, COX-2의 발현은 선택적으로 저해하였다. 이러한 결과는 해양 해면동물에서 유래된 furanoterpenoid계 화합물이 선택적으로 강력한 항암효과를 가질 수 있다는 것을 의미한다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>A549 암세포의 성장에 미치는 furanoterpenoid 화합물의 영향</h2><p>암세포의 증식에 미치는 furanoterpenoid 화합물의 세포 독성 정도를 비교하기 위하여 다양한 농도의 7가지의 furanoterpenoid 화합물이 희석되어 있는 배지에 A549 세포를 48시간 동안 배양한 후 MTT assay를 실시하였다. Fig. 2의 결과에서 알 수 있듯이 본 연구에 사용된 furanoterpenoids 화합물은 모두 약간의 정도 차이는 있지만 처리 농도 의존적으로 암세포의 증식을 강력히 억제하였다. 그중 가장 큰 세포 독성 효과를 보인 것은 sarcotin A이었으며, 그 다음은 (7E,12E,18R,20Z)-variabilin로서 \( LC_{50} \)은 약 \( 15 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 및 \( 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 정도였다. 이 결과는 실험 방법상의 차이점으로 선행연구의 결과와 직접 비교하기는 어려우나, 세포독성의 효과 면에서는 대체로 유사한 경향성을 보인다고 할 수 있겠다. 이러한 furanoterpenoids의 세포독성 효과는 Fig. 3A에 나타낸 바와 같이 암세포의 전체적인 형태변화에도 큰 영향을 미쳤으며, 특히 고농도 처리군에서 많은 세포들이 부착력을 상실하고 배지로 부유하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 ircinin-1 및 epi-sarcotrine B 처리군에서는 암세포의 모양이 길어지면서 분지를 형성하는 듯한 특이한 형태적 변화를 관찰할 수 있었다. 따라서 의 두 furanoterpenoid는 암세포의 분화 가능성과 연관된 계속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.</p><h2>Furanoterpenoids에 의한 apoptosis의 유발</h2><p>다음은 이러한 furanoterpenoids의 세포 독성에 의한 암세포의 성장억제와 형태적 변형이 암세포의 apoptosis 유발과 직접적인 연관성이 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 실시된 DAPI 염색의 결과는 Fig. 3B에 나타낸 바와 같다. Fig. 3에 나타낸 바와 같이 furanoterpenoids가 처리되지 않은 정상 배지에서 자란 암세포에서 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색아 되었으나 furanoterpenoids가 처리된 암세포의 경우, 염색질 응축에 의한 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 apoptotic body가 furanoterpenoids 처리 농도 의존적으로 증가되었다. 특히 apoptotic body의 형성이 상대적으로 많이 관찰된 것은 epi-sarcotin A, ircinin-1 , epi-sarcotrine B 등이었으며, 그중 ircinin-1 처리군에서 가장 많은 apoptotic body를 관찰할 수 있었다. 즉 이러한 apoptotic body의 출현은 nucleosome의 linker DNA 부분의 절단에 의한 DNA 단편화의 결과이므로 furanoterpenoids의 처리에 의한 암세포의 증식억제 및 형태적 변형이 암세포의 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.</p>	생명과학	[ "<h1>요약</h1><p>본 연구에서 국내 연근해에 서식하는 해면 Sarcotragus sp.", "(Dictyoceratida 속)에서 분리 추출된 7종의 furanoterpenoid계 화합물[sarcotin A, epi-sarcotin A, ircinin-1, epi-sarcotrine B, sarcotin I, (8E,13Z,20Z)-strobilinin/(7E,13Z, 20Z)-felixinin and (7E,12 E,18R,20Z)-variabilin]의 항암 활성을 비교하기 위하여 A549 인체폐암세포를 대상으로 그들의 세포독성을 조사하였고, 이와 연관된 세포증식 억제 및 apoptosis 유발에 관여할 것으로 예상되는 중요한 유전자 몇 가지의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.", "조사된 7종의 화합물 모두 처리 농도 의존적으로 A549 폐암세포의 증식을 억제하였는데, 그중 sarcotin A 및 (7E,12 E,18R,20Z)-variabilin이 비교적 높은 세포독성을 나타내었다.", "이러한 세포증식의 억제는 종양억제 유전자 p53 의존적 또는 비의존적으로 Bcl-2 유전자에 대한 Bax의 발현 증가와 연관된 apoptosis 유발과 관련이 있었으며, epi-sarcotin A, ircinin-1 및 epi-sarcotrine B 처리군에서 이러한 현상은 두드러지게 관찰되었다.", "또한 epi-sarcotin A와 ircinin-1은 COX-1의 발현에는 아무런 영향을 미치지 않았으나, COX-2의 발현은 선택적으로 저해하였다.", "이러한 결과는 해양 해면동물에서 유래된 furanoterpenoid계 화합물이 선택적으로 강력한 항암효과를 가질 수 있다는 것을 의미한다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>A549 암세포의 성장에 미치는 furanoterpenoid 화합물의 영향</h2><p>암세포의 증식에 미치는 furanoterpenoid 화합물의 세포 독성 정도를 비교하기 위하여 다양한 농도의 7가지의 furanoterpenoid 화합물이 희석되어 있는 배지에 A549 세포를 48시간 동안 배양한 후 MTT assay를 실시하였다.", "Fig.", "2의 결과에서 알 수 있듯이 본 연구에 사용된 furanoterpenoids 화합물은 모두 약간의 정도 차이는 있지만 처리 농도 의존적으로 암세포의 증식을 강력히 억제하였다.", "그중 가장 큰 세포 독성 효과를 보인 것은 sarcotin A이었으며, 그 다음은 (7E,12E,18R,20Z)-variabilin로서 \\( LC_{50} \\)은 약 \\( 15 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 및 \\( 20 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 정도였다.", "이 결과는 실험 방법상의 차이점으로 선행연구의 결과와 직접 비교하기는 어려우나, 세포독성의 효과 면에서는 대체로 유사한 경향성을 보인다고 할 수 있겠다.", "이러한 furanoterpenoids의 세포독성 효과는 Fig.", "3A에 나타낸 바와 같이 암세포의 전체적인 형태변화에도 큰 영향을 미쳤으며, 특히 고농도 처리군에서 많은 세포들이 부착력을 상실하고 배지로 부유하는 것을 관찰할 수 있었다.", "특히 ircinin-1 및 epi-sarcotrine B 처리군에서는 암세포의 모양이 길어지면서 분지를 형성하는 듯한 특이한 형태적 변화를 관찰할 수 있었다.", "따라서 의 두 furanoterpenoid는 암세포의 분화 가능성과 연관된 계속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.", "</p><h2>Furanoterpenoids에 의한 apoptosis의 유발</h2><p>다음은 이러한 furanoterpenoids의 세포 독성에 의한 암세포의 성장억제와 형태적 변형이 암세포의 apoptosis 유발과 직접적인 연관성이 있는지를 조사하였다.", "이를 위하여 실시된 DAPI 염색의 결과는 Fig.", "3B에 나타낸 바와 같다.", "Fig.", "3에 나타낸 바와 같이 furanoterpenoids가 처리되지 않은 정상 배지에서 자란 암세포에서 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색아 되었으나 furanoterpenoids가 처리된 암세포의 경우, 염색질 응축에 의한 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 apoptotic body가 furanoterpenoids 처리 농도 의존적으로 증가되었다.", "특히 apoptotic body의 형성이 상대적으로 많이 관찰된 것은 epi-sarcotin A, ircinin-1 , epi-sarcotrine B 등이었으며, 그중 ircinin-1 처리군에서 가장 많은 apoptotic body를 관찰할 수 있었다.", "즉 이러한 apoptotic body의 출현은 nucleosome의 linker DNA 부분의 절단에 의한 DNA 단편화의 결과이므로 furanoterpenoids의 처리에 의한 암세포의 증식억제 및 형태적 변형이 암세포의 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "인체폐암세포의 Bcl-2 family 및 cyclooxygenases의 발현에 미치는 해면동물 Sarcotragus sp. 유래 furanoterpenoids의 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a37aa122-6cd5-4b72-a78d-52b5843c0dd9", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2004", "doc_author": [ "최혜정", "김남득", "정지형", "최영현" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,308	<h1>결 과</h1><p>\( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리할 때에 신경세포(PC12)가 hypoxia 상태가 되는 것을 확인하기 위하여 HIF1 alpha의 발현을 관찰하였다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리하였을 때에 control에 비교하여 약 1.5배 HIF1 alpha가 증가하는 것이 관찰되었다(Fig. 1). \( \mathrm{CoCl}_{2} \)가 apopto-sis를 유도하는지를 확인하고, apoptosis를 유도하는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 농도와 처리시간을 결정하기 위하여 DNA fragmentation 실험을 하였다. 아무것도 처리하지 않은 control의 genomic DNA는 fragmentation이 나타나지 않았다. 또 다른 positive control로 chemical hypoxia inducible drug인 DFA와 ER stress in-ducible drug인 tunicamycin을 처리한 경우는 모두 처리 2일째에 DNA fragmentation이 나타났다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 경우는 \( 0.5 \times \) \( (0.05 \mathrm{mM}), 1 \times(0.1 \mathrm{mM}), 2 \times(0.2 \mathrm{mM}) \)의 농도로 처리한 1일째는 관찰되지 않지만 처리 2일째는 모두 DNA fragmentation이 관찰되었다. 이후의 실험은 \( 0.5 \times, 1 \times \) 농도로 2일 동안 처리하였다(Fig. 2). 위와 같이 적정한 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)을 처리하였을 때에 apop-tosis 현상에서 나타나는 또 다른 전형적인 현상인 apoptoticbody를 Hoechst 33342로 염색하여 형광현미경에서 관찰하였다. Fig. 3에서 화살표가 나타내는 것과 같이 정상세포 핵과는 다르게 핵의 응축이 일어나 apoptotic body를 형성하려는 세포가 관찰되었다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 처리에 따른 ER lumenal chaper-one의 발현을 알기 위하여 가장 대표적으로 잘 연구되어 있는 Bip의 발현을 관찰하였다(Fig. 4A). 당쇄형성저해에 의한 ERstress 유도제인 tunicamycin보다는 약하지만 분명하게 상승된 Bip 유전자의 발현이 \( 1 \times \)에서 관찰되었다. 그리고 ER mem-branous chaperone인 calnexin의 유전자 발현 역시 1.5배 정도 control에 비하여 강한 발현이 확인되었다(Fig. 4B). ER lumen에서 단백질의 redoxin chaperone으로 작용하는 ERp72,ERp29, PDI는 의미 있는 변화가 없거나 오히려 내려가는 경향을 보였다(Fig. 4D). ER membrane을 구성하는 단백질로서 proteasome의 ubiquitin-like domain에 결합하는 RibophorinI (Rpn1)의 발현은 control에 비해서 증가하였다(Fig. 4C). ERstress signal에 관여하는 ER membrane kinase인 IRE1, PERK,ATF6의 발현을 조사하였다. ATF6은 미미한 상승발현의 변화가 관찰되었고 PERK는 1.5배 강한 발현을 보였다. 그러나 IRE1의 경우는 \( 1 \times \)에서 약 2.5배 정도 증가한 발현을 보였다(Fig. 5). ATF6의 mRNA 발현이 아닌 ATF6 단백질의 발현변화를 Western blotting으로 관찰하였다. ATF6 단백질의 발현 역시 아주 약한 상승 발현만이 관찰되었다(Fig. 6). IRE1의 하부 정보단계인 XBP1 mRNA splicing을 실험하였다. Tunicamycin을 처리한 세포에서는 아주 강한 XBP1 mRNAsplicing이 관찰되었으나 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포군에서 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 7). PERK 단백질 자체의 발현변화를 Western blotting으로 관찰하였다. Control에 비하여 높은 발현을 보였다(Fig. 8). 한편 eIF2 \( \alpha \)의 인산화 정도를 관찰한 결과 eIF2 \( \alpha \) 인산화형이 PERK 단백질 자체의 발현 변화보다 훨씬 강한 발현을 보였다(Fig. 9). IRE1과 결합하여 하부 신호를 조절하는 TRAF2의 발현을 Western blotting으로 관찰하였다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포군에서 유일하게 강한 발현이 관찰되었다(Fig. 10). CHOP의 발현은 아주 약한 발현양상을 보였다.</p> <h1>서 론</h1><p>진핵세포(eukaryotic cell)는 외부로부터 각종 자극을 받으면 세포질의 단백질 대사를 조절하여 급격한 환경변화에 순응하는 한편, 특정 유전자산물을 대량생산하여 대응함으로써 세포의 생존을 지속시킨다. 최근에 세포질의 응답기전과는 다른 양상을 보이는 소포체(endoplasmic reticulum, ER)가 외부의 급격한 환경변화의 순응에 중요한 역할을 하는 것이 알려 지고 있다. 세포생리의 관점에서 가장 중요한 ER의 역할은 단백질의 번역 후 변형과정(post-translational modification step)을 수행하는 것이다. 즉, mRNA에서 만들어진 분비/막단백질은 ER를 거치면서 생리활성을 가질 수 있는 입체구조를 가지게 되는 것이다. 이런 현상을 protein folding이라고 하며, ER lumen에서 protein folding을 도와 주는 단백질 무리를 소포체 샤페론(ER molecular chaperone)이라고 부른다. 지금까지 잘 알려 진 것들로는 각각 고유 역할을 담당하는 Bip,GRP94, ERp72, PDI, ERp29, calnexin, calreticulin 등이 보고되어 있다. 또한 ER membrane에는 IRE1, PERK,ATF6 등 3종류의 ER 막관통 단백질이 있어 ER stress signal에 관여하는 것으로 알려 지고 있다. 생명체의 기본 단위인 세포는 발생분화를 시작한 조직이나 기관의 특징에 따라 일정한 시기 동안 정상적인 생리현상을 수행하다가 노화 혹은 외부의 환경변화를 겪게 되어 결국에는 죽게 된다. 세포의 죽음은 크게 apoptosis과 necrosis로 구분된다. Apoptosis는 관련유전자에 의해 이루어지며, 조절이 가능한 능동적 세포 죽음과정이다. 세포의 형태적 변화는 세포막의 파괴, 염색체의 응축 등과 더불어 세포내부의 물질들이 apoptotic body를 형성하고 macrophage에 의해서 포식 당하기 때문에 염증반응이 일어나지 않는다. 그러나 necrosis는 직접적으로 독성이있거나, 물리화학적 상해 등과 같이 갑작스런 외부환경의 변화에 의해 유발되는 수동적 과정으로 염증반응을 수반한다. 특히 apoptosis는 어떤 경우에는 정상적인 생리현상을 위하여 일어나며, 어떤 기능이 더 이상 신체에 이롭지 않다고 판단되는 경우에 자살을 한다. 그런 이유에서 apoptosis는 celldeath mechanism 혹은 cellular suicide 등으로도 불린다</p><p>퇴행성 신경계질환은 신경세포 손상과 소실로 이어지는 apoptosis가 그 궁극적 원인이다. Alzheimer's disease의 경우, 기억, 인지 등에 관여하는 대뇌피질, 해마 등에서 신경세포의 apoptosis 때문에 기억 상실을 포함한 증상들이 나타나는 것으로 보고되고 있으며, Parkinson's disease는 중뇌의 sub-stantia nigra에 있는 도파민계 신경세포들의 apoptosis 때문에 운동 기능 조절에 관여하는 기저핵의 기능 이상을 초래하는 것으로 알려 져 있다. Brain ischemia는 뇌경색 주위의 경계(ischemic penumbra)에서 서서히 진행하는 apoptosis가 매우 늦게 나타나는 세포죽음을 초래한다는 것이 보고되고있다. Seizures는 간질발작 중에 해마에서 일어나는 세포죽음이 DNA fragmentation을 수반하는 apoptosis라는 보고들이 있으며, Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)는 apopto-sis를 차단하는 신경성 apoptosis 저해 단백질(NAIP)의 유전자 결함이 주된 원인으로 apoptosis가 깊이 관여하는 것이 증명되었다. 이 같은 중추신경세포의 손상은 glutamate의 과다한 방출 또는 glutamate receptor의 과다한 흥분에 의하여, 비교적 짧은 시간에 신경세포의 비가역적 손상이 초래되는것이다. 중추 신경세포들은 현재까지는 한번 소실되면 다시 재생이 불가능한 것으로 알려져 있어 apoptosis의 분자적기전을 이해하고 이를 예방하는 방법을 모색하는 것이 더욱 중요한 의학적 숙제이다. 이 같은 apoptosis가 신경세포에서 일어날 때에 어떤 pathway를 거치는지를 이해하는 것은 가장 필요한 연구일 것이다. 본 연구에서는 ER stress에 과다하게 노출된 신경세포들이 어떤 ER 관련 인자를 통하여 apoptosis를 유발하는지를 알기 위하여 초기 apoptosis상태에서 ER 관련 인자들의 발현변화를 연구하였다</p> <p>Bip의 발현상승은 ER stress signal과 관련되어 있다고 알려져 있다. 즉, Bip이 ER lumen에서 ER membrane을 관통하고있는 IRE1, PERK, ATF6과 각각 결합하고 있다가 ER stress를 받으면 그들로부터 떨어져 나와서 ER chaperone의 기능을 발휘한다. IRE1은 ER에 존재하는 I형의 막관통 단백질로서, ERlumen의 N-말단이 ER stress를 인식하면 dimer가 되고 세포질 쪽에 있는 kinase domain이 autophosphorylation함으로서 IRE1 단백질분자의 C-말단의 ribonuclease domain이 활성화된다. 그 결과 yeast의 UPR에 특이적인 전사인자 Hac1p를 코드하고 있는 Hac유전자의 mRNA에서 이 번역을 강하게 억제하고 있는 intron이 제거되면서 Hac1p가 발현하여서 표적유전자의 전사가 촉진된다. 포유동물에도 yeast Ire1p와 상동성을 보이는 막관통형 단백질이 2종류(IRE1α와 IREβ) 존재하여 UPR에 관여하는 것으로 알려져 있다. 활성화된 IRE1 dimer는 XBP1 전사인자의 mRNA를 splicing하여 만들어진 또 다른 mRNA가 번역된 단백질 XBP1만이 전사인자의 활성을 가진다.</p><p>PERK에 의한 번역억제는 일반적으로 번역 개시단계에서 제어된다. 특히, 진핵생물 개시인자 2 eIF2의 α subuint의 51번째 serine이 인산화 되어서 번역이 전반적으로 억제되는 것이 알려져 있다. ER stress에 응답하여 일어나는 번역억제의 분자기구는 PERK라고 이름 부쳐진 단백질이 분리됨으로 인하여 크게 진전되었다. PERK도 IRE1α와 IRE1β와 같이 ER의 막을 관통(I 형)하는 protein kinase이다. ER lumen에 변성단백질이 축적되면 dimer가 되어 활성화된다. autophosphorylation를 통해서 활성화된 PERK의 세포질 측의 domain은 eIF2의 αsubuint를 phosphorylation하여 translation을 억제한다. ATF6은 II형의 막관통 단백질로서 DNA 결합 domain인 염기성 leusine zipper 영역은 세포질 쪽에 존재한다. ER lumen에 변성단백질이 축적되면 ATF6은 proteolysis를 받아서 활성화되고, protease의 작용을 받아서 ATF6의 세포질측의 1/2정도가 ER막에서 끊겨 나간다. 끊겨진 이 단편이 핵으로 이동하여 ERSE (ER stress element)의 CCACG 염기부분에 결합함으로써 표적유전자의 transcription이 활성화된다. ATF6이 ERSE에 결합하기 위하여서는 CCACG염기와 NF-Y가 결합하고 있는 CCAAT염기가 정확하게 9염기가 떨어져 있는 것이 필수적으로 NF-Y와 ATF6은 전사복합체를 형성한다. 이와 같이 IRE1, PERK, ATF6는 모두 ER stress에 의해 활성화되어 ERstress transducer의 역할을 수행한다. 본 연구에서는 신경세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리하여 hypoxia를 유도하였을 때, 어떤 ERstress signal이 이용되는지 알기 위해 ER membrane kinase인 IRE1, PERK, ATF6의 발현을 조사하였으며, ATF6은 미미한 발현의 변화가 관찰되었고 PERK는 1.5배를 상회하는 발현을 보였다. 그러나 IRE1의 경우는 \( 1 \mathrm{x} \) 농도에서 약 2.5배 정도 증가한 강한 발현을 보였다(Fig. 5). 즉 IRE1이 가장 강하게 활성화되며, 다음으로 PERK와 ATF6이 뒤를 잇는다. 이들 ER mem-brane kinase는 각각 고유한 하부 신호 전달 인자를 통해 ERstress response에 관여한다. 즉 IRE1은 XBP1 mRNA의 splic-ing을 통해, PERK는 eIF2 α를 phosphorylation시킴으로써, 그리고 ATF6은 mRNA로부터 ATF6 protein을 translation하여 ER stress response를 일으킨다. 본 연구에서는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의해 hypoxia로 유도된 신경세포에서 활성화된 ER membranekinase가 어떤 하부 신호 전달 인자를 매개로 하여 ER stressresponse를 일으키는지 그 산물의 발현을 조사하였으며, ATF6 단백질의 발현변화 역시 ATF6의 mRNA의 변화와 같이 약한 상승발현이 관찰되었고, PERK 단백질 자체의 발현과 PERK의 하부 신호 전달 인자인 eIF2 α의 인산화형이 강한 발현을 보여 ATF6과 PERK는 각각의 하부 신호 전달 인자를 통해 ER stress response에 관여하는 것으로 보인다. 그러나 IRE1의 하부 신호 전달인자인 XBP1 mRNA splicing을 관찰한 결과 IRE1 자체의 강한 발현이 있었음에도 XBP1 mRNA splicing이 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 7). XBP1의 mRNA가 splicing되어 활성화된 XBP1의 mRNA는 Pst I에 의해 splicing되지 아니하나, 활성화되지 아니한 XBP1의 mRNA는 splicing된다. Tunicamycin을 처리한 세포에서는 splicing이 없다. 즉 아주 강한 XBP1 mRNA splicing이 관찰되었으나 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포에서는 pst1 제한효소에 의한 splicing이 관찰되었으며, 이는 XBP1의 mRNA의 splicing은 전혀 발생하지 않았다는 의미다. 이들 결과로 볼 때 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의한 ER stress에서 ATF6과 PERK는 비록 약하지만 하부로 고유한 신호를 전달하여 ER stress response에 역할을 하는 것으로 보이나 IRE1은 전혀 하부로 신호를 전달하지 않았다. 그렇다면 IRE1이 관련하는 apoptosis pathway에서의 하부 신호 전달 인자인 TRAF2의 발현을 알아보았다(Fig. 10). 아주 강한 TRAF2의 발현이 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포군에서 유일하게 관찰되었다. 이는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)처리에 의한 apoptosis유도에는 IRE1은 ER stress 과정의 하부 신호 전달 인자인 XBP1을 작용시키지 않고 바로 TRAF2의 발현을 조절한다는 것을 말한다. 한편 ER stress와 관련하여 apoptosis를 유도하는 transcriptional factor로 알려진 C/EBP homologous protein (CHOP)의 발현은 아주 약한 발현양상을 보였고, 이 과정에 ATF6과 PERK가 일정한 역할을 담당하는 것으로 보인다.</p><p>Hypoxia에 의해 유도되는 신경세포의 apoptosis 기전은 아직 밝혀지지 아니한 부분이 많다. 본 연구에 의해서 신경세포가 hypoxia에 의한 ER stress에 과다하게 노출될 경우 apopto-sis가 발생할 수 있으며, 이에 관여하는 ER chaperone의 발현을 증명하여 그 기전을 도출하였으나, 복잡한 apoptosis의 과정을 총체적으로 파악하기 위해선, 다른 신호 전달 기전과의 연관성에 대한 연구가 폭넓게 이루어져야 하겠다. 이러한 지속적인 관심과 연구를 통해 그 기전과 관여인자가 명백해진다면, hypoxia에 가장 취약한 조직인 중추신경계 질환의 예방 및 치료에 응용할 수 있을 것으로 생각된다.</p> <h1>고 찰</h1><p>ER stress 상황을 유도하는 방법은 여러 가지가 있으며, 그중 조직 손상을 초래하는 대표적 원인인 hypoxia를 통해 ERstress를 유도할 수 있다. Hypoxia에 노출된 세포를 얻기 위하여 경동맥, 추골동맥 등의 혈관을 직접 결찰하여 hypoxia를 초래한 후 세포를 추출할 수 있으며, in vitro에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) \( 1 \sim 2 \% \) 이하의 \( \mathrm{O}_{2} \) 나머지는 \( \mathrm{N}_{2} \)로 채운 저산소 상태의 chamber에 배양된 세포를 보존하는 방법을 이용할 수도 있고, 본 연구에서와 같이 화학적으로 hypoxia 상태를 유도하는 것으로 알려진\( \mathrm{CoCl}_{2} \)나 Deferoxanine (DFA) 등의 물질로 세포를 처리하여 얻기도 한다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 cobalt ions는 ferrous ions의 antagonist로서 heme내 철 이온을 치환하여 heme protein \( \mathrm{O}_{2} \) sensor 내에 구조적 변화를 일으킴으로써 hypoxia를 유도한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 신경세포(PC12)를 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)로 처리하여 hypoxia를 유도한 후 apoptosis을 통해 세포가 사멸 되는 초기 과정에서의 ER 반응을 알아보았다. 따라서 우선 신경세포가 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의해서 hypoxia 상태가 만들어지는지를 확인하기 위해 저산소증에 대한 대사과정에서의 전사인자의 일종으로 hypoxia에 특이적으로 발현되는 hypo-xia-inducible factors (HIF)의 발현을 관찰하였다. Hypoxia 상태에서 HIF1 alpha는 mRNA의 expression이 증가하는 것이 아니라 p300과 같은 인자와 결합해서 핵내로 translocation하여 post-transcription에서 중요한 역할을 하지만, 초기 hypo-xia상태에서도 control보다는 전사발현 수준이 증가하는 것이 알려져 있어서, 본 실험에서는\( \mathrm{CoCl}_{2} \)에 의한 HIF1 alpha의 발현을 hypoxia 유도로 간주하고 관찰하였다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포군에서는 control에 비교하여 현격한 차이는 아니지만 약 1.5배 정도의 HIF1 alpha 발현증가를 확인하였다(Fig. 1). 결국,DFA와 함께 신경세포에서도 hypoxia 유도물질로 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 사용하는 것이 가능하다는 것을 말한다.</p><p>최근 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)는 hypoxia를 유도할 뿐만 아니라 DNA 손상을 유도하고, DNA손상 반응을 활성화시킨다고 보고되었다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)처리에 의해서 PC12 세포는 hypoxia 상태에 이르는 것을 확인하였으나, apoptosis의 증거를 얻기 위해, 그리고 apoptosis를 유도하는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)의 농도와 처리시간을 결정하기 위하여, apoptosis 특이적으로 관찰되는 DNA fragmentation실험을 하였다(Fig. 2). 무 처리된 control의 genomic DNA는 fragmentation이 나타나지 않았다. 그러나 positive control로 사용한 chemical hypoxia inducible drug인 DFA와 ER stressinducible drug인 tunicamycin의 경우는 처리 2일째에 DNAfragmentation이 관찰된다. \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 경우는 처리 dose에 관계없이 1일째는 DNA fragmentation이 관찰되지 않지만 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리 2일째는 모두 DNA fragmentation이 관찰되었고 농도를 높이 할수록 더욱 강한 DNA fragmentation이 관찰되었다. 이 실험은 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리함으로써 PC12 세포에서 apop-tosis를 유도할 수 있다는 것을 증명하였으나, 이 결과를 다시 한 번 확인하기 위하여, 또 다른 apoptosis 특이적인 세포변화, 즉 apoptotic body를 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 다음 Hoechst 33342로 염색하여 형광현미경에서 관찰하였고, Fig. 3에서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리한 세포에서 정상세포 핵과는 다르게 핵의 응축이 일어나 세포 조각으로 나눠지려는 초기 단계의 apoptotic body (화살표)가 형성되는 것을 관찰할 수 있다.</p><p>이상에서 PC12 세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리함으로서 hypoxia 유도와 함께 apoptosis가 유도된다는 것이 증명되었다. 그렇다면 이때에 ER stress mechanism은 어떻게 response하는지를 알기 위하여 ER stress 관련 인자들의 발현을 실험하였다. 먼저 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 따른 ER lumenal chaperone의 발현변화를 알기 위하여 ER lumen에서 chaperone으로 작용하는 Bip의 발현을 관찰하였다(Fig. 4A). Tunicamycin에 의한 ER stress유도보다는 약하지만 발현변화가 관찰될 정도로 Bip 유전자의 발현이 관찰되었다. 그리고 ER 막을 관통하는 ER mem-branous chaperone인 calnexin 유전자의 발현 역시 상승(약1.5배)하는 것이 확인되었다(Fig. 4B). PC12 세포에서 \( \mathrm{CoCl}_{2} \)를 처리하였을 때에는 ER inducible drug를 처리할 때만큼은 ERstress chaperone이 상승 발현하지는 않지만, 약한 발현상승은 분명하게 관찰되었다. 이 결과는 PC12 세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 의한 hypoxia/apoptosis 유도시에 ER stress mechanism이 관련되어 있다는 것을 말하는 것이다. 한편, ER lumen에서 신생단백질의 구조결정시 산화환원반응에 깊이 관여하 는ERp72, ERp29, PDI의 발현양이 증가하지 않았다. 오히려 이들의 발현이 하강하였다(Fig. 4D). 이는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 의한 세포생리적 변화는 신생단백질의 과정에는 관여하지 않는다는 것을 의미한다. ER membrane을 구성하는 대표적인 단백질로서, 세포질에 존재하는 proteasome의 ubiquitin-like domain에 결합하는 Ribophorin I (Rpn1)의 발현은 control에 비해서 1.5배 이상 증가하였다. 이 결과는 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리에 의해서 ER이 형태적으로 증가한 것을 말한다. 즉, PC12 세포에 \( \mathrm{CoCl}_{2} \) 처리함으로 인하여 ER stress response를 수행하기 위하여 혹은 초기 단계의 apoptosis 유도로 인한 ER chaperone의 증가로 말미암아 ER의 용적이 커진 것으로 사려 된다(Fig. 4C).</p>	생명과학	[ "<h1>결 과</h1><p>\\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리할 때에 신경세포(PC12)가 hypoxia 상태가 되는 것을 확인하기 위하여 HIF1 alpha의 발현을 관찰하였다. \\", "( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리하였을 때에 control에 비교하여 약 1.5배 HIF1 alpha가 증가하는 것이 관찰되었다", "(Fig. 1). \\", "( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)가 apopto-sis를 유도하는지를 확인하고, apoptosis를 유도하는 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)의 농도와 처리시간을 결정하기 위하여 DNA fragmentation 실험을 하였다.", "아무것도 처리하지 않은 control의 genomic DNA는 fragmentation이 나타나지 않았다.", "또 다른 positive control로 chemical hypoxia inducible drug인 DFA와 ER stress in-ducible drug인 tunicamycin을 처리한 경우는 모두 처리 2일째에 DNA fragmentation이 나타났다. \\", "( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)의 경우는 \\( 0.5 \\times \\) \\( (0.05 \\mathrm{mM}), 1 \\times(0.1 \\mathrm{mM}), 2 \\times(0.2 \\mathrm{mM}) \\)의 농도로 처리한 1일째는 관찰되지 않지만 처리 2일째는 모두 DNA fragmentation이 관찰되었다.", "이후의 실험은 \\( 0.5 \\times, 1 \\times \\) 농도로 2일 동안 처리하였다", "(Fig. 2).", "위와 같이 적정한 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)을 처리하였을 때에 apop-tosis 현상에서 나타나는 또 다른 전형적인 현상인 apoptoticbody를 Hoechst 33342로 염색하여 형광현미경에서 관찰하였다.", "Fig.", "3에서 화살표가 나타내는 것과 같이 정상세포 핵과는 다르게 핵의 응축이 일어나 apoptotic body를 형성하려는 세포가 관찰되었다. \\", "( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)의 처리에 따른 ER lumenal chaper-one의 발현을 알기 위하여 가장 대표적으로 잘 연구되어 있는 Bip의 발현을 관찰하였다", "(Fig. 4A).", "당쇄형성저해에 의한 ERstress 유도제인 tunicamycin보다는 약하지만 분명하게 상승된 Bip 유전자의 발현이 \\( 1 \\times \\)에서 관찰되었다.", "그리고 ER mem-branous chaperone인 calnexin의 유전자 발현 역시 1.5배 정도 control에 비하여 강한 발현이 확인되었다", "(Fig. 4B).", "ER lumen에서 단백질의 redoxin chaperone으로 작용하는 ERp72,ERp29, PDI는 의미 있는 변화가 없거나 오히려 내려가는 경향을 보였다", "(Fig. 4D).", "ER membrane을 구성하는 단백질로서 proteasome의 ubiquitin-like domain에 결합하는 RibophorinI (Rpn1)의 발현은 control에 비해서 증가하였다", "(Fig. 4C).", "ERstress signal에 관여하는 ER membrane kinase인 IRE1, PERK,ATF6의 발현을 조사하였다.", "ATF6은 미미한 상승발현의 변화가 관찰되었고 PERK는 1.5배 강한 발현을 보였다.", "그러나 IRE1의 경우는 \\( 1 \\times \\)에서 약 2.5배 정도 증가한 발현을 보였다", "(Fig. 5).", "ATF6의 mRNA 발현이 아닌 ATF6 단백질의 발현변화를 Western blotting으로 관찰하였다.", "ATF6 단백질의 발현 역시 아주 약한 상승 발현만이 관찰되었다", "(Fig. 6).", "IRE1의 하부 정보단계인 XBP1 mRNA splicing을 실험하였다.", "Tunicamycin을 처리한 세포에서는 아주 강한 XBP1 mRNAsplicing이 관찰되었으나 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리한 세포군에서 전혀 관찰되지 않았다", "(Fig. 7).", "PERK 단백질 자체의 발현변화를 Western blotting으로 관찰하였다.", "Control에 비하여 높은 발현을 보였다", "(Fig. 8).", "한편 eIF2 \\( \\alpha \\)의 인산화 정도를 관찰한 결과 eIF2 \\( \\alpha \\) 인산화형이 PERK 단백질 자체의 발현 변화보다 훨씬 강한 발현을 보였다", "(Fig. 9).", "IRE1과 결합하여 하부 신호를 조절하는 TRAF2의 발현을 Western blotting으로 관찰하였다. \\", "( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리한 세포군에서 유일하게 강한 발현이 관찰되었다", "(Fig. 10).", "CHOP의 발현은 아주 약한 발현양상을 보였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>진핵세포(eukaryotic cell)는 외부로부터 각종 자극을 받으면 세포질의 단백질 대사를 조절하여 급격한 환경변화에 순응하는 한편, 특정 유전자산물을 대량생산하여 대응함으로써 세포의 생존을 지속시킨다.", "최근에 세포질의 응답기전과는 다른 양상을 보이는 소포체(endoplasmic reticulum, ER)가 외부의 급격한 환경변화의 순응에 중요한 역할을 하는 것이 알려 지고 있다.", "세포생리의 관점에서 가장 중요한 ER의 역할은 단백질의 번역 후 변형과정(post-translational modification step)을 수행하는 것이다.", "즉, mRNA에서 만들어진 분비/막단백질은 ER를 거치면서 생리활성을 가질 수 있는 입체구조를 가지게 되는 것이다.", "이런 현상을 protein folding이라고 하며, ER lumen에서 protein folding을 도와 주는 단백질 무리를 소포체 샤페론(ER molecular chaperone)이라고 부른다.", "지금까지 잘 알려 진 것들로는 각각 고유 역할을 담당하는 Bip,GRP94, ERp72, PDI, ERp29, calnexin, calreticulin 등이 보고되어 있다.", "또한 ER membrane에는 IRE1, PERK,ATF6 등 3종류의 ER 막관통 단백질이 있어 ER stress signal에 관여하는 것으로 알려 지고 있다.", "생명체의 기본 단위인 세포는 발생분화를 시작한 조직이나 기관의 특징에 따라 일정한 시기 동안 정상적인 생리현상을 수행하다가 노화 혹은 외부의 환경변화를 겪게 되어 결국에는 죽게 된다.", "세포의 죽음은 크게 apoptosis과 necrosis로 구분된다.", "Apoptosis는 관련유전자에 의해 이루어지며, 조절이 가능한 능동적 세포 죽음과정이다.", "세포의 형태적 변화는 세포막의 파괴, 염색체의 응축 등과 더불어 세포내부의 물질들이 apoptotic body를 형성하고 macrophage에 의해서 포식 당하기 때문에 염증반응이 일어나지 않는다.", "그러나 necrosis는 직접적으로 독성이있거나, 물리화학적 상해 등과 같이 갑작스런 외부환경의 변화에 의해 유발되는 수동적 과정으로 염증반응을 수반한다.", "특히 apoptosis는 어떤 경우에는 정상적인 생리현상을 위하여 일어나며, 어떤 기능이 더 이상 신체에 이롭지 않다고 판단되는 경우에 자살을 한다.", "그런 이유에서 apoptosis는 celldeath mechanism 혹은 cellular suicide 등으로도 불린다</p><p>퇴행성 신경계질환은 신경세포 손상과 소실로 이어지는 apoptosis가 그 궁극적 원인이다.", "Alzheimer's disease의 경우, 기억, 인지 등에 관여하는 대뇌피질, 해마 등에서 신경세포의 apoptosis 때문에 기억 상실을 포함한 증상들이 나타나는 것으로 보고되고 있으며, Parkinson's disease는 중뇌의 sub-stantia nigra에 있는 도파민계 신경세포들의 apoptosis 때문에 운동 기능 조절에 관여하는 기저핵의 기능 이상을 초래하는 것으로 알려 져 있다.", "Brain ischemia는 뇌경색 주위의 경계(ischemic penumbra)에서 서서히 진행하는 apoptosis가 매우 늦게 나타나는 세포죽음을 초래한다는 것이 보고되고있다.", "Seizures는 간질발작 중에 해마에서 일어나는 세포죽음이 DNA fragmentation을 수반하는 apoptosis라는 보고들이 있으며, Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)는 apopto-sis를 차단하는 신경성 apoptosis 저해 단백질(NAIP)의 유전자 결함이 주된 원인으로 apoptosis가 깊이 관여하는 것이 증명되었다.", "이 같은 중추신경세포의 손상은 glutamate의 과다한 방출 또는 glutamate receptor의 과다한 흥분에 의하여, 비교적 짧은 시간에 신경세포의 비가역적 손상이 초래되는것이다.", "중추 신경세포들은 현재까지는 한번 소실되면 다시 재생이 불가능한 것으로 알려져 있어 apoptosis의 분자적기전을 이해하고 이를 예방하는 방법을 모색하는 것이 더욱 중요한 의학적 숙제이다.", "이 같은 apoptosis가 신경세포에서 일어날 때에 어떤 pathway를 거치는지를 이해하는 것은 가장 필요한 연구일 것이다.", "본 연구에서는 ER stress에 과다하게 노출된 신경세포들이 어떤 ER 관련 인자를 통하여 apoptosis를 유발하는지를 알기 위하여 초기 apoptosis상태에서 ER 관련 인자들의 발현변화를 연구하였다", "</p> <p>Bip의 발현상승은 ER stress signal과 관련되어 있다고 알려져 있다.", "즉, Bip이 ER lumen에서 ER membrane을 관통하고있는 IRE1, PERK, ATF6과 각각 결합하고 있다가 ER stress를 받으면 그들로부터 떨어져 나와서 ER chaperone의 기능을 발휘한다.", "IRE1은 ER에 존재하는 I형의 막관통 단백질로서, ERlumen의 N-말단이 ER stress를 인식하면 dimer가 되고 세포질 쪽에 있는 kinase domain이 autophosphorylation함으로서 IRE1 단백질분자의 C-말단의 ribonuclease domain이 활성화된다.", "그 결과 yeast의 UPR에 특이적인 전사인자 Hac1p를 코드하고 있는 Hac유전자의 mRNA에서 이 번역을 강하게 억제하고 있는 intron이 제거되면서 Hac1p가 발현하여서 표적유전자의 전사가 촉진된다.", "포유동물에도 yeast Ire1p와 상동성을 보이는 막관통형 단백질이 2종류(IRE1α와 IREβ) 존재하여 UPR에 관여하는 것으로 알려져 있다.", "활성화된 IRE1 dimer는 XBP1 전사인자의 mRNA를 splicing하여 만들어진 또 다른 mRNA가 번역된 단백질 XBP1만이 전사인자의 활성을 가진다.", "</p><p>PERK에 의한 번역억제는 일반적으로 번역 개시단계에서 제어된다.", "특히, 진핵생물 개시인자 2 eIF2의 α subuint의 51번째 serine이 인산화 되어서 번역이 전반적으로 억제되는 것이 알려져 있다.", "ER stress에 응답하여 일어나는 번역억제의 분자기구는 PERK라고 이름 부쳐진 단백질이 분리됨으로 인하여 크게 진전되었다.", "PERK도 IRE1α와 IRE1β와 같이 ER의 막을 관통(I 형)하는 protein kinase이다.", "ER lumen에 변성단백질이 축적되면 dimer가 되어 활성화된다.", "autophosphorylation를 통해서 활성화된 PERK의 세포질 측의 domain은 eIF2의 αsubuint를 phosphorylation하여 translation을 억제한다.", "ATF6은 II형의 막관통 단백질로서 DNA 결합 domain인 염기성 leusine zipper 영역은 세포질 쪽에 존재한다.", "ER lumen에 변성단백질이 축적되면 ATF6은 proteolysis를 받아서 활성화되고, protease의 작용을 받아서 ATF6의 세포질측의 1/2정도가 ER막에서 끊겨 나간다.", "끊겨진 이 단편이 핵으로 이동하여 ERSE (ER stress element)의 CCACG 염기부분에 결합함으로써 표적유전자의 transcription이 활성화된다.", "ATF6이 ERSE에 결합하기 위하여서는 CCACG염기와 NF-Y가 결합하고 있는 CCAAT염기가 정확하게 9염기가 떨어져 있는 것이 필수적으로 NF-Y와 ATF6은 전사복합체를 형성한다.", "이와 같이 IRE1, PERK, ATF6는 모두 ER stress에 의해 활성화되어 ERstress transducer의 역할을 수행한다.", "본 연구에서는 신경세포에 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리하여 hypoxia를 유도하였을 때, 어떤 ERstress signal이 이용되는지 알기 위해 ER membrane kinase인 IRE1, PERK, ATF6의 발현을 조사하였으며, ATF6은 미미한 발현의 변화가 관찰되었고 PERK는 1.5배를 상회하는 발현을 보였다.", "그러나 IRE1의 경우는 \\( 1 \\mathrm{x} \\) 농도에서 약 2.5배 정도 증가한 강한 발현을 보였다", "(Fig. 5).", "즉 IRE1이 가장 강하게 활성화되며, 다음으로 PERK와 ATF6이 뒤를 잇는다.", "이들 ER mem-brane kinase는 각각 고유한 하부 신호 전달 인자를 통해 ERstress response에 관여한다.", "즉 IRE1은 XBP1 mRNA의 splic-ing을 통해, PERK는 eIF2 α를 phosphorylation시킴으로써, 그리고 ATF6은 mRNA로부터 ATF6 protein을 translation하여 ER stress response를 일으킨다.", "본 연구에서는 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)에 의해 hypoxia로 유도된 신경세포에서 활성화된 ER membranekinase가 어떤 하부 신호 전달 인자를 매개로 하여 ER stressresponse를 일으키는지 그 산물의 발현을 조사하였으며, ATF6 단백질의 발현변화 역시 ATF6의 mRNA의 변화와 같이 약한 상승발현이 관찰되었고, PERK 단백질 자체의 발현과 PERK의 하부 신호 전달 인자인 eIF2 α의 인산화형이 강한 발현을 보여 ATF6과 PERK는 각각의 하부 신호 전달 인자를 통해 ER stress response에 관여하는 것으로 보인다.", "그러나 IRE1의 하부 신호 전달인자인 XBP1 mRNA splicing을 관찰한 결과 IRE1 자체의 강한 발현이 있었음에도 XBP1 mRNA splicing이 전혀 관찰되지 않았다", "(Fig. 7).", "XBP1의 mRNA가 splicing되어 활성화된 XBP1의 mRNA는 Pst I에 의해 splicing되지 아니하나, 활성화되지 아니한 XBP1의 mRNA는 splicing된다.", "Tunicamycin을 처리한 세포에서는 splicing이 없다.", "즉 아주 강한 XBP1 mRNA splicing이 관찰되었으나 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리한 세포에서는 pst1 제한효소에 의한 splicing이 관찰되었으며, 이는 XBP1의 mRNA의 splicing은 전혀 발생하지 않았다는 의미다.", "이들 결과로 볼 때 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)에 의한 ER stress에서 ATF6과 PERK는 비록 약하지만 하부로 고유한 신호를 전달하여 ER stress response에 역할을 하는 것으로 보이나 IRE1은 전혀 하부로 신호를 전달하지 않았다.", "그렇다면 IRE1이 관련하는 apoptosis pathway에서의 하부 신호 전달 인자인 TRAF2의 발현을 알아보았다", "(Fig. 10).", "아주 강한 TRAF2의 발현이 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리한 세포군에서 유일하게 관찰되었다.", "이는 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)처리에 의한 apoptosis유도에는 IRE1은 ER stress 과정의 하부 신호 전달 인자인 XBP1을 작용시키지 않고 바로 TRAF2의 발현을 조절한다는 것을 말한다.", "한편 ER stress와 관련하여 apoptosis를 유도하는 transcriptional factor로 알려진 C/EBP homologous protein (CHOP)의 발현은 아주 약한 발현양상을 보였고, 이 과정에 ATF6과 PERK가 일정한 역할을 담당하는 것으로 보인다.", "</p><p>Hypoxia에 의해 유도되는 신경세포의 apoptosis 기전은 아직 밝혀지지 아니한 부분이 많다.", "본 연구에 의해서 신경세포가 hypoxia에 의한 ER stress에 과다하게 노출될 경우 apopto-sis가 발생할 수 있으며, 이에 관여하는 ER chaperone의 발현을 증명하여 그 기전을 도출하였으나, 복잡한 apoptosis의 과정을 총체적으로 파악하기 위해선, 다른 신호 전달 기전과의 연관성에 대한 연구가 폭넓게 이루어져야 하겠다.", "이러한 지속적인 관심과 연구를 통해 그 기전과 관여인자가 명백해진다면, hypoxia에 가장 취약한 조직인 중추신경계 질환의 예방 및 치료에 응용할 수 있을 것으로 생각된다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>ER stress 상황을 유도하는 방법은 여러 가지가 있으며, 그중 조직 손상을 초래하는 대표적 원인인 hypoxia를 통해 ERstress를 유도할 수 있다.", "Hypoxia에 노출된 세포를 얻기 위하여 경동맥, 추골동맥 등의 혈관을 직접 결찰하여 hypoxia를 초래한 후 세포를 추출할 수 있으며, in vitro에서 \\( 5 \\% \\mathrm{CO}_{2} \\) \\( 1 \\sim 2 \\% \\) 이하의 \\( \\mathrm{O}_{2} \\) 나머지는 \\( \\mathrm{N}_{2} \\)로 채운 저산소 상태의 chamber에 배양된 세포를 보존하는 방법을 이용할 수도 있고, 본 연구에서와 같이 화학적으로 hypoxia 상태를 유도하는 것으로 알려진\\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)나 Deferoxanine (DFA) 등의 물질로 세포를 처리하여 얻기도 한다. \\", "( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)의 cobalt ions는 ferrous ions의 antagonist로서 heme내 철 이온을 치환하여 heme protein \\( \\mathrm{O}_{2} \\) sensor 내에 구조적 변화를 일으킴으로써 hypoxia를 유도한다고 알려져 있다.", "본 연구에서는 신경세포(PC12)를 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)로 처리하여 hypoxia를 유도한 후 apoptosis을 통해 세포가 사멸 되는 초기 과정에서의 ER 반응을 알아보았다.", "따라서 우선 신경세포가 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)에 의해서 hypoxia 상태가 만들어지는지를 확인하기 위해 저산소증에 대한 대사과정에서의 전사인자의 일종으로 hypoxia에 특이적으로 발현되는 hypo-xia-inducible factors (HIF)의 발현을 관찰하였다.", "Hypoxia 상태에서 HIF1 alpha는 mRNA의 expression이 증가하는 것이 아니라 p300과 같은 인자와 결합해서 핵내로 translocation하여 post-transcription에서 중요한 역할을 하지만, 초기 hypo-xia상태에서도 control보다는 전사발현 수준이 증가하는 것이 알려져 있어서, 본 실험에서는\\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)에 의한 HIF1 alpha의 발현을 hypoxia 유도로 간주하고 관찰하였다. \\", "( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리한 세포군에서는 control에 비교하여 현격한 차이는 아니지만 약 1.5배 정도의 HIF1 alpha 발현증가를 확인하였다", "(Fig. 1).", "결국,DFA와 함께 신경세포에서도 hypoxia 유도물질로 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 사용하는 것이 가능하다는 것을 말한다.", "</p><p>최근 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)는 hypoxia를 유도할 뿐만 아니라 DNA 손상을 유도하고, DNA손상 반응을 활성화시킨다고 보고되었다. \\", "( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)처리에 의해서 PC12 세포는 hypoxia 상태에 이르는 것을 확인하였으나, apoptosis의 증거를 얻기 위해, 그리고 apoptosis를 유도하는 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)의 농도와 처리시간을 결정하기 위하여, apoptosis 특이적으로 관찰되는 DNA fragmentation실험을 하였다", "(Fig. 2).", "무 처리된 control의 genomic DNA는 fragmentation이 나타나지 않았다.", "그러나 positive control로 사용한 chemical hypoxia inducible drug인 DFA와 ER stressinducible drug인 tunicamycin의 경우는 처리 2일째에 DNAfragmentation이 관찰된다. \\", "( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리한 경우는 처리 dose에 관계없이 1일째는 DNA fragmentation이 관찰되지 않지만 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\) 처리 2일째는 모두 DNA fragmentation이 관찰되었고 농도를 높이 할수록 더욱 강한 DNA fragmentation이 관찰되었다.", "이 실험은 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리함으로써 PC12 세포에서 apop-tosis를 유도할 수 있다는 것을 증명하였으나, 이 결과를 다시 한 번 확인하기 위하여, 또 다른 apoptosis 특이적인 세포변화, 즉 apoptotic body를 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리한 다음 Hoechst 33342로 염색하여 형광현미경에서 관찰하였고, Fig.", "3에서 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리한 세포에서 정상세포 핵과는 다르게 핵의 응축이 일어나 세포 조각으로 나눠지려는 초기 단계의 apoptotic body (화살표)가 형성되는 것을 관찰할 수 있다.", "</p><p>이상에서 PC12 세포에 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리함으로서 hypoxia 유도와 함께 apoptosis가 유도된다는 것이 증명되었다.", "그렇다면 이때에 ER stress mechanism은 어떻게 response하는지를 알기 위하여 ER stress 관련 인자들의 발현을 실험하였다.", "먼저 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\) 처리에 따른 ER lumenal chaperone의 발현변화를 알기 위하여 ER lumen에서 chaperone으로 작용하는 Bip의 발현을 관찰하였다", "(Fig. 4A).", "Tunicamycin에 의한 ER stress유도보다는 약하지만 발현변화가 관찰될 정도로 Bip 유전자의 발현이 관찰되었다.", "그리고 ER 막을 관통하는 ER mem-branous chaperone인 calnexin 유전자의 발현 역시 상승(약1.5배)하는 것이 확인되었다", "(Fig. 4B).", "PC12 세포에서 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\)를 처리하였을 때에는 ER inducible drug를 처리할 때만큼은 ERstress chaperone이 상승 발현하지는 않지만, 약한 발현상승은 분명하게 관찰되었다.", "이 결과는 PC12 세포에 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\) 처리에 의한 hypoxia/apoptosis 유도시에 ER stress mechanism이 관련되어 있다는 것을 말하는 것이다.", "한편, ER lumen에서 신생단백질의 구조결정시 산화환원반응에 깊이 관여하 는ERp72, ERp29, PDI의 발현양이 증가하지 않았다.", "오히려 이들의 발현이 하강하였다", "(Fig. 4D).", "이는 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\) 처리에 의한 세포생리적 변화는 신생단백질의 과정에는 관여하지 않는다는 것을 의미한다.", "ER membrane을 구성하는 대표적인 단백질로서, 세포질에 존재하는 proteasome의 ubiquitin-like domain에 결합하는 Ribophorin I (Rpn1)의 발현은 control에 비해서 1.5배 이상 증가하였다.", "이 결과는 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\) 처리에 의해서 ER이 형태적으로 증가한 것을 말한다.", "즉, PC12 세포에 \\( \\mathrm{CoCl}_{2} \\) 처리함으로 인하여 ER stress response를 수행하기 위하여 혹은 초기 단계의 apoptosis 유도로 인한 ER chaperone의 증가로 말미암아 ER의 용적이 커진 것으로 사려 된다(Fig. 4C).", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "CoCl2 처리로 유도된 hypoxia상태에서 세포자살과 ER stress에 관련된 인자의 발현", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a626a199-b87a-42e5-bb9f-4c54be49d1ff", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", "doc_author": [ "김선환", "권현조", "고현송", "송시헌", "권기상", "권오유", "최승원" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,309	<h1>서 론</h1><p>원암유전자(Proto-oncogene)는 정상세포에서는 세포성장 및 분화의 신호전달계를 조절하여 그 세포의 성장과 분화를 조절한다. 그러나, 원암유전자의 돌연변이나 생체환경요인에 의한 과발현 유도는 발암유전자(oncogene)로 전환하여, 암(cancer)의 전형적인 특성인 연속적인 증식과 전위 활성을 보인다. 많은 연구자들은 이러한 암의 특성을 이해하고 치료법을 찾기 위하여 수십년 동안 발암 혹은 원암유전자의 유전자 발현 기전을 연구해 왔으나, 암유발에서 유도 가능한 수많은 세포증식 신호전달매체들이 존재하여 이로부터 치료적 단서를 도출하는데 어려움을 겪고 있다.</p><p>TG-interacting factor (TGIF)는 Three amino acid loop extension (TALE) 계열의 단백질로 homeodomain을 포함하고 있는 전사억제인자이다. 이 homeobox 단백질은 발생과정에서 배아와 성체세포와 조직에서 선택적으로 활성화되어 특정유전자 군집의 발현을 조절하는 중요한 역할을 담당한다. TGIF는 Smad 단백질과 직접적으로 관계하여 Smad가 매개하는 전사활성을 억제하다. 즉, Transforming growth factor-b (TGF-b)에 의해 활성화된 Smad 복합체가 TGIF와 histone deacetylases (HDACs)를 모집하여 Smad target promoter의 활성을 억제한다.</p><p>HCCR은 인간의 자궁경부암세포에서 발암 유전자로 분리하였고, 발암원인으로는 발암억제 단백질인 p53의 발암억제기능을 방해하는 것으로 알려져 있다. 또한, HCCR단백질에 대한 세포내 분포 실험에서 미토콘드리아사립체(mitochondria)의 내막(inner membrane)에 위치한다.</p><p>본 연구에서는 HCCR의 발현기전을 이해하기 위하여 promoter 영역을 분리하여 특성을 분석하였다.</p> <h1>요 약</h1><p>원암단백질로 알려진 Human cervical cancer oncogene (HCCR)은 발암억제 단백질인 p53과 작용하여 다양한 암조직에서 암의 유발을 촉진한다. 그러나, 아직 정확한 발암 유도기전이 알려져 있지 않다. 이러한 의문을 해소하기 위한 일환으로 본 연구에서는 HCCR의 발현이 어떻게 조절되는지를 조사하였다. 이를 위해 먼저 HCCR5' 쪽의 promoter 영역을 분리하여 Luciferase assay법을 이용하여 K562, HEK293, A549 세포에서 분석하였고, Promoter의 -370에서 -406사이 \( 36 \mathrm{bp} \)의 첨가로 promoter활성이 의미 있게 억제됨을 관찰하였다. 또한, \( 36 \mathrm{bp} \)만을 포함하는 probe를 이용한 mobility shift assays (EMSA)에서 핵단백질이 결합함을 관찰하였고, 컴퓨터를 이용한 분석에서 TG-interacting factor (TGIF)에 대한 consensus sequences 존재함을 관찰하였다. TGIF 만을 포함하는 probe (TG)와 돌연변이를 유발한 probe (mTG)를 이용한 EMSA에서 이 자리에 TGIF가 결합함을 보였다. 또한, TGIF 자리에 돌연변이를 유발하면(pGL3-mTGIF) 발현의 억제가 회복됨을 관찰하였다. 본 연구에서는 HCCR promoter의 특성을 분석하였고, 이 과정에서 -390에서 -366 사이에 TGIF 전사인자가 결합하여 전사활성을 조절함을 증명하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>원암유전자(Proto-oncogene)는 정상세포에서는 세포성장 및 분화의 신호전달계를 조절하여 그 세포의 성장과 분화를 조절한다.", "그러나, 원암유전자의 돌연변이나 생체환경요인에 의한 과발현 유도는 발암유전자(oncogene)로 전환하여, 암(cancer)의 전형적인 특성인 연속적인 증식과 전위 활성을 보인다.", "많은 연구자들은 이러한 암의 특성을 이해하고 치료법을 찾기 위하여 수십년 동안 발암 혹은 원암유전자의 유전자 발현 기전을 연구해 왔으나, 암유발에서 유도 가능한 수많은 세포증식 신호전달매체들이 존재하여 이로부터 치료적 단서를 도출하는데 어려움을 겪고 있다.", "</p><p>TG-interacting factor (TGIF)는 Three amino acid loop extension (TALE) 계열의 단백질로 homeodomain을 포함하고 있는 전사억제인자이다.", "이 homeobox 단백질은 발생과정에서 배아와 성체세포와 조직에서 선택적으로 활성화되어 특정유전자 군집의 발현을 조절하는 중요한 역할을 담당한다.", "TGIF는 Smad 단백질과 직접적으로 관계하여 Smad가 매개하는 전사활성을 억제하다.", "즉, Transforming growth factor-b (TGF-b)에 의해 활성화된 Smad 복합체가 TGIF와 histone deacetylases (HDACs)를 모집하여 Smad target promoter의 활성을 억제한다.", "</p><p>HCCR은 인간의 자궁경부암세포에서 발암 유전자로 분리하였고, 발암원인으로는 발암억제 단백질인 p53의 발암억제기능을 방해하는 것으로 알려져 있다.", "또한, HCCR단백질에 대한 세포내 분포 실험에서 미토콘드리아사립체(mitochondria)의 내막(inner membrane)에 위치한다.", "</p><p>본 연구에서는 HCCR의 발현기전을 이해하기 위하여 promoter 영역을 분리하여 특성을 분석하였다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>원암단백질로 알려진 Human cervical cancer oncogene (HCCR)은 발암억제 단백질인 p53과 작용하여 다양한 암조직에서 암의 유발을 촉진한다.", "그러나, 아직 정확한 발암 유도기전이 알려져 있지 않다.", "이러한 의문을 해소하기 위한 일환으로 본 연구에서는 HCCR의 발현이 어떻게 조절되는지를 조사하였다.", "이를 위해 먼저 HCCR5' 쪽의 promoter 영역을 분리하여 Luciferase assay법을 이용하여 K562, HEK293, A549 세포에서 분석하였고, Promoter의 -370에서 -406사이 \\( 36 \\mathrm{bp} \\)의 첨가로 promoter활성이 의미 있게 억제됨을 관찰하였다.", "또한, \\( 36 \\mathrm{bp} \\)만을 포함하는 probe를 이용한 mobility shift assays (EMSA)에서 핵단백질이 결합함을 관찰하였고, 컴퓨터를 이용한 분석에서 TG-interacting factor (TGIF)에 대한 consensus sequences 존재함을 관찰하였다.", "TGIF 만을 포함하는 probe (TG)와 돌연변이를 유발한 probe (mTG)를 이용한 EMSA에서 이 자리에 TGIF가 결합함을 보였다.", "또한, TGIF 자리에 돌연변이를 유발하면(pGL3-mTGIF) 발현의 억제가 회복됨을 관찰하였다.", "본 연구에서는 HCCR promoter의 특성을 분석하였고, 이 과정에서 -390에서 -366 사이에 TGIF 전사인자가 결합하여 전사활성을 조절함을 증명하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "TGIF에 의한 Human cervical cancer oncogene (HCCR) 발현 조절", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a47873bd-c40d-482c-9b2d-81ed6af1fb14", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2009", "doc_author": [ "조광원" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,310	<h1>결과 및 고찰</h1><p>비만의 실질적인 원인은 체지방산화억제 작용과 에너지소비 감소에 기인하는 것이기 때문에 비만치료는 지방산화를 촉진하고 에너지소비를 촉진시킬 수 있는 방법을 강구하는 것이다. 다양한 기능성 식품이나 물질이 지방산산화를 촉진하는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 특히, 녹차에는 카테킨, 카페인 및 methylxanthine 등과 같은 화합물을 함유하고 있어 에너지소비를 증가시키고 체지방산화를 촉진하는 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 더욱이 녹차의 polyphenol은 콜레스테롤 흡수를 억제하여 콜레스테롤을 담즙산 형태로의 배설을 촉진시켜 심혈관질환 위험을 감소하는 효과도 있다. 또한 운동은 에너지소비를 증가시킬 수 있는 가장 효율적인 방법이다. 따라서 본 연구에서는 녹차와 운동의 단독 효과와 상승효과를 중학교 비만남학생들을 대상으로 12주간 처리하여 연구하였다.</p><p>먼저 녹차섭취, 운동 및 이들의 병행이 체중에 미치는 영향을 조사하였다. 녹차섭취나, 운동 및 이들의 병행은 체중변화에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 또한 실험 전 체중 값을 공변인으로 조정하여 실험 후 체중을 처리 별 ANCOVA 결과, 처리간 체중에도 아무런 차이가 없었다, 이와 같은 결과는 아마도 12주간의 처리기간이 짧고, 연구대상자(중학생 비만 남학생)의 대사가 활발한 젋은 중학생이기 때문인 것으로 생각된다. 체중의 변화는 없었으나 대상자의 특성 상 의자에 앉아 있는 시간이 많은 관계로 대상자의 복부지방률 변화를 측정하였다. 녹차섭취와 운동 단독처리는 대상자의 복부지방률에는 아무런 영향을 미치지 않았으나 이들의 병행처리는 복부지방률을 유의성 있게 감소하였다 \( (p<0.05)\). 그러나 사전 복부지방률을 공변인으로 설정하여 처리간 ANCOVA 결과 차이는 나타나지 않았다.</p><p>비만 및 심혈관질환과 관련성이 있는 혈중 TNF-\(\alpha\), IL-6 및 leptin 함량을 측정하였다. TNF-\(\alpha\)는 녹차섭취, 운동 및 이들의 병행처리에 의해 감소되었지만, 운동에 의해서만 유의성 있게 감소하였다 \( (p<0.05)\). IL-6의 함량은 운동처리 및 녹차와 운동 병행처리에서 각각 \( p<0.01 \) 및 \( p<0.05 \) 수준에서 유의성 있게 감소하였고, 녹차처리에 의해서는 감소되었지만 유의성은 없었다. 또한 leptin의 함량은 녹차 처리 \( (p<0.05) \), 운동처리 \( (p<0.05) \) 및 녹차와 운동처리 \( (p<0.05) \) 에 의해 유의성 있게 감소하였다. TNF-\(\alpha\), IL-6 및 leptin 함량에 대한 처리간의 효과를 분석한 결과 처리간 차이는 없었다.</p><p>Table 7은 TG의 변화를 나타낸 결과이다. TG는 녹차섭취에 의해 유의하게 증가하였으며 \( (p<0.01) \), 이는 정상범위 인 \( 143\mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)을 초과하였다. 그러나 TG의 함량은 운동에 의해서는 증가하였고, 녹차와 운동을 병행처리 한 경우에는 감소하였으나 유의성은 없었다. 더구나 대조군에서도 유의성은 없지만 증가하였다. 공변인의 효과를 조절하여 분석한 결과 처리간 차이가 나타났으며, Bonferroni 검증 결과 녹차처리는 다른 다른 처리와 비교하여 \( p< 0.01 \) 수준에서 유의성이 있었다. 이와 같은 결과는 녹차섭취나 운동에 의해 TG의 함량이 감소한다는 보고와 상이한 결과이다.</p><p>녹차섭취와 운동은 혈중 HDL-C 함량에는 영향을 미치지 않았고, 오히려 녹차섭취와 운동을 병행하였을 경우 HDL-C의 농도가 유의적 \( (p<0.05) \) 으로 낮아졌다. 이와 같은 결과는 기존의 결과와는 상반되는 결과이다. HDL-C는 TG치 변화에 영향을 받게 되는데 녹차섭취와 운동에 의해 TG의 증가가 HDL-C 감소에 영향을 미친 것으로 본다. 또한 본 연구에 참여한 대상의 기저치 TG와 HDL-C 수치가 정상범위 내이기 때문에 처리의 긍정적인 변화를 유도하지 못한 것으로 생각된다. 특히 녹차섭취군의 정상 TG수치에서 12주 후 임상적으로 높은 수치가 나타난 점은 실험기간 중 식이 관리가 제대로 되지 못하였기에 나타난 결과라고 본다. 즉 녹차섭취에 따른 TG 증가는 실험 처치기간 내 고지방섭취에 의한 변화일 것으로 생각된다.</p><p>비만은 염증유발 상태에 의해 심혈관질환의 주된 원인으로 간주되고 있다. 이근 비만 지방조직에서 분비되는 염증성 사이토카인 인 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 분비 증가가 죽상동맥경화증을 진행시키기 때문인 것으로 보고되고 있다. 염증반응은 TNF-\(\alpha\)와 IL-6는 leptin 분비를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. Leptin은 지방세포에서 지방축적에 의하여 분비되며 식욕억제 및 에너지소비를 증가시키지만 비만환자의 leptin 농도는 높아져 있으므로 leptin 투여에도 반응하지 않는 leptin 저항성이 발생된다고 밝혀지고 있다. 운동은 염증반응을 억제하여 세포자멸을 유도하는 TNF-\(\alpha\) 농도 감소와 관련이 있는데, 비만 흰쥐 및 비만 환자에게 운동으로 체중감소를 유도할 경우 혈중 TNF-\(\alpha\) 수준이 감소되는 것으로 알려져 있다. 또한 운동은 비만에 의해 높아진 leptin 수준을 낮추는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서, 녹차섭취는 leptin의 농도만 감소시켰고 \((p<0.05) \), 운동은 TNF-\(\alpha\) \( (p<0.05) \), IL-6 \( (p<0.01) \) 및 leptin 농도 \( (p<0.05) \)를 감소시켰다. 녹차섭취와 운동 병행은 IL-6 ( \( p<0.05) \)과 leptin 농도 \( (p<0.05) \)를 감소시켰다. 이와 같이 녹차섭취에 의한 leptin 감소 및 녹차섭취와 운동병행으로 IL-6과 leptin이 감소된 점은 비만의 관상 동맥질환 병변에서 염증유발 억제 및 에너지균형 조절에 긍정적인 영향을 미칠 수 있을 것으로 기대된다.</p><p>그러나 TNF-\(\alpha\)와 IL-6은 지방조직의 TG 분해를 자극하지만 본 연구에서 녹차 섭취에 의해 TG가 증가함에도 불구하고 IL-6과 leptin이 감소된 점은 녹차섭취에 의한 효과라고 판단하기 어렵다. 즉 처리군과 대조군의 실험기간 중 TG에 영향을 미칠 수 있는 식생활에 대한 관리를 하였으나 보고되지 않은 식생활 습관이 TG에 영향을 미칠 수가 있을 것으로 생각된다. 한편으로 연구대상자의 연령이 발육과 발달이 왕성한 시기로서 녹차섭취의 효과를 초과하여 일시적 또는 자연적 혈중 일부 요인의 변화가 있을 것으로 생각된다.</p><p>결론적으로 비만 중학생을 대상으로 한 녹차섭취 및 운동의 비만세포에서 분비되는 cytokine인 TNF-\(\alpha\), IL-6 및 leptin의 함량에 미치는 영향은 녹차섭취 및 운동의 효과는 볼 수 있었다. 그러나 이들의 시너지 효과는 볼 수 없었다. 이런 결과는 아마도 실험대상이 활동이 가장 활발한 중학생이었기 때문일 것으로 사료된다.</p> <h1>초록 : 녹차섭취와 운동에 의한 비만 청소년의 혈중 biochemical marker 함량 감소</h1><p>녹차섭취와 유산소운동이 비만 남자중학생의 체중과 혈중 biochemical marker에 미치는 영향에 관하여 연구하였다. 체지방율이 \( 25 \% \) 이상인 비만 남자중학생 36명을 대상으로 대조군 \( (\mathrm{n}=9) \), 녹차처리군 \((\mathrm{n}=9) \), 운동군 \( (\mathrm{n}=9) \)과 녹차와 운동 병행군 \( (\mathrm{n}=9) \) 으로 분류하여, 운동은 주 5회 60분씩 12주간 실시하였고, 녹차는 녹차열수출물을 음용(녹차건중 \( 1.5-1.7 \mathrm{~g} / \) 일) 하였다. 대조군은 녹차처리군이 섭취한 양의 물을 섭취하였다. 실험 시작전과 12주 후의 혈중 TNF-\(\alpha\), IL-6, leptin, TG 및 HDL-C 함량을 측정하였다. 대조군을 포함한 모든 처리군에서 체중 변화는 없었으나 병행군은 복부지방률이 감소하였다. 대조처리는 TNF-\(\alpha\), IL-6 및 leptin 함량에 아무런 영향을 미치지 않았다. 녹차처리는 leptin \( (p<0.05) \)을 감소시켰고, TG \((p<0.01) \)는 증가시켰다. 운동은 TNF-\(\alpha\)\((p<0.05)\), IL-6\((p<0.01) \) 및 leptin \( (p<0.05) \) 함량을 감소시켰다. 또한 녹차처리와 운동 병행은 IL-6\((p<0.05) \), leptin \( (p<0.05) \) 및 HDL-C \( (p<0.01) \) 함량을 감소시켰다. 이 결과는 녹차섭취나 운동은 젊은 비만 중학생의 혈중 염증 cytokine인 TNF-\(\alpha\), IL-6 및 leptin 함량 감소에 효과가 있었으나, 녹차섭취와 운동의 병행에 의한 synergy 효과는 없었다.</p> <h1>서 론</h1><p>청소년기는 성장과 발달이 빠르고 지방조직이 증가하기 때문에 비만발생에 위험한 시기이고, 성인비만으로 진전되기 때문에 청소년의 철저한 비만관리가 절실히 요구된다. 특히 청소년 비만은 심혈관 질환과 밀접한 관계가 있는 고혈압, 제2형당뇨병 및 고지혈증 등을 조기에 유발시키는 문제점을 안고 있다. 지방세포에서 분비되는 tumor necrosis factor- \( \alpha \) (TNF- \( \alpha \) ), interleukin-6 (IL-6), leptin 등의 면역조절 adipocytokine은 지방대사, 항상성 에너지의 균형 및 인슐린 저항성을 조절하는 등 여러 가지 생리학적 효과를 갖는다. 하지만 이들 adipocytikine 분비 이상은 비만과 관련된 대사성 증후군과 심혈관 질환의 발병을 촉진하는 것으로 보고되었다.</p><p>청소년비만은 유산소운동이나 녹차와 같은 기능성 식품을 섭취하여 에너지소비와 지방산산화를 증가 시킴으로써 해결할 수 있다. 운동은 에너지 소비를 요구하기 때문에 체중조절에 필수적인 요인이 된다. 특히 유산소운동은 죽상경화를 유발시키는 triglyceride (TG)과 low density lipoproteincholestrerol(LDL-C) 등은 감소시키는 반면 항 동맥경화 작용을 하는 high density lipoproteincholestrerol(HDL-C)은 증가시키는 것으로 보고되었다. 또한 유산소운동은 TNF-\(\alpha\), IL-6 등의 cytokine 생성에 긍정적인 영향을 미친다.</p><p>녹차는 열 발생과 지방산화를 증가시켜 체지방함량을 감소 시킴과 동시에, 다양한 약리효과를 나타내는 것으로 보고되었다. 녹차는 소비가 많고 여러 가지 생리활성이 과학적으로 규명되고 있어 기능성 식품으로서의 가치가 재평가 되고 있다. 특히, 녹차에 함유되어 있는 epigallocatechin gallate (EGCG)는 지방산 산화력의 증가 및 체지방, 복부지방을 감소시키며, 카페인 및 methylxanthine은 지방산산화 촉진 또는 지방합성을 억제하기 때문에 비만예방 및 치료에 활용되고 있다. 이들 성분은 체지방의 분해를 저해하는 adenosine 작용을 억제하여 체지방분해를 촉진하고 에너지 소비량을 증가시키는 효과가 있다. 또한 EGCG는 체지방 감소와 관련성이 있는 TNF-\(\alpha\)와 같은 cytokine 생성을 효율적으로 억제하는 물질로 밝혀졌다. 그리고 많은 녹차에 관련된 연구에서 녹차가 비만이나 심혈관계질환에 매우 도움이 된다고 보고하였으나 그렇지 않은 경우도 있는데, 이러한 결과는 녹차섭취방법이나 연구 대상자 개인차에 기인한다.</p><p>지금까지 비만에 대한 녹차섭취 효과연구는 주로 여고생이나 성인을 대상으로 수행되었나 성장과 발육이 왕성한 시기에 있는 청소년인 중학생을 대상으로 연구한 경우는 전무한 실정이다. 본 연구에서는 녹차섭취나 운동이 비만 청소년 학생의 체지방조절에 미치는 영향과 몇 가지 biochemical marker에 관하여 연구하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>결과 및 고찰</h1><p>비만의 실질적인 원인은 체지방산화억제 작용과 에너지소비 감소에 기인하는 것이기 때문에 비만치료는 지방산화를 촉진하고 에너지소비를 촉진시킬 수 있는 방법을 강구하는 것이다.", "다양한 기능성 식품이나 물질이 지방산산화를 촉진하는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.", "특히, 녹차에는 카테킨, 카페인 및 methylxanthine 등과 같은 화합물을 함유하고 있어 에너지소비를 증가시키고 체지방산화를 촉진하는 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 더욱이 녹차의 polyphenol은 콜레스테롤 흡수를 억제하여 콜레스테롤을 담즙산 형태로의 배설을 촉진시켜 심혈관질환 위험을 감소하는 효과도 있다.", "또한 운동은 에너지소비를 증가시킬 수 있는 가장 효율적인 방법이다.", "따라서 본 연구에서는 녹차와 운동의 단독 효과와 상승효과를 중학교 비만남학생들을 대상으로 12주간 처리하여 연구하였다.", "</p><p>먼저 녹차섭취, 운동 및 이들의 병행이 체중에 미치는 영향을 조사하였다.", "녹차섭취나, 운동 및 이들의 병행은 체중변화에 아무런 영향을 미치지 못하였다.", "또한 실험 전 체중 값을 공변인으로 조정하여 실험 후 체중을 처리 별 ANCOVA 결과, 처리간 체중에도 아무런 차이가 없었다, 이와 같은 결과는 아마도 12주간의 처리기간이 짧고, 연구대상자(중학생 비만 남학생)의 대사가 활발한 젋은 중학생이기 때문인 것으로 생각된다.", "체중의 변화는 없었으나 대상자의 특성 상 의자에 앉아 있는 시간이 많은 관계로 대상자의 복부지방률 변화를 측정하였다.", "녹차섭취와 운동 단독처리는 대상자의 복부지방률에는 아무런 영향을 미치지 않았으나 이들의 병행처리는 복부지방률을 유의성 있게 감소하였다 \\", "( (p<0.05)\\).", "그러나 사전 복부지방률을 공변인으로 설정하여 처리간 ANCOVA 결과 차이는 나타나지 않았다.", "</p><p>비만 및 심혈관질환과 관련성이 있는 혈중 TNF-\\(\\alpha\\), IL-6 및 leptin 함량을 측정하였다.", "TNF-\\(\\alpha\\)는 녹차섭취, 운동 및 이들의 병행처리에 의해 감소되었지만, 운동에 의해서만 유의성 있게 감소하였다 \\", "( (p<0.05)\\).", "IL-6의 함량은 운동처리 및 녹차와 운동 병행처리에서 각각 \\( p<0.01 \\) 및 \\( p<0.05 \\) 수준에서 유의성 있게 감소하였고, 녹차처리에 의해서는 감소되었지만 유의성은 없었다.", "또한 leptin의 함량은 녹차 처리 \\( (p<0.05) \\), 운동처리 \\( (p<0.05) \\) 및 녹차와 운동처리 \\( (p<0.05) \\) 에 의해 유의성 있게 감소하였다.", "TNF-\\(\\alpha\\), IL-6 및 leptin 함량에 대한 처리간의 효과를 분석한 결과 처리간 차이는 없었다.", "</p><p>Table 7은 TG의 변화를 나타낸 결과이다.", "TG는 녹차섭취에 의해 유의하게 증가하였으며 \\( (p<0.01) \\), 이는 정상범위 인 \\( 143\\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)을 초과하였다.", "그러나 TG의 함량은 운동에 의해서는 증가하였고, 녹차와 운동을 병행처리 한 경우에는 감소하였으나 유의성은 없었다.", "더구나 대조군에서도 유의성은 없지만 증가하였다.", "공변인의 효과를 조절하여 분석한 결과 처리간 차이가 나타났으며, Bonferroni 검증 결과 녹차처리는 다른 다른 처리와 비교하여 \\( p< 0.01 \\) 수준에서 유의성이 있었다.", "이와 같은 결과는 녹차섭취나 운동에 의해 TG의 함량이 감소한다는 보고와 상이한 결과이다.", "</p><p>녹차섭취와 운동은 혈중 HDL-C 함량에는 영향을 미치지 않았고, 오히려 녹차섭취와 운동을 병행하였을 경우 HDL-C의 농도가 유의적 \\( (p<0.05) \\) 으로 낮아졌다.", "이와 같은 결과는 기존의 결과와는 상반되는 결과이다.", "HDL-C는 TG치 변화에 영향을 받게 되는데 녹차섭취와 운동에 의해 TG의 증가가 HDL-C 감소에 영향을 미친 것으로 본다.", "또한 본 연구에 참여한 대상의 기저치 TG와 HDL-C 수치가 정상범위 내이기 때문에 처리의 긍정적인 변화를 유도하지 못한 것으로 생각된다.", "특히 녹차섭취군의 정상 TG수치에서 12주 후 임상적으로 높은 수치가 나타난 점은 실험기간 중 식이 관리가 제대로 되지 못하였기에 나타난 결과라고 본다.", "즉 녹차섭취에 따른 TG 증가는 실험 처치기간 내 고지방섭취에 의한 변화일 것으로 생각된다.", "</p><p>비만은 염증유발 상태에 의해 심혈관질환의 주된 원인으로 간주되고 있다.", "이근 비만 지방조직에서 분비되는 염증성 사이토카인 인 TNF-\\(\\alpha\\)와 IL-6의 분비 증가가 죽상동맥경화증을 진행시키기 때문인 것으로 보고되고 있다.", "염증반응은 TNF-\\(\\alpha\\)와 IL-6는 leptin 분비를 촉진시키는 것으로 알려져 있다.", "Leptin은 지방세포에서 지방축적에 의하여 분비되며 식욕억제 및 에너지소비를 증가시키지만 비만환자의 leptin 농도는 높아져 있으므로 leptin 투여에도 반응하지 않는 leptin 저항성이 발생된다고 밝혀지고 있다.", "운동은 염증반응을 억제하여 세포자멸을 유도하는 TNF-\\(\\alpha\\) 농도 감소와 관련이 있는데, 비만 흰쥐 및 비만 환자에게 운동으로 체중감소를 유도할 경우 혈중 TNF-\\(\\alpha\\) 수준이 감소되는 것으로 알려져 있다.", "또한 운동은 비만에 의해 높아진 leptin 수준을 낮추는 것으로 보고되고 있다.", "본 연구에서, 녹차섭취는 leptin의 농도만 감소시켰고 \\((p<0.05) \\), 운동은 TNF-\\(\\alpha\\) \\( (p<0.05) \\), IL-6 \\( (p<0.01) \\) 및 leptin 농도 \\( (p<0.05) \\)를 감소시켰다.", "녹차섭취와 운동 병행은 IL-6 ( \\( p<0.05) \\)과 leptin 농도 \\( (p<0.05) \\)를 감소시켰다.", "이와 같이 녹차섭취에 의한 leptin 감소 및 녹차섭취와 운동병행으로 IL-6과 leptin이 감소된 점은 비만의 관상 동맥질환 병변에서 염증유발 억제 및 에너지균형 조절에 긍정적인 영향을 미칠 수 있을 것으로 기대된다.", "</p><p>그러나 TNF-\\(\\alpha\\)와 IL-6은 지방조직의 TG 분해를 자극하지만 본 연구에서 녹차 섭취에 의해 TG가 증가함에도 불구하고 IL-6과 leptin이 감소된 점은 녹차섭취에 의한 효과라고 판단하기 어렵다.", "즉 처리군과 대조군의 실험기간 중 TG에 영향을 미칠 수 있는 식생활에 대한 관리를 하였으나 보고되지 않은 식생활 습관이 TG에 영향을 미칠 수가 있을 것으로 생각된다.", "한편으로 연구대상자의 연령이 발육과 발달이 왕성한 시기로서 녹차섭취의 효과를 초과하여 일시적 또는 자연적 혈중 일부 요인의 변화가 있을 것으로 생각된다.", "</p><p>결론적으로 비만 중학생을 대상으로 한 녹차섭취 및 운동의 비만세포에서 분비되는 cytokine인 TNF-\\(\\alpha\\), IL-6 및 leptin의 함량에 미치는 영향은 녹차섭취 및 운동의 효과는 볼 수 있었다.", "그러나 이들의 시너지 효과는 볼 수 없었다.", "이런 결과는 아마도 실험대상이 활동이 가장 활발한 중학생이었기 때문일 것으로 사료된다.", "</p> <h1>초록 : 녹차섭취와 운동에 의한 비만 청소년의 혈중 biochemical marker 함량 감소</h1><p>녹차섭취와 유산소운동이 비만 남자중학생의 체중과 혈중 biochemical marker에 미치는 영향에 관하여 연구하였다.", "체지방율이 \\( 25 \\% \\) 이상인 비만 남자중학생 36명을 대상으로 대조군 \\( (\\mathrm{n}=9) \\), 녹차처리군 \\((\\mathrm{n}=9) \\), 운동군 \\( (\\mathrm{n}=9) \\)과 녹차와 운동 병행군 \\( (\\mathrm{n}=9) \\) 으로 분류하여, 운동은 주 5회 60분씩 12주간 실시하였고, 녹차는 녹차열수출물을 음용(녹차건중 \\( 1.5-1.7 \\mathrm{~g} / \\) 일) 하였다.", "대조군은 녹차처리군이 섭취한 양의 물을 섭취하였다.", "실험 시작전과 12주 후의 혈중 TNF-\\(\\alpha\\), IL-6, leptin, TG 및 HDL-C 함량을 측정하였다.", "대조군을 포함한 모든 처리군에서 체중 변화는 없었으나 병행군은 복부지방률이 감소하였다.", "대조처리는 TNF-\\(\\alpha\\), IL-6 및 leptin 함량에 아무런 영향을 미치지 않았다.", "녹차처리는 leptin \\( (p<0.05) \\)을 감소시켰고, TG \\((p<0.01) \\)는 증가시켰다.", "운동은 TNF-\\(\\alpha\\)\\((p<0.05)\\), IL-6\\((p<0.01) \\) 및 leptin \\( (p<0.05) \\) 함량을 감소시켰다.", "또한 녹차처리와 운동 병행은 IL-6\\((p<0.05) \\), leptin \\( (p<0.05) \\) 및 HDL-C \\( (p<0.01) \\) 함량을 감소시켰다.", "이 결과는 녹차섭취나 운동은 젊은 비만 중학생의 혈중 염증 cytokine인 TNF-\\(\\alpha\\), IL-6 및 leptin 함량 감소에 효과가 있었으나, 녹차섭취와 운동의 병행에 의한 synergy 효과는 없었다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>청소년기는 성장과 발달이 빠르고 지방조직이 증가하기 때문에 비만발생에 위험한 시기이고, 성인비만으로 진전되기 때문에 청소년의 철저한 비만관리가 절실히 요구된다.", "특히 청소년 비만은 심혈관 질환과 밀접한 관계가 있는 고혈압, 제2형당뇨병 및 고지혈증 등을 조기에 유발시키는 문제점을 안고 있다.", "지방세포에서 분비되는 tumor necrosis factor- \\( \\alpha \\) (TNF- \\( \\alpha \\) ), interleukin-6 (IL-6), leptin 등의 면역조절 adipocytokine은 지방대사, 항상성 에너지의 균형 및 인슐린 저항성을 조절하는 등 여러 가지 생리학적 효과를 갖는다.", "하지만 이들 adipocytikine 분비 이상은 비만과 관련된 대사성 증후군과 심혈관 질환의 발병을 촉진하는 것으로 보고되었다.", "</p><p>청소년비만은 유산소운동이나 녹차와 같은 기능성 식품을 섭취하여 에너지소비와 지방산산화를 증가 시킴으로써 해결할 수 있다.", "운동은 에너지 소비를 요구하기 때문에 체중조절에 필수적인 요인이 된다.", "특히 유산소운동은 죽상경화를 유발시키는 triglyceride (TG)과 low density lipoproteincholestrerol(LDL-C) 등은 감소시키는 반면 항 동맥경화 작용을 하는 high density lipoproteincholestrerol(HDL-C)은 증가시키는 것으로 보고되었다.", "또한 유산소운동은 TNF-\\(\\alpha\\), IL-6 등의 cytokine 생성에 긍정적인 영향을 미친다.", "</p><p>녹차는 열 발생과 지방산화를 증가시켜 체지방함량을 감소 시킴과 동시에, 다양한 약리효과를 나타내는 것으로 보고되었다.", "녹차는 소비가 많고 여러 가지 생리활성이 과학적으로 규명되고 있어 기능성 식품으로서의 가치가 재평가 되고 있다.", "특히, 녹차에 함유되어 있는 epigallocatechin gallate (EGCG)는 지방산 산화력의 증가 및 체지방, 복부지방을 감소시키며, 카페인 및 methylxanthine은 지방산산화 촉진 또는 지방합성을 억제하기 때문에 비만예방 및 치료에 활용되고 있다.", "이들 성분은 체지방의 분해를 저해하는 adenosine 작용을 억제하여 체지방분해를 촉진하고 에너지 소비량을 증가시키는 효과가 있다.", "또한 EGCG는 체지방 감소와 관련성이 있는 TNF-\\(\\alpha\\)와 같은 cytokine 생성을 효율적으로 억제하는 물질로 밝혀졌다.", "그리고 많은 녹차에 관련된 연구에서 녹차가 비만이나 심혈관계질환에 매우 도움이 된다고 보고하였으나 그렇지 않은 경우도 있는데, 이러한 결과는 녹차섭취방법이나 연구 대상자 개인차에 기인한다.", "</p><p>지금까지 비만에 대한 녹차섭취 효과연구는 주로 여고생이나 성인을 대상으로 수행되었나 성장과 발육이 왕성한 시기에 있는 청소년인 중학생을 대상으로 연구한 경우는 전무한 실정이다.", "본 연구에서는 녹차섭취나 운동이 비만 청소년 학생의 체지방조절에 미치는 영향과 몇 가지 biochemical marker에 관하여 연구하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "녹차섭취와 운동에 의한 비만 청소년의 혈중 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5,311	<p>4일간의 EGCG 처리가 C2C12 myoblast 세포를 형태적 관점에서 보았을 때 smooth muscle의 형태로 변화시켰으며, 이러한 결과를 분자적으로 검증하기 위하여 smooth muscle의 지표로 널리 알려진 smooth muscle a-actin 단백질의 발현정도를 immunofluorescent staining 방법을 이용하여 알아보았다. Fig. 2의 d에 나타난 것과 같이 초록색(화살표)으로 나타난 부분이 smooth muscle a-actin 항체에 의해 염색된 smooth muscle a-actin 단백질이다. Fig. 2의 a와 b에서 보듯이 대조군에서는 세포 증식에 의해 핵이 많이 증가하였지만, smooth muscle \( a \)-actin 단백질은 전혀 찾아볼 수 없다. 반면, EGCG로 4일 동안 처리된 C2C12 myoblast 세포에서는 smooth muscle \( \alpha \)-actin 단백질의 발현을 확연히 관찰할 수 있었다. 또한 EGCG의 농도가 증가하면 할수록 plate 상에서 세포의 증식은 점점 줄어드는 반면, smooth muscle a-actin의 발현 빈도는 증가하였다. 이러한 결과는 EGCG가 C2C12 myoblast 세포에서 smooth muscle로의 분화를 촉진함을 분자적 수준에서 보여주는 것이다. smooth muscle \( \alpha \) -actin은 혈관벽 또는 smooth muscle을 가지고 있는 여러 조직에서 발견된다. smooth muscle \( \alpha \)-actin은 사실상 발아기의 심장근이나 골격근의 분화(embryonic differentiation)과정에서 일시적으로 나타나지만 성인의 심장이나 골격근에서는 나타나지 않는다. Springer 등은 C2C12 골격근 myoblast로부터 기인된 myotube에서 smooth muscle a-actin 단백질이 일시적으로 발현된다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 관찰된 smooth muscle \( \alpha \)-actin의 발현으로서 smooth muscle로 분화가 되었다고 단정하기는 어려울 것이라는 가능성을 배제할 수 없었다. 하지만 형태학적으로는 물론 골격근 my-otube의 가장 큰 특징 중 하나인 다핵(multinucleated)을 가진 세포 또한 관찰할 수 없었다. smooth muscle \( \alpha \)-actin을 발현하는 세포들에서 한 개 또는 두 개의 핵이 존재하였으며, 이러한 한 개 또는 두 개의 핵 수는 smooth muscle에서 나타나는 전형적인 특징 중 하나이다. 또한, 세포의 형태로 보았을 때 EGCG를 처리한 초기에는 길어지는 elongation 현상이 일어났으며, 시간이 점점 더 흐름에 따라 주위의 세포들과 fusion 현상이 일어나면서 형태가 매우 커지는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 근육 myotube가 형성될 때에도 나타나지만, myotube 형성 시에는 굵지만 길고 긴 형태의 tube 모양이 일반적으로 나타난다. 하지만 본 연구에서의 세포 형태는 일반적인 공통점을 찾기 어려울 만큼 다양한 형태의 세포가 형성되었다. 즉, 세포의 형태, 핵의 수, smooth muscle a-actin의 발현을 종합해 볼 때 EGCG가 C2C12 myoblast 세포를 smooth muscle로 분화시킴을 검증할 수 있었다.</p><p>본 연구에서는 한층 더 나아가 smooth muscle의 marker인 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA의 변화를 살펴보았다. 그 결과 4일간의 EGCG를 처리한 C2C12 myoblasts 세포에서 transgelin과 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA의 발현이 최대 약 9배와 5배 정도 각각 대조군에 비해 증가함을 나타냈다. 시간적인 개념으로 보았을 때 24시간 동안의 \( 50 \mu \mathrm{M} \mathrm{EGCG} \) 는 transgelin과 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으나, \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG를 48시간, 72시간동안 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA는 약 5-6배 정도 대조군에 비해 높게 발현됨을 나타내었다. 이러한 결과를 바탕으로 볼 때 식이성 폴리페놀인 EGCG가 mouse C2C12 myoblast 세포에서 중요한 후천적(epigenetic) 유전자 발현기전인 DNA 메틸화를 조절함으로써 골격근으로의 분화가 아닌 smooth muscle로의 분화를 유도함을 다시 한 번 검증할 수 있었다.</p><p>Smooth muscle 세포는 혈관의 발달과 혈관질환의 형성과 진행에 있어서 중요한 역할을 하지만, smooth muscle의 분화를 조절하는 기전에 대한 이해는 매우 부족한 실정이다. 이러한 smooth muscle의 분화기전에 대한 연구가 어려운 가장 큰 이유 중 한 가지는 골격근 발달과 분화 초기단계의 연구에 주로 사용되는 C2C12 세포와 \( 10 \mathrm{~T} 1 / 2 \) 세포에 상응하는 좋은 in vitro 분화 시스템이 부족하기 때문이다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 몇몇 학자들이 mouse embryonal carcinoma(p19)세포, 신경관 줄기세포(neural crest stem cell), mouse embryonic 10T1/2 세포를 smooth muscle로 전이분화(transdifferentiation)를 유도함으로써 초기 분화단계에 대한 기작연구를 수행하기에 이르렀다. 따라서 본 연구에서 보고한 mouse C2C12 세포가 녹차 추출성분인 EGCG에 의해 smooth muscle로의 전이분화는 smooth muscle의 형성과 분화초기의 연구에 있어서 훌륭한 시스템을 제공할 것으로 사료된다.</p> <h1>서 론</h1><p>DNA 메틸화(methylation)란 DNA의 염기 중 cytosine 5번째 탄소에 메틸 그룹 \( \left(\mathrm{CH}_{3}\right) \) 이 첨가되는 반응이다. 이 반응은 DNA methyltransferase라는 효소에 의해 반응이 일어나며, 포유동물 세포내의 유전자 발현을 조절하는 중요한 기전이다. DNA 메틸화는 DNA coding sequence에는 변화가 없는 상태에서 세포의 분화, genomic imprinting, X-염색체불활성화(X-chromosome inactivation), 발암과정(car-cinogenesis)등과 같은 다양한 기능을 함으로서 후천적 기작(epigenetic mechanism)이라고 불린다. DNA 메틸화는 이러한 기능뿐만 아니라 특정 유전자의 발현을 조절하는데 있어 매우 중요한 역할을 한다. 유전자내 promoter에서의 DNA 메틸화는 유전자발현의 억제를 조절하며, 특히 거의 모든 암에서 DNA 과메틸화(hypermethylation)가 일어난다. DNA는 항상 DNA 메틸화와 탈메틸화(demethylation)가 유기적으로 일어나면서 특정 유전자의 발현을 조절한다. 이와 같이 DNA 메틸화는 histone 메틸화와 histone 아세틸화와 함께 chromatin remodeling을 통한 유전자 발현과 억제에 중심적인 역할을 한다.</p><p>최근 많은 연구들이 DNA methyltransferase 효소 억제를 통해 새롭게 형성되는 DNA의 메틸화를 억제하고, 과메틸화로 인해 억제되었던 유전자의 재 발현에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 왜나하면, 많은 종류의 암세포에서 cell cycle regulators, tumor suppressor genes, DNA repair genes등과 같은 암세포의 증식을 조절하는 중요한 유전자들이 과메틸화로 인해 발현이 억제 또는 조절되기 때문이다. 또한 많은 유전자들의 발현을 조절하는 기전인 DNA 메틸화가 최근 암세포가 아닌 세포의 분화에도 영향을 미친다고 보고되고 있다. Cheng 등은 mouse embryo \( 10 \mathrm{~T} 1 / 2 \) 세포를 DNA 메틸화 억제제인 zebularine으로 처리한 후 10일이 경과하자 골격근의 대표적인 특징인 다핵의 myotube로 분화되었다고 보고하였다.</p><p>C2C12 myoblast는 근육으로 분화되기 전단계의 세포로서 여러 가지 호르몬이나 외부자극에 의해 다핵의 myotube로의 형태적인 분화로 특정 지어진다. 많은 선행연구들이 골격근 세포에 기초한 근육 형성과정을 밝히는데 있어서 분화가 진행되지 않은 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) 세포를 많이 이용하였다. 대부분의 연구들은 C2C12 myoblast 세포를 배양한 후 confluent한 상태가 되면 분화 배지로 세포를 배양하여 myotube로의 분화를 유도하였으며, 이 과정에서 일어나는 근육 형성 과정의 분자적 기작을 연구하였다. C2C12 myoblast는 성체 조직 줄기 세포(adult tissue-specific stem cells)의 한 종류로서 다른 조직으로의 분화가 가능한 multipotent한 세포지만, 앞에서 언급하였듯이 주로 분화 배지 환경에서의 myotube로의 분화에 관련된 기전 연구가 주를 이루어 왔다. 따라서 유전자 발현에 중요한 역할을 하는 후천적 기작의 하나인 DNA 메틸화의 억제가 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblast의 분화에 어떠한 영향을 미치는지와 과연 DNA 메틸화 억제제가 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblast를 myotube로 분화시킬 것인지에 대한 연구는 거의 이루어 지지 않았다.</p><p>많은 선행연구들에서 DNA 메틸화 억제제인 5-aza-2'-de-oxycytidine과 zebularine과 같은 일반적으로 널리 알려진 물질을 이용하여 DNA 메틸화를 연구하였으나, 여러 가지 부작용과 독성(toxicity)이 이러한 물질들을 사용하는데 있어서 큰 걸림돌이 되고 있다. 보다 효과적이고 비독성적인 DNA 메틸화 억제물질의 개발에 많은 연구가 집중되어, 많은 연구들이 대체물질에 대한 연구를 집중한 결과 음식물에 포함된 여러 가지 폴리페놀, 즉 마시는 차에 함유된 catechin과 과일에 다량 함유된 bioflavonoids들이 DNA 메틸화억제제로서의 역할을 한다는 것을 밝혀내었다[12,13]. 그 중 (-)-epi-gallocatechin-3-gallate(EGCG)는 최근 가장 주목받는 식이성 DNA 메틸화 억제제중 하나로서 catechol 구조를 포함하는 녹차에 함유되어 있는 폴리페놀(polyphenol)성분이다. EGCG는 암세포의 증식에 관련된 유전자의 발현을 조절함으로써 암세포의 증식을 억제하는데 매우 효력이 있는 것으로 알려지고 있지만, 식이성 EGCG 폴리페놀이 골격근 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblast 세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구의 목적은 녹차에서 추출된 폴리페놀 EGCG가 C2C12 myoblast 세포 분화에 미치는 영향을 조사하였다.</p> <h1>고찰</h1><p>DNA 메틸화와 같이 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자의 발현을 조절하는 기전인 후천적 기작은 최근에 많은 연구들에 의해 더욱 더 그 중요성이 증대되고 있는 것이 사실이다. 따라서 많은 연구들이 진행되고 있는 상황에서 그 역할과 중요성이 하나씩 밝혀지고 있지만 대부분의 연구들이 인류의 불치병의 하나로 여겨지는 암세포에서의 DNA 메틸화의 연구가 주로 진행되어 왔다. 또한 이제까지의 많은 연구들이 가장 보편적으로 널리 알려진 DNA 메틸화 억제제인 5-aza-2'-deoxycytidine과 zebularine 등과 같은 물질에 대한 연구가 주를 이루어 왔으나, 이러한 물질들이 세포내에 미치는 여러 가지 부작용과 독성(toxicity)으로 인해 최근 부작용과 독성이 없는 DNA 메틸화 억제제의 대체 물질에 대한 관심이 한층 고즈되고 있는 실정이다.</p><p>EGCG와 같은 식이에 함유된 폴리페놀(polyphenols) 성분이 우리 인체에 이롭다는 것은 최근 많이 연구를 통해 알려지고 있다. 특히 많은 연구들이 녹차가 암을 예방하고 암세포의 증식을 막는 작용을 한다고 보고하면서, 많은 사람들이 녹차에 관심을 가지고, 또한 실질적으로 복용하고 있다. 단지 암세포에서의 DNA 메틸화가 가지는 기능뿐만 아니라 다른 세포에서의 DNA 메틸화의 중요성과 기능에 대한 연구에 대한 관심이 한층 고조되고 있다. 이러한 연구들에서 도출된 결론은 DNA 메틸화를 포함한 histone 메틸화, histone 아세틸화(acetylation)와 같은 후천적 기작이 세포 운명의 전환(cell-fate conversion)에 중심적인 역할을 하는 기작이라는 것이다. 최근의 연구는 histone deacetylase 억제제인 val-proic acid와 DNA 메틸화 억제제인 5-aza-2'-deoxycytidine가 골수세포(bone marrow stromal cell)를 신경 줄기 세포(neural stem cell)로 전환시킨다는 것을 보고하였다. 또한 DNA 메틸화 억제제인 zebularine과 5-aza-2'- deoxy-cytidine으로 mouse embryo 10T1/2 줄기세포를 처리하자 골격근 형성에 있어서 필수적인 요소인 다핵(multinucleated)의 myotube로 분화되는 것을 관찰하였다. 이렇듯, 과거에는 성체 조직 줄기 세포(adult tissue-specific stem cells)는 embryonic 줄기세포가 다른 조직으로 분화할 수 있는 pluripotent한 능력을 가지고는 있는 것과는 달리 일반적으로 그 조직에 제한된 lineage-restricted progenies라고 봤던이론에 반하여 최근에 들어 성체 조직 줄기세포 또한 다양한 조직으로의 분화가 가능하다는 것을 밝히게 되었다. 하지만, 현재까지 폴리페놀 성분으로서 DNA 메틸화 억제제로 알려진 EGCG가 mouse C2C12 myoblast 세포 분화에 미치는 영향에 대한 연구는 전혀 이루어지지 않았다.</p><p>본 연구에서 EGCG를 사용한 이유는 앞서 언급하였듯이 EGCG가 녹차에 많이 함유된 catechol을 포함하고 있는 폴리페놀로서 많은 선행 연구에서 DNA 메틸화를 억제시키는 효과를 나타내었기 때문이다. 비록 catechol 구조를 함유하고 있는 여러 가지 다른 폴리페놀들, 예를 들어, catechin, epicatechin, quercetin, fisetin, myricetin, caffeic acid, chlorogenic acid들도 DNA 메틸화를 억제시켰지만 EGCG가 가장 강력하게 DNA 메틸화를 억제하였다. 배양된 유방암 세포인 MCF-7과 MDA-MB-231 세포에 EGCG를 처리하자 종양억제 유전자(tumor suppressor genes)인 retinoic acid receptor- \( \beta( \) RAR- \( \beta) \) 의 메틸화가 현저히 줄어들며, 그로인해 억제되었던 RAR- \( \beta \) 유전자의 mRNA와 단백질이 재 발현되었다. 또한 EGCG는 일반적인 폴리페놀 성분이 조직 내의 catechol-O-methyltransferase(COMT) 효소에 의한 폴리페놀 자체의 메틸화에 의해 생성되는 S-adenosyl-homo-cysteine(SAH)의 증가에 의한 feedback 기전에 의해 DNA 메틸화를 억제하는 것과는 달리 EGCG의 DNA 메틸화 억제기전은 modeling 연구에서 직접적으로 DNA methyl-transferase 효소와 결합을 함으로서 탁월한 억제기능을 발휘한다고 보고하였다. 다른 폴리패놀 성분과는 달리 EGCG만이 가지고 있는 독특한 구조인 gallic acid moiety가 높은 친화력(affinity)으로 DNA methyltransferase의 catalytic site와 결합하기 때문이다. 이와 같이 많은 풀리페놀 중 EGCG의 독특한 화학구조가 DNA 메틸화를 억제하는데 있어서 중요한 역할을 하며, 이로 인해 많은 연구들이 암 예방 차원에서 EGCG의 효능을 연구하는 주된 이유가 되고 있다. 이러한 강력한 EGCG의 DNA 메틸화 억제작용이 암세포에서 여러 가지 유전자의 발현을 조절하듯이 암세포가 아닌 C2C12 myoblast 세포의 분화와 관련 유전자 발현에 영향을 미칠 것이라는 가설아래 본 연구에서는 최대 \( 50 \mu \mathrm{M} \)의 EGCG를 4일 동안 mouse C2C12.myoblast 세포에 처리하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 세포주</h2><p>Fetal bovine serum, antibiotic, 세포배양 plate는 BioClone,Sigma, Falcon사로부터 각각 구입하였다. PCR primer는 Cosmo사로부터 제작하여 사용하였으며, EGCG는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.</p><h2>세포 배양 및 EGCG 처리</h2><p>Mouse C2C12 myoblast 세포는 \( 10 \% \) FBS(fetal bovine serum), \( 100 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)의 페니실린 G, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin sulfate를 함유하고 있는 Dulbeccco's Modified Eagles' Medium(DMEM) 을 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\left(5 \% \mathrm{CO}_{2}\right) \)의 incubator에서 배양하였다. 세포는 \( 30 \mathrm{~mm} \) plate에 \( 2 \mathrm{ml} \) 당 \( 1 \times 10^{4} \) 세포를 분주하고 24시간 후 여러 가지 농도 \( (0,3.125,6.25,12.5,25,50 \mu \mathrm{M}) \)의 EGCG를 처리하여 4일 동안 배양하였다. 배지는 3일 후 교환해 주었으며, EGCG 또한 배지 교환 시 재처리하였다. EGCG 처리 시간의 경과에 따른 smooth muscle \( \alpha \)-actin과 transgelin mRNA의 변화를 알아보기 위하여 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) 세포를 분주한 뒤 24시간 후 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG를 0,24,48,72시간동안 처리하였다.</p><h2>Immunofluorescent staining</h2><p>C2C12 myoblast 세포를 6 wells 배양 plate에 고정(fix)시키기 위하여 \( 3.7 \% \) formaldehyde \( (\mathrm{pH} 7-8) \) 를 함유하고 있는 PBS \( 1 \mathrm{ml} \) 를 각각의 well에 10 분간 처리하였다. 그 후 PBS 용액으로 fix된 세포를 씻어낸 후 \( 0.2 \% \) trinton X-100과 \( 10 \% \) goat serum을 포함하고 있는 PBS로 상온에서 15 분간 처리하여 세포를 permeabilization을 시켰다. 다음은 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblasts 세포에 mouse IgG smooth muscle \( \alpha \)-actin primary 항체 (Sigma, St. Louis, MO)를 1:1000 비율로 희석시킨 \( 600 \mathrm{ml} \)를 각각의 well에 상온에서 30 분간 배양시켰다. 다음 세포는 PBS로 3번 씻은 후 1:250 비율로 희석된 Alexa488-conjugated goat anti-mouse IgG secondary 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)로 상온에서 30분간 더 배양하였다. 마지막 단계로서 세포를 PBS로 3번 헹군 후 핵의 변화를 살펴보기 위하여 \( 1.5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 4',6-diamidino-2phenylindole(DAPI)를 이용하여 세포를 staining한 후 PBS로 3번 헹구어 내었다. 세포 배양 plate상에서의 smooth muscle \( \alpha \)-actin protein 단백질의 발현 정도는 디지털 이미지 system을 갖춘 Axiovert 200 epi-fluorescence 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 사진 촬영을 하였다.</p><h2>Total RNA 추출과 cDNA 합성</h2><p>대조군과 EGCG로 처리된 세포를 TRIzol reagent(Life Technologies, Grand Island, NY)를 각 well당 \( 600 \mu \mathrm{l} \) 넣은 후 total RNA를 RNeasy RNA extraction kit(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 얻었다. 추출된 RNA를 ultrapure water에 용해시킨 후 UV \( 260 \mathrm{~nm} \)에서 농도를 측정하였다. 그 다음 \( 0.5 \mu \mathrm{g} \)의 total RNA와 first strand cDNA synthesis \( k i t( \) Roche)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성조건은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분, \( 42{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 60분, \( 95{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분순으로 진행되었고, final volume은 \( 20 \mu \mathrm{l} \)였다.</p><h2>Real-time qunatitative PCR</h2><p>Transgelin(smooth muscle 22 protein)과 smooth muscle \( \alpha \)-actin messenger RNA(mRNA) 발현을 측정하기 위하여, double-stranded DNA dye인 SYBR Green(Perkin Elmer, Boston, MA)을 이용하여 fluorescence real-time PCR을 실시하였다. 본 실험에서 사용한 primer sequence는 Table 1에 나타난 바와 같다. SYBR Green 분석은 ABI PRISM 7700 system(Perkin Elmer, Applied Biosystems)을 이용하였으며, 모든 샘플은 최소한 2회 이상 반복 측정하였으며, 각각의 target mRNA의 발현은 glyceraldehyde 3-phosphate de-hydrogenase(GAPDH) mRNA양으로 보정하였다.</p> <h1>요약</h1><p>본 연구에서는 유전자 발현에 중요한 조절 역할을 하는 DNA 메틸화를 식이성 폴리페놀의 하나인 녹차의 대표적인 추출물 EGCG로 억제하였을 때 C2C12 myoblast 세포에 일어나는 현상을 살펴보았다. 그 결과 smooth muscle의 지표인 transgelin, smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA와 단백 질이 현저히 증가함을 보였고, 형태학적으로도 smooth muscle의 전형적인 모습을 보였다. 식이에 포함된 DNA 메틸화 억제제인 EGCG가 C2C12 myoblast를 smooth muscle로 분화를 유도하였으며, 암 예방 차원에서의 EGCG의 역할 외에 혈관질환과 같은 smooth muscle에 관련된 예방과 치료차원에서 EGCG의 역할이 있을 것으로 사료된다. 본 연구는 C2C12 myoblast를 smooth muscle로 유도하는 결정적인 신호전달 역할을 하는 유전자에 대한 연구는 수행하지 못하였다. 따라 서 EGCG에 의해 변화되는 유전자에 대한 기전연구가 필요하다고 하겠다.</p> <h1>결과</h1><h2>Immunofluorescent staining</h2><p>다양한 농도의 EGCG를 C2C12 myoblast 세포에 4일간 처리한 후 phase 상에서의 사진을 관찰한 결과 형태학적인 측면에서 C2C12 myoblast가 EGCG 처리 후 smooth muscle 세포로 분화되는 것을 관찰하였다. 세포의 형태로 보았을 때 Fig.2(a)에서 보는 바와 같이 대조군에서는 C2C12 myoblast 세포의 형태가 둥근 형태를 보이며, plate상에 \( 1 \times 10^{4} \) 로 세포를 분주한 후 4일이 경과하자 세포의 수가 많이 증식되었음을 확연히 관찰할 수 있다. 하지만 EGCG로 처리한 후 4일이 경과하자 Fig. 2c의 phase 사진에서 보듯이 C2C1 myoblast 세포의 형태가 elongation이 되었고 주변 세포들과의 fusion이 일어나서 smooth muscle의 형태를 보임을 알 수 있다. 또한 세포를 분주한 후 4일이 지났음에도 불구하고 EGCG로 처리한 세포에서는 세포의 밀도가 대조군에 비해서 확연히 낮음을 볼 수 있다. 세포의 증식 정도를 좀 더 명확히 알기위하여 DAPI로써 C2C12 myoblast 세포의 핵을 염색하였다. Fig. 2의 b와 d에서 보듯이 파란색으로 염색된 것이 각 세포의 핵을 나타낸다. Fig. 2의 b에서 보듯이 대조군에서는 핵의 숫자가 EGCG 처리된 세포에 비해 그 수와 밀도가 많이 증가하였음을 알 수 있다. 본 연구에서는 서론에서 언급하였듯 이 C2C1 세포를 분화배지 조건에서 배양을 하지 않고, \( 10 \% \) FBS 상태에서 EGCG를 처리하였다. 따라서 핵의 숫자가 EGCG 처리군에 비해 대조군에서 확연히 높다는 것은 EGCG가 세포의 증식을 억제하는 역할을 한다고 사료된다. 또한 이러한 결과가 단지 EGCG의 독성에 의한 결과일 가능성을 생각해 보지 않을 수 없다. 만약 독성에 의한 증식 억제라면 세포의 숫자에서는 EGCG 처리군이 적다고 하더라도 형태적으로도 같은 모양이 관찰되어야 할 것이다. 하지만, Fig. 2c의 phase 사진에서 보듯이 형태적으로 대조군과 비교하였을 때 전혀 다른 형태의 세포로 분화되었음을 알 수 있다.</p><h2>Transgelin mRNA</h2><p>Transgelin 유전자는 smooth muscle에 특징적으로 발현되는 유전자로서 smooth muscle의 지표(marker)로서 널리 쓰이고 있다. 따라서C2C12 myoblast 세포에 EGCG를 4일 간 처리한 후 smooth muscle marker인 transgelin mRNA에 어떠한 변화가 일어났는지를 real-time PCR을 이용하여 살펴보기 위하여 세포를 6 wells plate에 \( 1 \times 10^{4} \) 으로 분주를 한 후 24시간 후 EGCG를 대조군에는 처리하지 않았으며, EGCG 처리 군에는 각각 다른 농도 \( (3.125,6.25,12.5,25,50 \) \( \mu \mathrm{M}) \) 로서 4일간 처리하였다. 그 결과 EGCG로 4일간 처리한 세포에서는 transgelin mRNA 발현이 대조군 세포와 비교하 였을 때 농도 의존적으로 증가함을 보여준다. 가장 낮은 농도인 \( 3.125 \mu \mathrm{M} \) 에서는 transgelin mRNA 발현이 대조군 세포와 비교하였을 때 \( 34 \% \) 정도 유의하게 증가하였다. 더 나아가 \( 6.25 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG는 transgelin mRNA 발현을 \( 63 \% \) 정도 유의하게 증가시켰으며, \( 12.5 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG로 처리된 C2C12 myoblast 세포에서는 \( 148 \% \) 정도 중가치를 나타내었다. 본 실험에서 사용한 EGCG의 농도 중 최고 농도인 50\( \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG를 4일간 처리하자 transgelin mRNA 발현이 약 9배정도 유의하게 증가되었다. 본 실험의 mRNA 결과는 re-al-time PCR을 실시할 때 각각 샘플의 cDNA copy 수를 보정하기 위하여 transgelin mRNA 발현 정도를 각 샘플의 GAPDH mRNA로 보정하였다.</p><p>시간의 변화에 따른 transgelin mRNA 발현 정도를 살펴보기 위하여 \( 50 \mu \mathrm{M} \)의 EGCG를 각각 24,48,72시간 동안 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 transgelin mRNA 발현 변화를 살펴보았다. \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG을 24시간동안 세포에 처리한 결과 transgelin mRNA 발현은 대조군과 비교하였을 때 변화가 없었지만 48시간과 72시간동안 EGCG를 처리한 후에는 5-6배 가까이 유의하게 증가하였다.</p><h2>Smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA</h2><p>앞에서 언급한 바와 같이 4일 동안 EGCG를 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblast에 처리 후 smooth muscle a-actin 단백질이 발현됨을 immunofluorescent staining을 통해 입증하였다. 본 연구에서는 더 나아가 EGCG가 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA의 발현에 어떠한 영향을 미쳤는지를 알아보기 위해 smooth muscle \( \alpha \)-actin primer를 이용하여 real-time PCR을 실시하였다. EGCG의 농도가 낮을 때 \( (3.125,6.25 \mu \mathrm{M}) \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblast 세포에서의 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA 발현은 대조군과 비교하였을 때 적은 폭이지만 유의하게 약 \( 40 \% \) 정도 증가하였다. 농도가 점점 더 높아질수록 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA는 이에 비례하여 증가하는 경향을 보였으며, 가장 높은 농도인 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG는 \( \mathrm{C} 2 \mathrm{C} 12 \) myoblast 세포의 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA 발현을 약 4.5배정도 유의 하게 증가시켰다.</p><p>시간에 따른 smooth muscle \( \alpha \)-actin mRNA의 발현 변화를 보기 위하여 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 EGCG로 세포를 처리한 후 24,48,72시간이 경과한 후 각 시점에서 mRNA 농도 변화를 살펴본 결과 transgelin mRNA 발현 변화와 비슷한 경향으로 증가하였으며, 72시간 처리 후에는 약 6배정도 대조군과 비교하였 때 smooth muscle a-actin mRNA가 증가하였다.</p>	생명과학	[ "<p>4일간의 EGCG 처리가 C2C12 myoblast 세포를 형태적 관점에서 보았을 때 smooth muscle의 형태로 변화시켰으며, 이러한 결과를 분자적으로 검증하기 위하여 smooth muscle의 지표로 널리 알려진 smooth muscle a-actin 단백질의 발현정도를 immunofluorescent staining 방법을 이용하여 알아보았다.", "Fig.", "2의 d에 나타난 것과 같이 초록색(화살표)으로 나타난 부분이 smooth muscle a-actin 항체에 의해 염색된 smooth muscle a-actin 단백질이다.", "Fig.", "2의 a와 b에서 보듯이 대조군에서는 세포 증식에 의해 핵이 많이 증가하였지만, smooth muscle \\( a \\)-actin 단백질은 전혀 찾아볼 수 없다.", "반면, EGCG로 4일 동안 처리된 C2C12 myoblast 세포에서는 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin 단백질의 발현을 확연히 관찰할 수 있었다.", "또한 EGCG의 농도가 증가하면 할수록 plate 상에서 세포의 증식은 점점 줄어드는 반면, smooth muscle a-actin의 발현 빈도는 증가하였다.", "이러한 결과는 EGCG가 C2C12 myoblast 세포에서 smooth muscle로의 분화를 촉진함을 분자적 수준에서 보여주는 것이다.", "smooth muscle \\( \\alpha \\) -actin은 혈관벽 또는 smooth muscle을 가지고 있는 여러 조직에서 발견된다.", "smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin은 사실상 발아기의 심장근이나 골격근의 분화(embryonic differentiation)과정에서 일시적으로 나타나지만 성인의 심장이나 골격근에서는 나타나지 않는다.", "Springer 등은 C2C12 골격근 myoblast로부터 기인된 myotube에서 smooth muscle a-actin 단백질이 일시적으로 발현된다고 보고하였다.", "따라서 본 연구에서 관찰된 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin의 발현으로서 smooth muscle로 분화가 되었다고 단정하기는 어려울 것이라는 가능성을 배제할 수 없었다.", "하지만 형태학적으로는 물론 골격근 my-otube의 가장 큰 특징 중 하나인 다핵(multinucleated)을 가진 세포 또한 관찰할 수 없었다.", "smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin을 발현하는 세포들에서 한 개 또는 두 개의 핵이 존재하였으며, 이러한 한 개 또는 두 개의 핵 수는 smooth muscle에서 나타나는 전형적인 특징 중 하나이다.", "또한, 세포의 형태로 보았을 때 EGCG를 처리한 초기에는 길어지는 elongation 현상이 일어났으며, 시간이 점점 더 흐름에 따라 주위의 세포들과 fusion 현상이 일어나면서 형태가 매우 커지는 것을 관찰할 수 있었다.", "이러한 현상은 근육 myotube가 형성될 때에도 나타나지만, myotube 형성 시에는 굵지만 길고 긴 형태의 tube 모양이 일반적으로 나타난다.", "하지만 본 연구에서의 세포 형태는 일반적인 공통점을 찾기 어려울 만큼 다양한 형태의 세포가 형성되었다.", "즉, 세포의 형태, 핵의 수, smooth muscle a-actin의 발현을 종합해 볼 때 EGCG가 C2C12 myoblast 세포를 smooth muscle로 분화시킴을 검증할 수 있었다.", "</p><p>본 연구에서는 한층 더 나아가 smooth muscle의 marker인 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA의 변화를 살펴보았다.", "그 결과 4일간의 EGCG를 처리한 C2C12 myoblasts 세포에서 transgelin과 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin mRNA의 발현이 최대 약 9배와 5배 정도 각각 대조군에 비해 증가함을 나타냈다.", "시간적인 개념으로 보았을 때 24시간 동안의 \\( 50 \\mu \\mathrm{M} \\mathrm{EGCG} \\) 는 transgelin과 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으나, \\( 50 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 EGCG를 48시간, 72시간동안 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 transgelin과 smooth muscle a-actin mRNA는 약 5-6배 정도 대조군에 비해 높게 발현됨을 나타내었다.", "이러한 결과를 바탕으로 볼 때 식이성 폴리페놀인 EGCG가 mouse C2C12 myoblast 세포에서 중요한 후천적(epigenetic) 유전자 발현기전인 DNA 메틸화를 조절함으로써 골격근으로의 분화가 아닌 smooth muscle로의 분화를 유도함을 다시 한 번 검증할 수 있었다.", "</p><p>Smooth muscle 세포는 혈관의 발달과 혈관질환의 형성과 진행에 있어서 중요한 역할을 하지만, smooth muscle의 분화를 조절하는 기전에 대한 이해는 매우 부족한 실정이다.", "이러한 smooth muscle의 분화기전에 대한 연구가 어려운 가장 큰 이유 중 한 가지는 골격근 발달과 분화 초기단계의 연구에 주로 사용되는 C2C12 세포와 \\( 10 \\mathrm{~T} 1 / 2 \\) 세포에 상응하는 좋은 in vitro 분화 시스템이 부족하기 때문이다.", "이러한 문제를 해결하기 위하여 몇몇 학자들이 mouse embryonal carcinoma(p19)세포, 신경관 줄기세포(neural crest stem cell), mouse embryonic 10T1/2 세포를 smooth muscle로 전이분화(transdifferentiation)를 유도함으로써 초기 분화단계에 대한 기작연구를 수행하기에 이르렀다.", "따라서 본 연구에서 보고한 mouse C2C12 세포가 녹차 추출성분인 EGCG에 의해 smooth muscle로의 전이분화는 smooth muscle의 형성과 분화초기의 연구에 있어서 훌륭한 시스템을 제공할 것으로 사료된다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>DNA 메틸화(methylation)란 DNA의 염기 중 cytosine 5번째 탄소에 메틸 그룹 \\( \\left(\\mathrm{CH}_{3}\\right) \\) 이 첨가되는 반응이다.", "이 반응은 DNA methyltransferase라는 효소에 의해 반응이 일어나며, 포유동물 세포내의 유전자 발현을 조절하는 중요한 기전이다.", "DNA 메틸화는 DNA coding sequence에는 변화가 없는 상태에서 세포의 분화, genomic imprinting, X-염색체불활성화(X-chromosome inactivation), 발암과정(car-cinogenesis)등과 같은 다양한 기능을 함으로서 후천적 기작(epigenetic mechanism)이라고 불린다.", "DNA 메틸화는 이러한 기능뿐만 아니라 특정 유전자의 발현을 조절하는데 있어 매우 중요한 역할을 한다.", "유전자내 promoter에서의 DNA 메틸화는 유전자발현의 억제를 조절하며, 특히 거의 모든 암에서 DNA 과메틸화(hypermethylation)가 일어난다.", "DNA는 항상 DNA 메틸화와 탈메틸화(demethylation)가 유기적으로 일어나면서 특정 유전자의 발현을 조절한다.", "이와 같이 DNA 메틸화는 histone 메틸화와 histone 아세틸화와 함께 chromatin remodeling을 통한 유전자 발현과 억제에 중심적인 역할을 한다.", "</p><p>최근 많은 연구들이 DNA methyltransferase 효소 억제를 통해 새롭게 형성되는 DNA의 메틸화를 억제하고, 과메틸화로 인해 억제되었던 유전자의 재 발현에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.", "왜나하면, 많은 종류의 암세포에서 cell cycle regulators, tumor suppressor genes, DNA repair genes등과 같은 암세포의 증식을 조절하는 중요한 유전자들이 과메틸화로 인해 발현이 억제 또는 조절되기 때문이다.", "또한 많은 유전자들의 발현을 조절하는 기전인 DNA 메틸화가 최근 암세포가 아닌 세포의 분화에도 영향을 미친다고 보고되고 있다.", "Cheng 등은 mouse embryo \\( 10 \\mathrm{~T} 1 / 2 \\) 세포를 DNA 메틸화 억제제인 zebularine으로 처리한 후 10일이 경과하자 골격근의 대표적인 특징인 다핵의 myotube로 분화되었다고 보고하였다.", "</p><p>C2C12 myoblast는 근육으로 분화되기 전단계의 세포로서 여러 가지 호르몬이나 외부자극에 의해 다핵의 myotube로의 형태적인 분화로 특정 지어진다.", "많은 선행연구들이 골격근 세포에 기초한 근육 형성과정을 밝히는데 있어서 분화가 진행되지 않은 \\( \\mathrm{C} 2 \\mathrm{C} 12 \\) 세포를 많이 이용하였다.", "대부분의 연구들은 C2C12 myoblast 세포를 배양한 후 confluent한 상태가 되면 분화 배지로 세포를 배양하여 myotube로의 분화를 유도하였으며, 이 과정에서 일어나는 근육 형성 과정의 분자적 기작을 연구하였다.", "C2C12 myoblast는 성체 조직 줄기 세포(adult tissue-specific stem cells)의 한 종류로서 다른 조직으로의 분화가 가능한 multipotent한 세포지만, 앞에서 언급하였듯이 주로 분화 배지 환경에서의 myotube로의 분화에 관련된 기전 연구가 주를 이루어 왔다.", "따라서 유전자 발현에 중요한 역할을 하는 후천적 기작의 하나인 DNA 메틸화의 억제가 \\( \\mathrm{C} 2 \\mathrm{C} 12 \\) myoblast의 분화에 어떠한 영향을 미치는지와", "과연 DNA 메틸화 억제제가 \\( \\mathrm{C} 2 \\mathrm{C} 12 \\) myoblast를 myotube로 분화시킬 것인지에 대한 연구는 거의 이루어 지지 않았다.", "</p><p>많은 선행연구들에서 DNA 메틸화 억제제인 5-aza-2'-de-oxycytidine과 zebularine과 같은 일반적으로 널리 알려진 물질을 이용하여 DNA 메틸화를 연구하였으나, 여러 가지 부작용과 독성(toxicity)이 이러한 물질들을 사용하는데 있어서 큰 걸림돌이 되고 있다. 보다 효과적이고 비독성적인 DNA 메틸화 억제물질의 개발에 많은 연구가 집중되어, 많은 연구들이 대체물질에 대한 연구를 집중한 결과 음식물에 포함된 여러 가지 폴리페놀, 즉 마시는 차에 함유된 catechin과 과일에 다량 함유된 bioflavonoids들이 DNA 메틸화억제제로서의 역할을 한다는 것을 밝혀내었다[12,13]. 그 중 (-)-epi-gallocatechin-3-gallate(EGCG)는 최근 가장 주목받는 식이성 DNA 메틸화 억제제중 하나로서 catechol 구조를 포함하는 녹차에 함유되어 있는 폴리페놀(polyphenol)성분이다. EGCG는 암세포의 증식에 관련된 유전자의 발현을 조절함으로써 암세포의 증식을 억제하는데 매우 효력이 있는 것으로 알려지고 있지만, 식이성 EGCG 폴리페놀이 골격근 \\( \\mathrm{C} 2 \\mathrm{C} 12 \\) myoblast 세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지에 대한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구의 목적은 녹차에서 추출된 폴리페놀 EGCG가 C2C12 myoblast 세포 분화에 미치는 영향을 조사하였다.</p> <h1>고찰</h1><p>DNA 메틸화와 같이 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자의 발현을 조절하는 기전인 후천적 기작은 최근에 많은 연구들에 의해 더욱 더 그 중요성이 증대되고 있는 것이 사실이다. 따라서 많은 연구들이 진행되고 있는 상황에서 그 역할과 중요성이 하나씩 밝혀지고 있지만 대부분의 연구들이 인류의 불치병의 하나로 여겨지는 암세포에서의 DNA 메틸화의 연구가 주로 진행되어 왔다. 또한 이제까지의 많은 연구들이 가장 보편적으로 널리 알려진 DNA 메틸화 억제제인 5-aza-2'-deoxycytidine과 zebularine 등과 같은 물질에 대한 연구가 주를 이루어 왔으나, 이러한 물질들이 세포내에 미치는 여러 가지 부작용과 독성(toxicity)으로 인해 최근 부작용과 독성이 없는 DNA 메틸화 억제제의 대체 물질에 대한 관심이 한층 고즈되고 있는 실정이다.", "</p><p>EGCG와 같은 식이에 함유된 폴리페놀(polyphenols) 성분이 우리 인체에 이롭다는 것은 최근 많이 연구를 통해 알려지고 있다.", "특히 많은 연구들이 녹차가 암을 예방하고 암세포의 증식을 막는 작용을 한다고 보고하면서, 많은 사람들이 녹차에 관심을 가지고, 또한 실질적으로 복용하고 있다.", "단지 암세포에서의 DNA 메틸화가 가지는 기능뿐만 아니라 다른 세포에서의 DNA 메틸화의 중요성과 기능에 대한 연구에 대한 관심이 한층 고조되고 있다.", "이러한 연구들에서 도출된 결론은 DNA 메틸화를 포함한 histone 메틸화, histone 아세틸화(acetylation)와 같은 후천적 기작이 세포 운명의 전환(cell-fate conversion)에 중심적인 역할을 하는 기작이라는 것이다.", "최근의 연구는 histone deacetylase 억제제인 val-proic acid와 DNA 메틸화 억제제인 5-aza-2'-deoxycytidine가 골수세포(bone marrow stromal cell)를 신경 줄기 세포(neural stem cell)로 전환시킨다는 것을 보고하였다. 또한 DNA 메틸화 억제제인 zebularine과 5-aza-2'- deoxy-cytidine으로 mouse embryo 10T1/2 줄기세포를 처리하자 골격근 형성에 있어서 필수적인 요소인 다핵(multinucleated)의 myotube로 분화되는 것을 관찰하였다.", "이렇듯, 과거에는 성체 조직 줄기 세포(adult tissue-specific stem cells)는 embryonic 줄기세포가 다른 조직으로 분화할 수 있는 pluripotent한 능력을 가지고는 있는 것과는 달리 일반적으로 그 조직에 제한된 lineage-restricted progenies라고 봤던이론에 반하여 최근에 들어 성체 조직 줄기세포 또한 다양한 조직으로의 분화가 가능하다는 것을 밝히게 되었다.", "하지만, 현재까지 폴리페놀 성분으로서 DNA 메틸화 억제제로 알려진 EGCG가 mouse C2C12 myoblast 세포 분화에 미치는 영향에 대한 연구는 전혀 이루어지지 않았다.", "</p><p>본 연구에서 EGCG를 사용한 이유는 앞서 언급하였듯이 EGCG가 녹차에 많이 함유된 catechol을 포함하고 있는 폴리페놀로서 많은 선행 연구에서 DNA 메틸화를 억제시키는 효과를 나타내었기 때문이다.", "비록 catechol 구조를 함유하고 있는 여러 가지 다른 폴리페놀들, 예를 들어, catechin, epicatechin, quercetin, fisetin, myricetin, caffeic acid, chlorogenic acid들도 DNA 메틸화를 억제시켰지만 EGCG가 가장 강력하게 DNA 메틸화를 억제하였다.", "배양된 유방암 세포인 MCF-7과 MDA-MB-231 세포에 EGCG를 처리하자 종양억제 유전자(tumor suppressor genes)인 retinoic acid receptor- \\( \\beta( \\) RAR- \\( \\beta) \\) 의 메틸화가 현저히 줄어들며, 그로인해 억제되었던 RAR- \\( \\beta \\) 유전자의 mRNA와 단백질이 재 발현되었다.", "또한 EGCG는 일반적인 폴리페놀 성분이 조직 내의 catechol-O-methyltransferase(COMT) 효소에 의한 폴리페놀 자체의 메틸화에 의해 생성되는 S-adenosyl-homo-cysteine(SAH)의 증가에 의한 feedback 기전에 의해 DNA 메틸화를 억제하는 것과는 달리 EGCG의 DNA 메틸화 억제기전은 modeling 연구에서 직접적으로 DNA methyl-transferase 효소와 결합을 함으로서 탁월한 억제기능을 발휘한다고 보고하였다.", "다른 폴리패놀 성분과는 달리 EGCG만이 가지고 있는 독특한 구조인 gallic acid moiety가 높은 친화력(affinity)으로 DNA methyltransferase의 catalytic site와 결합하기 때문이다.", "이와 같이 많은 풀리페놀 중 EGCG의 독특한 화학구조가 DNA 메틸화를 억제하는데 있어서 중요한 역할을 하며, 이로 인해 많은 연구들이 암 예방 차원에서 EGCG의 효능을 연구하는 주된 이유가 되고 있다.", "이러한 강력한 EGCG의 DNA 메틸화 억제작용이 암세포에서 여러 가지 유전자의 발현을 조절하듯이 암세포가 아닌 C2C12 myoblast 세포의 분화와 관련 유전자 발현에 영향을 미칠 것이라는 가설아래 본 연구에서는 최대 \\( 50 \\mu \\mathrm{M} \\)의 EGCG를 4일 동안 mouse C2C12.myoblast 세포에 처리하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>시약 및 세포주</h2><p>Fetal bovine serum, antibiotic, 세포배양 plate는 BioClone,Sigma, Falcon사로부터 각각 구입하였다.", "PCR primer는 Cosmo사로부터 제작하여 사용하였으며, EGCG는 Sigma-Aldrich사로부터 구입하여 사용하였다.", "</p><h2>세포 배양 및 EGCG 처리</h2><p>Mouse C2C12 myoblast 세포는 \\( 10 \\% \\) FBS(fetal bovine serum), \\( 100 \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\)의 페니실린 G, \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) streptomycin sulfate를 함유하고 있는 Dulbeccco's Modified Eagles' Medium(DMEM) 을 이용하여 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C}\\left(5 \\% \\mathrm{CO}_{2}\\right) \\)의 incubator에서 배양하였다. 세포는 \\( 30 \\mathrm{~mm} \\) plate에 \\( 2 \\mathrm{ml} \\) 당 \\( 1 \\times 10^{4} \\) 세포를 분주하고 24시간 후 여러 가지 농도 \\( (0,3.125,6.25,12.5,25,50 \\mu \\mathrm{M}) \\)의 EGCG를 처리하여 4일 동안 배양하였다. 배지는 3일 후 교환해 주었으며, EGCG 또한 배지 교환 시 재처리하였다. EGCG 처리 시간의 경과에 따른 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin과 transgelin mRNA의 변화를 알아보기 위하여 \\( \\mathrm{C} 2 \\mathrm{C} 12 \\) 세포를 분주한 뒤 24시간 후 \\( 50 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 EGCG를 0,24,48,72시간동안 처리하였다.</p><h2>Immunofluorescent staining</h2><p>C2C12 myoblast 세포를 6 wells 배양 plate에 고정(fix)시키기 위하여 \\( 3.7 \\% \\) formaldehyde \\( (\\mathrm{pH} 7-8) \\) 를 함유하고 있는 PBS \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 각각의 well에 10 분간 처리하였다. 그 후 PBS 용액으로 fix된 세포를 씻어낸 후 \\( 0.2 \\% \\) trinton X-100과 \\( 10 \\% \\) goat serum을 포함하고 있는 PBS로 상온에서 15 분간 처리하여 세포를 permeabilization을 시켰다. 다음은 \\( \\mathrm{C} 2 \\mathrm{C} 12 \\) myoblasts 세포에 mouse IgG smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin primary 항체 (Sigma, St. Louis, MO)를 1:1000 비율로 희석시킨 \\( 600 \\mathrm{ml} \\)를 각각의 well에 상온에서 30 분간 배양시켰다. 다음 세포는 PBS로 3번 씻은 후 1:250 비율로 희석된 Alexa488-conjugated goat anti-mouse IgG secondary 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)로 상온에서 30분간 더 배양하였다. 마지막 단계로서 세포를 PBS로 3번 헹군 후 핵의 변화를 살펴보기 위하여 \\( 1.5 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 의 4',6-diamidino-2phenylindole(DAPI)를 이용하여 세포를 staining한 후 PBS로 3번 헹구어 내었다.", "세포 배양 plate상에서의 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin protein 단백질의 발현 정도는 디지털 이미지 system을 갖춘 Axiovert 200 epi-fluorescence 현미경(Zeiss, Germany)을 이용하여 사진 촬영을 하였다.", "</p><h2>Total RNA 추출과 cDNA 합성</h2><p>대조군과 EGCG로 처리된 세포를 TRIzol reagent(Life Technologies, Grand Island, NY)를 각 well당 \\( 600 \\mu \\mathrm{l} \\) 넣은 후 total RNA를 RNeasy RNA extraction kit(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 얻었다.", "추출된 RNA를 ultrapure water에 용해시킨 후 UV \\( 260 \\mathrm{~nm} \\)에서 농도를 측정하였다.", "그 다음 \\( 0.5 \\mu \\mathrm{g} \\)의 total RNA와 first strand cDNA synthesis \\( k i t( \\) Roche)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.", "cDNA 합성조건은 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 10분, \\( 42{ }^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 60분, \\( 95{ }^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 5분순으로 진행되었고, final volume은 \\( 20 \\mu \\mathrm{l} \\)였다.", "</p><h2>Real-time qunatitative PCR</h2><p>Transgelin(smooth muscle 22 protein)과 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin messenger RNA(mRNA) 발현을 측정하기 위하여, double-stranded DNA dye인 SYBR Green(Perkin Elmer, Boston, MA)을 이용하여 fluorescence real-time PCR을 실시하였다.", "본 실험에서 사용한 primer sequence는 Table 1에 나타난 바와 같다.", "SYBR Green 분석은 ABI PRISM 7700 system(Perkin Elmer, Applied Biosystems)을 이용하였으며, 모든 샘플은 최소한 2회 이상 반복 측정하였으며, 각각의 target mRNA의 발현은 glyceraldehyde 3-phosphate de-hydrogenase(GAPDH) mRNA양으로 보정하였다.", "</p> <h1>요약</h1><p>본 연구에서는 유전자 발현에 중요한 조절 역할을 하는 DNA 메틸화를 식이성 폴리페놀의 하나인 녹차의 대표적인 추출물 EGCG로 억제하였을 때 C2C12 myoblast 세포에 일어나는 현상을 살펴보았다.", "그 결과 smooth muscle의 지표인 transgelin, smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin mRNA와 단백 질이 현저히 증가함을 보였고, 형태학적으로도 smooth muscle의 전형적인 모습을 보였다.", "식이에 포함된 DNA 메틸화 억제제인 EGCG가 C2C12 myoblast를 smooth muscle로 분화를 유도하였으며, 암 예방 차원에서의 EGCG의 역할 외에 혈관질환과 같은 smooth muscle에 관련된 예방과 치료차원에서 EGCG의 역할이 있을 것으로 사료된다.", "본 연구는 C2C12 myoblast를 smooth muscle로 유도하는 결정적인 신호전달 역할을 하는 유전자에 대한 연구는 수행하지 못하였다.", "따라 서 EGCG에 의해 변화되는 유전자에 대한 기전연구가 필요하다고 하겠다.", "</p> <h1>결과</h1><h2>Immunofluorescent staining</h2><p>다양한 농도의 EGCG를 C2C12 myoblast 세포에 4일간 처리한 후 phase 상에서의 사진을 관찰한 결과 형태학적인 측면에서 C2C12 myoblast가 EGCG 처리 후 smooth muscle 세포로 분화되는 것을 관찰하였다.", "세포의 형태로 보았을 때 Fig.2(a)에서 보는 바와 같이 대조군에서는 C2C12 myoblast 세포의 형태가 둥근 형태를 보이며, plate상에 \\( 1 \\times 10^{4} \\) 로 세포를 분주한 후 4일이 경과하자 세포의 수가 많이 증식되었음을 확연히 관찰할 수 있다.", "하지만 EGCG로 처리한 후 4일이 경과하자 Fig.", "2c의 phase 사진에서 보듯이 C2C1 myoblast 세포의 형태가 elongation이 되었고 주변 세포들과의 fusion이 일어나서 smooth muscle의 형태를 보임을 알 수 있다.", "또한 세포를 분주한 후 4일이 지났음에도 불구하고 EGCG로 처리한 세포에서는 세포의 밀도가 대조군에 비해서 확연히 낮음을 볼 수 있다.", "세포의 증식 정도를 좀 더 명확히 알기위하여 DAPI로써 C2C12 myoblast 세포의 핵을 염색하였다.", "Fig.", "2의 b와 d에서 보듯이 파란색으로 염색된 것이 각 세포의 핵을 나타낸다.", "Fig.", "2의 b에서 보듯이 대조군에서는 핵의 숫자가 EGCG 처리된 세포에 비해 그 수와 밀도가 많이 증가하였음을 알 수 있다.", "본 연구에서는 서론에서 언급하였듯 이 C2C1 세포를 분화배지 조건에서 배양을 하지 않고, \\( 10 \\% \\) FBS 상태에서 EGCG를 처리하였다.", "따라서 핵의 숫자가 EGCG 처리군에 비해 대조군에서 확연히 높다는 것은 EGCG가 세포의 증식을 억제하는 역할을 한다고 사료된다.", "또한 이러한 결과가 단지 EGCG의 독성에 의한 결과일 가능성을 생각해 보지 않을 수 없다.", "만약 독성에 의한 증식 억제라면 세포의 숫자에서는 EGCG 처리군이 적다고 하더라도 형태적으로도 같은 모양이 관찰되어야 할 것이다.", "하지만, Fig.", "2c의 phase 사진에서 보듯이 형태적으로 대조군과 비교하였을 때 전혀 다른 형태의 세포로 분화되었음을 알 수 있다.", "</p><h2>Transgelin mRNA</h2><p>Transgelin 유전자는 smooth muscle에 특징적으로 발현되는 유전자로서 smooth muscle의 지표(marker)로서 널리 쓰이고 있다.", "따라서C2C12 myoblast 세포에 EGCG를 4일 간 처리한 후 smooth muscle marker인 transgelin mRNA에 어떠한 변화가 일어났는지를 real-time PCR을 이용하여 살펴보기 위하여 세포를 6 wells plate에 \\( 1 \\times 10^{4} \\) 으로 분주를 한 후 24시간 후 EGCG를 대조군에는 처리하지 않았으며, EGCG 처리 군에는 각각 다른 농도 \\( (3.125,6.25,12.5,25,50 \\) \\( \\mu \\mathrm{M}) \\) 로서 4일간 처리하였다.", "그 결과 EGCG로 4일간 처리한 세포에서는 transgelin mRNA 발현이 대조군 세포와 비교하 였을 때 농도 의존적으로 증가함을 보여준다.", "가장 낮은 농도인 \\( 3.125 \\mu \\mathrm{M} \\) 에서는 transgelin mRNA 발현이 대조군 세포와 비교하였을 때 \\( 34 \\% \\) 정도 유의하게 증가하였다.", "더 나아가 \\( 6.25 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 EGCG는 transgelin mRNA 발현을 \\( 63 \\% \\) 정도 유의하게 증가시켰으며, \\( 12.5 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 EGCG로 처리된 C2C12 myoblast 세포에서는 \\( 148 \\% \\) 정도 중가치를 나타내었다.", "본 실험에서 사용한 EGCG의 농도 중 최고 농도인 50\\( \\mu \\mathrm{M} \\) 의 EGCG를 4일간 처리하자 transgelin mRNA 발현이 약 9배정도 유의하게 증가되었다.", "본 실험의 mRNA 결과는 re-al-time PCR을 실시할 때 각각 샘플의 cDNA copy 수를 보정하기 위하여 transgelin mRNA 발현 정도를 각 샘플의 GAPDH mRNA로 보정하였다.", "</p><p>시간의 변화에 따른 transgelin mRNA 발현 정도를 살펴보기 위하여 \\( 50 \\mu \\mathrm{M} \\)의 EGCG를 각각 24,48,72시간 동안 C2C12 myoblast 세포에 처리한 후 transgelin mRNA 발현 변화를 살펴보았다. \\", "( 50 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 EGCG을 24시간동안 세포에 처리한 결과 transgelin mRNA 발현은 대조군과 비교하였을 때 변화가 없었지만 48시간과 72시간동안 EGCG를 처리한 후에는 5-6배 가까이 유의하게 증가하였다.", "</p><h2>Smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin mRNA</h2><p>앞에서 언급한 바와 같이 4일 동안 EGCG를 \\( \\mathrm{C} 2 \\mathrm{C} 12 \\) myoblast에 처리 후 smooth muscle a-actin 단백질이 발현됨을 immunofluorescent staining을 통해 입증하였다.", "본 연구에서는 더 나아가 EGCG가 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin mRNA의 발현에 어떠한 영향을 미쳤는지를 알아보기 위해 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin primer를 이용하여 real-time PCR을 실시하였다.", "EGCG의 농도가 낮을 때 \\( (3.125,6.25 \\mu \\mathrm{M}) \\mathrm{C} 2 \\mathrm{C} 12 \\) myoblast 세포에서의 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin mRNA 발현은 대조군과 비교하였을 때 적은 폭이지만 유의하게 약 \\( 40 \\% \\) 정도 증가하였다.", "농도가 점점 더 높아질수록 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin mRNA는 이에 비례하여 증가하는 경향을 보였으며, 가장 높은 농도인 \\( 50 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 EGCG는 \\( \\mathrm{C} 2 \\mathrm{C} 12 \\) myoblast 세포의 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin mRNA 발현을 약 4.5배정도 유의 하게 증가시켰다.", "</p><p>시간에 따른 smooth muscle \\( \\alpha \\)-actin mRNA의 발현 변화를 보기 위하여 \\( 50 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 EGCG로 세포를 처리한 후 24,48,72시간이 경과한 후 각 시점에서 mRNA 농도 변화를 살펴본 결과 transgelin mRNA 발현 변화와 비슷한 경향으로 증가하였으며, 72시간 처리 후에는 약 6배정도 대조군과 비교하였 때 smooth muscle a-actin mRNA가 증가하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "식이성 폴리페놀 (-)-epigallocatechin-3-gallate가 mouse C2C12 myoblast 분화에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a592a2d7-3b32-46c6-beed-b24ff37943c2", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2007", "doc_author": [ "김혜진", "이원준" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", 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5,312	<h1>서 론</h1><p>운동수행력 증진과 관련된 연구는 스포츠 과학 분야에서 가장 중요시되는 과제 중의 하나라고 할 수 있으며, 이에 대한 연구는 끊임없이 이루어지고 있다. 그 중 운동생리학 분야에서는 운동에 따른 피로를 지연시킴으로써 운동수행력을 향상시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 지속적으로 이어지고 있으며, 그 방법 중 하나로 영향학적 측면의 에너지 보충제 (ergogenic aid) 섭취가 많이 이용되고 있다. 에너지 보충제 투여는 직 \( \cdot \) 간접적으로 에너지 기질 동원 및 활용에 긍정적인 효과를 초래하여 피로를 지연시킴과 동시에 운동수행력을 증진시키는 역할을 하기 때문에 스포츠 현장에서 널리 이용되고 있으며 조금 더 신체에 부담을 주지 않으면서도 운동수행력을 증진시킬 수 있는 에너지 보충제를 찾아내기 위한 노력이 이뤄지고 있다.</p><p>국내의 경우 민간 및 한방요법을 비롯한 전래의학에 바탕을 두고 생약 및 자연식품으로부터 추출된 물질을 통해서 운동 시 에너지 보충제의 효과를 거둘 수 있을 것 이라는 가능성이 제시되어 왔다. 이에 근거하여 인삼, 가시오가피, 홍삼 등을 대상으로 이러한 성분들의 산소운반능력 및 운동피로 회복효과에 대한 실제적인 분석이 시도되어 왔다. 최근 이러한 기존의 성분들과 함께 국내 전래의학에서 널리 알려진 매실의 에너지 보충제로서의 효과에 대해 연구가 시도되고 있다.</p><p>매실은 매화나무의 열매이며 매화나무는 장미과에 속하는 낙엽활엽교목으로 이 나무의 핵과를 매실이라 한다. 원산지는 중국의 사천성과 호북성의 산간지로 알려져 있으며 한국, 중국 및 일본 등에 널리 분포되어 있다. 원래 매실은 행매라 하여 신맛이 약한데, 우리나라에 건너온 후 독특한 계절과 풍토의 영향으로 신맛이 강한 산매로 변했다. 이것은 매실의 생명인 구연사의 함유량이 훨씬 많은 좋은 매실로 변한 것이라고 볼 수 있으며 따라서 매실은 한국산이 최고품이라고 알려져 있다. 매실은 본초강목 신농본초경, 명의별록 등의 각종 한의서에 만성기침, 하열에 의한 가슴의 열기나 목마름, 오래된 학질, 만성 설사, 치질, 혈변, 혈뇨, 회충에 의한 급성복통이나 구토, 갈고리촌충 구제를 치료한다고 기록되어 있다. 현재까지 매실의 효능을 과학적으로 검증한 연구는 항산화성, 항혈전, 아질산염 소거작용, 피로회복, 간기능 개선 효과 등에 관한 것이었다. 이러한 기전을 바탕으로 매실은 활력유지, 피로회복 등에 효과를 가진 약제로 이용되어 왔다. 특히 강력한 알칼리성에 해당하는 것으로 알려진 매실은 풍부한 citric acid (구연산)를 중심으로 한 유기산, 무기질 등을 함유함으로서 운동수행 시 체내 신진대사 활성화, 노폐물 제거, 젖산생성 억제, 헤모글로빈과의 산소친화력 향상 등에 효과가 높다고 알려져 있어 대사 기능 촉진 및 피로회복 활성화 등에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.</p><p>이러한 매실의 기능과 관련된 연구로는 장거리 종목의 운동선수들을 대상으로 혈액 성분 변화에 대한 매실섭취효과가 분석된 바 있으며, Park 등은 여자 배드민턴 선수들을 대상으로 동일한 운동강도에서 매실 엑기스 섭취 후 혈중 젖산농도의 축적 현상이 감소한 것으로 보고한 바 있다. 그리고 Kim 등은 고온에서의 점증적인 운동 시 매실음료의 섭취시가 전반적으로 생수음료 섭취시보다 동일 시기에서 낮은 심박수를 나타내면서, 올아웃에 이르는 최대 운동지속시간이 유의하게 높았다고 보고하였다.</p><p>이와 같이 많은 연구들에서 운동수행 시 매실섭취에 따른 운동수행력 향상 및 피로 회복에 관한 효과가 입증되었지만 매실의 함량정도와 섭취량의 차이를 보이고 있으며, 또한 대부분의 실험들이 매실 외의 다른 물질이 함유된 음료를 섭취하거나, 섭취기간 중에 트레이닝 등의 운동수행이 동시에 이뤄짐으로써 입증된 효과가 매실 자체만의 효과라고 확신하기에는 어려움이 있다고 보여진다.</p><p>이에 본 연구에서는 6주간 다른 함유물질의 첨가 없이 매실 추출물만을 섭취하고, 6주간 특별한 운동처치를 하지 않음으로써 6주간 매실의 섭취만으로 운동수행 시 피로에 미치는 영향을 알아보고자 한다. 따라서, 본 연구는 6주간의 매실추출물 섭취가 에너지 기질 및 피로 물질 변화에 미치는 영향을 알아보는데 그 목적이 있다.</p> <h1>고 찰</h1><p>인체는 생명을 유지하기 위해, 그리고 신체활동을 위해 음식을 섭취하고, 섭취된 음식은 신체내로 흡수되어 에너지를 생성하게 된다. 이러한 에너지를 생성하기 위해 신체 내에서는 여러 화학적 작용을 거치게 되며, 에너지의 근원이 되는 영양소인 탄수화물, 지방, 단백질은 이러한 화학 작용들 중 citric acid cycle을 거치게 된다. 이 citric acid cycle을 통해 많은 에너지를 생성하게 되는데, citric acid cycle이 원활하게 돌아가는데 필수적인 것이 citric acid이다. 만약 citric acid cycle이 원활하게 돌아가지 않는다면 혈중 젖산이 축적되어 피로유발의 원인이 될 수 있다.</p><p>젖산 생성은 운동시 근육 피로를 유발하는 주요 인자로 간주되어 오고 있으며, 운동으로 인한 근육에서의 젖산 축적이 \( \mathrm{pH} \)를 감소시켜 피로를 유발시킨다고 알려져 있다.</p><p>본 연구에서 피로물질인 혈중 젖산 농도는 매실 섭취 전에 비해 매실 섭취 후 유의한 차는 나타나지 않았지만 낮은 수치를 보였다. 이러한 결과는 Kim 등이 12주간의 매실음료를 섭취시킨 그룹이 섭취하지 않은 그룹에 비해 유의하게 낮은 혈중 젖산 농도를 보여 피로회복에 효과적임을 입증한 연구와 Min 등이 매실음료와 스포츠음료를 비교해본 결과, 혈중 젖산 농도가 유의한 차는 나타나지 않았지만 스포츠음료보다 더 낮은 수치를 나타내었다는 연구와 일치하는 결과였다. 이 것은 매실 중에 포함된 citric acid가 에너지 생성 과정에서 젖산의 과잉생성을 억제하고 탄산가스를 물로 분해 시켜 체외로 배설시킴으로 조기에 피로물질을 없앤 것이라 할 수 있다. 또한, 매실에 다량 함유된 citric acid가 운동이 진행됨에 따라 산성화되어 가는 인체를 약알칼리성으로 유지할 수 있게 한 것뿐만 아니라, 매실이 운동 후 갈증을 감소시킨다는 효능이 있는데, 운동 시 발생하는 갈증을 감소시켜 에너지대사를 촉진시키는 동시에 젖산의 생성을 억제하여 피로를 회복시켜 새로운 에너지 생성을 더한 것으로 보인다.</p><p>근육에서의 피로를 유발시키는 또 다른 인자인 암모니아는 젖산의 생성을 유발하고 글리코겐의 빠른 저하를 가져와 근육의 피로를 유발시킨다고 알려져 있다. 본 연구에서 혈중 암모니아 농도는 매실 투여 전이 매실 투여 후보다 유의하게 높게 나타났다. 이는 매실 투여 전이 매실 투여 후에 비해 근육 세포막의 표면에 작용하는 전기적 자극을 변화시켜 근육의 장력 발생을 저하시키며, 그 결과 해당 작용에 있어서 주요 효소인Phosphofructokinase (PFK)의 활동을 자극하고 citric acid cycle과 gluconeogenesis를 저해하여 mitochondria 산화를 제한한 것이라 할 수 있다. 이로 인해 젖산의 축적을 가중시키고 근육에 저장되어 있는 글리코겐 고갈을 가속화시켰고, ATP 재생성을 손상시켜 AMP 축적을 가져와 암모니아 생성을 일으켰으며, 그 결과 피로 유발과 관련이 있는 산성화가 시작될 가능성을 제공했다고 본다. 반면 매실이 인체의 산성화를 억제함으로써 \( \mathrm{pH} \) 감소의 시작을 더디게 하여 속근 섬유의 동원 비율보다 지근 섬유가 운동에 관여하게 되어 암모니아의 적은 축적을 가져온 것 같으며, 결과적으로 혈중 젖산 농도의 적은 생성을 가져온 것이라 생각된다.</p><p>무기인산은 힘의 소멸과 연관이 있다고 알려져 있으며, 힘 발현은 무기인산의 농도와 밀접한 연관이 있다. 초기의 피로 관련 연구가 근육 피로의 원인을 산성화에 초점을 맞추었지만, 최근의 연구들은 세포내 무기인산(\(\mathrm{Pi}\)) 축적이 피로를 이끈다는 것에 주의를 기울이고 있다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구 대상</h2><p>본 연구는 남자 대학생 15명을 대상으로 하였으며, 연구 대상자의 신체적 특성은 Table 1에 나타나 있다.</p><h2>실험 절차</h2><p>본 실험의 절차는 Table 2와 같다.</p><h2>매실 추출물 및 위약 투여방법</h2><p>투여 전 테스트가 끝난 후, 매실 투여군은 매실추출물을, 위약 투여군은 위약을 6주간 일일 2회 섭취하였다. 매실 구성성분은 Table 3과 같다.</p><h2>최대산소섭취량 \( 75 \% \) 산정 및 테스트</h2><p>최대산소섭취량 (\(\mathrm{VO}_{2}\)max) 은 가스분석기 (Monographic사, USA, CPXsystem) 을 이용하여, breath by breath 방식으로 측정하였으며, Bruce protocol을 채택하여 트레드밀 (Quinto사, USA, Q65) 에서 실시하였다. \(75 \%\) \(\mathrm{VO}_{2}\)max 테스트를 위하여 테스트 전 각 피험자들의 \(\mathrm{VO}_{2}\)max를 바탕으로 그에 따른 최대산소섭취량의 \(75 \%\) (\(75 \% \) \(\mathrm{VO}_{2}\)max)를 산정하였다. 6주간의 매실추출물과 위약 섭취 전과 섭취 후 모두, Bruce protocol로 운동을 시작하여 프로그램에 미리 설정된 단계별로 운동 강도가 증가되도록 하다가, 각 피험자들의 산소섭취량이 미리 산정해 놓은 (\(\mathrm{VO}_{2}\)max) 수준에 도달하게 되면, 이를 유지시키기 위하여 트레드밀의 protocol을 수동으로 조절하여, 30 분간 트레드밀 달리기를 실시하였다.</p><h2>혈액채취 및 분석방법</h2><p>혈액 채취는 매실추출물과 위약 섭취전과 섭취 후(0주 및 6주) 에 각각 4회(안정 시, 종료 시, 회복 30분, 회복 1시간) 실시하였다. 채취된 혈액은 2,500~3,000 \(\mathrm{rpm} \) 에서 15~20분간 원심분리하여, 상층액을 얻어 혈중 피로요소(젖산, 암모니아,무기인산)과 에너지 기질(글루코스, 유리지방산)을 분석하는데 사용하였다. 혈중 젖산, 암모니아, 무기인산은 건식 생화학분석기(Kodak사, USA, EKTACHEM DT60 Ⅱ)를 사용하여 분석하였고, 글루코스는 면역분석기(Bayer사 USA, ADVIA 1650)를 이용하여 enzymatic 검사법을 사용하였다. 그리고 유리지방산은 자동생화학 분석기(Hitachi사, Japan, Hitachi 7150)를 이용하여 분석하였다.</p><h2>자료 처리</h2><p>본 연구에서 얻은 자료는 SPSS 통계 package (v. 12.0)를 이용하여 기술통계량을 산출하였다. 혈중 피로요인 및 에너지 기질 변화 형태 비교는 투여조건과 시기를 독립변인으로 하는 2(투여조건; 매실투여전, 매실투여후) \( \times 4 \) (시기; 안정 시, 운동종료, 회복 30분, 회복 60분) 요인설계하에 이루어졌으며, 투여조건과 시기를 반복 측정하는 이원 분산분석법(two-way ANOVA)을 이용하여 분석하였다. 모든 분석에서 유의한 차이를 보인 부분은 사후검증(Scheffe)을 실시하였으며, 유의수준은 0.05로 설정하였다.</p> <h1>결 과</h1><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 젖산 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과와 투여조건의 주효과에서는 유의한 차이가 나타나지 않았지만, 시기 \( [F(3,42)=133.780, p=0.000] \)의 주 효과는 유의하게 나타났다. 시기의 사후검증 결과, 운동종료 시 \( (M=6.843)\) 가 안정 시 \((M=1.176) \), 회복30분 \( (M=2.210) \), 회복60분\( (M=1.216) \) 보다 유의하게 높게 나타났으며 \( (p=0.000) \), 또한 회복 30분 \( (M=2.210) \)이 회복 60분 \( (M=1.216) \) 보다 유의하게 높게 나타났다 \( (p=0.000) \). 매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료, 회복 30분, 회복 60분 각각 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \( 2.03 \%\), \(5.57 \% \), \( 5.95 \% \) 적은 수치를 보여 매실 투여가 피로회복에 긍정적인 영향을 미침을 보였다.</p><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 암모니아 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과가 유의하게 나타났다 \( [F(3,36)=3.387, p< \)\( 0.05] \). 이에 대한 사후검증으로 매실 투여 조건에 대한 시기별 차이 분석을 위해 일원 변량분석을 실시하였다. 매실 투여 전, 운동 종료시가 가장 높은 수치를 나타냈으며, 안정 시, 회복 30분, 회복 60분 보다 유의하게 높게 나타났다 \( (p=0.000) \). 매실 투여 후에도 운동 종료시점이 가장 높은 수치를 나타냈으며, 안정시, 회복 30분, 회복 60분 보다 유의하게 높게 나타났다\( (p=0.000) \). 매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료, 회복 30분, 회복 60분 각각 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \(15.69 \%\), \(17.23 \%\), \(19.62 \% \) 적은 수치를 보여 매실 투여가 피로회복에 긍정적인 영향을 미침을 보였다. 또한, 투여조건 \( [F(1,12)=21.844, p<0.01] \) 과 시기 \( [F(3,36)=178.256, p=0.000] \)의 주 효과도 유의하게 나타났다. 투여조건의 사후검증 결과, 매실 투여 전 \( (M=67.73) \) 이 매실 투여 후 \( (M=55.70) \) 보다 유의하게 높았으며 \( (p<0.01) \), 시기의 경우, 운동 종료 시 \( (M=104.31) \)가 안정 시 \( (M=48.08) \), 회복 30분 \( (M=48.35) \), 회복 60분 \( (M=46.12) \) 보다 유의하게 높게 나타났다\( (p=0.000) \).</p><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 무기인산 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과와 투여조건의 주효과에서는 유의한 차이가 나타나지 않았지만, 시기 \( [F(3,30)=73.248, p=0.000] \)의 주효과는 유의하게 나타났다. 시기의 사후검증 결과, 운동 종료 시\( (M=5.068) \)가 안정 시 \( (M=3.714) \), 회복 30분 \( (M=8.905) \), 회복 60분 \( (M=3.627) \) 보다 유의하게 높게 나타났으며 \( (p=0.000) \), 또한 회복 30분 \( (M=3.905) \) 이 회복 60분 \( (M=3.627) \) 보다 유의하게 높게 나타났다 \( (p=0.000) \). 매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료, 회복 30분, 회복 60분 각각, 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \( 3.35 \% \), \( 3.88 \%\), \(4.89 \% \) 적은 수치를 보여 매실 투여가 피로회복에 긍정적인 영향을 미침을 보였다.</p><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 글루코스 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과, 투여조건과 시기의 주효과에서 유의한 차이가 나타나지 않았다.</p><p>매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료, 회복 30분, 회복 60분 각각 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \( 2.54 \%\), \(0.6 \%\), \( 3.11 \% \) 적은 수치를 보였다.</p><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 FFA 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과와 투여조건의 주효과에서는 유의한 차이가 나타나지 않았지만, 시기 \( [F(3,36)=14.9444, p=0.000] \)의 주효과는 유의하게 나타났다. 시기의 사후검증 결과, 안정 시\( (M=236.192) \)가 회복30분 \( (M=501.154) \)과 회복60분 \( (M=496.077) \)보다 유의하게 낮게 나타났으며( \( (p<0.01) \), 운동 종료 시\( (M=390.769) \)가 안정 시 \( (M=236.192) \) 와 회복 30분 \( (M=501.154) \)보다 유의하게 높게 나타났다 \( (p<0.01) \). 매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료 시 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \(33.78\%\) 높은 수치를 보임으로 운동수행 증진을 위한 에너지 기질인 유리지방산에 긍정적인 영향을 미침을 보였다.</p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>운동수행력 증진과 관련된 연구는 스포츠 과학 분야에서 가장 중요시되는 과제 중의 하나라고 할 수 있으며, 이에 대한 연구는 끊임없이 이루어지고 있다.", "그 중 운동생리학 분야에서는 운동에 따른 피로를 지연시킴으로써 운동수행력을 향상시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 지속적으로 이어지고 있으며, 그 방법 중 하나로 영향학적 측면의 에너지 보충제 (ergogenic aid) 섭취가 많이 이용되고 있다.", "에너지 보충제 투여는 직 \\( \\cdot \\) 간접적으로 에너지 기질 동원 및 활용에 긍정적인 효과를 초래하여 피로를 지연시킴과 동시에 운동수행력을 증진시키는 역할을 하기 때문에 스포츠 현장에서 널리 이용되고 있으며 조금 더 신체에 부담을 주지 않으면서도 운동수행력을 증진시킬 수 있는 에너지 보충제를 찾아내기 위한 노력이 이뤄지고 있다.", "</p><p>국내의 경우 민간 및 한방요법을 비롯한 전래의학에 바탕을 두고 생약 및 자연식품으로부터 추출된 물질을 통해서 운동 시 에너지 보충제의 효과를 거둘 수 있을 것 이라는 가능성이 제시되어 왔다.", "이에 근거하여 인삼, 가시오가피, 홍삼 등을 대상으로 이러한 성분들의 산소운반능력 및 운동피로 회복효과에 대한 실제적인 분석이 시도되어 왔다.", "최근 이러한 기존의 성분들과 함께 국내 전래의학에서 널리 알려진 매실의 에너지 보충제로서의 효과에 대해 연구가 시도되고 있다.", "</p><p>매실은 매화나무의 열매이며 매화나무는 장미과에 속하는 낙엽활엽교목으로 이 나무의 핵과를 매실이라 한다.", "원산지는 중국의 사천성과 호북성의 산간지로 알려져 있으며 한국, 중국 및 일본 등에 널리 분포되어 있다.", "원래 매실은 행매라 하여 신맛이 약한데, 우리나라에 건너온 후 독특한 계절과 풍토의 영향으로 신맛이 강한 산매로 변했다.", "이것은 매실의 생명인 구연사의 함유량이 훨씬 많은 좋은 매실로 변한 것이라고 볼 수 있으며 따라서 매실은 한국산이 최고품이라고 알려져 있다.", "매실은 본초강목 신농본초경, 명의별록 등의 각종 한의서에 만성기침, 하열에 의한 가슴의 열기나 목마름, 오래된 학질, 만성 설사, 치질, 혈변, 혈뇨, 회충에 의한 급성복통이나 구토, 갈고리촌충 구제를 치료한다고 기록되어 있다.", "현재까지 매실의 효능을 과학적으로 검증한 연구는 항산화성, 항혈전, 아질산염 소거작용, 피로회복, 간기능 개선 효과 등에 관한 것이었다.", "이러한 기전을 바탕으로 매실은 활력유지, 피로회복 등에 효과를 가진 약제로 이용되어 왔다.", "특히 강력한 알칼리성에 해당하는 것으로 알려진 매실은 풍부한 citric acid (구연산)를 중심으로 한 유기산, 무기질 등을 함유함으로서 운동수행 시 체내 신진대사 활성화, 노폐물 제거, 젖산생성 억제, 헤모글로빈과의 산소친화력 향상 등에 효과가 높다고 알려져 있어 대사 기능 촉진 및 피로회복 활성화 등에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.", "</p><p>이러한 매실의 기능과 관련된 연구로는 장거리 종목의 운동선수들을 대상으로 혈액 성분 변화에 대한 매실섭취효과가 분석된 바 있으며, Park 등은 여자 배드민턴 선수들을 대상으로 동일한 운동강도에서 매실 엑기스 섭취 후 혈중 젖산농도의 축적 현상이 감소한 것으로 보고한 바 있다.", "그리고 Kim 등은 고온에서의 점증적인 운동 시 매실음료의 섭취시가 전반적으로 생수음료 섭취시보다 동일 시기에서 낮은 심박수를 나타내면서, 올아웃에 이르는 최대 운동지속시간이 유의하게 높았다고 보고하였다.", "</p><p>이와 같이 많은 연구들에서 운동수행 시 매실섭취에 따른 운동수행력 향상 및 피로 회복에 관한 효과가 입증되었지만 매실의 함량정도와 섭취량의 차이를 보이고 있으며, 또한 대부분의 실험들이 매실 외의 다른 물질이 함유된 음료를 섭취하거나, 섭취기간 중에 트레이닝 등의 운동수행이 동시에 이뤄짐으로써 입증된 효과가 매실 자체만의 효과라고 확신하기에는 어려움이 있다고 보여진다.", "</p><p>이에 본 연구에서는 6주간 다른 함유물질의 첨가 없이 매실 추출물만을 섭취하고, 6주간 특별한 운동처치를 하지 않음으로써 6주간 매실의 섭취만으로 운동수행 시 피로에 미치는 영향을 알아보고자 한다.", "따라서, 본 연구는 6주간의 매실추출물 섭취가 에너지 기질 및 피로 물질 변화에 미치는 영향을 알아보는데 그 목적이 있다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>인체는 생명을 유지하기 위해, 그리고 신체활동을 위해 음식을 섭취하고, 섭취된 음식은 신체내로 흡수되어 에너지를 생성하게 된다.", "이러한 에너지를 생성하기 위해 신체 내에서는 여러 화학적 작용을 거치게 되며, 에너지의 근원이 되는 영양소인 탄수화물, 지방, 단백질은 이러한 화학 작용들 중 citric acid cycle을 거치게 된다.", "이 citric acid cycle을 통해 많은 에너지를 생성하게 되는데, citric acid cycle이 원활하게 돌아가는데 필수적인 것이 citric acid이다.", "만약 citric acid cycle이 원활하게 돌아가지 않는다면 혈중 젖산이 축적되어 피로유발의 원인이 될 수 있다.", "</p><p>젖산 생성은 운동시 근육 피로를 유발하는 주요 인자로 간주되어 오고 있으며, 운동으로 인한 근육에서의 젖산 축적이 \\( \\mathrm{pH} \\)를 감소시켜 피로를 유발시킨다고 알려져 있다.", "</p><p>본 연구에서 피로물질인 혈중 젖산 농도는 매실 섭취 전에 비해 매실 섭취 후 유의한 차는 나타나지 않았지만 낮은 수치를 보였다.", "이러한 결과는 Kim 등이 12주간의 매실음료를 섭취시킨 그룹이 섭취하지 않은 그룹에 비해 유의하게 낮은 혈중 젖산 농도를 보여 피로회복에 효과적임을 입증한 연구와 Min 등이 매실음료와 스포츠음료를 비교해본 결과, 혈중 젖산 농도가 유의한 차는 나타나지 않았지만 스포츠음료보다 더 낮은 수치를 나타내었다는 연구와 일치하는 결과였다.", "이 것은 매실 중에 포함된 citric acid가 에너지 생성 과정에서 젖산의 과잉생성을 억제하고 탄산가스를 물로 분해 시켜 체외로 배설시킴으로 조기에 피로물질을 없앤 것이라 할 수 있다.", "또한, 매실에 다량 함유된 citric acid가 운동이 진행됨에 따라 산성화되어 가는 인체를 약알칼리성으로 유지할 수 있게 한 것뿐만 아니라, 매실이 운동 후 갈증을 감소시킨다는 효능이 있는데, 운동 시 발생하는 갈증을 감소시켜 에너지대사를 촉진시키는 동시에 젖산의 생성을 억제하여 피로를 회복시켜 새로운 에너지 생성을 더한 것으로 보인다.", "</p><p>근육에서의 피로를 유발시키는 또 다른 인자인 암모니아는 젖산의 생성을 유발하고 글리코겐의 빠른 저하를 가져와 근육의 피로를 유발시킨다고 알려져 있다.", "본 연구에서 혈중 암모니아 농도는 매실 투여 전이 매실 투여 후보다 유의하게 높게 나타났다.", "이는 매실 투여 전이 매실 투여 후에 비해 근육 세포막의 표면에 작용하는 전기적 자극을 변화시켜 근육의 장력 발생을 저하시키며, 그 결과 해당 작용에 있어서 주요 효소인Phosphofructokinase (PFK)의 활동을 자극하고 citric acid cycle과 gluconeogenesis를 저해하여 mitochondria 산화를 제한한 것이라 할 수 있다.", "이로 인해 젖산의 축적을 가중시키고 근육에 저장되어 있는 글리코겐 고갈을 가속화시켰고, ATP 재생성을 손상시켜 AMP 축적을 가져와 암모니아 생성을 일으켰으며, 그 결과 피로 유발과 관련이 있는 산성화가 시작될 가능성을 제공했다고 본다.", "반면 매실이 인체의 산성화를 억제함으로써 \\( \\mathrm{pH} \\) 감소의 시작을 더디게 하여 속근 섬유의 동원 비율보다 지근 섬유가 운동에 관여하게 되어 암모니아의 적은 축적을 가져온 것 같으며, 결과적으로 혈중 젖산 농도의 적은 생성을 가져온 것이라 생각된다.", "</p><p>무기인산은 힘의 소멸과 연관이 있다고 알려져 있으며, 힘 발현은 무기인산의 농도와 밀접한 연관이 있다.", "초기의 피로 관련 연구가 근육 피로의 원인을 산성화에 초점을 맞추었지만, 최근의 연구들은 세포내 무기인산(\\(\\mathrm{Pi}\\)) 축적이 피로를 이끈다는 것에 주의를 기울이고 있다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구 대상</h2><p>본 연구는 남자 대학생 15명을 대상으로 하였으며, 연구 대상자의 신체적 특성은 Table 1에 나타나 있다.", "</p><h2>실험 절차</h2><p>본 실험의 절차는 Table 2와 같다.", "</p><h2>매실 추출물 및 위약 투여방법</h2><p>투여 전 테스트가 끝난 후, 매실 투여군은 매실추출물을, 위약 투여군은 위약을 6주간 일일 2회 섭취하였다.", "매실 구성성분은 Table 3과 같다.", "</p><h2>최대산소섭취량 \\( 75 \\% \\) 산정 및 테스트</h2><p>최대산소섭취량 (\\(\\mathrm{VO}_{2}\\)max) 은 가스분석기 (Monographic사, USA, CPXsystem) 을 이용하여, breath by breath 방식으로 측정하였으며, Bruce protocol을 채택하여 트레드밀 (Quinto사, USA, Q65) 에서 실시하였다. \\", "(75 \\%\\) \\(\\mathrm{VO}_{2}\\)max 테스트를 위하여 테스트 전 각 피험자들의 \\(\\mathrm{VO}_{2}\\)max를 바탕으로 그에 따른 최대산소섭취량의 \\(75 \\%\\) (\\(75 \\% \\) \\(\\mathrm{VO}_{2}\\)max)를 산정하였다.", "6주간의 매실추출물과 위약 섭취 전과 섭취 후 모두, Bruce protocol로 운동을 시작하여 프로그램에 미리 설정된 단계별로 운동 강도가 증가되도록 하다가, 각 피험자들의 산소섭취량이 미리 산정해 놓은 (\\(\\mathrm{VO}_{2}\\)max) 수준에 도달하게 되면, 이를 유지시키기 위하여 트레드밀의 protocol을 수동으로 조절하여, 30 분간 트레드밀 달리기를 실시하였다.", "</p><h2>혈액채취 및 분석방법</h2><p>혈액 채취는 매실추출물과 위약 섭취전과 섭취 후(0주 및 6주) 에 각각 4회(안정 시, 종료 시, 회복 30분, 회복 1시간) 실시하였다.", "채취된 혈액은 2,500~3,000 \\(\\mathrm{rpm} \\) 에서 15~20분간 원심분리하여, 상층액을 얻어 혈중 피로요소(젖산, 암모니아,무기인산)과 에너지 기질(글루코스, 유리지방산)을 분석하는데 사용하였다.", "혈중 젖산, 암모니아, 무기인산은 건식 생화학분석기(Kodak사, USA, EKTACHEM DT60 Ⅱ)를 사용하여 분석하였고, 글루코스는 면역분석기(Bayer사 USA, ADVIA 1650)를 이용하여 enzymatic 검사법을 사용하였다.", "그리고 유리지방산은 자동생화학 분석기(Hitachi사, Japan, Hitachi 7150)를 이용하여 분석하였다.", "</p><h2>자료 처리</h2><p>본 연구에서 얻은 자료는 SPSS 통계 package (v. 12.0)를 이용하여 기술통계량을 산출하였다.", "혈중 피로요인 및 에너지 기질 변화 형태 비교는 투여조건과 시기를 독립변인으로 하는 2(투여조건; 매실투여전, 매실투여후) \\( \\times 4 \\) (시기; 안정 시, 운동종료, 회복 30분, 회복 60분) 요인설계하에 이루어졌으며, 투여조건과 시기를 반복 측정하는 이원 분산분석법(two-way ANOVA)을 이용하여 분석하였다.", "모든 분석에서 유의한 차이를 보인 부분은 사후검증(Scheffe)을 실시하였으며, 유의수준은 0.05로 설정하였다.", "</p> <h1>결 과</h1><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 젖산 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과와 투여조건의 주효과에서는 유의한 차이가 나타나지 않았지만, 시기 \\( [F(3,42)=133.780, p=0.000] \\)의 주 효과는 유의하게 나타났다.", "시기의 사후검증 결과, 운동종료 시 \\( (M=6.843)\\) 가 안정 시 \\((M=1.176) \\), 회복30분 \\( (M=2.210) \\), 회복60분\\( (M=1.216) \\) 보다 유의하게 높게 나타났으며 \\( (p=0.000) \\), 또한 회복 30분 \\( (M=2.210) \\)이 회복 60분 \\( (M=1.216) \\) 보다 유의하게 높게 나타났다 \\", "( (p=0.000) \\).", "매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료, 회복 30분, 회복 60분 각각 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \\( 2.03 \\%\\), \\(5.57 \\% \\), \\( 5.95 \\% \\) 적은 수치를 보여 매실 투여가 피로회복에 긍정적인 영향을 미침을 보였다.", "</p><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 암모니아 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과가 유의하게 나타났다 \\", "( [F(3,36)=3.387, p< \\)\\( 0.05] \\).", "이에 대한 사후검증으로 매실 투여 조건에 대한 시기별 차이 분석을 위해 일원 변량분석을 실시하였다.", "매실 투여 전, 운동 종료시가 가장 높은 수치를 나타냈으며, 안정 시, 회복 30분, 회복 60분 보다 유의하게 높게 나타났다 \\", "( (p=0.000) \\).", "매실 투여 후에도 운동 종료시점이 가장 높은 수치를 나타냈으며, 안정시, 회복 30분, 회복 60분 보다 유의하게 높게 나타났다\\", "( (p=0.000) \\).", "매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료, 회복 30분, 회복 60분 각각 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \\(15.69 \\%\\), \\(17.23 \\%\\), \\(19.62 \\% \\) 적은 수치를 보여 매실 투여가 피로회복에 긍정적인 영향을 미침을 보였다.", "또한, 투여조건 \\( [F(1,12)=21.844, p<0.01] \\) 과 시기 \\( [F(3,36)=178.256, p=0.000] \\)의 주 효과도 유의하게 나타났다.", "투여조건의 사후검증 결과, 매실 투여 전 \\( (M=67.73) \\) 이 매실 투여 후 \\( (M=55.70) \\) 보다 유의하게 높았으며 \\( (p<0.01) \\), 시기의 경우, 운동 종료 시 \\( (M=104.31) \\)가 안정 시 \\( (M=48.08) \\), 회복 30분 \\( (M=48.35) \\), 회복 60분 \\( (M=46.12) \\) 보다 유의하게 높게 나타났다\\", "( (p=0.000) \\).", "</p><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 무기인산 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과와 투여조건의 주효과에서는 유의한 차이가 나타나지 않았지만, 시기 \\( [F(3,30)=73.248, p=0.000] \\)의 주효과는 유의하게 나타났다.", "시기의 사후검증 결과, 운동 종료 시\\( (M=5.068) \\)가 안정 시 \\( (M=3.714) \\), 회복 30분 \\( (M=8.905) \\), 회복 60분 \\( (M=3.627) \\) 보다 유의하게 높게 나타났으며 \\( (p=0.000) \\), 또한 회복 30분 \\( (M=3.905) \\) 이 회복 60분 \\( (M=3.627) \\) 보다 유의하게 높게 나타났다 \\", "( (p=0.000) \\).", "매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료, 회복 30분, 회복 60분 각각, 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \\( 3.35 \\% \\), \\( 3.88 \\%\\), \\(4.89 \\% \\) 적은 수치를 보여 매실 투여가 피로회복에 긍정적인 영향을 미침을 보였다.", "</p><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 글루코스 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과, 투여조건과 시기의 주효과에서 유의한 차이가 나타나지 않았다.", "</p><p>매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료, 회복 30분, 회복 60분 각각 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \\( 2.54 \\%\\), \\(0.6 \\%\\), \\( 3.11 \\% \\) 적은 수치를 보였다.", "</p><p>매실 투여 조건 간, 시기 간 혈장 FFA 농도 변화를 위해 이원변량분석을 실시하였고, 그 결과 매실 투여 조건과 시기의 상호작용효과와 투여조건의 주효과에서는 유의한 차이가 나타나지 않았지만, 시기 \\( [F(3,36)=14.9444, p=0.000] \\)의 주효과는 유의하게 나타났다.", "시기의 사후검증 결과, 안정 시\\( (M=236.192) \\)가 회복30분 \\( (M=501.154) \\)과 회복60분 \\( (M=496.077) \\)보다 유의하게 낮게 나타났으며( \\( (p<0.01) \\), 운동 종료 시\\( (M=390.769) \\)가 안정 시 \\( (M=236.192) \\) 와 회복 30분 \\( (M=501.154) \\)보다 유의하게 높게 나타났다 \\", "( (p<0.01) \\).", "매실 투여 전과 매실 투여 후를 비교하면, 유의한 차는 나타나지 않았지만 운동 종료 시 매실 투여 후가 매실 투여 전에 비해 \\(33.78\\%\\) 높은 수치를 보임으로 운동수행 증진을 위한 에너지 기질인 유리지방산에 긍정적인 영향을 미침을 보였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "The Effect of Prunus Mume Supplementation on Energy Substrate Levels and Fatigue Induction Factors", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a51c7570-7d35-4422-a0a4-24f84413b4a6", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", "doc_author": [ "Il-Young Paik", "Woe-Ryong Chang", "Yi-Sub Kwak", "Su-Youn Cho", "Hwa-Eun Jin" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,313	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>우수항균미생물 TBM 912의 선발동정</h2><p>강원도 일원에서 분리된 균주 중에서 항균활성이 시판중인 A사의 균주보다 우수한 균주로서 TBM 912임을 확인하여 이하의 실험에 선발하여 사용하였다. 이들의 항균활성을 A사 제품과 비교한 결과 잔디 및 식물병원균인 Rhizoctonia solani 와 Botrytis cinerea에 대하여 다소 우수한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었고(unpublished data), Fig. 1, 2에서와 같이 상당한 항균활성을 나타내어 우수균주로 선발하였다. 선발된 균주의 생리 ◦ 생화학적 특성을 조사한 결과를 Table 1에 나타내었으며, 이들의 그람양성, endospore 형성, catalase 양성 등의 성질에 기초하여 Bergey's manual에 따라 xmr성을 비교해 본 결과, 균주는 Bacillus 속인 것으로 추정되었다. 보다 정확한 동정을 위하여, 균주에서 염색체 DNA를 분리하여 PCR 방법으로 primer (5'-GAGTT TGATC CTG GC TC AG -3'[position 9 to 27 E.coli 165 rRNA]과 primer (5'-AGAA A GGAGG TGAT CAGCC-3'[position 1542 to 1525 E.coli \( 16 \mathrm{~S} \) rRNA])를 사용하여 16S 리보좀 DNA를 증폭시켰다. 그 결과 약 \( 1.5 \mathrm{~kb} \) 의 단편을 얻었으며 아가로스 전기영동으로 확인하였다. 이 단편을 pGEM-T easy 벡터에 서브클로닝하여, 5'-및 3'-말단의 부분적인 염기서열을 결정하였으며, data bank를 이용하여 상동성을 조사한 결과, 알려진 16S 리보좀DNA와 TBM 912 균주는 Bacillus subtilis와 \( 99 \% \) 의 상동성을 보였다. 따라서 분리 균주를 Bacillus subtilis 로 동정하였다.</p><h2>항균미생물 TBM 912의 세포벽 분해관련 효소의 분비</h2><p>분리균주의 길항작용 기작을 밝히기 위하여 항균미생물 TBM 912가 분비하는 세포벽 분해관련 효소의 생성유무가 육안으로 관찰되는 한천확산법 (agar diffusion method)으로 pectinase, cellulase, CMCase, xylanase, chitinase 및 protease 활성 유무를 확인한 결과, 분리균주 TBM 912 균주에서는 protease, CMCase, pectinase를 분비하였으며, 그 결과 중 pectinase 분비 결과만 Fig 4에 나타내었다. 이 결과에서 세포와 효소는 다수 분비됨이 확인되었으나 식물병원균 세포벽 분해관련 핵심적인 회소인 chitinase 등은 분비되지 않았다. 이 사실에서 분비 효소는 항균효과를 나타내는 주요인자는 아닌 것으로 판단된다.</p><h2>항균미생물 TBM 912의 항균물질</h2><p>산침전을 통해 methanol 추출에서 \( 530 \mathrm{mg} \)의 물질을 얻었다. 다시 알칼리성 물 \( 60 \mathrm{~m} / \)에 완전히 녹였고, Bradford 법으로 단백질량을 측정한 결과 \( 197 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이였다. \( 60 ~\mathrm{ml} \)에 총 단백질성 물질은 \( 12 \mathrm{~mg} \)정도이다. 이들 정제 물질의 항균활성도 다시 조사하였다. 또한 TLC로 전개하여 발색시약(\(2\% \) ninhydrin in acetone)으로 발색 후 heating하였고, 발색시약 (ethanaol: sulfuric acd : \(5\% \) phenol (70:20:10))으로 발색 후 heating하여 물질을 확인하였다. Peptide 발색에서 1개가 Rf : 0.28, lipid 발색에서 7개가 Rf : 0.93,0.68,0.37,0.28 .0 .23, 0.20,0.18에서 관찰되었다. 이 중에서 Rf 가 0.28인 spot이 동시에 발색되었으며 이것은 lipopepetide로서 항균활성을 나타내는 균주의 항균활성의 주체로 판단된다. 한편 SDS-PAGE 법으로 대포적인 lipopeptide인 surfactin과 iturin을 시료와 동시에 흘려 비교한 결과, 사용 분리균주는 surfactin과 iturin을 동시에 생산하는 균주로 확인되었으며, surfactin을 iturin 보다 많이 생산함을 알 수 있었다. TLC에서 iturin이 극히 소량이므로 관찰되지 않았으며 SDS-PAGE 상에서도 신경을 써야 관찰할 수 있는 정도였다. 또한 이 분획을 HPLC를 이용, acetonitrile/water (60 : 40) 의 이동상으로 surfactin 표준물질과 비교, 분석한 결과를 Fig. 7에 나타내었다. 이로써 Bacillus sp. TBM 912가 생산하는 대표적인 항균물질의 주체가 surfactin계 물질로 추정되었다.</p><p>본 실험에 사용된 분리균주는 농업, 의학 및 공업의 다양한 영역에서 활용될 가능성이 높은 균주로서 지속적으로 그 가능성을 다양한 분야에서 검증하여 나갈 필요성이 있을 것으로 판단된다. 마지막으로 본 분리균주는 안정성 검사에서 정상적인 식물의 활동에는 영향이 전혀 없었고 익충(누에)에도 영향이 없다는 것이 검증되어 미생물농약소재로 사용될 수 있음이 확인되었다(unpublished data). 토착미생물을 여러 가지 용도로 개발함은 국가 기술의 핵심적인 요소로 특히 토착미생물을 농업적으로 활용함으로서 변화하는 소비자의 기호에 부응하고 나아가 수출을 위한 안전농산물생산으로 외화획득에도 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.</p> <h1>실험 및 방법</h1><h2>항균활성 우수 미생물의 분리</h2><p>각종 토양으로부터 부식토를 채취하여 먼저 집적배양하였으며, 희석평판법으로 각종배지에 도말하여 생성된 콜로니를 1차 선별하였다. 이들을 대상으로 식물병원성 진균의 생육을 저해하는 효과에 기초하여 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 단일 콜로니가 생성되도록 수차례 계대배양을 실시하여, 잔디 및 식물 병원성 진균류인 Rhizoctonia solani AG2-2 와 Botrytis cineria에 대한 항진균 활성이 뛰어난 미생물을 분리하였다.</p><h2>분리 균주의 동정 및 특성 조사</h2><p>균주 동정을 위해 분리균주의 생리생화학적 성질을 상법에 의거 조사하였으며, 또한 배양온도 및 배양배지의 초기 \( \mathrm{pH} \) 차이에 따른 균주의 생육 특성을 조사하였다.</p><h2>16S 리보좀DNA 염기 서열 결정</h2><p>보다 정확한 균주동정을 위하여, 각 균주에서 염색체 DNA를 분리하여 primer 1 (5'-GAGTT TGATC CTGGC TCAG-3' [position 9 to 27 E.coli 16S rRNA]과 pri- mer 2 (5'-AGAAA GGAGG TGAT CAGCC-3'[position 1542 to 1525 E.coli 16S rRNA])를 사용하여 PCR 방법으로 16S 리보좀 DNA를 증폭시켜 염기서열을 결정하였다. 이들의 상동성과 진화학적 거리에 기초하여 균주를 동정하였다.</p><h2>항균할성 균주의 세포벽 분해관련 효소 분비 조사</h2><p>길항균의 길항기작 중의 하나는 병원성 진균의 세포벽을 이루고있는 물질의 분해나 생성 저해를 통하여 일어난다는 기작이 알려져 있다. 따라서 분리된 균주의 길항작용 기작을 밝히기 위한 기초 실험으로 세포벽 분해관련 효소의 생성유무가 육안으로 관찰되는 한천확산법(agar diffusion method)으로 pectinase, cellulase, CMCase, xylanase, chitin-ase 및 protease 활성 유무를 확인하였다.</p><h2>항균물질의 분리 및 활성확인</h2><p>분리균주의 배양액을 원심분리한 배양여액에 \( \mathrm{pH}~2.0 \)이 될 때까지 농염산을 가하였다. 이 반응액을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수시간 반응시켜 침전시킨 후, 원심분리하였다. 생성된 참 전물을 10배의 methanol로 진탕하여 추출한 뒤, 감압 농축하여 암갈색의 조추출물을 얻었다. 건조된 조추출물은 녹여서 병원균의 길항능력을 확인하기 위한 inhibition zone 시험에 사용하였다. 추출된 항균물질의 병원균 생육저해 활성을 disc 활성 inhi-bition zone으로 조사하였다. 이후 분리된 조추출물을 소량의 methanol에 녹여 silica gel column을 사용하여 methanol로서 용출시켜서 \( 4 \mathrm{ml} \)의 분획을 분취하였으며, 받은 각 분획의 활성을 측정하였다. 그리고 Thin layer chromatography (TLC)에 의하여 chloroform/methanol/water (65: 25: 4)의 전개용매를 사용하여 분리, UV 존재하에서 관찰하였고, nin-hydrin 염색액과 지질 발색 시야으로 발색조사하였으며, 대표적인 lipopeptide인 surfactin (Sigma, Co.)을 High Perfor-mance Liquid Chromatography (HPLC), SDS-PAGE로 동시에 흘려 항균물질을 결정하였다. HPLC를 통한 surfactin분석에는 Hypersil BDS C18 역상칼럼이 이용되었고, acetonitrile/ water의 적정비율 (60: 40)을 이동상으로 분당 \( 0.5~ \mathrm{ml} \) 의 flow rate 조건에서 수행되었다.</p> <p>미생물이 생산하는 항생물실은 의약품, 식품 및 농업용 등으로 널리 사용되고 있으며, 의약품으로는 항세균제, 항진균제, 항바이러스제 및 항종양제로서 다양한 물질이 탐색되어 실제로 사용되고 있다. 많은 항생물질 중 lipopeptide계 항생물질은 의약품으로서의 용도외에 화학계면활성제에 비교하여 생분해력을 가지면서도 저독성인 특징이 있고, 극한의 온도나 \( \mathrm{pH} \) 에서도 안정성을 가지므로 토양과 수질 오염원의 생물학적 정화에 이용가능하다. 또한 다양한 식물병원성 미생물에 대하여 효과가 있으므로 생물학적 병해방제에도 유용하며, 식품, 사료첨가제 및 화장품 등으로도 산업적으로 다양하게 사용될 수 있다. 그래서 lipopeptide계 항생물질을 산업적으로 활용하기 위한 방안은 다양한 측면에서 연구되고 있다.</p><p>그 중에서 산업적으로 부가가치가 높은 분야는 미생물농약 개발 분야로서 먼저 미생물이 생산하는 물질의 항균작용을 검증하여 각종 식물병원성 진균에 적용하는 것이다. 화학적 농약보다는 환경에 대하여 친화적으로 화학농약을 대체할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 둘째는 날로 증가되고 있는 유류오염과 각종 화학물질(PAH 등) 오염으로부터 토양과 수질을 보호하기 위한 분야로서 lipopeptide계 물질을 사용하면 처리효율을 높을 수 있는 등 많은 이점이 있으므로 오염된 한경을 정화하는 생물학적 환경처리기술에의 이용이다. 이러한 과정을 통하여 일부 안전성면에서 인체에 무해한 물질은 임상적인 검증을 통하여 의약품으로 개발되고 있다. 현재 lipopeptide계 물질로 많은 물질이 분리, 연구되어 알려져 있으나 다양한 토착미생물이 생산하는 신기능 및 고기능성 물질의 분리 및 대량생산 체제에 대한 연구는 미홉하므로 경제성이 있는 제품의 산업적인 생산을 위하여 많은 투자와 연구개발이 절실히 요구되고 있다. 최근에는 생명공학적 기법을 이용하여 lipopeptide계 물질 생산관련 유전자의 해석이 이루어지고 있으나 관련 유전자의 도입에 의한 형질전환균의 개발수준은 초기 단계에 불과하다. 따라서 생명공학 기법을 이용하여 기능성이 뛰어나면서 효율적으로 lipopeptide계 물질을 생산할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.</p><p>본 실험에서는 항균, 항바이러스 등 여러 측면에서 유용하며, 폐수정화 및 난분해성 물질의 정화능을 가지는 lipope-ptide계 물질을 생산하는 미생물을 잔디병해를 일으키는 식물병원균 저해능을 marker로 하여 토양으로부터 분리, 탐색하였으며, 항균물질을 분리, 그 성질을 보고하고자 한다.</p>	생명과학	[ "<h1>결과 및 고찰</h1><h2>우수항균미생물 TBM 912의 선발동정</h2><p>강원도 일원에서 분리된 균주 중에서 항균활성이 시판중인 A사의 균주보다 우수한 균주로서 TBM 912임을 확인하여 이하의 실험에 선발하여 사용하였다.", "이들의 항균활성을 A사 제품과 비교한 결과 잔디 및 식물병원균인 Rhizoctonia solani 와 Botrytis cinerea에 대하여 다소 우수한 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었고(unpublished data), Fig.", "1, 2에서와 같이 상당한 항균활성을 나타내어 우수균주로 선발하였다.", "선발된 균주의 생리 ◦ 생화학적 특성을 조사한 결과를 Table 1에 나타내었으며, 이들의 그람양성, endospore 형성, catalase 양성 등의 성질에 기초하여 Bergey's manual에 따라 xmr성을 비교해 본 결과, 균주는 Bacillus 속인 것으로 추정되었다.", "보다 정확한 동정을 위하여, 균주에서 염색체 DNA를 분리하여 PCR 방법으로 primer (5'-GAGTT TGATC CTG GC TC AG -3'[position 9 to 27 E.coli 165 rRNA]과 primer (5'-AGAA A GGAGG TGAT CAGCC-3'[position 1542 to 1525 E.coli \\( 16 \\mathrm{~S} \\) rRNA])를 사용하여 16S 리보좀 DNA를 증폭시켰다.", "그 결과 약 \\( 1.5 \\mathrm{~kb} \\) 의 단편을 얻었으며 아가로스 전기영동으로 확인하였다.", "이 단편을 pGEM-T easy 벡터에 서브클로닝하여, 5'-및 3'-말단의 부분적인 염기서열을 결정하였으며, data bank를 이용하여 상동성을 조사한 결과, 알려진 16S 리보좀DNA와 TBM 912 균주는 Bacillus subtilis와 \\( 99 \\% \\) 의 상동성을 보였다.", "따라서 분리 균주를 Bacillus subtilis 로 동정하였다.", "</p><h2>항균미생물 TBM 912의 세포벽 분해관련 효소의 분비</h2><p>분리균주의 길항작용 기작을 밝히기 위하여 항균미생물 TBM 912가 분비하는 세포벽 분해관련 효소의 생성유무가 육안으로 관찰되는 한천확산법 (agar diffusion method)으로 pectinase, cellulase, CMCase, xylanase, chitinase 및 protease 활성 유무를 확인한 결과, 분리균주 TBM 912 균주에서는 protease, CMCase, pectinase를 분비하였으며, 그 결과 중 pectinase 분비 결과만 Fig 4에 나타내었다.", "이 결과에서 세포와 효소는 다수 분비됨이 확인되었으나 식물병원균 세포벽 분해관련 핵심적인 회소인 chitinase 등은 분비되지 않았다.", "이 사실에서 분비 효소는 항균효과를 나타내는 주요인자는 아닌 것으로 판단된다.", "</p><h2>항균미생물 TBM 912의 항균물질</h2><p>산침전을 통해 methanol 추출에서 \\( 530 \\mathrm{mg} \\)의 물질을 얻었다.", "다시 알칼리성 물 \\( 60 \\mathrm{~m} / \\)에 완전히 녹였고, Bradford 법으로 단백질량을 측정한 결과 \\( 197 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)이였다. \\", "( 60 ~\\mathrm{ml} \\)에 총 단백질성 물질은 \\( 12 \\mathrm{~mg} \\)정도이다.", "이들 정제 물질의 항균활성도 다시 조사하였다.", "또한 TLC로 전개하여 발색시약(\\(2\\% \\) ninhydrin in acetone)으로 발색 후 heating하였고, 발색시약 (ethanaol: sulfuric acd : \\(5\\% \\) phenol (70:20:10))으로 발색 후 heating하여 물질을 확인하였다.", "Peptide 발색에서 1개가 Rf : 0.28, lipid 발색에서 7개가 Rf : 0.93,0.68,0.37,0.28 .0 .23, 0.20,0.18에서 관찰되었다.", "이 중에서 Rf 가 0.28인 spot이 동시에 발색되었으며 이것은 lipopepetide로서 항균활성을 나타내는 균주의 항균활성의 주체로 판단된다.", "한편 SDS-PAGE 법으로 대포적인 lipopeptide인 surfactin과 iturin을 시료와 동시에 흘려 비교한 결과, 사용 분리균주는 surfactin과 iturin을 동시에 생산하는 균주로 확인되었으며, surfactin을 iturin 보다 많이 생산함을 알 수 있었다.", "TLC에서 iturin이 극히 소량이므로 관찰되지 않았으며 SDS-PAGE 상에서도 신경을 써야 관찰할 수 있는 정도였다.", "또한 이 분획을 HPLC를 이용, acetonitrile/water (60 : 40) 의 이동상으로 surfactin 표준물질과 비교, 분석한 결과를 Fig.", "7에 나타내었다.", "이로써 Bacillus sp.", "TBM 912가 생산하는 대표적인 항균물질의 주체가 surfactin계 물질로 추정되었다.", "</p><p>본 실험에 사용된 분리균주는 농업, 의학 및 공업의 다양한 영역에서 활용될 가능성이 높은 균주로서 지속적으로 그 가능성을 다양한 분야에서 검증하여 나갈 필요성이 있을 것으로 판단된다.", "마지막으로 본 분리균주는 안정성 검사에서 정상적인 식물의 활동에는 영향이 전혀 없었고 익충(누에)에도 영향이 없다는 것이 검증되어 미생물농약소재로 사용될 수 있음이 확인되었다", "(unpublished data).", "토착미생물을 여러 가지 용도로 개발함은 국가 기술의 핵심적인 요소로 특히 토착미생물을 농업적으로 활용함으로서 변화하는 소비자의 기호에 부응하고 나아가 수출을 위한 안전농산물생산으로 외화획득에도 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.", "</p> <h1>실험 및 방법</h1><h2>항균활성 우수 미생물의 분리</h2><p>각종 토양으로부터 부식토를 채취하여 먼저 집적배양하였으며, 희석평판법으로 각종배지에 도말하여 생성된 콜로니를 1차 선별하였다.", "이들을 대상으로 식물병원성 진균의 생육을 저해하는 효과에 기초하여 균주를 선발하였다.", "선발된 균주는 단일 콜로니가 생성되도록 수차례 계대배양을 실시하여, 잔디 및 식물 병원성 진균류인 Rhizoctonia solani AG2-2 와 Botrytis cineria에 대한 항진균 활성이 뛰어난 미생물을 분리하였다.", "</p><h2>분리 균주의 동정 및 특성 조사</h2><p>균주 동정을 위해 분리균주의 생리생화학적 성질을 상법에 의거 조사하였으며, 또한 배양온도 및 배양배지의 초기 \\( \\mathrm{pH} \\) 차이에 따른 균주의 생육 특성을 조사하였다.", "</p><h2>16S 리보좀DNA 염기 서열 결정</h2><p>보다 정확한 균주동정을 위하여, 각 균주에서 염색체 DNA를 분리하여 primer 1 (5'-GAGTT TGATC CTGGC TCAG-3' [position 9 to 27 E.coli 16S rRNA]과 pri- mer 2 (5'-AGAAA GGAGG TGAT CAGCC-3'[position 1542 to 1525 E.coli 16S rRNA])를 사용하여 PCR 방법으로 16S 리보좀 DNA를 증폭시켜 염기서열을 결정하였다.", "이들의 상동성과 진화학적 거리에 기초하여 균주를 동정하였다.", "</p><h2>항균할성 균주의 세포벽 분해관련 효소 분비 조사</h2><p>길항균의 길항기작 중의 하나는 병원성 진균의 세포벽을 이루고있는 물질의 분해나 생성 저해를 통하여 일어난다는 기작이 알려져 있다.", "따라서 분리된 균주의 길항작용 기작을 밝히기 위한 기초 실험으로 세포벽 분해관련 효소의 생성유무가 육안으로 관찰되는 한천확산법(agar diffusion method)으로 pectinase, cellulase, CMCase, xylanase, chitin-ase 및 protease 활성 유무를 확인하였다.", "</p><h2>항균물질의 분리 및 활성확인</h2><p>분리균주의 배양액을 원심분리한 배양여액에 \\( \\mathrm{pH}~2.0 \\)이 될 때까지 농염산을 가하였다.", "이 반응액을 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 수시간 반응시켜 침전시킨 후, 원심분리하였다.", "생성된 참 전물을 10배의 methanol로 진탕하여 추출한 뒤, 감압 농축하여 암갈색의 조추출물을 얻었다.", "건조된 조추출물은 녹여서 병원균의 길항능력을 확인하기 위한 inhibition zone 시험에 사용하였다.", "추출된 항균물질의 병원균 생육저해 활성을 disc 활성 inhi-bition zone으로 조사하였다.", "이후 분리된 조추출물을 소량의 methanol에 녹여 silica gel column을 사용하여 methanol로서 용출시켜서 \\( 4 \\mathrm{ml} \\)의 분획을 분취하였으며, 받은 각 분획의 활성을 측정하였다.", "그리고 Thin layer chromatography (TLC)에 의하여 chloroform/methanol/water (65: 25: 4)의 전개용매를 사용하여 분리, UV 존재하에서 관찰하였고, nin-hydrin 염색액과 지질 발색 시야으로 발색조사하였으며, 대표적인 lipopeptide인 surfactin (Sigma, Co.)을 High Perfor-mance Liquid Chromatography (HPLC), SDS-PAGE로 동시에 흘려 항균물질을 결정하였다.", "HPLC를 통한 surfactin분석에는 Hypersil BDS C18 역상칼럼이 이용되었고, acetonitrile/ water의 적정비율 (60: 40)을 이동상으로 분당 \\( 0.5~ \\mathrm{ml} \\) 의 flow rate 조건에서 수행되었다.", "</p> <p>미생물이 생산하는 항생물실은 의약품, 식품 및 농업용 등으로 널리 사용되고 있으며, 의약품으로는 항세균제, 항진균제, 항바이러스제 및 항종양제로서 다양한 물질이 탐색되어 실제로 사용되고 있다.", "많은 항생물질 중 lipopeptide계 항생물질은 의약품으로서의 용도외에 화학계면활성제에 비교하여 생분해력을 가지면서도 저독성인 특징이 있고, 극한의 온도나 \\( \\mathrm{pH} \\) 에서도 안정성을 가지므로 토양과 수질 오염원의 생물학적 정화에 이용가능하다.", "또한 다양한 식물병원성 미생물에 대하여 효과가 있으므로 생물학적 병해방제에도 유용하며, 식품, 사료첨가제 및 화장품 등으로도 산업적으로 다양하게 사용될 수 있다.", "그래서 lipopeptide계 항생물질을 산업적으로 활용하기 위한 방안은 다양한 측면에서 연구되고 있다.", "</p><p>그 중에서 산업적으로 부가가치가 높은 분야는 미생물농약 개발 분야로서 먼저 미생물이 생산하는 물질의 항균작용을 검증하여 각종 식물병원성 진균에 적용하는 것이다.", "화학적 농약보다는 환경에 대하여 친화적으로 화학농약을 대체할 수 있을 것으로 기대되고 있다.", "둘째는 날로 증가되고 있는 유류오염과 각종 화학물질(PAH 등) 오염으로부터 토양과 수질을 보호하기 위한 분야로서 lipopeptide계 물질을 사용하면 처리효율을 높을 수 있는 등 많은 이점이 있으므로 오염된 한경을 정화하는 생물학적 환경처리기술에의 이용이다.", "이러한 과정을 통하여 일부 안전성면에서 인체에 무해한 물질은 임상적인 검증을 통하여 의약품으로 개발되고 있다.", "현재 lipopeptide계 물질로 많은 물질이 분리, 연구되어 알려져 있으나 다양한 토착미생물이 생산하는 신기능 및 고기능성 물질의 분리 및 대량생산 체제에 대한 연구는 미홉하므로 경제성이 있는 제품의 산업적인 생산을 위하여 많은 투자와 연구개발이 절실히 요구되고 있다.", "최근에는 생명공학적 기법을 이용하여 lipopeptide계 물질 생산관련 유전자의 해석이 이루어지고 있으나 관련 유전자의 도입에 의한 형질전환균의 개발수준은 초기 단계에 불과하다.", "따라서 생명공학 기법을 이용하여 기능성이 뛰어나면서 효율적으로 lipopeptide계 물질을 생산할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.", "</p><p>본 실험에서는 항균, 항바이러스 등 여러 측면에서 유용하며, 폐수정화 및 난분해성 물질의 정화능을 가지는 lipope-ptide계 물질을 생산하는 미생물을 잔디병해를 일으키는 식물병원균 저해능을 marker로 하여 토양으로부터 분리, 탐색하였으며, 항균물질을 분리, 그 성질을 보고하고자 한다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Bacillus sp. 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5,314	<h1>서 론</h1><p>한국 아동청소년 종합 실태조사 자료에 따르면, 청소년의 \( 45 \% \)가 운동 및 야외 신체활동을 거의 하지 않고, 정기적으로 운동에 참여하는 청소년은 \( 9 \% \)에 지나지 않는 것으로 나타났다. 아동 및 청소년기 비만의 문제점은 성인기의 비만으로 이어진다는데 그 심각성이 있다.</p><p>청소년기에 저체중이었던 사람이 성인기에 비만이 될 확률은 청소년기에 정상체중이었던 사람에 비해 \( 20 \% \) 정도이지만, 청소년기에 고도비만이었던 사람이 비만이 될 확률은 무 \( 160 \% \)%로써 16배나 증가한다. 이러한 성인비만은 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 지방간, 심장질환 등 각종 만성질환 위험요소가 되며 사망률 증가의 원인이 된다.</p><p>특히 아동, 청소년기 때의 비만도 성인기 비만처럼 고혈압, 고지혈증, 고혈당, 인슐린저항성, 심혈관질환과 같은 성인병발생의 위험요인이 될 수 있다고 여러 연구들은 보고하고 있다. 한국 남자 고등학생들을 대상으로 체질량지수(Body mass index: BMI)와 인슐린저항성의 관계를 분석한 결과, BMI가 \( 23 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 미만인 학생들의 인슐린저항성이 \( 2.01 \pm 1.00 \), BMI \( 2327 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 인 학생들은 \( 2.96 \pm 2.08 \), BMI 27 \( \mathrm{kg} / \mathrm{m}^{2} \) 이상인 학생들의 인슐린저항성은 \( 5.37 \pm 3.48 \) 로 비만도가 증가함에 따라 인슐린 저항성도 함께 증가하는 것으로 나타났다. 또한 체중을 감량할 경우 인슐린저항성이 감소됨으로써 인슐린감수성이 개선되는 것으로 알려지고 있다.</p><p>한편 Abel 등(2001)은 간과 근육에서 인슐린 저항성을 유도하는 지방세포로부터의 인자가 존재할 것이라 예견했고,그 후 유력한 인자로서 Retinol Binding Protein-4 (RBP-4)를 제시하였다. RBP-4는 주로 간에서 합성되고 비타민A인 레티놀과 결합하여 이를 전달하는 운반단백질(Transporter)로 알려져 있다.</p><p>2형 당뇨병 환자들을 대상으로 4주간의 규칙적인 운동을 통하여 혈청 RBP-4수치가 감소함으로써 인슐린 저항성에 효과적임을 보고하였다. 또한 허리둘레와 RBP-4와의 연관성에 관한 연구에서 혈중 RBP-4 농도가 증가할수록 허리둘레도 증가하였다고 보고함으로써, RBP-4농도의 증가는 전체 지방량 보다는 내장지방의 양이 더 큰 영향을 미칠 것으로 추정되고 있어 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.</p><p>한편, 비만과 대사증후군의 빈도가 증가함에 따라 비만과 연관된 인자들에 대한 관심이 증가하고 있음에 따라 지방조직에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 지방조직은 단순히 잉여에너지가 축적된 산물이 아니라, 아디포카인(Adipokine)이라 불리는 물질을 분비하는 중요한 내분비 조직으로 인식되고있다. 선행연구들에 의하면, 지방조직은 아디포카인을 분비하여 표적 장기에 영향을 주어 우리 몸의 항상성, 지방 및 당대사, 염증반응 등에 관여한다고 알려져 있다. 특히,아디포카인 중 아디포넥틴(adiponectin)이 가장 대표적으로 많이 알려져 있다.</p><p>지방세포에서 특이적으로 발현되는 아디포넥틴은 항당뇨병작용, 항동맥경화작용, 항염증성 효과를 가지고 있어 비만인과 당뇨병 환자의 경우 그 농도가 감소되는 것으로 알려지고 있다 또한 관상동맥질환 환자들에게서 아디포넥틴농도의 감소를 관찰할 수 있는데 이는 죽상 형성(atheromaformation)을 억제하는 효과가 있다. 따라서 아디포넥틴의 감소는 곧 동맥경화증의 발생의 주요 인자가 될 수 있다고 보고되고 있다.</p><p>성인을 대상으로 비만과 아디포넥틴의 연관성에 대한 연구는 많이 진행되어 왔으나, 성장기에 있는 소아 및 청소년 비만과 아디포넥틴의 연관성에 대한 추가적인 연구는 부족한 실정이다. 그리고 염증성 인자 중 하나인 IL-6(Interleukin-6)은 비만인 사람에게서도 농도가 증가된다. 특히 내장지방이 증가할 때 간문맥 내의 IL-6가 증가하게 되어 간에서의 중성지방 분비를 초래하여 결국 고중성지방혈증을 초래하는 것으로 보고되고 있으나, 운동에 의한 IL-6 농도의 변화에 관한 연구들은 서로 상반된 결과들을 보고하고 있다. 또한 비만으로 인해 나타날 수 있는 합병증 중 협심증이나 심근경색의 예후인자로 알려져 있는 혈중 CRP (C-ReactiveProtein)는 운동부족이나 혈관내 피세포 기능저하 등과 같은 많은 상황과 연관성이 높은 것으로 보고되고 있다. 따라서 비만은 다양한 염증성 표지자들과 밀접한 관련이 있는 것으로 사료된다.</p><p>이러한 선행연구들은 대부분 성인을 대상으로 한 연구이며,성장기에 있는 아동 및 청소년을 대상으로 한 연구는 국내외적으로 미흡한 실정이다. 따라서 성장기에 있는 비만 아동들을 대상으로 유산소 운동을 실시함으로써 신체조성의 변화와 함께 나타날 수 있는 인슐린 저항성, 혈관염증 반응인자 및 아디포넥틴의 변화와 관계를 규명할 필요가 있다.</p><p>이에 본 연구는 성장기에 있는 비만 아동을 대상으로 12주간의 중등도 유산소 운동을 실시한 후 신체구성 인자, 아디포넥틴,RBP-4, IL-6, CRP 등의 변화를 규명하여 성장기 아동 및 청소년들의 대사질환 이환율 감소를 위한 운동 효과를 검증하고, 효과적인 유산소 운동프로그램을 개발하는데 목적이 있다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상</h2><p>본 연구는 부산시에 거주하는 Y초등학교에 재학중인 11~13세의 초등학생 25명을 대상으로 실시하였다. 1998년 대한소아과학회에서 측정한 한국 소아의 표준 발육치를 참고로 하여 BMI 백분위수가 \( >95 \% \) 또는 비만도(\%) >120\%에 해당하는 비만 어린이를 대상으로 하였다. 비만도는 한국 소아의 신장별 체중 백분위의 50백분위수의 값을 표준체중으로 하여 [비만도\( (\%)=( \) 실측체중-표준체중 \( ) \times 100 \) /표준체중]으로 계산하여 비만학생을 선정하였다. 모든 연구 대상자들은 최근 6개월 이내 정기적인 운동을 하지 않은 피험자들로서 학생들과 부모에게 본 연구의 취지와 연구과정을 충분히 설명한 후 참여 동의서를 받고 운동군 13명, 대조군 12명으로 구성하여 본 연구에 참여시켰다. 대상자의 신체적 특성은 Table 1과 같다.</p><h1>재료 및 방법</h1><h2>체격 및 신체구성 측정</h2><p>본 연구의 신체구성 변인인 신장과 체중은 자동신장, 체중측정기로 \( 0.1 \mathrm{~cm} \) 단위까지 측정하고 신장과 체중을 이용하여 체질량지수를 계산하였다. 허리둘레는 줄자를 이용하여 직립자세에서 12번 늑골과 장골능선 가운데를 측정하였다. 체지방율(\%fat)은 임피던스의 원리를 이용한 체성분 분석기(Venus 5.5, Jawon medical, Korea)를 이용하여 측정하였다.</p><h2>혈압측정</h2><p>운동프로그램 실시 전과 12주 후의 최대운동부하 검사방법은 전자동 대사분석기(Quark b \( { }^{2} \) Cosmed, Italy)를 이용하여 변형된 Balke 트레드밀 프로토콜로 수행하였다. 최대운동부하 판정기준은 운동의 강도가 증가하여도 심박수가 증가하지 않고, 산소섭취량이 \( 150 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 이상 증가하지 않을 경우, 자각적 운동강도(ratings of perceived exertion, RPE)가 17 이상 그리고 호흡교환율(respiratory exchange ratio, RER)이 1.15이상 일 때로 하고 이것들 중 2개 이상을 만족할 때 최대운동부하로 판정하였다. 12주간 유산소 운동 프로그램을 위한 운동강도는 ACSM (American College of Sports Medicine,2005)의 기준을 근거로, 중강도(fast walking or jogging \( 50 \% \mathrm{HRR} \) 로 설정하고, ACSM의 대사방정식 \( \left[\mathrm{VO}_{2}=3.5+0.2\right. \) (속도)+0.9(속도)×경사도]을 이용하여 사전실험을 통해 얻은 최대산소섭취량을 기준으로 피험자들의 속도(speed)와 경사도(%grade)를 산출하였다.</p><h2>혈액분석</h2><p>혈액검사는 10시간 이상의 공복 상태를 확인한 후 오전 7시부터 상완정맥에서 혈액 \( 10 \mathrm{ml} \) 채취하여, 각각의 수집된 혈액샘플은 10분 동안 원심분리한 후 혈청을 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 에 냉동 보관하였다. 혈액 분석은 D대학병원 약리학실험실에서 직접Adiponectin, RBP-4, Insulin, IL-6를 분석하였다. 채혈 시기는 운동전과 12주 운동 후 운동의 마지막 효과를 배제하기 위해 72시간 경과한 후 동일한 조건에서 실시하였다. 혈중 포도당농도는 hexokinase법으로 자동분석기(Hichi, Japan)를 이용하여 측정하였다. 인슐린은 INC (limmuno Nucleo Cooperative,Stillwarer, USA) kit를 이용하여 방사면역측정법으로 측정하였다. 또한 Adiponectin, RBP4, IL-6는 ELISA법(AdipoGen,Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다.</p><h2>인슐린저항성 검사</h2><p>인슐린저항성은 공복혈당과 인슐린 농도를 이용하여 Homeostasis model assessment of insulin resistance(HOMA-IR)법으로 다음의 공식을 이용하여 계산하였다. HOMA-IR=[fasting insulin \( (\mathrm{uU} / \mathrm{ml}) \times \) fasting glucose \( (\mathrm{mg} / \mathrm{dl}) / 405 \)</p><h2>운동프로그램</h2><p>유산소 운동 프로그램은 12주간 주 3일 빈도로 개인별로 산출된 운동강도(속도, 경사도, %HRR)에 따라 \( 300 \mathrm{kcal} \)에 도달할 때까지 트레드밀 운동을 실시하였으며, 이 강도의 유지를 위하여 심박수 측정기(X-trainer, Polar, Finland)를 이용하여 모니터링 하였다. 운동처치 6주 후에 체력이 향상됨에 따라 중간실험(최대운동부하검사)을 통하여 새로운 운동강도를 설정하였으며, 12주까지 그 강도로 트레이닝을 실시하였다. 운동강도에 따른 유산소성 트레이닝 시 생리적 반응에 미치는 영향을 고려하여 트레이닝 기간 중에 모든 피험자들의 식생활과 일상생활이 규칙적이 되도록 독려하였으며, 12주간의 트레이닝 기간 동안 탈락자를 예방하기 위하여 개인면담을 실시하고, 수시로 격려하였다. 구체적인 운동 프로그램은 Table 2에 나타난 바와 같다.</p><h2>자료처리</h2><p>본 연구의 자료처리는 SPSS 19.0을 이용하여 측정항목별평균(M)과 표준편차(SD)를 산출하고, 유산소 운동 프로그램의 실시 전과 12주 후의 차이검증은 paired t-test를 실시하였으며. 평균차 검증을 위하여 반복측정에 의한 이원변량분석(two-way ANOVA with repeated measure)을 실시하였다. 유의수준(α)은 \( p<0.05 \) 로 설정하였다.</p> <h1>결 과</h1><h2>신체지수의 변화</h2><p>유산소 운동 전과 12주 후의 신체조성의 변화는 Table 3에제시한 바와 같다. 운동군에서 유산소 운동 12주 후 체중, 체질량지수(BMI), 체지방률이 각각 유의하게 감소하였다 \( (p<0.05 , p<0.001, p<0.001)\) 체질량지수에서 (집단 \( \times \) 시기) 간에 유의한 차이가 나타났으며 \( (p<0.05) \), 체지방률에서는 집단과 (집단 \( \times \) 시기) 간의 상호작용에서 유의한 차이가 나타났다 \( (p<0.05,0<0.05) \). 수축기 혈압에서는 집단 간, 시기 간, (집단 \( \times \) 시기) 간의 상호작용에서 각각 유의한 차이가 나타났으며 \( (p \times 0.05, p \times 0.01 \), \( p \times 0.05) \), 이완기 혈압에서는 운동군에서 유의하게 감소하였다 \( (p<0.05) \).</p><h2>공복혈당, 인슐린, 인슐린 저항성의 변화</h2><p>유산소 운동 전과 12주 후의 공복시 혈당, 인슐린, 인슐린저항성의 변화는 Table 4에 제시한 바와 같다. 유산소 운동 12주 전과 후의 글루코스의 변화는 운동군에서 유의하게 감소하였고\( (p<0.001) \), (집단 \( \times \) 시기) 간의 상호작용에서 유의한 차이가 나타났다\( (p \times 0.05) \). 인슐린과 인슐린저항성은 집단 간에 통계적으로 유의한 차이가 나타났으며 \( (p<0.01, p<0.05) \), 운동군에서 각각 유의하게 감소하였다 \( (p<0.001, p< 0.001) \).</p><h2>아디포넥틴 및 혈관염증인자의 변화</h2><p>유산소 운동 전과 12주 후의 아디포넥틴과 혈관염증인자의 변화는 Table 5에 제시한 바와 같다. 아디포넥틴은 운동군에서 유의하게 증가하였고\( (p<0.001)\) , 시기 간과 (집단 \( \times \) 시기) 간의 상호작용에서 유의한 차이가 나타났다\( (p<0.001, p<0.05) \). RBP4는 집단 간에 유의한 차이가 나타났고( \( p< 0.05) \), CRP는 운동군에서 유의하게 감소하였다( \( p< 0.01) \). IL-6는 운동군에서 유의하게 감소하였고\( (p<0.001)\), 집단 간과 (집단 \( \times \) 시기) 간의 상호작용에서 각각 통계적으로 유의한 차이가 나타났다\( (p<0.05, p<0.001) \).</p> <h1>고 찰</h1><p>최근 급속하게 비만아동 인구가 증가하는 가장 중요한 원인은 현대 생활양식의 변화와 좌식생활의 증가로 인한 에너지소비량 감소 때문이다. 특히 TV시청 시간이 증가하고, 컴퓨터게임이 주된 여가시간 활동이며, 컴퓨터 및 인터넷 사용 등의 좌식생활이 일상생활 행동유형에 대부분을 차지하고 있기 때문에 현대 아동 및 청소년의 과체중과 비만 발생 위험이 증가하고 있는 것이다.</p><p>현재 비만치료 운동방법으로 유산소운동에 대한 관심이 증가되고 있고, 비만환자들에게 체중감량을 목적으로 유용하게 활용되고 있는 운동프로그램이다. 본 연구에서 12주간 중강도유산소 운동을 실시한 후 비만아동의 체중, BMI, 체지방율, 아디포넥틴, 혈관염증지표(RBP-4, IL-6, CRP), 인슐린 및 인슐린저항성 등을 분석한 결과 지금까지 보고된 대부분의 선행연구들과 일치하고 있다. Kim 등(2007)은 비만고등학생들과 정상체중인 학생들을 비교한 결과 비만 학생들에게서 혈압, 총콜레스테롤, 저밀도 지단백 콜레스테롤, CRP, 인슐린과 인슐린저항성이 현저히 높게 나타났고, Adiponectin 수치는 유의하게 낮게 나타났다. 이중에서 비만학생 일부를 선발하여 규칙적인 운동(줄넘기 운동)을 6주간(주 5회, 50분/일) 실시한 결과 체중, BMI, 중성지방, CRP, 인슐린, 인슐린 저항성이 유의하게 감소되었고, 아디포넥틴은 유의하게 증가하였다. 다른 선행연구에서도 비만학생이 13주간 복합 트레이닝으로 신체구성, 체력, 대사증후군 위험인자가 유의하게 개선되었다. 이처럼 규칙적인 운동 및 신체활동은 저밀도 지단백 콜레스테롤을 낮추고 고밀도 지단백 콜레스테롤을 높여 심혈관질환을예방하고 고혈압 및 고지혈증을 개선하며, 또한 인슐린 저항성을 낮추고, 혈당조절 능력을 향상시켜 당뇨병 위험 요인들은 예방할 수 있는 것으로 보고하고 있다. 따라서 아동과청소년기의 규칙적인 유산소 운동은 체지방률을 감소시키고,체력을 증진시키며 나아가 인슐린 저항성을 포함한 심혈관질환 위험요인을 개선시킬 수 있을 것으로 사료된다.</p><p>아디포넥틴은 혈관손상과 동맥경화를 방지하고, 인슐린 작용과 당 조절 능력을 개선시키는 것으로 잘 알려져 있다.</p><p>본 연구에서 아디포넥틴은 집단 간에는 차이가 없었지만,처치 후에는 증가 하였다. 이는 유산소 운동 처치에 따른 비만아동의 아디포넥틴 농도에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 볼 수 있다. Yang 등(2001)은 체중을 감소시킨 이후에 아디포넥틴의 증가를 보고하였으며, 중성지방과 혈청 아디포넥틴의 농도가 음의 상관관계를 보여준 Hotta 등(2000)의 연구결과와 일치하였다.</p><p>본 연구에서 비만아동의 운동처치로 아디포넥틴 농도가 증가한 것은 운동을 통한 체지방률 감소 때문인 것으로 판단된다. 즉 아디포넥틴은 지방조직에서 특이적으로 발현되며, 지방과의 음의 상관관계를 보임에 따라 지방이 축적될수록 감소하므로 운동을 통한 체지방률 감소가 중요한 매개요인으로 작용한 것으로 생각된다. 특히 인슐린 농도 및 인슐린 저항성을 나타내는 HOMA-IR 값은 아디포넥틴 농도와 반대로 다른 연구결과와 마찬가지로 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구를 통해 아디포넥틴 농도는 현재 체지방율 및 인슐린 저항성과 반비례함을 확인할 수 있었다.</p><p>아동 및 청소년기의 운동 및 신체활동은 장기적으로 성인기때의 운동이나 신체활동 습관에 영향을 주기 때문에 그 중요성이 더욱 더 강조되고 있다. 주목할 만한 Jekal 등(2009)의 연구에서 12주간의 운동참여를 통해 비만한 학생들의 체질량지수가 정상체중 수준까지 감소되지는 않았지만, 인슐린저항성, 심혈관질환 위험요인 등의 건강관련 지표는 정상수준까지 개선되었다. 결론적으로 체중은 비만하지만 정기적인 신체활동 참여를 유지한다면, 비만으로 인한 당뇨병, 심혈관질환 발병의 지연 혹은 예방을 기대할 수 있을 것이다.</p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>한국 아동청소년 종합 실태조사 자료에 따르면, 청소년의 \\( 45 \\% \\)가 운동 및 야외 신체활동을 거의 하지 않고, 정기적으로 운동에 참여하는 청소년은 \\( 9 \\% \\)에 지나지 않는 것으로 나타났다.", "아동 및 청소년기 비만의 문제점은 성인기의 비만으로 이어진다는데 그 심각성이 있다.", "</p><p>청소년기에 저체중이었던 사람이 성인기에 비만이 될 확률은 청소년기에 정상체중이었던 사람에 비해 \\( 20 \\% \\) 정도이지만, 청소년기에 고도비만이었던 사람이 비만이 될 확률은 무 \\( 160 \\% \\)%로써 16배나 증가한다.", "이러한 성인비만은 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 지방간, 심장질환 등 각종 만성질환 위험요소가 되며 사망률 증가의 원인이 된다.", "</p><p>특히 아동, 청소년기 때의 비만도 성인기 비만처럼 고혈압, 고지혈증, 고혈당, 인슐린저항성, 심혈관질환과 같은 성인병발생의 위험요인이 될 수 있다고 여러 연구들은 보고하고 있다.", "한국 남자 고등학생들을 대상으로 체질량지수(Body mass index: BMI)와 인슐린저항성의 관계를 분석한 결과, BMI가 \\( 23 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 미만인 학생들의 인슐린저항성이 \\( 2.01 \\pm 1.00 \\), BMI \\( 2327 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 인 학생들은 \\( 2.96 \\pm 2.08 \\), BMI 27 \\( \\mathrm{kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 이상인 학생들의 인슐린저항성은 \\( 5.37 \\pm 3.48 \\) 로 비만도가 증가함에 따라 인슐린 저항성도 함께 증가하는 것으로 나타났다.", "또한 체중을 감량할 경우 인슐린저항성이 감소됨으로써 인슐린감수성이 개선되는 것으로 알려지고 있다.", "</p><p>한편 Abel 등(2001)은 간과 근육에서 인슐린 저항성을 유도하는 지방세포로부터의 인자가 존재할 것이라 예견했고,그 후 유력한 인자로서 Retinol Binding Protein-4 (RBP-4)를 제시하였다.", "RBP-4는 주로 간에서 합성되고 비타민A인 레티놀과 결합하여 이를 전달하는 운반단백질(Transporter)로 알려져 있다.", "</p><p>2형 당뇨병 환자들을 대상으로 4주간의 규칙적인 운동을 통하여 혈청 RBP-4수치가 감소함으로써 인슐린 저항성에 효과적임을 보고하였다.", "또한 허리둘레와 RBP-4와의 연관성에 관한 연구에서 혈중 RBP-4 농도가 증가할수록 허리둘레도 증가하였다고 보고함으로써, RBP-4농도의 증가는 전체 지방량 보다는 내장지방의 양이 더 큰 영향을 미칠 것으로 추정되고 있어 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.", "</p><p>한편, 비만과 대사증후군의 빈도가 증가함에 따라 비만과 연관된 인자들에 대한 관심이 증가하고 있음에 따라 지방조직에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.", "지방조직은 단순히 잉여에너지가 축적된 산물이 아니라, 아디포카인(Adipokine)이라 불리는 물질을 분비하는 중요한 내분비 조직으로 인식되고있다.", "선행연구들에 의하면, 지방조직은 아디포카인을 분비하여 표적 장기에 영향을 주어 우리 몸의 항상성, 지방 및 당대사, 염증반응 등에 관여한다고 알려져 있다.", "특히,아디포카인 중 아디포넥틴(adiponectin)이 가장 대표적으로 많이 알려져 있다.", "</p><p>지방세포에서 특이적으로 발현되는 아디포넥틴은 항당뇨병작용, 항동맥경화작용, 항염증성 효과를 가지고 있어 비만인과 당뇨병 환자의 경우 그 농도가 감소되는 것으로 알려지고 있다", "또한 관상동맥질환 환자들에게서 아디포넥틴농도의 감소를 관찰할 수 있는데 이는 죽상 형성(atheromaformation)을 억제하는 효과가 있다.", "따라서 아디포넥틴의 감소는 곧 동맥경화증의 발생의 주요 인자가 될 수 있다고 보고되고 있다.", "</p><p>성인을 대상으로 비만과 아디포넥틴의 연관성에 대한 연구는 많이 진행되어 왔으나, 성장기에 있는 소아 및 청소년 비만과 아디포넥틴의 연관성에 대한 추가적인 연구는 부족한 실정이다.", "그리고 염증성 인자 중 하나인 IL-6(Interleukin-6)은 비만인 사람에게서도 농도가 증가된다.", "특히 내장지방이 증가할 때 간문맥 내의 IL-6가 증가하게 되어 간에서의 중성지방 분비를 초래하여 결국 고중성지방혈증을 초래하는 것으로 보고되고 있으나, 운동에 의한 IL-6 농도의 변화에 관한 연구들은 서로 상반된 결과들을 보고하고 있다.", "또한 비만으로 인해 나타날 수 있는 합병증 중 협심증이나 심근경색의 예후인자로 알려져 있는 혈중 CRP (C-ReactiveProtein)는 운동부족이나 혈관내 피세포 기능저하 등과 같은 많은 상황과 연관성이 높은 것으로 보고되고 있다.", "따라서 비만은 다양한 염증성 표지자들과 밀접한 관련이 있는 것으로 사료된다.", "</p><p>이러한 선행연구들은 대부분 성인을 대상으로 한 연구이며,성장기에 있는 아동 및 청소년을 대상으로 한 연구는 국내외적으로 미흡한 실정이다.", "따라서 성장기에 있는 비만 아동들을 대상으로 유산소 운동을 실시함으로써 신체조성의 변화와 함께 나타날 수 있는 인슐린 저항성, 혈관염증 반응인자 및 아디포넥틴의 변화와 관계를 규명할 필요가 있다.", "</p><p>이에 본 연구는 성장기에 있는 비만 아동을 대상으로 12주간의 중등도 유산소 운동을 실시한 후 신체구성 인자, 아디포넥틴,RBP-4, IL-6, CRP 등의 변화를 규명하여 성장기 아동 및 청소년들의 대사질환 이환율 감소를 위한 운동 효과를 검증하고, 효과적인 유산소 운동프로그램을 개발하는데 목적이 있다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상</h2><p>본 연구는 부산시에 거주하는 Y초등학교에 재학중인 11~13세의 초등학생 25명을 대상으로 실시하였다. 1998년 대한소아과학회에서 측정한 한국 소아의 표준 발육치를 참고로 하여 BMI 백분위수가 \\( >95 \\% \\) 또는 비만도(\\%) >120\\%에 해당하는 비만 어린이를 대상으로 하였다.", "비만도는 한국 소아의 신장별 체중 백분위의 50백분위수의 값을 표준체중으로 하여 [비만도\\( (\\%)=( \\) 실측체중-표준체중 \\( ) \\times 100 \\) /표준체중]으로 계산하여 비만학생을 선정하였다.", "모든 연구 대상자들은 최근 6개월 이내 정기적인 운동을 하지 않은 피험자들로서 학생들과 부모에게 본 연구의 취지와 연구과정을 충분히 설명한 후 참여 동의서를 받고 운동군 13명, 대조군 12명으로 구성하여 본 연구에 참여시켰다.", "대상자의 신체적 특성은 Table 1과 같다.", "</p><h1>재료 및 방법</h1><h2>체격 및 신체구성 측정</h2><p>본 연구의 신체구성 변인인 신장과 체중은 자동신장, 체중측정기로 \\( 0.1 \\mathrm{~cm} \\) 단위까지 측정하고 신장과 체중을 이용하여 체질량지수를 계산하였다.", "허리둘레는 줄자를 이용하여 직립자세에서 12번 늑골과 장골능선 가운데를 측정하였다.", "체지방율(\\%fat)은 임피던스의 원리를 이용한 체성분 분석기(Venus 5.5, Jawon medical, Korea)를 이용하여 측정하였다.", "</p><h2>혈압측정</h2><p>운동프로그램 실시 전과 12주 후의 최대운동부하 검사방법은 전자동 대사분석기(Quark b \\( { }^{2} \\) Cosmed, Italy)를 이용하여 변형된 Balke 트레드밀 프로토콜로 수행하였다.", "최대운동부하 판정기준은 운동의 강도가 증가하여도 심박수가 증가하지 않고, 산소섭취량이 \\( 150 \\mathrm{ml} / \\mathrm{min} \\) 이상 증가하지 않을 경우, 자각적 운동강도(ratings of perceived exertion, RPE)가 17 이상 그리고 호흡교환율(respiratory exchange ratio, RER)이 1.15이상 일 때로 하고 이것들 중 2개 이상을 만족할 때 최대운동부하로 판정하였다.", "12주간 유산소 운동 프로그램을 위한 운동강도는 ACSM (American College of Sports Medicine,2005)의 기준을 근거로, 중강도(fast walking or jogging \\( 50 \\% \\mathrm{HRR} \\) 로 설정하고, ACSM의 대사방정식 \\( \\left[\\mathrm{VO}_{2}=3.5+0.2\\right. \\) (속도)+0.9(속도)×경사도]을 이용하여 사전실험을 통해 얻은 최대산소섭취량을 기준으로 피험자들의 속도(speed)와 경사도(%grade)를 산출하였다.", "</p><h2>혈액분석</h2><p>혈액검사는 10시간 이상의 공복 상태를 확인한 후 오전 7시부터 상완정맥에서 혈액 \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 채취하여, 각각의 수집된 혈액샘플은 10분 동안 원심분리한 후 혈청을 \\( -70^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에 냉동 보관하였다.", "혈액 분석은 D대학병원 약리학실험실에서 직접Adiponectin, RBP-4, Insulin, IL-6를 분석하였다.", "채혈 시기는 운동전과 12주 운동 후 운동의 마지막 효과를 배제하기 위해 72시간 경과한 후 동일한 조건에서 실시하였다.", "혈중 포도당농도는 hexokinase법으로 자동분석기(Hichi, Japan)를 이용하여 측정하였다.", "인슐린은 INC (limmuno Nucleo Cooperative,Stillwarer, USA) kit를 이용하여 방사면역측정법으로 측정하였다.", "또한 Adiponectin, RBP4, IL-6는 ELISA법(AdipoGen,Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다.", "</p><h2>인슐린저항성 검사</h2><p>인슐린저항성은 공복혈당과 인슐린 농도를 이용하여 Homeostasis model assessment of insulin resistance(HOMA-IR)법으로 다음의 공식을 이용하여 계산하였다.", "HOMA-IR=[fasting insulin \\( (\\mathrm{uU} / \\mathrm{ml}) \\times \\) fasting glucose \\( (\\mathrm{mg} / \\mathrm{dl}) / 405 \\)</p><h2>운동프로그램</h2><p>유산소 운동 프로그램은 12주간 주 3일 빈도로 개인별로 산출된 운동강도(속도, 경사도, %HRR)에 따라 \\( 300 \\mathrm{kcal} \\)에 도달할 때까지 트레드밀 운동을 실시하였으며, 이 강도의 유지를 위하여 심박수 측정기(X-trainer, Polar, Finland)를 이용하여 모니터링 하였다.", "운동처치 6주 후에 체력이 향상됨에 따라 중간실험(최대운동부하검사)을 통하여 새로운 운동강도를 설정하였으며, 12주까지 그 강도로 트레이닝을 실시하였다.", "운동강도에 따른 유산소성 트레이닝 시 생리적 반응에 미치는 영향을 고려하여 트레이닝 기간 중에 모든 피험자들의 식생활과 일상생활이 규칙적이 되도록 독려하였으며, 12주간의 트레이닝 기간 동안 탈락자를 예방하기 위하여 개인면담을 실시하고, 수시로 격려하였다.", "구체적인 운동 프로그램은 Table 2에 나타난 바와 같다.", "</p><h2>자료처리</h2><p>본 연구의 자료처리는 SPSS 19.0을 이용하여 측정항목별평균(M)과 표준편차(SD)를 산출하고, 유산소 운동 프로그램의 실시 전과 12주 후의 차이검증은 paired t-test를 실시하였으며.", "평균차 검증을 위하여 반복측정에 의한 이원변량분석(two-way ANOVA with repeated measure)을 실시하였다.", "유의수준(α)은 \\( p<0.05 \\) 로 설정하였다.", "</p> <h1>결 과</h1><h2>신체지수의 변화</h2><p>유산소 운동 전과 12주 후의 신체조성의 변화는 Table 3에제시한 바와 같다.", "운동군에서 유산소 운동 12주 후 체중, 체질량지수(BMI), 체지방률이 각각 유의하게 감소하였다 \\", "( (p<0.05 , p<0.001, p<0.001)\\) 체질량지수에서 (집단 \\( \\times \\) 시기) 간에 유의한 차이가 나타났으며 \\( (p<0.05) \\), 체지방률에서는 집단과 (집단 \\( \\times \\) 시기) 간의 상호작용에서 유의한 차이가 나타났다 \\", "( (p<0.05,0<0.05) \\).", "수축기 혈압에서는 집단 간, 시기 간, (집단 \\( \\times \\) 시기) 간의 상호작용에서 각각 유의한 차이가 나타났으며 \\( (p \\times 0.05, p \\times 0.01 \\), \\( p \\times 0.05) \\), 이완기 혈압에서는 운동군에서 유의하게 감소하였다 \\", "( (p<0.05) \\).", "</p><h2>공복혈당, 인슐린, 인슐린 저항성의 변화</h2><p>유산소 운동 전과 12주 후의 공복시 혈당, 인슐린, 인슐린저항성의 변화는 Table 4에 제시한 바와 같다.", "유산소 운동 12주 전과 후의 글루코스의 변화는 운동군에서 유의하게 감소하였고\\( (p<0.001) \\), (집단 \\( \\times \\) 시기) 간의 상호작용에서 유의한 차이가 나타났다\\", "( (p \\times 0.05) \\).", "인슐린과 인슐린저항성은 집단 간에 통계적으로 유의한 차이가 나타났으며 \\( (p<0.01, p<0.05) \\), 운동군에서 각각 유의하게 감소하였다 \\", "( (p<0.001, p< 0.001) \\).", "</p><h2>아디포넥틴 및 혈관염증인자의 변화</h2><p>유산소 운동 전과 12주 후의 아디포넥틴과 혈관염증인자의 변화는 Table 5에 제시한 바와 같다.", "아디포넥틴은 운동군에서 유의하게 증가하였고\\( (p<0.001)\\) , 시기 간과 (집단 \\( \\times \\) 시기) 간의 상호작용에서 유의한 차이가 나타났다\\", "( (p<0.001, p<0.05) \\).", "RBP4는 집단 간에 유의한 차이가 나타났고( \\( p< 0.05) \\), CRP는 운동군에서 유의하게 감소하였다", "( \\( p< 0.01) \\).", "IL-6는 운동군에서 유의하게 감소하였고\\( (p<0.001)\\), 집단 간과 (집단 \\( \\times \\) 시기) 간의 상호작용에서 각각 통계적으로 유의한 차이가 나타났다\\", "( (p<0.05, p<0.001) \\).", "</p> <h1>고 찰</h1><p>최근 급속하게 비만아동 인구가 증가하는 가장 중요한 원인은 현대 생활양식의 변화와 좌식생활의 증가로 인한 에너지소비량 감소 때문이다.", "특히 TV시청 시간이 증가하고, 컴퓨터게임이 주된 여가시간 활동이며, 컴퓨터 및 인터넷 사용 등의 좌식생활이 일상생활 행동유형에 대부분을 차지하고 있기 때문에 현대 아동 및 청소년의 과체중과 비만 발생 위험이 증가하고 있는 것이다.", "</p><p>현재 비만치료 운동방법으로 유산소운동에 대한 관심이 증가되고 있고, 비만환자들에게 체중감량을 목적으로 유용하게 활용되고 있는 운동프로그램이다.", "본 연구에서 12주간 중강도유산소 운동을 실시한 후 비만아동의 체중, BMI, 체지방율, 아디포넥틴, 혈관염증지표(RBP-4, IL-6, CRP), 인슐린 및 인슐린저항성 등을 분석한 결과 지금까지 보고된 대부분의 선행연구들과 일치하고 있다.", "Kim 등(2007)은 비만고등학생들과 정상체중인 학생들을 비교한 결과 비만 학생들에게서 혈압, 총콜레스테롤, 저밀도 지단백 콜레스테롤, CRP, 인슐린과 인슐린저항성이 현저히 높게 나타났고, Adiponectin 수치는 유의하게 낮게 나타났다.", "이중에서 비만학생 일부를 선발하여 규칙적인 운동(줄넘기 운동)을 6주간(주 5회, 50분/일) 실시한 결과 체중, BMI, 중성지방, CRP, 인슐린, 인슐린 저항성이 유의하게 감소되었고, 아디포넥틴은 유의하게 증가하였다.", "다른 선행연구에서도 비만학생이 13주간 복합 트레이닝으로 신체구성, 체력, 대사증후군 위험인자가 유의하게 개선되었다.", "이처럼 규칙적인 운동 및 신체활동은 저밀도 지단백 콜레스테롤을 낮추고 고밀도 지단백 콜레스테롤을 높여 심혈관질환을예방하고 고혈압 및 고지혈증을 개선하며, 또한 인슐린 저항성을 낮추고, 혈당조절 능력을 향상시켜 당뇨병 위험 요인들은 예방할 수 있는 것으로 보고하고 있다.", "따라서 아동과청소년기의 규칙적인 유산소 운동은 체지방률을 감소시키고,체력을 증진시키며 나아가 인슐린 저항성을 포함한 심혈관질환 위험요인을 개선시킬 수 있을 것으로 사료된다.", "</p><p>아디포넥틴은 혈관손상과 동맥경화를 방지하고, 인슐린 작용과 당 조절 능력을 개선시키는 것으로 잘 알려져 있다.", "</p><p>본 연구에서 아디포넥틴은 집단 간에는 차이가 없었지만,처치 후에는 증가 하였다.", "이는 유산소 운동 처치에 따른 비만아동의 아디포넥틴 농도에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 볼 수 있다.", "Yang 등(2001)은 체중을 감소시킨 이후에 아디포넥틴의 증가를 보고하였으며, 중성지방과 혈청 아디포넥틴의 농도가 음의 상관관계를 보여준 Hotta 등(2000)의 연구결과와 일치하였다.", "</p><p>본 연구에서 비만아동의 운동처치로 아디포넥틴 농도가 증가한 것은 운동을 통한 체지방률 감소 때문인 것으로 판단된다.", "즉 아디포넥틴은 지방조직에서 특이적으로 발현되며, 지방과의 음의 상관관계를 보임에 따라 지방이 축적될수록 감소하므로 운동을 통한 체지방률 감소가 중요한 매개요인으로 작용한 것으로 생각된다.", "특히 인슐린 농도 및 인슐린 저항성을 나타내는 HOMA-IR 값은 아디포넥틴 농도와 반대로 다른 연구결과와 마찬가지로 유의하게 감소하는 것으로 나타났다.", "따라서 본 연구를 통해 아디포넥틴 농도는 현재 체지방율 및 인슐린 저항성과 반비례함을 확인할 수 있었다.", "</p><p>아동 및 청소년기의 운동 및 신체활동은 장기적으로 성인기때의 운동이나 신체활동 습관에 영향을 주기 때문에 그 중요성이 더욱 더 강조되고 있다.", "주목할 만한 Jekal 등(2009)의 연구에서 12주간의 운동참여를 통해 비만한 학생들의 체질량지수가 정상체중 수준까지 감소되지는 않았지만, 인슐린저항성, 심혈관질환 위험요인 등의 건강관련 지표는 정상수준까지 개선되었다.", "결론적으로 체중은 비만하지만 정기적인 신체활동 참여를 유지한다면, 비만으로 인한 당뇨병, 심혈관질환 발병의 지연 혹은 예방을 기대할 수 있을 것이다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "중등도 유산소 운동이 비만아동의 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5,315	<h1>재료 및 방법</h1><h2>Macelignan과 한약재(CTH) 복합물의 준비</h2><p>본 연구에 사용된 인도네시아산 Myristica fragrans Houtt(macelignan)은 연세대 생명공학과 황재관교수 연구실에서 얻었으며, 부산대학교 한의학전문대학원의 조수인교수 연구실에서 Panax ginseng C.A.Meyer (인삼), Pueraria lobata (칡), Dioscorea batatas Decaisne (마), Rehmannia glutinosa (지황) ,Amomum cadamomum Linné (백두구), Poncirus fructus (지실), Evodia officinalis (오수유)을 구입 후 각 한약재를 \(1:1:1:1:1:1:1\)의 비율로 열수 추출하여 동결건조 후 분말화한 것 (CTH, \( 15 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW)을 macelignan (\(150 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW)과 함께 DMSO에 녹여 사용하였다. 본 연구에 사용된 약용식물들의 voucher specimens는 부산대학교 한의학전문대학원 본초학 연교실에 보관하였다.</p><h2>실험동물 및 사육</h2><p>28마리의 5주령 수컷 C57BL/KsJ-db/db (db/db) 마우스를 (주)오리엔트바이오를 통해 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다. db/db 마우스는 2주간 고형식이로 적응시킨 후, 당뇨실험군으로 하여 난괴법에 의해 당뇨대조군(db/db-control), roiglitazone군(db/db-rosi), macelignan군(db/db-Mace), macelignan+CTH군(db/db-Mace+CTH)으로 나누어 3 주간 사육하였다. 사육 기간에는 식이와 물을 자유롭게 먹도록 하였으며 KGLP (비임상시험관리기준)에 근거하여 동물사육실의 환경은 항온 \( \left(20 \pm 2^{\circ} \mathrm{C}\right) \), 항습\( (50 \pm 4 \%) \), 12 시간 간격(08:00-20:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하고 동물들은 polycarbonate cage에 한 마리씩 분리하여 사육하였다. 본 실험에 사용한 기본식이는 AIN-76 semi-synthetic diet 의 식이조성으로 만들어진 고형식이를 (주)중앙실험동물에서 구입하여 사육기간에 냉장 보관하여 급여하였으며, 본 연구에 사용된 rosiglitazone, macelignan과 CTH는 각각 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW, \( 15 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW, 그리고 macelignan (\( 15 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW)과 CTH (\( 150 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) BW)를 같이 섞어 3주간 경구 투여한 후에 희생하였다. 본 연구는 부산대 동물실험윤리위원회의 감독하에 진행되었다.</p><h2>시료 채취</h2><p>사육이 끝난 실험동물은 희생 전 12 시간 동안 절식시킨 후 에테르를 흡입시켜 마취시킨 다음, 복부 하대정맥(inferior vena cava)으로부터 공복혈액을 채취하였다. 실험동물의 장기 조직은 혈액채취 후 즉시 적출하여 PBS (phosphate buffered saline) 용액으로 수차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 칭량하였으며, 즉시 액체질소로 급냉시켜 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>공복혈당, 당화혈색소 \( (\mathrm{HbA1c}) \) 측정 및 혈장 분석</h2><p>실험기간에 6 일마다 1 회 12 시간 공복시킨 후에 그 혈당을 실험 동물의 꼬리를 자른 후 얻은 정맥혈을 이용하여 측정하였다. 이때, Glucometer (GlucoDr, Allmedicus, Anyang, Gyeonggi-do, Korea) 를 사용하였다. 당화혈색소( \( \mathrm{HbA1c}) \) 의 경우 희생 후 전혈을 이용하여 MicroMatTM II Hemoglobin \( \mathrm{A}_{1 c} \) Tes (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 측정하였다. 희생 후 전혈을 \( 4^{\circ} \mathrm{C}, 1,000 \times g \) 에서 15 분간 원심분리 후 혈장을 얻었으며, 분리된 혈장으로 insulin, glucagon, C-peptide (Mouse ELISA Kit, ALPCO Diagnostics, Salem, NH, USA)를 EILSA kit을 이용하여 측정하였다.</p><p>이 밖에도 혈장으로부터 total cholesterol, HDL-cholester-ol, triglyceride 함량을 아산제약(주)의 kit로 측정하였으며, free fatty acids 농도는 Wako Chemicals USA Inc. (Richmond, VA, USA)로부터 kit를 구입하여 측정하였다.</p><h2>내당능(intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT)) 검사 및 인슐린 민감도(intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT) 측정</h2><p>실험기간 중 희생 전에 실험동물을 대상으로 내당능 및 인슐린 민감도 검사를 실시하였다. 먼저, 내당능 검사는 실험동물을 12 시간 공복시킨 후 glucose \( (0.5 \mathrm{~g} / \mathrm{kg} \) BW)를 복강주사하고 0,30,60,120분마다 실험동물의 꼬리 정맥혈을 이용하여 혈당을 측정하였다. 2일 후, 인슐린 민감도를 알아 보기 위해, 다시 12시간 공복시킨 후 insulin ( \( 2 \mathrm{unit} / \mathrm{kg} \) BW) 을 복강 주사 하여 0,30,60,90분 동안의 혈당 변화를 살펴 보았다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험결과는 SPSS package 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA, \( 11.5 \) version)을 이용하여 실험군당 평균 \( \pm \) 표준오차로 표시하였고, 각 군간 평균치의 통계적 유의성 검정은 one-way ANOVA를 실시하고 다군간의 차이는 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple test로 사후 검정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>Macelignan과 CTH 복합물 투여가 db/db 마우스의 공복 혈당 및 당화혈색소에 미치는 영향</h2><p>투여했을 때의 공복혈당 변화를 Fig. 1에 나타내었다. 실험 전 난괴법에 의해 정해진 각 군별 평균 혈당은 \( 295 \pm 25 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \) 로 확실하게 당뇨가 발병된 상태였으며, 실험물질 투여 첫날의 공복혈당은 각 군간에 차이가 없었으나 시간 경과에 따른 변화가 나타났다. Rosiglitazone을 경구 투여한 군의 공복혈당은 실험시작 시점과 비교해 변화가 거의 없는 것으로 나타났으며, 실험이 종료될 때까지 계속 그 상태로 유지되었다. 당뇨 대조군의 경우 실험기간 동안 계속해서 공복혈당이 상승한데 비해, macelignan 투여군과 CTH를 병용 투여한 군들은 3 주간의 투여를 통해 공복혈당이 당뇨대조군에 비해 macelignan 단독 투여군의 경 우는 약 \( 27 \% \), 그리고 CTH를 병용 투여한 군은 약 \( 35 \% \) 유의적으로 낮아져 공복혈당의 상승이 둔화된 것으로 나타났다.</p><p>Macelignan을 단독 투여군과 CTH 병용하여 투여한 군간의 공복혈당 차이를 비교하면, CTH를 maclignan과 병용 투여 한 군에서 조금 더 낮은 경향을 보였으나, 두 군간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 따라서, 실험물질인 macelignan과 CTH를 병용하여 실험동물에 적용한 결과, 제2형 당뇨병에서 고혈당을 개선시키는 효과가 유의적으로 있는 것으로 사료된다.</p><p>희생 후 전혈을 이용하여 실시한 당화혈색소(HbA1c) 측정 결과에서는 당뇨대조군에 비해 macelignan과 CTH를 병용 투여한 군이 유의적인 차이를 보이며 \( 1 \% \) 정도가 감소한 것으로 나타났다.</p><p>HbA1c는 적혈구 생존시기인 약 3개월 동안에 일어나는 당화 반응의 변화에 따른 것이므로 약 3 개월간의 혈당조절 상태를 나타내며 정상인 내지 비당뇨인은 \( 7 \% \) 이하, 당뇨병 환자의 경우 \( 10 \% \) 이상으로 나타나는 경우가 많다. 뿐만 아니라, 당뇨병 진행을 나타내는 의미있는 지표로써 HbA1c가 \( 2 \% \) 증가할 때마다 당뇨 합병증의 하나인 망막병증의 발병 위험이 2 배 정도 증가한다는 것은 이미 잘 알려진 사실이다. 또한, Tuner 등 은 The UK Prospective Diabetes Study (UKPDS)에서 HbA1c의 수치가 증가할수록 \( \beta \)-세포의 기능이 약화된다고도 보고하였다. 본 실험결과, macelignan을 단독 투여한 군에서는 당뇨대조군과 차이가 없는 것으로 나타났으며, macelignan의 단독투여보다는 CTH 와의 병용 투여하는 것이HbA1c를 개선시키는데 더 효과가 있는 것으로 보인다.</p> <h2>Macelignan과 CTH 복합물 투여가 db/db 마우스의 혈중지질에 미치는 영향</h2><p>본 연구에서는 심한 당뇨병의 경우에 glucose를 대신해 에너지원으로 사용되어 체내 포도당 이용을 억제하게 하는 혈중 free fatty acids 함량을 측정하였다. 이때, 실험물질군 모두가 당노대조군보다 유의적으로 낮게 나타났으며, 그 중에서도 rosiglitazone를 투여한 경우가 가장 낮았다.</p><p>혈중 free fatty acids 함량의 증가는 인슐린 저항성을 야기하므로 비만과 인슐린 저항성 그리고 제2형 당뇨병의 주요 연결인자이며, 본 연구결과를 통해 macelignan을 단독 투여한 경우와 CTH를 병용 투여한 경우 모두 당뇨병에서의 혈중 지질상태를 개선시키는 것으로 나타났다.</p><p>앞서 언급한 free fatty acids와 마찬가지로 당뇨병이 심화될수록 혈중 함량이 높아지는 것으로 알려진 혈중 triglyceride 함량은 본 연구에서 실험 전·후를 비교한 결과, 당뇨대조군의 경우 높게 나타난 것에 비해 macelignan 단독 투여군과 함께 CTH를 병용 투여한 군에서 모두 유의적으로 낮게 나타났다.</p><p>혈중 total cholesterol 함량은 실험 전에는 모든 군에서 차이가 없었다. 그러나 실험종료 시점인 희생 후 측정한 결과에서는 다른 변화를 보였는데, 당뇨대조군에 비해 rosiglitazone을 투여한 군에서 유의적으로 높게 나타났으며, macelignan 단독투여 및 CTH를 함께 병용 투여한 군들에서는 유의적으로 낮게 나타났다.</p><p>당뇨병에서 가장 빈번하게 관찰되는 지질대사이상은 혈중 triglyceride와 cholesterol의 증가, 그리고 HDL-cholesterol의 감소 등을 들 수 있다. 따라서 실험물질을 투여한 경우 당대사 및 지질대사를 개선시켜 실험동물의 혈중 지질농도 저하경향을 보여준 것으로 짐작되며, 특히, macelignan을 단독으로 투여한 경우보다는 CTH를 병용 투여하는 것이 보다 효과적으로 혈중 지질상태를 개선시킬 수 있을 것으로 생각된다. 혈중 HDL-cholesterol 함량은 실험종료 후 측정한 결과 군간 차이는 없었다. 그러나 항동맥경화 지수인 total cholesterol에 대한 HDL-cholesterol의 비율인 HTR은 당뇨대조군과 약물 투여군(rosiglitazone)에서는 차이가 나타나지 않은 반면, macelignan 단독 투여군과 CTH를 함께 병 용 투여한 군에서 \( 20 \% \) 이상 유의적으로 높게 나타났다. 동맥경화지수 (AI)는 rosiglitazone을 투여한 군에서 가장 높았으나, macelignan 단독 투여군과 CTH를 함께 병용 투여한 군들에서는 당뇨대조군 및 rosiglitazone을 투여한 군보다 유의적으로 낮게 나타났다.</p><p>본 연구에서는 macelignan 단독투여 및 CTH 병용 투여군 모두가 동맥경화 예방에 도움이 되는 것으로 나타났다. 이는 HTR 과 AI의 상관관계를 통해서도 확인할 수 있었다. 다만, 두 군 간의 차이는 없었다.</p><p>혈중 HDL-cholesterol의 증감은 cholesterol의 역수송을 통해 체내 cholesetrol의 조절에 중요한 역할을 하고 있으며, 최근 LDL의 산화적 변형으로부터의 보호역할 역시 그 중요성이 알려져 있다. AI를 통해 동맥경화를 비롯한 심혈관계 질환 유발의 위험을 미리 짐작할 수 있다는 점에서 macelignan의 단독 투여 또는 CTH와의 병용 투여는 당뇨병 합병증을 보다 효과적으로 개선시킬 수 있을 것으로 판단되었다.</p> <h2>Macelignan과 CTH 복합물이 db/db 마우스의 내당능 및 인슐린 민감도에 미치는 영향</h2><p>Macelignan과 CTH 복합물을 db/db 마우스에 3 주간 경구 투여한 결과 내당능 및 인슐린 민감도에 변화가 생겼으며 Fig.3A 와 Fig.3B에 나타내었다.</p><p>식후혈당 조절상태를 나타내는 내당능 검사에서 당뇨대조군의 경우 glucose를 복강 주사한 후 상승된 혈당은 주사 후 60 분이 경과되었을 때, 가장 고혈당 상태를 보였다가 감소하기 시작했다. 그러나 2시간이 경과한 시점에서도 혈중 당이 적절하게 제거되지 못해 고혈당이 계속 유지되는 현상을 보였다. 나마지 군들에서는 glucose 복강주사 후 30 분에 가장 높은 혈당치를 보인 후 서서히 감소하기 시작하여 2 시간이 경과한시점에서는 glucose 주사 전 혈당에는 미치지 못하나 당뇨대조군에 비해서는 유의적으로 낮았다. 그 중에서도 macelignan과 CTH을 병용 투여한 군의 경우에는 혈당이 상승되는 정도가 macelignan군에 비해 더 완만했으며, 이미 60분이 지난 시점에서 당뇨대조군을 비롯한 나머지 군들에 비해 유의적으로 낮은 혈당을 보여 mcelignan을 단독으로 처리했을 때보다 macelignan과 CTH의 병용 투여가 식후혈당 조절 에 더 효과적인 것으로 나타났다.</p><p>식후혈당은 섭취하는 식품의 양뿐 아니라 식품의 종류와도 관련이 있으며, 포도당으로 소화 흡수가 느릴 경우 혈당의 증가반응이 느리게 나타나고, 빠른 경우에는 혈당이 급격히 증가하여 insulin 분비도 그만큼 더 증가시킨다고 하였다. 따라서, 내당능이 유의적으로 개선되지 않으면 심혈관계 질환 등의 합병증 유발 위험성이 더 큰 것으로 보고 되어 있으므로 macelignan과 CTH의 병용 투여는 당뇨병 합병증의 유발 위험성을 효과적으로 개선시키는데 도움이 될 것으로 판단된다.</p><p>이와 함께 분비된 인슐린과 인슐린 수용체의 효과적인 작용 여부를 알 수 있는 인슐린 민감도 역시 macelignan과 CTH를 병용 투여한 경우가 당뇨대조군에 비해 유의적으로 낮은 혈당을 보임으로써, macelignan의 단독 투여보다는 상대적으로 인슐린 수용체를 통한 세포 내 유입이 더 효과적으로 일어나 체내에서 이용되고 있는 것으로 보여진다.</p><h2>Macelignan과 CTH 복합물 투여가 db/db 마우스의 당뇨병 관련지표들에 미치는 영향</h2><p>고혈당 조절 및 당뇨병의 주요 지표인자로 알려진 insulin 등을 비롯한 호르몬들과 adipokines의 혈중 함량을 측정한 결과를 다음 Table 1에 나타내었다.</p><p>혈중 insulin 농도는 rosiglitazone을 투여한 군에서 가장 높았고, 나머지 군들간에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 혈중 glucagon 농도는 macelignan을 단독으로 처리한 군에서 당뇨대조군에 비해 유의적으로 감소되는 것으로 나타났으나, macelignan과 CTH를 병용한 경우에서는 유의적인 차이를 볼 수는 없었다.</p><p>앞서, Han 등은 macelignan을 단독으로 투여했을 때 혈중 insulin 농도가 낮아졌다고 보고하였으나, 본 연구에서는 혈중 insulin 농도에서는 뚜렷한 변화가 없었고 glucagon 함량이 유의적으로 낮게 나타났다. 체내의 glycogen 합성을 촉진하고 당신생을 억제하는 insulin 과는 달리 glucagon은 glucokinase 유전자의 전사를 억제하고 glucose-6-phospha-tase (G-6-Pase) 활성 및 mRNA 발현, 그리고 PEPCK의 전사를 촉진시켜 당 신생 증가를 유도하므로 macelignan을 적용 할 경우 체내 혈당조절을 효과적으로 개선시킬 수 있을 것으로 판단되었다. 그러나 본 연구결과에 따르면 macelignan과 CTH의 병용 투여가 macelignan의 단독 투여에 비해 더 개선 된 효과를 볼 수는 없었다.</p><p>혈중 C-peptide 농도는 당뇨대조군에 비해 실험물질군에서 모두 유의적으로 높았다. C-peptide는 인슐린의 전구 물질로서 인슐린의 반감기보다 더 길며, 심한 당뇨병 환자의 경우에는 췌장의 insulin 분비능에 대해 insulin보다도 더 잘 반영하는 것으로 알려져 있다. 또한 당뇨병의 진단뿐 아니라 병형을 판별하는데도 중요한 인자이다. 본 연구결과에서는 macelignan을 단독 투여했을 때 보다 CTH와 함께 투여한 경우 비록 insulin 함량 그 자체는 개선의 변화를 볼 수 없었으나 C-peptide 함량이 유의적으로 증가된 것으로 보아 췌장의 인슐린 분비능이 개선되거나 보호된 효과가 있을 것으로 판단되며, 이를 좀 더 분명하게 이해하기 위해서는 further study가 필요할 것으로 생각된다.</p><p>혈중 leptin농도는 당뇨대조군에 비해 macelignan과 CTH를 병용한 군에서 rosiglitazone군과 함께 유의적으로 증가한 것으로 나타났으나, macelignan을 단독 투여했을 때에는 차이가 없는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라 혈중 leptin농도는 체중증가와 양의 상관관계를 가지는 것도 본 연구결과로 확인되었다.</p><p>Leptin은 일반적으로 식욕억제에 관여하면서 insulin 작용을 향상시켜 다양한 경로를 통해 혈당조절에 관여하기도 한다. Table 2에 의하면, 실험시작 전과 후의 각 군별 실험동물의 체중을 비교하였을 때, 실험이 종료된 시점에서 당뇨대</p><p>조군의 경우 시간이 경과함에 따라 당노병이 심화되면 나타나는 증상들인 다음, 다식, 다다의 증상을 보이며 오히려 체중이 감소되는 것으로 나타났다. 그러나 rosi-glitazone을 투여한 군에서는 유의적으로 체중이 증가하여 비만 상태가 유지되는 것으로 나타났다. 이에 반해, macelignan과 CTH를 함께 병용한 군에서는 체중에서 변화를 찾을 볼 수는 없었다(Table 2).</p><p>따라서, 체중의 변화 없이 혈중 leptin 함량이 증가한 것은 당뇨병 개선에 도움이 될 것으로 짐작되며, macelignan 단독으로 투여한 것보다는 CTH와 병용 투여하는 것이 더 효과가 있을 것으로 생각된다.</p><p>지방세포의 분화과정에서 그 발현량이 증가되는 adiponectin은 비만과 인슐린 저항성을 관련 지을 수 있는 독립적인 인자로 당뇨병이 발병된 동물이나 사람에게서 현저히 낮게 나타난다. 본 연구에서는 당뇨병 치료제로 널리 사용되고 있는 thizolinidione계 약물인 rosiglitazone의 경우 당뇨대조군에 비해 혈중 adiponectin 농도가 월등이 높게 나타났다. Macelignan 및 CTH와 병용하는 군들의 경우에는 증가되는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다.</p> <h1>서 론</h1><p>당뇨병은 인슐린 저항성 및 상대적인 인슐린 분비장애로 인해 고혈당이 유지되는 대사성 만성질환이며, 경제발전이 가속화되고 생활이 서구화 및 간편화되면서 급격히 증가하고 있다. 이미 2003년에는 전세계적으로 2 억 명 가까이 당뇨병으로 고통받고 있으며, 2025년에는 3억 명을 넘어 성인인구(20 세 이상 기준)의 \( 6 \% \) 이상을 차지할 것으로 예측되고 있다. 국내 역학연구를 통해 살펴 보면, 우리나라의 당뇨병 유병률은 1970년대에는 약 \( 2 \% \)였던 것이 점차 증가하여 90년대 초부터는 약 \(7\%\)에 육박하는 결과를 보였다. 뿐만 아니라 아직 당뇨병으로 진단되지 않은 환자들까지 고려한다면 실질적인 당뇨병 환자 수는 그 이상으로 생각되며 2030년대에는 \( 10 \% \) 를 넘어설 것으로 예상되고 있다, 합병증 발병이 높은 당뇨병의 특성상 의료비용, 인력손실 및 사회적 파급효과 또한 클것으로 생각된다. 성인(20-79세) 당뇨병 환자의 건강보험 총 진료비는 전체 성인 총 진료비의 약 \(20\%\) 를 차지하였고, 일인당 총 진료비는 전 국민의 성별과 연령차이를 감안하여 3.0배나 높았다고 보고되었다. 당뇨병 환자의 사망률 또한 비당뇨병 환자인 일반인에 비해 \(2.2 \sim 7.3\)배나 높음을 알 수 있었다. 이에 당뇨병을 치료하거나 그 병세를 호전시키기 위해 효능이 우수한 경구용 약물(혈당강하제)을 비롯한 치료제 개발이 활발히 진행되고 있다. 그러나 이러한 치료제들은 약물복용에 따른 부작용과 환자의 내성이 계속해서 문제가 되고 있으므로 천연물을 이용한 당뇨병 치료제의 개발은 중요한 의미가 있을 것이다.</p><p>육두구(Myristicae Semen, nutmeg)는 육두구과(Myristicae)인 육두구나무(Myristica fragrans Houttuyn)의 성숙과 껍질을 벗기고 석회유에 1일간 담근 후 말린 생약이다. 육두구에는 myristic acid와 trimyristin (myristic acid triglyceride)가 풍부하게 존재하며 지방산 원료로서 마요네즈 등의 가공식품에 이용되고 있을 뿐 아니라 향신료, 소화제로 이용되기도 한다. 우리나라는 육두구를 중국, 인도네시아, 스리랑카, 다마스카르 등에서 연간 12톤 정도 수입하고 있다.</p><p>Macelignan은 육두구의 약용성분으로 이미 보고된 바 있는 약 30여 종의 lignan 중의 하나이며, 여러 연구자들에 의해 항박테리아 및 항염증 효과, 그리고 항균 및 항산화 등의 약리작용이 보고되었다. 특히, Han 등은 macelignan이 endoplasmic reticulum (ER) stress를 감소시키고 당뇨병 치료제 개발 target중 하나인 PPAR-\(\alpha\)/ \( \gamma \)-dual agonist로서의 항당뇨 효능을 세포주 실험과 제2형 당뇨동물모델 (db/db 마우스)을 이용하여 증명하였다. 그들은 macelignan을 db/db 마우스에 적용했을 때 serum glucose를 비롯한 insulin, triglycerides, free fatty acids 등과 skeletal muscle과 liver에서는 triglyceride가 감소함을 보고하였다.</p><p>이 밖에도, 선진국으로부터 시작된 대체의료 개념이 부각되면서 대체의료 소재들에 대한 관심도 높아지고 있다. 현재 미국에서 판매되고 있는 항당뇨 의약대체소재로 Lagerstroemia speciosa (바나바), Gymmem sylvestre (김네마), Mori folium (상엽), Psidium guajava (구아바잎), Oenothera odorat a(달맞이꽃) 등이 있으며, 최근에는 이 추출물 소재들에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다. 본 연구는 이를 토대로 실제 당뇨병 개선을 위해 한방치료에서 사용하는 약용식물들 중 Panax ginseng C.A.Meyer (인삼), Pueraria lobata (칡), Dioscorea batatas Decaisne (마), Rehmannia glutinosa (지황), Amomum cadamomum Linné (백두구), Poncirus fructus (지실), Evodia officinalis (오수유)을 열수 추출하여 복합 한약제를 만들었으며, 이 복합 한약재(Chienes traditional herbs, CTH)의 효과를 높이기 위해 macelignan를 함께 사용함으로써 항당뇨 효능 역시 높이고자 하였다. 따라서, Han 등의 선행연구에서 사용한 바 있는 식욕항진으로 인한 비만, 고혈당, 인슐린 저항성, 고렙틴혈증, 고인슐린혈증 등의 제2형 당뇨병 환자와 유사한 임상적 특징을 지닌 C57BL/KsJ-db/db 마우스를 이용하여 macelignan과 복합 한약제(CTH) 열수 추출물의 첨가 후 결과를 분석 및 평가함으로써 항당뇨 효과를 살펴 보고자 하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>Macelignan과 한약재(CTH) 복합물의 준비</h2><p>본 연구에 사용된 인도네시아산 Myristica fragrans Houtt(macelignan)은 연세대 생명공학과 황재관교수 연구실에서 얻었으며, 부산대학교 한의학전문대학원의 조수인교수 연구실에서 Panax ginseng C.A.Meyer (인삼), Pueraria lobata (칡), Dioscorea batatas Decaisne (마), Rehmannia glutinosa (지황) ,Amomum cadamomum Linné (백두구), Poncirus fructus (지실), Evodia officinalis (오수유)을 구입 후 각 한약재를 \\(1:1:1:1:1:1:1\\)의 비율로 열수 추출하여 동결건조 후 분말화한 것 (CTH, \\( 15 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\) BW)을 macelignan (\\(150 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\) BW)과 함께 DMSO에 녹여 사용하였다.", "본 연구에 사용된 약용식물들의 voucher specimens는 부산대학교 한의학전문대학원 본초학 연교실에 보관하였다.", "</p><h2>실험동물 및 사육</h2><p>28마리의 5주령 수컷 C57BL/KsJ-db/db (db/db) 마우스를 (주)오리엔트바이오를 통해 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 구입하였다.", "db/db 마우스는 2주간 고형식이로 적응시킨 후, 당뇨실험군으로 하여 난괴법에 의해 당뇨대조군(db/db-control), roiglitazone군(db/db-rosi), macelignan군(db/db-Mace), macelignan+CTH군(db/db-Mace+CTH)으로 나누어 3 주간 사육하였다.", "사육 기간에는 식이와 물을 자유롭게 먹도록 하였으며 KGLP (비임상시험관리기준)에 근거하여 동물사육실의 환경은 항온 \\( \\left(20 \\pm 2^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\), 항습\\( (50 \\pm 4 \\%) \\), 12 시간 간격(08:00-20:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하고 동물들은 polycarbonate cage에 한 마리씩 분리하여 사육하였다.", "본 실험에 사용한 기본식이는 AIN-76 semi-synthetic diet 의 식이조성으로 만들어진 고형식이를 (주)중앙실험동물에서 구입하여 사육기간에 냉장 보관하여 급여하였으며, 본 연구에 사용된 rosiglitazone, macelignan과 CTH는 각각 \\( 10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\) BW, \\( 15 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\) BW, 그리고 macelignan (\\( 15 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\) BW)과 CTH (\\( 150 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\) BW)를 같이 섞어 3주간 경구 투여한 후에 희생하였다.", "본 연구는 부산대 동물실험윤리위원회의 감독하에 진행되었다.", "</p><h2>시료 채취</h2><p>사육이 끝난 실험동물은 희생 전 12 시간 동안 절식시킨 후 에테르를 흡입시켜 마취시킨 다음, 복부 하대정맥(inferior vena cava)으로부터 공복혈액을 채취하였다.", "실험동물의 장기 조직은 혈액채취 후 즉시 적출하여 PBS (phosphate buffered saline) 용액으로 수차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 칭량하였으며, 즉시 액체질소로 급냉시켜 \\( -70^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에 보관하였다.", "</p><h2>공복혈당, 당화혈색소 \\( (\\mathrm{HbA1c}) \\) 측정 및 혈장 분석</h2><p>실험기간에 6 일마다 1 회 12 시간 공복시킨 후에 그 혈당을 실험 동물의 꼬리를 자른 후 얻은 정맥혈을 이용하여 측정하였다.", "이때, Glucometer (GlucoDr, Allmedicus, Anyang, Gyeonggi-do, Korea) 를 사용하였다.", "당화혈색소( \\( \\mathrm{HbA1c}) \\) 의 경우 희생 후 전혈을 이용하여 MicroMatTM II Hemoglobin \\( \\mathrm{A}_{1 c} \\) Tes (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 측정하였다.", "희생 후 전혈을 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C}, 1,000 \\times g \\) 에서 15 분간 원심분리 후 혈장을 얻었으며, 분리된 혈장으로 insulin, glucagon, C-peptide (Mouse ELISA Kit, ALPCO Diagnostics, Salem, NH, USA)를 EILSA kit을 이용하여 측정하였다.", "</p><p>이 밖에도 혈장으로부터 total cholesterol, HDL-cholester-ol, triglyceride 함량을 아산제약(주)의 kit로 측정하였으며, free fatty acids 농도는 Wako Chemicals USA Inc.", "(Richmond, VA, USA)로부터 kit를 구입하여 측정하였다.", "</p><h2>내당능(intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT)) 검사 및 인슐린 민감도(intraperitoneal insulin tolerance test (IPITT) 측정</h2><p>실험기간 중 희생 전에 실험동물을 대상으로 내당능 및 인슐린 민감도 검사를 실시하였다.", "먼저, 내당능 검사는 실험동물을 12 시간 공복시킨 후 glucose \\( (0.5 \\mathrm{~g} / \\mathrm{kg} \\) BW)를 복강주사하고 0,30,60,120분마다 실험동물의 꼬리 정맥혈을 이용하여 혈당을 측정하였다.", "2일 후, 인슐린 민감도를 알아 보기 위해, 다시 12시간 공복시킨 후 insulin ( \\( 2 \\mathrm{unit} / \\mathrm{kg} \\) BW) 을 복강 주사 하여 0,30,60,90분 동안의 혈당 변화를 살펴 보았다.", "</p><h2>통계처리</h2><p>실험결과는 SPSS package 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA, \\( 11.5 \\) version)을 이용하여 실험군당 평균 \\( \\pm \\) 표준오차로 표시하였고, 각 군간 평균치의 통계적 유의성 검정은 one-way ANOVA를 실시하고 다군간의 차이는 \\( \\mathrm{p}<0.05 \\) 수준에서 Duncan's multiple test로 사후 검정하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>Macelignan과 CTH 복합물 투여가 db/db 마우스의 공복 혈당 및 당화혈색소에 미치는 영향</h2><p>투여했을 때의 공복혈당 변화를 Fig.", "1에 나타내었다.", "실험 전 난괴법에 의해 정해진 각 군별 평균 혈당은 \\( 295 \\pm 25 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\) 로 확실하게 당뇨가 발병된 상태였으며, 실험물질 투여 첫날의 공복혈당은 각 군간에 차이가 없었으나 시간 경과에 따른 변화가 나타났다.", "Rosiglitazone을 경구 투여한 군의 공복혈당은 실험시작 시점과 비교해 변화가 거의 없는 것으로 나타났으며, 실험이 종료될 때까지 계속 그 상태로 유지되었다.", "당뇨 대조군의 경우 실험기간 동안 계속해서 공복혈당이 상승한데 비해, macelignan 투여군과 CTH를 병용 투여한 군들은 3 주간의 투여를 통해 공복혈당이 당뇨대조군에 비해 macelignan 단독 투여군의 경 우는 약 \\( 27 \\% \\), 그리고 CTH를 병용 투여한 군은 약 \\( 35 \\% \\) 유의적으로 낮아져 공복혈당의 상승이 둔화된 것으로 나타났다.", "</p><p>Macelignan을 단독 투여군과 CTH 병용하여 투여한 군간의 공복혈당 차이를 비교하면, CTH를 maclignan과 병용 투여 한 군에서 조금 더 낮은 경향을 보였으나, 두 군간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.", "따라서, 실험물질인 macelignan과 CTH를 병용하여 실험동물에 적용한 결과, 제2형 당뇨병에서 고혈당을 개선시키는 효과가 유의적으로 있는 것으로 사료된다.", "</p><p>희생 후 전혈을 이용하여 실시한 당화혈색소(HbA1c) 측정 결과에서는 당뇨대조군에 비해 macelignan과 CTH를 병용 투여한 군이 유의적인 차이를 보이며 \\( 1 \\% \\) 정도가 감소한 것으로 나타났다.", "</p><p>HbA1c는 적혈구 생존시기인 약 3개월 동안에 일어나는 당화 반응의 변화에 따른 것이므로 약 3 개월간의 혈당조절 상태를 나타내며 정상인 내지 비당뇨인은 \\( 7 \\% \\) 이하, 당뇨병 환자의 경우 \\( 10 \\% \\) 이상으로 나타나는 경우가 많다.", "뿐만 아니라, 당뇨병 진행을 나타내는 의미있는 지표로써 HbA1c가 \\( 2 \\% \\) 증가할 때마다 당뇨 합병증의 하나인 망막병증의 발병 위험이 2 배 정도 증가한다는 것은 이미 잘 알려진 사실이다.", "또한, Tuner 등 은 The UK Prospective Diabetes Study (UKPDS)에서 HbA1c의 수치가 증가할수록 \\( \\beta \\)-세포의 기능이 약화된다고도 보고하였다.", "본 실험결과, macelignan을 단독 투여한 군에서는 당뇨대조군과 차이가 없는 것으로 나타났으며, macelignan의 단독투여보다는 CTH 와의 병용 투여하는 것이HbA1c를 개선시키는데 더 효과가 있는 것으로 보인다.", "</p> <h2>Macelignan과 CTH 복합물 투여가 db/db 마우스의 혈중지질에 미치는 영향</h2><p>본 연구에서는 심한 당뇨병의 경우에 glucose를 대신해 에너지원으로 사용되어 체내 포도당 이용을 억제하게 하는 혈중 free fatty acids 함량을 측정하였다.", "이때, 실험물질군 모두가 당노대조군보다 유의적으로 낮게 나타났으며, 그 중에서도 rosiglitazone를 투여한 경우가 가장 낮았다.", "</p><p>혈중 free fatty acids 함량의 증가는 인슐린 저항성을 야기하므로 비만과 인슐린 저항성 그리고 제2형 당뇨병의 주요 연결인자이며, 본 연구결과를 통해 macelignan을 단독 투여한 경우와 CTH를 병용 투여한 경우 모두 당뇨병에서의 혈중 지질상태를 개선시키는 것으로 나타났다.", "</p><p>앞서 언급한 free fatty acids와 마찬가지로 당뇨병이 심화될수록 혈중 함량이 높아지는 것으로 알려진 혈중 triglyceride 함량은 본 연구에서 실험 전·후를 비교한 결과, 당뇨대조군의 경우 높게 나타난 것에 비해 macelignan 단독 투여군과 함께 CTH를 병용 투여한 군에서 모두 유의적으로 낮게 나타났다.", "</p><p>혈중 total cholesterol 함량은 실험 전에는 모든 군에서 차이가 없었다.", "그러나 실험종료 시점인 희생 후 측정한 결과에서는 다른 변화를 보였는데, 당뇨대조군에 비해 rosiglitazone을 투여한 군에서 유의적으로 높게 나타났으며, macelignan 단독투여 및 CTH를 함께 병용 투여한 군들에서는 유의적으로 낮게 나타났다.", "</p><p>당뇨병에서 가장 빈번하게 관찰되는 지질대사이상은 혈중 triglyceride와 cholesterol의 증가, 그리고 HDL-cholesterol의 감소 등을 들 수 있다.", "따라서 실험물질을 투여한 경우 당대사 및 지질대사를 개선시켜 실험동물의 혈중 지질농도 저하경향을 보여준 것으로 짐작되며, 특히, macelignan을 단독으로 투여한 경우보다는 CTH를 병용 투여하는 것이 보다 효과적으로 혈중 지질상태를 개선시킬 수 있을 것으로 생각된다.", "혈중 HDL-cholesterol 함량은 실험종료 후 측정한 결과 군간 차이는 없었다.", "그러나 항동맥경화 지수인 total cholesterol에 대한 HDL-cholesterol의 비율인 HTR은 당뇨대조군과 약물 투여군(rosiglitazone)에서는 차이가 나타나지 않은 반면, macelignan 단독 투여군과 CTH를 함께 병 용 투여한 군에서 \\( 20 \\% \\) 이상 유의적으로 높게 나타났다.", "동맥경화지수 (AI)는 rosiglitazone을 투여한 군에서 가장 높았으나, macelignan 단독 투여군과 CTH를 함께 병용 투여한 군들에서는 당뇨대조군 및 rosiglitazone을 투여한 군보다 유의적으로 낮게 나타났다.", "</p><p>본 연구에서는 macelignan 단독투여 및 CTH 병용 투여군 모두가 동맥경화 예방에 도움이 되는 것으로 나타났다.", "이는 HTR 과 AI의 상관관계를 통해서도 확인할 수 있었다.", "다만, 두 군 간의 차이는 없었다.", "</p><p>혈중 HDL-cholesterol의 증감은 cholesterol의 역수송을 통해 체내 cholesetrol의 조절에 중요한 역할을 하고 있으며, 최근 LDL의 산화적 변형으로부터의 보호역할 역시 그 중요성이 알려져 있다.", "AI를 통해 동맥경화를 비롯한 심혈관계 질환 유발의 위험을 미리 짐작할 수 있다는 점에서 macelignan의 단독 투여 또는 CTH와의 병용 투여는 당뇨병 합병증을 보다 효과적으로 개선시킬 수 있을 것으로 판단되었다.", "</p> <h2>Macelignan과 CTH 복합물이 db/db 마우스의 내당능 및 인슐린 민감도에 미치는 영향</h2><p>Macelignan과 CTH 복합물을 db/db 마우스에 3 주간 경구 투여한 결과 내당능 및 인슐린 민감도에 변화가 생겼으며 Fig.3A 와 Fig.3B에 나타내었다.", "</p><p>식후혈당 조절상태를 나타내는 내당능 검사에서 당뇨대조군의 경우 glucose를 복강 주사한 후 상승된 혈당은 주사 후 60 분이 경과되었을 때, 가장 고혈당 상태를 보였다가 감소하기 시작했다.", "그러나 2시간이 경과한 시점에서도 혈중 당이 적절하게 제거되지 못해 고혈당이 계속 유지되는 현상을 보였다.", "나마지 군들에서는 glucose 복강주사 후 30 분에 가장 높은 혈당치를 보인 후 서서히 감소하기 시작하여 2 시간이 경과한시점에서는 glucose 주사 전 혈당에는 미치지 못하나 당뇨대조군에 비해서는 유의적으로 낮았다.", "그 중에서도 macelignan과 CTH을 병용 투여한 군의 경우에는 혈당이 상승되는 정도가 macelignan군에 비해 더 완만했으며, 이미 60분이 지난 시점에서 당뇨대조군을 비롯한 나머지 군들에 비해 유의적으로 낮은 혈당을 보여 mcelignan을 단독으로 처리했을 때보다 macelignan과 CTH의 병용 투여가 식후혈당 조절 에 더 효과적인 것으로 나타났다.", "</p><p>식후혈당은 섭취하는 식품의 양뿐 아니라 식품의 종류와도 관련이 있으며, 포도당으로 소화 흡수가 느릴 경우 혈당의 증가반응이 느리게 나타나고, 빠른 경우에는 혈당이 급격히 증가하여 insulin 분비도 그만큼 더 증가시킨다고 하였다.", "따라서, 내당능이 유의적으로 개선되지 않으면 심혈관계 질환 등의 합병증 유발 위험성이 더 큰 것으로 보고 되어 있으므로 macelignan과 CTH의 병용 투여는 당뇨병 합병증의 유발 위험성을 효과적으로 개선시키는데 도움이 될 것으로 판단된다.", "</p><p>이와 함께 분비된 인슐린과 인슐린 수용체의 효과적인 작용 여부를 알 수 있는 인슐린 민감도 역시 macelignan과 CTH를 병용 투여한 경우가 당뇨대조군에 비해 유의적으로 낮은 혈당을 보임으로써, macelignan의 단독 투여보다는 상대적으로 인슐린 수용체를 통한 세포 내 유입이 더 효과적으로 일어나 체내에서 이용되고 있는 것으로 보여진다.", "</p><h2>Macelignan과 CTH 복합물 투여가 db/db 마우스의 당뇨병 관련지표들에 미치는 영향</h2><p>고혈당 조절 및 당뇨병의 주요 지표인자로 알려진 insulin 등을 비롯한 호르몬들과 adipokines의 혈중 함량을 측정한 결과를 다음 Table 1에 나타내었다.", "</p><p>혈중 insulin 농도는 rosiglitazone을 투여한 군에서 가장 높았고, 나머지 군들간에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.", "혈중 glucagon 농도는 macelignan을 단독으로 처리한 군에서 당뇨대조군에 비해 유의적으로 감소되는 것으로 나타났으나, macelignan과 CTH를 병용한 경우에서는 유의적인 차이를 볼 수는 없었다.", "</p><p>앞서, Han 등은 macelignan을 단독으로 투여했을 때 혈중 insulin 농도가 낮아졌다고 보고하였으나, 본 연구에서는 혈중 insulin 농도에서는 뚜렷한 변화가 없었고 glucagon 함량이 유의적으로 낮게 나타났다.", "체내의 glycogen 합성을 촉진하고 당신생을 억제하는 insulin 과는 달리 glucagon은 glucokinase 유전자의 전사를 억제하고 glucose-6-phospha-tase (G-6-Pase) 활성 및 mRNA 발현, 그리고 PEPCK의 전사를 촉진시켜 당 신생 증가를 유도하므로 macelignan을 적용 할 경우 체내 혈당조절을 효과적으로 개선시킬 수 있을 것으로 판단되었다.", "그러나 본 연구결과에 따르면 macelignan과 CTH의 병용 투여가 macelignan의 단독 투여에 비해 더 개선 된 효과를 볼 수는 없었다.", "</p><p>혈중 C-peptide 농도는 당뇨대조군에 비해 실험물질군에서 모두 유의적으로 높았다.", "C-peptide는 인슐린의 전구 물질로서 인슐린의 반감기보다 더 길며, 심한 당뇨병 환자의 경우에는 췌장의 insulin 분비능에 대해 insulin보다도 더 잘 반영하는 것으로 알려져 있다.", "또한 당뇨병의 진단뿐 아니라 병형을 판별하는데도 중요한 인자이다.", "본 연구결과에서는 macelignan을 단독 투여했을 때 보다 CTH와 함께 투여한 경우 비록 insulin 함량 그 자체는 개선의 변화를 볼 수 없었으나 C-peptide 함량이 유의적으로 증가된 것으로 보아 췌장의 인슐린 분비능이 개선되거나 보호된 효과가 있을 것으로 판단되며, 이를 좀 더 분명하게 이해하기 위해서는 further study가 필요할 것으로 생각된다.", "</p><p>혈중 leptin농도는 당뇨대조군에 비해 macelignan과 CTH를 병용한 군에서 rosiglitazone군과 함께 유의적으로 증가한 것으로 나타났으나, macelignan을 단독 투여했을 때에는 차이가 없는 것으로 나타났다.", "뿐만 아니라 혈중 leptin농도는 체중증가와 양의 상관관계를 가지는 것도 본 연구결과로 확인되었다.", "</p><p>Leptin은 일반적으로 식욕억제에 관여하면서 insulin 작용을 향상시켜 다양한 경로를 통해 혈당조절에 관여하기도 한다.", "Table 2에 의하면, 실험시작 전과 후의 각 군별 실험동물의 체중을 비교하였을 때, 실험이 종료된 시점에서 당뇨대</p><p>조군의 경우 시간이 경과함에 따라 당노병이 심화되면 나타나는 증상들인 다음, 다식, 다다의 증상을 보이며 오히려 체중이 감소되는 것으로 나타났다.", "그러나 rosi-glitazone을 투여한 군에서는 유의적으로 체중이 증가하여 비만 상태가 유지되는 것으로 나타났다.", "이에 반해, macelignan과 CTH를 함께 병용한 군에서는 체중에서 변화를 찾을 볼 수는 없었다", "(Table 2).", "</p><p>따라서, 체중의 변화 없이 혈중 leptin 함량이 증가한 것은 당뇨병 개선에 도움이 될 것으로 짐작되며, macelignan 단독으로 투여한 것보다는 CTH와 병용 투여하는 것이 더 효과가 있을 것으로 생각된다.", "</p><p>지방세포의 분화과정에서 그 발현량이 증가되는 adiponectin은 비만과 인슐린 저항성을 관련 지을 수 있는 독립적인 인자로 당뇨병이 발병된 동물이나 사람에게서 현저히 낮게 나타난다.", "본 연구에서는 당뇨병 치료제로 널리 사용되고 있는 thizolinidione계 약물인 rosiglitazone의 경우 당뇨대조군에 비해 혈중 adiponectin 농도가 월등이 높게 나타났다.", "Macelignan 및 CTH와 병용하는 군들의 경우에는 증가되는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>당뇨병은 인슐린 저항성 및 상대적인 인슐린 분비장애로 인해 고혈당이 유지되는 대사성 만성질환이며, 경제발전이 가속화되고 생활이 서구화 및 간편화되면서 급격히 증가하고 있다.", "이미 2003년에는 전세계적으로 2 억 명 가까이 당뇨병으로 고통받고 있으며, 2025년에는 3억 명을 넘어 성인인구(20 세 이상 기준)의 \\( 6 \\% \\) 이상을 차지할 것으로 예측되고 있다.", "국내 역학연구를 통해 살펴 보면, 우리나라의 당뇨병 유병률은 1970년대에는 약 \\( 2 \\% \\)였던 것이 점차 증가하여 90년대 초부터는 약 \\(7\\%\\)에 육박하는 결과를 보였다.", "뿐만 아니라 아직 당뇨병으로 진단되지 않은 환자들까지 고려한다면 실질적인 당뇨병 환자 수는 그 이상으로 생각되며 2030년대에는 \\( 10 \\% \\) 를 넘어설 것으로 예상되고 있다, 합병증 발병이 높은 당뇨병의 특성상 의료비용, 인력손실 및 사회적 파급효과 또한 클것으로 생각된다.", "성인(20-79세) 당뇨병 환자의 건강보험 총 진료비는 전체 성인 총 진료비의 약 \\(20\\%\\) 를 차지하였고, 일인당 총 진료비는 전 국민의 성별과 연령차이를 감안하여 3.0배나 높았다고 보고되었다.", "당뇨병 환자의 사망률 또한 비당뇨병 환자인 일반인에 비해 \\(2.2 \\sim 7.3\\)배나 높음을 알 수 있었다.", "이에 당뇨병을 치료하거나 그 병세를 호전시키기 위해 효능이 우수한 경구용 약물(혈당강하제)을 비롯한 치료제 개발이 활발히 진행되고 있다.", "그러나 이러한 치료제들은 약물복용에 따른 부작용과 환자의 내성이 계속해서 문제가 되고 있으므로 천연물을 이용한 당뇨병 치료제의 개발은 중요한 의미가 있을 것이다.", "</p><p>육두구(Myristicae Semen, nutmeg)는 육두구과(Myristicae)인 육두구나무(Myristica fragrans Houttuyn)의 성숙과 껍질을 벗기고 석회유에 1일간 담근 후 말린 생약이다.", "육두구에는 myristic acid와 trimyristin (myristic acid triglyceride)가 풍부하게 존재하며 지방산 원료로서 마요네즈 등의 가공식품에 이용되고 있을 뿐 아니라 향신료, 소화제로 이용되기도 한다.", "우리나라는 육두구를 중국, 인도네시아, 스리랑카, 다마스카르 등에서 연간 12톤 정도 수입하고 있다.", "</p><p>Macelignan은 육두구의 약용성분으로 이미 보고된 바 있는 약 30여 종의 lignan 중의 하나이며, 여러 연구자들에 의해 항박테리아 및 항염증 효과, 그리고 항균 및 항산화 등의 약리작용이 보고되었다.", "특히, Han 등은 macelignan이 endoplasmic reticulum (ER) stress를 감소시키고 당뇨병 치료제 개발 target중 하나인 PPAR-\\(\\alpha\\)/ \\( \\gamma \\)-dual agonist로서의 항당뇨 효능을 세포주 실험과 제2형 당뇨동물모델 (db/db 마우스)을 이용하여 증명하였다.", "그들은 macelignan을 db/db 마우스에 적용했을 때 serum glucose를 비롯한 insulin, triglycerides, free fatty acids 등과 skeletal muscle과 liver에서는 triglyceride가 감소함을 보고하였다.", "</p><p>이 밖에도, 선진국으로부터 시작된 대체의료 개념이 부각되면서 대체의료 소재들에 대한 관심도 높아지고 있다.", "현재 미국에서 판매되고 있는 항당뇨 의약대체소재로 Lagerstroemia speciosa (바나바), Gymmem sylvestre (김네마), Mori folium (상엽), Psidium guajava (구아바잎), Oenothera odorat a(달맞이꽃) 등이 있으며, 최근에는 이 추출물 소재들에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다.", "본 연구는 이를 토대로 실제 당뇨병 개선을 위해 한방치료에서 사용하는 약용식물들 중 Panax ginseng C.A.Meyer (인삼), Pueraria lobata (칡), Dioscorea batatas Decaisne (마), Rehmannia glutinosa (지황), Amomum cadamomum Linné (백두구), Poncirus fructus (지실), Evodia officinalis (오수유)을 열수 추출하여 복합 한약제를 만들었으며, 이 복합 한약재(Chienes traditional herbs, CTH)의 효과를 높이기 위해 macelignan를 함께 사용함으로써 항당뇨 효능 역시 높이고자 하였다.", "따라서, Han 등의 선행연구에서 사용한 바 있는 식욕항진으로 인한 비만, 고혈당, 인슐린 저항성, 고렙틴혈증, 고인슐린혈증 등의 제2형 당뇨병 환자와 유사한 임상적 특징을 지닌 C57BL/KsJ-db/db 마우스를 이용하여 macelignan과 복합 한약제(CTH) 열수 추출물의 첨가 후 결과를 분석 및 평가함으로써 항당뇨 효과를 살펴 보고자 하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "레이저 제2형 당뇨동물모델에서 macelignan과 한약제 열수 추출물의 병용효과", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-9bb4cd9b-e60e-4cdf-a495-b61d37153d9c", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", "doc_author": [ "여지영", "조수인", "정명호" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,316	<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상</h2><p>본 연구의 대상자는 주당 5시간 이상 정기적인 훈련에 참가하는 남자 골퍼 24명을 대상으로, 초급자(6개월 미만), 중급자(구력 2년 미만의 핸디 20), 고급자(구력 5년 이상의 세미프로) 등 세 그룹으로 분류하였다. 피험자들은 연구의 목적 및 처치를 충분히 이해하였으며, 본 실험에서 제시되는 운동 검사를 끝까지 수행할 수 있는 신체적 능력을 갖춘 자로 선정하였다(표 1).</p><h2>혈액분석 방법</h2><p>채혈은 초급, 중급, 고급그룹별로 100타, 200타, 300타 연습조건에서 각각 안정시, 운동종료, 회복 30분, 회복 4시간, 그리고 회복24시간에 실시하였다. 채혈된 혈액은 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리한 다음 분석에 사용되었다.</p><p>피로물질인 젖산과 암모니아는 Roche社(스위스)의 Cobas Integra 생화학 분석기에서 해당시약을 사용하여 분석하였고, 무기인산은 분리한 혈청을 Hitachi사(일본)의 Hitachi 747 생화학 분석기에서 분석하였다. 근손상 지표인 CK와 LDH는 건식 생화학분석기(Kodak EKTACHEM DTSCⅡ, USA)를 이용하여 분석하였으며, 크레아티닌은 TBA-200FR (Toshiba Corporation, Japan)을 이용하여 분석하였고, IGF-I 는 IRMA 방법으로 IGF-1 RIA kit(Diagnostic Systems Laboratories, Inc, USA)를 사용하여 측정하였다.</p><p>1차 테스트 : 안정시 채혈 후, 동일하게 아이언 7번 채를 이용하여 샷을 15초 간격으로 25분 동안 100개의 공을 치게 한 후 종료 즉시 채혈을 실시하였다. 이후 각 피험자들은 운동종료를 기준으로 회복 30분, 4시간, 그리고 24시간 후 채혈을 실시하였다.</p><p>2차 테스트: 1차 테스트를 실시한 후 1주일이 경과되면 2차 테스트를 실시하였다. 2차 테스트는 50분 동안 연습공 200개를 사용하며 절차는 1차 테스트와 동일하게 실시하였다.</p><p>3차 테스트 : 2차 테스트를 실시한 후 다시 1주일이 경과되면 3차 테스트를 실시하였다. 3차 테스트는 75분 동안 연습공 300개를 사용하며 절차는 1, 2차 테스트와 동일하게 실시하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>본 연구에서 얻은 자료는 SPSS/+PC+ v12.0 통계 패키지를 이용하여, 그룹(숙련도), 연습량, 채혈시기에 대한 모든 종속 변인들의 평균(M)과 표준편차(SD)를 구하였으며, 그룹, 연습량, 채현시기에 따라 혈중 근손상 지표물질, 피로물질, 크레아티닌, IGF-I의 농도차이를 알아보기 위하여 three-way repeated measurement on last factor of ANOVA를 실시하였다. 유의한 차이에 대한 사후검증은 Duncan 방법을 적용하였고, 통계적 유의수준은 \( \mathrm{a}=.05 \)에서 검정하였다.</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구의 목적은 골프 숙련도에 따른 아이언 샷 연습량이 혈중 근 손상 지표물질과 피로물질 농도 변화에 미치는 영향을 분석하는데 있었으며, 남자골프선수 24명을 대상으로 초급(8명), 중급(8명), 고급(8명)으로 나누어 각각 다른 연습량(100, 200, 300타)으로 연습하는 동안 채혈시기별로 혈중 근손상 지표물질인 CK(creatine kinase), LDH(lactate dehydrogenase), 혈중 피로물질인 무기인산, 젖산, 암모니아, 그리고 IGF- I (insulin like growth factor-I)과 크레아티닌의 수준차이를 비교하였다. 그 결과, 운동하는 동안 피로물질과 근손상 지표, 크레아티닌은 숙련도가 높을수록 낮은 수준을 보였으며, 연습량이 증가됨에 따라 높은 수준을 나타내었다. 회복시 피로물질과 크레아티닌은 운동종료 후 빠르게 회복되었으나, 근손상 지표, 특히 CK는 24시간이 지난 후에도 회복되지 못한 결과를 보였다. 따라서, 골프연습도 격렬한 운동과 마찬가지로 근손상과 상해를 예방하기 위해서는 개인의 숙련도와 연습량에 따라 차별화된 훈련과 회복방법을 고려해야 할 것으로 사료된다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상</h2><p>본 연구의 대상자는 주당 5시간 이상 정기적인 훈련에 참가하는 남자 골퍼 24명을 대상으로, 초급자(6개월 미만), 중급자(구력 2년 미만의 핸디 20), 고급자(구력 5년 이상의 세미프로) 등 세 그룹으로 분류하였다.", "피험자들은 연구의 목적 및 처치를 충분히 이해하였으며, 본 실험에서 제시되는 운동 검사를 끝까지 수행할 수 있는 신체적 능력을 갖춘 자로 선정하였다", "(표 1).", "</p><h2>혈액분석 방법</h2><p>채혈은 초급, 중급, 고급그룹별로 100타, 200타, 300타 연습조건에서 각각 안정시, 운동종료, 회복 30분, 회복 4시간, 그리고 회복24시간에 실시하였다.", "채혈된 혈액은 \\( 3,000 \\mathrm{rpm} \\)에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리한 다음 분석에 사용되었다.", "</p><p>피로물질인 젖산과 암모니아는 Roche社(스위스)의 Cobas Integra 생화학 분석기에서 해당시약을 사용하여 분석하였고, 무기인산은 분리한 혈청을 Hitachi사(일본)의 Hitachi 747 생화학 분석기에서 분석하였다.", "근손상 지표인 CK와 LDH는 건식 생화학분석기(Kodak EKTACHEM DTSCⅡ, USA)를 이용하여 분석하였으며, 크레아티닌은 TBA-200FR (Toshiba Corporation, Japan)을 이용하여 분석하였고, IGF-I 는 IRMA 방법으로 IGF-1 RIA kit(Diagnostic Systems Laboratories, Inc, USA)를 사용하여 측정하였다.", "</p><p>1차 테스트 : 안정시 채혈 후, 동일하게 아이언 7번 채를 이용하여 샷을 15초 간격으로 25분 동안 100개의 공을 치게 한 후 종료 즉시 채혈을 실시하였다.", "이후 각 피험자들은 운동종료를 기준으로 회복 30분, 4시간, 그리고 24시간 후 채혈을 실시하였다.", "</p><p>2차 테스트: 1차 테스트를 실시한 후 1주일이 경과되면 2차 테스트를 실시하였다.", "2차 테스트는 50분 동안 연습공 200개를 사용하며 절차는 1차 테스트와 동일하게 실시하였다.", "</p><p>3차 테스트 : 2차 테스트를 실시한 후 다시 1주일이 경과되면 3차 테스트를 실시하였다.", "3차 테스트는 75분 동안 연습공 300개를 사용하며 절차는 1, 2차 테스트와 동일하게 실시하였다.", "</p><h2>통계처리</h2><p>본 연구에서 얻은 자료는 SPSS/+PC+ v12.0 통계 패키지를 이용하여, 그룹(숙련도), 연습량, 채혈시기에 대한 모든 종속 변인들의 평균(M)과 표준편차(SD)를 구하였으며, 그룹, 연습량, 채현시기에 따라 혈중 근손상 지표물질, 피로물질, 크레아티닌, IGF-I의 농도차이를 알아보기 위하여 three-way repeated measurement on last factor of ANOVA를 실시하였다.", "유의한 차이에 대한 사후검증은 Duncan 방법을 적용하였고, 통계적 유의수준은 \\( \\mathrm{a}=.05 \\)에서 검정하였다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구의 목적은 골프 숙련도에 따른 아이언 샷 연습량이 혈중 근 손상 지표물질과 피로물질 농도 변화에 미치는 영향을 분석하는데 있었으며, 남자골프선수 24명을 대상으로 초급(8명), 중급(8명), 고급(8명)으로 나누어 각각 다른 연습량(100, 200, 300타)으로 연습하는 동안 채혈시기별로 혈중 근손상 지표물질인 CK(creatine kinase), LDH(lactate dehydrogenase), 혈중 피로물질인 무기인산, 젖산, 암모니아, 그리고 IGF- I (insulin like growth factor-I)과 크레아티닌의 수준차이를 비교하였다.", "그 결과, 운동하는 동안 피로물질과 근손상 지표, 크레아티닌은 숙련도가 높을수록 낮은 수준을 보였으며, 연습량이 증가됨에 따라 높은 수준을 나타내었다.", "회복시 피로물질과 크레아티닌은 운동종료 후 빠르게 회복되었으나, 근손상 지표, 특히 CK는 24시간이 지난 후에도 회복되지 못한 결과를 보였다.", "따라서, 골프연습도 격렬한 운동과 마찬가지로 근손상과 상해를 예방하기 위해서는 개인의 숙련도와 연습량에 따라 차별화된 훈련과 회복방법을 고려해야 할 것으로 사료된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "골프 숙련도에 따른 아이언 샷 연습량이 혈중 근손상 지표와 피로물질 농도에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-ae968395-d785-4ea1-ab0f-88cb3c820aeb", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2007", "doc_author": [ "서아람", "백일영", "서상훈", "진화은", "김영일", "조수영", "곽이섭", "우진희" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,317	<h3>성장호르몬, 인슐린, 코티졸 (growth hormone, insulin, cortisol)</h3><p>Competitive RIA method를 사용하여 동위원소 측정법으로 \( \gamma \)-counter (DPC社, COBRA 5010 Quantum & COBRA 5010 Ⅱ, Coat-a-Count growth hormone kit)를 이용하여 활성화를 분석하였다.</p><h3>갑상선호르몬 (T3, T4)</h3><p>\( \mathrm{T}_{3} \) 는 혈청 \( 100 \mu, \mathrm{T}_{4} \)는 혈청 \( 40 \mu l \) 에 \( 200 \mu \ell \)의 \( { }^{125} \mathrm{I}-\mathrm{T}_{3} \) 를 vortex mixer로 혼합시킨 후 1시간 동안 실온 \( \left(18 ~ 25^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 흔들어 주면서 배양을 시켰다. 그런 다음, 내용물을 뽑아내어 \( 0.9 \% \mathrm{NaCl} \) 용액 \( 1 \mathrm{~m} \ell \) 로 2번 침전시켜 방사능 측정을 하였다.</p><h2>실험절차</h2><h3>최대산소섭취량</h3><p>최대산소섭취량(\( \left.\mathrm{vO}_{2} \mathrm{max}\right) \) 은 트레드밀(Quinton)it, Q65)과 가스분석기(MedGraphicsi․, CPX system)를 이용하여 Bruce protocol로 실시하였다. 운동이 지속되는 동안 심박수측정기(polar社(핀란드), S610)를 이용하여 5분마다 심박수를 측정하였으며, Borg 15pts scale을 이용하여 피험자들의 운동자각도 측정을 병행하였다.</p><h3>실험절차</h3><p>피험자의 심박수와 산소섭취량이 각각 \( 70 \mathrm{bpm} \) 과 \( 3.5 \)\( \mathrm{ml} / \mathrm{kg} / \mathrm{min} \) 이하를 나타날 때를 기준으로 안정 시점을 잡았으며, 운동강도는 총 4회의 실험을 실시하는 동안 모두 \( \dot{\mathrm{v}} \) \( \mathrm{O}_{2} \mathrm{max} \) 의 약 \( 60 \% \)에 해당하는 \( 5 \mathrm{mph} \)의 속도와 \( 3 \% \)의 경사도를 부과한 절대강도로 90분간 달리기 운동을 실시하였다. 운동 45분경과 후 2차 채혈을 하였고, 90분간의 운동이 종료되는 즉시 3 차 채혈을 하였으며, 회복 30분에 4차 채혈한 후 종료하였다.</p><p>실험은 통제, BCAA, BCAA+OKG, 그리고 BCAA+albumin 투여 등 총 네 가지 실험조건으로 구성되었으며, 각 실험조건에 적용한 채혈시기 및 운동 형태, 운동 강도와 시간은 동일하였고, 각 실험조건 사이의 일정간격을 충분히 두어 에너지 보충제와 운동 테스트로 인한 영향을 없애도록 하였다.</p><h2>자료처리 방법</h2><p>본 연구에서 얻은 자료는 SPSS 통계 package (v. 11.0)를 이용하여 기술통계량을 산출하였다.</p><p>에너지 기질과 호르몬 변화 형태 비교는 그룹, 시기를 독립변인으로 하는 4(그룹; 통제, BCAA, BCAA+OKG,BCAA+albumin) \( \times 4 \) (시기; 안정, 운동 45분, 운동종료, 회복 30분) 요인설계하에 이루어졌으며, 이요인 분산분석법 (Two-way repeated ANOVA)을 이용하여 분석하였고, Tukey의 사후 검증법으로 평균치를 검색하였다 \( (\mathrm{p}<05) \).</p> <p>갑상선 호르몬은 전체적인 대사율을 조절하는 중추적인 역할을 하며, 주기적인 열발생 및 안정시 대사율에도 영향을 미치고, 체중조절과도 밀접한 관련이 있는 호르몬으로 알려져 있다. 모든 조직에 있어서 갑상선 호르몬은 대사율을 증진시키며, 안정시 대사량 비율을 \( 60 \sim 100 \% \) 까지 증진시킬 수 있다고 하였다. 또한, 운동을 하는 동안 갑상선 자극 호르몬의 방출은 증가하는 반면, 금식 후에는 감소하는 경향이 있다.</p><p>갑상선 호르몬에 영향을 미칠 수 있는 요소는 연령, 음식과 열량, 계절의 변화, 생리 주기와 임신의 영향, 자세, 신체 활동의 제한, 운동, 지역과 환경, 수술이나 외상 등을 들 수 있으나, 정상인에게 있어서 갑상선 호르몬 수준의 변화는 체중 변화, 신체적 훈련, 습관, 자세, 활동의 감소 등에 의한 변화는 크지가 않고, 요오드(iodine)의 결핍이 일어나지 않는 한 영양에 의한 차이도 아주 적다고 할 수 있다. 본 연구결과 갑상선 호르몬의 변화는 운동에 의해 약간 상승한 형태를 보여주고 있지만, 통계적으로 의미 없는 수준이며, 투여조건에 따라서도 차이를 보여주지 않고 있어, 일회성 운동이나 단기간의 영양소 섭취에 의해 민감하게 반응하여 분비되는 요인이 아님을 알 수 있다.</p><p>에너지 동원 형태와 관련하여 실펴본 에너지기질 중 하나인 혈중 글루코스는 네 가지 투여근 모두 운동 전에서 운동 45분까지 약간의 증가를 보이다가 종료시 약간 감소하는 경향을 보였으며 운동 전, 운동 45분, 종료시 모두 통제군이 가장 는은 경향을 보였다. 이는 섭취한 BCAA와 OKG가 운동을 지속하는데 필요한 긍정적인 에너지원으로 이용된 것으로 보여진다. 최대산소섭취량의 약 \( 60 \% \) 로 운동하는 동안 간으로부터 생성된 글루쿠스는 운동시작 90 분 정도 후에는 감소되기 시작하고, 간에 저장된 글리코겐은 고갈되어진다. 그러나 BCAA+OKG 그리고 BCAA+albumin을 투여하게 되면 투여된 BCAA와 그 밖의 물질이 근육으로 이동하고 산화되어 추가적인 에너지원을 공급하기 때문에 간에서 분해되어 혈중으로 방출되는 글루코스를 sparing 해주어 혈중의 글루코스 농도가 감소되는 것이다. 즉, BCAA등의 투여는 지구성 운동 후반부에 활동근의 글리커겐 고갈로 인한 운동 수행능력 저하 현상을 막아주는데 도움을 줄 수 있을 것이다.</p><p>따라서, 본 연구에서는 BCAA, BCAA+OKG 그리고 BCAA+albumin 투여가 장시간의 운동시 에너지원으로 이용될 수 있으며 이는 운동 후반부에 일어나는 글리코겐의 고갈을 억제하여 운동수행력에 도움을 줄 수 있을 것이라 볼 수 있다. 그러나, 에너지 동원 측면에서의 BCAA와 그 밖의 물질의 역할을 정확히 살펴보기 위해서 간 글리코겐 농도와 근육내 글리코겐의 분해정도, 그리고 근 글리코겐 고갈 후 산화되는 혈장의 BCAA 농도를 직접 측정한 더 많은 연구가 필요하다고 사료된다.</p><p>에너지 동원 형태와 관련하여 살펴본 또 다른 에너지기질인 유리지방산은 모든 시기에서 통제군에 비해 BCAA 투여군이 낮은 농도를 보였다. 반면 모든 시기에서 BCAA+OKG 투여군과 BCAA+albumin 투여군이 통제군과 BCAA 투여군에 비해 높은 유리지방산 수치를 보였다. 이와 같이, 모든 시기에 걸쳐 통제 군에 비해 BCAA+OKG 투여군과 BCAA+albumin 투여군의 유리지방산 농도가 높게 나타난 것은 BCAA+OKG와 BCAA+albumin 섭취 시 혈중 글루코스 농도가 다른 투여 군에 비해 낮게 나타난 결과와 관련지어 볼 수 있다. 즉, 투여된 BCAA+OKG는 물질이 근육으로 이동하고 산화되어 추가적인 에너지원을 공급한다고 볼 수 있는 것이며 BCAA+albumin 투여 역시 지구성 운동 후반부에 활동근의 글리코겐 고갈로 인한 운동 수행 능력 저하 현상을 막아주는데 도움을 주며, 이는 같은 운동 강도를 상대적으로 낮게 인식하도록 하여 에너지원으로서 지방 이용을 증가시켰다고 볼 수 있다. 또한, 투여된 알부민이 유리지방산이 근육으로 원활하게 이동하기 위한 긍정적인 효과로 작용했기 때문이라고 본다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구 대상</h2><p>본 연구의 대상자는 체육학 전공 남자 대학생 5명으로 하였다. 신체적 톡성은 Table 1과 같다.</p><h2>투여방법</h2><p>BCAA (leucine \( 50 \% \), isoleucine \( 25 \% \), valine \( 25 \% \))는 역삼투수 \( 300 \mathrm{ml} \)에 용해시킨 후, 공복상태에서 운동 1시간 전 체중 \( \mathrm{kg} \)당 \( 78 \mathrm{mg} \)의 양 \( (78 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \)을 섭취하도록 하였으며, OKG (ornithine \(64\%\), a-ketoglutarate \(36\%\)) 역시 역삼투수 \( 300 \mathrm{ml} \)에 용해시킨 다음, 같은 방법으로 섭취하였다. 알부민은 알부민 \( 20 \% \)로 구성된 주사액으로 실험 2시간 전 각 피험자에게 정맥주사를 통해 투여하였고 \( (1 \mathrm{ml} / \mathrm{kg}) \), 약 60분에서 90분 정도의 투여시간을 마친 후 1시간 정도의 휴식을 취한 후 테스트에 참가하였다.</p><h2>채혈 및 분석</h2><p>네 가지 실험조건 모두 안정 시, 운동 45분, 운동종료 시, 회복 30분 등 개인당 총 16회의 채혈을 하였으며 각 시기마다 21 gage needle을 이용하여 주전정맥(antecubital vein)에서 채혈하였다.</p><h3>글루코스(glucose)</h3><p>채취한 혈액을 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 15분간 원심 분리하여, 상층액을 건식생화학분석기(Kodak, EKTACJEM DT 60II)를 이용하여 분석하였다.</p><h3>유리 지방산(free fatty acid)</h3><p>섬유소원을 침전시키기 위한 clot activator가 포함된 vaccumtube를 이용하여 혈액을 채취한 후, \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 15분간 원심 분리하였다. 그리고 \( 0.5 \mathrm{ml} \) 추출된 혈청에 증류수와 STD 용액을 각각 \( 50 \mu \) 넣고, SICDIA NEFAZYME 검사 시약을 혼합한 훙, 5분간 찬물에 보관한 뒤, 생화학 분석기(Hitachis, Hitachi 7150)를 이용하여 측정하였다.</p><h3>암모니아(ammonia)</h3><p>Spectrophotometer (CL-750)를 사용하여 bethelot 반응을 알아보는 방법으로 분석하였다. 먼저, 혈중 암모니아를 생성할 수 있는 효소의 활성을 소실시키는 제단백 용액 \( 2 \mathrm{m \ell} \)에 혈액 \( 1 \mathrm{m \ell} \) 섞어서 원심 분리한 후, 상층액을 분리하였다. 그리고 phenol \( 4 \% \), nitroprusside 염 \( 0.015 \% \) 와 \( \mathrm{KOH} 4.1 \% \)를 첨가하여 알칼리성으로 만든 다음, 탄산칼륨 \( 28 \% \)와 염소산 칼륨 \( 3 \% \)가 함유되어 있는 시약을 사용하여 발색시킨 후, 파장 \( 630\mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h1>요약</h1><p>이상의 연구를 종합해보면, 장시간 운동시 BCAA 투여는 BCAA 산화시 발생되는 암모니아 등의 피로물질 축적에 의해 운동수행에 부정적 영향을 미칠 수도 있으나, 체내 글루코스가 소진되어가는 시점에서 유용한 에너지원으로 기여되어 운동수행에 도움이 될 수 있다고 보여진다. 또한, OKG나 알부민을 가중투여하면 크렙스 사이클의 중간물질로 또는 유리지방산 동원의 운반자로서 BCAA 단독 투여시 부정적으로 나타난 원인을 해결하여 운동수행에 긍정적 영향을 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 그러나, 운동과 BCAA, 그리고 내분비 체계와의 관계는 각 호르몬의 역할과 기능에 따라 도출되는 결론이 다를 수 있어, 앞으로 BCAA 대사와 관련된 효소반응 등에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 본다.</p> <h1>결 과</h1><h2>글루코스</h2><p>혈중 글루코스 농도는 네 가지 투여 군에서 모두 안정시에서 운동45분까지 약간의 증가를 보이다가 운동 45분 이후 점차 감소하는 경향을 보였다. 운동시기별 군간의 차이를 비교한 결과, 운동 45분에는 군간의 차이가 거의 없었지만, 운동종료시 BCAA+albumin 투여군의 수치가 가장 낮게 나타닜으며, 회복 30분에도 BCAA+albumin 투여군이 가장 낮게 나타났다.</p><h2>유리지방산</h2><p>혈중 유리지방산은 네 가지 실험조건 모두 안정시에서 운동종료까지 증가하였으나, 회복 30분에 BCAA와 BCAA+albumin 투여군은 계속 증가하고 통제군과 BCAA+OKG 투여군은 감소하는 경향을 보였다.</p><p>운동시기별 군간의 차이를 비교한 결과, 모든 시기에 BCAA+albumin 투여군의 혈중 유리지방산 농도가 가장 높게 나타났으며, 특히 회복 30분에는 통계적으로도 유의한 차이가 발견되었고 \( (\mathrm{p}<.05) \), 그 다음으로 BCAA+OKG 투여군의 수치가 두 번째로 높게 나타났다. BCAA 투여군의 수치는 운동 45분과 운동종료 시 통제군 보다 낮게 나타났지만, 회복 30분에서는 통제군 보다 높게 나타났다.</p><h2>암모니아</h2><p>혈중 암모니아 농도는 네 가지 실험조건 모두 운동수행과 더불어 증가하여 운동종료 시에 최고치를 보였으며, 회복에 따라 안정시 수준으로 감소하는 경향을 나타내었다. 운동시기별 군간의 차이를 비교한 결과, 안정시 BCAA 투여군이 가장 높았고, BCAA+albumin 투여군이 가장 낮았으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 운동 45분경과 후, BCAA 투여군이 가장 높게 나타났으며, BCAA+OKG 투여군과 BCAA+albumin 투여군 모두 통제군과 BCAA 투여군 사이에서 통계적으로 유의한 차이가 나타났다 \( (\mathrm{p}<.05) \). 운동 종료 시에는 BCAA 투여군이 가장 높았고, BCAA+albumin 투여군이 가장 낮았으나 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다. 회복 30분 역시, BCAA+albumin 투여군의 혈중 암모니아 농도 수준이 가장 낮게 나타났지만, 군 간에 유의한 차이는 나타나지 않았다.</p><h2>성장호르몬</h2><p>혈중 성장호르몬 농도의 변화는 네 가지 투여 군 모두 안정시에서 운동 45분까지 증가하였으나, 운동 종료시에 통제군과 BCAA+OKG 투여군은 계속 증가하고 BCAA와 BCAA+albumin 투여군은 감소하는 경향을 보였다. 운동시기별 군간의 차이를 비교한 결과, 종료시 BCAA와 BCAA+albumin 투여군 간에 유의한 차가 나타났으며 \( (\mathrm{p}<.05) \), BCAA+OKG 투여군에서 가장 높은 수치를 보였다.</p><h2>인슐린</h2><p>혈중 인슐린 농도의 변화는 BCAA+albumin 투여군을 제외하고 모두 안정시에서 종료시까지 감소하였으며, 회복 시 증가하는 경향이 나타났다. 군간에서는 유의한 차가 나타나지 않았지만, 종료시 BCAA+OKG 투여군에서 가장 낮은 수치를 보였으며, BCAA+albumin 투여군이 가장 높은 수치를 보였다. 시기별로 비교했을 때, 운동 종료시 통제군, BCAA 투여군, BCAA+albumin 투여군에서 안정시와 유의한 차이를 보였다 \( (\mathrm{p}<.05)\) .</p><h2>코티솔</h2><p>혈중 코티솔의 농도 변화는 모든 투여 군에서 안정시에서 종료시까지 증가하다가 BCAA+albumin 투여군을 제외하고 감소하는 경향을 보였다. 군간에서는 유의한 차가 나타나지 않았지만, 종료시 BCAA 투여군에서 가장 높은 수치를 보였다. 시기별로 비교했을 때, BCAA 투여군의 운동 45분과 종료시, 그리고 BCAA+albumin 투여군의 종료시에서 각각의 안정시와 유의한 차이를 보였다\( (\mathrm{p}<.05) \).</p><h2>갑상선호르몬 \( \left(T_{3}, T_{4}\right) \)</h2><p>혈중 \( \mathrm{T}_{3} \) 농도 변화는 BCAA+albumin 투여군을 제외하고 모두 안정시부터 종료시까지 증가하는 경향을 보였으나, 군간에서는 유의한 차가 나타나지 않았다. 시기별로 비교했을 때, 비투여군과 BCAA 투여군의 운동 45분과 종료시가 각각의 안정시와 유의한 차이를 보였다 \( (\mathrm{p}<.05) \) 혈중 \( \mathrm{T}_{4} \) 의 농도는 안정시부터 운동 45분까지 감소하다가 종료시 증가하는 경향을 나타냈다. 운동시기별 군간에서는 유의한 차가 나타나지 않았으나, 종료시 BCAA+OKG 투여군에서 가장 높은 수치를 보였다.</p> <h1>서론</h1><p>장시간 운동 시 단백질이 에너지원으로 중요한 역할을 한다고 알려진 이후 단백질이 운동수행에 미치는 영향과 에너지원으로서의 기여뿐만 아니라 호르몬과의 반응 등을 밝히는 연구들이 진행되고 있다.</p><p>BCAA(branched chain amino acid)는 루이신(leucine), 아이소루이신(isoleucine), 발린(valine)을 지칭하는 것으로 다른 필수 아미노산들은 주로 간에서 산화되어지는 것과는 달리 골격근에서 산화되어 운동 시 수축하는 골격근에서 사용된다고 알려져 있다. 근육에서 BCAA는 운동중과 스트레스 상황 모두에서 중요한 기질로서 작용하며 다른 아미노산과 단백질 합성의 전구자로서 제공된다. 또한 장시간의 운동 시 탄수화물이 고갈되고 에너지원으로서 지방 기여가 증가되면서 근육에서 중요한 에너지기질로 작용한다.</p><p>일반적으로 운동은 에너지 소비를 증가시키고 장시간 운동시 BCAA 산화를 크게 증진시킨다. BCAA는 운동 시 에너지원으로써 에너지 대사에 관여하며 크렙스 사이클(Kreb's cycle) 중간물질의 양을 증가시키고 당신생합성작용(gluconeogenesis)을 위한 기질로써 기여한다. 실제로 MacLean 등은 운동 전 BCAA의 구강 투여가 운동 시 세포내와 혈액 내 BCAA 수치를 증가시켰고 내인성 근육 단백질 분해를 억제시켰다고 보고했다. 그러나 Van Hall 등은 BCAA를 투여한 결과 크렙스 사이클 중간물질인 a-ketoglutarate의 감소를 보고하였으며, 이와 유사하게 Wagenmakers 등 또한 BCAA의 산화율 증가가 크렙스 사이클 중간물질의 점진적인 감소를 초래함으로써 오히려 에너지 고갈을 가져올 수 있다는 상반된 결과를 보였다.</p><p>장시간 운동 시 코티솔(cortisol), 성장호르몬(growth hormone), 갑상선호르몬 \( \left(\mathrm{T}_{3,}, \mathrm{~T}_{4}\right) \)의 분비 증가는 단백질 분해를 촉진시키고 필요한 에너지 생성을 위해 작용하게 된다. 아미노산 섭취는 성장호르몬과 인슐린(insulin)의 분비를 촉진시키는데, 실제로 Shimomura 등이 인슐린과 \( \mathrm{T}_{3} \)등이 BCAA의 대사 조절 효소인 BCKADH(branched-chain a-keto acid dehydrogenase)의 활성과 억제에 관여하는 BCKADH kinase의 발현에 관련이 깊다는 결과를 발표하면서 BCAA 대사와 연관된 호르몬의 변화를 관찰하는 것이 중요하게 대두되고 있다. 그러나 BCAA 대사와 관련된 특정 호르몬의 변화에 대한 연구는 매우 부족한 실정에 있다.</p><p>한편, OKG(ornithine a-ketoglutarate)는 ornithine 2분자와 a-ketoglutarate 1분자로 형성된 염이며, 크렙스 사이클 연료원으로 글루타메이트(glutamate) 생성에 사용되며 당신생합성과정의 전구체로써 작용한다. 또한, 인슐린과 성장호르몬 같은 동화작용적 호르몬의 분비와 대사산물의 합성에 관여하며, 골격근의 알지닌(arginine)과 글루타민(glutamine)의 양을 유의하게 증가시켰다는 보고가 있다. 그러나, 아직까지 OKG의 작용기전이 완전히 알려지지는 않은 실정이다.</p><p>BCAA 투여와 운동수행과의 관계에 관한 연구들 중에는 BCAA 투여시 일어날 수 있는 크렙스 사이클 중간물질인 a-ketoglutarate의 고갈을 억체하는 측면에서 OKG를 투여한 연구도 있지만, 후속되는 연구들에 의해 실질적인 OKG 투여의 a-ketoglutarate 고갈 억제의 기전을 검증하지는 못하였다고 볼 수 있고, 다양한 실험군 시도에 의한 이론적 논점들의 상호 검증도 요구되어지고 있다. 특히, 최근 인슬린, 코티솔, 갑상선 호르몬 등이 BCAA의 대사의 조설 효소인 BCKADH의 활성과 억제에 관여하는 BCKADH kinase 활동과 발현에 깊이 연관되어 있다는 연극결과가 발표되면서 BCAA 대사와 관련되어 이들 호르몬의 변화를 관찰하는 것이 매우 중요하다고 보고 있으나, 운동과 BCAA 대사를 호르몬과 연결시켜 수행한 포괄적인 연구는 아직은 미흡한 상태이다.</p><p>따라서, 본 연구는 BCAA와 BCAA 산화시 a-ketoglutarate 고갈을 억제하기 위해 OKG와 알부민(albumin)을 가중 투여하여 장시간 운동 시 혈중 에너지 대사산물(글루코스, 유리지방산, 암모니아)과 BCAA 산화와 관련된 호르몬(성장호르몬, 인슐린, 코티솔, \( \mathrm{T}_{3}, \mathrm{~T}_{4}\))에 미치는 영향을 규명하는데 그 목적이 있다.</p> <h1>고 찰</h1><p>단백질은 탄수화물과 지방에 비해 운동 시 에너지원으로의 기여가 상대적으로 작기 때문에, 덜 중요한 에너지원으로 생각할 수도 있다. 그러나, 훈련된 선수들의 장시간 운동 수행 마지막 시점에 에너지원으로 기여한다는 중요성을 감안한다면, 일부 운동종목 선수들의 기록에 결정적인 영향을 미치는 중요한 에너지원이다. 단백질은 인슐린, 성장호르몬, 그리고 BCAA 섭취에 의해서 합성이 증가하지만, 금식, 격렬한 운동, 그리고 코티솔에 의해 분해가 증가되고, BCAA와 같은 아미노산의 주입으로 단백질 분해는 감소된다. 즉, 단백질의 합성과 분해를 증가 또는 감소시키는 많은 서로 다른 잠재적 조절자들이 다양하게 존재하고 있으며, 단백질 turnover의 순(net) 변화는 거의 이러한 합성과 분해에 관계된 조절자의 총화를 반영하며 변화된다고 볼 수 있다. 이러한 조절자들 중에서 가장 잠재적인 조절자로 내분비 호르몬들을 들 수 있으며, 이는 순 단백질 변화와 거의 일치되며 변화하는 것으로 알려져 있다.</p><p>시상하부의 통제하에 뇌하수체 전엽에서 분비되는 성장 호르몬은 인슐린의 몇몇 작용에 반대되는 길항작용을 하지만, 근육과 간에 작용해서 인슐린과 유사한 합성의 역할을 하는 소마토미딘(somatomedins)이라고 알려진 펩타이드 IGF-1과 IGF-2의 방출을 자극하여 단백질 합성에 기여한다. 운동과 관련되어 성장호르몬은 저항성 운동 후 왕성하게 분비되며, 운동 후 음식물을 섭취하는 몇 시간 동안 성장호르몬 분비가 증가된다는 연구결과로 운동형태와 에너지 기질 섭취가 운동 후 성장호르몬 분비에 중요하게 작용한다고 볼 수 있다. 본 연구에서 성장호르몬 분비는 BCAA와 BCAA+OKG 투여군에서 운동과 회복 중 다른 투 여조건에 비해 높은 수준으로 나타났다. 이러한 현상은 Chandler 등의 연구에서 지적한 바와 같이, 운동과 식이에 따라 성장호르몬 분비는 영향을 받으며, BCAA와 OKG 가중투여로 운동이 진행됨에 따라 분해되는 단백질을 억제하고 단백질 합성을 위한 과정이 진행되었기 때문이라고 사료된다. 지구성 운동 중 증가되는 단백질 분해는 운동 중 합성되는 양 보다 분해되는 양이 많기 때문에 지구성 운동 중 단백질의 순 분해가 일어나고, 이것은 지구성 운동 중 필요한 에너지를 공급하는데 일부 기여하게 된다. 하지만, 운동 전 BCAA와 OKG의 투여로 단백질 재합성을 위한 내 분비 체계의 생리적 기여가 발생되었으며, 아미노산 분해가 억제되어 암모니아 발생도 감소되었다고 보여진다.</p><p>강한 강도의 운동에서 혈중 암모니아 수치가 급격히 가하는 현상으로 아미노산의 대사가 증가된다고 보기도 하지만, 강한 강도의 운동시 증가되는 대부분의 암모니아는 체내의 total adenine nucleotides 양의 유지를 위해 진행되는 PNC cycle에서 생성되고, 아미노산의 대사에 의해 증가되는 암모니아 양은 일부로 보고 있다. 하지만, Rowe는 근육 글루타메이트 농도가 단기간의 지치는 운동에서 안정시 수치의 \( 25-50 \% \) 정도로 낮아지는 것을 볼 때, 근육의 높은 암모니아 농도가 glutamine synthetase 반응을 통해 글루타메이트를 고갈시키고 있는 상태일 것이라고 보았다. 또한, Wagenmaker는 \( 70 \% \) 최대산소섭취량으로 2시간 운동시켰을 때, 암모니아의 농도가 13-180 uM 까지 증가되었다고 보고하면서, 이러한 운동 강도에서 아미노산 의 에너지 기여가 증가한다고 했다. 본 연구결과, BCAA+OKG와 BCAA+albumin 투여조건에서 암모니아 농도는 통제군과 BCAA투여조건에 비해서 운동하는 동안 낮게 나타났는데, 이는 장시간 운동시 나타나는 BCAA의 산화적 특성을 원인으로 제시할 수 있다. 즉, 장시간 운동으로 글리코겐은 감소하고 BCAA의 산화가 증가하게 되면 BCAA가 산화되는 과정에서 이용하는 크렙스 회로 중간자인 a-ketoglutarate 농도는 감소하게 된다. a-ketoglutarate의 감소로 글루타메이트 역시 감소하게 되고 이는 글루타민 생성을 감소시킨다. 따라서 글루타민 생성과 함께 제거되어야 할 암모니아가 제거되지 못하고 혈중에 축적된 것으로 볼 수 있다. 반면, BCAA+OKG 투여군은 통제군과 BCAA 투여군에 비해 낮은 암모니아 농도를 보였는데 이는 선행연구 결과와 일치하는 것으로, BCAA와 더불어 섭취한 OKG가 BCAA만을 섭취 시킬 때 초래되는 대사적 문세점들을 해결한 것으로 볼 수 있다. 즉, OKG를 섭취함으로써 크렙스 사이클의 중간물질인 a-ketoglutarate의 농도 감소가 억제 됐을 뿐만 아니라, 체내에서 글루타메이트를 생성하여 글루타데이트가 글루타민으로 전환되는 과정에서 암모니아를 제거한 것으로 볼 수 있다. 그리고 요소회로 (urea cycle)의 중간물질인 오르니틴 (ornithine) 농도를 증가시켜 암모니아를 신속히 요소 (urea)로 전환시킴으로써 암모니아 농도가 감소된 것으로 보여진다.</p><p>인슐린은 골격근과 간의 글루코스 섭취와 글리코겐 합성을 증가시키는 것으로 잘 알려져 있다. 그리고, 인슐린은 단백질과 관련하여 근육에서의 순 단백질 합성에 자극 효과를 가질 것으로 볼 수 있지만, 실제로 인슐린 효과는 근육 단백질 분해를 감소시키는데 있고, 근육 단백질 합성을 증가시키지는 않는 것으로 보고되고 있다. 본 실험결과, 인슐린은 운동이 진행됨에 따라 감소되는 현상을 보여 운동시 에너지 저장 보다는 이용 측면에서의 생리적 요구에 부응하기위해 분비가 감소된 것으로 보인다. 하지만, 운동과 회복 중 투여조건에 따른 인슐린 농도의 일관된 변화 형태 나타나지 않아, 아미노산 보충제 투여시 인슐린 분비가 촉진되며, 고인슐린분비혈증 (hyperinsulinemia)에서 근육의 단백질 합성과 BCAA 전달이 증가되는 것으로 보고한 Biolo 등의 선행연구와 유사한 점을 찾을 수 없었다. 이러한 결과는 아마도, BCAA와 인슐린과의 관계를 안정 시 또는 운동종료 후 상당한 시간이 경과한 회복시점과 운동이 진행 중인 시점을 비교하는 데서 오는 차이라고 볼 수 있으며, 운동 중인 상태에서 인슐린 분비는 단백질 합성보다는 글루코스 이용측면에서 보다 민감하게 반응하여 작용한다고 볼 수 있다.</p><p>Sahlin 등의 연구결과에 따르면, 운동의 시작과 함께 근육 글루타메이트 농도가 빠르게 감소되는데, 이것은 글루타메이트가 a-ketoglutarate의 탄소골격과 크렙스 사이클의 다른 중간자들로 전환되기 때문이고, 크렙스 사이클 중간물질의 감소는 지방산 산화 제한을 초래하게 되어, 원활한 에너지 공급에 차질이 생기고, 운동선수는 페이스를 감소시켜야만 한다. 따라서, 이러한 시기에 아미노산에 의한 크렙스 사이클 중간물질의 합성과 유지는 운동선수의 운동수행에 매우 중요한 역할을 하게 된다. Spencer는 운동의 시작 단계에서 증가된 해당과정 비율과 그에 따른 초성포도산 (pyruvate) 생성률의 증가가 글루타메이트로부터 생성되는 a-ketoglutarate와 알라닌 (alanine) 생성 사이의 빠른 평형을 가질 수 있도록 alanine aminotransferase 반응을 촉진시키는 역할을 한다고 했다. BCAA 산화와 관련된 코티솔의 기능은 단백질 분해를 자극하여 에너지를 생성시키는 기전에 관여하는 것이다. 본 실험결과 BCAA 투여와 OKG 투여조건에서 운동종료 시 통제군보다 코티솔 분비가 높게 나타난 것은 운동시간이 경과함에 따라 에너지 생성을 위한 아미노산 공급을 위해 단백질 분해를 촉진하는 보상적 작용 때문인 것으로 사료된다.</p>	생명과학	[ "<h3>성장호르몬, 인슐린, 코티졸 (growth hormone, insulin, cortisol)</h3><p>Competitive RIA method를 사용하여 동위원소 측정법으로 \\( \\gamma \\)-counter (DPC社, COBRA 5010 Quantum & COBRA 5010 Ⅱ, Coat-a-Count growth hormone kit)를 이용하여 활성화를 분석하였다.", "</p><h3>갑상선호르몬 (T3, T4)</h3><p>\\( \\mathrm{T}_{3} \\) 는 혈청 \\( 100 \\mu, \\mathrm{T}_{4} \\)는 혈청 \\( 40 \\mu l \\) 에 \\( 200 \\mu \\ell \\)의 \\( { }^{125} \\mathrm{I}-\\mathrm{T}_{3} \\) 를 vortex mixer로 혼합시킨 후 1시간 동안 실온 \\( \\left(18 ~ 25^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)에서 흔들어 주면서 배양을 시켰다.", "그런 다음, 내용물을 뽑아내어 \\( 0.9 \\% \\mathrm{NaCl} \\) 용액 \\( 1 \\mathrm{~m} \\ell \\) 로 2번 침전시켜 방사능 측정을 하였다.", "</p><h2>실험절차</h2><h3>최대산소섭취량</h3><p>최대산소섭취량(\\( \\left.\\", "mathrm{vO}_{2} \\mathrm{max}\\right) \\) 은 트레드밀(Quinton)it, Q65)과 가스분석기(MedGraphicsi․, CPX system)를 이용하여 Bruce protocol로 실시하였다.", "운동이 지속되는 동안 심박수측정기(polar社(핀란드), S610)를 이용하여 5분마다 심박수를 측정하였으며, Borg 15pts scale을 이용하여 피험자들의 운동자각도 측정을 병행하였다.", "</p><h3>실험절차</h3><p>피험자의 심박수와 산소섭취량이 각각 \\( 70 \\mathrm{bpm} \\) 과 \\( 3.5 \\)\\( \\mathrm{ml} / \\mathrm{kg} / \\mathrm{min} \\) 이하를 나타날 때를 기준으로 안정 시점을 잡았으며, 운동강도는 총 4회의 실험을 실시하는 동안 모두 \\( \\dot{\\mathrm{v}} \\) \\( \\mathrm{O}_{2} \\mathrm{max} \\) 의 약 \\( 60 \\% \\)에 해당하는 \\( 5 \\mathrm{mph} \\)의 속도와 \\( 3 \\% \\)의 경사도를 부과한 절대강도로 90분간 달리기 운동을 실시하였다.", "운동 45분경과 후 2차 채혈을 하였고, 90분간의 운동이 종료되는 즉시 3 차 채혈을 하였으며, 회복 30분에 4차 채혈한 후 종료하였다.", "</p><p>실험은 통제, BCAA, BCAA+OKG, 그리고 BCAA+albumin 투여 등 총 네 가지 실험조건으로 구성되었으며, 각 실험조건에 적용한 채혈시기 및 운동 형태, 운동 강도와 시간은 동일하였고, 각 실험조건 사이의 일정간격을 충분히 두어 에너지 보충제와 운동 테스트로 인한 영향을 없애도록 하였다.", "</p><h2>자료처리 방법</h2><p>본 연구에서 얻은 자료는 SPSS 통계 package (v. 11.0)를 이용하여 기술통계량을 산출하였다.", "</p><p>에너지 기질과 호르몬 변화 형태 비교는 그룹, 시기를 독립변인으로 하는 4(그룹; 통제, BCAA, BCAA+OKG,BCAA+albumin) \\( \\times 4 \\) (시기; 안정, 운동 45분, 운동종료, 회복 30분) 요인설계하에 이루어졌으며, 이요인 분산분석법 (Two-way repeated ANOVA)을 이용하여 분석하였고, Tukey의 사후 검증법으로 평균치를 검색하였다 \\", "( (\\mathrm{p}<05) \\).", "</p> <p>갑상선 호르몬은 전체적인 대사율을 조절하는 중추적인 역할을 하며, 주기적인 열발생 및 안정시 대사율에도 영향을 미치고, 체중조절과도 밀접한 관련이 있는 호르몬으로 알려져 있다.", "모든 조직에 있어서 갑상선 호르몬은 대사율을 증진시키며, 안정시 대사량 비율을 \\( 60 \\sim 100 \\% \\) 까지 증진시킬 수 있다고 하였다.", "또한, 운동을 하는 동안 갑상선 자극 호르몬의 방출은 증가하는 반면, 금식 후에는 감소하는 경향이 있다.", "</p><p>갑상선 호르몬에 영향을 미칠 수 있는 요소는 연령, 음식과 열량, 계절의 변화, 생리 주기와 임신의 영향, 자세, 신체 활동의 제한, 운동, 지역과 환경, 수술이나 외상 등을 들 수 있으나, 정상인에게 있어서 갑상선 호르몬 수준의 변화는 체중 변화, 신체적 훈련, 습관, 자세, 활동의 감소 등에 의한 변화는 크지가 않고, 요오드(iodine)의 결핍이 일어나지 않는 한 영양에 의한 차이도 아주 적다고 할 수 있다.", "본 연구결과 갑상선 호르몬의 변화는 운동에 의해 약간 상승한 형태를 보여주고 있지만, 통계적으로 의미 없는 수준이며, 투여조건에 따라서도 차이를 보여주지 않고 있어, 일회성 운동이나 단기간의 영양소 섭취에 의해 민감하게 반응하여 분비되는 요인이 아님을 알 수 있다.", "</p><p>에너지 동원 형태와 관련하여 실펴본 에너지기질 중 하나인 혈중 글루코스는 네 가지 투여근 모두 운동 전에서 운동 45분까지 약간의 증가를 보이다가 종료시 약간 감소하는 경향을 보였으며 운동 전, 운동 45분, 종료시 모두 통제군이 가장 는은 경향을 보였다.", "이는 섭취한 BCAA와 OKG가 운동을 지속하는데 필요한 긍정적인 에너지원으로 이용된 것으로 보여진다.", "최대산소섭취량의 약 \\( 60 \\% \\) 로 운동하는 동안 간으로부터 생성된 글루쿠스는 운동시작 90 분 정도 후에는 감소되기 시작하고, 간에 저장된 글리코겐은 고갈되어진다.", "그러나 BCAA+OKG 그리고 BCAA+albumin을 투여하게 되면 투여된 BCAA와 그 밖의 물질이 근육으로 이동하고 산화되어 추가적인 에너지원을 공급하기 때문에 간에서 분해되어 혈중으로 방출되는 글루코스를 sparing 해주어 혈중의 글루코스 농도가 감소되는 것이다.", "즉, BCAA등의 투여는 지구성 운동 후반부에 활동근의 글리커겐 고갈로 인한 운동 수행능력 저하 현상을 막아주는데 도움을 줄 수 있을 것이다.", "</p><p>따라서, 본 연구에서는 BCAA, BCAA+OKG 그리고 BCAA+albumin 투여가 장시간의 운동시 에너지원으로 이용될 수 있으며 이는 운동 후반부에 일어나는 글리코겐의 고갈을 억제하여 운동수행력에 도움을 줄 수 있을 것이라 볼 수 있다.", "그러나, 에너지 동원 측면에서의 BCAA와 그 밖의 물질의 역할을 정확히 살펴보기 위해서 간 글리코겐 농도와 근육내 글리코겐의 분해정도, 그리고 근 글리코겐 고갈 후 산화되는 혈장의 BCAA 농도를 직접 측정한 더 많은 연구가 필요하다고 사료된다.", "</p><p>에너지 동원 형태와 관련하여 살펴본 또 다른 에너지기질인 유리지방산은 모든 시기에서 통제군에 비해 BCAA 투여군이 낮은 농도를 보였다.", "반면 모든 시기에서 BCAA+OKG 투여군과 BCAA+albumin 투여군이 통제군과 BCAA 투여군에 비해 높은 유리지방산 수치를 보였다.", "이와 같이, 모든 시기에 걸쳐 통제 군에 비해 BCAA+OKG 투여군과 BCAA+albumin 투여군의 유리지방산 농도가 높게 나타난 것은 BCAA+OKG와 BCAA+albumin 섭취 시 혈중 글루코스 농도가 다른 투여 군에 비해 낮게 나타난 결과와 관련지어 볼 수 있다.", "즉, 투여된 BCAA+OKG는 물질이 근육으로 이동하고 산화되어 추가적인 에너지원을 공급한다고 볼 수 있는 것이며 BCAA+albumin 투여 역시 지구성 운동 후반부에 활동근의 글리코겐 고갈로 인한 운동 수행 능력 저하 현상을 막아주는데 도움을 주며, 이는 같은 운동 강도를 상대적으로 낮게 인식하도록 하여 에너지원으로서 지방 이용을 증가시켰다고 볼 수 있다.", "또한, 투여된 알부민이 유리지방산이 근육으로 원활하게 이동하기 위한 긍정적인 효과로 작용했기 때문이라고 본다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구 대상</h2><p>본 연구의 대상자는 체육학 전공 남자 대학생 5명으로 하였다.", "신체적 톡성은 Table 1과 같다.", "</p><h2>투여방법</h2><p>BCAA (leucine \\( 50 \\% \\), isoleucine \\( 25 \\% \\), valine \\( 25 \\% \\))는 역삼투수 \\( 300 \\mathrm{ml} \\)에 용해시킨 후, 공복상태에서 운동 1시간 전 체중 \\( \\mathrm{kg} \\)당 \\( 78 \\mathrm{mg} \\)의 양 \\( (78 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg}) \\)을 섭취하도록 하였으며, OKG (ornithine \\(64\\%\\), a-ketoglutarate \\(36\\%\\)) 역시 역삼투수 \\( 300 \\mathrm{ml} \\)에 용해시킨 다음, 같은 방법으로 섭취하였다.", "알부민은 알부민 \\( 20 \\% \\)로 구성된 주사액으로 실험 2시간 전 각 피험자에게 정맥주사를 통해 투여하였고 \\( (1 \\mathrm{ml} / \\mathrm{kg}) \\), 약 60분에서 90분 정도의 투여시간을 마친 후 1시간 정도의 휴식을 취한 후 테스트에 참가하였다.", "</p><h2>채혈 및 분석</h2><p>네 가지 실험조건 모두 안정 시, 운동 45분, 운동종료 시, 회복 30분 등 개인당 총 16회의 채혈을 하였으며 각 시기마다 21 gage needle을 이용하여 주전정맥(antecubital vein)에서 채혈하였다.", "</p><h3>글루코스(glucose)</h3><p>채취한 혈액을 \\( 3,000 \\mathrm{rpm} \\)에서 15분간 원심 분리하여, 상층액을 건식생화학분석기(Kodak, EKTACJEM DT 60II)를 이용하여 분석하였다.", "</p><h3>유리 지방산(free fatty acid)</h3><p>섬유소원을 침전시키기 위한 clot activator가 포함된 vaccumtube를 이용하여 혈액을 채취한 후, \\( 3,000 \\mathrm{rpm} \\) 에서 15분간 원심 분리하였다.", "그리고 \\( 0.5 \\mathrm{ml} \\) 추출된 혈청에 증류수와 STD 용액을 각각 \\( 50 \\mu \\) 넣고, SICDIA NEFAZYME 검사 시약을 혼합한 훙, 5분간 찬물에 보관한 뒤, 생화학 분석기(Hitachis, Hitachi 7150)를 이용하여 측정하였다.", "</p><h3>암모니아(ammonia)</h3><p>Spectrophotometer (CL-750)를 사용하여 bethelot 반응을 알아보는 방법으로 분석하였다.", "먼저, 혈중 암모니아를 생성할 수 있는 효소의 활성을 소실시키는 제단백 용액 \\( 2 \\mathrm{m \\ell} \\)에 혈액 \\( 1 \\mathrm{m \\ell} \\) 섞어서 원심 분리한 후, 상층액을 분리하였다.", "그리고 phenol \\( 4 \\% \\), nitroprusside 염 \\( 0.015 \\% \\) 와 \\( \\mathrm{KOH} 4.1 \\% \\)를 첨가하여 알칼리성으로 만든 다음, 탄산칼륨 \\( 28 \\% \\)와 염소산 칼륨 \\( 3 \\% \\)가 함유되어 있는 시약을 사용하여 발색시킨 후, 파장 \\( 630\\mathrm{~nm} \\)에서 측정하였다.", "</p> <h1>요약</h1><p>이상의 연구를 종합해보면, 장시간 운동시 BCAA 투여는 BCAA 산화시 발생되는 암모니아 등의 피로물질 축적에 의해 운동수행에 부정적 영향을 미칠 수도 있으나, 체내 글루코스가 소진되어가는 시점에서 유용한 에너지원으로 기여되어 운동수행에 도움이 될 수 있다고 보여진다.", "또한, OKG나 알부민을 가중투여하면 크렙스 사이클의 중간물질로 또는 유리지방산 동원의 운반자로서 BCAA 단독 투여시 부정적으로 나타난 원인을 해결하여 운동수행에 긍정적 영향을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.", "그러나, 운동과 BCAA, 그리고 내분비 체계와의 관계는 각 호르몬의 역할과 기능에 따라 도출되는 결론이 다를 수 있어, 앞으로 BCAA 대사와 관련된 효소반응 등에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 본다.", "</p> <h1>결 과</h1><h2>글루코스</h2><p>혈중 글루코스 농도는 네 가지 투여 군에서 모두 안정시에서 운동45분까지 약간의 증가를 보이다가 운동 45분 이후 점차 감소하는 경향을 보였다.", "운동시기별 군간의 차이를 비교한 결과, 운동 45분에는 군간의 차이가 거의 없었지만, 운동종료시 BCAA+albumin 투여군의 수치가 가장 낮게 나타닜으며, 회복 30분에도 BCAA+albumin 투여군이 가장 낮게 나타났다.", "</p><h2>유리지방산</h2><p>혈중 유리지방산은 네 가지 실험조건 모두 안정시에서 운동종료까지 증가하였으나, 회복 30분에 BCAA와 BCAA+albumin 투여군은 계속 증가하고 통제군과 BCAA+OKG 투여군은 감소하는 경향을 보였다.", "</p><p>운동시기별 군간의 차이를 비교한 결과, 모든 시기에 BCAA+albumin 투여군의 혈중 유리지방산 농도가 가장 높게 나타났으며, 특히 회복 30분에는 통계적으로도 유의한 차이가 발견되었고 \\( (\\mathrm{p}<.05) \\), 그 다음으로 BCAA+OKG 투여군의 수치가 두 번째로 높게 나타났다.", "BCAA 투여군의 수치는 운동 45분과 운동종료 시 통제군 보다 낮게 나타났지만, 회복 30분에서는 통제군 보다 높게 나타났다.", "</p><h2>암모니아</h2><p>혈중 암모니아 농도는 네 가지 실험조건 모두 운동수행과 더불어 증가하여 운동종료 시에 최고치를 보였으며, 회복에 따라 안정시 수준으로 감소하는 경향을 나타내었다.", "운동시기별 군간의 차이를 비교한 결과, 안정시 BCAA 투여군이 가장 높았고, BCAA+albumin 투여군이 가장 낮았으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다.", "운동 45분경과 후, BCAA 투여군이 가장 높게 나타났으며, BCAA+OKG 투여군과 BCAA+albumin 투여군 모두 통제군과 BCAA 투여군 사이에서 통계적으로 유의한 차이가 나타났다 \\", "( (\\mathrm{p}<.05) \\).", "운동 종료 시에는 BCAA 투여군이 가장 높았고, BCAA+albumin 투여군이 가장 낮았으나 통계적으로 유의한 차이는 보이지 않았다.", "회복 30분 역시, BCAA+albumin 투여군의 혈중 암모니아 농도 수준이 가장 낮게 나타났지만, 군 간에 유의한 차이는 나타나지 않았다.", "</p><h2>성장호르몬</h2><p>혈중 성장호르몬 농도의 변화는 네 가지 투여 군 모두 안정시에서 운동 45분까지 증가하였으나, 운동 종료시에 통제군과 BCAA+OKG 투여군은 계속 증가하고 BCAA와 BCAA+albumin 투여군은 감소하는 경향을 보였다.", "운동시기별 군간의 차이를 비교한 결과, 종료시 BCAA와 BCAA+albumin 투여군 간에 유의한 차가 나타났으며 \\( (\\mathrm{p}<.05) \\), BCAA+OKG 투여군에서 가장 높은 수치를 보였다.", "</p><h2>인슐린</h2><p>혈중 인슐린 농도의 변화는 BCAA+albumin 투여군을 제외하고 모두 안정시에서 종료시까지 감소하였으며, 회복 시 증가하는 경향이 나타났다.", "군간에서는 유의한 차가 나타나지 않았지만, 종료시 BCAA+OKG 투여군에서 가장 낮은 수치를 보였으며, BCAA+albumin 투여군이 가장 높은 수치를 보였다.", "시기별로 비교했을 때, 운동 종료시 통제군, BCAA 투여군, BCAA+albumin 투여군에서 안정시와 유의한 차이를 보였다 \\", "( (\\mathrm{p}<.05)\\) .", "</p><h2>코티솔</h2><p>혈중 코티솔의 농도 변화는 모든 투여 군에서 안정시에서 종료시까지 증가하다가 BCAA+albumin 투여군을 제외하고 감소하는 경향을 보였다.", "군간에서는 유의한 차가 나타나지 않았지만, 종료시 BCAA 투여군에서 가장 높은 수치를 보였다.", "시기별로 비교했을 때, BCAA 투여군의 운동 45분과 종료시, 그리고 BCAA+albumin 투여군의 종료시에서 각각의 안정시와 유의한 차이를 보였다\\", "( (\\mathrm{p}<.05) \\).", "</p><h2>갑상선호르몬 \\( \\left(T_{3}, T_{4}\\right) \\)</h2><p>혈중 \\( \\mathrm{T}_{3} \\) 농도 변화는 BCAA+albumin 투여군을 제외하고 모두 안정시부터 종료시까지 증가하는 경향을 보였으나, 군간에서는 유의한 차가 나타나지 않았다.", "시기별로 비교했을 때, 비투여군과 BCAA 투여군의 운동 45분과 종료시가 각각의 안정시와 유의한 차이를 보였다 \\", "( (\\mathrm{p}<.05) \\) 혈중 \\( \\mathrm{T}_{4} \\) 의 농도는 안정시부터 운동 45분까지 감소하다가 종료시 증가하는 경향을 나타냈다.", "운동시기별 군간에서는 유의한 차가 나타나지 않았으나, 종료시 BCAA+OKG 투여군에서 가장 높은 수치를 보였다.", "</p> <h1>서론</h1><p>장시간 운동 시 단백질이 에너지원으로 중요한 역할을 한다고 알려진 이후 단백질이 운동수행에 미치는 영향과 에너지원으로서의 기여뿐만 아니라 호르몬과의 반응 등을 밝히는 연구들이 진행되고 있다.", "</p><p>BCAA(branched chain amino acid)는 루이신(leucine), 아이소루이신(isoleucine), 발린(valine)을 지칭하는 것으로 다른 필수 아미노산들은 주로 간에서 산화되어지는 것과는 달리 골격근에서 산화되어 운동 시 수축하는 골격근에서 사용된다고 알려져 있다.", "근육에서 BCAA는 운동중과 스트레스 상황 모두에서 중요한 기질로서 작용하며 다른 아미노산과 단백질 합성의 전구자로서 제공된다.", "또한 장시간의 운동 시 탄수화물이 고갈되고 에너지원으로서 지방 기여가 증가되면서 근육에서 중요한 에너지기질로 작용한다.", "</p><p>일반적으로 운동은 에너지 소비를 증가시키고 장시간 운동시 BCAA 산화를 크게 증진시킨다.", "BCAA는 운동 시 에너지원으로써 에너지 대사에 관여하며 크렙스 사이클(Kreb's cycle) 중간물질의 양을 증가시키고 당신생합성작용(gluconeogenesis)을 위한 기질로써 기여한다.", "실제로 MacLean 등은 운동 전 BCAA의 구강 투여가 운동 시 세포내와 혈액 내 BCAA 수치를 증가시켰고 내인성 근육 단백질 분해를 억제시켰다고 보고했다.", "그러나 Van Hall 등은 BCAA를 투여한 결과 크렙스 사이클 중간물질인 a-ketoglutarate의 감소를 보고하였으며, 이와 유사하게 Wagenmakers 등 또한 BCAA의 산화율 증가가 크렙스 사이클 중간물질의 점진적인 감소를 초래함으로써 오히려 에너지 고갈을 가져올 수 있다는 상반된 결과를 보였다.", "</p><p>장시간 운동 시 코티솔(cortisol), 성장호르몬(growth hormone), 갑상선호르몬 \\( \\left(\\mathrm{T}_{3,}, \\mathrm{~T}_{4}\\right) \\)의 분비 증가는 단백질 분해를 촉진시키고 필요한 에너지 생성을 위해 작용하게 된다.", "아미노산 섭취는 성장호르몬과 인슐린(insulin)의 분비를 촉진시키는데, 실제로 Shimomura 등이 인슐린과 \\( \\mathrm{T}_{3} \\)등이 BCAA의 대사 조절 효소인 BCKADH(branched-chain a-keto acid dehydrogenase)의 활성과 억제에 관여하는 BCKADH kinase의 발현에 관련이 깊다는 결과를 발표하면서 BCAA 대사와 연관된 호르몬의 변화를 관찰하는 것이 중요하게 대두되고 있다.", "그러나 BCAA 대사와 관련된 특정 호르몬의 변화에 대한 연구는 매우 부족한 실정에 있다.", "</p><p>한편, OKG(ornithine a-ketoglutarate)는 ornithine 2분자와 a-ketoglutarate 1분자로 형성된 염이며, 크렙스 사이클 연료원으로 글루타메이트(glutamate) 생성에 사용되며 당신생합성과정의 전구체로써 작용한다.", "또한, 인슐린과 성장호르몬 같은 동화작용적 호르몬의 분비와 대사산물의 합성에 관여하며, 골격근의 알지닌(arginine)과 글루타민(glutamine)의 양을 유의하게 증가시켰다는 보고가 있다.", "그러나, 아직까지 OKG의 작용기전이 완전히 알려지지는 않은 실정이다.", "</p><p>BCAA 투여와 운동수행과의 관계에 관한 연구들 중에는 BCAA 투여시 일어날 수 있는 크렙스 사이클 중간물질인 a-ketoglutarate의 고갈을 억체하는 측면에서 OKG를 투여한 연구도 있지만, 후속되는 연구들에 의해 실질적인 OKG 투여의 a-ketoglutarate 고갈 억제의 기전을 검증하지는 못하였다고 볼 수 있고, 다양한 실험군 시도에 의한 이론적 논점들의 상호 검증도 요구되어지고 있다.", "특히, 최근 인슬린, 코티솔, 갑상선 호르몬 등이 BCAA의 대사의 조설 효소인 BCKADH의 활성과 억제에 관여하는 BCKADH kinase 활동과 발현에 깊이 연관되어 있다는 연극결과가 발표되면서 BCAA 대사와 관련되어 이들 호르몬의 변화를 관찰하는 것이 매우 중요하다고 보고 있으나, 운동과 BCAA 대사를 호르몬과 연결시켜 수행한 포괄적인 연구는 아직은 미흡한 상태이다.", "</p><p>따라서, 본 연구는 BCAA와 BCAA 산화시 a-ketoglutarate 고갈을 억제하기 위해 OKG와 알부민(albumin)을 가중 투여하여 장시간 운동 시 혈중 에너지 대사산물(글루코스, 유리지방산, 암모니아)과 BCAA 산화와 관련된 호르몬(성장호르몬, 인슐린, 코티솔, \\( \\mathrm{T}_{3}, \\mathrm{~T}_{4}\\))에 미치는 영향을 규명하는데 그 목적이 있다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>단백질은 탄수화물과 지방에 비해 운동 시 에너지원으로의 기여가 상대적으로 작기 때문에, 덜 중요한 에너지원으로 생각할 수도 있다.", "그러나, 훈련된 선수들의 장시간 운동 수행 마지막 시점에 에너지원으로 기여한다는 중요성을 감안한다면, 일부 운동종목 선수들의 기록에 결정적인 영향을 미치는 중요한 에너지원이다.", "단백질은 인슐린, 성장호르몬, 그리고 BCAA 섭취에 의해서 합성이 증가하지만, 금식, 격렬한 운동, 그리고 코티솔에 의해 분해가 증가되고, BCAA와 같은 아미노산의 주입으로 단백질 분해는 감소된다.", "즉, 단백질의 합성과 분해를 증가 또는 감소시키는 많은 서로 다른 잠재적 조절자들이 다양하게 존재하고 있으며, 단백질 turnover의 순(net) 변화는 거의 이러한 합성과 분해에 관계된 조절자의 총화를 반영하며 변화된다고 볼 수 있다.", "이러한 조절자들 중에서 가장 잠재적인 조절자로 내분비 호르몬들을 들 수 있으며, 이는 순 단백질 변화와 거의 일치되며 변화하는 것으로 알려져 있다.", "</p><p>시상하부의 통제하에 뇌하수체 전엽에서 분비되는 성장 호르몬은 인슐린의 몇몇 작용에 반대되는 길항작용을 하지만, 근육과 간에 작용해서 인슐린과 유사한 합성의 역할을 하는 소마토미딘(somatomedins)이라고 알려진 펩타이드 IGF-1과 IGF-2의 방출을 자극하여 단백질 합성에 기여한다.", "운동과 관련되어 성장호르몬은 저항성 운동 후 왕성하게 분비되며, 운동 후 음식물을 섭취하는 몇 시간 동안 성장호르몬 분비가 증가된다는 연구결과로 운동형태와 에너지 기질 섭취가 운동 후 성장호르몬 분비에 중요하게 작용한다고 볼 수 있다.", "본 연구에서 성장호르몬 분비는 BCAA와 BCAA+OKG 투여군에서 운동과 회복 중 다른 투 여조건에 비해 높은 수준으로 나타났다.", "이러한 현상은 Chandler 등의 연구에서 지적한 바와 같이, 운동과 식이에 따라 성장호르몬 분비는 영향을 받으며, BCAA와 OKG 가중투여로 운동이 진행됨에 따라 분해되는 단백질을 억제하고 단백질 합성을 위한 과정이 진행되었기 때문이라고 사료된다.", "지구성 운동 중 증가되는 단백질 분해는 운동 중 합성되는 양 보다 분해되는 양이 많기 때문에 지구성 운동 중 단백질의 순 분해가 일어나고, 이것은 지구성 운동 중 필요한 에너지를 공급하는데 일부 기여하게 된다.", "하지만, 운동 전 BCAA와 OKG의 투여로 단백질 재합성을 위한 내 분비 체계의 생리적 기여가 발생되었으며, 아미노산 분해가 억제되어 암모니아 발생도 감소되었다고 보여진다.", "</p><p>강한 강도의 운동에서 혈중 암모니아 수치가 급격히 가하는 현상으로 아미노산의 대사가 증가된다고 보기도 하지만, 강한 강도의 운동시 증가되는 대부분의 암모니아는 체내의 total adenine nucleotides 양의 유지를 위해 진행되는 PNC cycle에서 생성되고, 아미노산의 대사에 의해 증가되는 암모니아 양은 일부로 보고 있다.", "하지만, Rowe는 근육 글루타메이트 농도가 단기간의 지치는 운동에서 안정시 수치의 \\( 25-50 \\% \\) 정도로 낮아지는 것을 볼 때, 근육의 높은 암모니아 농도가 glutamine synthetase 반응을 통해 글루타메이트를 고갈시키고 있는 상태일 것이라고 보았다.", "또한, Wagenmaker는 \\( 70 \\% \\) 최대산소섭취량으로 2시간 운동시켰을 때, 암모니아의 농도가 13-180 uM 까지 증가되었다고 보고하면서, 이러한 운동 강도에서 아미노산 의 에너지 기여가 증가한다고 했다.", "본 연구결과, BCAA+OKG와 BCAA+albumin 투여조건에서 암모니아 농도는 통제군과 BCAA투여조건에 비해서 운동하는 동안 낮게 나타났는데, 이는 장시간 운동시 나타나는 BCAA의 산화적 특성을 원인으로 제시할 수 있다.", "즉, 장시간 운동으로 글리코겐은 감소하고 BCAA의 산화가 증가하게 되면 BCAA가 산화되는 과정에서 이용하는 크렙스 회로 중간자인 a-ketoglutarate 농도는 감소하게 된다.", "a-ketoglutarate의 감소로 글루타메이트 역시 감소하게 되고 이는 글루타민 생성을 감소시킨다.", "따라서 글루타민 생성과 함께 제거되어야 할 암모니아가 제거되지 못하고 혈중에 축적된 것으로 볼 수 있다.", "반면, BCAA+OKG 투여군은 통제군과 BCAA 투여군에 비해 낮은 암모니아 농도를 보였는데 이는 선행연구 결과와 일치하는 것으로, BCAA와 더불어 섭취한 OKG가 BCAA만을 섭취 시킬 때 초래되는 대사적 문세점들을 해결한 것으로 볼 수 있다.", "즉, OKG를 섭취함으로써 크렙스 사이클의 중간물질인 a-ketoglutarate의 농도 감소가 억제 됐을 뿐만 아니라, 체내에서 글루타메이트를 생성하여 글루타데이트가 글루타민으로 전환되는 과정에서 암모니아를 제거한 것으로 볼 수 있다.", "그리고 요소회로 (urea cycle)의 중간물질인 오르니틴 (ornithine) 농도를 증가시켜 암모니아를 신속히 요소 (urea)로 전환시킴으로써 암모니아 농도가 감소된 것으로 보여진다.", "</p><p>인슐린은 골격근과 간의 글루코스 섭취와 글리코겐 합성을 증가시키는 것으로 잘 알려져 있다.", "그리고, 인슐린은 단백질과 관련하여 근육에서의 순 단백질 합성에 자극 효과를 가질 것으로 볼 수 있지만, 실제로 인슐린 효과는 근육 단백질 분해를 감소시키는데 있고, 근육 단백질 합성을 증가시키지는 않는 것으로 보고되고 있다.", "본 실험결과, 인슐린은 운동이 진행됨에 따라 감소되는 현상을 보여 운동시 에너지 저장 보다는 이용 측면에서의 생리적 요구에 부응하기위해 분비가 감소된 것으로 보인다.", "하지만, 운동과 회복 중 투여조건에 따른 인슐린 농도의 일관된 변화 형태 나타나지 않아, 아미노산 보충제 투여시 인슐린 분비가 촉진되며, 고인슐린분비혈증 (hyperinsulinemia)에서 근육의 단백질 합성과 BCAA 전달이 증가되는 것으로 보고한 Biolo 등의 선행연구와 유사한 점을 찾을 수 없었다.", "이러한 결과는 아마도, BCAA와 인슐린과의 관계를 안정 시 또는 운동종료 후 상당한 시간이 경과한 회복시점과 운동이 진행 중인 시점을 비교하는 데서 오는 차이라고 볼 수 있으며, 운동 중인 상태에서 인슐린 분비는 단백질 합성보다는 글루코스 이용측면에서 보다 민감하게 반응하여 작용한다고 볼 수 있다.", "</p><p>Sahlin 등의 연구결과에 따르면, 운동의 시작과 함께 근육 글루타메이트 농도가 빠르게 감소되는데, 이것은 글루타메이트가 a-ketoglutarate의 탄소골격과 크렙스 사이클의 다른 중간자들로 전환되기 때문이고, 크렙스 사이클 중간물질의 감소는 지방산 산화 제한을 초래하게 되어, 원활한 에너지 공급에 차질이 생기고, 운동선수는 페이스를 감소시켜야만 한다.", "따라서, 이러한 시기에 아미노산에 의한 크렙스 사이클 중간물질의 합성과 유지는 운동선수의 운동수행에 매우 중요한 역할을 하게 된다.", "Spencer는 운동의 시작 단계에서 증가된 해당과정 비율과 그에 따른 초성포도산 (pyruvate) 생성률의 증가가 글루타메이트로부터 생성되는 a-ketoglutarate와 알라닌 (alanine) 생성 사이의 빠른 평형을 가질 수 있도록 alanine aminotransferase 반응을 촉진시키는 역할을 한다고 했다.", "BCAA 산화와 관련된 코티솔의 기능은 단백질 분해를 자극하여 에너지를 생성시키는 기전에 관여하는 것이다.", "본 실험결과 BCAA 투여와 OKG 투여조건에서 운동종료 시 통제군보다 코티솔 분비가 높게 나타난 것은 운동시간이 경과함에 따라 에너지 생성을 위한 아미노산 공급을 위해 단백질 분해를 촉진하는 보상적 작용 때문인 것으로 사료된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", 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5,318	<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료 및 시료 조제</h2><p>본 실험에서 사용된 곡류(옥수수, 괴구마, 현미, 찹쌀, 엿질금, 건호박)는 눙산물유통공사에서 구입한 것이며, 생약제(백출, 황정, 감초, 윽계, 의이인)는 대기 약령시장에서 구입하여 사용하였다. 곡류 및 생약제를 깨끗한 물로 2번 씻어 낸 다음 \( 60 \sim 65^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 12시간동안 열풍건조 후 분쇄하여 생식 시로로 사용하였으며, 이것을 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분동안 볶아서 화식 시료로 사용하였다. 생식 및 화식의 성분은 옥수수 \( 50 \% \), 고구마\( 10 \% \), 현미 \( 10 \% \), 찹쌀\( 10 \% \), 엿질금 \( 5 \% \), 건호박 \( 5 \% \) 이며, 백출, 황정, 감초, 육계, 의이인이 각각 \( 2 \% \) 씩 포함되었다.</p><h2>실험동물 및 식이</h2><p>체중이 \( 100 \sim 120 g \)인 Sprague-Dawely계 흰쥐 수컷을 구입(대한 실험동물 센터)하여 온도 \( 22 \pm 0.5^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 55 \pm 5 \% \), 12시간의 명암 주기를 유지하는 사육실에서 stainlesss steel cage에 1마리씩 분리하여 일주일간 적응시켰다. 본 실험에 들어가기 전에 생식과 화식을 각각 흰쥐 \( (\mathrm{n}=5) \) 에 일주일간 자유급식하여 섭취량을 조사한 결과 화식군의 섭취량이 생식군보다 높게 나타난 것을 근거로 하여 생식군의 평균 섭취량만큼 화식을 급여한 화식제한군(CP group)을 포함하여 실험군을 체중에 따라 4군으로 나누었다. 실험 기간 동안 물과 식이는 자유롭게 섭취케 하였고, 고지혈 유발 식이는 cholesterol \( 0.5 \% \), sodium cholate \( 0.25 \% \) 와 lard \( 9 \% \) 가 포함된 일반사료를 사용하였다.</p><p>처음 2 주 동안은 고지혈증을 유발하기 위해 고지혈증 유발 식이를 먹인후 체중에 따라 4 군으로 나누었으며, 나머지 3주는 생식 또는 화식이 \( 30 \% \) 혼합된 식이를 공급하였다. 실험동물의 체중은 오전의 일정한 시간에 매일 측정 하였으며 식이 섭춰량은 각 실험군별로 체중 측정 직전에 잔량을 수거하여 측정하였다.</p><h2>소화시간 측정</h2><p>소화시간 측정은 실험동물올 16 시간 동안 절식시킨 후 각각의 식이에 camine을 \( 0.3 \% \) 섞어 30 분 동안 공급한 후 변에 camine이 나타나는 시간을 측정하였다.</p><h2>채혈, 혈장 및 장기분리</h2><p>사욕이 끝난 실험동물은 희생시키기 12 시간 전부터 절식시키고 물만 공급하였으펴, ether로 마춰하여 복부대동맥으로부터 주사기로 채혈한 혈액은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (3000 \) \( \mathrm{rpm} / 15 \) 분)하여 혈장으로 사용하였다. 간장, 신장 밎 비장의 무게는 복부 절단한 실험동물로부터 각 장기롤 적출해서 지방 및 기타 결합조직을 제거한 후 생리식염수 \( (0.9 \% \mathrm{NaCl}) \) 로 세척하고 여지로 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다.</p><h2>혈장 지질분석</h2><p>혈장 중의 total cholesterol, high-density lipoprotein(HDL) cholesterol, triglyceride 함량은 측정 kit (아산제약)를 이용한 호소법으로 측정하였으며, low-density lipoprotein (LDL) cholesterol 함량은 total cholesterol-HDL cho-lesterol-(triglyceride/5)의 공식을 이용하여 계산하였다. 심혈관계 질환의 위험도 판정에 사용되는 요인인 동맥경화 지수(atherogenic index)와 total cholesterol 중의 HDL cholesterol 농도비는 각각 (total cholesterol-HDL cholesterol)/HDL cholesterol과 HDL cholesterol/total cholesterol의 공식을 이용하여 게산하였다.</p><h2>간장 지질분석</h2><p>간장 중 지질은 Folch법로 추출하였다. 냉동 보관된 간조직에 \( 0.9 \% \mathrm{NaCl} \) 용매를 가하여 homogenizer로 균질화한 후 일정액을 취한 다음 \( \mathrm{CHCl}_{3}-\mathrm{MeOH}(2: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 용매를 가하여 거른 후 \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 를 첩가하여 혼합한 다음 2,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상층액은 제거하고 하층액을 일정량 취한 후 \( \mathrm{N}_{2} \) gas로 건주시켰다. 건조된 시료를 \( \mathrm{CHCl}_{3} \) 로 용해시키고 triton \( X-100[15] \) 으로 처리한 후 혈장의 경우와 동일한 방법으로 total cholesterol과 triglyceride 함량을 측정하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험 결과들온 SPSS (statistical package of social science) program을 이용하여 분석, 비교하였다. 각 결과들은 one-way ANOVA분석을 통해 실험군별로 평균(mean)\( \pm \) 표준오차(SE)로 나타내었으며, 각 실혐군간의 평균치의 통계적 유의성은 \( p<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple range test와 Student's \( t \)-test로 검정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>체중 증가량, 식이 섭취량, 식이효율 및 장기 중량</h2><p>생식과 화식을 고지질이 유발된 흰쥐에 3주간 급여한 각 군의 체중 증가량, 식이 섭취량 및 식이 효율은 Table 2 와같다. 체중 증가량과 식이 섭취량에 있어서 대조군과 실험군들 사이에 유의적인 차이가 없었다.</p><p>5주간의 실험이 끝난 후 흰쥐의 간, 신장 및 비장의 중량은 Table 3 과 같다. 각 장기의 중량은 대조군과 실험군들 사이에 별다른 차이를 보이지 않았다.</p><p>본 실험에서의 생식 식이가 대조군과 비교하여 별다른 차이를 보이지 않는 것으로 보아 생식 식이가 실험동물의 성장이나 섭취에 별 다른 이상을 미치지 않는 것으로 사료된다.</p><h2>혈장 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성지방 농도</h2><p>혈장 중의 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성지방 농도를 Table 4에 나타내었다.</p><p>총 콜레스테롤 농도는 대조군에 비해 생식군이 \( 8.8 \% \) 가 유의적으로 낮게 나타났다. 혈장 중 총 콜레스테롤은 고혈압, 동맥경화증, 폐쇄성 황달, 혈액병, 내분비 질환 등에서 상승하며 중요한 것은 심혈관계질환의 주된 원인이 되는 hyperlipidemia를 구성하는 주된 물질이다. 본 실험에서 나타난 생식 식이군의 혈장 총 콜레스테롤의 저하는 생식섬유질 식이가 화식섬유질 식이에 비하여 혈액내 콜레스테롤 함량을 더 많이 감소시킨다는 보고와 같은 결과로 섬유질에 의한 소장 goblet cell에서 분비되는 점액성 물질이 unstirred water layer를 형성하여 지질의 흡수를 방해하기 때문인 것으로 생각되므로, 생식 섭취에 의한 혈장 종 콜레스테롤 농도의 저하는 심장순환계 질환의 예방에 효과적일 것으로 사료된다.</p><p>HDL 콜레스테롤의 농도는 유의적인 차이는 나타나지 않았지만, 대조군에 비해 생식군이 높게 나타났다. 따라서, 생식의 섭취가 동맥경화나 심혈관계 질환의 진행을 어느 정도 억제하거나 경감시킬 것으로 생각된다. 이 결과는 율무를 흰쥐에 급여한 Aoki와 Tuzillara의 연구결과와 유사하였다.</p><p>중성지방의 농도는 대조군에 비해 생식군이 \( 10.0 \% \) 가 유의적으로 낮게 나타났다. 이는 생식 급여로 인한 모세혈관 벽의 지단백 분해효소(lipoprotein lipase)를 활성화하여 중성지질의 주요 운반체인 킬로미크론과 VLDL의 분해를 촉진한 것으로 사료된다.</p><h2>LDL-콜레스테롤, 동맥경화지수 및 총 콜레스테롤의 HDL 콜레스테롤 농도비</h2><p>LDL-콜레스테롤, 동맥경화지수 및 총 콜레스테롤의 HDL-콜레스테롤 농도비는 Table 5에 나타내었다. 혈장 LDL-콜레스테롤 농도와 동맥경화지수는 대조군에 비해 생식군이 각각 \( 34.8 \% \) 와 \( 37.6 \% \) 가 유의적으로 감소하였고, 총 콜레스테롤에 대한 HDL-cholesterol의 농도비는 대조군에 비해 생식군이 \( 47.2 \% \) 가 증가하였다.</p><p>일반적으로 LDL-콜레스테롤은 혈중 콜레스태롤의 주된 운반형으로서, 동맥 혈관벽에 콜레스테롤을 축적시켜 동맥 경화를 촉진하므로 혈장 LDL-콜레스테롤 농도와 관상심장질환의 발생과 밀접한 상관관계가 있다. HDL 입자가 HDL의 유리콜레스테롤을 에스테르화하는 lecithin cholesterol acyltransferase(LCAT)의 활성화에 관여함으로써 콜레스테롤의 세포내 유입을 억제한다고 보고한 Glomset 의 결과와 같이 본 실험의 LDL-콜레스테롤과 동맥경화지수가 감소하는 것과 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 농도비가 증가한 것으로 보아 동맥경화의 방지 효과가 있는 것으로 판단된다.</p><h2>간장 총 콜레스테롤과 중성지방 농도</h2><p>간장 중의 총 콜레스테롤과 중성지방 농도는 Table 6과 같다. 간장 총 콜레스테롤과 중성지방 농도는 대조군에 비해 생식 식이군이 비교적 낮게 나타났지만 유의적인 차이는 보이지 않았다.</p><p>Kang 등의 보고에 의하면 율무 시리얼을 고지방 흰쥐에 섭취시켰을 때 간장의 중성지방과 콜레스테롤 함량에는 별다른 차이를 보이지 않았으며, 본 실험에서도 간장의 경우에 중성지방과 총콜레스테롤 농도에 생식 식이가 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.</p><h2>소화시간</h2><p>각 실험군의 소화시간은 Table 7에 나타내었다. 식이를 섭취한 후 소화에 걸리는 시간을 측정한 결과 생식 식이군이 대조군보다 104 분이나 오래동안 체내에 머무는 것으로 나타났다. 이는 화식에 비하여 생식이 불용성 물질이 많이 함유되어 있는 관계로 장내에서 소화되는 시간이 오래 걸리는 것으로 보이며, 이는 적은 섭취량으로 포만감을 장기간 지속시켜 다이어트에도 효과가 있으리라 추측된다.</p> <h1>요약</h1><p>생식이 고지혈증에 미치는 영향을 알아보기 위하여 고지혈증이 유도된 흰쥐에 생식과 일반사료를 섞어 먹인 후 혈장 및 간장에서 지질 성분을 측정하였다. 그 결과 체중의 증가량, 식이 섭취량 및 식이 회율에는 실험군들의 차이가 없었다. 생식 식이군이 대조군에 비해 혈장 총 콜레스테롤 \( (8.8 \%) \), 중성지방(10.0\%) 및 LD)-콜레스테롤(34.8\%)이 유의적으로 낮게 나타났으며, HDL-콜레스테롤은 유의성은 없지만 대조군보다 높게 나타났고, 간장에서도 총 콜레스테롤 \( (8.7 \%) \) 과 중성지방(16.7\%)이 낮게 나타났다. 또한 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 농도비(47.2\%)가 유의하게 증가하였고, 동맥경화지수(37.6\%)는 유의적으로 감소하였오며, 소화시간은 생식 식이군이 대조군에 비해 104분이나 체내에 오래 머무는 것으로 나타났다.</p> <h1>서 론</h1><p>현재 우리나라는 변화하는 사회구조와 급격한 식생활의 변화로 풍부한 영양을 섭취하는 것으로 생각하고 있으나, 오히려 서구화된 식생활로 영양부족과 불균형으로 인한 심장병이나, 암, 당노병, 비만 등과 같은 성인병문제가 대두되고 있으며, 특히 과거의 성인병의 발병이 지금은 청소년층으로 낮아지고 있는 상황에 있다. 이러한 성인병들의 치료는 병원성 기전에 직접적으로 작용하는 의약품올 이용한 치로로도 가능하지만, 을바른 식사로 전환함으로서 예방하거나 회복 될 수 있다.</p><p>최근에 발표된 보고에 따르면 생식인, 채식인, 일반인, 이 3가지 그룹의 건강상태를 조사해본 결과 위장병, 변비, 빈혈, 당뇨, 고헐압, 간장병, 신장병, 심장병, 암, 신경통과 관절염에 대하여 생식인의 무질환율이 \( 94 \% \) 로 체식인의 \( 64 \% \) 와 일반인의 \( 36 \% \) 에 비하여 현저하게 높더는 통계를 보였다. 또한 생식인은 칼슘, 철분, 비타민 \( \mathrm{A}, \mathrm{~B}_{1}, \mathrm{~B}_{2} \), 나이아신, 비타민 C 섭춰량이 일반인에 비해 훨씬 많았다. 이들의 건강상태는 시럭, 혈압, 혈당, 간기능 검사와 같은 건강 지표에 있어서도 생식인들이 횔씬 좋은 결과를 보여주고 있다. 일반적으로 생식은 일반식에 비하여 5~6배의 에너지 효율올 가진다고 알려져 있다[18]. 생식은 가공 중의 영양소나 미네랄이 파괴되는 화식[12]과 달리 인체의 신진대사에 중요한 성분인 비타민, 미네릴 등의 각종 영양소와 효소, 엽록소, 섬유질이 자연 그대로 남아있어 인체의 자연성을 회복하는 방법 중의 하나이다. 이러한 생식의 효능과 함께 우리 몸의 면역기전이나 다른 생체방어기구들을 보강하여 인체의 항상성을 유지시키는 것으로 알려진 전통생약제재들의 약효가 융화될 경우는 그 효과가 훨씬 상승될 것이다. 전통 생약제제들 중 백출은 이뇨와 혈압저하제, 황정은 자양, 강장과 강심제, 감초는 위장 보호와 해독제, 육계는 지방산 대용제, 의이인은 자양, 강장, 건위와 이뇨제 등 한방약으로 사용되어왔다. 이러한 천연물 유래의 전통생약들은 예로부터 질병치료나 개선 목적의 약재이외에도 많은 건강식에 첨가되어서 사용되어 왔으나, 그것이 생식제품의 일부분만을 차지하고 있을 뿐 그것들의 효과에 관해서는 자세하게 언급되지 못하고 있다.</p><p>따라서 본 연구에서는 체질에 맞게 엄선된 곡류 및 약제를 이용하여 혼합식 생식을 개발하고, 생산된 혼합식 생식과 화식이 고지혈증에 어떠한 영향을 미치는지를 비교 연구 하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>현재 우리나라는 변화하는 사회구조와 급격한 식생활의 변화로 풍부한 영양을 섭취하는 것으로 생가하고 있으나, 오히려 서구화된 식생활로 영양부족과 불균형으로 인한 심장병이나, 암, 당뇨병, 비만 등과 같은 성인병둔제가 대두 되고 있으며, 특히 과거의 성인병의 발병이 지곰은 청소년층으로 낮아지고 있는 상황에 있다. 이러한 성인병들의 치료는 병원성 기전에 직접적으로 작용하는 의약품을 이용한 치료로도 가능하지만, 을바른 식사로 전환함으로서 예방하거나 회복 될 수 있다.</p><p>최근에 발표된 보고에 따르면 생식인, 채식인, 일반인, 이 3 가지 그룹의 건강상태를 조사해본 결과 위장병, 변비, 빈혈, 당노, 고혈압, 간장병, 신장병, 심장병, 암, 신경통과 관절염에 대하여 생식인의 무질환율이 \( 94 \% \) 로 체식인의 \( 64 \% \) 와 일반인의 \( 36 \% \) 에 비하여 현저하게 높다는 통계를 보였다. 또한 생식인은 칼슘, 철분, 비타민 \( \mathrm{A}, \mathrm{B}_{1}, \mathrm{~B}_{2} \), 나이아신, 비타민 \( C \) 섭취량이 일반인에 비해 훨씬 많았다. 이들의 건강상태는 시력, 헐압, 혈당, 간기능 검사와 같은 건강 지표에 있어서도 생식인들이 횔씬 좋은 결과를 보여주고 있다. 일반적으로 생식은 일반식에 비하여 5~6배의 에너지 효율을 가진다고 알려져 있다. 생식은 가공 중의 영양소나 미네랄이 파괴되는 화식과 달리 인체의 신진대사에 중요한 성분인 비타민, 미네랄 등의 각종 영양소와 효소, 엽록소, 섬유질이 자연 그대로 남아있어 인체의 자연성을 회복하는 방법 중의 하나이다. 이러한 생식의 효능과 함께 우리 몸의 면역기전이나 다른 생체방어기구들을 보강하여 인체의 항상성을 유지시키는 것으로 알려진 전통생약제재들의 약효가 융화될 경우는 그 효과가 훨씬 상승될 것이다. 전통 생약제제들 중 벡출은 이뇨와 혈압저하제, 황정은 자양, 강장과 강심제, 감초는 위장 보호와 해독제, 육계는 지방산 대용제, 의이인은 자양, 강장,건위와 이뇨제 등 한방약으로 사용되어왔다. 이러한 천연물 유래의 전통생약들은 예로부터 질병치료나 개선 목적의 약재이외에도 많은 건강식에 첨가되어서 사용되어 왔으나, 그것이 생식제품의 일부분만을 차지하고 있을 뿐 그것들의 효과에 관해서는 자세하게 언급되지 못하고 있다.</p><p>따라서 본 연구에서는 체질에 맞게 엄선된 곡류 및 약제를 이용하여 혼합식 생식을 개발하고, 싱산된 혼합식 생식과 화식이 고지혈증에 어떠한 영향을 미치는지를 비교 연구 하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료 및 시료 조제</h2><p>본 실험에서 사용된 곡류(옥수수, 괴구마, 현미, 찹쌀, 엿질금, 건호박)는 눙산물유통공사에서 구입한 것이며, 생약제(백출, 황정, 감초, 윽계, 의이인)는 대기 약령시장에서 구입하여 사용하였다.", "곡류 및 생약제를 깨끗한 물로 2번 씻어 낸 다음 \\( 60 \\sim 65^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 12시간동안 열풍건조 후 분쇄하여 생식 시로로 사용하였으며, 이것을 \\( 100^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 30 분동안 볶아서 화식 시료로 사용하였다.", "생식 및 화식의 성분은 옥수수 \\( 50 \\% \\), 고구마\\( 10 \\% \\), 현미 \\( 10 \\% \\), 찹쌀\\( 10 \\% \\), 엿질금 \\( 5 \\% \\), 건호박 \\( 5 \\% \\) 이며, 백출, 황정, 감초, 육계, 의이인이 각각 \\( 2 \\% \\) 씩 포함되었다.", "</p><h2>실험동물 및 식이</h2><p>체중이 \\( 100 \\sim 120 g \\)인 Sprague-Dawely계 흰쥐 수컷을 구입(대한 실험동물 센터)하여 온도 \\( 22 \\pm 0.5^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 습도 \\( 55 \\pm 5 \\% \\), 12시간의 명암 주기를 유지하는 사육실에서 stainlesss steel cage에 1마리씩 분리하여 일주일간 적응시켰다.", "본 실험에 들어가기 전에 생식과 화식을 각각 흰쥐 \\( (\\mathrm{n}=5) \\) 에 일주일간 자유급식하여 섭취량을 조사한 결과 화식군의 섭취량이 생식군보다 높게 나타난 것을 근거로 하여 생식군의 평균 섭취량만큼 화식을 급여한 화식제한군(CP group)을 포함하여 실험군을 체중에 따라 4군으로 나누었다.", "실험 기간 동안 물과 식이는 자유롭게 섭취케 하였고, 고지혈 유발 식이는 cholesterol \\( 0.5 \\% \\), sodium cholate \\( 0.25 \\% \\) 와 lard \\( 9 \\% \\) 가 포함된 일반사료를 사용하였다.", "</p><p>처음 2 주 동안은 고지혈증을 유발하기 위해 고지혈증 유발 식이를 먹인후 체중에 따라 4 군으로 나누었으며, 나머지 3주는 생식 또는 화식이 \\( 30 \\% \\) 혼합된 식이를 공급하였다.", "실험동물의 체중은 오전의 일정한 시간에 매일 측정 하였으며 식이 섭춰량은 각 실험군별로 체중 측정 직전에 잔량을 수거하여 측정하였다.", "</p><h2>소화시간 측정</h2><p>소화시간 측정은 실험동물올 16 시간 동안 절식시킨 후 각각의 식이에 camine을 \\( 0.3 \\% \\) 섞어 30 분 동안 공급한 후 변에 camine이 나타나는 시간을 측정하였다.", "</p><h2>채혈, 혈장 및 장기분리</h2><p>사욕이 끝난 실험동물은 희생시키기 12 시간 전부터 절식시키고 물만 공급하였으펴, ether로 마춰하여 복부대동맥으로부터 주사기로 채혈한 혈액은 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 원심분리 \\( (3000 \\) \\( \\mathrm{rpm} / 15 \\) 분)하여 혈장으로 사용하였다.", "간장, 신장 밎 비장의 무게는 복부 절단한 실험동물로부터 각 장기롤 적출해서 지방 및 기타 결합조직을 제거한 후 생리식염수 \\( (0.9 \\% \\mathrm{NaCl}) \\) 로 세척하고 여지로 수분을 제거한 후 무게를 측정하였다.", "</p><h2>혈장 지질분석</h2><p>혈장 중의 total cholesterol, high-density lipoprotein(HDL) cholesterol, triglyceride 함량은 측정 kit (아산제약)를 이용한 호소법으로 측정하였으며, low-density lipoprotein (LDL) cholesterol 함량은 total cholesterol-HDL cho-lesterol-(triglyceride/5)의 공식을 이용하여 계산하였다.", "심혈관계 질환의 위험도 판정에 사용되는 요인인 동맥경화 지수(atherogenic index)와 total cholesterol 중의 HDL cholesterol 농도비는 각각 (total cholesterol-HDL cholesterol)/HDL cholesterol과 HDL cholesterol/total cholesterol의 공식을 이용하여 게산하였다.", "</p><h2>간장 지질분석</h2><p>간장 중 지질은 Folch법로 추출하였다.", "냉동 보관된 간조직에 \\( 0.9 \\% \\mathrm{NaCl} \\) 용매를 가하여 homogenizer로 균질화한 후 일정액을 취한 다음 \\( \\mathrm{CHCl}_{3}-\\mathrm{MeOH}(2: 1, \\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\) 용매를 가하여 거른 후 \\( \\mathrm{CaCl}_{2} \\) 를 첩가하여 혼합한 다음 2,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상층액은 제거하고 하층액을 일정량 취한 후 \\( \\mathrm{N}_{2} \\) gas로 건주시켰다.", "건조된 시료를 \\( \\mathrm{CHCl}_{3} \\) 로 용해시키고 triton \\( X-100[15] \\) 으로 처리한 후 혈장의 경우와 동일한 방법으로 total cholesterol과 triglyceride 함량을 측정하였다.", "</p><h2>통계처리</h2><p>본 실험 결과들온 SPSS (statistical package of social science) program을 이용하여 분석, 비교하였다.", "각 결과들은 one-way ANOVA분석을 통해 실험군별로 평균(mean)\\( \\pm \\) 표준오차(SE)로 나타내었으며, 각 실혐군간의 평균치의 통계적 유의성은 \\( p<0.05 \\) 수준에서 Duncan's multiple range test와 Student's \\( t \\)-test로 검정하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>체중 증가량, 식이 섭취량, 식이효율 및 장기 중량</h2><p>생식과 화식을 고지질이 유발된 흰쥐에 3주간 급여한 각 군의 체중 증가량, 식이 섭취량 및 식이 효율은 Table 2 와같다.", "체중 증가량과 식이 섭취량에 있어서 대조군과 실험군들 사이에 유의적인 차이가 없었다.", "</p><p>5주간의 실험이 끝난 후 흰쥐의 간, 신장 및 비장의 중량은 Table 3 과 같다.", "각 장기의 중량은 대조군과 실험군들 사이에 별다른 차이를 보이지 않았다.", "</p><p>본 실험에서의 생식 식이가 대조군과 비교하여 별다른 차이를 보이지 않는 것으로 보아 생식 식이가 실험동물의 성장이나 섭취에 별 다른 이상을 미치지 않는 것으로 사료된다.", "</p><h2>혈장 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 중성지방 농도</h2><p>혈장 중의 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 및 중성지방 농도를 Table 4에 나타내었다.", "</p><p>총 콜레스테롤 농도는 대조군에 비해 생식군이 \\( 8.8 \\% \\) 가 유의적으로 낮게 나타났다.", "혈장 중 총 콜레스테롤은 고혈압, 동맥경화증, 폐쇄성 황달, 혈액병, 내분비 질환 등에서 상승하며 중요한 것은 심혈관계질환의 주된 원인이 되는 hyperlipidemia를 구성하는 주된 물질이다.", "본 실험에서 나타난 생식 식이군의 혈장 총 콜레스테롤의 저하는 생식섬유질 식이가 화식섬유질 식이에 비하여 혈액내 콜레스테롤 함량을 더 많이 감소시킨다는 보고와 같은 결과로 섬유질에 의한 소장 goblet cell에서 분비되는 점액성 물질이 unstirred water layer를 형성하여 지질의 흡수를 방해하기 때문인 것으로 생각되므로, 생식 섭취에 의한 혈장 종 콜레스테롤 농도의 저하는 심장순환계 질환의 예방에 효과적일 것으로 사료된다.", "</p><p>HDL 콜레스테롤의 농도는 유의적인 차이는 나타나지 않았지만, 대조군에 비해 생식군이 높게 나타났다.", "따라서, 생식의 섭취가 동맥경화나 심혈관계 질환의 진행을 어느 정도 억제하거나 경감시킬 것으로 생각된다.", "이 결과는 율무를 흰쥐에 급여한 Aoki와 Tuzillara의 연구결과와 유사하였다.", "</p><p>중성지방의 농도는 대조군에 비해 생식군이 \\( 10.0 \\% \\) 가 유의적으로 낮게 나타났다.", "이는 생식 급여로 인한 모세혈관 벽의 지단백 분해효소(lipoprotein lipase)를 활성화하여 중성지질의 주요 운반체인 킬로미크론과 VLDL의 분해를 촉진한 것으로 사료된다.", "</p><h2>LDL-콜레스테롤, 동맥경화지수 및 총 콜레스테롤의 HDL 콜레스테롤 농도비</h2><p>LDL-콜레스테롤, 동맥경화지수 및 총 콜레스테롤의 HDL-콜레스테롤 농도비는 Table 5에 나타내었다.", "혈장 LDL-콜레스테롤 농도와 동맥경화지수는 대조군에 비해 생식군이 각각 \\( 34.8 \\% \\) 와 \\( 37.6 \\% \\) 가 유의적으로 감소하였고, 총 콜레스테롤에 대한 HDL-cholesterol의 농도비는 대조군에 비해 생식군이 \\( 47.2 \\% \\) 가 증가하였다.", "</p><p>일반적으로 LDL-콜레스테롤은 혈중 콜레스태롤의 주된 운반형으로서, 동맥 혈관벽에 콜레스테롤을 축적시켜 동맥 경화를 촉진하므로 혈장 LDL-콜레스테롤 농도와 관상심장질환의 발생과 밀접한 상관관계가 있다.", "HDL 입자가 HDL의 유리콜레스테롤을 에스테르화하는 lecithin cholesterol acyltransferase(LCAT)의 활성화에 관여함으로써 콜레스테롤의 세포내 유입을 억제한다고 보고한 Glomset 의 결과와 같이 본 실험의 LDL-콜레스테롤과 동맥경화지수가 감소하는 것과 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 농도비가 증가한 것으로 보아 동맥경화의 방지 효과가 있는 것으로 판단된다.", "</p><h2>간장 총 콜레스테롤과 중성지방 농도</h2><p>간장 중의 총 콜레스테롤과 중성지방 농도는 Table 6과 같다.", "간장 총 콜레스테롤과 중성지방 농도는 대조군에 비해 생식 식이군이 비교적 낮게 나타났지만 유의적인 차이는 보이지 않았다.", "</p><p>Kang 등의 보고에 의하면 율무 시리얼을 고지방 흰쥐에 섭취시켰을 때 간장의 중성지방과 콜레스테롤 함량에는 별다른 차이를 보이지 않았으며, 본 실험에서도 간장의 경우에 중성지방과 총콜레스테롤 농도에 생식 식이가 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.", "</p><h2>소화시간</h2><p>각 실험군의 소화시간은 Table 7에 나타내었다.", "식이를 섭취한 후 소화에 걸리는 시간을 측정한 결과 생식 식이군이 대조군보다 104 분이나 오래동안 체내에 머무는 것으로 나타났다.", "이는 화식에 비하여 생식이 불용성 물질이 많이 함유되어 있는 관계로 장내에서 소화되는 시간이 오래 걸리는 것으로 보이며, 이는 적은 섭취량으로 포만감을 장기간 지속시켜 다이어트에도 효과가 있으리라 추측된다.", "</p> <h1>요약</h1><p>생식이 고지혈증에 미치는 영향을 알아보기 위하여 고지혈증이 유도된 흰쥐에 생식과 일반사료를 섞어 먹인 후 혈장 및 간장에서 지질 성분을 측정하였다.", "그 결과 체중의 증가량, 식이 섭취량 및 식이 회율에는 실험군들의 차이가 없었다.", "생식 식이군이 대조군에 비해 혈장 총 콜레스테롤 \\( (8.8 \\%) \\), 중성지방(10.0\\%) 및 LD)-콜레스테롤(34.8\\%)이 유의적으로 낮게 나타났으며, HDL-콜레스테롤은 유의성은 없지만 대조군보다 높게 나타났고, 간장에서도 총 콜레스테롤 \\( (8.7 \\%) \\) 과 중성지방(16.7\\%)이 낮게 나타났다.", "또한 총 콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤 농도비(47.2\\%)가 유의하게 증가하였고, 동맥경화지수(37.6\\%)는 유의적으로 감소하였오며, 소화시간은 생식 식이군이 대조군에 비해 104분이나 체내에 오래 머무는 것으로 나타났다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>현재 우리나라는 변화하는 사회구조와 급격한 식생활의 변화로 풍부한 영양을 섭취하는 것으로 생각하고 있으나, 오히려 서구화된 식생활로 영양부족과 불균형으로 인한 심장병이나, 암, 당노병, 비만 등과 같은 성인병문제가 대두되고 있으며, 특히 과거의 성인병의 발병이 지금은 청소년층으로 낮아지고 있는 상황에 있다.", "이러한 성인병들의 치료는 병원성 기전에 직접적으로 작용하는 의약품올 이용한 치로로도 가능하지만, 을바른 식사로 전환함으로서 예방하거나 회복 될 수 있다.", "</p><p>최근에 발표된 보고에 따르면 생식인, 채식인, 일반인, 이 3가지 그룹의 건강상태를 조사해본 결과 위장병, 변비, 빈혈, 당뇨, 고헐압, 간장병, 신장병, 심장병, 암, 신경통과 관절염에 대하여 생식인의 무질환율이 \\( 94 \\% \\) 로 체식인의 \\( 64 \\% \\) 와 일반인의 \\( 36 \\% \\) 에 비하여 현저하게 높더는 통계를 보였다.", "또한 생식인은 칼슘, 철분, 비타민 \\( \\mathrm{A}, \\mathrm{~B}_{1}, \\mathrm{~B}_{2} \\), 나이아신, 비타민 C 섭춰량이 일반인에 비해 훨씬 많았다.", "이들의 건강상태는 시럭, 혈압, 혈당, 간기능 검사와 같은 건강 지표에 있어서도 생식인들이 횔씬 좋은 결과를 보여주고 있다.", "일반적으로 생식은 일반식에 비하여 5~6배의 에너지 효율올 가진다고 알려져 있다[18].", "생식은 가공 중의 영양소나 미네랄이 파괴되는 화식[12]과 달리 인체의 신진대사에 중요한 성분인 비타민, 미네릴 등의 각종 영양소와 효소, 엽록소, 섬유질이 자연 그대로 남아있어 인체의 자연성을 회복하는 방법 중의 하나이다.", "이러한 생식의 효능과 함께 우리 몸의 면역기전이나 다른 생체방어기구들을 보강하여 인체의 항상성을 유지시키는 것으로 알려진 전통생약제재들의 약효가 융화될 경우는 그 효과가 훨씬 상승될 것이다.", "전통 생약제제들 중 백출은 이뇨와 혈압저하제, 황정은 자양, 강장과 강심제, 감초는 위장 보호와 해독제, 육계는 지방산 대용제, 의이인은 자양, 강장, 건위와 이뇨제 등 한방약으로 사용되어왔다.", "이러한 천연물 유래의 전통생약들은 예로부터 질병치료나 개선 목적의 약재이외에도 많은 건강식에 첨가되어서 사용되어 왔으나, 그것이 생식제품의 일부분만을 차지하고 있을 뿐 그것들의 효과에 관해서는 자세하게 언급되지 못하고 있다.", "</p><p>따라서 본 연구에서는 체질에 맞게 엄선된 곡류 및 약제를 이용하여 혼합식 생식을 개발하고, 생산된 혼합식 생식과 화식이 고지혈증에 어떠한 영향을 미치는지를 비교 연구 하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>현재 우리나라는 변화하는 사회구조와 급격한 식생활의 변화로 풍부한 영양을 섭취하는 것으로 생가하고 있으나, 오히려 서구화된 식생활로 영양부족과 불균형으로 인한 심장병이나, 암, 당뇨병, 비만 등과 같은 성인병둔제가 대두 되고 있으며, 특히 과거의 성인병의 발병이 지곰은 청소년층으로 낮아지고 있는 상황에 있다.", "이러한 성인병들의 치료는 병원성 기전에 직접적으로 작용하는 의약품을 이용한 치료로도 가능하지만, 을바른 식사로 전환함으로서 예방하거나 회복 될 수 있다.", "</p><p>최근에 발표된 보고에 따르면 생식인, 채식인, 일반인, 이 3 가지 그룹의 건강상태를 조사해본 결과 위장병, 변비, 빈혈, 당노, 고혈압, 간장병, 신장병, 심장병, 암, 신경통과 관절염에 대하여 생식인의 무질환율이 \\( 94 \\% \\) 로 체식인의 \\( 64 \\% \\) 와 일반인의 \\( 36 \\% \\) 에 비하여 현저하게 높다는 통계를 보였다.", "또한 생식인은 칼슘, 철분, 비타민 \\( \\mathrm{A}, \\mathrm{B}_{1}, \\mathrm{~B}_{2} \\), 나이아신, 비타민 \\( C \\) 섭취량이 일반인에 비해 훨씬 많았다.", "이들의 건강상태는 시력, 헐압, 혈당, 간기능 검사와 같은 건강 지표에 있어서도 생식인들이 횔씬 좋은 결과를 보여주고 있다.", "일반적으로 생식은 일반식에 비하여 5~6배의 에너지 효율을 가진다고 알려져 있다.", "생식은 가공 중의 영양소나 미네랄이 파괴되는 화식과 달리 인체의 신진대사에 중요한 성분인 비타민, 미네랄 등의 각종 영양소와 효소, 엽록소, 섬유질이 자연 그대로 남아있어 인체의 자연성을 회복하는 방법 중의 하나이다.", "이러한 생식의 효능과 함께 우리 몸의 면역기전이나 다른 생체방어기구들을 보강하여 인체의 항상성을 유지시키는 것으로 알려진 전통생약제재들의 약효가 융화될 경우는 그 효과가 훨씬 상승될 것이다.", "전통 생약제제들 중 벡출은 이뇨와 혈압저하제, 황정은 자양, 강장과 강심제, 감초는 위장 보호와 해독제, 육계는 지방산 대용제, 의이인은 자양, 강장,건위와 이뇨제 등 한방약으로 사용되어왔다.", "이러한 천연물 유래의 전통생약들은 예로부터 질병치료나 개선 목적의 약재이외에도 많은 건강식에 첨가되어서 사용되어 왔으나, 그것이 생식제품의 일부분만을 차지하고 있을 뿐 그것들의 효과에 관해서는 자세하게 언급되지 못하고 있다.", "</p><p>따라서 본 연구에서는 체질에 맞게 엄선된 곡류 및 약제를 이용하여 혼합식 생식을 개발하고, 싱산된 혼합식 생식과 화식이 고지혈증에 어떠한 영향을 미치는지를 비교 연구 하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "생식이 고지혈증 흰쥐에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-abb6a729-2a8c-47c3-b5f1-ebae7b3ec20d", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2001", "doc_author": [ "양병근", "정상철", "박준보", "조성필", "최영선", "임상규", "송치현" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,319	<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상</h2><p>연구의 대상은 B광역시 G고등학교 재학중인 건강한 남자고등학생으로 본 연구의 목적을 이해하고 참여에 동의한 24명을 대상으로 하였다. 참여자로부터 연구시작 전 실험 참여 동의서를 받았고, 그룹은 무작위로 선정하여 태권도\(+\)부추섭취군 \( (\mathrm{n}=6) \), 태권도군 \( (\mathrm{n}=6) \), 부추섭취군 \( (\mathrm{n}=6) \), 대조군 \( (n=6) \)으로 구분하였다. 대상자들의 신체적 특성은 Table 1과 같으며 나이, 신장, 체중, BMI는 집단 간 유의한 차이가 없었다.</p><h2>운동방법</h2><p>태권도 프로그램은 김명일의 태권도 프로그램을 수정 보완하여 구성하였고, 운동강도는 PPLAR (Polar RS400sd, APAC, 90026360, USA)를 통한 심박수 변화량을 측정하여 \(1 \sim5\)주는 \(60 \sim 70\%\)HRR, \(6\sim 10\)주는 \(70 \sim 80\%\)HRR로 설정하였으며, 주 4회씩 매회 50분간, 10주간 실시하였으며, 태권도 프로그램은 Table 2와 같다.</p><h2>식이방법</h2><p>부추섭취는 10주간 부추환을 섭취시켰다. 부추환을 섭취하는 동안 일체의 약물이나 건강보조식품을 금하였고, 부추환의 성분은 수분 \( 11.0 \% \), 조단백질 \( 17.3 \% \), 조지방 \( 4.5 \% \), 조회분 \( 9.5 \% \)이었다.</p><h2>분석방법</h2><h3>신체조성</h3><p>피험자들의 신장과 체중, 체지방률, 부위별 근육량은 X-SCAN PLUS Ⅱ (JAWON Medical, PYD0017-070418, Korea)를 이용하여 반팔과 반바지의 간편한 복장으로 양말을 벗고, 시계와 목걸이, 귀고리 및 반지 등 금속류를 제거한 후, 기기에 올라서서 자동으로 신장과 체중을 측정하고, 양팔을 차렷 자세에서 가볍게 벌린 상태에서 힘을 뺀 편안한 자세로 체지방률과 부위별 근육량을 2회(0주, 10주) 측정하였다.</p><h3>혈액채취 및 분석방법</h3><p>실험 전 (0주)과 실험 후(10주)에 채혈 12시간 전 공복상태로 피험자의 전완정맥에서 \( 10 \mathrm{ml} \)를 채혈하여 원심분리기로 10분 간 \(3,000 \mathrm{rpm}\)에서 원심 분리하여 혈청을 분리한 후 분석 시까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서 보관 후 분석하였다.</p><h3>혈중지질</h3><p>혈중지질 검사는 총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C), 저밀도지단백 콜레스테롤 (LDL-C)의 농도는 혈액자동분석기(HTTACHI 7600-210 \(\&\) HITACHI 7180, Japan)에서 분석하였다.</p><h3>C반응단백</h3><p>High sensitivity C-반응단백은 BN Ⅱ 분석기(Dad Behring Inc, Deerfield, Illinois, USA)를 사용하여 자동화된 면역 비탁법(latex-enhanced immunonephelometric assay)으로 측정하였다.</p><h2>자료처리</h2><p>자료처리는 SPSS 18.0 통계프로그램을 이용하였으며, 측정된 모든 자료에 대해 평균과 표준편차(Mean\( \pm \)SD)를 산출하였다. 집단 내 사전·후 차이검증은 paired t-test, 집단 간 차이검증은 일원변량분석(one-way ANOVA)를 실시하였다. 사후검증은 Duncan을 실시하였으며, 통계적 유의적 수준은 \( \alpha=0.05 \)로 하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>청소년기는 신체적·심리적으로 급속한 성장과 발달이 일어나고 자아 개념이 구체적으로 형성되면서 호기심과 자극에 대해 매우 민감하기 때문에 이 시기의 학습과 경험은 그 사람의 평생을 좌우하며 인격 및 태도의 결정적 요인으로 작용하게 된다. 또한 청소년기에 있어서 스포츠 활동의 중요성을 인식하게 하고, 스포츠 활동을 적극적으로 권장함으로써 스포츠 활동을 적극적으로 권장함으로써 스포츠를 통하여 습득되는 활동 능력은 원만한 대인관계를 형성을 위한 필요한 지식 및 인격발달에 도움을 줄뿐만 아니라 집단생활에서 요구되는 새로운 경험을 제공해 준다.</p><p>혼자서 하는 운동보다 친구들과 어울러서 할 수 있는 운동이 지루하지 않으며 장기간 규칙적으로 실시할 수 있게 된다고 하였는데, 이러한 요소를 포함하고 있는 운동 중 하나가 태권도이며, 태권도는 우리나라 민족의 역사와 전통을 지닌 고유의 무술이며, 무도이다. 또한 태권도는 수련자들에게 강인하고 용기 있는 성품을 만들어 주어 매사에 주저함이 없이 앞장설 수 있는 통솔력과 강한 담력을 길러줄 수 있기 때문에 각광 받고 있는 스포츠 종목이라 할 수 있다.</p><p>태권도는 신체의 모든 부위를 사용하여 근력, 근지구력, 심폐지구력은 물론 뼈와 관절 및 근조직을 발달시켜 청소년은 물론 성인의 체력단련 및 균형 잡힌 신체를 형성하는데 도움을 주는 운동방법이며, 청소년기 태권도 실시에 따른 체력 및 혈중 지질 비교에서 체력의 향상 및 고밀도 지단백 콜레스테롤의(High density lipoprotein cholesterol; HDL-C)의 증가와 저밀도 지단백 콜레스테롤(Low density lipoprotein cholesterol; LDL-C)가 감소한다고 하였다. 또한 태권도 수련 집단과 비수련집단간 총콜레스테롤(Total cholesterol; TC), HDL-C, LDL-C, 혈당(glucose)에서 유의한 차가 나타나지 않았지만 비교집단의 수치가 태권도 수련집단에 비해 높은 경향을 나타내었다고 하여, 태권도운동이 지질대사에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 생각된다.</p><p>CRP (C-reactive protein)는 염증이 발생되면 단핵세포, 대식세포 및 지방세포에서 유도되는 염증유발성(pro-inflammation) 사이토카인(cytokine)에 의하여 촉진되어 간에서 합성이 이루어져 혈액 내로 나오는 것으로 알려져 있으며, 지방조직과도 상관성을 보이는 것으로 알려져 있다. 규칙적인 신체활동 및 유산소 운동은 심폐체력을 증가시키며, 심혈관질환의 발병 및 사망률을 감소시키고, 혈관염증과정을 변화시켜 피브리노겐 수준을 감소시킴으로써 심혈관질환의 예측인자인 CRP 수준에도 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 따라서 태권도는 모든 신체부위를 사용함으로써 심폐지구력 및 근지구력을 강화시키고, 체지방 연소의 효과를 증대시켜 CRP에 긍정적인 영향을 가져온다.</p><p>부뚜막에 심어 먹는 채소라 하여 부추(Allium tuberosum)라고 유래되었지만 지방에 따라 그 호칭도 여러 가지로 솔(전라도 지방), 졸(충청도 지방), 정구지(경상도 지방)라고도 불리며, 부추는 백합과에 속하는 Allium속 식물로 중국이 원산지로 아시아의 중부와 북부지방에서 자생하고 일본, 중국, 한국, 인도, 네팔, 태국, 필리핀 등지에서 재배되고 있다. 부추의 일반 성분으로는 \( 100 \mathrm{~g} \) 당 수분 \( 91.4 \% \), 단백질 \( 2.9 \% \), 지질 \( 0.5 \% \), 당질 \( 3.9 \% \) 등으로 다른 Allium속 식물에 비해 비타민 A, B, C가 풍부한 녹황색 채소로 특히, 건조 중량 당 \( 35 \% \)의 식이섬유를 함유하고 있어 현대인에게 부족하기 쉬운 식이섬유를 용이하게 공급할 수 있는 급원이 될 수있다.</p><p>부추는 allyl sulfide, dimethyl disulfide, dimethyl trisulfide과 같은 함황화학물, 함황 아미노산의 최종 산물인 taurine, linalool, kaempherol과 같은 flavonid를 함유하고 있다. Allium 속 식물의 함황화합물은 항암, 항균, 심혈관계질환 예방 활성, 황산화활성 및 독성물질에 대한 간독성 완화작용 등의 생리활성을 가지고 있다.</p><p>이처럼 부추는 다양한 생리적 유용성을 지닌 작물로 최근 부추에 대한 영양학적 가치와 저칼로리 식품으로써 단백질, 비타민 및 각종 무기성분이 풍부하게 함유된 건강식품으로 인식되고 있음에도 불구하고 부추의 이용에 대한 다양한 연구는 충분치 못한 실정이다. 따라서 본 연구는 생리활성이 우수한 부추섭취와 태권도운동이 남자고등학생을 대상으로 신체 조성, 혈중지질 및 C-반응단백에 미치는 영향들을 구명하기 위하여 실시하였다.</p> <h1>고 찰</h1><h2>신체조성</h2><p>이상적인 신체조성의 형성은 운동을 통해 이루어질 수 있는데, 이는 제지방의 증가와 체지방의 감소로 표현될 수 있다. 신체조성을 측정하는 것은 제지방량의 손실을 막아주는 더 효과적인 영양, 이상적인 체중과 식이요법을 위한 규정의 명확화, 지방이 지나치게 많거나 부족해서 생기는 위험을 파악 하는데 그 기초가 되기 때문에 더욱 중요하다.</p><p>선행연구에서 과체중과 비만고등학생을 대상으로 유산소 운동을 실시한 결과 체지방률이 유의하게 감소하였고, 정상체중의 남자 대학생을 대상으로 8주간 운동을 실시한 후 체지방이 감소하였다고 하였으며, 비만 청소년을 대상으로 12주간 태권도 수련을 실시한 결과 체지방률이 유의하게 감소하였다. 또한 태권도 운동을 하는 여자 대학생이 태권도 운동을 하지 않는 여자 대학생보다 체지방율이 유의하게 낮았다고 하였다.</p><p>본 연구 결과에서도 선행연구와 유사하였는데 태권도\(+\)부추섭취군, 태권도군, 부추섭취군의 체지방률 감소는 운동 형태에 상관없이 운동이 지속적일 경우 신체에 여러 가지 긍정적인 효과와 에너지 소비를 증가시켜 청소년기 비만을 예방하고 발육을 촉진시키므로 체지방에 긍정적인 효과를 주며, 부추에 포함된 비타민 및 각종 무기성분과 식이섬유가 풍부한 부추의 지속적인 섭취가 체내의 생리적 대사에 긍정적인 영향을 주어 체지방률 감소에 도움을 준 것으로 사료된다.</p><p>근육량의 감소는 신체적 기능저하는 물론 대사성 및 퇴행성 질환 발생에도 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되었다. 그러나 규칙적인 신체활동은 근육의 감소를 방지할 수 있으며, 근수축이 활발하게 이루어져서 골격근의 성장 및 비대를 유발하고 성장과 발육을 촉진시킨다. 또한 태권도 수련은 근육량의 증가와 지방의 감소를 가져와 신체조성에 긍정적인 변화를 미치는데, 본 연구에서는 근육량의 유의한 변화가 나타나지 않았다. 이는 태권도의 운동형태가 무산소성 운동보다는 유산소성 운동에 가까워 근육량의 증가를 가져오지 못 하였으며, 운동강도가 낮아 근육량의 증가를 가져오지 못 한 것으로 사료된다.</p><h2>헐중지질</h2><p>T-C는 심혈관계 질환에 유용한 지표로 활용되며, 모든 세포에서 존재하고 콜레스테롤 항상성을 유지하도록 도와준다. 운동형태에 따라 혈중지질에 미치는 영향은 잘 알려져 있는데, 일반적으로 T-C는 운동과 트레이닝에 의해 잘 감소하지 않고, 운동기간에도 영향을 받지 않으나, 체중과 체지방의 감소로 인해 수치가 감소하기도 한다. 연구결과 TC는 유의한 차이가 나타나지 않았는데 이는 대상자의 체격, 체중, 식사습관의 차이와 운동강도가 낮았던 것으로 사료된다.</p><p>규칙적인 유산소운동에 의해 안정 시 HDL-C 농도가 증가하는 것으로 알려져 있는데, 이는 운동에 의해 혈장 내 LPLA (lipoprotein lipase activity)가 활성화 되어 chylomicron, VLDL (very low density lipoprotein) 및 LDL 내의 콜레스테롤이 HDL로 전환되는 비율이 증가되고 간의 HTGLA(hepatic triglyceride lipase activity)가 운동에 의해 통제됨으로써 HDL의 catabolism이 낮아지기 때문이라고 하였다. 선행연구에서 흰쥐를 대상으로 유산소운동과 부추를 섭취시킨 결과 유산소운동과\(+\)부추섭취군, 유산소운동군, 부추섭취군이 HDL-C가 유의하게 증가하였다고 보고하였으며, 유산소운동을 8주간 실시 한 후 HDL-C농도가 유의하게 증가하였다. 이는 다양한 운동강도와 운동소요시간 등의 요인들이 HDL-C의 변화에 직접적으로 영향을 미치며, polyphenol 성분이 HDL-C 농도에 긍정적인 영향을 미친다. 본 연구에서도 태권도를 통한 유산소운동이 체지방률을 낮추고, lipoprotein lipase activity의 활성화를 가져와 HDL-C 에 긍정적인 영향을 미친 것으로 사료된다.</p><p>LDL-C은 고지혈증 및 동맥경화증의 위험인자로 알려져 있으며, 주요기능은 말초조직으로 cholesterol을 운반하는 역할을 한다. 선행 연구에서는 유도수련으로 LDL-C의 농도를 감소 하였고, 지구성 운동으로 LDL-C 농도가 유의한 감소를 나타낸다고 하였으며, 지방산군(들기름, 옥수수 유 및 돈지)에서 부추를 섭취시켰을 때 LDL-C 함량을 더 감소시켰다고 하였다. 본 연구결과 태권도\(+\)부추섭취군이 대조군에 비해 긍정적인 효과가 있었는데, 이는 태권도 운동과 부추섭취의 시너지 효과가 있는 것으로 생각되며, 태권도 운동으로 HDL-C농도가 높아져 LDL-C 농도를 낮추었으며, 식이섬유는 혈중지질 및 지단백 농도를 감소시키는데 효과적인데, 부추의 식이 섬유와 클로로필이 풍부하고 항혈전 성분인 adenosine이 LDL-C 농도를 감소시키는데 긍정적인 영향을 미친것으로 사료된다.</p><p>TG는 음식물에 의해 가장 많은 영향을 받지만, 신체적 훈련에 의해서도 \( 20 \sim 60 \% \) 까지 감소되어진다. 선행연구에서 태권도 품새 프로그램 수행이 운동에 의해 에너지원으로 활용되어 TG가 감소되었다는 보고와 12주간 태권도 운동이 비만여성의 TG가 감소되었다고 하였다. 이는 유산소운동으로 간 및 근육의 글리코겐이 소비되면서 근육과 순환되는 혈액중의 지방이 에너지원으로 이용되기 때문이다. 부추의 첨가가 중성지방을 감소시키는 효과가 있다고 하였으나, 본 구에서는 유의한 효과가 없었는데, 이는 흰쥐를 대상으로 유산소운동과 부추를 섭취시킨 연구에서 TG에서 차이가 없었다는 연구와 유사하다. 이는 태권도의 수련기간이 짧으며, 비만군이 아니라 정상군이어서 TG의 차이가 없는 것으로 사료된다.</p><p>혈중 지질성분에 대한 연구는 비만인을 대상으로 하는 연구가 많았으나, 비만 및 정상체중 남성을 대상으로 복합운동을 시킨 결과 정상체중군도 혈중지질에 긍정적인 영향을 주었다고 보고하여 향후 다양한 대상으로 지속적으로 연구가 되어야 할 것이다.</p><h2>C-반응단백</h2><p>C-반응단백(CRP)은 동맥경화성 혈관의 염증반응 정도를 반영하는 대표적인 지표로 인식 되어지고 있다. 높은 혈중 CRP 농도는 혈관내피 기능 손상과 혈관내피 중막을 두껍게 하여 조기 죽상경화증을 진행시켜 심혈관질환 발병 위험성을 높이는 것으로 알려져 있다. 아직 혈중 CRP농도의 감소매커니즘은 정확히 밝혀지지 않고 있지만, CRP의 생성이 지방세포에서 분비되는 IL-6 (interleukin6)와 TNF-\( \alpha \) (tumor ne-crosis factor- \( \alpha \)) 등의 염증관련성 cytokine의 상승과 관련이 있는 것으로 보아 체중 감량을 통한 지방량의 감소가 염증 관련성 cytokine 및 CRP를 감소시키는 것으로 생각된다. 이와 같은 CRP농도는 체중감소에 따라 감소된다고 보고되면서 CRP 개선을 위한 운동프로그램에 대한 연구가 진행되고 있다. 만성적으로 C-반응단백 농도가 높으면 심장병과 성인 당뇨병 위험이 커지고, 염증은 심장마비와 C-반응단백 농도가 \( 0.50 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \) 이상이면 심혈관계 질환도가 매우 높은 것으로 나타났으며, 규칙적인 운동을 실시하면 심혈관계 질환의 위험도 지연시킬 수 있으며, C-반응단백의 수준이 높으면 건강한 중년 남녀의 성인병 발병률이 \(2 \sim 3\)배 증가하는 것으로 보고하였다.</p><p>선행연구에서 비만청소년과 비만성인을 대상으로 운동 트레이닝 또는 체중 감량 프로그램을 실시한 결과 CRP 농도가 감소하였고, 비만 남고생을 대상으로 복합운동과 마늘환을 섭취시킨 결과 복합운동\(+\)마늘환섭취군이 유의하게 감소하였으며, 저칼로리섭취와 유산소운동을 병행한 결과 C-반응 단백 농도가 유의하게 감소하였다. 또한 HRR 60~70 \(\% \)에서 유산소운동을 실시한 후에 CRP농도가 감소하였다는 보고와 정상체중에서도 염증반응인자들이 긍정적으로 개선된다는 선행연구의 결과와는 일치하지 않게 본 연구에서는 상반된 결과인 본 연구에서는 C-반응단백에 차이가 나타나지 않았다. 이는 비만인이 아닌 정상인을 대상으로 하여 대상자의 특징과 운동강도가 낮았던 것으로 사료되어 운동방법과 대상에 따른 추후 지속적인 연구가 필요하다고 사료된다.</p> <h1>결 과</h1><h2>신체조성</h2><p>운동전과 10주간 운동 후 신체조성의 변화는 Table 3와 같다. 집단내에서 태권도\(+\)부추섭취군, 태권도군, 부섭섭취군은 체중과 근육량은 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 체지방률은 태권도\(+\)부추섭취군, 태권도군 \( (p \times 0.05) \), 부추섭취군이 \( (p<0.01) \) 유의하게 감소하였다. 대조군은 체중은 유의하게 \( (p<0.05) \) 높게 나타났으나, 체지방률과 근육량은 유의한 차이가 나타나지 않았다. 집단 간 유의한 차이는 없었다.</p><h2>혈중지질</h2><p>운동전과 10주간 운동 후 혈중지질의 변화는 Table 4와 같다. T-C와 TG의 변화는 태권도\(+\)부추섭취군, 태권도군, 부추섭취군, 대조군 모두 집단내 집단간 차이가 없었다. HDL-C는 집단내 태권도\(+\)부추섭취군과 태권도군이 유의하게 \( (p<0.01) \) 증가하였으며, 부추섭취군과 대조군은 유의한 차이가 없었다. 집단간 태권도\(+\)부추섭취군과 태권도군이 부추섭취군과 대조군보다 유의하게 \( (p<0.01) \) 증가하였다. LDL-C의 변화는 집단 내 유의한 차이는 없었으나, 집단간 태권도\(+\)부추섭취군이 대조군보다 유의하게 \( (p<0.05) \) 감소하였다.</p><h2>C-반응단백</h2><p>운동전과 10주간 운동 후 C-반응단백의 변화는 Table 5와 같다. C-반응단백의 변화는 태권도\(+\)부추섭취군, 태권도군, 부추섭취군, 대조군 모두 집단 내 집단간 차이가 없었다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상</h2><p>연구의 대상은 B광역시 G고등학교 재학중인 건강한 남자고등학생으로 본 연구의 목적을 이해하고 참여에 동의한 24명을 대상으로 하였다.", "참여자로부터 연구시작 전 실험 참여 동의서를 받았고, 그룹은 무작위로 선정하여 태권도\\(+\\)부추섭취군 \\( (\\mathrm{n}=6) \\), 태권도군 \\( (\\mathrm{n}=6) \\), 부추섭취군 \\( (\\mathrm{n}=6) \\), 대조군 \\( (n=6) \\)으로 구분하였다.", "대상자들의 신체적 특성은 Table 1과 같으며 나이, 신장, 체중, BMI는 집단 간 유의한 차이가 없었다.", "</p><h2>운동방법</h2><p>태권도 프로그램은 김명일의 태권도 프로그램을 수정 보완하여 구성하였고, 운동강도는 PPLAR (Polar RS400sd, APAC, 90026360, USA)를 통한 심박수 변화량을 측정하여 \\(1 \\sim5\\)주는 \\(60 \\sim 70\\%\\)HRR, \\(6\\sim 10\\)주는 \\(70 \\sim 80\\%\\)HRR로 설정하였으며, 주 4회씩 매회 50분간, 10주간 실시하였으며, 태권도 프로그램은 Table 2와 같다.", "</p><h2>식이방법</h2><p>부추섭취는 10주간 부추환을 섭취시켰다.", "부추환을 섭취하는 동안 일체의 약물이나 건강보조식품을 금하였고, 부추환의 성분은 수분 \\( 11.0 \\% \\), 조단백질 \\( 17.3 \\% \\), 조지방 \\( 4.5 \\% \\), 조회분 \\( 9.5 \\% \\)이었다.", "</p><h2>분석방법</h2><h3>신체조성</h3><p>피험자들의 신장과 체중, 체지방률, 부위별 근육량은 X-SCAN PLUS Ⅱ (JAWON Medical, PYD0017-070418, Korea)를 이용하여 반팔과 반바지의 간편한 복장으로 양말을 벗고, 시계와 목걸이, 귀고리 및 반지 등 금속류를 제거한 후, 기기에 올라서서 자동으로 신장과 체중을 측정하고, 양팔을 차렷 자세에서 가볍게 벌린 상태에서 힘을 뺀 편안한 자세로 체지방률과 부위별 근육량을 2회(0주, 10주) 측정하였다.", "</p><h3>혈액채취 및 분석방법</h3><p>실험 전 (0주)과 실험 후(10주)에 채혈 12시간 전 공복상태로 피험자의 전완정맥에서 \\( 10 \\mathrm{ml} \\)를 채혈하여 원심분리기로 10분 간 \\(3,000 \\mathrm{rpm}\\)에서 원심 분리하여 혈청을 분리한 후 분석 시까지 \\( -70^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 이하에서 보관 후 분석하였다.", "</p><h3>혈중지질</h3><p>혈중지질 검사는 총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C), 저밀도지단백 콜레스테롤 (LDL-C)의 농도는 혈액자동분석기(HTTACHI 7600-210 \\(\\&\\) HITACHI 7180, Japan)에서 분석하였다.", "</p><h3>C반응단백</h3><p>High sensitivity C-반응단백은 BN Ⅱ 분석기(Dad Behring Inc, Deerfield, Illinois, USA)를 사용하여 자동화된 면역 비탁법(latex-enhanced immunonephelometric assay)으로 측정하였다.", "</p><h2>자료처리</h2><p>자료처리는 SPSS 18.0 통계프로그램을 이용하였으며, 측정된 모든 자료에 대해 평균과 표준편차(Mean\\( \\pm \\)SD)를 산출하였다.", "집단 내 사전·후 차이검증은 paired t-test, 집단 간 차이검증은 일원변량분석(one-way ANOVA)를 실시하였다.", "사후검증은 Duncan을 실시하였으며, 통계적 유의적 수준은 \\( \\alpha=0.05 \\)로 하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>청소년기는 신체적·심리적으로 급속한 성장과 발달이 일어나고 자아 개념이 구체적으로 형성되면서 호기심과 자극에 대해 매우 민감하기 때문에 이 시기의 학습과 경험은 그 사람의 평생을 좌우하며 인격 및 태도의 결정적 요인으로 작용하게 된다.", "또한 청소년기에 있어서 스포츠 활동의 중요성을 인식하게 하고, 스포츠 활동을 적극적으로 권장함으로써 스포츠 활동을 적극적으로 권장함으로써 스포츠를 통하여 습득되는 활동 능력은 원만한 대인관계를 형성을 위한 필요한 지식 및 인격발달에 도움을 줄뿐만 아니라 집단생활에서 요구되는 새로운 경험을 제공해 준다.", "</p><p>혼자서 하는 운동보다 친구들과 어울러서 할 수 있는 운동이 지루하지 않으며 장기간 규칙적으로 실시할 수 있게 된다고 하였는데, 이러한 요소를 포함하고 있는 운동 중 하나가 태권도이며, 태권도는 우리나라 민족의 역사와 전통을 지닌 고유의 무술이며, 무도이다.", "또한 태권도는 수련자들에게 강인하고 용기 있는 성품을 만들어 주어 매사에 주저함이 없이 앞장설 수 있는 통솔력과 강한 담력을 길러줄 수 있기 때문에 각광 받고 있는 스포츠 종목이라 할 수 있다.", "</p><p>태권도는 신체의 모든 부위를 사용하여 근력, 근지구력, 심폐지구력은 물론 뼈와 관절 및 근조직을 발달시켜 청소년은 물론 성인의 체력단련 및 균형 잡힌 신체를 형성하는데 도움을 주는 운동방법이며, 청소년기 태권도 실시에 따른 체력 및 혈중 지질 비교에서 체력의 향상 및 고밀도 지단백 콜레스테롤의(High density lipoprotein cholesterol; HDL-C)의 증가와 저밀도 지단백 콜레스테롤(Low density lipoprotein cholesterol; LDL-C)가 감소한다고 하였다.", "또한 태권도 수련 집단과 비수련집단간 총콜레스테롤(Total cholesterol; TC), HDL-C, LDL-C, 혈당(glucose)에서 유의한 차가 나타나지 않았지만 비교집단의 수치가 태권도 수련집단에 비해 높은 경향을 나타내었다고 하여, 태권도운동이 지질대사에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 생각된다.", "</p><p>CRP (C-reactive protein)는 염증이 발생되면 단핵세포, 대식세포 및 지방세포에서 유도되는 염증유발성(pro-inflammation) 사이토카인(cytokine)에 의하여 촉진되어 간에서 합성이 이루어져 혈액 내로 나오는 것으로 알려져 있으며, 지방조직과도 상관성을 보이는 것으로 알려져 있다.", "규칙적인 신체활동 및 유산소 운동은 심폐체력을 증가시키며, 심혈관질환의 발병 및 사망률을 감소시키고, 혈관염증과정을 변화시켜 피브리노겐 수준을 감소시킴으로써 심혈관질환의 예측인자인 CRP 수준에도 영향을 미치는 것으로 알려져있다.", "따라서 태권도는 모든 신체부위를 사용함으로써 심폐지구력 및 근지구력을 강화시키고, 체지방 연소의 효과를 증대시켜 CRP에 긍정적인 영향을 가져온다.", "</p><p>부뚜막에 심어 먹는 채소라 하여 부추(Allium tuberosum)라고 유래되었지만 지방에 따라 그 호칭도 여러 가지로 솔(전라도 지방), 졸(충청도 지방), 정구지(경상도 지방)라고도 불리며, 부추는 백합과에 속하는 Allium속 식물로 중국이 원산지로 아시아의 중부와 북부지방에서 자생하고 일본, 중국, 한국, 인도, 네팔, 태국, 필리핀 등지에서 재배되고 있다.", "부추의 일반 성분으로는 \\( 100 \\mathrm{~g} \\) 당 수분 \\( 91.4 \\% \\), 단백질 \\( 2.9 \\% \\), 지질 \\( 0.5 \\% \\), 당질 \\( 3.9 \\% \\) 등으로 다른 Allium속 식물에 비해 비타민 A, B, C가 풍부한 녹황색 채소로 특히, 건조 중량 당 \\( 35 \\% \\)의 식이섬유를 함유하고 있어 현대인에게 부족하기 쉬운 식이섬유를 용이하게 공급할 수 있는 급원이 될 수있다.", "</p><p>부추는 allyl sulfide, dimethyl disulfide, dimethyl trisulfide과 같은 함황화학물, 함황 아미노산의 최종 산물인 taurine, linalool, kaempherol과 같은 flavonid를 함유하고 있다.", "Allium 속 식물의 함황화합물은 항암, 항균, 심혈관계질환 예방 활성, 황산화활성 및 독성물질에 대한 간독성 완화작용 등의 생리활성을 가지고 있다.", "</p><p>이처럼 부추는 다양한 생리적 유용성을 지닌 작물로 최근 부추에 대한 영양학적 가치와 저칼로리 식품으로써 단백질, 비타민 및 각종 무기성분이 풍부하게 함유된 건강식품으로 인식되고 있음에도 불구하고 부추의 이용에 대한 다양한 연구는 충분치 못한 실정이다.", "따라서 본 연구는 생리활성이 우수한 부추섭취와 태권도운동이 남자고등학생을 대상으로 신체 조성, 혈중지질 및 C-반응단백에 미치는 영향들을 구명하기 위하여 실시하였다.", "</p> <h1>고 찰</h1><h2>신체조성</h2><p>이상적인 신체조성의 형성은 운동을 통해 이루어질 수 있는데, 이는 제지방의 증가와 체지방의 감소로 표현될 수 있다.", "신체조성을 측정하는 것은 제지방량의 손실을 막아주는 더 효과적인 영양, 이상적인 체중과 식이요법을 위한 규정의 명확화, 지방이 지나치게 많거나 부족해서 생기는 위험을 파악 하는데 그 기초가 되기 때문에 더욱 중요하다.", "</p><p>선행연구에서 과체중과 비만고등학생을 대상으로 유산소 운동을 실시한 결과 체지방률이 유의하게 감소하였고, 정상체중의 남자 대학생을 대상으로 8주간 운동을 실시한 후 체지방이 감소하였다고 하였으며, 비만 청소년을 대상으로 12주간 태권도 수련을 실시한 결과 체지방률이 유의하게 감소하였다.", "또한 태권도 운동을 하는 여자 대학생이 태권도 운동을 하지 않는 여자 대학생보다 체지방율이 유의하게 낮았다고 하였다.", "</p><p>본 연구 결과에서도 선행연구와 유사하였는데 태권도\\(+\\)부추섭취군, 태권도군, 부추섭취군의 체지방률 감소는 운동 형태에 상관없이 운동이 지속적일 경우 신체에 여러 가지 긍정적인 효과와 에너지 소비를 증가시켜 청소년기 비만을 예방하고 발육을 촉진시키므로 체지방에 긍정적인 효과를 주며, 부추에 포함된 비타민 및 각종 무기성분과 식이섬유가 풍부한 부추의 지속적인 섭취가 체내의 생리적 대사에 긍정적인 영향을 주어 체지방률 감소에 도움을 준 것으로 사료된다.", "</p><p>근육량의 감소는 신체적 기능저하는 물론 대사성 및 퇴행성 질환 발생에도 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되었다.", "그러나 규칙적인 신체활동은 근육의 감소를 방지할 수 있으며, 근수축이 활발하게 이루어져서 골격근의 성장 및 비대를 유발하고 성장과 발육을 촉진시킨다.", "또한 태권도 수련은 근육량의 증가와 지방의 감소를 가져와 신체조성에 긍정적인 변화를 미치는데, 본 연구에서는 근육량의 유의한 변화가 나타나지 않았다.", "이는 태권도의 운동형태가 무산소성 운동보다는 유산소성 운동에 가까워 근육량의 증가를 가져오지 못 하였으며, 운동강도가 낮아 근육량의 증가를 가져오지 못 한 것으로 사료된다.", "</p><h2>헐중지질</h2><p>T-C는 심혈관계 질환에 유용한 지표로 활용되며, 모든 세포에서 존재하고 콜레스테롤 항상성을 유지하도록 도와준다.", "운동형태에 따라 혈중지질에 미치는 영향은 잘 알려져 있는데, 일반적으로 T-C는 운동과 트레이닝에 의해 잘 감소하지 않고, 운동기간에도 영향을 받지 않으나, 체중과 체지방의 감소로 인해 수치가 감소하기도 한다.", "연구결과 TC는 유의한 차이가 나타나지 않았는데 이는 대상자의 체격, 체중, 식사습관의 차이와 운동강도가 낮았던 것으로 사료된다.", "</p><p>규칙적인 유산소운동에 의해 안정 시 HDL-C 농도가 증가하는 것으로 알려져 있는데, 이는 운동에 의해 혈장 내 LPLA (lipoprotein lipase activity)가 활성화 되어 chylomicron, VLDL (very low density lipoprotein) 및 LDL 내의 콜레스테롤이 HDL로 전환되는 비율이 증가되고 간의 HTGLA(hepatic triglyceride lipase activity)가 운동에 의해 통제됨으로써 HDL의 catabolism이 낮아지기 때문이라고 하였다.", "선행연구에서 흰쥐를 대상으로 유산소운동과 부추를 섭취시킨 결과 유산소운동과\\(+\\)부추섭취군, 유산소운동군, 부추섭취군이 HDL-C가 유의하게 증가하였다고 보고하였으며, 유산소운동을 8주간 실시 한 후 HDL-C농도가 유의하게 증가하였다.", "이는 다양한 운동강도와 운동소요시간 등의 요인들이 HDL-C의 변화에 직접적으로 영향을 미치며, polyphenol 성분이 HDL-C 농도에 긍정적인 영향을 미친다.", "본 연구에서도 태권도를 통한 유산소운동이 체지방률을 낮추고, lipoprotein lipase activity의 활성화를 가져와 HDL-C 에 긍정적인 영향을 미친 것으로 사료된다.", "</p><p>LDL-C은 고지혈증 및 동맥경화증의 위험인자로 알려져 있으며, 주요기능은 말초조직으로 cholesterol을 운반하는 역할을 한다.", "선행 연구에서는 유도수련으로 LDL-C의 농도를 감소 하였고, 지구성 운동으로 LDL-C 농도가 유의한 감소를 나타낸다고 하였으며, 지방산군(들기름, 옥수수 유 및 돈지)에서 부추를 섭취시켰을 때 LDL-C 함량을 더 감소시켰다고 하였다.", "본 연구결과 태권도\\(+\\)부추섭취군이 대조군에 비해 긍정적인 효과가 있었는데, 이는 태권도 운동과 부추섭취의 시너지 효과가 있는 것으로 생각되며, 태권도 운동으로 HDL-C농도가 높아져 LDL-C 농도를 낮추었으며, 식이섬유는 혈중지질 및 지단백 농도를 감소시키는데 효과적인데, 부추의 식이 섬유와 클로로필이 풍부하고 항혈전 성분인 adenosine이 LDL-C 농도를 감소시키는데 긍정적인 영향을 미친것으로 사료된다.", "</p><p>TG는 음식물에 의해 가장 많은 영향을 받지만, 신체적 훈련에 의해서도 \\( 20 \\sim 60 \\% \\) 까지 감소되어진다.", "선행연구에서 태권도 품새 프로그램 수행이 운동에 의해 에너지원으로 활용되어 TG가 감소되었다는 보고와 12주간 태권도 운동이 비만여성의 TG가 감소되었다고 하였다.", "이는 유산소운동으로 간 및 근육의 글리코겐이 소비되면서 근육과 순환되는 혈액중의 지방이 에너지원으로 이용되기 때문이다.", "부추의 첨가가 중성지방을 감소시키는 효과가 있다고 하였으나, 본 구에서는 유의한 효과가 없었는데, 이는 흰쥐를 대상으로 유산소운동과 부추를 섭취시킨 연구에서 TG에서 차이가 없었다는 연구와 유사하다.", "이는 태권도의 수련기간이 짧으며, 비만군이 아니라 정상군이어서 TG의 차이가 없는 것으로 사료된다.", "</p><p>혈중 지질성분에 대한 연구는 비만인을 대상으로 하는 연구가 많았으나, 비만 및 정상체중 남성을 대상으로 복합운동을 시킨 결과 정상체중군도 혈중지질에 긍정적인 영향을 주었다고 보고하여 향후 다양한 대상으로 지속적으로 연구가 되어야 할 것이다.", "</p><h2>C-반응단백</h2><p>C-반응단백(CRP)은 동맥경화성 혈관의 염증반응 정도를 반영하는 대표적인 지표로 인식 되어지고 있다.", "높은 혈중 CRP 농도는 혈관내피 기능 손상과 혈관내피 중막을 두껍게 하여 조기 죽상경화증을 진행시켜 심혈관질환 발병 위험성을 높이는 것으로 알려져 있다.", "아직 혈중 CRP농도의 감소매커니즘은 정확히 밝혀지지 않고 있지만, CRP의 생성이 지방세포에서 분비되는 IL-6 (interleukin6)와 TNF-\\( \\alpha \\) (tumor ne-crosis factor- \\( \\alpha \\)) 등의 염증관련성 cytokine의 상승과 관련이 있는 것으로 보아 체중 감량을 통한 지방량의 감소가 염증 관련성 cytokine 및 CRP를 감소시키는 것으로 생각된다.", "이와 같은 CRP농도는 체중감소에 따라 감소된다고 보고되면서 CRP 개선을 위한 운동프로그램에 대한 연구가 진행되고 있다.", "만성적으로 C-반응단백 농도가 높으면 심장병과 성인 당뇨병 위험이 커지고, 염증은 심장마비와 C-반응단백 농도가 \\( 0.50 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\) 이상이면 심혈관계 질환도가 매우 높은 것으로 나타났으며, 규칙적인 운동을 실시하면 심혈관계 질환의 위험도 지연시킬 수 있으며, C-반응단백의 수준이 높으면 건강한 중년 남녀의 성인병 발병률이 \\(2 \\sim 3\\)배 증가하는 것으로 보고하였다.", "</p><p>선행연구에서 비만청소년과 비만성인을 대상으로 운동 트레이닝 또는 체중 감량 프로그램을 실시한 결과 CRP 농도가 감소하였고, 비만 남고생을 대상으로 복합운동과 마늘환을 섭취시킨 결과 복합운동\\(+\\)마늘환섭취군이 유의하게 감소하였으며, 저칼로리섭취와 유산소운동을 병행한 결과 C-반응 단백 농도가 유의하게 감소하였다.", "또한 HRR 60~70 \\(\\% \\)에서 유산소운동을 실시한 후에 CRP농도가 감소하였다는 보고와 정상체중에서도 염증반응인자들이 긍정적으로 개선된다는 선행연구의 결과와는 일치하지 않게 본 연구에서는 상반된 결과인 본 연구에서는 C-반응단백에 차이가 나타나지 않았다.", "이는 비만인이 아닌 정상인을 대상으로 하여 대상자의 특징과 운동강도가 낮았던 것으로 사료되어 운동방법과 대상에 따른 추후 지속적인 연구가 필요하다고 사료된다.", "</p> <h1>결 과</h1><h2>신체조성</h2><p>운동전과 10주간 운동 후 신체조성의 변화는 Table 3와 같다.", "집단내에서 태권도\\(+\\)부추섭취군, 태권도군, 부섭섭취군은 체중과 근육량은 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 체지방률은 태권도\\(+\\)부추섭취군, 태권도군 \\( (p \\times 0.05) \\), 부추섭취군이 \\( (p<0.01) \\) 유의하게 감소하였다.", "대조군은 체중은 유의하게 \\( (p<0.05) \\) 높게 나타났으나, 체지방률과 근육량은 유의한 차이가 나타나지 않았다.", "집단 간 유의한 차이는 없었다.", "</p><h2>혈중지질</h2><p>운동전과 10주간 운동 후 혈중지질의 변화는 Table 4와 같다.", "T-C와 TG의 변화는 태권도\\(+\\)부추섭취군, 태권도군, 부추섭취군, 대조군 모두 집단내 집단간 차이가 없었다.", "HDL-C는 집단내 태권도\\(+\\)부추섭취군과 태권도군이 유의하게 \\( (p<0.01) \\) 증가하였으며, 부추섭취군과 대조군은 유의한 차이가 없었다.", "집단간 태권도\\(+\\)부추섭취군과 태권도군이 부추섭취군과 대조군보다 유의하게 \\( (p<0.01) \\) 증가하였다.", "LDL-C의 변화는 집단 내 유의한 차이는 없었으나, 집단간 태권도\\(+\\)부추섭취군이 대조군보다 유의하게 \\( (p<0.05) \\) 감소하였다.", "</p><h2>C-반응단백</h2><p>운동전과 10주간 운동 후 C-반응단백의 변화는 Table 5와 같다.", "C-반응단백의 변화는 태권도\\(+\\)부추섭취군, 태권도군, 부추섭취군, 대조군 모두 집단 내 집단간 차이가 없었다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "", "eng": "The Effect of Taekwondo and Allium Tuberosum Intake on Body Composition, Blood Lipids and C-Reactive Protein" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-b004335e-5ca3-4bb4-943f-4d935770e511", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "Sang-Ho Lee", "Yeong-Ho Baek" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": 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5,320	<h1>요 약</h1><p>홍삼액의 첨가에 따른 발효가능성을 알아보기 위하여 홍삼액의 첨가량을 달리하여 발효특성을 조사하였다. 본 실험에서는 Saccharomyces cerevisiae JF-Y3을 이용하여 발효를 실시하였으며, 홍삼액 (\(20^{~\circ}\mathrm{brix})\)함량 \(10\sim50\%\), yeast extract \(0.5\sim2.5\%\)의 범위로 중심합성계획법에 의하여 10개의 구간으로 홍삼액의 알코올 발효특성을 살펴보았다. 효모수는 홍삼액 및 yeast extract 농도 모두에 영향을 받고 있었으며, 홍삼액 농도에 더 많은 영향을 받는 것으로 나타났다. 홍삼액 농도가 감소하고, yeast extract 농도가 증가할수록 효모수가 증가하는 것으로 나타났다. 알코올 함량이 가장 높게 나타난 발효조건은 홍삼액 함량 \(30\%\), yeast extract 함량 \(0.50\%\)이었으며, 이때의 최대값은 \(12.45\%\)로 예측되었다. 당도 및 총당 함량의 경우 각각 \(1\%\)이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었고, 당도의 경우 홍삼액 및 yeast extract 함량 두 조건에 모두 영향을 받는 것으로 나타났으며, 총당 함량의 경우 주로 홍삼액 농도에 영향을 받는 것으로 나타났다. 홍삼액 \(20^{~\circ}\mathrm{brix}\)의 함량을 \(10\sim 50\%\)까지 증가하여도 발효액의 알코을 함량이 모두 \(10\%\) 이상이었으며, 전반적으로 홍삼액 첨가에 따른 발효의 저해는 크게 일어나지 않는 것으로 나타나 홍삼의 유효한 성분을 이용한 기능성 주류 개발 시 홍삼농축액을 효율적으로 활용할 수 있을 것이다. 또한, 앞으로 홍삼액 발효 시의 알코올 성분에 대한 분석, 발효액에 대한 관능적 특성, 유효성분 등에 대한 특성 변화 등을 통한 고품질 홍삼주 제조와 관련하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.</p> <h1>서 론</h1><p>고려 인삼은 예로부터 생약재 중에서 가장 진귀한 약재로 사용되어 왔으며, 최근 인삼의 다양한 한방적 효능이 현대 과학적 연구를 통하여 점차 밝혀지고 있다. 인삼 사포닌이 갖는 약리작용은 다양하여 항통증, 항암, 항당뇨, 간 기능 항진작용, 항혈전 및 항염증 작용 등이 보고되고 있다.</p><p>홍삼은 수삼을 증숙시켜 건조시킨 것으로서 제조공정 중에 인삼 속에 함유된 전분은 알파화되고 수분은 \(10\%\) 이하로 감소되어 장기간 보관할 경우에도 미생물 오염으로부터 비교적 안전할 수 있다. 또한 제조과정 중 수삼이나 백삼에 함유되어 있지 않은 maltol, 사포닌 \(\mathrm{Rh}_{2}\) 등의 항암 및 항산화 성분이 생성된다고 알려져 있다. 홍삼은 항산화활성, 종양괴사 인자 분비 자극 현상 및 면역 억제 현상을 나타내는 saponin계 활성성분을 가지고 있어 항암효과를 나타내며 세포의 성장촉진과 생존기간을 연장시키고 피부 각질 형성세포의 증식을 억제시키는 ginsenoside계 활성성분을 가지고 있기 때문에 피부 노화 방지에도 탁월한 효과를 나타내는 것으로 알려져 왔다. 홍삼관련 연구로는 Kaneko 등이 홍삼이 말초혈관을 확장시켜 수족냉증을 개선하고 적혈구 변형능을 촉진시켜 말초혈액순환 개선에 효과를 나타내었다고 보고한 바 있으며, Fahim 등은 인삼 사포닌이 화학적으로 스테로이드 호르몬의 전구물질인 콜레스테롤의 구조와 유사하므로 생식 기능을 활발하게 한다고 하였다.</p><p>홍삼은 건강 증진 및 질병 예방을 위한 양질의 원료라고 할 수 있으며, 생활수준 향상 등으로 인해 국민의 건강에 대한 관심이 증가하여 보다 우수한 가공식품에 대한 수요가 급격히 높아지고 있다. 따라서, 본 연구에서는 홍삼의 고부가 가치 증대, 건강 증진에 기여 등을 위한 홍삼액 고함량 발효주의 제품개발에 앞서 홍삼액 첨가량이 중가함에 따라 알코올 발효가 적절히 일어나는가를 살펴보기 위하여 홍삼액의 함량에 따른 알코올 발효특성을 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험에 사용한 홍삼농축액( \(60^{\circ}\mathrm{brix})\)은 경북 풍기영농협동조합에서 생산된 것을 구입하여 \(4^{\circ}\mathrm{C}\) 냉장보관하면서 사용하였다.</p><h2>실험 계획</h2><p>홍삼액 첨가에 따른 알코올 발효의 실험 계획은 중심합성계획법에 의하여 설계하였고, 반응표면회귀분석을 위하여 statistical analysis system (SAS) program을 사용하였다. 독립변수(\(\mathrm{X_{n}})\)로서 홍삼액 농도\(\left(10,20,30,40,50\%, X_{1}\right)\) 및 yeast extract 농도\(\left(0.5,1,1.5,2,2.5 \%, X_{2}\right)\)로 설정하여 두 가지의 발효조건을 5수준(-2, -1, 0, 1, 2)으로 부호화하여 중심합성계획을 수립하고 10개의 조건으로 실험을 실시하였다. 각각의 발효조건에 따른 홍삼발효액의 이화학적 특성과 관련된 종속변수 \((\mathrm{Y_{n}})\)로는 효모수, 알코올 함량, 당도 및 총당 함량을 설정하여 측정한 값을 회귀분석에 사용하였다.</p><h2>균주 및 주모 배양</h2><p>예비 실험에서 수십 여종의 효모 중 홍삼액 첨가 배지에서 생육이 양호하고, 홍삼액에서 발효시 알코을 생성이 우수한 것으로 나타난 Saccharomyces cerevisiae JF-Y 3 효모를 선발하여, YM배지(yeast extract \(0.3\%\), malt extract \(0.3\%\), pep-tone \(0.5\%\), glucose \(1\%)\)에서 \(30^{\circ}\mathrm{C}\), 3일간 전배양하였으며, 발효 시 \(5\%(\mathrm{v/v})\)를 접종하였다. 홍삼액의 알코올 발효는 홍삼액 농도와 yeast extract 농도를 각각 달리하여 10일간 발효시켰다. 설탕(삼양사)은 \(25\%(\mathrm{w/v})\) 첨가하였으며, Yeast extract는 Difco사의 제품을 사용하였고, 홍삼액은 홍삼 농축액 \(\left(60^{~\circ}\mathrm{brix}\right)\)을 \(20^{~\circ}\mathrm{brix}\)로 희석한 것을 \(10\sim 50\%(\mathrm{v/v})\) 농도로 달리하여 발효에 사용하였다.</p><h2>효모수 측정</h2><p>10일간 발효시킨 홍삼발효액을 취하여 균일한 현탁액으로 한 후, 멸균생리식염수로 희석하고 Thoma Haematocytometer에 희석액을 적하하여 400배 배율의 현미경(Axiolab re, Carl Zeiss, Germany)으로 효모수를 측정하였다.</p><h2>알코올 함량 측정</h2><p>알코올 함량 측정은 발효액 \(100\mathrm{ml}\)를 취하여 \(8,000\mathrm{rpm}\)에서 20분간 원심분리하여 알코올자동증류장치(J. P. SELECTA, s.a., Spain)에서 알코올 증류 후 \(15^{\circ}\mathrm{C}\)로 보정한 다음 주정계\((10\sim 20\%)\)를 이용하여 알코올 함량을 측정하였다.</p><h2>당도 및 총당 함량 측정</h2><p>당도는 당도계(ATAGO N1, Japan)로 측정하였고, 각 발효액의 총당 함량은 phenol-sulfate법으로 spectrophotometer(UV-1601PC, Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 \(470\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 검액 대신 증류수를 넣어 동일하게 처리하였고, 이때 표준물질로는 glucose를 \(10\sim 50\mathrm{\mu g/ml}\)의 농도로 조제하여 검량곡선의 작성에 사용하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1><p>홍삼액의 첨가에 따른 발효가능성을 알아보기 위하여 홍삼액의 첨가량을 달리하여 발효특성을 조사하였다.", "본 실험에서는 Saccharomyces cerevisiae JF-Y3을 이용하여 발효를 실시하였으며, 홍삼액 (\\(20^{~\\circ}\\mathrm{brix})\\)함량 \\(10\\sim50\\%\\), yeast extract \\(0.5\\sim2.5\\%\\)의 범위로 중심합성계획법에 의하여 10개의 구간으로 홍삼액의 알코올 발효특성을 살펴보았다.", "효모수는 홍삼액 및 yeast extract 농도 모두에 영향을 받고 있었으며, 홍삼액 농도에 더 많은 영향을 받는 것으로 나타났다.", "홍삼액 농도가 감소하고, yeast extract 농도가 증가할수록 효모수가 증가하는 것으로 나타났다.", "알코올 함량이 가장 높게 나타난 발효조건은 홍삼액 함량 \\(30\\%\\), yeast extract 함량 \\(0.50\\%\\)이었으며, 이때의 최대값은 \\(12.45\\%\\)로 예측되었다.", "당도 및 총당 함량의 경우 각각 \\(1\\%\\)이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었고, 당도의 경우 홍삼액 및 yeast extract 함량 두 조건에 모두 영향을 받는 것으로 나타났으며, 총당 함량의 경우 주로 홍삼액 농도에 영향을 받는 것으로 나타났다.", "홍삼액 \\(20^{~\\circ}\\mathrm{brix}\\)의 함량을 \\(10\\sim 50\\%\\)까지 증가하여도 발효액의 알코을 함량이 모두 \\(10\\%\\) 이상이었으며, 전반적으로 홍삼액 첨가에 따른 발효의 저해는 크게 일어나지 않는 것으로 나타나 홍삼의 유효한 성분을 이용한 기능성 주류 개발 시 홍삼농축액을 효율적으로 활용할 수 있을 것이다.", "또한, 앞으로 홍삼액 발효 시의 알코올 성분에 대한 분석, 발효액에 대한 관능적 특성, 유효성분 등에 대한 특성 변화 등을 통한 고품질 홍삼주 제조와 관련하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>고려 인삼은 예로부터 생약재 중에서 가장 진귀한 약재로 사용되어 왔으며, 최근 인삼의 다양한 한방적 효능이 현대 과학적 연구를 통하여 점차 밝혀지고 있다.", "인삼 사포닌이 갖는 약리작용은 다양하여 항통증, 항암, 항당뇨, 간 기능 항진작용, 항혈전 및 항염증 작용 등이 보고되고 있다.", "</p><p>홍삼은 수삼을 증숙시켜 건조시킨 것으로서 제조공정 중에 인삼 속에 함유된 전분은 알파화되고 수분은 \\(10\\%\\) 이하로 감소되어 장기간 보관할 경우에도 미생물 오염으로부터 비교적 안전할 수 있다.", "또한 제조과정 중 수삼이나 백삼에 함유되어 있지 않은 maltol, 사포닌 \\(\\mathrm{Rh}_{2}\\) 등의 항암 및 항산화 성분이 생성된다고 알려져 있다.", "홍삼은 항산화활성, 종양괴사 인자 분비 자극 현상 및 면역 억제 현상을 나타내는 saponin계 활성성분을 가지고 있어 항암효과를 나타내며 세포의 성장촉진과 생존기간을 연장시키고 피부 각질 형성세포의 증식을 억제시키는 ginsenoside계 활성성분을 가지고 있기 때문에 피부 노화 방지에도 탁월한 효과를 나타내는 것으로 알려져 왔다.", "홍삼관련 연구로는 Kaneko 등이 홍삼이 말초혈관을 확장시켜 수족냉증을 개선하고 적혈구 변형능을 촉진시켜 말초혈액순환 개선에 효과를 나타내었다고 보고한 바 있으며, Fahim 등은 인삼 사포닌이 화학적으로 스테로이드 호르몬의 전구물질인 콜레스테롤의 구조와 유사하므로 생식 기능을 활발하게 한다고 하였다.", "</p><p>홍삼은 건강 증진 및 질병 예방을 위한 양질의 원료라고 할 수 있으며, 생활수준 향상 등으로 인해 국민의 건강에 대한 관심이 증가하여 보다 우수한 가공식품에 대한 수요가 급격히 높아지고 있다.", "따라서, 본 연구에서는 홍삼의 고부가 가치 증대, 건강 증진에 기여 등을 위한 홍삼액 고함량 발효주의 제품개발에 앞서 홍삼액 첨가량이 중가함에 따라 알코올 발효가 적절히 일어나는가를 살펴보기 위하여 홍삼액의 함량에 따른 알코올 발효특성을 조사하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험에 사용한 홍삼농축액( \\(60^{\\circ}\\mathrm{brix})\\)은 경북 풍기영농협동조합에서 생산된 것을 구입하여 \\(4^{\\circ}\\mathrm{C}\\) 냉장보관하면서 사용하였다.", "</p><h2>실험 계획</h2><p>홍삼액 첨가에 따른 알코올 발효의 실험 계획은 중심합성계획법에 의하여 설계하였고, 반응표면회귀분석을 위하여 statistical analysis system (SAS) program을 사용하였다.", "독립변수(\\(\\mathrm{X_{n}})\\)로서 홍삼액 농도\\(\\left(10,20,30,40,50\\%, X_{1}\\right)\\) 및 yeast extract 농도\\(\\left(0.5,1,1.5,2,2.5 \\%, X_{2}\\right)\\)로 설정하여 두 가지의 발효조건을 5수준(-2, -1, 0, 1, 2)으로 부호화하여 중심합성계획을 수립하고 10개의 조건으로 실험을 실시하였다.", "각각의 발효조건에 따른 홍삼발효액의 이화학적 특성과 관련된 종속변수 \\((\\mathrm{Y_{n}})\\)로는 효모수, 알코올 함량, 당도 및 총당 함량을 설정하여 측정한 값을 회귀분석에 사용하였다.", "</p><h2>균주 및 주모 배양</h2><p>예비 실험에서 수십 여종의 효모 중 홍삼액 첨가 배지에서 생육이 양호하고, 홍삼액에서 발효시 알코을 생성이 우수한 것으로 나타난 Saccharomyces cerevisiae JF-Y 3 효모를 선발하여, YM배지(yeast extract \\(0.3\\%\\), malt extract \\(0.3\\%\\), pep-tone \\(0.5\\%\\), glucose \\(1\\%)\\)에서 \\(30^{\\circ}\\mathrm{C}\\), 3일간 전배양하였으며, 발효 시 \\(5\\%(\\mathrm{v/v})\\)를 접종하였다.", "홍삼액의 알코올 발효는 홍삼액 농도와 yeast extract 농도를 각각 달리하여 10일간 발효시켰다.", "설탕(삼양사)은 \\(25\\%(\\mathrm{w/v})\\) 첨가하였으며, Yeast extract는 Difco사의 제품을 사용하였고, 홍삼액은 홍삼 농축액 \\(\\left(60^{~\\circ}\\mathrm{brix}\\right)\\)을 \\(20^{~\\circ}\\mathrm{brix}\\)로 희석한 것을 \\(10\\sim 50\\%(\\mathrm{v/v})\\) 농도로 달리하여 발효에 사용하였다.", "</p><h2>효모수 측정</h2><p>10일간 발효시킨 홍삼발효액을 취하여 균일한 현탁액으로 한 후, 멸균생리식염수로 희석하고 Thoma Haematocytometer에 희석액을 적하하여 400배 배율의 현미경(Axiolab re, Carl Zeiss, Germany)으로 효모수를 측정하였다.", "</p><h2>알코올 함량 측정</h2><p>알코올 함량 측정은 발효액 \\(100\\mathrm{ml}\\)를 취하여 \\(8,000\\mathrm{rpm}\\)에서 20분간 원심분리하여 알코올자동증류장치(J. P. SELECTA, s.a., Spain)에서 알코올 증류 후 \\(15^{\\circ}\\mathrm{C}\\)로 보정한 다음 주정계\\((10\\sim 20\\%)\\)를 이용하여 알코올 함량을 측정하였다.", "</p><h2>당도 및 총당 함량 측정</h2><p>당도는 당도계(ATAGO N1, Japan)로 측정하였고, 각 발효액의 총당 함량은 phenol-sulfate법으로 spectrophotometer(UV-1601PC, Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 \\(470\\mathrm{nm}\\)에서 흡광도를 측정하였다.", "대조구는 검액 대신 증류수를 넣어 동일하게 처리하였고, 이때 표준물질로는 glucose를 \\(10\\sim 50\\mathrm{\\mu g/ml}\\)의 농도로 조제하여 검량곡선의 작성에 사용하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "홍삼액의 알코올 발효 특성 모니터링", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-baa4cd85-d16f-4654-bf06-2c622198ad8b", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "김성호", "강복희", "노상균", "김종국", "이상한", "이진만" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,321	<h1>재료 및 방법</h1><p>옥수수(Zea mays L. cv Golden Cross Bantam 70) 종자를 1차 증류수에 4시간 이상 불린 후, 증류수로 적신 높이 \(12 \mathrm{cm}\)의 두 겹 종이수건의 상부 \(2 \mathrm{cm}\) 지점에 원뿌리 발생방향이 하부로 향하도록 일렬로 배열하여 동심원으로 감아 세우도록 고안된 paper roll을 제작하였다. 이 paper roll의 하부를 증류수 또는 처리하고자 하는 물질이 포함된 용액 \( 100 \mathrm{ml} \)에 담그고 \( 28{ }^{\circ} \mathrm{C} \)가 유지되는 광조건(낮 16시간; 밤 8시간)에서 2일간 생장시켰다.</p><p>굴중성 반응의 측정은 2일 된 옥수수의 원뿌리(primary root)를 이용하였다. 어린 옥수수 식물을 수평으로 고정하기 위해 사각 petridish의 접시와 뚜껑에 서로 마주보도록 양편으로 원형의 스티로폼을 부착하였으며, 한 면에 부착된 스티로폼 원반 위에 발아중인 옥수수의 열매를 넣고 뚜껑을 닫으면 뚜껑에 부착된 스티로폼이 옥수수를 약하게 압박하여 옥수수 열매가 고정되고 뿌리는 자유롭게 굽어질 수 있도록 고안하였다. Petridish 내부에 수분에 적신 종이수건을 넣어두고 petridish 자체도 물이 담긴 대형 용기 안에 고정함으로써 측정기간 동안 상대습도가 포화되도록 유지하였다. 측정 시작 시점까지는 식물체가 수직으로 유지되도록 사각 petridish를 고정하였다가 측정 시작과 동시에 일제히 수평으로 배치되도록 회전하여 고정하였으며, 매 시간 디지털 영상측정 장치로 촬영하여 ITPro \( ^{\mathrm{TM}} \) 프로그램(Sometech, Korea)으로 각도를 측정하였다. 각도는 원뿌리의 최초 수평 위치를 180\(^{\circ} \)로 표시하였으며 중력 방향을 \(90^{\circ} \)로 표시하여 굽어지는 정도를 표시하였다.</p><p>실험에 사용한 시약들의 구입처는 다음과 같다: \( \mathrm{CaCl}_{2} \) 와 sodium phosphate (Shinyo Pure Chemicals, Japan); \( \mathrm{MgCl}_{2} \) (Yakuri Pure Chemicals, Japan), \( \mathrm{MnCl}_{2} \) (ICN Biomedicals, USA); \( \mathrm{NaCl} \) (Junsei Pure Chemicals, Japan); Mannitol (Hayashi Pure Chemicals, Japan); Potassium phosphate (Bioworld, USA); \( \mathrm{MgSO}_{4} \) (Duchefa, the Netherlands).</p> <h1>요 약</h1><p>염분 스트레스에 노출된 옥수수(Zea mays) 유식물의 원뿌리는 길이생장이 억제되는데, 본 연구에서는 위와 같은 조건에서 뿌리의 굴중성 반응을 조사하였다. 고농도의 \( \mathrm{NaCl} \) 과 \( \mathrm{KCl} \)에 의해 스트레스를 받은 옥수수 원뿌리는 수평 상태에서 중력 자극을 받기 시작한 지 2시간 이후부터 대조구에 비하여 현저한 굴중성 반응을 나타내었다. 이리한 굴중성 촉진현상은 \( \mathrm{Na}^{+} \)가 아니라 \( \mathrm{K}^{+} \)에 의한 것이었으며, \( \mathrm{Cl}^{-} \)도 굴중성반응 촉진에 기여하였다. 이로부터 이들 \( \mathrm{K}^{+} \)와 \( \mathrm{Cl} \) 이온들이 세포 팽창에 필요한 삼투 조절자로 기능한다는 결론을 얻었다. 또한 염분 스트레스에 의하여 뿌리의 길이 생장이 억제되더라도 중력장 내에서의 위치 결정은 억제되지 않고 오히려 촉진된다는 점도 확인하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><p>옥수수(Zea mays L.", "cv Golden Cross Bantam 70) 종자를 1차 증류수에 4시간 이상 불린 후, 증류수로 적신 높이 \\(12 \\mathrm{cm}\\)의 두 겹 종이수건의 상부 \\(2 \\mathrm{cm}\\) 지점에 원뿌리 발생방향이 하부로 향하도록 일렬로 배열하여 동심원으로 감아 세우도록 고안된 paper roll을 제작하였다.", "이 paper roll의 하부를 증류수 또는 처리하고자 하는 물질이 포함된 용액 \\( 100 \\mathrm{ml} \\)에 담그고 \\( 28{ }^{\\circ} \\mathrm{C} \\)가 유지되는 광조건(낮 16시간; 밤 8시간)에서 2일간 생장시켰다.", "</p><p>굴중성 반응의 측정은 2일 된 옥수수의 원뿌리(primary root)를 이용하였다.", "어린 옥수수 식물을 수평으로 고정하기 위해 사각 petridish의 접시와 뚜껑에 서로 마주보도록 양편으로 원형의 스티로폼을 부착하였으며, 한 면에 부착된 스티로폼 원반 위에 발아중인 옥수수의 열매를 넣고 뚜껑을 닫으면 뚜껑에 부착된 스티로폼이 옥수수를 약하게 압박하여 옥수수 열매가 고정되고 뿌리는 자유롭게 굽어질 수 있도록 고안하였다.", "Petridish 내부에 수분에 적신 종이수건을 넣어두고 petridish 자체도 물이 담긴 대형 용기 안에 고정함으로써 측정기간 동안 상대습도가 포화되도록 유지하였다.", "측정 시작 시점까지는 식물체가 수직으로 유지되도록 사각 petridish를 고정하였다가 측정 시작과 동시에 일제히 수평으로 배치되도록 회전하여 고정하였으며, 매 시간 디지털 영상측정 장치로 촬영하여 ITPro \\( ^{\\mathrm{TM}} \\) 프로그램(Sometech, Korea)으로 각도를 측정하였다.", "각도는 원뿌리의 최초 수평 위치를 180\\(^{\\circ} \\)로 표시하였으며 중력 방향을 \\(90^{\\circ} \\)로 표시하여 굽어지는 정도를 표시하였다.", "</p><p>실험에 사용한 시약들의 구입처는 다음과 같다", ": \\( \\mathrm{CaCl}_{2} \\) 와 sodium phosphate (Shinyo Pure Chemicals, Japan); \\( \\mathrm{MgCl}_{2} \\) (Yakuri Pure Chemicals, Japan), \\( \\mathrm{MnCl}_{2} \\) (ICN Biomedicals, USA); \\( \\mathrm{NaCl} \\) (Junsei Pure Chemicals, Japan); Mannitol (Hayashi Pure Chemicals, Japan); Potassium phosphate (Bioworld, USA); \\( \\mathrm{MgSO}_{4} \\) (Duchefa, the Netherlands).", "</p> <h1>요 약</h1><p>염분 스트레스에 노출된 옥수수(Zea mays) 유식물의 원뿌리는 길이생장이 억제되는데, 본 연구에서는 위와 같은 조건에서 뿌리의 굴중성 반응을 조사하였다.", "고농도의 \\( \\mathrm{NaCl} \\) 과 \\( \\mathrm{KCl} \\)에 의해 스트레스를 받은 옥수수 원뿌리는 수평 상태에서 중력 자극을 받기 시작한 지 2시간 이후부터 대조구에 비하여 현저한 굴중성 반응을 나타내었다.", "이리한 굴중성 촉진현상은 \\( \\mathrm{Na}^{+} \\)가 아니라 \\( \\mathrm{K}^{+} \\)에 의한 것이었으며, \\( \\mathrm{Cl}^{-} \\)도 굴중성반응 촉진에 기여하였다.", "이로부터 이들 \\( \\mathrm{K}^{+} \\)와 \\( \\mathrm{Cl} \\) 이온들이 세포 팽창에 필요한 삼투 조절자로 기능한다는 결론을 얻었다.", "또한 염분 스트레스에 의하여 뿌리의 길이 생장이 억제되더라도 중력장 내에서의 위치 결정은 억제되지 않고 오히려 촉진된다는 점도 확인하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "염분 스트레스에 노출된 옥수수(Zea mays) 뿌리의 굴중성 반응", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-ad769d87-629c-49b3-a83b-6154c22d81f6", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "한두열", "이영나", "김여재", "박웅준" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,322	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>새송이 버섯파치 발효액의 첨가수준에 따른 돼지의 혈액 특성</h2><p>돼지의 비육기간 중 새송이 버섯파치 발효액을 \( 0 \%\)(C), \( 0.5 \%\)(T1), \( 1 \%\)(T1) 및 \( 1.5\%\)(T3)를 첨가 급이한 후 돼지의 혈액으로부터 총지질, 총콜레스테롤 및 중성지방을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 총지질은 대조구와 새송이 버섯파치 발효액 \( 0.5 \% \) 첨가구에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으나 \( 1 \% \) 및 \( 1.5 \% \) 첨가구에서는 각각 \( 277.09 \pm 10.77 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \) 와 \( 266.87 \pm 15.34 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \) 로 대조구에 비해 유의적으로 감소되었다. 총콜레스테롤도 총지질의 함량과 같은 경향으로 \( 1 \% \) 및 \( 1.5 \% \) 첨가구에서 각각 \( 86.17 \pm 4.50 \mathrm{mg} / \mathrm{dl}, 84.47 \pm 3.30 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 대조구 \( (94.82 \pm 2.16 \mathrm{mg} / \mathrm{dl}) \) 에 비해 유의적으로 감소되었다. 중성지방의 함량도 마찬가지로 새송이 버섯파치 발효액의 \( 1 \% \) 및 \( 1.5 \% \) 첨가구에서 대조구( \( (49.73 \pm 0.47 \mathrm{mg} / \mathrm{dl}) \) 에 비해 유의적으로 낮은 함량이었다.</p><p>새송이 버섯파치 발효액을 급이한 돼지의 혈청 중 HDL-, LDL-, VLDL-콜레스테롤 함량 및 동맥경화지수와 심혈관질환 위험지수를 산출한 결과는 Table 2와 같다. HDL-콜레스테롤 함량은 대조구 및 모든 실험군에서 \( 25.35 \pm 0.70 \) \( 25.81 \pm 0.99 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 범위로 새송이 버섯파치 발효액의 급이에 따른 유의적인 차이가 없었다. LDL-콜레스테롤의 함량은 새송이 버섯파치 발효액 \( 0.5 \% \) 및 \( 1 \% \) 첨가구에서는 대조구와 유의적인 차이가 없었으나, \( 1.5 \% \) 첨가구에서는 \( 49.43 \pm 3.94 \) \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 더 낮았다. VLDL-콜레스테롤의 함량은 대조구 및 처리구간의 유의차가 관찰되지 않았다.</p><p>동맥경화 지수 AI는 대조구 및 새송이 버섯파치 발효액 \( 0.5 \% \) 와 \( 1 \% \) 첨가구에서 \( 2.74 \pm 0.10 \sim 2.36 \pm 0.22 \) 의 범위로 새송이 버섯파치 발효액의 급이에 따른 유의차가 없었으나, \( 1.5 \% \) 첨가구에서는 \( 2.27 \pm 0.21 \) 로 대조구 및 여타 처리구에 비해 유의적인 감소를 보였다. 심혈관질환 위험지수 (CRF) 는 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율을 나타냄으로써 심혈관 질환의 위험도를 추정해 볼 수 있는데, 수치가 작을수록 심혈관질환 발병율이 낮은 것으로 알려져 있다. 본 실험 결과 심혈관질환 위험지수도 동맥경화지수와 동일한 경향으로 새송이 버섯파치 발효액 \( 1.5 \% \) 첨가급이 시 유의적으로 낮았다.</p><p>Park 등은 스테비아 부산물을 급여한 돼지의 혈청 콜레스테롤과 중성지방의 함량은 스테비아 급여구에서 유의적인 차이는 없었으나 전체적으로는 감소하는 경향이었는데 이는 스테비아 부산물에 함유된 조섬유와 Bacillus균 및 효모균의 영향으로 추정하였다. 혼합 생균제를 수준별로 급여한 경우 HDL-콜레스테롤의 함량이 대조구보다 더 높았으며 이러한 결과는 유산균 세포가 직접 콜레스테롤을 흡수함으로써 감소하거나, 담즙산의 가수분해 촉진으로 인하여 콜레스테롤 수요를 증가시키기 때문인데, 이와 같이 미생물에 의한 콜레스테롤 흡수 억제효과는 균주, 급여수준, 동물의 종, 사양환경 등에 따라 상이한 결과를 나타낼 수도 있다고 보고되어 있다. 이상의 결과로 미루어 볼 때, 본 실험의 결과 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군의 총지질, 총콜레스테롤, 중성지질 및 LDL-콜레스테롤 함량이 대조군에 비하여 더 낮게 정량된 것은 새송이 발효액 속의 균체 및 섬유소의 영향인 것으로 판단된다.</p><p>새송이 버섯파치 발효액을 농도별로 각각 급이한 돼지의 혈중 GOT, GPT 및 LDH 활성 및 혈청의 DPPH에 대한 항산화활성을 측정한 결과는 Table 3과 같다. 혈중 GOT 활성은 새송이 버섯파치 발효액의 급이량을 증가시킬수록 유의적으로 감소되어 대조군에서 \( 192.67 \pm 1.15 \mathrm{u} / \mathrm{ml} \) 이던 것이 새송이 버섯파치 발효액 \( 1.5 \% \) 첨가급이 시 \( 160.33 \pm 5.03 \mathrm{u} / \mathrm{ml} \) 로 감소하였다. GPT 활성도는 \( 0.5 \% \) 첨가구에서 대조구와 유의적인 차이가 없었으나 \( 1 \% \) 이상 첨가 시 유의적인 감소를 보였다. LDH 활성도는 \( 1 \% \) 와 \( 1.5 \% \) 첨가급이 시 각각 \( 1122.27 \pm \) \( 18.73 \mathrm{u} / \mathrm{ml} \) 와 \( 1116.46 \pm 52.25 \mathrm{u} / \mathrm{ml} \) 로 새송이 버섯파치 발효액 무첨가구에 비해 유의적으로 감소되었다. 혈액의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH에 대한 전자공여능을 측정한 결과 \( 45.92 \pm 2.46 \sim 47.25 \pm 1.64 \% \) 의 범위였으며, 대조군 및 시료군 간에 유의적인 차이는 없었다.</p> <h2>혈청 중 GOT, GPT 및 LDH 활성 측정</h2><p>혈청의 GOT (glutamic oxaloacetic transaminase) 및 GPT (glutamic pyruvic trans- aminase) 활성도는 GOT 및 GPT 측정용 kit시약(Asan, Korea)를 사용하여 \( 505 \mathrm{~nm} \) 에서 각각 흡광도를 측정한 다음 GOT, GPT 표준용액을 이용하여 작성한 표준검량곡선으로부터 산출하였다. LDH (lactate dehydrogenase)의 측정은 LDH 측정용 kit시약(AM 159-k, Asan, Korea)으로 측정하였으며, 혈중 함량은 혈청 \( 1 \mathrm{ml} \) 당 Wroblewski unit로 표시하였다.</p><h2>혈청 항산화 활성 측정</h2><p>혈청의 항산화 활성은 Lim 등의 방법에 따라 혈청 100 \( \mu l \) 에 \( \mathrm{ tris- HCl} \) 완충액 \( (100 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} \) 7.4)을 \( 1 \mathrm{ml} \) 가하여 혼합 한 후 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 용액 1 \( \mathrm{ml} \) 를 가한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 암실에서 15분간 반응시켰다. 여기에 chloroform \( 2 \mathrm{ml} \) 를 가하여 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10분간 원심분리시켜 하층부의 chloroform을 취하여 파장 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 항산화 활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 비로 나타내었다.</p><h2>관능 평가</h2><p>관능 평가는 각 시험구별로 육색(color), 이취(off-flavor), 씹힘성(tenderness), 다즙성(juiciness) 및 전반적인 기호도(overall acceptability)에 대해 7점 평가법으로 하였으며, 패널 요원은 훈련된 10 명으로 구성하였다. 관능검사를 위한 돈육은 저장 1일 \( \left(4 \pm 1^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 된 것을 사용하였으며, 시료는 모든 실험구별로 같은 조건으로 전자센서가 부착된 팬(electric grill, CG-131M, Cuckoo, Korea)을 미리 \( 170^{\circ} \mathrm{C} \) 로 예열한 후 양념 돈육을 넣고 앞면을 1분 구운 후 뒤집어서 뒷면을 2분간 더 구웠다. 구운 시료는 실온에서 1분간 냉각시킨 후 \( 4 \times 3 \mathrm{~cm} \) 로 잘라서 제시하였으며, 입안을 정수기물로 깨끗이 헹군 후 다음 평가를 하도록 하였다.</p><h2>물리적 특성 분석</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 첨가하여 급이한 돈육의 저장 중 물리적 특성을 분석하고자 육색, 가열감량 및 전단가를 측정하였다. 육색 측정은 육 부분을 2등분한 다음, 시료의 절단면에 대해서 Chromameter (Minolta Co. CR 301, Japan)를 사용하여 동일한 시료를 5회 반복하여 명도(lightness)를 나타내는 L값, 적색도(redness)를 나타내는 a값과 황색도(yellowness)를 나타내는 b값을 측정하였다. 이때 L값이 82.90, a값이 0.92, b 값이 0.78인 표준색판을 이용하여 표준화 작업을 한 후 측정하였다.</p><p>육의 가열감량은 \( 4 \times 4 \times 0.4 \mathrm{~cm} \) 정도로 돈육을 일정하게 절단하여 무게를 측정한 다음 polypropylene bag에 넣어 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \) 항온수조에서 30분간 가열한 후 실온에서 30간 냉각시켜 시료의 무게를 측정하였다. 이때의 가열감량은 시료의 가열 전.후 중량으로부터 산출하였다.</p><p>돈육의 전단가는 시료를 \( 4 \mathrm{~cm} \) 두께의 스테이크 모양으로 근섬유 방향과 반대 방향으로 절단하여 육 내부 온도가 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 유지되도록 가열한 후 상온으로 식혀 지름 \( 1.5 \) \( \mathrm{cm} \) 의 core를 이용하여 근섬유 방향의 원통형 절편으로 시료를 취하여 Instron (Model 1,000, USA)으로 측정하였다. 이때 Instron의 조건은 range \( 20 \mathrm{~kg} \), load cell \( 50 \mathrm{~kg} \), cross head speed \( 100 \mathrm{~mm} / \mathrm{min} \) 및 chart speed \( 100 \mathrm{~mm} / \mathrm{min} \) 이다.</p> <h2>TBARS의 변화</h2><p>돈육을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20일간 저장하면서 지질 산화도를 측정한 결과는 Table 10과 같다. 저장 기간이 경과함에 따라 모든 처리군에서 TBARS의 함량이 증가되어 지질 산화가 점차 심화되는 경향을 나타내었으나, 대조군에 비해 처리군에서 TBARS의 함량은 다소 낮은 경향이었다. 저장 10일에 대조군에서는 \( 0.21 \pm 0.02 \mathrm{MA} \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 으로 저장 1~5일에 비해 유의적으로 증가되었다. 반면에 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군에서는 저장 1~10일까지 유의적 차이가 없었으나, 저장 15일 이후 유의적으로 증가되는 현상을 보였다. 저장 20일에는 대조군, \( 0.5 \% \) 및 \( 1 \% \) 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군에 비해 \( 1.5 \% \) 첨가군에서 \( 0.23 \pm 0.01 \mathrm{MA} \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 으로 유의적인 감소를 보여, 돼지의 사육 시 새송이 버섯파치 발효액의 첨가가 돈육의 저장 중 지질산화 억제에 효과적인 것으로 사료된다.</p><p>돈육의 저장 기간 동안 TBARS 함량은 한약재 찌꺼기를 급이한 경우에 무첨가군에 비해 유의적으로 낮았는데, 이러한 결과는 한약재에 함유된 항산화성 물질에 기인된다고 보고되어 있다. 새송이 버섯 균병부위의 열수추출물은 폴리페놀 함량이 \( 1326.30 \mathrm{mg} \)\(\%\)이며, 항산화 활성 및 항균활성이 높은 것으로 보고되어 있다. 따라서 본 실험결과 새송이 버섯파치 발효액을 첨가 급이한 돈육의 저장 중 지질산화가 억제된 것도 새송이 버섯의 항산화성과 관련성이 있는 것으로 사료되며, 발효액의 급여량을 증가할수록 돈육의 저장 중 지질 산패를 지연시킬 수 있을 것이라 판단된다.</p><h2>지방산의 함량 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 급이하여 생산된 돈육의 저장 기간별 등심육의 지방산을 분석한 결과는 Table 11과 같다. 지방산은 총 7종이 동정되었으며, 포화 지방산은 palmitic acid \( \left(\mathrm{C}_{16: 0}\right) \) 가 가장 많았으며, 다음으로 stearic acid \( \left(\mathrm{C}_{18: 0}\right) \), myristic acid \( \left(C_{14: 0}\right) \) 순이었다. 불포화 지방산은 oleic acid \( \left(\mathrm{C}_{18: 1}\right) \) 의 함량이 가장 높아 모든 실험군에서 \( 37.45 \sim 45.81 \% \) 의 범위였으나 실험군 간의 함량 차이는 적었다. 포화지방산에 대한 불포화 지방산의 비율은 저장 1일에 대조군에서 \(1.23\)이었는데, 저장 15일까지 계속 증가하다가 저장 20일에 다소 감소하는 경향이었다. 처리구의 경우에는 \( 1.15 \sim 1.34 \mathrm{~s} \)의 범위였는데, 저장 20 일에 \( 1.20 \sim 1.319 \)의 범위였다. 새송이 버섯파치 발효액 첨가군에서 포화지방산에 대한 불포화 지방산의 비율 (UFA/SFA) 은 \( 0.5 \% \) 첨가군의 경우 저장 20 일까지 계속 감소되는 경향이었으며, \( 1 \% \) 첨가군 및 \( 1.5 \% \) 첨가군에서는 저장 15일까지 감소되다가 저장 20일에 다시 증가되어 대조군과 비슷한 경향이었다.</p><p>Park 등은 돈육 등심의 주요 지방산은 oleic acid, palmitic acid, linoleic acid 및 stearic acid의 순이었고 대조군과 처리군간의 유의적인 차이는 없다고 하였으며, Jung 등도 포화지방산은 palmitic acid, 불포화지방산은 oleic acid와 linoleic acid가 주를 이루며 시료 간에 유의차가 없다고 보고하였는데 본 실험의 결과도 이들의 결과와 잘 일치하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 동물의 사육</h2><p>시험에 공시한 재료는 경남 고성군 소재 농장에서 사육한 일반 백색계 3 원 교잡종 돼지 20두를 각 처리구마다 5두씩 4군으로 임의 배치하여 비육하였다. 급여사료는 육성돈 사료에 새송이 버섯파치 발효액을 각각 \( 0(C), 0.5 \%(T1), 1 \%(T2) \) 및 \( 1.5 \%(T3) \) 로 첨가하여 급이하였으며, 물과 사료는 사육기간 중 자유 급이시켰다. 비육 후 체중이 \( 100-110 \mathrm{~kg} \)의 규격돈일 때 출하하여 각 처리구를 모두 도축하였다.</p><p>새송이 버섯파치 발효액은 새송이 버섯 부산물인 버섯파치와 물을 \(2:1(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 로 혼합하여 분쇄한 후, 탄소원으로 sucrose를 \( 10 \% \) 첨가하고 \( 121^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 고압 살균한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 내외의 상온에서 냉각을 시키는 살균 및 냉각공정을 거쳐 Bacillus subtilis sp. BL-2, Saccharomaromyces carlsbergemsis Saflager S-23 및 Lactobacillus plantarum KCTC 3108을 첨가하여 발효하였다.</p><h2>실험 동물의 혈액 채취 및 처리</h2><p>실험 동물의 혈액 채취는 실험 동물의 도축 1일 전에 정맥으로부터 채취하여 \(0.5\%\) EDTA가 처리된 시험관에 넣어 약 1시간 동안 빙수 중에 정치한 후 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 실험에 사용하였다.</p><p>실험 동물의 육은 도축 후 등심근을 분할 정형하여 두당 \( 2.5 \mathrm{~kg} \) 씩 5마리에 대해서 총 \( 12.5 \mathrm{~kg} \) 의 등심 육을 얻었다. 이를 각각 \( 500 \mathrm{~g} \) 씩 polyethylene film으로 진공포장한 후 즉시 실험실로 옮겨 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉장실에 보관해 두고 사후 대사 작용이 완료된 시점인 사후 24 시간을 "저장 1 일"로 하여 각 처리구마다 1일, 5일, 10일, 15일 및 20일에 시료를 채취하여 저장 기간에 따른 이화학적 특성을 분석하였다.</p><h2>혈청 중 지질 성분의 분석</h2><p>총 지질은 Frings 등의 방법에 따라 \( 20 \mu l\) 의 혈청에 phospho-vanillin 시약을 첨가한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 15분간 반응시킨 후 혈청 무첨가구를 대조로 하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 총 콜레스테롤은 총 콜레스테롤 측정용 kit시약 (AM 202-k, Asan, Korea), 중성지방은 중성지방 측정용 kit 시약(AM 157S-k, Asan, Korea), HDL-cholesterol 함량의 측정은 HDL-C 측정용 kit시약(AM 203-k, Asan, Korea)으로 측정하였다. 이들 항목의 분석 결과로부터 LDL-cholesterol 함량은 혈청 총 콜레스테롤 - (HDL-C + 중성지방/5)의 계산식에 의해 산출하였고, VLDL-cholesterol 함량의 측정은 혈청 총 콜레스테롤 - (HDL-C + LDL-C)의 식으로부터 산출하였다. 또, 동맥경화지수(atherogenic index, AI)는 (혈청 총 콜레스테롤-HDL-C)/ HDL-C의 계산식으로부터 심혈관 질환 위험지수(cardiac risk factor, CRF) 는 총 콜레스테롤 / HDL-C 식에 따라 계산하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>돼지고기는 우리나라에서 가장 많이 소비되고 있는 식육으로 가공육보다 구이용으로 더 많이 소비되고 있다. 특히 삼겹살과 목심부위는 전체 생산량의 \( 30 \% \) 에 불과하나 소비자의 선호도는 \( 93 \% \) 에 이르고 있어 돈육의 소비패턴에 불균형을 이루고 있다. 국민의 생활수준 향상과 건강에 대한 관심 증대로 육질과 맛이 우수하고 기능성을 갖춘 고품질의 식육이 요구되고 있으며, 육류의 소비형태도 질적인 면이 중요시되고 있다. 이러한 소비자의 기호를 충족시키기 위하여 고품질의 돈육생산이 요구되고 있는데 그 대표적인 방법으로 돼지의 사육 시 기능성 물질을 첨가하여 급이함으로써 차별화된 돈육을 생산하는 방법이 이용되고 있으며, 기능성 사료를 급이한 돈육의 소비 양상이 증가되고 있는 점을 감안해 볼 때 고품질의 돈육 생산과 생산비 절감은 양돈 농가의 경쟁력 제고에 큰 영향을 미칠 것으로 생각된다.</p><p>그러나 현실적으로 축산물 품질의 고급화는 생산비 절감과 대립관계에 있다. 우리나라에서 사용되는 가축 배합사료의 \( 94 \% \) 는 수입에 의존하고 있으므로, 원료의 가격에 따른 사료 값의 변동이 불가피한 실정이다. 따라서 축산물의 생산비 절감을 위해서 우리나라에서 자체적으로 사료를 개발하는 것이 무엇보다 중요한 일이라 생각된다. 최근 돈육의 육질 향상과 기호도 증가 뿐만 아니라 사료비의 절감 효과를 위하여 식품으로 사용 후 폐기되는 부산물을 가축의 사료로 재생산하고자 하는 연구가 진행되고 있으며, 돼지의 사육 시 밀감 부산물, 감 껍질 분말, 한약재 찌꺼기, 발효 쌀겨, 남은 음식 발효물의 사료 중 혼합. 급이는 돈육의 기호성에 영향을 주지 않으며, 육질을 향상시켜 품질개선에 효과적이었다고 보고되어져 있다. 일본에서는 유산균으로 발효시킨 음식물 잔반 사료를 돼지에 급이하여 생산한 돈육의 선호도가 높았다고 보고된 바 있다.</p><p>새송이 버섯(Pleurotus eryngii)은 단백질, 비타민 및 무기질이 풍부하고, 특유의 향과 맛이 우수하여 소비자들이 선호하고 있는 버섯이며, 최근 새송이 버섯의 생리활성의 규명으로 그 소비도 2003년에 비해 2006년에는 46천 톤으로 약 3.5배 이상 급증하는 추세를 보이고 있다. 새송이 버섯은 주로 병재배에 의해 생산되며 버섯 생산량의 약 \( 6.5 \% \) 정도가 부산물로써 폐기되고 있는데, 특히 우리나라에서 재배되는 버섯의 부산물은 조회분의 함량이 \( 10 \% \) 정도로 낮아 반추동물의 사료로 가치를 인정받고 있다. 따라서 본 연구에서는 새송이 버섯의 재배 후 부산물로 발생되는 버섯 파치를 이용하여 제조한 발효액을 돼지에게 급이함으로써 도축 후 돼지의 혈장 지질의 양상과 돈육의 품질에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.</p> <h2>관능 평가</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 농도별로 급이하여 생산된 돈육 등심의 관능평가 결과는 Table 4 에 나타낸 바와 같다. 새송이 버섯파치 발효액의 급이량에 따른 돈육의 색, 이취 및 씹힘성은 실험군 간에 유의적인 차이가 없었다. 다즙성은 대조군에서 \( 4.80 \pm 0.84 \) 이었는데, 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군에서는 \( 5.29 \pm 0.49 \sim 5.50 \pm 0.84 \) 로 대조군에 비해 유의적으로 높았으나, 실험군 간의 유의차는 없었다. 돈육의 전반적인 기호도도 대조군에 비해 새송이 버섯파치 발효액을 급이한 돈육의 기호도가 유의적으로 높았으나, 각 실험군 간에는 유의차는 없었다.</p><p>소비자의 식육 구매의 주요 관능적 요인은 육색, 마블링의 정도가 주로 영향을 미치며 관능검사에서는 이러한 요인들보다는 가열 육을 입속에서 씹어 넘기는 과정에 혀의 감각으로 느껴지는 맛, 후각으로 느껴지는 향, 조직감 등이 종합적으로 관여하게 된다. 또한 육 가열시 일어나는 당의 분해, 단백질과 아미노산의 가열 분해물, 지질 분해 성분 등이 관여하게 되고 맛에 관여하는 핵산관련물질 및 유기산 등도 복합적으로 관능적 특성에 영향을 미친다고 알려져 있다. 본 실험의 결과 새송이 버섯파치 발효액을 급이하여 생산된 돈육의 기호도는 새송이 버섯파치 발효액 무첨가 돈육에 비해 다즙성이 우수하여 기호도를 높이는 것으로 판단되며, 발효액의 첨가량은 관능적 특성에는 큰 영향을 미치지 못하였다.</p><h2>육색의 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 급여한 돼지의 등심을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20일간 저장하면서 명도(lightness), 적색도(redness) 및 황색도(yellowness)를 측정한 결과는 Table 5와 같다. 저장 1 일에 명도는 \( 50.21 \pm 1.56 \sim 52.07 \pm 1.57 \)의 범위로 처리구간의 유의적인 차이가 없었으나 저장 기간 중 불규칙한 증감을 보이다가 저장 20일에는 모든 처리군에서 증가하는 경향을 보였는데, 새송이 버섯파치 발효액 \( 1.5 \% \) 첨가 급이군에서 \( 52.14 \pm 0.84 \) 로 유의적으로 낮았다. 적색도는 저장 1 일에 \( 7.60 \pm 1.63 \sim 7.99 \pm \)\( 0.74 \) 의 범위였으나, 저장 20 일에는 \( 8.10 \pm 0.38 \sim 8.85 \pm 0.53 \) 의 범위로 다소간의 증감이 있었으나 새송이 버섯파치 발효액의 첨가량 및 저장 기간에 따른 유의적인 차이는 없었다. 새송이 버섯파치 발효액 \( 1.5 \% \) 첨가 급이군을 제외한 실험군에서 황색도는 저장 15 일까지는 유의적인 차이가 없었는데, 저장 20 일에 \( 6.14 \pm 1.41 \sim 7.18 \pm 0.66 \) 의 범위로 유의적인 증가를 보였다.</p><p>발효 쌀겨의 급이는 돈육의 육색에 유의적인 차이를 나타내지 않으며, 잠분의 급여 수준과 기간도 육색의 변화에 큰 영향을 미치지 않으며, 저장기간의 경과에 따른 불규칙한 증감을 보인다는 보고는 본 실험 결과와 일치하는 경향이었다.</p> <h2>가열감량의 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 급이하여 생산된 돼지 등심의 저장기간에 따른 가열감량을 측정한 결과는 Table 6과 같다. 가열감량은 저장 5일부터 15일까지는 감소하였다가 저장 20일에는 다시 유의적으로 증가하는 경향이었다. 즉, 대조군의 경우 저장 1일에 \( 29.90 \pm 3.02 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \)에서 저장 15일에는 \( 24.69 \pm 0.94 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \)으로 유의적으로 감소하였다가 저장 20일에는 \( 30.07 \pm 2.49 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \) 으로 가열감량이 다시 증가하였다. 새송이 버섯파치 발효액 \( 1 \% \) 및 \( 1.5 \% \) 첨가 급이군도 저장 10일부터 가열감량이 감소하다가 저장 20일에는 다소 증가하였다.</p><p>육류의 조리 시 발생하는 가열감량은 조리된 육류의 다즙성 및 육제품 제조 시 제품의 수율에 영향을 주는 요인이 되는데, 잠분의 급여로 돈육의 저장 중 가열감량은 저장 초기에는 대조군과 실험군 사이의 유의차가 적었으나 저장 12일에는 잠분 급여군의 가열감량이 더 낮다고 한 보고는 본 실험의 결과와 일치하는 경향이었다. 또 육의 \( \mathrm{pH} \) 가 높으면 가열감량이 적다고 알려져 있는데, 본 실험의 결과에서도 이와 동일한 경향을 확인할 수 있었다.</p><h2>전단가의 변화</h2><p>Table 7은 저장기간에 따른 돼지 등심육의 전단가 변화를나타낸 것인데, 기간이 경과할수록 전단가는 점차 감소하였다. 대조군은 저장 1일에 \( 5.64 \pm 0.56 \mathrm{~cm} / \mathrm{kg}^{2} \) 으로 새송이 버섯파치 발효액첨가 급이군에 비해 유의적으로 높았으며, 저장 기간이 경과됨에 따라 감소되어졌다. 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군들의 전단가는 저장 1 일에 \( 4.57 \pm 0.46 \)~\( 5.07 \pm 0.22 \mathrm{~cm} / \mathrm{kg}^{2} \) 범위였으며, 발효액 \( 1.5 \% \) 급이군에서 \( 0.5 \% \) 급이군보다 유의적으로 높았다. 반면에 저장 10일에서 20일까지 저장기간 동안 전단가의 감소는 있었으나, 유의차는 없었다. 또한 저장 기간의 경과에 따라 대조구 및 실험군 간의 유의차도 적었으며, 저장 20일에 대조군에 비해 새송이 발효액 \( 1 \% \) 및 \( 1.5 \% \) 첨가 급이군에서 유의차를 보였다.</p><p>잔반의 발효사료는 돈육의 연도에 영향을 주지 않으며, 한약재 찌꺼기를 혼합 급이하여 생산된 돈육의 전단가는 대조구에 비해 처리구에서 낮았으며, 조직의 파쇄성이 유의적으로 높아 한약재 찌꺼기 급이로 육질의 연도가 낮아져 저작감을 상승시킬 수 있다고 보고하였는데, 본 실험결과도 새송이 버섯파치 발효액의 급이로 대조구에 비해 전단가가 낮아, 버섯파치 발효액을 급이함으로써 돈육의 육질이 부드러워졌음을 알 수 있었다.</p> <h2>화학적 특성 분석</h2><p>돈육의 수분은 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \) 상압가열 건조법, 조지방은 ether를 이용한 soxhlet 추출법으로 분석하였다. \( \mathrm{pH} \) 는 분쇄된 돈육 \( 10 \mathrm{~g} \) 에 증류수를 가하여 균질화한 후 최종 부피를 \( 100 \mathrm{ml} \) 로 조정한 후 여과하여pH-meter (Model 720, Thermo Orion, USA)로 측정하였다.</p><p>육의 TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances) 함량은 세절육 \( 5 \mathrm{~g} \) 에 butylated hydroxyanisole (BHA) \( 50 \mu l\)와 증류수 \( 15 \mathrm{ml} \) 를 가해 균질화 시킨 후 균질액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 시험관에 넣고 여기에 \( 2 \mathrm{ml} \) 의 thiobarbituric acid (TBA)/trichloro-acetic acid (TCA) 혼합용액을 넣어 완전히 혼합한 다음, \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 의 항온수조에서 15 분간 가열처리한 후 냉각시켜 \( 3,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리 하였다. 이때 상층액을 회수하여 spectrophotometer (Optizen 2120UV, Mecasys C. Ltd, Korea)로 \( 531 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였으며, TEP (1,1,3,3-tetraethoxypropane, Sigma-Aldrich Co. Ltd) 표준물질을 이용한 표준 검량곡선에 의하여 산출하였다.</p><p>돈육의 지방산은 Bligh와 Dyer의 방법에 따라 chloroform:methanol \( (\mathrm{C}: \mathrm{M}=2: 1, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 용액을 가하여 24시간 추출하여 얻은 지질을 \( 14 \% \mathrm{BF}_{3}-\mathrm{MeOH} 3 \mathrm{ml} \) 로 메칠에스테르화시켜 가스크로마토그래피(Hewlett Packard 5890 Ⅱ. USA)로 분석하였다. 이때 칼럼은 Ultra 2 (Crosslinked 5\% PH ME Siloxane, \( 25 \times 0.32 \mathrm{~mm} \times 0.52 \mu \mathrm{m} \) film thickness)를, 검출기는 불꽃 이온화 검출기를 사용하였다. 칼럼온도는 \( 160^{\circ} \mathrm{C} \) 에서부터 \( 190^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 분당 \( 5^{\circ} \mathrm{C} \) 씩 승온시키고, \( 220^{\circ} \mathrm{C} \) 까지는 분당 \( 3^{\circ} \mathrm{C} \) 씩 승온시킨 후 10분간 유지하였다. Injecter 온도는 \( 270^{\circ} \mathrm{C} \), 검출기 온도는 \( 300^{\circ} \mathrm{C} \) 로 하였으며 split ratio를 100:1로 하여 질소가스는 분당 \( 1.4 \mathrm{ml} \) 였다.</p><h2>통계 처리</h2><p>각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 얻은 결과를 SPSS 12.0을 사용하여 통계 처리하였으며, 각각의 시료에 대해 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었다. 각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.</p> <h1>요 약</h1><p>새송이 버섯파치 발효액 \( (0,0.5 \%, 1 \% \) 및 \( 1.5 \%) \) 의 급이가 돼지의 혈액 성분 및 돈육의 품질에 미치는 영향을 실험하였다. 돼지의 혈중 총 지질, 총콜레스테롤 및 중성지방은 대조군에 비해 \( 1.5 \% \) 첨가군에서 유의적으로 감소되었다. HDL-, LDL-, VLDL-콜레스테롤 함량은 대조군과 처리군간의 유의차가 없었다. 동맥경화 지수 및 심혈관 질환 위험지수는 대조군에 비해 \( 1.5 \% \) 발효액 급이군에서 유의적으로 낮았다. GOT, LDH 활성도는 \( 1.5 \% \) 첨가군에서 대조군 및 \( 0.5 \% \) 첨가군에 비해 유의적으로 낮았다. 혈중 항산화 활성은 \( 45.92 \pm 2.46 \sim 47.25 \pm \)\( 1.64 \% \) 의 범위로 유의차가 없었다. 돈육의 기호도는 대조군에 비해 새송이 버섯파치 발효액을 급이한 돈육에서 유의적으로 높았으나, 각 실험군간의 유의차는 없었다. 돈육 등심의 명도는 저장 1일에 유의차가 없었으나, 저장 20일에는 증가되는 경향이었고, 적색도는 새송이 버섯 발효액의 첨가량 및 저장 기간에 따른 유의차가 없었다. 가열감량은 새송이 버섯파치발효액 \( 1 \% \) 및 \( 1.5 \% \) 첨가 급이군에서 저장 10일부터 감소하다가 저장 20일에는 다소 증가하였다. 전단가는 저장 20일에 대조군에 비해 새송이 버섯파치 발효액 \( 1 \% \) 및 \( 1.5 \% \) 첨가 급이군에서 유의적으로 낮았다. 저장기간 동안 돈육의 수분, 조지방 함량 및 \( \mathrm{pH} \) 의 변화는 유의차가 없었다. TBARS의 함량은 저장 기간이 경과함에 따라 모든 처리군에서 증가되었으나, 대조군에 비해 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군에서 다소 낮았다. 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이 시 포화지방산에 대한 불포화 지방산의 비율(UFA/SFA)은 \( 1 \% \) 및 \( 1.5 \% \) 첨가군에서는 저장 15일까지 감소되다가 저장 20일에는 다시 증가되어 대조군과 비슷한 경향이었다.</p> <h2>수분 및 조지방의 함량 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액의 급이량 및 저장기간의 경과에 따른 돼지 등심의 수분 및 조지방 함량 변화는 Table 8에 나타낸 바와 같다. 저장 1일에는 대조군에서는 \( 72.02 \pm 1.61 \) \( \mathrm{g} / 100 \mathrm{~g} \) 이었으며, 새송이 버섯파치 발효액 \( 0.5 \% \) 와 \( 1 \% \) 첨가 급이군에서 각각 \( 68.32 \pm 2.22 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \) 및 \( 67.51 \pm 1.70 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \)으로 대조군에 비해 유의적으로 낮은 함량이었다. 이후 저장기간 동안 돈육의 수분 함량은 \( 72.20 \pm 1.64 \sim 74.91 \pm 0.78 \mathrm{~g} / 100 \)\( \mathrm{g} \) 으로 새송이 버섯파치 발효액 첨가량 및 저장기간에 따른 유의차가 없었다. 조지방 함량은 대조군 및 실험군간의 유의적인 차이가 없었으며, 대조군과 새송이 버섯파치 발효액 \( 1 \% \) 첨가 급이군의 경우 저장 기간에 따른 유의적인 차이도 없었다. 새송이 버섯파치 발효액 \( 0.5 \% \) 와 \( 1.5 \% \) 첨가군의 경우 저장 15일에 각각 \( 3.12 \pm 0.29 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \)과 \( 3.01 \pm 0.14 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \) 으로 증가하였으나 그 이후부터는 차이가 없었다.</p><p>돼지 사료에 활성탄을 \( 0.6 \% \) 첨가 급이한 결과 등심부위의 수분 및 조지방 함량은 대조군과 유의적인 차이가 없다는 보고와 머루주박을 급여한 돈육에서도 수분과 지방을 포함한 일반 성분에 변화가 없다는 보고가 있다.</p><p>육의 수분 함량이 높으면 고기는 연하고 부드러워 연도가 양호하다고 보고되어 있다. 또한, 근육의 수분 함량은 근육의 물리적 성숙도와 지방 함량에 따라 차이가 있는데, 약 \( 70 \sim 75 \% \) 로 구성되며 저장온도, 시간, 육의 종류 및 근육 부위에 따라서도 차이가 있다고 밝혀져 있다.</p><h2>\( \mathrm{pH} \)의 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액 급여 수준과 저장기간에 따른 돈육의 \( \mathrm{pH} \) 변화를 분석한 결과는 Table 9와 같다. 저장 1일에 \( \mathrm{pH} \) 는 새송이 발효액 \( 1.5 \% \) 급이군이 \( 5.64 \pm 0.02 \) 로 가장 낮았고, \( 0.5 \% \) 급이군은 \( 5.78 \pm 0.02 \) 로 가장 높았다. 저장 기간이 경과함에 따라 \( \mathrm{pH} \)는 불규칙한 증감을 보이면서 미량 증가하여 저장 20일에는 \( 5.76 \pm 0.02 \sim 5.87 \pm 0.03 \) 의 범위였으며 실험군간의 유의적인 차이가 없었다.</p><p>Kang 등은 어성초 분말을 첨가 급이한 돼지 등심의 냉장 저장 중 \( \mathrm{pH} \)는 저장 기간의 경과에 따라 미량씩 증가하는 경향이라고 하여 본 실험과 유사한 결과를 보고한 바 있다. Lee 등도 잠분을 급여한 돈육의 냉장 저장 중 \( \mathrm{pH} \) 는 저장기간이 경과함에 따라 전 처리구가 저장 초기 \( 5.47 \sim 5.58 \)의 범위였던 것이 저장 12일에는 \( 5.54 \sim 5.75 \) 로 다소 증가하였는데, 이는 단백질 분해에 따른 염기성기의 노출 및 암모니아 등의 생성, 단백질 완충물질의 변화, 전해질 해리의 감소 등에 기인한다고 하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>결과 및 고찰</h1><h2>새송이 버섯파치 발효액의 첨가수준에 따른 돼지의 혈액 특성</h2><p>돼지의 비육기간 중 새송이 버섯파치 발효액을 \\( 0 \\%\\)(C), \\( 0.5 \\%\\)(T1), \\( 1 \\%\\)(T1) 및 \\( 1.5\\%\\)(T3)를 첨가 급이한 후 돼지의 혈액으로부터 총지질, 총콜레스테롤 및 중성지방을 측정한 결과는 Table 1과 같다.", "총지질은 대조구와 새송이 버섯파치 발효액 \\( 0.5 \\% \\) 첨가구에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으나 \\( 1 \\% \\) 및 \\( 1.5 \\% \\) 첨가구에서는 각각 \\( 277.09 \\pm 10.77 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\) 와 \\( 266.87 \\pm 15.34 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\) 로 대조구에 비해 유의적으로 감소되었다.", "총콜레스테롤도 총지질의 함량과 같은 경향으로 \\( 1 \\% \\) 및 \\( 1.5 \\% \\) 첨가구에서 각각 \\( 86.17 \\pm 4.50 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl}, 84.47 \\pm 3.30 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 대조구 \\( (94.82 \\pm 2.16 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl}) \\) 에 비해 유의적으로 감소되었다.", "중성지방의 함량도 마찬가지로 새송이 버섯파치 발효액의 \\( 1 \\% \\) 및 \\( 1.5 \\% \\) 첨가구에서 대조구( \\( (49.73 \\pm 0.47 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl}) \\) 에 비해 유의적으로 낮은 함량이었다.", "</p><p>새송이 버섯파치 발효액을 급이한 돼지의 혈청 중 HDL-, LDL-, VLDL-콜레스테롤 함량 및 동맥경화지수와 심혈관질환 위험지수를 산출한 결과는 Table 2와 같다.", "HDL-콜레스테롤 함량은 대조구 및 모든 실험군에서 \\( 25.35 \\pm 0.70 \\) \\( 25.81 \\pm 0.99 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 의 범위로 새송이 버섯파치 발효액의 급이에 따른 유의적인 차이가 없었다.", "LDL-콜레스테롤의 함량은 새송이 버섯파치 발효액 \\( 0.5 \\% \\) 및 \\( 1 \\% \\) 첨가구에서는 대조구와 유의적인 차이가 없었으나, \\( 1.5 \\% \\) 첨가구에서는 \\( 49.43 \\pm 3.94 \\) \\( \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 로 더 낮았다.", "VLDL-콜레스테롤의 함량은 대조구 및 처리구간의 유의차가 관찰되지 않았다.", "</p><p>동맥경화 지수 AI는 대조구 및 새송이 버섯파치 발효액 \\( 0.5 \\% \\) 와 \\( 1 \\% \\) 첨가구에서 \\( 2.74 \\pm 0.10 \\sim 2.36 \\pm 0.22 \\) 의 범위로 새송이 버섯파치 발효액의 급이에 따른 유의차가 없었으나, \\( 1.5 \\% \\) 첨가구에서는 \\( 2.27 \\pm 0.21 \\) 로 대조구 및 여타 처리구에 비해 유의적인 감소를 보였다.", "심혈관질환 위험지수 (CRF) 는 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율을 나타냄으로써 심혈관 질환의 위험도를 추정해 볼 수 있는데, 수치가 작을수록 심혈관질환 발병율이 낮은 것으로 알려져 있다.", "본 실험 결과 심혈관질환 위험지수도 동맥경화지수와 동일한 경향으로 새송이 버섯파치 발효액 \\( 1.5 \\% \\) 첨가급이 시 유의적으로 낮았다.", "</p><p>Park 등은 스테비아 부산물을 급여한 돼지의 혈청 콜레스테롤과 중성지방의 함량은 스테비아 급여구에서 유의적인 차이는 없었으나 전체적으로는 감소하는 경향이었는데 이는 스테비아 부산물에 함유된 조섬유와 Bacillus균 및 효모균의 영향으로 추정하였다.", "혼합 생균제를 수준별로 급여한 경우 HDL-콜레스테롤의 함량이 대조구보다 더 높았으며 이러한 결과는 유산균 세포가 직접 콜레스테롤을 흡수함으로써 감소하거나, 담즙산의 가수분해 촉진으로 인하여 콜레스테롤 수요를 증가시키기 때문인데, 이와 같이 미생물에 의한 콜레스테롤 흡수 억제효과는 균주, 급여수준, 동물의 종, 사양환경 등에 따라 상이한 결과를 나타낼 수도 있다고 보고되어 있다.", "이상의 결과로 미루어 볼 때, 본 실험의 결과 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군의 총지질, 총콜레스테롤, 중성지질 및 LDL-콜레스테롤 함량이 대조군에 비하여 더 낮게 정량된 것은 새송이 발효액 속의 균체 및 섬유소의 영향인 것으로 판단된다.", "</p><p>새송이 버섯파치 발효액을 농도별로 각각 급이한 돼지의 혈중 GOT, GPT 및 LDH 활성 및 혈청의 DPPH에 대한 항산화활성을 측정한 결과는 Table 3과 같다.", "혈중 GOT 활성은 새송이 버섯파치 발효액의 급이량을 증가시킬수록 유의적으로 감소되어 대조군에서 \\( 192.67 \\pm 1.15 \\mathrm{u} / \\mathrm{ml} \\) 이던 것이 새송이 버섯파치 발효액 \\( 1.5 \\% \\) 첨가급이 시 \\( 160.33 \\pm 5.03 \\mathrm{u} / \\mathrm{ml} \\) 로 감소하였다.", "GPT 활성도는 \\( 0.5 \\% \\) 첨가구에서 대조구와 유의적인 차이가 없었으나 \\( 1 \\% \\) 이상 첨가 시 유의적인 감소를 보였다.", "LDH 활성도는 \\( 1 \\% \\) 와 \\( 1.5 \\% \\) 첨가급이 시 각각 \\( 1122.27 \\pm \\) \\( 18.73 \\mathrm{u} / \\mathrm{ml} \\) 와 \\( 1116.46 \\pm 52.25 \\mathrm{u} / \\mathrm{ml} \\) 로 새송이 버섯파치 발효액 무첨가구에 비해 유의적으로 감소되었다.", "혈액의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH에 대한 전자공여능을 측정한 결과 \\( 45.92 \\pm 2.46 \\sim 47.25 \\pm 1.64 \\% \\) 의 범위였으며, 대조군 및 시료군 간에 유의적인 차이는 없었다.", "</p> <h2>혈청 중 GOT, GPT 및 LDH 활성 측정</h2><p>혈청의 GOT (glutamic oxaloacetic transaminase) 및 GPT (glutamic pyruvic trans- aminase) 활성도는 GOT 및 GPT 측정용 kit시약(Asan, Korea)를 사용하여 \\( 505 \\mathrm{~nm} \\) 에서 각각 흡광도를 측정한 다음 GOT, GPT 표준용액을 이용하여 작성한 표준검량곡선으로부터 산출하였다.", "LDH (lactate dehydrogenase)의 측정은 LDH 측정용 kit시약(AM 159-k, Asan, Korea)으로 측정하였으며, 혈중 함량은 혈청 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 당 Wroblewski unit로 표시하였다.", "</p><h2>혈청 항산화 활성 측정</h2><p>혈청의 항산화 활성은 Lim 등의 방법에 따라 혈청 100 \\( \\mu l \\) 에 \\( \\mathrm{ tris- HCl} \\) 완충액 \\( (100 \\mathrm{mM}, \\mathrm{pH} \\) 7.4)을 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 가하여 혼합 한 후 \\( 0.5 \\mathrm{mM} \\) 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 용액 1 \\( \\mathrm{ml} \\) 를 가한 다음 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 의 암실에서 15분간 반응시켰다.", "여기에 chloroform \\( 2 \\mathrm{ml} \\) 를 가하여 \\( 3,000 \\mathrm{rpm} \\)에서 10분간 원심분리시켜 하층부의 chloroform을 취하여 파장 \\( 517 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "항산화 활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 비로 나타내었다.", "</p><h2>관능 평가</h2><p>관능 평가는 각 시험구별로 육색(color), 이취(off-flavor), 씹힘성(tenderness), 다즙성(juiciness) 및 전반적인 기호도(overall acceptability)에 대해 7점 평가법으로 하였으며, 패널 요원은 훈련된 10 명으로 구성하였다.", "관능검사를 위한 돈육은 저장 1일 \\( \\left(4 \\pm 1^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\) 된 것을 사용하였으며, 시료는 모든 실험구별로 같은 조건으로 전자센서가 부착된 팬(electric grill, CG-131M, Cuckoo, Korea)을 미리 \\( 170^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 로 예열한 후 양념 돈육을 넣고 앞면을 1분 구운 후 뒤집어서 뒷면을 2분간 더 구웠다.", "구운 시료는 실온에서 1분간 냉각시킨 후 \\( 4 \\times 3 \\mathrm{~cm} \\) 로 잘라서 제시하였으며, 입안을 정수기물로 깨끗이 헹군 후 다음 평가를 하도록 하였다.", "</p><h2>물리적 특성 분석</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 첨가하여 급이한 돈육의 저장 중 물리적 특성을 분석하고자 육색, 가열감량 및 전단가를 측정하였다.", "육색 측정은 육 부분을 2등분한 다음, 시료의 절단면에 대해서 Chromameter (Minolta Co. CR 301, Japan)를 사용하여 동일한 시료를 5회 반복하여 명도(lightness)를 나타내는 L값, 적색도(redness)를 나타내는 a값과 황색도(yellowness)를 나타내는 b값을 측정하였다.", "이때 L값이 82.90, a값이 0.92, b 값이 0.78인 표준색판을 이용하여 표준화 작업을 한 후 측정하였다.", "</p><p>육의 가열감량은 \\( 4 \\times 4 \\times 0.4 \\mathrm{~cm} \\) 정도로 돈육을 일정하게 절단하여 무게를 측정한 다음 polypropylene bag에 넣어 \\( 70^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 항온수조에서 30분간 가열한 후 실온에서 30간 냉각시켜 시료의 무게를 측정하였다.", "이때의 가열감량은 시료의 가열 전.후 중량으로부터 산출하였다.", "</p><p>돈육의 전단가는 시료를 \\( 4 \\mathrm{~cm} \\) 두께의 스테이크 모양으로 근섬유 방향과 반대 방향으로 절단하여 육 내부 온도가 \\( 75^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 10분간 유지되도록 가열한 후 상온으로 식혀 지름 \\( 1.5 \\) \\( \\mathrm{cm} \\) 의 core를 이용하여 근섬유 방향의 원통형 절편으로 시료를 취하여 Instron (Model 1,000, USA)으로 측정하였다.", "이때 Instron의 조건은 range \\( 20 \\mathrm{~kg} \\), load cell \\( 50 \\mathrm{~kg} \\), cross head speed \\( 100 \\mathrm{~mm} / \\mathrm{min} \\) 및 chart speed \\( 100 \\mathrm{~mm} / \\mathrm{min} \\) 이다.", "</p> <h2>TBARS의 변화</h2><p>돈육을 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 20일간 저장하면서 지질 산화도를 측정한 결과는 Table 10과 같다.", "저장 기간이 경과함에 따라 모든 처리군에서 TBARS의 함량이 증가되어 지질 산화가 점차 심화되는 경향을 나타내었으나, 대조군에 비해 처리군에서 TBARS의 함량은 다소 낮은 경향이었다.", "저장 10일에 대조군에서는 \\( 0.21 \\pm 0.02 \\mathrm{MA} \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\) 으로 저장 1~5일에 비해 유의적으로 증가되었다.", "반면에 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군에서는 저장 1~10일까지 유의적 차이가 없었으나, 저장 15일 이후 유의적으로 증가되는 현상을 보였다.", "저장 20일에는 대조군, \\( 0.5 \\% \\) 및 \\( 1 \\% \\) 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군에 비해 \\( 1.5 \\% \\) 첨가군에서 \\( 0.23 \\pm 0.01 \\mathrm{MA} \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\) 으로 유의적인 감소를 보여, 돼지의 사육 시 새송이 버섯파치 발효액의 첨가가 돈육의 저장 중 지질산화 억제에 효과적인 것으로 사료된다.", "</p><p>돈육의 저장 기간 동안 TBARS 함량은 한약재 찌꺼기를 급이한 경우에 무첨가군에 비해 유의적으로 낮았는데, 이러한 결과는 한약재에 함유된 항산화성 물질에 기인된다고 보고되어 있다.", "새송이 버섯 균병부위의 열수추출물은 폴리페놀 함량이 \\( 1326.30 \\mathrm{mg} \\)\\(\\%\\)이며, 항산화 활성 및 항균활성이 높은 것으로 보고되어 있다.", "따라서 본 실험결과 새송이 버섯파치 발효액을 첨가 급이한 돈육의 저장 중 지질산화가 억제된 것도 새송이 버섯의 항산화성과 관련성이 있는 것으로 사료되며, 발효액의 급여량을 증가할수록 돈육의 저장 중 지질 산패를 지연시킬 수 있을 것이라 판단된다.", "</p><h2>지방산의 함량 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 급이하여 생산된 돈육의 저장 기간별 등심육의 지방산을 분석한 결과는 Table 11과 같다.", "지방산은 총 7종이 동정되었으며, 포화 지방산은 palmitic acid \\( \\left(\\mathrm{C}_{16: 0}\\right) \\) 가 가장 많았으며, 다음으로 stearic acid \\( \\left(\\mathrm{C}_{18: 0}\\right) \\), myristic acid \\( \\left(C_{14: 0}\\right) \\) 순이었다.", "불포화 지방산은 oleic acid \\( \\left(\\mathrm{C}_{18: 1}\\right) \\) 의 함량이 가장 높아 모든 실험군에서 \\( 37.45 \\sim 45.81 \\% \\) 의 범위였으나 실험군 간의 함량 차이는 적었다.", "포화지방산에 대한 불포화 지방산의 비율은 저장 1일에 대조군에서 \\(1.23\\)이었는데, 저장 15일까지 계속 증가하다가 저장 20일에 다소 감소하는 경향이었다.", "처리구의 경우에는 \\( 1.15 \\sim 1.34 \\mathrm{~s} \\)의 범위였는데, 저장 20 일에 \\( 1.20 \\sim 1.319 \\)의 범위였다.", "새송이 버섯파치 발효액 첨가군에서 포화지방산에 대한 불포화 지방산의 비율 (UFA/SFA) 은 \\( 0.5 \\% \\) 첨가군의 경우 저장 20 일까지 계속 감소되는 경향이었으며, \\( 1 \\% \\) 첨가군 및 \\( 1.5 \\% \\) 첨가군에서는 저장 15일까지 감소되다가 저장 20일에 다시 증가되어 대조군과 비슷한 경향이었다.", "</p><p>Park 등은 돈육 등심의 주요 지방산은 oleic acid, palmitic acid, linoleic acid 및 stearic acid의 순이었고 대조군과 처리군간의 유의적인 차이는 없다고 하였으며, Jung 등도 포화지방산은 palmitic acid, 불포화지방산은 oleic acid와 linoleic acid가 주를 이루며 시료 간에 유의차가 없다고 보고하였는데 본 실험의 결과도 이들의 결과와 잘 일치하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 동물의 사육</h2><p>시험에 공시한 재료는 경남 고성군 소재 농장에서 사육한 일반 백색계 3 원 교잡종 돼지 20두를 각 처리구마다 5두씩 4군으로 임의 배치하여 비육하였다.", "급여사료는 육성돈 사료에 새송이 버섯파치 발효액을 각각 \\( 0(C), 0.5 \\%(T1), 1 \\%(T2) \\) 및 \\( 1.5 \\%(T3) \\) 로 첨가하여 급이하였으며, 물과 사료는 사육기간 중 자유 급이시켰다.", "비육 후 체중이 \\( 100-110 \\mathrm{~kg} \\)의 규격돈일 때 출하하여 각 처리구를 모두 도축하였다.", "</p><p>새송이 버섯파치 발효액은 새송이 버섯 부산물인 버섯파치와 물을 \\(2:1(\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\) 로 혼합하여 분쇄한 후, 탄소원으로 sucrose를 \\( 10 \\% \\) 첨가하고 \\( 121^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 15분간 고압 살균한 후, \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 내외의 상온에서 냉각을 시키는 살균 및 냉각공정을 거쳐 Bacillus subtilis sp.", "BL-2, Saccharomaromyces carlsbergemsis Saflager S-23 및 Lactobacillus plantarum KCTC 3108을 첨가하여 발효하였다.", "</p><h2>실험 동물의 혈액 채취 및 처리</h2><p>실험 동물의 혈액 채취는 실험 동물의 도축 1일 전에 정맥으로부터 채취하여 \\(0.5\\%\\) EDTA가 처리된 시험관에 넣어 약 1시간 동안 빙수 중에 정치한 후 \\( 3,000 \\mathrm{rpm} \\) 에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 실험에 사용하였다.", "</p><p>실험 동물의 육은 도축 후 등심근을 분할 정형하여 두당 \\( 2.5 \\mathrm{~kg} \\) 씩 5마리에 대해서 총 \\( 12.5 \\mathrm{~kg} \\) 의 등심 육을 얻었다.", "이를 각각 \\( 500 \\mathrm{~g} \\) 씩 polyethylene film으로 진공포장한 후 즉시 실험실로 옮겨 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 의 냉장실에 보관해 두고 사후 대사 작용이 완료된 시점인 사후 24 시간을 \"저장 1 일\"로 하여 각 처리구마다 1일, 5일, 10일, 15일 및 20일에 시료를 채취하여 저장 기간에 따른 이화학적 특성을 분석하였다.", "</p><h2>혈청 중 지질 성분의 분석</h2><p>총 지질은 Frings 등의 방법에 따라 \\( 20 \\mu l\\) 의 혈청에 phospho-vanillin 시약을 첨가한 후 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 15분간 반응시킨 후 혈청 무첨가구를 대조로 하여 \\( 540 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "총 콜레스테롤은 총 콜레스테롤 측정용 kit시약 (AM 202-k, Asan, Korea), 중성지방은 중성지방 측정용 kit 시약(AM 157S-k, Asan, Korea), HDL-cholesterol 함량의 측정은 HDL-C 측정용 kit시약(AM 203-k, Asan, Korea)으로 측정하였다.", "이들 항목의 분석 결과로부터 LDL-cholesterol 함량은 혈청 총 콜레스테롤 - (HDL-C + 중성지방/5)의 계산식에 의해 산출하였고, VLDL-cholesterol 함량의 측정은 혈청 총 콜레스테롤 - (HDL-C + LDL-C)의 식으로부터 산출하였다.", "또, 동맥경화지수(atherogenic index, AI)는 (혈청 총 콜레스테롤-HDL-C)/ HDL-C의 계산식으로부터 심혈관 질환 위험지수(cardiac risk factor, CRF) 는 총 콜레스테롤 / HDL-C 식에 따라 계산하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>돼지고기는 우리나라에서 가장 많이 소비되고 있는 식육으로 가공육보다 구이용으로 더 많이 소비되고 있다.", "특히 삼겹살과 목심부위는 전체 생산량의 \\( 30 \\% \\) 에 불과하나 소비자의 선호도는 \\( 93 \\% \\) 에 이르고 있어 돈육의 소비패턴에 불균형을 이루고 있다.", "국민의 생활수준 향상과 건강에 대한 관심 증대로 육질과 맛이 우수하고 기능성을 갖춘 고품질의 식육이 요구되고 있으며, 육류의 소비형태도 질적인 면이 중요시되고 있다.", "이러한 소비자의 기호를 충족시키기 위하여 고품질의 돈육생산이 요구되고 있는데 그 대표적인 방법으로 돼지의 사육 시 기능성 물질을 첨가하여 급이함으로써 차별화된 돈육을 생산하는 방법이 이용되고 있으며, 기능성 사료를 급이한 돈육의 소비 양상이 증가되고 있는 점을 감안해 볼 때 고품질의 돈육 생산과 생산비 절감은 양돈 농가의 경쟁력 제고에 큰 영향을 미칠 것으로 생각된다.", "</p><p>그러나 현실적으로 축산물 품질의 고급화는 생산비 절감과 대립관계에 있다.", "우리나라에서 사용되는 가축 배합사료의 \\( 94 \\% \\) 는 수입에 의존하고 있으므로, 원료의 가격에 따른 사료 값의 변동이 불가피한 실정이다.", "따라서 축산물의 생산비 절감을 위해서 우리나라에서 자체적으로 사료를 개발하는 것이 무엇보다 중요한 일이라 생각된다.", "최근 돈육의 육질 향상과 기호도 증가 뿐만 아니라 사료비의 절감 효과를 위하여 식품으로 사용 후 폐기되는 부산물을 가축의 사료로 재생산하고자 하는 연구가 진행되고 있으며, 돼지의 사육 시 밀감 부산물, 감 껍질 분말, 한약재 찌꺼기, 발효 쌀겨, 남은 음식 발효물의 사료 중 혼합.", "급이는 돈육의 기호성에 영향을 주지 않으며, 육질을 향상시켜 품질개선에 효과적이었다고 보고되어져 있다.", "일본에서는 유산균으로 발효시킨 음식물 잔반 사료를 돼지에 급이하여 생산한 돈육의 선호도가 높았다고 보고된 바 있다.", "</p><p>새송이 버섯(Pleurotus eryngii)은 단백질, 비타민 및 무기질이 풍부하고, 특유의 향과 맛이 우수하여 소비자들이 선호하고 있는 버섯이며, 최근 새송이 버섯의 생리활성의 규명으로 그 소비도 2003년에 비해 2006년에는 46천 톤으로 약 3.5배 이상 급증하는 추세를 보이고 있다.", "새송이 버섯은 주로 병재배에 의해 생산되며 버섯 생산량의 약 \\( 6.5 \\% \\) 정도가 부산물로써 폐기되고 있는데, 특히 우리나라에서 재배되는 버섯의 부산물은 조회분의 함량이 \\( 10 \\% \\) 정도로 낮아 반추동물의 사료로 가치를 인정받고 있다.", "따라서 본 연구에서는 새송이 버섯의 재배 후 부산물로 발생되는 버섯 파치를 이용하여 제조한 발효액을 돼지에게 급이함으로써 도축 후 돼지의 혈장 지질의 양상과 돈육의 품질에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.", "</p> <h2>관능 평가</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 농도별로 급이하여 생산된 돈육 등심의 관능평가 결과는 Table 4 에 나타낸 바와 같다.", "새송이 버섯파치 발효액의 급이량에 따른 돈육의 색, 이취 및 씹힘성은 실험군 간에 유의적인 차이가 없었다.", "다즙성은 대조군에서 \\( 4.80 \\pm 0.84 \\) 이었는데, 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군에서는 \\( 5.29 \\pm 0.49 \\sim 5.50 \\pm 0.84 \\) 로 대조군에 비해 유의적으로 높았으나, 실험군 간의 유의차는 없었다.", "돈육의 전반적인 기호도도 대조군에 비해 새송이 버섯파치 발효액을 급이한 돈육의 기호도가 유의적으로 높았으나, 각 실험군 간에는 유의차는 없었다.", "</p><p>소비자의 식육 구매의 주요 관능적 요인은 육색, 마블링의 정도가 주로 영향을 미치며 관능검사에서는 이러한 요인들보다는 가열 육을 입속에서 씹어 넘기는 과정에 혀의 감각으로 느껴지는 맛, 후각으로 느껴지는 향, 조직감 등이 종합적으로 관여하게 된다.", "또한 육 가열시 일어나는 당의 분해, 단백질과 아미노산의 가열 분해물, 지질 분해 성분 등이 관여하게 되고 맛에 관여하는 핵산관련물질 및 유기산 등도 복합적으로 관능적 특성에 영향을 미친다고 알려져 있다.", "본 실험의 결과 새송이 버섯파치 발효액을 급이하여 생산된 돈육의 기호도는 새송이 버섯파치 발효액 무첨가 돈육에 비해 다즙성이 우수하여 기호도를 높이는 것으로 판단되며, 발효액의 첨가량은 관능적 특성에는 큰 영향을 미치지 못하였다.", "</p><h2>육색의 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 급여한 돼지의 등심을 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 20일간 저장하면서 명도(lightness), 적색도(redness) 및 황색도(yellowness)를 측정한 결과는 Table 5와 같다.", "저장 1 일에 명도는 \\( 50.21 \\pm 1.56 \\sim 52.07 \\pm 1.57 \\)의 범위로 처리구간의 유의적인 차이가 없었으나 저장 기간 중 불규칙한 증감을 보이다가 저장 20일에는 모든 처리군에서 증가하는 경향을 보였는데, 새송이 버섯파치 발효액 \\( 1.5 \\% \\) 첨가 급이군에서 \\( 52.14 \\pm 0.84 \\) 로 유의적으로 낮았다.", "적색도는 저장 1 일에 \\( 7.60 \\pm 1.63 \\sim 7.99 \\pm \\)\\( 0.74 \\) 의 범위였으나, 저장 20 일에는 \\( 8.10 \\pm 0.38 \\sim 8.85 \\pm 0.53 \\) 의 범위로 다소간의 증감이 있었으나 새송이 버섯파치 발효액의 첨가량 및 저장 기간에 따른 유의적인 차이는 없었다.", "새송이 버섯파치 발효액 \\( 1.5 \\% \\) 첨가 급이군을 제외한 실험군에서 황색도는 저장 15 일까지는 유의적인 차이가 없었는데, 저장 20 일에 \\( 6.14 \\pm 1.41 \\sim 7.18 \\pm 0.66 \\) 의 범위로 유의적인 증가를 보였다.", "</p><p>발효 쌀겨의 급이는 돈육의 육색에 유의적인 차이를 나타내지 않으며, 잠분의 급여 수준과 기간도 육색의 변화에 큰 영향을 미치지 않으며, 저장기간의 경과에 따른 불규칙한 증감을 보인다는 보고는 본 실험 결과와 일치하는 경향이었다.", "</p> <h2>가열감량의 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액을 급이하여 생산된 돼지 등심의 저장기간에 따른 가열감량을 측정한 결과는 Table 6과 같다.", "가열감량은 저장 5일부터 15일까지는 감소하였다가 저장 20일에는 다시 유의적으로 증가하는 경향이었다.", "즉, 대조군의 경우 저장 1일에 \\( 29.90 \\pm 3.02 \\mathrm{~g} / 100 \\mathrm{~g} \\)에서 저장 15일에는 \\( 24.69 \\pm 0.94 \\mathrm{~g} / 100 \\mathrm{~g} \\)으로 유의적으로 감소하였다가 저장 20일에는 \\( 30.07 \\pm 2.49 \\mathrm{~g} / 100 \\mathrm{~g} \\) 으로 가열감량이 다시 증가하였다.", "새송이 버섯파치 발효액 \\( 1 \\% \\) 및 \\( 1.5 \\% \\) 첨가 급이군도 저장 10일부터 가열감량이 감소하다가 저장 20일에는 다소 증가하였다.", "</p><p>육류의 조리 시 발생하는 가열감량은 조리된 육류의 다즙성 및 육제품 제조 시 제품의 수율에 영향을 주는 요인이 되는데, 잠분의 급여로 돈육의 저장 중 가열감량은 저장 초기에는 대조군과 실험군 사이의 유의차가 적었으나 저장 12일에는 잠분 급여군의 가열감량이 더 낮다고 한 보고는 본 실험의 결과와 일치하는 경향이었다.", "또 육의 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 높으면 가열감량이 적다고 알려져 있는데, 본 실험의 결과에서도 이와 동일한 경향을 확인할 수 있었다.", "</p><h2>전단가의 변화</h2><p>Table 7은 저장기간에 따른 돼지 등심육의 전단가 변화를나타낸 것인데, 기간이 경과할수록 전단가는 점차 감소하였다.", "대조군은 저장 1일에 \\( 5.64 \\pm 0.56 \\mathrm{~cm} / \\mathrm{kg}^{2} \\) 으로 새송이 버섯파치 발효액첨가 급이군에 비해 유의적으로 높았으며, 저장 기간이 경과됨에 따라 감소되어졌다.", "새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군들의 전단가는 저장 1 일에 \\( 4.57 \\pm 0.46 \\)~\\( 5.07 \\pm 0.22 \\mathrm{~cm} / \\mathrm{kg}^{2} \\) 범위였으며, 발효액 \\( 1.5 \\% \\) 급이군에서 \\( 0.5 \\% \\) 급이군보다 유의적으로 높았다.", "반면에 저장 10일에서 20일까지 저장기간 동안 전단가의 감소는 있었으나, 유의차는 없었다.", "또한 저장 기간의 경과에 따라 대조구 및 실험군 간의 유의차도 적었으며, 저장 20일에 대조군에 비해 새송이 발효액 \\( 1 \\% \\) 및 \\( 1.5 \\% \\) 첨가 급이군에서 유의차를 보였다.", "</p><p>잔반의 발효사료는 돈육의 연도에 영향을 주지 않으며, 한약재 찌꺼기를 혼합 급이하여 생산된 돈육의 전단가는 대조구에 비해 처리구에서 낮았으며, 조직의 파쇄성이 유의적으로 높아 한약재 찌꺼기 급이로 육질의 연도가 낮아져 저작감을 상승시킬 수 있다고 보고하였는데, 본 실험결과도 새송이 버섯파치 발효액의 급이로 대조구에 비해 전단가가 낮아, 버섯파치 발효액을 급이함으로써 돈육의 육질이 부드러워졌음을 알 수 있었다.", "</p> <h2>화학적 특성 분석</h2><p>돈육의 수분은 \\( 105^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 상압가열 건조법, 조지방은 ether를 이용한 soxhlet 추출법으로 분석하였다. \\", "( \\mathrm{pH} \\) 는 분쇄된 돈육 \\( 10 \\mathrm{~g} \\) 에 증류수를 가하여 균질화한 후 최종 부피를 \\( 100 \\mathrm{ml} \\) 로 조정한 후 여과하여pH-meter (Model 720, Thermo Orion, USA)로 측정하였다.", "</p><p>육의 TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances) 함량은 세절육 \\( 5 \\mathrm{~g} \\) 에 butylated hydroxyanisole (BHA) \\( 50 \\mu l\\)와 증류수 \\( 15 \\mathrm{ml} \\) 를 가해 균질화 시킨 후 균질액 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 시험관에 넣고 여기에 \\( 2 \\mathrm{ml} \\) 의 thiobarbituric acid (TBA)/trichloro-acetic acid (TCA) 혼합용액을 넣어 완전히 혼합한 다음, \\( 90^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 의 항온수조에서 15 분간 가열처리한 후 냉각시켜 \\( 3,000 \\mathrm{rpm} \\) 에서 10분간 원심분리 하였다.", "이때 상층액을 회수하여 spectrophotometer (Optizen 2120UV, Mecasys C. Ltd, Korea)로 \\( 531 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였으며, TEP (1,1,3,3-tetraethoxypropane, Sigma-Aldrich Co. Ltd) 표준물질을 이용한 표준 검량곡선에 의하여 산출하였다.", "</p><p>돈육의 지방산은 Bligh와 Dyer의 방법에 따라 chloroform:methanol \\( (\\mathrm{C}: \\mathrm{M}=2: 1, \\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\) 용액을 가하여 24시간 추출하여 얻은 지질을 \\( 14 \\% \\mathrm{BF}_{3}-\\mathrm{MeOH} 3 \\mathrm{ml} \\) 로 메칠에스테르화시켜 가스크로마토그래피(Hewlett Packard 5890 Ⅱ. USA)로 분석하였다.", "이때 칼럼은 Ultra 2 (Crosslinked 5\\% PH ME Siloxane, \\( 25 \\times 0.32 \\mathrm{~mm} \\times 0.52 \\mu \\mathrm{m} \\) film thickness)를, 검출기는 불꽃 이온화 검출기를 사용하였다.", "칼럼온도는 \\( 160^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서부터 \\( 190^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 까지 분당 \\( 5^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 씩 승온시키고, \\( 220^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 까지는 분당 \\( 3^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 씩 승온시킨 후 10분간 유지하였다.", "Injecter 온도는 \\( 270^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 검출기 온도는 \\( 300^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 로 하였으며 split ratio를 100:1로 하여 질소가스는 분당 \\( 1.4 \\mathrm{ml} \\) 였다.", "</p><h2>통계 처리</h2><p>각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 얻은 결과를 SPSS 12.0을 사용하여 통계 처리하였으며, 각각의 시료에 대해 평균 \\( \\pm \\) 표준편차로 나타내었다.", "각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>새송이 버섯파치 발효액 \\( (0,0.5 \\%, 1 \\% \\) 및 \\( 1.5 \\%) \\) 의 급이가 돼지의 혈액 성분 및 돈육의 품질에 미치는 영향을 실험하였다.", "돼지의 혈중 총 지질, 총콜레스테롤 및 중성지방은 대조군에 비해 \\( 1.5 \\% \\) 첨가군에서 유의적으로 감소되었다.", "HDL-, LDL-, VLDL-콜레스테롤 함량은 대조군과 처리군간의 유의차가 없었다.", "동맥경화 지수 및 심혈관 질환 위험지수는 대조군에 비해 \\( 1.5 \\% \\) 발효액 급이군에서 유의적으로 낮았다.", "GOT, LDH 활성도는 \\( 1.5 \\% \\) 첨가군에서 대조군 및 \\( 0.5 \\% \\) 첨가군에 비해 유의적으로 낮았다.", "혈중 항산화 활성은 \\( 45.92 \\pm 2.46 \\sim 47.25 \\pm \\)\\( 1.64 \\% \\) 의 범위로 유의차가 없었다.", "돈육의 기호도는 대조군에 비해 새송이 버섯파치 발효액을 급이한 돈육에서 유의적으로 높았으나, 각 실험군간의 유의차는 없었다.", "돈육 등심의 명도는 저장 1일에 유의차가 없었으나, 저장 20일에는 증가되는 경향이었고, 적색도는 새송이 버섯 발효액의 첨가량 및 저장 기간에 따른 유의차가 없었다.", "가열감량은 새송이 버섯파치발효액 \\( 1 \\% \\) 및 \\( 1.5 \\% \\) 첨가 급이군에서 저장 10일부터 감소하다가 저장 20일에는 다소 증가하였다.", "전단가는 저장 20일에 대조군에 비해 새송이 버섯파치 발효액 \\( 1 \\% \\) 및 \\( 1.5 \\% \\) 첨가 급이군에서 유의적으로 낮았다.", "저장기간 동안 돈육의 수분, 조지방 함량 및 \\( \\mathrm{pH} \\) 의 변화는 유의차가 없었다.", "TBARS의 함량은 저장 기간이 경과함에 따라 모든 처리군에서 증가되었으나, 대조군에 비해 새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이군에서 다소 낮았다.", "새송이 버섯파치 발효액 첨가 급이 시 포화지방산에 대한 불포화 지방산의 비율(UFA/SFA)은 \\( 1 \\% \\) 및 \\( 1.5 \\% \\) 첨가군에서는 저장 15일까지 감소되다가 저장 20일에는 다시 증가되어 대조군과 비슷한 경향이었다.", "</p> <h2>수분 및 조지방의 함량 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액의 급이량 및 저장기간의 경과에 따른 돼지 등심의 수분 및 조지방 함량 변화는 Table 8에 나타낸 바와 같다.", "저장 1일에는 대조군에서는 \\( 72.02 \\pm 1.61 \\) \\( \\mathrm{g} / 100 \\mathrm{~g} \\) 이었으며, 새송이 버섯파치 발효액 \\( 0.5 \\% \\) 와 \\( 1 \\% \\) 첨가 급이군에서 각각 \\( 68.32 \\pm 2.22 \\mathrm{~g} / 100 \\mathrm{~g} \\) 및 \\( 67.51 \\pm 1.70 \\mathrm{~g} / 100 \\mathrm{~g} \\)으로 대조군에 비해 유의적으로 낮은 함량이었다.", "이후 저장기간 동안 돈육의 수분 함량은 \\( 72.20 \\pm 1.64 \\sim 74.91 \\pm 0.78 \\mathrm{~g} / 100 \\)\\( \\mathrm{g} \\) 으로 새송이 버섯파치 발효액 첨가량 및 저장기간에 따른 유의차가 없었다.", "조지방 함량은 대조군 및 실험군간의 유의적인 차이가 없었으며, 대조군과 새송이 버섯파치 발효액 \\( 1 \\% \\) 첨가 급이군의 경우 저장 기간에 따른 유의적인 차이도 없었다.", "새송이 버섯파치 발효액 \\( 0.5 \\% \\) 와 \\( 1.5 \\% \\) 첨가군의 경우 저장 15일에 각각 \\( 3.12 \\pm 0.29 \\mathrm{~g} / 100 \\mathrm{~g} \\)과 \\( 3.01 \\pm 0.14 \\mathrm{~g} / 100 \\mathrm{~g} \\) 으로 증가하였으나 그 이후부터는 차이가 없었다.", "</p><p>돼지 사료에 활성탄을 \\( 0.6 \\% \\) 첨가 급이한 결과 등심부위의 수분 및 조지방 함량은 대조군과 유의적인 차이가 없다는 보고와 머루주박을 급여한 돈육에서도 수분과 지방을 포함한 일반 성분에 변화가 없다는 보고가 있다.", "</p><p>육의 수분 함량이 높으면 고기는 연하고 부드러워 연도가 양호하다고 보고되어 있다.", "또한, 근육의 수분 함량은 근육의 물리적 성숙도와 지방 함량에 따라 차이가 있는데, 약 \\( 70 \\sim 75 \\% \\) 로 구성되며 저장온도, 시간, 육의 종류 및 근육 부위에 따라서도 차이가 있다고 밝혀져 있다.", "</p><h2>\\( \\mathrm{pH} \\)의 변화</h2><p>새송이 버섯파치 발효액 급여 수준과 저장기간에 따른 돈육의 \\( \\mathrm{pH} \\) 변화를 분석한 결과는 Table 9와 같다.", "저장 1일에 \\( \\mathrm{pH} \\) 는 새송이 발효액 \\( 1.5 \\% \\) 급이군이 \\( 5.64 \\pm 0.02 \\) 로 가장 낮았고, \\( 0.5 \\% \\) 급이군은 \\( 5.78 \\pm 0.02 \\) 로 가장 높았다.", "저장 기간이 경과함에 따라 \\( \\mathrm{pH} \\)는 불규칙한 증감을 보이면서 미량 증가하여 저장 20일에는 \\( 5.76 \\pm 0.02 \\sim 5.87 \\pm 0.03 \\) 의 범위였으며 실험군간의 유의적인 차이가 없었다.", "</p><p>Kang 등은 어성초 분말을 첨가 급이한 돼지 등심의 냉장 저장 중 \\( \\mathrm{pH} \\)는 저장 기간의 경과에 따라 미량씩 증가하는 경향이라고 하여 본 실험과 유사한 결과를 보고한 바 있다.", "Lee 등도 잠분을 급여한 돈육의 냉장 저장 중 \\( \\mathrm{pH} \\) 는 저장기간이 경과함에 따라 전 처리구가 저장 초기 \\( 5.47 \\sim 5.58 \\)의 범위였던 것이 저장 12일에는 \\( 5.54 \\sim 5.75 \\) 로 다소 증가하였는데, 이는 단백질 분해에 따른 염기성기의 노출 및 암모니아 등의 생성, 단백질 완충물질의 변화, 전해질 해리의 감소 등에 기인한다고 하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "새송이 버섯파치 발효액의 급이가 돈육의 품질에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-c1010f20-cfd0-4266-a2d9-73679a4be5b6", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "이수정", "강민정", "정미자", "이현욱", "서종권", "성낙주", "신정혜" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,323	<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구 대상</h2><p>본 연구의 실험 동물은 친자 교배 시킨 생후 9주령 된 F344 계열 수컷 흰쥐를 사용하였다. 실험 동물은 실험 전 일주일동안 실험실 환경에 적응시킨 후 2주(좌골신경 압박손상 후 3,7,14일) 동안 사육 및 실험을 거쳤다. 실험 동물은 전 실험기간을 통하여 고형 사료와 물을 자유스럽게 섭취하도록 하였으며, 온도는 \( 22-24^{\circ} \mathrm{C} \), 습도는 \( 50 \pm 10 \% \) 가 유지 되도록 하였고, 조명은 실험 동물의 야행성을 고려하여 밤낮주기(12시간 주/야)가 조절되는 실험실 환경에서 사육하도록 하였다.</p><h2>실험 절차</h2><p>실험 동물은 무작위 표본추출에 의하여 좌골신경 손상 후 비운동군, 좌골신경 손상 후 3일 동안 운동한 그룹, 7일 동안 운동한 그룹 그리고 14일 동안 운동한 그룹으로 분류하였고, 그룹 당 8마리를 할당하였다. 좌골신경 압박 손상을 주기 전 1주일 동안 treadmill 운동에 적응시키고, 적응 기간이 지난 후에 각 그룹에 좌골신경 압박 손상을 가하였다.</p><h2>운동 방법</h2><p>각 그룹에 운동 강도는 동일하게 사용하였으며, 운동 프로토콜은 트레드밀에서 \( 18 \mathrm{~meter} / \mathrm{min} \) 의 속도로 하루에 30분씩 2번 수행하는 저강도 운동으로 수행하였다. 수술을 받은 모든 쥐들은 2일 동안의 휴식을 취한 후 각각의 그룹에 해당하는 요일 동안 운동을 수행 하였다. 좌골신경 압박 손상 후 3,7,14일 동안 운동을 수행 한 쥐들은 각 그룹에 맞는 날짜에 마취시킨 후 좌골신경(sciatic nerve, \( \mathrm{SN} \) ), 감각신경절 (dorsal root ganglion, DRG) 그리고 척수(spinal cord, SC) 를 분리해 내었다. 분리된 모든 조직들은 실험에 사용될 때까지 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하였다.</p><h2>좌골 신경 압박 손상 수술 방법</h2><p>각 그룹의 쥐들은 케타민 \( (80 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \) 과 럼푼 \( (5 \mathrm{mg} / \mathrm{kg}) \) 의 혼합 용액을 복강에 주입하여 마취시킨 후 좌측 둔부의 근육과 대퇴 근육의 경계선을 절개하고, 좌골 신경을 드러내어 핀셋을 이용해 30초 동안 압박한 후 1분간의 휴식을 취하고 다시 30초 동안 압박하는 반복 손상을 주었다. 수술 후 2일 동안은 모든 그룹이 휴식을 취하게 한 후 실험을 수행하였다.</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구에서는 흰쥐의 좌골신경을 손상시킨 후 트레드밀 운동을 적용하여 신경돌기 성장과 좌골신경의 축삭 재생 및 신경성장 인자 발현 그리고 신경기능지수의 변화를 연구했다. 본 연구결과 좌골손상 후 트레드밀 운동을 실시한 그룹이 비운동군에 비해 축삭재생이 촉진되었고, 원위부의 좌골신경에서도 NGF, BDNF 단백질 발현이 상당히 증가된 것으로 나타났다. 또한 좌골신경지수를 검사한 결과에서도 운동을 실시한 흰쥐가 비운동 흰쥐에 비해 기능적 회복이 상당히 빠른 것으로 나타났다. 이러한 결과는 좌골손상 후 운동의 실시가 좌골신경의 축삭재생 촉진과 신경영양인자의 발현증가를 통해 기능적 회복에 도움이 될 수 있음을 보여주는 것이다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구 대상</h2><p>본 연구의 실험 동물은 친자 교배 시킨 생후 9주령 된 F344 계열 수컷 흰쥐를 사용하였다.", "실험 동물은 실험 전 일주일동안 실험실 환경에 적응시킨 후 2주(좌골신경 압박손상 후 3,7,14일) 동안 사육 및 실험을 거쳤다.", "실험 동물은 전 실험기간을 통하여 고형 사료와 물을 자유스럽게 섭취하도록 하였으며, 온도는 \\( 22-24^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 습도는 \\( 50 \\pm 10 \\% \\) 가 유지 되도록 하였고, 조명은 실험 동물의 야행성을 고려하여 밤낮주기(12시간 주/야)가 조절되는 실험실 환경에서 사육하도록 하였다.", "</p><h2>실험 절차</h2><p>실험 동물은 무작위 표본추출에 의하여 좌골신경 손상 후 비운동군, 좌골신경 손상 후 3일 동안 운동한 그룹, 7일 동안 운동한 그룹 그리고 14일 동안 운동한 그룹으로 분류하였고, 그룹 당 8마리를 할당하였다.", "좌골신경 압박 손상을 주기 전 1주일 동안 treadmill 운동에 적응시키고, 적응 기간이 지난 후에 각 그룹에 좌골신경 압박 손상을 가하였다.", "</p><h2>운동 방법</h2><p>각 그룹에 운동 강도는 동일하게 사용하였으며, 운동 프로토콜은 트레드밀에서 \\( 18 \\mathrm{~meter} / \\mathrm{min} \\) 의 속도로 하루에 30분씩 2번 수행하는 저강도 운동으로 수행하였다.", "수술을 받은 모든 쥐들은 2일 동안의 휴식을 취한 후 각각의 그룹에 해당하는 요일 동안 운동을 수행 하였다.", "좌골신경 압박 손상 후 3,7,14일 동안 운동을 수행 한 쥐들은 각 그룹에 맞는 날짜에 마취시킨 후 좌골신경(sciatic nerve, \\( \\mathrm{SN} \\) ), 감각신경절 (dorsal root ganglion, DRG) 그리고 척수(spinal cord, SC) 를 분리해 내었다.", "분리된 모든 조직들은 실험에 사용될 때까지 \\( -70^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 냉동고에 보관하였다.", "</p><h2>좌골 신경 압박 손상 수술 방법</h2><p>각 그룹의 쥐들은 케타민 \\( (80 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg}) \\) 과 럼푼 \\( (5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg}) \\) 의 혼합 용액을 복강에 주입하여 마취시킨 후 좌측 둔부의 근육과 대퇴 근육의 경계선을 절개하고, 좌골 신경을 드러내어 핀셋을 이용해 30초 동안 압박한 후 1분간의 휴식을 취하고 다시 30초 동안 압박하는 반복 손상을 주었다.", "수술 후 2일 동안은 모든 그룹이 휴식을 취하게 한 후 실험을 수행하였다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구에서는 흰쥐의 좌골신경을 손상시킨 후 트레드밀 운동을 적용하여 신경돌기 성장과 좌골신경의 축삭 재생 및 신경성장 인자 발현 그리고 신경기능지수의 변화를 연구했다.", "본 연구결과 좌골손상 후 트레드밀 운동을 실시한 그룹이 비운동군에 비해 축삭재생이 촉진되었고, 원위부의 좌골신경에서도 NGF, BDNF 단백질 발현이 상당히 증가된 것으로 나타났다.", "또한 좌골신경지수를 검사한 결과에서도 운동을 실시한 흰쥐가 비운동 흰쥐에 비해 기능적 회복이 상당히 빠른 것으로 나타났다.", "이러한 결과는 좌골손상 후 운동의 실시가 좌골신경의 축삭재생 촉진과 신경영양인자의 발현증가를 통해 기능적 회복에 도움이 될 수 있음을 보여주는 것이다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "운동이 좌골신경 손상 F344쥐의 Neurotrophins, BDNF, NT-3, GAP-43 단백질 발현과 축삭재생에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-aae897f7-0d39-4d31-9ca8-913d75d2e1cc", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2006", "doc_author": [ "윤진환", "서태범" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,324	<h1>서론</h1><p>최근 환경오염과 식생활환경의 급변화로 인해 심혈관계질환을 비룻한 각종 성인병들이 증가되었는데, 특히 고혈압은 아직 선천성 고혈압에 대해서는 알려진 바가 거의 없고 후천성 고혈압의 발병요인에 대해 일부 연구가 진행되고 있다. 즉 고혈압이 될 유전적 소인을 가진 사람들이 청소년기를 지나 나이가 들면서 발병이 증가되는 요인중의 하나로 알코올, 당뇨, 고염, 중금속 노출 등과 같은 여러 가지 외부 스트레스를 들 수 있다.</p><p>고혈압의 발병원인을 밝히기 위해 혈관 평활근의 수축 능력을 평가하게 되는데, 혈관은 수축제나 물리적인 환경 자극에 대해 수축반응을 나타내므로, 평활근을 수축시키기 위해 potassium chloride와 phenylephrine을 많이 이용하고 있다. 대개 potassium chloride는 혈관 평활근에 potential operated calcium channel을 통한 calcium을 이용하여 수축반응을 나타내게 된다. 적출 대동맥에 약물을 투여했을 때 potacium chloride에 의한 혈관의 수축은 세포내 저장된 calcium이나 세포 외부로부터 유입된 calcium 에 의해 야기되게 된다.</p><p>한편, 혈관의 이완반응은 강한 내피의존적인 이완력을 나타내는 acetylcholine, histamine 및 내피비의존적인 nitroprusside 등이 많이 이용되고 있다. 환경스트레스가 심혈관계에 미치는 선행연구에서 생리적 스트레스가 혈관 이완력에 영향을 주고, 횐쥐 혈관에 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)로 열자극을 주었을 때나 알콜을 처리한 흰쥐에서 처리 8시간째 혈관의 수축력이 증가되었다. 한편 고염식에 의한 혈관의 수축력은 다소 증가되었으나 유의적인 차이는 보이지 않았고, 중금속 노출에 의한 식물체의 생장저해나 식물 체 축적에 대한 연구와 신체 축적이나 질환유발에 대한 연구들이 있어 왔다.</p><p>산업의 발달과 환경공해로 인해 발생된 중금속은 먹이 연쇄를 따라 식물체와 동물 및 인체에 축적되어 신체 이상 증상이 나타날 수 있다. 이 중 비소는 자연계에 널리 존재하고 있고 우리가 인식하지 못하는 사이에 체내에 축적되어 심혈관계 질환을 유발할 수 있다고 보고되고 있다. 한편 비소가 고혈압을 유발한다는 보고와 그렇지 않다는 보고가 상반되게 나와 비소가 고혈압유발요인으로 작용하는지에 대한 검증이 필요한 실정이다. 또 동물실험에서 비소 처리로 스트레스 단백질 발현의 증가에 대한 연구가 일부 진행되었으나, 혈관조직에 따라 수축력에 변화를 초래하는지에 대한 연구는 부족한 실정이다.</p><p>따라서 본 연구는 외부 스트레스요인으로 농도별 비소를 처리하였을 때 혈압의 변화를 초래하는지와 대동맥에서 내피유무에 따른 phenylephrine에 대한 혈관 수축력과 내피의존적인 acetylcholine과 내피 비의존적인 sodium nitroprusside에 의한 혈관 이완력의 변화양상을 관찰하여 비소 스트레스가 횐쥐의 혈관수축력을 증가시켜 고혈압 유발과정에 관여하는지를 검토하고자 하였다.</p> <h1>요 약</h1><p>외부에서 가해진 비소 스트레스가 내피유무에 따른 흰쥐 대동맥의 수축력 증가와 이완반응에 미치는 영향을 알아보고자 본 실험을 실시하였다. 혈압의 측정은 생리기록계를 이용하였고, 내피 유무에 따른 혈관의 수축력은 Organ bath에 조직을 걸고 자동조절 생리기록계를 이용하여 측정하였다. 중추신경계를 파괴시킨 횐쥐의 생체 내 실험에서 비소처리로 vasopressin과 phenylephrine에 의한 혈관 수축력은 대조군에 비해 각각 \( 19.1 \% \)와 \( 46.6 \% \)로 대동맥의 혈압은 상승되었다. 0, 0.5, 1,2 및 \( 4 \mathrm{mM} \mathrm{As} \)을 처리한 적출 대동맥 실험에서 phenylephrine \( \left(10^{-6} \mathrm{M}\right) \) 을 가했을 때 5시간까지는 혈관 수축력의 변화가 미미했으나 8시간째 비소 처리군은 대조군에 비해 \( 39 \% \) 증가된 값을 보여 수축력이 더욱 유의하게 증가되었다. 내피 제거 시 저농도 비소처리에서 다소 신속한 수축반응을 보였으나 고농도 비소 처리시에는 내피유무에 따른 차이가 유의적이지 않았다. 이완제 sodium nitroprusside와 acetylcoline를 처리했을 때 대조군에 비해 다소 증가된 이완력을 보였고, 시간경과에 따라 내피 비의존적인 nitroprusside와 달리 내피 의존적인 acetylcholine에서 이완력이 대조군에 비해 다소 촉진되었다. 이상의 결과에서 \( 4 \mathrm{mM} \mathrm{As} \)처리시 혈관의 수축력은 증가되었으나 내피유무에 따른 차이는 유의적이지 않았고, 내피가 혈관의 이완력을 다소 촉진시킨 것으로 나타났다. 결론적으로 비소처리한 혈관은 내피유무와 무관하게 수축력이 증가되어 장기간 고농도 비소에 노출 시 고혈압을 유발할 우려가 있을 것으로 여겨진다.</p>	생명과학	[ "<h1>서론</h1><p>최근 환경오염과 식생활환경의 급변화로 인해 심혈관계질환을 비룻한 각종 성인병들이 증가되었는데, 특히 고혈압은 아직 선천성 고혈압에 대해서는 알려진 바가 거의 없고 후천성 고혈압의 발병요인에 대해 일부 연구가 진행되고 있다.", "즉 고혈압이 될 유전적 소인을 가진 사람들이 청소년기를 지나 나이가 들면서 발병이 증가되는 요인중의 하나로 알코올, 당뇨, 고염, 중금속 노출 등과 같은 여러 가지 외부 스트레스를 들 수 있다.", "</p><p>고혈압의 발병원인을 밝히기 위해 혈관 평활근의 수축 능력을 평가하게 되는데, 혈관은 수축제나 물리적인 환경 자극에 대해 수축반응을 나타내므로, 평활근을 수축시키기 위해 potassium chloride와 phenylephrine을 많이 이용하고 있다.", "대개 potassium chloride는 혈관 평활근에 potential operated calcium channel을 통한 calcium을 이용하여 수축반응을 나타내게 된다.", "적출 대동맥에 약물을 투여했을 때 potacium chloride에 의한 혈관의 수축은 세포내 저장된 calcium이나 세포 외부로부터 유입된 calcium 에 의해 야기되게 된다.", "</p><p>한편, 혈관의 이완반응은 강한 내피의존적인 이완력을 나타내는 acetylcholine, histamine 및 내피비의존적인 nitroprusside 등이 많이 이용되고 있다.", "환경스트레스가 심혈관계에 미치는 선행연구에서 생리적 스트레스가 혈관 이완력에 영향을 주고, 횐쥐 혈관에 \\( 42^{\\circ} \\mathrm{C} \\)로 열자극을 주었을 때나 알콜을 처리한 흰쥐에서 처리 8시간째 혈관의 수축력이 증가되었다.", "한편 고염식에 의한 혈관의 수축력은 다소 증가되었으나 유의적인 차이는 보이지 않았고, 중금속 노출에 의한 식물체의 생장저해나 식물 체 축적에 대한 연구와 신체 축적이나 질환유발에 대한 연구들이 있어 왔다.", "</p><p>산업의 발달과 환경공해로 인해 발생된 중금속은 먹이 연쇄를 따라 식물체와 동물 및 인체에 축적되어 신체 이상 증상이 나타날 수 있다.", "이 중 비소는 자연계에 널리 존재하고 있고 우리가 인식하지 못하는 사이에 체내에 축적되어 심혈관계 질환을 유발할 수 있다고 보고되고 있다.", "한편 비소가 고혈압을 유발한다는 보고와 그렇지 않다는 보고가 상반되게 나와 비소가 고혈압유발요인으로 작용하는지에 대한 검증이 필요한 실정이다.", "또 동물실험에서 비소 처리로 스트레스 단백질 발현의 증가에 대한 연구가 일부 진행되었으나, 혈관조직에 따라 수축력에 변화를 초래하는지에 대한 연구는 부족한 실정이다.", "</p><p>따라서 본 연구는 외부 스트레스요인으로 농도별 비소를 처리하였을 때 혈압의 변화를 초래하는지와 대동맥에서 내피유무에 따른 phenylephrine에 대한 혈관 수축력과 내피의존적인 acetylcholine과 내피 비의존적인 sodium nitroprusside에 의한 혈관 이완력의 변화양상을 관찰하여 비소 스트레스가 횐쥐의 혈관수축력을 증가시켜 고혈압 유발과정에 관여하는지를 검토하고자 하였다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>외부에서 가해진 비소 스트레스가 내피유무에 따른 흰쥐 대동맥의 수축력 증가와 이완반응에 미치는 영향을 알아보고자 본 실험을 실시하였다.", "혈압의 측정은 생리기록계를 이용하였고, 내피 유무에 따른 혈관의 수축력은 Organ bath에 조직을 걸고 자동조절 생리기록계를 이용하여 측정하였다.", "중추신경계를 파괴시킨 횐쥐의 생체 내 실험에서 비소처리로 vasopressin과 phenylephrine에 의한 혈관 수축력은 대조군에 비해 각각 \\( 19.1 \\% \\)와 \\( 46.6 \\% \\)로 대동맥의 혈압은 상승되었다.", "0, 0.5, 1,2 및 \\( 4 \\mathrm{mM} \\mathrm{As} \\)을 처리한 적출 대동맥 실험에서 phenylephrine \\( \\left(10^{-6} \\mathrm{M}\\right) \\) 을 가했을 때 5시간까지는 혈관 수축력의 변화가 미미했으나 8시간째 비소 처리군은 대조군에 비해 \\( 39 \\% \\) 증가된 값을 보여 수축력이 더욱 유의하게 증가되었다.", "내피 제거 시 저농도 비소처리에서 다소 신속한 수축반응을 보였으나 고농도 비소 처리시에는 내피유무에 따른 차이가 유의적이지 않았다.", "이완제 sodium nitroprusside와 acetylcoline를 처리했을 때 대조군에 비해 다소 증가된 이완력을 보였고, 시간경과에 따라 내피 비의존적인 nitroprusside와 달리 내피 의존적인 acetylcholine에서 이완력이 대조군에 비해 다소 촉진되었다.", "이상의 결과에서 \\( 4 \\mathrm{mM} \\mathrm{As} \\)처리시 혈관의 수축력은 증가되었으나 내피유무에 따른 차이는 유의적이지 않았고, 내피가 혈관의 이완력을 다소 촉진시킨 것으로 나타났다.", "결론적으로 비소처리한 혈관은 내피유무와 무관하게 수축력이 증가되어 장기간 고농도 비소에 노출 시 고혈압을 유발할 우려가 있을 것으로 여겨진다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "비소 스트레스에 의한 흰쥐 대동맥의 수축과 이완반응의 변화양상", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-a3fc0fe1-b45f-4a91-9a30-5c75fc5f7838", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2003", "doc_author": [ "권윤정", "박태규", "성유진", "김인겸", "김중영" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,325	<h1>요 약</h1><p>여러 종류의 호열성, 호기성 간균(Bacillus genus)군, 중금속 leaching 미생물군(Thiobacillus, T. ferooxidans), 그리고 여러 가지 난분해성 물질을 분해하는 미생물군 (Pseudomonas genus)을 활용하여 퇴비화의 조건을 연구하고 이를 이용하여 축산폐기물의 퇴비화에 미치는 효과를 연구하였다. \(35 \sim 40 \)의 C/N비, \( 50 \sim 65 \% \)의 함수율 범위에서 실험실용 회전드럼형 반응조에서의 퇴비화는 온도상승이 수동식 반응조보다 낮으며 느리게 일어났다. 퇴비화 후 성분분석에서 높은 수준의 광물질을 함유하는 것으로 화학비료 대체효과를 보여주며 퇴비화 전후 중금속 분석에서 \(\mathrm{As}\)는 모든 퇴비에서, \(\mathrm{Cr}\)은 돈분, \(\mathrm{pb}\)은 축분, \(\mathrm{Hg}\)은 계분, 그리고 \(\mathrm{Cu}\)는 축분퇴비에서 규제값 이하를 보여주었다. 여러 가지 부숙도 분석에서 퇴비의 숙성도를 나타내었다. SS 또는 EMB agar plate을 이용한 살모넬라균과 대장균의 검사에서 병원균에 대한 퇴비의 안전성이 확인되었다. 이러한 결과는 금속 및 다른 난분해성 물질을 생분해하는 미생물을 투입하여 퇴비의 중금속감소와 퇴비화 속도증가의 가능성을 시사한다.</p> <h1>서 론</h1><p>축산업의 규모가 수요의 증가로 인해 확대되어짐에 따라 축산 폐기물 발생은 총 폐기물 발생량의 \( 20 \% \) 을 차지하며 인공합성물질과 더불어 또 다른 지표수 및 지하수 오염, 토양의 산성화, 대기오염의 주요원인이 되고 있다. 그러나 축산업의 환경보전에 대한 법규제는 해마다 강화되고 있어 축산폐수 방류기준은 96년 이전에는 생물적 산소 요구량(Biological Oxygen Demand, BOD)와 부유물질 (Suspended Solid, SS)만 규제했으나 96년 이후 호소의 부영양화를 방지하기 위해 전 질소량(Total Nitrogen, T-N)과 전 인량(Total Phosphate, T-P)를 규제하기 시작했으며 98년부터는 T-N과 T-P의 기준이 더욱 강화되고 화학적 산소 요구량(Chemical Oxygen Demand, COD), 중금속 및 대장균 군이 추가되었다.</p><p>우리 나라에서 발생하는 축산폐기물의 전량을 비료의 가치로 환산할 때 이미 연간 권장 화학비료 요구량을 넘어설 정도로 많은 양이 생산된다. 축산 폐기물은 비료 성분이 많아 화학비료 대체효과가 크고, 유기물함량이 높기 때문에 이를 활용할 경우 토양의 이화학성 개선 및 환경오염 문제해결을 기대 할 수 있다. 그러나 악취와 오수 및 파리 발생 등 위생, 미관상 이유로 전통적 퇴비화마저 감소되어 가고 있으며 화학비료와 농약의 사용이 남발되어 토양의 산성화 및 황폐화가 급속도로 진행되고 있다. 또한 종래 퇴비화의 문제점으로 오랜 기간이 걸리는 것과 중금속 및 염의 집적문제, 그리고 병원성 미생물에 대한 안정성 문제를 들 수 있다. 이러한 문제점의 해결방안으로 선진국에서 시행되고 있는 퇴비화 시스템의 국산화개발 및 활용과 높은 질의 안정한 퇴비 생산에 관한 연구가 필요 되어진다.</p><p>퇴비화의 주된 공정은 미생물처리 공정으로 주로 자연에 존재하는 혼합균주를 그대로 활용하였다. 여러 종류의 혼합 균주에서는 종종 기질경쟁과 우점종에 의한 다른 미생물들의 성장저해 현상 등이 관찰되어지곤 한다. 그러나 Russell et al. 등은 EDTA를 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 14종 균주를 분리 동정하고 이를 이용하여 Metal-EDTA 생분해에 관한 연구를 보고하였다. 이들 14종은 Methylobacterium, Variovorax, Enterobacter, Aureobacterium, Bacillus속으로 이들 혼합 균주에 의해 철>구리>코발트>니켈>카드뮴의 순서로 제거됨을 보여주고 있다.</p><p>본 연구에서는 여러 종류의 호열성, 호기성 간균(Bacillus genus)군, 중금속leaching 미생물군(Thiobacillus, T. ferooxidans), 그리고 여러 가지 난분해성 물질을 분해하는 미생물군 (Pse-udomonas genus)을 활용하여 분해 조건을 연구하고 이를 이용하여 축산폐기물의 퇴비화에 미치는 효과를 연구하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1><p>여러 종류의 호열성, 호기성 간균(Bacillus genus)군, 중금속 leaching 미생물군(Thiobacillus, T.", "ferooxidans), 그리고 여러 가지 난분해성 물질을 분해하는 미생물군 (Pseudomonas genus)을 활용하여 퇴비화의 조건을 연구하고 이를 이용하여 축산폐기물의 퇴비화에 미치는 효과를 연구하였다. \\", "(35 \\sim 40 \\)의 C/N비, \\( 50 \\sim 65 \\% \\)의 함수율 범위에서 실험실용 회전드럼형 반응조에서의 퇴비화는 온도상승이 수동식 반응조보다 낮으며 느리게 일어났다.", "퇴비화 후 성분분석에서 높은 수준의 광물질을 함유하는 것으로 화학비료 대체효과를 보여주며 퇴비화 전후 중금속 분석에서 \\(\\mathrm{As}\\)는 모든 퇴비에서, \\(\\mathrm{Cr}\\)은 돈분, \\(\\mathrm{pb}\\)은 축분, \\(\\mathrm{Hg}\\)은 계분, 그리고 \\(\\mathrm{Cu}\\)는 축분퇴비에서 규제값 이하를 보여주었다.", "여러 가지 부숙도 분석에서 퇴비의 숙성도를 나타내었다.", "SS 또는 EMB agar plate을 이용한 살모넬라균과 대장균의 검사에서 병원균에 대한 퇴비의 안전성이 확인되었다.", "이러한 결과는 금속 및 다른 난분해성 물질을 생분해하는 미생물을 투입하여 퇴비의 중금속감소와 퇴비화 속도증가의 가능성을 시사한다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>축산업의 규모가 수요의 증가로 인해 확대되어짐에 따라 축산 폐기물 발생은 총 폐기물 발생량의 \\( 20 \\% \\) 을 차지하며 인공합성물질과 더불어 또 다른 지표수 및 지하수 오염, 토양의 산성화, 대기오염의 주요원인이 되고 있다.", "그러나 축산업의 환경보전에 대한 법규제는 해마다 강화되고 있어 축산폐수 방류기준은 96년 이전에는 생물적 산소 요구량(Biological Oxygen Demand, BOD)와 부유물질 (Suspended Solid, SS)만 규제했으나 96년 이후 호소의 부영양화를 방지하기 위해 전 질소량(Total Nitrogen, T-N)과 전 인량(Total Phosphate, T-P)를 규제하기 시작했으며 98년부터는 T-N과 T-P의 기준이 더욱 강화되고 화학적 산소 요구량(Chemical Oxygen Demand, COD), 중금속 및 대장균 군이 추가되었다.", "</p><p>우리 나라에서 발생하는 축산폐기물의 전량을 비료의 가치로 환산할 때 이미 연간 권장 화학비료 요구량을 넘어설 정도로 많은 양이 생산된다.", "축산 폐기물은 비료 성분이 많아 화학비료 대체효과가 크고, 유기물함량이 높기 때문에 이를 활용할 경우 토양의 이화학성 개선 및 환경오염 문제해결을 기대 할 수 있다.", "그러나 악취와 오수 및 파리 발생 등 위생, 미관상 이유로 전통적 퇴비화마저 감소되어 가고 있으며 화학비료와 농약의 사용이 남발되어 토양의 산성화 및 황폐화가 급속도로 진행되고 있다.", "또한 종래 퇴비화의 문제점으로 오랜 기간이 걸리는 것과 중금속 및 염의 집적문제, 그리고 병원성 미생물에 대한 안정성 문제를 들 수 있다.", "이러한 문제점의 해결방안으로 선진국에서 시행되고 있는 퇴비화 시스템의 국산화개발 및 활용과 높은 질의 안정한 퇴비 생산에 관한 연구가 필요 되어진다.", "</p><p>퇴비화의 주된 공정은 미생물처리 공정으로 주로 자연에 존재하는 혼합균주를 그대로 활용하였다. 여러 종류의 혼합 균주에서는 종종 기질경쟁과 우점종에 의한 다른 미생물들의 성장저해 현상 등이 관찰되어지곤 한다. 그러나 Russell et al. 등은 EDTA를 유일 탄소원으로 이용할 수 있는 14종 균주를 분리 동정하고 이를 이용하여 Metal-EDTA 생분해에 관한 연구를 보고하였다. 이들 14종은 Methylobacterium, Variovorax, Enterobacter, Aureobacterium, Bacillus속으로 이들 혼합 균주에 의해 철>구리>코발트>니켈>", "카드뮴의 순서로 제거됨을 보여주고 있다.", "</p><p>본 연구에서는 여러 종류의 호열성, 호기성 간균(Bacillus genus)군, 중금속leaching 미생물군(Thiobacillus, T.", "ferooxidans), 그리고 여러 가지 난분해성 물질을 분해하는 미생물군 (Pse-udomonas genus)을 활용하여 분해 조건을 연구하고 이를 이용하여 축산폐기물의 퇴비화에 미치는 효과를 연구하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "미생물에 의한 축산 폐기물 퇴비화에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-c0557aa6-0629-4bbe-925e-50decd6bc970", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2002", "doc_author": [ "신혜자" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,326	<h2>Zebrafish에서 hHtrA2의 DNA나 RNA의 발현양상의 비교 분석</h2><p>Zebrafish에서 hHtrA2의 발현양상을 알아보기 위하여 pWT-GFP DNA나 이 plasmid를 linearlize하여 in vitro에서 합성한 WT-GFP mRNA를 각각 embryo에 microinjection하여 단백질 발현의 효율을 조사하였다. WT-GFP DNA나 mRNA 각각을 one cell stage의 embryo에 약 \( 35 \mathrm{~pg} \)을 microinjection하였으며, 수정 후 24 시간째인 prim-5 stage [somite(체절) 발생이 끝나는 단계(총 30개의 somite 발생)]에서 관찰하였다. DNA의 microinjection 후 WT-GFP의 발현양상은 embryo 전체에 dot 형태로 나타나는 것을 확인할 수 있다. York에서 관찰되는 녹색의 형광은 plasmid로부터 발현되는 WT-GFP 단백질이 아니라 york 자체가 형광을 흡수함으로써 나타나는 background이다. WT-HtrA2 mRNA를 embyo에 microinjection 후 WT-HtrA2의 발현양상을 관찰한 결과, DNA를 embryo에 microinjection하였을 때 관찰할 수 있었던 dot 형태의 양상과는 달리 몸 전체에 퍼져 있는 것과 같은 발현양상을 보였다. 특히, 발생과정 중인 zebrafish의 머리 쪽에서 WT-HtrA2가 강하게 발현되며 몸통과 꼬리 쪽으로 갈수록 약하게 발현 되는 것을 관찰할 수 있었다. 이렇게 transient로 zebrafish embryo에서 DNA 또는 RNA로부터 WT-HtrA2 단백질을 발현시켰을 때 모든 세포에서 골고루 발현되지는 않지만 zebrafish의 body 전체에 퍼져 발현되는 양상을 보였다. 또한 DNA와 mRNA 모두 발생과정 중의 zebrafish에서 발현시키게 될 경우 발현에 별 문제점이 없으므로 실험 목적에 따라 DNA나 mRNA를 선택하여 zebrafish embryo에 microinjection하는 실험을 수행할 수 있다.</p><h2>Zebrafish에서의 WT-HtrA2 단백질 발현 시스템 구축</h2><p>앞 실험에서 DNA나 mRNA를 embryo에 microinjection하였을 때 GFP fusion 단백질의 발현을 잘 관찰할 수 있으므 로, in vitro에서 mRNA를 만드는 과정을 거치지 않고 plasmid DNA를 embryo에 직접 microinjection하여 발생과정 중인 zebrafish에서 WT-GFP의 발현양상을 관찰하는 방법을 선택하였다. DNA의 microinjection은 zebrafish embryo의 one cell stage에서만 실시하였다. 두 개의 다른 발생시기인 12 hours post fertilization (hpf) (5~6 somite stage, 5~6개의 somite가 발생하는 단계이며 최초로 눈이 구별되는 단계)와 24 hpf 에서 관찰하였으며, 발생하는 embyro의 측면을 관찰 하였다.</p></p>pWT-GFP, pS306A-GFP, pGFP plasmid 모두 동일한 양의 DNA를 embryo에 microinjection하여 각 단백질들의 발현양상을 관찰하였다. GFP가 zebrafish embryo에서 발현될 경우 zebrafish의 발생에 전혀 영향을 미치지 않는 것을 관찰할 수 있다. Zebrafish에서 WT-GFP가 S306A-GFP보다 다소 적은 양이 발현되기는 하나, 각각의 HtrA2 단백질의 발현을 쉽게 확인할 수 있고 GFP 자체도 zebrafish에 영향을 끼치지 않으므로 생체 내에서 HtrA2의 생리적 기능을 연구하는 데 이 발현 시스템을 이용할 수 있다. 또한 사용한 GFP나 HtrA2 발현 vector 모두 에서 embryo에 DNA를 microinjection한 후 24시간 일 때 보다는 early time인 12 시간대에 WT-GFP fusion 단백질이 더 잘 발현되는 것을 관찰할 수 있다. Zebrafish가 점점 성장해 감에 따라 단백질의 발현이 감소하며 72 시간 경에는 WT-GFP의 발현을 거의 관찰할 수 없었다(data not shown). 따라서 본 연구에서는 zebrafish에서 인간 유전자인 hHtrA2를 정상적으로 발현할 수 있는 시스템을 정립함으로써, 앞으로 zebrafish에서 hHtrA2의 생리적 기능을 연구하는 데 있어 기본적인 자료로 활용 할 수 있을 것이다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>Zebrafish의 사육</h2><p>Zebrafish는 적정 생육온도인 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)로 수온을 유지하여 사육하였다. Zebrafish의 산란과 수정은 빛에 의하여 유도되므로 zebrafish 생육과정은 낮 14 시간과 밤 10 시간으로 명암 주기를 조절하여 관리하였다. Brine shrimp (INVE)를 \( 28.5^{\circ} \mathrm{C} \)로 유지한 \( 2\% \) 소금물에서 18 시간 배양하여 부화시킨 후 깨끗한 물로 소금기를 제거하고 zebrafish 먹이로 사용하였다.</p><h2>Zebrafish 발현 용 hHtrA2 plasmid 제조</h2><p>Zebrafish에서 hHtrA2를 발현시키기 위하여 hHtrA2 cDNA를 pCS2+ expression vector에 클로닝 하였다. Zebrafish에서 발현된 단백질을 용이 하게 관찰하기 위하여 HtrA2의 C-terminus에 green fluorescence protein (GFP)를 fusion 시킨 plasmid를 제작하였다. 아미노산 134-458을 포함 하는 hHtrA2 mature form의 cDNA는 pFlag-hHtrA2 (aa 134-458) plasmid를 Bgl Ⅱ와 Kpn Ⅰ 으로 절단하여 얻었다. Bgl Ⅱ와 Kpn Ⅰ 으로 절단한 pEGFP-N3 plasmid (Clonetech)에 hHtrA2 fragment를 삽입하여 제작한 plasmid를 pEGFP-hHtrA2-GFP라 명명하였다. pEGFP-N3 plasmid의 Xba I enzyme site 주위의 sequence가 TCTAGATC(볼드체는 Dam methylase가 인지하는 nucleotide sequence임)이므로 E. coli 내에서 GATC sequence 중 A의 \( \mathrm{N}^{6} \) position이 Dam methylase에 의해 methylation되므로 Xba I (TCTAGA 인지) 효소로는 이 부분을 절단할 수 없다. 이 문제를 해결하기 위해 pEGFP-hHtrA2-GFP plasmid를 Dam methylase가 결여된 E. coli인 DAM strain에 transformation 시킨 후 Bgl Ⅱ와 Xba I 으로 절단하였다. 이렇게 얻어진 hHtrA2 (aa 134-458)-GFP를 BamH I 과 Xba I 으로 절단한 PCS2+ plasmid에 cloning하여 제작한 plasmid를 pWT-GFP라 명명하였다. Serine 306 residue를 alanine으로 변경하여 serine protease 효소 활성을 제거한 HtrA2 mutant form을 포함하는 pFlag-hHtrA2 (aa 134-458, S306A)로부터 hHtrA2 (S306A) fragment를 얻어 상기에서 설명한 방법으로 plasmid를 제작하여 그 이름을 pS306A-GFP라고 명명하였다.</p><h2>pRFP-NLS plasmid 제조</h2><p>Nucleus targeting vector를 제작하기 위해 red fluorescence protein (RFP)의 C-terminus에 nucleus localization signal (NLS)를 결합시켜 pRFP-NLS plasmid를 클로닝하였다. 이를위해 RFP cDNA fragment는 pDsRed1-N1 plasmid (Clonetech)를 template로 하여 PCR을 통해 얻었다. PCR을 위해 사용한 primer는 RFP-F (5'-GCGCGAATTCATGGTGCGCTCCTCCAAGAAC-3')와 RFP-R (5'-GCGCGCGGCCGCTAGTCGACCAGGAACAGGTGGTGGCGGC-3')이다. 증폭한 RFP fragment는 EcoR I 과 Not I restriction enzyme으로 절단하여 pEGFP-N1 plasmid (Clonetech)에 삽입하여 pRFP를 제작하였다. NLS 부분의 nucleotide를 얻기 위해 N1~N4의 4종류의 primer를 이용하였다: N1 (5'-GCGC GTCGACGATCCAAAAAAGAAAAGAAAGGTAGATCCAAAA-3'), N2 (5'-TAC CTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATC-3'), N3 (5'-A AGAAGAGAAAGGTAGATCCA-3'), N4 (5'-GCGCGGCCGCTTATACCTTTCTC TTCTTTTTTGGATC-3'). 먼저 N1과 N2를 혼합(A)하고 N3와 N4를 혼합(B)한 후 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분간 열을 가한 후 서서히 냉각시켜 각 complementary strand들을 annealing시켰다. A와 B 반응물을 흔합하여 T4 DNA ligase (Takara)를 이용하여 두 fragment를 ligation하여 PCR template로 이용하였다. 이 NLS template를 N1과 N4 primer를 이용하여 PCR로 증폭한 후 Sal I 과 Not I restriction enzyme으로 절단하여 pRFP (Sal I과 Not I 으로 절단) plasmid에 cloning하여 pRFP-NLS라고 명명하였다.</p> <h1>고 찰</h1><p>많은 연구자들이 지금까지 수행해 오고 있는 HtrA2에 관한 연구들은 enzyme activity나 이 단백질의 세포사멸 경로에서의 기능, 또는 세포사멸에 관여하는 다른 단백질들과의 상호작용 등에 관한 내용들이 주를 이룬다. 이러한 연구들은 cell 내에서 HtrA2가 관여하는 생체 반응의 mechanism을 규명하는 데 이용되지만, 실제로 whole-organism 내에서 HtrA2의 생리적 기능을 연구하기 위한 시스템이나 적절한 동물모델에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.</p><p>본 연구에서는 hHtrA2의 생리적 기능을 보다 명확히 연구하기 위한 기반 기술을 구축하기 위해, 인간과 유사한 새로운 척추동물 모델인 zebrafish를 선택하여 이 물고기의 발생과정 중 hHtrA2 발현을 관찰할 수 있는 적절한 vector 시스템과 발현 조건을 확립하였다. Expression vector인 pcDNA는 human CMV promoter를 가지고 있어 zebrafish나 mammalian cell에서 특정 유전자를 발현하는 데 이용할 수 있으나, in vitro에서 mRNA를 합성하는 데 사용하기는 적절하지 않아 pCS2+ vector를 사용하였다. 이 vector는 simian CMV promoter를 가지고 있고 SV40 polyA tail 뒤에 multiple restriction enzyme site가 존재하므로 plasmid DNA로 embryo 에 microinjection할 수 있을 뿐만 아니라, 이 plasmid를 linearlize하여 polyA tail을 가지고 있는 mRNA를 in vitro에서 쉽게 제작할 수 있다는 장점도 있다.</p><p>pCS2+ vector 시스템을 이용하여 zebrafish에서 microinjection한 후 WT-GFP의 DNA와 mRNA로부터 단백질의 발현을 비교한 결과 커다란 차이점은 보이지 않았다. DNA 는 mRNA와는 달리 embryo에 microinjection하면 nucleus로 가서 transcription이 일어나고, 합성된 mRNA가 cytoplasm으로 export된 후 protein synthesis machinery를 통해 단백질이 만들어져야 하므로 단백질 발현의 효율이 다소 낮을 수 있고 단백질이 발현하는 데 시간이 걸릴 수 있으나 다루기가 쉽다는 큰 장점이 있다.</p><p>WT-GFP DNA를 발현시켜 다음 실험을 진행하기 위한 일환으로 여러 가지 농도 \( (10, 50, 100 \mathrm{~pg}) \)의 DNA를 embryo에 microinjection하였다. DNA \( 100 \mathrm{~pg} \)을 embryo에 microinjection하였을 때는 발현을 확인하기도 전에 대부분의 microinjection 된 embryo가 사망하여 유전자의 발현을 거의 확인하지 못하였으며, \( 50\sim 100\mathrm{~pg} \)을 microinjection 하였을 때는 발생과정 중 embryo가 사망하는 비율이 매우 높았다. 전체 microinjection한 embryo 중 약 \( 70 \% \) 이상이 사망하여 다 음 실험을 진행하기에는 무리가 있었다. Embryo에 \( 10 \mathrm{~pg} \)의 DNA를 microinjection 하였을 경우 WT-GFP의 발현율이 너무 약하여 WT-GFP 단백질의 발현을 확인하기가 어려웠다. WT-GFP 단백질의 적절한 발현 조건을 잡기위해, \( 10 \mathrm{~pg} \) 과 \( 50 \mathrm{~pg} \) 사이의 농도인 \( 25\sim 35 \mathrm{~pg} \)을 embryo에 injection 하였을 때, WT-GFP 단백질의 발현율도 높으면서 embryo의 사망률 도 낮아 이 농도를 선택하였다(data not shown). 가시적으로 WT-GFP의 발현이 GFP vector alone이나 S306A-GFP보다 발현율이 다소 떨어짐을 볼 수 있다. 이러한 현상은 WT-GFP의 특성 때문이라고 사료되며 WT-GFP가 embryonic development상에서 어떠한 역할을 하는 지는 앞으로 좀더 연구가 진행되어야 할 부분이다.</p><p>이러한 연구결과를 바탕으로 mammalian cell에 transfection하는 expression plasmid를 zebrafish embryo에 microinjection하는 데 이용할 수 있으므로 인간 유전자의 발현과 기능을 mammalian cell과 zebrafish에서 동시에 연구할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 연구에서 정립한 발현 시스템을 이용하면 생체 내에서 hHtrA2의 생리적 기능을 용이하게 연구 할 수 있다.</p> <h1>요 약</h1><p>Mitochondrial serine protease로 알려진 human HtrA2 (hHtrA2)는 apoptosis 유도 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있을 뿐만 아니라 hHtrA2가 motor neuron degeneration과 관련이 있다는 최근 연구 결과가 있으나, hHtrA2의 생리적 기능은 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다. 이와 같이 생체 내에서 필수적인 업무를 담당하는 hHtrA2의 기능을 심도 있게 연구하기 위해서는 적절한 동물모델 시스템이 필요하나 이에 대한 연구도 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 hHtrA2의 기능 분석을 위한 기본적인 실험으로 zebrafish라는 동물모델을 선택하여 hHtrA2의 발현 시스템을 정립하였다. 먼저 zebrafish에 hHtrA2를 발현시키기 위하여 zebrafish에서 일반적으로 사용되는 발현 시스템인 pCS2+ vector에 hHtrA2와 GFP를 cloning하고 plasmid를 HEK293 cell에 transfection한 후, hHtrA2-GFP fusion 단백질의 발현을 immunoblot과 immunofluorescence staining assay로 확인한 바 약 \( 64 \mathrm{~kDa} \)의 hHtrA2 단백질의 발현을 확인할 수 있었다. Zebrafish에서 hHtrA2-GFP fusion 단백 질의 발현양상은 immunofluorescence microscope으로 확인하였다. hHtrA2-GFP DNA와 mRNA를 zebrafish embyro에 microinjection하여 두 가지 component의 발현을 비교 분석한 결과, DNA는 dot 형태로 mRNA는 몸 전체에 퍼져보이는 형태로 발현 양상의 차이는 있었으나 둘 다 zebrafish embryo에서 잘 발현되는 것을 알 수 있다. 다음 DNA를 주 component로 microinjection하여 zebrafish embryo에서 발현을 확인한 결과 hHtrA2는 72hpf 까지 발현이 지속되는 것을 확인하였다. 본 연구에서 정립한 hHtrA2의 zebrafish 발현 조건은 앞으로 zebrafish에서 hHtrA2의 생리적 기능을 심도있고 정확하게 연구하는 데 있어 기본적인 자료로 활용 할 수 있을 것이다.</p> <h1>서 론</h1><p>High temperature requirement protein A2 (HtrA2)는 mitochondrial serine protease로 Mxi2와 상호작용하는 단백질로 처음 동정되었다. HtrA2는 mitochondrial targeting sequence (MTS), transmembrane domain (TM), protease domain, PDZ domain으로 구성되어 있으며, mitochondria의 intermembrane space에 존재한다. Bacterial HtrA는 생리적 온도 \( \left(37^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서는 chaperon으로 작용하고, 고온에서는 unfolded protein이나 denatured protein을 제거하는 protease로서의 기능을 하는 단백질이다. 따라서 Escherichia coli (E. coli) protein HtrA (또는 Deg P)의 human homologue인 HtrA2도 생리적인 환경 변화에 대응하여 chaperon이나 protease로 작용할 가능성이 높다.</p><p>최근 UV, staurosporine 등과 같은 세포사멸 자극이 주어졌을 때, mitochondria로부터 Smac/DIABLO, cytochrome c등과 함께 HtrA2가 세포질로 방출되어 inhibitor of apoptosis protein (IAP)의 작용을 억제시켜 caspase 3-dependent cell death의 유발을 조절한다는 결과들이 발표되고 있다. 여러 연구를 통해 HtrA2는 apoptosis 경로에서 중추적인 역할을 담당하는 조절인자 중의 하나로 알려지고 있다. 또한 linkage analysis와 mutation screening을 통해 motor neuron degeneration 2 (mnd2) mice의 HtrA2 유전자에서 serine 276이 cysteine으로 mutation되어 있는 것을 확인하였고, HtrA2의 serine protease의 기능 상실로 인해 mnd2 mouse는 정상 mouse보다 비장과 흉선의 크기가 작고 몸의 크기가 작으며, 운동성이 저하되고, 평균 수명이 약 40일 정도가 되는 등의 phenotype을 나타낸다는 결과가 보고 되었다. 이 연구결과는 HtrA2가 퇴행성 뇌질환의 발병경로에서 중요한 역할을 할 수 있다는 가능성을 제시하고 있다. 그러나 여전히 HtrA2의 생리적 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않고, 적당한 동물 모델 시스템도 정립되어 있지 않은 실정이다. 따라서 HtrA2의 생리적 기능을 더욱 심도 있게 연구하기 위해서는 적절한 동물 모델 시스템이 필요하며, 이를 이용하여 HrA2의 serine protease 활성을 분석하는 연구가 필요하다.</p><p>본 연구에서는 human HtrA2 (hHtrA2)의 생리적 기능을 보다 명확히 규명하기 위한 일환으로 zebrafish라는 새로운 척추동물모델을 도입하였다. Zebrafish는 단 기간에 발생이 이루어지며 사육과 유지가 매우 손쉽다는 장점이 있다. 또한 embryo와 치어 상태가 매우 투명하여 내부의 장기 관찰이 용이하다는 장점이 있으며 인간의 장기와 기능적으로나 형태적으로 매우 유사하다. 최근 이러한 zebrafish의 장점으로 인해 zebrafish는 인간 유전자의 생리적 기능 연구를 위한 실험동물로 매우 각광을 받고 있다. Zebrafish에서 인간 유전자의 생리적 기능을 연구하기 위해서는 먼저 인간 유전자를 발현하는 기초 실험이 진행되어야 한다. 따라서 본 연구에서는 hHtrA2의 생리적 기능을 보다 명확히 밝히기 위한 기초 실험으로 zebrafish에서 hHtrA2를 발현하기 위한 시스템을 정립하였다.</p> <h2>Cell culture 및 transfection</H2><p>HEK293 cello \( 10 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) fetal bovine serum, \( 50 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) penicillin과 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium (DMEM) (Invitrogen)에서 \( 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 상태로 37 \( \mathrm{C} \)에서 배양하였다.</p><p>LipofectAMINE reagent (Invitrogen)를 이용하여 pWT-GFP, pS306A-GFP, pCS2+EGFP (pGFP라 명명) plasmid 각각을 HEK293 cell에 transfection하였다. HEK293 cell에 pRFP-NLS와 pWT-GFP나 pS306A-GFP를 co-transfection한 후 발현 양상을 immunofluorescent staining assay와 immunoblot assay 방법으로 관찰하였다.</p><h2>Immunoblot assay</h2><p>HEK293 cell에 DNA를 transfection하여 24 시간 경과한 후 cell을 harvest하여 배지를 제거하고 RIPA buffer ( \( 20 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \( \mathrm{pH} 7.5\), \( 150 \mathrm{~mM} \mathrm{~NaCl} \), \( 0.1 \% \) SDS, \( 1 \% \) Triton X-100, \( 1 \% \) sodium deoxycholate)로 30 분간 얼음에서 반응 시켜 cell을 용해시키고 ( \( 14,400\mathrm{xg} \)에서 30 분간 원심분리 하여 cell 찌꺼기를 제거하였다. Protein Assay Solution (Bio-Rad)을 이용하여 각각의 단백질 농도를 측정한 후, \( 20 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 \( 15 \% \) SDS-PAGE로 분리한 후 nitrocellulose membrane에 옮겨 immunoblotting을 실시하였다. hHtrA2 antibody를 반응시킨 다음 secondary antibody로 antigen-antibody complex와 반응시킨 후 ECL (Amersham Pharmacia Biotech.) 방법으로 밴드를 확인하였다.</p><h2>In vitro transcription에 의한 mRNA 제조</h2><p>pWT-GFP plasmid를 Nsi I 으로 linearization한 후 mMESSAGE mMACHINE high yield capped RNA transcription kit (Ambion)를 이용하여 in vitro에서 mRNA를 합성하였다. 이 plasmid에 SP6 promotor가 존재하므로 SP6 polymerase \( 200\mathrm{unit} \), capping과 RNA 합성에 이용되는 NTP mixture를 혼합하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 동안 반응 시켜 cap 구조를 가지고 있는 mRNA를 합성하였다. 합성한 mRNA \( (100 \mathrm{ng} / \mu \mathrm{l} \) 농도)를 각 embryo 당 \( 400\sim 600 \mathrm{~pl} \)를 microinjection하여 각 embryo에 약 \( 40 \sim 60 \mathrm{~pg} \)의 mRNA를 injection하였다.</p><h2>Microinjection</h2><p>Microinjection용 plasmid는 HiYield Plasmd Mini kit (Real Biotech Corp. RBC)을 이용하여 정제하였고, 이 정제된 DNA를 zebrafish embryo에 microinjection하였다. Needle (World Precision Instrument Inc.)을 \( 8 \sim 10 \mu \mathrm{m} \)로 제작하고 제작한 needle에 DNA 또는 RNA 용액을 넣은 후 injector (World Precision Instrument Inc.)를 이용하여 embryo에 DNA 또는 RNA를 microinjection 하였다. DNA 또는 RNA를 주입할 때는 1 세포기의 embryo를 이용하여 microinjection을 수행하였으며, sample이 embryo에 잘 injection 되었는 지를 확인하기 위해 DNA나 RNA를 포함하는 용액과 붉은 색을 띠는 phenol red (Sigma) 용액을 1:1 비율로 섞어서 사용하였다. Embryo 당 \( 250 \mathrm{~ng}/ \mu\mathrm{l}\)의 농도로 녹인 DNA 용액을 \( 140 \sim 240 \mathrm{~pl} \)씩 microinjection 하였으며, 이때 embryo에 주입하는 DNA의 양은 embryo당 약 \( 35 \sim 60 \mathrm{~pg} \) 이다.</p><p>한 개의 embryo에 microinjection하는 DNA 또는 RNA의 정확한 양을 알기 위해서는 먼저 embryo에 microinjection하는 DNA나 RNA 용액의 부피를 알아야한다. Embryo에 microinjection하는 sample의 부피는 hemacytometer와 heavy oil (Sigma)을 이용하여 측정하였다. Embyro에 microinjection하게 되는 DNA나 RNA 용액과 동일한 부피의 sample을 injector를 이용하여 heavy oil에 loading을 하게 되는 데, 이 때 loading된 용액은 구의 형태를 띠게 되므로 hemacytometer로 이 구의 반지름을 측정하여 구의 부피를 계산한다(구의 부피 \( \left.=4 / 3 \pi r^{3}\right) \). 이 구의 부피와 한 embryo에 한번 microinjection한 sample의 부피는 동일하므로, 이 부피를 이용하여 알고 있는 농도의 stock DNA나 RNA로부터 한 embryo당 microinjection한 DNA나 RNA의 양을 산출해 낼 수 있다.</p><h2>Microscopte 관찰</h2><p>Embryo의 관찰은 Stereo-Microscope (Leica)과 inverted fluorescence-microscope (Olympus)로 관찰하고, 사진은 DP70 디지털 카메라 (Olympus)로 촬영하였다.</p> <h1>결 과</h1><h2>Zebrafish에서 hHtrA2를 발현시키기 위한 plasmid 제작과 이용</h2><p>hHtrA2의 생리적 기능을 연구하기 위해서는 적절한 동물모델에서 hHtrA2를 발현할 수 있는 시스템의 정립이 필요하다. 이를 위하여 척추동물인 zebrafish를 동물모델로 선택하였고, 이 zebrafish에서 특정 유전자를 발현하기 위해 가장 널리 사용되고 있는 pCS2+ plasmid에 134에서 458 amino acid residue로 이루어진 mature HtrA2를 encoding하는 hHtrA2 cDNA를 cloning하였다. Zebrafish에서 hHtrA2의 발현양상을 용이하게 분석하기위하여 hHtrA2의 C-terminus에 GFP를 fusion시켰다. Zebrafish에서 hHtrA2의 생리적 기능을 비교 분석하기 위한 일환으로 serine protease activity를 갖고 있는 wild type hHtrA2 뿐만 아니라, 306 amino acid residue의 serine을 alanine으로 바꾸어 serine protease activity를 상실한 mutant hHtrA2를 발현하는 construct들을 제작하였다. 이 plasmid들은 zebrafish embryo에 microinjection하여 embryo의 발생단계에서 hHtrA2의 발현 양상을 연구하는 데 사용하였다. 또한, in vitro에서 합성한 mRNA를 zebrafish embryo에 microinjection하여 특정 유전자의 발현양상을 연구할 수 있다. 이를 위해 pWG-GFP plasmid를 Nsi I site restriction enzyme으로 절단, linearlize하여 zebrafish embryo에 microinjection할 hHtrA2 mRNA를 합성하기 위한 template로 이용하였다.</p><h2>Mammalian cell에서 hHtrA2의 발현양상 비교 분석</h2><p>Zebrafish embryo에 microinjection하여 발현 시스템을 정립하기 전에 HEK293 cell에 pWT-GFP나 pS306A-GFP plasmid를 transfection하여 hHtrA2의 발현양상을 immunobloting 방법으로 확인하였다. ExPASy Molecular Biology Server Program (http://us.expasy.org/tools/pi_html)을 이용하여 단백질의 분자량을 이론적으로 계산하면 mature hHtrA2은 \( 34.98 \mathrm{~kDa} \)이고 GFP는 \( 26.94 \mathrm{~kDa} \)이므로 hHtrA2-GFP fusion 단백질의 분자량은 \( 61.92 \mathrm{~kDa} \)이다. SDS-polyacrylamide gel 상에서 약 \( 64 \mathrm{~kDa} \) 의 hHtrA2-GFP fusion 단백질을 관찰할 수 있는데, 이는 이론적인 분자량의 수치와 거의 유사하다.</p><p>Immunofluorescent staining assay를 이용하여 cell 내에서 WT-GFP나 S306A-GFP fusion 단백질이 발현되는 양상과 cellular localization을 확인하였다. NLS sequence를 포함하는 pRFP-NLS plasmid를 hHtrA2 발현 vector와 co-transfection한 후 cell의 nucleus는 RFP의 발현으로 관찰하고, GFP fusion 단백질과 RFP의 merge 유무로 WT-GFP나 S306A-GFP가 nucleus에 존재하는 지 여부를 확인하였다. WT-GFP와 S306A-GFP 각각이 RFP와 merge가 되지 않는다는 것은 GFP-fusion 단백질이 nucleus에 존재하지 않는다는 것을 말해준다. Mitochondria에 주로 존재하는 full-length HtrA2와 는 달리 N-terminus에 존재하는 MTS를 제거한 WT-GFP와 S306A-GFP의 경우는 주로 cytosol에서 발현되는 것을 관찰할 수 있는데, 이는 기존의 연구 결과와 일치한다.</p>	생명과학	[ "<h2>Zebrafish에서 hHtrA2의 DNA나 RNA의 발현양상의 비교 분석</h2><p>Zebrafish에서 hHtrA2의 발현양상을 알아보기 위하여 pWT-GFP DNA나 이 plasmid를 linearlize하여 in vitro에서 합성한 WT-GFP mRNA를 각각 embryo에 microinjection하여 단백질 발현의 효율을 조사하였다.", "WT-GFP DNA나 mRNA 각각을 one cell stage의 embryo에 약 \\( 35 \\mathrm{~pg} \\)을 microinjection하였으며, 수정 후 24 시간째인 prim-5 stage [somite(체절) 발생이 끝나는 단계(총 30개의 somite 발생)]에서 관찰하였다.", "DNA의 microinjection 후 WT-GFP의 발현양상은 embryo 전체에 dot 형태로 나타나는 것을 확인할 수 있다.", "York에서 관찰되는 녹색의 형광은 plasmid로부터 발현되는 WT-GFP 단백질이 아니라 york 자체가 형광을 흡수함으로써 나타나는 background이다.", "WT-HtrA2 mRNA를 embyo에 microinjection 후 WT-HtrA2의 발현양상을 관찰한 결과, DNA를 embryo에 microinjection하였을 때 관찰할 수 있었던 dot 형태의 양상과는 달리 몸 전체에 퍼져 있는 것과 같은 발현양상을 보였다.", "특히, 발생과정 중인 zebrafish의 머리 쪽에서 WT-HtrA2가 강하게 발현되며 몸통과 꼬리 쪽으로 갈수록 약하게 발현 되는 것을 관찰할 수 있었다.", "이렇게 transient로 zebrafish embryo에서 DNA 또는 RNA로부터 WT-HtrA2 단백질을 발현시켰을 때 모든 세포에서 골고루 발현되지는 않지만 zebrafish의 body 전체에 퍼져 발현되는 양상을 보였다.", "또한 DNA와 mRNA 모두 발생과정 중의 zebrafish에서 발현시키게 될 경우 발현에 별 문제점이 없으므로 실험 목적에 따라 DNA나 mRNA를 선택하여 zebrafish embryo에 microinjection하는 실험을 수행할 수 있다.", "</p><h2>Zebrafish에서의 WT-HtrA2 단백질 발현 시스템 구축</h2><p>앞 실험에서 DNA나 mRNA를 embryo에 microinjection하였을 때 GFP fusion 단백질의 발현을 잘 관찰할 수 있으므 로, in vitro에서 mRNA를 만드는 과정을 거치지 않고 plasmid DNA를 embryo에 직접 microinjection하여 발생과정 중인 zebrafish에서 WT-GFP의 발현양상을 관찰하는 방법을 선택하였다.", "DNA의 microinjection은 zebrafish embryo의 one cell stage에서만 실시하였다.", "두 개의 다른 발생시기인 12 hours post fertilization (hpf) (5~6 somite stage, 5~6개의 somite가 발생하는 단계이며 최초로 눈이 구별되는 단계)와 24 hpf 에서 관찰하였으며, 발생하는 embyro의 측면을 관찰 하였다.", "</p></p>pWT-GFP, pS306A-GFP, pGFP plasmid 모두 동일한 양의 DNA를 embryo에 microinjection하여 각 단백질들의 발현양상을 관찰하였다.", "GFP가 zebrafish embryo에서 발현될 경우 zebrafish의 발생에 전혀 영향을 미치지 않는 것을 관찰할 수 있다.", "Zebrafish에서 WT-GFP가 S306A-GFP보다 다소 적은 양이 발현되기는 하나, 각각의 HtrA2 단백질의 발현을 쉽게 확인할 수 있고 GFP 자체도 zebrafish에 영향을 끼치지 않으므로 생체 내에서 HtrA2의 생리적 기능을 연구하는 데 이 발현 시스템을 이용할 수 있다.", "또한 사용한 GFP나 HtrA2 발현 vector 모두 에서 embryo에 DNA를 microinjection한 후 24시간 일 때 보다는 early time인 12 시간대에 WT-GFP fusion 단백질이 더 잘 발현되는 것을 관찰할 수 있다.", "Zebrafish가 점점 성장해 감에 따라 단백질의 발현이 감소하며 72 시간 경에는 WT-GFP의 발현을 거의 관찰할 수 없었다", "(data not shown).", "따라서 본 연구에서는 zebrafish에서 인간 유전자인 hHtrA2를 정상적으로 발현할 수 있는 시스템을 정립함으로써, 앞으로 zebrafish에서 hHtrA2의 생리적 기능을 연구하는 데 있어 기본적인 자료로 활용 할 수 있을 것이다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>Zebrafish의 사육</h2><p>Zebrafish는 적정 생육온도인 \\( 28^{\\circ} \\mathrm{C} \\)로 수온을 유지하여 사육하였다.", "Zebrafish의 산란과 수정은 빛에 의하여 유도되므로 zebrafish 생육과정은 낮 14 시간과 밤 10 시간으로 명암 주기를 조절하여 관리하였다.", "Brine shrimp (INVE)를 \\( 28.5^{\\circ} \\mathrm{C} \\)로 유지한 \\( 2\\% \\) 소금물에서 18 시간 배양하여 부화시킨 후 깨끗한 물로 소금기를 제거하고 zebrafish 먹이로 사용하였다.", "</p><h2>Zebrafish 발현 용 hHtrA2 plasmid 제조</h2><p>Zebrafish에서 hHtrA2를 발현시키기 위하여 hHtrA2 cDNA를 pCS2+ expression vector에 클로닝 하였다.", "Zebrafish에서 발현된 단백질을 용이 하게 관찰하기 위하여 HtrA2의 C-terminus에 green fluorescence protein (GFP)를 fusion 시킨 plasmid를 제작하였다.", "아미노산 134-458을 포함 하는 hHtrA2 mature form의 cDNA는 pFlag-hHtrA2 (aa 134-458) plasmid를 Bgl Ⅱ와 Kpn Ⅰ 으로 절단하여 얻었다.", "Bgl Ⅱ와 Kpn Ⅰ 으로 절단한 pEGFP-N3 plasmid (Clonetech)에 hHtrA2 fragment를 삽입하여 제작한 plasmid를 pEGFP-hHtrA2-GFP라 명명하였다.", "pEGFP-N3 plasmid의 Xba I enzyme site 주위의 sequence가 TCTAGATC(볼드체는 Dam methylase가 인지하는 nucleotide sequence임)이므로 E. coli 내에서 GATC sequence 중 A의 \\( \\mathrm{N}^{6} \\) position이 Dam methylase에 의해 methylation되므로 Xba I (TCTAGA 인지) 효소로는 이 부분을 절단할 수 없다.", "이 문제를 해결하기 위해 pEGFP-hHtrA2-GFP plasmid를 Dam methylase가 결여된 E. coli인 DAM strain에 transformation 시킨 후 Bgl Ⅱ와 Xba I 으로 절단하였다.", "이렇게 얻어진 hHtrA2 (aa 134-458)-GFP를 BamH I 과 Xba I 으로 절단한 PCS2+ plasmid에 cloning하여 제작한 plasmid를 pWT-GFP라 명명하였다.", "Serine 306 residue를 alanine으로 변경하여 serine protease 효소 활성을 제거한 HtrA2 mutant form을 포함하는 pFlag-hHtrA2 (aa 134-458, S306A)로부터 hHtrA2 (S306A) fragment를 얻어 상기에서 설명한 방법으로 plasmid를 제작하여 그 이름을 pS306A-GFP라고 명명하였다.", "</p><h2>pRFP-NLS plasmid 제조</h2><p>Nucleus targeting vector를 제작하기 위해 red fluorescence protein (RFP)의 C-terminus에 nucleus localization signal (NLS)를 결합시켜 pRFP-NLS plasmid를 클로닝하였다.", "이를위해 RFP cDNA fragment는 pDsRed1-N1 plasmid (Clonetech)를 template로 하여 PCR을 통해 얻었다.", "PCR을 위해 사용한 primer는 RFP-F (5'-GCGCGAATTCATGGTGCGCTCCTCCAAGAAC-3')와 RFP-R (5'-GCGCGCGGCCGCTAGTCGACCAGGAACAGGTGGTGGCGGC-3')이다.", "증폭한 RFP fragment는 EcoR I 과 Not I restriction enzyme으로 절단하여 pEGFP-N1 plasmid (Clonetech)에 삽입하여 pRFP를 제작하였다.", "NLS 부분의 nucleotide를 얻기 위해 N1~N4의 4종류의 primer를 이용하였다", ": N1 (5'-GCGC GTCGACGATCCAAAAAAGAAAAGAAAGGTAGATCCAAAA-3'), N2 (5'-TAC CTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATC-3'), N3 (5'-A AGAAGAGAAAGGTAGATCCA-3'), N4 (5'-GCGCGGCCGCTTATACCTTTCTC TTCTTTTTTGGATC-3').", "먼저 N1과 N2를 혼합(A)하고 N3와 N4를 혼합(B)한 후 \\( 95^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 3분간 열을 가한 후 서서히 냉각시켜 각 complementary strand들을 annealing시켰다.", "A와 B 반응물을 흔합하여 T4 DNA ligase (Takara)를 이용하여 두 fragment를 ligation하여 PCR template로 이용하였다.", "이 NLS template를 N1과 N4 primer를 이용하여 PCR로 증폭한 후 Sal I 과 Not I restriction enzyme으로 절단하여 pRFP (Sal I과 Not I 으로 절단) plasmid에 cloning하여 pRFP-NLS라고 명명하였다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>많은 연구자들이 지금까지 수행해 오고 있는 HtrA2에 관한 연구들은 enzyme activity나 이 단백질의 세포사멸 경로에서의 기능, 또는 세포사멸에 관여하는 다른 단백질들과의 상호작용 등에 관한 내용들이 주를 이룬다.", "이러한 연구들은 cell 내에서 HtrA2가 관여하는 생체 반응의 mechanism을 규명하는 데 이용되지만, 실제로 whole-organism 내에서 HtrA2의 생리적 기능을 연구하기 위한 시스템이나 적절한 동물모델에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.", "</p><p>본 연구에서는 hHtrA2의 생리적 기능을 보다 명확히 연구하기 위한 기반 기술을 구축하기 위해, 인간과 유사한 새로운 척추동물 모델인 zebrafish를 선택하여 이 물고기의 발생과정 중 hHtrA2 발현을 관찰할 수 있는 적절한 vector 시스템과 발현 조건을 확립하였다.", "Expression vector인 pcDNA는 human CMV promoter를 가지고 있어 zebrafish나 mammalian cell에서 특정 유전자를 발현하는 데 이용할 수 있으나, in vitro에서 mRNA를 합성하는 데 사용하기는 적절하지 않아 pCS2+ vector를 사용하였다.", "이 vector는 simian CMV promoter를 가지고 있고 SV40 polyA tail 뒤에 multiple restriction enzyme site가 존재하므로 plasmid DNA로 embryo 에 microinjection할 수 있을 뿐만 아니라, 이 plasmid를 linearlize하여 polyA tail을 가지고 있는 mRNA를 in vitro에서 쉽게 제작할 수 있다는 장점도 있다.", "</p><p>pCS2+ vector 시스템을 이용하여 zebrafish에서 microinjection한 후 WT-GFP의 DNA와 mRNA로부터 단백질의 발현을 비교한 결과 커다란 차이점은 보이지 않았다.", "DNA 는 mRNA와는 달리 embryo에 microinjection하면 nucleus로 가서 transcription이 일어나고, 합성된 mRNA가 cytoplasm으로 export된 후 protein synthesis machinery를 통해 단백질이 만들어져야 하므로 단백질 발현의 효율이 다소 낮을 수 있고 단백질이 발현하는 데 시간이 걸릴 수 있으나 다루기가 쉽다는 큰 장점이 있다.", "</p><p>WT-GFP DNA를 발현시켜 다음 실험을 진행하기 위한 일환으로 여러 가지 농도 \\( (10, 50, 100 \\mathrm{~pg}) \\)의 DNA를 embryo에 microinjection하였다.", "DNA \\( 100 \\mathrm{~pg} \\)을 embryo에 microinjection하였을 때는 발현을 확인하기도 전에 대부분의 microinjection 된 embryo가 사망하여 유전자의 발현을 거의 확인하지 못하였으며, \\( 50\\sim 100\\mathrm{~pg} \\)을 microinjection 하였을 때는 발생과정 중 embryo가 사망하는 비율이 매우 높았다.", "전체 microinjection한 embryo 중 약 \\( 70 \\% \\) 이상이 사망하여 다 음 실험을 진행하기에는 무리가 있었다.", "Embryo에 \\( 10 \\mathrm{~pg} \\)의 DNA를 microinjection 하였을 경우 WT-GFP의 발현율이 너무 약하여 WT-GFP 단백질의 발현을 확인하기가 어려웠다.", "WT-GFP 단백질의 적절한 발현 조건을 잡기위해, \\( 10 \\mathrm{~pg} \\) 과 \\( 50 \\mathrm{~pg} \\) 사이의 농도인 \\( 25\\sim 35 \\mathrm{~pg} \\)을 embryo에 injection 하였을 때, WT-GFP 단백질의 발현율도 높으면서 embryo의 사망률 도 낮아 이 농도를 선택하였다", "(data not shown).", "가시적으로 WT-GFP의 발현이 GFP vector alone이나 S306A-GFP보다 발현율이 다소 떨어짐을 볼 수 있다.", "이러한 현상은 WT-GFP의 특성 때문이라고 사료되며 WT-GFP가 embryonic development상에서 어떠한 역할을 하는 지는 앞으로 좀더 연구가 진행되어야 할 부분이다.", "</p><p>이러한 연구결과를 바탕으로 mammalian cell에 transfection하는 expression plasmid를 zebrafish embryo에 microinjection하는 데 이용할 수 있으므로 인간 유전자의 발현과 기능을 mammalian cell과 zebrafish에서 동시에 연구할 수 있는 장점이 있다.", "또한 본 연구에서 정립한 발현 시스템을 이용하면 생체 내에서 hHtrA2의 생리적 기능을 용이하게 연구 할 수 있다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>Mitochondrial serine protease로 알려진 human HtrA2 (hHtrA2)는 apoptosis 유도 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있을 뿐만 아니라 hHtrA2가 motor neuron degeneration과 관련이 있다는 최근 연구 결과가 있으나, hHtrA2의 생리적 기능은 아직 명확하게 밝혀져 있지 않다.", "이와 같이 생체 내에서 필수적인 업무를 담당하는 hHtrA2의 기능을 심도 있게 연구하기 위해서는 적절한 동물모델 시스템이 필요하나 이에 대한 연구도 미흡한 실정이다.", "따라서 본 연구에서는 hHtrA2의 기능 분석을 위한 기본적인 실험으로 zebrafish라는 동물모델을 선택하여 hHtrA2의 발현 시스템을 정립하였다.", "먼저 zebrafish에 hHtrA2를 발현시키기 위하여 zebrafish에서 일반적으로 사용되는 발현 시스템인 pCS2+ vector에 hHtrA2와 GFP를 cloning하고 plasmid를 HEK293 cell에 transfection한 후, hHtrA2-GFP fusion 단백질의 발현을 immunoblot과 immunofluorescence staining assay로 확인한 바 약 \\( 64 \\mathrm{~kDa} \\)의 hHtrA2 단백질의 발현을 확인할 수 있었다.", "Zebrafish에서 hHtrA2-GFP fusion 단백 질의 발현양상은 immunofluorescence microscope으로 확인하였다.", "hHtrA2-GFP DNA와 mRNA를 zebrafish embyro에 microinjection하여 두 가지 component의 발현을 비교 분석한 결과, DNA는 dot 형태로 mRNA는 몸 전체에 퍼져보이는 형태로 발현 양상의 차이는 있었으나 둘 다 zebrafish embryo에서 잘 발현되는 것을 알 수 있다.", "다음 DNA를 주 component로 microinjection하여 zebrafish embryo에서 발현을 확인한 결과 hHtrA2는 72hpf 까지 발현이 지속되는 것을 확인하였다.", "본 연구에서 정립한 hHtrA2의 zebrafish 발현 조건은 앞으로 zebrafish에서 hHtrA2의 생리적 기능을 심도있고 정확하게 연구하는 데 있어 기본적인 자료로 활용 할 수 있을 것이다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>High temperature requirement protein A2 (HtrA2)는 mitochondrial serine protease로 Mxi2와 상호작용하는 단백질로 처음 동정되었다.", "HtrA2는 mitochondrial targeting sequence (MTS), transmembrane domain (TM), protease domain, PDZ domain으로 구성되어 있으며, mitochondria의 intermembrane space에 존재한다.", "Bacterial HtrA는 생리적 온도 \\( \\left(37^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)에서는 chaperon으로 작용하고, 고온에서는 unfolded protein이나 denatured protein을 제거하는 protease로서의 기능을 하는 단백질이다.", "따라서 Escherichia coli (E.", "coli) protein HtrA (또는 Deg P)의 human homologue인 HtrA2도 생리적인 환경 변화에 대응하여 chaperon이나 protease로 작용할 가능성이 높다.", "</p><p>최근 UV, staurosporine 등과 같은 세포사멸 자극이 주어졌을 때, mitochondria로부터 Smac/DIABLO, cytochrome c등과 함께 HtrA2가 세포질로 방출되어 inhibitor of apoptosis protein (IAP)의 작용을 억제시켜 caspase 3-dependent cell death의 유발을 조절한다는 결과들이 발표되고 있다.", "여러 연구를 통해 HtrA2는 apoptosis 경로에서 중추적인 역할을 담당하는 조절인자 중의 하나로 알려지고 있다.", "또한 linkage analysis와 mutation screening을 통해 motor neuron degeneration 2 (mnd2) mice의 HtrA2 유전자에서 serine 276이 cysteine으로 mutation되어 있는 것을 확인하였고, HtrA2의 serine protease의 기능 상실로 인해 mnd2 mouse는 정상 mouse보다 비장과 흉선의 크기가 작고 몸의 크기가 작으며, 운동성이 저하되고, 평균 수명이 약 40일 정도가 되는 등의 phenotype을 나타낸다는 결과가 보고 되었다.", "이 연구결과는 HtrA2가 퇴행성 뇌질환의 발병경로에서 중요한 역할을 할 수 있다는 가능성을 제시하고 있다.", "그러나 여전히 HtrA2의 생리적 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않고, 적당한 동물 모델 시스템도 정립되어 있지 않은 실정이다.", "따라서 HtrA2의 생리적 기능을 더욱 심도 있게 연구하기 위해서는 적절한 동물 모델 시스템이 필요하며, 이를 이용하여 HrA2의 serine protease 활성을 분석하는 연구가 필요하다.", "</p><p>본 연구에서는 human HtrA2 (hHtrA2)의 생리적 기능을 보다 명확히 규명하기 위한 일환으로 zebrafish라는 새로운 척추동물모델을 도입하였다.", "Zebrafish는 단 기간에 발생이 이루어지며 사육과 유지가 매우 손쉽다는 장점이 있다.", "또한 embryo와 치어 상태가 매우 투명하여 내부의 장기 관찰이 용이하다는 장점이 있으며 인간의 장기와 기능적으로나 형태적으로 매우 유사하다.", "최근 이러한 zebrafish의 장점으로 인해 zebrafish는 인간 유전자의 생리적 기능 연구를 위한 실험동물로 매우 각광을 받고 있다.", "Zebrafish에서 인간 유전자의 생리적 기능을 연구하기 위해서는 먼저 인간 유전자를 발현하는 기초 실험이 진행되어야 한다.", "따라서 본 연구에서는 hHtrA2의 생리적 기능을 보다 명확히 밝히기 위한 기초 실험으로 zebrafish에서 hHtrA2를 발현하기 위한 시스템을 정립하였다.", "</p> <h2>Cell culture 및 transfection</H2><p>HEK293 cello \\( 10 \\%(\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\) fetal bovine serum, \\( 50 \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\) penicillin과 \\( 50 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium (DMEM) (Invitrogen)에서 \\( 5 \\% \\mathrm{CO}_{2} \\) 상태로 37 \\( \\mathrm{C} \\)에서 배양하였다.", "</p><p>LipofectAMINE reagent (Invitrogen)를 이용하여 pWT-GFP, pS306A-GFP, pCS2+EGFP (pGFP라 명명) plasmid 각각을 HEK293 cell에 transfection하였다.", "HEK293 cell에 pRFP-NLS와 pWT-GFP나 pS306A-GFP를 co-transfection한 후 발현 양상을 immunofluorescent staining assay와 immunoblot assay 방법으로 관찰하였다.", "</p><h2>Immunoblot assay</h2><p>HEK293 cell에 DNA를 transfection하여 24 시간 경과한 후 cell을 harvest하여 배지를 제거하고 RIPA buffer ( \\( 20 \\mathrm{mM} \\) Tris-HCl, \\( \\mathrm{pH} 7.5\\), \\( 150 \\mathrm{~mM} \\mathrm{~NaCl} \\), \\( 0.1 \\% \\) SDS, \\( 1 \\% \\) Triton X-100, \\( 1 \\% \\) sodium deoxycholate)로 30 분간 얼음에서 반응 시켜 cell을 용해시키고 ( \\( 14,400\\mathrm{xg} \\)에서 30 분간 원심분리 하여 cell 찌꺼기를 제거하였다.", "Protein Assay Solution (Bio-Rad)을 이용하여 각각의 단백질 농도를 측정한 후, \\( 20 \\mu \\mathrm{g} \\)의 단백질을 \\( 15 \\% \\) SDS-PAGE로 분리한 후 nitrocellulose membrane에 옮겨 immunoblotting을 실시하였다.", "hHtrA2 antibody를 반응시킨 다음 secondary antibody로 antigen-antibody complex와 반응시킨 후 ECL (Amersham Pharmacia Biotech.) 방법으로 밴드를 확인하였다.", "</p><h2>In vitro transcription에 의한 mRNA 제조</h2><p>pWT-GFP plasmid를 Nsi I 으로 linearization한 후 mMESSAGE mMACHINE high yield capped RNA transcription kit (Ambion)를 이용하여 in vitro에서 mRNA를 합성하였다.", "이 plasmid에 SP6 promotor가 존재하므로 SP6 polymerase \\( 200\\mathrm{unit} \\), capping과 RNA 합성에 이용되는 NTP mixture를 혼합하여 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 2시간 동안 반응 시켜 cap 구조를 가지고 있는 mRNA를 합성하였다.", "합성한 mRNA \\( (100 \\mathrm{ng} / \\mu \\mathrm{l} \\) 농도)를 각 embryo 당 \\( 400\\sim 600 \\mathrm{~pl} \\)를 microinjection하여 각 embryo에 약 \\( 40 \\sim 60 \\mathrm{~pg} \\)의 mRNA를 injection하였다.", "</p><h2>Microinjection</h2><p>Microinjection용 plasmid는 HiYield Plasmd Mini kit (Real Biotech Corp. RBC)을 이용하여 정제하였고, 이 정제된 DNA를 zebrafish embryo에 microinjection하였다.", "Needle (World Precision Instrument Inc.)을 \\( 8 \\sim 10 \\mu \\mathrm{m} \\)로 제작하고 제작한 needle에 DNA 또는 RNA 용액을 넣은 후 injector (World Precision Instrument Inc.)를 이용하여 embryo에 DNA 또는 RNA를 microinjection 하였다.", "DNA 또는 RNA를 주입할 때는 1 세포기의 embryo를 이용하여 microinjection을 수행하였으며, sample이 embryo에 잘 injection 되었는 지를 확인하기 위해 DNA나 RNA를 포함하는 용액과 붉은 색을 띠는 phenol red (Sigma) 용액을 1:1 비율로 섞어서 사용하였다.", "Embryo 당 \\( 250 \\mathrm{~ng}/ \\mu\\mathrm{l}\\)의 농도로 녹인 DNA 용액을 \\( 140 \\sim 240 \\mathrm{~pl} \\)씩 microinjection 하였으며, 이때 embryo에 주입하는 DNA의 양은 embryo당 약 \\( 35 \\sim 60 \\mathrm{~pg} \\) 이다.", "</p><p>한 개의 embryo에 microinjection하는 DNA 또는 RNA의 정확한 양을 알기 위해서는 먼저 embryo에 microinjection하는 DNA나 RNA 용액의 부피를 알아야한다.", "Embryo에 microinjection하는 sample의 부피는 hemacytometer와 heavy oil (Sigma)을 이용하여 측정하였다.", "Embyro에 microinjection하게 되는 DNA나 RNA 용액과 동일한 부피의 sample을 injector를 이용하여 heavy oil에 loading을 하게 되는 데, 이 때 loading된 용액은 구의 형태를 띠게 되므로 hemacytometer로 이 구의 반지름을 측정하여 구의 부피를 계산한다(구의 부피 \\( \\left.=4 / 3 \\pi r^{3}\\right) \\).", "이 구의 부피와 한 embryo에 한번 microinjection한 sample의 부피는 동일하므로, 이 부피를 이용하여 알고 있는 농도의 stock DNA나 RNA로부터 한 embryo당 microinjection한 DNA나 RNA의 양을 산출해 낼 수 있다.", "</p><h2>Microscopte 관찰</h2><p>Embryo의 관찰은 Stereo-Microscope (Leica)과 inverted fluorescence-microscope (Olympus)로 관찰하고, 사진은 DP70 디지털 카메라 (Olympus)로 촬영하였다.", "</p> <h1>결 과</h1><h2>Zebrafish에서 hHtrA2를 발현시키기 위한 plasmid 제작과 이용</h2><p>hHtrA2의 생리적 기능을 연구하기 위해서는 적절한 동물모델에서 hHtrA2를 발현할 수 있는 시스템의 정립이 필요하다.", "이를 위하여 척추동물인 zebrafish를 동물모델로 선택하였고, 이 zebrafish에서 특정 유전자를 발현하기 위해 가장 널리 사용되고 있는 pCS2+ plasmid에 134에서 458 amino acid residue로 이루어진 mature HtrA2를 encoding하는 hHtrA2 cDNA를 cloning하였다.", "Zebrafish에서 hHtrA2의 발현양상을 용이하게 분석하기위하여 hHtrA2의 C-terminus에 GFP를 fusion시켰다.", "Zebrafish에서 hHtrA2의 생리적 기능을 비교 분석하기 위한 일환으로 serine protease activity를 갖고 있는 wild type hHtrA2 뿐만 아니라, 306 amino acid residue의 serine을 alanine으로 바꾸어 serine protease activity를 상실한 mutant hHtrA2를 발현하는 construct들을 제작하였다.", "이 plasmid들은 zebrafish embryo에 microinjection하여 embryo의 발생단계에서 hHtrA2의 발현 양상을 연구하는 데 사용하였다.", "또한, in vitro에서 합성한 mRNA를 zebrafish embryo에 microinjection하여 특정 유전자의 발현양상을 연구할 수 있다.", "이를 위해 pWG-GFP plasmid를 Nsi I site restriction enzyme으로 절단, linearlize하여 zebrafish embryo에 microinjection할 hHtrA2 mRNA를 합성하기 위한 template로 이용하였다.", "</p><h2>Mammalian cell에서 hHtrA2의 발현양상 비교 분석</h2><p>Zebrafish embryo에 microinjection하여 발현 시스템을 정립하기 전에 HEK293 cell에 pWT-GFP나 pS306A-GFP plasmid를 transfection하여 hHtrA2의 발현양상을 immunobloting 방법으로 확인하였다.", "ExPASy Molecular Biology Server Program (http://us.expasy.org/tools/pi_html)을 이용하여 단백질의 분자량을 이론적으로 계산하면 mature hHtrA2은 \\( 34.98 \\mathrm{~kDa} \\)이고 GFP는 \\( 26.94 \\mathrm{~kDa} \\)이므로 hHtrA2-GFP fusion 단백질의 분자량은 \\( 61.92 \\mathrm{~kDa} \\)이다.", "SDS-polyacrylamide gel 상에서 약 \\( 64 \\mathrm{~kDa} \\) 의 hHtrA2-GFP fusion 단백질을 관찰할 수 있는데, 이는 이론적인 분자량의 수치와 거의 유사하다.", "</p><p>Immunofluorescent staining assay를 이용하여 cell 내에서 WT-GFP나 S306A-GFP fusion 단백질이 발현되는 양상과 cellular localization을 확인하였다.", "NLS sequence를 포함하는 pRFP-NLS plasmid를 hHtrA2 발현 vector와 co-transfection한 후 cell의 nucleus는 RFP의 발현으로 관찰하고, GFP fusion 단백질과 RFP의 merge 유무로 WT-GFP나 S306A-GFP가 nucleus에 존재하는 지 여부를 확인하였다.", "WT-GFP와 S306A-GFP 각각이 RFP와 merge가 되지 않는다는 것은 GFP-fusion 단백질이 nucleus에 존재하지 않는다는 것을 말해준다.", "Mitochondria에 주로 존재하는 full-length HtrA2와 는 달리 N-terminus에 존재하는 MTS를 제거한 WT-GFP와 S306A-GFP의 경우는 주로 cytosol에서 발현되는 것을 관찰할 수 있는데, 이는 기존의 연구 결과와 일치한다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Zebrafish 동물모델에서 human HtrA2A의 expression system 정립에 관한 연구", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-9ede3ae1-8fcb-401e-ae92-2a5e7a938a71", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2006", "doc_author": [ "조성원", "박효진", "김구영", "남민경", "김호영", "고인호", "김철히", "임향숙" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,327	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>항균활성 측정</h2><p>식품 유해 미생물 12종에 대한 해홍나물 부위별 추출물의 항균활성 결과는 Table 2와 Table 3에 나타내었다. 해홍나물 열수 추출물이나 메탄올 추출물의 항균활성은 전반적으로 항균 disc에 흡수시킨 추출물의 농도가 증가할수록 항균활성은 크게 나타났다. 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물에 항균활성을 보았을 때 뿌리, 줄기, 열매 순으로 항균활성을 나타내었는데 그람 음성균 7종에 대한 해홍나물 추출물의 항균활성을 보면 물 추출물이나 메탄올 추출물 모두 뿌리 추출물에서 강한 항균활성을 나타내었다. 물 추출물인 경우 V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, A. hydrophila, P. aeruginosa 순으로 메탄올 추출물 또한 물 추출물과 같은 V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, A. hydrophila, P. aeruginosa 순으로 항균활성을 나타내었고 그람 양성균 5종에 대한 해홍나물 추출물의 항균활성 또한 그람 음성균에서와 마찬가지로 줄기나 열매보다는 뿌리 추출물에서 높은 항균활성을 나타내었는데 물 추출물인 경우 B. subtilis, B. cereus, S. aureus 순으로 메탄올 추출물은 B. cereus, S. aureus, B. subtilis 순으로 강한 항균활성을 나타내었고 추출물 처리농도가 증가할수록 항균활성을 나타내는 저해환 크기가 비례적으로 증가하는 것을 알 수가 있는데 이는 추출물의 항균활성은 추출물의 농도에 의존적으로 증가한다는 것을 시사한다. 또한 메탄올 추출물같은 경우는 줄기와 열매 추출물에서도 뿌리 물 추출물과 유사하거나 좀 더 강한 항균활성을 나타내고 있다. 메탄올 추출물에서 물 추출물보다 강한 항균활성을 나타내는 것은 해홍나물의 주 항균성 물질이 물 보다는 메탄올에 더 잘 녹는 물질로 추정 된다. 해홍나물 메탄올 추출물이나 물 추출물을 paper disc방법에 의한 항균활성 측정에서 줄기나 열매 추출물과 비교 하였을 때 뿌리 추출물에서는 \( 0.5 \sim 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서부터 생육 저지환이 뚜렷이 나타났다. 위에 나타난 결과로 보았을 때는 해홍나물에서는 뿌리에서 메탄올로 항균성물질을 추출하는 것이 효과적일 것으로 생각된다.</p><h2>미생물 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정</h2><p>해홍나물 추출물의 미생물에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 해홍나물 부위별 추출물 중 항균활성이 가장 높게 나타난 뿌리의 추출물을 가지고 물 추출물과 메탄올 추출물의 MIC를 측정 비교하였다. 해홍나물 뿌리 추출물에 대한 최소저해농도는 물 추출물인 경우 그람 음성균에서는 A. hydrophila 그리고 그람 양성균에서는 S. aureus, B. cereus, B. subtilis에서 \( 0.50 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 생육을 저해 했으며 나머지 균에 대해서는 \( 1.00 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \), 메탄올 추출물은 그람 양성균에서는 B. cereus, B. subtilis 그람 음성균에서는 A. hydrophila에서 \( 0.10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도가 최소저해농도로 나타났다. 전체적으로 미생물의 MIC 결과를 분석해 보면 해홍나물 뿌리 추출물이 그람 양성균에서 그람 음성균보다 높은 항균활성을 나타냈다. 이는 항균활성이 그람 음성균인 E. coli, S. typhimurium 보다 그람 양성균인 S. aureus, B. cereus, B. subtilis에 대하여 강한 항균활성을 보였던 결과와 유사하게 나타내고 있다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험의 공시 재료인 해홍나물(Suaeda maritima)은 2006년 5월에서 8월까지 제주도 해안가에서 채집하여 뿌리, 줄기, 열매로 나누어 실험에 이용하였다. 식물분류는 한국식물도감과 제주식물도감 인터넷 사이트(http://www.nfc.co.kr)를 참고하였다.</p><h2>사용 균주</h2><p>본 연구에 사용된 균주는 Table 1에 나타낸 바와 같이 한국 미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism, KCCM), 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCIC) 그리고 American Type Culture Collection (ATCC)에서 그람 양성균 5종과 그람 음성균 7종으로 총 12종을 분양받아 사용하였다. 사용 배지는 Tryptic soybean agar (TSA), Tryptic soybean broth (TSB), Brain hcart infusion agar (BHIA), Brain heart infusion broth (BHIB), Marine agar(MA), Marine broth (MB), Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB) Difco (USA)사의 제품을 사용하여 stab culture하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보관하면서 3주마다 계대하여 실험에 사용하였다.</p><h2>시료 추출 방법</h2><p>생체로 채집된 해홍나물은 멸균수를 이용하여 모래, 흙 그리고 식물 외부에 묻어 있는 염분과 같은 이물질은 제거한 후 뿌리, 줄기, 열매 부위로 나누어서 바람이 통하는 음지에서 5일 이상 건조하여 수분을 충분히 제거하였다. 음건된 식물체는 각 부위별로 마쇄기를 이용하여 마쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.</p><p>해홍나물의 부위별 항균 효과를 알아보기 위한 추출물 조제는 각각 부위별로 증류수 \( 300 \mathrm{ml} \) 당 \( 10 \mathrm{~g} \)의 식물시료를 혼합하여 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕 상에서 약 30분간 중탕한 다음 Whatman No.2 여과지를 사용하여 1차 여과과정을 거친 후 pore size \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) syringe용 멸균 필터를 사용하여 무균적으로 식물열수 추출액을 조제하였다. 위 과정을 3회 반복하여 얻어진 시료는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕 상에서 감압 농축하여 얻은 물질을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.</p><p>해홍나물의 부위별 메탄올 추출물은 시료 \( 10 \mathrm{~g} \)에 메탄올 \( 300 \mathrm{ml} \)로 24시간 동안 상온에서 교반 침출 시킨 후 1차 추출한 후 Whatman No. 2 여과지를 사용하여 1차 여과과정을 거친 후 pore size \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) syringe용 멸균 필터를 사용하여 무균적으로 추출액을 조제하였다. 위 과정을 3회 반복하여 얻어진 시료는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 수욕 상에서 감압 농축하여 얻은 물질을 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.</p><h2>항균활성 측정</h2><p>추출물에 대한 항균활성 측정은 Murry 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 각 균주는 \( 10 \mathrm{ml} \)의 액체배지에서 18시간 정도 배양하여 세균 배양액을 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 Optical Density (O.D) 값 \( 0.4\left(10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml}\right) \)가 되게 조절한 후 멸균된 면봉을 사용하여 Muller Hinton agar (Difco, USA)에 회전하면서 배지 전면에 균액을 골고루 도말하였다. 항균측정용 시료액은 \( 0.1,0.5,1,2,3,5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 로 희석하여 멸균된 \( 8 \mathrm{~mm} \) paper disc (ADVANTEC, Japan)에 \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 흡수 건조시켜 시험용 평판배지위에 놓아 밀착시켜서 각 시험균의 최적 배양온도에서 24시간 배양 후 disc 주변에 생성된 생육저해환(clear zone, \(\mathrm{mm}\))을 측정하여 물 추출물과 메탄올 추출물의 항균활성을 비교 분석하였다.</p> <h2>미생물의 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정</h2><p>미생물의 최소저해농도(MIC)는 broth microdilution 방법을 응용하여 다음과 같이 측정하였다. 각각의 시험균을 18시간 배양한 후 세균 배양액을 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 Optical Density (O.D) 값 \( 0.4\left(10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml}\right) \)가 되게 조절한 후 96 well plate (SPL, Korea)에 각 시험균 배양액을 \( 100 \mu \mathrm{m} \) 씩 분주하고, 각 시료를 \( 0,0.10,0.25,0.50,1.00,1.50,2.00 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 \( 100 \mu \mathrm{m} \)씩 처리하여 24시간 배양한 후 해홍나물 물 추출물과 메탄올 추출물이 세균의 증식에 미치는 영향은 microplate reader (Bio-Tek Instruments Inc., USA)를 통해 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 비교 분석하였다.</p><h2>미생물의 생육저해율 측정</h2><p>해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물에 대한 미생물의 생육저해율 측정은 각각의 액체 배지 \( 10 \mathrm{ml} \)에 시험균을 18시간 배양 한 후 세균 배양액을 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 O.D 값 \( 0.4\left(10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml}\right) \)가 되게 조절한 후 96 well plate (SPL, Korea)에 분주하고, 각각의 시료를 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도로 처리하여 24시간 배양한 후 세균의 증식 저해 정도는 microplate reader (Bio-Tek Instruments Inc., USA)를 통해 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. 생육저해율(\(\%\)) 확인은 다음 식으로 확인하였다. 미생물의 생육저해율은 균의 정지기인 24시간에서 그 값을 측정 하였다.</p><p>Inhibitory effect (\(\%)=\{1 \)-(treatment-treatment blank \( ) / \)(control-control blank) \( \} \times 100 \)</p><h2>B. cereus와 V. parahaemolyticus의 생육곡선 측정</h2><p>해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물 중 가장 항균활성이 눞게 나타난 뿌리 추출물을 가지고 그람 양성균인 B. cereus와 그람 음성균인 V. parahaemolyticus를 대상으로 추출물 처리 농도에 따른 생육곡선을 측정 비교하였다. B. cereus와 V. parahaemolyticus 생육곡선 측정은 각각의 액체 배지 \( 10 \mathrm{ml} \) 에 시험균을 18시간 배양 한 후 세균 배양액을 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 O.D 값 \( 0.4\left(10^{6} \mathrm{CFU} / \mathrm{ml}\right) \)로 조절한 후 다시 \( 10^{8} \)배 희석하여 96 well plate (SPL, Korea)에 무균적으로 \( 100 \mu \mathrm{l}\) 분주하고, 뿌리 추출물을 well plate (SPL. KOREA)에 \( 0, 0.5, 1.0, 1.5,2.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)에 농도로 첨가하고 각각 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 배양하면서 4시간 마다 세균의 증식 정도를 microplate reader (Bio-Tek Instruments Inc., USA)를 통해 \( 650 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다.</p> <h2>미생물의 생육저해율 측정</h2><p>해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물의 농도를 \( 2\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 하여 각 시험균의 액체배지에 첨가한 후 미생물에 대한 생육 저해율을 측정하였다. Paper disc법에 의한 항균력 측정이나 MIC측정에서도 나타났듯이 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물 중 뿌리에서 추출한 시료에서 미생물에 대한 생육 저해율이 높게 나타났으며 생육저해율은 각 균주마다 차이를 나타냈지만 평균적으로 물 추출물은 \( 45 \% \) 메탄올 추출물은 \( 51 \% \)에 생육저해효과를 나타내었다. 줄기 부위에서는 물 추출물 \( 37 \% \) 메탄올 추출물 \( 42 \% \), 열매 부위에서는 물 추출물에서는 \( 36 \% \), 메탄올 추출물은 \( 41 \% \)에 생육저해효과를 나타내었다.</p><p>뿌리 부위 물추출물에서는 그람 양성균 B. cereus \((56\%)\)에 가장 높은 저해율을 나타냈으며 그람 음성균에서는 V. para-haemolyticus \((55\%)\)에 대해서 높은 저해율을 나타내었다. 메탄올 추출물에서는 그람 양성균 B. subtilis \( (62 \%) \), B. cereus \( (61 \%) \) 에 대해 강한 활성을 나타냈었고 그람 음성균에서는 \( V \). parahaemolyticus \( (62 \%) \)에 대해 가장 높은 활성을 나타냈다.</p><p>또한 해홍나물 부위별 추출물 중 가장 생육저해율이 높은 뿌리 물 추출물과 메탄올 추출물을 가지고 그람 양성균인 B.cereus와 그람 음성균인 V. parahaemolyticus에 대하여 \( 0,0.5, 1.0, 1.5, 2.0 \mathrm{mg} / \mathrm{m} \) 에 농도로 추출물을 처리하여 4시간 마다 24시간 동안 균주의 성장 속도를 측정 비교 분석하여 보았다. B. cereus에 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서는 배양 4시간 이후부터 급격한 증가를 보여 빠른 성장이 일어남을 관찰할 수가 있었으나 물 추출물을 첨가한 실험구에서는 8시간 때부터 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 와 \( 1.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인할 수가 있었다. 메탄올 추출물은 첨가한 실험구에서는 \(0.5\mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서부터 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인 할 수가 있었다. V. parahaemolyticus 같은 경우도 B. cereus에서와 같이 농도가 증가할수록 균의 중식이 완만하게 일어나 물 추출물을 첨가한 실험구에서는 12시간 때부터 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 와 \( 1.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인 할 수가 있었고 메탄올 추출물은 첨가한 실험구에서는 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서부터 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인 할 수가 있었다.</p> <h1>서 론</h1><p>최근 국민 생활수준의 향상과 더불어 식품 산업이 소비자들의 연구를 충족시키기 위해 계속해서 발달하고 있다. 특히 식품의 유통 및 저장 과정 중 부패나 변질을 야기하는 식품 유해 미생물의 증식을 억제하기 위한 연구가 계속되고 있다. 가열 등과 같은 물리적인 방법을 사용하여 식품의 유통 및 저장 기간을 연장하려고도 하지만 이는 식품에 품질을 저하시킬 수 있는 단점을 가지고 있다. 또한 인공 합성 식품보존료를 사용하지만 이는 지속적으로 사용하게 되면 인체에 부작용을 일으킬 수 있다는 안정성 문제가 제기되고 있다. 생활수준의 향상함으로서 건강 지향적으로 소비자의 욕구가 변화하고 있어서 식품을 보다 안전하게 공급할 수 있는 방안이 필요하게 되었다. 그 중에서도 가장 바람직한 것은 인체에 무해할 뿐만 아니라 영양성분이 함유되어 있어서 식품보존료 역할과 더불어 인체 생리활성 증강 작용을 할 수 있는 천연 항균물질을 개발하는 것일 것이다. 천연 항균물질에는 예전부터 사용해 온 소금, 식초 등 일반식품 소재 외에도 동물, 식물, 미생물 등에서 유래한 것들이 많다. 최근 자생식물이 가진 다양한 생리활성 중 항균효능에 관한 연구는 식품 의약품, 화장품, 축산업, 양식업 등 관련 분야에서 관심이 높아져 가고 있다. 이는 식물 생명체가 화학물질 합성공장이라 불릴 만큼 다양한 물질을 생산하고 특히 생명체 자기방어 기작과 관련한 대사 물질은 천연 항균 잠재력이 있다는 연구에 기초하고 있다고 생각되어 진다. 그러나 대부분이 식용 식물이나 한방 약용식물 또는 육상에 서식하는 자생식물을 위주로 연구가 이루어지고 있다고 볼 수 있다.</p><p>염생식물(Halophyte)은 염류가 함유된 토지에서 생육할 수 있는 식물로서 해안의 염습지, 내룩의 염습지, 염사막에 생육하는 고등식물에 한정하는 경우와 조류나 고등식물에서도 거머리말, 줄말 등의 해수 기수(brackish water) 속의 침수 식물(submerged plant)을 포함하는 경우도 있다. 우리나라에 생육하는 염생식물은 총 16과 40여 종이 보고되었으며 특히 서남해안 갯벌의 상부 지역에 군락이 잘 발달하여 있다. 대부분의 염생식물들은 염류를 축적하고 하나의 적응방식을 공유하며 염분에 대한 저항력을 가지고 있는 식물이다. 우리나라의 대표적인 염생식물로는 퉁퉁마디(함초, Saliconia herbacea), 나문재(Staeda asparagoides), 칠면초(Suaeda japonica), 갯질경(Limonium tetragonum), 갯개미취(Aster tripolium), 해당화(Rosa rugosa), 통보리사초(Carex kobomugi), 해홍나물 (Suaeda maritima) 등이 있다. 이러한 염생식물이 생육하는 환경은 담수와 해수가 교차하는 횟수가 끊임이 없으므로 염분농도는 계속해서 변화한다. 이렇듯 염생식물은 육상식물이나 해산식물보다 극한환경에서 서식하므로 생물학적으로 이용가능성이 높은 2차 대사산물이 다른 생물종보다 풍부할 것으로 생각이 되어 진다. 하지난 아직까지 염생식물을 이용하여 생물학적인 이용가능성에 대한 연구가 거의 없다. 염생식물 중에서 퉁퉁마디를 이용하여 DPPH 라디컬 소거활성, 약리효과, 항산화능에 관한 연구 그리고 해당화꽃을 이용한 화학성분, 항산화 효과, 생리활성 연구 등 일부 염생식물에 대한 연구가 이루어 졌을 뿐이다. 이번 연구에서 사용한 해홍나물은 제주도 해변에 자생하는 1년초 식물이며 5월에 자라는 어린순은 나물로도 먹을 수 있고 7-8월에 개화 한다. 주로 중부 이남에 분포하는데 오래전부터 고혈압과 간 해독, 비만증 치료와 신장, 방광에 효험이 있는 식물로 알려져 왔으나 아직까지 해홍나물에 관한 연구가 미흡한 상태이다. 본 연구에서는 약용 작물로서 해홍 나물에 보존 활용가치가 높다고 생각되어 해홍나물을 물과 메탄올 추출물을 가지고 식품 유해 미생물에 대하여 항균활성을 검색하여 천연 항균제로서의 사용 가능성을 비교 분석하고자 한다.</p>	생명과학	[ "<h1>결과 및 고찰</h1><h2>항균활성 측정</h2><p>식품 유해 미생물 12종에 대한 해홍나물 부위별 추출물의 항균활성 결과는 Table 2와 Table 3에 나타내었다.", "해홍나물 열수 추출물이나 메탄올 추출물의 항균활성은 전반적으로 항균 disc에 흡수시킨 추출물의 농도가 증가할수록 항균활성은 크게 나타났다.", "해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물에 항균활성을 보았을 때 뿌리, 줄기, 열매 순으로 항균활성을 나타내었는데 그람 음성균 7종에 대한 해홍나물 추출물의 항균활성을 보면 물 추출물이나 메탄올 추출물 모두 뿌리 추출물에서 강한 항균활성을 나타내었다.", "물 추출물인 경우 V.", "alginolyticus, V.", "parahaemolyticus, A. hydrophila, P. aeruginosa 순으로 메탄올 추출물 또한 물 추출물과 같은 V.", "alginolyticus, V.", "parahaemolyticus, A. hydrophila, P. aeruginosa 순으로 항균활성을 나타내었고 그람 양성균 5종에 대한 해홍나물 추출물의 항균활성 또한 그람 음성균에서와 마찬가지로 줄기나 열매보다는 뿌리 추출물에서 높은 항균활성을 나타내었는데 물 추출물인 경우 B. subtilis, B. cereus, S.", "aureus 순으로 메탄올 추출물은 B. cereus, S.", "aureus, B. subtilis 순으로 강한 항균활성을 나타내었고 추출물 처리농도가 증가할수록 항균활성을 나타내는 저해환 크기가 비례적으로 증가하는 것을 알 수가 있는데 이는 추출물의 항균활성은 추출물의 농도에 의존적으로 증가한다는 것을 시사한다.", "또한 메탄올 추출물같은 경우는 줄기와 열매 추출물에서도 뿌리 물 추출물과 유사하거나 좀 더 강한 항균활성을 나타내고 있다.", "메탄올 추출물에서 물 추출물보다 강한 항균활성을 나타내는 것은 해홍나물의 주 항균성 물질이 물 보다는 메탄올에 더 잘 녹는 물질로 추정 된다.", "해홍나물 메탄올 추출물이나 물 추출물을 paper disc방법에 의한 항균활성 측정에서 줄기나 열매 추출물과 비교 하였을 때 뿌리 추출물에서는 \\( 0.5 \\sim 1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도에서부터 생육 저지환이 뚜렷이 나타났다.", "위에 나타난 결과로 보았을 때는 해홍나물에서는 뿌리에서 메탄올로 항균성물질을 추출하는 것이 효과적일 것으로 생각된다.", "</p><h2>미생물 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정</h2><p>해홍나물 추출물의 미생물에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 해홍나물 부위별 추출물 중 항균활성이 가장 높게 나타난 뿌리의 추출물을 가지고 물 추출물과 메탄올 추출물의 MIC를 측정 비교하였다.", "해홍나물 뿌리 추출물에 대한 최소저해농도는 물 추출물인 경우 그람 음성균에서는 A. hydrophila 그리고 그람 양성균에서는 S.", "aureus, B. cereus, B. subtilis에서 \\( 0.50 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도에서 생육을 저해 했으며 나머지 균에 대해서는 \\( 1.00 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\), 메탄올 추출물은 그람 양성균에서는 B. cereus, B. subtilis 그람 음성균에서는 A. hydrophila에서 \\( 0.10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도가 최소저해농도로 나타났다.", "전체적으로 미생물의 MIC 결과를 분석해 보면 해홍나물 뿌리 추출물이 그람 양성균에서 그람 음성균보다 높은 항균활성을 나타냈다.", "이는 항균활성이 그람 음성균인 E. coli, S.", "typhimurium 보다 그람 양성균인 S.", "aureus, B. cereus, B. subtilis에 대하여 강한 항균활성을 보였던 결과와 유사하게 나타내고 있다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험의 공시 재료인 해홍나물(Suaeda maritima)은 2006년 5월에서 8월까지 제주도 해안가에서 채집하여 뿌리, 줄기, 열매로 나누어 실험에 이용하였다.", "식물분류는 한국식물도감과 제주식물도감 인터넷 사이트(http://www.nfc.co.kr)를 참고하였다.", "</p><h2>사용 균주</h2><p>본 연구에 사용된 균주는 Table 1에 나타낸 바와 같이 한국 미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganism, KCCM), 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCIC) 그리고 American Type Culture Collection (ATCC)에서 그람 양성균 5종과 그람 음성균 7종으로 총 12종을 분양받아 사용하였다.", "사용 배지는 Tryptic soybean agar (TSA), Tryptic soybean broth (TSB), Brain hcart infusion agar (BHIA), Brain heart infusion broth (BHIB), Marine agar(MA), Marine broth (MB), Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB) Difco (USA)사의 제품을 사용하여 stab culture하여 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 보관하면서 3주마다 계대하여 실험에 사용하였다.", "</p><h2>시료 추출 방법</h2><p>생체로 채집된 해홍나물은 멸균수를 이용하여 모래, 흙 그리고 식물 외부에 묻어 있는 염분과 같은 이물질은 제거한 후 뿌리, 줄기, 열매 부위로 나누어서 바람이 통하는 음지에서 5일 이상 건조하여 수분을 충분히 제거하였다.", "음건된 식물체는 각 부위별로 마쇄기를 이용하여 마쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.", "</p><p>해홍나물의 부위별 항균 효과를 알아보기 위한 추출물 조제는 각각 부위별로 증류수 \\( 300 \\mathrm{ml} \\) 당 \\( 10 \\mathrm{~g} \\)의 식물시료를 혼합하여 \\( 100^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 수욕 상에서 약 30분간 중탕한 다음 Whatman No.2 여과지를 사용하여 1차 여과과정을 거친 후 pore size \\( 0.45 \\mu \\mathrm{m} \\) syringe용 멸균 필터를 사용하여 무균적으로 식물열수 추출액을 조제하였다.", "위 과정을 3회 반복하여 얻어진 시료는 \\( 40^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 수욕 상에서 감압 농축하여 얻은 물질을 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.", "</p><p>해홍나물의 부위별 메탄올 추출물은 시료 \\( 10 \\mathrm{~g} \\)에 메탄올 \\( 300 \\mathrm{ml} \\)로 24시간 동안 상온에서 교반 침출 시킨 후 1차 추출한 후 Whatman No. 2 여과지를 사용하여 1차 여과과정을 거친 후 pore size \\( 0.45 \\mu \\mathrm{m} \\) syringe용 멸균 필터를 사용하여 무균적으로 추출액을 조제하였다.", "위 과정을 3회 반복하여 얻어진 시료는 \\( 40^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 수욕 상에서 감압 농축하여 얻은 물질을 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.", "</p><h2>항균활성 측정</h2><p>추출물에 대한 항균활성 측정은 Murry 등의 방법을 응용하여 측정하였다.", "각 균주는 \\( 10 \\mathrm{ml} \\)의 액체배지에서 18시간 정도 배양하여 세균 배양액을 \\( 650 \\mathrm{~nm} \\)에서 Optical Density (O.D) 값 \\( 0.4\\left(10^{6} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml}\\right) \\)가 되게 조절한 후 멸균된 면봉을 사용하여 Muller Hinton agar (Difco, USA)에 회전하면서 배지 전면에 균액을 골고루 도말하였다.", "항균측정용 시료액은 \\( 0.1,0.5,1,2,3,5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 로 희석하여 멸균된 \\( 8 \\mathrm{~mm} \\) paper disc (ADVANTEC, Japan)에 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\)를 흡수 건조시켜 시험용 평판배지위에 놓아 밀착시켜서 각 시험균의 최적 배양온도에서 24시간 배양 후 disc 주변에 생성된 생육저해환(clear zone, \\(\\mathrm{mm}\\))을 측정하여 물 추출물과 메탄올 추출물의 항균활성을 비교 분석하였다.", "</p> <h2>미생물의 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정</h2><p>미생물의 최소저해농도(MIC)는 broth microdilution 방법을 응용하여 다음과 같이 측정하였다.", "각각의 시험균을 18시간 배양한 후 세균 배양액을 \\( 650 \\mathrm{~nm} \\)에서 Optical Density (O.D) 값 \\( 0.4\\left(10^{6} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml}\\right) \\)가 되게 조절한 후 96 well plate (SPL, Korea)에 각 시험균 배양액을 \\( 100 \\mu \\mathrm{m} \\) 씩 분주하고, 각 시료를 \\( 0,0.10,0.25,0.50,1.00,1.50,2.00 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도로 \\( 100 \\mu \\mathrm{m} \\)씩 처리하여 24시간 배양한 후 해홍나물 물 추출물과 메탄올 추출물이 세균의 증식에 미치는 영향은 microplate reader (Bio-Tek Instruments Inc., USA)를 통해 \\( 650 \\mathrm{~nm} \\)에서 측정하여 비교 분석하였다.", "</p><h2>미생물의 생육저해율 측정</h2><p>해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물에 대한 미생물의 생육저해율 측정은 각각의 액체 배지 \\( 10 \\mathrm{ml} \\)에 시험균을 18시간 배양 한 후 세균 배양액을 \\( 650 \\mathrm{~nm} \\)에서 O.D 값 \\( 0.4\\left(10^{6} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml}\\right) \\)가 되게 조절한 후 96 well plate (SPL, Korea)에 분주하고, 각각의 시료를 \\( 2 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도로 처리하여 24시간 배양한 후 세균의 증식 저해 정도는 microplate reader (Bio-Tek Instruments Inc., USA)를 통해 \\( 650 \\mathrm{~nm} \\)에서 측정하였다.", "생육저해율(\\(\\%\\)) 확인은 다음 식으로 확인하였다.", "미생물의 생육저해율은 균의 정지기인 24시간에서 그 값을 측정 하였다.", "</p><p>Inhibitory effect (\\(\\%)=\\{1 \\)-(treatment-treatment blank \\( ) / \\)(control-control blank) \\( \\} \\times 100 \\)</p><h2>B.", "cereus와 V.", "parahaemolyticus의 생육곡선 측정</h2><p>해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물 중 가장 항균활성이 눞게 나타난 뿌리 추출물을 가지고 그람 양성균인 B. cereus와 그람 음성균인 V.", "parahaemolyticus를 대상으로 추출물 처리 농도에 따른 생육곡선을 측정 비교하였다.", "B. cereus와 V.", "parahaemolyticus 생육곡선 측정은 각각의 액체 배지 \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 에 시험균을 18시간 배양 한 후 세균 배양액을 \\( 650 \\mathrm{~nm} \\)에서 O.D 값 \\( 0.4\\left(10^{6} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{ml}\\right) \\)로 조절한 후 다시 \\( 10^{8} \\)배 희석하여 96 well plate (SPL, Korea)에 무균적으로 \\( 100 \\mu \\mathrm{l}\\) 분주하고, 뿌리 추출물을 well plate (SPL.", "KOREA)에 \\( 0, 0.5, 1.0, 1.5,2.0 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)에 농도로 첨가하고 각각 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)와 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 24시간 배양하면서 4시간 마다 세균의 증식 정도를 microplate reader (Bio-Tek Instruments Inc., USA)를 통해 \\( 650 \\mathrm{~nm} \\)에서 측정하였다.", "</p> <h2>미생물의 생육저해율 측정</h2><p>해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물의 농도를 \\( 2\\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)로 하여 각 시험균의 액체배지에 첨가한 후 미생물에 대한 생육 저해율을 측정하였다.", "Paper disc법에 의한 항균력 측정이나 MIC측정에서도 나타났듯이 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물 중 뿌리에서 추출한 시료에서 미생물에 대한 생육 저해율이 높게 나타났으며 생육저해율은 각 균주마다 차이를 나타냈지만 평균적으로 물 추출물은 \\( 45 \\% \\) 메탄올 추출물은 \\( 51 \\% \\)에 생육저해효과를 나타내었다.", "줄기 부위에서는 물 추출물 \\( 37 \\% \\) 메탄올 추출물 \\( 42 \\% \\), 열매 부위에서는 물 추출물에서는 \\( 36 \\% \\), 메탄올 추출물은 \\( 41 \\% \\)에 생육저해효과를 나타내었다.", "</p><p>뿌리 부위 물추출물에서는 그람 양성균 B. cereus \\((56\\%)\\)에 가장 높은 저해율을 나타냈으며 그람 음성균에서는 V.", "para-haemolyticus \\((55\\%)\\)에 대해서 높은 저해율을 나타내었다.", "메탄올 추출물에서는 그람 양성균 B. subtilis \\( (62 \\%) \\), B. cereus \\( (61 \\%) \\) 에 대해 강한 활성을 나타냈었고 그람 음성균에서는 \\( V \\).", "parahaemolyticus \\( (62 \\%) \\)에 대해 가장 높은 활성을 나타냈다.", "</p><p>또한 해홍나물 부위별 추출물 중 가장 생육저해율이 높은 뿌리 물 추출물과 메탄올 추출물을 가지고 그람 양성균인 B.cereus와 그람 음성균인 V.", "parahaemolyticus에 대하여 \\( 0,0.5, 1.0, 1.5, 2.0 \\mathrm{mg} / \\mathrm{m} \\) 에 농도로 추출물을 처리하여 4시간 마다 24시간 동안 균주의 성장 속도를 측정 비교 분석하여 보았다.", "B. cereus에 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서는 배양 4시간 이후부터 급격한 증가를 보여 빠른 성장이 일어남을 관찰할 수가 있었으나 물 추출물을 첨가한 실험구에서는 8시간 때부터 \\( 1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 와 \\( 1.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도에서 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인할 수가 있었다.", "메탄올 추출물은 첨가한 실험구에서는 \\(0.5\\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도에서부터 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인 할 수가 있었다.", "V. parahaemolyticus 같은 경우도 B. cereus에서와 같이 농도가 증가할수록 균의 중식이 완만하게 일어나 물 추출물을 첨가한 실험구에서는 12시간 때부터 \\( 1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 와 \\( 1.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도에서 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인 할 수가 있었고 메탄올 추출물은 첨가한 실험구에서는 \\( 0.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도에서부터 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인 할 수가 있었다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>최근 국민 생활수준의 향상과 더불어 식품 산업이 소비자들의 연구를 충족시키기 위해 계속해서 발달하고 있다.", "특히 식품의 유통 및 저장 과정 중 부패나 변질을 야기하는 식품 유해 미생물의 증식을 억제하기 위한 연구가 계속되고 있다.", "가열 등과 같은 물리적인 방법을 사용하여 식품의 유통 및 저장 기간을 연장하려고도 하지만 이는 식품에 품질을 저하시킬 수 있는 단점을 가지고 있다.", "또한 인공 합성 식품보존료를 사용하지만 이는 지속적으로 사용하게 되면 인체에 부작용을 일으킬 수 있다는 안정성 문제가 제기되고 있다.", "생활수준의 향상함으로서 건강 지향적으로 소비자의 욕구가 변화하고 있어서 식품을 보다 안전하게 공급할 수 있는 방안이 필요하게 되었다.", "그 중에서도 가장 바람직한 것은 인체에 무해할 뿐만 아니라 영양성분이 함유되어 있어서 식품보존료 역할과 더불어 인체 생리활성 증강 작용을 할 수 있는 천연 항균물질을 개발하는 것일 것이다.", "천연 항균물질에는 예전부터 사용해 온 소금, 식초 등 일반식품 소재 외에도 동물, 식물, 미생물 등에서 유래한 것들이 많다.", "최근 자생식물이 가진 다양한 생리활성 중 항균효능에 관한 연구는 식품 의약품, 화장품, 축산업, 양식업 등 관련 분야에서 관심이 높아져 가고 있다.", "이는 식물 생명체가 화학물질 합성공장이라 불릴 만큼 다양한 물질을 생산하고 특히 생명체 자기방어 기작과 관련한 대사 물질은 천연 항균 잠재력이 있다는 연구에 기초하고 있다고 생각되어 진다.", "그러나 대부분이 식용 식물이나 한방 약용식물 또는 육상에 서식하는 자생식물을 위주로 연구가 이루어지고 있다고 볼 수 있다.", "</p><p>염생식물(Halophyte)은 염류가 함유된 토지에서 생육할 수 있는 식물로서 해안의 염습지, 내룩의 염습지, 염사막에 생육하는 고등식물에 한정하는 경우와 조류나 고등식물에서도 거머리말, 줄말 등의 해수 기수(brackish water) 속의 침수 식물(submerged plant)을 포함하는 경우도 있다.", "우리나라에 생육하는 염생식물은 총 16과 40여 종이 보고되었으며 특히 서남해안 갯벌의 상부 지역에 군락이 잘 발달하여 있다.", "대부분의 염생식물들은 염류를 축적하고 하나의 적응방식을 공유하며 염분에 대한 저항력을 가지고 있는 식물이다.", "우리나라의 대표적인 염생식물로는 퉁퉁마디(함초, Saliconia herbacea), 나문재(Staeda asparagoides), 칠면초(Suaeda japonica), 갯질경(Limonium tetragonum), 갯개미취(Aster tripolium), 해당화(Rosa rugosa), 통보리사초(Carex kobomugi), 해홍나물 (Suaeda maritima) 등이 있다.", "이러한 염생식물이 생육하는 환경은 담수와 해수가 교차하는 횟수가 끊임이 없으므로 염분농도는 계속해서 변화한다.", "이렇듯 염생식물은 육상식물이나 해산식물보다 극한환경에서 서식하므로 생물학적으로 이용가능성이 높은 2차 대사산물이 다른 생물종보다 풍부할 것으로 생각이 되어 진다.", "하지난 아직까지 염생식물을 이용하여 생물학적인 이용가능성에 대한 연구가 거의 없다.", "염생식물 중에서 퉁퉁마디를 이용하여 DPPH 라디컬 소거활성, 약리효과, 항산화능에 관한 연구 그리고 해당화꽃을 이용한 화학성분, 항산화 효과, 생리활성 연구 등 일부 염생식물에 대한 연구가 이루어 졌을 뿐이다.", "이번 연구에서 사용한 해홍나물은 제주도 해변에 자생하는 1년초 식물이며 5월에 자라는 어린순은 나물로도 먹을 수 있고 7-8월에 개화 한다.", "주로 중부 이남에 분포하는데 오래전부터 고혈압과 간 해독, 비만증 치료와 신장, 방광에 효험이 있는 식물로 알려져 왔으나 아직까지 해홍나물에 관한 연구가 미흡한 상태이다.", "본 연구에서는 약용 작물로서 해홍 나물에 보존 활용가치가 높다고 생각되어 해홍나물을 물과 메탄올 추출물을 가지고 식품 유해 미생물에 대하여 항균활성을 검색하여 천연 항균제로서의 사용 가능성을 비교 분석하고자 한다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "제주도 해홍나물(Suaeda maritima) 추출물의 항균활성", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-b0378ff3-1680-4f7d-b2b6-b07f4c2b481b", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "문영건", "송창영", "여인규", "김기영", "허문수" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" 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5,328	<h2>HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 apoptosis 유발에 미치는 Bcl-2의 영향</h2><p>이상의 결과에서 HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 증식 억제 및 세포주기 교란은 Bcl-2의 과발현에 의해 극복되어질 수 있음을 알 수 있었으며, apoptosis 유발 시 전형적으로 나타나는 다양한 형태적 변형(membrane shrinkage, blebbing 등)이 동반된 것으로 관찰되었기 때문에, apoptosis 유발에 관한 추가적인 자료를 얻기 위하여 FACS 분석을 실시하였다. Fig. 3A 및 B에서 보는 바와 같이 U937/vector 세포의 경우, TSA의 처리 농도 의존적으로 sub-G1기에 해당되는 세포 빈도의 증가, 즉 apoptosis가 현저하게 유발되는 것으로 나타났으나, U937/Bcl-2 세포에서 TSA에 의한 apoptosis 유발은 효과적으로 억제되었다. 그러나 Na-B에 의한 apoptosis 유발은 Bcl-2 과발현에 의하여 억제되지 않아 Fig.1 및 2에서 관찰된 결과들과 상호 연계성이 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 형태적인 차이로 직접 확인하기 위하여 DAPI 염색 후 각 세포주 핵의 형태변화를 관찰하였다. Fig. 3C에서 보여주는 바와 같이 HDAC 저해제인 TSA나 Na-B에 의해서 U937/vector 세포에서는 전형적인 apoptotic 형태적 변화인 nuclear condensation, fragmentation, apoptotic body formation 등이 관찰되었다. 그리고 TSA에 의하여 일어나는 이러한 현상은 U937/Bcl-2 cell에서는 거의 완벽하게 억제되는 것으로 나타났으나 Na-B에 의한 효과는 U937/ vector와 U937/Bcl-2 세포에서 큰 차이가 나타나지 않아 Fig. 3A 및 B의 결과와 일치함을 알 수 있었다.</p> <h2>HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 세포주기 변화에 미치는 Bcl-2의 영향</h2><p>HDAC 저해제들에 의한 U937 세포의 증식억제 현상과 동반된 세포주기 교란에 미치는 Bcl-2의 영향을 조사하기 위하여 다양한 농도의 TSA 및 Na-B를 적정시간 처리한 후 FACS 분석을 실시하였다. Fig. 2 및 Table 1에 나타낸 바와 같이, 정상배지에서 배양된 U937/vactor 세포의 경우 G1기에 속하는 세포의 빈도는 약 \( 52.2 \% \) 정도였고, S기 및 G2/M기에 해당되는 세포의 빈도는 각각 \( 35.6 \% \) 및 \( 12.3 \% \)로 나타났다. TSA를 처리할 경우 G1기에 해당되는 세포의 빈도뿐 만아니라 G2/M기에 해당되는 빈도 역시 TSA의 농도 증가에 따라 현저하게 감소되어, 상대적으로 S기에 해당되는 세포의 빈도가 증가되었다(\(200 \mathrm{nM}\) 처리군의 경우 약 \( 68.6 \% \)로 대조군에 비하여 약 2 배 증가). 즉 Bcl-2가 과발현되지 않은 U937 세포에서의 선행연구 결과에서처럼 U937/vector 세포에서 TSA에 의한 세포증식의 억제는 세포주기 S arrest 유발과 직접적인 연관이 있음을 알 수 있었다. 그러나 U937/ Bcl-2 세포에서 TSA 처리에 의한 세포주기 진행에 미치는 영향을 조사한 결과, TSA를 처리하지 않은 배지에서 배양된 세포 및 TSA가 처리된 조건에서 배양된 세포 모두에서 세포주기 빈도 변화에 뚜렷한 차이점을 찾아볼 수가 없었다. Na-B 처리군의 경우는 U937/vector 세포에서 S기 및 G2/M기에 해당되는 세포의 빈도가 다소 감소했으나, 대조군에 비하여 큰 차이점은 없었으며, U937/Bcl-2 세포에서의 경우는 Na-B 처리 농도가 증가할수록 G1기에 해당되는 세포의 빈도가 다소 증가되는 경향성을 보여 주었다(\(2.0 \mathrm{mM}\) 처리군에서 약 1.5 정도 증가). 이러한 결과는 선행연구와는 약간의 차이가 있었으나, TSA와 Na-B처리군에 따른 차이점은 TSA 처리군에서만 관찰되는 Bcl-2의 과발현에 의한 세포 증식억제 차단 효과에 기인된 결과로 추정되어진다.</p> <h2>HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 apoptosis 조절인자들 변화에 미치는 Bcl-2의 영향</h2><p>이상의 결과에서 U937 세포의 Bcl-2 과발현이 HDAC 저해제 중, Na-B 보다는 TSA 처리에 의한 증식억제 및 세포교란 유도와 연관된 apoptosis 차단 효과가 더욱 높게 나타났으므로, TSA 처리군을 대상으로 apoptosis 조절에 중요한 유전자들의 발현 및 활성의 정도를 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포에서 비교하였다. 이를 위하여 먼저 조사된 유전자는 Bcl-2 family에 속하는 몇 가지 유전자 산물로서 Western blotting 분석에 의한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 결과에서 알 수 있듯이 apoptosis 억제에 관여하는 유전자 중 Bcl-xL의 발현은 두 세포주 모두에서 TSA의 처리에 따른 큰 차이점은 관찰되지 않았다. Bcl-2의 경우는 U937/vector 세포에서 \(50\mathrm{nM}\) 이상 처리군에서 대조군에 비하여 매우 감소되었음을 알 수 있었으나, U937/Bcl-2 세포에서는 \(100\mathrm{nM}\) 처리군에서 다소 감소되는 경향성을 보여 주었다. Apoptosis를 유발하는데 관여하는 Bcl-2 family 중 Bax는 TSA의 처리 유무에 따라 차이점은 없었으나, Bad의 경우 고농도 처리군에서 U937/vector 세포에서만 다소 발현이 증가되었다. 그리고 Bid의 경우 총 단백질 수준에서의 발현 차이도 없었으며, mitochondria로 이동되어 apoptosis 유도에 관여될 것으로 추정되는 tBid의 발현온 두 세포주에서 모두 발현이 되지 않았다. 따라서 Bcl-2 family 중 TSA 처리에 의하여 U937/vector 세포에서 관찰된 Bad 및 Bcl-2의 발현 변화가 U937/Bcl-2 세포에서는 크게 나타나지 않아 TSA에 대한 apoptosis 유발 감수성에 다소 관여되었던 것으로 추정된다.</p><p>다음은 apoptosis 유발의 초기 및 효과기 모두에서 중요한 역할을 하는 caspase의 발현 및 활성에 미치는 TSA의 영향을 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포에서 비교하였으며, Fig. 5A에 제시한 것과 같이 조사된 3가지 procaspase의 발현이 U937/Bcl-2에서 보다 U937/vector 세포에서 TSA 처리에 의하여 현저하게 감소되었음을 알 수 있었다. 따라서 TSA 처리에 의한 이들 caspase의 활성화 정도를 in vitro 활성 조사법으로 비교한 결과, Fig. 5B에 나타낸 바와 같이 caspase-3, -8및 -9의 활성이 \(100\mathrm{nM}\) TSA가 함유된 배지에서 48시간 배양된 U937/vector 세포에서 각각 4.3배, 3.2배 및 5.6배 증가되었음을 알 수 있었으나, U937/Bcl-2 세포에서는 각각 1.23배, 1,98배 및 2.4배 정도로 증가되어 Western blotting에 의한 단백질 발현의 결과에서처럼 TSA에 의하여 U937/Bcl-2 세포에서 크게 활성화 되지 않았음을 알 수 있었다.</p> <p>Apoptosis에 관여하는 여러 인자들 중 IAP family에 속하는 여러 유전자 산물은 곤충세포에서 바이러스 감염에 의한 apoptosis를 억제하기 위한 baculoviral 단백질 군들로서 외부 신호에 의한 세포 내 anti-apoptotic 활성을 지니는데, 이들은 caspase와의 직/간접적인 결합을 통하여 그들의 apoptotic 활성을 억제할 수 있을 것으로 밝혀져 있다. 그리고 FasL (Fas ligand)은 type II transmembrane 단백질로서 Fas와 결합하여 Fas가 활성화 되면 연관된 caspase의 활성화가 연속적으로 일어나 결국 apoptosis를 유발하게 되는 것으로 알려져 있다. 따라서 TSA에 의한 IAP family 및 Fas/FasL system의 발현변화에 미치는 Bcl-2 과발현의 영향을 조사하였으며, 그 결과는 Fig. 6에 나타낸 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 Fas/FasL system에 속하는 두 유전자의 발현은 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포에서 큰 차이점이 없었으나, IAP family에 속하는 유전자들의 경우 발현의 억제 정도가 전반적으로 U937/vector 세포주에서 TSA 처리농도의존적으로 감소하였음을 알 수 있었다. 이러한 U937/vector 세포에서의 IAP family의 발현 감소는 caspase의 활성화를 유도하여 apoptosis 유발을 촉진시켰을 것으로 생각되지만, Bcl-2의 과발현에 의하여 이러한 작용이 억제됨을 알 수 있었다.</p><p>한편 apoptosis의 가장 중요한 현상 중 하나가 DNA의 단편화 유도이며 여기에 관여하는 인자가 DNA fragmentation factor (DFF)이다. DFF family는 caspase-activated DNase인 DFF40/CAD와 inhibitor of caspase-activated DNase인 DFF45/ICAD로 구성되어 있다. DFF40/CAD와 DFF45/ICAD는 서로 complex를 형성하고 있으며, apoptosis가 유발되면 caspase-3과 같은 효과기 caspase에 의하여 ICAD의 두 군데 Asp 잔기에서 단편화가 일어나는 것으로 알려져 있다. 따라서 DFF40/CAD 및 DFF45/ICAD의 발현이 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포에서 TSA 처리에 의하여 발현의 차이를 유도하는지를 Western blotting으로 조사해본 결과, Fig. 5에 나타낸 바와 같이 U937/vector 세포에서 DFF40/CAD의 경우는 큰 변화가 관찰되지 않았다. 그리고 DFF45/ICAD의 경우, TSA 처리농도 의존적으로 단편화 현상이 관찰되었으나, U937/Bcl-2 세포에서는 큰 차이가 없었다. 즉 U937/Bcl-2 세포에 비하여 U937/vector 세포에서 TSA의 처리에 의한 apoptosis 유발은 caspase의 활성화와 연관된 DFF 45/ICAD의 활성화가 관여할 것으로 생각되며, DFF 45/ICAD의 활성화로 핵 내 DNA의 단편화 현상이 초래될 것으로 추정된다.</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구에서는 인체백혈병세포 U937에서 HDAC 저해제에 의한 증식억제, 세포주기 교란 및 apoptosis 유도에 미치는 Bcl-2 유전자의 영향에 관하여 조사하였다. 이를 위하여 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포주를 대상으로 대표적인 HDAC 저해제인 TSA 및 Na-B처리에 의한 세포 증식 및 생존율에 미치는 영향을 조사한 결과, TSA에 의한 U937 세포의 증식억제 및 생존율의 감소는 Bcl-2의 과발현에 의하여 차단되는 효과를 보였으나, Na-B는 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포사이에 큰 변화를 보이지는 않았다. 세포주기 교란효과에서 Na-B는 TSA에 비하여 유의적인 차이를 보이지 못하였으며, 이는 TSA에 의한 apoptosis가 U937/ Bcl-2 세포에서는 억제되었으나, Na-B에 의한 apoptosis는 Bcl-2의 과발현에 의하여 차단되지 못한 것과 연관성이 있는 결과였다. 또한 TSA에 의한 apoptosis 유발의 Bcl-2에 의한 차단 효과는 TSA에 의하여 활성화된 caspase의 활성 억제, Bcl-2 발현 자체의 완화 등 apoptosis 조절 인자들의 발현 및 활성 변화에 기인된 것임을 알 수 있었다.</p> <h2>Western blotting 분석</h2><p>단백질 발현 분석을 위하여 준비된 세포들을 lysis buffer[\(25\mathrm{mM}\) Tris-Cl (\(\mathrm{pH} 7.5\)), \(250\mathrm{mM} ~\mathrm{NaCl}, 5\mathrm{mM}\) EDTA, \(1\%\) NP-40, \(1\mathrm{mM}\) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \(5\mathrm{mM}\) dithiothreitol (DTT)]로 용해한 후, 정량하고 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 따른 이차 항체 반응을 실시한 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) 및 Calbiochem(Cambridge, MA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 per-oxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science에서 구입하였다.</p><h2>In vitro caspase 활성의 측정</h2><p>준비된 세포들로부터 단백질을 추출하고 정량하여 각각 \( 150 \mu \mathrm{g} \)의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 \( 100 \mu \mathrm{M} \)이 함유된 extraction buffer [\(40\mathrm{mM}\) HEPES (\(\mathrm{pH} 7.4\)), \( 20 \% \) glycerol(v/v), 1\(\mathrm{mM}\) EDTA, \(0.2\%\) NP-40 and \(10\mathrm{mM}\) DL-DTT] \(50 \mu \mathrm{l}\)에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 \( 100 \mu \mathrm{l}\)가 되게 하였다. 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고, caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA였다. 준비된 plate를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 \( 405 \mathrm{nm} \)의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>DNA와 복합체를 이루는 histone 단백질의 기능 조절에는 acetylation, methylation, 인산화, ubiquitination 및 ADP-ribosylation 여부 등이 관여하는데, 그 중 histone 단백질의 N-말단 부위에 존재하는 lysine을 acetylation시킴으로서 chromatin의 구조를 변화시키는데 관여하는 것이 histone acetyltransferase(HAT) 복합체이다. 특히 HAT에 의하여 histone 복합체를 이루는 4가지 histone의 lysine 잔기가 acetylation 되지만, N-말단 부위는 histone의 상호작용에 의한 nucleosome 구조 유지에 중요한 영향을 미치지 않는 곳이며 그곳이 hyper-acetylation되어도 nucleosome 구조의 변화에도 큰 영향이 없다. 그러나 histone의 acetylation에 의하여 chromatin의 구조적 folding이 불안전화 되어 DNA에 RNA polymerase II의 접근이 쉽게 될 수 있도록 하여 전사가 활성화될 수 있기 때문에 histone deacetylases(HDACs)에 의한 histone의 deacetylation은 전사활성을 억제한다는 의미가 된다. 따라서 HDAC 억제제의 개발은 항암치료제 개발의 수단으로서 매우 중요한 의미를 가지고 있으며, 현재까지 알려진 HDAC 억제제는 약 20여 가지 이상이고, HDAC 억제제의 대부분은 인체 암세포의 세포주기 교란 및 apoptosis 유발과 동물 모델에서 종양 증식억제 효과가 있는 것으로 보고되어지고 있다.</p><p>HDAC 억제제 중, Streptomyces에서 유래된 trichostatin A(TSA)는 항균제로서 처음 개발된 것이었으나 저농도 처리 조건에서 포유동물 세포 histone 단백질의 acetylation 유도 효과가 매우 높았으며, HDAC의 활성 또한 효과적으로 억제하는 것으로 알려진 후 대표적인 HDAC 억제제로 사용되는 물질이다. 선행연구들에서 TSA는 세포의 증식과 생존을 억제하는 유전자들의 전사활성을 유도하여 다양한 암세포의 세포주기 교란 및 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 왔다. 그리고 TSA 및 TSA의 hydroxamate 유도체들은 현재 임상시험에 사용 중이지만, 아직 인체 혈구 암세포에 관한 연구는 상대적으로 매우 미비하게 이루어져 있다.</p><p>한편 sodium butyrate(Na-B)는 포유동물 장내 세균에 의하여 생성되는 짧은 지방산으로, Kruh에 의하여 톡히 대장세포의 비정상적인 증식을 억제할 수 있음이 처음 밝혀진 바 있다. 비록 (Na-B)의 분자생물학적 기전은 아직까지 정확하지 않으나, HDAC의 활성을 저해할 수 있으며, 이로인한 세포주기, 분화 및 세포의 생존 등과 연관된 유전자들의 활성 변화를 위한 관련 유전자들의 chromatin remodeling과 전사활성을 조절할 수 있음이 밝혀지고 있다. 특히 (Na-B)가 처리된 암세포에서는 apoptosis 억제에 관여하는 유전자들의 발현은 일반적으로 감소되고, apoptosis 유도에 관여되는 유전자들의 발현이 증가되는 일반적인 유사성이 많은 종류의 암세포에서 보고되어지고 있다. 이러한 측면에서 (Na-B)는 정상세포에서는 큰 독성이 없는 범위에서 암세포의 apoptosis를 효율적으로 유도함으로서 암세포의 증식을 제어할 수 있는 물질로 많은 관심을 받고 있다.</p><p>암의 치료를 위한 분자생물학적 표적 중의 하나인 apoptosis 유발에는 p53이나 Bcl-2 및 Bax와 같은 유전자가 관여한다는 사실이 알려지면서 apoptosis와 연관된 분자적 기전이 최근 많이 밝혀져 왔다. 그중 Bcl-2 family에 속하는 Bcl-2member 유전자 산물은 apoptosis를 억제하는 반면, Bax member의 과발현이 이루어졌을 때는 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 있다. 이들은 서로 dimer를 형성하면서 cytochrome c와 같은 apoptosis 유발에 관여하는 인자들의 조절에 관여한다. 또한 caspase protease family 역시 apoptosis 유발에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 이들은 proenzyme 형태로 존재하다가 apoptosis 유도를 활성화되어 직접 또는 간접으로 세포 내에 존재하는 많은 표적 단백질의 분해에 관여하게 된다. 특히 apoptosis는 암세포의 생장, 증식의 억제와 암세포 파괴의 한 방법으로써 널리 연구되고 있으므로 항암제 개발을 위한 후보물질의 암세포 apoptosis 조절관련 기전해석은 필수적으로 선행되어져야할 분야로 인식되어지고 있다.</p><p>최근까지 본 연구실에서는 대표적인 HDAC 억제제인 TSA 및 (Na-B)에 의한 몇 가지 인체암세포의 증식에 미치는 연구를 진행하여 왔으며, 특히 인체혈구암세포인 U937 세포에서 이들에 의한 apoptosis 유발에 Bcl-2 family에 속하는 유전자들의 발현 변화가 중요하게 작용함을 발표한 바 있다. 따라서 본 연구에서는 인체백혈병 세포인 U937 세포에서 제작된 apoptosis 억제에 관여하는 Bcl-2 유전자가 과발현된 U937 세포주(U937/Bcl-2)와 정상수준을 유지하고 있는 세포주(U937/vector)를 대상으로 TSA나 (Na-B)와 같은 HDAC 억제제에 의한 인체백혈병 세포의 증식억제, 세포주기 교란 및 apoptosis 유도 활성의 차이를 조사하여 Bcl-2의 직접적인 영향을 비교하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 생존율 억제에 미치는 Bcl-2의 영향</h3><p>두 가지 종류의 HDAC 처해제인 TSA와 Na-B의 처리에 의한 U937 세포의 증식억제에 미치는 Bcl-2의 영향을 비교하기 위하여 본 연구에 사용된 U937/Bcl-2 세포주의 Bcl-2 단백질 발현의 정도를 U937/vector 세포주와 먼저 비교하였다. Fig. 1A에 나타낸 Western botting의 결과에서 알 수 있듯이 U937/Bcl-2 세포에서의 Bcl-2 단백질의 발현은 U937/ vector 세포보다 약 3배 이상 과발현되어 있음을 확인하였다. 다음은 이와 같은 Bcl-2 발현의 차이가 있는 두 세포주에서 HDAC 저해제의 세포증식 억제의 정도를 trypan blue 염색 후 hemocytometer counting 방법으로 비교한 결과, U937/ Bcl-2의 성장속도가 U937/vector에 비하여 다소 retardation되는 경향을 나타내긴 했으나 유의성 있는 값을 나타내지는 않았다(Fig. 1B). 따라서 HDAC 저해제에 의한 apoptosis 연구에 U937/vector와 U937/Bcl-2의 세포 성장률이 영향을 미치지 않을 것으로 추정되었기 때문에 U937/vector와 U937/Bcl-2 세포에서 HDAC 저해제인 TSA와 Na-B를 처리하여 세포증식율에 대한 효과를 조사하였다. Fig. 1B에서 보는 바와 같이 \(80\mathrm{nM}\) TSA를 24~72시간 동안 처리한 다음 세포증식율을 측정한 결과, TSA에 의한 세포증식 억제가 U937/BCl-2에서 현저히 회복됨을 알 수 있었다. 그러나 Na-B에 의한 세포증식 억제는 U937/Bcl-2에서도 U937/vector와 유사한 정도의 억제를 나타내고 있어 효과가 없는 것으로 사료된다(data not shown). 한편 U937/vector에서의 TSA 및 Na-B의 감수성은 U937 세포에서 관찰된 선행연구의 결과와도 유사하였다. 아울러 TSA와 Na-B의 처리에 의하여 세포증식의 억제뿐만 아니라 membrane blebbing 및 shrinkage와 같은 형태적 변형을 동반하는 등 세포의 죽음이 일어나는 것으로 관찰됨에 따라 MTT assay에 의한 세포 생존도 비교를 실시하였다. 그 결과, Fig. 1C 및 D에서 나타낸 바와 같이 TSA에 의한 생존도 감소는 Bcl-2의 과발현에 의하여 어느 정도 차단되는 효과가 있었으나, Na-B에 의한 생존도의 경우 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포간의 큰 차이점은 나타나지 않았다. 이는 선행연구에서 관찰된 경우와 매우 유사한 결과들이며, TSA에 의한 세포증식 억제는 Bcl-2의 과발현에 의해 극복되어 질 수 있으나, Na-B에 의한 증식 억제는 Bcl-2와 무관하다는 것을 의미한다.</p>	생명과학	[ "<h2>HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 apoptosis 유발에 미치는 Bcl-2의 영향</h2><p>이상의 결과에서 HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 증식 억제 및 세포주기 교란은 Bcl-2의 과발현에 의해 극복되어질 수 있음을 알 수 있었으며, apoptosis 유발 시 전형적으로 나타나는 다양한 형태적 변형(membrane shrinkage, blebbing 등)이 동반된 것으로 관찰되었기 때문에, apoptosis 유발에 관한 추가적인 자료를 얻기 위하여 FACS 분석을 실시하였다.", "Fig.", "3A 및 B에서 보는 바와 같이 U937/vector 세포의 경우, TSA의 처리 농도 의존적으로 sub-G1기에 해당되는 세포 빈도의 증가, 즉 apoptosis가 현저하게 유발되는 것으로 나타났으나, U937/Bcl-2 세포에서 TSA에 의한 apoptosis 유발은 효과적으로 억제되었다.", "그러나 Na-B에 의한 apoptosis 유발은 Bcl-2 과발현에 의하여 억제되지 않아 Fig.1 및 2에서 관찰된 결과들과 상호 연계성이 있음을 알 수 있었다.", "이러한 결과를 형태적인 차이로 직접 확인하기 위하여 DAPI 염색 후 각 세포주 핵의 형태변화를 관찰하였다.", "Fig.", "3C에서 보여주는 바와 같이 HDAC 저해제인 TSA나 Na-B에 의해서 U937/vector 세포에서는 전형적인 apoptotic 형태적 변화인 nuclear condensation, fragmentation, apoptotic body formation 등이 관찰되었다.", "그리고 TSA에 의하여 일어나는 이러한 현상은 U937/Bcl-2 cell에서는 거의 완벽하게 억제되는 것으로 나타났으나 Na-B에 의한 효과는 U937/ vector와 U937/Bcl-2 세포에서 큰 차이가 나타나지 않아 Fig.", "3A 및 B의 결과와 일치함을 알 수 있었다.", "</p> <h2>HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 세포주기 변화에 미치는 Bcl-2의 영향</h2><p>HDAC 저해제들에 의한 U937 세포의 증식억제 현상과 동반된 세포주기 교란에 미치는 Bcl-2의 영향을 조사하기 위하여 다양한 농도의 TSA 및 Na-B를 적정시간 처리한 후 FACS 분석을 실시하였다.", "Fig.", "2 및 Table 1에 나타낸 바와 같이, 정상배지에서 배양된 U937/vactor 세포의 경우 G1기에 속하는 세포의 빈도는 약 \\( 52.2 \\% \\) 정도였고, S기 및 G2/M기에 해당되는 세포의 빈도는 각각 \\( 35.6 \\% \\) 및 \\( 12.3 \\% \\)로 나타났다.", "TSA를 처리할 경우 G1기에 해당되는 세포의 빈도뿐 만아니라 G2/M기에 해당되는 빈도 역시 TSA의 농도 증가에 따라 현저하게 감소되어, 상대적으로 S기에 해당되는 세포의 빈도가 증가되었다", "(\\(200 \\mathrm{nM}\\) 처리군의 경우 약 \\( 68.6 \\% \\)로 대조군에 비하여 약 2 배 증가).", "즉 Bcl-2가 과발현되지 않은 U937 세포에서의 선행연구 결과에서처럼 U937/vector 세포에서 TSA에 의한 세포증식의 억제는 세포주기 S arrest 유발과 직접적인 연관이 있음을 알 수 있었다.", "그러나 U937/ Bcl-2 세포에서 TSA 처리에 의한 세포주기 진행에 미치는 영향을 조사한 결과, TSA를 처리하지 않은 배지에서 배양된 세포 및 TSA가 처리된 조건에서 배양된 세포 모두에서 세포주기 빈도 변화에 뚜렷한 차이점을 찾아볼 수가 없었다.", "Na-B 처리군의 경우는 U937/vector 세포에서 S기 및 G2/M기에 해당되는 세포의 빈도가 다소 감소했으나, 대조군에 비하여 큰 차이점은 없었으며, U937/Bcl-2 세포에서의 경우는 Na-B 처리 농도가 증가할수록 G1기에 해당되는 세포의 빈도가 다소 증가되는 경향성을 보여 주었다", "(\\(2.0 \\mathrm{mM}\\) 처리군에서 약 1.5 정도 증가).", "이러한 결과는 선행연구와는 약간의 차이가 있었으나, TSA와 Na-B처리군에 따른 차이점은 TSA 처리군에서만 관찰되는 Bcl-2의 과발현에 의한 세포 증식억제 차단 효과에 기인된 결과로 추정되어진다.", "</p> <h2>HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 apoptosis 조절인자들 변화에 미치는 Bcl-2의 영향</h2><p>이상의 결과에서 U937 세포의 Bcl-2 과발현이 HDAC 저해제 중, Na-B 보다는 TSA 처리에 의한 증식억제 및 세포교란 유도와 연관된 apoptosis 차단 효과가 더욱 높게 나타났으므로, TSA 처리군을 대상으로 apoptosis 조절에 중요한 유전자들의 발현 및 활성의 정도를 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포에서 비교하였다.", "이를 위하여 먼저 조사된 유전자는 Bcl-2 family에 속하는 몇 가지 유전자 산물로서 Western blotting 분석에 의한 결과를 Fig.", "4에 나타내었다.", "결과에서 알 수 있듯이 apoptosis 억제에 관여하는 유전자 중 Bcl-xL의 발현은 두 세포주 모두에서 TSA의 처리에 따른 큰 차이점은 관찰되지 않았다.", "Bcl-2의 경우는 U937/vector 세포에서 \\(50\\mathrm{nM}\\) 이상 처리군에서 대조군에 비하여 매우 감소되었음을 알 수 있었으나, U937/Bcl-2 세포에서는 \\(100\\mathrm{nM}\\) 처리군에서 다소 감소되는 경향성을 보여 주었다.", "Apoptosis를 유발하는데 관여하는 Bcl-2 family 중 Bax는 TSA의 처리 유무에 따라 차이점은 없었으나, Bad의 경우 고농도 처리군에서 U937/vector 세포에서만 다소 발현이 증가되었다.", "그리고 Bid의 경우 총 단백질 수준에서의 발현 차이도 없었으며, mitochondria로 이동되어 apoptosis 유도에 관여될 것으로 추정되는 tBid의 발현온 두 세포주에서 모두 발현이 되지 않았다.", "따라서 Bcl-2 family 중 TSA 처리에 의하여 U937/vector 세포에서 관찰된 Bad 및 Bcl-2의 발현 변화가 U937/Bcl-2 세포에서는 크게 나타나지 않아 TSA에 대한 apoptosis 유발 감수성에 다소 관여되었던 것으로 추정된다.", "</p><p>다음은 apoptosis 유발의 초기 및 효과기 모두에서 중요한 역할을 하는 caspase의 발현 및 활성에 미치는 TSA의 영향을 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포에서 비교하였으며, Fig.", "5A에 제시한 것과 같이 조사된 3가지 procaspase의 발현이 U937/Bcl-2에서 보다 U937/vector 세포에서 TSA 처리에 의하여 현저하게 감소되었음을 알 수 있었다.", "따라서 TSA 처리에 의한 이들 caspase의 활성화 정도를 in vitro 활성 조사법으로 비교한 결과, Fig.", "5B에 나타낸 바와 같이 caspase-3, -8및 -9의 활성이 \\(100\\mathrm{nM}\\) TSA가 함유된 배지에서 48시간 배양된 U937/vector 세포에서 각각 4.3배, 3.2배 및 5.6배 증가되었음을 알 수 있었으나, U937/Bcl-2 세포에서는 각각 1.23배, 1,98배 및 2.4배 정도로 증가되어 Western blotting에 의한 단백질 발현의 결과에서처럼 TSA에 의하여 U937/Bcl-2 세포에서 크게 활성화 되지 않았음을 알 수 있었다.", "</p> <p>Apoptosis에 관여하는 여러 인자들 중 IAP family에 속하는 여러 유전자 산물은 곤충세포에서 바이러스 감염에 의한 apoptosis를 억제하기 위한 baculoviral 단백질 군들로서 외부 신호에 의한 세포 내 anti-apoptotic 활성을 지니는데, 이들은 caspase와의 직/간접적인 결합을 통하여 그들의 apoptotic 활성을 억제할 수 있을 것으로 밝혀져 있다.", "그리고 FasL (Fas ligand)은 type II transmembrane 단백질로서 Fas와 결합하여 Fas가 활성화 되면 연관된 caspase의 활성화가 연속적으로 일어나 결국 apoptosis를 유발하게 되는 것으로 알려져 있다.", "따라서 TSA에 의한 IAP family 및 Fas/FasL system의 발현변화에 미치는 Bcl-2 과발현의 영향을 조사하였으며, 그 결과는 Fig.", "6에 나타낸 바와 같다.", "결과에서 알 수 있듯이 Fas/FasL system에 속하는 두 유전자의 발현은 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포에서 큰 차이점이 없었으나, IAP family에 속하는 유전자들의 경우 발현의 억제 정도가 전반적으로 U937/vector 세포주에서 TSA 처리농도의존적으로 감소하였음을 알 수 있었다.", "이러한 U937/vector 세포에서의 IAP family의 발현 감소는 caspase의 활성화를 유도하여 apoptosis 유발을 촉진시켰을 것으로 생각되지만, Bcl-2의 과발현에 의하여 이러한 작용이 억제됨을 알 수 있었다.", "</p><p>한편 apoptosis의 가장 중요한 현상 중 하나가 DNA의 단편화 유도이며 여기에 관여하는 인자가 DNA fragmentation factor (DFF)이다.", "DFF family는 caspase-activated DNase인 DFF40/CAD와 inhibitor of caspase-activated DNase인 DFF45/ICAD로 구성되어 있다.", "DFF40/CAD와 DFF45/ICAD는 서로 complex를 형성하고 있으며, apoptosis가 유발되면 caspase-3과 같은 효과기 caspase에 의하여 ICAD의 두 군데 Asp 잔기에서 단편화가 일어나는 것으로 알려져 있다.", "따라서 DFF40/CAD 및 DFF45/ICAD의 발현이 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포에서 TSA 처리에 의하여 발현의 차이를 유도하는지를 Western blotting으로 조사해본 결과, Fig.", "5에 나타낸 바와 같이 U937/vector 세포에서 DFF40/CAD의 경우는 큰 변화가 관찰되지 않았다.", "그리고 DFF45/ICAD의 경우, TSA 처리농도 의존적으로 단편화 현상이 관찰되었으나, U937/Bcl-2 세포에서는 큰 차이가 없었다.", "즉 U937/Bcl-2 세포에 비하여 U937/vector 세포에서 TSA의 처리에 의한 apoptosis 유발은 caspase의 활성화와 연관된 DFF 45/ICAD의 활성화가 관여할 것으로 생각되며, DFF 45/ICAD의 활성화로 핵 내 DNA의 단편화 현상이 초래될 것으로 추정된다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구에서는 인체백혈병세포 U937에서 HDAC 저해제에 의한 증식억제, 세포주기 교란 및 apoptosis 유도에 미치는 Bcl-2 유전자의 영향에 관하여 조사하였다.", "이를 위하여 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포주를 대상으로 대표적인 HDAC 저해제인 TSA 및 Na-B처리에 의한 세포 증식 및 생존율에 미치는 영향을 조사한 결과, TSA에 의한 U937 세포의 증식억제 및 생존율의 감소는 Bcl-2의 과발현에 의하여 차단되는 효과를 보였으나, Na-B는 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포사이에 큰 변화를 보이지는 않았다.", "세포주기 교란효과에서 Na-B는 TSA에 비하여 유의적인 차이를 보이지 못하였으며, 이는 TSA에 의한 apoptosis가 U937/ Bcl-2 세포에서는 억제되었으나, Na-B에 의한 apoptosis는 Bcl-2의 과발현에 의하여 차단되지 못한 것과 연관성이 있는 결과였다.", "또한 TSA에 의한 apoptosis 유발의 Bcl-2에 의한 차단 효과는 TSA에 의하여 활성화된 caspase의 활성 억제, Bcl-2 발현 자체의 완화 등 apoptosis 조절 인자들의 발현 및 활성 변화에 기인된 것임을 알 수 있었다.", "</p> <h2>Western blotting 분석</h2><p>단백질 발현 분석을 위하여 준비된 세포들을 lysis buffer[\\(25\\mathrm{mM}\\) Tris-Cl (\\(\\mathrm{pH} 7.5\\)), \\(250\\mathrm{mM} ~\\mathrm{NaCl}, 5\\mathrm{mM}\\) EDTA, \\(1\\%\\) NP-40, \\(1\\mathrm{mM}\\) phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), \\(5\\mathrm{mM}\\) dithiothreitol (DTT)]로 용해한 후, 정량하고 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다.", "분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 따른 이차 항체 반응을 실시한 후 enhanced chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL)을 적용시킨 다음 암실에서 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.", "본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.", "(Santa Cruz, CA) 및 Calbiochem(Cambridge, MA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 per-oxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science에서 구입하였다.", "</p><h2>In vitro caspase 활성의 측정</h2><p>준비된 세포들로부터 단백질을 추출하고 정량하여 각각 \\( 150 \\mu \\mathrm{g} \\)의 단백질을 fluorogenic peptide 기질 \\( 100 \\mu \\mathrm{M} \\)이 함유된 extraction buffer [\\(40\\mathrm{mM}\\) HEPES (\\(\\mathrm{pH} 7.4\\)), \\( 20 \\% \\) glycerol(v/v), 1\\(\\mathrm{mM}\\) EDTA, \\(0.2\\%\\) NP-40 and \\(10\\mathrm{mM}\\) DL-DTT] \\(50 \\mu \\mathrm{l}\\)에 혼합하였으며, microtiter plate에 다시 extraction buffer에 희석하여 각 sample 당 총 volume이 \\( 100 \\mu \\mathrm{l}\\)가 되게 하였다.", "실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고, caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA였다.", "준비된 plate를 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 3시간 동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 \\( 405 \\mathrm{nm} \\)의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>DNA와 복합체를 이루는 histone 단백질의 기능 조절에는 acetylation, methylation, 인산화, ubiquitination 및 ADP-ribosylation 여부 등이 관여하는데, 그 중 histone 단백질의 N-말단 부위에 존재하는 lysine을 acetylation시킴으로서 chromatin의 구조를 변화시키는데 관여하는 것이 histone acetyltransferase(HAT) 복합체이다.", "특히 HAT에 의하여 histone 복합체를 이루는 4가지 histone의 lysine 잔기가 acetylation 되지만, N-말단 부위는 histone의 상호작용에 의한 nucleosome 구조 유지에 중요한 영향을 미치지 않는 곳이며 그곳이 hyper-acetylation되어도 nucleosome 구조의 변화에도 큰 영향이 없다.", "그러나 histone의 acetylation에 의하여 chromatin의 구조적 folding이 불안전화 되어 DNA에 RNA polymerase II의 접근이 쉽게 될 수 있도록 하여 전사가 활성화될 수 있기 때문에 histone deacetylases(HDACs)에 의한 histone의 deacetylation은 전사활성을 억제한다는 의미가 된다.", "따라서 HDAC 억제제의 개발은 항암치료제 개발의 수단으로서 매우 중요한 의미를 가지고 있으며, 현재까지 알려진 HDAC 억제제는 약 20여 가지 이상이고, HDAC 억제제의 대부분은 인체 암세포의 세포주기 교란 및 apoptosis 유발과 동물 모델에서 종양 증식억제 효과가 있는 것으로 보고되어지고 있다.", "</p><p>HDAC 억제제 중, Streptomyces에서 유래된 trichostatin A(TSA)는 항균제로서 처음 개발된 것이었으나 저농도 처리 조건에서 포유동물 세포 histone 단백질의 acetylation 유도 효과가 매우 높았으며, HDAC의 활성 또한 효과적으로 억제하는 것으로 알려진 후 대표적인 HDAC 억제제로 사용되는 물질이다.", "선행연구들에서 TSA는 세포의 증식과 생존을 억제하는 유전자들의 전사활성을 유도하여 다양한 암세포의 세포주기 교란 및 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 왔다.", "그리고 TSA 및 TSA의 hydroxamate 유도체들은 현재 임상시험에 사용 중이지만, 아직 인체 혈구 암세포에 관한 연구는 상대적으로 매우 미비하게 이루어져 있다.", "</p><p>한편 sodium butyrate(Na-B)는 포유동물 장내 세균에 의하여 생성되는 짧은 지방산으로, Kruh에 의하여 톡히 대장세포의 비정상적인 증식을 억제할 수 있음이 처음 밝혀진 바 있다.", "비록 (Na-B)의 분자생물학적 기전은 아직까지 정확하지 않으나, HDAC의 활성을 저해할 수 있으며, 이로인한 세포주기, 분화 및 세포의 생존 등과 연관된 유전자들의 활성 변화를 위한 관련 유전자들의 chromatin remodeling과 전사활성을 조절할 수 있음이 밝혀지고 있다.", "특히 (Na-B)가 처리된 암세포에서는 apoptosis 억제에 관여하는 유전자들의 발현은 일반적으로 감소되고, apoptosis 유도에 관여되는 유전자들의 발현이 증가되는 일반적인 유사성이 많은 종류의 암세포에서 보고되어지고 있다.", "이러한 측면에서 (Na-B)는 정상세포에서는 큰 독성이 없는 범위에서 암세포의 apoptosis를 효율적으로 유도함으로서 암세포의 증식을 제어할 수 있는 물질로 많은 관심을 받고 있다.", "</p><p>암의 치료를 위한 분자생물학적 표적 중의 하나인 apoptosis 유발에는 p53이나 Bcl-2 및 Bax와 같은 유전자가 관여한다는 사실이 알려지면서 apoptosis와 연관된 분자적 기전이 최근 많이 밝혀져 왔다.", "그중 Bcl-2 family에 속하는 Bcl-2member 유전자 산물은 apoptosis를 억제하는 반면, Bax member의 과발현이 이루어졌을 때는 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 있다.", "이들은 서로 dimer를 형성하면서 cytochrome c와 같은 apoptosis 유발에 관여하는 인자들의 조절에 관여한다.", "또한 caspase protease family 역시 apoptosis 유발에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 이들은 proenzyme 형태로 존재하다가 apoptosis 유도를 활성화되어 직접 또는 간접으로 세포 내에 존재하는 많은 표적 단백질의 분해에 관여하게 된다.", "특히 apoptosis는 암세포의 생장, 증식의 억제와 암세포 파괴의 한 방법으로써 널리 연구되고 있으므로 항암제 개발을 위한 후보물질의 암세포 apoptosis 조절관련 기전해석은 필수적으로 선행되어져야할 분야로 인식되어지고 있다.", "</p><p>최근까지 본 연구실에서는 대표적인 HDAC 억제제인 TSA 및 (Na-B)에 의한 몇 가지 인체암세포의 증식에 미치는 연구를 진행하여 왔으며, 특히 인체혈구암세포인 U937 세포에서 이들에 의한 apoptosis 유발에 Bcl-2 family에 속하는 유전자들의 발현 변화가 중요하게 작용함을 발표한 바 있다.", "따라서 본 연구에서는 인체백혈병 세포인 U937 세포에서 제작된 apoptosis 억제에 관여하는 Bcl-2 유전자가 과발현된 U937 세포주(U937/Bcl-2)와 정상수준을 유지하고 있는 세포주(U937/vector)를 대상으로 TSA나 (Na-B)와 같은 HDAC 억제제에 의한 인체백혈병 세포의 증식억제, 세포주기 교란 및 apoptosis 유도 활성의 차이를 조사하여 Bcl-2의 직접적인 영향을 비교하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>HDAC 저해제에 의한 U937 세포의 생존율 억제에 미치는 Bcl-2의 영향</h3><p>두 가지 종류의 HDAC 처해제인 TSA와 Na-B의 처리에 의한 U937 세포의 증식억제에 미치는 Bcl-2의 영향을 비교하기 위하여 본 연구에 사용된 U937/Bcl-2 세포주의 Bcl-2 단백질 발현의 정도를 U937/vector 세포주와 먼저 비교하였다.", "Fig.", "1A에 나타낸 Western botting의 결과에서 알 수 있듯이 U937/Bcl-2 세포에서의 Bcl-2 단백질의 발현은 U937/ vector 세포보다 약 3배 이상 과발현되어 있음을 확인하였다.", "다음은 이와 같은 Bcl-2 발현의 차이가 있는 두 세포주에서 HDAC 저해제의 세포증식 억제의 정도를 trypan blue 염색 후 hemocytometer counting 방법으로 비교한 결과, U937/ Bcl-2의 성장속도가 U937/vector에 비하여 다소 retardation되는 경향을 나타내긴 했으나 유의성 있는 값을 나타내지는 않았다", "(Fig. 1B).", "따라서 HDAC 저해제에 의한 apoptosis 연구에 U937/vector와 U937/Bcl-2의 세포 성장률이 영향을 미치지 않을 것으로 추정되었기 때문에 U937/vector와 U937/Bcl-2 세포에서 HDAC 저해제인 TSA와 Na-B를 처리하여 세포증식율에 대한 효과를 조사하였다.", "Fig.", "1B에서 보는 바와 같이 \\(80\\mathrm{nM}\\) TSA를 24~72시간 동안 처리한 다음 세포증식율을 측정한 결과, TSA에 의한 세포증식 억제가 U937/BCl-2에서 현저히 회복됨을 알 수 있었다.", "그러나 Na-B에 의한 세포증식 억제는 U937/Bcl-2에서도 U937/vector와 유사한 정도의 억제를 나타내고 있어 효과가 없는 것으로 사료된다(data not shown).", "한편 U937/vector에서의 TSA 및 Na-B의 감수성은 U937 세포에서 관찰된 선행연구의 결과와도 유사하였다.", "아울러 TSA와 Na-B의 처리에 의하여 세포증식의 억제뿐만 아니라 membrane blebbing 및 shrinkage와 같은 형태적 변형을 동반하는 등 세포의 죽음이 일어나는 것으로 관찰됨에 따라 MTT assay에 의한 세포 생존도 비교를 실시하였다.", "그 결과, Fig.", "1C 및 D에서 나타낸 바와 같이 TSA에 의한 생존도 감소는 Bcl-2의 과발현에 의하여 어느 정도 차단되는 효과가 있었으나, Na-B에 의한 생존도의 경우 U937/vector 및 U937/Bcl-2 세포간의 큰 차이점은 나타나지 않았다.", "이는 선행연구에서 관찰된 경우와 매우 유사한 결과들이며, TSA에 의한 세포증식 억제는 Bcl-2의 과발현에 의해 극복되어 질 수 있으나, Na-B에 의한 증식 억제는 Bcl-2와 무관하다는 것을 의미한다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "HDAC 저해제에 의한 인체 백혈병 U937 세포의 apoptosis 유발에 미치는 Bcl-2의 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-add83645-2883-4a30-8582-22f9baaf3b51", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2007", "doc_author": [ "이중혁", "허만규", "박동일", "최병태", "최영현" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", 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5,329	<h1>초록 : 쌀 시럽박의 단백질 가수분해 특성</h1><p>쌀 부산물인 쌀 시럽박을 상업적으로 사용되는 8가지 protease로 최적화된 조건에서 단일 혹은 혼합 처리하여 수용성 단백질을 분리하였다. 이렇게 분리된 단백질을 Lowry, Kjeldahl 그리고 Gravimetric method 등 총 3가지 방법으로 분석을 한 결과 Protease M, Protease N, Protease A이 가장 높은 분해율을 나타내었다. 3가지 방법에서 모두 Protease M, Protease N, Protease A가 가장 높은 분해율을 나타내었지만, 특히 Gravimetric method의 경우 다른 두 분석방법에 비해 더 높은 단백질 함량을 보였다. 또한 위의 단일처리 결과를 바탕으로 3가지 protease를 혼합하여 처리하였을 때 단일처리와는 달리 상승효과가 나타나는 것을 알 수 있었다. 효소 처리를 하여 얻어진 단백질의 사이즈를 알아보기 위해 SDS-PAGE를 한 결과 어떠한 밴드도 형성이 되지 않았고, 이는 단백질이 마커의 최소사이즈 \( 15\ \mathrm{kDa} \)보다 작은 것으로 생각할 수 있다. 아미노산분석의 경우 총 아미노산의 함량은 Protease M을 단일 처리하였을 때와 비슷함을 알 수 있었다. 이는 Protease M의 경우 단백질을 분해할 때 peptide와 amino acid를 동시에 생성하는 특성을 가지고 있지만 Protease N의 경우는 peptide만을 생성하는 특성을 가지고 있어서 상대적으로 Protease M을 처리하였을 때 총 아미노산의 함량이 Protease N에 비해 높음을 알 수 있었으며 이러한 특성으로 인해서 효소를 혼합하였을 때도 총 아미노산의 함량은 같은 것으로 판단된다. 효소 처리 후 생성된 총 단백질 함량은 효소를 혼합할수록 증가하였지만 아미노산의 함량은 단일과 비교하였을 때 비슷한 결과를 나타내었는데 이것 또한 Protease M의 특성으로 인해서 기인된 것으로 판단되며 상대적으로 효소를 혼합할수록 아미노산으로 분해되지 못한 polypeptide가 단일 처리에 비해 다량 존재 할 것으로 판단된다.</p>	생명과학	[ "<h1>초록 : 쌀 시럽박의 단백질 가수분해 특성</h1><p>쌀 부산물인 쌀 시럽박을 상업적으로 사용되는 8가지 protease로 최적화된 조건에서 단일 혹은 혼합 처리하여 수용성 단백질을 분리하였다.", "이렇게 분리된 단백질을 Lowry, Kjeldahl 그리고 Gravimetric method 등 총 3가지 방법으로 분석을 한 결과 Protease M, Protease N, Protease A이 가장 높은 분해율을 나타내었다.", "3가지 방법에서 모두 Protease M, Protease N, Protease A가 가장 높은 분해율을 나타내었지만, 특히 Gravimetric method의 경우 다른 두 분석방법에 비해 더 높은 단백질 함량을 보였다.", "또한 위의 단일처리 결과를 바탕으로 3가지 protease를 혼합하여 처리하였을 때 단일처리와는 달리 상승효과가 나타나는 것을 알 수 있었다.", "효소 처리를 하여 얻어진 단백질의 사이즈를 알아보기 위해 SDS-PAGE를 한 결과 어떠한 밴드도 형성이 되지 않았고, 이는 단백질이 마커의 최소사이즈 \\( 15\\ \\mathrm{kDa} \\)보다 작은 것으로 생각할 수 있다.", "아미노산분석의 경우 총 아미노산의 함량은 Protease M을 단일 처리하였을 때와 비슷함을 알 수 있었다.", "이는 Protease M의 경우 단백질을 분해할 때 peptide와 amino acid를 동시에 생성하는 특성을 가지고 있지만 Protease N의 경우는 peptide만을 생성하는 특성을 가지고 있어서 상대적으로 Protease M을 처리하였을 때 총 아미노산의 함량이 Protease N에 비해 높음을 알 수 있었으며 이러한 특성으로 인해서 효소를 혼합하였을 때도 총 아미노산의 함량은 같은 것으로 판단된다.", "효소 처리 후 생성된 총 단백질 함량은 효소를 혼합할수록 증가하였지만 아미노산의 함량은 단일과 비교하였을 때 비슷한 결과를 나타내었는데 이것 또한 Protease M의 특성으로 인해서 기인된 것으로 판단되며 상대적으로 효소를 혼합할수록 아미노산으로 분해되지 못한 polypeptide가 단일 처리에 비해 다량 존재 할 것으로 판단된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "", "eng": "Hydrolysis of Rice Syrup Meal Using Various Commercial Proteases" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-b26d929f-90d1-47f1-9e97-dd15e729f663", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "김창원", "박진우", "최혁준", "한복경", "유승석", "김병용", "백무열", "김영록" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,330	<h1>결 과</h1><h2>\( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로시의 외형적 소견</h2><p>\( \mathrm{SO}_{2} \)에 폭로된 흰쥐는 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로 후 즉시 눈과 외비공을 앞발로 비볐으며 외비공은 콧물로 인하여 습윤하였으며 가만히 있지 않고 계속 움직이며, 심한 호홉곤란과 침울 증상을 보이다가 폭로 시간이 경과함에 따라 활동을 거의 멈추고 gas chamber의 한쪽 모서리에 집단적으로 모여 코를 복부 쪽으로 묻고 웅크리고 앉아 약한 호흡만 하였다.</p><h2>대조군 및 실험군의 조직학적 소견</h2><h3>(1) 대조군</h3><p>비강 호흡점막상피는 위중층섬모원주상피(psuedostratified ciliated columnar epithelium)로 되어 있었으며, 세포의 표면에는 많은 섬모(cilia)가 일정한 크기로 규칙적으로 배열되어 있었다. 점액질을 분비하는 배상세포(goblet cell)들은 섬모원주세포들 사이에 나타났으며 키가 큰 상피세포와 배상세포들의 핵은 길쭉한 타원형의 모양을 하고 있었다. 호흡상피의 기저부에 있는 기저세포(basal cell)들의 핵은 타원형 또는 길쪽한 삼각형을 하고 있었다. 점막하조직에는 점막하선이 나타났으며 장액선포(serous acinus)들로 되어 있었으며 하비중격선의 장액선포들은 PAS 양성물질을 가지고 있었으나 상비중격선의 장액선포들에서는 PAS 양성물질이 나타나지 않았다. 하비중격선의 선포들은 핵이 규칙적이며 상비중격선의 선포들보다 더 기저쪽에 놓여 있었다. 상피세포 사이에는 림프구들도 관찰되었다.</p><h3>(2) 실험군</h3><p>① \( 10 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>상피세포의 섬모소실과 탈락이 1시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 약하게 나타났으나 폭로 시간이 길어질수록 심하여졌으며 특히 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 상피세포사이의 경계가 불확실하였으며 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 편평화도 관찰되었다. 배상세포의 수가 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 대조군에 비해 많이 증가하였으나 1시간 폭로군은 대조군과 유사하였고 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 거의 소실되었다. PAS 양성 반응을 나타내는 하비중격선의 선포 수는 1시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 대조군에 비하여 감소하였으나 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 가장 많이 관찰되어 폭로시간이 길어질수록 증가하는 경향을 보였으나 이와는 대조적으로 상비중격선의 선포 수는 1시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 가장 많았고 폭로시간이 길어질수록 감소하는 경향을 보였다. 또한 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군의 선포들은 위축되어 크기는 작아졌으며 일부 선포는 파괴되었다. 상피세포의 점액화 현상은 1, 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 약하게 나타났으며 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 현저하게 많이 관찰되었다. 상피내에 호중구들이 많이 관찰되었으며, 고유판에서도 림프구들이 많이 관찰되었고 혈관도 심하게 확장되어 있었다.</p><p>② \( 25 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>상피세포들의 섬모소실, 탈락 및 공포화는 모든 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 일어났으며 폭로 시간이 길어질수록 그 정도는 심하였고 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 상피의 편평화가 광범위하게 일어나고 세포사이의 경계가 불확실하였다. 배상세포의 수는 1, 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 대조군에 비해 감소하였으나 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 증가하는 경향을 보였다. 상피세포의 점액화 현상도 모든 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 모두 관찰되었는데 1시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 더 심하게 나타났다. 하비중격선 선포의 수는 폭로 시간이 길어질수록 증가하여 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 가장 많이 나타났다. 상비중격선의 선포의 수는 1, 6시간 폭로군에서는 대조군보다 증가하였으나 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 약간 감소한 경향을 보였다. 그러나 폭로 시간이 길어질수록 선포들은 크기가 작아지고 파괴가 삼하게 일어났다. 고유판에서는 혈관의 확장과 함께 림프구들이 많이 관찰되었다.</p><p>③ \( 50 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>상피세포를의 변화는 1시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에 비해 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 심하게 일어났는데 상피세포들의 키가 낮아지고 섬모소실, 탈락, 공포화 및 편평화가 심하게 나타났으며 세포사이의 경계가 불확실하였다. 상피세포의 점액화 현상도 현저하였다. 특히 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군의 상피세포 사이에 호중구들이 많이 관찰되었다. 배상세포의 수는 대조군에 비해 많이 감소하였고 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 가장 많이 관찰되었으나 점액질이 많이 배출되었으며 1, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 수가 현저하게 감소하였고 특히 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군의 상피내에 점액선이 관찰되었으며 남아있는 상피세포들도 거의 점액화 되었다. 하비중격선의 선포와 상비중격선의 선포의 수는 대조군에 비해 1시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 약간 감소하였으나 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 오히려 현저히 증가하였으며 선포의 형태는 위축되고, 파괴가 심하게 일어났다. 혈관 확장과 림프구의 침윤도 관찰되었다.</p><p>④ \( 100 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>상피층의 세포들은 1시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 대부분 세포들이 파괴, 탈락되어 원주상피세포의 형태는 관찰되지 않았으며 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 상피세포는 거의 편평화되어 있었다. 배상세포들도 1시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서만 소수가 남아있었으나 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 모두 소실되었고 괴사, 탈락된 상피세포들 사이에서 상피층에는 점액선이 곳곳에서 관찰되었다. 점막하선의 하비중격선의 선포들은 모든 \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 대조군보다 그 수가 현저히 감소하여 소수만 관찰되었으며 상비중격선의 선포는 대부분 소실되었다. 고유층과 확장된 혈관 내에서 림프구와 호중구들이 관찰되었다.</p><p>⑤ \( 200 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>상피세포들의 변화는 \( 100 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군보다 더 심하게 일어났으며 대부분의 상피들이 편평화되었으며 배상세포들은 1 시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서만 소수 관찰되었으며 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 대부분 소실되었고 그 외의 변화도 \( 100 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서와 유사하거나 더 심하게 일어났다.</p><h2>대조군 및 실험군의 점액질에 대한 조직화학적 성상</h2><p>대조군 및 실험군 비중격 호흡점막에 대한 PAS반응, AB \(\mathrm{pH} \ 2.5 \) 염색, AB \(\mathrm{pH}\ 1.0\)염색, AB \(\mathrm{pH} \ 2.5\) -PAS염색 및 AF \(\mathrm{pH} \ 1.7\) -AB \(\mathrm{pH}\ 2.5\) 염색의 결과는 Table 1 및 2에서 보는 바와 같다.</p><h3>(1) 대조군</h3><p>비중격 호흡상피의 배상세포는 중동량의 중성점액질, 중등량 또는 상당량의 sulfomucin을 함유하고 있었으며 여기에 일부 배상세포들은 nonsulfomucin (sialomucin)을 더 함유하고 있었다. 상 및 하비중격선들 중 상비중격선은 모든 조직화학적 염색에 염색성이 없었으나 하비중격선은 상당량의 중성점액질만을 함유하고 있었다.</p><h3>(2) 실험군</h3><p>① \( 10 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>배상세포의 중성점액질과 산성점액질 중 sialomucin이 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 현저히 증가하였고, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군의 일부 세포에서 약간 감소하는 경향을 보였다. 대조군에서 관찰되지 않던 상피내 점액화세포들은 중성점액질만을 함유하고 있었다. 하비중격선은 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군의 일부 선포의 중성점액질이 대조군에 비하여 약간 증가하였다.</p><p>② \( 10 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>배상세포와 점액화세포의 중성점액질과 산성점액질은 폭로 시간이 길어질수록 점차 감소하는 경향이 나타났으나 대조적으로 하비중격선의 선포의 중성점액질은 폭로시간이 길어져도 변화가 없었다.</p><p>③ \( 50 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>일부 배상세포의 중성점액질은 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 약간 감소하였으나 산성점액질은 1, 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 많이 증가하였고 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 감소하였는데 sulfomucin은 감소하는 반면 sialomucin은 증가하는 경향을 보였다. 점액화세포의 중성점액질은 \( 25 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군과 유사하였다. 하비중격선의 중성점액질은 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군의 일부 선포에서 약간 감소하였으나 대부분의 선포는 대조군과 유사하였다.</p><p>④ \( 100 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>배상세포 및 하비중격선의 중성점액질과 산성점액질은 폭로 시간이 길어질수록 현저히 감소하는 경향을 보였으나 일부 상피내 점액화세포의 중성점액질은 약간 증가하는 경향을 보였다.</p><p>⑤ \( 200 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군</p><p>\( 100 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군의 결과와 유사하였다.</p> <h1>요 약</h1><p>\( \mathrm{SO}_{2} \)가 흰쥐 호흡기의 비강점막에 미치는 형태적인 변화 및 내적 환경인자인 glycoconjugates에 미치는 영향을 구명할 목적으로 \( 200 \sim 250 \mathrm{~g} \)의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하여 대조군과 \( \mathrm{SO}_{2} \) 실험군으로 나누어 \(\mathrm{SO}_{2} \) 실험군은 \(10 \mathrm{ppm}\), \(25 \mathrm{ppm}\), \(50 \mathrm{ppm}\), \(100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm} \)군으로 나누고 각 군은 다시 1시간, 3시간 및 6시간 폭로군으로 나누어 \( \mathrm{SO}_{2} \) 농도별 및 시간별로 미치는 영향을 대조군과 비교하였다. 형태적인 변화는 \( \mathrm{H}-\mathrm{E} \) 및 PAS염색으로 관찰하였고, 점액질 변화는PAS, AB\( \mathrm{pH}\ 2.5\), AB \(mathrm{ pH}\ 2.5\)-PAS, AB \( \mathrm{pH}\ 1.0 \) 및 AF \(\mathrm{pH}\ 1.7\) -AB \(\mathrm{pH}\ 2.5 \) 염색 등으로 관찰하였다.</p><p>비강호흡상피들은 대조군에 비해 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 정도의 차이는 있었지만 섬모소실, 상피세포의 탈락, 배상세포의 공포화, 상피세포의 편평화 및 상피세포의 점액화 등은 \( \mathrm{SO}_{2} \) 농도가 높아지고 폭로 시간이 길어질수록 광범위하게 나타났으며 상피세포의 점액화는 \( 50 \mathrm{ppm} \) \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 가장 현저하였다. 배상세포 및 비중격선의 선포 수는 폭로시간에 따라 정도의 차이는 있지만 저농도인 \( 25 \mathrm{ppm} \) 및 \( 50 \mathrm{ppm} \) \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 현저히 증가하는 반면 고농도인 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm} \) \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 현저히 감소하거나 대부분 소실되는 경향이 나타났다. 대조군에서 관찰되지 않았던 상피내 점액선이 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm}\) 1시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 더 현저하게 관찰되었다. \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군 비중격 상피 배상세포의 중성점액질은 \( 10 \mathrm{ppm}\) 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 대조군에 비해 많이 증가하였고 그 외의 실험군에서는 대조군에 비해 대부분의 세포에서 감소하거나 소실되었으며 대조군에서 나타나지 않던 점액화된 상피세포들은 모든 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 중성점액질만을 함유하고 있었으며 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm}\) \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 그 양이 감소하는 경향을 나타내었다. 산성점액질의 양은 \( 10 \mathrm{ppm} \) 및 \( 50 \mathrm{ppm} \) 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 대조군에 비하여 많이 증가하였으나 그 외 대부분의 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 현저히 감소하거나 소실되었다. 대조군에 비해 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 강 sulfomucin은 감소하는 경향을 나타내었고 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm}\) \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 강 sulfomucin은 소실되었으나 sialomucin은 대조군에 비해 증가하는 경향을 보였다. 하비중격선의 중성점액질 양은 대조군에 비해 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 감소하는 경항을 나타내었으며 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm}\) \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 그 감소가 아주 현저하여 대부분의 선포들에서 중성점액질이 소실되었다.</p><p>이상의 결과로 보아 \( \mathrm{SO}_{2} \)는 비강에 심대한 병리조직학적 변화뿐만 아니라 점액질 대사에 심대한 영향을 미쳐 심한 병변을 야기시킴을 알 수 있었다. 전반적으로 \( \mathrm{SO}_{2} \)의 호흡기 영향은 고농도로 갈수록 심한 영향을 미쳤으며 저농도에서도 폭로 시간이 길어짐에 따라 나타나는 \( \mathrm{SO}_{2} \)의 영향이 고농도와 유사한 경향을 나타내며 또한 모든 \( \mathrm{SO}_{2} \)의 농도를 비교해보면 폭로 시간이 길어질수록 그 영향이 더 심하게 나타났다.</p> <h1>고 찰</h1><p>\( \mathrm{SO}_{2} \)는 주로 석탄이나 석유의 연소시, 그리고 화학공업의 공정 중에 많이 발생하는 전형적인 자극성 가스로서 대기오염의 주원인이며 저농도(\( 0.1 \mathrm{ppm} \)이하)에서라도 장기간 노출되면 만성기관지염과 폐쇄성 호흡기 질환의 발병률이 증가하고, 1952년에 발생한 London smog사건을 비롯한 금세기 세계 도처에서 발생했던 대기오염에 의한 상기도 및 폐질환의 많은 예가 \( \mathrm{SO}_{2} \)의 농도와 피해의 빈도가 정비례하였다는 것도 역학적으로 실증되고 있다. 또한 만성적인 점액 및 객담의 과분비, 기도의 폐쇄, 기도의 염증 등을 특징으로 하는 사람의 만성기관지염을 유발하는 모델 물질로 이용된다. 비강은 후각기능 외에 하부기도로 가는 공기의 습도와 온도를 조절하며 물에 용해되는 가스와 기체 및 입자의 흡수장소가 되고 흡입되는 이물질을 제거하는 역할을 한다고 하였다.</p><p>정상 흰쥐 비강의 호흡상피는 위중층섬모원주상피로 덮여 있으며 섬모세포와 배상세포 및 기저세포들이 나타나며 고유층에는 점막하선인 장액선이 나타난다. 본 연구의 대조군 흰쥐 비강점막도 위의 선행연구들의 결과와 같이 위중층섬모원주상피로 되어있었으며 섬모세포, 배상세포 및 기저세포들이 관찰되었고 고유층에는 장액선이 나타났다.</p><p>\( \mathrm{SO}_{2} \)가 동물의 비강에 미치는 연구로 Lamb과 Reid 및 이종권은 흰쥐에, Giddens와 Fairchild, 홍인표와 김무강 및 Min들은 생쥐에, Greene들 및 Takenaka들은 개(beagle dog)에 대한 연구를 하였는데 동물의 종류, \( \mathrm{SO}_{2} \) 농도, 폭로 시간 및 폭로방법은 다르지만 비강에 미치는 형태적인 변화는 대체로 상피세포의 섬모 소실, 탕락, 괴사 그리고 편평화등이 나타나며 또한 점액층의 비후, 분비물질의 증가 및 배상세포 수의 일시적인 증가 및 염증성 반응이 나타난다고 하였다. 본 연구에서 비강 호흡상피들은 대조군에 비해 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 정도의 차이는 있었지만 저농도에서는 상피세포의 섬모소실, 공포 변성과 탈락이 약하게 일어났으나 고농도에서는 광범위하게 나타났으며 상피의 편평화는 저농도에서는 폭로시간이 길수록, 고농도에서는 모든 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 관찰되었으며 배상세포 및 비중격선의 선포 수는 폭로시간에 따라 정도의 차이는 있지만 저농도인 \( 25 \mathrm{ppm} \) 및 \( 50 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 현저히 증가하는 반면 고농도인 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm} \) \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 현저히 감소하거나 대부분 소실되는 경향이 나타났는데 이와 같은 결과 중 호흡상피 세포의 변화는 동물의 종류와 \( \mathrm{SO}_{2} \)의 폭로방법에는 차이가 있었지만 Giddens와 Fairchild, 홍인표와 김무강 및 Takenaka들의 연구결과와 일치하거나 유사하였다. 또한 \( 50 \mathrm{ppm} \) 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군과 \( 100 \mathrm{ppm} \) 3, 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군 및 \( 200 \mathrm{ppm} \) 1시간 \(\mathrm{SO}_{2} \) 폭로군의 상피층 내에서는 대조군에서 관찰되지 않던 점액선이 나타나 위의 보고와 차이가 있었으며 상피세포의 점액화가 더 뚜렷하게 나타난 것이 특이하였다.</p><p>Ballenger들 및 Sleigh는 점액섬모의 세정작용에는 점액세포의 점액선으로부터 분비되는 점액과 섬모세포의 섬모가 필수적이며 점액층과 섬모 사이에는 수분층인 섬모외층(periciliary layer)이 있어 효과적인 섬모의 세정작용을 유지시킨다고 하였으며 효과적인 세정작용은 일어나지 못하면 오염물질 혹은 감염원이 호흡기 점막에 머물게 되어 호흡기 질환을 유발하게 되며 유해물질이 호흡기 접막에 작용하게 되면 점막 상피세포내의 미세구조의 변화를 초래하게 되며 이들은 가역적인 변화를 거쳐 자극이 계속되면 비가역적 변화를 일으켜 결국 세포의 괴사를 초래하게 되는데 세포막의 손상, 공포의 형성, 섬모복합체(com-pound cilia)의 형성, 미토콘드리아의 팽창들은 비가역적인 병변을 의미한다고 하였다. 본 연구의 비강점막의 조직학적 구조의 변화는 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로가 위의 Trump와 Jones 및 Wanner의 보고처럼 \( \mathrm{SO}_{2} \)가 독성물질로 작용하여 가역적 및 비가역적인 영향을 미치는 것으로 사료된다.</p><p>정상 흰쥐 비강점막의 점액질에 관한 연구로 Pastor들은 흰쥐의 배상세포는 상당량의 중성점액질과 중등량의 산성점액질을 함유하고 배부 중격선은 소량의 중성점액질만을 함유하나 복부중격선은 중등량의 중성점액질만 함유한다고 하였다. 호흡점막의 배상세포는 상당량의 중성점액질과 중등량의 산성점액질을 함유하고 있다고 하였다. Taylor는 흰쥐의 전반부(anterior portion) 점막의 배상세포과 비중격선들은 PAS-양성반응을 나타내며 후반부의 선은 대부분은 PAS-음성반응을 나타내고 PAS-양성반응 선들의 핵은 규칙적으로 놓여 있으나 PAS-음성반응을 나타내는 선에서보다는 세포의 기저 쪽으로 더 가까이 놓여 있다고 하였다. Katz들은 흰쥐 비중격 점막의 상피와 선의 분포에 관한 연구에서 호흡부의 선은 PAS-음성선포와 PAS-양성선포로 구별된다고 하였으며, Bojsen -MØller는 호흡부의 선을 장액선포와 PAS-음성으로 구별된다고 하였다. 김창규들은 성장 중인 흰쥐의 비점막 분비조직에서 출생 직전에는 주로 중성당단백질을 함유하는 배상세포가 존재하다가 출생 후부터는 산성당단백질을 함유하는 분비세포의 수가 많이 증가한다고 하였다. 본 연구에서 대조군 흰쥐의 비중격 호흡점막의 배상세포는 중등량의 중성점액질과 중등량 또는 상당량의 sulfomucin을 함유하고 있었으며 일부 배상 세포들은 sialomucin을 더 함유하고 있었다. 점막하선 중 하비중격선은 상당량의 중성점액질만을 함유하였으나 상비중격선은 점액질은 함유하고 있지 않았다. 이러한 결과 중 배상세포의 점액질에 대한 연구 결과는 Pastor들 및 김창규들의 결과와 일치하였고 비중격선에 관한 결과는 Taylor 및 Katz들과 거의 일치하였으나 Pastor들 및 Bojsen-MØller의 연구보고들과는 상비중격선에서 차이가 있었으며 더 추시해 보아야 할 것으로 사료된다.</p><p>비강의 점액질은 독성물질이나 감염으로부터 점막을 보호하고, 건조를 막아준다.</p><p>호흡 상피와 후각상피의 비강 분비물은 정상 또는 병리적인 상태에서 비강 생리작용에 중요한 역할을 하며, 점액질은 주로 점액의 점성에 관계하며 기계적 상해에 대해 아래에 놓인 상피를 보호하고 미생물이나 박테리아, 독소의 통과에 방어적인 역할을 한다. Theate들은 사람의 비강점막을 이용하여 형태학 및 조직화학적 연구를 시행한 결과 비 알레르기나 만성 염증성 질환을 않고 있는 환자에서 호흡상피내의 장액세포가 점액세포로 대치되는 조직학적 변화를 관찰하였고, Fabricant는 비강내 질환시 나타나는 중성과 산성점액질 분비량의 변화는 콧물의 산성도를 조절하여 이차적으로 섬모 활성도를 저하시키고 또한 조직 내에서 중성 ◦ 산성점액질의 구성비가 변함에 따라서 점막의 산성도가 달라져 일부 질환에 대한 감수성이 변한다고 하였다. Gallagher들은 배상세포는 외부기류 차단과 같은 환경적인 변화에서 민감하게 변화를 일으킴으로써 적응과 방어면에서 일차적인 기능을 담당하고 있음을 고려하면 중성점액질 보다는 산성점액질 중 sulfomu-cin이 이러한 생리적 기능과 밀접한 관계가 있다고 하였다. 본 연구의 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군의 호흡점막 배상세포의 중성점액질은 \( 10 \mathrm{ppm} \) 3시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 대조군에 비해 많이 증가하였고 그 외의 실험군에서는 대조군에 비해 대부분의 세포에서 감소하거나 소실되었으며 대조군에서 나타나지 않던 상피내 점액화세포들은 모든 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 중성점액질만을 함유하고 있었으며 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm} \) \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 그 양이 감소하는 경향을 나타내었다. 산성점액질의 양은 \( 10 \mathrm{ppm} \) 및 \( 50 \mathrm{ppm} \) 3시간 폭로군에서는 대조군에 비하여 많이 증가하였으나 \( 10 \mathrm{ppm} \), \( 25 \mathrm{ppm} \) 및 \( 50 \mathrm{ppm} \) 6시간 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군 그리고 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm} \) 모든 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서는 현저히 감소하거나 소실되었다. 대조군에 비해 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 강 sulfomucin은 감소하는 경향을 나타내었으나 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm} \) \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 강 sulfomucin은 소실되었으나 sialomucin은 대조군에 비해 증가하는 경향을 보였다. 하비중격선의 중성점액질 양은 대조군에 비해 \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 감소하는 경향을 나타내었으며 \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm} \) \( \mathrm{SO}_{2} \) 폭로군에서 그 감소가 아주 현저하여 대부분의 선포들에서 중성점액질이 소실되었다. 본 연구의 이와 같은 결과는 \( \mathrm{SO}_{2} \)는 비강의 내적 환경에 유해한 인자로 작용하여 비강점막에 심한 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. \( \mathrm{SO}_{2} \)의 농도와 폭로시간에 따라 점액질의 증가 후 감소되는 현상과 sialomucin의 증가와 같은 점액질의 성상 변화 비록 독성 물질의 종류와 기관은 달라도 Fabricant 및 Gallagher들의 결과와 유사하였다. 배상세포들은 물리 화학적 자극에 대해 민감하며, 또한 자극물질의 종류에 따라 점액분비가 증감되고 점액질의 성상변화가 정상과 비정상조직의 주요한 구분요인이 되며, sulfomucin과 sialomucin의 동태가 매우 중요함을 알 수 있었으며, 또한 생체 방어기작에 점액질이 적극적으로 관여하는 것으로 사료된다.</p> <h1>연구재료 및 방법</h1><h2>실험 동물의 사육 및 처치</h2><h3>실험 동물의 사육</h3><p>실험 동물은 자유 급식법으로 사육한 체중 \( 200 \sim 250 \mathrm{~g} \)의 성숙한 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 예비 실험군에 10마리, 대조군에 3마리, 실험군에 45마리를 배정하여 사용하였다.</p><h3>폭로 방법</h3><p>폭로 장치는 투명한 아크릴로 만든 \( 100 \times 50 \times 40 \mathrm{~cm} \) 크기의 gas chamber속에 3마리씩의 흰쥐를 넣어 밀폐한 다음 흰쥐의 분당 환기량 \( (72.9 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \). \( / \mathrm{head}) \)을 기준으로 하여 확산 펌프로 gas chamber내에 일정 농도의 \( \mathrm{SO}_{2} \)를 충만 시키는 동시에 반대편에서는 흡입 펌프로 주입량 만큼 배출시킴으로써 gas chamber내에는 항상 일정 농도가 유지되도록 하였으며 30분마다 \( \mathrm{SO}_{2} \) 검지관(Kitakawa제, 일본)으로 측정하여 \( \mathrm{SO}_{2} \) 부족량을 계속 보충하여 일정한 농도가 유지되게 하였다. \( \mathrm{SO}_{2} \) 는 시중에서 판매되는 순도 \(99.9\%\)의 \( \mathrm{SO}_{2} \) (동진무역 종합가스제)를 사용하였다.</p><p>\( \mathrm{SO}_{2} \) 농도별, 폭로 시간별로 비강에 미치는 영향을 조직화학적으로 점사하기 위하여 \( 10 \mathrm{ppm}, 25 \mathrm{ppm}, 50 \mathrm{ppm} \), \( 100 \mathrm{ppm} \) 및 \( 200 \mathrm{ppm} \) 농도의 \( \mathrm{SO}_{2} \)에 흰쥐를 각각 1시간 폭로군, 3시간 폭로군 및 6시간 폭로군으로 나누어 gas cham-ber 속에서 폭로시켰다. 대조군은 수컷 흰쥐 3마리를 \( \mathrm{SO}_{2} \)를 주입하지 않은 gas chamber 속에 6시간 동안 처리하여 실험에 사용하였다.</p><h2>조직학적 구조</h2><p>대조군과 실험군의 흰쥐를 에테르로 마취시켜 비강은 하악을 제거한 두부에서 눈, 피부 및 주위 근육조직 제거한 후 중성포르말린에 고정하고 이온 교환 수지법(ion-exchange resin method)으로 탈회한 후 절치 유두(in-cisive papilla) 앞에서 첫 번째 구개 융기(first palate ridge)까지의 부위(level I)를 횡단(transverse section) 하였다. 탈회한 비강을 중성포르말린에 고정하여 수세와 각급 알콜에 탈수과정을 거쳐 paraplast (융점 \( \left.56^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에 포매하였으며 포매된 조직을 \( 5 \sim 6 \mu \mathrm{m} \)의 두께로 연속 절편을 만든 후 조직학적 구조를 H-E염색과 PAS반응법으로 염색한 후 관찰하였다.</p><h2>점액질의 조직화학</h2><p>대조군과 실험군에서 중성점액질의 검색은 PAS반응법을, 산성점액질의 검색은 AB pH 2.5염색법을, 산성점액질과 중성점액질의 조성검색은 AB pH 2.5-PAS염색법을, 산성점액질 중 sulfomucin의 검색은 AB pH 1.0염색법을, 그리고 산성점액질 중 sulfomucin과 sia-lomucin의 조성검색은 AF pH 1.7-AB pH 2.5엽색법을 사용하였다. 점액질에 대한 조직화학적 판정 기준온 청색은 B (blue), 적색은 R (red), 자색은 P (purple), 청자색은 BP (bluish purple), 적자색은 RP (reddish purple)으로 표시하였고 염색성의 등급은 염색된 정도에 따라 염색성이 없는 경우는 0 , 흔적적인 경우는 \( \pm \), 약한 염색성은 1, 중등도 염색성은 2 , 강한 염색성은 3 , 매우 강한 염색성은 4로 나누어 표시하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>결 과</h1><h2>\\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로시의 외형적 소견</h2><p>\\( \\mathrm{SO}_{2} \\)에 폭로된 흰쥐는 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로 후 즉시 눈과 외비공을 앞발로 비볐으며 외비공은 콧물로 인하여 습윤하였으며 가만히 있지 않고 계속 움직이며, 심한 호홉곤란과 침울 증상을 보이다가 폭로 시간이 경과함에 따라 활동을 거의 멈추고 gas chamber의 한쪽 모서리에 집단적으로 모여 코를 복부 쪽으로 묻고 웅크리고 앉아 약한 호흡만 하였다.", "</p><h2>대조군 및 실험군의 조직학적 소견</h2><h3>(1) 대조군</h3><p>비강 호흡점막상피는 위중층섬모원주상피(psuedostratified ciliated columnar epithelium)로 되어 있었으며, 세포의 표면에는 많은 섬모(cilia)가 일정한 크기로 규칙적으로 배열되어 있었다.", "점액질을 분비하는 배상세포(goblet cell)들은 섬모원주세포들 사이에 나타났으며 키가 큰 상피세포와 배상세포들의 핵은 길쭉한 타원형의 모양을 하고 있었다.", "호흡상피의 기저부에 있는 기저세포(basal cell)들의 핵은 타원형 또는 길쪽한 삼각형을 하고 있었다.", "점막하조직에는 점막하선이 나타났으며 장액선포(serous acinus)들로 되어 있었으며 하비중격선의 장액선포들은 PAS 양성물질을 가지고 있었으나 상비중격선의 장액선포들에서는 PAS 양성물질이 나타나지 않았다.", "하비중격선의 선포들은 핵이 규칙적이며 상비중격선의 선포들보다 더 기저쪽에 놓여 있었다.", "상피세포 사이에는 림프구들도 관찰되었다.", "</p><h3>(2) 실험군</h3><p>① \\( 10 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>상피세포의 섬모소실과 탈락이 1시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 약하게 나타났으나 폭로 시간이 길어질수록 심하여졌으며 특히 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 상피세포사이의 경계가 불확실하였으며 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 편평화도 관찰되었다.", "배상세포의 수가 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 대조군에 비해 많이 증가하였으나 1시간 폭로군은 대조군과 유사하였고 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 거의 소실되었다.", "PAS 양성 반응을 나타내는 하비중격선의 선포 수는 1시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 대조군에 비하여 감소하였으나 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 가장 많이 관찰되어 폭로시간이 길어질수록 증가하는 경향을 보였으나 이와는 대조적으로 상비중격선의 선포 수는 1시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 가장 많았고 폭로시간이 길어질수록 감소하는 경향을 보였다.", "또한 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군의 선포들은 위축되어 크기는 작아졌으며 일부 선포는 파괴되었다.", "상피세포의 점액화 현상은 1, 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 약하게 나타났으며 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 현저하게 많이 관찰되었다.", "상피내에 호중구들이 많이 관찰되었으며, 고유판에서도 림프구들이 많이 관찰되었고 혈관도 심하게 확장되어 있었다.", "</p><p>② \\( 25 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>상피세포들의 섬모소실, 탈락 및 공포화는 모든 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 일어났으며 폭로 시간이 길어질수록 그 정도는 심하였고 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 상피의 편평화가 광범위하게 일어나고 세포사이의 경계가 불확실하였다.", "배상세포의 수는 1, 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 대조군에 비해 감소하였으나 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 증가하는 경향을 보였다.", "상피세포의 점액화 현상도 모든 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 모두 관찰되었는데 1시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 더 심하게 나타났다.", "하비중격선 선포의 수는 폭로 시간이 길어질수록 증가하여 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 가장 많이 나타났다.", "상비중격선의 선포의 수는 1, 6시간 폭로군에서는 대조군보다 증가하였으나 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 약간 감소한 경향을 보였다.", "그러나 폭로 시간이 길어질수록 선포들은 크기가 작아지고 파괴가 삼하게 일어났다.", "고유판에서는 혈관의 확장과 함께 림프구들이 많이 관찰되었다.", "</p><p>③ \\( 50 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>상피세포를의 변화는 1시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에 비해 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 심하게 일어났는데 상피세포들의 키가 낮아지고 섬모소실, 탈락, 공포화 및 편평화가 심하게 나타났으며 세포사이의 경계가 불확실하였다.", "상피세포의 점액화 현상도 현저하였다.", "특히 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군의 상피세포 사이에 호중구들이 많이 관찰되었다.", "배상세포의 수는 대조군에 비해 많이 감소하였고 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 가장 많이 관찰되었으나 점액질이 많이 배출되었으며 1, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 수가 현저하게 감소하였고 특히 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군의 상피내에 점액선이 관찰되었으며 남아있는 상피세포들도 거의 점액화 되었다.", "하비중격선의 선포와 상비중격선의 선포의 수는 대조군에 비해 1시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 약간 감소하였으나 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 오히려 현저히 증가하였으며 선포의 형태는 위축되고, 파괴가 심하게 일어났다.", "혈관 확장과 림프구의 침윤도 관찰되었다.", "</p><p>④ \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>상피층의 세포들은 1시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 대부분 세포들이 파괴, 탈락되어 원주상피세포의 형태는 관찰되지 않았으며 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 상피세포는 거의 편평화되어 있었다.", "배상세포들도 1시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서만 소수가 남아있었으나 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 모두 소실되었고 괴사, 탈락된 상피세포들 사이에서 상피층에는 점액선이 곳곳에서 관찰되었다.", "점막하선의 하비중격선의 선포들은 모든 \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 대조군보다 그 수가 현저히 감소하여 소수만 관찰되었으며 상비중격선의 선포는 대부분 소실되었다.", "고유층과 확장된 혈관 내에서 림프구와 호중구들이 관찰되었다.", "</p><p>⑤ \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>상피세포들의 변화는 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군보다 더 심하게 일어났으며 대부분의 상피들이 편평화되었으며 배상세포들은 1 시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서만 소수 관찰되었으며 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 대부분 소실되었고 그 외의 변화도 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서와 유사하거나 더 심하게 일어났다.", "</p><h2>대조군 및 실험군의 점액질에 대한 조직화학적 성상</h2><p>대조군 및 실험군 비중격 호흡점막에 대한 PAS반응, AB \\(\\mathrm{pH} \\ 2.5 \\) 염색, AB \\(\\mathrm{pH}\\ 1.0\\)염색, AB \\(\\mathrm{pH} \\ 2.5\\) -PAS염색 및 AF \\(\\mathrm{pH} \\ 1.7\\) -AB \\(\\mathrm{pH}\\ 2.5\\) 염색의 결과는 Table 1 및 2에서 보는 바와 같다.", "</p><h3>(1) 대조군</h3><p>비중격 호흡상피의 배상세포는 중동량의 중성점액질, 중등량 또는 상당량의 sulfomucin을 함유하고 있었으며 여기에 일부 배상세포들은 nonsulfomucin (sialomucin)을 더 함유하고 있었다.", "상 및 하비중격선들 중 상비중격선은 모든 조직화학적 염색에 염색성이 없었으나 하비중격선은 상당량의 중성점액질만을 함유하고 있었다.", "</p><h3>(2) 실험군</h3><p>① \\( 10 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>배상세포의 중성점액질과 산성점액질 중 sialomucin이 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 현저히 증가하였고, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군의 일부 세포에서 약간 감소하는 경향을 보였다.", "대조군에서 관찰되지 않던 상피내 점액화세포들은 중성점액질만을 함유하고 있었다.", "하비중격선은 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군의 일부 선포의 중성점액질이 대조군에 비하여 약간 증가하였다.", "</p><p>② \\( 10 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>배상세포와 점액화세포의 중성점액질과 산성점액질은 폭로 시간이 길어질수록 점차 감소하는 경향이 나타났으나 대조적으로 하비중격선의 선포의 중성점액질은 폭로시간이 길어져도 변화가 없었다.", "</p><p>③ \\( 50 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>일부 배상세포의 중성점액질은 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 약간 감소하였으나 산성점액질은 1, 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 많이 증가하였고 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 감소하였는데 sulfomucin은 감소하는 반면 sialomucin은 증가하는 경향을 보였다.", "점액화세포의 중성점액질은 \\( 25 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군과 유사하였다.", "하비중격선의 중성점액질은 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군의 일부 선포에서 약간 감소하였으나 대부분의 선포는 대조군과 유사하였다.", "</p><p>④ \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>배상세포 및 하비중격선의 중성점액질과 산성점액질은 폭로 시간이 길어질수록 현저히 감소하는 경향을 보였으나 일부 상피내 점액화세포의 중성점액질은 약간 증가하는 경향을 보였다.", "</p><p>⑤ \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군</p><p>\\( 100 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군의 결과와 유사하였다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>\\( \\mathrm{SO}_{2} \\)가 흰쥐 호흡기의 비강점막에 미치는 형태적인 변화 및 내적 환경인자인 glycoconjugates에 미치는 영향을 구명할 목적으로 \\( 200 \\sim 250 \\mathrm{~g} \\)의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하여 대조군과 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 실험군으로 나누어 \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 실험군은 \\(10 \\mathrm{ppm}\\), \\(25 \\mathrm{ppm}\\), \\(50 \\mathrm{ppm}\\), \\(100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\)군으로 나누고 각 군은 다시 1시간, 3시간 및 6시간 폭로군으로 나누어 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 농도별 및 시간별로 미치는 영향을 대조군과 비교하였다.", "형태적인 변화는 \\( \\mathrm{H}-\\mathrm{E} \\) 및 PAS염색으로 관찰하였고, 점액질 변화는PAS, AB\\( \\mathrm{pH}\\ 2.5\\), AB \\(mathrm{ pH}\\ 2.5\\)-PAS, AB \\( \\mathrm{pH}\\ 1.0 \\) 및 AF \\(\\mathrm{pH}\\ 1.7\\) -AB \\(\\mathrm{pH}\\ 2.5 \\) 염색 등으로 관찰하였다.", "</p><p>비강호흡상피들은 대조군에 비해 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 정도의 차이는 있었지만 섬모소실, 상피세포의 탈락, 배상세포의 공포화, 상피세포의 편평화 및 상피세포의 점액화 등은 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 농도가 높아지고 폭로 시간이 길어질수록 광범위하게 나타났으며 상피세포의 점액화는 \\( 50 \\mathrm{ppm} \\) \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 가장 현저하였다.", "배상세포 및 비중격선의 선포 수는 폭로시간에 따라 정도의 차이는 있지만 저농도인 \\( 25 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 50 \\mathrm{ppm} \\) \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 현저히 증가하는 반면 고농도인 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 현저히 감소하거나 대부분 소실되는 경향이 나타났다.", "대조군에서 관찰되지 않았던 상피내 점액선이 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm}\\) 1시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 더 현저하게 관찰되었다. \\", "( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군 비중격 상피 배상세포의 중성점액질은 \\( 10 \\mathrm{ppm}\\) 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 대조군에 비해 많이 증가하였고 그 외의 실험군에서는 대조군에 비해 대부분의 세포에서 감소하거나 소실되었으며 대조군에서 나타나지 않던 점액화된 상피세포들은 모든 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 중성점액질만을 함유하고 있었으며 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm}\\) \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 그 양이 감소하는 경향을 나타내었다.", "산성점액질의 양은 \\( 10 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 50 \\mathrm{ppm} \\) 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 대조군에 비하여 많이 증가하였으나 그 외 대부분의 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 현저히 감소하거나 소실되었다.", "대조군에 비해 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 강 sulfomucin은 감소하는 경향을 나타내었고 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm}\\) \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 강 sulfomucin은 소실되었으나 sialomucin은 대조군에 비해 증가하는 경향을 보였다.", "하비중격선의 중성점액질 양은 대조군에 비해 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 감소하는 경항을 나타내었으며 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm}\\) \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 그 감소가 아주 현저하여 대부분의 선포들에서 중성점액질이 소실되었다.", "</p><p>이상의 결과로 보아 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)는 비강에 심대한 병리조직학적 변화뿐만 아니라 점액질 대사에 심대한 영향을 미쳐 심한 병변을 야기시킴을 알 수 있었다.", "전반적으로 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)의 호흡기 영향은 고농도로 갈수록 심한 영향을 미쳤으며 저농도에서도 폭로 시간이 길어짐에 따라 나타나는 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)의 영향이 고농도와 유사한 경향을 나타내며 또한 모든 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)의 농도를 비교해보면 폭로 시간이 길어질수록 그 영향이 더 심하게 나타났다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>\\( \\mathrm{SO}_{2} \\)는 주로 석탄이나 석유의 연소시, 그리고 화학공업의 공정 중에 많이 발생하는 전형적인 자극성 가스로서 대기오염의 주원인이며 저농도(\\( 0.1 \\mathrm{ppm} \\)이하)에서라도 장기간 노출되면 만성기관지염과 폐쇄성 호흡기 질환의 발병률이 증가하고, 1952년에 발생한 London smog사건을 비롯한 금세기 세계 도처에서 발생했던 대기오염에 의한 상기도 및 폐질환의 많은 예가 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)의 농도와 피해의 빈도가 정비례하였다는 것도 역학적으로 실증되고 있다.", "또한 만성적인 점액 및 객담의 과분비, 기도의 폐쇄, 기도의 염증 등을 특징으로 하는 사람의 만성기관지염을 유발하는 모델 물질로 이용된다.", "비강은 후각기능 외에 하부기도로 가는 공기의 습도와 온도를 조절하며 물에 용해되는 가스와 기체 및 입자의 흡수장소가 되고 흡입되는 이물질을 제거하는 역할을 한다고 하였다.", "</p><p>정상 흰쥐 비강의 호흡상피는 위중층섬모원주상피로 덮여 있으며 섬모세포와 배상세포 및 기저세포들이 나타나며 고유층에는 점막하선인 장액선이 나타난다.", "본 연구의 대조군 흰쥐 비강점막도 위의 선행연구들의 결과와 같이 위중층섬모원주상피로 되어있었으며 섬모세포, 배상세포 및 기저세포들이 관찰되었고 고유층에는 장액선이 나타났다.", "</p><p>\\( \\mathrm{SO}_{2} \\)가 동물의 비강에 미치는 연구로 Lamb과 Reid 및 이종권은 흰쥐에, Giddens와 Fairchild, 홍인표와 김무강 및 Min들은 생쥐에, Greene들 및 Takenaka들은 개(beagle dog)에 대한 연구를 하였는데 동물의 종류, \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 농도, 폭로 시간 및 폭로방법은 다르지만 비강에 미치는 형태적인 변화는 대체로 상피세포의 섬모 소실, 탕락, 괴사 그리고 편평화등이 나타나며 또한 점액층의 비후, 분비물질의 증가 및 배상세포 수의 일시적인 증가 및 염증성 반응이 나타난다고 하였다.", "본 연구에서 비강 호흡상피들은 대조군에 비해 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 정도의 차이는 있었지만 저농도에서는 상피세포의 섬모소실, 공포 변성과 탈락이 약하게 일어났으나 고농도에서는 광범위하게 나타났으며 상피의 편평화는 저농도에서는 폭로시간이 길수록, 고농도에서는 모든 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 관찰되었으며 배상세포 및 비중격선의 선포 수는 폭로시간에 따라 정도의 차이는 있지만 저농도인 \\( 25 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 50 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 현저히 증가하는 반면 고농도인 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 현저히 감소하거나 대부분 소실되는 경향이 나타났는데 이와 같은 결과 중 호흡상피 세포의 변화는 동물의 종류와 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)의 폭로방법에는 차이가 있었지만 Giddens와 Fairchild, 홍인표와 김무강 및 Takenaka들의 연구결과와 일치하거나 유사하였다.", "또한 \\( 50 \\mathrm{ppm} \\) 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군과 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 3, 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군", "및 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 1시간 \\(\\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군의 상피층 내에서는 대조군에서 관찰되지 않던 점액선이 나타나 위의 보고와 차이가 있었으며 상피세포의 점액화가 더 뚜렷하게 나타난 것이 특이하였다.", "</p><p>Ballenger들 및 Sleigh는 점액섬모의 세정작용에는 점액세포의 점액선으로부터 분비되는 점액과 섬모세포의 섬모가 필수적이며 점액층과 섬모 사이에는 수분층인 섬모외층(periciliary layer)이 있어 효과적인 섬모의 세정작용을 유지시킨다고 하였으며 효과적인 세정작용은 일어나지 못하면 오염물질 혹은 감염원이 호흡기 점막에 머물게 되어 호흡기 질환을 유발하게 되며 유해물질이 호흡기 접막에 작용하게 되면 점막 상피세포내의 미세구조의 변화를 초래하게 되며 이들은 가역적인 변화를 거쳐 자극이 계속되면 비가역적 변화를 일으켜 결국 세포의 괴사를 초래하게 되는데 세포막의 손상, 공포의 형성, 섬모복합체(com-pound cilia)의 형성, 미토콘드리아의 팽창들은 비가역적인 병변을 의미한다고 하였다.", "본 연구의 비강점막의 조직학적 구조의 변화는 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로가 위의 Trump와 Jones 및 Wanner의 보고처럼 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)가 독성물질로 작용하여 가역적 및 비가역적인 영향을 미치는 것으로 사료된다.", "</p><p>정상 흰쥐 비강점막의 점액질에 관한 연구로 Pastor들은 흰쥐의 배상세포는 상당량의 중성점액질과 중등량의 산성점액질을 함유하고 배부 중격선은 소량의 중성점액질만을 함유하나 복부중격선은 중등량의 중성점액질만 함유한다고 하였다.", "호흡점막의 배상세포는 상당량의 중성점액질과 중등량의 산성점액질을 함유하고 있다고 하였다.", "Taylor는 흰쥐의 전반부(anterior portion) 점막의 배상세포과 비중격선들은 PAS-양성반응을 나타내며 후반부의 선은 대부분은 PAS-음성반응을 나타내고 PAS-양성반응 선들의 핵은 규칙적으로 놓여 있으나 PAS-음성반응을 나타내는 선에서보다는 세포의 기저 쪽으로 더 가까이 놓여 있다고 하였다.", "Katz들은 흰쥐 비중격 점막의 상피와 선의 분포에 관한 연구에서 호흡부의 선은 PAS-음성선포와 PAS-양성선포로 구별된다고 하였으며, Bojsen -MØller는 호흡부의 선을 장액선포와 PAS-음성으로 구별된다고 하였다.", "김창규들은 성장 중인 흰쥐의 비점막 분비조직에서 출생 직전에는 주로 중성당단백질을 함유하는 배상세포가 존재하다가 출생 후부터는 산성당단백질을 함유하는 분비세포의 수가 많이 증가한다고 하였다.", "본 연구에서 대조군 흰쥐의 비중격 호흡점막의 배상세포는 중등량의 중성점액질과 중등량 또는 상당량의 sulfomucin을 함유하고 있었으며 일부 배상 세포들은 sialomucin을 더 함유하고 있었다.", "점막하선 중 하비중격선은 상당량의 중성점액질만을 함유하였으나 상비중격선은 점액질은 함유하고 있지 않았다.", "이러한 결과 중 배상세포의 점액질에 대한 연구 결과는 Pastor들 및 김창규들의 결과와 일치하였고 비중격선에 관한 결과는 Taylor 및 Katz들과 거의 일치하였으나 Pastor들 및 Bojsen-MØller의 연구보고들과는 상비중격선에서 차이가 있었으며 더 추시해 보아야 할 것으로 사료된다.", "</p><p>비강의 점액질은 독성물질이나 감염으로부터 점막을 보호하고, 건조를 막아준다.", "</p><p>호흡 상피와 후각상피의 비강 분비물은 정상 또는 병리적인 상태에서 비강 생리작용에 중요한 역할을 하며, 점액질은 주로 점액의 점성에 관계하며 기계적 상해에 대해 아래에 놓인 상피를 보호하고 미생물이나 박테리아, 독소의 통과에 방어적인 역할을 한다.", "Theate들은 사람의 비강점막을 이용하여 형태학 및 조직화학적 연구를 시행한 결과 비 알레르기나 만성 염증성 질환을 않고 있는 환자에서 호흡상피내의 장액세포가 점액세포로 대치되는 조직학적 변화를 관찰하였고, Fabricant는 비강내 질환시 나타나는 중성과 산성점액질 분비량의 변화는 콧물의 산성도를 조절하여 이차적으로 섬모 활성도를 저하시키고 또한 조직 내에서 중성 ◦ 산성점액질의 구성비가 변함에 따라서 점막의 산성도가 달라져 일부 질환에 대한 감수성이 변한다고 하였다.", "Gallagher들은 배상세포는 외부기류 차단과 같은 환경적인 변화에서 민감하게 변화를 일으킴으로써 적응과 방어면에서 일차적인 기능을 담당하고 있음을 고려하면 중성점액질 보다는 산성점액질 중 sulfomu-cin이 이러한 생리적 기능과 밀접한 관계가 있다고 하였다.", "본 연구의 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군의 호흡점막 배상세포의 중성점액질은 \\( 10 \\mathrm{ppm} \\) 3시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 대조군에 비해 많이 증가하였고 그 외의 실험군에서는 대조군에 비해 대부분의 세포에서 감소하거나 소실되었으며 대조군에서 나타나지 않던 상피내 점액화세포들은 모든 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 중성점액질만을 함유하고 있었으며 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 그 양이 감소하는 경향을 나타내었다.", "산성점액질의 양은 \\( 10 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 50 \\mathrm{ppm} \\) 3시간 폭로군에서는 대조군에 비하여 많이 증가하였으나 \\( 10 \\mathrm{ppm} \\), \\( 25 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 50 \\mathrm{ppm} \\) 6시간 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군", "그리고 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 모든 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서는 현저히 감소하거나 소실되었다.", "대조군에 비해 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 강 sulfomucin은 감소하는 경향을 나타내었으나 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 강 sulfomucin은 소실되었으나 sialomucin은 대조군에 비해 증가하는 경향을 보였다.", "하비중격선의 중성점액질 양은 대조군에 비해 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 감소하는 경향을 나타내었으며 \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 폭로군에서 그 감소가 아주 현저하여 대부분의 선포들에서 중성점액질이 소실되었다.", "본 연구의 이와 같은 결과는 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)는 비강의 내적 환경에 유해한 인자로 작용하여 비강점막에 심한 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. \\", "( \\mathrm{SO}_{2} \\)의 농도와 폭로시간에 따라 점액질의 증가 후 감소되는 현상과 sialomucin의 증가와 같은 점액질의 성상 변화 비록 독성 물질의 종류와 기관은 달라도 Fabricant 및 Gallagher들의 결과와 유사하였다.", "배상세포들은 물리 화학적 자극에 대해 민감하며, 또한 자극물질의 종류에 따라 점액분비가 증감되고 점액질의 성상변화가 정상과 비정상조직의 주요한 구분요인이 되며, sulfomucin과 sialomucin의 동태가 매우 중요함을 알 수 있었으며, 또한 생체 방어기작에 점액질이 적극적으로 관여하는 것으로 사료된다.", "</p> <h1>연구재료 및 방법</h1><h2>실험 동물의 사육 및 처치</h2><h3>실험 동물의 사육</h3><p>실험 동물은 자유 급식법으로 사육한 체중 \\( 200 \\sim 250 \\mathrm{~g} \\)의 성숙한 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 예비 실험군에 10마리, 대조군에 3마리, 실험군에 45마리를 배정하여 사용하였다.", "</p><h3>폭로 방법</h3><p>폭로 장치는 투명한 아크릴로 만든 \\( 100 \\times 50 \\times 40 \\mathrm{~cm} \\) 크기의 gas chamber속에 3마리씩의 흰쥐를 넣어 밀폐한 다음 흰쥐의 분당 환기량 \\( (72.9 \\mathrm{ml} / \\mathrm{min} \\). \\", "( / \\mathrm{head}) \\)을 기준으로 하여 확산 펌프로 gas chamber내에 일정 농도의 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)를 충만 시키는 동시에 반대편에서는 흡입 펌프로 주입량 만큼 배출시킴으로써 gas chamber내에는 항상 일정 농도가 유지되도록 하였으며 30분마다 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 검지관(Kitakawa제, 일본)으로 측정하여 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 부족량을 계속 보충하여 일정한 농도가 유지되게 하였다. \\", "( \\mathrm{SO}_{2} \\) 는 시중에서 판매되는 순도 \\(99.9\\%\\)의 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\) (동진무역 종합가스제)를 사용하였다.", "</p><p>\\( \\mathrm{SO}_{2} \\) 농도별, 폭로 시간별로 비강에 미치는 영향을 조직화학적으로 점사하기 위하여 \\( 10 \\mathrm{ppm}, 25 \\mathrm{ppm}, 50 \\mathrm{ppm} \\), \\( 100 \\mathrm{ppm} \\) 및 \\( 200 \\mathrm{ppm} \\) 농도의 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)에 흰쥐를 각각 1시간 폭로군, 3시간 폭로군", "및 6시간 폭로군으로 나누어 gas cham-ber 속에서 폭로시켰다.", "대조군은 수컷 흰쥐 3마리를 \\( \\mathrm{SO}_{2} \\)를 주입하지 않은 gas chamber 속에 6시간 동안 처리하여 실험에 사용하였다.", "</p><h2>조직학적 구조</h2><p>대조군과 실험군의 흰쥐를 에테르로 마취시켜 비강은 하악을 제거한 두부에서 눈, 피부 및 주위 근육조직 제거한 후 중성포르말린에 고정하고 이온 교환 수지법(ion-exchange resin method)으로 탈회한 후 절치 유두(in-cisive papilla) 앞에서 첫 번째 구개 융기(first palate ridge)까지의 부위(level I)를 횡단(transverse section) 하였다.", "탈회한 비강을 중성포르말린에 고정하여 수세와 각급 알콜에 탈수과정을 거쳐 paraplast (융점 \\( \\left.56^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)에 포매하였으며 포매된 조직을 \\( 5 \\sim 6 \\mu \\mathrm{m} \\)의 두께로 연속 절편을 만든 후 조직학적 구조를 H-E염색과 PAS반응법으로 염색한 후 관찰하였다.", "</p><h2>점액질의 조직화학</h2><p>대조군과 실험군에서 중성점액질의 검색은 PAS반응법을, 산성점액질의 검색은 AB pH 2.5염색법을, 산성점액질과 중성점액질의 조성검색은 AB pH 2.5-PAS염색법을, 산성점액질 중 sulfomucin의 검색은 AB pH 1.0염색법을, 그리고 산성점액질 중 sulfomucin과 sia-lomucin의 조성검색은 AF pH 1.7-AB pH 2.5엽색법을 사용하였다.", "점액질에 대한 조직화학적 판정 기준온 청색은 B (blue), 적색은 R (red), 자색은 P (purple), 청자색은 BP (bluish purple), 적자색은 RP (reddish purple)으로 표시하였고 염색성의 등급은 염색된 정도에 따라 염색성이 없는 경우는 0 , 흔적적인 경우는 \\( \\pm \\), 약한 염색성은 1, 중등도 염색성은 2 , 강한 염색성은 3 , 매우 강한 염색성은 4로 나누어 표시하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "\\(\\mathrm{SO_2}\\)가 흰쥐 비강 호흡부 점막의 조직학적 구조 및 점액질에 미치는 영향에 관한 연구", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-bce04dbd-3dcc-4313-b3d0-c90b621a95d4", 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5,331	<h1>요약</h1><p>가시상추(Prickly lettuce : Lactuca serriola)로부터 여러 가지 추출용매를 사용하여 생리활성물질을 분리하였다. 가시상추의 일반성분, vitamin, polyphenol성 물질 그리고 flavonoid 성분의 함량을 분석하였다. 또한, \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물에 의한 아질산염 제거 활성, 항산화 활성, 항균 활성을 측정하였다. \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물의 \( \mathrm{EtOAc} \) 분획에서 가장 높은 아질산염 제거 활성, 항산화 활성 그리고 항균 활성을 보여주었다. 그리고 polyphenol성 물질과 flavonoid의 함량도 가장 높았다. \( \mathrm{EtOAc} \) 분획 중 subfraction 2 ( \( \mathrm{EtOAc}: \mathrm{MeOH}=3: 1) \) 에서 가장 높은 항산화 활성을 보여주었다. Subfraction 2는 GC-MS에 의해 \( \rho \)-coumaric acid와 caffeic acid로 동정되었다. 가시상추 추출물의 용매 분획별 항균 활성을 검색한 결과, \( \mathrm{EtOAc} \) 분획에서 가장 높은 항균 활성을 보여주었다. 이러한 연구 결과는 가시상추 유래의 생리활성물질의 생물학적 활성을 이해하는데 필요한 기본 데이터를 제공해 줄 것이다.</p> <h1>서 론</h1><p>최근 생활수준의 향상과 식생활의 다양한 변화로 인해 식품의 영양학적 측면과 더불어 생체방어, 질병의 예방 및 회복, 노화방지 등의 건강기능성에 대한 관심이 증가되고 있다. 뿐 만 아니라 생체의 항상성 유지 및 생리기능 조절작용 등을 나타내는 생리활성 물질에 관한 관심이 증가되고 있고, 생리 활성을 나타내는 기능성 성분들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 식품에서의 이러한 연구는 식품의 보존성이나 기능성을 향상시키기 위해서 천연 항산화제, 항균성 물질, 항돌연변이원성물질, 항암성 물질등에 대한 연구가 주류를 이루고 있다.</p><p>식물 유래의 생리활성 물질들은 phenol성 화합물, carotenoid, flavonoid 등이 대부분으로서, 이들은 alkyl radical이 나 alkylperoxy radical에 수소를 공여하여 그 radical을 제거 함으로써 산화를 억제하는 활성을 가진 항산화제로 알려져 있다. Vitamin C와 phenol성 물질은 운동에 의해 증가되는 지질 과산화물인 MDA (maleondialdehyde)의 활성을 저하시키고 항산화 효소인 SOD (superoxide dismutase)의 활성을 증가시키는 것으로 보고되었다.</p><p>인간의 질병 및 노화는 대사과정 중 발생하는 superoxide, nitric oxide, 그리고 hydroxyl, peroxyl, alkoxyl 및 hydro-peroxyl radical 등의 산화반응에 기인하며, 이런 radical들은 체내 지질, 단백질, DNA와 같은 물질의 손상을 유발한다. 여러 연구결과에 의하면 과채류 등과 같은 식물성 식품을 충분히 섭취하는 것이 노화방지, 심혈관질환, 동맥경화, 암, 당뇨 등과 같은 만성질환의 예방과 치료에 도움이 되는 것으로 보고되었다.</p><p>가시상추(prickly lettuce)의 학명은 Lactuca serriola이며, 원산지인 중남부 유럽에서 분산되어 영국, 북아메리카, 서아시아, 북아프리카, 일본 등으로 분포 영역이 확산되고 있는 전 세계적 분포종이며, 국화과의 식물로 천이의 초기단계에 출현하는 선구식물로 보고되어 있다.</p><p>가시상추에 대한 연구로는 상추와 가시상추의 잡종에 대한 병리현상, 가시상추의 광합적 특성등에 대한 보고는 있었으나, 가시상추의 영양성분 및 생리활성 물질에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.</p><p>따라서 본 연구는 유럽 원산으로 국내에서 빠르게 분포 영역을 넓혀가고 있고, 풍부하게 자생하고 있는 가시상추를 유용자원으로 활용하고자 가시상추로부터 영양성분 및 여러 가지 생리활성물질을 분리하여 분석하고, 이들에 의한 여러 가지 생리활성을 규명하였다.</p> <h2>DPPH에 의한 항산화 활성 측정</h2><p>항산화 활성은 Leong의 방법에 따라 DPPH(1.1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) \( 20 \mathrm{mg} \) 을 EtOH \( 100 \mathrm{ml} \) 에 용 해한 후 증류수 \( 100 \mathrm{ml} \) 를 첨가한 후 여과지로 여과하였다. DPPH 용액은 대조구의 흡광도가 1.0 정도가 되도록 EtOH로 희석하여 사용하였다. 시료 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 시험관에 가하고 DPPH 용액 \( 4 \mathrm{ml} \) 를 혼합하여 10 분간 반응시킨 후 Spectrophotometer (Evolution 300, Thermo Electronic Co., England)로 \( 517 \mathrm{~nm} \) 에 서 흡광도를 측정하여 DPPH radical 제거활성을 계산하였다.</p><h2>화합물의 성분 확인 및 정량</h2><p>EtOAc 분획을 column chromatography에 걸어 얻은 분획 중 항균작용과 항산화작용이 우수하게 나타난 subfraction 2 에 대하여 GC와 GC-MS 를 이용하여 성분 분석을 하였다. GC(HP 6890, USA)의 분석조건은 SPB-5 (capillary, \( 0.53 \) \( \mathrm{mm} \times 30 \mathrm{~mm} \) ) column, oven 온도는 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 3 분 유지 후 \( 250^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 분당 \( 6^{\circ} \mathrm{C} \) 로 승온하였고, injector 온도는 \( 230^{\circ} \mathrm{C} \), detector 온도는 \( 260^{\circ} \mathrm{C} \), carrier gas는 질소, detector는 FID, 시료 주입량은\( 2 \mu l \) 로 하였다. GC 분석을 위한 시료는 N, O-bis (trimethylsilyl) -acetamide (BSA)와 \( \mathrm{CH}_{3} \mathrm{CN} \) (1:4) 시약으로 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응시켜 TMS화 시킨 후 사용하였다. GC-MS (HP 6890, USA)의 분석조건의 mode는 scan, electron energy 는 \( 70 \mathrm{eV} \), column은 HP-5 MS (capillary, \( 0.25 \mathrm{~mm} \times 30 \) \( \mathrm{m} \) ), oven 온도 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분 유지한 후 \( 290^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 분당 \( 10^{\circ} \mathrm{C} \) 로 승온하였고, injector 온도 \( 250^{\circ} \mathrm{C} \), carrier gas는 He, 1.0 \) \( \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 으로 하였다.</p><h2>식중독균에 대한 항균 활성 시험</h2><p>항균력 측정에 사용한 식중독 균주와 배지는 Table 1 과 같 으며, Escherichia coli 외 6균주는 한국유전자은행(KCTC)에서 분양받아 사용하였다. 항균성 시험은 paper disc \( (8 \mathrm{~mm}) \) 를 이용한 agar diffusion법으로 실험하였다. 선택 배지에 배양한 각 균주를 백금이를 이용하여 \( 10 \mathrm{ml} \) 의 Mueller-Hinton broth 에 접종하고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18~24시간 계대 배양한 후, 이 균액을 McFarland nephelometer에 0.5가 되도록 멸균생리식염수 로 희석하여 멸균 면봉으로 Muller - Hinton agar 평판에 고르게 바른 다음, paper disc에 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 각 추출물 \( 50 \mu l \) 를 흡수시켜 plate 표면에 얹고, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 18 시간 배양 후 디스크 주변의 발육억제대(inhibition zone)를 측정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>일반성분 함량 분석</h2><p>가시상추의 일반성분을 분석한 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 수분 \( 8.3 \% \), 회분 \( 14.1 \% \), 조단백질 \( 17.5 \% \), 조지방 \( 7.5 \% \), 탄수화물 \( 52.6 \% \) 이었다. Lee 등의 연구에 의하면 산수유 잎의 일반성분을 분석한 결과 회분 \( 4.6 \% \), 조단백질 \( 3.2 \% \), 조지 방 \( 4.5 \% \) 라고 보고하였다. Kong 및 \( \mathrm{Oh}[16] \) 에 의한 신갈나무 잎의 분석결과 수분 \( 7.9 \% \), 단백질 \( 17.5 \% \), 조지방 \( 2.8 \% \), 조회분 \( 4.4 \% \) 라고 보고하였다.</p><h2></h2><p>가시상추의 vitamin 함량을 분석한 결과, \( 100 \mathrm{~g} \) 당 \( \beta \) carotene은 \( 0.5 \mathrm{mg} \), vitamin \( B_{1} \) 은 \( 27.3 \mathrm{mg} \), vitamin \( B_{2} \) 는 \( 12.9 \) \( \mathrm{mg} \), vitamin C는 \( 6.9 \mathrm{mg} \), vitamin E는 \( 3.2 \mathrm{mg} \) 함유되어 있었 고, 그 중에서 \( \alpha \)-tocopherol \( 2.2 \mathrm{mg} \), \( \delta \)-tocopherol \( 0.8 \mathrm{mg} \), \( \gamma \) tocopherol \( 0.2 \mathrm{mg} \) 이 함유되어 있었다(Table 3). Shim 등[30]은 vitamin C가 민들레 잎에 \( 67.4 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~g} \), 참쑥에 \( 26.1 \mathrm{mg} / 100 \) \( \mathrm{g} \) 함유되어 있는 것으로 보고 하였으나, 가시상추는 그에 비하 여 낮게 함유되어 있었고, Kwon 등의 취나물에 vitamin C가 \( 2.5 \mathrm{mg} / 100 \mathrm{~g} \) 함유되어 있는 것으로 보고한 결과와 비교 하면 가시상추 잎은 높게 함유되어 있었다.</p><h2>Phenol성 물질 함량 분석</h2><p>\( \mathrm{MeOH} \) 조추출물을 각 용매로 분획하여 phenol성 물질 함 량을 분석한 결과, \( \mathrm{EtOAc} \) 분획에서 가장 높은 \( 13.9 \% \) 의 함량이 나타났으며, \( \mathrm{n}-\mathrm{BuOH} \) 분획 \( 7.2 \%, \mathrm{n} \)-hexane 분획 \( 6.2 \%, \mathrm{CHCl}_{3} \) 분획 \( 3.4 \%, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 분획에서 \( 1.2 \% \) 로 나타났다(Table 4).</p><p>Maxson 및 Rooney는 품종, 숙성 및 수확시기, 실험절차, 표준물질 등에 따라 분석치 간의 차이가 크므로 phenol성 물질 함량의 단순 비교는 적합하지 않다고 하였으며, Lee 등은 phenol성 물질의 함량이 높을수록 항산화 효과가 높다고 보고하여 본 연구 결과와 일치하였다.</p><h2>Flavonoid 함량 분석</h2><p>\( \mathrm{MeOH} \) 조추출물을 각 용매로 분획하여 flavonoid 함량을 분석한 결과, \( \mathrm{EtOAC} \) 분획에서 가장 높은 \( 27.7 \% \) 의 함량을 보였으며, \( \mathrm{n}-\mathrm{BuOH} \) 분획 \( 18.4 \%, \mathrm{n} \)-hexane 분획 \( 17.9 \%, \mathrm{CHCl}_{3} \) 분획 \( 15.1 \%, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 분획에서 \( 13.6 \% \) 의 함량을 나타내었다(Table 5).</p><p>Lee 등은 식물성 식품 중 flavonoid 함량을 분석한 결과, 녹차 \( 4.47 \% \), 프로폴리스 \( 5.21 \% \), 사철쑥 \( 4.82 \% \) 로 보고 하였고, Choi 등[4]은 머루 과피 추출물에서 EtOAc 추출물이 \( 0.6 \% \) 로 가장 높게 나타났다고 보고하였다. 이러한 결과는 본 연구 결과와 비교하면 매우 낮은 수준이었다.</p><p>식물체에 들어 있는 flavonoid 함량과 생리활성에 대한 연구 결과, flavonoid는 항균 활성, 항산화 효과와 항염 작용을 나타내고 있으며, 여러 종류의 종양 세포의 성장 및 분화를 저해시키는 효과가 있다. 따라서 본 연구에서 규명된 가시상추 잎에 다량으로 함유되어 있는 flavonoid 및 phenol성 물질계 항산화물질은 외부 환경 스트레스에 의해 과다하게 발생 되는 활성산소종을 제거하기 위해 작용하는 중요한 인자로 생각된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>가시상추 및 생리활성물질 추출</h2><p>실험에 사용한 가시상추(prickly lettuce : Lactuca serriola)는 2006년 5~6월 경북 경산시 자인면에서 채집하여 음지에서 건조한 후 분말로 하여 연구에 사용하였다. 분말 \( 600 \mathrm{~g} \) 을 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 시간씩 3회 추출하여 \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물을 얻었다. \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물을 10% \(\mathrm{MeOH} \) 에 현탁시켜 용매의 극성을 증 가시키는 용매분획법에 의해 n-hexane 분획, \( \mathrm{CHCl}_{3} \) 분획,\( \mathrm{EtOAC} \) 분획, \( \mathrm{n}-\mathrm{BuOH} \) 분획, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 분획을 얻었다.</p><p>항산화 활성이 우수하게 나타난 EtOAc 분획에 대하여 column chromatography를 수행하였다. \( 30 \mathrm{~mm} \) 유리제 column 에 시료 30 배의 silica gel을 n-hexane으로 충진하고 시료 2 \( \mathrm{g} \) 을 흡착시킨 후 EtOAc, EtOAc:MeOH (3:1), EtOAc:MeOH (1:1), EtOAc: \( \mathrm{MeOH} \) (1:3), \( \mathrm{MeOH} \) 순으로 순차적으로 \( 100 \mathrm{ml} \) 씩 내려 5 개의 소 분획으로 나누어 subfraction 1, subfraction 2, subfraction 3, subfraction 4, subfraction 5 로 명명하였다. 가시상추로부터 생리활성 물질의 분리 및 정제과정을 요약하면 Fig. 1과 같다.</p><h2>일반성분 분석</h2><p>가시상추의 수분, 회분, 조지방, 조단백질, 비타민 등 일반성 분은 식품공전 일반시험법에 따라 정량하였다. 즉, 수분함량은 상압가열건조법, 회분은 회화법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백질은 단백질 자동분석기법을 이용하여 분석하였으며, 값은 백분율로 나타내었다. 탄수화물 함량은 100 에서 수분, 조단백질, 조지방, 회분함량을 제한 값으로 하였다. 비타민은 HPLC 법으로 분석하였다.</p><h2>Phenol성 화합물 함량 측정</h2><p>Phenol성 물질 분석은 Dewanto 등의 방법에 따라 수행 하였다. 시료 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 2% sodium carbonate \( 2 \mathrm{ml} \) 를 가하여 3 분간 반응시킨 후 50% Folin-Ciocalteu reagent \( 0.1 \mathrm{ml} \) 를 가하여 3분간 반응 후 반응액의 흡광도를 \( 720 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 사용하였고 \( 10,30,50 \mathrm{ppm} \) 농도의 검량선을 작성하여 함량을 계산하였다.</p><h2>Flavonoid 함량 측정</h2><p>Flavonoid 분석은 Moreno 등의 방법에 따라 수행하였 다. 시료 \( 0.1 \mathrm{ml} \) 에 \( 80 \% \mathrm{EtOH} 0.9 \mathrm{ml} \) 를 혼합하고, \( 10 \% \) alumium nitrate \( 0.1 \mathrm{ml}, 1 \mathrm{M} \) potassium acetate \( 0.1 \mathrm{ml} \) 및 EtOH \( 4.3 \mathrm{ml} \) 를 각각 첨가하여 상온에서 40 분간 반응한 후 \( 415 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 사용하였 고 \( 50,100,150 \mathrm{ppm} \) 농도의 검량선을 작성하여 함량을 계산 하였다.</p><h2>아질산염 제거 활성 측정</h2><p>아질산염 제거 활성은 Gray 및 Dugan의 방법에 의하여 측정하였다. \( 1 \mathrm{mM} \) sodium nitrate 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 에 분획별 추출물 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 가하고 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{HCl} \) 을 사용하여 반응 용액의 \( \mathrm{pH} \) 를 1.2 로 조정한 다음 증류수로 총량을 \( 10 \mathrm{ml} \) 로 하였다. 이 용액을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응 시킨 후 각 반응액을 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 취하여 2% acetic acid용액 \( 5 \mathrm{ml} \), Griess 시약(A:B=1:1, A: 1% silfanilic acid in 30% acetic acid, B:1% naphthylamine in 30% acetic acid) \( 0.4 \) \( \mathrm{ml} \) 를 첨가하여 잘 혼합하여 실온에서 15 분간 방치시킨 후 520 \( \mathrm{nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 아질산염 제거능을 측정하였다.</p> <h2>아질산염 제거 활성 기능 측정</h2><p>가시상추의 아질산염 제거 작용은 Table 6 과 같이 EtOAc 분획이 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 첨가시 \( 63.0 \% \) 로 가장 높게 나타났으며, \( \mathrm{n}-\mathrm{Bu} \) \( \mathrm{OH} \) 분획 \( 35.6 \%, \mathrm{CHCl}_{3} \) 분획 \( 31.5 \%, \mathrm{n} \)-hexane 분획 \( 7.1 \%, \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 분획 \( 5.7 \% \) 로 나타났다.</p><p>아질산염 제거 활성에 영향을 미치는 성분으로는 Vitamin C, 아미노산과 펩타이드, phenol성 물질과 flavonoid 등이 보 고 되고 있으며, 가시상추의 아질산염 제거 활성은 각 분획에 용해되어 있는 이러한 성분들이 복합적으로 작용한 것으로 추정되며, nitrosamine의 생성을 효과적으로 억제함과 동시에 산화방지 효과 등 식품의 보존제로서 이용이 가능할 것으로 생각된다.</p><h2>항산화 활성 측정</h2><p>가시상추 각 분획별 항산화 활성을 측정한 결과, 용매 분획에 의한 항산화 활성은 \( \mathrm{EtOAc} \) 분획이 \( 56.2 \% \) 로 가장 강한 항산화 활성을 나타내었으며, 천연 항산화제로 많이 사용되고 있는 a-tocopherol 보다 항산화 활성이 우수하였고, 합성 산화방지제인 BHA보다는 조금 낮았다(Fig. 2). 우수하게 나타난 EtOAc 분획을 column chromatography를 수행하여 정제한결과, subfraction 2 에서 가장 우수한 항산화 활성이 나타났다(Fig. 3). Subfraction 2를 GC-MS로 분석한 결과, \( p \)-coumaric acid, caffeic acid로 동정되었다. Lee 및 Do 는 복분자 열매 의 항산화 활성 연구에서 phenol성 물질의 성분이 caffeic acid 라고 하였으며, Kim 등은 씀바귀 생즙 추출물의 생리활성에서 EtOAc 분획이 가장 강한 항산화 활성을 나타내었고, 항산화 작용이 vitamin C나 flavonoid의 작용에 의한 것으로, Kim 등도 대추잎 추출물의 생리활성 작용에서 EtOAc 분획에서 항산화 활성이 가장 높게 나타났다고 하였다. Kim 등은 다류원료 식물류 물 추출물의 항산화 효과에서 식물류 종류에 따라 항산화성에 많은 차이를 보였으며, 이들의 항산화성은 단일 항산화성 물질의 효과에 기인하기 보다는 phenol 성 화합물, vitamin C 등 복합적 효과에 의한 것이라 하였다.</p><h2>항산화 성분의 함량 분석</h2><p>항산화 성분의 함량을 비교하기 위하여 가시상추 잎, \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물, EtOAc 분획, column chromatography 분획 을 추출과 정제과정을 거쳐 GC로 정량한 결과는 Table 7과 같다. 가시상추 잎에서 분리한 2종 성분의 총 함량은 \( 0.08 \% \) \( (p \)-coumaric acid \( 0.02 \% \), caffeic acid \( 0.06 \%) \) 였으며, \( \mathrm{MeOH} \) 조 추출물은 \( 1.8 \%(p \)-coumaric acid \( 0.5 \% \), caffeic acid \( 1.3 \%) \) 이었 다. \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물을 용매 분획한 \( \mathrm{EtOAc} \) 분획의 총 함량은 \( 6.7 \%(p \)-coumaric acid \(1.7\%\), caffeic acid \(5.0\%\))이고, EtOAc 분획을 column chromatography를 수행하여 얻은 subfraction 2 분획의 총 함량은 \( 13.6 \% \) (p-coumaric acid \( 4.1 \% \), caffeic acid \( 9.5 \%) \) 로 정제를 진행 할수록 함량이 높아졌으며, p-coumaric acid 보다 caffeic acid의 함량이 높게 나타났다. Subfraction 3 의 함량은 \( p \)-coumaric acid 1.5\%, caffeic acid \( 4.8 \% \) 로 총 \( 6.3 \% \) 로 나타났으며, subfraction 1은 \( 0.2 \% \), subfraction 4 는 \( 0.5 \% \), subfraction 5 는 \( 0.3 \% \) 로 낮은 함량을 나타내었다. 따라서 \( \mathrm{EtOAc} \) 분획에서 분리한 항산화 성분은 subfraction 2와 subfraction 3에 대부분 존재하는 것으로 확인되었다.</p><h2>확인된 성분의 항산화 활성 측정</h2><p>확인된 2종의 화합물은 표준품을 이용하여 항산화 효과를 측정하였으며, 그 결과는 Fig. 4 와 같다. 항산화 효과를 측정하 기 위하여 추출과 정제 과정을 거친 \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물, \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물을 분획한 \( \mathrm{EtOAc} \) 분획, \( \mathrm{EtOAc} \) 분획을 column chromatography를 수행하여 얻은 subfraction 2 분획, subfraction 2 에서 확인한 2종의 화합물을 천연항산화제로 많이 이용되고 있는 \( \alpha \)-tocopherol과 합성산화방지제인 BHA와 비교하였다. \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물은 \( 7.8 \% \) 의 항산화 활성을 나타내었고, \( \mathrm{EtOAc} \) 분획은 \( 31.6 \% \), subfraction 2 분획은 \( 74.3 \% \) 로 높아졌다. Subfraction 2에서 확인된 2종의 화합물 중 \( p \)-coumaric acid는 \( 2.0 \% \) 로 항산화 활성을 거의 나타내지 않았으며, caffeic acid는 \( 94.0 \% \) 로 항산화제인 \( \alpha \)-tocopherol \(28.5\%\)와 BHA \( 44.3 \% \) 보다도 매우 높은 항산화 활성을 나타내었다. 따라서 가시상추 추출물에서 항산화 활성을 나타낸 성분은 caffeic acid에 기인된 것으로 생각된다.</p><h2>식중독균에 대한 항균 활성 측정</h2><p>식중독균에 대한 항균 활성을 검색하기 위하여 디스크확산 법을 이용하여 7종의 균주에 대하여 실험한 결과(Table 8), \( \mathrm{EtOAc} \) 분획에서 가장 강한 항균 활성이 나타났다.</p><p>\( \mathrm{EtOAc} \) 분획은 실험균주 7종 모두에 항균 활성을 나타내었으며, \( \mathrm{CHCl}_{3} \) 분획은 6 종, \( \mathrm{n} \)-hexane 분획과 \( \mathrm{BuOH} \) 분획은 5 종, \( \mathrm{MeOH} \) 조추출물은 2종의 균주에 대하여 항균 활성을 나타내 었으나, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 분획은 전혀 항균 활성을 나타내지 않았다.</p><p>Song 등은 청미래덩굴 뿌리에서 추출한 분획에서 \( \mathrm{EtOAc} \) 분획, \( \mathrm{CHCl}_{3} \) 분획, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 분획의 순으로 항균성이 나타나 본 실험의 결과와 유사하였다. 이상의 결과를 종합하면 가시상추의 항균성은 주로 \( \mathrm{EtOAc} \) 분획에서 기인된 것으로 생각 된다. 하지만 항균 활성을 담당하고 있는 화합물을 규명하기 위해서는 좀 더 정확한 분석이 요구된다.</p>	생명과학	[ "<h1>요약</h1><p>가시상추(Prickly lettuce : Lactuca serriola)로부터 여러 가지 추출용매를 사용하여 생리활성물질을 분리하였다.", "가시상추의 일반성분, vitamin, polyphenol성 물질 그리고 flavonoid 성분의 함량을 분석하였다.", "또한, \\( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물에 의한 아질산염 제거 활성, 항산화 활성, 항균 활성을 측정하였다. \\", "( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물의 \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획에서 가장 높은 아질산염 제거 활성, 항산화 활성 그리고 항균 활성을 보여주었다.", "그리고 polyphenol성 물질과 flavonoid의 함량도 가장 높았다. \\", "( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획 중 subfraction 2 ( \\( \\mathrm{EtOAc}: \\mathrm{MeOH}=3: 1) \\) 에서 가장 높은 항산화 활성을 보여주었다.", "Subfraction 2는 GC-MS에 의해 \\( \\rho \\)-coumaric acid와 caffeic acid로 동정되었다.", "가시상추 추출물의 용매 분획별 항균 활성을 검색한 결과, \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획에서 가장 높은 항균 활성을 보여주었다.", "이러한 연구 결과는 가시상추 유래의 생리활성물질의 생물학적 활성을 이해하는데 필요한 기본 데이터를 제공해 줄 것이다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>최근 생활수준의 향상과 식생활의 다양한 변화로 인해 식품의 영양학적 측면과 더불어 생체방어, 질병의 예방 및 회복, 노화방지 등의 건강기능성에 대한 관심이 증가되고 있다.", "뿐 만 아니라 생체의 항상성 유지 및 생리기능 조절작용 등을 나타내는 생리활성 물질에 관한 관심이 증가되고 있고, 생리 활성을 나타내는 기능성 성분들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.", "식품에서의 이러한 연구는 식품의 보존성이나 기능성을 향상시키기 위해서 천연 항산화제, 항균성 물질, 항돌연변이원성물질, 항암성 물질등에 대한 연구가 주류를 이루고 있다.", "</p><p>식물 유래의 생리활성 물질들은 phenol성 화합물, carotenoid, flavonoid 등이 대부분으로서, 이들은 alkyl radical이 나 alkylperoxy radical에 수소를 공여하여 그 radical을 제거 함으로써 산화를 억제하는 활성을 가진 항산화제로 알려져 있다.", "Vitamin C와 phenol성 물질은 운동에 의해 증가되는 지질 과산화물인 MDA (maleondialdehyde)의 활성을 저하시키고 항산화 효소인 SOD (superoxide dismutase)의 활성을 증가시키는 것으로 보고되었다.", "</p><p>인간의 질병 및 노화는 대사과정 중 발생하는 superoxide, nitric oxide, 그리고 hydroxyl, peroxyl, alkoxyl 및 hydro-peroxyl radical 등의 산화반응에 기인하며, 이런 radical들은 체내 지질, 단백질, DNA와 같은 물질의 손상을 유발한다.", "여러 연구결과에 의하면 과채류 등과 같은 식물성 식품을 충분히 섭취하는 것이 노화방지, 심혈관질환, 동맥경화, 암, 당뇨 등과 같은 만성질환의 예방과 치료에 도움이 되는 것으로 보고되었다.", "</p><p>가시상추(prickly lettuce)의 학명은 Lactuca serriola이며, 원산지인 중남부 유럽에서 분산되어 영국, 북아메리카, 서아시아, 북아프리카, 일본 등으로 분포 영역이 확산되고 있는 전 세계적 분포종이며, 국화과의 식물로 천이의 초기단계에 출현하는 선구식물로 보고되어 있다.", "</p><p>가시상추에 대한 연구로는 상추와 가시상추의 잡종에 대한 병리현상, 가시상추의 광합적 특성등에 대한 보고는 있었으나, 가시상추의 영양성분 및 생리활성 물질에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.", "</p><p>따라서 본 연구는 유럽 원산으로 국내에서 빠르게 분포 영역을 넓혀가고 있고, 풍부하게 자생하고 있는 가시상추를 유용자원으로 활용하고자 가시상추로부터 영양성분 및 여러 가지 생리활성물질을 분리하여 분석하고, 이들에 의한 여러 가지 생리활성을 규명하였다.", "</p> <h2>DPPH에 의한 항산화 활성 측정</h2><p>항산화 활성은 Leong의 방법에 따라 DPPH(1.1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) \\( 20 \\mathrm{mg} \\) 을 EtOH \\( 100 \\mathrm{ml} \\) 에 용 해한 후 증류수 \\( 100 \\mathrm{ml} \\) 를 첨가한 후 여과지로 여과하였다.", "DPPH 용액은 대조구의 흡광도가 1.0 정도가 되도록 EtOH로 희석하여 사용하였다.", "시료 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 시험관에 가하고 DPPH 용액 \\( 4 \\mathrm{ml} \\) 를 혼합하여 10 분간 반응시킨 후 Spectrophotometer (Evolution 300, Thermo Electronic Co., England)로 \\( 517 \\mathrm{~nm} \\) 에 서 흡광도를 측정하여 DPPH radical 제거활성을 계산하였다.", "</p><h2>화합물의 성분 확인 및 정량</h2><p>EtOAc 분획을 column chromatography에 걸어 얻은 분획 중 항균작용과 항산화작용이 우수하게 나타난 subfraction 2 에 대하여 GC와 GC-MS 를 이용하여 성분 분석을 하였다.", "GC(HP 6890, USA)의 분석조건은 SPB-5 (capillary, \\( 0.53 \\) \\( \\mathrm{mm} \\times 30 \\mathrm{~mm} \\) ) column, oven 온도는 \\( 120^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 3 분 유지 후 \\( 250^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 까지 분당 \\( 6^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 로 승온하였고, injector 온도는 \\( 230^{\\circ} \\mathrm{C} \\), detector 온도는 \\( 260^{\\circ} \\mathrm{C} \\), carrier gas는 질소, detector는 FID, 시료 주입량은\\( 2 \\mu l \\) 로 하였다.", "GC 분석을 위한 시료는 N, O-bis (trimethylsilyl) -acetamide (BSA)와 \\( \\mathrm{CH}_{3} \\mathrm{CN} \\) (1:4) 시약으로 \\( 60^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 10 분간 반응시켜 TMS화 시킨 후 사용하였다.", "GC-MS (HP 6890, USA)의 분석조건의 mode는 scan, electron energy 는 \\( 70 \\mathrm{eV} \\), column은 HP-5 MS (capillary, \\( 0.25 \\mathrm{~mm} \\times 30 \\) \\( \\mathrm{m} \\) ), oven 온도 \\( 80^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 2분 유지한 후 \\( 290^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 까지 분당 \\( 10^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 로 승온하였고, injector 온도 \\( 250^{\\circ} \\mathrm{C} \\), carrier gas는 He, 1.0 \\) \\( \\mathrm{ml} / \\mathrm{min} \\) 으로 하였다.", "</p><h2>식중독균에 대한 항균 활성 시험</h2><p>항균력 측정에 사용한 식중독 균주와 배지는 Table 1 과 같 으며, Escherichia coli 외 6균주는 한국유전자은행(KCTC)에서 분양받아 사용하였다.", "항균성 시험은 paper disc \\( (8 \\mathrm{~mm}) \\) 를 이용한 agar diffusion법으로 실험하였다.", "선택 배지에 배양한 각 균주를 백금이를 이용하여 \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 의 Mueller-Hinton broth 에 접종하고, \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 18~24시간 계대 배양한 후, 이 균액을 McFarland nephelometer에 0.5가 되도록 멸균생리식염수 로 희석하여 멸균 면봉으로 Muller - Hinton agar 평판에 고르게 바른 다음, paper disc에 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 각 추출물 \\( 50 \\mu l \\) 를 흡수시켜 plate 표면에 얹고, \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 18 시간 배양 후 디스크 주변의 발육억제대(inhibition zone)를 측정하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>일반성분 함량 분석</h2><p>가시상추의 일반성분을 분석한 결과 Table 2에서 보는 바와 같이 수분 \\( 8.3 \\% \\), 회분 \\( 14.1 \\% \\), 조단백질 \\( 17.5 \\% \\), 조지방 \\( 7.5 \\% \\), 탄수화물 \\( 52.6 \\% \\) 이었다.", "Lee 등의 연구에 의하면 산수유 잎의 일반성분을 분석한 결과 회분 \\( 4.6 \\% \\), 조단백질 \\( 3.2 \\% \\), 조지 방 \\( 4.5 \\% \\) 라고 보고하였다.", "Kong 및 \\( \\mathrm{Oh}[16] \\) 에 의한 신갈나무 잎의 분석결과 수분 \\( 7.9 \\% \\), 단백질 \\( 17.5 \\% \\), 조지방 \\( 2.8 \\% \\), 조회분 \\( 4.4 \\% \\) 라고 보고하였다.", "</p><h2></h2><p>가시상추의 vitamin 함량을 분석한 결과, \\( 100 \\mathrm{~g} \\) 당 \\( \\beta \\) carotene은 \\( 0.5 \\mathrm{mg} \\), vitamin \\( B_{1} \\) 은 \\( 27.3 \\mathrm{mg} \\), vitamin \\( B_{2} \\) 는 \\( 12.9 \\) \\( \\mathrm{mg} \\), vitamin C는 \\( 6.9 \\mathrm{mg} \\), vitamin E는 \\( 3.2 \\mathrm{mg} \\) 함유되어 있었 고, 그 중에서 \\( \\alpha \\)-tocopherol \\( 2.2 \\mathrm{mg} \\), \\( \\delta \\)-tocopherol \\( 0.8 \\mathrm{mg} \\), \\( \\gamma \\) tocopherol \\( 0.2 \\mathrm{mg} \\) 이 함유되어 있었다", "(Table 3).", "Shim 등[30]은 vitamin C가 민들레 잎에 \\( 67.4 \\mathrm{mg} / 100 \\mathrm{~g} \\), 참쑥에 \\( 26.1 \\mathrm{mg} / 100 \\) \\( \\mathrm{g} \\) 함유되어 있는 것으로 보고 하였으나, 가시상추는 그에 비하 여 낮게 함유되어 있었고, Kwon 등의 취나물에 vitamin C가 \\( 2.5 \\mathrm{mg} / 100 \\mathrm{~g} \\) 함유되어 있는 것으로 보고한 결과와 비교 하면 가시상추 잎은 높게 함유되어 있었다.", "</p><h2>Phenol성 물질 함량 분석</h2><p>\\( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물을 각 용매로 분획하여 phenol성 물질 함 량을 분석한 결과, \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획에서 가장 높은 \\( 13.9 \\% \\) 의 함량이 나타났으며, \\( \\mathrm{n}-\\mathrm{BuOH} \\) 분획 \\( 7.2 \\%, \\mathrm{n} \\)-hexane 분획 \\( 6.2 \\%, \\mathrm{CHCl}_{3} \\) 분획 \\( 3.4 \\%, \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\) 분획에서 \\( 1.2 \\% \\) 로 나타났다", "(Table 4).", "</p><p>Maxson 및 Rooney는 품종, 숙성 및 수확시기, 실험절차, 표준물질 등에 따라 분석치 간의 차이가 크므로 phenol성 물질 함량의 단순 비교는 적합하지 않다고 하였으며, Lee 등은 phenol성 물질의 함량이 높을수록 항산화 효과가 높다고 보고하여 본 연구 결과와 일치하였다.", "</p><h2>Flavonoid 함량 분석</h2><p>\\( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물을 각 용매로 분획하여 flavonoid 함량을 분석한 결과, \\( \\mathrm{EtOAC} \\) 분획에서 가장 높은 \\( 27.7 \\% \\) 의 함량을 보였으며, \\( \\mathrm{n}-\\mathrm{BuOH} \\) 분획 \\( 18.4 \\%, \\mathrm{n} \\)-hexane 분획 \\( 17.9 \\%, \\mathrm{CHCl}_{3} \\) 분획 \\( 15.1 \\%, \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\) 분획에서 \\( 13.6 \\% \\) 의 함량을 나타내었다", "(Table 5).", "</p><p>Lee 등은 식물성 식품 중 flavonoid 함량을 분석한 결과, 녹차 \\( 4.47 \\% \\), 프로폴리스 \\( 5.21 \\% \\), 사철쑥 \\( 4.82 \\% \\) 로 보고 하였고, Choi 등[4]은 머루 과피 추출물에서 EtOAc 추출물이 \\( 0.6 \\% \\) 로 가장 높게 나타났다고 보고하였다.", "이러한 결과는 본 연구 결과와 비교하면 매우 낮은 수준이었다.", "</p><p>식물체에 들어 있는 flavonoid 함량과 생리활성에 대한 연구 결과, flavonoid는 항균 활성, 항산화 효과와 항염 작용을 나타내고 있으며, 여러 종류의 종양 세포의 성장 및 분화를 저해시키는 효과가 있다.", "따라서 본 연구에서 규명된 가시상추 잎에 다량으로 함유되어 있는 flavonoid 및 phenol성 물질계 항산화물질은 외부 환경 스트레스에 의해 과다하게 발생 되는 활성산소종을 제거하기 위해 작용하는 중요한 인자로 생각된다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>가시상추 및 생리활성물질 추출</h2><p>실험에 사용한 가시상추(prickly lettuce : Lactuca serriola)는 2006년 5~6월 경북 경산시 자인면에서 채집하여 음지에서 건조한 후 분말로 하여 연구에 사용하였다.", "분말 \\( 600 \\mathrm{~g} \\) 을 \\( 80^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 4 시간씩 3회 추출하여 \\( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물을 얻었다. \\", "( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물을 10% \\(\\mathrm{MeOH} \\) 에 현탁시켜 용매의 극성을 증 가시키는 용매분획법에 의해 n-hexane 분획, \\( \\mathrm{CHCl}_{3} \\) 분획,\\( \\mathrm{EtOAC} \\) 분획, \\( \\mathrm{n}-\\mathrm{BuOH} \\) 분획, \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\) 분획을 얻었다.", "</p><p>항산화 활성이 우수하게 나타난 EtOAc 분획에 대하여 column chromatography를 수행하였다. \\", "( 30 \\mathrm{~mm} \\) 유리제 column 에 시료 30 배의 silica gel을 n-hexane으로 충진하고 시료 2 \\( \\mathrm{g} \\) 을 흡착시킨 후 EtOAc, EtOAc:MeOH (3:1), EtOAc:MeOH (1:1), EtOAc: \\( \\mathrm{MeOH} \\) (1:3), \\( \\mathrm{MeOH} \\) 순으로 순차적으로 \\( 100 \\mathrm{ml} \\) 씩 내려 5 개의 소 분획으로 나누어 subfraction 1, subfraction 2, subfraction 3, subfraction 4, subfraction 5 로 명명하였다.", "가시상추로부터 생리활성 물질의 분리 및 정제과정을 요약하면 Fig.", "1과 같다.", "</p><h2>일반성분 분석</h2><p>가시상추의 수분, 회분, 조지방, 조단백질, 비타민 등 일반성 분은 식품공전 일반시험법에 따라 정량하였다.", "즉, 수분함량은 상압가열건조법, 회분은 회화법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조단백질은 단백질 자동분석기법을 이용하여 분석하였으며, 값은 백분율로 나타내었다.", "탄수화물 함량은 100 에서 수분, 조단백질, 조지방, 회분함량을 제한 값으로 하였다.", "비타민은 HPLC 법으로 분석하였다.", "</p><h2>Phenol성 화합물 함량 측정</h2><p>Phenol성 물질 분석은 Dewanto 등의 방법에 따라 수행 하였다.", "시료 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 에 2% sodium carbonate \\( 2 \\mathrm{ml} \\) 를 가하여 3 분간 반응시킨 후 50% Folin-Ciocalteu reagent \\( 0.1 \\mathrm{ml} \\) 를 가하여 3분간 반응 후 반응액의 흡광도를 \\( 720 \\mathrm{~nm} \\) 에서 측정하였다.", "표준물질로 gallic acid를 사용하였고 \\( 10,30,50 \\mathrm{ppm} \\) 농도의 검량선을 작성하여 함량을 계산하였다.", "</p><h2>Flavonoid 함량 측정</h2><p>Flavonoid 분석은 Moreno 등의 방법에 따라 수행하였 다.", "시료 \\( 0.1 \\mathrm{ml} \\) 에 \\( 80 \\% \\mathrm{EtOH} 0.9 \\mathrm{ml} \\) 를 혼합하고, \\( 10 \\% \\) alumium nitrate \\( 0.1 \\mathrm{ml}, 1 \\mathrm{M} \\) potassium acetate \\( 0.1 \\mathrm{ml} \\) 및 EtOH \\( 4.3 \\mathrm{ml} \\) 를 각각 첨가하여 상온에서 40 분간 반응한 후 \\( 415 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "표준물질로 quercetin을 사용하였 고 \\( 50,100,150 \\mathrm{ppm} \\) 농도의 검량선을 작성하여 함량을 계산 하였다.", "</p><h2>아질산염 제거 활성 측정</h2><p>아질산염 제거 활성은 Gray 및 Dugan의 방법에 의하여 측정하였다. \\", "( 1 \\mathrm{mM} \\) sodium nitrate 용액 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 에 분획별 추출물 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 가하고 \\( 0.1 \\mathrm{~N} \\mathrm{HCl} \\) 을 사용하여 반응 용액의 \\( \\mathrm{pH} \\) 를 1.2 로 조정한 다음 증류수로 총량을 \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 로 하였다.", "이 용액을 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 1 시간 반응 시킨 후 각 반응액을 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 씩 취하여 2% acetic acid용액 \\( 5 \\mathrm{ml} \\), Griess 시약(A:B=1:1, A: 1% silfanilic acid in 30% acetic acid, B:1% naphthylamine in 30% acetic acid) \\( 0.4 \\) \\( \\mathrm{ml} \\) 를 첨가하여 잘 혼합하여 실온에서 15 분간 방치시킨 후 520 \\( \\mathrm{nm} \\) 에서 흡광도를 측정하여 아질산염 제거능을 측정하였다.", "</p> <h2>아질산염 제거 활성 기능 측정</h2><p>가시상추의 아질산염 제거 작용은 Table 6 과 같이 EtOAc 분획이 \\( 2 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 첨가시 \\( 63.0 \\% \\) 로 가장 높게 나타났으며, \\( \\mathrm{n}-\\mathrm{Bu} \\) \\( \\mathrm{OH} \\) 분획 \\( 35.6 \\%, \\mathrm{CHCl}_{3} \\) 분획 \\( 31.5 \\%, \\mathrm{n} \\)-hexane 분획 \\( 7.1 \\%, \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\) 분획 \\( 5.7 \\% \\) 로 나타났다.", "</p><p>아질산염 제거 활성에 영향을 미치는 성분으로는 Vitamin C, 아미노산과 펩타이드, phenol성 물질과 flavonoid 등이 보 고 되고 있으며, 가시상추의 아질산염 제거 활성은 각 분획에 용해되어 있는 이러한 성분들이 복합적으로 작용한 것으로 추정되며, nitrosamine의 생성을 효과적으로 억제함과 동시에 산화방지 효과 등 식품의 보존제로서 이용이 가능할 것으로 생각된다.", "</p><h2>항산화 활성 측정</h2><p>가시상추 각 분획별 항산화 활성을 측정한 결과, 용매 분획에 의한 항산화 활성은 \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획이 \\( 56.2 \\% \\) 로 가장 강한 항산화 활성을 나타내었으며, 천연 항산화제로 많이 사용되고 있는 a-tocopherol 보다 항산화 활성이 우수하였고, 합성 산화방지제인 BHA보다는 조금 낮았다", "(Fig. 2).", "우수하게 나타난 EtOAc 분획을 column chromatography를 수행하여 정제한결과, subfraction 2 에서 가장 우수한 항산화 활성이 나타났다", "(Fig. 3).", "Subfraction 2를 GC-MS로 분석한 결과, \\( p \\)-coumaric acid, caffeic acid로 동정되었다.", "Lee 및 Do 는 복분자 열매 의 항산화 활성 연구에서 phenol성 물질의 성분이 caffeic acid 라고 하였으며, Kim 등은 씀바귀 생즙 추출물의 생리활성에서 EtOAc 분획이 가장 강한 항산화 활성을 나타내었고, 항산화 작용이 vitamin C나 flavonoid의 작용에 의한 것으로, Kim 등도 대추잎 추출물의 생리활성 작용에서 EtOAc 분획에서 항산화 활성이 가장 높게 나타났다고 하였다.", "Kim 등은 다류원료 식물류 물 추출물의 항산화 효과에서 식물류 종류에 따라 항산화성에 많은 차이를 보였으며, 이들의 항산화성은 단일 항산화성 물질의 효과에 기인하기 보다는 phenol 성 화합물, vitamin C 등 복합적 효과에 의한 것이라 하였다.", "</p><h2>항산화 성분의 함량 분석</h2><p>항산화 성분의 함량을 비교하기 위하여 가시상추 잎, \\( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물, EtOAc 분획, column chromatography 분획 을 추출과 정제과정을 거쳐 GC로 정량한 결과는 Table 7과 같다.", "가시상추 잎에서 분리한 2종 성분의 총 함량은 \\( 0.08 \\% \\) \\( (p \\)-coumaric acid \\( 0.02 \\% \\), caffeic acid \\( 0.06 \\%) \\) 였으며, \\( \\mathrm{MeOH} \\) 조 추출물은 \\( 1.8 \\%(p \\)-coumaric acid \\( 0.5 \\% \\), caffeic acid \\( 1.3 \\%) \\) 이었 다. \\", "( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물을 용매 분획한 \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획의 총 함량은 \\( 6.7 \\%(p \\)-coumaric acid \\(1.7\\%\\), caffeic acid \\(5.0\\%\\))이고, EtOAc 분획을 column chromatography를 수행하여 얻은 subfraction 2 분획의 총 함량은 \\( 13.6 \\% \\) (p-coumaric acid \\( 4.1 \\% \\), caffeic acid \\( 9.5 \\%) \\) 로 정제를 진행 할수록 함량이 높아졌으며, p-coumaric acid 보다 caffeic acid의 함량이 높게 나타났다.", "Subfraction 3 의 함량은 \\( p \\)-coumaric acid 1.5\\%, caffeic acid \\( 4.8 \\% \\) 로 총 \\( 6.3 \\% \\) 로 나타났으며, subfraction 1은 \\( 0.2 \\% \\), subfraction 4 는 \\( 0.5 \\% \\), subfraction 5 는 \\( 0.3 \\% \\) 로 낮은 함량을 나타내었다.", "따라서 \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획에서 분리한 항산화 성분은 subfraction 2와 subfraction 3에 대부분 존재하는 것으로 확인되었다.", "</p><h2>확인된 성분의 항산화 활성 측정</h2><p>확인된 2종의 화합물은 표준품을 이용하여 항산화 효과를 측정하였으며, 그 결과는 Fig.", "4 와 같다.", "항산화 효과를 측정하 기 위하여 추출과 정제 과정을 거친 \\( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물, \\( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물을 분획한 \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획, \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획을 column chromatography를 수행하여 얻은 subfraction 2 분획, subfraction 2 에서 확인한 2종의 화합물을 천연항산화제로 많이 이용되고 있는 \\( \\alpha \\)-tocopherol과 합성산화방지제인 BHA와 비교하였다. \\", "( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물은 \\( 7.8 \\% \\) 의 항산화 활성을 나타내었고, \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획은 \\( 31.6 \\% \\), subfraction 2 분획은 \\( 74.3 \\% \\) 로 높아졌다.", "Subfraction 2에서 확인된 2종의 화합물 중 \\( p \\)-coumaric acid는 \\( 2.0 \\% \\) 로 항산화 활성을 거의 나타내지 않았으며, caffeic acid는 \\( 94.0 \\% \\) 로 항산화제인 \\( \\alpha \\)-tocopherol \\(28.5\\%\\)와 BHA \\( 44.3 \\% \\) 보다도 매우 높은 항산화 활성을 나타내었다.", "따라서 가시상추 추출물에서 항산화 활성을 나타낸 성분은 caffeic acid에 기인된 것으로 생각된다.", "</p><h2>식중독균에 대한 항균 활성 측정</h2><p>식중독균에 대한 항균 활성을 검색하기 위하여 디스크확산 법을 이용하여 7종의 균주에 대하여 실험한 결과(Table 8), \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획에서 가장 강한 항균 활성이 나타났다.", "</p><p>\\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획은 실험균주 7종 모두에 항균 활성을 나타내었으며, \\( \\mathrm{CHCl}_{3} \\) 분획은 6 종, \\( \\mathrm{n} \\)-hexane 분획과 \\( \\mathrm{BuOH} \\) 분획은 5 종, \\( \\mathrm{MeOH} \\) 조추출물은 2종의 균주에 대하여 항균 활성을 나타내 었으나, \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\) 분획은 전혀 항균 활성을 나타내지 않았다.", "</p><p>Song 등은 청미래덩굴 뿌리에서 추출한 분획에서 \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획, \\( \\mathrm{CHCl}_{3} \\) 분획, \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\) 분획의 순으로 항균성이 나타나 본 실험의 결과와 유사하였다.", "이상의 결과를 종합하면 가시상추의 항균성은 주로 \\( \\mathrm{EtOAc} \\) 분획에서 기인된 것으로 생각 된다.", "하지만 항균 활성을 담당하고 있는 화합물을 규명하기 위해서는 좀 더 정확한 분석이 요구된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "가시상추 유래 생리활성물질의 분리 및 특성 규명", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-b7efbabb-27e6-451a-ae36-ea6a0bea72ef", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2009", "doc_author": [ "문성일", "김성환", "허완", "김순영", "김종식", "이건주" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,332	<h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity:SODA 측정)</h2><p>기장 및 진도산 가닥미역과 기장 및 완도산 실미역의 methanol 추출물을 이용하여 SOD 유사활성 측정 결과를 Table 6에 나타냈다. SODA 측정 결과, 미역의 메탄올추출물 농도가 증가할수록 항산화 효과가 증가하였고, 기장 및 진도산 가닥미역의 SOD 유사활성은 각각 \( 66.1 \% \)와 \( 72.5 \%(10 \) \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) )였으며, 기장 및 완도산 실미역의 SODA 유사활성은 각각 \( 63.0 \% \)와 \( 71.4 \%(10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)로 측정되어, SOD-like 활성은 진도산 가닥미역과 완도산 실미역의 methanol 추출물에서 높게 나타났다. Superoxide dismutase (SOD)는 항산화 효소로서 세포에 유해한 oxygen radical를 과산화수소로 전환시키고 다시 catalase에 의하여 무해한 물 분자와 산소분자로 전환시켜 활성산소로부터 생체를 보호하는 것으로 알려져 있다. SOD는 분자량이 비교적 큰 단백질로서 열이나 알칼리에 약하여 이러한 단점을 보완할 수 있는 저분자물질로 체내에서 역할이 유사한 SOD 유사활성 물질에 대한 연구가 진행되어 있다.</p><h2>NO 생성 저해 효과</h2><p>대장균(Escherichia coli)에 의하여 생성된 bacterial lipopolysaccharise (LPS)를 대식세포에 처리하여 NO를 유도시킨 다음, 기장 및 진도산 가닥미역과 기장 및 완도산 실미역의 메탄올추출물을 각각 처리하여 NO 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 각 미역의 methanol 추출물 \( (200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)을 처리하여 LPS에 의한 NO생성 저해효과는 기장 및 완도산 가닥미역의 경우 각각 \( 40.7 \% \)와 \( 28.6 \% \)였으며, 기장 및 완도산 실미역의 NO생성 저해효과는 각각 \( 44.2 \% \)와 \( 35.7 \% \)로 가닥미역과 실미역 모두 기장산에서 NO생성 억제율이 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 미역 methanol 추출물이 면역기능과 밀접한 관계가 있음을 보여주는 것이다.</p><p>NO는 대부분의 포유류 동물의 세포내에서 생성되고 신경계에서는 화학적 신호 전달 물질로서 혈관계에서는 혈압 조절과 혈소판의 응집 및 호중성구의 집합작용, 골격근에서는 대사와 근 수축 조절 등 생리학적으로 중요한 역할을 한다. 최근 염증반응을 완화시키는데 있어서도 종래에 사용되어온 NO를 소거하는 방식보다는 superoxide anion의 생성을 저해하거나 NADPH oxidase의 활성을 감소시키는 방법이 더욱 비중 있게 다루어지고 있다.</p><p>세포독성활성은 MTT분석을 통하여 측정하였으며 LPS로 처리된 대식세포는 약 \( 50 \% \) 정도의 세포감소를 나타냈지만 미역추출물을 첨가하면 정상수준으로 회복되는 것이 관찰되었다(data not shown).</p>	생명과학	[ "<h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity:SODA 측정)</h2><p>기장 및 진도산 가닥미역과 기장 및 완도산 실미역의 methanol 추출물을 이용하여 SOD 유사활성 측정 결과를 Table 6에 나타냈다.", "SODA 측정 결과, 미역의 메탄올추출물 농도가 증가할수록 항산화 효과가 증가하였고, 기장 및 진도산 가닥미역의 SOD 유사활성은 각각 \\( 66.1 \\% \\)와 \\( 72.5 \\%(10 \\) \\( \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) )였으며, 기장 및 완도산 실미역의 SODA 유사활성은 각각 \\( 63.0 \\% \\)와 \\( 71.4 \\%(10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}) \\)로 측정되어, SOD-like 활성은 진도산 가닥미역과 완도산 실미역의 methanol 추출물에서 높게 나타났다.", "Superoxide dismutase (SOD)는 항산화 효소로서 세포에 유해한 oxygen radical를 과산화수소로 전환시키고 다시 catalase에 의하여 무해한 물 분자와 산소분자로 전환시켜 활성산소로부터 생체를 보호하는 것으로 알려져 있다.", "SOD는 분자량이 비교적 큰 단백질로서 열이나 알칼리에 약하여 이러한 단점을 보완할 수 있는 저분자물질로 체내에서 역할이 유사한 SOD 유사활성 물질에 대한 연구가 진행되어 있다.", "</p><h2>NO 생성 저해 효과</h2><p>대장균(Escherichia coli)에 의하여 생성된 bacterial lipopolysaccharise (LPS)를 대식세포에 처리하여 NO를 유도시킨 다음, 기장 및 진도산 가닥미역과 기장 및 완도산 실미역의 메탄올추출물을 각각 처리하여 NO 합성에 미치는 영향을 조사하였다.", "각 미역의 methanol 추출물 \\( (200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}) \\)을 처리하여 LPS에 의한 NO생성 저해효과는 기장 및 완도산 가닥미역의 경우 각각 \\( 40.7 \\% \\)와 \\( 28.6 \\% \\)였으며, 기장 및 완도산 실미역의 NO생성 저해효과는 각각 \\( 44.2 \\% \\)와 \\( 35.7 \\% \\)로 가닥미역과 실미역 모두 기장산에서 NO생성 억제율이 높은 것으로 나타났다.", "이러한 결과는 미역 methanol 추출물이 면역기능과 밀접한 관계가 있음을 보여주는 것이다.", "</p><p>NO는 대부분의 포유류 동물의 세포내에서 생성되고 신경계에서는 화학적 신호 전달 물질로서 혈관계에서는 혈압 조절과 혈소판의 응집 및 호중성구의 집합작용, 골격근에서는 대사와 근 수축 조절 등 생리학적으로 중요한 역할을 한다.", "최근 염증반응을 완화시키는데 있어서도 종래에 사용되어온 NO를 소거하는 방식보다는 superoxide anion의 생성을 저해하거나 NADPH oxidase의 활성을 감소시키는 방법이 더욱 비중 있게 다루어지고 있다.", "</p><p>세포독성활성은 MTT분석을 통하여 측정하였으며 LPS로 처리된 대식세포는 약 \\( 50 \\% \\) 정도의 세포감소를 나타냈지만 미역추출물을 첨가하면 정상수준으로 회복되는 것이 관찰되었다", "(data not shown).", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "시판 미역의 영양성분 및 생리활성 분석", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-c1319c6f-402f-453b-bcfc-d3052ed80216", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "최재석", "배희정", "김양춘", "박남희", "김태봉", "최영주", "최은영", "박선미", "최인순" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,333	<h1>초록 : Hsp70.1유전자결핍된 마우스에서 허혈 재관류 신장손상에 대한 전처치 운동의 보호효과</h1><p>이 연구는 Hsp70.1 유전자가 결핍된 생쥐를 이용하여 운동전처치에 따른 신장허혈재관류손상에서 혈청 크레아틴, 신장에서 CuSOD와 MnSOD의 발현변화를 관찰하는데 그 목적을 두고 있다. 실험동물은 c57/BL6 계 수컷 (wild trpe: WT)과 Hsp70.1 knockout KO 생주를 정상대조군\( (\mathrm{n}=8) \), 운동군 \( (\mathrm{n}=8) \), 허혈운동군 \( (\mathrm{n}=8) \) 및 허혈군 \( (\mathrm{n}=8) \)의 4군으로 분류하여 이용하였다. 실험종료 후 마취를 한 후 혈청 creatinine을 분석하기 위해서 신장에서 혈액을 추출하였고, 신장을 적출하여 wes ern blot 으로 eCuSOD와 MnSOD 발현변화를 비교하였다. KO 허혈군에서의 CuSOD, MnSOD는 다른 군에 비해 유의하게 낮게 \( (\mathrm{p}<0.001, \mathrm{p}<0.05) \) 발현하였으며, creatinine은 높은 \( (\mathrm{p}<0.001) \)농도로 나타났다. 반면 WT에서는 유의한 변화가 나타나지 않았다. 흥미롭게도 KO 허혈운동군에서의 CuSOD, MnSOD는 허혈군보다 뚜렷하게 증가하였으며, creatinine은 허혈군에 비해 현저히 감소 \( (\mathrm{p}<0.01) \)하였다. 이상의 결과를 종합하면 Hsp70은 신장허혈재관류손상에 직접적인 관련이 있음을 추정할 수 있다. 따라서 운동전 처치는 허혈성신장기능저하에 예방할 수 있다고 생각된다.</p>	생명과학	[ "<h1>초록 : Hsp70.1유전자결핍된 마우스에서 허혈 재관류 신장손상에 대한 전처치 운동의 보호효과</h1><p>이 연구는 Hsp70.1 유전자가 결핍된 생쥐를 이용하여 운동전처치에 따른 신장허혈재관류손상에서 혈청 크레아틴, 신장에서 CuSOD와 MnSOD의 발현변화를 관찰하는데 그 목적을 두고 있다.", "실험동물은 c57/BL6 계 수컷 (wild trpe: WT)과 Hsp70.1 knockout KO 생주를 정상대조군\\( (\\mathrm{n}=8) \\), 운동군 \\( (\\mathrm{n}=8) \\), 허혈운동군 \\( (\\mathrm{n}=8) \\) 및 허혈군 \\( (\\mathrm{n}=8) \\)의 4군으로 분류하여 이용하였다.", "실험종료 후 마취를 한 후 혈청 creatinine을 분석하기 위해서 신장에서 혈액을 추출하였고, 신장을 적출하여 wes ern blot 으로 eCuSOD와 MnSOD 발현변화를 비교하였다.", "KO 허혈군에서의 CuSOD, MnSOD는 다른 군에 비해 유의하게 낮게 \\( (\\mathrm{p}<0.001, \\mathrm{p}<0.05) \\) 발현하였으며, creatinine은 높은 \\( (\\mathrm{p}<0.001) \\)농도로 나타났다.", "반면 WT에서는 유의한 변화가 나타나지 않았다.", "흥미롭게도 KO 허혈운동군에서의 CuSOD, MnSOD는 허혈군보다 뚜렷하게 증가하였으며, creatinine은 허혈군에 비해 현저히 감소 \\( (\\mathrm{p}<0.01) \\)하였다.", "이상의 결과를 종합하면 Hsp70은 신장허혈재관류손상에 직접적인 관련이 있음을 추정할 수 있다.", "따라서 운동전 처치는 허혈성신장기능저하에 예방할 수 있다고 생각된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "", "eng": "Pre-Exercise Protective Effects Against Renal Ischemic Reperfusion Injuty in Hsp 70.1 Knockout Mice" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-b611c234-2706-4d2f-8020-188948aece9f", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", "doc_author": [ "이진", "김원규" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,334	<h1>서 론</h1><p>누룩은 우리나라의 전통주인 탁주 및 약주의 양조에 있어서 쌀 등의 전분질 원료를 분해하는 amylase를 비롯한 각종 가수분해효소를 공급하고 효모와 발효관련 미생물의 접종원으로 중요한 역할을 하고 있으며 이는 종류나 질에 따라 주질에 미치는 영향이 매우 크다.</p><p>누룩 미생물에 관한 연구는 1900 년대 초부터 시작하여 세균, 효모 및 진균 등 다양한 종이 영양배지를 이용하여 분리 \(\cdot\)동정되었다. 유 등의 보고에 따르면 1906년에서 1945년 사이에 다양한 세균(4속 16 종), 효모(8속 29종) 그리고 사상균(12속 59종)이 보고 되었으며 이후 분류 \(\cdot\) 동정기술의 발달에 의해 세분화된 종들이 추가적으로 보고되었다 . 누룩으로부터 유산균의 분리 \(\cdot\) 동정은 누룩이 탁주의 발효에 있어 전분의 가수분해와 알코올발효에 대한 역할 외에 탁주가 발효식품으로서 영양학적 가치를 높이는 데 주요한 역할을 하였다.</p><p>분자생물학적 기술은 미생물군집의 구조, 다양성을 밝히기 위해 이용되었으며, 미생물들은 16S 또는 28S rRNA gene과 같은 분자마커를 이용한 미생물의 동정을 위해 흔히 사용되어 왔다. DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석에서 크기는 동일하나 서열이 다른 DNA 증폭자(amplicons)를 분리할 수 있었다. 이러한 기술은 토양, 해양, 곤충, sludge 등 다양한 환경에서 미생물의 dy-namics 연구를 위해 광범위하게 이용되고 있다. 또한 이러한 방법은 김치, 와인, sausage , sourdough , coffee와 같은 식품에서 yeast 다양성 연구에도 이용되어왔다.</p><p>본 연구에서는 16S와 28S rRNA 유전자를 이용한 PCR-DGGE기술을 이용하여 탁주제조를 위한 전통누룩의 미생물 군집 다양성에 대한 연구를 수행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>누룩의 전처리</h2><p>누룩시료로는 (유)금정산성토산주에서 산성막걸리 생산을 위해 제조된 산성누룩을 사용하였다. 시료의 균질화는 누룩 \(10\mathrm{~g} \)을 분쇄하여 이루어졌으며 이중 \( 2 \mathrm{~g} \)은 미생물계수를 위해 그리고 \( 2 \mathrm{~g} \)은 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석을 위해 이용하였으며 나머지는 균주 보관용 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하였다.</p><h2>미생물 count 및 분리</h2><p>균질화된 누룩 \( 1 \mathrm{~g} \)을 생리식염수 \( 9 \mathrm{~ml} \)에 첨가하여 연속희석법으로 희석한 후 일반세균은 Plate Count Agar (PCA; Difco, USA)배지에 진균은 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco, USA) 배지에 도말하여 접종하였다. 배양은 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수행하였으며 PCA는 3일간 그리고 PDA는 5일간 배양 한 후 성장된 집락(colony)을 계수하였다. 미생물의 분리는 성장된 집락의 모양과 색을 기준으로 동일배지를 이용하여 분리하였으며 순수 분리된 균주는 \( 20 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) glycerol에 현탁 한 후 \( -70{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 보존하였다.</p><h2>Total genomic DNA의 추출</h2><p>누룩으로부터 세균과 진균의 genomic DNA 추출을 위한 세포파쇄를 위해 균질화된 누룩 \( 1 \mathrm{~g} \)을 막자 사발에 넣고 액체 질소를 이용하여 세포파쇄를 하였으며 동일과정을 4회 반복하였다. Genomic DNA의 추출은 hot phenol extraction법 에 의거하여 수행하였으며 그 방법은 다음과 같다. 액체질소에 첨가한 파쇄된 시료 \( 0.25 \mathrm{~g} \)은 Lysis buffer (\(50 \mathrm{~mM}\) Tris-base, \(20 \mathrm{~mM} \) EDTA, \(400 \mathrm{~mM} ~\mathrm{NaCl}, 0.75 \mathrm{~M} \) sucrose) \(1 \mathrm{~ml}, 10 \% \) sodium dodecyl sulfate (SDS) \( 100 \mu \mathrm{l}\)를 첨가한 후 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 15분간 반응하였다. 시료에 RNase A \( (10 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \)를 \( 10 \mu\mathrm{l}\) 첨가한 뒤 상온에서 5분 반응시킨 후 원심분리(\(16,000\times g, 10 \mathrm{~min}\))하여 상등액 \( 750 \mathrm{\mu l} \)를 취하였다. 동량에 phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1)을 첨가하여 혼합한 후 원심 분리 \( (16,000 \times g, 10 \mathrm{~min}) \)를 통하여 상등액 \( 600 \mathrm{\mu l} \)를 취하였다. 이 상등액에 동량의 chloroform: isoamyl alcohol (24:1)를 넣고 원심 분리한 후 상등액 \( 400 \mathrm{\mu l} \)를 빈 튜브에 옮기고 \( 100 \% \) cold ethanol \( 1 \mathrm{ml}, 3 \mathrm{M} \) sodium acetate \( 40 \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에서 200분 이상 정치하였다. 이후, 튜브를 원심분리(\(14,000\times g, 10 \mathrm{~min}) \)한 후 상등액을 제거하고 \( 70 \% \) cold etha-nol \( 1 \mathrm{ml} \)을 사용하여 혼합한 후 원심 분리하여 상등액을 제거하고 건조하였다. 최종적으로 \(100 \mathrm{\mu l} \)의 증류수에 용해한 후 \( 1 \% \) agarose gel을 이용하여 전기영동을 한 후 ethidium bro-mide (EtBr)로 염색하여 확인하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>누룩 내 미생물의 수와 순수 분리된 종의 동정</h2><p>(유)금정산성토산주의 누룩에서 일반세균은 \( 2.7 \times 10^{9} \mathrm{CFU} / \mathrm{g} \), 진균은 \( 3.5 \times 10^{8} \mathrm{CFU} / \mathrm{g} \)으로 나타났다(Fig. 1). 세균 수는 진균보다 약 10배 높게 나타났다. 김과 고의 보고에 따르면 전국에서 수집한 35종의 전통누룩에서 진균의 수는 \( 6.4 \times 10^{5} \sim \) \( 4.5 \times 10^{7} \mathrm{CFU} / \mathrm{g} \) 수준으로 나타났으며 본 결과에서 진균의 수가 다소 높게 나타났다. 배양된 plate에서 대표 종과 PCR-DGGE profile에서 우점종과의 비교를 위해 상기 계수된 plate로부터 colony의 형태적인 차이에 의해 대표성을 갖는 세균 4종과 진균 8종을 순수분리하였다. 분리균을 대상으로 16S및 28S rRNA gene염기서열을 결정하였으며 NCBI의 Gnenbank에 등록된 미생물과의 BLAST search를 통하여 가장 높은 유사성을 나타낸 종을 대상으로 동정한 결과는 Table 1에 나타내었다. 4종의 분리세균은 Actinobacteria인 Kocuria rhizophila, K. halotolerans, Proteobacteria인 Pantoea agglomerans 그리고 유산균인 Pediococcus pentosaceus로 동정되었다. 8종의 분리된 진균은 조상균인 Lichtheimia corymbifera, Mucor racemosus, Rhizopus microspores (2종), 자낭균류인 Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, 그리고 효모성 진균인 Trichomonascus farinosus, Pichia kudriavzevii 로 동정되었다.</p><h2>DGGE를 이용한 세균의 다양성 분석</h2><p>누룩으로부터 얻어진 total genomic DNA로부터 16S rRNA gene을 이용한 nested-PCR을 수행하였으며 세균의 다양성을 알아보기 위해 DGGE를 수행 하여 Fig. 2A에 나타내었다. DGGE분석 결과 16개의 구분되는 band를 확인하였으며 그 중 3개의 band가 다른 band들에 비하여 밀도가 높게 나타나 주된 우점군으로 판단되었다. 각 band의 DNA를 회수하여 염기서열을 결정한 후 NCBI의 BLAST search를 통하여 유사성이 높은 종을 대상으로 동정한 결과를 Fig. 2B에 나타내었다. 그 결과 Lactobacillus속(2종), Pediococcous속, Weissella속 (2종), Staphylococcus속, Pantoea속(2종)으로 나타났으며 그 외 uncultured bacterium, endophytic bacterium, uncultured Cyanobacteria와 Actinobacteria로 총 9속을 확인할 수 있었다. 또한 누룩 내 세균들 중에서 유산균이 많은 비율을 차지하였다. DGGE profile에서 band의 밀도를 비교하였을 때 주된 우점세균은 Pediococcous pentosaceus (B2와 B7) 그리고 비배양균인 Cyanobacteria (B11)로 판단된다. DGGE profile과 비교하여 PCA배지로부터 분리된 세균(Table 1)은 P. pentosaceus와 Pantoea agglomerans 였으며 그 외는 일치하지 않았다. 특히 배양에서 분리된 Actinobacteria인 Kocuria rhizophila와 K. hal-otolerans는 DGGE profile에서 동일 종은 검출되지 않았으나 uncultured actinobacterium이 검출되었다. 또한 DGGE방법은 PCR방법에 의존하기 때문에 검출한계인 \( 10^{4} \) cells 이하의 낮은 개체수로 인하여 검출되지 않은 것으로 사료된다. 국내에서 보고된 누룩 세균은 Bacillus, Micrococcus, Mycoplana, Erwinia, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerobacter, Pseudomonas, Bacillus, Enterococcu으로 총 11개의 속이며 기존에 보고된 2개의 속 외에 본 연구에서 새로 7속을 확인할 수 있었다.</p><p>국내 누룩에서 분리된 세균으로는 1945년 이전 국내 누룩 세균에 대한 고찰에서 Bacillus속(3종), Micrococcus속(4종), Mycoplana속(1종), Erwinia속(2종)이 동정되었다고 보고하였다. 신과 조는 Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenter-oides, Aerobacter속, Pseudomonas 속 등의 세균을 보고하였다. 양과 이는 산성누룩에서 Micrococcus varians, Bacillus subtilis를, 그리고 조와 하는 국내 누룩 유산균으로 L. medsen-teroides, Pediococcus acifilactici, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus murinus, Enterococcu faecium을 보고하였다. DGGE 분석결과와 비교할 때 L. plantarum을 제외한 대부분의 세균은 누룩에서 처음으로 보고된 종으로 판단된다.</p><p>누룩에서 순수분리된 균주와 비교하였을 때 DGGE 분석결과는 누룩 세균군집의 다양성을 보다 효율적으로 확인할 수 있었을 뿐만 아니라 종간의 풍부성(richness)의 상대적인 비교를 간접적으로 확인할 수 있었다(Table 1; Fig. 2).</p><h2>DGGE를 이용한 진균의 다양성 분석</h2><p>누룩으로부터 얻어진 total genomic DNA로부터 28S rRNA gene을 이용한 nested-PCR을 수행하였으며 누룩 진균의 다양성을 알아보기 위해 DGGE를 수행 하여 Fig. 3A에 나타내었다. 그 결과 DGGE profile에서 총 8개의 구분되는 band를 확인하였으며 2개의 band가(E7과 E8) 상대적으로 밀도가 높아 우점군으로 판단된다.</p><p>각 band로부터 DNA를 회수하여 염기서열을 결정한 후 NCBI BLAST search를 통하여 유사성이 높은 종을 대상으로 동정한 결과 Fig. 3B에 나타내었다. 그 결과 누룩 진균은 Pichia 속, Torulaspora 속, Wickerhamomyces 속, Sacharomycopsis 속, Aspergillus 속으로 5개의 속이었다. 이는 기존에 보고된 누룩 진균의 속인 Aspersillus, Mucor, Rhizopus, Absidia, Penicillum, Monascus, Amyolmyces, Saccharomyeces, Endomyces, Pichia, Hansenulas, Torulopsis, Candida 와 비교하여 (유)금정산성토산주에서 생산되는 누룩의 DGGE 결과에서 사상성 진균인 Aspergillus oryzae를 제외한 종은 검출되지 않았으나 효모성 진균인 Saccharomycopsis fibuligera, Torulaspora delbrueckii, Wickerhamomyces anomalus, Trichosporon asahii는 누룩진균으로 처음 확인할 수 있었다. 또한 DGGE 분석에서 높은 밀도를 보인 E7은 Pichia kudriavzevii 그리고 E8은 A. or-yzae로 동정되어 (유)금정산성토산주의 누룩에서 주된 진균으로 나타났다.</p><p>누룩으로부터 분리된 진균은 종 8종으로 효모성 진균이 2종 그리고 조상균이 4종 그리고 자낭균이 2종으로(Table 1) DGGE 분석결과와 비교하였을 때 P. kudriavzevii 와 A. oryzae인 2종만이 일치하였다. 이러한 종간의 불일치는 성장배지에서 분리된 진균들의 경우 성장된 군체의 형태적인 특성에 기초하여 분리하였기 때문으로 사료된다. 누룩에 존재하는 세균, 효모 및 사상성 진균의 세포(포자를 포함)로부터 total ge-nomic DNA를 추출하기 위해 세포파쇄는 액체질소 균질화 방법을 적용하였다. 일반적으로 성장세포보다는 포자의 파괴 효율이 다소 낮을 수는 있지만 Fig. 3에서 A. oryzae가 주된 우점종 중의 한 종으로 검출되어 사상성 진균의 세포 또는 포자 파쇄에 문제점은 낮은 것으로 판단된다. 시료에 존재하는 미생물의 검출효율에 있어 PCR-DGGE 기술은 시료 내에 종의 개체수가 \( 10^{4} \) cells 이하일 경우 검출되지 않는 한계성을 갖고 있어, 배양방법에 의해 분리된 사상성 진균은 낮은 개체수로 인하여 검출되지 않은 것으로 판단된다.</p><p>본 연구로부터 PCR-DGGE를 이용한 분자학적 기법은 누룩에서 세균, 효모 및 진균의 다양성을 설명하는 데 유의한 분석 방법임을 확인하였다. 세균의 경우 배양 가능한 8종과 비배양균인 4종의 존재를 확인하였다. 또한 진균의 경우 다양한 효모와 사상성 진균의 존재를 확인하였다. 반면 PCR-DGGE방법의 종의 검출한계성으로 낮은 개체수의 종까지 설명하는 데는 한계성이 있음을 확인하였다. 그러나 PCR-DGGE기술은 누룩 내 존재하는 종의 다양성을 효율적으로 설명하고 있어 누룩 내 존재하는 유용한 미생물자원의 확보 그리고 누룩의 기능, 품질평가 및 개량누룩의 개발 등을 연구하는 데 유용한 방법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.</p> <h2>DGGE</h2><p>DGGE는 Bio-Rad Dcode \( { }^{ \mathrm{TM}} \) universal mutation detection system (Bio-Rad, USA)를 이용하여 수행하였다. DGGE run-ning 조건은 두 경우 모두 \( 8 \% \)의 polyacrylamide gel을 사용하였고 denaturant의 농도는 16S rRNA gene 일 때 \( 40 \sim 60 \% \), 28S rRNA gene 일 때 \( 35 \sim 55 \% \)로 제작 하였으며 두 경우 모두 \( 50 \mathrm {~V} \)로 \( 14 \mathrm {~hr} \) 동안 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 UV를 이용하여 확인하였다.</p><h2>DGGE band elution 및 sequencing</h2><p>산성누룩의 Total DNA DGGE running에서 관찰 되는 16S rRNA gene, 28S rRNA gene band pattern에 의해 band로 판단한 부분을 E-tube에 담은 후 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 TE buffer를 넣고 elu-tion 과정을 진행하였다. \( - 70^ {\circ} \mathrm{C} \)와 \( 60^ {\circ} \mathrm{C} \)를 번갈아 가면서 열렸다 녹였다를 2번 반복하여 DNA가 용출 되도록 유도하고 \( 4^ {\circ} \mathrm{C} \)에서 overnight 하였다. 용출된 밴드를 주형 DNA로 사용하여 16S rRNA gene 대상은 338F-GC, 518R primer, 28S rRNA gene 대상은 GCNL-1, LS-2 primer를 이용하여 DNA를 증폭하였다. 증폭된 산물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제 한 뒤 (주)코스모진텍에 의뢰하여 sequencing을 수행하였다.</p><h2>순수 분리된 미생물의 동정</h2><p>순수분리된 세균을 PCA에 도말하여 \( 25^ {\circ} \mathrm{C} \)에서 2일간 배양한 후 Insta Gene Matrix (Bio-Rad, USA)를 이용한 colony PCR을 수행하였다. 증폭을 위한 반응은 누룩의 total genomic DNA를 이용한 16S rRNA gene의 경우와 동일한 조건으로 수행하였다. 진균의 경우 PDA에 도말하여 \( 25^ {\circ} \mathrm{C} \)에서 5일간 배양한 후 균체를 액체질소로 균질화 하였으며, PCR 증폭은 누룩의 total genomic DNA를 이용한 28S rRNA gene의 경우와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 세균과 진균의 PCR 산물은 (주)코스모진택사(한국)에 의뢰하여 sequencing을 수행하였다.</p><h2>염기서열 분석</h2><p>확보된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST, http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)에 등록되어 있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT(developed by Dr. J. Chun, version 3.2) 운영프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b에 의한 align-ment와 similarity를 통해 sequence data들을 비교하였다.</p> <h2>Polymerase Chain Reaction (PCR)</h2><p>누룩으로부터 얻어진 총 genomic DNA를 주형으로 하여 16S rRNA와 28S rRNA gene을 증폭하여 PCR 산물을 획득하였다. 세균은 16S rRNA gene 증폭을 위한 universal primer인 27F primer (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R primer (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였으며, 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다: \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 denatu-ration 30초, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 annealing 15초, \( 74{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 extension 1분 과정을 \(30 \mathrm{~cycle}\) 반복한 후, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 post-extension하였다. 진균은 28S rRNA gene의 증폭을 위한 D1/D2영역의 eukaryotic universal primer인 LROR primer (5'-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3')와 LR5 primer (5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3')를 이용하여 증폭하였으며(Vilgalys, http://www.biology.ducke.edu/fungi/mycolab/primers.htm), 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다: \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 denaturation 30초, \( 56^{\circ} \mathrm{C} \)에서 annealing 15초, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \)에서 extension 50초 과정을 \(30 \mathrm{~cycle}\) 반복한 후, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 post-extension하였다. 반응산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 EtBr로 염색하여 확인 한 다음 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)를 사용해 정제하였다.</p><h2>DGGE-PCR</h2><p>DGGE-PCR은 세균과 진균의 경우 모두16S rRNA와 28S rRNA gene의 증폭산물을 주형으로 nested-PCR과 touch down PCR을 병행하여 수행하였다. 16S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp인 338F-GC primer(5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')와 518R primer (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')이었으며 PCR을 위한 조건은 다음과 같다. \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3분 동안 pre-denaturation 한 후, \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 denaturation 30초, \( 64 \sim 55^{\circ} \mathrm{C} \) touchdown으로 30초, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \)에서 extension 30초 과정을 \( 30 \mathrm{~cy-cle}\) 반복한 후, \( 74^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7분 동안 post-extension하였다. 28S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp인 NL-1 primer (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')와 LS-2 primer (5'-ATT AAA CAA CTC GAC TC-3') 이었으며 PCR을 위한 조건은 16S rRNA의 경우와 동일하게 수행하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>누룩은 우리나라의 전통주인 탁주 및 약주의 양조에 있어서 쌀 등의 전분질 원료를 분해하는 amylase를 비롯한 각종 가수분해효소를 공급하고 효모와 발효관련 미생물의 접종원으로 중요한 역할을 하고 있으며 이는 종류나 질에 따라 주질에 미치는 영향이 매우 크다.", "</p><p>누룩 미생물에 관한 연구는 1900 년대 초부터 시작하여 세균, 효모 및 진균 등 다양한 종이 영양배지를 이용하여 분리 \\(\\cdot\\)동정되었다.", "유 등의 보고에 따르면 1906년에서 1945년 사이에 다양한 세균(4속 16 종), 효모(8속 29종) 그리고 사상균(12속 59종)이 보고 되었으며 이후 분류 \\(\\cdot\\) 동정기술의 발달에 의해 세분화된 종들이 추가적으로 보고되었다 .", "누룩으로부터 유산균의 분리 \\(\\cdot\\) 동정은 누룩이 탁주의 발효에 있어 전분의 가수분해와 알코올발효에 대한 역할 외에 탁주가 발효식품으로서 영양학적 가치를 높이는 데 주요한 역할을 하였다.", "</p><p>분자생물학적 기술은 미생물군집의 구조, 다양성을 밝히기 위해 이용되었으며, 미생물들은 16S 또는 28S rRNA gene과 같은 분자마커를 이용한 미생물의 동정을 위해 흔히 사용되어 왔다.", "DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석에서 크기는 동일하나 서열이 다른 DNA 증폭자(amplicons)를 분리할 수 있었다.", "이러한 기술은 토양, 해양, 곤충, sludge 등 다양한 환경에서 미생물의 dy-namics 연구를 위해 광범위하게 이용되고 있다.", "또한 이러한 방법은 김치, 와인, sausage , sourdough , coffee와 같은 식품에서 yeast 다양성 연구에도 이용되어왔다.", "</p><p>본 연구에서는 16S와 28S rRNA 유전자를 이용한 PCR-DGGE기술을 이용하여 탁주제조를 위한 전통누룩의 미생물 군집 다양성에 대한 연구를 수행하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>누룩의 전처리</h2><p>누룩시료로는 (유)금정산성토산주에서 산성막걸리 생산을 위해 제조된 산성누룩을 사용하였다.", "시료의 균질화는 누룩 \\(10\\mathrm{~g} \\)을 분쇄하여 이루어졌으며 이중 \\( 2 \\mathrm{~g} \\)은 미생물계수를 위해 그리고 \\( 2 \\mathrm{~g} \\)은 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 분석을 위해 이용하였으며 나머지는 균주 보관용 \\( -70^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 냉동고에 보관하였다.", "</p><h2>미생물 count 및 분리</h2><p>균질화된 누룩 \\( 1 \\mathrm{~g} \\)을 생리식염수 \\( 9 \\mathrm{~ml} \\)에 첨가하여 연속희석법으로 희석한 후 일반세균은 Plate Count Agar (PCA; Difco, USA)배지에 진균은 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco, USA) 배지에 도말하여 접종하였다.", "배양은 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 수행하였으며 PCA는 3일간 그리고 PDA는 5일간 배양 한 후 성장된 집락(colony)을 계수하였다.", "미생물의 분리는 성장된 집락의 모양과 색을 기준으로 동일배지를 이용하여 분리하였으며 순수 분리된 균주는 \\( 20 \\%(\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\) glycerol에 현탁 한 후 \\( -70{ }^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 보존하였다.", "</p><h2>Total genomic DNA의 추출</h2><p>누룩으로부터 세균과 진균의 genomic DNA 추출을 위한 세포파쇄를 위해 균질화된 누룩 \\( 1 \\mathrm{~g} \\)을 막자 사발에 넣고 액체 질소를 이용하여 세포파쇄를 하였으며 동일과정을 4회 반복하였다.", "Genomic DNA의 추출은 hot phenol extraction법 에 의거하여 수행하였으며 그 방법은 다음과 같다.", "액체질소에 첨가한 파쇄된 시료 \\( 0.25 \\mathrm{~g} \\)은 Lysis buffer (\\(50 \\mathrm{~mM}\\) Tris-base, \\(20 \\mathrm{~mM} \\) EDTA, \\(400 \\mathrm{~mM} ~\\mathrm{NaCl}, 0.75 \\mathrm{~M} \\) sucrose) \\(1 \\mathrm{~ml}, 10 \\% \\) sodium dodecyl sulfate (SDS) \\( 100 \\mu \\mathrm{l}\\)를 첨가한 후 \\( 60^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 15분간 반응하였다.", "시료에 RNase A \\( (10 \\mathrm{~mg} / \\mathrm{ml}) \\)를 \\( 10 \\mu\\mathrm{l}\\) 첨가한 뒤 상온에서 5분 반응시킨 후 원심분리(\\(16,000\\times g, 10 \\mathrm{~min}\\))하여 상등액 \\( 750 \\mathrm{\\mu l} \\)를 취하였다.", "동량에 phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1)을 첨가하여 혼합한 후 원심 분리 \\( (16,000 \\times g, 10 \\mathrm{~min}) \\)를 통하여 상등액 \\( 600 \\mathrm{\\mu l} \\)를 취하였다.", "이 상등액에 동량의 chloroform: isoamyl alcohol (24:1)를 넣고 원심 분리한 후 상등액 \\( 400 \\mathrm{\\mu l} \\)를 빈 튜브에 옮기고 \\( 100 \\% \\) cold ethanol \\( 1 \\mathrm{ml}, 3 \\mathrm{M} \\) sodium acetate \\( 40 \\mu \\mathrm{l} \\)를 첨가하여 \\( -20^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 200분 이상 정치하였다.", "이후, 튜브를 원심분리(\\(14,000\\times g, 10 \\mathrm{~min}) \\)한 후 상등액을 제거하고 \\( 70 \\% \\) cold etha-nol \\( 1 \\mathrm{ml} \\)을 사용하여 혼합한 후 원심 분리하여 상등액을 제거하고 건조하였다.", "최종적으로 \\(100 \\mathrm{\\mu l} \\)의 증류수에 용해한 후 \\( 1 \\% \\) agarose gel을 이용하여 전기영동을 한 후 ethidium bro-mide (EtBr)로 염색하여 확인하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>누룩 내 미생물의 수와 순수 분리된 종의 동정</h2><p>(유)금정산성토산주의 누룩에서 일반세균은 \\( 2.7 \\times 10^{9} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{g} \\), 진균은 \\( 3.5 \\times 10^{8} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{g} \\)으로 나타났다", "(Fig. 1).", "세균 수는 진균보다 약 10배 높게 나타났다.", "김과 고의 보고에 따르면 전국에서 수집한 35종의 전통누룩에서 진균의 수는 \\( 6.4 \\times 10^{5} \\sim \\) \\( 4.5 \\times 10^{7} \\mathrm{CFU} / \\mathrm{g} \\) 수준으로 나타났으며 본 결과에서 진균의 수가 다소 높게 나타났다.", "배양된 plate에서 대표 종과 PCR-DGGE profile에서 우점종과의 비교를 위해 상기 계수된 plate로부터 colony의 형태적인 차이에 의해 대표성을 갖는 세균 4종과 진균 8종을 순수분리하였다.", "분리균을 대상으로 16S및 28S rRNA gene염기서열을 결정하였으며 NCBI의 Gnenbank에 등록된 미생물과의 BLAST search를 통하여 가장 높은 유사성을 나타낸 종을 대상으로 동정한 결과는 Table 1에 나타내었다.", "4종의 분리세균은 Actinobacteria인 Kocuria rhizophila, K.", "halotolerans, Proteobacteria인 Pantoea agglomerans 그리고 유산균인 Pediococcus pentosaceus로 동정되었다.", "8종의 분리된 진균은 조상균인 Lichtheimia corymbifera, Mucor racemosus, Rhizopus microspores (2종), 자낭균류인 Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, 그리고 효모성 진균인 Trichomonascus farinosus, Pichia kudriavzevii 로 동정되었다.", "</p><h2>DGGE를 이용한 세균의 다양성 분석</h2><p>누룩으로부터 얻어진 total genomic DNA로부터 16S rRNA gene을 이용한 nested-PCR을 수행하였으며 세균의 다양성을 알아보기 위해 DGGE를 수행 하여 Fig.", "2A에 나타내었다.", "DGGE분석 결과 16개의 구분되는 band를 확인하였으며 그 중 3개의 band가 다른 band들에 비하여 밀도가 높게 나타나 주된 우점군으로 판단되었다.", "각 band의 DNA를 회수하여 염기서열을 결정한 후 NCBI의 BLAST search를 통하여 유사성이 높은 종을 대상으로 동정한 결과를 Fig.", "2B에 나타내었다.", "그 결과 Lactobacillus속(2종), Pediococcous속, Weissella속 (2종), Staphylococcus속, Pantoea속(2종)으로 나타났으며 그 외 uncultured bacterium, endophytic bacterium, uncultured Cyanobacteria와 Actinobacteria로 총 9속을 확인할 수 있었다.", "또한 누룩 내 세균들 중에서 유산균이 많은 비율을 차지하였다.", "DGGE profile에서 band의 밀도를 비교하였을 때 주된 우점세균은 Pediococcous pentosaceus (B2와 B7) 그리고 비배양균인 Cyanobacteria (B11)로 판단된다.", "DGGE profile과 비교하여 PCA배지로부터 분리된 세균(Table 1)은 P. pentosaceus와 Pantoea agglomerans 였으며 그 외는 일치하지 않았다.", "특히 배양에서 분리된 Actinobacteria인 Kocuria rhizophila와 K.", "hal-otolerans는 DGGE profile에서 동일 종은 검출되지 않았으나 uncultured actinobacterium이 검출되었다.", "또한 DGGE방법은 PCR방법에 의존하기 때문에 검출한계인 \\( 10^{4} \\) cells 이하의 낮은 개체수로 인하여 검출되지 않은 것으로 사료된다.", "국내에서 보고된 누룩 세균은 Bacillus, Micrococcus, Mycoplana, Erwinia, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerobacter, Pseudomonas, Bacillus, Enterococcu으로 총 11개의 속이며 기존에 보고된 2개의 속 외에 본 연구에서 새로 7속을 확인할 수 있었다.", "</p><p>국내 누룩에서 분리된 세균으로는 1945년 이전 국내 누룩 세균에 대한 고찰에서 Bacillus속(3종), Micrococcus속(4종), Mycoplana속(1종), Erwinia속(2종)이 동정되었다고 보고하였다.", "신과 조는 Lactobacillus casei, Leuconostoc mesenter-oides, Aerobacter속, Pseudomonas 속 등의 세균을 보고하였다.", "양과 이는 산성누룩에서 Micrococcus varians, Bacillus subtilis를, 그리고 조와 하는 국내 누룩 유산균으로 L.", "medsen-teroides, Pediococcus acifilactici, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus murinus, Enterococcu faecium을 보고하였다.", "DGGE 분석결과와 비교할 때 L.", "plantarum을 제외한 대부분의 세균은 누룩에서 처음으로 보고된 종으로 판단된다.", "</p><p>누룩에서 순수분리된 균주와 비교하였을 때 DGGE 분석결과는 누룩 세균군집의 다양성을 보다 효율적으로 확인할 수 있었을 뿐만 아니라 종간의 풍부성(richness)의 상대적인 비교를 간접적으로 확인할 수 있었다", "(Table 1; Fig. 2).", "</p><h2>DGGE를 이용한 진균의 다양성 분석</h2><p>누룩으로부터 얻어진 total genomic DNA로부터 28S rRNA gene을 이용한 nested-PCR을 수행하였으며 누룩 진균의 다양성을 알아보기 위해 DGGE를 수행 하여 Fig.", "3A에 나타내었다.", "그 결과 DGGE profile에서 총 8개의 구분되는 band를 확인하였으며 2개의 band가(E7과 E8) 상대적으로 밀도가 높아 우점군으로 판단된다.", "</p><p>각 band로부터 DNA를 회수하여 염기서열을 결정한 후 NCBI BLAST search를 통하여 유사성이 높은 종을 대상으로 동정한 결과 Fig.", "3B에 나타내었다.", "그 결과 누룩 진균은 Pichia 속, Torulaspora 속, Wickerhamomyces 속, Sacharomycopsis 속, Aspergillus 속으로 5개의 속이었다.", "이는 기존에 보고된 누룩 진균의 속인 Aspersillus, Mucor, Rhizopus, Absidia, Penicillum, Monascus, Amyolmyces, Saccharomyeces, Endomyces, Pichia, Hansenulas, Torulopsis, Candida 와 비교하여 (유)금정산성토산주에서 생산되는 누룩의 DGGE 결과에서 사상성 진균인 Aspergillus oryzae를 제외한 종은 검출되지 않았으나 효모성 진균인 Saccharomycopsis fibuligera, Torulaspora delbrueckii, Wickerhamomyces anomalus, Trichosporon asahii는 누룩진균으로 처음 확인할 수 있었다.", "또한 DGGE 분석에서 높은 밀도를 보인 E7은 Pichia kudriavzevii 그리고 E8은 A. or-yzae로 동정되어 (유)금정산성토산주의 누룩에서 주된 진균으로 나타났다.", "</p><p>누룩으로부터 분리된 진균은 종 8종으로 효모성 진균이 2종 그리고 조상균이 4종 그리고 자낭균이 2종으로(Table 1) DGGE 분석결과와 비교하였을 때 P. kudriavzevii 와 A. oryzae인 2종만이 일치하였다.", "이러한 종간의 불일치는 성장배지에서 분리된 진균들의 경우 성장된 군체의 형태적인 특성에 기초하여 분리하였기 때문으로 사료된다.", "누룩에 존재하는 세균, 효모 및 사상성 진균의 세포(포자를 포함)로부터 total ge-nomic DNA를 추출하기 위해 세포파쇄는 액체질소 균질화 방법을 적용하였다.", "일반적으로 성장세포보다는 포자의 파괴 효율이 다소 낮을 수는 있지만 Fig.", "3에서 A. oryzae가 주된 우점종 중의 한 종으로 검출되어 사상성 진균의 세포 또는 포자 파쇄에 문제점은 낮은 것으로 판단된다.", "시료에 존재하는 미생물의 검출효율에 있어 PCR-DGGE 기술은 시료 내에 종의 개체수가 \\( 10^{4} \\) cells 이하일 경우 검출되지 않는 한계성을 갖고 있어, 배양방법에 의해 분리된 사상성 진균은 낮은 개체수로 인하여 검출되지 않은 것으로 판단된다.", "</p><p>본 연구로부터 PCR-DGGE를 이용한 분자학적 기법은 누룩에서 세균, 효모 및 진균의 다양성을 설명하는 데 유의한 분석 방법임을 확인하였다.", "세균의 경우 배양 가능한 8종과 비배양균인 4종의 존재를 확인하였다.", "또한 진균의 경우 다양한 효모와 사상성 진균의 존재를 확인하였다.", "반면 PCR-DGGE방법의 종의 검출한계성으로 낮은 개체수의 종까지 설명하는 데는 한계성이 있음을 확인하였다.", "그러나 PCR-DGGE기술은 누룩 내 존재하는 종의 다양성을 효율적으로 설명하고 있어 누룩 내 존재하는 유용한 미생물자원의 확보 그리고 누룩의 기능, 품질평가 및 개량누룩의 개발 등을 연구하는 데 유용한 방법으로 활용할 수 있을 것으로 판단된다.", "</p> <h2>DGGE</h2><p>DGGE는 Bio-Rad Dcode \\( { }^{ \\mathrm{TM}} \\) universal mutation detection system (Bio-Rad, USA)를 이용하여 수행하였다.", "DGGE run-ning 조건은 두 경우 모두 \\( 8 \\% \\)의 polyacrylamide gel을 사용하였고 denaturant의 농도는 16S rRNA gene 일 때 \\( 40 \\sim 60 \\% \\), 28S rRNA gene 일 때 \\( 35 \\sim 55 \\% \\)로 제작 하였으며 두 경우 모두 \\( 50 \\mathrm {~V} \\)로 \\( 14 \\mathrm {~hr} \\) 동안 전기영동하여 EtBr로 염색한 후 UV를 이용하여 확인하였다.", "</p><h2>DGGE band elution 및 sequencing</h2><p>산성누룩의 Total DNA DGGE running에서 관찰 되는 16S rRNA gene, 28S rRNA gene band pattern에 의해 band로 판단한 부분을 E-tube에 담은 후 \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\)의 TE buffer를 넣고 elu-tion 과정을 진행하였다. \\", "( - 70^ {\\circ} \\mathrm{C} \\)와 \\( 60^ {\\circ} \\mathrm{C} \\)를 번갈아 가면서 열렸다 녹였다를 2번 반복하여 DNA가 용출 되도록 유도하고 \\( 4^ {\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 overnight 하였다.", "용출된 밴드를 주형 DNA로 사용하여 16S rRNA gene 대상은 338F-GC, 518R primer, 28S rRNA gene 대상은 GCNL-1, LS-2 primer를 이용하여 DNA를 증폭하였다.", "증폭된 산물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제 한 뒤 (주)코스모진텍에 의뢰하여 sequencing을 수행하였다.", "</p><h2>순수 분리된 미생물의 동정</h2><p>순수분리된 세균을 PCA에 도말하여 \\( 25^ {\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 2일간 배양한 후 Insta Gene Matrix (Bio-Rad, USA)를 이용한 colony PCR을 수행하였다.", "증폭을 위한 반응은 누룩의 total genomic DNA를 이용한 16S rRNA gene의 경우와 동일한 조건으로 수행하였다.", "진균의 경우 PDA에 도말하여 \\( 25^ {\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 5일간 배양한 후 균체를 액체질소로 균질화 하였으며, PCR 증폭은 누룩의 total genomic DNA를 이용한 28S rRNA gene의 경우와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다.", "세균과 진균의 PCR 산물은 (주)코스모진택사(한국)에 의뢰하여 sequencing을 수행하였다.", "</p><h2>염기서열 분석</h2><p>확보된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST, http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)에 등록되어 있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT(developed by Dr. J. Chun, version 3.2) 운영프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b에 의한 align-ment와 similarity를 통해 sequence data들을 비교하였다.", "</p> <h2>Polymerase Chain Reaction (PCR)</h2><p>누룩으로부터 얻어진 총 genomic DNA를 주형으로 하여 16S rRNA와 28S rRNA gene을 증폭하여 PCR 산물을 획득하였다.", "세균은 16S rRNA gene 증폭을 위한 universal primer인 27F primer (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R primer (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였으며, 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다", ": \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 denatu-ration 30초, \\( 56^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 annealing 15초, \\( 74{ }^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 extension 1분 과정을 \\(30 \\mathrm{~cycle}\\) 반복한 후, \\( 74^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 5분 동안 post-extension하였다.", "진균은 28S rRNA gene의 증폭을 위한 D1/D2영역의 eukaryotic universal primer인 LROR primer (5'-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3')와 LR5 primer (5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3')를 이용하여 증폭하였으며(Vilgalys, http://www.biology.ducke.edu/fungi/mycolab/primers.htm), 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다", ": \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 denaturation 30초, \\( 56^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 annealing 15초, \\( 74^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 extension 50초 과정을 \\(30 \\mathrm{~cycle}\\) 반복한 후, \\( 74^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 5분 동안 post-extension하였다.", "반응산물은 \\( 1.5 \\% \\) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 EtBr로 염색하여 확인 한 다음 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)를 사용해 정제하였다.", "</p><h2>DGGE-PCR</h2><p>DGGE-PCR은 세균과 진균의 경우 모두16S rRNA와 28S rRNA gene의 증폭산물을 주형으로 nested-PCR과 touch down PCR을 병행하여 수행하였다.", "16S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp인 338F-GC primer(5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')와 518R primer (5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')이었으며 PCR을 위한 조건은 다음과 같다. \\", "( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 3분 동안 pre-denaturation 한 후, \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 denaturation 30초, \\( 64 \\sim 55^{\\circ} \\mathrm{C} \\) touchdown으로 30초, \\( 74^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 extension 30초 과정을 \\( 30 \\mathrm{~cy-cle}\\) 반복한 후, \\( 74^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 7분 동안 post-extension하였다.", "28S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp인 NL-1 primer (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')와 LS-2 primer (5'-ATT AAA CAA CTC GAC TC-3') 이었으며 PCR을 위한 조건은 16S rRNA의 경우와 동일하게 수행하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "PCR-DGGE를 이용한 누룩에서의 미생물 다양성 분석", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-bd68a4d9-b817-4f52-b346-8ace254c140c", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2012", "doc_author": [ "권승직", "손재학" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,335	<h1>요 약</h1> <p>가지 열매로부터 neutral saline에 의한 추출, \( \left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 침전 및 Sephadex-G100을 이용한 affinity chromatography에 의해 분리한 lectin의 생화학석 특성을 연구하였다. Trypsin을 처리하지 않은 사람, 쥐와 토끼의 적혈구에서는 혈구 응집반응이 일어나지 않았으며, Trypsin을 처리한 사람, 쥐와 토끼의 적혈구 중에서는 쥐의 적혈구에서만 혈구 응집반응이 일어났다. SDS-PAGE에 의해 가지 lectin의 분자량을 확인한 결과, \( 19.3 \mathrm{~kDa} \)의 단일 band 임이 확인되었다. D-glucose를 포함하는 7개의 탄수화물은 \( 100 \mathrm{~mM} \) 이하의 농도에서 lectin과 적혈구의 응집을 저해시키지 않았으므로, 탄수화물에 대한 특이성이 나타나지 않았다. 최적 반응온도 범위는 \( 10-20^{\circ} \mathrm{C} \)로서, \( 20-70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 열에 대해 안정하였으며, 안정된 \( \mathrm{pH} \) 범위는 \( \mathrm{pH} ~6.2-7.2 \)로 확인되었다. \( \mathrm{Ca}^{2+}\), \(\mathrm{Co}^{2+}\), \(\mathrm{Cu}^{2+}\), \(\mathrm{Fe}^{2+}\), \(\mathrm{Mg}^{2+} \) 및 \( \mathrm{Mn}^{2+} 20 \mathrm{~mM} \) 이하의 농도에서는 lectin과 적혈구의 응집을 저해시키지 않았으므로, 금속이온에 대한 특이성이 나타나지 않았다</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1> <p>가지 열매로부터 neutral saline에 의한 추출, \\( \\left(\\mathrm{NH}_{4}\\right)_{2} \\mathrm{SO}_{4} \\) 침전 및 Sephadex-G100을 이용한 affinity chromatography에 의해 분리한 lectin의 생화학석 특성을 연구하였다.", "Trypsin을 처리하지 않은 사람, 쥐와 토끼의 적혈구에서는 혈구 응집반응이 일어나지 않았으며, Trypsin을 처리한 사람, 쥐와 토끼의 적혈구 중에서는 쥐의 적혈구에서만 혈구 응집반응이 일어났다.", "SDS-PAGE에 의해 가지 lectin의 분자량을 확인한 결과, \\( 19.3 \\mathrm{~kDa} \\)의 단일 band 임이 확인되었다.", "D-glucose를 포함하는 7개의 탄수화물은 \\( 100 \\mathrm{~mM} \\) 이하의 농도에서 lectin과 적혈구의 응집을 저해시키지 않았으므로, 탄수화물에 대한 특이성이 나타나지 않았다.", "최적 반응온도 범위는 \\( 10-20^{\\circ} \\mathrm{C} \\)로서, \\( 20-70^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 열에 대해 안정하였으며, 안정된 \\( \\mathrm{pH} \\) 범위는 \\( \\mathrm{pH} ~6.2-7.2 \\)로 확인되었다. \\", "( \\mathrm{Ca}^{2+}\\), \\(\\mathrm{Co}^{2+}\\), \\(\\mathrm{Cu}^{2+}\\), \\(\\mathrm{Fe}^{2+}\\), \\(\\mathrm{Mg}^{2+} \\) 및 \\( \\mathrm{Mn}^{2+} 20 \\mathrm{~mM} \\) 이하의 농도에서는 lectin과 적혈구의 응집을 저해시키지 않았으므로, 금속이온에 대한 특이성이 나타나지 않았다", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "가지 열매 lectin의 생화학적 성질", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-bcf4ae8b-8315-44d7-b906-326b5ef0f988", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "노광수" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,336	<p>분리된 genomic DNA를 제한호소 Sau3A I 으로 부분 절단한 후, \( 0.8 \% \) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 \( 3\sim 7 \mathrm{kb} \)의 DNA 절편을 분획하여 Gel extraction kit(Bioprogen, Daejeon, Korea)로 정제하였다. 분획된 DNA 절편을 insert로 하여 pWHM3 vector의 BamHI site에 ligation 하였다. 토양 genomic DNA 단편이 포함된 재조합 plasmid는 heatshock(\( 42^{\circ} \mathrm{C} \))에 의해 E. coli DH5\( \alpha \) competent cell에 형질전환 시켰고, ampicillin(50 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), Sigma, MO, USA), IPTG(20 \(\mu \mathrm{M} \), Sigma, USA) 그리고 X-gal(40 \( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), Sigma, MO, USA) 등이 포함된 LB plate 상에서 재조합 colony를 선별하였다.</p><p>이상의 방법으로 토양 metagenome library (Korea Soil Library, KSL)를 제작한 결과, 토양 DNA \( 1 \mu \mathrm{g} \)당 약 300여 개의 clone을 얻어 현재 약 20,000여 개의 metagenome library가 확보되었으며 모든 clone들은 대장균에서 발현되는 유용 유전자원을 확보하기 위하여 high throughput screening(HTS)에 적용이 가능하도록 96 well plate에서 배양한 후 \( 20 \% \) glycerol을 첨가하여 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다. 또한 각 well plate의 clone을 따로 모아서 clone pool의 형태로 하여 KSL1~133, 140, 141, 142로 각각 명명하여 총 136개의 clone pool을 \( 20 \% \) glycerol이 함유된 vial에 보관하였다.</p><p>Metagenome library 중 혈전용해 활성을 가진 형질전환주에 대한 효율적인 screening을 위해 우선 단백질 분해 활성을 가진 형질전환주를 선발하고자 \( 0.5 \% \) skim milk가 첨가된 LB plate에 tooth-pick로 접종하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 24시간 동안 항온기에서 배양하여 집락 주위에 나타나는 투명환의 생성유무를 기준으로 단백질 분해효소를 생산하는 활성 균주를 선발하였다. 특히, 단백질 분해 활성을 보이는 형질전환주에 대해서는 \( 0.5 \% \) skim milk 대신 \( 0.3 \% \) fibrin을 기질로 첨가한 LB plate 상에서 동일한 방법으로 혈전용해 활성을 조사하였다. \( 0.5 \% \) skim milk가 포함된 LB plate에 형질전환주를 도말하여 조사한 결과, KSL16-1, KSL16-56, KSL28-76, KSL28-88 등 4개의 clone들이 투명환을 보여 단백질 분해효소를 생 산하는 것으로 예상되었지만, 2차 확인 실힘에서는 KSL28-76, 28-88 등 2개의 clone에서만 활성의 재현성이 나타닜다. 이에 단백질 분해 활성이 있는 KSL28-76과 KSL28-88 clone의 배양 상등액을 시료로 하여 \( 0.3 \% \) fibrin 용액을 기질로 하여 가수분해 활성을 조사하였으나 fibrin(혈전)분해 활성은 보이지 않았다. 따라서 최종 선발된 KSL28-76과 KSL28-88 clone은 skim milk에 대한 단백질 분해 활성은 보였지만, 혈전용해 활성은 보이지 않는 것으로 보아 타 기질에 대한 추가적인 활성 조사가 필요할 것으로 생각된다.</p> <p>지금까지 혈관 질병에 관련된 치료제로서의 혈전분해효소를 다양한 전통발효식품이나 벌레, 토양 등에서 분리하였으나, 이러한 효소들은 치료제로서 경구투여의 어려움이 있고, 비경제적이며 반감기가 짧은 단점을 가지고 있다. 이에 본 연구에서는 이러한 단점을 보완할 수 있는 혈전분해효소를 한정된 자원에서 찾기 보다는 다양한 미지의 자원을 포함하고 있는 자연 환경인 토양에서 분리하기 위하여, 무배양법에의한 metagenome library를 구축하였고 이 library를 바탕으로 혈전용해 효소의 분리를 실시하였다. 비록 분리한 형질전환주는 기존에 알려져 있는 혈전용해효소를 생산하는 유전자와 유사한 결과를 보였지만, 무배양법에 의해 자연 환경의 matagenome으로부터 기존의 효소 작용 및 특성이 다른 nattokinase 종류의 혈전용해효소를 분리할 수 있는 가능성을 제시하였다. 이상의 결과를 토대로 하여 이미 확립된 토양 metagenome library에 대한 계속적인 screening 작업을 통해 새로운 혈전용해효소를 탐색하고 있으며, 기존에 확인된 결과에 대해서도 형질전환주가 발현하는 nattokinase에 대한 효소의 과발현 및 정제를 통한 효소의 특성에 대한 조사를 진행할 예정이다.</p> <p>따라서 토양과 같은 자연 환경으로부터 기존의 protease인 subtilisin과 같은 유용 유전자의 분리에 대한 보고가 많기 때문에 본 연구에서는 산업적, 의학적으로 유용한 효소 자원인 새로운 혈전용해효소를 전통식품에서 분리하는 것과 달리 지금까지 배양되지 않은 다양한 미생물의 유전자를 포함하고 있는 자연 환경인 토양으로부터 혈전용해효소를 탐색하고자 metagenomics 기법을 적용하여 soil metagenome library를 제작하고, activity-based screening과 sequence-based screening을 각각 실시하였다.</p><p>토양으로부터 total genomic DNA를 분리하기 위하여 2003년 12월에 금정산에서 각각 다른 장소의 인적이 드문 큰 바위 밑, 오래된 나무뿌리 근처 등 지표에서 \( 30 \sim 50 \mathrm{~cm} \) 아래로부터 2개의 토양시료를 채취하였고, 2004년 3월에는 금정산의 4곳의 다른 장소에서 동일한 방법으로 토양시료를 채취하여 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하여 사용하였다.</p><p>\( 5 \mathrm{~g} \)의 토양시료를 DNA extraction buffer(\( 100 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl \( [\mathrm{pH} 8.0] \), \( 1.5 \mathrm{~M}\)\( \mathrm{~NaCl}\), \( 100 \mathrm{~mM} \) sodium EDTA \( [\mathrm{pH} 8.0] \), \( 1 \% \) CTAB, \( 100 \mathrm{~mM} \) sodium phosphate \( [\mathrm{pH} 8.0] \)) \( 13.5 \mathrm{ml} \)와 \( 50 \mu \mathrm{l} \) proteinase \( \mathrm{K}(20 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml}) \)로 현탁한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 교반하여 혼합해 주고, \( 10 \% \) SDS \( 3 \mathrm{~ml} \)을 첨가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시킨 다음, 원심분리(\( 4,000 \mathrm{~rpm} \), \(10 \mathrm{~min} \), \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)) 하였다. 계속해서 humic acid를 제거하기 위해 \( 30 \% \) PEG 8,000을 포함한 \( 1.6 \mathrm{~M}\)\( \mathrm{~NaCl}\) 용액을 전체 부피의 \( 1 / 2 \) 만큼 넣고 상온에서 2시간 반응시켜 원심분리 하였으며, 침전물을 TE buffer(\( 10 \mathrm{~mM} \) Tris-HCl, \( 1 \mathrm{~mM} \) EDTA\([\mathrm{pH} 8.0] \)) \( 1 \mathrm{~ml} \)로 재현탁하고 \( 3 \mathrm{M} \) potassium acetate 200\( \mu \mathrm{l} \)를 첨가하여 얼음에서 5분 동안 정치시켰다. 원심분리 후, 동량의 phenol/chloroform/ isoamylalcohol(25/24/1)를 넣고 vortex 한 뒤, 원심분리하여 상등액 0.6배의 isopropanol을 넣고 2시간 동안 상온에서 침전시켰다. 원심분리 후, 침전물을 증류수 500\( \mu \mathrm{l} \)에 녹이고 DNA의 농도를 측정하였다.</p> <p>한편, 새로운 혈전용해효소 유전자를 탐색하기 위해 기존의 nattokinase와 유사한 serine protease(subtilisin)를 생산하는 것으로 알려진 Bacillus subtilis, B. subtilis sp. natto, Brevibacillus laterosporus, Geobacillus stearothermophilus의 protease를 encoding하는 sequence를 alignment하여 conserved 된 부분을 확인한 후, Pro 44F1(5'-CGC-WGC-CGG-AAA-CGA-AGG-TTC-3')와 Pro 419R1(5'-ACG-TGA-GGA-GTC-GCC-ATK-GAC-G-3'), Pro 771F2 (5'-CGT-TAA-TCT-TTA-CGA-TGG-CGT-TC-3')와 Pro 998R2(5'-CCG-CTG-TCG-ATA-ACM- GCT-AC-3') 등 2종류의 primer set를 제작하였다. PCR 반응을 위하여 총 20\( \mu \mathrm{l} \)의 reaction mixture를 준비 하였으며, 이 반응액은 약 \( 100 \mathrm{~ng} \)의 KSL cell suspension, \( 20 \mathrm{~nM} \) primer, \( 2.5 \mathrm{~mM} \) dNTPs, \( 1 \mathrm{U} \) Taq polymerase(Solgent, Daejeon, Korea), 그리고 \( 10 \mathrm{X} \) Taq polymerase reaction buffer를 포함하고 있다. 증폭반응은 thermocycler(PTC-100, MJ Research)를 이용하여 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 58^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초, \( 72^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30초의 조건으로 \( 50 \mathrm{~cycle} \) 동안 실시하였다.</p><p>혈전용해효소와 관련된 유전자에 대한 PCR을 수행하여 각 PCR products를 \(2 \% \) agarose gel에서 전기영동 한 결과, 136개의 KSL 중에서 pro 44F1와 pro 419R1 primer set에 의한 products\( (376 \mathrm{~bp}) \)는 14개, pro 771F2와 pro 998R2 primer set에 의한 products\( (228 \mathrm{~bp}) \)는 6개, 그려기 pro 44F1와 pro 998R2 primer set에 의한 products\( (955 \mathrm{~bp}) \)는 13개를 보인 PCR product의 특이성으로 보아 새로운 유전자의 가능성을 제시하고 있다. 이 중 가장 많은 수를 확보한 \( 376 \mathrm{~bp} \) 크기의 product는 \( 2 \% \) agarose gel 전기영동을 실시하여 분리된 각 bands를 정제하였다. 정제된 각 PCR products( \( 50 \mathrm{~ng} / \mu \mathrm{l}) \)는 pGEM-T vector( \( 50 \mathrm{~ng} / \mu \mathrm{l} \), Promega, WI, USA)와 \( 3: 1 \)의 비율 \( (v / v) \)로 혼합한 후, 상온에서 1시간 동안 ligation하였다. 재조합 plasmid는 E. coli DH5\( \alpha \) competent cell에 heat shock \( (42^{\circ} \mathrm{C}, 45 \mathrm{~sec}) \)을 이용한 형질전환 법으로 ampicillin\( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \), X-gal\( (40 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 그리고 IPTG\( (20 \mu \mathrm{M}) \)를 함유하고 있는 LB plate에 도말하여 재조합 colony를 선별하였다. 선별된 형질전환주는 다시 ampicillin \( (50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)이 포함되어 있는 LB broth에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \), \( 150 \mathrm{~rpm} \)의 조건으로 18시간 동안 액체배양 하였고 이를 DNA mini prep kit (BioproGen)을 이용하여 재조합 plasmid DNA를 최종 분리하였다. PCR products의 삽입여부는 pGEM-T vector의 specific restriction enzyme sites인 Pst I 과 Sph I 을 이용하여 절단한 다음 \( 0.8 \% \) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 PCR products가 삽입된 것으로 확인된 재조합 plasmid를 선별하였다. 분리된 재조합 plasmid를 기존에 보고된 혈전용해효소 유전자와 비교하기 위하여 pGEM-T vector에서 유래된 T7을 이용하여 DNA 염기서열 분석하였으며, 확보된 염기서열에 대해 clustal W (NCBI, USA) 등의 analytic tools를 이용하여 GenBank database(NCBI, USA)에 등재되어 있는 혈전용해 효소의 DNA 염기서열과 비교◦분석하였다. 그 결과, 형질전환주 KSL 3, 10, 16, 18, 39, 47, 48, 50, 79, 97, 140, 141, 142의 염기서열은 기존에 보고된 Bacillus subtilis var. natto 유전자의 염기서열과 \( 99 \% \) 이상 유사한 것으로 확인되었다.</p>	생명과학	[ "<p>분리된 genomic DNA를 제한호소 Sau3A I 으로 부분 절단한 후, \\( 0.8 \\% \\) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 \\( 3\\sim 7 \\mathrm{kb} \\)의 DNA 절편을 분획하여 Gel extraction kit(Bioprogen, Daejeon, Korea)로 정제하였다.", "분획된 DNA 절편을 insert로 하여 pWHM3 vector의 BamHI site에 ligation 하였다.", "토양 genomic DNA 단편이 포함된 재조합 plasmid는 heatshock(\\( 42^{\\circ} \\mathrm{C} \\))에 의해 E. coli DH5\\( \\alpha \\) competent cell에 형질전환 시켰고, ampicillin(50 \\( \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\), Sigma, MO, USA), IPTG(20 \\(\\mu \\mathrm{M} \\), Sigma, USA) 그리고 X-gal(40 \\( \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\), Sigma, MO, USA) 등이 포함된 LB plate 상에서 재조합 colony를 선별하였다.", "</p><p>이상의 방법으로 토양 metagenome library (Korea Soil Library, KSL)를 제작한 결과, 토양 DNA \\( 1 \\mu \\mathrm{g} \\)당 약 300여 개의 clone을 얻어 현재 약 20,000여 개의 metagenome library가 확보되었으며 모든 clone들은 대장균에서 발현되는 유용 유전자원을 확보하기 위하여 high throughput screening(HTS)에 적용이 가능하도록 96 well plate에서 배양한 후 \\( 20 \\% \\) glycerol을 첨가하여 \\( -70^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에 보관하였다.", "또한 각 well plate의 clone을 따로 모아서 clone pool의 형태로 하여 KSL1~133, 140, 141, 142로 각각 명명하여 총 136개의 clone pool을 \\( 20 \\% \\) glycerol이 함유된 vial에 보관하였다.", "</p><p>Metagenome library 중 혈전용해 활성을 가진 형질전환주에 대한 효율적인 screening을 위해 우선 단백질 분해 활성을 가진 형질전환주를 선발하고자 \\( 0.5 \\% \\) skim milk가 첨가된 LB plate에 tooth-pick로 접종하고 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 24시간 동안 항온기에서 배양하여 집락 주위에 나타나는 투명환의 생성유무를 기준으로 단백질 분해효소를 생산하는 활성 균주를 선발하였다.", "특히, 단백질 분해 활성을 보이는 형질전환주에 대해서는 \\( 0.5 \\% \\) skim milk 대신 \\( 0.3 \\% \\) fibrin을 기질로 첨가한 LB plate 상에서 동일한 방법으로 혈전용해 활성을 조사하였다. \\", "( 0.5 \\% \\) skim milk가 포함된 LB plate에 형질전환주를 도말하여 조사한 결과, KSL16-1, KSL16-56, KSL28-76, KSL28-88 등 4개의 clone들이 투명환을 보여 단백질 분해효소를 생 산하는 것으로 예상되었지만, 2차 확인 실힘에서는 KSL28-76, 28-88 등 2개의 clone에서만 활성의 재현성이 나타닜다.", "이에 단백질 분해 활성이 있는 KSL28-76과 KSL28-88 clone의 배양 상등액을 시료로 하여 \\( 0.3 \\% \\) fibrin 용액을 기질로 하여 가수분해 활성을 조사하였으나 fibrin(혈전)분해 활성은 보이지 않았다.", "따라서 최종 선발된 KSL28-76과 KSL28-88 clone은 skim milk에 대한 단백질 분해 활성은 보였지만, 혈전용해 활성은 보이지 않는 것으로 보아 타 기질에 대한 추가적인 활성 조사가 필요할 것으로 생각된다.", "</p> <p>지금까지 혈관 질병에 관련된 치료제로서의 혈전분해효소를 다양한 전통발효식품이나 벌레, 토양 등에서 분리하였으나, 이러한 효소들은 치료제로서 경구투여의 어려움이 있고, 비경제적이며 반감기가 짧은 단점을 가지고 있다.", "이에 본 연구에서는 이러한 단점을 보완할 수 있는 혈전분해효소를 한정된 자원에서 찾기 보다는 다양한 미지의 자원을 포함하고 있는 자연 환경인 토양에서 분리하기 위하여, 무배양법에의한 metagenome library를 구축하였고 이 library를 바탕으로 혈전용해 효소의 분리를 실시하였다.", "비록 분리한 형질전환주는 기존에 알려져 있는 혈전용해효소를 생산하는 유전자와 유사한 결과를 보였지만, 무배양법에 의해 자연 환경의 matagenome으로부터 기존의 효소 작용 및 특성이 다른 nattokinase 종류의 혈전용해효소를 분리할 수 있는 가능성을 제시하였다.", "이상의 결과를 토대로 하여 이미 확립된 토양 metagenome library에 대한 계속적인 screening 작업을 통해 새로운 혈전용해효소를 탐색하고 있으며, 기존에 확인된 결과에 대해서도 형질전환주가 발현하는 nattokinase에 대한 효소의 과발현 및 정제를 통한 효소의 특성에 대한 조사를 진행할 예정이다.", "</p> <p>따라서 토양과 같은 자연 환경으로부터 기존의 protease인 subtilisin과 같은 유용 유전자의 분리에 대한 보고가 많기 때문에 본 연구에서는 산업적, 의학적으로 유용한 효소 자원인 새로운 혈전용해효소를 전통식품에서 분리하는 것과 달리 지금까지 배양되지 않은 다양한 미생물의 유전자를 포함하고 있는 자연 환경인 토양으로부터 혈전용해효소를 탐색하고자 metagenomics 기법을 적용하여 soil metagenome library를 제작하고, activity-based screening과 sequence-based screening을 각각 실시하였다.", "</p><p>토양으로부터 total genomic DNA를 분리하기 위하여 2003년 12월에 금정산에서 각각 다른 장소의 인적이 드문 큰 바위 밑, 오래된 나무뿌리 근처 등 지표에서 \\( 30 \\sim 50 \\mathrm{~cm} \\) 아래로부터 2개의 토양시료를 채취하였고, 2004년 3월에는 금정산의 4곳의 다른 장소에서 동일한 방법으로 토양시료를 채취하여 그늘지고 통풍이 잘 되는 곳에서 하루 건조시킨 후, 거즈로 작은 돌과 나무뿌리, 나뭇잎 등의 이물질을 제거하여 사용하였다.", "</p><p>\\( 5 \\mathrm{~g} \\)의 토양시료를 DNA extraction buffer(\\( 100 \\mathrm{~mM} \\) Tris-HCl \\( [\\mathrm{pH} 8.0] \\), \\( 1.5 \\mathrm{~M}\\)\\( \\mathrm{~NaCl}\\), \\( 100 \\mathrm{~mM} \\) sodium EDTA \\( [\\mathrm{pH} 8.0] \\), \\( 1 \\% \\) CTAB, \\( 100 \\mathrm{~mM} \\) sodium phosphate \\( [\\mathrm{pH} 8.0] \\)) \\( 13.5 \\mathrm{ml} \\)와 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\) proteinase \\( \\mathrm{K}(20 \\mathrm{~mg} / \\mathrm{ml}) \\)로 현탁한 후, \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 30분간 교반하여 혼합해 주고, \\( 10 \\% \\) SDS \\( 3 \\mathrm{~ml} \\)을 첨가하여 \\( 65^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 2시간 반응시킨 다음, 원심분리(\\( 4,000 \\mathrm{~rpm} \\), \\(10 \\mathrm{~min} \\), \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)) 하였다.", "계속해서 humic acid를 제거하기 위해 \\( 30 \\% \\) PEG 8,000을 포함한 \\( 1.6 \\mathrm{~M}\\)\\( \\mathrm{~NaCl}\\) 용액을 전체 부피의 \\( 1 / 2 \\) 만큼 넣고 상온에서 2시간 반응시켜 원심분리 하였으며, 침전물을 TE buffer(\\( 10 \\mathrm{~mM} \\) Tris-HCl, \\( 1 \\mathrm{~mM} \\) EDTA\\([\\mathrm{pH} 8.0] \\)) \\( 1 \\mathrm{~ml} \\)로 재현탁하고 \\( 3 \\mathrm{M} \\) potassium acetate 200\\( \\mu \\mathrm{l} \\)를 첨가하여 얼음에서 5분 동안 정치시켰다.", "원심분리 후, 동량의 phenol/chloroform/ isoamylalcohol(25/24/1)를 넣고 vortex 한 뒤, 원심분리하여 상등액 0.6배의 isopropanol을 넣고 2시간 동안 상온에서 침전시켰다.", "원심분리 후, 침전물을 증류수 500\\( \\mu \\mathrm{l} \\)에 녹이고 DNA의 농도를 측정하였다.", "</p> <p>한편, 새로운 혈전용해효소 유전자를 탐색하기 위해 기존의 nattokinase와 유사한 serine protease(subtilisin)를 생산하는 것으로 알려진 Bacillus subtilis, B. subtilis sp.", "natto, Brevibacillus laterosporus, Geobacillus stearothermophilus의 protease를 encoding하는 sequence를 alignment하여 conserved 된 부분을 확인한 후, Pro 44F1(5'-CGC-WGC-CGG-AAA-CGA-AGG-TTC-3')와 Pro 419R1(5'-ACG-TGA-GGA-GTC-GCC-ATK-GAC-G-3'), Pro 771F2 (5'-CGT-TAA-TCT-TTA-CGA-TGG-CGT-TC-3')와 Pro 998R2(5'-CCG-CTG-TCG-ATA-ACM- GCT-AC-3') 등 2종류의 primer set를 제작하였다.", "PCR 반응을 위하여 총 20\\( \\mu \\mathrm{l} \\)의 reaction mixture를 준비 하였으며, 이 반응액은 약 \\( 100 \\mathrm{~ng} \\)의 KSL cell suspension, \\( 20 \\mathrm{~nM} \\) primer, \\( 2.5 \\mathrm{~mM} \\) dNTPs, \\( 1 \\mathrm{U} \\) Taq polymerase(Solgent, Daejeon, Korea), 그리고 \\( 10 \\mathrm{X} \\) Taq polymerase reaction buffer를 포함하고 있다.", "증폭반응은 thermocycler(PTC-100, MJ Research)를 이용하여 \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 30초, \\( 58^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 30초, \\( 72^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 30초의 조건으로 \\( 50 \\mathrm{~cycle} \\) 동안 실시하였다.", "</p><p>혈전용해효소와 관련된 유전자에 대한 PCR을 수행하여 각 PCR products를 \\(2 \\% \\) agarose gel에서 전기영동 한 결과, 136개의 KSL 중에서 pro 44F1와 pro 419R1 primer set에 의한 products\\( (376 \\mathrm{~bp}) \\)는 14개, pro 771F2와 pro 998R2 primer set에 의한 products\\( (228 \\mathrm{~bp}) \\)는 6개, 그려기 pro 44F1와 pro 998R2 primer set에 의한 products\\( (955 \\mathrm{~bp}) \\)는 13개를 보인 PCR product의 특이성으로 보아 새로운 유전자의 가능성을 제시하고 있다.", "이 중 가장 많은 수를 확보한 \\( 376 \\mathrm{~bp} \\) 크기의 product는 \\( 2 \\% \\) agarose gel 전기영동을 실시하여 분리된 각 bands를 정제하였다.", "정제된 각 PCR products( \\( 50 \\mathrm{~ng} / \\mu \\mathrm{l}) \\)는 pGEM-T vector( \\( 50 \\mathrm{~ng} / \\mu \\mathrm{l} \\), Promega, WI, USA)와 \\( 3: 1 \\)의 비율 \\( (v / v) \\)로 혼합한 후, 상온에서 1시간 동안 ligation하였다.", "재조합 plasmid는 E. coli DH5\\( \\alpha \\) competent cell에 heat shock \\( (42^{\\circ} \\mathrm{C}, 45 \\mathrm{~sec}) \\)을 이용한 형질전환 법으로 ampicillin\\( (50 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}) \\), X-gal\\( (40 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}) \\) 그리고 IPTG\\( (20 \\mu \\mathrm{M}) \\)를 함유하고 있는 LB plate에 도말하여 재조합 colony를 선별하였다.", "선별된 형질전환주는 다시 ampicillin \\( (50 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}) \\)이 포함되어 있는 LB broth에서 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\), \\( 150 \\mathrm{~rpm} \\)의 조건으로 18시간 동안 액체배양 하였고 이를 DNA mini prep kit (BioproGen)을 이용하여 재조합 plasmid DNA를 최종 분리하였다.", "PCR products의 삽입여부는 pGEM-T vector의 specific restriction enzyme sites인 Pst I 과 Sph I 을 이용하여 절단한 다음 \\( 0.8 \\% \\) agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 PCR products가 삽입된 것으로 확인된 재조합 plasmid를 선별하였다.", "분리된 재조합 plasmid를 기존에 보고된 혈전용해효소 유전자와 비교하기 위하여 pGEM-T vector에서 유래된 T7을 이용하여 DNA 염기서열 분석하였으며, 확보된 염기서열에 대해 clustal W (NCBI, USA) 등의 analytic tools를 이용하여 GenBank database(NCBI, USA)에 등재되어 있는 혈전용해 효소의 DNA 염기서열과 비교◦분석하였다.", "그 결과, 형질전환주 KSL 3, 10, 16, 18, 39, 47, 48, 50, 79, 97, 140, 141, 142의 염기서열은 기존에 보고된 Bacillus subtilis var.", "natto 유전자의 염기서열과 \\( 99 \\% \\) 이상 유사한 것으로 확인되었다.", "</p>" ]	{ 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5,337	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>발효 흥국마의 색소 측정</h2><p>식품에 사용되는 색소는 식품산업에서의 제품의 가치를 높이고, 소비자의 구매욕구와 식욕을 향상시키는 역할을 하고 있다. 현재까지 식품공업에서 가장 많이 사용되어 온 색소는 대부분 타르계 합성색소로 그 발암성 등 안전성에 문제가 발생함에 따라 천연색소에 대한 소비자의 요구가 증대됨으로서 식품에서의 천연색소 사용량이 계속적으로 증가되고 있는 실정이다. 그 중에서 미생물 유래의 천연색소는 배양기간이 타 천연색소 공급원과 달리 짧고 그 생산이 비교적 저비용으로 가능하다는 점에서 많은 장점을 가지고 있으며, 역사상 오래 전부터 주목받아 온 것은 홍주, 육류가공, 홍두부, 기타 음식물의 착색에 이용되어온 홍국(Ang-khak)이 있다.</p><p>본 연구에서는 홍국 색소 생산능 에 대하여 보고한 바 있는 Monascus sp. MK2 균주를 이용하여 마의 발효를 실시하였으며, 발효 홍국마의 에탄올 농도에 따른 추출물의 색소 생산량은 Table 1과 같다.</p><p>Table 1과 같이 에탄올 농도에 따른 발효 홍국마 추출물의 색소 생산능을 보면 에탄올 농도가 \( 50 \% \)일 때 yellow, orange및 red 색소는 각각 12.77, 11.66 및 13.48 unit으로 가장 높은 색소의 추출효율을 보였으며, 증류수만을 추출에 사용하였을 경우에는 yellow, orange 및 red 색소가 각각 3.38, 3.28 및 3.38 unit으로 낮은 색소의 추출효율을 나타내었다. 또한 에탄올 농도가 \(95\%\)일 경우에도 yellow, orange 및 red 색소가 각각 4.09, 3.14 및 3.74 unit으로 낮은 색소의 추출효율을 나타내었다. 이것은 대부분의 홍국색소는 수용성 색소와 지용성 색소의 형태로 존재하는데 \( 50 \% \)의 에탄올 농도에서 수용성 색소와 지용성 색소가 대부분 추출됨으로서 가장 높은 추출효율을 나타낸 것으로 사료된다. 이러한 결과는 홍국색소의 추출용매로서 에탄올을 사용하였을 때 색소 추출에 미치는 에탄올 농도의 영향이 \( 80 \% \)에서 최대의 색소 추출 효율을 보였다는 Lee 등과 Jeon 등의 연구와는 달랐으나, 본 실험에서도 에탄올 농도가 \( 75 \% \)일 경우에 yellow, orange 및 red 색소는 각각 12.54, 10.80 및 12.74 unit으로 높은 색소의 추출효율을 보임으로서 비슷한 결과를 보였으며, \( 40 \% \) 이하의 에탄올 농도에서는 색소의 추출 효율이 감소하였다는 결과와는 일치하였다</p><h2>발효 홍국마의 Monacolin K 생산</h2><p>Monacolin K (Lovastatin, Mevinolin)는 고지혈증 치료제로 사용되고 있는 것으로 1979년 일본의 Endo 교수가 처음 발견한 물질로서 monacolin J, L 등 홍국에 함유된 전체 mon-acolin계의 약 \( 80 \% \)를 차지하며 cholesterol 생합성 경로에서 HMG-CoA reductase를 특이적으로 억제함으로써 강력한 cholesterol 생합성 저해작용을 하는 것으로 보고되었다. Monacolin K의 작용기작은 monacolin K의 구조가 콜레스테롤 합성을 저해하는 가장 중요한 효소인 HMG-CoA (3-hy-droxy-3-methylglutaryl coenzyme A) 환원효소(EC 1.1.1.34) 저해제의 하나로, 결합하는 HMG-CoA 대신 HMG-CoA 환원효소와 미리 결합하여 mevalonate의 합성을 저해하고, 그 결과 콜레스테롤 생합성을 제한하여 혈관속의 콜레스테롤 수치를 효과적으로 감소시킨다고 알려져 있다. 특히 중증의 고콜레스테롤 혈증 환자에서도 매우 유효한 것으로 보고되었으며, 동맥경화에서 가장 좋지 않은 것으로 알려져 있는 LDL cho-lesterol을 우선적으로 낮춰주는 작용이 있는 것이 특징이다.</p><p>Fig. 1에 나타난 바와 같이, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7일간 발효하였을 때 monacolin K 생성량은 에탄올 농도가 높아질수록 monacolin K함량이 점차 높아지다가 에탄올 농도 \( 75 \% \) 일 때 \( 462.78\mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)으로 가장 높은 monacolin K의 함량을 나타내었으며, 에탄올 농도가 \( 95 \% \) 일 때는 추출량에 큰 차이를 볼 수 없었으나 \( 443.52\mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)로 monacolin K의 함량이 다소 낮게 추출되는 것을 알 수 있었다. 이처럼 monacolin K가 물에서는 거의 추출되지 않고 유기용매인 에탄올에 잘 추출되는 것으로 보았을 때 유기용매에 가용성인 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 에탄올 농도가 \( 80 \% \) 일 때 monacolin K의 추출효율이 높은 결과와 유사하였으며, Lee 등의 결과에서 Monascuspurpureus NTU 301 균주를 이용하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10일간 배양하였을 때 monacolin K 생성량이 \( 2,584\mathrm{mg} / \mathrm{kg} \) 이었다는 보고와 비교하면 약 5.5배 낮은 결과를 나타내었다. 하지만 Lee 등의 결과에서도 6일간 배양 했을 경우에는 monacolin K 함량이약 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)으로 나타났으며, 7일째부터 monacolin K 함량이 증가하는 것으로 보고하였다. 따라서 본 실험에서 사용한 균주 역시 배양기간을 길게 해줄 경우 monacolin K 함량을 증가 시킬 수 있으리라 생각되며, Monascus sp. 균주의 발효를 통한 이차대사산물의 생산은 균주의 개량, 최적 기질의 선택 및 배양조건의 최적화 등을 통하여 대량생산이 가능하리라 사료된다.</p><h2>발효 홍국마의 총 폴리페놀 함량</h2><p>식물계에 널리 분포되어 있는 총 페놀성 화합물은 다양한 구조와 분자량을 가진 이차대사산물로 free radical을 제거함으로써 산화를 억제하여 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 막아 항암, 항균, 노화방지 및 심장질환을 예방하는 등의생리활성 물질로 알려져 있으며 식품, 의약품, 화장품 등 많은 분야에 활용되고 있다. 이러한 페놀성 물질은 식물체의 고유한 색을 부여할 뿐만 아니라, 떫은맛과 쓴맛을 나타내는 대표적인 물질로서 식물성 식품의 고유한 식미감에도 깊이 관여할 수 있다.</p><p>본 실험에서 사용한 발효 홍국마의 에탄올 농도별 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과는 Fig. 2에 나타낸 바와 같이 대조구의 경우 에탄올 농도가 \( 50 \% \) 일 때 \( 442.5 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 이후에는 에탄올 농도가 높아질 수록 총 폴리페놀 함량은 낮아지는 것으로 조사되었다. 발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 경우 대조구와 마찬가지로 에탄올 농도가 높아질수록 총 폴리페놀 함량 또한 높아지다가 에탄올 농도가 \( 50 \% \) 일 때 \( 655.6 \mathrm{mg} / \mathrm{kg} \)으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 이후에는 에탄올 농도가 높아질수록 총 폴리페놀 함량 역시 낮아지는 것으로 조사되었다. 이로써 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 나타낸 \( 50 \% \) 에탄올 추출물의 경우 총 폴리페놀 함량이 대조구와 비교시 약 \( 32.5 \% \) 증가한 것으로 발효를 통한 총 폴리페놀 함량의 증대효과가 있는 것으로 조사됨으로써 향후 관련물질의 분리 및 정제를 통한 특성규명과 함께, 천연 항산화제로의 사용 가능성과 노화관련 건강기능식품 소재 개발 가능성 또한 있을 것으로 사료된다.</p><p>이러한 결과는 Park 등이 보고한 홍삼 및 홍국발효 홍삼추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 홍국발효홍삼 추출물에서 높았으며, 물 추출물 보다는 \( 70 \% \) 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량이 높았다는 결과와 유사한 것을 알 수 있었다. 또한 함초의 채취 시기별 총 폴리페놀 함량을 조사하였을때 8월에 채취한 함초의 \( 50 \% \) 에탄올 추출물에서 그 함량이 가장 높았다는 Cha 등의 보고와 일치하였으며, Cha 등이 보고한 두릅 잎의 경우, 물 추출물 보다 \( 70 \% \) 에탄올 및 \( 70 \% \) 메탄올 추출물에서 높은 함량을 보였다고 보고하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>홍국균은 Monascus 속의 곰팡이로서 분류학상 Ascomycotina 강, Plectomycetes 아강, Plectrascales 목, Hemiascomycetaceae과(반자낭균과), Aspergillaceae과,Monascaceae 족에 속하며, 자웅동체(hemothallic)이고, 무성생식기간에는 분생포자를 형성하고 유성생식기간에는 폐자기를 만들며, 격벽을 가지고 있는 Monascus sp.로써 현재 약20종, 균주로는 약 70여 종이 분리ᆞ동정되어 있다. 홍국균은 α-amylase, β-amylase, glucoamylase 및 lipase 등의 가수분해효소를 생성하는 것으로 알려져 있으며, 이 균은 항균력이 있어서 소화불량, 타상, 이질 및 탄저 등의 치료에 효과가 있다고 본초강목에 기록되어 있고, 한국, 중국, 대만,일본, 및 말레이시아 등 벼 재배 지역에서 오래 전부터 착색, 양조, 방부 등을 목적으로 주류, 두부, 육류 등 식품 뿐 만이아니라 한약재로도 사용되어 온 국(koji)으로 붉은색을 띄는곰팡이다. 홍국에서 monacolin A, J, K 및 그 유도체,GABA (γ-aminobutyric acid), dimerumic acid, 색소와 미지의 성분 등을 유도할 수 있으며, 이들은 혈당 강하, 혈압 강하, 항산화, 항생, 항혈전, 착색 및 방부작용이 있다. 이 같은 항생물질에 대한 저항성을 이용하여 육류의 저장시 냉장하기 전에 사용하였으며 근래에는 햄, 소시지 및 어묵의 가공시에 방부목적으로 이용되며, 토마토케첩 등의 제조시에 식품의 착색 목적으로도 쓰이고 있다.</p><p>마(Dioscorea sp.)는 다년생 넝쿨성 초본으로 전세계의 열대 및 아열대지방에서 널리 분포하는 식량 작물로서, 우리나라에서는 주로 경북 북부지역에서 약 \( 70 \% \) 정도가 생산되고 있다. 마는 예로부터 한방에서는 자양, 강장, 폐결핵 등에 유효하고 소염, 해독, 진해, 거담, 이뇨, 신경통, 류마티즘에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 마(Dioscorea batatas Dence)의성분은 전분이 생체중의 \( 8-24 \% \), 점질물이 \( 0.6-2.4 \% \)를 차지하며, 약용성분으로는 amylose, cholin, saponin 등이 포함되어 있다. 한편 마의 주요 약용성분으로 알려진 steroidal sap-onin은 다양한 생리활성에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 세포의 DNA 돌연변이를 방지하는 항 돌연변이성작용, 항암 및 항염증 작용 등이 알려져 있다.</p><p>예로부터 마는 한약제로 사용되고 있을 뿐 아니라 최근에는 중요한 기능성 식품소재로 인식되어 건강식품 또는 기능성식품 제조에 첨가되면서 그 사용량이 증가하고 있다. 마의 기능성에 관한 연구로 마 점질물이 중금속 제거능과 Angiotensin Converting Enzyme (ACE) 저해효과를 나타낸다는 보고와, 콜레스테롤 저하효과, 지질 분해효소 저해활성 및 항돌연변이 활성 등이 보고되어 있다. 그러나마를 이용한 발효식품에 관한 연구는 미미한 실정으로, 더욱이 Monascus sp. 균주를 활용한 마 발효에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았으며 특정 발효식품에서 마의 활용적인 측면에 관한 연구가 필요한 실정이다.</p><p>따라서 본 연구에서는 뛰어난 약리적인 효과가 인정되고 있는 홍국균(Monascus sp.)을 이용하여 마의 발효를 유도함으로써 마 자체로의 기능성 뿐만 아니라 홍국균 발효를 통한 기능성 마 발효물의 에탄올 추출물이 in vitro에서 우수한 ACE 저해활성과 항산화활성 등의 생리활성 효과를 확인하였기에 보고하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 배양</h2><p>배양본 실험에 사용한 균주는 한국식품연구원과 한국미생물보존센터에서 분양받은 표준균주 및 본 연구실에서 신규 분리한 균주들 중에서, 홍국색소 생산능이 우수한 것으로 조사된 Monascus sp. MK2 균주를 발효 홍국마 제조에 실험균주로 선발하여 본 실험에 사용하였다. 그리고 발효 홍국마의 제조를 위해 Monascus sp. MK2의 전배양 기본배지로 \( 3 \% \) rice powder, \( 0.15 \% \quad \mathrm{NaNO}_{2}, 0.1 \% \quad \mathrm{M}_{8} \mathrm{SO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 및 \( 0.25 \% \) \( \mathrm{KH}_{2} \mathrm{PO}_{4} \mathrm{pH} 6.0 \) 로 구성된 Lin's 배지를 사용하였으며, 본배양은 전 배양과 동일한 Lin's 배지에 Monascus sp. MK2 전배양액을 \( 2 \% \) (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 접종한 후 초기 \( \mathrm{pH} 6.0 \), 배양온도 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 130 \mathrm{rpm} \)으로 5일간 진탕 배양하여, 발효 홍국마의 제조를 위한 종균으로 사용하였다.</p><h2>발효 홍국마의 제조</h2><p>본 실험에 사용한 마 시료는 2009년 경북 안동에서 재배한 병마(Dioscorea batatas Dence.)를 구입하였으며, 구입 직후 \( 4^{\circ} \)에 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 발효 홍국마를 제조하기 위하여 마는 흐르는 물에 세척하여 뿌리 표면에 부착된 이물질을 없애고 말단 부분과 껍질을 제거한 후, 약 \( 3 \mathrm{~mm} \)정도로 절단하고 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 항량 건조하여 냉동보관 하면서 사용하였다. 발효 홍국마의 제조는 건조된 마를 물에 침지한후 불림을 행하였으며, 침지 후 물빼기를 실시한 다음 \( 100 \mathrm{~g} \)씩 배양통에 분취하였다. 이후 \( 121 \mathrm{C} \)에서 15분간 가압 멸균하고 실온으로 냉각시킨 다음 Monascus sp. MK2 배양액을 \( 4 \% \)\( (\mathrm{v} / \mathrm{w}) \)로 접종 한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 7일간 발효를 하였으며, 배양체의 덩어리 형성을 방지하고자 하루에 3회 규칙적으로 흔들어 주었다. 발효가 완료된 후에는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \)에서 수분함량 \( 10 \% \) 이하로 건조한 후 분쇄하여 냉동보관 하면서 실험에 필요한 시료로 사용하였다.</p><h2>발효 홍국마 색소 측정</h2><p>발효 홍국마로부터 색소의 측정은 에탄올을 농도별로 하여 각각 추출한 후 추출액을 \( 6,000 x \mathrm{~g} \)에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 적정배수까지 희석하여 UV-VIS spectropho-tometer (Hewlett Packard 8453, Germany)를 사용하여 yel-low 색소는 \( 400 \mathrm{~nm} \), orange 색소는 \( 470 \mathrm{~nm} \) 및 red 색소는 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 측정한 흡광도 값을 각각의 홍국색소 값으로 나타내었다. 또한 red 색소와 yellow 색소의 생성량을 \( 500 \mathrm{~nm} / 400 \) \( \mathrm{nm} \)의 비율로서 상대적으로 비교하였고, 1.0을 기준으로 하여그 이상은 red 색소의 생성 비율이 높은 것으로 그 이하는 yellow 색소의 생성 비율이 높은 것으로 나타내었으며, 이때 흡광도(OD) 1.0을 1 unit로 나타내었다</p><h2>HPLC를 이용한 Monacolin K의 정량</h2><p>발효 홍국마로부터 monacolin K의 정량은 에탄올을 농도별 \( (0,25,50,75 \) 및 \( 95 \%) \)로 하여 각각 추출한 후 추출액을 \( 6,000 \times \) g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 사용하였다. 즉, monacolin K의 추출은 홍국쌀 \( 1 \mathrm{~g} \)에 \( 0-95 \% \) 에탄올 \( 20 \mathrm{ml} \)을 첨가하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 150 \mathrm{rpm} \)으로 3시간 동안 교반하고 정치시킨 후 \( 6,000 \times \) g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 membrane filter ( \(0.45 \mathrm{μm} \), Millipore)로 여과하여 시료로 사용하였으며, 이때 사용한 HPLC 분석조건은 다음과 같다. Monacolin K의 정량은 Luna 5 μ Phenyl-Hexyl column\( (250 \times 4.6 \mathrm{~mm} \), Phenomenex Inc., USA)이 장착된 HPLC(Sykam, Germany)를 이용하여 flow rate : \( 1.0 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \), UV\( 237 \mathrm{~nm} \) 에서 검출하면서 injection volume 20 μl로 하여 aceto-nitile: \( 0.1 \% \) Phosphoric acid=\( =55: 45 \)의 비율로 용출시킨 후 표준monacolin K (Sigma co., USA)를 이용하여 peak의 면적비로써 비교 정량분석 하였다.</p><h2>DPPH radical 소거활성</h2><p>발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거활성은 Blois 등의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 농도별 시료 200 μl에 DPPH 용액을 800 μl를 가하여 혼합한 다음 실온에서 10분간 반응시킨후 \( 525 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 이때 DPPH radical 소거활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 나타내었으며, 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하였다.</p><h2>총 폴리페놀 함량</h2><p>발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 농도별 시료 50 μl에 \( 2 \% \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액 \( 1 \mathrm{ml} \)을 가하고, Folin &Ciocalteu's phenol reagents 50 μl를 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시킨 후 \( 760 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 tannic acid (Sigma co., USA)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 작성한 검량선으로부터 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.</p><h2>ACE 저해활성</h2><p>발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 ACE 저해활성의 측정은 Cushman과 Cheung의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉, 시료 100 μl에 \( 100 \mathrm{mM} \) sodium borate buffer \( (\mathrm{pH} 8.3 \) ) 100 μl를 가한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 전배양시켰다. 여기에 기질로서 hippuril-L-histidine-L-leucine (HLL, Sigma, U.S.A)용액 50 μl를 가하여 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 반응시킨 후 1 NHCl 250 μl를 가하여 반응을 정지시켰다. 여기에 ethyl acetate \( 1 \mathrm{ml} \)를 가하여 30초간 vortexing한 다음 \( 1,500 \times \) g으로 15분간 원심분리 한 후 상등액 800 μl를 취하였다. 이 상등액을 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \)에서 40분간 완전히 건조시킨 후 동일조건의 \( 100 \mathrm{mM} \) sodiumborate buffer \( (\mathrm{pH} \) 8.3) \( 1 \mathrm{ml} \)을 가하여 완전히 용해시켜 \(228 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 계산하였다.</p> <h2>발효 홍국마의 DPPH radical 소거활성</h2><p>DPPH는 화학적으로 안정화 된 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로서 \( 515 \sim 525 \mathrm{~nm} \) 부근에서 최대 흡광도를 가지는 보라색의 화합물로 ascorbic acid, BHA, 토코페롤, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 짙은 보라색이 탈색됨으로서 항산화물질의 전자공여능을 측정할 때 사용된다.</p><p>본 실험에서 사용한 발효 홍국마의 에탄올 농도별 추출물의 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과는 Fig. 3에 나타낸 바와 같이 대조구로서 발효를 하지 않은 마와 비교하여 측정한 결과, 대조구의 경우 에탄올 농도가 \( 25 \% \) 일 때 \( 80.8 \% \)로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 이후에는 에탄올 농도가 높아질수록 DPPH radical 소거활성은 낮아지는 것으로 조사되었다. 발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 경우 대조구와 마찬가지로 에탄올 농도가 높아질수록 DPPH radical 소거활성 또한 높아지다가 에탄올 농도가 \( 50 \% \) 일 때 \( 92.8 \% \)로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 이후에는 에탄올 농도가 높아질수록 DPPH radical 소거활성 역시 낮아지는 것으로 조사되었다.</p><p>이러한 결과는 Chung 등의 보고에서 항산화 성분 함량과 free radical 소거작용과의 상관관계에서 폴리페놀 함량에비례하여 활성이 증가한다고 보고하였으며, Kwon 등은 산겨릅나무 추출 분획물 중에 총 페놀함량이 가장 높았던 추출 분획물에서 가장 높은 DPPH radical 소거활성을 나타내었다는 보고와 일치하였다. 또한 Kang 등은 phenolic acid의 일종인 caffeic acid, ferulic acid, p-courmaric acid 등과 fla-vonoids의 일종인 catechin, quercetin과 catechol, chlorogenicacid를 포함한 기타 페놀성 물질이 전자공여능에 관여하는 것으로 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서 발효 홍국마 에탄올 \( 50 \% \) 추출물이 DPPH radical 소거활성이 높은 것은 높은 총폴리페놀 화합물의 함량에 기인하는 것으로 사료된다.</p><h2>발효 홍국마의 angiotensin converting enzyme (ACE)저해활성</h2><p>ACE는 renin-angiotensin-aldosterone system의 중요한 효소물질로서 불활성형의 angiotensin-I으로부터 C-terminal에서 dipeptide인 His-Leu를 분리시켜 가수분해 함으로서 강력한 혈관수축작용을 하는 angiotensin-II를 생성하는데, 혈압을 감소시키는 bradykinin을 불활성화시키는 효소로서 결국 본태성 고혈압의 원인이 되고 있다. 따라서 ACE 저해제는 ACE 활성을 저해함으로서 angiotensin-II의 생성 저해, aldos-terone의 분비 감소, 혈관확장제인 bradykinin의 증가 등의 과정을 통하여 신장혈관을 확장시켜 나트륨의 배설을 촉진 시킴으로서 혈압을 낮추어 줄 수 있으며, 이로 인해 심혈관질환 및 뇌혈관질환 등 고혈압과 관련이 깊은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.</p><p>본 실험에서 사용한 발효 홍국마의 에탄올 농도별 추출물의 ACE 저해활성을 측정한 결과는 Fig. 4에 나타낸 바와 같이 대조구로서 발효를 하지 않은 마와 비교하여 측정한 결과, 대조구와 발효 홍국마 에탄올 추출물 모두 물로만 추출하였을경우에는 ACE 저해활성이 전혀 없었으나, 에탄올 농도가 높아질수록 ACE 저해활성이 높아지는 것으로 조사되었다. 이로써 가장 높은 ACE 저해활성을 나타낸 \( 95 \% \) 에탄올 추출물의 경우 ACE 저해활성이 대조구와 비교 시 약 \( 33.1 \% \) 증가한 것으로 발효를 통한 ACE 저해활성의 증대 효과가 있는 것으로 조사되었다. 또한 물 추출에서는 ACE 저해활성이 전혀 없었고 에탄올 농도가 \( 95 \% \) 일 때 가장 높은 ACE 저해활성을 나타내는 것으로 보아 항산화활성과 관련된 물질이 아닌 또 다른 물질이 ACE 저해활성을 나타내는데 관여했다고 사료되며, 본연구에서 개발된 발효 홍국마는 고혈압을 예방하는데 있어서 기능성식품 또는 기능성 yogurt 제조의 원료로의 이용가능성이 크다고 생각된다.</p>	생명과학	[ "<h1>결과 및 고찰</h1><h2>발효 흥국마의 색소 측정</h2><p>식품에 사용되는 색소는 식품산업에서의 제품의 가치를 높이고, 소비자의 구매욕구와 식욕을 향상시키는 역할을 하고 있다.", "현재까지 식품공업에서 가장 많이 사용되어 온 색소는 대부분 타르계 합성색소로 그 발암성 등 안전성에 문제가 발생함에 따라 천연색소에 대한 소비자의 요구가 증대됨으로서 식품에서의 천연색소 사용량이 계속적으로 증가되고 있는 실정이다.", "그 중에서 미생물 유래의 천연색소는 배양기간이 타 천연색소 공급원과 달리 짧고 그 생산이 비교적 저비용으로 가능하다는 점에서 많은 장점을 가지고 있으며, 역사상 오래 전부터 주목받아 온 것은 홍주, 육류가공, 홍두부, 기타 음식물의 착색에 이용되어온 홍국(Ang-khak)이 있다.", "</p><p>본 연구에서는 홍국 색소 생산능 에 대하여 보고한 바 있는 Monascus sp.", "MK2 균주를 이용하여 마의 발효를 실시하였으며, 발효 홍국마의 에탄올 농도에 따른 추출물의 색소 생산량은 Table 1과 같다.", "</p><p>Table 1과 같이 에탄올 농도에 따른 발효 홍국마 추출물의 색소 생산능을 보면 에탄올 농도가 \\( 50 \\% \\)일 때 yellow, orange및 red 색소는 각각 12.77, 11.66 및 13.48 unit으로 가장 높은 색소의 추출효율을 보였으며, 증류수만을 추출에 사용하였을 경우에는 yellow, orange 및 red 색소가 각각 3.38, 3.28 및 3.38 unit으로 낮은 색소의 추출효율을 나타내었다.", "또한 에탄올 농도가 \\(95\\%\\)일 경우에도 yellow, orange 및 red 색소가 각각 4.09, 3.14 및 3.74 unit으로 낮은 색소의 추출효율을 나타내었다.", "이것은 대부분의 홍국색소는 수용성 색소와 지용성 색소의 형태로 존재하는데 \\( 50 \\% \\)의 에탄올 농도에서 수용성 색소와 지용성 색소가 대부분 추출됨으로서 가장 높은 추출효율을 나타낸 것으로 사료된다.", "이러한 결과는 홍국색소의 추출용매로서 에탄올을 사용하였을 때 색소 추출에 미치는 에탄올 농도의 영향이 \\( 80 \\% \\)에서 최대의 색소 추출 효율을 보였다는 Lee 등과 Jeon 등의 연구와는 달랐으나, 본 실험에서도 에탄올 농도가 \\( 75 \\% \\)일 경우에 yellow, orange 및 red 색소는 각각 12.54, 10.80 및 12.74 unit으로 높은 색소의 추출효율을 보임으로서 비슷한 결과를 보였으며, \\( 40 \\% \\) 이하의 에탄올 농도에서는 색소의 추출 효율이 감소하였다는 결과와는 일치하였다", "</p><h2>발효 홍국마의 Monacolin K 생산</h2><p>Monacolin K (Lovastatin, Mevinolin)는 고지혈증 치료제로 사용되고 있는 것으로 1979년 일본의 Endo 교수가 처음 발견한 물질로서 monacolin J, L 등 홍국에 함유된 전체 mon-acolin계의 약 \\( 80 \\% \\)를 차지하며 cholesterol 생합성 경로에서 HMG-CoA reductase를 특이적으로 억제함으로써 강력한 cholesterol 생합성 저해작용을 하는 것으로 보고되었다.", "Monacolin K의 작용기작은 monacolin K의 구조가 콜레스테롤 합성을 저해하는 가장 중요한 효소인 HMG-CoA (3-hy-droxy-3-methylglutaryl coenzyme A) 환원효소(EC 1.1.1.34) 저해제의 하나로, 결합하는 HMG-CoA 대신 HMG-CoA 환원효소와 미리 결합하여 mevalonate의 합성을 저해하고, 그 결과 콜레스테롤 생합성을 제한하여 혈관속의 콜레스테롤 수치를 효과적으로 감소시킨다고 알려져 있다.", "특히 중증의 고콜레스테롤 혈증 환자에서도 매우 유효한 것으로 보고되었으며, 동맥경화에서 가장 좋지 않은 것으로 알려져 있는 LDL cho-lesterol을 우선적으로 낮춰주는 작용이 있는 것이 특징이다.", "</p><p>Fig.", "1에 나타난 바와 같이, \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 7일간 발효하였을 때 monacolin K 생성량은 에탄올 농도가 높아질수록 monacolin K함량이 점차 높아지다가 에탄올 농도 \\( 75 \\% \\) 일 때 \\( 462.78\\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\)으로 가장 높은 monacolin K의 함량을 나타내었으며, 에탄올 농도가 \\( 95 \\% \\) 일 때는 추출량에 큰 차이를 볼 수 없었으나 \\( 443.52\\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\)로 monacolin K의 함량이 다소 낮게 추출되는 것을 알 수 있었다.", "이처럼 monacolin K가 물에서는 거의 추출되지 않고 유기용매인 에탄올에 잘 추출되는 것으로 보았을 때 유기용매에 가용성인 것을 알 수 있었다.", "이러한 결과는 에탄올 농도가 \\( 80 \\% \\) 일 때 monacolin K의 추출효율이 높은 결과와 유사하였으며, Lee 등의 결과에서 Monascuspurpureus NTU 301 균주를 이용하여 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 10일간 배양하였을 때 monacolin K 생성량이 \\( 2,584\\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\) 이었다는 보고와 비교하면 약 5.5배 낮은 결과를 나타내었다.", "하지만 Lee 등의 결과에서도 6일간 배양 했을 경우에는 monacolin K 함량이약 \\( 500 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\)으로 나타났으며, 7일째부터 monacolin K 함량이 증가하는 것으로 보고하였다.", "따라서 본 실험에서 사용한 균주 역시 배양기간을 길게 해줄 경우 monacolin K 함량을 증가 시킬 수 있으리라 생각되며, Monascus sp.", "균주의 발효를 통한 이차대사산물의 생산은 균주의 개량, 최적 기질의 선택 및 배양조건의 최적화 등을 통하여 대량생산이 가능하리라 사료된다.", "</p><h2>발효 홍국마의 총 폴리페놀 함량</h2><p>식물계에 널리 분포되어 있는 총 페놀성 화합물은 다양한 구조와 분자량을 가진 이차대사산물로 free radical을 제거함으로써 산화를 억제하여 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 막아 항암, 항균, 노화방지 및 심장질환을 예방하는 등의생리활성 물질로 알려져 있으며 식품, 의약품, 화장품 등 많은 분야에 활용되고 있다.", "이러한 페놀성 물질은 식물체의 고유한 색을 부여할 뿐만 아니라, 떫은맛과 쓴맛을 나타내는 대표적인 물질로서 식물성 식품의 고유한 식미감에도 깊이 관여할 수 있다.", "</p><p>본 실험에서 사용한 발효 홍국마의 에탄올 농도별 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과는 Fig.", "2에 나타낸 바와 같이 대조구의 경우 에탄올 농도가 \\( 50 \\% \\) 일 때 \\( 442.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\)으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 이후에는 에탄올 농도가 높아질 수록 총 폴리페놀 함량은 낮아지는 것으로 조사되었다.", "발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 경우 대조구와 마찬가지로 에탄올 농도가 높아질수록 총 폴리페놀 함량 또한 높아지다가 에탄올 농도가 \\( 50 \\% \\) 일 때 \\( 655.6 \\mathrm{mg} / \\mathrm{kg} \\)으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 이후에는 에탄올 농도가 높아질수록 총 폴리페놀 함량 역시 낮아지는 것으로 조사되었다.", "이로써 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 나타낸 \\( 50 \\% \\) 에탄올 추출물의 경우 총 폴리페놀 함량이 대조구와 비교시 약 \\( 32.5 \\% \\) 증가한 것으로 발효를 통한 총 폴리페놀 함량의 증대효과가 있는 것으로 조사됨으로써 향후 관련물질의 분리 및 정제를 통한 특성규명과 함께, 천연 항산화제로의 사용 가능성과 노화관련 건강기능식품 소재 개발 가능성 또한 있을 것으로 사료된다.", "</p><p>이러한 결과는 Park 등이 보고한 홍삼 및 홍국발효 홍삼추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 홍국발효홍삼 추출물에서 높았으며, 물 추출물 보다는 \\( 70 \\% \\) 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀 함량이 높았다는 결과와 유사한 것을 알 수 있었다.", "또한 함초의 채취 시기별 총 폴리페놀 함량을 조사하였을때 8월에 채취한 함초의 \\( 50 \\% \\) 에탄올 추출물에서 그 함량이 가장 높았다는 Cha 등의 보고와 일치하였으며, Cha 등이 보고한 두릅 잎의 경우, 물 추출물 보다 \\( 70 \\% \\) 에탄올 및 \\( 70 \\% \\) 메탄올 추출물에서 높은 함량을 보였다고 보고하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>홍국균은 Monascus 속의 곰팡이로서 분류학상 Ascomycotina 강, Plectomycetes 아강, Plectrascales 목, Hemiascomycetaceae과(반자낭균과), Aspergillaceae과,Monascaceae 족에 속하며, 자웅동체(hemothallic)이고, 무성생식기간에는 분생포자를 형성하고 유성생식기간에는 폐자기를 만들며, 격벽을 가지고 있는 Monascus sp.로써 현재 약20종, 균주로는 약 70여 종이 분리ᆞ동정되어 있다.", "홍국균은 α-amylase, β-amylase, glucoamylase 및 lipase 등의 가수분해효소를 생성하는 것으로 알려져 있으며, 이 균은 항균력이 있어서 소화불량, 타상, 이질 및 탄저 등의 치료에 효과가 있다고 본초강목에 기록되어 있고, 한국, 중국, 대만,일본, 및 말레이시아 등 벼 재배 지역에서 오래 전부터 착색, 양조, 방부 등을 목적으로 주류, 두부, 육류 등 식품 뿐 만이아니라 한약재로도 사용되어 온 국(koji)으로 붉은색을 띄는곰팡이다.", "홍국에서 monacolin A, J, K 및 그 유도체,GABA (γ-aminobutyric acid), dimerumic acid, 색소와 미지의 성분 등을 유도할 수 있으며, 이들은 혈당 강하, 혈압 강하, 항산화, 항생, 항혈전, 착색 및 방부작용이 있다.", "이 같은 항생물질에 대한 저항성을 이용하여 육류의 저장시 냉장하기 전에 사용하였으며 근래에는 햄, 소시지 및 어묵의 가공시에 방부목적으로 이용되며, 토마토케첩 등의 제조시에 식품의 착색 목적으로도 쓰이고 있다.", "</p><p>마(Dioscorea sp.)는 다년생 넝쿨성 초본으로 전세계의 열대 및 아열대지방에서 널리 분포하는 식량 작물로서, 우리나라에서는 주로 경북 북부지역에서 약 \\( 70 \\% \\) 정도가 생산되고 있다.", "마는 예로부터 한방에서는 자양, 강장, 폐결핵 등에 유효하고 소염, 해독, 진해, 거담, 이뇨, 신경통, 류마티즘에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.", "마(Dioscorea batatas Dence)의성분은 전분이 생체중의 \\( 8-24 \\% \\), 점질물이 \\( 0.6-2.4 \\% \\)를 차지하며, 약용성분으로는 amylose, cholin, saponin 등이 포함되어 있다.", "한편 마의 주요 약용성분으로 알려진 steroidal sap-onin은 다양한 생리활성에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 세포의 DNA 돌연변이를 방지하는 항 돌연변이성작용, 항암 및 항염증 작용 등이 알려져 있다.", "</p><p>예로부터 마는 한약제로 사용되고 있을 뿐 아니라 최근에는 중요한 기능성 식품소재로 인식되어 건강식품 또는 기능성식품 제조에 첨가되면서 그 사용량이 증가하고 있다.", "마의 기능성에 관한 연구로 마 점질물이 중금속 제거능과 Angiotensin Converting Enzyme (ACE) 저해효과를 나타낸다는 보고와, 콜레스테롤 저하효과, 지질 분해효소 저해활성 및 항돌연변이 활성 등이 보고되어 있다.", "그러나마를 이용한 발효식품에 관한 연구는 미미한 실정으로, 더욱이 Monascus sp.", "균주를 활용한 마 발효에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았으며 특정 발효식품에서 마의 활용적인 측면에 관한 연구가 필요한 실정이다.", "</p><p>따라서 본 연구에서는 뛰어난 약리적인 효과가 인정되고 있는 홍국균(Monascus sp.)을 이용하여 마의 발효를 유도함으로써 마 자체로의 기능성 뿐만 아니라 홍국균 발효를 통한 기능성 마 발효물의 에탄올 추출물이 in vitro에서 우수한 ACE 저해활성과 항산화활성 등의 생리활성 효과를 확인하였기에 보고하고자 한다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 배양</h2><p>배양본 실험에 사용한 균주는 한국식품연구원과 한국미생물보존센터에서 분양받은 표준균주 및 본 연구실에서 신규 분리한 균주들 중에서, 홍국색소 생산능이 우수한 것으로 조사된 Monascus sp.", "MK2 균주를 발효 홍국마 제조에 실험균주로 선발하여 본 실험에 사용하였다.", "그리고 발효 홍국마의 제조를 위해 Monascus sp.", "MK2의 전배양 기본배지로 \\( 3 \\% \\) rice powder, \\( 0.15 \\% \\quad \\mathrm{NaNO}_{2}, 0.1 \\% \\quad \\mathrm{M}_{8} \\mathrm{SO}_{4} \\cdot 7 \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\) 및 \\( 0.25 \\% \\) \\( \\mathrm{KH}_{2} \\mathrm{PO}_{4} \\mathrm{pH} 6.0 \\) 로 구성된 Lin's 배지를 사용하였으며, 본배양은 전 배양과 동일한 Lin's 배지에 Monascus sp.", "MK2 전배양액을 \\( 2 \\% \\) (\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\)로 접종한 후 초기 \\( \\mathrm{pH} 6.0 \\), 배양온도 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 \\( 130 \\mathrm{rpm} \\)으로 5일간 진탕 배양하여, 발효 홍국마의 제조를 위한 종균으로 사용하였다.", "</p><h2>발효 홍국마의 제조</h2><p>본 실험에 사용한 마 시료는 2009년 경북 안동에서 재배한 병마(Dioscorea batatas Dence.)를 구입하였으며, 구입 직후 \\( 4^{\\circ} \\)에 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.", "발효 홍국마를 제조하기 위하여 마는 흐르는 물에 세척하여 뿌리 표면에 부착된 이물질을 없애고 말단 부분과 껍질을 제거한 후, 약 \\( 3 \\mathrm{~mm} \\)정도로 절단하고 \\( 60^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 항량 건조하여 냉동보관 하면서 사용하였다.", "발효 홍국마의 제조는 건조된 마를 물에 침지한후 불림을 행하였으며, 침지 후 물빼기를 실시한 다음 \\( 100 \\mathrm{~g} \\)씩 배양통에 분취하였다.", "이후 \\( 121 \\mathrm{C} \\)에서 15분간 가압 멸균하고 실온으로 냉각시킨 다음 Monascus sp.", "MK2 배양액을 \\( 4 \\% \\)\\( (\\mathrm{v} / \\mathrm{w}) \\)로 접종 한 후 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 7일간 발효를 하였으며, 배양체의 덩어리 형성을 방지하고자 하루에 3회 규칙적으로 흔들어 주었다.", "발효가 완료된 후에는 \\( 60^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 수분함량 \\( 10 \\% \\) 이하로 건조한 후 분쇄하여 냉동보관 하면서 실험에 필요한 시료로 사용하였다.", "</p><h2>발효 홍국마 색소 측정</h2><p>발효 홍국마로부터 색소의 측정은 에탄올을 농도별로 하여 각각 추출한 후 추출액을 \\( 6,000 x \\mathrm{~g} \\)에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 적정배수까지 희석하여 UV-VIS spectropho-tometer (Hewlett Packard 8453, Germany)를 사용하여 yel-low 색소는 \\( 400 \\mathrm{~nm} \\), orange 색소는 \\( 470 \\mathrm{~nm} \\) 및 red 색소는 \\( 500 \\mathrm{~nm} \\)에서 측정한 흡광도 값을 각각의 홍국색소 값으로 나타내었다.", "또한 red 색소와 yellow 색소의 생성량을 \\( 500 \\mathrm{~nm} / 400 \\) \\( \\mathrm{nm} \\)의 비율로서 상대적으로 비교하였고, 1.0을 기준으로 하여그 이상은 red 색소의 생성 비율이 높은 것으로 그 이하는 yellow 색소의 생성 비율이 높은 것으로 나타내었으며, 이때 흡광도(OD) 1.0을 1 unit로 나타내었다", "</p><h2>HPLC를 이용한 Monacolin K의 정량</h2><p>발효 홍국마로부터 monacolin K의 정량은 에탄올을 농도별 \\( (0,25,50,75 \\) 및 \\( 95 \\%) \\)로 하여 각각 추출한 후 추출액을 \\( 6,000 \\times \\) g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 사용하였다.", "즉, monacolin K의 추출은 홍국쌀 \\( 1 \\mathrm{~g} \\)에 \\( 0-95 \\% \\) 에탄올 \\( 20 \\mathrm{ml} \\)을 첨가하여 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, 150 \\mathrm{rpm} \\)으로 3시간 동안 교반하고 정치시킨 후 \\( 6,000 \\times \\) g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 membrane filter ( \\(0.45 \\mathrm{μm} \\), Millipore)로 여과하여 시료로 사용하였으며, 이때 사용한 HPLC 분석조건은 다음과 같다.", "Monacolin K의 정량은 Luna 5 μ Phenyl-Hexyl column\\( (250 \\times 4.6 \\mathrm{~mm} \\), Phenomenex Inc., USA)이 장착된 HPLC(Sykam, Germany)를 이용하여 flow rate : \\( 1.0 \\mathrm{ml} / \\mathrm{min} \\), UV\\( 237 \\mathrm{~nm} \\) 에서 검출하면서 injection volume 20 μl로 하여 aceto-nitile: \\( 0.1 \\% \\) Phosphoric acid=\\( =55: 45 \\)의 비율로 용출시킨 후 표준monacolin K (Sigma co., USA)를 이용하여 peak의 면적비로써 비교 정량분석 하였다.", "</p><h2>DPPH radical 소거활성</h2><p>발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거활성은 Blois 등의 방법을 일부 변형하여 측정하였다.", "즉, 농도별 시료 200 μl에 DPPH 용액을 800 μl를 가하여 혼합한 다음 실온에서 10분간 반응시킨후 \\( 525 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하였다.", "이때 DPPH radical 소거활성은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 비교하여 나타내었으며, 양성대조군으로 ascorbic acid를 사용하였다.", "</p><h2>총 폴리페놀 함량</h2><p>발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis법을 일부 변형하여 측정하였다.", "즉, 농도별 시료 50 μl에 \\( 2 \\% \\mathrm{Na}_{2} \\mathrm{CO}_{3} \\) 용액 \\( 1 \\mathrm{ml} \\)을 가하고, Folin &Ciocalteu's phenol reagents 50 μl를 혼합한 다음 실온에서 30분간 반응시킨 후 \\( 760 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하였다.", "표준물질로는 tannic acid (Sigma co., USA)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 작성한 검량선으로부터 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.", "</p><h2>ACE 저해활성</h2><p>발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 ACE 저해활성의 측정은 Cushman과 Cheung의 방법을 일부 변형하여 측정하였다.", "즉, 시료 100 μl에 \\( 100 \\mathrm{mM} \\) sodium borate buffer \\( (\\mathrm{pH} 8.3 \\) ) 100 μl를 가한 후, \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 5분간 전배양시켰다.", "여기에 기질로서 hippuril-L-histidine-L-leucine (HLL, Sigma, U.S.A)용액 50 μl를 가하여 다시 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 30분간 반응시킨 후 1 NHCl 250 μl를 가하여 반응을 정지시켰다.", "여기에 ethyl acetate \\( 1 \\mathrm{ml} \\)를 가하여 30초간 vortexing한 다음 \\( 1,500 \\times \\) g으로 15분간 원심분리 한 후 상등액 800 μl를 취하였다.", "이 상등액을 \\( 120^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 40분간 완전히 건조시킨 후 동일조건의 \\( 100 \\mathrm{mM} \\) sodiumborate buffer \\( (\\mathrm{pH} \\) 8.3) \\( 1 \\mathrm{ml} \\)을 가하여 완전히 용해시켜 \\(228 \\mathrm{nm} \\)에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해활성을 계산하였다.", "</p> <h2>발효 홍국마의 DPPH radical 소거활성</h2><p>DPPH는 화학적으로 안정화 된 free radical을 가지고 있는 수용성 물질로서 \\( 515 \\sim 525 \\mathrm{~nm} \\) 부근에서 최대 흡광도를 가지는 보라색의 화합물로 ascorbic acid, BHA, 토코페롤, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 짙은 보라색이 탈색됨으로서 항산화물질의 전자공여능을 측정할 때 사용된다.", "</p><p>본 실험에서 사용한 발효 홍국마의 에탄올 농도별 추출물의 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과는 Fig.", "3에 나타낸 바와 같이 대조구로서 발효를 하지 않은 마와 비교하여 측정한 결과, 대조구의 경우 에탄올 농도가 \\( 25 \\% \\) 일 때 \\( 80.8 \\% \\)로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 이후에는 에탄올 농도가 높아질수록 DPPH radical 소거활성은 낮아지는 것으로 조사되었다.", "발효 홍국마 에탄올 농도별 추출물의 경우 대조구와 마찬가지로 에탄올 농도가 높아질수록 DPPH radical 소거활성 또한 높아지다가 에탄올 농도가 \\( 50 \\% \\) 일 때 \\( 92.8 \\% \\)로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 이후에는 에탄올 농도가 높아질수록 DPPH radical 소거활성 역시 낮아지는 것으로 조사되었다.", "</p><p>이러한 결과는 Chung 등의 보고에서 항산화 성분 함량과 free radical 소거작용과의 상관관계에서 폴리페놀 함량에비례하여 활성이 증가한다고 보고하였으며, Kwon 등은 산겨릅나무 추출 분획물 중에 총 페놀함량이 가장 높았던 추출 분획물에서 가장 높은 DPPH radical 소거활성을 나타내었다는 보고와 일치하였다.", "또한 Kang 등은 phenolic acid의 일종인 caffeic acid, ferulic acid, p-courmaric acid 등과 fla-vonoids의 일종인 catechin, quercetin과 catechol, chlorogenicacid를 포함한 기타 페놀성 물질이 전자공여능에 관여하는 것으로 보고한 바 있다.", "따라서 본 연구에서 발효 홍국마 에탄올 \\( 50 \\% \\) 추출물이 DPPH radical 소거활성이 높은 것은 높은 총폴리페놀 화합물의 함량에 기인하는 것으로 사료된다.", "</p><h2>발효 홍국마의 angiotensin converting enzyme (ACE)저해활성</h2><p>ACE는 renin-angiotensin-aldosterone system의 중요한 효소물질로서 불활성형의 angiotensin-I으로부터 C-terminal에서 dipeptide인 His-Leu를 분리시켜 가수분해 함으로서 강력한 혈관수축작용을 하는 angiotensin-II를 생성하는데, 혈압을 감소시키는 bradykinin을 불활성화시키는 효소로서 결국 본태성 고혈압의 원인이 되고 있다.", "따라서 ACE 저해제는 ACE 활성을 저해함으로서 angiotensin-II의 생성 저해, aldos-terone의 분비 감소, 혈관확장제인 bradykinin의 증가 등의 과정을 통하여 신장혈관을 확장시켜 나트륨의 배설을 촉진 시킴으로서 혈압을 낮추어 줄 수 있으며, 이로 인해 심혈관질환 및 뇌혈관질환 등 고혈압과 관련이 깊은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.", "</p><p>본 실험에서 사용한 발효 홍국마의 에탄올 농도별 추출물의 ACE 저해활성을 측정한 결과는 Fig.", "4에 나타낸 바와 같이 대조구로서 발효를 하지 않은 마와 비교하여 측정한 결과, 대조구와 발효 홍국마 에탄올 추출물 모두 물로만 추출하였을경우에는 ACE 저해활성이 전혀 없었으나, 에탄올 농도가 높아질수록 ACE 저해활성이 높아지는 것으로 조사되었다.", "이로써 가장 높은 ACE 저해활성을 나타낸 \\( 95 \\% \\) 에탄올 추출물의 경우 ACE 저해활성이 대조구와 비교 시 약 \\( 33.1 \\% \\) 증가한 것으로 발효를 통한 ACE 저해활성의 증대 효과가 있는 것으로 조사되었다.", "또한 물 추출에서는 ACE 저해활성이 전혀 없었고 에탄올 농도가 \\( 95 \\% \\) 일 때 가장 높은 ACE 저해활성을 나타내는 것으로 보아 항산화활성과 관련된 물질이 아닌 또 다른 물질이 ACE 저해활성을 나타내는데 관여했다고 사료되며, 본연구에서 개발된 발효 홍국마는 고혈압을 예방하는데 있어서 기능성식품 또는 기능성 yogurt 제조의 원료로의 이용가능성이 크다고 생각된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Biological Activities of Ethanol Extracts from Monascus-Fermented ChineseYam", 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5,338	<p>일반적인 스트레스 반응 중 원핵세균에서 가장 많이 연구된 것은 heat shock 반응이다. 대부분의 생물은 적정 온도보다 높은 온도에 노출되면 정상 단백질의 합성은 억제되고 heat shock 단백질의 합성을 급격히 유도, 합성하여 손상된 기능단백질의 구조를 정상적인 구조로 회복시킨다. 이러한 heat shock 단백질은 중금속, 에탄올, 산화적인 스트레스등의 다양한 스트레스 요인에 의해서도 유도되며, chemical pollutant에 의해서도 몇 가지 종류의 heat shock 단백질의 합성이 유도된다는 것이 보고되어 있다. 미생물들은 생육에 적합한 환경이 아닌 경우 환경에 대한 적응이 필요하다. 미생물들은 부적합한 환경에 대해 저항할 수 있는 기작과 stress 조건들에 의해 일어나는 손상을 복구하는 기작을 진화과정을 통하여 획득하고 있다.</p><p>한편 최근 연구가 활발히 진행되고 있는 유기용매 내성세균은 대부분이 그람 음성세균으로서 주로 Pseudomonas속에 속하고 있으며, 유기용매 내성세균의 유기용매에 대한 내성기작으로는 대개 세포와 외부환경 사이의 1 차적인 bar-rier로서 중요한 기능을 하는 세포막의 물리 화학적 특성(Physico-chemical)의 변화가 거론되고 있다. 세포의 막 구조 및 막 성분의 생리적 변화는 세포내 미소환경의 밀접하게 연관되어져 있으므로 유기용매에 의한 이들의 변화는 필수적인 것으로 생각되어진다.</p><p>유기용매 내성세균의 유기 용매에서의 내성기작의 해명은 유기용매 내성세균의 산업적인 이용에 앞서 선결되어야 할 과제이며, 동시에 유기용매 내성과 스트레스 반응과의 연관 성의 해명도 필수적으로 요구되고 있다.</p><p>본 연구에서는 stress 반응과 유기용매 내성기작의 연관성을 규명하기 위하여 그람 양성세균인 Micrococcus sp. BCNU 121 균주에 있어서 유기용매와 heat shock stress에서의 치사조건과 적응조건을 평판계수법으로 조사하였고, 유기용매와 heat stress를 상호 교차시켜 생존율을 비교하여 이들의 연관성을 보고하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>배지 및 시약</h2><p>Toluene stress에 대한 내성 test, 균주의 보존과 세포계수는 Brain Heart Infusion broth (BHI ; Difco Lab., Detroit USA)배지를 사용하였다.</p><h2>공시균주 및 배양조건</h2><p>본 실험에서는 그람 양성세균으로 유기용매에 내성을 가지는 Micrococcus sp. BCNU 121 균주를 공시하였다. 균주를 BHI broth 배지에서 24-48시간 배양하여 활성화시킨 후 종균으로 사용하였으며, 전배양액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 신선한 BHI broth 배지에 접종 후 \( 32^{\circ} \mathrm{C}\), \(180\mathrm{rpm} \) 으로 진탕 배양하였다. 회수된 전배양균주를 세정후 신선한 BHI broth 배지에 접종후 중간 증식기 \( \left(\mathrm{OD}_{660 \mathrm{~nm}}=0.6\right) \) 까지 배양하여, 다양한 농도의 용매와 온도 조건하에서 적응 처리한 후 \( 6,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하였다. 그리고 원심분리 회수된 균주를 세정후 각종 농도의 용매와 온도 조건에서 생존을 확인하여 준치사 농도, 온도 그리고 치사조건을 확인하였다.</p><h2>Stress tolerance</h2><p>균주를 신선한 LB배지에 접종후 중간 증식기 \( \left\langle\mathrm{OD}_{660}\right. \) \( \mathrm{nm}=0.6 \) )까지 배양하였다. 전배양액의 균주를 다양한 농도의 용매와 온도 조건하에서 적응 처리한 후 \( 6,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 대조구(non-treated cell)와 처리구(treated cell)를 배지에 흡광도 \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 1.0 이 되게 재현탁하였고, 각각의 배양액을 \( 10 \mathrm{ml} \) 씩 test tube에 분주하여 toluene 준치사 농도 \( 3 \% \) 와 준치사 온도 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 처리한 후 0분, 30분에서 샘플을 취하여 \( 0.9 \% \) sodium chloride에 연속 희석한 다음 BHI 한천 배지에 도말하였다. 이를 \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48시간 배양한 후 형성된 colony를 계수하여 stress 내성 정도를 비교하였다.</p><h2>생존율과 내성 assay</h2><p>대조구와 처리구에서 각각 colony를 계수하여 생존율을 측정하였다. 생존율은 0 분에서 colony forming unit (CFU)와 stress 처리 후 주어진 시간에서 CFU의 비율로 나타내었다. Toluene 준치사 농도와 준치사 온도에 대한 내성 효과를 tolerance factor로 표현하였으며, 대조구 세포의 퍼센트 생존율과 처리구 세포의 퍼센트 생존율에 대한 비율로 나타내었다. 모든 실험은 duplicate plating으로 3회 반복 실험하였다.</p>	생명과학	[ "<p>일반적인 스트레스 반응 중 원핵세균에서 가장 많이 연구된 것은 heat shock 반응이다.", "대부분의 생물은 적정 온도보다 높은 온도에 노출되면 정상 단백질의 합성은 억제되고 heat shock 단백질의 합성을 급격히 유도, 합성하여 손상된 기능단백질의 구조를 정상적인 구조로 회복시킨다.", "이러한 heat shock 단백질은 중금속, 에탄올, 산화적인 스트레스등의 다양한 스트레스 요인에 의해서도 유도되며, chemical pollutant에 의해서도 몇 가지 종류의 heat shock 단백질의 합성이 유도된다는 것이 보고되어 있다.", "미생물들은 생육에 적합한 환경이 아닌 경우 환경에 대한 적응이 필요하다.", "미생물들은 부적합한 환경에 대해 저항할 수 있는 기작과 stress 조건들에 의해 일어나는 손상을 복구하는 기작을 진화과정을 통하여 획득하고 있다.", "</p><p>한편 최근 연구가 활발히 진행되고 있는 유기용매 내성세균은 대부분이 그람 음성세균으로서 주로 Pseudomonas속에 속하고 있으며, 유기용매 내성세균의 유기용매에 대한 내성기작으로는 대개 세포와 외부환경 사이의 1 차적인 bar-rier로서 중요한 기능을 하는 세포막의 물리 화학적 특성(Physico-chemical)의 변화가 거론되고 있다.", "세포의 막 구조 및 막 성분의 생리적 변화는 세포내 미소환경의 밀접하게 연관되어져 있으므로 유기용매에 의한 이들의 변화는 필수적인 것으로 생각되어진다.", "</p><p>유기용매 내성세균의 유기 용매에서의 내성기작의 해명은 유기용매 내성세균의 산업적인 이용에 앞서 선결되어야 할 과제이며, 동시에 유기용매 내성과 스트레스 반응과의 연관 성의 해명도 필수적으로 요구되고 있다.", "</p><p>본 연구에서는 stress 반응과 유기용매 내성기작의 연관성을 규명하기 위하여 그람 양성세균인 Micrococcus sp.", "BCNU 121 균주에 있어서 유기용매와 heat shock stress에서의 치사조건과 적응조건을 평판계수법으로 조사하였고, 유기용매와 heat stress를 상호 교차시켜 생존율을 비교하여 이들의 연관성을 보고하고자 한다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>배지 및 시약</h2><p>Toluene stress에 대한 내성 test, 균주의 보존과 세포계수는 Brain Heart Infusion broth (BHI ; Difco Lab., Detroit USA)배지를 사용하였다.", "</p><h2>공시균주 및 배양조건</h2><p>본 실험에서는 그람 양성세균으로 유기용매에 내성을 가지는 Micrococcus sp.", "BCNU 121 균주를 공시하였다.", "균주를 BHI broth 배지에서 24-48시간 배양하여 활성화시킨 후 종균으로 사용하였으며, 전배양액 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 신선한 BHI broth 배지에 접종 후 \\( 32^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(180\\mathrm{rpm} \\) 으로 진탕 배양하였다.", "회수된 전배양균주를 세정후 신선한 BHI broth 배지에 접종후 중간 증식기 \\( \\left(\\mathrm{OD}_{660 \\mathrm{~nm}}=0.6\\right) \\) 까지 배양하여, 다양한 농도의 용매와 온도 조건하에서 적응 처리한 후 \\( 6,000 \\mathrm{rpm} \\) 에서 10분간 원심분리하였다.", "그리고 원심분리 회수된 균주를 세정후 각종 농도의 용매와 온도 조건에서 생존을 확인하여 준치사 농도, 온도 그리고 치사조건을 확인하였다.", "</p><h2>Stress tolerance</h2><p>균주를 신선한 LB배지에 접종후 중간 증식기 \\( \\left\\langle\\mathrm{OD}_{660}\\right. \\) \\", "( \\mathrm{nm}=0.6 \\) )까지 배양하였다.", "전배양액의 균주를 다양한 농도의 용매와 온도 조건하에서 적응 처리한 후 \\( 6,000 \\mathrm{rpm} \\) 에서 10분간 원심분리하였다.", "원심분리 후 대조구(non-treated cell)와 처리구(treated cell)를 배지에 흡광도 \\( 660 \\mathrm{~nm} \\) 에서 1.0 이 되게 재현탁하였고, 각각의 배양액을 \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 씩 test tube에 분주하여 toluene 준치사 농도 \\( 3 \\% \\) 와 준치사 온도 \\( 60^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 처리한 후 0분, 30분에서 샘플을 취하여 \\( 0.9 \\% \\) sodium chloride에 연속 희석한 다음 BHI 한천 배지에 도말하였다.", "이를 \\( 32^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 48시간 배양한 후 형성된 colony를 계수하여 stress 내성 정도를 비교하였다.", "</p><h2>생존율과 내성 assay</h2><p>대조구와 처리구에서 각각 colony를 계수하여 생존율을 측정하였다.", "생존율은 0 분에서 colony forming unit (CFU)와 stress 처리 후 주어진 시간에서 CFU의 비율로 나타내었다.", "Toluene 준치사 농도와 준치사 온도에 대한 내성 효과를 tolerance factor로 표현하였으며, 대조구 세포의 퍼센트 생존율과 처리구 세포의 퍼센트 생존율에 대한 비율로 나타내었다.", "모든 실험은 duplicate plating으로 3회 반복 실험하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Micrococcus sp. 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5,339	<h1>초록 : 급격한 환경변화에 대한 angelfish (Pterophyllum scalare) 젖산탈수소효소 동위효소의 변화</h1><p>열대 저산소 환경에 적응되어 있는 angelfish (Pterophyllum scalare)를 급격한 온도변화\( \left(27 \pm 0.5 \rightarrow 18 \pm 0.5^{\circ} \mathrm{C}\right.\)) 및 DO 변화 \( (6 \pm 1 \rightarrow 18\ \mathrm{ppm}) \)에 2시간 동안 적응시킨 후 젖산탈수소효소(EC 1.1.1.27, lactate dehydrogenase, LDH) 동위효소의 특성 및 유전자발현을 연구하였다. LDH 동위효소의 특성은 native-polyacrylamide gel 전기영동, Western blot 분석 및 효소활성 측정으로 확인하였다. 전기영동 결과 liver- 및 eye-specific Ldh-C 유전자는 간, 눈 및 뇌 조직에서 발현되었다. Western blot 분석 결과 LDH \(\mathrm{A}_4\) 동위효소는 \(\mathrm{B}_4\) 동위효소보다 음극 쪽에 나타났다. 간 조직에서 온도 저하 시 LDH \(\mathrm{A}_4\) 동위효소가 증가하고 \(\mathrm{B}_4\) 동위효소는 감소하였으며, DO 증가 시 LDH \(\mathrm{A}_4\) 및 \(\mathrm{C}_4\) 동위효소가 증가하고 \(\mathrm{B}_4\) 동위효소는 감소하였다. 눈 조직에서는 온도 저하 시 LDH \(\mathrm{A}_4\) 및 \(\mathrm{B}_4\) 동위효소가 증가하고 \(\mathrm{C}_4\) 동위효소는 감소하였으며, DO 증가 시 LDH \(\mathrm{A}_4\) 및 \(\mathrm{B}_4\) 동위효소는 증가하지만 \(\mathrm{C}_4\) 동위효소 및 하부단위체 C를 포함하는 동위효소는 감소하였다. 심장 조직에서는 DO 증가 시 LDH 활성이 증가하였고, LDH \(\mathrm{B}_4\) 동위효소가 증가하였다. 뇌 조직에서는 온도 저하 시 LDH \(\mathrm{A}_4\) 및 \(\mathrm{B}_4\) 동위효소가 증가하였고, DO 증가 시 LDH \(\mathrm{B}_4\) 동위효소는 증가하였다. 따라서 liver- 및 eye-specific Ldh-C는 DO 변화에 의해 영향을 받으며 간 및 눈 조직에서 LDH \(\mathrm{B}_4\) 및 \(\mathrm{C}_4\) 동위효소는 서로 상대적으로 조절되므로 \(\mathrm{C}_4\) 동위효소는 lactate oxidase로서 기능을 나타내는 것으로 사료된다.</p>	생명과학	[ "<h1>초록 : 급격한 환경변화에 대한 angelfish (Pterophyllum scalare) 젖산탈수소효소 동위효소의 변화</h1><p>열대 저산소 환경에 적응되어 있는 angelfish (Pterophyllum scalare)를 급격한 온도변화\\( \\left(27 \\pm 0.5 \\rightarrow 18 \\pm 0.5^{\\circ} \\mathrm{C}\\right.\\))", "및 DO 변화 \\( (6 \\pm 1 \\rightarrow 18\\ \\mathrm{ppm}) \\)에 2시간 동안 적응시킨 후 젖산탈수소효소(EC 1.1.1.27, lactate dehydrogenase, LDH) 동위효소의 특성 및 유전자발현을 연구하였다.", "LDH 동위효소의 특성은 native-polyacrylamide gel 전기영동, Western blot 분석 및 효소활성 측정으로 확인하였다.", "전기영동 결과 liver- 및 eye-specific Ldh-C 유전자는 간, 눈 및 뇌 조직에서 발현되었다.", "Western blot 분석 결과 LDH \\(\\mathrm{A}_4\\) 동위효소는 \\(\\mathrm{B}_4\\) 동위효소보다 음극 쪽에 나타났다.", "간 조직에서 온도 저하 시 LDH \\(\\mathrm{A}_4\\) 동위효소가 증가하고 \\(\\mathrm{B}_4\\) 동위효소는 감소하였으며, DO 증가 시 LDH \\(\\mathrm{A}_4\\) 및 \\(\\mathrm{C}_4\\) 동위효소가 증가하고 \\(\\mathrm{B}_4\\) 동위효소는 감소하였다.", "눈 조직에서는 온도 저하 시 LDH \\(\\mathrm{A}_4\\) 및 \\(\\mathrm{B}_4\\) 동위효소가 증가하고 \\(\\mathrm{C}_4\\) 동위효소는 감소하였으며, DO 증가 시 LDH \\(\\mathrm{A}_4\\) 및 \\(\\mathrm{B}_4\\) 동위효소는 증가하지만 \\(\\mathrm{C}_4\\) 동위효소 및 하부단위체 C를 포함하는 동위효소는 감소하였다.", "심장 조직에서는 DO 증가 시 LDH 활성이 증가하였고, LDH \\(\\mathrm{B}_4\\) 동위효소가 증가하였다.", "뇌 조직에서는 온도 저하 시 LDH \\(\\mathrm{A}_4\\) 및 \\(\\mathrm{B}_4\\) 동위효소가 증가하였고, DO 증가 시 LDH \\(\\mathrm{B}_4\\) 동위효소는 증가하였다.", "따라서 liver- 및 eye-specific Ldh-C는 DO 변화에 의해 영향을 받으며 간 및 눈 조직에서 LDH \\(\\mathrm{B}_4\\) 및 \\(\\mathrm{C}_4\\) 동위효소는 서로 상대적으로 조절되므로 \\(\\mathrm{C}_4\\) 동위효소는 lactate oxidase로서 기능을 나타내는 것으로 사료된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "", "eng": "Variation of Lactate Dehydrogenase Isozymes in Angelfish (Pterophyllum scalare) according to Acute Environment Change" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-c9ab9643-a42b-4362-bcee-fedf97b57c07", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", "doc_author": [ "안창수", "조성규", "염정우" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }