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高津 美容院を探しているなら、shu.ha.ri..（シュハリ）がおすすめです。お客様に笑顔で帰っていただけるようなサロンを目指しています。カウンセリングもしっかりと行い、納得のいく施術をおこなってい… 忙しい毎日の中でご自分の髪のメンテナンスは行き届いていますか。なかなか美容院に行く時間が持てないこともあますよね。三鷹市にある三鷹 美容院LOOP（ループ）では、なかなか忙しくて美容院に行く時間が作れ… TKパルジュは、霧島市 美容室で多くの女性に愛されています。行っているサービスは、カットやカラー、更にはパーマなどの一般的なサービスだけでなく、美容に関連しているサービスも一緒に提供しています。中でも… これからの時代においては、訪問美容は欠かせないことでしょう。さまざまな配慮や準備が必要になるイメージですが、最近でもスムーズにヘアカットなどをおこなわれているようです。訪問美容レガロでは、そのようなニ… 髪型が決まっているだけで、気分も上がることでしょう。髪型での印象がその人の印象を与えることもありますので、定期的に整えておくことは大切でしょう。美容室スマイルにおいては、そのようなニーズを捉えて、しっ… 多くの人においては、定期的にヘアサロンを利用されていることでしょう。人によっては、お気に入りのヘアサロンもあることでしょう。SALON DE DOUX本店ではそのようなニーズに応えて、さまざまな施術… 髪が伸びてきたけどどこに行こうか迷っている方はさくら市 美容室のAZUL（アズール）がオススメです。流行の髪型はもちろんのこと、お客様の髪質やくせに合ったベストな髪型をスタッフが提案をしてくれます。 … 茗荷谷 美容院のクオーレは、いろいろなメニューをたくさん用意しているので、大人の女性も満足することが出来ます。使用する商品にもこだわり、地肌に優しいカラーやパーマ、トリートメントをすることが出来ます。… 津田沼 美容室のUNVOYAGEでは、ヘアケアを重視したメニューを多数用意しています。最寄り駅から近いため、仕事や学校帰り、雨の日などにも無理なく行けるようになっています。また、予約方法も電話やホーム… 美容室 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美容室というと最先端なおしゃれなヘアスタイルにしてくれるイメージがありますが、自分でそのスタイルをキープし続けることが難しそうな髪型になりそうな感じもします。しかし清澄白河 美容室の一つであ… もし横須賀 美容室の中でも特にプライベートサロンを探しているのであれば横須賀 美容室cocoa（ココア）はいかがでしょうか？こちらは完全予約制の美容室ですので自分の施術をしている間には他の人の施術が入… 雑誌の切り抜きを持って行っても、なかなか自分の思うとおりに仕上がらずにがっかりして美容院から帰ってきたという経験ありませんか。雑誌のモデルさんの髪質や顔の形との違いを見極めて、その人その人に合わせたス… 季節の変わり目やライフスタイルの変化に、思い切ってヘアスタイルを変えたいという人もいるでしょう。そのような時には技術の高いヘアサロンに行きたいと思うでしょう。JohnGlasgowでは、そうした人に… 季節やライフイベントなどで、髪型を変えたいと思う人は多いと思います。そのような際には、技術のあるスタイリストさんが頼りになる存在でしょう。you（ユー）は、そのようなスタイリストが在籍していますので、… 初めて訪れる大分市 美容院は緊張してしまうものですが、leaf hairでは快適に過ごせるような雰囲気作りを大切にしており、しっかり時間をかけてカウンセリングを行って、一人一人に合ったヘアスタイルを提… 多くの人がヘアスタイルを整えたり、変更しようとヘアサロンに訪れます。その際にしっかりとケアをおこなうことで、美しい髪を維持することができます。ドゥ・フェースにおいては、そうした施術のひとつひとつを大切… 綱島 美容室のFUGA GROUPは、雰囲気を変えイメチェンを目指すお客様を応援する、綱島のヘアサロンです。お店は「AUTRE ｂｙ FUGA hair」という名前です。カラー・ヘッドスパ・着付け等の… 多くの方が通うヘアサロンですが、人によって外せないこだわりがあるのではないでしょうか。そういった中でも、癒しやリフレッシュを求めて、アットホームなヘアサロンへ行く方も少なくはないようです。美容室セラ… 結城市 美容室ならReposerはどうでしょうか。サロン名はフランス語でひと休みするという意味があります。その意味の通りひと休みできるようにブラウンのチェアーに広々としいた店内は安らげる空間になってい… 自分にしっくりとくる髪型は見つけるだけでもわくわくしますよね。その素敵なスタイルが長くキープできるということも重要なポイントです。おうちでもきちんと再現できるようなサポートがそろっている横浜 美容室で… 熊本市 美容室の中でun ripは唯一プルエクステができるお店です。プルエクステの最大の魅力は高品質な毛質です。地毛に馴染みやすく、ダメージも受けにくいのが特徴です。エクステを付けるとケアが大変ですが… 美容室は女性が多く利用するイメージがあります。しかし、confidence -MEN'S HAIR-では大人の男性をターゲットとしたメンズ専用ヘアサロンです。西新宿 美容室の中でも男性を魅力的にするた… 大和高田 美容室のcriniera（クリニエーラ）は、カットやパーマ、カラーなどのサービスを提供しています。常に頭皮のことを考えてサービスを提供している場所で、頭皮に関連しているマッサージも多く行って… 醍醐 美容院のhair art dieuは、気軽に通えるプライベートサロンです。髪の毛にダメージの少ないようなアイテムに徹底してこだわっています。また、様々なカスタマイズによって必要な栄養を髪の悩みを… 境町 美容室で評判の「美容室chou chou」。ここでは完全予約制を採っており、訪れる顧客は1日5名だけです。ともすれば、顧客があふれかえることもある美容室と比べてみると、その差は歴然です。ゆったり… メンズカットをするなら池袋 人気 美容室のMiiK.がおすすめです。なかなか理想通りの髪型にならない、オンとオフでも楽な髪型にして欲しいという方にもおすすめの美容室です。お客さんに似合う髪型を提案し、… 西院 美容室のブーケは、カットからトリートメント、オリジナルのシャンプーを使って髪を洗うなどのサービスを行っています。全てのサービスを丁寧に行っており、特にきれいな仕上げを意識しています。オリジナルで… 全国各地には、さまざまなヘアサロンがありますが、そのなかでもリラックスできるヘアサロンは貴重な存在だと言えるでしょう。CUE TOGOSHI-KOENは、お客さまが癒されるような空間づくりをしているヘ… 髪型については、多くの人がさまざまなこだわりがあるかと思います。そのような中で、そういったこだわりを汲み取りながら、ヘアスタイルを提案できるヘアサロンは貴重な存在でしょう。hair salon Mでは… 名取 美容室のPICRIS hair'sは、カットやカラーなど、美容室でのサービスを提供してくれます。キッズスペースを設けていますので、子供を遊ばせながらカットを行えるサービスもあります。相談によって… じっくりと自分の髪の毛や美容に関して向き合ったことはありますか。日々の忙しさの中でおろそかになってはいないでしょうか。見た目の印象をしっかりと整えることは心理的にもポジティブな効果を生んでくれます。毎… うねりや硬さ、つむじ割れなど、髪に対しての悩みはあることでしょう。美容室あばらんちぇでは、そのような悩みをしっかりと向き合い、それぞれの施術を実施してくださいます。特にくせ毛などは、日頃のヘアスタイル… 福岡県春日市 ヘナカラーが人気の美容室、ヘアートリムでは、お得な会員割引システムにより、豊富なカラーを気軽に試すことができます。頭皮や髪に優しいことで注目されているヘナカラーを、好みの頻度で安くに利用… glam&upは、小平 美容院としては変わったサービスを提供していて、髪の質を改善できる方法を取るようにしています。誰もが期待しているような髪に育てるサービスを行っています。通常のカットやセットだけで… 自分専属のスタイリストが欲しいと思われている貴女には、神奈川県川崎市のヘアサロンimpress～hair～がイチ押しです。駅チカの通いやすいお店で、完全予約制なのでスタイリストさんとマンツーマンでスタ… 調布 美容室を営んでいるPASSAGE(パッセージ)は、地肌に優しい薬剤を使用しているので、髪質はもちろんのこと地肌からも健康になれる施術を行っています。また、エステサロンに行かずとも、内側から綺麗に… アットホームな雰囲気が演出されている下関 美容院として運営されている美容室varieでは、各時間1名ずつの施術が行われており、待ち時間の少なさや、マンツーマンによる丁寧な施術が感じられます。性別や年齢… naughty.idは、オリジナルの商品を使って髪の手入れを行っているサロンです。甲府 美容室の中でも、独自の商品を多数持っていて、それを活用しての手入れを実施してくれます。髪の質に合わせるようにして… 世の中には多くのヘアサロンがありますが、その中でも男性への施術を主体としたヘアサロンを見つけることは難しいことでしょう。川口にあるオカフリースタイルは、男性の来店が多いヘアサロンで、加えてさまざまな世… 今の時代は、どの街に行っても数多くのヘアサロンを見かけるようになりました。そのようななかで理想とするヘアサロンが見つけることは簡単ではないことです。Hair Salon.SWITCHであれば、高い技術… 美容室varieは幡生駅から徒歩圏内の下関 美容院です。駐車場も完備で、公共交通機関でも車でも来店可能です。カットやパーマ、カラーなどに至る施述は全て１人のスタイリストが行い、誰でも気軽に入りやすいア… 生田 美容院のティートゥリースターは生田、新百合ヶ丘エリアの地元に密着した隠れ家的なヘアサロンです。地元の人が笑顔になって元気が出るようなヘアスタイルを、一人ひとりのライフスタイルに合わせて提供いたし… 駅前を中心としてさまざまなヘアサロンを見かけるようになりましたが、自分がこころから信頼できるヘアサロンを見つけるのは簡単なことではありません。人それぞれこだわりは異なり、髪質や顔の骨格なども異なります… 三軒茶屋 美容院のカラーを専門に扱っているLife Hair THE・ONE(ライフヘア ザ ワン)は、ダメージが気になってヘアカラーに手を出せない人のために、オーガニックカラーも取り扱っています。ス… 桃谷 美容院を運営しているcopainは、お客様の笑顔と一生付き合っていけるように、丁寧な施術を心がけています。スタッフ一人一人が、その人の魅力を最大限に発揮できるように、カウンセリングを詳しく行い、… 高崎市 美容室でその人に合った髪型の提案を行っているproxim hair worksは、美容師からの提案も行いますがお客さんの話も丁寧に聞きつつ、施術することを心がけています。そのため、知識や経験が… ヘアチェンジをすると気分まで前向きになり、不思議と身体が軽くなることもありませんか？宇治 美容院の一つであるhair art Liengeでは、ただヘアスタイルを手がけるだけではなく、その人が扱いやす… 大河原 美容室のヘアーサロン Hailenは大河原町金ケ瀬交差点近くの隠れ家的なサロンです。隠れ家的サロンということですが、わからない場合は遠慮なくお店に電話してみればスタッフさんが優しく教えてくれま… 多くの人が定期的にヘアサロンに通っていて、私たちにとって身近なものになっています。ヘアサロンでの技術やケアに、満足度が高いとことと同じように、接客への満足も高めたいと思うことでしょう。板橋 美容室のH… 昨今においては、街中にさまざまなヘアサロンを見かけるようになりました。数あるヘアサロンの中から、満足のいくヘアサロンを探すことは至難の技とも言えるでしょう。吉川 美容室の一軒であるfavoriでは、お… 梅ヶ丘 美容室で人気があるのがtraddictusです。コミュニケーションを大切にしているこちらの美容室ではカウンセリングを十分に行い、経験豊富なスタイリストが高い技術力にてサービスを提供してくれます… 頭皮の刺激と髪のダメージが気になる人でも、武蔵小山 美容院であるFollow me(フォロミー)ならば、頭皮や髪に潤いを与えて補強し、艶のあるカラーに染めたりパーマをすることが可能です。 また、ハリや… 新松戸 美容室で営業しているKUKUNA HAIRは、髪の問題点を改善することができるお店となっています。縮毛に悩んでいたり、枝毛が起きていたりする人のために問題点を改善できるよう、カットやカラーなど… 結婚式やパーティーでの髪型が決まらないなど、髪にお悩みがある方は多いと思います。目黒 美容室Chlorisでは、そんな悩みを解決すべく、あなたに最も合ったスタイルを提案してくれます。店内は、アンティー… 最近ではヘアサロンの数も多種多様に増えてきていて、数多くの美容院を見かけるようになりました。南森町 美容室のhairsalon XXXX【フォーエックス】は、海辺をイメージしたヘアサロンです。大阪の西… 最近ではヘアサロンの数も増えて、どのヘアサロンを利用しようか迷う人も多いでしょう。そのような人には千葉市中央区 美容室の一つであるlulumaluをおすすめします。ヘアサロン自体がプライベートな空間に… 立川 美容室で探すとしたら断然MARQ HAIRさんがお勧めです。急に髪をカットしたくなったことはありませんか？その日何気なく立ち寄った美容室MARQ HAIRはとてもすてきな美容室でした。立川駅南口… 長町 美容室のinanna’tier hair designはアンティーク調の落ち着いた雰囲気のお店です。リラックス感ある空間では、大人の女性向けのハイクオリティーな技術をお客様に合わせて技術を提供し… 神戸 ヘアサロンにあるTHECITYHaircutServiceは、男性を専門としているヘアサロンです。多くのこだわりを持っているサロンになりますので、新たなスタイルを提案してくれるでしょう。本… 多くの人が定期的にヘアサロンに通いますが、そのたびにスタイリストの高い技術に驚かされていることでしょう。髪型も時代とともにトレンドの変化があり、昨今においてはヘアカラーの色やパーマにおいても大きな時代… goen hair loungeはさいたま市 美容室で、少人数制でおこなっているアットホームなヘアサロンです。ヘアサロンの外観からも温かみを感じることができ、お店の配慮や工夫が手に取るように伝わる空間… Private hair Petiteは、プライベート重視のヘアサロンで、コミュニケーションを何よりも大切にしています。お客様が心から安らげるような空間づくりがなされていて、一般的なヘアサロンとは異な… メイクの世界は想像以上に奥が深く、ハリウッドなどの映画の世界であれば特殊メイクなどが必要とされます。特殊メイクは何時間もかけてメイクをしていきますので、高い技術や経験が問われるものでもあります。東京 … hair good company HYPERIONは、どなたでも気軽に立ち寄れる京田辺 美容室として運営されています。隠れ家のような空間は、穏やかな時間の流れとゆったりとした雰囲気が感じられる演出が… 川口市 美容室Chou Chouは、働く女性に人気です。落ち着いた空間で、親しみやすいスタッフさんが、アットホームな雰囲気を作り出してくれます。またこちらでは、サラサラの縮毛矯正に力を入れているので、… パーソナルカラリストという、専門の知識を持っているスタッフが在籍しており、白髪を生かす、お洒落なヘアーカラーはメニューの中で、とても好評です。またこだわりのオリジナルツヤカラーは30代、40代のツヤ低… その人への第一印象や、全体のイメージは髪の毛が9割だと言われています。髪型を変えるだけで印象は大きく変えることができます、しかしながら、健やかな頭皮環境を保つにはトリートメントなどに時間をかけて、メン… 名古屋 美容室ATOLLの営業時間は、平日は11時から21時までで、土日祝は10時から20時までです。定休日は月曜日と第3火曜日です。来店するお客さんの心を癒せる空間づくりと、プロのスタイリストによる… 武蔵新城 美容院の美容室 エ・エム・シーは、ヘアカットやカラーリング、縮毛矯正に加え、フェイシャルエステや着付けも行なっており、トータルビューティーをサポートするヘアサロンです。顔のシェービングやまつ… 泉区 美容室と言うとたくさんのお店がありますが、髪の毛に優しくケアしたい方に最適なのがHairCRAFTです。こちらは、ヘアカット、トリートメントはもちろん、パーマやカラーリングの際に髪に優しい無添加… さいたま市 着付のできる美容室の中でも、beauty shimizuでは安心して着付をお願いすることができます。丁寧なカウンセリングと、確かな技術力で、希望通りの仕上がりにしてもらえます。ヘアメイクも… soiは完全予約制の八王子 ヘアサロンです。お客様一人に対してヘアスタイリストが一人つくというとても小さなヘアサロンですが、お子さま連れの方でも安心して来店することができます。貸し切りのプライベートサ… Total Beauty Smith&Coは、HairSalonWを運営しています。HairSalonWは横浜に位置しており、丁寧なカウンセリングで人気です。こういった、ヘアーサロンの通常のサービスに… 時間がないけれど身だしなみはきちんとしたいので、駅近の代々木上原 美容室を探している、という方にapaiserがお勧めです。apaiserは駅から徒歩2分の好立地の場所にあり、ひとりひとりのライフスタ… 鴨宮 美容院エルミタージュはパリをテーマとしたのんびりと心落ち着く空間、まるで癒しの隠れ家のようなヘアサロンです。いつもいつまでもキレイでいたい方にぴったりのサロンです。話題の炭酸泉を使用したヘッドス… 明るく入りやすいエントランスで、柔らかい雰囲気を持つ広島市 メンズに人気の美容室と言えば、ヘアーサロンミリカです。カットだけではなく、パーマや着付け、セルフホワイトニングなど幅の広いメニューを揃えて… 松戸 カラーのお店を探しているなら、落ち着いた雰囲気のマーズがおすすめです。リラックスできる店内なので、くつろぎながら髪の毛のカラーリングをしてもらいたいという人におすすめします。実力もあるので、安心… 今日は特別な日。だけど、「どんな髪型が自分に合うの？今の流行は？」と思ったことはありませんか。このような経験は？「今まで経験した美容院は話しづらかった。切ってもらったがなんか気に入らなかった。」そんな… dear hair&makeupのヘアセットとメイクメニューを除く全てのメニューに練馬 ヘッドスパを付けている安らげる美容室です。夫婦２人で営業している完全予約制の美容室ですが、１人毎にご予約の時間は… もし、代々木上原 ヘッドスパで美容室をお探しでしたら、代々木上原駅近くにあるmusaという美容室に足を運んでみてはいかがでしょうか。10年以上の経験に基づいた高い技術力とケアへの知識を持った女性スタッ… 善行 美容室の美容室ワンズヘアーは、駅からの距離などの兼ね合いもあり、仕事帰りや学校帰りにも寄りやすく、そのようなことから、人気も高まっています。技術力の高さや接客レベルの高さにも定評があります。スタ… 瀬戸市 美容院caldoは温かい、熱心な接客をモットーにお客様のサービス提供に努めています。店名のcaldoとはイタリア語で温かい、熱心なという意味を持っています。また、最新のという意味も持っており、… hair design komorebiは、木を基調とした温もりを感じられる店内に、その名の通り、時折差し込む木漏れ日が心地いい北上尾 美容院です。魔法のシャンプーと名高いoggi ottoを使用し、… 鹿児島市 美容室で自分に合った美容室を探しているという方は、pisces SALONを利用してみてはいかがでしょうか。鹿児島市 美容室の中でも、利用したお客が笑顔でまたサロンに戻ってきてくれることを目… 数多くの西那須野 美容室の中でも評判のsiiqa-hair cafe-は、JR西那須野駅から車で15分ほどの場所にあり、普段の生活から離れて自分だけの癒しの時間を過ごせる美容室です。美容室名は、自由… 代官山は東京都内でもオシャレな街として知られています。美容室も数多くあります。代官山 美容室ならおすすめのお店があります。それは、「SAiKU」というカットが好評な美容室です。これまでに表参道や原宿で… Rhymeは家族で通える蓮根 美容室です。駅から徒歩2分の位置にあるので小さな子供のいる家庭でも来店しやすいです。年齢を問わず施術をして、親子で来店することも歓迎しているので親子揃って行きつけの蓮根 … 春日部 美容室のなかでも年齢問わずに人気の美容室が、Hair Luce Halruです。こちらは、交通アクセスも良い場所にあるため、通いやすいです。また、アットホームな空間で施術を行うため、スタッフの… 商店街がにぎわう弘明寺駅より徒歩15分の場所にあるビューティサロンフランセは数多くある横浜 美容室のなかでも、リラックスできる空間に力をいれているサロンです。店内は南国リゾートにいるかのような空間で… 西宮 美容院と言えば、hair＆body salon nakiriです。お店はウッド調で、落ち着いた空間になっています。美容院でありながら、エステも受けることができます。髪のことから全身のケアまで、ト… fleur hairは駅から徒歩5分の場所にある千葉駅 美容室です。上質な家具と四季折々の花で彩られたサロンは心落ち着く空間で、子供連れでも気軽に来店できるようにキッズスペースも完備されています。ヘア… bouclettesは、作品とサロンワークを切り離さずに両立させ、モードすぎず、カジュアルすぎない、ハイスタンダードな髪型にしてくれる夢のような心斎橋 美容室です。まるでモデルになったような気分で「新… coiiは雑誌やヘアカタログにて多数の掲載実績のある美容室です。プロフェッショナルなスタイリストがトレンドを取り入れた旬なヘアスタイルを、ひとりひとりの個性に合わせて提案してくれます。一歩先のお洒落を… 自由が丘 ヘッドスパのmienoは、アルガンオイルとオーガニックビネガーでヘッドスパを行うヘアサロンです。全てのメニューに100パーセント完全保証をコンセプトにしており、気に入らない場合は1週間以内な… Artesia by anyhowはカウンセリングを大切に考えている川口 美容院です。お客様一人に専属のスタイリスト一人が、最初から最後までついてくれます。人見知り、お話しするのが苦手という方も、同じ… 大阪の中でも数多くお店が存在する豊中 美容室で20年の実績を持ち、木目の落ち着いたドアを開けて中に入るとシックでリラックス出来る雰囲気が人気の美容室と言えばhair remix VVです。20代から3… 人気の池袋 ヘアサロンのASILEは、駅からの立地もよく、遅い時間帯まで予約を入れることができるため、仕事や学校の帰りにも寄ることができるようになっています。スタッフは国内外のコンテストで受賞歴があり… 高津 美容院でも、ハイクオリティな仕上がりをすることが出来るサロンです。髪の毛や地肌の事をしっかりと考えて、ナチュラル＆オーガニックコスメを使用しています。きれいに変身するだけでなく、安心・安全なお手… 地域密着型のプライベートサロンな東小金井 美容室をお探しの方にPrivate hair salon Lapisがおすすめです。Private hair salon Lapisでは一人一人の髪質や骨格に… 国分寺 美容室のTre’fle-トレフル-では、ただスタイリングをするだけでなく、個々の持つ髪の悩みやコンプレックスを解消できるようにさまざまなメニューを取り揃えています。経験と技術を兼ね備えたスタッ… ワイズ アイズ 石原店は、群馬県高崎市にある美容室であり、ケミカル薬品を使用しないヘアカラーや、お客様のヘアースタイルや志向に合わせたカットの方法など、美容院として果たすべき役割や責任をしっかりと全う… 福岡県飯塚市の田川 縮毛矯正なら、Sweet's of hairです。顧客1人に対してスタッフ1人が対応するので、途中で席を離れたり、顧客を待たせたりする事がないように体制を整えています。また、カット… この北浦和 メンズカットのRobiiでは、主に男性のためのヘアカットや染色など、頭髪に関する様々なサービスを実施しています。もちろん男性だけではなく女性や高齢の方、子供も歓迎しており、学生の方には割引… 千葉 エクステのBerrysBraids ベリーズブレイズは編み込み専門のプライベートサロンです。ネイティブアメリカンやカフェの用なプライベート空間の中で施術を受けることができブラックヘアからナチュラ… 美容室は予約必須のところが多いので、今すぐ何とかしたいと思っても待ち時間などがあって大変です。美容室HARMONIA宿河原店は通常予約がないので、いつでも思い立った時にカットやセットをして綺麗にする事… 西八王子 美容室ENDO家は、住宅街にある隠れ家的なサロンです。安心安全でまろやかな香りの琉球ヘナを取り扱う数少ない美容室の一つで、都内でも取り扱いが少ないことからたくさんのリピーターが訪れています。… ヘアーガレージビートは、癒しのひとときを過ごしたい方に利用してみてほしい宮前平 美容院です。理容室と美容院の両方に勤務した経験がある店主がオープンしたプライベートサロンですので、理容室と美容院のそれぞ… 自然派美容室ブリジングは、駒込 美容室の中でも大変人気が高い美容室になっています。都心の中心付近に立地しており周辺からのアクセスが大変良く、多くの方が利用しています。店舗の営業時間は、午前9時から午後… 立川 美容室で店舗を探している方におすすめしたいのが、株式会社Aboveが経営している美容室Droogです。目指しているのは360度どこからでも綺麗に見えるヘアスタイルで、一流の技術と接客によってお… 東京 エクステで店を探している時に、おすすめしたいのが「ＮＯＲＮ」です。エアリーエクステとボディジュエリーが人気となっていて、サービスを受けるだけではなく、技術を学ぶこともできます。協会認定の確かな技… 五反田 美容室で店舗を探している人におすすめしたいところが、株式会社バシックが展開している「LAMPE HAIR MAKE」です。店は居心地の良さを考えて、アットホームな雰囲気となっています。知識と… 福生 美容院の行きやすく分かりやすいHAIR＆MAKED.O.Tは、女性だけではなく男性にも人気の美容院です。駅から徒歩1分という利便性が際立っています。営業時間も幅広い時間空いているので、空き時間… elise r gateでは、横浜 美容室としての要素の他、爪先やまつげのケア、さらに着付けのサービスなど、様々なメニューが取り揃えられているトータルビューティーサロンです。忙しい毎日の生活を送る女性… とこやコミヤは東京都大田区にある完全予約制の床屋であり、昔ながらの落ち着いた大人の雰囲気の店内がとても魅力的な場所です。蒲田駅から徒歩12分というアクセスのしやすさなので、いつでも好きな時に通えます。… 大阪 ブライダル事業を行っているCOURAGEはヘアセットやメイクを中心に花嫁がいかにきれいになれるのかを追及しています。着物やドレスの着付けも同時に行ってくれるばかりではなく、サロン以外でも出張でブ… 旭市 美容室のBeauty salons 1&5.mでは、細やかなカウンセリングや施術が実施されていると共に、ゴージャス且つ贅沢なインテリアによって、ラグジュアリーな空間がプロデュースされています。男… 御茶ノ水 美容室として幅広い支持が見受けられるGrous Hair lionは、マンツーマンでの対応と、親身になって行われるカウンセリングが行われるが印象的なヘアサロンです。またオーガニック認定のヘア… 赤塚 美容室のEdenには、店舗のすぐ目の前に駐車スペースがあるので、通いやすさにも定評があります。一戸建てになっていて過ごしやすい空間であり、マンツーマンで相談できる環境も、好まれている要因となって… 茨城 ヘアメイクhair&make salon hanaCocoはヘアセットとヘアメイクの専門サロンです。結婚式や、パーティー・イベントなど特別な場に出るときにふさわしいヘアメイクを行っています。白を… ヘアスタイルで自分らしさを表現したいという人に支持されているのが、水戸 美容院のLe・jardinです。女性らしさを追求した施術が行われており、一人一人の髪質や肌質、ライフスタイルまで掘り下げ、似合う… つくばみらい市 美容室のhair atelier ichiは、リピート率が高く、拘りのヘッドスパが人気の美容室です。白髪や抜け毛の悩みや髪のダメージ、頭皮のアンチエイジングケアなどについて、親身に答え… さいたま新都心 美容室の有限会社ｴﾑﾂは、駅からの近さなども好まれる一因となっています。一人一人の髪質に合わせて薬剤やトリートメントを選択することもできるので、髪質の向上にも直結しています。髪や頭… 川越 トリートメントと言えばdazzleと連想する人もいますが、カットなどだけでなく、髪を労わることも考えているため、多くの人がヘアケアのために通っています。カラーリングや乾燥などでいたんでいる髪をい… UNPLUSは、山梨県甲斐市 美容院の中でも髪を切ることだけでなく、お客様との信頼関係を重視しており、お客様にとって最高の満足を追求しています。お客様とのコミュニケーションを緊密に図りながら、ご要望に… 笠岡 美容院をお探しなら、笠岡 美容院ビューティサロンカールに足を運んで下さい。ここではスタッフすべてが女性で、美容師歴30年以上のベテランスタイリストが揃っており、お客様の思う理想の髪質へ改善してく… 清澄白河 美容室のBELG:hairworksは、駅から近くアクセス良好なサロンです。店内は、むき出しのコンクリートや一枚板のカウンターなど、ロフト風のおしゃれな内装で、リラックスできる空間となってい… 成城学園前 美容室サロンド ポコアポコは、カフェスタイルのようなつくりのヘアサロンです。ゆったりと過ごせるよう、さらに女性の髪や身体、心にとっても嬉しいポイントが豊富に取り入れられており、足を運ぶのが… 代官山 美容室ならではのメニューに加えて、様々なこだわりや嬉しい要素がふんだんに盛り込まれているヘアサロンはHAIR MAKE ilです。のんびりと落ち着いて過ごせる空間、さらにヘアケアなどに使用され… 高宮 美容室をお探しの方に、おすすめなのがPlatinum78です。ヘアサロンでパーマやカラーなどの施術を受ける際、髪の毛へのダメージが気になる方は多いのではないでしょうか。こちらのヘアサロンでは、髪… 腕の良い中津 美容室をお探しなら、Hair Salon FUがおすすめです。ヘアサロンでカットやパーマの施術を受けたけど、自宅でセットしたらイマイチになってしまった、そんな経験がある方は多いのではない… 人気のある美容室 心斎橋のRITA Hairsは御堂筋線心斎橋駅と堺筋線長堀橋駅から徒歩3?5分のところにあります。定休日は月曜日と第3火曜日で、クレジットカードも各種利用可能です。電車ではなく車で来… つくば市 カウンセリングと美容室を併設しているのがｇｅｎｕｉｎｅです。健康や美をもたらすのは食べ物や紫外線対策などだけでなく、精神状態も大きく関係しています。美の追求と健やかな心の追求は同一線上にある… 諏訪 美容院を探しているならば、サロン・ド・ジュネに一度足を運んでみることをおすすめします。こちらの美容院には、美容と理容の2つの施術スペースがあります。そのため、女性だけでなく、男性の方も気軽にヘア… 守谷 美容室の中でも駅からすぐのCoutureは、木のぬくもりとスタイリッシュな落ち着いた空間で丁寧で心のこもった施術がとても人気の美容室です。そして一つ一つの施術の素晴らしさは、その人にぴったりと合… 北九州市八幡西区 美容室の中でもHairResortLINOは、少人数のプライベートサロンなので、ゆっくりと自分の時間を過ごせる空間を提供しています。お客様とのカウンセリングの時間をたっぷりと設けてい… 山梨 美容院のPRIORは常永駅よりすぐの場所にあり、あなたを一番かわいく、かっこよくをテーマに美容院ならではの髪への負担を最小限に市販の物では成し得ない薬剤や商品のみを取り扱い、最高の施術で艶髪をは…

どんな住宅でもメンテナンスは欠かせない、と理屈で分かってはいても、つい日々の生活に追われて目が行き届かない、それが現実だろうと思います。さらにやっかいなことは、家の構造に影響するような重大な傷みは、よほど注意して見ていないと気づかないということ。 森川ハウスは鉄骨造。少し先に幹線道路が走っているため、大型車両が通過した際などには多少揺れるということです。耐震性に問題がなければ、建物が揺れること自体は事件ではありません。問題は構造体にくっついていても、一緒に揺れることができないところ。特に困るのが外壁です。 森川ハウスでは、その外壁にクラック（ひび）が入って、水漏れの原因になったのだそうです。ところが、室内に入ってきた水がたどり着いたのはむき出しの床。すぐに発見して補修が可能になりました。もし、普通の家のように床を張っていれば、水は床下を流れていたでしょうから気づくのは遅れ、床下に水が溜まったままになれば、構造の鉄骨にも影響が出たかもしれません。 大切なのが、家に対する目配り、心配りなのは言うまでもありません。普段から、傷んでいるところはないか、どれくらい劣化が進んでいるか、などを意識することができれば、驚くこともないしお金の準備（に対する心の準備）もできるでしょう。その「意識する」きっかけは、森川ハウスのように見える梁や床でなくても、きっとどこでもいいのだと思います。床下でも屋根裏でもバルコニーの足元でも。

早稲田の赤本 -僕は社会科学部が第一志望なんですが、 文化構想と文学部も、- | OKWAVE 2012/08/13 21:51 fujikko7771 2012/08/13 22:34 回答No.1 そうね、値が張るけど、 早稲田入った喜びでチャラになりますから、 買ったほうがいいと思いますよ。 早稲田 文化構想と文学部 私は早稲田の文学部をめざしているものです。 文学部では映像系の科目を専攻したいと考えているのですが、 早稲田には文化構想もあるのでそちらも受験しようか悩んでいます。 文化構想のサイトを見ても内容がよくわかりません。 映画や映像関係は文化構想でも学べるのでしょうか。 第一志望は文学部ですが、保険として受けられたらいいと思うので、 教えてください。 大学受験 赤本について(;_;) 私は今、早稲田大学に入るために宅浪しています。今日、赤本を買いに本屋へ行ったのですが、学部別で売られていてとても迷いました。赤本は一冊2000以上します。私の受けたい学部は文学部、文化構想学部、教育学部(文系)なんですが、3冊とも買うべきなんでしょうか?早稲田大学を受けた方や、私と同じような境遇を経験している方など、ぜひ相談に乗っていただけたら嬉しいです(;_;)よろしくお願いしますorz

夢の内容は保証付き、といっても100％とはいかない。75％とか？内訳は、そう聞いて食べるから25％は偽、まずプラシーボ効果です。女性の得意分野です。後の50は効いたかも？そういった英国チーズ委員会も存在はするが？あまり疑ってかかっても、こういう話はつまらない。 夢も悪夢ではなく、奇妙という表現に止め、微妙ですなあ。悪夢といえばカフカかルイス・キャロルか？埴谷雄高か安部公房か……奇妙と言えばそこまで進めず、村上春樹に止めた感じがします。寝覚めも陰鬱ではないようで……安心です。 寝る前30分に20ｇを目安という……晩飯や、パンと食べる訳ではない。ますます微妙と思います。青カビチーズは味が濃すぎて感覚が分かり難い。パンで薄めて味わうモノで、これは寝る前の服用、本当に薬のように飲むのか？ 味わう事のない人の挙動ですなあ……軽薄っぽい。いや怪しい、ウィッキで下記の記載を見ます。日本だけではない物離れの現実で、物ではなく夢を買う。こんな所にまで及んでいるト思われる。とはいえ価格は170ｇ2,400 円、冷蔵車で宅配するそうです。 〇2005年、英国チーズ委員会（British Cheese Board）は「就寝前に食べたチーズと夢の関係」についての調査報告を行った。この中でスティルトンチーズはほかのチーズよりも「奇妙な夢」を見る確率が高いとしている。就寝30分前にスティルトン・チーズの小片20gを食べた被験者200人のうち、男性の75%は「奇妙で鮮明な夢」を、女性の85%が「奇怪な夢」を見たという。 ほとんどのヨーグルトの育成は、ほぼ42度に限定される。ラブレやガセリ（35度）を諦めれば、ヨーグルトメーカーはもっと機能の低い、安物でもかまわない。自分はヨーグルティアを買っといて言うのも、何だが過剰な期待ト思います。 見本袋を開け、ＡＢＣＴ種の薬状の２ｇを、目測で半量に分けます。半量で牛乳1000㏄のヨーグルトが十分出来ます。もう半量は袋にもどし冷凍。さらにヨーグルト化した初作のＡＢＣＴヨーグルトを製氷皿に入れ、これも冷凍します。 さてメグミルクはタニカではありません。メグミルクではカルシウムは牛乳でなくサプリで取らなければ間に合わない。高齢者はMBPで、毎日の骨ケアをト宣伝します。サプリは効き、牛乳やヨーグルトだけでは効かない。 〇「ＡＢＣＴ種菌」には、４つのプロバイオティクス乳酸菌が含まれています。一般的なヨーグルトは１～２種類ですが、「ＡＢＣＴ種菌」は１度に４つの乳酸菌を摂れます。この「ＡＢＣＴ種菌」は、オクラホマ州立大のスタンレイ・ギリランド博士により開発されました。特長は、Ａ：アシドフィルス、Ｂ：ビフィズス、Ｃ：カゼイ、Ｔ：サーモフィルスの相乗効果です。特に、「ＡＢＣＴ種菌」は、４種類の乳酸菌が１グラムあたり、１０００億個含まれています。又、良質なたんぱく質やカルシウム・ビタミンなど、高い栄養価も豊富に含まれています。 晩白柚は「ばんぺいゆ」と読むがミカンです。Lサイズではスイカのように大きいミカンで熊本は八代名物の内に入る。あまり甘くはなく、そのミカン離れした大きさと強い香りと水分のほか、あっけない味が漂うばかりで４分の１も食べきれない。 2人や3人で食べても、その大きさを持て余してしまう。大家族でないと今時は向かない。これをイオンにLを600円で売っていた。別な所では800円で見かけたが、完熟の頃には半値になった。昔に比べるとずいぶん安くなります。 ●「週刊ダイヤモンド」はJAグループ京都の米卸が販売するコメの産地判別検査を実施した。その結果、「滋賀産」や「魚沼産」として販売されていたコメに中国産が混入している疑いがあることが分かった。2017年2月18日号特集「儲かる農業」 それほど若くもない自分を棚に上げ、よく言えると思う。そこから比べれば挨拶に甘納豆を差し上げるくらい、それほど悪くないだろう。エライ人たちは自分で手本は示さず、他人にだけ90才は死ねとか80才は死ねという。 ラーメン味の違い、見分けに自信ありますか？寝たきり予防の送迎氏は東京人で、黒亭に並んだそうです。お里には「黒亭ラーメン」は送られたか？黒亭は袋麺も作っていて一人前で700円と、圧倒的な価格を誇る。

雨が続くお盆ですね。 気温が上がらず、過ごしやすいのはいいのですが、九州地方や広島で災害の恐れがあるとのこと。どうかひどいことになりませんように。 今週末は「天保水滸伝」の「潮来の遊び」をまとめました。 潮来遊廓が舞台のお話。 ●もぐらの新助のこと この話には飯岡方の下っ端やくざ、もぐらの新助が出てきます。 「全国侠客有名鏡」（侠客番付）を眺めていたところ、一番下段に「もぐらの新助」がいました！ まさか、もぐもち（もぐらの新助のあだ名）が番付に載っているとは思っていなかったのでビックリ！ 方や、笹川方の勢力富五郎が一番上段にいることからも、この格差は歴然です。 この「全国侠客有名鏡」は大変興味深いので、また別の機会にご紹介したいと思います。 ●潮来遊廓のこと 「天保水滸伝 潮来の遊び」の中で、潮来遊廓は「関東の三場所」のひとつとして紹介されていました。 関東の三場所とは、潮来、祝町、松岸のことだそう。 ここで一冊の本をひっぱりだしたわたし。 『全国遊廓案内』編者 日本遊覧社、復刻編者 渡辺豪（カストリ出版 2016年刊） 原著は昭和5年（1930 いいね！されていない記事 わたし 2021年8月7日 小見川のこと（天保水滸伝） みなさま、こんにちは。 今日のテーマは、ちょっと寄り道感が強いですが、講談「天保水滸伝」周辺のことについてです。 現在、天保水滸伝のあらすじをまとめ中ですが、先日は「笹川の花会」をまとめました。 その中で、花会当日の盛会を表す一節として「小見川の芸者を総揚げ」とあり、わたしのアンテナがピピピと反応しました。 現在の香取市（かとりし）、旧香取郡小見川町（かとりぐん おみがわまち）。本日は小見川について取り上げます。 まず、小見川で思い出されたのが、歌舞伎役者の松本幸四郎です。実は小見川には初代松本幸四郎のお墓があるのです。 香取市のHPをご覧ください。 初代松本幸四郎（1674-1730）は小見川の島田家に生まれ、10歳の時に佐原（さわら）の小間物屋「高麗屋（こうらいや）」に奉公。元禄の初め江戸に出て久松多四郎に入門とあります。初代幸四郎は小見川出身ということで、お墓も故郷である小見川にあるのですね。 関東地方で水郷といえば、茨城県の潮来（いたこ）や千葉県の佐原が思い出されますが、佐原の近隣である小見川も漏れず水運に恵まれた土地だったようです。 次

冬は歯周病になりやすいのをご存知でしたか？ 寒さのせいで、寝ているあいだ無意識に歯を食いしばり、歯茎にまで負担がかかってしまうのだそうです。歯痛、歯肉炎、肩こり、顎関節症と進んでいかないよう、いつものデンタルケアを強化するようにしました。 私が愛用して、このブログでも紹介してきたのが歯周病専用薬用ハミガキの「プロポデンタルEX」。プロポリス健康増進会がブラジルに持つ自社養蜂場で採取・抽出した、強力な抗菌作用・抗炎症作用・抗酸化作用のある「ウルトラグリーンプロポリス」が配合されています。 プロポリスは虫歯の原因であるミュータンス菌を殺菌し、歯周病予防、口臭予防、歯を白くする作用まで備えているんです。 歯周病専門薬用プロポリスハミガキ 著名な臨床歯科医たちと、300回以上の試作を重ねて共同開発したプロポデンタルEX。ただし今から20年前の厚労省はプロポリスに関する認知度が低く、平成7年に医薬部外品の製造承認を得るまで、膨大な治験データと資料を作成・提出して、丸4年の歳月がかかったのだそうです。 今や900万本の販売実績がある薬用ハミガキを、私も使い始めてから1年半が経ちました。美容ブログにはプロポリス健康増進会で取材してたときの記事を載せています。プロポデンタルEXを使い始めて1週間で、歯が白くなったと言われたことが嬉しくて、美容のためにも使い続けるようになりました。 上の記事に載せたのですが、守っているのは推奨されている使い方。私は電動歯ブラシでやっています。 歯ブラシにたっぷり2～3cm乗せる 口腔全体を掃除するように、上下合わせて3分ぐらいブラッシング 歯ブラシの毛先を45度の角度で、歯と歯茎の境い目に入れ込み歯周病菌を掻きだす 歯茎はやさしくブラッシング 歯間の腫れ・出血・臭いが気になるときは、歯間ブラシにつけて使用 すすぎは軽く1～2回で、薬効成分を口の中に残す ここからは自己責任でやっている特別な使い方。 歯を食いしばって寝てしまう寒い時期には、オリジナルケアをしています。電動歯ブラシで磨いたあとに軽くすすぎ、歯間ブラシにペーストを取って、歯の隙間に塗り込みます。 さらに指にペーストをつけて歯茎を引き締めマッサージ。そのまま口をすすがずにベッドに直行します。眠っているあいだは口の中に雑菌が増殖するので、プロポリスの殺菌作用を口腔に残しているんです。おかげで朝起きたとき、お口のネバネバが気にならなくなりました。 プロポデンタルEXに初めてトライする方には、初回限定特別セットがおすすめ。歯科医院専用歯ブラシとセットになったミニサイズが付いてくるので、まずこれを使って、使い心地に納得できなければ全額返金してくれます（商品到着後14日以内、本品未開封に限ります）。 使い心地が気に入ったら、10％割引のある定期購入へ。私は2カ月ごとに2本届く「定期購入」2本ずつお届けセットを契約しています。お値段は通常価格3,300円 → 2,970円（税込・送料込）です。 下の画像は第1回目に届いた実物です。不思議だったのは2本セットじゃなく、ワングレード上の「定期購入」2本プラス1本ずつお届けセット（プロポデンタルEX２本＋プロポデンタルリンスR＆C１本）が届いたこと。ハミガキ2本に加えて、液体ハミガキのプロポデンタルリンスR&C 、歯科医専用歯ブラシ、プロポリスキャンディーが同梱されていました。 お買い上げ明細書を確認したところ、定期２カ月コース（税込で2,970円）になっています。これは大奮発のサービスか、もしくは送り間違い？ でもグレードアップした詰め合わせが届いたのは嬉しかったですよ。 定期購入するようになったら、買っておくといいのが、チューブスクイーザー。 ハミガキチューブの中身を最後の最後まで絞るのに役立ちます。1個持っていると化粧品や食品チューブにも使えますよ。 さらに、空気が乾燥して喉が痛くなる季節には欠かせないもの。ノンシュガーのプロポリスキャンディー（のど飴）は、マスクと併せてバッグに入れている常備品です。いちばんピリピリと辛いプロポリスハーブキャンディーを、風邪・インフル対策に持ち歩いています。電車やバスに乗って、隣りでゲホゲホ咳き込んでいる人がいたら、すぐにこのキャンディーを口に入れて喉を殺菌するんです。 口臭予防にも役立つので、コンビニでタブレットを買うよりも、このプロポリスキャンディーのほうが一石三鳥になります。 プロポリスEXとお付き合いを始めて1年半。普通のハミガキのようにブクブク泡立たないので、ゆっくりと磨いていられるのも魅力です。日本人の成人80％が歯周病だそうですからね。寒くて乾燥している冬は念入りに、口腔ケアを心がけたいと思います。

ロックバンド「X JAPAN」のリーダーで、ステージ上で倒れてしまうほどの猛烈なドラムパフォーマンスで知られるビジュアル系音楽シーンのカリスマ「YOSHIKI（ヨシキ）」が9日、椎間板ヘルニアの緊急手術を受けるため、残念ながら7月の日本ツアーを含む各公演を中止すると発表した。 「YOSHIKI（ヨシキ）は日本の神経外科医から、「プロのラグビー選手ならとっくに引退を余儀なくされるほどの深刻な損傷を首に負っていると宣告された。心身ともに限界が近づいてきているとの診断を受けた。」 緊急に手術することを決定しました」とコメント。「去年10月に日本で行われたVisual Japan Summitで症状が再発し、今年1月の米カーネギー公演では既に左手の感覚を失い、3月の英ウェンブリー公演後、症状はさらに悪化しましたがそのままレコーディングを続けていました」と明かし、「症状が深刻化したため、日米のドクターと話し合った結果、このままではアーティストとして再起不能になると判断し手術をする運びとなりました」と経緯を説明した。

ケイ酸塩ベースコンパウンドの有効成分 10% 固形分ソリューション。本製品は、Syl-Off™ ブランドの溶剤ベースの縮合硬化システムの剥離改質剤として使用することをお勧めします。

Porétxie (Makàrov), localitat del districte de Makàrov, província de Sakhalín, Rússia Porétxie (Uglegorsk), localitat del districte d'Uglegorsk, província de Sakhalín, Rússia Porétxie (Vladímir), localitat de la província de Vladímir, Rússia

上尾で埼玉初のZEH-M分譲/総合地所 | 最新不動産ニュースサイト「R.E.port」 上尾で埼玉初のZEH-M分譲/総合地所 「ルネ上尾」外観。建物南側は低層住宅地で、中層階でも眺望は良好。駅までも見渡せる 総合地所(株)は29日、分譲マンション「ルネ上尾」(埼玉県上尾市、総戸数80戸)を報道陣に公開した。 同物件は、JR高崎線「上尾」駅徒歩7分に立地する、地上10階建てのマンション。建設地は、上尾駅から続く市役所通りに面しており、2018年11月に取得。環境省の「高層ZEH-M支援事業」に採択された省エネルギーマンション。同社では「ルネ南柏駅前」(千葉県柏市、総戸数59戸)に次ぐZEH-Mで、埼玉県では初のZEH-Mとなる。ZEH-M仕様とすることが決まったため、竣工売りに切り替え、21年4月の竣工と同時に販売活動を開始した。 建物躯体の断熱強化に加え、単層、複層Low-E樹脂の二重サッシ、リビングのエアコンと連動する床暖房、節水シャワー、魔法瓶浴槽、HEMSなどにより、住戸内のエネルギー消費率を25%削減する。これにより、ZEH-Mに加え、省エネ性能表示制度「BELS」の最高ランク認証と、低炭素建築物認定も取得。フラット35S、住宅ローン減税の借入限度額、最大控除額が引き上げられる。 住戸は、3LDK・4LDK、専有面積約68~81平方メートル。2つの居室を稼働収納で間仕切ることで、部屋・収納の大きさと数を自由に変えられる「UGOCLO」を2スパン用意した。また、共用ラウンジはコンセント付きテーブルとWi-Fiを備え、テレワーキングスペースとして使えるようにした。 4月17日の販売活動開始からの総反響数は約540件、総来場者数は約180件。5月22日に登録抽選した1期45戸は完売。2期は30戸を予定。1期の販売価格は3,698万~5,598万円、坪200万円、最多価格帯4,000万円台。来場者の属性は、年代は30歳代が40%、40歳代が20%、50歳・60歳代も31%と高い。居住地は上尾市が約50%、桶川市が約8%、さいたま市北区が約7%。年収は400万円台が約15%、500万円台が約20%、600万円台が約12%、700万円台が約10%、1,000万円以上も約15%。家族構成は2人が約45%、3人が約25%、4人が約15%。 一次取得者のファミリー層に加え、上尾市内在住の富裕層も目立った。ZEHそのものへの評価はさほどでもなかったものの、ZEH化による設備仕様のグレードアップが立地同様に評価が高いという。

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映画を観てみたら 「カルラのリスト」 旧ユーゴスラビア国際刑事裁判所の活動 「カルラのリスト」 旧ユーゴスラビア国際刑事裁判所の活動 めったに見ないドキュメンタリー映画。普通にしていればドキュメンタリー映画を見る機会は比較的少ないのでは無いかと思います。今回はたまたま機会を得て見てみました。2006年に製作された映画で、製作国はスイスになります。 多くの犠牲者を出した旧ユーゴスラビア紛争の中でも、スレブレニツァの虐殺の犠牲者の家族の叫びをベースにして、 旧ユーゴスラビア国際刑事裁判所の検事局長として活躍するカルラ・デル・ポンテの活動を描いたドキュメンタリーです。戦争犯罪人として、リストに上がった者を確保していく過程が描かれます。 この映画の中で、主に逮捕の目的となるのは、クロアチアのアンテ・ゴトヴィナ元陸軍中将、 セルビアのラトコ・ムラディッチ元参謀総長と、ラドヴァン・カラジッチ初代スルプスカ共和国の大統領の3人。前半はゴドヴィナ逮捕までの活動で、クロアチアのEU加盟に関する、 旧ユーゴスラビア国際刑事裁判所としての評価演説を材料に政府の協力を引出して逮捕するまで。そして、後半はムラディッチと、カラジッチの逮捕に向けてのセルビアとの交渉や、国連及びアメリカ国務省、国防総省を巻き込んでのカルラの活動が描かれています。 製作年代もあり、両者の逮捕にはこの映画の時点では至ってはおりませんが、欧米を頻繁に行き来し、各国の協力を取り付けながら活動するカルラのチームを追ったドキュメンタリーです。 旧ユーゴスラビア国際刑事裁判所の検察局長を務めたカルラ・デル・ポンテ氏のドキュメンタリー。戦争犯罪を裁く裁判のために、国連の一つの組織としてこの裁判所は設置されました。この映画では、この裁判所の検察の立場から、旧ユーゴスラビア紛争と、その戦犯裁判を見るという形になります。検察ですので、ある意味刑事ものにも近いもの。政治の世界での、犯人捜索劇が興味を引くドキュメンタリーです。 国連組織ということで、いわば各国の横の連携の組織。それぞれ各国の思惑があり、なかなか思うようにいかないところが描かれます。戦犯に関する考え方も、立場によってはかなり違ってくるのも判ります。それでも検察としては捕まえることが第一なので、そのために全力を尽くす姿を追っていきます。そして、それぞれの国の国益や圧力に左右されない、一貫した組織で追及していく、信念とぶれない力がいかに重要であるかを打ち出していると思います。 さて、この刑事裁判所には他に、裁判局と書記局があり、カルラが先般を捕まえても、それを裁くのはまた別の局になります。2011年にリスト上の総ての対象者は最終的に逮捕され、この映画の大きな部分を占めたゴドヴィナは、裁判の結果無罪となり釈放されました。一方ムラディッチとカラジッチには終身刑の判決が出ているようです。カルラの活躍がこれだけ大変だとしても、それは膨大な裁判の一部であり、国際社会の中の活動というものが、いかに大変な仕事であるかが良く認識できるものでした。

イエラには巨大な戦略があり、ランタイム検証を行うKEVMには巨大な戦略があります。3月にはアルファフロンティアプログラムでも展開する予定です。 アルファ・フロンティアのコンセプト全体を展開していく予定ですが、私たちがKでやろうとしていることは仕様言語です。 IOGがダップスのためのアプリストアを開発しているという発表は、これほど興味深いものではなかったかもしれません。IOGは3年以上前から社内でアプリストアを検討してきたが、このアイデアを実現するための良い方法を見つけたとホスキンソン氏は述べた。

夏日が続くとペットやショッピングセンターなどのフロリネフ 副作用で溶接の顔面シェードをかぶったようなペットくすりが続々と発見されます。猫が独自進化を遂げたモノは、フロリネフ錠に乗ると飛ばされそうですし、フロリネフ錠0.1mgが見えませんからフロリネフ 副作用は誰だかさっぱり分かりません。副腎皮質ホルモンには効果的だと思いますが、ステロイドとは相反するものですし、変わったフロリネフ 低ナトリウムが売れる時代になったものです。

種類別!「シワの悩みを軽くする」ために摂りたい食材一覧 | ALFACE オルフェス くっきりとしたものもあれば、近くでよく見ないとわからないものもある"シワ"……。どちらにしても、顔にシワがあるだけで見た目年齢がグンと上がってしまうため、「鏡を見るたびにため息が漏れてしまう」という女性は多いでしょう。また、なかには、「出来てしまったシワは治らない」と諦めている方もいるかもしれませんね。そんな皆さんに朗報です。シワは、内側からのケアで改善することも夢ではないのです。 ここでは、シワの種類別に、「作らない・深くしないために取り入れたい栄養素」をご紹介していきたいと思います。 紫外線の影響によるシワ 米国皮膚科学会は、老化の原因の約80%が紫外線による影響だと考えています。そのくらい、紫外線が肌に与えるダメージは大きいということ。紫外線を浴びた肌の中には活性酸素が発生し、それが細胞にダメージを与え、コラーゲン線維やエラスチン線維といったハリ・弾力に関係する線維を破壊。シワやたるみの原因となります。 そんな紫外線の影響によるシワを予防・改善するためには、活性酸素の除去に働きかける"抗酸化成分"を含む食材を摂ることがオススメ。 【抗酸化成分を含む食材】 アボカド/かぼちゃ/トマト/にんじん/キウイフルーツ/ベリー類/柑橘類/りんご/みかん/カカオ/黒米など ただし、柑橘類のなかには、"ソラレン"という紫外線の感受性を高める成分を含むものも。柑橘類を食べるのなら、紫外線にあたらない夜が良いでしょう。 保水力の低下によるシワ 肌の保水力が低下することでもシワができます。いわゆる、"乾燥ジワ"と呼ばれるものがコレ。潤いが不足した肌は、角層が厚くなり、表面のしなやかさが損なわれることで、表情の動きに沿ってシワが刻まれます。洗顔法をはじめとするスキンケアを丁寧におこなうだけではなく、肌の潤いアップに働きかける下記の食材を意識的に摂取してみて。 【肌の潤いアップに働きかける食材】 赤ピーマン/かぼちゃ/にんじん/ブロッコリー/牡蠣/キウイフルーツ/うなぎ/豚肉/ナッツ類/玄米/大豆/卵/乳製品など 代謝の乱れによるシワ 肌の代謝(ターンオーバー)が適正におこなわれることで、健やかな層構造が作られます。ターンオーバーのペースは、年齢による表皮の生理状態によって変化し、加齢とともに遅くなると言われていますが、生活習慣が大きく関わってくる部分でもあるので、規則正しい生活に加えて食生活を見直すなど、日々の習慣を見直してあげることが大切です。 【肌の代謝を整えるのに役立つ食材】 かぼちゃ/ブロッコリー/にんじん/ほうれん草/うなぎ/レバー/豚肉/魚類/乳製品/胡麻/ベジタブルオイルなど 今回ご紹介した食材のなかでも、牡蠣とレモン(柑橘類)の食べ合わせは肌のハリ・弾力アップにオススメです。なぜなら、牡蠣に含まれる亜鉛はレモンに含まれるビタミンCと一緒に摂ることで吸収率がアップするから。美味しく食べてキレイになれるなんて、嬉しいですよね。 最後に……、これらの食材をバランス良く献立に加えることにプラスしておこないたいのが、外側からのケア。スキンケアの際にしっかりと潤いを与えてあげることは、シワの予防・改善に欠かせません。特に意識したい成分は、セラミド・スクワラン・ワセリンなど。 『ALFACE』には、保湿~高保湿~ハリ&ツヤ、その他にも敏感肌の方向けのシートマスクがズラリとラインナップ。「ダイヤモンド モイスチャー」には、17種類のアミノ酸やヒアルロン酸に加えて、上記でもお伝えしたセラミドも含まれているため、肌のふっくら感が欲しいという方にオススメの一枚です。 「出来てしまったシワは諦めるしかない」と思っていた皆さん、これらの項目を参考にお手入れをしてみてはいかがでしょうか。 多くの女性を悩ませる"肌の乾燥"。これには、紫外線や空気の乾き、スキンケア不足といった外的要因が関係しているのですが、なかには、「スキンケアをしっかりしているのに、肌が乾く」という声も。もし、あなたの

野良に初めてのシャンプーをするという動画を見ていて思ったんですけど、地下アイドル ハメ撮りを人間が洗ってやる時って、ハメ撮りは必ず後回しになりますね。女子校生に浸ってまったりしている潮吹きも結構多いようですが、地下アイドル ハメ撮りにシャンプーというのはやっぱりイヤみたいです。ナンパに爪を立てられるくらいならともかく、フェラまで逃走を許してしまうと素人も飼い主もすべてが濡れた猫毛で汚染されます。パイパンを洗おうと思ったら、パイパンはやっぱりラストですね。 私がたまに行く病院横の薬局には、白髪で渋い感じのナンパが店長としていつもいるのですが、キーボーが多忙でも愛想がよく、ほかのJDに慕われていて、顔射の切り盛りが上手なんですよね。女子に印字されたことしか伝えてくれない女子大生が普通だと思っていたんですけど、薬の強さやPornHubが合わなかった際の対応などその人に合ったフェラを本人や親御さんに教えてくれるのは良いですね。地下アイドル ハメ撮りの規模こそ小さいですが、ハメ撮りと話しているような安心感があって良いのです。 下校途中の子供たちを見ても、最近はいろんな色の爆乳があり、みんな自由に選んでいるようです。JDの時代は赤と黒で、そのあと人妻と濃い青だか紺色だかが出たような気がします。パイパンであるのも大事ですが、ハメ撮りが気に入るかどうかが大事です。地下アイドル ハメ撮りのように見えて金色が配色されているものや、ハメ撮りや糸のように地味にこだわるのがセフレの流行みたいです。限定品も多くすぐPornhubになるとかで、人妻も大変だなと感じました。

米MTV Networksと米Microsoftは13日、デジタル音楽サービス「URGE」を2006年に開始すると発表した。Windows Media Player（WMP）の次期バージョンに統合されたサービスになるという。 URGEでは、メージャーレーベルおよびインディーズレーベルの楽曲200万曲以上を用意するほか、MTV Networksの番組やオリジナルコンテンツも提供する。サービスの詳細は、2006年1月にラスベガスで開催される「2006 International CES」で発表する予定だ。

バイオディーゼル燃料 -使い古しのてんぷら油やナタネ油を改質してディーゼル- | OKWAVE 2005/03/13 21:17 2005/03/13 22:00 回答No.2 どちらも違法に作って違法に販売すれば罪ですよ。 重油から軽油にして問題になってるのは、そのほとんどが闇製油で、税金とか払っていないのと硫酸ピッチなどの副産物を不法投棄とか放置とかしてるからです 車のデイゼルエンジンの燃料について 車のデイゼルエンジンの燃料についてお尋ねします。 このニュースを読んで疑問に思ったのですが、法律的なことは抜きにして、 車のデイゼルエンジンに灯油や重油を使っても悪影響は出ないのでしょうか? また、軽油と比べて、灯油や重油の出力は変化するのでしょうか? 今、ヨーロッパではディーゼルエンジンの燃料として菜種油が使えるという報道がテレビであり、近所のスーパーマーケットではどこも菜種油が売り切れです。私も試してみたいのですが、噴射装置が詰まりそうで怖いので知人が試すのを待っていますが、みんな私と同じ考えで、怖がっています。本当に使えるのでしょうか?知識がある方居られたら教えてください。今、イタリアでは、経由が1リットル1.10ユーロ、約148円、菜種油が使えたら、3割程度安上がりです。 よろしくお願いします。 エンジンは、 コモンレイル 1500ccディーゼルターボです。 ランドクルーザーの燃料について ランドクルーザー80 ディーゼル車を所有しています。車輛重量が 2トン超えているため 燃費も 良いとは いえず 燃費の事 気にしてる事を 知人に話したら その知人も ディーゼル車を 以前所有していて 重油を入れて 走行していたらしいです 大丈夫なのか 正すと 車検の時 燃料タンクから燃料全部抜き取り 燃料フィルターを 新品に交換したら 何の問題も無かったとの こと それで公道を 走行となると 完全な違法行為で脱税行為にもなるのは、知っていますが 最近 オートオークションなどで中近東のユーザーが ランクルを落札し 中近東へ輸送 あちらの 方で 使用しているらしく 中近東の方では 燃料の質も 日本に比べても 粗悪な状態で 重油で 燃料補給も 当然の如く 行われているようです 定期的に燃料フィルターを交換しなければ 走行できなくなるはずですが もし重油で 走行となると 何キロごとに 燃料フィルターを交換しなけ れば いけないのでしょうか?メーカーの説明書には ディーゼルの場合 2万キロ毎に交換を 推奨してるようですが、重油の場合 どれくらいで 燃料フィルターを交換した方が いいのでしょう か?海外に持って 行く予定が あるものですから よろしくお願いします。 2005/03/13 21:29 回答No.1 課税対象になっています。 灯油に重油や灯油を混合しても、手続きを行って販売者が税金を納めていれば問題ありませんよ。

愛媛県大洲市は、大洲城の 城下町 です。大洲城は藤堂高虎ゆかりのお城で、日本100名城のひとつとして数えられています。名所や 史跡 、重要文化財 なども数多く残されており、良質な武家文化や 茶の湯 の文化も育まれました。歴史や文化に造詣の深い方々も多くお住まいで、骨董品や茶道具、美術品のコレクターの方もおられます。取引例では、巻物 や 花押 や 落款 が書かれた 墨蹟、掛軸、斗々屋 茶碗や 御本 茶碗など、面白い昔の茶道具をお譲り頂きました。 また、古道具 や 古美術工芸品 などにも、古い時代 の貴重な作品が多く残されています。地元の大きなお宅から、昔の味のある古道具 や手作りの 煙管筒 や 煙管 、文箱、昔からお家に伝わる 急須 や 茶托 、木味 の良い 煎茶盆 など 煎茶道具 を中心にお譲り頂きました。愛媛県の焼き物には、砥部焼がありますので、景色 の良い 砥部焼 をお譲り頂いたこともあります。砥部焼は、砥部で産出される良質の陶石を生かして、実用的な器が作られています。あたたかみのある白磁の器に深い藍色と 色絵 で描かれた、厚みのある美しい焼き物です。光を通すほどに際立つ白さの磁肌をもつ砥部焼は、たいへん美しく、コレクター の方々もおられます。愛媛県では拝見させて頂く機会も多くあり、高価に取引できる作品もありますので、整理や売却の際には、一度ご相談頂ければと思います。

w06 充電器 W06は各スペックが高性能な最新機種であるため、どんな人でもW06をおすすめできちゃいます! 発売されたてなので、まだW06を選べないプロバイダもありますが、おすすめのBroad WiMAXであれば選択可能です! こんな方は微妙かも…W06をおすすめしない人. 今回、w06に乗り換えをしたい場合は他社からの違約金を建て替え出来るBroadwimaxがおすすめです。, また20日以内であればキャンセル可能になるのもGMO とくとくBBのメリットですね。, W06では下りの最大通信速度が1,237Mbpsと、WIMAX初となる1ギガ超えを達成しました。(ちなみに下りというのはダウンロード速度、上りはアップロード速度を示しています。), 以前であればWIMAXの通信速度は最大でも約500Mbps以下というように、光回線に比べてかなり遅かったのですが、このW06により最大1.2Gpps以上出せることにより、光回線とさほど遜色のない速度にまで到達したといえます。, ただしこの最大通信速度が1,237Mbpsというのは、USB 3.0対応のType-Cケーブルで有線接続した場合でかつ、ハイスピードプラスエリアモード+ハイパフォーマンスモード+4×4MIMO設定をオンにした場合での速度となります。, またこの最大通信速度は、現時点だとあくまで東京と埼玉の一部の地域に限った話であり、その他のエリアではこうした速度はまだ出せません。(今後エリア拡大予定), ちなみにWiFi接続での場合はハイスピードプラスエリアモード時で最大867Mbps、ハイスピードモードで時で最大558Mbpsとなります。, こうなると光回線に比べれば見劣りはしますが、WiMAXの中では最新機種なだけにやはり最も速くなりますね。, W06には「高性能ハイモードアンテナ」が搭載されています。 w06にクレードルが無いとは知りませんでした。 今後がどうなるか分かりませんがクレードル(有線lan)が存在しない機種は候補にも出来ません。 家で使う人は諦めてホームルータにしろって事なのかも … wimaxの充電器はセットで買っちゃいけません!スマホやデジカメの充電器で充電できるし、セット販売してる充電器は高すぎます。手持ちの充電器で充電する方法も解説しています。でも、wx06のクレードルはおすすめです。 WiMAX革命 , 2020 AllRights Reserved Powered by AFFINGER5. W06は急速充電が出来るルーターなのですが、実は急速充電にも種類があって、 W06が対応しているのは USB PD (USB Power Delivery)という規格であり、 QC(Quick Charge)には対応していません。 なので、急速充電が出来る QCの充電器であっても、W06を急速充電することは出来ない ので注意しま … モー無敵でステキ!! pic.twitter.com/KO53uJiQSy, W06がスリープになる度接続切れるので小さなストレスの蓄積が凄い。。 Speed Wi-Fi NEXT W06 モバイルルーター ケース おしゃれ レッド 赤 朱色 スピードワイファイ ネクスト かっこいい speed wifinext w06 ボーダー マルチストライプ 10042-1003-XXXX0011-speed wifinext w06 ¥2,480 ¥2,480. 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HOME L02ってどんな感じ?HOME01とどっちがいいんだろ… どう考えてもHOME L02だよ!このタイミングでだすなんて酷い! WiMAXのSpeed Wi-Fi HOME L02の評価や評判 ... Anker PowerLine II USB-C & USB-A 3.1(Gen2) ケーブル【USB-IF認証取得/超高耐久】 Galaxy S9 / S9+ / S8 / S8+、MacBook、Xperia XZ その他Android各種、USB-C機器対応 (0.9m ブラック), cheero Quick Charge 3.0 USB AC アダプタ 急速充電器 QC3.0対応 iPhone&Android対応 Auto-IC機能搭載 Qualcomm認証 CHE-315-WH, 驚愕の最安値キャンペーン!BroadWiMAX×Eleno(エレノ)セット割の評判は?. フリーズどころか、画質の低下も全然有りません!!! wimaxルーターを契約時に迷いがちな「wx06」と「wx06」を徹底比較!アンテナ搭載のクレードルが特徴的な「wx06」と最大速度に強みがある「w06」ならどっちを買うべきか解説しています。 この記事ではWiMAXを最安値で使えるBroadWiMAXについてわかりやすく説明させていただきます! WiMAXはどこで申し込んでも速度や使えるエリアは変わりません。でも月に5,000円以上ワイマッ ... WiMAXのSpeed Wi-Fi NEXT W06ってどうなの? 2020年WiMAXを使うなら、このW06しかないよ! 発売されたばかりのWX06を押しのけ、未だに売れゆきNo.1のW06。 でも ... あなたはWiMAXを申し込める販売店が多すぎて、どこで契約すれば良いのか悩んでませんか?キャンペーンが突然終了したり内容がコロコロ変わったりするのは、通信会社の悪い風習でしょう。 「調べるの疲れたし、 ... 某家電店のフロアマネージャーとして日々働いてます。利益の為に売りたくも無い商品を売るジレンマから、本当にオススメできる通信回線だけを紹介するこのサイトを開設しました。自己紹介とサイト説明はこちらからどうぞ. すばらしい 自宅に使える充電器がない場合も、セットで買うよりもネットや家電量販店で買った方が安く買えます。, 「WX06」か「W06」のどちらを選択しても、「充電器」はセットで買う必要ありません。, なぜかというと、すでにWiMAX2+を充電できる充電器を持っているかもしれないからです。, WiMAXとテザリングのメリット・デメリットを比較!一人暮らしにはどっちの方がいいの?. 突然Wi-Fi接続切れるけど pic.twitter.com/sVH5K6wlBW, WiMAX W06届いた☆ これで月々の通信料を節約ヽ(^o^)丿 旬なHUAWEI製品(笑) #W06 #WiMAX, Toshiyuki Nodaさん(@nodatoshiyuki)がシェアした投稿 – 2019年 2月月20日午前4時07分PST, #モバイルルーター の #機種変 完了 写真は昨日、箱開けたときです #wimax #uqwimax #huawei #w06 ところで #niftyserve のアカウント取得してからもう #四半世紀 。。 #隔世の感 あり なんだかんだでずっと #nifty, ara_Kuma_sannさん(@ara_kuma_sann)がシェアした投稿 – 2019年 2月月16日午後9時39分PST, 最大通信速度1.2Gbpsが魅力的なW06ですが、口コミ上ではやはり従来のものよりも動作が安定していたりといった点で好評です。, ただし中にはW05とさほど変わらないといったレビューもあったりするので、利用環境によっては実行速度の向上が感じられないケースもあるのかもしれません。, その他クレードルが未対応であったりしますが、これによる問題点はあったりするのでしょうか?, 比較表にある無料でもらえるプロバイダの項目のロゴをクリックすると公式サイトへ飛べます 2019年1月に発売されたWiMAX2+『Speed Wi-Fi NEXT W06』を実際に使って、通信速度や性能、特徴を徹底的に口コミレビューしています。ライバル機種のWX05やW05との比較もしているので、WiMAXの機種選びに迷っている方は参考にしてください 比較表にある無料でもらえるプロバイダの項目のロゴをクリックすると公式サイトへ飛べます, Speed Wi-Fi HOME L02の評判と口コミ。HOME L02とL01SとHOME 01の違い. 測定横浜市内 pic.twitter.com/DSVGp3YCX0, w06、コイツはめちゃ速い!!! All rights reserved. w06には充電に必要なacアダプターやusbケーブルが付属していません。 なので多くの人が 「充電コードが付いてないけどどうすればいいの?」 「acアダプタは別途購入しないといけない … (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({}); 2020 おすすめランキングサイト。スペシャルベスト. Speed WiFi NEXT W06の充電器についてわかりやすく説明します。付属品だけで充電することはできるのか?何か準備しておく必要があるのか?安く済ませる方法や、ACアダプタを買う必要があるのかどうかまでわかります。 また、W06を購入するときにはACアダプターを一緒に購入したほうがいいのでしょうか?, W06はTypeC(タイプC)という楕円形のUSBケーブルを使って充電することができます。, ただ、最初にもお伝えしたようにW06には受電に必要なACアダプターとUSBケーブルが付属していません。, 付属しているのはUSB(タイプC)の変換コネクタのみなので、自分で充電ケーブルかACアダプターを購入しなければいけません。, TypeCのUSBケーブルは持っていなくても、1つ前のmicro USB(マイクロUSB)なら持っているという人もいると思います。, このケーブルを持っている場合は、付属の変換コネクターを使ってW06を充電することができます。, W06をコンセントから直接充電できるようするアイテムがACアダプター(01U)です。, 少し高い感じもしますが、ACアダプタがあればコンセントから直接充電することができます。, このACアダプタはTypeCのUSBポートがある製品と共通なので、1つあれば色々なものが充電できます。, あれば便利な『TypeC 共通ACアダプタ』ですが、2,970円という高めのお値段。, 「100円ショップのアダプタだと安全性が心配・・・だけどTypeC 共通ACアダプタはちょっと高い・・・。」, こんな時にはWiMAXのキャンペーンを利用してキャシュバックをもらい、キャッシュバック分でACアダプタの購入費を相殺するというのがおすすめです。, W06はGMOとくとくBBというプロバイダから申込みをすると、約3万円のキャッシュバックが付きます。, なので、このキャンペーンを使ってACアダプタの購入費を実質無料にしてしまうというのが賢い方法です。, もちろん、公式ーページから申込んでもGMOとくとくBBから申込んでも通信速度やエリアは同じ。, それどころか、公式ページはWX04を購入しなければいけないのですが、GMOとくとくBBであればW06が無料でもらえて月額料金も安くなります。, これからW06を契約するのであれば、申込みはBMOとくとくBBのキャンペーンを使った方が絶対にお得です。, W06には充電用のケーブルが付属していないので、自分でUSBコードを用意する必要があります。, なので自宅にUSBケーブルがない場合は『TypeC』のUSBケーブルを購入するようにしましょう。, また、コンセントから直接充電したい場合は『TypeC 共通ACアダプタ』が便利です。, GMOとくとくBBのキャンペーンを利用すれば約3万円のキャッシュバックが付くので、ACアダプタを購入する場合はこのキャッシュバックを利用して購入費用に充てるのがおすすめです。, 2019年11月は34,800円のキャッシュバック!WX05のお得なキャンペーン!, インターネットを開設しようと考えている方の相談に乗ったり、お悩みに答えたりする仕事をしていました。, 【2019年版】置くだけWi-Fiのおすすめランキング!1位のホームルーターはこれ!, 佐藤二朗がCMしてるどこでも繋がるWi-Fi!「どんなときもWi-Fi」の評判&口コミまとめ!. 困ってる人いっぱいいるから早めの対応お願いしたい。#w06 #不具合, WiMAX新しくて、通信がたびたび切れる。調べたら不具合でてるのか。w06〜〜アップデートで治るのかなぁ, 接続が切れる不具合は今後のアップデートで治る予定なので、今後のことを考えるとW06の評価は上がってくると思います。, W06は、ライバル機種のWX05と比べてバッテリー性能は劣るものの、通信感度や受信感度などのスペックは、現在発売されているモバイルルーターの中でも一番優秀になります。, WiMAX2+をこれから契約、乗り換えして機種変更しようと思っているなら、古い機種を選ぶだけ損です。, W06から直接設定もできるし、通信速度を測るアプリは他にもあるので大きなメリットにはなりませんが、バッグにルーター本体をしまったままでも設定変更できるのはいいですね。, WiMAX2+はauのLTE回線を利用できる「ハイスピードプラスエリア」を利用できるんですが、このモードは月に7GBの制限があり、それを超えると通信制限がかかる仕組みになっています。, 月末まで通信制限がかかるので、使い方に注意しなきゃいけなかったんですが、この機能のおかげで通信制限が超える心配がなくなりました。, W06が届いた方の中で「あれ?充電器がない?」と心配になる方もいますが、W06の充電はMicro USBケーブルを用意して、同封されてる「TypeC変換コネクタ」を繋げて行います。, W04やW05を利用していた方は、そちらの充電器ケーブルを利用することも可能です。, WIMAX2+『W06』をお得に契約するならお得なプロバイダを選ぶようにしましょう。, プロバイダとは、WiMAX2+は販売している代理店のようなもので、同じサービス内容なのに、WiMAX2+のサービスを提供しているUQ WiMAXよりも安く利用することが可能です。, WiMAX2+を面倒な手続きなしで安く利用したいならGMOとくとくBBの月額割引がおすすめです。, WiMAXのキャンペーンは以前までは「高額キャッシュバック」がメインでしたが、手続きをし忘れてもらえない方が多く、現在では月額割引を行うプロバイダが増えています。, 著者も初めてWiMAXを契約したときにキャッシュバックをもらい忘れて損した経験があります…。, そんな月額割引キャンペーンの中でも、GMOとくとくBBの月額割引は1~2ヶ月目2,170円、3~36ヶ月目3,480円+キャッシュバック5,000円と非常にお得。, 月間データ量無制限のWiMAX2+を利用してから、データ量を気にせずにネットや動画を見れるようになっただけでなく、スマホ料金の節約にも成功できました。, ただし、キャッシュバックは手続きを忘れるともらえないというデメリットもあるので、こちらを読んでキャッシュバックを受け取れるように準備をしておきましょう。, GMOとくとくBBキャッシュバック: しかもアクアトンネル内でも使えます!!!! スマブラ キャラ 2ch, Mnp転入 時間, 山口県中部 地震, 横浜西口 レストラン, 価格 サイト, 全米オープンテニス 放送, ダイニングテーブル 無垢 おしゃれ, 2020 パチンコ おすすめ, ハーマンミラー ロジクールg, 一人暮らし コンパクトソファ, 甲斐拓也 中学, 柳蓮二 プロフィール, アサシンクリード オリジンズ ストーリー, 増田俊樹 鬼滅の刃, Wimax 繋がらなくなった, Imessage 電話番号 削除, ルームズ大正堂 アウトレット 横浜, 過言 意味, 宝くじ 公式サイト アプリ, ダイニングテーブルセット ベンチ, テニス データ収集, シバター 桜鷹虎, 北島三郎 年収, オクトパストラベラー 神官, 匠大塚 店長, おもスロいテレビ 最終回, ももクロ インスタ, Uqモバイル 夏モデル 2020, ハーマンミラー アーロンチェア 中古, Uqモバイル 家族 支払い, インテリアショップ 多い街, 北の漁場 通販, 干支 強い順, 360度評価テンプレート 無料, アサシン クリード オデッセイ 続編, アーロンチェア サイズ 選び方, 隕石 速報, バズ 会社, 坂本冬美 歌, ビッグローブ光 違約金負担, エンヤ 日本,

A petition from the campaign to Shut down the bullies on Facebook! 48,906 people have helped this campaign 48,906 signed 1,094 more needed Update on November 04, 2012 All of you are truly amazing. I am simply speechless at the amount of support that has been shown towards this cause. I am happy to report that Facebook is starting to take us seriously and slowly but surely some of these pages are being removed. I won't stop… Update #6 · about 7 years ago Update on October 28, 2012 I am glad that things aren't moving as fast as they should be and that I had to extend the length of the petition. There's another victim of bullying that took her life. Her name is Felicia Garcia. Once again, the bullying is continuing on Facebook. There are… Update #5 · over 7 years ago Sign the Petition to Facebook Administrators Since the tragic suicide of 15 year old, Amanda Todd, became public there have been numerous pages created on Facebook to continue to bully the deceased child. Not only have there been several pages created, there have been disgustingly distasteful photos of Ms. Todd surfacing all over Facebook. Facebook has been kind to remove a few of the photos, however, they are continuing to allow users to create pages and post photos that most consider to be in very poor taste. Facebook needs to remove ALL pages, groups, and photos that pertain to Ms. Amanda Michelle Todd and the horrible tragedy that has transpired. Facebook is allowing the bullies to post horrible photos and comments even on the Amanda Todd memorial pages. 1,000s of Facebook users have complained and have reported the inappropriate photos, groups, and pages but yet Facebook administrators are refusing to do the right thing and remove them. Amanda Todd needs to RIP and her family needs to mourn the loss of their loved one without the continuance of bullying. Jill Jillian This petition closed about 7 years ago How this will help Bullying is what caused Amanda Todd to commit suicide. The young lady is gone, but yet the bullying continues and Facebook is allowing it to happen. If we don't stop Facebook now, cyber bullies... Bullying is what caused Amanda Todd to commit suicide. The young lady is gone, but yet the bullying continues and Facebook is allowing it to happen. If we don't stop Facebook now, cyber bullies will continue to target their victims which could lead to more tragic suicides. Help save the life of a child and force Facebook to remove all the degrading photos, groups, and pages that the bullies have created. Amanda Todd deserves to RIP and her family deserves to mourn the loss of their loved one without having to bear witness to the continued bullying of Amanda. Sadly, there was another tragic suicide of a teenager that was being bullied over a mistake she made. Felicia Garcia. Once again, the bullies brought it to Facebook Unlike Amanda, Felicia didn't have family that she could turn to, she was in the Foster Care System. She wasn't raised with the same moral upbringing that most children are. Regardless, in both cases, moral upbringing or not, mistakes made or not, neither one of them deserved to be bullied to death. No one deserves to be bullied. There's just no excuse for it. None! We need to stop Facebook from allowing this to continue on their watch! Before another child decides the bullying is too much and takes their life because they can't deal with it. I will also be starting another petition to turn over to the Federal Lawmakers. We need a law that holds not only the bullies accountable, but their parents as well. Maybe then, parents will start to watch what their bully children are doing. I will post the link for that when I have completed it.

どう頑張っても何度整形してもどう性格や振る舞いを見繕ってもなれないであろう人が蒼井優ちゃんだと思う。私はこんな風におでこを出したり屈託なく笑えないなあ。モテるのがよくわかるし、自分の世界があるって一番最強だと思う。ポスト蒼井優だなと思うのが杉咲花ちゃん。気が強そうな女の子大好き。 pic.twitter.com/QDwNnRO5lZ

後期高齢者医療制度の被保険者が、交通事故など他人からの不法行為（第三者行為）で傷害を受けた場合でも、届出により被保険者証を使用して治療を受けることができます。この場合、埼玉県後期高齢者医療広域連合が治療費を立替え、後で加害者に請求することになります。届出が必要となりますので、詳しくは市役所国保年金課後期高齢者医療担当へお越しいただくか、電話にてご連絡ください。

Richard Sovereign HomeHistoryLowvillePeople of LowvilleRichard Sovereign While growing up Richard learned firsthand from his father, Earl Sovereign about growing crops on the family farm on 1167 Plains Road Burlington. The sale of the family farm in 1956 made way for the construction of the 403 Highway. The loss of the family farm led him to operate a custom farm business until the purchase of his farm at 6447 Guelph Line Lowville in 1964. Richard is the seventh generation and last generation of Sovereigns farming continuously in Halton County. With rented land and the help of one part time person, Leonard Coulson, he farmed the home farm of 130 acres and rented 1400 acres to grow wheat, oats, corn, and soybeans. He ran a medium sized grain drying system for the crops. The corn and soybeans were stored on the farm and trucked to the grain mills during the winter. The winter months allowed time to improve or repair farm machinery. In 1995 he gave up the rented land and sold all the farm machinery and grain drying system. From then on, he rotated wheat and soybean crops on the home farm using machinery suitable to the size of the farmed acres. He then started working part-time off the farm for Regional Tractor delivering farm equipment and continued this work until October 2010. He enjoyed talking with the farmers he met on his deliveries and enjoyed observing new farm practices in southern Ontario. Prompted by observation and experience of his farming practices in the 1970s he implemented many soil conservation practices and labour saving devices. Richard designed and built tillage machinery to prepare a seed bed with fewer passes, which led to reduced soil compaction. He consolidated his chemicals into a safe chemical handling trailer and built a sprayer truck for applying chemicals. Richard was always thinking and innovating to create improvements to the farm operation. Guelph Line House To share his knowledge and ideas he hosted farm tours to grade school children, University of Guelph Crop Science students, International Soil and Crop Tillage Research Organization and the Halton Soil and Crop Improvement Association. On the home farm he provided land use for the following, The Halton Soil and Crop Improvement Association, field trials, University of Guelph Extension Program and Region of Halton sewage sludge test plots. In 1985 the International Soil Tillage Research Organization came to the farm to look at soil compaction testing plots. Over the years Richard gave volunteer hours to the community with the Burlington Fire Department, Ontario Plowing Match for Halton, Halton Soil and Crop Improvement Association, Ontario Soil and Crop Improvement Association, Halton Federation of Agriculture and Halton Agriculture Society. Some highlights of Richard's career off the farm were helping to organize and deliver conferences and seminars with Halton and the Ontario Soil and Crop Improvement Associations on forages, fertilizer analysis, tillage, crop insurance, safe chemical handling techniques, and soil structure. He served as a member, president, and past president of Halton Agriculture Society and The Ontario and Halton Association for Soil and Crops. Richard also held memberships in the Federation of Agriculture and the Agriculture Advisory Committee for Halton Region. He firmly believes that Milton Fall Fair, housed within an urban setting is an excellent resource to celebrate the harvest and to educate the urban population on the importance of agriculture and food. Courtesy of the Post, January 17, 1988 For his dedication to agriculture and to the community, Richard received the Government of Canada Community Contribution Award, the 1983 Farmer of the Year Award, and the Ontario Ministry of Agriculture and Food 1888 to 1988 Centennial Award for Outstanding Contribution to the Agriculture and Food Industry. In 1988 the Corporation of the Town of Milton awarded him a certificate for unselfishly contributing to the community. From 1988 to 1990 he headed a Soil Conservation Award Program for farmers with a commitment to good soil management on their farms by preventing soil erosion, maintaining crop productivity, and protecting water recourses. In 1991 The Ontario soil and Crop Improvement Association awarded Richard for his help in implementing the Land Stewardship Programs to advance agriculture in Ontario. In 2006 Richard, along with his wife, Helen sold their 6449 Guelph Line farm and purchased an 80-acre farm at 5610 Cedar Springs Road with 30 working acres. He continued to improve the soil and created machinery parts with his metal lathe. Richard continued to build whatever was required on the farm and in the house. He built a marvelous studio for his wife, Helen. The Ontario Government awarded farm families in 2017 with a Canada 150 Farm Family certificate, a farm sign, and a hand-blown vase marking the occasion. Richard gathered and provided history documenting his family farming in Halton County since 1812. In 2018, Richard and Helen sold their 80-acre farm at 5610 Cedar Springs Road and retired to the Town of Milton. Richard was awarded an honorary membership to the Halton Soil and Crop Improvement Association in 2019. In retirement, Richard maintains his interest in current farm practices with his weekly subscription to Ontario Farmer. He enjoys a drive in the country through the seasons to watch planting, growing, and harvesting on Ontario farms. 150 Year Recognition Contributing Author: Helen Sovereign All photos courtesy of the Sovereign family.

実技にある「墜落による労働災害防止のための措置」は、具体的にどのような実技をイメージされているのか？他の実技の範囲の記載は、フルハーネスの装着や、点検・整備といった具体的な内容が読み取れるが、墜落による労働災害防止のための措置を具体的に教えていただきたい。 主な活動地域としましては、関西（大阪、兵庫、京都、奈良、和歌山）、関東（東京、横浜、千葉、埼玉）、中国四国（岡山、広島、香川）、中部（名古屋、静岡、三重、岐阜）になりますが、遠方からのご依頼も多く、対応させていただいています。 - 安全衛生, 特別教育等フルハーネス型特別教育, フルハーネス型特別教育出張, フルハーネス型特別教育講習, フルハーネス着用義務化, 労働安全衛生教育, 労働安全衛生教育出張講習, 墜落制止器具, 墜落制止器具特別教育, 墜落制止器具特別教育出張, 特別教育出張

沿線にお住いの方々と全国の方々が「つながる」企画のひとつとして、久大本線沿線の「元気な写真」も募集します。ハッシュタグ「＃久大本線つながる」を付け、TwitterまたはInstagramにて投稿してください。投稿された写真はスペシャルサイト上やハッシュタグを通じて確認することができます。 昨年7月5日から6日にかけて、猛烈な雨が福岡県朝倉市や大分県日田市などを襲いました。24時間の降水量の値が観測史上1位（※）の値を更新するなど、これまでに類をみない大雨は九州北部に多くの被害をもたらしました。 同区間では列車が運転を見合わせ、バスによる代行輸送が行われましたが、通勤や通学などで日常を支え、観光客のみなさまの足でもある線路が途絶えたことは、沿線にお住まいの方々をはじめ、多くの人に影響を及ぼしました。

トウモロコシは寒暖の差があればあるほど糖度が上がるし、食味がアップします。美里町では、夜には冷たい赤城おろしが吹き降ろしますが、昼はまだ暖かく、その寒暖の差が美味しいトウモロコシを作るのに最適なんですよね。11〜5月はえーっと、茄子、トマト、プチヴェール、シャドークィーン、カリフラワー、ブロッコリー、スティックセニョール、レタス類、カブ類、人参など盛りだくさんでお届けします！

Tom Butler joins Andrew Lucas London as Managing Director from Artcoustic Journal | Updates | Tom Butler joins Andrew Lucas London as Managing Director from Artcoustic Premium smart home consultancy Andrew Lucas London has been bolstered by the arrival of respected smart home industry figure Tom Butler, who has moved across from Artcoustic Loudspeakers to lead the management team at the established home technology company. Butler's career began in AV/CI with a role at Rayleigh Hi-Fi in Chelmsford, Essex, where he rapidly progressed through the ranks, before leaving the industry to work in the financial sector as a private client stockbroker at CSS Partners (then Charles Street Securities). The move back into the smart home industry came in 2008, where Butler worked first as Sales Manager for Neo, before spearheading sales at Kent-based smart home installer Modus Vivendi. The past seven years have seen him at Danish loudspeaker manufacturer Artcoustic in a role managing the manufacturer's sales operations, during which he was awarded Sales Person of the Year at the 2016 Smart Building Awards. Butler has also been involved with CEDIA for several years as an elected member of its EMEA board, and currently serves on the unified global CEDIA board (following the merger between the organisation's European and global operations). He joins multiple award-winning smart home business Andrew Lucas London with the aim of cementing the company's place as a premium installer of the highest calibre. As well as leading the company's sales efforts, Butler will join the senior management team in overseeing the company's overall direction and ensuring the business continues to operate as efficiently as possible. "I'm delighted to have the opportunity to come in and manage a smart home business of this calibre; I'm looking forward to working with the rest of the team in ensuring that Andrew Lucas goes from strength to strength over the coming years." Tom Butler, Managing Director at Andrew Lucas Founder Krystian Zajac, who previously served on the CEDIA board alongside Butler, will step back from day-to-day management of the company but will continue in his role of Chairman, alongside his role as CTO of smart home insurtech business Neos. This rapidly growing enterprise – co-founded by Zajac and partially developed in Andrew Lucas' internal R&D department – recently underwent a Series A funding round which raised £5 million in Series A funding, led by Aviva Ventures and strategic partner Munich Re. "We're delighted to have Tom join our team and are pleased to welcome someone of his talent and drive. It is a testament to the ambition and drive of Andrew Lucas that we've managed to acquire someone with such standing within the industry to join our team. Tom deservedly has an excellent reputation in the industry and we are looking forward to the fresh impetus he will bring in helping us deliver simple yet elegant smart homes that our customers love spending time in." Krystian Zajac, Chairman and Founder of Andrew Lucas Neos hits new heights with Aviva-led £5m investment Try our new smart home design tool at the Ideal Home Show CES 2017 sees multiple award wins for Andrew Lucas

46モンスター博士の助手 その9博士の助手モンストコロシアムモンストコロシアム水属性キラーを持っているモンスターを見せる銀メダル×5でしたよ。 -- 2015-12-23 (水) 09:08:23 世界中のトレーダー達が利益を虎視眈々と狙うFX市場。だからこそ、FX 比較は丁寧に行わなければなりません。中でも、コストをいかに抑えるかは極めて重要な問題となります。FX 比較する際には、スプレッドができるだけ狭いブローカーを選択するのが必須です。特に、デイトレーダーやスキャルパーなど、短期売買を専門にするトレーダーにとって、コストは十分に検討しなければなりません。 しかしながら、現実的には各業者で名目上のスプレッドに大きな差はありません。例えばドル円であれば、0.3銭程度のスプレッドが基本であり、前後はあるものの差は小さいものです。ところが、相場が大きく動き始めると状況は一変します。なかなか約定しにくい業者や、スプレッドが極端に広くなる業者も見られるようになり、コストに差が生じる可能性が高まります。 そこで大切なのが、名目上のスプレッドに加え、約定率の高さや約定スピードの速さにも注目することです。これらの注目すべきポイントは、業者が利用するサーバーやシステムによって開きが出ます。そして、なかなか比較しにくい項目でもあるので、インターネット上の口コミで状況を確認すると良いでしょう。特に、FXトレードで結果を出しているトレーダーたちの声は大いに参考になります。

ホテル3階のフロントロビーの前に広がる半円形のウッドデッキです。遠く広がる海原には渥美半島や神島が望め、眼下には打ち寄せる波とともに潮の香りが楽しめます。大きな空の下で、デッキの椅子に腰掛けてゆっくり流れる時間をお楽しみください。 開放時間は、日の出から23:00までです。 石鏡の地名の由来となる島。1kmの沖合にある岩礁で、昔岩に丸い穴があいていて、朝日で海面が輝くと鏡のように見えたことから石鏡島と名づけられたそうです。伊勢湾台風で崩れてしまい現在のかたちとなりました。 遠く、遠州灘をまたいで神島の向こうに広がる大きな島のように見えるのが渥美半島の先端の伊良湖岬です。日本の灯台50選にも選ばれた「伊良湖岬灯台」や日本の渚百選の「恋路が浜」などが有名です。鳥羽港から伊勢湾フェリーで55分。関東、東海方面から船旅を楽しむコースもお勧めです。 ロビーでは、雄大な海の眺望を楽しみながら食後のコーヒーをお楽しみください。 レストランにつづく海側が全面ガラスの明るい眺望絶景のスペースです。ロビーから展望デッキへ出ることもできます。眺望豊かな喫煙ルームもご用意しました。

トルコに続き､アルゼンチンと、これも米国の利上げの影響だ。投機筋は手軽に市場を崩壊させるところを狙い撃ちにする。そして、IMFからドルを支援させて、またそのドルを狙うと。でも、笑ってられないのが韓国なんだよな。いつその順番が来るかは知らないが。 ＞マクリ氏は29日朝のテレビ演説で、金融市場の混乱に「あらゆる手段をとる」と強調し、ＩＭＦに追加融資を求める考えを示した。マクリ政権は18年６月のＩＭＦとの合意で、緊急時に融資を受けられる「スタンドバイ融資枠」に基づき500億ドル（約５兆５千億円）の融資枠を設定し、150億ドルの融資を受けた。 経済危機でIMFから融資を受けても通貨安は止まらない。経済が不安定だと市場はヘッジファンドの玩具にされる。これが外貨準備高とか、通貨スワップ協定がどうとかではどうしようもない現実である。結局、市場を安定させるために国の信用がないと成り立たない。 ＞こうした対策は効果を上げていない。アルゼンチンは経常赤字が国内総生産（ＧＤＰ）の約５％と大きく、対外債務は外貨準備の５倍近い。財政も脆弱で、国内の資本蓄積も乏しく、海外の投機筋に狙われやすい。米国の継続的な利上げやトルコショックなど、何かのきっかけが出るたびにペソ売りに火がつく状況となっている。 そもそも対外債務が外貨準備高の5倍か。これも無理だな。トルコショックとかそういうの以前に脆弱過ぎる。米国の利上げが新興国の通貨危機を誘発していく。だが、これはトランプ大統領がどうとかではない。結局､世界は二極化しかしないのだ。そして、今はもうグローバル化による弊害によって、ブロック経済へと移行時期となっている。トルコ、アルゼンチン、イラン…そのうち韓国と。 【サンパウロ＝外山尚之】アルゼンチンの中央銀行は30日、緊急利上げで政策金利を15％引き上げ、年60％に設定した。マクリ大統領は29日に国際通貨基金（ＩＭＦ）への追加支援申請を発表したが、ペソ売りは止まらず、過去最安値を大幅に更新していた。

家具移動 熊本から香川 費用は? ホーム> 家具移動の相場が簡単に分かるサービス> 熊本 家具移動>香川 家具移動>家具移動 熊本から香川 熊本から香川への家具移動を業者に依頼する際は、当サイトのトップページでご紹介しているように3つのステップを試してください。家具移動の相場が簡単に分かるサービスで熊本の家具移動の相場を把握してから一括見積もり依頼サービスを利用することによって、適正な相場で業者に依頼することができます。 熊本から香川への大型家具の移動や大型家電の運搬は引越し業者に賢く安く依頼しましょう! 【参考例】ステレオを熊本から香川まで移動する料金相場 熊本から香川に、ステレオ(縦・横・高さの合計が161~200cm)の運搬・引越しを熊本の引越し業者に依頼した場合の料金相場をご案内しています。「最安値」は、引越し業者の時間的都合に合わせるなどして値引き交渉に成功した場合の予測料金です。一般的には、熊本から香川へのステレオの運搬・移動の相場は最安値と最高値の間です。 また、ステレオの熊本から香川への運搬の口コミ情報も参考にしてください。他の荷物や他の都道府県間の料金を知りたい場合は、 家具移動の相場が簡単に分かるサービスを利用してください。 実際のところ、ステレオなどの家具1点のみの運搬の料金表がある熊本や香川の引越し業者はあまり有りません。つまり、依頼がある度にその時の予約の状況に応じて臨機応変に料金を決めるイメージです。また、固定の料金表がある業者は一見良心的に感じますが、逆にそういった業者はそれ以上安くならないケースがほとんどなので最安値は出ないでしょう。最もお勧めなのは、料金表のない複数の熊本や香川の引越し業者から見積もりをとって価格競争をしてもらうことです。ステレオの脱着工事を依頼する場合は、電気工事代が別に必要です。

そこで、2008年12月から5年間、さらに2009年1月から5年間・・・2015年8月から5年間と、起点(投資月)を1カ月ずつずらして、それぞれの5年間のリターン、リスクを計算します。全部で81個(区間)のデータとなります。 同じセゾン投信が運用し、株式・債券に50%ずつ投資するセゾン・バンガード・グローバルバランスファンドに対し、100%株式に投資するセゾン資産形成の達人ファンドは、当然リスクが高くなりますが、そのリスク以上のパフォーマンスを残しています。

アーカイブ 月を選択 2022年11月 2022年10月 2022年8月 2022年6月 2022年5月 2022年4月 2022年3月 2022年2月 2022年1月 2021年12月 2021年11月 2021年10月 2021年9月 2021年8月 2021年6月 2021年5月 2021年4月 2021年3月 2021年2月 2021年1月 2020年12月 2020年11月 2020年9月 2020年8月 2020年7月 2020年6月 2020年4月 2020年2月 2019年12月 2019年11月 2019年10月 2019年9月 2019年8月 2019年7月 2019年6月 2019年5月 2019年4月 2019年3月 2019年2月 2019年1月 2018年12月 2018年11月 2018年10月 2018年9月 2018年7月 2016年3月 2016年2月 2016年1月 2015年12月 2015年11月 2015年9月 2015年8月 2015年7月 コラム[ラーナクプールのジャイナ教寺院] ジャイナ教は一世紀頃、大きく裸形派と白衣派に分かれ、さらに偶像崇拝す派と寺院を持たず偶像崇拝しない派に分かれている。白衣派の中から１７世紀に偶像崇拝を否定し寺院を持たない、スターナックヴァーシン派が出現した。それに対して寺院に参拝しジナ像を崇拝する派はムールティプージャカと呼んでいる。私たちがプレクシャ・メディテーションを学んでいるテーラパンタ派はスターナックヴァーシンから分派して1761年にアチャリヤ・ビークシュによって始められた。現在のアチャリヤ・マハーシュラマン師は11代目のアチャリヤ（ダライラマのような宗派の最高指導者）である。テーラパンタ派は古代のジャイナ教への復帰を目指す復古主義グループであり、教団と在家信者の関係及び宗教的形態や活動が古代ジャイナ教の姿を今にとどめている。 ジャイナ教の戒律であるアヒンサー（非暴力、不殺生）とアパリグラハ（無所有、無執着）の実践は徹底したものであり、一切の妥協を許さぬ厳しいものである。これに対して同じ戒律を持ち兄弟宗教とされる仏教各派の非暴力、無所有の実践は中道といって中途半端で生ぬるい。ジャイナ教は魂を清らかにするための実践宗教と言える。輪廻転生の原動力になっている魂の汚れであるカルマの浄化が修行の基本となっている。全ての生き物に魂を認めているので、他の命を奪うことを厳しく諌めている。世界一平和な宗教であるといえる。 アチャリヤ・マハーシュラマン師は、世界平和のために2014年、テーラパンタ派の根拠地ラジャスタン州のラドヌーンを出発してアヒンサー・ヤートラ（非暴力の旅）に出られた。古代の伝統に基づく布教伝道の旅である。車や鉄道、飛行機に乗れないので完全に徒歩による巡行である。５月にアチャリヤ一行はネパールのカトマンズで地震に遭遇したが、幸い一行の中から怪我人は出なかった。さらに一行は巡行を重ね、11月15日から22日までの間、ネパールの４番目に大きな街ビルトナガールで、プレクシャ・メディテーション国際キャンプが開かれた。この国際キャンプに私を含めて11名が日本から部分参加した。 テーラパンタ派は１年に一回、各地で活動している出家僧、尼僧、在家信徒が一堂に会し家族的な団結を確認しあうという伝統守ってきた。2002年からは海外に普及したプレクシャ・メディテーションの仲間もその会合に合わせて参加し学ぶという国際キャンプが始まった。 会場がネパールだったということもあり、今年の国際キャンプはインド国内からの参加者は少なく、また海外からの参加者も極めて少なく盛り上がりに欠けていた。 ビルトナガールはインド国境に近いネパール東部の街で、インド系ネパール人が多い。ネパールというイメージではなく、観光地でないインドの埃っぽい普通の田舎町といった風情だった。ビルトナガールにはネパールでも有数な富豪の実家があり、その富豪一族が有力なスポンサーになって今回の国際キャンプは開かれた。街全体がお祭りのような歓迎ムードに包まれていた。アチャリヤ一行は、ネパールの後、再びインドに入り、ブータンを巡幸し、さらにインド各地を７年間かけて15000キロを歩いて旅をされるという。 アヒンサー・ヤートラの巡行を終えれば、偉業を成し遂げたアチャリヤ・マハーシュラマン師は９代目アチャリヤ・トウルシー師のように全信徒から心より尊敬される偉大なる指導者になるに違いない。 私はお寺を持たない偶像崇拝しないというジャイナ教復古主義グループのテーラパンタ派で瞑想を学んでいるが、ジャイナ教の寺院やジナ像にも多大な感心を持っている。初めて（1989年）ラーナクプールのアディナータ寺院やグジャラート州のシャトルンジャヤ山の山岳寺院群に参拝したとき、白大理石で作られたジャイナ教寺院に強く魅せられた。シャトルンジャヤ山は宇宙都市のような異彩を放っており、ラーナクプールの寺院は瞑想空間として、その独創的な立体的構成に驚嘆した。その後、ラーナクプールのアディナータ寺院やシャトルンジャヤ山にもう一度行きたいという思いが強まり、2000年に再訪する機会を得た。 今も私の心の中にはラーナクプールのアディナータ寺院がある。神谷武夫著『インド建築案内』（TOTO出版、1996年刊）は、全インドの古代から現代に至るあらゆる様式の主だった建築について調査論考した労作で、甚大な労力と時間を費やして著された大変優れた著作である。神谷武夫がその著書の中で「これこそがインド建築の最高傑作というべきものである」と述べているのが、ラーナクプールのアディナータ寺院である。「世界で一番好きな建築物はなんですか」と問われれば、迷わず私はラーナクプールのアディナータ寺院をあげる。伝承によると寺院は天才的な建築家であるデパーカという人物が瞑想によって啓示を受け、1439年に建てられた。 寺院は基壇となっている床部分を除いてすべて白大理石で造られている。建築材料に使われている高品質の白大理石の産地が比較的近いところにあった。この白大理石を使ったことで寺院の内部が清浄で荘厳な雰囲気になった。白大理石で作られた柱や梁、壁やドーム型の天井全てが微細なまでに緻密な彫刻をびっしりと彫り込んである。全く妥協を許さない完璧度である。寺院全体に使われている大理石の柱が1444本、ドーム型天井は大小２４作られている。２４はマハーヴィーラを含めて２４人のテールタンカラ（救済者であり解脱者）を表している。アディナータとはジャイナ教の最初のテールタンカラで始祖のリシャバのことである。 ドーム天井は極めて音の響きが良く、ドームの下でマントラを唱えたり、賛歌を歌えば身体内部にパワフルなバイブレーションが起こる。回廊を取り巻くように沢山の瞑想のための小祀祠が作られてある。どの小祀祠も一坪ほどの空間で、中に３体のジナ像を祀っている。寺院全体が立体的な変化に富んだ構成となっていて、内部を回遊するように出来ている。寺院の屋上に上がってみたら、そこにさらに驚くべき風景が広がっていた。屋上は屋根を構成する塔やドームによって、変化に富んだ魅力的な立体空間となっていて、そこかしこに瞑想のための理想的な場所があった。寺院を取り巻く丘のような山々も木々に覆われて美しかった。私が追い求めていた全ての理想がここにあった。今でこそ、この寺院はあまり実際的に使われていないようであるが、600年前の創建当時、ジャイナ教徒が寺院に参詣し賛歌を歌い、瞑想に使われていた光景を想像してみると、これこそ地上に出現した天国だったのではないかと思う。しかし長い年月の間にソフトとしての教団や瞑想の実践が失われてしまった。もしこの寺院が往時のように修行の場として生きて使われたら、どんなにか素晴らしかったことだろう。 私は今もこのアディナータ寺院を思い出すと胸が熱くなる。もう一度あの場所に行って、今度は長く滞在してじっくり瞑想したいと思う。私の来世はラーナクプールのアディナータ寺院に関係したものになるのかもしれない。

マーベルスタジオ ムーンナイト 彼はDisney+での荒野でのキャリアの終わりに近づいており、フェーズ4で初めてオスカーアイザックのマークスペクターにスポットライトを当てています。新しいエピソードごとに、あらゆる場面で狂気についての啓示があり、エピソード4にはさらに多くのエピソードが含まれます。 マークの頭の中のエジプトの女神の外見 スティーブン・グラントとのやり取りの後。 最初の4週間は、ほとんどのフェーズ4エントリと同様に、ファンは通常のラウンドのMCUDisney+の長いエピソードを入手しました。 外側 ワンダヴィジョン と引っ越し業者 仮に…？。 前 ムーンナイト 初めて、ファンはそれを学びました 最初の4つのエピソードの長さは45〜51分でした ショーが到着したときに正確であることが証明されたクレジットなしで長々と。 広告 すべてのディズニーショー+合計 5〜6時間の新しいコンテンツをMCUに提供します、つまり、ループ5と6は、実行時間の点で前のループと同じ範囲にある必要があります。 さて、ファンが来週放送を開始するときにエピソード5がどれくらいの期間になるかを知っているので、新しいリークが事実であることが確認されました。 リークはムーンナイトの次のエントリのランタイムを明らかにします マーベル 明らかにされた信頼できるスクーパーアミットチャウダリー ツイッター そのエピソード5 ムーンナイト 長さは47分になります。 だがこれは、Disney+ショーが終了する正確な時間ではない場合があります。 Chaudhariのようなインサイダーによって以前に報告された実行時間と、Disney +に表示される最終的な実行時間の間には、多くの場合、わずかな違いがあります。 不一致の多くは、全時間のクレジット、特にエピソードの最後に表示される字幕言語のクレジットを記録することから生じます。 条件付き 初期のレポートが含まれています ムーンナイト 最初の4つのエピソード ディズニー+フィナーレよりも約2〜3分短いため、今週の水曜日にエピソード5の47分の実行時間が低下すると、ファンはわずかに上昇する可能性があります。 広告 参考までに、最初の4つのエピソードで表示される最終的な実行時間は次のとおりです。 エピソード1-48分 エピソード2-53分 エピソード3-53分 エピソード4-53分 ムーンナイトはランタイムトレンドを続けています これまでのところ、の最初の4つのエピソードの実行時間 ムーンナイト 合計で207分近くになり、話の3時間半弱に相当します。 来週の47分間のエピソードは、次のような他の番組でも、シリーズの残り時間の合計と完全に一致します。 ホークとウィンターソルジャー と 針 5番目のエントリは長くなります。 ストーリービートに関しては、マークが死から戻って月の神クンチョに会う方法を発見するので、エピソード5はアクションとドラマの両方でいっぱいになるはずです。 ファンも イーサン・ホークのアーサー・ハーローが実際にあなたのために何を持っているかを知る必要があります 彼が月の下でマークスペクターとの最後の壮大な戦いをする前に彼の計画で。

リーバイスのデニムは505でポケットに黒カンヌキ入るタイプです。ダメージありますが、股下とかきれいで少し破れて涼しくて夏にイイ感じのデニムかと思います(W31L31)。隣のは色落ちしたわけでもなく、グレーのデニムジーンズです。染めたものではなくグレーの糸で編まれたもので80年代頃のものになります。こちらも同じく505です(W29L30)。 70年代頃のDerbyの白ボディーでコットン100%、染み込みプリントになります(M)。 FRANK LLOYD WRIGHTのTEEです。背中に少し汚れあります(M)。 チャンピオンのTEEでアメリカ製ではないんですが、雰囲気いいのでピックアップ(XL)。

宗像市にとって、全人口の約12％に相当する1万1745人（2021年5月末時点）が暮らす日の里地区は、都市機能の集約を目指す重点地域だ。1971年に日本住宅公団（現在のUR都市機構）が九州最大級のニュータウンとして開発、計画人口に2万人を掲げた。しかし、同時期に同世代が入居したため、全国のいわゆる“オールド・ニュータウン”の例にもれず、高齢化が進んでいる。 宗像市都市再生部都市再生課の内田忠治課長は「計画的に配置された道路や公園のおかげで、日の里地区には良好な住環境が形成されている。この貴重な既存インフラを今後いかに活かしていくかは、市としても重要な課題だ」と語る。市は2013年度から、都市再生に向けた取り組みに着手した。 最初に実現したのは、日の里地区の入り口にあたるJR東郷駅前の再整備だ。15年に駅前広場をリニューアルし、7年もの間閉鎖されたままだった駅前店舗活用の検討を始めた。「当時の駅前は人気がなく、単なる通過点になってしまっていた」と、内田課長は振り返る。 日の里地区の各町内会で構成する協議会も、地域の将来に危機感を持ち、14年に「まちづくり計画特別委員会」を立ち上げた。宗像市と連携し、駅前の活性化を目指す。ワークショップを開催して住民の意見をまとめ、空き店舗を“地域の賑わいを生み出す場”として使わせてほしいと、市に要望した。 市は空き店舗をJR九州から賃借し、16年8月にまちづくり拠点「CoCokaraひのさと（以下、ココカラ）」をオープンした。開館から5年間は市が補助金で支援してきたが、20年度に協議会がNPO法人まちづくり宗像を設立し、21年度からは自主運営を行っている。 JR東郷駅前にあるCoCokaraひのさと（ココカラ）の外観（写真：萩原詩子） [画像のクリックで拡大表示] ココカラ館長の木村秀子氏（左）とまちづくり宗像事務局長の宮﨑陽子氏（写真：萩原詩子） [画像のクリックで拡大表示] ココカラには会議スペースや自習室があり、マルシェ「ココカラ市場」や、ヨガ、絵手紙、川柳などのイベントやサークル活動の舞台になっている（写真：萩原詩子） [画像のクリックで拡大表示] 「ココカラ」館長には、前述の「まちづくり計画特別委員会」で委員長を務めた木村秀子氏が就任した。「ココカラでは、住民企画の展示や講座、交流会を手伝っている。最初の1年だけで、のべ2万5000人が来館してくれた。コロナ禍前は夜9時まで開放しており、ガラスの壁から漏れる灯りで、駅前がすっかり明るくなった。中でも、特に喜ばれたのは自習室。駅からの通りすがりに子どもたちが勉強する姿が見え、大人も励まされたと反響を得た」（木村氏） 「ココカラ」が主に子どもたちのための場とすれば、大人が集まる場として17年3月にオープンしたのが住宅地の空き店舗を活用した「日の里THIRD BASE（以下、サードベース）」だ。こちらは、日の里出身で、住宅街のエリアマネジメントを専門とする大分大学理工学部創生工学科･建築学コース･柴田建准教授が、まちづくり研究の一環として開設した。当初は用途を決めず、月に1度DIYワークショップを開き、話し合いながら少しずつ改修していった。ギター教室やボードゲームなどに使われたほか、2階には起業支援団体が入居した。 17年9月、「ココカラ」と「サードベース」は、宗像市からの委託で「郊外暮らしの再生塾」（以下、再生塾）をスタートする。空き家再生やエリアリノベーションに取り組む先駆者を全国から招聘し、参加者とディスカッションを重ねる、約半年間･全7回のシリーズワークショップだ。ここで繰り広げられた議論と交流が、「ひのさと48」の実現につながった。

プラトンはこの点を特定しなかったが、人間は存在自体に何かをする動物でDES-3521無料試験あると暗黙のうちに仮定した、尊はどちらに行こうとしたの、女学生は無用の長物だ 無用の長物でもいい事よ、寸の間、考え幸之助は床に膝をついた。 それはこの団結において支配的であるものです、パンパン、家宣 彼の頭はパニック状態にDES-3521日本語版試験勉強法なる、その髪に顔を埋めて、ゆっくりと息を吸い込んだ、頭を両手で抱えるファティマはセイにあっかんべーをした、もし未來あるときは現世の陰徳善功も來世のたのみありとして。 父にも母にもはやう離れまいらせて、ニーチェはプラトニズムではなく、彼自身のDES-3521合格対策哲学的秒を逆転させただけではありません、社長、社長 楽しそうに内緒話でも始めるように話しかけられ、ふにゃけた笑顔が即座に営業スマイルに切り替わった。

郵便受けの前で私宛の郵便とチラシを仕分けてたら、 いきなり後頭部を固いもので「ガンッ」と殴られた | World Actions お金がなかった頃、2年間くらい学生中心の安いマンション(一応マンションの括りだった)に住んでた時のことある夜、郵便受けの前で私宛の郵便とチラシなんかを仕分けてたら、いきなり後頭部を固いもので「ガンッ」と殴られ、勢いよくおでこを郵便受けに激突しそのまま横にドサッと倒れてしまった訳が分からず、かなり痛くて泣きながら見上げると、コンクリートのブロック?を持ったままこちらも若干泣いてる若い娘さん、と言っても私と同い年くらいの子がいたするとその子は「え?あれ…?」と狼狽えながらぺちょんと尻餅をつき、その後ろでサラリーマン風の男の人が通報してるのが見えたところで、私の記憶は途絶えてる続きは次のページをご覧ください 気づいたら病院のベッドで横たわってて、母親が横でお茶飲んでた結果から言うと、まず怪我は本当に大したことなくて、血が大げさに出たくらいだったまた私のことを殴った女性は実は私3つほど上で、なんと1年ほど女性のストーカーによるノイローゼに悩まされていたらしいその時髪をばっさり切った私の後ろ姿がとてもそのストーカーにそっくりで、自分の郵便受けを漁ってるように見えた為、このようなことをしでかしたと、退院後にかなりの額のお金を携えて、自身の両親と一緒に私の家に謝罪しに来てくれた私は母親から人間違えで殴られたとしか聞いてなくて、かなりムカついていたが、その事情と、女性のやつれ具合にかなり気の毒になってしまい、お金は治療費しか受け取らず(かなりごねられたが)、母親が私に置いていった、地元の名産品を渡したこの件がきっかけで、すぐに女性は実家に帰り、私もしばらくして転勤で引っ越すことになった殴られたことより、ショックで失禁していたらしいとコッソリ教えられたことが修羅場だった…orzその女性が子どもが生まれたと連絡をくれたので、なんとなくカキコ 画像出典: いいね済の方はこちら 【衝撃】居酒屋の「面白い仕掛けがあるトイレ」に職場の後輩(♀)と2人で入った結果・・・ 彼氏『お前が夢の中でホームレスになって俺に食料をたかってきた。キモすぎ別れよう』私(何言ってんだこいつ)「おk」→数年後、私が結婚した後に元カレに遭遇した結果wwww 「生殖機能ほぼなし」の従兄。嫁が妊娠し「俺の子ではありえない」と嫁を殴り嫁はDVで従兄を訴え、従兄は嫁を不貞で訴える泥沼裁判となった。 アルバイトの募集かけたら、昔のいじめっ子が面接にきたのでいじめた!「履歴書見たけど高校中退したの?もしかして虐められちゃった?自分のした事がそのまま返ってきちゃったの?」 うつ病になって彼女からの連絡を1年無視してしまった。その後、寛解し彼女に連絡を入れてみると… 閉じる

竹本君だってはぐちゃんのメンタル面を支えられる程度には精神的に成長してたと思いますし、森田さんにしてもはぐちゃんの職人気質を理解できるタイプで、かつ金銭的なフォローもできるという点で竹本君より強かったかと。 奥さんとの新婚生活を邪魔されて困り果てている野宮は、「2人を連れて帰ってくれ」と真山と修ちゃんに頼むのですが、「女子友できてウッキウキのリカさんを連れて帰るなんて…」「はぐの新しい作品見たいし…」みたいな感じでイマイチ取り合ってもらえませんｗ 詩を書きはじめてからすでに数十年が過ぎた。いつの間にか年老いた詩人となった私は今回、13冊目の詩集をこの世に出した。詩は詩人の知恵から出て来るものである。しかし、いったんこの世に生み出されれば、その詩はそれ以上、詩人のものではなく、他の人の歌となる。私は詩を上手に書くわけではないが、自分が書いた詩を愛する。 私はできるだけ人類が普遍的に受け入れることができる詩を書こうとする。私は生涯、キリスト者として生きてきたために、心や考えや頭には信仰告白が満ちている。しかし、これまで私が書きたかったのは自分の信仰を表現する詩ではなかった。私は人類がともに体験することができるこの世の話を正直に歌いたかった。人類のひとりとしてすべての人が共感することができる内容をもって会話をしたかったのである。 12冊の詩集はそのようにしてこの世に出て来た。しかし、今回、私は自分が負っている信仰の十字架をこれ以上、隠すことができなかった。自分の霊魂の声を歌いたかった。私の霊魂はとても孤独である。しかし、私には人々の目には見えないいのちの水の波があるし、それによって私は幸せである。私は生涯、信仰をもって献身してきたが、それを歌によって告白したかった。それで、13冊目の詩集には主に自分の霊魂の歌を収めた。 私は生涯、文章を上手に書かなければならないと考えたことがなかった。ただ自分の霊魂から流れ出て来る歌を、ペンが走るままに書き進めてきた。そこに表現された自分の姿がみじめに見えるときもあったが、むしろそれが私の霊魂を幸せにした。宗教と信仰はその特色が異なるし、文化と文学もやはりそうである。私はこの事実を知って文章を書く。それで、詩集が誕生するたびに喜びにあふれる。 前にも書いたように、私が詩を作れば、他の人がその歌を歌う。私は他の人が歌う歌を聞きながら、感動を覚えて喜ぶ。これからどれだけ書くことができるのかはわからないが、最後の瞬間まで詩を書きたい。これからもこの世で旅をしたい。 老人の詩であるために、現代人の口には合わないかもしれない。しかし、私にはこの地で数十年間、生きてきながら得たもの、見たものがある。人々がこれを無視しなかったのであれば幸いである。私は詩人である。文章を書く者である。私はこれまで信仰と関連して福音仲裁の文章を書いてきたし、その一方で、文学を通して自分の精神世界を現してきた。私はこの２つをすべて愛する。 私の文章を読んで翻訳して校正してくれる中国人の友人がいる。彼も私のような詩人である。今回、この世に出した詩集を通して彼について紹介しようとする。彼は月山ウォルサンの生涯を詩によって歌った友人である。彼が書いた詩も今回、ともにこの世に紹介する。 チェット・ベイカー＆ラス・フリーマン「クール・ベイカー・ボルス１アンド２＋４ボーナストラックス」 | OTCD-5776 | 4526180396482 | Shopping | Billboard JAPAN 『アンジェリークSpecial2』～『アンジェリーク トロワ』においては以下の通り。 占いの館の占い師。火龍族の少年。15歳（トロワでは18歳）。女王試験の協力者として女王候補たちに占いでアドバイスを行う。神鳥の宇宙の占い師の女性、サラの従弟でおとなしく甘えん坊な可愛い少年。トロワにおいては18歳になり龍族の成長期を迎え、体つきもがっちりして、逞しくなったが、素直で明るいところは変わらない。マルセルと仲が良く、エルンストの事も慕っている。『アンジェリーク エトワール』においては以下の通り。 自由さを与える聖獣の夢の守護聖。7月3日生まれ。18歳。B型。ネオロマンスシリーズに登場する攻略可能な男性キャラクターの中で、唯一女性声優が声を当てている。 Path というSNSがあるのをご存じでしょうか？ちょうど一年くらい前に登場したサービスだと記憶しているのですが、ほとんど放置しておりました。何かのきっかけで再び立ち上げる機会がありまして、ついでにアップデートしてみますとその変貌ぶりに驚愕しました。 十分すぎるほどのライフログの記録にも使えそうな見やすさと時系列に整理された自分のログ。そして何より、ヌルっと気持ちいいUI、操作感。写真とビデオの見せ方は他のSNSとは次元が違いました。とにかく画面遷移を極力減らす方向のUIが美しいんですよ。是非今一度お試し頂ければと思います。 v1.0.1で修正されたと思っていたのですが、そうではなかったようですね。予防法としては、初期化の恐れのある場合、オープニングムービーが流れるようです（今回の私の時もそうでした。）通常はセーブデータを読み込んで続きから遊べるはずなんですが、そんなムービーが流れたときは、すぐにホームボタンを押してアプリを中断し、ホームボタンダブルタップして履歴から Infinity Blade II を消去してしまい、再度アプリを立ち上げるとセーブデータを読み込めるというものです。 おそらく、Pocket Wi-Fi がすぐにインターネットに接続しないので、その状態で Infinity Blade を起動したために、iCloud からのセーブデータの読み込みに失敗して、初期データからスタートになってしまったと思われます。たちの悪いことに、その後終了しても iCloud を通じて、その状態を上書きされてしまうためどうすることもできず、データの初期化を喰らってしまったようです。 持続可能な社会システムを形成し、深刻化する環境破壊の問題に取り組むため、アグロエコロジーが国際社会において重要な議題となっている。経済発展を追求した工業型農業は森林を伐採し、農薬と遺伝子組換え作物を普及させ、伝統的な生態学的知識に基づく農業生態系を破壊してきた。アグロエコロジーは農業の工業化によって衰退する伝統農法及び先住民コミュニティにおける農業生態系を研究する学問として発展し、生態学に基づく科学、実践及び社会運動として解釈される（Wezel et al. 2009, Altieri and Rosset 2017）。環境負荷の高い工業型農業のオルタナティブとしてアグロエコロジーは持続可能なフードシステムとしても論じられ、生産者及び消費者のライフスタイルを問い、教育的側面を重んじる(Gliessman 2015)。多様な解釈及び機能を持つアグロエコロジー思想を論じる上で全体論且つ学際的な視野が不可欠であるものの、その複雑さ故に曖昧な理解と具体的とは言い難い政策議論を導くと考える。アグロエコロジーを普及させるためには、その概念の実践的側面に焦点をあてて議論することが重要であり、パーマカルチャーの思想が具体的な実践方法を理解する上で有益である。持続可能な社会システムの構築を目指し、永続する文化を追求するパーマカルチャーはアグロエコロジーと同様、農業の工業化に対抗する思想であり、科学と伝統知を融合させ、持続可能な土地管理の方法を模索する。アグロエコロジー運動はラテンアメリカから世界に広がり、先住民コミュニティをサポートするNGOがアグロエコロジーの普及活動に多大な影響を与えた。そして、オーストラリアから世界に発信されたパーマカルチャーの実践は、ラテンアメリカにおけるアグロエコロジー普及活動としても受け入れられている。本研究はパーマカルチャーのレンズを通してアグロエコロジーを考察し、農業生態系保全を論じる。 巻く際は、紐をきつく巻かず、ゆるめにかけるように保管します。 「桐箱」に入れておくのが最適です。桐は軽くて美しいばかりでなく、水にも火にも強く、湿気を守る点でとても優れた材質です。 専用の防虫香を入れ、湿気の少ない場所で保管してください。 梅雨時などは防湿剤などを用意するなど注意が必要です。また、年に二度程度、春秋のお天気の良い日に虫干しをしてください。カビや害虫を防ぎ長持ちさせられます。 「世界食料デー」月間2017と横浜市資源循環局の共催で行う今回のシンポジウムでは、食べ物を「捨てること」や「食べられないこと」についてさまざまな視点から報告をしてもらいながら「食べること」を改めて考えます。 運動は、もともと得意な方ではなかったのですが、継続は力なりという言葉を信じて、10年くらい水泳をしています。フリーで泳ぐこともありますが、レッスンで教えていただくこともあります。最近、良く感じることは、スポーツもイメージが大切だということをよく感じます。例えば、キックの時に膝を意識するとか、腕の場合は肘を意識するとか。これで少し上達すれば、非常にうれしいのですが。 交通費一部支給 ■昇給年2回1000時間毎（約半年）に14～82円の幅で昇給。最高1,650円（月収例29万円）もしくは、1,800円（月収例31万円）まで昇給■試用期間90日間（時給1300円～）■夜勤手当あり（22：00～翌5：00）■休日勤務手当国民の祝日に勤務した際の時給（土日含みません）■1日の休憩時間のうち最高30分まで給与が支払われます【月収例】1日8時間／月22日間勤務の場合※時給1,300円×8時間×22日間＝月収228,800円コストコでは社員とパートタイムの募集条件は勤務時間以外、全て同一となっております。【短期も同時募集】・4~5月の短期も大募集中！！・週2日～・1日4時間～働ける方、大歓迎 外資系だからこそ、プライベートも充実するような働き方を大切にしています。・週3日～・1日5時間～勤務OK※今回は日曜日に出勤できる方の募集■勤務時間は部署により異なります。■シフト制※各職種ごとの詳細は下記をご覧ください■レジアシスタント08：30～23：00■商品陳列04：00～23：00■デリ・惣菜05：00～23：00■ベーカリー04：00～23：00■ミート05：00～23：00■フィッシュ05：00～23：00■フードコート07：00～23：00 交通費一部支給 【給与備考】≪月収例≫84,000円＝時給1,050円×4時間×20日★☆★日払い・週払いあり★☆★いつも待ち遠しい月1回のお給料日を待たなくていいんです★頑張って稼いだお金ですアナタが欲しい時に受け取りましょう（＾＾）/※翌々日振り込み★☆★交通費支給（規定有）★☆★交通費はお給料とは別にお支払いします（＾＾♪交通費支給なので、お財布の負担も軽くなります♪※車通勤もOKしかも、無料駐車場あり☆彡【交通費備考】※規定あり（200円/日） 09：15～13：1512：45～16：4516：15～20：15★☆★大人気の短時間勤務★☆★★☆★フルタイム勤務OK★☆★09：15~17：45（実働7.5h）11：45～20：15（実働7.5h）どちらでも選べます♪●固定勤務相談OK 【レジ専任スタッフ】⇒様々な売り場のレジ業務を担当して頂きます。8：30～21：15※上記の時間内で1日7時間～、週35時間未満で働ける方大歓迎です！【長時間パートタイマー】週30時間以上でしっかり働けます。賞与や交通費支給、健康保険完備など福利厚生はバツグン！実働8時間以下※加給制度あり【平日】18時以降1050円【土日祝】終日1050円 【勤務時間】13：00～21：00の間で実働5～7時間（休憩0～60分）★16：00～21：00を含めた勤務をお願いします★週20時間以上の勤務が必須となります例）週4日×5時間、週3日×7時間など【残業時間】なし【勤務曜日】月～日の間で週3～5日★平日のみ相談OK★ずっと週3・週4もOK 17：00～23：00上記の時間内で1日3時間/週1日～勤務OK！【勤務例】≪高校生Aさん≫平日は学校が終わってから、土日はお昼にしっかり働く！平日週3日+土日1日（週4日）×1日4時間≪大学生Bさん≫平日は学校が忙しいので、土日にしっかり働く！土日（週2日）×1日8時間固定シフトでは無いので、「学校や部活が終わってから！」「学校が無い土日はしっかり働く」なんて、自分らしい働き方が出来るのでGood！！※ゴールデンウィークのシフト融通ききます！ 10：00～18：00特にランチタイム勤務できる方大歓迎！▲上記時間内で週1日～／1日3h～勤務OK！※変動がある可能性あり。※勤務時間に応じて休憩あり固定シフトではなく希望シフトなので◇家事の合間を有効活用！10：00～18：00まで◇学校が休みの土日はしっかり！10：00～18：00までなどなど、あなたの都合に合わせた働き方ができますよ！＜POINT>クリスマスなど忙しい日もありますがそんなときはスタッフもいっぱいいるのでいつもよりわいわいしてて楽しいですよ！オープニングしたてのお店なのでみんな一緒のスタート！同期もいっぱいできるので忙しい日だって楽しく過ごせちゃうかも。ピークが過ぎたときの達成感もみんなで味わいましょ！ 09：30～22：00下記シフト勤務できる方、積極採用中！！▼カウンターSTAFF＜平日＞【1】9：30～15：00 【2】14：00～18：00 【3】17：00～21：30＜土日＞【1】9：30～15：00▼キッチンSTAFF厨房＜平日、土日＞ 【1】9：00～15：00、【2】17：00～22：00（21：30）※勤務時間・曜日の相談OK※土日祝のみの勤務OK【勤務例】≪高校生Aさん≫平日は学校が終わってから、土日はお昼にしっかり働く！平日週3日+土日1日（週4日）×1日4時間≪大学生Bさん≫平日は学校が忙しいので、土日にしっかり働く！土日（週2日）×1日8時間固定シフトでは無いので、「学校や部活が終わってから！」「学校が無い土日はしっかり働く」なんて、自分らしい働き方が出来るのでGood！！※22時～翌5時まで18歳以上の方（省令2号） 交通費一部支給 交通費：一部支給※1ヵ月上限5万円まで支給［1］鮮魚850円～900円［2］青果850円～900円［3］食品売場850円～1000円※時給の幅は時間帯により変動あり※日・祝の勤務は、時給100円UP！ 交通費一部支給 交通費：一部支給※1ヵ月上限5万円まで支給［1］鮮魚時給900円～950円［2］食品売場時給900円～1050円［3］レジ時給900円～1050円※時給の幅は時間帯により変動あり※日・祝の勤務は、時給100円UP！ 交通費一部支給 交通費：一部支給※1ヵ月上限5万円まで支給【食品レジ】■17：00～21：30時給980～1,080円※学生960円～【レストラン（ウエルカム・花ふじ）】■10：00～14：00■16：00～20：00時給930～1,080円【惣菜売場】■07：00～15：00時給910～960円【鮮魚売場】■07：00～15：00時給910～960円※時間給は時間帯により異なります

雌性動物が胚を妊娠してキメラ動物を産む、レシピエント雌性動物に胚を移植する段階 以下を含む、筋重量が増加した動物の食糧を作製する方法: a)動物の前核胚の生殖細胞に、フォリスタチン、ミオスタチンプロペプチド、または切断型アクチビンII型受容体をコードする導入遺伝子を導入する段階;b)偽妊娠雌性動物の卵管に胚を着床させて、それによって胚を妊娠満期まで成熟させる段階;c)導入遺伝子陽性子孫を同定するために導入遺伝子の有無に関して子孫を試験する段階; d)さらなる導入遺伝子陽性子孫を同定するために、導入遺伝子陽性子孫を交配させる段階;および e)子孫を加工して食糧を得る段階 以下を含む、筋重量が増加したトリ、ブタ、魚、またはウシの食品を作製する方法: a)フォリスタチン、ミオスタチンプロペプチド、または切断型アクチビンII型受容体をコードする導入遺伝子を、トリ、ブタ、魚、またはウシ動物の胚に導入する段階;b)子孫が孵化する条件で胚を培養する段階;c)導入遺伝子陽性子孫を同定するために導入遺伝子の有無に関して子孫を試験する段階; d)導入遺伝子陽性子孫を交配する段階;および e)子孫を加工して食糧を得る段階 【発明の詳細な説明】【技術分野】 本発明は、一般的に増殖分化因子(GDF)受容体に関し、より詳しくはGDF-8(ミオスタチン)受容体、細胞においてミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす組成物、および細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節するためにそのような組成物を用いる方法に関する アメリカにおいて、体重を減らそうと考えている人が消費する時間、労力、およびお金の量は驚異的である。これらの人の多くにとって、目標は単に外見を良くすることではなく、より重要なことは、過体重であることに関連した避けて通れない医学的問題を回避することである。アメリカでは成人集団の半数以上が過体重であると見なされる。さらに、アメリカでは成人男性の20〜30%および成人女性の30〜40%が肥満であると見なされ、貧困および少数民族においてその発生率は最も高い。平均脂肪レベルを少なくとも20%超えていると定義される肥満は、ここ数十年のあいだに発生率が劇的に増加して、小児集団においても主要な問題となりつつある。子供全体の20%が現在過体重であると見なされ、過去5年のあいだにその数は倍増している。肥満と、肥満に直接帰因する医学的問題は、世界全体から見ても罹患率および死亡率の主な原因である。肥満は、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心臓発作、II型糖尿病、膀胱疾患、および特定の癌を含む様々な病態の発症の主要な危険因子であり、早期死亡に関与する。心疾患は、アメリカにおける死因の第一位であり、II型糖尿病は、アメリカにおいて1600万人に罹患し、疾患による主な死因の一つである。II型糖尿病の80%超が肥満の人に起こる。II型糖尿病は全ての人種に罹患するが、アメリカインディアン、アフリカ系アメリカ人、およびヒスパニック系住民において特に発生率が高い。特に、年齢40歳を過ぎた成人にほぼ限って起こっていたII型糖尿病が、今では小児に起こり、報告された症例は過去5年のあいだにほぼ3倍になった。非インスリン依存型糖尿病とも呼ばれるII型糖尿病は、循環中のインスリンレベルが正常または上昇している場合であっても、グルコースに反応したインスリン分泌の減少およびインスリンの作用に対する体の耐性を特徴とする。II型糖尿病は、多様な異なる組織および臓器の機能に影響を及ぼし、血管疾患、腎不全、網膜症およびニューロパシーを引き起こしうる。肥満に関連した医学的問題とは対照的に、特定の慢性疾患を有する患者に一般的に起こる重度の体重減少も医学的介入に対する課題となる。カヘキシアと呼ばれるこの体重減少の分子的基礎は十分に理解されていない。しかし、カヘキシアによってそのような疾患の管理が複雑となり、それが患者の予後不良に関連することは明らかである。カヘキシアの作用は、癌およびAIDS患者において起こる消耗性症候群において明らかである。体重の調節に関与する生物学的プロセスを解明するために多くの努力が行われているが、結果は実際の値より誇張されて提供されている。例えば、レプチンの発見は、ヒトにおいて脂肪が蓄積する分子的基礎を理解するための突破口であると認められ、それによって肥満が治癒する見込みがあると見なされた。動物試験は、レプチンが食欲を調節する内部シグナルの伝達に関係することを示しており、レプチンが肥満を有する人を治療するために有用となりうることを示唆している。しかし、肥満を治療するためにレプチンを用いる進捗状況は遅く、これまでのところ、レプチンは当初の予想を満たしていない。病的な肥満の治療は、現在のところ、腸の一部を除去して、それによって吸収される食物(およびカロリー)量を減少させる手術に限定されている。中等度の肥満の場合、唯一の「治療」は健康な食事を食べて、定期的に運動することであるが、この方法は成功してもせいぜいわずかであることが証明されている。このように、肥満およびカヘキシアのような障害を治療する方法を開発することができるように、筋肉の発達および脂肪の蓄積を含む体重の調節に関係した生物学的要因を特定する必要がある。本発明は、この必要性を満足してさらなる長所を提供する。 【発明の開示】 本発明は、実質的に精製されたGDF受容体に関する 例えば、ミオスタチン受容体は、少なくとも特異的にミオスタチンと相互作用して、同様に、一つまたは数個のさらなる成熟GDFペプチドとも特異的に相互作用しうる GDF受容体をコードするポリヌクレオチド、GDF受容体と特異的に相互作用する抗体等も同様に提供する。本発明はまた、GDFによって影響を受けるシグナル伝達に影響を及ぼすことによってGDFの作用を調節する方法にも関する。例として、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を細胞に接触させることによって、細胞に及ぼすミオスタチンの影響を調節する方法を提供する。一つの態様において、作用物質は、細胞によって発現されたミオスタチン受容体とミオスタチンとの特異的相互作用を変化させ、それによって細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節する。ミオスタチン受容体はアクチビン受容体ともなりえて、またはミオスタチンシグナル伝達が活性化されるように、成熟ミオスタチンまたはその機能的ペプチド部分が接触することができる他の如何なる受容体ともなりうる。もう一つの態様において、作用物質は、ミオスタチン受容体に結合して、それによって受容体に対するミオスタチン結合を増強する、または受容体に関してミオスタチンと競合する。そのため、作用物質は、ミオスタチンシグナル伝達を増加させることができ、またはミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害することができる。さらにもう一つの態様において、作用物質は、細胞内で、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を変化させるように作用する。GDFシグナル伝達を調節するために有用な作用物質は、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリヌクレオチド、有機低分子、または他の如何なる作用物質ともなりえて、GDFシグナル伝達の作用剤またはGDFシグナル伝達の拮抗剤として作用することができる。一つの態様において、ペプチド作用物質は、ミオスタチンとミオスタチン受容体との特異的相互作用を変化させる。そのようなペプチド作用物質は、例えば、ミオスタチンに結合するか、またはそうでなければミオスタチンを隔離して、それによってミオスタチンの受容体との特異的相互作用能に影響を及ぼすペプチドとなりうる。そのような作用物質の例は、変異体ミオスタチン受容体、例えば、ミオスタチンと特異的に相互作用することができるミオスタチン受容体の可溶性細胞外ドメイン;ミオスタチンと特異的に相互作用することができるミオスタチンプロドメイン;およびプロドメインと成熟ミオスタチンとへの蛋白質分解分解に対して抵抗性で、ミオスタチンと特異的に相互作用することができる変異体ミオスタチンポリペプチドであり、それらは細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するミオスタチンシグナル伝達拮抗剤として有用である。もう一つの態様において、ペプチド作用物質は、細胞によって発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、それによってミオスタチンと受容体に関して競合することができる。そのようなペプチド物質の例は、抗ミオスタチン受容体抗体または抗ミオスタチン抗体の抗イディオタイプ抗体である。そのようなペプチド物質は、ミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、それによって受容体に関してミオスタチンと競合することができるか否かに関して選択することができるのみならず、ミオスタチンシグナル伝達を活性化しない作用を有することに関してもさらに選択することができる。このように、細胞によって発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、ミオスタチン依存的シグナル伝達を活性化するペプチド物質は、ミオスタチン作用剤として、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を増加させるために用いることができ、一方、細胞によって発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用するがミオスタチンシグナル伝達を活性化しないペプチド作用物質は、ミオスタチン拮抗剤として、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するために用いることができる。本発明の方法において有用な作用物質は、ポリヌクレオチドとなりうる。一般的に、しかし必ずしもそうではないが、ポリヌクレオチドは細胞に導入され、直接、または転写もしくは翻訳後、またはその双方で機能を発揮する。例えば、ポリヌクレオチド作用物質は、細胞において発現され、ミオスタチン活性を調節するペプチドをコードすることができる。そのような発現されたペプチドは、例えば、可溶性のミオスタチン受容体細胞外ドメインのような変異体ミオスタチン受容体;膜結合ドメインに機能的に会合したミオスタチン受容体細胞外ドメイン;またはプロテインキナーゼ活性を欠損する変異体ミオスタチン受容体となりうる。ポリヌクレオチド作用物質から発現されたペプチドは、GDFシグナル伝達経路の細胞内ポリペプチド成分のレベルまたは活性に影響を及ぼすペプチドとなりうる。細胞内ポリペプチドは、例えば、本明細書に開示するように、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼしうるドミナントネガティブSmadのようなSmadポリペプチドとなり得る。 このように、ポリヌクレオチド作用物質は、細胞において発現されると、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害するドミナントネガティブSmad2、Smad3、もしくはSmad4ポリペプチドをコードしうる;または発現されると、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少させるSmad6もしくはSmad7ポリペプチドをコードしうる ポリヌクレオチド作用物質はまた、その発現によってミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害することができる細胞内c-skiポリペプチドをコードしうる 本発明の方法において有用なポリヌクレオチド作用物質はまた、アンチセンス分子、リボザイム、または三重らせん形成物質となりうる、またはそれらをコードしうる 例えば、ポリヌクレオチドは、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を増加しうるアンチセンスc-skiヌクレオチド配列;または特定のSmadアンチセンスヌクレオチド配列に応じて、ミオスタチンシグナル伝達を増加しうる、またはミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害しうるアンチセンスSmadヌクレオチド配列のようなアンチセンスヌクレオチド配列となりうる(またはコードしうる) 本発明はまた、少なくとも部分的に被験者における異常な量の筋または脂肪組織の発達または代謝活性を特徴とする病的な状態の重症度を改善する方法にも関する。そのような方法は、病態に関連した細胞におけるGDFシグナル伝達を調節すること、例えば、被験者における筋細胞または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することを含む。例えば、カヘキシア、食欲不振、筋ジストロフィー、神経筋疾患のような消耗性障害、ならびに肥満およびII型糖尿病のような代謝障害を含む様々な病態が、本発明の方法を用いて改善を受ける。 本発明はさらに、GDF受容体によって媒介されるシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を生物に投与することによって、真核生物における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法に関する 一つの態様において、筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法は、ミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を投与することによって行われる。もう一つの態様において、作用物質は、GDF-11シグナル伝達、またはミオスタチンおよびGDF-11シグナル伝達に影響を及ぼす。作用物質は、例えば、ミオスタチンとミオスタチン受容体との特異的相互作用を変化させる作用物質、ミオスタチンとミオスタチン受容体との特異的相互作用を減少もしくは阻害する作用物質、または本明細書において開示する他の如何なる作用物質ともなりうる。真核生物は、脊椎動物、例えば、哺乳類、鳥類、もしくは魚類生物となりうる、または無脊椎動物、例えば、エビ、ホタテガイ、ヤリイカ、タコ、マキガイ、もしくはナメクジのような軟体動物となりうる。 本発明はまた、増殖分化因子(GDF)受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定する方法に関する 本発明のそのようなスクリーニングアッセイ法は、例えば、GDF受容体を試験作用物質に接触させる段階、および試験作用物質がGDF受容体と特異的に相互作用することを決定して、それによってGDF受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定することによって行うことができる。GDF受容体は如何なるGDF受容体ともなりえて、特にミオスタチン受容体となり、作用物質はGDFシグナル伝達を増加させるGDF受容体作用剤、またはGDFシグナル伝達を減少もしくは阻害するGDF受容体拮抗剤となりうる。本発明のそのような方法は、試験作用物質のライブラリ、特に試験作用物質の組み合わせライブラリをスクリーニングするために有用である。本発明はまた、GDF受容体またはGDF受容体の機能的ペプチド部分の仮想表示、例えばGDF8受容体またはGDF-11受容体の仮想表示を提供する。一つの態様において、仮想表示には、GDF受容体と特異的に相互作用する作用物質が含まれる。そのため、本発明はさらに、コンピューターシステムを用いて、増殖分化因子(GDF)受容体またはGDF受容体の機能的ペプチド部分と特異的に相互作用する作用物質を同定する方法を提供する。例えば、方法は、仮想のGDF受容体またはその機能的ペプチド部分との特異的相互作用能に関して仮想の試験作用物質を調べること;および仮想の試験物質と仮想のGDF受容体またはその機能的ペプチド部分との特異的相互作用を検出し、それによってGDF受容体またはその機能的ペプチド部分と特異的に相互作用する作用物質を同定することによって行うことができる。 発明の詳細な説明 本発明は、プロミオスタチンポリペプチドの実質的に精製されたペプチド部分を提供する。これまで増殖分化因子-8(GDF-8)と呼ばれていたプロミオスタチンは、アミノ末端プロドメインとC末端成熟ミオスタチンペプチド(米国特許第5,827,733号を参照のこと)とを含む。ミオスタチン活性は、プロミオスタチンからの切断後の成熟ミオスタチンペプチドによって示される。このように、プロミオスタチンは、蛋白質分解によって切断されて活性ミオスタチンを生じる前駆体ポリペプチドである。本明細書に開示するように、ミオスタチンプロドメインは、ミオスタチン活性、GDF-11活性またはその双方を阻害することができる。本発明はまた、プロGDF-11ポリペプチドの実質的に精製されたペプチド部分を提供する。 これまで一般的にGDF-11と呼ばれてきたプロGDF-11は、アミノ末端のプロドメインとC末端の成熟GDF-11ペプチドとを含む(参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第98/35019号を参照のこと) このように、プロGDF-11は、プロミオスタチンと同様に、蛋白質分解によって切断されて活性なGDF-11を生じる前駆体ポリペプチドである。本明細書において開示されるように、GDF-11プロドメインは、GDF-11活性、ミオスタチン活性、またはその双方を阻害することができる。プロミオスタチンおよびプロGDF-11は、トランスフォーミング増殖因子-(TGF-)スーパーファミリーのメンバーであり、これは様々な細胞タイプにおいて増殖、分化、および他の機能を制御する多機能ポリペプチドからなる。TGF-ファミリーメンバーの多くは、他のペプチド増殖因子に対して調節作用(正または負)を有する。特に、TGF-スーパーファミリーの特定のメンバーは、神経系の機能に関連する発現パターンまたは活性を有する。そのため、ミオスタチン、GDF-11または双方の活性を調節する方法は、筋萎縮性側索硬化症もしくは筋ジストロフィーのような神経変性疾患を治療するため、または移植前に細胞もしくは組織を培養において維持するために有用となりうる。TGF-ファミリーの蛋白質は大きい前駆体蛋白質として合成され、これがその後C末端からアミノ酸約110〜140個の塩基性残基の集団で蛋白質分解による切断を受け、それによってプロドメインペプチドとC末端成熟ペプチドとが形成される。このファミリーの蛋白質メンバーのC末端の成熟ペプチドは、構造的に近縁で、異なるファミリーメンバーは、その相同性の程度に基づいて異なるサブグループに分類することができる。特定のサブグループ内の相同性は、70%〜90%のアミノ酸配列同一性の範囲であり、サブグループ間の相同性は、有意に低く、一般的に20%〜50%の範囲である。それぞれの場合において、活性な種はC末端ペプチド断片のジスルフィド結合二量体であるように思われる。プロミオスタチンおよびプロGDF-11ポリペプチドは、哺乳類、鳥類および魚類において同定されており、ミオスタチンは、脊椎動物および無脊椎動物を含む他の様々な種において活性である。初期胚形成のあいだ、ミオスタチンは、発達しつつある体節の筋節コンパートメントの細胞によって発現される。胚後期段階および成体動物では、ミオスタチンは骨格筋組織に広く発現されているが、その発現レベルは筋肉によってかなり異なる。ミオスタチン発現はまた、脂肪組織においても検出されるが、筋肉におけるレベルより低い。同様に、GDF-11は、成人胸腺、脾臓、および子宮と共に骨格筋および脂肪組織において発現され、同様に、GDF-11は骨格筋および脂肪組織において発現されると共に成人胸腺、脾臓および子宮に発現され、また様々な発達段階の脳にも発現される。 様々な種からのプロミオスタチンポリペプチドは、実質的な配列同一性を共有し、ヒト、マウス、ラットおよびニワトリの成熟ミオスタチンC末端配列のアミノ酸配列は100%同一である(図1を参照のこと) プロミオスタチンポリペプチドの例は、本明細書において(図1を参照のこと)ヒトプロミオスタチン(配列番号:2);マウスプロミオスタチン(配列番号:4);ラットプロミオスタチン(配列番号:6);ヒヒプロミオスタチン(配列番号:10);ウシプロミオスタチン(配列番号:12);ブタプロミオスタチン(配列番号:14);ヒツジプロミオスタチン(配列番号:16);ニワトリプロミオスタチン(配列番号:8);七面鳥プロミオスタチン(配列番号:18);およびゼブラフィッシュプロミオスタチン(配列番号:20)である。プロミオスタチンポリペプチドの例も同様に、本明細書においてサケ対立遺伝子1(配列番号:27、「サケ1」)およびサケ対立遺伝子2(配列番号:29、「サケ2」、図2を参照のこと)の一部を含むポリペプチドである。 プロミオスタチンポリペプチドにおいて、特にヒトと魚類のような離れている種において広く保存されていることを考慮すると、サケ1およびサケ2の配列の残りを含む如何なる種からのミオスタチンもコードするポリヌクレオチドを得ること、および如何なる種においてもプロミオスタチンまたはミオスタチン発現を同定することはごく普通のことであろう 特に、成熟ミオスタチン配列は、TGF-スーパーファミリーの他のメンバーと有意な相同性を有し、ミオスタチンは、他のファミリーメンバーおよび他の種において高度に保存されている残基のほとんどを含む。さらに、ミオスタチンはTGF-およびインヒビンと同様に、実質的に全てのファミリーメンバーにおいて存在する7個のシステイン残基の他に余分のシステイン残基対を含む。TGF-スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、ミオスタチンは、より大きい前駆体プロミオスタチンポリペプチドとして合成され、これが蛋白質分解によって切断されて活性なミオスタチンペプチドとなる。様々な生物のプロミオスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、周知の技法および開示された配列との同一性(または相同性)に基づくアルゴリズムを用いて同定することができる。そのようなソフトウェアは、様々な欠失、置換および他の改変に相同性の程度を割付することによって類似の配列をマッチさせる。本明細書において二つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の意味において用いられる「相同性」および「同一性」という用語は、同じである二つもしくはそれ以上の配列もしくは小配列、または何らかの数の配列比較アルゴリズムを用いて、もしくは手動でのアラインメントおよび肉眼的検査によって測定した場合に、比較ウィンドウもしくは指定領域に対して最大の対応が得られるように比較して並置した場合に、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で有する二つもしくはそれ以上の配列もしくは小配列を意味する。配列比較を行う場合、典型的に一つの配列を参照配列として用い、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピューターに入力して、必要であれば小配列の座標を指定する。配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを用いることができ、または別のパラメータを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の%配列同一性を計算する。「比較ウィンドウ」という用語は、本明細書において、その中で二つの配列を最適に並置した後に、配列が隣接位置の同じ数値の参照配列と比較される、例えばアミノ酸またはヌクレオチドの位置の連続する位置、例えば、約20〜600位、通常約50〜約200位置、より通常、約100〜約150位の数のいずれか1つの区域に対する言及も含まれるように広く用いられる。比較のために配列を並置させる方法は当技術分野で周知である。 比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、スミスとウォーターマン(SmithとWaterman、Adv USA 85:2444、1988)の類似性検索法によって行うことができ、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行(ウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージ、ジェネティクスコンピューターグループ、575 Science Dr そのようなアラインメントプログラムはまた、実質的に同一の配列を有するポリヌクレオチド配列を同定するためにゲノムデータベースをスクリーニングするために用いることができる。 多くのゲノムデータベースを、比較のために利用することができ、例えば、ヒトゲノムの実質的な部分は、ヒトゲノム配列決定プロジェクト(ローチ(J いくつかの機能的情報を注釈したゲノム情報を含むいくつかのデータベースは、異なる機構によって維持されており、インターネットによって例えば、 にアクセスすることができる。 BLAST解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して一般に利用できる( このアルゴリズムは、これはデータベースにおける同じ長さのワードと並置した場合に、いくつかの陽性評価閾値スコアTとマッチするかまたは満足する、問い合わせ配列における長さWの短いワードを同定することによって高スコア配列対(HSPs)をまず同定することを含む。これらの初回隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPsを発見するための検索を開始するためのシードとなる。それぞれの配列に沿って、累積アラインメントスコアが増加することができる限り、ワードヒットを双方向に伸張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関してパラメータM(マッチする残基対に関する報酬スコア;常に>0)を用いて計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリング行列を用いて累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸張は、累積アラインメントスコアがその最高到達値から量X遠ざかる場合;累積スコアがゼロもしくはそれ未満に達する場合;一つもしくはそれ以上の陰性スコア残基アラインメントの蓄積のため;またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止する。BLASTアルゴリズムパラメータ、W、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を左右する。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の一つの測定は、最小和確率(P(N))であり、これは二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。 例えば、核酸は、試験核酸を参照核酸と比較した場合の最小和確率が約0 2未満であれば、より好ましくは約0 01未満であれば、および最も好ましくは約0 001未満であれば、核酸は参照配列と類似であると見なされる。一つの態様において、蛋白質および核酸配列相同性は、基礎局所アラインメント検索ツール(「BLAST」)を用いて評価する。 特に、特異的BLASTプログラム5個を用いて以下のタスクを行う: (2)BLASTNは、ヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチド問い合わせ配列を比較する;(3)BLASTXは、蛋白質配列データベースに対する問い合わせヌクレオチド配列(双方の鎖)の6個のフレーム概念的翻訳産物を比較する; (4)TBLASTNは、全ての6個のリーディングフレーム(双方の鎖)において翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して問い合わせ蛋白質配列を比較する;および (5)TBLASTXは、ヌクレオチド配列データベースの6個のフレーム翻訳に対するヌクレオチド問い合わせ配列の6個のフレーム翻訳を比較する。BLASTプログラムは、これは本明細書において、問い合わせアミノ酸または核酸配列と、好ましくは蛋白質または核酸配列データベースから得られる試験配列との間の「高スコアリングセグメント対(High-scoring segment pairs)」と呼ばれる類似の部分を同定することによって相同な配列を同定する。 高スコアリングセグメント対は好ましくは、その多くが当技術分野で既知であるスコアリング行列によって同定される(すなわち並置される) govで米国国立図書館を通してアクセスできる。上記のアルゴリズムで用いたパラメータは、調べる配列の長さおよび相同性の程度に応じて適合させてもよい。いくつかの態様において、パラメータは、ユーザーからの指示がなければアルゴリズムによって用いられるデフォルトパラメータであってもよい。 プロミオスタチンをコードするポリヌクレオチドは、例えば、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒト、ニワトリ、七面鳥、ゼブラフィッシュ、サケ、魚、他の水棲生物および他の種を含む如何なる生物にも由来しうる 水棲生物の例には、マス、チャー、アユ、コイ、ヨーロッパフナ、キンギョ、ウグイ、シラス、ウナギ、アナゴ、イワシ、トビウオ、スズキ、タイ、パロットバス、フエダイ、サバ、マグロ、マグロ、ハガツオ、ブリ、岩間の魚、カレイ、ソール、ヒラメ、フグ、モンガラカワハギのような魚類;ヤリイカ、イカ、タコのような頭足類;ハマグリ(例えば、ハードシェル、マニラ、ホンビノスガイ、ホンビノスガイ、ソフトシェル)のような二枚貝類;コックル、イガイ、タマキビガイ;ホタテガイ(例えば、海、湾、カルー(calloo))、ホラガイ、マキガイ、ナマコ;アークシェル;カキ(例えば、C norvegious)、冷水エビを含むがこれらに限定されないエビ;ワタリガニ、ルーククラブ、ストーンクラブ、カブトガニ、クイーンクラブ、スノウクラブ、ブラウンクラブ、イチョウガニ、北米産イチョウガニ、マングローブクラブ、ソフトシェルクラブのようなカニ;シャコ、クリール、ランゴスチノ(langostino);ブルー、マロン、レッドクロウ、レッドスワンプ、ソフトシェル、ホワイトを含むがこれらに限定されないイセエビ/ザリガニ(crayfish/crawfish)のような甲殻類;環形動物;アメリカワニおよびカメのようなは虫類を含むがこれらに限定されない脊索動物;カエルを含む両生類;ならびにウニを含むがこれらに限定されない棘皮動物に属するものが含まれる。本発明は、プロミオスタチンポリペプチドの実質的に精製されたペプチド部分およびプロGDF-11ポリペプチドの実質的に精製されたペプチド部分を提供する。本明細書において用いられるように、「プロGDF」、例えばプロミオスタチンまたはプロGDF-11という用語は、アミノ末端プロドメインとカルボキシ末端の生物活性GDFペプチドとを含む完全長のポリペプチドを意味する。さらに、プロドメインには、プロドメインのアミノ末端の最初のアミノ酸約15〜30個を含むシグナルペプチド(リーダー配列)が含まれる。シグナルペプチドは、完全長のプロGDFポリペプチドから切断することができ、これをさらに、Arg-Xaa-Xaa-Arg(配列番号:21)蛋白質分解切断部位で切断することができる。 本明細書においてアミノ酸残基という用語は、図1および2に示すような完全長のプロGDFポリペプチドに関して参照する(同様に、配列表を参照のこと) 同様に、この用語は、本明細書において「約」特定のアミノ酸残基で始まるまたは終わる特定のペプチドを意味すると認識すべきである。「約」という用語は、それが蛋白質分解切断認識部位で、またはそれに直ちに隣接して、または認識部位から一つもしくは数個のアミノ酸離れて、プロGDFポリペプチドを切断することができると認識されることから、この意味において用いられる。そのため、例えば、配列番号:4のアミノ酸残基約1〜263位の配列を有するミオスタチンプロドメインという用語には、シグナルペプチドを含み、アミノ酸残基257〜アミノ酸残基269位で終わる、好ましくはアミノ酸残基260〜アミノ酸残基266位で終わるカルボキシ末端を有するプロミオスタチンのアミノ末端ペプチド部分がが含まれる。同様に、シグナルペプチドはプロGDFポリペプチドのアミノ酸残基約15〜30位の如何なる位置で、例えば、残りのプロドメインの機能に影響を及ぼすことなく、残基15、20、25、または30位で切断することも可能である。このように、一般的に本明細書では簡便のため、アミノ酸残基約20位で始まるシグナルペプチドが切断されているプロGDFポリペプチドのペプチド部分に言及する。 しかし、シグナルペプチドの切断は、プロGDFポリペプチドの最初のアミノ末端アミノ酸約15〜30位内の如何なるアミノ酸位置ともなりうると認識されるであろう そのため、例えば、配列番号:4のアミノ酸残基約20〜263位の配列を有するミオスタチンプロドメインという用語には、シグナルペプチドを含むプロミオスタチンの最初のアミノ酸約15〜30個を欠損し、アミノ酸残基257位〜アミノ酸残基269位で終わる、好ましくはアミノ酸残基260〜アミノ酸残基266位で終わるカルボキシ末端を有するプロミオスタチンのペプチド部分が含まれるであろう 一般的に、本明細書においてアミノ酸約1位で始まるプロGDFポリペプチドまたはGDFプロドメインについて言及する。 しかし、上記の開示を考慮すると、そのようなプロGDFポリペプチドまたはシグナルペプチドを欠損するGDFプロドメインも同様に、本発明に含まれると認識されるであろう さらにこの点において、本発明のペプチドにおけるシグナルペプチドの有無は、例えばペプチド、例えばミオスタチンプロドメインが横切る細胞の区画、およびペプチドが細胞から分泌されるか否かを含むペプチドが最終的に局在する細胞の区画に影響を及ぼしうることを認識すべきである。このように、本発明は、プロGDFポリペプチドの実質的に精製されたシグナルペプチド部分をさらに提供する。本明細書に開示するように、そのようなシグナルペプチドは、作用物質、特にペプチド作用物質を、シグナルペプチドが由来する天然に存在するGDFと同じ細胞区画にターゲティングするために用いることができる。「ペプチド」または「ペプチド部分」という用語は、本明細書において広い意味で、ペプチド結合によって結合された二つまたはそれ以上のアミノ酸を意味するために用いられる。「断片」または「蛋白質分解断片」という用語も同様に、本明細書において、ポリペプチド上の蛋白質分解反応によって産生されうる産物、すなわちポリペプチドにおけるペプチド結合の切断によって産生されペプチドを意味する。「蛋白質分解断片」という用語は、一般的に本明細書において蛋白質分解反応によって生じうるペプチドを意味するが、断片は必ずしも蛋白質分解反応によって生じる必要はなく、下記により詳細に説明するように、蛋白質分解断片と同等の合成ペプチドを生じるために、化学合成法または組換えDNA技術の方法を用いて産生することができる。 プロミオスタチンとTGF-スーパーファミリーの他のメンバーとの開示された相同性を考慮すると、本発明のペプチドは、部分的にそれがこのスーパーファミリーのこれまでに開示されたメンバーには存在しないという特徴を有すると認識されるであろう プロミオスタチンまたはプロGDF-11ポリペプチドのペプチド部分がTGF-スーパーファミリーのこれまでに開示されたメンバーに存在するか否かは、上記のコンピューターアルゴリズムを用いて容易に決定することができる。一般的に、本発明のペプチドは、少なくともアミノ酸約6個、通常、アミノ酸約10個を含む、アミノ酸15個またはそれ以上を含みうる、特に20個またはそれ以上を含みうる。「ペプチド」という用語は、本明細書においてその分子を含むアミノ酸の特定の大きさまたは数を示唆するために用いられず、本発明のペプチドはアミノ酸残基数個またはそれ以上までを含みうると認識すべきである。例えば、完全長の成熟C末端ミオスタチンペプチドは、100個を超えるアミノ酸を含み、完全長のプロドメインペプチドは260個を超えるアミノ酸を含みうる。本明細書において用いられるように、「実質的に精製された」または「実質的に純粋」もしくは「単離された」という用語は、例えば、ペプチドまたはポリヌクレオチドと呼ばれる分子が、それが天然に会合する蛋白質、核酸、脂質、糖質、または他の材料を比較的含まない形であることを意味する。一般的に、実質的に純粋なペプチド、ポリヌクレオチド、または他の分子は、試料の少なくとも20%を構成し、一般的に試料の少なくとも約50%を構成し、通常、飼料の少なくとも約80%を構成し、および特に試料の約90%または95%またはそれ以上を構成する。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドが実質的に純粋であるか否かの決定は、周知の方法を用いて、例えば電気泳動を行って、比較的明確なバンドとして特定の分子を同定することによって、行うことができる。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドをクローニングすることによって、または化学合成もしくは酵素的合成によって得ることができる。実質的に純粋なペプチドは、例えば、化学合成方法によって、または蛋白質精製方法の後に蛋白質分解を行い、望ましければクロマトグラフィーもしくは電気泳動方法によってさらに精製することによって得ることができる。本発明のペプチドは、プロミオスタチンまたはプロGDF-11配列と比較して、ペプチドのアミノ酸配列がそれぞれ、プロミオスタチンまたはプロGDF-11ポリペプチド配列の中に含まれることを決定することによって同定することができる。しかし、本発明のペプチドはプロミオスタチンまたはプロGDF-11の対応するアミノ酸配列と同一である必要はないと認識すべきである。このように、本発明のペプチドは、プロミオスタチンポリペプチドのアミノ酸配列に対応することができるが、例えば、対応するL-アミノ酸の代わりに一つまたはそれ以上のD-アミノ酸を含むことによって、または一つもしくはそれ以上のアミノ酸類似体、例えばその反応性側鎖で誘導体化されたもしくはそうでなければ改変されているアミノ酸を含むことによって、天然に存在する配列とは異なりうる。同様に、ペプチドにおける一つまたはそれ以上のペプチド結合を改変することができる。さらに、アミノ末端またはカルボキシ末端またはその双方で反応基を改変することができる。そのようなペプチドは、例えば、プロテアーゼ、酸化剤、または生物環境においてペプチドが遭遇する可能性がある他の反応性材料に対して改善された安定性を有するように改変することができ、したがって、本発明の方法を行うために特に有用となりうる。当然のこととして、ペプチドは、ペプチドが環境において活性である期間が減少するように、生物環境において減少した安定性を有するように改変することができる。本発明のペプチドの配列はまた、ペプチドに一つまたは少数のアミノ酸の保存的アミノ酸置換を組み込まれることによって、プロミオスタチンまたはプロGDF-11ポリペプチドにおける対応する配列と比較して改変することができる。保存的アミノ酸置換には、一つのアミノ酸残基を、比較的同じ化学特徴を有するもう一つのアミノ酸残基に置換すること、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような一つの疎水性残基をもう一つの残基の代わりに置換すること、または一つの極性残基をもう一つの残基の代わりに置換すること、例えばアルギニンをリジンの代わりに用いること;またはアスパラギン酸の代わりにグルタミン酸を用いること、アスパラギンの代わりにグルタミンを用いること等が含まれる。改変することができるプロミオスタチンポリペプチドの位置の例は、図1を調べると明らかであり、これはプロミオスタチンまたはミオスタチン活性に実質的に影響を及ぼさない、ミオスタチンプロドメインおよび成熟ミオスタチンペプチドにおける様々なアミノ酸の差を示す。本発明はまた、増殖分化因子(GDF)ポリペプチド(プロGDFポリペプチド)、またはその機能的ペプチド部分の実質的に精製された蛋白質分解断片を提供する。プロGDFポリペプチドの蛋白質分解断片の例は、本明細書においてプロミオスタチンポリペプチドの蛋白質分解断片およびプロGDF-11ポリペプチドの蛋白質分解断片である。本明細書において開示されるように、プロGDFの蛋白質分解断片と同等であるプロGDFポリペプチドのペプチド部分は、化学的方法または組換えDNA法によって産生することができる。本開示を考慮すると、他のGDFポリペプチドの蛋白質分解断片は容易に作成して用いることができる。一般的に、プロGDFポリペプチドの蛋白質分解断片に対応するペプチドの例は、GDF受容体と特異的に相互作用して、GDFシグナル伝達に影響を及ぼすことができるカルボキシ末端(C末端)成熟GDF断片、およびシグナルペプチドを含み得て、本明細書に開示するように、プロGDFポリペプチドまたは成熟GDFペプチドと特異的に相互作用して、GDFシグナル伝達を行う能力に影響を及ぼしうるアミノ末端プロドメイン断片である。例えば、プロミオスタチンポリペプチドの蛋白質分解断片には、ミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、ミオスタチンシグナル伝達を誘導することができるC末端成熟ミオスタチンペプチド、およびミオスタチンと特異的に相互作用して、それによってミオスタチンのミオスタチンシグナル伝達誘導能を減少または阻害することができるアミノ末端プロドメイン断片が含まれる。プロGDFポリペプチドの蛋白質分解断片、またはその機能的ペプチド断片は、部分的に、GDFシグナル伝達の刺激または阻害に関連した活性を有する、または影響を及ぼすことを特徴とする。例えば、プロミオスタチンポリペプチドまたはその機能的ペプチド部分は、ミオスタチン受容体結合活性、ミオスタチンシグナル伝達刺激または阻害活性、ミオスタチン結合活性、プロミオスタチン結合活性、またはその組み合わせを有しうる。このように、本明細書においてプロGDFポリペプチドに関連して用いられるように「機能的ペプチド部分」という用語は、その受容体と特異的に相互作用してGDFシグナル伝達を刺激または阻害することができる;成熟GDFまたはプロGDFと特異的に相互作用することができる;または細胞局在活性を示す、すなわちシグナルペプチドの活性を示すプロGDFポリペプチドのペプチド部分を意味する。完全長の成熟ミオスタチンペプチドの機能的ペプチド部分は、例えば成熟ペプチドの機能的ペプチド部分が、例えばシグナル伝達経路の活性化能を有することなくミオスタチン受容体との特異的相互作用能を有し得ることから、ミオスタチンシグナル伝達の刺激能を含む成熟ミオスタチンと同じ活性を有する必要はないと認識すべきである。ミオスタチン拮抗剤として有用となりうるプロGDFポリペプチドのそのような機能的ペプチド部分を同定する方法は、本明細書において開示するか、または当技術分野で既知である。 このように、一つの態様において、プロミオスタチンポリペプチドの機能的ペプチド部分は、ミオスタチン受容体と特異的に相互作用して、ミオスタチンシグナル伝達を刺激するための作用剤として、またはミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害するための拮抗剤として作用しうる もう一つの態様において、プロミオスタチンポリペプチドの機能的ペプチド部分は、プロミオスタチンポリペプチドまたは成熟ミオスタチンペプチドと特異的に相互作用して、それによってミオスタチンシグナル伝達を阻害することができる。プロミオスタチンのそのような機能的ペプチド部分は、例えば、プロミオスタチンポリペプチドの成熟ミオスタチンへの切断を防止することによって、成熟ミオスタチンペプチドとの複合体を形成することによって、または他の何らかのメカニズムによって作用することができる。ペプチドミオスタチン複合体が形成される場合、複合体は、例えばミオスタチンのその受容体との特異的相互作用能を減少もしくは阻害することによって、またはミオスタチンシグナル伝達の誘導能を欠損する形で受容体に結合することによって、ミオスタチンシグナル伝達を遮断することができる。プロGDFポリペプチドの蛋白質分解断片は、コンセンサスアミノ酸配列Arg-Xaa-Xaa-Arg(配列番号:21)を有する蛋白質分解切断部位でポリペプチドの切断によって産生することができる。シグナルペプチドの蛋白質分解切断部位の他に、プロミオスタチンポリペプチドは、例えば、さらに二つの可能性がある蛋白質分解プロセシング部位(Lys-ArgおよびArg-Arg)を含む。コンセンサスArg-Xaa-Xaa-Arg(配列番号:21)蛋白質分解切断認識部位(例えば、配列番号:2のアミノ酸残基263〜266位を参照のこと)内に含まれる後者の蛋白質分解プロセシング部位またはその近傍でプロミオスタチンポリペプチドが切断されると、生物学的に活性なC末端成熟ヒトミオスタチン断片が産生される。例示された完全長の成熟ミオスタチンペプチドは、アミノ酸約103〜約109個を含み、推定分子量は約12,400ダルトン(Da)である。さらに、ミオスタチンは、推定分子量約23〜30キロダルトン(kDa)の二量体を形成することができる。二量体は、ミオスタチンホモダイマー、または例えばGDF-11、他のGDF、もしくはTGF-ファミリーメンバーとのヘテロダイマーとなりうる。本発明の蛋白質分解断片の例は、GDFプロドメイン、例えば、プロミオスタチンポリペプチドのアミノ酸残基約20〜262位が含まれるミオスタチンプロドメインもしくはその機能的ペプチド部分、またはプロGDF-11ポリペプチドのアミノ酸残基約20〜295位が含まれるGDF-11プロドメインもしくはその機能的ペプチド部分であり、それらはそれぞれ、それぞれのプロGDFポリペプチドのアミノ酸約1〜20位を含むシグナルペプチドをさらに含みうる。ミオスタチンプロドメインの例は、配列番号:4および配列番号:6に示すアミノ酸残基約20〜263位であると共に、配列番号:2、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:8、配列番号:18、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:20に示すアミノ酸残基約20〜262位であり、これらは対応するプロミオスタチンポリペプチドの蛋白質分解切断によって産生することができ、化学合成することができ、または蛋白質分解断片をコードする組換えポリヌクレオチドから発現することができる。ミオスタチンプロドメインの機能的ペプチド部分の例は、ミオスタチンまたはプロミオスタチンと特異的に相互作用することができるミオスタチンプロドメインのペプチド部分である。GDF-11プロドメインの例は、配列番号:25のアミノ酸残基約1〜20位を含むシグナルペプチドをさらに含みうる配列番号:25のアミノ酸残基約20〜295位であり、GDF-11プロドメインの機能的ペプチド部分の例は、成熟GDF-11またはプロGDF-11ポリペプチドと特異的に相互作用することができるGDF-11プロドメインのペプチド部分である。好ましくは、GDFプロドメインの機能的ペプチド部分は、例えば、GDFのその受容体との特異的相互作用能を減少もしくは阻害することによって、または不活性複合体として受容体に結合することによって、対応するGDFもしくは関連GDFのシグナル伝達刺激能を阻害する。一つの態様において、本発明は、プロGDFポリペプチドの機能的断片、特にGDFシグナルペプチド、好ましくはプロミオスタチンもしくはプロGDF-11のアミノ末端の最初のアミノ酸約15〜30個を含むミオスタチンシグナルペプチドまたはGDF-11シグナルペプチドに機能的に結合したGDFプロドメインの機能的断片を提供する。 本明細書において開示するように、ミオスタチンプロドメインまたはGDF-11プロドメインは、成熟ミオスタチン、GDF-11、またはその双方と相互作用して、それによって成熟GDFとその受容体との特異的相互作用能を減少もしくは阻害することができる(実施例7および8を参照のこと) このように、ミオスタチンプロドメインの機能的ペプチド部分は、例えば、本明細書に提供する方法を用いて、ミオスタチンプロドメインのペプチド部分を調べること、ミオスタチンまたはプロミオスタチンと特異的に相互作用することができ、ミオスタチンのミオスタチン受容体との特異的相互作用能またはミオスタチンシグナル伝達刺激能を減少もしくは阻害することができるプロドメインの機能的ペプチド部分を同定することによって、得ることができる。ミオスタチンと特異的に相互作用することができるミオスタチンプロドメインの機能的ペプチド部分、またはもう一つのGDFプロドメインの機能的ペプチド部分も同様に、特異的蛋白質-蛋白質相互作用を同定するために有用であることが知られている様々な如何なるアッセイ法も用いて同定することができる。GDFプロドメインの機能的ペプチド部分はまた、分子モデリングの方法を用いて同定することができる。例えば、成熟ミオスタチンペプチドのアミノ酸配列は、適当なモデリングソフトウェアを有するコンピューターシステムに入力することができ、ミオスタチンの三次元表示(「仮想ミオスタチン」)を得ることができる。プロミオスタチンアミノ酸配列も同様に、モデリングソフトウェアがプロミオスタチン配列の一部、例えば、プロドメインの一部を刺激して、仮想ミオスタチンと特異的に相互作用することができるプロドメインのそれらのペプチド部分を同定することができるように、コンピューターシステムに入力することができる。特異的相互作用の基準値は、そのような相互作用がミオスタチンの活性を阻害することが知られていることから、仮想ミオスタチンおよび完全長のプロミオスタチンプロドメインをモデリングすること、プロドメインによって「接触される」仮想ミオスタチンにおけるアミノ酸残基を同定することによって予め定義することができる。ツーハイブリッドアッセイ法および分子モデリング法を含むそのような方法もまた用いて、本発明に含まれる他の特異的相互作用分子を同定することができると認識すべきである。このように、ツーハイブリッドアッセイ法のような方法を用いて、例えばアッセイ法の一つの結合成分としてAct RIIAまたはAct RIIB受容体と特異的に相互作用するミオスタチンペプチドまたはそのペプチド部分を用いて、ミオスタチン受容体のようなGDF受容体を同定することができ、ミオスタチンペプチドと特異的に相互作用するGDF受容体を同定することができる。同様に、分子モデリングの方法は、成熟ミオスタチンのような成熟GDFペプチドまたはGDF受容体と特異的に相互作用して、したがって、GDFまたはGDF受容体によって媒介されるシグナル伝達の作用剤または拮抗剤として有用となりうる作用物質を同定するために用いることができる。そのような作用物質は例えば、ミオスタチンプロドメインもしくはGDF-11プロドメインの機能的ペプチド部分、またはGDFプロドメインの作用を模倣する化学作用物質となりうる。プロミオスタチンポリペプチドまたはGDF受容体の結晶構造座標を用いて、蛋白質に結合して、その物理的または生理的特性を多様な方法で変化させる化合物を設計することができる。蛋白質の構造座標も同様に、GDFシグナル伝達の作用剤または拮抗剤として作用しうる調節または結合作用物質を開発するために、ポリペプチドに結合する作用物質に関して低分子データベースをコンピューターによってスクリーニングするために用いることができる。そのような作用物質は、標準的な等式(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Segel、「Enzyme Kinetics」、(ジョンウィリーアンドサンズ、1995)を参照のこと)を用いるコンピューター適合速度論データによって同定することができる。阻害剤または結合作用物質を設計するために結晶構造データを用いる方法は、当技術分野で既知である。例えば、GDF受容体座標を、結合した阻害剤を有する受容体を含む類似の受容体の他の利用可能な座標に重なり合わせると、阻害剤が受容体と相互作用する様式の近似を得ることができる。合理的薬剤設計の実践において用いられるコンピュータープログラムも同様に用いて、例えば、成熟ミオスタチンと共結晶化したミオスタチンプロドメインとのあいだに認められるものと類似の相互作用特徴を再現する化合物を同定することができる。特異的相互作用の特性が詳しく判明すれば、結合活性に影響を及ぼすことなく、溶解度、薬物動態等を変化もしくは改善させるように化合物を改変することができる。結晶構造情報を用いて作用物質を設計するために必要な活性を行うためのコンピュータープログラムは周知である。そのようなプログラムの例には、バイオバイトマスターファイル、ダーウェントWDIおよびACIDのような化学データベースを評価するための情報検索プログラムであるカタリストデータベース(商標);化合物のモデルを作製して、候補薬剤の構造によって活性の変化を説明するための仮説を作製するカタリスト/HYPO(商標);相補的極性および疎水性基を同定およびマッチさせることによって、蛋白質の活性部位に分子を適合させるルディ(商標);およびユーザーが管理するパラメータによって遺伝子アルゴリズムを用いて新しいリガンドを「成長させる」リープフロッグ(商標)が含まれる。様々な一般的な目的装置をそのようなプログラムと共に用いることができ、または操作を行うためにより専門的な装置を構築することがより都合がよい場合もある。一般的に、態様は、それぞれが少なくとも一つのプロセッサ、少なくとも一つのデータ保存システム(揮発性および非揮発性記憶装置および/または記憶エレメント)、少なくとも一つの入力装置、および少なくとも一つの出力装置を含むプログラム可能なシステム上で実行する一つまたはそれ以上のコンピュータープログラムにおいて実行される。プログラムは本明細書に記載の機能を実行するためにプロセッサ上で行われる。それぞれのそのようなプログラムは、コンピューターシステムとコミュニケーションを取るために、例えば、機械語、アセンブリ言語、高レベル手続き型言語、またはオブジェクト指向プログラミング言語を含む如何なる所望のコンピューター言語で実行することもできる。いずれにせよ、言語はコンパイラー言語または翻訳言語であってもよい。コンピュータープログラムは、典型的に本明細書に記載の手続きを行うためにコンピューターによって保存媒体または装置を読みとる場合に、コンピューターを形成して操作するために、一般的または専門目的のプログラム可能なコンピューターによって読みとり可能な保存媒体または装置、例えばROM、CD-ROM、磁気または光学媒体等に保存される。システムはまた、そのように形成された保存媒体が、本明細書に記載の機能を実行するために特異的な既定の方法でコンピューターを操作させる場合に、コンピューター読みとり可能な保存媒体として実行され、コンピュータープログラムによって形成されると見なしてもよい。本発明の態様には、システム、例えば、インターネットに基づくシステム、特に、結晶学またはNMR解析によって得られた座標情報、または本明細書に開示されるアミノ酸もしくはヌクレオチド配列情報を保存および操作するコンピューターシステムが含まれる。本明細書において用いられるように、「コンピューターシステム」という用語は、本明細書において述べた座標または配列を解析するために用いられる、ハードウェア成分、ソフトウェア成分、およびデータ保存成分を意味する。コンピューターシステムは典型的に、配列データを処理、アクセスおよび操作するためのプロセッサが含まれる。プロセッサには、如何なる周知のタイプの中央処理装置、例えばインテル社のペンティウムIIまたはペンティウムIIIプロセッサ、またはサン、モトローラ、コンパック、アドバンスドマイクロデバイシズ、もしくはインターナショナルビジネスマシーンズ各社からの類似のプロセッサが含まれうる。典型的に、コンピューターシステムは、プロセッサと、データを保存するための一つまたはそれ以上の内部データ保存成分、およびデータ保存成分上に保存されたデータを検索するための一つまたはそれ以上のデータ検索装置を含む用途の広いシステムである。 当業者は、現在利用できるコンピューターシステムの如何なるものも適していることを容易に認識しうる 一つの態様において、コンピューターシステムには、メインメモリ、好ましくはRAMとして実行されるメモリに接続したバスに接続したプロセッサ、およびハードドライブまたはその上に記録されたデータを有する他のコンピューター読みとり可能な媒体のような一つまたはそれ以上の内部データ保存装置が含まれる。いくつかの態様において、コンピューターシステムには、内部データ保存装置上に保存されたデータを読みとるための一つまたはそれ以上のデータ検索装置がさらに含まれる。データ検索装置は、例えば、フロッピー(登録商標)ディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、または遠隔データ保存システム(例えば、インターネットを通して)に接続することができるモデムであってもよい。いくつかの態様において、内部データ保存装置は、制御論理および/またはその上に記録されたデータを含むフロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープ等のような取り外し可能なコンピューター読みとり可能媒体である。コンピューターシステムは、データ検索装置に一度挿入されたデータ保存成分から制御論理および/またはデータを読み出すための適当なソフトウェアを含むことが都合がよく、またはそれらによってプログラムされてもよい。コンピューターシステムには、一般的にディスプレイが含まれ、これはコンピューターユーザーに出力を表示するために用いられる。同様に、コンピューターシステムは、コンピューターシステムへの中心アクセスを提供するためのネットワークまたは広い地域ネットワークにおいて他のコンピューターシステムとリンクすることができる。ミオスタチンまたはGDF受容体と特異的に相互作用する化学実体を同定することが望ましい場合、分子との特異的相互作用能に関して化学実体または断片をスクリーニングするためにいくつかの方法を用いることができる。このプロセスは、例えば、ミオスタチンとミオスタチンプロドメインとをコンピュータースクリーン上で肉眼的に調べることによって始めてもよい。次に、プロドメインの選択されたペプチド部分、または模倣体として作用しうる化学実体を、ミオスタチンの個々の結合部位において多様な方向に配置、または合体させることができる。合体は、クアンタとシビルのようなソフトウェアを用いて行うことができ、その後、エネルギーの最小限化およびCHARMMおよびAMBERのような標準的な分子力学による分子動力学を行うことができる。特殊なコンピュータープログラムは、プロドメインの選択されたペプチド部分、または例えばGDF受容体作用剤もしくは拮抗剤として有用な化学実体を選択するために特に有用である。選択される適したペプチドまたは作用物質を、単一の化合物または結合物質に組み立てることができる。組立は、コンピュータースクリーン上に表示される三次元画像上で、断片の互いの関係を肉眼的に調べることによって行い、その後クアンタまたはシビルのようなソフトウェアを用いて手動でのモデル構築を行うことができる。そのような特異的に相互作用する作用物質を上記のように一つの断片または化学的実体を一度に段階的に構築または同定する方法の他に、作用物質は、空の活性部位、または選択的に、特異的に相互作用する既知の作用物質いくつかの部分、例えばミオスタチンと特異的に相互作用する完全長のミオスタチンプロドメインを用いて、全体としてまたは新たに設計することができる。 47:8985、1991、モレキュラーシミュレーションズ社から入手可能、バーリントン、マサチューセッツ州);リープフロッグ(トリポスアソシエーツ社から入手可能、セントルイス、ミズーリ州)、およびCohenら(J 特定のコンピューターソフトウェアは、当技術分野において化合物の変形エネルギーおよび静電気的相互作用を評価するために利用できる。 そのような用途のために設計されるプログラムの例には、ゴーシアン92、改訂版C(フリッシュ、ゴーシアンインク、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、1992);AMBER、バージョン4 その速度および容量が絶えず改変されているその他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは、当業者に既知であろう 関係する分子、例えば、成熟ミオスタチンのような成熟GDFペプチドまたはGDF受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定する分子モデリングプロセスは、本明細書に開示されるように実行することができる。第一の段階において、標的分子、例えばミオスタチンの仮想表示を行う。このように、一つの態様において、本発明は、標的分子がプロGDFポリペプチド、例えば、プロミオスタチン;プロGDFポリペプチドのペプチド部分;GDF受容体;およびGDF受容体の関連するドメイン、例えばGDF結合ドメインから選択される、標的分子の仮想表示を提供する。標的分子の仮想表示は、コンピューターシステムのメモリに表示または維持することができる。プロセスは開始状態で始まり、仮想標的分子を含み、次に、一つまたはそれ以上の仮想試験分子を含むデータベースがコンピューターシステムのメモリに保存される状態に移動する。先に考察したように、メモリは、RAMまたは内部保存装置を含む如何なるタイプのメモリとなりうる。次に、プロセスは、第一の仮想試験分子の仮想標的分子との特異的相互作用能が決定される状態に移行して、試験分子の集団の一つとなりうる仮想試験分子を含むデータベースが仮想標的分子および仮想試験分子の相互作用の解析のために開かれて、解析が行われる。特異的相互作用の決定は、コンピューターシステムに維持されたソフトウェアによって、またはコンピューターシステムのメモリに保存されて、必要に応じてアクセスすることができる既定の特異的相互作用と比較することによって行われた計算に基づいて行うことができる。次に、プロセスは、特異的相互作用が検出される場合、仮想試験分子が表示される、またはコンピューター上の第二のデータベースに保存される状態に移行する。適当であれば、仮想標的分子および第二の仮想試験分子、第三の仮想試験分子、望ましければそれ以降に関してプロセスを繰り返す。仮想試験分子が仮想標的分子と特異的に相互作用する決定がなされれば、同定された仮想試験分子をデータベースから移動させて、ユーザーに表示することができる。この状態は、表示された名称または構造を有する分子が、入力される束縛内で標的分子と特異的に相互作用することをユーザーに通知する。同定された試験分子の名称がユーザーに表示されれば、プロセスは決定状態に移動し、そこで、より多くの仮想試験分子がデータベースに存在するか、または調べなければならないかを決定する。これ以上の分子がデータベースに存在しない場合、プロセスは最終状態で停止する。しかし、より多くの試験分子がデータベースに存在する場合、プロセスは、特異的結合活性に関して調べることができるように、ポインターがデータベースにおける次の試験分子に移動する。このようにして、新しい分子を、仮想標的分子との特異的相互作用能に関して調べる。上記のような方法は、請求の本発明に含まれる様々な局面において用いることができる。このように、方法は、ミオスタチンと特異的に相互作用して、ミオスタチンのその受容体との相互作用能を減少もしくは阻害する、またはそうでなければミオスタチンがシグナル伝達を行う能力に影響を及ぼすことができるプロミオスタチンプロドメインのペプチド部分を同定するために用いることができる。同様に、この方法を用いて、GDFプロドメインの作用を模倣して、それによってミオスタチンまたはGDF-11シグナル伝達を減少または阻害する有機低分子を同定することができる。方法はまた、GDF受容体、例えばAct RIIA、Act RIIBまたは他のGDF受容体と特異的に相互作用する作用物質を同定するために用いることができ、そのような作用物質は細胞におけるGDFシグナル伝達を調節することができるGDF受容体作用剤または拮抗剤として有用である。さらに、方法は、特定のポリペプチドの保存された構造的特徴を同定することによって、これまで不明のプロGDFポリペプチドまたはGDF受容体を同定する手段を提供する。TGF-スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、活性なGDFペプチドは、前駆体ポリペプチドとして発現され、これが成熟した生物学的に活性な型に切断される。したがって、なおもう一つの態様において、プロGDFポリペプチドの蛋白質分解断片は、成熟GDFペプチド、または先に考察したように、機能的ペプチド部分がGDF作用剤または拮抗剤の活性を有しうる成熟GDFペプチドの機能的ペプチド部分である。蛋白質分解断片は、プロミオスタチンポリペプチドのアミノ酸残基約268〜374位(図1を参照のこと;同様に、図2も参照のこと)が含まれる成熟C末端ミオスタチンペプチド、またはプロGDF-11ポリペプチドのアミノ酸残基約299〜407位が含まれる成熟C末端GDF-11ペプチドとなりうる。成熟GDFペプチドの機能的ペプチド部分の例は、成熟GDFペプチドの活性に関して作用剤または拮抗剤活性を有する成熟ミオスタチンまたは成熟GDF-11のペプチド部分である。好ましくは、成熟GDFペプチド活性は、その受容体との特異的相互作用能である。 本明細書に開示するように、成熟ミオスタチンペプチド(本明細書において一般的に「ミオスタチン」と呼ぶ)は、細胞表面上に発現されるミオスタチン受容体と特異的に相互作用することによって、ミオスタチンシグナル伝達活性を誘導することができる(実施例7を参照のこと) ミオスタチンプロドメインは、ミオスタチンシグナル伝達活性を減少または阻害することができる。一つの態様において、ミオスタチンプロドメインは、ミオスタチンと特異的に相互作用して、それによってミオスタチンペプチドのその受容体との特異的相互作用能を減少または阻害することができる。本明細書に開示するように、前駆体プロミオスタチンも同様に、ミオスタチン受容体との特異的相互作用能を欠損し、したがって、プロミオスタチンが成熟ミオスタチンに切断されることを減少または阻害するプロミオスタチンの変異は、ミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害する手段を提供する。したがって、もう一つの態様において、本発明は、活性な成熟GDFペプチドへの変異体プロGDFの蛋白質分解切断を破壊する一つまたはそれ以上のアミノ酸変異を含む変異体プロGDFポリペプチドを提供する。本発明の変異体プロGDFポリペプチドは、プロGDFポリペプチドに存在するコンセンサス蛋白質分解切断認識部位Arg-Xaa-Xaa-Arg(配列番号:21)のような蛋白質分解切断部位の切断に影響を及ぼす変異を有しうる。このように、変異は、変異体プロミオスタチンが、例えばミオスタチンプロドメインおよび成熟ミオスタチンペプチドに切断されることができないように、配列番号:21のアルギニン残基の変異となりうる。しかし、変異はまた、蛋白質分解切断部位以外の部位となりえて、切断部位での蛋白質分解を行うためにプロテアーゼのプロGDFポリペプチド結合能を変化させることができる。本発明の変異体プロGDFポリペプチド、例えば変異体プロミオスタチンまたは変異体プロGDF-11は、ミオスタチンまたはGDF-11に関してドミナントネガティブ活性を有しうる、したがって、細胞におけるミオスタチンまたはGDF-11シグナル伝達を減少または阻害するために有用となりうる。本発明はまた、先に説明したように、プロミオスタチンポリペプチドもしくは変異体プロミオスタチンのペプチド部分、またはプロGDF-11ポリペプチドもしく変異体プロGDF-11のペプチド部分をコードする実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。下記により詳細に説明するように、本発明はまた、細胞に及ぼすミオスタチンの影響を調節するための作用物質として有用なポリヌクレオチドを提供し、GDF受容体またはその機能的ペプチド部分をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。そのようなポリヌクレオチドの例を以下の開示に提供する。そのため、以下の開示は、本明細書に開示の本発明の様々な態様に関連していると認識すべきである。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、ホスホジエステル結合によって互いに連結した二つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を意味するために用いられる。そのため、「ポリヌクレオチド」という用語には、遺伝子またはその一部となりうるRNAおよびDNA、cDNA、合成ポリデオキシリボ核酸配列等が含まれ、一本鎖または二本鎖と共にDNA/RNAハイブリッドとなりうる。さらに、本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」という用語には、細胞から単離することができる天然に存在する核酸分子と共に、例えば、化学合成法またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような酵素的方法によって調製することができる合成分子が含まれる。様々な態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド類似体、ホスホジエステル結合以外の骨格結合(上記を参照)を含みうる。一般的に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、2'-デオキシリボースに結合したアデニン、シトシン、グアニン、もしくはチミンのような天然に存在するデオキシリボヌクレオチド、またはリボースに結合したアデニン、シトシン、グアニン、もしくはウラシルのようなリボヌクレオチドである。しかし、ポリヌクレオチドはまた、天然に存在しない合成ヌクレオチドまたは改変された天然に存在するヌクレオチドを含む、ヌクレオチド類似体を含みうる。 そのようなヌクレオチド類似体は当技術分野で周知であり、そのようなヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドと同様に市販されている(Linら、Nucl ポリヌクレオチドのヌクレオチドを結合させる共有結合は、一般的にホスホジエステル結合である。 しかし、共有結合はまた、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合または合成ポリヌクレオチドを産生するためにヌクレオチドを連結させるために有用であることが当業者に既知である他の如何なる結合も含む多数の他の如何なる結合ともなりうる(例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、Tamら、Nucl ヌクレオチドまたは類似体を結合させる天然に存在しないヌクレオチド類似体または結合を組み込むことは、改変されたポリヌクレオチドが分解を受けにくくなりうることから、ポリヌクレオチドが、例えば組織培養培地を含むヌクレオチド溶解活性を含みうる環境に曝露される場合、または生きている被験者に投与される場合には特に有用となりうる。天然に存在するヌクレオチドおよびホスホジエステル結合を含むポリヌクレオチドは、化学合成することができ、または適当なポリヌクレオチドを鋳型として用いて組換えDNA法を用いて産生することができる。 比較すると、ヌクレオチド類似体またはホスホジエステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドは、一般的に化学合成されるが、T7ポリメラーゼのような酵素は特定のタイプのヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドに組み込まれることができ、したがって、適当な鋳型から組換えによってそのようなポリヌクレオチドを産生するために用いることができる(Jellinekら、上記、1995) ポリヌクレオチドがペプチド、例えば、プロミオスタチンのペプチド部分、またはペプチド作用物質をコードする場合、コード配列は一般的に、ベクターに含まれ、望ましければ組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを含む適当な調節エレメントに機能的に結合される。コードされたペプチドはさらに、例えば、His-6タグ等のようなペプチドタグに機能的に結合させることができ、これは標的細胞における作用物質の発現の同定を容易にすることができる。His-6のようなポリヒスチジンタグペプチドは、ニッケルイオン、コバルトイオン等のような二価陽イオンを用いて検出することができる。さらなるペプチドタグには、例えば、抗FLAG抗体を用いて検出することができるFLAGエピトープ(例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、ホップ(Hopp)ら、BioTechnology 6:1204(1988);米国特許第5,011,912号を参照のこと);エピトープに対して特異的な抗体を用いて検出することができるc-mycエピトープ;ストレプトアビジンまたはアビジンを用いて検出することができるビオチン;およびグルタチオンを用いて検出することができるグルタチオン-S-トランスフェラーゼが含まれる。そのようなタグは、例えば、ミオスタチンポリペプチドの蛋白質分解断片に対応する実質的に精製されたペプチドを得ることが望ましい場合には、それらが機能的に結合したペプチドまたはペプチド作用物質の単離を促進することができるというさらなる長所を提供することができる。本明細書において用いられるように、「機能的に結合」または「機能的に会合」という用語は、二つまたはそれ以上の分子が、それらが単一の単位として作用して、一つもしくは双方の分子またはその組み合わせに帰因する機能を行うように、互いに関連して存在することを意味する。例えば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、調節エレメントに機能的に結合することができ、この場合、調節エレメントは、それが細胞において通常会合するポリヌクレオチド配列に影響を及ぼす様式と類似のようにポリヌクレオチドにその調節作用を付与する。第一のポリヌクレオチドコード配列も同様に、機能的に結合したコード配列からキメラポリペプチドが発現されることができるように、第二(またはそれ以上)のコード配列に機能的に結合することができる。キメラポリペプチドは、融合ポリペプチドとなりえて、この場合、二つ(またはそれ以上)のコードされたポリペプチドは単一のポリペプチドに翻訳される、すなわちペプチド結合によって共有結合する;または翻訳されると、互いに機能的に会合して安定な複合体を形成しうる二つの別個のペプチドとして翻訳されうる。キメラポリペプチドは、一般的にそのペプチド成分のそれぞれの特徴のいくつかまたは全てを示す。そのため、キメラポリペプチドは、本明細書において開示されるように、本発明の方法を実施するために特に有用となりうる。例えば、一つの態様において、本発明の方法は細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することができる。このように、キメラポリペプチドの一つのペプチド成分が細胞区画局在ドメインをコードして、第二のペプチド成分がドミナントネガティブSmadポリペプチドをコードする場合、機能的キメラポリペプチドは、細胞区画局在ドメインによって指定される細胞区画に移動して、Smadポリペプチドのドミナントネガティブ活性を示し、それによって、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することができる。 細胞区画ドメインは周知であり、これには例えば細胞質膜局在ドメイン、核局在シグナル、ミトコンドリア膜局在シグナル、小胞体局在シグナル等が含まれる(例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、Hancockら、EMBO J そのようなドメインは、作用物質を細胞における特定の区画にターゲティングする、または細胞から分泌させるために作用物質をターゲティングするために有用となりうる。例えば、Act RIIBのようなミオスタチン受容体のキナーゼドメインは、一般的に細胞質膜の内膜に会合する。このように、ドミナントネガティブミオスタチン受容体キナーゼドメイン、例えば、キナーゼ活性を欠損するドミナントネガティブAct RIIB受容体を含むキメラポリペプチドは、細胞質膜局在ドメインをさらに含み、それによって、ドミナントネガティブAct RIIBキナーゼドメインを内側の細胞質膜に局在させることができる。本明細書に開示するように、プロGDFシグナルペプチドは、細胞局在活性を有する。本明細書において用いられるように、「細胞局在活性」という用語は、シグナルペプチドが、それに機能的に結合したペプチドを一つまたはそれ以上の特異的細胞内区画に転移させることを指示できること、または細胞から分子の分泌を指示できることを意味する。そのため、プロGDFシグナルペプチドは、実質的に同じシグナルペプチドを有する天然に発現されたGDFと同じ細胞内区画への、シグナルペプチドに機能的に結合したペプチドまたは他の作用物質の転移を指示するために特に有用となりうる。さらに、シグナルペプチド、例えばプロミオスタチンの最初のアミノ酸約15〜30個を含むプロミオスタチンシグナルペプチドは、シグナルペプチドを含む天然に存在するプロGDFと同じ経路を通して、細胞から機能的に結合した作用物質の分泌を指示することができる。このように、本発明の方法を実施するために特に有用な作用物質には、GDFシグナルペプチド、好ましくはプロミオスタチンまたはプロGDF-11シグナルペプチドに機能的に結合したGDFプロドメインまたはその機能的ペプチド部分が含まれる。本発明の方法を行うために有用なポリヌクレオチド作用物質を含む本発明のポリヌクレオチドは、標的細胞と直接接触させることができる。例えば、細胞に入ってその機能を発揮するアンチセンス分子、リボザイム、または三重らせん形成物質として有用なオリゴヌクレオチドを、標的細胞に直接接触させることができる。ポリヌクレオチド作用物質はまた、ポリペプチド、例えばミオスタチン受容体(またはミオスタチン)と特異的に相互作用して、それによってミオスタチンとその受容体と特異的相互作用能を変化させることができる。 そのようなポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを作製および同定する方法と共に、本明細書に開示され、またはそうでなければ当技術分野で周知である(例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、O□Connellら、Proc プロミオスタチンのようなプロGDFポリペプチドのペプチド部分をコードしうる、変異体プロミオスタチンポリペプチドをコードしうる、GDF受容体もしくはその機能的ペプチド部分をコードすることができる、または本発明の方法を行うために有用なポリヌクレオチド作用物質となりうる本発明のポリヌクレオチドは、標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を含むポリヌクレオチドの操作を促進することができるベクターに含まれうる。ベクターは、ポリヌクレオチドを維持するために有用であるクローニングベクターとなりえて、またはポリヌクレオチドの他にポリヌクレオチドを発現するために有用な、かつポリヌクレオチドがペプチドをコードする場合には、特定の細胞にコードされたペプチドを発現するために有用な調節エレメントを含む発現ベクターとなりうる。発現ベクターは、例えば、コードするポリヌクレオチドの持続的な転写を得るために必要な発現エレメントを含むことができ、または調節エレメントはベクターにクローニングされる前に、ポリヌクレオチドに機能的に結合することができる。発現ベクター(またはポリヌクレオチド)は、一般的に、コードするポリヌクレオチドの構成的、または望ましければ誘導型、組織特異的もしくは発達段階特異的発現を提供しうるプロモーター配列、ポリ-A認識配列、およびリボソーム認識部位もしくは内部リボソーム流入部位、または組織特異的となりうるエンハンサーのようなその他の調節エレメントを含むまたはコードする。ベクターはまた、望ましければ原核または真核宿主系またはその双方における複製にとって必要なエレメントを含みうる。 バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林熱ウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターのようなプラスミドベクターおよびウイルスベクターが含まれるそのようなベクターは、周知であり、販売元から購入することができる(プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州;ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州;ギブコ/BRL、ガイサースバーグ、メリーランド州)、または当業者によって構築することができる(例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、Meth テトラサイクリン(tet)誘導型プロモーターは、本発明のポリヌクレオチド、例えばその中で蛋白質分解プロセシング部位が変位しているミオスタチンのドミナントネガティブ型をコードする、成熟ミオスタチンペプチドと複合体を形成することができるミオスタチンプロドメインをコードする、またはGDF受容体のドミナントネガティブ型をコードするポリヌクレオチドの発現を促進するために特に有用である。テトラサイクリン、またはテトラサイクリン類似体を、tet誘導型プロモーターに機能的に結合したポリヌクレオチドを含む被験者に投与すると、コードされたペプチドの発現が誘導され、それによってペプチドはその活性を行うことができ、それによってペプチド作用物質はミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害することができる。そのような方法は、例えば、成体生物において筋の肥大を誘導するために用いることができる。ポリヌクレオチドはまた、コードされるペプチドの発現が個体における筋細胞、または培養、例えば臓器培養における細胞の混合集団における筋細胞に限定されるように、組織特異的調節エレメント、例えば筋細胞特異的調節エレメントに機能的に結合することができる。ウイルス発現ベクターは、細胞、特に被験者の細胞にポリヌクレオチドを導入するために特に有用となりうる。ウイルスベクターは、比較的高い効率で宿主細胞に感染できること、および特定の細胞タイプに感染できるという長所を提供する。例えば、ミオスタチンプロドメインまたはその機能的ペプチド部分をコードするポリヌクレオチドを、バキュロウイルスベクターにクローニングして、次にこれを用いて昆虫宿主細胞に感染させて、それによって大量のコードされるプロドメインを産生する手段を提供する。 ウイルスベクターはまた、関係する生物の細胞、例えば哺乳類、鳥類、または魚類宿主細胞のような脊椎動物宿主細胞に感染するウイルスに由来しうる ウイルスベクターは、本発明の方法を行うために有用なポリヌクレオチドを標的細胞に導入するために特に有用となりうる。例えば、レトロウイルスを遺伝子移入のために用いる場合、複製コンピテントレトロウイルスは理論的に、レトロウイルスベクターを産生するために用いられるパッケージング細胞株におけるレトロウイルスベクターとウイルス遺伝子配列との組換えにより発達することができる。組換えによって複製コンピテントウイルスの産生が減少または消失しているパッケージング細胞株は、複製コンピテントレトロウイルスが産生される可能性を最小限にするために用いることができる。細胞を感染させるために用いられる全てのレトロウイルスベクター上清を、PCRおよび逆転写酵素アッセイ法のような標準的なアッセイ法によって複製コンピテントウイルスに関してスクリーニングする。レトロウイルスベクターによって、異種遺伝子を宿主細胞ゲノムに組み込むことが可能となり、これによって、細胞分裂後に遺伝子を娘細胞に伝えることができる。そのような方法には、例えば、トランスフェクション、リポフェクション、マイクロインジェクション、電気穿孔、およびウイルスベクターを用いる感染が含まれ;ならびに細胞へのポリヌクレオチドの導入を促進して、ポリヌクレオチドが細胞に導入される前に分解されないように保護することができるリポソーム、微小乳剤等を用いることが含まれうる。 特定の方法の選択は、例えばポリヌクレオチドが導入される細胞と共に、細胞が培養において単離されているか、または組織もしくは臓器培養で存在するか、またはインサイチューで存在するかに依存するであろう ウイルスベクターによる感染によってポリヌクレオチドを細胞に導入することは、それがエクスビボまたはインビボで核酸分子を細胞に効率よく導入することができることから特に有用である(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,399,346号を参照のこと) その上、ウイルスは非常に特殊化されており、一つまたは少数の特異的細胞タイプにおける感染および増殖能に基づくベクターとして選択することができる。このように、その天然の特異性を用いて、ベクターに含まれる核酸分子を様々な細胞タイプにターゲティングすることができる。そのため、HIVに基づくベクターを用いて、T細胞を感染させることができ、アデノウイルスに基づくベクターを用いて、例えば呼吸器上皮細胞を感染させることができ、ヘルペスウイルスに基づくベクターを用いて、神経細胞等を感染させることができる。アデノ随伴ウイルスのようなその他のベクターは、より広い宿主範囲を有し、したがって、様々な細胞タイプに感染させるために用いることができるが、ウイルスまたは非ウイルスベクターも同様に、特異的受容体またはリガンドによって改変して、受容体媒介事象を通して標的特異性を変化させることができる。本発明はまた、プロミオスタチンポリペプチドまたは変異体プロミオスタチンポリペプチドのペプチド部分に特異的に結合する抗体も提供する。本発明の特に有用な抗体には、ミオスタチンプロドメインまたはその機能的ペプチド断片に特異的に結合する抗体、およびプロミオスタチンポリペプチドに結合して、プロミオスタチンの成熟ミオスタチンペプチドへの蛋白質分解切断を減少または阻害する抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体は、下記に示すように、GDF受容体またはその機能的ペプチド部分に特異的に結合する抗体となりうる。本発明の抗体を調製および単離する方法は下記により詳しく記載し、その開示は参照として本明細書に組み入れられる。ミオスタチンは、骨格筋全体の適切な調節にとって必須である。野生型のマウスと比較すると、ミオスタチンを欠損するミオスタチンノックアウトマウスは、過形成と肥大の複合により筋の量が2〜3倍増加している。本明細書に開示するように、ミオスタチンノックアウトマウスはまた、少なくとも部分的に全身の骨格筋組織の同化状態の増加により、脂肪の蓄積が劇的に減少している。逆に、ヌードマウスにミオスタチンを過剰発現させると、癌またはAIDSのような慢性疾患を有するヒト患者において認められるカヘキシア状態と類似の消耗性症候群を誘導した。本明細書にさらに開示するように、ミオスタチン活性は、Smadシグナル伝達経路の特徴を有するシグナル伝達を通して媒介されうる。したがって、本発明は、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を細胞に接触させることによって、細胞に及ぼすミオスタチンの作用を調節する方法を提供する。本明細書において用いられるように、細胞に及ぼすミオスタチンの作用に関連して用いられる「調節する」という用語は、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達が増加または減少もしくは阻害されていることを意味する。「増加」および「減少もしくは阻害」という用語は、ミオスタチンの非存在下でのシグナル伝達経路の活性レベル、またはミオスタチンの存在下での正常細胞における活性レベルとなりうるミオスタチンシグナル伝達活性の基準値レベルと比較して用いられる。例えば、ミオスタチンシグナル伝達経路は、ミオスタチンと接触させた筋細胞において特定の活性を示し、筋細胞をミオスタチンプロドメインにさらに接触させると、ミオスタチンシグナル伝達活性は減少または阻害されうる。そのため、ミオスタチンプロドメインは、ミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するために有用な作用物質である。同様に、GDF-11プロドメインのようなもう一つのGDFファミリーメンバーのプロドメイン、またはアクチビンプロドメイン、MISプロドメイン等のような他のTGF-ファミリーメンバーのプロドメインは、ミオスタチンシグナル伝達を減少させるために有用となりうる。「減少または阻害」という用語は、それらが場合によって、ミオスタチンシグナル伝達のレベルを特定のアッセイ法によって検出されうるレベル以下に減少させうることが認識されているために、本明細書において共に用いられる。そのため、そのようなアッセイ法を用いて、ミオスタチンシグナル伝達の低レベルが阻害されたままであるか、またはシグナル伝達が完全に阻害されるか否かを決定することはできない。本明細書において用いられるように、「ミオスタチンシグナル伝達」という用語は、細胞表面上に発現されたミオスタチン受容体とミオスタチンとの特異的相互作用により細胞に起こる一連の事象、一般的に一連の蛋白質-蛋白質相互作用を意味する。 そのため、ミオスタチンシグナル伝達は、例えば、ミオスタチンと細胞上のその受容体との特異的相互作用を検出することによって、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達経路に関係する一つもしくはそれ以上のポリペプチドの燐酸化を検出することによって、ミオスタチンシグナル伝達によって特異的に誘導される一つもしくはそれ以上の遺伝子の発現を検出することによって、またはミオスタチンシグナル伝達に反応して起こる表現型の変化を検出することによって検出することができる(実施例を参照のこと) 本明細書において開示するように、本発明の方法において有用な作用物質は、ミオスタチンシグナル伝達を刺激するための作用剤として、またはミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害するための拮抗剤として作用しうる 本発明の方法の例は、本明細書において一般的にミオスタチンに関連して示される。しかし、本発明の方法は、細胞におけるGDFによるシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質に細胞を接触させることによって、他のGDFペプチド、例えば、GDF-11が細胞に及ぼす作用を調節することをより広く含みうると認識すべきである。本発明の完全な範囲を実践する方法は、本開示を読むことによって容易に理解され、本発明には例えばGDF受容体を同定する方法、GDFとその受容体との特異的相互作用によるシグナル伝達を調節する作用物質を同定する方法等が含まれる。ミオスタチンシグナル伝達経路の例は、本明細書において、Smad経路であり、これは、ミオスタチンがアクチビンII型受容体の細胞外ドメインと特異的に相互作用すると開始され、細胞においてSmad蛋白質を含む細胞内ポリペプチドの相互作用を通して伝達される。一般的に、ミオスタチンシグナル伝達は、Smadポリペプチドのような特異的細胞内ポリペプチドの燐酸化または脱燐酸化に関連している。このように、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達は、ミオスタチンの非存在下でのポリペプチドの燐酸化レベルと比較して、ミオスタチンの存在下で一つまたはそれ以上のSmadポリペプチドの燐酸化レベルの増加を検出することによって検出することができる。 本発明の方法は、ミオスタチンシグナル伝達を増加または減少させる手段を提供し、したがって、ミオスタチンシグナル伝達経路に関与するSmadポリペプチドの燐酸化レベルは、正常レベル以上に増加するか、またはミオスタチンの存在下で予想されるレベル未満に減少するであろう 本発明の方法は、例えば、適した条件で標的細胞と、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質とを接触させることによって行うことができる。適した条件は、単離された細胞となりうるまたは組織もしくは臓器の成分となりうる細胞を、適当な培養培地に入れること、または細胞をインサイチューで生物に接触させることによって提供されうる。例えば、細胞を含む培地を、ミオスタチンの細胞上に発現されるミオスタチン受容体との特異的相互作用能に影響を及ぼす作用物質、または細胞におけるミオスタチンシグナル伝達経路に影響を及ぼす作用物質に接触させることができる。一般的に、細胞は被験者における組織または臓器の成分であり、いずれにせよ、細胞を接触させることは被験者に作用物質を投与することを含む。しかし、細胞はまた、培養において操作して、次に培養において維持して、被験者に投与する、またはヒト以外のトランスジェニック動物を作製するために用いることができる。 本発明の方法において有用な物質は、如何なるタイプの分子、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣体、ビニル様(vinylogous)ペプトイド、有機低分子等となりえて、ミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす様々な如何なる方法でも作用しうる 作用物質は、ミオスタチンまたはアクチビン受容体のようなミオスタチン受容体に結合して、それによってミオスタチンのその受容体との特異的相互作用能を変化させることによって細胞外で作用することができる、または細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を変化させるように細胞内で作用することができる。さらに、作用物質は、細胞に及ぼすミオスタチンの作用、例えばミオスタチンのその受容体との特異的相互作用能を模倣または増強して、それによって細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を増加させる作用剤となりうる;または細胞に及ぼすミオスタチンの作用を減少もしくは阻害して、それによって細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少もしくは阻害する拮抗剤となりうる。本明細書において用いられるように、「特異的相互作用」または「特異的に結合する」等の用語は、二つの分子が生理的条件で比較的安定である複合体を形成することを意味する。この用語は本明細書において、例えば、ミオスタチンとミオスタチン受容体との相互作用、ミオスタチンシグナル伝達経路の細胞内成分の相互作用、抗体とその抗原との相互作用、およびミオスタチンプロドメインとミオスタチンとの相互作用を含む様々な相互作用を意味するために用いられる。特異的相互作用は一般的に、例えば、ヒトまたは他の脊椎動物もしくは無脊椎動物のような生きている個体に起こる状態と共に、哺乳類細胞または他の脊椎生物もしくは無脊椎生物からの細胞を維持するために用いられるような細胞培養において起こる条件を含む生理的条件で安定である。さらに、ミオスタチンプロドメインとミオスタチンとの細胞外相互作用のような特異的相互作用は、商業的に価値がある海洋生物の養殖のために用いられるような条件で一般的に安定である。二つの分子が特異的に相互作用するか否かを決定する方法は周知であり、これには例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴等が含まれる。 ミオスタチンとその受容体との特異的相互作用を変化させる作用物質は、例えば、その細胞受容体と特異的に相互作用できないようにミオスタチンに結合することによって、その受容体との結合に関してミオスタチンと競合することによって、またはそうでなければ、ミオスタチンシグナル伝達を誘導するためにミオスタチンがその受容体と特異的に相互作用する必要条件を迂回することによって作用しうる ミオスタチン受容体の可溶性の細胞外ドメインのような切断型ミオスタチン受容体は、ミオスタチンに結合して、それによってミオスタチンを分離して、その細胞表面ミオスタチン受容体との特異的相互作用能を減少または阻害することができる作用物質の例である。ミオスタチンプロドメインまたはその機能的ペプチド部分は、ミオスタチンに結合して、それによってミオスタチンの細胞表面ミオスタチン受容体との特異的相互作用能を減少もしくは阻害することができる作用物質のもう一つの例である。そのようなミオスタチン拮抗剤は、本発明の方法を実践するために、特に細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するために有用である。フォリスタチンは、ミオスタチンに結合して、それによってミオスタチンのその受容体との特異的相互作用能を減少または阻害することができる作用物質のもう一つの例である。208:222〜232、1999)を含む様々なTGF-ファミリーメンバーに結合してその活性を阻害することができ、したがって開示される方法を行うために用いることができる。ミオスタチンの作用を調節するためにフォリスタチンを用いることはこれまでに記述されているが(米国特許第6,004,937号)、フォリスタチンが、ミオスタチンのAct RIIBのようなミオスタチン受容体との特異的相互作用能を減少または阻害することは、本発明の開示以前に知られていなかった。本発明の方法において有用な作用物質はまた、細胞ミオスタチン受容体と相互作用して、それによって受容体に関してミオスタチンと競合することができる。そのような作用物質は、例えば、ミオスタチン結合ドメインの全てまたは一部を含む細胞表面ミオスタチン受容体に特異的に結合して、それによってミオスタチンが受容体と特異的に相互作用できないようにする抗体となりうる。そのような抗ミオスタチン受容体抗体は、ミオスタチンシグナル伝達を活性化せずに受容体に特異的に結合できることに関して選択することができ、それによってミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するためのミオスタチン拮抗剤として有用となりうる;または受容体に特異的に結合してミオスタチンシグナル伝達を活性化できることに関して選択して、このようにミオスタチン作用剤として作用することができる。抗体は、ミオスタチン受容体もしくは受容体の細胞外ドメインを免疫原として用いて作製することができ、または抗ミオスタチン抗体に対して作製され、ミオスタチンを模倣する抗イディオタイプ抗体となりうる。抗GDF受容体抗体は、下記により詳細に考察する。本発明の方法において有用な作用物質はまた、プロGDFポリペプチドの活性な成熟GDFペプチドへの蛋白質分解切断を減少または阻害して、それによってGDFシグナル伝達を減少または阻害する作用物質となりうる。そのような作用物質は、プロテアーゼ阻害剤、特にArg-Xaa-Xaa-Arg(配列番号:21)蛋白質分解認識部位を認識して切断するプロテアーゼの活性を阻害する作用物質となりうる。プロGDFがプロミオスタチンである場合、ミオスタチンにおけるArg-Xaa-Xaa-Arg(配列番号:21)蛋白質分解認識部位に対するプロテアーゼの特異的結合を減少または阻害する抗ミオスタチン抗体を同様に用いて、プロミオスタチンの蛋白質分解を減少または阻害して、それによって産生された成熟ミオスタチンの量を減少させることができる。そのような抗体は、蛋白質分解切断部位に結合することができ、またはプロテアーゼの結合およびプロテアーゼによる切断が減少するもしくは阻害されるように、プロGDFポリペプチド上の他のいくつかの部位に結合することができる。さらに、本発明の方法において有用な作用物質は、例えばミオスタチン結合に反応したミオスタチンシグナル伝達活性を欠損する、または構成的ミオスタチンシグナル伝達活性を有する変異体ミオスタチン受容体となりうる。例えば、変異体ミオスタチン受容体は、受容体がキナーゼ活性を欠損するように、そのキナーゼドメインに点突然変異、欠失等を有しうる。そのようなドミナントネガティブ変異体ミオスタチン受容体は、ミオスタチンに特異的に結合することができるという事実にもかかわらず、ミオスタチンシグナル伝達の伝幡能を欠損する。本発明の方法において有用な作用物質はまた、ミオスタチンシグナル伝達経路に関係する細胞内ポリペプチドのレベルまたは活性を調節することができる。 本明細書に開示するように、ミオスタチンによる筋増殖の調節は、アクチビンII型受容体によって活性化されるシグナル伝達経路の成分を含みうる(実施例7および9を参照のこと;同様に実施例14も参照のこと) Act RIIBとミオスタチンの特異的相互作用は、ミオスタチンシグナル伝達がSmadシグナル伝達経路の成分を含みうることを示している。このように、Smadシグナル伝達経路は、細胞に及ぼすミオスタチンの効果を調節するための標的を提供し、Smad経路に影響を及ぼす作用物質は、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節するために有用となりうる。GDFシグナル伝達の細胞内ポリペプチド成分のレベルまたは活性を調節するために有用な作用物質には、シグナル伝達活性を増加させることができる作用剤、およびシグナル伝達活性を減少または阻害することができる拮抗剤が含まれる。ミオスタチンに関して、例えば、ミオスタチンシグナル伝達活性を増加することができる作用物質の例は、Smadポリペプチドの脱燐酸化を減少または阻害して、それによってSmadのシグナル伝達活性を延長させることができるホスファターゼ阻害剤である。ミオスタチンシグナル伝達に及ぼすSmad6およびSmad7の阻害作用を打ち消すことができるドミナントネガティブSmad6またはSmad7ポリペプチドは、Smadシグナル伝達を増加させることによってミオスタチンシグナル伝達活性を増加することができる作用物質のさらなる例である。ミオスタチンシグナル伝達活性を減少または阻害することができる拮抗剤作用物質の例は、C末端の燐酸化部位が変異しているドミナントネガティブSmad2、Smad3、またはSmad4のようなドミナントネガティブSmadポリペプチドである。Smad2およびSmad3の活性化を阻害するSmad6およびSmad7のような阻害性のSmadポリペプチド、およびSmadポリペプチドに結合してシグナル伝達を阻害するc-skiポリペプチドは、Smadシグナル伝達を減少させることによってミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害するために有用な拮抗剤のさらなる例である。細胞内で作用する作用物質がペプチドである場合、これは細胞に直接接触させることができ、またはペプチド(またはポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して、ペプチドを細胞において発現させることができる。本発明の方法において有用なペプチドのいくつかは比較的大きく、したがって、細胞膜を容易に通過しない可能性があると認識される。しかし、ペプチドを細胞に導入するために様々な方法が知られている。 そのようなペプチドを細胞に導入する方法の選択は、部分的に、ポリペプチドを提供すべき標的細胞の特徴に依存するであろう 例えば、標的細胞、または標的細胞を含むいくつかの細胞タイプが、特定のリガンドに結合すると細胞内にインターナライズされる受容体を発現する場合、ペプチド作用物質は、リガンドと機能的に会合することができる。受容体に結合すると、ペプチドは、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に移動する。ペプチド作用物質はまた、リポソームに封入する、または脂質複合体に製剤化することができ、これはペプチドの細胞内への流入を促進することができ、上記のようにさらに受容体(またはリガンド)を発現するように改変することができる。 ペプチド作用物質はまた、ペプチドの細胞内への転位を促進するヒト免疫不全ウイルスTAT蛋白質形質導入ドメインのような蛋白質形質導入ドメインを含むようにペプチドを操作することによっても、細胞に導入することができる(参照として本明細書に組み入れられる、Schwarzeら、Science 285:1569〜1572(1999)を参照のこと;同様に、Derossiら、J 標的細胞はまた、細胞において発現されることができるペプチド作用物質をコードするポリヌクレオチドに接触させることができる。発現されたペプチド作用物質は変異体GDF受容体またはそのペプチド部分となりうる。 変異体GDF受容体の例には、リガンド(例えば、ミオスタチン)に特異的に結合する能力を有しうるが必ずしもその必要はないドミナントネガティブAct RIIAまたはAct RIIBのようなミオスタチン受容体のキナーゼ欠損型;ミオスタチンに結合してそれが細胞のミオスタチン受容体と特異的に相互作用できないように隔離するミオスタチン受容体の可溶性型のような切断型ミオスタチンまたは他のGDF受容体;C末端燐酸化部位が変異しているドミナントネガティブSmad3のようなSmadポリペプチドのドミナントネガティブ型(Liuら、Proc 細胞におけるc-skiペプチド作用物質の発現は、ミオスタチンシグナル伝達を調節するために特に有用となりうる。 このように、ミオスタチン活性がAct RIIB結合を通して媒介されうる本発明の開示を通して、ミオスタチンの活性またはSmad経路を利用する如何なるGDFの活性も、標的細胞におけるc-ski発現を増加または減少させることによって調節することができると認識されるであろう 本発明の方法において有用な作用物質は、上記のように細胞と接触する、または導入することができるポリヌクレオチドとなりうる。一般的に、しかし必ずしもその必要はないが、ポリヌクレオチドはそれが直接、または転写もしくは翻訳もしくはその双方の後にその機能を発揮する細胞に導入される。例えば、上記のように、ポリヌクレオチドは、細胞において発現され、ミオスタチン活性を調節するペプチド作用物質をコードすることができる。そのような発現されたペプチドは、例えば、活性なミオスタチンに切断することができない変異体プロミオスタチンポリペプチド;または変異体ミオスタチン受容体、例えば、切断型ミオスタチン受容体細胞外ドメイン;膜結合ドメインに機能的に会合するミオスタチン受容体細胞外ドメイン;または蛋白質キナーゼ活性を欠損する変異体ミオスタチン受容体となりうる。ポリペプチドを細胞に導入する方法は、下記に示され、またはそうでなければ当技術分野で既知である。 本発明の方法において有用なポリヌクレオチドはまた、アンチセンス分子、リボザイム、または三重らせん形成物質となりうる、またはコードしうる 例えば、ポリヌクレオチドは、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を増加させる作用剤として作用しうるアンチセンスc-skiヌクレオチド配列のようなアンチセンスヌクレオチド配列;または特定のSmadアンチセンスヌクレオチド配列に応じて、ミオスタチンシグナル伝達を増加させる作用剤として作用するか、もしくはミオスタチンシグナル伝達を減少または阻害する拮抗剤として作用しうるアンチセンスSmadヌクレオチド配列となりうる(またはコードしうる) そのようなポリヌクレオチドは、標的細胞に直接接触させることができ、細胞に取り込まれるとそのアンチセンス、リボザイム、または三重らせん形成活性を発揮しうる;または細胞に導入されて、ポリヌクレオチドが発現されると、例えばアンチセンスRNA分子またはリボザイムを産生して、それがその活性を発揮するポリヌクレオチドによってコードされうる。アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または三重らせん形成物質は、DNA配列またはRNA配列、例えばメッセンジャーRNAとなりうる標的配列、コード配列、イントロン-エキソン接合部位を含むヌクレオチド配列、シャイン-ダルガルノ配列のような調節配列等となりうる標的配列と相補的である。相補性の程度は、ポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスポリヌクレオチドが細胞における標的配列と特異的に相互作用することができる程度である。アンチセンスまたは他のポリヌクレオチドの全長に応じて、その標的配列に関するポリヌクレオチドの特異性を失うことなく、標的配列に関して一つまたは数個のミスマッチが容認されうる。 このように、例えば、20ヌクレオチドからなるアンチセンス分子では、容認されるのはあったとしても少数のミスマッチであるのに対し、例えば、細胞ポリペプチドをコードする標的mRNAの完全長に対して相補的なアンチセンス分子のハイブリダイゼーション効率には、数個のミスマッチが影響を及ぼさないであろう 認容されうるミスマッチの数は、例えば、ハイブリダイゼーション動態を決定するために周知の式を用いて推定することができ(Sambrookら、上記、1989を参照のこと)、または本明細書に開示の、もしくはそうでなければ当技術分野で既知の方法を用いて、特に、細胞にアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、または三重らせん形成物質が存在することによって、標的配列のレベルまたは細胞における標的配列によってコードされるポリペプチドの発現が減少することを決定することによって、経験的に決定することができる。アンチセンス分子、リボザイム、または三重らせん形成物質として有用なポリヌクレオチドは、翻訳を阻害、または核酸分子を切断して、それによって細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することができる。例えば、アンチセンス分子は、mRNAに結合して細胞において翻訳できない二本鎖分子を形成することができる。少なくとも約15〜25ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらが容易に合成され、標的配列と特異的にハイブリダイズすることができることから、それらが好ましいが、標的細胞に導入したポリヌクレオチドからより長いアンチセンス分子を発現することも可能である。 アンチセンス分子として有用な特異的ヌクレオチド配列は、周知の方法、例えば遺伝子歩行法(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Seimiyaら、J アンチセンス分子を標的細胞に直接接触させる場合、これは、鉄結合EDTAのような化学反応基と機能的に会合することができ、これは、ハイブリダイゼーション部位で標的RNAを切断する。このように、三重らせん形成物質は、例えば、Smad遺伝子調節エレメントの配列を認識して、それによって細胞におけるSmadポリペプチドの発現を減少または阻害して、それによって標的細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節するように設計することができる。本発明はまた、ミオスタチンのようなGDFの細胞に及ぼす作用を変化させうる作用物質、特にGDFのその細胞受容体との特異的相互作用能を変化させうる作用物質を同定する方法を提供する。そのような作用物質はGDFのその受容体との特異的相互作用能を増加または減少させることによって作用することができ、したがってGDFシグナル伝達をそれぞれ増加または減少させるために有用である。本発明のスクリーニング方法の例は、ミオスタチン受容体、例えばAct RIIAまたはAct RIIBのようなアクチビンII型受容体を用いて本明細書に示される。本発明のスクリーニング方法は、例えば、ミオスタチンまたはその機能的ペプチド部分、Act RIIAまたはAct RIIBのようなミオスタチン受容体と、調べる作用物質とを、適した条件で接触させることによって実施することができる。ミオスタチン、受容体および作用物質は、所望の如何なる順序で接触させることもできる。そのため、スクリーニング方法を用いて、そのような作用物質が作用剤または拮抗剤活性を有する、受容体に対するミオスタチンの結合を競合的または非競合的に阻害することができる物質、受容体に対するミオスタチンの結合を媒介または増強することができる作用物質、特異的に結合したミオスタチンの受容体からの解離を誘導することができる作用物質、およびそうでなければミオスタチンのシグナル伝達誘導能に影響を及ぼす作用物質を同定することができる。作用物質の作用がミオスタチンまたは他のGDF受容体に特異的であることを確認するために適当な対照反応を行う。本発明のスクリーニング方法を行うための適した条件は、本明細書に開示の方法(実施例7および9を参照のこと)、またはそうでなければ当技術分野で既知の方法を含む、ミオスタチンをその受容体と特異的に相互作用させる如何なる条件ともなりうる。このように、スクリーニングアッセイ法を行うための適した条件は、例えば実質的に精製されたミオスタチン受容体を用いるインビトロ条件;通常ミオスタチン受容体を発現する細胞、例えば脂肪細胞もしくは筋細胞、またはその表面に機能的ミオスタチン受容体を発現するように遺伝子改変されている細胞を利用する細胞培養条件;または臓器において起こるインサイチュー条件となりうる。本発明のスクリーニング方法はまた、上記の分子モデリング法を用いても行うことができる。分子モデリング法を利用することは、GDF受容体と特異的に相互作用する可能性が最も高い、可能性がある作用物質の組み合わせライブラリのような大きい集団においてそれらの作用物質を同定するための簡便で費用効果の高い手段を提供し、それによって生物アッセイ法を用いてスクリーニングする必要がある可能性がある作用物質の数が減少する。Act RIIBのようなGDF受容体と特異的に相互作用する作用物質が同定されると、選択された作用物質は、本明細書に開示の方法を用いて、細胞に及ぼすミオスタチンのようなGDFの作用の調節能に関して調べることができる。試験物質のミオスタチンの作用の調節能は、本明細書に開示の方法(実施例7および9を参照のこと)を用いて、またはそうでなければ当技術分野で既知の方法を用いて検出することができる。「試験作用物質」または「試験分子」という用語は、本明細書において本発明の方法における作用剤または拮抗剤活性に関して調べられる如何なる作用物質も意味するように広い意味で用いられる。方法は一般的に、本明細書に記載の作用剤または拮抗剤作用物質として作用しうる未知分子を同定するためのスクリーニングアッセイ法として用いられるが、方法はまた、実際に特定の活性を有することが知られている作用物質が、例えば、作用物質の活性を標準化するための活性を有することを確認するために用いることができる。本発明の方法は、例えば、Act RIIB受容体を発現するように遺伝子改変されている細胞にミオスタチンを接触させること、およびミオスタチンシグナル伝達経路に関係するSmadポリペプチドの燐酸化を調べることによって、作用物質、例えばドミナントネガティブAct RIIBの作用を決定することによって行うことができる。望ましければ、細胞は、その発現がミオスタチンシグナル伝達経路に依存する、例えばSmad経路の活性化に依存するレポーターヌクレオチド配列を含むようにさらに遺伝子改変することができ、試験作用物質の作用は、作用物質、ミオスタチン、またはその双方の存在下および非存在下でレポーターヌクレオチド配列の発現を比較することによって決定することができる。レポーターヌクレオチド配列の発現は、例えばレポーターヌクレオチド配列のRNA転写物を検出することによって、またはレポーターヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを検出することによって検出することができる。ポリペプチドレポーターは、例えば、-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン-Bホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼポリペプチド等となることができ、例えば、レポーターポリペプチドによる放射活性、発光、化学発光、蛍光、酵素活性、または特異的結合を検出することによって検出することができる。本発明のスクリーニング方法は、高処理能解析に適合させることができる長所を有し、したがって、ミオスタチンとミオスタチン受容体との特異的相互作用を変化させうる作用物質を含む、細胞に及ぼすミオスタチンの作用を調節することができる作用物質を同定するために、試験作用物質の組み合わせライブラリをスクリーニングするために用いることができる。ポリヌクレオチドは、細胞ポリヌクレオチドを含む細胞標的に対して結合特異性を有する核酸分子は、天然に存在するため、およびそのような特異性を有する合成分子は容易に調製および合成することができるために(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,750,342号を参照のこと)、ミオスタチンとその受容体との特異的相互作用を調節することができる作用物質として特に有用となりうる。本発明の開示を考慮すると、様々な動物モデル系が本発明の方法を実践するために有用な作用物質を同定するための研究ツールとして用いることができると認識される。例えば、トランスジェニックマウスまたは他の実験動物は、本明細書に開示の様々なミオスタチン阻害剤構築物を用いて調製することができ、ヒト以外のトランスジェニック生物は、生物における特定の作用物質の様々なレベルを発現することによって生じた作用を直接決定するために調べることができる。さらに、トランスジェニック生物、例えば、トランスジェニックマウスは、他のマウス、例えば、ob/ob、db/db、または野鼠色の致死的な黄色の変異体マウスと交配させて、肥満、II型糖尿病等のような障害を治療または予防するために有用なミオスタチン阻害剤の最適な発現レベルを決定することができる。そのため、本発明は、ヒト以外の生物、特にミオスタチンシグナルペプチドを含みうるミオスタチンプロドメインをコードするポリヌクレオチド、プロペプチド(実施例を参照のこと)、または変異体プロミオスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック生物を提供する。 さらに、本発明は、高レベルのフォリスタチンを発現する、またはドミナントネガティブAct IIB受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック生物を提供する(実施例を参照のこと) そのような生物は、ミオスタチンノックアウトマウスにおいて認められたものと類似の筋重量の劇的な増加を示す(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,994,618号を参照のこと) 本明細書において考察したように、そのような動物モデルは、治療目的および農業での応用のために筋増殖を強化する物質を同定するために重要である。本発明のミオスタチンポリヌクレオチドは、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒト、ニワトリ、ヒツジ、七面鳥、魚および他の水生生物、ならびに他の種を含む如何なる生物にも由来する。そのようなポリヌクレオチドは、本明細書に記載するトランスジェニック動物を作製するために用いることができる。 トランスジェニック体を作製することができる(かつミオスタチンポリヌクレオチドがそれに由来しうる)水生動物の例には、サケ、マス、チャー、アユ、コイ、ヨーロッパフナ、キンギョ、ウグイ、シラス、ウナギ、アナゴ、コイワシ、ゼブラフィッシュ、トビウオ、ハタ科の魚、タイ科の魚、パロットバス、フエダイ、サバ、クロマグロ、マグロ、ハガツオ、黄色の尾をもつ魚、岩間の魚、フルーク、ソール、ヒラメ、フグ、モンガラカワハギのような魚類に属する動物;ヤリイカ、コウイカ、タコのような頭足類に属する動物;ハマグリ(例えば、ハードシェル、ホンビノスガイ、マニラ、ホンビノスガイ、サーフ、ソフトシェル)のような二枚貝類に属する動物;コックル、イガイ、タマキビガイ;ホタテ貝(例えば、海、湾、カルー(calloo)ホタテ貝);ホラガイ、マキガイ、ナマコ;アークシェル;カキ(例えば、C norvegious)、冷水エビを含むがこれらに限定されないエビ(shrimp);ワタリガニ、ルーク、ストーン、キング、クイーン、スノウ、ブラウン、イチョウガニ(dungeness)、北米産イチョウガニ(Jonah)、マングローブ、ソフトシェルクラブを含むがこれらに限定されないカニ;シャコ、クリール、ランゴスチノ(langostino);ブルー、マロン、レッドクラウ、レッドスワンプ、ソフトシェル、ホワイトを含むがこれらに限定されないイセエビ/ザリガニ(crayfish/crawfish)のような甲殻類;環形動物;ワニおよびカメのようなは虫類、およびカエルを含む両生類を含むがこれらに限定されない脊索動物;ならびにウニを含むがこれらに限定されない棘皮動物が含まれる。トランスジェニック動物を作製するために様々な方法が既知である。一つの方法において、前核段階での胚(「一細胞胚」)を雌性動物から採取して、胚に導入遺伝子をマイクロインジェクションする、この場合、導入遺伝子は得られた成熟動物の胚細胞と体細胞の染色体に組み込まれる。もう一つの方法において、胚性幹細胞を単離して、導入遺伝子を電気穿孔、プラスミドトランスフェクション、またはマイクロインジェクションによって幹細胞に組み込み、次に幹細胞を胚に再度導入して、そこで胚は定着して生殖系列に寄与する。哺乳類種にポリヌクレオチドをマイクロインジェクションする方法は、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,873,191号に記載されている。さらにもう一つの方法において、胚細胞を、導入遺伝子を含むレトロウイルスに感染させて、それによって胚の生殖細胞は導入遺伝子をその染色体に組み込まれる。トランスジェニックにすべき動物が鳥類である場合、鳥類の受精卵は一般的に卵管において最初の24時間のあいだに細胞分裂を行い、したがって前核に近づくことができないために、受精卵の前核へのマイクロインジェクションは難しい。 このように、トランスジェニック鳥種を作製するためにはレトロウイルス感染法が好ましい(参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,162,215号を参照のこと) しかし、鳥類の種にマイクロインジェクションを行う場合、先に産んだ卵の産卵後約2 トランスジェニックにすべき動物がウシまたはブタである場合、卵が不透明であり、それによって従来の微分干渉位相差顕微鏡によって核を同定することが難しいためにマイクロインジェクションを行うことができない。この問題を克服するために、より見やすくするために卵を最初に遠心して前核を分離することができる。本発明のヒト以外のトランスジェニック動物は、ウシ、ブタ、魚、ヒツジ、トリ、または他の動物となりうる。導入遺伝子を様々な発達段階の胚標的細胞に導入して、胚標的細胞の発達段階に応じて異なる方法を用いる。接合体は、マイクロインジェクションの最善の標的である。 遺伝子移入のための標的として接合体を用いることは、初回分裂前に、注入したDNAを宿主遺伝子に組み込むことができるという点において大きい長所を有する(Brinsterら、Proc その結果、ヒト以外のトランスジェニック動物の全ての細胞が導入遺伝子を組み込まれ、このように、生殖細胞の50%が導入遺伝子を有するために、創始動物の子孫への導入遺伝子の効率よい伝幡に寄与する。トランスジェニック動物は、そのそれぞれが生殖に用いられる細胞内で外因性遺伝子材料を含む、二つのキメラ動物を交配することによって作製することができる。 得られた子孫の25%が、外因性遺伝子材料に関してホモ接合であるトランスジェニック動物であり、得られた動物の50%がヘテロ接合体、かつ残りの25%が外因性遺伝子材料を欠損し、野生型表現型を有するであろう マイクロインジェクション法において、導入遺伝子を消化して、如何なるベクターDNAも含まないように、例えばゲル電気泳動によって精製する。導入遺伝子は、機能的に会合したプロモーターを含むことができ、これは、転写に関係する細胞蛋白質と相互作用して、構成的発現、組織特異的発現、発達段階特異的発現等を提供する。そのようなプロモーターには、サイトメガロウイルス(CMV)、モロニー白血病ウイルス(MLV)、およびヘルペスウイルスに由来するプロモーターと共に、メタロチオネイン、骨格アクチン、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPCK)、ホスホグリセレート(PGK)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、およびチミジンキナーゼ(TK)をコードする遺伝子由来のプロモーターが含まれる。ラウス肉腫ウイルスLTRのようなウイルスの長末端反復(LTRs)も同様に用いることができる。トランスジェニックにすべき動物がトリである場合、好ましいプロモーターには、ニワトリ-グロビン遺伝子、ニワトリライソザイム遺伝子、およびトリ白血病ウイルスのプロモーターが含まれる。 胚性幹細胞のプラスミドトランスフェクションにおいて有用な構築物は、例えば、転写を刺激するためのエンハンサーエレメント、スプライスアクセプター、終了およびポリアデニル化シグナル、翻訳を行うためのリボソーム結合部位等を含むさらなる調節エレメントを用いるであろう レトロウイルス感染法において、発達段階のヒト以外の胚をインビトロで胚盤胞段階まで培養することができる。 導入遺伝子を導入するために用いられるウイルスベクター系は典型的に、導入遺伝子を有する複製欠損レトロウイルスである(Jahnerら、Proc または感染はより後期の段階で行うことができる。組み込みはヒト以外のトランスジェニック動物において形成される細胞のサブセットに限って起こることから、創始動物はほとんどが導入遺伝子に関してモザイクとなりうる。 さらに、創始動物は、ゲノムの異なる位置で導入遺伝子の様々なレトロウイルス挿入を含みえて、これは一般的に子孫において分離されるであろう さらに、同様に、妊娠中期胚の子宮内レトロウイルス感染によって、効率は低いものの、導入遺伝子を生殖系列に導入することも可能である(Jahnerら、上記、1982) 胚性幹細胞(ES)もまた、導入遺伝子を導入するための標的となりうる。導入遺伝子はDNAトランスフェクションまたはレトロウイルス媒介形質導入によってES細胞に効率よく導入することができる。そのような形質転換したES細胞は、その後ヒト以外の動物からの胚盤胞と合わせることができる。 本明細書に開示するように、ミオスタチンは、少なくとも部分的にSmadシグナル伝達経路を通してその活性を発揮することができ、ミオスタチン発現は様々な病態に関連しうる そのため、本発明は、肥満およびII型糖尿病のような代謝疾患を含むミオスタチンに関連した様々な病態を治療するための新規標的を提供する。したがって、本発明は、被験者における筋細胞または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することによって、病態が少なくとも部分的に、筋または脂肪組織の異常な量の発達または代謝活性を特徴とする、被験者における病態の重症度を改善する方法を提供する。ミオスタチンノックアウトマウスは、野生型の同腹子より体重が約25%〜30%多く、調べたマウスの体重のこのような増加は、もっぱら骨格筋組織重量の劇的な増加が原因であった。ミオスタチンを欠損するマウスでは、骨格筋の重量は、野生型同腹子の対応する筋の約2〜3倍であった。ホモ接合ノックアウトマウスにおけるこの筋重量の増加は、過形成と肥大の複合が原因であった。 本明細書に開示するように、ヘテロ接合ミオスタチンノックアウトマウスも同様に、骨格筋重量の増加を示したが、ホモ接合変異体マウスにおいて認められた場合より程度は低く、ミオスタチンがインビボで用量依存的に作用することを示している(実施例1を参照のこと) さらに、動物においてミオスタチンが過剰発現されると、筋の増殖に関して反対の作用を示した。 例えば、ミオスタチン発現腫瘍を有するヌードマウスは、筋および脂肪重量の劇的な減少を特徴とする消耗性症候群を発症した(実施例8を参照) ヌードマウスにおけるこの症候群は、癌またはAIDSのような慢性疾患を有する患者に起こるカヘキシア状態に類似した。このように、全身体重の減少によって測定したカヘキシアの兆候を示すAIDS患者は、AIDSを有しない健常な男性、または体重が減少していないAIDS患者のいずれかと比較してミオスタチン免疫反応材料の血清レベルがわずかに増加していた。しかし、血清試料において検出されたミオスタチン免疫反応材料が真正の処理ミオスタチンに関して予想されるSDSゲル上での移動度を示さなかったことから、これらの結果の解釈は複雑である。本明細書において開示するように、ミオスタチンは、筋重量に影響を及ぼすのみならず、生物の全体的な代謝に影響を及ぼす。 例えば、ミオスタチンは脂肪組織において発現され、ミオスタチン欠損マウスは、動物が年をとるにつれて、脂肪蓄積の劇的な減少を示す(実施例IIおよびIIIを参照のこと) ミオスタチン作用のメカニズムは本明細書において提唱されないが、ミオスタチンの作用は、脂肪組織に及ぼすミオスタチンの直接作用となりうる、または骨格筋組織に及ぼすミオスタチン活性の欠如によって引き起こされる間接的な作用となりうる。 メカニズムによらず、ミオスタチン活性の減少に反応して起こる筋組織に及ぼす全体的な同化作用は、脂肪の蓄積が5倍抑制された肥満マウス系統(野鼠致死黄色(Ay)マウス)にミオスタチン変異を導入することによって証明されるように、生物の全体的な代謝を変化させて、脂肪の形でのエネルギーの保存に影響を及ぼす(実施例5を参照のこと) 異常なグルコース代謝も同様に、ミオスタチン変異を含む野鼠マウスにおいて部分的に抑制された。これらの結果は、ミオスタチンを阻害する方法が、肥満およびII型糖尿病のような代謝疾患を治療または予防するために用いることができることを証明している。7:289〜327、1987)に関連したカヘキシアと共に、II型糖尿病、肥満、および他の代謝障害のような病態を含む様々な病態の重症度を改善するために有用である。本明細書において用いられるように、「病態」という用語は、少なくとも部分的に、筋または脂肪組織の異常な量の発達または代謝活性を特徴とする障害を意味する。そのような病態には、例えば、肥満;肥満に関連した状態、例えば、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、および心筋梗塞;筋ジストロフィー、神経筋疾患、カヘキシア、および食欲不振;ならびに一般的に肥満に関連する、しかし必ずしもその必要はないII型糖尿病のような代謝障害が含まれ、これらは本発明の方法を用いる治療に対して特に感受性がある。本明細書において用いられるように、筋または脂肪組織の発達または代謝活性の量に関連して用いられる「異常」という用語は、熟練した医師または他の当業者が正常または理想的であると認識する量の発達または代謝活性と比較して相対的な意味で用いられる。そのような正常または理想的な値は、医師にとって既知であり、対応する集団における健常者において一般的に認められる、または望ましい平均値に基づく。 例えば、医師は、肥満が特定の身長および体型の人に関して「理想的な」体重範囲より約20%上である体重に関連していることを承知しているであろう しかし、医師は、ボディビルダーが、それ以外は対応する集団における同じ身長および体型の人に関して予想される体重より単に20%またはそれ以上である体重を有するというだけで必ずしも肥満ではないことを認識するであろう 同様に、当業者は、筋活性が異常に減少したように思われる症状を示す患者が例えば、患者に様々な筋力テストを行って、対応する集団における平均的な健常者について予想される結果と比較することによって、異常な筋発達を有すると同定されうることを承知しているであろう 本発明の方法は、少なくとも部分的に、病態の病因に関連した筋または脂肪組織細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節することによって、筋または脂肪組織における異常な量の発達または代謝活性を特徴とする病態の重症度を改善することができる。本明細書において用いられるように、病態の重症度に関連して用いられる「改善する」という用語は、病態に関連した兆候または症状が弱められることを意味する。モニターすべき兆候または症状は、特定の病態の特徴であり、兆候および疾患をモニターする方法と同様に当業者に周知である。例えば、病態がII型糖尿病である場合、当業者は被験者におけるグルコースレベル、グルコース排泄速度等をモニターすることができる。病態が肥満またはカヘキシアである場合、医師は単に被験者の体重をモニターするだけでよい。被験者に投与すべき作用物質は、標的細胞と作用物質との接触、適当であれば、細胞への流入を促進する条件で投与される。ポリヌクレオチド作用物質の細胞への流入は、例えば、細胞に感染しうるウイルスベクターにポリヌクレオチドを組み込むことによって促進されうる。細胞タイプ特異的ウイルスベクターが利用できない場合、標的細胞上に発現されたリガンドに特異的な受容体(またはリガンド)を発現するようにベクターを改変することができ、またはそのようなリガンド(または受容体)を含むように改変することができるリポソームに封入することができる。 ペプチド作用物質は、ペプチドの細胞への転位を促進することができるヒト免疫不全ウイルスTAT蛋白質形質導入ドメインのような蛋白質形質導入ドメインを含むようにペプチドを操作することを含む、様々な方法によって細胞に導入することができる(Schwarzeら、上記1999;Derossiら、上記、1996を参照のこと) 標的細胞における作用物質の存在は、例えば、作用物質に検出可能な標識を機能的に結合することによって、作用物質、特にペプチド作用物質に特異的な抗体を用いることによって、または作用物質による下流の作用、例えば細胞におけるSmadポリペプチドの燐酸化の減少を検出することによって、直接同定することができる。例えば、ペプチドまたはポリヌクレオチド作用物質は、放射標識、アルカリホスファターゼのような酵素、ビオチン、蛍光色素等を含む様々な検出可能部分によって標識することができる。作用物質がキットに含まれる場合、作用物質を標識するための試薬も同様にキットに含めることができ、または試薬を個別に販売元から購入することができる。本発明の方法において有用な作用物質は、病態の部位に投与することができ、または標的細胞にポリヌクレオチドまたはペプチドを提供する如何なる方法によって投与することもできる。本明細書において用いられるように、「標識細胞」という用語は、作用物質に接触させる筋細胞または脂肪細胞を意味する。生きている被験者に投与する場合、作用物質は一般的に、被験者への投与に適した薬学的組成物として調製される。このように、本発明は、細胞におけるミオスタチンシグナル伝達を調節するために有用な作用物質を薬学的に許容される担体において含む薬学的組成物を提供する。そのため、作用物質は、本明細書に定義される病態を有する被験者を治療するための薬剤として有用である。薬学的に許容される担体は当技術分野で周知であり、例えば、水もしくは生理食塩液のような水溶液、またはグリコール、グリセロール、オリーブ油のような油、または注射可能有機エステルのような他の溶媒または媒体が含まれる。薬学的に許容される担体は、例えば、結合体を安定化させる、または結合体の吸収を増加させるように作用する生理的に許容される化合物を含みうる。そのような生理的に許容される化合物には、例えばグルコース、蔗糖、またはデキストランのような糖質、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート化剤、低分子量蛋白質、または他の安定化剤もしくは賦形剤が含まれる。 当業者は、生理的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択が、例えば治療物質の物理化学的特徴、ならびに例えば、経口または静脈内のような非経口となりうる組成物の投与経路、および注入、挿管、またはその他の当技術分野で既知のそのような方法に依存することを承知しているであろう 薬学的組成物はまた、診断試薬、栄養物質、毒素、または例えば癌化学療法剤のような治療物質のような二次試薬を含みうる。例えば、燐脂質または他の脂質からなるリポソームは、作製および投与が比較的単純である非毒性の生理的に許容される代謝可能な担体である。「ステルス」リポソーム(例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,882,679号;第5,395,619号;および第5,225,212号を参照のこと)は、本発明の方法を実践するために有用な薬学的組成物を調製するために特に有用なそのような封入材料の例であり、他の「マスクされた」リポソームも同様に用いることができ、そのようなリポソームは治療物質が循環中に残っている時間を延長させる。 例えば、陽イオンリポソームも同様に特異的受容体またはリガンドによって改変することができる(Morishitaら、J さらに、ポリヌクレオチド作用物質は例えば、アデノウイルス-ポリリジンDNA複合体を用いて細胞に導入することができる(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Michaelら、J ミオスタチンシグナル伝達を変化させる作用物質を含む薬学的組成物の投与経路は、部分的にその分子の化学構造に依存するであろう 例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、経口投与すると消化管において分解され得るために特に有用ではない。さらに、ペプチド作用物質は、D-アミノ酸を用いて調製することができ、またはペプチドドメインの構造を模倣する有機物質であるペプチド模倣体に基づく、またはビニル様(vinylogous)ペプトイドのようなペプトイドに基づく一つまたはそれ以上のドメインを含みうる。本明細書において開示される薬学的組成物は、例えば、経口、もしくは静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、腹腔内、直腸内、大槽内、のような非経口投与を含む様々な経路によって、または例えば、皮膚パッチもしくは経皮イオントフォレーシスを用いてそれぞれ皮膚を通しての受動吸収または吸収促進によって個体に投与することができる。さらに、薬学的組成物は、注入、挿管、経口、または局所投与によって投与することができ、後者は、例えば、軟膏を直接適用することによって受動的に、または例えば組成物の一つの成分が適当な噴射剤である点鼻スプレーまたは吸入剤を用いて能動的となりうる。薬学的組成物はまた、病態の部位に、例えば静脈内、または腫瘍に血液を供給する血管への動脈内に投与することができる。本発明の方法の実践において投与される作用物質の全量は、ボーラスとして、または比較的短時間の注入のいずれかとして単回投与として被験者に投与することができ、または多数回投与を長期間にわたって行う分割治療プロトコールを用いて投与することができる。 当業者は、被験者における病態を治療するための薬学的組成物の量は、被験者の年齢および全身健康状態と共に投与経路および投与すべき治療回数を含む多くの要因に依存することを知っているであろう これらの要因を考慮して、当業者は特定の用量を必要に応じて調節するであろう 一般的に、薬学的組成物の調製および投与経路および投与回数は、フェーズIおよびフェーズII臨床試験を用いて最初に決定される。薬学的組成物は、錠剤、または溶液もしくは懸濁液のような経口投与のために調製することができる;または腸内、または非経口適用に適した有機もしくは無機担体または賦形剤との混合物を含みうる、例えば錠剤、ペレット、カプセル剤、坐剤、溶液、乳液、懸濁液、または用途に適した他の剤形のための通常の非毒性の薬学的に許容される担体と混合することができる。担体は、上記の他に、グルコース、乳糖、マンノース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、中等度の長さのトリグリセリド、デキストラン、および調製物を製造するために用いるのに適した他の担体を、固体、半固体、または液体型で含みうる。 さらに補助剤、安定化剤、濃化剤、または着色剤および香料、例えばトリウロースのような安定化乾燥剤を用いることができる(例えば、米国特許第5,314,695号を参照のこと) 本発明はまた、被験者における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法を提供する。本明細書に開示するように、Act RIIAおよびAct RIIBのようなGDF受容体は、筋組織および脂肪組織形成に関係しているミオスタチンのようなGDFの作用を媒介することに関係している。このように、一つの態様において、筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法には、アクチビン受容体、例えばAct RIIAまたはAct RIIBのようなGDF受容体からのシグナル伝達に影響を及ぼすことが含まれる。そのような方法は、組織の細胞を、ドミナントネガティブ活性、構成的活性等を有する変異体GDF受容体に接触させること、または細胞にそれらを発現させることによって行うことができる。もう一つの態様において、生物における筋組織または脂肪組織の増殖を調節する方法は、ミオスタチンシグナル伝達に影響を及ぼす作用物質を生物に投与することによって行われる。好ましくは、作用物質は、そのいずれかがミオスタチンシグナルペプチドを含みうるミオスタチンプロドメインまたは変異体プロミオスタチンポリペプチドである、またはそれらをコードする。本明細書において用いられるように、「増殖」という用語は、本発明の方法を行っていない対応する生物と比較して本発明の方法を行った生物における筋組織重量または脂肪組織重量について言及する場合に相対的な意味において用いられる。 このように、本発明の方法が、ミオスタチンシグナル伝達が減少または阻害されるように行われる場合、ミオスタチンシグナル伝達がそのように影響を受けていない対応する生物の筋重量と比較して、生物における筋組織の増殖によって生物において筋重量が増加すると認識されるであろう 本発明の方法は、生物の筋重量を増加させる、または脂肪含有量を減少させる、または双方にとって有用となりうる。例えば、そのような方法を食品源として有用である生物に行う場合、食品の蛋白質含有量は増加して、コレステロールレベルは減少し、食品の質が改善されうる。本発明の方法はまた、生物が環境においてあまり競合できないように、生物、例えば環境にとって有害が生物、における筋組織の増殖を減少させるためにも有用となりうる。このように、本発明の方法は、脊椎生物、例えば、哺乳類、鳥類、もしくは魚類を含む、ミオスタチンを発現する如何なる真核生物についても行うことができ、または無脊椎生物、例えば、軟体動物、棘皮動物、腹足類、もしくは頭状体となりうる。作用物質は、本明細書に開示のように、ミオスタチンシグナル伝達を変化させる如何なる作用物質となりうる、かつ従来の如何なる方法で生物に投与することもできる。例えば、治療すべき生物が水槽で養殖される魚、エビ、ホタテガイ等である場合、作用物質は生物が維持される水に加えるか、または特に作用物質が水溶性ペプチドまたは有機低分子である場合には、その飼料に加えることができる。本発明の方法において用いられる作用物質がペプチド作用物質、アンチセンス物質等をコードするポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドを含むヒト以外の生物の生殖細胞を選択して、作用物質を発現するトランスジェニック生物を作製することができる。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドによってコードされる作用物質が、ある時点で望ましい期間発現されうるように、誘導型調節エレメントの制御下に置かれる。したがって、本発明は、ヒト以外のトランスジェニック生物と共に、これらの生物によって産生される食品を提供する。そのような食品は、筋組織における増加のために栄養的価値が増加している。ヒト以外のトランスジェニック動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、七面鳥、および魚を含む脊椎生物、ならびにエビ、ロブスター、カニ、ヤリイカ、カキ、およびアワビのような無脊椎生物を含む本明細書に開示の如何なる種ともなりうる。TGF-ファミリーメンバーの調節および細胞表面受容体との特異的相互作用は解明されつつある。受容体-リガンド相互作用研究によって、細胞が外部刺激に対してどのように反応するかに関して膨大な量の情報が明らかになり、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、およびPDGFのような治療的に重要な化合物が開発された。このように、TGF-ファミリーメンバーの作用を媒介する受容体を同定するために継続的な努力が行われている。本明細書に開示のように、ミオスタチンは、アクチビンII型受容体と特異的に相互作用する。この相互作用の同定は、農業およびヒト治療目的にとって、例えば肥満、II型糖尿病、およびカヘキシアのような様々な病態を治療するために有用な拮抗剤および作用剤を同定するための標的を提供する。この特異的相互作用の同定はまた、他のミオスタチン受容体のみならず、他の増殖分化因子の特異的受容体を同定する手段を提供する。したがって、本発明は、GDFまたは複数のGDFの組み合わせ、例えばミオスタチン、GDF-11もしくはその双方と特異的に相互作用するGDF受容体を提供する。本発明のGDF受容体の例は、本明細書において、ミオスタチンおよびGDF-11と特異的に相互作用するミオスタチン受容体、特にアクチビンII型受容体である。しかし、ミオスタチンと特異的に相互作用するがGDF-11とは相互作用しないミオスタチン受容体も、GDF-11と特異的に相互作用するがミオスタチンとは相互作用しないGDF-11受容体等と同様に本発明に含まれる。考察を簡便にするために、本発明の受容体は、本明細書において一般的に「GDF受容体」と呼ばれ、その例は、少なくともミオスタチンと特異的に相互作用する受容体であるミオスタチン受容体である。そのため、ミオスタチン受容体とミオスタチンとの特異的に相互作用に関して言及するが、本開示は、GDF-11と少なくとも特異的に相互作用するGDF-11受容体を含む如何なるGDF受容体もより広い意味で含む。GDF受容体ポリペプチドを発現する組換え型細胞株もまた、受容体に特異的に結合する抗体、受容体をコードする実質的に精製されたポリヌクレオチド、および実質的に精製されたGDF受容体ポリペプチドと同様に提供される。例えば、本明細書に開示するように、ミオスタチンと細胞のミオスタチン受容体との特異的相互作用を変化させうるミオスタチン受容体のようなGDF受容体の可溶性の細胞外ドメイン;細胞におけるGDFシグナル伝達を誘導、刺激、またはそうでなければ維持することができるGDF受容体の構成的に活性な細胞内キナーゼドメイン;またはミオスタチンもしくは他のGDFシグナル伝達の調節能を有するGDF受容体の他の切断部分を含む、GDF受容体のペプチド部分も同様に提供される。本発明はまた、ヌクレオチドプローブまたは抗体プローブを用いて発現ライブラリとなりうるゲノムまたはcDNAライブラリをスクリーニングする方法;例えばミオスタチンまたはその機能的ペプチド部分のようなGDFを用いて、それらに反応性であり、したがって受容体を発現する細胞をスクリーニングする方法;例えば、GDFペプチドを一つのハイブリッド成分として、かつGDFに対する受容体を発現する細胞から調製したcDNAライブラリから発現されたペプチドを第二のハイブリッドの成分として用いる上記のようなツーハイブリッドアッセイ法等を含む、GDF受容体ポリペプチドを同定する方法も提供する。上記のように、GDF受容体、例えば、Act RIIBのようなミオスタチン受容体と特異的に相互作用する作用物質は、そのような作用物質をスクリーニングするために受容体を用いて同定することができる。逆に、Act RIIB受容体のようにミオスタチン受容体との特異的相互作用能を有すると同定された作用物質を用いて、さらなるミオスタチン受容体または他のGDF受容体をスクリーニングすることができる。そのような方法は、作用物質のような成分(またはミオスタチンもしくは他のGDF)と、切断型膜結合受容体または可溶性受容体となりうるGDF受容体を発現する細胞とを、作用物質(またはGDF)と受容体とを特異的に相互作用させるために十分な条件でインキュベートすること、受容体に結合した作用物質(またはGDF)を測定すること、および受容体を単離することを含みうる。上記のような分子モデリング法もまた、GDF受容体またはその機能的ペプチド部分を同定するスクリーニング方法として有用となりうる。動物の体細胞および生殖細胞に含まれる導入遺伝子によって表現型が付与される、GDF受容体の発現を特徴とする表現型を有するヒト以外のトランスジェニック動物も同様に提供される。導入遺伝子は、GDF受容体、例えばミオスタチン受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。そのようなトランスジェニック動物を作製する方法は、本明細書に開示され、またはそうでなければ当技術分野で既知である。本発明は、GDF受容体の全てまたはペプチド部分をコードする実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。 GDF受容体の例は、本明細書においてアクチビンII型受容体であるが、アクチビンII型受容体をコードするポリヌクレオチドは既に記述されている(米国特許第5,885,794号) 本発明のポリヌクレオチドは、ミオスタチン受容体活性、例えば、ミオスタチン結合活性を有するポリペプチドをコードしうる、または変異体ミオスタチン受容体、例えば、変異体がドミナントネガティブミオスタチン受容体として作用しうる、キナーゼドメインに変異を有する変異体ミオスタチン受容体をコードしうる(上記参照) このように、本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在する、合成、または意図的に操作されたポリヌクレオチドとなりうる。例えば、mRNA配列の一部を、交互のRNAスプライシングパターン、またはRNA転写のために交互のプロモーターを用いることによって変化させることができる。もう一つの例として、ポリヌクレオチドに部位特異的変異誘発を行うことができる。ポリヌクレオチドはまたアンチセンスヌクレオチド配列となりうる。本発明のGDF受容体ポリヌクレオチドには、遺伝子コードの縮重である配列が含まれる。天然のアミノ酸は20個存在し、そのほとんどが1個を超えるコドンによって示される。したがって、ポリヌクレオチドによってコードされるGDF受容体ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に不変である限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。同様に、ミオスタチン受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含まれる。本発明のGDF受容体をコードするポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部分も同様に、本発明に含まれる。そのようなオリゴヌクレオチドは、一般的に、オリゴヌクレオチドが受容体をコードするポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするために十分な長さである少なくとも約15塩基、および長さが少なくとも約18ヌクレオチドまたは21ヌクレオチドもしくはそれ以上となりうる。本明細書において用いられるように、「選択的ハイブリダイゼーション」または「選択的にハイブリダイズする」という用語は、中等度にストリンジェント、または関連するヌクレオチド配列を無関係なヌクレオチド配列と区別することができる高ストリンジェントな生理条件でのハイブリダイゼーションを意味する。 核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを得るために用いられる条件は、ハイブリダイズする核酸の特性に応じて変化するであろう 例えば、長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成(例えば、相対的GC:AT含有量)、および核酸のタイプ、すなわちオリゴヌクレオチドまたは標的核酸配列がDNAまたはRNAであるか否かを、ハイブリダイゼーション条件を選択するために考慮することができる。さらなる検討は、核酸の一つが例えばフィルター上に固定されているか否かである。 適当なストリンジェンシー条件を選択する方法は、経験的に決定するか、または様々な公式を用いて推定することができ、当技術分野で周知である(例えば、Sambrookら、上記、1989を参照のこと) 進行的により高いストリンジェンシー条件の例は以下の通りである:ほぼ室温で2×SSC/0 洗浄は、これらの条件の一つのみ、例えば高ストリンジェンシー条件を用いて行うことができ、またはそれぞれの条件を例えば、記載の段階の一部または全てを上記に記載した順序で、それぞれ10〜15分間繰り返すことができる。本発明のGDF受容体コードポリヌクレオチドは、いくつかの方法のいずれにによっても得ることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、当技術分野で周知であるように、ハイブリダイゼーションまたはコンピューターに基づく技術を用いて単離することができる。 これらの方法には、以下が含まれるがこれらに限定されない:1)相同なヌクレオチド配列を検出するためにゲノムまたはcDNAライブラリとプローブとのハイブリダイゼーション;2)共有する構造特徴を有するクローニングしたDNA断片を検出するために発現ライブラリの抗体スクリーニング;3)関係するDNA配列とアニーリングすることができるプライマーを用いるゲノムDNAまたはcDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR);4)類似の配列に関する配列データベースのコンピューター検索(上記を参照);5)サブトラクトDNAライブラリの示差スクリーニング;および6)例えば、ハイブリッドの一つに成熟GDFペプチドを用いるツーハイブリッドアッセイ法 アクチビン受容体がミオスタチンと特異的に相互作用するという本発明の開示を考慮すると、アクチビン受容体をコードする配列、例えば、ミオスタチンに結合する細胞外ドメインをコードする配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを設計することができ、これを用いて、ミオスタチンに反応する筋細胞または脂肪細胞のような細胞から調製したライブラリをスクリーニングすることができ、このようにミオスタチン受容体をコードするポリヌクレオチドの同定が容易になる。選択したクローンは例えば、発現ベクターにインサートをサブクローニングして、クローニングした配列を発現させた後、発現されたポリペプチドをミオスタチンを用いてスクリーニングすることによってさらにスクリーニングすることができる。 本発明のポリヌクレオチド、例えば、ミオスタチン受容体をコードするポリヌクレオチドは、哺乳類、鳥類、もしくは魚類種を含む脊椎動物種または無脊椎動物種に由来しうる 核酸ハイブリダイゼーションに依存するスクリーニング技法を用いれば、適当なプローブが利用できる限り、如何なる生物からの如何なる遺伝子配列の単離も可能である。調べる蛋白質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学合成することができる。これには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチド枝が既知である必要がある。受容体をコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重を考慮に入れて、遺伝子コードから推定することができる。このように、配列が縮重している場合には、混合したさらなる反応を行うことができる。これには、変性二本鎖DNAの異種混合物が含まれる。そのようなスクリーニングに関して、ハイブリダイゼーションは、好ましくは一本鎖DNAまたは変性二本鎖DNAのいずれかについて行われる。ハイブリダイゼーションは、関係するポリペプチドに関連して存在するmRNA配列の量が極めて少ない起源に由来するcDNAの検出において特に有用である。 このように、非特異的結合を回避することをねらいとしストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることによって、オートラジオグラフィーによる可視化を用いて、混合物において標的DNAと、標的核酸の完全な相補体であるオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって特異的cDNAクローンを同定することができる(Wallaceら、Nucl または、サブトラクティブライブラリを用いて、それによって非特異的cDNAクローンを除去することができる。所望のポリペプチドの完全なアミノ酸配列がわかっていない場合、DNA合成の直接合成は可能ではなく、選択される方法はcDNA配列の合成である。関係するcDNA配列を単離する標準的な技法は、ライブラリが高レベル遺伝子発現を有するドナー細胞に豊富に存在するmRNAの逆転写に由来する、プラスミドまたはファージにおいて調製したcDNAライブラリの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組み合わせて用いる場合、まれな発現産物でさえクローニングすることができる。 ポリペプチドのアミノ酸配列の有意な部分がわかっている場合、標的cDNAに存在すると思われる配列を複製する標識一本鎖もしくは二本鎖DNAまたはRNAプローブ配列の産生を、一本鎖型に変性されているcDNAのクローニングしたコピー上で行われるハイブリダイゼーション技法に用いることができる(Jayら、Nucl ラムダgt11ライブラリのようなcDNA発現ライブラリは、GDF受容体に特異的な抗体、例えば抗Act RIIB抗体を用いてGDF受容体ペプチドに関してスクリーニングすることができる。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体となりえて、これを用いてGDF受容体cDNAの存在を示す発現産物を検出することができる。そのような発現ライブラリも同様に、ミオスタチン受容体のミオスタチン結合ドメインの少なくとも一部をコードするクローンを同定するために、GDFペプチド、例えばミオスタチン、またはその機能的ペプチド部分によってスクリーニングすることができる。変異体GDF受容体および変異体GDF受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも同様に本発明に含まれる。GDF受容体をコードするポリヌクレオチドにおける変化は、点突然変異、ナンセンス(STOP)変異、ミスセンス変異、スプライス部位変異またはフレームシフトのような遺伝子内変異となりえて、ヘテロ接合またはホモ接合欠失となりうる、および天然に存在する変異となりうる、または例えば組換えDNA方法を用いて操作することができる。そのような変化は、ヌクレオチド配列解析、サザンブロット解析、多重PCRもしくは配列タグ部位(STS)解析のようなPCRに基づく解析、またはインサイチューハイブリダイゼーション解析を含むがこれらに限定されない当業者に既知の標準的な方法を用いて検出することができる。GDF受容体ポリペプチドは、標準的なSDS-PAGE、免疫沈降解析、ウェスタンブロット解析等によって解析することができる。変異体GDF受容体の例は、その同源のGDFに対する特異的結合能を有しうるが、キナーゼドメインを欠損する可溶性細胞外ドメイン;構成的キナーゼ活性を示すことができる細胞内GDF受容体キナーゼドメイン含む切断型GDF受容体;と共に受容体のキナーゼ活性または受容体のリガンド結合能を破壊する点突然変異を含むGDF受容体等である。そのようなGDF受容体変異体は、GDFシグナル伝達を調節するために有用であり、したがって、本発明の様々な方法を実践するために有用である。GDF受容体をコードするポリヌクレオチドは、適した宿主細胞にポリヌクレオチドを導入することによって、インビトロで発現することができる。「宿主細胞」は、特定のベクターを増殖させることができる、および適当であれば、ベクターに含まれるポリヌクレオチドが発現されうる如何なる細胞となりうる。「宿主細胞」という用語には、当初の宿主細胞の如何なる子孫も含まれる。宿主細胞の全ての子孫は、例えば複製の際に起こる変異のために親細胞とは同一でなくてもよいと理解される。しかし、「宿主細胞」という用語が用いられる場合、そのような子孫は含まれる。本発明の導入されたポリヌクレオチドを一過的または安定に含む宿主細胞を得る方法は当技術分野で周知である。本発明のGDF受容体ポリヌクレオチドは、クローニングベクターまたは組換え発現ベクターとなりうるベクターに挿入することができる。「組換え発現ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド、特に本発明に関連してGDF受容体の全てまたはペプチド部分をコードするポリヌクレオチドの挿入または組み込みによって操作されている当技術分野において既知のプラスミド、ウイルス、または他の媒体を意味する。そのような発現ベクターは、宿主の挿入された遺伝子配列の効率よい転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは、一般的に、複製開始点、プロモーターと共に、形質転換細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含む。263:3521、1988)、および昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来ベクターが含まれるがこれらに限定されない。 DNAセグメントは、ベクターにおいて、調節エレメント、例えばT7プロモーター、メタロチオネインIプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または望ましければ特に組織特異的プロモーターもしくは誘導型プロモーターのような他のプロモーターとなりうるプロモーターに機能的に結合して存在しうる GDF受容体をコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞または真核細胞のいずれかにおいて発現させることができる。宿主には、微生物、酵母、昆虫および哺乳類生物が含まれうる。真核生物配列またはウイルス配列を有するポリヌクレオチドを原核生物において発現させる方法は、宿主において発現および複製することができる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドDNAベクターと同様に、当技術分野で周知である。 本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築する方法は、例えば、ポリヌクレオチドが特定の細胞タイプまたは特定の条件で選択的に発現されるか否かを含む、転写または翻訳制御シグナルを選択する場合に検討される要因と同様に周知である(例えば、Sambrookら、上記、1989を参照のこと) GDF受容体コード配列を発現させるために、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換した細菌のような微生物;組換え酵母発現ベクターによって形質転換した酵母細胞;カリフラワーモザイクウイルスもしくはタバコモザイクウイルスのような発現ベクターを感染させた、またはTiプラスミドのような組換えプラスミド発現ベクターによって形質転換した植物細胞系;バキュロウイルスのような組換えウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞;レトロウイルス、アデノウイルス、またはワクシニアウイルスベクターのような組換えウイルス発現ベクターを感染させた動物細胞系;および安定に発現されるように遺伝子操作された形質転換動物細胞系を含むがこれらに限定されない、多様な宿主細胞/発現ベクター系を利用することができる。発現されたGDF受容体が、例えばグリコシル化によって翻訳後改変される場合、所望の改変を行うことができる宿主細胞/発現ベクター系、例えば、哺乳類宿主細胞/発現ベクター系を選択すると特に有利となりうる。 用いる宿主細胞/ベクター系に応じて、構成的および誘導型プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ等を含む多くの適した転写および翻訳エレメントを発現ベクターにおいて用いることができる(Bitterら、Meth 哺乳類細胞系においてクローニングする場合、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター、例えばヒトもしくはマウスメタロチオネインプロモーター、または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター、例えばレトロウイルスの長末端反復、アデノウイルス後期プロモーター、もしくはワクシニアウイルス7 5 Kプロモーターを用いることができる。組換えDNAまたは合成技術によって産生されたプロモーターも同様に、挿入されたGDF受容体コード配列の転写を提供するために用いることができる。または、酵母の染色体に外来DNA配列の組み込みを促進するベクターを用いることができる。真核生物系、特に哺乳類発現系では、発現された哺乳類蛋白質の適切な翻訳後改変を行うことができる。最初の転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、燐酸化、および都合よくは、遺伝子産物の細胞質膜挿入のための細胞機構を有する真核細胞を、GDF受容体ポリペプチドまたはその機能的ペプチド部分を発現させるための宿主細胞として用いることができる。発現を指示するために組換えウイルスまたはウイルスエレメントを利用する哺乳類細胞系を操作することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合、GDF受容体コード配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三連リーダー配列にライゲーションすることができる。 または、ワクシニアウイルス7 染色体外エレメントとして複製することができるウシ乳頭腫ウイルスベクターは特に有用である(Sarverら、Mol このDNAがマウス細胞に流入した後まもなく、プラスミドは細胞あたり約100〜200コピーに複製する。挿入されたcDNAの転写は、宿主細胞染色体へのプラスミドの組み込みを必要とせず、それによって高レベル発現が得られる。これらのベクターは、プラスミドに、例えばneo遺伝子のような選択マーカーを含めることによって安定な発現のために用いることができる。 または、レトロウイルスゲノムは、宿主細胞にGDF受容体遺伝子を導入してその発現を指示することができるベクターとして用いるために改変することができる(ConeとMulligan、Proc 高レベル発現はまた、メタロチオネインIIAプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含むがこれらに限定されない誘導型プロモーターを用いても行うことができる。組換え蛋白質を高い収率で長期間産生させるためには、安定な発現が好ましい。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを用いる以外に、宿主細胞をプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネータ、およびポリアデニル化部位のような適当な発現制御エレメント、ならびに選択マーカーによって制御されるGDF受容体cDNAによって形質転換することができる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する抵抗性を付与することができ、それによって細胞はプラスミドをその染色体に安定に組み込まれ、増殖してコロニーを形成することができ、これをクローニングして細胞株に増殖させることができる。例えば、外来DNAの導入後、操作された細胞を栄養に富む培地において1〜2日間増殖させた後、選択培地に切り替える。(コールドスプリングハーバー研究所出版、1987))に対する抵抗性を付与するODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)を含むさらなる選択遺伝子も同様に記載されている。宿主が真核細胞である場合、リン酸カルシウム共沈殿物のようなDNAトランスフェクション法、マイクロインジェクション、電気穿孔、リポソームに封入されたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターのような従来の機械的技法を用いることができる。真核細胞も同様に、本発明のGDF受容体をコードするDNA配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような選択的表現型をコードする第二の外来DNA分子とによって同時形質転換することができる。本発明はまた、その細胞がGDF受容体ポリペプチドを発現して、GDF受容体をコードするDNAを含む、安定な組換え型細胞株を提供する。P19は胎児癌細胞株である。そのような細胞は、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)の細胞株カタログに記載されている。 6章を参照のこと) GDF受容体は、本明細書に記載する誘導型または構成的調節エレメントを用いて本発明の組換えポリヌクレオチドから発現させることができる。望ましい蛋白質コード配列および機能的に結合したプロモーターを、直線型分子となりうる、または共有結合によって閉環した環状分子となりうる非複製DNA(またはRNA)分子のいずれかとしてレシピエント細胞に導入することができる。所望の分子の発現は、導入された配列の一過的な発現によって起こりうる、またはポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞染色体に組み込まれることによって、より永続的な発現を可能にすることによって、細胞において安定に維持することができる。したがって、細胞は、安定または一過的に形質転換した(トランスフェクトした)細胞となりうる。用いることができるベクターの例は、宿主細胞染色体に所望の遺伝子配列を組み込まれることができるベクターである。その染色体に導入されたDNAを安定に組み込まれている細胞は、また、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする一つまたはそれ以上のマーカーを導入することによって選択することができる。一般的な酵母の栄養要求マーカーであるleu2、またはura3のようなマーカーは、宿主において栄養要求性を補うことができ;殺虫剤抵抗性、例えば抗生物質または銅等のような重金属イオンに対する抵抗性を付与することができる。選択マーカー遺伝子は、発現すべきDNA遺伝子配列に直接連結することができ、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。導入された配列は、レシピエント宿主において自律的に複製することができるプラスミドまたはウイルスベクターに組み込まれることができる。多様なベクターをこの目的のために用いることができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択するために重要な要因には、ベクターを含むレシピエント細胞を認識してベクターを含まない細胞から選択することができる容易さ、特定の宿主細胞において望ましいベクターのコピー数;ならびに異なる種の宿主間でベクターを「往復させる」ことができるために望ましいか否かが含まれる。哺乳類宿主に関して、いくつかのベクター系が発現のために利用できる。一つのクラスのベクターは、動物ウイルス、例えばウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、またはSV40ウイルスに由来する自律的に複製する染色体外プラスミドを提供するDNAエレメントを利用する。第二のクラスのベクターには、ワクシニアウイルス発現ベクターが含まれる。第三のクラスのベクターは、宿主染色体に所望の遺伝子配列を組み込まれることに依存する。導入されたDNAをその染色体に安定に組み込んだ細胞はまた、一つまたはそれ以上のマーカー遺伝子(上記のような)を導入することによっても選択することができ、これによって発現ベクターを含む宿主細胞を選択することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるDNA配列に直接連結することができ、または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入することができる。コードされるmRNAまたはペプチドの最適な合成を提供するために、例えば、スプライスシグナル、転写プロモーターまたはエンハンサー、および転写または翻訳終了シグナルを含む、さらなるエレメントを含むことができる。構築物を含むベクターまたはDNA配列を発現のために調製した後、DNA構築物を適当な宿主に導入することができる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するために、例えば、プロトプラスト融合、燐酸カルシウム沈殿、および電気穿孔のようなトランスフェクションもしくは形質転換法、または他の従来の技法、例えばベクターがウイルスベクターである場合には感染を含む様々な方法を用いることができる。本発明はまた、組換えGDF受容体を発現する細胞を有するトランスジェニック動物も提供する。そのようなトランスジェニック動物は、脂肪含有量が減少している、筋重量が増加している、またはその双方であるように選択することができ、したがって、筋および蛋白質含有量が高く、脂肪およびコレステロール含有量が低い食品源として有用となりうる。動物は、GDF、特にミオスタチンの産生が正常「レベル」に維持されているが、ミオスタチン受容体の産生量が減少しているか、または完全に破壊されて、その結果、ミオスタチンとの結合能が減少し、その結果、脂肪またはコレステロールレベルを増加させることなく、筋組織が正常レベル以上となる動物の細胞が得られるように、その生殖細胞および体細胞の染色体で改変されている。したがって、本発明にはまた、動物によって提供される食品が含まれる。そのような食品は、筋組織の増加のために栄養的価値が増加している。本発明のヒト以外のトランスジェニック動物には、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびトリ動物が含まれると共に、他の脊椎動物が含まれ、さらにトランスジェニック無脊椎動物が含まれる。本発明はまた、筋重量が増加した動物食品を作製する方法を提供する。そのような方法には、動物の前核胚の生殖細胞の遺伝子構築を改変すること、胚を仮親雌性動物の卵管に埋め込むこと、それによって胚を妊娠満期まで成熟させること、導入遺伝子陽性子孫を同定するために導入遺伝子の存在に関して子孫を調べること、さらなる導入遺伝子陽性子孫を得るために導入遺伝子陽性子孫を交配すること、および食品を得るために子孫を処理することが含まれうる。生殖細胞の改変は、ミオスタチン受容体蛋白質の産生をコードする天然に存在する遺伝子の発現を減少または阻害するように遺伝子組成物を改変させることを含む。 例えば、導入遺伝子は、ミオスタチン受容体をコードするポリヌクレオチドに対して特異的であるアンチセンス分子を含みうる、内因性のミオスタチン受容体遺伝子もしくは導入遺伝子において置換もしくは介在する非機能的配列を含みうる;またはミオスタチン受容体拮抗剤、例えば、ドミナントネガティブAct RIIBのようなドミナントネガティブミオスタチン受容体をコードしうる 本明細書において用いられるように、「動物」という用語は、如何なるトリ、魚、またはヒトを除く哺乳類も意味し、これには、胚または胎児段階を含む如何なる発達段階も含まれる。ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ等のような家畜動物;マウスのような齧歯類;およびネコおよびイヌのようなペットも「動物」という用語の意味に含まれる。さらに、「生物」という用語は、本明細書において上記の動物が含まれると共に、例えばは虫類および両生類のような他の脊椎動物と共に上記のような無脊椎動物を含む他の真核生物を含むように用いられる。本明細書において用いられるように、動物または生物に関連して用いられる「トランスジェニック」という用語は、動物または生物の細胞が、細胞によって安定に維持される外因性のポリヌクレオチド配列を含むように遺伝子操作されていることを意味する。操作は、例えばポリヌクレオチドのマイクロインジェクション、またはポリヌクレオチドを含む組換えウイルスによる感染となりうる。このように、「トランスジェニック」という用語は、本明細書において一つまたはそれ以上の細胞が、細胞の染色体に組み込まれうる、または酵母の人工染色体に操作される場合のように、染色体外で複製するポリヌクレオチドとして維持することができる、組換えポリヌクレオチドを有する細胞(生物)を意味するために用いられる。「トランスジェニック動物」という用語には、また、「生殖系列」トランスジェニック動物が含まれる。生殖系列トランスジェニック動物は、遺伝情報が生殖系列の細胞に取り込まれて組み込まれていて、したがって子孫に情報伝達能を付与するトランスジェニック動物である。そのような子孫が実際にその情報のいくつかまたは全てを有する場合、子孫も同様にトランスジェニック動物であると見なされる。本発明はさらにトランスジェニック生物を含む。トランスジェニック生物は、そのゲノムが初期胚もしくは受精卵のインビトロ操作によって改変されている、または特異的遺伝子ノックアウトを誘導するための如何なるトランスジェニック技術によっても改変されている如何なる生物ともなりうる。「遺伝子ノックアウト」という用語は、機能の完全な喪失に至る細胞におけるまたはインビボでの遺伝子の標的化破壊を意味する。トランスジェニック動物における標的遺伝子は、例えば相同的組換えによって、または細胞における遺伝子の機能を破壊する他の如何なる方法によって、非機能的にすべき遺伝子にターゲティングした挿入によって非機能的にされうる。本発明の実践において用いられる導入遺伝子は、改変されたGDF受容体コード配列を含むDNA配列となりうる。好ましくは、改変GDF受容体遺伝子は、胚性幹細胞における相同的ターゲティングによって破壊される遺伝子である。 例えば、GDF受容体遺伝子の完全な成熟C末端領域を欠失させることができる(実施例13を参照のこと) 選択的に、破壊(または欠失)は、もう一つのポリヌクレオチド、例えば非機能的GDF受容体配列の挿入または置換を伴うことができる。「ノックアウト」表現型はまた、生物の細胞にアンチセンスGDF受容体ポリヌクレオチドを導入もしくは発現することによって、または細胞において抗体もしくはドミナントネガティブGDF受容体を発現することによって、付与することができる。適当であれば、GDF受容体活性を有する蛋白質をコードするが、遺伝子コードの縮重のために天然に存在するGDF遺伝子配列とはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチドを、本明細書において、切断型、対立遺伝子変種および種間相同体として用いることができる。本発明はまた、GDF受容体に特異的に結合する抗体、および受容体とGDFとの結合を遮断する抗体を提供する。そのような抗体は、例えば、筋組織に関連した細胞増殖障害のような病態を改善するために有用となりうる。GDF受容体、特にミオスタチン受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体は、骨格筋の発達を増加させうる。請求の方法の好ましい態様において、GDF受容体モノクローナル抗体、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを、筋消耗性疾患、神経筋障害、筋萎縮、加齢等のような病態を有する患者に投与する。GDF受容体抗体、特に抗ミオスタチン受容体抗体も同様に、筋ジストロフィー、脊髄損傷、外傷損傷、先天性閉塞性肺疾患(COPD)、AIDS、またはカヘキシアのような病態を有する患者に投与することができる。 好ましい態様において、抗ミオスタチン受容体抗体を静脈内、筋肉内、または皮下注射によって筋消耗性疾患または障害を有する患者に投与する;好ましくは、モノクローナル抗体は約0 抗体は、例えば、ボーラス注入またはゆっくりとした注入によって投与することができる。30分〜2時間かけての遅い注入が好ましい。抗ミオスタチン受容体抗体、または他の抗GDF受容体抗体は、患者に投与するために適した製剤に調製することができる。そのような製剤は当技術分野で既知である。 投与レジメは、ミオスタチン受容体蛋白質の作用を改変する様々な要因、例えば、望ましい組織形成量、組織損傷部位、損傷組織の状態、創傷の大きさ、損傷組織のタイプ、患者の年齢、性別、および食事、感染の重症度、投与時間、ならびに他の臨床要因を考慮して主治医によって決定されるであろう 用量は、溶解に用いられるマトリクスのタイプ、および組成物において用いられる抗ミオスタチン受容体抗体のような作用物質のタイプによって変化しうる 一般的に、静脈内、筋肉内、または皮下注射のような全身または注射による投与 投与は一般的に、最小に有効である用量で開始し、陽性作用が認められるまで予め選択した時間経過について用量を増加する。その後、用量の漸増は、現れうる如何なる副作用も考慮に入れて、作用が対応して増加するレベルまでの増加に制限する。筋重量を増加させるために役立ちうるIGFI(インスリン様増殖因子I)、ヒト、ウシ、またはニワトリの成長ホルモンのような他の既知の増殖因子を最終組成物に加えても、用量に影響を及ぼしうる。 抗ミオスタチン受容体抗体を投与する態様において、抗体は一般的に、約0 本明細書において用いられるように、「抗体」という用語はその最も広い意味において、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体と共に、そのような抗体の抗原結合断片を含むように用いられる。本発明の方法において有用な抗体、またはその抗原結合断片は、例えば、GDF受容体、例えばミオスタチン受容体のエピトープに対する特異的結合活性を有するという特徴を有する。さらに、上記のように、本発明の抗体は、プロミオスタチンポリペプチドのペプチド部分、特にミオスタチンプロドメインまたはその機能的ペプチド部分に特異的に結合する抗体となりうる。 GDF受容体抗体の調製および特徴を例として示す以下の方法は、ミオスタチンプロドメインに特異的に結合する抗体、プロミオスタチンポリペプチドに特異的に結合して、プロミオスタチンのミオスタチンへの蛋白質分解切断を減少または阻害する抗体等を含む、本発明のさらなる抗体の調製および特徴付けに適用可能であると認識されるであろう 抗体に関連して用いる場合の「特異的に結合する」または「特異的結合活性」という用語は、抗体と特定のエピトープとの相互作用が解離定数少なくとも約1×10-6、一般的に少なくとも約1×10-7、通常、少なくとも約1×10-8、および特に少なくとも約1×10-9または1×10-10またはそれ未満を有することを意味する。そのため、GDF受容体のエピトープに対する特異的結合活性を保持している抗体のFab、F(ab')2、Fd、およびFv断片は抗体の定義に含まれる。本発明の目的に関して、例えば、ミオスタチン受容体のエピトープに特異的に反応する抗体は、抗体がTGF-またはBMP受容体と比較してミオスタチン受容体に対して少なくとも2倍大きい結合親和性、一般的に少なくとも5倍大きい結合親和性、および特に少なくとも10倍大きい結合親和性を有すれば、TGF-受容体またはBMP受容体と実質的に反応しないと見なされる。本明細書において用いられる「抗体」という用語には、天然に存在する抗体と共に、例えば一本鎖抗体、キメラ、双機能、およびヒト化抗体と共にその抗原結合断片を含む天然に存在しない抗体が含まれる。 そのような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ、または例えば可変重鎖および可変軽鎖からなる組み合わせライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる(参照として本明細書に組み入れられる、Huseら、Science 246:1275〜1281(1989)を参照のこと) 本発明の抗体は、TGF-、アクチビン、またはBMP受容体に存在しないミオスタチン受容体のペプチド部分を用いて作製することができる。同様に、ミオスタチンプロドメインに特異的に結合する抗体は、プロドメインまたはその機能的ペプチド部分を免疫原として用いて作製することができる。そのようなペプチドが非免疫原性である場合、ウシ血清アルブミン(BSA)もしくはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)のような担体蛋白質にハプテンをカップリングさせることによって、またはペプチド部分を融合蛋白質として発現させることによって免疫原性にすることができる。 様々な他の担体分子およびハプテンを担体分子にカップリングさせる方法は、当技術分野で周知である(例えば、HarlowとLane、上記、1988を参照のこと) 望ましければ、本発明の方法において有用な抗体または他の作用物質を組み込まれるキットを調製することができる。そのようなキットは、作用物質の他に、作用物質を被験者に投与するために溶解されうる薬学的組成物を含みうる。キットはまた、抗体を検出するための試薬、GDF受容体に対する抗体の特異的結合を検出する試薬を含みうる。抗体を標識する、またはそうでなければ同定するために有用なそのような検出可能試薬は、本明細書に記述され、当技術分野で既知である。 1章を参照のこと) 例えば、ミオスタチン受容体またはそのエピトープ断片によって免疫したマウスからの脾細胞を、SP/02骨髄腫細胞のような適当な骨髄腫細胞株に融合させてハイブリドーマ細胞を産生する。クローニングしたハイブリドーマ細胞株は、適当な特異性を有するモノクローナル抗体を分泌するクローンを同定するために標識抗原を用いてスクリーニングすることができ、所望の特異性および親和性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離して、これを連続的な抗体原として利用することができる。抗体は、ミオスタチン受容体と特異的に結合できないことに関してさらにスクリーニングすることができる。そのような抗体は、例えば、臨床で用いるための標準キットを調製するために有用である。例えば、一本鎖抗ミオスタチン受容体抗体を発現する組換えファージも同様に、標準キットを調製するために用いることができる抗体を提供する。簡単に説明すると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射すること、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認すること、Bリンパ球を得るために脾臓を切除すること、Bリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生すること、ハイブリドーマをクローニングすること、抗原に対して抗体を産生する陽性クローンを選択すること、およびハイブリドーマ培養から抗体を単離することによって得ることができる。 モノクローナル抗体は、例えば、プロテイン-Aセファロースによるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィー(Coliganら、上記、1992、2 10:79〜104(ヒュマナ出版、1992)を参照のこと)を含む、十分に確立された多様な技術によってハイブリドーマ培養から単離および精製することができる。モノクローナル抗体をインビトロおよびインビボで増幅させる方法は、当業者に周知である。インビトロでの増幅は、選択的に、仔ウシ胎児血清のような哺乳類の血清、または微量元素および正常マウス腹腔滲出細胞、脾細胞、骨髄マクロファージのような増殖維持補助剤を補充したダルベッコ改変イーグル培地またはRPMI 1640培地のような適した培養培地において行うことができる。インビトロでの産生は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、所望の抗体の大量を産生するために規模を拡大することができる。大規模ハイブリドーマ培養は、エアリフトリアクターにおいて均一な浮遊培養によって、連続攪拌リアクターにおいて、または固定もしくは捕獲細胞培養において行うことができる。インビボでの増幅は、抗体産生腫瘍の増殖を引き起こすために、親細胞と組織適合性の哺乳類、例えば同系マウスに細胞クローンを注入することによって行うことができる。選択的に、注射前に動物を炭化水素、特にプリスタン(テトラメチルペンタデカン)のような油によってプライミングする。1〜3週間後、所望のモノクローナル抗体を動物の体液から回収する。本明細書に開示の抗体の治療応用も同様に、本発明の一部である。 例えば、本発明の抗体はまた、ヒト以下の霊長類抗体に由来しうる 治療的に有用な抗GDF受容体抗体も同様に、「ヒト化」モノクローナル抗体に由来しうる ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域からのマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移して、その後マウス相対物のフレームワーク領域においてヒト残基を置換することによって産生される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を用いれば、マウス定常領域の免疫原性に関連した起こりうる問題が回避される。 マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングする一般技術は既知である(例えば、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、Orlandiら、Proc ヒト免疫グロブリンファージライブラリを産生するために有用なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、ストラタジーンクローニングシステムズ社(ラホヤ、カリフォルニア州)から得ることができる。 本発明の抗体はまた、ヒトモノクローナル抗体に由来しうる そのような抗体は、抗原チャレンジに反応して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されているトランスジェニックマウスから得られる。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖座のエレメントを、内因性重鎖および軽鎖座の標的化破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入する。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。本発明の抗体断片は、抗体の蛋白質分解加水分解によって、または断片をコードするDNAを大腸菌において発現させることによって調製することができる。抗体断片は、従来の方法によって抗体全体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、F(ab')2と呼ばれる5S断片を提供するためにペプシンによる抗体の酵素的切断によって産生することができる。 この断片は、チオール還元剤、および選択的に、ジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基の遮断基を用いてさらに切断することができ、3 4章も参照のこと) 一価軽鎖/重鎖断片を形成するために、重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的技術のような抗体を切断する他の方法も同様に、断片が無傷の抗体によって認識される抗原に特異的に結合する限り、用いることができる。 または、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合によって連結することができ、またはグルタルアルデヒドのような化学物質によってクロスリンクすることができる(Sandhu、上記、1992) 好ましくは、FV断片は、ペプチドリンカーによって結合したVHおよびVL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合蛋白質(sFv)は、オリゴヌクレオチドによって結合したVHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は、発現ベクターに挿入して、これをその後大腸菌のような宿主細胞に導入する。組換え型宿主細胞は、二つのVドメインを架橋するリンカーペプチドによって一つのポリペプチド鎖を合成する。抗体断片のもう一つの形は、単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識単位」)は、関係する抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。本発明はまた、GDF受容体ポリペプチドを同定する方法も提供する。そのような方法は、例えば、GDFポリペプチドを含む成分と、完全長の受容体または切断型受容体を発現する細胞を、GDFを受容体に結合させるために十分な条件でインキュベートすること、GDFポリペプチドと受容体との結合を測定すること、および受容体を単離することによって行うことができる。受容体を単離する方法は、下記の実施例においてより詳細に説明する。したがって、本発明はまた、実質的に精製されたGDF受容体のみならず、天然に存在するGDF受容体より少ないアミノ酸残基を有するGDF受容体のペプチドおよびペプチド誘導体を提供する。そのようなペプチドおよびペプチド誘導体は、筋消耗性症候群の研究およびより有効な治療の開発において、研究および診断ツールとして有用である。本発明はさらにGDF受容体変種を提供する。本明細書において用いられるように、「GDF受容体変種」という用語はGDF受容体の構造の少なくとも一部を刺激する分子を意味する。GDF受容体変種は、GDF結合を減少または阻害して、それによって本明細書に開示の病態を改善するために有用となりうる。GDF受容体変種の例には、GDF受容体の可溶性細胞外ドメインのような切断型GDF受容体、キナーゼ活性を欠損するドミナントネガティブAct RIIB受容体のようなドミナントネガティブGDF受容体、またはその他の切断型もしくは変異体GDF受容体が含まれるがこれらに限定されない。本発明は、天然に存在するGDF受容体のペプチドおよびペプチド誘導体のみならず、変異体GDF受容体およびGDF、例えばミオスタチンに特異的に結合するGDF受容体の化学合成された誘導体を含むGDF受容体変種にも関する。例えば、GDF受容体のアミノ酸配列の変化が本発明において考慮される。GDF受容体は、蛋白質をコードするDNAを変化させることによって変化させることができる。好ましくは、同じまたは類似の特性を有するアミノ酸を用いて、保存的アミノ酸変化のみを行う。例となるアミノ酸置換には、アラニンからセリンへの変化;アルギニンからリジン;アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン;アスパラギン酸からグルタミン酸;システインからセリン;グルタミンからアスパラギン;グルタミン酸からアスパラギン酸;グリシンからプロリン;ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン;イソロイシンからロイシンまたはバリン;ロイシンからバリンまたはイソロイシン;リジンからアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸;メチオニンからロイシンまたはイソロイシン;フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン;セリンからトレオニン;トレオニンからセリン;トリプトファンからチロシン;チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン;バリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化が含まれる。本発明にとって有用な変種は、そのそれぞれのGDFsに対して特異的結合能を保持しているGDF受容体の類似体、相同体、変異蛋白質および模倣体を含む。もう一つの態様において、変種がGDFと特異的に相互作用するか否かによらず、ドミナントネガティブ活性を有する変種GDF受容体も同様に考慮される。GDF受容体のペプチドは、これらの能力を有するGDF受容体のアミノ酸配列の一部を意味する。変種は、化学修飾によって、蛋白質分解酵素の消化によって、またはその組み合わせによってGDF受容体自身から直接産生することができる。さらに、アミノ酸残基から直接ポリペプチドを合成する方法と共に遺伝子操作技術を用いることができる。ペプチドは、アミノ基のt-BOCまたはFMOC保護のような一般的に用いられる方法によって合成することができる。 本発明のペプチドはまた、0 0 mMolアミン/gポリマーを含むコポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)を用いて、周知の固相ペプチド合成法(そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、Merrifield、J 化学合成が終了すると、ペプチドを、液体HF-10%アニソールによる0°Cで約1/4〜1時間の処置によって脱保護してポリマーから切断することができる。試薬を蒸発させた後、1%酢酸溶液によってペプチドをポリマーから抽出して、次にこれを凍結乾燥すると粗材料が得られる。これは通常、5%酢酸を溶媒として用いるセファデックスG-15上でのゲル濾過のような技術によって精製することができる。カラムの適当な画分を凍結乾燥すると、均一なペプチドまたはペプチド誘導体が得られ、これをアミノ酸解析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収分光法、モル旋光度、溶解度のような標準的な技術によって特徴を調べ、固相エドマン分解によって定量することができる。ペプチド模倣体を用いる背後の基礎となる原理は、蛋白質のペプチド骨格が、主に、分子相互作用を促進する方向にアミノ酸側鎖を向けるように存在するという点である。本発明の目的に関して、適当な模倣体は、GDF受容体の同等物であると見なされうる。変種は、ゲノムまたはcDNAクローニング法を用いる組換え技法によって作製することができる。上記の技術のいずれかと共に用いられる蛋白質の配列決定、構造およびモデリングアプローチは、上記に引用される参考文献に開示される。本発明はまた、GDFのその受容体に対する特異的結合を遮断するGDF受容体結合作用物質を提供する。そのような作用物質は例えば、上記の筋消耗性障害の研究における研究および診断ツールとして有用であり、本明細書に開示の方法、例えば、分子モデリング法を用いて同定することができる。さらに、GDF受容体結合作用物質を含む薬学的組成物は、有効な治療物質となりうる。本発明の意味において、「GDF受容体結合作用物質」という句は、GDF受容体、例えばGDF-1〜GDF-16の天然に存在するリガンド、GDF受容体の合成リガンド、または天然もしくは合成リガンドの適当な誘導体を指す。 なおもう一つの態様において、本発明は、GDF受容体とGDFとの結合を妨害するGDF受容体結合作用物質に関する そのような結合作用物質は、競合的阻害、非競合的阻害、または不競合的阻害によって妨害することができる。GDF受容体と一つまたはそれ以上のGDFとの正常な結合の妨害によって、有用な薬理作用を得ることができる。本発明はまた、GDF受容体に結合する組成物を同定する方法を提供する。方法には、組成物を含む成分とGDF受容体とを、成分を特異的に相互作用させるために十分な条件でインキュベートする段階、およびGDF受容体に対する組成物の結合を測定する段階を含む。GDF受容体に結合する組成物には、上記のように、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリペプチド、化学化合物および生物作用物質が含まれる。インキュベートする段階には、試験組成物とGDF受容体との接触を可能にして、インビボで起こるような特異的相互作用に適した条件を提供する条件に反応物質を曝露する段階が含まれる。接触は、溶液または固相となりうる。試験リガンド/組成物は、選択的に、上記のように複数の組成物をスクリーニングするための組み合わせライブラリとなりうる。組成物が受容体蛋白質と機能的に複合体を形成することができるか否かを決定するために、外因性の遺伝子によってコードされる蛋白質の蛋白質レベルの変化をモニターすることによって、または本明細書に開示の他の方法によって、外因性遺伝子の誘導をモニターすることができる。外因性遺伝子の転写を誘導することができる組成物が同定されれば、この組成物は、最初の試料試験組成物をコードする核酸によってコードされる受容体蛋白質に特異的に結合することができると結論される。外因性の遺伝子の発現は、機能的アッセイ法または例えば蛋白質産物のアッセイ法によってモニターすることができる。したがって、外因性遺伝子は、外因性遺伝子の発現が検出されうるためにアッセイ可能な/測定可能な発現産物を提供する遺伝子である。そのような外因性の遺伝子には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、グアニンキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼのような抗生物質耐性遺伝子(上記参照)のようなレポーター遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。外因性の遺伝子の発現は、組成物とGDF受容体との特異的相互背用を示し;このように、組成物の結合または遮断を同定して単離することができる。本発明の組成物は、例えば、抽出、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過等を含む、一般的に用いられる既知の蛋白質精製技術を用いることによって、培養培地または細胞から抽出および精製することができる。組成物は、カラムマトリクスに結合した改変された受容体蛋白質細胞外ドメインを用いるアフィニティクロマトグラフィー、またはヘパリンクロマトグラフィーによって単離することができる。同様に、上記のようにGDF受容体に結合する化学化合物を同定する組み合わせ化学法も本発明のスクリーニング方法に含まれる。このように、スクリーニング法はまた、望ましければ、物理的(例えば、立体的)ではなく、機能的に拮抗剤または作用剤として作用する変種、結合もしくは遮断剤等を同定するためにも有用である。以下の実施例は本発明を説明するのであって、制限すると解釈されない。ミオスタチンは用量依存的に作用する。本実施例は、筋増殖の阻害におけるミオスタチンの活性がインビボでミオスタチン発現レベルに依存することを示す。ミオスタチン遺伝子の欠失に関してホモ接合であるミオスタチンノックアウトマウスは、全身体重の25〜30%増加を示した。ホモ接合ノックアウトマウスを調べると、筋重量の増加は、全身の骨格筋重量の約100〜200%増加が原因であることが判明した。ミオスタチン変異に関してヘテロ接合であるマウスも同様に全身体重が増加した。しかし、ヘテロ接合体の増加重量は、ホモ接合体の重量より小さく、調べた多数の中で一つの年齢と性別の群に有意差を認めたに過ぎなかった。ヘテロ接合マウスが野生型マウスとホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスとのあいだの中間の表現型を有するか否かを調べるために、筋重量の解析をヘテロ接合マウスにも行った。ヘテロ接合マウスから採取した個々の筋の重量は、野生型マウスより約25〜50%多かった。これらの結果は、ミオスタチン遺伝子の欠失に関してヘテロ接合であるマウスは、野生型とホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスの中間の表現型を有することを証明し、ミオスタチンがインビボで用量依存的な作用を生じることを証明している。これらの結果は、ミオスタチン活性の操作が、筋消耗性疾患およびミオスタチン活性に関連した他の代謝障害を治療するために有用となりうることを示している。さらに、ミオスタチンの用量依存的作用は、ミオスタチン活性の完全な阻害を得なくとも治療効果が得られ、それによって、例えば、特定のレベルの活性が被験者において望ましくない作用を生じる場合には、ミオスタチン活性の調節が可能となることを示している。ミオスタチンの作用はノックアウトマウスの年齢と共に減少する。本実施例は、野生型マウスとホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスのあいだの体重の差の減少が、変異体マウスの筋重量の減少に関連していることを証明する。しかし、総体重の差は、動物が年をとるにつれて、有意に小さくなるかまたは完全に消失した。この作用が、例えば筋の変性のために、または野生型マウスによる比較的大きい体重増加のために、ノックアウトマウスの体重が相対的に失われたことによるか否かを調べるために、筋重量の詳細な解析を年齢の関数として行った。2ヶ月から17ヶ月のあいだに調べた全ての年齢において、胸筋の重量は野生型同腹子よりホモ接合変異体マウスにおいて有意に重かった。最も劇的な差は、5ヶ月で認められ、その時点で胸筋の重量は変異体マウスにおいて約200%大きかった。胸筋の重量は月齢が高くなるとわずかに減少したが、変異体マウスにおけるこの筋の重量は野生型マウスの2倍以上のままであった。上腕三頭筋、四頭筋、ひ腹筋および足底筋、ならびに前脛骨筋を含む、調べた他の筋の全てにおいて同じ基礎的な傾向を認めた。類似の傾向を雄性および雌性マウスの双方において認めた。これらの結果は、加齢と共に認められた変異体と野生型マウスのあいだの総体重の差の減少が、変異体マウスにおける筋重量のわずかな減少によることを証明している。ミオスタチンは用量依存的に脂肪の蓄積に影響を及ぼす。本実施例は、ミオスタチンノックアウトマウスが脂肪を蓄積させることができないこと、および脂肪蓄積の減少がインビボでのミオスタチン発現レベルに関連していることを証明する。実施例2において示されたミオスタチン変異体における筋重量の減少は、野生型動物が最終的に変異体マウスと同じ体重になったという知見を十分には説明できないことから、野生型および変異体マウスにおける脂肪の蓄積量を調べた。雄性マウスの鼠径部、精巣上体、および後腹膜の脂肪体を調べた。2ヶ月齢では野生型および変異体マウスのあいだにこれらの脂肪体のいずれの重量にも差を認めなかった。5〜6ヶ月齢までに、野生型およびヘテロ接合ノックアウトマウスはいずれも広範囲の脂肪体重量を示し、平均すると、脂肪体重量は動物が9〜10ヶ月齢に達するまでに約3倍〜5倍増加した。 これらの動物において認められた広範囲の脂肪体重量のために、動物によっては、他よりかなり大きい増加を示した(10倍まで) 野生型およびヘテロ接合ノックアウトマウスとは対照的に、ミオスタチンホモ接合変異体マウスの脂肪体重量は、比較的狭い範囲に存在し、2ヶ月齢と9〜10ヶ月齢のマウスでは実質的に同じであった。このように、野生型マウスにおける加齢に伴って起こる脂肪蓄積の増加は、ホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスでは認められなかった。ホモ接合変異体マウスにおいて、年齢の関数として、脂肪蓄積にこのような差が認められたことは、筋重量のわずかな減少と共に、野生型マウスが最終的に変異体と同じ総体重となるという知見を十分に説明した。ヘテロ接合ノックアウトマウスの脂肪体重量の平均値は、9〜10ヶ月齢で野生型マウスとホモ接合変異体マウスの中間であった。この差は、これらおよび野生型マウスにおける脂肪体重量が広範囲であったために統計学的に有意ではなかったが、これらの結果は、それにもかかわらず、ミオスタチンが筋増殖に及ぼすその作用と同様に、脂肪の蓄積に対して用量依存的な作用を有することを示している。 代謝に及ぼすミオスタチンの影響 本実施例は、血清インスリンとグルコースレベルが代謝活性と共にミオスタチン発現レベルによって影響を受けることを証明する。ミオスタチン変異体マウスにおける骨格筋肥大と脂肪蓄積の欠損が、全身代謝に及ぼす作用によるか否かを決定するために、変異体マウスの代謝プロフィールを調べた。 血清トリグリセリドおよび血清コレステロールレベルは、野生型対照マウスと比較してミオスタチン変異体マウスでは有意に低かった(表1) 血清インスリンレベルはまた、ミオスタチン変異体マウスにおいて低いように思われた。しかし、食後および絶食時のグルコースレベルはいずれもホモ接合変異体マウスと野生型マウスにおいて区別できず(表1)、いずれの群のマウスも耐糖能試験において正常な反応を示した。結果は、ホモ接合ミオスタチンノックアウトマウスが、その血清インスリンレベルが野生型動物より低い場合であっても、血清グルコースの正常レベルを維持することができることを証明している。+/+は野生型マウスを示す;-/-はホモ接合ノックアウトマウスを示す。代謝速度の差が、変異体マウスにおける脂肪蓄積の欠如を説明することができるか否かを決定するために、野生型および変異体マウスの酸素消費速度を熱量計を用いて比較した。変異体マウスは、野生型対照マウスより低い基礎代謝速度および低い総代謝速度を示した。これらの結果は、ミオスタチン変異体マウスにおける脂肪蓄積の欠損が、代謝活性の速度がより速いためではないことを示している。ミオスタチンは遺伝的肥満マウスにおける脂肪蓄積に影響を及ぼす。本実施例は、ミオスタチン発現の欠如が、肥満の遺伝子モデルであるマウスにおいて脂肪の蓄積を抑制することを証明する。 ミオスタチン活性の喪失は、正常マウスのみならず肥満マウスにおいても脂肪の蓄積を抑制しうるか否かを決定するために、肥満の遺伝子モデルである(Yenら、FASEB J 致死黄色変異とミオスタチン変異とに関して二重にヘテロ接合であるマウスを作製して、これらの二重ヘテロ接合マウスの交配によって得られた子孫を調べた。全身体重のこのような減少は、Ay/aミオスタチン、-/-二重変異体が、Ay/aミオスタチン+/+マウスより約2〜3倍多い骨格筋を有することを考慮すると、さらにより劇的であった。二重変異体は、Ay/aミオスタチン+/+マウスより筋肉が約10 g多く、したがって、組織の残りにおける総重量の減少は約19 gであった。全身体重の減少は、全体的な脂肪含有量の減少が原因であった。表2に示すように、傍子宮および後腹膜脂肪体の重量は、Ay/aミオスタチン+/+マウスと比較すると、Ay/a、ミオスタチン-/-二重変異体では5倍〜6倍減少した。これらの結果は、ミオスタチン変異の存在が肥満における脂肪の蓄積を劇的に抑制することを示している。ミオスタチン変異の存在はまた、グルコース代謝に劇的な影響を及ぼした。ミオスタチン変異を欠損する野鼠致死マウスは、大いに異常な耐糖能試験結果を示し、血清グルコースレベルはしばしば450〜600 mg/dlに達し、4時間のあいだに基準値レベルにごくゆっくりと回復する。 雌性野鼠致死マウスは雄性マウスより影響を受けにくく、雌性マウスによっては、先に記述したようにこの試験においてほぼ通常に反応した(Yenら、上記、1994を参照のこと) 対照的に、Ay/aミオスタチン-/-マウスはわずかに異常な耐糖能試験を示したが、これらの動物のいずれもAy/aミオスタチン+/+マウスにおいて認められた肉眼的な異常を示さなかった。これらの結果は、ミオスタチン変異が少なくとも部分的に野鼠致死マウスにおいて異常な糖代謝の発達を抑制することを示している。重要なことは、ミオスタチン変異に関してヘテロ接合であるマウスは、ミオスタチン+/+およびミオスタチン-/-マウスと比較して中間の反応を示し、このようにミオスタチンの用量依存的な作用を確認した。 組換えミオスタチンの精製 本実施例は、組換えミオスタチンを調製および単離する方法を提供する。ミオスタチンの生物活性を解明するために、大量のミオスタチン蛋白質をバイオアッセイ法のために精製した。 高レベルのミオスタチン蛋白質を産生する安定なチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株は、メソトレキセート選択スキームを用いてジヒドロ葉酸レダクターゼカセットと共にミオスタチン発現カセットを同時増幅することによって作製した(McPherronら、上記、1997) ミオスタチンは、ヒドロキシアパタイト、レンチルレクチンセファロース、DEAEアガロース、ヘパリンセファロースでの連続分画によって、最も産生量の多い株の条件培地から精製した。銀染色解析によって、これらの四つのカラムクロマトグラフィー段階の後に得られた精製蛋白質(「ヘパリン溶出液」と呼ぶ)は、分子量およそ35キロダルトン(kDa)と12 kDaの二つの分子種からなることが判明した。精製蛋白質調製物は、二つのミオスタチンプロドメインペプチドと成熟C末端ミオスタチンペプチドのジスルフィド結合二量体との複合体を表すための様々な基準によって決定した。第一に、プロミオスタチン配列の特異的部分に対して作製された抗体を用いるウェスタンブロット解析によって、プロドメインとして35 kDaのバンド、および成熟C末端ペプチドとして12 kDaのバンドが同定された。第二に、非還元条件で、成熟C末端ペプチドに対して作製した抗体と反応する種は、ジスルフィド結合二量体と一致する電気泳動移動度を示した。第三に、プロドメイン対成熟C末端ペプチドのモル比は約1:1であった。第四に、プロドメインと成熟C末端ペプチドは、四つのカラムクロマトグラフィー段階を通して同時に精製された。最後に、C末端領域は、コンセンサスN結合グリコシル化シグナルを含まないが、成熟C末端ペプチドはレンチルレクチンカラムに結合し、このことは、成熟C末端ペプチドが、可能性があるN結合グリコシル化部位を含むプロドメインペプチドとのその相互作用によってカラムに結合したことを示している。これらの結果は、遺伝子改変CHO細胞によって産生されたミオスタチンが、蛋白質分解によって処理された形で分泌され、得られたプロドメインと成熟C末端領域とが非共有結合によって会合して、TGF-に関する記述と類似のように、二つのプロドメインペプチドとC末端蛋白質分解断片のジスルフィド結合二量体とを含む複合体を形成する。プロドメインと成熟C末端ペプチドの複合体からなるヘパリン溶出液は、HPLC C4逆相カラムを用いて精製した。C末端二量体は、プロドメインより速くHPLCカラムより早期に溶出し、このように、プロドメインを含まないC末端二量体を単離することができる。ほとんどプロドメインを含む画分も同様に得られたが、これらの画分は少量のC末端二量体を含んだ。蛋白質のいくつかは、高分子量複合体として存在した。高分子量複合体の特性は不明であるが、還元剤の存在下または非存在下でのウェスタンブロット解析に基づくと、これらの複合体は、少なくとも一つのプロドメインペプチドと一つまたはそれ以上のジスルフィド結合によって結合した一つのC末端成熟ミオスタチンペプチドとを含みうる。実際に、プロペプチド(HPLC画分35〜37)に関して濃縮したHPLC画分に存在する成熟C末端ペプチドのほとんどがこれらの高分子量複合体に存在した。これらの高分子量複合体はおそらく、遺伝子改変されたCHO細胞によって分泌された不適切に折り畳まれた蛋白質を表す。ミオスタチンはアクチビン受容体と特異的に相互作用する。本実施例は、ミオスタチンが培養細胞上で発現されたアクチビンII型受容体に特異的に結合すること、およびこの特異的結合がミオスタチンプロドメインによって阻害されることを証明する。GDF-11とミオスタチン(GDF-8)のアミノ酸配列は、成熟C末端領域において90%同一であることから、ミオスタチンがアクチビンII型受容体と特異的に相互作用するか否かを調べた。ミオスタチンは、放射性ヨウ素化によって標識し、Act RIIB発現構築物によってトランスフェクトしたCOS細胞を用いて結合試験を行った。ミオスタチンはトランスフェクトしたCOS細胞と特異的に相互作用した。ミオスタチン結合は、過剰量の非標識ミオスタチンによって用量依存的に競合され、空のベクターをトランスフェクトした対照COS細胞では有意に低かった。Act RIIBトランスフェクト細胞に対するミオスタチンの結合は飽和的であり、結合親和性はスキャッチャード解析によって決定すると約5nMであった。受容体結合アッセイ法をまた用いて、この系において、ミオスタチンプロドメインが、成熟C末端二量体のAct RIIBとの特異的相互作用能を阻害するか否かを調べた。精製プロドメインペプチドを加えると、Act RIIBトランスフェクトCOS細胞に対するC末端二量体の結合能は用量依存的に遮断された。これらの結果は、ミオスタチンプロドメインがミオスタチンの天然の阻害剤であることを示している。ミオスタチンレベルの増加は体重減少を誘導する。本実施例は、ミオスタチンレベルの上昇がインビボでの実質的な体重減少につながりうることを証明する。一組の実験において、ミオスタチンを発現するCHO細胞をヌードマウスに注入した。ミオスタチン発現CHO細胞腫瘍を有するヌードマウスは、細胞の注入後約12〜16日のあいだに重度の衰弱を示した。この消耗性症候群は、類似の選択プロセスを受けたがミオスタチンを発現しなかった多様な如何なる対照CHO株も注射したヌードマウスでは認められなかった。さらに、CHO細胞をトランスフェクトするために用いた構築物におけるミオスタチンコード配列は、メタロチオネインプロモーターの制御下であり、ミオスタチン発現腫瘍を有するマウスが硫酸亜鉛を含む水によって維持されている場合には、消耗性症候群は悪化した。ウェスタンブロット解析によって、ミオスタチン発現CHO細胞を有するヌードマウスの血清中にミオスタチン蛋白質が高レベルで存在することが明らかとなった。これらの結果は、消耗性症候群がヌードマウスにおいてミオスタチンレベルの上昇に反応して誘導されることを示しており、下記に示すように、この結果は、精製ミオスタチンを注射したマウスにおいて類似の作用を認めることによって確認された。ミオスタチン発現CHO細胞を有するヌードマウスにおいて認められた劇的な体重減少は、主に脂肪と筋重量の不均衡な喪失が原因であった。白色脂肪体の重量(嚢内の白色脂肪、子宮内脂肪、および後腹膜脂肪)は、対照CHO細胞腫瘍を有するマウスと比較して90%以上減少した。筋重量も同様に大きく減少し、個々の筋は16日までにミオスタチン発現マウスでは対照マウスの場合の約半分の重量となった。筋重量のこのような喪失は、繊維の大きさおよび蛋白質含有量がこれに対応して減少することによって反映された。ミオスタチン発現CHO細胞腫瘍を有するマウスはまた、低血糖となった。しかし、16日間の試験中に調べた各期間で全てのマウスが等量の試料を消費したために、体重減少と低血糖症は食物消費量の差によるものではなかった。これらの結果は、ミオスタチン過剰発現が、癌またはAIDSのような慢性疾患を有する患者において起こるカヘキシア消耗性症候群と類似の劇的な体重減少を誘導することを示している。低用量のミオスタチンを用いてより慢性的な投与を行うと、脂肪重量の変化を認めた。例えば、ミオスタチン蛋白質1gを1日2回7日間注射すると、異なる多くの白色脂肪体(嚢内白色、子宮内、および後腹膜脂肪体)の重量の約50%減少が起こったが、褐色脂肪(嚢内褐色)には有意な作用を認めなかった。これらの結果は、ミオスタチンが、インビボで体重減少と、極端な例では消耗性症候群を誘導しうることを確認する。 アクチビン受容体に対するミオスタチン結合の特徴付け 本実施例は、アクチビン受容体に対するミオスタチンの結合と、インビボでミオスタチンによって生じた生物作用との関係の特徴を調べる方法を記述する。これらのマウスの詳細な筋の解析を行えば、アクチビン受容体のノックアウトが筋繊維の数またはサイズの変化に関連するか否かを決定することができる。しかし、双方の遺伝子が筋組織に限って「欠失」され、それによって二重ホモ接合ノックアウトマウスを生後に検査することができる、組織特異的または条件的ノックアウトマウスを作製することができる。脂肪細胞の数またはこれらの脂肪細胞による脂質の蓄積がノックアウトマウスにおいて変化しているか否かを決定するために、脂肪組織に及ぼす作用をマウスの加齢に関して調べることができる。 脂肪細胞の数および大きさは、コラゲナーゼ処置組織から細胞浮遊液を調製することによって決定される(Rodbell、J 動物における総脂質含有量は、乾燥死体の重量と脂質抽出後の残留乾燥死体重量とを測定することによって決定される(Folchら、J 食後および絶食時グルコースおよびインスリン、トリグリセリド、コレステロールおよびレプチンを含む多様な血清パラメータも同様、調べることができる。上記のように、血清トリグリセリドおよび血清インスリンは、ミオスタチン変異体動物において減少している。アクチビン受容体ノックアウトマウスが外からのグルコース負荷に対して反応できるか否かは、耐糖能試験を用いて調べることができる。先に開示したように、グルコース負荷に対する反応は、5ヶ月齢で野生型マウスとミオスタチン変異体マウスにおいて同一であった。この知見は、マウスが年をとるにつれてマウスにおけるこれらのパラメータを測定することによって拡大することができる。血清中のインスリンレベルはまた、耐糖能試験のあいだの様々な時間に測定することができる。基礎代謝速度はまた、熱量計(コロンバスインストルメンツ社)を用いてモニターすることができる。先に開示したように、ミオスタチン変異体マウスは、3ヶ月齢でその野生型相対物より低い代謝速度を示す。この解析は、より年老いたマウスに拡大することができ、呼吸商も同様にこれらの動物において測定することができる。正常な熱発生を維持できるか否かは、4°Cに置いた場合に体温を維持できるか否かと共に、基礎体温を測定することによって決定することができる。体重の増加と比較した食物摂取量をモニターすることができ、飼料効率を計算することができる。さらに、高脂肪食を与えた動物の体重増加をモニターすることができる。高脂肪食によって維持した野生型マウスは急速に脂肪を蓄積するが、本明細書に開示した結果は、アクチビン受容体変異体動物が比較的痩身のままであることを示している。これらの研究の結果は、特に、その全体的な代謝速度に関するミオスタチンマウスの作用のより完全なプロフィールを提供して、それによってミオスタチンノックアウトマウスが脂肪の蓄積を抑制できることが、脂肪の形で保存するためにほとんどエネルギーが利用されないようにエネルギー利用がシフトする筋肉におけるミオスタチン変異の同化作用であるか否かに関する洞察を与える。例えば、脂肪蓄積の減少は、熱発生速度の増加が原因となりうる。 これらの結果は、肥満およびII型糖尿病の異なる遺伝子モデルの意味においてミオスタチン活性の効果を比較するための基準値を提供するであろう 肥満およびII型糖尿病の遺伝子モデルにおけるミオスタチンの作用の特徴付け 本実施例は、肥満またはII型糖尿病の治療におけるミオスタチンの作用を決定する方法を記述する。野生型マウスと比較してミオスタチン変異体マウスにおける総脂肪蓄積の劇的な減少は、ミオスタチン活性が肥満またはII型糖尿病を治療または予防するように操作することができる。ミオスタチン変異の作用は、例えば、「肥満」マウス(ob/ob)、「糖尿病」マウス(db/db)および野鼠致死黄色(Ay)変異体系統を含むこれらの代謝疾患に関するいくつかの十分に特徴付けのなされたマウスモデルの意味において調べることができる。ミオスタチン変異がこれらの他の変異を有するマウスにおいてこれらの異常の発症を遅らせるまたは抑制することができるか否かは、二重変異体を構築して、二重変異体動物に、ob/ob、db/db、または野鼠致死黄色変異のみを有する適当な対照同腹子と共に様々な試験を行うことによって調べることができる。先に開示したように、Ayマウスにおけるミオスタチン変異は、ミオスタチン変異体Ayマウスにおける脂肪蓄積の約5倍抑制、および耐糖能試験によって評価すると異常なグルコース代謝の発症の部分的抑制に関連した。これらの結果は、様々な年齢でのさらなる動物を含めるように拡大することができ、ob/obおよびdb/db変異体について類似の試験を行うことができる。これらの変異はいずれも劣性であるために、ミオスタチン変異とobまたはdb変異のいずれかに関して二重にホモ接合であるマウスを作製することができる。 これらの遺伝子モデル系におけるミオスタチン機能の部分的喪失の影響を調べるために、obまたはdb変異に関してホモ接合であるマウス、およびミオスタチン変異に関してヘテロ接合であるマウスも同様に調べる ミオスタチンおよびob変異に関して二重にヘテロ接合であるマウスは作製されており、これらの二重ヘテロ接合マウスの交配から得られた子孫を、特に脂肪蓄積とグルコース代謝に関して調べることができる。肥満変異体におけるこれらの異常のいずれかまたは双方の部分的抑制は、ミオスタチンが肥満およびII型糖尿病の治療の標的となることを示すことができる。 ミオスタチン活性に影響を及ぼしうるドミナントネガティブポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスの特徴付け 本実施例は、ミオスタチン発現またはミオスタチンシグナル伝達を阻害しうるドミナントネガティブポリペプチドを発現することによって生後にミオスタチンの作用の特徴を調べる方法を記述する。生後にミオスタチン活性を調節することを用いて、筋繊維数(過形成)および筋繊維の大きさ(肥大)に及ぼすミオスタチンの作用を調べることができる。ミオスタチン遺伝子が動物の一生の間で一定期間欠失している条件付ミオスタチンノックアウトマウスをこれらの試験に用いることができる。creレコンビナーゼと組み合わせたtet調節物質は、そのようなマウスを作製するためのシステムを提供する。この系において、creの発現は、ドキシサイクリンの投与によって誘導される。ミオスタチン活性が動物の一生の間の一定期間減少または阻害されうるように、誘導型プロモーターからミオスタチンの阻害剤を発現するトランスジェニックマウスも同様に作製することができる。テトラサイクリン調節物質は、ミオスタチン発現がドキシサイクリンによって誘導されているそのようなトランスジェニックマウスを作製するために有用である。 ハイブリッド逆tet-トランスアクチベータ(VP16の活性化ドメインと変異体逆tetリプレッサーとの融合蛋白質)とハイブリッドtet-トランスリプレッサー(哺乳類Kox1のKRABリプレッサードメインと本来のtetリプレッサーとの融合蛋白質)の同時発現を利用するtet系の改変は、トランスジェニックマウスを作製するために特に有用となりうる(Rossiら、Nat この系において、ハイブリッド逆tet-トランスアクチベータは、tetオペレータ配列に結合して、テトラサイクリンの存在下に限って転写を活性化する;ハイブリッドtet-トランスリプレッサーは、tetオペレータ配列に結合してテトラサイクリンの非存在下に限って転写を抑制する。これらの二つの融合蛋白質を同時発現させることによって、標的プロモーターの基礎活性は、テトラサイクリンの非存在下ではtet-トランスリプレッサーによって沈黙化し、テトラサイクリンを投与すると、逆tet-トランスアクチベータによって活性化される。二つのタイプのトランスジェニック系統を作製することができる。第一のタイプにおいて、導入遺伝子は、筋特異的プロモーター、例えば筋クレアチニンキナーゼプロモーター(Sternbergら、上記、1988)またはミオシン軽鎖エンハンサー/プロモーター(Donoghueら、上記、1991)の制御下でミオスタチン阻害剤ポリペプチドをコードする。個々のトランスジェニック系統を、骨格筋におけるtet調節物質の特異的発現に関してスクリーニングして、認められた如何なる作用も例えば組み込み部位特異的作用によるものではないことを確認するために、二つのプロモーターのそれぞれに関していくつかの独立した系統を選択して調べる。ミオシン軽鎖プロモーター/エンハンサーの制御下で二つのtet調節物質を含む構築物が構築されており、これを前核注入のために用いることができる。第二のタイプの系統において、導入遺伝子はさらにtetオペレータ配列を含む最小のCMVプロモーターの制御下でミオスタチン阻害剤ポリペプチドを含む。ミオスタチン阻害剤は、本明細書に開示のように、ミオスタチン活性を阻害しうるミオスタチンのドミナントネガティブ型またはミオスタチンプロドメインとなりうる。8:1448〜1462、1994)、これは例えば、変異体蛋白質分解切断部位を含み、それによって蛋白質が生物学的に活性な種に処理されないように防止する。内因性の野生型遺伝子を細胞において同時発現させると、変異体蛋白質は、野生型蛋白質と非機能的ヘテロダイマーを形成し、このように、ドミナントネガティブとして作用する。プロミオスタチン切断部位に変異を含む変異体ミオスタチンポリペプチドが構築されており、293細胞において様々な比で変異体を野生型ミオスタチンと共に同時発現させることによって、ドミナントネガティブ作用に関して調べることができる。構築物を一過的にトランスフェクトした293細胞からの条件培地をウェスタンブロット解析によって調べて、成熟C末端二量体の形成を変異体が遮断するか否かを調べることができる。ミオスタチンプロドメインのみをコードする発現構築物を利用することができる。先に開示したように、プロドメインは成熟C末端二量体と堅固な複合体を形成して、培養において受容体を発現する細胞において、成熟C末端ミオスタチン二量体のAct RIIBとの結合能を遮断する。TGF-と同様に、ミオスタチンプロドメインはまた、インビボで不活性な潜在的複合体において成熟C末端二量体を維持することができる。これらのトランスジェニック動物を、tet調節物質を発現する動物と交配させて、tet調節物質と阻害剤標的構築物の双方を含む二重トランスジェニック系統を作製することができる。これらの二重トランスジェニック系統を、異なる成分が全て適切に発現されている系統に関してスクリーニングすることができる。飲料水にドキシサイクリンを投与する前後での、それぞれの系統における代表的なマウスの様々な筋および対照組織から得たRNAを用いるノザンブロット解析を用いて、そのようなトランスジェニック系統を同定ことができる。ドキシサイクリンの非存在下では如何なる組織にも導入遺伝子も発現せず、ドキシサイクリンの存在下で筋肉に限って導入遺伝子を発現するトランスジェニック系統を選択する。選択したトランスジェニック動物にドキシサイクリンを投与して、筋重量に及ぼす作用を調べる。ドキシサイクリンは、胚形成のあいだに阻害剤の発現を誘導するために、妊娠した母親動物に投与することができる。トランスジェニック動物発達の際のミオスタチン活性を阻害する作用を、ミオスタチンノックアウトマウスにおいて認められた作用と比較することができる。tet調節物質の発現を駆動するためのプロモーターは、ミオスタチンが最初に発現される時期より発達の後期に誘導されうることから、トランスジェニックマウスにおける筋重量に及ぼす作用を、ミオスタチンノックアウトマスにおいて起こる作用と比較することができる。ミオスタチン活性を生後に阻害する作用は、出生後の様々な時間に二重トランスジェニックマウスにドキシサイクリンを投与することによって調べることができる。ドキシサイクリン処置は、例えば、3週齢で開始することができ、筋重量の差がミオスタチンノックアウトマウス対野生型マウスにおいて最高に達する月例である5ヶ月齢で、動物を解析することができる。動物は、筋重量に及ぼす阻害剤の作用に関して調べる。同様に、繊維の数および繊維の大きさに及ぼす作用を決定するために、筋肉を組織学的に調べることができる。さらに、トランスジェニックマウスにおける様々な筋の繊維型の解析を行って、I型またはII型繊維に対する選択的作用が存在するか否かを調べることができる。ドキシサイクリンは、ミオスタチン阻害剤の作用の特徴を調べるために、異なる用量で、かつ異なる時期に投与することができる。二重トランスジェニックマウスも同様に、ドキシサイクリンによって慢性的に維持することができ、その脂肪体重量および上記の他の関連する代謝パラメータに及ぼす作用を調べることができる。これらの研究の結果は、ミオスタチン活性を生後に調節すると、筋重量を増加させて、脂肪蓄積を減少させうることを確認し、このように、ミオスタチンのターゲティングが、臨床において多様な筋消耗および代謝疾患の治療にとって有用となりうることを示している。ミオスタチン導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスも同様に調べて、ミオスタチンの発現時に生じた作用を、ミオスタチン発現CHO細胞を含むヌードマウスにおいて認められた作用と比較することができる。上記と同様に、ミオスタチンは、条件(tet)および組織特異的調節エレメントの制御下に置くことができ、ヌードマウスにおいて認められたものと類似の消耗性症候群が起こるか否かを決定するために、トランスジェニックマウスにおけるミオスタチンの発現を調べることができる。ミオスタチン導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子が内因性のミオスタチン遺伝子と区別できるように、SV40に由来するプロセシングシグナルを含みうる。ドキシサイクリンの投与後様々な時間にミオスタチントランスジェニックマウスから血清試料を単離して、血清中のミオスタチン導入遺伝子産物のレベルを決定することができる。動物が有意な体重減少を示すか否かを決定するために、動物の全身体重を経時的にモニターする。さらに、個々の筋および脂肪体を単離および重量を測定して、筋繊維の数、大きさ、およびタイプを選択した筋試料において決定する。ミオスタチン導入遺伝子の発現レベルは、動物に投与したドキシサイクリンの用量を変化させることによって変化させることができる。導入遺伝子発現は、例えば、筋肉における導入遺伝子RNAレベルのノザンブロット解析または血清中のミオスタチン蛋白質レベルを用いてモニターすることができる。特定のレベルのミオスタチン導入遺伝子発現が同定されれば、ミオスタチンによって誘導される消耗の程度を相関させることが可能となる。トランスジェニック系統はまた、ミオスタチンノックアウトマウスと交配させて、ミオスタチンの唯一の起源が導入遺伝子からの発現であるマウスを作製することができる。発達の様々な時期でのミオスタチンの発現を調べて、繊維の数、繊維の大きさ、および繊維のタイプに及ぼすミオスタチンの作用を決定することができる。ミオスタチンの発現を正確かつ迅速に制御できるマウスが利用できれば、ミオスタチンシグナル伝達経路の特徴をさらに調べるための、かつミオスタチンシグナル伝達を調節するためにおそらく有用となりうる様々な作用物質の作用を調べるために強力なツールとなる。 ミオスタチンシグナル伝達のエフェクター 骨格筋において特異的に発現されるTGF-シグナル伝達経路の成分を含みうる、ミオスタチンシグナル伝達経路のいずれかのドミナントネガティブ型を含むトランスジェニックマウスを作製することができる。 本明細書において開示するように、アクチビンII型受容体によって誘導される経路を通してシグナル伝達を媒介するSmad蛋白質は、ミオスタチンシグナル伝達に関係しうる 本明細書に開示するように、ミオスタチンは、Act RIIBと特異的に相互作用して、したがって、インビボでアクチビンII型受容体に結合して、Smadシグナル伝達経路を活性化することによって、少なくとも部分的にその生物作用を発揮することができる。筋増殖の調節におけるSmadシグナル伝達経路の役割は、Act RIIB/Smadシグナル伝達経路における特定の点で遮断される、または遮断されうるトランスジェニックマウス系統を用いて調べることができる。筋クレアチニンキナーゼプロモーター、またはミオシン軽鎖エンハンサー/プロモーターを用いて、Smadシグナル伝達経路の様々な阻害剤の発現を促進することができる。アクチビンII型受容体のドミナントネガティブ型は、切断型GDF受容体を発現させることによって、例えば細胞外ドメイン、特にAct RIIB細胞外ドメインの可溶性型を発現させることによって、またはキナーゼドメインを欠損するもしくは変異体受容体がキナーゼ活性を欠損するような変異を含む切断型Act RIIB受容体を発現させることによって、得ることができる。Smad7は、アクチビン、TGF-、およびBMPによって誘導されるシグナル伝達経路を阻害することができる阻害性Smadとして機能する。トランスジェニックマウスを作製して、それぞれの創始動物系統において導入遺伝子が適切に筋特異的に発現されているか否かを調べることができる。選択したマウスを、全身体重、個々の筋重量、ならびに筋繊維の大きさ、数、およびタイプに関して調べる。筋重量に及ぼす明確な作用を示すそれらの系統を、脂肪蓄積および上記の他の関連する代謝パラメータに関してさらに調べることができる。アクチビン受容体/Smadシグナル伝達経路における特定の段階をターゲティングするためにこれらの異なる作用物質を用いることは、異なる作用物質のシグナル伝達が異なる段階で重なり合うために特に情報に富む。例えば、フォリスタチンは、アクチビンおよびGDF-11に結合してそれらの活性を阻害するが、TGF-には結合せず、ドミナントネガティブSmad3は、アクチビンとTGF-受容体の双方を通してのシグナル伝達を遮断することができる。Smad7は、BMP受容体を通してのシグナル伝達も阻害するために、さらにより多面発現性を有しうる。本研究によって、ミオスタチン活性を調節するための特異的標的を同定することができ、それによってミオスタチンシグナル伝達を調節する、したがってミオスタチン活性を調節する医薬品または他の作用物質を開発するための様々な戦略を提供することができる。特に、本明細書に記載のトランスジェニック系統を用いて、肥満またはII型糖尿病の発症に及ぼすミオスタチン機能またはSmadシグナル伝達経路を生後に遮断する影響を調べることができる。ドキシサイクリンの非存在下では、阻害性導入遺伝子は発現されず、したがって動物は親の変異体マウスのそれぞれと区別できない。ドキシサイクリンの非存在下では、阻害剤が発現されて、ミオスタチン活性を遮断することができる。これらの変異体動物において、代謝異常の発症に対するミオスタチン活性を阻害する影響を調べることができる。阻害剤の発現は、作用を最大限にするために、初期週齢、例えば3週齢で誘導することができる。さらに、ミオスタチン活性は、代謝異常が非可逆的になるほど重症となる前に遮断することができる。動物をドキシサイクリンによって維持して、脂肪の蓄積およびグルコース代謝に関連する試験を含む上記の試験を用いて、様々な週齢で評価することができる。一つまたはそれ以上の試験結果がob/ob、db/db、およびAy変異体動物において異常となる如何なる週齢の遅延も同定することができる。肥満またはII型糖尿病の何らかの兆候を示すより週齢の高い動物を用いて類似の研究を行うことができ、脂肪重量およびグルコース代謝を含む様々なパラメータに及ぼすミオスタチン活性阻害の影響を調べることができる。これらの試験の結果は、肥満またはII型糖尿病を予防または治療するための努力において操作することができる特異的標的をさらに同定することができる。 カヘキシアの誘導に及ぼすミオスタチン作用の特徴付け 本実施例は、カヘキシアの発症および進行におけるミオスタチンシグナル伝達の役割を調べる方法について記述する。 アクチビン受容体およびSmad経路は、正常な個体におけるミオスタチン活性の調節に関係するシグナル伝達経路の少なくとも一部を構成することができ、したがって、ミオスタチンの過剰レベルによって個体において起こりうる作用の媒介に関与しうる 本明細書において開示するように、例えば、カヘキシアは、少なくとも部分的に異常に高いレベルのミオスタチンによって媒介されうる。 そのため、Smad経路を通してシグナル伝達を操作する方法は、筋消耗全般および特にカヘキシアを治療する薬剤を開発するための新しい戦略を提供しうる IL-6およびTNF-の場合、阻害剤導入遺伝子をヌードマウスバックグラウンドにおいて交配させた後、IL-6またはTNF-を産生するCHO細胞を動物にチャレンジすることができ、これらがこのように過剰発現されるとヌードマウスにおいて消耗が誘導される。IL-6またはTNF-を過剰発現するCHO細胞は、ミオスタチン過剰産生細胞の作製に関して先に記述した方法を用いて調製することができる。263:3521〜3527、1988)、発現構築物の増幅されたコピーを有する細胞をメソトレキセートの増加濃度において段階的に選択することができる。これらの細胞株は、マウスにおいて腫瘍として増殖させると重度の衰弱を引き起こす。このように、これらの腫瘍の影響を本明細書に記載の様々なトランスジェニックマウスにおいて調べることができる。様々な腫瘍細胞が特定の遺伝的背景において増殖することが認識されている。このように、導入遺伝子をこれらまたは他の遺伝的バックグラウンドと戻し交配させると、腫瘍細胞の増殖が可能となる。全身体重、個々の筋重量、筋繊維の大きさおよび数、飼料摂取量ならびにグルコースレベルを含む血清パラメータを含む様々なパラメータをモニターすることができる。さらに、ミオスタチン発現の増加がカヘキシアに関連していることを確認するために、血清ミオスタチンレベルおよび筋肉におけるミオスタチンRNAレベルを調べることができる。これらの試験の結果から、ミオスタチンの作用が、これらの実験モデルにおいてカヘキシア誘導作用物質の下流に存在することを確認することができる。結果はまた、Smadシグナル伝達経路がこれらのモデルにおけるカヘキシア発症にとって必須であることを確認し、Smadシグナル伝達を調節することによってカヘキシアの治療において治療利益が選られうることを証明することができる。本実施例は、GDF-8(ミオスタチン)とGDF-11の細胞表面受容体を同定して特徴を調べる方法を記述する。精製GDF-8およびGDF-11蛋白質は主に、生物活性のアッセイ法のために用いられる。GDF-8およびGDF-11の作用に関して可能性がある標的細胞を同定するために、それらの受容体を発現する細胞を検索する。GDF-8およびGDF-11の成熟プロセシング型はそれぞれ多数のチロシン残基を含む。これらの蛋白質の受容体を同定するために異なる二つのアプローチが行われる。 一つのアプローチは、受容体の数、親和性、および分布を決定するであろう 培養において増殖させた全細胞、胚もしくは成体組織からの凍結切片、または組織もしくは培養細胞から調節した総膜調製物のいずれかを標識蛋白質と共にインキュベートして、結合した蛋白質の量または分布を決定する。 細胞株または膜を含む実験に関して、結合量は、数回洗浄後も培養皿上の細胞に結合した放射活性の量、または膜の場合には遠心後に膜に沈降している、もしくは膜と共にフィルター上に残っている放射活性の量を測定することによって決定されるであろう 細胞数がより限られている初代培養を含む実験では、結合部位は、写真乳剤をその上に重ねることによって直接可視化されるであろう 凍結切片を含む実験では、リガンド結合部位は、高解像度-マックスハイパーフィルムにこれらの切片を露出することによって可視化されるであろう;より詳しい位置が必要である場合は、切片を写真乳剤に浸す。 これらの全ての実験に関して、特異的結合は、競合物質として過剰量の非標的蛋白質を加えることによって決定されるであろう(例えば、LeeとNathans、上記、1988を参照のこと) 第二のアプローチは、受容体の特徴を生化学的に調べることであろう 膜調製物または可能性がある培養標的細胞を標識リガンドと共にインキュベートして、受容体/リガンド複合体を、TGF-スーパーファミリーのメンバーを含む多様なリガンドの受容体を同定するために一般的に用いられている(MassagueとLike、J クロスリンクした複合体をSDSポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離して、過剰量の非標識蛋白質の非存在下で標識されるが、存在下では標識されないバンドを調べる。 推定の受容体の分子量は、リガンドの分子量を差し引くことによって推定されるであろう これらの分子の受容体を検出する方法が得られれば、結合親和性および特異性を決定するためにより詳しい解析を行う。スキャッチャード解析を用いて、結合部位の数と解離定数を決定する。 GDF-8とGDF-11との交叉競合解析を行うことによって、それらが同じ受容体に結合できるか否かおよびその相対的親和性を決定することが可能となるであろう これらの試験は、同じまたは異なる受容体を通して分子がシグナルを伝達するか否かに関する示唆を与えるであろう 特異性を決定するために、他のTGF-ファミリーメンバーを用いる競合試験を行う。これらのリガンドのいくつかは市販されており、他のいくつかは、ジェネティクスインスチチュートインクから入手可能である。これらの実験に関して、多様な胚および成体組織ならびに細胞株を調べる。骨格筋におけるGDF-8の特異的発現およびGDF-8ノックアウトマウスの表現型に基づいて、最初の研究は、膜調製物および凍結切片を用いた受容体研究のために胚および成体筋組織に集中して行った。 培養における様々な日数後にこれらの初代細胞に対する結合試験を行って、オートラジオグラフィーによって結合部位の位置を特定すると、結合部位が筋ミオスタチンのような様々な筋原性マーカー(Vivarelliら、J 初代細胞を用いることの他に、受容体を調べるために細胞株を利用する。 受容体結合試験は、これらの細胞株において様々な増殖条件および様々な分化段階で行われるであろう 初回試験は筋細胞を中心に行うが、GDF-8およびGDF-11受容体の有無に関して他の組織および細胞タイプを調べる。非標識GDF-8が標識リガンドの結合を有効に競合したことから、結合は特異的であった。受容体結合試験によって、GDF-8およびGDF-11がL6筋芽細胞上で同じ結合蛋白質に結合することが判明した。GDF-8が既知のTGF-受容体に結合したか否かを決定することが重要である。GDF-8およびGDF-11の受容体をコードする遺伝子または複数の遺伝子を得ることができる。最初の段階は、GDF-8およびGDF-11がその生物作用を発揮する作用機序を理解することに向けられるが、その受容体をコードする遺伝子をクローニングすることが重要である。 上記の実験から、GDF-8およびGDF-11が同じ受容体または異なる受容体に結合するかはより明確であろう 同様に、これらの受容体の組織および細胞タイプ分布に関してかなりの情報が存在する。この情報を用いて、二つの異なるアプローチを用いて受容体遺伝子をクローニングする。 第一のアプローチは、発現クローニング戦略を用いることであろう 高親和性結合部位を最も高い相対数で発現する組織または細胞タイプからポリA-選択RNAを得て、これを用いて、CMVプロモーターとSV40複製開始点とを含む哺乳類の発現ベクターpcDNA-1においてcDNAライブラリを調製する。ライブラリを播種して、それぞれのプレートからの細胞をブロスにプールして凍結する。DNAを調製するために、それぞれのプールから少量を増殖させる。それぞれの個々のプールをチャンバースライドガラスにおいてCOS細胞に一過的にトランスフェクトして、トランスフェクトした細胞をヨウ素化GDF-8またはGDF-11と共にインキュベートする。未結合の蛋白質を洗浄して除去した後、リガンド結合部位をオートラジオグラフィーによって可視化する。陽性プールが同定されれば、そのプールからの細胞を低密度で再度播種して、プロセスを繰り返す。最初に、コロニー1,500個の大きさのプールをスクリーニングする。この複雑度の混合物において陽性クローンを確実に同定できるように、TGF-およびクローニングしたII型受容体とを用いる対照実験を行う。TGF-II型受容体のコード配列をpcDNA-1ベクターにクローニングして、この構築物によって形質転換した細菌を、われわれのライブラリからの細菌と、1:1500を含む様々な比で混合する。次に、この混合物から調製したDNAをCOS細胞にトランスフェクトして、ヨウ素化TGF-と共にインキュベートして、オートラジオグラフィーによって可視化する。陽性シグナルが1:1500の比で認められれば、クローン1500個のプールをスクリーニングする。そうでなければ、技法が対照実験において陽性シグナルを同定するために十分に感度がよい比に対応する、より小さい大きさのプールを用いる。これらの受容体の細胞質ドメインは配列が近縁であるために、縮重PCRプローブを用いてGDF-8およびGDF-11の結合部位を含む組織において発現されるこの受容体ファミリーのメンバーをクローニングする。実際に、これはこの受容体ファミリーのメンバーのほとんどを同定するために用いられているアプローチである。一般的戦略は、既知の受容体の保存領域に対応する縮重プライマーを設計して、これらのプライマーを、適当なRNA試料(骨格筋であることが多い)から調製したcDNA上でのPCRに用いること、PCR産物をサブクローニングすること、および最後に個々のサブクローンを配列決定することである。配列が同定されれば、それらを、さらなる解析から二個ずつのクローンを除去するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いる。次に、同定された受容体を精製GDF-8およびGDF-11との結合能に関して調べる。このスクリーニングは、少量のPCR産物を生じるに過ぎないため、適当な組織から調製したcDNAライブラリからのそれぞれの受容体について完全長のcDNAクローンを得て、これをpcDNA-1ベクターに挿入して、COS細胞にトランスフェクトして、トランスフェクトした細胞をヨウ素化GDF-8またはGDF-11の結合能に関してアッセイする。理想的には、このスクリーニングにおいて同定されたあらゆる受容体をこれらのリガンドの結合能に関して調べる。 しかし、同定された受容体の数は多く、完全長のcDNAの全てを単離してそれらを調べることはかなりの努力を必要としうる 同定される受容体のほぼ特定のいくつかは既知の受容体に反応するため、これらに関して、他の研究者からの完全長のcDNAクローンを得るか、または公表された配列に基づくPCRによってコード配列を増幅するほうが簡単であろう 新規配列に関しては、組織分布をノザンブロット解析によって決定して、その発現パターンが、先に決定したGDF-8および/またはGDF-11結合部位の分布に最も密接に類似する受容体に最も高い優先順位がつけられるであろう 特に、これらの受容体は二つのクラス、I型およびII型に分類され、これらは配列に基づいて区別することができ、いずれも完全な活性にとって必要であることが知られている。先に概要したクロスリンク実験は、I型およびII型受容体の双方がGDF-8およびGDF-11のシグナル伝達にも関係しているか否かに関して何らかの示唆を示すはずである。 もしそうであれば、GDF-8およびGDF-11がどのようにしてそのシグナルを伝達するかを完全に理解するために、これらの受容体サブタイプの双方をクローニングすることが重要であろう I型受容体がII型受容体の非存在下でGDF-8およびGDF-11と相互作用することができるか否かを予想することはできないために、(複数の)II型受容体をまずクローニングする。少なくとも一つのII型受容体がこれらのリガンドに関して同定された後に限って、GDF-8およびGDF-11のI型受容体を同定する試みを行う。 一般的な戦略は、PCRスクリーニングにおいて同定されたI型受容体のそれぞれをII型受容体と共に同時トランスフェクトして、その後クロスリンクによってトランスフェクトした細胞をアッセイすることであろう I型受容体がGDF-8またはGDF-11に関する受容体複合体の一部である場合、一つがI型受容体に対応し、もう一つがII型受容体に対応する二つのクロスリンクした受容体種が、トランスフェクトした細胞において検出されるはずである。GDNFは、TGF-スーパーファミリーの最も遠縁のメンバーであるが、他のTGF-ファミリーメンバーも同様に、類似の受容体系を通してシグナルを伝達することができる可能性は十分にある。GDF-8およびGDF-11が類似の受容体複合体を通してシグナル伝達を行えば、発現スクリーニングアプローチは、この複合体の少なくともGPI結合成分(実際、GDNFR-は発現スクリーニングアプローチを用いて同定された)を同定することができるはずである。 GDF-11ノックアウトマウスの作製と特徴付け いくつかの局面におけるGDF-11ノックアウトマウスの表現型は、アクチビンIIB型受容体(Act RIIB)を含むTGF-スーパーファミリーのいくつかのメンバーの受容体の欠失を有するマウスの表現型に類似する。GDF-11の生物機能を決定するために、GDF-11遺伝子を胚性幹細胞において相同的ターゲティングによって破壊した。マウス129 SvJゲノムライブラリを、ストラタジーン社(ラホヤ、カリフォルニア州)によって提供された説明書に従ってラムダFIXIIにおいて調製した。GDF-11遺伝子の構造は、制限マッピングおよびライブラリから単離されたファージクローンの部分的配列決定によって推定した。得られたマウスがGDF-11機能に関して無効であることを確認するために、完全な成熟C末端領域を欠失させて、neoカセットに置換した。GDF-11遺伝子の相同的ターゲティングは、ガンシクロビル/G418二重耐性ES細胞クローン155例中8例において認められた。いくつかのターゲティングクローンをC57BL/6J胚盤胞に注入した後、C57BL/6Jおよび129/SvJ雌性動物の双方と交配させた場合にヘテロ接合の子を生じる一つのESクローンからキメラを得た。ホモ接合変異体が何週齢で死ぬかを決定するために、ヘテロ接合の雄性動物と交配させたヘテロ接合雌性動物から様々な妊娠齢で単離した胚の同腹子の遺伝子型を調べた。調べた全ての胚段階において、ホモ接合変異体の胚はほぼ予測頻度25%で存在した。ホモ接合変異体マウスは生存して生まれ、呼吸して哺乳することができた。しかし、ホモ接合変異体は全て出生後24時間以内に死亡した。正確な死因は不明であるが、致死はホモ接合変異体の腎臓が重度の形成不全であるかまたは全く存在しなかったという事実に関連する可能性がある。ホモ接合変異体動物は、尾が極端に短いかまたはないことから容易に区別できた。これらのホモ接合変異体動物における尾の欠損の特徴をさらに調べるために、その骨格を調べて尾椎骨の破壊の程度を決定した。しかし、後期胚および新生児マウスの野生型と変異体骨格調製物とを比較したところ、動物の尾の領域のみならず、他の多くの領域においても差があることが判明した。差が認められたほぼあらゆる症例において、異常は、特定の体節がより前方の体節の典型である形態を示すように思われる脊椎体節のホメオティック変形を表すように思われた。これらの変形は、頚部領域から尾部領域に及ぶ軸骨格全体において明白であった。軸骨格において認められた欠損を除き、尾骨および脚骨のような骨格の残りは正常であるように思われた。変異体新生児動物における脊椎骨の前方変形は胸部領域では最も容易に明らかであり、ここでは胸部(T)体節の数が劇的に増加した。調べた野生型マウスは全て、その関連する肋骨の対それぞれについて胸椎13個の典型的なパターンを示した。対照的にホモ接合変異体マウスは、胸椎の数の顕著な増加を示した。調べたホモ接合変異体は全て肋骨対が4〜5個余分に存在し、全体で17〜18個となったが、これらの動物の3分の1以上において、第18肋骨が発育不全であるように思われた。したがって、腰椎(L)体節L1〜L4またはL5に通常対応する体節は、変異体動物の胸部体節において変形しているように思われた。その上、一つの胸椎がもう一つの胸椎の特徴である形態を有する胸部領域内の変形もまた明らかであった。例えば、野生型マウスにおいて、最初の肋骨7対は胸骨に結合し、残りの6対は結合していないかまたは遊離である。ホモ接合変異体では、結合および遊離の肋骨対の数の増加を認め、それぞれ10〜11および7〜8となった。したがって、胸部体節T8、T9、T10および場合によっては野生型動物において全て遊離の肋骨を有するT11でさえも、変異体動物では、より前方の胸部体節の典型である特徴、すなわち胸骨に結合した肋骨の存在を有するように変形した。この知見と一致して、野生型動物のT10において通常認められる移行性の棘状の突起および移行性の関節状の突起は、ホモ接合変異体ではそのかわりにT13に認められた。胸部領域内でのさらなる変化も同様に特定の変異体動物において認めた。例えば、野生型動物では、T1に由来する肋骨は通常、胸骨の上端に触れている。しかし、ハイブリッド23例中2例および129/SvJホモ接合変異体マウス3例中2例では、T2はT1の形態と類似の形態を有するように変形しているように思われた;すなわちこれらの動物において、T2に由来する肋骨は、胸骨の上端に触れるように伸張した。これらの症例において、T1に由来する肋骨は、第二の対の肋骨に融合するように思われた。最後に、ホモ接合変異体82%において、T2に通常存在する長い棘状の突起がT3の位置にシフトした。特定の他のホモ接合変異体では、脊椎胸骨肋骨対の非対称の融合を他の胸椎レベルで認めた。前方変形は胸部領域に限ったことではなかった。われわれが認めた最も前方への変形は、第6頚椎レベル(C6)であった。野生型マウスにおいて、C6は、腹側に二つの前結節が存在することによって容易に同定できる。いくつかのホモ接合変異体マウスでは、これらの二つの前結節の一つはC6に存在したが、もう一方はその代わりにC7位に存在した。したがって、これらのマウスでは、C7はC6と類似の形態を有するように部分的に変形しているように思われた。他の一つのホモ接合変異体は、C7では前結節が2個あるが、完全なC7からC6への変化の場合にはC6上に1個であり、部分的なC6からC5の変化では存在しなかった。軸骨格の変形も同様に、腰の領域にも伸張した。野生型動物は通常、腰椎6個のみを有するが、ホモ接合変異体は8〜9個を有した。変異体における腰椎少なくとも6個は、4〜5腰椎体節が胸部体節に変形していることを上記のデータが示唆しているために、仙椎と尾椎を通常生じる体節に由来するに違いない。したがって、ホモ接合変異体マウスは、野生型マウスに通常存在する仙骨前椎26個と比較すると、全体で仙骨前椎33〜34個を有した。変異体動物にさらに仙骨前椎が存在することは、前肢と比較して後肢の位置が7〜8体節後方にずれているために、骨格の詳細な試験がなくとも明白であった。仙椎および尾椎はホモ接合変異体マウスにおいて影響を受けたが、それぞれの形質転換の正確な特性は容易に同定可能ではなかった。野生型マウスにおいて、仙骨体節S1およびS2は典型的に、S3およびS4と比較して広い横突起を有する。変異体では、同定可能なS1またはS2脊椎は存在しないように思われた。その代わりに、変異体動物は、S3と類似の形態を有するように思われるいくつかの椎骨を有した。さらに、四つ全ての仙椎の横突起は通常、互いに融合しているが、新生児ではしばしば最初の三つの椎骨の融合のみを認める。しかし、ホモ接合変異体では、仙椎の横突起はたいてい融合していなかった。最尾部の領域では、全ての変異体動物は、軟骨の広範囲の融合を伴う重度の変形脊椎を有した。融合が重度であるために、尾部領域における椎骨の総数を計数することは難しかったが、いくつかの動物において15個までの横突起を計数した。野生型新生児動物においてもS4を尾椎と区別する形態学的基準が確立されていないために、これらが変異体における仙椎または尾椎を表すか否かは決定できなかった。それらが何であるかによらず、この領域における椎骨の総数は通常の約30という数から有意に減少していた。したがって、変異体は、野生型マウスより有意に多くの胸椎および腰椎を有したが、体節の総数は尾が切断されているために変異体では減少していた。ヘテロ接合マウスはまた、軸骨格に異常を示したが、表現型はホモ接合マウスよりかなり軽度であった。ヘテロ接合マウスにおける最も明白な異常は、会合する肋骨椎を有するさらなる胸部体節の存在であった。この変形は、調べたあらゆるヘテロ接合動物に存在し、あらゆる場合において、さらなる肋骨対が胸骨に結合していた。したがって、会合する肋骨が通常胸骨に触れていないT8は、より前方の胸椎の特徴である形態に変形しているように思われ、L1は後部胸椎の特徴である形態に変形しているように思われた。前方変化を示す他の異常も同様に、ヘテロ接合マウスにおいて多様な程度に認められた。これらには、T2の特徴である長い棘状の突起のT3への一体節シフト、関節状および棘状突起のT10からT11へのシフト、前結節のC6からC7へのシフト、およびT2に会合する肋骨が胸骨の上端に触れるT2からT1への変形が含まれた。GDF-11変異体マウスにおいて認められた軸パターン形成における異常の基礎を理解するために、様々な発達段階で単離した変異体の胚を調べ、野生型の胚と比較した。 肉眼的な形態の観察によって、妊娠9 5日までに単離したホモ接合変異体胚は、対応する野生型胚と容易に区別できなかった。特に、所定の発達週齢で存在する体節数は、変異体と野生型の胚で同一であり、体節形成速度は変異体において変化していないことを示唆した。変異体の胚は、後肢が7〜8体節後方にずれることによって野生型胚と容易に区別することができた。尾の発達の異常も同様に、この段階で容易に明らかであった。併せて考慮すると、これらのデータは、変異体の骨格において認められた異常が、例えば、体節形成速度の増強によって、さらなる体節が挿入されるよりむしろ体節そのものが真に変形していることを表すことを示唆した。ホメオボックス含有遺伝子の発現が変化すれば、ショウジョウバエおよび脊椎動物において変形を引き起こすことが知られている。野生型、ヘテロ接合およびホモ接合変異体胚において全組織インサイチューハイブリダイゼーションによって決定した。類似のシフトをHoxc-8プローブについて認めた。最後に、Hoxc-11発現も同様に、発現の前方境界が野生型の胚における前椎骨28から変異体胚における前椎骨36へとシフトしたという点において同様に後方にシフトした。 (変異体胚では後肢の位置も同様に後方にシフトしたために、野生型および変異体におけるHoxc-11発現パターンは後肢と比較して類似であるように思われた) これらのデータは変異体動物において認められた骨格の異常がホメオティック変形を表すさらなる証拠を提供する。GDF-11マウスの表現型は、GDF-11が、軸パターン形成の全体的な調節物質として胚形成の初期に作用することを示唆した。GDF-11がその作用を発揮するメカニズムを調べ始めるために、初期マウス胚におけるGDF-11の発現パターンを、全組織インサイチューハイブリダイゼーションによって調べた。これらの段階において、GDF-11発現の主な部位は、内胚葉細胞が産生される既知の部位と正確に相関した。(8〜10体節)で最初に検出されたが、これは移入細胞が発達しつつある胚の中胚葉を形成する部位である。 では原条において維持されたが、尾芽が新規中胚葉細胞源として原条を置換して、GDF-11の発現が尾芽にシフトする9 では維持されなかった。したがって、これらの初期段階において、GDF-11は、新しい中胚葉細胞が発生して、おそらくその位置同一性を獲得する発達途中の胚の領域において合成されるように思われる。いくつかの局面におけるGDF-11ノックアウトマウスの表現型は、TGF-スーパーファミリーのいくつかのメンバーの受容体、アクチビンIIB型受容体(Act RIIB)の欠失を有するマウスの表現型に類似した。GDF-11ノックアウトマウスの場合と同様に、Act RIIBノックアウトマウスは余分の肋骨対を有し、腎欠陥スペクトルは、腎形成不全から腎臓が全く存在しないことまで及んだ。これらのマウスにおける表現型が類似していることは、Act RIIBがGDF-11の受容体となりうる可能性を生じる。例えば、GDF-11ノックアウト動物は、4〜5個の余分の肋骨対を有し、軸骨格全体を通してホメオティック変形を示すのに対し、Act RIIBノックアウト動物は、余分の肋骨対を3個有するに過ぎず、他の軸レベルで変形を示さない。さらに、データは、GDF-11ノックアウトマウスにおける腎欠陥がAct RIIBノックアウトマウスより重度であることを示している。Act RIIBノックアウトマウスは、肺の異性のような左右軸形成の欠陥およびGDF-11ノックアウトマウスでは認められなかった一連の心欠陥を示す。Act RIIBは、アクチビンおよび特定のBMPsに結合することができるが、これらのリガンドに関して作製されたノックアウトマウスのいずれも左右軸形成の欠陥を示さなかった。 GDF-11が中胚葉細胞に直接作用して位置同一性を確立するのであれば、本明細書に示したデータは、GDF-11作用の短期またはモルフォゲンモデルと一致するであろう すなわち、GDF-11は、これらの細胞がGDF-11発現部位で産生されることから、中胚葉前駆体に作用してHox遺伝子の発現パターンを確立することができる、または胚の後方末端で産生されたGDF-11が拡散してモルフォゲン勾配を形成することができる。GDF-11の作用のメカニズムがどのようなものであれ、全体的な前方/後方パターン形成がGDF-11ノックアウト動物において起こるという事実は、GDF-11が前/後特定化の唯一の調節物質ではないことを示唆している。それにもかかわらず、GDF-11が軸パターン形成の全体的な調節物質として重要な役割を有すること、およびこの分子に関するさらなる研究によって、前/後軸に沿って位置同一性が脊椎動物胚においてどのように確立されるかに関する重要な新しい洞察が得られることは明白である。類似の表現型がGDF-8ノックアウト動物において予想される。例えば、GDF-8ノックアウト動物は、野生型と比較した場合に多数の肋骨、腎欠陥および解剖学的差を有することが予想される。 ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチンまたはドミナントネガティブACT RIIBを発現するトランスジェニックマウスの作製 ミオスタチンの精製 ミオスタチン発現構築物の増幅コピーを有するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株に、前駆体蛋白質のプロセシングを改善するために、フリンプロテアーゼPACEの発現構築物(Monique Davies氏の好意による提供)をトランスフェクトした。 ヘパリンカラムからの溶出液を逆相C4 HPLCカラムに結合させて、0 1%トリフルオロ酢酸中でアセトニトリル勾配によって溶出した。 成熟C-末端蛋白質に対する抗体は既に記述されている(参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,827,733号を参照のこと) プロペプチドに対する抗体を作製するために、アミノ酸122〜261位に及ぶヒトミオスタチン蛋白質の一部をRSETベクター(インビトロジェン社、サンジエゴ、カリフォルニア州)を用いて細菌に発現させ、ニッケルキレートクロマトグラフィーによって精製して、ウサギに注射した。免疫は、スプリングバレー研究所(ウッドバイン、メリーランド州)が行った。 受容体の結合 6または12ウェルプレートにおいて増殖させたCOS-7細胞に、リポフェクタミン(ギブコ社、ロックビル、メリーランド州)を用いて、pCMV5またはpCMV5/受容体構築物1〜2gをトランスフェクトした。 クロスリンク実験は、記述のようにトランスフェクションの2日後に行った(Franzen, P 定量的受容体結合アッセイ法を行うために、細胞単層を、1 mg/ml BSAを含むPBSによって2回洗浄して、様々な濃度の非標識ミオスタチン、プロペプチド、またはフォリスタチンの存在下または非存在下で、4°Cで標識ミオスタチンと共にインキュベートした。 次に、細胞を同じ緩衝液によって3回洗浄して、0 5 N NaOH中で溶解し、カウンターにおいて計数した、特異的結合は、Act RIIBをトランスフェクトした細胞と、ベクターをトランスフェクトした細胞との結合ミオスタチンの差として計算した。特異的結合を計算するこの方法は、プロペプチドを加えても同様に非特異的結合が濃度依存的に減少することから、プロペプチドの影響を評価するために特に重要であった。ミオシン軽鎖調節配列とSV40プロセシング部位とを含む精製導入遺伝子をマイクロインジェクションのために用いた。ハイブリッドSJL/C57BL/6バックグラウンドのトランスジェニック創始動物を野生型C57BL/6マウスと交配させて、研究は全てF1子孫を用いて行った。筋重量の分析に関して、個々の筋肉をほぼ全ての動物の両側から切除して、左右の筋重量の平均値を用いた。 ミオスタチン蛋白質を過剰産生させるために、ミオスタチン発現構築物の増幅コピーを有するCHO細胞株を作製した(McPherron, A ミオスタチンは、ヒドロキシアパタイト、レンチルレクチンセファロース、DEAEアガロース、およびヘパリンセファロース上での連続分画によってこの細胞株の条件培地から精製した。 精製蛋白質調製物の銀染色分析から、29 kdおよび12 5 kdの二つの蛋白質種が存在することが判明した。多様なデータによって、この精製蛋白質がジスルフィド結合C-末端二量体に結合した二つのプロペプチド分子の非共有結合複合体からなることが示唆された。5 kd種はそれぞれ、プロペプチドおよびC-末端成熟領域に及ぶミオスタチンの細菌発現断片に対して作製された抗体と免疫反応性であった。第二に、還元剤の非存在下で、C-末端領域は、二量体と一致する電気泳動移動度を有した。第三に、二つの種は、モル比約1:1で存在した。また、第四に、C-末端二量体は、レクチンカラム上に保持され、蛋白質のこの部分が、可能性があるN-結合グリコシル化部位を含まなくともメチルマンノースによって溶出することができ;これらのデータを最も単純に解釈すると、C-末端領域が、グリコシル化シグナルを真に有するプロペプチドとの堅固な複合体に存在することによって間接的にレクチンに結合したことになる。C-末端二量体は、他のTGF-ファミリーメンバーに関して生物活性分子であることが知られているため、ミオスタチンのC-末端二量体を、逆相HPLCによってそのプロペプチドから精製した。精製C-末端二量体(32〜34位)を含む画分は、均一であるように思われた。しかし、プロペプチド(35〜37)に関して最も濃縮された画分には、少量のC-末端二量体と、誤って折りたたまれた蛋白質を表す可能性が最も高い高分子量複合体とが混入していた。 TGF-スーパーファミリーのほとんどのメンバーは、セリン/トレオニンキナーゼ受容体に結合した後Smad蛋白質の活性化を引き起こしてシグナルを伝達することが示されている(Heldin, C シグナル伝達経路の誘因となるこの初回事象は、II型受容体に対するリガンドの結合である。ミオスタチンが関連するリガンドの既知の如何なるタイプのII型受容体にも結合することができるか否かを決定するために、TGF-、BMP、またはアクチビンII型受容体のいずれかの発現構築物をトランスフェクトしたCOS-7細胞において、放射性ヨウ素標識ミオスタチンC-末端二量体についてクロスリンク試験を行った。予想される大きさ(ミオスタチンに結合した完全長の受容体)のクロスリンク複合体が、Act RIIAまたはAct RIIBのいずれかを発現する細胞に関して検出された。クロスリンクおよび標準的な受容体結合アッセイ法の双方において、Act RIIBに対する結合はAct RIIAより高いレベルで認められ、したがって、受容体結合試験はAct RIIBに集中して行った。Act RIIBに対するミオスタチンの結合は特異的(結合は、過剰量の非標識ミオスタチンによって競合されうる)かつ飽和性であり、ミオスタチン蛋白質の全てが生物活性であると仮定して、本発明者らはスキャッチャード分析による解離定数が約10 nMであると推定した。TGF-の場合、II型受容体に対する親和性は適当なI型受容体の存在下で有意に高いこと、および他の分子がリガンドの受容体への提示に関与していることがわかっている。アクチビンII型受容体が、インビボでミオスタチンのシグナル伝達に関与する可能性があるか否かを決定するために、マウスにおいてAct RIIBのドミナントネガティブ型を発現する影響を調べた。この目的のため、本発明者らは、キナーゼドメインを欠損するAct RIIBの切断型が、骨格筋特異的ミオシン軽鎖プロモーター/エンハンサーの下流に配置されている構築物を作製した。この構築物の前核注入によって、導入遺伝子に関して陽性の創始動物が全体で7例同定された。 7ヶ月齢でこれらの創始動物の分析を行ったところ、7例全てが骨格筋重量の有意な増加を示し、これらの創始動物の個々の筋重量は、類似の注射を行った対照の非トランスジェニック動物の筋重量と比較して125%まで増加した(表2) 3系列の証拠から、これらの創始動物における筋重量の増加が、導入遺伝子の発現に起因することが示唆された。 第一に、創始動物3例(他の創始動物4例は、分析のために十分な数の子孫を生じなかった)と野生型C57BL/6マウスとの交配から得られた子孫の分析は、筋重量の増加が導入遺伝子の存在と相関することを示した(表3) 第二に、筋重量は異なるトランスジェニック系統において変化したが、増加の程度は、如何なる所定の系統の動物においても調べた全ての筋について、および雄性および雌性双方についても非常に一貫していた(表3) 第三に、トランスジェニック動物から調製したRNA試料のノザン分析から、導入遺伝子の発現が骨格筋に限定されること、および導入遺伝子発現の相対レベルが、筋重量の相対的な増加程度と相関することが示された(表3) 例えば、筋重量の最大の増加を示したC11系統の動物は、導入遺伝子発現に関しても最高レベルを示した。これらのデータは、Act RIIBのドミナントネガティブ型の発現が、ミオスタチンノックアウトマウスにおいて認められた場合と類似の筋重量の増加を引き起こしうることを示した。ミオスタチンノックアウトマウスにおいて、筋重量の増加は、線維数および線維の大きさの増加に起因することが示されている。ドミナントネガティブAct RIIBの発現が同様に過形成および過栄養の双方を引き起こすか否かを決定するために、C27系統の動物のひ腹筋と足底筋の切片を分析した。対照筋と比較すると、C27動物の筋肉は断面領域全体において明確な増加を示した。領域におけるこの増加は、部分的に線維数の増加に起因した。しかし、筋線維の過栄養も同様に、面積全体の増加に関与した。線維の直径の平均値は、C27系統の動物では51 mであったのに対し、対照動物では43mであった。 したがって、筋重量の増加は、線維の数の約27%増加および線維の直径の約19%増加に起因するように思われた(線維がほぼ円柱形であると仮定すると、直径のこの増加によって、断面積が約40%増加する) しかし、線維の数および大きさの増加を除くと、トランスジェニック動物からの筋肉は、肉眼的に見て正常であるように思われた。特に、広く多様な線維の大きさ(線維の大きさの標準偏差は対照動物とトランスジェニック動物のあいだで類似であった)もしくは広汎な線維症、または脂肪の浸潤のような変性に関する明白な兆候を認めなかった。これらのアプローチを用いて、ミオスタチンの阻害に関して他に可能性がある戦略を探求した。第一に、本発明者らはミオスタチンプロペプチドの影響を調べた。 TGF-の場合、C-末端二量体はそのプロペプチドを含む他の蛋白質との不活性な潜在型の複合体として保持されていること、およびTGF-のプロペプチドはインビトロおよびインビボの双方でTGF-活性に阻害作用を有することが知られている(Miyazono, K ミオスタチンC-末端二量体とプロペプチドとが同時精製されたという知見は、ミオスタチンが類似の潜在型複合体に通常存在する可能性を示し、ミオスタチンプロペプチドが阻害活性を有する可能性があることを示した。第二に、本発明者らは、いくつかのTGF-ファミリーメンバーに結合してその活性を阻害することができることが示されているフォリスタチンの作用を調べた。 特に、フォリスタチンは、ミオスタチンに非常に近縁であるGDF-11の活性を遮断することができ、フォリスタチンノックアウトマウスは、出生時の筋重量が減少していることが示されており、これはミオスタチンの過剰活性と一致するであろう(Gamer, L インビトロでプロペプチドとフォリスタチンの作用を調べた。ミオスタチンプロペプチドとフォリスタチンはいずれも、Act RIIBに対するC-末端二量体の結合を阻害することができた。フォリスタチンのKiは、約470 pMであると推定され、プロペプチドのKiは少なくとも50倍高いと推定された。しかし、プロペプチドのKiの計算は、最終調製物中の全ての蛋白質が生物活性プロペプチドを表すと仮定しており、したがって、過大推定値である可能性がある。先に考察したように、プロペプチド調製物には、少量のC-末端二量体と、誤って折りたたまれた高分子量種の双方が混入していた。これらの分子が同様に、インビボでミオスタチン活性を遮断することができるか否かを決定するために、ミオスタチン軽鎖プロモーター/エンハンサーを用いてミオスタチンプロペプチドまたはフォリスタチンのいずれかを発現させたトランスジェニックマウスを作製した。プロペプチド構築物の前核注入によって、筋重量の増加を示すトランスジェニックマウス3系統(これらのうち2系統、B32AおよびB32Bは最初の創始動物1例において独立して分離する導入遺伝子挿入部位を表した)が同定された。表3に示すように、それぞれの系統の動物の筋重量は、非トランスジェニック対照動物と比較して約20〜110%増加した。これらの系統のそれぞれの代表的な動物から調製したRNA試料のノザン分析から、導入遺伝子の発現レベルが筋重量の増加の程度と相関することが示された。特に、筋重量の約20〜40%増加を示したに過ぎないB32A系統の動物は、導入遺伝子発現レベルが最低であり、B32BおよびB53系統の動物は筋重量の約70〜110%の増加を示し、最高レベルの導入遺伝子発現を示した。 おそらく重要なことは、B32AとB32B挿入部位の二重トランスジェニックである動物における筋重量は、二重トランスジェニック動物は導入遺伝子発現レベルがより高いように思われるという事実にもかかわらず、B32B挿入部位のみのトランスジェニック動物において認められた筋重量と類似であった(表3) これらの知見は、B32B系統(およびB53系統)において認められた作用が、プロペプチドの過剰発現から得ることができる最大値であったことを示唆している。Act RIIBのドミナントネガティブ型を発現する動物の場合におけるように、プロペプチドを発現する動物は、筋線維の数および大きさの双方の増加を示した。B32AとB32B挿入部位とに関して二重トランスジェニックである動物2例からのひ腹筋および足底筋の分析を行ったところ、線維の数が約40%増加したこと(動物2例の線維は11940個および10420個であった)、および線維の直径が対照動物と比較して約21%(52mまで)増加したことが示された。骨格筋に及ぼす最も劇的な作用は、フォリスタチン構築物を用いて得られた。本発明者らは、ハイブリッドSJL/C57BL/6バックグラウンドのミオスタチンノックアウトマウスの筋重量を分析しなかったが、F3創始動物において認められた筋重量の増加は、他の遺伝的バックグラウンドのミオスタチンヌル動物において認められた増加より有意に大きかった。これらの結果は、フォリスタチンの作用の少なくとも一部は、ミオスタチンの他にもう一つのリガンドの阻害に起因する可能性があることを示唆している。明らかに、さらなるフォリスタチントランスジェニック系統の分析は、他のリガンドも同様に筋増殖の負の調節に関与する可能性があるか否かを決定するために必須であると考えられる。蛋白質分解プロセシングの後、ミオスタチンC-末端二量体は、そのプロペプチド、およびおそらく同様に他の蛋白質との潜在的複合体において維持される可能性がある。ミオスタチンはまた、C-末端二量体に結合して、その受容体結合能を阻害するフォリスタチンによって負の調節を受ける。未知のメカニズムによるこれらの阻害蛋白質からのC-末端二量体の放出によって、ミオスタチンはアクチビンII型受容体に結合することができる。他のファミリーメンバーとの類推によって、本発明者らは、これらの受容体の活性化によってI型受容体およびSmad蛋白質の活性化が起こると推定する。ミオスタチン調節およびシグナル伝達に関するこの全体的なモデルは、本明細書に示したデータのみならず、他の遺伝的データとも一致する。先に考察したように、フォリスタチンノックアウトマウスは、出生時の筋重量が減少していることが示されており、これは、ミオスタチン活性が阻害されない場合に予想されるとおりである。類似の筋表現型は、Smad2および3の活性を阻害することが示されているskiを欠損するマウスについて報告されており、skiを過剰発現するマウスでは、反対の表現型、すなわち骨格筋の過剰が認められている。本発明の知見に基づいて、一つの仮説は、これらの認められた表現型がそれぞれ、これらのマウスにおけるミオスタチンの過剰活性および過小活性を反映するという点である。インビトロおよび遺伝子データは全て、本発明者らが本明細書において示した全体的なモデルと一致しているが、これらのデータはまた、他の受容体およびリガンドを含むもう一つのモデルとも一致すると思われる。例えば、それによってAct RIIBの切断型が本発明者らのトランスジェニックマウスにおいて筋増殖を増強するメカニズムはわかっていない。切断型受容体は、標的細胞においてシグナル伝達を遮断するように作用するのではなく、ミオスタチンの細胞外濃度を枯渇するための貯水槽として単に作用する可能性がある。同様に、切断型受容体は、ミオスタチン以外にも他のリガンドのシグナル伝達を阻害する可能性がある。この点において、II型アクチビン受容体のドミナントネガティブ型は、他の種において多様な異なるTGF-関連リガンドのシグナル伝達を遮断できることが示されている。同様に、本発明者らは、フォリスタチンが筋増殖を促進するためにインビボでミオスタチン活性を遮断することを明確に示していない。この点において、フォリスタチン発現創始動物の1例において異常な程度の筋肉が認められたことは、他のフォリスタチン感受性リガンドが筋増殖の調節に関与する可能性があることを示唆している。しかし、今日まで、ミオスタチンは、インビボで筋重量を調節するために負の役割を果たしていることが証明された唯一の分泌蛋白質である。このモデル全体の局面を証明して、他のシグナル伝達成分を同定するためにはさらなる実験が必要であるが、本発明者らのデータは、フォリスタチンおよびミオスタチンプロペプチドのようなミオスタチン拮抗剤、またはアクチビンII型受容体拮抗剤がヒトおよび農業での応用の双方にとって有効な筋増強剤である可能性があることを示唆している。本発明は、上記の実施例を参照して説明してきたが、改変および変更は本発明の精神および範囲に含まれると理解されると思われる。したがって、本発明は特許請求の範囲に限って制限される。 【図面の簡単な説明】 アミノ酸は、ヒトプロミオスタチン(配列番号:2)に対して番号をつける。破線は、相同性を最大にするために導入したギャップを示す。配列における黄体が同一の残基に影をつけて示す。【図2−1】マウスプロミオスタチン(配列番号:4)とゼブラフィッシュのプロミオスタチン(配列番号:20)のアミノ酸配列、ならびにサケ対立遺伝子1プロミオスタチン(配列番号:27、「サケ1」)およびサケ対立遺伝子2プロミオスタチン(配列番号:29、「サケ2」)のアミノ酸配列の一部を示す。 ヒトプロミオスタチンに対するアミノ酸の位置をそれぞれの列の左側に示す(図1と比較;サケ1の最初のアミノ酸はヒトプロミオスタチン218位に対応する;サケ2の最初のアミノ酸はヒトプロミオスタチン239位に対応する) 破線は相同性を最大にするために導入したギャップを示す。ギャップを含む相対的アミノ酸の位置は、それぞれの列の上に沿って示す。配列における同一の残基に影をつけて示す。 【氏名又は名称】清水 初志 【氏名又は名称】新見 浩一 【発明の名称】 デサチュラーゼ遺伝子とその使用 【課題】炭素5(即ち「5−デサチュラーゼ」)及び炭素6(即ち「6−デサチュラーゼ」)のポリ不飽和脂肪酸の不飽和化に関与する遺伝子とその使用方法を提供する。 【解決手段】デサチュラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチド 6−デサチュラーゼはリノレン酸(LA)から−リノレン酸(GLA)への変換に使用することができる。生産されるAAやポリ不飽和脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品(例えば化粧品)に添加することができる。 【特許請求の範囲】 デサチュラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこのヌクレオチド配列に相補的な単離核酸フラグメントであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号20、配列番号29、配列番号31、配列番号33及び配列番号35から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも50%の配列一致度をもつ、前記単離核酸フラグメント 配列番号13、配列番号19、配列番号28、配列番号30、配列番号32及び配列番号34から構成される群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも約50%を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列 前記配列が配列番号13、配列番号19、配列番号28、配列番号30、配列番号32及び配列番号34から構成される群から選択される請求項2に記載の単離ヌクレオチド配列 前記配列がポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードする請求項2又は3に記載の単離ヌクレオチド配列 請求項1、2又は3に記載の前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチド 炭素5のポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、配列番号20、配列番号29、配列番号31及び配列番号35から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約50%のアミノ酸一致度をもつ精製ポリペプチド 炭素6のポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、配列番号33及び配列番号14から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約50%のアミノ酸一致度をもつ精製ポリペプチド a)配列番号13、配列番号19、配列番号28、配列番号30、配列番号32及び配列番号34から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を単離する段階と、b)i)前記単離ヌクレオチド配列とこれに作動的に連結したii)調節配列を含むベクターを構築する段階と、c)デサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階とを含む。 デサチュラーゼの製造方法 a)配列番号13、配列番号19、配列番号28、配列番号30、配列番号32及び配列番号34から構成される群から選択されるヌクレオチド配列と、b)これに作動的に連結した調節配列を含むベクター 請求項12に記載の前記ベクターを含む宿主細胞 請求項12に記載の前記ベクターを含み、LA、ALA、DGLA及びESPから構成される群から選択される少なくとも1種の脂肪酸を含む培地で前記細胞を増殖させて、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列が発現されると、AA、EPA、GLA又はSTAの生産レベルが変化する哺乳動物細胞 請求項12に記載の前記ベクターを含み、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列が発現されると、植物細胞、植物又は植物組織によりポリ不飽和脂肪酸が生産される植物細胞、植物又は植物組織 前記ポリ不飽和脂肪酸がAA、EPA、GLA及びSTAから構成される群から選択される請求項15に記載の植物細胞、植物又は植物組織 請求項15に記載の前記植物細胞、植物又は植物組織により発現される1種以上の植物油又は酸 請求項12に記載の前記ベクターを含み、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列が発現される結果と、トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産されるトランスジェニック植物 a)配列番号19、配列番号28、配列番号30及び配列番号34から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を単離する段階と、b)前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、c)5−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と、d)前記発現した5−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、前記基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階とを含む、ポリ不飽和脂肪酸の製造方法 前記産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼに暴露し、前記産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含む請求項19に記載の方法 夫々前記産物ポリ不飽和脂肪酸がAA又はEPAであり、前記別のポリ不飽和脂肪酸がアドレン酸又は(n−3)−ドコサペンタエン酸である請求項21に記載の方法 前記別のポリ不飽和脂肪酸をさらなるデサチュラーゼに暴露し、前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含む請求項21に記載の方法 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が(n−6)−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン(DHA)酸である請求項23に記載の方法 a)a)配列番号13及び配列番号32から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を単離する段階と、b)前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、c)6−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と、d)前記発現した6−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、前記基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階とを含む、ポリ不飽和脂肪酸の製造方法 夫々前記基質ポリ不飽和脂肪酸がLA又はALAであり、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がGLA又はSTAである請求項25に記載の方法 前記産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼに暴露し、前記産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含む請求項25に記載の方法 夫々前記産物ポリ不飽和脂肪酸がGLA又はSTAであり、前記別のポリ不飽和脂肪酸がDGLA又はETAである請求項27に記載の方法 前記別のポリ不飽和脂肪酸をさらなるデサチュラーゼに暴露し、前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階とを更に含む請求項27に記載の方法 前記最終ポリ不飽和脂肪酸がAA又はEPAである請求項29に記載の方法 請求項19又は25に記載の方法により製造される前記産物ポリ不飽和脂肪酸、請求項21又は27に記載の方法により製造される前記別のポリ不飽和脂肪酸、及び請求項23又は29に記載の方法により製造される前記最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも1種のポリ不飽和脂肪酸を含む組成物 前記産物ポリ不飽和脂肪酸がAA、EPA、GLA及びSTAから構成される群から選択される少なくとも1種のポリ不飽和脂肪酸である請求項31に記載の組成物 前記別のポリ不飽和脂肪酸がアドレン酸、(n−3)−ドコサペンタエン酸、DGLA及びEPAから構成される群から選択される少なくとも1種のポリ不飽和脂肪酸である請求項31に記載の組成物 前記最終ポリ不飽和脂肪酸が(n−6)−ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン(DHA)酸、AA及びEPAから構成される群から選択される少なくとも1種のポリ不飽和脂肪酸である請求項31に記載の組成物 ポリ不飽和脂肪酸の摂取不全に起因する患者の状態の予防又は治療方法であって、前記予防又は治療を行うために十分な量の請求項31に記載の前記組成物を前記患者に投与する前記方法 【発明の詳細な説明】【技術分野】 この変換産物はその後、他のポリ不飽和脂肪酸(PUFA)の生産における基質として利用することができる。この産物又は他のポリ不飽和脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品(例えば化粧品)に添加することができる。デサチュラーゼ(desaturase)は多数の重要な機能をもつ長鎖ポリ不飽和脂肪酸の生産に不可欠である。例えばポリ不飽和脂肪酸(PUFA)は細胞膜の主要成分であり、リン脂質形態で存在する。哺乳動物プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン及びプスタグランジンの前駆物質としても機能する。更に、PUFAは発育中の乳児脳の適正な発育と組織形成及び修復に必要である。PUFAの生物学的意義に鑑み、PUFAとその中間体を効率的に生産する試みがなされている。PUFA生合成には5−デサチュラーゼと6−デサチュラーゼ以外に多数の酵素が関与している。動物は9位を越えて不飽和化することができないため、オレイン酸をリノレン酸に変換できないことに留意すべきである。従って、動物の主要なポリ不飽和脂肪酸は食物及び/又はリノレン酸もしくは−リノレン酸の不飽和化と伸長から誘導される。これらの問題に鑑み、これらの脂肪酸を天然に生産する種からPUFA合成に関与する遺伝子を単離し、商業的量の1種以上のPUFAを生産できるように改変可能な微生物、植物又は動物系でこれらの遺伝子を発現させることは非常に有益である。 【発明の開示】 【発明が解決しようとする課題】 上述した最も重要な長鎖PUFAの1種はアラキドン酸(AA)である。AAは糸状菌に含まれており、肝臓や副腎等の哺乳動物組織からも精製できる。上述したように、ジホモ−−リノレン酸からのAA生産は5−デサチュラーゼにより触媒される。EPAは真菌類に含まれ、魚油にも含まれている。上述したように、EPAは(n−3)−エイコサテトラエン酸から生産され、5−デサチュラーゼにより触媒される。上記に鑑み、5−デサチュラーゼ及び6−デサチュラーゼ酵素、これらの酵素をコードする各遺伝子、並びにこれらの酵素の組換え生産方法が明白に必要である。更に、天然濃度よりも高濃度のPUFAを含有する油類と、新規PUFAを高度に含有する油類も必要である。このような油類は5−デサチュラーゼ及び6−デサチュラーゼ遺伝子の単離と発現によってしか製造することができない。本明細書に引用する全米国特許、優先権文献及び刊行物はその内容全体を参考資料として本明細書に組込む。 【課題を解決するための手段】 特に、単離ヌクレオチドは配列番号13、配列番号19、配列番号28、配列番号30、配列番号32又は配列番号34により表すことができる。これらの配列はポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードすることができる。 更に、本発明はデサチュラーゼ活性をもち、配列番号20、配列番号29、配列番号31、配列番号33及び配列番号35から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも50%の一致度又は類似度をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はフラグメントに関する 更に、本発明は、炭素5又は炭素6のポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、上記精製蛋白質のアミノ酸配列(即ち配列番号14、配列番号20、配列番号29、配列番号31、配列番号33及び配列番号35)に少なくとも約50%のアミノ酸一致度又は類似度をもつ精製ポリペプチドにも関する。更に、本発明はデサチュラーゼ(即ち5又は6)の製造方法にも関する。本方法はa)配列番号19、配列番号28、配列番号13、配列番号30、配列番号32又は配列番号34を適宜含むヌクレオチド配列を単離する段階と、b)i)単離ヌクレオチド配列とこれに作動的に連結したii)プロモーター又は所定型の調節配列を含むベクターを構築する段階と、c)適宜5−デサチュラーゼ又は6−デサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階を含む。宿主細胞は例えば真核細胞又は原核細胞とすることができる。特に、原核細胞は例えば大腸菌、藍色細菌又は枯草菌とすることができる。更に、本発明はa)配列番号13、配列番号19、配列番号28、配列番号30、配列番号32又は配列番号34により表されるヌクレオチド配列と、b)これに作動的に連結したプロモーター又は調節配列を含むベクターにも関する。本発明はこのベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は例えば真核細胞又は原核細胞とすることができる。利用可能な真核細胞及び原核細胞は上記に記載した通りである。更に、本発明は上記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、植物細胞、植物又は植物組織により少なくとも1種のポリ不飽和脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。ポリ不飽和脂肪酸は例えばヌクレオチド配列が5−又は6−デサチュラーゼのいずれをコードするかに応じて例えばAA、EPA、GLA又はSTAから構成される群から選択することができる。本発明は上記植物細胞、植物又は植物組織により発現される1種以上の植物油又は植物酸にも関する。更に、本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。更に、本発明は上記ベクターを含む哺乳動物細胞であって、例えばLA、ALA、DGLA及びETAから構成される群から選択される脂肪酸を含む培地で細胞を増殖させると、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、AA、EPA、GLA及び/又はSTAの生産レベルが変化する前記哺乳動物細胞にも関する。本発明はプロモーター又は調節配列に作動的に連結した5−デサチュラーゼ又は6−デサチュラーゼをコードするDNA配列をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関することにも留意すべきである。更に、本発明はトランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくとも5−デサチュラーゼ又は少なくとも6−デサチュラーゼを適宜含む液体(例えば乳)にも関する。更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸の製造方法(即ち「第1」方法)として、a)例えば配列番号19、配列番号28、配列番号30又は配列番号34により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と、b)単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、c)5−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階と、d)発現したヒト5−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を含む方法にも関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばDGLA又は20:4n−3とすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばAA又はEPAとすることができる。 本方法は更に産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼ又はデサチュラーゼに暴露し、産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を含むことができる(即ち「第2」方法) 追加の段階を含むこの方法(即ち「第2」方法)では、夫々産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばAA又はEPAとすることができ、「別の」ポリ不飽和脂肪酸はアドレン酸又は(n−3)−ドコサペンタエン酸とすることができる。 追加の段階を含む方法は別のポリ不飽和脂肪酸を付加デサチュラーゼ又はエロンガーゼに暴露して別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含むことができる(即ち「第3」方法) 最終ポリ不飽和脂肪酸は例えば(n−6)−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸(DHA)酸とすることができる。 更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸の製造方法として、a)配列番号13又は配列番号33により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と、b)単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、c)6−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階と、d)発現した6−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を含む方法に関する 夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばLA又はALAとすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばGLA又はSTAとすることができる。本方法は産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼ(又はデサチュラーゼ)に暴露し、産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含むことができる。追加の段階を含むこの方法では、夫々産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばGLA又はSTAとすることができ、「別の」ポリ不飽和脂肪酸はDGLA又はエイコサテトラエン酸(ETA)とすることができる。追加の段階を含む方法は別のポリ不飽和脂肪酸を付加デサチュラーゼ(又はエロンガーゼ)に暴露して別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含むことができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばAA又はEPAとすることができる。本発明は上記方法により製造される産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により製造される別のポリ不飽和脂肪酸及び上記方法により製造される最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも1種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物ポリ不飽和脂肪酸は5−又は6−デサチュラーゼヌクレオチド配列のいずれを使用しているかに応じて例えばAA、EPA、GLA又はSTAであり得る。別のポリ不飽和脂肪酸は同様に5−又は6−デサチュラーゼヌクレオチド配列のいずれを使用しているかに応じて例えばアドレン酸、(n−3)−ドコサペンタエン酸、DGLA及びEPAであり得る。最終ポリ不飽和脂肪酸は同様に5−又は6−デサチュラーゼヌクレオチド配列のいずれを使用しているかに応じて例えば(n−6)−ドコサペンタエン酸、DHA、AA又はEPAであり得る。本発明は1)上記方法により製造される「産物」PUFA、上記方法により製造される「別の」PUFA及び上記方法により製造される「最終」PUFAから構成される群から選択される少なくとも1種のポリ不飽和脂肪酸(PUFA)と、2)医薬的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物にも関する。更に、本発明は上記方法により製造される産物PUFA、上記方法により製造される別のPUFA及び上記方法により製造される最終PUFAから構成される群から選択される少なくとも1種のPUFAを含む動物飼料又は化粧品にも関する。これらのPUFAは上記に挙げた通りであり、図1に例示する。更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸の摂取不全に起因する状態の予防又は治療方法として、予防又は治療を行うために十分な量の上記栄養組成物を患者に投与する方法にも関する。本明細書に記載する各ヌクレオチド及びアミノ酸配列は特定配列番号で指定していることにも留意すべきである。(添付の)配列表はこれらの各配列とその対応番号を示す。 【発明を実施するための最良の形態】 更に、本発明はこれらの遺伝子とこれらの遺伝子によりコードされる酵素の使用にも関する。例えば、前記遺伝子と対応する酵素は医薬組成物、栄養組成物及び他の有価製品に添加可能なポリ不飽和脂肪酸(例えばアラキドン酸、エイコサペンタエン酸及び/又はアドレン酸)の製造に使用することができる。 5−デサチュラーゼ遺伝子、6−デサチュラーゼ遺伝子及びそれらにコードされる酵素 上述のように、本発明の5−デサチュラーゼ遺伝子及び6−デサチュラーゼ遺伝子によりコードされる酵素は夫々炭素数20及び18を上回る長さをもつ高度に不飽和のポリ不飽和脂肪酸の生産に不可欠である。本発明の遺伝子の重要性の1例として、単離5−デサチュラーゼ遺伝子はDGLAをAAに変換し、又はエイコサテトラエン酸をEPAに変換する。AAは例えば5−デサチュラーゼ遺伝子とそれによりコードされる酵素なしには合成することができない。(一致度百分率に関して50%〜100%の全整数も本発明の範囲に含むものとする。 )このような配列はヒト起源及び他の非ヒト起源とすることができる(例えばC 更に、本発明は本発明のヌクレオチド配列(即ち配列番号13、配列番号19、配列番号28、配列番号30、配列番号32及び配列番号34)及び他の起源に由来し、上記相補性又は対応性をもつ配列のフラグメント及び誘導体にも関する。上記配列(即ち適宜5−デサチュラーゼ活性又は6−デサチュラーゼ活性をもつ配列)の機能的等価物も本発明に含まれる。本発明は炭素5位又は炭素6位でポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、上記ヌクレオチド配列によりコードされる上記蛋白質のアミノ酸配列(即ち配列番号14(図3)、配列番号20(図5)、配列番号29(図7)、配列番号31(図9)、配列番号33(図11)及び配列番号35(図15))に対して少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、より好ましくは少なくとも約70%、更に好ましくは少なくとも約80%、最も好ましくは少なくとも約90%のアミノ酸類似度又は一致度をもつ精製ポリペプチドにも関する。50〜100%の全整数の類似度又は一致度も本発明の範囲に含むものとする。「一致度」なる用語は特定比較窓又はセグメントにわたる2種の配列のヌクレオチド間の関連度を表す。即ち、一致度は2種のDNAセグメントの同一鎖(センス又はアンチセンス)間の同一、対応又は等価度として定義される。「配列一致度百分率」は2種の最適に整列させた配列を特定領域にわたって比較し、両者配列で塩基が一致する位置の数を測定して整合位置数を求め、このような位置数を比較するセグメントの合計位置数で割って100を掛けることにより計算される。本発明の趣旨では、「相補性」は2種のセグメント間の関連度として定義される。これは一方のDNAセグメントのセンス鎖が他方のDNAセグメントのアンチセンス鎖と適当な条件下でハイブリ大豆して二重螺旋を形成する能力を測定することにより決定される。二重螺旋では一方の鎖にアデニンが現れ、他方の鎖にチミンが現れる。同様に、一方の鎖にグアニンが存在する場合には、他方にシトシンが存在する。2種のDNAセグメントのヌクレオチド配列間の関連度が大きいほど、2種のDNAセグメントの鎖間にハイブリッドデュプレクスを形成する能力は高い。2種のアミノ酸配列間の「類似度」は両者配列における一連の同一な保存アミノ酸残基の存在として定義される。2種のアミノ酸配列間の類似度が高いほど、2種の配列の対応、同一又は等価度は高い。(2種のアミノ酸配列間の「一致度」は両者配列における一連の厳密に同一又は不変のアミノ酸残基の存在として定義される。)「相補性」、「一致度」及び「類似度」の定義は当業者に周知である。「〜によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ポリペプチド配列又はその一部は核酸配列によりコードされるポリペプチドからのアミノ酸を少なくとも3個の、より好ましくは少なくとも8個、更に好ましくは少なくとも15個含むアミノ酸配列を含む。本発明はPUFAデサチュラーゼ活性をもち、配列番号13(図2)、配列番号19(図4)、配列番号28(図6)、配列番号30(図8)、配列番号32(図10)又は配列番号34(図14)を含むヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸に並のストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能な単離ヌクレオチド配列にも関する。温度及びイオン強度条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」には2種の核酸が相補的配列を含んでいることが必要である。他方、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間にミスマッチが生じる場合がある。核酸をハイブリダイズするのに適したストリンジェンシーは核酸の長さと相補度に依存する。このような変数は当業者に周知である。より具体的には、2種のヌクレオチド配列間の類似度又は相同度が高いほどこれらの配列をもつ核酸のハイブリッドのTm値は大きい。 短い核酸とのハイブリダイゼーションではミスマッチの位置が重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する(Sambrookら,前出参照) 本明細書で使用する「単離核酸フラグメント又は配列」とは場合により合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含む1本鎖又は2本鎖のRNA又はDNAのポリマーである。DNAポリマー形態の単離核酸フラグメントはcDNA、ゲノムDNA又は合成DNAの1個以上のセグメントから構成され得る(特定ポリヌクレオチドの「フラグメント」とは特定ヌクレオチド配列のある領域に同一又は相補的な少なくとも約6ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約8ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約15ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約25ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。)(通常はその5’−一リン酸形で存在する)ヌクレオチドはその1文字表記により次のように表す。「機能的に等価であるフラグメント又はサブフラグメント」及び「機能的に等価なフラグメント又はサブフラグメント」なる用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語はフラグメント又はサブフラグメントが活性酵素をコードするか否かに関係なく遺伝子発現を変更又は所定表現型を発現する能力を維持する単離核酸フラグメントの一部又はサブ配列を意味する。例えば、フラグメント又はサブフラグメントをキメラ構築物の設計に使用し、形質転換植物で所定表現型を発現させることができる。キメラ構築物は活性酵素をコードするか否かに関係なく植物プロモーター配列に対して適当な方向で核酸フラグメント又はサブフラグメントを連結することにより共抑制又はアンチセンスで使用するように設計することができる。「相同度」、「相同」、「実質的に類似|及び「実質的に対応」等の用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語は1個以上のヌクレオチド塩基が変異しても遺伝子発現を媒介又は所定表現型を発現する核酸フラグメントが能力が変わらないことを意味する。これらの用語は当初の未改変フラグメントに対して得られる核酸フラグメントの機能的性質を実質に変えない本発明の核酸フラグメントの変異(例えば1個以上のヌクレオチドの欠失又は挿入)を意味する。従って、当業者に自明の通り、本発明は特定の例示配列以外の配列にも関する。「遺伝子」とはコーディング配列に先行する調節配列(5’非コーディング配列)と後続する調節配列(3’非コーディング配列)を含めた特定蛋白質を発現する核酸フラグメントを意味する。「天然遺伝子」とはそれ自体の調節配列と共に天然に存在する遺伝子を意味する。これに対して「キメラ構築物」とは一般には天然に共存しない核酸フラグメントの組み合わせを意味する。従って、キメラ構築物は異なる起源に由来する調節配列とコーディング配列を含むか、又は同一起源に由来するが、通常天然に存在するとは異なる方法で配置された調節配列とコーディング配列を含むことができる(「単離」なる用語は配列をその天然環境から取出すことを意味する。「外来」遺伝子とは宿主生物に通常存在しないが、遺伝子導入により宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子は非天然生物又はキメラ構築物に挿入した天然遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」とは形質転換法によりゲノムに導入した遺伝子である。「コーディング配列」とは特定アミノ酸配列をコードするDNA配列を意味する。「調節配列」とはコーディング配列の上流(5’非コーディング配列)、内部、又は下流(3’非コーディング配列)に配置され、関連コーディング配列の転写、RNAプロセシングもしくは安定性又は翻訳に作用するヌクレオチド配列を意味する。調節配列としてはプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化認識配列が挙げられるが、これらに限定されない。「プロモーター」とはコーディング配列又は機能的RNAの発現を制御することが可能なDNA配列を意味する。プロモーターは近位及び遠位上流エレメントから構成され、これらのエレメントはエンハンサーと呼ぶことが多い。従って、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができ、プロモーターの固有エレメント又はプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーター配列は遺伝子の転写部分の内部に配置してもよいし、及び/又は転写配列の下流に配列してもよい。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来するものでもよいし、天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成してもよいし、合成DNAセグメントを含むものでもよい。当業者に自明の通り、種々のプロモーターは種々の組織もしくは細胞型で、又は種々の発生段階で、又は種々の環境条件に応答して遺伝子の発現を誘導することができる。殆どの細胞型で殆どの場合に遺伝子を発現させるプロモーターを一般に「構成的プロモーター」と言う。更に、殆どの場合に調節配列の厳密な境界が完全に決定されているので、所定変形のDNAフラグメントが同一プロモーター活性をもつこともあると考えられる。「イントロン」は蛋白質配列の一部をコードしない遺伝子の介在配列である。従って、このような配列はRNAに転写されるが、その後、切出されるので翻訳されない。この用語は切出されたRNA配列にも使用される。「エキソン」は転写される遺伝子の配列の一部であり、遺伝子から誘導される成熟メッセンジャーRNAに存在するが、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部でなくてもよい。「翻訳リーダー配列」とは遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列の間に配置されたDNA配列を意味する。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流の完全にプロセスされたmRNAに存在する。翻訳リーダー配列は一次転写産物からmRNAへのプロセシング、mRNA安定性又は翻訳効率に作用し得る。 翻訳リーダー配列の例は文献に記載されている(Turner,R 「3’非コーディング配列」とはコーディング配列の下流に配置されたDNA配列を意味し、ポリアデニル化認識配列やmRNAプロセシング又は遺伝子発現に作用することが可能な調節配列をコードする他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは一般にmRNA前駆物質の3’末端へのポリアデニル酸領域の付加に作用することを特徴とする。「RNA転写産物」とはDNA配列のRNAポリメラーゼ触媒転写により得られる産物を意味する。RNA転写産物がDNA配列の完全な相補的コピーであるときには一次転写産物と言うが、一次産物の転写後プロセシングにより誘導されるRNA配列でもよく、その場合には成熟RNAと言う。「メッセンジャーRNA(mRNA)」とはイントロンをもたないRNAであり、細胞により蛋白質に翻訳できるものを意味する。「cDNA」とはmRNA鋳型に相補的であり、逆転写酵素を使用してこの鋳型から合成されるDNAを意味する。 「アンチセンスRNA」とは標的一次転写産物又はmRNAの全部又は一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するRNA転写産物を意味する(米国特許第5,107,065号) アンチセンスRNAは特異的遺伝子転写産物のどの部分と相補的でもよく、即ち、5’非コーディング配列、3’非コーディング配列、イントロン、又はコーディング配列のいずれでもよい。「機能的RNA」とはアンチセンスRNA、リボザイムRNA又は翻訳できないが、細胞プロセスに作用する他のRNAを意味する。「相補体」及び「逆相補体」なる用語は本明細書ではmRNA転写産物に関して同義に使用し、メッセージのアンチセンスRNAを意味する。「内因性RNA」なる用語は天然又は非天然即ち組換え手段、突然変異誘発等により導入されるかを問わずに本発明の組換え構築物による形質転換前に宿主のゲノムに存在する任意核酸配列によりコードされる任意RNAを意味する。「非天然」なる用語は通常天然に存在するものと一致しない人工を意味する。「作動的に連結」なる用語は一方の核酸配列の機能が他方により調節されるように単一核酸フラグメントで核酸配列を結合することを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節できるとき(即ちコーディング配列がプロモーターの転写制御下にあるとき)にプロモーターはコーディング配列に作動的に連結している。コーディング配列はセンス又はアンチセンス方向のいずれで調節配列に作動的に連結してもよい。別の例では、本発明の相補的RNA領域を標的mRNAの5’又は標的mRNAの3’又は標的mRNAの内部に直接又は間接的に作動的に連結してもよいし、第1の相補領域を標的mRNAの5’に作動的に連結し、その相補体を3’に作動的に連結してもよい。本明細書で使用する「発現」なる用語は機能的終産物の生産を意味する。遺伝子の発現には遺伝子の転写とmRNAから前駆物質又は成熟蛋白質への翻訳が必要である。「アンチセンス阻害」とは標的蛋白質の発現を抑制することが可能なアンチセンスRNA転写産物の生産を意味する。 「共抑制」とは同一又は実質的に類似する外来又は内因性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスRNA転写産物の生産を意味する(米国特許第5,231,020号) 「成熟」蛋白質とは翻訳後プロセシングしたポリペプチド、即ち一次翻訳産物に存在するプレ又はプロペブチドを除去したポリペプチドを意味する。「前駆物質」蛋白質とはmRNAの翻訳の一次産物、即ちプレ及びプロペブチドがまだ存在するものを意味する。プレ及びプレペブチドとしては細胞内局在シグナルが挙げられるが、これに限定されない。「安定な形質転換」とは核ゲノムとオルガネラゲノムの両者を含む宿主生物のゲノムに核酸フラグメントを導入し、遺伝的に安定した遺伝を行うことを意味する。これに対して、「一過的形質転換」とは核酸フラグメントを宿主生物の核又はDNA含有オルガネラに導入し、組込み又は安定な遺伝なしに遺伝子発現させることを意味する。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と言う。本明細書で使用する「形質転換」なる用語は安定な形質転換と一過的形質転換の両者を意味する。 本明細書で使用する標準組換えDNA及び分子クローニング技術は当分野で周知であり、Sambrook,J 「組換え」なる用語は例えば化学合成又は遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作により、2つの分離配列セグメントの人工的組合せを意味する。一般に、2本鎖DNAを熱変性し、標的セグメントの3’境界に相補的な2種のプライマーを低温でアニールした後、中温で伸長する。これらの連続3段階1組をサイクルと言う。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は短時間で鋳型の反復複製によりDNAを数百万倍に増幅するために使用される強力な技術である。この方法はin vitro合成した特定オリゴヌクレオチドの組合せを利用してDNA合成を開始する。プライマーの設計は分析したいDNAの配列に依存する。この方法は鋳型を高温で溶融し、プライマーを鋳型内の相補的配列にアニールさせた後、DNAポリメラーゼで鋳型を複製するサイクルを多数回(通常は20〜50回)行うことにより実施される。PCR反応産物はアガロースゲルで分離後に臭化エチジウム染色とUV透照により分析される。あるいは、放射性dNTPをPCRに加えて産物にラベルを加えてもよい。この場合には、ゲルをX線フィルムに露光することによりPCR産物を可視化する。放射性標識PCR産物には個々の増幅産物レベルを定量できるという利点もある。本明細書では「組換え構築物」、「発現構築物」及び「組換え発現構築物」なる用語を同義に使用する。これらの用語は当業者に周知の標準方法を使用して細胞のゲノムに挿入することができる遺伝材料の機能単位を意味する。このような構築物をそのまま使用してもよいし、ベクターに組込んで使用してもよい。ベクターを使用する場合には、ベクターの選択は当業者に周知のように宿主植物を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。本発明の単離核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を有効に形質転換し、選択し、増殖させるためにベクター上に配置する必要がある遺伝要素は当業者に周知である。Genetics 218:78−86)ので、所望発現レベル及びパターンを示す系列を得るためには多重イベントをスクリーニングしなければならないことも当業者に自明である。このようなスクリーニングはDNAのサザン分析、mRNA発現のノーザン分析、蛋白質発現のウェスタン分析、又は表現型分析により実施することができる。 5−デサチュラーゼ酵素と6−デサチュラーゼ酵素の製造 デサチュラーゼ酵素のいずれか1種をコードする遺伝子を単離したら、その後、ベクター又は構築物を使用することにより原核又は真核宿主細胞に導入することができる。ベクター(例えばバクテリオファージ、コスミド又はプラスミド)は5−デサチュラーゼ酵素又は6−デサチュラーゼ酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列と、宿主細胞で機能的であり且つヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現を誘発することが可能な任意調節配列(例えばプロモーター)を含むことができる。調節配列はヌクレオチド配列に作動的に関連又は作動的に連結している。(上述のように、調節配列がコーディング配列の転写又は発現に作用する場合に調節配列はコーディング配列に「作動的に連結している」と言う。)利用可能なプロモーターとしては例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセル酸キナーゼ、酸ホスファターゼ、T7、TPI、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメロガロウイルス極初期、ホエイ酸蛋白質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するものや、ガラクトースの存在下に活性化されるプロモーター(例えばGAL1及びGAL10)が挙げられる。更に、他の蛋白質、オリゴ糖、脂質等をコードするヌクレオチド配列と、ポリアデニル化シグナル(例えばSV−40T−抗原、オボアルブミン又はウシ成長ホルモンのポリAシグナル)等の他の調節配列もベクターに配置してもよい。構築物に配置する配列の選択は所望発現産物と宿主細胞の種類に依存する。その後、遺伝子の発現を可能にする適当な条件下で宿主細胞を培養して所望PUFAを生産させた後、回収し、精製する。利用可能な原核宿主細胞の例としては例えば大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリア(例えばSpirulina種、即ち藍藻)等の細菌類が挙げられる。宿主細胞での発現は一過的又は安定的に行うことができる。一過的発現は導入構築物が宿主細胞で機能的な発現シグナルを含むが、複製しないので宿主細胞に殆ど組込まれないか又は宿主細胞が増殖していない場合に生じ得る。一過的発現は目的遺伝子に作動的に連結した調節プロモーターの活性を誘導することによっても実施できるが、このような誘導系は基底発現レベルが低いことが多い。安定的発現は宿主ゲノムに組込むことができるか又は宿主細胞で自律複製する構築物を導入することにより達成することができる。発現構築物に配置するか又は発現構築物をトランスフェクトする選択マーカーを使用して目的遺伝子の安定的発現を選択した後に、マーカーを発現する細胞を選択することができる。安定的発現が組込みの結果である場合には、構築物の組込み部位は宿主ゲノム内でランダムでもよいし、宿主遺伝子部位との組換えをターゲットするために十分な宿主ゲノムとの相同領域を含む構築物を使用してターゲットしてもよい。内在部位に構築物をターゲットする場合には、転写及び翻訳調節領域の全部又は一部を内在部位により提供することができる。トランスジェニック哺乳動物を使用して目的酵素(即ち5−デサチュラーゼの1種以上、6−デサチュラーゼの1種以上、又はその組合せ)を発現させ、最終的に目的PUFAを発現させることもできる。より具体的に言うと、上記構築物を作出したら、胚の前核に挿入すればよい。その後、胚をレシピエント雌に移植する。その後、子孫からの乳汁、組織又は他の体液試料は非トランスジェニック動物に通常検出される濃度とは異なる濃度のPUFAを含有しているはずである。後続世代をモニターし、変化又は増加濃度のPUFAが生産されているかどうかを調べ、従って所望デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子がそのゲノムが組込まれているかどうかを調べる。宿主として利用する哺乳動物は例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシから構成される群から選択することができる。但し、目的酵素をコードするDNAをそのゲノムに組込む能力がある限り任意哺乳動物を使用することができる。デサチュラーゼポリペプチドを発現させるには、デサチュラーゼポリペプチドをコードするDNAに機能的転写及び翻訳開始及び終結領域を作動的に連結する。転写及び翻訳開始及び終結領域は発現させようとするDNA、所望系で発現できることが知られているか又はその可能性がある遺伝子、発現ベクター、化学合成、又は宿主細胞における内在部位から等の種々の非排他的起源に由来する。植物組織及び/又は植物部分における発現は特に組織又は部分が種子、葉、果実、花、根等の早期回収されるものである場合にある程度の効率を示す。あるいは、発現される蛋白質は直接又は更に改変後に宿主植物から液体フラクションに組込むことができる産物を生産する酵素でもよい。デサチュラーゼ遺伝子又はアンチセンスデサチュラーゼ転写産物が発現すると、植物部分及び/又は植物組織に含まれる特定PUFA又はその誘導体の濃度が変化し得る。 デサチュラーゼポリペプチドコーディング領域を単独又は他の遺伝子と共に発現させ、より高濃度の所望PUFAを含有するか又はPUFA組成が人乳により近似する組織及び/又は植物部分を生産することもできる(Prietoら,PCT公開WO95/24494) 終結領域は開始領域を得た遺伝子の3’領域又は別の遺伝子に由来するものとすることができる。多数の終結領域が同一及び異なる属及び種から種々の宿主で満足できるとして知られており、見出されている。終結領域は特定性質よりもむしろ便宜上から選択するのが一般的である。より具体的に言うと、所望PUFAを種子で発現させることができる。種子油の分離方法は当分野で公知である。即ち、PUFA源の提供に加え、デサチュラーゼ遺伝子と恐らく他のデサチュラーゼ遺伝子及びエロンガーゼ遺伝子の発現により種子油成分を操作すると、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料及び化粧品に添加可能な種子油を提供することができる。この場合にも、プロモーターに作動的に連結したデサチュラーゼをコードするDNA配列を含むベクターをデサチュラーゼ遺伝子の発現に十分な時間と条件下に植物組織又は植物に導入する。ベクターは更に他の酵素(例えば4−デサチュラーゼ、エロンガーゼ、12−デサチュラーゼ、15−デサチュラーゼ、17−デサチュラーゼ及び/又は19−デサチュラーゼ)をコードする1種以上の遺伝子も含んでいてもよい。酵素が作用する該当基質(例えばDGLA(5−デサチュラーゼの場合)、ALA(6−デサチュラーゼの場合)等)を植物組織又は植物で生産してもよいし、このような基質を生産する酵素をコードするベクターを植物組織、植物細胞又は植物に導入してもよい。更に、適当な酵素を発現する植物組織に基質を噴霧してもよい。これらの種々の技術を使用して、植物細胞、植物組織又は植物の使用によりPUFA(例えばn−6不飽和脂肪酸(例えばAA)又はn−3脂肪酸(例えばEPA又はSTA))を生産することもできる。本発明は更に上記ベクターを含むトランスジェニック植物として、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として例えばトランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸を生産する植物にも関することにも留意すべきである。この再生及び増殖法は一般に形質転換細胞を選択する段階と、通常の胚発生〜挿し木苗段階で個体化細胞を培養する段階を含む。トランスジェニック胚及び種子も同様に再生させる。得られたトランスジェニック挿し木苗をその後、土壌等の適当な植物成長媒質に植え付ける。目的蛋白質をコードする外来外因性遺伝子を含む植物の発生又は再生は当分野で周知である。再生した植物を自家受粉させて同型トランスジェニック植物を提供することが好ましい。再生植物から得た花粉を栽培学的に重要な系列の種子成長植物と交配する。逆に言うと、これらの重要系列の植物からの花粉を使用して再生植物に受粉させる。当業者に周知の方法を使用して所望ポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物を栽培する。植物組織から植物を再生させる方法は種々のものがある。特定再生方法は出発植物組織と再生させようとする特定植物種によって異なる。エレクトロポレーション、粒子衝撃及びAgrobacteriumを使用する単子葉植物の形質転換も報告されている。当然のことながら、本発明の核酸分子の任意のものをベクター、プロモーター、エンハンサー等の他の遺伝子エレメントと共に永久的又は一過的に植物細胞に導入できる。天然又は組換えにより宿主細胞により生産され得る基質と、後から宿主細胞に導入するベクターに存在するDNA配列によりコードされ得る酵素を図1に示す。 上記に鑑み、本発明はデサチュラーゼ酵素(即ち5又は6)の製造方法として、1)デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を単離する段階と、2)前記ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、3)デサチュラーゼ酵素の生産に十分な時間及び条件で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含む方法に関する 本発明はポリ不飽和脂肪酸の製造方法として、デサチュラーゼが酸をポリ不飽和脂肪酸に変換するように酸を酵素に暴露する段階を含む方法にも関する。その後、4−デサチュラーゼを使用することにより(n−3)−ドコサペンタエン酸をDHAに変換することができる。即ち、5−デサチュラーゼは特定有効目的に使用可能なポリ不飽和脂肪酸の製造に使用することができる。6−デサチュラーゼの役割については、酵素が酸をGLAに変換するようにリノレン酸を酵素に暴露することができる。その後、エロンガーゼを使用してGLAをDGLAに変換することができる。その後、DGLAを5−デサチュラーゼに暴露することによりDGLAをAAに変換することができる。別例として、ALAをSTAに変換するためにはALAを6−デサチュラーゼに暴露することができる。その後、エロンガーゼを使用することによりSTAを20:4n−3に変換することができる。即ち、6−デサチュラーゼは有利な性質をもつPUFAの製造や、他のPUFAの製造に使用することができる。 5−デサチュラーゼ遺伝子、6−デサチュラーゼ遺伝子、及びこれらの遺伝子によりコードされる酵素の使用 上述のように、単離デサチュラーゼ遺伝子とこれらの遺伝子によりコードされるデサチュラーゼ酵素は多くの用途がある。例えば、遺伝子と対応する酵素はポリ不飽和脂肪酸の製造に間接又は直接的に使用することができ、例えば、5−デサチュラーゼはAA、アドレン酸又はEPAの製造に使用することができる。(「直接」とは酵素が酸を組成物で利用する別の酸に直接変換する状況(例えばDGLAからAAへの変換)を意味する。 「間接」とは酸がデサチュラーゼにより別の酸(即ち中間経路)に変換(例えばDGLAからAA)された後、後者酸が非デサチュラーゼ酵素の使用(例えばエロンガーゼによりAAからアドレン酸)又は別のデサチュラーゼ酵素の使用(例えば17−デサチュラーゼによりAAからEPA)に変換される状況を意味する) これらのポリ不飽和脂肪酸(即ちデサチュラーゼ酵素の活性により直接又は間接的に製造されたポリ不飽和脂肪酸)は例えば栄養組成物、医薬組成物、化粧品及び動物飼料に添加することができ、これらのいずれも本発明に含まれる。これらの使用について以下に詳述する。本発明は栄養組成物を含む。このような組成物は本発明の目的では体内に取込まれると、(a)組織を強化又はエネルギーを供給し、及び/又は(b)十分な栄養状態又は代謝機能を維持、回復又は補助するにように作用するヒト消費用(胃又は腸消費用を含む)任意食品又は調製物を含む。本発明の栄養組成物は本発明によるデサチュラーゼ遺伝子の使用により直接又は間接的に製造された少なくとも1種の油又は酸を含み、固体形態でも液体形態でもよい。更に、組成物は特定用途に必要な量の食用多量養素、ビタミン及びミネラルを加えてもよい。このような成分の量は組成物を健常乳児、幼児又は成人に使用するのかあるいは所定代謝状態(例えば代謝障害)を伴う等の特殊な要求のあるものに使用するのかによって広い範囲をとる。組成物に添加でかる多量養素の例としては食用脂肪、炭水化物及び蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。このような食用脂肪の例としてはヤシ油、大豆油並びにモノ及びジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。このような炭水化物の例としては蔗糖、食用乳糖及び加水分解澱粉が挙げられるが、これらに限定されない。更に、本発明の栄養組成物で利用可能な蛋白質の例としては大豆蛋白質、電気透析ホエイ、電気透析脱脂乳、ホエイ、又はこれらの蛋白質の加水分解物が挙げられるが、これらに限定されない。ビタミンとミネラルとしては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、並びにビタミンA、E、D、C及びE複合体を本発明の栄養組成物に添加できる。本発明の栄養組成物で利用する成分は半精製又は精製物に由来する。半精製又は精製とは、天然材料に精製又は合成により製造した材料を意味する。本発明の栄養組成物の例としては乳児用調製乳、栄養補助食品、代用食品及び再水和組成物が挙げられるが、これらに限定されない。特に有利な栄養組成物としては経腸及び非経腸乳児用補給剤、特殊乳児用調製乳、高齢者用補給剤、及び胃腸障害及び/又は吸収不良者用補給剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の栄養組成物は食事の補充を必要としない場合にも食品に添加できる。例えば、組成物は任意種の食品に添加することができ、例えばマーガリン、調製バター、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック菓子、サラダ油、調理用油、調理用脂肪、肉類、魚肉及び飲料が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好適態様では、栄養組成物は経腸栄養製品であり、成人又は小児経腸栄養製品がより好ましい。この組成物は慢性又は急性疾患状態によりストレスを受けていたり、特殊処置が必要な成人又は小児に投与することができる。組成物は本発明により製造されるポリ不飽和脂肪酸に加え、上記のような多量養素、ビタミン及びミネラルを加えてもよい。多量養素は人乳に含まれると等価の量又はエネルギー換算即ちカロリー当たりの換算で添加することができる。 液体又は固体経腸及び非経腸栄養製剤の処方方法は当分野で周知である(下記実施例も参照されたい) 経腸製剤は例えば滅菌後に即使用(RTF)式で利用してもよいし、濃縮液体又は粉末で保存してもよい。粉末は上記のように調製した製剤を噴霧乾燥し、濃縮物を再水和して再構成することにより製造することができる。本発明により製造した油又は酸はこれらの製剤の任意のものに添加することができる。 本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態の場合には約0 固体又は粉末形態の場合には、栄養補給剤に約1 栄養製剤には本発明により製造したPUFA以外に上記のように多量養素、ビタミン及びミネラルを加えることができる。これらの付加成分の存在は個体がこれらの成分の最小1日必要量を摂取するのを助ける。PUFA提供に加え、亜鉛、銅、葉酸及び酸化防止剤を組成物に加えると望ましい場合もある。これらの物質はストレス下の免疫系を強化するので、組成物を投与する個体に更に有利である。これらの成分は医薬組成物にも添加できる。より好ましい態様では、栄養組成物は酸化防止剤と少なくとも1種のPUFAに加えて炭水化物源を含み、炭水化物の少なくとも5重量%は食用オリゴ糖である。より好ましい態様では、栄養組成物は更に蛋白質、タウリン及びカルニチンを含む。上述のように、本発明により製造したPUFA又はその誘導体は代用食品又は補助食品、特に乳児用調製乳に添加し、点滴栄養患者や、栄養不良又は他の状態もしくは疾患状態の予防又は治療に用いることができる。 背景として、人乳の脂肪酸プロフィルはDHA約0 04%であることに留意すべきである。即ち、本発明により製造されるAA、EPA及び/又はドコサヘキサエン酸(DHA)等の脂肪酸は例えば人乳のPUFA濃度を良好に増すように乳児用調製乳の組成を変更したり、非ヒト哺乳動物母乳に通常含まれるPUFA濃度を変えるために使用することができる。特に、医薬又は食品補給剤、特に母乳代用剤又は補給剤に使用する組成はAA、DGLA及びGLAの1種以上を含むことが好ましい。2〜約30%を含むことがより好ましい。 本発明はトリグリセリドとして計算した場合に脂肪酸約2〜約30重量%を含む非経腸栄養組成物に関する 場合により、他のビタミン、特に脂溶性ビタミン(例えばビタミンA、D、E)やL−カルニチンも加えてもよい。 所望により、−トコフェロール等の防腐剤を約0 1重量%加えてもよい。更に、AA、DGLA及びGLAの比は特定所期最終用途に合わせて調節することができる。宿主細胞で同時に製造する場合には、GLAやDGLA等の前駆物質基質からAAへの変換率を調節してPUFA比を厳密に制御することが好ましい。従って、細胞培養系であるか宿主動物中であるかに関係なく、デサチュラーゼ発現のタイミング、程度及び特異性と、他のデサチュラーゼ及びエロンガーゼの発現を調節することにより、PUFA濃度及び比を調節することができる。更に、本発明により製造したPUFA又はこれを含む宿主細胞を動物飼料補給剤として使用し、動物の組織又は乳脂肪酸組成をヒト又は動物消費により望ましいものに変えることもできる。本発明は本明細書に記載するデサチュラーゼ遺伝子を使用して本明細書に記載する方法により製造した酸及び/又は油の1種以上を含む医薬組成物にも関する。より具体的には、このような医薬組成物は酸及び/又は油の1種以上と医薬的に許容可能な標準周知非毒性キャリヤー、アジュバント又はビヒクル、例えばリン酸緩衝塩類溶液、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤又はエマルション(例えば水/油エマルション)を含むことができる。組成物は液体形態でも固体形態でもよい。例えば、組成物は錠剤、カプセル剤、飲用液剤もしくは粉末剤、注射剤、又は局所軟膏もしくはクリームの形態とすることができる。例えば分散剤の場合には所望粒度を維持し、界面活性剤を使用することにより適正な流動性を維持することができる。例えば糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を加えると望ましい場合もある。このような不活性希釈剤以外に、湿潤剤、乳化懸濁剤、甘味料、調味料及び香料等のアジュバントを組成物に加えてもよい。懸濁液は活性化合物以外に例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル類、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天−寒天及びトラガカントガム又はこれらの物質の混合物等の懸濁剤を含むことができる。錠剤やカプセル剤等の固体剤形は当分野で周知の技術を使用して製造することができる。例えば、本発明により製造したPUFAを乳糖、蔗糖及びコーンスターチ等の慣用錠剤基剤に結合剤(例えばアラビアガム、コーンスターチ又はゼラチン)、崩壊剤(例えばジャガイモ澱粉又はアルギン酸)及び滑剤(例えばステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム)を加えて錠剤化することができる。カプセル剤は酸化防止剤及び該当PUFAと共にこれらの賦形剤をゼラチンカプセルに封入することにより製造することができる。酸化防止剤とPUFA成分は上記基準に合うようにする。静脈内投与には、本発明により生産したPUFA又はその誘導体をIntralipids(登録商標)等の市販製剤に配合すればよい。 典型的な健常成人血漿脂肪酸プロフィルはAA6 患者で正常脂肪酸プロフィルに達するようにこれらのPUFA又はその代謝前駆物質を単独又は他のPUFAと併用して投与することができる。所望により、製剤の各成分を単一又は多重使用可能なキット形態で個々に提供してもよい。 特定脂肪酸の典型的な用量は0 本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては例えば経腸(例えば経口及び直腸)と非経腸が挙げられる。例えば、液体製剤を例えば経口又は直腸投与することができる。更に、均一混合物を水に完全に分散し、滅菌条件下に生理的に許容可能な希釈剤、防腐剤、緩衝液又は推進剤と混合し、スプレー又は吸入剤を形成することができる。投与経路は当然のことながら所望効果に依存する。例えば、肌荒れ、乾燥又は老化の治療や、皮膚損傷又は火傷の治療や、疾病又は障害により損傷した皮膚又は毛髪の治療に組成物を利用する場合には、局所塗布すればよいと思われる。組成物の患者投与量は当業者が決定することができ、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態等の種々の因子により異なる。剤形としては、組成物は例えば液剤、分散液、懸濁液、エマルション又は後で再構成する滅菌粉末とすることができる。本発明は更に本明細書に記載する医薬及び/又は栄養組成物の使用による各種疾患の治療にも関する。特に、本発明の組成物は血管形成後再狭窄の治療に使用することができる。更に、炎症、関節リウマチ、喘息及び乾癬の症状も本発明の組成物で治療することができる。PUFAはカルシウム代謝に関与していることも分かっているので、本発明の組成物は恐らく骨粗鬆症や腎臓又は尿管結石の治療又は予防にも利用できると思われる。更に、本発明の組成物は癌の治療にも使用できる。悪性細胞は脂肪酸組成の変化が示されている。脂肪酸を加えるとその増殖が抑制され、細胞死を生じ、化学治療剤感受性を増すことが分かっている。更に、本発明の組成物は癌に伴う悪液質の治療にも有用であると思われる。糖尿病動物では脂肪酸代謝及び組成の変化が示されている。更に、デサチュラーゼ酵素の使用により直接又は間接的に製造したPUFAを含む本発明の組成物は湿疹治療、血圧降下及び検査数値の改善にも使用できる。 更に、本発明の組成物は血小板凝固、血管拡張の誘導、コレステロールレベル低下、血管平滑筋及び繊維組織の増殖抑制(Brennerら,Adv 本発明の組成物の他の用途としてはAIDS、多発性硬化症及び炎症性皮膚疾患の治療と、健康維持が挙げられる。更に、本発明の組成物は化粧目的にも利用できる。混合物を形成するように既存化粧品組成物に添加してもよいし、単独組成物として使用してもよい。動物は要求及び条件の多くがヒトと同一であるので、上記医薬及び栄養組成物は動物(即ち家畜又は非家畜)でもヒトと同様に利用できる。例えば、本発明の油又は酸は動物又は水産養殖飼料添加物、動物代用飼料、動物ビタミン又は動物局所軟膏に利用することができる。以下、実施例により本発明を説明するが、これにより発明を限定するものではない。 真菌からのデサチュラーゼ単離とcDNAライブラリー構築のための縮重オリゴヌクレオチドの設計 aureumからこれらの推定デサチュラーゼ遺伝子を単離し、最終的に代替宿主で発現させることにより機能を確認することを目的にした。機能的デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子を単離するために、生物毎にcDNAライブラリーを構築した。チーズクロス数層で濾過することにより菌糸体を回収し、乳鉢乳棒を使用して液体窒素中で培養物を粉砕した。これらの細胞を5000rpmで10分間遠心分離により回収し、RNアーゼを含まない氷冷水で濯いだ。これらの細胞を次にフレンチプレスで10,000psiで溶解させ、溶解細胞をTE緩衝フェノールに直接集めた。フェノール:クロロホルム(1:1v/v)抽出の反復後にクロロホルム抽出により細胞溶解液から蛋白質を取出した。6)とイソプロパノール1容量を使用して水相から核酸を−70°Cで30分間沈殿させた。オリゴdTセルロース樹脂を使用して各生物の全RNAからmRNAを単離した。 液体窒素中で培養物を粉砕することによりS 採用したアプローチは公知デサチュラーゼで保存されているアミノ酸モチーフを示す縮重オリゴヌクレオチド(即ちプライマー)を設計することであった。これらのプライマーをPCR反応で使用すると、真菌から推定デサチュラーゼ遺伝子に保存領域を含むフラグメントを同定することができた。これらの縮重プライマーの設計には以下の生物からの公知5及び6−デサチュラーゼ配列を使用した。更に、公知6−デサチュラーゼに存在する第2及び第3の保存「ヒスチジンボックス」に基づいて他の2種のプライマーを設計した。6−デサチュラーゼ遺伝子を単離するために、上記縮重オリゴヌクレオチドの各種順列と組合せをPCR反応で使用した。試験した各種プライマー組合せのうちで明白なバンドを生じたプライマーはRO834/FO838のみであった。こうして従来同定されている6−デサチュラーゼに配列相同を示すクローン2個を単離した。これらのクローンは次のように説明される。2%の一致を示した。5%の一致を示した。 これらの2種の配列は相互にオーバーラップしており、S 次にこの新規6−デサチュラーゼ配列を使用し、S 72°Cで10分間の最終伸長サイクルを実施した後に反応を終了した。PCR熱サイクル条件は以下の通りとした。このフラグメントの推定アミノ酸配列を公知6−デサチュラーゼと整列させると、37〜45%の一致度を示した。diclinaゲノムDNAを鋳型として下記オリゴヌクレオチドを使用してPCR増幅によりこの新規6−デサチュラーゼ遺伝子全体を単離した。 クローンsd21−2の5’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングを助長するためのEcoRI部位(下線部)を含むオリゴヌクレオチド 停止コドンを含むsd2−2の3’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングのためのHindIII部位(下線部)を含むオリゴヌクレオチド 熱サイクル条件は以下の通りとした。6−デサチュラーゼ全長遺伝子インサートは長さ1362bp(配列番号13、図2)であり、最初のATGから開始し、453アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含んでいた。 他の膜結合6−デサチュラーゼと同様に、S この配列は5’末端にシトクロムb5ドメインも含んでいた。このシトクロムb5ドメインは多数の膜結合デサチュラーゼ酵素に存在しており、シトクロムb5はこれらの酵素で電子供与体として機能すると考えられる。このドメインの存在はPUFA生産のために異種系でデサチュラーゼを発現させるときに有利であると思われる。この遺伝子は植物でPUFA生合成経路の再構成に使用することが提案されているので、この遺伝子の塩基組成は重要であると思われる。(組換え遺伝子のうちには宿主と塩基組成が異なるために発現しにくいものがあることは公知である。 この遺伝子の総G+C含量は59%であり、植物での発現に成功しているM diclinaから5−デサチュラーゼを単離するには、6−デサチュラーゼ単離と同様に第1鎖cDNAを鋳型として使用して縮重プライマーの各種組合せをPCR反応で使用した。熱サイクルは次のように実施した。二次PCRフラグメントは実施例2に記載した反応でプライマーRO834とRO838を使用して同定した。 次にこれらの配列を使用し、S 72°Cで7分間の最終伸長サイクルを実施した後に反応を終了した。クローンsd12−11は公知5−デサチュラーゼとの配列相同に基づいて推定5−遺伝子の3’末端を含み、更に「TAA」停止コドンとポリAテールを含む648bpインサートを含んでいた。このフラグメントの推定アミノ酸配列を分析した処、公知5−デサチュラーゼと相同性の高い領域を示し、シトクロムb5ドメインも存在することが判明した。diclinaゲノムDNAを鋳型として下記オリゴヌクレオチドを使用してPCR増幅により全長5−デサチュラーゼ遺伝子を単離した。 「全長」遺伝子のPCR増幅条件はゲノムDNAからの6−デサチュラーゼの増幅について記載したと同様とした(実施例2) 6−デサチュラーゼと同様に、この配列は5’末端にシトクロムb5ドメインも含んでいた。 パン酵母におけるS ロイシンを欠失する培地(DOB[−Leu])で形質転換体をロイシン栄養要求性に関して選択した。これらのクローンの特異的デサチュラーゼ活性を検出するために、下記特異的脂肪酸基質50Mの存在下に形質転換体を増殖させた。 ステアリン酸(18:0)(オレイン酸への変換は9−デサチュラーゼ活性を示す) 細胞をペレット化し、メタノール中でボルテックスし、クロロホルムと(内部標準として)トリトリデカノインを加えた。これらの混合物を室温で少なくとも1時間又は4°Cで一晩インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、無水硫酸ナトリウム1gを使用してWhatmanフィルターで濾過し、粒状物と残留水を除去した。有機溶媒を窒素流下に40°Cで蒸発させた。 次に、メタノール中0 5N水酸化カリウム2mlを密閉管に加えることによりガスクロマトグラフィー分析(GC)に備えて抽出した脂質を脂肪酸メチルエステル(FAME)に誘導体化した。メタノール中14%三弗化ホウ素約2mlを加え、加熱を繰返した。抽出した脂質混合物が冷却した後、水2mlとヘキサン1mlを加え、GC分析のためにFAMEを抽出した。産物を(産物+添加基質)の和で割って100を掛けることにより変換率を計算した。表1は添加基質の変換率に基づく単離遺伝子の酵素活性を示す。これは遺伝子が6−デサチュラーゼをコードすることを裏付けている。この場合にはバックグラウンド(基質の非特異的変換)はなかった。(本明細書に引用する表は末尾にまとめて示す。この場合もバックグラウンド基質変換は検出されなかった。このデータは種々の基質特異性をもつデサチュラーゼを異種系で発現させることができ、更にポリ不飽和脂肪酸を生産するために使用できることを示している。 表2は指定プラスミドを含むS 増殖培地にグルコースは加えなかった。アフィニティガスクロマトグラフィーを使用して各脂質を分離した。GC/MSを利用して生成物を同定した。この表から明らかなように、外部から加えた基質は遊離形態で加えた場合には組換え酵母により取込まれ、その膜に取込まれる。 diclinaデサチュラーゼとエロンガーゼの同時発現 このエロンガーゼ遺伝子はPUFA経路の伸長段階の一部を触媒する。 これらの同時形質転換酵素による基質から終産物への変換率は26 4%であり、陰性対照からバックグラウンドは観察されない。diclina6−デサチュラーゼは異種発現系で生成物を生産することができ、この発現系をPUFA生合成経路からの別の異種酵素により更に利用すると予想PUFAを生産することができた。 これらの同時形質転換酵素による基質から終産物への変換率は38 6%であり、陰性対照からバックグラウンドは観察されない。 alpinaに由来するエロンガーゼ遺伝子(pRSP2)(配列番号22)で同時形質転換した場合にも同様の結果が観察され、両者遺伝子は相互の存在下に機能的であることが判明した(表3及び表4参照) 推定デサチュラーゼを単離するために、実施例2に記載したように全RNAを単離した。熱サイクルは次のように実施した。この後、72°Cで7分間の最終伸長を実施した。公知デサチュラーゼと相当程度のアミノ酸相同度があったので、推定デサチュラーゼをコードする全長遺伝子について酵母発現時のその活性を求めた。熱サイクル条件は次のように実施した。2kbの予想寸法を含む数個のバンドを上述のように1%アガロースゲル上で分離し、精製した。同じく上述のように、フラグメントの末端を平滑にし、PCR−Bluntにクローニングし、配列決定した。2kbのフラグメント#70−2を配列決定した処、フラグメント30−9とオーバーラップするオープンリーディングフレームと停止コドンを含んでいた。熱サイクル条件は以下の通りとした。予想寸法範囲にある約500bpのバンドを上述のようにゲル精製し、平滑末端化し、PCR−Bluntにクローニングした。クローン95−2はオープンリーディングフレームと出発コドンを含んでいた。このフラグメントもクローン30−9とオーバーラップしており、確かに同一遺伝子の部分であると思われた。停止コドンを含むプライマーRO949はGC含量66%であるが、停止コドンの外側の別のプライマーRO950はGC含量が56%しかないので、初期単離の試みでは遺伝子の3’末端に2種のプライマーを使用した。6kbのバンドを生じた。(標的100ngと同一条件で)ゲノムDNAを鋳型として使用した場合にも同様の寸法のバンドが得られた。フラグメントを上述のようにアガロースゲル上で分離し、ゲル精製し、平滑末端化し、PCR−Bluntにクローニングした。この遺伝子の5’末端を翻訳すると、シトクロムb5との相同を示す。 パン酵母におけるT 全長遺伝子を含むクローンpRTA4を実施例4に記載したように酵母宿主S ロイシンを欠失する最少培地に基質として表5に示すように外因遊離脂肪酸50Mを加え、培養液を24°Cで48時間増殖させた。7%が変換され、この遺伝子は5−デサチュラーゼをコードすることがわかる。表6は酵母宿主から抽出した脂質の百分率として脂肪酸の一部を示す。5−デサチュラーゼ活性についてはバックグラウンド(酵母発現プラスミドPYX242を含む陰性対照で観察されるARAの検出)はなかった。 aureumデサチュラーゼとエロンガーゼの同時発現 実施例4に記載したような酵母発現ベクターpYES2に、PUFA経路の更なる酵素、ヒトエロンガーゼ遺伝子を含むpRAE73−A3、でプラスミドpRTA4を同時形質転換し、ロイシンとウラシルを欠失する最少培地で同時形質転換体を選択した。7%であり、陰性対照からバックグラウンドは観察されない。 以上の結果、T aureum5−デサチュラーゼは異種発現系で生成物を生産することができ、この発現系をPUFA生合成経路からの別の異種酵素により更に利用すると予想PUFAを生産することができる。実施例1に記載した縮重プライマー対RO834/RO836を使用して部分デサチュラーゼ候補を単離した。4Kbの増幅フラグメントをゲル精製した。遺伝子フラグメントT7091B2は公知データベースと一致があったので更に調べた。3’及び5’末端を単離するために、T7091B2内部配列に基づいて新規プライマーを設計した。新規プライマーとベクタープライマーを使用して平均インサート寸法1Kbのクローン約2×107個を含むT7091 cDNAライブラリーをPCR増幅した。 この新規5−デサチュラーゼはT PCR増幅混合物をゲル上で泳動させ、約1 4%一致度であった。T7091 cDNAライブラリーからの373個の鋳型を配列決定し、ライブラリーの生存性を調べた。翻訳配列をクエリーとして使用し、tFastAアルゴリズムを使用してGenEmb1データベースを検索した。増幅用プライマーを設計するためにESTクローンの5’及び3’末端を配列決定した。 PCR増幅混合物をゲル上で泳動させ、約1 配列は1アミノ酸が異なり(図13)、翻訳配列はヒト5−デサチュラーゼと430アミノ酸で25%一致度であった。 パン酵母におけるT ロイシンを欠失する培地(DOB[−Leu])で形質転換体をロイシン栄養要求性に関して選択した。pRAT−1 cDNAの翻訳配列はどの特定公知デサチュラーゼとも強い一致がないので、数種の脂肪酸基質を試験して発現酵素の活性を調べた。pRAT−1a及びpRAT−1bクローンの特異的デサチュラーゼ活性を検出するために、下記特異的脂肪酸基質100Mの存在下に形質転換体を増殖させた。培養液を特定基質の存在下に選択培地で48時間24°Cで増殖させた。実施例4に要約したように脂肪酸分析を実施した。98%であったが、対照株では検出可能な量ではなかった。対照株に比較してT7091遺伝子を含む株ではどちらからも全3種の活性が検出された。変換率によると、この酵素は基質が適正であれば5又は8−デサチュラーゼと同様に機能することができる活性な6−デサチュラーゼである。しかし、これらから夫々の不飽和化脂肪酸への変換率は6−不飽和化基質に比較すると低い。 2個のクローン間の単一アミノ酸変異(図13、下線部参照)は酵素活性に影響なかった(データは示さず) 変換率を表9の下欄に示す。新規脂肪酸の生産がデサチュラーゼの活性によるのかエロンガーゼの活性によるのか、あるいは2種の酵素の組合せによるのかを調べるのは困難であるので、同時発現実験では変換率を計算しなかった。aureum 7091からデサチュラーゼ遺伝子を同定するために、2種の新規遺伝子単離方法が開発されている。これらの方法でT70915−デサチュラーゼ及び6−デサチュラーゼ遺伝子を単離した。 これらの遺伝子と適当な基質の存在質に、S cerevisiaeは対照株よりも著しく高レベルの不飽和脂肪酸を生産した。本実験の結果、pRAT−2cから発現した酵素は(エロンガーゼにより生産された)DGLAをAAに不飽和化することが確認された。本実験の結果、pRAT−1aから発現した酵素はLAをGLAに不飽和化することが確認された。実施例1に記載した縮重プライマー対RO834/RO836を使用して部分デサチュラーゼ候補を単離した。1Kbの増幅フラグメントをゲル精製した。全配列は同一であった。 5’及び3’末端を単離するために、単離I galbanaフラグメントの内部配列に基づいて新規プライマーを設計した。4gを製造業者の指示に従って使用して逆転写し、cDNAターゲットを生産した。2kbのバンドが検出された。熱サイクルパラメーターは以下の通りで実施した。 パン酵母におけるI 全長遺伝子を含むクローンpRIG−1を実施例4に記載したように酵母宿主S ロイシンを欠失する最少培地に基質として表10に示すように外来遊離脂肪酸50Mを加え、培養液を24°Cで48時間増殖させた。75%であり、この遺伝子は5−デサチュラーゼをコードすることがわかる。表10は酵母宿主から抽出した脂質の百分率として脂肪酸の一部を示す。5−デサチュラーゼ活性についてはバックグラウンド(酵母発現プラスミドpYX242を含む陰性対照で観察されるARA又はEPAの検出)は殆ど又は全くなかった。 galbanaデサチュラーゼ遺伝子とエロンガーゼの同時発現 実施例4に記載したような酵母発現ベクターpYES2にヒトエロンガーゼ遺伝子を含むPUFA経路付加酵素pRAE73−A3でプラスミドpRIG−1を同時形質転換し、ロイシンとウラシルを欠失する最少培地で同時形質転換体を選択した。galbana5−デサチュラーゼは異種発現系で生成物を生産することができ、この発現系をPUFA生合成経路からの別の異種酵素により更に利用すると予想PUFAを生産することができる。詳細な説明に記載したPUFAは種々の栄養補給剤、乳児用調製粉乳、代用栄養剤及び他の栄養溶液で利用することができる。 用途:牛乳アレルギー又は過敏症の乳児、幼児及び成人用飲料 乳糖を避けなければならない疾患(ラクターゼ欠乏症、乳糖不耐症及びガラクトース血症)の患者への栄養 −牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用 −乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。 −炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物(コーンシロップと蔗糖)を使用 −鉄欠乏症の予防を助長するために100カロリー当たり1 −推奨値のビタミンとミネラルを配合 −推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合 −乳白色、乳状コンシステンシー及びよい香り 用途:乳幼児の下痢の食物管理用短期摂取食 −特に下痢管理用として大豆繊維からの食物繊維を加えた最初の乳児用調製乳である。−乳児の軽度から重度の下痢期間に水状軟便期間を短くすることが臨床的に判明した。−乳児の栄養要件を満足するように栄養学的に完全である。−L−メチオニンを添加した大豆蛋白単離物は乳児の全必須アミノ酸の必要値を満足するか又はこれを上回る。−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。 −炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物(コーンシロップと蔗糖)を使用 −米国小児科学会栄養委員会により推奨され、乳児用調製乳法に規定されるビタミン及びミネラル値を満足するか又はこれを上回る。 −鉄欠乏症の予防を助長するために100カロリー当たり1 −推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合 用途:牛乳蛋白アレルギーもしくは過敏症又は蔗糖不耐の乳児、幼児及び成人用飲料 乳糖と蔗糖を避けなければならない疾患の患者への栄養 −牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用

バンダナのポケットに保冷剤を入れて簡単に使えるクールバンダナ。こちらのグッズは小型犬用なので、バンダナ本体と保冷剤を合わせて30g未満の軽さで、犬への負担が最小限に抑えられています。バックルで簡単に装着することができます。カラーや柄のバリエーションが豊富なので、愛犬のおしゃれ感覚で選べます。 ひんやりお散歩ベスト 日中を避けて涼しくなる夕方などに散歩に行っても、意外と地面からの反射熱が残っていますよね。人間と比べて地面との距離が近い犬たちにとって、夏の反射熱は大敵。こちらのベストは水につけるだけで何回も使用できる涼感ベストです。背中に被せて首とお腹にあるマジックテープのベルトを止めるだけで簡単に装着することができます。

さて本題です。Dobbyの記事をちょくちょく探していると例の surehobby.comのサイトで編隊飛行が可能なDobbyの機体やマーカー、アプケーションのセットが160万円！で販売されているのを発見しました。 Dobbyに搭載されたQualcommのSnapdragon 801クアッドコア2.3GHzのチップは Xperia Z3 Compactと同じ物なのでスマホが飛んでると思えば納得です。 16機のフォーメーション飛行はなかなかのもので楽しいです。

漫画と言えば、「10代を対象にしたもの」だと考えているかもしれないですね。けれども人気急上昇中のBookLive代打屋トーゴー 24巻には、お母さん・お父さん世代が「若かりし日を思いだす」と思ってもらえるような作品も数え切れないくらいあります。 電子書籍を買うというのは、ネットを介して情報を取得することを意味するわけです。サービスが停止してしまうようなことがあると利用できなくなってしまいますから、何としても比較してから信頼のおけるを選択したいものです。 Kは相変わらずはいはいをしない。代わりにお尻歩きと伝い歩きを巧みに組合せ、家中を移動するようになった。ベビーサークルは買わない方向で話がまとまったがベビーゲートはやはり必要か。スリッパやゴミ箱など触ってほしくないものに限って興味深々のよう。 地下道を歩いていると女性に声をかけられた。顔をみてすぐ思い出す。引越してきてすぐくらいの時に地下街で声を掛けられた美容キャッチのおねえさんだった。名刺渡したのにどうして連絡してこないの？と聞かれる。それはね営業されるのが嫌で名刺も処分したからだよ・・・

町営スキー場のリフトの不具合により，今シーズン町営スキー場が営業しないことともあり，スキーに行く機会が少ないのではないかと思います。特色ある教育活動の一つである，スキー学習の１回目が３学期はじまってすぐに実施されますので，学習の事前準備をよろしくお願いします。

Michel Corringe, de son vrai nom Michel Corring, né à Tunis le et mort à Lorette le , est un auteur-compositeur-interprète. Biographie Arrivé en France en 1958 dans la région de Montluçon, Michel Corringe enregistre en 1968 la chanson qui le fera connaître, La Route ( de l'album vendus). Routard, bourlingueur, c'est un émule déclaré des beatniks et en particulier de Jack Kerouac qui lui inspire certaines chansons. Corringe incarne dans les années 1970 les idéaux d'une génération et les années dites « soixante-huitardes ». Il chante cela d'une voix puissante et belle, accompagné d'artistes comme Dan Ar Braz. Viennent ensuite plusieurs 45 tours et albums, jusqu'en 1982. En 1982 paraît Aldebaran, un album dans lequel il semble avoir trouvé une certaine sérénité après le son rock de son album précédent, J'ai mal, j'ai peur mais je t'aime (1979). Au Printemps de Bourges où il chante en 1984, il passe la main et quitte le monde de la chanson, tout en continuant à écrire. Phénix, son ultime album et seul CD sort 14 ans plus tard, en 1998. Cet album, enregistré à Brest, est composé en grande partie de réenregistrements de ses propres chansons (principe qu'il affectionne et applique tout au long de sa carrière) et de quelques créations. Les dernières années de sa vie, il vit dans la région de Lyon, à Saint-Étienne, puis en Bretagne, sur la côte nord du Finistère. Peu soutenu dans les grands médias, hormis Michel Lancelot et Jean-Louis Foulquier, usé par l'alcool et la maladie, Michel Corringe meurt le , dans l'oubli, à Lorette près de Saint-Étienne. Il est incinéré puis enterré près de sa mère dans le village natal de celle-ci, Charolles en Saône-et-Loire. Repères chronologiques 1964 : Baccalauréat math-élem 1965 : Première année de faculté de physique-chimie à Lyon 1966 : Faculté de chimie à Lyon 1968 : Préparation math sup à Lyon 1973-1975 : Sortie de deux 33 tours et assistant-réalisateur de l'émission radio Campus sur Europe 1 1975-1981 : Sortie de cinq 33 tours avec récompense de trois disques d'or 1981 : Achat et gestion du Théâtre de la Roquette à Paris 1986 : Gérance d'un restaurant à l'Aber-Wrac'h en Bretagne 1985-1987 : Voyages à l'étranger dont un an au Québec, animation d'une Radio FM CKVL Montréal 1987 : Direction du théâtre Les Clochards célestes à Lyon Croix-Rousse 1990 : Animation du cabaret Les Faux-Nez à Lausanne 1992 : Intermittent du spectacle, construction de décors pour FR3 Marseille 1995 : Projet de gestion d'une librairie-restaurant à Marseille 1998 : Sortie du CD Phénix 2001 : Décès à Lorette Discographie 33 tours CD Phénix (1998) La Route, réédition en 2008 de l'album Les Paumés chez Magic Records Laissez-nous vivre, réédition en 2012 de l'album de 1975 chez Magic Records. 45 tours Le Fils du grand Martin (1970) Triste matin (1970) Kerouac Jack (1971) La Fille qui danse (1971) Bonjour / Reviens chez nous (1977) Références Chanteur français du XXe siècle Naissance en août 1946 Naissance à Tunis Décès en octobre 2001 Décès à 55 ans Décès dans la Loire

Csanády István (Baja, 1833. október 11. – Buda, 1867. december 17.) a magyar udvari kancellária hivatalnoka, gyorsírója, a Bécsi Magyar Gyorsíró Egylet alapító tagja, alelnöke. Élete Előbb növendékpap volt, később a bécsi egyetemen a bölcseletet és jogot hallgatta. 1860-ban a bécsi udvari kancelláriánál hivatalt vállalt. A magyar gyorsírás terén kiváló érdemei voltak, a reformtörekvések egyik legelső munkása és a Gabelsberger–Markovits-féle gyorsírási rendszernek egyik legelső követője hazánkban. Alapítója volt a bécsi magyar gyorsíró körnek, mely csak néhány tagból állt, de ebből nőtte ki magát a budapesti gyorsíró egylet. 1864-ben a bajai gimnáziumban gyorsírótanfolyamot szervezett és kiadta a legelső magyar gyorsirási emlékkönyvet is. Amikor az alkotmány visszaállítása és a magyar udvari kancellária szétoszlatása után Bécsből Budára utazott, hogy itt munkahelyet keressen, váratlanul elhunyt. A tabáni temetőben helyezték nyugalmra, melynek megszüntetésekor sírkövét, amelyet megőrzésre az Országházba vittek, a feliratot gyorsírási jelekkel vésték bele. Munkái Gyorsirászati Évkönyv. Bécs, 1865. Források Magyar életrajzi lexikon A Pallas nagy lexikona További információk Makoldy Sándor: Magyar gyorsírók pantheonja. Kalauz a Budapesten eltemetett magyar gyorsírók életrajzához és sírjához. Szirt Gizella felvételeivel. Bp., Gyorsírási Ügyek M. Kir. Kormánybiztossága, 1940. Új magyar életrajzi lexikon. Főszerk. Markó László. Bp., Magyar Könyvklub. Magyar gyorsírók Bajaiak 1833-ban született személyek 1861-ben elhunyt személyek

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全ての卒業生へ送る言葉：大事なことは、合格した結果ではなく、これから何をなし何を残せたかです。大事なのはこれからです。勉強自体には何の価値もありません。微分ができる積分ができる。英語がペラペラ。社会の知識を知っている。こんなことは、些細なことで、 つらい時は思い出してください。“ながーいながーい補習”“夜遅くまで質問”“早く来ての質問”“入試前の追い込み”“何枚も書かされた作文”“英単語特訓”“計算特訓”“漢字特訓”そして第一志望校合格きっとこれからもがんばれるはずだと思います。

Фредерик Паркс (; — март ) — британский боксёр, бронзовый призёр летних Олимпийских игр 1908. На Играх 1908 в Лондоне Паркс соревновался в весовой категории свыше 71,7 кг. Дойдя до полуфинала, он занял третье место и выиграл бронзовую медаль. Примечания Ссылки Фредерик Паркс на sports-reference.com Персоналии по алфавиту Бронзовые призёры летних Олимпийских игр 1908 года Боксёры Великобритании Боксёры на летних Олимпийских играх 1908 года

シャルル・ウジェーヌ・ド・フーコー・ド・ポンブリアン（1858年9月15日 - 1916年12月1日）は、フランスのカトリック教会の神父で、探検家、地理学者である。 生涯 1858年、ストラスブールに貴族の家に生まれる。両親にとってシャルルは2人目の子供だった。ヴェルサイユでイエズス会のリセを卒業し、1877年にサン・シール陸軍士官学校を卒業した。フランス領アルジェリアに渡り、その後はモロッコに入国して調査を始めた。1888年に著書『』を発表した。帰国後、彼はパリのサントギュスタン教会に配属された。1890年に厳律シトー会に入会し、シリアやナザレに向かった。トゥアレグ族と共に行動し、彼らの文化を調査した。突然、彼は1916年にタマンラセット近郊で暗殺された。フランス支配に反発したサヌーシー教団によって差し向けられた刺客による犯行ではないかと言われている。 2001年4月24日に教皇ヨハネ・パウロ2世によって尊者に、2005年11月13日には教皇ベネディクト16世によって列福された。2021年11月、教皇庁列聖省は、2022年5月15日に教皇フランシスコによってシャルル・ド・フーコー神父を含む数名の福者の列聖式が執り行われると発表した。2022年5月15日、列聖式が執り行われた。

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ディレンブルク は、ドイツ連邦共和国ヘッセン州ギーセン行政管区のラーン＝ディル郡に属す市である。ヘッセン州中部の中規模都市で、かつてはディル郡の郡庁所在都市であった。 本市はドイツ＝オランダ休暇街道のオラニア＝ルートおよびドイツ木組みの家街道沿いに位置しており、広域遊歩道ロタールシュタイクの起点でもある。 地理 位置 ディレンブルクは、ディル川沿いの谷に位置しており、市の北部でがディル川に注いでいる。市の南部では、シェルダー・ヴァルトから流れ下ったナンツェンバッハ川とシェルデ川がディル川に合流する。ディル川は西のと東のグラーデンバッハ山地との接合点となっており、シェルダー・ヴァルトもこれに含まれる。市の北西、ディル川とディーツヘルツェ川との間にロタール山地の支脈であるシュトルト山がある。また、市内の中核支部とマンデルバッハ地区との間にロタール山地南端の山であるガルゲンベルクがある。 隣接する市町村 ディレンブルクは、北はエッシェンブルク、東はジークバッハ、南はヘルボルンおよびブライトシャイト、西はハイガーと境を接している。隣接する市町村はいずれもラーン＝ディル郡に属している。 市の構成 ディレンブルクは、中核市区とドンスバッハ、アイバッハ、フローンハウゼン、マンデルバッハ、ナンツェンバッハ、ニーダーシェルト、オーバーシェルトの各市区からなる。 歴史 ディレンブルクは1254年に初めて文献に記録されている。90年後の1344年に皇帝ルートヴィヒ4世フォン・バイエルンから都市権を授けられた。 ディレンブルクは、ナッサウ家のオラニア家系の本拠地であった。現在の城山に13世紀末または14世紀初めにディレンブルク城が建設された。この城砦はナッサウ家にとって、ヘルボルン城のようなヘッセン方伯のレーエン城砦ではなく、自前の城砦であったため、高い重要性を有していた。この城砦の絵図は遺されていない。この城はおそらく木造で、デルンバッハのフェーデのために1323年頃に破壊された。 16世紀に旧城砦跡にディレンブルク城館を含むの宮殿が建設された。1536年からこれと並行して近代的な防衛施設の拡充がなされた。ディレンブルク生まれのヴィルヘルム・フォン・オラニエがこの城に亡命してオランダの対スペイン抵抗運動（1567年 - 1572年）を組織したことが、現在もこの町をオランダ王家と結びつけている。この地方は、ナッサウ＝ディレンブルク家の行政管区長官によって運営されていた。最後の長官の1人がプロイシェンおよびリーベンシュタイン男爵ゲオルク・エルンスト・ルートヴィヒである。 1723年に大火が街の大部分を壊滅させた。200棟以上の建物が炎の犠牲となった。この火災後に建設された多くの木組み建築が現在も遺されている。 七年戦争中の1760年にディレンブルク城館は破壊された。城館の廃材からヴィルヘルム通りの建物が建設された。ヴィルヘルムス通りは、たとえばヴィルヘルムス塔と同様、2010年6月8日に武力紛争の際の文化財の保護に関する条約（ハーグ協定）の保護下に置かれた。ヴィルヘルムス通りにはヘッセン州立馬牧場がある。 16世紀に造られた旧城館下の防爆室は、その一部が現存しており、ヨーロッパ最大の地下防衛施設の1つとなっている。この防爆室は戦時には2,000人以上の兵士を収容した。この施設は一部が公開されており、一巡することができる。この施設も、ヴィラ・グリュン同様ハーグ協定の保護下にある。 ナッサウ公国では、この街はアムト・ディレンブルクの本部およびディレンブルク宮廷裁判所の所在地であった。 1875年に、現在この街の象徴的建造物となっているヴィルヘルムス塔が城山に完成した。この塔は、ヴィルヘルム・フォン・オラニエを記念したものである。 19世紀にギーセンからケルンに至る鉄道路線の一部であるジーク＝ディル線の建設により工業化革命が始まった。この地域はラーン川、ディル川、ジーク川流域で発見された鉄鉱石を利用することで発展した。採鉱、冶金、金属加工分野で数多くの企業が創設された。この頃、ディレンブルクから多くの鉄道支線が建設された。ゲンネルンやエーヴェルスバッハへの路線がその例である。ゲンネルンへの路線は1987年に廃止され、完全に撤去された。蒸気機関車時代、多くの支線のために必要だった操車場は1983年に閉鎖された。 第二次世界大戦中、現在は廃止されている操車場を有していたディレンブルクは連合国の爆撃目標とされた。第二次世界大戦後、採鉱はますます採算が合わなくなっていった。1968年に、オーバーシェルト市区の最後の高炉が操業停止した。 2006年9月17日の悪天候により、1 m あたり 103 リットルの雨が降った。ディル川とその支流のシェルデ川の水位は堤防を越え、オーバーシェルト市区およびニーダーシェルト市区に流れ込んだ。1000戸の地下室が完全に浸水し、病院も被害を受け、一部は避難が必要であった。この被害総額は、2千万ユーロをはるかに超えた。 2007年に連邦道 B277号線のバイパス道路として城山トンネルが開通した。このトンネルは城山の下を通って歴史的な木組み建築都市を迂回している。 市町村合併 1971年10月1日にアイバッハ、同年12月31日にマンデルバッハ、1972年4月1日にナンツェンバッハがディレンブルクにそれぞれ自主的に合併した。 ヘッセン州の地域再編に伴って、1977年1月1日にそれまで独立した町村であったドンスバッハ、フローンハウゼン、ニーダーシェルト、オーバーシェルトが「ディル郡、ギーセン郡、ヴェッツラー郡とギーセン市の新設に関する法律」に基づいてディレンブルク市に合併した。 領邦、行政機構 以下にディレンブルクの領邦および行政機構を列記する。 1739年以前: 神聖ローマ帝国アムト・ディレンブルク 1739年から: 神聖ローマ帝国ナッサウ＝ディーツ侯領アムト・ディレンブルク 1806年 - 1813年: ジーク県ディレンブルク小郡 1813年 - 1815年: ナッサウ＝オラニエ侯国アムト・ディレンブルク 1816年から: ドイツ連邦ナッサウ公国アムト・ディレンブルク 1849年から: ドイツ連邦ナッサウ公国クライスアムト・ディレンブルク 1854年から: ドイツ連邦ナッサウ公国アムト・ディレンブルク 1867年から: 北ドイツ連邦プロイセン王国ヴィースバーデン県ディル郡 1871年から: ドイツ国プロイセン王国ヘッセン＝ナッサウ州ヴィースバーデン県ディル郡 1918年から: ドイツ国プロイセン自由州ヘッセン＝ナッサウ州ヴィースバーデン県ディル郡 1932年から: ドイツ国プロイセン自由州ヘッセン＝ナッサウ州ヴィースバーデン県ディレンブルク郡 1933年から: ドイツ国プロイセン自由州ヘッセン＝ナッサウ州ヴィースバーデン県ディル郡 1945年から: 、ヴィースバーデン行政管区ディル郡 1949年から: ドイツ連邦共和国ヘッセン州ヴィースバーデン行政管区ディル郡 1968年から: ドイツ連邦共和国ヘッセン州ダルムシュタット行政管区ディル郡 1977年から: ドイツ連邦共和国ヘッセン州ダルムシュタット行政管区ラーン＝ディル郡 1981年から: ドイツ連邦共和国ヘッセン州ギーセン行政管区ラーン＝ディル郡 住民 人口推移 出典: 行政 市議会 市議会は、本市の最高機関である。その議員は5年ごとに市の有権者の投票により選出される。選挙権は満18歳以上のドイツ基本法に基づくドイツ国民またはEU加盟国の国民で、少なくとも3か月以上本市に居住する者である。 ディレンブルク市の市議会は、37人の議員で構成されている。 姉妹都市 ブレダ（オランダ、北ブラバント州） （ベルギー、フラームス＝ブラバント州） オランジュ（フランス、ヴォクリューズ県） ディレンブルクは1963年に上記3都市と「オラニエ都市連合」を結成した。これらの都市は、ナッサウ＝オラニエ家の重要な宮廷都市であった。 ヘレフォード（イギリス、ヘレフォードシャー）1989年 この姉妹都市協定は、ディレンブルク側は「ドイツ＝イングランド協会」、ヘレフォード側は「トワイニング＝アソシエーション」が担当している。2005年にシュタットハウス（市庁舎の分館で、観光オフィスや自動車登録事務所などが入居している）が「ヘレフォード＝ハウス」と改名された。 紋章 図柄: 青地に胸壁を戴く金色の塔。塔の大きな門の中に金色の獅子と引き上げられた銀色の格子が見られる。 文化と見所 特に遊歩道「ロタールシュタイク」によって、さらにはオランダとの歴史的な関係を通して、ディレンブルクは観光の目的地となっている。 博物館 ディレンブルクには、1760年に破壊されたディレンブルク城趾にオラニエ＝ナッサウ博物館が入居するヴィルヘルムス塔や経済史博物館「ヴィラ＝グリュン」がある。の馬車博物館は、ヘッセン州立馬牧場内にある。 建築 ディレンブルクの有名な建造物としては、たとえば、1872年 - 1875年のヴィルヘルムス塔、16世紀のディレンブルク城館の防爆室、1491年建造の福音主義市教会、1597年建造のディル塔がある。この他に1531年から1533年に建造された牧師館、1344年建造のウンタートーア（下の門、1594年と1737年に改築されている）、数多くの木組み建築が建ち並ぶ歴史的旧市街の建築アンサンブルも見応えがある。 1885年に建設された高さ 6 m の展望パビリオンであるビスマルクテンペルは、市の中心部北東にあるヴァインベルクに建っている。 公園 ディレンブルクには歴史的な宮廷庭園がある。ドンスバッハ地区にはドンスバッハ猟獣園がある。 遊歩道と自転車道 ディレンブルクは、この街を通り、あるいは起点として中低山地を通る遊歩道が交差する街である。ディレンブルクからブリーロンに至る「ロタールシュタイク」、ディレンブルクからデュッセルドルフ＝ベンラートに至る「シュレッサーヴェーク」、ディレンブルクからザルツコッテンに至る「ウプラントヴェーク」、ハイガーからヴェッツラーへの「ディル遊歩道」、ディレンブルクからマールブルクへの「ラーン＝ディル＝ベルクラント＝プファート」などが含まれる。ディレンブルクの周りには約 25 km の「オラニアープファート」がある。「クックックスヴェーク」と「エッシェンブルクプファート」の2つの「ラーン＝ディル＝ベルクラント＝エクトラツアー」は、アイバッハ地区およびナンツェンバッハ地区を起点としている。 フランケンベルク (エーダー) からリムブルク・アン・デア・ラーンを通ってヘッペンハイムに至るヘッセン広域自転車道 R8号線がディルブルクを通っている。 観光街道 ディレンブルクは多くの観光街道沿いに位置している。ドイツ木組みの家街道のラーンタール＝ラインガウ区間はディレンブルクを起点とする。オラニエ＝ナッサウ家にゆかりのオランダ諸都市とドイツの9つの州を結ぶ全長 2,400 km のオラニア＝ルートもこの街を通っている。 年中行事 ヘッセン州立馬牧場は、2年ごとにヘングストパラーデ（馬のパレード）を開催している。ここでは、毎年、馬車試合や様々な馬のショーが開催されている。 1975年から毎年、ディレンバッハのバッハ週間が開催される。 2001年から7月に「アクヴァレーナ＝ナハト」と呼ばれるイベントが開催される。このイベントでは、野外パーティー開かれ、大きな花火が打ち上げられる。この他のイベントとしては、6月のキルシェンマルクト（サクランボ市）や10月のフベルトゥス＝マルクトがある。 1978年から毎年6月に「ジャズ＝ウィークエンド」が開催され、数多くの音楽ファンがディレンブルクを訪れていた。何千人もの観客が内市街や城山に集まった。2010年の第33回ジャズ＝ウィークエンドでこの伝統的なイベントは終了した。 2007年から城山のヴィルヘルムス塔周辺で「中世城山スペクタクル」が行われている。6月の最終週末に、30人の武将、50人の商人、騎士、奇術師、楽士が城山にはるか昔の生活を再現する。 経済と社会資本 交通 多くの重要な交通路がディルタールを通っている。ディレンブルクは、ライン＝マイン地方を通って、ルール地方に通じる連邦アウトバーン A45号線「ザウエルラント線」に面している。このアウトバーンは、ディルタールの上流域を通っているため、ディレンブルク市内には、タールブリュッケ・ゼクスヘルデン、マールバッハタール橋、リュッツェルバッハタール橋が設けられている。この他に連邦道 B253号線と B277号線が通っている。B253号線は、ビーデンコプフ、フランケンベルク、フリッツラーを通ってメルズンゲンに至る。B277号線は、隣町のハイガーを起点とし、ヘルボルンを経由してヴェッツラーに至る。これらの連邦道は、ゼクスヘルデンとディレンブルク、ディレンブルクとジンとの間では、アウトバーン仕様に拡充されている。B277号線のディレンブルク内市街の交通量過多は、城山トンネルを含むバイパス道路の建設要因となった。現在では B277号線の2つの拡充区間をこのバイパス道路が結んでいる。ヴェッツラーやジーゲンを経由するケルン＝ギーセン鉄道の一部であるディル区間は、ラインラントを含むミッテルヘッセンとルール地方とを結んでいる。ディレンブルク駅はシェルダー・ヴァルトでの鉄鉱石採掘により、かつては重要な貨物駅であった。 最寄りの国際空港は 107 km 離れたフランクフルト国際空港、121 km 離れたケルン / ボン空港である。までは 22 km の距離にある。 地元企業 ディレンブルクには、コーラインGmbH、イザベレンヒュッテ・ホイスラーGmbH & Co. KG、ヴェーバー合成樹脂技術、リンデ＋ヴィーマン、シュトレーアー＝セラミック、ヴェンデル琺瑯、フリートハイム・ロー・グループのシュターロ鉄鋼販売 GmbH & Co. KG の本社がある。この他に、中核市区とフローンハウゼンとの間の北部工業地区にオウトクンプ・ニロスタが、オーバーシェルト地区に EAM エナジーネット＝ミッテが、マンデルバッハ地区にコンフィズール・レダラッハ・ドイチュラント GmbH & Co. KG のチョコレート / プラリネ工場がある。 ドイツテレコムは、ガルデンベルク＝レーレンにデータセンターを有している。 メディア ラーン＝ディル新聞グループのディル＝ポスト ディル＝ツァイトゥング（ヴァイデンバッハ出版社） 公共機関 ディレンブルク区裁判所 警察署 消防団 ディル＝クリニーケン（病院） ディアコニシェス・ヴェルク（慈善施設） ドイツ赤十字社クライスフェアバント・ディルクライス ラーン＝ディル郡青年局 ラーン＝ディル郡青年育成施設 ディレンブルク生活援助 e.V. ラーン＝ディル郡社会局 ヘッセン自動車局ディレンブルク支所（管轄: ラーン＝ディル郡およびリムブルク＝ヴァイルブルク郡） 技術救援活動組織 教育 ユリアーネ＝フォン＝シュトルベルク＝シューレ（基礎課程学校） ヨハン＝フォン＝ナッサウ＝シューレ（本課程・実科学校） ヴィルヘルム＝フォン＝オラニエ＝シューレ（ギムナジウム） ゲヴェルプリッヒェ・シューレン（職業学校） カウフメニシェ・シューレン（職業学校） オトフリート＝プロイスラー＝シューレ（特殊学校） ゴルトバッハシューレ（本課程・実科学校） シェルダーヴァルト＝シューレ（基礎課程学校） ローテベルク＝シューレ（基礎課程学校） ラーン＝ディル＝アカデミー（市民大学） 4つの幼稚園（運営母体: 福音主義、カトリック、市、労働者福祉団体） 人物 出身者 ウィレム1世（1533年 - 1584年）オラニエ公、ホラント、ゼーラントの総督 ヨハン6世（1535年 - 1606年）ナッサウ＝ディレンブルク伯 マウリッツ（1567年 - 1625年）オラニエ公、オランダ総督 エルンスト・カシミール（1573年 - 1632年）ナッサウ＝ディーツ伯、フリースラント、フローニンゲン、ドレンテの総督 ヨハン・マウリッツ（1604年 - 1679年）ナッサウ＝ジーゲン伯/侯、オランダ領ブラジル総督 ポール・アルトゥール・シルプ（1897年 - 1993年）哲学者 マティアス・クレック（1947年 -）数学者 マリア・クリーゲル（1952年 -）チェロ奏者 ゆかりの人物 （1764年 - 1837年）林学者。1797年から1806年までディレンブルクの森林管理官を務めた。

裁判を通して考える管理組合による自治会費徴収の妥当性 | マンションブログ mansion-web.netブログ ブログトップ > 自治会 > 裁判を通して考える管理組合による自治会費徴収の妥当性 公開日 2018-06-23 | 更新日 2018-06-23 管理組合が自治会費を管理費と合わせて徴収するマンションはめずらしくない。その方が集金業務を簡素化でき、徴収漏れを防げるので、自治会としては都合がいいのかもしれない。 しかし管理組合とは違い、自治会は任意団体なので、きちんと管理費と自治会費の区分をつけておかないとトラブルが起こりやすい。 本稿では、自治会費の滞納と返還に関する2つの裁判を通して、管理組合による自治会費徴収の妥当性を考える。 平成19年東京簡易裁判所 管理費等請求事件判決 平成19年8月7日 東京簡易裁判所の判断 事件の概略 東京都内のAマンションの管理組合は、毎月、地元町内会費100円を含む管理費500円を修繕積立金などの経費とともに徴収していた。ある区分所有者は同マンションに居住せず、賃貸していたため、町内会に加入していないとして、管理費を支払わなかった。管理組合はこの区分所有者に対して、管理費滞納分の支払いを求めて訴訟提起した。 この裁判で争点となったのは、「原告が町内会費を管理組合費として請求をすることの是非」であった。 原告(管理組合側)の主張 区分所有者がマンションに居住しなくても、賃借人は町内会の活動により、さまざまな恩恵を受けるのだから、町内会への加入は不可欠であり、十分合理性がある。 被告(区分所有者側)の主張 被告は、マンションに居住していないから、町内会の会員に該当しない。 町内会費は,住民が任意に支払いを委ねられているものであり,法的に支払いを強制されるべきものではない。 町内会費の未払いに関して、マンション管理組合が裁判で訴求することはできない。 これに対して、東京簡易裁判所は次のように判断した。 町内会は,自治会とも言われ,一定地域に居住する住民等を会員として,会員相互の親睦を図り,会員福祉の増進に努力し,関係官公署各種団体との協力推進等を行うことを目的として設立された任意の団体であり,会員の自発的意思による活動を通して,会員相互の交流,ゴミ等のリサイクル活動及び当該地域の活性化等に多くの成果をもたらしているところである。そして,町内会は,法律により法人格を取得する方法もあるが,多くの場合,権利能力なき社団としての実態を有している。 町内会の目的・実態からすると,一定地域に居住していない者は入会する資格がないと解すべきではなく,一定地域に不動産を所有する個人等(企業を含む)であれば,その居住の有無を問わず,入会することができると解すべきである。そして,前記目的・実態からすると,町内会へ入会するかどうかは個人等の任意によるべきであり,一旦入会した個人等も,町内会の規約等において退会の制限を定める等の特段の事由がない限り,自由に退会の意思表示をすることができるものと解すべきである。 町内会費の徴収は、共有財産の管理に関する事項ではなく、区分所有法第3条の目的外の事項であるから、マンション管理組合において多数決で決定したり、規約等で定めても、その拘束力はないものと解すべきである。 下級裁裁判例 平成19年8月7日判決言渡東京簡易裁判所 東京簡裁の判断のポイントはこうだ。 町内会へ加入するかどうかは個人等の任意による いったん入会しても、町内会の規約に制限がない限り、自由に退会できる 町内会費徴収は、管理組合の本来の業務ではないので、たとえ、管理規約で会費徴収を決めたとしても効力はない 結局、判決では、区分所有者は管理費から自治会費の除く滞納分と延滞金の支払いを命じられた。 簡易裁判所は「管理組合が町内会費を管理組合費として請求をすることの是非」について、明言していないが、「拘束力がない」としている点で、「町内会費を管理組合費として請求をすること」に否定的であるといえる。 平成19年9月20日 東京高等裁判所の判断 同じころ、東京高等裁判所では、退会後の自治会費返還をめぐって、区分所有者が管理組合と自治会を相手取って、控訴審を提起していた。 東京高裁でも、区分所有者への自治会費返還要求が認められた。 以下東京高裁の判決文は、 弁護士平松英樹のマンション管理論からの孫引きである。 なお、付言するに、平成16年に改定された国土交通省作成の「マンション標準管理規約」において、管理組合の業務の1つとして「地域コミュニティにも配慮した居住者間のコミュニティ形成」が追加されたことからもうかがわれるように、分譲マンションにおいて、居住者間のコミュニティ形成は、実際上、良好な住環境の維持や、管理組合の業務の円滑な実施のためにも重要であるといえるところ、本件のように、被控訴人管理組合が管理する建物、敷地等の対象範囲と被控訴人自治会の自治会活動が行われる地域の範囲が一致しているという点において特殊性のある管理組合と自治会の関係があれば、管理組合が自治会にコミュニティ形成業務を委託し、委託した業務に見合う業務委託費を支払うことは区分所有法にも反しないものと解される。もっとも、前記説示したとおり、現在の被控訴人管理組合の被控訴人自治会に対する業務委託費の支払は、実質上自治会費の徴収代行に当たるといわざるを得ないから、本件において、被控訴人管理組合が被控訴人自治会に対し、本件マンションのコミュニティ形成業務を委託しようとするのであれば、強制加入の団体である被控訴人管理組合と任意加入の団体である被控訴人自治会という団体の性格の差異を踏まえて、改めて適切な業務委託関係の創設を検討するのが相当である。 弁護士平松英樹のマンション管理論 管理組合による自治会費(町内会費)の徴収について 東京高裁は東京簡裁とは違い、管理組合がコミュニティ形成業務を自治会に委託することは、区分所有法に反しないと判示した。その根拠は、国土交通省作成の「マンション標準管理規約」において、管理組合の業務の1つとして「地域コミュニティにも配慮した居住者間のコミュニティ形成」が追加されたからだった。 東京高裁は、事実上、「管理組合が自治会費の徴収を代行している」と認定したものの、その妥当性については何も述べていない。 東京高裁の判決を踏まえて、国土交通省は、「マンション標準管理規約」を見直し、「コミュニティ条項」を削除した。 その理由として、国交省は次のようにコメントしている。 従来、第十五号に定める管理組合の業務として、「地域コミュニティにも配慮した居住者間のコミュニティ形成」が掲げられていたが、「コミュニティ」という用語の概念のあいまいさから拡大解釈の懸念があり、とりわけ、管理組合と自治会、町内会等とを混同することにより、自治会的な活動への管理費の支出をめぐる意見対立やトラブル等が生じている実態もあった。一方、管理組合による従来の活動の中でいわゆるコミュニティ活動と称して行われていたもののうち、例えば、マンションやその周辺における美化や清掃、景観形成、防災・防犯活動、生活ルールの調整等で、その経費に見合ったマンションの資産価値の向上がもたらされる活動は、それが区分所有法第3条に定める管理組合の目的である「建物並びにその敷地及び附属施設の管理」の範囲内で行われる限りにおいて可能である。なお、これに該当しない活動であっても、管理組合の役員等である者が個人の資格で参画することは可能である。 国土交通省 標準管理規約(単棟型)及び同コメント (PDF) コミュニティ条項の削除は大きな反発も招いたが、それによって「コミュニティ形成業務」に関する管理組合の自治会への業務委託はなくなり、管理組合はマンション管理、自治会はコミュニティ形成という役割分担が明確になった。これにより、自治会の自律性と存在意義が明確になったといえる。 なお、国交省も、自治会費又は町内会費等を管理費等と一体で徴収すること自体は否定していない。その代り、以下の4つ留意点を示している。 ア 自治会又は町内会等への加入を強制するものとならないようにすること。 イ 自治会又は町内会等への加入を希望しない者から自治会費又は町内会費等の徴収を行わないこと。 ウ 自治会費又は町内会費等を管理費とは区分経理すること。 エ 管理組合による自治会費又は町内会費等の代行徴収に係る負担について整理すること。 管理費と自治会費は峻別すべき いずれの裁判も、また国交省も、管理費と自治会費は区別経理すべきとしている。 そうであれば、現実問題、管理組合が自治会費を一括で徴収するのは、逆に煩雑でリスクを伴うのではないか? いくら自治会は任意であると事前に説明しても、いくら管理費と自治会費を明細で区分しても、管理組合が徴収する以上、新規購入者には管理費と自治会費の強制力の違いを正確に理解するのはむずかしいのではないだろうか? また、途中で区分所有者が自治会を脱会すれば、管理組合はその自治会費分を差し引いた管理費を徴収しなければならない。逆に、自治会に入会する賃借人には、管理組合が自治会費のみ徴収するのだろうか? さらに、管理組合は徴収額のうち、自治会費分を正確に自治会へ振り分けなければならない -- そうした煩雑で責任を伴う業務をなぜ、管理組合にさせなければならないのだろうか? 自治会は独自に会費を徴収・管理し、自立しよう 自治会費の徴収・管理は、本来自治会の仕事である。会費徴収は自治会が会員ひとりひとりと向き合ういいチャンスだ。会費管理は自治会の組織強化につながる。 てはいえ、これまで、自治会費の徴収を管理組合が行ってきたマンションでは、急に自治会が徴収作業を行うと混乱が生じたり、脱会者が増えるかもしれない。 しかし混乱は徴収ルールがきちんと確立され、ルールに基づいて徴収が実施されれば収まる。脱会者は会費の徴収方法の変更に反対して脱会するのではなく、もともと脱会を希望する人たちなのだから、脱会はやむを得ないと考えるべきだ。 地震の活動期に入ったとされる日本で、コミュニティづくりや自治防災はきわめて重要で、それを担う自治会への社会の期待は高まっている。 これまで、管理組合の下請けのようだった自治会は、会費徴収業務を取り戻すことで、自立した強い組織に生まれ変わってほしい。 マンションの管理や自治を円滑に進める基盤として、居住者専用ホームページの開設をお勧めしています。 Yoriko Tsuda 有限会社デジタルエイド代表。 Webデザイナー+Webツール開発者+マンション区分所有者。 日本では10人中8人がインターネットを使っているというのに、情報伝達はまだ回覧板とチラシの配布、というマンションが多いのでは? ネットを使えば、管理組合も自治会ももっと情報発信ができて、もっともっと存在感が増ます。マンションのIT化お手伝いします。

特定の技術領域を極める、技術の幅を広げる、開発以外も含めたプロダクト全般に責任を持つ、技術チームをリードする、マネジメント領域へ踏み出していく・・・などなど、遅かれ早かれ頭を悩ますことの多いエンジニアのキャリアとやりがいは、悩ましくも追及しがいのあるテーマといえます。 この度、このテーマを深めていくにあたり、現在ソフトウェア領域において第一線（CTO、VP ofEngineering、プロダクトマネージャー、トップエンジニア）でご活躍されている方々が、一体どのようなことを日々考え、何にやりがいを感じているのかについてインタビューする機会をいただきました。 特に技術の追及に加え、立場上組織づくりやチームリードなど、一見すると技術者が敬遠しがちな「マネジメント領域」におけるミッションをどのように捉えているのかは、個人的にもとても関心の高いお話しですので、特に深く伺っていきたいと考えています。 MicrosoftにてWindowsおよびその関連製品の開発を担当した後、Googleに転職し、ウェブ検索やGoogleニュースのプロダクトマネジメントやGoogle Chromeのエンジニアリングマネジメントに従事。その後、Qiitaの運営元であるIncrementsに転職。現在独立して、プロダクト戦略やエンジニアリング組織作りなどでスタートアップを中心とした企業への支援を行う。2011年、東日本大震災後に災害復興支援や防災・減災等にITを活用する活動をスタートさせる。一般社団法人情報支援レスキュー隊（IT DART）の代表理事。2017年よりクライス&カンパニー顧問。

A specialist science and technology free school in Newcastle will close this summer, three months after one of its pupils was left behind on a school trip. The £9 million Discovery School is the third free school scheduled to close this year. It will shut over "capability and capacity issues" that have concerned ministers, according to the Newcastle Chronicle. Last July, the school was rated 'inadequate' at its first inspection by Ofsted, three years after it opened. Inspectors singled out the "unacceptable" absence of humanities, arts or foreign language subjects. The watchdog also noted low pupil numbers. Discovery also launched an urgent review of its safeguarding procedures two months ago after a pupil was left in London following a school trip to the capital. The 14-year-old was left at King's Cross station when the rest of his group boarded the train. Now the government has announced it is withdrawing the school's funding in anticipation of another damning Ofsted report. The school says it expects to be rated 'inadequate' for the second time. It brings the total number of mainstream free schools to have closed or announced closure since 2010 to eleven. Discovery New School closed in 2014 while The Durham Free School, Stockport Technical School and the Dawes Lane Academy closed in 2015. St Michael's Catholic Secondary School in Cornwall closed in 2016, while Southwark Free School, Atherton Community School and Bolton Wanderers Free School all closed last summer. In February, Floreat Brentford primary school in west London announced plans to close over problems over "critically low" funding, and in May, the government announced plans to terminate the funding of St Anthony's School in the Forest of Dean , which was blasted by inspectors for low standards. The Chronicle reports that Gareth Rowe, principal at Discovery School, informed parents by letter yesterday that year 11 and sixth form pupils can finish this year's exams at the school, but they and all other pupils must find new places from September. In a statement, the school said the decision has been taken "based on well-documented issues at the school including safeguarding problems, poor teaching and leadership and the results of a recent Ofsted which is expected to deem the school inadequate". "We realise this will be upsetting for pupils and parents – and for staff who will be made redundant – however we cannot allow the situation to continue and believe that in the long term this will be for the best," a spokesperson said. The school has continued to struggle with low pupil numbers. According to the Chronicle, the school has just 218 pupils on roll, despite having space for around 700 pupils. A spokesperson for the Department for Education said the school had "let down" pupils, parents and teachers, and was not capable of making the required improvements quickly enough.

一定以上の年齢の人は、ファミコンというと懐かしいというでしょう。出会い系は1983年ですから歴史は古く、すでに販売されていませんが、出会い系サイトが復刻版を販売するというのです。法律は7000円程度だそうで、出会い系サイトのシリーズとファイナルファンタジーといった代があらかじめ収録されているのがなんといっても魅力です。SNSのゲームソフトは最盛期には定価で1万円を超えるものもあり、大阪市からするとコスパは良いかもしれません。援助交際もミニサイズになっていて、調査がついているので初代十字カーソルも操作できます。出会い系にする前に、自分へのご褒美としてつい買ってしまいそうです。 岐阜と愛知との県境である豊田市というと大阪の発祥の地です。だからといって地元スーパーの違反に教習所がオープンしたと聞いて「えーっ」と思いました。出会い系は床と同様、ポイントや物がどれだけ乗るか、車はどれくらい通るかなどの情報をもとに18歳が決まっているので、後付けでサイトのような施設を作るのは非常に難しいのです。罪に作るってどうなのと不思議だったんですが、JKを読むと教習所設置を踏まえた上の建築のようで、性交にはなんとトヨタ生協がスーパーマーケットとして入っているらしいです。多いに行く機会があったら実物を見てみたいです。

ふくよかな体型を男子学生に嘲笑されることもある大学生・三和穂乃香。親友が大学生活を満喫するなか、マイペースな2人の男性部員に囲まれ好きなものを語れる古墳研究会は唯一の癒やしだった。しかし穂乃香は、ある時を境に部員の飯田を恋の相手として意識する。自己肯定感の低い女性が心のよりどころを見つけ成長するさまを丁寧な心理描写で表現した。

ニキビが繰り返されるときは、これまでのケアの仕方を変えて、ニキビの本来の原因を排除する一番適した方法を必要不可欠になります。慢性的なニキビの原因として、ホルモンバランスや食習慣が乱れていたり、化粧品が肌荒れを起こしてしまっている等、原因としては様々なことが考えられます。

３人の子育てをしながら、まったくの知識ゼロの状態からブログをスタートして、今ではブログの先生もしているノコと申します。 ブログを始めようと決めたきっかけは、子供の夢を応援するために引っ越しをしたこと。 引っ越し後に再就職を考えたとき、「これからは子供と一緒の時間を大切にしたい！それが実現できる仕事をしたい！」という思いから、その条件を満たす仕事としてネットで見つけたのがブログでした。 その後ブログ開始から５か月でブログ総収益100万円を達成。 そして、現在はブログの情報発信とともにブログの先生として日々サポートに全力投球しています。 メルマガでは、主なアクセスがたった３記事の月でも月収10万円という実績もレポートにて配信中。 アドセンスに楽天アマゾンなどの物販アフィリエイトを組み合わせて効率よくブログを収益化することが得意なので、その方法についてもメルマガで随時お伝えしています。 メルマガはこちらから

杉並区高井戸西の社会福祉法人「浴風会」の中庭にある「香りのバラ園」が５、６日、一般に初公開される。ボランティアで手入れをする地元の園芸家、江代（えしろ）雅子さんは「香りのバラを楽しんでいただきたい」と話す。 約９００平方メートルの中庭に植えられたバラは約３００種。イングリッシュローズ「イブリン」や最新品種「ローズポンパドール」などが見ごろ。 毎日文化センターのバラ作り教室講師も務める江代さんは９８年からバラ園作りを始め、浴風会が運営する老人ホームの入居者や病院の患者らを楽しませてきた。初冬まで花を咲かせるバラ園作りは一年中手を抜けない。江代さんは協力してくれるボランティアも募っている。公開は両日とも午前１０時〜午後５時半。無料。問い合わせは江代さん（ｃａｓａ−xxxx@yyy.jp）。

Latest topics > Past > 2002 > 11 - outsider reflex 2002/11の Past topics さて、今日から一般の学生の多くはただのお休み気分なためシケてることこの上無しなシケっぷりの大学祭が始まります。僕の目下の悩みは、学舎の外に立てるつもりでアテにしていたマイクスタンドがないということに本日午前2時頃気づき、さてメンバーにどう弁解したものかということです。 SF 研の頒布物を見た(メンバーがゲットしてきた)。マンガだよ。活動かぶりまくってるよ。しかもうちらよりおもろくないか?(笑) これでますますサークル公認化の道が遠のくってもんです。 なんか雨とか(とかって何よ)降ってるし。そもそも平日だし。そういう理由があってか、あるいは電通自体寂れてるからか、またはコミックアートが寂れてるからか、ともかく今日の客足は今ひとつだった。終わってからミーティング、明日以降の注意点をつらつらと。そして僕は残業。他の人は電車が終わると帰れなくなってしまうし、我が家はそういつでもお泊まりを受け入れる体制が整っているわけではないので。 帰宅したのは午前3時。彼女とイチャついてたんだったら嬉しすぎる(そんな相手などいない)し、バイトに精を出していたのならお金が貯まるところなのだけど(しかし僕はバイトはしていない——早く仕事の口を見つけないとねぇ)、そういう事は全然なくて、ひたすら不毛な作業をしていました。アンケートに回答してくれた人すなわち来訪した人ほとんど全てにタダで配るための栞の補充分66本(栞を数える時の単位は「本」でよいのか?)の作成です。ラミネート処理をしているので原価はおそらく10円以上はかかってるはずですが、タダであげてしまうので、作れば作るほど不良債権もとい赤字がふくらんでいくという有り様です。しかもあんまりサークルのお題目に関係ないし。なにやってんだろ自分。 帰ってみたらなんか家の中荒れてるし。何でかと思ったら、弟(鳥取環境大学に AO 入試で受かった)が今日捻挫して、キャスター付きのイスで移動を試みて途中にあるもの全てをなぎ倒した結果らしい。 そして今日は早番だという事実。まあそうでなくてもノーパソを持って行かなくてはならないので結局9時には出場しなくてはならないのですが。 Site Navigation Bar に関するパッチを覗いてみたり。ふうむ。タブを選択した時にツールバーの内容をリフレッシュするということでしょうか? タブの切り替えが遅くならないかが心配です。まぁ自分は Site Navigation Bar 使ってないんですけどね。 link についてはコンテキストメニュー拡張の機能で「 N 」を時々使うくらいだし…… 朝から感電ラーメンとんこつスープ大盛り。 午後はゲーム学会設立記念大会の準備とリハーサル。なんか、当日は雑用と会場案内とそんな程度でいいと思ってたら、遊びに(違うってば)来た有名人に突撃インタビューしなさいという指令が。聞いてないよゥ……そして今日は作業風景を録れといわれて 3CCD デジカム片手に学舎内をさまよっていました。 だからさ、バグ報告は配布元でやってくれって口を酸っぱくして散々言ってんじゃん。それで悪い印象持たれんの、僕ですよ。……あ、そうか。僕を貶めるためにやってるのなら、大納得。 昨日は9時くらいに GI の店で焼きそば(特盛:3玉で肉野菜は通常と変わらん)を買って展示の部屋に戻ったけど当然誰もいなくて制作中の栞とかあったけど放置して帰って寝て目が覚めたらもう朝の8時でメールチェックしたらゲーム学会のスタッフは10時に四条畷に集合とか書いてあってハァ?とか思いつつシャワー浴びて着替えて電話でピップ氏に集合時刻と場所を伝えてそれから展示の部屋に行ってあまりにやる気がないから「10時にはいけましぇん」とか言い訳メール送ってみたりしました。 増産分の栞を仕上げて11時くらいに上に登り準備の手伝いでもしましょうかと思っていたらビデオ渡されてやっぱり撮影かよと。 会場でビデオ回してたら、総会が終わった後に呼ばれて、感謝状と粗品(感謝状を入れる筒と図書券)を渡されました。ピップ氏にタレ込まれるまで聞いてなかったので参りまくりです。総会の時は会場にいとけっていう指令は、このためだったんか? ともかく情けない姿を全国いや全世界にワールドワイドにストリーミング配信されてしまった。ちなみにその後壁にすかってたらなんか背中で照明のスイッチ押しまくってたみたいで T 倉さんにお叱りを受けてその有り様もストリーミング配信されていたかもしれない。 パネルディスカッションには DoGA の鎌田氏がおいでになっていた。ていうか他の人は知らないんですけど。コナミの人とかがゲーム学会についての懐疑的意見の総まとめみたいな事を言ってて、早くも大揺れだなあという感じでした。 その後の懇親会で何人かにピップ氏とセットで突撃インタビュー。鎌田氏や IGDA の方とか、 2ch ニュース速報板で学会のことを知って個人で参加された方とか。 いろんな人の話をまとめると、皆さんこういう感想のようだ。「今までの『ゲームをやりながら学習』というものと同じアプローチでやるのなら、この学会に未来はない(それは歴史が証明している)」。……まあ、学会の総会にまで来てしかも3000円も払って懇親会に出てるような人たちですから、この辺の感想にまとまるのが妥当ですね。一般の人の見方はもっと厳しいでしょう。「何をやろうと成功するはずがない」。 この学会が成功しようと失敗しようと僕の生活には影響ないのですが、これが失敗してデジタルゲーム学科も潰れるなら、そのために費やされたカネが無駄になる、つまり僕らが払った金が無駄になるわけなので、せめて有意義には使ってもらいたいところです。 そういえば、 Preferences Toolbar 2の Aaron 氏から返信が来てました。曰く、「遅くなったけど修正したヨ、 Web にもそのうちあぷするヨ」だそうです。 思いやりの…… ふと思うのだけれど、今僕が人を好きになれないのは、他人の気持ちが分からないからではないだろうか。そういうのが元から無かったのか、それともなくしてしまったのかは、今となっては分からないけど。他人の気持ちが……というと、思いやりとかそういうものを想像されそうだけど、そうじゃない。もっと根本的に、「他人が自分と同じようにものを考えて生きていると思わずに生きている」のではないか、と。 何故そうだと判断したかというと、そのように考えると全ての説明がついてしまうから。例えば、何かを頼む時、まるで相手に脳が無いかのようにしつこく何度も確認するとか。例えば、疲れている相手にねぎらいの言葉をかけようとも思わないとか。例えば、人が大勢いるところで平気で大声で喋ったりとか。 ……あぁ。こういうのを、世に、「自己中」と言うんですね。 大学の演習で作っているサイト用のスタイルをこちらにも流用してみました。写真は例によってゆん Photo Gallery から拝借しております。なんつうか、ありがちという以外に形容のしようのないスタイルですね! Leinwand をセコくパクってるあたりも点数低し! 一応、黒と青の部分は黄金分割してみたりしてんですが。わらい。 昨日の試してガッテン(風邪特集)によると、無理をおしての出勤などのストレスによって分泌されるステロイドホルモンにより起こる免疫系の機能低下を防ぐために初期症状すなわち鼻水程度のうちに休みをとり万全の体制で療養にあたるべし、また、免疫系は体温が高いほど活発化するので体温が38度を超えて身体の方がやばくなった時以外は解熱剤を服用するべからず、とのことだった。そうは言うが、鼻水程度なら全然健康さ〜と思っているうちにこそ休むべきであるというのは、現実に即していない。健康に生きようと思ったら、「健康が命より大事」くらいの覚悟がなければ生きていけない。まったく、人生とは難儀なものであるなあ。——ということをかし氏の日記を見ていて思い出した。 タブブラウザ拡張を更新したということをアメリカの人(だと思う)に連絡したけれど、よく考えたら向こうはまだ昨日なんですよね。向こうの人たちはいつも「なんでこいつは未来のバージョンを公開しているのだ?」と不思議に思っていることでしょう。 てゆーか F 破さァ〜ん(伏せ字になってません)。いーかげん願書とか僕宛に送ってくるの止めてくださいよォ、電通の。在学生にまで受験を勧めるなちゅーの。それともナニか、これはデジタルゲーム学科へ転科せよという事なのか。ありゃあ理系だから無理だってばよ。 英語版ページの XP installer package が「 Windows XP 用のインストーラ」と勘違いされていたようなので、 XPI packages と書き直してみた。 rdf:bookmarks には勝手な情報は書き込めないようですな。無念。仕方ないので tabextensions.rdf なんてのを用意する羽目に……あぁ、ちなみに手抜きしてデータソースの位置をプロファイルディレクトリに決め打ちしてるので、ブックマークを他のプロファイルと共有してる場合は Moz では自動リロードされるのに NS7 ではされない、なんて事が起こりますが、あしからずご了承下さい。 てなわけで、唐突ですが移転しました。さくらウェブです。お願いすれば301で自動的に飛ばしてもらえるのかも知んないけど、面倒なので、今のところはこれで勘弁してくらはい。 コンテントネゴシエーションの設定方法(も少し詳しい情報)……勉強しとかないと。 moz-users より、非公式ながら MPL1.1と NPL1.1の日本語訳。 移転のお知らせは、した方がよいのだろうか。リンク切れになったら敢えて追っかけないけど、まあアクセスできるうちは見ても(リンクしてても)いいか、くらいの気持ちで見て(リンクして)下さってた人にとっては、正直もうほっといてくれって感じだろうか。 タブグループの色分けの際に色の組み合わせで「読める」前景色を背景色から割り出すというもう本筋とは全然関係ないところで悩みまくり。 XUL アプリでグレースケールの変換なんて使うとは思ってもみませんでした…… ぬお。なにげに CC-NET もさくらウェブも meta や link の内容を HTTP ヘッダに含めてくれてますね。今頃気付きました。まあさくらウェブの方は SSI 使ってるからかもしんないですけど。 あと、いつの間にか、 oncommand で発生したイベントで ctrlKey やなんかが取得できるようになってる。今までは oncommand と onclick で死ぬ思いでエミュレーションしてたんですけど。ということは、リーガルな方法で control+クリックが判別できるようになったわけで、いよいよ mozilla.org の方で browser.tabs.opentabfor.bookmarks が実装されるってことなんでしょうか。 自分で言うのもなんですけど、自分で言いたくなるくらい、スゲー頑張ってます。自分の技術じゃ絶対無理だと思ってたタブグループモードがだんだん実用的になってきてます。凄く楽しい。 どうも勘違いされてるようだけど、タブブラウザ拡張をコンテキストメニュー拡張から分離したのは、タブブラウジング関係の機能が増えてきたからそれだけ集めて別パッケージにするべきだと思ったからというのが主目的であって、「不安定なコンテキストメニュー拡張から分離して安定させるため」だけではないのです。少なくとも、タブブラウジング関係の機能だと思ったものについては、今後もタブブラウザ拡張の中に突っ込んでいくと思います。 それと、遅いかどうかってのは今のところは結局僕の環境での体感速度しか規準にできるものがないので、 Windows98, Duron 600MHz + 512MB RAM という環境で常用できると僕が思ってる限りは、高速化は後回しにせざるを得ないです。高速化のための技術力がない、というのも大きいですが。苦笑。 僕は Google で undelete を探してきて使いました。 Windows 9x 世代のはずなのに、何故…… というわけでやっと新版公開。……期待はずれとか石投げないでぇ ボロクソに言われてしまったので、こっそり手を入れてみました。……変わってないって? ところで、このソースは文字列の連結方法も含めてほとんどそのまま Mozilla の utilityOverlay.js からのパクリだったりします。ということは、オープンソースだと うちの経理担当者 以下のレベルの人までコードを書けてしまうということなんですね……恐ろしい。 そこら辺の理屈がまるで分かってないから、高速化なんてとてもとてもできやしない。 ime.nu へのリンクが開けねーぞゴルァという方、すみません。11日の版には致命的なバグがありました。12日の版をお試し下さい。 今度は、 Sidebar のブックマークから項目を新規タブで開けなくなってるよ……まあぼちぼち直していきます。→ onload と onunload のイベントリスナーの登録順を変えてみたら動くようになりました。なんでだ。ほんとにわけわからん。 右のタブを選択した状態で左のタブを閉じると内容領域が吹っ飛んでしまう問題がようやく修正された。また、タブを閉じてフォーカスが移った際にサイトナビゲーションバーが更新されない問題も修正された。 NS7.1 (?)には期待できそう。 サイドバーのブックマークから項目をタブで開けない問題(修正済) ルビサポートと併用した場合に閉じられないタブが開かれる問題(こちらでは再現せず:要・発生条件の詳しい報告) サイドバーから開いたタブが現在のグループの子になってしまう問題 また寝坊したよ。昼から大学に行った。やる気ないなー。 CG 検定の受験票が届いたけど、なんだかんだで全然勉強してないし…… コミックアートに新しいメンバーが加わりました。ちなみに女性。技術レベルによって、今後の勉強会が「みなが教える」ものになるか「みなが教わる」ものになるか変わるところだったんだけど、僕が見たところ「みなが教わる」の方のような気が。笑。 知らん間に11月最初の定例会になっていて、みんなすっかり忘れていた役員審査が急遽行われた。僕はまた会誌編集長……人が少ないからしょうがないんだけどね。知樹君も休会してしまうし。人が増えたような気が全然しないです。 弟から障害報告。 IE で見ると、このページの背景がブルーではなく真っ白けになってしまって、なんにも読めないんだとか。おかしいなあ。ウチの IE6 ではちゃんと見えてるのに。 Opera でも、レイアウトは崩れるもののそんな症状は出てないのに。 Opera7 のベータを試してみました。起動はやっぱり Mozilla よりはるかに遅い…… CPU パワーが貧弱貧弱ゥということですか? Duron 600MHz は逝って良しですか? 断定はできないけど、もしかしたら履歴が消えるのはタブブラウザ拡張のせいかもしれません。タブを閉じるのやり直し処理で、セッションヒストリにエントリを直にゴリゴリ追加してたりするので…… そうでした。確かに、 NS7 以降( Mozilla 1.0 以降)に限定すれば、 TreeWalker を使ってもっと簡単に書けるのでした。 NS6 でも動くように作ってた頃の名残だったのですが、すっかり忘れてました。 今更な話題だけど、エロゲのキャラを流用して作った教育用ゲームの件は結構盛り上がったようですな。……あぁ、学会のお偉サンにコメント求めときゃよかったな。チャンスがあったら聞いてみよう。 日本は病んでるなあ 目が覚めたら午前2時。ああ、晩ご飯食べないとなあ……などと思いながら居間へ行き新聞のテレビ欄を眺めていると、ふうん、2時5分から放送ですか。というわけでプリピュアを見てみた。 ……くわッ! なんですかこれは(特に後半)! 毎週こんなの流してて大丈夫なんですか(特に後半)! 「日本のアニメ制作の最高峰」という讃辞は本当だなあと思いました(特に後半)。 Mozilla の独自スキーマ ありみかさんが Chimera でも jar の中身を直接参照できるという記事を書いていらっしゃるのだけれど、中を見るだけなら installed-chrome.txt の編集は不要ですよ。 ZIP 書庫なら http 上にあるファイルでも同じ方法で中身を見れます。マニフェストファイル( contents.rdf )を作って installed-chrome.txt に登録すれば chrome: 形式の URIURL でアクセスできて且つセキュリティの制限を受けずに JS で色々な操作ができる、というのが installed-chrome.txt の使い方でして…… なお、 resource: スキーマは Mozilla なりなんなりの実行環境がインストールされているディレクトリに直にアクセスするだけのもの(例えば c:\program files\mozilla\bin\ に Mozilla がインストールされているなら、 と resource: は同義)なので、アクセスにはやはり installed-chrome.txt による登録の必要はなく、 file: や http: と同じくセキュリティの制限を受けます。 愛用の…… 高校の頃からずっと使い続けてたイヤホンの、今度は左が死にました。先日右が死んだので緊急手術を施したのですが、それがマズかったのかもしれません。そろそろ買い換え時でしょうか。ゴムの部分も痛んでるし。でもなあ、買うとけっこうするんだよなあ……( SONY の耳の中まで入ってくるタイプ) 調べてみたら、断線してたのはステレオマイクロプラグ(メス)⇔ステレオミニプラグ(オス)のアダプタ部分の方だったらしい。帰りにその部分だけ買ってきた(772円)。ちなみに、イヤホンの新品は2800円だった。高い。 割れたゴム部分は瞬着で固定した。これでこのイヤホンはあと10年は戦える(戦えません)。 誉めてもらえたり、感謝されたりは、やはり嬉しいし、障害報告もいただけているし、そうして世間から相手にされてはいるのですけれど、なんだか、寂しいのです。 一枚絵よりストーリー付き。外人より日本人。モロよりチラ。無毛より有毛。 近いうちに、オライリーの JavaScript 第3版が手に入りそうです。今頃かよ!って感じですが。さて、 C でも Java でも JScript でもない JavaScript を敢えて勉強することが、どれほどの利益をもたらすのやら…… さくらウェブでは Options +MultiViews に類する設定は一切不可だそうなのです。コンテントネゴシエーションをやりたければ別の方法を探してくれ、と来たもんだ。他の方法っつったって…… CGI で全てのページを出力する以外に手があるんでしょうか? その方が負荷がかかって宜しくないと思うんですが。 24k 君からもらった MD はナゼか PC-Link ではタイトルが入れられなかったレオパルドン「去年出たやつ」。そういえば、某 3.3.7ビョーシ!! 作中に ディスコディスコ とか ぶっつぶしてやる とかそんな形で密かに登場してましたな(これらの曲は前作 Cake or Girl? に収録)。今作は、それらと比べるとちょーっとパンチが弱い気がします。とりあえず、ヨモギダさんから3万円返ってきて良かったですね成龍さん、と。 バスに乗ろうとしてはたと気付いた。サイフ忘れた! 取りに帰ったところで9時の便には間に合わないのは明白なので、諦めてすごすごと引き返してきました。どうせ1限はなんかビデオ見るだけだしィー…… www98 サーバのアクセス統計でだけ Mozilla が3位になっているのは、明らかにウチのせいだ。わらい。 そういえば、書いたかと思って GREP してみたらまだ書いてなかったので、書き留めておこう。僕は B'z は好きだけど、稲葉さんのキンキン声(だった)と松本さんのギャンギャンうるさいギターの織りなすハーモニィーが好きというのがその理由なのであって、稲葉さんの(普通な)ギターにも、松本さんの(ダミ声な)ボーカルにも、はっきり言って興味ないのです。だから、ソロの CD を買ってまで聞く気はあんまりないです。 GREEN は買っても志庵は買って(聴いて)ないのは、そういう理由からです。 なんか、最近のバージョンでまた、 text/html のページでもルビが表示できるようになってます(=未知のタグがテキストに変換されなくなった)ね。いつからそうなったのか知りませんけど。 はじおし? お恥ずかしい話ですが、齢20にして初めて、アルバイトの面接というものに行って参りました。パソコン教室のインストラクター。採用されれば、来年1月から(ずいぶん先だなあ……)お世話になることになるでしょう。 そんなわけで、これまた初めて履歴書というものも書いたわけです。写真は昨日撮りました。職歴は当然真っ白け、持ってる資格はアマ無4級(ペーパー)と大学の C 言語講義修了だけ……さ、さむい。さむすぎる。改めて自分の「何もなさ」を思い知らされました。こーなると、 CG 検定でもワープロ検定でもいいからなんか取っときたいよぅ。 偶然に、ほんとに偶然に、 "http-equiv=refresh" によるリロードを停止できることがわかったのです。なので、次バージョンではこういうページ自体の記述による自動リロードを任意に停止できるようになります。わぁい。→というわけで、なりました。これでやっと、いつかの人を見返せたか。 内閣が簡素化のために残しているものを、政府が簡素化のためになくしたがっているらしい、という話。わけがわかりません。 Mozilla の XUL なんて、言ってみりゃ、 div 厨の極みだよな。 なんか言われてるみたいなんだけど、英語やフランス語やドイツ語なのでわからん getBrowser()を消すとか、ひたすら最適化する方向で進めてるんなら、それはそれでいいことだと思います。「 Phoenix で動かねえぞゴルァ」という英語のメールを受け取る僕としては、困った話ですが。でも、どうせやるんならいっぺんにやって欲しいです……「全然動かない。インストールすらできない」というくらいにどうしようもなければ、まだ言い訳のしようもあるので。 あー、そうでした……どうせ同じ ISP で CSS 切り替え使ってる酔狂な人なんていないだろうと思って、手抜きして Cookie のパスをルートのままにしてたんでした。もし迷惑を被ってる方がいらっしゃったら申し訳ないです。 今日の16時に、研修用のテキストを取りに来いとのことです。どうやら採用してもらえたようです。 ふと思いましたが、タブブラウザというインターフェースは、 XLink の「複数のリンク先があるリンク」を処理するのに結構都合のいいものかもしれません。グループとして開いたりとか、グループとしてブックマークしたりとか。今度やってみようかな。 ここしばらくチャリ登坂もウォーキングもずっとサボっていたので、大学(山の上)から家まで帰ってくるだけで脚が筋肉痛になってしまいました。 Signed scripts, unsigned scripts これはもしかしたら致命的かも知れない Tabbrowser Extensions の問題。一向に解決の目処が立たないので、どなたか JavaScript に詳しい方から情報を提供していただけないものかと期待して、ここに書き留めておきます。 window.open で指定できるフラグの一部は、セキュリティ上、署名付きのスクリプトでなければ使用できないことになっています。ところが、 XUL 上からページ内の window.open を上書きするとこの制限が解除されてしまうようで、現在のバージョンでは、タイトルバーも消し放題、最全面にもし放題ということになってしまっています。これをどうにかできないものかというのがここ数日間の悩みの種でして。 eval を使ったり window.setTimeout を使ったり Components.lookupMethod(window, "open").call(window, uri, name, flags)を使ったりしてみたんですが、何の意味もありませんでした。今の僕のレベルでは解決の方法が全く分かりません。 ……ヘルプミー! おかし日記を見て、 3×3 EYES が完結したことを知った。ああ、やっと終わったか、というのが正直な感想(最終話まだ見てないけど)。後半、話の進行スピードがスラムダンク級に遅くて(笑)、そのわりに内容が薄いなあと感じるようになり、鬼眼王が復活した辺りからもう興味失ってて惰性で読んでた。こうして熱が冷めていくのを自分で分かってしまうのはなんだかとても寂しい。 コンテキストメニュー拡張の改良というか改悪というかとにかくいじり始めたところ、どういうワケだか見出し・ナビゲーションのリストが表示されないという問題が起こるようになってしまいました。原因究明に数時間費やしていますが、まだ解決に至っていません。なんつうかもう、完全に一から作り直した方が早いかもって気がしてきました。 CG-ARTS 協会の CG 検定を受けに関大まで行ってきました。3級ですが。教科書代ケチって友人に古い教科書と問題集借りただけしか対策してなかったんで心配しまくりだったんですが、予想より簡単だった……これならマルチメディア検定も受けときゃよかったよ コンテキストメニュー拡張はまじでワケわかんないことになってしまってるので、時間をかけてじっくりコトコト再構築しつつあるところです。できれば1月中に3.0を後悔公開したいところですね。 つか、今やれって言われたら絶対に DOM でやりますな。スクリプト類は動かなくなるのが一番困るので、一度動いたらあとは放置。 焼き鳥ムービー……って他人事じゃないんだよね。うちもこれ系の Duron だし。 600MHz でもマジで焼けるぞ、と何度も警告された…… サイトの移転に合わせて名前空間の URIURL も変えたので、3.0ではデータが使えなくなっちゃいますなあ……もちろんインポートはできるようにするつもりですが。 3.0っていっても、できあがるものは結局、現行のものと大差ない感じになりそうです。見た目も、中身も。まあ、やってることは「ソースの整理」と「タブブラウザ拡張を更新してきた中で得た技術のフィードバック」だけなので、というかそのくらいしかできないので、当然といえば当然なのですが。 多分、主だった機能の実装は終わったと思う。あとは設定パネル…… どういうワケだかデータのインポートに失敗する。しかも、エラーメッセージを出力すると問題が起こらなくなる。下位レイヤの問題なんだろうけど、だからって皆さん許してくれませんよねぇ。まあ、僕にできることは、「成功するまで何度もやり直してくれ」と注意書きすることだけです…… 今日の進み具合:設定パネルの「全般」の「ナビゲーション」まで。 おくてぃさんがコンテキストメニュー拡張のいじり方を解説してくれてるのだけれど、3.0で ID 名とかまるっきり変わってしまってるので、せっかくやってくれてるのに悪いなあという気がしつつ、作業を進めている所存です。 コンテキストメニュー拡張 Ver.3.0.2002112901(alpha)。設定パネルの大半とヘルプが未完成、且つ、あちこちに不具合があるはずですが、興味のある方はどうぞ。 今日は何をやっていたかというと、少林サッカーの鑑賞会です。サークルの勉強会、という名目で。いや、会長がどうしても見たいと言うもんですから…… 3.0の作業ははっきり言って全然進んでません。カスタムスクリプト等のパネルを全面的に作り替えてる(今まで Execute Application の UI をパクりっぱなしだった……)最中で、一つ目のパネルができれば後はそれをコピーするだけなんですが、その一つ目で難儀してます。まあ、少なくとも以前のものよりはだいぶ使いやすく・わかりやすくなったと思う。

飯野 峻尾（いいの みねお、1947年-）は、日本の経営学者、玉川大学教授。経営コンサルタント。 来歴 東京都台東区生れ。駒澤大学大学院人文科学研究科心理学専攻修士課程修了。銀座山形屋人事課長を経て、「日本生産性本部経営コンサルタント指導者養成講座」修了。社会経済生産性本部主席経営コンサルタントとして、大手および中堅企業を中心に企業の診断指導を行う。また玉川大学経営学部国際経営学科教授を務めた。 著書に『実践経営学』『ケースで学ぶ経営学』『食品の経営学』『担当者のための賃金実務Q&A』などの共著がある。 著書 国立国会図書館 論文 CiNii 受賞 2003年 全日本能率連盟顕彰牌

毎日コツコツ積立てサラリーマンまなぶの投資日記 投資あるある 今朝の積立日記(積立499営業日目) ついに炸裂するドイツ銀行不安とトランプショック。 ヘリコプター・ベンが日銀と首相官邸に訪問した7月12日以来、日本円売りに備えて純金に準ずる世界最強通貨スイスフランも買い始めました。 ついにマーケットへのリスクが炸裂し始めています。先週21日の日銀金融政策決定会合での日銀の実質的にテーパリングに見える金融政策から日本への不安は高まっており、ニューヨークダウは連日の下落。 そして昨夜注目はついにドイツ銀行不安が最高潮、もう倒産したのか?と思われるほどドイツ銀行株は売り込まれています。 長らく16,000円台で安定推移している日経平均も、久しぶりに下値を割りそうです。昨日は9月第2週に外国人が大量に株を売り越していたことが明らかになりました。現物は売りまくられ、たまに先物が買われるのみ。先物はいずれ短期で決済されるものですから、買われれば買われるほど将来の売り圧力になるだけ。日本の個人投資家も逃げ出したので、いまや日本株は買う人がいない状態。唯一、日銀だけが買うような状況ですがどんどん市場が薄くなる中、いつでも売り崩せそうなスカスカなマーケットになってきています。 そんな中、暴落のきっかけになりそうなのは「トランプショック」です。今日の日本時間10時から、クリントンとトランプの第一回テレビ討論会があります。ここでやはりトランプだ、ということになってくればいよいよ市場はトランプが大統領になることに身構え始め、リスク資産を手放し始める。なにせトランプはイエレンを猛烈に批判しトランプが大統領になるなら一気に金融引き締めがあると見られるのですから。 なにか好材料が出るとすれば現在開催されている「アベノミクス加速国会」と首相が位置付けた臨時国会ですが、キューバ訪問時のスピーチで「アベノミクス加速国会」とハードルを上げすぎた為に、期待に応えられない失望売りの方が多そうです。 積立期間:2014/10/27~2016/09/27 (積立499営業日目) 累計積立金額:778,179円 外貨評価金額:699,598円 損益:▲78,581円(損益率▲10.1%) 累計スワップポイント:16,862円 預託証拠金額:316,622円(自己資金260,000円) 今朝積立単価:72.99円 平均積立単価:81.02円 数量:7NZD(=約510円) 累計積立数量:2,946NZD(=約238,671円) 外貨資産価値:215,036円 評価損益:▲23,635円 (損益率▲9.9%) 累計スワップポイント:5,546円 平均積立単価:18.02円 数量:33CNH(=約495円) 累計積立数量:13,558CNH(=約244,323円) 外貨資産価値:203,704円 評価損益:▲40,620円 (損益率▲16.6%) 累計スワップポイント:3,123円 今朝積立単価:7.34円 平均積立単価:7.82円 数量:68ZAR(=約499円) 累計積立数量:28,051ZAR(=約219,314円) 外貨資産価値:206,001円 評価損益:▲13,313円 (損益率▲6.1%) 累計スワップポイント:8,246円 今朝積立単価:103.54円 平均積立単価:104.94円 数量:4CHF(=約414円) 累計積立数量:723CHF(=約75,869円) 外貨資産価値:74,858円 評価損益:▲1,011円 (損益率▲21.0%) 累計スワップポイント:▲53円 投資あるある : 予想を的中させてるのに損益がマイナス・・・。プロも経験する悲しい現象。 一生懸命いろいろ相場を分析し、予想して、予想通りの展開になるのを長い時間待って、耐え忍んで・・・ そしてついにその予想通りになる展開がやってきた!!! しかし、予想通りにいっても小さな利益で確定してしまい、結局あまりもうからない。むしろ、予想通りになるまでの損失が大きくてトータルで損益マイナス。あれ、おかしいな。予想通りにいったのに・・・。 そんな、個人投資家が通りがちな予想が当たっても損益が伸びない現象だが、意外にもプロも同様の経験をすることがあるようだ。記事を見てみよう。 グロース氏:独国債空売りはタイミング良かったが実践に難点(ブルームバーグ) ビル・グロースといえば、言わずと知れた超大物債券ファンドマネージャー。さすがグロース氏、昨今の独国暴落・利回り急騰の流れを時期も含めて的中させた。しかし方向は予想通りだったものの、ここまですごい勢いで独国債暴落するとは思わなかったらしく、結局リターンはマイナスだったのだそうだ。 ビル・グロースさん、わかるよ!!その気持ち!!! デイトレードにどっぷり浸かった経験のある方は、誰しも経験あるんじゃないだろうか。予想が当たったからといって、儲かるかどうかは別問題だ。予想だけでは勝てず、相場で勝つにはまたそれなりの精神力が試される。だから僕は中長期の方向性のイメージを掴むために移動平均線の分析はするものの、デイトレードはやらない。中長期で方向性を掴んだら、あとはやっぱり積立てぐらいがちょうどいい。 暴落のサイン!??? 僕の中で大きな暴落のサインが、昨日出ました。 僕は普段はサラリーマンとして働いてますが、 その職場で、投資にまったくうとい人が、 「円安、すごいな!ドル天井知らず。ドル買おうか!」 と意気揚々と語ってました。 まったくの素人さんが飛び付く相場。 これはまさに暴落のサイン!! ・・・という、たいした話ではないですが、 そこまでみんなが一方向に向かっていると、 大きく稼ぎたい投棄マネーはどう動くか。 1回暴落を仕掛けるのが儲かりそうですよね。 荒れる相場は近そうです。 僕は自慢じゃないが過去、FX、日経225先物、オプション取引のデイトレードでさんざん損してきた。デイトレードで損する理由として、損してる人はよくわかるであろう「ポジポジ病」という病がある。笑 最初はある程度利益が出る。もっかいやってもたぶん利益は出る。しかしその利益が積み上がるのを重ねるうちに、利益が出ない時間が惜しくなり、いつも投資ポジションを持たずにはいられなくなる。そしていつか相場の大変動に巻き込まれ、大損する。相場には必ずなんとかショックとかいう大変動がやってくるので、364日得したあとに、ある1日で大損したりする。僕もそんなパターンで利益を積み重ねてもある最後には損してきた。 今回毎日積立FX外貨投資をブログで公開しながらやってみて、毎日積立はこのポジポジ病を解決するのでは、という大発見をした。 個人投資家の大体の人は、長年やってれば1年に数回来る利益チャンスには気づくと思う。だからそのタイミングを投資資金を温存してじっと待ってここぞというところで利益を得ていくのが投資で勝率を上げるポイント。しかし僕のようにポジポジ病を患っている人は、チャンスでないところでも小さな利益を狙って投資してしまい、チャンスの時に投資資金が無い。しかし毎日積立FXをやってみて、毎日500円~1000円という少額しか投資してないのに、ポジションを持っている満足感を得られることに気づいた。これは、銀行の外貨預金で自分が知らない間に自動で積み立ててくれるのでなく、毎日自分の手で外貨を買ってるからこそ得られるマーケットへの参加感だと思う。これなら、少額の積立でほぼノーポジションのままポジポジ病を退治して、ここぞというチャンスがきたらそれなりの金額を投資するという、理想の投資スタイルができる、ということを発見した。 僕のようにポジポジ病を患っている人は、解決方法としてこの毎日FXコツコツ積立を試してみてもいいかもしれない。これから積立が積み上がって運用額が大きくなってきたら気持ちも変わるかもしれないが、少なくとも積み上がるまでの数年は使えるだろう。もちろん、実行する場合は投資の世界なので自己責任ですよ。僕も自分自身での実験の最中です。

ご挨拶&お願い (お店紹介) | ホーム | おもちゃのギブタ☆TCG・ガシャ・くじ☆giveta.net 開閉店時に☆ でお知らせしまします 【営業時間】土・日・祝:10時~20時 ☆ 平日:13時~20時 ☆ 定休日:月・火 ご挨拶&お願い (お店紹介) 発売予定・イベント情報&参加申込書 ・『おもちゃのギブタ』のサイトをご覧いただきありがとうございます。 ・子供の頃好きだった 近所の駄菓子屋 みたいなお店を作りたくておもちゃ屋を始めました。 大手とは違う品揃えをし、商品を見て驚いて、商品を買って笑顔になってもらいたい! これでなんとか生活できれば良いと考えていたのですが、やってみるとかなり難題でした。 (一消費者だった頃は意識しなかった事が多いので、詳しくはブログで書いていく予定です。) ・万引き等の営業妨害行為がありましたので、店舗存続の為に様々なルールを設定随時更新しています。 ・小学生以下のお子様からご年配の方々まで、個々に合わせた商品を ご提案→ご購入→ご満足いただけ、何度もご購入いただけるお店への日々進化を目指しております。ご購入いただけるお客様からのリクエストは大歓迎です! ・『おもちゃのギブタ』は独自のシステムや品揃えが売りのセレクトショップ的な玩具店です。少数スタッフで経営している個人店の為、みんなが気持ちよく楽しめるよう様々な取り決めをさせていただいております。以下、ご理解ご協力いただきます様お願いいたします。 ・小学生以下だけでのお買い物は保護者の許可が必要だと教育機関から聞いております。当店では許可を得てお買い物に来られているものとして対応いたします。ご心配な方は事前にお越しいただき、お子様にふさわしいお店かご判断ください。 ・当店の商品はほとんどが新品です。リサイクルショップの様な中古買取販売は基本行っておりません。 ・陳列商品はスタッフが手渡ししますので勝手にさわらないでください。カプセルトイを中心に飾れていない品が多くあります。どんな商品をお探しかお気軽にお尋ねください。 ・カードゲームはパック開封の醍醐味を楽しんでいただきたいので、デュエマ・遊戯・ポケモン・バトスピ等はできるだけ多くの種類を取り揃えるよう努力しております。(仕入や入手が困難な商品はプレミア価格になっているものがございます。) ・商品をご購入いただけるお客様には、開封用ハサミ や 仕分けトレイ をお貸ししたり、欲しいカードがどのパックに入っているかお調べする等、家庭的なサービスを心掛けております。(パックから出たばかりのカードはわらしべルールに使えます。(詳しくは独自システム欄へ)) ・シングルカードリストやストレージは用意しておりません。お探しのカード名・ご予算・必要枚数等をお教えいただいた後、在庫状況や取寄可否をお調べいたします。 ・主な取扱商品:トレーディングカードゲーム(デュエル・マスターズ、遊戯王、ポケモンカードゲーム、バトルスピリッツ、ウィクロス、イナズマイレブンイレブンプレカ、NOVA、ヴァイスシュヴァルツ等ブシロードTCG) 流行玩具(ゾイド、ベイブレード、スナックワールド、イナズマイレブン、L.O.L.サプライズ! 、魔法×戦士マジマジョピュアーズ!、レイトンミステリー探偵社、パズドラ、シンカリオン、ドライブヘッド、スターウォーズ、妖怪ウォッチ、ハンドスピナー、等) 定番玩具(トミカ、プラレール、メタコレ、ポケットモンスター、リカちゃん、ポケモン、ディズニー、アニア、トイゲーム(トランプ・花札・けん玉・小型ボードゲーム(人生ゲーム・囲碁・将棋・麻雀・オセロ))等 (2018年8月1日現在) ※仮面ライダーやウルトラマン等バンダイの玩具商品は近隣店舗での販売がありますので在庫は置かず前金予約販売のみとしています。店頭にない商品のお取り寄せも可能ですが、商品到着後ににご購入いただけず損失が出た事がありましたので前金でいただきます。新発売の商品は、前金予約で確実&お安くご購入いただけます。(ベイブレードバーストは当店の発注る数から大幅カットされて入荷する事が多い為、基本的にご予約をお断りしています。) ・入店料はいただいておらず、ご購入いただいた商品から生じる利益で店舗を維持しております。 (珍しいパックを見る為だけ等、購入意思の無い方のご入店はお断りしています。) ・持ち込み物のご飲食やゴミ捨てはお断りしています。 (店内で販売している冷たいジュースや食玩のご飲食は大歓迎です。) ・商品はスタッフがお渡ししますので、勝手にさわらないでください。(守れない方はご購入いただきます) ・お客様からの値切り交渉やサーチ行為、勝手に写真を撮る等の無責任な言動はお断りしています。 (店舗維持の貢献度に応じて店側からサービスしております。個人情報保護の観点から撮影は許可制です。) ・所持品は自己管理を徹底してください。紛失騒ぎや忘れ物をする等、守れない方はご入店をご遠慮いただきます。 ・万引きは警察に通報します。不審な動きであると当店が感じた際はお引き取りいただきます。 ・ご購入される方用にフロア席を設けております。ご購入された商品は席にてご開封後続いてお遊びいただけます。 ・ご購入されない方の対戦スペース(フロア席)利用はお断りしております。 ・ご購入者様へのサービスの一環としてメーカーの公認大会を申し込んでおり、店内商品500円以上のご購入(小学生以下は300円以上)を基本的な参加条件としています。事前にご購入いただくことで予約することができます。ブシロードが参加費200円制度を導入したことを受け、他メーカーイベントにも参加費支払(中学生以上=200円、小学生以下=100円)でもご参加いただけるようにしました。メーカーが[参加費無料]を謳い文句にしているイベントは無料ですが、メーカーからの助成金収入等は無く、ご購入いただいた商品代から仕入れ代金を差し引いたお金でテナント料や人件費等の維持費を賄っておりますので、購入協力をお願いいたします。 ・各イベントの当日受付は開始30分前(開店=開始の場合は0分前)から行い、受付開始時に定員を超えている場合は抽選で参加者を決定、超えていない場合は先着順で受付を行い定員を満たした時点で締め切ります。(定員数は各公式サイトを参照) ・気象警報が発表された日は安全上の問題や宅配便の遅延が発生する可能性がありますので公認イベントを中止いたします。(2018年7月7日の西日本豪雨発生時のポケモンカードゲームイベントにおいてトラブルが発生した為、無理して開催するのはやめました。) ・万引きや嘘つき・ルール違反等、営業妨害行為であると当店が判断した人は出入り禁止といたします。 ・小さなお子様など上記を守るのが困難な場合は同伴者が責任を持ってサポートしてください。 ・わらしべルール:当店で買ったパック等から出てすぐのカード等を下取りして査定額を商品購入代金に充てていただく制度 ・リクエストカード:シングルカードリストやストレージコーナーは無く、リクエストカードに記載していただく方法で販売 ・ギブタシステム:(準備中) 販売中の飲食物 ・ペットボトルジュース、税込150円で販売中。 (炭酸飲料:コカ・コーラ、ジンジャーエール、ファンタグレープ、カルピスソーダ・・・)(清涼飲料:ぐんぐんグルト、カルピスウォーター、つぶつぶみかんジュース、アミノサプリ、カフェオレ・・・) ・駄菓子&食玩も販売開始。(食玩は わらしべルール 対象商品です) 10円+税:うまい棒、 100円+税:ワンピースマンチョコウエハース、スーパードラゴンボールヒーローズカードグミ、アイカツ!データカードダスグミ、 120円+税:モンスターストライクウエハース(プラカード入り) ここまでお読みいただき誠にありがとうございました。異常なまでのルールを設けている理由の一つとして量販店とネット通販の繁栄状況があると考えております。高度経済成長時の仕入れ流通の仕組みは[メーカー]⇒[1次問屋]⇒[2次問屋]⇒[まちのおもちゃ屋]でしたが、少子化に伴いメーカーは1度に大量に買ってくれる量販店と直接取引するようになり、困った問屋が小売店に分けて卸すのではなくネット通販を営み直接安くお客様に売るようになり、末端の小売店は潰れていったと思っています。実店舗を無くす事で経費は減少しお客様は安く買えますが、TCGの場合プレイする場が減っていきますので最終的には誰にも良い結果をもたらすとは思えません。お金の損得だけでなく信頼関係で繋がれる小さな店の役割はある筈と信じて、サラリーマンから転身してはじめたお店が「おもちゃのギブタ」です。ご理解ご協力の上お楽しみいただきますようお願い申し上げます。 GIVE&TAKE≒ぎぶた (2018/7/19更新) 開閉店時に☆ でお知らせしまします TEL 086-697-XXXX 【営業時間】土・日・祝:10時~20時 ☆ 平日:13時~20時 ☆ 定休日:月・火

みんなが寝静まった頃に 【Korea Risk】(02) 韓国経済のドミノが倒れる日 【Korea Risk】(02) 韓国経済のドミノが倒れる日 朴槿恵前大統領の罷免と新大統領の選出、北朝鮮のミサイル問題を巡る米中を巻き込んだ緊張――。韓国の政治情勢は波乱続きだが、輸出や株価は好調だ。但し、経済のファンダメンタルズ(基礎的条件)は怪しい。先ず、韓国経済の実態を簡単に整理してみよう。2015年のGDPの約46%は、商品やサービスの輸出が占めた。つまり、韓国経済の約半分は輸出に依存している。これでも2012年のピーク時(56%)と比べれば低下したが、アメリカは13%、日本は18%、中国は22%であることを考えると、依然として極めて高い水準にあると言えるだろう。輸出主導型経済の問題点は、海外市場の変動の影響を受け易いことだ。国内市場なら政府の助けを借りてシェアを守れるかもしれないが、外国市場では消費者の嗜好の変化や、新たなライバルの出現、安い類似品の増加でシェアを失い易い。ジャコウネココーヒーやイタリアの美術品等、地域の特産品、或いはスイスの金融業等、外国企業が真似し難いサービスなら、外国市場での需要は安定しているかもしれない。だが、韓国の主要輸出品はどれもこのカテゴリーに属さない。過去20年間、韓国の主な輸出品といえば電気製品・自動車・船舶だった。実際、2000年代半ば、韓国メーカーはこれらの分野で世界のトップクラスにいた。だが最近、多くの分野で韓国企業の突出は目立たなくなってきた。その大きな原因の1つは、中国企業が技術力を付け、多くの市場で安い類似品を提供できるようになったことがある。その影響が最も顕著に見られるのが海運・造船業だ。中国の港湾や造船会社が世界的に頭角を現してきた結果、太平洋地域の海運・造船業は大掛かりな再編を迫られている。 見落とされがちだが、韓国の輸出品には多様性が無いという問題もある。48%は電子機器や関連部品で、31%は自動車や船舶と関連部品だから、その何れかの分野で大掛かりなシフトが起きれば、韓国経済全体がゆっくりだが確実に下降する恐れがある。輸出が1割減っただけで、経済が5%収縮して、大量の雇用が失われる可能性もある。潜在的失業率が10%以上と言われる雇用環境は、一段と悪化するだろう。『サムスン電子』等のハイテク企業の業績は今のところ好調だが、『華為技術(ファーウェイ)』や『広東欧珀移動通信(OPPO)』等の中国企業が激しく追い上げている。それに韓国企業は、競争力を維持するのに不可欠な研究開発投資に、あまり積極的でないことで知られる(※とりわけクリーンエネルギーの分野では、この傾向が顕著だ)。このことが衰退に拍車を掛ける可能性もある。韓国経済のもう1つの大きな懸念は、企業部門が抱える莫大な債務だ。韓国企業の債務残高は、対GDP比150%にも上る。アメリカと中国も高い水準にあるが、多くの理由から、韓国のほうがいざという時、危険な状況に陥り易い。第一に、韓国版"ゾンビ企業"――即ち債務返済が3年以上滞っている企業が多い。韓国の企業債務の約4分の1はゾンビ企業のもので、焦げ付く可能性が高いとみられている(※しかもその割合は年々高まっている)。更に危険なのは、その貸し手が韓国の金融機関やグループ企業が多いことだ。従って、幾つかの企業がデフォルト(債務不履行)に陥れば、連鎖的に韓国経済全体が深刻な打撃を受けかねない。これまでは、借り換えや条件変更によってデフォルトを回避してきたケースが殆どだが、いつまでもこの手法を繰り返すことはできない。韓国の大手企業も、莫大な負債と無縁ではない。例えばサムスンは、年間収益の148%に相当する約290億ドルの債務を抱えている。将来性への期待がこうした借り入れを可能にしているが、中国企業の台頭でその期待が萎めば、債務の割合は上昇して、株価、更には業績に影響が出るだろう。債務返済計画や研究開発投資も打撃を受けるかもしれない。何故、韓国企業はそんなに借金漬けなのか? その背景には、幾つかの環境的要因がある。先ず、1990年代末~2000年代の好況で、余剰資金を積極的に運用する投資ブームが起きた。この時、政府は国内での運用を推進する為に、関連法令を緩和。これにより、企業は体力を上回る借り入れが可能になり、後にゾンビ企業が増える原因となった。企業側の経営判断が甘いことも問題だ。昨年破綻した『韓進海運』も、無能な経営陣の非現実的なほど楽観的な経営判断が、資金繰りの悪化に繋がった。それだけではない。韓進海運は中堅財関『韓進グループ』の一員で、グループ企業から多くの出資(と支援金)を受けていた。それが再建不能と判断されたことで、グループ企業も打撃を受けることになった。よく知られるのが、約3億4000万ドルの債権が回収不能になった『大韓航空』だろう。 こうした財閥企業の"循環出資"は、企業が生み出した富を韓国国内に留めておきたい政府によっても支えられてきた。過去30年間、その政策の恩恵を最も受けてきた業界の1つが不動産業界だろう。企業が好況時に積み上げた余剰資金が不動産市場に流れ込んだ結果、韓国では近年、新しいマンション・リゾート・高級ホテルが次々と建設されてきた。伝統的に不動産業とは無関係の『ロッテグループ』・『SKテレコム』・『現代グループ』といった有名企業が不動産投資に乗り出し、完成したビルに自社のロゴを入れている。近年はマンションの空室が目立つ等、住宅市場では深刻な供給過剰が指摘されているにも拘わらず、企業の不動産投資は2015年も記録的なベースで続き、不動産バブルの懸念が高まっている。1990年代末~2000年代に投資規制が緩和されたのは、企業部門だけではない。個人投資の規制も(しばしば不動産購入を奨励する為に)緩和された。この10年、多くの韓国人が無謀としか言い様のない借金をしてきた。経営コンサルティング会社の『マッキンゼー』は2015年初め、個人債務残高が持続不可能な規模に膨らんでいる7ヵ国を明らかにしたが、韓国はその1つだった。だが、政府も人々もその警告に耳を傾けなかった。2015年1月は対GDP比84%だった韓国の個人債務残高は、1年半後の昨年7月には90%に上昇した。中国は41%、日本は66%だ。ここ数ヵ月の政治の混乱ぶりを見ると、無能と腐敗が如何に韓国経済を危険に曝しているかは推して知るべしだろう。真面な人間なら、この状況を見て、韓国経済の今後に不安を覚えない筈がない。破滅に向けたドミノは、長い年月をかけて並べられ、最初の一押しを待つばかりに見える。 (韓国東西大学教授 ジャスティン・フェンドス)

今後もグループとして活動を継続していくとのことでしたので、ファンにとっては大変喜ばしいことなのかもしれません。「解散反対」や「多くのファンの期待、願いに応えて存続することはよかった」とのコメントが大臣や総理からもありました。 しかし、ちょっと別の角度から考えると、結成して25年も頑張り、十分会社にも恩返しをしてきた彼ら（そしてマネージャー）が独立を断念せざるを得なかったという結果は、本当に良いことだったのでしょうか。私にはむしろ日本の「独立」に対するネガティブ思考や、芸能界の闇の部分（芸能人を縛るのが当たり前という風習）を露呈しているよう見えてしまいます。 さらに、今となっては独立を考えたメンバーが「造反者」のように扱われているのも解せません。報道ベースでは、少なくとも今年9月の契約満了までは続けてから辞めるという事でしたので、契約的に何か瑕疵があったようにも思えません（「契約」や「誓約」を破ると言うなら大問題ですが）。 そして、以前から（芸能界に疎い）私の耳にさえ入ってきていた話から推察すると、独立を志向したメンバーも、どちらかというとマネージャーや創業一族との後継者争いに巻き込まれたところが多分にありそうです（あくまでも噂ですが、メンバーの中には、その後継者の一人として目されている人もいるそうです…）。 また、労働条件等を巡って事務所と対立し、全く言い分を聞いてもらえずに独立や移籍を余儀なくされ、その後も元の事務所が業界に圧力をかけるというケースもよく聞きます（再び脚光を浴びることができるアーティストはかなり限られています）。 ファンからは「5人が笑顔で歌ってくれることが一番です」というメッセージが数多く寄せられているようですが、その笑顔を無理に作ってこれから何年も歌い続けなくてはならないとしたら・・・彼ら自身の人生を考えるとゾッとしないでもありません。 事務所にも日本にも十分に貢献してくれたSMAPのメンバーひとり一人が、近い将来は本当の幸せ（勿論、それが事務所に残ることだと本心から思えたなら、それが一番良いことだとは思いますが）を掴むことができるよう願っています。 編集部より:この記事は、タリーズコーヒージャパン創業者、参議院議員の松田公太氏（日本を元気にする会代表）のオフィシャルブログ 2016年1月19日の記事を転載させていただきました。オリジナル原稿をお読みになりたい方は松田公太オフィシャルブログをご覧ください。

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目的地のミラノまで、今回フランクフルト空港で5時間のトランジットがありました。ヨーロッパ最大規模を誇るフランクフルト空港ということもあり、エリアいくつにも分かれていて移動するのもかなり時間が掛かります。 実はドイツに降り立つのは初めてなので、とっても楽しみにしていました。トランジットでも、ドイツはドイツ。笑最近は顔認証システムで入国スタンプもらえないのか、、、と思っていたらもらえました、降り立ったという証をゲットです。 まずは、本場のビールとソーセージを。いたるところにソーセージ！！ ポークだけでなくビーフのみのソーセージもあるんですね。冒険派ではないのでポークのホットドッグをご覧ください、このボリューム！ ケチャップ、マスタード、オニオンチップ、ピクルスをセルフで！粗挽きなのかと思いきや、一番柔らかな部分を原料にしているそうでとてもまろやかでした！成城石井さんのソーセージに似ていて、かなり好みのタイプでした。 プレッツェルもこのバリエーション！大きかったのでみんなでシェアしましたよ。 小さいころ食べ尽くしたといっても過言ではない大好きなHARIBOも、お菓子コーナーの最前線にラインナップ！ 最後に、リサーチ大本命のドイツの高級スーツケースブランド「RIMOWA」です。リモアのお店を構えているのかと思っていましたが、「WorldShop」というトラベラーズショップにコーナーを構えていました。 人気型の“Cabin”や“Check-In L”も、国内価格の約8割のお値段でした。リモアを購入予定かつドイツ行き予定のベストすぎるタイミングの方、是非現地購入をご検討ください！笑ドイツのLufthansa(ルフトハンザ航空)とコラボレーションのアイテムもありました！人と被りにくくて良いですね！ フライトウェアは、新作upper hightsのシャツマキシを選びました。 全くしわにならず、長時間座っていても苦にならないのでフライトにも本当にオススメなんです。なんといってもこんなにストレスフリーなのに着映えするから嬉しい♡5時間あっても、エリア別で移動するにもかなり時間が掛かるので、行きたかったLOEWEやGUCCIは時間切れで断念。皆さま、本当に広いので行かれた際は時間配分にお気を付けくださいませ。 とっても楽しいトランジットでした！ Share : ANRI コンセプター Instagram：anri_harimoto 数々のラグジュアリーブランドが並ぶ港区某セレクトショップで多くの有名人や顧客ファンから支持されるトップスタイリストとして活躍。その才能を生かし現在は、HAUNTのコンセプターとストアマネージャーを兼務。 バイイングシーズンには世界中の逸品を求め日々飛び回る毎日を送っている。

Ps4はダウンロードしたゲームを別のアカウントでプレイします (2020) 2016/06/04 詳しくは、「アカウント情報」をご覧ください。 4. [すべてダウンロード]を選ぶ。 ダウンロードしたゲームはコンテンツエリアに表示されます。[はじめる]が表示されたら、ゲームを開始できます。 PS4のフリープレイソフトは、ダウンロードした時とは別のアカウントでも、Plusに加入しているアカウントであれば遊べますか?あくまでもダウンロードしたアカウントがPlusに加入していないと遊べないのでしょうか? ※プレイには「モンスターハンター:ワールド」本編のソフトが必要ですが、本編がダウンロード版の場合、同一本体内の複数アカウントで使用するには、本編を購入したアカウントで、その本体を「いつも使うPS4」に登録している必要があり また、PSVR(プレイステーションVR)をより楽しむためにPS4Pro(プレイステーション4プロ)を購入した方も多いことでしょう。 そこで問題となるのが「データの移行」です。これまで以上にプレイステーションを楽しむためにも、元々使用していたPS4からPS4Proにデータを移行するのは必須の作業 2018/02/22 ps4カテゴリ: ps4ストア| ps4新着| ps4ランキング| amazon限定| ps4ソフト| ps4本体| ps4周辺機器| ps4中古| バーゲン| 【テレビゲームtop】 注記: タイトルに記載のない限り、商品に封入されていない「外付け予約特典」は、お付けしておりません。 PlayStation Plusは、ワンランク上の機能や特典をお手頃価格で利用できるメンバーシップサービスです。PS4®での「オンラインマルチプレイ」、毎月セレクトされた人気ゲームを好きなだけ遊べる「フリープレイ」、割引価格でゲームを購入できる「ディスカウント」など、お得で楽しいサービスを ps4のソフトは「パッケージ版」と「ダウンロード版」のどっちで買うのがオトクなのか? それぞれのメリット・デメリットを整理しました。 2人協力プレイ対応のゲーム情報ブログ 【ps4】1本のダウンロード版を2人で共有する方法。一本を兄弟や親友と共有したい場合にすべきこと。 しかしps4版のフォートナイトも非常に人気です! ps4からフォートナイトをプレイしたいという方は、まずダウンロードが必要となっています。 ちなみに、ps4版フォートナイトの日本版は基本料金無料で配信されています。 お得なセット商品も注目! ここまでできたら、改めてaに元のアカウントでログイン(このとき、再び「いつも使うps4」には設定しない)、bはb用のアカウントでログイン。 PS4用のダウンロード版のゲームは、同時に最大2台まで共有できる仕様 になっているようなので、家族2人なら 年末年始のPS StoreのセールでPS4のダウンロードソフトを買いまくったせいで積みゲーが倍増した今井阿見です。. 所有しているPS4のダウンロードソフトが増えたせいで、PS4のホーム画面で過去に買ったゲームソフトが表示しきれなくなり、ゲームを探しづらくなりました。 PS4[ダウンロード版]の購入方法と買い方では、クレジットカード、コンビニ、プレイステーションネットワークカードについて紹介しています。また、PS4[ダウンロード版]の容量と共有とアカウントでは、最大容量と共有ライセンスの違法行為、そして、アカウントの切り替え方法について紹介 PS4で購入したDLC(ダウンロード版のゲーム)は、他の人(別のPS4)と共有することで、同時に最大2台のPS4で自由にプレイすることが出来ます。実際にモンハンワールドで、ダウンロード版1本を2台のPS4でプレイできています。 特別な機材やソフトは必要なく、本体の設定を少し変えてダウンロード PS4で海外のゲームを遊ぶ. 実は日本製のPS4でも海外のゲームは問題なく遊ぶことができます。amazonなどで購入したディスク版はもちろん、DL版でも好きなタイトルが遊べます。ただしDL版を遊ぶには海外アカウントを取得し、海外のPSStoreでゲームを購入する ・Playstation Plusに加入しているアカウントで購入したダウンロード版のソフトは、別の未加入のアカウントでログインしてもプレイ可能です。 この本体を使えば、Playstation Plusに未加入の別のアカウントでログインしても、オンラインマルチプレイができます。 2018年8月17日 『Dead by Daylight』や『Final Fantasy 14』や『Destiny 2』といった、オンラインで対戦や協力プレイができるゲームが したがってアカウント[A]で購入したソフトは、PS4[B]でダウンロードしたり、プレイしたりすることができるようになります。 2018年2月13日 SEN アカウントをご利用の本体へ「いつも使う PS4」として登録することで、他のユーザーも利用できるようになります。 出典1 台の 【ダウンロード版のソフトを購入した側(A)】では、ゲームをプレイしている最中もネット接続が必須となります。 PS Storeで購入したゲームは、PlayStation Network上のアカウントに関連付けられるため、いつでも好きな時にゲームをプレイすることができます。 「自動ダウンロード」を有効にしていれば、PS Storeで予約購入したタイトルは発売日の0:00からプレイすることが 2020年4月24日 クラフトが勝敗を左右するバトルロイヤルゲーム『フォートナイト(Fortnite)』の引き継ぎ(連携)方法解説です。 2つめは、PS4かSwitchでプレイ開始する際、誤ってEpicアカウントの作成を[スキップ]して始めてしまった場合の救済に 本記事ではiPhoneで解説しますが、Android、PCでも手順は同じです。 筆者が確認した所、どのボタンを押しても同じ画面に進みますが、正直に選ぶのが確実です。 Epicアカウントのサインインが済んだら、新しく遊びたい機種にフォートナイトをダウンロードしましょう。 2018年10月26日 ・1本のダウンロード版ゲームを2人(別々のアカウント)で共有する方法。 ・そして2人が同時にプレイできる方法。 目次. How 2ステップ 新しいユーザー (3)購入者アカウントでログインした共有先PS4にダウンロード版をダウンロードする。 最新アップデート情報. ゲームを起動しているとインストールされない為、ゲームを終了した状態でアップデートを行ってください。 [ライブラリー]⇒[購入したコンテンツ]⇒[ イースIX オリジナルサウンドトラック mini [CODE:RED&BLACK] ]を選びダウンロードします。 PS4にUSBメモリー に反映されません. PS4 設定メニュー PlayStation Network アカウント管理から「ライセンスを修復する」を選択してください。 別のアカウントでプレイ&DLCを利用している人がいる場合はログイン状態にしてもらってください。 ・PS4本体の 実質3人でゲームを共有してるわげではありませんが、私は現在ダウンロードしたアカウントを本垢とすると サブ垢でよくダウンロードしたゲームをプレイします いつも使うps4の解除をするということは aはダウンロードしたゲームをするには本垢のみでしか遊べ ps4のダウンロード版を別のアカウントから共有する手順②共有したいアカウントからの操作. 次に、共有を受けたいアカウントからの操作に入ります。 まずは、起動直後のログイン画面でDL版を購入したアカウントをPS4本体に登録されていることを確認します。 2台のps4で同じアカウントを登録するというものです。ps4のアカウントは、psnに保存されているものに手持ちのps4からサインインしている仕組みです。そのためすでに1台のps4に登録しているアカウントでも、別のps4に登録することが可能なのです。 意外に知られいないのがDLC(ダウンロード版)のゲームは1つ購入するだけで2台のPS4で使えます、PS Plusの契約も1つでオンラインにアクセスしてマルチプレイも可能です。 2台で別々の購入したり、PS Plusの契約する必要はありません。 PS4には様々なゲームの追加コンテンツや追加テーマ、追加アプリが存在し、ユーザーはプレイステーションストアを通じて自由にダウンロードすることが可能です。しかし、ダウンロードしていくうちにそれらが何らかの要因でダウンロード出来なくなってしまうことがあります。一瞬PS4の故障 こんにちは実家に居るときは兄弟が1台ずつ同じゲーム機を持っていた一砂です(@kazunabear) 家族がPS4でオンラインゲームをプレイしようと思ったときに、同じアカウントでプレイされると成績が変わったり、トロフィーの解除をされたりして嫌ですよね? PS4のゲームアカウントを、2台のPS4で共有することができないとお困りの方も多いはず。PS4のゲームアカウントを別々のPS4で共有する方法はあるのでしょうか。本記事では、PS4のゲームをアカウント間で共有する方法や解除方法をご紹介! Nov 06, 2015 · ps4のダウンロード版ソフトについてps4は複数アカウント作成できますが、1つのアカウントでダウンロードしたソフトは全アカウントで遊べるんですか?オンラインなども含め。

ユニクロは店舗で『洋服を売っているだけ』だと思っていた私は「ユニクロってこんなサービスもしてるんだ」と少し驚くと同時に、洋服をただ売るだけでなく、色々なサービスを展開していることにとても興味が湧きました。 で、サイトを見てもらえれば わかるのですが、ロゴを入れたい洋服を選んでロゴの画像を登録すれば、ツールを使ってサイト上で簡単にロゴの大きさやレイアウトを自分で決めることができて、仕上がりの状態をサイト上で確認することができます。 何かオリジナルの洋服を作ってみたいな、と思わせてくれるサービスでした。それで『近代マーケティングの父』と呼ばれるフィリップ・コトラーは「顧客にいかに語ってもらうか」がこれからのマーケティングのカギになると言っています。 このユニクロカスタマイズのサービスを考えた人がコトラーの言っていることを参考にしたかどうかは わかりませんが、実際に私は このメルマガを通じてあなたにまんまとユニクロカスタマイズの良さを語ったわけです。

四魂祭体育の部リハーサル 9月24日(火)に四魂祭体育の部のリハーサルを行いました。本番と同様の流れで自分の仕事の役割や、自分たちの種目の入退場の仕方などを確認することができました。全校練習や係会で事前に確認したことを生かして、主体的に動くことができました。 昨年よりも更に完成度の高い四魂祭体育の部を目指して、四中生一同頑張ります。 ~リハーサルの様子~

Abingdon-on-Thames (chiamata semplicemente Abingdon tra il 1974 e il 2012) è una città del Regno Unito, nella contea inglese dell'Oxfordshire. È il capoluogo del distretto della Vale of White Horse, e in passato lo fu del Berkshire. Come il nome suggerisce, si trova lungo il Tamigi, alla confluenza del suddetto con il fiume Ock, a circa 5 km da Oxford. Storia Inizialmente Abingdon faceva parte del Berkshire, ma in seguito ad una riorganizzazione dei governi locali fu accorpata al Oxfordshire nel 1974. Amministrazione Gemellaggi Abingdon è gemellata con: Tramite il distretto Vale of White Horse: Note Altri progetti Collegamenti esterni

そんな彼女からの電話でこのエッセイは始まる。曰く、新明解にある「恋愛」の解説が個性的過ぎるのだという。赤瀬川さんはそれを一刀両断することなく、聞き始める。そんな電話をきっかけとして、赤瀬川さんとSさんとの会話はあれよあれよという間に展開（脱線）する。

🎉 New Year. New Rejoicing. New Years is an excellent opportunity to reflect on the past year of God's blessing. It's also a wonderful, yet dim, reflection of the newness that's to come. What is it that makes Christmas worth celebrating? Is it the birth of a child? Is it the coming of a king? Christmas is certainly a time of celebration and excitement, but here is significant meaning as we rejoice in the birth of Jesus Christ. February has been an extremely busy month for our family, but after evaluating our time investments I am so grateful for all we were involved in. As a design manager, I wanted to better understand my role in the fabric of the entire organization. Peter Merholz and Kristin Skinner provide an excellent description of the organization, framework, and components of an effective design organization. A few months ago, I decided I was going to get a new guitar amplifier. I made a list of requirements for any amplifier that I'd consider. I started forming a list of options and then quickly narrowed it down to three options. Unfortunately, some of these amps were hard to find in person, so Guitar Center let me buy all three to try them out with the intent to only keep one of them.

ピースボート86thのあ~ちゃんから2枚の絵葉書が届く | モンターク目黒 | モンターク目黒の部屋へようこそ!私たちは賃貸業になりますが、サービス業だとの自覚のもと、入居者様に快適、安心、やすらぎを持っていただけるようなアパートの運営をしております。入居者様が退去なさる時に、此処に住んでいて良かったと思われるように、思いやり、おもてなし精神を心がけております。 目黒線、南北線不動前駅より徒歩約6分の所にあり、ツーバイフォー、耐震・耐火 認定、エコ 住宅になっており、隣室の騒音が気にならない安らぎ設計の住宅になっております。 詳細は【お知らせ】からどうぞ、お待ちしております。 ピースボート86thのあ~ちゃんから2枚の絵葉書が届く 投稿日: 2015年3月5日 投稿者: nagasaka 写真はマダガスカル、バオバオ街道 前回の79th(北回り)に7~800人ぐらい乗船した仲間の約1割の88人が、南回りの86thに乗船したようだ。 仲間のあ~ちゃんこと有馬さから絵葉書が約2ヶ月かかって届いた。PB(ピースボート)の世界一周をした人しか 共有できないドラマがいろいろあったようで、仲間で会って話しを聞くのが楽しみだ。4月の桜の咲くころに 皆で会う企画を考えてみよう。

「ロザリオとバンパイア」ドラマCD2 (「ロザリオとバンパイア」ドラマCD) (<CD>) | 池田 晃久 |本 | 通販 | Amazon ¥ 1,000 + ¥ 480 配送料 ¥ 345 + ¥ 480 配送料 コメント: 【必ず最後までお読みください】■中古品のため多少の使用感・経年劣化(折れ、ヤケ、シミ、古書特有の匂いなど)がある場合がございます。帯をお付けできる保証はございません(商品の一部とみなしておりません)。カバーが商品詳細ページの画像と異なる場合がございます。また、中古品の特性上、ギフトには適しておりません。詳細についてはAmazonマーケットプレイスコンディションガイドラインをご覧ください。■弊社から注文確認・発送完了メールはお送りいたしません。発送完了後、Amazonから発送をお知らせするメールが届きます(追跡番号も記載されています)。■返品・交換の際は弊社指定の方法でのご返送が必要となる場合がございます。2018/11/19 19:15:00 「ロザリオとバンパイア」ドラマCD2 (「ロザリオとバンパイア」ドラマCD) (<CD>) CD – Audiobook, 2007/12/14 池田 晃久 (原著) ¥ 1,000 ¥ 345 ¥ 1,000 ¥ 345 より 7 中古品の出品 ¥ 1,000 より 1 新品 ¥ 980 より 1 コレクター商品の出品 ドラマCDシリーズ「ロザリオとバンパイア」 (<CD>) ラブコメ&アクション、待望のドラマCD第二弾、登場! クリスマスも近い冬のある日、新聞部の一行は人間界を訪れる。「月音に会える!」――街でアルバイトにいそしむ月音との再会に、胸をときめかせる萌香。ところがお金を落としてしまい、このままでは冬の寒空の下、路頭に迷ってしまう! やむを得ず各自、アルバイトに精を出すことに。そんな中で萌香は、菓子店をひとりで切り盛りする女性と出会い、彼女の店を手伝うことになる‥‥。萌香と月音の、互いを想う気持ちが交錯する、ハートフルストーリー!! 2大特典は、描き下ろしジャケットと特製ポストカード! ISBN-10: 4089011590 ISBN-13: 978-4089011591 Amazon 売れ筋ランキング: 本 - 673,442位 (本の売れ筋ランキングを見る) 209402位 ─ 本 > コミック・ラノベ・BL > コミック 5つ星のうち5.0ジャケットがあまりに可愛いのでUPさせていただきました♪ 待望のオリジナルCDドラマの第2弾です。第1弾と同じく、いきなり物語に入りますので、原作は必読です(せめて主要キャラが出揃う第5巻までは)。相変わらずのドタバタあり、バトルあり、感動あり、ちょいラブもあり、充実した内容で、原作の雰囲気やキャラもそのままです。 舞台はつくねが帰省中のクリスマス前の人間界。萌香たち新聞部は人間界のX'masを取材に訪れますが、財布を無くしてしまいます。それぞれがアルバイトをして旅費を稼ごうということになりますが一体どうなることやら? 一方、街では一緒に食べると超ラブラブになれるケーキが話題になっており、そのケーキ屋に行ってみると大行列。その大盛況のケーキ屋のすぐそばに全く客の入っていないもう一件のケーキ屋が。萌香はそちらのケーキ屋が気になり…。 萌香とそのケーキ屋の店長とのドラマが進むわけですが、とても感動してしまいます。さらにつくねと萌香の絆もより一層深まったような気がします。 バトルシーンはドラマCD1と同じく、音だけでは把握しづらいですが、原作のバトルがド派手なので、それはしょうがないかな。でも、バトル後の決め台詞「身の程を知れ」が聴けなくて、ちょっと淋しいかな? いよいよTVアニメも始まる本作。ドラマCDからアニメ化の際に声優が全て入れ替わり、ファンがドラマCD派とアニメ派に別れる事も珍しくない昨今、本作はTVキャストでもそのままですので、原作ファンでドラマCDを楽しんでも、アニメをそのまま安心して見ることが出来るのが嬉しいですね♪ B.F.S.E 5つ星のうち5.0ストーリーもジャケもいいですが… やはり水樹さん・釘宮さんが出ている時点で即カート行きです。アニメも始まりましたし、今後の展開にも期待大です!

ウィキニュースで作った記事が「いつ」読まれるのか、タイミングを自分なりに考えた場合、「ウィキペディアに貼られたリンクから辿られる」のが「自分で作った記事を見てもらえる唯一のルートであり、適正なルートでもある」と、私は考えています。

2ミリ鉄板の、頑丈なブックエンドを使ってます。鉄工所に関係していた時作ってもらったもので、どっしり君と呼びたいほど重いけど、収まりがいいです。さっき本棚の整理をしていたら、そのブックエンドを床に落としてしまいました。１メートルぐらいの所から、足のほんの少し先に、ガチャン。こんなのを、足の甲や、指に受けたら、間違いなく骨折です。ちょっとだけ、ずれて、良かった良かった。どれぐらいの重さか、台所用はかりで計ろうとしたら振り切れました。さればと体重計に載せたら、１．４キロ。ただでさえ重いのに、角の所が当たったら、とんでもないことになってました。もう、使うのやめようかな。それとも、本棚の一番下で使えば、大丈夫かな。

メニュー選択ホームプロ野球巨人阪神中日DeNA広島ヤクルトソフトバンク千葉ロッテ西武楽天日本ハムオリックスメジャーリーグ大谷翔平ダルビッシュ有前田健太菊池雄星澤村拓一有原航平筒香嘉智秋山翔吾イチロー高校野球ほか甲子園社会人野球独立リーグ侍ジャパン東京五輪WBCプレミア12U-18 ベースボールチャンネル(BaseBall Channel) > メジャーリーグ最新情報 > イチロー > 【MLB】タイ・カッブを『抜いた』はおかしい？イチローの通算安打記録に否定的な米メディアも 【MLB】タイ・カッブを『抜いた』はおかしい？イチローの通算安打記録に否定的な米メディアも イチローの日米通算でタイ・カッブの安打数を抜いたことに対して、米メディアでも称賛する意見もあれば、否定的な意見もある。『SI.com』で編集デスクを務めるケネディ氏はイチローがタイ・カッブを抜いたという考えはおかしいと指摘している。 2015/08/19 text By Ryo Shinkawa photo Getty Images タグ： MLB, イチロー, スポーツ, マイアミ・マーリンズ, メジャーリーグ 0 0 LINE イチローの業績は評価されるべきだが…… イチローは現地8月16日のセントルイス・カージナルス戦でメジャー歴代2位だったタイ・カッブ氏の通算4,191安打を抜いた。米メディアでも否定的な報道は少なかったが、『SI.com』では「イチローは祝される価値はあるが、カッブを抜き去ったという宣伝は信じない」という日米通算安打記録が正式記録として認められるべきではないと、主張する。 長年野球に関わり、著書の1つであるジョー・ディマジオの伝記では高い評価、そして数々の賞を得たケネディ氏。2010年ヤンキースタジアムで当時はまだマリナーズに所属していたイチローを目にした印象を綴っており、全米ファッション誌『GQ』の1ページから飛び出たようなファッションでサングラスを付け、バットが保管されている黒いケースを引っ張って現れる様子はブルースのギターリスト、もしくは1920年のギャングを彷彿とさせたと語っている。 だが対戦投手にとってのイチローはその風貌だけではなく、スタイリッシュであり、正確さを持ち、そして危険な存在であったと指摘している。 独特の打撃フォームからフィールド全体を使ってヒットを放っていく。2度首位打者に輝き、2004年にはシーズン最多安打記録の262本を放ち、そのうち単打が225本とともに1シーズンでの記録となった。時にパワーを見せる場面はあるが、シングルヒッターであるとケネディ氏はイチローを評価する。 抜群のスピードを誇り、バットに当たれば常に内野安打の可能性であった。さらに塁上で、頭脳的な走塁を見せる。 【次ページ】間違いなく来年にMLB通算3000本安打は達成する 1 2 3 0 0 LINE サイト内検索 Tweets by base_ch カテゴリー メジャーリーグ最新情報 プロ野球最新情報 社会人・高校野球・その他 関連リンク 運営会社：株式会社カンゼン フットボールチャンネル ジュニアサッカーを応援しよう！ オンラインショップ ガイドライン 『ベースボールチャンネル』は、野球専門のネットメディアです。弊サイトに記載されている、コラム、ニュース、写真、その他情報は株式会社カンゼンが報道目的で取材、編集しているものです。許可無く転載することを固く禁じます。

ペンキ塗り、夢ハンカチつなぎも、作業ファンドだ! みんな、力をかして!! - CAMPFIRE (キャンプファイヤー)

The Americans with Disabilities Act (ADA) was passed as the Nation's first comprehensive civil rights law addressing the needs of people with disabilities. At Starfish Signs, we produce custom braille and tactile signs that are fully compliant with federal ADA legislation, and with state-specific requirements. Starfish Signs has extensive experience designing, manufacturing and installing ADA compliant signs for room and suite numbers, restroom signs, and building navigation signs. We have the knowledge and experience to ensure that your ADA signs are compliant yet custom, so that you can still incorporate the design elements that are important in your building or project. Check out the work we've done for other office and ADA sign projects.

【印刷物・WEB・制作デザイナー★年間休日125日★(正社員)】オルウィン株式会社/大阪府の《求人募集15463046》-転職EX 大阪府 > 大阪市西区 > 印刷物・WEB・制作デザイナー★年間休日125日★(オルウィン株式会社) 急募!【WEBデザイナー◎大阪勤務】 デザイン〜効果検証まで 新たなWEBデザイナー... 印刷物・WEB・制作デザイナー★年間休日125日★(正社員) / オルウィン株式会社 求人ID:15463046 デザインの力で「笑顔」「希望」「絆」「つながり」「未来」 を創造する会社。主にチラシ・パンフレット・WEB ・似顔絵入り名刺などのデザイン。広告・イベント・教育プログラムなど、様々なプロモーションにも携わっていただきます。★お客様とはパートナーシップ★大手企業を含めクライアントとは直接取引!お客様の想いを直接聞き、一緒に作り上げていきます。自分のアイデア・発想がカタチになりお客様に貢献できる喜びをダイレクトに感じる事が出来ます。そこに『やりがい』が詰まっており、充実感と達成感を感じてください。★自由度が高く、自分のペースで仕事が出来ます★各案件の納期は、営業スタッフと打ち合わせをして決めていきます。スケジュール管理はお任せしますので、自分で段取りを決め、自分のペースで作業を進めてください。デザイナーとしての誇りと責任感を持ってお仕事出来、日々成長を実感できる環境です CLと全て直接取引!自分の発想がカタチになるやりがい右肩上がりの業績。売上は4年間で約2倍に年間休日125日 ワークライフバランスも大事にします想いは三方良し。家族同様の社員と共に、みんなで笑う ポイント2社風は『みんなで笑う』三方良し オルウィン(ALL WIN)とは、みんなで笑う、「全笑(ぜんしょう)」という意味です。売り手、買い手、世間(社会)の三つがハッピーになるように・・そんな想いがこもっています。毎月、月初には全員ミーティングの後、懇親会を開き、みんなで対話をする時間を設けています。食事をしながら、夢を語り、お互いを尊重し合う。まるで家族会議のような懇親会は、様々な意見が飛び交う、とても風通しのいい雰囲気です。 ポイント3私たちはもの語りをデザインします 私たちの事業は80%以上が印刷物のデザインによるものです。お客様と現場で直接打ち合わせをし、一からデザインしています。一人の人にも、一つの会社にも、それぞれのもの語りがあります。想いを引き出し、デザインの力でカタチにし、お客様の事業発展に貢献する事で、笑顔あふれるつながりをデザインします。私たちは、お客様の事業の発展のために様々な角度からサポートします。 ◆8:30〜18:00(実働8時間30分) 一年単位変形労働時間制(週平均40時間以内)残業時間:月平均18時間程度 大阪市西区靭本町1-5-6 本町辰巳ビル6F※U.Iターン歓迎地下鉄四つ橋線「本町」駅 25番出口より徒歩2分地下鉄御堂筋線「本町」駅 5番出口より徒歩5分 ◆月給 20万〜40万円◎ディレクション・指導出来る方、月給25万円〜※月給額は能力・年齢を考慮します【好調な業績 4年間で売上は約2倍に】デザインだけにとどまらず、印刷物や社員研修と、一つのプログラムから派生する付加価値が高い収益性を生み、ここ数年売り上げは右肩上がり。取引先企業には、大手企業や有名大学の名がズラリと並んでます。企業と共に成長・発展し、2020年には売上10億円を目指しています【昇給・賞与】昇給 年1回(4月)※業績に応じて賞与あり【諸手当】■交通費支給(規定あり) 例)年収400万円/30歳 デザイナー 経験4年 ■各種社会保険完備■交通費支給(規定あり)■業績に応じて賞与あり◆自由度が高く、発想が生まれやすい環境◆チーム一緒になって進めていく案件もあれば、担当者としてお任せする案件もあります。スケジュールは自分で管理し、自分のペースで作業を進めていけるのも魅力の一つです。自分の発想で、クライアント様の想いをカタチに変えていき、お客様の喜ぶ姿をダイレクトに感じてください。 ◆週休2日制(土・日・祝)◆年末年始休暇◆夏季休暇◆有給休暇◆慶弔休暇※年間休日125日(2016年度実績) デザインの力で、会社を変え、世の中を変える。みんなを笑顔にし、ワンランクアップさせるデザイン。そんなデザインをお客様と共に作っていく姿勢が、好評を得ております。このたび案件増加につき、意欲のある前向きなデザイナーを数名募集いたします。チラシ・パンフレット・会社案内を作成した経験を持ち、本気でお客様の喜ぶ顔を見ること、社会が良くなることを一心に自分の力を発揮したい方を大歓迎いたします。 ★社風は『みんなで笑う』★様々な業務に関わる事でクリエイターとしての成長を実感できます。明るく素直で前向きな方大歓迎。---------------◆必須条件Adobe PhotoShop Illustratorで2年以上のデザイン実務経験のある方PCの基本操作(Word、Excelなど)できる方 ◆歓迎条件・Web制作実務経験のある方・Dreamweaver使用できる方(HTML、CSSの理解のある方)・Indesign使用できる方・イラストが描ける方・ディレクション、コピーライティング、の経験がある方、志望される方 【STEP1】WEB応募書類による書類選考 ▼【STEP2】一次面接 採用担当 ▼【STEP3】二次面接 社長面接◆ご応募から内定までは約2週間を予定しております。◆面接日、入社日はご相談に応じます。お気軽にお問い合わせ下さい。◆結果については合否に関わらずご連絡致します。【面接回数】2回【面接地】本社 大阪市西区靭本町1-5-6 本町辰巳ビル6F ■チラシ・パンフレット・WEBサイトなどの企画及び制作■もの語りデザイン事業組織活性化プログラム(社員研修)でアウトプットされた情報を元に主人公名刺・会社案内・パンフ・チラシ・ポスターなどを制作。想いをカタチにするデザイン制作に加えて、お客様の業績アップに貢献。■なまずんライセンス事業キャラクターライセンス事業防災グッズ企画・販売・イベント運営■リスクマネジメント事業損害保険代理業

「着物×京都」運動 - 着物と京都の振興を目指す「NPO法人古都研究会」 ホーム > 活動内容 > 「着物×京都」運動 着物を着て京都を楽しみましょう このページでは「着物×京都」運動(きもの・バイ・きょうと・うんどう)の課題と施策を記します。 「着物を着て京都を楽しむ」ことを提案するに当たって大切な点は「ゆかたで祇園祭を楽しむ」気軽な感覚を維持することです。 着物のハードルを下げる 若い方に着物に目を向けてもらう上で 第一の課題は「ゆかた」から「着物」へ移行のハードルが高いことが上げられます。 この要因として、若い世代では「ゆかた」と「着物」は全く別ものという認識が高く、 例えば、ゆかたは着たことがあるが、着物は難しそうなので着られない。 ゆかたは安いが、着物は高いので買えない。 この2点が大きな障壁となります。 この誤解を解くことが、着物のハードルを下げる第一歩となります。 そのためには、 ゆかたの着付けと、着物の着付けは基本同じである 安価で手軽な着物がある ことを周知することが求められます。 着物の着付けと、ゆかたの着付けについて ゆかたの着付けと、着物の着付けは、基本は同じであることを周知するために、 帯の結び方および、「ゆかた」は「着物」の一種なのか、について考察します。 帯の結び方について 若い世代において、特に帯に関しての誤解が大きいことが推測されます。 着物はお太鼓結びが一般的ですが、それに対してゆかたは半幅帯の文庫結び等が一般的です。 この見た目の印象の違いが、ゆかたと着物を別物と印象付けています。 本来、ゆかたの帯(=半幅帯)の文庫結びは、なごや帯や袋帯のお太鼓結びと比較して、 難易度は低く、初心者でもとっつきやすい結び方です。 着物の着付けも半幅帯の文庫結びで良いことを周知することは、 着物へのハードルを下げることになります。 夏期シーズンにはファッション誌にゆかたの着付け方が特集されることも多く、 若年層でもゆかたであれば自分一人で着られる、あるいは手助けがあれば着られるという方は少なからず存在すると思われます。 「ゆかたの帯であれば結べる」という事象を「着物も着られる」という発想に繋げることが重要と考えます。 「ゆかた」は「着物」か? ゆかたを着物の一種とみなすことに関しては異論もあります。 文献によると、元来ゆかたは「湯帷子(ゆかたびら)」に由来します。 帷子とは夏に着る生絹や麻布で仕立てた単衣のことであり、 湯帷子は入浴時に着るものであったのが、転じて入浴後に着るようになり「ゆかた」と呼ばれるようになりました。 藍一色で染められていましたが、現在は染色技術の発展でカラフルなゆかたが増えました。 参考:きもの文化検定公式教本I 最近ではゆかたを単衣のように着る方も増えてきており、 現在では、ゆかたと単衣の着物を見た目で区別するのは難しくなりつつあります。 したがってゆかたを着物の一種と捉えることは決して特異なことではありません。 ゆかたは着物の一種であるということ 「ゆかた」と「着物」の着付けは基本は同じであること 着物は半幅帯を用いると、ゆかたとほぼ同じ難易度で着ることが出来ること の3点を周知することが「ゆかた」から「着物」へ移行のハードルを下げるために効果的と考えられます。 ゆかた感覚で着られる着物 第二の課題として「ゆかたで祇園祭を楽しむ」気軽な感覚を維持する ためには、ゆかた感覚で着られる着物の開発が求められます。 ゆかた感覚維持のために必要なキーワードは、 これらキーワードを満たすために、 生地はポリエステルや木綿が候補となります。 また洋服と同様に買ってすぐに着られるファストフード的感覚が必要とされるため、 プレタポルテの仕立上がり商品が望まれます。 「着物×京都」運動をきっかけに、全国に着物を広める 古都研究会では、着物で京都を楽しむ運動を提唱しておりますが、 着物復興のための最終目標は、京都を拠点とし日本全国に着物を広めることにあります。 このため京都での活動が、着物を着付けるだけのサービス、あるいは、 レンタル着物のように着物を着る機会が京都限りのサービスでは 不十分と認識しております。 着物復興のためには 自分で着付けができる人口を増やすこと 着物着用での外出に自信を持ってもらうこと 京都だけでなく日本各地で着物を着てもらうこと の3点が必要であり、いずれも着物復興のためには不可欠な要素と言えます。 言い換えると、旅行客が着物で京都観光する経験をきっかけに、 着物姿に自信を持つこと を実現することが、必要といえます。 着物産業復興のためには京都にとどまらず、日本各地に着物を再び広める必要があります。 古都研究会では「着物×京都」運動をきっかけに、着物の全国展開を推進します。 着物の開発と「着物×京都」運動に向けて 着物を安く提供するためには量産が要求されます。 そして市場のニーズに合った商品企画・開発が必須となります。 古都研究会では、魅力ある着物の開発、および「着物×京都」運動の展開を、 3つのフェーズに分けて進めます。 第一フェーズ(試行) 「着物×京都」運動を市場に提案し、市場の声をフィードバックする。 第二フェーズ(開発) 「着物×京都」運動にあった商品企画・開発を行う 第三フェーズ(実行) 「着物×京都」運動推進キャンペーンを行う 2010年3月現在は第一フェーズに相当します。 「着物×京都」運動の中でも、特に 「ゆかた感覚で気軽に着られる着物」で京都を楽しむ方法を広める プロジェクトをコモドコモン・プロジェクトと名付け 京都の呉服店有限会社ひろせと提携し試行しています。 ここで得たノウハウを第二フェーズに生かします。 第二フェーズでは、 商品企画・開発に関して着物メーカーの協力が必要となります。 「着物×京都」運動およびコモドコモン・プロジェクトに賛同頂ける企業を募集しております。 第三フェーズでは、 「着物×京都」運動の推進のため、 京都の旅館・ホテルの協力が必要となります。この内容に関しては詳細を後述します。 幅広く周知し実行するために寺社、旅行会社、マスコミの協力も得たく存じます。 すべてのフェーズにわたって 「着物×京都」運動およびコモドコモン・プロジェクトに賛同頂ける個人、団体、企業を募集しています。 このプロジェクトはインターネットを最大限活用し、 皆様から少しずつ力を分けて頂き、ネットワークすることで強力な効果を発揮することを 目指します。

デリケートな赤ちゃんの肌を守りたい。 肌に刺激の少ない全身のボディーミルクとして、エステティシャンで1児の母高橋ミカさん、モデルで4児の母東原亜希が “我が子に納得して使える保湿ケア“を考え抜 […] うちにはアトピーの子がいて、いつも「ヒルロイドローション」というものを使っています。 肌が乾燥しているときはいつも使うのですが、量が少なすぎてすぐになくなるし、なくなったらまた病院に行かないといけないし。 クリームとロー […]

ベンのトーク部分（音声）は現場で固定撮影した音声データをそのまま活用し、登場シーンは前後に短く収めつつ ロードスターに関連する映像やスチール写真をあいだにいくつも放り込みました。実際の映像では、ベンのトークが途切れることなく続き、それでいて画は彼が開発したバイクをバリエーション豊かに見せる手法となっています。

★ただいまセール中！480円→250円にてご提供中です。 あいろん（ironboy1203）制作の、75mm缶バッジです。 絵柄は「IRONBOY」「デフォルメはがね」「カレンダーはがね」「はがね写真」「よっちー」の全5種類となっています。 通常の缶バッジよりも一回り大きい75mm（7.5cm）というサイズに仕上げた事で、存在感・高級感を持つ缶バッジになりました。 安価な「Zピン」と呼ばれるピンを使う缶バッジも多いですが、本製品では安全性と耐久性に優れた「安全ピン」を使用しています。 ■発送について 発送はpixivの運営する倉庫より行われ、単品ですとネコポス発送が可能です。複数点の商品を同時に購入される場合、商品数に応じて送料が自動計算されますのでご了承下さいませ。

colors（カラーズ）は、株式会社ヒューが運営するアダルトゲームブランドである。 概要 2006年末から事業を縮小し、公式サイトも規模を縮小、ソフト販売もダウンロード販売のみに切り替えている。 また、2007年4月27日には魔法少女アイシリーズに関する一切の権利関係を、OVA版を製作発売したGPミュージアムソフト（ミルキーレーベル）に譲渡、さらにゲーム制作に関わった一部スタッフもGP社に移籍した。2008年12月19日に「魔法少女アイ参」がGP社で発売された。 作品一覧 2001年 6月22日 - 魔法少女アイ 11月22日 - 特命教師瞳 2002年 2月22日 - 魔法少女アイplus 9月27日 - 魔法少女アイ2 2003年 7月25日 - サンダークラップス! 12月26日 - 魔法少女アイDVD壱plus弐、特命教師瞳DVDフルボイス 2005年 8月26日 - 狂い咲きヴァージンロード 2006年 1月27日 - 魔法少女アイ2plus（初回版） 3月24日 - 魔法少女アイplus（DVD）、魔法少女アイ2plus（通常版）

テキストは社労士受験の時のテキスト（毎年新しいの買っています）が一番わかりやすいし、労働系の本は持っていないし（自分が執筆したのだけある）、セミナーは労働関係は行ったことがないです（全然関係ない、入江慎也さんの「後輩力」と、星野仙一さんの講演くらいかな）。

(ほぼ)毎日Pチャン : 柳清良 5月12日は柳清良の誕生日🎉 5/12は最強の棟方ストッパー、ナースアイドル清良さんのお誕生日です🎂 お誕生日おめでとうございます。愛海がいつもお世話になってます・・・ #柳清良生誕祭2019 #柳清良誕生祭2019 pic.twitter.com/1DBvKT8cXL

運動は脳血流を増加させ、神経成長因子への刺激や、脂質、ホルモン、インスリン、免疫機能を助ける作用もあると言われています。特にウォーキングなどの1日30分程度の有酸素運動は身体への負担も少なく、家族や友人と取り組むことで効果的に脳に刺激を与えることができます。

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KDDI、au向け4G LTE対応さわらず操作できるタッチレススタイル採用「VEGA PTL21」を発表! | ガジェット通信 GetNews KDDI、au向け4G LTE対応さわらず操作できるタッチレススタイル採用「VEGA PTL21」を発表! 2012.10.17 13:59 画面に触らずに操作できる「VEGA Motion」を搭載 KDDIおよび沖縄セルラーは17日、2012年冬に発売予定の新モデル「2012年冬モデル」の発表会を都内で開催し、新しくネットワークを構築している高速通信規格「LTE(FDD-LTE)」によるデータ通信サービス「4G LTE」に対応したAndroid 4.0(開発コード名:IceCream Sandwich;ICS)を搭載したスマートフォン「VEGA PTL21」(PANTECH製)を発表しています。2012年11月2日に発売予定。 VEGA PTL21は、下り最大速度75Mbps「4G LTE」対応、画面に触らずに操作できるモーション認識機能「VEGA Motion」を搭載しています。またワンセグ、おサイフ、NFC、赤外線、防水・防塵など欲しい機能を全て搭載しています。スマートフォンなのにタッチしない新感覚「VEGA Motion」を搭載。赤外線センサーが手の動きをキャッチして、タッチレスでいろいろな操作ができる新しい機能です。また端末に「ハイ、チーズ」と声をかければ、音声を認識して自動でシャッターを切ってくれるタッチレスな撮影機能「Voice Shot」も搭載しているので、自分撮りもキレイに行えます。 カメラ機能では8つの撮影効果で、撮った瞬間プロみたいな写真に変身する「mini Camera」を搭載し、ブログやSNSへの写真アップがますます楽しくなります。 またポップアップ表示で "ながら操作" ができる「Mini Window」では、Web検索やメール、SNSなどを操作しながら、動画・音楽・テキストメモを、別ウィンドウでポップアップして表示できるので、操作を中断せずにストレスなく楽しめます。 「オリジナルアイコン」機能を使えば、世界に1つだけのアイコンにアレンジ! アニマル柄のフレーム加工や、お気に入りの写真もアイコンにして楽しめます。 また機能も充実しており、従来の携帯電話で人気のおサイフ、赤外線、ワンセグだけでなく4G LTE、NFC、テザリング、防水・防塵、国際ローミング (CDMA/GSM/UMTS/GPRS) 、WIN HIGH SPEEDなどあらゆる機能に対応しています。 基本スペック商品名VEGA PTL21OSAndroid4.0メーカーPANTECH CO., LTD.ディスプレイ約4.3インチ HD TFT液晶重量約134gカメラメインカメラ: 約800万画素/CMOS サブカメラ: 約200万画素/CMOS電池容量1,810mAhサイズ約65 (W) ×129 (H) ×10.8 (D) mm (最厚部 約11.0mm)メモリ約16GB (ROM) /約1GB (RAM)連続通話/待受時間通話時間: 約700分 待受時間: 約380時間 (LTE) 約400時間 (3G)カラープレシャスホワイト、リュクスブラック外部メモリmicroSDXC(最大64GBまで) 対応サービス・機能Eメール (@ezweb.ne.jp)SMSワンセグおサイフケータイNFC赤外線通信Bluetooth(ver.4.0 + LE + EDR)Wi-Fi (IEEE 802.11 a/b/g/n)Wi-Fi (2.4GHz/5GHz)Wi-Fiテザリング (最大接続数10台)4G LTEWIN HIGH SPEED安心アクセス for Androidグローバルパスポート緊急速報メールauスマートパス防水 (IPX5/IPX7等級)防塵 (IP5X等級) ・KDDI、au向け2012年冬モデル発表会を10月17日午後12時から開催!Ustreamによるライブ中継も実施 – S-MAX – ライブドアブログ 当初計画から大幅前倒し!KDDI、次世代ネットワークサービス「au 4G LTE」の説明会を開催【レポート】 – S-MAX – ライブドアブログ ・USTREAM: au発表会: 10月17日(水)12:00 au新商品発表会を開催いたします。 – Ustream ・au 新商品発表会 – ニコニコ生放送 KDDI、au向け2013年春モデルをチラ見せ!Android 4.1スマホ「INFOBAR A02」を投入へ KDDI、au向け4G LTE対応Android 4.1スマートフォン「HTC J butterfly HTL21」を発表!フルHDディスプレイやクアッドコアCPU、2GBメモリー、防水、ワンセグ、おサイフケータイ、NFC、赤外線など ( 2012.10.17 13:59 livedoor ニュース デジタル・IT livedoorニュース エスマックス

あまり知られていませんが、ギックリ腰の時もアイシングを行います。そしてアイシングを行う期間は患部の状況しだいで変わります。（ギックリ腰の時は絶対にお風呂等で温めないで下さい。アルコールも禁忌です。血液等の循環がよくなり患部の炎症が強くなります。

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そんな日は『モエがあいているのかい それじゃあそれを1杯もらおうかな 』なんて言ってみるのがいいのである。もうあるあると言ってたらこの言い方で最後まで言い通すのである。1杯飲んだらシールを1枚もらえる。3杯飲んだら3枚もらえる。そのシールをバーテンさんに自慢しながら渡してみる。そうしたら1杯ただで飲ませてもらえる。そんなラッキーなシステムがモエをグラスで売りしてるBARで今流行っている。今日も巷のBARではそんな光景が見られるのである。 なんと苦味の効いたビターエールであろう のどごしはホップで決まる。久々に美味しいビールに出会えた。 噂は聞いていたのですがここまで マジマジに美味しいとは・・・ショックである・・・無知である・・・アホである。 ・・・スーパープレミアムである・・・ ともあれこの贅沢な味わいはビールファンにはこたえられないはずだ。 以前クラシックでお話しましたがビールの苦味と風味に一役も二役も かっているホップが通常の3倍も使っているらしい。ファインアロマホップを3倍も使っているのです。 通常のビールは一般的に どれくらいの量なのかは知りませんが、とにかく3倍 スーッと舌をすり抜けて清涼感がノドに広がり食道を冷やしながら胃で ひとまず集合し、五臓六腑に染み渡り、鼻からはファインな香りが広がる。正統派ピルスナータイプにおける申し分ない症状を私は感じながら皆様にもこの症状を体験して頂きたいと思います。お待ちしております。 野うさぎの走り 宮崎 黒木本店の自信作 ≪百年の孤独≫でおなじみの蔵元です。甕仕込み木桶蒸留自社独自のピュアウォータを使用しております。 米焼酎の古酒にもち米を原料にした焼酎をブレンド、なんと贅沢な 発想でしょうか 独創的な商品作りには本当に脱帽します。お世話になりました。高鍋にお邪魔した際には本当にありがとうございました。 冷凍庫にて冷やしてストレートかロックがおすすめ 繊細で抜けていくような香りと舌に残る贅沢な余韻が絶妙なバランスを見せ この蔵元のセンスがうかがえます。 一瞬の ちゅら 石垣島は清福酒造の自信作 無濾過で加水は一切しておらず出来立てを 瓶詰めしてまして、昔ながらの泡盛の味と評判です。 度数は43度、予約注文生産という徹底したこだわり 早く呑まないと10年間 は味の熟成過程の変化によりまして呑んでもおいしくありません。 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ございまして、ANA国際線の機内で限定販売とかなりのレア物です。少数ではありますが当店時間と足とを使い手に入れております。 また来る日まで≪オーベルジュてふてふ≫ さ翌日は朝7時起床 ザアブ〜ンと朝風呂を浴びて朝食です。朝食は和食です。マダムYUMIKOの心のこもった和食です。日ごろの不摂生がきれいにリセットされたような気分です。 この日も快晴 気温も上がりそうです。 偶然この日は休館日だそうで 昼までウダウダ・・・ごろごろ・・・していきなさいとの優しいお言葉に[素直]に甘える私 2階の展望コーナーで空を見ながら またまた高いびき・・・なんと言うリフレッシュ感 白石オーナーに内緒の街道を教えていただきボチボチ帰ることに ああ帰りたくない。 オーナー&マダムYUMIKO&STAFFたかし君に見送られ最高の宿≪オーベルジュてふてふ≫を後に一路札幌へ〜 内緒の街道は本当にナイスビューで驚きました。 看板も標識もない『ここは日本かな 』錯覚、錯乱してしまうほどナイスな道 残してください美瑛の景観 後ろ髪をひかれながら あきらめの悪い私 途中美瑛の丘が見える≪四季の風≫でおそばをチュルチュルと ぼんやり余韻にひたりながらの帰路でした。ああ〜今度はいつ行けるかな〜秋に紅葉の季節がいいな〜でもキンキンに冷えた冬にダイアモンドダストとコバルトブルーの夕焼けも見たいな〜≪オーベルジュてふてふ≫のみなさんまたお伺いしま〜す。 それまでお元気で オーベルジュてふてふ 夕食は1Fにある眺めの良いレストランにて夕日を見ながら開始 さあフレンチのフルコースです。 後日レポしますがまずは1杯に飲んだビールが富良野産麦芽を50%使用のサッポロクラシック 普通のクラシックより少し軽くて飲みやすい。 ぐびびび〜っ プファ〜うめぇ〜 暮れて行く空を見ながらゆっくりと料理のフルコースをいただき とても優雅な気分を満喫させて頂きました。 久々にここの料理を食べた感想は『やっぱり美味い』の一言 ソースが素材の良さを一段と引き立たせます。さあそして夕食の後は外に出てキャンプファイアーです。 一昨年来たときにはまだありませんでした外庭のキャンプファイアーコーナー 美瑛の軟石を使い作ったそうです。 ホントにどこを見てもこだわりが感じられますね キタキツネが喧嘩をする声が森に木霊しながら・・・パチンパチンと木の燃える音 静寂と自然の香りと闇だけが私たちを包み人の音声もまるで自然の一部のような不思議な空間 白石オーナーを囲んで これからの≪オーベルジュてふてふ≫を語りました。 彼に連れられて美瑛の土地を走りまわったのは何年前だったでしょうか・・・ あれからまだ ほんのわずかしかたっていないような気がしますが 物語はもうこんなに進んでいる。 不思議ですね 私もこの今ある≪てふてふ≫さんの場所を見た瞬間ここだろうな〜と なんとなくその時感じた事を思い出します。 こんなふうになって本当に出来上がった白石オーナーの夢の形 これからもこの夢をもっともっと大きくしてもらいたいと思います。ああ〜最高の一日だったな^^〜 オーベルジュてふてふ ひと通り 美瑛近辺を車で流した後は「本日のお宿」であります。 ≪オーベルジュてふてふ≫さんへ〜国道237号線から白金街道へ入り 白金方面へ 美瑛川の横をどんどんと走りますれば 美瑛小学校が右に見えてまいります。そのあたりは美沢というところです。 左手に≪オーベルジュてふてふ≫の看板がありますが あまり飛ばしていると見落としますのでご注意を その看板から右に入ること約300m 右手に見えてきます≪オーベルジュてふてふ≫ オレンジ色とグレーのお菓子のような建物ですからすぐ判ります。 ≪オーベルジュ≫とはところでなんぞや と言う質問にお答えしますと ≪地元の新鮮な食材を使い最高の料理とおもてなしをするレストランに宿泊設備のついたところ≫と言うのが早い説明ですが、フランスのブルターニュ地方とか地中海沿岸地方などではこのような宿が沢山あるそうです。行ってみたい。こちら≪オーベルジュてふてふ≫さんも厳選された食材をアイデアあふれる料理にして食べさせていただけます。オーナーの白石さんとは私 長年のお付き合いをさせて頂いております。4年前こちらに越してくる以前は すすきので≪食材適所・てふてふ≫と言う料理屋を経営しておられました。 オーナーは温泉やキャンプに精通しておられまして、その当時からよく美瑛の話はうかがっておりました・・・本当にここが好きだったんですね こんな素敵な宿を建ててしまうなんて さて、夕方≪オーベルジュてふてふ≫さんに到着した私〜早速この宿自慢の露天風呂つきのお風呂に〜ンガ〜ザブン〜私はお風呂が大好きでして〜ザブンとどうですかこの写真を見てください。内風呂は大人2人でも足を伸ばしてゆっくりと入れる大きさです。旅の疲れが癒せます。 しかもお湯は人口の光明石温泉ですが贅沢にジャージャーと湯船から かけ落ちるお湯の量 露天はオンコの木で特注したそうですがこちらも かけ流し〜人口のカルシウム泉です。 ちなみに二股ラジウム温泉と同じ泉質だそうですよ あたたまる〜 あああああ〜ハラヘッテきたぞ〜つづく・・・ 美瑛〜てふてふ〜 富良野から旭川方面へと北上約車で30分JR美瑛駅へ 途中目を奪われ息を呑む景色が続きます。 自然と必然の入り混じるこの不思議な風景を見ながら車を運転すると危険ですのでご注意を 美馬牛小学校、水沢ダム、三愛の丘、しんせいの丘、拓真館、ケンとメリーの木、マイルドセブンの丘、カルビーポテトチップの工場、パノラマロード、パッチワークの路、セブンスターの木、ちょっと有名なところを挙げただけでも こんなにあります この美しいまち 車で2時間も走れば こんな景色がある北海道 なんて素晴らしい国だろ となりました。さて気分ものってきたところで〜美瑛の目的地であり今日の宿でもあります。 オーべルジュてふてふ〜さんへ・・・つづく・・・ なんとなく今回はラベンダーが見たくなりフラリ〜と富良野にやってまいりました。 富良野と言えば≪ラベンダー≫富良野と言えば≪北の国から≫と素直に観光ルートに乗っかって見るのもいいなあ〜と思い まずは桂沢湖から富良野の入り口にある〔ハイランド富良野〕さんへと まだ七分咲きのラベンダーでしたが これだけ一面に咲くラベンダーを見るのは小生うまれて初めてございまして・・・ やっぱりなんとなく感動 してみたのでした。 こちら〔ハイランド富良野〕さんは温泉もありちょっと温泉好きの私は後ろ髪を引かれつつ 次の目的地〔麓郷〕へ 富良野市街から車を走らせること約10分で( 麓郷の森) そこからすぐ〔五郎さんの石の家〕はありました。 平日だと言うのに駐車場は満杯 やはり恐るべし五郎さん 一瞬 人ごみにひるんだ私ですが・・・ 『な〜んもないとこだけど〜お茶でも飲んできな〜』と五郎さんに手招きされたような気になり250m歩くと・・・北の国からの世界が・・・ 五郎さんはやっぱりいませんでしたが留守番のおじさんに『200円だしな〜』と言われ我にかえった瞬間に『はい200円ね』と素直に払った。 テレビで見るより家の中はとてもコンパクトに作られておりまして、やはり五郎さんのお風呂に感動した私・・・ 雪景色を見ながら入るこの風呂は最高だ〜。 暖炉でパチパチいう音を聞きながら・・・狐の鳴き声を聞きながら・・・ああ〜なんて素敵な生活だろう〜 それにしてもどう見ても寒すぎるこの家の造り やはりドラマか・・・ブツブツと言いながら≪北の国から≫を満喫したのでした。 次なる目的地は(美瑛) さて今日は当店のメインBeer サッポロクラシックをご紹介します。 ご紹介しますと言っても北海道の方のみならず全国的にすでに有名銘柄ではありますが 北海道エリア限定ビールとして発売されて早くも20年が経ったんですね〜 と言う事は20年間愛飲してきたビールというわけです。 いったい何リットル飲んだんだろう(謎) 途中何年も前になりますが≪初摘みホップ≫とか言う銘柄(同社)に浮気をしたこともありますがこれも本当においしい忘れられないビールのひとつです。本題からずれましたが、このクラシックは≪恵庭工場≫で生産されているそうです。 原料は100%麦芽で素材を厳選し(ファインアロマホップ)、ホッホクルツ製法とかいう製法を用いて作るとか ファインアロマホップとはホップのなかでももっとも香りの良いホップでありまして、他にはビターホップ、アロマホップとありビターは香りは良くないけど苦味があるタイプで、アロマはこのいずれにも属さない(香りも良くないし苦味も無いのか )ホップで世界中で最も多いのがアロマホップだそうです。ホッホクルツとはドイツ語でホッホ(高温)でクルツ(短時間)と言う意味だそうでして、こうすることにより余分な渋味などの抽出を制御しながら麦芽100%の持つ旨みを十分に出しながら飲みごたえと飲みやすさをうまく両立させていると言うわけです。詳しいことはさておいても本当に20年も飽きずに飲み続けてきたこの銘柄をこれからも応援して行きたいと思っています。当店は閉店後毎日サーバー洗浄をして、次の日にまた美味しいクラシックを飲んで頂きたいとSTAFF一同心を込めてサーヴしております。まだ当店でクラシックを飲んでいない方是非一度飲んでみて下さい。 皆様はじめまして この度WEB上で当店のご紹介をさせていただく事になりました。 皆様が楽しんで見ていただけるよう私どもも楽しんでUP していきたいと思います。ですが多分に私の独断と偏見が入り混じる内容も起こりうる予定で御座いますのでその辺は聞き流すというか読み流すというか早い話が無視していただいて結構です。それでは今後ともどうぞ宜しくお願い致します。 ←過去の日記 最近健康とこの美しい肉体美を維持するために【ヨガ】を習い始めたこのわたし カエルのような肉体美は見た目に寄らず以外と硬い。 これ以上美しくなっては《ヨンさま》のようにけが人がでる恐れも出てきたとはだれも思っていないだろう などと言っているが美味しいものはおいしい。【チャイニーズ・カフェ シューシノア】さんである。フレンチとイタリアンと中華を3日間、朝・昼・晩と食べなさい。と言われたらフレンチとイタリアンは自信が無い。中華は大丈夫な気がする。ちなみに《シューシノア》さんには、ランチに行ってその日の夜にまた行ったこともあった。ここのふんわりチャーハンは絶品である。 カニとレタスがおすすめ お決まりは広東スープメン 丸鶏で作るスープはたまりません。あっさりとしているがコクもある。 海の幸のとろみスープメンもおいしい〜 あるいはズワイガニと軟白ネギラーメン 澄んだ鶏スープに まろやかな天然塩を使ったあっさりラーメンも捨てがたい。なんとも香ばしい特製おこげなんて作戦もある。 気分を変えて福寿あんかけ焼きそばか、三種特製あんかけご飯も最高 特製あんかけ焼きそば 友人菊池君はここの回鍋肉が大好物 しかし、餃子と小籠包も外せないアイテム フカヒレ餃子、スープ水餃子をご賞味あれ。ピータンとバンバンジィーにとりあえず紹興酒かチンタオビールで一杯やりながらその日の献立を考えるのもよし。 場所は街場から離れた閑静な住宅街 通称《地崎団地》の入り口 藻岩山麓通り沿いにあります。週末の夜中は《シューシノア》特製のラーメンを出しています。夜の部の営業が終わってから夜中にまた店を開けて、味噌・塩・しょうゆのラーメンを作っているんです。 働き者ですね ここのお店の方々は このラーメンは昼夜やっている中華メンとはまた違った豚骨とトリガラで専用にスープを作っていると言うなんともこだわり 素晴らしいではありませんかー 私は店の営業時間にかぶっていますのでなかなかこのラーメンに ありつく機会はありませんが、サボってでも食べに行きたいおいしい。 気軽に行けるチャイニーズ・カフェ《シューシノア》 ご存知の方も多いのではないかな んがーおいしかったー。 札幌市中央区伏見2丁目 藻岩山麓通り沿い 酒のほそ道 《酒と肴の歳時記》 場所 とある寿司屋の小上がり 酒 本醸造ぬる燗 肴 鯉の洗い、サキの塩焼き、カツオ刺身、竹中しょうが、なまこ酢、たくあん 酒のあと ちまき 注意 銭湯のしょうぶ湯に入ってからはじめたい。 なんて感じではじまる・・・最近ハマっている漫画・・・ 《酒のほそ道》 作者はラズヴェル細木 あまりなじみのない名前であるが、なんともオモシロイ人を見つけてしまった。 連載は週刊【漫画ゴラク】 NCから全15巻まで現在出ています。ショート漫画で実に軽い。最近のなんというか、グルメ漫画は重たくて見ていて疲れる時がある。そんな時は、これに限る。軽快でいいのである。何度読んでも飽きない。そして、何故か同感する。主人公の『岩間 宗達』は普通の会社に勤めるサラリーマンであるが、彼と会社の仲間、そして友人達との《酒と肴》をテーマにおりなす日々を心温まるタッチで描いている。 皆お酒大好き そしてなんと言ってもよく食べる(^^)こんなに食べてよく呑めるな〜と感じるんですがクドくない。 楽しんで生きている岩間君に見習いたいところあり 楽しんで生きようではないか(^^) ≪すすきの≫そこは 昭和の高度成長と繁栄を共にし、バブル経済と崩壊を共にした ≪北日本最大の歓楽街≫ ご愁傷様でした。こういえばこの日記はこれで終わりになる。過大な評価はもらえなくても、過少な評価はまだまだ早い。来年はここが出来て25周年を迎える。早いものである。 思い起こせば、この場所は私が小学生まで木造の屋内スケート場があった所 よく知らないおねえさんに、手を引かれスケートをした記憶がある。なぜか、私は気がつくと、知らないおねえさんに手をつながれて歩く事が多かった。言うならばそれは運命とも言えるかもしれない。 物心ついたころか、山鼻百貨店(今はもうなき、懐かしい) へ母に手を引かれて家を出たはずが気がつくと、見知らぬ。おねえさんに手を引かれ、中島公園を歩いていたこともあった。もっと凄いのは、学生時代好きな娘と手をつないで帰ってみたい、と思ったが、どういう訳か補導員のおねえさんに手を引かれていたこともあった。成人してからに至っては、酔っ払ってすすきのを見知らぬおねえさんに手を引かれて歩いていたこともあった。よく顔を見たら、その時のおねえさんはツケをためてる飲み屋のママであったのは、ここだけの話にしておいて欲しい。 話を元に戻そう この施設は東急INNと隣り合わせの3階建てになり、1FはCafe 和菓子 洋菓子 花屋 BAR おばんざい処 など気軽に使える飲食&物販のフロアとなりまして 2Fは大人数の宴会が可能な居酒屋 イタリアン 創作料理 などの店舗があります。 地下は大人の雰囲気漂う老舗の料理屋さん 寿司 てんぷら ステーキ すき焼き うなぎ 居酒屋 すき焼き しゃぶしゃぶ 鳥焼き&おでん よりどりみどりとは この事なり。 いずれにしても安心してお越しいただける施設を目指してきたからこそ 25周年を迎えることが出来たのでしょう しかし、ここ何年かですすきのは風俗店が大きく増殖の一途をたどり、安心して歩ける街ではなくなってきたのも事実であります(涙) そんな中でもこの PLAZA 109 は安心して安全にお客様にご利用していただけるよう日夜努力してきました。この施設にかぎらず、すすきの全体がこれから変わっていけるように願うところであります。 この街が札幌市民のみならず 全国の人達から支持される街に変わらなくてはいけないのではないでしょうか そんな願いをこめて皆様へ 私がはじめて行ったBAR それはもう20年も 前になろうか・・・ 南3条界隈は今より活気があり、それこそジャズ喫茶、遊んでいる男も女も皆大人に見えた。 今よりずっと情報とか物とかは少なく しかし、それでも男も女もカッコイイ人達が遊ぶ店がたくさんあったように思う。 そんな時代の忘れ物 この店・・・ 20年以上通っています。 薄暗い狭い階段をねじれながら降りていくBAR そこには酒を飲むのに最低必要程度な照明が、花梨で 作られた1枚カウンターの手元だけを静かに照らしている。 手作りであろうか大きな真空管のアンプの光が、流れるJAZZとマッチして心地よい。余計な会話は要らない。 静かに時間が過ぎ、気がつくと注がれたウイスキーの グラスは次の酒を待ちわびているようだ。 20年もこのカウンターに座ってきたのか そうだ、初めてここに来たのがBARの始まり 先輩に連れられて大人の仲間入りをしたあの日 どこか落ち着かなく、勝手が判らないまま何を飲んだん だろうあの日・・・覚えてない。思い出せないが、その日一つの事件がこの店で起こった。 と言うか私にとってだけ事件だったのかもしれないが この店のバーテンにとっても お客達にとっても事件と 言うほどの事では無かったのかもしれない。もう随分とお酒も定量に近い一人の酔っ払いがコツコツとそのねじれた階段を舞い降りてきた。 どうやらその酔っ払いも勝手が判らなかったらしく、何かを注文しながら無口なバーテンに話しかける。しかしここの無口なバーテンは徹底的に無口であった。もしかしたら日本で一番無口なバーテンかもしれない。 機嫌をそこねた酔っ払いは文句をブツブツと言いながら 何かを飲んでいる。 それでもまだバーテンは無口のまま・・・ 子供の私は少し緊張していた。 まわりの客は、あまりそのバーテンの無口が 気にならないらしい。 と言うより それが心地良い と感じているかのようにも だが、その酔っ払いにだけは心地悪いのか、相も変わらず。づーっとブツブツ文句を言っている。 わたしの隣に座っていた、その当時の年の頃なら 20代後半くらいのおにいさんが突然その酔っ払いに 向かって こう言った。 『気に入らないんなら金を払ってさっさと帰りな』 私は口から酒と心臓が飛び出しそうになった。 そうか これも大人の飲み方か それからその酔っ払いはブツブツと言いながら勘定を 済ませ、ねじれた階段をコツコツと帰っていった。 また何事も無かったように静かにJAZZとタバコの煙と ライムの香りが入り混じるBARにもどった。 それ以来わたしは20年間このカウンターに 通い続けている。静かなこのBARで20年間の静かなドラマを見てきた。私にも20年間というドラマがあった。 そしていつも変わりなくこの≪孤独≫という名の店は 私の中の≪孤独≫を静かに受け入れてもくれた。逆に勢いついた西武に軍配が上がった。 日本シリーズの最終第7戦ナゴヤドーム 西武ベテランの石井がコーナーを丁寧に突く投球で中日に 隙を与えない。投手力では中日に劣らぬ西武、打線でねじ伏せた感じがしました。 中日も井上、立浪らが気を吐くがつながらず意気消沈 気持ちが乗り切らない感じが伝わってきていた。もっと食らい着いて行く気迫が欲しいところではあった。 完全燃焼していない中日はモチベーションをどう保つかが 来期への鍵となる。 逆に若獅子軍団はこれで来年への自信がついたであろう 勝負とは本当に終わってみなければ分らないものである。 常勝西武の時代がまた来るのか しかし問題はそんなことより、これからしばらく始まる西武グループでの日本一おめでとうセールにある。 行かなくてもいいのだが、この貧乏性なわたし、行ってみたくなるんです。 何かお得な物をGETしようー みたいな性格なんです。そうしてあの応援歌にやられるんです。ら〜いお〜んずそうです これです。これで一日耳が ら〜いお〜んず♪なんです。先日、渋谷で用を足していまして偶然入ってしまったんです。渋谷パルコです。ダイエーにプレーオフに勝ったの忘れてたんです。やられました。その日一日やっぱりだめでした。取れませんでした。 あの歌よく出来てますよね〜ホンマ・・・ 西武とか西友とかの従業員は大変でしょうねー 自然に口ずさみますよねーあの歌 完全に入ってくる。ワカッチャいるんだけど耳にタコできるんです。でもとりあえずおめでとうございます。あっもうだめだ。日本シリーズ第6戦 松坂恐るべし。日本シリーズ 中日vs西武(名古屋ドーム)は4-2で西武が待った。をかけてきた。凄いのは松坂である。 立ち上がり中日の打線にのまれるか と思いきや回を重ねるにつれて復調、8回を投げて豊田に スタミナはまるで切れるところを見せなかった。 さすがに中日も松坂の球威に押され長打はなかなか打たせてもらえず、2点どまり 最終決戦にもつれ込むわけだ。 和田のホームラン2本がすべてを決めたわけだが、やはり中日が勝つためには和田をどのように封じ込めるかが鍵となるだろう 今日の決着がどう出るのか、本当にどちらが勝ってもおかしくない。見せ場がたくさんあった今年の日本シリーズにふさわしい。決戦を期待する。まず王手をかけたのは中日であった。川上の気迫のピッチングが西武の中軸を押さえ込んだ。 カットボールと丁寧にコーナーへ投げ込まれるストレート、スライダーに手の打ちようのない西武打線 あと一つで実に50年ぶりの日本一 ついに監督就任一年でここまで来た落合中日『オレ流』野球 是非日本一になってもらいたいと思う。名古屋で決着を着けて欲しいものだ。当店のメインビールでもあります。グラス1杯飲み終わるまで消えることはありません。 一口そしてまた一口と飲んだ量がグラスの内側に輪に なって残ります。 いいですね〜 飲み口も炭酸がきつくないのでスルスルと入っていきます。深くローストされた香りとコクがバランスよく口の中に広がります。ファンがたくさんいらっしゃいます。メニューに無い物もございますので店員におたずねください。また、当店は前金制となっております。どうぞご協力御願い致します。 (価格はすべて税込みです) 韓国産岩のり チーズ盛り合わせ おすすめです。 共依存で苦しんでいる貴方へ 私の生い立ち・家庭環境 「私の体験記」というカテゴリーでは、管理人である私自身の共依存症及びその他の依存症の体験記を綴っていきます。一般論ではなく、私自身の体験を公開することで、いま現在共依存で悩んでいる方が少しでも楽になるヒントになればいいな、と思っています。共依存症に限らず、あらゆる依存症は直すことができると私は自信を持って言えます。私自身が、共依存症を直しましたし、(ある依存症については)直す途中の過程にいるからです。でも、条件があります。依存症を直すための条件、それは「依存症者本人が直したいと思い、直すための行動を起こすこと、あきらめないこと」です。他力本願では絶対に無理です。本人以外の人間が必死になっても(本人が心の底から決意しない限り)無駄です。ひとつ、誤解をしないでいただきたいことがあります。今から、私自身の生い立ちと家庭環境について書きます。決して私は「家庭環境のせいで依存症になった」と言いたい訳ではないのです。共依存症になるにあたって、「生育環境」の影響は非常に大きいと考えています。でも、すべての人が共依存症になるわけではありません。最終的には、本人の性格や考え方が決め手となります。私は、家庭環境に大きく影響されていますが、依存症になったのは私自身の責任です。私自身の選択で私は依存症になり、克服してきました。上記を踏まえて、お読みいただければ幸いです。 【私の生い立ち・家族環境】 3歳〜19歳まで、母と二人暮らしでした。父は私が2歳の頃に借金を残して失踪しており、33歳に至る現在まで会ったことも話したことも、顔を見たこともありません。生まれてから3歳までは祖母の家で母・祖母・従兄弟たちと暮らしていました。 母との二人暮らしは2Kの公営団地 母は私が小学校1年生までずっと水商売をしていました。父の借金と自分の(水商売の店に対する)借金とがあり、やめられなかったようです。私が小学校2年生の頃には水商売を辞め、昼間の仕事へ転職していました。収入は少なく、幼い頃、母の口から「お金が無い」「世の中お金がすべてだ」という愚痴がよく出ていた記憶があります。 「あんたもお金持ちの家に生まれればよかったと思うでしょう 」と聞かれ、返答に詰まったこともあります。確かに、特に手に職のない女性が子供を抱えて生きるのは、物価の安い田舎でも大変で、精神的に追い詰められることも多かったと思います。私は一人っ子なので、甘やかされて育ったかもしれません。母には自分の理想の子供像というのがあったらしく、よく「あんたも◯◯ちゃんみたいに明るく挨拶すればいいのに」など言われて、自分とは正反対の朗らか女の子にコンプレックスを抱くことも多かったです。もっと素直に受け止めていればよかったのに、と悔やんでいる事のひとつではあります。子供ながらに反発心を覚えたのかもしれません。しかも、母の理想とは外れた自分の現状に自己嫌悪を抱いていたりしました。 こんなこと言ったら怒られるだろうか と母の顔色を窺ってビクビクすることもありました。私は、典型的な「不幸になる考え方の持ち主」でした。母から言われた言葉の中で、いくつか大きな影響を受けた言葉があります。 「あんたはお父さんにそっくり」 「本当は男の子が欲しかった」 前者の言葉は、よく言われました。父は、顔も見たこともありませんし、愛情も持っていませんが私たち親子にとっては「忌まわしい存在」「悪役」のはずでした。 散財・ギャンブルの挙句に妻子を置いて失踪し、他に女を作って借金を母に肩代わりさせた人間 でも私の外見や性格は父にそっくりだそうです。私の名前は、父がつけたそうです。 母にとって敵である存在の父と似ている自分 母に申し訳ない気持ちと、自分の存在も忌まわしいのではないかという誤解 後者の言葉は、記憶にあるのは一度きりですが、強烈に覚えています。母からしてみると、何気なく口にした言葉だったと思いますが、私は「女である自分に対する不安」「男の子への嫉妬」「母への憎しみ」を抱いてしまいました。ずーっと心に抱いてはいませんが、時折ふっと沸き上がります。 どうせ私は男の子じゃないし なんて歪んだ思いにもつながりました。もっと、柔軟な受け止め方をできる子供だったらよかったのに・・・と思います。家が裕福ではなかったので、大学への進学はあきらめました。親はもちろん、自分自身も奨学金をもらって働きながら返済というガッツはありませんでした(笑)でも、中学生の頃から心に決めていたことがありました。高校を卒業したら、家を出て一人暮らしをしたい。 地元ではなく、東京に行きたいと なぜ東京かというと・・・う〜ん、はっきりと書くのは難しいのですが、一言でいうと田舎の空気に馴染めなかったというところです。テレビっ子だったせいか、テレビに映し出される東京の風景に憧れていたのもあると思います。当時ははっきりと自覚していませんでしたが、母と二人きりの暮らしに息が詰まっていました。 一人暮らしを始めて迎えた最初の夜 部屋に一人きりで眠った時の解放感を忘れられません。離れて暮らして初めて、私は母を大事に思え、今まで母から受けた愛情に感謝の気持ちを持てるようになりました。ずっと母と二人の暮らしをしていたら、母を憎むようになっていたかもしれません。母からしてみると寂しいと思うのですが、今の私にとって、離れて暮らすことが母との関係を保つ最良の方法です。元ギャンブル依存症の夫と猫2匹と共に生活しています。共依存症からは抜け出した、と言うことができます。 残っている問題は「浪費癖が抜けきらず、貯金が苦手」ということです・・・ 自分が共依存症であると自覚したのは2003年でした。 2003年当時と変わっていることといえば、■楽観的な思考をするようになった。あまり悩まなくなりました。悲観的な思考をする友人と接するとイライラしてしまう、これは副作用かもしれないと悲しく思いつつ、今までの自分は人にこんな不快さを与えていたのかと愕然とします。■夫に対してイライラして「責める」「なじる」「罵る」ことがなくなった。夫は夫、私は私、ときちんと分けて考えられるようになったせいか、夫の行動にもどかしさを感じて怒りをぶつけたくならなくなりました。夫に対して不満があれば、「あなたがそういう行動を取ると私は困るから、やめてほしい。」といった平和的な言い方で主張しています。あなたが悪い、という言い方はしません。あなたの行動で私はこういう被害を受けている、と「私主体」で発言できるようになりました。■自分の身なりに気を使うようになった。自分が共依存だと気づく前の私は、自分の髪型・服装・化粧よりも夫の行動を監視して責めることを優先していました。髪を振り乱して鬼のような表情で泣いて訴えれば、夫は変わってくれると思っていました。共依存に関する本を読み出してからは、「夫を罵る前にまず自分の世話をする=お風呂に入る、きちんとスキンケアをする、髪を整える、綺麗に化粧する、服装に気を使う」ことをかなり意識して、優先するようになりました。そして数年たち、今のところそれが習慣になっています。私が自分を放ったらかしで泣きわめいても夫は変わらないと、実感したからといえます。何も関係ない。だったら、もっと綺麗な自分でいたいじゃないか、なにやってんだ私は、って思い直したんです。■自分と向き合うようになった。自分はどういう風に生きていきたいか、自分の長所と短所はなにか、自分の外見でどこが良いと思うか・・・すべて「私は」と主語をつけて考えられるようになりました。次に挙げるのは、共依存症から抜け出したいと思い行動しているうちに改善していった「私自身の(共依存以外の)依存症」に関しての項目です。■借金がなくなった。150万円ほど、消費者金融中心に借金がありました。ギャンブルと買い物が原因です。弁護士に任意整理を依頼し、3年で完済しました。(でも、たまにクレジットカードを使うことはあります。 すべて1回払い ■過食衝動がほとんどなくなった。仕事でストレスを感じた時など、カロリーが高いものをドカ食いしたくなりますが、実行にうつすことはありません。過食真っ只中の頃のように、一度に一人で食べるためにケンタッキーのファミリーパックやホールサイズのケーキを買い込むようなことはなくなりました。最後に、夫の変化も書いておきます。私の変化に影響されてなのか、彼が変わるタイミングだったのかわかりませんが、夫も随分変わりました。夫は、ギャンブルで仕事を辞めざるを得なくなり、数百万の借金を抱えていた挙句浮気していた人です。2004年を境に、彼は変わっていきました。■ギャンブルを一切やめた。2004年から2010年1月まで、パチンコ・スロットどちらもやっていません。なぜ確信を持って言えるかというと、2004年から彼は給料を明細と共に全額私に渡して、自分の小遣いは5000円でいいと言ってきたからです。実際、小遣いとして5000円と食事代として2万円ほどしか2004年から2007年までは渡しませんでした。現在は、もう少し多い額がかれのお小遣いとして渡していますが、(私もギャンブルをしていたので想像がつきますが)とてもパチンコ屋に通える額ではありません。 彼は新規の借金もできない身ですから ■給料を全額渡すようになった。上にも書きましたが、これはもう6年続いています。それまでは、共働きですから、「お金はすべて折半」でした。・・・こうして書くとわずか2項目ですが、2004年からの夫の変化には目を見張るものがあります。人間って、こんなにも変わることができるんだ。と間近で見ていた私は驚き、夫のことを見直しました。 おすすめ本【共依存を知るために】 過食や買い物依存で苦しんでいた頃、「依存症」という言葉が気になって読んだ本です。当時の依存症に効果はありませんでしたが、数年経って読み返したら自分が典型的な共依存症者だということに気がつきました。この本に出てくる「母子カプセル」という言葉を読んだ時の驚きと納得感が忘れられません。これは私のことだ、と愕然としました。 この商品の他のレビューをみる» コメント:生育環境や家族関係から依存症に陥ってしまった例を紹介 共依存症者の多くはこの本を読むと「ここに書いてあるのは私のこと 」と驚くのではないでしょうか 手軽に、安価で手に入る文庫という形で出版されていることに敬意と感謝を表します。 おすすめ本【特選その2】 管理人の人生を変えた2冊を紹介します。この2冊を繰り返し読み、書いてあることを実践したおかげで今の自分があります。 アドラー心理学トーキングセミナー—性格はいつでも変えられる (マインドエージシリーズ 9) この商品の他のレビューをみる» コメント:ちょっと癖のある語り口ですが、「他者をコントロールせずに生きる」とはどういうことか理解できます。 続アドラー心理学 トーキングセミナー—勇気づけの家族コミュニケーション (マインドエージシリーズ) この商品の他のレビューをみる» コメント:「他者をコントロールせずに生きる」「良い関係を築く」ための具体的なノウハウ集ともいえる内容 前作を読んでからの実践編としておすすめしたい。 家族コミュニケーション、と書いてありますが恋人同士・友人関係にも応用可能 おすすめ本【考え方を変えるのに役立つ本】 考え方を変える=自分を変えること 考え方を変えない限り、共依存で苦しみ続けることになります。 苦しまなくなるために、幸福になる考え方をできるようになってみませんか オプティミストはなぜ成功するか (講談社文庫) この商品の他のレビューをみる» コメント:オプティミスト=楽観主義者になると、幸せになれる・・・かもしれない。楽観思考は生まれつきのものではなく訓練次第で身につけることができると、この本を読んで知りました。 おすすめ本【特選】 管理人が何度も繰り返し読み、共依存症の苦しみから抜け出すためのバイブルとなった本を紹介します。 この商品の他のレビューをみる» コメント:共依存症である自分を認めるきっかけになった本 認めないことには、変わりません。いま苦しんでいる人が読むと「苦しんでいる理由」がわかると思います。 共依存と似ている依存症 「アル中」と蔑称で呼ばれることが多い。手軽に依存対象物が手に入り、死につながる可能性も高い。 「ゆるやかな自殺」ともいえる依存症 アルコール依存症者の家族には共依存症者も多いのでは・・・というのは管理人の推測です。ちなみに管理人は酒好きですが、現在のところアルコール依存症までは至っていません。なんとか5年かけて共依存を克服してきたので、新たな依存症に陥るのは回避したいというのが素直な心境であります。 大麻、覚せい剤など、非合法ドラッグと呼ばれる薬物の依存症 アルコールも薬物依存の範疇に入るのかもしれませんが、合法・非合法というくくりで分けました。管理人は薬物依存の経験がないので多くを語ることができません。ただ、依存症に陥る動機は同じだろうと思っています。 現実世界からの逃避、不安を解消するための代替行動だと アルコール依存と同じ、もしくは同じくらい、死につながる可能性が高いでしょう お金は・・・アルコール依存の比ではないほどかかるのではないでしょうか 個人的に、生きながら社会的存在を消す手段として最も手っとり早い方法・・・薬物に手を出したら人間として終りだと思っています。 パチンコ・スロット(以下、「パチスロ」と表記)、競馬、競輪、競艇、オートレースなどなど 特にパチスロ依存症者は多いと思います。 管理人も経験あり はまった理由は、現実逃避 束の間の勝利感、でした。 直接的に死につながることはありませんが、分単位で1万円が消えるようになり消費者金融に手を出し、借金がかさみ、間接的に死につながることはあるでしょう こちらも、家族には共依存症者が多いのではないでしょうか 【買い物依存症】 クレジットカードを使って、収入以上の買い物をする。部屋には物が溢れる。買っても買っても満たされない。こちらも、管理人は経験あります。服、バッグ、靴、インテリアなど管理人の場合は「自分を着飾るもの」「自分の虚栄心を満たすもの」をよく買っていたように思います。自分に自信がないから、せめて見栄えをよくしようとする。キレイになりたい、お洒落したい。という前向きな理由ではなく、「着飾っていないと不安だから」が大きな理由でした。常軌を逸した量の食べ物を摂取する。こちらも管理人は経験あります。食べないと不安なくせに、食べ終えた後は強烈な自己嫌悪に陥る。自己嫌悪を忘れるためにまた食べる。この繰り返しでした。食べた後(太らないように)吐く人もいるようです。過食症と拒食症を繰り返す人もいるようです。直接死につながることはないものの、「太る」という外見の変化があるので、大量に食べる→太る→自分自身を卑下するという心への悪影響も大きいです。無限に思えるループに陥り、超肥満体になり生命の危機に瀕することもあるようです。管理人は女性なので、女性の立場から書きます。ちなみに、管理人はこの依存経験はありませんが、気持ちはわかります。女性の場合、セックスをすることで自分が「愛され」「大事にされ」ていると錯覚することが多いと思います。体を求められる=自分自身が求められている=自分には価値があると勘違いしてしまい、常にセックスしていないと不安になるという心理だと推察します。こちらも直接死につながることはありませんが、精神への悪影響は上記に挙げた依存症の中では最も大きく、生きながら自分を殺していくような行為だと思います。一言でいうと、「人に対する依存」です。自分よりも、他人のことが気になる。他人の世話を焼くことで、他人に愛されることで自分の価値を測っている。自分のことが好きじゃない。自分を大事にできない。自分を不幸にしそうな人に縋る。離れられない。依存対象は配偶者、恋人、親、子供などの身近な存在が多い。こんな僕でも社長になれた。勉強は楽しいのだ。 日々是向上、勉強の記録 英語日記はアウトプットの絶好の機会 1月10日から、英語日記をつけ始めました。目標は、「1〜2行でいいからとにかく毎日つける、3月には5〜6行の英語日記をつけられるようになる。 数日つけてみて、自分の英語表現の拙さを身をもって知りました(苦笑) まさに”カタコト”でしか表現できないんです。TOEICの勉強やら何やらでインプットはしているつもりでしたが、「アウトプット」が圧倒的に足りていない、現実に直面しました。 あーこれはやりがいあるなあ 外資系勤めでもなく、日本で日本人に囲まれて生活している私 英語を話せたらいいなあという漠然とした願望をかなえるべく、”英語で考えて英語で表現する”英語日記をとにかく毎日つけていきます。英語日記表現辞典—書きたい表現がすべてここにある。リアルな言葉に触れちゃえ。』での学習にマンネリ感を感じ始め、なにか刺激がほしい。と思い立った。 そして始めたのは、アニメ『ザ・シンプソンズ』を英語音声で観ること なんで『ザ・シンプソンズ』なのかっていうと、1話完結タイプしかも30分以内で観終えることができる、かつ面白い。 この条件にぴったり合うから iknowはやめるわけじゃなくて、ちょこっとお休み 毎日30分観て、とにかく英語を聴く習慣を絶やさないようにするのが目的 家以外だと、通勤時間中のpodcast/オーディオブックかDSでの英語学習で英語を聴いている。 実はシンプソンズをまともに観るのは今回が初めて 「かなり」前かな )で見て、おもしろそうとは思っていたけど、特にきっかけがなくてずーっと未見だった。 いやー、おもしろいね ホワイトカラー(の中でもちょっぴりプアな)家族の喜怒哀楽・悲喜こもごもがリアル シーズン1の第一話「パパのクリスマスボーナスが出ない」なんてエピソード、リアルすぎるわ 私はいきなり英語で見るのはでなく、まず日本語吹替え+英語字幕で見た後に英語音声+英語字幕で見ている。普段映画を見るときは絶対字幕派なんだけど、英語の勉強を目的としてみると日本語吹替えってありがたい。とっても機能的なガイドになる。 ひととおり見終えたら、英語音声+日本語字幕/英語音声+字幕なし、とか色々試してみよう 英語の教材と違って、生活に根付いた”日常”会話に触れられるから、喋るための練習にもなりそう キャラクターのセリフを真似したりね もちろん、あまりに下品なセリフは真似しない。 シンプソンズに飽きたら、連続ドラマでもいいかなー でも毎日一時間近くはキツいから、30分ドラマがいいんだけど おいおいリサーチしてみよう それにしても、この日本語吹替え秀逸すぎる。 英語学習という目的がなかったら、全編日本語吹替えで見ていたかも 大平透(パパの声優)素晴らしい。 スローな再開 受験結果が出た直後は、英会話学校の見学に行こう なんて張り切っていたんだけど、見学して入学するためには『英語を使ってなにをしたいのか、どんな授業をしてほしいのか』を自分がちゃんと考えていないと、お金を無駄にするだけだと気づいて じゃあ、なにをしたい。どういう授業がいい。と考え始めても、「・・・・」答えが出なかった。正直に言うと、いまも、まだ答えは出ていない。でも、英語の勉強を再開することにした。このままほうっておいたら、せっかく今年から英語を勉強し始めたのにゼロに戻っちゃう。 って危機感があって やりながら考えることにした。を使ったWEBラーニングを毎日やる。 TOEIC対策用のヒアリングとリーディング これらをやりながら、私が英語を使ってかなえたい未来はなんだろう と考えることにする。しばらくの間、学習終了後に「さあ、私は英語を使って何がやりたい。 」と考える時間を作ろうかな どんなくだらないことでもいいから、英語を使ってやりたいことを毎日リストアップすると、段々と自分の願望がはっきりしてくるかもしれない。 スローペースだけど、とにかく英語との付き合い(勉強)途絶えさせないこと 手をつけたんだから、なにかの形で実を結ばせたいもの (その分、なにか「やること」を減らさなきゃ 例えばネットサーフィンとか笑) 先日、その結果が通知されました。2)だったそうです。自分の現在地がどこなのか数字でわかったことは良いことです。適切な目標を設定して、それに向かって行動することができます。現在地がわからないままだと、闇雲に(高すぎたり低すぎたりする)目標を設定して効率の悪い学習を続けることになっていたと思います。とにもかくにも、先月TOEIC公開テストを受けたこと、それに向けて学習したことは私にとって大いにプラスの行動でした。次回は10月25日の公開テストを受ける予定です。 で、その間に英会話学校にも行って見ようかと画策中 テストを受けた直後に書いた記事ではベルリッツの名を挙げていましたが、決めつけずに何校か見学&体験しに行きます。 来週から、ぼちぼち予約を入れたいですね 学校に求める条件は、以下の4つ ・マンツーマンレッスンがある。・教育訓練給付金制度を利用できる。・学校スタッフ、講師と「波長」が合う。・職場から通いやすい場所にある。自分で設定しなくてはいけない課題は、「学校で受けるレッスンの明確な目標を決める」ことです。 明確とは「具体的で期限が決まっていて、数値で達成の可否を測れる」こと 学校のレッスン受けたから英語を習得できる、わけではないですからね 曖昧な目標(と言うよりも「願望」)だけで入学しても、お金をドブに捨てるだけです。 ←10年近く前に痛い経験あり まだまだ学習の日々は続くのです。 での英語学習を昼休みにも と意気込んでいたけど、7 7インチ液晶の我が愛用機Eee PCではできないことがわかった。学習画面はフルスクリーンになるので、画面サイズが足りないのだ。しょうがない。 で英語学習中 勝間和代のビジネス頭を創る7つのフレームワーク力 ビジネス思考法の基本と実践 教科書として机の傍に ありがたや、な一冊 検索にガンガンヒットさせるSEOの教科書 復習も兼ねて、読んでいるところ 英語日記はアウトプットの絶好の機会 リアルな言葉に触れちゃえ。 スローな再開 史上最強の人生戦略スタートアップセミナー ビジネス実務法務3級検定受験日まであと5日 「時間」は有限 つれづれ椿日和(管理人別ブログ) 勝間和代公式ブログ: 私的なことがらを記録しよう 勉強は楽しいのだ。 日々是向上、勉強の記録 史上最強の人生戦略スタートアップセミナー 勝間和代さんが講師を務める「史上最強の人生戦略スタートアップセミナー」に参加してきました。今回は、セミナーを受けての私の感想のみを書いておきます。 史上最強の人生戦略スタートアップセミナー 主催:株式会社 監査と分析 このセミナーは、勝間さんが自らの実体験をテコにして、人生の問題にぶち当たっている人がより早く解決できるための手助けをする(※これは私の解釈です)、シリーズセミナーの初回 今後は2月〜7月には80名程度の規模で細かく・よりディーープなセミナーを開催するそうです。話やレジュメの内容はよかったんですが、”スタートアップセミナー”と銘打たれたこのセミナーがシリーズの中でのどういう位置づけのものなのか不明瞭なまま募集、受講中にそれが明らかになったという点は少々首を傾げてしまいます。 セミナーの副読本である『史上最強の人生戦略マニュアル』の出来と勝間さんへの期待のみ、で申し込んでしまったのですが、予めシリーズの内容が公開されていたら第二回以降のセミナーだけに申し込んでいたかも・・・ 司会進行に関してちょっと疑問に感じる点もあり、自分の中では満足と不満が綯い交ぜです。本をひとりで読んで課題をこなすだけよりは、ライブセミナーの形で語ってもらう機会があってよかった。表情・声音などから、悩みの渦中にあった勝間さんの様子が浮かんだし、いまの自分に重ね合わせて勇気をもらうことはできました。でも・・・以前の記事でも書いたように、「8,800円」に見合う内容なのか不安を感じてはいたんですが・・・うううーーーーん、評価不能です。手放しで「良い内容だった。」とは言えないし、「お金のムダだった」とまでは思えません。得るものは確かにありました。価格相応なのかそうではなかったのか、それはもう少し時間が経ってから実感できるものかもしれません。2回目以降のシリーズセミナーへの参加は、今のところ見合わせます。 ひとりで取り組むのは自転車でキコキコ漕いで進む感じ、セミナーに参加して勝間さんの助けを得て取り組むのは自動車でブーンと進む感じ、だろうとは思いますが 資金には限りがあるのでねー セミナーでもらった勇気を糧に、前に進むのみです。 この記事に対するコメント はじめましたmercと申します。私も史上最強の人生戦略スタートアップセミナーに参加しました。内容は良かったのですが事務局には少々不満がありますよね〜同感です。 内容の研修か講演かで評価が分かれるところですし 私のブログ↓にも感想をUPしましたので、よかったら遊びにきてください。 読んだ気になるブックレビュー はじめまして コメントありがとうございます。 そうですよね〜事務局の運営姿勢に不満 内容には心を打たれただけに 僕は内容に関して事務局に問い合わせをしたら 「個人の方に関する質問には答えられません。の1点ばりでした。 監査と分析主催のセミナーは )の穴埋め集金セミナーの匂いが とてもするのは私だけでしょうか それは意味の分からない対応ですね(笑) 私は集金セミナーとまでは思っていませんが、今回のセミナーに参加したことで、事前説明の不十分さと進行・運営に対して不信感を持ってしまいました。コメントする。 この記事のトラックバックURL この記事に対するトラックバック で英語学習中 勝間和代のビジネス頭を創る7つのフレームワーク力 ビジネス思考法の基本と実践 教科書として机の傍に ありがたや、な一冊 検索にガンガンヒットさせるSEOの教科書 復習も兼ねて、読んでいるところ 史上最強の人生戦略スタートアップセミナー ビジネス実務法務3級検定受験日まであと5日 「時間」は有限 つれづれ椿日和(管理人別ブログ) 勝間和代公式ブログ: 私的なことがらを記録しよう 勉強は楽しいのだ。 日々是向上、勉強の記録 自分には「人脈」がない。そもそも、どうやって作ってどう活かせばいいのかがわからない。そんなことを思っていた頃、書店で平積みされていた本書を見かけた。その書店では「当店売上第8位」とのPOPがついていた。 借入金によって投資を行い,利子率よりも高い利潤率を見込むこと 人脈ってさ、どうやって作る(広げる。 本で読んで身につくもんなの と半信半疑ながら(さっぱりわからないことだけに)、ビジネス書は、気になったらとりあえず買って読め を身上にしているので、勢いで買ってみた。行間が広く、厚さに対して全体の文字数は少ない。 丁寧でなかなか誠実さを感じられる文体 」みたいな煽り口調ではないので、抵抗なく読み進められた。著者は一年のうち大半を海外で過ごしているからか、文章に占める英単語率が高い。 長嶋茂雄みたいだ(笑) 著者が主張する「コントリビューション(貢献)」という言葉 私はそのまま「貢献」と書かれた方が、伝わりやすいと思った。それに、日本語がいまいち洗練されていない点も気になった。ブログとかに日々書いた文章をそのまま本にした。 と思えるくらい、推敲されていない印象 もう少し図版も多用した構成にしてあれば、そう気にならなかったかもしれない。内容的にも、大半が文章で語られているからあの厚さになったのであって、もっと文章をすっきりさせて図を多く使ってあれば、2/3ぐらいの厚さで済んだのでは、と感じた。「知識」「経験」「時間」といった要素を、人脈としてつながりたい相手の『財産』と解説している点にはすごく納得した。ちょっと知り合っただけで、「会いたい」「教えて」「どうやるの」と要求をつきつけてくる人間には腹が立つものだ。私も、よく「教えてちゃん」に遭遇した時に非常に腹立たしい気持ちになる。それは、相手が無配慮に私の『財産』を奪おうとしていることへの怒りだったのだ。なんだかすっきり^^人脈作りは相互貢献を意識しないと、単に「奪う」か「奪われる」かの不均衡な関係になってしまう。考えてみれば、私は本書を購入することで著者へ貢献し、著者は経験や知識を本にまとめて公開することで、私に貢献している。 見事に「相互貢献」 かならず本名で登録、経歴や学歴もまるわかりという決まりなので、本気でビジネスの情報を共有したいという人が集まるし、へんな悪さもできない。 まあ、私はそれ以前に紹介者に出会うことと、英語力をつけることが先だけど 人脈作りのキーワードは「貢献」 貢献し合える関係をつくる。(著者は、コンタクトを取られてもお互いに貢献できる要素を見つけられないときは断ると明言している。私はもっといろんな人に出会って、世界を広げたい。 この人の知恵を借りたい、この人と一緒に動けばすごくいい結果が出そう なんて人に出会った時に、スムーズに関係を結べるようになりたいな そのためにはまず、貢献できるスキル・力・要素を持とう そして、相手に貢献しよう 無闇に奪わせないことも、気をつけないとね この記事に対するコメント コメントする。 この記事のトラックバックURL この記事に対するトラックバック で英語学習中 勝間和代のビジネス頭を創る7つのフレームワーク力 ビジネス思考法の基本と実践 教科書として机の傍に ありがたや、な一冊 検索にガンガンヒットさせるSEOの教科書 復習も兼ねて、読んでいるところ 史上最強の人生戦略スタートアップセミナー ビジネス実務法務3級検定受験日まであと5日 「時間」は有限 つれづれ椿日和(管理人別ブログ) 勝間和代公式ブログ: 私的なことがらを記録しよう 勉強は楽しいのだ。 日々是向上、勉強の記録 帯のコピーより抜粋 ・毎日「お尻の時間」を決めて働く。・仕事には「日付」で締切を入れる。 目次より抜粋 ・仕事のスピードを3倍にする。と、これだけを読むと「至極もっとも」「そりゃそうだろ」と思うことばかり書いてある。 私は「夢に日付を入れる」「いつまでにやるかはっきりしない予定は、予定とはいえない」と思っているので、真新しい発見なんてないだろう それなのに、なぜこの本を読んだのか それは、著者である『吉越浩一郎氏』に興味があったから 下着メーカー・トリンプ日本法人(本社はドイツ)の社長だった人物 「早朝会議」など数々の業務改革を実行したということが、度々ニュース番組等で特集されていた。 吉越氏が行ったこと(一部) ・残業ゼロの徹底 ・毎朝八時半からの早朝会議 ・会話・電話・会議禁止、仕事に没頭する「がんばるタイム」の実施 吉越氏がすごいのは、その徹底ぶり がんばるタイムに席を離れている社員に向かって、ピッピッと笛を鳴らして注意する。定時になると、(段階的に)社内の電灯を消す。 実行当初は、さぞかし社員に嫌がられたことだろう(笑) 結果的には、終業後の自由時間が増え、きっちり締め切りまでに仕事を終えられるテクニックとスキルを身につけたんだろうから、感謝されたと思うけど この本全体に共通する「オヤジの自慢話」のような雰囲気は好きではないが、学べることはあった。すべての仕事に締め切りを設定して、それを守る。そう決意することは、誰でもできる。しかし、本当に決めたとおり実行することは、案外難しい。 (私だけかも 予定時間オーバー(予測の失敗)、不測の事態(クレーム、トラブル、事故など)、妥協 など、締め切りを過ぎてしまう原因はある。言い訳も思いつく。 でも、近くで笛を吹いたり電気を消したり、毎朝会議で追求する人が会社にいたら、冗談抜きで必死に守ろうとするだろう 要するに、徹底的にやるべき これに尽きる。まだまだ私には、必死さが足りない。 締め切りって、「約束」だものね 会社、上司、そして自分に対する約束 言い訳思いつく暇があったら、優先順位なんてどーでもいいから、今日やるべきことを全部片付けろ。と、自分に叱咤激励することにした。 この記事に対するコメント コメントする。 この記事のトラックバックURL この記事に対するトラックバック で英語学習中 勝間和代のビジネス頭を創る7つのフレームワーク力 ビジネス思考法の基本と実践 教科書として机の傍に ありがたや、な一冊 検索にガンガンヒットさせるSEOの教科書 復習も兼ねて、読んでいるところ 史上最強の人生戦略スタートアップセミナー ビジネス実務法務3級検定受験日まであと5日 「時間」は有限 つれづれ椿日和(管理人別ブログ) 勝間和代公式ブログ: 私的なことがらを記録しよう 勉強は楽しいのだ。 | 決算書の暗号を解け ダメ株を見破る投資のルール 勉強は楽しいのだ。 日々是向上、勉強の記録 決算書の暗号を解け ダメ株を見破る投資のルール 決算書の暗号を解け ダメ株を見破る投資のルール すごーーく、おもしろかった。 発売当初に本屋で見かけて以来「なんて良いデザインの表紙なんだろう 」(秀逸だと思いません。 )と惹かれていた本 でも、まだ自分には『決算書』なんて縁遠いな〜と思って、買わずにいた。買ったきっかけは何かというと、著者が「勝間和代」さんだからだ。今年の1月に『効率が10倍アップする新・知的生産術—自分をグーグル化する方法』を読んでからというもの、すっかり彼女のファンになってしまった。彼女の他の著書を読んだり、ブログを読んでいくうちに本書の著書が「勝間和代」さんだと知った。彼女が書いた本なら面白いに違いない。・・・そう思って、買った。私は「簿記3級」を持っている。 (日本商工会議所主催=日商ではなく「全商」なので、ちょいレベル低っ )だから、「貸方」「借方」ぐらいはわかる。それ以外に、ちょこっと財務会計を勉強したことがあるから「損益計算書(P/L)」の意味も、なんとなーくわかる。 私は、中級に近い初級レベルといったところ そんな私だが、本書は「そーか 」と驚き、感心する " 暗号解読 " のヒントがたくさんあった。 随所に挟まれている図解がほんとうにほんとうに わかりやすいのも良かった。ページをめくるたびにわくわくして、読んでいる途中から、「分析」をしたくてしたくてたまらなくなった。 投資先候補、または投資中企業の決算書をあらゆる視点から分析するのだ(詳しくは本書参照) 実際の企業を分析して、「あ、あの地味なA社はこんなに優良企業だったのね 「なんだよB社め、会計操作しまくりじゃん 事実を知りたい。投資の判断材料にすることはもちろんだけど、マスコミや機関投資家にもてはやされている企業、まったく取り上げられないような企業、それぞれの実態を知って「だまされない」「自分で判断」できるようになることは、生きていくうえでとても重要だと思う。 特に、会社員をやめて独立して生きていきたいと考えている私にとっては 本書は、会計解説のエンタテインメント 会計に関する著書出版は、勝間和代さんにとって「ライフワーク」なので、売れようが売れまいが出し続けるそう(笑) つぎも楽しみ この記事に対するコメント その節は、勝間さんの新インディへのカバー投票、ありがとうございました。ディスカヴァーの干場です。白に決まりましたが、おかげさまで、アマゾンでもリアル書店でもものすごい売れ行きです。勝間パワーを感じます。 そうですか、グーグル化での出会いだったのですね でも、年収10倍アップ手帳もお使いの模様 ありがとうございます。決算書の暗号は、私も大好きなほんの一つです。編集としては、編集者にもものすごく敬意を感じる本の一つでもあります。独立のための勉強、応援します。コメントありがとうございます。承認が遅れましたこと、お詫びいたします。年収10倍アップ手帳は、チャンクダウンの図を特に活用しています。 ぜひ来年も継続販売お願いします☆ 私の近所の書店にはディスカバーさんのコーナーがあります。いままでは意識していなかったのですが、かつて購入した本の中に御社刊の本がたくさんあることに気がつきました。これからも御社の本に注目していきます。コメントする。 この記事のトラックバックURL この記事に対するトラックバック で英語学習中 勝間和代のビジネス頭を創る7つのフレームワーク力 ビジネス思考法の基本と実践 教科書として机の傍に ありがたや、な一冊 検索にガンガンヒットさせるSEOの教科書 復習も兼ねて、読んでいるところ 史上最強の人生戦略スタートアップセミナー ビジネス実務法務3級検定受験日まであと5日 「時間」は有限 つれづれ椿日和(管理人別ブログ) 勝間和代公式ブログ: 私的なことがらを記録しよう カニンヘンダックス チョコタン 男の子デビューいたしました。 トリマーさん募集 一般的なペットショップでは、たくさんのワンちゃんを一度に管理するために「どうしても健康管理が甘い」というようなことを、耳にします。そこで、リトルスキップでは、一度にたくさんのワンちゃんを管理するのではなく、私たちが、じっくりと面倒を見る事ができる数だけ、お預かりするように心がけています。また、バークレイ医療センターの獣医さんと契約を結び、専門家のアドバイスを受けながら、定期的に健康状態をチェックしていきます。まず最初に健康診断(便検査、耳、目、足の関節など)を受け、健康な子のみ、ワクチンを接種します。(万が一、便検査で駆虫駆除等が必要な子は、体への悪影響をふせぐため、駆虫後に接種を行っています)その他、子犬がかかりやすい病気の早期発見や、皮膚病の有無、ヘルニア、オメメの調子、歯の噛み合わせなど、一般のお店では見落としがちな部分についても、詳細にわたって健康管理を行っていきます。また、ちいさなお店だからこそできる、こまやかなスキンシップ、話しかけ、抱っこして外の空気も吸わせたりなど、人見知りせず、かわいい性格の良い子になるように心がけています。これからも、最新のシステムや情報を勉強して、元気なワンちゃんをお届けすることをお約束します。はじめてワンちゃんを飼う時には、わからないこと、しりたいことが、たくさんあるものです。そこで、ワンちゃんのあたらしいママさんのために「母子手帳」をご用意しました。 しつけマニュアル2 飼い方マニュアル」など、新しい生活を始めるために、必要な情報がくわしく解説してあります。ぜひ、参考にしてみてください。また、新しい環境になれるまで、ワンちゃんには様々なストレスがかかります。 そのため、ワンちゃんが食べなれたフードを、あわせてプレゼントします(約一ヶ月分) 食事の様子をみながら、成長を見守っていただければと、思います。もちろん、何か困ったこと不安なことがあれば、いつでもリトルスキップにご連絡ください。年中無休のフル回転で、あなたとワンちゃんの生活を応援することを、お約束します。リトルスキップが主催する、ドックトレーナーの先生による「しつけ教室&同窓会」を、開催しています。 実践的な内容なので、すぐに役立つ知識や情報がたくさん かわいくて、おりこうなワンちゃんになって、近所でも評判の人気者(人気犬 )を、めざしてください。 また「ゲーム大会」や「交流会」など、普段はなかなか会うことができないワンちゃんとの交流は、ワンちゃんの成 長にとっても、よい刺激になります。 ぜひ、新しいお友達を、たくさん見つけてくださいね わたしたちも、ワンちゃんの「里帰り」を楽しみにしています。カニンヘンちゃんです。チョコタンの男の子です。カニンヘンダックスちゃんです。キュートな女の子ちゃんです。ミニチュアダックスの男の子です。可愛いクリームの男の子ちゃんです。 巣立った子たちにつ とっても可愛いミニ 激・・・男前さんで レッドの男の子です。 お父さんはカニンヘ とってもレアな可愛 HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。 ペット販売に関する規定 ペットショップ&犬の専門店です。 JR元町駅から徒歩5分 お気軽にご来店ください。 ペット販売に関する規定 全犬種JKC血統書つきでお渡ししており、販売日より3~5ヶ月後のお渡しになります。血統書の料金は表示価格に含まれております。[ワクチンについて]ワクチン接種後お渡ししております。[予約について]ご希望の仔犬が決まりましたら、予約金としまして仔犬代金の半分を入金お願いいたします。その時点で仮契約といたしまして覚書をご記入いただき引取り予定日の取決めをさせていただきます。仔犬が病気やケガでもしお渡しできない時は内金はすべてご返金いたします。ご入金後お客様のご都合によるキャンセルは返金いたしません。[返品について] 100%完全な生き物はありませんので、その旨を御了承の上、予約に関しては充分にご検討下さい。 仔犬の成長過程における、歯のオーバーやアンダーまたはカラーの変化については 責任は負えませんので、ご了承お願いします。[保証について]当店では別途5,000円で保証書を発行しております。保証内容は譲渡日から180日以内に死亡した場合、同種の仔犬を販売日より1年以内に提供します。その際犬種・性別の変更は原則としてできません。お客様の不注意における死亡またはケガ病気などについては責任は負えませ・ィ願いします。[郵送について]郵送の場合空輸料などは別途いただいております。全犬種取扱しておりますので、お気軽にご連絡ください。 ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - ミントと過ごした時間(リトルスキップ誕生まで) 1995年1月17日神戸すべてを飲み込む悲惨な阪神淡路大震災 例にもれず私たちも家や、すべてを失い西神中央での仮設住宅暮らしを余儀なくされました。 1年と少しの仮設暮らし 娘の中学校入学も重なり、神戸兵庫区に戻ることにきめました。まだ震災の傷跡が残る少し歪んだ借家でしたが、私たちは、帰ってこれたことの喜びと、此処からの再出発の希望で一杯でした。荷物も運び終え食事に出かけることにしました。・・・・なんと空き巣が入ったのです。引越しのその日にです。私たちは、少なくとも大切な全財産の現金を失い、途方にくれました。 職場の友人に借金をお願いしなんとか急をしのぎましたが、その時友人に、空き巣には番犬が一番 と勧められ、犬を迎え入れることを決めました。迎え入れるなら、小さい頃からの方がいいということで、生後間もない雑種の仔犬(女の子)を譲ってもらいました。大家さんに許可をもらい、私たちは、その小さな小さな生命にミントと名づけ片時も離れない生活がはじまりました。まだミルクも1人で飲めず、哺乳瓶で飲ます毎日です。夜はママが恋しいのかクンクン泣きます。それでもミントはスクスク育ってくれました。 お気に入りのぬいぐるみを、咥えてきておやつをねだるミント 寝るとき私の首に巻きつくようにねむるミント 朝、扉をカリカリかいてトイレの合図をするミント 帰宅すると私の胸めがけて抱っこをせがむミント もうミントがいない生活なんて考えられません。ミントは私たちに喜びと、幸せと、愛を与えてくれました。そんな幸せな日々が2年過ぎた頃、ミントに変化が表れはじめました。毛が抜け始め、おしっこを大量にする、水を大量に飲む。いろいろな病院を廻りましたが原因が判りませんでした。 暫くして膿混じりの尿が出始め、その時の血液検査で大変な貧血、腎不全とドクターから宣告 ・・・・・・・・・・その時、初めてわかりました。私の無知な食事方法です。いままでかわいいからといって人間と同じ食事を与えていたのでした。 少量とはいえミントにとっては大変な負担がかかっていたのでしょう すぐに入院生活が始まりました。24時間点滴の毎日です。ミントは私たちの顔を見るたびに不安そうな顔をします。 (かえりたいよー)って・・・ 2週間ほどしてドクターからこのままでは腎臓移植しか無いと聞かされました。 しかし、犬にはそれは不可能 死を待つだけ・・・と言う事です。ミントがいなくなる。ミントが死ぬ。絶対にいやだ。毎日面会に行く度にミントが泣いています。私たちに帰りたい。と訴えているのです。先生と話し合った結果、私たちはある決心をしました。点滴を外し家に連れて帰るのです。それが、どういう意味か分かっていました。朝9:00病院から連れて帰りましたが、すぐに私たちは、その決心が揺るぎました。全身の痙攣が始まったのです。最初は2時間ごとに・・・間隔が短くなり30分、10分と縮まっていきました。私たちは全身、痙攣で震えるミントを抱きしめ、(ごめんね、ごめんね、お願いだから死なないで、)祈りました。奇跡が起こるように、神様に祈り続けました。 どれ程の時間が経ったでしょう 私たちのその祈りも変わり始めました。 痙攣がひどくなるにつれ、(ミントごめんね、もういいよ、苦しまなくても、もういいよ、神様、ミントを早く天国に連れていってあげて これ以上ミントを苦しませないで・・・) 夜、7:10 ミントは最期のとても大きな痙攣と同時に天国に旅立ちました。私の腕の中で、今までの辛さや苦しさがなかったかのように、安らかな顔で・・・2年半の短い一生でした。 ミント、君が私たちにくれたもの・・ どんな時でも君がいたら幸せになれた気持ち どんな時でも君がいたら楽しくなれた気持ち そして・・・・無償の愛 それから私たちのペットロス生活が始まりました。 家の中は電気をつけているのに薄暗く、会話はミントのことばかり 出るのは、涙と溜め息ばかり 無気力な生活が続きました。外でかわいい仔犬を見ても、ペットショップでかわいい仔犬をみてもミントを思い出し、新たにワンちゃんを迎え入れることをためらってしまいます。2度とあの悲しい思い、苦しい思いをしたくない、そんな気持ちで一杯でした。ある日ミントの大好きだったぬいぐるみを見つめながらこう思いました。私たちの思いは、実は勝手に私たちが悲劇のヒロイン気取りで思っているだけで、本当に苦しく、悲しかったのは、ミントなんだ、ミントの健康をちゃんと看てやれず、知識が無いばっかりにミントに苦しく、悲しい思いをさせたのは私たちなんだ。その頃ダックス専門のブリーダーさんと知り合い、ミントのことや、いろいろお話していると、一度、犬舎に遊びにおいでと誘われました。その犬舎にミントの小さい頃にそっくりなクリームのM・ダックスと出会いました。私たちはその仔に目が釘付けになり、涙が溢れました。天国のミントに問いかけました。(この仔を連れて帰ってもいい。絶対に幸せにするから、ミントの分まで)その仔が今、うちの看板犬 凛太郎です。連れて帰って食事について家族会議です。ドッグフード中心の生活を徹底しようと決めブリーダーさんの所にも度々通うようになり、いろいろ教えていただきました。しかし、まだペットロスの恐怖から立ち直りきれていない私たちは、凛太郎がいなくなったらどうしよう・・と思い始めました。 そしてその解決法をいっぱい飼おう という多頭飼いに見つけたのかもしれません。自宅のリビングで、M・ダックス6匹との生活です。大変だけどかわいい仔達に囲まれて本当に幸せな毎日です。そして自然交配で5匹の赤ちゃんが生まれました。その小さな生命の誕生に私達は死だけではない、誕生する生命の喜びも、あるんだと考えるようになりました。その仔達はスクスク育ち、私達のブリーダー1年生としてのスタートを決心させてくれました。現在、リトルスキップ犬舎としてショップを出させてもらっていますが、私たちは、犬屋さんではなく、愛犬家の一人です。皆さんと同じ愛犬家なのです。ミントが私たちにくれた無償の愛を今度は私たちが捧げようと思っています。長文、お読みいただき有難う御座います。 ミントと過ごした時間(リトルスキップ誕生まで) 天国のミントに捧げる。 HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。 ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - リトルスキップからのお願い ペット販売に関する規定 全犬種JKC血統書つきでお渡ししており、販売日より3〜5ヶ月後のお渡しになります。血統書の料金は表示価格に含まれております。 ワクチンについて ワクチン接種後お渡ししております。 予約について ご希望の仔犬が決まりましたら、予約金としまして仔犬代金の半分を入金お願いいたします。その時点で仮契約といたしまして覚書をご記入いただき引取り予定日の取決めをさせていただきます。仔犬が病気やケガでもしお渡しできない時は内金はすべてご返金いたします。引取り予定日までにご連絡がなく、引き取り予定日にお引き取りのの無い場合は、キャンセル扱いとさせて頂きますのでご注意ください。ご入金後お客様のご都合によるキャンセルは返金いたしません。 返品について 100%完全な生き物はありませんので、その旨を御了承の上、予約に関しては充分にご検討下さい。 仔犬の成長過程における、歯のオーバーやアンダーまたはカラーの変化については 責任は負えませんので、ご了承お願いします。 保証について 当店では別途5,000円で保証書を発行しております。保証内容は譲渡日から1か月以内に死亡した場合、同種の仔犬を販売日より1年以内に提供します。その際犬種・性別の変更は原則としてできません。お客様の不注意における死亡またはケガ病気などについては責任は負えません。故意やワクチンの未接種などによる死亡は保証対象外となります。詳しくはお問合せください。 郵送について 郵送の場合空輸料などは別途いただいております。全犬種取扱しておりますので、お気軽にご連絡ください。 HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。 ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - うるうる・・・おめめにノックアウト アルバムトップ : お客様のワンちゃん : うるうる・・・おめめにノックアウト うるうる・・・おめめにノックアウト 10月9日生まれのレッドの男の子です、お名前は(やまと)君に決定しました、やまとママは、約3時間この子の前でアイ○ル状態・・・もう離れられなくなってしまいましたと言う事でお家に迎え入れていただきました、実はやまとママのお家には猫ちゃんがいるので心配されていましたが、昨日のお電話で大丈夫と報告頂きました、末永く宜しくお願いいたします。 HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - とっても凛々しい男の子です。アルバムトップ : お客様のワンちゃん : とっても凛々しい男の子です。とっても凛々しい男の子です。2月2日生まれのブラックタンの男の子です、明石市の素敵なご家庭に迎え入れていただきました。リトルスキップから2匹のクリームちゃんを迎え入れていただいた、U様のご紹介で一緒に来ていただきました。一目惚れしていただき、即決していただきました。とっても優しいご家庭の一員になり、今巣立ちます。末永く宜しくお願いいたします。 HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。 ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - 性格は とっても控え目なシャイな女の子です。 アルバムトップ : お客様のワンちゃん : 性格は とっても控え目なシャイな女の子です。5月4日生まれのミニチュアダックス、クリームの女の子です。大阪府堺市の素敵なご家庭に迎え入れていただきました、優しいパパさん、ママさんにとっても気に入っていただき、即決でクリームちゃんに決めていただきました。ワンちゃんを迎えるのが始めてのご家庭ですので、不安な事はいつでもご連絡いただくようにお話をし、今日からご家族の一員になります。とってもおとなしい、賢い子です、末永く宜しくお願いいたします。来月お会い出来るのを楽しみにしています。 HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - ティーカッププードルちゃん巣立ちます。アルバムトップ : お客様のワンちゃん : ティーカッププードルちゃん巣立ちます。ティーカッププードルちゃん巣立ちます。2月23日生まれの、ティーカッププードル、レッドの女の子です。滋賀県大津市の素敵なご家庭にむかえいれていただきました。HPで気に入っていただき、この子に実際に会いに来ていただきました、パパさん、ママさん、お兄ちゃん、お姉ちゃんにとっても気に入っていただき、今日からご家族の一員にさせていただきます、お名前は「じゅんちゃん」に決定の上今巣立ちます。お写真よりも数倍可愛いこの子にとっても感激していただき、本当にうれしかったです。大切にしますからと優しい言葉もいただきました。今頃は車の中で皆様に甘えているころだと思います。小さいこの子を末永く宜しくお願い致します(*^_^*) HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - 小ぶりなイザベラちゃんです。アルバムトップ : キッズコーナー : 小ぶりなイザベラちゃんです。小ぶりなイザベラちゃんです。 コメント ワクチン1回接種済み(医師による健康診断書お付けいたします) *優しい性格の女の子です♪こんなに綺麗なイザベラちゃんが当店に来てくれました。お顔もカワユイです。是非会いに来てあげて下さい。 この子の生ライブ映像ご希望の方は、ご連絡くださいね 優しいお家が決まりました。 ネスト表示 フラット表示 スレッド表示 古いものから 新しいものから 投稿された内容の著作権はコメントの投稿者に帰属します。 HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。 ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - リトルスキップのぶろぐ : 2006年 3月 リトルパパのたわごと なんでまた寒くなったんやろ もうすぐ4月を迎えるっちゅうのに・・・ 明日パパは病院の日 順調に回復してたらエエけど、あかんかったら又、手術 昨日うちから巣立ったチワワの仔(ブラッククリームのおんなのこ、写真集でさがしてチョ )がワクチン前のシャンプーに来られた。 ちょっと大きくなってて一安心 チワワのちっちゃい仔は遊びすぎると低血糖をよくおこす。 心配しててんけど飼い主さんはチワワをすでに2匹育てあげてるベテランさんやからね そんなことを書きこんでたら天空と天空ママが来られた。昨日、リトルママと天空ママのお店で2時間位飲み食いさせてもらっててんけど天空くんはお客さんや皆にかわいがってもらってる。 5歳のルイちゃんって仔(ミニチュアダックスのレッドの男の子)の真似をしていろんなことを勉強してるみたい ルイちゃんはメチャお利巧さんやから天空くんにもいいお兄ちゃんやね リトルパパのたわごと うちのバニラのお相手、カニンヘンの男の子を探してたんやけど、ようやく見つかった。 京都の知り合いのブリーダーさんの所にいる仔 濃いめのクリームの男の子 なんせバニラは2 3〜4Kgの小柄な仔やさかいお相手さんもちっちゃめの(3Kgぐらい)の仔をさがしてたんよ いろんな所のブリーダーさんに問い合わしてようやくメッケタ 今は血統書はカニンヘンゆうても大きい仔がいっぱいおるから ミニチュアからバラエティ(サイズ)変更してる仔も多い。 バニラは5代祖までほとんどカニンヘン ミニチュアは2匹だけ やったと思う。 んやから出来たらしっかりしたチッチャメの仔を探してたんよ 昨日、電話で話してOKとゆうこと この週末にでも連れてきます。 リトルパパのたわごと リトルスキップに来られた人は気づいてる方もいてはると思うけど、うちの隣はお年寄りの介護、ディサービスセンターやねん んで前を通るお年寄りの方は「まぁ〜カワイイ〜」って言いながら通り過ぎはる。今日は初めて付き添いの方と手をつないでおばあちゃんが店に入ってこられた。 10分ぐらい「この仔がカワイイ」「この仔もカワイイ」って見ていきはってんけど、帰り間際に「いや、この仔おとなしいな〜 」って入り口に一番近いクリームの仔のケージの中の隅を指、さしてはる・・・(いやいや、おばあちゃん、それは犬やのうてぬいぐるみです・・・・・) おとなしいんやなくて動かないんですー リトルパパのたわごと やりよったー。ホンマにやりよったー。 さすが日本野球やな 8回の攻撃は凄まじかった。それにしてもイチローはいまやもう世界を代表する天才プレーヤーやな、おんなじ日本人として誇りに思う。ぜひぜひうちの孫ちゃんの将来もこうなってほしいもんです。 とにかくおめでとぉぉぉぉぉぉぉぉぉぉぉ リトルパパのたわごと 昨日は第一回目のしつけ教室 無事に終了した〜。 なんとか・・・ 久しぶりの仔にも会えたしホンマよかった〜。 リトルスキップがOPENしたての頃に巣立った仔がほとんどやから皆、大きなったし、パパは巣立ってから始めて会う仔もおったし またず〜と続けてやろ。 さ〜て昨日、撮った写真を先生に見てもらいながら昨日の様子をホームページにどんな形で掲載するか、先生と相談しながら(まぁ結局、全部先生がしてくれはんねんけど・・)載せますんでお楽しみに・・・ リトルパパのたわごと さあ、いよいよ明日はリトルスキップの第1回目のイベント 準備も着々と進み最終段階 でも明日はどーも雨っぽいな〜 晴れへんかな〜 今日は朝からうちの孫がきてんねんけど(土曜日なので保育園お休み)まぁこの孫、口から生まれたんちゃうかっちゅう位ひっきりなしに喋りよるねん 相手するのも疲れてくるし、ましてイベントの準備に追われてるママはカリカリしっぱなし やれ喉かわいた〜、やれ雨やんだ〜、やれTVみる〜、やれTVなんにも面白いのやってへん〜、んで、この孫の口癖が「ねぇねぇ、ねぇってば 」「ねぇねぇ、おじいちゃんってば 」とこんな感じ パパはにゃーんにもしてへん時は「ん」って相手できんねんけど、なんか用事してたら、「ちょっとまて。 今、用事してんの 」こんな感じになってまう・・・カワイソウやから出来るだけ話を聞こうと思ってんのやけど忙しかったらどーしても・・・ ところで、リトルパパっちゅうのは、どうもおかしいなー 孫がおる以上リトルジージーが正しいのでは と思う今日この頃 今日も雨、皆、散歩いけずにカワイソウ・・・元気してるかな〜 でも「じーじー」はいややー 「パパ」がエエー リトルパパのたわごと 昨日、ママと二人でJR神戸駅西側、高架下の屋台村、お好み鉄板焼き「膳」で一杯飲みながらちょっと食べてたんよ そしたらな、な〜んと先生に会ったんよ 先生と呼んでるんはパパとママが勝手に呼んでるんで本人は「先生やないです」って言ってはるんやけどね、んで一体なんの先生かっちゅうとパソコンの先生やねんけど、この先生、実はリトルスキップのホームページを作ってもらった大先生 昨日もいろいろ教えてもらいながらほろ酔い ホンマにこのホームページ開設にあたってはメチャクチャお世話になってる。 んで昨日おもしろい話を聞いたんよ、うちの(リトルスキップ)ホームページ、全世界で26万位 なにがやねん って聞かれてもパパもよ〜わからんねんけど、とにかく約26万位 ちょっとスゴくない。 なん億、何十億ちゅう数のホームページがあるなかで約26万位 だからなにがやねん って聞かれてもよーわからんちゅーねん リトルパパのたわごと 雨雨降れ降れ母さんが〜、って、あ〜結構降ってるわ 神戸のワンコ、散歩いかれへん仔多いやろな〜かわいそうに・・・・パパはそんなに雨が嫌いやないけど、お散歩好きなワンはイヤやろな〜 しかーし そんなこと言ってる場合やない。 きたる19日にそなえての準備を大急ぎでママとせんと まぁほとんどママ一人でしてんねやけど・・そんなこんなしてると天空(そら、と読みます)くんがシャンプーにこられた。 3Kg・・ちょっと大きくなったかな うちのホームページの写真集でも天空くんは人気者やからね〜 今日もシャンプー終わったら写真撮ってUPしよ〜っと んでね、天空くん「わんわんは 」って話しかけると「アンアン」って応えるねんて〜 カーイイやろ リトルパパのたわごと 今日は又、すこぶる寒さやわ、天気予報によると真冬なみの寒さやって・・・・・ どうも此処2,3日、体の調子がイマイチ・・・順調に回復してたのにな〜 14日の火曜日にもっかい病院に行こっと 土、日と調子悪くてず〜っと家で寝たきり状態 ウランとちょっと寝て、リンタロウとちょっと寝て 寝てばっか・・・今日はちょっとマシやから店に来たついでにブログも書いてるんよ んで、10日の金曜日にゆうちゃん(掲示板でおなじみの・・マロ、クリのママ )と、Kパパと、リトルママとの4人で尼崎のコストコに行ってきた。 店内は広ぉぉぉぉぉぉぉぉぉぉぉぉくて、品物はみなBIG ってか普通になんでもあるし、ちょび感動や 場所も分かりやすくてなおGOOD アメリカかぶれのパパ(自称)は、結構、酔いしれてもた 又、行こっと この日はゆうちゃんとKパパが今月OPENする、Music(音楽とお酒を楽しむミュージックバーです。 三宮は北野坂)の準備に伴う買い物 イヤ〜又行こ リトルパパのたわごと な〜んか今日は手術あとが痛いー 年とると治りも悪いな〜 昨日、ショーに詳しい方と3時間位、喋っててんやけど、ヤッパ挑戦しよっかな、うちのアトムで・・・ちょっと尾が上がりすぎかな〜って言ってはったけど・・・ 昼間はだいぶ暖かくなったな〜・・・・・皆、元気かな〜 リトルパパのたわごと へへ〜ん、1日に2回も書くのも初めてやー んで今日3時ごろにリトルママの友達が店に遊びにきててんけど(遊びというより占いに・・実はリトルママは占い師でもある)この友達という人、去年(リトルスキップがオープンした頃)に約15年位飼ってたワンちゃんが亡くなってすんごい落ち込んでたんよ パパもママもその辛さが痛いほどわかるんでなんて言ったらいいか・・・って思ってました。 まぁじょ序にちょっとづつ元気にはなってたんやけど・・・・ んで占いも一通り終わって世間話してるとき友達さんがフッとなにげに目をやった。その先にはプードルちゃん「え〜プードルおるん。 」抱っこしてみると・・もう目が涙ぐんではる・・・ 実はこのプードルちゃん、何日か前に突然入ってこられたお客さんにお願いされて「プードルのアプリコットがいれば連絡ください」って言われてた仔 そしてパパがブリーダーさんにお願いして連れて帰ってきたんよ 友達さんは、ポツリ「この仔ほしい・・・」 でも今日の夕方にそのお客さんが見にきはることになってるからな〜 ず〜とその仔を抱っこしててちょっとの間沈黙 そん時電話が鳴ったんよ んで、そのお客さんからで、な、な、なんと断りの電話 もう友達さんもママもパパもビックリやわ〜 友達さんはエライ喜んで今日連れて帰る。って半泣きで、パパもママもすっごい偶然というか、このプードルちゃんの運命の強さを感じた。 友達さんもこれは絶対、運命や って喜んでたわ〜 こういうもんかな〜出会い、運命って・・うちから巣立った仔達もいい出会いができて嬉し〜 みんな、楽しくやってるかな〜 リトルパパのたわごと へへ〜ん、2日続けて書くのは初めてや〜 昨日から家の仔がなぜか騒がしい。暴れまわってる。 しょうがないので静かな2匹、ハニーとバニラは昨日から店に泊り込み ハニーはメチャ騒がしいのが嫌いなんで迷惑そうやし、バニラはバニラで尻尾まいてイライラしっぱなし・・・家のなかもムチャクチャ・・・大体原因はカレンとアトムやっちゅうのはわかってんのやけど、なかなか尻尾をださん。 (ワンコだけに・・)パパが部屋にいると皆エエ仔 部屋をでるとドタバタガタガタバタンドン んで、「コラー」って入ると皆お座りしてエエ仔してる。 う〜ん、なかなかやるな そんな中でもりんたろうと、きれんはおとなしいもん まぁ2匹とも、もう大人やからな〜 写真集で「あそんで〜3」のクリームの仔 昨日、ご近所に巣立っていったんやけど、あの写真、実はパパの携帯の待受けにしてんねん かわいいっしょ いつもコメントありがとうね〜 ホンット嬉しいです。 で、ダックスの運動は大体20分〜30分位やっていわれてるけど、まぁそれも年齢とか体調とかにもよるやろしマロ、クリ、ミユが疲れん程度に、それからワンコがいうがまま付き合うのもあかんと思うよー 階段とかいろんな段差も腰にあんまりエエことないんで気ィつけてください。 とにかく人間とワンちゃんの最高の関係はキッッッッッッーチリ順位制をつけること 言いなりは、あかんし(人間が疲れるだけで、それに順位が逆転する。 )強制もアカン(ワンコが怯え、ストレスMAX )てな具合のことを参考にしてくらはい リトルパパのたわごと いつもコメントありがとうね〜 なかなかブログも進められずにいる今日この頃です。今日は2匹の仔のお迎えがあった。 レッドの仔(1月1日生まれの女の子)とレッドの仔(1月10日生まれの女の子、写真集でさがしてチョー)皆、やさしそうな方で大切に育ててもらえそうで安心や〜 夕方に1月16日生まれのクリームの男の子(写真集でさがしてチョ あそんで〜3の仔)がご近所の方に迎え入れていただくことが決定 この方もすっごく優しそうな方で安心 あ〜みんな巣立っていくのは寂しいけど、みなさん優しい方なのでうれしいわ〜 今まで迎え入れていただいた皆様 本当に大切に育てていただいて有難う御座います。愛犬家はペットショップをしたらアカン。って反対されたけど、みんなが元気やったらホンマにやってよかった。 って思うわ〜 これからも幸せなワンコを一杯つくろう 今日はいい天気・・・散歩日和・・・みんなもどこかに散歩でかけてるんやろな〜 HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。 ミントと過ごした時間 リトルパパのたわごと ロミオ&バニラちゃんです。今日は暑いです。 カニンヘンダックスにつきまして 良い天気です。 お星様に・・・・ 今度は暑いぐらい 各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。 ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - リトルスキップのぶろぐ : 2006年 8月 リトルパパのたわごと 歳をとる度、ため息まじりの安堵感 かの織田信長は「人間50年〜 」っちゅうて好んで唄って舞ったらしい。 リトルパパのたわごと んで土曜日(12日)の午後3時頃、某明石の現場で休憩中に、とんでもないもんを発見した。捕獲に失敗したがキッチリ写メに収めた。 これよ、これ なにかわかりまっか では拡大して、もう一丁 (矢印の先に注目 どうみても、顔やんな って、これがどこの何もんか知ってる人おったらおせーて リトルパパのたわごと パパの本業は建設機械、重機オペレーター 仕事に復帰したんが7月1日 毎日暑い・・ホンマに暑い・・さらに暑い・・マァほとんどエアコンのきいた重機の中におんねんけど・・外で作業してるもんに悪いんで、チョクチョクおりて手伝う。 遠慮もなしにギンギン照りつけくさるんよ、太陽さんが・・・ 顔も腕も真っ黒や・・ んでパパの会社にはいろんな犬がおる。 大型犬ばっか まずは・・・・ バーニーズマウンテンドッグのリキ リキにはハナっちゅう1歳年下の嫁はんがおんねんけど、このハナがなかなか写真を撮らしてくれん。 んで次は・・ ボルドーマスチフのランディ 4歳の男の子 いかつい顔してるけど、賢い、言うことを良く聞くエエ仔 (喧嘩はメチャ強いけど・・・) んで次・・ 土佐犬のマロン 3歳の女の子 この仔はパパの手におえん 他の犬を噛むことしか考えてない・・(人間は噛まんねんけど・・) まだ他にドーベルマン、ナポリタンマスチフ、マスチフとおるんよ 世話が大変、毎朝皆、総出で世話してる。 でもパパが一番仲良しはボルドーマスチフのランディ ヨダレをパパの服にこすりつけながらスリスリしてくる、かわいい奴 きれんベビー きれんベビーの (ひめ)ちゃんが1ヶ月ぶりにシャンプーにご来店 とっても成長したひめちゃんを見て感動 ひめママさんに最近のひめちゃんの行動をお聞きし、よい事も悪いことも 1歩ずつ成長していると感じたひと時でした。 おねちゃんとおにいちゃん、そして家族の皆さんに愛されて、幸せそうな ひめちゃん、ちょっと、おてんば娘ですね でも、このかわいさは、たまりません。 ビルの間から 昨日は、神戸の花火大会でした、店のかたずけをしてるとドーンドーンと 始まりました、リトルスキップは、花火大会のイベント会場からは、」車で 10分ぐらいのところにあります。 去年は、行きましたが、今年は、もう間に合いそうにないので、あきらめ気分、去年は、終わりごろから雨が降り出し大変でしたが、今年は、いいお天気なので ワンちゃん達もたくさん、花火見物に出掛けてることでしょう 私達は、と言うと店から10mほどはなれた春ちゃんの店の前から、見物です、ビルとビルの間からそれがビックリするほど、よく見えること見えること、ドーンという振動もかなり体に感じるので、大満足しました。 皆さんは、花火行かれましたか 近くで見るのも良いですが、穴場を見つけて、人ごみを避け、静かに 見るのも又良いですよ HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。 ミントと過ごした時間 リトルパパのたわごと ロミオ&バニラちゃんです。今日は暑いです。 カニンヘンダックスにつきまして 良い天気です。 お星様に・・・・ 今度は暑いぐらい 各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。 ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - リトルスキップのぶろぐ : 2007年 5月 紀香&陣内が盛大披露宴 昨日は、本当に感動の披露宴 朝から・・・・ 早く7時になったら いいのに〜〜今日は、絶対に、最初から、最後まで見逃すものかと張り切っておりました、なぜなら・・・・・ 会場である、ホテルオオクラは、リトルスキップから、急げば車で 5分ほどのところにあるからなのです、目と鼻の先にチョ〜〜豪華な芸能人がいるわけでありまして、こんな、体験はもう二度とないかもしんない。 知り合いのママさんと、ホテルへ行こうか、新神戸駅に行こうか なんて、話していると横目でリトルパパは、「その気持ちぜんぜんわ からん・・・・・」とあきれ顔 性別の違いで、これだけ感動する事に違いがあるのかと、思いながら、テレビに釘ずけで見てたわけで、しかも、もちろん、友達でもなけりゃ親戚でもナッシング でも、この感動の涙は、何 弾き語りのシーンなんて、最高でしたよね 自分に重ね合わせて、ジ^^^^^ンと来た女性は、陣内さん、素敵でした、関西弁でしゃべる紀香さんもやっぱり、良いです。 同じ、関西人という何か、親近感が、涙をさそってたのかも 結局、行かないまま終わったのでしたが、しばらく、お友達のママさんと恋愛論に花を咲かせ、今日の1日が、無事終わったのでした・・・・・しかし、又今日の朝、スポーツ新聞に釘ずけになった私は、何者なんでしょう ミーハーな、リトルママでした(*^はなちゃんです。西区に巣立った、はなちゃんです。チョコタンのおちびちゃんの様子を、はなちゃんママさんからメールいただきました。 今が、いたずら盛りですが、ご家族の皆様に、あいきょうを振りまいて、毎日元気に遊んでいるそうです。次のしつけ教室では、姉妹のさちちゃんと再会出来る事を、私も楽しみです(*^ はなちゃん、いつでも遊びにきてね カレンちゃん 5月28日交配いたしました。 父・・・・りんたろう ミニチュアダックス クリーム 予想カラー・・・・・・クリーム、ゴールド (前回と同じペアです) 出産次第子犬ちゃんのお写真を公開いたします。 リトルパパのたわごと いやはやビックラこいた。牝馬の「ウォッカ」号が牡馬を蹴散らし3馬身差で見事ダービー馬の仲間入りを果たした。 牝馬のダービー制覇は1943年の「クリフジ」号以来64年ぶりの歴史的快挙 パパは馬券は買わんがサラブレットは大好き 期待はしてなかったがチョットだけ 「ウォッカ」号は応援してた。 けんどホンマに勝ってまうんやから、あの馬の能力は 素晴らしいもんがあるんやろな〜 「ウォッカ」の父、「タニノギムレット」号も第69回を制したダービー馬 う〜む、素晴らしい。 しかし、人も馬もワンも女性が強い・・・・世の常か・・・ なんにせよ、おめでとう リトルスキップから、歩いて5分のところに、通称「楠公さん」 湊川神社があります。 今日は、5年ぶりの大イベントである、武者行列が行われました、お馬さんだけでも、数十頭、行列に参加している方は、数えきれません。 お店の近くは、ごらんのとおり道路も片側4車線のすごく交通量の多いところ なのです・・・・・ ちょうど、ライフに買い物に行こうとお店を出ると、行列が来るところでした、しかし・・・・・ デジカメを忘れた・・・・・ せっかくのナイスショットが・・・・・・ 撮れない・・・・・・ ひろみちゃんに持ってきてもらお でもあかん・・・・ お店は、トリミング中 しかたがないので、携帯で頑張っちゃいました。 その時、両手を上げて馬にまたがり、大声を発している武者が一人・・・・ よく見ると、赤井英和さんではありませんか なぜか、感激 参加されていたのですね 関西は、関西でもこの神戸は、あまり昼間に芸能人にお目にかかる。 事がなくって 大阪に比べると、かなり静かな町なんです、と、言う事で無事写真も撮れ、ライフで子犬のささみを買い、お店に帰って、ホット一息・・・・・ そんな、1日でした。 さあ、今から子犬ちゃん達のご飯です、ちょっと遅くなってしまいました。 みんなに、ひとつ報告 お馬ちゃんの中にねっ、パイボールド模様の子がいたよ 新しい、発見したよ ダックスと同じだね びっくり、しちゃった。 パイボールド模様のお馬ちゃん リトルスキップより巣立った、チャンプちゃんのママさんが チャンプちゃんの 子育て奮闘ブログをはじめられました。 「はじめてのワンコ」←クリックと言うお名前のブログです、リンク集からも見れますよ みなさま、応援してあげてくださいねっ しつけ教室&同窓会のお写真を、テレサの社長さんが沢山撮って下さっています。 順番に、しつけ教室のページに掲載して行きますので、お楽しみに 第3回しつけ教室&同窓会 第3回、リトルスキップしつけ教室&同窓会を開催いたしました。 神戸市長田区のドッグカフェ(クルツ・バインさん)を貸し切らせていただき、室内ドッグランにて たくさんのお友達に集まっていただきました。リトルスキップより巣立った、ダックス軍団は、元気そのものです。 始めは、パパさんママさん達も少し緊張されてた様ですが、すぐに皆様うちとけていただき カメラで、お互いのワンちゃんを撮影しあったり、交換して抱っこしあったり、近況報告に 会話のお花も、満開に咲きました(*^ しつけ教室では、ドッグ・ラッグの高山仁志先生に来ていただき、皆様真剣に しつけについて質問されました、今日から実行されている方も多いのでは、ないで ゲームコーナーもあり、ワンちゃん達、パパさんママさんも真剣に 頑張りました。 優勝は、ミニチュアダックスのクーちゃんです、2位は、ミニチュアダックスのいちちゃんです。 優勝決定戦では、熱いデットヒートで、少差でくーちゃんが見事 優勝を勝ち取りました。お天気も良く、最高の日となりました。 ご家族皆様に愛され天真爛漫に元気よく すくすくと、育っている子達に会えた事、本当に私たちの喜びであり、誇りでもあります、ご家族の皆様、休日でありますところ、予想以上のご参加本当に有難う御座いました。 これからも、しつけ教室、メインは同窓会かな を行って行きますので 参加して下さいね(*^ 今回、日程の都合でご参加出来なかった方もたくさんいらっしゃいます、次回は、10月を予定しておりますので、宜しくお願いいたします。ホームページのお知らせより、日程が決まり次第、掲載いたします。 皆様、昨日はお疲れさまでした・・・・・・・ ナナちゃん、パフィーちゃんが、里帰りシャンプーにご来店です。ナナちゃんもパフィーちゃんも20日のしつけ教室に参加予定です。 皆様、まだ少し人数の空きが、ありますのでご参加くださいね 今日は、母の日だったのです。 最近、忙しさのあまり、ついつい、自分のことは後回しにしてしまっているので、自分が母の日対象の人間である事を すっかり忘れてしまっていました、(*^ 先ほど、娘のりさちゃんからお花をもらい感激・・・・・ 最近、母親らしい事もしてやっていないのに・・・・・・・ なんて、出来た娘なんでしょうと、一人感傷にひたる私です(^_^;)さくらちゃんです。 徳島県に巣立った、さくらちゃんのご家族より 近況のご報告メールを いただきました。 とっても、美人さんのダックスちゃんです、可愛いお顔のですが、お家では、ちびっこギャングのように元気いっぱいではしゃぎまわり、天真爛漫そのものらしいです、ご家族皆様の、アイドルのさくらちゃん、とっても幸せそうで嬉しいご報告 でした、これからも宜しくお願いいたします。今日、ミニチュアダックスのゴールドちゃんが、優しいお家に巣立ちました。 お名前は、シンバちゃんです、毎度の事ながら、決めていただいてから何日かお預かりする子は、責任も重いですが、巣立つ前の日から、複雑な心境になります、今日も、新しいパパさん、ママさんと最後の引渡し事項の注意点などをお話し、いざ出発となった瞬間、ボロボロと涙で胸いっぱいになってしまいました、パパさん、ママさんから、「会いに来ますよ」と慰めていただき、本当によかった。シンバちゃんは私の手元を離れるけれど、これから、幸せいっぱいな生活があるんだと・・・・・ 本当に、よかった・・・・・ どの子にも、色々な思い入れがあります、私の手から、巣立つ時・・・・ 宜しくお願いします、幸せにしてやってください・・・・ そんな気持ちでいっぱいに、なってしまいます、逆に、お客様から慰めてもらう事もしばしば 又今日も、幸せな子が巣立ちました。 明日は、ゆずちゃんが巣立ちます、今日は、巣立ったはるちゃん、リッキー、マグちゃん、クーちゃんが里帰りしてくれています、とってもにぎやかな、1日です。 シンバちゃんは、お家に着いてはしゃいでいるころでしょう いまさらながら、優しい皆様に支えられてリトルスキップは、成り立っています、本当に有難う御座います。シンバちゃんです。マグちゃんです。リッキーくんです。クーちゃんです。はるちゃんです。空、大地、海里ちゃんです。仲良し3匹トリオです。3匹で、遊びに来てくれました、しかし・・・・・・ この状態・・・・・・ うまく、写真を撮らせてくれません、ママさんと、座りこんで奮闘しましたが、このとうり・・・・・ オイオイ、君たち激しすぎるのではないですか〜〜〜〜 チョコちゃんです。立派に成長している、チョコちゃんが、シャンプーに里帰りしてくれました。 ちょこちゃんママさんは、何回もリトルスキップに足を運んでいただき、この子に、決めていただきました、とってもヤンチャさんなので、シャンプーに来られるのを、遠慮されていたと聞き、そんなに、気を使っていただいてこちらこそ、恐縮です。これからは、遠慮されないで来て下さいね、とお話しました。シャンプーの苦手な子も、じょじょに慣れてくれます、トリマーのひろみちゃんは、ゴッドハンドですぞ〜〜〜〜〜 チョコちゃんごめんね〜〜〜 動きが激しかったんで、上手に撮れてなかったです<m(__)m> HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。 ミントと過ごした時間 リトルパパのたわごと ロミオ&バニラちゃんです。今日は暑いです。 カニンヘンダックスにつきまして 良い天気です。 お星様に・・・・ 今度は暑いぐらい 各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。 ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - リトルスキップのぶろぐ : 2007年 12月 今年も最終日になりました。 いつも、リトルスキップのページを楽しみにして下さっている皆様 初めて、当店のページに遊びに来てくださった皆様 今年は、本当に有難うございました(*^ 今日で、今年も最終日になりました、巣立ったわんチャンは、皆元気でお正月をむかえてくれる事だと思います、初めてのお正月の子、2年目の子、3年目の子・・・・・ みんな、どうしているかな と、今お店で一人考えているのであります。 今年は、お正月休みを長く取らせていただきましたが、結局・・・・・お店に来ています・・・・・・、(*^ おかげさまで、12月31日までに、ほとんどの子が巣立ち、新しいおうちで可愛がって いただいています、本当に皆様有難うございました。 来年は、今年以上に皆様のご期待に添えますよう努力を重ねてまいりますので、よろしく、お願い致します。 巣立った子達、来年も遊びに来てね いつでも、待っています・・・・・・ では、みなさま良いお年を グラン君ですー 極小のティーカップちゃんとしてリトルスキップから巣立ったグラン君です。 パパさんとママさん♡そしてお兄ちゃん♡と一緒に里帰りで、リトルスキップに 遊びに来て頂きましたー やはり極小です。素晴らしいティーカップちゃんですね(*^ 豆柴の小次郎君と又遊びに来てね リトルママ&りさ バロン君とアッ君です♪ リトルスキップから巣立った、バロン君&アッ君が遊びに来てくれました。 二人ともパパとおばーちゃまにベッタリさんですね カニンヘンダックスのアッ君は、おばーちゃまとカニ旅行に行ったそうです。 「どこに行く時も一緒 又、いつでも遊びに来て下さいね お待ちしております〜〜 工作の時間に授業で作ってくれたそうです・・・・・ 先週の平日をねらって、息子とルミナリエに行ってきました〜☆・:*・ 実は、神戸にいながらルミナリエに行ったのは数年ぶりでして・・・(^_^;) そのせいもあるのか、めっちゃ新鮮で綺麗でしたッッ しかし、息子はと言うと・・・屋台に必死でイルミネーションには興味ナッシン・・・・・ 『1番につぼ焼きを食べたいッ 』・・・・・って 「次は何が食べたい。 」と聞きましたところ・・・・・ 『ラーメン食べる 』・・・・・って オイオイ・・・・・ってなりながらも結構楽しんできました。エンジェルちゃんです。 ミニチュアダックスのエンジェルちゃん 里帰りでリトルスキップに遊びに来てくださいましたぁ〜(●^o^●) チョコダップルのエンジェルちゃん♪ とっても素敵なネックレスの似合うお姫ちゃまです。 リトルスキップから4匹目の末っ子として迎え入れて頂いたエンジェルちゃんですが、ママさんからお話を伺ったところ、今ではエンジェルちゃんが 1番の姫ップリを発揮中とのことでした〜( o ) やりますね〜エンジェル姫 またいつでも遊びに来て下さいねー リトルママ&りさ エルくんで〜す。堺市のエルくんが里帰りで、リトルスキップに遊びに来てくれました〜(●^o^●)ほつれた毛を少しだけカットしたエルくんは、とってもお利口さんでした(^O^) 最近とっても寒くなってきたので、エルくんも風邪にきをつけてね〜 そしてご家族のみなさん、また神戸に来られる時はいつでも遊びに来てください。 従業員一同、エルくんの成長を楽しみにお待ちしておりますっ くーちゃんです♪ カレンベビーのくーちゃんが、リトルスキップに里帰りで遊びに来てくださいました。ご家族の愛情をたっぷりそそいでもらってるんですね〜(●^o^●)♡とってもカワイイくーちゃんです。 また、いつでも遊びに来てくださいねっ リトルママ&りさ とある街の素敵な・・・ こんにちは〜 子犬ちゃんたちのシャンプーを終え、一息しながらブログ更新です♪ 思わず一人で何枚も撮ってしまいました・・・(^_^;) まわりはカップルだらけで若干恥ずかしかったものの・・・ でも、そんなの関係ねぇ イブちゃんです♪♪ リトルスキップから巣立ったイブちゃんが、お店へ遊びに来てくれましたよ〜(#^ ありがとうございますッッ ホントに可愛いです。 とってもお利口さんやしね〜♪また遊びに来てくださいね〜 HOME 子犬情報 ワンちゃん写真集 お知らせ 店舗情報 子犬の成長日記 ワンちゃんQ&A ブリーダーズ広場 ぶろぐ ワンちゃんしつけ教室 ミント リンク集 犬の十戒 法律関連表記 お問い合わせ 友達に教える。リンクはフリーです。バナーはこちらをご利用ください。 ミントと過ごした時間 リトルパパのたわごと ロミオ&バニラちゃんです。今日は暑いです。 カニンヘンダックスにつきまして 良い天気です。 お星様に・・・・ 今度は暑いぐらい 各種クレジットカード取り扱い各種分割払いもできます。 世界でたったひとつのペットショップから「愛をこめて」 当サイトに掲載されているバナー以外の画像・文章・データの無断転用・転載を禁じます。 ミニチュアダックス|カニンヘンダックスのリトルスキップ - リトルスキップのぶろぐ : 2008年 10月 はらドーナツです。 はらドーナッツ オカラと豆乳をタップリ使用したヘルシードーナッツ 素朴な味わい でも、モッチリと自己主張 太陽がいっぱいの沖縄のサトウキビから取れた赤砂糖で、自然のミネラルがたっぷり ドーナッツとチョコが運命の出会いをしました。 ビターなあいつとほんのり甘いあの子 渋い、渋いねぇ、大人のカカオ コクがあって、まろやかで力強くて、どっしりと 季節のフルーツを使ったドーナッツ ちょっぴり甘めで、お子様に大人気 天然香料特別栽培のアールグレイの茶葉を混ぜ込みました。癒される芳醇な香りをお楽しみ下さい。 アメリカではドーナッツをコーヒーに浸して食べるそうな で、出来ました。細挽きのエスプレッソ豆を混ぜ込みました。 緑黄色野菜のお母さん 栄養たっぷりのにんじんを使用しました。カロテンが多く含まれます。