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id int32 0 5.48k	corpus stringlengths 176 110k	category stringclasses 24 values	sentence_ls listlengths 1 830	metadata dict
5,400	<h1>고 찰</h1><p>귤나무속과 근연한 것을 금감속(genus Fortunella), 탱자나무속(genus Poncirus), 그리고 호주의 Microcitrus속과 Eremocitrus속을 들고 있으며, 현재 대부분 식물분류학자들은 Microcitrus속과 Eremocitrus속을 Citrus속에 포함하고 있다. 그 외 두 추가적인 속으로 Triphasia속과 Clymenia속이 있지만 이들은 Citrus속의 일부로는 간주하지 않는다.</p><p>감귤류는 다배성으로 종속간 교잡이 가능하여 형태만으로는 분류형질을 설정하기 힘들다. Swingle의 감귤속 분류체계에 따르면 파페다아속(subgenus Papeda)은 야생종 16종을 설정하였고, 감귤아속(subgenus Gitrus)에는 재배종은 설정하였다. 반면에 Tanaka는 화서의 유무에 따라 초생감귤아속 (subgenus Archicitrus)과 후생감귤아속(subgenus Metacitrus)으로 157종을 기록하여 분류학자들에 따라 큰 차이를 나타낸다.</p><p>한국 내 분포하는 귤나무속 식물은 광귤나무, 유자나무, 당귤나무, 귤나무, 레몬이다. 레몬은 도감에 따라 제외하기도 한다. 이 다섯 종 중에서 광귤나무, 당귤나무, 레몬은 같은 분지군 내에 있다. 반면에 유자나무는 귤나무는 다른 분지군에 있으면서 금감과 분지군을 형성한다. 탱자나무는 가장 분화된 것으로 구분된다. 이는 형태적 분류와 일치하지 않는다. 이런 차이는 종 분류에 사용된 trnL-trnF 서열이 약 \(650 \mathrm{bp} \) 로 정보가 적은 탓에 기인한다. 보다 정확한 분자계통분류를 위해서는 보다 많은 서열과 엽록체 외에 핵 부위의 서열을 추가하는 것이 더 분해능을 높일 수 있을 것이다.</p><p>한편 앞서 random amplified polymorphic DNA (RAPD) 마커에 의한 연구는 탱자나무와 금감, 유자나무를 다른 분지군으로 분리하여 유자나무를 제외하고는 본 결과와 유사한 양상을 나타내었다. 특히 우에 의한 감귤류(Citrus)와 탱자나무(Poncirus)의 종속간 분석에서 탱자나무와 탱자나무와 교잡한 황금귤은 감귤류와 분리된다. 그리고 유자나무와 재래유자나무 등은 계통도에서 다른 분지군과 합류됨으로 유자나무는 종내 변이가 크거나 채집 지역 간 변이가 크다는 것을 시사한다. 이는 본 연구에서도 유자나무의 서열이 다른 감귤속 식물에 비해 서열이 크게 다른 것과 일치한다. 한편 우에 의한 탱자나무와 유자나무를 교잡했을 때 그 자손은 삼출엽 (ternate or trifoliate)인 탱자나무와 단신복엽(simple compound leaf)인 유자나무의 잎 형태를 가지고 있다. 부계를 어떤 종으로 교잡해도 단신복엽의 비율이 매우 높고 탱자나무속을 제외하고는 귤나무속 식물은 거의 단신복엽이다. 따라서 귤나무속이 탱자나무속보다 금감속에 더 유연관계가 있다고 볼 수 있다.</p><p>귤나무는 우리나라가 점차 아열대 기후로 접어들면 제주도에서 남해안 지역으로 확대될 수 있을 것이다. 본 연구 결과 유전적으로 유사한 근연관계에 있는 분류군은 비록 형태적으로 달라도 유전적으로 크게 다르지는 않는 것으로 볼 수 있다. 따라서 육종 측면에서 교잡이나 다양도를 높이는 방안으로 본 연구 결과가 이용될 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h1>결 과</h1><p>귤나무속 7개 분류군에 대한 trnL-trnF 부위의 profiles는 100 bp ladder DNA marker로 크기를 비교한 결과 평균 651 nucleotides \( (\mathrm{bp}) \) 의 크기를 가지고 있었다(Table 3). 이들 밴드를 purification하여 DNA 염기서열을 분석한 결과 귤나무속 식물은 610-707 bp이었다. 최고와 최저의 차이는 삽입과 결실에 의한 것이다.</p><p>\( \mathrm{A}+\mathrm{T} \) 함량은 \( 70.2-76.9 \% \) 였으며, 분류군간 염기 차이는 4 분류군 염기 단지 Citrus junos의 C에서만 유의성을 나타내었다.</p><p>서열 쌍 거리 분석에서 광귤나무와 레몬, 광귤나무와 당귤, 레몬과 당귤이 유전적 거리가 0.007로 근연하였다. 반면에 유자나무와 탱자나무는 유전적 거리가 0.719로 가장 먼 유연관계를 나타내었다. 유자나무는 나머지 분류군의 쌍에 비해 유전적 거리가 높았다.</p><p>모든 염기 자리마다 불일치 지수(disparity index) 또는 불균등 지수를 산출하였다(Table 5). 0 보다 클 경우 서열 간 진화분화의 차이가 우연에 의한 예상 값보다 염기 조성 편향에서 큰 차이를 나타내게 된다. 많은 분류 쌍에서 0.05보다 작을 경우 서열이 같은 패턴을 가지고 진화했다는 귀무가설을 수용 할 수 없는 결과가 나타났다.</p><p>DNA 서열에서 염기 치환이 같은 패턴으로 진화해왔다는 가설을 몬테-카를로 테스트(500 반복)로 검증하였다. \( \mathrm{C} \) 에서 \( \mathrm{T} \) 로 치환이 22.84로 가장 높았으며 \( \mathrm{G} \) 에서 \( \mathrm{A} \) 의도 15.23으로 높았다. 또한 치환에 대한 24 핵산 치환 모델을 적용하였다. 베이시안 정보 기준은 Hasegawa-Kishino-Yano 척도 3846.4에서 가장 낮았다. 알카이케 정보 기준도 3751.3에서 3974.2로 유사하였다. 염기치환의 전이/전형의 비는 0.79에서 1.31로 모델 간 큰 차이가 나타났다.</p><p>타지마(Tajima)의 중립성 검증에서 자리 수는 7 일 때 분리되는 자리 수는 2900 이었으며 이들의 비는 0.482였고, 다양도는 0.197로 나타났다. 중립설의 검증 결과는 음의 값을 나타내므로 유전적 변이를 증가시키는 힘이 도태에 의한 중립가설보다는 삽입과 결실에 의한 결실돌연변이설로 설명된다 \( (\mathrm{D}=-1.080) \).</p><p>귤나무속 7 분류군에 대한 trnL-trnF 서열을 이용한 계통관계 분석에서 4 개의 분지도 모두 탱자나무가 다른 분류군과 가장 먼 유연관계를 나타내었는데. MP tree에서는 유자나무와 금감이 속이 다름에도 불구하고 같은 분지군을 형성하였으며 이는 귤나무가 금감과 같은 분지군을 형성한 ML tree, ME tree, NJ tree와 가장 큰 차이다. 4 개의 trees 모두 레몬과 당귤이 가장 근연하였고 이들은 광귤나무와 sister관계를 나타내었으며 높은 지지도를 나타낸 반면 다른 외부마디는 지지도가 높지 않았다.</p> <p>당귤나무(Citrus sinensis (L.) Osbeck)은 상록활엽 관목이다. 잎은 호생하며 타원형이고 넓은 예저 또는 원저이며 길이 \(5\sim 7\mathrm{cm} \) 로서 가장자리가 밋밋하거나 파상의 잔톱니가 있고 엽병의 날개가 없거나 좁다. 열매는 장과로 지름 \(3\sim 4\mathrm{cm} \)의 원형 또는 난형이며 등황색 또는 황적색으로 중심부가 충실하다. 외과피는 얇으며, 과육과 잘 떨어지고 밋밋하며 광택이 난다. 꽃은 6 월에 피며 백색이고 향기가 있으며, 엽액에 1송이씩 달린다. 꽃받침잎과 꽃잎은 각각 5 개이고 20 개 정도의 수술과 1 개의 암술이 있다. 높이가 \( 5 \mathrm{~m} \) 에 달하고 가지에 가시가 없다.</p><p>귤나무(Citrus unshius. Marcov.)는 높이가 \( 3 \sim 5 \mathrm{~m} \) 이고 가지가 퍼지며 가시가 없다. 잎은 어긋나고 타원형으로 가장자리가 밋밋하거나 물결 모양 잔 톱니가 있다. 잎자루의 날개는 뚜렷하지 않다. 꽃은 6월에 흰색으로 핀다. 꽃받침조각과 꽃잎은 5개씩이고 수술은 여러 개이며 암술은 1 개이다. 열매는 작은 공 모양이고 지름 \( 5 \sim 8 \mathrm{~cm} \) 이며 노란빛을 띤 붉은색으로 익는다. 이와 비슷하지만 잎이 타원형이고 열매가 원형 또는 달걀 모양이다.</p><p>금감(Fortunella japonica Swingle var. margarita (Swingle)Makino)은 상록 활엽관목이다. 잎은 호생하고 피침형이며 양끝이 좁고 원저이며 길이 \(4\sim 9\mathrm{cm} \), 너비 \( 2\sim 4 \mathrm{cm} \) 로서 가장자리에 톱니가 거의 없고 표면은 녹색, 뒷면은 백록색이며 엽맥이 뚜렷치 않다. 엽육 중에는 많은 소유점이 있고 엽병에 좁은 날개가 있다. 꽃은 백색으로서 향기가 있으며 1-2개가 엽액에 모여 달리고, 화경은 길이 \( 3\sim5 \mathrm{mm} \) 이며, 꽃받침은 5개, 난형이고 꽃이 핀 후 커지며, 꽃잎도 5개이고 긴 타원형으로 길이 \( 7 \mathrm{~mm} \) 이며 5-7월에 개화한다. 수술은 많으며 1개의 암술이 있고 자방은 4-5실이다. 열매는 감과로 둥글며 지름 \(2\sim 3\mathrm{cm} \)이고 10~11 월에 오렌지색으로 성숙하고 먹을 수 있다. 종자는 난형이며 길이 \( 7\sim 10 \mathrm{mm} \) 이다. 수피는 회청색이고 줄기가 많이 갈라지며 가시가 없다.</p><p>탱자나무(Poncirus trifoliat L.)는 낙엽 교목이다. 원산지는 중국이며 중국과 한국 중부 이남에 분포한다. 높이 약 \( 3 \mathrm{~m} \) 정도까지 자란다. \( 5 \mathrm{~cm} \) 정도의 가시가 나 있다. 잎은 3출 겹잎으로 어긋나는데, 작은 잎은 타원형 또는 달걀 모양이며 끝은 둔하거나 약간 들어가고 밑은 뾰족하며 가장자리에 둔한 톱니가 있다. 가지는 약간 납작하고 녹색이며 가시는 길이 \( 3 \sim 5 \) \( \mathrm{cm} \) 로서 굵고 어긋난다. 꽃은 잎보다 먼저 흰색으로 5월경에 하나씩 피며 잎겨드랑이에 달린다. 꽃잎은 5개이며, 수술은 많다. 열매는 장과로 둥글고 노란색이며 9월에 익는다.</p><p>식물의 분자생물학적 분류에 사용되는 엽록체 tRNA (trn) 유전자 중 leucine-tRNA (trnL)와 Proline-tRNA(trnF)의 서열 (trnL-trnF)은 한 개의 group I intron, 한 개의 intergenic spacer, 그리고 한 개의 trnF exon으로 구성되어 있다. Group I intron은 잘 보존된 핵심 구조로 pre-tRNA로부터 자가 스플라이싱을 촉매하는 활성 자리를 암호화하고 있다. trnL intron은 group I의 첫 번째 intron이며 tRNA 유전자를 저해한다. 다른 엽록체 DNA group I 인트론은 16S rRNA, psbA, psbC, 그리고 psaB 유전자에서 발견된다. 식물에서 trnL 인트론은 보통 양측면의 trnL exons에서 보존된 부위이다. intergenic spacer에서 이차 구조 요소(secondary-structural ele-ments) 스프라이싱 부위에서는 발견되지 않는다.</p><p>국내에서 귤나무속에 대한 임의 DNA 증폭(random amplified DNA, RAPD)에 의한 분자 마커로 분류학적 연구를 수행 한 바 있다. 그러나 이 두 마크 간에 같은 분류군의 위치와 일부 분지군이 tree상에 일치하지 않은 점이 있었다. 따라서 본 연구의 목적은 엽록체 trnL-trnF 부위서열을 이용한 귤나무속과 근연 속 분류군에 대한 유연관계를 실행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 연구에 사용된 귤나무속과 근연 속의 재료는 2010년부터 2011년에 걸쳐 우리나라의 각지에서 총 7종을 채집하여 실험에 사용하였다.</p><p>광귤나무(Citrus aurantium L.)와 귤나무(Citrus unshiu S.Marcov.)는 경기도 포천시 소흘읍에서 채집하였으며, 유자나무(Citrus junas Tanaka), 당귤(Citrus sinensis (L.) Osbeck), 금감(Fortunella japonica Swingle var. margarita (Swingle) Makino)는 제주시 애월읍 봉성리에서 채집하였으며, 레몬 (Citrus limonia Osbeck)과 탱자나무(Poncirus trifoliat (L.) Rafinesque)은 경상남도 진주시 이반성면 대천리에서 채집하였다.</p><h2>genomic DNA 추출</h2><p>각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 Plant DNA Zol Reagent (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA를 사용하였다 추출방법은 \( 0.3 \mathrm{~g} \) 의 신선한 잎을 액체질소로 마쇄한 다음 사용자의 지침서에 의거하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 에탄올 등 여액의 제거를 위해 진공 흡입기로 5 분간 건조시킨 후 \( \mathrm{TE} 100 \mathrm{ul} \) 에 용해하여 3일간 냉장보관하였다. 용해된 시료는 DyNA 200 fluorometer (Amersham Pharmacia Biotech, USA)를 이용하여 DNA 정량을 체크하였고 TE로 DNA 농도가 균질하게 조정하여 본 분석을 위해 사용하거나 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에 보관하였다.</p><h2>분석</h2><p>엽록체의 trnL intron과 trnL-trnF spacer 부위는 Taberlet et al 이 고안한 시발체(primer)로 PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭시켰다.</p><p>PCR 반응을 위하여 추출한 각 분류군의 게놈 DNA \( 50 \mathrm{ng} \), 각 dNTP \( 100 \mathrm{uM} \), 시발체 각 \( 0.2 \mathrm{uM}, 1 x \) enzyme buffer, Taq polymerase 2 unit를 넣고 증류수로 전체 \( 50 \mathrm{ul} \) volume이 되도록 추가하였다. 증폭반응은 초기 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 90 \mathrm{sec} \) 간 변성한 후, 28 사이클로 \( 94^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 30 \mathrm{sec}, 42^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 60 \mathrm{sec}, 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 60 \mathrm{sec} \) 간 실시하였고, 추가로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 연장하였다.</p><p>PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 분리하였는데 이때 절편들의 상대적 크기를 비교하기 위해 \( 100 \mathrm{bp} \) ladder DNA marker를 같이 loading시켰다. 전기영동 후 젤은 ethidium bromide로 염색하여 밴드를 현상하였다. 현상된 젤은 Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, San Leandro, CA, USA)을사용하여 밴드 양상을 조사하였다. 이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다. 증폭된 단편들은 bluescript (Pharmatech)로 클론하였고, ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)로 서열화하였다. 각각의 종에서 최소 10 개 클론들을 분석하였다.</p><h2>통계 분석</h2><p>분류군간 유전적 거리 \( (I) \) 와 유전적 동질성 \( (D) \) 은 분류군간 염기쌍의 비교로 산출하였다[12]. PAUP에서 분류군간 핵산 차이에 의한 유의성 검증, 염기 빈도, 서열쌍 거리, uncorrected "\(p\)"에 의한 측정된 거리 등을 산출하였다. 염기자리 당 서열 간 염기 조성 차이, 불일치 계수를 검증하였다.</p><p>핵산치환 모델 분석은 최적 치환 패턴에 대한 최소 Bayesian Information Criterion (BIC)값을 고려하였다. 각 모델에 대해 Akaike Information Criterion, corrected (AICc)값, Maximum Likelihood value (InL), 척도의 수는 Nei와 Kumar의 식에 의거하였다. 염기 자리 간 진화율에 대한 비균등성은 진화적으로 비변이 부분 \( (+I) \) 을 가진 Gamma 분포 \( (+G) \) 로 나타낸 모델을 사용하였다. 염기치환의 전이/전형의 비율에 대한 평가 \( (R) \) 역시 이 모델에 근거하여 산출하였다.</p><p>서열간 코돈의 중립성 검증은 갭과 결손 서열을 제외하고 500 회 반복으로 MEGA5로 실시하였다[22]. 타지마의 여러 통계치( \( \mathrm{M}= \) number of sites, \( \mathrm{S}=\mathrm{Number} \) of segregating sites, \( \mathrm{ps}=\mathrm{S} / \mathrm{M} \), and \( \pi= \) nucleotide diversity. \( \mathrm{D}= \) Taiima test statistic)를 산출하였다.</p><h2>유연관계 분석</h2><p>각 식물종 trnL intron과 trnL-trnF spacer 부위에서 얻은 크로마토그램(chromatogram)은 소프트웨어 Sequence Navigator 1.0.1 (Applied Biosystems Inc.)로 편집하였다. trnL intron과 trnL-trnF spacer 부위 서열에서 결손부위를 포함한 서열 배당은 MEGA5와 Clustal X program으로 분석하였다. 배당된 서열에서 gap의 부위는 missing data로 처리하였다. 그러나 계통학적으로 정보적인 인델은 이진법 처리로 데이터에 삽입하였다.</p><p>최절약법에 의한 tree (maximum parsimonious tree, MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bi-section-reconnection에 따랐다[18]. 최우법(maximum like-lihood tree, ML), N-J법(neighbor-ioining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다. 계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.57의 NEIGHBOR, neighbor-ioining (NJ) 방법에 의해 구성하였다. 분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 500회 반복법으로 실시하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>운향과(Rutaceae) 귤나무속(Citrus)은 동남아시아에 약 10여 종이 있으며 그 중 귤은 과일로 널리 알려져 있다. 귤과 형태적으로 유사한 금감속(Genus Fortunella)에 금귤 또는 금감(Fortunella japonica var. margarita) (Swingle) Makino)이 있다. 귤나무를 접목시킨 다양한 귤의 품종이 제주도에는 재배되고 있다. 귤나무속 식물은 인디아 북동지방, 비얀마, 중국의 운남지방이 기원지로 알려져 있다. 이 속의 식물들은 귤, 레몬, 자몽, 라임으로 잘 알려져 있다. 이 속의 분류는 복잡하고 여러 종간 또는 클론 번식으로 종간 교잡이 형성되어 매우 복잡하다. 귤나무속의 분류는 학자마다 견해를 달리하여 이창복와 이영노에 따랐다.</p><p>광귤나무(Citrus aurantium L.)는 높이가 \( 4 \sim 5 \mathrm{~m} \) 정도로 잎이 많이 나고 가지에 가시가 있다. 잎은 어긋나고 달걀 모양이며 길이 \(7\sim 10\mathrm{cm} \)이다. 잎 끝이 뵤족하고 물결 모양의 톱니가 있으며 잎자루에 날개가 있다. 5월에 흰색 꽃이 총상꽃 차례로 1 개 또는 몇 개씩 피는데, 꽃잎과 꽃받침은 각각 5 개 이며 20 24개의 수술과 1 개의 암술이 있다. 씨방은 둥글고 녹색이다. 열매는 장과로 둥글면서도 편평하고 지름 \( 6 \sim 8 \) \( \mathrm{cm} \) 이며 10월에 노란빛을 띤 갈색으로 익는다. 종자는 쐐기형 달걀 모양이다.</p><p>유자나무(Citrus junos Tanaka)는 바닷가나 민가부근에서 자란다. 중국 원산이며 남쪽에서 과수로 심는다. 높이 약 \(4 \mathrm{m} \) 이다. 가지에 뵤족한 가시가 있다. 잎은 어긋나고 달걀 모양 긴 타원형이며 가장자리에 둔한 톱니가 있고 잎자루에 날개가 있다. 꽃은 양성화이며 5~6월에 흰색으로 피는데, 잎겨드랑이에 1 개씩 달린다. 꽃받침조각과 꽃잎은 5개씩이고 수술은 20개가 통처럼 합쳐지거나 5개로 나누어진다. 열매는 장과로서 편구형이며 지름 \( 4 \sim 7 \mathrm{~cm} \) 이고 9 10월에 익는다. 빛깔은 밝은 노란색이며 겉이 울퉁불퉁하고 향기가 있다.</p><p>레몬(Citrus limonia Osbeck)은 히말라야가 원산지로 시원하고 기후의 변화가 없는 곳에서 잘 자란다. 높이는 \( 3 \sim 6 \mathrm{~m} \) 이다. 잎은 어긋나고 어릴 때는 붉은 색을 띠지만 점점 녹색으로 변한다. 꽃은 5 10월에 피고 잎겨드랑이에 하나씩 또는 몇개씩 무리지어 달린다. 꽃봉오리는 붉은 색이고, 꽃의 안쪽은 흰색, 바깥쪽은 붉은빛이 강한 자주색을 띤다. 열매는 타원모양이고 겉껍질이 녹색이지만 익으면 노란 색으로 변하며 향기가 강하다. 종자는 달걀 모양이고 양끝이 뽀족하다.</p> <h1>초록 : trnL-trnF 서열에 의한 한국 귤나무속과 두 근연 식물종의 계통분류학적 연구</h1><p>귤나무속은 운향과(Rutaceae)에 속한다. 동남아시아, 미얀마, 중국 운남에서 기원된 것으로 알려져 있다. 이 속의 분류관계는 복잡한데 클론번식과 야생식물과 교잡이 빈번하다. 식물에서 속간 속내 계통관계 추론을 위해 널리 이용되고 있는 엽록체 trnL-trnF 부위가 있다. 이 귤나무속과 두 근연한 탱자나무속과 금감속에 속하는 7 종간 계통 관계를 평가하였다. 많은 삽입이 발견되었고 속내 종간 변이는 결실/삽입에 의한 것으로 밝혀졌다. 이 속의 레몬과 당귤나무은 네 계통도(MP, ML, ME, and NJ) 에서 모두 같은 분지군을 형성하여 가장 근연관계에 있었고 광귤나무(향귤나무)과 자매군을 형성하였다. 유자나무는 이들과 많은 서열 차이를 나타내었다. 외부 분지군은 낮은 지지도를 나타내었다.</p>	생명과학	[ "<h1>고 찰</h1><p>귤나무속과 근연한 것을 금감속(genus Fortunella), 탱자나무속(genus Poncirus), 그리고 호주의 Microcitrus속과 Eremocitrus속을 들고 있으며, 현재 대부분 식물분류학자들은 Microcitrus속과 Eremocitrus속을 Citrus속에 포함하고 있다.", "그 외 두 추가적인 속으로 Triphasia속과 Clymenia속이 있지만 이들은 Citrus속의 일부로는 간주하지 않는다.", "</p><p>감귤류는 다배성으로 종속간 교잡이 가능하여 형태만으로는 분류형질을 설정하기 힘들다.", "Swingle의 감귤속 분류체계에 따르면 파페다아속(subgenus Papeda)은 야생종 16종을 설정하였고, 감귤아속(subgenus Gitrus)에는 재배종은 설정하였다.", "반면에 Tanaka는 화서의 유무에 따라 초생감귤아속 (subgenus Archicitrus)과 후생감귤아속(subgenus Metacitrus)으로 157종을 기록하여 분류학자들에 따라 큰 차이를 나타낸다.", "</p><p>한국 내 분포하는 귤나무속 식물은 광귤나무, 유자나무, 당귤나무, 귤나무, 레몬이다.", "레몬은 도감에 따라 제외하기도 한다.", "이 다섯 종 중에서 광귤나무, 당귤나무, 레몬은 같은 분지군 내에 있다.", "반면에 유자나무는 귤나무는 다른 분지군에 있으면서 금감과 분지군을 형성한다.", "탱자나무는 가장 분화된 것으로 구분된다.", "이는 형태적 분류와 일치하지 않는다.", "이런 차이는 종 분류에 사용된 trnL-trnF 서열이 약 \\(650 \\mathrm{bp} \\) 로 정보가 적은 탓에 기인한다.", "보다 정확한 분자계통분류를 위해서는 보다 많은 서열과 엽록체 외에 핵 부위의 서열을 추가하는 것이 더 분해능을 높일 수 있을 것이다.", "</p><p>한편 앞서 random amplified polymorphic DNA (RAPD) 마커에 의한 연구는 탱자나무와 금감, 유자나무를 다른 분지군으로 분리하여 유자나무를 제외하고는 본 결과와 유사한 양상을 나타내었다.", "특히 우에 의한 감귤류(Citrus)와 탱자나무(Poncirus)의 종속간 분석에서 탱자나무와 탱자나무와 교잡한 황금귤은 감귤류와 분리된다.", "그리고 유자나무와 재래유자나무 등은 계통도에서 다른 분지군과 합류됨으로 유자나무는 종내 변이가 크거나 채집 지역 간 변이가 크다는 것을 시사한다.", "이는 본 연구에서도 유자나무의 서열이 다른 감귤속 식물에 비해 서열이 크게 다른 것과 일치한다.", "한편 우에 의한 탱자나무와 유자나무를 교잡했을 때 그 자손은 삼출엽 (ternate or trifoliate)인 탱자나무와 단신복엽(simple compound leaf)인 유자나무의 잎 형태를 가지고 있다.", "부계를 어떤 종으로 교잡해도 단신복엽의 비율이 매우 높고 탱자나무속을 제외하고는 귤나무속 식물은 거의 단신복엽이다.", "따라서 귤나무속이 탱자나무속보다 금감속에 더 유연관계가 있다고 볼 수 있다.", "</p><p>귤나무는 우리나라가 점차 아열대 기후로 접어들면 제주도에서 남해안 지역으로 확대될 수 있을 것이다.", "본 연구 결과 유전적으로 유사한 근연관계에 있는 분류군은 비록 형태적으로 달라도 유전적으로 크게 다르지는 않는 것으로 볼 수 있다.", "따라서 육종 측면에서 교잡이나 다양도를 높이는 방안으로 본 연구 결과가 이용될 수 있을 것으로 사료된다.", "</p> <h1>결 과</h1><p>귤나무속 7개 분류군에 대한 trnL-trnF 부위의 profiles는 100 bp ladder DNA marker로 크기를 비교한 결과 평균 651 nucleotides \\( (\\mathrm{bp}) \\) 의 크기를 가지고 있었다", "(Table 3).", "이들 밴드를 purification하여 DNA 염기서열을 분석한 결과 귤나무속 식물은 610-707 bp이었다.", "최고와 최저의 차이는 삽입과 결실에 의한 것이다.", "</p><p>\\( \\mathrm{A}+\\mathrm{T} \\) 함량은 \\( 70.2-76.9 \\% \\) 였으며, 분류군간 염기 차이는 4 분류군 염기 단지 Citrus junos의 C에서만 유의성을 나타내었다.", "</p><p>서열 쌍 거리 분석에서 광귤나무와 레몬, 광귤나무와 당귤, 레몬과 당귤이 유전적 거리가 0.007로 근연하였다.", "반면에 유자나무와 탱자나무는 유전적 거리가 0.719로 가장 먼 유연관계를 나타내었다.", "유자나무는 나머지 분류군의 쌍에 비해 유전적 거리가 높았다.", "</p><p>모든 염기 자리마다 불일치 지수(disparity index) 또는 불균등 지수를 산출하였다", "(Table 5).", "0 보다 클 경우 서열 간 진화분화의 차이가 우연에 의한 예상 값보다 염기 조성 편향에서 큰 차이를 나타내게 된다.", "많은 분류 쌍에서 0.05보다 작을 경우 서열이 같은 패턴을 가지고 진화했다는 귀무가설을 수용 할 수 없는 결과가 나타났다.", "</p><p>DNA 서열에서 염기 치환이 같은 패턴으로 진화해왔다는 가설을 몬테-카를로 테스트(500 반복)로 검증하였다. \\", "( \\mathrm{C} \\) 에서 \\( \\mathrm{T} \\) 로 치환이 22.84로 가장 높았으며 \\( \\mathrm{G} \\) 에서 \\( \\mathrm{A} \\) 의도 15.23으로 높았다.", "또한 치환에 대한 24 핵산 치환 모델을 적용하였다.", "베이시안 정보 기준은 Hasegawa-Kishino-Yano 척도 3846.4에서 가장 낮았다.", "알카이케 정보 기준도 3751.3에서 3974.2로 유사하였다.", "염기치환의 전이/전형의 비는 0.79에서 1.31로 모델 간 큰 차이가 나타났다.", "</p><p>타지마(Tajima)의 중립성 검증에서 자리 수는 7 일 때 분리되는 자리 수는 2900 이었으며 이들의 비는 0.482였고, 다양도는 0.197로 나타났다.", "중립설의 검증 결과는 음의 값을 나타내므로 유전적 변이를 증가시키는 힘이 도태에 의한 중립가설보다는 삽입과 결실에 의한 결실돌연변이설로 설명된다 \\( (\\mathrm{D}=-1.080) \\).", "</p><p>귤나무속 7 분류군에 대한 trnL-trnF 서열을 이용한 계통관계 분석에서 4 개의 분지도 모두 탱자나무가 다른 분류군과 가장 먼 유연관계를 나타내었는데.", "MP tree에서는 유자나무와 금감이 속이 다름에도 불구하고 같은 분지군을 형성하였으며 이는 귤나무가 금감과 같은 분지군을 형성한 ML tree, ME tree, NJ tree와 가장 큰 차이다.", "4 개의 trees 모두 레몬과 당귤이 가장 근연하였고 이들은 광귤나무와 sister관계를 나타내었으며 높은 지지도를 나타낸 반면 다른 외부마디는 지지도가 높지 않았다.", "</p> <p>당귤나무(Citrus sinensis (L.) Osbeck)은 상록활엽 관목이다.", "잎은 호생하며 타원형이고 넓은 예저 또는 원저이며 길이 \\(5\\sim 7\\mathrm{cm} \\) 로서 가장자리가 밋밋하거나 파상의 잔톱니가 있고 엽병의 날개가 없거나 좁다.", "열매는 장과로 지름 \\(3\\sim 4\\mathrm{cm} \\)의 원형 또는 난형이며 등황색 또는 황적색으로 중심부가 충실하다.", "외과피는 얇으며, 과육과 잘 떨어지고 밋밋하며 광택이 난다.", "꽃은 6 월에 피며 백색이고 향기가 있으며, 엽액에 1송이씩 달린다.", "꽃받침잎과 꽃잎은 각각 5 개이고 20 개 정도의 수술과 1 개의 암술이 있다.", "높이가 \\( 5 \\mathrm{~m} \\) 에 달하고 가지에 가시가 없다.", "</p><p>귤나무(Citrus unshius.", "Marcov.)는 높이가 \\( 3 \\sim 5 \\mathrm{~m} \\) 이고 가지가 퍼지며 가시가 없다.", "잎은 어긋나고 타원형으로 가장자리가 밋밋하거나 물결 모양 잔 톱니가 있다.", "잎자루의 날개는 뚜렷하지 않다.", "꽃은 6월에 흰색으로 핀다.", "꽃받침조각과 꽃잎은 5개씩이고 수술은 여러 개이며 암술은 1 개이다.", "열매는 작은 공 모양이고 지름 \\( 5 \\sim 8 \\mathrm{~cm} \\) 이며 노란빛을 띤 붉은색으로 익는다.", "이와 비슷하지만 잎이 타원형이고 열매가 원형 또는 달걀 모양이다.", "</p><p>금감(Fortunella japonica Swingle var.", "margarita (Swingle)Makino)은 상록 활엽관목이다.", "잎은 호생하고 피침형이며 양끝이 좁고 원저이며 길이 \\(4\\sim 9\\mathrm{cm} \\), 너비 \\( 2\\sim 4 \\mathrm{cm} \\) 로서 가장자리에 톱니가 거의 없고 표면은 녹색, 뒷면은 백록색이며 엽맥이 뚜렷치 않다.", "엽육 중에는 많은 소유점이 있고 엽병에 좁은 날개가 있다.", "꽃은 백색으로서 향기가 있으며 1-2개가 엽액에 모여 달리고, 화경은 길이 \\( 3\\sim5 \\mathrm{mm} \\) 이며, 꽃받침은 5개, 난형이고 꽃이 핀 후 커지며, 꽃잎도 5개이고 긴 타원형으로 길이 \\( 7 \\mathrm{~mm} \\) 이며 5-7월에 개화한다.", "수술은 많으며 1개의 암술이 있고 자방은 4-5실이다.", "열매는 감과로 둥글며 지름 \\(2\\sim 3\\mathrm{cm} \\)이고 10~11 월에 오렌지색으로 성숙하고 먹을 수 있다.", "종자는 난형이며 길이 \\( 7\\sim 10 \\mathrm{mm} \\) 이다.", "수피는 회청색이고 줄기가 많이 갈라지며 가시가 없다.", "</p><p>탱자나무(Poncirus trifoliat L.)는 낙엽 교목이다.", "원산지는 중국이며 중국과 한국 중부 이남에 분포한다.", "높이 약 \\( 3 \\mathrm{~m} \\) 정도까지 자란다. \\", "( 5 \\mathrm{~cm} \\) 정도의 가시가 나 있다.", "잎은 3출 겹잎으로 어긋나는데, 작은 잎은 타원형 또는 달걀 모양이며 끝은 둔하거나 약간 들어가고 밑은 뾰족하며 가장자리에 둔한 톱니가 있다.", "가지는 약간 납작하고 녹색이며 가시는 길이 \\( 3 \\sim 5 \\) \\( \\mathrm{cm} \\) 로서 굵고 어긋난다.", "꽃은 잎보다 먼저 흰색으로 5월경에 하나씩 피며 잎겨드랑이에 달린다.", "꽃잎은 5개이며, 수술은 많다.", "열매는 장과로 둥글고 노란색이며 9월에 익는다.", "</p><p>식물의 분자생물학적 분류에 사용되는 엽록체 tRNA (trn) 유전자 중 leucine-tRNA (trnL)와 Proline-tRNA(trnF)의 서열 (trnL-trnF)은 한 개의 group I intron, 한 개의 intergenic spacer, 그리고 한 개의 trnF exon으로 구성되어 있다.", "Group I intron은 잘 보존된 핵심 구조로 pre-tRNA로부터 자가 스플라이싱을 촉매하는 활성 자리를 암호화하고 있다.", "trnL intron은 group I의 첫 번째 intron이며 tRNA 유전자를 저해한다.", "다른 엽록체 DNA group I 인트론은 16S rRNA, psbA, psbC, 그리고 psaB 유전자에서 발견된다.", "식물에서 trnL 인트론은 보통 양측면의 trnL exons에서 보존된 부위이다.", "intergenic spacer에서 이차 구조 요소(secondary-structural ele-ments) 스프라이싱 부위에서는 발견되지 않는다.", "</p><p>국내에서 귤나무속에 대한 임의 DNA 증폭(random amplified DNA, RAPD)에 의한 분자 마커로 분류학적 연구를 수행 한 바 있다.", "그러나 이 두 마크 간에 같은 분류군의 위치와 일부 분지군이 tree상에 일치하지 않은 점이 있었다.", "따라서 본 연구의 목적은 엽록체 trnL-trnF 부위서열을 이용한 귤나무속과 근연 속 분류군에 대한 유연관계를 실행하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>본 연구에 사용된 귤나무속과 근연 속의 재료는 2010년부터 2011년에 걸쳐 우리나라의 각지에서 총 7종을 채집하여 실험에 사용하였다.", "</p><p>광귤나무(Citrus aurantium L.)와 귤나무(Citrus unshiu S.Marcov.)는 경기도 포천시 소흘읍에서 채집하였으며, 유자나무(Citrus junas Tanaka), 당귤(Citrus sinensis (L.) Osbeck), 금감(Fortunella japonica Swingle var.", "margarita (Swingle) Makino)는 제주시 애월읍 봉성리에서 채집하였으며, 레몬 (Citrus limonia Osbeck)과 탱자나무(Poncirus trifoliat (L.) Rafinesque)은 경상남도 진주시 이반성면 대천리에서 채집하였다.", "</p><h2>genomic DNA 추출</h2><p>각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 Plant DNA Zol Reagent (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA를 사용하였다 추출방법은 \\( 0.3 \\mathrm{~g} \\) 의 신선한 잎을 액체질소로 마쇄한 다음 사용자의 지침서에 의거하여 DNA를 추출하였다.", "추출된 DNA는 에탄올 등 여액의 제거를 위해 진공 흡입기로 5 분간 건조시킨 후 \\( \\mathrm{TE} 100 \\mathrm{ul} \\) 에 용해하여 3일간 냉장보관하였다.", "용해된 시료는 DyNA 200 fluorometer (Amersham Pharmacia Biotech, USA)를 이용하여 DNA 정량을 체크하였고 TE로 DNA 농도가 균질하게 조정하여 본 분석을 위해 사용하거나 \\( -20^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 냉동고에 보관하였다.", "</p><h2>분석</h2><p>엽록체의 trnL intron과 trnL-trnF spacer 부위는 Taberlet et al 이 고안한 시발체(primer)로 PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭시켰다.", "</p><p>PCR 반응을 위하여 추출한 각 분류군의 게놈 DNA \\( 50 \\mathrm{ng} \\), 각 dNTP \\( 100 \\mathrm{uM} \\), 시발체 각 \\( 0.2 \\mathrm{uM}, 1 x \\) enzyme buffer, Taq polymerase 2 unit를 넣고 증류수로 전체 \\( 50 \\mathrm{ul} \\) volume이 되도록 추가하였다.", "증폭반응은 초기 \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 \\( 90 \\mathrm{sec} \\) 간 변성한 후, 28 사이클로 \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 \\( 30 \\mathrm{sec}, 42^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 \\( 60 \\mathrm{sec}, 72^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 \\( 60 \\mathrm{sec} \\) 간 실시하였고, 추가로 \\( 72^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 5 분간 연장하였다.", "</p><p>PCR 산물은 \\( 1.5 \\% \\) agarose gel에서 분리하였는데 이때 절편들의 상대적 크기를 비교하기 위해 \\( 100 \\mathrm{bp} \\) ladder DNA marker를 같이 loading시켰다.", "전기영동 후 젤은 ethidium bromide로 염색하여 밴드를 현상하였다.", "현상된 젤은 Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, San Leandro, CA, USA)을사용하여 밴드 양상을 조사하였다.", "이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다.", "증폭된 단편들은 bluescript (Pharmatech)로 클론하였고, ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)로 서열화하였다.", "각각의 종에서 최소 10 개 클론들을 분석하였다.", "</p><h2>통계 분석</h2><p>분류군간 유전적 거리 \\( (I) \\) 와 유전적 동질성 \\( (D) \\) 은 분류군간 염기쌍의 비교로 산출하였다[12].", "PAUP에서 분류군간 핵산 차이에 의한 유의성 검증, 염기 빈도, 서열쌍 거리, uncorrected \"\\(p\\)\"에 의한 측정된 거리 등을 산출하였다.", "염기자리 당 서열 간 염기 조성 차이, 불일치 계수를 검증하였다.", "</p><p>핵산치환 모델 분석은 최적 치환 패턴에 대한 최소 Bayesian Information Criterion (BIC)값을 고려하였다.", "각 모델에 대해 Akaike Information Criterion, corrected (AICc)값, Maximum Likelihood value (InL), 척도의 수는 Nei와 Kumar의 식에 의거하였다.", "염기 자리 간 진화율에 대한 비균등성은 진화적으로 비변이 부분 \\( (+I) \\) 을 가진 Gamma 분포 \\( (+G) \\) 로 나타낸 모델을 사용하였다.", "염기치환의 전이/전형의 비율에 대한 평가 \\( (R) \\) 역시 이 모델에 근거하여 산출하였다.", "</p><p>서열간 코돈의 중립성 검증은 갭과 결손 서열을 제외하고 500 회 반복으로 MEGA5로 실시하였다[22].", "타지마의 여러 통계치( \\( \\mathrm{M}= \\) number of sites, \\( \\mathrm{S}=\\mathrm{Number} \\) of segregating sites, \\( \\mathrm{ps}=\\mathrm{S} / \\mathrm{M} \\), and \\( \\pi= \\) nucleotide diversity. \\", "( \\mathrm{D}= \\) Taiima test statistic)를 산출하였다.", "</p><h2>유연관계 분석</h2><p>각 식물종 trnL intron과 trnL-trnF spacer 부위에서 얻은 크로마토그램(chromatogram)은 소프트웨어 Sequence Navigator 1.0.1 (Applied Biosystems Inc.)로 편집하였다.", "trnL intron과 trnL-trnF spacer 부위 서열에서 결손부위를 포함한 서열 배당은 MEGA5와 Clustal X program으로 분석하였다.", "배당된 서열에서 gap의 부위는 missing data로 처리하였다.", "그러나 계통학적으로 정보적인 인델은 이진법 처리로 데이터에 삽입하였다.", "</p><p>최절약법에 의한 tree (maximum parsimonious tree, MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bi-section-reconnection에 따랐다[18].", "최우법(maximum like-lihood tree, ML), N-J법(neighbor-ioining tree, NJ)으로 tree 작성을 실시하여 비교하였다.", "계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.57의 NEIGHBOR, neighbor-ioining (NJ) 방법에 의해 구성하였다.", "분류군의 가지에 대한 Bootstrap 분석은 500회 반복법으로 실시하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>운향과(Rutaceae) 귤나무속(Citrus)은 동남아시아에 약 10여 종이 있으며 그 중 귤은 과일로 널리 알려져 있다.", "귤과 형태적으로 유사한 금감속(Genus Fortunella)에 금귤 또는 금감(Fortunella japonica var.", "margarita) (Swingle) Makino)이 있다.", "귤나무를 접목시킨 다양한 귤의 품종이 제주도에는 재배되고 있다.", "귤나무속 식물은 인디아 북동지방, 비얀마, 중국의 운남지방이 기원지로 알려져 있다.", "이 속의 식물들은 귤, 레몬, 자몽, 라임으로 잘 알려져 있다.", "이 속의 분류는 복잡하고 여러 종간 또는 클론 번식으로 종간 교잡이 형성되어 매우 복잡하다.", "귤나무속의 분류는 학자마다 견해를 달리하여 이창복와 이영노에 따랐다.", "</p><p>광귤나무(Citrus aurantium L.)는 높이가 \\( 4 \\sim 5 \\mathrm{~m} \\) 정도로 잎이 많이 나고 가지에 가시가 있다.", "잎은 어긋나고 달걀 모양이며 길이 \\(7\\sim 10\\mathrm{cm} \\)이다.", "잎 끝이 뵤", "족하고 물결 모양의 톱니가 있으며 잎자루에 날개가 있다.", "5월에 흰색 꽃이 총상꽃 차례로 1 개 또는 몇 개씩 피는데, 꽃잎과 꽃받침은 각각 5 개 이며 20 24개의 수술과 1 개의 암술이 있다.", "씨방은 둥글고 녹색이다.", "열매는 장과로 둥글면서도 편평하고 지름 \\( 6 \\sim 8 \\) \\( \\mathrm{cm} \\) 이며 10월에 노란빛을 띤 갈색으로 익는다.", "종자는 쐐기형 달걀 모양이다.", "</p><p>유자나무(Citrus junos Tanaka)는 바닷가나 민가부근에서 자란다.", "중국 원산이며 남쪽에서 과수로 심는다.", "높이 약 \\(4 \\mathrm{m} \\) 이다.", "가지에 뵤", "족한 가시가 있다.", "잎은 어긋나고 달걀 모양 긴 타원형이며 가장자리에 둔한 톱니가 있고 잎자루에 날개가 있다.", "꽃은 양성화이며 5~6월에 흰색으로 피는데, 잎겨드랑이에 1 개씩 달린다.", "꽃받침조각과 꽃잎은 5개씩이고 수술은 20개가 통처럼 합쳐지거나 5개로 나누어진다.", "열매는 장과로서 편구형이며 지름 \\( 4 \\sim 7 \\mathrm{~cm} \\) 이고 9 10월에 익는다.", "빛깔은 밝은 노란색이며 겉이 울퉁불퉁하고 향기가 있다.", "</p><p>레몬(Citrus limonia Osbeck)은 히말라야가 원산지로 시원하고 기후의 변화가 없는 곳에서 잘 자란다.", "높이는 \\( 3 \\sim 6 \\mathrm{~m} \\) 이다.", "잎은 어긋나고 어릴 때는 붉은 색을 띠지만 점점 녹색으로 변한다.", "꽃은 5 10월에 피고 잎겨드랑이에 하나씩 또는 몇개씩 무리지어 달린다.", "꽃봉오리는 붉은 색이고, 꽃의 안쪽은 흰색, 바깥쪽은 붉은빛이 강한 자주색을 띤다.", "열매는 타원모양이고 겉껍질이 녹색이지만 익으면 노란 색으로 변하며 향기가 강하다.", "종자는 달걀 모양이고 양끝이 뽀족하다.", "</p> <h1>초록 : trnL-trnF 서열에 의한 한국 귤나무속과 두 근연 식물종의 계통분류학적 연구</h1><p>귤나무속은 운향과(Rutaceae)에 속한다.", "동남아시아, 미얀마, 중국 운남에서 기원된 것으로 알려져 있다.", "이 속의 분류관계는 복잡한데 클론번식과 야생식물과 교잡이 빈번하다.", "식물에서 속간 속내 계통관계 추론을 위해 널리 이용되고 있는 엽록체 trnL-trnF 부위가 있다.", "이 귤나무속과 두 근연한 탱자나무속과 금감속에 속하는 7 종간 계통 관계를 평가하였다.", "많은 삽입이 발견되었고 속내 종간 변이는 결실/삽입에 의한 것으로 밝혀졌다.", "이 속의 레몬과 당귤나무은 네 계통도(MP, ML, ME, and NJ) 에서 모두 같은 분지군을 형성하여 가장 근연관계에 있었고 광귤나무(향귤나무)과 자매군을 형성하였다.", "유자나무는 이들과 많은 서열 차이를 나타내었다.", "외부 분지군은 낮은 지지도를 나타내었다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Phylogenic Study of Genus Citrus and Two Relative Genera in Korea by trnL-trnF Sequence", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-df0602a6-5a79-4bec-aa61-97c6a84b9ceb", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "Man Kyu Huh", "Hye Jeong Yoon", "Joo Soo Choi" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,401	<h1>서 론</h1><p>표피의 기저층에 존재하는 melanin은 인간의 피부색을 결정짓는데 가장 중요한 역할을 하며, 멜라닌 세포 (melanocyte) 내의 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관인 멜라닌소체(melanosome)에서 합성된다. 멜라닌 합성은 tyrosinase, tyrosinase related protein- 1 (TRP-1)과 tyrosinase related protein-2 (TRP-2), cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 유도 물질인 adrenocorticotropic hormone (ACTH), forskolin과 a-melanocyte stimulating hormone (MSH) 등에 의해서 조절 된다.</p><p>멜라닌의 합성은 아미노산의 하나인 tyrosine을 기질로 하여 tyrosinase에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)와 DOPAquinone으로 대사된다. DOPAquinone 이후의 반응은 크게 적갈색에서 황색을 결정하는 pheomelanin과 흑갈색에서 갈색을 결정하는 eumelanin 생성의 2가지로 나뉘어진다. 따라서 멜라닌 생성의 주요 효소인 tyrosinase의 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시켜 미백 효과를 유도할 수 있다.</p><p>최근 천연물에서 tyrosinase 억제 활성을 가진 화합물을 개발하기 위한 노력이 많이 이루어지고 있다. 잘 알려진 tyrosinase 억제 물질인 누룩곰팡이로부터 분리된 kojic acid, hydroquinone, oxyresveratrol, 그리고 p-hydroxybenzyl alcohol은 멜라닌 합성을 억제한다고 보고되고 있다. Fucoidan은 분자량이 20만 달톤을 넘는 고분자 물질로 황산기(sulfate group)를 가진 산성의 수용성 다당류로서 끈적끈적한 점질구조로 구성 되어있다. 가수분해에 의해서 L-fucose가 다량 함유되어 있는 것이 밝혀지면서 처음에는 fucoidin으로 명명되었다가 지금은 다당 명명법에 따라 fucoidan으로 불려지게 되었다. 미역, 다시마 등의 갈조류 성분의 새로운 생리활성성분으로 각광을 받고 있는 fucoidan은 천연 미백물질로서의 가능성이 매우 높은 물질로 밝혀지고 있다.</p><p>본 연구에서는 fucoidan의 멜라닌 합성에 대한 억제효과를 알아보기 위하여 cell free system인 mushroom tyrosinase activity와 B16F10 melanoma 세포의 총 멜라닌 양을 측정하여 멜라닌 합성 억제 정도를 측정하고 tyrosianse의 활성을 억제하는 정도를 평가하였으며, 아울러 멜라닌 자극 호르몬인 \( \alpha-\)MSH를 처리하여 과색소 현상을 유도 후, 과색소 침착시 fucoidan의 미백효과를 조사하였다. 이때 멜라닌 생합성 경로에 관여하는 tyrosinase의 활성 부위에 포함 되어 있는 구리 이온을 킬레이트 시킴으로써 멜라닌 활성을 저해시키는 것으로 알려진 kojic acid를 양성대조군으로 사용하여 fucoidan과 비교하였다.</p> <h2>\( \alpha-\)MSH 로 멜라닌 생성 유도 후 fucoidan의 멜라닌 생성 억제 효과</h2><p>멜라닌 생성 유도 물질인 \( \alpha \)-MSH는 뇌하수체 및 피부를 포함한 여러 가지 말초조직에서 분비되는 pleiotropic mole-cule로써 표피세포의 성장과 증식, 국소조직의 면역 조절, 멜라닌 색소 생성 등 다양한 생리적 기능에 관여한다. 이는 세포막 수용체(melanocortin receptor 1, MC1R)와 결합하여 Gs 단백질을 활성화시키고, 이차적으로 adenylate cyclase활성에 의해 cAMP가 증가되고 연속적으로 protein kinase A(PKA), tyrosinase 활성 등을 통하여 멜라닌 생성을 촉진시키며 microphthalmia-associated transcription factor (MITF) 단백질의 발현을 증가시켜 tyrosinase 유전자의 발현을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 실제로 Hunt 등은 \( \alpha \)-MSH에 의해 멜라닌 형성 및 tyrosinas 활성이 증가되었다고 보고 한 바 있다. 이에 본 연구에서도 B16F10 melanoma 세포에 \( \alpha-\)MSH를 투여함으로써 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성에 fucoidan이 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. Fucoidan이 멜라닌을 생성하는 세포 수준에서 미백효과가 있는 지를 확인하기 위하여 \( \alpha-\)MSH로 자극한 B16F10 mela-noma 세포에서 멜라닌 생성을 관찰하였다. B16F10 melanoma 세포에서 \( 1 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \alpha-\)MSH로 유도된 군은 대조군에 비하여 멜라닌 생성량이 \( 193.3 \% \) 증가하였다. 여기에 fucoidan \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 처리된 경우 fucoidan을 처리하지 않은 \( \alpha-\)MSH 유도군에 비하여 \( 15.3 \% \)의 멜라닌 생성이 감소하였고, \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서는 \( 29.1 \%, 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서는 \( 37.5 \%, 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도 \( 45.1 \% \)의 멜라닌 생성 감소율을 보였으며, fucoidan \( 50 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서만 통계적으로 유의하였다 \( (\mathrm{p}<0.05, \mathrm{Fig} .6) \). 양성대조군인 kojic acid와 비교 하였을 때 \( 10 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서만 fucoidan에 의한 멜라닌 생성량 감소가 더 많았으나 1, 20, 그리고 50 \(\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 kojic acid에 의한 멜라닌 생성량 감소가 더 많았다.</p><h2>\( \alpha-\)MSH 투여 후 tyrosinase의 활성도에 미치는 fucoidan의 효과</h2><p>B16F10 melanoma 세포에 \( \alpha \)-MSH를 처리한 후 tyrosinase 활성도에 미치는 fucoidan의 효과를 확인하였다. B16F10 melanoma 세포에 \( 1 ~\mu \mathrm{M} \) 의 \( \alpha \)-MSH를 투여하였을 때 대조군에 비하여 tyrosinase 활성도가 \( 182.4 \% \) 증가하였다. Fucoidan \( 1 \mu \mathrm{g}/\mathrm{ml} \) 처리시 \( \alpha \)-MSH 군에 비하여 tyrosinase 활성도가 \( 6.6 \% \) 감소하였으며 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 \( 26.6 \%, 20 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 \( 38.7 \% \), 최종 농도인 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 \( 50.6 \% \)의 tyrosinase 활성도 억제 효과가 있었다( \( \mathrm{p}<0.05 \), Fig. 7). 양성대조군인 kojic acid와 비교하였을 때 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도를 제외한 모든 농도에서 fucoidan에 의한 tyrosinase의 활성도 감소가 더 많았다.</p><h2>전기영동 gel에서 DOPA 염색을 통한 tyrosinase 발현 정도</h2><p>멜라닌 생성 과정 중 tyrosinase는 tyrosine을 DOPA로 전환시키는 tyrosine hydroxylase와 DOPA를 DOPAquinone으로 전환시키는 DOPA oxidase의 두 가지 역할을 함으로써 멜라닌 합성의 처음 두 단계 반응을 촉매하게 된다. 본 연구에서는 DOPA에서 DOPA quinone으로 전환될 때 관련되는 DOPA oxidase 발현 정도를 DOPA 염색을 통하여 관찰하였다. B16F10 melanoma 세포에 \( \alpha-\)MSH와 fucoidan을 48시간 동안 처리하여 얻어진 세포 lysate를 SDS\(- 10 \% \) acrylamide gel 상에서 전기영동한 후 기질인 L-DOPA 용액을 습윤시켜 검은색의 tyrosinase 밴드를 측정하였다. Fucoidan은 \( \alpha \)-MSH 자극으로 유도한 tyrosinase 발현을 농도 의존적으로 억제하였다. 양성대조군인 koiic acid와 비교하였을 때에도 각 농도에서 fucoidan에 의한 tyrosinase 발현 억제가 koiic acid보다 더 심하였다. 이는 fucoidan이 tyrosinase의 활성을 억제하는 효과가 있음을 의미한다. 결론적으로 fucoidan은 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도에 있어서 억제 작용을 나타내므로 미백 활성 물질로서의 가능성을 가지고 있는 것으로 생각된다.</p> <h1>요 약</h1><p>미역, 다시마 등 갈조류의 추출물로서 생리활성성분으로 각광 받고 있는 fucoidan이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 알아봄으로써 미백제로서의 개발 가능성 여부를 확인하기 위하여 B16F10 melnoma 세포를 이용하여 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도에 대한 실험의 결과 B16F10 melnoma 세포의 멜라닌 생성과 tyrosinase 활성도는 fucoidan의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 억제되었다. B16F10 melnoma 세포에 \( \alpha-\)MSH를 투여 후 멜라닌 생성과 tyrosinase의 활성도 역시 fucoidan의 농도가 증가할수록 멜라닌 생성과 tyrosinase 활성도가 억제되는 경향을 보였다. 또한 DOPA 염색의 결과 fucoidan은 농도 의존적으로 tyrosinase 활성도를 억제하였다. 이상의 결과 해조 추출 다당류인 fucoidan은 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도 억제 작용을 나타내므로 미백 활성 물질로서의 가능성을 가지고 있는 것으로 생각된다.</p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>표피의 기저층에 존재하는 melanin은 인간의 피부색을 결정짓는데 가장 중요한 역할을 하며, 멜라닌 세포 (melanocyte) 내의 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관인 멜라닌소체(melanosome)에서 합성된다.", "멜라닌 합성은 tyrosinase, tyrosinase related protein- 1 (TRP-1)과 tyrosinase related protein-2 (TRP-2), cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 유도 물질인 adrenocorticotropic hormone (ACTH), forskolin과 a-melanocyte stimulating hormone (MSH) 등에 의해서 조절 된다.", "</p><p>멜라닌의 합성은 아미노산의 하나인 tyrosine을 기질로 하여 tyrosinase에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)와 DOPAquinone으로 대사된다.", "DOPAquinone 이후의 반응은 크게 적갈색에서 황색을 결정하는 pheomelanin과 흑갈색에서 갈색을 결정하는 eumelanin 생성의 2가지로 나뉘어진다.", "따라서 멜라닌 생성의 주요 효소인 tyrosinase의 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시켜 미백 효과를 유도할 수 있다.", "</p><p>최근 천연물에서 tyrosinase 억제 활성을 가진 화합물을 개발하기 위한 노력이 많이 이루어지고 있다.", "잘 알려진 tyrosinase 억제 물질인 누룩곰팡이로부터 분리된 kojic acid, hydroquinone, oxyresveratrol, 그리고 p-hydroxybenzyl alcohol은 멜라닌 합성을 억제한다고 보고되고 있다.", "Fucoidan은 분자량이 20만 달톤을 넘는 고분자 물질로 황산기(sulfate group)를 가진 산성의 수용성 다당류로서 끈적끈적한 점질구조로 구성 되어있다.", "가수분해에 의해서 L-fucose가 다량 함유되어 있는 것이 밝혀지면서 처음에는 fucoidin으로 명명되었다가 지금은 다당 명명법에 따라 fucoidan으로 불려지게 되었다.", "미역, 다시마 등의 갈조류 성분의 새로운 생리활성성분으로 각광을 받고 있는 fucoidan은 천연 미백물질로서의 가능성이 매우 높은 물질로 밝혀지고 있다.", "</p><p>본 연구에서는 fucoidan의 멜라닌 합성에 대한 억제효과를 알아보기 위하여 cell free system인 mushroom tyrosinase activity와 B16F10 melanoma 세포의 총 멜라닌 양을 측정하여 멜라닌 합성 억제 정도를 측정하고 tyrosianse의 활성을 억제하는 정도를 평가하였으며, 아울러 멜라닌 자극 호르몬인 \\( \\alpha-\\)MSH를 처리하여 과색소 현상을 유도 후, 과색소 침착시 fucoidan의 미백효과를 조사하였다.", "이때 멜라닌 생합성 경로에 관여하는 tyrosinase의 활성 부위에 포함 되어 있는 구리 이온을 킬레이트 시킴으로써 멜라닌 활성을 저해시키는 것으로 알려진 kojic acid를 양성대조군으로 사용하여 fucoidan과 비교하였다.", "</p> <h2>\\( \\alpha-\\)MSH 로 멜라닌 생성 유도 후 fucoidan의 멜라닌 생성 억제 효과</h2><p>멜라닌 생성 유도 물질인 \\( \\alpha \\)-MSH는 뇌하수체 및 피부를 포함한 여러 가지 말초조직에서 분비되는 pleiotropic mole-cule로써 표피세포의 성장과 증식, 국소조직의 면역 조절, 멜라닌 색소 생성 등 다양한 생리적 기능에 관여한다.", "이는 세포막 수용체(melanocortin receptor 1, MC1R)와 결합하여 Gs 단백질을 활성화시키고, 이차적으로 adenylate cyclase활성에 의해 cAMP가 증가되고 연속적으로 protein kinase A(PKA), tyrosinase 활성 등을 통하여 멜라닌 생성을 촉진시키며 microphthalmia-associated transcription factor (MITF) 단백질의 발현을 증가시켜 tyrosinase 유전자의 발현을 촉진하는 것으로 알려져 있다.", "실제로 Hunt 등은 \\( \\alpha \\)-MSH에 의해 멜라닌 형성 및 tyrosinas 활성이 증가되었다고 보고 한 바 있다.", "이에 본 연구에서도 B16F10 melanoma 세포에 \\( \\alpha-\\)MSH를 투여함으로써 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성에 fucoidan이 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.", "Fucoidan이 멜라닌을 생성하는 세포 수준에서 미백효과가 있는 지를 확인하기 위하여 \\( \\alpha-\\)MSH로 자극한 B16F10 mela-noma 세포에서 멜라닌 생성을 관찰하였다.", "B16F10 melanoma 세포에서 \\( 1 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 \\( \\alpha-\\)MSH로 유도된 군은 대조군에 비하여 멜라닌 생성량이 \\( 193.3 \\% \\) 증가하였다.", "여기에 fucoidan \\( 1 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 의 농도로 처리된 경우 fucoidan을 처리하지 않은 \\( \\alpha-\\)MSH 유도군에 비하여 \\( 15.3 \\% \\)의 멜라닌 생성이 감소하였고, \\( 10 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 의 농도에서는 \\( 29.1 \\%, 20 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 의 농도에서는 \\( 37.5 \\%, 50 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도 \\( 45.1 \\% \\)의 멜라닌 생성 감소율을 보였으며, fucoidan \\( 50 ~\\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서만 통계적으로 유의하였다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05, \\mathrm{Fig} .6) \\).", "양성대조군인 kojic acid와 비교 하였을 때 \\( 10 ~\\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서만 fucoidan에 의한 멜라닌 생성량 감소가 더 많았으나 1, 20, 그리고 50 \\(\\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서는 kojic acid에 의한 멜라닌 생성량 감소가 더 많았다.", "</p><h2>\\( \\alpha-\\)MSH 투여 후 tyrosinase의 활성도에 미치는 fucoidan의 효과</h2><p>B16F10 melanoma 세포에 \\( \\alpha \\)-MSH를 처리한 후 tyrosinase 활성도에 미치는 fucoidan의 효과를 확인하였다.", "B16F10 melanoma 세포에 \\( 1 ~\\mu \\mathrm{M} \\) 의 \\( \\alpha \\)-MSH를 투여하였을 때 대조군에 비하여 tyrosinase 활성도가 \\( 182.4 \\% \\) 증가하였다.", "Fucoidan \\( 1 \\mu \\mathrm{g}/\\mathrm{ml} \\) 처리시 \\( \\alpha \\)-MSH 군에 비하여 tyrosinase 활성도가 \\( 6.6 \\% \\) 감소하였으며 \\( 10 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서는 \\( 26.6 \\%, 20 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)에서는 \\( 38.7 \\% \\), 최종 농도인 \\( 50 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서는 \\( 50.6 \\% \\)의 tyrosinase 활성도 억제 효과가 있었다", "( \\( \\mathrm{p}<0.05 \\), Fig. 7).", "양성대조군인 kojic acid와 비교하였을 때 \\( 1 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 농도를 제외한 모든 농도에서 fucoidan에 의한 tyrosinase의 활성도 감소가 더 많았다.", "</p><h2>전기영동 gel에서 DOPA 염색을 통한 tyrosinase 발현 정도</h2><p>멜라닌 생성 과정 중 tyrosinase는 tyrosine을 DOPA로 전환시키는 tyrosine hydroxylase와 DOPA를 DOPAquinone으로 전환시키는 DOPA oxidase의 두 가지 역할을 함으로써 멜라닌 합성의 처음 두 단계 반응을 촉매하게 된다.", "본 연구에서는 DOPA에서 DOPA quinone으로 전환될 때 관련되는 DOPA oxidase 발현 정도를 DOPA 염색을 통하여 관찰하였다.", "B16F10 melanoma 세포에 \\( \\alpha-\\)MSH와 fucoidan을 48시간 동안 처리하여 얻어진 세포 lysate를 SDS\\(- 10 \\% \\) acrylamide gel 상에서 전기영동한 후 기질인 L-DOPA 용액을 습윤시켜 검은색의 tyrosinase 밴드를 측정하였다.", "Fucoidan은 \\( \\alpha \\)-MSH 자극으로 유도한 tyrosinase 발현을 농도 의존적으로 억제하였다.", "양성대조군인 koiic acid와 비교하였을 때에도 각 농도에서 fucoidan에 의한 tyrosinase 발현 억제가 koiic acid보다 더 심하였다.", "이는 fucoidan이 tyrosinase의 활성을 억제하는 효과가 있음을 의미한다.", "결론적으로 fucoidan은 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도에 있어서 억제 작용을 나타내므로 미백 활성 물질로서의 가능성을 가지고 있는 것으로 생각된다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>미역, 다시마 등 갈조류의 추출물로서 생리활성성분으로 각광 받고 있는 fucoidan이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 알아봄으로써 미백제로서의 개발 가능성 여부를 확인하기 위하여 B16F10 melnoma 세포를 이용하여 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도에 대한 실험의 결과 B16F10 melnoma 세포의 멜라닌 생성과 tyrosinase 활성도는 fucoidan의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 억제되었다.", "B16F10 melnoma 세포에 \\( \\alpha-\\)MSH를 투여 후 멜라닌 생성과 tyrosinase의 활성도 역시 fucoidan의 농도가 증가할수록 멜라닌 생성과 tyrosinase 활성도가 억제되는 경향을 보였다.", "또한 DOPA 염색의 결과 fucoidan은 농도 의존적으로 tyrosinase 활성도를 억제하였다.", "이상의 결과 해조 추출 다당류인 fucoidan은 B16F10 melanoma 세포의 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도 억제 작용을 나타내므로 미백 활성 물질로서의 가능성을 가지고 있는 것으로 생각된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Fucoidan의 멜라닌 합성과 tyrosinase 활성도 억제 효과", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-dc68270f-b42b-498b-b1c4-53673aaab6ab", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2009", 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5,402	<h1>서 론</h1><p>고추는 자식과 타식을 겸하는 작물로서 타식율이 \( 5 \sim 30 \% \)로 높아서 자식에만 의존하는 작물에 비하여 고정계통 육성에 시간과 노력이 많이 소요되는 단점이 있다. 또한 고추에 대한 재배농민의 선호도와 소비자의 기호가 다양해지면서 신품종 육성에도 유전자원의 활용 폭이 넓어지고 효율적인 육종방법의 개발에도 다양한 연구가 수행되고 있지만, 아직까지도 역병이나 탄저병과 같은 주요병해에 저항성을 나타내는 내병성 품종의 개발성과가 미흡한 것이 가장 큰 문제점이다. 그리고 웅성불임성을 이용하여 육성된 일대잡종의 종자는 순도 문제가 아직도 미해결 과제로 남아 있는 실정이다.</p><p>최근 분자생물학이 발전하면서 외래의 DNA를 식물체내에 직접 도입하여 목적형질을 개량하는 형질전환법이 작물의 품종개량에 실용적으로 이용되면서 기존 육종 방법의 단점을 크게 개선할 수 있다는 점에서 육종전반에 걸쳐 폭 넓은 이용이 전망되고 있다. 식물 세포수준에서 이루어지는 이러한 생명공학 기술의 응용에서 가장 기본이 되는 것은 세포나 조직으로부터 식물체를 성공적으로 재분화 시킬 수 있는 조직배양 시스템의 확립이 선결과제인데, 고추에서는 Gunay와 Rao가 자엽과 하배축으로부터 식물체 재분화에 성공한 이래로 원형질체, 체세포배, 제 1 본엽등을 배양하여 식물체를 재분화 시킨 예가 있으나 그 효율은 다른 작물에 비해 낮은 실정이다.</p><p>따라서 본 실험은 고추의 자엽조직을 이용하여 식물체재분화 효율을 향상 시킬 수 있는 최적의 식물체재분화 배지를 구명하고, 나아가 고추 형질전환 연구에 기초 자료를 제시하고자 수행하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><p>고추의 식물체 재분화 배지조건을 구명하기위하여 경북 북부지방에서 재래종으로 재배되고 있는 '수비초'와 '금탑'의 자엽과 본엽의 조직을 이용하였다. 종자는 \( 70 \% \) ethanol에서 30 초, \( 2 \%\) \(\mathrm{NaOCl} \) 에서 15 분간 소독한 후 멸균수로 3회 세척하여 MS기본배지가 분주된 배양병당 20~30립씩을 치상하여 16 시간 일장 \( 40 \mu \mathrm{mol} \cdot \mathrm{m}^{-2} \cdot \mathrm{sec}^{-1} \) 의 cool-white 형광, \( 25 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 배양실에서 발아시켰다. 발아 후 10~14일째에 자엽을 엽병 \( 1 \sim 2 \mathrm{~mm} \) 정도를 포함하도록 절단하여 재분화 효율 구명을 위한 재료로 사용하였다.</p><p>Shoot를 유도하기 위해 MS배지에 zeatin \( 1,2,3,4,5 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 처리, BA \( 1, 2, 4, 6, 8, 10 \mathrm{mg} /\mathrm{l}\) 처리와 zeatin \(2,3,4 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 와 NAA \( 0.01,0.05,0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 를 조합하여 이용하였다. Root를 유기하기 위해서 MS배지에 NAA \( 0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 와 IAA \( 0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 를 첨가하였다. 치상수는 처리당 10 조직 4반복으로 하였고, 배양환경은 온도 \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C}\), 16시간 명조건에서 배양하였으며, 분화율은 치상 후 30일 경과 후 조사하였다.</p> <h1>적 요</h1><p>재래종 고추인 '수비초'와 '금탑'의 자엽을 이용한 식물체 재분화 조건을 구명하기 위해 시험한 결과, shoot 분화율은 \( 2 \sim 4 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) zeatin 에서 \( 0.05 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) NAA 혼용에서 분화율이 높았고, 뿌리 분화율은 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{l}\) NAA 에서 높았다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><p>고추의 자엽조직으로부터 shoot 분화를 위해 \(4 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) zeatin을 첨가했을 때 신초 분화율이 '수비초' \( 60 \% \), '금탑' \(80 \%\)로 높았고, BA의 경우 '수비초'는 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 에서 \( 50 \% \), '금탑'은 \( 8 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \)에서 \( 65.0 \% \) 였다. 적절한 shoot 분화를 위해서는 BA의 경우 Zeatin보다 2배 정도의 농도가 필요하였으며, 두 생장조절제에서 재래 고정종인 '수비초'보다 시판 교잡종인 '금탑'의 shoot 분화율이 높았다. Zeatin과 NAA 혼용시 '수비초'와 '금탑'에서 Zeatin \(2 \sim 4 \mathrm{mg}/\mathrm{l}\)에서 NAA \( 0.05 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) 혼용에서 신초의 분화율이 \( 90 \% \) 이상 이었고, NAA \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \)에서는 신초 분화율이 떨어지는 경향이었다. Zeatin과 NAA 혼용할 경우 분화율은 높았지만, callus의 생장으로 초기 신초의 생장에 다소 영향이 있었다.</p><p>고추 조직배양에서 식물체 재분화 능력이 genotype 간에 큰 차이를 보인다는 것은 여러 연구자들에 의해 보고되었는데, Ochoa-Alejo와 Ireta-Moreno는 하배축을 재료로 16개의 genotype에 대한 식물체 재분화능력을 비교한 바, 재분화능력이 높은 것과 보통 그리고 거의 안 되는 것으로 구분되었으며 이들의 재분화능력은 배지조성이 바뀌어도 큰 차이가 없었다고 하였다. Dabauza와 Pena는 10개의 genotype에 대하여 7 가지 배양조직에 따라 식물체 재분화율을 조사한 바, 배양 조직의 종류보다는 genotype에 따라 식물체 재분화율의 차이가 뚜렷함을 보고하였다. 본 연구에서도 고추 genotype 간에 식물체 재분화율의 차이가 나타났으나 배지내에 식물생장호르몬의 조성에 따라 genotype 차이가 크게 나타나지 않아 Christopher와 Rajam의 연구와는 차이가 나는 경향을 나타내었다.</p><p>고추의 조직배양은 Dix와 Street가 고추 영양체 조직으로부터 캘러스를 유기하고 증식시킨 이래로 Gunay와 Rao가 MS배지에 IAA와 BA를 이용하여 자엽과 하배축으로부터 식물체 재분화에 성공하였다. 그 이후 자엽과 하배축, 본엽 조직으로부터 식물체재분화는 되었으나, 본 실험의 결과보다 식물체 재분화율이 높지 않았다. 따라서 고추의 조직배양이나 형질전환 연구에 식물체 재분화 효율의 배지로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료되었다.</p><p>생장조절제 첨가할 경우 뿌리 분화율은 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{l}\) NAA 에서 '수비초' \( 75.0 \% \), '금탑' \( 85.0 \% \) 였고, \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{l} \) IAA에서 '수비초' \( 68.3 \% \), '금탑' \( 81.7 \% \)로 양호하였다. 적절한 root의 분화를 위해서 IAA는 NAA보다 높은 농도가 필요하였다. 두 생장조절제 모두 시판종인 '금탑'이 재래종인 '수비초'보다 뿌리 분화율이 높았다.</p><p>식물체 재분화 배지에서 얻어진 신초들은 배지에 식물 호르몬을 전혀 첨가하지 않고 뿌리를 분화시키는 경우를 제외하고는 대부분 높은 농도의 NAA 혹은 IAA를 처리하여 뿌리를 유기한 다음 순화단계로 진행된다. 그러나 식물체재분화배지에서 얻어진 신초의 크기가 작거나 모양이 변형된 경우 그리고 신초가 rosette형으로 분화된 경우에는 뿌리유기 처리를 하더라도 정상적인 신초로 발달되는 빈도가 낮아 완전한 식물체를 얻지 못하였다. PAA(phenylacetic acid) 처리, 24-epi-brassinolide처리를 통하여 신초를 신장시켜서 뿌리 유기율을 향상시켰음을 보고하였다. 본 연구에서는 IAA와 NAA를 처리하여 어린식물체가 재분화한 후 뿌리가 발생되고 완전한 식물체를 얻은 것은 Gunay와 Rao, Phillips와 Hubstenberger, Agrawal 등의 연구결과와 유사한 경향으로 나타났다.</p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>고추는 자식과 타식을 겸하는 작물로서 타식율이 \\( 5 \\sim 30 \\% \\)로 높아서 자식에만 의존하는 작물에 비하여 고정계통 육성에 시간과 노력이 많이 소요되는 단점이 있다.", "또한 고추에 대한 재배농민의 선호도와 소비자의 기호가 다양해지면서 신품종 육성에도 유전자원의 활용 폭이 넓어지고 효율적인 육종방법의 개발에도 다양한 연구가 수행되고 있지만, 아직까지도 역병이나 탄저병과 같은 주요병해에 저항성을 나타내는 내병성 품종의 개발성과가 미흡한 것이 가장 큰 문제점이다.", "그리고 웅성불임성을 이용하여 육성된 일대잡종의 종자는 순도 문제가 아직도 미해결 과제로 남아 있는 실정이다.", "</p><p>최근 분자생물학이 발전하면서 외래의 DNA를 식물체내에 직접 도입하여 목적형질을 개량하는 형질전환법이 작물의 품종개량에 실용적으로 이용되면서 기존 육종 방법의 단점을 크게 개선할 수 있다는 점에서 육종전반에 걸쳐 폭 넓은 이용이 전망되고 있다.", "식물 세포수준에서 이루어지는 이러한 생명공학 기술의 응용에서 가장 기본이 되는 것은 세포나 조직으로부터 식물체를 성공적으로 재분화 시킬 수 있는 조직배양 시스템의 확립이 선결과제인데, 고추에서는 Gunay와 Rao가 자엽과 하배축으로부터 식물체 재분화에 성공한 이래로 원형질체, 체세포배, 제 1 본엽등을 배양하여 식물체를 재분화 시킨 예가 있으나 그 효율은 다른 작물에 비해 낮은 실정이다.", "</p><p>따라서 본 실험은 고추의 자엽조직을 이용하여 식물체재분화 효율을 향상 시킬 수 있는 최적의 식물체재분화 배지를 구명하고, 나아가 고추 형질전환 연구에 기초 자료를 제시하고자 수행하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><p>고추의 식물체 재분화 배지조건을 구명하기위하여 경북 북부지방에서 재래종으로 재배되고 있는 '수비초'와 '금탑'의 자엽과 본엽의 조직을 이용하였다.", "종자는 \\( 70 \\% \\) ethanol에서 30 초, \\( 2 \\%\\) \\(\\mathrm{NaOCl} \\) 에서 15 분간 소독한 후 멸균수로 3회 세척하여 MS기본배지가 분주된 배양병당 20~30립씩을 치상하여 16 시간 일장 \\( 40 \\mu \\mathrm{mol} \\cdot \\mathrm{m}^{-2} \\cdot \\mathrm{sec}^{-1} \\) 의 cool-white 형광, \\( 25 \\pm 2^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 배양실에서 발아시켰다.", "발아 후 10~14일째에 자엽을 엽병 \\( 1 \\sim 2 \\mathrm{~mm} \\) 정도를 포함하도록 절단하여 재분화 효율 구명을 위한 재료로 사용하였다.", "</p><p>Shoot를 유도하기 위해 MS배지에 zeatin \\( 1,2,3,4,5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) 처리, BA \\( 1, 2, 4, 6, 8, 10 \\mathrm{mg} /\\mathrm{l}\\) 처리와 zeatin \\(2,3,4 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) 와 NAA \\( 0.01,0.05,0.1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) 를 조합하여 이용하였다.", "Root를 유기하기 위해서 MS배지에 NAA \\( 0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) 와 IAA \\( 0.01,0.05,0.1,0.5,1.0 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) 를 첨가하였다.", "치상수는 처리당 10 조직 4반복으로 하였고, 배양환경은 온도 \\( 25 \\pm 1^{\\circ} \\mathrm{C}\\), 16시간 명조건에서 배양하였으며, 분화율은 치상 후 30일 경과 후 조사하였다.", "</p> <h1>적 요", "</h1><p>재래종 고추인 '수비초'와 '금탑'의 자엽을 이용한 식물체 재분화 조건을 구명하기 위해 시험한 결과, shoot 분화율은 \\( 2 \\sim 4 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) zeatin 에서 \\( 0.05 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) NAA 혼용에서 분화율이 높았고, 뿌리 분화율은 \\( 0.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l}\\) NAA 에서 높았다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><p>고추의 자엽조직으로부터 shoot 분화를 위해 \\(4 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) zeatin을 첨가했을 때 신초 분화율이 '수비초' \\( 60 \\% \\), '금탑' \\(80 \\%\\)로 높았고, BA의 경우 '수비초'는 \\( 10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) 에서 \\( 50 \\% \\), '금탑'은 \\( 8 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\)에서 \\( 65.0 \\% \\) 였다.", "적절한 shoot 분화를 위해서는 BA의 경우 Zeatin보다 2배 정도의 농도가 필요하였으며, 두 생장조절제에서 재래 고정종인 '수비초'보다 시판 교잡종인 '금탑'의 shoot 분화율이 높았다.", "Zeatin과 NAA 혼용시 '수비초'와 '금탑'에서 Zeatin \\(2 \\sim 4 \\mathrm{mg}/\\mathrm{l}\\)에서 NAA \\( 0.05 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) 혼용에서 신초의 분화율이 \\( 90 \\% \\) 이상 이었고, NAA \\( 0.1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\)에서는 신초 분화율이 떨어지는 경향이었다.", "Zeatin과 NAA 혼용할 경우 분화율은 높았지만, callus의 생장으로 초기 신초의 생장에 다소 영향이 있었다.", "</p><p>고추 조직배양에서 식물체 재분화 능력이 genotype 간에 큰 차이를 보인다는 것은 여러 연구자들에 의해 보고되었는데, Ochoa-Alejo와 Ireta-Moreno는 하배축을 재료로 16개의 genotype에 대한 식물체 재분화능력을 비교한 바, 재분화능력이 높은 것과 보통 그리고 거의 안 되는 것으로 구분되었으며 이들의 재분화능력은 배지조성이 바뀌어도 큰 차이가 없었다고 하였다.", "Dabauza와 Pena는 10개의 genotype에 대하여 7 가지 배양조직에 따라 식물체 재분화율을 조사한 바, 배양 조직의 종류보다는 genotype에 따라 식물체 재분화율의 차이가 뚜렷함을 보고하였다.", "본 연구에서도 고추 genotype 간에 식물체 재분화율의 차이가 나타났으나 배지내에 식물생장호르몬의 조성에 따라 genotype 차이가 크게 나타나지 않아 Christopher와 Rajam의 연구와는 차이가 나는 경향을 나타내었다.", "</p><p>고추의 조직배양은 Dix와 Street가 고추 영양체 조직으로부터 캘러스를 유기하고 증식시킨 이래로 Gunay와 Rao가 MS배지에 IAA와 BA를 이용하여 자엽과 하배축으로부터 식물체 재분화에 성공하였다.", "그 이후 자엽과 하배축, 본엽 조직으로부터 식물체재분화는 되었으나, 본 실험의 결과보다 식물체 재분화율이 높지 않았다.", "따라서 고추의 조직배양이나 형질전환 연구에 식물체 재분화 효율의 배지로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료되었다.", "</p><p>생장조절제 첨가할 경우 뿌리 분화율은 \\( 0.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l}\\) NAA 에서 '수비초' \\( 75.0 \\% \\), '금탑' \\( 85.0 \\% \\) 였고, \\( 1.0 \\mathrm{mg} / \\mathrm{l} \\) IAA에서 '수비초' \\( 68.3 \\% \\), '금탑' \\( 81.7 \\% \\)로 양호하였다.", "적절한 root의 분화를 위해서 IAA는 NAA보다 높은 농도가 필요하였다.", "두 생장조절제 모두 시판종인 '금탑'이 재래종인 '수비초'보다 뿌리 분화율이 높았다.", "</p><p>식물체 재분화 배지에서 얻어진 신초들은 배지에 식물 호르몬을 전혀 첨가하지 않고 뿌리를 분화시키는 경우를 제외하고는 대부분 높은 농도의 NAA 혹은 IAA를 처리하여 뿌리를 유기한 다음 순화단계로 진행된다.", "그러나 식물체재분화배지에서 얻어진 신초의 크기가 작거나 모양이 변형된 경우 그리고 신초가 rosette형으로 분화된 경우에는 뿌리유기 처리를 하더라도 정상적인 신초로 발달되는 빈도가 낮아 완전한 식물체를 얻지 못하였다.", "PAA(phenylacetic acid) 처리, 24-epi-brassinolide처리를 통하여 신초를 신장시켜서 뿌리 유기율을 향상시켰음을 보고하였다.", "본 연구에서는 IAA와 NAA를 처리하여 어린식물체가 재분화한 후 뿌리가 발생되고 완전한 식물체를 얻은 것은 Gunay와 Rao, Phillips와 Hubstenberger, Agrawal 등의 연구결과와 유사한 경향으로 나타났다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "고추의 조직을 이용한 생장조절제 처리가 식물체 재분화 효율에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-e6cf95ac-4379-4364-904f-5a7019030800", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2006", "doc_author": [ "이문중", "권태룡", "한증슬", "김경민", "김창길", "오중열" ], 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5,403	<h1>결 과</h1><h2>일반적 특성</h2><p>대상자는 25세 미만이 \( 39.2 \%\), 25세 이상 30세 미만이 \( 28.8 \% \), 30세 이상이 \( 32.0 \% \) 으로 평균( \( 29.3 \pm 9.05 \))세이었다. 대상자의 출신지는 베트남이 \( 48.4 \% \)로 가장 많았으며, 그 다음으로는 중국이 \( 24.1 \% \), 필리핀이 \( 13.1 \% \)순으로 나타났으며, 그 외 캄보디아, 우즈베키스탄, 인도네시아, 태국, 일본, 러시아, 페루, 칠레, 몽골이었다. 한국에 거주한 기간은 1년 미만이 \( 26.8 \% \), 1년 이상 2년 미만은 \( 26.1 \% \), 2년 이상 3년 미만은 \( 18.3 \% \), 3년 이상은 \( 28.8 \% \)이었다. 종교는 무교가 \( 86.9 \% \)로 가장 많았으며, 불교는 \( 2.6 \% \), 기독교는 \( 3.9 \% \), 천주교는 \( 6.5 \% \)이었다. 결혼상태는 \( 100.0 \% \)가 기혼이었으며, 1명 이상의 자녀가 있는 경우가 \( 66.7 \% \)이었다(Table 1).</p><h2>생식건강상태</h2><p>월경 전 증후군이 있는 사람은 \( 57.5 \% \)이었으며, 월경통이 있는 대상자는 \( 59.5 \% \)이었다. 지난 1년간 월경이 규칙적이었던 대상자는 \( 48.4 \% \)이었으며, 생식기 감염치료를 받은 경험이 있는 대상자는 \( 7.8 \% \)였다. 생식기 가려움이 있다고 응답한 대상자는 \( 21.6 \% \)이었고, 질 분비물이 증가하였다는 대상자는 \( 17.0 \% \)이었다. 질 분비물에서 냄새가 난다는 대상자는 \( 20.9 \% \)이었으며, 불규칙적인 질 출혈이 있는 대상자는 \( 2.0 \% \)이었으며, 현재 생식기 질병을 가지고 있는 대상자는 \( 7.8 \% \)이었다.</p><p>현재 임신 중인 대상자는 \( 7.8 \% \)였고, 임신경험이 있는 대상자는 \( 75.2 \% \), 임신경험이 없는 대상자는 \( 24.8 \% \)이었다. 체외수정 시술경험은 \( 5.9 \% \)가 있었고 유산경험이 있는 대상자는 \( 22.9 \% \)이었다. 분만경험은 \( 61.4 \% \)가 있었고, \( 1.3 \% \)가 조산경험이 있었다. 산욕기 합병증이 있었던 대상자는 \( 8.5 \% \), 모유수유를 한 경험이 있는 대상자는 \( 46.5 \% \)이었다(Table 2).</p><h2>체성분 조성</h2><p>대상자의 \( 68 \% \)가 체단백질량 표준범위인 8.1-9.9이었고, \( 81.7 \% \)가 체무기질량 표준범위인 2.79-3.41에 있었다. 체지방률의 경우 \( 53.6 \% \)가 표준범위인 \( 18.0-28.0 \% \)인 반면 \( 16.3 \% \)가 표준 이하인 \( 17.9 \% \) 이하, \( 30.1 \% \)가 표준이상인 \( 28.1 \% \) 이상이었다. 대상자의 \( 61.4 \% \)가 BMI 표준범위인 18.5-23.0인 반면 \( 17.0 \% \)가 저체중이었다. 복부비만에 대한 판단기준으로 사용되는 허리와 엉덩이 둘레의 비는 \( 41.8 \% \)가 표준범위인 0.7-0.8인 반면 0.81 이상이 \( 58.2 \% \)로 표준 이상이었다(Table 3).</p><h2>일반적 특성에 따른 생식건강상태</h2><p>대상자의 일반적 특성에 따른 생식건강상태를 살펴본 결과는 Table 4와 같다. 대상자의 연령에 따라 체외수정 경험(\(\mathrm{X}^{2} =6.60\), \(\mathrm{p}=0.037 \)), 임신경험(\( \mathrm{X}^{2}=6.35\), \(\mathrm{p}=0.042 \))과 유산경험(\( \mathrm{X}^{2} =14.72\), \(\mathrm{p}=0.001 \) )이 유의한 차이를 나타냈다. 체외수정 경험은 25-30세가 많았고, 임신과 유산경험은 30세 이상이 다른 연령대에 비해 많았다.</p><p>대상자의 국적에 따라 월경 전 증후군(\(x^{2}=10.84\), \(\mathrm{p}=0.028\)), 지난 1년간 월경의 규칙성(\( x^{2}=9.94\), \(\mathrm{p}=0.041 \)), 질 분비물에서의 냄새(\( x^{2}=11.68\), \(\mathrm{p}=0.020 \)), 체외수정 시술경험(\( x^{2}=11.76\), \(\mathrm{p}=0.019 \)), 분만경험(\( x^{2}=13.71\), \(\mathrm{p}=0.008 \)), 모유수유경험(\( \mathrm{x}^{2}=16.59\), \(\mathrm{p}=0.035 \))이 유의한 차이를 보였다. 월경 전 증후군, 질 분비물 냄새 및 체외수정 시술경험과 베트남 출신의 대상자가 다른 국가 출신 대상자 보다 많았다. 또한 지난 1년간 월경의 규칙성, 분만경험과 모유수유경험도 배트남 출신의 대상자가 다른 국적 출신의 대상자 보다 많았다.</p><p>대상자의 한국 내 체류기간에 따라 체외수정 시술경험, 임신경험(\(X^{2}=58.64\), \(\mathrm{p}<0.001 \)), 분만 경험\( \left(X^{2}=49.36, \mathrm{p}<0.001\right) \)과 모유수유경험 (\(X^{2}=44.89\), \(\mathrm{p}<0.001 \))이 유의한 차이를 보였다. 대상자의 종교유무에 따라 월경 전 증후군(\( X^{2}=13.23\), \(\mathrm{p}<0.001 \)), 생식기감염 치료경험(\( x^{2}=4.70\), \(\mathrm{p}=0.030 \))과 모유수유경험(\( X^{2}=7.87 \), \( \mathrm{p}=0.020 \))이 유의한 차이를 보였다. 체외수정 시술경험은 한국 내 체류기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다. 임신경험, 분만경험, 모유수유경험 또한 한국 내 체류기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다.</p><p>대상자의 자녀유무에 따라 월경통(\( x^{2}=5.42\), \(\mathrm{p}=0.020 \)), 임신 경험(\( \mathrm{x}^{2}=85.78\), \(\mathrm{p}<0.001 \)), 분만경험(\( \mathrm{x}^{2}=114.23\), \(\mathrm{p}<0.001 \)), 출산 합병증(\( \mathrm{x}^{2}=7.10\), \(\mathrm{p}<0.008 \))과 모유수유경험(\(\mathrm{x}^{2}=66.24\), \(\mathrm{p}<0.001 \))이 유의한 차이를 보였다. 자녀가 있는 군이 없는 군에 비해 월경통이 많았다.</p><h2>일반적 특성에 따른 체성분 조성</h2><p>대상자의 일반적 특성에 따른 체성분 조성은 Table 5와 같다. 대상자의 일반적 특성에 따른 체단백질과 체무기질량은 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 대상자의 체지방률은 국적(\( \mathrm{x}^{2}=32.27\), \(\mathrm{p}<0.001 \))과 종교유무(\( \mathrm{x}^{2}=9.17\), \(\mathrm{p}=0.010 \))에 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 표준이하 혹은 표준이상의 체지방률은 베트남 출신, 종교가 없는 군이 다른 군에 비해 많았다. 체질량지수는 연령(\( x^{2}=15.60\),\( \mathrm{p}=0.004 \)), 국적(\( \mathrm{x}^{2}=25.08\), \(\mathrm{p}=0.002 \)) 및 체류기간(\( x^{2}=17.06\), \(\mathrm{p}=0.009 \))에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 체질량지수가 표준이하인 경우는 25-30세, 베트남 출신, 한국 거주 기간이 13-24개월인 군이 다른 군에 비해 많았으며, 체질량지수가 표준이상인 경우는 30세 이상, 중국 출신, 거주기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다. 허리와 엉덩이 둘레 비는 연령(\(\mathrm{x}^{2}=26.71\), \(\mathrm{p}<0.001 \)), 국적(\( \mathrm{x}^{2}=12.04\), \(\mathrm{p}=0.017 \)) 및 종교유무(\( \mathrm{x}^{2}=4.51\), \(\mathrm{p}=0.034 \))에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 허리와 엉덩이 둘레 비가 표준 이상인 경우는 연령 30세 이상, 베트남 출신, 한국 거주 기간이 37개월 이상, 종교가 없는 군이 다른 군에 비해 많았다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구설계</h2><p>본 연구는 부산지역 결혼이주여성의 생식건강상태와 체성분 조성을 파악하고자 시도된 서술적 조사연구이다.</p><h2>연구대상</h2><p>본 연구의 자료수집에 앞서 부산대학교 병원 임상시험센터의 IRB심사를 받았다. 2008년 7월 21일부터 2009년 7월 25일까지 B광역시 간호사회에서 주최한 S구, J구, B구와 N구 결혼이민자를 위한 건강증진사업에 자발적으로 참여한 결혼이주여성 중 연구자가 연구의 목적과 자료의 결과는 연구의 목적 이외에서는 사용되지 않음을 설명하고, 원할 때 언제든지 연구 참여를 철회할 수 있음을 설명 후 설문지 작성과 체성분검사 및 각종 검사에 대해 동의한 154명을 대상으로 하였다.</p><h2>연구도구</h2><p>자료 수집을 위해 일반적 특성과 생식건강으로 구성된 구조화된 설문지를 사용하였으며 연구자가 문헌을 토대로 구성하여 간호학과 교수 2인과 산부인과 전문의 1인의 자문을 받아 수정하였다.</p><p>체성분 분석은 Inbody 720 (주 바이오스페이스, 한국)을 이용하여 측정하였다. 분석된 체성분은 body protein mass, body mineral mass, percent body fat, body mass index와 waist-hip ratio이었다.</p><h2>자료수집 방법</h2><p>설문지 내용은 영어, 베트남어, 중국어로 번역하였으며, B광역시에 거주하고 있는 결혼이주여성자조모임을 담당하고 있는 간호사, 필리핀 자원봉사자, 베트남 자원봉사자, 중국 자원봉사자와 함께 검토, 분석하면서 부적절한 문항을 수정 보완하였다. 설문조사는 결혼이주여성의 가족들이 외부인의 접근에 대해 경계한다는 특징을 고려하여 개별방문보다는 결혼이주여성에 대한 서비스를 제공하는 기관과 함께 하였다. 설문지 자료 수집을 위해 연구자는 필리핀어 자원봉사자, 베트남어 자원봉사자와 중국어 자원봉사자의 도움을 받아 설문 문항을 설명하면서 자료를 수집하였으며, 혈압, 맥박측정, 혈당검사, 소변검사 및 체성분 검사를 하였다. 이후 연구자는 대상자와 1:1 면담을 통해 검사결과를 반영한 건강상담을 하고 검사결과지를 개인별로 제공하였다.</p><h2>자료분석</h2><p>수집된 자료의 분석은 SPSS 12.0 프로그램을 사용하여 분석하였다. 대상자의 일반적인 특성, 생식건강상태와 체성분 조성은 실수와 백분율로 분석하였다. 일반적인 특성에 따른 생식건강상태 및 체성분 조성의 차이는 \( \chi^{2} \)-test를 이용하였다.</p> <h1>초록</h1><p>본 연구는 부산지역 결혼이주여성의 생식건강상태와 체성분 조성을 파악하여 결혼이주여성의 건강증진을 위한 기초자료를 제공하기 위해 수행된 서술적 조사연구이다. 연구대상은 부산시에 거주하고 있는 결혼이주여성 154명이었으며. 자료수집 기간은 2008년 7월 21일부터 2009년 7월 25일까지였다. 결혼이주여성의 일반적인 특성, 생식건강상태를 측정하기 위해 구조화된 설문지를 사용하였고 신체계측과 체성분 검사를 하였다. 대상자의 연령에 따라 체외수정 경험, 임신경험과 유산경험이 유의한 차이를 나타내었으며 대상자의 국적에 따라 월경, 월경 전 증후군, 지난 1년간 월경의 규칙성, 질 분비물에서의 냄새, 체외수정 시술경험, 분만경험, 모유수유경험이 유의한 차이를 보였다. 대상자의 한국 내 체류기간에 따라 체외수정 시술경험, 임신경험, 분만경험과 모유수유경험이 유의한 차이를 보였고 대상자의 종교유무에 따라 월경 전 증후군, 생식기감염 치료경험과 모유수유경험이 유의한 차이를 보였다. 대상자의 자녀유무에 따라 월경통, 임신경험, 분만경험, 출산합병증과 모유수유경험이 유의한 차이를 보였다. 대상자의 체지방률은 국적과 종교유무에 통계적으로 유의한 차이를 보였으며 체질량지수는 연령, 국적 및 체류기간에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 허리와 엉덩이 둘레 비는 연령, 국적 및 종교유무에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 결혼이주여성의 연령과 출신국가 별 특성을 고려한 체계적인 건강관리 및 영양관리 프로그램 개발이 요구된다.</p> <h1>고 찰</h1><p>여러 국가에서 온 여성결혼 이주자와 한국 남성간의 국제결혼이 급증함에 따라 여성결혼 이주자의 사회 문화적 문제 및 인권문제에 대한 관심이 높아지고 있는 현 시점에서 새로운 간호대상자로서 이들에 대한 관심과 접근이 필요하다. 특히 결혼이주여성의 건강은 자신 뿐 아니라 다음 세대의 건강에 영향을 미칠 수 있으므로 이들의 실질적인 건강문제를 파악하는 것은 여성결혼 이주자들을 위한 간호영역에서의 중재 방안 모색을 위해 중요할 것이다. 본 연구 대상자들은 베트남 국적이 가장 많았고 다음으로는 중국과 필리핀이 많았는데 이는 결혼 중개업자를 통한 한국 남성과 베트남 여성간의 결혼이 급증한 최근 추세를 반영한 것으로 보인다.</p><p>본 연구에서 생식기 가려움이 있다고 응답한 대상자는 \( 21.6 \% \)이었고, 질 분비물이 증가했다는 대상자는 \( 17.0 \% \)였으며, 질 분비물에서 냄새가 난다는 대상자는 \( 20.9 \% \), 불규칙적인 질 출혈이 있는 대상자가 \( 2.0 \% \)이었다. 이러한 결과는 우리나라 내국 20-30대 기혼 여성과 비교하여 어떤 차이가 있는지를 파악하기 위한 추후연구를 할 필요가 있겠다.</p><p>가임기 여성을 대상으로 한 본 연구에서는 현재 임신 중인 대상자가 \( 7.8 \% \)였으나, 임신 중이거나 자녀를 가진 자 중 아직 단산을 하지 않은 국제결혼이주여성을 대상으로 한 Kim과 Koh의 연구결과에서 임신 중인 경우가 \( 58 \% \)였다. 이는 결혼이주 여성의 출산관련 교육과 출산지원에 대한 우선적인 요구를 반영해야 함을 시사하는 것으로 볼 수 있다.</p><p>한편, 임신경험이 없는 대상자가 \( 24.8 \% \), 체외수정 경험이 있는 대상자가 \( 5.9 \% \)였는데 이는 Seol 등의 연구에서 결혼 이주 여성의 \( 11.4 \% \)가 임신을 위하여 노력함에도 불구하고 임신이 되지 않는 것으로 보고한 결과와 부분적으로 일치하여 그 원인에 대한 추후 연구가 필요하다. 특히, 본 연구에서는 결혼이주 여성의 사회문화적 적응에 대해서는 조사하지 않았지만 추후 이들 변인과 임신과의 관계도 살펴볼 필요가 있다.</p><p>유산경험이 있는 대상자는 \( 22.9 \% \)였는데 이는 유산경험이 \( 20.2 \% \)로 나타난 Seol 등의 연구 결과와 유사하였다. 산욕기 합병증이 있었던 대상자는 \( 8.5 \% \), 모유수유를 한 경험이 있는 대상자는 \( 46.5 \% \)로 전남 M군, Y군에 거주하는 이주여성을 대상으로 한 Kim의 연구와 비교할 때 산욕기 합병증의 경우 \( 6.9 \% \)로 유사하였으나 모유수유 경험의 경우 Kim의 연구에서 \( 58.8 \% \)로 본 연구 결과보다 높았다.</p><p>본 연구는 결혼이주 여성의 영양상태에 대한 연구가 극히 드문 현 시점에서 실제 계측을 통해 결혼이주 여성의 영양상태를 구체적으로 확인하였다는데 큰 의미를 갖는다. 다만, 기존의 선행연구에서는 결혼이주 여성의 체성분 조성을 보고한 연구가 없어 직접적인 비교에는 제한이 있다. 더불어 한국 내 국 20-30대 여성의 체성분 조성을 보고한 연구도 드물어 국민 건강영양조사 결과 및 여대생의 체성분 조성을 보고한 Chung과 Chang 연구결과와 비교하였다. 대상자의 \( 32.0 \% \)가 체단백질량 부족이었고, \( 18.3 \% \)가 체무기질량 부족이었다. 이는 여대생을 대상으로 체성분 조성을 측정한 Chung과 Chang의 연구에서 여대생의 \( 13.2 \% \)가 체단백질량 부족, \( 16.8 \% \)가 체무기질량 부족인 결과와 비교할 때 결혼이주여성의 심각한 단백질 섭취 부족을 보여주었다.</p><p>결혼이주여성의 체질량지수를 측정한 결과 우리나라 20대 일반 여성의 경우 25이상이 \( 14.3 \% \)인데 반해 연구대상자는 \( 21.6 \% \)로 나타나 우리나라 20대 보다 비만도가 낮았다. 그러나 결혼이주여성의 \( 17 \% \)가 저체중으로 2005년 국민건강영양조사 결과에서 20세 이상 여성의 \( 5.7 \% \)가 저체중인 것과 비교할 때 두 배 이상 높았다. 또한, 체지방률의 경우 모든 여대생이 표준범위 이상의 체지방률을 보여 체지방률 저하인 대상자가 \( 0 \% \)인 Chung과 Chang의 연구와는 달리 본 연구대상자의 \( 16.3 \% \)가 표준범위보다 낮은 체지방률을 나타내었다. 이는 체지방의 축적과 달리 \(30 \sim 50\%\) 체지방의 감소는 영양실조로 생명에 위협을 줄 수 있고, 각 개인의 기초대사량은 제지방과 밀접한 관계가 있으므로, 결혼이주여성의 영양관리에 대한 보건학적 접근과 효율적인 대안 마련이 시급함을 시사한다고 할 수 있다.</p><p>대상자의 국적에 따라 월경 전 증후군, 지난 1년간 월경의 규칙성, 질 분비물에서의 냄새, 체외수정 시술경험, 분만경험, 모유수유경험이 유의한 차이를 보였는데 특이한 점은 배트남 출신의 대상자가 다른 국가 출신 대상자 보다 높은 분포를 나타내었다. 이러한 분포가 민족 특성에 따른 차이인지를 파악하기 위한 추후 연구가 필요하리라 사료된다.</p><p>대상자의 일반적 특성에 따른 체단백질과 체무기질량은 유의한 차이가 없는 반면 표준이하 혹은 표준이상의 체지방률은 베트남 출신이 다른 국가 출신의 대상자보다 많아 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 체질량지수가 표준이상인 경우는 30세 이상, 중국 출신, 거주기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다. 허리와 엉덩이 둘레 비가 표준이상인 경우는 연령 30세 이상, 베트남 출신, 한국 거주 기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다. 즉, 전체적으로 볼 때 30세 이상, 베트남 출신, 체류기간이 37개월 이상인 군의 비만도 지수가 다른 군에 비해 높은 것으로 나타나 이를 고려한 관리방안 모색이 필요하리라 사료된다.</p><p>본 연구는 B광역시에 거주하는 결혼이주여성이 조사의 대상이었기 때문에 대표성 확보의 제한으로 인한 결과 해석의 제한점이 있지만, 기존 연구의 대부분이 농어촌 지역 및 중소 도시 결혼이주여성의 정신, 심리건강을 조사한 반면 본 연구는 대도시 결혼이주여성을 대상으로 거의 연구된 바 없는 여성생식건강을 포함한 생식건강상태와 체성분 조성을 조사했다는데 의의가 있다.</p> <h1>서 론</h1><p>1990년대 이후 한국 남성들이 아시아 여러 나라 또는 구소련 출신의 여성과 결혼하여 한국에서 사는 현상이 급증하여 2001년부터 5년간 국제결혼 이주여성은 연평균 \( 43.9 \% \)로 증가하였고 2020년에는 국제결혼이 한국 사회 전체 결혼에서 차지하는 비율이 \( 32 \% \)까지 증가할 것으로 전망하고 있다.</p><p>특히 출산율 최저 도시로 발표된 부산지역은 저출산, 고령화와 노동인구의 감소 등과 맞물려, 부산의 전체 결혼건수는 감소하는데 반해, 국제결혼은 증가 추세에 있다. 이는 국제결혼을 통한 이주자와 그 출생아동 비율의 급속한 증가를 예측할 수 있으며, 이로 인한 건강문제의 발생이 어느 지역 보다 높을 수 있음을 의미한다. 또한 간호현장에서 결혼이주여성을 대상자로 접하게 되는 빈도가 늘어남에 따라 이들의 건강상태 파악과 효율적인 간호 제공의 필요성이 부각되고 있다.</p><p>결혼이주 여성의 출신국은 최근 2-3년 사이에 중국, 일본, 필리핀, 베트남, 태국, 몽골, 우즈베키스탄, 러시아 등 점차 다양해지고 있어 언어적, 문화적 차이로 인한 효율적인 건강관리가 어려운데, 결혼이주여성의 약 \( 20 \% \)가 인공임신중절을 택하고 있으며, 여성 질환, 임신기간과 산후조리기간의 건강 문제, 빈혈, 불임 등을 보고하고 있다. 또한, 부인과 질환의 경우 대부분의 결혼이주여성이 부인과 검진을 받아본 경험이 없으며, 질병 상태임에도 불구하고 치료를 잘 받지 못하고 있어 앞으로 임신, 출산, 양육과 함께 가족건강을 책임 질 이들 결혼이주여성의 실질적인 건강상태를 파악하여 해결 방법을 모색해야 할 것이다.</p><p>이에 보건복지가족부에서는 결혼이주여성을 보건소 맞춤형방문건강관리사업 대상으로 포함시켜 정책적으로 체계적인 서비스를 제공하려고 노력하고 있으나 이들에 대한 실질적인 자료 부족으로 아직까지 구체적인 실무지침이나 이에 대한 대응방안을 마련하지 못하고 있는 실정이다.</p><p>우리나라의 결혼이주여성의 건강에 대한 선행연구를 살펴보면, 결혼이주여성의 사회문화적 적응과 국제결혼 가정의 문제를 주로 다루고 있을 뿐, 결혼이주자들의 건강상태를 파악하여 이에 대한 보건의료지원을 위한 대안 마련이 절실함에도 불구하고, 이에 관한 연구는 결혼이주여성의 스트레스, 우울 및 심리적 건강에 대한 연구와 건강상태에 불과하다. 기존 결혼이주 여성의 건강상태에 관한 연구결과를 살펴보면 결혼이주여성의 연령이 20-30대로 임신중이거나 임신을 계획하고 있으며, 여성 질환 문제를 가지고 있으나 치료를 잘 받지 못하는 것으로 보고하면서 여성생식건강에 관한 후속연구를 제언한 바 있으나 실제 가임기에 있는 결혼이주여성의 생식건강에 관한 연구는 아직까지 거의 연구된 바 없다.</p><p>또한, 선행연구에서 결혼이주 여성 세 명 중 한명이 저체중이며, 가장 높은 이환율을 보이는 질환이 빈혈임을 감안할 때 이들의 영양 상태를 확인할 필요가 있다. 체성분 조성 측정은 신체구성 성분의 함량과 분포를 정량적으로 측정하여 영양상태 평가 및 비만, 심장질환과 순환계 질환 평가 그리고 반복측정을 통한 질환의 진행 속도를 파악하기 위한 수단으로 이용된다. 이에 본 연구는 국제결혼을 통한 결혼이주여성이 증가하고 있는 부산지역 결혼이주여성을 대상으로 생식건강상태와 체성분 조성을 파악하고자 한다.</p><p>본 연구의 목적은 결혼이주여성의 건강상태와 체성분 조성을 알아보기 위하여 결혼이주 여성의 일반적 특성, 생식건강상태와 체성분 조성, 결혼이주 여성의 일반적 특성에 따른 생식건강상태와 체성분 조성을 파악하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>결 과</h1><h2>일반적 특성</h2><p>대상자는 25세 미만이 \\( 39.2 \\%\\), 25세 이상 30세 미만이 \\( 28.8 \\% \\), 30세 이상이 \\( 32.0 \\% \\) 으로 평균( \\( 29.3 \\pm 9.05 \\))세이었다.", "대상자의 출신지는 베트남이 \\( 48.4 \\% \\)로 가장 많았으며, 그 다음으로는 중국이 \\( 24.1 \\% \\), 필리핀이 \\( 13.1 \\% \\)순으로 나타났으며, 그 외 캄보디아, 우즈베키스탄, 인도네시아, 태국, 일본, 러시아, 페루, 칠레, 몽골이었다.", "한국에 거주한 기간은 1년 미만이 \\( 26.8 \\% \\), 1년 이상 2년 미만은 \\( 26.1 \\% \\), 2년 이상 3년 미만은 \\( 18.3 \\% \\), 3년 이상은 \\( 28.8 \\% \\)이었다.", "종교는 무교가 \\( 86.9 \\% \\)로 가장 많았으며, 불교는 \\( 2.6 \\% \\), 기독교는 \\( 3.9 \\% \\), 천주교는 \\( 6.5 \\% \\)이었다.", "결혼상태는 \\( 100.0 \\% \\)가 기혼이었으며, 1명 이상의 자녀가 있는 경우가 \\( 66.7 \\% \\)이었다", "(Table 1).", "</p><h2>생식건강상태</h2><p>월경 전 증후군이 있는 사람은 \\( 57.5 \\% \\)이었으며, 월경통이 있는 대상자는 \\( 59.5 \\% \\)이었다.", "지난 1년간 월경이 규칙적이었던 대상자는 \\( 48.4 \\% \\)이었으며, 생식기 감염치료를 받은 경험이 있는 대상자는 \\( 7.8 \\% \\)였다.", "생식기 가려움이 있다고 응답한 대상자는 \\( 21.6 \\% \\)이었고, 질 분비물이 증가하였다는 대상자는 \\( 17.0 \\% \\)이었다.", "질 분비물에서 냄새가 난다는 대상자는 \\( 20.9 \\% \\)이었으며, 불규칙적인 질 출혈이 있는 대상자는 \\( 2.0 \\% \\)이었으며, 현재 생식기 질병을 가지고 있는 대상자는 \\( 7.8 \\% \\)이었다.", "</p><p>현재 임신 중인 대상자는 \\( 7.8 \\% \\)였고, 임신경험이 있는 대상자는 \\( 75.2 \\% \\), 임신경험이 없는 대상자는 \\( 24.8 \\% \\)이었다.", "체외수정 시술경험은 \\( 5.9 \\% \\)가 있었고 유산경험이 있는 대상자는 \\( 22.9 \\% \\)이었다.", "분만경험은 \\( 61.4 \\% \\)가 있었고, \\( 1.3 \\% \\)가 조산경험이 있었다.", "산욕기 합병증이 있었던 대상자는 \\( 8.5 \\% \\), 모유수유를 한 경험이 있는 대상자는 \\( 46.5 \\% \\)이었다", "(Table 2).", "</p><h2>체성분 조성</h2><p>대상자의 \\( 68 \\% \\)가 체단백질량 표준범위인 8.1-9.9이었고, \\( 81.7 \\% \\)가 체무기질량 표준범위인 2.79-3.41에 있었다.", "체지방률의 경우 \\( 53.6 \\% \\)가 표준범위인 \\( 18.0-28.0 \\% \\)인 반면 \\( 16.3 \\% \\)가 표준 이하인 \\( 17.9 \\% \\) 이하, \\( 30.1 \\% \\)가 표준이상인 \\( 28.1 \\% \\) 이상이었다.", "대상자의 \\( 61.4 \\% \\)가 BMI 표준범위인 18.5-23.0인 반면 \\( 17.0 \\% \\)가 저체중이었다.", "복부비만에 대한 판단기준으로 사용되는 허리와 엉덩이 둘레의 비는 \\( 41.8 \\% \\)가 표준범위인 0.7-0.8인 반면 0.81 이상이 \\( 58.2 \\% \\)로 표준 이상이었다", "(Table 3).", "</p><h2>일반적 특성에 따른 생식건강상태</h2><p>대상자의 일반적 특성에 따른 생식건강상태를 살펴본 결과는 Table 4와 같다.", "대상자의 연령에 따라 체외수정 경험(\\(\\mathrm{X}^{2} =6.60\\), \\(\\mathrm{p}=0.037 \\)), 임신경험(\\( \\mathrm{X}^{2}=6.35\\), \\(\\mathrm{p}=0.042 \\))과 유산경험(\\( \\mathrm{X}^{2} =14.72\\), \\(\\mathrm{p}=0.001 \\) )이 유의한 차이를 나타냈다.", "체외수정 경험은 25-30세가 많았고, 임신과 유산경험은 30세 이상이 다른 연령대에 비해 많았다.", "</p><p>대상자의 국적에 따라 월경 전 증후군(\\(x^{2}=10.84\\), \\(\\mathrm{p}=0.028\\)), 지난 1년간 월경의 규칙성(\\( x^{2}=9.94\\), \\(\\mathrm{p}=0.041 \\)), 질 분비물에서의 냄새(\\( x^{2}=11.68\\), \\(\\mathrm{p}=0.020 \\)), 체외수정 시술경험(\\( x^{2}=11.76\\), \\(\\mathrm{p}=0.019 \\)), 분만경험(\\( x^{2}=13.71\\), \\(\\mathrm{p}=0.008 \\)), 모유수유경험(\\( \\mathrm{x}^{2}=16.59\\), \\(\\mathrm{p}=0.035 \\))이 유의한 차이를 보였다.", "월경 전 증후군, 질 분비물 냄새 및 체외수정 시술경험과 베트남 출신의 대상자가 다른 국가 출신 대상자 보다 많았다.", "또한 지난 1년간 월경의 규칙성, 분만경험과 모유수유경험도 배트남 출신의 대상자가 다른 국적 출신의 대상자 보다 많았다.", "</p><p>대상자의 한국 내 체류기간에 따라 체외수정 시술경험, 임신경험(\\(X^{2}=58.64\\), \\(\\mathrm{p}<0.001 \\)), 분만 경험\\( \\left(X^{2}=49.36, \\mathrm{p}<0.001\\right) \\)과 모유수유경험 (\\(X^{2}=44.89\\), \\(\\mathrm{p}<0.001 \\))이 유의한 차이를 보였다.", "대상자의 종교유무에 따라 월경 전 증후군(\\( X^{2}=13.23\\), \\(\\mathrm{p}<0.001 \\)), 생식기감염 치료경험(\\( x^{2}=4.70\\), \\(\\mathrm{p}=0.030 \\))과 모유수유경험(\\( X^{2}=7.87 \\), \\( \\mathrm{p}=0.020 \\))이 유의한 차이를 보였다.", "체외수정 시술경험은 한국 내 체류기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다.", "임신경험, 분만경험, 모유수유경험 또한 한국 내 체류기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다.", "</p><p>대상자의 자녀유무에 따라 월경통(\\( x^{2}=5.42\\), \\(\\mathrm{p}=0.020 \\)), 임신 경험(\\( \\mathrm{x}^{2}=85.78\\), \\(\\mathrm{p}<0.001 \\)), 분만경험(\\( \\mathrm{x}^{2}=114.23\\), \\(\\mathrm{p}<0.001 \\)), 출산 합병증(\\( \\mathrm{x}^{2}=7.10\\), \\(\\mathrm{p}<0.008 \\))과 모유수유경험(\\(\\mathrm{x}^{2}=66.24\\), \\(\\mathrm{p}<0.001 \\))이 유의한 차이를 보였다.", "자녀가 있는 군이 없는 군에 비해 월경통이 많았다.", "</p><h2>일반적 특성에 따른 체성분 조성</h2><p>대상자의 일반적 특성에 따른 체성분 조성은 Table 5와 같다.", "대상자의 일반적 특성에 따른 체단백질과 체무기질량은 통계적으로 유의한 차이가 없었다.", "대상자의 체지방률은 국적(\\( \\mathrm{x}^{2}=32.27\\), \\(\\mathrm{p}<0.001 \\))과 종교유무(\\( \\mathrm{x}^{2}=9.17\\), \\(\\mathrm{p}=0.010 \\))에 통계적으로 유의한 차이를 보였다.", "표준이하 혹은 표준이상의 체지방률은 베트남 출신, 종교가 없는 군이 다른 군에 비해 많았다.", "체질량지수는 연령(\\( x^{2}=15.60\\),\\( \\mathrm{p}=0.004 \\)), 국적(\\( \\mathrm{x}^{2}=25.08\\), \\(\\mathrm{p}=0.002 \\)) 및 체류기간(\\( x^{2}=17.06\\), \\(\\mathrm{p}=0.009 \\))에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다.", "체질량지수가 표준이하인 경우는 25-30세, 베트남 출신, 한국 거주 기간이 13-24개월인 군이 다른 군에 비해 많았으며, 체질량지수가 표준이상인 경우는 30세 이상, 중국 출신, 거주기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다.", "허리와 엉덩이 둘레 비는 연령(\\(\\mathrm{x}^{2}=26.71\\), \\(\\mathrm{p}<0.001 \\)), 국적(\\( \\mathrm{x}^{2}=12.04\\), \\(\\mathrm{p}=0.017 \\)) 및 종교유무(\\( \\mathrm{x}^{2}=4.51\\), \\(\\mathrm{p}=0.034 \\))에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다.", "허리와 엉덩이 둘레 비가 표준 이상인 경우는 연령 30세 이상, 베트남 출신, 한국 거주 기간이 37개월 이상, 종교가 없는 군이 다른 군에 비해 많았다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구설계</h2><p>본 연구는 부산지역 결혼이주여성의 생식건강상태와 체성분 조성을 파악하고자 시도된 서술적 조사연구이다.", "</p><h2>연구대상</h2><p>본 연구의 자료수집에 앞서 부산대학교 병원 임상시험센터의 IRB심사를 받았다.", "2008년 7월 21일부터 2009년 7월 25일까지 B광역시 간호사회에서 주최한 S구, J구, B구와 N구 결혼이민자를 위한 건강증진사업에 자발적으로 참여한 결혼이주여성 중 연구자가 연구의 목적과 자료의 결과는 연구의 목적 이외에서는 사용되지 않음을 설명하고, 원할 때 언제든지 연구 참여를 철회할 수 있음을 설명 후 설문지 작성과 체성분검사 및 각종 검사에 대해 동의한 154명을 대상으로 하였다.", "</p><h2>연구도구</h2><p>자료 수집을 위해 일반적 특성과 생식건강으로 구성된 구조화된 설문지를 사용하였으며 연구자가 문헌을 토대로 구성하여 간호학과 교수 2인과 산부인과 전문의 1인의 자문을 받아 수정하였다.", "</p><p>체성분 분석은 Inbody 720 (주 바이오스페이스, 한국)을 이용하여 측정하였다.", "분석된 체성분은 body protein mass, body mineral mass, percent body fat, body mass index와 waist-hip ratio이었다.", "</p><h2>자료수집 방법</h2><p>설문지 내용은 영어, 베트남어, 중국어로 번역하였으며, B광역시에 거주하고 있는 결혼이주여성자조모임을 담당하고 있는 간호사, 필리핀 자원봉사자, 베트남 자원봉사자, 중국 자원봉사자와 함께 검토, 분석하면서 부적절한 문항을 수정 보완하였다.", "설문조사는 결혼이주여성의 가족들이 외부인의 접근에 대해 경계한다는 특징을 고려하여 개별방문보다는 결혼이주여성에 대한 서비스를 제공하는 기관과 함께 하였다.", "설문지 자료 수집을 위해 연구자는 필리핀어 자원봉사자, 베트남어 자원봉사자와 중국어 자원봉사자의 도움을 받아 설문 문항을 설명하면서 자료를 수집하였으며, 혈압, 맥박측정, 혈당검사, 소변검사 및 체성분 검사를 하였다.", "이후 연구자는 대상자와 1:1 면담을 통해 검사결과를 반영한 건강상담을 하고 검사결과지를 개인별로 제공하였다.", "</p><h2>자료분석</h2><p>수집된 자료의 분석은 SPSS 12.0 프로그램을 사용하여 분석하였다.", "대상자의 일반적인 특성, 생식건강상태와 체성분 조성은 실수와 백분율로 분석하였다.", "일반적인 특성에 따른 생식건강상태 및 체성분 조성의 차이는 \\( \\chi^{2} \\)-test를 이용하였다.", "</p> <h1>초록</h1><p>본 연구는 부산지역 결혼이주여성의 생식건강상태와 체성분 조성을 파악하여 결혼이주여성의 건강증진을 위한 기초자료를 제공하기 위해 수행된 서술적 조사연구이다.", "연구대상은 부산시에 거주하고 있는 결혼이주여성 154명이었으며.", "자료수집 기간은 2008년 7월 21일부터 2009년 7월 25일까지였다.", "결혼이주여성의 일반적인 특성, 생식건강상태를 측정하기 위해 구조화된 설문지를 사용하였고 신체계측과 체성분 검사를 하였다.", "대상자의 연령에 따라 체외수정 경험, 임신경험과 유산경험이 유의한 차이를 나타내었으며 대상자의 국적에 따라 월경, 월경 전 증후군, 지난 1년간 월경의 규칙성, 질 분비물에서의 냄새, 체외수정 시술경험, 분만경험, 모유수유경험이 유의한 차이를 보였다.", "대상자의 한국 내 체류기간에 따라 체외수정 시술경험, 임신경험, 분만경험과 모유수유경험이 유의한 차이를 보였고 대상자의 종교유무에 따라 월경 전 증후군, 생식기감염 치료경험과 모유수유경험이 유의한 차이를 보였다.", "대상자의 자녀유무에 따라 월경통, 임신경험, 분만경험, 출산합병증과 모유수유경험이 유의한 차이를 보였다.", "대상자의 체지방률은 국적과 종교유무에 통계적으로 유의한 차이를 보였으며 체질량지수는 연령, 국적 및 체류기간에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다.", "허리와 엉덩이 둘레 비는 연령, 국적 및 종교유무에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보였다.", "결혼이주여성의 연령과 출신국가 별 특성을 고려한 체계적인 건강관리 및 영양관리 프로그램 개발이 요구된다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>여러 국가에서 온 여성결혼 이주자와 한국 남성간의 국제결혼이 급증함에 따라 여성결혼 이주자의 사회 문화적 문제 및 인권문제에 대한 관심이 높아지고 있는 현 시점에서 새로운 간호대상자로서 이들에 대한 관심과 접근이 필요하다.", "특히 결혼이주여성의 건강은 자신 뿐 아니라 다음 세대의 건강에 영향을 미칠 수 있으므로 이들의 실질적인 건강문제를 파악하는 것은 여성결혼 이주자들을 위한 간호영역에서의 중재 방안 모색을 위해 중요할 것이다.", "본 연구 대상자들은 베트남 국적이 가장 많았고 다음으로는 중국과 필리핀이 많았는데 이는 결혼 중개업자를 통한 한국 남성과 베트남 여성간의 결혼이 급증한 최근 추세를 반영한 것으로 보인다.", "</p><p>본 연구에서 생식기 가려움이 있다고 응답한 대상자는 \\( 21.6 \\% \\)이었고, 질 분비물이 증가했다는 대상자는 \\( 17.0 \\% \\)였으며, 질 분비물에서 냄새가 난다는 대상자는 \\( 20.9 \\% \\), 불규칙적인 질 출혈이 있는 대상자가 \\( 2.0 \\% \\)이었다.", "이러한 결과는 우리나라 내국 20-30대 기혼 여성과 비교하여 어떤 차이가 있는지를 파악하기 위한 추후연구를 할 필요가 있겠다.", "</p><p>가임기 여성을 대상으로 한 본 연구에서는 현재 임신 중인 대상자가 \\( 7.8 \\% \\)였으나, 임신 중이거나 자녀를 가진 자 중 아직 단산을 하지 않은 국제결혼이주여성을 대상으로 한 Kim과 Koh의 연구결과에서 임신 중인 경우가 \\( 58 \\% \\)였다.", "이는 결혼이주 여성의 출산관련 교육과 출산지원에 대한 우선적인 요구를 반영해야 함을 시사하는 것으로 볼 수 있다.", "</p><p>한편, 임신경험이 없는 대상자가 \\( 24.8 \\% \\), 체외수정 경험이 있는 대상자가 \\( 5.9 \\% \\)였는데 이는 Seol 등의 연구에서 결혼 이주 여성의 \\( 11.4 \\% \\)가 임신을 위하여 노력함에도 불구하고 임신이 되지 않는 것으로 보고한 결과와 부분적으로 일치하여 그 원인에 대한 추후 연구가 필요하다.", "특히, 본 연구에서는 결혼이주 여성의 사회문화적 적응에 대해서는 조사하지 않았지만 추후 이들 변인과 임신과의 관계도 살펴볼 필요가 있다.", "</p><p>유산경험이 있는 대상자는 \\( 22.9 \\% \\)였는데 이는 유산경험이 \\( 20.2 \\% \\)로 나타난 Seol 등의 연구 결과와 유사하였다.", "산욕기 합병증이 있었던 대상자는 \\( 8.5 \\% \\), 모유수유를 한 경험이 있는 대상자는 \\( 46.5 \\% \\)로 전남 M군, Y군에 거주하는 이주여성을 대상으로 한 Kim의 연구와 비교할 때 산욕기 합병증의 경우 \\( 6.9 \\% \\)로 유사하였으나 모유수유 경험의 경우 Kim의 연구에서 \\( 58.8 \\% \\)로 본 연구 결과보다 높았다.", "</p><p>본 연구는 결혼이주 여성의 영양상태에 대한 연구가 극히 드문 현 시점에서 실제 계측을 통해 결혼이주 여성의 영양상태를 구체적으로 확인하였다는데 큰 의미를 갖는다.", "다만, 기존의 선행연구에서는 결혼이주 여성의 체성분 조성을 보고한 연구가 없어 직접적인 비교에는 제한이 있다.", "더불어 한국 내 국 20-30대 여성의 체성분 조성을 보고한 연구도 드물어 국민 건강영양조사 결과 및 여대생의 체성분 조성을 보고한 Chung과 Chang 연구결과와 비교하였다.", "대상자의 \\( 32.0 \\% \\)가 체단백질량 부족이었고, \\( 18.3 \\% \\)가 체무기질량 부족이었다.", "이는 여대생을 대상으로 체성분 조성을 측정한 Chung과 Chang의 연구에서 여대생의 \\( 13.2 \\% \\)가 체단백질량 부족, \\( 16.8 \\% \\)가 체무기질량 부족인 결과와 비교할 때 결혼이주여성의 심각한 단백질 섭취 부족을 보여주었다.", "</p><p>결혼이주여성의 체질량지수를 측정한 결과 우리나라 20대 일반 여성의 경우 25이상이 \\( 14.3 \\% \\)인데 반해 연구대상자는 \\( 21.6 \\% \\)로 나타나 우리나라 20대 보다 비만도가 낮았다.", "그러나 결혼이주여성의 \\( 17 \\% \\)가 저체중으로 2005년 국민건강영양조사 결과에서 20세 이상 여성의 \\( 5.7 \\% \\)가 저체중인 것과 비교할 때 두 배 이상 높았다.", "또한, 체지방률의 경우 모든 여대생이 표준범위 이상의 체지방률을 보여 체지방률 저하인 대상자가 \\( 0 \\% \\)인 Chung과 Chang의 연구와는 달리 본 연구대상자의 \\( 16.3 \\% \\)가 표준범위보다 낮은 체지방률을 나타내었다.", "이는 체지방의 축적과 달리 \\(30 \\sim 50\\%\\) 체지방의 감소는 영양실조로 생명에 위협을 줄 수 있고, 각 개인의 기초대사량은 제지방과 밀접한 관계가 있으므로, 결혼이주여성의 영양관리에 대한 보건학적 접근과 효율적인 대안 마련이 시급함을 시사한다고 할 수 있다.", "</p><p>대상자의 국적에 따라 월경 전 증후군, 지난 1년간 월경의 규칙성, 질 분비물에서의 냄새, 체외수정 시술경험, 분만경험, 모유수유경험이 유의한 차이를 보였는데 특이한 점은 배트남 출신의 대상자가 다른 국가 출신 대상자 보다 높은 분포를 나타내었다.", "이러한 분포가 민족 특성에 따른 차이인지를 파악하기 위한 추후 연구가 필요하리라 사료된다.", "</p><p>대상자의 일반적 특성에 따른 체단백질과 체무기질량은 유의한 차이가 없는 반면 표준이하 혹은 표준이상의 체지방률은 베트남 출신이 다른 국가 출신의 대상자보다 많아 통계적으로 유의한 차이를 보였다.", "체질량지수가 표준이상인 경우는 30세 이상, 중국 출신, 거주기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다.", "허리와 엉덩이 둘레 비가 표준이상인 경우는 연령 30세 이상, 베트남 출신, 한국 거주 기간이 37개월 이상인 군이 다른 군에 비해 많았다.", "즉, 전체적으로 볼 때 30세 이상, 베트남 출신, 체류기간이 37개월 이상인 군의 비만도 지수가 다른 군에 비해 높은 것으로 나타나 이를 고려한 관리방안 모색이 필요하리라 사료된다.", "</p><p>본 연구는 B광역시에 거주하는 결혼이주여성이 조사의 대상이었기 때문에 대표성 확보의 제한으로 인한 결과 해석의 제한점이 있지만, 기존 연구의 대부분이 농어촌 지역 및 중소 도시 결혼이주여성의 정신, 심리건강을 조사한 반면 본 연구는 대도시 결혼이주여성을 대상으로 거의 연구된 바 없는 여성생식건강을 포함한 생식건강상태와 체성분 조성을 조사했다는데 의의가 있다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>1990년대 이후 한국 남성들이 아시아 여러 나라 또는 구소련 출신의 여성과 결혼하여 한국에서 사는 현상이 급증하여 2001년부터 5년간 국제결혼 이주여성은 연평균 \\( 43.9 \\% \\)로 증가하였고 2020년에는 국제결혼이 한국 사회 전체 결혼에서 차지하는 비율이 \\( 32 \\% \\)까지 증가할 것으로 전망하고 있다.", "</p><p>특히 출산율 최저 도시로 발표된 부산지역은 저출산, 고령화와 노동인구의 감소 등과 맞물려, 부산의 전체 결혼건수는 감소하는데 반해, 국제결혼은 증가 추세에 있다.", "이는 국제결혼을 통한 이주자와 그 출생아동 비율의 급속한 증가를 예측할 수 있으며, 이로 인한 건강문제의 발생이 어느 지역 보다 높을 수 있음을 의미한다.", "또한 간호현장에서 결혼이주여성을 대상자로 접하게 되는 빈도가 늘어남에 따라 이들의 건강상태 파악과 효율적인 간호 제공의 필요성이 부각되고 있다.", "</p><p>결혼이주 여성의 출신국은 최근 2-3년 사이에 중국, 일본, 필리핀, 베트남, 태국, 몽골, 우즈베키스탄, 러시아 등 점차 다양해지고 있어 언어적, 문화적 차이로 인한 효율적인 건강관리가 어려운데, 결혼이주여성의 약 \\( 20 \\% \\)가 인공임신중절을 택하고 있으며, 여성 질환, 임신기간과 산후조리기간의 건강 문제, 빈혈, 불임 등을 보고하고 있다.", "또한, 부인과 질환의 경우 대부분의 결혼이주여성이 부인과 검진을 받아본 경험이 없으며, 질병 상태임에도 불구하고 치료를 잘 받지 못하고 있어 앞으로 임신, 출산, 양육과 함께 가족건강을 책임 질 이들 결혼이주여성의 실질적인 건강상태를 파악하여 해결 방법을 모색해야 할 것이다.", "</p><p>이에 보건복지가족부에서는 결혼이주여성을 보건소 맞춤형방문건강관리사업 대상으로 포함시켜 정책적으로 체계적인 서비스를 제공하려고 노력하고 있으나 이들에 대한 실질적인 자료 부족으로 아직까지 구체적인 실무지침이나 이에 대한 대응방안을 마련하지 못하고 있는 실정이다.", "</p><p>우리나라의 결혼이주여성의 건강에 대한 선행연구를 살펴보면, 결혼이주여성의 사회문화적 적응과 국제결혼 가정의 문제를 주로 다루고 있을 뿐, 결혼이주자들의 건강상태를 파악하여 이에 대한 보건의료지원을 위한 대안 마련이 절실함에도 불구하고, 이에 관한 연구는 결혼이주여성의 스트레스, 우울 및 심리적 건강에 대한 연구와 건강상태에 불과하다.", "기존 결혼이주 여성의 건강상태에 관한 연구결과를 살펴보면 결혼이주여성의 연령이 20-30대로 임신중이거나 임신을 계획하고 있으며, 여성 질환 문제를 가지고 있으나 치료를 잘 받지 못하는 것으로 보고하면서 여성생식건강에 관한 후속연구를 제언한 바 있으나 실제 가임기에 있는 결혼이주여성의 생식건강에 관한 연구는 아직까지 거의 연구된 바 없다.", "</p><p>또한, 선행연구에서 결혼이주 여성 세 명 중 한명이 저체중이며, 가장 높은 이환율을 보이는 질환이 빈혈임을 감안할 때 이들의 영양 상태를 확인할 필요가 있다.", "체성분 조성 측정은 신체구성 성분의 함량과 분포를 정량적으로 측정하여 영양상태 평가 및 비만, 심장질환과 순환계 질환 평가 그리고 반복측정을 통한 질환의 진행 속도를 파악하기 위한 수단으로 이용된다.", "이에 본 연구는 국제결혼을 통한 결혼이주여성이 증가하고 있는 부산지역 결혼이주여성을 대상으로 생식건강상태와 체성분 조성을 파악하고자 한다.", "</p><p>본 연구의 목적은 결혼이주여성의 건강상태와 체성분 조성을 알아보기 위하여 결혼이주 여성의 일반적 특성, 생식건강상태와 체성분 조성, 결혼이주 여성의 일반적 특성에 따른 생식건강상태와 체성분 조성을 파악하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": 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5,404	<h1>요 약</h1><p>대장균 트립토판 합성효소의 \( \beta \)반응의 빠른 속도 반응에 일가 양이온의 영향을 D56N과 D56G 잔기치환체를 대상으로 조사하였다. 일가 양이온을 처리하였을 때 생성되는 중간반응 생성물의 생성과 분해 속도가 영향을 받았다. 56번 자리 잔기치환체도 야생형에 비해 반응의 중간산물의 생성과 분해에 있어 모두 느린 속도를 보여주고 있다. 이들 잔기 치환체에 미치는 일가 양이온의 영향 또한 달라졌다. 이 결과는 대장균의 효소에서도 56번 잔기가 이소조절에 관여하고 있고, 이 과정에서 일가 양이온들이 이소조절 리간드역할을 수행하는 것을 보여준다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>효소와 시약</h2><p>모든 시약은 순도가 높은 것(ultra pure)을 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.</p><h2>박테리아 균주 및 풀라스미드</h2><p>대장균 균주 RB797 (F' laci" proL8/arg Nal' Rif recA sup lacproⅫⅠ)는 야생종 또는 돌연변이 trpA 유전자와 정상적인 trpB 유전자를 포함한 플라스미드를 갖고 있다. 야생종과 D56E, D56G 그리고 D56N 돌연변이 트립토판 중합효소 \( \alpha\)소단위체의 trpA gene은 암피실린에 저항성을 보이는 \( \beta \)-lactamase 유전자를 플라스미드에 가지고 있다. trpA 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 ptactrpA는 단백질의 대량발현 과정에 사용하였다. trpA 유전자는 D-젖당에 의해 대량발현이 유도되는 tac 전사조절인자를 가지고 있다.</p><h2>단백질의 과량 발현 및 분리</h2><p>야생형 및 돌연변이 단백질들은 대장균 RB797에서 발현하고 분리하였다. 야생형 및 잔기치환 단백질들을 과량 발현시키고 분리한 방법은 이미 보고된 방법에 따랐다. 황산암모늄\( \left(\left(\mathrm{NH}_{4}\right)_{2} \mathrm{SO}_{4}\right) \) 침전법과 이온크로마토그래피 HPLC로 분리 하였다. 정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE을 실시하여 Coomassie Brilliant Blue R로 염색하여 확인하였다. 순수 정제된 야생형의 \( \alpha \)소단위체의 농도는 \( \mathrm{E}^{1 \%}{ }^{278 \mathrm{~nm}}\)=\(4.4 \), \( \beta \)소단위체의 경우 \( \mathrm{E}^{1 \%}{ }^{17 \mathrm{nnm}}\)=\(6.5 \) 를 사용하여 결정하였다. 잔기치환 단백질의 경우에는 야생형을 표준으로 microbiuret 방법을 사용하였다.</p><h2>빠른 \( \beta \)반응 속도 측정</h2><p>단백질 용액 \( (10 \mu \mathrm{M}) \)을 \( 40 \mathrm{mM} \) 세린 또는 \( 0.5 \mathrm{mM} \) 인돌린 용액을 stopped flow로 섞어주고 형광의 변화를 측정하였다. 사용된 용액은 모두 \( 50 \mathrm{mM} \) TEA buffer \( (\mathrm{pH} \7.8) \) 용액이었다. 일가 양이온의 영향은 \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}\), \(100 \mathrm{mM} \mathrm{~KCI}\) 또는 \(50 \mathrm{mM} \mathrm{~NH}{ }_{4} \mathrm{Cl} \) 을 양쪽 용액에 첨가하여 조사하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1><p>대장균 트립토판 합성효소의 \\( \\beta \\)반응의 빠른 속도 반응에 일가 양이온의 영향을 D56N과 D56G 잔기치환체를 대상으로 조사하였다.", "일가 양이온을 처리하였을 때 생성되는 중간반응 생성물의 생성과 분해 속도가 영향을 받았다.", "56번 자리 잔기치환체도 야생형에 비해 반응의 중간산물의 생성과 분해에 있어 모두 느린 속도를 보여주고 있다.", "이들 잔기 치환체에 미치는 일가 양이온의 영향 또한 달라졌다.", "이 결과는 대장균의 효소에서도 56번 잔기가 이소조절에 관여하고 있고, 이 과정에서 일가 양이온들이 이소조절 리간드역할을 수행하는 것을 보여준다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>효소와 시약</h2><p>모든 시약은 순도가 높은 것(ultra pure)을 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.", "</p><h2>박테리아 균주 및 풀라스미드</h2><p>대장균 균주 RB797 (F' laci\" proL8/arg Nal' Rif recA sup lacproⅫⅠ)는 야생종 또는 돌연변이 trpA 유전자와 정상적인 trpB 유전자를 포함한 플라스미드를 갖고 있다.", "야생종과 D56E, D56G 그리고 D56N 돌연변이 트립토판 중합효소 \\( \\alpha\\)소단위체의 trpA gene은 암피실린에 저항성을 보이는 \\( \\beta \\)-lactamase 유전자를 플라스미드에 가지고 있다.", "trpA 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 ptactrpA는 단백질의 대량발현 과정에 사용하였다.", "trpA 유전자는 D-젖당에 의해 대량발현이 유도되는 tac 전사조절인자를 가지고 있다.", "</p><h2>단백질의 과량 발현 및 분리</h2><p>야생형 및 돌연변이 단백질들은 대장균 RB797에서 발현하고 분리하였다.", "야생형 및 잔기치환 단백질들을 과량 발현시키고 분리한 방법은 이미 보고된 방법에 따랐다.", "황산암모늄\\( \\left(\\left(\\mathrm{NH}_{4}\\right)_{2} \\mathrm{SO}_{4}\\right) \\) 침전법과 이온크로마토그래피 HPLC로 분리 하였다.", "정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE을 실시하여 Coomassie Brilliant Blue R로 염색하여 확인하였다.", "순수 정제된 야생형의 \\( \\alpha \\)소단위체의 농도는 \\( \\mathrm{E}^{1 \\%}{ }^{278 \\mathrm{~nm}}\\)=\\(4.4 \\), \\( \\beta \\)소단위체의 경우 \\( \\mathrm{E}^{1 \\%}{ }^{17 \\mathrm{nnm}}\\)=\\(6.5 \\) 를 사용하여 결정하였다.", "잔기치환 단백질의 경우에는 야생형을 표준으로 microbiuret 방법을 사용하였다.", "</p><h2>빠른 \\( \\beta \\)반응 속도 측정</h2><p>단백질 용액 \\( (10 \\mu \\mathrm{M}) \\)을 \\( 40 \\mathrm{mM} \\) 세린 또는 \\( 0.5 \\mathrm{mM} \\) 인돌린 용액을 stopped flow로 섞어주고 형광의 변화를 측정하였다.", "사용된 용액은 모두 \\( 50 \\mathrm{mM} \\) TEA buffer \\( (\\mathrm{pH} \\7.8) \\) 용액이었다.", "일가 양이온의 영향은 \\( 100 \\mathrm{mM} \\mathrm{~NaCl}\\), \\(100 \\mathrm{mM} \\mathrm{~KCI}\\) 또는 \\(50 \\mathrm{mM} \\mathrm{~NH}{ }_{4} \\mathrm{Cl} \\) 을 양쪽 용액에 첨가하여 조사하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "트립토판 합성효소의 β반응속도에 미치는 일가양이온의 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-dbad3f08-b144-4b58-af2c-1f796b6ecc5a", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2004", "doc_author": [ "김일", "신혜자", "임운기", "김한도" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,405	<h1>결과 밎 고찰</h1><p>30종류의 천연산물을 용존산소 분석법으로 의하여 분석한 AUC를 기존의 합성 항산화제와 비교해보면 \( 0.02 \% \)의 BHA 및 \( 0.02 \% \)의 BHT는 각각 1656.80 및 1516.58이었으며, 천연산물의 AUC는 승마 (Cimicifugae rhizoma: 1045.24), 산수유 (Corni fructus: 984.50)등은 높은 항산화력을 보여 합성 항산화제를 대용 할 수 있을 것으로 사료되었으며, 상백피 (Mori cortex radicis: 723.28), 연자육 (Nelumbo nuclfera gaertner: 695.86) 및 당귀 (Angelicae gigantis radix: 532.32) 등은 \(0.02\%\)의 \( \beta \)-carotene(485.28) 보다 나은 항산화력을 나타내었다. 천연산물 중에서도 항산화력이 \( 0.02 \% \)의 \( \beta \)-carotene 보다 강한 제재들이 많아 합성 항산화제의 대용뿐만 아니라, ROS 제거를 위한 생체투여가 가능한 물질도 많음을 알 수 있었으며, 유산균 발효유, 식품보존제 및 항노화 제재 등의 다방면 으로 사용이 가능할 것으로 판단되며 구체적인 30 종류의 천연산물 AUC는 전보에 수록하였다.</p><h2>한 종류의 천연산물로부터 V. parahaemolyticus의 성장 제어</h2><p>V. parahaemolyticus 균주는 marine medium을 사용하였고, 백작약, 오가피, 황백, 상백피, 녹차, 오배자, 황련, 황기 등에 의하여 대조군 보다 성장이 저해되었으며, 이 천연산물들의 약리효과를 보면, 백작약은 해독 작용과 통증완화(상통)작용을 하며, 오가피는 사지불수, 간 및 신장의 기능을 도우는(자보간신) 작용을, 황백은 해독, 살충, 황달 및 여성의 대하를 치료하고, 상백피는 토하고 설사하며 위의 경련(퇴란토사)에 각각 효과가 있으며, 녹차는 열을 사하고 정신을 맑게하며(사열청신), 소변이 잘 나오게(이뇨)하는 작용이 있고, 오배자는 해독작용을, 황련은 장을 두텁게하고, 황달을 치료하며 오장의 냉열을 조절하는 기능(정장냉열)이 있으며, 황기 폐를 보하며(보폐), 여성의 대하 및 소변 (폐한)을 치료하는 것으로 알려져 있다 . 이 천연산물에 의한 V. parahaemolyticus 의 제어 정도를 아래의 Fig. 1에 나타내었다. Fig. 1 에서 V . parahaemolyticus는 황백 및 황련에 의하여 \( 100 \% \) 제어됨을 보이고 있으며, 녹차는 \( 90 \% \), 오배자는 \( 75 \% \), 백작약은 \( 52 \% \)의 제어 효과를 보여 여름철의 횟감에 자주 감염되는 V. parahaemolyticus에 인한 식중독을 줄 일수 있을 것으로 판단된다.</p><h2>두 종류의 천연산물 조합으로부터 V. parahaemolyticus의 성장 제어</h2><p>V. parahaemolyticus는 황백과 오미자, 오가피와 오미자, 오가피와 상백피 및 황금과 황기 등에 의하여 제어 되었으며, 그 정도를 Fig. 2에 나타내었다. Fig. 2로부터 황백과 오미자의 조합은 \( 68.7 \% \) 의 제어율을, 오가피와 오미자(상백피) 및 황금과 황기의 조합은 \( 53 \% \)의 제어율을 보였다.</p><h2>세 종류의 천연산물 조합으로부터 V. parahaemolyticus의 성장 제어</h2><p>Vibrio parahaemolyticus 균주는 황백과 오미자 및 오가피, 황백과 오미자 및 황금, 황백과 오미자 및 황기, 황백과 오미자 및 황련, 황백과 오미자 및 백작약, 황백과 오가피 및 황금, 황백과 오가피 및 황기, 황백과 오가피 및 황련, 황백과 오가피 및 백작약, 황백과 황금 및 황기, 황백과 황금 및 황련, 황백과 황금 및 백작약, 황백과 황기 및 황련, 황백과 황기 및 백작약, 황백과 황련 및 백작약, 오미자와 오가피 및 황금 등의 3차 조합에서 매우 잘 제어 되었으며, 그 제어 정도를 Fig. 3에 나타내었다. V. parahaemolyticus 균주는 황백, 오가피 등을 공통 조합으로 한 배합에서 모두 \( 95 \% \)의 제어율을 보여 식중독 제어에 높은 가능성을 보였다.</p> <h2>네 종류의 천연산물 조합으로부터 V. parahaemolyticus 의 성장 제어</h2><p>V. parahaemolyticus 균주는 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합, 오가피, 황기와 황백 및 백작약의 조합, 황기, 황백과 황련 및 황금의 조합, 오미자, 오가피와 황기 및 황련의 조합, 황백, 황련과 황금 및 백작약의 조합, 황기, 황백과 황련 및 백작약 등의 조합에 의하여 대조군보다 성장이 저해 되었으며, 이 균주의 제어 정도를 아래의 Fig. 4에 나타내었 다. Fig. 4에 의하면 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합, 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합이 \( 95 \% \) 의 저해율을 보 여 V. parahaemolyticus의 균주는 거의 완벽하게 제어될 수 있음을 보였다.</p><h2>V. parahaemolyticus의 성장 제어 효과률 갖는 4 종류 천연산물 조합의 항산화력</h2><p>V. parahaemolyticus의 성장을 현저하게 저해하는 4 종류의 천연산물의 조합으로 이루어 진 4 종류의 조합의 항산화력을 용존산소 분석법에 의하여 분석한 결과, 황기, 황백과 황련 및 백작약 조합의 AUC가 625.46으로써 가장 높았으며, 다음으로 오가피, 황기와 황백 및 백작약의 조합(609.68), 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합(583.01), 황기, 황백과 황련 및 황금의 조합(551.38)의 순서로 나타났다(Fig. 5). 이들의 항산화력은 대조군의 AUC인 116.61보다 5.4 배 정도 강한 것으로 나타났으며, 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합, 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합이 \( 95 \% \)의 저해율을 보여 항산화력이 큰 조합에서 제어가 잘 됨을 보였다.</p><h2>Hydroxyl radical 소거 활성</h2><p>V. parahaemolyticus 의 제어는 황기 및 황백을 공통 배합으로 하고 백작약이나 오가피가 배합된 조합에서 hydroxylradical의 소거능이 좋은 것으로 나타났으며, 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합(D)은 높은 희석배수에서도 \( 95 \% \) 이상의 소거율을 보였고, 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합(A) 및 오가피, 황기와 황백 및 백작약의 조합(B)에서 \( 90 \% \) 이상의 소거율을, 그리고 황기, 황백과 황련 및 황금의 조합(C)에서 \( 80 \% \) 이상의 소거율을 보였다(Fig. 6). 이 조합의 응용도에 따라 활성산소의 제거와 동시에 어패류의 식중독은 예방 가능할 것으로 사료된다.</p><h2>총 phenol함량 및 방향족의 측정</h2><p>V. parahaemolyticus의 성장을 촉진하는 4 종류의 각 조합에 따른 방향족의 함량 및 총 phenol 함량을 Table 1에 나타내었으며, Yeo 등의 논문에서 본보와 같은 방법으로 측정한 증제차, 볶음차, 오룡차 및 홍차의 수용성 추출물의 총 phenol 량은 각각 1.71, 1.54, 0.96 및 \( 0.89 \mu \mathrm{g} / 100 \mathrm{~g} \)으로 보고하였으며, 본 실험에 사용한 4종류 종류의 조합은 녹차 중의 증제차나 볶음차의 비발효차 보다 \( 28 \sim 39\)배 이상 높은 것으로 나타났으며, 반발효차인 오룡차 보다는 52배, 발효차인 홍차보다는 56배 정도 높은 것으로 나타났다. 이것은 4 종류의 조합을 구성하는 천연산물의 성분 내에는 녹차보다 다양한 종류의 phenols, phenolic acid 및 polyphenol 등을 가지고 있기 때문으로 사료된다.</p> <h1>서 론</h1><p>Vibrio paraheamolyticus는 해양 세균의 일종으로 \( 3 \sim 5 \% \)의 식염농도에서 잘 발육하고, \( 10 \% \)이상의 식염농도에서는 성장이 정지되는 세균으로, 그람 음성 무아포 간균으로 통성 혐기성이다. 발육최적 온도는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)부근으로 비병원성 Vibrio의 \( 25 \sim 30^{\circ} \mathrm{C} \)와는 극히 대조적이다. 이 균은 최적조건에서 약 10분에 1회의 속도로 분열하므로 대장균의 약 20분에 비해 증식속도가 빨라 2~3시간에 병을 일으킬 수 있는 균량에 도달할 수 있어 위험성을 내포하고 있다. 5~11월에 발생하는 식중독을 일으키는 대표적인 균으로서 연안의 해수, 연안 흙, 플랑크톤 등에 널리 분포되어 있고, 특히 육지로부터 오염되기 쉬운 해역에 많다. 따라서 오염된 해수로부터 침전물, 플랑크톤 등에 1차 감염을 일으키고, 굴, 새우, 바닷가제, 게, 대합 등의 해산물의 감염과 이 들의 교차 오염으로 인하여 생선회, 초밥, 도시락, 및 야채 샐러드 등의 복합 식품의 오염, 그리고 어패류로부터 조리 기구, 손가락, 도마, 행주, 식칼 등을 거쳐 간접적으로 다른 식품들의 2차 오염원이 되기도 하며, 위장염, 창상 감염을 일으켜 설사, 복부 경련 및 욕지기의 증상을 나타내고, 일본에서는 심부정맥에 의해 사망한 예도 있다. 이 균은 여름철에 염분이 적절히 함유된 식품 중에서 급속하게 증식되므로, 이러한 장염 비브리오균 (V. paraheamolyticus)을 제어 할 수 있는 제재를 합성 항생물질이 아닌 천연산물로부터 개발하여 장염 및 패혈증을 예방할 수 있다면 어민들의 소득을 향상 시킬 수 있는 방법이 될 수 있을 것이다. 이러한 제재의 개발에 이용되는 천연산물이 강한 항산화력을 가지면 생체에서 발생되는 alcoxyl radical \((\mathrm{RO •}\)), singlet oxygen \( \left({ }^{1} \mathrm{O}_{2}\right) \), peroxynitrite anion \((\mathrm{ONOO})\), peroxyl radical \( (\mathrm{ROO} \cdot) \), nitric oxide ( \( \mathrm{NO}) \), semiquinone radical, hydrogen peroxide \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \), superoxide anion \( \left(\mathrm{O}_{2}{ }^{-}\right) \), hypochlorous acid \((\mathrm{HOCl})\) 등의 ROS(reactive oxygen species) 을 제거할 수 있으므로 세포의 괴사에 의한 기능의 저하 및 질병을 예방 할 수 있어 다기능성의 제재의 개발이 가능 할 것이다. 뿐만 아니라 이 균주는 생선, 패류 및 연체류 등의 대부분 해산물에 감염되어 더운 하절기에 회 등의 깔끔한 맛을 원하는 수요자에게는 큰 위험으로 인식 되어 있고, 공급자 또한 심각한 재정적 위기에 봉착되어 수요자, 공급자 모두가 피해를 입고 있는 것이 현재의 실정이며, 이 균주들의 제어가 가능하면 소비자에게는 맛을, 공급자에게는 시간적, 경제적 여유를 가질 수 있을 것이다. 균주들을 제어함에 있어 클로람페니콜, 테트라사이클린, 아미노 글리코시드, 3세대 세팔로스포린, 아즈트레오남, 이미페넴, 및 퀴놀론계 항생제 등의 항생물질이나 벤조익산, 모노라우린, 모노카프린 및 프로필히드록시벤족인산 등의 화학적 물질을 사용하지 않음으로써 대외적인 신뢰도와 수출에 있어서도 큰 역할을 할 것으로 판단된다.</p> <h1>요 약</h1><p>V. parahaemolyticus의 성장은 선택되어진 천연산물의 한 종류 단독으로서도 저해되었으며, 또한 이 들의 조합에 의해서도 특징적으로 성장이 저해되었으며, 이것은 항산화력이 강한 천연산물들을 free radical의 제거와 동시에 V. parahaemolyticus의 성장 억제 물질로 사용할 수 있고 이를 이용하여 기능성 항산화 제재의 제조가 가능하리라 사료된다. V. parahaemolyticus 는 한 종류의 천연산물 황백 및 황련에 의하여 \( 100 \% \) 제어됨을 보이고 있으며, 녹차는 \( 90 \% \), 오배자는 \( 75 \% \), 백작약은 \( 52 \% \)의 제어 효과를 보여 이 세균의 대사를 제어하는 성분이 있거나, 세포막의 수송 환경의 변화에 의한 물질의 전달이 제어되는 것으로 추정된다. 그 리고 두 종류 천연산물의 조합인 황백과 오미자의 조합은 \( 68.7 \% \)의 제어율을, 오가피와 오미자(상백피) 및 황금과 황기의 조합은 \( 53 \% \)의 제어 효과를 보였다. 세 종류의 천연산물 조합인 황백과 오미자 및 오가피, 황백과 오가피 및 황금, 오미자와 오가피 및 황금 등의 황백, 오가피 등을 공통 조합으로 한 배합에서 노두 \( 95 \% \)의 제어율을 보였다. 네 종류 천연산물의 조합, 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합, 오가피, 황기와 황백 및 백작약의 조합, 황기, 황백과 황련 및 황금의 조합, 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합 등에 의하여 성장이 \( 95 \% \)의 저해율을 보였다. 이 조합들의 항산화력은 황기, 황백과 황련 및 백작약 조합의 AUC가 625.46으로써 가장 높았으며, 대조군보다 5.4 배 정도 강한 것으로 나타났고,항산화력이 큰 조합에서 제어가 잘 됨을 보였다. hydroxyl radical의 소거활성은 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합에서 \(95\%\) 이상의 소거율을 보였다. 또한, 방향족의 함량 및 총 phenol 함량은 가공된 녹차들보다 30배 이상 높은 것으로 나타났다. 이것은 항산화력이 강한 천연산물들을 이용하여 free radical의 제거와 동시에 V. parahaemolyticus의 성장 저해 물질로 사용할 수 있으며, 생체의 기능을 향상시킬 수 있는 기능성 제재로의 응용 가능성을 보였다.</p>	생명과학	[ "<h1>결과 밎 고찰</h1><p>30종류의 천연산물을 용존산소 분석법으로 의하여 분석한 AUC를 기존의 합성 항산화제와 비교해보면 \\( 0.02 \\% \\)의 BHA 및 \\( 0.02 \\% \\)의 BHT는 각각 1656.80 및 1516.58이었으며, 천연산물의 AUC는 승마 (Cimicifugae rhizoma: 1045.24), 산수유 (Corni fructus: 984.50)등은 높은 항산화력을 보여 합성 항산화제를 대용 할 수 있을 것으로 사료되었으며, 상백피 (Mori cortex radicis: 723.28), 연자육 (Nelumbo nuclfera gaertner: 695.86) 및 당귀 (Angelicae gigantis radix: 532.32) 등은 \\(0.02\\%\\)의 \\( \\beta \\)-carotene(485.28) 보다 나은 항산화력을 나타내었다.", "천연산물 중에서도 항산화력이 \\( 0.02 \\% \\)의 \\( \\beta \\)-carotene 보다 강한 제재들이 많아 합성 항산화제의 대용뿐만 아니라, ROS 제거를 위한 생체투여가 가능한 물질도 많음을 알 수 있었으며, 유산균 발효유, 식품보존제 및 항노화 제재 등의 다방면 으로 사용이 가능할 것으로 판단되며 구체적인 30 종류의 천연산물 AUC는 전보에 수록하였다.", "</p><h2>한 종류의 천연산물로부터 V.", "parahaemolyticus의 성장 제어</h2><p>V.", "parahaemolyticus 균주는 marine medium을 사용하였고, 백작약, 오가피, 황백, 상백피, 녹차, 오배자, 황련, 황기 등에 의하여 대조군 보다 성장이 저해되었으며, 이 천연산물들의 약리효과를 보면, 백작약은 해독 작용과 통증완화(상통)작용을 하며, 오가피는 사지불수, 간 및 신장의 기능을 도우는(자보간신) 작용을, 황백은 해독, 살충, 황달 및 여성의 대하를 치료하고, 상백피는 토하고 설사하며 위의 경련(퇴란토사)에 각각 효과가 있으며, 녹차는 열을 사하고 정신을 맑게하며(사열청신), 소변이 잘 나오게(이뇨)하는 작용이 있고, 오배자는 해독작용을, 황련은 장을 두텁게하고, 황달을 치료하며 오장의 냉열을 조절하는 기능(정장냉열)이 있으며, 황기 폐를 보하며(보폐), 여성의 대하 및 소변 (폐한)을 치료하는 것으로 알려져 있다 .", "이 천연산물에 의한 V.", "parahaemolyticus 의 제어 정도를 아래의 Fig.", "1에 나타내었다.", "Fig.", "1 에서 V .", "parahaemolyticus는 황백 및 황련에 의하여 \\( 100 \\% \\) 제어됨을 보이고 있으며, 녹차는 \\( 90 \\% \\), 오배자는 \\( 75 \\% \\), 백작약은 \\( 52 \\% \\)의 제어 효과를 보여 여름철의 횟감에 자주 감염되는 V.", "parahaemolyticus에 인한 식중독을 줄 일수 있을 것으로 판단된다.", "</p><h2>두 종류의 천연산물 조합으로부터 V.", "parahaemolyticus의 성장 제어</h2><p>V.", "parahaemolyticus는 황백과 오미자, 오가피와 오미자, 오가피와 상백피 및 황금과 황기 등에 의하여 제어 되었으며, 그 정도를 Fig.", "2에 나타내었다.", "Fig.", "2로부터 황백과 오미자의 조합은 \\( 68.7 \\% \\) 의 제어율을, 오가피와 오미자(상백피) 및 황금과 황기의 조합은 \\( 53 \\% \\)의 제어율을 보였다.", "</p><h2>세 종류의 천연산물 조합으로부터 V.", "parahaemolyticus의 성장 제어</h2><p>Vibrio parahaemolyticus 균주는 황백과 오미자 및 오가피, 황백과 오미자 및 황금, 황백과 오미자 및 황기, 황백과 오미자 및 황련, 황백과 오미자 및 백작약, 황백과 오가피 및 황금, 황백과 오가피 및 황기, 황백과 오가피 및 황련, 황백과 오가피 및 백작약, 황백과 황금 및 황기, 황백과 황금 및 황련, 황백과 황금 및 백작약, 황백과 황기 및 황련, 황백과 황기 및 백작약, 황백과 황련 및 백작약, 오미자와 오가피 및 황금 등의 3차 조합에서 매우 잘 제어 되었으며, 그 제어 정도를 Fig.", "3에 나타내었다.", "V. parahaemolyticus 균주는 황백, 오가피 등을 공통 조합으로 한 배합에서 모두 \\( 95 \\% \\)의 제어율을 보여 식중독 제어에 높은 가능성을 보였다.", "</p> <h2>네 종류의 천연산물 조합으로부터 V.", "parahaemolyticus 의 성장 제어</h2><p>V.", "parahaemolyticus 균주는 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합, 오가피, 황기와 황백 및 백작약의 조합, 황기, 황백과 황련 및 황금의 조합, 오미자, 오가피와 황기 및 황련의 조합, 황백, 황련과 황금 및 백작약의 조합, 황기, 황백과 황련 및 백작약 등의 조합에 의하여 대조군보다 성장이 저해 되었으며, 이 균주의 제어 정도를 아래의 Fig.", "4에 나타내었 다.", "Fig.", "4에 의하면 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합, 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합이 \\( 95 \\% \\) 의 저해율을 보 여 V.", "parahaemolyticus의 균주는 거의 완벽하게 제어될 수 있음을 보였다.", "</p><h2>V.", "parahaemolyticus의 성장 제어 효과률 갖는 4 종류 천연산물 조합의 항산화력</h2><p>V.", "parahaemolyticus의 성장을 현저하게 저해하는 4 종류의 천연산물의 조합으로 이루어 진 4 종류의 조합의 항산화력을 용존산소 분석법에 의하여 분석한 결과, 황기, 황백과 황련 및 백작약 조합의 AUC가 625.46으로써 가장 높았으며, 다음으로 오가피, 황기와 황백 및 백작약의 조합(609.68), 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합(583.01), 황기, 황백과 황련 및 황금의 조합(551.38)의 순서로 나타났다", "(Fig. 5).", "이들의 항산화력은 대조군의 AUC인 116.61보다 5.4 배 정도 강한 것으로 나타났으며, 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합, 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합이 \\( 95 \\% \\)의 저해율을 보여 항산화력이 큰 조합에서 제어가 잘 됨을 보였다.", "</p><h2>Hydroxyl radical 소거 활성</h2><p>V.", "parahaemolyticus 의 제어는 황기 및 황백을 공통 배합으로 하고 백작약이나 오가피가 배합된 조합에서 hydroxylradical의 소거능이 좋은 것으로 나타났으며, 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합(D)은 높은 희석배수에서도 \\( 95 \\% \\) 이상의 소거율을 보였고, 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합(A) 및 오가피, 황기와 황백 및 백작약의 조합(B)에서 \\( 90 \\% \\) 이상의 소거율을, 그리고 황기, 황백과 황련 및 황금의 조합(C)에서 \\( 80 \\% \\) 이상의 소거율을 보였다", "(Fig. 6).", "이 조합의 응용도에 따라 활성산소의 제거와 동시에 어패류의 식중독은 예방 가능할 것으로 사료된다.", "</p><h2>총 phenol함량 및 방향족의 측정</h2><p>V.", "parahaemolyticus의 성장을 촉진하는 4 종류의 각 조합에 따른 방향족의 함량 및 총 phenol 함량을 Table 1에 나타내었으며, Yeo 등의 논문에서 본보와 같은 방법으로 측정한 증제차, 볶음차, 오룡차 및 홍차의 수용성 추출물의 총 phenol 량은 각각 1.71, 1.54, 0.96 및 \\( 0.89 \\mu \\mathrm{g} / 100 \\mathrm{~g} \\)으로 보고하였으며, 본 실험에 사용한 4종류 종류의 조합은 녹차 중의 증제차나 볶음차의 비발효차 보다 \\( 28 \\sim 39\\)배 이상 높은 것으로 나타났으며, 반발효차인 오룡차 보다는 52배, 발효차인 홍차보다는 56배 정도 높은 것으로 나타났다.", "이것은 4 종류의 조합을 구성하는 천연산물의 성분 내에는 녹차보다 다양한 종류의 phenols, phenolic acid 및 polyphenol 등을 가지고 있기 때문으로 사료된다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>Vibrio paraheamolyticus는 해양 세균의 일종으로 \\( 3 \\sim 5 \\% \\)의 식염농도에서 잘 발육하고, \\( 10 \\% \\)이상의 식염농도에서는 성장이 정지되는 세균으로, 그람 음성 무아포 간균으로 통성 혐기성이다.", "발육최적 온도는 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)부근으로 비병원성 Vibrio의 \\( 25 \\sim 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)와는 극히 대조적이다.", "이 균은 최적조건에서 약 10분에 1회의 속도로 분열하므로 대장균의 약 20분에 비해 증식속도가 빨라 2~3시간에 병을 일으킬 수 있는 균량에 도달할 수 있어 위험성을 내포하고 있다.", "5~11월에 발생하는 식중독을 일으키는 대표적인 균으로서 연안의 해수, 연안 흙, 플랑크톤 등에 널리 분포되어 있고, 특히 육지로부터 오염되기 쉬운 해역에 많다.", "따라서 오염된 해수로부터 침전물, 플랑크톤 등에 1차 감염을 일으키고, 굴, 새우, 바닷가제, 게, 대합 등의 해산물의 감염과 이 들의 교차 오염으로 인하여 생선회, 초밥, 도시락, 및 야채 샐러드 등의 복합 식품의 오염, 그리고 어패류로부터 조리 기구, 손가락, 도마, 행주, 식칼 등을 거쳐 간접적으로 다른 식품들의 2차 오염원이 되기도 하며, 위장염, 창상 감염을 일으켜 설사, 복부 경련 및 욕지기의 증상을 나타내고, 일본에서는 심부정맥에 의해 사망한 예도 있다.", "이 균은 여름철에 염분이 적절히 함유된 식품 중에서 급속하게 증식되므로, 이러한 장염 비브리오균 (V. paraheamolyticus)을 제어 할 수 있는 제재를 합성 항생물질이 아닌 천연산물로부터 개발하여 장염 및 패혈증을 예방할 수 있다면 어민들의 소득을 향상 시킬 수 있는 방법이 될 수 있을 것이다.", "이러한 제재의 개발에 이용되는 천연산물이 강한 항산화력을 가지면 생체에서 발생되는 alcoxyl radical \\((\\mathrm{RO •}\\)), singlet oxygen \\( \\left({ }^{1} \\mathrm{O}_{2}\\right) \\), peroxynitrite anion \\((\\mathrm{ONOO})\\), peroxyl radical \\( (\\mathrm{ROO} \\cdot) \\), nitric oxide ( \\( \\mathrm{NO}) \\), semiquinone radical, hydrogen peroxide \\( \\left(\\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}_{2}\\right) \\), superoxide anion \\( \\left(\\mathrm{O}_{2}{ }^{-}\\right) \\), hypochlorous acid \\((\\mathrm{HOCl})\\) 등의 ROS(reactive oxygen species) 을 제거할 수 있으므로 세포의 괴사에 의한 기능의 저하 및 질병을 예방 할 수 있어 다기능성의 제재의 개발이 가능 할 것이다.", "뿐만 아니라 이 균주는 생선, 패류 및 연체류 등의 대부분 해산물에 감염되어 더운 하절기에 회 등의 깔끔한 맛을 원하는 수요자에게는 큰 위험으로 인식 되어 있고, 공급자 또한 심각한 재정적 위기에 봉착되어 수요자, 공급자 모두가 피해를 입고 있는 것이 현재의 실정이며, 이 균주들의 제어가 가능하면 소비자에게는 맛을, 공급자에게는 시간적, 경제적 여유를 가질 수 있을 것이다.", "균주들을 제어함에 있어 클로람페니콜, 테트라사이클린, 아미노 글리코시드, 3세대 세팔로스포린, 아즈트레오남, 이미페넴, 및 퀴놀론계 항생제 등의 항생물질이나 벤조익산, 모노라우린, 모노카프린 및 프로필히드록시벤족인산 등의 화학적 물질을 사용하지 않음으로써 대외적인 신뢰도와 수출에 있어서도 큰 역할을 할 것으로 판단된다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>V.", "parahaemolyticus의 성장은 선택되어진 천연산물의 한 종류 단독으로서도 저해되었으며, 또한 이 들의 조합에 의해서도 특징적으로 성장이 저해되었으며, 이것은 항산화력이 강한 천연산물들을 free radical의 제거와 동시에 V.", "parahaemolyticus의 성장 억제 물질로 사용할 수 있고 이를 이용하여 기능성 항산화 제재의 제조가 가능하리라 사료된다.", "V. parahaemolyticus 는 한 종류의 천연산물 황백 및 황련에 의하여 \\( 100 \\% \\) 제어됨을 보이고 있으며, 녹차는 \\( 90 \\% \\), 오배자는 \\( 75 \\% \\), 백작약은 \\( 52 \\% \\)의 제어 효과를 보여 이 세균의 대사를 제어하는 성분이 있거나, 세포막의 수송 환경의 변화에 의한 물질의 전달이 제어되는 것으로 추정된다.", "그 리고 두 종류 천연산물의 조합인 황백과 오미자의 조합은 \\( 68.7 \\% \\)의 제어율을, 오가피와 오미자(상백피) 및 황금과 황기의 조합은 \\( 53 \\% \\)의 제어 효과를 보였다.", "세 종류의 천연산물 조합인 황백과 오미자 및 오가피, 황백과 오가피 및 황금, 오미자와 오가피 및 황금 등의 황백, 오가피 등을 공통 조합으로 한 배합에서 노두 \\( 95 \\% \\)의 제어율을 보였다.", "네 종류 천연산물의 조합, 오가피, 황기와 황백 및 황련의 조합, 오가피, 황기와 황백 및 백작약의 조합, 황기, 황백과 황련 및 황금의 조합, 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합 등에 의하여 성장이 \\( 95 \\% \\)의 저해율을 보였다.", "이 조합들의 항산화력은 황기, 황백과 황련 및 백작약 조합의 AUC가 625.46으로써 가장 높았으며, 대조군보다 5.4 배 정도 강한 것으로 나타났고,항산화력이 큰 조합에서 제어가 잘 됨을 보였다.", "hydroxyl radical의 소거활성은 황기, 황백과 황련 및 백작약의 조합에서 \\(95\\%\\) 이상의 소거율을 보였다.", "또한, 방향족의 함량 및 총 phenol 함량은 가공된 녹차들보다 30배 이상 높은 것으로 나타났다.", "이것은 항산화력이 강한 천연산물들을 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5,406	<h1>고 찰</h1><p>본 연구에서 우리는 에탄올의 세포증식 억제 효과가 정상</p><p>세포와 암세포에서 조사하여 차이가 있는 것을 알 수 있었다. 특히 ras 유전자 변이에 의한 발암원성에 의한 세포증식에는 에탄올이 세포증식이나 DNA합성을 방해하지 못 하는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 에탄올의 세포증식억제 효과의 작용점이 Ras단백질의 upstream이거나 독립적인 경로를 통하는것으로 알 수 있다. 본 연구에서 사용한 세포 미세주사기술은 세포내 신호전달분자가 특정 세포 현상이나 호르몬과 같은 신호유발 인자에 관여하는지 여부를 직접적으로 보여주는 기술이다. 세포미세주사기술을 통해 활성화된 발암원성 Ras\( ^{V12} \) 단백질이 에탄올의 존재하에서도 DNA 합성을 정상적으로 유도함을 알 수 있는데, 이 결과는 발암원성 Ras\( ^{V12} \) 단백질의 작용점이 에탄올에 의한 억제효과를 나타내는 작용점과 먼 곳에 존재하는 것으로 결론지을 수가 있다.</p><p>ras 암유전자가 관여하는 세포증식 신호전달경로는 잘 알려져 있으나, 에탄올의 carcinogen 작용과의 관계는 아직 완전히 규명되지 않았다. 최근 에탄올의 장기 투여에의해 간암조직에서 H-ras의 변이를, 췌장암에서는 K-ras의 변이를 유도하는 것이 보고되었다. 즉 에탄올에 의한 직접적인 ras 유전자의 변이를 통해 암발생을 유도할 뿐 아니라, 본 연구결과에의하면 변이된 ras 유전자에 의한 세포증식도 억제하지 못하는 것을 알 수 있었다. 최근 Chavez 등은 에탄올에 의해 간암 발생이 야기되며 정상적인 간세포의 증식은 억제하는 것이 쥐의 실험에서 보고하였다. 즉 정상세포의 세포증식은 에탄올에 의해 억제되었지만, 발암원성 ras 에 의해 형질전환 세포는 에탄올에 대해 영향을 받지 않았다. 그러므로 동일 조직에서 형질전환된 암세포는 에탄올 존재 여부와는 상관없이 지속적으로 세포증식이 진행되나, 그와는 반대로 정상세포는 세포증식과정을 멈출 것이다. 따라서 에탄올에 의한 세포증 억제 효과는 정상세포에서는 작용하나 Ras 또는 기타 암유전자의 변이에 의해 유도된 세포증식은 에탄올에 의해 세포증식이 영향을 받지 않으므로 암세포의 증식을 간접적으로 도와주는 결과를 초래하는 것으로 추정할 수 있다.</p><p>활성산소가 암세포의 증식을 유도하거나 암세포의 유지에 중요한 것은 잘 알려져 있다. 또한 활성산소는 어떤 조건이나 세포에서는 세포 노쇠와 세포사멸을 유도하는 것도 잘 알려져있다. 이 상반된 활성산소의 영향의 기전은 생성되는 활성산소의 양이나 종류에 따라 다르며 세포 종류나 환경의 차이 등에 의해서도 반응할 것으로 추정된다. Ras에 의한 암세포에서 활성산소의 생성능이나 역할은 세포 종류와 Ras isoform에따라 상반된 결과가 보고 되어 있다. 본 실험에서는 Ras에 의해 형질전환된 Rat-2 세포의 경우에서는 활성산소 생성이 증가된 것이 관찰되었다. 그러나 대조군 세포에서 관찰된 에탄올에 의한 활성산소의 생성이 이 Ras 형질전환세포에서는 관찰되지 않았다. 따라서 Ras로 형질전환된 세포의 경우에는 세포내 redox state의 변화가 야기되어 이미 세포가 높은 활성산소에 적응되어 증식되고 있기 때문에 에탄올에 의한 세포증식 억제 효과가 작용하지 않는 것으로 사료되나, 정확한 기전을 밝히기 위해서는 앞으로 추가적인 실험이 필요한 것으로 생각된다.</p><p>정상적인 세포증식은 EGF, IGF-1, 인슐린등과 같은 다양한 성장인자들이 유도하며 이러한 성장인자들의 세포증식 효과를 에탄올이 억제하는 것이 알려져 있다. 에탄올에 의해 간세포의 인슐린신호와 EGF신호 및 IGF-1신호에 의한 세포증식이 억제 되었고, 또한 본 연구팀은 인슐린에 의한 DNA 합성 유도를 에탄올이 억제하였고, 이는 에탄올에 의한 PI3-kinase 활성 억제와 관련이 있는 것을 보고하였다. 그러나 본 연구결과에서는 발암원성 ras 유전자에 의한 세포증식은 에탄올이 억제하지 못하므로 에탄올에 의한 세포증식 억제 효과의 작용점은 ras 단백질 위에 존재하는 PI3-kinase의 작용을 억제하거나 또는 활성산소의 형성을 통해 발생하는 것으로 사료된다.</p> <h1>서 론</h1><p>WHO의 보고에 따르면 인간암발생의 \( 3.6 \% \)가 에탄올에 기인한다고 발표하였고, 1988년부터 International Agency for Research on Cancer (IARC)는 에탄올을 carcinogen으로 분류하였고, 그 뒤 동물에서도 carcinogen실험 결과를 보고하였다. 에탄올에 의해 주로 발생하는 암으로는 구강암, 인후암, 후두암, 간암, 대장암, 유방암 등이 있는 것으로 알려져 있다. 대장암과 유방암은 이전에 알려진 것보다 훨씬 높은 빈도로 에탄올 섭취와 연관이 있는 것으로 밝혀졌다.</p><p>에탄올에 연관된 암 발생의 genetic susceptibility연구에서 에탄올 대사, folate 대사, DNA repair에 관련된 유전자들의 유전적 다양성이 알려져 있다. 그 중 alcohol dehydrogen-ase와 aldehyde dehydrogenase의 유전적 다형성이 일부 암 발생에 관련이 있는 것으로 보고되었으나, 에탄올의 대사에 관련한 CYP2E1 등은 관련이 없는 것으로 알려져 있다.</p><p>에탄올에 의한 암발생의 분자기전은 다양하다. 최근 에탄올의 장기 투여에 의해 ras유전자의 변이가 발생하는 것이 보고되었다. ras 유전자는 세포증식, 세포분화, 세포 골격변화를 포함하는 다양한 세포 활동에 관여한다. 이러한 ras의 과발현이나 변이는 여러 종류의 인간 암에서 \( 30 \% \)의 빈도로 발견된다. 특히 ras 암유전자의 12번, 13번, 61번 아미노산 위치에서의 변이가 잘 발견된다. 발암원성 H-ras 암유전자에 의해 형질전환된 쥐에 에탄올을 투여했을 시에 표준 group에 비해 높은 빈도의 종양이 발생함을 보고했다. 따라서 에탄올이 발암원성 ras 유전자에 의한 종양 발생에 중요한 역할을 할 수 있다.</p><p>에탄올에 의한 세포증식억제 작용은 췌장 랑게르한스 세포 증식, 골수세포 증식 및 분화, T-cell 증식에서 보여지고, Smooth muscle cell 분화, 골세포 분화, 신경조직 형성와 같은 정상적인 세포작용도 억제하는 것이 보고되었다. 또한 에탄올은 간절제술이나 간의 화학적 손상 후에 회복을 방해하는 것으로 알려져 있다. 이러한 에탄올의 세포증식이나 세포 회복에 대한 억제효과는 잘 알려져 있으나, 암세포의 세포증식억제 효과에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서 에탄올의 여러 조직별 정상세포와 암세포의 세포증식억제 효과를 비교하였고, 발암원성 \( \mathrm{H}-\mathrm{ras}^{\mathrm{V} 12} \)와 발암원성 \( \mathrm{K}-\mathrm{ras}^{\mathrm{V} 12} \)에 의해 형질 전환된 세포에서 세포증식과 DNA 합성을 관찰함으로써 에탄올에 의한 세포증식억제효과가 발암원성ras 유전자에 의한 암발생에는 어떤 영향을 미치는지를 조사하였다. 이번 실험결과에서 우리는 에탄올에 의해 세포증식 억제효과가 일반적인 정상세포에서는 작동하나 암세포 특히 ras 유전자 변이에 의한 세포의 증식에는 영향이 없음을 알 수 있었다.</p> <h1>초록 : 정상세포와 암세포의 증식 억제에 대한 에탄올의 영향</h1><p>에탄올은 사람에 대한 발암물질로 잘 알려져 있다. 또한 여러 조직이나 세포에서의 에탄올에 의한 세포증식 억제효과도 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 여러 암세포에서 에탄올에 의한 세포증식억제 효과를 조사하였는데 특히 발암원성 ras로 형질전환되거나 미세주입된 세포에서의 영향을 조사하였다. 에탄올은 여러 정상세포들의 증식을 억제하였다. 반면에 여러 암세포나 발암원성 Ras에 의한 세포증식은 억제하지 못 하였다. 또한 발암원성 단백질의 세포내 미세주사에 의한 DNA합성 유도도 에탄올에 의해 억제 되지 않았다. 이러한 에탄올의 세포증식 억제 효과근 N Eacetylcysteine이나 4-methylpyrazole과 같은 항산화제에 의해 제거되었다. 이러한 실험 결과근 에탄올에 의한 세포증식억제 효과는 Ras단백질의 upstream에 있거나 또는 Ras와 독립적으로 작용하며, 활성산소 형성과 밀접한 관계가 있다는 것을 알려준다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>세포주와 재료</h2><p>정상세포주와 암세포주들은 각 조직별로 American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA)에서 구입하였고, ATCC에서 권하는 방법대로 각 배지에 배양하였다. H-ras\( ^{V 12} \)-transformed Rat-2세포와 K-ras\( { }^{V 12} \)-transformed Rat-2세포 및 대조군 Rat-2 세포는 Dr. J.K Pai (Merck/Schering-Plough, Whitehouse Station, NJ)로부터 제공받았고, 이는 \( 10 \% \) fetal bovine serum이 포함된 DMEM 배지에서 유지하였다. Bromodeoxyuridine (BrdU)과 mouse anti-BrdU antibody는 GE Healthcare Life Science (Piscataway, NJ)의 제품을 사용하 였고, FITC-conjugated anti-rat IgG antibody는 Jackson Lab (Bar Harbor, ME)에서 제공받았다. 다른 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (Germany)에서 구입하였다.</p><h2>에탄올에 의한 세포증식 효과 측정</h2><p>각 세포들은 여러 농도의 에탄올에서 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였고, 에탄올을 함유한 배지는 매일 교환하였다. 에탄올의 증발을 최소화하기 위해서 parafilm으로 밀봉하였고, 이러한 처리는 원래의 세포증식이나 세포 morphology를 방해하지 않았다. 에타올을 처리한 세포는 trypsin으로 분리하고, 세포수는 tryphan blue staining을 통해 세포 숫자를 계산하였다. 항산화제인 N-acetylcysteine \( (1 \mathrm{mM}) \), 4-methylpyrazole \( (1 \) \( \mathrm{mM}) \), vitamin E \((25 \mathrm{mM}) \), trolox \( (0.2 \mathrm{mM}) \)는 에탄올 처리 1시간 전에 처리하였고, 그 후에 에탄올 \( (100 \mathrm{mM}) \)을 처리하고 세포를 배양하였다. 에탄올에 의한 세포증식억제효과에 대한 항산화제의 효과를 알아보는 실험은 위와 같은 방법으로 진행하였다.</p><h2>세포미세주사 및 BrdU 면역형광법을 이용한 DNA 합성 실험</h2><p>세포미세주사법을 이용하여 발암원성 Ras에 의한 DNA 합성에 대한 에탄올의영향을 조사하기 위해 oncogenic H-Ras\( ^{V12} \)를 정상유방 세포주인 MCF-12A세포에 주사하여 DNA합성은 아래와 같이 측정하였다. 요약하면, MCF-12A세포를 coverslip 위에서 배양한 후, serum-free DMEM으로 배양하여 세포주기를 정지시켰다. 이 세포를 미세주사하기 에탄올(100 \( \mathrm{mM}) \)으로 4시간동안 처리하였다. 그 후에 발암원성 H-Ras\( ^{V12} \) protein \( (2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)를 rat IgG \( (4 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)과 함께 MCF-12A세포에 미세주사하였다. MCF-12A 세포를 키운 3개의 coverslip에 coverslip당 평균 200개의 세포에 미세주사하였고, 이를 두 번 반복하였다. 따라서 미세주사 결과는 평균 1,200개의 세포에서 나온 결과이다. 미세주사한 세포의 생존율은 \( 90 \% \)이상이 었다. 미세주사된 세포는 BrdU를 세포 배지에 투입하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 동안 배양하고, 이를 \( 90 \% \)에탄올로 세포를 고정하였다. 미세주사된 세포는 anti-BrdU antibody로 면역염색하고, 그 후에 TRITC-conjugated anti-mouse igG antibody로 처리되었다. 미세주사된 세포를 찾기위해 세포에 같이 주사된 rat IgG를 FITC-labeled anti-rat IgG antibody로 염색하였다. 미세주사된 세포는 세포질의 FITC 염색으로 확인되고, DNA 합성은 핵의 TRITC 염색으로 확인되며, 에탄올이 발암원성 Ras에 의한 DNA 합성 유도에 대한 영향을 형광현미경으로 그 결과를 조사하였다.</p><h2>세포내 활성산소의 측정</h2><p>세포내 활성산소양의 측정은 2,7-dichlorohydrofluerescence \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{DCFDA}\right) \)가 형광을 나타내는 2,7-dichlorofluorescein (DCF)로 산화되는 측정법에 의해 조사하였다 . \( 100 \% \) 에탄올에 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCFDA} \) stock 용액 \( (12.5 \mathrm{mM}) \) 을 만들어 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관 하였고, \( 25 \mu \mathrm{M} \)의 working 용액을 사용하였다. DCF의 형광광도는 형광마이크로 리더(Bio-Tek Instruments, Winooki, VT, USA)를 사용하여 excitation 파장은 \( 485 \mathrm{~nm} \), emission 파장은 \( 530 \mathrm{~nm} \) 에서 측정하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험에서 얻어진 결과치는 ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(means \( \pm \mathrm{SE}) \)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검정은 Fischer's Protected LSD post-hoc test로 하였다.</p> <h1>결 과</h1><h2>정상세포와 암세포의 세포증식에 대한 에탄올의 억제 효과 비교</h2><p>다양한 조직 유래의 정상세포주와 암세포주를 배양하여 에탄올에 의한 세포증식억제 효과를 조사하였다. 사용한 세포주를 분류하면, 유방세포주로는 사람의 정상세포인 MCF-12A와 대표적인 유방암세포 연구에 사용되는 MCF-7, SK-BR-3, T-47D에서의 에탄올의 효과를 비교하였고, 간세포는 정상세포인 Chang세포주와 간암세포인 HepG2세포를 비교하였고, 췌장세포로는 정상세포인 HIT-T12와 암세포인 MIA PaCa-2를 비교하였고, 신경세포에서는 정상세포인 RSC96과 암세포인 PC-12 및 Neuro-2a를 비교하였고, 폐세포로는 정상세포인 WI-38과 암세포인 HT-1080 및 A549 세포를 비교하였다. 그 결과, 공통적으로 정상세포에서는 에탄올에 의해 세포증식이 현저하게 억제되었고, 반면 암세포에서는 그 효과가 없음을 알 수 있었다. 또한 일반적인 세포 연구에 많이 사용되는 신장 유래 세포인 CV-1, 근육세포인 L6, 지방세포인 3T3-L1에서도 동일하게 에탄올에 의해 세포성장이 억제 되었다. 그 억제 정도는 조직별로 차이가 있으며, 신경세포에서 현저한 억제 효과가 관찰되었고, 유방세포에서는 그 효과 다소 약함을 알 수 있었다.</p><h2>발암원성 H-ras와 K-ras에 의해 형질전환된 세포에서의 에탄올의 세포증식 억제 효과</h2><p>Fig. 1의 실험에서 사용한 암세포는 다양한 암유전자의 변이로 형질전환된 세포이므로 세포내의 어떤 유전자 변이로 인한 것인지, 세포증식 신호전달 과정의 어떤 경로가 에탄올의 세포증식 억제효과를 상쇄하는지 알 수 없으므로 이를 이해하는 것은 중요하다. 따라서 본 연구에서 정상적인 Rat-2 세포에 발암원성 H-ras\( ^{V12} \)나K-ras\( ^{V12} \)로 형질전환 시킨 세포에서 에탄올의 세포증식 억제 효과를 조사하여 Ras단백질과의</p><p>상호관계를 알아보았다. Fig. 2에서 보이는 바와 같이 에탄올은 parental Rat-2 세포의 증식을 농도의존적으로 억제했고, 이를 다른 세포주 연구와 비교해볼 때 유의성을 가진 것을 알 수 있었다. 반대로 형질변환된 H-ras나 K-ras 세포의 경우에는 에탄올 존재 하에서도 세포증식에는 특이한 영향이 없었다. 이는 에탄올의 세포증식억제 작용이 ras 변이에 의한 세포 증식은 억제할 수 없으며, 또한 이는 알코올의 작용점이 Ras 단백질의 upstream에 존재하거나, 아니면 Ras단백질과는 상관이 없을 것이란 것을 보여준다.</p><h2>정상유방세포인 MCF-12A에 미세주입된 발암원성 H-Ras\( ^{V12} \) 단백질에 의한 DNA 합성 유도에 대한 에탄올의 영향</h2><p>발암원성 ras\({ }^{\mathrm{V} 12} \)와 에탄올에 의한 세포증식억제 효과 사이의 관계를 직접적으로 확인하기 위해 우리는 세포미세주사기술을 적용했다. 정상유방세포인 MCF-12A세포의 세포주기를 정지시켜 DNA 합성을 억제시킨 후, 발암원성 발암원성 H-Ras\( ^{V12} \) 단백질을 세포 내로 미세주사하고, 주입된 Ras단백질에 의한 세포증식을 위한 DNA합성에 대한 에탄올의 영향을 알아보았다. 본 연구팀에 미세주사된 발암원성 H-Ras\( ^{V12} \) 단백질은 농도의존적으로 DNA 합성을 촉진한다고보고하였다. 대조군으로 미세주입된 Rat IgG를 주입한 세포에서는 \( 15 \% \)의 세포에서 DNA 합성이 일어났고, 발암원성 Ras\( ^{V12} \) 단백질이 미세주입된 세포에서는 \( 66 \% \)의 세포에서 DNA합성이 유도되었다. 에탄올을 전처리한 세포에 발암원성 H-Ras단백질를 미세주입한 세포에서는 \( 58.6 \% \)세포에서 DNA합성이 유도되었다. 따라서 에탄올에 의해 유의한 영향은 존재하지 않았다. 이러한 결과는 에탄올에 의한 세포증식 억제효과를 나타내는 작용점이 Ras단백질이 관여하는DNA 합성 유도 신호전달경로에서 Ras 단백질의 upstream에 존재하거나, 아니면 Ras단백질과는 상관이 없을 것이란 것을 다시 한번 확인해준다.</p><h2>에탄올의 세포증식 억제효과와 활성산소 형성과의 상관관계에 관한 연구</h2><p>Ras단백질외에도 활성산소가 에탄올의 세포증식억제 효과에 중요한 것으로 보고되어 왔다. 우리는 다음으로 활성 산소가 에탄올에 의한 세포증식억제효과와 어떤 관계가 있는지 알아보기 위해, 먼저 에탄올에 의한 활성산소의 형성을 조사하였고, Ras 형질전환 Rat-2 세포에서의 활성산소 형성을 조사하였다. 에탄올에 의해 대조군인 Rat-2 세포에서 활성산소 생성이 증가하였다. Ras 형질전환 세포에서는 ROS의 발생을 조사한 결과, 대조군에 비해 증가하였다. 그러나 에탄올에 의해 유의한 활성산소의 증가를 관찰할 수 없었다. 정상세포에서 에탄올에 의해 증가한 활성산소가 세포증식 억제를 유도하는지를 조사하기 위해 free radical trapping agent를 사용하여 에탄올의 세포증식억제효과에 대한 영향을 조사하였다. 사용한 활성산소 억제제로서 free radical scav-enger 인 N-acetylcysteine (NAC), CYP2E1 inhibitor인 4-methylpyrazole (4-MP), lipid peroxidation inhibitorol vita-min E} (Vit. E), soluble Vit. E인 trolox와 같은 항산화제를 사용하였다. 항산화제를 MCF-12A세포에 전처리 후, 에탄올을 처리하고 그 효과를 측정하였다. NAC와 4-MP는 효과적으로 에탄올에 의한 세포증식 억제효과를 방해하였다. 그러나 흥미롭게도 Vit. E와 그 유도체인 trolox는 에탄올에 의한 세포증식억제 작용에는 특이한 효과가 없었다. 즉 수용성 항산화제인 NAC나 4-MP와 지용성 항산화제인 Vit. E계열간의 작용 차이는 에탄올에 의해 형성된 활성산소 중 세포내 수용성 부위에 작용하는 것이 에탄올에 의한 세포증식 억제에 중요할 것으로 사료된다. 이러한 결과는 활성산소 형성이 에탄올에 의한 세포증식 억제효과에 중요한 역할을 하며, 활성산소의 형성 부위에 따라 다르게 작용한다는 것을 알 수 있다.</p>	생명과학	[ "<h1>고 찰</h1><p>본 연구에서 우리는 에탄올의 세포증식 억제 효과가 정상</p><p>세포와 암세포에서 조사하여 차이가 있는 것을 알 수 있었다.", "특히 ras 유전자 변이에 의한 발암원성에 의한 세포증식에는 에탄올이 세포증식이나 DNA합성을 방해하지 못 하는 것을 알 수 있었다.", "이 결과는 에탄올의 세포증식억제 효과의 작용점이 Ras단백질의 upstream이거나 독립적인 경로를 통하는것으로 알 수 있다.", "본 연구에서 사용한 세포 미세주사기술은 세포내 신호전달분자가 특정 세포 현상이나 호르몬과 같은 신호유발 인자에 관여하는지 여부를 직접적으로 보여주는 기술이다.", "세포미세주사기술을 통해 활성화된 발암원성 Ras\\( ^{V12} \\) 단백질이 에탄올의 존재하에서도 DNA 합성을 정상적으로 유도함을 알 수 있는데, 이 결과는 발암원성 Ras\\( ^{V12} \\) 단백질의 작용점이 에탄올에 의한 억제효과를 나타내는 작용점과 먼 곳에 존재하는 것으로 결론지을 수가 있다.", "</p><p>ras 암유전자가 관여하는 세포증식 신호전달경로는 잘 알려져 있으나, 에탄올의 carcinogen 작용과의 관계는 아직 완전히 규명되지 않았다.", "최근 에탄올의 장기 투여에의해 간암조직에서 H-ras의 변이를, 췌장암에서는 K-ras의 변이를 유도하는 것이 보고되었다.", "즉 에탄올에 의한 직접적인 ras 유전자의 변이를 통해 암발생을 유도할 뿐 아니라, 본 연구결과에의하면 변이된 ras 유전자에 의한 세포증식도 억제하지 못하는 것을 알 수 있었다.", "최근 Chavez 등은 에탄올에 의해 간암 발생이 야기되며 정상적인 간세포의 증식은 억제하는 것이 쥐의 실험에서 보고하였다.", "즉 정상세포의 세포증식은 에탄올에 의해 억제되었지만, 발암원성 ras 에 의해 형질전환 세포는 에탄올에 대해 영향을 받지 않았다.", "그러므로 동일 조직에서 형질전환된 암세포는 에탄올 존재 여부와는 상관없이 지속적으로 세포증식이 진행되나, 그와는 반대로 정상세포는 세포증식과정을 멈출 것이다.", "따라서 에탄올에 의한 세포증 억제 효과는 정상세포에서는 작용하나 Ras 또는 기타 암유전자의 변이에 의해 유도된 세포증식은 에탄올에 의해 세포증식이 영향을 받지 않으므로 암세포의 증식을 간접적으로 도와주는 결과를 초래하는 것으로 추정할 수 있다.", "</p><p>활성산소가 암세포의 증식을 유도하거나 암세포의 유지에 중요한 것은 잘 알려져 있다.", "또한 활성산소는 어떤 조건이나 세포에서는 세포 노쇠와 세포사멸을 유도하는 것도 잘 알려져있다.", "이 상반된 활성산소의 영향의 기전은 생성되는 활성산소의 양이나 종류에 따라 다르며 세포 종류나 환경의 차이 등에 의해서도 반응할 것으로 추정된다.", "Ras에 의한 암세포에서 활성산소의 생성능이나 역할은 세포 종류와 Ras isoform에따라 상반된 결과가 보고 되어 있다.", "본 실험에서는 Ras에 의해 형질전환된 Rat-2 세포의 경우에서는 활성산소 생성이 증가된 것이 관찰되었다.", "그러나 대조군 세포에서 관찰된 에탄올에 의한 활성산소의 생성이 이 Ras 형질전환세포에서는 관찰되지 않았다.", "따라서 Ras로 형질전환된 세포의 경우에는 세포내 redox state의 변화가 야기되어 이미 세포가 높은 활성산소에 적응되어 증식되고 있기 때문에 에탄올에 의한 세포증식 억제 효과가 작용하지 않는 것으로 사료되나, 정확한 기전을 밝히기 위해서는 앞으로 추가적인 실험이 필요한 것으로 생각된다.", "</p><p>정상적인 세포증식은 EGF, IGF-1, 인슐린등과 같은 다양한 성장인자들이 유도하며 이러한 성장인자들의 세포증식 효과를 에탄올이 억제하는 것이 알려져 있다.", "에탄올에 의해 간세포의 인슐린신호와 EGF신호 및 IGF-1신호에 의한 세포증식이 억제 되었고, 또한 본 연구팀은 인슐린에 의한 DNA 합성 유도를 에탄올이 억제하였고, 이는 에탄올에 의한 PI3-kinase 활성 억제와 관련이 있는 것을 보고하였다.", "그러나 본 연구결과에서는 발암원성 ras 유전자에 의한 세포증식은 에탄올이 억제하지 못하므로 에탄올에 의한 세포증식 억제 효과의 작용점은 ras 단백질 위에 존재하는 PI3-kinase의 작용을 억제하거나 또는 활성산소의 형성을 통해 발생하는 것으로 사료된다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>WHO의 보고에 따르면 인간암발생의 \\( 3.6 \\% \\)가 에탄올에 기인한다고 발표하였고, 1988년부터 International Agency for Research on Cancer (IARC)는 에탄올을 carcinogen으로 분류하였고, 그 뒤 동물에서도 carcinogen실험 결과를 보고하였다.", "에탄올에 의해 주로 발생하는 암으로는 구강암, 인후암, 후두암, 간암, 대장암, 유방암 등이 있는 것으로 알려져 있다.", "대장암과 유방암은 이전에 알려진 것보다 훨씬 높은 빈도로 에탄올 섭취와 연관이 있는 것으로 밝혀졌다.", "</p><p>에탄올에 연관된 암 발생의 genetic susceptibility연구에서 에탄올 대사, folate 대사, DNA repair에 관련된 유전자들의 유전적 다양성이 알려져 있다.", "그 중 alcohol dehydrogen-ase와 aldehyde dehydrogenase의 유전적 다형성이 일부 암 발생에 관련이 있는 것으로 보고되었으나, 에탄올의 대사에 관련한 CYP2E1 등은 관련이 없는 것으로 알려져 있다.", "</p><p>에탄올에 의한 암발생의 분자기전은 다양하다.", "최근 에탄올의 장기 투여에 의해 ras유전자의 변이가 발생하는 것이 보고되었다.", "ras 유전자는 세포증식, 세포분화, 세포 골격변화를 포함하는 다양한 세포 활동에 관여한다.", "이러한 ras의 과발현이나 변이는 여러 종류의 인간 암에서 \\( 30 \\% \\)의 빈도로 발견된다.", "특히 ras 암유전자의 12번, 13번, 61번 아미노산 위치에서의 변이가 잘 발견된다.", "발암원성 H-ras 암유전자에 의해 형질전환된 쥐에 에탄올을 투여했을 시에 표준 group에 비해 높은 빈도의 종양이 발생함을 보고했다.", "따라서 에탄올이 발암원성 ras 유전자에 의한 종양 발생에 중요한 역할을 할 수 있다.", "</p><p>에탄올에 의한 세포증식억제 작용은 췌장 랑게르한스 세포 증식, 골수세포 증식 및 분화, T-cell 증식에서 보여지고, Smooth muscle cell 분화, 골세포 분화, 신경조직 형성와 같은 정상적인 세포작용도 억제하는 것이 보고되었다.", "또한 에탄올은 간절제술이나 간의 화학적 손상 후에 회복을 방해하는 것으로 알려져 있다.", "이러한 에탄올의 세포증식이나 세포 회복에 대한 억제효과는 잘 알려져 있으나, 암세포의 세포증식억제 효과에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.", "본 연구에서 에탄올의 여러 조직별 정상세포와 암세포의 세포증식억제 효과를 비교하였고, 발암원성 \\( \\mathrm{H}-\\mathrm{ras}^{\\mathrm{V} 12} \\)와 발암원성 \\( \\mathrm{K}-\\mathrm{ras}^{\\mathrm{V} 12} \\)에 의해 형질 전환된 세포에서 세포증식과 DNA 합성을 관찰함으로써 에탄올에 의한 세포증식억제효과가 발암원성ras 유전자에 의한 암발생에는 어떤 영향을 미치는지를 조사하였다.", "이번 실험결과에서 우리는 에탄올에 의해 세포증식 억제효과가 일반적인 정상세포에서는 작동하나 암세포 특히 ras 유전자 변이에 의한 세포의 증식에는 영향이 없음을 알 수 있었다.", "</p> <h1>초록 : 정상세포와 암세포의 증식 억제에 대한 에탄올의 영향</h1><p>에탄올은 사람에 대한 발암물질로 잘 알려져 있다.", "또한 여러 조직이나 세포에서의 에탄올에 의한 세포증식 억제효과도 잘 알려져 있다.", "본 연구에서는 여러 암세포에서 에탄올에 의한 세포증식억제 효과를 조사하였는데 특히 발암원성 ras로 형질전환되거나 미세주입된 세포에서의 영향을 조사하였다.", "에탄올은 여러 정상세포들의 증식을 억제하였다.", "반면에 여러 암세포나 발암원성 Ras에 의한 세포증식은 억제하지 못 하였다.", "또한 발암원성 단백질의 세포내 미세주사에 의한 DNA합성 유도도 에탄올에 의해 억제 되지 않았다.", "이러한 에탄올의 세포증식 억제 효과근 N Eacetylcysteine이나 4-methylpyrazole과 같은 항산화제에 의해 제거되었다.", "이러한 실험 결과근 에탄올에 의한 세포증식억제 효과는 Ras단백질의 upstream에 있거나 또는 Ras와 독립적으로 작용하며, 활성산소 형성과 밀접한 관계가 있다는 것을 알려준다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>세포주와 재료</h2><p>정상세포주와 암세포주들은 각 조직별로 American Tissue Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA)에서 구입하였고, ATCC에서 권하는 방법대로 각 배지에 배양하였다.", "H-ras\\( ^{V 12} \\)-transformed Rat-2세포와 K-ras\\( { }^{V 12} \\)-transformed Rat-2세포 및 대조군 Rat-2 세포는 Dr. J.K Pai (Merck/Schering-Plough, Whitehouse Station, NJ)로부터 제공받았고, 이는 \\( 10 \\% \\) fetal bovine serum이 포함된 DMEM 배지에서 유지하였다.", "Bromodeoxyuridine (BrdU)과 mouse anti-BrdU antibody는 GE Healthcare Life Science (Piscataway, NJ)의 제품을 사용하 였고, FITC-conjugated anti-rat IgG antibody는 Jackson Lab (Bar Harbor, ME)에서 제공받았다.", "다른 모든 시약들은 Sigma-Aldrich (Germany)에서 구입하였다.", "</p><h2>에탄올에 의한 세포증식 효과 측정</h2><p>각 세포들은 여러 농도의 에탄올에서 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 배양하였고, 에탄올을 함유한 배지는 매일 교환하였다.", "에탄올의 증발을 최소화하기 위해서 parafilm으로 밀봉하였고, 이러한 처리는 원래의 세포증식이나 세포 morphology를 방해하지 않았다.", "에타올을 처리한 세포는 trypsin으로 분리하고, 세포수는 tryphan blue staining을 통해 세포 숫자를 계산하였다.", "항산화제인 N-acetylcysteine \\( (1 \\mathrm{mM}) \\), 4-methylpyrazole \\( (1 \\) \\( \\mathrm{mM}) \\), vitamin E \\((25 \\mathrm{mM}) \\), trolox \\( (0.2 \\mathrm{mM}) \\)는 에탄올 처리 1시간 전에 처리하였고, 그 후에 에탄올 \\( (100 \\mathrm{mM}) \\)을 처리하고 세포를 배양하였다.", "에탄올에 의한 세포증식억제효과에 대한 항산화제의 효과를 알아보는 실험은 위와 같은 방법으로 진행하였다.", "</p><h2>세포미세주사 및 BrdU 면역형광법을 이용한 DNA 합성 실험</h2><p>세포미세주사법을 이용하여 발암원성 Ras에 의한 DNA 합성에 대한 에탄올의영향을 조사하기 위해 oncogenic H-Ras\\( ^{V12} \\)를 정상유방 세포주인 MCF-12A세포에 주사하여 DNA합성은 아래와 같이 측정하였다.", "요약하면, MCF-12A세포를 coverslip 위에서 배양한 후, serum-free DMEM으로 배양하여 세포주기를 정지시켰다.", "이 세포를 미세주사하기 에탄올(100 \\( \\mathrm{mM}) \\)으로 4시간동안 처리하였다.", "그 후에 발암원성 H-Ras\\( ^{V12} \\) protein \\( (2 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}) \\)를 rat IgG \\( (4 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}) \\)과 함께 MCF-12A세포에 미세주사하였다.", "MCF-12A 세포를 키운 3개의 coverslip에 coverslip당 평균 200개의 세포에 미세주사하였고, 이를 두 번 반복하였다.", "따라서 미세주사 결과는 평균 1,200개의 세포에서 나온 결과이다.", "미세주사한 세포의 생존율은 \\( 90 \\% \\)이상이 었다.", "미세주사된 세포는 BrdU를 세포 배지에 투입하여 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 16시간 동안 배양하고, 이를 \\( 90 \\% \\)에탄올로 세포를 고정하였다.", "미세주사된 세포는 anti-BrdU antibody로 면역염색하고, 그 후에 TRITC-conjugated anti-mouse igG antibody로 처리되었다.", "미세주사된 세포를 찾기위해 세포에 같이 주사된 rat IgG를 FITC-labeled anti-rat IgG antibody로 염색하였다.", "미세주사된 세포는 세포질의 FITC 염색으로 확인되고, DNA 합성은 핵의 TRITC 염색으로 확인되며, 에탄올이 발암원성 Ras에 의한 DNA 합성 유도에 대한 영향을 형광현미경으로 그 결과를 조사하였다.", "</p><h2>세포내 활성산소의 측정</h2><p>세포내 활성산소양의 측정은 2,7-dichlorohydrofluerescence \\( \\left(\\mathrm{H}_{2} \\mathrm{DCFDA}\\right) \\)가 형광을 나타내는 2,7-dichlorofluorescein (DCF)로 산화되는 측정법에 의해 조사하였다 . \\", "( 100 \\% \\) 에탄올에 \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{DCFDA} \\) stock 용액 \\( (12.5 \\mathrm{mM}) \\) 을 만들어 \\( -20^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에 보관 하였고, \\( 25 \\mu \\mathrm{M} \\)의 working 용액을 사용하였다.", "DCF의 형광광도는 형광마이크로 리더(Bio-Tek Instruments, Winooki, VT, USA)를 사용하여 excitation 파장은 \\( 485 \\mathrm{~nm} \\), emission 파장은 \\( 530 \\mathrm{~nm} \\) 에서 측정하였다.", "</p><h2>통계처리</h2><p>실험에서 얻어진 결과치는 ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준오차(means \\( \\pm \\mathrm{SE}) \\)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검정은 Fischer's Protected LSD post-hoc test로 하였다.", "</p> <h1>결 과</h1><h2>정상세포와 암세포의 세포증식에 대한 에탄올의 억제 효과 비교</h2><p>다양한 조직 유래의 정상세포주와 암세포주를 배양하여 에탄올에 의한 세포증식억제 효과를 조사하였다.", "사용한 세포주를 분류하면, 유방세포주로는 사람의 정상세포인 MCF-12A와 대표적인 유방암세포 연구에 사용되는 MCF-7, SK-BR-3, T-47D에서의 에탄올의 효과를 비교하였고, 간세포는 정상세포인 Chang세포주와 간암세포인 HepG2세포를 비교하였고, 췌장세포로는 정상세포인 HIT-T12와 암세포인 MIA PaCa-2를 비교하였고, 신경세포에서는 정상세포인 RSC96과 암세포인 PC-12 및 Neuro-2a를 비교하였고, 폐세포로는 정상세포인 WI-38과 암세포인 HT-1080 및 A549 세포를 비교하였다.", "그 결과, 공통적으로 정상세포에서는 에탄올에 의해 세포증식이 현저하게 억제되었고, 반면 암세포에서는 그 효과가 없음을 알 수 있었다.", "또한 일반적인 세포 연구에 많이 사용되는 신장 유래 세포인 CV-1, 근육세포인 L6, 지방세포인 3T3-L1에서도 동일하게 에탄올에 의해 세포성장이 억제 되었다.", "그 억제 정도는 조직별로 차이가 있으며, 신경세포에서 현저한 억제 효과가 관찰되었고, 유방세포에서는 그 효과 다소 약함을 알 수 있었다.", "</p><h2>발암원성 H-ras와 K-ras에 의해 형질전환된 세포에서의 에탄올의 세포증식 억제 효과</h2><p>Fig.", "1의 실험에서 사용한 암세포는 다양한 암유전자의 변이로 형질전환된 세포이므로 세포내의 어떤 유전자 변이로 인한 것인지, 세포증식 신호전달 과정의 어떤 경로가 에탄올의 세포증식 억제효과를 상쇄하는지 알 수 없으므로 이를 이해하는 것은 중요하다.", "따라서 본 연구에서 정상적인 Rat-2 세포에 발암원성 H-ras\\( ^{V12} \\)나K-ras\\( ^{V12} \\)로 형질전환 시킨 세포에서 에탄올의 세포증식 억제 효과를 조사하여 Ras단백질과의</p><p>상호관계를 알아보았다.", "Fig.", "2에서 보이는 바와 같이 에탄올은 parental Rat-2 세포의 증식을 농도의존적으로 억제했고, 이를 다른 세포주 연구와 비교해볼 때 유의성을 가진 것을 알 수 있었다.", "반대로 형질변환된 H-ras나 K-ras 세포의 경우에는 에탄올 존재 하에서도 세포증식에는 특이한 영향이 없었다.", "이는 에탄올의 세포증식억제 작용이 ras 변이에 의한 세포 증식은 억제할 수 없으며, 또한 이는 알코올의 작용점이 Ras 단백질의 upstream에 존재하거나, 아니면 Ras단백질과는 상관이 없을 것이란 것을 보여준다.", "</p><h2>정상유방세포인 MCF-12A에 미세주입된 발암원성 H-Ras\\( ^{V12} \\) 단백질에 의한 DNA 합성 유도에 대한 에탄올의 영향</h2><p>발암원성 ras\\({ }^{\\mathrm{V} 12} \\)와 에탄올에 의한 세포증식억제 효과 사이의 관계를 직접적으로 확인하기 위해 우리는 세포미세주사기술을 적용했다. 정상유방세포인 MCF-12A세포의 세포주기를 정지시켜 DNA 합성을 억제시킨 후, 발암원성 발암원성 H-Ras\\( ^{V12}", "\\) 단백질을 세포 내로 미세주사하고, 주입된 Ras단백질에 의한 세포증식을 위한 DNA합성에 대한 에탄올의 영향을 알아보았다. 본 연구팀에 미세주사된 발암원성 H-Ras\\( ^{V12}", "\\) 단백질은 농도의존적으로 DNA 합성을 촉진한다고보고하였다. 대조군으로 미세주입된 Rat IgG를 주입한 세포에서는 \\( 15 \\% \\)의 세포에서 DNA 합성이 일어났고, 발암원성 Ras\\( ^{V12}", "\\) 단백질이 미세주입된 세포에서는 \\( 66 \\% \\)의 세포에서 DNA합성이 유도되었다. 에탄올을 전처리한 세포에 발암원성 H-Ras단백질를 미세주입한 세포에서는 \\( 58.6 \\% \\)세포에서 DNA합성이 유도되었다. 따라서 에탄올에 의해 유의한 영향은 존재하지 않았다. 이러한 결과는 에탄올에 의한 세포증식 억제효과를 나타내는 작용점이 Ras단백질이 관여하는DNA 합성 유도 신호전달경로에서 Ras 단백질의 upstream에 존재하거나, 아니면 Ras단백질과는 상관이 없을 것이란 것을 다시 한번 확인해준다.</p><h2>에탄올의 세포증식 억제효과와 활성산소 형성과의 상관관계에 관한 연구</h2><p>Ras단백질외에도 활성산소가 에탄올의 세포증식억제 효과에 중요한 것으로 보고되어 왔다. 우리는 다음으로 활성 산소가 에탄올에 의한 세포증식억제효과와 어떤 관계가 있는지 알아보기 위해, 먼저 에탄올에 의한 활성산소의 형성을 조사하였고, Ras 형질전환 Rat-2 세포에서의 활성산소 형성을 조사하였다. 에탄올에 의해 대조군인 Rat-2 세포에서 활성산소 생성이 증가하였다. Ras 형질전환 세포에서는 ROS의 발생을 조사한 결과, 대조군에 비해 증가하였다. 그러나 에탄올에 의해 유의한 활성산소의 증가를 관찰할 수 없었다. 정상세포에서 에탄올에 의해 증가한 활성산소가 세포증식 억제를 유도하는지를 조사하기 위해 free radical trapping agent를 사용하여 에탄올의 세포증식억제효과에 대한 영향을 조사하였다. 사용한 활성산소 억제제로서 free radical scav-enger 인 N-acetylcysteine (NAC), CYP2E1 inhibitor인 4-methylpyrazole (4-MP), lipid peroxidation inhibitorol vita-min E}", "(Vit. E)", ", soluble Vit.", "E인 trolox와 같은 항산화제를 사용하였다.", "항산화제를 MCF-12A세포에 전처리 후, 에탄올을 처리하고 그 효과를 측정하였다.", "NAC와 4-MP는 효과적으로 에탄올에 의한 세포증식 억제효과를 방해하였다.", "그러나 흥미롭게도 Vit.", "E와 그 유도체인 trolox는 에탄올에 의한 세포증식억제 작용에는 특이한 효과가 없었다.", "즉 수용성 항산화제인 NAC나 4-MP와 지용성 항산화제인 Vit.", "E계열간의 작용 차이는 에탄올에 의해 형성된 활성산소 중 세포내 수용성 부위에 작용하는 것이 에탄올에 의한 세포증식 억제에 중요할 것으로 사료된다.", "이러한 결과는 활성산소 형성이 에탄올에 의한 세포증식 억제효과에 중요한 역할을 하며, 활성산소의 형성 부위에 따라 다르게 작용한다는 것을 알 수 있다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Anti-Proliferative Effect of Ethanol on Normal and Cancer Cells", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-d70fa1f0-8e50-4eb1-b44d-3e7cb8b602e8", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2012", "doc_author": [ "Myung-Ju Oh", "Jihyun Kim", "Su-Hyun Park", "Young-Hwa Jeong", "Kun Wang", "Byung-Wook Cho", "Byung H. 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5,407	<p>이와 같이 deca-BDEs 동족체 계열인 BDE-209는 광학적, 생물학적 분해에 의해 탈 브롬화되어 nona-, octa- 및 hexa-BDEs 등의 저 브롬화 물질로 분해되어 생물축적이 용이한 상태로 변형된다. 또한, 탈 브롬화되어 생성된 octa-BDEs의 경우, 난분해성으로 환경에 오래 잔류되며, 자외선에 의한 penta-BDEs로 분해되어 더욱 독성이 강한 물질을 형성하기도 한다.</p><p>하지만 본 연구에서 penta-BDEs 등 저 브롬계 화합물에 의한 인체노출이 특정 PBDEs 제품 또는 환경 중에 일반적으로 존재하는 고 브롬계 화합물의 탈 브롬화에 의해 야기되는지에 대해서는 명확하지 않았다. 이러한 이성체 분포의 변화는 다양한 상업용 PBDEs 제품을 포함하여 복합적인 노출경로이기 때문일지도 모른다.</p><p>일반적으로 PBDEs의 인체축적 경로는 다양한 경로가 있으나 식품은 tetra-에서 penta-BDEs까지의 저 브롬계 화합물의 주요 노출원인이다. 특히, 어류소비량은 PBDE의 체내축적에 큰 영향을 미치며, 육류 및 유제품 소비량 또한 PBDEs의 체내축적에 기여하고 있다.</p><p>이와 같이 식품을 통한 PBDEs 섭취가 중요한 노출경로임을 전제로 한다면 산업활동이 제한되어 있는 춘천지역 여성 모유 중 PBDEs에 의한 체내축적은 식생활과 관련이 있을 것으로 판단되어 가능성 있는 노출원인과 경로를 파악하기 위하여 모든 산모의 식이습성에 따른 각각의 PBDE 이성체별 농도와 \( \sum \ PBDEs \) 농도를 Table 6에 나타내었다.</p><p>분산분석(one-way ANOVA) 방법으로 평가한 결과 \(95\% \) 신뢰수준에서 \( \sum \ PBDEs \) 농도와 식이습성 사이에 통계학적 유의한 상관성은 나타나지 않았으며, 각 이성체별 PBDE 농도 사이에서도 유의한 상관성은 없었으나 이들 세 그룹간에는 어류 소비량이 많은 여성의 모유 중 \( \sum \ PBDEs \) 농도가 다소 높았으며, 육류 및 유제품 또한 소비량이 많은 여성들의 모유 중에서 \( \sum \ PBDEs \)의 농도가 높게 나타났다.</p><p>한국인 식습관 보고에 따르면 총 음식섭취량의 \( 25 \% \ (321.1 \mathrm{~g}) \)가 곡류이며, 어패류는 \( 5.2 \% \ (67.7 \mathrm{~g}) \), 육류 \( 7.4 \% \ (95.1 \mathrm{~g}) \) 그리고 유제품의 소비량은 \( 7 \% \ (89.7 \mathrm{~g}) \)로 어패류의 소비량은 다른 구미 선진국과 비교하여 상당히 높다.</p><p>We 등은 식품을 통한 PBDEs 섭취평가에서 한국인의 PBDEs 섭취에 가장 높게 기여하는 것은 어패류로 1일 식품섭 취량의 \( 42.6 \% \)에 해당하였으며, 육류와 유제품을 통한 \( \sum \ PBDEs \) 섭취비율은 각각 \( 19.6 \%, 10.2 \% \)로 어패류 및 육류를 즐겨 섭취하는 식생활을 갖고 있는 사람에게 높은 농축을 보일 것으로 보고하였다. 또한 성인이 하루에 섭취하는 PBDEs 총량에 대하여 BDE-47은 \( 42.9 \% \)로 상당한 비율로 존재하였다. 이와 같이 많은 어패류 섭취량는 한국인 모유 시료에서 검출된 PBDEs 농도에 대한 노출 원인 중 하나로 기여할 것으로 판단되며, \( \sum \ PBDEs \)에 대해 높은 기여율을 보이는 BDE-47의 오염원 역시 어패류의 다량 섭취에 의한 것으로 주목할 필요성이 있다.</p><p>식품 섭취 외에도 인간의 PBDEs의 노출에는 다양한 경로가 관여할 것으로 예상되는데 그 중 전자제품의 사용에 의해 노출, 집먼지와 같은 입자상 물질 또는 오염된 실내 공기의 흡입으로 PBDEs에 노출될 수 있다.</p><p>Siödin 등의 연구결과 컴퓨터를 많이 다루는 사무실 공기 중의 미세먼지에는 상당량의 PBDEs를 함유하고 있는 것으로 나타났으며, Zhu 등은 모유 내 \( \sum \ PBDEs \) 농도와 전자제품 사용에 따른 유의한 상관성을 보고하였다 \( (p<0.01) \). 그러나 Darnerud 등은 총량적인 면에서 PBDEs의 주 노출경로는 공기보다는 식품의 섭취가 대부분을 차지한다고 보고하였다.</p><p>따라서 본 연구의 결과는 직업적으로 노출된 경우를 제외하고는 한국인에 있어 PBDEs 오염경로가 식품섭취를 포함한 복합적인 원인과 경로를 통하여 노출되고 있음을 시사한다. 하지만 본 연구에서 나타난 PBDEs의 오염 수준은 적은 시료 수에 바탕을 두고 있기 때문에 한국 내 다른 지역의 값을 반영 할 수도 반영하지 않을 수도 있다는 점에 주목해야 한다. 한국의 일반인을 대상으로 PBDEs의 다양한 노출 경로를 파악하기 위해서는 지속적인 연구가 필요하다.</p> <h1>서 론</h1><p>브롬계 난연제(Brominated flame retardants, BFR)는 저렴한 비용과 사용상의 용이함으로 인하여 사용빈도가 높고 특히, PBDEs (Polybrominated diphenyl ethers)는 중합체 물질에 녹는 유일한 난연제 원료로 지난 30년 동안 컴퓨터 외장, 전기회로 기판 등의 플라스틱, 섬유, 가정용품, 건축소재, 카페트 코팅 등의 화염방지제로서 첨가되어 광범위하게 사용되어왔다. PBDEs는 현재 penta-, octa- 및 deca-BDEs 등이 상업적으로 생산되고 2001년 세계시장 수요는 북아메리카(33,100톤, \( 49 \% \)) 아시아 (24,650톤, \( 37 \%\)) 그리고 유럽 8,360톤\( (12 \%) \) 순으로 소비 되고 있다.</p><p>PBDEs에 의해 유발되는 환경문제는 1980년대부터 주목받기 시작하여 환경오염 및 인체노출 문제의 심각성이 알려지기 시작하였다. PBDEs는 화학적 구조상 PCBs (Polychlorinated biphenyls)와 유사하고 비교적 낮은 수용성과 지용성으로 환경 중 잔류성이 크며, 인체축적이 쉽다. 또한, PBDEs에 의한 인체 내 독성은 PCBs나 다이옥신에 비해서 매우 제한적이나 일부 동물에 대한 연구에서 잠재적인 갑상선 장애와 신경독성이 보고되었으며, 특히 penta-BDEs는 낮은 농도에서도 내분비계, 신경계, 생식기 등에 대한 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다.</p><p>대부분의 PCBs 그리고 OCPs (Organochlorine pesticides)와 같은 유기염소계 화합물들은 규제가 시작된 1970년대 이후부터 그 잔류수준이 점차 감소하고 있는 반면, PBDEs는 공기, 물, 퇴적물, 토양 및 생물군과 같은 다양한 환경시료에서 검출되고 있으며, 인체 내 농도는 지속적으로 증가하고 있다. 스웨덴 여성 모유의 경우 PBDEs가 매 5년마다(1972~1997년) 2배씩 지속적으로 증가하여 약 60배 정도의 농도 증가를 보였으며, 농도 범위는 \( 0.07 \sim 4.02 \mathrm{ng} / \mathrm{g} \) lipid였다. 이는 체중 \( 5 \mathrm{~kg} \)의 유아가 하루에 \( 1.5\mathrm{~l} \)의 모유를 섭취할 경우 \( 1.5\mathrm{~ng} / \mathrm{kg} \cdot \mathrm{bw} / \mathrm{day} \)에서 \( 84\mathrm{~ng} / \mathrm{kg} \cdot \mathrm{bw} / \mathrm{day} \) 정도를 섭취하는 양에 해당된다. 우리나라와 지리적으로 가까운 일본 여성 모유에 대한 연구에서도 PBDEs 잔류수준이 1973년에서 1998년 동안 불검출에서 \( 2.31\mathrm{~ng} / \mathrm{g} \) lipid로 지속적으로 증가하였다.</p><p>이로 인하여 최근, 유럽공동체에서는 PBDEs에 대한 과학적 위해성 평가 결과를 바탕으로 단계적으로 모든 penta-, octa- BDEs 제품의 생산과 사용을 금지시켰다. 그러나 deca-BDEs는 경제성 및 성능면에서 대체 물질을 찾기 어려워 여전히 전 세계적으로 많이 사용되고 있는 실정이다.</p><p>인체시료인 모유는 유럽, 북미, 일본 등에서 PBDEs에 대한 인체노출 정도를 평가하고 생물지표 연구를 위해 사용되고 있지만 국내에서 PBDEs 인체노출에 대한 연구는 거의 이루어지고 있지 않다. 이에 본 연구는 모유 중 PBDEs 축적특성과 이성체별 경향 평가를 바탕으로 인체 노출 경로를 파악하기 위하여 특별한 점오염원이 없는 지역에 거주하는 여성 모유에서 tri-부터 hepta-BDEs까지 총 7종의 주요 이성체를 측정하여 평가하였다.</p> <h1>초록 : 춘천지역 모유 중 폴리브롬화디페닐에테르(PBDEs)의 이성체별 분포특성과 노출경로</h1><p>본 연구는 비교적 청정한 지역인 춘천시에 거주하는 일반인 모유 중 PBDEs의 노출 경로를 확인하기 위해 처음으로 시도된 연구이다. 본 연구지역의 모유 중 \( \sum \ PBDEs \)의 수준은 북아메리카지역에 비하여 낮은 수준이었으나 일부 아시아, 유럽국가와 유사하였다. 모유 내 PBDEs의 축적은 산모의 특성과 상관관계가 나타나지 않았으나, 상업용 PBDEs 제품을 포함하여 여러 복합적 인자에 의하여 노출되고 있었으며, 식품 섭취와 같은 식이노출은 한국인에 있어 중요한 노출 경로의 하나로 판단되었다. 따라서 본 연구 결과는 한국인의 PBDEs 노출 경로 파악에 중요한 정보를 제공하여, 장차 PBDEs 및 관련 브롬계 난연제의 노출에 따른 인체 위해성 평가를 수행함에 있어 중요한 참고자료가 될 것이다. 또한, 한국 내의 PBDEs에 대한 인체노출 경로를 명확하게 하기 위한 연구는 계속적으로 이루어져야 할 것이다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>PBDEs 축적특성 및 농도비교</h2><p>인체모유에서 일반적으로 조사되는 7종의 주요 PBDE 이성체(BDE-28, -47, -99, -100, -153, -154 및 -183)는 모든 분석시료에서 검출되었다. 이는 한국의 일반인 인체 내 PBDEs에 노출되고 있음을 시사한다. 분석한 7종의 PBDE 이성체별 잔류농도를 Table 3에 나타내었다.</p><p>\( \sum \ PBDEs \) 농도는 \( 1.14 \sim 5.49 \mathrm{~ng} / \mathrm{g} \) lipid의 범위로 평균 농도는 \( 2.35 \mathrm{~ng} / \mathrm{g} \) lipid (중앙값, \( 1.84 \mathrm{~ng} / \mathrm{g} \) lipid)이었으며, 이중 초산부 여성 모유 중 \( \sum \ PBDEs\) 농도 수준이 경산부 여성보다 더 높았다. 초산부 여성 모유 중 \( \sum \ PBDEs\) 농도 수준은 경산부 여성보다 1.7배 정도 높게 나타났으며, \( t \)-test 결과 통계적으로 유의하였다 \( (t=-2.13, p<0.05) \). 유해물질은 모유 및 태반을 통하여 산모로부터 유아에게 배출되어지기 때문에 경산부의 경우 이전의 출산 및 모유수유를 통해 체내에 축적되어 있던 PBDEs가 배출되어 초산부의 모유 내 잔류수준보다 낮게 나타난 결과로 판단된다.</p><p>본 연구의 모유 중 \( \sum \ PBDEs \) 농도 수준은 폴란드, 독일, 이탈리아 등 몇몇 유럽국가와 일본, 중국, 대만 등 동아시아지역과 유사한 수준을 나타내었지만 일부 아시아국가(베트남, 인도네시아) 보다는 다소 높았고 호주보다 낮았으나, 북아메리카에 위치하고 있는 미국, 캐나다 보다 매우 낮은 수준이었다. 이러한 결과는 Table 5에 나타낸 바와 같이 각 나라의 상업적 PBDEs의 구성 및 사용량으로 인한 차이로 유추 할 수 있을 것이다. 북아메리카 지역은 세계 PBDEs 시장 중 총 소비량이 약 \( 50 \% \)에 달하며, 특히, 상업적 penta-BDEs 제품의 \( 90 \% \) 이상을 소비하였다. 따라서, 유럽과 아시아 지역보다 북아메리카 지역의 높은 PBDEs 수준은 이로 인한 것으로 사료된다.</p><p>우리나라의 브롬계 난연제는 미국의 Great lake Chemical, Albermarle와 이스라엘 DSBG (Dead Sea Bromine Group) 및 일본의 Tosoh에서 원료 및 화학제품 형태로 수입되고 있다. 2004년 브롬계 난연제의 수입량은 69,000톤으로 1993년 (16,800톤)에 비하여 약 \( 400 \% \) 이상 증가하였다.</p><p>따라서 국내의 다양한 환경 및 인체시료에서 새로운 잔류성 유기오염물질인 PBDEs 화합물이 검출되는 것은 놀라운 일이 아니다. 그 예로 국내 연안해역에서 수집된 홍합 내 PBDEs의 수준은 다른 아시아, 유럽 국가의 홍합과 비교했을 때 유사하거나 높게 나타났다. 또한, 국내의 대부분의 식품류에서 PBDEs가 검출되었으며, 특히, 동물성 식품(어 ◦ 패류, 육류 및 유제품 등)은 더 오염되어 있다. Wang 등은 동아시아의 대기입자성물질 분석을 통하여 한국, 중국, 러시아에서 높은 수준의 PBDEs가 검출되었다고 보고하였으며, 이를 통한 결론으로 한국이 중국과 더불어 아시아 지역의 PBDEs의 잠재적 소비자 중 하나임을 알 수 있다.</p><p>그러나 본 연구지역인 춘천시는 PBDEs가 많이 방출될 가능성이 있는 전자, 자동차, 석유화학, 철강, 전기 등을 생산하는 공업 중심지역이 아니라 섬유, 식품, 조립금속 및 기계장비 등 근본적으로 산업활동이 제한되어 있는 지역임에도 불구하고 모유 내 PBDEs 농도가 Table 4에 나타낸 동아시아 지역과 유사한 수준으로 검출되었다. 한편, \( \sum \ PBDEs \) 농도와 산모의 특성(연령, 체중, 키, BMI) 사이에는 상관관계가 나타나지 않았는데 이는 선행 연구결과에서도 유사한 결과를 보이고 있어 모유 내 PBDEs 수준 변화는 다른 요인이 존재함을 시사한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상 및 시료채취</h2><p>본 연구는 인체시료를 채취함에 있어 윤리적, 과학적인 측면을 검토하고 시료 제공자를 보호하며, 연구의 이득과 위험을 판단해 균형을 잡기 위하여 보건복지부 생명윤리 및 안전에 관한 법률 제9조의 규정에 따라 본 연구계획은 기관생명윤리심의회의 IRB(Institutional review boards)에 의하여 승인되었다. 1964년 헬싱키 선언으로 공식화된 윤리기준과 2000년 개정된 기준을 따랐다.</p><p>연구대상자는 본 연구의 취지를 잘 이해하고 협력이 가능한 일반인을 대상으로 2006년 춘천지역에 거주하고 있는 22명의 산모로부터 수집하였다. 모든 산모는 대상지역에서 최소 5년이상 거주하고 수유대상 유아는 1인이며, 모유제공에 이상이 없는 건강한 산모(모유제공, 동의서 작성)를 대상으로 하였다. 또한, 직업, 연령, 식이습관, 흡연습관과 같은 산모정보는 모유를 수집할 때 설문지에 기록하였다. 연구대상 산모는 모두 비흡연자였으며, 직업적인 노출은 없었다. 산모의 연령, 체중, 신체질량지수(Body mass index, BMI) 등 일반적인 특성을 Table 1에 요약하였다.</p><p>모유 시료의 채취는 광분해의 영향을 최소화하기 위하여 \( 100 \mathrm{~ml} \) 용량의 테프론으로 코팅된 병마개가 있는 갈색 유리병을 이용하여 출산 후 30일째 모유를 \( 50 \sim 100 \mathrm{~ml} \) 채취하였다. 채취된 모유는 분석 전까지 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 이하에서 냉동 보관하였다.</p><h2>분석방법</h2><p>모유 시료 \( 50 \mathrm{~g} \)을 취하여 \( 500 \mathrm{~ml} \) 분액여두에 넣고 이때 농도 보정 및 회수율 산정을 위하여 정제용 내부표준물질(MBDE-MXFS, Wellington Laboratories, Canada) C-labelled BDEs (C-BDE-28,-47,-99,-100,-153,-154 및 -183) \( 1,250 \mathrm{~pg} \)을 첨가 하여 잘 흔들어준 뒤 소량의 옥살산나트륨, 에탄올, 염화나트륨(PCB analysis grade, Wako, Japan)을 가하여 분해시켰다. 이후 \( n \)-헥산(Ultra residue analysis, J.T. Baker) \( 100 \mathrm{~ml} \)를 첨가하여 액-액 추출을 3회 반복한 다음 세정수 \( 200 \mathrm{~ml} \)로 2회에 걸쳐 수세하였으며, 추출액은 무수황산나트륨(PCB analysis grade, Wako, Japan)을 통과시켜 수분을 제거하였다. 추출액은 회전증발농축기(EYELA N-1000)를 이용하여 \( 2 \mathrm{~ml} \)까지 농축한 다음 지질 및 방해물질을 제거하기 위하여 다층실리카겔컬럼(70~230 mesh, Merck, Darmstadt, Germany)을 통과시켰다. 다층실리카겔 컬럼은 하단부터 무수황산나트륨 \( 1 \mathrm{~g} \), 중성 실리카 \( 1 \mathrm{~g} \), \( 2 \% \) 알칼리 실리카 \( 3 \mathrm{~g} \), 중성 실리카 \( 1 \mathrm{~g} \), \( 44 \% \) 황산 실리카 \( 10 \mathrm{~g} \), \( 22 \% \) 황산실리카 \( 4 \mathrm{~g} \), 중성 실리카 \( 1 \mathrm{~g} \), 무수황산나트륨 \( 3 \mathrm{~g} \)을 충진 한 후 \( n \) 헥산 \( 50 \mathrm{~ml} \)를 통과시켜 PCBs 및 기타 방해물질을 제거한 후 \( 10 \% \) 디클로로메탄:\( n\)-헥산\( \mathrm{v}/ \mathrm{v} \) \( 150 \mathrm{~ml} \)를 이용하여 PBDEs를 용출시킨 다음 활성탄(dioxin analysis grade, Wako, Japan) \( 1 \mathrm{g} \)을 사용하여 \(25\%\) 디클로로메탄:\( n \)-헥산 \( (\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) \( 80 \mathrm{~ml} \)를 이용하여 PBDEs를 회수하였다.</p><p>회수된 용출액은 회전 증발 농축기와 질소농축기를 이용해 \( 50 \mu \mathrm{l} \)로 농축한 후 회수율 측정용 내부표준물질(MBDE-MXFR, Wellington Laboratories, Canada) C-BDE-77, -138을 \( 1,250\mathrm{~pg} \) 첨가하고 최종적으로 \( 25 \mu \mathrm{l} \)로 농축한 다음 HRGC/HRMS (Agilent 6890 series gas chromatograph/JEOL Mstation 800D mass spectrometer)로 분해능 10,000 이상(\(10 \% \) valley)에서 선택이온검출법(Selected ion monitoring, SIM) 모드로 검출하였다.</p><p>PBDEs 각 이성체에 대한 정성확인을 각 동족체마다 2개의 선택이온의 이온 강도의 비가 \( 99 \% \) 신뢰구간에 들어오면 정성 확인된 것으로 간주하였으며, 대상물질이 검출된 경우에는 이에 대응하는 LCS (Labelled compounds standard)에 대한 반응계수를 이용한 동위원소 희석법(Isotope dilution method)과 상대반응계수(Relative Response Factor, RRF)를 이용한 내부표준법에 따라 정량하였다.</p><p>본 연구에서는 바탕시료(blank sample) 분석은 는 용매나 초자로 부터 방해물질 또는 오염을 검토하기 위하여 5개 시료마다 1개씩 동시에 분석하였다. 주입된 7종의 C-이성체의 평균 회수율은 \(64 \sim 115 \% \)의 범위로 USEPA (EPA 1614 draft)에 의해 확립된 조건범위 \( 25 \sim 150 \% \)를 만족하였으며, 검출한계(Limit of detection, LOD) 범위는 \( 0.02 \sim 0.08 \mathrm{~ng} / \mathrm{g} \) 이었다.</p><h2>통계적 분석</h2><p>PBDEs와 연구대상자의 인구통계학적 특성(연령, BMI, 신장, 몸무게 등) 또는 관련 인자 사이의 상관관계를 찾기 위해 피어슨 상관분석(pearson correlation analysis)을 실시하였으며, 두 그룹사이(예, 출산경험)를 비교할 때 student \( t \)-test를 사용하였다. 일원적 분산분석(one way ANOVA)과 Bonferroni post-hoc test는 식이습성(예, 어류, 육류, 유제품 섭취 빈도)사이의 비교를 위해 사용되었으며, \( p<0.05 \)의 차이는 통계학적으로 유의하다고 간주하였다. 결과 해석을 위한 데이터의 통계분석은 Statistica (version 6.0, statsoft Inc., OK, USA) software system으로 수행되었다.</p> <h2>이성체별 분포특성 및 노출 경로</h2><p>모유 중 PBDE 이성체 농도의 총합을 \( 100 \% \)로 했을 때의 각 이성체 분포를 Fig. 2에 나타내었으며, 각 국의 모유 내 잔류 특성과 비교하였다.</p><p>모유 내 PBDE 이성체 구성은 BDE-47, -99, -100 그리고 BDE-153이 주요 이성체로 유사한 경향을 보였다. 상업적 penta-BDEs 제품의 주요 이성체인 BDE-47이 \(36.1\% \)로 가장 높은 구성비로 나타났고 \( \sum \ PBDEs \) 사이에서 매우 유의한 양의 상관성이 확인되었다 \( (r=0.936, p<0.001) \). 다음으로 BDE-153은 \( \sum \ PBDEs \)에 대하여 약 \( 27 \% \) 기여하였으며, BDE-99와 -100은 각 각 \( 11.7 \%, 11.1 \% \)로 유사한 구성비를 보였다. BDE-47과 - 153의 합은 \( \sum \ PBDEs \) 농도에 대하여 \( 60 \% \) 이상의 높은 구성비를 차지 하였다. 반면, BDE-28, -154, -183은 \( 10 \% \) 이하의 낮은 구성비를 보였다.</p><p>이와 같은 PBDE 이성체 구성비는 Fig. 3에 나타낸 바와 같이 BDE-47과 BDE-153이 \( 60 \% \) 이상 높은 분포로 나타나는 몇몇 아시아와 유럽국가의 일반 여성 모유 중의 이성체 구성비와 유사하였다. 그러나 BDE-99와 -100의 구성비가 BDE-153보다 더 높은 수준으로 나타나는 미국, 캐나다 그리고 호주에서 관찰되는 일반적인 경향과는 차이가 있었다. 이는 북아메리카와 호주에서 BDE-47, -99, -100이 주요 이성체로 구성되어 있는 상업적 penta-BDEs 제품인 Bromkal 70-5DE와 DE-71의 사용이 더 많기 때문인 것으로 사료된다.</p><p>2001년 전 세계적으로 사용된 상업적 penta-BDEs 제품의 총량은 7,500톤으로 이 중 7,100톤을 북아메리카에서 사용하였으며, 아시아와 유럽국가에서는 각각 150톤을 소비하였다. 또한, 모유 시료에서 penta- 및 octa-BDEs의 상업적 제품의 분포평가에서 BDE-47, -99 및 -100의 합과 BDE-153, -154,-183의 합의 비(R)는 미국, 캐나다 및 호주의 모유시료에서 높은 비율이 나타났고, 한국, 일본 등 아시아와 유럽 국가들은 낮게 나타났다. 이러한 결과는 Table 5와 같이 상업적 penta-BDEs 제품의 세계적인 수요시장과 일치한다.</p><p>전기◦전자, 방염, 플라스틱과 관련된 제조업체에서 주로 사용되는 국내 브롬계 난연제는 1993년에서 2004년까지 연간\( 13.5 \% \)씩 증가하는 추세이며, 브롬계 난연제의 총 소비량은 총 방염제 시장의 약 \(53\%\) 정도를 차지하고 있었다. 따라서 본 연구에서 BDE-47이 대부분의 모유 시료에서 높은 비율로 나타나는 가능성 있는 원인 중의 하나로 PBDEs 제품의 광범위한 상업적 이용으로 인한 생물 농축성을 들 수 있다. 상업용 penta-BDEs 제품에 \( 40 \% \) 이상 혼합되어 있는 BDE-47은 분자량이 큰 octa- 및 deca-BDEs에 비하여 생체 축적성이 높기 때문에 식품, 어류 그리고 인체시료인 혈액에서도 가장 높은 비율로 검출되고 있어 모유에서도 유사한 결과로 판단되어 진다.</p><p>Fig. 4에 모유 중의 PBDE 이성체 분포패턴과 상업용으로 생산된 PBDEs 제품인 Bromkal 70-5DE, DE-71, Bromkal 79-8DE의 이성체 분포패턴을 비교하였다. 상업용으로 생산된 penta-BDEs 제품인 Bromkal 70-5DE와 DE-71의 조성은 BDE-28,-47,-99,-100,-153 및 -154가 주로 혼합되어 있으며, octa-BDEs의 제품인 Bromkal 79-8DE와 DE-79는 주로 BDE-153,-154,-183,-196,-197,-206,-207 및 -209에 의해 혼합 되어 있다.</p><p>그러나 Fig. 4와 같이 모유 중 PBDEs 이성체 패턴은 상업용으로 생산된 penta-, octa-BDEs 제품의 이성체 패턴과 다소 차이가 있음을 알 수 있다. Penta-BDEs 제품 중 BDE-47, -100은 유사한 경향이었으나 BDE-99의 비율은 상업용 제품보다 낮고 BDE-153은 상업용 제품에 대응하여 모유 시료에서 약 3배 이상 높게 나타났다. 특히, BDE-183은 octa-BDEs 제품인 DE-79의 주요 이성체로 모유 시료에서 약 8배 정도 낮았다.</p><p>이러한 상업용 PBDEs 제품의 이성체 분포와 유사하지 않은 모유 중 이성체 분포 변화는 탈 브롬화와 배출과정에 의한 결과 일 수도 있다. 또한, 본 연구에서 \( \sum \ PBDEs \)에 대하여 BDE-153의 높은 분포 역시 유사한 결과를 얻었다. 최근 인체 시료인 모유 내 \( \sum \ PBDEs \) 연구결과 BDE-153의 높은 분포가 deca-BDEs의 탈 브롬화에 의한 원인이라고 보고하고 있다. BDE-209의 탈 브롬화는 어류 및 조류와 같이 낮은 영양단계의 생물에서도 관찰되며, 인체 내의 BDE-209의 반감기는 약 15일 정도로 매우 짧다.</p>	생명과학	[ "<p>이와 같이 deca-BDEs 동족체 계열인 BDE-209는 광학적, 생물학적 분해에 의해 탈 브롬화되어 nona-, octa- 및 hexa-BDEs 등의 저 브롬화 물질로 분해되어 생물축적이 용이한 상태로 변형된다.", "또한, 탈 브롬화되어 생성된 octa-BDEs의 경우, 난분해성으로 환경에 오래 잔류되며, 자외선에 의한 penta-BDEs로 분해되어 더욱 독성이 강한 물질을 형성하기도 한다.", "</p><p>하지만 본 연구에서 penta-BDEs 등 저 브롬계 화합물에 의한 인체노출이 특정 PBDEs 제품 또는 환경 중에 일반적으로 존재하는 고 브롬계 화합물의 탈 브롬화에 의해 야기되는지에 대해서는 명확하지 않았다.", "이러한 이성체 분포의 변화는 다양한 상업용 PBDEs 제품을 포함하여 복합적인 노출경로이기 때문일지도 모른다.", "</p><p>일반적으로 PBDEs의 인체축적 경로는 다양한 경로가 있으나 식품은 tetra-에서 penta-BDEs까지의 저 브롬계 화합물의 주요 노출원인이다.", "특히, 어류소비량은 PBDE의 체내축적에 큰 영향을 미치며, 육류 및 유제품 소비량 또한 PBDEs의 체내축적에 기여하고 있다.", "</p><p>이와 같이 식품을 통한 PBDEs 섭취가 중요한 노출경로임을 전제로 한다면 산업활동이 제한되어 있는 춘천지역 여성 모유 중 PBDEs에 의한 체내축적은 식생활과 관련이 있을 것으로 판단되어 가능성 있는 노출원인과 경로를 파악하기 위하여 모든 산모의 식이습성에 따른 각각의 PBDE 이성체별 농도와 \\( \\sum \\ PBDEs \\) 농도를 Table 6에 나타내었다.", "</p><p>분산분석(one-way ANOVA) 방법으로 평가한 결과 \\(95\\% \\) 신뢰수준에서 \\( \\sum \\ PBDEs \\) 농도와 식이습성 사이에 통계학적 유의한 상관성은 나타나지 않았으며, 각 이성체별 PBDE 농도 사이에서도 유의한 상관성은 없었으나 이들 세 그룹간에는 어류 소비량이 많은 여성의 모유 중 \\( \\sum \\ PBDEs \\) 농도가 다소 높았으며, 육류 및 유제품 또한 소비량이 많은 여성들의 모유 중에서 \\( \\sum \\ PBDEs \\)의 농도가 높게 나타났다.", "</p><p>한국인 식습관 보고에 따르면 총 음식섭취량의 \\( 25 \\% \\ (321.1 \\mathrm{~g}) \\)가 곡류이며, 어패류는 \\( 5.2 \\% \\ (67.7 \\mathrm{~g}) \\), 육류 \\( 7.4 \\% \\ (95.1 \\mathrm{~g}) \\) 그리고 유제품의 소비량은 \\( 7 \\% \\ (89.7 \\mathrm{~g}) \\)로 어패류의 소비량은 다른 구미 선진국과 비교하여 상당히 높다.", "</p><p>We 등은 식품을 통한 PBDEs 섭취평가에서 한국인의 PBDEs 섭취에 가장 높게 기여하는 것은 어패류로 1일 식품섭 취량의 \\( 42.6 \\% \\)에 해당하였으며, 육류와 유제품을 통한 \\( \\sum \\ PBDEs \\) 섭취비율은 각각 \\( 19.6 \\%, 10.2 \\% \\)로 어패류 및 육류를 즐겨 섭취하는 식생활을 갖고 있는 사람에게 높은 농축을 보일 것으로 보고하였다.", "또한 성인이 하루에 섭취하는 PBDEs 총량에 대하여 BDE-47은 \\( 42.9 \\% \\)로 상당한 비율로 존재하였다.", "이와 같이 많은 어패류 섭취량는 한국인 모유 시료에서 검출된 PBDEs 농도에 대한 노출 원인 중 하나로 기여할 것으로 판단되며, \\( \\sum \\ PBDEs \\)에 대해 높은 기여율을 보이는 BDE-47의 오염원 역시 어패류의 다량 섭취에 의한 것으로 주목할 필요성이 있다.", "</p><p>식품 섭취 외에도 인간의 PBDEs의 노출에는 다양한 경로가 관여할 것으로 예상되는데 그 중 전자제품의 사용에 의해 노출, 집먼지와 같은 입자상 물질 또는 오염된 실내 공기의 흡입으로 PBDEs에 노출될 수 있다.", "</p><p>Siödin 등의 연구결과 컴퓨터를 많이 다루는 사무실 공기 중의 미세먼지에는 상당량의 PBDEs를 함유하고 있는 것으로 나타났으며, Zhu 등은 모유 내 \\( \\sum \\ PBDEs \\) 농도와 전자제품 사용에 따른 유의한 상관성을 보고하였다 \\", "( (p<0.01) \\).", "그러나 Darnerud 등은 총량적인 면에서 PBDEs의 주 노출경로는 공기보다는 식품의 섭취가 대부분을 차지한다고 보고하였다.", "</p><p>따라서 본 연구의 결과는 직업적으로 노출된 경우를 제외하고는 한국인에 있어 PBDEs 오염경로가 식품섭취를 포함한 복합적인 원인과 경로를 통하여 노출되고 있음을 시사한다.", "하지만 본 연구에서 나타난 PBDEs의 오염 수준은 적은 시료 수에 바탕을 두고 있기 때문에 한국 내 다른 지역의 값을 반영 할 수도 반영하지 않을 수도 있다는 점에 주목해야 한다.", "한국의 일반인을 대상으로 PBDEs의 다양한 노출 경로를 파악하기 위해서는 지속적인 연구가 필요하다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>브롬계 난연제(Brominated flame retardants, BFR)는 저렴한 비용과 사용상의 용이함으로 인하여 사용빈도가 높고 특히, PBDEs (Polybrominated diphenyl ethers)는 중합체 물질에 녹는 유일한 난연제 원료로 지난 30년 동안 컴퓨터 외장, 전기회로 기판 등의 플라스틱, 섬유, 가정용품, 건축소재, 카페트 코팅 등의 화염방지제로서 첨가되어 광범위하게 사용되어왔다.", "PBDEs는 현재 penta-, octa- 및 deca-BDEs 등이 상업적으로 생산되고 2001년 세계시장 수요는 북아메리카(33,100톤, \\( 49 \\% \\)) 아시아 (24,650톤, \\( 37 \\%\\)) 그리고 유럽 8,360톤\\( (12 \\%) \\) 순으로 소비 되고 있다.", "</p><p>PBDEs에 의해 유발되는 환경문제는 1980년대부터 주목받기 시작하여 환경오염 및 인체노출 문제의 심각성이 알려지기 시작하였다.", "PBDEs는 화학적 구조상 PCBs (Polychlorinated biphenyls)와 유사하고 비교적 낮은 수용성과 지용성으로 환경 중 잔류성이 크며, 인체축적이 쉽다.", "또한, PBDEs에 의한 인체 내 독성은 PCBs나 다이옥신에 비해서 매우 제한적이나 일부 동물에 대한 연구에서 잠재적인 갑상선 장애와 신경독성이 보고되었으며, 특히 penta-BDEs는 낮은 농도에서도 내분비계, 신경계, 생식기 등에 대한 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다.", "</p><p>대부분의 PCBs 그리고 OCPs (Organochlorine pesticides)와 같은 유기염소계 화합물들은 규제가 시작된 1970년대 이후부터 그 잔류수준이 점차 감소하고 있는 반면, PBDEs는 공기, 물, 퇴적물, 토양 및 생물군과 같은 다양한 환경시료에서 검출되고 있으며, 인체 내 농도는 지속적으로 증가하고 있다.", "스웨덴 여성 모유의 경우 PBDEs가 매 5년마다(1972~1997년) 2배씩 지속적으로 증가하여 약 60배 정도의 농도 증가를 보였으며, 농도 범위는 \\( 0.07 \\sim 4.02 \\mathrm{ng} / \\mathrm{g} \\) lipid였다.", "이는 체중 \\( 5 \\mathrm{~kg} \\)의 유아가 하루에 \\( 1.5\\mathrm{~l} \\)의 모유를 섭취할 경우 \\( 1.5\\mathrm{~ng} / \\mathrm{kg} \\cdot \\mathrm{bw} / \\mathrm{day} \\)에서 \\( 84\\mathrm{~ng} / \\mathrm{kg} \\cdot \\mathrm{bw} / \\mathrm{day} \\) 정도를 섭취하는 양에 해당된다.", "우리나라와 지리적으로 가까운 일본 여성 모유에 대한 연구에서도 PBDEs 잔류수준이 1973년에서 1998년 동안 불검출에서 \\( 2.31\\mathrm{~ng} / \\mathrm{g} \\) lipid로 지속적으로 증가하였다.", "</p><p>이로 인하여 최근, 유럽공동체에서는 PBDEs에 대한 과학적 위해성 평가 결과를 바탕으로 단계적으로 모든 penta-, octa- BDEs 제품의 생산과 사용을 금지시켰다.", "그러나 deca-BDEs는 경제성 및 성능면에서 대체 물질을 찾기 어려워 여전히 전 세계적으로 많이 사용되고 있는 실정이다.", "</p><p>인체시료인 모유는 유럽, 북미, 일본 등에서 PBDEs에 대한 인체노출 정도를 평가하고 생물지표 연구를 위해 사용되고 있지만 국내에서 PBDEs 인체노출에 대한 연구는 거의 이루어지고 있지 않다.", "이에 본 연구는 모유 중 PBDEs 축적특성과 이성체별 경향 평가를 바탕으로 인체 노출 경로를 파악하기 위하여 특별한 점오염원이 없는 지역에 거주하는 여성 모유에서 tri-부터 hepta-BDEs까지 총 7종의 주요 이성체를 측정하여 평가하였다.", "</p> <h1>초록 : 춘천지역 모유 중 폴리브롬화디페닐에테르(PBDEs)의 이성체별 분포특성과 노출경로</h1><p>본 연구는 비교적 청정한 지역인 춘천시에 거주하는 일반인 모유 중 PBDEs의 노출 경로를 확인하기 위해 처음으로 시도된 연구이다.", "본 연구지역의 모유 중 \\( \\sum \\ PBDEs \\)의 수준은 북아메리카지역에 비하여 낮은 수준이었으나 일부 아시아, 유럽국가와 유사하였다.", "모유 내 PBDEs의 축적은 산모의 특성과 상관관계가 나타나지 않았으나, 상업용 PBDEs 제품을 포함하여 여러 복합적 인자에 의하여 노출되고 있었으며, 식품 섭취와 같은 식이노출은 한국인에 있어 중요한 노출 경로의 하나로 판단되었다.", "따라서 본 연구 결과는 한국인의 PBDEs 노출 경로 파악에 중요한 정보를 제공하여, 장차 PBDEs 및 관련 브롬계 난연제의 노출에 따른 인체 위해성 평가를 수행함에 있어 중요한 참고자료가 될 것이다.", "또한, 한국 내의 PBDEs에 대한 인체노출 경로를 명확하게 하기 위한 연구는 계속적으로 이루어져야 할 것이다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>PBDEs 축적특성 및 농도비교</h2><p>인체모유에서 일반적으로 조사되는 7종의 주요 PBDE 이성체(BDE-28, -47, -99, -100, -153, -154 및 -183)는 모든 분석시료에서 검출되었다.", "이는 한국의 일반인 인체 내 PBDEs에 노출되고 있음을 시사한다.", "분석한 7종의 PBDE 이성체별 잔류농도를 Table 3에 나타내었다.", "</p><p>\\( \\sum \\ PBDEs \\) 농도는 \\( 1.14 \\sim 5.49 \\mathrm{~ng} / \\mathrm{g} \\) lipid의 범위로 평균 농도는 \\( 2.35 \\mathrm{~ng} / \\mathrm{g} \\) lipid (중앙값, \\( 1.84 \\mathrm{~ng} / \\mathrm{g} \\) lipid)이었으며, 이중 초산부 여성 모유 중 \\( \\sum \\ PBDEs\\) 농도 수준이 경산부 여성보다 더 높았다.", "초산부 여성 모유 중 \\( \\sum \\ PBDEs\\) 농도 수준은 경산부 여성보다 1.7배 정도 높게 나타났으며, \\( t \\)-test 결과 통계적으로 유의하였다 \\", "( (t=-2.13, p<0.05) \\).", "유해물질은 모유 및 태반을 통하여 산모로부터 유아에게 배출되어지기 때문에 경산부의 경우 이전의 출산 및 모유수유를 통해 체내에 축적되어 있던 PBDEs가 배출되어 초산부의 모유 내 잔류수준보다 낮게 나타난 결과로 판단된다.", "</p><p>본 연구의 모유 중 \\( \\sum \\ PBDEs \\) 농도 수준은 폴란드, 독일, 이탈리아 등 몇몇 유럽국가와 일본, 중국, 대만 등 동아시아지역과 유사한 수준을 나타내었지만 일부 아시아국가(베트남, 인도네시아) 보다는 다소 높았고 호주보다 낮았으나, 북아메리카에 위치하고 있는 미국, 캐나다 보다 매우 낮은 수준이었다.", "이러한 결과는 Table 5에 나타낸 바와 같이 각 나라의 상업적 PBDEs의 구성 및 사용량으로 인한 차이로 유추 할 수 있을 것이다.", "북아메리카 지역은 세계 PBDEs 시장 중 총 소비량이 약 \\( 50 \\% \\)에 달하며, 특히, 상업적 penta-BDEs 제품의 \\( 90 \\% \\) 이상을 소비하였다.", "따라서, 유럽과 아시아 지역보다 북아메리카 지역의 높은 PBDEs 수준은 이로 인한 것으로 사료된다.", "</p><p>우리나라의 브롬계 난연제는 미국의 Great lake Chemical, Albermarle와 이스라엘 DSBG (Dead Sea Bromine Group) 및 일본의 Tosoh에서 원료 및 화학제품 형태로 수입되고 있다.", "2004년 브롬계 난연제의 수입량은 69,000톤으로 1993년 (16,800톤)에 비하여 약 \\( 400 \\% \\) 이상 증가하였다.", "</p><p>따라서 국내의 다양한 환경 및 인체시료에서 새로운 잔류성 유기오염물질인 PBDEs 화합물이 검출되는 것은 놀라운 일이 아니다.", "그 예로 국내 연안해역에서 수집된 홍합 내 PBDEs의 수준은 다른 아시아, 유럽 국가의 홍합과 비교했을 때 유사하거나 높게 나타났다.", "또한, 국내의 대부분의 식품류에서 PBDEs가 검출되었으며, 특히, 동물성 식품(어 ◦ 패류, 육류 및 유제품 등)은 더 오염되어 있다.", "Wang 등은 동아시아의 대기입자성물질 분석을 통하여 한국, 중국, 러시아에서 높은 수준의 PBDEs가 검출되었다고 보고하였으며, 이를 통한 결론으로 한국이 중국과 더불어 아시아 지역의 PBDEs의 잠재적 소비자 중 하나임을 알 수 있다.", "</p><p>그러나 본 연구지역인 춘천시는 PBDEs가 많이 방출될 가능성이 있는 전자, 자동차, 석유화학, 철강, 전기 등을 생산하는 공업 중심지역이 아니라 섬유, 식품, 조립금속 및 기계장비 등 근본적으로 산업활동이 제한되어 있는 지역임에도 불구하고 모유 내 PBDEs 농도가 Table 4에 나타낸 동아시아 지역과 유사한 수준으로 검출되었다.", "한편, \\( \\sum \\ PBDEs \\) 농도와 산모의 특성(연령, 체중, 키, BMI) 사이에는 상관관계가 나타나지 않았는데 이는 선행 연구결과에서도 유사한 결과를 보이고 있어 모유 내 PBDEs 수준 변화는 다른 요인이 존재함을 시사한다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상 및 시료채취</h2><p>본 연구는 인체시료를 채취함에 있어 윤리적, 과학적인 측면을 검토하고 시료 제공자를 보호하며, 연구의 이득과 위험을 판단해 균형을 잡기 위하여 보건복지부 생명윤리 및 안전에 관한 법률 제9조의 규정에 따라 본 연구계획은 기관생명윤리심의회의 IRB(Institutional review boards)에 의하여 승인되었다.", "1964년 헬싱키 선언으로 공식화된 윤리기준과 2000년 개정된 기준을 따랐다.", "</p><p>연구대상자는 본 연구의 취지를 잘 이해하고 협력이 가능한 일반인을 대상으로 2006년 춘천지역에 거주하고 있는 22명의 산모로부터 수집하였다.", "모든 산모는 대상지역에서 최소 5년이상 거주하고 수유대상 유아는 1인이며, 모유제공에 이상이 없는 건강한 산모(모유제공, 동의서 작성)를 대상으로 하였다.", "또한, 직업, 연령, 식이습관, 흡연습관과 같은 산모정보는 모유를 수집할 때 설문지에 기록하였다.", "연구대상 산모는 모두 비흡연자였으며, 직업적인 노출은 없었다.", "산모의 연령, 체중, 신체질량지수(Body mass index, BMI) 등 일반적인 특성을 Table 1에 요약하였다.", "</p><p>모유 시료의 채취는 광분해의 영향을 최소화하기 위하여 \\( 100 \\mathrm{~ml} \\) 용량의 테프론으로 코팅된 병마개가 있는 갈색 유리병을 이용하여 출산 후 30일째 모유를 \\( 50 \\sim 100 \\mathrm{~ml} \\) 채취하였다.", "채취된 모유는 분석 전까지 \\( -20^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 이하에서 냉동 보관하였다.", "</p><h2>분석방법</h2><p>모유 시료 \\( 50 \\mathrm{~g} \\)을 취하여 \\( 500 \\mathrm{~ml} \\) 분액여두에 넣고 이때 농도 보정 및 회수율 산정을 위하여 정제용 내부표준물질(MBDE-MXFS, Wellington Laboratories, Canada) C-labelled BDEs (C-BDE-28,-47,-99,-100,-153,-154 및 -183) \\( 1,250 \\mathrm{~pg} \\)을 첨가 하여 잘 흔들어준 뒤 소량의 옥살산나트륨, 에탄올, 염화나트륨(PCB analysis grade, Wako, Japan)을 가하여 분해시켰다.", "이후 \\( n \\)-헥산(Ultra residue analysis, J.T. Baker) \\( 100 \\mathrm{~ml} \\)를 첨가하여 액-액 추출을 3회 반복한 다음 세정수 \\( 200 \\mathrm{~ml} \\)로 2회에 걸쳐 수세하였으며, 추출액은 무수황산나트륨(PCB analysis grade, Wako, Japan)을 통과시켜 수분을 제거하였다.", "추출액은 회전증발농축기(EYELA N-1000)를 이용하여 \\( 2 \\mathrm{~ml} \\)까지 농축한 다음 지질 및 방해물질을 제거하기 위하여 다층실리카겔컬럼(70~230 mesh, Merck, Darmstadt, Germany)을 통과시켰다.", "다층실리카겔 컬럼은 하단부터 무수황산나트륨 \\( 1 \\mathrm{~g} \\), 중성 실리카 \\( 1 \\mathrm{~g} \\), \\( 2 \\% \\) 알칼리 실리카 \\( 3 \\mathrm{~g} \\), 중성 실리카 \\( 1 \\mathrm{~g} \\), \\( 44 \\% \\) 황산 실리카 \\( 10 \\mathrm{~g} \\), \\( 22 \\% \\) 황산실리카 \\( 4 \\mathrm{~g} \\), 중성 실리카 \\( 1 \\mathrm{~g} \\), 무수황산나트륨 \\( 3 \\mathrm{~g} \\)을 충진 한 후 \\( n \\) 헥산 \\( 50 \\mathrm{~ml} \\)를 통과시켜 PCBs 및 기타 방해물질을 제거한 후 \\( 10 \\% \\) 디클로로메탄:\\( n\\)-헥산\\( \\mathrm{v}/ \\mathrm{v} \\) \\( 150 \\mathrm{~ml} \\)를 이용하여 PBDEs를 용출시킨 다음 활성탄(dioxin analysis grade, Wako, Japan) \\( 1 \\mathrm{g} \\)을 사용하여 \\(25\\%\\) 디클로로메탄:\\( n \\)-헥산 \\( (\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\) \\( 80 \\mathrm{~ml} \\)를 이용하여 PBDEs를 회수하였다.", "</p><p>회수된 용출액은 회전 증발 농축기와 질소농축기를 이용해 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\)로 농축한 후 회수율 측정용 내부표준물질(MBDE-MXFR, Wellington Laboratories, Canada) C-BDE-77, -138을 \\( 1,250\\mathrm{~pg} \\) 첨가하고 최종적으로 \\( 25 \\mu \\mathrm{l} \\)로 농축한 다음 HRGC/HRMS (Agilent 6890 series gas chromatograph/JEOL Mstation 800D mass spectrometer)로 분해능 10,000 이상(\\(10 \\% \\) valley)에서 선택이온검출법(Selected ion monitoring, SIM) 모드로 검출하였다.", "</p><p>PBDEs 각 이성체에 대한 정성확인을 각 동족체마다 2개의 선택이온의 이온 강도의 비가 \\( 99 \\% \\) 신뢰구간에 들어오면 정성 확인된 것으로 간주하였으며, 대상물질이 검출된 경우에는 이에 대응하는 LCS (Labelled compounds standard)에 대한 반응계수를 이용한 동위원소 희석법(Isotope dilution method)과 상대반응계수(Relative Response Factor, RRF)를 이용한 내부표준법에 따라 정량하였다.", "</p><p>본 연구에서는 바탕시료(blank sample) 분석은 는 용매나 초자로 부터 방해물질 또는 오염을 검토하기 위하여 5개 시료마다 1개씩 동시에 분석하였다.", "주입된 7종의 C-이성체의 평균 회수율은 \\(64 \\sim 115 \\% \\)의 범위로 USEPA (EPA 1614 draft)에 의해 확립된 조건범위 \\( 25 \\sim 150 \\% \\)를 만족하였으며, 검출한계(Limit of detection, LOD) 범위는 \\( 0.02 \\sim 0.08 \\mathrm{~ng} / \\mathrm{g} \\) 이었다.", "</p><h2>통계적 분석</h2><p>PBDEs와 연구대상자의 인구통계학적 특성(연령, BMI, 신장, 몸무게 등) 또는 관련 인자 사이의 상관관계를 찾기 위해 피어슨 상관분석(pearson correlation analysis)을 실시하였으며, 두 그룹사이(예, 출산경험)를 비교할 때 student \\( t \\)-test를 사용하였다.", "일원적 분산분석(one way ANOVA)과 Bonferroni post-hoc test는 식이습성(예, 어류, 육류, 유제품 섭취 빈도)사이의 비교를 위해 사용되었으며, \\( p<0.05 \\)의 차이는 통계학적으로 유의하다고 간주하였다.", "결과 해석을 위한 데이터의 통계분석은 Statistica (version 6.0, statsoft Inc., OK, USA) software system으로 수행되었다.", "</p> <h2>이성체별 분포특성 및 노출 경로</h2><p>모유 중 PBDE 이성체 농도의 총합을 \\( 100 \\% \\)로 했을 때의 각 이성체 분포를 Fig.", "2에 나타내었으며, 각 국의 모유 내 잔류 특성과 비교하였다.", "</p><p>모유 내 PBDE 이성체 구성은 BDE-47, -99, -100 그리고 BDE-153이 주요 이성체로 유사한 경향을 보였다.", "상업적 penta-BDEs 제품의 주요 이성체인 BDE-47이 \\(36.1\\% \\)로 가장 높은 구성비로 나타났고 \\( \\sum \\ PBDEs \\) 사이에서 매우 유의한 양의 상관성이 확인되었다 \\", "( (r=0.936, p<0.001) \\).", "다음으로 BDE-153은 \\( \\sum \\ PBDEs \\)에 대하여 약 \\( 27 \\% \\) 기여하였으며, BDE-99와 -100은 각 각 \\( 11.7 \\%, 11.1 \\% \\)로 유사한 구성비를 보였다.", "BDE-47과 - 153의 합은 \\( \\sum \\ PBDEs \\) 농도에 대하여 \\( 60 \\% \\) 이상의 높은 구성비를 차지 하였다.", "반면, BDE-28, -154, -183은 \\( 10 \\% \\) 이하의 낮은 구성비를 보였다.", "</p><p>이와 같은 PBDE 이성체 구성비는 Fig.", "3에 나타낸 바와 같이 BDE-47과 BDE-153이 \\( 60 \\% \\) 이상 높은 분포로 나타나는 몇몇 아시아와 유럽국가의 일반 여성 모유 중의 이성체 구성비와 유사하였다.", "그러나 BDE-99와 -100의 구성비가 BDE-153보다 더 높은 수준으로 나타나는 미국, 캐나다 그리고 호주에서 관찰되는 일반적인 경향과는 차이가 있었다.", "이는 북아메리카와 호주에서 BDE-47, -99, -100이 주요 이성체로 구성되어 있는 상업적 penta-BDEs 제품인 Bromkal 70-5DE와 DE-71의 사용이 더 많기 때문인 것으로 사료된다.", "</p><p>2001년 전 세계적으로 사용된 상업적 penta-BDEs 제품의 총량은 7,500톤으로 이 중 7,100톤을 북아메리카에서 사용하였으며, 아시아와 유럽국가에서는 각각 150톤을 소비하였다.", "또한, 모유 시료에서 penta- 및 octa-BDEs의 상업적 제품의 분포평가에서 BDE-47, -99 및 -100의 합과 BDE-153, -154,-183의 합의 비(R)는 미국, 캐나다 및 호주의 모유시료에서 높은 비율이 나타났고, 한국, 일본 등 아시아와 유럽 국가들은 낮게 나타났다.", "이러한 결과는 Table 5와 같이 상업적 penta-BDEs 제품의 세계적인 수요시장과 일치한다.", "</p><p>전기◦전자, 방염, 플라스틱과 관련된 제조업체에서 주로 사용되는 국내 브롬계 난연제는 1993년에서 2004년까지 연간\\( 13.5 \\% \\)씩 증가하는 추세이며, 브롬계 난연제의 총 소비량은 총 방염제 시장의 약 \\(53\\%\\) 정도를 차지하고 있었다.", "따라서 본 연구에서 BDE-47이 대부분의 모유 시료에서 높은 비율로 나타나는 가능성 있는 원인 중의 하나로 PBDEs 제품의 광범위한 상업적 이용으로 인한 생물 농축성을 들 수 있다.", "상업용 penta-BDEs 제품에 \\( 40 \\% \\) 이상 혼합되어 있는 BDE-47은 분자량이 큰 octa- 및 deca-BDEs에 비하여 생체 축적성이 높기 때문에 식품, 어류 그리고 인체시료인 혈액에서도 가장 높은 비율로 검출되고 있어 모유에서도 유사한 결과로 판단되어 진다.", "</p><p>Fig.", "4에 모유 중의 PBDE 이성체 분포패턴과 상업용으로 생산된 PBDEs 제품인 Bromkal 70-5DE, DE-71, Bromkal 79-8DE의 이성체 분포패턴을 비교하였다.", "상업용으로 생산된 penta-BDEs 제품인 Bromkal 70-5DE와 DE-71의 조성은 BDE-28,-47,-99,-100,-153 및 -154가 주로 혼합되어 있으며, octa-BDEs의 제품인 Bromkal 79-8DE와 DE-79는 주로 BDE-153,-154,-183,-196,-197,-206,-207 및 -209에 의해 혼합 되어 있다.", "</p><p>그러나 Fig.", "4와 같이 모유 중 PBDEs 이성체 패턴은 상업용으로 생산된 penta-, octa-BDEs 제품의 이성체 패턴과 다소 차이가 있음을 알 수 있다.", "Penta-BDEs 제품 중 BDE-47, -100은 유사한 경향이었으나 BDE-99의 비율은 상업용 제품보다 낮고 BDE-153은 상업용 제품에 대응하여 모유 시료에서 약 3배 이상 높게 나타났다.", "특히, BDE-183은 octa-BDEs 제품인 DE-79의 주요 이성체로 모유 시료에서 약 8배 정도 낮았다.", "</p><p>이러한 상업용 PBDEs 제품의 이성체 분포와 유사하지 않은 모유 중 이성체 분포 변화는 탈 브롬화와 배출과정에 의한 결과 일 수도 있다.", "또한, 본 연구에서 \\( \\sum \\ PBDEs \\)에 대하여 BDE-153의 높은 분포 역시 유사한 결과를 얻었다.", "최근 인체 시료인 모유 내 \\( \\sum \\ PBDEs \\) 연구결과 BDE-153의 높은 분포가 deca-BDEs의 탈 브롬화에 의한 원인이라고 보고하고 있다.", "BDE-209의 탈 브롬화는 어류 및 조류와 같이 낮은 영양단계의 생물에서도 관찰되며, 인체 내의 BDE-209의 반감기는 약 15일 정도로 매우 짧다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Congener Specific Profiles and Exposure Pathways of Polybrominated Diphenyl Ethers (PBDEs) in Breast Milk of Chuncheon Area", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-ec372510-809d-4272-83c3-9d3e10aadfaf", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", "doc_author": [ "Sung-Ug We", "In-Cheon Baek", "Sang-Ah Park", "Seong-Hoon Kang", "Yu-Jin Cho", "Bong-Hui Cho", "Cho-Hee Yoon", "Ki-Ho Kim", "Byung-Yoon Min" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,408	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>초산 발효를 위한 사용 균주의 선별</h2><p>초산 발효를 행하기 이전에 적절한 알코올을 획득하기 위해 양파를 이용하여 알코올 발효를 수행하였고, 그 결과는 김 등이 이미 보고를 하였다. 알코올 발효를 바탕으로 하여 생성된 알코올을 이용하여 초산 발효를 수행하기 위해 초산균을 선별하였다.</p><p>초산균을 선별하기 위해, 시판중인 감 식초, 사과 식초 그리고 완숙기에 들어선 김치액을 각각 초산균 분리용 액체 배지에 넣어 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm}\), 72시간 동안 전배양과 본배양을 거친 배양액을 초산균 분리용 한천 배지에 3 분 도말하여 clear zone을 형성하면서 나타난 단일 colony 17개를 1차로 분리하고 각각 APJ-1 \(\sim\) APJ-17로 명명하였다. 1차로 분리한 단일 colony들을 다시 액체 배지에 넣어 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \)에서 72시간 동안 진탕 배양하였다. 이 배양액을 초산균 분리용 한천 배지에 paper disc법을 이용하여 clear zone을 형성하는 크기를 비교하여 초산발효능이 뛰어난 균주 5개를 선별하였다. 이렇게 선별된 균주를 다시 초산균 분리용 액체 배지에 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm}\), 10일 동안 배양하면서 생성된 산도를 \( 0.1 \mathrm{N} \mathrm{NaOH} \)를 이용하여 중화 적정하였다. 그 결과 APJ-3에서 가장 높은 산도를 나타내었다. 5개의 균주를 양파즙 배지 100\( \mathrm{ml} \)에 \( 110^{\circ} \mathrm{C}\), 10분간 멸균하여 \( 5 \% \)의 알코올을 넣고 \( 10 \% \)의 배양액을 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm}\), 10일 동안 배양하면서 균 생육도와 산도를 측정하였다. 그 결과 APJ-3에서 가장 높은 생육도를 보였고, 가장 높은 산도를 나타내어 APJ-3을 실험 균주로 선택하여 다음 실험에 사용하였다.</p><h2>식초 생성 최적 조건 검토</h2><h3>Ethanol에 의한 영향</h3><p>사용 균주의 초산 생성 최적 ethanol 함량을 조사하기 위하여 멸균된 양파즙 배지 \( 10 \mathrm{ml} \)을 test tube에 넣고, 전술한 방법으로 종초를 만들어 \( 10 \% \) 농도로 접종하여 ethanol를 각각 2, 4, 6, 8 \(\% \)씩 첨가하여 9일 동안 \( 200 \mathrm{rpm} \)에서 진탕 배양하여, 전술한 분석 방법에 따라 \( \mathrm{pH} \), 초산의 변화를 측정하였다. 그 결과\( \mathrm{pH} \)는 \( 4 \% \) ethanol 첨가일 때 가장 낮았으며, 산도는 3-5일에서 \( 2 \% \)에서 높게 나타났지만, 시간이 경과함에 따라 \( 4 \% \)가 높게 유지되는 것을 알 수 있었다. 그리고 초기 알코올 농도가 \( 8 \% \) 일 때는 초산 발효 속도가 지연되는 경향을 보이는 데, 이는 초기 알코올 농도가 너무 높으면 초산생성이 저해됨을 알 수 있다. 이는 김 등의 매실 식초 제조, 김 등의 보리 식초 제조, 양 등의 클로버 꽃 식초 제조시 알코올 농도가 각각 \( 4 \sim 6 \%, 6 \% \) 및 \( 4.5 \% \)라고 한 것과 같은 결과를 보였다.</p><h3>온도에 의한 영향</h3><p>사용 균주의 초산 생산 최적 온도를 조사하기 위하여 멸균된 양파즙 배지 \( 10 \mathrm{ml} \)을 test tube에 넣고, 전술한 방법으로 종초를 만들어 \( 10 \% \) 농도로 접종하여 \( 25,30,37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 9일 동안 \( 200 \mathrm{rpm} \)으로 진탕 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 \( \mathrm{pH} \), 초산의 변화를 측정하였다. 그 결과 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도에서 가장 높은 산도를 보였으며, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서는 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)보다 낮은 초산 생성능을 보였다. 따라서 발효 최적 온도는\( 30^{\circ} \mathrm{C} \)임을 알 수 있었다. Muraoka 등과 Hekmat와 Vortmeyer는 초산 발효시 배양액의 온도가 낮으면 균주 성장이 억제되고, 높으면 균주의 성장을 활발하나 초산 생성능이 떨어짐과 동시에 오염 현상이 있음을 보고한 바 있다.</p><h3>교반에 의한 영향</h3><p>공시균의 초산 생성에 필요한 산소 요구성을 파악하기 위하여 종초를 양파즙 배지의 \( 10 \% \) 농도로 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도에서 \( 150,200,250 \mathrm{rpm} \)으로 각각 달리하여 9일 동안 배양하였다. 그 결과 \( 150 \mathrm{rpm} \)에서 \( \mathrm{pH} \)가 높았으며, 산도는 낮은 결과를 보였다. 반면 \( 200 \mathrm{rpm} \)에서 낮은 \( \mathrm{pH} \)를 보이고, 산도는 높은 결과를 보였으며, \( 250 \mathrm{rpm} \)에서는 \( 200 \mathrm{rpm} \)과 \( \mathrm{pH} \)와 산도에서 큰 차이를 보이지 않았다. 결과적으로 200\( \mathrm{rpm} \)에서의 배양이 경제적으로 봤을 때 초산 발효 때 최적 \( \mathrm{rpm} \)임을 알 수 있었다.</p><p>통기량에 대한 효과를 알아보기 위하여 배양 용기를 각각 달리하여 초산 생성의 변화를 관찰하였다. 즉, \( \Phi 20 \mathrm{~mm} \) test tube와 \( 50 \mathrm{ml} \) 삼각 flask에 각각 \( 10 \mathrm{ml} \)의 전처리된 양파즙을 넣고 \( 10 \% \)의 종초를 접종하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \)에서 9일 동안 배양하였다. \( 50 \mathrm{ml} \) 삼각 flask를 사용한 결과 선행실험에서 3도를 넘기기 힘들었던 양파식초의 산도가 4 도 이상으로 높아진 결과를 보였다. 그러므로 초산의 생성량을 증가시키기 위해서는 산소의 적절한 공급이 필수적인 것으로 판단된다.</p><h2>2단계 발효를 통한 식초의 최적 생성 조건 검토</h2><p>연속된 2단계 발효를 통해서 식초를 생성하기 위한 알코올 발효는 믹서기로 파쇄한 양파를 \( 100^{\circ} \mathrm{C}\), 30분간 열처리하여 양파의 고유한 냄새를 없애고 sucrose로 초기 당도가 \( 16^{\circ} \mathrm{brix} \)가 되도록 보당하여 초산 발효를 위한 알코올 발효에 가장 효과적인 기질을 만들었다. 양파즙에 접종하는 주모의 양은 경제적으로 많은 알코올의 생성능을 보인 \( 5 \% \)를 접종하여 알코올 발효가 가장 잘 일어나는 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 배양 온도에서 4일간 정치 배양하였다. \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였을 때 초산 발효에 적절한 알코올 함량인 \( 5 \% \)대에 도달하여 일정하게 유지되었다.</p><p>알코올 발효가 끝난 양파주를 \( 8,000 \mathrm{rpm}\), 10분간 원심분리하여 상등액만을 취하여 \( 40 \mu \mathrm{m} \) filter에 통과시켜 찌꺼기를 완전히 제거하여 초산발효의 기질로 이용하였다. 처리된 양파주를 공기와의 접촉이 용이한 \( 500 \mathrm{ml} \) 삼각 flask에 \( 100 \mathrm{ml} \)을 넣고 준비되어진 종초를 양파주 부피 대비 \( 10 \% \)를 접종하여, 초산 발효시 필요한 초기 알코올 농도 5\(\%\)와, 초기 산도 \( 2 \% \)로 맞출 수 있었다. 이것을 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{rpm} \)에서 진탕 배양하면서 초산의 농도와 알코올 함량의 변화를 살펴본 결과, 최종 산도는 \( 5.2 \% \), 잔류 알코올 함량은 \( 1 \% \) 미만으로 우리 나라의 산업자원부 기술표준원에서 정한 과실 식초의 조건을 만족하는 양파 식초를 제조하는 것이 가능하였다.</p><table border><caption>Table 1. Production of onionic vinegar by each conditions</caption><tbody><tr><td>Cultural condition</td><td>Total acidity (\(\%\))</td></tr><tr><td colspan="2">Alcohol concentration</td></tr><tr><td>2\(\%\)</td><td>1.68</td></tr><tr><td>4\(\%\)</td><td>2.28</td></tr><tr><td>6\(\%\)</td><td>2.02</td></tr><tr><td>8\(\%\)</td><td>1.24</td></tr><tr><td colspan="2">Temperature</td></tr><tr><td>25\({}^{\circ}\mathrm{C}\)</td><td>2.04</td></tr><tr><td>30\({}^{\circ}\mathrm{C}\)</td><td>2.21</td></tr><tr><td>37\({}^{\circ}\mathrm{C}\)</td><td>1.65</td></tr><tr><td colspan="2">Agitation</td></tr><tr><td>150\(\mathrm{rpm}\)</td><td>1.61</td></tr><tr><td>200\(\mathrm{rpm}\)</td><td>2.16</td></tr><tr><td>250\(\mathrm{rpm}\)</td><td>2.14</td></tr><tr><td colspan="2">Air-contact surface area</td></tr><tr><td>\( \Phi \) \( 20 \mathrm{~mm} \) test tube</td><td>2.16</td></tr><tr><td>\( 50 \mathrm{ml}\) \(\triangle \) flask</td><td>3.96</td></tr></tbody></table>	생명과학	[ "<h1>결과 및 고찰</h1><h2>초산 발효를 위한 사용 균주의 선별</h2><p>초산 발효를 행하기 이전에 적절한 알코올을 획득하기 위해 양파를 이용하여 알코올 발효를 수행하였고, 그 결과는 김 등이 이미 보고를 하였다.", "알코올 발효를 바탕으로 하여 생성된 알코올을 이용하여 초산 발효를 수행하기 위해 초산균을 선별하였다.", "</p><p>초산균을 선별하기 위해, 시판중인 감 식초, 사과 식초 그리고 완숙기에 들어선 김치액을 각각 초산균 분리용 액체 배지에 넣어 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, 200 \\mathrm{rpm}\\), 72시간 동안 전배양과 본배양을 거친 배양액을 초산균 분리용 한천 배지에 3 분 도말하여 clear zone을 형성하면서 나타난 단일 colony 17개를 1차로 분리하고 각각 APJ-1 \\(\\sim\\) APJ-17로 명명하였다.", "1차로 분리한 단일 colony들을 다시 액체 배지에 넣어 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, 200 \\mathrm{rpm} \\)에서 72시간 동안 진탕 배양하였다.", "이 배양액을 초산균 분리용 한천 배지에 paper disc법을 이용하여 clear zone을 형성하는 크기를 비교하여 초산발효능이 뛰어난 균주 5개를 선별하였다.", "이렇게 선별된 균주를 다시 초산균 분리용 액체 배지에 접종하여 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, 200 \\mathrm{rpm}\\), 10일 동안 배양하면서 생성된 산도를 \\( 0.1 \\mathrm{N} \\mathrm{NaOH} \\)를 이용하여 중화 적정하였다.", "그 결과 APJ-3에서 가장 높은 산도를 나타내었다.", "5개의 균주를 양파즙 배지 100\\( \\mathrm{ml} \\)에 \\( 110^{\\circ} \\mathrm{C}\\), 10분간 멸균하여 \\( 5 \\% \\)의 알코올을 넣고 \\( 10 \\% \\)의 배양액을 접종하여 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, 200 \\mathrm{rpm}\\), 10일 동안 배양하면서 균 생육도와 산도를 측정하였다.", "그 결과 APJ-3에서 가장 높은 생육도를 보였고, 가장 높은 산도를 나타내어 APJ-3을 실험 균주로 선택하여 다음 실험에 사용하였다.", "</p><h2>식초 생성 최적 조건 검토</h2><h3>Ethanol에 의한 영향</h3><p>사용 균주의 초산 생성 최적 ethanol 함량을 조사하기 위하여 멸균된 양파즙 배지 \\( 10 \\mathrm{ml} \\)을 test tube에 넣고, 전술한 방법으로 종초를 만들어 \\( 10 \\% \\) 농도로 접종하여 ethanol를 각각 2, 4, 6, 8 \\(\\% \\)씩 첨가하여 9일 동안 \\( 200 \\mathrm{rpm} \\)에서 진탕 배양하여, 전술한 분석 방법에 따라 \\( \\mathrm{pH} \\), 초산의 변화를 측정하였다.", "그 결과\\( \\mathrm{pH} \\)는 \\( 4 \\% \\) ethanol 첨가일 때 가장 낮았으며, 산도는 3-5일에서 \\( 2 \\% \\)에서 높게 나타났지만, 시간이 경과함에 따라 \\( 4 \\% \\)가 높게 유지되는 것을 알 수 있었다.", "그리고 초기 알코올 농도가 \\( 8 \\% \\) 일 때는 초산 발효 속도가 지연되는 경향을 보이는 데, 이는 초기 알코올 농도가 너무 높으면 초산생성이 저해됨을 알 수 있다.", "이는 김 등의 매실 식초 제조, 김 등의 보리 식초 제조, 양 등의 클로버 꽃 식초 제조시 알코올 농도가 각각 \\( 4 \\sim 6 \\%, 6 \\% \\) 및 \\( 4.5 \\% \\)라고 한 것과 같은 결과를 보였다.", "</p><h3>온도에 의한 영향</h3><p>사용 균주의 초산 생산 최적 온도를 조사하기 위하여 멸균된 양파즙 배지 \\( 10 \\mathrm{ml} \\)을 test tube에 넣고, 전술한 방법으로 종초를 만들어 \\( 10 \\% \\) 농도로 접종하여 \\( 25,30,37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 각각 9일 동안 \\( 200 \\mathrm{rpm} \\)으로 진탕 배양하여 전술한 분석 방법에 따라 \\( \\mathrm{pH} \\), 초산의 변화를 측정하였다.", "그 결과 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)의 온도에서 가장 높은 산도를 보였으며, \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서는 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\)보다 낮은 초산 생성능을 보였다.", "따라서 발효 최적 온도는\\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)임을 알 수 있었다.", "Muraoka 등과 Hekmat와 Vortmeyer는 초산 발효시 배양액의 온도가 낮으면 균주 성장이 억제되고, 높으면 균주의 성장을 활발하나 초산 생성능이 떨어짐과 동시에 오염 현상이 있음을 보고한 바 있다.", "</p><h3>교반에 의한 영향</h3><p>공시균의 초산 생성에 필요한 산소 요구성을 파악하기 위하여 종초를 양파즙 배지의 \\( 10 \\% \\) 농도로 접종하여 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)의 온도에서 \\( 150,200,250 \\mathrm{rpm} \\)으로 각각 달리하여 9일 동안 배양하였다.", "그 결과 \\( 150 \\mathrm{rpm} \\)에서 \\( \\mathrm{pH} \\)가 높았으며, 산도는 낮은 결과를 보였다.", "반면 \\( 200 \\mathrm{rpm} \\)에서 낮은 \\( \\mathrm{pH} \\)를 보이고, 산도는 높은 결과를 보였으며, \\( 250 \\mathrm{rpm} \\)에서는 \\( 200 \\mathrm{rpm} \\)과 \\( \\mathrm{pH} \\)와 산도에서 큰 차이를 보이지 않았다.", "결과적으로 200\\( \\mathrm{rpm} \\)에서의 배양이 경제적으로 봤을 때 초산 발효 때 최적 \\( \\mathrm{rpm} \\)임을 알 수 있었다.", "</p><p>통기량에 대한 효과를 알아보기 위하여 배양 용기를 각각 달리하여 초산 생성의 변화를 관찰하였다.", "즉, \\( \\Phi 20 \\mathrm{~mm} \\) test tube와 \\( 50 \\mathrm{ml} \\) 삼각 flask에 각각 \\( 10 \\mathrm{ml} \\)의 전처리된 양파즙을 넣고 \\( 10 \\% \\)의 종초를 접종하여 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, 200 \\mathrm{rpm} \\)에서 9일 동안 배양하였다. \\", "( 50 \\mathrm{ml} \\) 삼각 flask를 사용한 결과 선행실험에서 3도를 넘기기 힘들었던 양파식초의 산도가 4 도 이상으로 높아진 결과를 보였다.", "그러므로 초산의 생성량을 증가시키기 위해서는 산소의 적절한 공급이 필수적인 것으로 판단된다.", "</p><h2>2단계 발효를 통한 식초의 최적 생성 조건 검토</h2><p>연속된 2단계 발효를 통해서 식초를 생성하기 위한 알코올 발효는 믹서기로 파쇄한 양파를 \\( 100^{\\circ} \\mathrm{C}\\), 30분간 열처리하여 양파의 고유한 냄새를 없애고 sucrose로 초기 당도가 \\( 16^{\\circ} \\mathrm{brix} \\)가 되도록 보당하여 초산 발효를 위한 알코올 발효에 가장 효과적인 기질을 만들었다.", "양파즙에 접종하는 주모의 양은 경제적으로 많은 알코올의 생성능을 보인 \\( 5 \\% \\)를 접종하여 알코올 발효가 가장 잘 일어나는 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)의 배양 온도에서 4일간 정치 배양하였다. \\", "( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 배양하였을 때 초산 발효에 적절한 알코올 함량인 \\( 5 \\% \\)대에 도달하여 일정하게 유지되었다.", "</p><p>알코올 발효가 끝난 양파주를 \\( 8,000 \\mathrm{rpm}\\), 10분간 원심분리하여 상등액만을 취하여 \\( 40 \\mu \\mathrm{m} \\) filter에 통과시켜 찌꺼기를 완전히 제거하여 초산발효의 기질로 이용하였다.", "처리된 양파주를 공기와의 접촉이 용이한 \\( 500 \\mathrm{ml} \\) 삼각 flask에 \\( 100 \\mathrm{ml} \\)을 넣고 준비되어진 종초를 양파주 부피 대비 \\( 10 \\% \\)를 접종하여, 초산 발효시 필요한 초기 알코올 농도 5\\(\\%\\)와, 초기 산도 \\( 2 \\% \\)로 맞출 수 있었다.", "이것을 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, 200 \\mathrm{rpm} \\)에서 진탕 배양하면서 초산의 농도와 알코올 함량의 변화를 살펴본 결과, 최종 산도는 \\( 5.2 \\% \\), 잔류 알코올 함량은 \\( 1 \\% \\) 미만으로 우리 나라의 산업자원부 기술표준원에서 정한 과실 식초의 조건을 만족하는 양파 식초를 제조하는 것이 가능하였다.", "</p><table border><caption>Table 1. Production of onionic vinegar by each conditions</caption><tbody><tr><td>Cultural condition</td><td>Total acidity (\\(\\%\\))</td></tr><tr><td colspan=\"2\">Alcohol concentration</td></tr><tr><td>2\\(\\%\\)</td><td>1.68</td></tr><tr><td>4\\(\\%\\)</td><td>2.28</td></tr><tr><td>6\\(\\%\\)</td><td>2.02</td></tr><tr><td>8\\(\\%\\)</td><td>1.24</td></tr><tr><td colspan=\"2\">Temperature</td></tr><tr><td>25\\({}^{\\circ}\\mathrm{C}\\)</td><td>2.04</td></tr><tr><td>30\\({}^{\\circ}\\mathrm{C}\\)</td><td>2.21</td></tr><tr><td>37\\({}^{\\circ}\\mathrm{C}\\)</td><td>1.65</td></tr><tr><td colspan=\"2\">Agitation</td></tr><tr><td>150\\(\\mathrm{rpm}\\)</td><td>1.61</td></tr><tr><td>200\\(\\mathrm{rpm}\\)</td><td>2.16</td></tr><tr><td>250\\(\\mathrm{rpm}\\)</td><td>2.14</td></tr><tr><td colspan=\"2\">Air-contact surface area</td></tr><tr><td>\\( \\Phi \\) \\( 20 \\mathrm{~mm} \\) test tube</td><td>2.16</td></tr><tr><td>\\( 50 \\mathrm{ml}\\) \\(\\triangle \\) flask</td><td>3.96</td></tr></tbody></table>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "2단계 발효에 의한 양파식초 제조의 최적 조건 검토", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-e5b17b3f-ac2d-44c4-9831-b9c8695095cb", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "김삼웅", "박재효", "전홍기" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,409	<h1>서 론</h1><p>중금속에 의한 환경오염의 심각성은 산업 폐수로 인한 수질의 오염에서 기인한다. 중금속 함유 페수처리에서 화학적 침전법이 많이 이용되는 것은 운전의 용이와 저렴한 비용 때문이다. 그러나 이 방법은 2차 오염의 발생과 100 \( \mathrm{mg} / \ell \) 이하의 저농도에서 중금속 제거율이 낮으며 중금속이 동시에 존재할 때 처리효율이 떨어진다는 단점을 가지고 있다.</p><p>따라서 이러한 단점을 보완하기 위한 새로운 처리법으로서 생물체(biomass)를 이용하여 중금속이나 방사성물질을 제거하는데 이용하고 있는데 지금까지 알려진 미생물 합착제로는 세균, 진균, 조류 등이 알려져 있다. 어떤 미생물도 이온 흡착 가능한 많은 부위가 있으며 어느 한 형태의 분자나 기능 group 만이 금속 흡착에 관여하는 것은 아니다. 생물흡착의 주요기전은 크게 세포벽 성분에의 합착, 세포외 고분자와의 표면 결합(sur-face binding), 효소 분비물에 의한 불활성화와 표면 침전 (surface precipitation), 세포내 단백질과의 화합물 형성, 세포내에서의 중금속의 변화, sidophores에 의한 내부축적 (intracellular accumulation)으로 나누고 있으나 현재 세포 표면 흡착이 주로 연구되고 있으며 넓은 미생물의 표면에 흡착시켜 제거하는 생물 흡착법이 주목 받고 있다.</p><p>본 실험에서는 우리나라 자연계 미생물의 자정력을 조사하기 위하여 담수 식물의 근계에 부착한 토착 미생물을 분리하고, 분리된 균주 중 중금속에 대한 영향을 비교 조사하기 위하여 분리된 균종인 Enterobacter intemnedious KH410을 이용하여 독성 중금속인 납과 카드뮴, 구리를 이용하여 최저 생육 저지 농도, 최적 조건에서의 중금속 홉착효율을 파악함으로써 분리 균주의 중금속간의 특성에 대한 기초 연구를 수행하여 보다 효율적인 중금속 제거기반을 마련하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 배양</h2><p>우리나라 남부지역의 담수에 서식하는 수초의 뿌리에서 분리된 균을 미생물 자동 동정시스템 분석기 (E-10136, Biolog Microstation, Biolog, USA)를 사용하여 동정하고 similarity 값 0.5 이상을 신뢰도 값으로 하여 중금속에 대한 저항성을 나타내는 균주를 선별하여 사용하였다. 사용균주를 선별하기 위한 배지로는 일정량의 중금속과 \(0.5\%\) \( \mathrm{NaCl} \)을 첨가한 Nutrient broth를 사용하였으며, 균체 회수를 위한 배지로는 LB(Luria-Bertani)배지를 사용하였으며 최대 균체 생산량을 유도하기 위하여 최적 \( \mathrm{pH} \), 온도의 설정 및 탄소원, 질소원 등을 첨가하여 생산 균체량을 비교하였다.</p><h2>균체 건조법</h2><p>중금속 흡착을 위한 균체의 준비를 위하여 배양액을 원심분리 \( (3,000 \times g, \) 30분\( ) \) 한 후 멸균수로 현탁 및 세척과정을 거쳐서 다시 원심분리 하였다. 이 과정을 2회 더 반복한 다음 \( 20 \mathrm{~m} \ell \) 의 멸균수에 현탁하고, 동결건조기(Freeze dryer FD-1, Eyela, Japan)내에서 진공이 된 상태에서 72 시간 급속 동결한 후 건조과정을 거쳐 수분을 제거하고 분말화하여 사용하였다.</p><h2>중금속 용액 제조 및 정량</h2><p>사용 중금속으로는 질산염인 \( \mathrm{Pb}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2}, \mathrm{Cd}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2} \). \( 4 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, \mathrm{Cu}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2} \cdot 3 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 를 사용하였으며, 이것을 3 차 탈 이온수에 녹여 일정한 농도로 맞춘 후 멸균하여 사용하였다. 혼합 중금속은 각각의 중금속을 동일한 비율로 섞어 3차 탈 이온수에 녹여 일정한 농도로 맞춘 후 멸균하여 사용하였다. 중금속 정량을 위해 원자흡광광두계(Atomic adsorp-tion spectrometry, Shimazu AA6500 series, Japan)율 사용하였다. 각각의 중금속 표준용액을 적정 농도로 희석한 후 표준 검량선을 작성하였고, 예비 측정을 거쳐 검량선의 측정 가용 농도 범위를 정하였으며, 시로도 검량선의 범위에 들어가도록 희석하여 측정, 정량하였다</p><h2>최저 생육 저지 농도 (MIC)</h2><p>적정 농도의 단일, 혼합 중금속을 함유한 최적조건 배지 \( (500 \mathrm{~m} \ell, 200 \mathrm{~m} \ell) \) 의 전 배양액을 접종 후 배양하였으며, 배양액에서 \( 4 \mathrm{~m} \ell \) 을 취하여 분광광도계(Shimazu, UV- \( 160 \mathrm{~A} \), Japan)를 사용하여 \( 600 \mathrm{~nm} \) 에서 배양상태를 확인하였다. MIC의 결과에 따라 실험에 적용할 중금속 농도를 정하였다. 전 실험의 모든 결과는 4번이상의 반복과정을 거쳤다.</p><h2>흡착관련 계산식</h2><p>흡착에 관련된 모든 계산식은 다음과 같다.</p><p>\( q=\frac{V(C i-C f)}{M} \) : 흡착량의 단순계산<caption>(1)</caption></p><p>\( q \) : 중금속의 흡착량 \( \mathrm{V} \) : 반응 용액의 부피 \( (\ell) \) \( \mathrm{Ci}, \mathrm{Cf} \) : 초기, 최종 상등액의 중금속량 (mg/ \( ) \) \( \mathrm{M} \) : 흡착제의 건조무게 (g biomass)</p><p>\( \ln q=\left(\frac{1}{n}\right) \ln C e q+\ln K \) : 매개변수를 구하기 위한 선형식<caption>(2)</caption></p><p>\( \mathrm{K} \) : 흡착 용량 \( \frac{1}{n} \) :홉착강도</p><p>\( q=K \times \mathrm{Ceq}^{\frac{1}{n}}: \) Freundlich, Langmuir 상수식<caption>(3)</caption></p><p>\( q \) : 흡착제 무게당 중금속의 흡착량 ( \( \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) biomass) Ceq : 잔류 중금속 평형농도 (mg/ ใ) K, \( -\frac{1}{n} \) : 흡착제의 특성에 따라 결정되는 매개변수</p><p>\( \ln q=\frac{b Q \operatorname{maxCeq}}{1+b C e q} \) : 단분자 홉착을 전제로 하여 얻어진 Langmuir 흡착 등온식<caption>(4)</caption></p><p>\( \mathrm{q} \) : 흡착제 무게당 중금속의 홉착량 (mg/g biomass) \( \mathrm{b} \) : 홉착으로 인한 자유도 감소와 에너지 상태의 차이를 반영하는 평형 상수Qmax : 최대 훕착량 (mg/g biomass) Ceq : 용액의 평형 농도 (mg/ \( \ell) \)</p><p>\[\frac{1}{q}=-\frac{1}{b Q \max } \times-\frac{1}{C e q}+\frac{1}{Q \max }\] : (4)식의 선형화식<caption>(5)</caption></p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>중금속에 의한 환경오염의 심각성은 산업 폐수로 인한 수질의 오염에서 기인한다.", "중금속 함유 페수처리에서 화학적 침전법이 많이 이용되는 것은 운전의 용이와 저렴한 비용 때문이다.", "그러나 이 방법은 2차 오염의 발생과 100 \\( \\mathrm{mg} / \\ell \\) 이하의 저농도에서 중금속 제거율이 낮으며 중금속이 동시에 존재할 때 처리효율이 떨어진다는 단점을 가지고 있다.", "</p><p>따라서 이러한 단점을 보완하기 위한 새로운 처리법으로서 생물체(biomass)를 이용하여 중금속이나 방사성물질을 제거하는데 이용하고 있는데 지금까지 알려진 미생물 합착제로는 세균, 진균, 조류 등이 알려져 있다.", "어떤 미생물도 이온 흡착 가능한 많은 부위가 있으며 어느 한 형태의 분자나 기능 group 만이 금속 흡착에 관여하는 것은 아니다.", "생물흡착의 주요기전은 크게 세포벽 성분에의 합착, 세포외 고분자와의 표면 결합(sur-face binding), 효소 분비물에 의한 불활성화와 표면 침전 (surface precipitation), 세포내 단백질과의 화합물 형성, 세포내에서의 중금속의 변화, sidophores에 의한 내부축적 (intracellular accumulation)으로 나누고 있으나 현재 세포 표면 흡착이 주로 연구되고 있으며 넓은 미생물의 표면에 흡착시켜 제거하는 생물 흡착법이 주목 받고 있다.", "</p><p>본 실험에서는 우리나라 자연계 미생물의 자정력을 조사하기 위하여 담수 식물의 근계에 부착한 토착 미생물을 분리하고, 분리된 균주 중 중금속에 대한 영향을 비교 조사하기 위하여 분리된 균종인 Enterobacter intemnedious KH410을 이용하여 독성 중금속인 납과 카드뮴, 구리를 이용하여 최저 생육 저지 농도, 최적 조건에서의 중금속 홉착효율을 파악함으로써 분리 균주의 중금속간의 특성에 대한 기초 연구를 수행하여 보다 효율적인 중금속 제거기반을 마련하고자 하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 배양</h2><p>우리나라 남부지역의 담수에 서식하는 수초의 뿌리에서 분리된 균을 미생물 자동 동정시스템 분석기 (E-10136, Biolog Microstation, Biolog, USA)를 사용하여 동정하고 similarity 값 0.5 이상을 신뢰도 값으로 하여 중금속에 대한 저항성을 나타내는 균주를 선별하여 사용하였다.", "사용균주를 선별하기 위한 배지로는 일정량의 중금속과 \\(0.5\\%\\) \\( \\mathrm{NaCl} \\)을 첨가한 Nutrient broth를 사용하였으며, 균체 회수를 위한 배지로는 LB(Luria-Bertani)배지를 사용하였으며 최대 균체 생산량을 유도하기 위하여 최적 \\( \\mathrm{pH} \\), 온도의 설정 및 탄소원, 질소원 등을 첨가하여 생산 균체량을 비교하였다.", "</p><h2>균체 건조법</h2><p>중금속 흡착을 위한 균체의 준비를 위하여 배양액을 원심분리 \\( (3,000 \\times g, \\) 30분\\( ) \\) 한 후 멸균수로 현탁 및 세척과정을 거쳐서 다시 원심분리 하였다.", "이 과정을 2회 더 반복한 다음 \\( 20 \\mathrm{~m} \\ell \\) 의 멸균수에 현탁하고, 동결건조기(Freeze dryer FD-1, Eyela, Japan)내에서 진공이 된 상태에서 72 시간 급속 동결한 후 건조과정을 거쳐 수분을 제거하고 분말화하여 사용하였다.", "</p><h2>중금속 용액 제조 및 정량</h2><p>사용 중금속으로는 질산염인 \\( \\mathrm{Pb}\\left(\\mathrm{NO}_{3}\\right)_{2}, \\mathrm{Cd}\\left(\\mathrm{NO}_{3}\\right)_{2} \\). \\", "( 4 \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}, \\mathrm{Cu}\\left(\\mathrm{NO}_{3}\\right)_{2} \\cdot 3 \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\) 를 사용하였으며, 이것을 3 차 탈 이온수에 녹여 일정한 농도로 맞춘 후 멸균하여 사용하였다.", "혼합 중금속은 각각의 중금속을 동일한 비율로 섞어 3차 탈 이온수에 녹여 일정한 농도로 맞춘 후 멸균하여 사용하였다.", "중금속 정량을 위해 원자흡광광두계(Atomic adsorp-tion spectrometry, Shimazu AA6500 series, Japan)율 사용하였다.", "각각의 중금속 표준용액을 적정 농도로 희석한 후 표준 검량선을 작성하였고, 예비 측정을 거쳐 검량선의 측정 가용 농도 범위를 정하였으며, 시로도 검량선의 범위에 들어가도록 희석하여 측정, 정량하였다", "</p><h2>최저 생육 저지 농도 (MIC)</h2><p>적정 농도의 단일, 혼합 중금속을 함유한 최적조건 배지 \\( (500 \\mathrm{~m} \\ell, 200 \\mathrm{~m} \\ell) \\) 의 전 배양액을 접종 후 배양하였으며, 배양액에서 \\( 4 \\mathrm{~m} \\ell \\) 을 취하여 분광광도계(Shimazu, UV- \\( 160 \\mathrm{~A} \\), Japan)를 사용하여 \\( 600 \\mathrm{~nm} \\) 에서 배양상태를 확인하였다.", "MIC의 결과에 따라 실험에 적용할 중금속 농도를 정하였다.", "전 실험의 모든 결과는 4번이상의 반복과정을 거쳤다.", "</p><h2>흡착관련 계산식</h2><p>흡착에 관련된 모든 계산식은 다음과 같다.", "</p><p>\\( q=\\frac{V(C i-C f)}{M} \\) : 흡착량의 단순계산<caption>(1)</caption></p><p>\\( q \\) : 중금속의 흡착량 \\( \\mathrm{V} \\) : 반응 용액의 부피 \\( (\\ell) \\) \\( \\mathrm{Ci}, \\mathrm{Cf} \\) : 초기, 최종 상등액의 중금속량 (mg/ \\( ) \\) \\( \\mathrm{M} \\) : 흡착제의 건조무게 (g biomass)</p><p>\\( \\ln q=\\left(\\frac{1}{n}\\right) \\ln C e q+\\ln K \\) : 매개변수를 구하기 위한 선형식<caption>(2)</caption></p><p>\\( \\mathrm{K} \\) : 흡착 용량 \\( \\frac{1}{n} \\) :홉착강도</p><p>\\( q=K \\times \\mathrm{Ceq}^{\\frac{1}{n}}: \\) Freundlich, Langmuir 상수식<caption>(3)</caption></p><p>\\( q \\) : 흡착제 무게당 중금속의 흡착량 ( \\( \\mathrm{mg} / \\mathrm{g} \\) biomass) Ceq : 잔류 중금속 평형농도 (mg/ ใ) K, \\( -\\frac{1}{n} \\) : 흡착제의 특성에 따라 결정되는 매개변수</p><p>\\( \\ln q=\\frac{b Q \\operatorname{maxCeq}}{1+b C e q} \\) : 단분자 홉착을 전제로 하여 얻어진 Langmuir 흡착 등온식<caption>(4)</caption></p><p>\\( \\mathrm{q} \\) : 흡착제 무게당 중금속의 홉착량 (mg/g biomass) \\( \\mathrm{b} \\) : 홉착으로 인한 자유도 감소와 에너지 상태의 차이를 반영하는 평형 상수Qmax : 최대 훕착량 (mg/g biomass) Ceq : 용액의 평형 농도 (mg/ \\( \\ell) \\)</p><p>\\[\\frac{1}{q}=-\\frac{1}{b Q \\max } \\times-\\frac{1}{C e q}+\\frac{1}{Q \\max }\\] : (4)식의 선형화식<caption>(5)</caption></p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Enterobacter intermedious KH410의 중급속 흡착 특성", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-e7c34c3e-8a59-4158-a69d-446b21603db9", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2003", "doc_author": [ "김영희", "정영기", "김광현", "김병우", "정경태", "김병석", "박지원", "이동준", "신현철", "이승기" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,410	<h1>초록 : 감나무 잎으로 부터 분리한 tyrosinase 억제물질의 응용</h1><p>감잎으로부터 tyrosinase 억제물질의 추출을 위하여 \( 60 \% \) ethanol을 사용하여 추출한 경우 추출물의 phenol성 물질 함량이 \( 21.91 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)로 가장 높았고, tyrosinase 억제효과도 \( 37 \% \)의 억제율로 가장 높게 나타났다. 감잎 추출물로부터 tyrosinase 저해 활성 물질을 정제하기 위하여 Sephadex LH-20 column과 MCl-gel CHP-20 column을 이용하여 gradient로 용출한 결과 tyrosinase 저해 활성을 가지는 2가지 순수한 compound를 정제하였으며, 정제 된 2가지 compound를 구조 동정한 결과, (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3이었다. 정제물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3는 \( 29.5\), \(40.2 \% \)의 저해활성을 나타내었으며, melanoma 세포에서의 멜라닌 생합성 저해효과를 측정한 결과 (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3는 각각 \( 32.5\), \( 46.7 \% \)의 저해활성을 나타내어 멜라닌생성억제효과가 매우 뛰어남을 알 수 있었다. 정제된 미백물질을 이용하여 제조한 essence 제품의 안정성을 살펴본 결과, 미백 essence제품의 \( \mathrm{pH} \) 는 \( 10,000 \mathrm{ppm} \)의 농도에서 \( 4.90 \sim 4.95 \) 였으며, 점도는 \( 23,000 \sim 26,000 \)로 60일 동안의 저장기간 동안 큰 변화를 나타내지 않았다. 일반적 보존 시험인 온도에 따른 안정성과 광안정성(인공광, 자연광) 검사에서도 안정하였으며, 특수, 가혹 보존 시험인 온도순환에 따른 안정성 검사에서도 상의 분리와 변색, 변취 없이 모두 안정함을 확인할 수 있었다.</p> <h2>정제물의 tyrosinase 저해활성 확인</h2><p>Tyrosinase는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, melanosome 내에서 tyrosine을 산화시켜 DOPA를 만드는 tyrosine hydroxylase로, DOPA를 산화시켜 DOPA quinone을 만드는 DOPA oxidase로서 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요한 효소로 작용한다. 이렇게 피부 내에서 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해할 수 있는 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 Table 4와 같이 측정되었다. 감잎으로부터 분리한 (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3는 각각 \( 29.5\), \(40.2 \% \)의 저해활성을 나타내어 tyrosinase 저해활성이 비교적 높게 나타났다. Lee 등의 제주산 식물을 이용한 tyrosinase 억제 활성을 측정한 결과 \( 1,000 \mathrm{ppm} \)의 농도에서 \( 10.0 \% \) 미만의 효과가 나타났으며, Jung 등의 토사자, 숙지황, 오가피 추출물 \( 1,000 \mathrm{ppm} \) 에서 \( 30.0 \% \)미만의 저해능을 나타낸 결과와, An 등의 진달래꽃 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 열수 및 에탄올 추출물 \( 1,000 \mathrm{ppm} \)에서 각각 \( 24.0\), \(48.0 \% \)의 저해를 나타낸 결과와 비교하여 감잎의 활성이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한 Kwak 등의 쑥 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)에서 hexane, chloroform 및 ethyl acetate로 분획한 추출물이 각각 \( 55.8\), \(57.5\), \(60.2 \% \)의 효과를 나타내었으며, Kwak 등이 치자열매의 에탄올 추출물을 hexane, chloroform 및 ethyl acetate로 분획한 치차열매 분획물의 tyrosinase 저해능이 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 72.0 \%\), \(59.0 \%\), \(99.7 \% \)를 나타내었다고 보고한 것과 유사한 저해활성을 나타내어 tyrosinase 저해활성이 우수함을 확인할 수 있었다.</p><h2>Melanoma cell (B16F10)에서의 melanin 생합성 저해율 확인</h2><p>감잎 정제물을 천연 미백제로 사용하기 위하여 melanoma세포에서의 멜라닌 생합성을 측정한 결과 Table 5와 같이 측정되었다. 감잎으로부터 분리한 (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3는 멜라닌생성 저해효과가 각각 \( 32.5\), \(46.7 \% \) 의 저해활성을 나타내었다. 이는 Kwak 등의 치자 열매 추출물의 B16F10 melanoma 세포의 melanin 억제효과가 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)에서 열수 추출물의 경우 \( 36.3 \% \), 에탄올 추출물의 경우 \( 55.9 \% \) 로 나타나 감잎의 멜라닌 생성억제효과와 비슷함을 알 수 있었고, Hwang 등의 인삼의 부위별 멜라닌 생성억제효과에서 건조 인삼시료 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 27.0 \% \) 의 저해율을 나타내었으며, Cho 등의 유기농의 멜라닌 생성 억제 효과에서 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 유기농 butanol 분획물의 경우 \( 25.0 \% \) 의 저해율을 나타내었고, Kim 등의 안정화시킨 vitamin C와 파이토스핑고신의 멜라닌 생성 억제 효과에서 대조군인 코직산이 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 44.7 \% \) 의 억제효과와 비교하여, 감잎의 멜라닌 저해 효과가 우수함을 확인할 수 있었으며, 우수한 천연 미백제로 사용이 가능할 것으로 사료된다.</p> <h2>감나무잎 추출물을 활용한 essence 제품의 안정성</h2><p>Table 6의 처방에 따라 제조하여 실온 \( \left(25^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 보관한 essence 제품을 60일간의 \( \mathrm{pH} \) 와 점도 측정 결과 Fig. 5 와 같았다. Essence 제품의 경우 \( 10,000 \mathrm{ppm} \)의 농도에서 \( \mathrm{pH} \) 측정결과 \( 4.90 \sim 4.95 \)로 60일 동안의 저장기간 동안 큰 변화를 나타내지 않았다. Essence 제품의 점도를 Brookfield LV-Ⅱ digital viscometer로 측정한 결과 실온 \( \left(25^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 에서 보관한 essence 제품의 점도를 60 일 동안 측정한 결과 \( 23,000 \sim 26,000 \mathrm{cP} \) 사이에 분포했으며 저장기간 동안 수치상의 큰 변화 없이 안정하였다. 화장품의 열에 의한 경시적 품질열화현상을 관찰하기 위해서 온도안정성 평가를 실시한 결과 Table 7 과 같이 \( 0\), \(25\), \(40^{\circ} \mathrm{C} \)의 온도에서 보관한 essence 제품은 60일 동안 모든 온도 조건에서 안정한 것으로 나타났다. 불안정한 화장품의 경우 고온 \( (40^{\circ} \mathrm{C} \) )에서는 외관의 산패, 변색, 변취, 점도, 증발, 부유, 침전, 탁도(투명도), 분리 등이 관찰되며, 저온에서는 응고, 침전, 탁도(투명도), 결정 석출, 분리 등의 화학적◦물리적 변화가 관찰된다. 이와 같은 현상은 사용성에 큰 영향을 줄뿐 아니라, 화장품이 갖는 미적외관, 이미지의 손실에도 영향을 준다. 일반적으로 화장품의 품질수명은 소비자가 끝까지 사용할 때 까지를 보증해야 하므로 안정성을 체크해야 하며, essence 제품은 60일 동안 경시적 변화 없이 안정하였다. Essence 제품의 인공광과 자연광에 대한 안정성을 실시한 결과 Table 8과 9 와 같이 저장 기간 동안 모두 안정함을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때 감나무 잎의 미백물질이 첨가된 화장품은 제조 후 태양광과 형광등의 빛에 노출되어도 비교적 안정성을 유지한다고 판단되었다. 온도순환에 따른 안정성 시험법은 4계절이 분명한 우리나라에서 화장품의 저온 및 고온의 보관조건에 따른 물성변화를 관찰하기 위하여 실시하고 있으며, 또한 온도 변화에 따라 유화◦가용화에서의 물성변화를 관찰하기 위하여 실시한다. 제품의 대부분은 고온에서 가수분해 현상 및 기타 현상 등이 빨리 일어나며, 저온인 경우는 부피팽창, 용해도차에 의한 계면막 손상, 침전 등이 일어난다. Essence 제품을 \( -15\), \(-10\), \(-5\), \(0\), \(5\), \(10\), \(15\), \(25\), \(37.5\), \(40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 24시간 보관한 후 온도 순환에 따른 안정성을 관찰한 결과 Table 10과 같이 10 cycle 모두에서 상의 분리와 변색, 변취 없이 안정함을 육안으로 확인할 수 있었으며, essence 제품을 급격한 온도 조건인 고온 \( \left(25^{\circ} \mathrm{C}\right) \)과 저온 \( \left(-10^{\circ} \mathrm{C}\right) \)의 온도 변화를 주어 각각 24시간 보관하여 3일과 7일차에 안정성을 관찰한 결과 Table 11과 같이 상의 분리와 변색, 변취 없이 모두 안정함을 확인할 수 있었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>Ethanol 농도에 따른 phenol성 물질의 용출량</h2><p>감나무잎 추출물의 추출 조건을 확립하기 위해 다양한 농도의 ethanol을 추출용매로 하여 phenol성 물질의 용출량을 측정하였다. 그 결과 Fig. 1 과 같이 \( 60 \% \) ethanol을 사용하여 추출하였을 경우 가장 높은 용출량을 확인 할 수 있었으며, tyrosinase 억제 효과도 \( 60 \% \) ethanol 추출물에서 가장 높게 나타나는 것으로 보아 phenol성 물질의 함량과의 상관관계가 인정되었다. 따라서 이후의 실험은 물 추출물과 \( 60 \% \) 에탄올 추출물을 이용하여 실시하였다.</p><h2>추출물의 tyrosinase 억제 효과 측정</h2><p>Tyrosinase는 tyrosine으로부터 3,4-dihydroxyphenylalanine과 DOPA-quinone을 거쳐 최종적으로 흑갈색의 melanin 색소 생성에 관계하는 효소로써 야채나 과실류 특히 감자의 갈변현상과 피부에 암갈색의 색소 물질을 침착 시키는 원인이 되기도 한다. 본 연구에서는 식물 유래 추출물로부터 미백 및 갈변 저해물질을 분리하고 미백효과를 검토하여 기능성 화장품 소재로서 활용키 위해 tyrosinase 억제효과를 검토한 결과 Fig.2 에서와 같이 감잎 \( 60 \% \) 에탄올 추출물에서 약 \( 37 \% \) 의 tyrosinase 억제효과를 나타내어 가장 높은 저해효과를 확인할 수 있었다. 그리고 전체적으로 물 추출물보다는 에탄올 추출물이 tyrosinase 저해활성이 높은 것을 확인할 수 있었다. Tyrosinase 저해활성은 폴리페놀의 종류 및 그 구조와 상관관계가 있는 것으로 Kim 등은 보고하였고, 또한 폴리페놀 중에서도 catechin류는 tyrosinase 저해활동을 나타내지 않았지만, gallocatechin이나 epicatechin류에서 높은 저해활성을 나타내었으며, monomer보다 dimer에서 저해활성이 더 우수하였다고 안 등은 보고하였다.</p><h2>감잎 추출물로부터 tyrosinase 저해 물질의 정제 및 동정</h2><p>Tyrosinase 저해 활성 측정 결과 감잎 추출물에서 \( 37 \% \) 의 저해력을 나타내어 감잎으로부터 효소활성 저해 물질로 생각되어지는 화합물인 polyphenol류를 정제하고자 하였다. 감잎을 \( 60 \%\) EtOH로 추출하여 농축하고 Sephadex LH-20 column에 충진하여 \( 60 \%\) EtOH을 용매로 하여 용리한 결과 Fig. 3과 같이 3가지 분획물을 얻을 수 있었으며, 세가지 분획 중 B 분획에서 효소 저해 활성이 확인되어, Sephadex LH-20 column을 이용하여 EtOH을 \( 0 \rightarrow 100 \% \)까지 변화시키며 2차 분리를 수행한 결과 B 분획에서 3 가지 (B-1, B-2, B-3) 분획이 검출되었고, C 분획에서 2가지 (C-1, C-2)분획이 검출되었다. 이들 분획 중 B-2와 C-1에서 tyrosinase 저해활성이 검출되었으나, TLC 상에서 혼합물로 판정되어 순수물질로 분리하기 위하여, B-2와 C-1을 MCI-gel CHP-20 column을 이용하여 3차 분리 하였다. 이때 용리 조건은 MeOH을 \( 0 \rightarrow 100 \% \) 로 gra-dient로 용출하였다. 그 결과 Fig. 3에서와 같이 B-2로부터 B-2-1와 B-2-2을, C-1으로 부터 C-1-1, C-1-2 및 C-1-3의 단일 물질을 얻을 수 있었으며, 각 정제물을 이용하여 tyrosinase저해 활성을 측정한 결과 B-2-2(compound A)와 C-1-2(com-pound B)에서 높은 효소 저해 활성을 확인할 수 있었다. 정제된 2가지 compound의 동정을 위하여 구조 분석을 한 결과, compound A는 무색침상형으로 melting point가 \(186 \sim 189^{\circ} \mathrm{C} \) 이었고, \( [\mathrm{a}]_{\mathrm{D}} \)가 \( +2.4^{\circ}(\mathrm{C}=1.0 \), acetone\()\)이었으며, negative FAB-MS에서 305의 분자량을 얻었으므로 (-)-epicatechin 및 (+)-catechin에 산소 분자 1개가 더 결합한 물질임을 알 수 있었고, \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) spectrum에서 \( 2.56 \mathrm{ppm} \) (dd), \( 2.75 \mathrm{ppm} \) (dd)는 alipatic 영역의 \( 4-\mathrm{H} \) 를 의미하고 \( 4.13 \mathrm{ppm}(\mathrm{s})\), \(4.74 \mathrm{ppm} \) (d)은 catechol의 전형적인 signal로써 \( 3,2-\mathrm{H} \) 를 확인할 수 있었다. 또한 \( 5.86\), \(5.99 \mathrm{ppm} \) spectrum은 doublet의 분열 양상으로 \( 6,8-\mathrm{H} \)임을 시사하였고 \( 6.52 \mathrm{ppm} \)의 \( 2 \mathrm{H} \)분의 singlet는 \( 2^{\prime}, 6^{\prime}-\mathrm{H} \) 로서 (+)-gallocatechin으로 동정하였다. 이러한 결과는 Sakanaka등의 분석 결과와 일치하였다. Compound B는 염갈색의 무정형으로 \( [a]_{D} \)는 \( -157.6^{\circ}(\mathrm{C}=1.0 \), acetone\( ) \) 이었고 anisalde-hyde- \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)에서 갈색반응을 나타내었으며, negative FAB-MS에서 \( \mathrm{m} / \mathrm{z} ; 609[\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \)의 분자량을 얻었으므로 축합형 탄닌의 dimeric 이상의 화합물임을 알 수 있었다. Compound \( \mathrm{B} \)를 monomer로 제조하기 위해 thiolysis반응을 거쳐 Sephadex LH-20 column으로 분리한 결과 Fig. 4에서와 같이 compound B-1과 B-2가 \( 1: 1 \mathrm{~mol} \) 의 비율로 얻어 졌으며 B-1의 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) spectrum을 확인한 결과 \( 4.09 \mathrm{ppm} \) (2 \( \left.\mathrm{H}, \mathrm{s}^{2},-\mathrm{SCH}_{2}-\right) \), \( 7.16 \sim 7.46 \mathrm{ppm} \) (\( 5 \mathrm{H} \), aromatic)에서 benzylthioether화된 물질로 확인 되었고, 다시 물질의 확실한 귀속을 위하여 Raney \( \mathrm{Ni} \)하에 탈황 반응을 거쳐 Sephadex LH-20으로 정제한 결과 B-3를 얻을 수 있었다. B-3의 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) 을 살펴본 결과 com-pound A의 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \)과 일치하여 (+)-gallocatechin으로 동정 하였으며 B-2의 \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR} \) 도 (+)-gallocatechin의 signal과 일치하였다. 또한 compound B물질의 spectrum에서 상부에 해당하는 \( 4-\mathrm{H} \) 의 결합정수가 크므로 compound \( \mathrm{B} \) 는 상부에 \( (+) \)-gallocatechin, 하부에 (+)-gallocatechin이 \( 4 \mathrm{a}-8 \) 의 결합형태로 결합된 prodelphinidin B-3로 동정하였다. 이러한 결과는 안 등의 결과와 일치하였다.</p> <h2>Phenol성 화합물의 정제</h2><h3>Sephadex LH-20에 의한 정제</h3><p>Sephadex LH-20 column을 충진한 후 흡착성의 성질에 의해 분리하였다. 용출용매는 normal phase type으로서 \( \mathrm{EtOH} \)\( \rightarrow \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 및 \( 60 \% \mathrm{EtOH} \) 과 reverse phase type으로 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \rightarrow \mathrm{EtOH} \) 의 순으로 용출시켜 TLC 상에서 phenol성 물질의 유무 및 종류를 확인하고 농축, 건조하였다.</p><h3>MCI-gel CHP 20P에 의한 정제</h3><p>MCI-gel은 다공성 polystyren gel로서 흡착성을 이용하였으며 용출용매는 일반적인 reverse phase type인 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \rightarrow \mathrm{EtOH} \)로 용출하여 TLC 상에서 확인하였다.</p><h3>Thiolysis</h3><p>Nonaka 등의 방법에 따라 시료 \( 200 \mathrm{~mg} \) 을 \( \mathrm{AcOH}-\mathrm{EtOH}(10\mathrm{ml}) \)에 용해하고 benzylmercaptan \( 6 \mathrm{ml} \)를 첨가한 후 reflux 상태에서 6 시간 동안 완전 thiolysis하였다. 반응생성물은 Sephadex LH-20 column으로 \( 60 \% \mathrm{MeOH} \) 및 \( \mathrm{EtOH} \)을 사용하여 반복 정제하여 2 종류의 분해물을 얻었다.</p><h3>Desulfurization</h3><p>Nonaka 등의 방법에 따라 시료 \( 100 \mathrm{mg} \)을 \( 10 \% \) \( \mathrm{AcOH}-\mathrm{EtOH}(3 \mathrm{ml}) \)에 용해하고 Raney nikel ethanol slurry에 첨가하여 실온에서 2 시간 방치하였다. 방치 후 침전된 Raney nikel을 여과하고 감압 농축하여 Sephadex LH-20 column에서 \( \mathrm{EtOH} \)로 정제하였다.</p><h2>정제된 phenol성 화합물의 물리 및 화학적 성질</h2><p>Infrared (IR) spectrum은 할로겐화 알칼리 정제법을 이용하여 순수 분리된 시료 \( 1 \mathrm{mg} \) 을 \( \mathrm{KBr} 100 \mathrm{mg} \) 분말과 잘 섞어 배합한 후 가압 정제를 만들어 측정하였다. 핵자기 공명 분광기(Nuclear Magnetic Resonance, NMR) spectrum은 FT방법 (Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 정제물 \( 10 \mathrm{mg} \)을 측정용매 \( \mathrm{CDCl}_{3}+\mathrm{DMSO}-\mathrm{D}_{6}+\mathrm{D}_{2} \mathrm{O} \)에 \( 5 \sim 20 \%(\mathrm{~W} / \mathrm{V}) \) 비율로 용해시키고 TMS [Tetramethylsilane; \( \left(\mathrm{CH}_{3}\right)_{4}\mathrm{Si} \)]를 기준 물질로하여 PMR \( (300 \mathrm{MHz}) \)로 측정하였다. Mass spectrum 측정은 고체 시료 \( 1 \mathrm{mg} \)을 감압상태 \( \left(10^{-4} \sim 10^{-6} \mathrm{mmHg}\right) \)에서 negative ion FAB-mass spectrum을 이용하여 화학적 분석법에 의해 측정하였다. 이때 측정 용매로서는 thioglycerol을 사용하였으며, 측정조건에서 emitter 전류는 \( 22 \sim 28 \mathrm{eV} \)이며, 이온원의 가속가압이 \( 6 \sim 7 \mathrm{KV} \)에서 질량분석을 하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>최근에 피부 흑화의 생물학적 현상에 대한 이해가 높아짐에 따라 여러 가지 미백자원에 대한 연구가 가능해졌다. 이에 우리나라와 일본을 비롯하여 동양권 시장에서 경쟁을 원하는 다국적 기업들을 중심으로 새로운 표적에 작용하는 미백제의 연구가 활발히 진행되고 있으며, 우리나라에서는 화장품 법 시행과 함께 기능성 화장품의 연구 및 기술개발이 더욱 발전하고 있다. 기능성 화장품은 다른 화장품과 달리 안전성 유효성을 과학적으로 입증하여 관련기관으로부터 허가를 취득하여야 하는 제품이며, 따라서 소비자들의 효과에 대한 신뢰성이 높은 제품이다. 미백화장품의 원료개발에 있어 천연원료에 대한 연구는 우리 전통의학에 기반을 둔 원료개발이라는 점과 우리나라 소비자들의 화장품 선호도와 맞물려 국내 화장품 개발의 주력분야가 되고 있으며, 우리가 경쟁력을 확보할 수 있는 부분이므로 지속적인 개발이 필요하다.</p><p>피부의 색조를 결정하는 주요한 인자인 melanin은 표피 기저층의 melanocyte라고 불리는 색소세포 내의 melanosome에서 생합성 된다. 멜라닌 생합성의 시작물질인 tyrosine은 멜라닌 세포내에서의 tyrosinase에 의해 DOPA, DOPA quinone을 거쳐 indole-5,6-quinone으로의 중합에 의해 melanin을 생성하는 것으로 알려져 있다. 또한 사람의 피부색을 결정하는 가장 중요한 요인인 멜라닌(melanin)은 피부의 광노화나 일광각화증을 억제할 뿐만 아니라, 기미, 주근깨, 검버섯 등의 부분적인 hyperpigmentation을 일으키는 역할을 하고 있다. 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 melanocyte내의 소기관인 melanosome에서 생합성되며, melanocyte의 수지상 돌기를 통하여 주위의 keratinocyte로 전달되고, 피부의 각질층으로 이행한다. 상기의 색소 침착을 치유하기 위해 멜라닌 생성을 억제하는 hydroquinone, resorcinol 등의 페놀 유도체나, L-ascorbic acid와 그 유도체 및 kojic acid, arbu-tin, lactic acid, glucosamine, tunicamycin 등이 개발되었으나, 피부 자극이나 안정성에 문제가 있어 극히 제한된 양만 사용되고 있다.</p><p>감의 과육과 잎에 많은 양이 들어 있는 polyphenol 중 탄닌의 성상은 널리 알려져 있는데 그 중에서도 탄닌의 특징인 단백질 및 금속이온과의 결합에 관해서는 그 응용을 포함하여 연구가 진행되어 왔으며, 효소활성의 저해 작용도 중요한 탄닌의 역할로 인식되어지고 있다. Feudenberg와 Haslam에 의해 분류된 축합형 탄닌은 flavan-3-ol 유도체로서는 (-)-epicatechin, (+)-catechin 등이 가장 많으며 강산으로 처리하면 anthocyanidin류를 생성하므로 proanthocyanidin으로 총칭되고 있다. Namba 등은 86종의 생약에서 수종의 flavonol 및 flavonoid 성분을 분리하여 보고하였다. 최근 식물에 함유되어 있는 생리활성 성분에 대한 관심이 높아져 이들 생리활성 성분을 함유한 천연식물 소재들을 천연 항산화제와 항진균제의 원료로 이용하려는 시도가 많이 이루어지고 있다. 식품에 존재하는 생리활성 물질의 대부분은 페놀성 화합물이고 이들 페놀성 화합물은 일반적 으로 수용성이며 플라보노이드 류가 주를 이루고 단순한 페놀 류, 페놀산, 페닐 프로파노이드 류, 페놀성 퀴논 류들을 포함하는 것으로 항균, 항알러지, 항산화, 항종양, 항암, 충치방지, 심장질환 및 당뇨병 예방 등의 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.</p>따라서 각종 생리활성 물질로서 주목받고 있는 탄닌의 ty-rosinase 저해활성을 이용한 미백화장품으로 개발하기 위하여 떫은 감잎으로부터 분리한 tyrosinase 저해활성을 갖는 탄닌을 분리, 동정하고 화장품제조에 적용하여 보았다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험에 사용한 감나무잎은 경북상주소재의 감 농장에서 수확하여 건조 후 분쇄하여 저온저장하면서 이용하였다.</p><h2>감잎추출물의 조제</h2><p>감잎 분말 \( 1 \mathrm{~g} \) 을 물과 \( 60 \% \) ethanol \( 100 \mathrm{ml} \)에 넣고 6시간 동안 추출한 후 상징액을 Whatman No. 1로 여과하여 여액을 시료로 사용하였다.</p><h2>Phenol성 화합물 정량</h2><p>시료 \( 1 \mathrm{~ml} \) 를 \( 95 \% \) ethanol \( 1 \mathrm{~ml} \)와 증류수 \( 5 \mathrm{~ml} \)를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent \( 0.5 \mathrm{~ml} \)를 넣어 잘 섞어주고, 5 분간 방치한 후, \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} 1 \mathrm{~ml} \)를 가한 후, 흡광도 \( 725 \mathrm{~nm} \)에서 1 시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하였다.</p><h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2><p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 \( 0.175 \mathrm{~M} \) sodium phosphate buffer ( \( \mathrm{pH} \) 6.8) \( 0.5 \mathrm{~ml} \)에 \( 10 \mathrm{~mM} \) L-DOPA를 녹인 기질액 \( 0.2 \mathrm{~ml} \) 및 시료용액 \( 0.1 \mathrm{~ml} \)의 혼합액에 mushroom tyrosinase (\( 110\mathrm{~unit} / \mathrm{ml} \)) \( 0.2 \mathrm{~ml} \)을 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \( 475 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p><p>저해율(\( \% \))=(1- \( \left.\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p><h2>Melanoma cell (B16F10)에서의 melanin 생합성 저해율 측정</h2><p>피부 멜라노마 세포로부터의 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi 등의 방법에 따라 측정하였다. DMEM 배지로 배양 된 멜라노마 세포를 \( 100 \mathrm{mm} \) culture dish에 \( 2 \times 10^{6} \mathrm{cell} / \mathrm{dish} \) 가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 \( 2 \mathrm{ml} \) 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액( \( \mathrm{pH} \) 7.4)으로 세척하였다. 그. 다음 \( 0.25 \mathrm{M} \) trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 \( 1 \times 10^{6} \) 세포 당 \( 1 \mathrm{ml} \)의 \( 5 \% \) TCA로 처리하고, 2,500 rpm으로 2회 원심분리한 후 분리된 melanin을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether:ethanol (1:3) \( 1 \mathrm{ml} \) 를 가하여 2회 원심분리 한 후 ether \( 1 \mathrm{ml} \)로 세척 건조시켰다. 건조된 melanin에 \( 1 \mathrm{~N} \) \( \mathrm{NaOH} \)를 \( 1 \mathrm{~ml} \) 가하여 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응시킨 후 분광 광도계 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. Melanin 생합성 저해는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p><p>Melanin 생합성 저해율(\( \%\)) \(= 1- \left(\frac{\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\text { 대조구의 흡광도 }}\right) \times 100 \)</p> <h2>감나무잎 추출물을 활용한 화장품(essence)의 제조</h2><p>Essence제품의 제조는 수상에 보습제인 glycerin, poly ethylene glycol 1500과 방부제를 넣어 \( 80^{\circ} \mathrm{C} \)까지 가열하여 용해시킨 후, homo mixer (T.K. Homo Mixer Mark Ⅱ, Tokushu kika kogyo Co. Ltd., Osaka, Japan)를 이용하여 3,000 rpm에서 2분간 유화하고, 미리 분산한 lubrajel DV와 점증제인 carbopol 940을 넣고 2분간 유화하였다. Triethanolamine (TEA)를 넣고 3분간 더 유화한 후, 에탄올상인 PEG-40 hydro genated castor oil을 넣어 2분간 유화한 후 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 까지 냉각하고 탈기하여 제조하였다.</p><h2>감나무잎 추출물을 활용한 화장품의 안정성 실험</h2><p>\( \mathrm{pH} \) 측정은 Metrohm (Metrohm 691, Metrohm UK Ltd. Herisau, Switzerland)을 이용하여 \( 25 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관한 essence를 측정하였다. 점도측정은 Brookfield Viscometer를 이용하여 스핀들(spindle) No. 4 를 택하여 \( 6 \mathrm{rpm} \)에서 1분간 점도를 측정하였다. 화장품의 온도에 따른 안성성 시험법은 소정의 온도 조건 (\( 0\), \(25\), \(40^{\circ} \mathrm{C}\))에 보관하여, 경시적 변화에 따른 유분리, 침전, 변색 등의 상태변화를 관찰하였다. 인공광 노출 시험은 투명용기에 화장품을 담아 sun lamp 장치(내부온도는 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \), 광원과 용기의 거리는 \( 20.3 \mathrm{~cm} \))에 넣은 후 인공 \( \mathrm{UV} \) 조사 후 0.5, 1, 2, 3시간 동안의 변색, 발색, 변취, 산패 등의 변화를 관찰하였다. 또한 자연광 노출 시험은 화장품을 투명용기에 담아 햇빛이 잘 드는 실외에 보관하여 7, 15일 동안의 변색, 발색, 변취, 산패 등의 변화를 관찰하였다. 온도순환에 따른 안정성 시험은 화장품을 투명용기에 담아 \( -15^{\circ} \mathrm{C}\), \(-10^{\circ} \mathrm{C}\), \(-5^{\circ} \mathrm{C} \), \( 0^{\circ} \mathrm{C}\), \(5^{\circ} \mathrm{C}\), \(10^{\circ} \mathrm{C}\), \(15^{\circ} \mathrm{C}\), \(25^{\circ} \mathrm{C}\), \(37.5^{\circ} \mathrm{C}\), \(40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 각각 24시간 보관한 후 이를 1 cycle로 하여 10회 반복 시행하여 온도 순환에 따른 안정성을 평가하였다. 냉해동순환(freeze & thaw cycling)에 따른 안정성 시험은 화장품을 투명용기에 담아 \( -10^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에 각각 24 시간 보관하여 이를 1 cycle로 하여 3, 7일 동안의 안정성을 관찰하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>초록 : 감나무 잎으로 부터 분리한 tyrosinase 억제물질의 응용</h1><p>감잎으로부터 tyrosinase 억제물질의 추출을 위하여 \\( 60 \\% \\) ethanol을 사용하여 추출한 경우 추출물의 phenol성 물질 함량이 \\( 21.91 \\mathrm{mg} / \\mathrm{g} \\)로 가장 높았고, tyrosinase 억제효과도 \\( 37 \\% \\)의 억제율로 가장 높게 나타났다.", "감잎 추출물로부터 tyrosinase 저해 활성 물질을 정제하기 위하여 Sephadex LH-20 column과 MCl-gel CHP-20 column을 이용하여 gradient로 용출한 결과 tyrosinase 저해 활성을 가지는 2가지 순수한 compound를 정제하였으며, 정제 된 2가지 compound를 구조 동정한 결과, (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3이었다.", "정제물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3는 \\( 29.5\\), \\(40.2 \\% \\)의 저해활성을 나타내었으며, melanoma 세포에서의 멜라닌 생합성 저해효과를 측정한 결과 (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3는 각각 \\( 32.5\\), \\( 46.7 \\% \\)의 저해활성을 나타내어 멜라닌생성억제효과가 매우 뛰어남을 알 수 있었다.", "정제된 미백물질을 이용하여 제조한 essence 제품의 안정성을 살펴본 결과, 미백 essence제품의 \\( \\mathrm{pH} \\) 는 \\( 10,000 \\mathrm{ppm} \\)의 농도에서 \\( 4.90 \\sim 4.95 \\) 였으며, 점도는 \\( 23,000 \\sim 26,000 \\)로 60일 동안의 저장기간 동안 큰 변화를 나타내지 않았다.", "일반적 보존 시험인 온도에 따른 안정성과 광안정성(인공광, 자연광) 검사에서도 안정하였으며, 특수, 가혹 보존 시험인 온도순환에 따른 안정성 검사에서도 상의 분리와 변색, 변취 없이 모두 안정함을 확인할 수 있었다.", "</p> <h2>정제물의 tyrosinase 저해활성 확인</h2><p>Tyrosinase는 피부 멜라닌 생성에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, melanosome 내에서 tyrosine을 산화시켜 DOPA를 만드는 tyrosine hydroxylase로, DOPA를 산화시켜 DOPA quinone을 만드는 DOPA oxidase로서 작용하여 멜라닌 중합체를 합성하는데 중요한 효소로 작용한다.", "이렇게 피부 내에서 멜라닌 중합체 생합성을 효과적으로 저해할 수 있는 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 Table 4와 같이 측정되었다.", "감잎으로부터 분리한 (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3는 각각 \\( 29.5\\), \\(40.2 \\% \\)의 저해활성을 나타내어 tyrosinase 저해활성이 비교적 높게 나타났다.", "Lee 등의 제주산 식물을 이용한 tyrosinase 억제 활성을 측정한 결과 \\( 1,000 \\mathrm{ppm} \\)의 농도에서 \\( 10.0 \\% \\) 미만의 효과가 나타났으며, Jung 등의 토사자, 숙지황, 오가피 추출물 \\( 1,000 \\mathrm{ppm} \\) 에서 \\( 30.0 \\% \\)미만의 저해능을 나타낸 결과와, An 등의 진달래꽃 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 열수 및 에탄올 추출물 \\( 1,000 \\mathrm{ppm} \\)에서 각각 \\( 24.0\\), \\(48.0 \\% \\)의 저해를 나타낸 결과와 비교하여 감잎의 활성이 우수함을 확인할 수 있었다.", "또한 Kwak 등의 쑥 추출물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 \\( 10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)에서 hexane, chloroform 및 ethyl acetate로 분획한 추출물이 각각 \\( 55.8\\), \\(57.5\\), \\(60.2 \\% \\)의 효과를 나타내었으며, Kwak 등이 치자열매의 에탄올 추출물을 hexane, chloroform 및 ethyl acetate로 분획한 치차열매 분획물의 tyrosinase 저해능이 \\( 10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 에서 \\( 72.0 \\%\\), \\(59.0 \\%\\), \\(99.7 \\% \\)를 나타내었다고 보고한 것과 유사한 저해활성을 나타내어 tyrosinase 저해활성이 우수함을 확인할 수 있었다.", "</p><h2>Melanoma cell (B16F10)에서의 melanin 생합성 저해율 확인</h2><p>감잎 정제물을 천연 미백제로 사용하기 위하여 melanoma세포에서의 멜라닌 생합성을 측정한 결과 Table 5와 같이 측정되었다.", "감잎으로부터 분리한 (+)-gallocatechin과 prodelphinidin B-3는 멜라닌생성 저해효과가 각각 \\( 32.5\\), \\(46.7 \\% \\) 의 저해활성을 나타내었다.", "이는 Kwak 등의 치자 열매 추출물의 B16F10 melanoma 세포의 melanin 억제효과가 \\( 10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)에서 열수 추출물의 경우 \\( 36.3 \\% \\), 에탄올 추출물의 경우 \\( 55.9 \\% \\) 로 나타나 감잎의 멜라닌 생성억제효과와 비슷함을 알 수 있었고, Hwang 등의 인삼의 부위별 멜라닌 생성억제효과에서 건조 인삼시료 \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서 \\( 27.0 \\% \\) 의 저해율을 나타내었으며, Cho 등의 유기농의 멜라닌 생성 억제 효과에서 \\( 200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 유기농 butanol 분획물의 경우 \\( 25.0 \\% \\) 의 저해율을 나타내었고, Kim 등의 안정화시킨 vitamin C와 파이토스핑고신의 멜라닌 생성 억제 효과에서 대조군인 코직산이 \\( 100 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서 \\( 44.7 \\% \\) 의 억제효과와 비교하여, 감잎의 멜라닌 저해 효과가 우수함을 확인할 수 있었으며, 우수한 천연 미백제로 사용이 가능할 것으로 사료된다.", "</p> <h2>감나무잎 추출물을 활용한 essence 제품의 안정성</h2><p>Table 6의 처방에 따라 제조하여 실온 \\( \\left(25^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)에서 보관한 essence 제품을 60일간의 \\( \\mathrm{pH} \\) 와 점도 측정 결과 Fig.", "5 와 같았다.", "Essence 제품의 경우 \\( 10,000 \\mathrm{ppm} \\)의 농도에서 \\( \\mathrm{pH} \\) 측정결과 \\( 4.90 \\sim 4.95 \\)로 60일 동안의 저장기간 동안 큰 변화를 나타내지 않았다.", "Essence 제품의 점도를 Brookfield LV-Ⅱ digital viscometer로 측정한 결과 실온 \\( \\left(25^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\) 에서 보관한 essence 제품의 점도를 60 일 동안 측정한 결과 \\( 23,000 \\sim 26,000 \\mathrm{cP} \\) 사이에 분포했으며 저장기간 동안 수치상의 큰 변화 없이 안정하였다.", "화장품의 열에 의한 경시적 품질열화현상을 관찰하기 위해서 온도안정성 평가를 실시한 결과 Table 7 과 같이 \\( 0\\), \\(25\\), \\(40^{\\circ} \\mathrm{C} \\)의 온도에서 보관한 essence 제품은 60일 동안 모든 온도 조건에서 안정한 것으로 나타났다.", "불안정한 화장품의 경우 고온 \\( (40^{\\circ} \\mathrm{C} \\) )에서는 외관의 산패, 변색, 변취, 점도, 증발, 부유, 침전, 탁도(투명도), 분리 등이 관찰되며, 저온에서는 응고, 침전, 탁도(투명도), 결정 석출, 분리 등의 화학적◦물리적 변화가 관찰된다.", "이와 같은 현상은 사용성에 큰 영향을 줄뿐 아니라, 화장품이 갖는 미적외관, 이미지의 손실에도 영향을 준다.", "일반적으로 화장품의 품질수명은 소비자가 끝까지 사용할 때 까지를 보증해야 하므로 안정성을 체크해야 하며, essence 제품은 60일 동안 경시적 변화 없이 안정하였다.", "Essence 제품의 인공광과 자연광에 대한 안정성을 실시한 결과 Table 8과 9 와 같이 저장 기간 동안 모두 안정함을 나타내었다.", "이러한 결과로 볼 때 감나무 잎의 미백물질이 첨가된 화장품은 제조 후 태양광과 형광등의 빛에 노출되어도 비교적 안정성을 유지한다고 판단되었다.", "온도순환에 따른 안정성 시험법은 4계절이 분명한 우리나라에서 화장품의 저온 및 고온의 보관조건에 따른 물성변화를 관찰하기 위하여 실시하고 있으며, 또한 온도 변화에 따라 유화◦가용화에서의 물성변화를 관찰하기 위하여 실시한다.", "제품의 대부분은 고온에서 가수분해 현상 및 기타 현상 등이 빨리 일어나며, 저온인 경우는 부피팽창, 용해도차에 의한 계면막 손상, 침전 등이 일어난다.", "Essence 제품을 \\( -15\\), \\(-10\\), \\(-5\\), \\(0\\), \\(5\\), \\(10\\), \\(15\\), \\(25\\), \\(37.5\\), \\(40^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 각각 24시간 보관한 후 온도 순환에 따른 안정성을 관찰한 결과 Table 10과 같이 10 cycle 모두에서 상의 분리와 변색, 변취 없이 안정함을 육안으로 확인할 수 있었으며, essence 제품을 급격한 온도 조건인 고온 \\( \\left(25^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)과 저온 \\( \\left(-10^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)의 온도 변화를 주어 각각 24시간 보관하여 3일과 7일차에 안정성을 관찰한 결과 Table 11과 같이 상의 분리와 변색, 변취 없이 모두 안정함을 확인할 수 있었다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>Ethanol 농도에 따른 phenol성 물질의 용출량</h2><p>감나무잎 추출물의 추출 조건을 확립하기 위해 다양한 농도의 ethanol을 추출용매로 하여 phenol성 물질의 용출량을 측정하였다.", "그 결과 Fig.", "1 과 같이 \\( 60 \\% \\) ethanol을 사용하여 추출하였을 경우 가장 높은 용출량을 확인 할 수 있었으며, tyrosinase 억제 효과도 \\( 60 \\% \\) ethanol 추출물에서 가장 높게 나타나는 것으로 보아 phenol성 물질의 함량과의 상관관계가 인정되었다.", "따라서 이후의 실험은 물 추출물과 \\( 60 \\% \\) 에탄올 추출물을 이용하여 실시하였다.", "</p><h2>추출물의 tyrosinase 억제 효과 측정</h2><p>Tyrosinase는 tyrosine으로부터 3,4-dihydroxyphenylalanine과 DOPA-quinone을 거쳐 최종적으로 흑갈색의 melanin 색소 생성에 관계하는 효소로써 야채나 과실류 특히 감자의 갈변현상과 피부에 암갈색의 색소 물질을 침착 시키는 원인이 되기도 한다.", "본 연구에서는 식물 유래 추출물로부터 미백 및 갈변 저해물질을 분리하고 미백효과를 검토하여 기능성 화장품 소재로서 활용키 위해 tyrosinase 억제효과를 검토한 결과 Fig.2 에서와 같이 감잎 \\( 60 \\% \\) 에탄올 추출물에서 약 \\( 37 \\% \\) 의 tyrosinase 억제효과를 나타내어 가장 높은 저해효과를 확인할 수 있었다.", "그리고 전체적으로 물 추출물보다는 에탄올 추출물이 tyrosinase 저해활성이 높은 것을 확인할 수 있었다.", "Tyrosinase 저해활성은 폴리페놀의 종류 및 그 구조와 상관관계가 있는 것으로 Kim 등은 보고하였고, 또한 폴리페놀 중에서도 catechin류는 tyrosinase 저해활동을 나타내지 않았지만, gallocatechin이나 epicatechin류에서 높은 저해활성을 나타내었으며, monomer보다 dimer에서 저해활성이 더 우수하였다고 안 등은 보고하였다.", "</p><h2>감잎 추출물로부터 tyrosinase 저해 물질의 정제 및 동정</h2><p>Tyrosinase 저해 활성 측정 결과 감잎 추출물에서 \\( 37 \\% \\) 의 저해력을 나타내어 감잎으로부터 효소활성 저해 물질로 생각되어지는 화합물인 polyphenol류를 정제하고자 하였다.", "감잎을 \\( 60 \\%\\) EtOH로 추출하여 농축하고 Sephadex LH-20 column에 충진하여 \\( 60 \\%\\) EtOH을 용매로 하여 용리한 결과 Fig.", "3과 같이 3가지 분획물을 얻을 수 있었으며, 세가지 분획 중 B 분획에서 효소 저해 활성이 확인되어, Sephadex LH-20 column을 이용하여 EtOH을 \\( 0 \\rightarrow 100 \\% \\)까지 변화시키며 2차 분리를 수행한 결과 B 분획에서 3 가지 (B-1, B-2, B-3) 분획이 검출되었고, C 분획에서 2가지 (C-1, C-2)분획이 검출되었다.", "이들 분획 중 B-2와 C-1에서 tyrosinase 저해활성이 검출되었으나, TLC 상에서 혼합물로 판정되어 순수물질로 분리하기 위하여, B-2와 C-1을 MCI-gel CHP-20 column을 이용하여 3차 분리 하였다.", "이때 용리 조건은 MeOH을 \\( 0 \\rightarrow 100 \\% \\) 로 gra-dient로 용출하였다.", "그 결과 Fig.", "3에서와 같이 B-2로부터 B-2-1와 B-2-2을, C-1으로 부터 C-1-1, C-1-2 및 C-1-3의 단일 물질을 얻을 수 있었으며, 각 정제물을 이용하여 tyrosinase저해 활성을 측정한 결과 B-2-2(compound A)와 C-1-2(com-pound B)에서 높은 효소 저해 활성을 확인할 수 있었다.", "정제된 2가지 compound의 동정을 위하여 구조 분석을 한 결과, compound A는 무색침상형으로 melting point가 \\(186 \\sim 189^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 이었고, \\( [\\mathrm{a}]_{\\mathrm{D}} \\)가 \\( +2.4^{\\circ}(\\mathrm{C}=1.0 \\), acetone\\()\\)이었으며, negative FAB-MS에서 305의 분자량을 얻었으므로 (-)-epicatechin 및 (+)-catechin에 산소 분자 1개가 더 결합한 물질임을 알 수 있었고, \\( { }^{1} \\mathrm{H}-\\mathrm{NMR} \\) spectrum에서 \\( 2.56 \\mathrm{ppm} \\) (dd), \\( 2.75 \\mathrm{ppm} \\) (dd)는 alipatic 영역의 \\( 4-\\mathrm{H} \\) 를 의미하고 \\( 4.13 \\mathrm{ppm}(\\mathrm{s})\\), \\(4.74 \\mathrm{ppm} \\) (d)은 catechol의 전형적인 signal로써 \\( 3,2-\\mathrm{H} \\) 를 확인할 수 있었다.", "또한 \\( 5.86\\), \\(5.99 \\mathrm{ppm} \\) spectrum은 doublet의 분열 양상으로 \\( 6,8-\\mathrm{H} \\)임을 시사하였고 \\( 6.52 \\mathrm{ppm} \\)의 \\( 2 \\mathrm{H} \\)분의 singlet는 \\( 2^{\\prime}, 6^{\\prime}-\\mathrm{H} \\) 로서 (+)-gallocatechin으로 동정하였다.", "이러한 결과는 Sakanaka등의 분석 결과와 일치하였다.", "Compound B는 염갈색의 무정형으로 \\( [a]_{D} \\)는 \\( -157.6^{\\circ}(\\mathrm{C}=1.0 \\), acetone\\( ) \\) 이었고 anisalde-hyde- \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{SO}_{4} \\)에서 갈색반응을 나타내었으며, negative FAB-MS에서 \\( \\mathrm{m} / \\mathrm{z} ; 609[\\mathrm{M}-\\mathrm{H}]^{-} \\)의 분자량을 얻었으므로 축합형 탄닌의 dimeric 이상의 화합물임을 알 수 있었다.", "Compound \\( \\mathrm{B} \\)를 monomer로 제조하기 위해 thiolysis반응을 거쳐 Sephadex LH-20 column으로 분리한 결과 Fig.", "4에서와 같이 compound B-1과 B-2가 \\( 1: 1 \\mathrm{~mol} \\) 의 비율로 얻어 졌으며 B-1의 \\( { }^{1} \\mathrm{H}-\\mathrm{NMR} \\) spectrum을 확인한 결과 \\( 4.09 \\mathrm{ppm} \\) (2 \\( \\left.\\", "mathrm{H}, \\mathrm{s}^{2},-\\mathrm{SCH}_{2}-\\right) \\), \\( 7.16 \\sim 7.46 \\mathrm{ppm} \\) (\\( 5 \\mathrm{H} \\), aromatic)에서 benzylthioether화된 물질로 확인 되었고, 다시 물질의 확실한 귀속을 위하여 Raney \\( \\mathrm{Ni} \\)하에 탈황 반응을 거쳐 Sephadex LH-20으로 정제한 결과 B-3를 얻을 수 있었다.", "B-3의 \\( { }^{1} \\mathrm{H}-\\mathrm{NMR} \\) 을 살펴본 결과 com-pound A의 \\( { }^{1} \\mathrm{H}-\\mathrm{NMR} \\)과 일치하여 (+)-gallocatechin으로 동정 하였으며 B-2의 \\( { }^{1} \\mathrm{H}-\\mathrm{NMR} \\) 도 (+)-gallocatechin의 signal과 일치하였다.", "또한 compound B물질의 spectrum에서 상부에 해당하는 \\( 4-\\mathrm{H} \\) 의 결합정수가 크므로 compound \\( \\mathrm{B} \\) 는 상부에 \\( (+) \\)-gallocatechin, 하부에 (+)-gallocatechin이 \\( 4 \\mathrm{a}-8 \\) 의 결합형태로 결합된 prodelphinidin B-3로 동정하였다.", "이러한 결과는 안 등의 결과와 일치하였다.", "</p> <h2>Phenol성 화합물의 정제</h2><h3>Sephadex LH-20에 의한 정제</h3><p>Sephadex LH-20 column을 충진한 후 흡착성의 성질에 의해 분리하였다.", "용출용매는 normal phase type으로서 \\( \\mathrm{EtOH} \\)\\( \\rightarrow \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\) 및 \\( 60 \\% \\mathrm{EtOH} \\) 과 reverse phase type으로 \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\rightarrow \\mathrm{EtOH} \\) 의 순으로 용출시켜 TLC 상에서 phenol성 물질의 유무 및 종류를 확인하고 농축, 건조하였다.", "</p><h3>MCI-gel CHP 20P에 의한 정제</h3><p>MCI-gel은 다공성 polystyren gel로서 흡착성을 이용하였으며 용출용매는 일반적인 reverse phase type인 \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} \\rightarrow \\mathrm{EtOH} \\)로 용출하여 TLC 상에서 확인하였다.", "</p><h3>Thiolysis</h3><p>Nonaka 등의 방법에 따라 시료 \\( 200 \\mathrm{~mg} \\) 을 \\( \\mathrm{AcOH}-\\mathrm{EtOH}(10\\mathrm{ml}) \\)에 용해하고 benzylmercaptan \\( 6 \\mathrm{ml} \\)를 첨가한 후 reflux 상태에서 6 시간 동안 완전 thiolysis하였다.", "반응생성물은 Sephadex LH-20 column으로 \\( 60 \\% \\mathrm{MeOH} \\) 및 \\( \\mathrm{EtOH} \\)을 사용하여 반복 정제하여 2 종류의 분해물을 얻었다.", "</p><h3>Desulfurization</h3><p>Nonaka 등의 방법에 따라 시료 \\( 100 \\mathrm{mg} \\)을 \\( 10 \\% \\) \\( \\mathrm{AcOH}-\\mathrm{EtOH}(3 \\mathrm{ml}) \\)에 용해하고 Raney nikel ethanol slurry에 첨가하여 실온에서 2 시간 방치하였다.", "방치 후 침전된 Raney nikel을 여과하고 감압 농축하여 Sephadex LH-20 column에서 \\( \\mathrm{EtOH} \\)로 정제하였다.", "</p><h2>정제된 phenol성 화합물의 물리 및 화학적 성질</h2><p>Infrared (IR) spectrum은 할로겐화 알칼리 정제법을 이용하여 순수 분리된 시료 \\( 1 \\mathrm{mg} \\) 을 \\( \\mathrm{KBr} 100 \\mathrm{mg} \\) 분말과 잘 섞어 배합한 후 가압 정제를 만들어 측정하였다.", "핵자기 공명 분광기(Nuclear Magnetic Resonance, NMR) spectrum은 FT방법 (Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 정제물 \\( 10 \\mathrm{mg} \\)을 측정용매 \\( \\mathrm{CDCl}_{3}+\\mathrm{DMSO}-\\mathrm{D}_{6}+\\mathrm{D}_{2} \\mathrm{O} \\)에 \\( 5 \\sim 20 \\%(\\mathrm{~W} / \\mathrm{V}) \\) 비율로 용해시키고 TMS [Tetramethylsilane; \\( \\left(\\mathrm{CH}_{3}\\right)_{4}\\mathrm{Si} \\)]를 기준 물질로하여 PMR \\( (300 \\mathrm{MHz}) \\)로 측정하였다.", "Mass spectrum 측정은 고체 시료 \\( 1 \\mathrm{mg} \\)을 감압상태 \\( \\left(10^{-4} \\sim 10^{-6} \\mathrm{mmHg}\\right) \\)에서 negative ion FAB-mass spectrum을 이용하여 화학적 분석법에 의해 측정하였다.", "이때 측정 용매로서는 thioglycerol을 사용하였으며, 측정조건에서 emitter 전류는 \\( 22 \\sim 28 \\mathrm{eV} \\)이며, 이온원의 가속가압이 \\( 6 \\sim 7 \\mathrm{KV} \\)에서 질량분석을 하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>최근에 피부 흑화의 생물학적 현상에 대한 이해가 높아짐에 따라 여러 가지 미백자원에 대한 연구가 가능해졌다.", "이에 우리나라와 일본을 비롯하여 동양권 시장에서 경쟁을 원하는 다국적 기업들을 중심으로 새로운 표적에 작용하는 미백제의 연구가 활발히 진행되고 있으며, 우리나라에서는 화장품 법 시행과 함께 기능성 화장품의 연구 및 기술개발이 더욱 발전하고 있다.", "기능성 화장품은 다른 화장품과 달리 안전성 유효성을 과학적으로 입증하여 관련기관으로부터 허가를 취득하여야 하는 제품이며, 따라서 소비자들의 효과에 대한 신뢰성이 높은 제품이다.", "미백화장품의 원료개발에 있어 천연원료에 대한 연구는 우리 전통의학에 기반을 둔 원료개발이라는 점과 우리나라 소비자들의 화장품 선호도와 맞물려 국내 화장품 개발의 주력분야가 되고 있으며, 우리가 경쟁력을 확보할 수 있는 부분이므로 지속적인 개발이 필요하다.", "</p><p>피부의 색조를 결정하는 주요한 인자인 melanin은 표피 기저층의 melanocyte라고 불리는 색소세포 내의 melanosome에서 생합성 된다.", "멜라닌 생합성의 시작물질인 tyrosine은 멜라닌 세포내에서의 tyrosinase에 의해 DOPA, DOPA quinone을 거쳐 indole-5,6-quinone으로의 중합에 의해 melanin을 생성하는 것으로 알려져 있다.", "또한 사람의 피부색을 결정하는 가장 중요한 요인인 멜라닌(melanin)은 피부의 광노화나 일광각화증을 억제할 뿐만 아니라, 기미, 주근깨, 검버섯 등의 부분적인 hyperpigmentation을 일으키는 역할을 하고 있다.", "멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 melanocyte내의 소기관인 melanosome에서 생합성되며, melanocyte의 수지상 돌기를 통하여 주위의 keratinocyte로 전달되고, 피부의 각질층으로 이행한다.", "상기의 색소 침착을 치유하기 위해 멜라닌 생성을 억제하는 hydroquinone, resorcinol 등의 페놀 유도체나, L-ascorbic acid와 그 유도체 및 kojic acid, arbu-tin, lactic acid, glucosamine, tunicamycin 등이 개발되었으나, 피부 자극이나 안정성에 문제가 있어 극히 제한된 양만 사용되고 있다.", "</p><p>감의 과육과 잎에 많은 양이 들어 있는 polyphenol 중 탄닌의 성상은 널리 알려져 있는데 그 중에서도 탄닌의 특징인 단백질 및 금속이온과의 결합에 관해서는 그 응용을 포함하여 연구가 진행되어 왔으며, 효소활성의 저해 작용도 중요한 탄닌의 역할로 인식되어지고 있다.", "Feudenberg와 Haslam에 의해 분류된 축합형 탄닌은 flavan-3-ol 유도체로서는 (-)-epicatechin, (+)-catechin 등이 가장 많으며 강산으로 처리하면 anthocyanidin류를 생성하므로 proanthocyanidin으로 총칭되고 있다.", "Namba 등은 86종의 생약에서 수종의 flavonol 및 flavonoid 성분을 분리하여 보고하였다.", "최근 식물에 함유되어 있는 생리활성 성분에 대한 관심이 높아져 이들 생리활성 성분을 함유한 천연식물 소재들을 천연 항산화제와 항진균제의 원료로 이용하려는 시도가 많이 이루어지고 있다.", "식품에 존재하는 생리활성 물질의 대부분은 페놀성 화합물이고 이들 페놀성 화합물은 일반적 으로 수용성이며 플라보노이드 류가 주를 이루고 단순한 페놀 류, 페놀산, 페닐 프로파노이드 류, 페놀성 퀴논 류들을 포함하는 것으로 항균, 항알러지, 항산화, 항종양, 항암, 충치방지, 심장질환 및 당뇨병 예방 등의 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.", "</p>따라서 각종 생리활성 물질로서 주목받고 있는 탄닌의 ty-rosinase 저해활성을 이용한 미백화장품으로 개발하기 위하여 떫은 감잎으로부터 분리한 tyrosinase 저해활성을 갖는 탄닌을 분리, 동정하고 화장품제조에 적용하여 보았다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험 재료</h2><p>본 실험에 사용한 감나무잎은 경북상주소재의 감 농장에서 수확하여 건조 후 분쇄하여 저온저장하면서 이용하였다.", "</p><h2>감잎추출물의 조제</h2><p>감잎 분말 \\( 1 \\mathrm{~g} \\) 을 물과 \\( 60 \\% \\) ethanol \\( 100 \\mathrm{ml} \\)에 넣고 6시간 동안 추출한 후 상징액을 Whatman No. 1로 여과하여 여액을 시료로 사용하였다.", "</p><h2>Phenol성 화합물 정량</h2><p>시료 \\( 1 \\mathrm{~ml} \\) 를 \\( 95 \\% \\) ethanol \\( 1 \\mathrm{~ml} \\)와 증류수 \\( 5 \\mathrm{~ml} \\)를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent \\( 0.5 \\mathrm{~ml} \\)를 넣어 잘 섞어주고, 5 분간 방치한 후, \\( \\mathrm{Na}_{2} \\mathrm{CO}_{3} 1 \\mathrm{~ml} \\)를 가한 후, 흡광도 \\( 725 \\mathrm{~nm} \\)에서 1 시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로 양을 환산하였다.", "</p><h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2><p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다.", "반응구는 \\( 0.175 \\mathrm{~M} \\) sodium phosphate buffer ( \\( \\mathrm{pH} \\) 6.8) \\( 0.5 \\mathrm{~ml} \\)에 \\( 10 \\mathrm{~mM} \\) L-DOPA를 녹인 기질액 \\( 0.2 \\mathrm{~ml} \\) 및 시료용액 \\( 0.1 \\mathrm{~ml} \\)의 혼합액에 mushroom tyrosinase (\\( 110\\mathrm{~unit} / \\mathrm{ml} \\)) \\( 0.2 \\mathrm{~ml} \\)을 첨가하여 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 \\( 475 \\mathrm{~nm} \\)에서 측정하였다.", "Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.", "</p><p>저해율(\\( \\% \\))=(1- \\( \\left.\\", "frac{\\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\\text { 대조구의 흡광도 }}\\right) \\times 100 \\)</p><h2>Melanoma cell (B16F10)에서의 melanin 생합성 저해율 측정</h2><p>피부 멜라노마 세포로부터의 melanin 생합성 저해 측정은 Hosoi 등의 방법에 따라 측정하였다.", "DMEM 배지로 배양 된 멜라노마 세포를 \\( 100 \\mathrm{mm} \\) culture dish에 \\( 2 \\times 10^{6} \\mathrm{cell} / \\mathrm{dish} \\) 가 되게 분주하고 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 \\( 2 \\mathrm{ml} \\) 첨가하고, 48시간 후에 인산완충액( \\( \\mathrm{pH} \\) 7.4)으로 세척하였다.", "그. 다음 \\( 0.25 \\mathrm{M} \\) trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 \\( 1 \\times 10^{6} \\) 세포 당 \\( 1 \\mathrm{ml} \\)의 \\( 5 \\% \\) TCA로 처리하고, 2,500 rpm으로 2회 원심분리한 후 분리된 melanin을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether:ethanol (1:3) \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 가하여 2회 원심분리 한 후 ether \\( 1 \\mathrm{ml} \\)로 세척 건조시켰다.", "건조된 melanin에 \\( 1 \\mathrm{~N} \\) \\( \\mathrm{NaOH} \\)를 \\( 1 \\mathrm{~ml} \\) 가하여 \\( 80^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 1 시간 반응시킨 후 분광 광도계 \\( 405 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하였다.", "Melanin 생합성 저해는 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.", "</p><p>Melanin 생합성 저해율(\\( \\%\\)) \\(= 1- \\left(\\frac{\\text { 시료첨가군의 흡광도 }}{\\text { 대조구의 흡광도 }}\\right) \\times 100 \\)</p> <h2>감나무잎 추출물을 활용한 화장품(essence)의 제조</h2><p>Essence제품의 제조는 수상에 보습제인 glycerin, poly ethylene glycol 1500과 방부제를 넣어 \\( 80^{\\circ} \\mathrm{C} \\)까지 가열하여 용해시킨 후, homo mixer (T.K. Homo Mixer Mark Ⅱ, Tokushu kika kogyo Co. Ltd., Osaka, Japan)를 이용하여 3,000 rpm에서 2분간 유화하고, 미리 분산한 lubrajel DV와 점증제인 carbopol 940을 넣고 2분간 유화하였다.", "Triethanolamine (TEA)를 넣고 3분간 더 유화한 후, 에탄올상인 PEG-40 hydro genated castor oil을 넣어 2분간 유화한 후 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 까지 냉각하고 탈기하여 제조하였다.", "</p><h2>감나무잎 추출물을 활용한 화장품의 안정성 실험</h2><p>\\( \\mathrm{pH} \\) 측정은 Metrohm (Metrohm 691, Metrohm UK Ltd.", "Herisau, Switzerland)을 이용하여 \\( 25 \\pm 1^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에 보관한 essence를 측정하였다.", "점도측정은 Brookfield Viscometer를 이용하여 스핀들(spindle) No. 4 를 택하여 \\( 6 \\mathrm{rpm} \\)에서 1분간 점도를 측정하였다.", "화장품의 온도에 따른 안성성 시험법은 소정의 온도 조건 (\\( 0\\), \\(25\\), \\(40^{\\circ} \\mathrm{C}\\))에 보관하여, 경시적 변화에 따른 유분리, 침전, 변색 등의 상태변화를 관찰하였다.", "인공광 노출 시험은 투명용기에 화장품을 담아 sun lamp 장치(내부온도는 \\( 40^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 광원과 용기의 거리는 \\( 20.3 \\mathrm{~cm} \\))에 넣은 후 인공 \\( \\mathrm{UV} \\) 조사 후 0.5, 1, 2, 3시간 동안의 변색, 발색, 변취, 산패 등의 변화를 관찰하였다.", "또한 자연광 노출 시험은 화장품을 투명용기에 담아 햇빛이 잘 드는 실외에 보관하여 7, 15일 동안의 변색, 발색, 변취, 산패 등의 변화를 관찰하였다.", "온도순환에 따른 안정성 시험은 화장품을 투명용기에 담아 \\( -15^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(-10^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(-5^{\\circ} \\mathrm{C} \\), \\( 0^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(5^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(10^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(15^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(25^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(37.5^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(40^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 각각 24시간 보관한 후 이를 1 cycle로 하여 10회 반복 시행하여 온도 순환에 따른 안정성을 평가하였다.", "냉해동순환(freeze & thaw cycling)에 따른 안정성 시험은 화장품을 투명용기에 담아 \\( -10^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 와 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에 각각 24 시간 보관하여 이를 1 cycle로 하여 3, 7일 동안의 안정성을 관찰하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "감나무 잎으로 부터 분리한 tyrosinase 억제물질의 응용", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-ce4f3825-ab47-48c9-873c-3d41f3cf24e4", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "조영제", "안봉전", "김정환" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,411	<h2>RT-PCR analysis</h2><p>실험에 사용된 RNA는 사포닌을 전처리 한 HDF 세포로부터 추출하였다. 추출을 위해 세포는 Trizol®로 분해시키고 \( 25^{\circ} \mathrm{C}\), \(12,000 \times g\) 에서 15 분 동안 원심분리 한 뒤 cholroform을 첨가하였다. Isopropanol은 상등액에 \(1:1\) 비율로 첨가되었고 RNA pellet은 원심분리에 의해 얻어졌다. Ethanol로 씻어낸 뒤, 추출된 RNA는 diethyl pyrocarbonate - treated RNase - free waster에 녹이고 GENios® microplate reader (Tecan Austria BmbH )를 이용하여 \( 260 \mathrm{~nm} \) 에서 정량하였다. 같은 양의 RNA (\( 1 \mu g \))는 \( 42^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 1 \mathrm{X} \) reverse transcriptase (RT) buffer, \( 1 \mathrm{~mm} \) dNTPs, \( 500 \mathrm{ng} \) of oligo (dT) 15 primers, \( 140 \mathrm{U} \) of murine Moloney leukaemia virus (MMLV) reverse tran-scriptase 그리고 \( 40 \mathrm{U} \) of RNase inhibitor를 포함하는 master-mix 에 45 분 동안 방치함으로써 역전사 되었다. PCR은 MMP-1, MMP-2 그리고 glyceraldehydes-3-phosphate de-hydrogenase (G3PDH) mRNA를 증폭시키기 위해 automatic Whatman thermocycler (Bionmetra, Kent, UK)를 사용하여 수행되었다. 원하는 cDNA를 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 시퀀스는 다음을 따른다. MMP-1 (forward primer: 5-ATGCTGAAACCCTGAAGGTG-3, reverse primer: 5-CTGCT TGACCCTCAGAGACC-3), MMP-2 (forward pri-mer: 5'- TGCTGAAGGA CACACTAAAGAAGA-3', reverse primer: \( \quad \) 5'-TTGCCATCCTTCTCAA AG TTGTAGG-3'), G3PDH (forward primer: 5'-TGAAGGTCGGTGTG AAC GGATTTGGC-3' reverse primer: 5'-CATGTAGGCCAT GAGG ATCCA CCAC-3) PCR 생성물을 \( 2\% \) agarose gel에 전기영동 시킨뒤 ethidium bromide로 염색하였으며, AlphaEase® gel image- analysis software (alpha Inotech, San Leandro, CA, USA)를 사용하여 정량하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>각 실험은 3 회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각 각의 시료농도에 대해 평균표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student's test 한 후 \( p<0.05 \) 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.</p> <h2>환원력 assay</h2><p>Oyaizu 의 방법에 따라 측정하였다. 시료 \( 1 \mathrm{ml} \)에 \( \mathrm{pH} 6.6\)의 \( 200 \mathrm{mM} \) 인산 완충액 및 \( 1 \% \)의 potassium ferricyanide를 각 \( 1 \mathrm{ml} \) 씩 차례로 가하여 교반한 후 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)의 수욕상에서 \(20 \mathrm{min}\) 동안 반응시켰다. 여기에 \( 10 \% \) TCA (trichloroacetic acid) 용액을 \( 1 \mathrm{ml} \) 가하여 \( 13,500 \times \)에서 \( 15 \mathrm{~min} \) 동안 원심분리하여 상등액 \( 1 \mathrm{ml} \)에 증류수 및 ferric chloride 각 \( 1 \mathrm{ml} \)을 혼합한 후 \( 700 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 시료첨가군과 대조군의 흡광도 비를 \( \% \)값으로 환산하였다.</p><h2>세포배양</h2><p>Human dermal fibroblast (HDF) 세포는 \( 5\% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 및 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 95\% \) 이상의 습도를 유지한 배양기에서 \( 10 \% \) fetal bovine serum, \( 2 \mathrm{mM} \) glutamine and \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.</p><h2>MTT assay</h2><p>Hansen 의 방법에 따라 HDF세포에 대한 사포닌의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.</p><h2>Hydroxyl radical에 의한 DNA 손상을 전기영동법으로 분석</h2><p>Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 HDF 세포로부터 추출 하였다. Fenton반응에 의하여 발생된 hy-droxyl radical에 노출된 DNA 산화는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다. 먼저 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 DNA 용액에 시험농도의 사포닌, \( 200 \mu \mathrm{MeSO}_{4}\), \(1 \mathrm{mM} \mathrm{H} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 및 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) genomic DNA 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 상온에서 반응시킨 후 \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA 를 첨가하여 반응을 종결시킨다. \( 1 \mu \mathrm{g} \)의 DNA를 포함하는 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 의 반응혼합물을 \( 1 \% \) agarose gel에서 \( 100 \mathrm{~V} \)로 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 전기영동 하였다. Gel은 \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) ethidium bromide로 염색하여 물로 세척하여 UV로 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.</p> <h2>Gelatin zymography</h2><p>MMP-2 활성은 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에서 배양한 HDF 세포에 사포닌를 처리한 후에 이전에 기술된 방법에 따라 실험을 수행하였다. \( 50 \mathrm{\mu g} \)의 총단백질을 함유하는 세포배양액을 \( 1.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) gelatin을 포함하는 비환원조건의 \( 10 \% \) polyacrylamide gels를 이용하여 전기영동하였다. Gelatin이 분해된 bands는 청색배경에 투명한 bands로 나타난다. Bands의 진하기는 MMPs의 활성에 비례하여 나타나는데 LAS3000® image analyzer (Fuififilm Life Science, Tokyo, Japan)를 관찰한 후 촬영하였다.</p><h2>Casein zymography</h2><p>MMP-1 활성은 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에서 배양한 HDF 세포에 사포닌를 처리한 후에 이전에 기술된 방법을 변형하여 실험을 수행하였다. \( 50 \mathrm{\mu g} \)의 총단백질을 함유하는 세포배양액을 \( 1.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) casein을 포함하는 비환원조건의 \( 10 \% \) polyacrylamide gels를 이용하여 전기영동하였다. Casein이 분해된 bands는 청색배경에 투명한 bands로 나타난다. Bands의 진하기는 MMPs의 활성에 비례하여 나타나는데 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 관찰한 후 촬영하였다.</p><h2>Western blot analysis</h2><p>HDF 세포에 용출 완충용액 (\( 50 \mathrm{mM} \) Tris-HCl, \(\mathrm{pH} 7.5\), \( 0.4 \% \) Nonidet \( P-40, 120 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(1.5 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{MgCl} 2,2 \mathrm{mM} \) phenylmethylsulfonyl fluoride, \( 80 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) leupeptin, \( 3 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaF} \) and \( 1 \mathrm{mM} \) DTT)을 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 30 \mathrm{~min} \) 동안 처리하였다. \( 10 \mathrm{\mu g} \) 의 세포용출액을 \( 10 \% \) Tris - HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이 시켰다. 그 다음 \( 10\% \) skim milk를 nitrocellulose membrane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1 차 항체(anti-Nrf2, anti-SOD-1, anti-SOD-2, anti-SOD-3, anti-beta-actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fuifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.</p> <h1>결과</h1><h2>사포닌의 세포 증식 효과</h2><p>사포닌의 사람 섬유아세포에 독성을 미치지 않는 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 사포닌은 대조군과 비교하여 \( 10 \mathrm{lg} / \mathrm{ml} \)이하의 농도에서 \( 19.8 \% \)의 세포생존력이 증가되는 것으로 판정되었다. 그 이상의 농도에서는 급격히 생존율이 저하되는 경향을 보였다. 따라서 사포닌은 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이하의 범위에서는 세포독성이 없는 것으로 판단되어 이 농도 이하에서 계속적인 실험을 수행 하였다.</p><h2>Cell free systems에서 DPPH, hydrogen peroxide 및 lipid peroxidation에 대한 사포닌의 항산화 효능 및 환원력</h2><p>생체에서 산화적 스트레스와 관련되어 있는 DPPH, hydrox-yl radical, hydrogen peroxide와 같은 활성산소종에 대한 사포닌의 소거능력 및 환원력에 대하여 조사하였다. DPPH radi-cal 소거법은 DPPH radical이 항산화 물질로 인해 환원되면, 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 지질과산화의 초기 억제 정도를 예측 할 수 있다. 사포닌의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH 를 이용하여 항산화 작용을 측정한 결과 Fig. 2A 에서 보는 바와 같이, DPPH에 대하여 사포닌의 소거효과가 없는 것으로 나타났다. 양성 대조군은 vitamin C 는 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)를 사용하였는데 \( 80 \% \)의 소거효과를 나타내었다. 그 다음 사포닌의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \) 소거능을 확인 하기 위하여 Hydrogen peroxide scav-enging assay를 수행 하였다. 양성 대조군은 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 vitamin C 를 사용하였다. Fig. 2B 에서 보는 바와 같이 사포닌은 \( 1,5,10,50,100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)로 처리하여 농도 의존적으로 소거능이 증가함을 확인 할 수 있었다. 사포닌의 환원력 측정에는 potas-sium ferrycyanide reduction법을 사용하여 사포닌의 금속이온을 환원시키는 환원력을 조사하기 위하여 흡광도를 측정한 결과, vitamin C 는 \( 0.01 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 의 농도에서 대조군에 비교하여 \( 448 \% \) 의 환원력을 나타냈으며, 사포닌은 \( 1 \mathrm{lg} / \mathrm{ml} \) 이상의 농도에서 환원력이 대조군에 비하여 증가하였다(Fig. 2C). 사포닌은 \( 1,5,10,50,100 \mathrm{lg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 처리한 경우 각각의 환원력은 \( 265 \%\), \(269 \%\), \(274 \%\), \(290 \%\), \(316 \% \) 로 나타나 그 효과가 우수한 것으로 나타났다. 마지막으로 지질 과산화에 대한 사포닌에 의한 항산화 효과를 조사하기 위하여 linolenic acid를 Fenton반응으로 발생시킨 hydroxyl radical에 노출시켰다. 먼저 hydroxyl radical에 의한 지질 과산화 확인을 위하여 기존에 알려진 친유성 항산화제인 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 의 vitamin E 의 지질과산화에 대한 억제효능을 평가한 결과, Fig. 2에서 보여지는 바와 같이 \( 38 \% \) 의 지질과산화 억제효과가 관찰되었다. 사포닌은 농도 의존적인 효과는 보여주지 않았으나 \( 1 \mathrm{lg} / \mathrm{ml} \) 이상의 농도에서 유의성 있는 지질과산화 억제효과를 관찰 할 수 있었다.</p> <h1>고 찰</h1><p>여러 가지 요인들에 의해 체내에 생성된 유해 활성산소종은 다양한 질병과 병적 노화 등과 매우 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다. 광노화로 알려진 자외선에 의한 피부 노화 현상 역시 자외선에 의해 유해한 활성산소가 피부 세포 내에서 생성되어 조직을 파괴하기 때문에 일어나는 현상이다. 피부 세포 내에서 생성된 활성산소는 효소나 단백질과 같이 복잡한 분자구조를 갖는 고분자와 가교결합을 이룸으로써 그 기능을 저하시키고, 피부의 중요 구성성분인 콜라겐과 결합조직, DNA 등을 파괴함으로써 표피와 진피를 모두 변형 시킨다. 사포닌의 유해 활성산소종 소거능력을 측정하여 본 결과, 사포닌은 과산화수소 소거 능력을 나타내었다. Superoxides와 SODs (Superoxide dismutases)의 불균등화 촉매반응에 의하여 발생 된 과산화수소는 산소결합이 깨지면서 hydroxyl radi-cal 을 생성하여 주변 조직 또는 DNA 등을 산화시킨다. 생성된 과산화수소는 체내 제거 기전인 catalase 또는 glutathione GSH 에 의하여 물과 산소로 분해되면서 소거된다. 즉 사포넌은 Superoxide와 같은 유해 활성산소 소거의 중간 산물인 과산화수소를 소거함으로써 항산화 방어기작을 나타낸다. 또한 사포닌은 유해 활성산소종의 산화작용을 억제하는 환원력이 우수한 것으로 나타났다. 이것은 활성산소 소거능력이 환원 능력과 연관성이 있음을 보여준다. 뿐만 아니라 사포닌은 DNA의 산화적 손상에 대한 보호 효과 역시 탁월했다. 이것은 사포닌의 과산화수소 소거 효과와도 일치한다. 과산화수소는 Superoxide와 Singlet oxygen와 함께 DNA의 가지 절단에 있어 중심 역할을 하기 때문이다. 따라서 사포닌은 과산화수소를 유의성 있게 소거함으로써 DNA의 산화를 막아 여러 가지 질병과 암으로부터 보호효과를 나타낸다. 반면 기질 단백질 분해 효소인 Matrix metalloproteinase (MMPs)는 유해 활성산소와 달리 세포외기질 ECM, 기저막 BM 의 중요한 구성 요소인 콜라겐과 같은 결합조직을 특이적으로 분해함으로써 세포의 이동, 상처치유, 조직 재생 등과 같이 세포의 분리가 요구되는 생리적 과정에서 필수적인 요소로써 작용한다. 하지만 종양, 암 세포에서 MMPs가 자체적으로 분비되거나 숙주세포에서의 분비를 유도하는 경우에는 MMPs가 세포간 분리를 일으켜 주변 조직으로 종양, 암 세포의 침윤과 전이를 돕는다. 최근의 연구 결과에 따르면, 사포닌은 섬유아육종세포인 HT-1080에서 암의 전이와 침윤에 필수적인 MMP-2와 MMP-9의 활성과 발현을 억제함으로써 항암효과를 갖는다는 연구결과가 보고되었다. 본 연구에서 섬유아세포에 사포넌이 처리된 경우에는 MMP-1과 MMP-2의 활성이 증가되고, 단백질 발현이 감소되고 유전자 발현에는 영향이 없다는 것을 확인하였다. 즉, 사포넌이 정상 피부세포에서는 MMP-1과 MMP-2의 활성을 증가 시킴으로써 세포 재생을 촉진 시키고, 비정상적인 섬유아육종세포에서는 MMP-2와 MMP-9의 활성과 발현을 억제시킴으로써 선택적으로 MMPs의 활성을 조절 한다고 판단된다. 이는 예로부터 동양에서 사용되어 오는 상처 치료제에 사포닌이 주요 성분으로 포함됨을 잘 설명해 주는 것으로 실제로 사포닌의 세포생존력을 측정한 결과 섬유아세포의 생존력을 증가시켜 세포를 재생시킴을 확인 하였다. 이것은 사포닌의 정상 피부세포에서 MMP 의 활성 증가 효과와도 잘 일치하는 결과이다. 사포닌이 정상 피부세포에서 MMPs의 분비와 활성을 촉진시킴으로써 상처 치유의 중요 단계인 세포 증식과 조직 재형성에 있어 큰 효과를 나타내 조직 재생을 증가시키는 것으로 사료된다. 사포닌이 피부재생에 있어 필수요소인 혈관 내피세포 증식인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)의 활성을 증가시킨다는 연구보고 역시 우리의 결과와 일치하였다. VEGF는 혈관형성에 있어 핵심적 인자로, Kerationocytes 세포를 자극하여 MMP-2의 분비를 증가시켜 세포의 재생을 돕는다. 이러한 이전의 연구결과와 본 연구에서 사포닌이 MMP-2와 MMP-1의 활성을 증가시켜 세포의 재생을 돕는 연구결과와 일치한다. 따라서 사포닌의 피부세포 증식 효과, 과산화수소 소거에 따른 항산화 효과, DNA의 산화적 손상으로부터의 보호 효과 그리고 MMPs의 단백질 발현은 억제시키나 피부세포에서 특이적으로 MMPs의 활성을 증가시키는 효과로 미루어 보아 사포닌이 상처치료제 및 항노화제의 주성분으로서 잠재적인 가능성이 기대된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시료의 제조</h2><p>세포배양을 위한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / am-photericin (각각 \( 10,000 \mathrm{U} / \mathrm{ml}\), \( 10,000 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 및 \( 2,500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. HDF 세포는 (주) LG 생활건강 기술원으로부터 제공받았다. 사포닌 (Sigma 84510), MTT reagent, gelatin, agarose와 spermidine 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.</p><h2>DPPH radical assay</h2><p>Brand-Williams 실험방법을 변형하여 1,1-di-phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 사포닌의 소거능력을 측정하였다. 시험농도의 사포닌을 DPPH 용액을 가하여 \( 10 \mathrm{sec} \) 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 \( 20 \mathrm{~min} \) 동안 반응 시킨 후 \( 525 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. DPPH radical 함량은 시료 첨 가군과 대조군의 흡광도 비를 \( \% \) 값으로 환산하여 나타내었다.</p><h2>Hydroxyl radical assay</h2><p>Chung 등의 실험방법을 변형하여 hydroxyl radical을 측정하였다. \( 50 \mu \mathrm{l} \) \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{FeSO} 4 \)와 \( 50 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 이용한 Fenton 반응으로 hydroxyl radical를 발생시켰다. 발생된 radical을 \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \) 2-de-oxyribose, \( 150 \mu \mathrm{l} \)의 \( 0.1 \mathrm{M} \) phosphate buffer (\(\mathrm{pH} 7.4\))의 존재 하에서 시험농도의 사포닌과 반응시킨 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 4 \mathrm{hr} \) 동안 반응시켰다. 여기에 \( 250 \mu \mathrm{l} \)의 \(2.8\%\) TCA (trichloroacetic acid) 및 \( 250 \mu \mathrm{l} \)의 \(1\%\) TBA (thiobabituric acid)를 첨가한 후에 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)로 가열하였다. 그 후 상온에서 식힌 다음 \( 1,000 \times g \)에서 \( 5 \mathrm{~min} \)동안 원심분리하였다. 회수한 상등액은 \( 532 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였으며 사포닌의 항산화 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 \( \% \) 값으로 환산하였다.</p><h2>Hydrogen peroxide scavenging assay</h2><p>Choi 등의 실험방법을 변형하여 Hydrogen peroxide에 대한 소거활성을 측정하였다. \( 80 \mu \mathrm{l} \)의 사포닌, \( 25 \mu \mathrm{l} \)의 \( 10 \mathrm{mM} \) hydrogen peroxide 및 \( 100 \mu \mathrm{l} \)의 \( 0.01 \mathrm{M} \) 인산완충용액( \( \mathrm{pH} 5.0 \))을 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 5 \mathrm{~min} \) 동안 반응시켰다. 그 후, \( 15 \mu \mathrm{l} \)의 \( 1.25 \mathrm{mM}\) ABTS 및 \( 30 \mu \mathrm{l} \)의 peroxidase \( 37^{\circ} \mathrm{C}\)에서 \( 10 \mathrm{~min} \) 동안 반응시켜 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며 사포닌의 항산화 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 \( \% \) 값으로 환산하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>식물 사포닌은 배당체의 한 종류로 콩, 인삼, 홍삼, 도라지, 미나리, 양파, 마늘, 그 외 야생 식물 등 다양한 식물에서 다량 발견된다. 사포닌은 항산화 효능이 있는 것으로 알려져 있으며 항염증, 암세포의 증식 억제, 단백질 및 지질합성 촉진 등 다양한 생물학적 성질을 갖고 있다. 예로부터 동양에서 상처나 여러 가지 병의 치료에 중요한 치료제로 사용 되었으며, 지금까지도 사포닌이 풍부한 인삼 또는 홍삼 뿌리는 세계적으로도 널리 사용되고 있다.</p><p>나이가 들어감에 따라 활성산소에 의한 조직 손상이 증가하는 데, 이는 효소의 활성을 상실 시키거나, DNA, RNA, 효소 및 세포막을 손상시키고, 결국 세포사를 일으켜 성인병이나 암 등의 여러 가지 질병과 병적 노화를 촉진시킨다. 대부분의 활성 산소는 superoxide dismutase (SOD), catalase, perox-idase 등과 같은 항산화 효소에 의하여 생체내에서 제거되나, 남아 있는 활성산소는 \( \beta \)-carotene, tocopherol 등과 같은 항산화제에 의하여 제거된다. 이러한 항산화제로 잘 알려져 있는 사포닌은 몸 안에서 DDMP (2,3-dihydro-2,5-dihy-droxy-6methyl-4H-pyran-4one) 라는 물질을 만들어 활성 산소와 반응하여 몸 안의 독성 산소 물질을 억제하여 세포의 산화를 막는다는 연구보고가 있다. 뿐만 아니라 사포닌은 활성산소 억제효소인 nonprotein-SH, superoxide dis-utase (SOD), catalase, glutathione (GSH) peroxidase 및<p>GSH reductase의 활성을 증가시킨다는 보고도 있다. 활성 산소는 피부 노화를 일으키는 원인 중 하나로 자외선이 피부에 침투하여 유해한 활성산소를 생성하여 피부의 표피와 진피를 모두 변화시킨다. 자외선에 의해 활성산소가 생성되면 진피층을 이루는 collagen이 분해되어 주름이 생기고 피부 노화가 진행되는데, 이를 광노화라고 한다. 노화가 진행 됨은 세포 재생과도 밀접한 관련이 있다. 활성산소에 의한 생체 구성 분자의 파괴, 섬유아세포의 사멸 등으로 인해 콜라겐 결핍이 생기면 노화가 진행 되는 것이다. 사포닌은 HDF 와 같은 표피세포의 증식을 증가시키며, matrix metalloproteinases (MMPs)와 같은 기질 분해효소의 활성을 높인다. MMPs는 기저막(besement membrane, BM)의 중요한 구성 성분 및 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 주요 단백질 구성요소들을 분해 시킬 수 있어서 상처수복과 재생 및 세포의 침윤, 만성염증, 신 혈관생성, 암전이에 중요한 역할을 한다.</p><p>MMPs는 현재 약 20 여 종류가 밝혀져 있으며 활성화된 MMPs 는 단백질분해 억제제인 tissue inhibitors of matrix metal-loproteinases (TIMPs)와 복합체를 형성함으로써 활성이 조절된다. 이전의 연구 보고에 따르면 사포닌이 다량 함유된 홍삼 추출액은 혈관 내피 세포 성장인자(Vascular endo-therlial growth factor, VEGF)의 활성을 증가시켜 세포재생을 촉진 시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 saponin은 MMPs 의 활성을 증가시켜 상처 부위의 재편성과 재형성 그리고 신 혈관 생성을 증가시키고 세포의 증식과 분화를 촉진하여 상처치유에 큰 효과가 있을 것으로 기대되어 진다. 따라서 본 연구에서는 사포닌의 항산화 효과와 및 사람 피부 섬유아 세포(Human dermal fibroblasts, HDF)에서 MMPs의 활성 및 발현에 미치는 영향을 조사하였다.</p>	생명과학	[ "<h2>RT-PCR analysis</h2><p>실험에 사용된 RNA는 사포닌을 전처리 한 HDF 세포로부터 추출하였다.", "추출을 위해 세포는 Trizol®로 분해시키고 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(12,000 \\times g\\) 에서 15 분 동안 원심분리 한 뒤 cholroform을 첨가하였다.", "Isopropanol은 상등액에 \\(1:1\\) 비율로 첨가되었고 RNA pellet은 원심분리에 의해 얻어졌다.", "Ethanol로 씻어낸 뒤, 추출된 RNA는 diethyl pyrocarbonate - treated RNase - free waster에 녹이고 GENios® microplate reader (Tecan Austria BmbH )를 이용하여 \\( 260 \\mathrm{~nm} \\) 에서 정량하였다.", "같은 양의 RNA (\\( 1 \\mu g \\))는 \\( 42^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 \\( 1 \\mathrm{X} \\) reverse transcriptase (RT) buffer, \\( 1 \\mathrm{~mm} \\) dNTPs, \\( 500 \\mathrm{ng} \\) of oligo (dT) 15 primers, \\( 140 \\mathrm{U} \\) of murine Moloney leukaemia virus (MMLV) reverse tran-scriptase 그리고 \\( 40 \\mathrm{U} \\) of RNase inhibitor를 포함하는 master-mix 에 45 분 동안 방치함으로써 역전사 되었다.", "PCR은 MMP-1, MMP-2 그리고 glyceraldehydes-3-phosphate de-hydrogenase (G3PDH) mRNA를 증폭시키기 위해 automatic Whatman thermocycler (Bionmetra, Kent, UK)를 사용하여 수행되었다.", "원하는 cDNA를 증폭시키기 위해 사용된 프라이머 시퀀스는 다음을 따른다.", "MMP-1 (forward primer: 5-ATGCTGAAACCCTGAAGGTG-3, reverse primer: 5-CTGCT TGACCCTCAGAGACC-3), MMP-2 (forward pri-mer: 5'- TGCTGAAGGA CACACTAAAGAAGA-3', reverse primer: \\( \\quad \\) 5'-TTGCCATCCTTCTCAA AG TTGTAGG-3'), G3PDH (forward primer: 5'-TGAAGGTCGGTGTG AAC GGATTTGGC-3' reverse primer: 5'-CATGTAGGCCAT GAGG ATCCA CCAC-3) PCR 생성물을 \\( 2\\% \\) agarose gel에 전기영동 시킨뒤 ethidium bromide로 염색하였으며, AlphaEase® gel image- analysis software (alpha Inotech, San Leandro, CA, USA)를 사용하여 정량하였다.", "</p><h2>통계처리</h2><p>각 실험은 3 회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각 각의 시료농도에 대해 평균표준편차로 나타내었다.", "각 시료 농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student's test 한 후 \\( p<0.05 \\) 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.", "</p> <h2>환원력 assay</h2><p>Oyaizu 의 방법에 따라 측정하였다.", "시료 \\( 1 \\mathrm{ml} \\)에 \\( \\mathrm{pH} 6.6\\)의 \\( 200 \\mathrm{mM} \\) 인산 완충액 및 \\( 1 \\% \\)의 potassium ferricyanide를 각 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 씩 차례로 가하여 교반한 후 \\( 50^{\\circ} \\mathrm{C} \\)의 수욕상에서 \\(20 \\mathrm{min}\\) 동안 반응시켰다.", "여기에 \\( 10 \\% \\) TCA (trichloroacetic acid) 용액을 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 가하여 \\( 13,500 \\times \\)에서 \\( 15 \\mathrm{~min} \\) 동안 원심분리하여 상등액 \\( 1 \\mathrm{ml} \\)에 증류수 및 ferric chloride 각 \\( 1 \\mathrm{ml} \\)을 혼합한 후 \\( 700 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하였다.", "시료의 환원력은 시료첨가군과 대조군의 흡광도 비를 \\( \\% \\)값으로 환산하였다.", "</p><h2>세포배양</h2><p>Human dermal fibroblast (HDF) 세포는 \\( 5\\% \\) \\( \\mathrm{CO}_{2} \\) 및 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 \\( 95\\% \\) 이상의 습도를 유지한 배양기에서 \\( 10 \\% \\) fetal bovine serum, \\( 2 \\mathrm{mM} \\) glutamine and \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.", "</p><h2>MTT assay</h2><p>Hansen 의 방법에 따라 HDF세포에 대한 사포닌의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.", "</p><h2>Hydroxyl radical에 의한 DNA 손상을 전기영동법으로 분석</h2><p>Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 HDF 세포로부터 추출 하였다.", "Fenton반응에 의하여 발생된 hy-droxyl radical에 노출된 DNA 산화는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다.", "먼저 \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\)의 DNA 용액에 시험농도의 사포닌, \\( 200 \\mu \\mathrm{MeSO}_{4}\\), \\(1 \\mathrm{mM} \\mathrm{H} \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}_{2} \\) 및 \\( 50 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) genomic DNA 를 첨가하였다.", "반응 혼합물을 \\( 30 \\mathrm{~min} \\) 동안 상온에서 반응시킨 후 \\( 10 \\mathrm{mM} \\) EDTA 를 첨가하여 반응을 종결시킨다. \\", "( 1 \\mu \\mathrm{g} \\)의 DNA를 포함하는 \\( 20 \\mu \\mathrm{l} \\) 의 반응혼합물을 \\( 1 \\% \\) agarose gel에서 \\( 100 \\mathrm{~V} \\)로 \\( 30 \\mathrm{~min} \\) 동안 전기영동 하였다.", "Gel은 \\(1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) ethidium bromide로 염색하여 물로 세척하여 UV로 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.", "</p> <h2>Gelatin zymography</h2><p>MMP-2 활성은 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에서 배양한 HDF 세포에 사포닌를 처리한 후에 이전에 기술된 방법에 따라 실험을 수행하였다. \\", "( 50 \\mathrm{\\mu g} \\)의 총단백질을 함유하는 세포배양액을 \\( 1.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) gelatin을 포함하는 비환원조건의 \\( 10 \\% \\) polyacrylamide gels를 이용하여 전기영동하였다.", "Gelatin이 분해된 bands는 청색배경에 투명한 bands로 나타난다.", "Bands의 진하기는 MMPs의 활성에 비례하여 나타나는데 LAS3000® image analyzer (Fuififilm Life Science, Tokyo, Japan)를 관찰한 후 촬영하였다.", "</p><h2>Casein zymography</h2><p>MMP-1 활성은 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에서 배양한 HDF 세포에 사포닌를 처리한 후에 이전에 기술된 방법을 변형하여 실험을 수행하였다. \\", "( 50 \\mathrm{\\mu g} \\)의 총단백질을 함유하는 세포배양액을 \\( 1.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) casein을 포함하는 비환원조건의 \\( 10 \\% \\) polyacrylamide gels를 이용하여 전기영동하였다.", "Casein이 분해된 bands는 청색배경에 투명한 bands로 나타난다.", "Bands의 진하기는 MMPs의 활성에 비례하여 나타나는데 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 관찰한 후 촬영하였다.", "</p><h2>Western blot analysis</h2><p>HDF 세포에 용출 완충용액 (\\( 50 \\mathrm{mM} \\) Tris-HCl, \\(\\mathrm{pH} 7.5\\), \\( 0.4 \\% \\) Nonidet \\( P-40, 120 \\mathrm{mM}\\) \\(\\mathrm{NaCl}\\), \\(1.5 \\mathrm{mM}\\) \\(\\mathrm{MgCl} 2,2 \\mathrm{mM} \\) phenylmethylsulfonyl fluoride, \\( 80 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\) leupeptin, \\( 3 \\mathrm{mM} \\) \\( \\mathrm{NaF} \\) and \\( 1 \\mathrm{mM} \\) DTT)을 첨가하여 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 \\( 30 \\mathrm{~min} \\) 동안 처리하였다. \\", "( 10 \\mathrm{\\mu g} \\) 의 세포용출액을 \\( 10 \\% \\) Tris - HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이 시켰다.", "그 다음 \\( 10\\% \\) skim milk를 nitrocellulose membrane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1 차 항체(anti-Nrf2, anti-SOD-1, anti-SOD-2, anti-SOD-3, anti-beta-actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다.", "Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fuifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.", "</p> <h1>결과</h1><h2>사포닌의 세포 증식 효과</h2><p>사포닌의 사람 섬유아세포에 독성을 미치지 않는 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.", "Fig.", "1에서 보는 바와 같이 사포닌은 대조군과 비교하여 \\( 10 \\mathrm{lg} / \\mathrm{ml} \\)이하의 농도에서 \\( 19.8 \\% \\)의 세포생존력이 증가되는 것으로 판정되었다.", "그 이상의 농도에서는 급격히 생존율이 저하되는 경향을 보였다.", "따라서 사포닌은 \\( 10 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)이하의 범위에서는 세포독성이 없는 것으로 판단되어 이 농도 이하에서 계속적인 실험을 수행 하였다.", "</p><h2>Cell free systems에서 DPPH, hydrogen peroxide 및 lipid peroxidation에 대한 사포닌의 항산화 효능 및 환원력</h2><p>생체에서 산화적 스트레스와 관련되어 있는 DPPH, hydrox-yl radical, hydrogen peroxide와 같은 활성산소종에 대한 사포닌의 소거능력 및 환원력에 대하여 조사하였다.", "DPPH radi-cal 소거법은 DPPH radical이 항산화 물질로 인해 환원되면, 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 지질과산화의 초기 억제 정도를 예측 할 수 있다.", "사포닌의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH 를 이용하여 항산화 작용을 측정한 결과 Fig.", "2A 에서 보는 바와 같이, DPPH에 대하여 사포닌의 소거효과가 없는 것으로 나타났다.", "양성 대조군은 vitamin C 는 \\( 100 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)를 사용하였는데 \\( 80 \\% \\)의 소거효과를 나타내었다.", "그 다음 사포닌의 \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}_{2} \\) 소거능을 확인 하기 위하여 Hydrogen peroxide scav-enging assay를 수행 하였다.", "양성 대조군은 \\( 100 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)의 vitamin C 를 사용하였다.", "Fig.", "2B 에서 보는 바와 같이 사포닌은 \\( 1,5,10,50,100 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)로 처리하여 농도 의존적으로 소거능이 증가함을 확인 할 수 있었다.", "사포닌의 환원력 측정에는 potas-sium ferrycyanide reduction법을 사용하여 사포닌의 금속이온을 환원시키는 환원력을 조사하기 위하여 흡광도를 측정한 결과, vitamin C 는 \\( 0.01 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\) 의 농도에서 대조군에 비교하여 \\( 448 \\% \\) 의 환원력을 나타냈으며, 사포닌은 \\( 1 \\mathrm{lg} / \\mathrm{ml} \\) 이상의 농도에서 환원력이 대조군에 비하여 증가하였다", "(Fig. 2C).", "사포닌은 \\( 1,5,10,50,100 \\mathrm{lg} / \\mathrm{ml} \\) 의 농도로 처리한 경우 각각의 환원력은 \\( 265 \\%\\), \\(269 \\%\\), \\(274 \\%\\), \\(290 \\%\\), \\(316 \\% \\) 로 나타나 그 효과가 우수한 것으로 나타났다.", "마지막으로 지질 과산화에 대한 사포닌에 의한 항산화 효과를 조사하기 위하여 linolenic acid를 Fenton반응으로 발생시킨 hydroxyl radical에 노출시켰다.", "먼저 hydroxyl radical에 의한 지질 과산화 확인을 위하여 기존에 알려진 친유성 항산화제인 \\( 100 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\) 의 vitamin E 의 지질과산화에 대한 억제효능을 평가한 결과, Fig.", "2에서 보여지는 바와 같이 \\( 38 \\% \\) 의 지질과산화 억제효과가 관찰되었다.", "사포닌은 농도 의존적인 효과는 보여주지 않았으나 \\( 1 \\mathrm{lg} / \\mathrm{ml} \\) 이상의 농도에서 유의성 있는 지질과산화 억제효과를 관찰 할 수 있었다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>여러 가지 요인들에 의해 체내에 생성된 유해 활성산소종은 다양한 질병과 병적 노화 등과 매우 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다.", "광노화로 알려진 자외선에 의한 피부 노화 현상 역시 자외선에 의해 유해한 활성산소가 피부 세포 내에서 생성되어 조직을 파괴하기 때문에 일어나는 현상이다.", "피부 세포 내에서 생성된 활성산소는 효소나 단백질과 같이 복잡한 분자구조를 갖는 고분자와 가교결합을 이룸으로써 그 기능을 저하시키고, 피부의 중요 구성성분인 콜라겐과 결합조직, DNA 등을 파괴함으로써 표피와 진피를 모두 변형 시킨다.", "사포닌의 유해 활성산소종 소거능력을 측정하여 본 결과, 사포닌은 과산화수소 소거 능력을 나타내었다.", "Superoxides와 SODs (Superoxide dismutases)의 불균등화 촉매반응에 의하여 발생 된 과산화수소는 산소결합이 깨지면서 hydroxyl radi-cal 을 생성하여 주변 조직 또는 DNA 등을 산화시킨다.", "생성된 과산화수소는 체내 제거 기전인 catalase 또는 glutathione GSH 에 의하여 물과 산소로 분해되면서 소거된다.", "즉 사포넌은 Superoxide와 같은 유해 활성산소 소거의 중간 산물인 과산화수소를 소거함으로써 항산화 방어기작을 나타낸다.", "또한 사포닌은 유해 활성산소종의 산화작용을 억제하는 환원력이 우수한 것으로 나타났다.", "이것은 활성산소 소거능력이 환원 능력과 연관성이 있음을 보여준다.", "뿐만 아니라 사포닌은 DNA의 산화적 손상에 대한 보호 효과 역시 탁월했다.", "이것은 사포닌의 과산화수소 소거 효과와도 일치한다.", "과산화수소는 Superoxide와 Singlet oxygen와 함께 DNA의 가지 절단에 있어 중심 역할을 하기 때문이다.", "따라서 사포닌은 과산화수소를 유의성 있게 소거함으로써 DNA의 산화를 막아 여러 가지 질병과 암으로부터 보호효과를 나타낸다.", "반면 기질 단백질 분해 효소인 Matrix metalloproteinase (MMPs)는 유해 활성산소와 달리 세포외기질 ECM, 기저막 BM 의 중요한 구성 요소인 콜라겐과 같은 결합조직을 특이적으로 분해함으로써 세포의 이동, 상처치유, 조직 재생 등과 같이 세포의 분리가 요구되는 생리적 과정에서 필수적인 요소로써 작용한다.", "하지만 종양, 암 세포에서 MMPs가 자체적으로 분비되거나 숙주세포에서의 분비를 유도하는 경우에는 MMPs가 세포간 분리를 일으켜 주변 조직으로 종양, 암 세포의 침윤과 전이를 돕는다.", "최근의 연구 결과에 따르면, 사포닌은 섬유아육종세포인 HT-1080에서 암의 전이와 침윤에 필수적인 MMP-2와 MMP-9의 활성과 발현을 억제함으로써 항암효과를 갖는다는 연구결과가 보고되었다.", "본 연구에서 섬유아세포에 사포넌이 처리된 경우에는 MMP-1과 MMP-2의 활성이 증가되고, 단백질 발현이 감소되고 유전자 발현에는 영향이 없다는 것을 확인하였다.", "즉, 사포넌이 정상 피부세포에서는 MMP-1과 MMP-2의 활성을 증가 시킴으로써 세포 재생을 촉진 시키고, 비정상적인 섬유아육종세포에서는 MMP-2와 MMP-9의 활성과 발현을 억제시킴으로써 선택적으로 MMPs의 활성을 조절 한다고 판단된다.", "이는 예로부터 동양에서 사용되어 오는 상처 치료제에 사포닌이 주요 성분으로 포함됨을 잘 설명해 주는 것으로 실제로 사포닌의 세포생존력을 측정한 결과 섬유아세포의 생존력을 증가시켜 세포를 재생시킴을 확인 하였다.", "이것은 사포닌의 정상 피부세포에서 MMP 의 활성 증가 효과와도 잘 일치하는 결과이다.", "사포닌이 정상 피부세포에서 MMPs의 분비와 활성을 촉진시킴으로써 상처 치유의 중요 단계인 세포 증식과 조직 재형성에 있어 큰 효과를 나타내 조직 재생을 증가시키는 것으로 사료된다.", "사포닌이 피부재생에 있어 필수요소인 혈관 내피세포 증식인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)의 활성을 증가시킨다는 연구보고 역시 우리의 결과와 일치하였다.", "VEGF는 혈관형성에 있어 핵심적 인자로, Kerationocytes 세포를 자극하여 MMP-2의 분비를 증가시켜 세포의 재생을 돕는다.", "이러한 이전의 연구결과와 본 연구에서 사포닌이 MMP-2와 MMP-1의 활성을 증가시켜 세포의 재생을 돕는 연구결과와 일치한다.", "따라서 사포닌의 피부세포 증식 효과, 과산화수소 소거에 따른 항산화 효과, DNA의 산화적 손상으로부터의 보호 효과 그리고 MMPs의 단백질 발현은 억제시키나 피부세포에서 특이적으로 MMPs의 활성을 증가시키는 효과로 미루어 보아 사포닌이 상처치료제 및 항노화제의 주성분으로서 잠재적인 가능성이 기대된다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료 및 시료의 제조</h2><p>세포배양을 위한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / am-photericin (각각 \\( 10,000 \\mathrm{U} / \\mathrm{ml}\\), \\( 10,000 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 및 \\( 2,500 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다.", "HDF 세포는 (주) LG 생활건강 기술원으로부터 제공받았다.", "사포닌 (Sigma 84510), MTT reagent, gelatin, agarose와 spermidine 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.", "</p><h2>DPPH radical assay</h2><p>Brand-Williams 실험방법을 변형하여 1,1-di-phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 사포닌의 소거능력을 측정하였다.", "시험농도의 사포닌을 DPPH 용액을 가하여 \\( 10 \\mathrm{sec} \\) 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 \\( 20 \\mathrm{~min} \\) 동안 반응 시킨 후 \\( 525 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "DPPH radical 함량은 시료 첨 가군과 대조군의 흡광도 비를 \\( \\% \\) 값으로 환산하여 나타내었다.", "</p><h2>Hydroxyl radical assay</h2><p>Chung 등의 실험방법을 변형하여 hydroxyl radical을 측정하였다. \\", "( 50 \\mu \\mathrm{l} \\) \\( 10 \\mathrm{mM} \\mathrm{FeSO} 4 \\)와 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\)의 \\( 10 \\mathrm{mM} \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}_{2} \\)를 이용한 Fenton 반응으로 hydroxyl radical를 발생시켰다.", "발생된 radical을 \\( 25 \\mu \\mathrm{l} \\)의 \\( 10 \\mathrm{mM} \\) EDTA, \\( 25 \\mu \\mathrm{l} \\)의 \\( 10 \\mathrm{mM} \\) 2-de-oxyribose, \\( 150 \\mu \\mathrm{l} \\)의 \\( 0.1 \\mathrm{M} \\) phosphate buffer (\\(\\mathrm{pH} 7.4\\))의 존재 하에서 시험농도의 사포닌과 반응시킨 다음 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 \\( 4 \\mathrm{hr} \\) 동안 반응시켰다.", "여기에 \\( 250 \\mu \\mathrm{l} \\)의 \\(2.8\\%\\) TCA (trichloroacetic acid) 및 \\( 250 \\mu \\mathrm{l} \\)의 \\(1\\%\\) TBA (thiobabituric acid)를 첨가한 후에 \\( 100^{\\circ} \\mathrm{C} \\)로 가열하였다.", "그 후 상온에서 식힌 다음 \\( 1,000 \\times g \\)에서 \\( 5 \\mathrm{~min} \\)동안 원심분리하였다.", "회수한 상등액은 \\( 532 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였으며 사포닌의 항산화 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 \\( \\% \\) 값으로 환산하였다.", "</p><h2>Hydrogen peroxide scavenging assay</h2><p>Choi 등의 실험방법을 변형하여 Hydrogen peroxide에 대한 소거활성을 측정하였다. \\", "( 80 \\mu \\mathrm{l} \\)의 사포닌, \\( 25 \\mu \\mathrm{l} \\)의 \\( 10 \\mathrm{mM} \\) hydrogen peroxide 및 \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\)의 \\( 0.01 \\mathrm{M} \\) 인산완충용액( \\( \\mathrm{pH} 5.0 \\))을 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 \\( 5 \\mathrm{~min} \\) 동안 반응시켰다.", "그 후, \\( 15 \\mu \\mathrm{l} \\)의 \\( 1.25 \\mathrm{mM}\\) ABTS 및 \\( 30 \\mu \\mathrm{l} \\)의 peroxidase \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C}\\)에서 \\( 10 \\mathrm{~min} \\) 동안 반응시켜 \\( 405 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하였으며 사포닌의 항산화 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 \\( \\% \\) 값으로 환산하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>식물 사포닌은 배당체의 한 종류로 콩, 인삼, 홍삼, 도라지, 미나리, 양파, 마늘, 그 외 야생 식물 등 다양한 식물에서 다량 발견된다.", "사포닌은 항산화 효능이 있는 것으로 알려져 있으며 항염증, 암세포의 증식 억제, 단백질 및 지질합성 촉진 등 다양한 생물학적 성질을 갖고 있다.", "예로부터 동양에서 상처나 여러 가지 병의 치료에 중요한 치료제로 사용 되었으며, 지금까지도 사포닌이 풍부한 인삼 또는 홍삼 뿌리는 세계적으로도 널리 사용되고 있다.", "</p><p>나이가 들어감에 따라 활성산소에 의한 조직 손상이 증가하는 데, 이는 효소의 활성을 상실 시키거나, DNA, RNA, 효소 및 세포막을 손상시키고, 결국 세포사를 일으켜 성인병이나 암 등의 여러 가지 질병과 병적 노화를 촉진시킨다.", "대부분의 활성 산소는 superoxide dismutase (SOD), catalase, perox-idase 등과 같은 항산화 효소에 의하여 생체내에서 제거되나, 남아 있는 활성산소는 \\( \\beta \\)-carotene, tocopherol 등과 같은 항산화제에 의하여 제거된다.", "이러한 항산화제로 잘 알려져 있는 사포닌은 몸 안에서 DDMP (2,3-dihydro-2,5-dihy-droxy-6methyl-4H-pyran-4one) 라는 물질을 만들어 활성 산소와 반응하여 몸 안의 독성 산소 물질을 억제하여 세포의 산화를 막는다는 연구보고가 있다.", "뿐만 아니라 사포닌은 활성산소 억제효소인 nonprotein-SH, superoxide dis-utase (SOD), catalase, glutathione (GSH) peroxidase 및<p>GSH reductase의 활성을 증가시킨다는 보고도 있다.", "활성 산소는 피부 노화를 일으키는 원인 중 하나로 자외선이 피부에 침투하여 유해한 활성산소를 생성하여 피부의 표피와 진피를 모두 변화시킨다.", "자외선에 의해 활성산소가 생성되면 진피층을 이루는 collagen이 분해되어 주름이 생기고 피부 노화가 진행되는데, 이를 광노화라고 한다.", "노화가 진행 됨은 세포 재생과도 밀접한 관련이 있다.", "활성산소에 의한 생체 구성 분자의 파괴, 섬유아세포의 사멸 등으로 인해 콜라겐 결핍이 생기면 노화가 진행 되는 것이다.", "사포닌은 HDF 와 같은 표피세포의 증식을 증가시키며, matrix metalloproteinases (MMPs)와 같은 기질 분해효소의 활성을 높인다.", "MMPs는 기저막(besement membrane, BM)의 중요한 구성 성분 및 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 주요 단백질 구성요소들을 분해 시킬 수 있어서 상처수복과 재생 및 세포의 침윤, 만성염증, 신 혈관생성, 암전이에 중요한 역할을 한다.", "</p><p>MMPs는 현재 약 20 여 종류가 밝혀져 있으며 활성화된 MMPs 는 단백질분해 억제제인 tissue inhibitors of matrix metal-loproteinases (TIMPs)와 복합체를 형성함으로써 활성이 조절된다.", "이전의 연구 보고에 따르면 사포닌이 다량 함유된 홍삼 추출액은 혈관 내피 세포 성장인자(Vascular endo-therlial growth factor, VEGF)의 활성을 증가시켜 세포재생을 촉진 시키는 것으로 알려져 있다.", "따라서 saponin은 MMPs 의 활성을 증가시켜 상처 부위의 재편성과 재형성 그리고 신 혈관 생성을 증가시키고 세포의 증식과 분화를 촉진하여 상처치유에 큰 효과가 있을 것으로 기대되어 진다.", "따라서 본 연구에서는 사포닌의 항산화 효과와 및 사람 피부 섬유아 세포(Human dermal fibroblasts, HDF)에서 MMPs의 활성 및 발현에 미치는 영향을 조사하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Effect of Saponin with Antioxidant Activity on Matrix Metalloproteinase in Human Dermal Fibroblasts", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-dd98b090-cc72-4e16-8e4f-e2e8484e7c77", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "Hye-jung Park", "Moon-Moo Kim", "Dong-Hwan Lee" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,412	<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상</h2><p>B광역시에 거주하는 체지방률이 \( 30 \% \) 이상인 비만중년여성을 대상으로 건강설문지와 직접 면접에 의하여 과거에 병력이 없고, 현재 특별한 질환이 없으며 평소 규칙적인 유산소성 운동에 참여하지 않은 30명으로 하였다. 피검자 중 본인의 희망에 따라 운동참가 희망자 16명과 운동 참가가 불가능한자 14명을 선정하여 실시하였으나 운동기간 중 성실히 참가하지 않은자와 측정 및 검사 결과가 신뢰성이 없는자를 제외한 후 body fat \( (\% \))이 \( 39.91 \pm 1.34 \)인 하타요가집단 9명과 \( 40.94 \pm 2.46 \)인 통제 집단 9명중 본 연구의 목적과 취지를 이해하고 본인의 동의를 얻은 총 18명을 대상으로 측정 및 검사결과를 분석하였으며, 연구대상의 신체적 특성은 Table 1과 같다.</p><h2>측정 항목 및 방법</h2><h3>신체조성 측정</h3><p>체지방률, 제지방량, 체질량지수 및 내장지방 면적은 체성분분석기(InBody 720)를 이용하여 측정하였다. 허리둘레는 줄자를 이용하여 바닥과 수평을 이루고 배꼽부위를 평행으로 지나도록 하고, 직립 자세에서 호기 말에 측정 하였고, 엉덩이 둘레는 옆에서 봤을 때 가장 볼록한 부위를 2회 측정하여 평균값을 기록하였다. WHR은 허리둘레를 엉덩이 둘레로 나눈 값으로 하였다.</p><h3>혈청지질 측정</h3><p>채혈 전 24시간 동안 혈관기능조절 관련인자, 약물 및 카페인 섭취를 금지하였으며, 혈액샘플은 운동 전과 16주 후 12시간 이상 공복상태를 유지하여 전완 주정맥에서 1회용 주사기(Bom Medrea Co, LTD)를 사용하여 \( 15 \mathrm{~ml} \)를 채혈하여 총콜레스테롤은 COP-POD법(TBA-200 FRNEO, Japan), 유리지방산(FFA)과 글루코스(glucose)는 효소법, 중성지방은 유리 Glycerol 소거법(TBA-200 FRNEO, Japan), 고밀도지단백 콜레스테롤과 저밀도지단백 콜레스테롤은 직접측정법(TBA 200-FRNEO, Japan), 인슐린은 \(\gamma\)-Counter (Cobra 5010, USA)으로 분석하였다. 인슐린 저항성지수(HOMA -IR)는 다음의 공식에 의하여 산출하였다.<p>HOMA-IR=fasting insulin (\( \mu\mathrm{U}/ \mathrm{ml}) \)\( \times \)fasting glucose (\(\mathrm{mmol} / \mathrm{l}) \)/22.5</p><h2>건강체력 측정</h2><h3>악력</h3><p>Digital dynamometer를 사용하여 악력계의 지침이 밖으로 향하도록 잡고, 둘째 손가락의 제 2관절이 거의 직각이 되도록 폭을 조절해서 잡은 후 직립자세로 두발을 벌려 서서, 좌우 교대로 2회씩 측정하여 각각 좋은 기록을 \( 0.1 \mathrm{~kg} \)로 기록하였다.</p><h3>배근력</h3><p>Digital back dynamometer를 사용하여 대 위에서 양발 끝을 \( 15 \mathrm{~cm} \)정도 벌려 서서 손잡이를 바로잡고 상체를 \( 30^{\circ} \) 전방으로 기울인 다음 배근력계의 손잡이 높이를 조절하여 양손으로 상체를 일으키면서 손잡이를 서서히 힘껏 끌어당기며, 2회 실시하여 좋은 기록을 \( 0.1 \mathrm{~kg} \)로 계측하였으며, 사전에 충분한 유연체조를 실시하게 하였다.</p><h3>무릎 댄 팔굽혀 펴기</h3><p>마루바닥에 어깨 너비로 손을 짚고 무릎을 바닥에 대어 발을 위로 든 자세로 팔을 펴서 가슴이나 턱이 가볍게 마루에 닿을 정도로 팔꿈치를 90도 이하로 굽혔다가 편다. 팔을 펼때 발끝을 위로 펴고 발을 위로 들어 올린다. 실시 속도는 2초에 1회 리듬으로 하며, 팔굽혀 펴기를 더 이상 할 수 없을 때까지의 올바른 동작으로 실시한 회수만 세어 기록하였다.</p><h3>윗몸 일으키기</h3><p>Bent-knee sit-ups방법을 이용하여 측정시간은 30초 동안 양발을 \( 30 \mathrm{~cm} \) 정도 벌리고 무릎을 직각으로 굽히게 하여 양팔꿈치가 무릎에 닿는 회수를 기록 하였다.</p><h3>간이 하버드 스텝 테스트</h3><p>\( 50 \mathrm{~cm} \) 높이의 의자를 3분간 오르내리는 운동을 1분간 30회 속도로 실시한 후 운동직후 1분에서 1분 30초까지의 맥박수를 측정하여 공식에 의해서 산출 하였다.</p><p>\( \underset{\text { (PFI) }}{\text { 체력지수 }}=\frac{\text { 운동지속시간(초) }}{5.5 \times 30 \text {초간의 맥박수 }} \times 100 \)</p><h3>앉아 윗몸 앞으로 굽히기</h3><p>피검자는 맨발로 두 발바닥이 체전굴계의 수직면에 완전히 닿도록 무릎을 펴고 두발 사이의 간격은 \( 5 \mathrm{~cm} \) 정도로 하여 바르게 앉아서, 상체를 천천히 굽히면서 두 손의 중지로 측정기를 서서히 밀도록 하며 2회 측정하여 좋은 기록을 \( 0.1 \mathrm{~cm} \)로 기록 하였다.</p><h3>하타요가운동 프로그램</h3><p>Iyenger 요가 프로그램을 참조로 체위(asana; sitting down)를 수정◦보완하여 구성하였고, 운동집단의 하타요가운동 프로그램은 Table 2와 같이 주 3회씩 매회 60분간 16주간 실시하였고, 각 운동 동작 마다 개인의 최대운동범위(ROM)의 \( 80\sim 90 \% \) 범위에서 실시하도록 하였으며, 측정기간 중에는 본 운동프로그램 이외의 특별한 규칙적인 운동을 실시하지 않도록 하였다.</p><h2>자료 처리</h2><p>SPSS/PC\( ^{+} \) Version 18.0 프로그램을 이용하여 집단별, 요인별 평균과 표준편차를 산출하고, 운동 프로그램의 실시 전과 16주 후의 차이검정은 paired \( t \)-test, 하타요가집단과 통제집단의 차이검정은 \( t \)-test로 하였으며, 통계적 유의수준은 \( \alpha=0.05 \)로 하였다.</p> <h1>결 과</h1><h2>신체조성과 내장지방면적의 변화</h2><p>운동 전과 16주간 하타요가운동 후 신체조성과 내장지방의 변화는 Table 3과 같다.</p><p>집단 내에서 하타요가집단은 체중(weight), 체지방률\( (\% \)BF), 체질량지수(BMI), 허리엉덩이둘레비(WHR) 및 내장지방면적(VFA)은 유의하게 감소하였고, 제지방량(LBM)은 유의하게 증가하였으나, 통제집단은 체중, 체지방률, 체질량지수 및 내장 지방면적은 유의하게 증가하였고, 체지방량은 유의하게 감소하였다.</p><p>집단 간의 차이는 운동실시 전에는 모든 요인에서 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 운동 후에는 체중, 체지방량 및 허리엉덩이둘레비는 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 체지방률, 체질량지수 및 내장지방면적 모두 하타요가집단이 통제집단보다 유의하게 낮게 나타났다.</p><h2>혈청지질과 에너지 대사의 변화</h2><p>운동 전과 16주간 하타요가운동 후 혈청지질과 에너지 대사의 변화는 Table 4와 같다.</p><p>집단 내에서 하타요가집단은 총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 저밀도지단백 콜레스테롤(LDL-C), 유리지방산(FFA) 및 인슐린저항성지수(HOMA-IR)는 유의하게 감소하였고, 고밀도지단백 콜레스테롤(HDL-C)는 유의하게 증가하였으나, 인슐린(insulin) 및 글루코스(glucose)는 유의한 차이가 나타나지 않았다. 통제집단은 HDL-C는 유의하게 감소하였고, TC, TG, LDL-C, FFA, glucose는 유의하게 증가하였으나 인슐린저항성지수(HOMA-IR)는 유의한 차이가 나타나지 않았다.</p><p>집단 간의 차이는 운동실시 전에는 모든 요인에서 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 운동 후에는 HLD-C는 유의한 차이가 나타나지 않았으나, TC, TG, LDL-C, FFA, insulin, glucose 및 HOMA-IR는 하타요가집단이 통제집단보다 유의하게 낮게 나타닜다.</p><h2>건강체력의 변화</h2><p>운동 전과 16주간 하타요가 운동 후 건강체력의 변화는 Table 5와 같다.</p><p>집단 내에서 하타요가집단은 악력, 배근력, 팔굽혀펴기, 윗몸일으키기, 하버드스텝테스트 및 앉아 윗몸앞으로 굽히기 등 모든 항목에서 유의하게 증가하였고, 통제집단은 모든 항목에서 유의하게 감소하였다.</p><p>집단 간의 차이는 운동실시 전, 하버드스텝테스트를 제외한 모든 요인에서 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 운동 후에는 팔굽혀펴기와 윗몸일으키기에서 하타요가집단은 유의하게 높게 나타났고, 통제집단은 유의하게 낮게 나타났다.</p> <h1>고 찰</h1><p>규칙적인 유산소운동은 에너지소비를 증가시켜 지방사용을 활성화하고 기초대사량의 증가시키고, 체지방량을 감소시킨다. 또한 신체조성, 고혈압과 혈당 및 비만 등의 위험 요인을 감소시키며, 심혈 관계 질환을 예방하거나 그 진행을 지연 및 억제시킨다. 그러므로 지속적인 유산소 운동은 비만과 관련된 대사성 질환요인을 감소시키므로 가장 유용한 비만치료 및 예방요법으로 권장되고 있다.</p><p>본 연구에서 하타요가운동을 실시한 후 운동집단은 체중, 체지방률, 체질량지수, 허리엉덩이둘레비 및 내장지방면적이 유의하게 감소하였고, 제지방량은 유의하게 증가하였으며, 통제집단은 체중, 체지방률, 체질량지수 및 내장지방면적이 유의하게 증가하였고, 제지방량은 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 규칙적인 요가 운동이 비만중년여성들의 체중 증가를 억제 및 감소시키는 효과가 있다는 보고와 폐경기 여성을 대상으로 12개월간 하타요가운동을 실시한 결과 체중이 \( 3.97 \% \) 감소하였으며, 남자 고등학생을 대상으로 12개월간 요가운동을 실시한 결과 체중과 체지방량이 유의하게 감소하였다는 연구결과와 유사하였다. 또한 장기간의 규칙적인 요가운동이 에너지소비를 증가시킴으로써 체지방량을 감소시켜 비만중년여성의 체중, 체지방률, 체지방량, 허리엉덩이둘레비, 체질량지수 및 내장지방 면적을 감소시키고 제지방량의 증가로 기초대사량을 높임으로써 체지방량의 증가를 억제하고, 내장지방의 축적을 감소하여 대사증후군의 위험요인과 비만증의 이환율을 감소시키는 효과가 있을 것으로 사료된다.</p><p>Grundy는 활동적인 여성들은 좌업생활을 하는 여성들보다 TC, TG, LDL-C가 낮으며, HDL-C의 수준이 높아 관상심장질환의 위험률이 낮지만, 좌업생활을 하는 여성의 경우는 관상심장 질환의 발병률이 매년 증가하는 추세를 보인다고 하였다. 특히 여성비만은 영양 과다 섭취보다는 신체활동과 활동 폭의 위축이 더 큰 원인으로 당뇨, 비만증과 높은 TG농도가 관상심질환에 복합적으로 관여한 것으로 생각된다.</p><p>본 연구에서 요가운동을 실시한 후 운동집단은 TC, TG, LDL-C 및 유리지방산은 유의하게 감소하였고, HDL-C는 유의하게 증가하였으며, 통제 집단은 TC, TG, LDL-C 및 유리지방산은 유의하게 증가하였고, HDL-C는 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 심혈관질환과 당뇨병환자를 대상으로 요가운동을 실시한 결과 TC와 LDL-C는 유의하게 감소하였으며, HDL-C는 유의하게 증가하였다는 보고와 고혈압환자를 대상으로 12주간 요가운동을 실시한 결과 TC, TG가 유의하게 감소하여 고혈압환자의 심혈관 질환에 대한 위험변인에 중요한 역할을 하였다고 보고한 결과와 매우 유사하였으며, 또한 관상동맥 질환자를 대상으로 14주간 요가운동을 실시한 결과 TC, TG 및 LDL-C는 유의하게 감소하였고, HDL-C는 유의하게 증가하여 관상 동맥 질환 의 위험요인을 예방하고 완화시키는 유익한 효과가 있었으며, 폐경 전 비만중년 여성을 대상으로 한 연구결과 체중감량 후 TC, TG가 유의하게 감소되었다고 보고한 결과와도 유사하였다.</p><p>복부비만은 질병의 이환율 및 사망률을 높이는 독립적인 위험인자인데 이는 복부내장에 과잉 축적된 지방이 분해되어 유리지방산이 증가되기 때문이며, 이러한 유리지방산의 증가는 근육에서 포도당 이용을 감소시키고 간에서 포도당과 인슐린 저항성에 영향을 줌으로써 인슐린 저항성을 초래하게 된다.</p><p>본 연구에서 요가운동을 실시한 결과 운동집단은 인슐린 저항성지수는 유의하게 감소하였고, 인슐린 및 글루코스는 감소하였으나 유의한 차이는 없었으며, 통제집단은 글루코스와 인슐린 저항성 지수는 유의하게 증가하였고, 인슐린은 증가하였으나 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 허리둘레가 \( 100 \mathrm{~cm} \) 이상이면 지단백 대사와 혈장 인슐린 및 글루코스의 항상성에 이상이 생기며, 이 역치 수준은 남녀에서 비슷하다고 하였으며, 심혈관질환과 당뇨병환자를 대상으로 요가운동을 실시한 결과 공복 시 혈당이 유의하게 감소하였고, 고혈압환자를 대상으로 12주간 요가운동을 실시한 결과 혈당과 혈압이 유의하게 감소하여 고혈압환자의 심혈관 질환에 대한 위험 변인에 중요한 역할을 한다고 하였다. 또한 중년의 제2형 당뇨병환자를 대상으로 6주간 요가운동을 실시한 결과 공복 시 혈당이 유의하게 감소하였고, 폐경 전 비만 중년여성을 대상으로 체중감량 후 렙틴,TC, TG 및 인슐린이 각각 유의하게 감소되었으며, 인슐린 감수성이 유의하게 증가하였다는 보고와 유사하였다. 따라서 장기간의 규칙적인 요가운동이 지방분해를 촉진시키고 에너지대사 조절에 따른 인슐린 저항을 감소시켜 대사질환 및 심혈관질환의 예방에 긍정적인 효과가 있었던 것으로 본다.</p><p>본 연구에서 요가운동을 실시한 후 운동집단은 악력, 배근력, 팔굽혀펴기, 윗몸일으키기, 하버드스텝테스트 및 앉아 윗몸앞으로 굽히기가 유의하게 증가하였으나, 통제집단은 모든 항목에서 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 요가운동이 근력과 근지구력의 향상을 가져와 요통예방에 효과가 있다고 보고하여 본 연구의 결과와 유사하며, 20대를 대상으로 하타요가 운동을 실시한 결과 산소섭취량, 근력, 근지구력 및 유연성에서도 유의하게 증가하였고, 체육교사를 대상으로 12주간 요가운동을 실시 한 결과 체중, 심박수 및 호흡률이 감소하여 폐 기능이 개선되었으며, 초등학생을 대상으로 6개월간 요가운동을 실시한 결과 폐기능, 근력, 근지구력 및 악력이 유의하게 증가하였다고 보고한 결과와도 비슷하였다.</p><p>폐경 전 후 중년여성을 대상으로 주당 3~4회, 운동경력 3년 이상의 운동군(130명)과 비운동군(200명)을 비교한 결과 운동군이 비운동군보다 팔굽혀펴기는 6.19회, 윗몸일으키기는 11.66회가 각각 유의하게 높게 나타났다. 이러한 결과는 장기간 지속적이며 규칙적인 요가운동은 40대 이후의 신체적인 외형뿐만 아니라 가령에 따라 체력이 저하되고, 관절의 가동 범위가 줄어들어 유연성이 감소되는 현상을 예방하고 개선하여 건강을 유지하는데 효과가 좋은 운동이라고 사료된다.</p><p>이상의 결과에서 비만중년여성들의 장기간의 규칙적이고 지속적인 요가운동이 비만중년 여성의 체조성과 혈청지질, 에너지대사 조절인자 및 건강체력의 여러 요인에서 유의한 효과가 나타나 폐경기 전의 비만여성의 지질변화를 긍정적으로 개선시킴에 따라 폐경기 후 감소될 수 있는 고밀도지단백 콜레스테롤을 증가시켜 심혈관질환의 예방에 도움이 되고 비만해소와 대사합병증 예방에 긍정적인 효과가 있었다고 본다. 따라서 중년여성들에게 생활습관병 예방을 위하여 비만 해소와 건강체력향상에 효과가 좋은 요가운동을 실시할 것을 적극 권장하며, 요가운동의 효과를 더욱 신뢰성 있게 밝히기 위하여 남녀 및 여러 연령층의 연구대상에 대한 비교연구가 필요하다고 생각된다.</p> <h1>초록 : 하타요가 운동이 비만중년여성의 신체조성, 혈청지질 및 건강체력에 미치는 영향</h1><p>본 연구는 체지방률이 \(30 \% \) 이상인 비만중년여성 18명을 대상으로 하타요가 운동이 체조성과 혈청지질 및 건강체력에 미치는 효과와 내장지방에 영향을 미치는 요인을 규명하기 위하여 하타요가 운동을 16주간 운동군과 비운동군으로 나누어 주3회, \( 80-90 \% \) ROMmax, 60분간 실시한 후 운동 전과 후의 신체조성, 내장지방, 혈청지질, 에너지대사 및 건강체력을 측정하여 비교 분석하였다. 본 연구의 결과 운동 후에 하타요가집단은 체중, 체지방률\(( \%\)BF), 체질량지수(BMI), 허리엉덩이둘레비(WHR) 및 내장지방면적(VFA)이 유의하게 감소하였다. 총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 저밀도지단백 콜레스테롤(LDL-C), 유리지방산(FFA)은 유의하게 감소하였으나, 고밀도지단백 콜레스테롤(HDL-C)은 유의하게 증가하였으며, 인슐린 저항성지수(HOMA-IR)는 유의하게 감소하였다. 하타요가 집단은 악력, 배근력, 팔굽혀펴기, 윗몸일으키기, 하버드스텝테스트 및 앉아 윗몸앞으로 굽히기는 유의하게 증가하였다. 따라서 장기간의 규칙적이고 지속적인 요가운동이 비만중년 여성의 심혈관질환의 예방에 도움이 되고 비만해소와 대사합병증예방에 긍정적인 효과가 있을 것으로 사료된다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>연구대상</h2><p>B광역시에 거주하는 체지방률이 \\( 30 \\% \\) 이상인 비만중년여성을 대상으로 건강설문지와 직접 면접에 의하여 과거에 병력이 없고, 현재 특별한 질환이 없으며 평소 규칙적인 유산소성 운동에 참여하지 않은 30명으로 하였다.", "피검자 중 본인의 희망에 따라 운동참가 희망자 16명과 운동 참가가 불가능한자 14명을 선정하여 실시하였으나 운동기간 중 성실히 참가하지 않은자와 측정 및 검사 결과가 신뢰성이 없는자를 제외한 후 body fat \\( (\\% \\))이 \\( 39.91 \\pm 1.34 \\)인 하타요가집단 9명과 \\( 40.94 \\pm 2.46 \\)인 통제 집단 9명중 본 연구의 목적과 취지를 이해하고 본인의 동의를 얻은 총 18명을 대상으로 측정 및 검사결과를 분석하였으며, 연구대상의 신체적 특성은 Table 1과 같다.", "</p><h2>측정 항목 및 방법</h2><h3>신체조성 측정</h3><p>체지방률, 제지방량, 체질량지수 및 내장지방 면적은 체성분분석기(InBody 720)를 이용하여 측정하였다.", "허리둘레는 줄자를 이용하여 바닥과 수평을 이루고 배꼽부위를 평행으로 지나도록 하고, 직립 자세에서 호기 말에 측정 하였고, 엉덩이 둘레는 옆에서 봤을 때 가장 볼록한 부위를 2회 측정하여 평균값을 기록하였다.", "WHR은 허리둘레를 엉덩이 둘레로 나눈 값으로 하였다.", "</p><h3>혈청지질 측정</h3><p>채혈 전 24시간 동안 혈관기능조절 관련인자, 약물 및 카페인 섭취를 금지하였으며, 혈액샘플은 운동 전과 16주 후 12시간 이상 공복상태를 유지하여 전완 주정맥에서 1회용 주사기(Bom Medrea Co, LTD)를 사용하여 \\( 15 \\mathrm{~ml} \\)를 채혈하여 총콜레스테롤은 COP-POD법(TBA-200 FRNEO, Japan), 유리지방산(FFA)과 글루코스(glucose)는 효소법, 중성지방은 유리 Glycerol 소거법(TBA-200 FRNEO, Japan), 고밀도지단백 콜레스테롤과 저밀도지단백 콜레스테롤은 직접측정법(TBA 200-FRNEO, Japan), 인슐린은 \\(\\gamma\\)-Counter (Cobra 5010, USA)으로 분석하였다.", "인슐린 저항성지수(HOMA -IR)는 다음의 공식에 의하여 산출하였다.", "<p>HOMA-IR=fasting insulin (\\( \\mu\\mathrm{U}/ \\mathrm{ml}) \\)\\( \\times \\)fasting glucose (\\(\\mathrm{mmol} / \\mathrm{l}) \\)/22.5</p><h2>건강체력 측정</h2><h3>악력</h3><p>Digital dynamometer를 사용하여 악력계의 지침이 밖으로 향하도록 잡고, 둘째 손가락의 제 2관절이 거의 직각이 되도록 폭을 조절해서 잡은 후 직립자세로 두발을 벌려 서서, 좌우 교대로 2회씩 측정하여 각각 좋은 기록을 \\( 0.1 \\mathrm{~kg} \\)로 기록하였다.", "</p><h3>배근력</h3><p>Digital back dynamometer를 사용하여 대 위에서 양발 끝을 \\( 15 \\mathrm{~cm} \\)정도 벌려 서서 손잡이를 바로잡고 상체를 \\( 30^{\\circ} \\) 전방으로 기울인 다음 배근력계의 손잡이 높이를 조절하여 양손으로 상체를 일으키면서 손잡이를 서서히 힘껏 끌어당기며, 2회 실시하여 좋은 기록을 \\( 0.1 \\mathrm{~kg} \\)로 계측하였으며, 사전에 충분한 유연체조를 실시하게 하였다.", "</p><h3>무릎 댄 팔굽혀 펴기</h3><p>마루바닥에 어깨 너비로 손을 짚고 무릎을 바닥에 대어 발을 위로 든 자세로 팔을 펴서 가슴이나 턱이 가볍게 마루에 닿을 정도로 팔꿈치를 90도 이하로 굽혔다가 편다.", "팔을 펼때 발끝을 위로 펴고 발을 위로 들어 올린다.", "실시 속도는 2초에 1회 리듬으로 하며, 팔굽혀 펴기를 더 이상 할 수 없을 때까지의 올바른 동작으로 실시한 회수만 세어 기록하였다.", "</p><h3>윗몸 일으키기</h3><p>Bent-knee sit-ups방법을 이용하여 측정시간은 30초 동안 양발을 \\( 30 \\mathrm{~cm} \\) 정도 벌리고 무릎을 직각으로 굽히게 하여 양팔꿈치가 무릎에 닿는 회수를 기록 하였다.", "</p><h3>간이 하버드 스텝 테스트</h3><p>\\( 50 \\mathrm{~cm} \\) 높이의 의자를 3분간 오르내리는 운동을 1분간 30회 속도로 실시한 후 운동직후 1분에서 1분 30초까지의 맥박수를 측정하여 공식에 의해서 산출 하였다.", "</p><p>\\( \\underset{\\text { (PFI) }}{\\text { 체력지수 }}=\\frac{\\text { 운동지속시간(초) }}{5.5 \\times 30 \\text {초간의 맥박수 }} \\times 100 \\)</p><h3>앉아 윗몸 앞으로 굽히기</h3><p>피검자는 맨발로 두 발바닥이 체전굴계의 수직면에 완전히 닿도록 무릎을 펴고 두발 사이의 간격은 \\( 5 \\mathrm{~cm} \\) 정도로 하여 바르게 앉아서, 상체를 천천히 굽히면서 두 손의 중지로 측정기를 서서히 밀도록 하며 2회 측정하여 좋은 기록을 \\( 0.1 \\mathrm{~cm} \\)로 기록 하였다.", "</p><h3>하타요가운동 프로그램</h3><p>Iyenger 요가 프로그램을 참조로 체위(asana; sitting down)를 수정◦보완하여 구성하였고, 운동집단의 하타요가운동 프로그램은 Table 2와 같이 주 3회씩 매회 60분간 16주간 실시하였고, 각 운동 동작 마다 개인의 최대운동범위(ROM)의 \\( 80\\sim 90 \\% \\) 범위에서 실시하도록 하였으며, 측정기간 중에는 본 운동프로그램 이외의 특별한 규칙적인 운동을 실시하지 않도록 하였다.", "</p><h2>자료 처리</h2><p>SPSS/PC\\( ^{+} \\) Version 18.0 프로그램을 이용하여 집단별, 요인별 평균과 표준편차를 산출하고, 운동 프로그램의 실시 전과 16주 후의 차이검정은 paired \\( t \\)-test, 하타요가집단과 통제집단의 차이검정은 \\( t \\)-test로 하였으며, 통계적 유의수준은 \\( \\alpha=0.05 \\)로 하였다.", "</p> <h1>결 과</h1><h2>신체조성과 내장지방면적의 변화</h2><p>운동 전과 16주간 하타요가운동 후 신체조성과 내장지방의 변화는 Table 3과 같다.", "</p><p>집단 내에서 하타요가집단은 체중(weight), 체지방률\\( (\\% \\)BF), 체질량지수(BMI), 허리엉덩이둘레비(WHR) 및 내장지방면적(VFA)은 유의하게 감소하였고, 제지방량(LBM)은 유의하게 증가하였으나, 통제집단은 체중, 체지방률, 체질량지수 및 내장 지방면적은 유의하게 증가하였고, 체지방량은 유의하게 감소하였다.", "</p><p>집단 간의 차이는 운동실시 전에는 모든 요인에서 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 운동 후에는 체중, 체지방량 및 허리엉덩이둘레비는 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 체지방률, 체질량지수 및 내장지방면적 모두 하타요가집단이 통제집단보다 유의하게 낮게 나타났다.", "</p><h2>혈청지질과 에너지 대사의 변화</h2><p>운동 전과 16주간 하타요가운동 후 혈청지질과 에너지 대사의 변화는 Table 4와 같다.", "</p><p>집단 내에서 하타요가집단은 총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 저밀도지단백 콜레스테롤(LDL-C), 유리지방산(FFA) 및 인슐린저항성지수(HOMA-IR)는 유의하게 감소하였고, 고밀도지단백 콜레스테롤(HDL-C)는 유의하게 증가하였으나, 인슐린(insulin) 및 글루코스(glucose)는 유의한 차이가 나타나지 않았다.", "통제집단은 HDL-C는 유의하게 감소하였고, TC, TG, LDL-C, FFA, glucose는 유의하게 증가하였으나 인슐린저항성지수(HOMA-IR)는 유의한 차이가 나타나지 않았다.", "</p><p>집단 간의 차이는 운동실시 전에는 모든 요인에서 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 운동 후에는 HLD-C는 유의한 차이가 나타나지 않았으나, TC, TG, LDL-C, FFA, insulin, glucose 및 HOMA-IR는 하타요가집단이 통제집단보다 유의하게 낮게 나타닜다.", "</p><h2>건강체력의 변화</h2><p>운동 전과 16주간 하타요가 운동 후 건강체력의 변화는 Table 5와 같다.", "</p><p>집단 내에서 하타요가집단은 악력, 배근력, 팔굽혀펴기, 윗몸일으키기, 하버드스텝테스트 및 앉아 윗몸앞으로 굽히기 등 모든 항목에서 유의하게 증가하였고, 통제집단은 모든 항목에서 유의하게 감소하였다.", "</p><p>집단 간의 차이는 운동실시 전, 하버드스텝테스트를 제외한 모든 요인에서 유의한 차이가 나타나지 않았으나, 운동 후에는 팔굽혀펴기와 윗몸일으키기에서 하타요가집단은 유의하게 높게 나타났고, 통제집단은 유의하게 낮게 나타났다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>규칙적인 유산소운동은 에너지소비를 증가시켜 지방사용을 활성화하고 기초대사량의 증가시키고, 체지방량을 감소시킨다.", "또한 신체조성, 고혈압과 혈당 및 비만 등의 위험 요인을 감소시키며, 심혈 관계 질환을 예방하거나 그 진행을 지연 및 억제시킨다.", "그러므로 지속적인 유산소 운동은 비만과 관련된 대사성 질환요인을 감소시키므로 가장 유용한 비만치료 및 예방요법으로 권장되고 있다.", "</p><p>본 연구에서 하타요가운동을 실시한 후 운동집단은 체중, 체지방률, 체질량지수, 허리엉덩이둘레비 및 내장지방면적이 유의하게 감소하였고, 제지방량은 유의하게 증가하였으며, 통제집단은 체중, 체지방률, 체질량지수 및 내장지방면적이 유의하게 증가하였고, 제지방량은 유의하게 감소한 것으로 나타났다.", "이러한 결과는 규칙적인 요가 운동이 비만중년여성들의 체중 증가를 억제 및 감소시키는 효과가 있다는 보고와 폐경기 여성을 대상으로 12개월간 하타요가운동을 실시한 결과 체중이 \\( 3.97 \\% \\) 감소하였으며, 남자 고등학생을 대상으로 12개월간 요가운동을 실시한 결과 체중과 체지방량이 유의하게 감소하였다는 연구결과와 유사하였다.", "또한 장기간의 규칙적인 요가운동이 에너지소비를 증가시킴으로써 체지방량을 감소시켜 비만중년여성의 체중, 체지방률, 체지방량, 허리엉덩이둘레비, 체질량지수 및 내장지방 면적을 감소시키고 제지방량의 증가로 기초대사량을 높임으로써 체지방량의 증가를 억제하고, 내장지방의 축적을 감소하여 대사증후군의 위험요인과 비만증의 이환율을 감소시키는 효과가 있을 것으로 사료된다.", "</p><p>Grundy는 활동적인 여성들은 좌업생활을 하는 여성들보다 TC, TG, LDL-C가 낮으며, HDL-C의 수준이 높아 관상심장질환의 위험률이 낮지만, 좌업생활을 하는 여성의 경우는 관상심장 질환의 발병률이 매년 증가하는 추세를 보인다고 하였다.", "특히 여성비만은 영양 과다 섭취보다는 신체활동과 활동 폭의 위축이 더 큰 원인으로 당뇨, 비만증과 높은 TG농도가 관상심질환에 복합적으로 관여한 것으로 생각된다.", "</p><p>본 연구에서 요가운동을 실시한 후 운동집단은 TC, TG, LDL-C 및 유리지방산은 유의하게 감소하였고, HDL-C는 유의하게 증가하였으며, 통제 집단은 TC, TG, LDL-C 및 유리지방산은 유의하게 증가하였고, HDL-C는 유의하게 감소한 것으로 나타났다.", "이러한 결과는 심혈관질환과 당뇨병환자를 대상으로 요가운동을 실시한 결과 TC와 LDL-C는 유의하게 감소하였으며, HDL-C는 유의하게 증가하였다는 보고와 고혈압환자를 대상으로 12주간 요가운동을 실시한 결과 TC, TG가 유의하게 감소하여 고혈압환자의 심혈관 질환에 대한 위험변인에 중요한 역할을 하였다고 보고한 결과와 매우 유사하였으며, 또한 관상동맥 질환자를 대상으로 14주간 요가운동을 실시한 결과 TC, TG 및 LDL-C는 유의하게 감소하였고, HDL-C는 유의하게 증가하여 관상 동맥 질환 의 위험요인을 예방하고 완화시키는 유익한 효과가 있었으며, 폐경 전 비만중년 여성을 대상으로 한 연구결과 체중감량 후 TC, TG가 유의하게 감소되었다고 보고한 결과와도 유사하였다.", "</p><p>복부비만은 질병의 이환율 및 사망률을 높이는 독립적인 위험인자인데 이는 복부내장에 과잉 축적된 지방이 분해되어 유리지방산이 증가되기 때문이며, 이러한 유리지방산의 증가는 근육에서 포도당 이용을 감소시키고 간에서 포도당과 인슐린 저항성에 영향을 줌으로써 인슐린 저항성을 초래하게 된다.", "</p><p>본 연구에서 요가운동을 실시한 결과 운동집단은 인슐린 저항성지수는 유의하게 감소하였고, 인슐린 및 글루코스는 감소하였으나 유의한 차이는 없었으며, 통제집단은 글루코스와 인슐린 저항성 지수는 유의하게 증가하였고, 인슐린은 증가하였으나 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다.", "이러한 결과는 허리둘레가 \\( 100 \\mathrm{~cm} \\) 이상이면 지단백 대사와 혈장 인슐린 및 글루코스의 항상성에 이상이 생기며, 이 역치 수준은 남녀에서 비슷하다고 하였으며, 심혈관질환과 당뇨병환자를 대상으로 요가운동을 실시한 결과 공복 시 혈당이 유의하게 감소하였고, 고혈압환자를 대상으로 12주간 요가운동을 실시한 결과 혈당과 혈압이 유의하게 감소하여 고혈압환자의 심혈관 질환에 대한 위험 변인에 중요한 역할을 한다고 하였다.", "또한 중년의 제2형 당뇨병환자를 대상으로 6주간 요가운동을 실시한 결과 공복 시 혈당이 유의하게 감소하였고, 폐경 전 비만 중년여성을 대상으로 체중감량 후 렙틴,TC, TG 및 인슐린이 각각 유의하게 감소되었으며, 인슐린 감수성이 유의하게 증가하였다는 보고와 유사하였다.", "따라서 장기간의 규칙적인 요가운동이 지방분해를 촉진시키고 에너지대사 조절에 따른 인슐린 저항을 감소시켜 대사질환 및 심혈관질환의 예방에 긍정적인 효과가 있었던 것으로 본다.", "</p><p>본 연구에서 요가운동을 실시한 후 운동집단은 악력, 배근력, 팔굽혀펴기, 윗몸일으키기, 하버드스텝테스트 및 앉아 윗몸앞으로 굽히기가 유의하게 증가하였으나, 통제집단은 모든 항목에서 유의하게 감소한 것으로 나타났다.", "이러한 결과는 요가운동이 근력과 근지구력의 향상을 가져와 요통예방에 효과가 있다고 보고하여 본 연구의 결과와 유사하며, 20대를 대상으로 하타요가 운동을 실시한 결과 산소섭취량, 근력, 근지구력 및 유연성에서도 유의하게 증가하였고, 체육교사를 대상으로 12주간 요가운동을 실시 한 결과 체중, 심박수 및 호흡률이 감소하여 폐 기능이 개선되었으며, 초등학생을 대상으로 6개월간 요가운동을 실시한 결과 폐기능, 근력, 근지구력 및 악력이 유의하게 증가하였다고 보고한 결과와도 비슷하였다.", "</p><p>폐경 전 후 중년여성을 대상으로 주당 3~4회, 운동경력 3년 이상의 운동군(130명)과 비운동군(200명)을 비교한 결과 운동군이 비운동군보다 팔굽혀펴기는 6.19회, 윗몸일으키기는 11.66회가 각각 유의하게 높게 나타났다.", "이러한 결과는 장기간 지속적이며 규칙적인 요가운동은 40대 이후의 신체적인 외형뿐만 아니라 가령에 따라 체력이 저하되고, 관절의 가동 범위가 줄어들어 유연성이 감소되는 현상을 예방하고 개선하여 건강을 유지하는데 효과가 좋은 운동이라고 사료된다.", "</p><p>이상의 결과에서 비만중년여성들의 장기간의 규칙적이고 지속적인 요가운동이 비만중년 여성의 체조성과 혈청지질, 에너지대사 조절인자 및 건강체력의 여러 요인에서 유의한 효과가 나타나 폐경기 전의 비만여성의 지질변화를 긍정적으로 개선시킴에 따라 폐경기 후 감소될 수 있는 고밀도지단백 콜레스테롤을 증가시켜 심혈관질환의 예방에 도움이 되고 비만해소와 대사합병증 예방에 긍정적인 효과가 있었다고 본다.", "따라서 중년여성들에게 생활습관병 예방을 위하여 비만 해소와 건강체력향상에 효과가 좋은 요가운동을 실시할 것을 적극 권장하며, 요가운동의 효과를 더욱 신뢰성 있게 밝히기 위하여 남녀 및 여러 연령층의 연구대상에 대한 비교연구가 필요하다고 생각된다.", "</p> <h1>초록 : 하타요가 운동이 비만중년여성의 신체조성, 혈청지질 및 건강체력에 미치는 영향</h1><p>본 연구는 체지방률이 \\(30 \\% \\) 이상인 비만중년여성 18명을 대상으로 하타요가 운동이 체조성과 혈청지질 및 건강체력에 미치는 효과와 내장지방에 영향을 미치는 요인을 규명하기 위하여 하타요가 운동을 16주간 운동군과 비운동군으로 나누어 주3회, \\( 80-90 \\% \\) ROMmax, 60분간 실시한 후 운동 전과 후의 신체조성, 내장지방, 혈청지질, 에너지대사 및 건강체력을 측정하여 비교 분석하였다.", "본 연구의 결과 운동 후에 하타요가집단은 체중, 체지방률\\(( \\%\\)BF), 체질량지수(BMI), 허리엉덩이둘레비(WHR) 및 내장지방면적(VFA)이 유의하게 감소하였다.", "총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 저밀도지단백 콜레스테롤(LDL-C), 유리지방산(FFA)은 유의하게 감소하였으나, 고밀도지단백 콜레스테롤(HDL-C)은 유의하게 증가하였으며, 인슐린 저항성지수(HOMA-IR)는 유의하게 감소하였다.", "하타요가 집단은 악력, 배근력, 팔굽혀펴기, 윗몸일으키기, 하버드스텝테스트 및 앉아 윗몸앞으로 굽히기는 유의하게 증가하였다.", "따라서 장기간의 규칙적이고 지속적인 요가운동이 비만중년 여성의 심혈관질환의 예방에 도움이 되고 비만해소와 대사합병증예방에 긍정적인 효과가 있을 것으로 사료된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "하타요가 운동이 비만중년여성의 신체조성, 혈청지질 및 건강체력에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-f4f81148-1920-4966-a273-259f72f44c61", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "김도연", "이정아", "양점홍" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,413	<h1>재료 및 방법</h1><h2>공시재료</h2><p>본 연구에 사용된 보리 품종은 강보리와 올보리 등 겉보리 2품종과 새찰쌀보리, 새쌀보리, 무등쌀보리 등 쌀보리 3품종을 재료로 사용하였다.</p><h2>실험방법</h2><p>실험은 동아대학교 종합농장에서 실시했으며, 교배모본은 1998년 10월 14일에 파종하였고 1999년 4월 6일부터 4월 30일까지 각 교배 조합에 따라 교배하여 \( \mathrm{F}_{1} \)종자를 채종하였다. 그리고 \( \mathrm{F}_{1} \)종자와 이들 친품종을 1999년 10월 27일에 2조점파로 주간거리는 \( 60 \mathrm{~cm} \times 15 \mathrm{~m} \)로 1립씩 파종하였고, 2000년 3월부터 10월까지 간장, 수장, 망장, 엽장, 엽폭, 주당수수,수당립수, 천립중 등 8개 형질올 조사하였다. 각 형질의 측정치는 반복(3반복, 7개체)에 따른 개체별로 측정하여 평균치를 구하고 heterosis, heterobeltiosis와 유전력 및 상관관계 등을 분석하였다.</p><h2>분석방법</h2><p>각 형질 측정치에 대한 heteriosis는\( \left\{100 \times\left(\mathrm{F}_{1}\right.\right. \)의 평균치-양친의 평균치)/양친의 평균치\|로 계산하였고, heterobel-tiosis는 \( \left\{100 \times\left(\mathrm{F}_{1}\right.\right. \)의 평균치-양친 중 큰 친의 평균치 \( ) / \) 양친중 가장 큰 친의 평균치\}로서 산출하였다. 분산분석의 유의성검정, 유전력검정, 상관관계는 강보리 X 새찰쌀보리, 강보리 X 새쌀보리, 강보리 X 무등쌀보리, 올보리×새찰쌀보리,올보리 X 새쌀보리, 올보리 X 무등쌀보리조합을 정. 역간 교잡을 하여 측정하였다. 그리고 유전력, 유전상관, 표현형상관은 Robinson(1949, 1951) & Grafius(1952)의 분석법을 이용하여 아래의 공식으로 계산하였다.</p><p>\( \begin{aligned} \mathrm{h}^{2} &=\sigma_{\mathrm{G}}^{2} /\left(\sigma_{\mathrm{G}}^{2}+\sigma_{\mathrm{E}}^{2}\right), \quad \mathrm{rPh}=\frac{\operatorname{Cov} X Y}{\sqrt{\sigma^{2} X \cdot \sigma^{2} Y}}, \\ \mathrm{rG} &=\frac{\operatorname{Cov} X Y}{\sqrt{\sigma^{2} X_{G} \cdot \sigma^{2} Y_{G}}} \end{aligned} \)</p> <h1>요 약</h1><p>정역교잡에 따른 보리의 겉보리와 쌀보리의 \( \mathrm{F}_{1} \)세대에 대한 잡종강세의 정도와 이들의 유전적 작용을 평가할 수 있는 heterosis나 heterobeltiosis의 검정과 유전력 및 상관관계를 분석한 결과는 다음과 같다.</p><p>겉보리 X 쌀보리, 쌀보리 X 겉보리의 교배조합에 따른 heterosis는 간장, 수장, 망장, 엽장, 엽폭, 주당수수, 수당립수, 천립중 등의 모든 형질에서 정의 강세율을 보였다. 쌀보리×겉보리의 교배조합이 겉보리 X 쌀보리의 교배조합보다heterosis나 heterobeltiosis가 간장, 엽장, 엽폭, 주당수수, 수당립수 등에서 강세의 정도가 다소 높았고, 피과성의 우성정도는 피성이 과성에 대하여 우성이었음을 확인하였다. 그리고 교배조합간의 유전력은 엽폭에서 \( 94.5 \% \)로 가장 높게 나타났으며, 각 조사형질 대부분 \( 76.7-94.5 \% \)로 높은 수치를 나타내었다. 또한 겉보리와 쌀보리의 정역교배조합간 상관 관계는 정교배의 경우, 엽장과 주당수수\( \left(0.970^{}\right) \), 간장과 수당립수\( \left(0.963^{ }\right) \), 망장과 엽장\( \left(0.862^{ }\right) \)이 정으로 높은 유전상관을, 역교배의 경우, 간장과 수장\( \left(0.926^{ }\right) \), 망장과 엽장\( \left(0.922^{}\right) \), 주당수수와 수당립수\( \left(0.713^{* *}\right) \)가 높은 유전상관을 나타내었다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>공시재료</h2><p>본 연구에 사용된 보리 품종은 강보리와 올보리 등 겉보리 2품종과 새찰쌀보리, 새쌀보리, 무등쌀보리 등 쌀보리 3품종을 재료로 사용하였다.", "</p><h2>실험방법</h2><p>실험은 동아대학교 종합농장에서 실시했으며, 교배모본은 1998년 10월 14일에 파종하였고 1999년 4월 6일부터 4월 30일까지 각 교배 조합에 따라 교배하여 \\( \\mathrm{F}_{1} \\)종자를 채종하였다.", "그리고 \\( \\mathrm{F}_{1} \\)종자와 이들 친품종을 1999년 10월 27일에 2조점파로 주간거리는 \\( 60 \\mathrm{~cm} \\times 15 \\mathrm{~m} \\)로 1립씩 파종하였고, 2000년 3월부터 10월까지 간장, 수장, 망장, 엽장, 엽폭, 주당수수,수당립수, 천립중 등 8개 형질올 조사하였다.", "각 형질의 측정치는 반복(3반복, 7개체)에 따른 개체별로 측정하여 평균치를 구하고 heterosis, heterobeltiosis와 유전력 및 상관관계 등을 분석하였다.", "</p><h2>분석방법</h2><p>각 형질 측정치에 대한 heteriosis는\\( \\left\\{100 \\times\\left(\\mathrm{F}_{1}\\right.\\right. \\)의 평균치-양친의 평균치)", "/양친의 평균치\|로 계산하였고, heterobel-tiosis는 \\( \\left\\{100 \\times\\left(\\mathrm{F}_{1}\\right.\\right. \\)의 평균치-양친 중 큰 친의 평균치 \\( ) / \\) 양친중 가장 큰 친의 평균치\\}로서 산출하였다.", "분산분석의 유의성검정, 유전력검정, 상관관계는 강보리 X 새찰쌀보리, 강보리 X 새쌀보리, 강보리 X 무등쌀보리, 올보리×새찰쌀보리,올보리 X 새쌀보리, 올보리 X 무등쌀보리조합을 정. 역간 교잡을 하여 측정하였다.", "그리고 유전력, 유전상관, 표현형상관은 Robinson(1949, 1951) & Grafius(1952)의 분석법을 이용하여 아래의 공식으로 계산하였다.", "</p><p>\\( \\begin{aligned} \\mathrm{h}^{2} &=\\sigma_{\\mathrm{G}}^{2} /\\left(\\sigma_{\\mathrm{G}}^{2}+\\sigma_{\\mathrm{E}}^{2}\\right), \\quad \\mathrm{rPh}=\\frac{\\operatorname{Cov} X Y}{\\sqrt{\\sigma^{2} X \\cdot \\sigma^{2} Y}}, \\\\ \\mathrm{rG} &=\\frac{\\operatorname{Cov} X Y}{\\sqrt{\\sigma^{2} X_{G} \\cdot \\sigma^{2} Y_{G}}} \\end{aligned} \\)</p> <h1>요 약</h1><p>정역교잡에 따른 보리의 겉보리와 쌀보리의 \\( \\mathrm{F}_{1} \\)세대에 대한 잡종강세의 정도와 이들의 유전적 작용을 평가할 수 있는 heterosis나 heterobeltiosis의 검정과 유전력 및 상관관계를 분석한 결과는 다음과 같다.", "</p><p>겉보리 X 쌀보리, 쌀보리 X 겉보리의 교배조합에 따른 heterosis는 간장, 수장, 망장, 엽장, 엽폭, 주당수수, 수당립수, 천립중 등의 모든 형질에서 정의 강세율을 보였다.", "쌀보리×겉보리의 교배조합이 겉보리 X 쌀보리의 교배조합보다heterosis나 heterobeltiosis가 간장, 엽장, 엽폭, 주당수수, 수당립수 등에서 강세의 정도가 다소 높았고, 피과성의 우성정도는 피성이 과성에 대하여 우성이었음을 확인하였다.", "그리고 교배조합간의 유전력은 엽폭에서 \\( 94.5 \\% \\)로 가장 높게 나타났으며, 각 조사형질 대부분 \\( 76.7-94.5 \\% \\)로 높은 수치를 나타내었다.", "또한 겉보리와 쌀보리의 정역교배조합간 상관 관계는 정교배의 경우, 엽장과 주당수수\\( \\left(0.970^{}\\right) \\), 간장과 수당립수\\( \\left(0.963^{ }\\right) \\), 망장과 엽장\\( \\left(0.862^{ }\\right) \\)이 정으로 높은 유전상관을, 역교배의 경우, 간장과 수장\\( \\left(0.926^{ }\\right) \\), 망장과 엽장\\( \\left(0.922^{}\\right) \\), 주당수수와 수당립수\\( \\left(0.713^{* *}\\right) \\)가 높은 유전상관을 나타내었다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "겉보리와 쌀보리의 교잡 F1 세대에서 생육 및 수량형질의 잡종강세와 정역간 교잡효과", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-e385ef77-4b7b-4844-8fad-c16b28005c7a", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2002", "doc_author": [ "정영주", "정영수", "정원복" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,414	<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주의 분리</h2><p>검정콩, 시판 및 가정용 청국장, 전통된장 등의 분리원 \(1\mathrm{g} \)을 멸균 생리식엄수 10 m에 첨가하여 잘 현탁시켜 10분 동안 방치한 다음, 그것의 \( 0.1 \mathrm{mk} \).씩을 \( 2 \% \) milk casein을 첨가한 LB(yeast extract \( 0.5 \% \), tryptone \( 1 \%\), \(\mathrm{NaCl~} 1 \% \) )평판배지(CM)와 \( 2 \% \) 가용성전분을 첨가한 LB평판배지(SM)에 각각 도말하여 \( 30^{\circ} \mathrm{C}\) 2일간 배양하였다. 두 배지상에서 나타난 colony 중에서 halo zone의 크기가 크고, 명확하며 성장속도가 빠른 단일 colony만을 1차 선별하였다. LB배지에 각각 접종하여 2일간 진탕배양한 후, 각 분리균에 대한 protease와 amylase 활성을 측정한 다음, 효소활성이 비교적 높은 균주를 2차 선별하였다.</p><h2>최종 선정</h2><p>Halo zone의 크기가 크고 가 효소활성이 높은 균으로 2차 선별된 각 균주들을 LB배자상에서 액체 배양하여 배양액 \(1\mathrm{~ml}\)를 effendorf tube에 넣고 8,000 rpm, 5 분 동안 원심 분리한 후, 상징액을 약 \(\2/3\)정도 버리고 멸균수 1 \(\mathrm{ml}\)가하여 균체를 재현탁시킨 다음, \( 100 \mu \mathrm{g}\)를 fibrin 배지상에 접종하여 경시적으로 halo zone의 크기를 관찰하여 혈전용해능을 측정하였다. 또한 남은 배양액은 멸균 생리식염수로 세척 - 집균한 다음, 일정한 농도로 희석하여 증자된 검정콩에 접종한 후, \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 72시간 발효시키면서 방향성, 점질물의 생성능력 및 전항의 혈전 용해능이 가장 우수한 것을 최종 공시균주로 선정하였다.</p><h2>최종균주의 동정</h2><p>최종적으로 선정된 공시균주의 동정은 형태학적, 배양학적, 생리 및 생화학적 특성과 탄소원 자화성을 조사한 다음, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 준하여 확인하였다.</p><p>공시균주의 형태적 특성은 NB(Nutrient broth)배지에 \( 1.5 \% \) agar를 함유시킨 NA(Nutrient agar)배지상에서 성장한 colony의 모양을 관찰하였고, 내생포자 형성은 균주를 Bartholomew와 Wittwer에 의한 Wirtz변법으로 염색하여 광학현미경(Nikon, Labophot형)으로 관찰하였다. 표면 형태는 균주를 \(3\%\) glutaraldehyde- phosphate \( (\mathrm{pH~} \) 7.2)에 3시간 전 고정하고 같은 농도의 완충액으로 세척한 후 \( 2 \% \) \( \mathrm{OsO}_{4} \)-phosphate buffer에 2시간 동안 후 고정하여 알코올 \( 50,70,85,90,95,99,100 \% \)의 상승 농도 순으로 탈수하고 아세톤으로 재 탈수시킨 다음 시료대에 접착하여 \(\mathrm{Au}\)로 coating(\(200^{ \circ} \mathrm{A}\), 진공증착)하여 주사전자현미경(SEM, Akasi SX-40)으로 관찰하였다.</p><p>배양조건 및 배양상의 특징은 NB배지에 공시균주를 접종하여 여러 범위의 온도 \( \left(25,30,35,40,45^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 와 초기 \( \mathrm{pH}(5.5,6.0,6.5,7.0,7.5) \) 에서 20시간 진탕배양 \( (220 \mathrm{rpm}) \) 한 후, \( 660 \mathrm{~nm} \) 에서 홉광도를 측정하여 검토하였다. 생리 및 생화학적 특성은 casein - gelatin - starch의 가수분해, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{S} \) 생성, 질산염 환원, 효소생성 등에 대하여 조사하였다.</p><p>탄소원의 자화성은 \( \alpha \)-cyclodextrin을 포함한 95 가지의 탄소원로 구성된 GP microplate (MicroStation \( { }^{\mathrm{TM}} \), BIOLOG, Inc., U.S.A.)를 이용하여 조사하였다. 각 분리균주를 첨가 하여 발효시킨 청국상의 불쾌춰 발생은 훈련된 패널원 5명을 통하여 발효된 청국장의 불쾌춰 강도를 확인하였다(\(+ \): 매우 약함, \( ++ \): 약함, \( +++ \): 강함, \( ++++ \): 매우 강함).</p> <h1>요약</h1><p>고품질의 기능성 검정콩 청국장을 제조하기 위하여 여러 가지 균원시료로부터 halo zone법에 의하여 437 균주를 1차 분리하고 최종적으로 SMY-212를 검정콩 청국장 발효균으로 선정하였다. 최종 분리균주는 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성과 GP-microplate 동정 시스템에 의하여 Bacillus megaterium과 유사한 균주로 확인하였고, 효소활성(protease : \( 124.8 \mathrm{U} / \mathrm{m \ell}, \alpha \)-amylase : \( 78.2 \mathrm{U} / \mathrm{m \ell} \), glucoamy-lase : \( 13.9 \mathrm{U} / \mathrm{m \ell} \))은 매우 높았으며, 점질물 형성과 혈전용해능도 우수하였다.</p> <h2>균주의 동정</h2><p>최종 선별한 SMY-212균주의 동정을 위하여 형태학적, 배양학적 및 생화학적 특성을 검토하였다. 이 분리균주는 간균\((1.0 \sim 1.2 \times 5.2 \sim 6.3 \mu \mathrm{m}) \)이며, 내생포자를 형성하였다. 또한 운동성을 가진 호기성 세균으로서 starch, casein, gelatin을 가수분해하였고, \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{S} \) 가스는 생성하지 않았다. 성장 \( \mathrm{pH} \) 범위는 \(5 \sim 8 \)정도의 중성부근이며, 성장온도는 \(25 \sim 45 ^{\circ} \mathrm{C} \)로서 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 의하여 Bacillus속의 특성을 가지고 있었다. 그리고 균체의 GP microplate상의 탄소원을 조사한 결과, 아주 잘 이용하는 당류로서는 dextrin, glycogen, cellobiose, fructose, \( \alpha \)-D-glucose, maltose, man-nose, 3-methyl glucose, palatinose, sucrose, furanose였으며, 유기산으로는 methyl pyruvate, pyruvic acid였다. 부분적으로 이용하는 당류로서는 gentiobiose, maltotriose, psicose였으며, 유기산으로는 L-malic acid였으며, 그 외의 당과 유기산, 아미노산 등은 잘 이용하지 못하는 특성을 나타내었다. 결론적으로 95가지 탄소원의 이용과 각종 균주 특성을 종합하여 볼 때, 분리된 공시균주는 Bacillus megaterium과 아주 유사한 균종으로 확인되었다.</p><h2>균주의 생육특성</h2><p>분리한 SMY-212 공시균주의 생육곡선을 검토한 결과, 접종 후 2.5시간의 유도기를 지나 대수증식기에서 균의 증식이 왕성해지면서 \( \alpha \)-amylase protease의 효소활성이 급격히 증가함을 알 수 있었다. 배양온도를 \(25, 30, 35,40,45^{\circ} \mathrm{C} \) 로 조정한 진탕배양기 \( (220 \mathrm{rpm}) \)에서 2일간 배양하여 생육 및 효소생성능을 측정한 결과, \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 생육 및 효소활성이 왕성하였다. 배지의 초기 \( \mathrm{pH} \)를 \( 5.5 \sim 7.5 \)까지 간 구간별로 조정하여 배양한 결과, 생육 및 효소생성의 최적 \( \mathrm{pH} \)는 6.5 부근으로 나타났다.</p> <h1>서 론</h1><p>청국장은 우리 나라 전통상류 중의 하나로 담금 시간과 방법이 짧고 간단한 속성 퐁 발효식품으로서 곡류와 채소류를 상식하는 조상둘의 부족하기 쉬운 단백질과 지방질 급원식품으로 중요한 역할을 담당하여 왔다. 전통 청국장은 건조한 볏짚이나 콩의 종피에 많이 서식하고 있는 고초균(Bacillus subtilis)을 포함한 Bacillus속 세균둘이 원료 콩의 단백질과 당질을 추도적으로 발효시켜 소화합수율을 증진시키고, 독특한 풍미와 점질물을 형성하며 가종 효소와 박테리오신울 포함한 기능성 물질을 생산하게 된다. 이들 자연발효균에 의하여 전통적으로 제조되는 청국장온 지방이나 가정마다 맛과 향기가 다른데, 그 이유로는 자연 발효균의 종류와 분포, 콩의 종류와 저장상테, 발호온도와 습포, 발효기간 등이 다르기 때문인 것으로 판단된다. 청국장에 대한 연구는 대두를 원료로 한 발효과정 중 성분변화, 물성변화, 점질물의 생산, 제조방법과 이용실태조사, 혈전용해효소 균주와 물질의 분리 및 특성, 항고혈압성 펩타이드의 생산 및 분리 등에 관한 것이 있다. 최근에는 청국장의 발효율을 높이고 새로운 기능성을 강화하기 위하여 여러 가지의 고초균과 Bacillus속 균주 스타트를 증자대두에 첨가하여 청국장 제조 및 그 품질특성에 관한 연구들이 있다.</p><p>검정콩은 대두에 비하여 종피가 두겁고 육질에 견고하게 부착되어 있으며, 내부조직이 악간 단단하므로 증자할 때 팽윤도와 발효할 때 콩단백질의 분해율이 낮을 뿐만아니라, 검정콩의 종피로부터 항균성 물질이 존재하여 발효도가 낮다. 종피의 수용성 색소 누출로 인한 식품 고유의 색깥이나 품질변화를 초래하기 때문에, 주로 쌀 - 보리 - 잡곡과 혼합하여 밥밑콩으로 이용되거나 자반용 콩으로 사용되었고, 일부는 떡소, 제과용, 약콩으로 이용되고 있지만, 간장, 된장, 청국장 등의 장류제조에는 많이 이용되지 않고 있다.</p><p>따라서 본 연구에서는 우리나라 청국장의 고유한 맛을 재현하면서 우수한 기능성을 갖는 고품질의 검정콩 청국장을 제조하기 위하여 우선 민간에서 약용으로 알려져 있는 검정콩을 주재료로 이용하여 청국장 발효에 적합한 균주를 분리하여 몇 가지 균학적 특성을 조사하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>균주의 분리</h2><p>검정콩, 시판 및 가정용 청국장, 전통된장 등의 분리원 \\(1\\mathrm{g} \\)을 멸균 생리식엄수 10 m에 첨가하여 잘 현탁시켜 10분 동안 방치한 다음, 그것의 \\( 0.1 \\mathrm{mk} \\).씩을 \\( 2 \\% \\) milk casein을 첨가한 LB(yeast extract \\( 0.5 \\% \\), tryptone \\( 1 \\%\\), \\(\\mathrm{NaCl~} 1 \\% \\) )평판배지(CM)와 \\( 2 \\% \\) 가용성전분을 첨가한 LB평판배지(SM)에 각각 도말하여 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}\\) 2일간 배양하였다.", "두 배지상에서 나타난 colony 중에서 halo zone의 크기가 크고, 명확하며 성장속도가 빠른 단일 colony만을 1차 선별하였다.", "LB배지에 각각 접종하여 2일간 진탕배양한 후, 각 분리균에 대한 protease와 amylase 활성을 측정한 다음, 효소활성이 비교적 높은 균주를 2차 선별하였다.", "</p><h2>최종 선정</h2><p>Halo zone의 크기가 크고 가 효소활성이 높은 균으로 2차 선별된 각 균주들을 LB배자상에서 액체 배양하여 배양액 \\(1\\mathrm{~ml}\\)를 effendorf tube에 넣고 8,000 rpm, 5 분 동안 원심 분리한 후, 상징액을 약 \\(\\2/3\\)정도 버리고 멸균수 1 \\(\\mathrm{ml}\\)가하여 균체를 재현탁시킨 다음, \\( 100 \\mu \\mathrm{g}\\)를 fibrin 배지상에 접종하여 경시적으로 halo zone의 크기를 관찰하여 혈전용해능을 측정하였다.", "또한 남은 배양액은 멸균 생리식염수로 세척 - 집균한 다음, 일정한 농도로 희석하여 증자된 검정콩에 접종한 후, \\( 40^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 72시간 발효시키면서 방향성, 점질물의 생성능력 및 전항의 혈전 용해능이 가장 우수한 것을 최종 공시균주로 선정하였다.", "</p><h2>최종균주의 동정</h2><p>최종적으로 선정된 공시균주의 동정은 형태학적, 배양학적, 생리 및 생화학적 특성과 탄소원 자화성을 조사한 다음, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 준하여 확인하였다.", "</p><p>공시균주의 형태적 특성은 NB(Nutrient broth)배지에 \\( 1.5 \\% \\) agar를 함유시킨 NA(Nutrient agar)배지상에서 성장한 colony의 모양을 관찰하였고, 내생포자 형성은 균주를 Bartholomew와 Wittwer에 의한 Wirtz변법으로 염색하여 광학현미경(Nikon, Labophot형)으로 관찰하였다.", "표면 형태는 균주를 \\(3\\%\\) glutaraldehyde- phosphate \\( (\\mathrm{pH~} \\) 7.2)에 3시간 전 고정하고 같은 농도의 완충액으로 세척한 후 \\( 2 \\% \\) \\( \\mathrm{OsO}_{4} \\)-phosphate buffer에 2시간 동안 후 고정하여 알코올 \\( 50,70,85,90,95,99,100 \\% \\)의 상승 농도 순으로 탈수하고 아세톤으로 재 탈수시킨 다음 시료대에 접착하여 \\(\\mathrm{Au}\\)로 coating(\\(200^{ \\circ} \\mathrm{A}\\), 진공증착)하여 주사전자현미경(SEM, Akasi SX-40)으로 관찰하였다.", "</p><p>배양조건 및 배양상의 특징은 NB배지에 공시균주를 접종하여 여러 범위의 온도 \\( \\left(25,30,35,40,45^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\) 와 초기 \\( \\mathrm{pH}(5.5,6.0,6.5,7.0,7.5) \\) 에서 20시간 진탕배양 \\( (220 \\mathrm{rpm}) \\) 한 후, \\( 660 \\mathrm{~nm} \\) 에서 홉광도를 측정하여 검토하였다.", "생리 및 생화학적 특성은 casein - gelatin - starch의 가수분해, \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{S} \\) 생성, 질산염 환원, 효소생성 등에 대하여 조사하였다.", "</p><p>탄소원의 자화성은 \\( \\alpha \\)-cyclodextrin을 포함한 95 가지의 탄소원로 구성된 GP microplate (MicroStation \\( { }^{\\mathrm{TM}} \\), BIOLOG, Inc., U.S.A.)를 이용하여 조사하였다.", "각 분리균주를 첨가 하여 발효시킨 청국상의 불쾌춰 발생은 훈련된 패널원 5명을 통하여 발효된 청국장의 불쾌춰 강도를 확인하였다", "(\\(+ \\): 매우 약함, \\( ++ \\): 약함, \\( +++ \\): 강함, \\( ++++ \\): 매우 강함).", "</p> <h1>요약</h1><p>고품질의 기능성 검정콩 청국장을 제조하기 위하여 여러 가지 균원시료로부터 halo zone법에 의하여 437 균주를 1차 분리하고 최종적으로 SMY-212를 검정콩 청국장 발효균으로 선정하였다.", "최종 분리균주는 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성과 GP-microplate 동정 시스템에 의하여 Bacillus megaterium과 유사한 균주로 확인하였고, 효소활성(protease : \\( 124.8 \\mathrm{U} / \\mathrm{m \\ell}, \\alpha \\)-amylase : \\( 78.2 \\mathrm{U} / \\mathrm{m \\ell} \\), glucoamy-lase : \\( 13.9 \\mathrm{U} / \\mathrm{m \\ell} \\))은 매우 높았으며, 점질물 형성과 혈전용해능도 우수하였다.", "</p> <h2>균주의 동정</h2><p>최종 선별한 SMY-212균주의 동정을 위하여 형태학적, 배양학적 및 생화학적 특성을 검토하였다.", "이 분리균주는 간균\\((1.0 \\sim 1.2 \\times 5.2 \\sim 6.3 \\mu \\mathrm{m}) \\)이며, 내생포자를 형성하였다.", "또한 운동성을 가진 호기성 세균으로서 starch, casein, gelatin을 가수분해하였고, \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{S} \\) 가스는 생성하지 않았다.", "성장 \\( \\mathrm{pH} \\) 범위는 \\(5 \\sim 8 \\)정도의 중성부근이며, 성장온도는 \\(25 \\sim 45 ^{\\circ} \\mathrm{C} \\)로서 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 의하여 Bacillus속의 특성을 가지고 있었다.", "그리고 균체의 GP microplate상의 탄소원을 조사한 결과, 아주 잘 이용하는 당류로서는 dextrin, glycogen, cellobiose, fructose, \\( \\alpha \\)-D-glucose, maltose, man-nose, 3-methyl glucose, palatinose, sucrose, furanose였으며, 유기산으로는 methyl pyruvate, pyruvic acid였다.", "부분적으로 이용하는 당류로서는 gentiobiose, maltotriose, psicose였으며, 유기산으로는 L-malic acid였으며, 그 외의 당과 유기산, 아미노산 등은 잘 이용하지 못하는 특성을 나타내었다.", "결론적으로 95가지 탄소원의 이용과 각종 균주 특성을 종합하여 볼 때, 분리된 공시균주는 Bacillus megaterium과 아주 유사한 균종으로 확인되었다.", "</p><h2>균주의 생육특성</h2><p>분리한 SMY-212 공시균주의 생육곡선을 검토한 결과, 접종 후 2.5시간의 유도기를 지나 대수증식기에서 균의 증식이 왕성해지면서 \\( \\alpha \\)-amylase protease의 효소활성이 급격히 증가함을 알 수 있었다.", "배양온도를 \\(25, 30, 35,40,45^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 로 조정한 진탕배양기 \\( (220 \\mathrm{rpm}) \\)에서 2일간 배양하여 생육 및 효소생성능을 측정한 결과, \\( 35^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 생육 및 효소활성이 왕성하였다.", "배지의 초기 \\( \\mathrm{pH} \\)를 \\( 5.5 \\sim 7.5 \\)까지 간 구간별로 조정하여 배양한 결과, 생육 및 효소생성의 최적 \\( \\mathrm{pH} \\)는 6.5 부근으로 나타났다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>청국장은 우리 나라 전통상류 중의 하나로 담금", "시간과 방법이 짧고 간단한 속성 퐁 발효식품으로서 곡류와 채소류를 상식하는 조상둘의 부족하기 쉬운 단백질과 지방질 급원식품으로 중요한 역할을 담당하여 왔다.", "전통 청국장은 건조한 볏짚이나 콩의 종피에 많이 서식하고 있는 고초균(Bacillus subtilis)을 포함한 Bacillus속 세균둘이 원료 콩의 단백질과 당질을 추도적으로 발효시켜 소화합수율을 증진시키고, 독특한 풍미와 점질물을 형성하며 가종 효소와 박테리오신울 포함한 기능성 물질을 생산하게 된다.", "이들 자연발효균에 의하여 전통적으로 제조되는 청국장온 지방이나 가정마다 맛과 향기가 다른데, 그 이유로는 자연 발효균의 종류와 분포, 콩의 종류와 저장상테, 발호온도와 습포, 발효기간 등이 다르기 때문인 것으로 판단된다.", "청국장에 대한 연구는 대두를 원료로 한 발효과정 중 성분변화, 물성변화, 점질물의 생산, 제조방법과 이용실태조사, 혈전용해효소 균주와 물질의 분리 및 특성, 항고혈압성 펩타이드의 생산 및 분리 등에 관한 것이 있다.", "최근에는 청국장의 발효율을 높이고 새로운 기능성을 강화하기 위하여 여러 가지의 고초균과 Bacillus속 균주 스타트를 증자대두에 첨가하여 청국장 제조 및 그 품질특성에 관한 연구들이 있다.", "</p><p>검정콩은 대두에 비하여 종피가 두겁고 육질에 견고하게 부착되어 있으며, 내부조직이 악간 단단하므로 증자할 때 팽윤도와 발효할 때 콩단백질의 분해율이 낮을 뿐만아니라, 검정콩의 종피로부터 항균성 물질이 존재하여 발효도가 낮다.", "종피의 수용성 색소 누출로 인한 식품 고유의 색깥이나 품질변화를 초래하기 때문에, 주로 쌀 - 보리 - 잡곡과 혼합하여 밥밑콩으로 이용되거나 자반용 콩으로 사용되었고, 일부는 떡소, 제과용, 약콩으로 이용되고 있지만, 간장, 된장, 청국장 등의 장류제조에는 많이 이용되지 않고 있다.", "</p><p>따라서 본 연구에서는 우리나라 청국장의 고유한 맛을 재현하면서 우수한 기능성을 갖는 고품질의 검정콩 청국장을 제조하기 위하여 우선 민간에서 약용으로 알려져 있는 검정콩을 주재료로 이용하여 청국장 발효에 적합한 균주를 분리하여 몇 가지 균학적 특성을 조사하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "검정콩 청국장 제조를 위한 Bacillus megaterium SMY-212의 분리 및 균학적 특성", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-e633f846-81dc-4d38-bfc7-9ea079017c85", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2001", "doc_author": [ "손미예", "권선화", "성찬기", "이상원", "박석규" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,415	<h1>결 과</h1><h2>STME의 성숙지방세포에서의 중성지방 축적 억제 효과</h2><p>산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 콩과에 속하는 약재로 이미 백혈병, 폐암세포에 항암 효과 및 식중독 미생물에 항균효과를 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 오늘날 비만은 질병으로 분류하고 있으며 무한 증식을 가장 큰 특징으로 하는 암세포와 비슷하게 비만세포 또한 계속적인 증식을 이어나가며 세포 내에 중성지방을 축적하는 또 다른 특징을 가지고 있다. 따라서, 산두근 메탄올 추출물(STME)이 지방세포의 분화 및 중성지방 축적에 어떠한 영향을 미치는 지 검토하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포의 성숙지방세포로의 유도와 함께 STME를 각각 \( 10, 50, 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로 처리하였다.</p><p>앞서 재료 및 방법에서도 설명하였듯이, 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 유도 및 분화에는 몇 가지의 단계(Day 0, 2, 4, 6)와 분화유도제를 필요로 한다. STME의 중성지방 축적 억제효과는 가장 마지막 단계인 Day 6, 즉 분화가 완료된 성숙 지방세포에서 Oil Red O 염색 후 위상차현미경으로 관찰하였다. Fig. 1A의 결과에 제시한 것처럼 Day 6 때의 분화 유도가 끝난 성숙지방세포의 세포 형태 및 지방세포 내의 중성지방 축적(lipid droplet)량은 대조군에 비해 STME를 농도별로 첨가한 세포에서는 농도 의존적으로 지방 축적량이 감소되는 것을 확인 할 수 있었으며, \( 200 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 현저한 차이를 확인할 수 있었다. 중성지방 축적량을 정량적으로 조사하기 위하여 중성지방을 염색한 Oil Red O 염색 성분을 isopropanol로 용해시킨 후 흡광도를 측정 하였다. 그 결과 Fig. 1B에 나타낸 것과 같이 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었으며 STME 처리 최고 농도인 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서는 약 \( 70 \% \) 정도 지방 축적량이 감소됨을 확인하였다.</p><p>이러한 중성지방 축적의 현저한 감소는 STME에 의한 기능적인 활성인지 혹은 지방전구세포에 독성으로 인한 세포의 사멸에 의한 것인지 검토할 필요가 있었다. 따라서 \( 10 \sim 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 범위의 농도에서 3T3-L1 지방전구세포에 대한 세포 독성을 검토한 결과 실험한 모든 농도에서 \( 90 \% \) 이상의 생존율을 보였으므로 현재 실험 범위의 농도에서는 STME의 독성에 의한 효과가 아니라 중성지방 축적 억제 효과에 의한 것임을 알 수 있었다(data not shown).</p><h2>STME의 mitotic clonal expansion (MCE) 억제 효과</h2><p>지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 지방전구세포의 증식(preadipocyte proliferation), 성숙지방세포로의 분화(differentiation), 성숙지방세포의 증식(proliferation)으로 나누어 진행되지만, 지방세포로의 분화가 일어나기 위해서는 adipogenic signal induction, growth arrest (G1 phase), mitotic clonal expansion, re-enter cell cycle과 같은 아주 복잡하고 질서 정연한 단계를 거친다. 이중 mitotic clonal expansion 단계는 정지되었던 세포주기가 분화유도제의 자극에 의해 세포주기가 다시 움직여 세포 수가 2~4배 증가하는 단계이다. 이 mitotic clonal expansion 단계를 억제하면 성숙 지방세포로의 분화가 더 이상 진행되지 않는다는 연구 결과가 이미 보고되어 있다. 따라서 본 연구는 STME가 이러한 활성을 나타내는지 알아보기 위하여 3T3-L1 지방전구세포의 분화유도를 위하여 분화유도제를 처리함과 동시에 STME를 \( 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리하여 Day 1, Day 2의 기간 동안 세포수의 변화를 측정하였다. Fig. 2의 결과와 같이 대조군으로 사용한 3T3-L1의 경우 Day 0에서 분화유도제를 첨가하고 분화유도 하였을 때 Day 1에서 1.9배, Day 2 에서 2.4배로 세포수가 증가하는 것을 확인하였다. 하지만 STME \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)를 첨가한 경우, Day 1 에서 1.3배, Day 2 에서 1.7배 증가하였으며 \( 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 Day 1에서 1.3배, Day 2에서 1.3배로 더 이상의 세포수 증가를 확인할 수 없었다. 이상의 결과로 STME는 3T3-L1의 mitotic clonal expansion 단계를 억제시키는 것을 알 수 있었다.</p><h2>STME의 지방세포 분화 조절 인자들의 발현에 미치는 영향</h2><p>지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 복잡한 단계를 거치게 되며 관련된 여러 조절인자들의 발현 촉진 과정을 거치게 된다. 이러한 분화 과정에서 가장 중추적인 역할을 하는 것이 peroxisome proliferation activated receptor gamma(\(PPAR \gamma \) )와 CCAAT enhancer binding protein (C/EBP) family라고 불리는 전사인자들이다. 분화 유도 물질은 이러한 전사 인자들의 발현을 촉진시킴으로써 지방전구세포를 지방세포로 분화시킨다. 먼저\(C/EBP \beta \)는 전구지방세포에서 분화유도제에 의해 발현 유도되어 실질적인 지방세포 분화를 담당하는 \(PPAR \gamma \) 와 \( C/EBP \alpha \)의 발현을 유도하는 단백질로 분화초기 clonal expansion (Day 2) 과정에서는 발현량이 많으나 성숙지방세포(Day 6)가 되면 발현이 저하되는 특징을 나타낸다. 한편, \( C/EBP \alpha \)는 \( PPAR \gamma \)의 발현을 유도할 뿐만 아니라 \( PPAR \gamma \) 와 협력하여 지방세포의 성숙분화를 담당하는 유전자의 발현을 제어하고 있는 것으로 알려져 있다. \( PPAR \gamma \)는 핵 내 수용체형의 전사인자로써 같은 수용체형 전사인자 \( RXR\alpha \) (\(retinoid \times \ receptor \alpha \) )와 heterodimer를 형성하여 여러 종의 지방산이나 지방산 대사산물의 내인성 ligand로써 결합하여 전사능이 활성화된다. 또한, 지방세포의 성숙분화시기에 유도되며 지방세포 특이적 유전자의 promoter영역에 존재하는 PPAR 결합영역인 PPRE (PPAR responsive element)에 결합하여 그 유전자의 발현을 유도한다. 따라서 여기서 언급한 초기의 \( C/EBP \beta \), 성숙기의 \(PPAR \gamma \)와 \( C/EBP \alpha \)의 발현에 STME가 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 세포는 2가지 단계로 MCE 단계(Day 2)와 완전분화 단계(Day 6)의 세포를 이용하였으며, 단백질 발현량의 변화는 Western blot analysis를 행하여 확인하였다. 그 결과 Day 2와 Day 6에서 이들 전사인자들의 확연한 발현 차이를 확인할 수 있었다. 먼저, Fig. 3A의 결과에 의하면 지방세포 분화초기단계에 발현이 유도되는 \( C/EBP \beta \)는 Day 2의 단계에서 농도 의존적으로 발현이 저하되는 것을 확인하였다. 완전분화 단계의 Day 6의 결과에서는 \( C/EBP \alpha \)가 STME 농도에 따라 농도 의존적으로 발현이 확연히 저하되는 것을 확인할 수 있었으며 \(PPAR \gamma \) 또한 발현이 저하되었다. SREBPIc의 유전자 또한 발현이 농도 의존적으로 저하됨을 확인하였으며 이 유전자는 지방산이나 콜레스테롤 합성에 필수 전사인자인 SREBP (sterol regulatory element binding protein)의 하나이며 \(PPAR \gamma \) ligand 생성에도 관여하는 것으로 보고되어 있다. 따라서 STME는 지방세포 분화 및 지방산 합성 관련 유전자의 발현을 억제하여 성숙지방세포로의 분화 및 지방 축적을 억제하는 것으로 사료된다.</p><h2>STME의 처리에 의한 세포주기의 변화분석</h2><p>앞선 결과에 의하면 STME의 처리에 따라 MCE의 억제 및 관련 유전자들의 발현 억제를 확인 할 수 있었다. 지방전구세포는 분화유도제에 의해 세포가 증식-분화-증식의 다단계를 거치면서 성숙지방세포로 분화되기 때문에 STME가 이러한 세포주기 변화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포(Day 0)에 분화유도제와 STME를 처리하여 세포주기 변화가 확인 가능한 14시간째에 회수하여 FACS analysis를 시행하였다. Fig. 4에서 확인되는 것처럼 분화유도제만 처리한 대조군에서는 sub-G1기의 개체군이 \( 6.7 \% \), G1기 개체군이 \( 16.9 \% \), S기 개체군이 \( 42.17 \% \), G2/M기 개체군이 \( 41.3 \% \)로 세포주기 별로 고루 분포하고 있음을 확인할 수 있었다. 이에 비해 STME를 처리한 세포에서는 STME의 농도가 \( 10, 50, 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)으로 증가할수록 G1기 개체군의 비율이 \( 33.68 \%, 39,39 \%, 48.03 \%, 55.14 \% \)로 계속 증가되었으며, 상대적으로 S기 개체군의 비율이 \( 38.2 \%, 31.4 \%, 16.5 \%, 5.1 \% \)로 점점 감소하는 것을 알 수 있었다. 즉, STME의 처리 농도가 증가될수록 세포들은 세포주기에서 G1기의 분포가 높아져 STME는 지방전구세포의 G1 arrest를 유도함을 확인 할 수 있었다.</p><h2>STME의 처리에 의한 세포주기의 G1 arrest 관련 단백질들의 발현 변화</h2><p>Fig. 4의 결과에서 STME는 3T3-L1 세포의 세포주기를 G1기에서 정지시킴으로서 분화를 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. 이것을 보다 명확하게 분석하기 위해서 G1 arrest에 관계하는 단백질들의 발현량의 변화를 검토하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포(Day 0)에 분화유도제와 STME를 처리하여 14시간 반응시킨 후 회수하여 Western blot analysis를 시행하였다. 확인한 단백질은 세포주기 G1기에서 S기로의 전이에 필수적인 단백질인 Cdk2, pRb, phospho-pRb 및 전사인자 E2F-1과, G1기 전이를 저해하는 Cdk inhibitor p21의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, STME의 처리 농도가 증가될수록 Cdk2의 발현량이 감소되었으며, Rb 단백질의 인산화가 확연하게 감소함과 동시에 전사인자인 E2F-1의 발현 감소가 확인되었다. 더 뚜렷한 변화는 Cdk2 inhibitor인 p21의 발현량이 현저하게 농도 의존적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 결과는 STME의 처리에 의해 p21의 발현량이 증가되며 이로 인해 Cdk2의 활성이 억제되고, 이어서 전사인자인 Rb의 인산화를 저하시켜 세포주기가 G1기에서 정지되는 것으로 사료된다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>산두근 메탄올 추출물(STME)의 제조</h2><p>본 실험에 사용한 산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 삼흥건재약업사(서울)에서 구입한 후, 잘게 세절하여 분말화한 후, 산두근 \( 100 \mathrm{~g} \)에 메탄올 2\( \mathrm{l} \)를 첨가하여 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 3회 추출하였다. 추출액을 Whatman No.2 paper(Whatman international Ltd., England)로 여과하여 불순물을 제거하고 그 여액을 감압 농축기를 사용하여 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 감압, 농축하여 추출물 \( 19.2 \mathrm{~g} \)을 얻었으며 이를 STME (Sophora tankinensis Gapnep. MeOH extract)로 명명하고 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 초저온 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 실험 시에는 이 추출물을 DMSO에 녹여 \( 500 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 만든 다음 이를 적정한 농도로 희석하여 사용하였다.</p><h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 성숙지방세포로의 분화 유도</h2><p>본 실험에 사용한 3T3-L1 (mouse embryonic fibroblast cell line) 지방전구세포는 미국세포은행(American Type Culture Collection: ATCC, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 세포의 배양은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 \( 10\% \) bovine calf serum (BCS, Gibco BRL)과 100 \( \mathrm{units}/ \mathrm{ml} \)의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)을 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 조건 하에서 배양하였다. 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 몇 단계를 거치면서 진행되기 때문에 각 단계를 날짜 별로 표기하였다. 먼저 3T3-L1 세포가 cell dish에서 confluent 상태가 되었을 때를 Day 0이라고 하며 이때, 분화유도제로 사용되는 insulin, dex-amethasone 및 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)을 각각 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}, 0.25 \mu \mathrm{M}, 0.5 \mathrm{mM} \) 첨가하여 분화를 유도하고 2일간 배양하였다(Day 2). 또한 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 \( 10\mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 insulin을 첨가하고 2일간 더 배양하였다(Day 4). 여기에 배지 교환과 \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 insulin 첨가 후 2일간 더 배양 한 상태를 Day 6이라 하며 성숙지방세포의 실험을 행하였다.</p><h2>세포 내 지방입자의 염색 및 정량(Oil Red O 염색)</h2><p>3T3-L1 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화 및 분화 억제는 Oil Red O 염색법을 이용하여 분화 시에 형성되는 지방구를 염색하여 확인하였다. STME는 Day 0, 2, 4,6의 단계마다 배지 교환 시 함께 처리하였으며 농도는 \( 10 \sim200 \mathrm{ug} / \mathrm{ml} \)범위로 처리하였다. 대조군으로 \( 0.5 \% \) DMSO만 처리하여 배양 한 3T3-L1 지방전구세포를 사용하였으며, 실험군과 대조군 모두 완전한 지방세포로의 분화가 이루어진 시점에 모든 plate의 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffered saline (PBS)으로 세포를 세척한 뒤, \( 10 \% \) formalin을 처리하여 실온에서 1시간 고정시켰다. Formalin을 완전히 제거한 다음 \( 60 \% \) isopropanol로 세척한 뒤 Oil Red O working solution을 넣고 실온에서 10분간 염색을 하였다. 이 때 Oil Red O working solution은 Oil Red O powder \( 0.35 \mathrm{~g} \)을 \( 100 \mathrm{ml} \)의 isopropanol에 녹인 뒤 증류수에 6:4의 비율로 희석한 다음 여과하여 사용하였다. 세포를 염색한 뒤 Oil Red O working solution을 완전히 제거 한 다음 증류수로 4번 세척하고 위상차현미경으로 세포의 염색 상태를 관찰하였다. 또한 정량적 분석을 위하여 \( 100 \% \) isopropanol로 세포로부터 지방을 용출시켜 spectrophotometer를 이용하여 \( 500 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 중성지방의 축적량을 계산하였다.</p><h2>세포증식 속도 측정(Mitotic clonal expansion 저해 효능)</h2><p>지방세포의 분화과정에서 mitotic clonal expansion 과정은 필수적이며 분화유도제로 분화를 인위적으로 유도시킬 때 분화초기 2일안에 일어난다. 따라서 STME가 지방전구세포 3T3-L1의 분화과정 중 nitotic clonal expansion 과정에 미치는 영향을 조사하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포를 \( 60 \mathrm{~mm~} \)dish에 \( 1 \times 10^{5} \)cells/dish의 농도로 분주하여 배양 한 다음 day 0 때에 분화유도제와 STME를 농도별(\(10, 50, 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 처리하여 배양하였다. Day 0, 1, 2의 세포를 각각 회수하고 trypan blue assay 법으로 염색하여 3T3-L1 지방전구세포의 증식속도를 측정하였다. 배양한 세포를 배지를 제거하고 \( 0.05 \% \) trysin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시켜서 PBS를 적당량 첨가하여 세포를 모았다. 이것을 2,000 \( \mathrm{rpm} \)으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 다시 \( 1 \mathrm{ml} \)의 PBS와 \( 0.4 \% \) trypan blue solution (SIGMA)을 첨가하여 2분간 처리하여 살아 있는 세포수를 위상차현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 계수하였다.</p><h2>Flow cytometry 분석에 의한 세포주기 변화 측정</h2><p>3T3-L1 지방전구세포를 \( 60 \mathrm{~mm} \) dish에 \( 1 \times 10^{5} \) cells/dish의 농도로 분주하여 배양하여 confluent 상테가 된 day 0 때에 분화유도제와 STME를 농도별(\(10, 50, 100, 200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \)로 처리하였다. 그 후, 3T3-L1 지방전구세포의 doubling time인 14시간 후에 세포를 회수하여 PBS로 세척하고 \( 100 \% \) ethanol을 이용하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 고정시켰다. 고정된 세포는 분석 전에 PBS로 세척하고 ribonuclease A를 최종농도 \( 1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이 되도록 첨가한 다음 실온에서 30분간 반응시켰다. 세포주기 변화는 PI/RNase staining buffer (BD Pharmingen \( ^{\mathrm{TM}} \) )용액을 500 \( \mu\mathrm{l} \) 첨가한 후 유세포 분석기(FACS, Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였으며 결과는 Cell Quest program을 이용하여 분석하였다.</p><h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2><p>세포주기 변화 측정과 동일한 상태의 세포를 배양하여 회수하였다. 세포 내의 총 단백질 정량을 위한 전기영동을 실시하기 위하여 회수한 세포를 PBS로 한번 세척한 후 CSK 완충액 [\( 100 \mathrm{mM} \ Pipes (\mathrm{PH} 6.8), 100 \mathrm{mM} \mathrm{~NaCl}, 1 \mathrm{mM} \mathrm{~MgCl}_{2}, 1 \mathrm{mM} \ EGTA, 1 \mathrm{mM~} dithiothreitol (DTT)\)]에 \( 0.1\% \) Triton X-100, \(1 \mathrm{mM~} ATP\)와 \( 1\% \) Protease inhibitor Cocktail (BD Pharmingen \( ^{\mathrm{TM}} \) )이 첨가된 용액으로 현탁하여 15분간 반응 시킨 후 초음파 파쇄기로 파쇄 하였다. 파쇄 한 세포는 \( 14,000\mathrm{rpm} \)에서 20분간 원심 분리하였으며, 상등액 내의 단백질량은 BCA법을 이용하여 정량한 후 동량의 단벡질 \( (25 \mathrm{ug}) \)을 sodium dodecyl sulfate (SDS) - polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 하였다. 전기영동 후 gel 내의 단백질을 PVDF membrane에 전사시킨 후 blocking solution [\( 0.15 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl}, 1 \mathrm{~M~} Tris-HCI (\mathrm{pH} 7.5), 0.1 \% \ Triton X-100, \ 5\%\ BSA\)]을 사용하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 16시간 blocking 시켰다. 1차 항체는 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), 16시간 반응시켰으며, TBS buffer [\( 50\mathrm{mM}\ Tris-HCl \mathrm{~pH} 7.5\), \( 0.15\mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \), \( 0.1 \% \ Triton X-100\)]를 사용하여 membrane을 세척 한 다음 2차 항체를 넣고 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 16시간 반응시켰다. Membrane을 세척한 후 면역반응 단백질은 화학발광 시스템(Chemiluminescence system; Super Signal West Femto Maxium sensitivity Substrate, Pierce, USA)으로 검출하였다. Western blotting에 사용된 \( C/EBP \alpha \), \(C/EBP \beta \)의 1차 항체는 Cell signaling Technolgy (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며 \( PPAR \gamma \), SREBP1c, p21, p27, CyclinE, Cdk2, Rb, Phospho-Rb, E2F-1 등의 1차 항체 및 anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG는 Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.</p> <h1>초록 : 산두근 추출물의 세포주기 정지를 통한 3T3-L1 지방전구세포의 분화 억제</h1><p>산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 예로부터 동양지역에서 전통적인 약용식물로 사용되어 왔다. 본 연구에서는 3T3-L1 지방전구세포의 성숙지방세포로의 분화와 세포 내 지방생성에 대한 산두근 메탄올 추출물(STME)의 효과와 메커니즘에 대해 조사하였다. STME를 \( 0-200 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도로 처리한 다음, Oil Red O 염색으로 세포 내 축적되는 지방구와 지질의 양을 측정한 결과 농도의존적으로 크게 감소됨을 확인하였으며 3T3-L1 지방전구세포의 분화와 관련된 단백질의 발현의 변화를 조사하였다. 지방세포의 특이적 marker인 peroxisome proliferator-activated receptor \( \gamma \) (PPAR \( \gamma \) ), cytidine-cytidine-adenosine-adenosine-thymine (CCAAT)/enhancer-binding proteins \( \alpha, \beta\ (C/EBP \alpha,\ C/EBP \beta) \) 그리고 sterol regulatory element binding protein (SREBP)의 발현이 STME를 처리하였을 때 현저하게 저해됨을 확인하였다. 세포주기의 변화를 분석한 결과 STME는 지방세포 분화 초기 단계인 mitotic clonal expansion 단계에서 G1기로 세포주기를 정지시켰다. 더불어 G1 arrest와 관련된 단백질의 변화를 조사 한 결과, 3T3-L1 세포에 STME를 처리하였을 때 p21의 발현량이 확연하게 증가하였으며, Cdk2, E2F-1 그리고 phosphor-Rb의 발현량은 농도의존적으로 감소하였다. 이러한 결과들에 의하여 STME은 메탄올 추출물임에도 불구하고 3T3-L1 지방전구세포가 성숙지방세포로 분화할 때 G1 arrest를 통하여 지방세포 분화를 억제하며 관련 유전자의 발현 억제도 확연하게 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 항 비만 천연물 소재 탐구의 기초자료로 유용하게 쓰일 것으로 사료된다.</p> <h1>서 론</h1><p>비만은 에너지의 섭취와 소비 불균형으로 발생하는 대사성질환으로 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심장질환, 암 발생 등 각종 성인병 및 만성 질환을 유발하는 원인으로 알려져 있다. 비만은 유전적 요인, 식생활 및 생활습관과 같은 개인의 생활 환경적 요인에 따라 유발되는데 전 세계적으로 비만인구는 날로 증가 추세에 있으며, 한국도 식생활의 서구화와 생활습관의 변화에 따라 계속 증가 추세에 있어 비만 치료와 예방에 사회적 관심이 증대되고 있다. 이러한 시대, 사회적 요구에 부응하여 최근 많은 연구자들이 식품이나 천연물에서 부작용이 적고 효과적인 비만 치료제 또는 비만 예방 소재를 찾고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.</p><p>항비만 관련 소재 연구나 기작 연구에는 일반적으로 mouse embryo 유래의 지방전구세포를 이용한 3T3-L1 adipocyte dif-ferentiation system을 많이 사용하고 있다. 비만은 지방전구세포가 adipogenesis 과정에 의하여 성숙지방세포로 분화되고 여기에 섭취된 영양물 중의 triglyceride가 축적되어 지방세포 내에 과포화 지방구가 형성되어 유발된다. Adipogenesis 과정은 insulin을 포함한 호르몬 자극과 함께 분화과정에 관여하는 유전자들의 발현에 펄요한 전사인자들의 활성이 필수적이며, 크게 지방전구세포의 증식(preadipocyte proliferation), 성숙지방세포로의 분화(differentiation) 및 성숙지방세포의 증식(proliferation) 과정과 같은 3단계로 진행되고, 그 중 가장 중요한 differentiation 과정에서는 adipogenic signal induction, growth arrest (G1기), mitotic clonal expansion, re-enter cell cycle의 세부적인 단계를 거친다. 이런 단계에 따라 관련 유전자들의 발현 양상도 달라지는데 먼저 분화초기에 전사인자 CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) family로 알려진 C/EBP\( \beta \)가 분화유도인자(adipogenic inducer)인 insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX)의 자극에 의해 발현된다. 다음은 C/EBP\( \beta \)가 signal-regulated kinase \( 1 / 2 \) (ERK\( 1 / 2 \)), glycogen synthase kinase-3\( \beta \) GSK-3\( \beta \), cyclin-dependent kinase 2 (Cdk2)와 같은 인산화 효소에 의해 활성형으로 변화하게 되고, 이때부터는 실질적으로 전사조절 인자로 작용하여 지방세포의 분화 및 증식에 중요한 역할을 담당하는 peroxisome pro-liferator-activated receptor \( \gamma \) (PPAR \( \gamma \) )와 C/EBP\( \alpha \) 에 대해 유전자의 발현을 유도하게 된다. 분화초기 조절인자 C/EBP\( \beta \)가 활성화되어 분화후기 조절인자 PPAR\( \gamma \)와 C/EBP\( \alpha \)가 유도되는데 약 2일이 소요되며, 그 후 G1기에 정지되어 있던 지방 전구세포가 S기로 들어가면서 세포증식이 일어나기 시작하여 세포수가 3~4배 증가하는데, 이때를 mitotic clonal expansion 과정이라 한다. 이 과정은 지방세포 분화에 필수적인 과정이며 지방세포 성숙에 중요한 단계이다. 성숙지방세포로의 분화 단계인 differentiation 과정은 수일에서 수주의 시간이 걸리며, 분화된 세포는 형태적으로 둥글게 되고, PPAR\( \gamma \)와 C/EBP\( \alpha \)의 발현으로 인해 실제로 지방세포의 표현형을 결정짓는 대부분의 유전자들이 조절되거나 그 발현이 활성화된다. 이들 유전자들로는 GPDH (glycer-ophosphate dehydrogenase), ACC (acetyl-CoA carboxylase), ME (malic enzyme), Glut4 (Glucose transporter type), IR (insulin receptor), aP2 (adipocyte selective fatty acid binding protein) 등이 있다. 이러한 과정을 통해서 중성지방의 지방구 (lipid droplet)들이 세포질에 나타나게 되고, 시간이 지남에 따라 커지고 또 합쳐지면서 하나 혹은 몇 개의 큰 방울이 되어 지방세포의 분화가 완료된다. 비만을 예방하거나 치료하기 위하여 이러한 분화과정을 적절히 조절하는 화합물을 탐색하는 것도 항비만 소재 개발에 관한 연구에 있어서 중요한 전략 중의 하나다. 지방세포의 분화는 growth arrest와 mitotic clonal expansion을 반복하면서 분화가 진행되는 특징을 가지고 있기 때문에 분화과정에 있는 지방세포를 growth arrest시켜 mitotic clonal expansion 단계로 진행되는 과정을 차단함으로써 항비만 효과를 나타낼 수 있다.</p><p>산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 콩과에 속하는 땅비싸리의 뿌리와 뿌리줄기를 말하는 것으로 주로 우리나라와 중국 등지에 분포하고 있으며, 8~9월경에 뿌리를 채취하여 깨끗이 씻은 다음 햇볕에 말려 주로 약재로 사용한다. 산두근에 대한 연구로는 국내에서 여러 유형의 백혈병 환자에 대한 효능과 폐암세포에 대한 항암효과가 보고되어 있으며 식중독성 미생물에 대해 항균효과가 있는 것으로 보고되어있다.</p><p>본 연구는 지방세포 분화를 억제하는 항비만 소재를 탐색하던 중 산두근(Sophora tonkinensis Gapnep) 메탄올 추출물이 insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX)이 포함된 분화유도인자로 adipogenesis 과정을 유발시킨 지방전구세포인 3T3-L1 세포에서 어떠한 영향을 미쳤는지 조사하였고, 그 결과 산두근 추출물이 분화과정에서 세포의 성장을 G1기에서 정지시킴으로써 분화를 억제할 뿐만 아니라 이미 분화가 완료된 성숙지방세포에서도 지질축적의 감소 효과를 확인하였기에 보고하는 바이다.</p> <h1>결 론</h1><p>본 연구는 천연물인 STME (Sophora tonkenesis Gapnep, (MeOH extract)를 이용하여 지방세포의 분화억제 및 그 작용 기작에 대해 조사하였다. 사용된 세포는 지방세포의 전구세포로 알려져 있는 3T3-L1 세포를 이용하였으며 이 세포의 특징은 미분화 상태를 유지하다가 분화유도제(insulin, dex-amethasone, 1-methyl-3-isobutylxanthine, prostaglandin F2\(\alpha \) 등)를 첨가할 경우 성숙 지방세포로 분화하는 것으로 알려져 있다.</p><p>본 연구에서 지방세포의 특징인 지방구형성(지방축적)에 미치는 영향을 관찰한 결과, STME는 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 것을 억제하고 중성지방의 축적을 억제하는 것으로 나타났다. 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 C/EBP와 \( PPAR \gamma \)를 중심으로 수백 개의 유전자 발현이 조절되어 일어나는 복잡한 과정이다. 초기 분화에서 발현되는 \( C/EBP \beta \) 는 \( C/EBP \alpha \)와 \( PPAR \gamma \)의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. \( C/EBP \beta \)가 제거된 마우스에서는 지방세포가 형성되지 않는 것이 확인되어 지방세포의 분화에 \( C/EBP \beta \)가 중요한 역할을 한다는 사실이 보고되어 있다. 그래서 본 연구에서 STME가 지방세포 분화초기에 발현하는 \( C/EBP \beta \)의 발현에 미치는 영향을 조사하였더니 \( C/EBP \beta \)의 발현량이 STME의 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하였다. 지방세포의 분화에 핵심전사인자인 \( C/EBP \alpha \)와 \( PPAR \gamma \)에 대한 STME의 효과도 관찰하였다. 여러 앞선 연구에서 \( PPAR \gamma \)와 \( C/EBP \alpha \)가 지방세포분화에서 매우 중요한 역할을 담당한다고 보고되어 있다. Fig. 3B는 STME가 지방세포 분화 유도 시, \( PPAR \gamma \)와 \( C/EBP \alpha \)의 발현에 어떤 영향을 주는지 보여준다. STME를 처리 하지 않고 분화시킨 3T3-L1 세포에서는 \( PPAR \gamma \)와 \( C/EBP \alpha \)발현량이 크게 증가하였다. 그러나 STME처리에 의해 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다. Fig. 3의 결과에 의하면 STME에 의해 지방세포 분화초기에 \( C/EBP \beta \)의 발현량이 감소되었고, 이것이 \( PPAR \gamma \)와 \( C/EBP \alpha \)의 발현 저하에 영향을 주었다고 사료된다. 즉, 이러한 전사인자들의 발현양상은 STME가 지방세포의 분화과정에서 일어나는 지방축적 저하와 일치하여 분화관련 전사인자들의 발현을 조절하여 지방합성을 조절하고 있음을 알 수 있었다. 또한 STME는 지방세포의 가장 큰 특징인 mitotic clonal expansion을 억제하며 세포주기를 G1기에 정지시키는 G1 arrest 효과를 강력하게 나타냈다. 특징적으로 Cdk inhibitor 인 p21의 발현량이 STME의 처리 농도 의존적으로 현저하게 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며 p21의 증가에 따라 Cdk의 발현저하, Rb 단백질의 탈인산, E2P의 감소 등도 관찰되어 이러한 세포주기 관련 단백질들의 발현 제어에 의해 3T3-L1 세포의 분화과정 중 G1 arrest가 강력하게 일어나고 있음을 알 수 있었다.</p><p>산두근은 현재까지 항염즘, 항암 및 항균 작용 등이 보고되어 있으나 비만세포의 분화 억제에 관한 내용으로는 처음 보고하는 것으로, 산두근의 메탄올 추출물임에도 불구하고 G1 arrest에 의한 분화억제, 지방축적 억제, 유전자 레벨의 제어기전이 분명한 항비만 천연물 소재로서의 가능성을 확인하였으며, 이러한 생리활성 기능을 가진 활성 단일 성분을 분리하여 그 구조를 규명하는 연구를 현재 진행 중에 있다.</p>	생명과학	[ "<h1>결 과</h1><h2>STME의 성숙지방세포에서의 중성지방 축적 억제 효과</h2><p>산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 콩과에 속하는 약재로 이미 백혈병, 폐암세포에 항암 효과 및 식중독 미생물에 항균효과를 가지고 있는 것으로 보고되어 있다.", "오늘날 비만은 질병으로 분류하고 있으며 무한 증식을 가장 큰 특징으로 하는 암세포와 비슷하게 비만세포 또한 계속적인 증식을 이어나가며 세포 내에 중성지방을 축적하는 또 다른 특징을 가지고 있다.", "따라서, 산두근 메탄올 추출물(STME)이 지방세포의 분화 및 중성지방 축적에 어떠한 영향을 미치는 지 검토하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포의 성숙지방세포로의 유도와 함께 STME를 각각 \\( 10, 50, 100, 200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)로 처리하였다.", "</p><p>앞서 재료 및 방법에서도 설명하였듯이, 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 유도 및 분화에는 몇 가지의 단계(Day 0, 2, 4, 6)와 분화유도제를 필요로 한다.", "STME의 중성지방 축적 억제효과는 가장 마지막 단계인 Day 6, 즉 분화가 완료된 성숙 지방세포에서 Oil Red O 염색 후 위상차현미경으로 관찰하였다.", "Fig.", "1A의 결과에 제시한 것처럼 Day 6 때의 분화 유도가 끝난 성숙지방세포의 세포 형태 및 지방세포 내의 중성지방 축적(lipid droplet)량은 대조군에 비해 STME를 농도별로 첨가한 세포에서는 농도 의존적으로 지방 축적량이 감소되는 것을 확인 할 수 있었으며, \\( 200 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서는 현저한 차이를 확인할 수 있었다.", "중성지방 축적량을 정량적으로 조사하기 위하여 중성지방을 염색한 Oil Red O 염색 성분을 isopropanol로 용해시킨 후 흡광도를 측정 하였다.", "그 결과 Fig.", "1B에 나타낸 것과 같이 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었으며 STME 처리 최고 농도인 \\( 200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)에서는 약 \\( 70 \\% \\) 정도 지방 축적량이 감소됨을 확인하였다.", "</p><p>이러한 중성지방 축적의 현저한 감소는 STME에 의한 기능적인 활성인지 혹은 지방전구세포에 독성으로 인한 세포의 사멸에 의한 것인지 검토할 필요가 있었다.", "따라서 \\( 10 \\sim 200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 범위의 농도에서 3T3-L1 지방전구세포에 대한 세포 독성을 검토한 결과 실험한 모든 농도에서 \\( 90 \\% \\) 이상의 생존율을 보였으므로 현재 실험 범위의 농도에서는 STME의 독성에 의한 효과가 아니라 중성지방 축적 억제 효과에 의한 것임을 알 수 있었다", "(data not shown).", "</p><h2>STME의 mitotic clonal expansion (MCE) 억제 효과</h2><p>지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 지방전구세포의 증식(preadipocyte proliferation), 성숙지방세포로의 분화(differentiation), 성숙지방세포의 증식(proliferation)으로 나누어 진행되지만, 지방세포로의 분화가 일어나기 위해서는 adipogenic signal induction, growth arrest (G1 phase), mitotic clonal expansion, re-enter cell cycle과 같은 아주 복잡하고 질서 정연한 단계를 거친다.", "이중 mitotic clonal expansion 단계는 정지되었던 세포주기가 분화유도제의 자극에 의해 세포주기가 다시 움직여 세포 수가 2~4배 증가하는 단계이다.", "이 mitotic clonal expansion 단계를 억제하면 성숙 지방세포로의 분화가 더 이상 진행되지 않는다는 연구 결과가 이미 보고되어 있다.", "따라서 본 연구는 STME가 이러한 활성을 나타내는지 알아보기 위하여 3T3-L1 지방전구세포의 분화유도를 위하여 분화유도제를 처리함과 동시에 STME를 \\( 100, 200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도로 처리하여 Day 1, Day 2의 기간 동안 세포수의 변화를 측정하였다.", "Fig.", "2의 결과와 같이 대조군으로 사용한 3T3-L1의 경우 Day 0에서 분화유도제를 첨가하고 분화유도 하였을 때 Day 1에서 1.9배, Day 2 에서 2.4배로 세포수가 증가하는 것을 확인하였다.", "하지만 STME \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)를 첨가한 경우, Day 1 에서 1.3배, Day 2 에서 1.7배 증가하였으며 \\( 200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서는 Day 1에서 1.3배, Day 2에서 1.3배로 더 이상의 세포수 증가를 확인할 수 없었다.", "이상의 결과로 STME는 3T3-L1의 mitotic clonal expansion 단계를 억제시키는 것을 알 수 있었다.", "</p><h2>STME의 지방세포 분화 조절 인자들의 발현에 미치는 영향</h2><p>지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 복잡한 단계를 거치게 되며 관련된 여러 조절인자들의 발현 촉진 과정을 거치게 된다.", "이러한 분화 과정에서 가장 중추적인 역할을 하는 것이 peroxisome proliferation activated receptor gamma(\\(PPAR \\gamma \\) )와 CCAAT enhancer binding protein (C/EBP) family라고 불리는 전사인자들이다.", "분화 유도 물질은 이러한 전사 인자들의 발현을 촉진시킴으로써 지방전구세포를 지방세포로 분화시킨다.", "먼저\\(C/EBP \\beta \\)는 전구지방세포에서 분화유도제에 의해 발현 유도되어 실질적인 지방세포 분화를 담당하는 \\(PPAR \\gamma \\) 와 \\( C/EBP \\alpha \\)의 발현을 유도하는 단백질로 분화초기 clonal expansion (Day 2) 과정에서는 발현량이 많으나 성숙지방세포(Day 6)가 되면 발현이 저하되는 특징을 나타낸다.", "한편, \\( C/EBP \\alpha \\)는 \\( PPAR \\gamma \\)의 발현을 유도할 뿐만 아니라 \\( PPAR \\gamma \\) 와 협력하여 지방세포의 성숙분화를 담당하는 유전자의 발현을 제어하고 있는 것으로 알려져 있다. \\", "( PPAR \\gamma \\)는 핵 내 수용체형의 전사인자로써 같은 수용체형 전사인자 \\( RXR\\alpha \\) (\\(retinoid \\times \\ receptor \\alpha \\) )와 heterodimer를 형성하여 여러 종의 지방산이나 지방산 대사산물의 내인성 ligand로써 결합하여 전사능이 활성화된다.", "또한, 지방세포의 성숙분화시기에 유도되며 지방세포 특이적 유전자의 promoter영역에 존재하는 PPAR 결합영역인 PPRE (PPAR responsive element)에 결합하여 그 유전자의 발현을 유도한다.", "따라서 여기서 언급한 초기의 \\( C/EBP \\beta \\), 성숙기의 \\(PPAR \\gamma \\)와 \\( C/EBP \\alpha \\)의 발현에 STME가 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다.", "세포는 2가지 단계로 MCE 단계(Day 2)와 완전분화 단계(Day 6)의 세포를 이용하였으며, 단백질 발현량의 변화는 Western blot analysis를 행하여 확인하였다.", "그 결과 Day 2와 Day 6에서 이들 전사인자들의 확연한 발현 차이를 확인할 수 있었다.", "먼저, Fig.", "3A의 결과에 의하면 지방세포 분화초기단계에 발현이 유도되는 \\( C/EBP \\beta \\)는 Day 2의 단계에서 농도 의존적으로 발현이 저하되는 것을 확인하였다.", "완전분화 단계의 Day 6의 결과에서는 \\( C/EBP \\alpha \\)가 STME 농도에 따라 농도 의존적으로 발현이 확연히 저하되는 것을 확인할 수 있었으며 \\(PPAR \\gamma \\) 또한 발현이 저하되었다.", "SREBPIc의 유전자 또한 발현이 농도 의존적으로 저하됨을 확인하였으며 이 유전자는 지방산이나 콜레스테롤 합성에 필수 전사인자인 SREBP (sterol regulatory element binding protein)의 하나이며 \\(PPAR \\gamma \\) ligand 생성에도 관여하는 것으로 보고되어 있다.", "따라서 STME는 지방세포 분화 및 지방산 합성 관련 유전자의 발현을 억제하여 성숙지방세포로의 분화 및 지방 축적을 억제하는 것으로 사료된다.", "</p><h2>STME의 처리에 의한 세포주기의 변화분석</h2><p>앞선 결과에 의하면 STME의 처리에 따라 MCE의 억제 및 관련 유전자들의 발현 억제를 확인 할 수 있었다.", "지방전구세포는 분화유도제에 의해 세포가 증식-분화-증식의 다단계를 거치면서 성숙지방세포로 분화되기 때문에 STME가 이러한 세포주기 변화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포(Day 0)에 분화유도제와 STME를 처리하여 세포주기 변화가 확인 가능한 14시간째에 회수하여 FACS analysis를 시행하였다.", "Fig.", "4에서 확인되는 것처럼 분화유도제만 처리한 대조군에서는 sub-G1기의 개체군이 \\( 6.7 \\% \\), G1기 개체군이 \\( 16.9 \\% \\), S기 개체군이 \\( 42.17 \\% \\), G2/M기 개체군이 \\( 41.3 \\% \\)로 세포주기 별로 고루 분포하고 있음을 확인할 수 있었다.", "이에 비해 STME를 처리한 세포에서는 STME의 농도가 \\( 10, 50, 100, 200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)으로 증가할수록 G1기 개체군의 비율이 \\( 33.68 \\%, 39,39 \\%, 48.03 \\%, 55.14 \\% \\)로 계속 증가되었으며, 상대적으로 S기 개체군의 비율이 \\( 38.2 \\%, 31.4 \\%, 16.5 \\%, 5.1 \\% \\)로 점점 감소하는 것을 알 수 있었다.", "즉, STME의 처리 농도가 증가될수록 세포들은 세포주기에서 G1기의 분포가 높아져 STME는 지방전구세포의 G1 arrest를 유도함을 확인 할 수 있었다.", "</p><h2>STME의 처리에 의한 세포주기의 G1 arrest 관련 단백질들의 발현 변화</h2><p>Fig.", "4의 결과에서 STME는 3T3-L1 세포의 세포주기를 G1기에서 정지시킴으로서 분화를 억제하는 것을 확인 할 수 있었다.", "이것을 보다 명확하게 분석하기 위해서 G1 arrest에 관계하는 단백질들의 발현량의 변화를 검토하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포(Day 0)에 분화유도제와 STME를 처리하여 14시간 반응시킨 후 회수하여 Western blot analysis를 시행하였다.", "확인한 단백질은 세포주기 G1기에서 S기로의 전이에 필수적인 단백질인 Cdk2, pRb, phospho-pRb 및 전사인자 E2F-1과, G1기 전이를 저해하는 Cdk inhibitor p21의 발현 변화를 확인하였다.", "그 결과, STME의 처리 농도가 증가될수록 Cdk2의 발현량이 감소되었으며, Rb 단백질의 인산화가 확연하게 감소함과 동시에 전사인자인 E2F-1의 발현 감소가 확인되었다.", "더 뚜렷한 변화는 Cdk2 inhibitor인 p21의 발현량이 현저하게 농도 의존적으로 증가함을 확인 할 수 있었다.", "이와 같은 결과는 STME의 처리에 의해 p21의 발현량이 증가되며 이로 인해 Cdk2의 활성이 억제되고, 이어서 전사인자인 Rb의 인산화를 저하시켜 세포주기가 G1기에서 정지되는 것으로 사료된다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>산두근 메탄올 추출물(STME)의 제조</h2><p>본 실험에 사용한 산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 삼흥건재약업사(서울)에서 구입한 후, 잘게 세절하여 분말화한 후, 산두근 \\( 100 \\mathrm{~g} \\)에 메탄올 2\\( \\mathrm{l} \\)를 첨가하여 \\( 75^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 3시간 동안 3회 추출하였다.", "추출액을 Whatman No.2 paper(Whatman international Ltd., England)로 여과하여 불순물을 제거하고 그 여액을 감압 농축기를 사용하여 \\( 45^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 감압, 농축하여 추출물 \\( 19.2 \\mathrm{~g} \\)을 얻었으며 이를 STME (Sophora tankinensis Gapnep.", "MeOH extract)로 명명하고 \\( -70^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 초저온 냉동고에 보관하면서 사용하였다.", "실험 시에는 이 추출물을 DMSO에 녹여 \\( 500 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)의 농도로 만든 다음 이를 적정한 농도로 희석하여 사용하였다.", "</p><h2>3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 성숙지방세포로의 분화 유도</h2><p>본 실험에 사용한 3T3-L1 (mouse embryonic fibroblast cell line) 지방전구세포는 미국세포은행(American Type Culture Collection: ATCC, USA)에서 분양 받아 사용하였다.", "세포의 배양은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 \\( 10\\% \\) bovine calf serum (BCS, Gibco BRL)과 100 \\( \\mathrm{units}/ \\mathrm{ml} \\)의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL)을 첨가하고 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C}, 5 \\% \\mathrm{CO}_{2} \\) 조건 하에서 배양하였다.", "지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 몇 단계를 거치면서 진행되기 때문에 각 단계를 날짜 별로 표기하였다.", "먼저 3T3-L1 세포가 cell dish에서 confluent 상태가 되었을 때를 Day 0이라고 하며 이때, 분화유도제로 사용되는 insulin, dex-amethasone 및 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)을 각각 \\( 10 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}, 0.25 \\mu \\mathrm{M}, 0.5 \\mathrm{mM} \\) 첨가하여 분화를 유도하고 2일간 배양하였다", "(Day 2).", "또한 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 \\( 10\\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 insulin을 첨가하고 2일간 더 배양하였다", "(Day 4).", "여기에 배지 교환과 \\( 10 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 insulin 첨가 후 2일간 더 배양 한 상태를 Day 6이라 하며 성숙지방세포의 실험을 행하였다.", "</p><h2>세포 내 지방입자의 염색 및 정량(Oil Red O 염색)</h2><p>3T3-L1 지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화 및 분화 억제는 Oil Red O 염색법을 이용하여 분화 시에 형성되는 지방구를 염색하여 확인하였다.", "STME는 Day 0, 2, 4,6의 단계마다 배지 교환 시 함께 처리하였으며 농도는 \\( 10 \\sim200 \\mathrm{ug} / \\mathrm{ml} \\)범위로 처리하였다.", "대조군으로 \\( 0.5 \\% \\) DMSO만 처리하여 배양 한 3T3-L1 지방전구세포를 사용하였으며, 실험군과 대조군 모두 완전한 지방세포로의 분화가 이루어진 시점에 모든 plate의 배지를 제거하고 차가운 phosphate buffered saline (PBS)으로 세포를 세척한 뒤, \\( 10 \\% \\) formalin을 처리하여 실온에서 1시간 고정시켰다.", "Formalin을 완전히 제거한 다음 \\( 60 \\% \\) isopropanol로 세척한 뒤 Oil Red O working solution을 넣고 실온에서 10분간 염색을 하였다.", "이 때 Oil Red O working solution은 Oil Red O powder \\( 0.35 \\mathrm{~g} \\)을 \\( 100 \\mathrm{ml} \\)의 isopropanol에 녹인 뒤 증류수에 6:4의 비율로 희석한 다음 여과하여 사용하였다.", "세포를 염색한 뒤 Oil Red O working solution을 완전히 제거 한 다음 증류수로 4번 세척하고 위상차현미경으로 세포의 염색 상태를 관찰하였다.", "또한 정량적 분석을 위하여 \\( 100 \\% \\) isopropanol로 세포로부터 지방을 용출시켜 spectrophotometer를 이용하여 \\( 500 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하여 중성지방의 축적량을 계산하였다.", "</p><h2>세포증식 속도 측정(Mitotic clonal expansion 저해 효능)</h2><p>지방세포의 분화과정에서 mitotic clonal expansion 과정은 필수적이며 분화유도제로 분화를 인위적으로 유도시킬 때 분화초기 2일안에 일어난다.", "따라서 STME가 지방전구세포 3T3-L1의 분화과정 중 nitotic clonal expansion 과정에 미치는 영향을 조사하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포를 \\( 60 \\mathrm{~mm~} \\)dish에 \\( 1 \\times 10^{5} \\)cells/dish의 농도로 분주하여 배양 한 다음 day 0 때에 분화유도제와 STME를 농도별(\\(10, 50, 100, 200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}) \\)로 처리하여 배양하였다.", "Day 0, 1, 2의 세포를 각각 회수하고 trypan blue assay 법으로 염색하여 3T3-L1 지방전구세포의 증식속도를 측정하였다.", "배양한 세포를 배지를 제거하고 \\( 0.05 \\% \\) trysin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시켜서 PBS를 적당량 첨가하여 세포를 모았다.", "이것을 2,000 \\( \\mathrm{rpm} \\)으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 다시 \\( 1 \\mathrm{ml} \\)의 PBS와 \\( 0.4 \\% \\) trypan blue solution (SIGMA)을 첨가하여 2분간 처리하여 살아 있는 세포수를 위상차현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 계수하였다.", "</p><h2>Flow cytometry 분석에 의한 세포주기 변화 측정</h2><p>3T3-L1 지방전구세포를 \\( 60 \\mathrm{~mm} \\) dish에 \\( 1 \\times 10^{5} \\) cells/dish의 농도로 분주하여 배양하여 confluent 상테가 된 day 0 때에 분화유도제와 STME를 농도별(\\(10, 50, 100, 200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}) \\)로 처리하였다.", "그 후, 3T3-L1 지방전구세포의 doubling time인 14시간 후에 세포를 회수하여 PBS로 세척하고 \\( 100 \\% \\) ethanol을 이용하여 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 고정시켰다.", "고정된 세포는 분석 전에 PBS로 세척하고 ribonuclease A를 최종농도 \\( 1 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)이 되도록 첨가한 다음 실온에서 30분간 반응시켰다.", "세포주기 변화는 PI/RNase staining buffer (BD Pharmingen \\( ^{\\mathrm{TM}} \\) )용액을 500 \\( \\mu\\mathrm{l} \\) 첨가한 후 유세포 분석기(FACS, Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였으며 결과는 Cell Quest program을 이용하여 분석하였다.", "</p><h2>Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석</h2><p>세포주기 변화 측정과 동일한 상태의 세포를 배양하여 회수하였다.", "세포 내의 총 단백질 정량을 위한 전기영동을 실시하기 위하여 회수한 세포를 PBS로 한번 세척한 후 CSK 완충액 [\\( 100 \\mathrm{mM} \\ Pipes (\\mathrm{PH} 6.8), 100 \\mathrm{mM} \\mathrm{~NaCl}, 1 \\mathrm{mM} \\mathrm{~MgCl}_{2}, 1 \\mathrm{mM} \\ EGTA, 1 \\mathrm{mM~} dithiothreitol (DTT)\\)]에 \\( 0.1\\% \\) Triton X-100, \\(1 \\mathrm{mM~} ATP\\)와 \\( 1\\% \\) Protease inhibitor Cocktail (BD Pharmingen \\( ^{\\mathrm{TM}} \\) )이 첨가된 용액으로 현탁하여 15분간 반응 시킨 후 초음파 파쇄기로 파쇄 하였다.", "파쇄 한 세포는 \\( 14,000\\mathrm{rpm} \\)에서 20분간 원심 분리하였으며, 상등액 내의 단백질량은 BCA법을 이용하여 정량한 후 동량의 단벡질 \\( (25 \\mathrm{ug}) \\)을 sodium dodecyl sulfate (SDS) - polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 하였다.", "전기영동 후 gel 내의 단백질을 PVDF membrane에 전사시킨 후 blocking solution [\\( 0.15 \\mathrm{~M} \\mathrm{~NaCl}, 1 \\mathrm{~M~} Tris-HCI (\\mathrm{pH} 7.5), 0.1 \\% \\ Triton X-100, \\ 5\\%\\ BSA\\)]을 사용하여 \\( 4{ }^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 16시간 blocking 시켰다.", "1차 항체는 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C}\\), 16시간 반응시켰으며, TBS buffer [\\( 50\\mathrm{mM}\\ Tris-HCl \\mathrm{~pH} 7.5\\), \\( 0.15\\mathrm{M} \\mathrm{~NaCl} \\), \\( 0.1 \\% \\ Triton X-100\\)]를 사용하여 membrane을 세척 한 다음 2차 항체를 넣고 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 16시간 반응시켰다.", "Membrane을 세척한 후 면역반응 단백질은 화학발광 시스템(Chemiluminescence system; Super Signal West Femto Maxium sensitivity Substrate, Pierce, USA)으로 검출하였다.", "Western blotting에 사용된 \\( C/EBP \\alpha \\), \\(C/EBP \\beta \\)의 1차 항체는 Cell signaling Technolgy (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며 \\( PPAR \\gamma \\), SREBP1c, p21, p27, CyclinE, Cdk2, Rb, Phospho-Rb, E2F-1 등의 1차 항체 및 anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG는 Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.", "</p> <h1>초록 : 산두근 추출물의 세포주기 정지를 통한 3T3-L1 지방전구세포의 분화 억제</h1><p>산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 예로부터 동양지역에서 전통적인 약용식물로 사용되어 왔다.", "본 연구에서는 3T3-L1 지방전구세포의 성숙지방세포로의 분화와 세포 내 지방생성에 대한 산두근 메탄올 추출물(STME)의 효과와 메커니즘에 대해 조사하였다.", "STME를 \\( 0-200 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도로 처리한 다음, Oil Red O 염색으로 세포 내 축적되는 지방구와 지질의 양을 측정한 결과 농도의존적으로 크게 감소됨을 확인하였으며 3T3-L1 지방전구세포의 분화와 관련된 단백질의 발현의 변화를 조사하였다.", "지방세포의 특이적 marker인 peroxisome proliferator-activated receptor \\( \\gamma \\) (PPAR \\( \\gamma \\) ), cytidine-cytidine-adenosine-adenosine-thymine (CCAAT)/enhancer-binding proteins \\( \\alpha, \\beta\\ (C/EBP \\alpha,\\ C/EBP \\beta) \\) 그리고 sterol regulatory element binding protein (SREBP)의 발현이 STME를 처리하였을 때 현저하게 저해됨을 확인하였다.", "세포주기의 변화를 분석한 결과 STME는 지방세포 분화 초기 단계인 mitotic clonal expansion 단계에서 G1기로 세포주기를 정지시켰다.", "더불어 G1 arrest와 관련된 단백질의 변화를 조사 한 결과, 3T3-L1 세포에 STME를 처리하였을 때 p21의 발현량이 확연하게 증가하였으며, Cdk2, E2F-1 그리고 phosphor-Rb의 발현량은 농도의존적으로 감소하였다.", "이러한 결과들에 의하여 STME은 메탄올 추출물임에도 불구하고 3T3-L1 지방전구세포가 성숙지방세포로 분화할 때 G1 arrest를 통하여 지방세포 분화를 억제하며 관련 유전자의 발현 억제도 확연하게 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 항 비만 천연물 소재 탐구의 기초자료로 유용하게 쓰일 것으로 사료된다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>비만은 에너지의 섭취와 소비 불균형으로 발생하는 대사성질환으로 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심장질환, 암 발생 등 각종 성인병 및 만성 질환을 유발하는 원인으로 알려져 있다.", "비만은 유전적 요인, 식생활 및 생활습관과 같은 개인의 생활 환경적 요인에 따라 유발되는데 전 세계적으로 비만인구는 날로 증가 추세에 있으며, 한국도 식생활의 서구화와 생활습관의 변화에 따라 계속 증가 추세에 있어 비만 치료와 예방에 사회적 관심이 증대되고 있다.", "이러한 시대, 사회적 요구에 부응하여 최근 많은 연구자들이 식품이나 천연물에서 부작용이 적고 효과적인 비만 치료제 또는 비만 예방 소재를 찾고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.", "</p><p>항비만 관련 소재 연구나 기작 연구에는 일반적으로 mouse embryo 유래의 지방전구세포를 이용한 3T3-L1 adipocyte dif-ferentiation system을 많이 사용하고 있다.", "비만은 지방전구세포가 adipogenesis 과정에 의하여 성숙지방세포로 분화되고 여기에 섭취된 영양물 중의 triglyceride가 축적되어 지방세포 내에 과포화 지방구가 형성되어 유발된다.", "Adipogenesis 과정은 insulin을 포함한 호르몬 자극과 함께 분화과정에 관여하는 유전자들의 발현에 펄요한 전사인자들의 활성이 필수적이며, 크게 지방전구세포의 증식(preadipocyte proliferation), 성숙지방세포로의 분화(differentiation) 및 성숙지방세포의 증식(proliferation) 과정과 같은 3단계로 진행되고, 그 중 가장 중요한 differentiation 과정에서는 adipogenic signal induction, growth arrest (G1기), mitotic clonal expansion, re-enter cell cycle의 세부적인 단계를 거친다.", "이런 단계에 따라 관련 유전자들의 발현 양상도 달라지는데 먼저 분화초기에 전사인자 CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) family로 알려진 C/EBP\\( \\beta \\)가 분화유도인자(adipogenic inducer)인 insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX)의 자극에 의해 발현된다.", "다음은 C/EBP\\( \\beta \\)가 signal-regulated kinase \\( 1 / 2 \\) (ERK\\( 1 / 2 \\)), glycogen synthase kinase-3\\( \\beta \\) GSK-3\\( \\beta \\), cyclin-dependent kinase 2 (Cdk2)와 같은 인산화 효소에 의해 활성형으로 변화하게 되고, 이때부터는 실질적으로 전사조절 인자로 작용하여 지방세포의 분화 및 증식에 중요한 역할을 담당하는 peroxisome pro-liferator-activated receptor \\( \\gamma \\) (PPAR \\( \\gamma \\) )와 C/EBP\\( \\alpha \\) 에 대해 유전자의 발현을 유도하게 된다.", "분화초기 조절인자 C/EBP\\( \\beta \\)가 활성화되어 분화후기 조절인자 PPAR\\( \\gamma \\)와 C/EBP\\( \\alpha \\)가 유도되는데 약 2일이 소요되며, 그 후 G1기에 정지되어 있던 지방 전구세포가 S기로 들어가면서 세포증식이 일어나기 시작하여 세포수가 3~4배 증가하는데, 이때를 mitotic clonal expansion 과정이라 한다.", "이 과정은 지방세포 분화에 필수적인 과정이며 지방세포 성숙에 중요한 단계이다.", "성숙지방세포로의 분화 단계인 differentiation 과정은 수일에서 수주의 시간이 걸리며, 분화된 세포는 형태적으로 둥글게 되고, PPAR\\( \\gamma \\)와 C/EBP\\( \\alpha \\)의 발현으로 인해 실제로 지방세포의 표현형을 결정짓는 대부분의 유전자들이 조절되거나 그 발현이 활성화된다.", "이들 유전자들로는 GPDH (glycer-ophosphate dehydrogenase), ACC (acetyl-CoA carboxylase), ME (malic enzyme), Glut4 (Glucose transporter type), IR (insulin receptor), aP2 (adipocyte selective fatty acid binding protein) 등이 있다.", "이러한 과정을 통해서 중성지방의 지방구 (lipid droplet)들이 세포질에 나타나게 되고, 시간이 지남에 따라 커지고 또 합쳐지면서 하나 혹은 몇 개의 큰 방울이 되어 지방세포의 분화가 완료된다.", "비만을 예방하거나 치료하기 위하여 이러한 분화과정을 적절히 조절하는 화합물을 탐색하는 것도 항비만 소재 개발에 관한 연구에 있어서 중요한 전략 중의 하나다.", "지방세포의 분화는 growth arrest와 mitotic clonal expansion을 반복하면서 분화가 진행되는 특징을 가지고 있기 때문에 분화과정에 있는 지방세포를 growth arrest시켜 mitotic clonal expansion 단계로 진행되는 과정을 차단함으로써 항비만 효과를 나타낼 수 있다.", "</p><p>산두근(Sophora tonkinensis Gapnep)은 콩과에 속하는 땅비싸리의 뿌리와 뿌리줄기를 말하는 것으로 주로 우리나라와 중국 등지에 분포하고 있으며, 8~9월경에 뿌리를 채취하여 깨끗이 씻은 다음 햇볕에 말려 주로 약재로 사용한다.", "산두근에 대한 연구로는 국내에서 여러 유형의 백혈병 환자에 대한 효능과 폐암세포에 대한 항암효과가 보고되어 있으며 식중독성 미생물에 대해 항균효과가 있는 것으로 보고되어있다.", "</p><p>본 연구는 지방세포 분화를 억제하는 항비만 소재를 탐색하던 중 산두근(Sophora tonkinensis Gapnep) 메탄올 추출물이 insulin, dexamethasone 및 3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX)이 포함된 분화유도인자로 adipogenesis 과정을 유발시킨 지방전구세포인 3T3-L1 세포에서 어떠한 영향을 미쳤는지 조사하였고, 그 결과 산두근 추출물이 분화과정에서 세포의 성장을 G1기에서 정지시킴으로써 분화를 억제할 뿐만 아니라 이미 분화가 완료된 성숙지방세포에서도 지질축적의 감소 효과를 확인하였기에 보고하는 바이다.", "</p> <h1>결 론</h1><p>본 연구는 천연물인 STME (Sophora tonkenesis Gapnep, (MeOH extract)를 이용하여 지방세포의 분화억제 및 그 작용 기작에 대해 조사하였다.", "사용된 세포는 지방세포의 전구세포로 알려져 있는 3T3-L1 세포를 이용하였으며 이 세포의 특징은 미분화 상태를 유지하다가 분화유도제(insulin, dex-amethasone, 1-methyl-3-isobutylxanthine, prostaglandin F2\\(\\alpha \\) 등)를 첨가할 경우 성숙 지방세포로 분화하는 것으로 알려져 있다.", "</p><p>본 연구에서 지방세포의 특징인 지방구형성(지방축적)에 미치는 영향을 관찰한 결과, STME는 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 것을 억제하고 중성지방의 축적을 억제하는 것으로 나타났다.", "지방전구세포에서 성숙지방세포로의 분화는 C/EBP와 \\( PPAR \\gamma \\)를 중심으로 수백 개의 유전자 발현이 조절되어 일어나는 복잡한 과정이다.", "초기 분화에서 발현되는 \\( C/EBP \\beta \\) 는 \\( C/EBP \\alpha \\)와 \\( PPAR \\gamma \\)의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. \\", "( C/EBP \\beta \\)가 제거된 마우스에서는 지방세포가 형성되지 않는 것이 확인되어 지방세포의 분화에 \\( C/EBP \\beta \\)가 중요한 역할을 한다는 사실이 보고되어 있다.", "그래서 본 연구에서 STME가 지방세포 분화초기에 발현하는 \\( C/EBP \\beta \\)의 발현에 미치는 영향을 조사하였더니 \\( C/EBP \\beta \\)의 발현량이 STME의 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하였다.", "지방세포의 분화에 핵심전사인자인 \\( C/EBP \\alpha \\)와 \\( PPAR \\gamma \\)에 대한 STME의 효과도 관찰하였다.", "여러 앞선 연구에서 \\( PPAR \\gamma \\)와 \\( C/EBP \\alpha \\)가 지방세포분화에서 매우 중요한 역할을 담당한다고 보고되어 있다.", "Fig.", "3B는 STME가 지방세포 분화 유도 시, \\( PPAR \\gamma \\)와 \\( C/EBP \\alpha \\)의 발현에 어떤 영향을 주는지 보여준다.", "STME를 처리 하지 않고 분화시킨 3T3-L1 세포에서는 \\( PPAR \\gamma \\)와 \\( C/EBP \\alpha \\)발현량이 크게 증가하였다.", "그러나 STME처리에 의해 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하였다.", "Fig.", "3의 결과에 의하면 STME에 의해 지방세포 분화초기에 \\( C/EBP \\beta \\)의 발현량이 감소되었고, 이것이 \\( PPAR \\gamma \\)와 \\( C/EBP \\alpha \\)의 발현 저하에 영향을 주었다고 사료된다.", "즉, 이러한 전사인자들의 발현양상은 STME가 지방세포의 분화과정에서 일어나는 지방축적 저하와 일치하여 분화관련 전사인자들의 발현을 조절하여 지방합성을 조절하고 있음을 알 수 있었다.", "또한 STME는 지방세포의 가장 큰 특징인 mitotic clonal expansion을 억제하며 세포주기를 G1기에 정지시키는 G1 arrest 효과를 강력하게 나타냈다.", "특징적으로 Cdk inhibitor 인 p21의 발현량이 STME의 처리 농도 의존적으로 현저하게 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며 p21의 증가에 따라 Cdk의 발현저하, Rb 단백질의 탈인산, E2P의 감소 등도 관찰되어 이러한 세포주기 관련 단백질들의 발현 제어에 의해 3T3-L1 세포의 분화과정 중 G1 arrest가 강력하게 일어나고 있음을 알 수 있었다.", "</p><p>산두근은 현재까지 항염즘, 항암 및 항균 작용 등이 보고되어 있으나 비만세포의 분화 억제에 관한 내용으로는 처음 보고하는 것으로, 산두근의 메탄올 추출물임에도 불구하고 G1 arrest에 의한 분화억제, 지방축적 억제, 유전자 레벨의 제어기전이 분명한 항비만 천연물 소재로서의 가능성을 확인하였으며, 이러한 생리활성 기능을 가진 활성 단일 성분을 분리하여 그 구조를 규명하는 연구를 현재 진행 중에 있다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "산두근 추출물의 세포주기 정지를 통한 3T3-L1 지방전구세포의 분화 억제", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-de7b7688-2a67-40a4-8c3c-eb1d5b151c03", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "정현영", "현숙경", "최영현", "김병우", "권현주" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,416	<h2>혈청지질의 변화</h2><p>12주 복합트레이닝 전 · 후의 혈청지질의 변화는 Table 5에 나타냈다.</p><p>12주 복합트레이닝 후 혈청지질에서 TC, TG, LDL-C은 유의하게 감소하였고 HDL-C 증가하였으나 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.</p><p>선행연구를 살펴보면 체지방률 \( 30 \% \) 이상인 여중생을 대상으로 12주, 주 3회, 매회 \( 4 \mathrm{km} \) 달리기를 실시한 결과 TC가 운동군은 \( 192.57 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 \( 171.45 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 \( 21.12 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)가 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05 \))감소하였고, 40대 여성을 대상으로 매회 60분, 주 5회, 12주간 운동을 실시하여 TC가 운동전 \( 185.29 \pm 5.49 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 운동 후 \( 164.86 \pm 7.49 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05 \)) 감소하였다.</p><p>본 연구에서 운동을 실시한 운동군에서 TC의 농도가 운동군이 운동 전 \( 221.37 \pm 40.63 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 운동 후 \( 186.00 \pm 35.56 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 감소한 것은 유산소 운동과 근저항성 운동의 복합트레이닝을 실험대상자들의 수준에 맞도록 운동 강도 재설정 및 운동 강도의 유지와 더불어 연구의 대상자가 신체활동이나 운동참여가 낮은 중년비만여성이란 점에서 혈중 TC의 농도에 영향을 미친 것으로 생각되어 진다.</p><p>본 연구결과 12주 복합트레이닝 후 HDL-C는 운동군에서는 운동전 \( 58.72 \pm 11.62 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 \( 63.73 \pm 11.76 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 \( 5.01 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \) 증가하였으며, 대조군이 \( 56.57 \pm 10.01 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 \( 55.52 \pm 7.10 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 \( 1.05 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)가 감소하였는데 이와 같은 결과는 40대 이상의 중년여성을 대상으로 10주간 주 4회, 복합 운동 후 HDL-C가 \( 2.85 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)증가했다는 연구의 결과와 일치하였다.</p><p>이상의 여러 선행연구의 결과에 비추어 볼 때, 복합트레이닝의 두 가지 운동 유형은 혈중 HDL-C의 증가에 기여할 수 있는 운동으로 운동의 긍정적인 가능성을 제시할 수 있고 복합트레이닝을 장기간 규칙적으로 실시한다면 비만들의 HDL-C의 농도개선에 긍정적인 효과를 줄 것이라고 생각된다. 혈중 LDL-C의 농도는 일반적으로 TC의 약 \( 70 \% \)를 차지하고 있고, 중성지방을 운반하여 동맥벽에 축적시키는 역할을 하므로 혈액의 흐름을 방해하여 결과적으로 심근경색을 일으키게 된다. 그러나 운동은 혈중 LDL-C의 농도를 저하시키는 작용을 하는데, 그 감소의 정도는 운동기간과 운동량이 많을수록 그리고 체중이 감소하면 LDL-C를 저하시킬 수 있다. 40대 이상의 중년여성을 대상으로 10주간 주 4회 유산소 운동과 근력 운동을 실시한 결과 LDL-C는 운동전에 비해 다소 감소하였으나 통계적으로 유의한 차이는 없었으며, 20대 여성들을 대상으로 12주간 복합트레이닝을 실시한 결과 LDL-C가 \( 11.16 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \) 감소된 것으로 보고하였고, BMI가 \( 25 \% \) 이상인 비만대학생을 대상으로 복합트레이닝 프로그램을 12주간 실시한 결과 혈중 LDL-C의 감소를 보고하였다. 12주 복합트레이닝을 실시한 운동군에서 LDL-C \( 127.87 \pm 34.58 \)\( \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 \( 103.37 \pm 23.01 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 \( 24.50 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)가 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05 \)) 감소한 본 연구의 결과와 선행연구들의 결과가 유사하게 나타났다. 본 연구의 대상자 대부분이 단순성 비만이라는 사실로 미루어 볼 때 심혈관질환 위험인자인 혈중 LDL-C의 감소는 심혈관계통의 순환작용이 향상된 것으로 인해 혈중 LDL-C의 축적비율이 낮아지는 결과로 사료된다.</p><p>TG가 증가하면 관상동맥질환의 위험성은 증가하나 운동을 통하여 이를 낮춤으로써 심혈관질환을 예방할 수 있다. 40대 이상의 중년여성을 대상으로 10주간, 주 4일 유산소 운동과 근력 운동을 실시한 연구에서 TG가 운동 후 유의하게 감소하였다고 보고하였고, 대학생을 대상으로 8주간 복합트레이닝을 실시한 연구에서도 대조군은 TG가 \( 86.00 \pm 32.63 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 \( 97.38 \pm 36.72 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 \( 11.38 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)가 증가하였으며, 운동군에서는 운동 전 \( 74.13 \pm 54.06 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 운동 후 \( 61.13 \pm 44.70 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 \( 13.00 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)가 감소하였다고 보고하였다.</p><p>이상의 선행연구들을 살펴보면 대부분 운동에 의하여 체내의 TG는 감소한다는 연구가 지배적인 것으로 나타났다. 본연구에서도 대조군은 \( 147.37 \pm 57.03 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 \( 153.87 \pm 61.88 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 \( 6.50 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)가 증가하였고, 12주 복합트레이닝 전 운동군에서는 운동 전 \( 146.62 \pm 49.10 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)에서 운동 후 \( 101.87 \pm 21.87 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)로 \( 44.75 \mathrm{mg} / \mathrm{dl} \)가 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.01 \)) 감소한 것으로 나타났다. 본 연구의 혈중 TG 농도의 유의한 감소는 12주 복합트레이닝을 실시함으로서 비만중년여성의 TG농도를 감소시키고 TG의 동원비율 및 산화능력의 효율성을 증가시킬 수 있다는 긍정적인 영향을 미친다고 사료된다.</p> <h1>서론</h1><p>현대인에게 영양과잉, 불규칙한 생활습관, 운동부족 및 과중한 스트레스가 주로 심혈관 질환의 발병률을 증가시켜 심장병, 고혈압, 뇌졸중과 같은 만성 퇴행성 질환을 일으키는 원인이 되고 있다. 이러한 생활양식과 관련된 질환의 일반적인 원인은 과다한 영양섭취와 이로 인한 비만이다. 비만은 대사증후군으로 분류되어 혈당, 중성지방, HDL-C, LDL-C, 복부비만 등이 주요 지표이며 이들은 관상동맥질환에 대한 위험요인으로도 분류되어 있다. 특히 우리나라 사망원인 중 높은 비율을 차지하고 있는 관상동맥질환, 뇌졸중, 고지혈증 등과 같은 심혈관 질환은LDL-C의 증가와 HDL-C의 감소에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 그리고 심혈관계질환의 \( 95 \% \)는 동맥경화증으로부터 비롯되고, 동맥경화증의 \( 50 \% \) 이상은 신체적 활동부족과 운동부족이 주된 원인으로 비만과 관련이 있다. 특히 비만으로 인한 인슐린 저항성 증가는 대사이상과 심 · 혈관 질환 위험인자들이 출현하여 복부 비만, 당불내성, 이상 지질 혈증(고중성지방, 저HDL-C, 고 LDL-C), 고혈압 등의 질환을 유발하는 심각한 대사증후군 (metabolic syndrome)을 초래하게 된다. TNF-\(\alpha\)는 분비되는 양에 따라서 그 기능에 차이를 나타낸다. 저농도의 TNF-\(\alpha\)는 혈관 내피세포에 백혈구 부착기능을 항진시키며, 식세포의 세균 살해작용을 한다. 그리고 고농도의 TNF-\(\alpha\)는 심근 수축력을 감소시키고 인슐린 감수성을 억제 시키는 역할을 한다. 염증유발 물질 중 하나인 TNF-\(\alpha\)는 인슐린의 직접적인 신호를 손상시키며, 인슐린 저항성을 야기 시키는 인자로 알려져 있다. 지방조직에서는 TNF-\(\alpha\)와 adiponcetin이 서로의 분비를 억제한다고 하며 TNF-\(\alpha\) rnRNA와 TNF-\(\alpha\)단백질은 비만한 사람에게서 더 증가하고, 비만에서 TNF-\(\alpha\)의 과분비는 인슐린 저항성의 중요한 매개체이다. TNF-\(\alpha\) 관한 운동의 효과는 다양하게 보고되고 있는데 규칙적인 운동이 TNF-\(\alpha\), IL-6 등의 싸이토카인 수치를 감소시키고 이것이 내피의 기능과 인슐린 민감성을 증가시켜 지방조직의 감소와 더불어 체중을 감소시킨다는 연구와 일회성 중등도 운동은 TNF-\(\alpha\)를 감소시키거나 변화가 없다는 보고가 있으며, 일회성 고강도 운동은 TNF-\(\alpha\)를 증가시킨다는 보고가 있다. 비만청소년 7명을 16주간 복합트레이닝을 실시한 결과 TNF-\(\alpha\)가 감소하였고 체지방률이 \( 30 \% \) 이상 되는 비만여성 7명을 대상으로 12주간 에어로빅 프로그램을 실시한 결과 TNF-\(\alpha\)가 감소하였으며, 복부피하지방과 내장지방 비율이 0.4 이상인 복부내장지방형 비만여성 7명을 대상으로 12주간 복합트레이닝을 실시한 결과 TNF-a는 감소하였다고 보고하였다. 지속적인 신체운동은 저하하고 있는 말초조직의 인슐린 감수성을 개선시키므로 인슐린 저항성에 의한 고인슐린혈증을 개선하는 효과도 있으며, 혈당을 낮춰주는 역할로 인하여 당뇨병 따위의 치료에 쓰인다.</p><p>특히 중년여성의 비만에 영향을 미치는 요인들은 최근에 많은 관심을 받게 되어 많은 연구가 진행되고 있다. 여성은 임신과 출산 후유증으로 인하여 체중이 증가 되는 등 신체구성의 변화가 나타나게 된다. 여성의 중년기는 신체적으로 모든 기관의 기능이 감퇴하기 시작하는 시기로서, 호르몬의 변화와 노화징후의 발현, 그리고 생활에서 겪는 스트레스 등의 신체적 · 심리적인 이유 때문에 건강관리가 소홀하게 되고, 실제로 건강을 위협하는 많은 문제에 직면하게 된다. 중년여성들의 대부분은 복부비만으로 인한 문제가 심각하게 발생하기 때문에 체지방을 감소시키기 위한 다각적인 노력이 수반되어야 할 것이다. 유산소 운동의 효과는 운동기간이 길수록 그리고 운동량이 많을수록 보다 뚜렷이 나타난다. 짧은 시간에 격심한 운동을 하는 것보다 지속적으로 운동을 해야 피하에 축적된 지방이 분해되어 에너지로 이용되기 때문에 비만치료에 효과가 있다.</p><p>이에 비하여 무산소성 운동과 관련한 연구에서는 일반적으로 심혈관기능이나 혈청지질에 대한 트레이닝의 긍정적인 효과가 없는 것으로 알려져 있어 논란의 소지가 남아있는데, 일반적으로 체중조절 및 대사성질환예방을 위한 운동방법은 저항성 운동의 위험성과 체중감량 등에 대한 부정적 인식으로 인해 대부분 유산소 운동에 의존하는 경향을 보인다. 적당한 강도와 짧은 휴식시간을 포함한 중량운동의 형태인 웨이트 훈련도 유산소적인 운동 형태와 같은 생리적 효과를 유도 할 수 있는 잠재적 역량을 지니고 있고, 웨이트 트레이닝은 그 자체가 골격근에 직접적으로 자극을 부가하기 때문에 산화적 에너지대사능력의 향상을 유도하여 체중감소의 부수적인 효과 및 안정시 대사량의 증가를 통한 열량소비의 효율성을 향상 시키는 효과를 준다.</p><p>지금까지의 선행연구는 유산소성 운동과 저항성 운동의 복합운동프로그램에서 중년비만여성의 신체구성과 혈중지질대사에 긍정적인 변화를 초래한 것으로 보고되고 있으나 심혈관질환 위험인자에 미치는 영향에 대한 복합트레이닝의 효과에 대해서는 미흡한 실정이다. 이에 본 연구는 복합트레이닝이 중년여성의 신체조성, 혈청지질과 더불어 심혈관질환 위험인자에 미치는 영향을 알아보는 것으로서 건강상의 이상적 징후가 나타나기 시작하는 중년여성의 복합운동 프로그램개발에 기초자료를 제공하는데 의의가 있다. 따라서 본 연구의 목적은 12주간의 복합트레이닝이 중년비만여성들의 신체특성, 신체조성, 혈청지질 그리고 심혈관질환 위험인자에 미치는 영향을 규명하는 것이다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>대상 및 설계</h2><p>본 연구의 대상자는 B광역시 D구 L스포츠센터에서 규칙적으로 12주간 복합트레이닝에 참여할 운동군 8명과 대조군 8명으로 체지방률이 \( 30 \% \) 이상, 신체질량지수(BMI) \( 25 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 이상인 비만중년여성 16명을 대상으로 하였다. 이들의 신체적 특성은 Table 1에 나타난 바와 같다.</p><h2>채혈 및 분석</h2><p>Biospace, Inbody 4.0 korea를 이용하여 대상자의 신장, 체중, LBM, \(\% \)Body Fat 그리고 BMI를 측정하였고, 허리와 둔부 둘레의 비율을 계산하여 WHR을 구하였다. 안정 시 혈압은 Automatic Blood Pressure Monitor TM-2665P, Japan을 이용하여 좌측상완에서 충분한 안정을 취한 후 2분 간격으로 3번씩 측정하였다. 혈액채취는 12주간 복합트레이닝 전 · 후 10시간 이상의 공복상태에서 Becton Dickinson Vacurainger System을 이용하여 전완정맥에서 각각 \( 10 \mathrm{ml} \)씩 채혈하여 분석하였다. TC와 TG는 Hitachi 736-20, Japan을 이용하여 효소법으로 분석하였고, LDL-C와 HDL-C도 Hitachi 736-20, Japan을 이용하여 침전법과 직접법으로 분석하였다. TNF-\(\alpha\) (Tumor necrosis factor-alpha)는 ELIA (Enzytine Linked Immonosorbent Assay)를 이용하여 \( 430 \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, 인슐린은 Modular E170 장비를 이용하여 분석하였다. 한편 운동 중 최대산소섭취량과 HR은 Quinton Metabolic Cart 4500 USA를 이용하여 측정하였다.</p><h2>운동방법</h2><p>복합트레이닝에서 유산소운동은 최대운동부하 검사방법은 점증다단계 부하법을 수정하여 Q65 트레드밀(Quinton, U.S.A)에서 측정하였다. 경사도는 \( 0 \% \) 로 하고 \( 100 \mathrm{m} / \mathrm{min} \)의 속도로 3분간 준비운동을 하여 3분간 휴식을 취한 직후 주행 속도 \( 100 \mathrm{m} / \mathrm{min} \)에서 매 3분경과시 \( 20 \mathrm{m} / \mathrm{min} \)씩 속도를 증가시켜 대상자가 최대운동에 도달하도록 하였다. HRmax의 \( 60 \% \)에 해당하는 목표심박수(THR)를 산출한 후 회귀방정식을 이용하였다. \(50 \sim 70\%\) HRmax로 1회 30분간 실시하였다. 운동 부하가 증가해도 심박수(HR)의 증가가 없고, 산소섭취량의 증가도 \( 150 \mathrm{mg} / \mathrm{min} \) 이하 일 때, RER이 1.15 이상인 경우와 주관적 운동 강도(RPE)가 17 이상일 때를 최대운동부하로 판정하였다.</p><p>근저항 운동은 Bench press, Lat pull down, Seated shoulder press, Arm curl, Leg curl, Leg press, Triceps push-down등의 7종목으로 구성하였다. 최대근력(1RM)의 \(60-70\%\) 강도부하로 반복횟수 \(10-15\)회, 3세트, 40분간 실시하였으며, 6주 후에 최대산소섭취량과 1 RM을 재측정하여 운동 강도를 재설정하였다. 본 연구를 위한 12주 복합트레이닝 프로그램은 Table 2와 같다.</p><h2>자료처리</h2><p>모든 자료처리는 SPSS (Ver. 14.0) Program을 이용하여 검사항목의 평균값(M)과 표준편차(SD)를 산출하였고, 12주간복합트레이닝 전 · 후의 항목별 평균값차이를 비교하기 위해 집단 내에는 대응표본t검증(Paired t-test)을 실시하였다. 실험 전 두 집단 간의 동질성여부를 검증하기위해 독립t검증 (Independent t-test)을 실시하였으며, 모든 통계적 유의수준은 \( \mathrm{p}<0.05 \) 로 설정하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>신체특성의 변화</h2><p>12주간 복합트레이닝 전·후의 신체특성의 변화를 Table3 에 나타내었다.</p><p>12주 복합트레이닝 후 신체특성에서 체중, BMI, WHR는 각각 유의하게 감소한 것으로 나타났고, 수축기 확장기 혈압이 각각 증가하였으나 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다.</p><p>본 연구에서 12주 복합트레이닝 후에 운동군의 체중이 \( 3.18 \mathrm{kg} \) 유의하게 감소하였고 대조군에서는 \( 1.05 \mathrm{kg} \)이 증가하였다. 선행보고에서 6주간 40대 중년여성을 대상으로 조깅 및 수영 복합트레이닝을 실시하여 체중의 유의한 감소를 나타내었다. 중년여성을 대상으로 \( 60 \% \) HRmax의 강도로 1회 30분간, 주 6회, 10주간 유산소와 저항운동의 복합트레이닝을 실시한 결과, 체중이 \( 2.86 \mathrm{kg} \) 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05 \)) 감소되었던 것과 일치하는 결과로 규칙적인 복합트레이닝이 중년여성의 체중조절을 위한 적합한 건강관리방안 중 하나로 사료된다. 이처럼 복합트레이닝 후 체중의 감소는 복합운동을 규칙적으로 실시함으로써 에너지소비열량이 증가한 결과라고 할 수 있겠다. BMI는 신장과 가장 상관관계가 낮고, 체지방과 가장 상관이 높은 것으로 알려져 있다. BMI의 변화에 대한 선행연구에서 중년남성과 여성 총 130명을 대상으로 저항성트레이닝을 1RM 의 \( 70 \% \) 로 40분, 유산소 트레이닝을 HRmax의 \( 60-70 \% \)에 해당하는 목표심박수로 트레드밀달리기 30분으로 구성된 복합트레이닝을 주 5회, 1회 70분, 5개월간 실시하여 BMI가 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05 \)) 감소한 것으로 나타났으며, 중년여성 16명을 대상으로 12주간 규칙적인 유산소 트레이닝을 실시한 연구에서도 운동군에서 12주 유산소 트레이닝 후 BMI가 \( 0.96 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.01 \)) 감소하였다는 선행연구와 마찬가지로 본 연구에서도 운동군에서의 BMI가 12주 복합트레이닝 전 \( 25.71 \pm 0.56 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 에서 12주 복합트레이닝 후 \( 22.60 \pm 0.64 \mathrm{kg} / \mathrm{m}^{2} \)으로 \( 3.11 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 이 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05\)) 감소한 것으로 나타나 선행연구와 동일한 결과를 나타내었다. 12주 복합트레이닝 후 체중의 유의한 감소가 BMI수치의 감소에 영향을 주었을 것이라 생각된다.</p><p>WHR은 심혈관질환, 당뇨병과 같은 비만합병증의 주원인인 내장지방과 피하지방을 나타내기 때문에 비만과 관련된 질병예측에 유용한 지표이다. 복합트레이닝과 관련된 선행연구에서 규칙적인 운동이 제2형 당뇨병 노인여성의 혈당, 혈중지질수준 및 체성분에 미치는 영향에 관한 연구에서 노인 여성 총 20명을 대상으로 24주간 복합트레이닝을 실시하여 WHR가 유의하게 (\(\mathrm{p}<0.1\)) 감소하였다. 비만여대생을 대상으로 한 연구결과를 보면 12주간의 운동 후 WHR는 \( 0.04 \% \) 유의하게 감소한 것으로 보고하여 체지방률이 \( 30 \% \) 이상인 20-30대 성인비만여성을 대상으로 8주 동안 복합트레이닝을 실시하여 WHR에서 통계적으로 유의한 차이 (\(\mathrm{p}<0.001\))가 있다고 보고하였다. 신체적으로 비활동적인 사람은 활동적인 사람에 비해 고혈압 발생위험이 \( 35-52\%\) 정도 더 높고 특히 비만한 사람들에게서 고혈압 발생위험이 높다. 본 연구에서는 12주 복합트레이닝 후 운동군은 수축기혈압이 \( 117.37 \pm 13.47 \mathrm{mmHg} \)에서 \( 119.37 \pm 8.21 \mathrm{mmHg} \) 로, 확장기혈압이 \( 72.37 \pm 5.80 \mathrm{mmHg} \)에서 \( 74.00 \pm 5.97 \mathrm{mmHg} \) 으로 유의한 차이는 없었지만 각각 높아졌다. 이는 12 주간 수중운동이 안정시 수축기 · 확장기혈압에서 유의한 차가 없다고 보고한 결과와, 24주간 유산소성 운동이 수축기 · 확장기 혈압에 유의한 변화가 없다고 보고하여 본 연구와 일치하는 부분이지만, 운동의 역할이 혈압강하효과와 순환기능을 향상시키는 역할을 하는 것으로 운동여부에 따른 폐경기전 · 후 여성의 심혈관질환 위험요인 차이분석에서 운동이 수축기 · 확장기 혈압을 낮춘다는 보고와 규칙적인 유산소성 운동은 혈압의 감소에 도움이 된다는 선행연구들과는 일치하지 않는 것으로 나타났다.</p> <h2>심혈관질환 위험인자의 변화</h2><p>12주 복합트레이닝 전 · 후의 심혈관질환 위험인자변화는 Table 6에 나타내었다.</p><p>12주 복합트레이닝 후 심혈관질환 위험인자의 변화는 인슐린, TNF-\(\alpha\)가 각각 유의하게 감소한 것으로 나타났다.</p><p>16주간 에어로빅스 트레이닝 후 인슐린이 \( 11.91 \mu \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)가 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.01 \)) 감소되어 에어로빅스 트레이닝이 인슐린저항성을 감소시킬 수 있다고 하였으며, 체지방률 \( 30 \% \) 이상인 여중생 18명을 대상으로 10주간 30-40분 달리기실시 후 인슐린농도는 운동군이 \( 26.58 \mu \mathrm{U} / \mathrm{ml}\)에서 \( 10.83 \mu \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)로 유의한 감소가 나타났고, 통제군은 \( 25.11 \mu \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)에서 \( 25.88 \mu \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)로 유의한 차이가 나타나지 않았다고 보고하였다. 지속적인 신체운동은 저하하고 있는 말초조직의 인슐린 감수성을 개선시키므로 인슐린 저항성에 의한 고인슐린혈증을 개선하는 효과도 있으며, 혈당을 낮춰주는 역할로 인하여 당뇨병 따위의 치료에 쓰인다. 본 연구에서 인슐린은 대조군에서 \( 8.18 \mu \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)가 감소하였지만 유의한 차이 (\( \mathrm{p}<0.05 \))가 나지는 않았으며, 12주 복합트레이닝을 실시한 운동군에서 운동전 \( 16.35 \pm 12.82 \mu \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)에서 12주 복합트레이닝 후 \( 5.06 \pm 3.81 \mu \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)로 \( 11.29 \mu \mathrm{U} / \mathrm{ml} \)가 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05 \)) 감소하여, 식이요법이나 운동요법 등을 통해 체지방을 감소 시켰을 때 인슐린저항성이 감소됨을 보고한 다수의 선행연구들과도 일치하였다. 따라서 규칙적인 복합트레이닝은 인슐린의 분비를 감소시켜 인슐린 저항성을 감소시킬 수 있다는 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 것으로 사료된다.</p><p>TNF-\(\alpha\)는 지방조직에 대하여 다양한 활동을 나타내며, 지방 세포에서 글루코스와 인슐린 수용체신호를 억제한다. TNF-\(\alpha\)에 관한 운동의 효과는 다양하게 보고되고 있는데 BMI가 \( 35 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 이상인 132명의 비만자를 대상으로 6개월에 걸쳐 저지방식이요법과 운동병행프로그램을 통해 TNF-\(\alpha\)는 유의한 변화가 없다고 보고하였고, 비만중년여성 56명을 대상으로 1년간의 체중감소프로그램을 실시한 결과 TNF-\(\alpha\)가 유의하게 감소하였고, BMI가 \( 27.8 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 이상인 16명의 비만여성을 대상으로 12주간 최대심박수의 \( 70 \% \), 주5회 30분씩 자전거운동을 통한 연구결과에서 TNF- \(\alpha\)의 농도가 감소하였다. 지방조직에서는 TNF-\(\alpha\)와 adiponcetin이 서로의 분비를 억제한다고 하며 TNF-\(\alpha\) rnRNA와 TNF-\(\alpha\) 단백질은 비만 한 사람에게서 더 증가하고, 비만에서 TNF-\(\alpha\)의 과분비는 인슐린 저항성의 중요한 매개체이다. 일회성 운동에 의한 염증유발 물질인 TNF-\(\alpha\)에 관한 운동의 효과는 다양하게 보고되고 있는데, 중등도 운동은 TNF-\(\alpha\)를 감소시키거나 변화가 없다는 보고가 있으며, 고강도 운동은 TNF-\(\alpha\)를 증가시킨다는 보고가 있다.</p><p>본 연구결과를 통해서도 12주 복합트레이닝 후 운동군의 TNF-\(\alpha\)는 운동전 \( 1.68 \pm 0.45 \mathrm{pg} / \mathrm{ml} \)에서 운동 후 \( 0.87 \pm 0.23 \mathrm{pg} / \mathrm{ml} \)로 \( 0.81 \mathrm{pg} / \mathrm{ml} \)가 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05 \)) 감소한 결과를 보였는데, 이는 10주에 걸쳐 내장지방형비만자를 유산소 운동과 근저항 운동의 복합트레이닝을 실시한 연구에서 TNF-\(\alpha\)가 운동 전 \( 0.093 \pm 0.014 \mathrm{pg} / \mathrm{ml} \)에서 복합트레이닝 후 \( 0.076 \pm 0.007 \mathrm{pg} / \mathrm{ml} \)로 \( 0.017 \mathrm{pg} / \mathrm{ml} \)가 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05 \)) 감소한 연구 결과와 일치하는 것으로 나타나 운동을 통한 긍정적인 효과를 보인 것으로 생각된다. 12주간의 복합트레이닝이 염증유발 물질인 TNF-\(\alpha\)의 농도를 감소시킴은 물론 인슐린저항성과 관련된 심혈관질환, 당뇨병, 대사성증후군을 예방하는데 효과적인 방법이라고 사료된다.</p> <h2>신체조성의 변화</h2><p>12주 복합트레이닝 전 · 후의 신체조성의 변화는 Table 4 에나타냈다.</p><p>12주 복합트레이닝 후 신체조성에서 체지방량, 체지방률은 유의하게 감소하였으며, 제지방량은 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 제지방량의 변화에 대한 선행연구에서 비만여성을 대상으로 10주간 유산소 및 저항운동을 실시한 결과 제지방량이 유의하게 증가를 보였고, 12주간 유산소와 근저항 및 요가의 복합운동을 실시하여 제지방량이 \( 1.7 \mathrm{kg} \) 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.01 \)) 증가하는 것으로 나타났다. 중년여성을 대상으로 \( 60 \% \) HRmax의 강도로 1회 30분간, 주 6회 10주간 복합트레이닝 실시한 결과 제지방률이 통계적으로 유의한 차이는 없었지만 \( 1.25 \mathrm{kg} \)이 증가하는 것으로 나타났다고 하였다. 본 연구에서도 12주간의 유산소 운동과 저항운동을 병행하여 유산소 운동은 \(50-70\%\) HRmax, 저항운동은 \(1\mathrm{RM}\)의 \(60-70\%\)로 주 5회, 90분간의 운동 빈도로 각각 수행하였으며, 제지방량의 변화는 대조군이 \( 39.93 \pm 4.16 \mathrm{kg} \)에서 \( 39.56 \pm 4.24 \mathrm{kg} \)으로 \( 0.37 \mathrm{kg} \)이 감소하였으나 유의한 차이는 없었으며, 운동군에서는 12주 복합 트레이닝 전 \( 40.13 \pm 4.11 \mathrm{~kg} \) 에서 12주 복합트레이닝 후 \( 41.66 \pm 3.84 \mathrm{~kg} \)으로 \( 1.53 \mathrm{~kg} \) 이 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.05 \)) 증가하였는데 체중 당 근육의 증가를 보인 선행연구와 유사한 효과를 나타냈다. 이는 제지방량이 증가된 만큼 활동할 수 있는 운동능력이 향상되고 혈액이 원활하게 흐를 수 있도록 도와주는 역할을 한 것으로 생각되며 꾸준하게 복합트레이닝을 실시하면 동맥경화와 같은 심혈관질환을 사전에 예방하는데 도움이 될것이라고 사료된다. 일반적으로 체지방감소를 위해서는 운동중에 혈중유리지방산의 이용을 증가시키는 운동을 통해 체지방량을 줄이는 지방산화량의 증가가 필요하다. 규칙적인 프로그램으로 수영운동에 참여한 40대 중년여성들중에서 운동을 실시한 운동군에서 체지방량이 \( 17.19 \pm 6.68 \mathrm{kg} \), 운동에 참여하지 않은 통제군이 \( 19.62 \pm 4.34 \mathrm{~kg} \)으로 집단간의 유의한 차이가 있는 것으로 보고하였다. 비만중년여성을 대상으로 실시한 중강도 유산소 운동은 혈중 유리지방산의 대사에 의해서 체지방량을 감소시키는데 더 효과적이라고 보고하였다.</p><p>또한 비만중년여성들을 대상으로 12주간 복합트레이닝을 실시한 결과, 체지방량이 통제군에서는 \( 22.22 \pm 1.41 \mathrm{~kg} \)에서 \( 23.31 \pm 1.41 \mathrm{~kg} \)으로 증가하였으며 운동을 실시한 운동군에서는 \( 23.14 \pm 1.30 \mathrm{~kg} \)에서 운동 후 \( 18.12 \pm 1.11 \mathrm{~kg} \)으로 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.01 \)) 감소하였다. 체지방률이 \( 25 \%\)~\(35 \% \)사이의 40대 비만여성을 대상으로 웨이트트레이닝 및 트레드밀운동집단과 웨이트트레이닝집단을 12주간 훈련시킨 결과 체지방량이 두 집단 모두 각각 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.01 \)) 감소하였는데, 이는 본 연구의 결과에서도 운동군의 경우 체지방량은 운동전 \( 19.23 \pm 2.22 \mathrm{~kg} \)에서 12주 복합트레이닝 후 \( 17.11 \pm 1.43 \mathrm{~kg} \)으로 \( 2.12 \mathrm{~kg} \)이 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.1 \)) 감소하였으며, 운동을 실시하지 않은 대조군에서는 체지방량이 \( 19.18 \pm 3.48 \mathrm{~kg} \) 에서 \( 21.11 \pm 2.83 \mathrm{~kg} \)으로 \( 1.93 \mathrm{~kg} \)이 증가하였다. 이와 같은 결과는 보다 많은 에너지소비활동을 할 수 있는 유산소 운동과 저항 운동을 병행하여 실시하면 체지방량의 감소에 긍정적인 영향을 미친다는 것으로, 걷기 운동과 근저항성트레이닝으로 구성된 복합트레이닝의 적용은 중년비만여성의 체지방량 감소에 긍정적인 효과를 나타내며, 비만해소를 위한 체지방 감소에 효율적인 운동 방법으로 향후 보다 다양한 운동프로그램의 적용과 지속적인 연구가 이루어져야 할 것이다.</p><p>12주간 주 3회 복합트레이닝을 실시한 결과 체지방률이 \( 2 \% \)감량한 것으로 보고하였고, 12주간 복합트레이닝을 실시한 운동군에서 운동 전 \( 28.04 \pm 6.07 \% \)에서 운동 후 \( 23.07 \pm 2.69 \% \)로 유의하게 (\(\mathrm{p}<0.05\)) 감소하였다고 보고하였다. 과도한 체지방의 축적은 관상동맥질환, 고혈압, 그리고 당뇨병과 같은 건강상의 문제에 부정적인 영향을 미친다. 규칙적인 운동은 이러한 체지방감소를 위한 비만자들에게 일반적으로 권유하는 방법이다. 운동과 체지방률의 변화와 관련된 연구를 살펴보면 체지방률이 \( 30 \% \) 이상인 비만여자중학생을 대상으로 10주간 복합트레닝을 실시한 결과 유산소성 운동집단의 체지방률이 \( 4.9 \% \), 저항성 운동집단은 체지방률 \( 4.4 \% \)감소를 보고하였다. 또한 BMI가 \( 25 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 이상의 비만남자대학생을 대상으로 12주간 복합트레이닝을 실시한 연구에서도 체지방률의 감소를 보고하였다. 본 연구에서도 12주간 복합트레이닝을 실시한 결과 체지방률의 변화는 대조군이 \( 32.96 \pm 1.45 \% \)에서 \( 34.02 \pm 2.00 \% \)로 유의하게 (\( \mathrm{p}<0.01 \)) 증가하였으며, 운동군에서는 \( 32.83 \pm 2.07 \% \)에서 12주간 복합트레이닝 후 \( 29.30 \pm 2.22 \% \)로 운동전 보다 통계적으로 유의한 차이 (\( \mathrm{p}<0.001 \))를 보이며 감소하여 선행연구와 유사한 결과를 나타내었다. 12주간의 복합트레이닝 후 체지방률의 감소는 선행연구의 결과와 마찬가지로 규칙적인 운동이 중성지방과 유리지방산을 에너지원으로 이용함과 동시에 지방산화를 촉진시켜서 체지방률의 감소요인으로 작용하였을 것이라고 생각된다.</p> <h1>초록</h1><p>본 연구는 부산광역시에 거주하고 있는 비만중년여성(체지방률 \( 30 \% \) 이상, BMI \( 25 \mathrm{~kg} / \mathrm{m}^{2} \) 이상) 16명을 대상으로 12주간 복합트레이닝 전 · 후에 나타나는 신체특성, 신체조성, 혈청지질과 심혈관질환 위험인자에 어떠한 변화가 나타나는지 규명하여 그 기초자료를 제시하는데 목적이 있다. 본 연구의 결과로는: 1) 12주 복합트레이닝 후 신체특성에서 체중, BMI, WHR는 각각 유의하게 감소한 것으로 나타났고, 수축기 확장기 혈압이 각각 증가하였으나 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다. 2) 12주 복합트레이닝 후 신체조성에서 체지방량, 체지방률은 유의하게 감소하였으며, 제지방량은 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 3) 12주 복합트레이닝 후 혈청지질에서 TC, TG,LDL-C는 유의하게 감소하였고 HDL-C 증가하였으나 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다. 4) 12주 복합트레이닝 후 심혈관질환 위험인자의 변화는 인슐린, 염증유발 인자인 TNF-\(\alpha\)가 각각 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 본 연구의 결과를 종합해 볼 때 12주간의 복합트레이닝 적용이 중년비만여성들의 심혈관질환 위험인자의 변화에 긍정적인 변화를 보였으나, 비만으로 인해 나타나는 각종 현대병을 예방하기 위한 운동처방을 하기위해서는 보다 더 구체적이고, 체계적인 연구가 계속 되어야 할 것으로 사료된다.</p>	생명과학	[ "<h2>혈청지질의 변화</h2><p>12주 복합트레이닝 전 · 후의 혈청지질의 변화는 Table 5에 나타냈다.", "</p><p>12주 복합트레이닝 후 혈청지질에서 TC, TG, LDL-C은 유의하게 감소하였고 HDL-C 증가하였으나 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.", "</p><p>선행연구를 살펴보면 체지방률 \\( 30 \\% \\) 이상인 여중생을 대상으로 12주, 주 3회, 매회 \\( 4 \\mathrm{km} \\) 달리기를 실시한 결과 TC가 운동군은 \\( 192.57 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 \\( 171.45 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 \\( 21.12 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)가 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\))감소하였고, 40대 여성을 대상으로 매회 60분, 주 5회, 12주간 운동을 실시하여 TC가 운동전 \\( 185.29 \\pm 5.49 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 운동 후 \\( 164.86 \\pm 7.49 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)) 감소하였다.", "</p><p>본 연구에서 운동을 실시한 운동군에서 TC의 농도가 운동군이 운동 전 \\( 221.37 \\pm 40.63 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 운동 후 \\( 186.00 \\pm 35.56 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 감소한 것은 유산소 운동과 근저항성 운동의 복합트레이닝을 실험대상자들의 수준에 맞도록 운동 강도 재설정 및 운동 강도의 유지와 더불어 연구의 대상자가 신체활동이나 운동참여가 낮은 중년비만여성이란 점에서 혈중 TC의 농도에 영향을 미친 것으로 생각되어 진다.", "</p><p>본 연구결과 12주 복합트레이닝 후 HDL-C는 운동군에서는 운동전 \\( 58.72 \\pm 11.62 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 \\( 63.73 \\pm 11.76 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 \\( 5.01 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\) 증가하였으며, 대조군이 \\( 56.57 \\pm 10.01 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 \\( 55.52 \\pm 7.10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 \\( 1.05 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)가 감소하였는데 이와 같은 결과는 40대 이상의 중년여성을 대상으로 10주간 주 4회, 복합 운동 후 HDL-C가 \\( 2.85 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)증가했다는 연구의 결과와 일치하였다.", "</p><p>이상의 여러 선행연구의 결과에 비추어 볼 때, 복합트레이닝의 두 가지 운동 유형은 혈중 HDL-C의 증가에 기여할 수 있는 운동으로 운동의 긍정적인 가능성을 제시할 수 있고 복합트레이닝을 장기간 규칙적으로 실시한다면 비만들의 HDL-C의 농도개선에 긍정적인 효과를 줄 것이라고 생각된다.", "혈중 LDL-C의 농도는 일반적으로 TC의 약 \\( 70 \\% \\)를 차지하고 있고, 중성지방을 운반하여 동맥벽에 축적시키는 역할을 하므로 혈액의 흐름을 방해하여 결과적으로 심근경색을 일으키게 된다.", "그러나 운동은 혈중 LDL-C의 농도를 저하시키는 작용을 하는데, 그 감소의 정도는 운동기간과 운동량이 많을수록 그리고 체중이 감소하면 LDL-C를 저하시킬 수 있다.", "40대 이상의 중년여성을 대상으로 10주간 주 4회 유산소 운동과 근력 운동을 실시한 결과 LDL-C는 운동전에 비해 다소 감소하였으나 통계적으로 유의한 차이는 없었으며, 20대 여성들을 대상으로 12주간 복합트레이닝을 실시한 결과 LDL-C가 \\( 11.16 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\) 감소된 것으로 보고하였고, BMI가 \\( 25 \\% \\) 이상인 비만대학생을 대상으로 복합트레이닝 프로그램을 12주간 실시한 결과 혈중 LDL-C의 감소를 보고하였다.", "12주 복합트레이닝을 실시한 운동군에서 LDL-C \\( 127.87 \\pm 34.58 \\)\\( \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 \\( 103.37 \\pm 23.01 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 \\( 24.50 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)가 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)) 감소한 본 연구의 결과와 선행연구들의 결과가 유사하게 나타났다.", "본 연구의 대상자 대부분이 단순성 비만이라는 사실로 미루어 볼 때 심혈관질환 위험인자인 혈중 LDL-C의 감소는 심혈관계통의 순환작용이 향상된 것으로 인해 혈중 LDL-C의 축적비율이 낮아지는 결과로 사료된다.", "</p><p>TG가 증가하면 관상동맥질환의 위험성은 증가하나 운동을 통하여 이를 낮춤으로써 심혈관질환을 예방할 수 있다.", "40대 이상의 중년여성을 대상으로 10주간, 주 4일 유산소 운동과 근력 운동을 실시한 연구에서 TG가 운동 후 유의하게 감소하였다고 보고하였고, 대학생을 대상으로 8주간 복합트레이닝을 실시한 연구에서도 대조군은 TG가 \\( 86.00 \\pm 32.63 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 \\( 97.38 \\pm 36.72 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 \\( 11.38 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)가 증가하였으며, 운동군에서는 운동 전 \\( 74.13 \\pm 54.06 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 운동 후 \\( 61.13 \\pm 44.70 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 \\( 13.00 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)가 감소하였다고 보고하였다.", "</p><p>이상의 선행연구들을 살펴보면 대부분 운동에 의하여 체내의 TG는 감소한다는 연구가 지배적인 것으로 나타났다.", "본연구에서도 대조군은 \\( 147.37 \\pm 57.03 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 \\( 153.87 \\pm 61.88 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 \\( 6.50 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)가 증가하였고, 12주 복합트레이닝 전 운동군에서는 운동 전 \\( 146.62 \\pm 49.10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)에서 운동 후 \\( 101.87 \\pm 21.87 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)로 \\( 44.75 \\mathrm{mg} / \\mathrm{dl} \\)가 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.01 \\)) 감소한 것으로 나타났다.", "본 연구의 혈중 TG 농도의 유의한 감소는 12주 복합트레이닝을 실시함으로서 비만중년여성의 TG농도를 감소시키고 TG의 동원비율 및 산화능력의 효율성을 증가시킬 수 있다는 긍정적인 영향을 미친다고 사료된다.", "</p> <h1>서론</h1><p>현대인에게 영양과잉, 불규칙한 생활습관, 운동부족 및 과중한 스트레스가 주로 심혈관 질환의 발병률을 증가시켜 심장병, 고혈압, 뇌졸중과 같은 만성 퇴행성 질환을 일으키는 원인이 되고 있다.", "이러한 생활양식과 관련된 질환의 일반적인 원인은 과다한 영양섭취와 이로 인한 비만이다.", "비만은 대사증후군으로 분류되어 혈당, 중성지방, HDL-C, LDL-C, 복부비만 등이 주요 지표이며 이들은 관상동맥질환에 대한 위험요인으로도 분류되어 있다.", "특히 우리나라 사망원인 중 높은 비율을 차지하고 있는 관상동맥질환, 뇌졸중, 고지혈증 등과 같은 심혈관 질환은LDL-C의 증가와 HDL-C의 감소에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다.", "그리고 심혈관계질환의 \\( 95 \\% \\)는 동맥경화증으로부터 비롯되고, 동맥경화증의 \\( 50 \\% \\) 이상은 신체적 활동부족과 운동부족이 주된 원인으로 비만과 관련이 있다.", "특히 비만으로 인한 인슐린 저항성 증가는 대사이상과 심 · 혈관 질환 위험인자들이 출현하여 복부 비만, 당불내성, 이상 지질 혈증(고중성지방, 저HDL-C, 고 LDL-C), 고혈압 등의 질환을 유발하는 심각한 대사증후군 (metabolic syndrome)을 초래하게 된다.", "TNF-\\(\\alpha\\)는 분비되는 양에 따라서 그 기능에 차이를 나타낸다.", "저농도의 TNF-\\(\\alpha\\)는 혈관 내피세포에 백혈구 부착기능을 항진시키며, 식세포의 세균 살해작용을 한다.", "그리고 고농도의 TNF-\\(\\alpha\\)는 심근 수축력을 감소시키고 인슐린 감수성을 억제 시키는 역할을 한다.", "염증유발 물질 중 하나인 TNF-\\(\\alpha\\)는 인슐린의 직접적인 신호를 손상시키며, 인슐린 저항성을 야기 시키는 인자로 알려져 있다.", "지방조직에서는 TNF-\\(\\alpha\\)와 adiponcetin이 서로의 분비를 억제한다고 하며 TNF-\\(\\alpha\\) rnRNA와 TNF-\\(\\alpha\\)단백질은 비만한 사람에게서 더 증가하고, 비만에서 TNF-\\(\\alpha\\)의 과분비는 인슐린 저항성의 중요한 매개체이다.", "TNF-\\(\\alpha\\) 관한 운동의 효과는 다양하게 보고되고 있는데 규칙적인 운동이 TNF-\\(\\alpha\\), IL-6 등의 싸", "이토카인 수치를 감소시키고 이것이 내피의 기능과 인슐린 민감성을 증가시켜 지방조직의 감소와 더불어 체중을 감소시킨다는 연구와 일회성 중등도 운동은 TNF-\\(\\alpha\\)를 감소시키거나 변화가 없다는 보고가 있으며, 일회성 고강도 운동은 TNF-\\(\\alpha\\)를 증가시킨다는 보고가 있다.", "비만청소년 7명을 16주간 복합트레이닝을 실시한 결과 TNF-\\(\\alpha\\)가 감소하였고 체지방률이 \\( 30 \\% \\) 이상 되는 비만여성 7명을 대상으로 12주간 에어로빅 프로그램을 실시한 결과 TNF-\\(\\alpha\\)가 감소하였으며, 복부피하지방과 내장지방 비율이 0.4 이상인 복부내장지방형 비만여성 7명을 대상으로 12주간 복합트레이닝을 실시한 결과 TNF-a는 감소하였다고 보고하였다.", "지속적인 신체운동은 저하하고 있는 말초조직의 인슐린 감수성을 개선시키므로 인슐린 저항성에 의한 고인슐린혈증을 개선하는 효과도 있으며, 혈당을 낮춰주는 역할로 인하여 당뇨병 따위의 치료에 쓰인다.", "</p><p>특히 중년여성의 비만에 영향을 미치는 요인들은 최근에 많은 관심을 받게 되어 많은 연구가 진행되고 있다.", "여성은 임신과 출산 후유증으로 인하여 체중이 증가 되는 등 신체구성의 변화가 나타나게 된다.", "여성의 중년기는 신체적으로 모든 기관의 기능이 감퇴하기 시작하는 시기로서, 호르몬의 변화와 노화징후의 발현, 그리고 생활에서 겪는 스트레스 등의 신체적 · 심리적인 이유 때문에 건강관리가 소홀하게 되고, 실제로 건강을 위협하는 많은 문제에 직면하게 된다.", "중년여성들의 대부분은 복부비만으로 인한 문제가 심각하게 발생하기 때문에 체지방을 감소시키기 위한 다각적인 노력이 수반되어야 할 것이다.", "유산소 운동의 효과는 운동기간이 길수록 그리고 운동량이 많을수록 보다 뚜렷이 나타난다.", "짧은 시간에 격심한 운동을 하는 것보다 지속적으로 운동을 해야 피하에 축적된 지방이 분해되어 에너지로 이용되기 때문에 비만치료에 효과가 있다.", "</p><p>이에 비하여 무산소성 운동과 관련한 연구에서는 일반적으로 심혈관기능이나 혈청지질에 대한 트레이닝의 긍정적인 효과가 없는 것으로 알려져 있어 논란의 소지가 남아있는데, 일반적으로 체중조절 및 대사성질환예방을 위한 운동방법은 저항성 운동의 위험성과 체중감량 등에 대한 부정적 인식으로 인해 대부분 유산소 운동에 의존하는 경향을 보인다.", "적당한 강도와 짧은 휴식시간을 포함한 중량운동의 형태인 웨이트 훈련도 유산소적인 운동 형태와 같은 생리적 효과를 유도 할 수 있는 잠재적 역량을 지니고 있고, 웨이트 트레이닝은 그 자체가 골격근에 직접적으로 자극을 부가하기 때문에 산화적 에너지대사능력의 향상을 유도하여 체중감소의 부수적인 효과 및 안정시 대사량의 증가를 통한 열량소비의 효율성을 향상 시키는 효과를 준다.", "</p><p>지금까지의 선행연구는 유산소성 운동과 저항성 운동의 복합운동프로그램에서 중년비만여성의 신체구성과 혈중지질대사에 긍정적인 변화를 초래한 것으로 보고되고 있으나 심혈관질환 위험인자에 미치는 영향에 대한 복합트레이닝의 효과에 대해서는 미흡한 실정이다.", "이에 본 연구는 복합트레이닝이 중년여성의 신체조성, 혈청지질과 더불어 심혈관질환 위험인자에 미치는 영향을 알아보는 것으로서 건강상의 이상적 징후가 나타나기 시작하는 중년여성의 복합운동 프로그램개발에 기초자료를 제공하는데 의의가 있다.", "따라서 본 연구의 목적은 12주간의 복합트레이닝이 중년비만여성들의 신체특성, 신체조성, 혈청지질 그리고 심혈관질환 위험인자에 미치는 영향을 규명하는 것이다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>대상 및 설계</h2><p>본 연구의 대상자는 B광역시 D구 L스포츠센터에서 규칙적으로 12주간 복합트레이닝에 참여할 운동군 8명과 대조군 8명으로 체지방률이 \\( 30 \\% \\) 이상, 신체질량지수(BMI) \\( 25 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 이상인 비만중년여성 16명을 대상으로 하였다.", "이들의 신체적 특성은 Table 1에 나타난 바와 같다.", "</p><h2>채혈 및 분석</h2><p>Biospace, Inbody 4.0 korea를 이용하여 대상자의 신장, 체중, LBM, \\(\\% \\)Body Fat 그리고 BMI를 측정하였고, 허리와 둔부 둘레의 비율을 계산하여 WHR을 구하였다.", "안정 시 혈압은 Automatic Blood Pressure Monitor TM-2665P, Japan을 이용하여 좌측상완에서 충분한 안정을 취한 후 2분 간격으로 3번씩 측정하였다.", "혈액채취는 12주간 복합트레이닝 전 · 후 10시간 이상의 공복상태에서 Becton Dickinson Vacurainger System을 이용하여 전완정맥에서 각각 \\( 10 \\mathrm{ml} \\)씩 채혈하여 분석하였다.", "TC와 TG는 Hitachi 736-20, Japan을 이용하여 효소법으로 분석하였고, LDL-C와 HDL-C도 Hitachi 736-20, Japan을 이용하여 침전법과 직접법으로 분석하였다.", "TNF-\\(\\alpha\\) (Tumor necrosis factor-alpha)는 ELIA (Enzytine Linked Immonosorbent Assay)를 이용하여 \\( 430 \\mathrm{nm} \\)에서 흡광도를 측정하였으며, 인슐린은 Modular E170 장비를 이용하여 분석하였다.", "한편 운동 중 최대산소섭취량과 HR은 Quinton Metabolic Cart 4500 USA를 이용하여 측정하였다.", "</p><h2>운동방법</h2><p>복합트레이닝에서 유산소운동은 최대운동부하 검사방법은 점증다단계 부하법을 수정하여 Q65 트레드밀(Quinton, U.S.A)에서 측정하였다.", "경사도는 \\( 0 \\% \\) 로 하고 \\( 100 \\mathrm{m} / \\mathrm{min} \\)의 속도로 3분간 준비운동을 하여 3분간 휴식을 취한 직후 주행 속도 \\( 100 \\mathrm{m} / \\mathrm{min} \\)에서 매 3분경과시 \\( 20 \\mathrm{m} / \\mathrm{min} \\)씩 속도를 증가시켜 대상자가 최대운동에 도달하도록 하였다.", "HRmax의 \\( 60 \\% \\)에 해당하는 목표심박수(THR)를 산출한 후 회귀방정식을 이용하였다. \\", "(50 \\sim 70\\%\\) HRmax로 1회 30분간 실시하였다.", "운동 부하가 증가해도 심박수(HR)의 증가가 없고, 산소섭취량의 증가도 \\( 150 \\mathrm{mg} / \\mathrm{min} \\) 이하 일 때, RER이 1.15 이상인 경우와 주관적 운동 강도(RPE)가 17 이상일 때를 최대운동부하로 판정하였다.", "</p><p>근저항 운동은 Bench press, Lat pull down, Seated shoulder press, Arm curl, Leg curl, Leg press, Triceps push-down등의 7종목으로 구성하였다.", "최대근력(1RM)의 \\(60-70\\%\\) 강도부하로 반복횟수 \\(10-15\\)회, 3세트, 40분간 실시하였으며, 6주 후에 최대산소섭취량과 1 RM을 재측정하여 운동 강도를 재설정하였다.", "본 연구를 위한 12주 복합트레이닝 프로그램은 Table 2와 같다.", "</p><h2>자료처리</h2><p>모든 자료처리는 SPSS (Ver.", "14.0) Program을 이용하여 검사항목의 평균값(M)과 표준편차(SD)를 산출하였고, 12주간복합트레이닝 전 · 후의 항목별 평균값차이를 비교하기 위해 집단 내에는 대응표본t검증(Paired t-test)을 실시하였다.", "실험 전 두 집단 간의 동질성여부를 검증하기위해 독립t검증 (Independent t-test)을 실시하였으며, 모든 통계적 유의수준은 \\( \\mathrm{p}<0.05 \\) 로 설정하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>신체특성의 변화</h2><p>12주간 복합트레이닝 전·후의 신체특성의 변화를 Table3 에 나타내었다.", "</p><p>12주 복합트레이닝 후 신체특성에서 체중, BMI, WHR는 각각 유의하게 감소한 것으로 나타났고, 수축기 확장기 혈압이 각각 증가하였으나 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다.", "</p><p>본 연구에서 12주 복합트레이닝 후에 운동군의 체중이 \\( 3.18 \\mathrm{kg} \\) 유의하게 감소하였고 대조군에서는 \\( 1.05 \\mathrm{kg} \\)이 증가하였다.", "선행보고에서 6주간 40대 중년여성을 대상으로 조깅 및 수영 복합트레이닝을 실시하여 체중의 유의한 감소를 나타내었다.", "중년여성을 대상으로 \\( 60 \\% \\) HRmax의 강도로 1회 30분간, 주 6회, 10주간 유산소와 저항운동의 복합트레이닝을 실시한 결과, 체중이 \\( 2.86 \\mathrm{kg} \\) 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)) 감소되었던 것과 일치하는 결과로 규칙적인 복합트레이닝이 중년여성의 체중조절을 위한 적합한 건강관리방안 중 하나로 사료된다.", "이처럼 복합트레이닝 후 체중의 감소는 복합운동을 규칙적으로 실시함으로써 에너지소비열량이 증가한 결과라고 할 수 있겠다.", "BMI는 신장과 가장 상관관계가 낮고, 체지방과 가장 상관이 높은 것으로 알려져 있다.", "BMI의 변화에 대한 선행연구에서 중년남성과 여성 총 130명을 대상으로 저항성트레이닝을 1RM 의 \\( 70 \\% \\) 로 40분, 유산소 트레이닝을 HRmax의 \\( 60-70 \\% \\)에 해당하는 목표심박수로 트레드밀달리기 30분으로 구성된 복합트레이닝을 주 5회, 1회 70분, 5개월간 실시하여 BMI가 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)) 감소한 것으로 나타났으며, 중년여성 16명을 대상으로 12주간 규칙적인 유산소 트레이닝을 실시한 연구에서도 운동군에서 12주 유산소 트레이닝 후 BMI가 \\( 0.96 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.01 \\)) 감소하였다는 선행연구와 마찬가지로 본 연구에서도 운동군에서의 BMI가 12주 복합트레이닝 전 \\( 25.71 \\pm 0.56 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 에서 12주 복합트레이닝 후 \\( 22.60 \\pm 0.64 \\mathrm{kg} / \\mathrm{m}^{2} \\)으로 \\( 3.11 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 이 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05\\)) 감소한 것으로 나타나 선행연구와 동일한 결과를 나타내었다.", "12주 복합트레이닝 후 체중의 유의한 감소가 BMI수치의 감소에 영향을 주었을 것이라 생각된다.", "</p><p>WHR은 심혈관질환, 당뇨병과 같은 비만합병증의 주원인인 내장지방과 피하지방을 나타내기 때문에 비만과 관련된 질병예측에 유용한 지표이다.", "복합트레이닝과 관련된 선행연구에서 규칙적인 운동이 제2형 당뇨병 노인여성의 혈당, 혈중지질수준 및 체성분에 미치는 영향에 관한 연구에서 노인 여성 총 20명을 대상으로 24주간 복합트레이닝을 실시하여 WHR가 유의하게 (\\(\\mathrm{p}<0.1\\)) 감소하였다.", "비만여대생을 대상으로 한 연구결과를 보면 12주간의 운동 후 WHR는 \\( 0.04 \\% \\) 유의하게 감소한 것으로 보고하여 체지방률이 \\( 30 \\% \\) 이상인 20-30대 성인비만여성을 대상으로 8주 동안 복합트레이닝을 실시하여 WHR에서 통계적으로 유의한 차이 (\\(\\mathrm{p}<0.001\\))가 있다고 보고하였다.", "신체적으로 비활동적인 사람은 활동적인 사람에 비해 고혈압 발생위험이 \\( 35-52\\%\\) 정도 더 높고 특히 비만한 사람들에게서 고혈압 발생위험이 높다.", "본 연구에서는 12주 복합트레이닝 후 운동군은 수축기혈압이 \\( 117.37 \\pm 13.47 \\mathrm{mmHg} \\)에서 \\( 119.37 \\pm 8.21 \\mathrm{mmHg} \\) 로, 확장기혈압이 \\( 72.37 \\pm 5.80 \\mathrm{mmHg} \\)에서 \\( 74.00 \\pm 5.97 \\mathrm{mmHg} \\) 으로 유의한 차이는 없었지만 각각 높아졌다.", "이는 12 주간 수중운동이 안정시 수축기 · 확장기혈압에서 유의한 차가 없다고 보고한 결과와, 24주간 유산소성 운동이 수축기 · 확장기 혈압에 유의한 변화가 없다고 보고하여 본 연구와 일치하는 부분이지만, 운동의 역할이 혈압강하효과와 순환기능을 향상시키는 역할을 하는 것으로 운동여부에 따른 폐경기전 · 후 여성의 심혈관질환 위험요인 차이분석에서 운동이 수축기 · 확장기 혈압을 낮춘다는 보고와 규칙적인 유산소성 운동은 혈압의 감소에 도움이 된다는 선행연구들과는 일치하지 않는 것으로 나타났다.", "</p> <h2>심혈관질환 위험인자의 변화</h2><p>12주 복합트레이닝 전 · 후의 심혈관질환 위험인자변화는 Table 6에 나타내었다.", "</p><p>12주 복합트레이닝 후 심혈관질환 위험인자의 변화는 인슐린, TNF-\\(\\alpha\\)가 각각 유의하게 감소한 것으로 나타났다.", "</p><p>16주간 에어로빅스 트레이닝 후 인슐린이 \\( 11.91 \\mu \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\)가 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.01 \\)) 감소되어 에어로빅스 트레이닝이 인슐린저항성을 감소시킬 수 있다고 하였으며, 체지방률 \\( 30 \\% \\) 이상인 여중생 18명을 대상으로 10주간 30-40분 달리기실시 후 인슐린농도는 운동군이 \\( 26.58 \\mu \\mathrm{U} / \\mathrm{ml}\\)에서 \\( 10.83 \\mu \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\)로 유의한 감소가 나타났고, 통제군은 \\( 25.11 \\mu \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\)에서 \\( 25.88 \\mu \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\)로 유의한 차이가 나타나지 않았다고 보고하였다.", "지속적인 신체운동은 저하하고 있는 말초조직의 인슐린 감수성을 개선시키므로 인슐린 저항성에 의한 고인슐린혈증을 개선하는 효과도 있으며, 혈당을 낮춰주는 역할로 인하여 당뇨병 따위의 치료에 쓰인다.", "본 연구에서 인슐린은 대조군에서 \\( 8.18 \\mu \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\)가 감소하였지만 유의한 차이 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\))가 나지는 않았으며, 12주 복합트레이닝을 실시한 운동군에서 운동전 \\( 16.35 \\pm 12.82 \\mu \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\)에서 12주 복합트레이닝 후 \\( 5.06 \\pm 3.81 \\mu \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\)로 \\( 11.29 \\mu \\mathrm{U} / \\mathrm{ml} \\)가 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)) 감소하여, 식이요법이나 운동요법 등을 통해 체지방을 감소 시켰을 때 인슐린저항성이 감소됨을 보고한 다수의 선행연구들과도 일치하였다.", "따라서 규칙적인 복합트레이닝은 인슐린의 분비를 감소시켜 인슐린 저항성을 감소시킬 수 있다는 긍정적인 영향을 미칠 수 있는 것으로 사료된다.", "</p><p>TNF-\\(\\alpha\\)는 지방조직에 대하여 다양한 활동을 나타내며, 지방 세포에서 글루코스와 인슐린 수용체신호를 억제한다.", "TNF-\\(\\alpha\\)에 관한 운동의 효과는 다양하게 보고되고 있는데 BMI가 \\( 35 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 이상인 132명의 비만자를 대상으로 6개월에 걸쳐 저지방식이요법과 운동병행프로그램을 통해 TNF-\\(\\alpha\\)는 유의한 변화가 없다고 보고하였고, 비만중년여성 56명을 대상으로 1년간의 체중감소프로그램을 실시한 결과 TNF-\\(\\alpha\\)가 유의하게 감소하였고, BMI가 \\( 27.8 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 이상인 16명의 비만여성을 대상으로 12주간 최대심박수의 \\( 70 \\% \\), 주5회 30분씩 자전거운동을 통한 연구결과에서 TNF- \\(\\alpha\\)의 농도가 감소하였다.", "지방조직에서는 TNF-\\(\\alpha\\)와 adiponcetin이 서로의 분비를 억제한다고 하며 TNF-\\(\\alpha\\) rnRNA와 TNF-\\(\\alpha\\) 단백질은 비만 한 사람에게서 더 증가하고, 비만에서 TNF-\\(\\alpha\\)의 과분비는 인슐린 저항성의 중요한 매개체이다.", "일회성 운동에 의한 염증유발 물질인 TNF-\\(\\alpha\\)에 관한 운동의 효과는 다양하게 보고되고 있는데, 중등도 운동은 TNF-\\(\\alpha\\)를 감소시키거나 변화가 없다는 보고가 있으며, 고강도 운동은 TNF-\\(\\alpha\\)를 증가시킨다는 보고가 있다.", "</p><p>본 연구결과를 통해서도 12주 복합트레이닝 후 운동군의 TNF-\\(\\alpha\\)는 운동전 \\( 1.68 \\pm 0.45 \\mathrm{pg} / \\mathrm{ml} \\)에서 운동 후 \\( 0.87 \\pm 0.23 \\mathrm{pg} / \\mathrm{ml} \\)로 \\( 0.81 \\mathrm{pg} / \\mathrm{ml} \\)가 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)) 감소한 결과를 보였는데, 이는 10주에 걸쳐 내장지방형비만자를 유산소 운동과 근저항 운동의 복합트레이닝을 실시한 연구에서 TNF-\\(\\alpha\\)가 운동 전 \\( 0.093 \\pm 0.014 \\mathrm{pg} / \\mathrm{ml} \\)에서 복합트레이닝 후 \\( 0.076 \\pm 0.007 \\mathrm{pg} / \\mathrm{ml} \\)로 \\( 0.017 \\mathrm{pg} / \\mathrm{ml} \\)가 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)) 감소한 연구 결과와 일치하는 것으로 나타나 운동을 통한 긍정적인 효과를 보인 것으로 생각된다.", "12주간의 복합트레이닝이 염증유발 물질인 TNF-\\(\\alpha\\)의 농도를 감소시킴은 물론 인슐린저항성과 관련된 심혈관질환, 당뇨병, 대사성증후군을 예방하는데 효과적인 방법이라고 사료된다.", "</p> <h2>신체조성의 변화</h2><p>12주 복합트레이닝 전 · 후의 신체조성의 변화는 Table 4 에나타냈다.", "</p><p>12주 복합트레이닝 후 신체조성에서 체지방량, 체지방률은 유의하게 감소하였으며, 제지방량은 유의하게 증가한 것으로 나타났다.", "제지방량의 변화에 대한 선행연구에서 비만여성을 대상으로 10주간 유산소 및 저항운동을 실시한 결과 제지방량이 유의하게 증가를 보였고, 12주간 유산소와 근저항 및 요가의 복합운동을 실시하여 제지방량이 \\( 1.7 \\mathrm{kg} \\) 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.01 \\)) 증가하는 것으로 나타났다.", "중년여성을 대상으로 \\( 60 \\% \\) HRmax의 강도로 1회 30분간, 주 6회 10주간 복합트레이닝 실시한 결과 제지방률이 통계적으로 유의한 차이는 없었지만 \\( 1.25 \\mathrm{kg} \\)이 증가하는 것으로 나타났다고 하였다.", "본 연구에서도 12주간의 유산소 운동과 저항운동을 병행하여 유산소 운동은 \\(50-70\\%\\) HRmax, 저항운동은 \\(1\\mathrm{RM}\\)의 \\(60-70\\%\\)로 주 5회, 90분간의 운동 빈도로 각각 수행하였으며, 제지방량의 변화는 대조군이 \\( 39.93 \\pm 4.16 \\mathrm{kg} \\)에서 \\( 39.56 \\pm 4.24 \\mathrm{kg} \\)으로 \\( 0.37 \\mathrm{kg} \\)이 감소하였으나 유의한 차이는 없었으며, 운동군에서는 12주 복합 트레이닝 전 \\( 40.13 \\pm 4.11 \\mathrm{~kg} \\) 에서 12주 복합트레이닝 후 \\( 41.66 \\pm 3.84 \\mathrm{~kg} \\)으로 \\( 1.53 \\mathrm{~kg} \\) 이 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)) 증가하였는데 체중 당 근육의 증가를 보인 선행연구와 유사한 효과를 나타냈다.", "이는 제지방량이 증가된 만큼 활동할 수 있는 운동능력이 향상되고 혈액이 원활하게 흐를 수 있도록 도와주는 역할을 한 것으로 생각되며 꾸준하게 복합트레이닝을 실시하면 동맥경화와 같은 심혈관질환을 사전에 예방하는데 도움이 될것이라고 사료된다.", "일반적으로 체지방감소를 위해서는 운동중에 혈중유리지방산의 이용을 증가시키는 운동을 통해 체지방량을 줄이는 지방산화량의 증가가 필요하다.", "규칙적인 프로그램으로 수영운동에 참여한 40대 중년여성들중에서 운동을 실시한 운동군에서 체지방량이 \\( 17.19 \\pm 6.68 \\mathrm{kg} \\), 운동에 참여하지 않은 통제군이 \\( 19.62 \\pm 4.34 \\mathrm{~kg} \\)으로 집단간의 유의한 차이가 있는 것으로 보고하였다.", "비만중년여성을 대상으로 실시한 중강도 유산소 운동은 혈중 유리지방산의 대사에 의해서 체지방량을 감소시키는데 더 효과적이라고 보고하였다.", "</p><p>또한 비만중년여성들을 대상으로 12주간 복합트레이닝을 실시한 결과, 체지방량이 통제군에서는 \\( 22.22 \\pm 1.41 \\mathrm{~kg} \\)에서 \\( 23.31 \\pm 1.41 \\mathrm{~kg} \\)으로 증가하였으며 운동을 실시한 운동군에서는 \\( 23.14 \\pm 1.30 \\mathrm{~kg} \\)에서 운동 후 \\( 18.12 \\pm 1.11 \\mathrm{~kg} \\)으로 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.01 \\)) 감소하였다.", "체지방률이 \\( 25 \\%\\)~\\(35 \\% \\)사이의 40대 비만여성을 대상으로 웨이트트레이닝 및 트레드밀운동집단과 웨이트트레이닝집단을 12주간 훈련시킨 결과 체지방량이 두 집단 모두 각각 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.01 \\)) 감소하였는데, 이는 본 연구의 결과에서도 운동군의 경우 체지방량은 운동전 \\( 19.23 \\pm 2.22 \\mathrm{~kg} \\)에서 12주 복합트레이닝 후 \\( 17.11 \\pm 1.43 \\mathrm{~kg} \\)으로 \\( 2.12 \\mathrm{~kg} \\)이 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.1 \\)) 감소하였으며, 운동을 실시하지 않은 대조군에서는 체지방량이 \\( 19.18 \\pm 3.48 \\mathrm{~kg} \\) 에서 \\( 21.11 \\pm 2.83 \\mathrm{~kg} \\)으로 \\( 1.93 \\mathrm{~kg} \\)이 증가하였다.", "이와 같은 결과는 보다 많은 에너지소비활동을 할 수 있는 유산소 운동과 저항 운동을 병행하여 실시하면 체지방량의 감소에 긍정적인 영향을 미친다는 것으로, 걷기 운동과 근저항성트레이닝으로 구성된 복합트레이닝의 적용은 중년비만여성의 체지방량 감소에 긍정적인 효과를 나타내며, 비만해소를 위한 체지방 감소에 효율적인 운동 방법으로 향후 보다 다양한 운동프로그램의 적용과 지속적인 연구가 이루어져야 할 것이다.", "</p><p>12주간 주 3회 복합트레이닝을 실시한 결과 체지방률이 \\( 2 \\% \\)감량한 것으로 보고하였고, 12주간 복합트레이닝을 실시한 운동군에서 운동 전 \\( 28.04 \\pm 6.07 \\% \\)에서 운동 후 \\( 23.07 \\pm 2.69 \\% \\)로 유의하게 (\\(\\mathrm{p}<0.05\\)) 감소하였다고 보고하였다.", "과도한 체지방의 축적은 관상동맥질환, 고혈압, 그리고 당뇨병과 같은 건강상의 문제에 부정적인 영향을 미친다.", "규칙적인 운동은 이러한 체지방감소를 위한 비만자들에게 일반적으로 권유하는 방법이다.", "운동과 체지방률의 변화와 관련된 연구를 살펴보면 체지방률이 \\( 30 \\% \\) 이상인 비만여자중학생을 대상으로 10주간 복합트레닝을 실시한 결과 유산소성 운동집단의 체지방률이 \\( 4.9 \\% \\), 저항성 운동집단은 체지방률 \\( 4.4 \\% \\)감소를 보고하였다.", "또한 BMI가 \\( 25 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 이상의 비만남자대학생을 대상으로 12주간 복합트레이닝을 실시한 연구에서도 체지방률의 감소를 보고하였다.", "본 연구에서도 12주간 복합트레이닝을 실시한 결과 체지방률의 변화는 대조군이 \\( 32.96 \\pm 1.45 \\% \\)에서 \\( 34.02 \\pm 2.00 \\% \\)로 유의하게 (\\( \\mathrm{p}<0.01 \\)) 증가하였으며, 운동군에서는 \\( 32.83 \\pm 2.07 \\% \\)에서 12주간 복합트레이닝 후 \\( 29.30 \\pm 2.22 \\% \\)로 운동전 보다 통계적으로 유의한 차이 (\\( \\mathrm{p}<0.001 \\))를 보이며 감소하여 선행연구와 유사한 결과를 나타내었다.", "12주간의 복합트레이닝 후 체지방률의 감소는 선행연구의 결과와 마찬가지로 규칙적인 운동이 중성지방과 유리지방산을 에너지원으로 이용함과 동시에 지방산화를 촉진시켜서 체지방률의 감소요인으로 작용하였을 것이라고 생각된다.", "</p> <h1>초록</h1><p>본 연구는 부산광역시에 거주하고 있는 비만중년여성(체지방률 \\( 30 \\% \\) 이상, BMI \\( 25 \\mathrm{~kg} / \\mathrm{m}^{2} \\) 이상) 16명을 대상으로 12주간 복합트레이닝 전 · 후에 나타나는 신체특성, 신체조성, 혈청지질과 심혈관질환 위험인자에 어떠한 변화가 나타나는지 규명하여 그 기초자료를 제시하는데 목적이 있다. 본 연구의 결과로는: 1) 12주 복합트레이닝 후 신체특성에서 체중, BMI, WHR는 각각 유의하게 감소한 것으로 나타났고, 수축기 확장기 혈압이 각각 증가하였으나 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다. 2) 12주 복합트레이닝 후 신체조성에서 체지방량, 체지방률은 유의하게 감소하였으며, 제지방량은 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 3)", "12주 복합트레이닝 후 혈청지질에서 TC, TG,LDL-C는 유의하게 감소하였고 HDL-C 증가하였으나 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.", "4) 12주 복합트레이닝 후 심혈관질환 위험인자의 변화는 인슐린, 염증유발 인자인 TNF-\\(\\alpha\\)가 각각 유의하게 감소한 것으로 나타났다.", "본 연구의 결과를 종합해 볼 때 12주간의 복합트레이닝 적용이 중년비만여성들의 심혈관질환 위험인자의 변화에 긍정적인 변화를 보였으나, 비만으로 인해 나타나는 각종 현대병을 예방하기 위한 운동처방을 하기위해서는 보다 더 구체적이고, 체계적인 연구가 계속 되어야 할 것으로 사료된다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "복합트레이닝이 중년비만여성의 심혈관질환 위험인자에 미치는 영향", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-de675720-012a-4765-8474-8241008e8df9", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", 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5,417	<h1>결 과</h1><h2>식도점막의 일반 조직학적 구조</h2><p>조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치 및 졸복의 식도점막은 상피와 고유판으로 이루어진 점막종주름이 잘 발달되어 있었고, 일차 · 이차 주름은 어종에 따라 다소 형태적인 차이가 있었다. 조피볼락의 식도는 키가 낮고 아래가 넓은 일차 주름에 곳곳에 이차 주름이 발달되어 있었으나 용치놀래기와 송곳니베도라치는 좁고 긴 일차 주름에 이차 주름이 형성되어 있었고, 졸복은 유곽형의 일차 주름에 이차 주름이 나타났다.</p><p>4종의 어류 식도 점막 상피는 중층편평상피로 되어 있었으나, 조피볼락과 용치놀래기에는 중충편평상피로 덮인 일차 주름사이에 단층입방상피로 덮인 일차 주름이 간혹 나타났다. 식도의 점막상피층에서 조피볼락과 용치놀래기의 단충입방상피내에는 점액세포들이 나타나지 않았으나 중층편평상피내에는 점액세포들이 많이 나타났으며 크기, 형태 및 분포는 어종에 따라 현저한 차이를 보였다.</p><p>조피볼락의 식도 점액세포들은 식도상피 표층아래에 주로 한층, 간혹 두세층으로 단층입방상피를 제외한 식도 점막상피 전체에 걸쳐 나타났고 구형, 타원형 및 곤봉형의 큰 점액 세포와 중간 점액세포가 대부분이었으며 구형, 곤봉형의 작은 점액세포도 소수 관찰되었다(Fig. 10).</p><p>용치놀래기 식도 점액세포들은 식도상피 표층아래에 주로 한층, 간혹 두세층으로 배열하고 있었으며 단충입방상피로된 작은 일차 주름을 제외한 상피전체에 걸쳐 나타났다. 구형, 타원형의 큰 점액세포와 타원형, 곤봉형의 중간 점액세포가 대부분이었으며 구형, 타원형의 작은 점액세포도 소수 나타났다(Fig. 11).</p><p>송곳니베도라치(Fig. 7)와 졸복(Fig. 12)의 점액세포들은 식도 점막상피 전체에 걸쳐 표충아래에 주로 한층, 간혹 여러층으로 배열된 것도 있었으며 점액세포의 모양은 구형, 타원형이었고 중간형 크기가 대부분이었으며 작은 점액세포도 소수 관찰되었다.</p><p>전체적으로 볼 때 조피볼락, 용치놀래기 및 졸복의 식도에서 점액세포의 수가 많았고 송곳니베도라치에는 그 수가 적었다.</p><h2>식도 점액세포의 복합당질에 대한 lectin의 조직화학적 성상</h2><p>조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치 및 졸복 식도 점액 세포의 복합당질에 대한 lectin의 결합양상은 Table 2에서 보는 바와 같다.</p><h3>조피볼락</h3><p>식도의 큰 점액세포는 DBA (Fig. 1)와 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, 대부분의 큰 점액세포는 RCA-1 (Fig. 10)과 sWGA에 미약한 반응을(Fig. 13), BSL-1에는 대부분이 반응이 없었으나 소수의 큰 점액세포가 약한 반응 내지 중등도 반응을 나타내었고(Fig. 9) 그 외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \( \alpha / \beta \)-N-acetyl- D-galactosamine을 소량 내지 중등량, \( \beta \)-D-galactose와 \( \beta \)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량, 소수의 큰 점액세포는 \( \alpha \)-D-galactose을 소량 내지 중등량 함유하고 있었다.</p><p>식도의 중간 크기 점액세포는 DBA (Fig. 1)와 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, BSL-1 (Fig. 9), RCA-1 (Fig. 10) 및 sWGA (Fig. 13)에는 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였는데 이들 점액세포 중에는 BSL-1과 RCA-1에 반응을 보이지 않는 것도 있었고 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \( \alpha / \beta \)N-acetyl-D-galactosamine을 소량 내지 중등량, \( \alpha \)-D-galactose, \( \beta \)-D-galactose 및 \( \beta \)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하고 있는 것으로 나타났다.</p><p>식도의 작은 점액세포는 SBA와 BSL-1 (Fig. 9)에 약한 반응 내지 중등도 반응을, RCA-1에 전혀 반응을 보이지 않는 소수의 작은 점액세포를 제외하고는 DBA (Fig. 1), RCA-1 (Fig. 10) 및 sWGA (Fig. 13)에 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였으며 그 외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \( \beta \)-N-acetyl-D-galactosamine과 \( \alpha \)-D-galactose를 소량 내지 중등량, \( \alpha \)-N-acetyl-D-galactosamine, \( \beta \)-D-galactose 및 \( \beta \)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하고 있었다.</p> <h1>고 찰</h1><p>일반적으로 어류 식도는 고등 척추동물과 같이 큰 종주름이 잘 발달되어 있으며 점막상피는 중층편평상피로 덮여있고 상피내에 많은 점액세포가 분포되어 있음은 오래전부터 여러 연구자들에 의하여 기재되었다. 이 점액세포의 형태는 배상세포의 형태를 하거나 전형적인 배상세포와 다른 형태를 하고 있으며, 이 점액세포들의 분포는 어종에 따라 차이가 있다고 하였다.</p><p>본 연구에 사용한 어종에서도 위의 보고와 같이 어류 식도에는 큰 일차 종주름이 잘 발달되어 있었는데 어종에 따라 차이가 있어 조피볼락은 키가 낮고 아래가 넓으며 용치놀래기와 송곳니베도라치는 가늘고 길며, 졸복은 주름 길이가 짧고 상부가 무딘 유곽형이었으며 4종 모두 일차 주름에 작은 이차 주름이 형성되어 있었다.</p><p>점막상피는 4종 모두 중층편평상피로 되어 있었는데 조피볼락과 용치놀래기에서는 단층입방상피로 된 이차주름이 곳곳에 나타난 점이 특이하였으며, 이 단층입방상피로 덮힌 이차 주름은 상피가 특수화된 것으로 식도호흡장치로 사료된다.</p><p>본 연구에서는 Reifel과 Travill처럼 세포의 형태를 나누지 않고, 조운복과 최인장, 이숙희와 조운복, 정권순 등처럼 국소적인 분포와 형태 및 크기에 따라 관찰하였다. 조피볼락과 용치놀래기에서 식도점액세포들은 큰 점액세포, 중간 점액세포 및 작은 점액세포들이 섞여 있었으며, 송곳니베도라치와 졸복의 점액세포들은 중간 및 작은 점액 세포들이 섞여 있었다. 이와같은 결과는 Reifel과 Travill, 조운복과 최인장, 이숙희와 조운복, 정권순 등의 보고와 같이 어종에 따라서 점액세포는 형태적 차이뿐만 아니라 크기 및 국소적인 분포에도 차이가 있음을 밝혀주고 있는데 이것은 어종에 따른 특성이라고 사료된다.</p><p>경골어류 식도점막상피 점액질의 조직화학적 연구는 많으나 복합당질에 대한 lectin의 조직화학적 성상에 대한 연구는 전혀 없었다. lectin의 조직화학적 성상에 대해서는 사람의 공장, 쥐의 창자상피, 척추동물의 작은창자 배상세포 및 흰쥐 결장근위부 배상세포가 연구되어 있으며, 경골어류를 대상으로 한 것은 잉어 아가미 과립세포 및 점액세포, 감성돔 창자 배상세포가 보고 되어 있다.</p><p>복합당질의 일종인 당단백질은 oligosaccharide side chain을 가지며 100 여종의 hexose 중 glucose, mannose, fucose, galactose, N-acetyl-D-glucosamine등이 포함되어 있다. 복합당질은 세포표면 및 내강면에 분포하고 그 다양성은 세포의 기능, 조성, 구조, 물리화학적 변형 및 세포의 인지에 따라 변이성이 심하며, 세포의 분화, 형태 형성에 따라 잔기가 완성되므로 분화정도에 따라 그 분포와 양에는 차이가 있다. 복합당질은 당 잔기에 대해 높은 친화성 및 특이성을 가진 단백질 또는 당단백질인 lectin으로 조직화학적 분석이 가능하기 때문에 본 연구에서는 이제까지 한번도 연구된 적이 없는 경골어류 식도 점액세포의 복합당질에 대한 lectin의 결합양상을 분석하였다.</p><p>식도 점액세포들의 lectin 결합양상은 본 연구에서 어종과 점액세포의 크기에 따라 차이가 있어 조피볼락의 모든 점액세포들은 DBA, SBA, RCA-1 및 sWGA에 반응을 보이고 중간 및 작은 점액세포는 이들 lectin 외에 BSL-1에도 반응을 나타내었다. DBA와 SBA에는 모든 점액세포들이 약한 반응 내지 중등도 반응을, 대부분의 큰 점액세포는 RCA-1과 sWGA에 미약한 반응을, 중간 및 작은 점액세포는 RCA-1에 반응이 없거나 미약한 반응 내지 약한 반응을, sWGA에 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였다. BSL-1에 중간 점액세포는 반응이 없거나 미약한 반응을, 작은 점액세포는 약한 반응 내지 중등도 반응을 보였다.</p><p>용치놀래기에서는 DBA와 SBA에 대부분의 중간 및 작은 점액세포와 약간의 큰 점액세포가 반응을 나타내나 sWGA에는 대부분의 중간 점액세포만 반응이 나타나고, PNA에 모든 점액세포와 약간의 중간 및 작은 점액세포가 반응을 나타내었으며 그 외의 lectin들에는 반응이 없었다. 모든 큰 점액세포는 PNA에 중등도 내지 강한 반응을, 중간 및 작은 점액세포는 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, 대부분의 중간 점액세포는 DBA와 sWGA에 미약한 반응 내지 중동도 반응을, 미약한 반응 내지 약한 반응을 각각 나타내었다.</p><p>송곳니베도라치의 대부분의 중간 점액세포와 작은 점액세포는 sWGA에 약한 반응을, Con A에는 반응이 없거나 미약한 반응을 보였으며, 작은 점액세포는 SBA에 미약한 반응 내지 약한 반응을 나타내었으나 그 외의 lectin들에는 반응이 없었다.</p><p>졸복의 중간 점액세포는 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, PNA에 중등도 반응을, RCA-1에 약한 반응을 그리고 sWGA와 UEA-1에는 대부분의 중간 점액세포에서 약한 반응 내지 중등도 반응을 나타내었다. 작은 점액세포는 SBA와 PNA에 미약한 반응 내지 약한 반응을, RCA-1에 약한 반응 내지 중등도 반응을 나타내었고 Con A에는 중간 및 작은 점액세포 모두 반응이 없거나 미약한 반응을 나타내었으나 그외의 lectin들에는 반응이 없었다.</p><p>조피볼락의 점액세포에서 DBA와 SBA의 양이 많고, 용치놀래기에서는 큰 점액세포에서 PNA 양이, 중간 및 작은 점액세포에서 SBA 양이, 졸복의 경우 중간 점액세포에서 SBA, PNA, sWGA 및 UEA-1의 양이, 작은 점액세포에서 RCA-1의 양이 많았다.</p><p>Harris와 Hunt는 어류의 점액질은 생화학적 연구에서 대부분 sialic acid 잔기와 glucose, mannose, glucosamine, galactose 및 glactosamine을 함유한다고 했는데 본 연구에서는 어종에 따라 당잔기에 차이가 있어 위의 보고와 상이함을 알 수 있다. 또한 Hidalgo 등은 잉어의 아가미 점액세포는 WGA, DBA 및 SBA에 반응하나 PNA에 반응하지 않는다고 하였으며, Madrid 등은 감성돔의 창자 배상세포는 PNA, WGA, DBA 및 SBA에 반응하는 세포와 반응하지 않는 세포가 섞여 있었으나 Con A에는 반응하지 않는다고 하였다.</p><p>본 연구와 위의 연구들에서 보면 어종에 따라 lectin 결합양상에 차이가 있는데 Hidalgo 등의 언급처럼 lectin 결합양상이 점액세포를 구분하는데 특이하게 유용한 것 같고 또한 어종간의 점액세포의 결합양상은 종간의 특이성에 기인하는 것으로 생각되며 같은 종에서도 점액세포의 lectin의 결합양상이 다른 것은 김기림 등이 흰쥐 결장 근위부의 술잔세포가 놓여 있는 부위에 따라 복합당질의 당 잔기가 다르게 나타나는 것은 아마도 점액세포의 성숙과정과 기능이 각각 다름을 나타내주는 것으로 생각된다고 한 것처럼 어류 식도 점액세포들의 성숙 과정 또는 어류 식도의 특이한 기능에 기인하는 것으로 사료되나 앞으로 이에 대한 연구가 더 있어야 할 것으로 생각된다.</p><h1>요 약</h1><p>경골어류인 조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치 및 졸복 식도 점액세포의 복합당질 성상을 biotinylated lectin인 DBA, SBA, PNA, BSL-1, RCA-1, sWGA, UEA-1, LCA 및 Con A로 연구하였다. 조피볼락과 용치놀래기는 큰 - 중간 및 작은 점액세포가 섞여 있었고, 송곳니베도라치와 졸복은 중간 및 작은 점액세포들이 섞여 있었다. 식도 점액세포들의 lectin 결합양상도 어종에 따라 차이가 있었으며 조피볼락은 DBA, SBA, BSL-1, RCA-1 및 sWGA에, 용치놀래기는 DBA, SBA, PNA 및 sWGA에, 송곳니베도라치는 SBA 및 sWGA에 각각 반응을 하였으며 졸복은 DBA, LCA 및 Con A를 제외한 모든 lectin에 반응하였다. 조피볼락의 모든 점액세포에는 DBA, SBA 및 sWGA가, 작은 점액세포에는 이 외에 BSL-1이 반응하였다. 용치놀래기의 큰 점액세포에서는 PNA가, 중간 점액세포에는 DBA, SBA 및 sWGA가, 작은 점액세포에는 DBA와 SBA가 반응하였다. 송곳니베도라치의 중간 점액세포에는 sWGA가, 작은 점액세포에는SBA와 sWGA가 반응하였으며 졸복은 모든 점액세포에 SBA, PNA 및 RCA-1가, 중간 점액세포에는 이 외에 sWGA와 UEA-1이 반응하였다. 특히 조피볼락의 점액세포에서 DBA와 SBA의 양이 많고, 용치놀래기에서는 큰 점액세포에서 PNA 양이, 중간 및 작은 점액세포에서 SBA 양이 많았으며, 졸복의 경우 중간 점액세포에서 SBA, PNA, sWGA 및 UEA-1의 양이, 작은 점액세포에서 RCA-1의 양이 많았다.</p> <p>경골어류의 식도상피는 다른 척추동물과 같이 중층편평상피로 덮여 있으나 상피층내에 점액세포들이 나타나는 점이 다르며 이들 점액세포들은 식도내강에 점액질을 분비하여 음식물이 운반될 때 거친 먹이 조각들로부터 식도의 내면을 보호한다. 특히 경골어류의 식도는 어종에 따라 다양한 점막 주름이 발달되어 있으며 크기가 다른 점액세포들이 출현한다.</p><p>경골어류 식도 점액세포 분비물의 조직화학적 성상은 어종에 따른 차이가 있을 뿐만 아니라 동종내 개체간에도 차이가 있다. 경골어류의 식도는 섭취한 음식물을 인두로부터 위까지 수송하기 위한 도관으로서의 기능이외에 형태적인 복잡성과 점액세포들에서 분비되는 점액질의 성상으로 보아 소화과정에서 어떤 기능을 담당하고 있는 것으로 추정된다.</p><p>Lectin은 당단백질로서 탄수화물의 특정한 당 잔기에 높은 친화성을 가지고 있어 복합당질의 탄수화물 분자의 성상을 조직화학적으로 규명하는데 유용한 도구로 사용된다.</p><p>어류의 점액질은 수용성 당단백질로 중성 pH에서 음전하를 띠게 하는데 관여하는 sialic acid 잔기를 함유하며 또한 mannose, glucose, glucosamine, galactose 및 galactosamine과 같은 당과 serine, threonine과 같은 아미노산을 함유한다. 이들 점액질의 polyanionic mucous layer는 삼투조절, 기계적 손상과 감염에 대한 보호 및 소화작용에 관여한다.</p><p>경골어류 식도 점액세포의 복합당질에 대한 prelectin 연구는 많이 되어 있으나 lectin에 대한 연구는 없었다. 본 연구에서는 경골어류 중 현재까지 연구된 바 없는 조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치 및 졸복 식도 점액세포의 복합당질을 lectin 조직화학으로 연구하였다.</p><h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물의 처치 및 고정</h2><p>본 실험에 사용한 경골어류는 횟대목(Scorpaeniformes) 양볼락과(Scorpaenidae)의 조피볼락 Sebastes schlegeli Hilgendorf, 농어목(Percida) 놀래기과(Labridae)의 용치놀래기 Halichoeres poecilopterus (Temminck et Schlegel), 장갱이과(Stichaeidae)의 송곳니베도라치 Bryzoichthys lysimus (Jordan et Snyder) 및 복어목(Tetraodontiformes) 참복과(Tetraodontidae)의 졸복 Takifugu pardalis (Temminck et Schlegel)을 사용하였다.</p><p>실험 동물을 희생시킨후 흉복강을 절개하여 식도의 중간부를 절취한 후 \( 10 \% \) 중성 포르말린용액에 24시간동안 고정한 다음 수세과정을 거친 후 각급 알콜에서 탈수과정, 투명화과정을 거쳐 paraplast (융점 \( 56 \sim 58^{\circ} \mathrm{C} \) )에 포매하여 \( 6 ~\mu \mathrm{M} \) 두께의 연속절편을 만들었다.</p><h2>조직학적 구조</h2><p>식도의 조직학적 구조를 관찰하기 위하여 hematoxylineosin(HE) 염색과 PAS 반응을 실시하였다.</p><h2>복합당질에 대한 lectin의 조직화학</h2><p>식도 점액세포의 복합당질의 당 잔기를 검색하기 위해 탈 파라핀한 조직을 \( 3 \% \) methanolic hydrogen peroxide에 실온에서 30분간 처리하고, PBS (phosphate buffer saline, \( 0.01 \mathrm{~M} \), pH 7.4)로 10분간 3회 세척한 후 비특이성 반응을 없애기 위하여 \( 1 \% \) bovine serum albumin 용액에 실온에서 30분간 두었다가 압지로 부드럽게 용액을 제거시킨 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 습도를 유지하면서 9가지의 biotinylated lectin (Vector Lab., Bur-lingame, C.A., USA) 중 DBA, PNA, BSL-1, sWGA 및 UEA-1은 Hepes buffer (\( 10 \mathrm{~mM} \) Hepes 용액, pH 7.5, \( 0.15 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl} \), \( 0.1 \mathrm{~mM} \mathrm{~Ca}{ }^{2+} \), \( 0.045 \% \) sodium azide)에, LCA와 Con A는 상기 Hepes buffer에 \( 0.01 \mathrm{~mM} \)의 \( \mathrm{Mn}^{2+} \)이 포함된 용액에, RCA-1은 phosphate 용액(\( 10 \mathrm{~mM} \) phosphate buffer, pH 7.5, \( 0.15 \mathrm{~M} \mathrm{~NaCl} \), \( 0.085 \% \) sodium azide)에 Table 1과 같은 농도로 희석하여 24시간 동안 반응시켰다.</p><p>PBS로 세척한 후 ABC kit (avidin-biotin-peroxidase complex, Vector Lab.) 시약에 실온에서 60분간 반응시켰다. 다시 PBS로 세척한 후 TB (Tris buffer, \( 0.05 \mathrm{M} \), pH 7.6에 \( 0.02 \% \) 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma)와 \( 0.01 \% \) \( \mathrm{H_{2}O_{2}} \)를 혼합한 용액에 실온에서 약 10분간 발색시켰다. TB에 10분간 세척하고 다시 PBS에 10분간 세척한 후 증류수로 세척하여 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색한 후 poly-mount (polyscience, USA)로 봉입하였다.</p><p>Lectin의 반응정도는 음성은 0, 흔적적인 반응은 \( \pm \), 약한 반응은 +, 중등도의 반응은 ++, 강한 반응은 +++, 매우 강한 반응은 ++++ 등으로 표시하였다.</p> <h3>용치놀래기</h3><p>식도의 큰 점액세포는 PNA에 중등도 내지 강한 반응을 (Fig. 6), DBA (Fig. 2), SBA 및 sWGA에 대해서는 대부분의 큰 점액세포는 반응을 보이지 않았으나 소수의 큰 점액세포가 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였으며 그외의 lectin들에는 반응을 보이지 않는 것으로 보아 galactose-\( \beta \)-1,3-N-acetyl-D-galactosamine을 중등량 내지 상당량 함유하고 있었으며 소수의 큰 점액세포는 \( \alpha / \beta \)N-acetyl-D-galactosamine과 \( \beta \)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하고 있었다.</p><p>식도의 대부분의 중간 크기 점액세포는 DBA (Fig. 2)와 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을 보였으나 반응을 보이지 않거나 미약한 반응을 보이는 중간 크기 점액세포도 있었다. sWGA에는 대부분의 중간 크기 점액세포가 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였고 소수의 중간 크기 점액세포는 PNA (Fig. 6)에 미약한 반응 내지 중등도 반응을 보였으며 그 외의 lectin들에는 반응이 나타나지 않는 것으로 보아 대부분의 중간 크기 점액세포는 \( \alpha / \beta \)-N-acetyl-D-galactosamine을 소량 내지 중등량, \( \beta \)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하며 소수의 중간 크기 점액세포는 galactose-\( \beta \)-1,3-N-acetyl-D-galactosamine을 미량 내지 중등량 함유하고 있는 것으로 나타났다.</p><p>식도의 작은 점액세포는 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, DBA에는 반응이 없는 것에서부터 중등도 반응까지 다양하게 나타났으며(Fig. 2), PNA에 대부분의 작은 점액세포는 반응을 보이지 않았으나 소수의 작은 점액세포가 약한 반응 내지 중등도 반응을 보였고(Fig. 6) 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \( \beta \)-N-acetyl-D-galactosamine을 소량 내지 중등량, \( \alpha \)-N-acetyl-D-galactosamine은 없는것에서 중등량 까지 함유하며, 소수의 작은 점액세포는galactose-\( \beta \)-1,3-N-acetyl-D- galactosamine을 소량 내지 중등량 함유하고 있는 것으로 나타났다.</p><h3>송곳니베도라치</h3><p>식도의 중간 크기 점액세포는 Con A에 반응이 없거나 미약한 반응을, SBA에는 대부분의 중간크기 점액세포가 반응이 없었으나 소수의 세포에서 미약한 반응을 보였다(Fig. 4). sWGA에 대부분의 중간 크기 점액세포는 약한 반응을 보였으나 소수의 세포에서 미약한 반응을 보였고(Fig. 14) 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \( \alpha \)-D-mannose와 \( \alpha \)-D-glucose를 함유하지 않거나 미량 함유하며 소수의 중간 크기 점액세포는 \( \beta \)-N-acetyl-D-galactosamine을 미량, \( \beta \)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하는 것으로 나타났다.</p><p>식도의 작은 점액세포는 sWGA에 약한 반응을(Fig. 14), SBA에 미약한 반응 내지 약한 반응을(Fig. 4), Con A에는 반응이 없거나 미약한 반응을 나타내었고 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \( \beta \)-N-acetyl-D-glucosamine을 소량, \( \beta \)-N-acetyl-D-galactosamine을 미량 내지 소량, \( \alpha \)-D- man-nose와 \( \alpha \)-D-glucose를 함유하지 않거나 미량 함유하는 것으로 나타났다.</p><h3>졸복</h3><p>식도의 중간 크기 점액세포는 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을(Fig. 5), PNA에는 중등도 반응을 나타내었다(Fig. 8). RCA-1(Fig. 12), sWGA(Fig. 15) 및 UEA-1에는 반응이 없거나 미약한 반응을 보이는 소수의 중간 크기 점액세포를 제외하고는 대부분이 약한 반응 내지 중등도 반응을 나타내었고 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \( \beta \)-N-acetyl-D-galactosamine을 소량 내지 중등량, galactose-\( \beta- \)1,3-N-acetyl-D-galactosamine을 중등량 함유하며, 대부분의 중간 크기 점액세포가 \( \beta \)-N-acetyl-D-glucosamine과 \( \alpha \)-L-fucose를 소량 내지 중등량, \( \beta \)-D-galactose를 소량, \( \alpha \)-D-galactose, \( \alpha \)-D-mannose 및 \( \alpha \)-D-glucose를 함유하지 않거나 미량 함유하는 것으로 나타났다.</p><p>식도의 대부분의 작은 점액세포는 RCA-1에 약한 반응 내지 중등도 반응을 보였으나 반응을 보이지 않는 작은 점액세포도 소수 관찰되었으며(Fig. 12), SBA (Fig. 5)와 PNA (Fig. 8)에는 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였다. BSL-1, sWGA (Fig. 15) 및 UEA-1에 대해서는 미약한 반응을 보이는 소수의 작은 점액세포를 제외하고 대부분의 작은 점액세포는 반응을 보이지 않았고 Con A에는 반응이 없거나 미약한 반응을 보였으며 그 외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 대부분의 작은 점액세포가 \( \beta \)-D-galactose를 소량 내지 중등량 함유하며 \( \beta \)-N-acetyl-D-galactosamine과 galactose-\( \beta \)-1,3-N-acetyl-D-galactosamine을 미량 내지 소량 함유하고 있었다. 소수의 작은 점액세포는 \( \alpha \)-D-galactose, \( \beta \)-N-acetyl-D-glucosamine 및 \( \alpha \)-L-fucose를 미량 함유하며 \( \alpha \)-D-mannose와 \( \alpha \)-D-glucose를 함유하지 않거나 미량 함유하는 것으로 나타났다.</p>	생명과학	[ "<h1>결 과</h1><h2>식도점막의 일반 조직학적 구조</h2><p>조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치 및 졸복의 식도점막은 상피와 고유판으로 이루어진 점막종주름이 잘 발달되어 있었고, 일차 · 이차 주름은 어종에 따라 다소 형태적인 차이가 있었다.", "조피볼락의 식도는 키가 낮고 아래가 넓은 일차 주름에 곳곳에 이차 주름이 발달되어 있었으나 용치놀래기와 송곳니베도라치는 좁고 긴 일차 주름에 이차 주름이 형성되어 있었고, 졸복은 유곽형의 일차 주름에 이차 주름이 나타났다.", "</p><p>4종의 어류 식도 점막 상피는 중층편평상피로 되어 있었으나, 조피볼락과 용치놀래기에는 중충편평상피로 덮인 일차 주름사이에 단층입방상피로 덮인 일차 주름이 간혹 나타났다.", "식도의 점막상피층에서 조피볼락과 용치놀래기의 단충입방상피내에는 점액세포들이 나타나지 않았으나 중층편평상피내에는 점액세포들이 많이 나타났으며 크기, 형태 및 분포는 어종에 따라 현저한 차이를 보였다.", "</p><p>조피볼락의 식도 점액세포들은 식도상피 표층아래에 주로 한층, 간혹 두세층으로 단층입방상피를 제외한 식도 점막상피 전체에 걸쳐 나타났고 구형, 타원형 및 곤봉형의 큰 점액 세포와 중간 점액세포가 대부분이었으며 구형, 곤봉형의 작은 점액세포도 소수 관찰되었다", "(Fig. 10).", "</p><p>용치놀래기 식도 점액세포들은 식도상피 표층아래에 주로 한층, 간혹 두세층으로 배열하고 있었으며 단충입방상피로된 작은 일차 주름을 제외한 상피전체에 걸쳐 나타났다.", "구형, 타원형의 큰 점액세포와 타원형, 곤봉형의 중간 점액세포가 대부분이었으며 구형, 타원형의 작은 점액세포도 소수 나타났다", "(Fig. 11).", "</p><p>송곳니베도라치(Fig. 7)와 졸복(Fig. 12)의 점액세포들은 식도 점막상피 전체에 걸쳐 표충아래에 주로 한층, 간혹 여러층으로 배열된 것도 있었으며 점액세포의 모양은 구형, 타원형이었고 중간형 크기가 대부분이었으며 작은 점액세포도 소수 관찰되었다.", "</p><p>전체적으로 볼 때 조피볼락, 용치놀래기 및 졸복의 식도에서 점액세포의 수가 많았고 송곳니베도라치에는 그 수가 적었다.", "</p><h2>식도 점액세포의 복합당질에 대한 lectin의 조직화학적 성상</h2><p>조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치 및 졸복 식도 점액 세포의 복합당질에 대한 lectin의 결합양상은 Table 2에서 보는 바와 같다.", "</p><h3>조피볼락</h3><p>식도의 큰 점액세포는 DBA (Fig. 1)와 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, 대부분의 큰 점액세포는 RCA-1 (Fig. 10)과 sWGA에 미약한 반응을(Fig. 13)", ", BSL-1에는 대부분이 반응이 없었으나 소수의 큰 점액세포가 약한 반응 내지 중등도 반응을 나타내었고(Fig.", "9) 그 외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \\( \\alpha / \\beta \\)-N-acetyl- D-galactosamine을 소량 내지 중등량, \\( \\beta \\)-D-galactose와 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량, 소수의 큰 점액세포는 \\( \\alpha \\)-D-galactose을 소량 내지 중등량 함유하고 있었다.", "</p><p>식도의 중간 크기 점액세포는 DBA (Fig. 1)와 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, BSL-1 (Fig. 9)", ", RCA-1 (Fig. 10)", "및 sWGA (Fig.", "13)에는 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였는데 이들 점액세포 중에는 BSL-1과 RCA-1에 반응을 보이지 않는 것도 있었고 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \\( \\alpha / \\beta \\)N-acetyl-D-galactosamine을 소량 내지 중등량, \\( \\alpha \\)-D-galactose, \\( \\beta \\)-D-galactose 및 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하고 있는 것으로 나타났다.", "</p><p>식도의 작은 점액세포는 SBA와 BSL-1 (Fig. 9)에 약한 반응 내지 중등도 반응을, RCA-1에 전혀 반응을 보이지 않는 소수의 작은 점액세포를 제외하고는 DBA (Fig. 1)", ", RCA-1 (Fig. 10)", "및 sWGA (Fig.", "13)에 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였으며 그 외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-galactosamine과 \\( \\alpha \\)-D-galactose를 소량 내지 중등량, \\( \\alpha \\)-N-acetyl-D-galactosamine, \\( \\beta \\)-D-galactose 및 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하고 있었다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>일반적으로 어류 식도는 고등 척추동물과 같이 큰 종주름이 잘 발달되어 있으며 점막상피는 중층편평상피로 덮여있고 상피내에 많은 점액세포가 분포되어 있음은 오래전부터 여러 연구자들에 의하여 기재되었다.", "이 점액세포의 형태는 배상세포의 형태를 하거나 전형적인 배상세포와 다른 형태를 하고 있으며, 이 점액세포들의 분포는 어종에 따라 차이가 있다고 하였다.", "</p><p>본 연구에 사용한 어종에서도 위의 보고와 같이 어류 식도에는 큰 일차 종주름이 잘 발달되어 있었는데 어종에 따라 차이가 있어 조피볼락은 키가 낮고 아래가 넓으며 용치놀래기와 송곳니베도라치는 가늘고 길며, 졸복은 주름 길이가 짧고 상부가 무딘 유곽형이었으며 4종 모두 일차 주름에 작은 이차 주름이 형성되어 있었다.", "</p><p>점막상피는 4종 모두 중층편평상피로 되어 있었는데 조피볼락과 용치놀래기에서는 단층입방상피로 된 이차주름이 곳곳에 나타난 점이 특이하였으며, 이 단층입방상피로 덮힌 이차 주름은 상피가 특수화된 것으로 식도호흡장치로 사료된다.", "</p><p>본 연구에서는 Reifel과 Travill처럼 세포의 형태를 나누지 않고, 조운복과 최인장, 이숙희와 조운복, 정권순 등처럼 국소적인 분포와 형태 및 크기에 따라 관찰하였다.", "조피볼락과 용치놀래기에서 식도점액세포들은 큰 점액세포, 중간 점액세포 및 작은 점액세포들이 섞여 있었으며, 송곳니베도라치와 졸복의 점액세포들은 중간 및 작은 점액 세포들이 섞여 있었다.", "이와같은 결과는 Reifel과 Travill, 조운복과 최인장, 이숙희와 조운복, 정권순 등의 보고와 같이 어종에 따라서 점액세포는 형태적 차이뿐만 아니라 크기 및 국소적인 분포에도 차이가 있음을 밝혀주고 있는데 이것은 어종에 따른 특성이라고 사료된다.", "</p><p>경골어류 식도점막상피 점액질의 조직화학적 연구는 많으나 복합당질에 대한 lectin의 조직화학적 성상에 대한 연구는 전혀 없었다.", "lectin의 조직화학적 성상에 대해서는 사람의 공장, 쥐의 창자상피, 척추동물의 작은창자 배상세포 및 흰쥐 결장근위부 배상세포가 연구되어 있으며, 경골어류를 대상으로 한 것은 잉어 아가미 과립세포 및 점액세포, 감성돔 창자 배상세포가 보고 되어 있다.", "</p><p>복합당질의 일종인 당단백질은 oligosaccharide side chain을 가지며 100 여종의 hexose 중 glucose, mannose, fucose, galactose, N-acetyl-D-glucosamine등이 포함되어 있다.", "복합당질은 세포표면 및 내강면에 분포하고 그 다양성은 세포의 기능, 조성, 구조, 물리화학적 변형 및 세포의 인지에 따라 변이성이 심하며, 세포의 분화, 형태 형성에 따라 잔기가 완성되므로 분화정도에 따라 그 분포와 양에는 차이가 있다.", "복합당질은 당 잔기에 대해 높은 친화성 및 특이성을 가진 단백질 또는 당단백질인 lectin으로 조직화학적 분석이 가능하기 때문에 본 연구에서는 이제까지 한번도 연구된 적이 없는 경골어류 식도 점액세포의 복합당질에 대한 lectin의 결합양상을 분석하였다.", "</p><p>식도 점액세포들의 lectin 결합양상은 본 연구에서 어종과 점액세포의 크기에 따라 차이가 있어 조피볼락의 모든 점액세포들은 DBA, SBA, RCA-1 및 sWGA에 반응을 보이고 중간 및 작은 점액세포는 이들 lectin 외에 BSL-1에도 반응을 나타내었다.", "DBA와 SBA에는 모든 점액세포들이 약한 반응 내지 중등도 반응을, 대부분의 큰 점액세포는 RCA-1과 sWGA에 미약한 반응을, 중간 및 작은 점액세포는 RCA-1에 반응이 없거나 미약한 반응 내지 약한 반응을, sWGA에 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였다.", "BSL-1에 중간 점액세포는 반응이 없거나 미약한 반응을, 작은 점액세포는 약한 반응 내지 중등도 반응을 보였다.", "</p><p>용치놀래기에서는 DBA와 SBA에 대부분의 중간 및 작은 점액세포와 약간의 큰 점액세포가 반응을 나타내나 sWGA에는 대부분의 중간 점액세포만 반응이 나타나고, PNA에 모든 점액세포와 약간의 중간 및 작은 점액세포가 반응을 나타내었으며 그 외의 lectin들에는 반응이 없었다.", "모든 큰 점액세포는 PNA에 중등도 내지 강한 반응을, 중간 및 작은 점액세포는 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, 대부분의 중간 점액세포는 DBA와 sWGA에 미약한 반응 내지 중동도 반응을, 미약한 반응 내지 약한 반응을 각각 나타내었다.", "</p><p>송곳니베도라치의 대부분의 중간 점액세포와 작은 점액세포는 sWGA에 약한 반응을, Con A에는 반응이 없거나 미약한 반응을 보였으며, 작은 점액세포는 SBA에 미약한 반응 내지 약한 반응을 나타내었으나 그 외의 lectin들에는 반응이 없었다.", "</p><p>졸복의 중간 점액세포는 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, PNA에 중등도 반응을, RCA-1에 약한 반응을 그리고 sWGA와 UEA-1에는 대부분의 중간 점액세포에서 약한 반응 내지 중등도 반응을 나타내었다.", "작은 점액세포는 SBA와 PNA에 미약한 반응 내지 약한 반응을, RCA-1에 약한 반응 내지 중등도 반응을 나타내었고 Con A에는 중간 및 작은 점액세포 모두 반응이 없거나 미약한 반응을 나타내었으나 그외의 lectin들에는 반응이 없었다.", "</p><p>조피볼락의 점액세포에서 DBA와 SBA의 양이 많고, 용치놀래기에서는 큰 점액세포에서 PNA 양이, 중간 및 작은 점액세포에서 SBA 양이, 졸복의 경우 중간 점액세포에서 SBA, PNA, sWGA 및 UEA-1의 양이, 작은 점액세포에서 RCA-1의 양이 많았다.", "</p><p>Harris와 Hunt는 어류의 점액질은 생화학적 연구에서 대부분 sialic acid 잔기와 glucose, mannose, glucosamine, galactose 및 glactosamine을 함유한다고 했는데 본 연구에서는 어종에 따라 당잔기에 차이가 있어 위의 보고와 상이함을 알 수 있다.", "또한 Hidalgo 등은 잉어의 아가미 점액세포는 WGA, DBA 및 SBA에 반응하나 PNA에 반응하지 않는다고 하였으며, Madrid 등은 감성돔의 창자 배상세포는 PNA, WGA, DBA 및 SBA에 반응하는 세포와 반응하지 않는 세포가 섞여 있었으나 Con A에는 반응하지 않는다고 하였다.", "</p><p>본 연구와 위의 연구들에서 보면 어종에 따라 lectin 결합양상에 차이가 있는데 Hidalgo 등의 언급처럼 lectin 결합양상이 점액세포를 구분하는데 특이하게 유용한 것 같고 또한 어종간의 점액세포의 결합양상은 종간의 특이성에 기인하는 것으로 생각되며 같은 종에서도 점액세포의 lectin의 결합양상이 다른 것은 김기림 등이 흰쥐 결장 근위부의 술잔세포가 놓여 있는 부위에 따라 복합당질의 당 잔기가 다르게 나타나는 것은 아마도 점액세포의 성숙과정과 기능이 각각 다름을 나타내주는 것으로 생각된다고 한 것처럼 어류 식도 점액세포들의 성숙 과정 또는 어류 식도의 특이한 기능에 기인하는 것으로 사료되나 앞으로 이에 대한 연구가 더 있어야 할 것으로 생각된다.", "</p><h1>요 약</h1><p>경골어류인 조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치 및 졸복 식도 점액세포의 복합당질 성상을 biotinylated lectin인 DBA, SBA, PNA, BSL-1, RCA-1, sWGA, UEA-1, LCA 및 Con A로 연구하였다.", "조피볼락과 용치놀래기는 큰 - 중간 및 작은 점액세포가 섞여 있었고, 송곳니베도라치와 졸복은 중간 및 작은 점액세포들이 섞여 있었다.", "식도 점액세포들의 lectin 결합양상도 어종에 따라 차이가 있었으며 조피볼락은 DBA, SBA, BSL-1, RCA-1 및 sWGA에, 용치놀래기는 DBA, SBA, PNA 및 sWGA에, 송곳니베도라치는 SBA 및 sWGA에 각각 반응을 하였으며 졸복은 DBA, LCA 및 Con A를 제외한 모든 lectin에 반응하였다.", "조피볼락의 모든 점액세포에는 DBA, SBA 및 sWGA가, 작은 점액세포에는 이 외에 BSL-1이 반응하였다.", "용치놀래기의 큰 점액세포에서는 PNA가, 중간 점액세포에는 DBA, SBA 및 sWGA가, 작은 점액세포에는 DBA와 SBA가 반응하였다.", "송곳니베도라치의 중간 점액세포에는 sWGA가, 작은 점액세포에는SBA와 sWGA가 반응하였으며 졸복은 모든 점액세포에 SBA, PNA 및 RCA-1가, 중간 점액세포에는 이 외에 sWGA와 UEA-1이 반응하였다.", "특히 조피볼락의 점액세포에서 DBA와 SBA의 양이 많고, 용치놀래기에서는 큰 점액세포에서 PNA 양이, 중간 및 작은 점액세포에서 SBA 양이 많았으며, 졸복의 경우 중간 점액세포에서 SBA, PNA, sWGA 및 UEA-1의 양이, 작은 점액세포에서 RCA-1의 양이 많았다.", "</p> <p>경골어류의 식도상피는 다른 척추동물과 같이 중층편평상피로 덮여 있으나 상피층내에 점액세포들이 나타나는 점이 다르며 이들 점액세포들은 식도내강에 점액질을 분비하여 음식물이 운반될 때 거친 먹이 조각들로부터 식도의 내면을 보호한다.", "특히 경골어류의 식도는 어종에 따라 다양한 점막 주름이 발달되어 있으며 크기가 다른 점액세포들이 출현한다.", "</p><p>경골어류 식도 점액세포 분비물의 조직화학적 성상은 어종에 따른 차이가 있을 뿐만 아니라 동종내 개체간에도 차이가 있다.", "경골어류의 식도는 섭취한 음식물을 인두로부터 위까지 수송하기 위한 도관으로서의 기능이외에 형태적인 복잡성과 점액세포들에서 분비되는 점액질의 성상으로 보아 소화과정에서 어떤 기능을 담당하고 있는 것으로 추정된다.", "</p><p>Lectin은 당단백질로서 탄수화물의 특정한 당 잔기에 높은 친화성을 가지고 있어 복합당질의 탄수화물 분자의 성상을 조직화학적으로 규명하는데 유용한 도구로 사용된다.", "</p><p>어류의 점액질은 수용성 당단백질로 중성 pH에서 음전하를 띠게 하는데 관여하는 sialic acid 잔기를 함유하며 또한 mannose, glucose, glucosamine, galactose 및 galactosamine과 같은 당과 serine, threonine과 같은 아미노산을 함유한다.", "이들 점액질의 polyanionic mucous layer는 삼투조절, 기계적 손상과 감염에 대한 보호 및 소화작용에 관여한다.", "</p><p>경골어류 식도 점액세포의 복합당질에 대한 prelectin 연구는 많이 되어 있으나 lectin에 대한 연구는 없었다.", "본 연구에서는 경골어류 중 현재까지 연구된 바 없는 조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치 및 졸복 식도 점액세포의 복합당질을 lectin 조직화학으로 연구하였다.", "</p><h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물의 처치 및 고정</h2><p>본 실험에 사용한 경골어류는 횟대목(Scorpaeniformes) 양볼락과(Scorpaenidae)의 조피볼락 Sebastes schlegeli Hilgendorf, 농어목(Percida) 놀래기과(Labridae)의 용치놀래기 Halichoeres poecilopterus (Temminck et Schlegel), 장갱이과(Stichaeidae)의 송곳니베도라치 Bryzoichthys lysimus (Jordan et Snyder) 및 복어목(Tetraodontiformes) 참복과(Tetraodontidae)의 졸복 Takifugu pardalis (Temminck et Schlegel)을 사용하였다.", "</p><p>실험 동물을 희생시킨후 흉복강을 절개하여 식도의 중간부를 절취한 후 \\( 10 \\% \\) 중성 포르말린용액에 24시간동안 고정한 다음 수세과정을 거친 후 각급 알콜에서 탈수과정, 투명화과정을 거쳐 paraplast (융점 \\( 56 \\sim 58^{\\circ} \\mathrm{C} \\) )에 포매하여 \\( 6 ~\\mu \\mathrm{M} \\) 두께의 연속절편을 만들었다.", "</p><h2>조직학적 구조</h2><p>식도의 조직학적 구조를 관찰하기 위하여 hematoxylineosin(HE) 염색과 PAS 반응을 실시하였다.", "</p><h2>복합당질에 대한 lectin의 조직화학</h2><p>식도 점액세포의 복합당질의 당 잔기를 검색하기 위해 탈 파라핀한 조직을 \\( 3 \\% \\) methanolic hydrogen peroxide에 실온에서 30분간 처리하고, PBS (phosphate buffer saline, \\( 0.01 \\mathrm{~M} \\), pH 7.4)로 10분간 3회 세척한 후 비특이성 반응을 없애기 위하여 \\( 1 \\% \\) bovine serum albumin 용액에 실온에서 30분간 두었다가 압지로 부드럽게 용액을 제거시킨 후 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 습도를 유지하면서 9가지의 biotinylated lectin (Vector Lab., Bur-lingame, C.A., USA) 중 DBA, PNA, BSL-1, sWGA 및 UEA-1은 Hepes buffer (\\( 10 \\mathrm{~mM} \\) Hepes 용액, pH 7.5, \\( 0.15 \\mathrm{~M} \\mathrm{~NaCl} \\), \\( 0.1 \\mathrm{~mM} \\mathrm{~Ca}{ }^{2+} \\), \\( 0.045 \\% \\) sodium azide)에, LCA와 Con A는 상기 Hepes buffer에 \\( 0.01 \\mathrm{~mM} \\)의 \\( \\mathrm{Mn}^{2+} \\)이 포함된 용액에, RCA-1은 phosphate 용액(\\( 10 \\mathrm{~mM} \\) phosphate buffer, pH 7.5, \\( 0.15 \\mathrm{~M} \\mathrm{~NaCl} \\), \\( 0.085 \\% \\) sodium azide)에 Table 1과 같은 농도로 희석하여 24시간 동안 반응시켰다.", "</p><p>PBS로 세척한 후 ABC kit (avidin-biotin-peroxidase complex, Vector Lab.) 시약에 실온에서 60분간 반응시켰다.", "다시 PBS로 세척한 후 TB (Tris buffer, \\( 0.05 \\mathrm{M} \\), pH 7.6에 \\( 0.02 \\% \\) 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma)와 \\( 0.01 \\% \\) \\( \\mathrm{H_{2}O_{2}} \\)를 혼합한 용액에 실온에서 약 10분간 발색시켰다.", "TB에 10분간 세척하고 다시 PBS에 10분간 세척한 후 증류수로 세척하여 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색한 후 poly-mount (polyscience, USA)로 봉입하였다.", "</p><p>Lectin의 반응정도는 음성은 0, 흔적적인 반응은 \\( \\pm \\), 약한 반응은 +, 중등도의 반응은 ++, 강한 반응은 +++, 매우 강한 반응은 ++++ 등으로 표시하였다.", "</p> <h3>용치놀래기</h3><p>식도의 큰 점액세포는 PNA에 중등도 내지 강한 반응을 (Fig. 6)", ", DBA (Fig.", "2), SBA 및 sWGA에 대해서는 대부분의 큰 점액세포는 반응을 보이지 않았으나 소수의 큰 점액세포가 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였으며 그외의 lectin들에는 반응을 보이지 않는 것으로 보아 galactose-\\( \\beta \\)-1,3-N-acetyl-D-galactosamine을 중등량 내지 상당량 함유하고 있었으며 소수의 큰 점액세포는 \\( \\alpha / \\beta \\)N-acetyl-D-galactosamine과 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하고 있었다.", "</p><p>식도의 대부분의 중간 크기 점액세포는 DBA (Fig. 2)와 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을 보였으나 반응을 보이지 않거나 미약한 반응을 보이는 중간 크기 점액세포도 있었다.", "sWGA에는 대부분의 중간 크기 점액세포가 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였고 소수의 중간 크기 점액세포는 PNA (Fig.", "6)에 미약한 반응 내지 중등도 반응을 보였으며 그 외의 lectin들에는 반응이 나타나지 않는 것으로 보아 대부분의 중간 크기 점액세포는 \\( \\alpha / \\beta \\)-N-acetyl-D-galactosamine을 소량 내지 중등량, \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하며 소수의 중간 크기 점액세포는 galactose-\\( \\beta \\)-1,3-N-acetyl-D-galactosamine을 미량 내지 중등량 함유하고 있는 것으로 나타났다.", "</p><p>식도의 작은 점액세포는 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을, DBA에는 반응이 없는 것에서부터 중등도 반응까지 다양하게 나타났으며(Fig. 2)", ", PNA에 대부분의 작은 점액세포는 반응을 보이지 않았으나 소수의 작은 점액세포가 약한 반응 내지 중등도 반응을 보였고(Fig.", "6) 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-galactosamine을 소량 내지 중등량, \\( \\alpha \\)-N-acetyl-D-galactosamine은 없는것에서 중등량 까지 함유하며, 소수의 작은 점액세포는galactose-\\( \\beta \\)-1,3-N-acetyl-D- galactosamine을 소량 내지 중등량 함유하고 있는 것으로 나타났다.", "</p><h3>송곳니베도라치</h3><p>식도의 중간 크기 점액세포는 Con A에 반응이 없거나 미약한 반응을, SBA에는 대부분의 중간크기 점액세포가 반응이 없었으나 소수의 세포에서 미약한 반응을 보였다", "(Fig. 4).", "sWGA에 대부분의 중간 크기 점액세포는 약한 반응을 보였으나 소수의 세포에서 미약한 반응을 보였고(Fig.", "14) 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \\( \\alpha \\)-D-mannose와 \\( \\alpha \\)-D-glucose를 함유하지 않거나 미량 함유하며 소수의 중간 크기 점액세포는 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-galactosamine을 미량, \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-glucosamine을 미량 내지 소량 함유하는 것으로 나타났다.", "</p><p>식도의 작은 점액세포는 sWGA에 약한 반응을(Fig. 14)", ", SBA에 미약한 반응 내지 약한 반응을(Fig.", "4), Con A에는 반응이 없거나 미약한 반응을 나타내었고 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-glucosamine을 소량, \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-galactosamine을 미량 내지 소량, \\( \\alpha \\)-D- man-nose와 \\( \\alpha \\)-D-glucose를 함유하지 않거나 미량 함유하는 것으로 나타났다.", "</p><h3>졸복</h3><p>식도의 중간 크기 점액세포는 SBA에 약한 반응 내지 중등도 반응을(Fig. 5)", ", PNA에는 중등도 반응을 나타내었다", "(Fig. 8).", "RCA-1(Fig. 12)", ", sWGA(Fig.", "15) 및 UEA-1에는 반응이 없거나 미약한 반응을 보이는 소수의 중간 크기 점액세포를 제외하고는 대부분이 약한 반응 내지 중등도 반응을 나타내었고 그외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-galactosamine을 소량 내지 중등량, galactose-\\( \\beta- \\)1,3-N-acetyl-D-galactosamine을 중등량 함유하며, 대부분의 중간 크기 점액세포가 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-glucosamine과 \\( \\alpha \\)-L-fucose를 소량 내지 중등량, \\( \\beta \\)-D-galactose를 소량, \\( \\alpha \\)-D-galactose, \\( \\alpha \\)-D-mannose 및 \\( \\alpha \\)-D-glucose를 함유하지 않거나 미량 함유하는 것으로 나타났다.", "</p><p>식도의 대부분의 작은 점액세포는 RCA-1에 약한 반응 내지 중등도 반응을 보였으나 반응을 보이지 않는 작은 점액세포도 소수 관찰되었으며(Fig. 12)", ", SBA (Fig. 5)와 PNA (Fig. 8)에는 미약한 반응 내지 약한 반응을 보였다.", "BSL-1, sWGA (Fig.", "15) 및 UEA-1에 대해서는 미약한 반응을 보이는 소수의 작은 점액세포를 제외하고 대부분의 작은 점액세포는 반응을 보이지 않았고 Con A에는 반응이 없거나 미약한 반응을 보였으며 그 외의 lectin들에는 반응이 없는 것으로 보아 대부분의 작은 점액세포가 \\( \\beta \\)-D-galactose를 소량 내지 중등량 함유하며 \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-galactosamine과 galactose-\\( \\beta \\)-1,3-N-acetyl-D-galactosamine을 미량 내지 소량 함유하고 있었다.", "소수의 작은 점액세포는 \\( \\alpha \\)-D-galactose, \\( \\beta \\)-N-acetyl-D-glucosamine 및 \\( \\alpha \\)-L-fucose를 미량 함유하며 \\( \\alpha \\)-D-mannose와 \\( \\alpha \\)-D-glucose를 함유하지 않거나 미량 함유하는 것으로 나타났다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "조피볼락, 용치놀래기, 송곳니베도라치 및 졸복 식도 점액세포의 복합당질에 대한 Lectin 조직화학", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-eac10fe4-8a4f-42ac-82b7-e81986304c29", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2004", "doc_author": [ "정길남", "이웅희", "조기진", "정권순", "조운복" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,418	<h1>초록 : 따개비 분획물의 항균 및 항암 효과</h1><p>본 연구에서는 갑각류에 속하는 따개비를 각 용매 별로 분획하여 항균효과, 암세포 증식 억제 및 QR 유도 활성 효과를 알아보았다. 따개비의 각 분획물 AAMH, AAMB, AAMM 및 AAMA층을 식중독 원인균인 Staphylococcus aureus (ATCC 25923), E.coli (ATCC 21990) 및 Salmonella enteritidis (ATCC 13076)와 단백질 부패 원인균인 Proteus mirabilis (ATCC 25933)의 4가지 균주에 처리하여 항균 활성을 조사한 결과 부탄올 분획층인 AAMB층에서 가장 높은 항균 활성 효과를 나타내었다. 또한 HepG2와 B16-F10 세포주에 대한 암세포 증식 억제 효과를 알아 본 결과 메탄올 분획층인 AAMM에서 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다. 그리고 quinone reductase를 가지고 있는 간암 세포인 HepG2 세포주를 이용한 QR 유도 활성 효과의 결과에서도 암세포 성장 억제 효과의 결과에서와 마찬가지로 메탄올 분획층인 AAMM층에서 가장 높은 QR 유도 활성 효과를 나타내었다. 대조군을 1 로 하여 비교한 결과 20, 40, 60, 80 및 \( 100\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 의 시료 농도 첨가 시 AAMM층에서 그 효과가 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하였으며, 각각 1.20, 1.54, 1.59, 1.82 및 2.04배의 QR 유도 활성 증가 효과를 나타내었다. 따라서 본 연구결과는 앞으로 따개비를 이용한 항균, 항암관련 기능성 식품에 대한 개발 가능성이 보이며, 이를 위한 부탄올 및 메탄올 분획물에 대한 집중적인 연구가 요구되어진다. 그리고 해양 동물 중의 하나인 갑각류에 속하는 따개비에 대한 활성 연구에 있어 기초자료가 될 것으로 예상되며, 해양생물이 크게 대두되고 있는 요즈음 유사 종의 갑각류인 새우나 게에 비해 그 활용도가 극히 낮은 따개비에 대한 소비촉진에 영향을 끼칠것으로 기대되어진다.</p>	생명과학	[ "<h1>초록 : 따개비 분획물의 항균 및 항암 효과</h1><p>본 연구에서는 갑각류에 속하는 따개비를 각 용매 별로 분획하여 항균효과, 암세포 증식 억제 및 QR 유도 활성 효과를 알아보았다.", "따개비의 각 분획물 AAMH, AAMB, AAMM 및 AAMA층을 식중독 원인균인 Staphylococcus aureus (ATCC 25923), E.coli (ATCC 21990) 및 Salmonella enteritidis (ATCC 13076)와 단백질 부패 원인균인 Proteus mirabilis (ATCC 25933)의 4가지 균주에 처리하여 항균 활성을 조사한 결과 부탄올 분획층인 AAMB층에서 가장 높은 항균 활성 효과를 나타내었다.", "또한 HepG2와 B16-F10 세포주에 대한 암세포 증식 억제 효과를 알아 본 결과 메탄올 분획층인 AAMM에서 높은 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다.", "그리고 quinone reductase를 가지고 있는 간암 세포인 HepG2 세포주를 이용한 QR 유도 활성 효과의 결과에서도 암세포 성장 억제 효과의 결과에서와 마찬가지로 메탄올 분획층인 AAMM층에서 가장 높은 QR 유도 활성 효과를 나타내었다.", "대조군을 1 로 하여 비교한 결과 20, 40, 60, 80 및 \\( 100\\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\) 의 시료 농도 첨가 시 AAMM층에서 그 효과가 농도 의존적으로 유의성 있게 증가하였으며, 각각 1.20, 1.54, 1.59, 1.82 및 2.04배의 QR 유도 활성 증가 효과를 나타내었다.", "따라서 본 연구결과는 앞으로 따개비를 이용한 항균, 항암관련 기능성 식품에 대한 개발 가능성이 보이며, 이를 위한 부탄올 및 메탄올 분획물에 대한 집중적인 연구가 요구되어진다.", "그리고 해양 동물 중의 하나인 갑각류에 속하는 따개비에 대한 활성 연구에 있어 기초자료가 될 것으로 예상되며, 해양생물이 크게 대두되고 있는 요즈음 유사 종의 갑각류인 새우나 게에 비해 그 활용도가 극히 낮은 따개비에 대한 소비촉진에 영향을 끼칠것으로 기대되어진다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "", "eng": "Antimicrobial- and Anticarcinogenic Activities of Amphitrite albicostatu Fractions" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-f4d05de3-6908-4c50-bae9-d2a7eca3b862", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", "doc_author": [ "신혜정", "신미옥" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,419	<h1>재료 및 방법</h1><h2>광감작제 및 광원</h2><p>광감작제로 사용한 photofrin (Axcan Pharma Inc., Canada) 은 멸균된 증류수에 녹여서 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 용액으로 제조한 후 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 의 냉동실에서 보관하였다. 광원은 광감작제가 최대 광독성능을 나타내는 \( 630 \mathrm{~nm} \) diode laser (Biolitec, Germany)를 사용하였다. \( 1 \mathrm{~cm} \) cylindrical diffuser fiber을 메탈박스 안에 설치하여 단위면적 당 에너지 세기를 \( 0.83 \mathrm{~mW} / \mathrm{cm}^{2} \) 이 되도록 조절하여 15분간 총 \( 7.47 \mathrm{~J} / \mathrm{cm}^{2} \) 의 에너지를 조사하였다.</p><h2>세포 배양</h2><p>실험에 사용한 인체 두경부 암세포 주(Human Head and Neck Cell Line)인 AMC-HN3은 서울 아산 병원에서 분양 받았으며, RPMI-1640 (Hyclone, USA)배지에 \(10\%\) fetal bovine serum (Hyclone)과 \( 100 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \) 의 penicillin 및 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 streptomycin (Hyclone)이 포함된 성장배지를 사용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}, 5 \% \mathrm{CO}_{2} \) 가 유지되는 배양기(Thermo Forma, USA)에서 배양하였다.</p><h2>세포 독성능</h2><p>인체 두경부 암세포주에서 genistein과 광역학 치료와의 병행처리에 의한 세포 독성능을 확인하기 위해 MTT assay 를 수행하였다. 지수 성장시기의 세포를 \( 10^{4} \) \( \mathrm{cells} / \mathrm{well} \)이 되게 96 well plate에 분주하고 24 시간 동안 배양한 후 genistein을 \( 25,50,100,200 \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 이에 광감작제 \( (100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) 100 \mu 1 \) 첨가한 후 2배 희석법으로 처리하여 6시간 동안 배양기에서 배양하고 새로운 배지로 교환 후 \( 630 \mathrm{~nm} \) diode laser로 조사하였다. 24시간 배양 후 \( \mathrm{pH} \ 7.3 \) 의 DPBS에 녹인 MTT (Sigma Chemical Co., USA)용액 \( (2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) 을 첨가하고 4 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 dimethylsulfoxide (DMSO, Japan)를 첨가하여 formazan을 잘 용해시키고 microplate reader (Bio-Rad 550, Bio-Rad, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Hoechst 33342 및 PI 염색</h2><p>핵의 형태학적 변화로 세포사멸을 관찰하기 위해서 고사 세포와 정상세포의 핵을 파랗게 염색하는 Hoechst 33342 (Sigma Chemical Co.)와 괴사세포의 핵을 붉게 염색하는 Propidium Iodide (PI, Sigma Chemical Co.)를 사용하였다. 광역학 치료 후 Hoechst \( 33342(1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 를 첨가하여 30분 동안 반응시킨 후, 배지를 교환하여 PI \( (1 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}) \) 를 첨가하여 10분 동안 배양한 후 confocal microscopy (Carl Zeiss, Germany)를 이용해 관찰 하였다.</p><h2>General reactive oxygen species 측정</h2><p>\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \) (Molecular Probes Inc., USA)형광시약을 사용하여 세포 내에 존재하는 general reactive oxygen species (G-ROS)를 확인하였다. \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \) 는 acetylation에 의해 변한 DCF 자체로는 형광이 없지만 세포내의 ROS와 만나게 되면 형광을 가지는 특성을 가지고 있다. 광역학 치료 후 두경부 암세포를 DPBS로 두세 번 씻어내고, \( 10 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \) 를 첨가하여 30분 동안 배양 후 flow cytometer BD Biosciences, USA)로 측정하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>광역학 치료(Photodynamic Therapy)는 광감작제(Photosensitizer)의 투여 후 광감작제를 활성화 시킬 수 있는 파장의 빛을 조사함으로써 광감작제가 축적되어 있는 암조직에 치명적인 손상을 유도하여 괴사시키는 치료방법이다. 광역학 치료에 의한 세포내 작용기전의 시작은 세포 내의 반응으로 세포 내에 축적된 광감작제가 외부의 빛에너지와 산소가 반응하여 ROS 또는 활성산소 \( \left(\mathrm{O}_{2}{ }^{-}\right) \)를 생성시키거나(Type II 반응), 감작제가 전자 전달계에 관여하는 경우 자유라디칼이 형성되어(Type I 반응) 세포파괴가 일어난다. 광역학 치료는 다양한 암세포들에 세포 독성능을 가지고 있으며, carboplatin과 같은 항암제와의 병행 치료 시에 효과적인 세포 독성능을 나타낸다고 보고되었는데, 이 때 세포괴사 뿐 만 아니라 세포고사를 통해서 세포 사멸을 유도한다고 알려져 있다.</p><p>Hematoporphyrin 유도체(HPD) 중 하나인 photofrin은 1 세대 광감작제 중 하나로 현재 임상적으로 널리 사용되고 있다. Photofrin의 세포 내 축척은 세포마다 조금 씩 다르게 나타나는데, 자궁 경부암세포에서는 핵막에 위치하고, 악성흑색종세포에서는 mitochondria에 축적된다고 보고되었으며, 표피종양세포에서는 세포막에 위치하여 ROS를 형성한 후 세포고사를 유도한다고 보고되었다.</p><p>Chemopreventive agent의 항암효과에 대해 많은 연구가 진행되고 있는데 이 중 genistein은 콩류에 존재하는 phenol 계 화합물이다. Flavonoid의 한 그룹인 isoflavones의 주요물질 중 하나로 백혈병 세포, 신경교종 세포, 자궁경부암 세포, 위장암 세포 등에서 세포사멸을 일으킨다. 특히, in vitro 위암세포 모델에서 genistein에 의한 암세포 증식억제기전의 연구결과 세포고사 유발과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다.</p><p>본 연구에서는 두경부 암세포 주에서 genistein의 증식억제 효과를 알아보고, genistein을 광역학 치료와 병행 치료 시 나타나는 세포 독성능 및 세포고사 유발에 대해 연구하였다.</p> <h1>고 찰</h1><p>현재 광역학 치료에 사용되는 수많은 광감작제들은 세포 의 소기관에 축척되어 세포사멸을 야기한다. 현재 사용되고 있는 광감작제 중 hematophorphyrin 유도체(HPD)를 근간으로 하는 photofrin은 실제 임상에 쓰이고 있고 주로 종양의 혈관손상을 야기하여 간접적으로 세표괴사를 일으키지만, 체내에서 유지되는 시간이 길다는 단점을 가지고 있다. 단점을 해결하고자 항암제들과의 병행 치료를 통해 세포괴사를 유도하는 연구가 진행되고 있다.</p><p>최근에 항암제와 비슷한 세포독성능을 가지고 있으면서 세포손상에 영향을 주지 않는 chemopreventive agent가 활발히 연구되어지고 있다. 최근 Wang 등은 자연에서 추출한 genistein, curcumin, resveratrol, EGCG가 췌장암 세포에서 세포독성능을 일으키고 이들을 각각 병행치료 하였을 경우 세포사멸이 증가됨을 보고하였다. 또한 genistein은 효율적인 암 치료를 위해서 항암제나 방사선치료법등과의 병행치료가 연구되어지고 있으며, curcumin은 광역학 치료와의 병행치료가 연구되었다. 그러나, genistein과 광역학 치료의 병행치료는 아직 연구가 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 인체 두경부 암세포에 genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 세포독성능을 살펴 보았다. 그 결과, 광역학 치료를 단독으로 처리한 군과 비교하여, genistein과 병행치료를 하였을 때 photofrin \( 1.56 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 세포 독성능이 증가하였으나, photofrin \( 3.13 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서는 광역학 치료의 단독처리군과 병행 치료간의 세포 독성능이 비슷하게 나타났다.</p><p>최근 연구에 의하면 레이저 조사 에너지의 양에 따른 세포사멸을 관찰하였는데 광역학 치료 시 \( \mathrm{IC}_{50} \) 의 광량 에너지는 세포 고사가, \( \mathrm{IC}_{80} \) 의 광량에서는 세포괴사를 통한 세포사멸이 더 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 본 연구에서 병행 치료 시 나타나는 세포 독성능에 따른 핵의 형태를 관찰 한 결과, genistein을 \( 50 \mu \mathrm{M} \) 의 농도로 단독처리한 경우 시간에 따라 큰 변화가 나타나지 않았고 광역학 치료를 단독 처리 시 \( \mathrm{IC}_{50} \) 과 \( \mathrm{IC}_{80} \) 모두 apoptotic body는 거의 없으며 시간의존적으로 세포괴사가 나타났다. 그러나, 광역학 치료를 \( \mathrm{IC}_{80} \) 으로 처리하였을 때 광역학 치료 단독처리와 비교하여 genistein과 병행치료 시 3시간 때부터 약 3배 이상의 apoptotic body를 관찰하였다. 즉, 광역학 치료와 genistein을 병행 치료 하였을 때 세포고사를 유도하는 것으로 나타났다.</p><p>암세포를 치료할 때 사용되는 여러 가지 항암제들은 mitochondria membrane의 손상으로 발생하는 ROS와 밀접한 연관이 있다 광역학 치료는 빛에 의해 활성화된 광감작제 분자와 체내 산소분자에 의해 ROS가 생성된다고 알려져 있다. 이러한 기전은 type I 반응과 type II 반응으로 나뉘는데 대부분의 광역학 치료기전은 type II 반응이 주로 일어난다. Genistein을 항암제와 같이 병행치료를 하였을 때 ROS가 증가하여 세포고사를 유도한다는 보고가 있다. 본 연구에서 처리하지 않은 세포에 비해 genistein과 광역학 치료를 단독으로 처리하였을 때 세포 내 존재하는 ROS가 각각 증가 하였으며, 병행 치료하였을 때는 더 많은 ROS가 형성되는 것으로 나타났다. 즉, genistein에 의해 생성된 ROS가 photofrin에 연관된 광역학 치료에 의해 동반되어 증가하는 것으로 보여 진다.</p><p>최근 Kim 등은 흑색종 세포에서 genistein을 처리했을 때 Bcl-2의 감소 및 Bax의 증가가 나타났으며, 세포고사 유발에 mitochondria와 연관된 Bcl-2 family발현과 관련이 있다고 보고 하였다. 또한 genistein이 간암세포에서도 mitochondria의 손상을 주어 ROS를 증가시키고 세포고사를 유도한다고 밝혀졌다. 선행연구 등에 미루어 볼 때 genistein이 세포 내 ROS를 유발하여 mitochondria가 손상되고, 또한 photofrin에 의한 광역학 치료도 mitochondria을 손상 시켜 세포고사를 유도하는 것으로 추측되어 진다. 그러나, 이에 대한 정확한 세포사멸기전의 신호전달 현상을 추가연구를 통해 밝혀내야 할 것이다.</p><p>인체 두경 부 암세포 주에서 genistein과 광역학 치료를 병행 치료 시 세포 내에 발생하는 ROS에 의해 mitochondria 에 세포손상을 주고 신호 전달을 통해 약 3시간에서 6시간 사이에 세포고사를 유도 하는 것으로 확인하였다. 부작용을 최소화 할 수 있는 chemopreventive agent인 genistein을 사용함으로써 더 효율적인 광역학 치료를 기대한다.</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구에서는 두경부 암세포 주에서 genistein의 증식억제 효과를 알아보고, genistein을 광역학 치료와 병행 치료시 나타나는 세포 독성능 및 세포고사 유발에 대해 연구 하였다. 두경부 암세포 주에서 genistein의 세포독성능을 확인한 결과, 농도 및 시간 의존적으로 세포 독성능이 나타났다. 이에 genistein을 photofrin을 이용한 광역학 치료와 병행 치료 시 더 많은 세포 독성능이 나타났다. Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 형태적 변화는 광역학 치료시에는 주로 세포괴사의 형태가 관찰 되었으나, genistein과 병행 치료 시에는 세포고사가 관찰 되었다. 시간별로 관찰하였을 때, 광역학 치료를 \( \mathrm{IC}_{80} \) 으로 처리하였을 때 3시간 때에 apoptotic body가 약 3배정도 증가하였다. 세포 내 ROS를 확인한 결과 genistein과 광역학 치료를 단독으로 처리하였을 때 세포 내 존재하는 ROS가 각각 증가 하였으며, 병행 치료하였을 때는 더 많은 ROS가 형성되는 것으로 나타났다. 즉, genistein이 세포 내 ROS를 유발하여 mitochondria가 손상되고, 또한 photofrin에 의한 광역학 치료도 mitochondria를 손상시켜 세포고사를 유도하는 것으로 추측되어 진다.</p> <h1>결 과</h1><h2>Genistein에 의한 인체 두경부 암세포 증식 억제</h2><p>Genistein이 인체 두경부 암세포의 성장에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해서 AMC-HN3 세포 주에서 세포 독성능을 조사하였다. Genistein을 다양한 농도로 \( (0-1,000 \mu \mathrm{M}) \) 처리한 후 24,48시간 후의 세포 독성능을 확인해본 결과, genistein의 농도 및 시간 의존적으로 세포 증식 억제가 나타났다. 즉, 인체 두경부 암세포에서 genistein이 세포 증식을 억제시키는 것을 확인하였다.</p><h2>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료에 의한 세포 독성능 증가</h2><p>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해서 genistein을 \( 25\),\(50\),\(100\),\(200\) \(\mu \mathrm{M} \) 의 농도로 첨가하고 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 의 photofrin을 2배 희석법으로 처리 하여 세포 독성능을 확인하였다. 광역학 치료를 단독으로 처리했을 때는 세포 독성능이 \( 1.56 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 일 때부터 농도 의존적으로 증식 억제 효과를 관찰할 수 있었다. 그러나, genistein과 병행 치료하였을 때는 photofrin의 농도가 \( 1.56 \mu \mathrm{g} \) \( / \mathrm{ml} \) 일 때는 광역학 치료 단독처리에 비해 약 \( 5 \% \) 정도 세포독 성능이 증가하였다. 그러나 photofrin의 농도가 \( 3.13 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이상의 농도에서는 광역학 치료의 단독 처리군과 비슷한 세포 독성능을 나타났다. 광역학 치료와 genistein과 병행치료 시에는 \( 1.56 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 세포독성능이 증가한 것으로 나타났다.</p><h2>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 세포의 형태적 변화 양상</h2><p>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 세포사멸의 형태학적 변화를 관찰하기 위해서 광역학 치료 1,3,6,12 시간 후 Hoechst 33342 및 PI 염색을 실시하였다. 광역학 치료시 photofrin의 농도를 \( 50 \% \) inhibition concentration \( \left(\mathrm{IC}_{50}\right) \) ) 인 \( 2 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 과 \( 80 \% \) inhibition concentration \( \left(\mathrm{IC}_{80}\right) \) 인 \( 4 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 로 처리하였을 때는 세포괴사의 형태가 관찰되었으며, apoptotic body는 거의 관찰되지 않았다. 그러나, photofrin의 농도를 \( \mathrm{IC}_{80} \) 으로 병행 치료한 실험군 에서는 광역학 치료 단독처리군과 비교하였을 때 3시간 경과 시 apoptotic body가 약 3배 정도 증가하여, 6시간까지 계속 증가하고, 12시간 경과 시에는 오히려 세포괴사가 일어났다. 즉, 세포괴사를 유발하는 광역학 치료를 genistein과 병행 치료 시에 세포고사를 유도하는 것으로 나타났다.</p><h2>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 ROS의 동반 증가</h2><p>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 세포 내 ROS를 확인하기 위해서 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{DCF}-\mathrm{DA} \) 로 염색해 FACS를 이용해 분석하였다. Photofrin의 농도를 \( \mathrm{IC}_{50} \) 과 \( \mathrm{IC}_{80} \) 으로 광역학 치료를 단독 처리한 경우 photofrin 농도 의존적으로 ROS가 증가한 것으로 나타났다. 또한, genistein을 단독으로 처리한 경우도 대조군과 비교하여 ROS가 증가하였으며, genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시에는 genistein을 단독 처리 시 형성된 ROS가 동반 증가한 것으로 나타났다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>광감작제 및 광원</h2><p>광감작제로 사용한 photofrin (Axcan Pharma Inc., Canada) 은 멸균된 증류수에 녹여서 \\( 1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 의 용액으로 제조한 후 \\( -20^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 의 냉동실에서 보관하였다.", "광원은 광감작제가 최대 광독성능을 나타내는 \\( 630 \\mathrm{~nm} \\) diode laser (Biolitec, Germany)를 사용하였다. \\", "( 1 \\mathrm{~cm} \\) cylindrical diffuser fiber을 메탈박스 안에 설치하여 단위면적 당 에너지 세기를 \\( 0.83 \\mathrm{~mW} / \\mathrm{cm}^{2} \\) 이 되도록 조절하여 15분간 총 \\( 7.47 \\mathrm{~J} / \\mathrm{cm}^{2} \\) 의 에너지를 조사하였다.", "</p><h2>세포 배양</h2><p>실험에 사용한 인체 두경부 암세포 주(Human Head and Neck Cell Line)인 AMC-HN3은 서울 아산 병원에서 분양 받았으며, RPMI-1640 (Hyclone, USA)배지에 \\(10\\%\\) fetal bovine serum (Hyclone)과 \\( 100 \\mathrm{unit} / \\mathrm{ml} \\) 의 penicillin 및 \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 의 streptomycin (Hyclone)이 포함된 성장배지를 사용하여 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C}, 5 \\% \\mathrm{CO}_{2} \\) 가 유지되는 배양기(Thermo Forma, USA)에서 배양하였다.", "</p><h2>세포 독성능</h2><p>인체 두경부 암세포주에서 genistein과 광역학 치료와의 병행처리에 의한 세포 독성능을 확인하기 위해 MTT assay 를 수행하였다.", "지수 성장시기의 세포를 \\( 10^{4} \\) \\( \\mathrm{cells} / \\mathrm{well} \\)이 되게 96 well plate에 분주하고 24 시간 동안 배양한 후 genistein을 \\( 25,50,100,200 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다.", "이에 광감작제 \\( (100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}) 100 \\mu 1 \\) 첨가한 후 2배 희석법으로 처리하여 6시간 동안 배양기에서 배양하고 새로운 배지로 교환 후 \\( 630 \\mathrm{~nm} \\) diode laser로 조사하였다.", "24시간 배양 후 \\( \\mathrm{pH} \\ 7.3 \\) 의 DPBS에 녹인 MTT (Sigma Chemical Co., USA)용액 \\( (2 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}) \\) 을 첨가하고 4 시간 동안 배양하였다.", "배지를 제거한 후 dimethylsulfoxide (DMSO, Japan)를 첨가하여 formazan을 잘 용해시키고 microplate reader (Bio-Rad 550, Bio-Rad, USA)를 이용하여 \\( 540 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "</p><h2>Hoechst 33342 및 PI 염색</h2><p>핵의 형태학적 변화로 세포사멸을 관찰하기 위해서 고사 세포와 정상세포의 핵을 파랗게 염색하는 Hoechst 33342 (Sigma Chemical Co.)와 괴사세포의 핵을 붉게 염색하는 Propidium Iodide (PI, Sigma Chemical Co.)를 사용하였다.", "광역학 치료 후 Hoechst \\( 33342(1 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}) \\) 를 첨가하여 30분 동안 반응시킨 후, 배지를 교환하여 PI \\( (1 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml}) \\) 를 첨가하여 10분 동안 배양한 후 confocal microscopy (Carl Zeiss, Germany)를 이용해 관찰 하였다.", "</p><h2>General reactive oxygen species 측정</h2><p>\\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{DCF}-\\mathrm{DA} \\) (Molecular Probes Inc., USA)형광시약을 사용하여 세포 내에 존재하는 general reactive oxygen species (G-ROS)를 확인하였다. \\", "( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{DCF}-\\mathrm{DA} \\) 는 acetylation에 의해 변한 DCF 자체로는 형광이 없지만 세포내의 ROS와 만나게 되면 형광을 가지는 특성을 가지고 있다.", "광역학 치료 후 두경부 암세포를 DPBS로 두세 번 씻어내고, \\( 10 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{DCF}-\\mathrm{DA} \\) 를 첨가하여 30분 동안 배양 후 flow cytometer BD Biosciences, USA)로 측정하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>광역학 치료(Photodynamic Therapy)는 광감작제(Photosensitizer)의 투여 후 광감작제를 활성화 시킬 수 있는 파장의 빛을 조사함으로써 광감작제가 축적되어 있는 암조직에 치명적인 손상을 유도하여 괴사시키는 치료방법이다.", "광역학 치료에 의한 세포내 작용기전의 시작은 세포 내의 반응으로 세포 내에 축적된 광감작제가 외부의 빛에너지와 산소가 반응하여 ROS 또는 활성산소 \\( \\left(\\mathrm{O}_{2}{ }^{-}\\right) \\)를 생성시키거나(Type II 반응), 감작제가 전자 전달계에 관여하는 경우 자유라디칼이 형성되어(Type I 반응) 세포파괴가 일어난다.", "광역학 치료는 다양한 암세포들에 세포 독성능을 가지고 있으며, carboplatin과 같은 항암제와의 병행 치료 시에 효과적인 세포 독성능을 나타낸다고 보고되었는데, 이 때 세포괴사 뿐 만 아니라 세포고사를 통해서 세포 사멸을 유도한다고 알려져 있다.", "</p><p>Hematoporphyrin 유도체(HPD) 중 하나인 photofrin은 1 세대 광감작제 중 하나로 현재 임상적으로 널리 사용되고 있다.", "Photofrin의 세포 내 축척은 세포마다 조금 씩 다르게 나타나는데, 자궁 경부암세포에서는 핵막에 위치하고, 악성흑색종세포에서는 mitochondria에 축적된다고 보고되었으며, 표피종양세포에서는 세포막에 위치하여 ROS를 형성한 후 세포고사를 유도한다고 보고되었다.", "</p><p>Chemopreventive agent의 항암효과에 대해 많은 연구가 진행되고 있는데 이 중 genistein은 콩류에 존재하는 phenol 계 화합물이다.", "Flavonoid의 한 그룹인 isoflavones의 주요물질 중 하나로 백혈병 세포, 신경교종 세포, 자궁경부암 세포, 위장암 세포 등에서 세포사멸을 일으킨다.", "특히, in vitro 위암세포 모델에서 genistein에 의한 암세포 증식억제기전의 연구결과 세포고사 유발과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되었다.", "</p><p>본 연구에서는 두경부 암세포 주에서 genistein의 증식억제 효과를 알아보고, genistein을 광역학 치료와 병행 치료 시 나타나는 세포 독성능 및 세포고사 유발에 대해 연구하였다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>현재 광역학 치료에 사용되는 수많은 광감작제들은 세포 의 소기관에 축척되어 세포사멸을 야기한다.", "현재 사용되고 있는 광감작제 중 hematophorphyrin 유도체(HPD)를 근간으로 하는 photofrin은 실제 임상에 쓰이고 있고 주로 종양의 혈관손상을 야기하여 간접적으로 세표괴사를 일으키지만, 체내에서 유지되는 시간이 길다는 단점을 가지고 있다.", "단점을 해결하고자 항암제들과의 병행 치료를 통해 세포괴사를 유도하는 연구가 진행되고 있다.", "</p><p>최근에 항암제와 비슷한 세포독성능을 가지고 있으면서 세포손상에 영향을 주지 않는 chemopreventive agent가 활발히 연구되어지고 있다.", "최근 Wang 등은 자연에서 추출한 genistein, curcumin, resveratrol, EGCG가 췌장암 세포에서 세포독성능을 일으키고 이들을 각각 병행치료 하였을 경우 세포사멸이 증가됨을 보고하였다.", "또한 genistein은 효율적인 암 치료를 위해서 항암제나 방사선치료법등과의 병행치료가 연구되어지고 있으며, curcumin은 광역학 치료와의 병행치료가 연구되었다.", "그러나, genistein과 광역학 치료의 병행치료는 아직 연구가 미흡한 실정이다.", "따라서 본 연구에서는 인체 두경부 암세포에 genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 세포독성능을 살펴 보았다.", "그 결과, 광역학 치료를 단독으로 처리한 군과 비교하여, genistein과 병행치료를 하였을 때 photofrin \\( 1.56 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 에서 세포 독성능이 증가하였으나, photofrin \\( 3.13 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 에서는 광역학 치료의 단독처리군과 병행 치료간의 세포 독성능이 비슷하게 나타났다.", "</p><p>최근 연구에 의하면 레이저 조사 에너지의 양에 따른 세포사멸을 관찰하였는데 광역학 치료 시 \\( \\mathrm{IC}_{50} \\) 의 광량 에너지는 세포 고사가, \\( \\mathrm{IC}_{80} \\) 의 광량에서는 세포괴사를 통한 세포사멸이 더 활성을 갖는 것으로 보고되었다.", "본 연구에서 병행 치료 시 나타나는 세포 독성능에 따른 핵의 형태를 관찰 한 결과, genistein을 \\( 50 \\mu \\mathrm{M} \\) 의 농도로 단독처리한 경우 시간에 따라 큰 변화가 나타나지 않았고 광역학 치료를 단독 처리 시 \\( \\mathrm{IC}_{50} \\) 과 \\( \\mathrm{IC}_{80} \\) 모두 apoptotic body는 거의 없으며 시간의존적으로 세포괴사가 나타났다.", "그러나, 광역학 치료를 \\( \\mathrm{IC}_{80} \\) 으로 처리하였을 때 광역학 치료 단독처리와 비교하여 genistein과 병행치료 시 3시간 때부터 약 3배 이상의 apoptotic body를 관찰하였다.", "즉, 광역학 치료와 genistein을 병행 치료 하였을 때 세포고사를 유도하는 것으로 나타났다.", "</p><p>암세포를 치료할 때 사용되는 여러 가지 항암제들은 mitochondria membrane의 손상으로 발생하는 ROS와 밀접한 연관이 있다 광역학 치료는 빛에 의해 활성화된 광감작제 분자와 체내 산소분자에 의해 ROS가 생성된다고 알려져 있다.", "이러한 기전은 type I 반응과 type II 반응으로 나뉘는데 대부분의 광역학 치료기전은 type II 반응이 주로 일어난다.", "Genistein을 항암제와 같이 병행치료를 하였을 때 ROS가 증가하여 세포고사를 유도한다는 보고가 있다.", "본 연구에서 처리하지 않은 세포에 비해 genistein과 광역학 치료를 단독으로 처리하였을 때 세포 내 존재하는 ROS가 각각 증가 하였으며, 병행 치료하였을 때는 더 많은 ROS가 형성되는 것으로 나타났다.", "즉, genistein에 의해 생성된 ROS가 photofrin에 연관된 광역학 치료에 의해 동반되어 증가하는 것으로 보여 진다.", "</p><p>최근 Kim 등은 흑색종 세포에서 genistein을 처리했을 때 Bcl-2의 감소 및 Bax의 증가가 나타났으며, 세포고사 유발에 mitochondria와 연관된 Bcl-2 family발현과 관련이 있다고 보고 하였다.", "또한 genistein이 간암세포에서도 mitochondria의 손상을 주어 ROS를 증가시키고 세포고사를 유도한다고 밝혀졌다.", "선행연구 등에 미루어 볼 때 genistein이 세포 내 ROS를 유발하여 mitochondria가 손상되고, 또한 photofrin에 의한 광역학 치료도 mitochondria을 손상 시켜 세포고사를 유도하는 것으로 추측되어 진다.", "그러나, 이에 대한 정확한 세포사멸기전의 신호전달 현상을 추가연구를 통해 밝혀내야 할 것이다.", "</p><p>인체 두경 부 암세포 주에서 genistein과 광역학 치료를 병행 치료 시 세포 내에 발생하는 ROS에 의해 mitochondria 에 세포손상을 주고 신호 전달을 통해 약 3시간에서 6시간 사이에 세포고사를 유도 하는 것으로 확인하였다.", "부작용을 최소화 할 수 있는 chemopreventive agent인 genistein을 사용함으로써 더 효율적인 광역학 치료를 기대한다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구에서는 두경부 암세포 주에서 genistein의 증식억제 효과를 알아보고, genistein을 광역학 치료와 병행 치료시 나타나는 세포 독성능 및 세포고사 유발에 대해 연구 하였다.", "두경부 암세포 주에서 genistein의 세포독성능을 확인한 결과, 농도 및 시간 의존적으로 세포 독성능이 나타났다.", "이에 genistein을 photofrin을 이용한 광역학 치료와 병행 치료 시 더 많은 세포 독성능이 나타났다.", "Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 형태적 변화는 광역학 치료시에는 주로 세포괴사의 형태가 관찰 되었으나, genistein과 병행 치료 시에는 세포고사가 관찰 되었다.", "시간별로 관찰하였을 때, 광역학 치료를 \\( \\mathrm{IC}_{80} \\) 으로 처리하였을 때 3시간 때에 apoptotic body가 약 3배정도 증가하였다.", "세포 내 ROS를 확인한 결과 genistein과 광역학 치료를 단독으로 처리하였을 때 세포 내 존재하는 ROS가 각각 증가 하였으며, 병행 치료하였을 때는 더 많은 ROS가 형성되는 것으로 나타났다.", "즉, genistein이 세포 내 ROS를 유발하여 mitochondria가 손상되고, 또한 photofrin에 의한 광역학 치료도 mitochondria를 손상시켜 세포고사를 유도하는 것으로 추측되어 진다.", "</p> <h1>결 과</h1><h2>Genistein에 의한 인체 두경부 암세포 증식 억제</h2><p>Genistein이 인체 두경부 암세포의 성장에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해서 AMC-HN3 세포 주에서 세포 독성능을 조사하였다.", "Genistein을 다양한 농도로 \\( (0-1,000 \\mu \\mathrm{M}) \\) 처리한 후 24,48시간 후의 세포 독성능을 확인해본 결과, genistein의 농도 및 시간 의존적으로 세포 증식 억제가 나타났다.", "즉, 인체 두경부 암세포에서 genistein이 세포 증식을 억제시키는 것을 확인하였다.", "</p><h2>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료에 의한 세포 독성능 증가</h2><p>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해서 genistein을 \\( 25\\),\\(50\\),\\(100\\),\\(200\\) \\(\\mu \\mathrm{M} \\) 의 농도로 첨가하고 \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 의 photofrin을 2배 희석법으로 처리 하여 세포 독성능을 확인하였다.", "광역학 치료를 단독으로 처리했을 때는 세포 독성능이 \\( 1.56 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 일 때부터 농도 의존적으로 증식 억제 효과를 관찰할 수 있었다.", "그러나, genistein과 병행 치료하였을 때는 photofrin의 농도가 \\( 1.56 \\mu \\mathrm{g} \\) \\( / \\mathrm{ml} \\) 일 때는 광역학 치료 단독처리에 비해 약 \\( 5 \\% \\) 정도 세포독 성능이 증가하였다.", "그러나 photofrin의 농도가 \\( 3.13 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 이상의 농도에서는 광역학 치료의 단독 처리군과 비슷한 세포 독성능을 나타났다.", "광역학 치료와 genistein과 병행치료 시에는 \\( 1.56 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 에서 세포독성능이 증가한 것으로 나타났다.", "</p><h2>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 세포의 형태적 변화 양상</h2><p>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 세포사멸의 형태학적 변화를 관찰하기 위해서 광역학 치료 1,3,6,12 시간 후 Hoechst 33342 및 PI 염색을 실시하였다.", "광역학 치료시 photofrin의 농도를 \\( 50 \\% \\) inhibition concentration \\( \\left(\\mathrm{IC}_{50}\\right) \\) ) 인 \\( 2 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 과 \\( 80 \\% \\) inhibition concentration \\( \\left(\\mathrm{IC}_{80}\\right) \\) 인 \\( 4 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 로 처리하였을 때는 세포괴사의 형태가 관찰되었으며, apoptotic body는 거의 관찰되지 않았다.", "그러나, photofrin의 농도를 \\( \\mathrm{IC}_{80} \\) 으로 병행 치료한 실험군 에서는 광역학 치료 단독처리군과 비교하였을 때 3시간 경과 시 apoptotic body가 약 3배 정도 증가하여, 6시간까지 계속 증가하고, 12시간 경과 시에는 오히려 세포괴사가 일어났다.", "즉, 세포괴사를 유발하는 광역학 치료를 genistein과 병행 치료 시에 세포고사를 유도하는 것으로 나타났다.", "</p><h2>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 ROS의 동반 증가</h2><p>Genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시 나타나는 세포 내 ROS를 확인하기 위해서 \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{DCF}-\\mathrm{DA} \\) 로 염색해 FACS를 이용해 분석하였다.", "Photofrin의 농도를 \\( \\mathrm{IC}_{50} \\) 과 \\( \\mathrm{IC}_{80} \\) 으로 광역학 치료를 단독 처리한 경우 photofrin 농도 의존적으로 ROS가 증가한 것으로 나타났다.", "또한, genistein을 단독으로 처리한 경우도 대조군과 비교하여 ROS가 증가하였으며, genistein과 광역학 치료의 병행 치료 시에는 genistein을 단독 처리 시 형성된 ROS가 동반 증가한 것으로 나타났다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "AMC-HN3 인체 두경부 암세포에서 genistein photofrin PDT의 병행처리에 의한 세포 독성능의 증가", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-e3419dd8-489a-4427-9166-b70d359adbbb", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "강정욱", "정필상", "신장인", "손승렬", "안진철" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,420	<h1>요 약</h1><p>건조방법(천일, 열풍 및 동결건조)을 달리한 와송의 물과 \( 95 \% \) 에탄올추출물이 지질과산화 억제에 미치는 영향과 대두유와 돈지에 첨가되었을 때 자동산화와 가열산화 조건에서 항산화능을 평가하였다. Linoleic acid 기질에서 지질과산화 억제능은 모든 시료에서 저장기간이 길어질수록 상승하였으며, 물추출물보다 에탄올추출물에서 더 효과적이었다. 건조 방법에 따라서는 열풍건조 \(>\) 동결건조 \(>\) 천일건조 순으로 유의적인 차이를 보였다. \( \mathrm{FeCl}_{2} \) 및 \( \mathrm{CuSO}_{4} \) 첨가시 열풍건조 시료의 에탄올추출물에서 지질과산화 억제능이 가장 높았다. 열풍건조 와송의 에탄올추출물을 대두유 및 돈지에 \( 0.1, 0.5 \) 및 \( 1.0 \mathrm{~g} / 100 \mathrm{~g} \) 으로 첨가하여 \( 60^{\circ} \mathrm{C}\)(28일) 와 \( 180^{\circ} \mathrm{C}\)(48시간)에서 저장하였다. \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 저장할 경우 산가는 저장기간 동안 대두유가 대조구보다 낮았으며, 돈지의 경우 저장초기에는 높았으나, 저장 28일 후에는 대조구 및 BHT 첨가구보다 낮은 값이었다. 아니시딘가 및 과산화물가도 대조구 및 BHT 첨가구보다는 낮은 값을 보였다. \( 180^{\circ} \mathrm{C} \)에서 가열 저장 한 경우에도 이와 유사한 경향이었다. TBA가는 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 저장시 저장기간이 경과함에 따라 대두유에서 상승되었으나, 시료량이 많을수록 증가폭은 적었다. \( 180^{\circ} \mathrm{C} \) 에 저장한 경우에는 36시간 후에 돈지에서 시료량이 많을수록 유의적인 감소를 보였다. 따라서 열풍건조 와송의 에탄올추출물은 지질을 함유한 식품에 항산화제로 적용될 경우 저장기간 및 가열시간에 따른 유지의 산화억제에 유효할 것으로 기대된다.</p> <h2>식용유지에 대한 항산화력 평가</h2><p>와송 열풍건조 에탄올추출물을 대상으로 대두유 및 돈지에 대한 항산화력 평가를 위하여 산가(acid value), 아니시딘가(anisidine value), 과산화물가(peroxide value) 및 TBA가 (thiobarbituric acid value)를 측정하였다. 산가는 유지 \( 2 \mathrm{~g} \) 에 \( 100 \ \mathrm{ml} \) ether-ethanol용액 \( (2: 1=\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 과 \( 5 \% \) phenolphthalein 2-3방울을 가한 후 \( 0.1 \mathrm{~N} \mathrm{KOH} \) 용액으로 적정하였다. 아니시딘가는 \( 5\ \mathrm{ml} \) 의 시료와 iso-octane의 혼합액 \( (1: 49=\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 에 \( 0.25 \% \) p-anisidine시약 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 첨가한 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 암소에서 10분간 반응시켜 \( 350 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시료액 \( 5 \ \mathrm{ml} \) 와 빙초산 \( 1 \ \mathrm{ml} \) 를 가하여 동일하게 수행한 것을 비반응 시험용액으로 하고, 시험용액 대신 trimethylpenthane을 사용하여 실험한 것을 바탕용액으로 하여 이들의 흡광도 값으로부터 산출하였다. 과산화물가는 시료 \( 1 \mathrm{~g} \) 에 chloroform-acetic acid용액 \( (2: 3=\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)\( 20 \mathrm{ml} \) 와 \( 1 \mathrm{ml} \) 포화 \( \mathrm{KI} \) 용액을 넣은 후 5분간 암실에 정치시킨 다음 증류수 \( 6 \mathrm{ml} \) 를 첨가하고 \( 1 \% \) 전분용액을 지시약으로 하여 \( 0.01 \mathrm{~N} \) sodium thiosulfate로 적정하였다. TBA가는 유지에 benzene \( 10 \mathrm{ml} \) 를 혼합하여 용해시킨 후 TBA용액 \( 10 \mathrm{ml} \) 를 가하고 4분간 방치한 다음 아래층을 회수하여 \( 95^{\circ} \mathrm{C} \) water bath 상에서 30분간 가열한 후 빙수 중에서 급냉시켜 \( 530 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>통계 처리</h2><p>각 실험은 5회 이상 반복실험을 통하여 결과를 얻어 SPSS 12.0을 사용하여 통계처리하였으며, 각각의 시료에 대해 평균\(\pm\)표준편차로 나타내었다. 각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 \( \mathrm{p}<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1><p>건조방법(천일, 열풍 및 동결건조)을 달리한 와송의 물과 \\( 95 \\% \\) 에탄올추출물이 지질과산화 억제에 미치는 영향과 대두유와 돈지에 첨가되었을 때 자동산화와 가열산화 조건에서 항산화능을 평가하였다. Linoleic acid 기질에서 지질과산화 억제능은 모든 시료에서 저장기간이 길어질수록 상승하였으며, 물추출물보다 에탄올추출물에서 더 효과적이었다. 건조 방법에 따라서는 열풍건조 \\(>\\) 동결건조 \\(>\\) 천일건조 순으로 유의적인 차이를", "보였다. \\", "( \\mathrm{FeCl}_{2} \\) 및 \\( \\mathrm{CuSO}_{4} \\) 첨가시 열풍건조 시료의 에탄올추출물에서 지질과산화 억제능이 가장 높았다.", "열풍건조 와송의 에탄올추출물을 대두유 및 돈지에 \\( 0.1, 0.5 \\) 및 \\( 1.0 \\mathrm{~g} / 100 \\mathrm{~g} \\) 으로 첨가하여 \\( 60^{\\circ} \\mathrm{C}\\)(28일) 와 \\( 180^{\\circ} \\mathrm{C}\\)(48시간)에서 저장하였다. \\", "( 60^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 저장할 경우 산가는 저장기간 동안 대두유가 대조구보다 낮았으며, 돈지의 경우 저장초기에는 높았으나, 저장 28일 후에는 대조구 및 BHT 첨가구보다 낮은 값이었다.", "아니시딘가 및 과산화물가도 대조구 및 BHT 첨가구보다는 낮은 값을 보였다. \\", "( 180^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 가열 저장 한 경우에도 이와 유사한 경향이었다.", "TBA가는 \\( 60^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 저장시 저장기간이 경과함에 따라 대두유에서 상승되었으나, 시료량이 많을수록 증가폭은 적었다. \\", "( 180^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에 저장한 경우에는 36시간 후에 돈지에서 시료량이 많을수록 유의적인 감소를 보였다.", "따라서 열풍건조 와송의 에탄올추출물은 지질을 함유한 식품에 항산화제로 적용될 경우 저장기간 및 가열시간에 따른 유지의 산화억제에 유효할 것으로 기대된다.", "</p> <h2>식용유지에 대한 항산화력 평가</h2><p>와송 열풍건조 에탄올추출물을 대상으로 대두유 및 돈지에 대한 항산화력 평가를 위하여 산가(acid value), 아니시딘가(anisidine value), 과산화물가(peroxide value) 및 TBA가 (thiobarbituric acid value)를 측정하였다.", "산가는 유지 \\( 2 \\mathrm{~g} \\) 에 \\( 100 \\ \\mathrm{ml} \\) ether-ethanol용액 \\( (2: 1=\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\) 과 \\( 5 \\% \\) phenolphthalein 2-3방울을 가한 후 \\( 0.1 \\mathrm{~N} \\mathrm{KOH} \\) 용액으로 적정하였다.", "아니시딘가는 \\( 5\\ \\mathrm{ml} \\) 의 시료와 iso-octane의 혼합액 \\( (1: 49=\\mathrm{w} / \\mathrm{v}) \\) 에 \\( 0.25 \\% \\) p-anisidine시약 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 첨가한 후 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 암소에서 10분간 반응시켜 \\( 350 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "이때 시료액 \\( 5 \\ \\mathrm{ml} \\) 와 빙초산 \\( 1 \\ \\mathrm{ml} \\) 를 가하여 동일하게 수행한 것을 비반응 시험용액으로 하고, 시험용액 대신 trimethylpenthane을 사용하여 실험한 것을 바탕용액으로 하여 이들의 흡광도 값으로부터 산출하였다.", "과산화물가는 시료 \\( 1 \\mathrm{~g} \\) 에 chloroform-acetic acid용액 \\( (2: 3=\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\)\\( 20 \\mathrm{ml} \\) 와 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 포화 \\( \\mathrm{KI} \\) 용액을 넣은 후 5분간 암실에 정치시킨 다음 증류수 \\( 6 \\mathrm{ml} \\) 를 첨가하고 \\( 1 \\% \\) 전분용액을 지시약으로 하여 \\( 0.01 \\mathrm{~N} \\) sodium thiosulfate로 적정하였다.", "TBA가는 유지에 benzene \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 를 혼합하여 용해시킨 후 TBA용액 \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 를 가하고 4분간 방치한 다음 아래층을 회수하여 \\( 95^{\\circ} \\mathrm{C} \\) water bath 상에서 30분간 가열한 후 빙수 중에서 급냉시켜 \\( 530 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "</p><h2>통계 처리</h2><p>각 실험은 5회 이상 반복실험을 통하여 결과를 얻어 SPSS 12.0을 사용하여 통계처리하였으며, 각각의 시료에 대해 평균\\(\\pm\\)표준편차로 나타내었다.", "각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 \\( \\mathrm{p}<0.05 \\) 수준에서 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "유지 기질에 대한 와송 추출물의 항산화 효과", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-e96636c6-b277-4136-b249-fa9653d68cde", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "이수정", "차지영", "신정혜", "정미자", "성낙주" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,421	<h1>재료 및 방법</h1><p>부산의 황령산(동경 \( 129^{\circ} 04^{\prime} 14^{\prime \prime} \sim 129^{\circ} 06^{\prime} 43^{\prime \prime} \), 북위 \( 35^{\circ} \)\( 08^{\prime} 08^{\prime \prime} \sim 35^{\circ} 10^{\prime} 09^{\prime \prime} \), 해발 약 \( 429 \mathrm{~m} \))에서 5회 즉, 2006년 5월, 2007년 3월, 7월, 9월 및 10월에 집돼지 사체를 각각 1구씩 설치하였다. 부산은 대체로 온화한 지역으로, 각 계절의 평균기온과 습도는 각각 봄(3월~5월) \( 13.0^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 63 \% \), 여름(6월~8월) \( 23.5^{\circ} \mathrm{C} \) 와 \( 81.6 \% \), 가을(9월~11월) \( 16.9^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 66.3 \% \), 겨울(12월~2월) \( 4.3^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 52.5 \% \)로서 네 계절이 뚜렷하다.</p><p>실험에 사용한 집돼지 다섯 마리의 무게는 각각 \( 17 \sim 25 \)\( \mathrm{kg} \)로서, 매 실험마다 집돼지를 도축한 직후 실험장소의 지상에 설치하고, \( 15 \mathrm{mm} \) 간격의 철망 \( (80 \mathrm{cm} \times 40 \mathrm{cm} \times 40 \mathrm{cm}) \)을 덮어 다른 포식동물들의 접근을 막았다. 한편 제 2차 실험인 2007년 3월 실험부터는 이전 실험으로 인한 환경변화로부터의 영향을 최소화하기 위해서, 사체를 직전 실험장소로부터 \( 30 \mathrm{m} \)이상 떨어진 장소에 설치하였다.</p><p>사체의 부패단계는 Moon과 Moon에 따라 다음의 5단계로 나누었다.</p><p>주검발생 단계(Fresh stage): 일반적으로 사체가 사망한 직후를 말하며, 이때 사체는 외형적 변화가 거의 없고 사체의 온도는 주변의 기온과 비슷하며 냄새가 거의 나지 않는다.</p><p>팽창단계(Bloated stage): 사체 내부의 박테리아나 원생동물들의 활동으로 부패가 시작되어 가스가 생성되며, 이로 인해 사체의 복부가 팽창되며, 악취가 나기 시작한다. 사체의 온도가 외부기온보다 높아지기 시작하며, 사체의 무게는 조금씩 감소하기 시작한다.</p><p>부패단계(Decay stage): 사체의 부패속도가 빨라지고 파리 유충들의 섭식활동이 일어나는 시기로서, 부패와 곤충의 섭식활동으로 인해 복부에 구멍이 똟리고 가스가 빠져 나가며, 사체의 악취가 심해지고 사체의 무게가 급격하게 감소하며, 사체의 내부 온도는 최고로 올라간다.</p><p>건조단계(Dry stage): 사체에서 뼈와 연골, 피부과 털을 제외한 대부분의 조직들이 사라지고 무게의 감소율이 떨어지며, 사체의 온도는 주위 기온과 비슷해진다. 악취는 점점 감소한다.</p><p>백골화단계(Bonified stage): 피부 외 다른 조직들도 포식되거나 부패하여 뼈만 남은 상태를 말한다. 악취는 매우 감소하거나 나지 않는다.</p><p>각 사체의 무게와 온도 및 주변의 온도를 실험개시일로부터 처음 10일 까지는 매일, 20일째 까지는 2일 간격으로, 그 이후는 3~5일 간격으로 측정하였다. 사체의 무게는 이동용 저울(HS-25K, Basco Co. China)을 이용하여 측정하였고, 사체의 온도와 외부 온도는 Dallas semiconductor사의 자동온도기록장치(Data logger, Thermochron iButton \( { }^{\mathrm{TM}} \) : DS1921L-F51, Dallas semiconductor Co., Lst., USA)를 이용하였다. 한편, 제 1차 실험을 위하여 2006년 5월에 설치한 사체에 대해서는 사체의 무게와 사체의 온도 및 주변의 온도를 측정하지 못했으며, 건조단계 이후에는 주변의 토목공사로 인해 실험장소가 폐쇄됨으로써 사체를 관찰할 수 없었다. 또한 제 4차 실험을 위하여 2007년 9월에 설치한 사체의 경우 태풍 '나리'로 인해 자동온도기록장치가 유실되어 사체의 온도를 측정하지 못하였다.</p><p>각 사체 설치 직후 모여드는 곤충을 각 단계별로 포충망을 사용하여 사체 주변에서 채집하였다. 또한 사체에서 \(10 \mathrm{cm} \) 떨어진 곳에 \( 10 \sim 15 \mathrm{cm} \) 깊이로 pitfall trap 4개를 설치하였고, 일부 기어 다니는 성충과 유충들은 핀셋을 이용하여 직접 채집하였다. 채집된 표본들 중 성충들은 \( 70 \% \) 알코올에 넣어 보관하였고, 유충들은 끓는 물에 담근 후 \( 70 \% \) 알코올에 보관하였다. 사체 관찰 개시 처음 10일간(1~10일)은 하루에 한번씩, 그 이후 10일간(11~20일)은 2일에 한번씩, 21 일 이후(~115일)는 4~10일 간격으로 사체를 방문하여 관찰되는 거의 모든 곤충을 채집하였다. 표본의 동정을 위해서 Lee의 한국곤충생태도감을 참조하였다.</p> <h2>곤충상의 변화</h2><p>본 연구 결과, 사체에 많이 모이는 곤충들의 종류는 주로 파리목 검정파리과와 딱정벌레목 반날개과의 곤충이지만, 계절에 따라 많이 나타나는 곤충의 종류가 변하는 것을 알 수 있었다. 즉, 봄철인 2007년 3월과 2006년 5월, 가을철인 2007년 10월에는 검정파리과(2006년 5월, \(43.6\%\); 2007년 3월, \(44.2\%\); 2007년 10월 \(49.1\%\))의 곤충이, 여름철인 2007년 7월에는 검정 파리과(\(28.1\%\))와 반날개과(\(28.1\%\))가 유사한 정도로 많이 나타나며, 9월에는 반날개과(\(64.2\%\))의 곤충이 가장 많이 나타났다.</p><p>한편 대부분의 법의곤충학적 연구에서 파리목의 곤충이 사체에 가장 먼저 도착하는 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서도 모든 실험 기간을 통해서 가장 먼저 사체에 도착하는 곤충은 파리목의 곤충이었다. 즉, 2006년 5월에는 검정파리과에 속하는 금파리속의 1종이, 2007년 3월에는 금파리속의 1종과 큰검정파리가, 2007년 7월에는 금파리속의 1종과 쉬파리과 쉬파리속의 1종이, 2007년 9월과 10월에는 구리금파리가 각각 가장 먼저 도착하여 주로 검정파리과 곤충이 사체에 가장 먼저 접근함이 밝혀졌다. Lim의 연구에서도 검정파리과의 곤충들이 가장 먼저 도착하는 종들임이 보고된 바 있고, 종류는 다르지만 하와이에서도 검정파리과에 속하는 Chrusomya megacephala와 Chrsomya rufifacies가 가장 먼저 도착하며, 콜롬비아(안데스산맥 고원지대, \( 3,000\mathrm{m} \)이상)에서도 검정파리과에 속하는 Calliphora nigribasis, Compsomyiops vrerna, Dasumorellia seguyi, Famma sp. 및 Limnophora sp.가 가장 먼저 도착하는 종으로 알려져 있다. 그러나 콜롬비아의 또 다른 지역(콜롬비아 메를린, 해발 \( 1,450 \mathrm{m} \))에서 수행된 연구에서는 쉬파리과와 집파리과의 곤충들이 사체주위에 가장 먼저 나타나, 사체에 가장 먼저 도착하는 파리종류는 지역적으로 차이가 있음을 알 수 있다.</p><p>본 연구에서 검정파리과의 곤충들은 사체에 가장 먼저 도착하는 종류일 뿐 아니라, 부패초기 즉 주검발생단계부터 팽창 단계에 이르기까지 가장 많이 관찰되는 종류로서, 부산지역에서 수행된 오징어와 흰쥐를 이용한 연구, 경남지방에서 닭고기, 돼지고기 및 쇠고기를 이용한 연구, 미국 버지니아주에서 집돼지를 이용한 연구, 콜롬비아 안데스산맥의 고원에서 집돼지를 이용한 연구에서도 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 검정파리과는 사체부패초기의 지표곤충으로 이용될 수 있음이 확인되었다. 그러나 검정파리과의 개체 수는 계절에 따라 변화하여 2007년 3월에 가장 많으며, 2006년 5월 >2007년 7월 >2007년 10월 >2007년 9월의 순으로 감소되는 점으로부터 검정파리과 곤충은 이른 봄에 활동이 가장 활발함을 알 수 있었다.</p><p>한편 부패후기 즉 부패단계로부터 백골화단계까지는 2007년 3월을 제외한 전 실험기간 즉, 2006년 5월과 2007년 7월, 9월 및 10월에는 포식성인 딱정벌레목 반날개과의 곤충이 다수 관찰되며, 따라서 5월 이후의 부패후기 지표곤충은 반날개과의 곤충들임이 밝혀졌다. 한편 부패후기에 나타나는 반날개과 곤충의 개체수는 계절에 따라 변화하여 2007년 9월 >2007년 7월 >2006년 5월 >2007년 3월 >2007년 10월의 순으로 많이 채집되는 점으로부터 반날개과가 여름에는 활동이 활발하지만 봄과 가을에 활동이 감소함을 알 수 있었다. 부패후기에 반날개과가 많이 출현하는 경향은 Goff 와 Flynn, Kimberly 등 및 Lim의 연구에서도 보고된 바 있는데, 부패단계에 따라 많이 나타나는 곤충이 다른 이유로서, 부패 초기에는 검정파리과, 쉬파리과, 집파리과 등, 부패물이나 사체를 주식으로 하는 시식성 곤충들이 모이지만, 파리목의 곤충들의 유충이 부화된 부패후기에는 파리유충들을 포식하기위한, 반날개과 등의 포식성 곤충들이 사체에 접근하기 때문이라고 생각되었다. 반날개과가 주로 파리유충을 먹는 포식성 곤충임은 Reed에 의해서 보고된 바 있다. 한편, 2007년 3월의 경우 부패후기에 반날개과도 다수 나타나지만, 파리목에 속하는 집파리과가 가장 많이 관찰되는데, 이 시기의 주위 온도는 다른 실험기간에 비해 낮고, 따라서 부패가 오랫동안 지속됨으로 인해 파리목의 곤충이 출현하는 기간이 길어져서 포획된 개체수가 증가한 것으로 생각되었다.</p><p>이상으로부터 사체의 부패속도는 주위의 온도, 기후변화 및 유충의 부화량의 영향을 받으며, 또한 사체에 모여드는 곤충은 사체의 부패초기에는 시식성 곤충이 많이 나타나지만 부패 후기에는 주로 포식성 곤충이 많이 모여드는 것으로 밝혀졌다. 따라서 사체의 부패정도나 채집된 곤충을 사후경과시간을 유추하기 위한 자료로 사용하기 위해서는 사건발생지역의 기후적 요인 및 서식하는 곤충들의 생태가 고려되어야 하는 것으로 생각되었다.</p> <h1>고 찰</h1><h2>사체의 부패 속도, 무게 및 온도 변화</h2><p>사체의 부패 속도에 영향을 미치는 요인으로서 온도, 습도, 강수량, 토양의 산도, 사체의 외상, 곤충들의 접근용이성, 매장된 깊이, 육식동물과 설치동물의 활동, 사체의 크기와 무게, 사체가 놓여진 곳의 표면상태, 의복류, 방부처리 등이 있다고 보고된 바 있다.</p><p>본 연구결과 사체가 백골화 직전 단계에 이르기까지 주위 온도가 비교적 낮은 2007년 3월(주위 온도 \( 10 \sim 26^{\circ} \mathrm{C} \), 평균 \( 17^{\circ} \mathrm{C} \) )에는 113일, 2006년 5월(주위 온도 \( 10.5 \sim 28^{\circ} \mathrm{C} \), 평균 \(17.8^{\circ} \mathrm{C} \))에는 54일이, 주위 온도가 높아진 7월(주위 온도 \(20 \sim 31^{\circ} \mathrm{C} \), 평균 \( \left.24.5^{\circ} \mathrm{C}\right) \)과 9월(주위 온도 \( 20 \sim 29^{\circ} \mathrm{C} \), 평균 \( 24.8^{\circ} \mathrm{C} \))에는 각각 7일과 12일이 걸렸으며, 다시 주위 온도가 낮아진 10월 (주위 온도 \( 14.5 \sim 26^{\circ} \mathrm{C} \), 평균 \(19.8^{\circ}\mathrm{C}\))에는 53일 이상이 걸려, 사체의 부패속도는 주위의 온도가 높을수록 빠르게 진행됨을 알 수 있었다. 이러한 경향은 열대성 기후지역 또는 남반구에 위치한 지역의 연구에서도 보고된 바 있는데, 하와이의 오하우섬에서 7월(여름, 평균기온 \( 29.4^{\circ} \mathrm{C} \) )에 수행된 연구에서 백골화직전 단계까지 약 20일이 걸렸으며, 남반구 아르헨티나의 부에노스아이레스에서 실행 된 연구에서 여름 (최고 \( 40^{\circ} \mathrm{C}\)) 에 는 약 16일, 겨울(최고 \( 17 \sim 18^{\circ} \mathrm{C}\))에는 약 63일이, 콜롬비아의 메를린(주위 온도 \( 20 \sim 24.5^{\circ} \mathrm{C}\))과 안데스산맥의 고산지대(주위 온도 \( 10 \sim 22^{\circ} \mathrm{C}\))에서 수행된 연구에서는 각각 51일이 걸렸다고 보고된 바 있다.</p><p>사체의 부패속도에 영향을 주는 또 하나의 중요한 요인으로서 사체에 모여드는 포식자의 섭식활동에 의한 영향을 들 수 있다. 사체의 부패속도에 영향을 주는 포식자로서 박테리아, 원생동물 및 부화된 시식성 파리유충 등을 들 수 있는데, 이들의 활동이 활발할수록 사체 내부의 온도가 상승함이 알려져 있다. 본 연구에서도 이들의 활동이 가장 활발한 부패단계 또는 건조단계의 사체 온도가 주위 온도보다 각각 최고 \(5\sim20^{\circ} \mathrm{C}\) 높은 점이 이를 뒷받침하고 있다. 한편, 2007년 10월 중의 사체 온도(최고\( 40^{\circ} \mathrm{C}\))가 2007년 7월 (최고 \( 31^{\circ} \mathrm{C}\))에 비해 더 상승한 것은 흥미로우며, 이는 10월 중에는 비가 거의 내리지 않아 유충의 섭식활동이 지속적으로 활발하게 진행된 반면, 7월 중에는 유충들이 10월과 유사한 정도로 대량 부화했음에도 불구하고, 자주 내린 비에 의해서 유충 또는 박테리아 등의 활동이 억제되어 사체 온도가 상승하지 못한 것이라고 생각되었다.</p> <h1>결 과</h1><h2>사체의 부패 기간, 무게 및 온도의 변화</h2><p>각 실험기간 중에 측정된 주위 온도와 강수량은 각각 2006년 5월에는 \( 10.5 \sim 28^{\circ} \mathrm{C} \) (평균 \( 17.8^{\circ} \mathrm{C} \), 기상청, 2006 자료 참고)와 \( 504.8 \mathrm{~mm}, 2007 \) 년 3월에는 \( 10 \sim 26^{\circ} \mathrm{C}\left(\right. \) 평균 \( 17.0^{\circ} \mathrm{C} \), 이하 실측기온)와 \( 531.2 \mathrm{~mm}, 2007 \) 년 7월에는 \( 20 \sim 31^{\circ} \mathrm{C}\left(\right. \) 평균 \( \left.24.5^{\circ} \mathrm{C}\right) \)와 \( 85.50 \mathrm{~mm}, 2007 \) 년 9월에는 \( 20.5 \sim 29.5^{\circ}\mathrm{C}\left(\right. \) 평균 \( \left.24.8^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 와 \( 113 \mathrm{~mm}, 2007 \) 년 10 월에는 \( 14.5 \sim 26^{\circ} \mathrm{C}\left(\right. \) 평균 \( \left.19.8^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 와 \( 35.5 \)\( \mathrm{mm} \) 를 기록하였다(Fig. 1 5). 한편 2006년 5월에 설치한 사체의 경우 주검발생단계, 팽창단계, 부패단계 및 건조단계 별로 각각 3일, 5일, 3일 및 43일이상이 걸려 총 54일 이상이 경과되었으며, 2007년 3월에는 5일, 9일, 26일 및 73일이 걸려 총 113일이, 2007년 7월에는 2일, 2일, 2일 및 1일이 걸려 총 7일이, 2007년 9월에는 3일, 2일, 2일 및 5일로 총 12일이, 2007년 10월에는 주검발생단계, 팽창단계 및 부패단계 별로 각각 4일, 3일 및 3일이 걸렸으며, 건조단계는 40일 이상으로서 총 50일 이상이 걸렸다(Table 1). 한편 사체의 무게는 2007년 3월, 7월, 9월 및 10월 모두, 팽창단계부터 감소하기 시작해서 부패 단계에서 급감하는 현상을 나타내었고, 사체가 거의 부패하여 사체의 무게가 약 1 / 10로 감소하는데 걸리는 기간은 2007년 3월에는 약 90일, 2007년 7월에는 약 7일, 2007년 9월에는 약 16일, 2007년 10월에는 약 16일이 걸려, 7월에 무게가 가장 빨리 감소함을 알 수 있었다(Fig. 2 5).</p><p>사체의 온도 변화를 비교하면 2007년 3월, 7월 및 10월 모두 팽창단계부터 온도가 상승하기 시작해서 부패단계에 최고 온도를 나타내어 주변의 온도보다 \(5\sim 20^{\circ} \mathrm{C} \) 높게 상승하였다(Fig.2, 3, 5). 또한 10월에 설치한 사체의 최고 온도 \( \left(40^{\circ} \mathrm{C}\right) \)는 3월 \( \left(25^{\circ} \mathrm{C}\right) \)과 7월에 설치한 사체 \( \left(31^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에 비해 더 높았다.</p><h2>곤충상의 변화</h2><p>5차에 걸친 실험 기간을 통해서 총 7목 28과 48종 1,157개체의 곤충들이 채집되었으며, 모든 실험 시기에 파리의 유충이 주검발생단계부터 관찰되기 시작해서 부패단계에 사체에 대부분을 덮을 정도로 증가하며 건조단계 이후 감소하였다. 각 실험시기에 대한 곤충상의 변화를 Table 2~6에 제시하였다.</p><h3>2006년 5월</h3><p>위에서 언급한 바와 같이 사체 설치 후 건조단계가 진행되는 도중에 조사장소가 폐쇄되어, 그 이후의 관찰은 불가능했다. 사체설치 후 건조단계 도중까지 4목 17과 24종이 채집되었고, 벌목(Hymenoptera) 개미과(Formicidae)의 2종이 관찰되었다(Table 2). 파리목(Diptera) 검정파리과(Calliphoridae)의 금파리속의 1종(Lucilia sp.a)이 가장 먼저 도착했고, 검정파리과(2종, 123개체, 43.6\%)와 집파리과(Muscidae, 2종, 45개체, \( 16 \% \) )의 곤충이 다수 채집되었다. 건조단계의 곤충상이 가장 다양하였으며, 부패단계까지는 검정파리과가 많이 보였지만, 건조단계에는 딱정벌레과(Carabidae), 풍뎅이붙이과(Histeridae), 반날개과(Staphylinidae) 등 딱정벌레목(Coleoptera)의 곤충들이 많이 관찰되었다.</p><h3>2007년 3월</h3><p>5목 14과 28종이 채집되었고, 검정파리과의 금파리속의 1종(Lucilia sp.a)과 큰검정파리(Calliphora lata)가 가장 먼저 도착 했으며, 검정파리과(7종, 231개체, \(44.2\%\))와 집파리과(3종, 221 개체, \( 42.2 \%) \) 의 곤충이 다수 채집되었다(Table 3). 부패단계의 곤충상이 가장 다양했으며, 팽창단계까지는 검정파리과가 많았지만 부패단계 이후에는 집파리과가 가장 많이 관찰되었다.</p><h3>2007년 7월</h3><p>4목 14과 21종이 채집되었고, 검정파리과 금파리속의 1종 (Lucilia sp.a)과 쉬파리과(Sarcophagidae) 쉬파리속의 1종(Parasarcophaga sp.a)이 가장 먼저 도착했으며, 딱정벌레목의 반날개과(3종, 45개체, \(28.1\%\))와 파리목의 검정파리과(4종, 45 개체, \(28.1\%\))가 다수 채집되었다(Table 4). 나타나는 종수가 2006년 5월과 2007년 3월에 비해 감소하였고, 특히 부패단계에 더욱 감소했다. 팽창단계까지는 검정파리과가 많이 나타나지만, 부패단계 이후에는 딱정벌레목이 많이 나타났다. 즉, 부패단계와 건조단계에는 반날개과가, 백골화단계에는 풍뎅이붙이과가 가장 많이 관찰되었다.</p><h3>2007년 9월</h3><p>4목 12과 13종이 채집되었고, 검정파리과의 구리금파리(Lucilia sericata)가 가장 먼저 도착했으며, 반날개과(3종, 77개체, \( 64.2 \% \))가 가장 많이 채집되었다(Table 5). 나타나는 종수가 이전 실험기간들에 비해서 매우 감소했으며, 특히 팽창단계와 부패단계에는 2~3종 만이 보였고, 백골화단계에는 전혀 관찰되지 않았다. 검정파리과가 주검발생단계에는 가장 많이 관찰되었지만, 팽창단계부터 건조단계까지는 반날개과가 가장 많이 나타났다. 특히 건조단계에는 반날개과 등, 딱정벌레목의 곤충이 주로 포획되었고, 말벌과(Vespidae)의 말벌(Vespa crabro)이 비교적 많이 채집된 점도 특징적이었다.</p><h3>2007년 10월</h3><p>3목 7과 8종이 채집되었고, 검정파리과의 구리금파리(Lucilia sericata)가 가장 먼저 도착했으며, 검정파리과(2종, 28개체, \( 49.1 \% \))와 말벌과(1종, 9개체, \( 15.8 \% \))가 많이 채집되었다 (Table 6). 이 기간 중에는 관찰되는 종수가 가장 적었고, 검정 파리과가 전 기간동안 가장 많이 관찰되었다. 반날개과가 부패단계부터 나타났었고, 말벌이 전 기간 중에 나타난 점이 특징적이었다.</p> <h1>서 론</h1><p>사체는 곤충에 있어 중요한 먹이공급원인데, 사체의 사후 경과시간에 따라 사체에 모여드는 곤충들의 종류가 달라, 사체주변에서 채집되는 곤충들은 사체의 사망시간을 추정하는 법의학적 증거로 이용될 수 있다. 일반적으로 법의학에서 사후경과시간(postmortem interval, PMI)을 추정하기 위한 방법으로는 사체의 체온을 측정하거나 안구 내 칼륨의 수치를 확인하는 방법 등이 쓰여 왔지만 사후 72시간이 지난 후에는 이런 측정치를 사용할 수 없으므로 법의곤충학적 연구가 때로는 사망시간을 측정할 수 있는 유일한 방법이 되기도 한다.</p><p>법의곤충학적 증거는 프랑스에서 1850년에 최초로 법률상 증거로 채택되었는데, 이후 법의곤충학에 대한 연구는 점차 증가하였고, 현재 유럽 및 미국, 캐나다, 남미 일부에서 이 방면의 연구가 활발하게 진행 중에 있다. 법의곤충학적 연구를 위해서는 주로 집돼지(Sus scrofa)가 이용되는데 집돼지는 피부에 털이 적어 비교적 넓은 면적이 노출되어 있고, 잡식성이어서 소화기관의 구조가 사람과 유사하며, 더욱이 손쉽게 구할 수 있는 실험 재료이므로 법의학적 연구에 많이 사용된다. 한편 우리나라에서는 법의곤충학적 연구로서 물고기나 토끼, 새 등을 이용하여 실험한 소수의 연구가 있을 뿐이며, 집돼지 등 인간의 크기에 근접한 동물을 이용한 논문은 아직까지는 보고된 바 없다.</p><p>본 연구의 목적은 집돼지(Sus scrofa)를 계절별(봄~가을)로 설치하여 환경에 따른 사체부패의 속도를 알아보고, 각 계절별로 채집된 곤충들의 천이패턴을 조사하여 사체의 사후 경과시간을 추정하기 위한 법의곤충학적 자료를 얻는데 있다.</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구는 집돼지 사체주위에서 채집되는 곤충의 천이패턴을 이용해서 사체의 사후경과시간을 추정하기 위한, 법의학적 증거모델을 제시하고자 수행되었다. 사체의 주변에서 총 7목 28과 48종의 곤충이 채집되었는데, 계절에 따라 많이 나타나는 곤충이 변하여 3월, 5월 및 10월에는 검정파리과가, 7월에는 검정파리과와 반날개과가 같은 비율로, 9월에는 반날개과가 많이 관찰되었다. 검정파리과 곤충은 모든 실험을 통해서 사체에 가장 먼저 도착하는 곤충이며 또한, 부패초기의 지표 곤충임이 밝혀졌다. 그러나 부패후기의 지표곤충은 3월을 제외한 나머지 연구기간 중에는 반날개과, 3월에는 집파리과였는데, 3월에는 낮은 온도로 인해서 사체 부패 기간이 오랫동안 지속되었으므로 사체 주위에 모여든 집파리과의 개체수도 증가한 것으로 생각되었다. 이상으로부터 사체의 사후경과시간을 유추하기 위해서는 사체의 부패 정도나 사체 주변에 나타나는 곤충 뿐 아니라, 조사 지역의 기후 조건도 고려해야 할 것으로 생각되었다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><p>부산의 황령산(동경 \\( 129^{\\circ} 04^{\\prime} 14^{\\prime \\prime} \\sim 129^{\\circ} 06^{\\prime} 43^{\\prime \\prime} \\), 북위 \\( 35^{\\circ} \\)\\( 08^{\\prime} 08^{\\prime \\prime} \\sim 35^{\\circ} 10^{\\prime} 09^{\\prime \\prime} \\), 해발 약 \\( 429 \\mathrm{~m} \\))에서 5회 즉, 2006년 5월, 2007년 3월, 7월, 9월 및 10월에 집돼지 사체를 각각 1구씩 설치하였다.", "부산은 대체로 온화한 지역으로, 각 계절의 평균기온과 습도는 각각 봄(3월~5월) \\( 13.0^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 와 \\( 63 \\% \\), 여름(6월~8월) \\( 23.5^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 와 \\( 81.6 \\% \\), 가을(9월~11월) \\( 16.9^{\\circ} \\mathrm{C} \\)와 \\( 66.3 \\% \\), 겨울(12월~2월) \\( 4.3^{\\circ} \\mathrm{C} \\)와 \\( 52.5 \\% \\)로서 네 계절이 뚜렷하다.", "</p><p>실험에 사용한 집돼지 다섯 마리의 무게는 각각 \\( 17 \\sim 25 \\)\\( \\mathrm{kg} \\)로서, 매 실험마다 집돼지를 도축한 직후 실험장소의 지상에 설치하고, \\( 15 \\mathrm{mm} \\) 간격의 철망 \\( (80 \\mathrm{cm} \\times 40 \\mathrm{cm} \\times 40 \\mathrm{cm}) \\)을 덮어 다른 포식동물들의 접근을 막았다.", "한편 제 2차 실험인 2007년 3월 실험부터는 이전 실험으로 인한 환경변화로부터의 영향을 최소화하기 위해서, 사체를 직전 실험장소로부터 \\( 30 \\mathrm{m} \\)이상 떨어진 장소에 설치하였다.", "</p><p>사체의 부패단계는 Moon과 Moon에 따라 다음의 5단계로 나누었다.", "</p><p>주검발생 단계(Fresh stage): 일반적으로 사체가 사망한 직후를 말하며, 이때 사체는 외형적 변화가 거의 없고 사체의 온도는 주변의 기온과 비슷하며 냄새가 거의 나지 않는다.", "</p><p>팽창단계(Bloated stage): 사체 내부의 박테리아나 원생동물들의 활동으로 부패가 시작되어 가스가 생성되며, 이로 인해 사체의 복부가 팽창되며, 악취가 나기 시작한다.", "사체의 온도가 외부기온보다 높아지기 시작하며, 사체의 무게는 조금씩 감소하기 시작한다.", "</p><p>부패단계(Decay stage): 사체의 부패속도가 빨라지고 파리 유충들의 섭식활동이 일어나는 시기로서, 부패와 곤충의 섭식활동으로 인해 복부에 구멍이 똟리고 가스가 빠져 나가며, 사체의 악취가 심해지고 사체의 무게가 급격하게 감소하며, 사체의 내부 온도는 최고로 올라간다.", "</p><p>건조단계(Dry stage): 사체에서 뼈와 연골, 피부과 털을 제외한 대부분의 조직들이 사라지고 무게의 감소율이 떨어지며, 사체의 온도는 주위 기온과 비슷해진다.", "악취는 점점 감소한다.", "</p><p>백골화단계(Bonified stage): 피부 외 다른 조직들도 포식되거나 부패하여 뼈만 남은 상태를 말한다.", "악취는 매우 감소하거나 나지 않는다.", "</p><p>각 사체의 무게와 온도 및 주변의 온도를 실험개시일로부터 처음 10일 까지는 매일, 20일째 까지는 2일 간격으로, 그 이후는 3~5일 간격으로 측정하였다.", "사체의 무게는 이동용 저울(HS-25K, Basco Co. China)을 이용하여 측정하였고, 사체의 온도와 외부 온도는 Dallas semiconductor사의 자동온도기록장치(Data logger, Thermochron iButton \\( { }^{\\mathrm{TM}} \\) : DS1921L-F51, Dallas semiconductor Co., Lst., USA)를 이용하였다.", "한편, 제 1차 실험을 위하여 2006년 5월에 설치한 사체에 대해서는 사체의 무게와 사체의 온도 및 주변의 온도를 측정하지 못했으며, 건조단계 이후에는 주변의 토목공사로 인해 실험장소가 폐쇄됨으로써 사체를 관찰할 수 없었다.", "또한 제 4차 실험을 위하여 2007년 9월에 설치한 사체의 경우 태풍 '나리'로 인해 자동온도기록장치가 유실되어 사체의 온도를 측정하지 못하였다.", "</p><p>각 사체 설치 직후 모여드는 곤충을 각 단계별로 포충망을 사용하여 사체 주변에서 채집하였다.", "또한 사체에서 \\(10 \\mathrm{cm} \\) 떨어진 곳에 \\( 10 \\sim 15 \\mathrm{cm} \\) 깊이로 pitfall trap 4개를 설치하였고, 일부 기어 다니는 성충과 유충들은 핀셋을 이용하여 직접 채집하였다.", "채집된 표본들 중 성충들은 \\( 70 \\% \\) 알코올에 넣어 보관하였고, 유충들은 끓는 물에 담근 후 \\( 70 \\% \\) 알코올에 보관하였다.", "사체 관찰 개시 처음 10일간(1~10일)은 하루에 한번씩, 그 이후 10일간(11~20일)은 2일에 한번씩, 21 일 이후(~115일)는 4~10일 간격으로 사체를 방문하여 관찰되는 거의 모든 곤충을 채집하였다.", "표본의 동정을 위해서 Lee의 한국곤충생태도감을 참조하였다.", "</p> <h2>곤충상의 변화</h2><p>본 연구 결과, 사체에 많이 모이는 곤충들의 종류는 주로 파리목 검정파리과와 딱정벌레목 반날개과의 곤충이지만, 계절에 따라 많이 나타나는 곤충의 종류가 변하는 것을 알 수 있었다.", "즉, 봄철인 2007년 3월과 2006년 5월, 가을철인 2007년 10월에는 검정파리과(2006년 5월, \\(43.6\\%\\); 2007년 3월, \\(44.2\\%\\); 2007년 10월 \\(49.1\\%\\))의 곤충이, 여름철인 2007년 7월에는 검정 파리과(\\(28.1\\%\\))와 반날개과(\\(28.1\\%\\))가 유사한 정도로 많이 나타나며, 9월에는 반날개과(\\(64.2\\%\\))의 곤충이 가장 많이 나타났다.", "</p><p>한편 대부분의 법의곤충학적 연구에서 파리목의 곤충이 사체에 가장 먼저 도착하는 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서도 모든 실험 기간을 통해서 가장 먼저 사체에 도착하는 곤충은 파리목의 곤충이었다. 즉, 2006년 5월에는 검정파리과에 속하는 금파리속의 1종이, 2007년 3월에는 금파리속의 1종과 큰검정파리가, 2007년 7월에는 금파리속의 1종과 쉬파리과 쉬파리속의 1종이, 2007년 9월과 10월에는 구리금파리가 각각 가장 먼저 도착하여 주로 검정파리과 곤충이 사체에 가장 먼저 접근함이 밝혀졌다. Lim의 연구에서도 검정파리과의 곤충들이 가장 먼저 도착하는 종들임이 보고된 바 있고, 종류는 다르지만 하와이에서도 검정파리과에 속하는 Chrusomya megacephala와 Chrsomya rufifacies가 가장 먼저 도착하며, 콜롬비아(안데스산맥 고원지대, \\( 3,000\\mathrm{m} \\)이상)에서도 검정파리과에 속하는 Calliphora nigribasis, Compsomyiops vrerna, Dasumorellia seguyi, Famma sp. 및 Limnophora sp.가 가장 먼저 도착하는 종으로 알려져 있다. 그러나 콜롬비아의 또 다른 지역(콜롬비아 메를린, 해발 \\( 1,450 \\mathrm{m} \\))에서 수행된 연구에서는 쉬파리과와 집파리과의 곤충들이 사체주위에 가장 먼저 나타나, 사체에 가장 먼저 도착하는 파리종류는 지역적으로 차이가 있음을 알 수 있다.</p><p>본 연구에서 검정파리과의 곤충들은 사체에 가장 먼저 도착하는 종류일 뿐 아니라, 부패초기 즉 주검발생단계부터 팽창 단계에 이르기까지 가장 많이 관찰되는 종류로서, 부산지역에서 수행된 오징어와 흰쥐를 이용한 연구, 경남지방에서 닭고기, 돼지고기 및 쇠고기를 이용한 연구, 미국 버지니아주에서 집돼지를 이용한 연구, 콜롬비아 안데스산맥의 고원에서 집돼지를 이용한 연구에서도 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 검정파리과는 사체부패초기의 지표곤충으로 이용될 수 있음이 확인되었다. 그러나 검정파리과의 개체 수는 계절에 따라 변화하여 2007년 3월에 가장 많으며, 2006년 5월 >2007년 7월 >2007년 10월 >2007년 9월의 순으로 감소되는 점으로부터 검정파리과 곤충은 이른 봄에 활동이 가장 활발함을 알 수 있었다.</p><p>한편 부패후기 즉 부패단계로부터 백골화단계까지는 2007년 3월을 제외한 전 실험기간 즉, 2006년 5월과 2007년 7월, 9월 및 10월에는 포식성인 딱정벌레목 반날개과의 곤충이 다수 관찰되며, 따라서 5월 이후의 부패후기 지표곤충은 반날개과의 곤충들임이 밝혀졌다. 한편 부패후기에 나타나는 반날개과 곤충의 개체수는 계절에 따라 변화하여 2007년 9월 >2007년 7월 >2006년 5월 >2007년 3월 >2007년 10월의 순으로 많이 채집되는 점으로부터 반날개과가 여름에는 활동이 활발하지만 봄과 가을에 활동이 감소함을 알 수 있었다.", "부패후기에 반날개과가 많이 출현하는 경향은 Goff 와 Flynn, Kimberly 등 및 Lim의 연구에서도 보고된 바 있는데, 부패단계에 따라 많이 나타나는 곤충이 다른 이유로서, 부패 초기에는 검정파리과, 쉬파리과, 집파리과 등, 부패물이나 사체를 주식으로 하는 시식성 곤충들이 모이지만, 파리목의 곤충들의 유충이 부화된 부패후기에는 파리유충들을 포식하기위한, 반날개과 등의 포식성 곤충들이 사체에 접근하기 때문이라고 생각되었다.", "반날개과가 주로 파리유충을 먹는 포식성 곤충임은 Reed에 의해서 보고된 바 있다.", "한편, 2007년 3월의 경우 부패후기에 반날개과도 다수 나타나지만, 파리목에 속하는 집파리과가 가장 많이 관찰되는데, 이 시기의 주위 온도는 다른 실험기간에 비해 낮고, 따라서 부패가 오랫동안 지속됨으로 인해 파리목의 곤충이 출현하는 기간이 길어져서 포획된 개체수가 증가한 것으로 생각되었다.", "</p><p>이상으로부터 사체의 부패속도는 주위의 온도, 기후변화 및 유충의 부화량의 영향을 받으며, 또한 사체에 모여드는 곤충은 사체의 부패초기에는 시식성 곤충이 많이 나타나지만 부패 후기에는 주로 포식성 곤충이 많이 모여드는 것으로 밝혀졌다.", "따라서 사체의 부패정도나 채집된 곤충을 사후경과시간을 유추하기 위한 자료로 사용하기 위해서는 사건발생지역의 기후적 요인 및 서식하는 곤충들의 생태가 고려되어야 하는 것으로 생각되었다.", "</p> <h1>고 찰</h1><h2>사체의 부패 속도, 무게 및 온도 변화</h2><p>사체의 부패 속도에 영향을 미치는 요인으로서 온도, 습도, 강수량, 토양의 산도, 사체의 외상, 곤충들의 접근용이성, 매장된 깊이, 육식동물과 설치동물의 활동, 사체의 크기와 무게, 사체가 놓여진 곳의 표면상태, 의복류, 방부처리 등이 있다고 보고된 바 있다.", "</p><p>본 연구결과 사체가 백골화 직전 단계에 이르기까지 주위 온도가 비교적 낮은 2007년 3월(주위 온도 \\( 10 \\sim 26^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 평균 \\( 17^{\\circ} \\mathrm{C} \\) )에는 113일, 2006년 5월(주위 온도 \\( 10.5 \\sim 28^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 평균 \\(17.8^{\\circ} \\mathrm{C} \\))에는 54일이, 주위 온도가 높아진 7월(주위 온도 \\(20 \\sim 31^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 평균 \\( \\left.24.5^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)과 9월(주위 온도 \\( 20 \\sim 29^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 평균 \\( 24.8^{\\circ} \\mathrm{C} \\))에는 각각 7일과 12일이 걸렸으며, 다시 주위 온도가 낮아진 10월 (주위 온도 \\( 14.5 \\sim 26^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 평균 \\(19.8^{\\circ}\\mathrm{C}\\))에는 53일 이상이 걸려, 사체의 부패속도는 주위의 온도가 높을수록 빠르게 진행됨을 알 수 있었다.", "이러한 경향은 열대성 기후지역 또는 남반구에 위치한 지역의 연구에서도 보고된 바 있는데, 하와이의 오하우섬에서 7월(여름, 평균기온 \\( 29.4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) )에 수행된 연구에서 백골화직전 단계까지 약 20일이 걸렸으며, 남반구 아르헨티나의 부에노스아이레스에서 실행 된 연구에서 여름 (최고 \\( 40^{\\circ} \\mathrm{C}\\)) 에 는 약 16일, 겨울(최고 \\( 17 \\sim 18^{\\circ} \\mathrm{C}\\))에는 약 63일이, 콜롬비아의 메를린(주위 온도 \\( 20 \\sim 24.5^{\\circ} \\mathrm{C}\\))과 안데스산맥의 고산지대(주위 온도 \\( 10 \\sim 22^{\\circ} \\mathrm{C}\\))에서 수행된 연구에서는 각각 51일이 걸렸다고 보고된 바 있다.", "</p><p>사체의 부패속도에 영향을 주는 또 하나의 중요한 요인으로서 사체에 모여드는 포식자의 섭식활동에 의한 영향을 들 수 있다.", "사체의 부패속도에 영향을 주는 포식자로서 박테리아, 원생동물 및 부화된 시식성 파리유충 등을 들 수 있는데, 이들의 활동이 활발할수록 사체 내부의 온도가 상승함이 알려져 있다.", "본 연구에서도 이들의 활동이 가장 활발한 부패단계 또는 건조단계의 사체 온도가 주위 온도보다 각각 최고 \\(5\\sim20^{\\circ} \\mathrm{C}\\) 높은 점이 이를 뒷받침하고 있다.", "한편, 2007년 10월 중의 사체 온도(최고\\( 40^{\\circ} \\mathrm{C}\\))가 2007년 7월 (최고 \\( 31^{\\circ} \\mathrm{C}\\))에 비해 더 상승한 것은 흥미로우며, 이는 10월 중에는 비가 거의 내리지 않아 유충의 섭식활동이 지속적으로 활발하게 진행된 반면, 7월 중에는 유충들이 10월과 유사한 정도로 대량 부화했음에도 불구하고, 자주 내린 비에 의해서 유충 또는 박테리아 등의 활동이 억제되어 사체 온도가 상승하지 못한 것이라고 생각되었다.", "</p> <h1>결 과</h1><h2>사체의 부패 기간, 무게 및 온도의 변화</h2><p>각 실험기간 중에 측정된 주위 온도와 강수량은 각각 2006년 5월에는 \\( 10.5 \\sim 28^{\\circ} \\mathrm{C} \\) (평균 \\( 17.8^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 기상청, 2006 자료 참고)와 \\( 504.8 \\mathrm{~mm}, 2007 \\) 년 3월에는 \\( 10 \\sim 26^{\\circ} \\mathrm{C}\\left(\\right. \\)", "평균 \\( 17.0^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 이하 실측기온)와 \\( 531.2 \\mathrm{~mm}, 2007 \\) 년 7월에는 \\( 20 \\sim 31^{\\circ} \\mathrm{C}\\left(\\right. \\)", "평균 \\( \\left.24.5^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)와 \\( 85.50 \\mathrm{~mm}, 2007 \\) 년 9월에는 \\( 20.5 \\sim 29.5^{\\circ}\\mathrm{C}\\left(\\right. \\)", "평균 \\( \\left.24.8^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\) 와 \\( 113 \\mathrm{~mm}, 2007 \\) 년 10 월에는 \\( 14.5 \\sim 26^{\\circ} \\mathrm{C}\\left(\\right. \\)", "평균 \\( \\left.19.8^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\) 와 \\( 35.5 \\)\\( \\mathrm{mm} \\) 를 기록하였다", "(Fig. 1 5).", "한편 2006년 5월에 설치한 사체의 경우 주검발생단계, 팽창단계, 부패단계 및 건조단계 별로 각각 3일, 5일, 3일 및 43일이상이 걸려 총 54일 이상이 경과되었으며, 2007년 3월에는 5일, 9일, 26일 및 73일이 걸려 총 113일이, 2007년 7월에는 2일, 2일, 2일 및 1일이 걸려 총 7일이, 2007년 9월에는 3일, 2일, 2일 및 5일로 총 12일이, 2007년 10월에는 주검발생단계, 팽창단계 및 부패단계 별로 각각 4일, 3일 및 3일이 걸렸으며, 건조단계는 40일 이상으로서 총 50일 이상이 걸렸다", "(Table 1).", "한편 사체의 무게는 2007년 3월, 7월, 9월 및 10월 모두, 팽창단계부터 감소하기 시작해서 부패 단계에서 급감하는 현상을 나타내었고, 사체가 거의 부패하여 사체의 무게가 약 1 / 10로 감소하는데 걸리는 기간은 2007년 3월에는 약 90일, 2007년 7월에는 약 7일, 2007년 9월에는 약 16일, 2007년 10월에는 약 16일이 걸려, 7월에 무게가 가장 빨리 감소함을 알 수 있었다", "(Fig. 2 5).", "</p><p>사체의 온도 변화를 비교하면 2007년 3월, 7월 및 10월 모두 팽창단계부터 온도가 상승하기 시작해서 부패단계에 최고 온도를 나타내어 주변의 온도보다 \\(5\\sim 20^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 높게 상승하였다", "(Fig.2, 3, 5).", "또한 10월에 설치한 사체의 최고 온도 \\( \\left(40^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)는 3월 \\( \\left(25^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)과 7월에 설치한 사체 \\( \\left(31^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\)에 비해 더 높았다.", "</p><h2>곤충상의 변화</h2><p>5차에 걸친 실험 기간을 통해서 총 7목 28과 48종 1,157개체의 곤충들이 채집되었으며, 모든 실험 시기에 파리의 유충이 주검발생단계부터 관찰되기 시작해서 부패단계에 사체에 대부분을 덮을 정도로 증가하며 건조단계 이후 감소하였다.", "각 실험시기에 대한 곤충상의 변화를 Table 2~6에 제시하였다.", "</p><h3>2006년 5월</h3><p>위에서 언급한 바와 같이 사체 설치 후 건조단계가 진행되는 도중에 조사장소가 폐쇄되어, 그 이후의 관찰은 불가능했다.", "사체설치 후 건조단계 도중까지 4목 17과 24종이 채집되었고, 벌목(Hymenoptera) 개미과(Formicidae)의 2종이 관찰되었다", "(Table 2).", "파리목(Diptera) 검정파리과(Calliphoridae)의 금파리속의 1종(Lucilia sp.a)이 가장 먼저 도착했고, 검정파리과(2종, 123개체, 43.6\\%)와 집파리과(Muscidae, 2종, 45개체, \\( 16 \\% \\) )의 곤충이 다수 채집되었다.", "건조단계의 곤충상이 가장 다양하였으며, 부패단계까지는 검정파리과가 많이 보였지만, 건조단계에는 딱정벌레과(Carabidae), 풍뎅이붙이과(Histeridae), 반날개과(Staphylinidae) 등 딱정벌레목(Coleoptera)의 곤충들이 많이 관찰되었다.", "</p><h3>2007년 3월</h3><p>5목 14과 28종이 채집되었고, 검정파리과의 금파리속의 1종(Lucilia sp.a)과 큰검정파리(Calliphora lata)가 가장 먼저 도착 했으며, 검정파리과(7종, 231개체, \\(44.2\\%\\))와 집파리과(3종, 221 개체, \\( 42.2 \\%) \\) 의 곤충이 다수 채집되었다", "(Table 3).", "부패단계의 곤충상이 가장 다양했으며, 팽창단계까지는 검정파리과가 많았지만 부패단계 이후에는 집파리과가 가장 많이 관찰되었다.", "</p><h3>2007년 7월</h3><p>4목 14과 21종이 채집되었고, 검정파리과 금파리속의 1종 (Lucilia sp.a)과 쉬파리과(Sarcophagidae) 쉬파리속의 1종(Parasarcophaga sp.a)이 가장 먼저 도착했으며, 딱정벌레목의 반날개과(3종, 45개체, \\(28.1\\%\\))와 파리목의 검정파리과(4종, 45 개체, \\(28.1\\%\\))가 다수 채집되었다", "(Table 4).", "나타나는 종수가 2006년 5월과 2007년 3월에 비해 감소하였고, 특히 부패단계에 더욱 감소했다.", "팽창단계까지는 검정파리과가 많이 나타나지만, 부패단계 이후에는 딱정벌레목이 많이 나타났다.", "즉, 부패단계와 건조단계에는 반날개과가, 백골화단계에는 풍뎅이붙이과가 가장 많이 관찰되었다.", "</p><h3>2007년 9월</h3><p>4목 12과 13종이 채집되었고, 검정파리과의 구리금파리(Lucilia sericata)가 가장 먼저 도착했으며, 반날개과(3종, 77개체, \\( 64.2 \\% \\))가 가장 많이 채집되었다", "(Table 5).", "나타나는 종수가 이전 실험기간들에 비해서 매우 감소했으며, 특히 팽창단계와 부패단계에는 2~3종 만이 보였고, 백골화단계에는 전혀 관찰되지 않았다.", "검정파리과가 주검발생단계에는 가장 많이 관찰되었지만, 팽창단계부터 건조단계까지는 반날개과가 가장 많이 나타났다.", "특히 건조단계에는 반날개과 등, 딱정벌레목의 곤충이 주로 포획되었고, 말벌과(Vespidae)의 말벌(Vespa crabro)이 비교적 많이 채집된 점도 특징적이었다.", "</p><h3>2007년 10월</h3><p>3목 7과 8종이 채집되었고, 검정파리과의 구리금파리(Lucilia sericata)가 가장 먼저 도착했으며, 검정파리과(2종, 28개체, \\( 49.1 \\% \\))와 말벌과(1종, 9개체, \\( 15.8 \\% \\))가 많이 채집되었다", "(Table 6).", "이 기간 중에는 관찰되는 종수가 가장 적었고, 검정 파리과가 전 기간동안 가장 많이 관찰되었다.", "반날개과가 부패단계부터 나타났었고, 말벌이 전 기간 중에 나타난 점이 특징적이었다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>사체는 곤충에 있어 중요한 먹이공급원인데, 사체의 사후 경과시간에 따라 사체에 모여드는 곤충들의 종류가 달라, 사체주변에서 채집되는 곤충들은 사체의 사망시간을 추정하는 법의학적 증거로 이용될 수 있다.", "일반적으로 법의학에서 사후경과시간(postmortem interval, PMI)을 추정하기 위한 방법으로는 사체의 체온을 측정하거나 안구 내 칼륨의 수치를 확인하는 방법 등이 쓰여 왔지만 사후 72시간이 지난 후에는 이런 측정치를 사용할 수 없으므로 법의곤충학적 연구가 때로는 사망시간을 측정할 수 있는 유일한 방법이 되기도 한다.", "</p><p>법의곤충학적 증거는 프랑스에서 1850년에 최초로 법률상 증거로 채택되었는데, 이후 법의곤충학에 대한 연구는 점차 증가하였고, 현재 유럽 및 미국, 캐나다, 남미 일부에서 이 방면의 연구가 활발하게 진행 중에 있다.", "법의곤충학적 연구를 위해서는 주로 집돼지(Sus scrofa)가 이용되는데 집돼지는 피부에 털이 적어 비교적 넓은 면적이 노출되어 있고, 잡식성이어서 소화기관의 구조가 사람과 유사하며, 더욱이 손쉽게 구할 수 있는 실험 재료이므로 법의학적 연구에 많이 사용된다.", "한편 우리나라에서는 법의곤충학적 연구로서 물고기나 토끼, 새 등을 이용하여 실험한 소수의 연구가 있을 뿐이며, 집돼지 등 인간의 크기에 근접한 동물을 이용한 논문은 아직까지는 보고된 바 없다.", "</p><p>본 연구의 목적은 집돼지(Sus scrofa)를 계절별(봄~가을)로 설치하여 환경에 따른 사체부패의 속도를 알아보고, 각 계절별로 채집된 곤충들의 천이패턴을 조사하여 사체의 사후 경과시간을 추정하기 위한 법의곤충학적 자료를 얻는데 있다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>본 연구는 집돼지 사체주위에서 채집되는 곤충의 천이패턴을 이용해서 사체의 사후경과시간을 추정하기 위한, 법의학적 증거모델을 제시하고자 수행되었다.", "사체의 주변에서 총 7목 28과 48종의 곤충이 채집되었는데, 계절에 따라 많이 나타나는 곤충이 변하여 3월, 5월 및 10월에는 검정파리과가, 7월에는 검정파리과와 반날개과가 같은 비율로, 9월에는 반날개과가 많이 관찰되었다.", "검정파리과 곤충은 모든 실험을 통해서 사체에 가장 먼저 도착하는 곤충이며 또한, 부패초기의 지표 곤충임이 밝혀졌다.", "그러나 부패후기의 지표곤충은 3월을 제외한 나머지 연구기간 중에는 반날개과, 3월에는 집파리과였는데, 3월에는 낮은 온도로 인해서 사체 부패 기간이 오랫동안 지속되었으므로 사체 주위에 모여든 집파리과의 개체수도 증가한 것으로 생각되었다.", "이상으로부터 사체의 사후경과시간을 유추하기 위해서는 사체의 부패 정도나 사체 주변에 나타나는 곤충 뿐 아니라, 조사 지역의 기후 조건도 고려해야 할 것으로 생각되었다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "돼지 사체에 출현하는 곤충상의 천이에 대한 연구", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-f5a5b517-efdf-42b7-bbe1-a36cf37880de", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "정재봉", "윤명희" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,422	<h1>결 과</h1><p>조팝나무속 12개 분류군에 대한 ITS profiles은 \( 100 \mathrm{bp} \) ladder DNA marker로 크기를 비교한 결과 약 \( 670 \mathrm{~bp}\) nucleotides의 크기를 가지고 있었다. 65개는 parsimony-정보적이고 45개는 변이를 가지나 parsimony-비정보적이고, 그리고 410개는 일정한 characters를 나타내었다. ITS1의 DNA 서열은 \( 227 \mathrm{bp} \) (S. pubescens)에서 \( 242 \mathrm{bp} \) (S. salicifolia)까지 가진다(Table 3). 대부분 \( 237 \mathrm{bp} \) 또는 \( 238 \mathrm{bp} \) 를 나타내었다. 5.8S의 서열은 대부분 \( 157 \sim 159 \mathrm{bp} \) 를 가지나 S. chartacea, S. trichocarpa, S. cantoniensis, S. thunbergii는 \( 165 \mathrm{bp} \) 를 가진다. ITS2는 \( 263 \sim 271 \mathrm{bp} \) 를 가진다. 전체적으로 \( 641 \mathrm{bp} \) (S. pubescens)에서 \( 673 \mathrm{bp} \) (S. trichocarpa)를 가진다.</p><p>S. pubescens는 다른 분류군에 비해 염기수가 매우 달랐다(Table 4). 5.8S의 서열만 볼 때 일부 동일한 서열을 가진 그룹(예: S. chinensis와 S. fritschiana var. obtusifolia) 등이 있는 반면 대부분 많은 차이가 있었다.</p><p>세부적으로 ITS1 서열에서 아구장나무가 \( 104 \sim 119 \mathrm{bp} \) 가 차이가 나서 다른 분류군에 비해 가장 다른 것으로 나타났다(Table 5). 그 다음으로는 인가목조팜나무가 ( 79 \sim 119 \mathrm{bp} \) 로 달랐다. 참조팝나무도 \( 53 \sim 104 \mathrm{bp} \)로 차이가 났다.</p><p>5.8S의 서열은 ITS1과 ITS2에 비해 보존서열이 많았다(Table 6). 여기에서도 아구장나무와 인가목조팜나무가 다른 분류군과 약간 차이를 나타내었다.</p><p>ITS2 서열은 ITS1보다 큰 차이가 없고 보존된 서열이 많았다(Table 7). 아구장나무가 \( 62 \sim 95 \mathrm{bp} \) 가 차이가 나서 다른 분류군에 비해 가장 다른 것으로 나타났다. 그 다음으로는 꼬리조팝나무가 \( 22 \sim 82 \mathrm{bp} \) 가 차이가 나서 다른 분류군과 구별되었다.</p><p>전체 유전적 분화는 가장 근연관계로 유사도가 높은 분류군으로 둥근잎조팝나무와 일본조팝나무사이로 나타났다(Table 8). 가장 유연관계가 먼 분류군으로는 아구장나무와 꼬리조팜나무로 나타났다.</p><p>NJ algorithm에 의한 조팝나무속 식물군에 대한 clustering을 조사하였다(Fig. 1). 조팝나무와 산조팝나무는 같은 clade를 형성하고 갈기조팝나무와 sister group를 형성한다. 이들 그룹은 공조팝나무와 꼬리조팝나무가 형성한 clade와 근연관계에 있다. 참조팝나무와 덤불조팝나무가 근연관계가 있고 일본조팝나무와 sister를 형성한다. 인가목조팝나무와 아구장나무는 독립적으로 분리되었다.</p> <h1>서 론</h1><p>장미목(Rosaceae)에 속하는 조팝나무속(Genus Spiraea) 식물은 낙엽성 관목으로 세계적으로 약 70여 종이 알려져 있으며, 학자에 따라서는 약 100 여 종까지 속하는 것으로 알려져 있다. 조팝나무속의 대부분은 만주와 시베리아, 유리시아 등 북반구의 온대와 한대에 걸쳐 분포하고 있다. 현재 우리나라에는 16종이 분포하고 있으며 그 중 백두산지역에 분포하는 긴잎조팝나무(Spiraea media SCHM.)와 북부 지역 산야에 분포하는 긴잎산조팝나무(Spiraea pseudocrenata NAKAI)를 제외한 총 14종이 남한에 분포한다. 우리나라에서 분포되어 있는 분류군에는 조팝나무(Spiraea prunifolia for. simpliciflora NAKAI), 인가목조팝나무(Spiraea chamaedryfolia var. ulmifolia (SCOP.) MAXIM.), 떡조팝나무(Spiraea chartacea NAKAI), 당조팝나무(Spiraea chinensis MAXIM.), 둥근잎조팝나무(Spiraea fritschiana var. obtusifolia NAKAI), 덤블조팝나무(Spiraea miyabei KOIDZ), 갈기조팝나무(Spiraea trichocarpa NAKAI), 참조팝나무(Spiraea fritschiana SCHNEID), 일본조팝나무(Spiraea japonica L. f.), 아구장나무(Spiraea pubescens TURCZ.), 꼬리조팝나무(Spiraea salicifolia L.), 산조팝 나무(Spiraea blumei G. DON), 공조팝나무(Spiraea cantoniensis LOUR.), 가는잎조팝나무(Spiraea thunbergii SIEB.)가 있다. 그런데 아구장나무의 두 변종인 설악아구장나무(Spiraea pubescens TURCZ. var. lasiocarpa NAKAI)와 초평조팝나무(Spiraea pubescens TURCZ. var. leiocarpa NAKAI)이 보고되었고, 북부지방에 좀조팝나무(Spiraea microgyna NAKAI), 긴잎산조팝나무(Spiraea pseudo-crenata NAKAI)가 보고되었다.</p><p>ITS (nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences)는 핵 내 리보솜 DNA 전사 서열 중 일부로 빠른 진화를 나타내는 분자시계 중의 하나로 rbcL gene (the gene encoding a large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate car-boxylase/oxidase)과 더불어 종 수준 이하의 분류군에서 분자 계통 분류학적 연구에 많이 쓰이고 있다.</p><p>분자생물학적 형질의 유사도는 통계적 오차를 포함하고 있어도 오차의 범위 내에서 유의한 차이를 나타내면서 분류학의 계통적 근연관계를 반영하고 있기 때문에 계통수를 개관적으로 구축할 수 있다. 분자생물학적 형질은 일정한 속도에서 변화하기 때문에 계통수에서 시간에 관한 정보도 포함할 수 있는 점이 큰 장점이 되므로 이를 이용하여 조팝나무 속 식물의 계통분석 연구에 이용하였다.</p> <p>가는잎조팝나무는 중국 및 일본에서 자라는 낙엽관목으로서 관상용으로 심고 있으며 가지는 가늘고 길고 끝이 처지며 어릴 때는 다소 모가지고 털이 있다. 잎은 밝은 녹색이고 뒷면 맥 위에 털이 다소 있는 수도 있다.</p><p>조팝나무 속의 분류군들은 나무의 크기가 적당하고 꽃이 아름답고 개화 기간이 비교적 길며, 생육과 번식이 용이하여 여러 가지 품종이 개발되고 있다. 또한 원예용 이외에도 약용식물로도 이용되는데 한방에서는 해열, 말라리아, 거담, 강장, 구토 등의 증상에 치료제로 이용해 왔으며, 조팝나무류에서 아스피린의 원료를 발견하여 연구를 하고 있다.</p><p>본 연구의 주된 초점의 하나는 분자 마커로 조팝나무속 식물군에 대한 종의 분화정도를 구별 할 수 있느냐 하는데 있다. 기존의 유전적 마커인 RAPD (random amplified polymorphic DNA)는 임의 유전자의 증폭을 이용한 것으로 근연 종간 구별에 널리 쓰였으며 현재도 사용되고 있다. RAPD 분석은 다른 분자생물학적 기법에 비해 신속하고, 서열에 대한 예비적인 지식이 그다지 많이 필요하지 않아 실험의 경비도 다른 기법에 비해 저렴하여 종 분류기법에 PCR 개발에 힘입어 널리 사용되고 있으나 재현성에 문제가 제기되기도 한다. 그 밖에도 제한효소 단편 다형인 RFLP (restriction fragment length polymorphism)도 쓰이고 있으나 많은 양의 DNA가 필요하거나 다양한 제한효소를 준비해야 하는 등 경제적 비용이 막대하게 필요한데 비해 얻는 정보량은 적어 요즘은 잘 이용되지 않고 있다. 또 microsatellites도 형질의 특성과 아울러 이용되기도 하지만 사전의 정보가 필요하다는 단점이 있다. ITS (nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences)는 핵 내 리보소옴 DNA 전사 서열 중 일부로 빠른 진화를 나타내는 분자시계 중의 하나로 rbcL gene (the gene encoding a large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxidase)과 더불어 종 수준 이하의 분류군에서 분자 계통 분류학적 연구에 많이 쓰이고 있다.</p><p>형태에 의한 조팝나무속 식물군에 대한 분류는 형태에 결과와 플라보노이드에 의한 분류가 있다. 이들 결과와 형태에 의한 조팝나무속 식물군에 대한 분류는 형태에 결과와 플라보노이드에 의한 분류가 있다. 이들 결과와 본 연구결과를 비교하면 다음과 같다. 참조팝나무와 덤불조팝나무가 같은 clade를 가지는 것은 세 결과와 일치한다. 그러나 일부 꼬리조팝나무와 갈기조팝나무가 근연한 것은 유사하나 다른 분류군에 대해서는 형태와 플라보노이드에 의한 결과와 서로 다르다. 특히 아구장나무가 독립적인 것은 앞의 형태와 플라보노이드에 의한 결과와 전혀 다르다. 형태에 의한 결과에서는 떡조팝나무와 당조팝나무가 같은 clade를 이루고 아구장나무와 sister 그릅을 형성한다. 플라보노이드에 의한 결과에서는 아구장나무가 독립적인 분류군이 아니고 인가목조팝나무가 갈기조팝나무와 더불어 독립적이다. 특히 조팝나무속 식물종은 꼬리조퐙나무만 원추화서이고 참조팝나무, 좀조팝나무, 덤불조팝나무, 갈기조팝나무는 복산방화서, 아구장나무, 당조팝나무, 인가목나무, 산조팝나무, 긴잎산조팝나무는 산방화서이다. 발아구 모양에서는 갈기조팝나무는 약단구형이나 나머지 종은 단구형이다. 세포학적 측면에서 조팝나무속은 염색체수 \( x=9 \) 의 기본형에 \( 2 n=18 \) 이나 꼬리조팝나무는 \( 2 n=36 \) 이다.</p><p>전반적으로 형태에 의한 분류와 세포학적, 본 연구의 분자 생물학적 기법에 의한 결과가 일치하지 않는다. 그 이유 중의 또 다른 하나는 우리나라에서는 보고된 바 없으나 다른 나라에서 조팝나무속 식물들의 교잡을 들 수 있다. 따라서 교잡에 의한 형태의 중간형이나 분류형질을 어지럽히는 요인이 발생할 수 있다. 이에 대한 방안으로 조팝나무속 식물군에 대한 rbcL gene 같은 엽록체에 의한 서열분석이 추가되면 보다 명확할 것으로 판단된다.</p> <h1>고 찰</h1><p>조팝나무속에 속하는 식물은 높이가 \( 1.5 \sim 2 \mathrm{~m} \) 이고, 줄기는 모여 나며 밤색이고, 능선이 있으며 윤기가 난다. 잎은 어긋나고 타원형이며 가장자리에 잔 톱니가 있다. 꽃은 4~5월에 피고 백색이며 4~6개씩 산형꽃차례로 달리며, 가지의 윗부분은 전체 꽃만 달려서 백색 꽃으로 덮인다. 꽃잎은 달걀을 거꾸로 세운 모양이며, 꽃받침조각이 뾰족하며 각각 5개씩이고, 수술은 많으며, 암술은 4~5개씩이고 수술보다 짧다.</p><p>조팝나무는 꽃이 핀 모양이 튀긴 좁쌀을 붙인 것처럼 보이기 때문에 조팝이라 명명하였으며 수목은 관상용으로 식재하고, 어린 순은 나물로 식용한다.</p><p>인가목조팝나무는 경북, 강원도 및 북부지방에서 자라는 낙엽관목으로서 높이가 \( 1 \mathrm{~m} \) 에 달하고 가지에 뚜렷한 능선이 있으며 털이 없다. 잎은 호생하고 난형이며 첨두 원저로서 표면에 털이 없고 뒷면은 회백색이며 맥액에 털이 있고 가장자리에 톱니가 있다.</p><p>떡조팝나무는 대흑산도와 홍도에서 자라는 낙엽관목으로서 당조팝나무와 비슷하지만 앞이 두껍고 윤채가 있으며 뒷면에 털이 있고 잎은 두꺼우며 넓은 도란형 또는 도란상 원형이고 길이 \( 15 \sim 35 \mathrm{~mm} \) 이며 양끝이 좁으며 표면에 윤채가 있다.</p><p>당조팝나무는 경북, 강원도, 황해도 및 북부지방에서 자라는 낙엽관목으로서 높이가 \( 1.5 \mathrm{~m} \) 에 달하고 가지는 옆으로 휘며 어릴 때는 황갈색 털이 밀생하다. 잎은 호생하고 마름모, 난형 또는 도란형이며 예두 또는 원두이고 원저 또는 넓은 예저이며 길이가 \( 3 \sim 5 \mathrm{~cm} \) 로 가장자리에 결각상의 예리한 톱니가 있거나 3개로 갈라지고 표면은 짙은 녹색이며 잔털이 있고 뒷면에는 황색털이 밀생한다.</p><p>둥근이조팝나무는 서울(북한산)에서 자라는 낙엽관목으로 수고가 \( 1 \mathrm{~m} \), 잔가지는 능선이 있고 적갈색으로서 털이 없으며 겨울눈은 난형 예두이다. 잎은 호생하고 타원형 또는 넓은 타원형이며 양끝이 둔하고 길이 \( 2 \sim 5 \mathrm{~cm} \) 로서 겹톱니 또는 홑톱니가 있으며 표면은 짙은 녹색이고 뒷면은 회록색으로 엽맥이 돌출하며 털이 없거나 맥 위에 털이 있다.</p><p>참조팝나무는 중부 이북에서 자라는 낙엽관목으로 가지는 능각이 있고 털이 없으며 자갈색이다. 씨방은 \( 4 \sim 5 \) 개로서 수술의 기부와 더불어 연한 홍색이고 열매는 지름 \( 3 \mathrm{~mm} \) 로서 복봉선 이외에는 털이 없으며 9월에 익는다.</p><p>일본조팝나무는 일본산의 낙엽관목으로 잎은 가장자리에 불규칙라고 예리한 톱니가 있으며 뒷면은 색깔이 연하거나 백색이고 양면 또는 뒷면에 털이 있으며 끝이 뾰족하다.</p><p>아구장나무는 중부 이북의 산지에서 자라는 낙엽관목으로 수고가 \( 2 \mathrm{~m} \), 잔가지에 털이 있다. 열매 뒷면에 오랫동안 긴 털이 남아 있고 과서에 털이 없는 것을 설악아구장나무(var. lasiocarpa NAKAI), 잎에 털이 적고 씨방에 털이 없는 것을 초평조팝나무(var. leiocarpa NAKAI)라 한다.</p><p>공조팝나무는 중국산 낙엽관목으로 가지 끝이 다소 처진다. 꽃은 4월에 잎과 같이 피고 지름 \( 7 \sim 10 \mathrm{mm} \) 로서 백색이며 가지에 산형상으로 나열되어 마치 작은 공을 쪼개어 나열한 것 같아 공조팝나무라고 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료와 genomic DNA 추출</h2><p>한국에 자생하는 조팝나무속 14종, 조팝나무(Spiraea prunifolia for. simpliciflora NAKAI), 인가목조팝나무(Spiraea chamaedryfolia var. ulmifolia (Scop.) MAXIM.), 떡조팝나무(Spiraea chartacea NAKAI), 당조팝나무(Spiraea chinensis MAXIM.), 둥근잎조팝나무(Spiraea fritschiana var. obtusifolia NAKAI), 덤불조팝나무(Spiraea miyabei KOIDZ.), 갈기조팝나무(Spiraea trichocarpa NAKAI), 참조팝나무(Spiraea fritschiana SCHNEID), 일본조팝나무(Spiraea japonica L.), 아구장나무(Spiraea pubescens TURCZ.), 꼬리조팝나무(Spiraea salicifolia L.), 산조팝나무(Spiraea blumei G. DON), 공조팝나무(Spiraea cantoniensis LOUR.), 가는잎조팝나무(Spiraea thunbergii SIEBID)를 채집하였다(Table 1). 각 종당 수령 3년 이상의 식물체에서 20개체로부터 잎을 취하였다. 집단간 분석을 위하여 한 개체 당 하나의 잎에서 각각 DNA를 추출하여 집단 간 차이를 비교하는데 사용하였다. 같은 층층나무과의 식나무(Aucuba japonica THUNBERG)를 대조군으로 사용하였다.</p><p>각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 Plant DNA Zol Reagent (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA)를 사용하였는데 사용자의 지침서에 의거하여 추출하였다. 건조시킨 후 TE \( 100 \mathrm{ul} \)에 용해하였다. 3일간 냉장 보관한 후 DNA정량을 체크하여 DNA 농도가 균질하게 조정하였다.</p><h2>ITS 분석</h2><p>ITS1-5.8S-ITS2의 서열은 White 등의 방법에 따랐다. ITS1, ITS2, ITS3, ITS4의 염기 시발체를 이용하여 유전자 증폭(PCR)을 실시하였다(Table 2). 이들은 리보소옴 coding 부위인 18S와 28S rRNA 유전자 부위와 noncoding 부위인 5.8S rRNA 유전자부위를 증폭하였다.</p><p>PCR 반응을 위하여 추출한 각 분류군의 게놈 DNA \( 50 \mathrm{ng} \), 각 dNTP \( 100 \mathrm{uM} \), 시발체 각 \( 0.2 \mathrm{uM}, 1 \mathrm{x} \) enzyme buffer, Taq polymerase \( 2 \mathrm{unit} \)를 넣고 증류수로 전체 \( 50 \mathrm{ul} \) volume이 되도록 추가하였다. 증폭반응은 초기 \( 94^{\circ} \mathrm{C} ~ 90 \mathrm{sec} \) 간 변성한 후, 28 사이클로 \( 94^{\circ} \mathrm{C} ~ 30 \mathrm{sec}, 42^{\circ} \mathrm{C} ~ 60 \mathrm{sec}, 72^{\circ} \mathrm{C} ~ 60 \mathrm{sec} \) 간 실시하였고 추가로 \( 72^{\circ} \mathrm{C} 5 \) 분간 연장하였다.</p><p>PCR 산물은 \( 1.5 \% \) agarose gel에서 분리하였으며 ethidium bromide로 염색하여 밴드를 현상하였다. 이때 절편들의 상대적 크기를 비교하기 위해 \( 100 \mathrm{bp} \) ladder DNA marker를 같이 loading시켰다. Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, USA)을 사용하여 밴드 양상을 조사하였다. 이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다. 추출된 DNA를 bluescript vector와 ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, USA)로 서열화하였다.</p><h2>계통관계 분석</h2><p>서열에서 결손부위를 포함한 서열 배당은 MEGA4 version 4.0과 Clustal X program으로 분석하였다. 최절약법에 의한 tree (MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bisection-reconnection에 따랐다. 계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.57의 NEIGHBOR, neighbor-joining(NJ) 방법에 의해 구성하였다. Bootstrap 분석은 1,000회 반복법으로 실시하였다.</p><p>분류군 간 유전적 거리(I)와 유전적 동질성(D)은 분류군간 염기쌍의 비교로 산출하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>결 과</h1><p>조팝나무속 12개 분류군에 대한 ITS profiles은 \\( 100 \\mathrm{bp} \\) ladder DNA marker로 크기를 비교한 결과 약 \\( 670 \\mathrm{~bp}\\) nucleotides의 크기를 가지고 있었다.", "65개는 parsimony-정보적이고 45개는 변이를 가지나 parsimony-비정보적이고, 그리고 410개는 일정한 characters를 나타내었다.", "ITS1의 DNA 서열은 \\( 227 \\mathrm{bp} \\) (S.", "pubescens)에서 \\( 242 \\mathrm{bp} \\) (S.", "salicifolia)까지 가진다(Table 3).", "대부분 \\( 237 \\mathrm{bp} \\) 또는 \\( 238 \\mathrm{bp} \\) 를 나타내었다.", "5.8S의 서열은 대부분 \\( 157 \\sim 159 \\mathrm{bp} \\) 를 가지나 S.", "chartacea, S.", "trichocarpa, S.", "cantoniensis, S.", "thunbergii는 \\( 165 \\mathrm{bp} \\) 를 가진다.", "ITS2는 \\( 263 \\sim 271 \\mathrm{bp} \\) 를 가진다.", "전체적으로 \\( 641 \\mathrm{bp} \\) (S.", "pubescens)에서 \\( 673 \\mathrm{bp} \\) (S. trichocarpa)를 가진다.", "</p><p>S.", "pubescens는 다른 분류군에 비해 염기수가 매우 달랐다", "(Table 4). 5.8S의 서열만 볼 때 일부 동일한 서열을 가진 그룹(예: S. chinensis와 S. fritschiana var. obtusifolia)", "등이 있는 반면 대부분 많은 차이가 있었다.", "</p><p>세부적으로 ITS1 서열에서 아구장나무가 \\( 104 \\sim 119 \\mathrm{bp} \\) 가 차이가 나서 다른 분류군에 비해 가장 다른 것으로 나타났다", "(Table 5).", "그 다음으로는 인가목조팜나무가 ( 79 \\sim 119 \\mathrm{bp} \\) 로 달랐다.", "참조팝나무도 \\( 53 \\sim 104 \\mathrm{bp} \\)로 차이가 났다.", "</p><p>5.8S의 서열은 ITS1과 ITS2에 비해 보존서열이 많았다", "(Table 6).", "여기에서도 아구장나무와 인가목조팜나무가 다른 분류군과 약간 차이를 나타내었다.", "</p><p>ITS2 서열은 ITS1보다 큰 차이가 없고 보존된 서열이 많았다", "(Table 7).", "아구장나무가 \\( 62 \\sim 95 \\mathrm{bp} \\) 가 차이가 나서 다른 분류군에 비해 가장 다른 것으로 나타났다.", "그 다음으로는 꼬리조팝나무가 \\( 22 \\sim 82 \\mathrm{bp} \\) 가 차이가 나서 다른 분류군과 구별되었다.", "</p><p>전체 유전적 분화는 가장 근연관계로 유사도가 높은 분류군으로 둥근잎조팝나무와 일본조팝나무사이로 나타났다", "(Table 8).", "가장 유연관계가 먼 분류군으로는 아구장나무와 꼬리조팜나무로 나타났다.", "</p><p>NJ algorithm에 의한 조팝나무속 식물군에 대한 clustering을 조사하였다", "(Fig. 1).", "조팝나무와 산조팝나무는 같은 clade를 형성하고 갈기조팝나무와 sister group를 형성한다.", "이들 그룹은 공조팝나무와 꼬리조팝나무가 형성한 clade와 근연관계에 있다.", "참조팝나무와 덤불조팝나무가 근연관계가 있고 일본조팝나무와 sister를 형성한다.", "인가목조팝나무와 아구장나무는 독립적으로 분리되었다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>장미목(Rosaceae)에 속하는 조팝나무속(Genus Spiraea) 식물은 낙엽성 관목으로 세계적으로 약 70여 종이 알려져 있으며, 학자에 따라서는 약 100 여 종까지 속하는 것으로 알려져 있다.", "조팝나무속의 대부분은 만주와 시베리아, 유리시아 등 북반구의 온대와 한대에 걸쳐 분포하고 있다.", "현재 우리나라에는 16종이 분포하고 있으며 그 중 백두산지역에 분포하는 긴잎조팝나무(Spiraea media SCHM.)와 북부 지역 산야에 분포하는 긴잎산조팝나무(Spiraea pseudocrenata NAKAI)를 제외한 총 14종이 남한에 분포한다.", "우리나라에서 분포되어 있는 분류군에는 조팝나무(Spiraea prunifolia for. simpliciflora NAKAI)", ", 인가목조팝나무(Spiraea chamaedryfolia var.", "ulmifolia (SCOP.) MAXIM.), 떡조팝나무(Spiraea chartacea NAKAI), 당조팝나무(Spiraea chinensis MAXIM.), 둥근잎조팝나무(Spiraea fritschiana var.", "obtusifolia NAKAI), 덤블조팝나무(Spiraea miyabei KOIDZ), 갈기조팝나무(Spiraea trichocarpa NAKAI), 참조팝나무(Spiraea fritschiana SCHNEID), 일본조팝나무(Spiraea japonica L. f.), 아구장나무(Spiraea pubescens TURCZ.), 꼬리조팝나무(Spiraea salicifolia L.), 산조팝 나무(Spiraea blumei G. DON), 공조팝나무(Spiraea cantoniensis LOUR.), 가는잎조팝나무(Spiraea thunbergii SIEB.)가 있다.", "그런데 아구장나무의 두 변종인 설악아구장나무(Spiraea pubescens TURCZ. var. lasiocarpa NAKAI)와 초평조팝나무(Spiraea pubescens TURCZ.", "var.", "leiocarpa NAKAI)이 보고되었고, 북부지방에 좀조팝나무(Spiraea microgyna NAKAI), 긴잎산조팝나무(Spiraea pseudo-crenata NAKAI)가 보고되었다.", "</p><p>ITS (nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences)는 핵 내 리보솜 DNA 전사 서열 중 일부로 빠른 진화를 나타내는 분자시계 중의 하나로 rbcL gene (the gene encoding a large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate car-boxylase/oxidase)과 더불어 종 수준 이하의 분류군에서 분자 계통 분류학적 연구에 많이 쓰이고 있다.", "</p><p>분자생물학적 형질의 유사도는 통계적 오차를 포함하고 있어도 오차의 범위 내에서 유의한 차이를 나타내면서 분류학의 계통적 근연관계를 반영하고 있기 때문에 계통수를 개관적으로 구축할 수 있다.", "분자생물학적 형질은 일정한 속도에서 변화하기 때문에 계통수에서 시간에 관한 정보도 포함할 수 있는 점이 큰 장점이 되므로 이를 이용하여 조팝나무 속 식물의 계통분석 연구에 이용하였다.", "</p> <p>가는잎조팝나무는 중국 및 일본에서 자라는 낙엽관목으로서 관상용으로 심고 있으며 가지는 가늘고 길고 끝이 처지며 어릴 때는 다소 모가지고 털이 있다.", "잎은 밝은 녹색이고 뒷면 맥 위에 털이 다소 있는 수도 있다.", "</p><p>조팝나무 속의 분류군들은 나무의 크기가 적당하고 꽃이 아름답고 개화 기간이 비교적 길며, 생육과 번식이 용이하여 여러 가지 품종이 개발되고 있다.", "또한 원예용 이외에도 약용식물로도 이용되는데 한방에서는 해열, 말라리아, 거담, 강장, 구토 등의 증상에 치료제로 이용해 왔으며, 조팝나무류에서 아스피린의 원료를 발견하여 연구를 하고 있다.", "</p><p>본 연구의 주된 초점의 하나는 분자 마커로 조팝나무속 식물군에 대한 종의 분화정도를 구별 할 수 있느냐 하는데 있다.", "기존의 유전적 마커인 RAPD (random amplified polymorphic DNA)는 임의 유전자의 증폭을 이용한 것으로 근연 종간 구별에 널리 쓰였으며 현재도 사용되고 있다.", "RAPD 분석은 다른 분자생물학적 기법에 비해 신속하고, 서열에 대한 예비적인 지식이 그다지 많이 필요하지 않아 실험의 경비도 다른 기법에 비해 저렴하여 종 분류기법에 PCR 개발에 힘입어 널리 사용되고 있으나 재현성에 문제가 제기되기도 한다.", "그 밖에도 제한효소 단편 다형인 RFLP (restriction fragment length polymorphism)도 쓰이고 있으나 많은 양의 DNA가 필요하거나 다양한 제한효소를 준비해야 하는 등 경제적 비용이 막대하게 필요한데 비해 얻는 정보량은 적어 요즘은 잘 이용되지 않고 있다.", "또 microsatellites도 형질의 특성과 아울러 이용되기도 하지만 사전의 정보가 필요하다는 단점이 있다.", "ITS (nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences)는 핵 내 리보소옴 DNA 전사 서열 중 일부로 빠른 진화를 나타내는 분자시계 중의 하나로 rbcL gene (the gene encoding a large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxidase)과 더불어 종 수준 이하의 분류군에서 분자 계통 분류학적 연구에 많이 쓰이고 있다.", "</p><p>형태에 의한 조팝나무속 식물군에 대한 분류는 형태에 결과와 플라보노이드에 의한 분류가 있다.", "이들 결과와 형태에 의한 조팝나무속 식물군에 대한 분류는 형태에 결과와 플라보노이드에 의한 분류가 있다.", "이들 결과와 본 연구결과를 비교하면 다음과 같다.", "참조팝나무와 덤불조팝나무가 같은 clade를 가지는 것은 세 결과와 일치한다.", "그러나 일부 꼬리조팝나무와 갈기조팝나무가 근연한 것은 유사하나 다른 분류군에 대해서는 형태와 플라보노이드에 의한 결과와 서로 다르다.", "특히 아구장나무가 독립적인 것은 앞의 형태와 플라보노이드에 의한 결과와 전혀 다르다.", "형태에 의한 결과에서는 떡조팝나무와 당조팝나무가 같은 clade를 이루고 아구장나무와 sister 그릅을 형성한다.", "플라보노이드에 의한 결과에서는 아구장나무가 독립적인 분류군이 아니고 인가목조팝나무가 갈기조팝나무와 더불어 독립적이다.", "특히 조팝나무속 식물종은 꼬리조퐙나무만 원추화서이고 참조팝나무, 좀조팝나무, 덤불조팝나무, 갈기조팝나무는 복산방화서, 아구장나무, 당조팝나무, 인가목나무, 산조팝나무, 긴잎산조팝나무는 산방화서이다.", "발아구 모양에서는 갈기조팝나무는 약단구형이나 나머지 종은 단구형이다.", "세포학적 측면에서 조팝나무속은 염색체수 \\( x=9 \\) 의 기본형에 \\( 2 n=18 \\) 이나 꼬리조팝나무는 \\( 2 n=36 \\) 이다.", "</p><p>전반적으로 형태에 의한 분류와 세포학적, 본 연구의 분자 생물학적 기법에 의한 결과가 일치하지 않는다.", "그 이유 중의 또 다른 하나는 우리나라에서는 보고된 바 없으나 다른 나라에서 조팝나무속 식물들의 교잡을 들 수 있다.", "따라서 교잡에 의한 형태의 중간형이나 분류형질을 어지럽히는 요인이 발생할 수 있다.", "이에 대한 방안으로 조팝나무속 식물군에 대한 rbcL gene 같은 엽록체에 의한 서열분석이 추가되면 보다 명확할 것으로 판단된다.", "</p> <h1>고 찰</h1><p>조팝나무속에 속하는 식물은 높이가 \\( 1.5 \\sim 2 \\mathrm{~m} \\) 이고, 줄기는 모여 나며 밤색이고, 능선이 있으며 윤기가 난다.", "잎은 어긋나고 타원형이며 가장자리에 잔 톱니가 있다.", "꽃은 4~5월에 피고 백색이며 4~6개씩 산형꽃차례로 달리며, 가지의 윗부분은 전체 꽃만 달려서 백색 꽃으로 덮인다.", "꽃잎은 달걀을 거꾸로 세운 모양이며, 꽃받침조각이 뾰족하며 각각 5개씩이고, 수술은 많으며, 암술은 4~5개씩이고 수술보다 짧다.", "</p><p>조팝나무는 꽃이 핀 모양이 튀긴 좁쌀을 붙인 것처럼 보이기 때문에 조팝이라 명명하였으며 수목은 관상용으로 식재하고, 어린 순은 나물로 식용한다.", "</p><p>인가목조팝나무는 경북, 강원도 및 북부지방에서 자라는 낙엽관목으로서 높이가 \\( 1 \\mathrm{~m} \\) 에 달하고 가지에 뚜렷한 능선이 있으며 털이 없다.", "잎은 호생하고 난형이며 첨두 원저로서 표면에 털이 없고 뒷면은 회백색이며 맥액에 털이 있고 가장자리에 톱니가 있다.", "</p><p>떡조팝나무는 대흑산도와 홍도에서 자라는 낙엽관목으로서 당조팝나무와 비슷하지만 앞이 두껍고 윤채가 있으며 뒷면에 털이 있고 잎은 두꺼우며 넓은 도란형 또는 도란상 원형이고 길이 \\( 15 \\sim 35 \\mathrm{~mm} \\) 이며 양끝이 좁으며 표면에 윤채가 있다.", "</p><p>당조팝나무는 경북, 강원도, 황해도 및 북부지방에서 자라는 낙엽관목으로서 높이가 \\( 1.5 \\mathrm{~m} \\) 에 달하고 가지는 옆으로 휘며 어릴 때는 황갈색 털이 밀생하다.", "잎은 호생하고 마름모, 난형 또는 도란형이며 예두 또는 원두이고 원저 또는 넓은 예저이며 길이가 \\( 3 \\sim 5 \\mathrm{~cm} \\) 로 가장자리에 결각상의 예리한 톱니가 있거나 3개로 갈라지고 표면은 짙은 녹색이며 잔털이 있고 뒷면에는 황색털이 밀생한다.", "</p><p>둥근이조팝나무는 서울(북한산)에서 자라는 낙엽관목으로 수고가 \\( 1 \\mathrm{~m} \\), 잔가지는 능선이 있고 적갈색으로서 털이 없으며 겨울눈은 난형 예두이다.", "잎은 호생하고 타원형 또는 넓은 타원형이며 양끝이 둔하고 길이 \\( 2 \\sim 5 \\mathrm{~cm} \\) 로서 겹톱니 또는 홑톱니가 있으며 표면은 짙은 녹색이고 뒷면은 회록색으로 엽맥이 돌출하며 털이 없거나 맥 위에 털이 있다.", "</p><p>참조팝나무는 중부 이북에서 자라는 낙엽관목으로 가지는 능각이 있고 털이 없으며 자갈색이다.", "씨방은 \\( 4 \\sim 5 \\) 개로서 수술의 기부와 더불어 연한 홍색이고 열매는 지름 \\( 3 \\mathrm{~mm} \\) 로서 복봉선 이외에는 털이 없으며 9월에 익는다.", "</p><p>일본조팝나무는 일본산의 낙엽관목으로 잎은 가장자리에 불규칙라고 예리한 톱니가 있으며 뒷면은 색깔이 연하거나 백색이고 양면 또는 뒷면에 털이 있으며 끝이 뾰족하다.", "</p><p>아구장나무는 중부 이북의 산지에서 자라는 낙엽관목으로 수고가 \\( 2 \\mathrm{~m} \\), 잔가지에 털이 있다.", "열매 뒷면에 오랫동안 긴 털이 남아 있고 과서에 털이 없는 것을 설악아구장나무(var. lasiocarpa NAKAI)", ", 잎에 털이 적고 씨방에 털이 없는 것을 초평조팝나무(var. leiocarpa NAKAI)라 한다.", "</p><p>공조팝나무는 중국산 낙엽관목으로 가지 끝이 다소 처진다.", "꽃은 4월에 잎과 같이 피고 지름 \\( 7 \\sim 10 \\mathrm{mm} \\) 로서 백색이며 가지에 산형상으로 나열되어 마치 작은 공을 쪼개어 나열한 것 같아 공조팝나무라고 한다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료와 genomic DNA 추출</h2><p>한국에 자생하는 조팝나무속 14종, 조팝나무(Spiraea prunifolia for. simpliciflora NAKAI)", ", 인가목조팝나무(Spiraea chamaedryfolia var.", "ulmifolia (Scop.) MAXIM.), 떡조팝나무(Spiraea chartacea NAKAI), 당조팝나무(Spiraea chinensis MAXIM.), 둥근잎조팝나무(Spiraea fritschiana var.", "obtusifolia NAKAI), 덤불조팝나무(Spiraea miyabei KOIDZ.), 갈기조팝나무(Spiraea trichocarpa NAKAI), 참조팝나무(Spiraea fritschiana SCHNEID), 일본조팝나무(Spiraea japonica L.), 아구장나무(Spiraea pubescens TURCZ.), 꼬리조팝나무(Spiraea salicifolia L.), 산조팝나무(Spiraea blumei G. DON), 공조팝나무(Spiraea cantoniensis LOUR.), 가는잎조팝나무(Spiraea thunbergii SIEBID)를 채집하였다", "(Table 1).", "각 종당 수령 3년 이상의 식물체에서 20개체로부터 잎을 취하였다.", "집단간 분석을 위하여 한 개체 당 하나의 잎에서 각각 DNA를 추출하여 집단 간 차이를 비교하는데 사용하였다.", "같은 층층나무과의 식나무(Aucuba japonica THUNBERG)를 대조군으로 사용하였다.", "</p><p>각 식물체로부터 DNA를 추출하기 위하여 Plant DNA Zol Reagent (Life Technologies Inc., Grand Island, New York, USA)를 사용하였는데 사용자의 지침서에 의거하여 추출하였다.", "건조시킨 후 TE \\( 100 \\mathrm{ul} \\)에 용해하였다.", "3일간 냉장 보관한 후 DNA정량을 체크하여 DNA 농도가 균질하게 조정하였다.", "</p><h2>ITS 분석</h2><p>ITS1-5.8S-ITS2의 서열은 White 등의 방법에 따랐다.", "ITS1, ITS2, ITS3, ITS4의 염기 시발체를 이용하여 유전자 증폭(PCR)을 실시하였다", "(Table 2).", "이들은 리보소옴 coding 부위인 18S와 28S rRNA 유전자 부위와 noncoding 부위인 5.8S rRNA 유전자부위를 증폭하였다.", "</p><p>PCR 반응을 위하여 추출한 각 분류군의 게놈 DNA \\( 50 \\mathrm{ng} \\), 각 dNTP \\( 100 \\mathrm{uM} \\), 시발체 각 \\( 0.2 \\mathrm{uM}, 1 \\mathrm{x} \\) enzyme buffer, Taq polymerase \\( 2 \\mathrm{unit} \\)를 넣고 증류수로 전체 \\( 50 \\mathrm{ul} \\) volume이 되도록 추가하였다.", "증폭반응은 초기 \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} ~ 90 \\mathrm{sec} \\) 간 변성한 후, 28 사이클로 \\( 94^{\\circ} \\mathrm{C} ~ 30 \\mathrm{sec}, 42^{\\circ} \\mathrm{C} ~ 60 \\mathrm{sec}, 72^{\\circ} \\mathrm{C} ~ 60 \\mathrm{sec} \\) 간 실시하였고 추가로 \\( 72^{\\circ} \\mathrm{C} 5 \\) 분간 연장하였다.", "</p><p>PCR 산물은 \\( 1.5 \\% \\) agarose gel에서 분리하였으며 ethidium bromide로 염색하여 밴드를 현상하였다.", "이때 절편들의 상대적 크기를 비교하기 위해 \\( 100 \\mathrm{bp} \\) ladder DNA marker를 같이 loading시켰다.", "Alpha Image TM (Alpha Innotech Co, USA)을 사용하여 밴드 양상을 조사하였다.", "이후 젤에서 DNA를 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)로 추출하였다.", "추출된 DNA를 bluescript vector와 ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystem, USA)로 서열화하였다.", "</p><h2>계통관계 분석</h2><p>서열에서 결손부위를 포함한 서열 배당은 MEGA4 version 4.0과 Clustal X program으로 분석하였다.", "최절약법에 의한 tree (MP)는 heuristic search, branch-swapping options, tree bisection-reconnection에 따랐다.", "계통분석의 분지는 PHYLIP version 3.57의 NEIGHBOR, neighbor-joining(NJ) 방법에 의해 구성하였다.", "Bootstrap 분석은 1,000회 반복법으로 실시하였다.", "</p><p>분류군 간 유전적 거리(I)와 유전적 동질성(D)은 분류군간 염기쌍의 비교로 산출하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "ITS 서열을 이용한 조팝나무속의 계통분류학적 연구", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-e7ed2f11-0626-4b63-b348-ac85d50c3fff", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "허만규", "허홍욱", "이소영" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,423	<p>식물체가 건조 및 염 스트레스를 받으면 각 기관의 물질 생산의 변이, 분화 및 발달 억제를 통해서 식물의 생산활동을 현저히 저하시켜, 식물의 생장, 형태, 개체발생 및 대사생리에 영향을 미치는 것으로 연구되어 왔다. 염 및 건조스트레스에 대한 연구는 수분결핍에 유도된 ABA 축적 등의 식물체내 호르몬의 변화, 광합성 조절, 삼투조절 물질인 proline의 축적과 체내 이동, 방사선 동위원소를 이용하여 비파괴적인 방법으로 식물체내 수분이동 등의 보고가 있다. 또한 식물체가 염해를 입으면 줄기나 뿌리의 신장감소, 건물중의 감소, 엽면적의 감소, 개화율의 지연이 된다고 알려져 있다.</p><p>현재까지 스트레스에 관련된 형태학적 생리학적 조사는 주로 폿트 또는 양액재배로 이루어지고 있으며, 고체배지를 이용한 실험방법은 아직 확립되어 있지 않다. 이러한 점을 감안하여 본 실험은 고체 배지를 이용한 새로운 실험방법을 이용하여 건조 및 염 스트레스에 대한 식물체의 형태학적인 특성을 뿌리신장률, 근단구조, 물질생산 등의 측면에서 조사하여, 벼 발아단계에서 스트레스 내성품종 육성을 위한 새로운 선발방법을 제공하고자 본 실험을 수행하였다.</p>	생명과학	[ "<p>식물체가 건조 및 염 스트레스를 받으면 각 기관의 물질 생산의 변이, 분화 및 발달 억제를 통해서 식물의 생산활동을 현저히 저하시켜, 식물의 생장, 형태, 개체발생 및 대사생리에 영향을 미치는 것으로 연구되어 왔다.", "염 및 건조스트레스에 대한 연구는 수분결핍에 유도된 ABA 축적 등의 식물체내 호르몬의 변화, 광합성 조절, 삼투조절 물질인 proline의 축적과 체내 이동, 방사선 동위원소를 이용하여 비파괴적인 방법으로 식물체내 수분이동 등의 보고가 있다.", "또한 식물체가 염해를 입으면 줄기나 뿌리의 신장감소, 건물중의 감소, 엽면적의 감소, 개화율의 지연이 된다고 알려져 있다.", "</p><p>현재까지 스트레스에 관련된 형태학적 생리학적 조사는 주로 폿트 또는 양액재배로 이루어지고 있으며, 고체배지를 이용한 실험방법은 아직 확립되어 있지 않다.", "이러한 점을 감안하여 본 실험은 고체 배지를 이용한 새로운 실험방법을 이용하여 건조 및 염 스트레스에 대한 식물체의 형태학적인 특성을 뿌리신장률, 근단구조, 물질생산 등의 측면에서 조사하여, 벼 발아단계에서 스트레스 내성품종 육성을 위한 새로운 선발방법을 제공하고자 본 실험을 수행하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Agar 배지를 이용한 건조 및 염 처리에 대한 벼 식물체의 근계 변화", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-f4b6181c-09a3-469f-8a23-1a4566bc4939", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2004", "doc_author": [ "강동진", " 石井龍一", "김길웅", "이인중" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,424	<h1>고 찰</h1><p>폐경 후 나타나는 만성질환은 비만과 관련되어 있으며 비만은 미토콘드리아 수를 감소시켜 인슐린저항성의 발병률을 높이는 것으로 보고되어 있다. 그러나 운동이 비만치료에 있어서 그 효과가 있음에도 불구하고 폐경관련 비만에서 미토콘드리아 생합성에 관련된 인자들의 발현차이를 규명한 연구는 여전히 부족하다. 따라서 본 연구는 난소절 제로 폐경 모델흰쥐를 대상으로 고지방식이로 비만을 유도함과 동시에 규칙적인 운동을 통해 미토콘드리아 생합성과 관련된 유전자 PPAR-\(\gamma\), PGC-1(\(\alpha\),\(\beta\)), TFAM, 그리고 NRf-1 의 발현양상을 알아보고자 하였다. 본 연구에서는 난소절제 후고지방식이로 증가된 체중과 피하 지방량을 알아보기 위해 무게를 측정하였고, 그 결과 H군이 다른 두 군에 비해 증가된 지방의 무게를 보여주었다. 이러한 결과는 고지방 식이로 지방의 증가로 체중이 늘어난 것으로 사료되며, 폐경에 따른 에스트로겐 호르몬 감소로 혈중 콜레스테롤의 수치를 높여 중성 지방의 축적을 증가시킨 것으로 볼 수 있다. 반면 운동은 폐경기 여성에게 체중 조절에 효과가 있는 것처럼 본 연구에서도 고지방식이와 운동을 함께 수행한 H+EX군의 피하지방무게는 H군에 비하여 유의하게 감소하였다. 이는 지속적으로 고지방식이를 섭취하였음에도 불구하고 규칙적인 운동에 따른 신체활동의 증가가 대사를 촉진시켜 지방산의 산화활동을 높였기 때문에 지방분해를 가속화시켜 결국 지방덩어리가 줄어들어 체중이 감소된 것으로 판단된다.</p><p>최근 지방조직에서 미토콘드리아의 활성은 지방분해(lipolysis)와 지질합성(lipogenesis)을 포함하여 지질대사에 도움을 준다고 알려지면서 이들 활성 기전에 관심이 모아지고 있다. 미토콘드리아는 성장 과 증식을 하기 위해 자신의 DNA를 쪼개며 그 수를 증가시키기 위해 PPAR-\( \gamma \), PGC-1, NRF-1, TFAM의 유전자들을 활성시킨다. 즉 지방조직에서 발현하는 PPAR-\( \gamma \)는 지질단백분해효소와 같은 adipocytic 유전자들의 발현을 상향조절하여 지방합성을 유도한다. 또한 PPAR-\( \gamma \)의 발현이 증가하면 TNF 생성을 억제시켜 염증을 저하시키고, adiponectine의 생산 활동이 증가되어 인슐린민 감성을 높여 지방세포속에 있는 미토콘드리아 수를 증가시킨다.</p><p>PGC-1은 \( a \) 와 \( \beta \) 로 구분하며 지방산산화와 관련된 유전자들을 증가시킨다고 알려져 있다. 즉 estrogen receptor related receptor인 핵수용체 와 결합하여 포도당산화를 막을 뿐만 아니라 미토콘드리아생합성 관련 유전자들의 활동을 높여 지방의 이용률과 지방산화를 증가시킨다. 게다가 PGC-1는 NRF-1와 TFAM의 upstream에 놓여 있기 때문에 미토콘드리아생합성인자들과 결합하여 산화 인산화 관련유전자들의 전사활동을 도와 미토콘드리아를 증식, 호흡, 열조절(thermogenesis), 그리고 DNA의 전사를 활성시켜 미토콘드리아의 수를 증가시킬 수 있으며 NRF-1의 활성을 유도한다. NRF-1은 TFAM의 합성을 자극하는 전사인자들을 중계하며, 최종적으로 TFAM을 합성시켜 mtDNA 분자들의 복제활동을 높여 그 수를 증가하도록 도와준다. 그러므로 이들 유전자들은 미토콘드리아를 복제하여 그 수를 증가시키는데 중요한 역할을 담당하는 인자들이기에 이들 유전자들의 발현 증가가 비만개선에 필요하다고 본다. 그러므로 본 연구는 고지방식이로 유도된 비만집단인 H군에서 PPAR-\(\gamma\), PGC-1(\(\alpha\),\(\beta\)), TFAM, NRf-1 발현을 조사하였고, 그 결과 다른 두 군에 비해 모두 억제된 것으로 나타났다. 그러나 운동을 수행한 H+EX군의 PPAR-\(\gamma\), PGC-1(\(\alpha\),\(\beta\)), TFAM, 그리고 NRf- 1의 발현은 H군 보다 더욱 증가된 것으로 나타났으며, 조직 내 산재하고 있는 미토콘드리아의 수 역시 유의하게 증가한 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 고지방식이에 따른 지방산의 증가로 미토콘드리아의 수와 산화 인산화(oxidative phosphorylation)를 모두 감소시켜 미토콘드리아의 생합성 관련 유전자들의 발현이 억제되어 그 수가 감소된다는 보고와 함께 폐경비만의 지방세포에서도 일치된 결과라 사료된다.</p><p>Fasshauer와 Paschke 에 의하면 PPAR-\( \gamma \) 의 결핍은 확실히 비만과 인슐린저항성이 나타난다고 하였으며, Civitarese 등은 비만이 지질과 탄수화물대사를 결함시키고, 이어서 미토콘드리아의 생합성을 억제한다고 보고하였다. 그러므로 폐경기 비만에 따른 지방세포에서는 미토콘드리아 생합성 관련유전자가 억제되는 것으로 판단된다.</p><p>반면 운동이 미토콘드리아의 생합성 관련 유전자들의 발현을 증가시킨 이유는 운동으로 근육 세포내 \( \mathrm{Ca}^{++} \)농도를 증가 시키고 연속된 신호전달이 AMP kinase (AMPK)의 활성으로 이어져 PGC-1의 발현을 유도시킬 수 있다. 또한 규칙적인 운동은 지속적인 \( \mathrm{Ca}^{++} \)증가로 calmodulin dependent kinase(CaMK) 활동을 높여 순차적으로 PGC-1\(\alpha\), \( 1\beta\), TFAM, NRf-1의 발현을 유도하여 미토콘드리아의 생합성을 증가시킨다. 뿐만 아니라 운동은 산소흡수량을 높여 산소이용률을 증가시키고 이어서 ROS생성을 높인다. 이때 ROS는 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)를 증가시키며, 증가된 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \)는 PGC-1\(\alpha\)를 상승시켜 미토콘드리아 생합성을 유도하는 것으로 알려져 있다.</p><p>Suarez 등와 Vina 등은 운동으로 생성된 ATP 증가가 산화 인산화의 능력을 더욱 가속화시켰기 때문에 미토콘드리아의 기능과 복제 수를 증가시킨다고 보고하였다. 그러므로 본 연구는 운동을 통해 피하지방세포 내 미토콘드리아생합성 유전자들의 발현을 증가시켰고, 이들의 증가는 미토콘드리아 수 증가에도 영향을 미칠 것으로 사료된다. 따라서 규칙적인 운동은 폐경기 비만에 있어서 그 피하지방의 감소를 비롯하여 지방세포 내 미토콘드리아 생합성 유전자들의 활동에 긍정적 으로 작용될 가능성이 높다고 판단된다.</p> <h1>서 론</h1><p>비만은 지방세포의 수와 크기를 증가시키며, 환경적, 유전적, 정신적인 원인에 의해 발병된다. 특히 폐경기 여성들은 폐경전 보다 적은 신체활동과 난소 기능결핍에 따른 에스트로겐 분비능력의 결함 등으로 인해 인체의 생리적 변화로 쉽게 비만해진다. 이들 비만은 단순히 외형적 모습만 변화하는 것이 아니라 여러 대사증후(고혈압, 인슐린 저항성, 제 2형 당뇨병)의 발병과 함께 사망률을 높이는 원인으로서 그 심각성이 매우 크다. 그러므로 폐경 후 체중조절은 비만을 개선하고 이에 따른 질병을 예방할 수 있기에 많은 여성들의 관심이 주목되고 있다.</p><p>일반적으로 지방조직은 잉여 칼로리(excess calories)의 저장고로서 중성지방의 형태로 에너지를 저장하고 있다가 영양이 부족할 때 유리지방산(free fatty acids, FFA)으로 분해되어 연료로 사용된다. 그러나 지방저장고의 에너지사용이 적어지면 체중이 늘어나 비만해 지고 지방 세포 내 미토콘드리아는 생합성 능력과 분해의 불균형으로 기능장애가 나타난다. 즉 미토콘드리아의 생합성과 수 감소로 나타나는 기능장애는 에너지소비와 ATP합성을 떨어뜨리고, ROS의 활동을 증가시켜 산화적 손상을 일으키는 원인이 된다. 뿐만 아니라 글루코스와 유리지방산의 대사를 방해하여 인슐린저항성과 같은 병적 상태를 유발하는 것으로 알려져 있다.</p><p>그러므로 비만에 있어서 미토콘드리아의 기능이 중요하며, 그 기능을 유지하기 위해서는 미토콘드리아의 생합성 및 수가 증가되어야 한다. 이러한 미토콘드리아의 생합성을 조절하는 몇몇 유전자들은 peroxisome proliferators-activated receptor (PPAR)- \( \gamma \), PPAR coactivator-1 (PGC-1), nuclear respiratory factor-1 (NRf-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) 등이 있다.</p><p>이중 PPAR-\( \gamma \) 는 핵에 있는 수용체로서 지방산수송단백질과 long chain acyl-CoA synthase 발현을 유도하여 미토콘드리아 내 지방산 흡수를 높여주고 PGC-1과 함께 발현을 한다. PGC-1은 미토콘드리아 DNA (mtDNA)에 의해 생합성과 호흡관련유전자(NRf-1, TFAM)들의 전사활동을 조절하여 지방산대사의 전사인자들을 조절한다.</p><p>NRf-1은 전자전달계, 글루코스 운반, 철 생합성 단백질 발현을 도와 mtDNA 전사와 복제를 담당하며, TFAM는 mtDNA를 유지하는 인자로서 미토콘드리아의 복제를 활성 시킨다. 따라서 이들 인자들의 발현증가를 위한 수단이 요구되며 그 중 운동과 같은 신체활동은 미토콘드리아 생합성에 크게 기인하는 것으로 보고되어 있다. 운동은 체중과 체성분을 조절하고, 혈압조절과 더불어 콜레스테롤을 감소시킬 뿐만 아니라 제2형 당뇨병 과 심혈관질환을 개선시키고 비만을 예방하는 효과를 가지고 있다. 또한 규칙적인 운동이 PGC-1, TFAM의 발현단계를 높여 미토콘드리아 생합성증가를 도와준다고 알려져 있다.</p><p>그러나 폐경기 비만에 따른 피하지방에서 미토큰드리아의 생합성 조절에 대한 연구는 아직까지 명확하게 규명되어 있지 않고 있다.</p><p>이에 본 연구는 폐경모델로 난소절제술과 고지방식이로 비만을 유도하였으며, 이들 피하지방에서 분리된 지방세포에서 발현되는 PPAR-\( \gamma \), PGC-1\( (a, \beta) \), TFAM, NRf-1 의 유전자들이 어떻게 변화되는지 관찰하고자 하며, 규칙적으로 수행한 운동이 미토콘드리아 생합성 관련 유전자들에 어떠한 영향을 미치는지 규명하는데 그 목적을 두고 알아보고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물 및 식이 방법</h2><p>실험동물은 8주령 Sprague-Dawley (SD)계 암컷 흰쥐(rat)를 사용하였다. 모든 실험동물은 H대학 동물실험윤리위원회로부터 승인(HY-IACUC -10-026)을 받은 후 SPF된 실험동물실에서 사육되었다. 1주간의 적응기를 거친 후 난소절제 수술을 하였고, 2주간의 회복기를 거친 후 본 실험을 시작하였다. 실험 집단은 총 3집단으로 나누어 분류하였으며, 한 집단에 4마리씩 각각 다음과 같이 group을 배정하였다. (1) General diet group (C group), (2) High fat diet (H group) (3) High fat diet + Exercise group (H+EX group)으로 7주 동안 식이와 물은 자유롭게 섭취하였고, 고지방식이는 아래 Table 1과 같다.</p><h2>운동방법</h2><p>운동방법은 Melton 등[23]의 수영훈련방법을 인용하였으며, 운동군들은 수심 \( 70 \mathrm{~cm} \), 수온 31-33 \( { }^{\circ} \mathrm{C} \)의 실험동물용 수조에서 첫 1주 동안 5-40분까지 시간을 점진적으로 증가시켜 수영훈련 적응기를 거쳤다. 본 운동은 동시간대 (am 10:00) 규칙적으로 실시하였으며, 주당 5일 총 6주간 실시하였고, 4주까지는 60분씩, 5~6주는 유산소성 트레이닝 효과를 확실하게 수행하기 위하여 75분씩 실시하였다. 이러한 수영방법은 무부하상태에서 자유롭게 수영하도록 하였고, 이들 수영운동의 강도는 중등도(최대산소섭취량 \( 60 \% \) 해당)에 해당되는 것으로 알려져 있으며, 운동직후 실험동물의 체온감소를 예방하기 위해 마른수건과 헤어드라이기를 즉시 이용하여 물기를 제거한 후 사육실로 옮겨졌다.</p><h2>조직채취</h2><p>수영운동은 희생 24시간 전부터 중단하였고, 식이는 12시간 전부터 절식하였으며, 물만 공급하였다. 실험종료일에는 혼합마취액(Rumpun:Zoletil=1:1 비율로 혼합)으로 마취한 후 하복부의 피부를 박리한 후 서혜부(lingunal region)에 있는 모든 지방을 적출하여 미세저울(microsclae: OHAUS Corp,AR2140, USA)로 무게를 측정한 후 염색용과 지방세포분리용으로 구분하여 나누었다.</p><h2>지방세포분리 방법</h2><p>서혜부지방조직에서 지방세포를 분리하기 위해 Gómez-Ruiz 등의 방법을 인용하였다. 채취한 지방조직은 2분간 가위로 잘게 자른 후 준비된 \(3\%\) bovine serum albumin을 함유한 Krebs-Ringer bicarbonate (KRBA) buffer (Sigma-Aldrich, USA) \( 1 \mathrm{ml} \)와 collagenase type II ( \( 1.25 \mathrm{~g} / \mathrm{ml} \), Sigma-Aldrich, USA)를 함께 혼합한 용액 속에 작게 분쇄된 조직을 넣은 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) water bath에 넣고 60분간 수시로 흔들어 주면서 분해시켰다. 이후 \( 100 \mu \mathrm{m} \) 나일론 여과지(mesh filter, BD bioscience, USA)를 이용하여 불순물들을 제거하였고, 200x g에서 1분간 원심분리하여 지방세포 등을 모은 후 KRBA buffer \( 15 \mathrm{ml} \) 로 3회 세척한 후 다시 원심분리하여 상층액은 제거하였으며, 하부에 모아진 지방세포들은 \( -70^{\circ} \mathrm{C} \) 냉동고에서 사용할 때까지 보관하였다.</p><h2>RT-PCR</h2><p>분리된 지방세포에 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, USA)을 넣고 균질화하였다. 튜브 \( 1 \mathrm{ml} \) 당 \( 200 \mu\mathrm{l} \)의 chloroform을 첨가한 후 힘차게 흔들어 준 다음 실온에서 5분간 반응시킨 후 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10분간 원심분리(12500x g)하고, RNA를 분리하였다. 각 군별 total RNA를 정량하기 위해 Smartspec \( { }^{\mathrm{TM}} \) Plus spectrophotometer (Bio RAD, USA)를 이용하여 측정하였다. RNA 역전사(reverse transcription)를 반응시키기 위해 total RNA \( 5 \mu \mathrm{g} \) 을 DEPC, 10mMdNTI, Oligo (dT)를 첨가하여 PCR 기계(T 3000 Thermocycler, Biometra; Germany)로 반응시켜 cDNA를 얻어내었다. 지방 세포에서 발현되는 유전자들의 염기서열과 반응조건은 Table 2와 같이 수행하였고, PCR 반응산물은 \( 2 \% \) agarose gel에서 \( 100 \mathrm{~V} \)로 전기 영동하여 UV transilluminator로 사진을 찍은 후 mRNA의 발현 정도를 Gel doc 2000 (Bio red; ITALY)을 이용하여 농도를 측정하였다.</p><h2>면역조직화학염색</h2><p>염색용 지방조직은 \( 4 \% \) paraformaldehyde, \( 0.1 \% \) glutaraldehyde와 0.1M phosphate buffer saline (PBS) 으로 혼합된 고정액으로 실온에서 12시간 고정하였으며, 이후 \( 30 \% \) sucrose에서 7일간 냉장 보관하였다. 냉동절편기(Leica, Germany)를 이용하여 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 지방조직을 \( 20 ~\mu \mathrm{m} \) 두께로 절편을 제작한 후 0.1M PBS로 세척하고 \( 10 \% \) normal donkey serum (NDS)으로 40분간 실온에서 반응시켰다. 이후 1차 항체인 Mitochondria Marker (Abcam, CB, UK)를 1:300으로 희석하여 \( 4{ }^{\circ} \mathrm{C} \)에서 12시간 반응시켰다. 이어서 0.1M PBS로 3회 5분간 세척한 후 \( 2 \% \) NDS로 15분간 실온에서 처리한 후 Cy3-conjugated affinipure donkey anti-IgG (1:200, Invitrogen, USA)를 사용하여 3시간 반응시킨 다음 0.1M PBS로 3회 5분간 다시 세척한 후 microscope slides (Fisher Scientific)에 mounting medium (Vectashield, Vector Lab, USA)과 커버슬라이드로 봉입하고 형광현미경(Leica TCS, Wetzlaar, Germany)으로 관찰하였다.</p><h2>자료처리방법</h2><p>이 연구에서 얻어진 모든 결과는 SPSS/PC 11.0 통계 프로그램을 이용하여, 각 변인에 대한 기술통계치(mean\(\pm\)SD)를 산출하고 집단 간 변인의 차이를 확인하기 위해 일원변량분석을 실시하였으며 집단 간 유의한 차이가 있을 경우 LSD (least significant difference)를 이용하여 사후검증을 실시하였다. 유의 기준은 \( a=0.05 \) 수준으로 설정하였다.</p> <h1>결 과</h1><h2>피하지방무게</h2><p>피하지방의 무게는 C군\( (2.66 \pm 0.5 \mathrm{~g}) \)과 비교하여 H군 \( (6.45 \pm 0.64 \mathrm{~g}) \)에서 지방무게가 증가하였으며, 유의한 차이 \( (p<0.01) \)가 있는 것으로 나타났다. 그러나 H+EX군\( (2.58 \pm 0.85 \)\( \mathrm{g}) \)에서는 H군\( (6.45 \pm 0.64 \mathrm{~g}) \)에 비해 유의하게 \( (p<0.01) \) 감소된 지방의 무게로 나타났다.</p><h2>PPAR- \( \gamma \), PGC-1\( \alpha \), PGC-1\( \beta \) mRNA</h2><p>PPAR- \( \gamma \), PGC-1\( (\alpha, \beta)\) mRNA 는 H군이 다른 군에 비해 거의 발현되지 않았으며, H+EX군에서는 H군과 C군에 비해 증가된 것으로 유의한 차이\( (p<0.05, ~p<0.01) \)가 있는 것으로 나타났다.</p><h2>NRf-1, TFAM mRNA</h2><p>NRF-1 mRNA는 H군이 다른 군에 비해 가장 낮게 발현되었으며 유의한 차이\( (p<0.05) \)가 있는 것으로 나타났으며, H군의 TFAM mRNA발현 역시 거의 나타나지 않았다. 반면 H+EX군에서의 NRF-1, TFAM mRNA는 H군과 C군에 비해 증가하였고 유의한 차이 \( (p<0.05, ~p<0.01) \)가 있는 것으로 나타났다.</p><h2>조직학적 소견</h2><p>지방조직 내 산재하고 있는 미토콘드리아를 관찰한 결과, H군에서는 다른 두 군에 비하여 음성반응이 나타났다. 그러나 H+EX군의 미토콘드리아는 다른 두 군보다도 유의하게 더 높은 양성반응으로 관찰되었다.</p>	생명과학	[ "<h1>고 찰</h1><p>폐경 후 나타나는 만성질환은 비만과 관련되어 있으며 비만은 미토콘드리아 수를 감소시켜 인슐린저항성의 발병률을 높이는 것으로 보고되어 있다.", "그러나 운동이 비만치료에 있어서 그 효과가 있음에도 불구하고 폐경관련 비만에서 미토콘드리아 생합성에 관련된 인자들의 발현차이를 규명한 연구는 여전히 부족하다.", "따라서 본 연구는 난소절 제로 폐경 모델흰쥐를 대상으로 고지방식이로 비만을 유도함과 동시에 규칙적인 운동을 통해 미토콘드리아 생합성과 관련된 유전자 PPAR-\\(\\gamma\\), PGC-1(\\(\\alpha\\),\\(\\beta\\)), TFAM, 그리고 NRf-1 의 발현양상을 알아보고자 하였다.", "본 연구에서는 난소절제 후고지방식이로 증가된 체중과 피하 지방량을 알아보기 위해 무게를 측정하였고, 그 결과 H군이 다른 두 군에 비해 증가된 지방의 무게를 보여주었다.", "이러한 결과는 고지방 식이로 지방의 증가로 체중이 늘어난 것으로 사료되며, 폐경에 따른 에스트로겐 호르몬 감소로 혈중 콜레스테롤의 수치를 높여 중성 지방의 축적을 증가시킨 것으로 볼 수 있다.", "반면 운동은 폐경기 여성에게 체중 조절에 효과가 있는 것처럼 본 연구에서도 고지방식이와 운동을 함께 수행한 H+EX군의 피하지방무게는 H군에 비하여 유의하게 감소하였다.", "이는 지속적으로 고지방식이를 섭취하였음에도 불구하고 규칙적인 운동에 따른 신체활동의 증가가 대사를 촉진시켜 지방산의 산화활동을 높였기 때문에 지방분해를 가속화시켜 결국 지방덩어리가 줄어들어 체중이 감소된 것으로 판단된다.", "</p><p>최근 지방조직에서 미토콘드리아의 활성은 지방분해(lipolysis)와 지질합성(lipogenesis)을 포함하여 지질대사에 도움을 준다고 알려지면서 이들 활성 기전에 관심이 모아지고 있다.", "미토콘드리아는 성장 과 증식을 하기 위해 자신의 DNA를 쪼개며 그 수를 증가시키기 위해 PPAR-\\( \\gamma \\), PGC-1, NRF-1, TFAM의 유전자들을 활성시킨다.", "즉 지방조직에서 발현하는 PPAR-\\( \\gamma \\)는 지질단백분해효소와 같은 adipocytic 유전자들의 발현을 상향조절하여 지방합성을 유도한다.", "또한 PPAR-\\( \\gamma \\)의 발현이 증가하면 TNF 생성을 억제시켜 염증을 저하시키고, adiponectine의 생산 활동이 증가되어 인슐린민 감성을 높여 지방세포속에 있는 미토콘드리아 수를 증가시킨다.", "</p><p>PGC-1은 \\( a \\) 와 \\( \\beta \\) 로 구분하며 지방산산화와 관련된 유전자들을 증가시킨다고 알려져 있다.", "즉 estrogen receptor related receptor인 핵수용체 와 결합하여 포도당산화를 막을 뿐만 아니라 미토콘드리아생합성 관련 유전자들의 활동을 높여 지방의 이용률과 지방산화를 증가시킨다.", "게다가 PGC-1는 NRF-1와 TFAM의 upstream에 놓여 있기 때문에 미토콘드리아생합성인자들과 결합하여 산화 인산화 관련유전자들의 전사활동을 도와 미토콘드리아를 증식, 호흡, 열조절(thermogenesis), 그리고 DNA의 전사를 활성시켜 미토콘드리아의 수를 증가시킬 수 있으며 NRF-1의 활성을 유도한다.", "NRF-1은 TFAM의 합성을 자극하는 전사인자들을 중계하며, 최종적으로 TFAM을 합성시켜 mtDNA 분자들의 복제활동을 높여 그 수를 증가하도록 도와준다.", "그러므로 이들 유전자들은 미토콘드리아를 복제하여 그 수를 증가시키는데 중요한 역할을 담당하는 인자들이기에 이들 유전자들의 발현 증가가 비만개선에 필요하다고 본다.", "그러므로 본 연구는 고지방식이로 유도된 비만집단인 H군에서 PPAR-\\(\\gamma\\), PGC-1(\\(\\alpha\\),\\(\\beta\\)), TFAM, NRf-1 발현을 조사하였고, 그 결과 다른 두 군에 비해 모두 억제된 것으로 나타났다.", "그러나 운동을 수행한 H+EX군의 PPAR-\\(\\gamma\\), PGC-1(\\(\\alpha\\),\\(\\beta\\)), TFAM, 그리고 NRf- 1의 발현은 H군 보다 더욱 증가된 것으로 나타났으며, 조직 내 산재하고 있는 미토콘드리아의 수 역시 유의하게 증가한 것으로 관찰되었다.", "이러한 결과는 고지방식이에 따른 지방산의 증가로 미토콘드리아의 수와 산화 인산화(oxidative phosphorylation)를 모두 감소시켜 미토콘드리아의 생합성 관련 유전자들의 발현이 억제되어 그 수가 감소된다는 보고와 함께 폐경비만의 지방세포에서도 일치된 결과라 사료된다.", "</p><p>Fasshauer와 Paschke 에 의하면 PPAR-\\( \\gamma \\) 의 결핍은 확실히 비만과 인슐린저항성이 나타난다고 하였으며, Civitarese 등은 비만이 지질과 탄수화물대사를 결함시키고, 이어서 미토콘드리아의 생합성을 억제한다고 보고하였다.", "그러므로 폐경기 비만에 따른 지방세포에서는 미토콘드리아 생합성 관련유전자가 억제되는 것으로 판단된다.", "</p><p>반면 운동이 미토콘드리아의 생합성 관련 유전자들의 발현을 증가시킨 이유는 운동으로 근육 세포내 \\( \\mathrm{Ca}^{++} \\)농도를 증가 시키고 연속된 신호전달이 AMP kinase (AMPK)의 활성으로 이어져 PGC-1의 발현을 유도시킬 수 있다.", "또한 규칙적인 운동은 지속적인 \\( \\mathrm{Ca}^{++} \\)증가로 calmodulin dependent kinase(CaMK) 활동을 높여 순차적으로 PGC-1\\(\\alpha\\), \\( 1\\beta\\), TFAM, NRf-1의 발현을 유도하여 미토콘드리아의 생합성을 증가시킨다.", "뿐만 아니라 운동은 산소흡수량을 높여 산소이용률을 증가시키고 이어서 ROS생성을 높인다.", "이때 ROS는 \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}_{2} \\)를 증가시키며, 증가된 \\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}_{2} \\)는 PGC-1\\(\\alpha\\)를 상승시켜 미토콘드리아 생합성을 유도하는 것으로 알려져 있다.", "</p><p>Suarez 등와 Vina 등은 운동으로 생성된 ATP 증가가 산화 인산화의 능력을 더욱 가속화시켰기 때문에 미토콘드리아의 기능과 복제 수를 증가시킨다고 보고하였다.", "그러므로 본 연구는 운동을 통해 피하지방세포 내 미토콘드리아생합성 유전자들의 발현을 증가시켰고, 이들의 증가는 미토콘드리아 수 증가에도 영향을 미칠 것으로 사료된다.", "따라서 규칙적인 운동은 폐경기 비만에 있어서 그 피하지방의 감소를 비롯하여 지방세포 내 미토콘드리아 생합성 유전자들의 활동에 긍정적 으로 작용될 가능성이 높다고 판단된다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>비만은 지방세포의 수와 크기를 증가시키며, 환경적, 유전적, 정신적인 원인에 의해 발병된다.", "특히 폐경기 여성들은 폐경전 보다 적은 신체활동과 난소 기능결핍에 따른 에스트로겐 분비능력의 결함 등으로 인해 인체의 생리적 변화로 쉽게 비만해진다.", "이들 비만은 단순히 외형적 모습만 변화하는 것이 아니라 여러 대사증후(고혈압, 인슐린 저항성, 제 2형 당뇨병)의 발병과 함께 사망률을 높이는 원인으로서 그 심각성이 매우 크다.", "그러므로 폐경 후 체중조절은 비만을 개선하고 이에 따른 질병을 예방할 수 있기에 많은 여성들의 관심이 주목되고 있다.", "</p><p>일반적으로 지방조직은 잉여 칼로리(excess calories)의 저장고로서 중성지방의 형태로 에너지를 저장하고 있다가 영양이 부족할 때 유리지방산(free fatty acids, FFA)으로 분해되어 연료로 사용된다.", "그러나 지방저장고의 에너지사용이 적어지면 체중이 늘어나 비만해 지고 지방 세포 내 미토콘드리아는 생합성 능력과 분해의 불균형으로 기능장애가 나타난다.", "즉 미토콘드리아의 생합성과 수 감소로 나타나는 기능장애는 에너지소비와 ATP합성을 떨어뜨리고, ROS의 활동을 증가시켜 산화적 손상을 일으키는 원인이 된다.", "뿐만 아니라 글루코스와 유리지방산의 대사를 방해하여 인슐린저항성과 같은 병적 상태를 유발하는 것으로 알려져 있다.", "</p><p>그러므로 비만에 있어서 미토콘드리아의 기능이 중요하며, 그 기능을 유지하기 위해서는 미토콘드리아의 생합성 및 수가 증가되어야 한다.", "이러한 미토콘드리아의 생합성을 조절하는 몇몇 유전자들은 peroxisome proliferators-activated receptor (PPAR)- \\( \\gamma \\), PPAR coactivator-1 (PGC-1), nuclear respiratory factor-1 (NRf-1), mitochondrial transcription factor A (TFAM) 등이 있다.", "</p><p>이중 PPAR-\\( \\gamma \\) 는 핵에 있는 수용체로서 지방산수송단백질과 long chain acyl-CoA synthase 발현을 유도하여 미토콘드리아 내 지방산 흡수를 높여주고 PGC-1과 함께 발현을 한다.", "PGC-1은 미토콘드리아 DNA (mtDNA)에 의해 생합성과 호흡관련유전자(NRf-1, TFAM)들의 전사활동을 조절하여 지방산대사의 전사인자들을 조절한다.", "</p><p>NRf-1은 전자전달계, 글루코스 운반, 철 생합성 단백질 발현을 도와 mtDNA 전사와 복제를 담당하며, TFAM는 mtDNA를 유지하는 인자로서 미토콘드리아의 복제를 활성 시킨다.", "따라서 이들 인자들의 발현증가를 위한 수단이 요구되며 그 중 운동과 같은 신체활동은 미토콘드리아 생합성에 크게 기인하는 것으로 보고되어 있다.", "운동은 체중과 체성분을 조절하고, 혈압조절과 더불어 콜레스테롤을 감소시킬 뿐만 아니라 제2형 당뇨병 과 심혈관질환을 개선시키고 비만을 예방하는 효과를 가지고 있다.", "또한 규칙적인 운동이 PGC-1, TFAM의 발현단계를 높여 미토콘드리아 생합성증가를 도와준다고 알려져 있다.", "</p><p>그러나 폐경기 비만에 따른 피하지방에서 미토큰드리아의 생합성 조절에 대한 연구는 아직까지 명확하게 규명되어 있지 않고 있다.", "</p><p>이에 본 연구는 폐경모델로 난소절제술과 고지방식이로 비만을 유도하였으며, 이들 피하지방에서 분리된 지방세포에서 발현되는 PPAR-\\( \\gamma \\), PGC-1\\( (a, \\beta) \\), TFAM, NRf-1 의 유전자들이 어떻게 변화되는지 관찰하고자 하며, 규칙적으로 수행한 운동이 미토콘드리아 생합성 관련 유전자들에 어떠한 영향을 미치는지 규명하는데 그 목적을 두고 알아보고자 한다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물 및 식이 방법</h2><p>실험동물은 8주령 Sprague-Dawley (SD)계 암컷 흰쥐(rat)를 사용하였다.", "모든 실험동물은 H대학 동물실험윤리위원회로부터 승인(HY-IACUC -10-026)을 받은 후 SPF된 실험동물실에서 사육되었다.", "1주간의 적응기를 거친 후 난소절제 수술을 하였고, 2주간의 회복기를 거친 후 본 실험을 시작하였다.", "실험 집단은 총 3집단으로 나누어 분류하였으며, 한 집단에 4마리씩 각각 다음과 같이 group을 배정하였다.", "(1) General diet group (C group), (2) High fat diet (H group) (3) High fat diet + Exercise group (H+EX group)으로 7주 동안 식이와 물은 자유롭게 섭취하였고, 고지방식이는 아래 Table 1과 같다.", "</p><h2>운동방법</h2><p>운동방법은 Melton 등[23]의 수영훈련방법을 인용하였으며, 운동군들은 수심 \\( 70 \\mathrm{~cm} \\), 수온 31-33 \\( { }^{\\circ} \\mathrm{C} \\)의 실험동물용 수조에서 첫 1주 동안 5-40분까지 시간을 점진적으로 증가시켜 수영훈련 적응기를 거쳤다.", "본 운동은 동시간대 (am 10:00) 규칙적으로 실시하였으며, 주당 5일 총 6주간 실시하였고, 4주까지는 60분씩, 5~6주는 유산소성 트레이닝 효과를 확실하게 수행하기 위하여 75분씩 실시하였다.", "이러한 수영방법은 무부하상태에서 자유롭게 수영하도록 하였고, 이들 수영운동의 강도는 중등도(최대산소섭취량 \\( 60 \\% \\) 해당)에 해당되는 것으로 알려져 있으며, 운동직후 실험동물의 체온감소를 예방하기 위해 마른수건과 헤어드라이기를 즉시 이용하여 물기를 제거한 후 사육실로 옮겨졌다.", "</p><h2>조직채취</h2><p>수영운동은 희생 24시간 전부터 중단하였고, 식이는 12시간 전부터 절식하였으며, 물만 공급하였다.", "실험종료일에는 혼합마취액(Rumpun:Zoletil=1:1 비율로 혼합)으로 마취한 후 하복부의 피부를 박리한 후 서혜부(lingunal region)에 있는 모든 지방을 적출하여 미세저울(microsclae: OHAUS Corp,AR2140, USA)로 무게를 측정한 후 염색용과 지방세포분리용으로 구분하여 나누었다.", "</p><h2>지방세포분리 방법</h2><p>서혜부지방조직에서 지방세포를 분리하기 위해 Gómez-Ruiz 등의 방법을 인용하였다.", "채취한 지방조직은 2분간 가위로 잘게 자른 후 준비된 \\(3\\%\\) bovine serum albumin을 함유한 Krebs-Ringer bicarbonate (KRBA) buffer (Sigma-Aldrich, USA) \\( 1 \\mathrm{ml} \\)와 collagenase type II ( \\( 1.25 \\mathrm{~g} / \\mathrm{ml} \\), Sigma-Aldrich, USA)를 함께 혼합한 용액 속에 작게 분쇄된 조직을 넣은 후 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) water bath에 넣고 60분간 수시로 흔들어 주면서 분해시켰다.", "이후 \\( 100 \\mu \\mathrm{m} \\) 나일론 여과지(mesh filter, BD bioscience, USA)를 이용하여 불순물들을 제거하였고, 200x g에서 1분간 원심분리하여 지방세포 등을 모은 후 KRBA buffer \\( 15 \\mathrm{ml} \\) 로 3회 세척한 후 다시 원심분리하여 상층액은 제거하였으며, 하부에 모아진 지방세포들은 \\( -70^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 냉동고에서 사용할 때까지 보관하였다.", "</p><h2>RT-PCR</h2><p>분리된 지방세포에 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, USA)을 넣고 균질화하였다.", "튜브 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 당 \\( 200 \\mu\\mathrm{l} \\)의 chloroform을 첨가한 후 힘차게 흔들어 준 다음 실온에서 5분간 반응시킨 후 \\( 4{ }^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 10분간 원심분리(12500x g)하고, RNA를 분리하였다.", "각 군별 total RNA를 정량하기 위해 Smartspec \\( { }^{\\mathrm{TM}} \\) Plus spectrophotometer (Bio RAD, USA)를 이용하여 측정하였다.", "RNA 역전사(reverse transcription)를 반응시키기 위해 total RNA \\( 5 \\mu \\mathrm{g} \\) 을 DEPC, 10mMdNTI, Oligo (dT)를 첨가하여 PCR 기계(T 3000 Thermocycler, Biometra; Germany)로 반응시켜 cDNA를 얻어내었다.", "지방 세포에서 발현되는 유전자들의 염기서열과 반응조건은 Table 2와 같이 수행하였고, PCR 반응산물은 \\( 2 \\% \\) agarose gel에서 \\( 100 \\mathrm{~V} \\)로 전기 영동하여 UV transilluminator로 사진을 찍은 후 mRNA의 발현 정도를 Gel doc 2000 (Bio red; ITALY)을 이용하여 농도를 측정하였다.", "</p><h2>면역조직화학염색</h2><p>염색용 지방조직은 \\( 4 \\% \\) paraformaldehyde, \\( 0.1 \\% \\) glutaraldehyde와 0.1M phosphate buffer saline (PBS) 으로 혼합된 고정액으로 실온에서 12시간 고정하였으며, 이후 \\( 30 \\% \\) sucrose에서 7일간 냉장 보관하였다.", "냉동절편기(Leica, Germany)를 이용하여 \\( -20^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 지방조직을 \\( 20 ~\\mu \\mathrm{m} \\) 두께로 절편을 제작한 후 0.1M PBS로 세척하고 \\( 10 \\% \\) normal donkey serum (NDS)으로 40분간 실온에서 반응시켰다.", "이후 1차 항체인 Mitochondria Marker (Abcam, CB, UK)를 1:300으로 희석하여 \\( 4{ }^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 12시간 반응시켰다.", "이어서 0.1M PBS로 3회 5분간 세척한 후 \\( 2 \\% \\) NDS로 15분간 실온에서 처리한 후 Cy3-conjugated affinipure donkey anti-IgG (1:200, Invitrogen, USA)를 사용하여 3시간 반응시킨 다음 0.1M PBS로 3회 5분간 다시 세척한 후 microscope slides (Fisher Scientific)에 mounting medium (Vectashield, Vector Lab, USA)과 커버슬라이드로 봉입하고 형광현미경(Leica TCS, Wetzlaar, Germany)으로 관찰하였다.", "</p><h2>자료처리방법</h2><p>이 연구에서 얻어진 모든 결과는 SPSS/PC 11.0 통계 프로그램을 이용하여, 각 변인에 대한 기술통계치(mean\\(\\pm\\)SD)를 산출하고 집단 간 변인의 차이를 확인하기 위해 일원변량분석을 실시하였으며 집단 간 유의한 차이가 있을 경우 LSD (least significant difference)를 이용하여 사후검증을 실시하였다.", "유의 기준은 \\( a=0.05 \\) 수준으로 설정하였다.", "</p> <h1>결 과</h1><h2>피하지방무게</h2><p>피하지방의 무게는 C군\\( (2.66 \\pm 0.5 \\mathrm{~g}) \\)과 비교하여 H군 \\( (6.45 \\pm 0.64 \\mathrm{~g}) \\)에서 지방무게가 증가하였으며, 유의한 차이 \\( (p<0.01) \\)가 있는 것으로 나타났다.", "그러나 H+EX군\\( (2.58 \\pm 0.85 \\)\\( \\mathrm{g}) \\)에서는 H군\\( (6.45 \\pm 0.64 \\mathrm{~g}) \\)에 비해 유의하게 \\( (p<0.01) \\) 감소된 지방의 무게로 나타났다.", "</p><h2>PPAR- \\( \\gamma \\), PGC-1\\( \\alpha \\), PGC-1\\( \\beta \\) mRNA</h2><p>PPAR- \\( \\gamma \\), PGC-1\\( (\\alpha, \\beta)\\) mRNA 는 H군이 다른 군에 비해 거의 발현되지 않았으며, H+EX군에서는 H군과 C군에 비해 증가된 것으로 유의한 차이\\( (p<0.05, ~p<0.01) \\)가 있는 것으로 나타났다.", "</p><h2>NRf-1, TFAM mRNA</h2><p>NRF-1 mRNA는 H군이 다른 군에 비해 가장 낮게 발현되었으며 유의한 차이\\( (p<0.05) \\)가 있는 것으로 나타났으며, H군의 TFAM mRNA발현 역시 거의 나타나지 않았다.", "반면 H+EX군에서의 NRF-1, TFAM mRNA는 H군과 C군에 비해 증가하였고 유의한 차이 \\( (p<0.05, ~p<0.01) \\)가 있는 것으로 나타났다.", "</p><h2>조직학적 소견</h2><p>지방조직 내 산재하고 있는 미토콘드리아를 관찰한 결과, H군에서는 다른 두 군에 비하여 음성반응이 나타났다.", "그러나 H+EX군의 미토콘드리아는 다른 두 군보다도 유의하게 더 높은 양성반응으로 관찰되었다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "규칙적 운동이 고지방식이 난소절제흰쥐의 지방세포에서 미토콘드리아 생합성 유전자들의 변화", "eng": "Change of Mitochondrial Biogenesis Genes on Regular Exercise Training inAdipocytes of Ovariectomized Rats Fed on High Fat Diet" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-eee8a00d-c4ec-448b-ad2d-4bb387bea72d", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "이진" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,425	<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 파아지 분리 재료</h2><p>호염성 파아지 분리에 사용한 균주는 천일염으로부터 분리 동정된 Haloarcular sp. EH-1을 사용하였으며, 일반가정에서 담근 멸치 젓갈을 파아지 분리 재료로 사용하였다.</p><h2>사용배지</h2><p>증균 및 파아지 액체배지는 Sehgal and Gibbons 복합배지를 사용하였으며, 용균반 헝성을 위해서 \( 1.5 \% \) agar가 첨가된 Sehgal and Gibbons 평판배지와 \(0.5\%\) agar가 첨가된 중층배지를 사용하였다. 전자현미경 관찰을 위한 파아지 현탁액으로는 \( 25 \% \mathrm{NaCl} \) 과 \( 0.08 \mathrm{M} \mathrm{MgSO} \) 가 포함된 용액을 사용하였다.</p><h2>파아지의 분리 및 정량</h2><p>파아지의 분리를 위해 Pauling의 방법에 따라 숙주 균을 증균배지에서 대수증식기까지 진탕배양한 다음 여과한 멸치 젓갈을 균배양액에 혼합하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \(48\sim72\)시간 진탕배양하였다. 배양액을 원심분리(\(12,000 \mathrm{rpm}\), 10분)하여 상등액을 중층법으로 준비된 평판위에 한방울 떨어뜨려서 플라스틱 용기에 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 57일간 배양하고 용균부 위를 관찰하여 파아지의 존재유무를 확인하였다. 반점 시험으로 배양 상등액의 파아지액을 중층법으로 용균반 형성을 확인한 후, 한 용균반을 선택하여 2회 이상 단일 용균반을 분리하여 파아지를 순수분리하였다.</p><h2>전자현미경에 의한 파아지 형태 관찰</h2><p>200 메시의 구리 그리드에 콜로디온 지지막을 입히고 탄소를 증착시킨 후 농축 정제된 파아지액 \( 3 \mu \mathrm{l} \) 를 묻혀 1시간 정도 건조시키고 \( 1 \% \) glutaraldehyde - \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium cacodylate 완충액 \( (\mathrm{pH} 7.4\))에서 2시간 동안 고정시킨 후 \( 4 \% \) uranyl acetate 용액으로 \(30\sim60\)초 동안 염색을 하고 3 회 수세하여 건조시킨 후 전자현미경(JEM 122 EX-Ⅱ, JEOL, Japan)으로 \( 80 \mathrm{kV} \) 하에서 형태를 관찰하였다.</p><h2>Isolation of halophage DNA</h2><p>Halophage DNA 분리를 위해 먼저 정제된 파아지액에 동량의 \( 20 \%\) PEG 6000 이 늑아있는 \( 2.5 \mathrm{M} \mathrm{NaCl} \) 액을 첨가 하여 \( 4 \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 방치한 후 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 10분)하여 모은 침전물을 TE 완충액 \( (1 \mathrm{mM} \) EDTA, \( 10 \mathrm{mM} \) Tris-Cl, \(\mathrm{pH} 7.5\)) \( 500 \mu \ell \) 로 현탁하였다. 이 현탁액에 동일한 양의 페놀을 첨가하고 10 분간 vortex하여 방치한 후 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 5 분)한 다음 상등액을 분리하고 동일한 양의 페놀/클로로포롬을 첨가해서 잘 혼합한 후 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 5분)하여 분리한 상등액에 다시 동일한 양의 클로로포름을 넣고 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 5분) 하여 상등액을 회수하였다. 이 상등액에 1/10 의 \( 3 \mathrm{M} \) sodium acetate \((\mathrm{pH} 5.2)\)와 2 배의 \( 100^{\%} \) 에탄올 \( \left(-20^{\circ} \mathrm{C}\right) \) 을 넣어 반응액을 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 하룻밤 보관한 후 원심분리 \( (12,000 \mathrm{rpm}\), 10 분)한 다음, 계속해서 \( 70 \% \) 에탄올로 수세하였다. 모아진 침전물은 건조시키고 \( 1 \mathrm{ml} \) 의 TE 완충액으로 녹인 다음 \( -20^{\circ} \mathrm{C} \) 에 보관하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>파아지의 분리</h2><p>순수분리한 파아지의 플라그 형태와 크기는 Fig. 1에 나타내었다. 분리된 파아지의 플라그는 대체로 작고 선명한 핀 형태로써 크기는 직경 \( 0.5 \sim 1.0 \mathrm{~mm} \) 어었다. 이러한 결과는 직경 \( 0.5 \sim 1.0 \mathrm{~mm} \) 의 작고 투명한 플라그를 나타내는 Haloferax Aa 2.2의 파아지와 크기가 유사하였으나, 직경 2.5 3.0 mm의 비교적 크고 투명한 플라그를 나타내는 고염성균인 Ch2에 비하면 매우 작은 플라그를 나타내었다.</p><h2>파아지의 전자현미경적 관찰</h2><p>순수 분리한 파아지를 농축하여 음성염색으로 그 형태를 관찰한 결과 Fig. 2에 나타낸 바와 같이, tap pol 형태로 지름 \( 68 \mathrm{~nm} \) 의 대칭형 두부와 길이 \( 100 \mathrm{~nm} \) 의 contractile 미부를 가지고 있었으며 base plate가 관찰되었다. 이러한 결과는 \( 58 \mathrm{~nm} \) 지름의 icosahedral 두부와 \( 94 \mathrm{~nm} \) 길이의 contractile 미부를 가지는 Bradley group의 A1 유형에 속하며, base plate가 관찰된 H. salinarium 파아지 HF 1 및 HF 2의 형태와 유사하였으며, \( 64 \mathrm{~nm} \) 지름의 icosahedral 두부와 \( 170 \mathrm{~nm} \) 길이의 contractile 미부를 가지는 H. halobium 의 \( \Phi\) H 파아지에 비해 미부의 길이가 짧았으나, 일반적인 호염성 파아지의 형태가 \( \lambda \) 와 같은 세균성 파아지와 구조적으로 유사한 형태를 나타낸다고 하는 Nuttall의 보고와 일치하였다.</p><h2>파아지 DNA 서열 분석</h2><p>파아지 DNA의 게놈 크기를 측정하기 위해서 \( 0.7 \% \) 아가 로즈 겔 전기영동을 실시하여 측정한 결과는 Fig. 3 에 나타낸 바와 같이, 게놈의 크기는 약 \( 20 \mathrm{Kbp} \) 정도였다. H. salinarium 파아지 HF1 및 HF2 파아지의 DNA 크기는 약 \( 73.5 \mathrm{Kbp}\), H. halobium 파아지의 DNA 는 약 \(59 \mathrm{Kbp} \) 로 보고되었으므로, 본 공시균으로부터 분리된 파아지 DNA 는 이들에 비하면 크기가 비교적 작은 DNA 임을 알 수 있었다. DNA 염기서열을 검토한 결과는 Fig. 4 에 나타내었다. 본 파아지 DNA는 H. salinarium으로부터 분리된 파아지 hp 32와는 \( 52.87 \% \) 의 매우 낮은 상동성을 나타내었으므로, 현재까지 밝혀진 호염성 파아지인 H.salinarium phage hp 32 및 H. halobium phage phi H 와 는 다른 새로운 호염성 파아지 일 것으로 추측된다.</p> <h2>DNA cloning</h2><p>준비된 Halophage DNA와 pTZ 18R plasmid vector를 각각 Eco R I 와 Hind III로 digestion한 다음 T4 DNA ligase를 이용하여 ligation시켰다. 재조합된 plasmid는 Maniatis 등의 방법에 따라 E. coli DH5a에 대해 transformation 시켰는데 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) ampicilline과 \( 1 \mathrm{mM} \) isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG), 그리고 \(2 \% \) 5bromo-4-chloro-3-indoylgalactoside(X-gal)이 포함되어 있는 LB 평판배지에 도말하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 \( 16 \sim 24 \) 시간 배양하여 white colony를 형질전환체로 선별하였다. 다수의 재조합 플라스미드는 alkaline lysis 방법에 따라 분리하였으며, 삽입된 DNA 단편에 대해서는 Eco RI 와 Hind III로 digestion하여 \( 1 \% \) agarose gel상에서 확인하였다.</p><h2>DNA sequencing</h2><p>BigDye terminator cycle sequencing ready reaction과 ABI PRISM 377 automated sequencer(Perkin-Elmer)를 이용하여 halophage DNA 염기서열 분석을 실시하였다. 즉 \( 8 \mu \mathrm{l}\) terminator ready reaction mix, \( 1.5 \mu \mathrm{l} \) temperate DNA \( (0.2 \mu \mathrm{g} / \mu \mathrm{l}) \) 및 3.2 pmole M13-20 universal primer를 최종 부피가 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 가 되도록 혼합한 시료를 \( 96^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 초, \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 초, \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 4 분간 25 회 반복하여 증폭한 후 에탄올로 침전시켜 얻은 침전물을 loading용 완충액 (formamide to EDTA/blue dextran 5:1) \( 6 \mu \mathrm{l} \) 에 현탁하여 잘 혼합하고 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 분간 변성시켜 automated sequencer에 주입하여 염기서열을 결정하였다. DNA 염기서열의 분석은 FASTA database 프로그램을 사용하였으며, Gene bank/EMBL database에 저장된 유전자 염기서열들을 활용하여 유사성을 조사하였다.</p> <h1>요 약</h1><p>멸치 젓갈에서 분리된 파아지의 일반적인 성질과 파아지 DNA 서열을 분석한 결과는 다음과 같다. 멸치 젓갈에서 분리된 파아지의 플라그는 대체로 작고 선명한 핀 형태 로 직경 \( 0.5 \sim 1.0 \mathrm{~mm} \) 이었으며, 파아지의 형태는 지름 \( 68 \mathrm{~nm} \) 의 대칭형 두부와 길이 \( 100 \mathrm{~nm} \) 의 contractile 미부를 가지고 있었고 base plate가 관찰되었다. 파아지 DNA의 크기는 약 \( 20 \mathrm{Kbp} \) 정도이었으며, DNA 염기서열은 H. salinarium 파아지 hp 32와 \( 52.87 \% \) 의 상동성을 나타내었으나 보다 정확한 분류를 위해 파아지 DNA 의 전체 염기서열에 대한 분석이 이루어져야 할 것이다.</p> <h1>서 론</h1><p>호염성균은 소금호수나 염전과 같은 천연환경이나 염장 어류와 피혁과 같은 인위적으로 염도를 높인 환경과 같이 고염수 \( (>15 \%, \mathrm{w} / \mathrm{v}, \mathrm{NaCl}) \) 에서 우점미생물 집단을 형성하며, 성장을 위해 요구되는 호염도에 따라 내염성 \( (0 \sim 0.3 \mathrm{M}) \), 중호염성 \( (0.2 \sim 2.0 \mathrm{M}) \), 고호염성 \( (3.0 \sim 5.0 \mathrm{M}) \) 으로 분류하고 있다. 최근 고호염성균은 극지 미생물의 연구의 중요한 과제가 될 뿐만 아니라, 염류폐수처리, 중금속회수, polymer 및 고호염성 효소를 이용한 젓갈 숙성등 산업적 이용면의 연구가 활발해지고 있다. 그러나 우리나라에서는 고호염성균의 기초연구뿐 아니라 산업적 응용에 관한 연구도 부족하며, 특히 고호염성균에서 분리 된 박테리오파아지(파아지)에 대한 보고는 매우 드물다. Wais 등은 H. halobium 및 H. cutirubrum에 감염되는 파아지를 분리하였으며, Torsvik와 Dundas는 H . salinarium에서, Pauling은 H. halobium에서 각각 파아지를 분리하였다는 보고가 있을 뿐이다. 최근 고호염성균이 유전연구의 과제로서 점차 많이 다루어지면서, 이미 알려진 진정세균의 유전자 전달구조에 대한 연구는 고세균의 유전자 전달과정에도 많은 연구 재료를 제공하였다. Dyall-Smith 밎 Schalkwyk는 진정세균의 유전자 모델과의 차이점 및 유사성을 제시하였고, Daniels 등은 고호염성 파아지를 이용하여 숙주의 바이러스 제한.및 변형 메카니즘이 고세균에서 작동된다고 하는 사실을 증명하였으며, 그리고 Clines 등은 초기 형질도입 과정 실험에 고호염성 파아지 DNA를 이용하였다. 이러한 발전에도 불구하고 고호염성 파아지에 대한 보고는 여전히 기초 바이러스학 수준에 머무르고 있다.</p><p>본 연구에서는 고호염성균 Haloarcular sp. EH-1을 이용하여 멸치젓갈에서 파아지를 분리하여 고세균 영역의 고호염성균의 유전적 연구의 기초를 제공하고자 본 파아지의 DNA를 분리하여 DNA 서열을 분석하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>사용균주 및 파아지 분리 재료</h2><p>호염성 파아지 분리에 사용한 균주는 천일염으로부터 분리 동정된 Haloarcular sp.", "EH-1을 사용하였으며, 일반가정에서 담근 멸치 젓갈을 파아지 분리 재료로 사용하였다.", "</p><h2>사용배지</h2><p>증균 및 파아지 액체배지는 Sehgal and Gibbons 복합배지를 사용하였으며, 용균반 헝성을 위해서 \\( 1.5 \\% \\) agar가 첨가된 Sehgal and Gibbons 평판배지와 \\(0.5\\%\\) agar가 첨가된 중층배지를 사용하였다.", "전자현미경 관찰을 위한 파아지 현탁액으로는 \\( 25 \\% \\mathrm{NaCl} \\) 과 \\( 0.08 \\mathrm{M} \\mathrm{MgSO} \\) 가 포함된 용액을 사용하였다.", "</p><h2>파아지의 분리 및 정량</h2><p>파아지의 분리를 위해 Pauling의 방법에 따라 숙주 균을 증균배지에서 대수증식기까지 진탕배양한 다음 여과한 멸치 젓갈을 균배양액에 혼합하고 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 \\(48\\sim72\\)시간 진탕배양하였다.", "배양액을 원심분리(\\(12,000 \\mathrm{rpm}\\), 10분)하여 상등액을 중층법으로 준비된 평판위에 한방울 떨어뜨려서 플라스틱 용기에 넣어 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 57일간 배양하고 용균부 위를 관찰하여 파아지의 존재유무를 확인하였다.", "반점 시험으로 배양 상등액의 파아지액을 중층법으로 용균반 형성을 확인한 후, 한 용균반을 선택하여 2회 이상 단일 용균반을 분리하여 파아지를 순수분리하였다.", "</p><h2>전자현미경에 의한 파아지 형태 관찰</h2><p>200 메시의 구리 그리드에 콜로디온 지지막을 입히고 탄소를 증착시킨 후 농축 정제된 파아지액 \\( 3 \\mu \\mathrm{l} \\) 를 묻혀 1시간 정도 건조시키고 \\( 1 \\% \\) glutaraldehyde - \\( 0.1 \\mathrm{M} \\) sodium cacodylate 완충액 \\( (\\mathrm{pH} 7.4\\))에서 2시간 동안 고정시킨 후 \\( 4 \\% \\) uranyl acetate 용액으로 \\(30\\sim60\\)초 동안 염색을 하고 3 회 수세하여 건조시킨 후 전자현미경(JEM 122 EX-Ⅱ, JEOL, Japan)으로 \\( 80 \\mathrm{kV} \\) 하에서 형태를 관찰하였다.", "</p><h2>Isolation of halophage DNA</h2><p>Halophage DNA 분리를 위해 먼저 정제된 파아지액에 동량의 \\( 20 \\%\\) PEG 6000 이 늑아있는 \\( 2.5 \\mathrm{M} \\mathrm{NaCl} \\) 액을 첨가 하여 \\( 4 \\mathrm{C} \\) 에서 하룻밤 방치한 후 원심분리 \\( (12,000 \\mathrm{rpm}\\), 10분)하여 모은 침전물을 TE 완충액 \\( (1 \\mathrm{mM} \\) EDTA, \\( 10 \\mathrm{mM} \\) Tris-Cl, \\(\\mathrm{pH} 7.5\\)) \\( 500 \\mu \\ell \\) 로 현탁하였다.", "이 현탁액에 동일한 양의 페놀을 첨가하고 10 분간 vortex하여 방치한 후 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 원심분리 \\( (12,000 \\mathrm{rpm}\\), 5 분)한 다음 상등액을 분리하고 동일한 양의 페놀/클로로포롬을 첨가해서 잘 혼합한 후 원심분리 \\( (12,000 \\mathrm{rpm}\\), 5분)하여 분리한 상등액에 다시 동일한 양의 클로로포름을 넣고 원심분리 \\( (12,000 \\mathrm{rpm}\\), 5분) 하여 상등액을 회수하였다.", "이 상등액에 1/10 의 \\( 3 \\mathrm{M} \\) sodium acetate \\((\\mathrm{pH} 5.2)\\)와 2 배의 \\( 100^{\\%} \\) 에탄올 \\( \\left(-20^{\\circ} \\mathrm{C}\\right) \\) 을 넣어 반응액을 \\( -20^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 하룻밤 보관한 후 원심분리 \\( (12,000 \\mathrm{rpm}\\), 10 분)한 다음, 계속해서 \\( 70 \\% \\) 에탄올로 수세하였다.", "모아진 침전물은 건조시키고 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 의 TE 완충액으로 녹인 다음 \\( -20^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에 보관하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>파아지의 분리</h2><p>순수분리한 파아지의 플라그 형태와 크기는 Fig.", "1에 나타내었다.", "분리된 파아지의 플라그는 대체로 작고 선명한 핀 형태로써 크기는 직경 \\( 0.5 \\sim 1.0 \\mathrm{~mm} \\) 어었다.", "이러한 결과는 직경 \\( 0.5 \\sim 1.0 \\mathrm{~mm} \\) 의 작고 투명한 플라그를 나타내는 Haloferax Aa 2.2의 파아지와 크기가 유사하였으나, 직경 2.5 3.0 mm의 비교적 크고 투명한 플라그를 나타내는 고염성균인 Ch2에 비하면 매우 작은 플라그를 나타내었다.", "</p><h2>파아지의 전자현미경적 관찰</h2><p>순수 분리한 파아지를 농축하여 음성염색으로 그 형태를 관찰한 결과 Fig.", "2에 나타낸 바와 같이, tap pol 형태로 지름 \\( 68 \\mathrm{~nm} \\) 의 대칭형 두부와 길이 \\( 100 \\mathrm{~nm} \\) 의 contractile 미부를 가지고 있었으며 base plate가 관찰되었다.", "이러한 결과는 \\( 58 \\mathrm{~nm} \\) 지름의 icosahedral 두부와 \\( 94 \\mathrm{~nm} \\) 길이의 contractile 미부를 가지는 Bradley group의 A1 유형에 속하며, base plate가 관찰된 H. salinarium 파아지 HF 1 및 HF 2의 형태와 유사하였으며, \\( 64 \\mathrm{~nm} \\) 지름의 icosahedral 두부와 \\( 170 \\mathrm{~nm} \\) 길이의 contractile 미부를 가지는 H. halobium 의 \\( \\Phi\\) H 파아지에 비해 미부의 길이가 짧았으나, 일반적인 호염성 파아지의 형태가 \\( \\lambda \\) 와 같은 세균성 파아지와 구조적으로 유사한 형태를 나타낸다고 하는 Nuttall의 보고와 일치하였다.", "</p><h2>파아지 DNA 서열 분석</h2><p>파아지 DNA의 게놈 크기를 측정하기 위해서 \\( 0.7 \\% \\) 아가 로즈 겔 전기영동을 실시하여 측정한 결과는 Fig.", "3 에 나타낸 바와 같이, 게놈의 크기는 약 \\( 20 \\mathrm{Kbp} \\) 정도였다.", "H. salinarium 파아지 HF1 및 HF2 파아지의 DNA 크기는 약 \\( 73.5 \\mathrm{Kbp}\\), H. halobium 파아지의 DNA 는 약 \\(59 \\mathrm{Kbp} \\) 로 보고되었으므로, 본 공시균으로부터 분리된 파아지 DNA 는 이들에 비하면 크기가 비교적 작은 DNA 임을 알 수 있었다.", "DNA 염기서열을 검토한 결과는 Fig.", "4 에 나타내었다.", "본 파아지 DNA는 H. salinarium으로부터 분리된 파아지 hp 32와는 \\( 52.87 \\% \\) 의 매우 낮은 상동성을 나타내었으므로, 현재까지 밝혀진 호염성 파아지인 H.salinarium phage hp 32 및 H. halobium phage phi H 와 는 다른 새로운 호염성 파아지 일 것으로 추측된다.", "</p> <h2>DNA cloning</h2><p>준비된 Halophage DNA와 pTZ 18R plasmid vector를 각각 Eco R I 와 Hind III로 digestion한 다음 T4 DNA ligase를 이용하여 ligation시켰다.", "재조합된 plasmid는 Maniatis 등의 방법에 따라 E. coli DH5a에 대해 transformation 시켰는데 \\( 50 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) ampicilline과 \\( 1 \\mathrm{mM} \\) isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG), 그리고 \\(2 \\% \\) 5bromo-4-chloro-3-indoylgalactoside(X-gal)이 포함되어 있는 LB 평판배지에 도말하여 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 \\( 16 \\sim 24 \\) 시간 배양하여 white colony를 형질전환체로 선별하였다.", "다수의 재조합 플라스미드는 alkaline lysis 방법에 따라 분리하였으며, 삽입된 DNA 단편에 대해서는 Eco RI 와 Hind III로 digestion하여 \\( 1 \\% \\) agarose gel상에서 확인하였다.", "</p><h2>DNA sequencing</h2><p>BigDye terminator cycle sequencing ready reaction과 ABI PRISM 377 automated sequencer(Perkin-Elmer)를 이용하여 halophage DNA 염기서열 분석을 실시하였다.", "즉 \\( 8 \\mu \\mathrm{l}\\) terminator ready reaction mix, \\( 1.5 \\mu \\mathrm{l} \\) temperate DNA \\( (0.2 \\mu \\mathrm{g} / \\mu \\mathrm{l}) \\) 및 3.2 pmole M13-20 universal primer를 최종 부피가 \\( 20 \\mu \\mathrm{l} \\) 가 되도록 혼합한 시료를 \\( 96^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 10 초, \\( 50^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 5 초, \\( 60^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 4 분간 25 회 반복하여 증폭한 후 에탄올로 침전시켜 얻은 침전물을 loading용 완충액 (formamide to EDTA/blue dextran 5:1) \\( 6 \\mu \\mathrm{l} \\) 에 현탁하여 잘 혼합하고 \\( 90^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 2 분간 변성시켜 automated sequencer에 주입하여 염기서열을 결정하였다.", "DNA 염기서열의 분석은 FASTA database 프로그램을 사용하였으며, Gene bank/EMBL database에 저장된 유전자 염기서열들을 활용하여 유사성을 조사하였다.", "</p> <h1>요 약</h1><p>멸치 젓갈에서 분리된 파아지의 일반적인 성질과 파아지 DNA 서열을 분석한 결과는 다음과 같다.", "멸치 젓갈에서 분리된 파아지의 플라그는 대체로 작고 선명한 핀 형태 로 직경 \\( 0.5 \\sim 1.0 \\mathrm{~mm} \\) 이었으며, 파아지의 형태는 지름 \\( 68 \\mathrm{~nm} \\) 의 대칭형 두부와 길이 \\( 100 \\mathrm{~nm} \\) 의 contractile 미부를 가지고 있었고 base plate가 관찰되었다.", "파아지 DNA의 크기는 약 \\( 20 \\mathrm{Kbp} \\) 정도이었으며, DNA 염기서열은 H. salinarium 파아지 hp 32와 \\( 52.87 \\% \\) 의 상동성을 나타내었으나 보다 정확한 분류를 위해 파아지 DNA 의 전체 염기서열에 대한 분석이 이루어져야 할 것이다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>호염성균은 소금호수나 염전과 같은 천연환경이나 염장 어류와 피혁과 같은 인위적으로 염도를 높인 환경과 같이 고염수 \\( (>15 \\%, \\mathrm{w} / \\mathrm{v}, \\mathrm{NaCl}) \\) 에서 우점미생물 집단을 형성하며, 성장을 위해 요구되는 호염도에 따라 내염성 \\( (0 \\sim 0.3 \\mathrm{M}) \\), 중호염성 \\( (0.2 \\sim 2.0 \\mathrm{M}) \\), 고호염성 \\( (3.0 \\sim 5.0 \\mathrm{M}) \\) 으로 분류하고 있다.", "최근 고호염성균은 극지 미생물의 연구의 중요한 과제가 될 뿐만 아니라, 염류폐수처리, 중금속회수, polymer 및 고호염성 효소를 이용한 젓갈 숙성등 산업적 이용면의 연구가 활발해지고 있다.", "그러나 우리나라에서는 고호염성균의 기초연구뿐 아니라 산업적 응용에 관한 연구도 부족하며, 특히 고호염성균에서 분리 된 박테리오파아지(파아지)에 대한 보고는 매우 드물다.", "Wais 등은 H. halobium 및 H. cutirubrum에 감염되는 파아지를 분리하였으며, Torsvik와 Dundas는 H .", "salinarium에서, Pauling은 H. halobium에서 각각 파아지를 분리하였다는 보고가 있을 뿐이다.", "최근 고호염성균이 유전연구의 과제로서 점차 많이 다루어지면서, 이미 알려진 진정세균의 유전자 전달구조에 대한 연구는 고세균의 유전자 전달과정에도 많은 연구 재료를 제공하였다.", "Dyall-Smith 밎 Schalkwyk는 진정세균의 유전자 모델과의 차이점 및 유사성을 제시하였고, Daniels 등은 고호염성 파아지를 이용하여 숙주의 바이러스 제한.및 변형 메카니즘이 고세균에서 작동된다고 하는 사실을 증명하였으며, 그리고 Clines 등은 초기 형질도입 과정 실험에 고호염성 파아지 DNA를 이용하였다.", "이러한 발전에도 불구하고 고호염성 파아지에 대한 보고는 여전히 기초 바이러스학 수준에 머무르고 있다.", "</p><p>본 연구에서는 고호염성균 Haloarcular sp.", "EH-1을 이용하여 멸치젓갈에서 파아지를 분리하여 고세균 영역의 고호염성균의 유전적 연구의 기초를 제공하고자 본 파아지의 DNA를 분리하여 DNA 서열을 분석하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Haloarcular sp. EH-1에 의한 bacteriophage의 분리", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-ed68212e-748d-43be-9417-ca216b431c66", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2003", "doc_author": [ "정명주" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,426	<h2>Indel marker의 활용</h2><p>핵 DNA의 유전정보는 Mendelian inheritance를 따르는 유전양상을 나타냄으로, 대립인자의 유무에 따라 선친과 후대의 직접적인 혈연관계를 추정할 수 있는 매우 중요한 분자적 증거가 된다. 축산분야에서 핵 DNA의 유전정보는 다형성이 높은 marker의 조합을 통해 유전자 분석체계는 대규모 축군 내에서 개체식별뿐만 아니라 대부분 부분육으로 유통되는 축산물의 동일성검사를 통한 원산지 추적이 가능한 단계에 접어들었다. 특히 한우의 경우 우리나라에서 전면적인 DNA 기반 생산이력추적제와 도체에 대한 동일성검사의 정착으로 국내산 한우에 대한 유통 질서가 정착하는 데 크게 기여하였으며, 부가적으로 해외에서 수입된 수육과의 구분도 가능해졌다. 본 연구에서 발견된 Indel_15의 조사결과와 같이 특정 품종에서 어느 한 대립인자가 완전히 상실된 형태의 marker들을 조합한다면, 유전자 분석을 통한 품종의 식별이 훨씬 더 수월해 질 것으로 예상된다.</p><p>1990 년대 멸종위기 이후 복원된 제주흑우는 농촌진홍청 국립축산과학원 난지축산시험장과 제주도 축산진흥원에서만 보존되고 있으며, 최근 산업화에 농가의 강력한 요구에 따라 제주혹우 정액과 수정란을 농가에 보급하고 있다. Han 등은 제주흑우 유래의 ET, AI 후대우의 검출에서 한우의 생산이력추적제에 이용되고 있는 국제동물유전학회(International Society of Animal Genetics, ISAG) 권장 11종의 MS marker에 대한 정보만으로는 상대적으로 폐쇄축군인 제주흑우 집단에서는 다형성 빈도가 상대적으로 낮아 친자감별이나 개체식별의 효율성이 낮아 추가적인 marker 도입의 필요성을 언급하였고, 이에 따라 한우 생산이력추적제 marker 11 종외에 MS 11 종과 제주흑우 특이적 모색을 결정하는 MC1R와 ASIP의 SNP를 추가한 24 종의 유전자 marker 체계를 제안한 바 있다. Lim등은 MS 분석체계에서 marker의 구성이 한우 집단에서 정보력에 차이를 보여, 한우 생산이력추적제를 위한 분석체계의 도입에 적절한 구성이 필요함을 제안하였다.</p><p>본 연구에서 고안한 indel marker의 경우 제주흑우 집단에서 이형접합율, PIC 등이 상대적으로 높다는 점에서 향후 기존의 MS marker 위주의 유전자 검사 체계를 보완하거나 유전자형 판독에 있어 기술적인 어려움을 나타내는 MS marker를 대처할 수 있는 체계도 가능 하리라 판단된다. MS marker에 비해 indel marker가 비록 대립인자의 수가 한정되어 있어 기본적으로 PIC가 상대적으로 낮은 점은 없지 않지만, 친자감별 등에서 요구되는 명확한 유전자형의 판독 등에는 훨씬 더 유리하며, PCR 산물에 대한 agarose gel 전기영동만으로도 marker의 유전자형을 명확하게 판독할 수 있어, 표지된 형광분자를 확인하게 위해 이용되는 고가의 검사장비를 갖추지 않아도 된다는 장점이 있다고 하겠다. 향후 본 연구에서 고안된 indel marker들을 단독으로 또는 MS marker들과 조합하여 다량의 시료들을 신속하고 명확하게 분석할 수 있는 multi-plex PCR 기법 등이 개발된다면, 친자검정, 개체식별 등 혈통정립 사업뿐만 아니라, 제주흑우 생산이력추적제나 품종인증검사체계 등의 기틀을 마련하는 데 기여할 것으로 사료된다.</p> <h1>서 론</h1><p>과거부터 혈액형이나 혈액단백질의 동위효소에 대한 정보뿐만 아니라 최근에는 법의학적 검증에서 DNA 분석기법, 특히 초위성체(microsatellite marker, MS) DNA 표지인자의 반복양상에 따른 유전자형 자료를 기반으로 가축 품종들의 유연관계, 혈통 증명, 집단 식별 및 개체추적과 친자확인 등에 광범위하게 이용되고 있다. 또한 한우의 황모색, 제주흑우의 흑모색 등 품종 특이적 특성을 반영하는 유전자의 단일염기변이(single nucleotide polymorphism, SNP)와 부계(Y 염색체)나 모계(mtDNA) 유전을 통해 자손으로 전달되는 유전자의 다형성들은 검증 대상에서 특이적으로 중요한 정보의 보유여부를 판독할 수 있는 자료로써 활용 가능성이 제기되었다.</p><p>현재 우리나라에서 적용되고 있는 한우의 생산이력추적제나 품종식별 역시 이들 유전자 표지인자의 다형성을 근거로 적용되고 있다. Lim 등은 한우 생산이력추적제용 MS체계에서 marker의 구성에 따라 집단의 정보력에 차이가 있어 적정 집단의 다양성 정보를 보다 효율적으로 분석할 수 있는 체계의 구축을 제안한 바 있다. Han 등의 수정란이식과 인공수정 후손을 추적한 연구보고에서도 MS 이외의 marker들과의 적절한 조합이 필요함을 제안하였다. 현재 개체의 동일성검사나 친자감별 등에 활용되고 있는 MS marker의 경우는 상대적으로 높은 돌연변이율을 보이며, 암(cancer)이나 유전질환과 관련된 유전자의 구조적 돌연변이와 불안정성(MSinstability), 이형접합성의 획득/상실(gain/loss of hetero-geneity) 등을 나타내기도 한다. 특히 두개의 염기가 반복되는 di-nucleotide (nt) repeat MS의 경우는 실험과정에서 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭 시 주형 DNA 서열의 단순반복에 의한 효소의 slip-page 현상에 의해 stutter band들이 형성되고 이는 유전자형의 결정에서 false positive를 나타낼 수 있는 원인이 된다. 또한 여러 개의 유전자들을 동시에 증폭하는 다중 증폭(multi-plex PCR) 시험은 효소의 차등 증폭양상을 나타내어 data의 일부가 상대적으로 낮은 수준으로 검출되거나 관찰되지 않는 결과를 초래하기도 한다. 이와 같은 문제점들의 보완을 위해 di-nt repeat MS marker set 분석에서의 문제점들을 해결하기 위해 상대적으로 다형정보량은 적으나, 돌연변이율이 낮은 tri-, tetra-nt repeat나 minisatellite, variable num-ber of tandem repeat (VNTR), SNP, indel marker 등에 의한 보완의 필요성이 제안되고 있다.<p><p>소에서는 전체 유전체 서열이 보고된 이후 next generation sequencing 등을 통해 다량의 유전체 정보들이 지속적으로 보고되고 있으며, 유전 정보들과 표현형의 상관관계의 분석이 진행되고 있다. 본 연구에서는 Bovine Genome Project에서 보고한 소의 유전체 서열과 발현서열표식(expressed se-quence tag, EST) database의 서열들을 비교하여 얻어낸 삽입/결실 다형을 나타내는 표지인자들을 한우와 제주흑우를 포함한 소 품종들에서 평가하여 다형성의 유형과 대립인자의 분포를 확인하고자 수행하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>Indel marker의 선정</h2><p>연구에 이용한 indel marker의 고안을 위해 한우의 cDNA library sequencing을 통해 얻은 EST 염기서열을 NCBI data-base 상에 보고된 Bovine Genome 서열을 대상으로 BLAST분석을 통해 삽입/결실 다형성을 확인하였다. 다형성을 나타내는 총 958 개의 영역을 검출하였다. 검출된 영역 중 단백질을 암호화하는 영역에 해당되는 것은 총 51 종으로 확인되었고, 이 중 삽입/결실된 단위서열의 길이가 5-nt 이상, 50-nt이하인 42 종을 다시 선별했다. 선발한 42 종의 marker들은 한우 96 두를 대상으로 PCR 효율과 다형성의 빈도를 사전평가하였다(자료 미기재). 사전평가를 통해 유전자 marker의 PIC 수준이 0.25 이상인 9 종의 indel marker들을 최종 선발하였다(Table 1).<h2>Indel marker의 다형성</h2><p>제주흑우와 한우를 포함한 소 6 품종에서 indel marker 9 종의 다형성을 PCR 산물에 대한 agarose gel 전기영동으로 확인하였다. 각각의 indel marker에 대한 PCR 증폭산물은 oli-go nucleotide의 삽입/결실을 보여주는 두 가지의 동형접합자형들(LL, SS)과 하나의 이형접합자형(LS)으로 구분되었다. 전체 9 종의 marker 중에서 Indel-15를 제외한 8 종의 marker들은 모두 다형성을 나타내었고, Indel-15는 Holstein과 Charolais 품종에서는 조사에 이용한 모든 시료에서 결실형인 유전자형이 전혀 발견되지 않았다.</p><p>Indel-15의 경우 BTA5에 위치하는 염기서열로 확인되었으며, 시험에 사용된 품종 중 대표적인 외국산 소 품종인 Holstien과 Charolais에서 결실형 유전자형이 없다는 점은 비록 본 연구에서 사용한 품종별 개체 수가 충분히 많다고 단정할 수는 없으나, Iindel-15 marker의 유전자형 분포가 해당 품종을 검출할 수 있는 분자 표지인자로 활용할 수 있다는 점을 보여준다고 하겠다.</p><h2>Indel marker의 다형정보량(PIC)</h2><p>Table 2는 각각의 indel marker에 대한 PIC를 나타낸 것이다. 전체적으로는 제주흑우의 PIC가 평균 0.362로 가장 높고, Charolais는 0.246으로 가장 낮은 수준을 나타내었다. 제주흑우에서는 HW_G04 marker의 PIC가 0.373으로 가장 높고, Indel_06 marker가 0.305로 가장 낮은 수준을 보였다. 한우에서는 HW_G04에서 0.374로 가장 높고 Indel_29 marker에서 0.269로 가장 낮은 수준을 보였다. 외국 소 품종 중에서 Angus와 Hereford는 Indel_32에서 각각 0.088과 0.083, Charolais와 Holstein은 Indel_15에서 0.000으로 가장 낮은 수준을 나타내었다. 모든 품종에서 PIC가 0.300 이상인 marker는 HW_G01과 HW_G04로 확인되었다.</p><h2>제주흑우에서 Indel marker의 다형성</h2><p>Table 3은 제주흑우 집단에서 9 종의 marker에 대한 대립인자 빈도와 이형접합율, HWE 등을 조사한 결과이다. MAF가 가장 높은 marker는 HW_G04 (0.435), 가장 낮은 marker는 Indel_06 (0.189)로 확인되었다. Ho는 HW_G01 (0.604)에서 가장 높고, Indel_29 (0.274)에서 가장 낮았다. Indel_29 marker는 \( x^{2} \) value가 13.6257, P-value 0.0002로 HWE 가 매우 유의한 수준으로 나타났으며, HW_G01은 \( x^{2} \) value가 7.7336, P-value 0.0054로 HWE 가 유의한 수준임을 나타내었다. 성염색체 상에 위치한 Indel_29 marker에서 가장 높은 수준의 HWE 유의성을 보인 점은 현재 제주흑우 원종 집단들이 국립축산과학원 난지축산시험장과 제주도 축산진흥원에서만 유지되고 있으며, 이들 두 집단 내에서 발생할 수 있는 근친을 피하기 위한 전략으로 각각의 집단에서 보유한 종모우의 인공수정용 정액을 교차하여 사용함으로 인해 나타난 결과로 추정된다. 특히, 제주흑우의 종모우들이 1990년대 농가에서 수집하여 복원할 당시에 고능력을 보였던 2 마리의 핵심 종모우에서 유래되었다는 점 또한 무시할 수 없다. 즉, 두 집단에서 유래된 소수의 종모우가 보유한 유전자형들만이 집단 간 교차를 통한 인공수정을 통해 전달되기 때문에 임의적 자연교배 유전집단을 추정할 수 있는 HWE 상에서는 유의성이 높아지는 결과를 나타낸다고 하겠다.</p>	생명과학	[ "<h2>Indel marker의 활용</h2><p>핵 DNA의 유전정보는 Mendelian inheritance를 따르는 유전양상을 나타냄으로, 대립인자의 유무에 따라 선친과 후대의 직접적인 혈연관계를 추정할 수 있는 매우 중요한 분자적 증거가 된다.", "축산분야에서 핵 DNA의 유전정보는 다형성이 높은 marker의 조합을 통해 유전자 분석체계는 대규모 축군 내에서 개체식별뿐만 아니라 대부분 부분육으로 유통되는 축산물의 동일성검사를 통한 원산지 추적이 가능한 단계에 접어들었다.", "특히 한우의 경우 우리나라에서 전면적인 DNA 기반 생산이력추적제와 도체에 대한 동일성검사의 정착으로 국내산 한우에 대한 유통 질서가 정착하는 데 크게 기여하였으며, 부가적으로 해외에서 수입된 수육과의 구분도 가능해졌다.", "본 연구에서 발견된 Indel_15의 조사결과와 같이 특정 품종에서 어느 한 대립인자가 완전히 상실된 형태의 marker들을 조합한다면, 유전자 분석을 통한 품종의 식별이 훨씬 더 수월해 질 것으로 예상된다.", "</p><p>1990 년대 멸종위기 이후 복원된 제주흑우는 농촌진홍청 국립축산과학원 난지축산시험장과 제주도 축산진흥원에서만 보존되고 있으며, 최근 산업화에 농가의 강력한 요구에 따라 제주혹우 정액과 수정란을 농가에 보급하고 있다.", "Han 등은 제주흑우 유래의 ET, AI 후대우의 검출에서 한우의 생산이력추적제에 이용되고 있는 국제동물유전학회(International Society of Animal Genetics, ISAG) 권장 11종의 MS marker에 대한 정보만으로는 상대적으로 폐쇄축군인 제주흑우 집단에서는 다형성 빈도가 상대적으로 낮아 친자감별이나 개체식별의 효율성이 낮아 추가적인 marker 도입의 필요성을 언급하였고, 이에 따라 한우 생산이력추적제 marker 11 종외에 MS 11 종과 제주흑우 특이적 모색을 결정하는 MC1R와 ASIP의 SNP를 추가한 24 종의 유전자 marker 체계를 제안한 바 있다.", "Lim등은 MS 분석체계에서 marker의 구성이 한우 집단에서 정보력에 차이를 보여, 한우 생산이력추적제를 위한 분석체계의 도입에 적절한 구성이 필요함을 제안하였다.", "</p><p>본 연구에서 고안한 indel marker의 경우 제주흑우 집단에서 이형접합율, PIC 등이 상대적으로 높다는 점에서 향후 기존의 MS marker 위주의 유전자 검사 체계를 보완하거나 유전자형 판독에 있어 기술적인 어려움을 나타내는 MS marker를 대처할 수 있는 체계도 가능 하리라 판단된다.", "MS marker에 비해 indel marker가 비록 대립인자의 수가 한정되어 있어 기본적으로 PIC가 상대적으로 낮은 점은 없지 않지만, 친자감별 등에서 요구되는 명확한 유전자형의 판독 등에는 훨씬 더 유리하며, PCR 산물에 대한 agarose 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HWE 가 유의한 수준임을 나타내었다.", "성염색체 상에 위치한 Indel_29 marker에서 가장 높은 수준의 HWE 유의성을 보인 점은 현재 제주흑우 원종 집단들이 국립축산과학원 난지축산시험장과 제주도 축산진흥원에서만 유지되고 있으며, 이들 두 집단 내에서 발생할 수 있는 근친을 피하기 위한 전략으로 각각의 집단에서 보유한 종모우의 인공수정용 정액을 교차하여 사용함으로 인해 나타난 결과로 추정된다.", "특히, 제주흑우의 종모우들이 1990년대 농가에서 수집하여 복원할 당시에 고능력을 보였던 2 마리의 핵심 종모우에서 유래되었다는 점 또한 무시할 수 없다.", "즉, 두 집단에서 유래된 소수의 종모우가 보유한 유전자형들만이 집단 간 교차를 통한 인공수정을 통해 전달되기 때문에 임의적 자연교배 유전집단을 추정할 수 있는 HWE 상에서는 유의성이 높아지는 결과를 나타낸다고 하겠다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "제주흑우, 한우 및 수입 소 품종에서 새로운 indel 마커의 다형성과 대립인자 분포", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-efddf438-13f5-48db-8697-4c187f2f5c80", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2012", "doc_author": [ "한상현", "김재환", "조인철", "조상래", "조원모", "김상금", "김유경", "강용준", "박용상", "김영훈", "박세필", "김은영", "이성수", "고문석" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", 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5,427	<h1>서 론</h1><p>우리나라는 전통적으로 소를 이용한 사골, 꼬리, 도가니 및 잡 뼈를 장시간 끓여서 그 용출액을 이용한 탕 요리 문화가 발달하여 왔다. 지금까지 국내의 뼈 추출물에 관한 연구는 한우 사골의 용출액이 칼슘 및 단백질의 공급원으로 평가되었으며, 칼슘, 인, 총질소 등 유효영양성분의 충분한 추출을 위해서는 12시간 이상의 가열이 필요하고 뼈와 물의 중량비는 10배 이상이 필요하다는 보고가 있다. 추출 방법으로 단시간(6시간) 추출할 경우 3차까지 추출하는 것이 바람직하다는 등 한우 중심의 연구가 있었다. 그리고 수입소가 증가하면서 수입우와 한우를 비교한 것으로 냄새, 맛 등에서 한우가 우수하다고 보고하였다. 최근에는 소품종에 따른 이화학적 특성, 관능특성 및 영양특성에서 한우 뼈 용출액이 우수하다는 보고가 있다. 그리고 연골 조직에 많이 함유되어 있는 뮤코폴리사카라이드의 일종인 콘드로이친황산은 젖소에서 높다고 밝혔다.</p><p>콜라겐은 결합조직과 뼈의 중요한 단백질로서 장시간 가열처리할 경우 젤라틴화하는 특성이 있다는 보고와 포유동물의 연골과 뼈에 있는 콘드로이친황산은 성숙 이후의 연령이 적은 동물에서 많이 함유되어있으며 나이가 들수록 감소한다는 Gilbreath 등의 보고가 있다. 이와 같이 전통적으로 사골을 애용하는 소뼈에 대한 연구는 다소 이루어 졌지만, 세계화된 식문화 패턴에 따라 최근 수입량이 증가하고 있는 캥거루 고기에 대한 연구는 호주나 뉴질랜드의 식습관에 바탕을 둔 식품학적 연구가 있지만 우리나라 탕 문화에 기인한 캥거루 꼬리뼈에 대한 연구는 없는 상태다. 우리나라는 2005년도부터 년간 약 65톤 정도의 캥거루 꼬리를 수입하기 시작하였으며, 2007년도부터는 증가 추세로 년간 130톤 정도를 수입하였다(자료제공: 동대축산 및 무역).</p><p>따라서, 본 연구에서는 캥거루의 수입육 중 꼬리의 식품학적 이해를 위해 콜라겐 및 콘드로이친황산 함량, 단백질 및 지질 함량 그리고 CLA (Conjugated linoleic acid) 함량을 조사하였다.</p> <h1>요약</h1><p>캥거루의 수입육 중 꼬리의 식품학적 이해를 위해 콜라겐 및 콘드로이친황산 함량, 단백질 및 지질 함량, 미량원소 함량 그리고 CLA 함량을 조사한 결과 황산분해시료의 콜라겐 함량은 캥거루꼬리, 소꼬리 시료 모두에서 고기보다 뼈에 월등히 함량이 높았다. 캥거루꼬리와 소꼬리의 시료 사이에는 캥거루 꼬리가 고기 및 뼈에서 모두 약 1.7배 1.2배로 높은 함량을 나타냈다. 캥거루 꼬리 고기시료 수용액 추출의 콘드로이친황산 함량 성분이 소꼬리고기 보다 1.3배 정도 높았다. 또한 뼈 수용액 추출은 캥거루꼬리가 소꼬리 보다 콘드로이친황산 함량 성분이 2.4배 이상 높았다. 캥거루꼬리에서 다양한 기능을 가지는 CLA는 4가지이성체가 주성분이고, 함량은 소고기꼬리의 \( 0.92 \% \)에 비하여 5.3배 정도나 많은 \( 4.9 \% \)의 높은 비율로 존재하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>우리나라는 전통적으로 소를 이용한 사골, 꼬리, 도가니 및 잡 뼈를 장시간 끓여서 그 용출액을 이용한 탕 요리 문화가 발달하여 왔다.", "지금까지 국내의 뼈 추출물에 관한 연구는 한우 사골의 용출액이 칼슘 및 단백질의 공급원으로 평가되었으며, 칼슘, 인, 총질소 등 유효영양성분의 충분한 추출을 위해서는 12시간 이상의 가열이 필요하고 뼈와 물의 중량비는 10배 이상이 필요하다는 보고가 있다.", "추출 방법으로 단시간(6시간) 추출할 경우 3차까지 추출하는 것이 바람직하다는 등 한우 중심의 연구가 있었다.", "그리고 수입소가 증가하면서 수입우와 한우를 비교한 것으로 냄새, 맛 등에서 한우가 우수하다고 보고하였다.", "최근에는 소품종에 따른 이화학적 특성, 관능특성 및 영양특성에서 한우 뼈 용출액이 우수하다는 보고가 있다.", "그리고 연골 조직에 많이 함유되어 있는 뮤코폴리사카라이드의 일종인 콘드로이친황산은 젖소에서 높다고 밝혔다.", "</p><p>콜라겐은 결합조직과 뼈의 중요한 단백질로서 장시간 가열처리할 경우 젤라틴화하는 특성이 있다는 보고와 포유동물의 연골과 뼈에 있는 콘드로이친황산은 성숙 이후의 연령이 적은 동물에서 많이 함유되어있으며 나이가 들수록 감소한다는 Gilbreath 등의 보고가 있다.", "이와 같이 전통적으로 사골을 애용하는 소뼈에 대한 연구는 다소 이루어 졌지만, 세계화된 식문화 패턴에 따라 최근 수입량이 증가하고 있는 캥거루 고기에 대한 연구는 호주나 뉴질랜드의 식습관에 바탕을 둔 식품학적 연구가 있지만 우리나라 탕 문화에 기인한 캥거루 꼬리뼈에 대한 연구는 없는 상태다.", "우리나라는 2005년도부터 년간 약 65톤 정도의 캥거루 꼬리를 수입하기 시작하였으며, 2007년도부터는 증가 추세로 년간 130톤 정도를 수입하였다(자료제공: 동대축산 및 무역).", "</p><p>따라서, 본 연구에서는 캥거루의 수입육 중 꼬리의 식품학적 이해를 위해 콜라겐 및 콘드로이친황산 함량, 단백질 및 지질 함량 그리고 CLA (Conjugated linoleic acid) 함량을 조사하였다.", "</p> <h1>요약</h1><p>캥거루의 수입육 중 꼬리의 식품학적 이해를 위해 콜라겐 및 콘드로이친황산 함량, 단백질 및 지질 함량, 미량원소 함량 그리고 CLA 함량을 조사한 결과 황산분해시료의 콜라겐 함량은 캥거루꼬리, 소꼬리 시료 모두에서 고기보다 뼈에 월등히 함량이 높았다.", "캥거루꼬리와 소꼬리의 시료 사이에는 캥거루 꼬리가 고기 및 뼈에서 모두 약 1.7배 1.2배로 높은 함량을 나타냈다.", "캥거루 꼬리 고기시료 수용액 추출의 콘드로이친황산 함량 성분이 소꼬리고기 보다 1.3배 정도 높았다.", "또한 뼈 수용액 추출은 캥거루꼬리가 소꼬리 보다 콘드로이친황산 함량 성분이 2.4배 이상 높았다.", "캥거루꼬리에서 다양한 기능을 가지는 CLA는 4가지이성체가 주성분이고, 함량은 소고기꼬리의 \\( 0.92 \\% \\)에 비하여 5.3배 정도나 많은 \\( 4.9 \\% \\)의 높은 비율로 존재하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "캥거루 꼬리의 영양학적 특성", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-f3cfcde3-5028-4579-83c0-127da860c323", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "하순옥", "박인혜", "이용석", "김재규", "정수열", "최용락" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,428	<h2>단백질 분리, 전기영동 및 Western blot analysis</h2><p>준비된 세포들을 적당량의 lysis buffer [\(25 \mathrm{mM} \) Tris- \( \mathrm{Cl}(\mathrm{pH} 7.5\)), \( 250 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl}\), \(5 \mathrm{mM} \) EDTA, \(1\%\) NP-40, \( 1 \mathrm{mM} \) phenyl-methylsulfonyl fluoride (PMSF), \( 5 \mathrm{mM} \) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 반응 시킨 후, \( 14,000 \mathrm{rpm} \)으로 30분간 원심분리하여 상층액을 모았다. 상층액의 단백질을 정량화한 후 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 전이시킨 후, 비특이적인 단백질에 대해 blocking을 실시하였다. 준비된 membrane을 적정 항체로 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlignton Heights, IL, USA)을 처리하여 특정 단백질의 발현 정도를 비교하였다.</p><h2>In vitro caspase activity 측정</h2><p>동일한 조건에서 준비된 세포들의 단백질을 96-well plate에 동량 분주하고 \( 2 \times \) reaction buffer를 각각 \( 50 \mu \mathrm{l} \)씩 넣어 주어 총 \( 100 \mu \mathrm{l} \)가 되게 한 후 각각의 caspase 기질을 첨가하였다. 준비된 plate를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 암상태에서 3시간 동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 \( 405 \mathrm{~nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Caspase 활성 측정을 위한 colormetric assay kit는 R\(\&\)D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고, 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고, caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA였다.</p><h2>통계 처리</h2><p>모든 실험결과는 평균 \( \pm \) 표준편차로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student \( t \)-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>HUVECs의 생존 및 증식에 미치는 글루타민 및 혈청 결핍의 영향</h2><p>HUVECs의 생존 및 증식에 미치는 글루타민의 영향을 조사하기 위하여 정상배지에서 배양된 HUVECs를 글루타민이 없는 조건에서 24시간 및 48시간 배양한 후 hemocytometer counting을 이용하여 생존한 세포의 수 및 MTT assay를 이용한 증식율의 변화를 측정하였다. Fig. 1에 나타낸 바와 같이 글루타민이 결핍된 조건에서 HUVECs는 시간의 경과에 따라 세포의 생존율 및 증식율이 글루타민 결핍 시간의 증가에 따라 모두 감소되었다. HUVECs의 증식에 혈청이 필수적으로 요구되며, 혈청이 결핍되었을 경우 apoptosis가 일어난다는 것은 잘 알려진 바 있다. 또한 HUVECs에서는 정확한 비교 선행 연구가 없지만, in vitro 조건에서 글루타민의 결핍도 세포의 증식을 억제하며 apoptosis를 유발할 수 있음이 Drogat et al.에 의하여 보고된 바 있다. 그러나 동일 조건에서 혈청 결핍보다는 글루타민의 결핍에서 HUVECs의 증식율은 현저히 낮게 나타났으며, 혈청과 글루타민가 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs의 증식율은 더욱 더 낮게 나타났다.</p><p>이러한 글루타민 및 혈청의 단독 및 동시 결핍에 의한 HUVECs의 증식율의 저하 현상이 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 DAPI staining을 한 후 핵의 형태변화 및 flow cytometry 분석에 의한 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도를 비교하였다. Fig. 3의 결과에서 알 수 있듯이 글루타민 또는 혈청이 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs는 전형적인 apoptosis가 일어났을 경우 관찰되는 염색질의 응축에 의한 apoptotic body 현상이 뚜렷하게 증가되었으며, 글루타민 및 혈청이 모두 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서는 이러한 현상을 오히려 관찰할 수 없었다. 아울러 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도 역시 글루타민 또는 혈청이 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서는 각각 \( 18 \% \) 및 \( 29 \% \) 정도로 관찰되어 각각의 단독 결핍에 의한 생존율 저하 현상과 연관성이 있었으나, 글루타민과 혈청이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서는 \(5\%\) 정도로 정상배지에서 배양된 세포의 자연적 apoptosis 유발 빈도인 \(3\%\)에 유사한 빈도를 보여주었다. 즉 글루타민과 혈청이 동시에 결핍된 조건에서 HUVECs의 증식 및 생존율이 저하되었지만, 각각의 결핍에 의하여 나타나는 apoptosis 유발은 오히려 차단되었음을 알 수 있었다. 또한 글루타민과 혈청이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 세포의 경우 G1기에 해당되는 세포의 빈도가 다소 증가되었으며, 이러한 현상 세포주기 교란과 연관이 있는지의 여부에 대해서는 추후 연구가 필요할 것으로 생각된다.</p> <h1>초록</h1><p>글루타민과 혈청은 세포의 생존과 증식에 기본적으로 요구되지만, 그들의 양적 변화에 따른 내피세포 반응에 관한 신호전달 관련 연구는 거의 이루어지지 않았다. 본 연구에서는 인체 재대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)의 증식에 미치는 글루타민과 혈청의 결핍에 관한 영향을 조사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 글루타민 및 혈청이 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs의 증식 억제는 apoptosis 유발과 연관성이 있었음을 DAPI staining에 의한 핵의 형태 변화와 유세포 분석을 통하여 확인하였다. 비록 혈청이 결핍된 조건보다 글루타민 결핍에 의한 apoptosis 유발 정도가 더 높게 나타났으나, 두 현상에 의한 apoptosis의 유발은 anti-apoptotic Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현 저하와 pro-apoptotic Bax의 발현 증가, IAP family 단백질의 발현 감소, caspase의 활성 증가에 따른 PARP 단백질의 단편화와 연관성이 있었다. 또한 이러한 조건에서 HUVECs의 Bid 발현의 감소 또는 tBid 발현의 증가 현상이 관찰되어, 글루타민 또는 혈청 결핍에 의한 HUVECs의 apoptosis 유발은 세포막 수용체 및 미토콘드리아 활성 경로를 동시에 통하여 이루어지고 있음을 알 수 있었다. 그러나 글루타민과 혈청이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs의 증식 억제 현상은 각각의 조건에 비하여 증가되었으나 apoptosis는 유발되지 않았다.</p> <h1>서 론</h1><p>내피세포(endothelial cell)는 염증, 혈관재생 및 혈관신생에서 중요한 역할을 하는 세포이다. 내피세포의 항상성은 내피세포의 증식과 사멸의 균형에 의존적이며, 혈관 벽의 보존을 위하여 내피세포는 일반적으로 세포의 사멸에 대하여 내성을 지니고 있다. 이러한 측면에서 apoptosis는 내피세포에 의해 형성되는 조직의 항상성뿐만 아니라 다양한 질환의 원인과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어지고 있다. 특히 apoptosis에 의한 내피 손상은 아테롬성 동맥 경화증, 동종 이식 맥관 장애, 고혈압, 폐혈증 등과 많은 염증성 장애과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 현재 내피세포의 대표적인 apoptosis 유도 인자로서 lipopolysaccharide, tumor necrosis factor (TNF)-\(\alpha\), interferon-\(\gamma\), 산화적 스트레스 및 transforming growth factor \( \beta \)1, amyloid-\( \beta \)등이 알려진 반면, fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor(VEGF) 및 endothelin 등은 내피세포의 apoptosis 억제인자로 알려져 있다. 이러한 측면에서 in vitro 조건에서 혈청(serum) 공급의 차단은 내피세포의 apoptosis를 촉진하는 환경을 제공해 줄 수 있다. 또한 에너지 대사 측면에서 글루타민의 공급제한 역시 내피세포의 apoptosis를 유도하는 인자로서 작용할 수 있으나, 그에 대한 구체적인 기전은 알려진 바 없다.</p><p>일반적으로 내피세포의 apoptosis는 Fas 및 TNF receptor-1과 같은 세포막 죽음의 수용체 경로(extrinsic pathway)와 미토콘드리아 의존적 경로(intrinsic pathway)에 의하여 유도될 수 있다. 특히 심혈관계 질환과 연계된 내피세포의 미토콘드리아 경로를 통한 apoptosis 조절에는 Bcl-2 family 단백질들의 발현 변화와 caspase 단백질의 활성이 주요 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 미토콘드리아에서의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 결정적 인자로 작용할 수 있음이 밝혀졌다. 그러나 최근 연구에 의하면 내피세포에서의 apoptosis에서 ROS-의존적 caspase- 8의 활성화가 세포막 수용체 경로와 미토콘드리아 경로를 연결 및 증폭할 수 있는 것으로 알려져 아마도 내피세포의 apoptosis 유발은 내피세포가 처한 환경적 스트레스의 종류에 매우 의존적일 수 있음을 의미한다. 따라서 본 연구에서는 내피세포의 기본적인 증식에 필요한 글루타민과 혈청의 유무에 따른 내피세포의 반응을 조사하였다. 이를 위하여 인체 재대정맥 내피세포(humanumbilical vein endothelial cells, HUVECs)가 글루타민 또는 혈청이 단독 또는 동시에 결핍된 조건에서 apoptosis 유발에 어떤 반응을 보이는지를 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양</h2><p>HUVECs은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, \( 10 \% \) fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)penicillin/streptomycin이 함유된 정상 RPMI 1640 (글루타민 농도: \( 2.05 \mathrm{mM} \) ) 및 글루타민 결핍 RPMI 1640 (Invitrogen)배지를 이용하여 배양하였다.</p><h2>Hemocytometere를 이용한 세포 생존율 및 MTT assy에 의한 세포 증식율 측정</h2><p>글루타민 또는 혈청 결핍이 HUVECs의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 6-well plate에 세포를 \( 1 \times 10^{5} \)개 \( / \mathrm{ml} \)로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, 글루타민 또는 혈청이 결핍된 RPMI-1640 배지로 교체하였다. 적정 시간 경과 후 상층액을 제거하고 \( 0.05 \% \) trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 phosphate-buffered saline (PBS)와 \(0.5\%\) trypan blue solution을 각 well 당 첨가하였다. 약 2분 후 sample을 hemocytometer에 적용한 후 도립 현미경을 이용하여 살아있는 세포를 계수하여 상대적 수치로 비교하였다. MTT assay를 위하여 적정 시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO,USA)를 \( 0.5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도가 되게 배지로 희석하여 분주하고 3시간 동안 \(\mathrm{CO}_{2} \) incubator에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)를 적정량 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 \( 200 \mu \mathrm{l} \)씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 540 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>Apoptosis 유도의 확인</h2><p>글루타민 또는 혈청 결핍에 의한 HUVECs의 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) 염색을 이용한 핵의 형태적 변화를 관찰하였다. 이를 위하여 동일조건에서 배양된 HUVECs를 \( 37 \% \) formaldehyde 용액과 PBS를 \( 1: 9 \)의 비율로 섞은 fixing solution을 이용하여 상온에서 10분 동안 고정하고 DAPI 용액으로 염색시켰다. 15분 정도 염색시킨 후, mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 핵의 형태 변화를 관찰하였다. 또한 apoptosis 유도의 정량적인 비교 분석을 위하여 준비된 세포를 모은 후 PBS로 충분히 씻고 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickison, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI)를 처리하여 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), 암조건에서 10분 이상 염색시켰다. 염색된 세포를 25-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCallibur (Becton Dickison)를 이용하여 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 Cell Quest software 프로그램을 이용하여 sub-G1기에 해당되는 세포의 빈도를 apoptosis가 일어난 세포로 정량화하였다.</p>	생명과학	[ "<h2>단백질 분리, 전기영동 및 Western blot analysis</h2><p>준비된 세포들을 적당량의 lysis buffer [\\(25 \\mathrm{mM} \\) Tris- \\( \\mathrm{Cl}(\\mathrm{pH} 7.5\\)), \\( 250 \\mathrm{mM} \\mathrm{NaCl}\\), \\(5 \\mathrm{mM} \\) EDTA, \\(1\\%\\) NP-40, \\( 1 \\mathrm{mM} \\) phenyl-methylsulfonyl fluoride (PMSF), \\( 5 \\mathrm{mM} \\) dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 1시간 반응 시킨 후, \\( 14,000 \\mathrm{rpm} \\)으로 30분간 원심분리하여 상층액을 모았다.", "상층액의 단백질을 정량화한 후 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다.", "분리된 단백질을 함유한 acrylamide gel을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 전이시킨 후, 비특이적인 단백질에 대해 blocking을 실시하였다.", "준비된 membrane을 적정 항체로 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlignton Heights, IL, USA)을 처리하여 특정 단백질의 발현 정도를 비교하였다.", "</p><h2>In vitro caspase activity 측정</h2><p>동일한 조건에서 준비된 세포들의 단백질을 96-well plate에 동량 분주하고 \\( 2 \\times \\) reaction buffer를 각각 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\)씩 넣어 주어 총 \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\)가 되게 한 후 각각의 caspase 기질을 첨가하였다.", "준비된 plate를 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 암상태에서 3시간 동안 incubation 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 \\( 405 \\mathrm{~nm} \\)의 파장에서 흡광도를 측정하였다.", "Caspase 활성 측정을 위한 colormetric assay kit는 R\\(\\&\\)D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였고, 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고, caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)-pNA였다.", "</p><h2>통계 처리</h2><p>모든 실험결과는 평균 \\( \\pm \\) 표준편차로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student \\( t \\)-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>HUVECs의 생존 및 증식에 미치는 글루타민 및 혈청 결핍의 영향</h2><p>HUVECs의 생존 및 증식에 미치는 글루타민의 영향을 조사하기 위하여 정상배지에서 배양된 HUVECs를 글루타민이 없는 조건에서 24시간 및 48시간 배양한 후 hemocytometer counting을 이용하여 생존한 세포의 수 및 MTT assay를 이용한 증식율의 변화를 측정하였다.", "Fig.", "1에 나타낸 바와 같이 글루타민이 결핍된 조건에서 HUVECs는 시간의 경과에 따라 세포의 생존율 및 증식율이 글루타민 결핍 시간의 증가에 따라 모두 감소되었다.", "HUVECs의 증식에 혈청이 필수적으로 요구되며, 혈청이 결핍되었을 경우 apoptosis가 일어난다는 것은 잘 알려진 바 있다.", "또한 HUVECs에서는 정확한 비교 선행 연구가 없지만, in vitro 조건에서 글루타민의 결핍도 세포의 증식을 억제하며 apoptosis를 유발할 수 있음이 Drogat et al.에 의하여 보고된 바 있다.", "그러나 동일 조건에서 혈청 결핍보다는 글루타민의 결핍에서 HUVECs의 증식율은 현저히 낮게 나타났으며, 혈청과 글루타민가 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs의 증식율은 더욱 더 낮게 나타났다.", "</p><p>이러한 글루타민 및 혈청의 단독 및 동시 결핍에 의한 HUVECs의 증식율의 저하 현상이 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 DAPI staining을 한 후 핵의 형태변화 및 flow cytometry 분석에 의한 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도를 비교하였다.", "Fig.", "3의 결과에서 알 수 있듯이 글루타민 또는 혈청이 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs는 전형적인 apoptosis가 일어났을 경우 관찰되는 염색질의 응축에 의한 apoptotic body 현상이 뚜렷하게 증가되었으며, 글루타민 및 혈청이 모두 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서는 이러한 현상을 오히려 관찰할 수 없었다.", "아울러 sub-G1기에 속하는 세포의 빈도 역시 글루타민 또는 혈청이 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서는 각각 \\( 18 \\% \\) 및 \\( 29 \\% \\) 정도로 관찰되어 각각의 단독 결핍에 의한 생존율 저하 현상과 연관성이 있었으나, 글루타민과 혈청이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs에서는 \\(5\\%\\) 정도로 정상배지에서 배양된 세포의 자연적 apoptosis 유발 빈도인 \\(3\\%\\)에 유사한 빈도를 보여주었다.", "즉 글루타민과 혈청이 동시에 결핍된 조건에서 HUVECs의 증식 및 생존율이 저하되었지만, 각각의 결핍에 의하여 나타나는 apoptosis 유발은 오히려 차단되었음을 알 수 있었다.", "또한 글루타민과 혈청이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 세포의 경우 G1기에 해당되는 세포의 빈도가 다소 증가되었으며, 이러한 현상 세포주기 교란과 연관이 있는지의 여부에 대해서는 추후 연구가 필요할 것으로 생각된다.", "</p> <h1>초록</h1><p>글루타민과 혈청은 세포의 생존과 증식에 기본적으로 요구되지만, 그들의 양적 변화에 따른 내피세포 반응에 관한 신호전달 관련 연구는 거의 이루어지지 않았다.", "본 연구에서는 인체 재대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)의 증식에 미치는 글루타민과 혈청의 결핍에 관한 영향을 조사하였다.", "본 연구의 결과에 의하면 글루타민 및 혈청이 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs의 증식 억제는 apoptosis 유발과 연관성이 있었음을 DAPI staining에 의한 핵의 형태 변화와 유세포 분석을 통하여 확인하였다.", "비록 혈청이 결핍된 조건보다 글루타민 결핍에 의한 apoptosis 유발 정도가 더 높게 나타났으나, 두 현상에 의한 apoptosis의 유발은 anti-apoptotic Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현 저하와 pro-apoptotic Bax의 발현 증가, IAP family 단백질의 발현 감소, caspase의 활성 증가에 따른 PARP 단백질의 단편화와 연관성이 있었다.", "또한 이러한 조건에서 HUVECs의 Bid 발현의 감소 또는 tBid 발현의 증가 현상이 관찰되어, 글루타민 또는 혈청 결핍에 의한 HUVECs의 apoptosis 유발은 세포막 수용체 및 미토콘드리아 활성 경로를 동시에 통하여 이루어지고 있음을 알 수 있었다.", "그러나 글루타민과 혈청이 동시에 결핍된 조건에서 배양된 HUVECs의 증식 억제 현상은 각각의 조건에 비하여 증가되었으나 apoptosis는 유발되지 않았다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>내피세포(endothelial cell)는 염증, 혈관재생 및 혈관신생에서 중요한 역할을 하는 세포이다.", "내피세포의 항상성은 내피세포의 증식과 사멸의 균형에 의존적이며, 혈관 벽의 보존을 위하여 내피세포는 일반적으로 세포의 사멸에 대하여 내성을 지니고 있다.", "이러한 측면에서 apoptosis는 내피세포에 의해 형성되는 조직의 항상성뿐만 아니라 다양한 질환의 원인과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어지고 있다.", "특히 apoptosis에 의한 내피 손상은 아테롬성 동맥 경화증, 동종 이식 맥관 장애, 고혈압, 폐혈증 등과 많은 염증성 장애과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.", "현재 내피세포의 대표적인 apoptosis 유도 인자로서 lipopolysaccharide, tumor necrosis factor (TNF)-\\(\\alpha\\), interferon-\\(\\gamma\\), 산화적 스트레스 및 transforming growth factor \\( \\beta \\)1, amyloid-\\( \\beta \\)등이 알려진 반면, fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor(VEGF) 및 endothelin 등은 내피세포의 apoptosis 억제인자로 알려져 있다.", "이러한 측면에서 in vitro 조건에서 혈청(serum) 공급의 차단은 내피세포의 apoptosis를 촉진하는 환경을 제공해 줄 수 있다.", "또한 에너지 대사 측면에서 글루타민의 공급제한 역시 내피세포의 apoptosis를 유도하는 인자로서 작용할 수 있으나, 그에 대한 구체적인 기전은 알려진 바 없다.", "</p><p>일반적으로 내피세포의 apoptosis는 Fas 및 TNF receptor-1과 같은 세포막 죽음의 수용체 경로(extrinsic pathway)와 미토콘드리아 의존적 경로(intrinsic pathway)에 의하여 유도될 수 있다.", "특히 심혈관계 질환과 연계된 내피세포의 미토콘드리아 경로를 통한 apoptosis 조절에는 Bcl-2 family 단백질들의 발현 변화와 caspase 단백질의 활성이 주요 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 미토콘드리아에서의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 결정적 인자로 작용할 수 있음이 밝혀졌다.", "그러나 최근 연구에 의하면 내피세포에서의 apoptosis에서 ROS-의존적 caspase- 8의 활성화가 세포막 수용체 경로와 미토콘드리아 경로를 연결 및 증폭할 수 있는 것으로 알려져 아마도 내피세포의 apoptosis 유발은 내피세포가 처한 환경적 스트레스의 종류에 매우 의존적일 수 있음을 의미한다.", "따라서 본 연구에서는 내피세포의 기본적인 증식에 필요한 글루타민과 혈청의 유무에 따른 내피세포의 반응을 조사하였다.", "이를 위하여 인체 재대정맥 내피세포(humanumbilical vein endothelial cells, HUVECs)가 글루타민 또는 혈청이 단독 또는 동시에 결핍된 조건에서 apoptosis 유발에 어떤 반응을 보이는지를 조사하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>세포배양</h2><p>HUVECs은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며, \\( 10 \\% \\) fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)penicillin/streptomycin이 함유된 정상 RPMI 1640 (글루타민 농도: \\( 2.05 \\mathrm{mM} \\) ) 및 글루타민 결핍 RPMI 1640 (Invitrogen)배지를 이용하여 배양하였다.", "</p><h2>Hemocytometere를 이용한 세포 생존율 및 MTT assy에 의한 세포 증식율 측정</h2><p>글루타민 또는 혈청 결핍이 HUVECs의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위하여 6-well plate에 세포를 \\( 1 \\times 10^{5} \\)개 \\( / \\mathrm{ml} \\)로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, 글루타민 또는 혈청이 결핍된 RPMI-1640 배지로 교체하였다.", "적정 시간 경과 후 상층액을 제거하고 \\( 0.05 \\% \\) trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 phosphate-buffered saline (PBS)와 \\(0.5\\%\\) trypan blue solution을 각 well 당 첨가하였다.", "약 2분 후 sample을 hemocytometer에 적용한 후 도립 현미경을 이용하여 살아있는 세포를 계수하여 상대적 수치로 비교하였다.", "MTT assay를 위하여 적정 시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO,USA)를 \\( 0.5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 농도가 되게 배지로 희석하여 분주하고 3시간 동안 \\(\\mathrm{CO}_{2} \\) incubator에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)를 적정량 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 \\( 200 \\mu \\mathrm{l} \\)씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \\( 540 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하였다.", "</p><h2>Apoptosis 유도의 확인</h2><p>글루타민 또는 혈청 결핍에 의한 HUVECs의 증식억제가 apoptosis 유도와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) 염색을 이용한 핵의 형태적 변화를 관찰하였다.", "이를 위하여 동일조건에서 배양된 HUVECs를 \\( 37 \\% \\) formaldehyde 용액과 PBS를 \\( 1: 9 \\)의 비율로 섞은 fixing solution을 이용하여 상온에서 10분 동안 고정하고 DAPI 용액으로 염색시켰다.", "15분 정도 염색시킨 후, mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 핵의 형태 변화를 관찰하였다.", "또한 apoptosis 유도의 정량적인 비교 분석을 위하여 준비된 세포를 모은 후 PBS로 충분히 씻고 CycleTEST Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickison, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI)를 처리하여 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 암조건에서 10분 이상 염색시켰다.", "염색된 세포를 25-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCallibur (Becton Dickison)를 이용하여 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 Cell Quest software 프로그램을 이용하여 sub-G1기에 해당되는 세포의 빈도를 apoptosis가 일어난 세포로 정량화하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "", "eng": "Effects of Glutamine Deprivation and Serum Starvation of the Growth of Human Umbilical Vein Endothelial Cells" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-ebe6a110-9b33-4157-91e5-6dffac9e65d5", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2013", "doc_author": [ "정진우", "이혜현", "박철", "김운재", "최영현" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,429	<h1>요 약</h1><p>사이모신 베타 4와 VEGF의 발현을 여러 인간 조직에서 tis-sue microarray를 사용하여 조사하였다. 사이모신 베타 4는 간, 이자, 침샘의 관상피, 심장에서 강한 발현을 보였으며 피부, 폐, 이자, 림프절, 갑상선, 요관, 폐와 부신의 혈관 내피세포 등에서 중간 수준의 발현 양상을 보였다. VEGF의 발현 양상은 대체적으로 사이모신 베타 4 와 동일하였으며 이자, 요관, 유선, 간, 식도, 신장, 폐, 부신 등의 혈관 내피세포에서 강하게 발현되었다. 이러한 결과를 통해 사이모신 베타 4는 간, 이자, 침샘의 관상피, 심장에서 중요한 역할을 담당하며 VEGF와 같은 발현 양상을 보여 혈관 신생작용에 관여함을 확인하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1><p>사이모신 베타 4와 VEGF의 발현을 여러 인간 조직에서 tis-sue microarray를 사용하여 조사하였다.", "사이모신 베타 4는 간, 이자, 침샘의 관상피, 심장에서 강한 발현을 보였으며 피부, 폐, 이자, 림프절, 갑상선, 요관, 폐와 부신의 혈관 내피세포 등에서 중간 수준의 발현 양상을 보였다.", "VEGF의 발현 양상은 대체적으로 사이모신 베타 4 와 동일하였으며 이자, 요관, 유선, 간, 식도, 신장, 폐, 부신 등의 혈관 내피세포에서 강하게 발현되었다.", "이러한 결과를 통해 사이모신 베타 4는 간, 이자, 침샘의 관상피, 심장에서 중요한 역할을 담당하며 VEGF와 같은 발현 양상을 보여 혈관 신생작용에 관여함을 확인하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Tussue microarray를 이용한 사이모신 베타4(Thymosin β4)와 vascular endothelial cell growth factor (VEGF)의 ", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-f0b38942-c09c-4a09-85e5-eafee9aac5d5", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2009", "doc_author": [ "옥미선", "차희재" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,430	<h1>초록</h1><p>지금까지의 연구에 의하면 산야 발효액에 대한 보고가 미비하므로 본 연구에서는 산야의 기능성에 관한 연구를 위하여 산야 발효액으로 여러 가지 생리활성과 면역활성에 대하여 분석하였다. 우선, 산야의 항산화 활성을 측정하기 위하여 DPPH 활성과 플라보노이드 함량을 측정하였다. 그 결과 DPPH법을 통해 측정한 산야 발효액의 항산화력은 \( 94.3 \% \) 의 radical 소거능을 나타내었다. BHA와 비교 했을 때 유사한 항산화력이 측정되었는데, 이것은 항산화 활성이 높은 것으로 산야의 항산화력에 관한 높은 이용가치를 의미한다. 산야 발효액의 총 플라보이드 함량은 \( 4.646 \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 으로 높았으며, 이는 높은 항산화능과 연관성이 있는 것으로 나타났다. 산야 발효액과 면역활성과의 연관성은 NO 합성률과 LPS에 의해 유도되는 NO 합성 저해률 분석으로 조사되었다. 그 결과, 산야 발효액은 무려 11배의 높은 NO 합성율을 보였다. 또한 LPS에 의해 유도된 NO 합성 저해율은 \( 56 \% \) 로 나타나 산야의 높은 면역효과를 증명하고 있다. 혈전분해능에 대한 산야 발효액의 분석 결과는 혈전용해제로 알려져 있는 plasmin 보다 높은 활성을 보이고 있다. SOD 유사활성은 \( 42.2 \% \) 로 비교적 높은 SOD 유사활성을 나타내었고, xanthine oxidase 저해활성은 \( 75.6 \% \) 로 높게 나타났다. 항고혈압 측정실험에서는 \( 73.5 \% \) 의 저해율을 나타내어 ACE 저해 활성이 뛰어난 것으로 나타났다. 이상의 결과는 산야의 우수한 생리활성을 증명하고 있고, 항산화력, 면역활성 및 항고혈압 효과가 높은 것으로 나타나 기능성 음료의 소재로서 그 활용도가 높을 것으로 판단된다.</p> <h2>Nitric oxide (\(\mathrm{NO}\)) 생성량 측정 및 cell viability 측정</h2><p>\(\mathrm{NO}\)의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite양을 측정하였다. 대식세포를 세포 배양판에 \( 5 \times 10^{5} \) cells/ml의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 \(\mathrm{NO}\)를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다. \( 100 \mu \mathrm{l}\) 의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약 [\( 1 \% \) sulfanilamide ( \( 30 \% \) acetic acid)와 \(0.1\%\) N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (\(60\%\) acetic acid) 혼합액]을 가하여 상온에서 20 분간 반응시켰다. \(\mathrm{NO}\)의 활성 정도는 ELISA 판독기를 사용하여 \( 800 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 범위에서 \( 540 \mathrm{~nm} \) 흡광도를 측정하였다.</p><p>세포독성 실험은 mitochondrial dehydrogenase activity의 index를 나타내는 MTT colorimetric reduction assay 법으로 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 분석하였다. 96-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW 264.7 macrophage를 \( 1 \times 10^{5} \) cells/well의 농도로 분주하였다. 분주 24시간 후 각 시료가 함유되어 있는 배지를 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 씩 넣어 48시간 동안 배양하였다. Plate에 \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\) 3-(4,5- dimethylth-iazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma) 용액을 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 첨가하여 4 시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시키 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다. DMSO \( 150 \mu \mathrm{l} \)을 첨가하여 formazan을 녹인 후 \( 570 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>혈전분해능 측정</h2><p>혈전용해 활성의 측정에 있어서는 Astrup와 Hullertz의 방법을 변형하여 사용하였다. \(0.4\%\) Fibrinogen (Sigma)을 sodium borate buffer ( \( 10 \mathrm{mM} \) sodium borate, \( 160 \mathrm{mM} \) boric acid, \( 40 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \). Merk)에 녹인 다음 직경 \( 87 \times 10 \mathrm{~mm} \) petridish에 \( 10 \mathrm{ml} \)을 넣은 후 thrombin (\(1,000 \mathrm{unit}/\mathrm{ml}\) Sigma) \( 20 \mathrm{unit}\)를 첨가하여 실온에 30분간 방치하여 응고시켰다. 응고된 fibrin plate 에 각 시료를 적당량 점적하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였으며, 활성의 세기를 측정하기 위하여 혈전분해효소 plasmin과 비교 후 \(\mathrm{unit}\)로 환산하여 단위를 정하였다.</p><h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase -like activity: SODA) 측정</h2><p>추출물의 SOD 유사활성은 Marklund 와 Marklund의 방법에 따라 과산화수소 \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \) 로 전환시키는 반응을 촉매하는 pylogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다. 시료를 농도별로 희석하여, 시료 \( 10 \mu \mathrm{l} \) 에 \( \mathrm{pH} 8.5\)로 보정한 Tris-\(\mathrm{HCl}\) buffer (\( 50 \mathrm{mM} \) tris [hydroxymethyl] amino-methane, \( 10 \mathrm{mM} \) EDTA, \( \mathrm{pH} 8.5\)) \(150 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 7.2 \mathrm{mM} \) pyrogallol \( 10 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 10 분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm{~N} \mathrm{~HCl}\) \(50 \mu \mathrm{l} \)를 가하여 반응을 정지 시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 ELISA reader를 사용하여 \( 420 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(\(\%\))로 나타내었다.</p><p>SODA(\(\%)=\left(1-\frac{A}{B}\right) \times 100 \)</p><p>\( \mathrm{A} \) : 시료 첨가구의 흡광도, \( \mathrm{B} \) : 시료 무첨가구의 흡광도</p> <h2>Xanthine Oxidase 억제 활성</h2><p>Xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide radials 소거활성은 NBT (nitro-blue tetrazolium) 환원법을 사용하여 검정하였다. 즉, \( 0.8 \mathrm{mM} \) xanthine을 포함하는 \( 0.1 \mathrm{mM} \) phos-phate buffer ( \(\mathrm{pH} 8.0\)) \( 0.5 \mathrm{ml} \) 와 \( 0.48 \mathrm{mM} \) NBT를 포함하는 \( 0.1 \mathrm{mM} \) phosphate buffer \( (\mathrm{pH}8.0 \) )에 시료를 농도별로 각각 처리하여 혼합한 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5 분간 incubation 하였다. 반응물에 xanthine oxidase \( (0.049 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \) 을 \( 1.0 \mathrm{ml} \) 을 가하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20 분간 incubation시켰다. 그 후, \( 69 \mathrm{mM}\)SDS를 \( 2.0 \mathrm{ml} \) 을 첨가하여 반응을 정지 시킨 후 \( 560 \mathrm{~nm} \) 흡광도에서 측정하였다. 농도별 시료에 따른 NBT 환원에 대한 저해능은 다음과 같은 식으로 계산하였다.</p><p>XO inhibition \( (\%)=\frac{C-S}{C-B} \times 100 \)</p><p>B (blank): \( 0.8 \mathrm{mM} \) xanthine 포함한 \( 0.1 \mathrm{mM} \) buffer \( (\mathrm{pH} 8.0\) )와 \( 69 \mathrm{mM} \) SDS만 첨가한 반응액 흡광도</p><p>C (control): 시료대신 \( 0.48 \mathrm{mM}\) NBT를 첨가한 반응액 흡광도</p><p>S (Sample): 시료 첨가한 반응액 흡광도</p><h2>ACE(Angiotensin I -Converting Enzyme) 저해능 측정</h2><p>ACE저해 활성은 Cushman 등의 방법에 따라 측정하였으며, 조효소액은 rabbit lung acetone powder (Sigma, USA)를 \( 0.3 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 을 함유한 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium borate buffer \( (\mathrm{pH} 8.3\)) 에 \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{ml}\)(\(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 24 시간 추출한 후, \( 4^{\circ} \mathrm{C} \), \( 4,000 \mathrm{rpm} \) 에서 40 분간 원심 분리하여 상등액을 ACE 조효소액으로 사용하였다. 기질은 \( 0.3 \mathrm{M} \mathrm{~NaCl} \) 이 함유된 \( 0.1 \mathrm{M} \) sodium borate buffer \( (\mathrm{pH} 8.3\))에 HHL (hippuryl- histidyl-leucine)을 \( 5 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\) \((\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 의 농도로 녹인 후 기질로 사용하였다. ACE저해활성은 시료 \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 ACE 조효소액 \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 가한 다음 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 분간 예비반응 시킨 후, 기질 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 을 가한 후 다시 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 시간 반응 시켰다. \( 1 \mathrm{N} \mathrm{~HCl} \) \(150 \mu \mathrm{l} \) 로 반응을 정지시키고 ethyl acetate \( 750 \mu \mathrm{l} \) 가한 후, 1 분간 교반하고 \( 4^{\circ} \mathrm{C}\), \(5,000 \mathrm{rpm} \) 에서 10 분간 원심 분리 한 후 상등액 \( 500 \mu \mathrm{l} \) 를 얻었다. 이상등액을 \( 120^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30 분간 완전히 건조시켜 \( \mathrm{MeOH}\) \(2 \mathrm{ml} \) 을 넣은 후 \( 228 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로서는 시료 대신 시료용매 \( 50 \mu \mathrm{l} \) 를 가해 실험 하였으며, ACE 저해 활성효과는 다음 계산식을 이용하여 실험하였다.</p><p>ACE inhibition \( (\%)=(C-S / C-B) \times 100 \)</p><p>S: Sample absorbance. C: Control absorbance. B: Blank absorbance</p><h2>HPLC 분석</h2><p>Flavonoid glycoside 분석을 위한 표준용액 \( (1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \) Quercetin, Kaemferol, Myricetin, Apigenine, Luteolin, Rutin을 메탄올에 용해시켜 사용하였고, 시료 \( (10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}) \)는 메탄올에 용해 한 후 Sea-pak C18 cartridge와 \( 0.2 \mu \mathrm{m} \) filter로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다. 분석용 column은 Octadecylsilane (ODS) C18 \( (4.6 \times 25 \mathrm{~cm}\), \(5 \mu \mathrm{m}) \)을 사용하였고, 용매는 \( \mathrm{MeOH} / \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} / \)Acetic acid \( (5 / 93 / 2\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)와 \( 60 \% \mathrm{~MeOH} \) 를 사용하여 linear gradient해서 55분간 용출 시킨 후 15 분간은 \( 60 \% \mathrm{~MeOH} \) 로서 용출하였다. Total flow rate은 \( 1 \mathrm{ml} / \mathrm{min} \) 로 하였고, detector는 UV \( 370 \mathrm{~nm} \) 에서, column temp. oven은 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 로 하여 Shimadzu LC-10AD으로 분석하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>시료 채취 및 발효</h2><p>본 실험에 사용된 실험 재료는 증류수 \(10 \mathrm{~l}\)에 산야(민들레 \( 40 \mathrm{~g} \), 연자육 \( 40 \mathrm{~g} \), 솔잎 \( 30 \mathrm{~g} \), 참나리 \( 30 \mathrm{~g} \), 애쑥 \( 30 \mathrm{~g} \), 질경이 \( 30 \mathrm{~g} \), 뽕열매 \( 40 \mathrm{~g} \), 감초 \( 24 \mathrm{~g} \), 도라지 \( 9 \mathrm{~g} \), 쇠비름 \( 9 \mathrm{~g} \), 자소엽 \( 9 \mathrm{~g} \), 박하 \( 36 \mathrm{~g} \), 금불초 \( 9 \mathrm{~g} \), 오가피 \( 18 \mathrm{~g} \), 참마 \( 15 \mathrm{~g} \), 연뿌리 \( 18 \mathrm{~g} \), 두충 \( 30 \mathrm{~g} \), 둥글레 \( 200 \mathrm{~g} \), 녹차잎 \( 100 \mathrm{~g}\)) 와 다시마 (\( 100 \mathrm{g} \)) 및 미네랄 수(해양성심층수, \( 0.5 \% \))는 부재료로 첨가하여 당의 농도가 50.0~60.0 \(\mathrm{Brix}\)가 되도록 설탕시럽을 넣은 후 발효시켰다. 약 6개월 동안 발효 시킨 후 산야 발효액의 \( \mathrm{pH} 5.2 \) 였고, 시료로 사용하기 위해 발효액은 여과하였으며 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 냉장 보관하였다.</p><h2>전자공여능(Electron donation ability: EDA) 측정</h2><p>전자공여능 측정은 Blois의 방법에 따라서 각 시료의 DPPH (1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 시료를 농도별로 희석하여 시료 \( 40 \mu \mathrm{l} \) 와 \( 1.5 \mathrm{mM} \) DPPH용액 \( 160 \mu \mathrm{l} \) 를 섞은 후, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 30분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 \( 520 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA \((\%)=( \) 대조구흡광도\(-\)시료첨가구흡광도) / 대조구흡광도\(\times 100\)으로 계산하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.</p><h2>세포배양</h2><p>마우스대식세포주인 RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA. USA)에서 구입하였으며, 세포배양에 사용된 배지인 RPMI 1640 medium (Eagle's MEM)과 fetal bovine serum (FBS), Hank's balanced salt solution (HBSS) 등은 모두 Hyclone (Logan, UT, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다 RAW264.7 세포주는 \( 10 \% \) FBS와 100 \(\mathrm{unit}\)의 penicillin과 streptomycin이 함유된 RPMI 1640 media를 사용하여 \( 5 \% \) 의 이산화탄소를 포함한 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 의 포화습도 공기조건하에서 배양하였다.</p> <h2>대식세포에서의 Nitric oxide 생성능 측정</h2><p>대식세포를 이용하여 Nitric oxide \(\mathrm{NO}\) 생성능을 확인한 결과를 Fig. 2에 나타내었다. \(\mathrm{NO}\)는 면역 세포에서 NOS (nitricoxide syntase)에 의해 생성되는데 다량으로 외부의 자극에 의해 유전자 수준에서 발현되고 주로 침입한 미생물이나 종양 세포에 대해 독성을 갖는 방어 물질로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 \(\mathrm{NO}\)가 세포 활성화 물질 및 reactive oxygen intermediates (ROI)에 의해 유발된 세포 독성을 최소화 시키는 역할이 밝혀짐으로 이 분야에 대해서 활발히 연구되고 있다. 이에 본 실험에서는 시료를 대식세포에 투여하여 \(\mathrm{NO}\)의 생성능을 확인하였다. 결과에서도 확인할 수 있는 것처럼 대식세포가 생성하는 \(\mathrm{NO}\)량 \( 2 \mu \mathrm{m} \) 보다 발효액의 첨가로 인해 \( 22.0 \mu \mathrm{m} \) 의 높은 \(\mathrm{NO}\) 생성능을 나타내었다. 이로써, 산야가 면역활성과 관련하여 활용 가능성이 있으며 전통발효를 통해 높은 면역활성의 증진이 있음을 확인할 수 있었다. 지금까지의 연구는 주로 침입한 미생물이나 종양세포가 분비하는 독성물질로 유발되는 \(\mathrm{NO}\) 생성을 저해하는 효능에 대해 조사해 왔으며, 방어 물질로 또는 독성을 최소화시킬 수 있는 물질로써의 \(\mathrm{NO}\) 생성 활성에 대한 연구는 거의 없는 것으로 판단된다.</p><h2>\(\mathrm{NO}\) Assay 및 cell viability</h2><p>대장균 Bacterial lipopolysaccharide (LPS)를 대식세포에 처리하여 \(\mathrm{NO}\)를 유도시킨 다음 산야 발효액을 대식세포에 처리하여 \(\mathrm{NO}\) 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과, LPS에 의하여 유도된 대식세포의 \(\mathrm{NO}\) 합성은 산야 발효액을 농도별로 첨가하였을 때 점차 감소하였다. 발효액의 첨가로 \( 56 \% \) 의 \(\mathrm{NO}\) 생성 저해능을 나타났으며, 이러한 결과는 산야로 부터의 성분들이 면역기능과 밀접한 관계가 있음을 보여주는 것이다. \(\mathrm{NO}\)는 L-arginine의 guanidino nitrogen으로부터 nitric oxide synthase (NOS)에 의하여 생성되며, \(\mathrm{NO}\)는 분비조직과 세포의 기능에 영향을 미치며, 세포성 면역계의 주된 역할의 하나로 세포 독성이나 성장 억제 작용을한다. \(\mathrm{NO}\)는 대부분의 포유류 동물의 세포내에서 생성되고 신경계에서는 화학적 신호 전달 물질로서, 혈관계에서는 혈압 조절과 혈소판의 응집 및 호중성구의 집합 작용을, 골격근에서는 대사와 근 수축 조절 등 생리학적으로 중요한 역할을한다. \(\mathrm{NO}\)가 발현하는 기능의 다양성은 농도 및 표적세포의 활성화여부에 따라 달라진다고 알려져 있다. 대식세포가 pathogen에 의하여 활성화되면 \(\mathrm{NO}\) 뿐만 아니라 superoxide anion을 호흡과정에 의하여 대량생산되는데, \(\mathrm{NO}\) 자신은 매우 약한 산화성을 가진 라디칼로서 vitamin E와 비슷하게 세포의 지질과산화물을 막는 항산화 기능도 수행한다는 보고도 있다. 최근 염증반응을 완화시키는데 있어서도 종래에 사용되어온 \(\mathrm{NO}\)를 소거하는 방식보다는 superoxide anion의 생성을 저해 하거나 NADPH oxidase의 활성을 감소시키는 방법이 더욱 비중 있게 다루어지고 있다.</p><p>LPS에 의한 산야 성분의 \(\mathrm{NO}\) 합성 저해효과 또한 연구되어 왔는데 Seo 등은 \( 50 \% \) 이상의 \(\mathrm{NO}\) 생성 저해능을 \( 100 \mu \mathrm{g} / \) \( \mathrm{ml} \)의 봉선화, 금불초, 산옥잠화, 모시풀등과 같은 약초의 메틸 추출물에서 보고하였다. 이는 본 연구에서 이용된 시료보다 높은 \(\mathrm{NO}\) 합성 저해율을 나타내고 있다. Ahn 등은 도라지의 \(\mathrm{NO}\) 합성 저해율을 보고하였는데, 우수한 \(\mathrm{NO}\) 합성 저해율로 차세대 염증질환 치료제와 예방약으로 활용할 수 있을 것으로 판단하고 있다. 이는 역시 본 연구에서 분석된 산야의 활용도를 대변하고 있다.</p><p>발효액 시료에 대한 세포활성은 MTT 분석을 통해서 측정하였다. 그 결과 시료로 처리된 대식세포의 세포생존율이 \( 90 \% \)정도를 나타내는 바 본 연구에서 사용된 시료에 대한 세포독성은 없는 것으로 관찰되었다. 또한, 실험결과에 나타난 \(\mathrm{NO}\)의 생성량의 변화가 세포독성에 의한 영향과는 무관함을 확인할 수 있었다.</p> <h1>서론</h1><p>지금까지의 약용식물 및 약재에 대한 연구는 주로 유기용매로 특정성분을 추출하여 여러 가지 생리활성을 가지는 물질 탐색에 대한 연구와 효능이 우수하고 안전한 약물개발에 대한 연구로 수행되어 왔다. 또한 대체의약으로 천연물질에 대한 관심이 높아지면서 약용식물에 대한 과학적인 연구와 천연 의약품 개발에 더욱 많은 연구를 수행하고 있다. 이는 최근 생활수준의 향상으로 평균수명의 연장과 건강에 대한 관심이 높아지면서 그리고, 식습관에 기인하는 여러 가지 만성질환의 증가로 인해 더욱 더 항산화, 항암, 면역증진 및 혈행개선 등의 생리활성을 갖는 약용식물에 대한 연구가 진행되게 되었다. 특히, 건강음료 개발에 약용식물을 활용하고자 해 왔는데, 현재 시판되고 있는 건강음료의 종류는 섬유소를 주로한 변비예방과 정장작용을 돕는 것이거나 체중조절을 위한것, 체내수분과 전해질공급을 위한 것이 대부분이며, 그 외 건강 보양을 위한 것 등이 개발되고 있다. 아직은 약용식물을 이용한 음료개발에 관한 연구가 일부 영역만을 다루고 있어 건강기능성 음료로 활용하기 위해서는 앞으로 다각적인 연구가 요구된다.</p><p>이에 약용식물이 함유하고 있는 여러 가지 효소들을 활성화시켜 다양한 생화학반응을 일으킴으로 해서 식물체의 성분들이 소화·흡수되기 쉬운 형태로 전환될 수 있게 하여 새로운 생리기능을 하는 물질로 변화시키거나 유용성분이 증가한 음료를 개발하는 것이 부각되고 있다. 효소를 이용한 식품개발로는 미생물의 활동으로 유기화합물이 분해되면서 알코올, 유기산, 탄산가스 등 분해산물을 생성하는 발효의 과정이 있다. 이는 오래전부터 이용되어 왔는데, 과실 전통발효의 경우가 해당된다. 주로 발효성 당이 다량 함유되어있는 과실을 발효시켜 술로 많이 이용되어 왔는데, 탄수화물원이 부족할 경우에는 발효원료에 설탕, 전분 등 탄수화물원을 첨가하여 발효해왔다. 최근 들어 식품의 발효를 통해 생성되는 유기산 및 분해산물들이 건강에 좋다는 연구 결과 등이 발표되면서 발효 식품의 인기는 점점 높아지고 있는 실정이다. 또한, 최근의 정제가공식품은 제조과정에서 효소들이 대부분 파괴되며, 특히 식품보존제로 첨가되는 화학성분들은 효소활성을 약화시키는 작용을 하므로 더욱 더 발효식품에 대한 관심이 고조되고 있다.</p><p>본 연구에서는 한약방에서 유통되고 있는 약재들의 농약 및 약초의 독성문제 등을 극복하고, 면역기능 증진 및 혈행개선 효과가 현저한 다기능성 음료를 개발하기 위한 방안으로 19가지의 산야초를 발효시킨 후 발효음료의 항산화작용, 면역기능, 혈전분해력, ACE 활성억제 등의 생리활성을 연구하였다.</p> <h2>혈전분해능 측정</h2><p>혈전은 혈관손상으로 혈액이 유출될 때 합성되는 섬유성 단백질인 피브린으로 알려져 있다. 이들 피브린은 그대로 두면 다시 용해되는데 이는 혈장 속에 있는 플라스미노겐이 활성화하여 plasmin이 되어 피브린을 분해시키기 때문이다. 하지만 어떤 장애로 인한 불균형으로 인하여 혈전이 분해되지 않고 응집되어 혈관에 축적됨으로서 혈전증을 야기시킨다. 이에 본 연구에서는 산야의 혈전분해능을 조사하고자 하였으며, 그 결과 산야 발효액에서 혈전분해능이 나타났다. 특히, 산야 열수 추출물과 positive control인 plasmin을 비교 분석용으로 사용하였는데, plasmin \( 1 \mu \mathrm{g} \)과 산야 열수 추출물 \( 10 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 혈전분해능과 비교실험을 실시한 결과 산야 발효액에서 높은 혈전분해능을 나타냈다. 발효액의 혈전분해능은 체온과 유사한 온도인 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응 후 확인되고 있는데, 이는 plasmin보다 더 효율적으로 보인다. 이에 반해 추출물에서는 혈전분해능을 보이지 않고 있어 산야 발효액의 혈전분해능은 발효 중 생성된 균주들의 혈전분해능으로 사료된다. 지금까지의 보고에 의하면 된장으로부터 분리된 Bacillus 속 KDO-13, 치즈로부터 분리된 B. amyloliquefaciens DC-4 , 흑두로 제조한 청국에서 분리된 B. subtilis BB-1 , 멸치액젓으로부터 분리된 B. subtilis JM-3 , 청국장으로부터 분리된 B. subtilis KCK-7등이 혈전분해능이 우수한 것으로 알려져 있다.</p><h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity: SODA) 측정</h2><p>Superoxide dismutase (SOD)는 항산화 효소로서 세포에 유해한 oxygen radical을 과산화수소 전환시키고 다시 catalase에 의하여 무해한 물 분자와 산소분자로 전환시켜 활성산소로부터 생체를 보호하는 기능으로 알려져 있다. SOD는 분자량이 비교적 큰 단백질로서 열이나 알칼리에 약하여 이러한 단점을 보완할 수 있는 저분자물질로 체내에서 역할이 유사한 SOD 유사활성 물질에 대한 연구가 진행되고 있다.</p><p>본 연구에서 산야 발효액의 SOD 유사활성은 최고농도에서 \( 42.2 \% \) 의 활성을 보였으며 SOD 활성은 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하였다. 대조구인 Vit. C의 경우 농도 \( 0.1 \% \) 일 때 \( 77.3 \% \) 로 보고되어 있는데, 산야 발효액과의 비교결과에 따르면 대조구 보다 낮은 SOD 유사활성을 나타내고있다. 하지만, 이러한 결과는 비교적 항산화력이 높은 과일로 알려진 브로콜리, 딸기 착즙액의 SOD 유사활성 (\( 41.4 \%\), \(30 \% \))보다 약간 높은 SOD 유사활성을 나타낸다.</p><h2>Xanthine oxidase 저해 활성</h2><p>Xanthine oxidase는 purine 대사에 관여하는 효소로서 xanthine 또는 hypoxanthine의 산소를 때어내면서 과산화수소 (\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2} \))를 생성하게 되고, 나머지 골격이 uric acid를 형성하여 혈장 내에 과량 존재하게 되면 골절에 축적되어 심한 통증을 유발하는 통풍과 신장에 침착되어 신장질환을 일으키는 효소로 알려져 있다. Xanthine oxidase 저해활성 측정은 일종의 항산화 능을 측정하는 방법으로 본 실험에서는 대조구로 catechin을 사용하였으며 산야 발효액과 농도별로 비교하였다. Xanthine oxidase저해 활성 측정 결과 농도가 증가할수록 저해활성이 증가하였으며, 대조구인 catechin과 비교한 결과 \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)에서 \( 79.8 \% \)인 반면, 100 배 희석한 산야 발효액은 \( 75.6 \% \)로 높게 나타났다. Catechin은 polyphenol계 항산화 물질로써 식물성 대사산물로 알려져 있으며 항산화효과가 비타민 E에 비해 무려 50배나 되고, 비타민 C에 비해 100배에 달하기 때문에, 체내의 활성산소를 제거하는 효과가 매우 탁월하다고 알려져 있다. 특히, 산야 발효액의 XOase 저해효과는 catechin의 효과보다 높은 결과를 나타내고 있어 본 연구의 산야 발효액이 우수한 항산화 소재로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.</p><h2>ACE 저해작용</h2><p>ACE는 renin에 의하여 생성된 angiotensin Ⅰ으로부터 C-말단 dipeptide (His-Leu)를 가수분해 시킴으로서 강력한 혈관 수축작용을 나타내는 angiotensin Ⅱ를 생성하여 고혈압의 원인이 되고 있다. Angiotensin Ⅱ는 혈관을 수축시키는 작용을 하고, 부신에서 aldosterone의 분비를 촉진시켜 체내 수분 보유량을 많게 하여 결과적으로 혈압을 상승시키는 작용을 한다. ACE의 작용이 계속 지속화 될 경우 고혈압이 지속되어 혈관벽이 약화되어 터지게 되거나, 뇌졸중 등의 여러 질환을 유발시킬 수 있다. 이러한 ACE의 활성 저해인자로는 저분자 peptide들과 그 유도체들, 녹차에 존재하는 catechin과 메밀의 rutin과 같은 polyphenol 성분들이 대표적으로 알려져 있다. 이러한 ACE의 작용을 억제하기 위한 활성이 산야에 있는 지 알아보기 위해 실험을 한 결과, 산야 발효액에서 높은 활성을 나타내었다. 대조구로 현재 시판되고 있는 항고혈압제인 captopril을 사용하였으며, captopril \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 에서 \(93.0\%\)의 저해 활성을 보였는데 10 배 희석한 산야 발효액에서 \( 73.5 \% \)의 저해 활성을 보였다. 이러한 결과는 고혈압 예방 효능이 높은 기능성 식품인 유색감자 보다 뛰어난 효능을 나타내고있다. 따라서 본 연구에서 개발된 산야 발효액은 고혈압 예방 기능성 음료로서 이용가능성이 높은 것으로 사료된다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>DPPH에 의한 항산화 활성</h2><p>인체내의 free radical은 지질, 단백질등과 반응하여 생체의 노화를 촉진할 수 있는 물질로, 이러한 free radical를 제거할수 있는 천연물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거법은 항산화물질의 전자공여능을 이용한 항산화 측정법으로써 주로 pheonlic 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용되는 방법이다. 본 연구에서 산야 발효액의 항산화 효과를 DPPH radical 제거 정도를 측정하여 전자공여능으로 나타낸 결과 발효 원액에서 \(94.3\%\)로 나타났다(Fig. 1). 일반적으로 이용되는 positive control인 BHA \( 0.1 \% \) 에서 항산화 활성이 \( 96.2 \% \) 로 나타나고 있어서 이와 비슷한 수준으로 보이고 있는 산야 발효액은 상당히 높은 항산화 활성을 나타내고 있어 그 이용가치가 높음을 시사하고 있다. 특히, 발효액에서 더 높은 항산화능을 보이고 있는데 이는 발효중 미생물들의 작용을 통해서 생성된 새로운 활성 성분에 기인하는 것으로 판단된다.</p><p>Moon, Yoo, Kwak, Yen등의 보고에 의하면 감초, 녹차, 박하, 솔잎의 추출물의 활성이 높은 것으로 나타나 본 연구의 시료인 산야 발효액은 항산화 활성과 관련된 물질이 많을 것이라 사료된다. 특히, 활성산소와 쉽게 반응하는 물질로는 flavone 및 flavonol 같은 페놀성 화합물을 들 수 있는데 각 생약재에 함유되어 있는 이들 페놀성 화합물 및 플라보이드류가 항산화 활성을 나타내는 물질로 추정된다.</p><h2>플라보노이드 함량 분석</h2><p>지금까지의 보고에 의하면 항산화능과 플라보노이드의 함량에는 비례적인 연관성이 있다고 알려져 왔다. 이에 본 연구에서는 항산화능이 우수한 산야 발효액에 대한 플라보노이드 함량을 HPLC로 정량 분석하였다(Table 1). Quercetin은 산야 발효액에서 \( 87 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g} \)의 함량을 보였지만, Kaemferol와 myricetin은 관찰되지 않았다. Apigenine의 함량 분석과정에서 산야 발효액의 결과 \( 484 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g} \)으로 높은 함량을 나타내었다.Luteolin의 경우에서도 \( 222 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g} \)으로 높은 함량이 관찰되었다. 대표적인 플라보노이드계 물질인 Rutin은 \( 3,853 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g} \)으로 횔씬 높은 함량을 보이고 있는데, 이로써 총 플라보노이드의 함량은 산야 발효액에서 \( 4,646 \mu \mathrm{g} / \mathrm{g} \)으로, 이는 Fig. 1 에서 보이는 높은 라디칼 소거능과 일치한다. 따라서, 자연에 존재하는 대부분의 플라보노이드가 나타내는 항산화능은 라디칼의 소거능이 큰 것에서 찾아 볼 수 있다고 생각할 수 있다. 이러한 결과는 Kang이 감귤껍질에서 플라보노이드를 분리 추출하여 실시한 산화억제능에서도 동일한 결과를 나타낸바 있다. Kim 등이 대두에서 각종 용매를 이용하여 플라보노이드를 추출하여 실험한 항산화능에서도 동일한 결과를 나타내었으며 붉나무 순차용매 추출물의 항산화 효과를 비교한 Lee 등의 연구결과에서도 이러한 사실을 입증한 바 있다.</p>	생명과학	[ "<h1>초록</h1><p>지금까지의 연구에 의하면 산야 발효액에 대한 보고가 미비하므로 본 연구에서는 산야의 기능성에 관한 연구를 위하여 산야 발효액으로 여러 가지 생리활성과 면역활성에 대하여 분석하였다.", "우선, 산야의 항산화 활성을 측정하기 위하여 DPPH 활성과 플라보노이드 함량을 측정하였다.", "그 결과 DPPH법을 통해 측정한 산야 발효액의 항산화력은 \\( 94.3 \\% \\) 의 radical 소거능을 나타내었다.", "BHA와 비교 했을 때 유사한 항산화력이 측정되었는데, 이것은 항산화 활성이 높은 것으로 산야의 항산화력에 관한 높은 이용가치를 의미한다.", "산야 발효액의 총 플라보이드 함량은 \\( 4.646 \\mathrm{mg} / \\mathrm{g} \\) 으로 높았으며, 이는 높은 항산화능과 연관성이 있는 것으로 나타났다.", "산야 발효액과 면역활성과의 연관성은 NO 합성률과 LPS에 의해 유도되는 NO 합성 저해률 분석으로 조사되었다.", "그 결과, 산야 발효액은 무려 11배의 높은 NO 합성율을 보였다.", "또한 LPS에 의해 유도된 NO 합성 저해율은 \\( 56 \\% \\) 로 나타나 산야의 높은 면역효과를 증명하고 있다.", "혈전분해능에 대한 산야 발효액의 분석 결과는 혈전용해제로 알려져 있는 plasmin 보다 높은 활성을 보이고 있다.", "SOD 유사활성은 \\( 42.2 \\% \\) 로 비교적 높은 SOD 유사활성을 나타내었고, xanthine oxidase 저해활성은 \\( 75.6 \\% \\) 로 높게 나타났다.", "항고혈압 측정실험에서는 \\( 73.5 \\% \\) 의 저해율을 나타내어 ACE 저해 활성이 뛰어난 것으로 나타났다.", "이상의 결과는 산야의 우수한 생리활성을 증명하고 있고, 항산화력, 면역활성 및 항고혈압 효과가 높은 것으로 나타나 기능성 음료의 소재로서 그 활용도가 높을 것으로 판단된다.", "</p> <h2>Nitric oxide (\\(\\mathrm{NO}\\)) 생성량 측정 및 cell viability 측정</h2><p>\\(\\mathrm{NO}\\)의 생성은 비색법으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite양을 측정하였다.", "대식세포를 세포 배양판에 \\( 5 \\times 10^{5} \\) cells/ml의 세포가 되도록 재부유하여 LPS의 자극하에 24시간 배양하고 그 배양 상층액 내의 \\(\\mathrm{NO}\\)를 Griess 시약과 반응시켜 측정하였다. \\", "( 100 \\mu \\mathrm{l}\\) 의 세포배양 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약 [\\( 1 \\% \\) sulfanilamide ( \\( 30 \\% \\) acetic acid)와 \\(0.1\\%\\) N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (\\(60\\%\\) acetic acid) 혼합액]을 가하여 상온에서 20 분간 반응시켰다. \\", "(\\mathrm{NO}\\)의 활성 정도는 ELISA 판독기를 사용하여 \\( 800 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 농도 범위에서 \\( 540 \\mathrm{~nm} \\) 흡광도를 측정하였다.", "</p><p>세포독성 실험은 mitochondrial dehydrogenase activity의 index를 나타내는 MTT colorimetric reduction assay 법으로 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 분석하였다.", "96-well microtiter plate (Nunc, Vangaard, Neptune, NJ)에 RAW 264.7 macrophage를 \\( 1 \\times 10^{5} \\) cells/well의 농도로 분주하였다.", "분주 24시간 후 각 시료가 함유되어 있는 배지를 \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\) 씩 넣어 48시간 동안 배양하였다.", "Plate에 \\( 2 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}\\) 3-(4,5- dimethylth-iazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma) 용액을 \\( 20 \\mu \\mathrm{l} \\) 씩 첨가하여 4 시간 동안 배양시키고 formazan을 형성시키 후 조심스럽게 상등액을 제거하였다.", "DMSO \\( 150 \\mu \\mathrm{l} \\)을 첨가하여 formazan을 녹인 후 \\( 570 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "</p><h2>혈전분해능 측정</h2><p>혈전용해 활성의 측정에 있어서는 Astrup와 Hullertz의 방법을 변형하여 사용하였다. \\", "(0.4\\%\\) Fibrinogen (Sigma)을 sodium borate buffer ( \\( 10 \\mathrm{mM} \\) sodium borate, \\( 160 \\mathrm{mM} \\) boric acid, \\( 40 \\mathrm{mM} \\mathrm{NaCl} \\).", "Merk)에 녹인 다음 직경 \\( 87 \\times 10 \\mathrm{~mm} \\) petridish에 \\( 10 \\mathrm{ml} \\)을 넣은 후 thrombin (\\(1,000 \\mathrm{unit}/\\mathrm{ml}\\) Sigma) \\( 20 \\mathrm{unit}\\)를 첨가하여 실온에 30분간 방치하여 응고시켰다.", "응고된 fibrin plate 에 각 시료를 적당량 점적하여 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였으며, 활성의 세기를 측정하기 위하여 혈전분해효소 plasmin과 비교 후 \\(\\mathrm{unit}\\)로 환산하여 단위를 정하였다.", "</p><h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase -like activity: SODA) 측정</h2><p>추출물의 SOD 유사활성은 Marklund 와 Marklund의 방법에 따라 과산화수소 \\( \\left(\\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}_{2}\\right) \\) 로 전환시키는 반응을 촉매하는 pylogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다.", "시료를 농도별로 희석하여, 시료 \\( 10 \\mu \\mathrm{l} \\) 에 \\( \\mathrm{pH} 8.5\\)로 보정한 Tris-\\(\\mathrm{HCl}\\) buffer (\\( 50 \\mathrm{mM} \\) tris [hydroxymethyl] amino-methane, \\( 10 \\mathrm{mM} \\) EDTA, \\( \\mathrm{pH} 8.5\\)) \\(150 \\mu \\mathrm{l} \\) 와 \\( 7.2 \\mathrm{mM} \\) pyrogallol \\( 10 \\mu \\mathrm{l} \\) 를 첨가하여 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 10 분간 반응시킨 후 \\( 1 \\mathrm{~N} \\mathrm{~HCl}\\) \\(50 \\mu \\mathrm{l} \\)를 가하여 반응을 정지 시켰다.", "반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 ELISA reader를 사용하여 \\( 420 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "SOD 유사활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(\\(\\%\\))로 나타내었다.", "</p><p>SODA(\\(\\%)=\\left(1-\\frac{A}{B}\\right) \\times 100 \\)</p><p>\\( \\mathrm{A} \\) : 시료 첨가구의 흡광도, \\( \\mathrm{B} \\) : 시료 무첨가구의 흡광도</p> <h2>Xanthine Oxidase 억제 활성</h2><p>Xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide radials 소거활성은 NBT (nitro-blue tetrazolium) 환원법을 사용하여 검정하였다.", "즉, \\( 0.8 \\mathrm{mM} \\) xanthine을 포함하는 \\( 0.1 \\mathrm{mM} \\) phos-phate buffer ( \\(\\mathrm{pH} 8.0\\)) \\( 0.5 \\mathrm{ml} \\) 와 \\( 0.48 \\mathrm{mM} \\) NBT를 포함하는 \\( 0.1 \\mathrm{mM} \\) phosphate buffer \\( (\\mathrm{pH}8.0 \\) )에 시료를 농도별로 각각 처리하여 혼합한 후, \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 5 분간 incubation 하였다.", "반응물에 xanthine oxidase \\( (0.049 \\mathrm{U} / \\mathrm{ml}) \\) 을 \\( 1.0 \\mathrm{ml} \\) 을 가하여 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 20 분간 incubation시켰다.", "그 후, \\( 69 \\mathrm{mM}\\)SDS를 \\( 2.0 \\mathrm{ml} \\) 을 첨가하여 반응을 정지 시킨 후 \\( 560 \\mathrm{~nm} \\) 흡광도에서 측정하였다.", "농도별 시료에 따른 NBT 환원에 대한 저해능은 다음과 같은 식으로 계산하였다.", "</p><p>XO inhibition \\( (\\%)=\\frac{C-S}{C-B} \\times 100 \\)</p><p>B (blank): \\( 0.8 \\mathrm{mM} \\) xanthine 포함한 \\( 0.1 \\mathrm{mM} \\) buffer \\( (\\mathrm{pH} 8.0\\) )와 \\( 69 \\mathrm{mM} \\) SDS만 첨가한 반응액 흡광도</p><p>C (control): 시료대신 \\( 0.48 \\mathrm{mM}\\) NBT를 첨가한 반응액 흡광도</p><p>S (Sample): 시료 첨가한 반응액 흡광도</p><h2>ACE(Angiotensin I -Converting Enzyme) 저해능 측정</h2><p>ACE저해 활성은 Cushman 등의 방법에 따라 측정하였으며, 조효소액은 rabbit lung acetone powder (Sigma, USA)를 \\( 0.3 \\mathrm{M} \\mathrm{~NaCl} \\) 을 함유한 \\( 0.1 \\mathrm{M} \\) sodium borate buffer \\( (\\mathrm{pH} 8.3\\)) 에 \\( 1 \\mathrm{~g} / \\mathrm{ml}\\)(\\(\\mathrm{w} / \\mathrm{v}) \\) 의 농도로 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 24 시간 추출한 후, \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\), \\( 4,000 \\mathrm{rpm} \\) 에서 40 분간 원심 분리하여 상등액을 ACE 조효소액으로 사용하였다.", "기질은 \\( 0.3 \\mathrm{M} \\mathrm{~NaCl} \\) 이 함유된 \\( 0.1 \\mathrm{M} \\) sodium borate buffer \\( (\\mathrm{pH} 8.3\\))에 HHL (hippuryl- histidyl-leucine)을 \\( 5 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}\\) \\((\\mathrm{w} / \\mathrm{v}) \\) 의 농도로 녹인 후 기질로 사용하였다.", "ACE저해활성은 시료 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\)에 ACE 조효소액 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\)를 가한 다음 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 5 분간 예비반응 시킨 후, 기질 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\) 을 가한 후 다시 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 1 시간 반응 시켰다. \\", "( 1 \\mathrm{N} \\mathrm{~HCl} \\) \\(150 \\mu \\mathrm{l} \\) 로 반응을 정지시키고 ethyl acetate \\( 750 \\mu \\mathrm{l} \\) 가한 후, 1 분간 교반하고 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(5,000 \\mathrm{rpm} \\) 에서 10 분간 원심 분리 한 후 상등액 \\( 500 \\mu \\mathrm{l} \\) 를 얻었다.", "이상등액을 \\( 120^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 30 분간 완전히 건조시켜 \\( \\mathrm{MeOH}\\) \\(2 \\mathrm{ml} \\) 을 넣은 후 \\( 228 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "대조구로서는 시료 대신 시료용매 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\) 를 가해 실험 하였으며, ACE 저해 활성효과는 다음 계산식을 이용하여 실험하였다.", "</p><p>ACE inhibition \\( (\\%)=(C-S / C-B) \\times 100 \\)</p><p>S: Sample absorbance.", "C: Control absorbance.", "B: Blank absorbance</p><h2>HPLC 분석</h2><p>Flavonoid glycoside 분석을 위한 표준용액 \\( (1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}) \\) Quercetin, Kaemferol, Myricetin, Apigenine, Luteolin, Rutin을 메탄올에 용해시켜 사용하였고, 시료 \\( (10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}) \\)는 메탄올에 용해", "한 후 Sea-pak C18 cartridge와 \\( 0.2 \\mu \\mathrm{m} \\) filter로 여과하여 HPLC 분석용 시료로 사용하였다.", "분석용 column은 Octadecylsilane (ODS) C18 \\( (4.6 \\times 25 \\mathrm{~cm}\\), \\(5 \\mu \\mathrm{m}) \\)을 사용하였고, 용매는 \\( \\mathrm{MeOH} / \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O} / \\)Acetic acid \\( (5 / 93 / 2\\), \\(\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\)와 \\( 60 \\% \\mathrm{~MeOH} \\) 를 사용하여 linear gradient해서 55분간 용출 시킨 후 15 분간은 \\( 60 \\% \\mathrm{~MeOH} \\) 로서 용출하였다.", "Total flow rate은 \\( 1 \\mathrm{ml} / \\mathrm{min} \\) 로 하였고, detector는 UV \\( 370 \\mathrm{~nm} \\) 에서, column temp.", "oven은 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 로 하여 Shimadzu LC-10AD으로 분석하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>시료 채취 및 발효</h2><p>본 실험에 사용된 실험 재료는 증류수 \\(10 \\mathrm{~l}\\)에 산야(민들레 \\( 40 \\mathrm{~g} \\), 연자육 \\( 40 \\mathrm{~g} \\), 솔잎 \\( 30 \\mathrm{~g} \\), 참나리 \\( 30 \\mathrm{~g} \\), 애쑥 \\( 30 \\mathrm{~g} \\), 질경이 \\( 30 \\mathrm{~g} \\), 뽕열매 \\( 40 \\mathrm{~g} \\), 감초 \\( 24 \\mathrm{~g} \\), 도라지 \\( 9 \\mathrm{~g} \\), 쇠비름 \\( 9 \\mathrm{~g} \\), 자소엽 \\( 9 \\mathrm{~g} \\), 박하 \\( 36 \\mathrm{~g} \\), 금불초 \\( 9 \\mathrm{~g} \\), 오가피 \\( 18 \\mathrm{~g} \\), 참마 \\( 15 \\mathrm{~g} \\), 연뿌리 \\( 18 \\mathrm{~g} \\), 두충 \\( 30 \\mathrm{~g} \\), 둥글레 \\( 200 \\mathrm{~g} \\), 녹차잎 \\( 100 \\mathrm{~g}\\)) 와 다시마 (\\( 100 \\mathrm{g} \\)) 및 미네랄 수(해양성심층수, \\( 0.5 \\% \\))는 부재료로 첨가하여 당의 농도가 50.0~60.0 \\(\\mathrm{Brix}\\)가 되도록 설탕시럽을 넣은 후 발효시켰다.", "약 6개월 동안 발효 시킨 후 산야 발효액의 \\( \\mathrm{pH} 5.2 \\) 였고, 시료로 사용하기 위해 발효액은 여과하였으며 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 냉장 보관하였다.", "</p><h2>전자공여능(Electron donation ability: EDA) 측정</h2><p>전자공여능 측정은 Blois의 방법에 따라서 각 시료의 DPPH (1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다.", "시료를 농도별로 희석하여 시료 \\( 40 \\mu \\mathrm{l} \\) 와 \\( 1.5 \\mathrm{mM} \\) DPPH용액 \\( 160 \\mu \\mathrm{l} \\) 를 섞은 후, \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 30분 동안 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하여 \\( 520 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하였다.", "전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 EDA \\((\\%)=( \\) 대조구흡광도\\(-\\)시료첨가구흡광도) / 대조구흡광도\\(\\times 100\\)으로 계산하였다.", "시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 흡광도차를 비교하여 프리라디칼의 제거활성을 백분율로 나타내었다.", "</p><h2>세포배양</h2><p>마우스대식세포주인 RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA.", "USA)에서 구입하였으며, 세포배양에 사용된 배지인 RPMI 1640 medium (Eagle's MEM)과 fetal bovine serum (FBS), Hank's balanced salt solution (HBSS) 등은 모두 Hyclone (Logan, UT, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다", "RAW264.7 세포주는 \\( 10 \\% \\) FBS와 100 \\(\\mathrm{unit}\\)의 penicillin과 streptomycin이 함유된 RPMI 1640 media를 사용하여 \\( 5 \\% \\) 의 이산화탄소를 포함한 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 의 포화습도 공기조건하에서 배양하였다.", "</p> <h2>대식세포에서의 Nitric oxide 생성능 측정</h2><p>대식세포를 이용하여 Nitric oxide \\(\\mathrm{NO}\\) 생성능을 확인한 결과를 Fig.", "2에 나타내었다. \\", "(\\mathrm{NO}\\)는 면역 세포에서 NOS (nitricoxide syntase)에 의해 생성되는데 다량으로 외부의 자극에 의해 유전자 수준에서 발현되고 주로 침입한 미생물이나 종양 세포에 대해 독성을 갖는 방어 물질로서 작용하는 것으로 알려져 있다.", "또한, 최근에는 \\(\\mathrm{NO}\\)가 세포 활성화 물질 및 reactive oxygen intermediates (ROI)에 의해 유발된 세포 독성을 최소화 시키는 역할이 밝혀짐으로 이 분야에 대해서 활발히 연구되고 있다.", "이에 본 실험에서는 시료를 대식세포에 투여하여 \\(\\mathrm{NO}\\)의 생성능을 확인하였다.", "결과에서도 확인할 수 있는 것처럼 대식세포가 생성하는 \\(\\mathrm{NO}\\)량 \\( 2 \\mu \\mathrm{m} \\) 보다 발효액의 첨가로 인해 \\( 22.0 \\mu \\mathrm{m} \\) 의 높은 \\(\\mathrm{NO}\\) 생성능을 나타내었다.", "이로써, 산야가 면역활성과 관련하여 활용 가능성이 있으며 전통발효를 통해 높은 면역활성의 증진이 있음을 확인할 수 있었다.", "지금까지의 연구는 주로 침입한 미생물이나 종양세포가 분비하는 독성물질로 유발되는 \\(\\mathrm{NO}\\) 생성을 저해하는 효능에 대해 조사해 왔으며, 방어 물질로 또는 독성을 최소화시킬 수 있는 물질로써의 \\(\\mathrm{NO}\\) 생성 활성에 대한 연구는 거의 없는 것으로 판단된다.", "</p><h2>\\(\\mathrm{NO}\\) Assay 및 cell viability</h2><p>대장균 Bacterial lipopolysaccharide (LPS)를 대식세포에 처리하여 \\(\\mathrm{NO}\\)를 유도시킨 다음 산야 발효액을 대식세포에 처리하여 \\(\\mathrm{NO}\\) 활성에 미치는 영향을 조사하였다.", "그 결과, LPS에 의하여 유도된 대식세포의 \\(\\mathrm{NO}\\) 합성은 산야 발효액을 농도별로 첨가하였을 때 점차 감소하였다.", "발효액의 첨가로 \\( 56 \\% \\) 의 \\(\\mathrm{NO}\\) 생성 저해능을 나타났으며, 이러한 결과는 산야로 부터의 성분들이 면역기능과 밀접한 관계가 있음을 보여주는 것이다. \\", "(\\mathrm{NO}\\)는 L-arginine의 guanidino nitrogen으로부터 nitric oxide synthase (NOS)에 의하여 생성되며, \\(\\mathrm{NO}\\)는 분비조직과 세포의 기능에 영향을 미치며, 세포성 면역계의 주된 역할의 하나로 세포 독성이나 성장 억제 작용을한다. \\", "(\\mathrm{NO}\\)는 대부분의 포유류 동물의 세포내에서 생성되고 신경계에서는 화학적 신호 전달 물질로서, 혈관계에서는 혈압 조절과 혈소판의 응집 및 호중성구의 집합 작용을, 골격근에서는 대사와 근 수축 조절 등 생리학적으로 중요한 역할을한다. \\", "(\\mathrm{NO}\\)가 발현하는 기능의 다양성은 농도 및 표적세포의 활성화여부에 따라 달라진다고 알려져 있다.", "대식세포가 pathogen에 의하여 활성화되면 \\(\\mathrm{NO}\\) 뿐만 아니라 superoxide anion을 호흡과정에 의하여 대량생산되는데, \\(\\mathrm{NO}\\) 자신은 매우 약한 산화성을 가진 라디칼로서 vitamin E와 비슷하게 세포의 지질과산화물을 막는 항산화 기능도 수행한다는 보고도 있다.", "최근 염증반응을 완화시키는데 있어서도 종래에 사용되어온 \\(\\mathrm{NO}\\)를 소거하는 방식보다는 superoxide anion의 생성을 저해 하거나 NADPH oxidase의 활성을 감소시키는 방법이 더욱 비중 있게 다루어지고 있다.", "</p><p>LPS에 의한 산야 성분의 \\(\\mathrm{NO}\\) 합성 저해효과 또한 연구되어 왔는데 Seo 등은 \\( 50 \\% \\) 이상의 \\(\\mathrm{NO}\\) 생성 저해능을 \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\) \\( \\mathrm{ml} \\)의 봉선화, 금불초, 산옥잠화, 모시풀등과 같은 약초의 메틸 추출물에서 보고하였다.", "이는 본 연구에서 이용된 시료보다 높은 \\(\\mathrm{NO}\\) 합성 저해율을 나타내고 있다.", "Ahn 등은 도라지의 \\(\\mathrm{NO}\\) 합성 저해율을 보고하였는데, 우수한 \\(\\mathrm{NO}\\) 합성 저해율로 차세대 염증질환 치료제와 예방약으로 활용할 수 있을 것으로 판단하고 있다.", "이는 역시 본 연구에서 분석된 산야의 활용도를 대변하고 있다.", "</p><p>발효액 시료에 대한 세포활성은 MTT 분석을 통해서 측정하였다.", "그 결과 시료로 처리된 대식세포의 세포생존율이 \\( 90 \\% \\)정도를 나타내는 바 본 연구에서 사용된 시료에 대한 세포독성은 없는 것으로 관찰되었다.", "또한, 실험결과에 나타난 \\(\\mathrm{NO}\\)의 생성량의 변화가 세포독성에 의한 영향과는 무관함을 확인할 수 있었다.", "</p> <h1>서론</h1><p>지금까지의 약용식물 및 약재에 대한 연구는 주로 유기용매로 특정성분을 추출하여 여러 가지 생리활성을 가지는 물질 탐색에 대한 연구와 효능이 우수하고 안전한 약물개발에 대한 연구로 수행되어 왔다.", "또한 대체의약으로 천연물질에 대한 관심이 높아지면서 약용식물에 대한 과학적인 연구와 천연 의약품 개발에 더욱 많은 연구를 수행하고 있다.", "이는 최근 생활수준의 향상으로 평균수명의 연장과 건강에 대한 관심이 높아지면서 그리고, 식습관에 기인하는 여러 가지 만성질환의 증가로 인해 더욱 더 항산화, 항암, 면역증진 및 혈행개선 등의 생리활성을 갖는 약용식물에 대한 연구가 진행되게 되었다.", "특히, 건강음료 개발에 약용식물을 활용하고자 해 왔는데, 현재 시판되고 있는 건강음료의 종류는 섬유소를 주로한 변비예방과 정장작용을 돕는 것이거나 체중조절을 위한것, 체내수분과 전해질공급을 위한 것이 대부분이며, 그 외 건강 보양을 위한 것 등이 개발되고 있다.", "아직은 약용식물을 이용한 음료개발에 관한 연구가 일부 영역만을 다루고 있어 건강기능성 음료로 활용하기 위해서는 앞으로 다각적인 연구가 요구된다.", "</p><p>이에 약용식물이 함유하고 있는 여러 가지 효소들을 활성화시켜 다양한 생화학반응을 일으킴으로 해서 식물체의 성분들이 소화·흡수되기 쉬운 형태로 전환될 수 있게 하여 새로운 생리기능을 하는 물질로 변화시키거나 유용성분이 증가한 음료를 개발하는 것이 부각되고 있다.", "효소를 이용한 식품개발로는 미생물의 활동으로 유기화합물이 분해되면서 알코올, 유기산, 탄산가스 등 분해산물을 생성하는 발효의 과정이 있다.", "이는 오래전부터 이용되어 왔는데, 과실 전통발효의 경우가 해당된다.", "주로 발효성 당이 다량 함유되어있는 과실을 발효시켜 술로 많이 이용되어 왔는데, 탄수화물원이 부족할 경우에는 발효원료에 설탕, 전분 등 탄수화물원을 첨가하여 발효해왔다.", "최근 들어 식품의 발효를 통해 생성되는 유기산 및 분해산물들이 건강에 좋다는 연구 결과 등이 발표되면서 발효 식품의 인기는 점점 높아지고 있는 실정이다.", "또한, 최근의 정제가공식품은 제조과정에서 효소들이 대부분 파괴되며, 특히 식품보존제로 첨가되는 화학성분들은 효소활성을 약화시키는 작용을 하므로 더욱 더 발효식품에 대한 관심이 고조되고 있다.", "</p><p>본 연구에서는 한약방에서 유통되고 있는 약재들의 농약 및 약초의 독성문제 등을 극복하고, 면역기능 증진 및 혈행개선 효과가 현저한 다기능성 음료를 개발하기 위한 방안으로 19가지의 산야초를 발효시킨 후 발효음료의 항산화작용, 면역기능, 혈전분해력, ACE 활성억제 등의 생리활성을 연구하였다.", "</p> <h2>혈전분해능 측정</h2><p>혈전은 혈관손상으로 혈액이 유출될 때 합성되는 섬유성 단백질인 피브린으로 알려져 있다.", "이들 피브린은 그대로 두면 다시 용해되는데 이는 혈장 속에 있는 플라스미노겐이 활성화하여 plasmin이 되어 피브린을 분해시키기 때문이다.", "하지만 어떤 장애로 인한 불균형으로 인하여 혈전이 분해되지 않고 응집되어 혈관에 축적됨으로서 혈전증을 야기시킨다.", "이에 본 연구에서는 산야의 혈전분해능을 조사하고자 하였으며, 그 결과 산야 발효액에서 혈전분해능이 나타났다.", "특히, 산야 열수 추출물과 positive control인 plasmin을 비교 분석용으로 사용하였는데, plasmin \\( 1 \\mu \\mathrm{g} \\)과 산야 열수 추출물 \\( 10 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)의 혈전분해능과 비교실험을 실시한 결과 산야 발효액에서 높은 혈전분해능을 나타냈다.", "발효액의 혈전분해능은 체온과 유사한 온도인 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 2시간 반응 후 확인되고 있는데, 이는 plasmin보다 더 효율적으로 보인다.", "이에 반해 추출물에서는 혈전분해능을 보이지 않고 있어 산야 발효액의 혈전분해능은 발효 중 생성된 균주들의 혈전분해능으로 사료된다.", "지금까지의 보고에 의하면 된장으로부터 분리된 Bacillus 속 KDO-13, 치즈로부터 분리된 B. amyloliquefaciens DC-4 , 흑두로 제조한 청국에서 분리된 B. subtilis BB-1 , 멸치액젓으로부터 분리된 B. subtilis JM-3 , 청국장으로부터 분리된 B. subtilis KCK-7등이 혈전분해능이 우수한 것으로 알려져 있다.", "</p><h2>SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity: SODA) 측정</h2><p>Superoxide dismutase (SOD)는 항산화 효소로서 세포에 유해한 oxygen radical을 과산화수소 전환시키고 다시 catalase에 의하여 무해한 물 분자와 산소분자로 전환시켜 활성산소로부터 생체를 보호하는 기능으로 알려져 있다.", "SOD는 분자량이 비교적 큰 단백질로서 열이나 알칼리에 약하여 이러한 단점을 보완할 수 있는 저분자물질로 체내에서 역할이 유사한 SOD 유사활성 물질에 대한 연구가 진행되고 있다.", "</p><p>본 연구에서 산야 발효액의 SOD 유사활성은 최고농도에서 \\( 42.2 \\% \\) 의 활성을 보였으며 SOD 활성은 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하였다.", "대조구인 Vit.", "C의 경우 농도 \\( 0.1 \\% \\) 일 때 \\( 77.3 \\% \\) 로 보고되어 있는데, 산야 발효액과의 비교결과에 따르면 대조구 보다 낮은 SOD 유사활성을 나타내고있다.", "하지만, 이러한 결과는 비교적 항산화력이 높은 과일로 알려진 브로콜리, 딸기 착즙액의 SOD 유사활성 (\\( 41.4 \\%\\), \\(30 \\% \\))보다 약간 높은 SOD 유사활성을 나타낸다.", "</p><h2>Xanthine oxidase 저해 활성</h2><p>Xanthine oxidase는 purine 대사에 관여하는 효소로서 xanthine 또는 hypoxanthine의 산소를 때어내면서 과산화수소 (\\( \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}_{2} \\))를 생성하게 되고, 나머지 골격이 uric acid를 형성하여 혈장 내에 과량 존재하게 되면 골절에 축적되어 심한 통증을 유발하는 통풍과 신장에 침착되어 신장질환을 일으키는 효소로 알려져 있다.", "Xanthine oxidase 저해활성 측정은 일종의 항산화 능을 측정하는 방법으로 본 실험에서는 대조구로 catechin을 사용하였으며 산야 발효액과 농도별로 비교하였다.", "Xanthine oxidase저해 활성 측정 결과 농도가 증가할수록 저해활성이 증가하였으며, 대조구인 catechin과 비교한 결과 \\(1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)에서 \\( 79.8 \\% \\)인 반면, 100 배 희석한 산야 발효액은 \\( 75.6 \\% \\)로 높게 나타났다.", "Catechin은 polyphenol계 항산화 물질로써 식물성 대사산물로 알려져 있으며 항산화효과가 비타민 E에 비해 무려 50배나 되고, 비타민 C에 비해 100배에 달하기 때문에, 체내의 활성산소를 제거하는 효과가 매우 탁월하다고 알려져 있다.", "특히, 산야 발효액의 XOase 저해효과는 catechin의 효과보다 높은 결과를 나타내고 있어 본 연구의 산야 발효액이 우수한 항산화 소재로 개발될 수 있을 것으로 기대된다.", "</p><h2>ACE 저해작용</h2><p>ACE는 renin에 의하여 생성된 angiotensin Ⅰ으로부터 C-말단 dipeptide (His-Leu)를 가수분해 시킴으로서 강력한 혈관 수축작용을 나타내는 angiotensin Ⅱ를 생성하여 고혈압의 원인이 되고 있다.", "Angiotensin Ⅱ는 혈관을 수축시키는 작용을 하고, 부신에서 aldosterone의 분비를 촉진시켜 체내 수분 보유량을 많게 하여 결과적으로 혈압을 상승시키는 작용을 한다.", "ACE의 작용이 계속 지속화 될 경우 고혈압이 지속되어 혈관벽이 약화되어 터지게 되거나, 뇌졸중 등의 여러 질환을 유발시킬 수 있다.", "이러한 ACE의 활성 저해인자로는 저분자 peptide들과 그 유도체들, 녹차에 존재하는 catechin과 메밀의 rutin과 같은 polyphenol 성분들이 대표적으로 알려져 있다.", "이러한 ACE의 작용을 억제하기 위한 활성이 산야에 있는 지 알아보기 위해 실험을 한 결과, 산야 발효액에서 높은 활성을 나타내었다.", "대조구로 현재 시판되고 있는 항고혈압제인 captopril을 사용하였으며, captopril \\( 10 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 에서 \\(93.0\\%\\)의 저해 활성을 보였는데 10 배 희석한 산야 발효액에서 \\( 73.5 \\% \\)의 저해 활성을 보였다.", "이러한 결과는 고혈압 예방 효능이 높은 기능성 식품인 유색감자 보다 뛰어난 효능을 나타내고있다.", "따라서 본 연구에서 개발된 산야 발효액은 고혈압 예방 기능성 음료로서 이용가능성이 높은 것으로 사료된다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>DPPH에 의한 항산화 활성</h2><p>인체내의 free radical은 지질, 단백질등과 반응하여 생체의 노화를 촉진할 수 있는 물질로, 이러한 free radical를 제거할수 있는 천연물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.", "특히 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical 소거법은 항산화물질의 전자공여능을 이용한 항산화 측정법으로써 주로 pheonlic 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용되는 방법이다.", "본 연구에서 산야 발효액의 항산화 효과를 DPPH radical 제거 정도를 측정하여 전자공여능으로 나타낸 결과 발효 원액에서 \\(94.3\\%\\)로 나타났다", "(Fig. 1).", "일반적으로 이용되는 positive control인 BHA \\( 0.1 \\% \\) 에서 항산화 활성이 \\( 96.2 \\% \\) 로 나타나고 있어서 이와 비슷한 수준으로 보이고 있는 산야 발효액은 상당히 높은 항산화 활성을 나타내고 있어 그 이용가치가 높음을 시사하고 있다.", "특히, 발효액에서 더 높은 항산화능을 보이고 있는데 이는 발효중 미생물들의 작용을 통해서 생성된 새로운 활성 성분에 기인하는 것으로 판단된다.", "</p><p>Moon, Yoo, Kwak, Yen등의 보고에 의하면 감초, 녹차, 박하, 솔잎의 추출물의 활성이 높은 것으로 나타나 본 연구의 시료인 산야 발효액은 항산화 활성과 관련된 물질이 많을 것이라 사료된다.", "특히, 활성산소와 쉽게 반응하는 물질로는 flavone 및 flavonol 같은 페놀성 화합물을 들 수 있는데 각 생약재에 함유되어 있는 이들 페놀성 화합물 및 플라보이드류가 항산화 활성을 나타내는 물질로 추정된다.", "</p><h2>플라보노이드 함량 분석</h2><p>지금까지의 보고에 의하면 항산화능과 플라보노이드의 함량에는 비례적인 연관성이 있다고 알려져 왔다.", "이에 본 연구에서는 항산화능이 우수한 산야 발효액에 대한 플라보노이드 함량을 HPLC로 정량 분석하였다", "(Table 1).", "Quercetin은 산야 발효액에서 \\( 87 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{g} \\)의 함량을 보였지만, Kaemferol와 myricetin은 관찰되지 않았다.", "Apigenine의 함량 분석과정에서 산야 발효액의 결과 \\( 484 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{g} \\)으로 높은 함량을 나타내었다.", "Luteolin의 경우에서도 \\( 222 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{g} \\)으로 높은 함량이 관찰되었다.", "대표적인 플라보노이드계 물질인 Rutin은 \\( 3,853 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{g} \\)으로 횔씬 높은 함량을 보이고 있는데, 이로써 총 플라보노이드의 함량은 산야 발효액에서 \\( 4,646 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{g} \\)으로, 이는 Fig.", "1 에서 보이는 높은 라디칼 소거능과 일치한다.", "따라서, 자연에 존재하는 대부분의 플라보노이드가 나타내는 항산화능은 라디칼의 소거능이 큰 것에서 찾아 볼 수 있다고 생각할 수 있다.", "이러한 결과는 Kang이 감귤껍질에서 플라보노이드를 분리 추출하여 실시한 산화억제능에서도 동일한 결과를 나타낸바 있다.", "Kim 등이 대두에서 각종 용매를 이용하여 플라보노이드를 추출하여 실험한 항산화능에서도 동일한 결과를 나타내었으며 붉나무 순차용매 추출물의 항산화 효과를 비교한 Lee 등의 연구결과에서도 이러한 사실을 입증한 바 있다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Development of Functional Beverage (SanYa) from Fermented Medical Plants and Evaluation of Its Physiological Activities", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-e78d8d9d-85de-421b-8efb-20008079cb78", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", "doc_author": [ "Eun Kyung Cho", "Hyo Ju Song", "Hea Eun Cho", "In Soon Choi", "Young 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5,431	<h1>요 약</h1><p>톳 및 모자반 에탄올 및 물 추출물의 아질산염 소거효과를 검토한 결과, 톳 및 모자반 에탄올 추출물의 경우는 모두 강산성 조건하에서 시료농도가 증가할수록 소거효과도 증가하는 것으로 나타났으며, 그 소거효과는 톳이 모자반보다 약간 우수하였다. 그리고 \( \mathrm{pH} \) 변화에 따른 아질산염의 소거효과에 있어서는 톳 및 모자반 모두 강산성 조건하에서는 시료농도가 증가할수록 우수한 것으로 나타났으나 \( \mathrm{pH} \) 가 중성 부근에서는 소거효과가 떨어지는 것으로 나타났다. 또한 강산성 조건 하에서 반응시간이 경과함에 따라 시료농도가 증가할수록 그 소거효과는 우수하였다. 한편 톳 및 모자반 물 추출물에 대한 아질산염의 소거효과는 \( \mathrm{pH}1.2 \) 강산성 조건 하에서 도든 구가 시료농도 증가에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 또한 \( \mathrm{pH} \) 변화 조건에 따른 소거효과는 \( \mathrm{pH}1.2 \) 산성조건에서는 소거율이 증가한 것으로 나타난 반면 \( \mathrm{pH} \) 가 4.2 및 6.0 조건에서는 강산성 조건보다 낮은 소거율을 나타내었다. 특히 \( \mathrm{pH}6.0 \) 중성부근의 조건에서는 그 소거효과가 아주 미약한 것으로 나타났다. 그리고 반응시간에 따른 아질산염의 소거효과는 시료농도가 증가함에 따라 그 소거효과도 증가한 것으로 나타났다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>톳 및 모자반 에탄올 추출물의 아질산염 소거효과</h2><p>톳 및 모자반의 에탄올 추출물에 대한 아질산염의 소거효과를 확인하기 위하여 추출물들을 각각 \( 25 \mathrm{mg}\), \(50 \mathrm{mg} \) 및 \( 100 \mathrm{mg} \) 첨가하여 \( \mathrm{pH} 1.2\) 강산성 조건하에서 1시간 반응시켜 조사하고 그 소거효과를 Table 1에 나타내었다. 톳 추출물의 경우는 시료량에 따라 \( 38.9 \sim 77.3\% \)의 소거효과를 나타내었으며, 시료농도가 증가할수록 아질산염의 소거효과도 증가하였다. 또한 모자반의 경우에 있어서는 \(51.5 \sim 64.2 \% \) 의 소거효과를 나타내어 시료농도 증가에 따른 소거효과 정도는 톳 만큼 뚜렷하지는 않았다. 그리고 시료농도 증가에 따른 아질산염 소거효과에 있어서는 모자반 보다는 톳이 약간 우수한 것으로 나타났다. Table 2는 톳 에탄올 추출물을 각각 \( 25 \mathrm{mg}\), \(50 \mathrm{mg} \) 및 \( 100 \mathrm{mg} \) 첨가하여 \( \mathrm{pH} \) 변화에 따른 아질산염 소거효과를 조사한 것으로 \( \mathrm{pH} 1.2\) 조건 하에서는 \( 38.9 \sim 77.3 \% \) 의 소거효과를 나타내었으며, \( \mathrm{pH}4.2 \) 조건에서는 \( 36.4 \sim 56.7 \% \) 로 나타났다. 또한 \( \mathrm{pH} 6.0\) 에서는 \( 4.8 \sim 6.6 \% \) 정도의 소거효과를 나타내어 \( \mathrm{pH} \) 가 높아짐에 따라 아질산염의 소거효과는 떨어지는 것으로 나타났으며, 강산성 조건 하에서는 시료농도 증가에 따른 소거효과도 뚜렷하였으나 \( \mathrm{pH} \) 증가와 더불어 시료농도의 증가에 따른 소거효과는 인정되지 않았다. 이는 아민류나 아질산과의 반응에 의해 생성되는 N-nitrosamine의 적합한 \( \mathrm{pH} \) 가 2.5~3.5의 산성영역이라기 볼때 톳의 산성조건 하에서의 아질산염 소거효과는 우수한 것으로 생각된다. 그러나 체내 홉수된 2급 아민 등은 장내에서 bacteria에 의해 \( \mathrm{pH} 6.5 \) 중성부근에서도 2급 아민의 니트로소화 반응을 촉진한다는 것을 미루어 볼때 톳의 에탄올 추출물의 중성부근에서의 아질산염 소거효과는 아주 미약한 것으로 나타났다. 그리고 톳 에탄올 추출물에 대한 \( \mathrm{pH} 1.2 \) 조건하에서 반응시간 경과에 따른 아질산염 소거효과를 조사하고 Fig. 1에 나타내었다. 여기서는 시료농도가 증가할수록 그리고 반응시간이 경과할수록 그 소거효과는 종가하는 것으로 나타났으며, 반응 3시간 후에는 \( 25 \mathrm{mg}\), \(50 \mathrm{mg} \) 및 \( 100 \mathrm{mg} \) 구에서 각각 \( 59.5 \%\), \(73.6 \% \) 및 \( 81.7 \% \) 의 소거효과를 나타내었다. 반면에 Table 2의 모자반 에탄올 추출물에 있어서는 \( \mathrm{pH}1.2 \) 조건에서는 \( 51.5 \sim 64.2 \% \) 로 나타났으며, \( \mathrm{pH} 4.2 \) 에서는 \( 26.8-42.6 \% \), \( \mathrm{pH} 6.0 \) 에서는 \( 5.1 \sim 11.7 \% \) 로 나타나 \( \mathrm{pH} \) 가 높을수록 아질산염의 소거율은 급격히 떨어지는 것으로 나타났다. 그러나 \( \mathrm{pH} \) 가 낮은 산성조건 영역에서는 시료량이 증가할수록 그 소거효과가 정도의 차이는 있으나 약간 높아지는 것으로 나타났다. 그리고 \( \mathrm{pH}1.2 \) 조건하에서 시간 경과에 따른 모자반 에탄올 추출물의 아질산염 소거효과에 있어서는 시료농도 증가에 따라 그러고 반응시간이 길어짐에 따라 아질산염의 소거율도 증가하여 반응 3시간 후에는 모든 구에서 \(63.8 \sim 78.8\%\)로 나타났다.</p> <h2>톳 및 모자반 물추출물의 아질산염 소거효과</h2><p>톳 및 모자반의 물 추출물에 대한 아질산염의 소거효과를 확인하고 그 결과를 Table 3에 나타내었다. 즉 추출물들을 각각 \( 25 \mathrm{mg}\), \(50 \mathrm{mg} \) 및 \( 100 \mathrm{mg} \) 첨가하고 \( \mathrm{pH} 1.2 \)조건에서 1 시간 반응시킨 후의 아질산염 소거효과는 톳에서는 \( 39.0 \%\), \(40.9 \% \) 및 \( 64.6 \% \) 로 나타났으며, 모자반의 경우는 \( 27.6 \%\), \(42.4 \% \) 및 \( 61.8 \% \) 로 나타나 전구가 시료농도 증가에 따른 소거효과는 증가하는 것으로 나타났으며, 두 시료간에 있어서의 소거효과도 비슷한 것으로 나타났다. Table 4 는 톳으로 부터 얻은 물 추출물의 아질산염 소거효과를 \( \mathrm{pH} \) 조건에 따라 나타낸 것으로 \( \mathrm{pH} 1.2 \) 조건에서는 시료증가에 따라 \( 30 \sim 64.6\% \) 를 나타냈으며, \( \mathrm{pH} 4.2\) 에서는 \(33.0 \sim 47.5 \%\) , \( \mathrm{pH} 6.0 \)에서는 \( 8.3 \sim 11.0 \% \) 를 나타내었다. 물 추출물의 경우에 있어서도 \( \mathrm{pH} \) 가 산성영역에서 시료농도가 증가 할수록 그 소거효과는 높아지는 것으로 나타났다. 그러나 앞의 에탄올 추출물에 비해서는 정도의 차이는 있으나 그 소거효과가 약간 떨어지는 것으로 나타났다. 그리고 반응시간 경과에 따른 톳 물 추출물의 아질산염 소거효과는 Fig. 3 과 같다. 여기서는 시료량에 따라서 반응 30분 경과시에는 \( 35.6 \sim 60.4 \% \) 의 소거효과를 나타내었으며, 반응 3 시간 후에는 \( 51.2 \sim 79.7\% \)를 나타내어 모든 구에서 반응시간이 경과됨에 따라 소거효과는 높아지는 것으로 나타났다. 한편 모자반 물 추출물의 경우에 있어서는 \( \mathrm{pH} 1.2 \) 강산성 조건에서는 \( 27.6 \sim 61.8 \% \) 의 소거효과를 나타냈으며, 시료량의 증가에 따라서 그 소거효과는 뚜렸하게 나타났다. 반면에 \( \mathrm{pH} \) 가 4.2 및 6.0 조건에서는 \( 6.0 \sim 24.2 \% \) 로 나타나 강산성 조건 보다는 떨어지는 것으로 나타났다(Table 4). 그리고 반응시간 경과에 따라서는 시료농도가 증가할수록 그 소거효과는 뚜렸하게 나타났는데 \( 25 \mathrm{mg}, 50 \mathrm{mg} \) 및 \( 100 \mathrm{mg} \) 첨가구에 있어 반응 30 분 경과 시에는 \( 25.4 \%\), \(40.4 \% \) 및 \( 58.5 \% \)의 소거율을 나타내었으나, 반응 3시간 후에는 \( 35.3 \%\), \(62.7 \% \) 및 \( 86.2 \% \) 로 시료증가에 따른 그 소거효과가 높은 것으로 나타났다(Fig. 4). 이는 야채 및 해조 추출물, 결명자 추출물, 유자 및 칡 추출물, 황백 추출물, 황련 및 황금 추출물, 녹즙 추출물에서 보고한 아질산염의 소거효과와 비교하여 볼 때 시료간에 정도의 차이는 있으나 \( \mathrm{pH} 1.2 \) 강산성 조건 하에서는 그 소거효과가 우수한 것으로 나타났다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>시료조제</h2><p>본 실험에 사용된 톳(Hizikia fusiforme)과 모자반(Sargas-sum fulvellum)은 건조한 것을 구입하여 분쇄한 다음 각각 \( 50 \mathrm{~g} \) 을 \( 70 \% \) ethanol을 가하여 약 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 6 시간 환류추출 한 뒤 상등액을 회수하여 \( 3,000 \mathrm{rpm} \)에서 10 분간 원심 분리한 다음 그 여액을 rotary vaccum evaporator를 이용하여 농축하고 이를 에탄올 추출물(E-Ex)로 하였다. 그리고 에탄올을 추출하고 난 잔사물에 다시 물을 가하고 에탄올 추출물과 동일한 방법으로 추출하고 이를 물 추출물(W-Ex)로 하였으며, 에탄올 및 물추출물의 두시료는 \( 90^{\circ} \mathrm{C} \) 정도에서 열풍건조 하여 분말로 만든 후 일정농도로 조제하여 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.</p><h2>아질산염 소거능의 측정</h2><p>아질산염의 소거능 측정은 Gray 등의 방법에 의하여 측정하였다. 즉 \( 2 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaNO} \) 수용액 \( 2 \mathrm{ml} \) 에 일정량의 시료를 가하여 \( 0.1 \mathrm{N} \mathrm{~HCl} \) 과 \( 0.2 \mathrm{M} \) 구연산 완충액으로 반응 용액의 \( \mathrm{pH} \) 를 각각 1.2, 4.2, 6.0으로 조절하여 총량을 \( 10 \mathrm{ml} \) 로 하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 일정기간 저장시킨 다음 이 용액 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 취하여 \( 2 \% \) 초산 \( 5 \mathrm{ml} \) 과 Griss시약 (\( 1 \% ~ \text{sulfanilic acid} : 1 \% ~ \text{napthylamine} = 1: 1 \) ) \( 0.4 \mathrm{ml} \)를 첨가하고 다시 15 분간 방치한 다음 \( 520 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 아래식에 의거 아질산염 소거율을 구하였다.</p><p>\( N(\%)=\left(1-\frac{a-c}{b}\right) \times 100 \)</p><p>\( \mathrm{N} \) : 아질산염 소거율 (\(\%\))</p><p>\(a : 2 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaNO}_{2} \) 용액에 시료를 첨가하여 일정시간 저장후에 측정한 흡광도</p><p>\(b : 2 \mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaNO}_{2} \) 단독 용액을 a와 동일 조건으로 측정한 흡광도</p><p>\(c:\) 시료의 흡광도</p> <h1>서 론</h1><p>식품산업의 발달과 더불어 식품의 기호성과 간편성 및 자연식품의 수명을 연장시킨 가공식품들이 다양하게 생산 보급되고 있다. 이러한 가공식품들에 있어서는 각종 첨가물들이 사용되고 있으며 이는 인체에 직 간접적으로 영향을 미치고 있다. 이 중 자연식품 및 가공식품에 있어 우리 인체에 영향을 미치는 물질 중 하나가 화학적 발암물질인 nitrosamine이다. 육제품이나 수산가공품 등에 발색제로 첨가되는 질산염이나 아질산염은 육의 발색 및 육색의 안정화 뿐만아니라 clostridium botulinum에 대한 정균작용, 육의 보수성 및 결착성 등을 개선하고, 풍미향상 및 지방산패를 억제시키는 효과가 있다. 그러나 이러한 아질산염은 dialkylamines과 함께 반응하여 강력한 발암물질인 dialkylnitrosamines을 생성한다 동물실험에 있어 흰쥐에서 N-nitrosodimethylamine(NDMA)이 간암을 유발하며, N-nitrosamine 화합물에 대한 동물실험 결과 햑 300 여종의 N-ritroso 화합물 중 약 \( 90 \% \) 이상이 암을 유발하는 것으로 보고되었다. 이러한 발암물질인 nitrosamine은 \( \mathrm{ppm} \) 수준의 낮은 농도에서도 암을 유발할 수 있고 생체외에서 흡수될 뿐만아니라 생체내에서 합성될 수 있기 때문이다. 사람은 위액 \( \mathrm{pH} \) 가 1~4 범위이므로 위 내에 이들 전구물질이 공존할 경우 인체내에서 N-nitrosamine을 생성할 가능성이 있다고 하였으며, 아민류나 아질산과의 반응에 적합한 \( \mathrm{pH} \) 를 2.5~3.5 범위라고 하였다. 또한 최적 \( \mathrm{pH} \)를 벗어나면 N-nitrosamine의 생성은 급격히 줄어들지만 가열이나 formaldehyde 및 장내세균과 같은 촉매인자가 존재할 경우 중성이나 알칼리 조건에서도 nitroso화 반응이 진행된다고 보고하고 있다. 그리고 체내에 흡수된 2급 아민 등이 뇨 중으로 배설되기 전에 장내에서 미생물에 의한 N-nitrosamine의 합성가능성을 암시하였고, bacteria에 의해 \( \mathrm{pH} \) 6.5의 중성부근에서도 2 급 아민의 nitroso화 반응을 촉진시키는 것을 확인하였다. 또한 궤양성 대장염, 만성 B형 간염 및 Helicobactor pylori에 의한 만성 위염 등의 만성적인 염증상태에서 분비되는 nitric oxide(\(\mathrm{NO}\))에 의해서 혹은 활성화된 macrophage에 의해 생성된다는 것이 보고되고 있다 . 설치류에 대한 동물실험에서 여러 종류의 nitrosamine이 간, 인두, 비강, 구강점막, 신장, 췌장, 방광, 폐, 갑상선, 위장, 림프조직, 신경계 등 여러 조직에서 암을 유발할 수 있는 것으로 밝혀지고 있다. 최근 연구결과에 의하면 이러한 N-nitroso compounds(NOC)에 대한 노출이 인체에서도 위암, 후두암, 인두암 및 방광암의 발생을 증가시키고, 특히 흡연 및 씹는 담배로 인한 구강 및 호흡기 종양의 발생과도 관련 된 것으로 보고되고 있다. 이와 같이 nitrosamine은 직접적인 발암물질로 작용하기 때문에 이의 생성억제를 위한 연구가 진행되고 있는데 주로 아질산염과 2 급 아민은 통한 위 내의 생합성을 억제하는 물질의 개발과 탐색이다. Kim 등은 야채 및 해조추출물, Kato 등은 melanoidins의 아질산염 소거작용을 보고하였다. 그리고 결명자 추출물, 유자 및 칡 추출물, 저령, 황백 추출물, 황금 및 황련 추출물 등의 한약재에 대한 아질산염의 소거효과에 대하여도 다수 보고되고 있으며, 그외 마늘에서 추출한 diallyl sulfide, 녹차와 그 추출물인 polyphenol 등 및 녹즙 추출물이 nitrosamine의 생성억제 효과가 있음이 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 최근에 와서 해조류의 탄수화물이 혈관 내 콜레스테롤 침착방지 및 장관운동을 원활하게 하고 중금속의 배출 등에 효과가 있고, 당류성분에 항암작용이 있다는 보고와 함께 그 가치가 인정되고 있는 해조류 중 갈조식물인 톳(Hizikia fusiforme)과 모자반(Sargassum fulvellum)에 대한 에탄올 및 물 추출물의 아질산염 소거작용을 검토하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1><p>톳 및 모자반 에탄올 및 물 추출물의 아질산염 소거효과를 검토한 결과, 톳 및 모자반 에탄올 추출물의 경우는 모두 강산성 조건하에서 시료농도가 증가할수록 소거효과도 증가하는 것으로 나타났으며, 그 소거효과는 톳이 모자반보다 약간 우수하였다.", "그리고 \\( \\mathrm{pH} \\) 변화에 따른 아질산염의 소거효과에 있어서는 톳 및 모자반 모두 강산성 조건하에서는 시료농도가 증가할수록 우수한 것으로 나타났으나 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 중성 부근에서는 소거효과가 떨어지는 것으로 나타났다.", "또한 강산성 조건 하에서 반응시간이 경과함에 따라 시료농도가 증가할수록 그 소거효과는 우수하였다.", "한편 톳 및 모자반 물 추출물에 대한 아질산염의 소거효과는 \\( \\mathrm{pH}1.2 \\) 강산성 조건 하에서 도든 구가 시료농도 증가에 따라 증가하는 것으로 나타났다.", "또한 \\( \\mathrm{pH} \\) 변화 조건에 따른 소거효과는 \\( \\mathrm{pH}1.2 \\) 산성조건에서는 소거율이 증가한 것으로 나타난 반면 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 4.2 및 6.0 조건에서는 강산성 조건보다 낮은 소거율을 나타내었다.", "특히 \\( \\mathrm{pH}6.0 \\) 중성부근의 조건에서는 그 소거효과가 아주 미약한 것으로 나타났다.", "그리고 반응시간에 따른 아질산염의 소거효과는 시료농도가 증가함에 따라 그 소거효과도 증가한 것으로 나타났다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>톳 및 모자반 에탄올 추출물의 아질산염 소거효과</h2><p>톳 및 모자반의 에탄올 추출물에 대한 아질산염의 소거효과를 확인하기 위하여 추출물들을 각각 \\( 25 \\mathrm{mg}\\), \\(50 \\mathrm{mg} \\) 및 \\( 100 \\mathrm{mg} \\) 첨가하여 \\( \\mathrm{pH} 1.2\\) 강산성 조건하에서 1시간 반응시켜 조사하고 그 소거효과를 Table 1에 나타내었다.", "톳 추출물의 경우는 시료량에 따라 \\( 38.9 \\sim 77.3\\% \\)의 소거효과를 나타내었으며, 시료농도가 증가할수록 아질산염의 소거효과도 증가하였다.", "또한 모자반의 경우에 있어서는 \\(51.5 \\sim 64.2 \\% \\) 의 소거효과를 나타내어 시료농도 증가에 따른 소거효과 정도는 톳 만큼 뚜렷하지는 않았다.", "그리고 시료농도 증가에 따른 아질산염 소거효과에 있어서는 모자반 보다는 톳이 약간 우수한 것으로 나타났다.", "Table 2는 톳 에탄올 추출물을 각각 \\( 25 \\mathrm{mg}\\), \\(50 \\mathrm{mg} \\) 및 \\( 100 \\mathrm{mg} \\) 첨가하여 \\( \\mathrm{pH} \\) 변화에 따른 아질산염 소거효과를 조사한 것으로 \\( \\mathrm{pH} 1.2\\) 조건 하에서는 \\( 38.9 \\sim 77.3 \\% \\) 의 소거효과를 나타내었으며, \\( \\mathrm{pH}4.2 \\) 조건에서는 \\( 36.4 \\sim 56.7 \\% \\) 로 나타났다.", "또한 \\( \\mathrm{pH} 6.0\\) 에서는 \\( 4.8 \\sim 6.6 \\% \\) 정도의 소거효과를 나타내어 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 높아짐에 따라 아질산염의 소거효과는 떨어지는 것으로 나타났으며, 강산성 조건 하에서는 시료농도 증가에 따른 소거효과도 뚜렷하였으나 \\( \\mathrm{pH} \\) 증가와 더불어 시료농도의 증가에 따른 소거효과는 인정되지 않았다.", "이는 아민류나 아질산과의 반응에 의해 생성되는 N-nitrosamine의 적합한 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 2.5~3.5의 산성영역이라기 볼때 톳의 산성조건 하에서의 아질산염 소거효과는 우수한 것으로 생각된다.", "그러나 체내 홉수된 2급 아민 등은 장내에서 bacteria에 의해 \\( \\mathrm{pH} 6.5 \\) 중성부근에서도 2급 아민의 니트로소화 반응을 촉진한다는 것을 미루어 볼때 톳의 에탄올 추출물의 중성부근에서의 아질산염 소거효과는 아주 미약한 것으로 나타났다.", "그리고 톳 에탄올 추출물에 대한 \\( \\mathrm{pH} 1.2 \\) 조건하에서 반응시간 경과에 따른 아질산염 소거효과를 조사하고 Fig.", "1에 나타내었다.", "여기서는 시료농도가 증가할수록 그리고 반응시간이 경과할수록 그 소거효과는 종가하는 것으로 나타났으며, 반응 3시간 후에는 \\( 25 \\mathrm{mg}\\), \\(50 \\mathrm{mg} \\) 및 \\( 100 \\mathrm{mg} \\) 구에서 각각 \\( 59.5 \\%\\), \\(73.6 \\% \\) 및 \\( 81.7 \\% \\) 의 소거효과를 나타내었다.", "반면에 Table 2의 모자반 에탄올 추출물에 있어서는 \\( \\mathrm{pH}1.2 \\) 조건에서는 \\( 51.5 \\sim 64.2 \\% \\) 로 나타났으며, \\( \\mathrm{pH} 4.2 \\) 에서는 \\( 26.8-42.6 \\% \\), \\( \\mathrm{pH} 6.0 \\) 에서는 \\( 5.1 \\sim 11.7 \\% \\) 로 나타나 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 높을수록 아질산염의 소거율은 급격히 떨어지는 것으로 나타났다.", "그러나 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 낮은 산성조건 영역에서는 시료량이 증가할수록 그 소거효과가 정도의 차이는 있으나 약간 높아지는 것으로 나타났다.", "그리고 \\( \\mathrm{pH}1.2 \\) 조건하에서 시간 경과에 따른 모자반 에탄올 추출물의 아질산염 소거효과에 있어서는 시료농도 증가에 따라 그러고 반응시간이 길어짐에 따라 아질산염의 소거율도 증가하여 반응 3시간 후에는 모든 구에서 \\(63.8 \\sim 78.8\\%\\)로 나타났다.", "</p> <h2>톳 및 모자반 물추출물의 아질산염 소거효과</h2><p>톳 및 모자반의 물 추출물에 대한 아질산염의 소거효과를 확인하고 그 결과를 Table 3에 나타내었다.", "즉 추출물들을 각각 \\( 25 \\mathrm{mg}\\), \\(50 \\mathrm{mg} \\) 및 \\( 100 \\mathrm{mg} \\) 첨가하고 \\( \\mathrm{pH} 1.2 \\)조건에서 1 시간 반응시킨 후의 아질산염 소거효과는 톳에서는 \\( 39.0 \\%\\), \\(40.9 \\% \\) 및 \\( 64.6 \\% \\) 로 나타났으며, 모자반의 경우는 \\( 27.6 \\%\\), \\(42.4 \\% \\) 및 \\( 61.8 \\% \\) 로 나타나 전구가 시료농도 증가에 따른 소거효과는 증가하는 것으로 나타났으며, 두 시료간에 있어서의 소거효과도 비슷한 것으로 나타났다.", "Table 4 는 톳으로 부터 얻은 물 추출물의 아질산염 소거효과를 \\( \\mathrm{pH} \\) 조건에 따라 나타낸 것으로 \\( \\mathrm{pH} 1.2 \\) 조건에서는 시료증가에 따라 \\( 30 \\sim 64.6\\% \\) 를 나타냈으며, \\( \\mathrm{pH} 4.2\\) 에서는 \\(33.0 \\sim 47.5 \\%\\) , \\( \\mathrm{pH} 6.0 \\)에서는 \\( 8.3 \\sim 11.0 \\% \\) 를 나타내었다.", "물 추출물의 경우에 있어서도 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 산성영역에서 시료농도가 증가 할수록 그 소거효과는 높아지는 것으로 나타났다.", "그러나 앞의 에탄올 추출물에 비해서는 정도의 차이는 있으나 그 소거효과가 약간 떨어지는 것으로 나타났다.", "그리고 반응시간 경과에 따른 톳 물 추출물의 아질산염 소거효과는 Fig.", "3 과 같다.", "여기서는 시료량에 따라서 반응 30분 경과시에는 \\( 35.6 \\sim 60.4 \\% \\) 의 소거효과를 나타내었으며, 반응 3 시간 후에는 \\( 51.2 \\sim 79.7\\% \\)를 나타내어 모든 구에서 반응시간이 경과됨에 따라 소거효과는 높아지는 것으로 나타났다.", "한편 모자반 물 추출물의 경우에 있어서는 \\( \\mathrm{pH} 1.2 \\) 강산성 조건에서는 \\( 27.6 \\sim 61.8 \\% \\) 의 소거효과를 나타냈으며, 시료량의 증가에 따라서 그 소거효과는 뚜렸하게 나타났다.", "반면에 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 4.2 및 6.0 조건에서는 \\( 6.0 \\sim 24.2 \\% \\) 로 나타나 강산성 조건 보다는 떨어지는 것으로 나타났다", "(Table 4).", "그리고 반응시간 경과에 따라서는 시료농도가 증가할수록 그 소거효과는 뚜렸하게 나타났는데 \\( 25 \\mathrm{mg}, 50 \\mathrm{mg} \\) 및 \\( 100 \\mathrm{mg} \\) 첨가구에 있어 반응 30 분 경과 시에는 \\( 25.4 \\%\\), \\(40.4 \\% \\) 및 \\( 58.5 \\% \\)의 소거율을 나타내었으나, 반응 3시간 후에는 \\( 35.3 \\%\\), \\(62.7 \\% \\) 및 \\( 86.2 \\% \\) 로 시료증가에 따른 그 소거효과가 높은 것으로 나타났다", "(Fig. 4).", "이는 야채 및 해조 추출물, 결명자 추출물, 유자 및 칡 추출물, 황백 추출물, 황련 및 황금 추출물, 녹즙 추출물에서 보고한 아질산염의 소거효과와 비교하여 볼 때 시료간에 정도의 차이는 있으나 \\( \\mathrm{pH} 1.2 \\) 강산성 조건 하에서는 그 소거효과가 우수한 것으로 나타났다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>시료조제</h2><p>본 실험에 사용된 톳(Hizikia fusiforme)과 모자반(Sargas-sum fulvellum)은 건조한 것을 구입하여 분쇄한 다음 각각 \\( 50 \\mathrm{~g} \\) 을 \\( 70 \\% \\) ethanol을 가하여 약 \\( 90^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 6 시간 환류추출 한 뒤 상등액을 회수하여 \\( 3,000 \\mathrm{rpm} \\)에서 10 분간 원심 분리한 다음 그 여액을 rotary vaccum evaporator를 이용하여 농축하고 이를 에탄올 추출물(E-Ex)로 하였다.", "그리고 에탄올을 추출하고 난 잔사물에 다시 물을 가하고 에탄올 추출물과 동일한 방법으로 추출하고 이를 물 추출물(W-Ex)로 하였으며, 에탄올 및 물추출물의 두시료는 \\( 90^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 정도에서 열풍건조 하여 분말로 만든 후 일정농도로 조제하여 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.", "</p><h2>아질산염 소거능의 측정</h2><p>아질산염의 소거능 측정은 Gray 등의 방법에 의하여 측정하였다.", "즉 \\( 2 \\mathrm{mM}\\) \\(\\mathrm{NaNO} \\) 수용액 \\( 2 \\mathrm{ml} \\) 에 일정량의 시료를 가하여 \\( 0.1 \\mathrm{N} \\mathrm{~HCl} \\) 과 \\( 0.2 \\mathrm{M} \\) 구연산 완충액으로 반응 용액의 \\( \\mathrm{pH} \\) 를 각각 1.2, 4.2, 6.0으로 조절하여 총량을 \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 로 하고 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 일정기간 저장시킨 다음 이 용액 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 취하여 \\( 2 \\% \\) 초산 \\( 5 \\mathrm{ml} \\) 과 Griss시약 (\\( 1 \\% ~ \\text{sulfanilic acid} : 1 \\% ~ \\text{napthylamine} = 1: 1 \\) ) \\( 0.4 \\mathrm{ml} \\)를 첨가하고 다시 15 분간 방치한 다음 \\( 520 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하여 아래식에 의거 아질산염 소거율을 구하였다.", "</p><p>\\( N(\\%)=\\left(1-\\frac{a-c}{b}\\right) \\times 100 \\)</p><p>\\( \\mathrm{N} \\) : 아질산염 소거율 (\\(\\%\\))</p><p>\\(a : 2 \\mathrm{mM}\\) \\(\\mathrm{NaNO}_{2} \\) 용액에 시료를 첨가하여 일정시간 저장후에 측정한 흡광도</p><p>\\(b : 2 \\mathrm{mM}\\) \\(\\mathrm{NaNO}_{2} \\) 단독 용액을 a와 동일 조건으로 측정한 흡광도</p><p>\\(c:\\) 시료의 흡광도</p> <h1>서 론</h1><p>식품산업의 발달과 더불어 식품의 기호성과 간편성 및 자연식품의 수명을 연장시킨 가공식품들이 다양하게 생산 보급되고 있다.", "이러한 가공식품들에 있어서는 각종 첨가물들이 사용되고 있으며 이는 인체에 직 간접적으로 영향을 미치고 있다.", "이 중 자연식품 및 가공식품에 있어 우리 인체에 영향을 미치는 물질 중 하나가 화학적 발암물질인 nitrosamine이다.", "육제품이나 수산가공품 등에 발색제로 첨가되는 질산염이나 아질산염은 육의 발색 및 육색의 안정화 뿐만아니라 clostridium botulinum에 대한 정균작용, 육의 보수성 및 결착성 등을 개선하고, 풍미향상 및 지방산패를 억제시키는 효과가 있다.", "그러나 이러한 아질산염은 dialkylamines과 함께 반응하여 강력한 발암물질인 dialkylnitrosamines을 생성한다 동물실험에 있어 흰쥐에서 N-nitrosodimethylamine(NDMA)이 간암을 유발하며, N-nitrosamine 화합물에 대한 동물실험 결과 햑 300 여종의 N-ritroso 화합물 중 약 \\( 90 \\% \\) 이상이 암을 유발하는 것으로 보고되었다.", "이러한 발암물질인 nitrosamine은 \\( \\mathrm{ppm} \\) 수준의 낮은 농도에서도 암을 유발할 수 있고 생체외에서 흡수될 뿐만아니라 생체내에서 합성될 수 있기 때문이다.", "사람은 위액 \\( \\mathrm{pH} \\) 가 1~4 범위이므로 위 내에 이들 전구물질이 공존할 경우 인체내에서 N-nitrosamine을 생성할 가능성이 있다고 하였으며, 아민류나 아질산과의 반응에 적합한 \\( \\mathrm{pH} \\) 를 2.5~3.5 범위라고 하였다.", "또한 최적 \\( \\mathrm{pH} \\)를 벗어나면 N-nitrosamine의 생성은 급격히 줄어들지만 가열이나 formaldehyde 및 장내세균과 같은 촉매인자가 존재할 경우 중성이나 알칼리 조건에서도 nitroso화 반응이 진행된다고 보고하고 있다.", "그리고 체내에 흡수된 2급 아민 등이 뇨 중으로 배설되기 전에 장내에서 미생물에 의한 N-nitrosamine의 합성가능성을 암시하였고, bacteria에 의해 \\( \\mathrm{pH} \\) 6.5의 중성부근에서도 2 급 아민의 nitroso화 반응을 촉진시키는 것을 확인하였다.", "또한 궤양성 대장염, 만성 B형 간염 및 Helicobactor pylori에 의한 만성 위염 등의 만성적인 염증상태에서 분비되는 nitric oxide(\\(\\mathrm{NO}\\))에 의해서 혹은 활성화된 macrophage에 의해 생성된다는 것이 보고되고 있다 .", "설치류에 대한 동물실험에서 여러 종류의 nitrosamine이 간, 인두, 비강, 구강점막, 신장, 췌장, 방광, 폐, 갑상선, 위장, 림프조직, 신경계 등 여러 조직에서 암을 유발할 수 있는 것으로 밝혀지고 있다.", "최근 연구결과에 의하면 이러한 N-nitroso compounds(NOC)에 대한 노출이 인체에서도 위암, 후두암, 인두암 및 방광암의 발생을 증가시키고, 특히 흡연 및 씹는 담배로 인한 구강 및 호흡기 종양의 발생과도 관련 된 것으로 보고되고 있다.", "이와 같이 nitrosamine은 직접적인 발암물질로 작용하기 때문에 이의 생성억제를 위한 연구가 진행되고 있는데 주로 아질산염과 2 급 아민은 통한 위 내의 생합성을 억제하는 물질의 개발과 탐색이다.", "Kim 등은 야채 및 해조추출물, Kato 등은 melanoidins의 아질산염 소거작용을 보고하였다.", "그리고 결명자 추출물, 유자 및 칡 추출물, 저령, 황백 추출물, 황금 및 황련 추출물 등의 한약재에 대한 아질산염의 소거효과에 대하여도 다수 보고되고 있으며, 그외 마늘에서 추출한 diallyl sulfide, 녹차와 그 추출물인 polyphenol 등 및 녹즙 추출물이 nitrosamine의 생성억제 효과가 있음이 보고되고 있다.", "따라서 본 연구에서는 최근에 와서 해조류의 탄수화물이 혈관 내 콜레스테롤 침착방지 및 장관운동을 원활하게 하고 중금속의 배출 등에 효과가 있고, 당류성분에 항암작용이 있다는 보고와 함께 그 가치가 인정되고 있는 해조류 중 갈조식물인 톳(Hizikia fusiforme)과 모자반(Sargassum fulvellum)에 대한 에탄올 및 물 추출물의 아질산염 소거작용을 검토하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { 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5,432	<h1>요 약</h1><p>한국의 제주도와 서해안 염전의 해수로 부터 각각 빨강(JU11-1), 노랑(JU14), 주황(TA20)의 색소를 생성하는 3 균주를 분리하였으며, 이들의 분류학적 특성 및 16S rRNA 서열 분석 결과 3 균주 모두 Pseudoalteromonas 속 세균으로 밝혀졌다. 이들 각각의 색소 최대 흡수파장은 각각 \( 537,378,387 \mathrm{~nm} \)로 나타났다. 균주는 Marine broth 2216에서 잘 자랐으며, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \), \( 2 \% ~\mathrm{NaCl}, \mathrm{pH} ~6-7\) 의 조건에서 Ju11-1과 Ju14는 배양 24 시간에, TA20은 배양 28 시간에 최대 색소 생성을 나타냈다. 탄소원으로 maltose를 \( 1 \% \) 첨가하였을 경우 색소 생성이 우수하였으며, 질소원으로는 beef extract를 \( 1 \% \) 첨가하였을 경우 최적의 색소 생성을 나타냈다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>분리 균주의 동정</h2><p>제주도 근해의 해수에서 색소 생성능이 우수한 JU11-1 (빨강)과 Ju14 (노랑)이 분리되었으며 서해안의 평화염전의 해수로 부터 TA20 (주황) 균주가 선별되었다. 이들은 모두 그람음성의 운동성을 갖는 간균으로 \( \mathrm{pH} ~6-7\)과 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 최적 생장을 나타냈다. 이 균주들은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \)에서 생장하지 않았으나 JU11-1과 Ju14는 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)까지 생장하는 반면 염전의 해수에서 분리한 TA20 균주의 경우 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서도 생장 가능하여 천일 염전에 적응한 결과로 생각되었다. 세 균주 모두 카탈라제 양성을 나타내었으며 Ju14를 제외한 두 균주는 glucose와 lactose로부터 산을 생성하지 않았으며 지방산 조성은 Pseudoalteromonas 속 세균의 주요 지방산으로 알려진 16:1\( \omega\)7c 가 \(24.5-28.9\%\)로 가장 높은 비율을 나타내어 이들 균주의 주요 지방산이 Pseudoalteromonas 속과 일치함을 확인하였다. 염색체 DNA의 \( \mathrm{G}+\mathrm{C} \) 함량\( (\mathrm{mol} \%) \)은 Ju11-1은 \( 44.3 \%,\) TA20은 \( 44.9 \% \) 나타내어 Pseudoalteromonas 속 세균의 \(38-48\%\) 범위에 들어있으나 Ju11-1은 \(52.3\%\)를 나타내어 전형적인 Pseudoalteromonas 속 세균의 \( \mathrm{G}+\mathrm{C} \) 함량 범위에는 들지 않았다(Table 1). 16S rRNA 염기서열 분석 결과, Ju11-1은 Pseudoalteromonas sp. AF227238과 \(99\%\), Ju14는 Pseudoalteromonas sp. AY394862와 \(99\%\), TA20은 Pseudoalteromonas pscicida AY839777과 \( 99.5 \% \)의 상동성을 나타내어 세 균주 모두 서열 유사도 \( 99 \% \) 이상에서 Pseudoalteromonas 속에 속하였다.</p><h2>색소의 추출 및 특성</h2><p>분리된 Pseudoalteromonas 균주들이 생산하는 색소는 etha-nol, methanol, acetone과 methanol : acetone \( (7: 2, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)과 같은 유기용매에는 잘 녹으나 물에는 잘 녹지 않았다. 이들 균주가 생산하는 색소는 지용성 색소로써 물을 제외하고 사용된 모든 유기용매에서의 추출 효율은 유사하였다(Fig. 1).</p><p>세 균주의 색소를 에탄올로 추출한 뒤 스펙트로포토미터로 \(350-900 \mathrm{~nm} \)에서 측정하여 최대 흡수파장을 조사한 결과, Pseudoalteromonas sp. Ju11-1의 색소는 \( 537 \mathrm{~nm} \)에서, Pseudoalteromonas sp. Ju14 색소는 \( 378 \mathrm{~nm} \), Pseudoalteromonas pscicida TA20 색소는 \( 387 \mathrm{~nm} \)에서 가각 최대 흡수파장을 나타냈다. \( 537 \mathrm{~nm} \)에서 최대 흡수파장을 나타낸 Pseudoalteromonas sp. Ju11-1의 색소는 anthocyan (\(531 \mathrm{~nm}\))과 유사한 흡수 파장을 나타내었다. 관찰된 최대 흡수파장은 이후의 색소 최적 생성 조건 조사에서 색소량을 측정하기 위한 흡수파장으로 사용하였다.</p><h2>색소의 최적 생성 조건</h2><h3>온도, \( \mathrm{pH}, \mathrm{NaCl} \)</h3><p>색소 생성 균주 Pseudoalteromonas sp. Ju11-1, Pseudoalteromonas sp. Ju14와 Pseudoalteromonas pscicida TA20에 대한 색소 생성에 대한 배양 온도의 영향을 검토한 결과 3 균주 모두 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 균체량과 색소 생성이 가장 우수하였다. 해양세균인 Erythrobacter, Vibrio, Bacillus 속의 세균인 경우, 각각 색소 생성능이, \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 21^{\circ} \mathrm{C}, 25^{\circ} \mathrm{C} \)인 것과는 대조적인 결과를 나타내었다.</p><p>색소 생성에 미치는 배지의 초기 \( \mathrm{pH} \)에 대한 영향을 검토한 결과, Pseudoalteromonas sp. Ju11-1과Pseudoalteromonas sp. Ju14 균주의 경우 \( \mathrm{pH} \)에서 최대의 색소 생성을 나타내었으나 Pseudoalteromonas pscicida TA20 균주의 경우 \(\mathrm{pH}~ 7\)에서 최대의 색소 생성을 나타내었다. \( \mathrm{pH}~ 5\)의 조건에서는 Pseudoalteromonas sp. Ju11-1과 Pseudoalteromonas pscicida TA20의 경우 균체의 생장과 색소 생성 급격히 감소하였다(Fig. 2). 이는 해양성 Erythrobacter의 경우, \( \mathrm{pH} ~ 6\)에서 최적 색소 생성이 이루어졌으며, 해양성 Bacillus인 경우 \( \mathrm{pH}~ 7 \)에서 최적 색소 생성능을 나타낸 것과 유사한 결과였다.</p><p>색소 생성에 \( \mathrm{NaCl} \) 농도가 미치는 영향에 대하여 배지의 \( \mathrm{NaCl} \)의 농도를 \( 0 \% \)에서 \( 7 \% \)까지 변화를 주어 검토한 결과, 세 균주 모두에서 \( 2 \% \)의 \( \mathrm{NaCl} \) 농도에서 최적의 균체 생장과 색소 생성이 관찰되었으며 \( 3 \% \) 이상의 \( \mathrm{NaCl} \) 농도에서는 점진적으로 균체량과 색소량이 감소되었다(Fig. 3). 해양성 Vibrio sp.가 생산하는 적색 색소의 경우, 균체의 생산은 \( 0 \% ~\mathrm{NaCl} \)에서, 색소 생성은 \( 1-2 \% ~\mathrm{NaCl} \) 농도가 최적인 것으로 나타나 균체의 생산과 색소생성의 최적 조건이 서로 다른 것으로 보고되었으나 본 실험에서 사용한 분리 균주들은 균체의 생육과 색소의 생산이 모두 \( 2 \% ~\mathrm{NaCl} \)에서 최적을 나타내었다. 해양 미생물은 육상 미생물에 비하여 높은 염 농도에서 자라는 특성이 있는데, 본 연구에서 사용한 균주는 \( 2 \% \)의 \( \mathrm{NaCl} \)이 첨가된 조건에서 최적 생장이 관찰되어 비교적 다른 세균에 의한 오염이 적어 색소의 생산 시 유리한 조건으로 작용할 것으로 사료된다.</p><p>MA 배지를 이용하여 각 균주의 최적 \( \mathrm{pH} \)인 \( \mathrm{pH}~ 6\)과 \(7\)에서, \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)의 조건에서 배양시간에 따른 영향을 검토한 결과, 균체량은 세 균주 모두 24 시간에서 최대로 나타났으나, 색소의 최적 생성은 Pseudoalteromonas sp. Ju11-1과 Pseudoalteromonas sp. Ju14의 경우 24 시간에서, Pseudoalteromonas pscicida TA20의 경우 28 시간에 관찰되었다. 세 균주 중 색소 생성능은 Pseudoalteromonas pscicida TA20 균주가 가장 우수하였다(Fig. 4). 해양성 균주들이 배양 48 시간 혹은 24 시간에 최대 색소 생성을 나타내는 것과 유사한 결과였다.</p><h3>탄소원과 질소원</h3><p>탄소원이 색소 생성에 미치는 영향에 대하여 검토하기 위하여 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, sucrose, mannitol, sorbitol과 glycerol을 각각 최종 농도 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \)로 배지에 첨가하여 관찰한 결과 거의 모든 탄소원에서 생육이 저해되었으나 Ju11-1 균주의 경우 lactose에서, Pseudoalteromonas sp. Ju14와 Pseudoalteromonas pscicida TA20 균주의 경우는 maltose를 첨가하였을 때 균체 생장과 색소 생성이 향상되는 것으로 나타났다. Carotenoid를 생산하는 해양세균 Erythrobacter의 경우 mannitol 이, Vibrio의 경우 fructose가 최적의 탄소원인 것과는 다른 결과였으며, 이는 세균 종의 차이에 기인하는 대사능의 차이 때문으로 생각된다. 또한 색소의 생산은 균체 생장 곡선과 거의 비례하는 것으로 나타났다(Table 2).</p><p>질소원의 영향을 조사하기위하여 탄소원으로 \( 1 \% \)의 mal-tose가 포함된 배지에 각각 3종의 무기질소원과 5종의 유기 질소원에 대하여 조사한 결과, 유기 질소원을 첨가하였을 경우가 무기질소원을 첨가한 경우에 비하여 색소 생성능이 우수하였다. 색소 생성능에 미치는 질소원의 영향에 관한 많은 실험에서 무기질소원보다 유기질소원에서 색소의 생성이 좋은 것으로 나타난 결과와 일치하는 것이다. 유기질소원으로는 beef extract를 첨가하였을 경우 균체의 생장과 색소 생성이 가장 우수하였다(Table 3). 이 결과는 Park 등의 Monascus purpureus P-57 곰팡이를 연구한 결과에서 질소원으로는 beef extract를 사용한 경우에 색소의 생성이 가장 우수하다는 보고와 일치하는 결과이며, malt extract를 첨가하였을 경우 균체의 생장과 색소의 생성이 저해되는 결과를 나타냈다.</p><p>해양환경으로부터 분리한 색소 생성능이 우수한 Pseudoalteromonas sp. Ju11-1, Pseudoalteromonas sp. Ju14와 Pseudoalteromonas pscicida TA20의 3 균주는 동일한 Pseudoalteromonas 속 세균으로 각기 다른 색소를 생성하며 각 색소의 최적 생성 조건이 균주에 따라 차이를 나타내었다. 이는 carotenoid를 생성하는 비광합성 세균인 Hymenobacter의 경우, carotenoid의 조성에 의해 종(species)의 구분이 가능하며, 색소의 생성과 세균 종간의 유연관계가 있음을 시사한 Klassen과 Foght의 보고와 유사한 결과이다.</p> <h2>16S rDNA 염기서열 증폭 및 분석</h2><p>염기서열 결정을 위하여, DNA 증폭 및 염기서열 결정은 Yeon 등의 방법을 이용하였다. 16S rDNA의 염기서열의 결정은 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') primer와 926r (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') primer를 사용하여 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA를 사용하여 부분 염기서열을 결정하였다. 16S rDNA 염기서열의 상동성 검색은 GenBank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast 검색에 의해 실행하였다.</p><h2>색소의 추출 및 특성</h2><p>분리된 균주를 MB (marine broth media) \( 200 \mathrm{~ml} \)이 담긴 \( 500 \mathrm{~ml} \) 플라스크에 접종하고, \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 200 \mathrm{~rpm} \)으로 30 시간 진탕 배양하였다. 배양액은 \(6,000 \mathrm{~rpm}\)에서 15 분간 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하였고 여기에 물, ethanol, methanol, methanol:acetone \( (7: 2, \mathrm{v} / \mathrm{v}) \)을 각각 첨가하여 3회 반복 추출하였다. 추출한 색소는 스펙트로포토미터(Spectronic Genesys 5, Miltonroy, USA)를 이용하여 \(350-900 \mathrm{nm}\) 파장에서 흡광도를 측정하였다.</p><h2>색소의 최적 생성 조건</h2><h3>온도, \( \mathrm{pH}, \mathrm{NaCl} \)</h3><p>온도와 \( \mathrm{pH} \)에 따른 균주별 색소의 최적 생성 조건을 규명하기 위하여, MB 배지에 배양액을 \( 1 \%(\mathrm{v} / \mathrm{v}) \) 접종하여, 측정하고자 하는 온도, \( \mathrm{pH} \) 조건에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 4시간 간격으로 스펙트로포토미터를 이용하여 균체량과 색소량을 측정하였다. 온도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C}, 30^{\circ} \mathrm{C} \)와 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 배양하였고 \( \mathrm{pH} \)의 영향을 알아보기 위하여 \( \mathrm{KOH} \)와 \( \mathrm{HCl} \)를 사용하여 각각 \( \mathrm{pH} ~5, \mathrm{pH}~ 6,\mathrm{pH} ~7, \mathrm{pH} ~ 8\)과 \( \mathrm{pH} ~9\)로 조정된 배지를 이용하였으며, \( \mathrm{NaCl} \) 농도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 균주의 최적 생장 \( \mathrm{NaCl} \) 농도를 조사하기 위한 배지와 동일한 배지를 사용하여 \( 0 \%, 1 \%, 2 \%, 3 \%, 4 \%, 5 \%, 6 \% \)와 \( 7 \% \)까지 \( \mathrm{NaCl} \) 농도가 조정된 배지에 균을 접종하고 배양하면서 측정하였다. 각 조건별 균체량은 \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였으며, 색소량은 각 균주의 최대 흡수 파장인 \( 537 \mathrm{~nm}, 378 \mathrm{~nm}, 387 \mathrm{~nm} \)에서 각각 측정하였다.</p><h3>탄소원과 질소원</h3><p>균주별 탄소원과 질소원이 색소 생성 조건에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Kim 등의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, \( 0.75 \% \) casamino acid, \( 1.0 \% \) yeast extract, \( 0.3 \% \) sodium citrate, \( 0.2 \% \) potassium chloride, \( 2.0 \% \) magnesium sulphate, \( 0.0023 \% \) ferric sulfate \( (\mathrm{pH} ~7.4\))에 \( \mathrm{NaCl} \) 농도를 \( 2 \% \)로 한 배지에 최종 농도 \( 1 \% \)가 되도록 각각 탄소원과 질소원을 첨가하고 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 스펙트로포토미터를 사용하여 각 균주의 최대 흡수파장에서 흡광도를 측정하였다. 탄소원은 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, su-crose, mannitol, sorbitol, glycerol를 첨가하여 확인하였고, 질소원으로는 yeast extract, malt extract, beef extract, tryptone과 peptone의 유기질소원과 potassium nitrate, ammonium nitrate와 sodium nitrate의 무기질소원을 사용하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>색소는 크게 천연색소와 합성색소로 나누어지며 식품공업, 화장품, 의약품, 가축사료 첨가제 등으로 다양하게 사용되어지고 있다. 19세기 이후 화학공업의 발달과 함께 합성 색소가 개발되어 광범위하게 사용되어져 왔지만 안정성 등이 문제가 되면서 이의 대안으로 천연색소에 대한 관심이 증가되고 있으며 식품, 의약품 및 화장품 등에서 점차 천연색소의 사용이 증가하고 있다. 현재 사용되고 있는 천연색소는 주로 식물성 색소로 chlorophyll, carotenoid, phycopyrine, anthox-anthin, anthocyanin, 천연 carotine, xanthophyll 등이 알려져 있으며 천연 색소는 착색료 용도 외에도 비타민 A 전구체, 면역기능의 활성화, 산소래디칼의 제거 등, 영양성과 약리성을 가지고 있다는 점에서도 주목받고 있다. 그러나 지금까지 천연색소는 대부분 동물이나 식물에서 직접 추출하여 사용되었으나 추출이 용이하지 않을 뿐만 아니라 생육조건과 자연 환경에 따라 품질의 변화가 심하여 일정한 품질을 유지하기가 어렵다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 최근에는 대량생산이 가능하고 상시 안정된 품질의 제품을 생산할 수 있는 미생물 색소에 대하여 관심이 증가하고 있다. 지금까지 연구된 미생물 유래 색소로서는 홍국균(Monascus sp.)이 생산하는 적색 색소, Rhodotorula 속의 car-otenoid, Rhodopila globiformis의 적색 색소, Rhodospirillum ru-brum의 황색 색소, Rhodopseudomonas viridis의 녹색 색소, Azotobacter vinelandii와 Streptomyces californicus의 청색 색소,Serratia marcescens의 황색 색소 등에 관한 연구가 있다. 이 중에서도 해양 미생물을 이용한 색소 생산은 높은 염농도로 인하여 다른 미생물의 오염이 적고 세포 용해는 낮은 염농도에서 쉽게 일어나기 때문에 색소의 추출이 쉽다는 장점을 가지고 있다. 이에 해양미생물을 이용한 미생물 색소에 관한 연구가 다수 보고되고 있다</p><p>본 연구에서는 미생물 색소 개발의 기초자료를 제공하고자 제주도를 비롯한 섬지역의 해안 해수와 서해안의 평화염전의 해수로부터 색소생성능이 우수한 해양세균, Pseudoalteromonas 속 Ju11-1, Ju14, TA20 세 균주를 분리하여 균주들의 분류학적 특성과 최적 색소 생성 조건에 관하여 검토하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 배지</h2><p>본 실험에 사용한 균주는 2001년 7월부터 2003년 8월까지 제주도, 가거도, 추자도, 귀녀, 구들녀와 태안 염전의 해수로부터 Marine broth 2216 (Difco, USA)에서 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, ~1 \sim 3 \) 일간 배양 후 형태적으로 다르게 구분되는 집락을 분리하였고 이 중 색소를 생성하는 30 균주를 1차적으로 선별하고 최종적으로 색소 생성능이 우수한 Ju11-1, Ju14, TA20 세 균주를 선별하여 실험에 사용하였다. 순수 분리된 균주는 배양액에 \( 20 \% \) glycer-ol을 첨가하여 \( -80^{\circ} \mathrm{C} \)에 보관하였다.</p><h2>균주의 형태 및 생화학적 특성</h2><p>분리된 균주들은 MA (Marine agar 2216, Difco, USA) 배지를 기본배지로 하여 배양온도 \( 30^{\circ} \mathrm{C} \)에서 Yeon 등의 방법에 따라 그람염색, 운동성 및 최적 \( \mathrm{pH} \)를 조사하였다. \( \mathrm{pH} \)는 \( \mathrm{KOH} \)와 \( \mathrm{HCl} \)로 각 각 조정하였다. 최적 \( \mathrm{NaCl} \) 농도는 Ventosa 등의 기초배지를 변형하여 사용하였다. 즉, \( \mathrm{MgSO}_{4}\cdot7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 4.8 \mathrm{~g}; ~\mathrm{MgCl}_{2} \cdot 6 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 3.5 \mathrm{~g};~ \mathrm{KCl}, 1.0 \mathrm{~g} ;~ \mathrm{CaCl}_{2} \cdot2 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}, 0.18\mathrm{~g};~\mathrm{NaHCO}_{3}, 0.03 \mathrm{~g}; ~\mathrm{NaBr}, 0.013 \mathrm{~g} \)을 주요 염성분으로 사용하였고, Bacto-Peptone (Difco, USA), \( 2.5 \mathrm{~g} \); Yeast extract (Difco, USA), \( 5.0 \mathrm{~g} \); Glucose (Sigma, USA), \( 1.0 \mathrm{~g} \); 증류수 \(1,000 \mathrm{~ml}\), \(\mathrm{pH} ~7.2\)에 \( \mathrm{NaCl} \)은 각각 \( 0 \%, 1 \%, 2 \%, 3 \%, 4 \%, 5 \%, 6 \% \)와 \( 7 \% \)가 첨가된 배지를 사용하여 최적 생장 \( \mathrm{NaCl} \) 농도를 구하였으며, 당으로부터 산 생성능 조사에는 glucose 대신 조사하고자 하는 기질을 \( 1 \% \) 첨가하여 사용하였다.</p><h2>염색체 DNA의 분리 및 \( \mathrm{G}+\mathrm{C} \) 함량\( (\mathrm{mol} \%) \) 측정</h2><p>세균 세포의 염색체 DNA 분리와 \( \mathrm{G}+\mathrm{C} \) 함량\( (\mathrm{mol} \%) \)의 측정은 Jeon과 Park 의 방법에 따라 결정하였다. nuclease P1과 Alkaline phosphatase를 처리한 후 HPLC (High-performance Lipiud Chromatograph, Simadzu, Japan)에 의해 측정하였다.</p><h2>지방산 조성의 분석</h2><p>균체지방산의 분석은 MA 배지에 \( 30^{\circ} \mathrm{C}, 48 \) 시간 배양하여 Lim 등[11]의 방법에 따라 Sherlock Microbial Identification System (MIDI Inc., USA)에 의해 분석하였으며 유사도 \( 0.5 \) 이상을 신뢰성 있는 결과로 판별하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1><p>한국의 제주도와 서해안 염전의 해수로 부터 각각 빨강(JU11-1), 노랑(JU14), 주황(TA20)의 색소를 생성하는 3 균주를 분리하였으며, 이들의 분류학적 특성 및 16S rRNA 서열 분석 결과 3 균주 모두 Pseudoalteromonas 속 세균으로 밝혀졌다.", "이들 각각의 색소 최대 흡수파장은 각각 \\( 537,378,387 \\mathrm{~nm} \\)로 나타났다.", "균주는 Marine broth 2216에서 잘 자랐으며, \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\), \\( 2 \\% ~\\mathrm{NaCl}, \\mathrm{pH} ~6-7\\) 의 조건에서 Ju11-1과 Ju14는 배양 24 시간에, TA20은 배양 28 시간에 최대 색소 생성을 나타냈다.", "탄소원으로 maltose를 \\( 1 \\% \\) 첨가하였을 경우 색소 생성이 우수하였으며, 질소원으로는 beef extract를 \\( 1 \\% \\) 첨가하였을 경우 최적의 색소 생성을 나타냈다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>분리 균주의 동정</h2><p>제주도 근해의 해수에서 색소 생성능이 우수한 JU11-1 (빨강)과 Ju14 (노랑)이 분리되었으며 서해안의 평화염전의 해수로 부터 TA20 (주황) 균주가 선별되었다.", "이들은 모두 그람음성의 운동성을 갖는 간균으로 \\( \\mathrm{pH} ~6-7\\)과 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 최적 생장을 나타냈다.", "이 균주들은 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 생장하지 않았으나 JU11-1과 Ju14는 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)까지 생장하는 반면 염전의 해수에서 분리한 TA20 균주의 경우 \\( 45^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서도 생장 가능하여 천일 염전에 적응한 결과로 생각되었다.", "세 균주 모두 카탈라제 양성을 나타내었으며 Ju14를 제외한 두 균주는 glucose와 lactose로부터 산을 생성하지 않았으며 지방산 조성은 Pseudoalteromonas 속 세균의 주요 지방산으로 알려진 16:1\\( \\omega\\)7c 가 \\(24.5-28.9\\%\\)로 가장 높은 비율을 나타내어 이들 균주의 주요 지방산이 Pseudoalteromonas 속과 일치함을 확인하였다.", "염색체 DNA의 \\( \\mathrm{G}+\\mathrm{C} \\) 함량\\( (\\mathrm{mol} \\%) \\)은 Ju11-1은 \\( 44.3 \\%,\\) TA20은 \\( 44.9 \\% \\) 나타내어 Pseudoalteromonas 속 세균의 \\(38-48\\%\\) 범위에 들어있으나 Ju11-1은 \\(52.3\\%\\)를 나타내어 전형적인 Pseudoalteromonas 속 세균의 \\( \\mathrm{G}+\\mathrm{C} \\) 함량 범위에는 들지 않았다", "(Table 1).", "16S rRNA 염기서열 분석 결과, Ju11-1은 Pseudoalteromonas sp.", "AF227238과 \\(99\\%\\), Ju14는 Pseudoalteromonas sp.", "AY394862와 \\(99\\%\\), TA20은 Pseudoalteromonas pscicida AY839777과 \\( 99.5 \\% \\)의 상동성을 나타내어 세 균주 모두 서열 유사도 \\( 99 \\% \\) 이상에서 Pseudoalteromonas 속에 속하였다.", "</p><h2>색소의 추출 및 특성</h2><p>분리된 Pseudoalteromonas 균주들이 생산하는 색소는 etha-nol, methanol, acetone과 methanol : acetone \\( (7: 2, \\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\)과 같은 유기용매에는 잘 녹으나 물에는 잘 녹지 않았다.", "이들 균주가 생산하는 색소는 지용성 색소로써 물을 제외하고 사용된 모든 유기용매에서의 추출 효율은 유사하였다", "(Fig. 1).", "</p><p>세 균주의 색소를 에탄올로 추출한 뒤 스펙트로포토미터로 \\(350-900 \\mathrm{~nm} \\)에서 측정하여 최대 흡수파장을 조사한 결과, Pseudoalteromonas sp.", "Ju11-1의 색소는 \\( 537 \\mathrm{~nm} \\)에서, Pseudoalteromonas sp.", "Ju14 색소는 \\( 378 \\mathrm{~nm} \\), Pseudoalteromonas pscicida TA20 색소는 \\( 387 \\mathrm{~nm} \\)에서 가각 최대 흡수파장을 나타냈다. \\", "( 537 \\mathrm{~nm} \\)에서 최대 흡수파장을 나타낸 Pseudoalteromonas sp.", "Ju11-1의 색소는 anthocyan (\\(531 \\mathrm{~nm}\\))과 유사한 흡수 파장을 나타내었다.", "관찰된 최대 흡수파장은 이후의 색소 최적 생성 조건 조사에서 색소량을 측정하기 위한 흡수파장으로 사용하였다.", "</p><h2>색소의 최적 생성 조건</h2><h3>온도, \\( \\mathrm{pH}, \\mathrm{NaCl} \\)</h3><p>색소 생성 균주 Pseudoalteromonas sp.", "Ju11-1, Pseudoalteromonas sp.", "Ju14와 Pseudoalteromonas pscicida TA20에 대한 색소 생성에 대한 배양 온도의 영향을 검토한 결과 3 균주 모두 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 균체량과 색소 생성이 가장 우수하였다.", "해양세균인 Erythrobacter, Vibrio, Bacillus 속의 세균인 경우, 각각 색소 생성능이, \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C}, 21^{\\circ} \\mathrm{C}, 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\)인 것과는 대조적인 결과를 나타내었다.", "</p><p>색소 생성에 미치는 배지의 초기 \\( \\mathrm{pH} \\)에 대한 영향을 검토한 결과, Pseudoalteromonas sp.", "Ju11-1과Pseudoalteromonas sp.", "Ju14 균주의 경우 \\( \\mathrm{pH} \\)에서 최대의 색소 생성을 나타내었으나 Pseudoalteromonas pscicida TA20 균주의 경우 \\(\\mathrm{pH}~ 7\\)에서 최대의 색소 생성을 나타내었다. \\", "( \\mathrm{pH}~ 5\\)의 조건에서는 Pseudoalteromonas sp.", "Ju11-1과 Pseudoalteromonas pscicida TA20의 경우 균체의 생장과 색소 생성 급격히 감소하였다", "(Fig. 2).", "이는 해양성 Erythrobacter의 경우, \\( \\mathrm{pH} ~ 6\\)에서 최적 색소 생성이 이루어졌으며, 해양성 Bacillus인 경우 \\( \\mathrm{pH}~ 7 \\)에서 최적 색소 생성능을 나타낸 것과 유사한 결과였다.", "</p><p>색소 생성에 \\( \\mathrm{NaCl} \\) 농도가 미치는 영향에 대하여 배지의 \\( \\mathrm{NaCl} \\)의 농도를 \\( 0 \\% \\)에서 \\( 7 \\% \\)까지 변화를 주어 검토한 결과, 세 균주 모두에서 \\( 2 \\% \\)의 \\( \\mathrm{NaCl} \\) 농도에서 최적의 균체 생장과 색소 생성이 관찰되었으며 \\( 3 \\% \\) 이상의 \\( \\mathrm{NaCl} \\) 농도에서는 점진적으로 균체량과 색소량이 감소되었다", "(Fig. 3).", "해양성 Vibrio sp.가 생산하는 적색 색소의 경우, 균체의 생산은 \\( 0 \\% ~\\mathrm{NaCl} \\)에서, 색소 생성은 \\( 1-2 \\% ~\\mathrm{NaCl} \\) 농도가 최적인 것으로 나타나 균체의 생산과 색소생성의 최적 조건이 서로 다른 것으로 보고되었으나 본 실험에서 사용한 분리 균주들은 균체의 생육과 색소의 생산이 모두 \\( 2 \\% ~\\mathrm{NaCl} \\)에서 최적을 나타내었다.", "해양 미생물은 육상 미생물에 비하여 높은 염 농도에서 자라는 특성이 있는데, 본 연구에서 사용한 균주는 \\( 2 \\% \\)의 \\( \\mathrm{NaCl} \\)이 첨가된 조건에서 최적 생장이 관찰되어 비교적 다른 세균에 의한 오염이 적어 색소의 생산 시 유리한 조건으로 작용할 것으로 사료된다.", "</p><p>MA 배지를 이용하여 각 균주의 최적 \\( \\mathrm{pH} \\)인 \\( \\mathrm{pH}~ 6\\)과 \\(7\\)에서, \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)의 조건에서 배양시간에 따른 영향을 검토한 결과, 균체량은 세 균주 모두 24 시간에서 최대로 나타났으나, 색소의 최적 생성은 Pseudoalteromonas sp.", "Ju11-1과 Pseudoalteromonas sp.", "Ju14의 경우 24 시간에서, Pseudoalteromonas pscicida TA20의 경우 28 시간에 관찰되었다.", "세 균주 중 색소 생성능은 Pseudoalteromonas pscicida TA20 균주가 가장 우수하였다", "(Fig. 4).", "해양성 균주들이 배양 48 시간 혹은 24 시간에 최대 색소 생성을 나타내는 것과 유사한 결과였다.", "</p><h3>탄소원과 질소원</h3><p>탄소원이 색소 생성에 미치는 영향에 대하여 검토하기 위하여 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, sucrose, mannitol, sorbitol과 glycerol을 각각 최종 농도 \\( 1 \\%(\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\)로 배지에 첨가하여 관찰한 결과 거의 모든 탄소원에서 생육이 저해되었으나 Ju11-1 균주의 경우 lactose에서, Pseudoalteromonas sp.", "Ju14와 Pseudoalteromonas pscicida TA20 균주의 경우는 maltose를 첨가하였을 때 균체 생장과 색소 생성이 향상되는 것으로 나타났다.", "Carotenoid를 생산하는 해양세균 Erythrobacter의 경우 mannitol 이, Vibrio의 경우 fructose가 최적의 탄소원인 것과는 다른 결과였으며, 이는 세균 종의 차이에 기인하는 대사능의 차이 때문으로 생각된다.", "또한 색소의 생산은 균체 생장 곡선과 거의 비례하는 것으로 나타났다", "(Table 2).", "</p><p>질소원의 영향을 조사하기위하여 탄소원으로 \\( 1 \\% \\)의 mal-tose가 포함된 배지에 각각 3종의 무기질소원과 5종의 유기 질소원에 대하여 조사한 결과, 유기 질소원을 첨가하였을 경우가 무기질소원을 첨가한 경우에 비하여 색소 생성능이 우수하였다.", "색소 생성능에 미치는 질소원의 영향에 관한 많은 실험에서 무기질소원보다 유기질소원에서 색소의 생성이 좋은 것으로 나타난 결과와 일치하는 것이다.", "유기질소원으로는 beef extract를 첨가하였을 경우 균체의 생장과 색소 생성이 가장 우수하였다", "(Table 3).", "이 결과는 Park 등의 Monascus purpureus P-57 곰팡이를 연구한 결과에서 질소원으로는 beef extract를 사용한 경우에 색소의 생성이 가장 우수하다는 보고와 일치하는 결과이며, malt extract를 첨가하였을 경우 균체의 생장과 색소의 생성이 저해되는 결과를 나타냈다.", "</p><p>해양환경으로부터 분리한 색소 생성능이 우수한 Pseudoalteromonas sp.", "Ju11-1, Pseudoalteromonas sp.", "Ju14와 Pseudoalteromonas pscicida TA20의 3 균주는 동일한 Pseudoalteromonas 속 세균으로 각기 다른 색소를 생성하며 각 색소의 최적 생성 조건이 균주에 따라 차이를 나타내었다.", "이는 carotenoid를 생성하는 비광합성 세균인 Hymenobacter의 경우, carotenoid의 조성에 의해 종(species)의 구분이 가능하며, 색소의 생성과 세균 종간의 유연관계가 있음을 시사한 Klassen과 Foght의 보고와 유사한 결과이다.", "</p> <h2>16S rDNA 염기서열 증폭 및 분석</h2><p>염기서열 결정을 위하여, DNA 증폭 및 염기서열 결정은 Yeon 등의 방법을 이용하였다.", "16S rDNA의 염기서열의 결정은 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') primer와 926r (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') primer를 사용하여 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA를 사용하여 부분 염기서열을 결정하였다.", "16S rDNA 염기서열의 상동성 검색은 GenBank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast 검색에 의해 실행하였다.", "</p><h2>색소의 추출 및 특성</h2><p>분리된 균주를 MB (marine broth media) \\( 200 \\mathrm{~ml} \\)이 담긴 \\( 500 \\mathrm{~ml} \\) 플라스크에 접종하고, \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, 200 \\mathrm{~rpm} \\)으로 30 시간 진탕 배양하였다.", "배양액은 \\(6,000 \\mathrm{~rpm}\\)에서 15 분간 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하였고 여기에 물, ethanol, methanol, methanol:acetone \\( (7: 2, \\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\)을 각각 첨가하여 3회 반복 추출하였다.", "추출한 색소는 스펙트로포토미터(Spectronic Genesys 5, Miltonroy, USA)를 이용하여 \\(350-900 \\mathrm{nm}\\) 파장에서 흡광도를 측정하였다.", "</p><h2>색소의 최적 생성 조건</h2><h3>온도, \\( \\mathrm{pH}, \\mathrm{NaCl} \\)</h3><p>온도와 \\( \\mathrm{pH} \\)에 따른 균주별 색소의 최적 생성 조건을 규명하기 위하여, MB 배지에 배양액을 \\( 1 \\%(\\mathrm{v} / \\mathrm{v}) \\) 접종하여, 측정하고자 하는 온도, \\( \\mathrm{pH} \\) 조건에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 4시간 간격으로 스펙트로포토미터를 이용하여 균체량과 색소량을 측정하였다.", "온도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C}, 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)와 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 배양하였고 \\( \\mathrm{pH} \\)의 영향을 알아보기 위하여 \\( \\mathrm{KOH} \\)와 \\( \\mathrm{HCl} \\)를 사용하여 각각 \\( \\mathrm{pH} ~5, \\mathrm{pH}~ 6,\\mathrm{pH} ~7, \\mathrm{pH} ~ 8\\)과 \\( \\mathrm{pH} ~9\\)로 조정된 배지를 이용하였으며, \\( \\mathrm{NaCl} \\) 농도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 균주의 최적 생장 \\( \\mathrm{NaCl} \\) 농도를 조사하기 위한 배지와 동일한 배지를 사용하여 \\( 0 \\%, 1 \\%, 2 \\%, 3 \\%, 4 \\%, 5 \\%, 6 \\% \\)와 \\( 7 \\% \\)까지 \\( \\mathrm{NaCl} \\) 농도가 조정된 배지에 균을 접종하고 배양하면서 측정하였다.", "각 조건별 균체량은 \\( 660 \\mathrm{~nm} \\)에서 측정하였으며, 색소량은 각 균주의 최대 흡수 파장인 \\( 537 \\mathrm{~nm}, 378 \\mathrm{~nm}, 387 \\mathrm{~nm} \\)에서 각각 측정하였다.", "</p><h3>탄소원과 질소원</h3><p>균주별 탄소원과 질소원이 색소 생성 조건에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Kim 등의 방법을 변형하여 사용하였다.", "즉, \\( 0.75 \\% \\) casamino acid, \\( 1.0 \\% \\) yeast extract, \\( 0.3 \\% \\) sodium citrate, \\( 0.2 \\% \\) potassium chloride, \\( 2.0 \\% \\) magnesium sulphate, \\( 0.0023 \\% \\) ferric sulfate \\( (\\mathrm{pH} ~7.4\\))에 \\( \\mathrm{NaCl} \\) 농도를 \\( 2 \\% \\)로 한 배지에 최종 농도 \\( 1 \\% \\)가 되도록 각각 탄소원과 질소원을 첨가하고 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 스펙트로포토미터를 사용하여 각 균주의 최대 흡수파장에서 흡광도를 측정하였다.", "탄소원은 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, su-crose, mannitol, sorbitol, glycerol를 첨가하여 확인하였고, 질소원으로는 yeast extract, malt extract, beef extract, tryptone과 peptone의 유기질소원과 potassium nitrate, ammonium nitrate와 sodium nitrate의 무기질소원을 사용하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>색소는 크게 천연색소와 합성색소로 나누어지며 식품공업, 화장품, 의약품, 가축사료 첨가제 등으로 다양하게 사용되어지고 있다.", "19세기 이후 화학공업의 발달과 함께 합성 색소가 개발되어 광범위하게 사용되어져 왔지만 안정성 등이 문제가 되면서 이의 대안으로 천연색소에 대한 관심이 증가되고 있으며 식품, 의약품 및 화장품 등에서 점차 천연색소의 사용이 증가하고 있다.", "현재 사용되고 있는 천연색소는 주로 식물성 색소로 chlorophyll, carotenoid, phycopyrine, anthox-anthin, anthocyanin, 천연 carotine, xanthophyll 등이 알려져 있으며 천연 색소는 착색료 용도 외에도 비타민 A 전구체, 면역기능의 활성화, 산소래디칼의 제거 등, 영양성과 약리성을 가지고 있다는 점에서도 주목받고 있다.", "그러나 지금까지 천연색소는 대부분 동물이나 식물에서 직접 추출하여 사용되었으나 추출이 용이하지 않을 뿐만 아니라 생육조건과 자연 환경에 따라 품질의 변화가 심하여 일정한 품질을 유지하기가 어렵다는 단점이 있다.", "이러한 단점을 극복하기 위하여 최근에는 대량생산이 가능하고 상시 안정된 품질의 제품을 생산할 수 있는 미생물 색소에 대하여 관심이 증가하고 있다.", "지금까지 연구된 미생물 유래 색소로서는 홍국균(Monascus sp.)이 생산하는 적색 색소, Rhodotorula 속의 car-otenoid, Rhodopila globiformis의 적색 색소, Rhodospirillum ru-brum의 황색 색소, Rhodopseudomonas viridis의 녹색 색소, Azotobacter vinelandii와 Streptomyces californicus의 청색 색소,Serratia marcescens의 황색 색소 등에 관한 연구가 있다.", "이 중에서도 해양 미생물을 이용한 색소 생산은 높은 염농도로 인하여 다른 미생물의 오염이 적고 세포 용해는 낮은 염농도에서 쉽게 일어나기 때문에 색소의 추출이 쉽다는 장점을 가지고 있다.", "이에 해양미생물을 이용한 미생물 색소에 관한 연구가 다수 보고되고 있다</p><p>본 연구에서는 미생물 색소 개발의 기초자료를 제공하고자 제주도를 비롯한 섬지역의 해안 해수와 서해안의 평화염전의 해수로부터 색소생성능이 우수한 해양세균, Pseudoalteromonas 속 Ju11-1, Ju14, TA20 세 균주를 분리하여 균주들의 분류학적 특성과 최적 색소 생성 조건에 관하여 검토하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>사용 균주 및 배지</h2><p>본 실험에 사용한 균주는 2001년 7월부터 2003년 8월까지 제주도, 가거도, 추자도, 귀녀, 구들녀와 태안 염전의 해수로부터 Marine broth 2216 (Difco, USA)에서 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, ~1 \\sim 3 \\) 일간 배양 후 형태적으로 다르게 구분되는 집락을 분리하였고 이 중 색소를 생성하는 30 균주를 1차적으로 선별하고 최종적으로 색소 생성능이 우수한 Ju11-1, Ju14, TA20 세 균주를 선별하여 실험에 사용하였다.", "순수 분리된 균주는 배양액에 \\( 20 \\% \\) glycer-ol을 첨가하여 \\( -80^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에 보관하였다.", "</p><h2>균주의 형태 및 생화학적 특성</h2><p>분리된 균주들은 MA (Marine agar 2216, Difco, USA) 배지를 기본배지로 하여 배양온도 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 Yeon 등의 방법에 따라 그람염색, 운동성 및 최적 \\( \\mathrm{pH} \\)를 조사하였다. \\", "( \\mathrm{pH} \\)는 \\( \\mathrm{KOH} \\)와 \\( \\mathrm{HCl} \\)로 각 각 조정하였다.", "최적 \\( \\mathrm{NaCl} \\) 농도는 Ventosa 등의 기초배지를 변형하여 사용하였다.", "즉, \\( \\mathrm{MgSO}_{4}\\cdot7 \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}, 4.8 \\mathrm{~g}; ~\\mathrm{MgCl}_{2} \\cdot 6 \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}, 3.5 \\mathrm{~g};~ \\mathrm{KCl}, 1.0 \\mathrm{~g} ;~ \\mathrm{CaCl}_{2} \\cdot2 \\mathrm{H}_{2} \\mathrm{O}, 0.18\\mathrm{~g};~\\mathrm{NaHCO}_{3}, 0.03 \\mathrm{~g}; ~\\mathrm{NaBr}, 0.013 \\mathrm{~g} \\)을 주요 염성분으로 사용하였고, Bacto-Peptone (Difco, USA), \\( 2.5 \\mathrm{~g} \\); Yeast extract (Difco, USA), \\( 5.0 \\mathrm{~g} \\); Glucose (Sigma, USA), \\( 1.0 \\mathrm{~g} \\); 증류수 \\(1,000 \\mathrm{~ml}\\), \\(\\mathrm{pH} ~7.2\\)에 \\( \\mathrm{NaCl} \\)은 각각 \\( 0 \\%, 1 \\%, 2 \\%, 3 \\%, 4 \\%, 5 \\%, 6 \\% \\)와 \\( 7 \\% \\)가 첨가된 배지를 사용하여 최적 생장 \\( \\mathrm{NaCl} \\) 농도를 구하였으며, 당으로부터 산 생성능 조사에는 glucose 대신 조사하고자 하는 기질을 \\( 1 \\% \\) 첨가하여 사용하였다.", "</p><h2>염색체 DNA의 분리 및 \\( \\mathrm{G}+\\mathrm{C} \\) 함량\\( (\\mathrm{mol} \\%) \\) 측정</h2><p>세균 세포의 염색체 DNA 분리와 \\( \\mathrm{G}+\\mathrm{C} \\) 함량\\( (\\mathrm{mol} \\%) \\)의 측정은 Jeon과 Park 의 방법에 따라 결정하였다.", "nuclease P1과 Alkaline phosphatase를 처리한 후 HPLC (High-performance Lipiud Chromatograph, Simadzu, Japan)에 의해 측정하였다.", "</p><h2>지방산 조성의 분석</h2><p>균체지방산의 분석은 MA 배지에 \\( 30^{\\circ} \\mathrm{C}, 48 \\) 시간 배양하여 Lim 등[11]의 방법에 따라 Sherlock Microbial Identification System (MIDI Inc., USA)에 의해 분석하였으며 유사도 \\( 0.5 \\) 이상을 신뢰성 있는 결과로 판별하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "해양환경에서 분리한 Pseudoalteromonas 속 균주들의 특징 및 색소 생성 최적 조건", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-ee4f5f4f-3f75-41de-9984-e344c41a8415", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "정동우", "박진숙" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,433	<h2>알레르기 유도 및 판정</h2><p>마우스에게 알레르기 면역반응을 유도하기 위하여, OVA 를 adjuvant인 aluminium hydroxide (\(20 \mu \mathrm{g} / \text{마우스}\)) 및 Bordetella pertussis 사균 부유액 (\( 1 \times 10^{9} \) bacteria/마우스)과 혼합하여 마우스 복강으로 1회 투여하였고, 이때 투여된 OVA의 양은 선행연구의 결과에 따라 알레르기가 잘 유발되는 용량인 마우스당 \( 1 \mathrm{mg} \) 이 되도록 하였다. OVA 에 대한 알레르기 유발의 판정은 OVA로 감작 시킨 후 15 일째 OVA(\(100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mouse}\)) 를 마우스 꼬리정맥으로 투여하고(i.v.) Haffner 의 방법에 준하여 알레르기 유발을 판정하였다.</p><h2>비장 Index의 측정</h2><p>알레르기 면역감작 후 감작된 정도를 비교하기 위하여 Chandra와 그의 동료들에 의한 연구방법에 따라 spleen in-dex를 측정하였고, 이 방법으로 비장의 크기에 따라 면역력이 이루어진 정도를 비교하고 알레르기가 유도될 때 비장의 크기가 병적으로 커지는 지에 대하여 알아보았다.</p><p>* spleen index=spleen weight/animal weight</p><h2>복강의 대식세포와 비장의 T 림프구 및 B 림프구의 분리</h2><p>복강의 대식세포를 분리하기 위하여, 수영훈련 기간별 훈련된 마우스를 \( \mathrm{CO}_{2} \) gas로 희생시키고, RPMI 1640 배지 (\( 2 \mathrm{mM} \) L-glutamine, \( 2.2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) sodium bicarbonate, \(100 \mathrm{units} / \mathrm{ml} \) penicillin, \( 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) streptomycine, 및 \( 2 \mathrm{mM} \) HEPES buffer 가 첨가됨) \( 10 \mathrm{ml} \) 를 \( 10 \mathrm{ml} \) 주사기(18 gauge needle)에 넣어 마우스 복강 내로 2-3회 주사하고 복강 세척액을 채취하였다. 이 세척액에서 세포를 분리하여 우태아 혈청이 \( 10 \% \) 함유된 RPMI 배지(이후 완전 배지로 칭함)에 부유시킨 (\( 1 \times 10^{6} \mathrm{cells}/\mathrm{ml}\)) 후 \( 75 \mathrm{~cm}^{2} \) culture flask에 넣어 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \%\) \(\mathrm{CO}_{2} \) 항원 항습기에서 3 시간 동안 배양하였다.</p><p>배양 후 culture flask로부터 flask 표면에 부착되지 않은 세포는 RPMI 1640 배지로 3회 세척하여 제거하고 flask 표면에 부착된 세포는 차가운 배지와 rubber policeman을 이용하여 flask로부터 때어내어 완전배지에 \( 1 \times 10^{6} \mathrm{cells}/ \mathrm{ml} \)로 부유시켰다.</p><h2>림프구 증식반응</h2><p>림프구의 증식 측정은 \( \left[{ }^{3} \mathrm{H}\right] \)-thymidine (\( { }^{3} \mathrm{H}-\mathrm{TdR}\)) in-corporation 방법에 의해 시행할 것이다. 우선 림프구 부유액 \( 100 \mu\mathrm{I}(\mathrm{I} \times 10^{5} \text{cells})\)를 96-well round bottomed microplate (Corning, Rochester, NY)에 분주하고, \( 10 \mu \mathrm{g} / \mathrm{well}\)의 OVA를 첨가하여 4 일간 배양하였다. 배양 후 이 plate의 각 well에 \(10 \mu \mathrm{l}(1.0 \mu\) \(\mathrm{Ci}) \) 의 \( { }^{3} \mathrm{H}-\mathrm{TdR} \) (New England Nuclear, Boston, MA)을 첨가하고 6 시간 연장 배양하였다.</p><p>각 well에 배양된 세포들은 glass filter에 흡착시키고 beta counter로 \( { }^{3} \mathrm{H}-\mathrm{TdR} \) 의 조사량을 측정하여 세포의 증식 반응을 산정하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물 그룹핑과 실험절차</h2><p>본 연구목적을 달성하기 위하여 무 병원성 환경(pathogen free system)에서 사육한 생후 7주령의 BALE/c 마우스(female)를 H센타에서 구입하고 이들 마우스를 D대학교 실험동물실에서 사육하며 P기관과 협의하여 실험에 이용하였다.</p><p>본 연구의 실험은 2 단계로 구분하여 진행하였다. 우선 1 단계에서는 훈련기간에 따른 운동 유발성 알레르기 면역반응 및 기전을 확인하는 연구로 운동의 기간을 6 주 훈련군, 9 주 훈련군 및 12 주 훈련군으로 구분하였다. 알레르기 반응을 유발한 후 아나플락시스를 조사하고 세포를 분리하여 분석 및 실험하였다. 따라서 각 군당 20 마리씩 알레르기 유발 통제군 (S, sensitized, \(\mathrm{n}=20\)), 6주 훈련군(ST6, sensitized with 6 wk trained, \( \mathrm{n}=20 \)), 9주 훈련군(ST9, sensitized with 9 wk trained, \( \mathrm{n}=20 \) ) 및 12 주 훈련군(ST12, sensitized with 12 wk trained, \( \mathrm{n}=20 \)) 으로 구분하여 수영훈련 기간별 알레르기 반응을 유도하였을 때, 알레르기 아나플락시스를 조사하고 아울러 비장지수, 림프구 증식반응 및 복강과 비장세포에서 ROS를 함께 측정하였다. 이 때, 알레르기 아나플락시스는 그룹 당 15 마리를 사용하였고, 나머지는 세포분석과 ROS 측정을 위하여 사용하였다.</p><p>한편, 2 단계에서는 1 단계의 실험결과를 토대로 하여 운동 유발성 알레르기 아나플락시스가 가장 잘 유도되는 9 주와 12 주의 2군을 대상으로 수영훈련을 다시 수행하게 한 후 운동 유발성 알레르기를 유도하고 각각 catalase와 비타민 C 를 투여한 후 치료효과를 검증하였다. 따라서 2단계에서는 운동 유발성 알레르기가 잘 유도되는 9주 훈련군과 12 주 훈련군에서 그룹당 20마리씩 알레르기 통제군(S, sensitized; \( \mathrm{n}=20 \)), cata-lase 투여 훈련군(ST9C, sensitized with 9 weeks trained and catalase supplementation, \( \mathrm{n}=20\) ; \(\mathrm{ST} 12 \mathrm{C} \), sensitized with 12 weeks trained and catalase supplementation, \( \mathrm{n}=20 \) ) 및 비타민 C 투여 훈련군(ST9V, sensitized with 9 weeks trained and vitamin supplementation, \( \mathrm{n}=20\) ; \(\mathrm{ST} 12 \mathrm{~V} \), sensitized with 12 weeks trained and vitamin supplementation, \( \mathrm{n}=20 \) )으로 구분하여 1단계의 분석내용과 비교분석하였다. 특히, 투여 효과를 보기 위해서 1 단계 실험에서 차이가 크게 나타났던 복강세포를 사용하였고, 투여 후 복강세포의 ROS 생성을 함께 비교하였으며 아나플락시스 테스트(ASAS)를 함께하여 투여효과를 훈련기간에 따라 분석하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><p>본 연구에서는 BALB/c 마우스를 모델로 하여 알레르기 항원과 비 알레르기 항원이 면역계 세포들의 활성 산소종 생성에 미치는 효과와 활성 산소종 생성 조절에 따른 알레르기 면역반응의 변화를 관찰하고, 서로 다른 기간의 규칙적인 운동 활동을 수행한 개체에서 알레르기를 유발하여 운동 유발성 알레르기의 질환의 기전을 분석하였다. 아울러 운동 유발성 알레르기 치료제로서의 활성 산소종 생성 조절제들을 적용하여 전반적인 운동 유발성 알레르기 질환의 치료효과를 규명하는데 그 연구 목적이 있었으며 결과는 다음과 같다.</p><p>우선 1 차 연구결과에서 비장 지수는 Fig. 1에서 보는 것처럼 감작 통제군, 6 주 훈련 감작군, 9 주 훈련 감작군 및 12 주 감작 훈련군의 4군에서 통제군에 비해 모든 그룹에서 비장 지수가 증가함을 알 수 있었다. 증가의 양상은 훈련기간에 의존하여 증가함을 알 수 있었으며, 통제군에 비해 모든 군에서 통계적으로도 유의하게 증가함을 알 수 있었다 (\( \mathrm{p}<0.05 \)). 비장 지수가 증가한다는 사실은 훈련에 따라 림프구가 증가를 하여 면역화가 되었다는 것을 의미하는데, 본 연구결과는 비장지수가 비정상적으로 크게 증가하여 알레르기가 유도되었음을 나타내고 있다. 본 연구결과를 통하여 운동 유발성 알레르기 질환의 유발은 훈련기간이 늘어남에 따라 증가함을 알 수 있었다.</p><p>실험 후 각 그룹별 비장세포에서 림프구를 추출하여 셀 카운트 후 세포를 배양을 하고 세포배지와 OVA로 각각 자극한 후 세포수를 측정하였으며 그 결과는 Fig. 2에 나타나 있다.</p><p>Fig. 2에서 나타나 있는 것과 같이 in vitro에서 일반배지(media)로 자극하였을 때, 림프구의 수는 통제값과 비교하여, 현저히 증가하였고 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(\( \mathrm{p}<0.05 \)). 이는 훈련 자체가 림프구를 자극하였기 때문에 나타난 결과로 판단된다. 한편 OVA로 자극하였을 때에도 세포수가 현저하게 증가를 하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다 (\( \mathrm{p}<0.05 \)). 그리고 이러한 증가는 일반배지(media) 자극 시 보다 더욱 큰 값을 보였다. 이는 OVA로 감작된 세포에서 같은 자극에 대한 민감한 반응으로 의미있는 결과로 여겨진다.</p><p>림프구 자극반응 실험 후 운동 유발성 알레르기반응이 활성 산소와 연관성이 있는가를 보기위해 비장과 복강세포에서 ROS 를 측정하였고, 비장에서 측정된 ROS에 대한 결과가 Fig. 3 에 나타나 있다. 그림에서 보는 것과 같이 감작 통제군에 비해 훈련 감작군 모두에서 ROS의 증가가 나타나긴 하였지만 통계적으로 유의한 증가를 보이지 않아 본 연구결과 운동 유발성 알레르기 쇼크사와 비장세포에서 발현하는 ROS는 큰 연관이 없는 것으로 나타났다.</p><p>한편, 비장세포 뿐만이 아니라 복강세포에서 발현하는 ROS 의 결과를 분석한 결과 통제군에 비해 모든 군에서 유의한 증가를 나타내었고 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다 (\( \mathrm{p}<0.05 \)). 그리고 이러한 증가는 훈련기간과 직접적인 연관이 있는데, 훈련기간이 길어질수록 활성산소의 증가가 크게 나타남을 알 수 있었다. 이러한 결과는 훈련 후 아나플락시스 테스트의 결과 Fig. 5 와 같은 양상을 보인다. 따라서, 운동 유발성 알레르기 질환의 정도는 복강 림프구에서 발생하는 ROS의 양과 직접적인 연관성이 있음을 알 수 있다.</p> <p>이제까지 수행된 운동과 천식 및 알레르기 반응에 대한 연구로는 엘리트 운동선수들의 운동 유발성 기도수축에 미치는 효과를 분석하고 진단법을 제시한 연구, 운동 유발성 천식 환자에게 일어나는 기도수축과 증가된 비반세포(mast cell)가 알레르기 반응에 영향력을 미친다는 연구, 올림픽선수를 포함하는 엘리트 선수들과 일반 달리기 동호인을 대상으로 천식과 알레르기를 비교한 결과 엘리트 못지않게 많은 동호인들이 운동 유발성 천식과 알레르기 증세를 호소하지만 동호인들은 치료나 처방이 부족하다는 연구, 달리기 운동을 수행한 아동들을 대상으로 한 심호흡 운동이 운동 유발성 천식에 효과 있다는 연구 및 운동 유발성 알레르기 환자들에게 효과적인 관리가 필요하다는 연구 등이 있었다.</p><p>특히, 최근 운동 유발성 알레르기 아나플락시스(anaphylaxis) 기전에 대한 연구결과가 보고되었는데, 이 연구는 꾸준히 수영훈련을 한 개체에서 알레르기를 유도하였을 때 통제군에 비해 알레르기 아나플락시스가 더 잘 일어난다는 것을 주장하고 있으며, 이는 훈련군에서 Th2 세포의 증식이 더 잘 일어났기 때문이며, Th2 세포의 증식을 유도하는 싸이토카인이 더 발달되었기 때문이라고 주장하고 있다.</p><p>이와 같이 운동 유발성 알레르기 면역반응의 기전들은 일부 밝혀지고 있으나 동일 알레르겐에 대한 면역반응의 유발이 개체에 따라 다르게 나타나고, 또한 알레르기 반응 양상도 개체에 따라 다르게 나타나는 원인에 대해서는 국내 뿐 아니라 해외에서도 연구가 미미한 실정이다. 또한 현재까지 운동 유발성 천식 및 운동유발성 알레르기 면역반응에 대한 과학적인 연구가 미미한 상태이며, 수행된 대부분의 연구들은 운동 유발성 알레르기 질환의 증상과 항 히스타민 치료에 대한 연구가 주를 이루고 있다.</p><p>1998년도 미국 올림픽 운동선수들에 대한 천식과 알레르기 보고에서 설문에 응답한 운동선수 699명 중에 \( 15.3 \% \) 인 107 명이 이전에 운동 유발성 천식을 포함하는 알레르기 경험을 호소하였고, \( 13.9 \% \) 인 97 명의 운동선수들이 이로 인한 약물을 사용하고 있다고 밝히고 있어 이 분야에 대한 기전적이고도 심도있는 연구가 절실히 요구되고 있다. 그러나 이제까지 활성 산소종을 중심으로 하여 운동 유발성 알레르기 질환에 대한 기전적 영향, 발생기전 및 처치에 관한 전반적인 연구는 국 내 • 외적으로 미미한 실정에 있다.</p><p>따라서 본 연구에서는 BALB/c 마우스를 모델로 하여 알레르기 항원과 비 알레르기 항원이 면역계 세포들의 활성 산소종 생성에 미치는 효과와 활성 산소종 생성 조절에 따른 알레르기 면역반응의 변화를 관찰하고, 서로 다른 기간의 규칙적인 운동 활동을 수행한 개체에서 알레르기를 유발하여 운동 유발성 알레르기 질환의 기전을 분석하고, 아울러 운동 유발성 알레르기 치료제로서의 활성 산소종 생성 조절제들을 적용하여 전반적인 운동 유발성 알레르기 질환의 치료효과를 규명하는데 그 연구 목적이 있다.</p> <h1>서 론</h1><p>전 세계적으로 알레르기 환자는 늘어나고 있으며, 알레르기를 유발하는 원인으로 음식, 환경, 스트레스 및 운동 등 다양한 것이 밝혀지고 있다.</p><p>오늘날 면역학의 발전으로 알레르기 면역반응의 기전들이 밝혀지고 있으나, 동일 알레르겐(allergen)에 대한 면역반응의 유발이 개체에 따라 다르고 알레르기 반응양상도 개체에 따라 다르게 나타나기 때문에 연구의 어려움이 있다.</p><p>최근 연구에 따르면 천식을 포함하는 알레르기 반응이 운동 활동의 경험에 따라서 다른 양상으로 나타나는데, 이는 운동이 T 림프구의 증식을 유도하여 면역력을 증가시켜 주기는 하나 비균형적인 증식을 유도하기 때문으로 제안되고 있다. 더욱이 이러한 반응이 활성 산소종(reactive oxygen spe-cies: ROS)의 발생을 포함하는 산화-항산화 반응과 밀접하게 관련 있음이 밝혀짐에 따라 이 분야에 대한 연구가 주목된다.</p><p>면역계와 관련하여 세포내에서 생성되는 활성 산소종들이 제 2의 신호 전달자로 작용되어 세포의 노화와 아폽토우시스 (apoptosis)를 유도하지만 T림프구를 활성화 시키고, 항원전달세포(antigen presenting cell)인 수지상세포(dendritic cell)의 세포표면 분자들인 조직적합항원(MHC Class >Ⅱ mole-cules)과 보조 자극자(co-stimulatory molecules)인 CD40 및 CD86 등의 발현을 증가시킴으로 T 림프구의 증식을 유발시키는 것으로도 보고되고 있다.</p><p>알레르기 항원에 대한 면역반응에서 항원전달세포의 CD86과 T 림프구의 CD28의 상호작용이 Th2 세포의 활성화를 증진시키고 B 림프구의 IgE 생성과 호산구(eosinophil)의 보강(recruitment)에 매우 중요한 역할을 한다는 연구결과들로 미루어 보았을 때, 활성 산소종 생성의 조절은 알레르기 항원에 대한 면역반응을 조절할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.</p><p>특히, 활성 산소종은 운동 활동과도 직접적인 상호작용을 하는 것으로 알려져 있다. 규칙적인 훈련을 한 실험집단의 경우, 안정 시 비장세포와 복강세포에서 생성되는 활성 산소종이 전반적으로 높게 나타나고 반대로 상당한 운동 스트레스를 받을 경우에는 훈련을 하지 않은 집단에 비해 활성 산소종이 상대적으로 적게 올라가는 것으로 보고되고 있다. 이는 훈련된 상태에 따라서 다른 양상으로 나타나는데, 비 훈련군에 서는 활성 산소종이 생성되면 세포에 상당한 스트레스를 주어 면역력이 감소하는 현상을 나타내지만 훈련군에서는 체계화된 항산화 효소가 활성 산소종의 유해성을 막아주기 때문으로 해석할 수 있다.</p><p>하지만 격렬한 운동을 하는 운동선수들의 경우 운동 유발성 천식(exercise-induced asthma: EIA)으로 인하여 훈련과 시합이 중단되는 경험을 하기도 한다. 그러나 운동 유발성 천식의 증상이 일시적이고, 이에 대한 체계적인 연구가 진행되지 않고 있어 운동선수들에게 심각한 문제로 여겨지고 있다. 일반적으로 격렬한 운동을 하는 많은 운동선수들이 알레르기 질환 중 하나인 천식으로 고생하고 있는데, 이는 운동 자체가 과 호흡을 일으키고 그로인한 폐에서의 수분과 온도의 감소가 기도를 수축하게 하여 천식현상이 일어나는 것으로 알려져있다. 또한 운동으로 유발되는 과 호흡은 과다한 활성 산소종을 발생시키고, 인체의 항산화 체제 불균형을 유발하여 해를 끼치게 된다.</p> <p>마지막으로 운동 유발성 알레르기 쇼크를 나타내는 아나플락시스(ASAS)를 실험한 결과 운동유발성 알레르기 반응은 복강 ROS의 결과와 유사한 경향을 보이며 증가하였고 통제군에 비해 모든 군에서 증가하여 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다( \(\mathrm{p}<0.05\)). 알레르기 쇼크사의 정도도 훈련의 기간과 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었고, 증가의 정도는 복강 ROS보다 더 큰 값을 보임을 알 수 있었다.</p><p>이러한 1단계 연구결과를 바탕으로 본 연구자는 투여 효과를 검증하기 위해 알레르기 쇼크사가 잘 유발되는 9주와 12주 군을 선택하여 2차 실험을 진행하였다.</p><p>2 차 실험에서는 1 차 실험과 같이 9주와 12 주간 훈련을 실시한 후 각각 비타민과 catalase를 투여하였는데, 실험결과 우선 9주군의 ROS 값은 통제군에 비해 catalase 투여 시 거의 같은 값을 보여 투여효과가 나타나지 않은 반면에 비타민 투여 시 ROS값이 현저하게 감소하여 통계적으로도 유의한 차이를 보였다 \(\mathrm{p}<0.05\)).</p><p>따라서 9주 훈련군에서 ROS를 감소시키기 위하여 catalase 투여는 효과가 없었으나 비타민투여는 효과적임을 알 수 있었다. 그리고 9주군의 ASAS는 Fig. 7에 나타난 것과 같이 cata-lase는 효과가 없었으나 비타민은 효과적임을 알 수 있었다. 이는 ROS와 비슷한 양상을 보였고 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다 (\(\mathrm{p}<0.05\)).</p><p>한편, 12 주간 훈련군에서 복강 ROS값은 catalase 처치군에서는 별 다른 차이를 보이지 않았으나 비타민 투여군에서는 통계적으로 유의하게 감소함을 알 수 있었다(p<0.05). 이러한 결과는 9주군과 같은 결과를 나타내었으며, 알레르기 치료효과에 대한 훈련의 정도는 큰 차이를 나타내지 않음을 알 수 있었고 catalase투여 보다는 비타민 투여가 운동유발성 알레르기 치료에 효과적임을 나타내고 있다.</p><p>그리고 12 주간 훈련군에서 ASAS값도 비타민 투여군에서 통계적으로 현저한 감소를 나타내었고 9주군과 비슷한 양상을 보였다. 그리고 복강 ROS값의 패턴과 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 훈련의 기간에 따른 투여효과의 차이는 나타나지 않았으며, 운동유발성 알레르기를 치료하기 위해선 catalase를 투여하는 것 보다 비타민을 투여하는 것이 더욱 효과적임을 알 수 있엇다.</p> <h2>복강추출세포 및 비장 림프구에 의해 생성된 ROS 측정</h2><p>완전배지에 \( 5 \times 10^{5} \mathrm{cells}/\mathrm{ml}\)로 부유시킨 비장 림프구와 복강 추출세포 부유액 \( 500 \mu 1 \) 에 \( 1 \mathrm{mM} \) 5-(and-6)-chloromethyl-\( 2^{\prime} \), \( 7^{\prime} \)-dichlorodihydro-fluorescein diacetate (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)를 \( 5 \mu \mathrm{l} \) 에 첨가하여 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \(5 \% \) \( \mathrm{CO}_{2} \) 항온항습기에서 10 분간 배양하고 ice에 넣어 반응을 중지시키고 유세포 분석기(FACscan, Becton dickinson)를 이용하여 fluorescence를 측정하여 중앙값으로 나타내었다.</p><h2>실험동물의 수영훈련</h2><p>실험동물의 사육실은 clean 사육실로서 온도 \( 22 \pm 2^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 50 \pm 5 \% \), 소음(\(40-50 \mathrm{Phon}\) 이하) 및 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 제어되도록 하였다. 무균음료 및 멸균사료를 자유롭게 섭취시켰다. 훈련군으로 분류된 실험동물은 1 주간의 환경적응과 1 주간의 수영 적응훈련기간을 가진 후 적응여부를 가려, 8 주 동안 주 5회(1회에 50분간) 훈련을 실시하였다. 본 실험의 수영 적응훈련으로는 주 5 회를 같은 시간에 최초 10 분부터 30 분까지 매일 5 분간 시간을 점증적으로 증가시키며 실시하고, 본 훈련 8 주 동안은 같은 시간에 50 분간의 수영을 주 5회 실시했다. 이 때, 사용된 pool은 \( 70 \times 70 \times 60 \mathrm{~cm} \) 규격을 사용하며 수온은 섭씨 \( 26\)~\(28\) \( ^{\circ} \mathrm{C} \)를 유지하도록 했다. 한편, 통제군은 훈련군이 훈련을 하는 동안 같은 수조 내의 같은 수온에 몸만 잠기게 통제하였다.</p><h2>실험동물 희생</h2><p>적응훈련과 본 훈련이 끝난 실험동물들은 동물 수술실 도착 후, 충분한 안정을 취한 뒤 마취제 에틸에테르를 이용하여 마취시키고, 복부를 절개하여 복부 대정맥에서 정맥혈 \( 1 \mathrm{ml} \) 를 채취하였다.</p><h2>통계처리</h2><p>본 연구에서 얻은 자료의 통계처리는 SPSS 통계 package를 이용하여 기술 통계량을 산출하고, 통계치의 유의성은 항목별 one-way ANOVA로 분석였으며 그룹간의 의의는 DUNCAN으로 사후 검증하였다 (\( \mathrm{p}<0.05 \)).</p>	생명과학	[ "<h2>알레르기 유도 및 판정</h2><p>마우스에게 알레르기 면역반응을 유도하기 위하여, OVA 를 adjuvant인 aluminium hydroxide (\\(20 \\mu \\mathrm{g} / \\text{마우스}\\)) 및 Bordetella pertussis 사균 부유액 (\\( 1 \\times 10^{9} \\) bacteria/마우스)과 혼합하여 마우스 복강으로 1회 투여하였고, 이때 투여된 OVA의 양은 선행연구의 결과에 따라 알레르기가 잘 유발되는 용량인 마우스당 \\( 1 \\mathrm{mg} \\) 이 되도록 하였다.", "OVA 에 대한 알레르기 유발의 판정은 OVA로 감작 시킨 후 15 일째 OVA(\\(100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{mouse}\\)) 를 마우스 꼬리정맥으로 투여하고(i.v.) Haffner 의 방법에 준하여 알레르기 유발을 판정하였다.", "</p><h2>비장 Index의 측정</h2><p>알레르기 면역감작 후 감작된 정도를 비교하기 위하여 Chandra와 그의 동료들에 의한 연구방법에 따라 spleen in-dex를 측정하였고, 이 방법으로 비장의 크기에 따라 면역력이 이루어진 정도를 비교하고 알레르기가 유도될 때 비장의 크기가 병적으로 커지는 지에 대하여 알아보았다.", "</p><p>* spleen index=spleen weight/animal weight</p><h2>복강의 대식세포와 비장의 T 림프구 및 B 림프구의 분리</h2><p>복강의 대식세포를 분리하기 위하여, 수영훈련 기간별 훈련된 마우스를 \\( \\mathrm{CO}_{2} \\) gas로 희생시키고, RPMI 1640 배지 (\\( 2 \\mathrm{mM} \\) L-glutamine, \\( 2.2 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) sodium bicarbonate, \\(100 \\mathrm{units} / \\mathrm{ml} \\) penicillin, \\( 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) streptomycine, 및 \\( 2 \\mathrm{mM} \\) HEPES buffer 가 첨가됨) \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 를 \\( 10 \\mathrm{ml} \\) 주사기(18 gauge needle)에 넣어 마우스 복강 내로 2-3회 주사하고 복강 세척액을 채취하였다.", "이 세척액에서 세포를 분리하여 우태아 혈청이 \\( 10 \\% \\) 함유된 RPMI 배지(이후 완전 배지로 칭함)에 부유시킨 (\\( 1 \\times 10^{6} \\mathrm{cells}/\\mathrm{ml}\\)) 후 \\( 75 \\mathrm{~cm}^{2} \\) culture flask에 넣어 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(5 \\%\\) \\(\\mathrm{CO}_{2} \\) 항원 항습기에서 3 시간 동안 배양하였다.", "</p><p>배양 후 culture flask로부터 flask 표면에 부착되지 않은 세포는 RPMI 1640 배지로 3회 세척하여 제거하고 flask 표면에 부착된 세포는 차가운 배지와 rubber policeman을 이용하여 flask로부터 때어내어 완전배지에 \\( 1 \\times 10^{6} \\mathrm{cells}/ \\mathrm{ml} \\)로 부유시켰다.", "</p><h2>림프구 증식반응</h2><p>림프구의 증식 측정은 \\( \\left[{ }^{3} \\mathrm{H}\\right] \\)-thymidine (\\( { }^{3} \\mathrm{H}-\\mathrm{TdR}\\)) in-corporation 방법에 의해 시행할 것이다.", "우선 림프구 부유액 \\( 100 \\mu\\mathrm{I}(\\mathrm{I} \\times 10^{5} \\text{cells})\\)를 96-well round bottomed microplate (Corning, Rochester, NY)에 분주하고, \\( 10 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{well}\\)의 OVA를 첨가하여 4 일간 배양하였다.", "배양 후 이 plate의 각 well에 \\(10 \\mu \\mathrm{l}(1.0 \\mu\\) \\(\\mathrm{Ci}) \\) 의 \\( { }^{3} \\mathrm{H}-\\mathrm{TdR} \\) (New England Nuclear, Boston, MA)을 첨가하고 6 시간 연장 배양하였다.", "</p><p>각 well에 배양된 세포들은 glass filter에 흡착시키고 beta counter로 \\( { }^{3} \\mathrm{H}-\\mathrm{TdR} \\) 의 조사량을 측정하여 세포의 증식 반응을 산정하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>실험동물 그룹핑과 실험절차</h2><p>본 연구목적을 달성하기 위하여 무 병원성 환경(pathogen free system)에서 사육한 생후 7주령의 BALE/c 마우스(female)를 H센타에서 구입하고 이들 마우스를 D대학교 실험동물실에서 사육하며 P기관과 협의하여 실험에 이용하였다.", "</p><p>본 연구의 실험은 2 단계로 구분하여 진행하였다.", "우선 1 단계에서는 훈련기간에 따른 운동 유발성 알레르기 면역반응 및 기전을 확인하는 연구로 운동의 기간을 6 주 훈련군, 9 주 훈련군 및 12 주 훈련군으로 구분하였다.", "알레르기 반응을 유발한 후 아나플락시스를 조사하고 세포를 분리하여 분석 및 실험하였다.", "따라서 각 군당 20 마리씩 알레르기 유발 통제군 (S, sensitized, \\(\\mathrm{n}=20\\)), 6주 훈련군(ST6, sensitized with 6 wk trained, \\( \\mathrm{n}=20 \\)), 9주 훈련군(ST9, sensitized with 9 wk trained, \\( \\mathrm{n}=20 \\) ) 및 12 주 훈련군(ST12, sensitized with 12 wk trained, \\( \\mathrm{n}=20 \\)) 으로 구분하여 수영훈련 기간별 알레르기 반응을 유도하였을 때, 알레르기 아나플락시스를 조사하고 아울러 비장지수, 림프구 증식반응 및 복강과 비장세포에서 ROS를 함께 측정하였다.", "이 때, 알레르기 아나플락시스는 그룹 당 15 마리를 사용하였고, 나머지는 세포분석과 ROS 측정을 위하여 사용하였다.", "</p><p>한편, 2 단계에서는 1 단계의 실험결과를 토대로 하여 운동 유발성 알레르기 아나플락시스가 가장 잘 유도되는 9 주와 12 주의 2군을 대상으로 수영훈련을 다시 수행하게 한 후 운동 유발성 알레르기를 유도하고 각각 catalase와 비타민 C 를 투여한 후 치료효과를 검증하였다.", "따라서 2단계에서는 운동 유발성 알레르기가 잘 유도되는 9주 훈련군과 12 주 훈련군에서 그룹당 20마리씩 알레르기 통제군(S, sensitized; \\( \\mathrm{n}=20 \\)), cata-lase 투여 훈련군(ST9C, sensitized with 9 weeks trained and catalase supplementation, \\( \\mathrm{n}=20\\) ; \\(\\mathrm{ST} 12 \\mathrm{C} \\), sensitized with 12 weeks trained and catalase supplementation, \\( \\mathrm{n}=20 \\) ) 및 비타민 C 투여 훈련군(ST9V, sensitized with 9 weeks trained and vitamin supplementation, \\( \\mathrm{n}=20\\) ; \\(\\mathrm{ST} 12 \\mathrm{~V} \\), sensitized with 12 weeks trained and vitamin supplementation, \\( \\mathrm{n}=20 \\) )으로 구분하여 1단계의 분석내용과 비교분석하였다.", "특히, 투여 효과를 보기 위해서 1 단계 실험에서 차이가 크게 나타났던 복강세포를 사용하였고, 투여 후 복강세포의 ROS 생성을 함께 비교하였으며 아나플락시스 테스트(ASAS)를 함께하여 투여효과를 훈련기간에 따라 분석하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><p>본 연구에서는 BALB/c 마우스를 모델로 하여 알레르기 항원과 비 알레르기 항원이 면역계 세포들의 활성 산소종 생성에 미치는 효과와 활성 산소종 생성 조절에 따른 알레르기 면역반응의 변화를 관찰하고, 서로 다른 기간의 규칙적인 운동 활동을 수행한 개체에서 알레르기를 유발하여 운동 유발성 알레르기의 질환의 기전을 분석하였다.", "아울러 운동 유발성 알레르기 치료제로서의 활성 산소종 생성 조절제들을 적용하여 전반적인 운동 유발성 알레르기 질환의 치료효과를 규명하는데 그 연구 목적이 있었으며 결과는 다음과 같다.", "</p><p>우선 1 차 연구결과에서 비장 지수는 Fig.", "1에서 보는 것처럼 감작 통제군, 6 주 훈련 감작군, 9 주 훈련 감작군 및 12 주 감작 훈련군의 4군에서 통제군에 비해 모든 그룹에서 비장 지수가 증가함을 알 수 있었다.", "증가의 양상은 훈련기간에 의존하여 증가함을 알 수 있었으며, 통제군에 비해 모든 군에서 통계적으로도 유의하게 증가함을 알 수 있었다", "(\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)).", "비장 지수가 증가한다는 사실은 훈련에 따라 림프구가 증가를 하여 면역화가 되었다는 것을 의미하는데, 본 연구결과는 비장지수가 비정상적으로 크게 증가하여 알레르기가 유도되었음을 나타내고 있다.", "본 연구결과를 통하여 운동 유발성 알레르기 질환의 유발은 훈련기간이 늘어남에 따라 증가함을 알 수 있었다.", "</p><p>실험 후 각 그룹별 비장세포에서 림프구를 추출하여 셀 카운트 후 세포를 배양을 하고 세포배지와 OVA로 각각 자극한 후 세포수를 측정하였으며 그 결과는 Fig.", "2에 나타나 있다.", "</p><p>Fig.", "2에서 나타나 있는 것과 같이 in vitro에서 일반배지(media)로 자극하였을 때, 림프구의 수는 통제값과 비교하여, 현저히 증가하였고 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다", "(\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)).", "이는 훈련 자체가 림프구를 자극하였기 때문에 나타난 결과로 판단된다.", "한편 OVA로 자극하였을 때에도 세포수가 현저하게 증가를 하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다", "(\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)).", "그리고 이러한 증가는 일반배지(media) 자극 시 보다 더욱 큰 값을 보였다.", "이는 OVA로 감작된 세포에서 같은 자극에 대한 민감한 반응으로 의미있는 결과로 여겨진다.", "</p><p>림프구 자극반응 실험 후 운동 유발성 알레르기반응이 활성 산소와 연관성이 있는가를 보기위해 비장과 복강세포에서 ROS 를 측정하였고, 비장에서 측정된 ROS에 대한 결과가 Fig.", "3 에 나타나 있다.", "그림에서 보는 것과 같이 감작 통제군에 비해 훈련 감작군 모두에서 ROS의 증가가 나타나긴 하였지만 통계적으로 유의한 증가를 보이지 않아 본 연구결과 운동 유발성 알레르기 쇼크사와 비장세포에서 발현하는 ROS는 큰 연관이 없는 것으로 나타났다.", "</p><p>한편, 비장세포 뿐만이 아니라 복강세포에서 발현하는 ROS 의 결과를 분석한 결과 통제군에 비해 모든 군에서 유의한 증가를 나타내었고 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다", "(\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)).", "그리고 이러한 증가는 훈련기간과 직접적인 연관이 있는데, 훈련기간이 길어질수록 활성산소의 증가가 크게 나타남을 알 수 있었다.", "이러한 결과는 훈련 후 아나플락시스 테스트의 결과 Fig.", "5 와 같은 양상을 보인다.", "따라서, 운동 유발성 알레르기 질환의 정도는 복강 림프구에서 발생하는 ROS의 양과 직접적인 연관성이 있음을 알 수 있다.", "</p> <p>이제까지 수행된 운동과 천식 및 알레르기 반응에 대한 연구로는 엘리트 운동선수들의 운동 유발성 기도수축에 미치는 효과를 분석하고 진단법을 제시한 연구, 운동 유발성 천식 환자에게 일어나는 기도수축과 증가된 비반세포(mast cell)가 알레르기 반응에 영향력을 미친다는 연구, 올림픽선수를 포함하는 엘리트 선수들과 일반 달리기 동호인을 대상으로 천식과 알레르기를 비교한 결과 엘리트 못지않게 많은 동호인들이 운동 유발성 천식과 알레르기 증세를 호소하지만 동호인들은 치료나 처방이 부족하다는 연구, 달리기 운동을 수행한 아동들을 대상으로 한 심호흡 운동이 운동 유발성 천식에 효과 있다는 연구 및 운동 유발성 알레르기 환자들에게 효과적인 관리가 필요하다는 연구 등이 있었다.", "</p><p>특히, 최근 운동 유발성 알레르기 아나플락시스(anaphylaxis) 기전에 대한 연구결과가 보고되었는데, 이 연구는 꾸준히 수영훈련을 한 개체에서 알레르기를 유도하였을 때 통제군에 비해 알레르기 아나플락시스가 더 잘 일어난다는 것을 주장하고 있으며, 이는 훈련군에서 Th2 세포의 증식이 더 잘 일어났기 때문이며, Th2 세포의 증식을 유도하는 싸", "이토카인이 더 발달되었기 때문이라고 주장하고 있다.", "</p><p>이와 같이 운동 유발성 알레르기 면역반응의 기전들은 일부 밝혀지고 있으나 동일 알레르겐에 대한 면역반응의 유발이 개체에 따라 다르게 나타나고, 또한 알레르기 반응 양상도 개체에 따라 다르게 나타나는 원인에 대해서는 국내 뿐 아니라 해외에서도 연구가 미미한 실정이다.", "또한 현재까지 운동 유발성 천식 및 운동유발성 알레르기 면역반응에 대한 과학적인 연구가 미미한 상태이며, 수행된 대부분의 연구들은 운동 유발성 알레르기 질환의 증상과 항 히스타민 치료에 대한 연구가 주를 이루고 있다.", "</p><p>1998년도 미국 올림픽 운동선수들에 대한 천식과 알레르기 보고에서 설문에 응답한 운동선수 699명 중에 \\( 15.3 \\% \\) 인 107 명이 이전에 운동 유발성 천식을 포함하는 알레르기 경험을 호소하였고, \\( 13.9 \\% \\) 인 97 명의 운동선수들이 이로 인한 약물을 사용하고 있다고 밝히고 있어 이 분야에 대한 기전적이고도 심도있는 연구가 절실히 요구되고 있다.", "그러나 이제까지 활성 산소종을 중심으로 하여 운동 유발성 알레르기 질환에 대한 기전적 영향, 발생기전 및 처치에 관한 전반적인 연구는 국 내 • 외적으로 미미한 실정에 있다.", "</p><p>따라서 본 연구에서는 BALB/c 마우스를 모델로 하여 알레르기 항원과 비 알레르기 항원이 면역계 세포들의 활성 산소종 생성에 미치는 효과와 활성 산소종 생성 조절에 따른 알레르기 면역반응의 변화를 관찰하고, 서로 다른 기간의 규칙적인 운동 활동을 수행한 개체에서 알레르기를 유발하여 운동 유발성 알레르기 질환의 기전을 분석하고, 아울러 운동 유발성 알레르기 치료제로서의 활성 산소종 생성 조절제들을 적용하여 전반적인 운동 유발성 알레르기 질환의 치료효과를 규명하는데 그 연구 목적이 있다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>전 세계적으로 알레르기 환자는 늘어나고 있으며, 알레르기를 유발하는 원인으로 음식, 환경, 스트레스 및 운동 등 다양한 것이 밝혀지고 있다.", "</p><p>오늘날 면역학의 발전으로 알레르기 면역반응의 기전들이 밝혀지고 있으나, 동일 알레르겐(allergen)에 대한 면역반응의 유발이 개체에 따라 다르고 알레르기 반응양상도 개체에 따라 다르게 나타나기 때문에 연구의 어려움이 있다.", "</p><p>최근 연구에 따르면 천식을 포함하는 알레르기 반응이 운동 활동의 경험에 따라서 다른 양상으로 나타나는데, 이는 운동이 T 림프구의 증식을 유도하여 면역력을 증가시켜 주기는 하나 비균형적인 증식을 유도하기 때문으로 제안되고 있다.", "더욱이 이러한 반응이 활성 산소종(reactive oxygen spe-cies: ROS)의 발생을 포함하는 산화-항산화 반응과 밀접하게 관련 있음이 밝혀짐에 따라 이 분야에 대한 연구가 주목된다.", "</p><p>면역계와 관련하여 세포내에서 생성되는 활성 산소종들이 제 2의 신호 전달자로 작용되어 세포의 노화와 아폽토우시스 (apoptosis)를 유도하지만 T림프구를 활성화 시키고, 항원전달세포(antigen presenting cell)인 수지상세포(dendritic cell)의 세포표면 분자들인 조직적합항원(MHC Class >Ⅱ mole-cules)과 보조 자극자(co-stimulatory molecules)인 CD40 및 CD86 등의 발현을 증가시킴으로 T 림프구의 증식을 유발시키는 것으로도 보고되고 있다.", "</p><p>알레르기 항원에 대한 면역반응에서 항원전달세포의 CD86과 T 림프구의 CD28의 상호작용이 Th2 세포의 활성화를 증진시키고 B 림프구의 IgE 생성과 호산구(eosinophil)의 보강(recruitment)에 매우 중요한 역할을 한다는 연구결과들로 미루어 보았을 때, 활성 산소종 생성의 조절은 알레르기 항원에 대한 면역반응을 조절할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.", "</p><p>특히, 활성 산소종은 운동 활동과도 직접적인 상호작용을 하는 것으로 알려져 있다.", "규칙적인 훈련을 한 실험집단의 경우, 안정 시 비장세포와 복강세포에서 생성되는 활성 산소종이 전반적으로 높게 나타나고 반대로 상당한 운동 스트레스를 받을 경우에는 훈련을 하지 않은 집단에 비해 활성 산소종이 상대적으로 적게 올라가는 것으로 보고되고 있다.", "이는 훈련된 상태에 따라서 다른 양상으로 나타나는데, 비 훈련군에 서는 활성 산소종이 생성되면 세포에 상당한 스트레스를 주어 면역력이 감소하는 현상을 나타내지만 훈련군에서는 체계화된 항산화 효소가 활성 산소종의 유해성을 막아주기 때문으로 해석할 수 있다.", "</p><p>하지만 격렬한 운동을 하는 운동선수들의 경우 운동 유발성 천식(exercise-induced asthma: EIA)으로 인하여 훈련과 시합이 중단되는 경험을 하기도 한다.", "그러나 운동 유발성 천식의 증상이 일시적이고, 이에 대한 체계적인 연구가 진행되지 않고 있어 운동선수들에게 심각한 문제로 여겨지고 있다.", "일반적으로 격렬한 운동을 하는 많은 운동선수들이 알레르기 질환 중 하나인 천식으로 고생하고 있는데, 이는 운동 자체가 과 호흡을 일으키고 그로인한 폐에서의 수분과 온도의 감소가 기도를 수축하게 하여 천식현상이 일어나는 것으로 알려져있다.", "또한 운동으로 유발되는 과 호흡은 과다한 활성 산소종을 발생시키고, 인체의 항산화 체제 불균형을 유발하여 해를 끼치게 된다.", "</p> <p>마지막으로 운동 유발성 알레르기 쇼크를 나타내는 아나플락시스(ASAS)를 실험한 결과 운동유발성 알레르기 반응은 복강 ROS의 결과와 유사한 경향을 보이며 증가하였고 통제군에 비해 모든 군에서 증가하여 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다", "( \\(\\mathrm{p}<0.05\\)).", "알레르기 쇼크사의 정도도 훈련의 기간과 밀접한 연관이 있음을 알 수 있었고, 증가의 정도는 복강 ROS보다 더 큰 값을 보임을 알 수 있었다.", "</p><p>이러한 1단계 연구결과를 바탕으로 본 연구자는 투여 효과를 검증하기 위해 알레르기 쇼크사가 잘 유발되는 9주와 12주 군을 선택하여 2차 실험을 진행하였다.", "</p><p>2 차 실험에서는 1 차 실험과 같이 9주와 12 주간 훈련을 실시한 후 각각 비타민과 catalase를 투여하였는데, 실험결과 우선 9주군의 ROS 값은 통제군에 비해 catalase 투여 시 거의 같은 값을 보여 투여효과가 나타나지 않은 반면에 비타민 투여 시 ROS값이 현저하게 감소하여 통계적으로도 유의한 차이를 보였다 \\", "(\\mathrm{p}<0.05\\)).", "</p><p>따라서 9주 훈련군에서 ROS를 감소시키기 위하여 catalase 투여는 효과가 없었으나 비타민투여는 효과적임을 알 수 있었다.", "그리고 9주군의 ASAS는 Fig.", "7에 나타난 것과 같이 cata-lase는 효과가 없었으나 비타민은 효과적임을 알 수 있었다.", "이는 ROS와 비슷한 양상을 보였고 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다", "(\\(\\mathrm{p}<0.05\\)).", "</p><p>한편, 12 주간 훈련군에서 복강 ROS값은 catalase 처치군에서는 별 다른 차이를 보이지 않았으나 비타민 투여군에서는 통계적으로 유의하게 감소함을 알 수 있었다", "(p<0.05).", "이러한 결과는 9주군과 같은 결과를 나타내었으며, 알레르기 치료효과에 대한 훈련의 정도는 큰 차이를 나타내지 않음을 알 수 있었고 catalase투여 보다는 비타민 투여가 운동유발성 알레르기 치료에 효과적임을 나타내고 있다.", "</p><p>그리고 12 주간 훈련군에서 ASAS값도 비타민 투여군에서 통계적으로 현저한 감소를 나타내었고 9주군과 비슷한 양상을 보였다.", "그리고 복강 ROS값의 패턴과 유사한 경향을 나타내었다.", "따라서 훈련의 기간에 따른 투여효과의 차이는 나타나지 않았으며, 운동유발성 알레르기를 치료하기 위해선 catalase를 투여하는 것 보다 비타민을 투여하는 것이 더욱 효과적임을 알 수 있엇다.", "</p> <h2>복강추출세포 및 비장 림프구에 의해 생성된 ROS 측정</h2><p>완전배지에 \\( 5 \\times 10^{5} \\mathrm{cells}/\\mathrm{ml}\\)로 부유시킨 비장 림프구와 복강 추출세포 부유액 \\( 500 \\mu 1 \\) 에 \\( 1 \\mathrm{mM} \\) 5-(and-6)-chloromethyl-\\( 2^{\\prime} \\), \\( 7^{\\prime} \\)-dichlorodihydro-fluorescein diacetate (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)를 \\( 5 \\mu \\mathrm{l} \\) 에 첨가하여 혼합한 후 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C}\\), \\(5 \\% \\) \\( \\mathrm{CO}_{2} \\) 항온항습기에서 10 분간 배양하고 ice에 넣어 반응을 중지시키고 유세포 분석기(FACscan, Becton dickinson)를 이용하여 fluorescence를 측정하여 중앙값으로 나타내었다.", "</p><h2>실험동물의 수영훈련</h2><p>실험동물의 사육실은 clean 사육실로서 온도 \\( 22 \\pm 2^{\\circ} \\mathrm{C} \\), 습도 \\( 50 \\pm 5 \\% \\), 소음(\\(40-50 \\mathrm{Phon}\\) 이하) 및 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 제어되도록 하였다.", "무균음료 및 멸균사료를 자유롭게 섭취시켰다.", "훈련군으로 분류된 실험동물은 1 주간의 환경적응과 1 주간의 수영 적응훈련기간을 가진 후 적응여부를 가려, 8 주 동안 주 5회(1회에 50분간) 훈련을 실시하였다.", "본 실험의 수영 적응훈련으로는 주 5 회를 같은 시간에 최초 10 분부터 30 분까지 매일 5 분간 시간을 점증적으로 증가시키며 실시하고, 본 훈련 8 주 동안은 같은 시간에 50 분간의 수영을 주 5회 실시했다.", "이 때, 사용된 pool은 \\( 70 \\times 70 \\times 60 \\mathrm{~cm} \\) 규격을 사용하며 수온은 섭씨 \\( 26\\)~\\(28\\) \\( ^{\\circ} \\mathrm{C} \\)를 유지하도록 했다.", "한편, 통제군은 훈련군이 훈련을 하는 동안 같은 수조 내의 같은 수온에 몸만 잠기게 통제하였다.", "</p><h2>실험동물 희생</h2><p>적응훈련과 본 훈련이 끝난 실험동물들은 동물 수술실 도착 후, 충분한 안정을 취한 뒤 마취제 에틸에테르를 이용하여 마취시키고, 복부를 절개하여 복부 대정맥에서 정맥혈 \\( 1 \\mathrm{ml} \\) 를 채취하였다.", "</p><h2>통계처리</h2><p>본 연구에서 얻은 자료의 통계처리는 SPSS 통계 package를 이용하여 기술 통계량을 산출하고, 통계치의 유의성은 항목별 one-way ANOVA로 분석였으며 그룹간의 의의는 DUNCAN으로 사후 검증하였다", "(\\( \\mathrm{p}<0.05 \\)).", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "운동 유발성 알레르기 질환분석 및 비타민 C와 catalase 투여 효과 분석", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-fe6649f1-c085-4c2b-9453-cf44cdbf836b", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", "doc_author": [ "곽이섭" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", 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5,434	<h1>재료 및 방법</h1><h2>길항세균 분리</h2><p>논토양에서 벼의 근권 미생물을 분리하기 위하여 무균적으로 발아시킨 볍씨를 \( 0.6 \% \) agarose 배지 위에 치상하고, 벼 뿌리로부터 \( 1 \sim 2 \mathrm{~cm} \) 거리에 논토양 \( 0.5 \mathrm{~g} \) 을 놓고 28에서 48시간 항온처리한 후, 뿌리를 갈아서 현탁액으로 만든 다음 LC배지에 도말하여 균주를 분리하였다. 본 연구에 사용한 길항균 RRj 228균주는 농촌진흥청 공동연구팀으로부터 분양 받아 사용하였다.</p><h2>길항세균 동정</h2><p>분리한 길항세균을 동정하기 위하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology를 이용하여 생리, 생화학적인 특성을 조사하였고, 분자유전학적 분류법은 16S rDNA sequence 분석법으로 실시하였다. 추출한 rDNA는 PCR을 수행하여 증폭시켜서 pGEMT-T vector에 삽입한 후, 염기서열결정은 자동염기서열분석기(ABI 3100, Applied Biosystem, USA)를 사용하여 분석하였다. 결정된 염기서열은 NCBI의 등록 염기서열과 비교하여 분석하여 동정하였다.</p><h2>길항세균의 항균스펙트럼</h2><p>순수 분리한 세균 중에서 항균력이 뛰어난 Pseudomonas sp. RRj 228균을 재배작물 주요병원균인 Colletotrichum acutatum KACC40804 (고추탄저균), Phytopthola capsici (고추역병균), Botrytis cinerea (잿빛곰팡이균), Pythium ultimum (모잘록병원균) 및 Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum (토양병원균)에 대한 PDA plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다. Colletotrichum acutatum은 (주)청미바이오에서 분양을 받았으며, PDA plate는 \( 1 / 5 \) strength PDA로 각 병원균과 RRj 228균을 동시에 접종하여 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 1 ~ 6일 간 배양한 다음 생육저지대를 측정하여 항균활성스펙트럼으로 조사하였다.</p><h2>배양여액과 배양여액 추출물의 항균효과</h2><p>Pseudomonas RRj 228 을 NB배지에 접종하여 \( 26^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5일간 정취배양 한 다음, 배양액을 원심분리를 실시하여 배양여액을 얻고, 배양여액을 고체배지 제조에 0.5 배, 10 배, 100 배의 희석농도로 첨가하였다. 배양여액을 첨가한 배지에 고추탄저균 C. acutatum 모잘록병균 P. ultimum 토양병원균 R. solant를 접종하여, 균의 생육정도로 항균효과를 측정하였다. 배양여액추출물은 \( \mathrm{CHCl}_{3} \) 을 이용하여 배양여액을 추출하고, 회전농축기로 완전히 농축시킨 다음, DMSO에 녹여 배지에 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 의 농도로 첨가하였다. 대조구에는 추출물용해에 사용한 DMSO \( 500 \mu \mathrm{l} \) 를 첨가하여 균의 생육 정도를 측정하였다.</p><p>\( \mathrm{ED}_{50} \) 값은 probit analysis software로 산출하였다. \( \mathrm{ED}_{50} \) 측정에 사용한 균주는 고추탄저균 C. acutatum 모잘록병균 P. ultimum 토양병원균 R. solani를 배양여액과 추출물을 첨가한 배지에 접종하여 생육정도를 측정하였다.</p><h2>항균물질의 분리정제</h2><p>고추탄저균에 대해 강력한 항균활성을 나타내는 물질을 분리하기 위하여 RRj 228 균을 NA배지에 접종한 후 \( 26^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 2 일간 배양한 후 NB배지에 접종하여 \( 26^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 5 일간 정치배양하였다. 배양액을 원심분리로 균체를 제거하고 \( \mathrm{pH} \) 를 7.0으로 조정한 다음 ethylacetate로 추출하여 물질분리에 이용하였다. 병원균 배양에 추출물을 처리하여 항균활성을 확인하였고, 항균물질을 분리하기 위하여 open column chromatography를 실시하였다. 시료를 \( 180 \mathrm{~g} \) 의 silica gel (Kiesel gel 60, 70-230 mesh: Merck, Germany) column에 가한 다음 n-hexane:ethylacetate (\(4:1\), \(3:2\), \(1:1\), \(2:3\), \(1:4\) \(\mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 및 ethylacetate 등의 용매조건으로 용출시켜 89개의 fraction을 얻었으며, 물질의 분리 pattern을 확인하기 위하여 TLC를 실시한 다음 Rf값이 유사한 것을 6개 그룹으로 나누어 회수하였다. 항균활성을 나타내는 물질은 column 용매조건 n-hexane:ethylacetate (4:1)과 n-hexane:ethylacetate (3:2)에서 용출되어져 나왔다. 활성이 있는 그룹을 농축한 결과 \( 4.67 \mathrm{~g} \) 의 시료를 획득하였다. 1 차 column에서 얻은 항균활성물질을 2 차 column으로 \( 80 \mathrm{~g} \) 의 silica gel (Kiesel gel 60, 70-230 mesh: Merck, Germany)이 충진된 column에 가한 다음 \( \mathrm{n} \)-hexane:ethylacetate (\(1:0\), \(4:1\), \(8: 5\), \(8: 7\), \(8: 10\), \(8: 20\), \(8: 40\) \(\mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 및 ethylacetate 등의 용매조건으로 용출시켜 150개의 fraction을 얻었으며, 물질의 분리 pattern을 확인하기 위하여 TLC를 실시하여 Rf값이 유사한 것을 9 개 그룹으로 나누어 회수하였다. 활성을 나타내는 6, 7번 그룹을 농축하여 \( 4 \mathrm{~g} \) 을 얻어 인접한 물질을 제거하기 위하여 TLC를 실시하였다. TLC는 chloroform:ethylacetate (\( 5: 1\), \(\mathrm{v} / \mathrm{v} \)) 조건으로 preparative TLC (\( 20 \times 10 \mathrm{~cm}\), \(0.25 \mathrm{~mm} \), Kiesel gel 60, F254, Merck)를 실시하였다. TLC를 통하여 \( 78.6 \mathrm{mg} \) 의 항균활성물질을 순수 분리하였다.</p><h2>항균물질 구조동정</h2><p>순수 분리한 항균물질의 구조분석을 위하여 질량분석은 double-focusing high-resolution (HR) mass spectrometer (JEOL JMS DX-303: JEOL Ltd, Tokyo, Japan)으로 electron impact (EI) mode, chemical ionization(CI) mode에서 분석하였고, fast atom bombardment (FAB) mass 방법으로 분자량을 측정하였다. 시료의 matrix로는 glycerol과 Xe를 혼합액으로 사용하였다. 핵자기공명 (\( { }^{1} \mathrm{H-NMR}\),\( ^{13} \mathrm{C-NMR}\), DEPT, \({ }^{1} \mathrm{H}-{ }^{1} \mathrm{H} \)COSY, HMQC, HMBC) 분석은 Bruker AMX-500 (\(500 \mathrm{MHz}\)) NMR spectrometer (Bruker Analytische Messtechnik Gmbh, Rheinstetten, Germany)로 측정하였다. 분리한 물질은 \( \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD} \) 에 녹여 측정하였으며, 내부표준 물질로는 tetramethyl silane (TMS)을 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>길항세균 분리 및 배양</h2> <p>작물의 재배에 있어 근권환경이 아주 중요하며, 근권의 미생물 생육상이 작물의 생육과 토양환경조성에 많은 영향을 미친다. 작물의 근권미생물에는 병을 일으키는 병원균과 식물 생육 촉진물질을 분비하여 식물의 생장을 촉진하는 생장촉진균 및 항생물질을 분비하여 병원균의 생육을 억제하는 길항균 등이 생육하고 있다. 식물 생육촉진 활성과 병원균 길항활성을 동시에 갖는 균주들도 볼 수 있다. 벼 재배지 토양으로부터 벼 뿌리 착생력을 갖는 미생물을 분리하기 위하여 Fig. 1의 A와 같은 방법으로 미생물을 배양한 다음 벼 뿌리로부터 균을 분리하였다. 분리한 균주는 막대기 모양을 하고 있었고, 전자 현미경사진에서 편모를 확인할 수 있었다(Fig. 1B). Photodex-trose agar 배지에 접종하여 배양을 하면 24시간 이후에는 적황색을 띄다가 일주일 정도 경과하면 다소 색상이 엷어진다 (Fig. 2). 분리한 균주는 벼 뿌리에 대한 착생력이 아주 높았으며, 식물의 생육을 촉진하는 활성이 있었고, 병원균에 대한 항균활성도 아주 높았다(Fig. 2). 특히 고추탄저균 C. acutatum에 대한 항균활성이 뛰어났다(Fig. 2). 분리한 길항세균의 배양은 nutrient broth (NB)배지에 접종하여 \( 26^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5~7일간 정취배양 한 다음 배양여액을 얻고, 배양여액을 물질추출과 항균실험에 이용하였다.</p> <h2>길항세균의 항균스펙트럼</h2> <p>논토양에서 분리한 길항세균 RRj 228을 배양조건을 달리하여 항균물질의 생산을 조사한 결과, PBD 배지에서 배양하는 것 보다 NB 배지에 배양했을 때 항균물질의 생산이 많았으며, 진탕배양보다 정취배양에서 항균물질의 생산이 많았다. 온도 조건은 \( 26^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \) 범위 내에서는 큰 차이가 없었으며, 배지의 \( \mathrm{pH} \)를 조절도 큰 영향이 없었고, 배지의 종류 즉, 영양원의 종류에 많은 차이를 보였다. \( 26^{\circ} \mathrm{C} \)에서 일주일 정취 배양한 다음 배양여액과 용매추출물을 이용하여 B. cinerea, C. acuta-tum, F. oxysporum, P. capsici, P. ultimum, R. solani에 대한 plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다(Table 1). 그 결과 고추탄저균, 고추역병균 및 잿빛곰팡이병원균에 강한 항균활성을 나타냈으며, 시들음병원균에도 좋은 항균활성을 나타냈다. 그러나 모잘록병원균에는 약한 항균활성을 보였으며, F. oxy-sporum에는 항균활성이 나타나지 않았다. 고추재배에 있어서 탄저병과 역병이 가장 많은 피해를 입히는 병해로서, 역병은 P. capsici가 병원균이고, 탄저병은 C. gloeosporioides와 C. acuta-tum가 강력한 병원성을 가진다. C. acutatum는 국내 탄저병 발병포장에서 분포도를 조사한 결과 가장 많은 분포도를 나타내며, 전생육기에 탄저병을 일으키기 때문에 방제가 꼭 필요하다. 더욱이 수확기 과실에도 병이 발생하기 때문에 화학농약의 사용이 어려워 온도와 습도조절 등의 환경조건을 조절하여 병해를 축소시키는 것이 중요하며, 수확기에 비가 내릴 경우에는 탄저병의 발생이 심하므로 RRj 228균이나 Burkhoderiasp. AK-17 등을 이용한 생물제제를 사용하여 탄저병 확산을 막는 것이 가장 바람직할 것으로 여겨진다. RRj 228균은 잿빛곰팡이병원균에도 좋은 항균활성을 나타내므로 딸기나 잎들깨 등의 잿빛곰팡이병과 고온다습한 환경에서 연작재배에 의한 병의 다발을 막을 수 있고, 밀폐된 시설하우스의 특이환경에서 병원성 곰팡이의 피해를 줄일 수 있을 것으로 보여진다. 시설하우스 뿐만 아니라 일반 노지에도 RRj 228을 이용한 생물학적 방제시스템을 구축하면 저농약 재배로 안전한 농산물생산이 가능할 것이다.</p> <h1>초록</h1> <p>식물 근권미생물은 식물의 뿌리 표면과 내부에 정착하면서 식물생장 촉진물질을 분비하여 식물생육에 직접적인 영향을 주거나, 항균물질을 분비하여 병원균으로부터 식물 근권환경을 보호하여 식물의 생육을 촉진하게 된다. 이러한 활성을 갖고 있는 미생물을 분리하여 동정하며, 항균물질을 분리, 동정하여 지속농업의 발전과 농업환경의 보전을 위하여 연구를 실시하였다. 논토양으로부터 식물생육촉진활성과 항균활성을 갖는 RRj 228균주를 분리하여, 생리·생화학적방법과 유전학적 방법으로 동정한 결과, Pseudomonas sp.로 동정되었다. RRj 228균주는 B. cinerea, P. ultimum P. capsici와 R. solani에도 높은 항균활성을 보였으며, 특히 고추탄저병원균인 C. acutatum에 강력한 항균활성을 나타냈다. RRj 228균의 배양여액을 C. acutatum, R. solani 및 P. ultimum에 대한 \( \mathrm{ED}_{50} \)값을 측정한 결과 0.14, 0.16, 0.29 \( \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 나타났다. 항균활성물질은 RRj 228 배양여액으로부터 각종 크로마토그라피법으로 순수분리하고, NMR과 GC/MS 등의 기기분석을 실시하여 구조를 Phenazine-1-carboxylic acid (분자량 224)로 동정하였다.</p> <h1>서 론</h1><p>고추는 우리나라의 대표 과채류로서 음식에 많이 사용을 하고 있으나 1990년 후반부터 재배면적이 줄어들고 있고, 작황에 따라 생산량도 차이를 보이고 있다. 고추생산량에 가장 큰 영향을 주는 것은 병해피해와 전년도 가격형성이 가장 큰 요인이 되어지며, 재배농민의 노령화도 하나의 요인으로 볼 수 있다. 병원균의 피해는 Phytophthora capsici에 의한 역병과 Colletrichum 속 병원균에 의한 탄저병으로, 진균에 의한 피해가 대부분이다. 진균병은 발생시기와 발생부위에 다양한 요인에 따라 차이를 보이고 있으며, 역병은 전 생육기에 걸쳐서 발생된다. 역병은 토양에 가까운 줄기에서부터 발병되어져 식물체를 고사시키며, 고추생산의 약 \( 20 \% \)가 감소시키는 피해를 입힌다. 탄저병은 역병과 함께 고추의 최대병해로 주로 과실을 침해하여 수량감소에 직접적인 영향을 미친다. 발생초기에는 작은 반점이 생기고 점차 확대되어 둥글게 썩어가며 흑갈색을 띄게 된다. 탄저병의 발생은 재배지와 기후에 따라 큰 차이를 보인다. 노지재배에서는 장마철에 많이 발생하고, 비가 잦은 해에 많이 발생하며, 하우스 재배에서는 수분관리를 잘해주면 발생빈도가 적고, 탄저병은 빗물에 의한 전파양식 때문에 하우스에서는 적게 발생한다. 고추탄저병으로부터 피해를 줄이기 위해 esterase gene을 삽입하여 고추탄저병 저항성품종 개발 연구와 감염률이 일정 이하인 품종을 저항성 품종으로 선발하는 연구 등이 있었으나 국내에 재배되는 대부분의 고추품종은 탄저병 감수성 품종이라 할 수 있다. 국내 고추재배에서 발생하는 탄저병의 병원균은 Colletotrichum acutatum, C. coccodes, C. dematium C. glocosporicides 및 Glomerella cingulata 5종이 분리 동정되어 보고 되어있으며, C. acutatum은 국내 고추탄저병원균을 모니터링 한 결과 주된 탄저병원균이었으며, 이는 고추탄저병 발병의 \( 98.2 \% \) 를 차지하는 우점종으로 풋고추와 붉은 고추 모두에 발생하여 많은 피해를 주고, 유묘와 성묘 및 열매까지 전 생육기에 강한 병원성을 나타내며 고추재배에 큰 피해를 주는 것을 확인했다. C. coccodes는 불완전균으로 고추 유묘의 잎과 줄기, 및 어린 과실에 병원성이 강하고, C. gloeosporioides는 고추탄저병균 중 제일 강력한 병원균으로 보고되어 있으며, C. acutatum과 같이 풋고추와 붉은 고추 모두에 병을 발생시킨다. 고온 다습할 때와 강우 시에 발생이 많고 종자전염의 대표적인 균으로 병든 과실의 종자 내 외부에 흡착하여 전염된다. 고추는 진균에 의한 피해가 심하여 농약사용을 많이 하는데 주로 생으로 섭취를 하기 때문에 잔류농약에 대한 주의가 요구되는 대표적인 과채류이다. 최근에는 농산물안전성에 대한 소비자들의 요구도가 높아짐으로써 농약의 사용을 줄이고, 천연물과 미생물을 이용한 생물학적 제제 사용이 늘어나고 있어 생물학적 제제의 연구와 개발이 많이 이루어지고 있다. 고추역병을 생물학적으로 방제하기 위해 황련추출물을 이용한 고추역병균에 대한 항균활성조사와 길항미생물의 탐색과 길항기작에 대한 연구 등이 이루어졌다.</p><p>고추탄저병 방제를 위한 길항미생물의 연구는 엽면에서 분리한 B. subtilis, 점액세균 Myxococcus 속, 토양에서 분리한 Bacillus sp., Pseudomonas sp.등의 보고가 있다.</p><p>본 연구는 논토양에서 분리한 Pseudomonas sp. RRj 228을 이용하여 C. acutatum에 대한 항균활성과 항균물질에 대한 연구결과를 보고하여, 고추탄저병원균의 생물학적방제재 개발에 기초자료를 제공하고자 한다.</p> <h2>길항세균 동정</h2><p>RRj 228을 "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"를 이용한 생리, 생화학적인 특성을 조사결과 gram staining에 음성이었으며 막대형의 호기성균이었다. 효소활성 검사에는 catalase와 oxydase 활성은 나타났으나 lipase 활성은 없었으며, casein과 gelatin 가수분해력은 보였으나 starch 분해력은 없었다. 배지에 첨가된 탄소원이 arabinose, fructose, gal-actose, glucose, mannitol, sucrose, xylose의 경우에는 생육 중에 산을 생성하고, 탄소원이 lactose, dextrine, ramnose, sor-bitol, maltose, dulcitol의 경우에는 알칼리를 생성하는 것을 확인할 수 있었다(Table 2). 분자유전학적인 분류를 위해 추출한 DNA로 PCR을 수행한 결과 \( 1,500 \mathrm{bp} \) 정도의 증폭된 DNA 단편을 확인할 수 있었으며, 16\(\mathrm{S}\) rDNA 부분 염기서열을 GenBank library의 염기서열과 상동성을 조사한 결과 Pseudomonas chlorororaphis, P. Corrugata, P. tolaasii 등 다수의 Pseudomonas 종과 \( 99 \% \) 이상의 염기서열 상동성을 나타내었으므로 Pseudomonas sp.로 분류하고 Pseudomonas sp. RRj 228 균주로 명명하여, 농촌진흥청 농업생명공학연구원 부설 한국 농용미생물보존센터(KACC)에 기탁하여 수탁번호 KACC 1052를 부여 받았다.</p><h2>배양여액과 배양여액 추출물의 항균효과</h2><p>RRj 228 배양 여과액을 0.5배, 10배, 100배의 희석농도로 고체배지제조에 첨가하여 병원균의 생육억제효과를 조사하였다. 배양여액의 희석농도에 비례해서 병원균의 생육이 억제되는 것을 확인했다(Fig. 3). 고추탄저균의 경우에는 배양여액을 10배 희석을 하여 처리하면 탄저균의 생육이 \( 10 \% \) 억제되는 것을 확인할 수 있었다. R. solani도 배양여액을 10배 희석하여 처리하면 \( 10 \% \) 이상의 병원균생육 억제효과가 나타났다. 사용한 모든 균주에 2배 희석농도에서는 \( 20 \sim 30 \% \)의 생육억제효과 를 볼 수 있었다. 고추를 비롯한 과채류재배에 RRj 228배양여액을 일정농도로 물에 희석하여 살포하거나 관주를 하면 병원균의 피해를 예방할 수 있다. 배양여액 뿐만 아니라 배양액을 그대로 토양에 관주를 혼합하여 사용하면 PGPR (plant growth-promoting rhizobacterium) 처리효과를 얻을 수 있을 것이다.</p><p>배양여액을 원심분리한 다음 \( \mathrm{CHCl}_{3} \)으로 추출하고, 농축하여 추출물을 \( 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml}\), \(2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 배지조제에 첨가하여 만든 plate에 병원균을 접종하여 C. acutatum, P. ultimum, 및 R. solani의 생육정도를 조사하였다. 사용한 모든 균주에서 강력한 항균활성이 나타났고, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 아주 미약한 생육을 확인할 수 있었으며, \( 2 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 모든 균주가 전혀 생육을 하지 못했다. 반복실험을 통하여 얻은 값으로 ED50 분석프로그램에 도입하여 ED50값을 산출한 결과, 고추탄저병원균에 대한 ED50값은 \( 0.14 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 나타났고, 뿌리썩음병원균에 대한 ED50값은 \( 0.16 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)로 1차 추출물로서는 높은 활성을 나타냈다(Table 3). 골프장에서는 잔디뿌리썩음 병원균인 R. solani피해를 줄이기 위해서 과대한 살균제 사용을 하고 있는 실정으로 이는 수계환경보호에 큰 문제가 되어지고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 미생물제제를 비롯한 생물제제 방제법을 택하고 있다. RRj 228 균주의 배양액제제나 생균을 처리하면 R. solani방제에 많은 도움이 될 것으로 사료되어진다.</p><h2>항균물질 구조동정</h2><p>Pseudomanas sp. RRj 228균의 배양액으로부터 분리한 228-7 물질의 구조동정은 FAB질량분석, \( { }^{1} \mathrm{H}\)-NMR, \({ }^{13} \mathrm{C}\)-NMR, \({ }^{1} \mathrm{H}-{ }^{1} \mathrm{H} \) COSY, HMQC 그리고 HMBC 분석을 통하여 화학적인 구조 분석을 시도하였다. 228-7 물질을 FAB 질량분석에서 \( [\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+} \) 225과 EI 질량분석에서 \( [\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{-} \) 223을 확인되어져 분자량이 224 dalton으로 결정되었다. 정확한 구조를 결정하기 위하여 \( { }^{1} \mathrm{H}\)-NMR과 \( { }^{13} \mathrm{C}\)-NMR 분석을 실시한 결과, \( { }^{1} \mathrm{H}\)-NMR 분석에서 하나의 hydroxyl group이 존재함을 알 수 있었고, 13C-NMR 분석에서 탄소수가 13개이며, 1개의 carboxyl group (C-1' \( \delta \mathrm{c} \) \( 166.1 \mathrm{ppm} \))이 존재하는 것이 관찰되었다(Table 4). 7개의 methine proton (\( \mathrm{H}-2\), \(\delta_{\mathrm{H}}\) \(8.98\) \(\rightarrow\) \( \delta_{\mathrm{C}}\) \(137.7\) ; \(\mathrm{H}-3\), \(\delta_{\mathrm{H}}\) \(8.05\) \(\rightarrow\) \(\delta_{\mathrm{C}}\) \(130.3\); \(H-4\), \( \delta_{\mathrm{H}}\) \(8.53\) \(\rightarrow\) \(\delta_{\mathrm{c}}\) \(135.4\) ; \(\mathrm{H}-7\), \(\delta_{\mathrm{H}}\) \(8.36\) \(\rightarrow\) \(\delta_{\mathrm{C}}\) \(128.2\) ; \(\mathrm{H}-8 \), \( \delta_{\mathrm{H}}\) \(7.99\) \(\rightarrow\) \(\delta_{\mathrm{C}}\) \(131.9\) ; \(\mathrm{H}-9\), \(\delta_{\mathrm{H}}\) \(8.02\) \(\rightarrow\)\( \delta_{\mathrm{C}}\) \(133.5\) ; \(\mathrm{H}-10\), \(\delta_{\mathrm{H}}\) \(8.29 \) \( \rightarrow \delta \mathrm{c}\) \(130.3 \))을 확인하였다. Liu가 S. salina에서 분리한 phena-zine-1-carboxylic acid와 chemical shift를 비교한 결과, me-thine proton의 chemical shift는 일치하였고, C-7과 C-10의 chemical shift가 \( 130.1 \mathrm{ppm} \)과 \( 128.0 \mathrm{ppm} \)에서 \( 128.2 \mathrm{ppm} \)과 \( 130.3 \mathrm{ppm} \)으로 이동하였으나 다른 carbon의 chemical shift는 일치하였다. \( { }^{1} \mathrm{H}-{ }^{1} \mathrm{H} \) COSY 분석을 통하여 양성자들 사이의 cross peak를 관찰하였다. 이상의 결과들을 정리한 결과, me-thine proton chemical shift와 carbon chemical shift 및 분자량 결과를 종합한 결과 Phenazine-1-carboxylic acid로 동정하였다(Fig. 4).</p>	생명과학	[ "<h1>재료 및 방법</h1><h2>길항세균 분리</h2><p>논토양에서 벼의 근권 미생물을 분리하기 위하여 무균적으로 발아시킨 볍씨를 \\( 0.6 \\% \\) agarose 배지 위에 치상하고, 벼 뿌리로부터 \\( 1 \\sim 2 \\mathrm{~cm} \\) 거리에 논토양 \\( 0.5 \\mathrm{~g} \\) 을 놓고 28에서 48시간 항온처리한 후, 뿌리를 갈아서 현탁액으로 만든 다음 LC배지에 도말하여 균주를 분리하였다.", "본 연구에 사용한 길항균 RRj 228균주는 농촌진흥청 공동연구팀으로부터 분양 받아 사용하였다.", "</p><h2>길항세균 동정</h2><p>분리한 길항세균을 동정하기 위하여 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology를 이용하여 생리, 생화학적인 특성을 조사하였고, 분자유전학적 분류법은 16S rDNA sequence 분석법으로 실시하였다.", "추출한 rDNA는 PCR을 수행하여 증폭시켜서 pGEMT-T vector에 삽입한 후, 염기서열결정은 자동염기서열분석기(ABI 3100, Applied Biosystem, USA)를 사용하여 분석하였다.", "결정된 염기서열은 NCBI의 등록 염기서열과 비교하여 분석하여 동정하였다.", "</p><h2>길항세균의 항균스펙트럼</h2><p>순수 분리한 세균 중에서 항균력이 뛰어난 Pseudomonas sp.", "RRj 228균을 재배작물 주요병원균인 Colletotrichum acutatum KACC40804 (고추탄저균), Phytopthola capsici (고추역병균), Botrytis cinerea (잿빛곰팡이균), Pythium ultimum (모잘록병원균) 및 Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum (토양병원균)에 대한 PDA plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다.", "Colletotrichum acutatum은 (주)청미바이오에서 분양을 받았으며, PDA plate는 \\( 1 / 5 \\) strength PDA로 각 병원균과 RRj 228균을 동시에 접종하여 \\( 28^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 1 ~ 6일 간 배양한 다음 생육저지대를 측정하여 항균활성스펙트럼으로 조사하였다.", "</p><h2>배양여액과 배양여액 추출물의 항균효과</h2><p>Pseudomonas RRj 228 을 NB배지에 접종하여 \\( 26^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 5일간 정취배양 한 다음, 배양액을 원심분리를 실시하여 배양여액을 얻고, 배양여액을 고체배지 제조에 0.5 배, 10 배, 100 배의 희석농도로 첨가하였다.", "배양여액을 첨가한 배지에 고추탄저균 C. acutatum 모잘록병균 P. ultimum 토양병원균 R.", "solant를 접종하여, 균의 생육정도로 항균효과를 측정하였다.", "배양여액추출물은 \\( \\mathrm{CHCl}_{3} \\) 을 이용하여 배양여액을 추출하고, 회전농축기로 완전히 농축시킨 다음, DMSO에 녹여 배지에 \\( 0.1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}\\), \\(1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}\\), \\(2 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\) 의 농도로 첨가하였다.", "대조구에는 추출물용해에 사용한 DMSO \\( 500 \\mu \\mathrm{l} \\) 를 첨가하여 균의 생육 정도를 측정하였다.", "</p><p>\\( \\mathrm{ED}_{50} \\) 값은 probit analysis software로 산출하였다. \\", "( \\mathrm{ED}_{50} \\) 측정에 사용한 균주는 고추탄저균 C. acutatum 모잘록병균 P. ultimum 토양병원균 R.", "solani를 배양여액과 추출물을 첨가한 배지에 접종하여 생육정도를 측정하였다.", "</p><h2>항균물질의 분리정제</h2><p>고추탄저균에 대해 강력한 항균활성을 나타내는 물질을 분리하기 위하여 RRj 228 균을 NA배지에 접종한 후 \\( 26^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 2 일간 배양한 후 NB배지에 접종하여 \\( 26^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 5 일간 정치배양하였다.", "배양액을 원심분리로 균체를 제거하고 \\( \\mathrm{pH} \\) 를 7.0으로 조정한 다음 ethylacetate로 추출하여 물질분리에 이용하였다.", "병원균 배양에 추출물을 처리하여 항균활성을 확인하였고, 항균물질을 분리하기 위하여 open column chromatography를 실시하였다.", "시료를 \\( 180 \\mathrm{~g} \\) 의 silica gel (Kiesel gel 60, 70-230 mesh: Merck, Germany) column에 가한 다음 n-hexane:ethylacetate (\\(4:1\\), \\(3:2\\), \\(1:1\\), \\(2:3\\), \\(1:4\\) \\(\\mathrm{v} / \\mathrm{v} \\)) 및 ethylacetate 등의 용매조건으로 용출시켜 89개의 fraction을 얻었으며, 물질의 분리 pattern을 확인하기 위하여 TLC를 실시한 다음 Rf값이 유사한 것을 6개 그룹으로 나누어 회수하였다.", "항균활성을 나타내는 물질은 column 용매조건 n-hexane:ethylacetate (4:1)과 n-hexane:ethylacetate (3:2)에서 용출되어져 나왔다.", "활성이 있는 그룹을 농축한 결과 \\( 4.67 \\mathrm{~g} \\) 의 시료를 획득하였다.", "1 차 column에서 얻은 항균활성물질을 2 차 column으로 \\( 80 \\mathrm{~g} \\) 의 silica gel (Kiesel gel 60, 70-230 mesh: Merck, Germany)이 충진된 column에 가한 다음 \\( \\mathrm{n} \\)-hexane:ethylacetate (\\(1:0\\), \\(4:1\\), \\(8: 5\\), \\(8: 7\\), \\(8: 10\\), \\(8: 20\\), \\(8: 40\\) \\(\\mathrm{v} / \\mathrm{v} \\)) 및 ethylacetate 등의 용매조건으로 용출시켜 150개의 fraction을 얻었으며, 물질의 분리 pattern을 확인하기 위하여 TLC를 실시하여 Rf값이 유사한 것을 9 개 그룹으로 나누어 회수하였다.", "활성을 나타내는 6, 7번 그룹을 농축하여 \\( 4 \\mathrm{~g} \\) 을 얻어 인접한 물질을 제거하기 위하여 TLC를 실시하였다.", "TLC는 chloroform:ethylacetate (\\( 5: 1\\), \\(\\mathrm{v} / \\mathrm{v} \\)) 조건으로 preparative TLC (\\( 20 \\times 10 \\mathrm{~cm}\\), \\(0.25 \\mathrm{~mm} \\), Kiesel gel 60, F254, Merck)를 실시하였다.", "TLC를 통하여 \\( 78.6 \\mathrm{mg} \\) 의 항균활성물질을 순수 분리하였다.", "</p><h2>항균물질 구조동정</h2><p>순수 분리한 항균물질의 구조분석을 위하여 질량분석은 double-focusing high-resolution (HR) mass spectrometer (JEOL JMS DX-303: JEOL Ltd, Tokyo, Japan)으로 electron impact (EI) mode, chemical ionization(CI) mode에서 분석하였고, fast atom bombardment (FAB) mass 방법으로 분자량을 측정하였다.", "시료의 matrix로는 glycerol과 Xe를 혼합액으로 사용하였다.", "핵자기공명 (\\( { }^{1} \\mathrm{H-NMR}\\),\\( ^{13} \\mathrm{C-NMR}\\), DEPT, \\({ }^{1} \\mathrm{H}-{ }^{1} \\mathrm{H} \\)COSY, HMQC, HMBC) 분석은 Bruker AMX-500 (\\(500 \\mathrm{MHz}\\)) NMR spectrometer (Bruker Analytische Messtechnik Gmbh, Rheinstetten, Germany)로 측정하였다.", "분리한 물질은 \\( \\mathrm{CD}_{3} \\mathrm{OD} \\) 에 녹여 측정하였으며, 내부표준 물질로는 tetramethyl silane (TMS)을 사용하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1>\n\n<h2>길항세균 분리 및 배양</h2>\n\n<p>작물의 재배에 있어 근권환경이 아주 중요하며, 근권의 미생물 생육상이 작물의 생육과 토양환경조성에 많은 영향을 미친다.", "작물의 근권미생물에는 병을 일으키는 병원균과 식물 생육 촉진물질을 분비하여 식물의 생장을 촉진하는 생장촉진균 및 항생물질을 분비하여 병원균의 생육을 억제하는 길항균 등이 생육하고 있다.", "식물 생육촉진 활성과 병원균 길항활성을 동시에 갖는 균주들도 볼 수 있다.", "벼 재배지 토양으로부터 벼 뿌리 착생력을 갖는 미생물을 분리하기 위하여 Fig.", "1의 A와 같은 방법으로 미생물을 배양한 다음 벼 뿌리로부터 균을 분리하였다.", "분리한 균주는 막대기 모양을 하고 있었고, 전자 현미경사진에서 편모를 확인할 수 있었다", "(Fig. 1B).", "Photodex-trose agar 배지에 접종하여 배양을 하면 24시간 이후에는 적황색을 띄다가 일주일 정도 경과하면 다소 색상이 엷어진다 (Fig. 2).", "분리한 균주는 벼 뿌리에 대한 착생력이 아주 높았으며, 식물의 생육을 촉진하는 활성이 있었고, 병원균에 대한 항균활성도 아주 높았다", "(Fig. 2).", "특히 고추탄저균 C. acutatum에 대한 항균활성이 뛰어났다", "(Fig. 2).", "분리한 길항세균의 배양은 nutrient broth (NB)배지에 접종하여 \\( 26^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 5~7일간 정취배양 한 다음 배양여액을 얻고, 배양여액을 물질추출과 항균실험에 이용하였다.", "</p>\n\n<h2>길항세균의 항균스펙트럼</h2>\n\n<p>논토양에서 분리한 길항세균 RRj 228을 배양조건을 달리하여 항균물질의 생산을 조사한 결과, PBD 배지에서 배양하는 것 보다 NB 배지에 배양했을 때 항균물질의 생산이 많았으며, 진탕배양보다 정취배양에서 항균물질의 생산이 많았다.", "온도 조건은 \\( 26^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 \\( 28^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 범위 내에서는 큰 차이가 없었으며, 배지의 \\( \\mathrm{pH} \\)를 조절도 큰 영향이 없었고, 배지의 종류 즉, 영양원의 종류에 많은 차이를 보였다. \\", "( 26^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 일주일 정취 배양한 다음 배양여액과 용매추출물을 이용하여 B. cinerea, C. acuta-tum, F. oxysporum, P. capsici, P. ultimum, R.", "solani에 대한 plate 대치배양법으로 항균력을 조사하였다", "(Table 1).", "그 결과 고추탄저균, 고추역병균 및 잿빛곰팡이병원균에 강한 항균활성을 나타냈으며, 시들음병원균에도 좋은 항균활성을 나타냈다.", "그러나 모잘록병원균에는 약한 항균활성을 보였으며, F. oxy-sporum에는 항균활성이 나타나지 않았다.", "고추재배에 있어서 탄저병과 역병이 가장 많은 피해를 입히는 병해로서, 역병은 P. capsici가 병원균이고, 탄저병은 C. gloeosporioides와 C. acuta-tum가 강력한 병원성을 가진다.", "C. acutatum는 국내 탄저병 발병포장에서 분포도를 조사한 결과 가장 많은 분포도를 나타내며, 전생육기에 탄저병을 일으키기 때문에 방제가 꼭 필요하다.", "더욱이 수확기 과실에도 병이 발생하기 때문에 화학농약의 사용이 어려워 온도와 습도조절 등의 환경조건을 조절하여 병해를 축소시키는 것이 중요하며, 수확기에 비가 내릴 경우에는 탄저병의 발생이 심하므로 RRj 228균이나 Burkhoderiasp.", "AK-17 등을 이용한 생물제제를 사용하여 탄저병 확산을 막는 것이 가장 바람직할 것으로 여겨진다.", "RRj 228균은 잿빛곰팡이병원균에도 좋은 항균활성을 나타내므로 딸기나 잎들깨 등의 잿빛곰팡이병과 고온다습한 환경에서 연작재배에 의한 병의 다발을 막을 수 있고, 밀폐된 시설하우스의 특이환경에서 병원성 곰팡이의 피해를 줄일 수 있을 것으로 보여진다.", "시설하우스 뿐만 아니라 일반 노지에도 RRj 228을 이용한 생물학적 방제시스템을 구축하면 저농약 재배로 안전한 농산물생산이 가능할 것이다.", "</p> <h1>초록</h1>\n\n<p>식물 근권미생물은 식물의 뿌리 표면과 내부에 정착하면서 식물생장 촉진물질을 분비하여 식물생육에 직접적인 영향을 주거나, 항균물질을 분비하여 병원균으로부터 식물 근권환경을 보호하여 식물의 생육을 촉진하게 된다.", "이러한 활성을 갖고 있는 미생물을 분리하여 동정하며, 항균물질을 분리, 동정하여 지속농업의 발전과 농업환경의 보전을 위하여 연구를 실시하였다.", "논토양으로부터 식물생육촉진활성과 항균활성을 갖는 RRj 228균주를 분리하여, 생리·생화학적방법과 유전학적 방법으로 동정한 결과, Pseudomonas sp.로 동정되었다.", "RRj 228균주는 B. cinerea, P. ultimum P. capsici와 R.", "solani에도 높은 항균활성을 보였으며, 특히 고추탄저병원균인 C. acutatum에 강력한 항균활성을 나타냈다.", "RRj 228균의 배양여액을 C. acutatum, R.", "solani 및 P. ultimum에 대한 \\( \\mathrm{ED}_{50} \\)값을 측정한 결과 0.14, 0.16, 0.29 \\( \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)로 나타났다.", "항균활성물질은 RRj 228 배양여액으로부터 각종 크로마토그라피법으로 순수분리하고, NMR과 GC/MS 등의 기기분석을 실시하여 구조를 Phenazine-1-carboxylic acid (분자량 224)로 동정하였다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>고추는 우리나라의 대표 과채류로서 음식에 많이 사용을 하고 있으나 1990년 후반부터 재배면적이 줄어들고 있고, 작황에 따라 생산량도 차이를 보이고 있다.", "고추생산량에 가장 큰 영향을 주는 것은 병해피해와 전년도 가격형성이 가장 큰 요인이 되어지며, 재배농민의 노령화도 하나의 요인으로 볼 수 있다.", "병원균의 피해는 Phytophthora capsici에 의한 역병과 Colletrichum 속 병원균에 의한 탄저병으로, 진균에 의한 피해가 대부분이다.", "진균병은 발생시기와 발생부위에 다양한 요인에 따라 차이를 보이고 있으며, 역병은 전 생육기에 걸쳐서 발생된다.", "역병은 토양에 가까운 줄기에서부터 발병되어져 식물체를 고사시키며, 고추생산의 약 \\( 20 \\% \\)가 감소시키는 피해를 입힌다.", "탄저병은 역병과 함께 고추의 최대병해로 주로 과실을 침해하여 수량감소에 직접적인 영향을 미친다.", "발생초기에는 작은 반점이 생기고 점차 확대되어 둥글게 썩어가며 흑갈색을 띄게 된다.", "탄저병의 발생은 재배지와 기후에 따라 큰 차이를 보인다.", "노지재배에서는 장마철에 많이 발생하고, 비가 잦은 해에 많이 발생하며, 하우스 재배에서는 수분관리를 잘해주면 발생빈도가 적고, 탄저병은 빗물에 의한 전파양식 때문에 하우스에서는 적게 발생한다.", "고추탄저병으로부터 피해를 줄이기 위해 esterase gene을 삽입하여 고추탄저병 저항성품종 개발 연구와 감염률이 일정 이하인 품종을 저항성 품종으로 선발하는 연구 등이 있었으나 국내에 재배되는 대부분의 고추품종은 탄저병 감수성 품종이라 할 수 있다.", "국내 고추재배에서 발생하는 탄저병의 병원균은 Colletotrichum acutatum, C. coccodes, C. dematium C. glocosporicides 및 Glomerella cingulata 5종이 분리 동정되어 보고 되어있으며, C. acutatum은 국내 고추탄저병원균을 모니터링 한 결과 주된 탄저병원균이었으며, 이는 고추탄저병 발병의 \\( 98.2 \\% \\) 를 차지하는 우점종으로 풋고추와 붉은 고추 모두에 발생하여 많은 피해를 주고, 유묘와 성묘 및 열매까지 전 생육기에 강한 병원성을 나타내며 고추재배에 큰 피해를 주는 것을 확인했다.", "C. coccodes는 불완전균으로 고추 유묘의 잎과 줄기, 및 어린 과실에 병원성이 강하고, C. gloeosporioides는 고추탄저병균 중 제일 강력한 병원균으로 보고되어 있으며, C. acutatum과 같이 풋고추와 붉은 고추 모두에 병을 발생시킨다.", "고온 다습할 때와 강우 시에 발생이 많고 종자전염의 대표적인 균으로 병든 과실의 종자 내 외부에 흡착하여 전염된다.", "고추는 진균에 의한 피해가 심하여 농약사용을 많이 하는데 주로 생으로 섭취를 하기 때문에 잔류농약에 대한 주의가 요구되는 대표적인 과채류이다.", "최근에는 농산물안전성에 대한 소비자들의 요구도가 높아짐으로써 농약의 사용을 줄이고, 천연물과 미생물을 이용한 생물학적 제제 사용이 늘어나고 있어 생물학적 제제의 연구와 개발이 많이 이루어지고 있다.", "고추역병을 생물학적으로 방제하기 위해 황련추출물을 이용한 고추역병균에 대한 항균활성조사와 길항미생물의 탐색과 길항기작에 대한 연구 등이 이루어졌다.", "</p><p>고추탄저병 방제를 위한 길항미생물의 연구는 엽면에서 분리한 B. subtilis, 점액세균 Myxococcus 속, 토양에서 분리한 Bacillus sp., Pseudomonas sp.등의 보고가 있다.", "</p><p>본 연구는 논토양에서 분리한 Pseudomonas sp.", "RRj 228을 이용하여 C. acutatum에 대한 항균활성과 항균물질에 대한 연구결과를 보고하여, 고추탄저병원균의 생물학적방제재 개발에 기초자료를 제공하고자 한다.", "</p> <h2>길항세균 동정</h2><p>RRj 228을 \"Bergey's Manual of Systematic Bacteriology\"를 이용한 생리, 생화학적인 특성을 조사결과 gram staining에 음성이었으며 막대형의 호기성균이었다.", "효소활성 검사에는 catalase와 oxydase 활성은 나타났으나 lipase 활성은 없었으며, casein과 gelatin 가수분해력은 보였으나 starch 분해력은 없었다.", "배지에 첨가된 탄소원이 arabinose, fructose, gal-actose, glucose, mannitol, sucrose, xylose의 경우에는 생육 중에 산을 생성하고, 탄소원이 lactose, dextrine, ramnose, sor-bitol, maltose, dulcitol의 경우에는 알칼리를 생성하는 것을 확인할 수 있었다", "(Table 2).", "분자유전학적인 분류를 위해 추출한 DNA로 PCR을 수행한 결과 \\( 1,500 \\mathrm{bp} \\) 정도의 증폭된 DNA 단편을 확인할 수 있었으며, 16\\(\\mathrm{S}\\) rDNA 부분 염기서열을 GenBank library의 염기서열과 상동성을 조사한 결과 Pseudomonas chlorororaphis, P. Corrugata, P. tolaasii 등 다수의 Pseudomonas 종과 \\( 99 \\% \\) 이상의 염기서열 상동성을 나타내었으므로 Pseudomonas sp.로 분류하고 Pseudomonas sp.", "RRj 228 균주로 명명하여, 농촌진흥청 농업생명공학연구원 부설 한국 농용미생물보존센터(KACC)에 기탁하여 수탁번호 KACC 1052를 부여 받았다.", "</p><h2>배양여액과 배양여액 추출물의 항균효과</h2><p>RRj 228 배양 여과액을 0.5배, 10배, 100배의 희석농도로 고체배지제조에 첨가하여 병원균의 생육억제효과를 조사하였다.", "배양여액의 희석농도에 비례해서 병원균의 생육이 억제되는 것을 확인했다", "(Fig. 3).", "고추탄저균의 경우에는 배양여액을 10배 희석을 하여 처리하면 탄저균의 생육이 \\( 10 \\% \\) 억제되는 것을 확인할 수 있었다.", "R. solani도 배양여액을 10배 희석하여 처리하면 \\( 10 \\% \\) 이상의 병원균생육 억제효과가 나타났다.", "사용한 모든 균주에 2배 희석농도에서는 \\( 20 \\sim 30 \\% \\)의 생육억제효과 를 볼 수 있었다.", "고추를 비롯한 과채류재배에 RRj 228배양여액을 일정농도로 물에 희석하여 살포하거나 관주를 하면 병원균의 피해를 예방할 수 있다.", "배양여액 뿐만 아니라 배양액을 그대로 토양에 관주를 혼합하여 사용하면 PGPR (plant growth-promoting rhizobacterium) 처리효과를 얻을 수 있을 것이다.", "</p><p>배양여액을 원심분리한 다음 \\( \\mathrm{CHCl}_{3} \\)으로 추출하고, 농축하여 추출물을 \\( 0.1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}\\), \\(1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml}\\), \\(2 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)의 농도로 배지조제에 첨가하여 만든 plate에 병원균을 접종하여 C. acutatum, P. ultimum, 및 R.", "solani의 생육정도를 조사하였다.", "사용한 모든 균주에서 강력한 항균활성이 나타났고, \\( 1 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서 아주 미약한 생육을 확인할 수 있었으며, \\( 2 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)의 농도에서는 모든 균주가 전혀 생육을 하지 못했다.", "반복실험을 통하여 얻은 값으로 ED50 분석프로그램에 도입하여 ED50값을 산출한 결과, 고추탄저병원균에 대한 ED50값은 \\( 0.14 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)로 나타났고, 뿌리썩음병원균에 대한 ED50값은 \\( 0.16 \\mathrm{mg} / \\mathrm{ml} \\)로 1차 추출물로서는 높은 활성을 나타냈다", "(Table 3).", "골프장에서는 잔디뿌리썩음 병원균인 R.", "solani피해를 줄이기 위해서 과대한 살균제 사용을 하고 있는 실정으로 이는 수계환경보호에 큰 문제가 되어지고 있다.", "이러한 문제를 해결하기 위하여 미생물제제를 비롯한 생물제제 방제법을 택하고 있다.", "RRj 228 균주의 배양액제제나 생균을 처리하면 R.", "solani방제에 많은 도움이 될 것으로 사료되어진다.", "</p><h2>항균물질 구조동정</h2><p>Pseudomanas sp.", "RRj 228균의 배양액으로부터 분리한 228-7 물질의 구조동정은 FAB질량분석, \\( { }^{1} \\mathrm{H}\\)-NMR, \\({ }^{13} \\mathrm{C}\\)-NMR, \\({ }^{1} \\mathrm{H}-{ }^{1} \\mathrm{H} \\) COSY, HMQC 그리고 HMBC 분석을 통하여 화학적인 구조 분석을 시도하였다.", "228-7 물질을 FAB 질량분석에서 \\( [\\mathrm{M}+\\mathrm{H}]^{+} \\) 225과 EI 질량분석에서 \\( [\\mathrm{M}+\\mathrm{H}]^{-} \\) 223을 확인되어져 분자량이 224 dalton으로 결정되었다.", "정확한 구조를 결정하기 위하여 \\( { }^{1} \\mathrm{H}\\)-NMR과 \\( { }^{13} \\mathrm{C}\\)-NMR 분석을 실시한 결과, \\( { }^{1} \\mathrm{H}\\)-NMR 분석에서 하나의 hydroxyl group이 존재함을 알 수 있었고, 13C-NMR 분석에서 탄소수가 13개이며, 1개의 carboxyl group (C-1' \\( \\delta \\mathrm{c} \\) \\( 166.1 \\mathrm{ppm} \\))이 존재하는 것이 관찰되었다", "(Table 4).", "7개의 methine proton (\\( \\mathrm{H}-2\\), \\(\\delta_{\\mathrm{H}}\\) \\(8.98\\) \\(\\rightarrow\\) \\( \\delta_{\\mathrm{C}}\\) \\(137.7\\) ; \\(\\mathrm{H}-3\\), \\(\\delta_{\\mathrm{H}}\\) \\(8.05\\) \\(\\rightarrow\\) \\(\\delta_{\\mathrm{C}}\\) \\(130.3\\); \\(H-4\\), \\( \\delta_{\\mathrm{H}}\\) \\(8.53\\) \\(\\rightarrow\\) \\(\\delta_{\\mathrm{c}}\\) \\(135.4\\) ; \\(\\mathrm{H}-7\\), \\(\\delta_{\\mathrm{H}}\\) \\(8.36\\) \\(\\rightarrow\\) \\(\\delta_{\\mathrm{C}}\\) \\(128.2\\) ; \\(\\mathrm{H}-8 \\), \\( \\delta_{\\mathrm{H}}\\) \\(7.99\\) \\(\\rightarrow\\) \\(\\delta_{\\mathrm{C}}\\) \\(131.9\\) ; \\(\\mathrm{H}-9\\), \\(\\delta_{\\mathrm{H}}\\) \\(8.02\\) \\(\\rightarrow\\)\\( \\delta_{\\mathrm{C}}\\) \\(133.5\\) ; \\(\\mathrm{H}-10\\), \\(\\delta_{\\mathrm{H}}\\) \\(8.29 \\) \\( \\rightarrow \\delta \\mathrm{c}\\) \\(130.3 \\))을 확인하였다.", "Liu가 S.", "salina에서 분리한 phena-zine-1-carboxylic acid와 chemical shift를 비교한 결과, me-thine proton의 chemical shift는 일치하였고, C-7과 C-10의 chemical shift가 \\( 130.1 \\mathrm{ppm} \\)과 \\( 128.0 \\mathrm{ppm} \\)에서 \\( 128.2 \\mathrm{ppm} \\)과 \\( 130.3 \\mathrm{ppm} \\)으로 이동하였으나 다른 carbon의 chemical shift는 일치하였다. \\", "( { }^{1} \\mathrm{H}-{ }^{1} \\mathrm{H} \\) COSY 분석을 통하여 양성자들 사이의 cross peak를 관찰하였다.", "이상의 결과들을 정리한 결과, me-thine proton chemical shift와 carbon chemical shift 및 분자량 결과를 종합한 결과 Phenazine-1-carboxylic acid로 동정하였다", "(Fig. 4).", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Pseudomonas sp. 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5,435	<h1>결과 및 고찰</h1><h2>벼의 고친화성 인산 운반체 유전자 족</h2><p>벼의 전체 유전체의 염기서열이 완전히 밝혀진 현재, 벼에는 13종의 고친화성 운반체 유전자(OsPT)들이 존재하는 것으로 보고되고 있다. 그 중에서 9종의 OsPT 유전자들(OsPTY, OsPT2, OsPT3, OsPT4, OsPT5, OsPT6, OsPT7, OsPT8, OsPT12)은 서로 아미노산 서열이 \( 70 \% \) 이상 같으며, 이들 유전자들은 애기장대, 감자, 토마토 등 다른 종에서 분리되고 잘 연구된 고친화성 운반체 유전자들과도 아미노산 서열이 유사하였다. 이러한 결과는 이들 유전자들은 다른 종에서 실험적으로 확인 된바와 같이, 토양으로부터 인산의 흡수와 이동 등 식물체내의 인산 항상성 유지에 관여 할 것으로 생각된다. 그러나 나머지 4종의 OsPT 유전자들(OsPT9, OsPT10, OsPT11, OsPT13)은 아미노산 서열이 기존의 고친화성 운반체 유전자들과의 유사성이 낮은 것으로 보아 그 특이적인 기능이 있을 것으로 예상된다. 따라서 전자의 9종의 OsPT 유전자들을 그룹1로, 후자의 4 종의 OsPT 유전자들을 그룹2로 세분하였다. 또한 그룹1과 그룹2 간에는 유전체의 구성적인 면에서도 확연한 차이점이 발견된다. 그룹1에 속하는 OsPT 유전자들은 모두 하나의 exon으로 구성되어있는 반면에, 그룹2에 속하는 OsPT 유전자들은 하나 이상의 intron을 포함하고 있다. 이러한 구조적 차이점은 그룹 2 의 OsPT 유전자의 진화 과정은 그룹1의 OsPT 유전자들과는 별개로 진행되어왔을 가능성을 시사한다. 특히 벼의 OsPT11 유전자와 감자의 StPT3 유전자가 뿌리에 공생하며 식물체에 인산을 공급하고 arbuscular mycorrhizal 균류의 감염에 특이적으로 반응하며, 균류로부터 직접적으로 인산을 흡수하는데 관여한다는 연구 결과는 이러한 가설을 지지하다.</p><p>벼에는 12개의 염색체가 존재하는데, 13종의 OsPT 유전자는 6개의 염색체에만 편재되어 있다. 특히, 3번 염색체에는 가장 많은 4개의 OsPT 유전자들이 존재하는데, 이들 서로 간의 아미노산 서열의 유사성이 높기 때문에 하나의 유전자가 진화 과정 중에 2번의 duplication 과정을 거쳐서 현재의 상태로 이른 것으로 생각된다. 그러나 4번 염색체에 존재하는 3개의 OsPT 유전자들의 경우, OsPT13 단백질의 아미노산 서열은 다른 두 종의 OsPT 단백질과는 확연히 다른 반면에 OsPT4과 OsPT5 단백질의 아미노산 서열이 서로 유사하다. 이러한 결과는 OsPT4 또는 OsPT5 유전자와 OsPT13 유전자는 진화초기에 기능적으로 분리되었고 OsPT4과 OsPT5 유전자는 최근의 duplication 과정을 거쳐 형성된 것임을 의미한다. 따라서 현재의 벼 유전체에 존재하는 13종의 OsPT 유전자 중에서 아미노산 서열이 서로 유사한 그룹1의 OsPT 유전자는 소수의 원시 OsPT 유전자가 최근의 duplication에 의해서 형성되었으며 기능적으로도 유사할 것으로 생각된다.</p><h2>벼의 고천화성 인산 운반체의 위상</h2><p>본 연구에서는 전형적인 고친화성 인산 운반체 유전자 군에 속하는 OsPT1과 OsPT7 유전자의 기능 분석에 집중하였다. Figure 1B의 hydrophobicity plot에서 보는 바와 같이, OsPT1과 OsPT7 단백질은 아미노 말단과 카르복시 말단이 세포질 쪽으로 존재하고 세포막을 가로지르는 12개의 비친 수성 영역을 가진 전형적인 세포막에 존재하는 내재성 단백질의 구조를 가지고 있다. 특히 6번째와 7번째 비친수성 영역 사이와 카르복시 말단 부위에는 긴 친수성 영역이 세포질 쪽으로 존재하며, 구조적으로 유사한 모든 고친화성 인산 운반체에서도 이러한 영역들이 존재한다는 사실은 이 영역이 인산 운반체의 기능 조절에 중요한 기능을 할 것이라는 추정을 가능하게 한다. 실제로 protein kinase C와 casein kinase II에 의해서 인산화 될 것으로 추정되는 아미노산 잔기들이 컴퓨터를 이용한 조사에서 발견된다. 그러나 아직 이러한 기능이 생화학적 실험으로 증명되지는 않았다. 일반적으로 고친화성 양분 운반체 유전자는 해당 양분이 충분히 있는 조건에선 그 발현이 억제되었다가 결핍이 오면 급속히 발현이 증가되는 양상을 보인다. 이러한 전사단계의 주된 조절이외에도 단백질 수준에서 활성 조절 기작 또한 매우 중요할 것으로 생각된다. 툭히 desensitization 반응에서처럼, 미세한 환경 변화에 신속한 반응이 필요한 경우 또는 환경 변화에 따라 더 이상 단백질의 기능이 필요 없는 경우에는 단백질 수준에서의 조절이 유리하다. 실제로 질산 결핍시 대량 발현되는 효모의 고친화성 질산 운반체 단백질은 질산이 충분한 조건에선 그 유전자의 전사과정이 억제됨과 동시에 단백질은 ubiquitinylation 과정을 거쳐 액포에서 분해됨으로써 식물체내의 질산 항상성을 유지하는 것으로 보고되고 있다. 이 단백질의 중앙에 있는 긴 친수성 영역은 세포질 쪽으로 존재하며 ubiquitinylation의 표적 부위로서 단백질의 안정성을 조절한다고 알려져 있다.</p>	생명과학	[ "<h1>결과 및 고찰</h1><h2>벼의 고친화성 인산 운반체 유전자 족</h2><p>벼의 전체 유전체의 염기서열이 완전히 밝혀진 현재, 벼에는 13종의 고친화성 운반체 유전자(OsPT)들이 존재하는 것으로 보고되고 있다.", "그 중에서 9종의 OsPT 유전자들(OsPTY, OsPT2, OsPT3, OsPT4, OsPT5, OsPT6, OsPT7, OsPT8, OsPT12)은 서로 아미노산 서열이 \\( 70 \\% \\) 이상 같으며, 이들 유전자들은 애기장대, 감자, 토마토 등 다른 종에서 분리되고 잘 연구된 고친화성 운반체 유전자들과도 아미노산 서열이 유사하였다.", "이러한 결과는 이들 유전자들은 다른 종에서 실험적으로 확인 된바와 같이, 토양으로부터 인산의 흡수와 이동 등 식물체내의 인산 항상성 유지에 관여 할 것으로 생각된다.", "그러나 나머지 4종의 OsPT 유전자들(OsPT9, OsPT10, OsPT11, OsPT13)은 아미노산 서열이 기존의 고친화성 운반체 유전자들과의 유사성이 낮은 것으로 보아 그 특이적인 기능이 있을 것으로 예상된다.", "따라서 전자의 9종의 OsPT 유전자들을 그룹1로, 후자의 4 종의 OsPT 유전자들을 그룹2로 세분하였다.", "또한 그룹1과 그룹2 간에는 유전체의 구성적인 면에서도 확연한 차이점이 발견된다.", "그룹1에 속하는 OsPT 유전자들은 모두 하나의 exon으로 구성되어있는 반면에, 그룹2에 속하는 OsPT 유전자들은 하나 이상의 intron을 포함하고 있다.", "이러한 구조적 차이점은 그룹 2 의 OsPT 유전자의 진화 과정은 그룹1의 OsPT 유전자들과는 별개로 진행되어왔을 가능성을 시사한다.", "특히 벼의 OsPT11 유전자와 감자의 StPT3 유전자가 뿌리에 공생하며 식물체에 인산을 공급하고 arbuscular mycorrhizal 균류의 감염에 특이적으로 반응하며, 균류로부터 직접적으로 인산을 흡수하는데 관여한다는 연구 결과는 이러한 가설을 지지하다.", "</p><p>벼에는 12개의 염색체가 존재하는데, 13종의 OsPT 유전자는 6개의 염색체에만 편재되어 있다.", "특히, 3번 염색체에는 가장 많은 4개의 OsPT 유전자들이 존재하는데, 이들 서로 간의 아미노산 서열의 유사성이 높기 때문에 하나의 유전자가 진화 과정 중에 2번의 duplication 과정을 거쳐서 현재의 상태로 이른 것으로 생각된다.", "그러나 4번 염색체에 존재하는 3개의 OsPT 유전자들의 경우, OsPT13 단백질의 아미노산 서열은 다른 두 종의 OsPT 단백질과는 확연히 다른 반면에 OsPT4과 OsPT5 단백질의 아미노산 서열이 서로 유사하다.", "이러한 결과는 OsPT4 또는 OsPT5 유전자와 OsPT13 유전자는 진화초기에 기능적으로 분리되었고 OsPT4과 OsPT5 유전자는 최근의 duplication 과정을 거쳐 형성된 것임을 의미한다.", "따라서 현재의 벼 유전체에 존재하는 13종의 OsPT 유전자 중에서 아미노산 서열이 서로 유사한 그룹1의 OsPT 유전자는 소수의 원시 OsPT 유전자가 최근의 duplication에 의해서 형성되었으며 기능적으로도 유사할 것으로 생각된다.", "</p><h2>벼의 고천화성 인산 운반체의 위상</h2><p>본 연구에서는 전형적인 고친화성 인산 운반체 유전자 군에 속하는 OsPT1과 OsPT7 유전자의 기능 분석에 집중하였다.", "Figure 1B의 hydrophobicity plot에서 보는 바와 같이, OsPT1과 OsPT7 단백질은 아미노 말단과 카르복시 말단이 세포질 쪽으로 존재하고 세포막을 가로지르는 12개의 비친 수성 영역을 가진 전형적인 세포막에 존재하는 내재성 단백질의 구조를 가지고 있다.", "특히 6번째와 7번째 비친수성 영역 사이와 카르복시 말단 부위에는 긴 친수성 영역이 세포질 쪽으로 존재하며, 구조적으로 유사한 모든 고친화성 인산 운반체에서도 이러한 영역들이 존재한다는 사실은 이 영역이 인산 운반체의 기능 조절에 중요한 기능을 할 것이라는 추정을 가능하게 한다.", "실제로 protein kinase C와 casein kinase II에 의해서 인산화 될 것으로 추정되는 아미노산 잔기들이 컴퓨터를 이용한 조사에서 발견된다.", "그러나 아직 이러한 기능이 생화학적 실험으로 증명되지는 않았다.", "일반적으로 고친화성 양분 운반체 유전자는 해당 양분이 충분히 있는 조건에선 그 발현이 억제되었다가 결핍이 오면 급속히 발현이 증가되는 양상을 보인다.", "이러한 전사단계의 주된 조절이외에도 단백질 수준에서 활성 조절 기작 또한 매우 중요할 것으로 생각된다.", "툭히 desensitization 반응에서처럼, 미세한 환경 변화에 신속한 반응이 필요한 경우 또는 환경 변화에 따라 더 이상 단백질의 기능이 필요 없는 경우에는 단백질 수준에서의 조절이 유리하다.", "실제로 질산 결핍시 대량 발현되는 효모의 고친화성 질산 운반체 단백질은 질산이 충분한 조건에선 그 유전자의 전사과정이 억제됨과 동시에 단백질은 ubiquitinylation 과정을 거쳐 액포에서 분해됨으로써 식물체내의 질산 항상성을 유지하는 것으로 보고되고 있다.", "이 단백질의 중앙에 있는 긴 친수성 영역은 세포질 쪽으로 존재하며 ubiquitinylation의 표적 부위로서 단백질의 안정성을 조절한다고 알려져 있다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "애기장대에서의 벼 유래의 고친화성 인산 운반체 유전자들의 기능 분석", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-fa17b369-2d7d-445a-8d26-61b6c3338f9b", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "서현미", "정윤희", "김윤혜", "권택민", "정순재", "이영병", "김도훈", "남재성" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,436	<h1>요 약</h1><p>본 연구는 심장재활에 참여한 고혈압을 동반한 급성관상동맥질환자중 내과적인 약물로 조절되지 않은 고혈압 환자의 경우와 약물로 조절되는 정상 혈압 환자군에서 트레드밀 운동과 고정식 자전거 운동 수행시 강도별 혈압과 심근산소소비량, 자각지수에 대한 반응을 구명하고자 목적하였다. 이를 위해 6주간의 심장재활 프로그램에 참여한 심혈관질환 환자를 연구대상으로 약물에 대한 혈압이 조절되는 혈압약물반응군과 약물에 대한 혈압이 조절되지 혈압약물비반응군 환자를 동원하여, 트레드밀 운동부하검사를 실시하여 예비심박수를 구하였으며, 이를 근거로 중강도 운동강도 (\( 60 \%\)HRR) 와 고강도 운동강도(\( 85 \%\)HRR)의 심박수에서 트레드밀 운동과 고정식자전거 운동을 실시하였다. 혈압의 조절유무에 따라 강도별 트레드밀과 고정식자전거 운동 시에 나타난 심혈관반응의 결과는 다음과 같다. 첫째, 중강도 (\( 60 \%\)HRR) 와 고강도(\( 85 \%\)HRR)에서 운동 형태(exercise mode)에 따른 혈압약물반응군과 혈압약물비반응군과의 심혈관 반응에 대한 결과 모든 운동강도에서 고정식자전거 운동이 트레드밀 운동보다 수축기혈압, 이완기혈압, 평균동맥혈압, 심근산소소비량, 운동자각도 모두 유의하게 높았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 또한 고정식 자전거의 \( 60 \% \) 강도에서 나타난 심혈관계에 미치는 부담이 \( 85 \% \) 강도의 트레드밀에서 받는 부담과 비슷하였다. 둘째, 혈압약물비반응군은 모든 운동방법(중강도 트레드밀, 고강도 트레드밀, 중강도 고정식자전거, 고강도 고정식자전거)에서 혈압약물반응군보다 유의하게 높은 이완기혈압(DBP) 을 나타냈고 \( (\mathrm{p}<0.05) \), 이와 함께 평균동맥혈압(MAP) 역시 모든 운동방법에서 혈압약물비반응군이 혈압약물반응군 보다 유의하게 높았다\( (\mathrm{p}<0.05) \). 이때, 수축기 혈압에서는 혈압약물비반응군이 중강도자전거 운동방법( (\( 60 \%\)HRR-cycle exercise)에서만 정상군보다 유의하게 높게 나타났다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 즉, 혈압약물 비반응군이 중강도자전거 운동방법에서 수축기혈압과 이완기기혈압, 평균동맥혈압이 혈압약물반응군 보다 유의하게 높았다. 셋째, 심근산소소비량(RPP)에서 혈압약물비반응군과 혈압약물반응군과 중강도자전거 운동에서 유의한 차이는 없었으며 중강도 트레드밀 운동과 중강도자전거 운동 간의 평균 차이에서 중강도자전거 운동이 혈압약물반응군보다 혈압약물비반응군에서 유의하게 높게 증가하였음에도 불구하고 운동자각도(RPE)는 중강도자전거 운동에서 혈압약물반응군과 혈압약물비반응군 간에는 차이를 보이지 않았다.</p><p>이상의 결과, 심장재활운동전에 내과적으로 혈압 조절과 상관없이 고혈압 심장질환과 정상혈압 심장질환환자 모두 같은 강도에서 트레드밀보다 고정식 자전거 운동 시에는 모두 철저한 혈압감시가 필요하였다. 특히 고혈압심혈관질환 환자는 혈압의 상승폭이 보다 큰 결과를 보여 트레드밀에 적용한 운동 강도를 동일하게 고정식자전거에 적용하는 것은 적합하지 못하였다.</p> <p>증가된 부하의 심혈관계 작용을 요구하는 고정식 자전거 운동은 고혈압을 가지는 급성관상동맥 질환자에게는 위험한 운동이 될 가능성이 있다. 그 이유는 고혈압을 유지하는 환자는 정상인보다 안정시, 저강도, 중강도, 고강도 운동에서의 각각 운동강도에서 모두 정상인보다 증가된 보다 높은 혈압을 가지는 생리적 기전이 작용하기 때문이다. 급성관상동 맥질환자의 경우 심장수술 후 약물에 의한 혈압을 조절과 함께 재활 프로그램을 실시하여야 한다. 이때, 혈압강하제 약물에 대한 반응은 유전적 요인과 환경적 요인, 생활습관과 과거 약물복용여부와 복용기간 등에 따라 다르게 나타나며, 이로 인해 혈압강하제에 의해 반응에 대한 개인차가 나타나 특정 혈압강하제처방에 의해 쉽게 혈압이 조절되는 급성관상동맥질환자가 있으며, 특정 혈압강하제에 반응하지 않아 고혈압 상태를 유지하는 환자도 있다. 이들 급성 관상동맥질환자들은 수술후 재활단계에서 안정시 수축기/이완기 혈압이 180/100이 넘지 않는다면 고혈압 상태이더라도 약물처방과 함께 환자의 관상동맥증후군의 재발방지와 일상생활의 정상적인 복귀, 심혈관계 기능 개선 및 혈압강하 치료를 위해 고정식 자전거 운동이나 트레드밀 운동형태와 같은 유산소운동을 통해 재활운동을 실시한다. 이 결과, 복합적인 원인에 의해 혈압강하제 약물에 대한 반응 하지 않은 고혈압 환자는 높은 혈압을 가진 상태에서 재활프로그램을 실시하는데, 재활시 고정식 자전거 운동을 통해 유산소운동을 실시한다면 고정식 자전거 운동은 트레드밀 운동보다 모든 운동강도에서 더욱 증가된 혈압 수준을 요구하기 때문에, 고혈압을 가진 급성관상동맥질환자의 고정식 자전거 운동은 더욱 증가된 혈압과 함께 이로 인한 심혈관의 부담이 증가될 가능성이 있다. 또한, 혈압강하제 약물 처방에 의해 조절되지 않은 고혈압 급성관상동맥질환자는 유산소 운동에서 정상혈압환자와 달리 동일한 운동강도 수준에서 증가된 혈압과 심혈관 부담에도 불구하고 낮은 운동자각도 수준을 나타낸다.</p><p>이를 근거로 할 때, 심장재활운동을 하는 급성관상동맥질환자 중 높은 혈압을 가지는 고혈압 급성관상동맥질환자는 고정식 자전거에서의 운동이 더욱 높은 혈압과 이로 인한 심혈관계의 부담을 가중키는 반면 낮은 운동자각도 반응에 의한 운동조절 기전에 문제를 가질 가능성이 있다. 따라서 심장재활운동을 하는 고혈압 심혈관환자들의 고정식 자전거 운동에 대한 심혈관계의 반응에 대한 과학적 정보와 이를 근거한 운동 지침이 필요한 상태이다. 그러나 실제로 고혈압 심혈관환자에 대한 고정식 자전거 운동에 대한 심혈관계 반응 및 운동자각도 반응에 대한 정보가 국외에는 Reed의 일반인에서 고정식 자전거 운동이 증가된 혈압을 가진다는 정보만 있을 뿐이며, 국내의 경우 김영주 등이 보고한 고혈압 환자가 고정식 자전거 운동에서 트레드밀 보다 높은 혈압을 가진다는 보고만 이루어 졌을 뿐, 실제 정상 혈압이 유지되는 환자의 차이를 비교하여 실제적인 심혈관계의 부담에 대한 수준과 이에 따른 운동처방에 대한 정보는 미비한 실정이다.</p><p>따라서 본 연구는 심장재활에 참여한 고혈압을 동반한 급성관상동맥질환자중 내과적인 약물로 조절되지 않은 고혈압 환자의 경우와 약물로 조절되는 정상 혈압 환자군에서 트레드밀 운동과 고정식 자전거 운동 수행시 강도별 혈압과 심근 산소소비량, 자각지수를 알아봄으로 고혈압을 동반한 급성 관상동맥질환자가 운동형태와 운동강도에 따른 심혈관계의 반응 및 부담 수준을 구명하고 이를 근거로 급성관상 동맥질환자의 운동치료에 대한 적절한 운동처방의 정보를 제공하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구 대상</h2><p>본 연구에서는 불안정 협심증 및 급성 심근경색증으로 S 병원에 입원하여 경피적 관상동맥 성형술과 약물처치를 받은 환자들 중 6주간의 심장재활 프로그램에 참여한 환자를 연구대상으로 하였다. 연구대상자는 모두 고혈압의 과거력을 갖고 있었으며 이들 중 불안정협심증 34명, 급성심근경색 40명으로 총 74명이었으며(Table 1), 이들 대상자중 심각한 부정맥, 좌심실 박출율(ejection fraction) \(40\%\)이하의 심부전증, 운동부하 검사를 받기 어려운 만성 폐쇄성 폐질환과 근골격계질환, 운동유발성 고혈압, 운동부하 검사도중 심혈관계 이상반응으로 검사를 중단한 경우, 실험기간 중 약물이 바뀐 경우는 실험 대상에서 제외되었다.</p><h2>연구 방법</h2><p>운동부하검사는 심혈 관질환자들에게 주로 적용되는 modified Bruce protocol을 이용하여 환자 자신이 힘들어서 더 이상 검사를 수행하기 어려울 때까지 시행하는 점진적 증상제한 운동부하검사(symptom limited GXT)를 실시하였으며, 검사 중 환자의 흥통, 어지러움 같은 자각증상이나 모니터 상 ST 분절 하강이나 상승, 발작성 심방빈맥과 방실 및 심실 빈맥, R on T 현상 같은 위험한 심전도와 안정시 혈압이 \( 180 / 100 \mathrm{mmHg} \) 나 운동 시 혈압이 \( 250 / 115 \mathrm{mmHg} \) 이상 상승할 때, 예상 최대심박수(220-나이) 이상 초과할 때, 검사 중 부하가 증가함에도 불구하고 심박수가 증가하지 않을 때, 혈압이 검사 중 \( 20 \mathrm{mmHg} \) 이상 감소할 때 등 미국심장학회의 운동부하검사 조기 종료 기준에 따라 검사를 종료시켰다. 검사는 12 채널 실시간 운동부하 검사용 심전도 검사기 Q4500 및 호흡가스 분석기 QMC (Quinton, USA), 자동 혈압 및 맥박 측정기(Model 412, USA) 그리고 운동부하 검사용 트레드밀(Medtrack ST 55, Quinton, USA)을 사용하였다. 운동부하검사를 통하여 안정 시 및 최대운동 시의 심박수, 혈압, 최고산소 소모량(Peak oxygen consumption, \( \mathrm{VO}_{2 \text { peak }} \))을 기록하였다. 운동자각지수는 6-20 Borg scale을 이용하였다. 약물투여는 운동부하검사 및 심장재활 프로그램 참여 동안 중단하거나 변경하지 않고 유지하였다.</p><p>모든 환자들은 퇴원 후 1주 내에 심장재활 클리닉에 내원하여 운동부하검사를 시행하였다. 운동은 Karvonen (1957)의 운동강도 설정 방식(최대심박수-안정시 \(\times \)심박수\(\%\)강도)+ 안정시 심박수)을 토대로 하였으며 목표심박수 운동강도는 \( 60 \%\) HRR와 \( 85 \%\) HRR로 선정하였다. 모든 운동시간 중에 무선심전도를 부착하여 모니터로 심박수와 심전도(심근허혈: ST 분절 하강이나 상승유무, 부정맥: 비지속 및 지속성 심방, 방실, 심실빈맥, R on T)를 감시하였고 운동 종료 마지막 2분 전 심혈관 반응을 측정하였다. 운동부하검사 이후 심장재활센타 외래에서 환자는 6주간 주3회 1시간 정도의 감시 하에 통원재활 치료를 받게 되며 운동유형은 고정식 자전거와 트레드밀로 시행 된다. 심장재활의 운동강도는 2주마다 점진적으로 증가시켜 마지막 2주 동안은 목표심박수의 \( 85 \% \)까지 유지시키는 방식으로 진행되지만 본 연구를 위해 적응 단계 없이 4일 동안 운동유형을 달리하여 이틀 동안은 \( 60 \% \) 강도로, 3 일과 4 일은 \( 85 \% \) 강도로 실시하였다. 심장재활 1 회 운동은 준비운동 10분, 본 운동 27분, 정리운동 10분간 운동을 계속하는 방식으로 진행되며 본 운동은 트레드밀과 고정식 자전거 운동을 각기 12분씩 시행하는데 첫 12분의 운동이 끝나면 운동기구에서 내려와 평지를 편안한 속도로 걸으면서 3분간 쉬다가 다음 12분 동안 운동하게 된다. 심장재활 첫날 트레드밀 운동강도를 목표심박수의 \( 60 \% \) 강도까지 점진적으로 증가시킨 후 운동 종료 2분 전에 심박수, 혈압, 심근산소소비량 (심박수\( \times\)수축기혈압), 운동 자각지수를 측정 하였다. 둘째날은 고정식 자전거 운동 시에 같은 방식으로 심박수, 혈압, 심근산소소비량(심박수\( \times\)수축기혈압), 운동자각지수를 측정하였으며 이와 같은 방식으로 셋째날 트레드밀과 넷째날 고정식 자전거로 \( 85 \% \) 의 운동강도에서 심박수, 혈압, 심근산소소비량(심박수 \( \times\)수축기혈압), 운동자각지수를 측정하였다. 심장재활 프로그램에 참여한 74명 중 안정시 혈압이 약물에 의해 조절되는 혈압약물반응군과 약물에도 불구하고 조절되지 않은 혈압약물비반응군으로 분류하였다.</p><h2>자료 처리</h2><p>이 연구에서 얻은 자료는 참여한 환자들의 일반적인 특성과 혈압, 심근산소소비량(RPP), 운동자각도(RPE) 등의 변인들이 있었다. 이 변인들에 대한 자료들은 먼저 평균과 표준 편차를 포함한 기술통계치로 산출하였고, 이후 혈압약물비 반응군과 혈압약물반응군의 평균차이를 독립표본 T-검증을 실시하여 분석하였다. 혈압약물비반응군과 혈압약물반응군에서 네가지 운동량(treadmill exercise at \( 60 \%\)HRR, cycle exercise at \( 60 \%\)HRR, treadmill exercise at \( 85 \%\) HRR, cycle exercise at \( 85 \%\) HRR)을 실시하여 얻은 네 가지 운동량의 혈압, 심근산소소비량, 운동자각도의 평균값들에 대한 차이는 일원변량분석(repeated one-way ANOVA)을 실시하였으며, 운동방법간(treadmill exercise at \( 60 \%\)HRR, cycle exercise at \( 60 \%\)HRR, treadmill exercise at \( 85 \%\) HRR, cycle exercise at (\( 85 \%\) HRR)에 유의한 차이가 있을 경우, LSD 분석법을 이용하여 사후검증을 실시하였다. 집단 간(혈압약물비반응군 vs. 혈압약물반응군)의 평균차 검증은 독립표본 T-검증을 실시하였고, 운동형태에 따른 RPP 차이에 대한 평균은 운동강도 (\( 60 \%\)HRR vs. \( 85 \%\) HRR)간의 차이는 대응표본 T-검증을, 집단 간은 독립표본 T-검증을 실시하여 분석하였다. 검사결과에 대한 통계적 수락 수준은 \( \mathrm{p}<0.05 \)로 하였으며, 자료 처리는 SPSS 14.0 윈도우버전을 이용하였다.</p> <p>한편 본 연구에서는 선행연구에서 보고하지 못했던 중강도 \( 60 \%\)HRR와 \( 85 \%\)HRR에서의 고정식 자전거 운동에 대한 심혈관 부담의 수준과 자각도 수준을 연구한 결과에서 중강도 고정식 운동이 고강도의 트레드밀 운동에 의한 심혈관 부담과 자각도 수준에 해당한 결과는 관상동맥중재술을 받은 상태 환자가 재활을 위해 고정식 자전거 운동을 할 경우 중강도의 고정식 자전거 운동일지라도 트레드밀보다 높은 심혈관부담을 가지는 원인 때문에 부작용을 유발할 가능성을 제시하였다. 실제로 이번 실험 중에서 트레드밀 운동에서는 1명만이 흉통을 호소한 것에 비해 고정식자전거 운동 시에는 3명이 흉통을 호소하였고 1명의 심방세동이 유발되었고 4명은 운동을 중단하였다. 따라서 심혈관 질환자에게 중◦고강도의 고정식 자전거 운동을 수행시킬 경우 트레드밀 보다는 더 큰 심근에 부담을 주면서 운동하게 되므로 강도설정에 있어 주의가 필요하다.</p><p>위와 같이 고정식 자전거가 높은 혈압 및 심혈관 부담을 가지는 반응을 한 결과에서 혈압약물비반응군과 혈압약물반응군 간의 운동량(중강도 트레드밀, 고강도 트레드밀, 중강도 고정자전거, 고강도 고정자전거)에 따른 혈압 및 혈관반응에 대한 차이를 분석하면 Table 2에서 나타나듯이, 약물반응에 의해 혈압이 정상으로 유지되는 혈압약반응군보다 혈압이 조절되지 않은 약물비반응군에서 모든 운동량에 대한 이완기혈압(DBP) 은 유의하가 높았으며 \( (\mathrm{p}<0.05) \), 이와 함께 평균 동맥혈압(MAP) 역시 모든 운동방법에서 혈압약물비반응군이 혈압약물반응군보다 유의하게 높았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 이때, 수축기 혈압에서는 혈압약물비반응군이 중강도자전거 운동방법 (\(60\%\)HRR-cycle exercise)에서만 정상군보다 유의하게 높게 나타났다. 이와 함께, 중강도자전거 운동에서 심근산소소비량(RPP)이 혈압약물비반응군과 혈압약물반응군간에 유의한 차이는 없었으나, Fig. 1 과 같이 중강도에서의 \( \triangle \)심근산소소비량\( \left(\triangle \mathrm{RPP}_{\text {중강도 }}=\mathrm{RPP}_{\text {중강도 고정식 자전거 }}-\mathrm{RPP}_{\text {중강도 트레드밀 }}\right) \)에서 혈압약물반응군보다 혈압약물비반응군에서 유의하게 높게 증가했다\( (\mathrm{p}<0.05) \).</p><p>이 결과 중강도에서 고정식 자전거 운동에 의해 심근산소소비량(RPP) 트레드밀 운동에 의한 심근산소소비량(RPP)보다 유의한 수준으로 증가한 것을 나타내었다. 그러나 증가된 심근산소소비량과 함께, 수축기와 이완기 혈압, 평균혈압이 중강도 고정식 자전거 운동에 의해 중강도 트레드밀 운동보다 유의하게 증가하였으나, 운동자각도(RPE) 만큼은 혈압약물반응군과 혈압약물비반응군간에는 차이가 없었다(Table 2). 종합하면, 혈압약물비반응군은 중강도 고정식 자전거 운동에서 혈압약물반응군보다 높은 심혈관의 부담을 가졌으나, 운동에 대한 강도를 인지하는 운동자각도는 증가하지 못하였다.</p><p>일반인에서 운동 강도가 증가함에 따라 혈압이 증가하는 것은 잘 알려져 있으며. 이와 함께 Basett 등은 안성시 혈압 수준이 운동 강도에 따라 증가된 혈압을 결정한다고 보고하였다. Basett 등의 연구에서 혈압이 높은 사람은 안정 시부터 운동강도가 최대에 이르기까지 전체 운동 강도 범위에서 혈압이 낮은 사람보다 일정하게 높은 혈압을 유지하였다. 이와 같은 혈압의 반응에 따라 고혈압을 가진 환자의 경우 운동 강도의 증가는 더욱 가중된 혈압의 증가를 가져올 가능성이 있으며, 특히 트레드밀이 아닌 고정식 자전거로 운동 실천한다면 운동 강도의 증가와 함께 고정식 자전거로 인한 혈압 증가의 부담이 더욱 가중되어 심혈관의 부담이 위험한 수준까지 증가할 가능성이 있다. 본 연구의 결과에서 안정시 고혈압이 유지되는 급성관상동맥질환자는 중강도와 고강도에서 모두 정상혈압으로 조절되는 급성관상동맥질환자보다 혈압 및 심혈관의 부담이 보다 증가된 것을 발견되었다. 즉 고정식 자전거가 트레드밀보다 같은 강도에서의 심근산소소비량을 증가시키는 현상에 대해서는 선행연구와 일치한 것으로 나타났으며 특히 약물로 혈압이 조절되지 않는 관상동맥증후군 고혈압환자의 경우 더 큰 부담을 주는 것으로 나타났다. 이는 고정식 자전거가 관상동맥질환이 있는 환자에게서 약물로 조절되지 않는 고혈압환자의 말초저항이나 심근수축력을 더 크게 상승시키는 요인으로 작용했을 것으로 사료된다.</p> <p>운동의 힘든 정도 및 운동강도를 표현할 때 개개인의 운동부하 검사를 통해 측정된 최대 예비심박수 및 최대 산소소비량의 상대적인 백분율과 운동자각도를 이용할 수 있다. 특히 운동자각도인 Borg scale은 개개인의 차이가 있지만 운동부하 검사간의 차이가 적고 운동부하검사 시 느끼는 피로도와 일상생활에서 느끼는 피로도와 일치하는 장점이 있다. 본 연구에서는 \( 60 \% \) 목표심박수의 낮은 중강도의 운동 중에 고정식 자전거의 수축기 혈압이 증가되므로 고혈압집단이 정상집단보다 높은 심근산소소비 량이 증가함에도 불구하고 환자가 느끼는 힘든 자각도가 정상군과 차이가 없다는 것은 두 가지를 추측할 수 있다. 하나는 \( 60 \% \) 강도의 비교적 낮은 운동 강도이기 때문에 혈압상승으로 인한 심근산소소비량이 자전거에서 유의하게 크지만 그 증가폭이 힘든 느낌이 들만큼 크지 않았을 것이며, 또 한가지는 혈압 상승은 자각증상이 없는 것이 대부분이고 그 상승폭이 역시 힘든 느낌이 들만큼 크지 않았기 때문이라 사료 된다. 그러나 \( 60 \% \) 의 낮은 운동 시에 고정식 자전거에서 높은 심근산소비량을 보였는데도 고혈압집단에서 힘든 느낌이 없었다는 것은 고혈압을 가진 급성관상동맥질환자가 운동에 따른 심혈관의 부담을 지각하지 못한 채 운동하여 과도한 운동을 실시할 위험이 있기 때문에 임상적으로 주의해야할 결과라고 생각된다. 특히, 본 연구에서는 고혈압집단의 \( 85 \% \) 강도시 고정식자전거에서 \( 15.4 \pm 1.34 \) (힘들다)로 심장재활 2단계 운동 시 11~14정도의 자각도 범위에서 이루어져야하기 때문에 심장 재활 운동 시 고정식 자전거의 \( 85 \% \) 목표심박수 강도는 심혈관계에 부담이 될 수 있는 것으로 나타났다.</p><p>한편, 본 연구의 제한점으로는 급성관상동맥질환자에게 투여되는 여러 종류의 혈압처치 약물이 환자의 상태에 따라 일괄적으로 투여되지 않고 복잡하기 때문에 대표적으로 투여되는 ACEI (angiotensin-converting enzyme inhibitor)와 ATII (angiotesin II recepter antagonist), Beta blocker, calcium channel blocker, Diuretics, Vasodilators 등을 단독 또는 혼용하여 투여된 환자를 체계적으로 분류 할 수 없었다. 이에 대한 연구를 위하여 향후에 대규모 환자를 대상으로 환자상태에 따른 일괄적인 약물군을 분류하여 연구하는 것이 보다 의미 있는 연구가 될 것으로 사료된다.</p><p>결론적으로 심장재활운동전에 내과적으로 혈압 조절과 상관없이 같은 강도에서 트레드밀보다 고정식 자전거에서 운동중 수축기와 이완기혈압 및 평균동맥혈압, 심근산소소비량, 자각도가 유의하게 높았으며 혈압이 조절되지 않은 고혈압 급성심근경색질환의 경우 조절되는 정상혈압의 급성심근경색질환자 보다 중강도에서는 수축기와 이완기가, 고강도에서는 이완기가 유의하게 높은 것으로 나타났다. 또한 중강도에서는 고혈압 집단의 심근산소소비량이 정상군보다 높았음에도 불구하고 정상군과 비슷한 힘든 느낌을 받아 주의가 필요한 것으로 나타났다. 고정식자전거에서 \( 85 \% \)HRR 강도의 운동은 고혈압성 급성심근경색질환자들의 자각도가 15(힘들다)로 표현하여 \( 85 \%\)(HRR) 수준보다는 \(70\sim80\%\)(HRR)정도로 낮게 설정하는 것이 보다 안전한 운동처방이라 사료된다. 따라서 고정식 자전거 운동 시에는 두 집단 모두 철저한 혈압감시가 필요하며 특히 고혈압집단에서의 혈압이 더 상승하는 결과를 보여 트레드밀에 적용한 운동 강도를 동일하게 고정식자전거에 적용하는 것은 무리가 따르는 것으로 나타났다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><p>심장재활에 참여한 환자에서 유산소운동은 일반적으로 고정식 자전거와 트레드밀의 운동방식을 가장 많이 사용하지만 같은 허용 심박수를 두 방식에 적용할 경우 심혈관질환자가 심근에 받는 영향에 대해서는 논란이 되어왔다. 따라서 이 연구는 심장재활운동을 하는 급성관상동맥질환자 중 높은 혈압을 가지는 고혈압 급성관상동맥질환자에서 고정식 자전거 운동이 트레드밀 운동 보다 고혈압 급성관상동맥질환자의 혈압을 보다 증가시키고 이로 인한 심혈관계의 부담이 보다 크게 가중되는지에 대한 구명을 목적하였다. 또한, 고혈압 급성관성동맥질환자에서 고정식 자전거 운동에서 높은 강도와 증가된 혈압에도 불구하고 운동 강도를 지각하는 운동자각도가 적절하게 반응하는지에 대해 구명을 위해서 실시하였다. 이를 위해 본 연구에서는 중강도(\(60\%\)HRR)와 고강도 (\(85\%\)HRR)에서 운동 형태(exercise mode)에 따른 심혈 관질환의 혈압약물반응군(anti-hypertensive drug responder)과 혈압약물비반응군(anti-hypertensive drug nonresponder)과의 심혈관 반응을 실험하였으며, 그 결과는 Table 2와 같았다.</p><p>우선, 혈압약물반응군과 혈압약물비반응군에서 실시한 네가지 운동방법(중강도 트레드밀, 중강도 고정식 자전거, 고강도 트레드밀, 고강도 고정식 자전거) 중에서 두 집단 모두 중강도 고정식 자전거 운동이 동일한 강도인 중강도 트레드밀 운동보다 유의하게 높은 수축기혈압, 이완기혈압, 평균동맥 혈압, 심근산소소비량, 운동자각도 모두 유의하게 높게 나타났다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 특히 주목되는 결과는 중강도 고정식 자전거 운동은 동일 운동 강도인 중강도 트레드밀 운동 보다 모든 심혈관계 및 운동자각도의 부담이 유의하게 높을 뿐만 아니라 \( (\mathrm{p}<0.05) \), 그 수준이 고강도의 트레드밀 운동에서 나타난 모든 심혈관계 및 운동자각도의 부담에 동등한 수준이었다. 이와 함께, 고강도 고정식 자전거 운동은 동일한 고강도 운동 강도에서의 트레드밀 보다 모든 심혈관계 반응(수축기혈압, 이완기혈압, 평균동맥혈압, 심근산소소비량) 및 운동자각도의 부담이 역시 유의하게 높았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 이 결과는 유산소운동을 위한 운동형태 중 고정식 자전거 운동 형태는 트레드밀 운동형태 보다 동일한 운동 강도에서 현저하게 증가된 심혈관계 부담을 가지는 것을 의미하였다.</p><p>운동 형태에 따른 심혈관계 및 혈압에 대한 반응을 연구한 Reed의 선행 연구에서는 좌업식 아프리카계 미국 여성을 대상으로 \( 40 \% \)와 \( 60 \% \)의 목표심박수 강도에서 고정식 자전거와 트레드밀을 비교하였는데, 연구 결과 수축기와 이완기 모두 고정식 자전거에서 높은 혈압을 가진다고 보고하였고, Kasai 등은 운동유발성 혈관경련 협심증(vasospastic angina)자를 대상으로 최대 운동 시 고정식 자전거 운동에서 수축기혈압 및 이완기혈압이 트레드밀 운동 시 혈압보다 높았다고 보고 하였다. 국내 연구에서도 김영주 등은 심근경색환자를 대상으로 6주 동안 2주 간격으로 목표심박수의 \( 40 \%\), \(60 \% \), \( 85 \% \) 강도로 증가시키면서 실시한 고정식 자전거 운동은 트레드밀 운동 보다 높게 혈압이 상승한다는 연구결과를 보고해, 본 연구의 고정식 자전거 운동이 트레드밀 운동보다 높은 혈압이 요구된다는 결과와 일치함을 보였다. 이러한 생리학적 원인은 고정식 자전거 운동이 트레드밀 운동과는 달리 기계적인 효율성 감소와 운동하지 않는 근육혈관의 수축반응을 더 크게 하여 근육 내 동맥을 압박하여 혈류저항을 증가시키며 정맥의 환류(venus return)를 어렵게 하여 혈압의 증가를 더 크게 유발하며, 미주신경 자극이 감소된 것과 관련이 있다. 또한 고정식 자전거 운동은 강도가 증가하면서 하체 근육 내 긴장도가 더 크고 증가하면서 상체의 등척성 수축(isometric contraction)에 의해 혈압의 증가하는 기전도 고정식 자전거 운동 시 작용할 것으로 보인다.</p> <h1>서 론</h1><p>급성관상동맥질환은 한국인의 주요 3대 사망원인의 하나인 심혈관질환에 속하는 질환으로, 동맥내피세포의 기능 부전으로 염증반응을 일으키면서 경화반(plaqe)이 서서히 증식하다가 경화반이 어느 순간 파열되면서 혈전을 일으켜 관상동맥의 급성폐색으로 사망하는 질환이다. 관상동맥 질환의 위험인자로는 조절할 수 있는 인자로서 고혈압, 당뇨, 흡연, 고지혈증, 비만, 스트레스, 운동부족이 있으며, 조절할 수 없는 인자로 연령, 인종, 가족력, 성별이 있다. 이중 고혈압은 심혈 관계 질환에 의한 사망률에 영향을 주는 중요한 위험 인자이고, 관상동맥질환 환자의 치료와 특히 심장재활 프로그램에서 조절되어야 하는 중요한 요인이다.</p><p>관상동맥질환 환자에서 심장재활 프로그램은 육체적, 심리적, 사회적 능력을 발병 이전의 수준으로 회복시키고, 환자에 내재된 혈압 등의 위험인자들을 개선하여 향후 병의 진행을 늦추거나 역전시킴으로 재발 방지를 목표로 한다. 심장재활 프로그램의 주된 처방은 운동 치료로서, 환자는 병원에서 감시 하에 6-8주간의 운동재활 프로그램을 실시하게 된다. 운동재활시 환자에게 시행되는 운동형식은 유산소성 운동으로 운동 강도는 트레드밀에서 실시한 운동부하검사(grad exercise test, GXT)에서 얻어진 안정시 심박수와 최대심박수를 Kavonen의 공식 『\{(최대심박수-안정시심박수) \( \times \% \) 강도 \( \}+ \) 안정시심박수)』에 대입해 \( 50 \%-85 \% \) 예비심박수 ( \(50\%-85\%\) heart rate reservoir, HRR) 범위 내에서 운동을 한다. 요약하면, 관상동맥질환 환자의 주요한 재활프로그램인 운동프로그램은 트레드밀 운동부하 검사를 통해 \( 50 \%\sim 85 \% \) 의 예비심박수 범위를 운동강도로 하여 트레드밀 운동과 고정식 자전거 운동 형태를 통해 유산소성 운동을 전통적으로 실시해 왔다.</p><p>그러나 최근 몇몇 연구들에 의하면 트레드밀 운동부하검사에 따라 처방된 운동강도를 트레드밀 운동과 고정식 자전거 운동에서 동일하게 사용하는 것은 문제가 될 것으로 보고되고 있다. Reed는 동일하게 설정된 특정 심박예비량 운동강도에서 실시된 고정식 자전거 운동은 트레드밀 운동보다 높은 혈압수준을 나타낸다고 보고하였으며, Claudio 등과 Carter 등의 보고에서도 동일하게 설정된 운동강도에서 심혈관반응이 다르다고 보고 하였다. 또한 국내에서도 동일한 심박수에서의 고정식 자전거 운동이 동일한 심박수의 트레드밀 운동보다 증가된 혈압수준을 보고하였다. 따라서 동일한 심박수의 운동강도에서 운동을 실시할 때, 운동형태 중에서 고정식 자전거 운동은 트레드밀 달리기 운동 보다 더 높을 혈압을 가진다. 이 결과 유산소운동 중에서 고정식 자전거 운동은 트레드밀 운동보다 동일한 운동강도를 실시하는 상태에서 보다 증가된 부하의 심혈관계 작용을 요구한다.</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1><p>본 연구는 심장재활에 참여한 고혈압을 동반한 급성관상동맥질환자중 내과적인 약물로 조절되지 않은 고혈압 환자의 경우와 약물로 조절되는 정상 혈압 환자군에서 트레드밀 운동과 고정식 자전거 운동 수행시 강도별 혈압과 심근산소소비량, 자각지수에 대한 반응을 구명하고자 목적하였다.", "이를 위해 6주간의 심장재활 프로그램에 참여한 심혈관질환 환자를 연구대상으로 약물에 대한 혈압이 조절되는 혈압약물반응군과 약물에 대한 혈압이 조절되지 혈압약물비반응군 환자를 동원하여, 트레드밀 운동부하검사를 실시하여 예비심박수를 구하였으며, 이를 근거로 중강도 운동강도 (\\( 60 \\%\\)HRR) 와 고강도 운동강도(\\( 85 \\%\\)HRR)의 심박수에서 트레드밀 운동과 고정식자전거 운동을 실시하였다.", "혈압의 조절유무에 따라 강도별 트레드밀과 고정식자전거 운동 시에 나타난 심혈관반응의 결과는 다음과 같다.", "첫째, 중강도 (\\( 60 \\%\\)HRR) 와 고강도(\\( 85 \\%\\)HRR)에서 운동 형태(exercise mode)에 따른 혈압약물반응군과 혈압약물비반응군과의 심혈관 반응에 대한 결과 모든 운동강도에서 고정식자전거 운동이 트레드밀 운동보다 수축기혈압, 이완기혈압, 평균동맥혈압, 심근산소소비량, 운동자각도 모두 유의하게 높았다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "또한 고정식 자전거의 \\( 60 \\% \\) 강도에서 나타난 심혈관계에 미치는 부담이 \\( 85 \\% \\) 강도의 트레드밀에서 받는 부담과 비슷하였다.", "둘째, 혈압약물비반응군은 모든 운동방법(중강도 트레드밀, 고강도 트레드밀, 중강도 고정식자전거, 고강도 고정식자전거)에서 혈압약물반응군보다 유의하게 높은 이완기혈압(DBP) 을 나타냈고 \\( (\\mathrm{p}<0.05) \\), 이와 함께 평균동맥혈압(MAP) 역시 모든 운동방법에서 혈압약물비반응군이 혈압약물반응군 보다 유의하게 높았다\\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "이때, 수축기 혈압에서는 혈압약물비반응군이 중강도자전거 운동방법( (\\( 60 \\%\\)HRR-cycle exercise)에서만 정상군보다 유의하게 높게 나타났다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "즉, 혈압약물 비반응군이 중강도자전거 운동방법에서 수축기혈압과 이완기기혈압, 평균동맥혈압이 혈압약물반응군 보다 유의하게 높았다.", "셋째, 심근산소소비량(RPP)에서 혈압약물비반응군과 혈압약물반응군과 중강도자전거 운동에서 유의한 차이는 없었으며 중강도 트레드밀 운동과 중강도자전거 운동 간의 평균 차이에서 중강도자전거 운동이 혈압약물반응군보다 혈압약물비반응군에서 유의하게 높게 증가하였음에도 불구하고 운동자각도(RPE)는 중강도자전거 운동에서 혈압약물반응군과 혈압약물비반응군 간에는 차이를 보이지 않았다.", "</p><p>이상의 결과, 심장재활운동전에 내과적으로 혈압 조절과 상관없이 고혈압 심장질환과 정상혈압 심장질환환자 모두 같은 강도에서 트레드밀보다 고정식 자전거 운동 시에는 모두 철저한 혈압감시가 필요하였다.", "특히 고혈압심혈관질환 환자는 혈압의 상승폭이 보다 큰 결과를 보여 트레드밀에 적용한 운동 강도를 동일하게 고정식자전거에 적용하는 것은 적합하지 못하였다.", "</p> <p>증가된 부하의 심혈관계 작용을 요구하는 고정식 자전거 운동은 고혈압을 가지는 급성관상동맥 질환자에게는 위험한 운동이 될 가능성이 있다.", "그 이유는 고혈압을 유지하는 환자는 정상인보다 안정시, 저강도, 중강도, 고강도 운동에서의 각각 운동강도에서 모두 정상인보다 증가된 보다 높은 혈압을 가지는 생리적 기전이 작용하기 때문이다.", "급성관상동 맥질환자의 경우 심장수술 후 약물에 의한 혈압을 조절과 함께 재활 프로그램을 실시하여야 한다.", "이때, 혈압강하제 약물에 대한 반응은 유전적 요인과 환경적 요인, 생활습관과 과거 약물복용여부와 복용기간 등에 따라 다르게 나타나며, 이로 인해 혈압강하제에 의해 반응에 대한 개인차가 나타나 특정 혈압강하제처방에 의해 쉽게 혈압이 조절되는 급성관상동맥질환자가 있으며, 특정 혈압강하제에 반응하지 않아 고혈압 상태를 유지하는 환자도 있다.", "이들 급성 관상동맥질환자들은 수술후 재활단계에서 안정시 수축기/이완기 혈압이 180/100이 넘지 않는다면 고혈압 상태이더라도 약물처방과 함께 환자의 관상동맥증후군의 재발방지와 일상생활의 정상적인 복귀, 심혈관계 기능 개선 및 혈압강하 치료를 위해 고정식 자전거 운동이나 트레드밀 운동형태와 같은 유산소운동을 통해 재활운동을 실시한다.", "이 결과, 복합적인 원인에 의해 혈압강하제 약물에 대한 반응 하지 않은 고혈압 환자는 높은 혈압을 가진 상태에서 재활프로그램을 실시하는데, 재활시 고정식 자전거 운동을 통해 유산소운동을 실시한다면 고정식 자전거 운동은 트레드밀 운동보다 모든 운동강도에서 더욱 증가된 혈압 수준을 요구하기 때문에, 고혈압을 가진 급성관상동맥질환자의 고정식 자전거 운동은 더욱 증가된 혈압과 함께 이로 인한 심혈관의 부담이 증가될 가능성이 있다.", "또한, 혈압강하제 약물 처방에 의해 조절되지 않은 고혈압 급성관상동맥질환자는 유산소 운동에서 정상혈압환자와 달리 동일한 운동강도 수준에서 증가된 혈압과 심혈관 부담에도 불구하고 낮은 운동자각도 수준을 나타낸다.", "</p><p>이를 근거로 할 때, 심장재활운동을 하는 급성관상동맥질환자 중 높은 혈압을 가지는 고혈압 급성관상동맥질환자는 고정식 자전거에서의 운동이 더욱 높은 혈압과 이로 인한 심혈관계의 부담을 가중키는 반면 낮은 운동자각도 반응에 의한 운동조절 기전에 문제를 가질 가능성이 있다.", "따라서 심장재활운동을 하는 고혈압 심혈관환자들의 고정식 자전거 운동에 대한 심혈관계의 반응에 대한 과학적 정보와 이를 근거한 운동 지침이 필요한 상태이다.", "그러나 실제로 고혈압 심혈관환자에 대한 고정식 자전거 운동에 대한 심혈관계 반응 및 운동자각도 반응에 대한 정보가 국외에는 Reed의 일반인에서 고정식 자전거 운동이 증가된 혈압을 가진다는 정보만 있을 뿐이며, 국내의 경우 김영주 등이 보고한 고혈압 환자가 고정식 자전거 운동에서 트레드밀 보다 높은 혈압을 가진다는 보고만 이루어 졌을 뿐, 실제 정상 혈압이 유지되는 환자의 차이를 비교하여 실제적인 심혈관계의 부담에 대한 수준과 이에 따른 운동처방에 대한 정보는 미비한 실정이다.", "</p><p>따라서 본 연구는 심장재활에 참여한 고혈압을 동반한 급성관상동맥질환자중 내과적인 약물로 조절되지 않은 고혈압 환자의 경우와 약물로 조절되는 정상 혈압 환자군에서 트레드밀 운동과 고정식 자전거 운동 수행시 강도별 혈압과 심근 산소소비량, 자각지수를 알아봄으로 고혈압을 동반한 급성 관상동맥질환자가 운동형태와 운동강도에 따른 심혈관계의 반응 및 부담 수준을 구명하고 이를 근거로 급성관상 동맥질환자의 운동치료에 대한 적절한 운동처방의 정보를 제공하고자 한다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>연구 대상</h2><p>본 연구에서는 불안정 협심증 및 급성 심근경색증으로 S 병원에 입원하여 경피적 관상동맥 성형술과 약물처치를 받은 환자들 중 6주간의 심장재활 프로그램에 참여한 환자를 연구대상으로 하였다.", "연구대상자는 모두 고혈압의 과거력을 갖고 있었으며 이들 중 불안정협심증 34명, 급성심근경색 40명으로 총 74명이었으며(Table 1), 이들 대상자중 심각한 부정맥, 좌심실 박출율(ejection fraction) \\(40\\%\\)이하의 심부전증, 운동부하 검사를 받기 어려운 만성 폐쇄성 폐질환과 근골격계질환, 운동유발성 고혈압, 운동부하 검사도중 심혈관계 이상반응으로 검사를 중단한 경우, 실험기간 중 약물이 바뀐 경우는 실험 대상에서 제외되었다.", "</p><h2>연구 방법</h2><p>운동부하검사는 심혈 관질환자들에게 주로 적용되는 modified Bruce protocol을 이용하여 환자 자신이 힘들어서 더 이상 검사를 수행하기 어려울 때까지 시행하는 점진적 증상제한 운동부하검사(symptom limited GXT)를 실시하였으며, 검사 중 환자의 흥통, 어지러움 같은 자각증상이나 모니터 상 ST 분절 하강이나 상승, 발작성 심방빈맥과 방실 및 심실 빈맥, R on T 현상 같은 위험한 심전도와 안정시 혈압이 \\( 180 / 100 \\mathrm{mmHg} \\) 나 운동 시 혈압이 \\( 250 / 115 \\mathrm{mmHg} \\) 이상 상승할 때, 예상 최대심박수(220-나이) 이상 초과할 때, 검사 중 부하가 증가함에도 불구하고 심박수가 증가하지 않을 때, 혈압이 검사 중 \\( 20 \\mathrm{mmHg} \\) 이상 감소할 때 등 미국심장학회의 운동부하검사 조기 종료 기준에 따라 검사를 종료시켰다.", "검사는 12 채널 실시간 운동부하 검사용 심전도 검사기 Q4500 및 호흡가스 분석기 QMC (Quinton, USA), 자동 혈압 및 맥박 측정기(Model 412, USA) 그리고 운동부하 검사용 트레드밀(Medtrack ST 55, Quinton, USA)을 사용하였다.", "운동부하검사를 통하여 안정 시 및 최대운동 시의 심박수, 혈압, 최고산소 소모량(Peak oxygen consumption, \\( \\mathrm{VO}_{2 \\text { peak }} \\))을 기록하였다.", "운동자각지수는 6-20 Borg scale을 이용하였다.", "약물투여는 운동부하검사 및 심장재활 프로그램 참여 동안 중단하거나 변경하지 않고 유지하였다.", "</p><p>모든 환자들은 퇴원 후 1주 내에 심장재활 클리닉에 내원하여 운동부하검사를 시행하였다.", "운동은 Karvonen (1957)의 운동강도 설정 방식(최대심박수-안정시 \\(\\times \\)심박수\\(\\%\\)강도)+ 안정시 심박수)을 토대로 하였으며 목표심박수 운동강도는 \\( 60 \\%\\) HRR와 \\( 85 \\%\\) HRR로 선정하였다.", "모든 운동시간 중에 무선심전도를 부착하여 모니터로 심박수와 심전도(심근허혈: ST 분절 하강이나 상승유무, 부정맥: 비지속 및 지속성 심방, 방실, 심실빈맥, R on T)를 감시하였고 운동 종료 마지막 2분 전 심혈관 반응을 측정하였다.", "운동부하검사 이후 심장재활센타 외래에서 환자는 6주간 주3회 1시간 정도의 감시 하에 통원재활 치료를 받게 되며 운동유형은 고정식 자전거와 트레드밀로 시행 된다.", "심장재활의 운동강도는 2주마다 점진적으로 증가시켜 마지막 2주 동안은 목표심박수의 \\( 85 \\% \\)까지 유지시키는 방식으로 진행되지만 본 연구를 위해 적응 단계 없이 4일 동안 운동유형을 달리하여 이틀 동안은 \\( 60 \\% \\) 강도로, 3 일과 4 일은 \\( 85 \\% \\) 강도로 실시하였다.", "심장재활 1 회 운동은 준비운동 10분, 본 운동 27분, 정리운동 10분간 운동을 계속하는 방식으로 진행되며 본 운동은 트레드밀과 고정식 자전거 운동을 각기 12분씩 시행하는데 첫 12분의 운동이 끝나면 운동기구에서 내려와 평지를 편안한 속도로 걸으면서 3분간 쉬다가 다음 12분 동안 운동하게 된다.", "심장재활 첫날 트레드밀 운동강도를 목표심박수의 \\( 60 \\% \\) 강도까지 점진적으로 증가시킨 후 운동 종료 2분 전에 심박수, 혈압, 심근산소소비량 (심박수\\( \\times\\)수축기혈압), 운동 자각지수를 측정 하였다.", "둘째날은 고정식 자전거 운동 시에 같은 방식으로 심박수, 혈압, 심근산소소비량(심박수\\( \\times\\)수축기혈압), 운동자각지수를 측정하였으며 이와 같은 방식으로 셋째날 트레드밀과 넷째날 고정식 자전거로 \\( 85 \\% \\) 의 운동강도에서 심박수, 혈압, 심근산소소비량(심박수 \\( \\times\\)수축기혈압), 운동자각지수를 측정하였다.", "심장재활 프로그램에 참여한 74명 중 안정시 혈압이 약물에 의해 조절되는 혈압약물반응군과 약물에도 불구하고 조절되지 않은 혈압약물비반응군으로 분류하였다.", "</p><h2>자료 처리</h2><p>이 연구에서 얻은 자료는 참여한 환자들의 일반적인 특성과 혈압, 심근산소소비량(RPP), 운동자각도(RPE) 등의 변인들이 있었다.", "이 변인들에 대한 자료들은 먼저 평균과 표준 편차를 포함한 기술통계치로 산출하였고, 이후 혈압약물비 반응군과 혈압약물반응군의 평균차이를 독립표본 T-검증을 실시하여 분석하였다.", "혈압약물비반응군과 혈압약물반응군에서 네가지 운동량(treadmill exercise at \\( 60 \\%\\)HRR, cycle exercise at \\( 60 \\%\\)HRR, treadmill exercise at \\( 85 \\%\\) HRR, cycle exercise at \\( 85 \\%\\) HRR)을 실시하여 얻은 네 가지 운동량의 혈압, 심근산소소비량, 운동자각도의 평균값들에 대한 차이는 일원변량분석(repeated one-way ANOVA)을 실시하였으며, 운동방법간(treadmill exercise at \\( 60 \\%\\)HRR, cycle exercise at \\( 60 \\%\\)HRR, treadmill exercise at \\( 85 \\%\\) HRR, cycle exercise at (\\( 85 \\%\\) HRR)에 유의한 차이가 있을 경우, LSD 분석법을 이용하여 사후검증을 실시하였다.", "집단 간(혈압약물비반응군 vs.", "혈압약물반응군)의 평균차 검증은 독립표본 T-검증을 실시하였고, 운동형태에 따른 RPP 차이에 대한 평균은 운동강도 (\\( 60 \\%\\)HRR vs. \\", "( 85 \\%\\) HRR)간의 차이는 대응표본 T-검증을, 집단 간은 독립표본 T-검증을 실시하여 분석하였다.", "검사결과에 대한 통계적 수락 수준은 \\( \\mathrm{p}<0.05 \\)로 하였으며, 자료 처리는 SPSS 14.0 윈도우버전을 이용하였다.", "</p> <p>한편 본 연구에서는 선행연구에서 보고하지 못했던 중강도 \\( 60 \\%\\)HRR와 \\( 85 \\%\\)HRR에서의 고정식 자전거 운동에 대한 심혈관 부담의 수준과 자각도 수준을 연구한 결과에서 중강도 고정식 운동이 고강도의 트레드밀 운동에 의한 심혈관 부담과 자각도 수준에 해당한 결과는 관상동맥중재술을 받은 상태 환자가 재활을 위해 고정식 자전거 운동을 할 경우 중강도의 고정식 자전거 운동일지라도 트레드밀보다 높은 심혈관부담을 가지는 원인 때문에 부작용을 유발할 가능성을 제시하였다.", "실제로 이번 실험 중에서 트레드밀 운동에서는 1명만이 흉통을 호소한 것에 비해 고정식자전거 운동 시에는 3명이 흉통을 호소하였고 1명의 심방세동이 유발되었고 4명은 운동을 중단하였다.", "따라서 심혈관 질환자에게 중◦고강도의 고정식 자전거 운동을 수행시킬 경우 트레드밀 보다는 더 큰 심근에 부담을 주면서 운동하게 되므로 강도설정에 있어 주의가 필요하다.", "</p><p>위와 같이 고정식 자전거가 높은 혈압 및 심혈관 부담을 가지는 반응을 한 결과에서 혈압약물비반응군과 혈압약물반응군 간의 운동량(중강도 트레드밀, 고강도 트레드밀, 중강도 고정자전거, 고강도 고정자전거)에 따른 혈압 및 혈관반응에 대한 차이를 분석하면 Table 2에서 나타나듯이, 약물반응에 의해 혈압이 정상으로 유지되는 혈압약반응군보다 혈압이 조절되지 않은 약물비반응군에서 모든 운동량에 대한 이완기혈압(DBP) 은 유의하가 높았으며 \\( (\\mathrm{p}<0.05) \\), 이와 함께 평균 동맥혈압(MAP) 역시 모든 운동방법에서 혈압약물비반응군이 혈압약물반응군보다 유의하게 높았다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "이때, 수축기 혈압에서는 혈압약물비반응군이 중강도자전거 운동방법 (\\(60\\%\\)HRR-cycle exercise)에서만 정상군보다 유의하게 높게 나타났다.", "이와 함께, 중강도자전거 운동에서 심근산소소비량(RPP)이 혈압약물비반응군과 혈압약물반응군간에 유의한 차이는 없었으나, Fig.", "1 과 같이 중강도에서의 \\( \\triangle \\)심근산소소비량\\( \\left(\\triangle \\mathrm{RPP}_{\\text {중강도 }}=\\mathrm{RPP}_{\\text {중강도 고정식 자전거 }}-\\mathrm{RPP}_{\\text {중강도 트레드밀 }}\\right) \\)에서 혈압약물반응군보다 혈압약물비반응군에서 유의하게 높게 증가했다\\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "</p><p>이 결과 중강도에서 고정식 자전거 운동에 의해 심근산소소비량(RPP) 트레드밀 운동에 의한 심근산소소비량(RPP)보다 유의한 수준으로 증가한 것을 나타내었다.", "그러나 증가된 심근산소소비량과 함께, 수축기와 이완기 혈압, 평균혈압이 중강도 고정식 자전거 운동에 의해 중강도 트레드밀 운동보다 유의하게 증가하였으나, 운동자각도(RPE) 만큼은 혈압약물반응군과 혈압약물비반응군간에는 차이가 없었다", "(Table 2).", "종합하면, 혈압약물비반응군은 중강도 고정식 자전거 운동에서 혈압약물반응군보다 높은 심혈관의 부담을 가졌으나, 운동에 대한 강도를 인지하는 운동자각도는 증가하지 못하였다.", "</p><p>일반인에서 운동 강도가 증가함에 따라 혈압이 증가하는 것은 잘 알려져 있으며.", "이와 함께 Basett 등은 안성시 혈압 수준이 운동 강도에 따라 증가된 혈압을 결정한다고 보고하였다.", "Basett 등의 연구에서 혈압이 높은 사람은 안정 시부터 운동강도가 최대에 이르기까지 전체 운동 강도 범위에서 혈압이 낮은 사람보다 일정하게 높은 혈압을 유지하였다.", "이와 같은 혈압의 반응에 따라 고혈압을 가진 환자의 경우 운동 강도의 증가는 더욱 가중된 혈압의 증가를 가져올 가능성이 있으며, 특히 트레드밀이 아닌 고정식 자전거로 운동 실천한다면 운동 강도의 증가와 함께 고정식 자전거로 인한 혈압 증가의 부담이 더욱 가중되어 심혈관의 부담이 위험한 수준까지 증가할 가능성이 있다.", "본 연구의 결과에서 안정시 고혈압이 유지되는 급성관상동맥질환자는 중강도와 고강도에서 모두 정상혈압으로 조절되는 급성관상동맥질환자보다 혈압 및 심혈관의 부담이 보다 증가된 것을 발견되었다.", "즉 고정식 자전거가 트레드밀보다 같은 강도에서의 심근산소소비량을 증가시키는 현상에 대해서는 선행연구와 일치한 것으로 나타났으며 특히 약물로 혈압이 조절되지 않는 관상동맥증후군 고혈압환자의 경우 더 큰 부담을 주는 것으로 나타났다.", "이는 고정식 자전거가 관상동맥질환이 있는 환자에게서 약물로 조절되지 않는 고혈압환자의 말초저항이나 심근수축력을 더 크게 상승시키는 요인으로 작용했을 것으로 사료된다.", "</p> <p>운동의 힘든 정도 및 운동강도를 표현할 때 개개인의 운동부하 검사를 통해 측정된 최대 예비심박수 및 최대 산소소비량의 상대적인 백분율과 운동자각도를 이용할 수 있다.", "특히 운동자각도인 Borg scale은 개개인의 차이가 있지만 운동부하 검사간의 차이가 적고 운동부하검사 시 느끼는 피로도와 일상생활에서 느끼는 피로도와 일치하는 장점이 있다.", "본 연구에서는 \\( 60 \\% \\) 목표심박수의 낮은 중강도의 운동 중에 고정식 자전거의 수축기 혈압이 증가되므로 고혈압집단이 정상집단보다 높은 심근산소소비 량이 증가함에도 불구하고 환자가 느끼는 힘든 자각도가 정상군과 차이가 없다는 것은 두 가지를 추측할 수 있다.", "하나는 \\( 60 \\% \\) 강도의 비교적 낮은 운동 강도이기 때문에 혈압상승으로 인한 심근산소소비량이 자전거에서 유의하게 크지만 그 증가폭이 힘든 느낌이 들만큼 크지 않았을 것이며, 또 한가지는 혈압 상승은 자각증상이 없는 것이 대부분이고 그 상승폭이 역시 힘든 느낌이 들만큼 크지 않았기 때문이라 사료 된다.", "그러나 \\( 60 \\% \\) 의 낮은 운동 시에 고정식 자전거에서 높은 심근산소비량을 보였는데도 고혈압집단에서 힘든 느낌이 없었다는 것은 고혈압을 가진 급성관상동맥질환자가 운동에 따른 심혈관의 부담을 지각하지 못한 채 운동하여 과도한 운동을 실시할 위험이 있기 때문에 임상적으로 주의해야할 결과라고 생각된다.", "특히, 본 연구에서는 고혈압집단의 \\( 85 \\% \\) 강도시 고정식자전거에서 \\( 15.4 \\pm 1.34 \\) (힘들다)로 심장재활 2단계 운동 시 11~14정도의 자각도 범위에서 이루어져야하기 때문에 심장 재활 운동 시 고정식 자전거의 \\( 85 \\% \\) 목표심박수 강도는 심혈관계에 부담이 될 수 있는 것으로 나타났다.", "</p><p>한편, 본 연구의 제한점으로는 급성관상동맥질환자에게 투여되는 여러 종류의 혈압처치 약물이 환자의 상태에 따라 일괄적으로 투여되지 않고 복잡하기 때문에 대표적으로 투여되는 ACEI (angiotensin-converting enzyme inhibitor)와 ATII (angiotesin II recepter antagonist), Beta blocker, calcium channel blocker, Diuretics, Vasodilators 등을 단독 또는 혼용하여 투여된 환자를 체계적으로 분류 할 수 없었다.", "이에 대한 연구를 위하여 향후에 대규모 환자를 대상으로 환자상태에 따른 일괄적인 약물군을 분류하여 연구하는 것이 보다 의미 있는 연구가 될 것으로 사료된다.", "</p><p>결론적으로 심장재활운동전에 내과적으로 혈압 조절과 상관없이 같은 강도에서 트레드밀보다 고정식 자전거에서 운동중 수축기와 이완기혈압 및 평균동맥혈압, 심근산소소비량, 자각도가 유의하게 높았으며 혈압이 조절되지 않은 고혈압 급성심근경색질환의 경우 조절되는 정상혈압의 급성심근경색질환자 보다 중강도에서는 수축기와 이완기가, 고강도에서는 이완기가 유의하게 높은 것으로 나타났다.", "또한 중강도에서는 고혈압 집단의 심근산소소비량이 정상군보다 높았음에도 불구하고 정상군과 비슷한 힘든 느낌을 받아 주의가 필요한 것으로 나타났다.", "고정식자전거에서 \\( 85 \\% \\)HRR 강도의 운동은 고혈압성 급성심근경색질환자들의 자각도가 15(힘들다)로 표현하여 \\( 85 \\%\\)(HRR) 수준보다는 \\(70\\sim80\\%\\)(HRR)정도로 낮게 설정하는 것이 보다 안전한 운동처방이라 사료된다.", "따라서 고정식 자전거 운동 시에는 두 집단 모두 철저한 혈압감시가 필요하며 특히 고혈압집단에서의 혈압이 더 상승하는 결과를 보여 트레드밀에 적용한 운동 강도를 동일하게 고정식자전거에 적용하는 것은 무리가 따르는 것으로 나타났다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><p>심장재활에 참여한 환자에서 유산소운동은 일반적으로 고정식 자전거와 트레드밀의 운동방식을 가장 많이 사용하지만 같은 허용 심박수를 두 방식에 적용할 경우 심혈관질환자가 심근에 받는 영향에 대해서는 논란이 되어왔다.", "따라서 이 연구는 심장재활운동을 하는 급성관상동맥질환자 중 높은 혈압을 가지는 고혈압 급성관상동맥질환자에서 고정식 자전거 운동이 트레드밀 운동 보다 고혈압 급성관상동맥질환자의 혈압을 보다 증가시키고 이로 인한 심혈관계의 부담이 보다 크게 가중되는지에 대한 구명을 목적하였다.", "또한, 고혈압 급성관성동맥질환자에서 고정식 자전거 운동에서 높은 강도와 증가된 혈압에도 불구하고 운동 강도를 지각하는 운동자각도가 적절하게 반응하는지에 대해 구명을 위해서 실시하였다.", "이를 위해 본 연구에서는 중강도(\\(60\\%\\)HRR)와 고강도 (\\(85\\%\\)HRR)에서 운동 형태(exercise mode)에 따른 심혈 관질환의 혈압약물반응군(anti-hypertensive drug responder)과 혈압약물비반응군(anti-hypertensive drug nonresponder)과의 심혈관 반응을 실험하였으며, 그 결과는 Table 2와 같았다.", "</p><p>우선, 혈압약물반응군과 혈압약물비반응군에서 실시한 네가지 운동방법(중강도 트레드밀, 중강도 고정식 자전거, 고강도 트레드밀, 고강도 고정식 자전거) 중에서 두 집단 모두 중강도 고정식 자전거 운동이 동일한 강도인 중강도 트레드밀 운동보다 유의하게 높은 수축기혈압, 이완기혈압, 평균동맥 혈압, 심근산소소비량, 운동자각도 모두 유의하게 높게 나타났다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "특히 주목되는 결과는 중강도 고정식 자전거 운동은 동일 운동 강도인 중강도 트레드밀 운동 보다 모든 심혈관계 및 운동자각도의 부담이 유의하게 높을 뿐만 아니라 \\( (\\mathrm{p}<0.05) \\), 그 수준이 고강도의 트레드밀 운동에서 나타난 모든 심혈관계 및 운동자각도의 부담에 동등한 수준이었다.", "이와 함께, 고강도 고정식 자전거 운동은 동일한 고강도 운동 강도에서의 트레드밀 보다 모든 심혈관계 반응(수축기혈압, 이완기혈압, 평균동맥혈압, 심근산소소비량) 및 운동자각도의 부담이 역시 유의하게 높았다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "이 결과는 유산소운동을 위한 운동형태 중 고정식 자전거 운동 형태는 트레드밀 운동형태 보다 동일한 운동 강도에서 현저하게 증가된 심혈관계 부담을 가지는 것을 의미하였다.", "</p><p>운동 형태에 따른 심혈관계 및 혈압에 대한 반응을 연구한 Reed의 선행 연구에서는 좌업식 아프리카계 미국 여성을 대상으로 \\( 40 \\% \\)와 \\( 60 \\% \\)의 목표심박수 강도에서 고정식 자전거와 트레드밀을 비교하였는데, 연구 결과 수축기와 이완기 모두 고정식 자전거에서 높은 혈압을 가진다고 보고하였고, Kasai 등은 운동유발성 혈관경련 협심증(vasospastic angina)자를 대상으로 최대 운동 시 고정식 자전거 운동에서 수축기혈압 및 이완기혈압이 트레드밀 운동 시 혈압보다 높았다고 보고 하였다.", "국내 연구에서도 김영주 등은 심근경색환자를 대상으로 6주 동안 2주 간격으로 목표심박수의 \\( 40 \\%\\), \\(60 \\% \\), \\( 85 \\% \\) 강도로 증가시키면서 실시한 고정식 자전거 운동은 트레드밀 운동 보다 높게 혈압이 상승한다는 연구결과를 보고해, 본 연구의 고정식 자전거 운동이 트레드밀 운동보다 높은 혈압이 요구된다는 결과와 일치함을 보였다.", "이러한 생리학적 원인은 고정식 자전거 운동이 트레드밀 운동과는 달리 기계적인 효율성 감소와 운동하지 않는 근육혈관의 수축반응을 더 크게 하여 근육 내 동맥을 압박하여 혈류저항을 증가시키며 정맥의 환류(venus return)를 어렵게 하여 혈압의 증가를 더 크게 유발하며, 미주신경 자극이 감소된 것과 관련이 있다.", "또한 고정식 자전거 운동은 강도가 증가하면서 하체 근육 내 긴장도가 더 크고 증가하면서 상체의 등척성 수축(isometric contraction)에 의해 혈압의 증가하는 기전도 고정식 자전거 운동 시 작용할 것으로 보인다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>급성관상동맥질환은 한국인의 주요 3대 사망원인의 하나인 심혈관질환에 속하는 질환으로, 동맥내피세포의 기능 부전으로 염증반응을 일으키면서 경화반(plaqe)이 서서히 증식하다가 경화반이 어느 순간 파열되면서 혈전을 일으켜 관상동맥의 급성폐색으로 사망하는 질환이다.", "관상동맥 질환의 위험인자로는 조절할 수 있는 인자로서 고혈압, 당뇨, 흡연, 고지혈증, 비만, 스트레스, 운동부족이 있으며, 조절할 수 없는 인자로 연령, 인종, 가족력, 성별이 있다.", "이중 고혈압은 심혈 관계 질환에 의한 사망률에 영향을 주는 중요한 위험 인자이고, 관상동맥질환 환자의 치료와 특히 심장재활 프로그램에서 조절되어야 하는 중요한 요인이다.", "</p><p>관상동맥질환 환자에서 심장재활 프로그램은 육체적, 심리적, 사회적 능력을 발병 이전의 수준으로 회복시키고, 환자에 내재된 혈압 등의 위험인자들을 개선하여 향후 병의 진행을 늦추거나 역전시킴으로 재발 방지를 목표로 한다.", "심장재활 프로그램의 주된 처방은 운동 치료로서, 환자는 병원에서 감시 하에 6-8주간의 운동재활 프로그램을 실시하게 된다.", "운동재활시 환자에게 시행되는 운동형식은 유산소성 운동으로 운동 강도는 트레드밀에서 실시한 운동부하검사(grad exercise test, GXT)에서 얻어진 안정시 심박수와 최대심박수를 Kavonen의 공식 『\\{(최대심박수-안정시심박수) \\( \\times \\% \\) 강도 \\( \\}+ \\) 안정시심박수)』에 대입해 \\( 50 \\%-85 \\% \\) 예비심박수 ( \\(50\\%-85\\%\\) heart rate reservoir, HRR) 범위 내에서 운동을 한다.", "요약하면, 관상동맥질환 환자의 주요한 재활프로그램인 운동프로그램은 트레드밀 운동부하 검사를 통해 \\( 50 \\%\\sim 85 \\% \\) 의 예비심박수 범위를 운동강도로 하여 트레드밀 운동과 고정식 자전거 운동 형태를 통해 유산소성 운동을 전통적으로 실시해 왔다.", "</p><p>그러나 최근 몇몇 연구들에 의하면 트레드밀 운동부하검사에 따라 처방된 운동강도를 트레드밀 운동과 고정식 자전거 운동에서 동일하게 사용하는 것은 문제가 될 것으로 보고되고 있다.", "Reed는 동일하게 설정된 특정 심박예비량 운동강도에서 실시된 고정식 자전거 운동은 트레드밀 운동보다 높은 혈압수준을 나타낸다고 보고하였으며, Claudio 등과 Carter 등의 보고에서도 동일하게 설정된 운동강도에서 심혈관반응이 다르다고 보고 하였다.", "또한 국내에서도 동일한 심박수에서의 고정식 자전거 운동이 동일한 심박수의 트레드밀 운동보다 증가된 혈압수준을 보고하였다.", "따라서 동일한 심박수의 운동강도에서 운동을 실시할 때, 운동형태 중에서 고정식 자전거 운동은 트레드밀 달리기 운동 보다 더 높을 혈압을 가진다.", "이 결과 유산소운동 중에서 고정식 자전거 운동은 트레드밀 운동보다 동일한 운동강도를 실시하는 상태에서 보다 증가된 부하의 심혈관계 작용을 요구한다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "심장재활에 참여한 급성 관상동맥증후군 환자에서 약물 반응과 운동 형태의 변화에 따른 심혈관과 운동자각도의 반응", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-fafc8cbf-4828-4b0d-913d-d534f5550f44", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2008", "doc_author": [ "김영주", "김철현" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,437	<h1>요 약</h1><p>본 연구는 감귤박 급여가 한우등심의 이화학적 특성 및 기호성에 미치는 영향을 연구할 목적으로 수행하였다. 시료는 감귤박을 급여하지 않은 한우등심(TMR-0)과 감귤박을 급여한 한우등심(TMR-1)으로 하였다. TMR-0는 비육우용 배합사료와 건초를 분리 급여하면서 관행적으로 사육하였으며, TMR-1은 육성기 및 비육전기 일부(약 17개월)는 TMR-0와 같은 방법으로 사육한 후 나머지 10개월(비육전기 및 후기) 동안은 감귤부산물 TMR 사료를 급여하였다. 한우등심의 명도, 적색도 및 황색도는 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의적인 차이가 없었다. \( \mathrm{pH} \) 는 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 낮았으며, VBN함량, TBARS값 및 EDA는 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의적인 차이가 없었다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 한우등심의 보수력, 동결감량 및 가열감량은 TMR-0 및 TMR- 1 사이에 유의적인 차이는 없었지만, 해동감량은 TMR-0 \((7.35\%\))가 TMR-1 \((3.04\%\))보다 유의적으로. 높았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 한우등심의 경도는 TMR-0가 TMR-1보다 높고, 탄성은 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 높았으며, 응집성, 뭉침성, 저작성 및 전단력은 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의한 차이가 없었다. 저장 중 \( \mathrm{pH} \) 및 VBN 함량은 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의적인 차이가 없었지만, TBARS값은 저장 4 주째 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 낮았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 생육의 색깔 및 향기는 TMR-0 및 TMR- 1 사이에 유의한 차이가 없었다. 가열육의 풍미 및 연도는 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 우수하였으며, 맛, 다즙성 및 전 체적인 기호도는 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의성이 없었다 \( (p<0.05) \).</p> <h2>표면 색깔</h2><p>한우 등심의 표면 색깔의 측정은 색차계(Chromameter CR-200b, Minolta Camera Co., Japan)를 이용하여 \( \mathrm{L}^{}\) (명도), \( \mathrm{a}^{} \) (적색도) 및 \( \mathrm{b}^{} \) (황색도)로 나타내었으며, 이때 색보정을 위해 이용되는 표준 백색판의 \( \mathrm{L}^{}\), \(\mathrm{a}^{}\), \(\mathrm{~b}^{} \) 값은 각각 97.6, -6.6, 6.3이었다.</p><h2>pH, VBN 함량, TBARS 값 및 전자공여능 측정</h2><p>한우등심의 \( \mathrm{pH} \) 측정은 \( \mathrm{pH} \) meter(ATI Orion 370, USA)의 유리전극을 고기에 직접 꽂아 측정하였으며, VBN (volatile basic nitrogen) 함량은 식품공전에 준하여 실험하였다. 그리고 TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) 값은 시료를 perchloric acid 및 BHT와 함께 균질하고 여과하여 얻어진 여과물에 TBA 시약을 가하고 \( 531 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 나타난 값을 시료 \( \mathrm{kg} \) 당 반응물 \( \mathrm{mg} \) malonaldehyde로 계산하였다. 전자공여능(electron donating ability, EDA)의 측정은 Blois의 방법에 따라 각 추출물의 DPPH (1,1-dephenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소 공여효과로서 시료들의 환원력을 측정하였다. EDA 측정을 위하여 DPPH (1,1-dephenyl-2-picrylhydrazyl) 시약은 \( 59 \mathrm{mg} \) 을 정확히 취하여 ethanol \( 1,000 \mathrm{~mL} \) 에 녹여 사용하였다. 소정 농도의 시료에 DPPH 용액 \( 1 \mathrm{~mL} \) 를 가하여 혼합하고, 실온에서의 시료에 DPPH 용액 \( 1 \mathrm{~mL} \) 를 가하여 혼합하고, 실온에서 30 분간 방치한 후, ice bath에서 반응을 종료시켜 \( 520 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하여 다음과 같이 계산하였다.</p><p>Electron donating ability (EDA, \(\%\))=\(100-\)(시료 흡광도/대조구 흡광도 \( \times 100 \) )</p><h2>보수력 및 감량율</h2><p>보수력은 Hofmann 등의 방법으로 측정하여 planimeter(X-plan, Ushikata 360d Ⅱ, Japan)로 면적을 구하고 육의 표면적을 수분의 면적으로 나눈 값으로 표시하였다. 그리고 동결 감량은 \( -18^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 27 일간 동결하였을 때 동결 전후의 무게, 해동 감량은 \( 4^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 20시간 해동하였을 때의 해동 전후의 무게, 가열 감량은 시료의 중심온도 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \) 가 되도록 가열하였을 때 가열 전후의 무게 차이를 각각 백분율로 나타내었다.</p><h2>기계적 물성</h2><p>한우등심의 기계적 물성은 근섬유와 평행하게 가로, 세로, 높이를 각각 40, 15 및 \( 5 \mathrm{~mm} \) 로 자른 시료에 대해서 rheometer (CR-200D, SUN scientific Co., Japan)를 이용하여 측정하였다. 이 때에 전단력은 전단력 칼날(angle adapter 10번)을 이용하여 table speed \( 120 \mathrm{~mm} / \mathrm{min} \), graph interval \( 30 \mathrm{m} / \mathrm{sec} \), load cell(Max) \( 10 \mathrm{~kg} \) 의 조건에서 측정하고, 경도(hardness), 탄성(springiness), 응집성(cohesiveness)은 점탄성용(round adapter 25번)을 이용하여 table speed \( 120\mathrm{mm} / \mathrm{min} \), graph interval \( 30 \mathrm{~m} / \mathrm{sec} \), load cell(Max) \( 2 \mathrm{~kg} \)의 조건으로 하였다. 뭉침성(gumminess)은 peak max \(\times\) cohesiveness 값으로, 저작성(chewiness)은 (peak max \( \div \) distance) \( \times \) cohesiveness \( \times \) springiness 값으로 나타내었다.</p><h2>기호성 및 통계처리</h2><p>한우등심의 기호성을 위한 고기의 준비는 \( 200^{\circ} \mathrm{C} \) 의 가열판 위에서 중심부의 온도가 \( 75^{\circ} \mathrm{C} \) 가 되도록 가열하였다. 기호성은 관능평가원에 의하여 맛, 풍미, 연도, 다즙성 및 전체적인 기호성에 대하여 가장 좋다(like extremely)를 7점, 가장 나쁘다(dislike extremely)를 1점으로 하는 7점 기호척도법으로 하였다. 그리고 얻어진 결과의 자료는 SAS program을 이용하여 분석하였고, Duncan의 다중검정법으로 \( 5 \% \) 수준에서 유의성을 검정하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>한우는 제주도 소재 5 개 농장에서 각각 거세한 수컷 20두씩 100두를 27개월간 사육하였으며, 모든 농장에서 동일하게 대조구와 감귤박 TMR(total mixed ration) 사료 급여조건이 다른 처리구를 정하여 각각 6두씩 배치하여 사양시험을 하였으며, 그 결과 증체율, 사료효율 등이 좋은 처리구를 선택하여 분석용 시료로 하였다. 이때 생체중량은 \( 715 \pm 35 \mathrm{~kg} \) 이었다. 분석용 시료는 감귤박 TMR 사료를 급여하지 않은 한우 등심(TMR-0), 그리고 육성기 및 비육전기의 일부(17개월)는 대조구와 같은 방법으로 사육한 후 나머지 10개월(비육전기의 일부 및 후기)은 감귤박 TMR 사료를 급여한 한우등심 (TMR-1)으로 하였다. 도축 후 측정한 한우등심의 등지방 두께는 TMR-0 및 TMR-1이 각각 \( 10.30 \pm 1.74 \) 및 \( 8.03 \pm 0.35 \mathrm{~mm} \)였고, 배최장근 단면적은 각각 \( 76.10 \pm 8.82 \) 및 \( 78.68 \pm 9.12 \mathrm{~cm}^{2} \)이었다. 도축 후 12 시간 예비 냉각한 지육에서 등심을 분할하여 진공포장하고 실험실로 이동하여 도축 후 2 일이 될 때 까지 \( 3 \pm 1^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 냉장한 후 실험에 이용하였다.</p><p>감귤박은 제주개발공사 감귤공장에서 감귤 농축액을 제조 한 후 발생한 부산물로 수분함량은 \( 85 \sim 92 \% \) 의 것을 이용하였다. 잔류농약 검사결과 유기인계, 유기염소계 및기타 계열 23개를 분석한 결과 모든 성분이 검출되지 않았다. 감귤박 TMR 사료는 비육한우 영양 요구량이 맞도록 감귤박을 첨가하여 (주)신일의 TMR 배합기로 제조하였다. TMR 사료의 배합비율은 TMR-0의 경우 비육전기에는 사료 \( \mathrm{kg} \) 당 옥수수 \( 267 \mathrm{~g} \), 단백질 \( 115 \mathrm{~g} \), 혼합사료 \( 267 \mathrm{~g} \), 건초 \( 343 \mathrm{~g} \), premix \( 8\mathrm{g} \) 을 급여하였으며, 비육후기는 사료 \( \mathrm{kg} \) 당 옥수수 \( 96 \mathrm{~g} \), 보리 \( 255 \mathrm{~g} \), 혼합사료 \( 478 \mathrm{~g} \), 건초 \( 159 \mathrm{~g} \), premix \( 12 \mathrm{~g} \) 을 급여하였다. 그리고 TMR-1은 비육전기에 사료 \( \mathrm{kg} \) 당 감귤박 \( 340 \mathrm{~g} \), 옥수수 \( 171 \mathrm{~g} \), 단백질 \( 114 \mathrm{~g} \), 혼합사료 \( 142 \mathrm{~g} \), 건초 \( 227 \mathrm{~g} \), premix \( 6 \mathrm{~g} \) 을 급여하였으며, 비육후기에는 사료 \( \mathrm{kg} \) 당 감귤 박 \( 120 \mathrm{~g} \), 옥수수 \( 60 \mathrm{~g} \), 보리 \( 240 \mathrm{~g} \), 혼합사료 \( 419 \mathrm{~g} \), 건초 \( 150\mathrm{g} \), premix \( 11 \mathrm{~g} \) 을 급여하였다. Premix는 비타민 A, K, B1, B2, B12, 인산칼슙, 나이아신, 엽산, 망간, 아연, 철, 구리, 코발트 및 BHT로 구성되었다.</p> <h2>한우등심의 보수력 및 감량율</h2><p>감귤박을 급여하지 않은 한우등심(TMR-0) 및 감귤박을 급여한 한우등심(TMR-1)의 보수력, 동결감량, 해동감량 및 가열감량에 대한 결과롤 Table 3 에 나타내었다. 보수력은 TMR-0 및 TMR-1이 각각 53.06 및 \( 59.37 \% \) 로 유의성은 없었지만 감귤박을 급여한 한우등십이 높았다. 동결감량은 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의성이 없었으며, 해동감량은 TMR-0 및 TMR-1이 각각 7.35 및 \( 3.04 \% \) 로 TMR-1이 유의하게 낮았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 그리고 열탕 가열감량은 TMR-0 및 TMR-1이 각각 22.03 및 \( 20.89 \% \), 팬 가열감량은 각각 26.54 및 \( 22.33 \% \) 로 유의성은 없었지만 TMR-1의 가열감량이 낮은 경향이었다. 보수력이 낮으면 감량이 증가하는 것으로 알려져 있는데, Moon 등은 가열감량은 육즙이 유출되면서 발생하고 보수력이 낮으면 가열감량은 증가한다고 보고하였으며, Jung은 단백질 변성으로 보수력이 감소하면 해동 감량이 증가한다고 하여서, 본 연구의 결과와 일치하였다.</p><h2>한우등심의 기계적 물성</h2><p>한우등심의 기계적 물성으로 경도, 탄성, 응집성, 뭉침성, 저작성 및 전단력을 측정하고 그 결과를 Table 4 에 나타내었다. 감귤박을 급여하지 않은 한우등심(TMR-0) 및 감귤박을 급여한 한우등심(TMR-1)의 경도는 각각 822.83 및 707.00 dyne\( / \mathrm{cm}^{2} \) 으로 TMR-1이 유의적으로 낮았으며, 탄성은 각각 82.17 및 \( 91.64 \% \) 로 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 높았다. 그리고 응집성, 뭉침성, 저작성 및 전단력은 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의한 차이가 없었다. Moon 등 및 Song등은 식품의 물성은 수분함량, 지방함량, 원료 및 단백질의 변성정도 등에 따라 다르게 나타난다고 보고한 바가 있다. 본 연구의 결과는 감귤박을 급여한 한우등심이 급여하지 않은 것보다 경도가 낮고 탄성이 높은 것은 육질은 부드러우면서 탄력이 좋은 것으로 해석할 수 있는데, 감귤박의 어떤 성분이 근육에 이러한 현상을 일으키는지에 대한 연구가 구체적으로 이루어져야 하겠다.</p><h2>저장 중 한우등심의 \( \mathrm{pH}\), VBN 함량 및 TBARS값의 변화</h2><p>한우등심을 3, 30 및 45 일 동안 저장하면서 실험한 \( \mathrm{pH} \), VBN함량 및 TBARS값의 변화에 대한 결과는 Table 5 와 같다. 한우등심을 45 일 동안 저장하였을 때에 TMR- 0 의 \( \mathrm{pH} \) 는 \( 5.60 \sim 5.86\)으로 유의적으로 증가하였으며, TMR-1은 \( 5.61 \sim 5.83\)으로 유의적으로 증가하였지만 저장기간별 TMR-0 및 TMR-1 사이에는 유의성이 없었다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 한우등심의 VBN 함량은 TMR-0가 저장 중 \( 10.31 \sim 18.90 \mathrm{mg}\%\)로 유의적으로 증가하였으며, TMR-1은 \( 10.53 \sim 17.87 \mathrm{mg}\% \) 로 유의하게 증가 하였다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 그러나 저장기간별 TMR-0 및 TMR-1 사이에는 VBN함량의 차이가 없었고 식품공전(2002)에서 신선도로 규정한 \( 20 \mathrm{mg} \% \) 이하를 유지하고 있었다. VBN은 단백질이 분해되어 peptone, polypeptide 및 아미노산 등으로 된 후 세균의 환원작용으로 생성된 저분자 무기태질소로서 그 함량에는 미생물의 수가 영향을 미칠 수 있다.</p><p>한우등심 저장 중 TBARS값은 TMR-0가 \( 0.13 \sim 0.20 \mathrm{mg} \mathrm{MA} / \mathrm{kg} \) 으로 증가하였고, TMR-1은 \( 0.12 \sim 0.17 \mathrm{mg} \mathrm{MA} / \mathrm{kg} \) 으로 유의적으로 증가하였으며, 저장 45 일째의 TBARS값은 TMR-0가 TMR-1보다 높은 경향이었다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). TBARS값을 이용한 지방의 산화지수에 대하여 Turner 등은 TBARS 값이 \( 0.46 \mathrm{mg} \mathrm{MA} / \mathrm{kg} \) 이하이면 가식권이고, \( 1.2 \mathrm{mg} \mathrm{MA} / \mathrm{kg} \) 이상이면 완전부패라는 기준과 본 연구의 결과를 비교하여 볼 때에 저장 45 일까지는 지방산화에 의한 안전성은 확보되었으며, 감귤박의 급여가 한우등심의 지방산화를 억제하고 있었음을 알 수 있었다.</p><h2>한우등심의 기호성</h2><p>감귤박의 급여가 기호성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 생육의 색깔 및 향기, 가열육의 맛, 풍미, 연도, 다즙성 및 전체적인 기호도를 Table 6 에 나타내었다. 생육의 색깔 및 향기는 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의적인 차이가 없었다.</p><p>그리고 가열육의 맛, 다즙성 및 전체적인 기호도는 유의성은 없지만 TMR-1이 TMR-0보다 우수하였고, 풍미 및 연도는 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 높았다 \( (\mathrm{p}<0.05) \). 고기의 기호성은 유리아미노산, 지방산, ATP관련 화합물, 산, 당, 펩티드 등 많은 성분들이 복합적으로 작용하여 나타나는데, 이 중 맛은 유리아미노산, 펩티드, 아민, 단백질, 당, 유기산, 핵산 등의 비휘발성 화합물들에 의하고, 풍미는 유리아미노산, 저분자 펩티드, IMP 등의 흔합물이 가열에 의하여 형성되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 생육의 색깔과 향기는 유의성이 없는데도 불구하고 가열육의 기호도가 우수 한 것은 감귤박을 급여한 한우등심에 축적되어 있는 어떤 기호도 향상성분이 가열에 의하여 발현되어 나타난 것으로 생각된다.</p><p>이상의 결과에서 감귤박을 급여한 한우등심의 보수력 및 기계적 물성이 우수하고, 저장성이 좋으며, 기호성이 우수하여서 감귤박을 소에게 급여하는 것은 감귤박 폐기물의 재이용과 기능성 소고기 생산 가능성을 확인한 것이었다. 다만 앞으로 더 연구되어야 할 것은 감귤박 급여로 어떤 성분들이 근육에 축적되어 품질 및 기호성을 더 우수하게 하는지에 대한 것이다.</p> <h1>걸과 및 고찰</h1><h2>한우등심의 표면색깔</h2><p>감귤박을 급여하지 않은 한우등심(TMR-0) 및 감귤박을 급여한 한우등심(TMR-1)의 표면색깔은 Table 1과 같다. 그 결과 \( \mathrm{L}^{} \) 값(명도)은 TMR-0 및 TMR-1이 각각 38.97 및 37.93, \( \mathrm{a}^{} \) 값(적색도)은 각각 15.87 및 18.85, 그리고 \( \mathrm{b}^{*} \) 값(황색도)은 각각 6.96 및 9.57로서 시료 간에 유의적인 차이가 없었다. 고기의 색깔은 myoglobin, oxymyoglobin 및 metmyoglobin의 농도와 화학적 상태에 따라서 결정되고, 소고기의 경우 근육 내의 지방축적이 우수할수록 명도가 높아지는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 사료조성 외에는 같은 조건으로 사육하였고, 사료 중의 감귤박에 함유된 carotenoid계 색소나 이들의 갈변물질이 근육에 축적되어 색깔이 다를 것으로 예측하였으나 유의성이 없는 것은 감귤 펄프의 급여량이 \( 340 \mathrm{~g} / \mathrm{kg} \) 으로 펄프 상태로는 \( 34 \% \) 에 해당되지만 건조 물(감귤 펄프의 수분함량 \(85 \sim 92\%\))로는 \( 2.7 \sim 5.1 \% \) 에 불과하기 때문에 급여량이 적고, 또 사육기간 27 개월 중 감귤박 사료의 급여기간이 10 개월로 급여기간이 적었던 것에서 오는 결과로 판단된다.</p><h2>한우등심의 \( \mathrm{pH}\), VBN 함량, TBARS값 및 EDA</h2><p>감귤박을 급여한 한우등심의 \( \mathrm{pH}\), VBN 함량, TBARS값 및 EDA를 실험하고 그 결과를 Table 2 에 나타내었다. 한우등심의 \( \mathrm{pH} \) 는 TMR-0 및 TMR-1이 각각 5.56 및 5.64로 TMR-1이 유의하게 높았으며( \( \mathrm{p}<0.05)\), VBN함량은 각각 10.19 및 11.47 \( \mathrm{mg} \%\)로 유의성이 없었다. 그리고 TBARS값은 TMR-0 및 TMR-1이 \( 0.13 \mathrm{mg} \mathrm{MA} / \mathrm{kg} \) 으로 같았고, 항산화력을 나타내는 전자공여능 즉 EDA는 각각 \( 38.56 \) 및 \( 43.07 \% \) 로 유의한 차이가 없었다. 그러나 EDA의 경우 TMR-1이 TMR-0보다 높아 항산화력이 높을 것으로 판단되며 유의성 있는 결과를 얻기 위해서는 감귤박 급여량을 증가시킨 실험이 이루어져야 하겠다. 식품에 대한 항산화력 지표의 하나로 EDA 측정 결과가 이용된다. 항산화제는 활성산소를 제거하는 생물 의학적 반응을 촉매하면서 유해한 변화나 손상을 주지 않으며, 유해한 활성산소를 이동시키거나 안정적인 상태로 만들고, 식품성분 중에서는 vitamin, mineral, flavonoid 및 polyphenol 등이 이러한 항산화능을 가지고 있다. 본 연구에 이용한 감귤박은 vitamin, flavonoid 및 polyphenol 물질이 함유되어 있기 때문에 항산화력이 있지만 급여된 감귤박의 유효성분들이 근육 중에 일부만 축적되거나 급여량 또는 급여기간이 적은데서 오는 결과로 인하여 유의성이 없는 것으로 판단되었다.</p> <h1>서 론</h1><p>육류의 소비는 국민소득의 증가와 축산업의 발전에 따른 대량 사육으로 인하여 가격이 저렴해지면서 꾸준히 증가하였다. 그 중에서 소고기는 수입에 따른 공급확대와 소고기를 주원료로 하는 전문 외식산업이 발달하면서 소비량이 증가하여 왔고, 앞으로도 당분간은 이런 추세가 계속될 것으로 보인다. 그러나 최근에는 육류의 과다 섭취와 육류 조리과정에서 발생된 인체 유해물질로 인하여 비만을 비롯한 각종 성인병의 발병건수가 늘어나면서 소비자들은 안전한 육류에 대한 관심이 높아지고 있다. 따라서 건강 지향적 육류의 생산에 대한 연구가 체계적으로 이루어져 소비자들이 안심하고 이용할 수 있는 기능성 육류가 생산되어야 하겠고, 아직은 기능성을 가진 소고기를 계획 생산하기는 어렵지만 여기에 대한 기초연구는 꾸준히 이루어지고 있다. Kook과 Kim은 죽초액 급여수준이 우육의 생산성, 혈액성상 및 육질에 미치는 영향을 연구하였으며, Park 등은 유기 셀레늄 강화버섯 폐배지를 급여한 소 채끝육의 육질 특성에 관하여, 그리고 Kim등은 거정석과 비타민 A급여에 의한 성장성, 혈액성상 및 도체특성에 대하여 연구하였다. Choi등은 n-3계 다가불포화지방산의 급여가 근육과 지방조직의 형성에 미치는 영향을 연구하였으며, Robbins 등은 비타민 E의 급여가 연도, 풍미, 다즙성 등을 향상시킨다고 보고하였다. 또 Reverte 등은 항산화제롤 급여하였을 경우 소 재구성 스테이크의 지질산화가 감소되고, 동결저장 중의 산패가 억제되었다고 보고하였다. 그러나 이러한 국내외의 연구들은 대부분 특정 성분만을 소의 사료에 배합하여 급여하는 형식으로서 과일 또는 그 부산물을 사료와 함께 직접 급여하여 생산된 소고기의 품질특성을 연구한 결과들은 매우 드물다. 특히 생리활성물질이 많이 함유되어 있는 감귤박을 급여하여 사육한 우육의 품질특성을 연구한 것은 거의 없다.</p><p>감귤박은 밀감 주스, 통조림, 잼 등의 가공품을 제조하고 남은 부산물로서 외피, 내피, 씨 등으로 구성되어 있고, 여기에는 비타민, 유기산, 유리당, 섬유질 등을 포함한 유효성분들이 많이 함유되어 있어서 건강식품의 소재로서 이용되기도 한다. 감귤박에는 naringin, hesperidin 등의 flavonoid류가 많이 함유되어 있어서, 항산화 작용이 있고, citric acid를 포함한 malic acid, succinic acid 등의 유기산이 풍부하며, pinene, linalool 등의 휘발성 풍미물질이 함유되어 있어 항균작용이 있고, 씨에는 oleic acid, linoleic acid, linolenic acid 등의 불포화지방산이 많이 함유되어 있으며, 껍질과 펄프에는 cryptoxanthin, violaxanthin 등의 carotenoid류가 다량 함유되어 있고, niacin, ascorbic acid같은 비타민이 많아 영양가치도 높다. 따라서 감귤박의 이용범위가 넓을 것 같지만 사용량은 대단히 적어 대부분 폐기 하고 있는 실정이다.</p><p>그러므로 여러 가지 유용성분을 가진 감귤박을 효과적으 로 이용하는 방법을 찾는 것은 매우 중요한 일이다. 그 방법 의 하나로 가축의 사료에 감귤박을 첨가하여 이용하는 기술 이 필요하며, 이젓을 소에게 급여하여 얻어진 고기의 차별성 이 인정된다면 감귤박의 효과적 처리와 축산업 활성화에 크 게 기여하리라 생각된다. 따라서 본 연구는 부존자원을 이용 한 사료비 절감과 기능성 한우육 생산 가능성을 모색하고자 감귤박을 한우에게 급여하고 이화학적 성질 및 관능특성을 검토하였기에 보고하고자 한다.</p>	생명과학	[ "<h1>요 약</h1><p>본 연구는 감귤박 급여가 한우등심의 이화학적 특성 및 기호성에 미치는 영향을 연구할 목적으로 수행하였다.", "시료는 감귤박을 급여하지 않은 한우등심(TMR-0)과 감귤박을 급여한 한우등심(TMR-1)으로 하였다.", "TMR-0는 비육우용 배합사료와 건초를 분리 급여하면서 관행적으로 사육하였으며, TMR-1은 육성기 및 비육전기 일부(약 17개월)는 TMR-0와 같은 방법으로 사육한 후 나머지 10개월(비육전기 및 후기) 동안은 감귤부산물 TMR 사료를 급여하였다.", "한우등심의 명도, 적색도 및 황색도는 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의적인 차이가 없었다. \\", "( \\mathrm{pH} \\) 는 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 낮았으며, VBN함량, TBARS값 및 EDA는 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의적인 차이가 없었다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "한우등심의 보수력, 동결감량 및 가열감량은 TMR-0 및 TMR- 1 사이에 유의적인 차이는 없었지만, 해동감량은 TMR-0 \\((7.35\\%\\))가 TMR-1 \\((3.04\\%\\))보다 유의적으로.", "높았다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "한우등심의 경도는 TMR-0가 TMR-1보다 높고, 탄성은 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 높았으며, 응집성, 뭉침성, 저작성 및 전단력은 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의한 차이가 없었다.", "저장 중 \\( \\mathrm{pH} \\) 및 VBN 함량은 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의적인 차이가 없었지만, TBARS값은 저장 4 주째 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 낮았다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "생육의 색깔 및 향기는 TMR-0 및 TMR- 1 사이에 유의한 차이가 없었다.", "가열육의 풍미 및 연도는 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 우수하였으며, 맛, 다즙성 및 전 체적인 기호도는 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의성이 없었다 \\", "( (p<0.05) \\).", "</p> <h2>표면 색깔</h2><p>한우 등심의 표면 색깔의 측정은 색차계(Chromameter CR-200b, Minolta Camera Co., Japan)를 이용하여 \\( \\mathrm{L}^{}\\) (명도), \\( \\mathrm{a}^{} \\) (적색도) 및 \\( \\mathrm{b}^{} \\) (황색도)로 나타내었으며, 이때 색보정을 위해 이용되는 표준 백색판의 \\( \\mathrm{L}^{}\\), \\(\\mathrm{a}^{}\\), \\(\\mathrm{~b}^{} \\) 값은 각각 97.6, -6.6, 6.3이었다.", "</p><h2>pH, VBN 함량, TBARS 값 및 전자공여능 측정</h2><p>한우등심의 \\( \\mathrm{pH} \\) 측정은 \\( \\mathrm{pH} \\) meter(ATI Orion 370, USA)의 유리전극을 고기에 직접 꽂아 측정하였으며, VBN (volatile basic nitrogen) 함량은 식품공전에 준하여 실험하였다.", "그리고 TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) 값은 시료를 perchloric acid 및 BHT와 함께 균질하고 여과하여 얻어진 여과물에 TBA 시약을 가하고 \\( 531 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하여 나타난 값을 시료 \\( \\mathrm{kg} \\) 당 반응물 \\( \\mathrm{mg} \\) malonaldehyde로 계산하였다.", "전자공여능(electron donating ability, EDA)의 측정은 Blois의 방법에 따라 각 추출물의 DPPH (1,1-dephenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 수소 공여효과로서 시료들의 환원력을 측정하였다.", "EDA 측정을 위하여 DPPH (1,1-dephenyl-2-picrylhydrazyl) 시약은 \\( 59 \\mathrm{mg} \\) 을 정확히 취하여 ethanol \\( 1,000 \\mathrm{~mL} \\) 에 녹여 사용하였다.", "소정 농도의 시료에 DPPH 용액 \\( 1 \\mathrm{~mL} \\) 를 가하여 혼합하고, 실온에서의 시료에 DPPH 용액 \\( 1 \\mathrm{~mL} \\) 를 가하여 혼합하고, 실온에서 30 분간 방치한 후, ice bath에서 반응을 종료시켜 \\( 520 \\mathrm{~nm} \\) 에서 흡광도를 측정하여 다음과 같이 계산하였다.", "</p><p>Electron donating ability (EDA, \\(\\%\\))=\\(100-\\)(시료 흡광도/대조구 흡광도 \\( \\times 100 \\) )</p><h2>보수력 및 감량율</h2><p>보수력은 Hofmann 등의 방법으로 측정하여 planimeter(X-plan, Ushikata 360d Ⅱ, Japan)로 면적을 구하고 육의 표면적을 수분의 면적으로 나눈 값으로 표시하였다.", "그리고 동결 감량은 \\( -18^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 27 일간 동결하였을 때 동결 전후의 무게, 해동 감량은 \\( 4^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 20시간 해동하였을 때의 해동 전후의 무게, 가열 감량은 시료의 중심온도 \\( 75^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 가 되도록 가열하였을 때 가열 전후의 무게 차이를 각각 백분율로 나타내었다.", "</p><h2>기계적 물성</h2><p>한우등심의 기계적 물성은 근섬유와 평행하게 가로, 세로, 높이를 각각 40, 15 및 \\( 5 \\mathrm{~mm} \\) 로 자른 시료에 대해서 rheometer (CR-200D, SUN scientific Co., Japan)를 이용하여 측정하였다.", "이 때에 전단력은 전단력 칼날(angle adapter 10번)을 이용하여 table speed \\( 120 \\mathrm{~mm} / \\mathrm{min} \\), graph interval \\( 30 \\mathrm{m} / \\mathrm{sec} \\), load cell(Max) \\( 10 \\mathrm{~kg} \\) 의 조건에서 측정하고, 경도(hardness), 탄성(springiness), 응집성(cohesiveness)은 점탄성용(round adapter 25번)을 이용하여 table speed \\( 120\\mathrm{mm} / \\mathrm{min} \\), graph interval \\( 30 \\mathrm{~m} / \\mathrm{sec} \\), load cell(Max) \\( 2 \\mathrm{~kg} \\)의 조건으로 하였다.", "뭉침성(gumminess)은 peak max \\(\\times\\) cohesiveness 값으로, 저작성(chewiness)은 (peak max \\( \\div \\) distance) \\( \\times \\) cohesiveness \\( \\times \\) springiness 값으로 나타내었다.", "</p><h2>기호성 및 통계처리</h2><p>한우등심의 기호성을 위한 고기의 준비는 \\( 200^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 의 가열판 위에서 중심부의 온도가 \\( 75^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 가 되도록 가열하였다.", "기호성은 관능평가원에 의하여 맛, 풍미, 연도, 다즙성 및 전체적인 기호성에 대하여 가장 좋다(like extremely)를 7점, 가장 나쁘다(dislike extremely)를 1점으로 하는 7점 기호척도법으로 하였다.", "그리고 얻어진 결과의 자료는 SAS program을 이용하여 분석하였고, Duncan의 다중검정법으로 \\( 5 \\% \\) 수준에서 유의성을 검정하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>재료</h2><p>한우는 제주도 소재 5 개 농장에서 각각 거세한 수컷 20두씩 100두를 27개월간 사육하였으며, 모든 농장에서 동일하게 대조구와 감귤박 TMR(total mixed ration) 사료 급여조건이 다른 처리구를 정하여 각각 6두씩 배치하여 사양시험을 하였으며, 그 결과 증체율, 사료효율 등이 좋은 처리구를 선택하여 분석용 시료로 하였다.", "이때 생체중량은 \\( 715 \\pm 35 \\mathrm{~kg} \\) 이었다.", "분석용 시료는 감귤박 TMR 사료를 급여하지 않은 한우 등심(TMR-0), 그리고 육성기 및 비육전기의 일부(17개월)는 대조구와 같은 방법으로 사육한 후 나머지 10개월(비육전기의 일부 및 후기)은 감귤박 TMR 사료를 급여한 한우등심 (TMR-1)으로 하였다.", "도축 후 측정한 한우등심의 등지방 두께는 TMR-0 및 TMR-1이 각각 \\( 10.30 \\pm 1.74 \\) 및 \\( 8.03 \\pm 0.35 \\mathrm{~mm} \\)였고, 배최장근 단면적은 각각 \\( 76.10 \\pm 8.82 \\) 및 \\( 78.68 \\pm 9.12 \\mathrm{~cm}^{2} \\)이었다.", "도축 후 12 시간 예비 냉각한 지육에서 등심을 분할하여 진공포장하고 실험실로 이동하여 도축 후 2 일이 될 때 까지 \\( 3 \\pm 1^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 에서 냉장한 후 실험에 이용하였다.", "</p><p>감귤박은 제주개발공사 감귤공장에서 감귤 농축액을 제조 한 후 발생한 부산물로 수분함량은 \\( 85 \\sim 92 \\% \\) 의 것을 이용하였다.", "잔류농약 검사결과 유기인계, 유기염소계 및기타 계열 23개를 분석한 결과 모든 성분이 검출되지 않았다.", "감귤박 TMR 사료는 비육한우 영양 요구량이 맞도록 감귤박을 첨가하여 (주)신일의 TMR 배합기로 제조하였다.", "TMR 사료의 배합비율은 TMR-0의 경우 비육전기에는 사료 \\( \\mathrm{kg} \\) 당 옥수수 \\( 267 \\mathrm{~g} \\), 단백질 \\( 115 \\mathrm{~g} \\), 혼합사료 \\( 267 \\mathrm{~g} \\), 건초 \\( 343 \\mathrm{~g} \\), premix \\( 8\\mathrm{g} \\) 을 급여하였으며, 비육후기는 사료 \\( \\mathrm{kg} \\) 당 옥수수 \\( 96 \\mathrm{~g} \\), 보리 \\( 255 \\mathrm{~g} \\), 혼합사료 \\( 478 \\mathrm{~g} \\), 건초 \\( 159 \\mathrm{~g} \\), premix \\( 12 \\mathrm{~g} \\) 을 급여하였다.", "그리고 TMR-1은 비육전기에 사료 \\( \\mathrm{kg} \\) 당 감귤박 \\( 340 \\mathrm{~g} \\), 옥수수 \\( 171 \\mathrm{~g} \\), 단백질 \\( 114 \\mathrm{~g} \\), 혼합사료 \\( 142 \\mathrm{~g} \\), 건초 \\( 227 \\mathrm{~g} \\), premix \\( 6 \\mathrm{~g} \\) 을 급여하였으며, 비육후기에는 사료 \\( \\mathrm{kg} \\) 당 감귤 박 \\( 120 \\mathrm{~g} \\), 옥수수 \\( 60 \\mathrm{~g} \\), 보리 \\( 240 \\mathrm{~g} \\), 혼합사료 \\( 419 \\mathrm{~g} \\), 건초 \\( 150\\mathrm{g} \\), premix \\( 11 \\mathrm{~g} \\) 을 급여하였다.", "Premix는 비타민 A, K, B1, B2, B12, 인산칼슙, 나이아신, 엽산, 망간, 아연, 철, 구리, 코발트 및 BHT로 구성되었다.", "</p> <h2>한우등심의 보수력 및 감량율</h2><p>감귤박을 급여하지 않은 한우등심(TMR-0) 및 감귤박을 급여한 한우등심(TMR-1)의 보수력, 동결감량, 해동감량 및 가열감량에 대한 결과롤 Table 3 에 나타내었다.", "보수력은 TMR-0 및 TMR-1이 각각 53.06 및 \\( 59.37 \\% \\) 로 유의성은 없었지만 감귤박을 급여한 한우등십이 높았다.", "동결감량은 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의성이 없었으며, 해동감량은 TMR-0 및 TMR-1이 각각 7.35 및 \\( 3.04 \\% \\) 로 TMR-1이 유의하게 낮았다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "그리고 열탕 가열감량은 TMR-0 및 TMR-1이 각각 22.03 및 \\( 20.89 \\% \\), 팬 가열감량은 각각 26.54 및 \\( 22.33 \\% \\) 로 유의성은 없었지만 TMR-1의 가열감량이 낮은 경향이었다.", "보수력이 낮으면 감량이 증가하는 것으로 알려져 있는데, Moon 등은 가열감량은 육즙이 유출되면서 발생하고 보수력이 낮으면 가열감량은 증가한다고 보고하였으며, Jung은 단백질 변성으로 보수력이 감소하면 해동 감량이 증가한다고 하여서, 본 연구의 결과와 일치하였다.", "</p><h2>한우등심의 기계적 물성</h2><p>한우등심의 기계적 물성으로 경도, 탄성, 응집성, 뭉침성, 저작성 및 전단력을 측정하고 그 결과를 Table 4 에 나타내었다.", "감귤박을 급여하지 않은 한우등심(TMR-0) 및 감귤박을 급여한 한우등심(TMR-1)의 경도는 각각 822.83 및 707.00 dyne\\( / \\mathrm{cm}^{2} \\) 으로 TMR-1이 유의적으로 낮았으며, 탄성은 각각 82.17 및 \\( 91.64 \\% \\) 로 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 높았다.", "그리고 응집성, 뭉침성, 저작성 및 전단력은 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의한 차이가 없었다.", "Moon 등 및 Song등은 식품의 물성은 수분함량, 지방함량, 원료 및 단백질의 변성정도 등에 따라 다르게 나타난다고 보고한 바가 있다.", "본 연구의 결과는 감귤박을 급여한 한우등심이 급여하지 않은 것보다 경도가 낮고 탄성이 높은 것은 육질은 부드러우면서 탄력이 좋은 것으로 해석할 수 있는데, 감귤박의 어떤 성분이 근육에 이러한 현상을 일으키는지에 대한 연구가 구체적으로 이루어져야 하겠다.", "</p><h2>저장 중 한우등심의 \\( \\mathrm{pH}\\), VBN 함량 및 TBARS값의 변화</h2><p>한우등심을 3, 30 및 45 일 동안 저장하면서 실험한 \\( \\mathrm{pH} \\), VBN함량 및 TBARS값의 변화에 대한 결과는 Table 5 와 같다.", "한우등심을 45 일 동안 저장하였을 때에 TMR- 0 의 \\( \\mathrm{pH} \\) 는 \\( 5.60 \\sim 5.86\\)으로 유의적으로 증가하였으며, TMR-1은 \\( 5.61 \\sim 5.83\\)으로 유의적으로 증가하였지만 저장기간별 TMR-0 및 TMR-1 사이에는 유의성이 없었다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "한우등심의 VBN 함량은 TMR-0가 저장 중 \\( 10.31 \\sim 18.90 \\mathrm{mg}\\%\\)로 유의적으로 증가하였으며, TMR-1은 \\( 10.53 \\sim 17.87 \\mathrm{mg}\\% \\) 로 유의하게 증가 하였다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "그러나 저장기간별 TMR-0 및 TMR-1 사이에는 VBN함량의 차이가 없었고 식품공전(2002)에서 신선도로 규정한 \\( 20 \\mathrm{mg} \\% \\) 이하를 유지하고 있었다.", "VBN은 단백질이 분해되어 peptone, polypeptide 및 아미노산 등으로 된 후 세균의 환원작용으로 생성된 저분자 무기태질소로서 그 함량에는 미생물의 수가 영향을 미칠 수 있다.", "</p><p>한우등심 저장 중 TBARS값은 TMR-0가 \\( 0.13 \\sim 0.20 \\mathrm{mg} \\mathrm{MA} / \\mathrm{kg} \\) 으로 증가하였고, TMR-1은 \\( 0.12 \\sim 0.17 \\mathrm{mg} \\mathrm{MA} / \\mathrm{kg} \\) 으로 유의적으로 증가하였으며, 저장 45 일째의 TBARS값은 TMR-0가 TMR-1보다 높은 경향이었다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "TBARS값을 이용한 지방의 산화지수에 대하여 Turner 등은 TBARS 값이 \\( 0.46 \\mathrm{mg} \\mathrm{MA} / \\mathrm{kg} \\) 이하이면 가식권이고, \\( 1.2 \\mathrm{mg} \\mathrm{MA} / \\mathrm{kg} \\) 이상이면 완전부패라는 기준과 본 연구의 결과를 비교하여 볼 때에 저장 45 일까지는 지방산화에 의한 안전성은 확보되었으며, 감귤박의 급여가 한우등심의 지방산화를 억제하고 있었음을 알 수 있었다.", "</p><h2>한우등심의 기호성</h2><p>감귤박의 급여가 기호성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 생육의 색깔 및 향기, 가열육의 맛, 풍미, 연도, 다즙성 및 전체적인 기호도를 Table 6 에 나타내었다.", "생육의 색깔 및 향기는 TMR-0 및 TMR-1 사이에 유의적인 차이가 없었다.", "</p><p>그리고 가열육의 맛, 다즙성 및 전체적인 기호도는 유의성은 없지만 TMR-1이 TMR-0보다 우수하였고, 풍미 및 연도는 TMR-1이 TMR-0보다 유의적으로 높았다 \\", "( (\\mathrm{p}<0.05) \\).", "고기의 기호성은 유리아미노산, 지방산, ATP관련 화합물, 산, 당, 펩티드 등 많은 성분들이 복합적으로 작용하여 나타나는데, 이 중 맛은 유리아미노산, 펩티드, 아민, 단백질, 당, 유기산, 핵산 등의 비휘발성 화합물들에 의하고, 풍미는 유리아미노산, 저분자 펩티드, IMP 등의 흔합물이 가열에 의하여 형성되는 것으로 알려져 있다.", "본 연구에서 생육의 색깔과 향기는 유의성이 없는데도 불구하고 가열육의 기호도가 우수 한 것은 감귤박을 급여한 한우등심에 축적되어 있는 어떤 기호도 향상성분이 가열에 의하여 발현되어 나타난 것으로 생각된다.", "</p><p>이상의 결과에서 감귤박을 급여한 한우등심의 보수력 및 기계적 물성이 우수하고, 저장성이 좋으며, 기호성이 우수하여서 감귤박을 소에게 급여하는 것은 감귤박 폐기물의 재이용과 기능성 소고기 생산 가능성을 확인한 것이었다.", "다만 앞으로 더 연구되어야 할 것은 감귤박 급여로 어떤 성분들이 근육에 축적되어 품질 및 기호성을 더 우수하게 하는지에 대한 것이다.", "</p> <h1>걸과 및 고찰</h1><h2>한우등심의 표면색깔</h2><p>감귤박을 급여하지 않은 한우등심(TMR-0) 및 감귤박을 급여한 한우등심(TMR-1)의 표면색깔은 Table 1과 같다.", "그 결과 \\( \\mathrm{L}^{} \\) 값(명도)은 TMR-0 및 TMR-1이 각각 38.97 및 37.93, \\( \\mathrm{a}^{} \\) 값(적색도)은 각각 15.87 및 18.85, 그리고 \\( \\mathrm{b}^{*} \\) 값(황색도)은 각각 6.96 및 9.57로서 시료 간에 유의적인 차이가 없었다.", "고기의 색깔은 myoglobin, oxymyoglobin 및 metmyoglobin의 농도와 화학적 상태에 따라서 결정되고, 소고기의 경우 근육 내의 지방축적이 우수할수록 명도가 높아지는 것으로 알려져 있다.", "본 연구에서는 사료조성 외에는 같은 조건으로 사육하였고, 사료 중의 감귤박에 함유된 carotenoid계 색소나 이들의 갈변물질이 근육에 축적되어 색깔이 다를 것으로 예측하였으나 유의성이 없는 것은 감귤 펄프의 급여량이 \\( 340 \\mathrm{~g} / \\mathrm{kg} \\) 으로 펄프 상태로는 \\( 34 \\% \\) 에 해당되지만 건조 물(감귤 펄프의 수분함량 \\(85 \\sim 92\\%\\))로는 \\( 2.7 \\sim 5.1 \\% \\) 에 불과하기 때문에 급여량이 적고, 또 사육기간 27 개월 중 감귤박 사료의 급여기간이 10 개월로 급여기간이 적었던 것에서 오는 결과로 판단된다.", "</p><h2>한우등심의 \\( \\mathrm{pH}\\), VBN 함량, TBARS값 및 EDA</h2><p>감귤박을 급여한 한우등심의 \\( \\mathrm{pH}\\), VBN 함량, TBARS값 및 EDA를 실험하고 그 결과를 Table 2 에 나타내었다.", "한우등심의 \\( \\mathrm{pH} \\) 는 TMR-0 및 TMR-1이 각각 5.56 및 5.64로 TMR-1이 유의하게 높았으며( \\( \\mathrm{p}<0.05)\\), VBN함량은 각각 10.19 및 11.47 \\( \\mathrm{mg} \\%\\)로 유의성이 없었다.", "그리고 TBARS값은 TMR-0 및 TMR-1이 \\( 0.13 \\mathrm{mg} \\mathrm{MA} / \\mathrm{kg} \\) 으로 같았고, 항산화력을 나타내는 전자공여능 즉 EDA는 각각 \\( 38.56 \\) 및 \\( 43.07 \\% \\) 로 유의한 차이가 없었다.", "그러나 EDA의 경우 TMR-1이 TMR-0보다 높아 항산화력이 높을 것으로 판단되며 유의성 있는 결과를 얻기 위해서는 감귤박 급여량을 증가시킨 실험이 이루어져야 하겠다.", "식품에 대한 항산화력 지표의 하나로 EDA 측정 결과가 이용된다.", "항산화제는 활성산소를 제거하는 생물 의학적 반응을 촉매하면서 유해한 변화나 손상을 주지 않으며, 유해한 활성산소를 이동시키거나 안정적인 상태로 만들고, 식품성분 중에서는 vitamin, mineral, flavonoid 및 polyphenol 등이 이러한 항산화능을 가지고 있다.", "본 연구에 이용한 감귤박은 vitamin, flavonoid 및 polyphenol 물질이 함유되어 있기 때문에 항산화력이 있지만 급여된 감귤박의 유효성분들이 근육 중에 일부만 축적되거나 급여량 또는 급여기간이 적은데서 오는 결과로 인하여 유의성이 없는 것으로 판단되었다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>육류의 소비는 국민소득의 증가와 축산업의 발전에 따른 대량 사육으로 인하여 가격이 저렴해지면서 꾸준히 증가하였다.", "그 중에서 소고기는 수입에 따른 공급확대와 소고기를 주원료로 하는 전문 외식산업이 발달하면서 소비량이 증가하여 왔고, 앞으로도 당분간은 이런 추세가 계속될 것으로 보인다.", "그러나 최근에는 육류의 과다 섭취와 육류 조리과정에서 발생된 인체 유해물질로 인하여 비만을 비롯한 각종 성인병의 발병건수가 늘어나면서 소비자들은 안전한 육류에 대한 관심이 높아지고 있다.", "따라서 건강 지향적 육류의 생산에 대한 연구가 체계적으로 이루어져 소비자들이 안심하고 이용할 수 있는 기능성 육류가 생산되어야 하겠고, 아직은 기능성을 가진 소고기를 계획 생산하기는 어렵지만 여기에 대한 기초연구는 꾸준히 이루어지고 있다.", "Kook과 Kim은 죽초액 급여수준이 우육의 생산성, 혈액성상 및 육질에 미치는 영향을 연구하였으며, Park 등은 유기 셀레늄 강화버섯 폐배지를 급여한 소 채끝육의 육질 특성에 관하여, 그리고 Kim등은 거정석과 비타민 A급여에 의한 성장성, 혈액성상 및 도체특성에 대하여 연구하였다.", "Choi등은 n-3계 다가불포화지방산의 급여가 근육과 지방조직의 형성에 미치는 영향을 연구하였으며, Robbins 등은 비타민 E의 급여가 연도, 풍미, 다즙성 등을 향상시킨다고 보고하였다.", "또 Reverte 등은 항산화제롤 급여하였을 경우 소 재구성 스테이크의 지질산화가 감소되고, 동결저장 중의 산패가 억제되었다고 보고하였다.", "그러나 이러한 국내외의 연구들은 대부분 특정 성분만을 소의 사료에 배합하여 급여하는 형식으로서 과일 또는 그 부산물을 사료와 함께 직접 급여하여 생산된 소고기의 품질특성을 연구한 결과들은 매우 드물다.", "특히 생리활성물질이 많이 함유되어 있는 감귤박을 급여하여 사육한 우육의 품질특성을 연구한 것은 거의 없다.", "</p><p>감귤박은 밀감 주스, 통조림, 잼 등의 가공품을 제조하고 남은 부산물로서 외피, 내피, 씨 등으로 구성되어 있고, 여기에는 비타민, 유기산, 유리당, 섬유질 등을 포함한 유효성분들이 많이 함유되어 있어서 건강식품의 소재로서 이용되기도 한다.", "감귤박에는 naringin, hesperidin 등의 flavonoid류가 많이 함유되어 있어서, 항산화 작용이 있고, citric acid를 포함한 malic acid, succinic acid 등의 유기산이 풍부하며, pinene, linalool 등의 휘발성 풍미물질이 함유되어 있어 항균작용이 있고, 씨에는 oleic acid, linoleic acid, linolenic acid 등의 불포화지방산이 많이 함유되어 있으며, 껍질과 펄프에는 cryptoxanthin, violaxanthin 등의 carotenoid류가 다량 함유되어 있고, niacin, ascorbic acid같은 비타민이 많아 영양가치도 높다.", "따라서 감귤박의 이용범위가 넓을 것 같지만 사용량은 대단히 적어 대부분 폐기 하고 있는 실정이다.", "</p><p>그러므로 여러 가지 유용성분을 가진 감귤박을 효과적으 로 이용하는 방법을 찾는 것은 매우 중요한 일이다.", "그 방법 의 하나로 가축의 사료에 감귤박을 첨가하여 이용하는 기술 이 필요하며, 이젓을 소에게 급여하여 얻어진 고기의 차별성 이 인정된다면 감귤박의 효과적 처리와 축산업 활성화에 크 게 기여하리라 생각된다.", "따라서 본 연구는 부존자원을 이용 한 사료비 절감과 기능성 한우육 생산 가능성을 모색하고자 감귤박을 한우에게 급여하고 이화학적 성질 및 관능특성을 검토하였기에 보고하고자 한다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, 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5,438	<h2>PAP의 발현</h2><p>PAP 는 전립선뿐만이 아니라 뇌, 신장, 간, 폐, 근육, 태반, 침샘, 비장, 갑상선, 흉선 등에서 발현된다. 이 중 태반과 간에서 발현하는 acid phosphatase는 대부분 lysosome에 위치하기 때문에 lysosomal acid phosphatase (LAP)라고 명명되었고, secretory PAP는 전립선에서만 발현되는 특징이 있는 것으로 알려져 있다. PAP의 발현은 나이와도 상관관계가 있는데, 태어날 때는 높은 수준으로 PAP를 발현하다가 생후 6 개월까지 점점 감소하여 발현이 사라지고, 10 세 이후부터 사춘기까지 발현량이 다시 점차 증가하는 양상을 보인다. 이로 미루어 볼 때 PAP의 발현은 2차 성징을 결정짓는 testosterone과 같은 성 호르몬과 연관되어 있음을 알 수 있다. PAP 의 mRNA 양을 quantitative PCR을 이용하여 전립선에서 확인하였을 때는 정상 전립선이나 전립선 암 모두 PAP의 transcript가 상당히 증가되어 있음을 확인하였고, 이는 다른 조직 대비 정상 전립선 조직에서 50 5,000배, 전립선 암 조직에서 110~6,000배 가량 높은 수준임이 확인되었다. 한편, 면역조직화학법으로 분석하여 보았을 때 정상의 유방조직에서는 PAP가 발견되었으나, 유방암종(breast carcinoma)에서는 PAP가 전혀 관찰되지 않았고, 결장암종(colon carcino-ma) 에서는 전체 시료 중 \( 40 \% \) 의 시료에서만 PAP가 관찰되었으며 그 PAP 수준도 정상 전립선 혹은 전립선암종(prostate carcinoma)에서보다 낮은 수준임이 확인되었다. 이상의 결과들은 PAP 발현이 전립선에서 특이적으로 높음을 말해주며, 또 PAP 발현 정도가 조직의 암 발생과 역의 상관관계가 있음을 보여준다.</p><h2>PAP 유전자의 발현 조절</h2><p>PAP 유전자 발현조절에 관여하는 인자들에는 androgen, androgen repector, \( \mathrm{NF}-\kappa \mathrm{B}, \mathrm{TNF}-\mathrm{a}, \mathrm{IL}-1 \) 등이 알려져 있다. Human prostatic carcinoma에서 PAP의 promoter 분석을 통해 ATG 코돈의 \( 56 \mathrm{bp} \) 와 \( 91\mathrm{bp} \) upstream에 두 개의 major transcription initiation site가 존재함이 확인되었다. 또한 promoter region을 chloramphenicol acetyl transferase (CAT) reporter 유전자로 분석한 연구에서는 -1258에서 -779 사이의 element가 PAP의 세포유형 특이적 발현을 가능케 하는 부분이라는 것이 밝혀졌다. 또한, PAP 조절부위에서 전사인자 결합부위 염기서열인 GAAATATGATA element가 여섯 번 발견되는데 (-588 /-558,-267 /-237,-160/-130,+211 /+241, +239 /+269,+1136 /+1164) , 이 중 두 부위 (-160 /-130, +239 /+269)는 조직 특이적 발현에 관여함을 electrophoretic mobility shift assay를 통해 확인하였다 . Androgen은 androgen receptor (AR)에 직접적으로 결합하여 전립선의 발달과 기능에 중요한 영향을 미치게 되는데, PAP 의 조절부위에서 androgen-AR complex가 작용하는 androgen response element (ARE)가 총 세 번 발견된다 (-151 /-140,+218 /+229, +244 /+255). ARE에 androgen-AP complex가 homodimer를 이루어 ARE에 직접 결합하는데, 이 세부분 중 -151/-140 부분은 androgen level이 정상일 때 hPAP의 transcription을 활성화시키지만, +218 /+229,+244 /+255 부분은 androgen level이 낮을 때 hPAP의 transcription을 억제하는 기능을 한다. 이러한 사실들은 hPAP의 발현 시 androgen이 중요하게 관여함을 보여준다. 한편 TNF-a와 IL-1 등이 \( \mathrm{NF}-\kappa \mathrm{B}\)를 통해 PAP promoter의 활성을 증가시킴이 보고되었는데, deletion analysis를 통하여 -1356/-779 \( 577 \mathrm{bp} \) 가 cisactive enhancer region임을 확인하였고, 향후 연구결과로 \( \mathrm{NF}-\kappa \mathrm{B}\) 가 PAP promoter 영역 -1254/-1249의 AGGTGT motif에 결합하여 작용함으로써 전립선 암 세포주 특이적인 PAP 발현을 증가시킴이 확인되었다. 이 외에도 PAP의 promoter region에 조직 특이적 발현을 조절하는 element들이 상당수 존재할 것으로 예상되는 바, PAP의 발현 조절에 관한 연구는 PAP의 기능을 연구하는데 많은 도움을 줄 것으로 기대된다.</p> <h1>결과</h1><p>1935 년 전립선에서 처음으로 동정된 이후, PAP는 전립선암의 표지자로서 꾸준히 각광받아왔다. PAP는 PSA와 같은 다른 표지자들보다 더 높은 상관관계로 전립선 암의 예후를 더 잘 예측할 수 있고, 전립선 암의 형태학적 특징과도 잘 부합하기 때문에 전립선 암의 표지자로서의 잠재력이 크다고 할 수 있다. 또한, PAP는 phosphotyrosine phosphatase로서 작용하여 ErbB-2의 탈 인산화를 유도하고 ERK1/2와 MAPK의 비활성화를 유도하여 세포 성장 신호를 억제할 수 있는데, 아직 cellular PAP 발현 감소의 원인이 밝혀지지 않은 바, 이의 원인 규명이 전립선 암의 발생과정에 대한 이해를 도울 수 있을 것이다. 한편, PAP가 전립선 암에서 과 발현되는 특성에 착안한 DNA vaccine이 현재 개발 중이고, 면역치료방법이 상용화되는 등 PAP의 중요성에 부각한 연구들이 진행되고 있는데, 무엇보다 전립선 암이 발생 후 어떤 형태의 PAP 발현이 조절되어 전체 PAP가 증가하는지에 대한 원인이 밝혀져야 한다. 즉, 여겨 형태의 PAP 발현 조절의 원인 규명이 절실하고, 이런 암과 관련된 기능 외에 PAP가 전립선세포 성장과 관련된 다른 단백질들과 어떤 상호작용을 하는가에 대한 연구들을 통해 전립선 암의 예방과 치료, 그리고, 기능이 밝혀지지 않은 다른 phosphatase의 연구에도 많은 도움을 줄 수 있을 것이다.</p> <h2>PAP의 효소 활성</h2><p>PAP의 탈 인산화 과정은 기존에 알려진 fructose-2,6-bi-sphosphatase의 탈 인산화 과정과 비슷하다. Zhang 등의 연구를 통하여 PAP의 active site는 His12와 Asp258임이 밝혀졌는데, H12D 또는 D258A mutant에서는 ErbB-2의 phospho-tyrosine level이 감소하지 않음이 확인되었다. PAP의 탈 인산화 과정은 His12 잔기가 nucleophile로 작용하여 기질의 phosphate를 받아들여 phosphohistidine intermediate를 형성하여 시작한다. 이후 Asp258가 general acid로 작용하여 기질을 가수분해시키고 기질의 탈 인산화를 유발한다. 또한 His12 뿐만이 아니라 His257, Asp258, Arg11, Arg15, Arg54, Arg79 등이 중요한 잔기임을 site-directed mutagenesis를 통하여 확인하였으며 이들은 서로 다른 종들간에 잘 보존되어 있다. 이 잔기들 중 His257은 에너지 장벽을 낮추어 주는 역할을 하고, Asp258이 proton donor로서의 역할을 한다는 모델이 제시되었다. 이와 같이 PAP의 catalytic activesite와 탈 인산화의 모델에 대해 알려졌는데, 현재까지 PAP의 기질로는 AMP, ErbB-2 phosphotyrosine, phosphocholine, phosphocreatine 정도가 밝혀져 있다. PAP의 조직 특이적 발현 특성과 protein tyrosine phosphatase의 가능성을 볼 때, 아직 밝혀지지 않은 PAP의 기질들이 많이 존재할 것으로 추정된다. 이러한 PAP의 기질들을 밝혀내면, 아직 이해되지 않는 신호전달과정들이 정립되거나 새로운 신호전달 경로들이 발견될 수 있을 것이다. 이런 노력들을 통해 PAP가 전립선 암의 발생과 진행에 어떤 영향을 주는지를 구체적으로 이해할 수 있을 것이며, 더 나아가 전립선 암의 진단 및 치료와 예방에 큰 도움을 줄 것으로 기대된다.</p><h2>전립선 암에서의 PAP의 기능</h2><p>PAP는 전립선 세포의 성장을 조절할 수 있는 것으로 알려졌는데, 그 정확한 기작은 아직 밝혀지지 않았다. 전립선 암의 초기 발생과정에서 PAP 발현의 억제는 human ErbB-2 receptor (HER-2)의 tyrosine의 hyperphosphorylation을 유발하여 하부의 ERK와 MAPK signaling이 활성화되고 세포 성장이 촉진되는 결과를 가져온다. 이와는 다른 기작으로, \( \mathrm{HER}-2 \) 가 활성화됨에 따라 \( \mathrm{PI} 3 \mathrm{~K} \) 가 활성화 되는데, 이는 PI를 인산화시키고 Akt pathway의 활성화로 이어진다. 결국 ERK1/2와 Akt 모두 androgen이 존재하지 않는 상황에서도 androgen receptor의 인산화를 유발하여 세포 성장을 촉진시킬 수 있게 된다. 이 과정에서 PAP는 PI의 인산화를 막아 세포 성장을 억제하는 역할을 담당할 수 있다. 이들을 종합해 볼 때, PAP의 발현이 전립선 암 진행과 역의 상관관계를 가짐을 예측할 수 있다. 즉 전립선 암의 진행 정도가 심할수록 더 낮은 수준으로 PAP가 발현되게 되고[38], 낮은 PAP의 발현은 악성종양 생성의 위험이 높다는 것을 암시한다. 이러한 이유 때문에 PAP도 tumor suppressor의 한 종류로 간주되기도 한다. 한편 immunohistochemical staining시 높은 Gleason score의 전립선 암에서 PAP의 강력한 발현이 감소하는 대신 secretory form의 PAP가 증가하여 분열하는 세포들의 세포막으로 결합하게 되고 이를 통해 PAP가 phos-phatase 기능을 수행하는데 이것이 proliferative prostatic disease에서 중요한 역할을 담당하는 것이다. 또한, PAP는 active site가 세포 밖으로 노출되어 있는 막관통단백질 형태로도 존재하는 바, tumorigenesis동안에 아직 알려지지 않은 기작으로 인하여 막관통단백질 형태의 PAP 발현이 늘어났을 가능성도 있다.</p> <h2>전립선 암 표지자로서의 PAP</h2><p>전립선 암이 진행될수록 sercetory PAP의 발현이 증가하므로 PAP는 전립선 암의 표지자로 널리 사용될 수 있다. 그러나, 최근 prostate-specific antigen (PSA)이 PAP보다 전립선 암 detection에 sensitive하다는 근거를 바탕으로 PAP를 대신하여 전립선 암의 표지자로 많이 연구되고 있다. 하지만, PAP의 농도가 PSA보다 전립선 암의 형태학적 특징과 상관관계가 더 크고, 193명의 환자를 대상으로 조사한 cause-spe-cific survival (CSS)은 PAP의 농도가 \( 1.5 \mathrm{U} / 1 \) 이하, \( 1.5 \sim 2.4 \) \( \mathrm{U} / 1,2.5 \mathrm{U} / 1 \) 이상에서 각각 \( 93 \%, 87 \%, 75 \% \) 를 보인 반면 \( (p=0.013)\), PSA 의 농도가 \( 10 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}, 10 \sim 20 \mathrm{ng} / \mathrm{ml}, 20 \mathrm{ng} / \mathrm{ml} \) 이상일 때 \( 92 \%, 76 \%, 83 \% \) 를 보였다 \( (p=0.393) \). 이를 볼 때, PAP가 PSA보다 높은 상관관계를 지니고 있어 CSS의 지표로 활용될 수 있음이 확인되었다. 따라서, PAP가 전립선 암의 지표로서 갖는 유용성과 중요성에 대한 새로운 시각과 후속 연구가 필요해졌고, 이런 노력들의 일환으로 2011년도에 면역치료(immunotherapy) 방법인 PROVENGE (Sipuleucel-T)가 임상시험을 마치고 FDA제품화 승인을 받아 시판 중이다. 이는 전립선 암 세포의 \( 95 \% \) 이상이 PAP를 발현하고 있는 것에 착안하여, 환자로부터 antigen presenting cell (APC)을 추출해내고, 이를 PAP와 GM-CSF에 노출시켜 활성화 시키는 protocol이다. 이렇게 활성화된 APC를 다시 환자에게 주입하여 생체내 T-cell의 활성화를 유도하면, 활성화된 T-cell이 전립선 암세포를 공격하여 전립선 암을 치료하게 되는 전략이다. 한편, PAP를 발현하는 DNA vaccine도 전립선 암의 예방 및 치료를 목표로 임상시험 중에 있다. 이는 임상시험 결과 22 명의 환자 중 10 명의 환자에게서 antigen-specific T-cell 증식 (proliferation)과 \( \mathrm{CD8}^{+} \mathrm{INF}_{\gamma} \) 의 증가를 확인하여, 이 DNA vaccine이 전립선 암의 예방 및 치료 효과를 보일 것으로 기대하고 있다. 이상과 같이 전립선 암과 PAP의 상관관계와 PAP 기능에 관한 기초연구가 활발히 진행되어 PAP에 대한 심층적 이해가 가능해지면, 전립선 암 세포 특이적으로 발현되는 PAP의 특성을 이용하여 보다 나은 전립선 암 치료제나 백신이 가능할 것으로 기대된다.</p><h2>Prostatic acid phosphatase의 다른 기능들</h2><p>정상적인 전립선 세포에서는 PAP가 human EGF re-ceptor-2 (HER-2)의 phosphotyrosine 잔기를 dephosphorylation시켜 downstream인 ERK와 MAPK의 신호전달을 억제하고 이는 세포 성장과 tumorigenicity의 억제로 이어지게 된다. 이런 PAP의 잘 알려진 기능 외에도 PAP가 정액에 풍부하게 존재하여 수정 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 예측되고 있다. 한 연구에서는 365 명의 정액 시료를 분석한 결과, PAP의 농도가 높을수록 정자의 농도가 낮아짐을 발견 하였고, 이 PAP 농도와 정자부족증의 높은 상관관계를 바탕으로 PAP가 정자부족증의 표지자로 사용되어지기도 한다. 하지만, PAP가 정자부족증을 유발하는 분자적 기작에 대해서는 자세히 밝혀지지 않았다. 또한 prostate cDNA li-brary를 대상으로 한 yeast two-hybrid screening을 통해 sex hormone-binding globulin과 PAP가 직접적으로 결합한다는 사실을 밝혔지만, 역시 그 의미에 관해서는 구체적으로 알려진 바가 없다. 또, PAP의 세가지 형태 중 secretory PAP와 transmembrane PAP는 ectonucleotidase로 작용하여 AMP를 분해하여 extracellular adenosine을 만들고, 이 adenosine은 nociceptive neuron의 A1R을 활성화시켜 만성 통증의 감소를 가져오기도 한다. 이렇듯 PAP는 전립선 암뿐만 아니라 여러 다른 기능들을 담당할 수 있는 바, PAP 를 제대로 이해하기 위해서는 그 기능과 생체 내 역할에 대한 보다 체계적인 접근이 필요할 것이다.</p> <h1>초록 : Prostatic acid phosphatase의 전립선 암에서의 역할</h1><p>Prostatic acid phosphatase (PAP)는 전립선 암의 진단에 널리 사용되는 표지자로서 1935년 처음으로 동정되었고 인체 전립선에 가장 많이 존재하는 탈 인산화효소이다. PAP는 prostate epithelial cells에서 합성되는 전립선 특이적인 효소로서, 산성 환경에서 효소활성을 띠는 acid phosphatase 그룹에 속한다. PAP는 전립선액에 풍부히 존재하여 수정, 정자부족증, 만성통증의 감소에 관여한다. 그러나 가장 눈에 띄는 기능은 ERK1/2와 MAPK 경로에 관계된 HER-2와 PI3P의 탈 인산화를 유도하여 세포 성장 신호를 억제하고 전립선 암의 억제자로 작용하는 것이다. 최근 PAP DNA 백신을 이용하는 임상시험이 현재 진행 중이고, PAP를 이용한 immunotherapy를 통해 전립선 암을 치료하는 방법이 FDA의 승인을 받아 시행되고 있다. 이러한 PAP의 임상적 중요성에도 불구하고 현재까지 PAP의 분자적 조절기작에 대한 이해는 제한적이라 PAP에 대한 많은 연구가 필요한 실정이다. PAP는 \( \mathrm{NF}-\kappa \mathrm{B}, \mathrm{TNF}-a \), IL-1 및 androgen과 androgen receptor에 의하여 promoter region이 조절된다고 알려졌다. 본 총 설에서는 현재까지 밝혀진 PAP 유전자 및 단백질의 특징들과 더불어 전립선 암에서의 PAP의 기능, 발현 조절,역할들을 종합하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>Phosphatase의 중요성</h2><p>단백질의 인산화/탈 인산화 과정은 대사과정, 세포주기, DNA 복제, 전사, 번역, 신호전달 등 무수히 많은 세포 과정들 을 조절하는 중요한 기작이다. 탈 인산화에 관여하는 효소인 phosphatase는 크게 non-specific phosphatase와 protein phosphatase 그룹으로 나는데, non-specific phosphatase는 효소의 적정 환경에 따라서 alkaline phosphatase와 acid phosphatase로, 기질의 종류에 따라 tyrosine-specific phosphatase, serine/threonine-specific phosphatase, dual specificity phosphatase, lipid phosphatase 등으로 나뉜다. 정상적인 세포에서는 phosphatase와 kinase가 서로 길항적으로 작용하여 인산화/탈 인산화가 평형상태를 이루고 있는데, 이 평형상태가 파괴되면 다양한 질병으로 이어질 수 있다. 특히, 암의 발생과 진행에 있어서 hyperphosphorylation의 중요성이 강조되어온 바, 비정상적으로 인산화를 유도하는 kinase에 관한 연구가 그동안 활발히 이루어져 왔다. 그러나, 최근 암화 과정에서 kinase의 반대 역할을 담당하는 phosphatase도 중요한 역할을 담당할 수 있음이 부각되고 있어 이에 대한 연구들이 점차 많이 진행될 것으로 예상된다.</p><h2>Prostatic acid phosphatase 유전자와 단백질의 구조</h2><p>Human prostatic acid phosphatase (PAP)는 선딥샘의 상피 세포(epithelial cells)에서 합성되어 전립선액으로 분비되는 glycoprotein이다. PAP는 1935년에 전립선에서 처음으로 밝혀져, 지난 수십 년간 관련 연구가 진행되어 왔지만 아직 명확한 생리적 기능은 밝혀지지 않은 효소이다. Human PAP 유전자는 3q21~23에 위치하고 있으며, cDNA는 354 개의 아미노산을 지정한다. PAP는 32개의 잔기로 이루어진 signal peptide를 N-terminal에 갖는 41 kDa의 단백질이며, 산성 환경에서 탈 인산화 활성을 갖는 효소이다. 처음에는 10 개의 exon을 가지는 세포 내 단백질(cellular PAP)로 알려졌지만, secretory PAP도 발견되었고, 최근에는 상대적으로 3'-UTR이 짧고 alternative splicing에 의하여 추가적으로 exon 11을 갖는 새로운 형태의 PAP도 발견되었다. Secretory PAP와 cellular PAP는 exon 10b를 포함한 동일한 구조를 가지고, transmembrane PAP는 exon 10a, 11 등을 갖는 막단백질 형태임이 최근 밝혀졌다.</p><p>PAP는 두 개의 catalytically inactive subunit들이 비공유결합(non-covalent bond)을 이루며 homodimer를 형성하여 활성화 된다. Monomer PAP에는 총 여섯 개의 cysteine이 존재하는데, 이 여섯 개의 cysteine은 모든 포유류에서 잘 보존되어 있으며, Cys129-Cys340, Cys183-Cys281, Cys315-Cys319 에서와 같이 이황화결합(disulfide bond)을 형성하고 있다. PAP에는 세 개의 putative N-linked glycosylation sites가 존재하는데, 이중 Asn62와 Asn301에는 high man-nose-type carbohydrate가 붙고, Asn188은 부분적으로 sialylation이 됨이 밝혀졌다. 또한 site-directed muta- genesis연구를 통하여 PAP의 효소활성에는 Histidine(H12, H257), Aspartate (D258), 그리고 Arginine (R11, R15, R54, R79) 잔기들이 중요함이 밝혀졌다.</p> <h1>서 론</h1><p>Phosphatase는 kinase와 함께 단백질의 인산화/탈 인산화를 균형적으로 조절하여 다양한 cellular process에 관여한다. 이러한 인산화/탈 인산화 과정은 signal transduction과정에서 중요한 역할을 담당하게 되는데, 비정상적인 kinase에 의한 hyperphosphorylation은 tumorigenesis 과정 동안 세포 성장 신호를 지속적으로 유지시키는 역할을 하게 된다. 한편 비정상적인 phosphatase는 단백질의 탈 인산화를 저해하여 세포 성장신호의 억제를 불가능하게 하는 결과를 가져온다. 현재까지 kinase에 의한 단백질의 hyperphosphorylation으로 발생하는 암에 관한 연구는 많이 진행되어 왔지만, phosphatase에 의한 세포 성장신호의 억제를 통한 암의 치료에 관해서는 많이 연구가 진행되어 있지 않다.</p><p>Prostatic acid phosphatase (PAP)는 1935년 전립선에서 처음 발견되었는데, Table 1에서 보듯이 secretory form, transmembrane form, 그리고 cellular form의 세가지 형태가 존재한다. 전립선 암의 진행 정도에 비례하여 secretory PAP의 발현이 증가하고 이 secretory PAP가 분열하는 세포막에서 탈 인산화 작용을 한다는 사실이 알려졌다 . PAP는 PSA와 같은 다른 전립선 암 표지자들보다 형태학적 특징과 높은 상관관계를 지니고 있기 때문에, 이를 바탕으로 PAP는 과거 수십년간 전립선 암의 표지자(marker)로서 혈청검사와 조직검사에 널리 사용되어 왔다. 이런 표지자로서의 기능과는 다른 측면으로 전립선이 암이 되는 과정에서 cellular PAP 발현의 감소로 인해 탈 인산화가 제대로 일어나지않아 세포 성장 신호가 지속적으로 유지되는 현상도 밝혀졌다. 즉, cellular PAP 발현의 감소가 전립선 암 발생 원인중의 하나가 되고, 이 경우 PAP는 tumor supressor의 역할을 하는 것으로 추정된다. PAP의 전립선 특이적 발현의 조절 기작 관련해서도 PAP promoter 부위에서의cisacting element들이 몇몇 보고된 바 있지만, 이들 외에 다른 조절 기작들이 존재할 것으로 여겨지고 있다. 이러한 PAP 발현의 증가 및 감소가 갖는 의미와 전립선에서 여러 형태의 PAP들이 갖는 역할에 대해서는 아직까지 많은 부분들이 알려져 있지 않다. PAP의 탈 인산화 능력은 전립선 세포에서의 신호전달 과정에 중요한 의미를 지니는 바, 이에 본 총설에서는 현재까지 밝혀진 PAP의 유전자 및 단백질의 구조와 기능, PAP 발현의 조절 기작과 전립선 암 발생에 갖는 의미 등을 고찰하였다.</p>	생명과학	[ "<h2>PAP의 발현</h2><p>PAP 는 전립선뿐만이 아니라 뇌, 신장, 간, 폐, 근육, 태반, 침샘, 비장, 갑상선, 흉선 등에서 발현된다.", "이 중 태반과 간에서 발현하는 acid phosphatase는 대부분 lysosome에 위치하기 때문에 lysosomal acid phosphatase (LAP)라고 명명되었고, secretory PAP는 전립선에서만 발현되는 특징이 있는 것으로 알려져 있다.", "PAP의 발현은 나이와도 상관관계가 있는데, 태어날 때는 높은 수준으로 PAP를 발현하다가 생후 6 개월까지 점점 감소하여 발현이 사라지고, 10 세 이후부터 사춘기까지 발현량이 다시 점차 증가하는 양상을 보인다.", "이로 미루어 볼 때 PAP의 발현은 2차 성징을 결정짓는 testosterone과 같은 성 호르몬과 연관되어 있음을 알 수 있다.", "PAP 의 mRNA 양을 quantitative PCR을 이용하여 전립선에서 확인하였을 때는 정상 전립선이나 전립선 암 모두 PAP의 transcript가 상당히 증가되어 있음을 확인하였고, 이는 다른 조직 대비 정상 전립선 조직에서 50 5,000배, 전립선 암 조직에서 110~6,000배 가량 높은 수준임이 확인되었다.", "한편, 면역조직화학법으로 분석하여 보았을 때 정상의 유방조직에서는 PAP가 발견되었으나, 유방암종(breast carcinoma)에서는 PAP가 전혀 관찰되지 않았고, 결장암종(colon carcino-ma) 에서는 전체 시료 중 \\( 40 \\% \\) 의 시료에서만 PAP가 관찰되었으며 그 PAP 수준도 정상 전립선 혹은 전립선암종(prostate carcinoma)에서보다 낮은 수준임이 확인되었다.", "이상의 결과들은 PAP 발현이 전립선에서 특이적으로 높음을 말해주며, 또 PAP 발현 정도가 조직의 암 발생과 역의 상관관계가 있음을 보여준다.", "</p><h2>PAP 유전자의 발현 조절</h2><p>PAP 유전자 발현조절에 관여하는 인자들에는 androgen, androgen repector, \\( \\mathrm{NF}-\\kappa \\mathrm{B}, \\mathrm{TNF}-\\mathrm{a}, \\mathrm{IL}-1 \\) 등이 알려져 있다.", "Human prostatic carcinoma에서 PAP의 promoter 분석을 통해 ATG 코돈의 \\( 56 \\mathrm{bp} \\) 와 \\( 91\\mathrm{bp} \\) upstream에 두 개의 major transcription initiation site가 존재함이 확인되었다.", "또한 promoter region을 chloramphenicol acetyl transferase (CAT) reporter 유전자로 분석한 연구에서는 -1258에서 -779 사이의 element가 PAP의 세포유형 특이적 발현을 가능케 하는 부분이라는 것이 밝혀졌다.", "또한, PAP 조절부위에서 전사인자 결합부위 염기서열인 GAAATATGATA element가 여섯 번 발견되는데 (-588 /-558,-267 /-237,-160/-130,+211 /+241, +239 /+269,+1136 /+1164) , 이 중 두 부위 (-160 /-130, +239 /+269)는 조직 특이적 발현에 관여함을 electrophoretic mobility shift assay를 통해 확인하였다 .", "Androgen은 androgen receptor (AR)에 직접적으로 결합하여 전립선의 발달과 기능에 중요한 영향을 미치게 되는데, PAP 의 조절부위에서 androgen-AR complex가 작용하는 androgen response element (ARE)가 총 세 번 발견된다 (-151 /-140,+218 /+229, +244 /+255).", "ARE에 androgen-AP complex가 homodimer를 이루어 ARE에 직접 결합하는데, 이 세부분 중 -151/-140 부분은 androgen level이 정상일 때 hPAP의 transcription을 활성화시키지만, +218 /+229,+244 /+255 부분은 androgen level이 낮을 때 hPAP의 transcription을 억제하는 기능을 한다.", "이러한 사실들은 hPAP의 발현 시 androgen이 중요하게 관여함을 보여준다.", "한편 TNF-a와 IL-1 등이 \\( \\mathrm{NF}-\\kappa \\mathrm{B}\\)를 통해 PAP promoter의 활성을 증가시킴이 보고되었는데, deletion analysis를 통하여 -1356/-779 \\( 577 \\mathrm{bp} \\) 가 cisactive enhancer region임을 확인하였고, 향후 연구결과로 \\( \\mathrm{NF}-\\kappa \\mathrm{B}\\) 가 PAP promoter 영역 -1254/-1249의 AGGTGT motif에 결합하여 작용함으로써 전립선 암 세포주 특이적인 PAP 발현을 증가시킴이 확인되었다.", "이 외에도 PAP의 promoter region에 조직 특이적 발현을 조절하는 element들이 상당수 존재할 것으로 예상되는 바, PAP의 발현 조절에 관한 연구는 PAP의 기능을 연구하는데 많은 도움을 줄 것으로 기대된다.", "</p> <h1>결과</h1><p>1935 년 전립선에서 처음으로 동정된 이후, PAP는 전립선암의 표지자로서 꾸준히 각광받아왔다.", "PAP는 PSA와 같은 다른 표지자들보다 더 높은 상관관계로 전립선 암의 예후를 더 잘 예측할 수 있고, 전립선 암의 형태학적 특징과도 잘 부합하기 때문에 전립선 암의 표지자로서의 잠재력이 크다고 할 수 있다.", "또한, PAP는 phosphotyrosine phosphatase로서 작용하여 ErbB-2의 탈 인산화를 유도하고 ERK1/2와 MAPK의 비활성화를 유도하여 세포 성장 신호를 억제할 수 있는데, 아직 cellular PAP 발현 감소의 원인이 밝혀지지 않은 바, 이의 원인 규명이 전립선 암의 발생과정에 대한 이해를 도울 수 있을 것이다.", "한편, PAP가 전립선 암에서 과 발현되는 특성에 착안한 DNA vaccine이 현재 개발 중이고, 면역치료방법이 상용화되는 등 PAP의 중요성에 부각한 연구들이 진행되고 있는데, 무엇보다 전립선 암이 발생 후 어떤 형태의 PAP 발현이 조절되어 전체 PAP가 증가하는지에 대한 원인이 밝혀져야 한다.", "즉, 여겨 형태의 PAP 발현 조절의 원인 규명이 절실하고, 이런 암과 관련된 기능 외에 PAP가 전립선세포 성장과 관련된 다른 단백질들과 어떤 상호작용을 하는가에 대한 연구들을 통해 전립선 암의 예방과 치료, 그리고, 기능이 밝혀지지 않은 다른 phosphatase의 연구에도 많은 도움을 줄 수 있을 것이다.", "</p> <h2>PAP의 효소 활성</h2><p>PAP의 탈 인산화 과정은 기존에 알려진 fructose-2,6-bi-sphosphatase의 탈 인산화 과정과 비슷하다.", "Zhang 등의 연구를 통하여 PAP의 active site는 His12와 Asp258임이 밝혀졌는데, H12D 또는 D258A mutant에서는 ErbB-2의 phospho-tyrosine level이 감소하지 않음이 확인되었다.", "PAP의 탈 인산화 과정은 His12 잔기가 nucleophile로 작용하여 기질의 phosphate를 받아들여 phosphohistidine intermediate를 형성하여 시작한다.", "이후 Asp258가 general acid로 작용하여 기질을 가수분해시키고 기질의 탈 인산화를 유발한다.", "또한 His12 뿐만이 아니라 His257, Asp258, Arg11, Arg15, Arg54, Arg79 등이 중요한 잔기임을 site-directed mutagenesis를 통하여 확인하였으며 이들은 서로 다른 종들간에 잘 보존되어 있다.", "이 잔기들 중 His257은 에너지 장벽을 낮추어 주는 역할을 하고, Asp258이 proton donor로서의 역할을 한다는 모델이 제시되었다.", "이와 같이 PAP의 catalytic activesite와 탈 인산화의 모델에 대해 알려졌는데, 현재까지 PAP의 기질로는 AMP, ErbB-2 phosphotyrosine, phosphocholine, phosphocreatine 정도가 밝혀져 있다.", "PAP의 조직 특이적 발현 특성과 protein tyrosine phosphatase의 가능성을 볼 때, 아직 밝혀지지 않은 PAP의 기질들이 많이 존재할 것으로 추정된다.", "이러한 PAP의 기질들을 밝혀내면, 아직 이해되지 않는 신호전달과정들이 정립되거나 새로운 신호전달 경로들이 발견될 수 있을 것이다.", "이런 노력들을 통해 PAP가 전립선 암의 발생과 진행에 어떤 영향을 주는지를 구체적으로 이해할 수 있을 것이며, 더 나아가 전립선 암의 진단 및 치료와 예방에 큰 도움을 줄 것으로 기대된다.", "</p><h2>전립선 암에서의 PAP의 기능</h2><p>PAP는 전립선 세포의 성장을 조절할 수 있는 것으로 알려졌는데, 그 정확한 기작은 아직 밝혀지지 않았다.", "전립선 암의 초기 발생과정에서 PAP 발현의 억제는 human ErbB-2 receptor (HER-2)의 tyrosine의 hyperphosphorylation을 유발하여 하부의 ERK와 MAPK signaling이 활성화되고 세포 성장이 촉진되는 결과를 가져온다.", "이와는 다른 기작으로, \\( \\mathrm{HER}-2 \\) 가 활성화됨에 따라 \\( \\mathrm{PI} 3 \\mathrm{~K} \\) 가 활성화 되는데, 이는 PI를 인산화시키고 Akt pathway의 활성화로 이어진다.", "결국 ERK1/2와 Akt 모두 androgen이 존재하지 않는 상황에서도 androgen receptor의 인산화를 유발하여 세포 성장을 촉진시킬 수 있게 된다.", "이 과정에서 PAP는 PI의 인산화를 막아 세포 성장을 억제하는 역할을 담당할 수 있다.", "이들을 종합해 볼 때, PAP의 발현이 전립선 암 진행과 역의 상관관계를 가짐을 예측할 수 있다.", "즉 전립선 암의 진행 정도가 심할수록 더 낮은 수준으로 PAP가 발현되게 되고[38], 낮은 PAP의 발현은 악성종양 생성의 위험이 높다는 것을 암시한다.", "이러한 이유 때문에 PAP도 tumor suppressor의 한 종류로 간주되기도 한다.", "한편 immunohistochemical staining시 높은 Gleason score의 전립선 암에서 PAP의 강력한 발현이 감소하는 대신 secretory form의 PAP가 증가하여 분열하는 세포들의 세포막으로 결합하게 되고 이를 통해 PAP가 phos-phatase 기능을 수행하는데 이것이 proliferative prostatic disease에서 중요한 역할을 담당하는 것이다.", "또한, PAP는 active site가 세포 밖으로 노출되어 있는 막관통단백질 형태로도 존재하는 바, tumorigenesis동안에 아직 알려지지 않은 기작으로 인하여 막관통단백질 형태의 PAP 발현이 늘어났을 가능성도 있다.", "</p> <h2>전립선 암 표지자로서의 PAP</h2><p>전립선 암이 진행될수록 sercetory PAP의 발현이 증가하므로 PAP는 전립선 암의 표지자로 널리 사용될 수 있다.", "그러나, 최근 prostate-specific antigen (PSA)이 PAP보다 전립선 암 detection에 sensitive하다는 근거를 바탕으로 PAP를 대신하여 전립선 암의 표지자로 많이 연구되고 있다.", "하지만, PAP의 농도가 PSA보다 전립선 암의 형태학적 특징과 상관관계가 더 크고, 193명의 환자를 대상으로 조사한 cause-spe-cific survival (CSS)은 PAP의 농도가 \\( 1.5 \\mathrm{U} / 1 \\) 이하, \\( 1.5 \\sim 2.4 \\) \\( \\mathrm{U} / 1,2.5 \\mathrm{U} / 1 \\) 이상에서 각각 \\( 93 \\%, 87 \\%, 75 \\% \\) 를 보인 반면 \\( (p=0.013)\\), PSA 의 농도가 \\( 10 \\mathrm{ng} / \\mathrm{ml}, 10 \\sim 20 \\mathrm{ng} / \\mathrm{ml}, 20 \\mathrm{ng} / \\mathrm{ml} \\) 이상일 때 \\( 92 \\%, 76 \\%, 83 \\% \\) 를 보였다 \\", "( (p=0.393) \\).", "이를 볼 때, PAP가 PSA보다 높은 상관관계를 지니고 있어 CSS의 지표로 활용될 수 있음이 확인되었다.", "따라서, PAP가 전립선 암의 지표로서 갖는 유용성과 중요성에 대한 새로운 시각과 후속 연구가 필요해졌고, 이런 노력들의 일환으로 2011년도에 면역치료(immunotherapy) 방법인 PROVENGE (Sipuleucel-T)가 임상시험을 마치고 FDA제품화 승인을 받아 시판 중이다.", "이는 전립선 암 세포의 \\( 95 \\% \\) 이상이 PAP를 발현하고 있는 것에 착안하여, 환자로부터 antigen presenting cell (APC)을 추출해내고, 이를 PAP와 GM-CSF에 노출시켜 활성화 시키는 protocol이다.", "이렇게 활성화된 APC를 다시 환자에게 주입하여 생체내 T-cell의 활성화를 유도하면, 활성화된 T-cell이 전립선 암세포를 공격하여 전립선 암을 치료하게 되는 전략이다.", "한편, PAP를 발현하는 DNA vaccine도 전립선 암의 예방 및 치료를 목표로 임상시험 중에 있다.", "이는 임상시험 결과 22 명의 환자 중 10 명의 환자에게서 antigen-specific T-cell 증식 (proliferation)과 \\( \\mathrm{CD8}^{+} \\mathrm{INF}_{\\gamma} \\) 의 증가를 확인하여, 이 DNA vaccine이 전립선 암의 예방 및 치료 효과를 보일 것으로 기대하고 있다.", "이상과 같이 전립선 암과 PAP의 상관관계와 PAP 기능에 관한 기초연구가 활발히 진행되어 PAP에 대한 심층적 이해가 가능해지면, 전립선 암 세포 특이적으로 발현되는 PAP의 특성을 이용하여 보다 나은 전립선 암 치료제나 백신이 가능할 것으로 기대된다.", "</p><h2>Prostatic acid phosphatase의 다른 기능들</h2><p>정상적인 전립선 세포에서는 PAP가 human EGF re-ceptor-2 (HER-2)의 phosphotyrosine 잔기를 dephosphorylation시켜 downstream인 ERK와 MAPK의 신호전달을 억제하고 이는 세포 성장과 tumorigenicity의 억제로 이어지게 된다.", "이런 PAP의 잘 알려진 기능 외에도 PAP가 정액에 풍부하게 존재하여 수정 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 예측되고 있다.", "한 연구에서는 365 명의 정액 시료를 분석한 결과, PAP의 농도가 높을수록 정자의 농도가 낮아짐을 발견 하였고, 이 PAP 농도와 정자부족증의 높은 상관관계를 바탕으로 PAP가 정자부족증의 표지자로 사용되어지기도 한다.", "하지만, PAP가 정자부족증을 유발하는 분자적 기작에 대해서는 자세히 밝혀지지 않았다.", "또한 prostate cDNA li-brary를 대상으로 한 yeast two-hybrid screening을 통해 sex hormone-binding globulin과 PAP가 직접적으로 결합한다는 사실을 밝혔지만, 역시 그 의미에 관해서는 구체적으로 알려진 바가 없다.", "또, PAP의 세가지 형태 중 secretory PAP와 transmembrane PAP는 ectonucleotidase로 작용하여 AMP를 분해하여 extracellular adenosine을 만들고, 이 adenosine은 nociceptive neuron의 A1R을 활성화시켜 만성 통증의 감소를 가져오기도 한다.", "이렇듯 PAP는 전립선 암뿐만 아니라 여러 다른 기능들을 담당할 수 있는 바, PAP 를 제대로 이해하기 위해서는 그 기능과 생체 내 역할에 대한 보다 체계적인 접근이 필요할 것이다.", "</p> <h1>초록 : Prostatic acid phosphatase의 전립선 암에서의 역할</h1><p>Prostatic acid phosphatase (PAP)는 전립선 암의 진단에 널리 사용되는 표지자로서 1935년 처음으로 동정되었고 인체 전립선에 가장 많이 존재하는 탈 인산화효소이다.", "PAP는 prostate epithelial cells에서 합성되는 전립선 특이적인 효소로서, 산성 환경에서 효소활성을 띠는 acid phosphatase 그룹에 속한다.", "PAP는 전립선액에 풍부히 존재하여 수정, 정자부족증, 만성통증의 감소에 관여한다.", "그러나 가장 눈에 띄는 기능은 ERK1/2와 MAPK 경로에 관계된 HER-2와 PI3P의 탈 인산화를 유도하여 세포 성장 신호를 억제하고 전립선 암의 억제자로 작용하는 것이다.", "최근 PAP DNA 백신을 이용하는 임상시험이 현재 진행 중이고, PAP를 이용한 immunotherapy를 통해 전립선 암을 치료하는 방법이 FDA의 승인을 받아 시행되고 있다.", "이러한 PAP의 임상적 중요성에도 불구하고 현재까지 PAP의 분자적 조절기작에 대한 이해는 제한적이라 PAP에 대한 많은 연구가 필요한 실정이다.", "PAP는 \\( \\mathrm{NF}-\\kappa \\mathrm{B}, \\mathrm{TNF}-a \\), IL-1 및 androgen과 androgen receptor에 의하여 promoter region이 조절된다고 알려졌다.", "본 총 설에서는 현재까지 밝혀진 PAP 유전자 및 단백질의 특징들과 더불어 전립선 암에서의 PAP의 기능, 발현 조절,역할들을 종합하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>Phosphatase의 중요성</h2><p>단백질의 인산화/탈 인산화 과정은 대사과정, 세포주기, DNA 복제, 전사, 번역, 신호전달 등 무수히 많은 세포 과정들 을 조절하는 중요한 기작이다.", "탈 인산화에 관여하는 효소인 phosphatase는 크게 non-specific phosphatase와 protein phosphatase 그룹으로 나는데, non-specific phosphatase는 효소의 적정 환경에 따라서 alkaline phosphatase와 acid phosphatase로, 기질의 종류에 따라 tyrosine-specific phosphatase, serine/threonine-specific phosphatase, dual specificity phosphatase, lipid phosphatase 등으로 나뉜다.", "정상적인 세포에서는 phosphatase와 kinase가 서로 길항적으로 작용하여 인산화/탈 인산화가 평형상태를 이루고 있는데, 이 평형상태가 파괴되면 다양한 질병으로 이어질 수 있다.", "특히, 암의 발생과 진행에 있어서 hyperphosphorylation의 중요성이 강조되어온 바, 비정상적으로 인산화를 유도하는 kinase에 관한 연구가 그동안 활발히 이루어져 왔다.", "그러나, 최근 암화 과정에서 kinase의 반대 역할을 담당하는 phosphatase도 중요한 역할을 담당할 수 있음이 부각되고 있어 이에 대한 연구들이 점차 많이 진행될 것으로 예상된다.", "</p><h2>Prostatic acid phosphatase 유전자와 단백질의 구조</h2><p>Human prostatic acid phosphatase (PAP)는 선딥샘의 상피 세포(epithelial cells)에서 합성되어 전립선액으로 분비되는 glycoprotein이다.", "PAP는 1935년에 전립선에서 처음으로 밝혀져, 지난 수십 년간 관련 연구가 진행되어 왔지만 아직 명확한 생리적 기능은 밝혀지지 않은 효소이다.", "Human PAP 유전자는 3q21~23에 위치하고 있으며, cDNA는 354 개의 아미노산을 지정한다.", "PAP는 32개의 잔기로 이루어진 signal peptide를 N-terminal에 갖는 41 kDa의 단백질이며, 산성 환경에서 탈 인산화 활성을 갖는 효소이다.", "처음에는 10 개의 exon을 가지는 세포 내 단백질(cellular PAP)로 알려졌지만, secretory PAP도 발견되었고, 최근에는 상대적으로 3'-UTR이 짧고 alternative splicing에 의하여 추가적으로 exon 11을 갖는 새로운 형태의 PAP도 발견되었다.", "Secretory PAP와 cellular PAP는 exon 10b를 포함한 동일한 구조를 가지고, transmembrane PAP는 exon 10a, 11 등을 갖는 막단백질 형태임이 최근 밝혀졌다.", "</p><p>PAP는 두 개의 catalytically inactive subunit들이 비공유결합(non-covalent bond)을 이루며 homodimer를 형성하여 활성화 된다.", "Monomer PAP에는 총 여섯 개의 cysteine이 존재하는데, 이 여섯 개의 cysteine은 모든 포유류에서 잘 보존되어 있으며, Cys129-Cys340, Cys183-Cys281, Cys315-Cys319 에서와 같이 이황화결합(disulfide bond)을 형성하고 있다.", "PAP에는 세 개의 putative N-linked glycosylation sites가 존재하는데, 이중 Asn62와 Asn301에는 high man-nose-type carbohydrate가 붙고, Asn188은 부분적으로 sialylation이 됨이 밝혀졌다.", "또한 site-directed muta- genesis연구를 통하여 PAP의 효소활성에는 Histidine(H12, H257), Aspartate (D258), 그리고 Arginine (R11, R15, R54, R79) 잔기들이 중요함이 밝혀졌다.", "</p> <h1>서 론</h1><p>Phosphatase는 kinase와 함께 단백질의 인산화/탈 인산화를 균형적으로 조절하여 다양한 cellular process에 관여한다.", "이러한 인산화/탈 인산화 과정은 signal transduction과정에서 중요한 역할을 담당하게 되는데, 비정상적인 kinase에 의한 hyperphosphorylation은 tumorigenesis 과정 동안 세포 성장 신호를 지속적으로 유지시키는 역할을 하게 된다.", "한편 비정상적인 phosphatase는 단백질의 탈 인산화를 저해하여 세포 성장신호의 억제를 불가능하게 하는 결과를 가져온다.", "현재까지 kinase에 의한 단백질의 hyperphosphorylation으로 발생하는 암에 관한 연구는 많이 진행되어 왔지만, phosphatase에 의한 세포 성장신호의 억제를 통한 암의 치료에 관해서는 많이 연구가 진행되어 있지 않다.", "</p><p>Prostatic acid phosphatase (PAP)는 1935년 전립선에서 처음 발견되었는데, Table 1에서 보듯이 secretory form, transmembrane form, 그리고 cellular form의 세가지 형태가 존재한다.", "전립선 암의 진행 정도에 비례하여 secretory PAP의 발현이 증가하고 이 secretory PAP가 분열하는 세포막에서 탈 인산화 작용을 한다는 사실이 알려졌다 .", "PAP는 PSA와 같은 다른 전립선 암 표지자들보다 형태학적 특징과 높은 상관관계를 지니고 있기 때문에, 이를 바탕으로 PAP는 과거 수십년간 전립선 암의 표지자(marker)로서 혈청검사와 조직검사에 널리 사용되어 왔다.", "이런 표지자로서의 기능과는 다른 측면으로 전립선이 암이 되는 과정에서 cellular PAP 발현의 감소로 인해 탈 인산화가 제대로 일어나지않아 세포 성장 신호가 지속적으로 유지되는 현상도 밝혀졌다.", "즉, cellular PAP 발현의 감소가 전립선 암 발생 원인중의 하나가 되고, 이 경우 PAP는 tumor supressor의 역할을 하는 것으로 추정된다.", "PAP의 전립선 특이적 발현의 조절 기작 관련해서도 PAP promoter 부위에서의cisacting element들이 몇몇 보고된 바 있지만, 이들 외에 다른 조절 기작들이 존재할 것으로 여겨지고 있다.", "이러한 PAP 발현의 증가 및 감소가 갖는 의미와 전립선에서 여러 형태의 PAP들이 갖는 역할에 대해서는 아직까지 많은 부분들이 알려져 있지 않다.", "PAP의 탈 인산화 능력은 전립선 세포에서의 신호전달 과정에 중요한 의미를 지니는 바, 이에 본 총설에서는 현재까지 밝혀진 PAP의 유전자 및 단백질의 구조와 기능, PAP 발현의 조절 기작과 전립선 암 발생에 갖는 의미 등을 고찰하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "Prostatic acid phosphatase의 전립선 암에서의 역할", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-f6fd236d-d198-423f-a155-2a52036d8993", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2011", "doc_author": [ "공훈영", "이학종", "변종회" ], "doc_publisher": "한국생명과학회", "dataset_info": { "identifier": "02-031-001-NL", "name": "기술과학 문서 기계독해 데이터", "category": "자연어", "last_updated": "2023-05-10" } }
5,439	<h1>서 론</h1><p>현대인은 산소에 의한 산화적 스트레스에 항상 노출이 되어있으며, 이러한 산화적 스트레스는 정상적인 경우 생체내에 존재하는 항산화계에 의해 제거되지만 산업화 이후 계속적으로 증가한 각종 환경오염물질, 흡연, 알콜 및 방사선 등은 인체에 산화적 스트레스를 가중시키고 있다. 산화적 스트레스가 제거되지 못하면 생체막의 손상, 고분자 단백질 및 DNA의 변형과 기능 상실 등으로 인한 다양한 퇴행성 질환이 유발될 수 있으므로 이로 인해 유발되는 건강문제를 해결할 수 있는 물질로서 항산화제에 대한 관심이 집중되고 있다. 또한, 항산화제는 합성항산화제와 천연항산화제로 구분되며 합성 항산화제인 butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), Benzoic acid, poxybenzoic ester는 오랫동안 이용되어 왔으나 다량 섭취 시 유해하다는 논문기록 등에 기인하여 합성 항산화제에 대한 소비자의 거부반응으로 그의 수요가 급격히 감소되고 있는 추세이며, 이를 대체하기 위해 천연물에서 유래된 항산 화 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.</p><p>한의학에서는 국내 자생수종이 한약의 재료로 사용 되어 왔으며, 그 가운데 열매는 널리 이용되고 쉽게 접할 수 있는 재료이다. 또한 국민 생활소득의 향상으로 국민들의 기능성 화장품과 기능성 식품의 수요는 증가하고 있고, 기능성 제품들의 효능 증대를 위하여 천연물들을 사용하여 화장품, 식품, 의약품 산업에 응용되고 있다. 본 연구의 재료인 정금나무 또한 현재 널리 이용되지 않고 있으나 주 자생지인 전라북도, 충청남도 및 경기남부에서는 결실기인 10월 초에 결실량이 풍부하며, 조류에 의한 피해가 거의 발생하지 않고 주민들이 열매를 채취하여 술이나 음료의 재료로 사용되고 있다.</p><p>정금나무(Vaccinium oldhami)는 진달래과에 속하며, 한국의 남부, 충남, 충북, 황해도 등지의 산 중턱, 산등성이에 나는 낙엽관목으로 수고는 \(2-3 \mathrm{m} \) 정도이며, 가지의 굵기 또한 지름 \( 2 \mathrm{~cm} \) 미만이다. 현재까지의 정금나무에 대한 인체 유효성분 분석은 잎과 가지를 원재료로 하는 연구는 진행되어 왔으나, 정금나무의 생장특징과 향후 활용 및 산업화적인 측면에서 검토해 보았을 때 잎 또는 가지를 원재료로 할 경우 영속적인 대량생산과 재료목의 보전이 불가능한 단점이 있다. 반면 열매의 경우, 결실량이 풍부하고 과육이 자주색을 띄고 있어 향후 제품생산 단계에서 별도의 화학색소 첨가가 필요치 않을 것으로 사료되며 생육 특징 또한 기존 교목층 아래에서 생육 또는 재배가 가능하므로, 대단위 면적에서 연중 일정한 수량을 영속적으로 생산할 수 있는 장점이 있다. 그리고 정금나무 열매를 시료로한 성분 분석이나 항산화 활성을 알아보기 위한 연구는 지금까지 사례가 없으므로, 반드시 필요한 연구라고 사료된다. 이에 본 연구에서는 향후 정금나무 열매의 식품, 화장품 및 바이오산업 등으로 응용을 위하여 항산화활성을 검증하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>시료 제조</h2><p>본 연구에 사용된 정금나무의 열매는 2009 년 10 월 12 일에 충청남도 태안군 안면읍 일원에서 채취하였다. 시료에 아세톤과 물을 7:3(volume/volume)의 비율로 넣은 다음 3일 동안 추출한 후 여과하여 회전 농축기로 감압 농축하여 동결 건조 후 사용하였다.</p><h2>총 폴리페놀 함량 측청</h2><p>총 폴리페놀 함량은 phosphomolybdic acid가 페놀성 물질과 반응하여 청색으로 발색되는 것을 이용한 Folin-Denis법 을 통해 측정하였다. 즉, 농도별 시료용액 \( 1,500 \mu \mathrm{l} \) 에 1N-Folin-Ciocalteu phenol reagent 시약을 \(500 \mu \mathrm{l} \)가하고 3분간 반응 후 \( 10 \% \)의 포화 \( \mathrm{Na}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액 \( 500 \mu \mathrm{l} \)를 가하였다. 이 혼합액을 1 시간 반응 후 \( 640 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, tannic acid를 이용하여 표준곡선으로 함량을 구하 였다.</p><h2>전자공여능 측정 (Elctron donating ability)</h2><p>전자공여능은 Blois 방법을 변형한 1.1-diphenyl-2-pic-rylhydrazyl (DPPH) free radical 소거법으로 측정하였다. DPPH 는 자신이 가지고 있는 홀수의 전자 때문에 \( 517 \mathrm{~nm} \)에서 강한 흡수 스펙드럼을 보이나 페놀성 화합물과 같이 수소 전자를 제공해 주는 전자공여체와 반응하게 되면 전자를 제공하는 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 되며 흡수 band도 사라지게 되고 안정한 분자가 된다. 즉 \( 70 \% \) ethanol을 용매로 한 \(10, 50, 100, 500, 1,000 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)의 농도별 시료액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)와 \( 99.9 \% \) ethanol에 용해 한 \( 0.2 \mathrm{mM} \)의 DPPH \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 교반한 후 암소에 30분 반응 후 \( 517 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에 대한 흡광도 감소치를 DPPH 라디칼 소거활성으로 하여 항산화 활성도를 나타내었다. 이때 상대 활성의 비교를 위하여 양성대조군으로 BHA를 사용하였다.</p><h2>Nitic oxide radical 소거능 측정</h2><p>Nitric oxide (NO) radical 소거 실험은 Marcocci 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. \( 20 \mathrm{~mM} \) phosphate buffer \( \mathrm{pH} \) 7.4에 용해시킨 \( 10 \mathrm{mM} \) sodium nitroferricyanide (Ⅲ) dihydrate \( 50 \mu \mathrm{l} \)과 농도별 시료액 \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 150분간 반응시켰다. 이 반응액에 griess reagent \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 15분 후 \( 542 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하여 nitrite 소거활성을 확인하였다.</p><h2>ABTS cation radical 소거능 측정</h2><p>\( \mathrm{ABTS}^{◦+} \)radical을 이용한 항산화력 측정은 \( \mathrm{ABTS}^{◦+} \)Cation Decolorization Assay방법에 의하여 측정하였다. ABTS(2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 7.4\( \mathrm{mM} \)과 potassium persulphate \( 2.6 \mathrm{mM} \)을 12시간 이상 암소에 방치하여 청록색의 \( \mathrm{ABTS}^{◦+} \)radical을 형성 시키며 이 용액은 냉장 보관하였다. radical stock solution은 \( 734 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 몰 흡광계수\( \left(\varepsilon=1.6 \times 10^{4} \mathrm{~mol}^{-1} \mathrm{~cm}^{-1}\right) \)를 이용하여 methanol로 희석하였다. 이 stock solution \(100 \mu \mathrm{l} \)에 시료추출 용액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)을 가한 후 상온에서 1 분 방치하여 \( 734 \mathrm{~nm} \)에서 반응액의 흡광도 변화를 측정하였다.</p><h2>Hydrogen peroxides 소거능 측정</h2><p>Hydrogen peroxide 저해활성은 Jayaprakasha등의 방법에 의해 측정하였다. 농도 별 시료용액 \(1000 \mu \mathrm{l} \)와 phos-phate-buffer saline (PBS at \( \mathrm{pH}~7.4\))에 녹인 \( 40 \mathrm{mM} \) hydro-gen peroxide solution \(2,000 ~\mu \mathrm{l}\) 를 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응시킨 후 반응액 중에 저해된 hydrogen peroxide의 양을 \(230 ~\mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 합성 항산화 물질인 BHA와 활성을 비교해 보았다.</p><h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2><p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 농도별 시료액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)와 \( 500 \mu\mathrm{l}\)의 \( 0.175 \mathrm{M} \) sodium phosphate buffer (\(\mathrm{pH} 6.8\))와 \( 10 \mathrm{mM} \) L-DOPA 녹인 기질액 \( 200 \mu \mathrm{l} \)에 \( 200 \mu \mathrm{l} \)의 mushroom tyrosinase \( (110 \mathrm{U} / \mathrm{ml}) \)을 첨가 후 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2분간 반응시킨 후 생성된 DOPA chrome을 \( 475 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.</p><h2>통계처리</h2><p>실험 결과는 3회 반복 측정 후 평균 \( \pm \mathrm{SD} \)로 나타내었다. 통계분석은 SAS program (SAS Institue, Cary, NC, USA)을 이용하여 분산분석한 후 Duncan의 다중검정을 실시하였으며, 상관관계를 분석하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>총 폴리페놀 함량</h2><p>페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 하나 또는 두 개 이상의 수산기로 치환된 방향족환을 가지고 있다 이들은 phenolic hydroxyl (OH)기를 가지고 있는데, 이것은 분자 내 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질과 같은 거대 분자들과 결합하는 성질이 있기 때문에 항산화 작용과 관련한 생체 free radical 들을 안정된 화합물로 형성하도록 하여 산화 억제 작용을 한다</p><p>총 폴리페놀 함량을 tannic acid를 기준 물질로 하여 정금나무 열매 추출물에 포함되어있는 페놀 함량을 측정한 결과 \( 55.972 \mathrm{mg} \) TAE\( /\mathrm{g} \) (TAE: Tannic Acid Equivalents)으로 함유되어 있었다. 국내산 식품의 총 폴리페놀 함량 분석을 보고한 결과를 보면 밤 속껍질(Chestnut's inner skin)과 감잎(Persimmon leaf)이 가장 높은 수치를 나타내었고, \( \mathrm{mg} / \mathrm{g} \) 으로 환산하였을 때 둘 다 \( 57.6 \mathrm{~mg} / \mathrm{g} \)으로 정금나무 열매추출물과 유사한 함량을 나타내었다.</p><h2>전자공여능</h2><p>안정한 free radical을 함유하는 DPPH분자는 항산화제의 radical 소거능을 평가하기 위해 일반적으로 많이 이용된다. 생체내의 유해 활성 산소, 유리기 등은 생체막의 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화물을 축적시키는데, 이로 인해 생체 기능의 저하 또는 노화를 유발시킨다. 이러한 원인물질의 생성을 억제하기 위하여 연쇄반응차단 항산화제로 산패의 기본 물질인 lipid radical과 반응하여 안정한 물질로 전환시키거나 연쇄반응 개시 속도를 연장시킨다.</p><p>Fig. 1은 정금나무 열매 추출물의 \(10, 50, 100, 500, 1,000\mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 농도의 DPPH radical의 소거 결과로써, 농도 의존적으로 DPPH radical 소거능이 증가를 확인 할 수 있었고, \( 500 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \) 에서 \( 98 \% \)이상의 소거 활성을 나타내었다. 이는 \( 500 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)농도부터 합성항산화제의 지표물질인 BHA의 DPPH radical 소거 활성보다 높은 수치를 나타내어 정금나무의 높은 항산화 효과를 확인할 수 있었다.</p><h2>\( \mathrm{ABTS}^{◦+} \)radical 소거능</h2><p>DPPH radical의 소거활성과 같이 일반적으로 많이 이용되는 ABTS radical cation 소거 능은 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonnium salt(ABTS)와 potassium persulfate와의 반응으로 \( \mathrm{ABTS}^{◦+} \) radical이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되는데, 시료를 첨가함에 따라 연한녹색으로 decolorization 되는 것을 측정 하는 방법이며, hydrogendonating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다.</p><p>Fig. 2는 정금나무 열매의 \( \mathrm{ABTS}^{◦+} \) radical cation 소거활성 결과이다. 이는 농도 의존적으로 소거능이 증가함을 보였고 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 66.7 \% \)로 \( 50 \% \)가 넘는 활성을 띠었지만, 대조군인 BHA 보다는 낮은 소거활성을 확인하였다.</p><h2>Nitric oxide radical 소거능</h2><p>NO는 혈액응고 및 혈압조절 기능, 암세포에 대한 면역기능 등이 있지만, 과량이 존재하면 인체에 유해한 영향을 미치게 되어 세포손상뿐만 아니라 염증 반응을 비롯한 뇌막염, 알츠하이머병과 파킨슨병 같은 퇴행성 질환에 중요한 요인으로 작용한다. 또한 superoxide 음이온 \( \left(\mathrm{O}_{2}\right) \)과 쉽게 반응하여 매우 반응성이 높고 독성이 강한 산화제인 peroxynitrite \( \left(\mathrm{ONOO}^{-}\right) \)를 생성한다.</p><p>Fig. 3은 nitric oxide \( (\mathrm{NO}) \) radical 소거능을 측정한 결과를 나타낸 것으로 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 이상의 농도에서는 양성 대조군인 ascorbic acid 보다 낮은 활성을 나타내었다. 그러나 \( 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 57 \% \)로 소거활성을 나타내며, \(10 \sim 100 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 낮은 농도에서 ascorbic acid 보다 높은 활성이 나타났다.</p><h2>Hydrogen peroxides 소거능</h2><p>Hydrogen peroxide는 산소의 환원대사물질로서 미토콘드리아나 peroxisome 등의 정상세포로부터 형성 되거나 다양한 외부 요소에 의해 형성되는데, DNA 및 단백질 손상을 유발하거나 생체막 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 지질을 생성함으로써 생체기능저하 또는 노화 및 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다.</p><p>Fig. 4는 정금나무 열매 추출물의 hydrogen peroxide의 소거활성 결과로서 농도 의존적으로 증가 추이를 나타내었으며, \( 50 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml}\)에서 \( 70 \%, 100 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 80.8 \% \)의 활성을 나타내어 낮은 농도에서도 높은 radical 소거능을 나타내며, 대조군인 BHA보다 활성이 높게 나타남으로 인하여 정금나무의 높은 hydrogen peroxides 소거능을 확인 할 수 있었다.</p><h2>Tyrosinase 저해능</h2><p>Tyrosine 활성 억제제는 피부 내에서의 melanin polymer 합성을 효과적으로 저해할 수 있어 피부 미백제의 개발에 있어서 tyrosinase 활성억제 실험은 유용한 평가법으로 인정되고 있다. 따라서 tyrosinase는 melanin 생합성 과정에서 중요한 역할을 하므로 tyrosinase 억제제를 피부의 melanin 색소생성을 조절할 수 있는 물질로 사용할 수 있다.</p><p>Fig. 5는 정금나무 열매 추출물의 Tyrosinase 저해능을 나타내었다. 정금나무 열매의 추출물의 Tyrosinase 저해능은 \( 5,000 \mathrm{\mu g} / \mathrm{ml} \)에서 \( 68 \% \)의 효과를 나타내었으며 농도 의존적으로 증가하는 경향을 확인하였다.</p>	생명과학	[ "<h1>서 론</h1><p>현대인은 산소에 의한 산화적 스트레스에 항상 노출이 되어있으며, 이러한 산화적 스트레스는 정상적인 경우 생체내에 존재하는 항산화계에 의해 제거되지만 산업화 이후 계속적으로 증가한 각종 환경오염물질, 흡연, 알콜 및 방사선 등은 인체에 산화적 스트레스를 가중시키고 있다.", "산화적 스트레스가 제거되지 못하면 생체막의 손상, 고분자 단백질 및 DNA의 변형과 기능 상실 등으로 인한 다양한 퇴행성 질환이 유발될 수 있으므로 이로 인해 유발되는 건강문제를 해결할 수 있는 물질로서 항산화제에 대한 관심이 집중되고 있다.", "또한, 항산화제는 합성항산화제와 천연항산화제로 구분되며 합성 항산화제인 butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), Benzoic acid, poxybenzoic ester는 오랫동안 이용되어 왔으나 다량 섭취 시 유해하다는 논문기록 등에 기인하여 합성 항산화제에 대한 소비자의 거부반응으로 그의 수요가 급격히 감소되고 있는 추세이며, 이를 대체하기 위해 천연물에서 유래된 항산 화 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.", "</p><p>한의학에서는 국내 자생수종이 한약의 재료로 사용 되어 왔으며, 그 가운데 열매는 널리 이용되고 쉽게 접할 수 있는 재료이다.", "또한 국민 생활소득의 향상으로 국민들의 기능성 화장품과 기능성 식품의 수요는 증가하고 있고, 기능성 제품들의 효능 증대를 위하여 천연물들을 사용하여 화장품, 식품, 의약품 산업에 응용되고 있다.", "본 연구의 재료인 정금나무 또한 현재 널리 이용되지 않고 있으나 주 자생지인 전라북도, 충청남도 및 경기남부에서는 결실기인 10월 초에 결실량이 풍부하며, 조류에 의한 피해가 거의 발생하지 않고 주민들이 열매를 채취하여 술이나 음료의 재료로 사용되고 있다.", "</p><p>정금나무(Vaccinium oldhami)는 진달래과에 속하며, 한국의 남부, 충남, 충북, 황해도 등지의 산 중턱, 산등성이에 나는 낙엽관목으로 수고는 \\(2-3 \\mathrm{m} \\) 정도이며, 가지의 굵기 또한 지름 \\( 2 \\mathrm{~cm} \\) 미만이다.", "현재까지의 정금나무에 대한 인체 유효성분 분석은 잎과 가지를 원재료로 하는 연구는 진행되어 왔으나, 정금나무의 생장특징과 향후 활용 및 산업화적인 측면에서 검토해 보았을 때 잎 또는 가지를 원재료로 할 경우 영속적인 대량생산과 재료목의 보전이 불가능한 단점이 있다.", "반면 열매의 경우, 결실량이 풍부하고 과육이 자주색을 띄고 있어 향후 제품생산 단계에서 별도의 화학색소 첨가가 필요치 않을 것으로 사료되며 생육 특징 또한 기존 교목층 아래에서 생육 또는 재배가 가능하므로, 대단위 면적에서 연중 일정한 수량을 영속적으로 생산할 수 있는 장점이 있다.", "그리고 정금나무 열매를 시료로한 성분 분석이나 항산화 활성을 알아보기 위한 연구는 지금까지 사례가 없으므로, 반드시 필요한 연구라고 사료된다.", "이에 본 연구에서는 향후 정금나무 열매의 식품, 화장품 및 바이오산업 등으로 응용을 위하여 항산화활성을 검증하였다.", "</p> <h1>재료 및 방법</h1><h2>시료 제조</h2><p>본 연구에 사용된 정금나무의 열매는 2009 년 10 월 12 일에 충청남도 태안군 안면읍 일원에서 채취하였다.", "시료에 아세톤과 물을 7:3(volume/volume)의 비율로 넣은 다음 3일 동안 추출한 후 여과하여 회전 농축기로 감압 농축하여 동결 건조 후 사용하였다.", "</p><h2>총 폴리페놀 함량 측청</h2><p>총 폴리페놀 함량은 phosphomolybdic acid가 페놀성 물질과 반응하여 청색으로 발색되는 것을 이용한 Folin-Denis법 을 통해 측정하였다.", "즉, 농도별 시료용액 \\( 1,500 \\mu \\mathrm{l} \\) 에 1N-Folin-Ciocalteu phenol reagent 시약을 \\(500 \\mu \\mathrm{l} \\)가하고 3분간 반응 후 \\( 10 \\% \\)의 포화 \\( \\mathrm{Na}_{2} \\mathrm{CO}_{3} \\) 용액 \\( 500 \\mu \\mathrm{l} \\)를 가하였다.", "이 혼합액을 1 시간 반응 후 \\( 640 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하였으며, tannic acid를 이용하여 표준곡선으로 함량을 구하 였다.", "</p><h2>전자공여능 측정 (Elctron donating ability)</h2><p>전자공여능은 Blois 방법을 변형한 1.1-diphenyl-2-pic-rylhydrazyl (DPPH) free radical 소거법으로 측정하였다.", "DPPH 는 자신이 가지고 있는 홀수의 전자 때문에 \\( 517 \\mathrm{~nm} \\)에서 강한 흡수 스펙드럼을 보이나 페놀성 화합물과 같이 수소 전자를 제공해 주는 전자공여체와 반응하게 되면 전자를 제공하는 hydrogen radical을 받아 phenoxy radical을 생성하게 되며 흡수 band도 사라지게 되고 안정한 분자가 된다.", "즉 \\( 70 \\% \\) ethanol을 용매로 한 \\(10, 50, 100, 500, 1,000 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)의 농도별 시료액 \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\)와 \\( 99.9 \\% \\) ethanol에 용해", "한 \\( 0.2 \\mathrm{mM} \\)의 DPPH \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\)를 넣고 교반한 후 암소에 30분 반응 후 \\( 517 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하였다.", "대조군에 대한 흡광도 감소치를 DPPH 라디칼 소거활성으로 하여 항산화 활성도를 나타내었다.", "이때 상대 활성의 비교를 위하여 양성대조군으로 BHA를 사용하였다.", "</p><h2>Nitic oxide radical 소거능 측정</h2><p>Nitric oxide (NO) radical 소거 실험은 Marcocci 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. \\", "( 20 \\mathrm{~mM} \\) phosphate buffer \\( \\mathrm{pH} \\) 7.4에 용해시킨 \\( 10 \\mathrm{mM} \\) sodium nitroferricyanide (Ⅲ) dihydrate \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\)과 농도별 시료액 \\( 50 \\mu \\mathrm{l} \\)를 넣고 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 150분간 반응시켰다.", "이 반응액에 griess reagent \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\)를 넣고 15분 후 \\( 542 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도를 측정하여 nitrite 소거활성을 확인하였다.", "</p><h2>ABTS cation radical 소거능 측정</h2><p>\\( \\mathrm{ABTS}^{◦+} \\)radical을 이용한 항산화력 측정은 \\( \\mathrm{ABTS}^{◦+} \\)Cation Decolorization Assay방법에 의하여 측정하였다.", "ABTS(2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) 7.4\\( \\mathrm{mM} \\)과 potassium persulphate \\( 2.6 \\mathrm{mM} \\)을 12시간 이상 암소에 방치하여 청록색의 \\( \\mathrm{ABTS}^{◦+} \\)radical을 형성 시키며 이 용액은 냉장 보관하였다.", "radical stock solution은 \\( 734 \\mathrm{~nm} \\)에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 몰 흡광계수\\( \\left(\\varepsilon=1.6 \\times 10^{4} \\mathrm{~mol}^{-1} \\mathrm{~cm}^{-1}\\right) \\)를 이용하여 methanol로 희석하였다.", "이 stock solution \\(100 \\mu \\mathrm{l} \\)에 시료추출 용액 \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\)을 가한 후 상온에서 1 분 방치하여 \\( 734 \\mathrm{~nm} \\)에서 반응액의 흡광도 변화를 측정하였다.", "</p><h2>Hydrogen peroxides 소거능 측정</h2><p>Hydrogen peroxide 저해활성은 Jayaprakasha등의 방법에 의해 측정하였다.", "농도 별 시료용액 \\(1000 \\mu \\mathrm{l} \\)와 phos-phate-buffer saline (PBS at \\( \\mathrm{pH}~7.4\\))에 녹인 \\( 40 \\mathrm{mM} \\) hydro-gen peroxide solution \\(2,000 ~\\mu \\mathrm{l}\\) 를 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 10분간 반응시킨 후 반응액 중에 저해된 hydrogen peroxide의 양을 \\(230 ~\\mathrm{nm} \\)에서 흡광도를 측정하였다.", "합성 항산화 물질인 BHA와 활성을 비교해 보았다.", "</p><h2>Tyrosinase 저해활성 측정</h2><p>Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다.", "농도별 시료액 \\( 100 \\mu \\mathrm{l} \\)와 \\( 500 \\mu\\mathrm{l}\\)의 \\( 0.175 \\mathrm{M} \\) sodium phosphate buffer (\\(\\mathrm{pH} 6.8\\))와 \\( 10 \\mathrm{mM} \\) L-DOPA 녹인 기질액 \\( 200 \\mu \\mathrm{l} \\)에 \\( 200 \\mu \\mathrm{l} \\)의 mushroom tyrosinase \\( (110 \\mathrm{U} / \\mathrm{ml}) \\)을 첨가 후 \\( 25^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 2분간 반응시킨 후 생성된 DOPA chrome을 \\( 475 \\mathrm{~nm} \\)에서 측정하였다.", "Tyrosinase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.", "</p><h2>통계처리</h2><p>실험 결과는 3회 반복 측정 후 평균 \\( \\pm \\mathrm{SD} \\)로 나타내었다.", "통계분석은 SAS program (SAS Institue, Cary, NC, USA)을 이용하여 분산분석한 후 Duncan의 다중검정을 실시하였으며, 상관관계를 분석하였다.", "</p> <h1>결과 및 고찰</h1><h2>총 폴리페놀 함량</h2><p>페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 하나 또는 두 개 이상의 수산기로 치환된 방향족환을 가지고 있다", "이들은 phenolic hydroxyl (OH)기를 가지고 있는데, 이것은 분자 내 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질과 같은 거대 분자들과 결합하는 성질이 있기 때문에 항산화 작용과 관련한 생체 free radical 들을 안정된 화합물로 형성하도록 하여 산화 억제 작용을 한다</p><p>총 폴리페놀 함량을 tannic acid를 기준 물질로 하여 정금나무 열매 추출물에 포함되어있는 페놀 함량을 측정한 결과 \\( 55.972 \\mathrm{mg} \\) TAE\\( /\\mathrm{g} \\) (TAE: Tannic Acid Equivalents)으로 함유되어 있었다.", "국내산 식품의 총 폴리페놀 함량 분석을 보고한 결과를 보면 밤 속껍질(Chestnut's inner skin)과 감잎(Persimmon leaf)이 가장 높은 수치를 나타내었고, \\( \\mathrm{mg} / \\mathrm{g} \\) 으로 환산하였을 때 둘 다 \\( 57.6 \\mathrm{~mg} / \\mathrm{g} \\)으로 정금나무 열매추출물과 유사한 함량을 나타내었다.", "</p><h2>전자공여능</h2><p>안정한 free radical을 함유하는 DPPH분자는 항산화제의 radical 소거능을 평가하기 위해 일반적으로 많이 이용된다.", "생체내의 유해 활성 산소, 유리기 등은 생체막의 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화물을 축적시키는데, 이로 인해 생체 기능의 저하 또는 노화를 유발시킨다.", "이러한 원인물질의 생성을 억제하기 위하여 연쇄반응차단 항산화제로 산패의 기본 물질인 lipid radical과 반응하여 안정한 물질로 전환시키거나 연쇄반응 개시 속도를 연장시킨다.", "</p><p>Fig.", "1은 정금나무 열매 추출물의 \\(10, 50, 100, 500, 1,000\\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\) 농도의 DPPH radical의 소거 결과로써, 농도 의존적으로 DPPH radical 소거능이 증가를 확인 할 수 있었고, \\( 500 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\) 에서 \\( 98 \\% \\)이상의 소거 활성을 나타내었다.", "이는 \\( 500 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)농도부터 합성항산화제의 지표물질인 BHA의 DPPH radical 소거 활성보다 높은 수치를 나타내어 정금나무의 높은 항산화 효과를 확인할 수 있었다.", "</p><h2>\\( \\mathrm{ABTS}^{◦+} \\)radical 소거능</h2><p>DPPH radical의 소거활성과 같이 일반적으로 많이 이용되는 ABTS radical cation 소거 능은 2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonnium salt(ABTS)와 potassium persulfate와의 반응으로 \\( \\mathrm{ABTS}^{◦+} \\) radical이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되는데, 시료를 첨가함에 따라 연한녹색으로 decolorization 되는 것을 측정 하는 방법이며, hydrogendonating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다.", "</p><p>Fig.", "2는 정금나무 열매의 \\( \\mathrm{ABTS}^{◦+} \\) radical cation 소거활성 결과이다.", "이는 농도 의존적으로 소거능이 증가함을 보였고 \\( 500 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)에서 \\( 66.7 \\% \\)로 \\( 50 \\% \\)가 넘는 활성을 띠었지만, 대조군인 BHA 보다는 낮은 소거활성을 확인하였다.", "</p><h2>Nitric oxide radical 소거능</h2><p>NO는 혈액응고 및 혈압조절 기능, 암세포에 대한 면역기능 등이 있지만, 과량이 존재하면 인체에 유해한 영향을 미치게 되어 세포손상뿐만 아니라 염증 반응을 비롯한 뇌막염, 알츠하이머병과 파킨슨병 같은 퇴행성 질환에 중요한 요인으로 작용한다.", "또한 superoxide 음이온 \\( \\left(\\mathrm{O}_{2}\\right) \\)과 쉽게 반응하여 매우 반응성이 높고 독성이 강한 산화제인 peroxynitrite \\( \\left(\\mathrm{ONOO}^{-}\\right) \\)를 생성한다.", "</p><p>Fig.", "3은 nitric oxide \\( (\\mathrm{NO}) \\) radical 소거능을 측정한 결과를 나타낸 것으로 \\( 500 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\) 이상의 농도에서는 양성 대조군인 ascorbic acid 보다 낮은 활성을 나타내었다.", "그러나 \\( 100 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)에서 \\( 57 \\% \\)로 소거활성을 나타내며, \\(10 \\sim 100 \\mu \\mathrm{g} / \\mathrm{ml} \\)의 낮은 농도에서 ascorbic acid 보다 높은 활성이 나타났다.", "</p><h2>Hydrogen peroxides 소거능</h2><p>Hydrogen peroxide는 산소의 환원대사물질로서 미토콘드리아나 peroxisome 등의 정상세포로부터 형성 되거나 다양한 외부 요소에 의해 형성되는데, DNA 및 단백질 손상을 유발하거나 생체막 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 지질을 생성함으로써 생체기능저하 또는 노화 및 성인병을 유발하는 것으로 알려져 있다.", "</p><p>Fig.", "4는 정금나무 열매 추출물의 hydrogen peroxide의 소거활성 결과로서 농도 의존적으로 증가 추이를 나타내었으며, \\( 50 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml}\\)에서 \\( 70 \\%, 100 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)에서 \\( 80.8 \\% \\)의 활성을 나타내어 낮은 농도에서도 높은 radical 소거능을 나타내며, 대조군인 BHA보다 활성이 높게 나타남으로 인하여 정금나무의 높은 hydrogen peroxides 소거능을 확인 할 수 있었다.", "</p><h2>Tyrosinase 저해능</h2><p>Tyrosine 활성 억제제는 피부 내에서의 melanin polymer 합성을 효과적으로 저해할 수 있어 피부 미백제의 개발에 있어서 tyrosinase 활성억제 실험은 유용한 평가법으로 인정되고 있다.", "따라서 tyrosinase는 melanin 생합성 과정에서 중요한 역할을 하므로 tyrosinase 억제제를 피부의 melanin 색소생성을 조절할 수 있는 물질로 사용할 수 있다.", "</p><p>Fig.", "5는 정금나무 열매 추출물의 Tyrosinase 저해능을 나타내었다.", "정금나무 열매의 추출물의 Tyrosinase 저해능은 \\( 5,000 \\mathrm{\\mu g} / \\mathrm{ml} \\)에서 \\( 68 \\% \\)의 효과를 나타내었으며 농도 의존적으로 증가하는 경향을 확인하였다.", "</p>" ]	{ "doc_category": { "KDC": "470.5", "DDC": "" }, "doc_title": { "kor": "정금나무(Vaccinium oldhami) 열매의 항산화 효과", "eng": "" }, "doc_type": "논문", "doc_id": "8a2ae4d1-fc97e74b-42a7-4b43-a27d-9fb85a44f27b", "doc_number": { "ISSN": "1225-9918", "ISBN": "", "DOI": "", "UCI": "" }, "doc_year": "2010", 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