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흑두 품종의 영향 콩의 종류가 발아에 비치는 영향을 검토하여 Fig. 2에 나타내었다. 흑두의 대표적 품종인 흑태, 서목태 및 서리태를 3시간 침지 후 2시간 물빼기의 조건으로 침지시켜 실온에서 발아를 행한 후 싹의 길이를 측정한 결과 12시간 경과 후 품종별 싹의 길이는 흑태, 서목태 및 서리태가 각각 \( 10 \mathrm { ~mm } , 10 \) \( \mathrm { mm } \) 및 \( 8 \mathrm { ~mm } \)이었으며 48시간째는 \( 35 \mathrm { ~mm } , 30 \mathrm { ~mm } \) 및 31 \( \mathrm { mm } \)로 싹의 길이가 거의 비슷하였다. 청국장의 제조 시 콩의 표면적이 넓으면 청국장의 발효가 효율적으로 진행될 것으로 생각되어 3종류의 흑두 중 콩의 알갱이가 적어 표면적이 넓은 서목태를 선정하여 이하의 실험을 행하였다. 발아 온도의 영향 발아 온도가 흑두의 발아율에 미치는 영향을 검토하여 Fig. 3에 나타내었다. 발아 온도가 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 인 경우는 48시간 발아시켜도 \( 2 \% \) 미만의 발아율을 나타내었으나, \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서는 발아 12시간째에 \( 50 \% \), 24시간째에도 약 \( 83 \% \), 48시간째에는 약 \( 95 \% \)의 발아율을 나타내었다. 그러나 발아 온도를 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 높였을 경우는 상온에서 발아시키는 것보다 발아율이 떨어져 48시간째에 각각 \( 75 \% \)와 \( 68 \% \)의 발아율을 나타내었다. 이상의 결과로 흑두의 발아 온도는 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 저온이나 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 고온에서보다 \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 상온에서 행하는 것이 적당한 것으로 생각되어졌다. 일반 성분의 변화 상온에서 발아시킨 서목태 싹의 길이가 흑두의 일반 성분 변화에 미치는 영향을 검토하여 Table 1에 나타내었다. 대조구는 발아시키지 않은 서목태를 사용하였다. 조단백과 조지방은 발아가 진행됨에 따라 그 함량이 약간씩 감소하여 싹의 길이가 \( 15 \mathrm { ~mm } \)일 때 각각 \( 23.7 \% \) 및 \( 12.9 \% \)의 함량을 나타내었다. 그러나 조회분은 \( 5.3 \sim 5.8 \% \), 조섬유는 \( 9.5 \sim 10.4 \% \)로 함량 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. Kim등은 우리나라 전통 콩의 이화학적 특성 연구에서 콩의 종류에 따라 조단백의 함량이 \( 38.7 \sim 46.3 \% \), 조지방의 함량이 \( 14.1 \sim 19.2 \% \) 및 조회분의 함량이 \( 4.2 \sim 5.0 \% \)로 보고하여 조단백 성분을 제외한 다른 성분은 본 연구의 결과와 비슷하였다. Kim 등의 장려 품종 콩의 이화학적 특성에서도 조단백의 함량이 \( 37.42 \sim 44.37 \% \), 조지방의 함량이 \( 19.49 \sim 21.17 \% \), 조회분의 함량이 \( 5.10 \sim 6.02 \% \) 및 조섬유의 함량이 \( 4.41 \sim 5.95 \% \) 로 조섬유의 함량을 제외하고 유사한 결과를 보였다.

청국장 제조 시 효율적인 발효를 위해 표면적이 넓은 흑두인 서목태를 이용한 실험을 진행하였다. 실험 결과, 흑두의 발아 온도는 10°C의 저온과 25°C의 고온보다는 18°C의 상온에서 가장 적절하다는 결론을 도출하였다. 또한, 발아 진행에 따라 조단백과 조지방 함량은 감소하였으나, 조회분과 조섬유 함량은 변화가 미미하였다. 본 연구 결과는 Kim 등의 연구 결과와 일치하여, 콩의 종류에 따라서도 이러한 변화가 나타나는 것을 확인하였다.

서 론 콩은 우리나라 전통 장류 발효식품의 주된 원료로 사용되어져 왔고 또한 식물류의 기능성 소재로서 양질의 단백질과 불포화지방산이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.그리고 최근의 연구에 의하면 콩 발효식품의 영양적 인자로 알려진 여러 종류의 물질들이 오히려 항암성, 항산화능 및 면역성 강화 등의 다양한 새로운 기능성을 가지는 것으로 보고되어 콩의 생리활성과 영양학적 중요성에 대한 많은 관심과 기대가 고조되고 있는 실정이다. 우리나라의 전통 콩 발효식품 중의 하나인 청국장은 간장,된장, 고추장과는 달리 전통장류 중 유일하게 소금을 첨가하지 않고 고온에서 속성으로 발효시킨 식품이기 때문에 전통적으로 콩을 수확한 뒤 늦가을부터 초봄 사이에 각 가정에서 손쉽게 제조하여 소금이나 마늘, 고춧가루 등을 섞어 절구통으로 찧어 단지에 다져 넣어 보관하면서 찌개의 재료로 사용하여 왔다. 그러나 그 제조방법은 정형화 된 것이 없고 경험에 의해서 전래된 방법대로 깨끗한 볏짚을 사용하여 삶은 콩을 따뜻한 아랫목에 덮어 두면 하룻밤 사이에 표면이 회백색이 되고 끈적끈적한 실이 나오면서 뜨워진다. 이와 같은 청국장은 된장보다 단백질과 지방이 많으나 소화흡수율은 오히려 높으며, 칼슘과 비타민 A, B의 중요한 공급원, 청국장균의 정장효과, 섬유질의 변비예방효과, 발암물질과 콜레스테롤의 체외 배출효과, 점질물(mucin)의 알코올 흡수에 의한 해장효과 등이 우수한 것으로 밝혀져 있다. 청국장에 대한 연구로는 발효과정 중 청국장의 성분변화, 발효미생물과 발효조건 및 원료 콩의 차이에 따른 청국장의 품질변화 , 세균학적 특성, 효소학적 특성 및 향기성분 등에 관한 보고 등은 다수 있으나 청국장을 제조할 때 콩의 생리활성 등을 보다 효율적으로 이용하기 위한 연구는 전무한 실정이기 때문에 본 연구자들은 활성화된 상태의 콩을 청국장의 재료로 이용하기 위하여 일반청국장 제조법을 약간 변형한 두아청국장의 제조방법을 시도하였다. 즉, 전통적인 청국장 제조는 콩을 냉수에 수침시켜 증자한 후 발효시키지만, 두아청국장은 수침한 콩을 균일하게 발아시킨 다음 증자한 후 적당한 온도에서 발효를 행하여 청국장을 제조하였다. 이와 같은 두아청국장 개발을 위한 기초 자료를 제공하고자 본 연구에서는 콩의 수침방법, 최적발아온도, 발아된 원료의 특성 및 isoflavone 함량 등을 검토하였다. 재료 및 방법 실험 재료 본 연구에서 사용한 콩은 2006년 가을에 수확한 흑태, 서리태 및 서목태의 3품종을 사용하였다. 이들 품종은 모두 경상대학교 자원식물환경학부 유전육종연구실에서 작물유전체 기능연구 및 바이오그린 사업연구비의 협조를 얻어 유전자 조작이 아닌 전통적인 유전·육종기술을 이용하여 육종된 콩 품종의 일부를 분양 받아 사용하였다.

콩은 우리나라 전통적인 장류 발효식품의 핵심 원료로서, 단백질과 불포화 지방산을 풍부하게 함유하고 있다. 최근의 연구에 따르면, 콩 발효식품은 항암, 항산화 및 면역 강화 등 다양한 기능성을 갖는 것으로 알려져 있다. 볏짚을 사용하여 콩을 삶고 덮어두면 뜨거워져 표면이 하얗게 변하고 끈적이는 실이 나온다. 청국장은 단백질과 지방이 많고, 소화 흡수율이 높아 비타민 A, B, 칼슘을 공급하며, 다양한 건강 효과를 가지고 있다. 본 연구에서는 콩의 수침 방법, 최적 발아 온도, 발아된 원료의 특성 및 isoflavone 함량 등을 조사하여 두아청국장 제조를 위한 기초 정보를 제공한다.

발아 조건 확립 흑두의 최적 발아조건을 확립하기 위하여 콩의 침지조건은 6시간 및 12시간 동안 냉수에 침지하여 발아 시키는 것과 3시간 침지한 다음 2시간 물빼기를 3회 반복한 후 일정온도에서 발아 시키는 조건에 대하여 검토하였다. 발아온도는 수침한 콩을 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } , 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \)(실온), \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 일정시간 발아시킨 후 발아율을 조사하였다. 발아는 빛이 들지 않고 배수가 용이한 용기에 담아 행하였다. 청국장의 제조 두아청국장의 제조는 콩을 선별, 세정 및 수침한 다음 발아시켜 싹의 길이가 \( 20 \mathrm { ~mm } \)정도 균일하게 성장하였을 때 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분 동안 증자하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 항온실에서 발효를 행하였다. 대조구인 전통청국장은 냉수에 콩을 12시간 수침시킨 후 물빼기를 하고 stainless steel에 담아 두아청국장 제조과정과 동일하게 발효시켰다. 그리고 제조한 청국장의 관능검사는 훈련된 패널원 5명을 통하여 각 생청국장을 검사하는 방법과 청국장 찌개(물 \( 500 \mathrm { ml } \)에 청국장 \( 50 \mathrm { ~g } \), 두부 \( 10 \mathrm { ~g } \), 소금 \( 3 \mathrm { ~g } \), 무 \( 10 \mathrm { ~g } \) )를 만들어 검사하는 2가지 방법을 사용하였다. 평가항목은 전자의 경우 색깔, 고유의 냄새 및 점질물의 형성에 대하여, 후자의 경우는 색깔, 구수한 맛, 이취 및 전체적인 선호도에 대하여 실시하였다. 평가방법은 4점 기호도 채점법 ( + 매우 싫다, + + 약간 싫다, + + + 약간 좋다, + + + + 매우 좋다)을 이용하였다. 이화학적 분석 콩 및 청국장의 일반성분인 조단백, 조지방, 조회분 및 조섬유는 상법에 준하여 분석하였다. 총산은 각 시료 \( 10 \mathrm { ~g } \)을 \( 250 \mathrm { ml } \) 삼각플라스크에 넣고 증류수 \( 90 \mathrm { ml } \)을 첨가하여 2시간 동안 교반한 다음 원심분리 \( (8,000 \times g, 10 \mathrm { ~min } ) \) 하여 상등액을 취한 후 그 상등액 \( 20 \mathrm { ml } \)에 증류수 \( 180 \mathrm { ml } \)을 첨가하여 페놀프탈렌용액을 2 3방울 떨어뜨린 다음 \( 0.1 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \)로 적정하여 초산함량으로 환산하여 계산하였다. \( \mathrm { pH } \)는 시료를 10배 희석하여 \( \mathrm { pH } \)meter로 측정하였다.

흑두의 최적 발아조건을 확립하기 위해 다양한 침지 시간과 온도 조건에서 실험을 수행하였으며, 두아청국장 제조에는 발아시킨 콩을 사용하였다. 발아된 콩은 증기에서 30분 동안 가열 후, 항온실에서 발효를 진행하였다. 제품의 조단백, 조지방, 조회분 및 조섬유 같은 일반성분은 표준방법에 따라 분석하였다.

효소 활성 Protease 활성측정을 위한 기질용액은 milk casein \( 1.8 \mathrm { ~g } \)을 sodium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 7.2) 300 \mathrm { ml } \)에 용해하여 사용하였다. 효소활성 측정은 조효소액 \( 1 \mathrm { ml } \)에 기질용액 \( 5 \mathrm { ml } \)을 넣고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10 분간 반응시킨 다음, \( 0.4 \mathrm { M } \) trichloracetic acid (TCA) \( 5 \mathrm { ml } \)을 넣어 30분간 방치하여 반응을 중지시켰다. 반응 중지액을 원심분리하여 얻은 상징액 \( 2 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.5 \mathrm { M } \) \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } 5 \mathrm { ml } \)와 1 / 3 농도로 희석한 foline phenol 시약 \( 1 \mathrm { ml } \)을 첨가하여 발색 시킨 후 \( 660 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 tyrosine \( ( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)의 양으로 나타내었다. Protease 1 unit는 조효소액 \( 1 \mathrm { ml } \)가 1 분간 \( 1 \mu \mathrm { g } \)의 trosine을 생성하는 효소의 양으로 나타내었다. \( \beta \)-Glucosidase 활성은 조효소액을 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 미리 활성화시켜 사용하였다. \( 5 \mathrm { mM } p \) - nitro-phenyl - \( \beta \) - D - glucopyranoside (sigma chemical Co., USA)를 함유한 \( 50 \mathrm { mM } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 6.0) \( 0.5 \mathrm { ml } \) 에 조효소액 \( 0.2 \mathrm { ml } \)를 가하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 sodium tetraborate 포화용액으로 반응을 중지시켜 유리되는 p-nitrophenol의 양을 \( 405 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성 1 unit는 1분 동안에 \( p \)-nitro-phenol 1 μmole을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. Glucoamylase 활성은 시험관에 \( 0.05 \mathrm { M } \)acetate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 4.8)에 \( 1 \% \)가용성전분을 녹인 기질용액을 \( 5 \mathrm { ml } \)와 조효소액 \( 1 \mathrm { ml } \)을 첨가 한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 반응 시키고 그 반응액 \( 1 \mathrm { ml } \)을 취하여 환원당량을 DNS법으로 측정하였다. 효소 활성 1 unit는 1분 동안에 \( 1 \mu \) mole의 glucose를 생산하는 효소량으로 나타내었다.

Protease, Glucoamylase의 활성을 측정하기 위한 다양한 시약과 버퍼를 사용하여 실험하였다. 이 중 Protease의 활성 측정을 위해 우유 카세인을 이용하였고, 반응 결과를 tyrosine의 양으로 표현하였다. Glucoamylase의 활성은 가용성 전분을 이용한 반응 후 DNS법으로 환원당량을 측정하여 나타내었다. 각각의 실험은 특정 온도와 시간에서 반응을 진행하였으며, 효소의 활성은 해당 조건에서 생산되는 특정 물질의 양으로 표현되었다.

효소 활성 발아된 서목태의 싹 길이가 여러 가지 효소 활성에 미치는 영향을 검토하여 Fig. 4에 나타내었다. Protease의 활성은 싹이 발아하여 성장함에 따라 그 활성은 점차 낮아져 싹의 길이가 \( 15 \mathrm { ~mm } \)일 때 0.48 unit를 나타낸 반면에 glucoamylase활성은 싹의 길이가 \( 0 \mathrm { ~mm } \)일 때는 \( 0.2 \) unit 이었으나 20 \( \mathrm { mm } \)일 때는 0.4 unit로 싹 길이가 성장함에 따라 효소활성이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 \( \beta \)-glucosidase활성은 발 아 콩의 싹 길이에 크게 영향을 반지 않는 것으로 나타났다. Isoflavone 함량 발아 싹의 길이가 콩의 대표적 생리활성 성분인 isoflavone 함량에 미치는 영향을 검토하여 Fig. 5에 나타내었다. 대조구는 발아하지 않는 서목태를 사용하였다. 대조구에서는 \( 134.2 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)이었으나 싹의 길이가 5, 10 및 \( 15 \mathrm { ~mm } \)까지 증가함에 따라 각각139.12,148.22 및 \( 149.37 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)으로 약간씩 증가하였다. 그러나 싹의 길이가 \( 20 \mathrm { ~mm } \)일 때는 \( 259.52 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)급격하게 증가하여 대조구보다 약 2배 높은 isoflavone 함량을 나타내었다. 이상의 결과로 두아청국장을 제조할 때 발아콩의 싹 길 이는 glucoamylase 및 \( \beta \)-glucosidase활성이 약간 높고, 그리고 isoflavone 함량이 가장 높게 나타난 \( 20 \mathrm { ~mm } \)일 때가 적당한 것으로 생각되었다. 두아 청국장의 제조 두아청국장의 특성을 검토할 목적으로 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 청국장을 제조한 다음 그 특성을 검토하여 Table 2에 나타내었다. 발효시간에 따른 각 성분의 함량 변화는 거의 일어나지 않았지만 조단백, 조지방 및 조섬유 함량은 전통 청국장 Chungkukjang A보다 두아 청국장(Chungkukjang B)에서 약간 높게 나타났다. 그러나 조회분의 함량은 \( 4.56 \sim 4.81 \% \)이었으며 \( \mathrm { pH } \)는 7.21 8.55 범위로 거의 비슷하였다. 본 연구의 결과는 Joo 등이 시판 청국장의 일반성분을 조사한 결과 조단백은 \( 11.99 \sim 22.5 \%, \mathrm { pH } 6.40 \) 7.27라고 보고한 내용 등과는 유사하였으나 조지방 함량이 \( 1.28 \sim 5.55 \% \)라고 보고한 내용과는 약간 상이하였다. 그러나 Yang 등의 청국장 분 말에서 조지방이 \( 15.3 \sim 16.3 \% \)로 보고한 결과와는 유사한 함량을 보였다.

발아된 서목태의 싹 길이가 20 mm일 때 glucoamylase, \(\beta\)-glucosidase 활성이 약간 높고 대표적 생리 활성 성분인 Isoflavone 함량이 최대가 된다. 두아청국장이 발효에 따른 성분 변화는 거의 없지만 전통청국장보다 조단백 ,조지방 및 조섬유,함량이 약간 높게 나타난다.

Isoflavone 분석 Isoflavone 분석은 동결건조 하여 분쇄한 시료 \( 1 \mathrm { ~g } \)에 0.1 N HCl \(2 \mathrm { ml } \)와 acetonitril (HPLC grade, 99.9%) \( 10 \mathrm { ml } \)를 첨가한 다음 실온에서 2 시간 교반한 후 여과지(No. 4)로 여과하여 그 여과액을 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)이하에서 진공농축 시켜 \( 80 \% \) meth-anol (HPLC grade, 99.9 \%) \( 10 \mathrm { ml } \)에 용해시킨 다음 \( 0.45 \mu \mathrm { m } \) membrane filter로 다시 여과하여 HPLC의 분석시료로 사용하였다. Isoflavone isomer 분석을 위한 HPLC (LC-10AD, Liquid Chlomatograph)의 칼럼은 YMC-pack ODS-AM-303 \( (5 \mu \mathrm { m } , 25 \mathrm { ~cm } \times 4.6 \mathrm { ~mm } \) i.d \( ) \)을 사용하였고, UV/VIS Detector 유속은 solvent \( 1 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \)로 하였다. 파장은 \( 254 \mathrm { ~nm } \)에서 3차 증류수의 \( 0.1 \% \) glacial acetic acid를 용매로 하여 \( 0.1 \% \) gla-cial acetic acid / acetonitrile linear을 이동상으로 하여 line-ar gradient법으로 분석하였다. Isoflavone의 표준품은 일본 후지코 주식회사에서 구입하여 사용하였다. 결과 및 고찰 흑두의 침지 조건 흑두를 발아시켜 청국장을 제조하는 두아청국장의 제조방법을 확립하기 위하여 먼저 흑두의 침지조건을 검토하였다. 냉수에 6시간 침지시킨 시험구의 발아율은 12시간째에 약 \( 1 \%, 24 \) 시간째에는 약 \( 5 \% \)정도를 나타내었으나 12시간 침지시킨 시험구에서는 발아 12시간째에 \( 30 \% \), 24시간째에는 \( 50 \% \)정도의 발아율을 나타내었다. 그러나 3시간 침지후 2시간 물빼기를 3회 반복한 시험구에서는 발아 12시간째에 \( 50 \% \), 발아 24 시간째에는 \( 80 \% \)정도의 높은 발아율을 나타내었다. 그리고 6시간 및 12시간 침지시킨 흑두의 싹 길이는 불균일하였지만, 3시간 침지 후 2시간 물빼기를 행한 시험구 의 싹 길이는 매우 균일하였다. 이상의 결과로 두아청국장 제조를 위한 콩은 3시간 침지 후 2시간 물빼기를 반복하는 것이 수분흡수량이 보다 효율적인 것으로 생각 되어졌다.

Isoflavone 분석은 동결건조 후 분쇄한 시료 1g에 0.1 N HCl 2ml와 acetonitril 10ml를 첨가해 실온에서 2시간 교반하고 여과지로 여과한 여과액을 30\(^\circ \mathrm{C}\) 이하에서 진공농축해 80% methanol 10ml에 용해시킨 후 0.45\(\mu\mathrm{m}\) membrane filter로 여과해 HPLC의 분석시료로 사용했다. 두아청국장의 제조방법을 확립하기 위해 흑두의 침지조건을 실험하니 콩을 3시간 침지 후 2시간 물빼기를 반복하는 것이 수분흡수량이 효율적인 것으로 나타났다.

관능 검사 본 연구에서 개발한 두아 청국장의 기호도를 평가하기 위하여 두아 생청국장에 대한 관능검사를 실시하여 Table 3에 나타내었다. 청국장의 발효가 종료된 직후에 실시한 생청국장의 관능검사 결과 색깔 및 점질물 생성은 대조구와 두아청국장이 거의 비슷하였지만 청국장 고유의 불쾌취는 오히려 두아 청국장에서 적게 발생하는 것으로 나타났다. 그리고 결과는 나타내지 않았지만 두아 청국장으로 찌개(물 \( 500 \mathrm { ml } \)에 청국장 \( 50 \mathrm { ~g } \), 두부 \( 10 \mathrm { ~g } \), 소금 \( 3 \mathrm { ~g } \), 무 \( 10 \mathrm { ~g } \) )를 만들어 실시한 관능검사에서도 거의 유사한 결과를 나타내었다. 이상의 결과로 콩을 발아시켜 제조한 두아 청국장의 경우 관능검사에서 대조구와 거의 유사한 결과를 나타내고 원료 콩에서 기능성 물질인 isoflavone 함량 등은 오히려 높게 검출되었기 때문에 두아청국장을 개발할 가치가 있는 것으로 생각되었다.이후의 연구는 개발한 두아 청국장의 생리활성 및 기능성 등의 깊이 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다. 요 약 콩의 기능성을 보다 효율적으로 이용할 목적으로 청국장을 제조할 때 콩을 약간 발아시켜 제조한 두아청국장의 개발조건을 검토하였다. 흑두의 침지조건은 3시간 침지 후 2시간 물빼기를 3회 반복한 시험구에서 발아 12 시간째에 \( 50 \% \), 발아 24시간째에는 \( 80 \% \)정도의 높은 발아율을 나타내었다. 흑두의 발아온도를 검토한 결과 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 저온이나 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 고온보다 \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 상온이 적당하였다. 발아 콩의 일반성분을 검토한 결과 조단백과 조지방은 발아가 진행됨에 따라 그 함량이 약간 감소하였으나 조회분은 \( 5.3 \sim 5.8 \% \), 조섬유는 \( 9.5 \sim 10.4 \% \)로 대조구와 거의 비슷한 함량을 나타났다. 발아 콩의 효소활성을 측정한 결과 protease의 활성은 싹이 성장함에 따라 그 활성이 약간 낮아졌으나 glucoamylase활성은 증가하였으며, \( \beta \)-glucosidase활성은 싹 길이에 크게 영향을 받지않는 것으로 나타났다. 그러나 isoflavone 함량은 싹의 길이 가 \( 20 \mathrm { ~mm } \)일 때는 약 \( 260 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)으로 급격하게 증가하여 대조구보다 약 2배 높은 함량을 나타내었다. 두아청국장의 기호도를 평가한 결과 청국장의 색깔 및 점질물 생성은 전통청국장과 거의 차이가 없었지만 청국장 고유의 불쾌취는 오히려 두아청국장에서 적게 발생하는 것으로 나타났다. 그리고 두아청국장으로 찌게를 만들어 실시한 관능검사에서도 거의 유사한 결과를 나타내었다.

본 연구에서는 두아 청국장의 기호도를 평가하기 위해 관능검사를 실시하여 색깔, 점질물 생성 등과 불쾌취 발생 정도가 대조구와 비슷하게 나타났다. 두아 청국장으로 찌개를 만들어 행한 관능검사 또한 비슷한 결과를 나타냈다. 두아 청국장의 원료 콩에서 기능성 물질인 isoflavone이 발효과정 중 합성되어 있음을 알 수 있었다.

재료 및 방법 국화분말을 첨가한 빵의 제조 본 실험에 사용한 국화는 2009년 경남 마산에서 수확한 백국(White Chrysanthemum morifolium Ramat)을 동결건조 후 \(100\mesh\)로 분쇄하여 밀가루 \( 100 \% \) 기준으로 국화분말을 \(0\sim 7 \% \)씩 각각 다르게 첨가하였고, Table 1 과 같은 원료의 배합조건으로 식빵을 만들어 사용하였다. 또 반죽공정은 직접반죽법 (straight dough method)에 따라 쇼트닝을 제외한 모든 재료를 믹서 볼에 넣고 저속 3분간 믹싱 후 클린업단계(clean up stage)에서 쇼트닝을 혼합하고 저속 2분간 믹싱한 뒤 중속으로 8분간 더 믹싱하고 고속에서 1분간 믹싱하여 신장성이 최대인 최종단계(final stage)까지 반죽을 완료하였다. 반죽의 온도는 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)로 맞추었고 1 차 발효 조건은 온도 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 80 \% \) 에서 60분간 발효 후 \( 180 \mathrm{~g} \)씩 분할하고 둥글리기 하여 실온에서 15분간 중간발효를 실시하였다. 중간발효가 끝난 반죽은 밀대를 이용하여 반죽 내 가스를 뺀 다음 정형하여 산 모양으로 팬닝(panning)하였다. 또 2차 발효는 온도 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 90 \% \) 조건에서 50분간 발효하여 윗불 \( 170^{\circ} \mathrm{C} \), 아랫불 \( 200^{\circ} \mathrm{C} \)로 예열된 오븐(Model FDO-7102, Dae Young Co., Korea)에서 35분간 구워 냉각 후 식빵용 포장지인 polyethylene (PE)필름 포장지를 이용하여 포장한 뒤 상온에 보관하며 실험에 사용하였다. 비용적 및 굽기 손실율 측정 식빵의 무게는 빵을 구운 후 실온에서 식힌 후 측정하였고 부피는 종자치환법으로 측정하였다. 각 시료는 3회 반복 측정 하였으며 빵의 비용적(specific volume)은 빵의 부피\(( \mathrm{ml} \))를 반죽의 무게 \( (\mathrm{g}) \)로 나눠 계산하였다. 굽기손실율은 다음의 식으로 계산하였다 굽기손실율 \( (\%)=(\) Dough weight \( (\mathrm{g})- \) Bread weight \( (\mathrm{g}) \)) / Dough weigh \( (\mathrm{g}) \times 100 \) 반죽의 물리·화학적 특성 측정 국화분말을 첨가한 빵의 \( \mathrm{pH} \)와 가용성 고형물함량은 빵 \(10 \mathrm{g} \)에 \( 90 \mathrm{ml} \)의 증류수를 첨가 후 Stomacher Lab Blender (400 cirulator, seward, England)로 \( 230 \mathrm{rpm} \), 30초간 균질화 시켜 \( \mathrm{pH} \) meter (Orion Research Inc., Boston, MA, USA)와 굴절계(Atago Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 각각 3회 반복 측정하였다. 빵의 경도는 Rheometer Compac-100 (Sun Scientific Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 Jung 등의 방법에 따라 측정하였다. 시료의 중심부를 \( 2 \times 2 \times 2 \mathrm{~cm} \)로 잘라서 평판에 놓고 지름 \( 3 \mathrm{~cm} \)의 구 probe로 누를 때 얻어지는 최대값의 힘을 5회 반복 측정하였다. Rheometer측정 조건은 최대하중 \( 2 \mathrm{~kg} \), table speed \( 60 \mathrm{~mm} / \mathrm{min} \)으로 하였다. 빵의 색도 또한 식빵을 \( 2 \times 2 \times 2 \)\( \mathrm{cm} \)로 잘라 색차계(Model JC801, Color Techno System Co.,Japan)를 이용하여 색도를 측정하고 L (Lightness), a (redness), b (yellowness) 값으로 나타내었다. 각각의 시료마다 5회 반복 측정하였으며, 표준 백판은 \( \mathrm{X} \)값 94.25, \( \mathrm{Y} \)값 96.06, \( \mathrm{Z} \)값 114.26 (\(\mathrm{L} \) 값 98.01, \(\mathrm{a}\)값 \( 2.27, \mathrm{b} \) 값 -1.13)이였다. 관능검사 국화분말의 첨가량을 달리한 식빵의 기호도 조사는 경남대학교 대학원생 15 명을 대상으로 실온에서 0,2,4일간 저장한 시료를 이용하여 각각 3회에 걸쳐 실시하였다. \( 0 \%, 3 \%, 5 \% \), \( 7 \% \) 국화를 첨가한 4가지 시료에 대해 식빵의 향(Flavor bal-ance), 경도(Hardness), 쓴맛 정도(Bitterness), 촉촉한 정도(Moistness), 종합적인 기호도(Overall acceptability)의 항목으로 관능검사를 Blind test로 실시하였다. 10점 척도법에 준하여 각 관능이 좋거나 강할수록 점수가 높고 나쁘거나 약할수록 낮은 점수를 주도록 하였다. 통계분석 통계분석은 Statistical Analysis System (SAS) package를 이용하여 분산분석을 실시하였고 각 시료간의 유의성 검증은 던컨의 다중 범위시험법(Duncan's multiple range test)을 사용하였다.

본 연구에서는 동결건조한 백국을 이용하여 국화분말을 식빵에 첨가하고 제조하였다. 반죽은 직접반죽법을 사용하여 쇼트닝을 제외한 재료를 믹서 볼에 넣고 세 단계로 믹싱하였다. 발효 조건은 온도 27°C, 습도 80%에서 60분 동안 1차 발효 후 분할 및 둥글기와 15분의 중간발효를 거친다. 국화분말을 첨가한 빵의 pH와 가용성 고형물함량은 Stomacher Lab Blender와 측정기를 사용하여 측정하였다. 통계 분석은 SAS 패키지를 사용하여 분산분석을 수행하였으며, Duncan의 다중 범위시험법을 사용하여 각 시료간의 유의성을 확인하였다.

결과 및 고찰 국화분말을 첨가한 빵의 반죽 및 제빵 특성 국화분말의 첨가는 빵의 반죽특성에 몇 가지 변화를 유도하였다. 국화분말을 첨가한 빵의 경우 무첨가 시료에 비해 제빵 시간이 9~23분 더 소요되는 것을 알 수 있었다. Table 2에서 보는 바와 같이 \( 5 \% \) 와 \( 7 \% \) 의 국화분말을 첨가한 시료의 1차 발효시간이 60분에서 75분으로 증가하였으며 2차 발효는 모든 첨가군에서 5분이 더 소요되었는데 이것은 국화분말의 첨가가 효모의 발효지연에 영향을 미친 것으로 판단된다. 또 굽는 과정에서도 첨가군 모두에서 5분이 더 소요되었는데 이러한 결과는 국화분말에 포함된 섬유소에 의해 수분 흡수율이 증가하였고 그로 인해 빵의 수분 보수력이 향상된 것으로 보인다. 그러나 Mixing time은 1~2분 짧아졌는데 이것은 국화분말 첨가량이 많아질수록 전체 밀가루의 함량은 적어지므로 결국 반죽에 포함된 gluten 함량의 감소에 의해 Mixing time이 짧아진 것으로 판단된다. 국화분말 첨가 빵의 부피, 무게, 비용적 및 굽기손실율 국화의 첨가량을 달리한 빵의 무게, 굽기손실율, 부피, 비용적은 Table 3과 같다. 국화분말의 첨가량이 증가할수록 빵의 무게가 증가하였는데 반죽의 무게가 일정한 것에 비해 빵의 무게는 증가함으로써 결국 굽기손실율이 감소하는 결과를 보였다. 반대로 부피의 경우 국화분말을 첨가할수록 감소하는 경향을 관찰할 수 있었는데 이는 국화분말의 첨가에 의해 나타나는 발효의 지연과 국화에 포함된 섬유소에 의해 수분 보수력이 증가하여 빵의 굽기과정 중에 나타난 수분의 손실감소가 원인인 것으로 추측된다. 따라서 비용적 또한 국화분말의 첨가량이 증가할수록 감소하는 경향을 보였다. 국화분말을 첨가한 빵의 저장 중 특성 변화 고형물함량과 경도의 변화 국화분말의 첨가에 따른 빵의 고형물함량의 변화는 거의 나타나지 않았지만 경도는 국화분말의 첨가량에 따라 증가하는 경향을 보였다. 저장기간에 따라 국화분말의 첨가유무에 관계없이 모든 시료에서 증가하는 경향을 보였고 특히 국화분말 첨가군의 경우 무첨가 시료에 비해 저장기간에 따른 경도의 증가가 더욱 컸다. 무첨가 시료의 경우에는 저장 4일째 가장 높은 경도를 보이다가 점차 감소하는 경향을 보인 반면 국화분말 첨가군의 경우 저장 6일째까지 증가하였다. 빵의 고형물함량에 차이가 없음에도 불구하고 경도의 차이가 나타나는 것은 빵의 부피가 감스할수록 경도가 높아진다는 사실과 일치하는 결과이다. \( \mathrm{pH} \)의 변화 국화분말의 첨가에 따른 빵의 \( \mathrm{pH} \) 변화는 무첨가 시료의 경우 \( \mathrm{pH} 5.63 \), 첨가군은 \( \mathrm{pH} 5.30 \)으로 국화분말의 첨가에 의해 \( \mathrm{pH} \)가 약 0.33정도 낮아지는 것을 확인하였다. 또 저장기간에 따라 \( \mathrm{pH} \)는 거의 변화없이 첨가군들의 \( \mathrm{pH} \)가 모두 낮게 유지되었다. 따라서 낮은 \( \mathrm{pH} \)는 미생물증식을 억제시키는 효과가 있으므로 빵의 저장 안전성에 도움이 될 것으로 생각된다. 또한 제빵의 특성을 고려해도 지친 반죽의 경우 \( \mathrm{pH} \)는 5.0 이하이고 어린 반죽은 6.0 이상이므로 국화분말의 첨가가 제빵에는 문제되지 않는 것으로 판단된다. 색도의 변화 국화분말의 첨가에 따른 빵의 색도변화는 Table 7과 같다. 색의 명도를 나타내는 \( \mathrm{L} \)값은 무첨가 시료가 80.78로 가장 높았고 \( 7 \% \) 첨가시료가 67.41로 가장 낮은 값을 보였다. 따라서 국화 분말의 첨가량이 많아질수록 빵의 명도는 감소하는 것으로 확인되었다. 또 적색도를 나타내는 \( \mathrm{a} \)값의 경우 무첨가시료가 -2.59, \( 7 \% \) 첨가시료가 -1.99로 점차 적색에 가까워지는 경향을 보였으며 황색도 \( \mathrm{b} \)값은 무첨가 시료보다 첨가군이 높아 국화분말의 첨가에 따라 황색에 가까워짐을 알 수 있었다. 그러나 저장기간에 따른 색도의 변화는 거의 나타나지 않았다. 국화분말을 첨가한 빵의 저장기간에 따른 관능 변화 국화분말의 첨가량을 달리한 빵의 관능검사는 Table 8에서 보는 바와 같이 식빵의 향(Flavor balance), 경도(Hardness), 쓴맛 정도(Bitterness), 촉촉한 정도(Moistness), 종합적인 기호도(Overall acceptability)에 대해 Blind test로 실시하였다. 그 결과 향과 경도, 그리고 촉촉한 정도는 모든 실험군에서 큰 차이를 보이지 않았으나 종합적인 기호도의 경우 무첨가 시료가 가장 우수한 값을 나타냈으며 국화분말의 첨가량이 많을수록 낮아지는 경향을 보였다. 또 저장기간이 경과함에 따라 모든 실험군의 종합적인 기호도는 감소하였는데 특히 국화분말의 첨가량이 적을수록 종합적인 기호도의 감소폭은 크게 나타났다. 따라서 빵에 국화분말을 첨가하는 것은 빵의 풍미를 유지하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

국화분말을 첨가하여 빵을 굽는 실험에서, 국화분말은 수분 흡수율을 증가시켜 빵의 수분 보수력을 향상시키고, 빵의 무게를 증가시켰다. 그 결과, 굽기 손실율은 감소하였다. 그러나 향, 경도, 촉촉함 등에는 큰 차이를 보이지 않았으며, 종합적인 기호도는 국화분말 첨가량이 많아질수록 낮아지는 경향을 보였다.

서 론 식생활의 형태가 서구화 내지는 편리한 식생활 패턴으로 변모되면서 주식대용으로 빵 소비가 크게 증가하게 되었고, 국민들의 건강에 대한 높은 관심으로 기능성이 부여된 제품에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다. 따라서 빵이 가지는 장점인 간편성과 맛뿐만 아니라 건강적인 측면까지 고려한 기능성이 첨가된 제품의 개발이 요구되고 있다. 최근에는 빵에 기능성 및 저장성을 부여하기 위해 다양한 식품소재의 사용이 시도되고 있는데 지금까지 발표된 연구결과들을 보면 당 알코올, 멍게껍질, 저항전분(resistant starch), 그리고 미강식이성섬유 등을 이용한 기능성 제품에 관한 연구가 있다. 또한 부추와 녹차가루를 이용한 연구, 신선초가루를 첨가한 식빵의 품질특성, 측백의 히노키티올 추출물의 효과, 미역과 다시마가루, 그리고 느타리버섯을 이용한 제품연구, 양파나 마늘분 등의 향신료를 첨가한 빵에 대한 연구 등이 있다. 그러나 예로부터 한방 및 민간요법에서 많이 이용되고 있으며 중국에서는 불로장생의 영약으로 귀하게 여겨줬고 현대에 와서는 국화차, 국화주 등의 제품에 원료가 되고 있는 국화를 첨가한 빵에 대한 연구는 지금까지 이루어진 바 없다. 국화는 쌍떡잎식물로 국화목 국화과에 속하며 중국이 원산으로 알려져 있으며 우리나라에는 중부 이남지역의 산간지에 널리 자생되고 있다. 또 산국과 소국으로 대별되어 전통식품의 천연향 및 천연색소 소재로써 널리 사용되어왔다. 최근 한방에서 산국의 꽃잎이 중추신경 진정작용, 혈압강화작용, 결핵 및 각종 바이러스에 대한 억제 효과 등이 있는 것으로 보고되었으며 주요 약리 성분으로 chrysnathemine, camphor 등이 밝혀져 있다. 또 국화에는 우수한 항균성분을 가지고 있다는 연구보.고가 있어 식품의 보존성을 높이는 천연보존제로써의 기능을 기대할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 빵에 국화분말을 첨가할 수 있는지에 대한 기초연구를 수행하기 위해 식빵에 \( 0 \%, 3 \%, 5 \%, 7 \% \) 의 국화분말을 첨가하여 반죽특성, 비용적 및 굽기 손실율, 고형물함량, 경도, \( \mathrm{pH} \), 색도, 관능검사 등을 실시하였다. 또 국화분말의 첨가가 빵의 품질유지에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 상온에서 8일간 저장하며 품질변화를 관찰하였다.

빵에 국화분말을 첨가할 수 있는지에 대한 기초연구를 수행하기 위해 식빵에 \( 0 \%, 3 \%, 5 \%, 7 \% \) 의 국화분말을 첨가하여 반죽특성, 비용적 및 굽기 손실율, 고형물함량, 경도, \( \mathrm{pH} \), 색도, 관능검사 등을 실시하였으며 또 국화분말의 첨가가 빵의 품질유지에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 상온에서 8일간 저장하며 품질변화를 관찰하였다.

서 론 파(Allium fistulosum)는 우리나라에서 식용으로 널리 사용되고 있는 백합목 백합과의 여러해살이풀로서, 파의 뿌리 부분은 특히 한의학에서 총백이라 불리며 맵고 따뜻한 성질을 가져 감기를 치료하는 데 사용되어져 왔다. 일반적으로 파는 칼슘과 비타민을 풍부하게 함유하고 있으며, 특히 파의 매운 향을 내는 황화아릴 성분은 소화를 돕고 장을 튼튼하게 하는 강장작용을 가진 것으로 알려져 있다. 또한 최근 연구에 따르면 파는 항산화작용을 포함하여 항혈액응고, 항콜레스테롤, 항균작용 및 혈당 강하 작용 등을 가지고 있음이 보고되었으나, 파 추출물의 염증에 관한 효과는 아직 연구가 미비한 실정이다. 염증 반응은 외부 자극에 대한 생체의 정상적인 방어 기작으로서 발생 위치에 따라 관절염, 천식, 염증성 장질환 및 동맥 경화 등과 같은 여러 가지 질병의 유발 원인이 된다. 특히 중추신경계(central never system, CNS) 내의 염증은 뇌에 존재하는 세포에 의해 일어나거나 혹은 말초로부터 면역세포가 침투함에 따라 일어나는데, CNS의 염증반응에 관여하는 대표적인 세포로서 microglia가 있다. Microglia의 활성화는 다양한 약물이나 독소에 의해 유발되어 이물질을 제거하고 신경성장 인자를 분비하여 신경세포 보호 및 CNS의 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 그러나 microglia의 활성화가 기본적으로 긍정적인 치유 과정임에도 불구하고, 활성화 상태가 너무 오래 지속되거나 과도하게 활성화될 시에는 진행성 염증반응을 일으켜 nitric oxide \((\mathrm{NO})\), prostaglandin \(\mathrm{E}_{2}\) \((\mathrm{PGE}_{2})\), tumor necrosis alpha \((\mathrm{TNF}-\alpha)\), interleukin-1\(\beta\)(IL-1\(\beta\)) 및 interleukin-6 (IL-6) 등과 같은 염증성 매개인자 및 염증성 cytokine과 reactive oxygen species (ROS) 등을 배출함으로써 신경 독성을 유발하고 뇌실질 조직을 파괴함으로서, 알츠하이머 치매, 파킨슨씨 병 및 크로이펠츠-야콥병과 같은 신경퇴행성 질환의 원인이 됨과 동시에 이러한 환자들의 병소에서 활성화된 microglia가 축적되어 있음이 보고되고 있다. 염증 산물인 \(\mathrm{NO}\)와 \(\mathrm{PGE}_{2}\)는 각각 in-ducible \(\mathrm{NO}\) synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)에 의해 만들어지므로 이들 염증성 유전자와 그 산물을 효과적으로 조절하는 것이 신경염증 조절뿐만 아니라 신경퇴행성 질환의 치료에 중요한 표적으로 인식되고 있다. 본 연구에서는 immortalized 된 mouse microglia BV2 세포에 lipopolysaccharide (LPS)를 이용하여 인위적인 활성화 및 염증반응을 일으킨 후 다양한 파 추출물이 염증 저해 활성을 보이는지 조사하였다. 그 결과 파 추출물이 iNOS, COX-2 및 염증성 cytokine의 발현과 그 최종 산물을 조절함으로써 신경 염증 반응을 효과적으로 억제할 수 있을 가능성을 관찰하였기에 이를 보고하는 바이다.

파는 칼슘과 비타민을 풍부하게 함유하고 항산화작용 및 항혈액응고, 항콜레스테롤, 항균작용 및 혈당 강하 작용 등을 가지며, 파 추출물이 신경 염증 반응을 효과적으로 억제할 수 있는 염증 저해 활성을 보인다.

고 찰 Microglia는 CNS에 존재하는 면역세포로서 다양한 약물이나 독소에 의해 활성화되어 이물질을 제거하고 면역기능을 나타내므로 신경세포를 보호하고 CNS의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 그러나 microglia가 과도하게 활성화 될 경우 진행성인 염증반응을 일으켜 \(\mathrm{NO}\), \(\mathrm{PGE}_{2}\), 전구염증 cytokine 및 ROS 등을 배출하며, 이러한 인자들은 microglia 매개 신경 독성을 유발한다고 알려져 있다. 염증성 반응과 연관된 과도한 \(\mathrm{NO}\)와 \(\mathrm{PGE}_{2}\)를 생성하는 효소로서 iNOS와 COX-2가 가장 중요한 표적 유전자인데, iNOS는 세포질 안에서 여러 단계를 거쳐 \(\mathrm{NO}\)를 생성하며, COX-2는 prostanoids인 prostaglandins, prostacyclin 및 thromboxanes 등의 합성을 촉진하여 염증반응을 유도하는 핵심 인자로서 작용한다. 병리학적 측적에서 iNOS와 COX-2는 다양한 CNS의 외상과 질병 연관 조직에서 과다하게 발현되어 있으며, 특히 신경교증(gliosis) 및 파킨슨씨 병의 흑질 내 glia 세포에서 발현이 동시에 증가되어 있음이 보고되어 있다. 또한 LPS를 처리한 마우스 뇌의 microglia에서 iNOS와 COX-2가 동시에 과발현된다는 보고 등 은 다양한 in vitro 실험에서 LPS는 microglia를 활성화시켜 염증반응 및 신경독성을 유발하는 자극원으로 사용될 수 있음을 의미한다. 몇 가지 선행 연구에서 iNOS와 COX-2의 저해제가 LPS로 유도한 신경독성에 대해 보호 효과를 보인 바, microglia에서 iNOS 및 COX-2의 발현을 효과적으로 저지하는 것이 염증성 cytokine의 생성 억제와 함께 신경염증과 신경퇴행성 질환의 치료와 예방을 위한 일반적인 접근 방법으로 인식되고 있다. 본 연구에서는 BV2 세포에 LPS를 처리하여 인위적으로 염증반응을 유도시킨 후 4가지 종류의 파 추출물의 염증 저해활성 효과를 비교하였다. 이를 위하여 파의 전체 및 뿌리 부분을 각각 열수 및 에탄올 추출물을 사용하였으며, 먼저 각 파 추출물 및 LPS의 단독 처리 혹은 복합 처리에 의해 세포독성을 나타내지 않는 조건을 설정하였고, 동일 조건에서 파 추출물이 LPS에 의해 유도된 염증 매개 인자인 iNOS와 COX-2의 발현 증가를 억제할 수 있는지를 조사하였다. Fig. 2 및 3에 제시된 바와 같이 본 실험에 사용된 파 추출물은 추출물의 종류에 따라 다소의 차이는 있었지만, 전반적으로 LPS에 의해 유도된 iNOS 및 COX-2의 발현을 매우 억제하였음을 확인할 수 있었다. 아울러 iNOS의 발현 증가데 대한 반응 산물인 \(\mathrm{NO}\)의 생성 억제 효과를 조사한 결과에서도, 파 추출물은 전반적으로 처리 농도 의존적으로 LPS에 의한 \(\mathrm{NO}\) 의 생성을 유의적으로 차단시켰으며, 이는 전사 및 번역 수준에서 iNOS의 발현 억제 효과와 연관성이 있었음을 알 수 있었다. 다음은 파 추출물의 염증성 cytokine의 발현 및 반응 산물의 억제 효과를 조사하기 위하여 동일 조건에서 LPS에 의해 유도된 TNF-\(\alpha\), IL-1\(\beta\) 및 IL-6의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. Fig. 5의 결과에 제시한 바와 같이, 조사된 4종류의 파 추출물 은 LPS에 의해 유도된 3가지 종류의 cytokine의 발현을 전사 수준에서 효과적으로 억제하였음을 알 수 있었다. 이러한 전사 수준에서의 염증성 cytokine의 발현 저하가 cytokine의 생성 억제와 연관성이 있는지의 여부를 조사한 결과, TNF-\(\alpha\)의 생성 억제에 전체 열수 추출물(WERA)이 유의적인 효과를 보였지만, 나머지 파 추출물에 대한 효과는 전사 수준에서의 발현 억제 효과에 비하여 다소 미비하게 나타났다. 이러한 파 추출물의 염증성 cytokine 발현의 전사 수준 억제 효과와 cytokine의 생성 억제 효과가 다소 다르게 나타난 가능성으로 해당 cytokine 유전자들의 전사 후 번역 과정에서의 조절 및 다른 신호 전달계들과의 상호 작용 여부 등을 생각할 수 있겠지만, 파 추출물이 iNOS와 염증성 cytokine의 증가를 억제하는 경향성은 분명하였으며, 4가지의 파 추출물 중에서는 파 전체 에탄올 추출물(EEWA)이 가장 탁월한 항염증 효과를 보였다. 본 연구에서 사용된 파 추출물의 염증 억제 작용에 관한 추가적인 연구의 수행과 활성형 분획의 선별과 후보물질의 동정 등에 관한 연구가 추가로 이루어져야겠지만, 본 연구의 결과는 파 추출물이 CNS의 면역세포인 microglia의 과도한 활성화로 인한 신경염증 작용을 차단함으로써 항염증 효과 및 신경 보호 효과를 지닐 수 있음을 보여 주는 것이다.

Microglia는 중추신경계의 면역세포로, 다양한 약물과 독소에 반응해 이물질을 제거하며 신경세포를 보호하고 항상성을 유지하는 핵심 역할을 한다. 병리학적 관점에서 보면, iNOS와 COX-2는 CNS의 손상 및 질환과 연관된 조직에서 과발현되는데, 이는 특히 신경교증과 파킨슨 병의 흑질 내 글리아 세포에서 동시에 증가하는 현상이다. iNOS와 COX-2를 억제하는 약물이 신경독성에 대한 보호 효과를 보였으며, 이로 인해 iNOS와 COX-2의 발현을 저지하는 것이 신경염증과 신경퇴행성 질환 치료 및 예방에 대한 일반적인 접근법으로 인식되고 있다. 이 연구에서는 파 추출물이 microglia의 과도한 활성화로 인한 신경염증을 차단하고, 따라서 항염증 및 신경 보호 효과를 지니는 가능성을 보여주었다.

결 과 파 추출물의 BV2 세포에 대한 세포독성 여부 다양한 파 추출물이 BV2 세포에 독성을 나타내지 않는 조건에서 항염증효과를 조사하기 위해 준비된 파 추출물을 각각 단독 처리한 후 MTT assay를 먼저 실시하였다. Fig. 1A에 나타난 바와 같이 파 추출물 처리 24시간 후 WEWA, EEWA 및 WERA 처리군에서는 \(250\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)까지, EERA 단독 처리군에서는 \(40\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)까지는 BV2 세포가 각각 \(90\%\) 이상의 생존율을 보였으나, 그 이상의 처리 농도에서는 처리 농도 의존적으로 세포독성을 나타내었다. 이상의 결과를 바탕으로 WEWA, EEWA 및 WERA 처리군은 \(250\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)을, EERA 처리군은 \(40 \mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)을 최고농도로 선정하여 몇 가지 농도별로 1시간 선처리한 후 LPS \((500\mathrm{ng}/\mathrm{ml})\)를 처리하여 24시간 경과 후에 생존율을 측정하였다. Fig. 1B의 결과에서 알 수 있듯이 각 추출물의 최고 농도와 LPS를 동시에 처리하여도 생존율이 \(90\%\) 이상으로서 BV2 세포에 대한 독성을 나타내지 않았기에 이를 항염증효능 실험 조건으로 선정하였다. LPS로 유도한 BV2 세포의 iNOS 및 COX-2 발현 증가에 미치는 파 추출물의 영향 이상에서 설정된 조건에서 LPS 처리에 의하여 활성화된 BV2 세포에서 파 추출물의 항염증 효과를 조사하기 위하여 LPS에 의해 유도된 대표적인 염증 매개 유전자인 iNOS와 COX-2의 발현에 미치는 파 추출물의 영향을 전사 및 번역 수준에서 조사하였다. 그 결과 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2 유전자의 mRNA 및 단백질 발현이 전체적으로 파 추출물의 처리 농도 의존적으로 감소되었는데, iNOS 발현 억제의 효과는 EEWA 처리군과 EERA 처리군에서 강하게 나타났으며, COX-2 발현의 경우 WEWA 처리군과 EERA 처리군에서 효과적으로 억제시켰음을 알 수 있었다. 아울러 EEWA 처리군은 iNOS의 발현을 현저히 억제한 반면에 COX-2의 억제능은 비교적 낮게 나타났으며, WERA 처리군은 mRNA 수준에서는 두 유전자의 발현을 억제하였으나 단백질수준에서의 억제능은 다소 약하게 나타났다. 따라서 파 추출물의 종류에 따라 정도의 차이는 있지만, 파 추출물이 iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 억제함으로서 항염증효능이 있을 것임을 알 수 있었다. LPS로 유도된 BV2 세포의 \(\mathrm{NO}\) 생성 증가에 미치는 파 추출물의 영향 이상의 결과에서 관찰된 파 추출물의 iNOS 발현 억제 효능이 iNOS의 반응 산물인 \(\mathrm{NO}\)의 생성 억제와 연관되어 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 파 추출물을 각각 단독 처리하거나 1시간 선처리한 후 LPS를 처리하여 \(\mathrm{NO}\) 생성량을 측정하기 위하여 Griess assay를 실시하였다. 그 결과는 Fig.4 에 나타난 바와 같이 LPS 처리 후 현저히 증가했던 \(\mathrm{NO}\)의 생성량이 파 추출물 처리에 의해 처리 농도 의존적으로 감소되었는데, 특히 EEWA 처리군에서는 거의 대조군 수준까지 감소하여 가장 탁월한 효과를 보였다. 아울러 WEWA와 EERA 처리군은 비슷한 수준의 \(\mathrm{NO}\) 생성 억제 효과를 보였으며, WERA 처리군의 효과가 상대적으로 적게 나타났으며, 이러한 결과들은 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현 억제 수준과 그 경향성이 유사하였다. LPS로 유도된 BV2 세포의 염증성 cytokine 발현 증가에 미치는 파 추출물의 영향 다음은 microglia가 활성화되었을 때 분비되는 대표적인 염증성 cytokine인 TNF-\(\alpha\), IL-1\(\beta\) 및 IL-6의 발현에 미치는 파 추출물의 영향을 조사하였다. Fig. 5 의 결과에서 알 수 있듯이 LPS 처리에 의하여 조사된 3 가지 cytokine의 발현이 전사 수준에서 모두 증가되었으나, 파 추출물 처리에 의하여 전체적으로 감소되는 경향성을 보였다. 특히 IL-1가 4 가지 파 추출물 처리에 의해 3 가지 유전자의 발현을 가장 현저하게 감소시켰으며, IL-6은 파 뿌리 추출물인 WERA와 EERA에 의해서만 감소하는 경향을 보였다. 그리고 TNF-a 발현의 경우 WEWA 처리군에서 약간 감소하였으며, 다른 파 추출물에 의해서 억제되는 효과가 약하게 나타났다. 그러나 전반적으로 LPS로 유도된 전구염증 cytokine의 mRNA 수준을 억제하는 경향을 보여 파 추출물이 iNOS 및 COX-2와 함께 cytokine들의 발현 억제를 통하여 염증반응을 억제할 수 있을 가능성을 보여주었다. LPS에 의하여 증가된 BV2 세포의 TNF-\(\alpha\) 및 lL-6 생성에 미치는 파 추출물의 영향 Fig. 5 에서 관찰된 파 추출물의 염증성 cytokine의 발현 억제 효과가 cytokine의 생성 억제 효과와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 동일 조건에서 배양된 BV2 세포에서의 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 양적 변화를 조사하였다. 먼저 TNF-\(\alpha\) 생성의 경우, Fig. 5A에 나타낸 바와 같이 LPS 처리에 의하여 증가된 TNF-\(\alpha\) 생성이 EEWA 처리에 의하여 유의적인 감소를 보였고, WEWA와 EERA 처리군에서도 TNF-\(\alpha\) 생성량을 다소 감소되었으나 통계적으로 유의할 수준은 아니었다. IL-6의 경우도 LPS 단독 처리에 의하여 매우 증가되었으며, 파 추출물의 처리에 의하여 부분적으로 감소되었으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었다. 이들 결과는 Fig. 5 에서 보여준 TNF-\(\alpha\) 와 IL-6의 mRNA 발현 변화와는 다소 차이가 있었음을 알 수 있었는데, EERA 처리군에서 TNF-\(\alpha\)의 mRNA는 큰 변화가 없었으나 실제 TNF-\(\alpha\)의 생성은 감소하였다는 점과, WERA 처리군에서 IL-6의 mRNA 수준은 감소하였으나 실제 IL-6의 생성은 오히려 다소 증가하였다는 점 등이다. 이들은 유전자의 발현 과정에서 전사 후 번역 과정이나 번역 후 조절 과정에서 변화가 생겼을 것으로 추측되며, 이에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

파 추출물이 독성을 나타내지 않는 조건에서 준비된 파 추출물을 각각 단독으로 처리한 후 MTT assay를 항염증효과를 조사하기 위하여 우선적으로 실험을 수행하였다. 각 추출물의 최고 농도와 LPS를 동시에 처리한 결과, 생존율이 \(90\%\) 이상으로서 BV2 세포에 대한 독성을 나타내지 않았기 때문에 이를 항염증효능 실험 조건으로 선정하였는데 이를 통하여 파 추출물이 iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 억제하면서 항염증효능이 있을 것임을 알 수 있었다. 또한, WEWA와 EERA 처리군은 비슷한 수준의 \(\mathrm{NO}\) 생성 억제 효과를 보였으며, WERA 처리군의 효과가 상대적으로 적게 나타났으며, 이러한 결과들은 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현 억제 수준과 그 경향성이 유사하였는데, 전사 후 번역 과정과 번역 후 조절 과정에서 유전자의 발현 과정에서의 변화가 생겼을 것으로 예상되어지며, 이에 대하여 지속적으로 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료되어진다.

재료 및 방법 실험 재료 본 실험에 사용된 파(A. fistulosum) 추출물은 인제대학교 식품영양학과에서 공급받았으며, 세포 배양에 사용된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fatal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. mRNA 발현 분석을 위해 사용된 primer (Bioneer, Taejeon, Korea)는 Table 1에 표기하였으며, 단백질 발현 분석에 쓰인 모든 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 사용하였고, anti-rabbit 및 anti-mouse 2차 항체는 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 별도 표기하지 않은 모든 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 세포 배양 본 실험에 사용된 BV2 세포는 인제대학교 의과대학 면역학 교실로부터 제공받아, DMEM 배지에 \(10\%\mathrm{FBS}\)와 \(1\%\) penicillin-streptomycin을 첨가하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \( 5\% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. 모든 실험에서 BV2 세포는 다양한 파 추출물을 각각 1시간 선처리한 후 LPS \((500\mathrm{ng/ml})\)를 처리하여 24시간 배양하였다. MTT assay에 의한 세포독성 조사 세포 배양용 6 well plate에 BV2 세포를 \(6\times 10^{5}\mathrm{cells/well}\)로 분주하여 24시간 안정화시킨 후, 파 전체 열수 추출물(water extract from the whole A. fistulosum, WEWA), 파 전체 에탄올 추출물(ethanol extract from the whole A. fistulosum, EEWA), 파 뿌리 열수 추출물(water extract from the root of A. fistulosum, WERA) 및 파 뿌리 에탄올 추출물(ethanol extract from the root of A. fistulosum, EERA)을 각각 농도별로 1시간 선처리 후 LPS를 후처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 배지를 모두 제거하고, tetrazolium bromide salt (MTT)를 \(0.5\mathrm{mg/ml}\) 농도로 희석하여 well 당 \(1\mathrm{ml}\) 씩 분주하였다. 2시간 배양 후 상층액을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)로 formazin을 모두 용해시켜 96 well plate에 \(200\mathrm{\mu l}\) 씩 옮긴 다음 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다. RT-PCR에 의한 mRNA의 분석 상기와 동일 조건에서 배양된 세포를 모아서 TRIzol re-agent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)에 lysis 시켜 total RNA를 분리하고, 정량을 통해 동량의 RNA를 준비한 후 iNOS, COX-2, TNF-\(\alpha\), IL-\(1\beta\), IL-6 및 glyceraldhyde-3-phos-phate dehydrogenase (GAPDH)의 primer, EPC water, ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 각각 혼합하여 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)로 증폭시켰다. 그 후 \(1\%\) agarose gel에 ethidium bromide (EtBr)를 첨가하여 굳힌 다음, 각 sample을 동량 loading하여 \(100\mathrm{~V}\)에서 전기영동시킨 후, UV 하에서 mRNA 발현의 차이를 비교하였다. Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석 준비된 세포들을 모아서 lysis buffer [\(25 \mathrm{mM}\) Tris-Cl (\(\mathrm{pH} 7.5\), \(250\mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(5\mathrm{mM}\) EDTA, \(1\%\) NP-40, \(1\mathrm{~mM}\) pheny-methylsulfonyl fluoride (PMSF), \(5\mathrm{~mM} \) dithiothreitol (DTT)]에 1시간 가량 lysis시켰다. 그 후 Bio-rad 단백질 정량 시약과 그 사용방법을 따라 정량 후, Laemmli sample buffer (Bio-rad)를 동량으로 섞어 SDS-polyacrylamide gel에 loading한 후 \(90\mathrm{~V}\)로 전기영동으로 분리하고, electroblotting을 통해 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 옮긴 다음, \(5\%\) skim milk로 1시간 동안 blocking하고 \(4^{\circ} \mathrm{C}\)에서 1차 항체를 붙여 1시간 이상 반응시켰다. 그 후 PBS-T로 수차례 세척하고 상온에서 1시간 동안 2차 항체를 붙인 후 다시 PBS-T로 세척하고 암실에서 Enhanced Chemilunimoecence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp.)에 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켰다. NO의 측정 Griess assay를 통하여 \(\mathrm{NO}\) 생성량을 측정하였다. 이를 위해 세포 배양용 6 well plate에 상기한 방식으로 세포를 배양한 후, 각 well에서 상층액을 \(100\mathrm{\mu l} \)씩 회수하여 각각 Griess reagent [\(1\%\) sulfanilamide, \(0.1\%\) N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride, \(2.5 \%\) \(\mathrm{H}_{3}\mathrm{PO}_{4}\)] \(100\mathrm{\mu l}\)와 혼합하여 96 well plate에 분주하였다. ELISA reader \((540\mathrm{~nm})\)를 사용하여 흡광도를 측정한 후, sodium nitrite \((\mathrm{NaNO}_{2})\)의 standard curve를 바탕으로 \(\mathrm{NO}\) 농도를 계산하였다. Cytokine의 측정 세포 배양용 6 well plate에 상기한 방식으로 세포를 배양한 후, 각 well에서 상층액을 회수하였다. 상층액 내 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 양은 각각 R&D System Inc (Minneapolis, MN, USA)에서 구입한 Fluorokine MAP Mouse IL-6 kit와 Fluorokine MAP Mouse TNF-\(\alpha\) kit를 사용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음, ELISA reader로 흡광도를 측정한 후 standard curve를 바탕으로 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 생성량을 계산하였다. 통계 처리 모든 실험결과는 평균\(\pm\)표준편차로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student \(t\)-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.

BV2 세포를 \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \( 5\% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 DMEM 배지에 \(10\%\mathrm{FBS}\)와 \(1\%\) penicillin-streptomycin을 첨가하여 배양하고, LPS \((500\mathrm{ng/ml})\)를 처리하여 24시간 배양하여 mRNA 발현 분석과 단백질 발현 분석을 수행하였다. MTT assay에 의한 세포독성 조사, RT-PCR에 의한 mRNA의 분석, Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석, NO 농도 및 Cytokine를 측정하였다.

서 론 최근 우리나라는 생활의 변화로 동물성 포화지방, 고칼로리 식품의 섭취 등 지방 섭취량이 증가함에 따라 고콜레스테롤, 성인병, 동맥경화, 고혈압 등 순환기계 질환이 점차 증가되고 있는 추세다. 뿐만 아니라 순환기계 질환이 한국인 사망원인의 30% 이상을 차지하고, 주요 위험인자인 고지혈증 또한 빠른 속도로 증가하고 있으며, 심혈관계 질환에서는 혈중 콜레스테롤, 중성 지질의 증가 및 지단백 함량의 변화와 같은 비정상적인 지질대사가 문제시 되고 있다. 질환의 발병 원인은 지질대사 이상으로 나타나게 되는데, 그중에서 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 뿐만 아니라 고 탄수화물식이로 인한 당질유도성 고 중성지질혈증(hypertriglyceridemia)으로 유발된다는 보고가 있다. 혈중 콜레스테롤의 농도 조절은 콜레스테롤의 흡수, 생합성, 담즙산으로의 합성과 배설, 조직으로의 분배 등 복합적인 기전들의 상호작용에 의하여 이루어진다.식사로부터 섭취된 콜레스테롤은 간으로 운반된 후 일부는 담즙산을 형성하며 담즙산은 소장으로 분비되어 지방을 유화시켜 소화를 촉진하고 다시 간으로 흡수되는 장간순화를 하며, 또한, 지방 분해산물과 콜레스테롤의 유화 는 담즙산의 생리적 기전이며, 이 담즙산 pool은 담즙산의 장간 재순환과 콜레스테롤 전구체로부터 담즙산의 합성에 의해 만들어진다. 이는 담즙산이 콜레스테롤로부터 합성되는 물질로서 체내 콜레스테롤이 체외로 배설되는 유일한 경로이다. 콜레스테롤 대사 과정 가운데 간의 콜레스테롤을 제거하기 위한 담즙합성을 위해 포합 빌리루빈 및 UDP-glucuronyl transferase (UDP-GT) 활성이 증가되고 콜레스테롤의 이용을 증가시켜 조직과 혈중의 콜레스테롤을 저하시키는 기능으로 본다. 울금(Curcuma longa L, tumeric)은 우리나라에서 예로부터 고지혈증의 민간요법에 쓰이는 약재로, 원산지는 인도, 중국 및 일본 등으로 생강과의 다년초로서 고온다습한 남부 아시아, 아프리카 및 중남미에 자생하고 있다. 울금의 대표적인 성분인 커큐민(curcumin)은 고지혈 모델에서 담즙분비 촉진을 통하여 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시키는 것으로 보고되었다. 최근 울금에 대한 여러 연구가 활발히 이루어지고 있는데 이와 관련된 보고로는 명일엽과 울금 추출물의 투여가 고콜레스테롤 식이와 P-407로 유도한 고지혈증쥐의 혈중 지질대사 효과가 우수함을 보고 하였으며, 발효울금의 투여가 마우스의 간 기능 및 혈중 지질함량에 혈중지질을 효과적으로 개선하였다는 연구 등이 보고되고 있다. 또한, 울금의 활성 성분인 커큐민은 콜레스테롤 수치를 감소시키며, 담즙분비를 촉진시키고, 콜레스테롤의 생합성에 관여하는 squalene synthase 억제작용 및 간에 축적된 콜레스테롤 수치를 저하시킨다고 알려졌으나, 울금과 관련되어 UDP-glucuronyl transferase (UDP-GT) 활성과 담즙산의 함량에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 울금의 지질대사 개선효과를 입증하고자 고지방 및 고콜레스테롤 식이를 공급한 흰쥐에게 울금 분말을 공급한 후, 체내 혈청 및 분변에서의 지질 함량, 간조직의 UDP-glucuronyl tranferase 활성 및 bile acid 함량 측정을 통하여 울금의 지질대사 효과를 규명하고자 하였다.

동물성 포화지방과 고칼로리 식품 섭취 증가로 인해 우리나라의 순환기계 질환 유병률이 증가하는 가운데, 혈중 콜레스테롤 농도는 복합적인 기작을 통해 조절된다. 이 중 간에서 콜레스테롤을 제거하는 과정인 담즙합성은 포합 빌리루빈 및 UDP-GT 활성 증가와 연결되어 있다. 본 연구는 고지방 및 고콜레스테롤 식이를 섭취하는 흰쥐에게 울금 분말을 공급하여, 울금의 지질대사 효과를 조사하였다. 조사는 혈청 및 분변에서의 지질 함량, 간조직의 UDP-GT 활성 및 담즙산 함량 측정을 통해 이루어졌다.

간조직의 총지질, 중성지방 및 총콜레스테롤 함량 측정 간조직의 지질성분을 관찰한 결과는 Table 4와 같다. 간조직의 총 지질함량을 관찰한 결과 고지방 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말 공급군 모두에서 감소하였고, 특히 TPB군에서는 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 중성지질의 함량은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였고, 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말 공급군 모두에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 콜레스테롤 함량에서 는 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 감소하였고, 울금 분말을 공급한 모든군에서는 고지방 · 고콜레스테롤에 비해 감소하였으나 유의적인 차이는 없었다. 일반적으로 지방 또는 콜레스테를의 섭취에 의해 간 조직에서 지질대사의 이상이 초래되어 지질의 침착에 의해 간의 무게가 증가하고 간에서의 지질과 콜레스테롤 함량이 증가한다는 여러 연구에서와 같이 고지방 · 고콜레스테롤로 유도된 비만 쥐에서 울금 분말의 공급은 지질의 흡수를 지연 시키거나 억제하여 지질대사의 개선에 효과적으로 작용했을 것으로 사료되어진다. 분변의 총콜레스테롤 및 중성지방 함량 Table 5는 분변의 총콜레스테롤 및 중성지질의 함량을 나타낸 결과이다. 분변의 총 콜레스테롤 함량은 고지방 · 고콜레스테롤에서에 비해 울금 분말을 공급한 군에서는 증가되 었으나 그 차이는 다소 적었다. 중성지방의 함량 또한 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 증가되었고, 울금 분말을 공급한 군에서는 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 유의적이지는 않았지만 증가하는 경향을 보였다. 울금에 함유된 식이섬유는 소장에서 콜레스테롤과 담즙산의 재흡수를 저해하는데 식이섬유가 소화기에서 콜레스테롤 및 담즙산과 직접 결합하므로써 흡수가 억제되어 분변으로의 배설이 증가된다고 밝혀진 바 있다. 이와 같이 울금 분말을 공급함 으로서 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 변으로서의 중성지질의 배설량이 증가하는 것을 볼 때 체내의 지질지하 효능이 있을 것으로 추측된다. 혈청 중의 total bile acid 함량 체내 콜레스테롤 대사의 최종 산물인 담즙산 함량을 측정한 결과 Fig. 1과 같다. 혈청 중의 담즙산 농도가 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말을 공급한 TPA, TPB 군에서 유의적으로 증가하였으며, 이러한 효과는 울금 5% 를 공급한 TPB 군에서 현저하였다. 이는 Cha 등의 연구에서 함초에 다량 함유된 식이섬유에 의해 콜레스테롤로부터 간 내의 콜레스테롤로부터 담즙산의 합성을 증가시켜 혈중으로 분비를 증가시킨 연구와 비슷한 경향을 보였다. 울금 또한 다량의 식이섬유의 작용에 의하며 혈중으로 담즙산의 분비를 증가시킨 것으로 추측된다. 간의 UDP-glucuronyl transferase 활성 UDP-glucuronyl transferase는 UDP-glucuronic acid를 glucuronic acid로 전환 촉매하는 내인성, 외인성 화합물의 해독기전에 중요한 효소로 담즙합성에 풜요한 황색 담즙 색소인 bilirubin의 생성에 관여한다. 간의 담즙대사와 관련된 glucuronidation율을 알아보기 위헤 UDP-glucuronyl transferase (UDP-GT) 활성을 관찰한 결과는 Fig. 2 와 같다. 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 증가되었고, 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말을 공급한 TPA군과 TPB군에서 증가되었다. 특히 울금 분말 5%를 공급한 TPB 군은 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 유의적으로 증가되어 가장 높은 활성을 나타내었다. Song 등의 연구에서는 폴리페놀의 함량이 뛰어난 고추씨 에탄올 추출물의 섭취로 인해 고지방 · 고콜레스테롤 식이로 증가된 콜레스테롤을 감소시킨 연구와 비 슷한 경향을 보였다. 이는 울금 또한 폴리페놀 함량이 뛰어나다는 Jang의 연구결과와 유사함을 알 수 있었다. 따라서 울금 파우더를 공급함으로써 간에 증가된 콜레스테롤을 제거하기 위해 담즙합성을 위한 UDP-GT의 활성이 증가되었을 것으로 판단된다.

간조직의 지질성분 관찰 결과, 울금 분말 공급군에서 총 지질함량이 고지방 고콜레스테롤 군에 비해 감소하였다. 특히 TPB군에서는 더욱 감소하였다. 이는 울금 분말이 지질 흡수를 억제하여 지질대사를 개선하며, 중성지질의 배설량 증가를 통해 지질지하 효능을 갖는 것으로 파악된다. 또한, 울금 분말 공급으로 인해 혈청 중 담즙산 농도가 증가하였으며, 이는 울금이 폴리페놀을 풍부하게 함유하고 있음을 반영한다. 즉, 울금 파우더 공급이 간의 콜레스테롤 제거와 담즙 합성을 촉진한다.

혈청의 중성지방, 총콜레스테롤, \( \mathrm { HDL } \)-콜레스테롤, \( \mathrm { LDL } \) 콜레스테롤의 함량과 동맥경화지수(atherogenic index, Al) 측정 혈청 내 중성지방 함량은 표준 효소법에 의한 kit (Asan Co., Gyeonggi, Korea)를 사용하여 \(550\mathrm{nm}\)에서 홉광도를 측정하여 계산하였다. 총콜레스테롤 함량은 표준 효소법에 의한 kit(Asan Co., Gyeonggi, Korea)를 사용하여 \(500\mathrm{nm}\) 에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 HDL-콜레스테롤 함량은 \(2\%\) dextron sulfate 용액과 \(1\mathrm{M}\) 의 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 침전액을 1:1로 혼합하여 \(12,000\mathrm{rpm}\)에서 8 분간 원심분리하여 그 상층액을 표준 효소법에 의한 kit (Asan Co., Gyeonggi, Korea)를 사용하여 (500\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다. 혈청 LDL-콜레스테롤 함량은 Friedewald의 계산법으로, 혈청 동맥경화지 수(AI)는 Fiordaliso의 계산법으로 각각 산출하였다. 간조직의 총지질, 중성지방 및 총콜레스테롤 함량 측정 간조직의 총지질의 함량은 Folch 등의 방법에 의해 추출하여 정량하였고, 간조직 지질의 정량에서는 Sale 등의 수정된 방법으로 측정하였다. 중성지방과 콜레스테롤 측정용 효소시액에 유화제로서 \(0.5\%\) Triton X-100과 \(3\mathrm{nM}\) sodium cholate를 혼합하여 발색 시 일어나는 탁도(turbidity)를 제거하여 간조직의 triglyceride와 cholesterol 농도를 \(550\mathrm{nm}\)와 \(500\mathrm{nm}\)에서 각각 흡광도를 측정하였다. 분변의 총콜레스테롤과 중성지질 함량 측정 실험 전 마지막 3일간의 변의 wet 무게를 측정한 후 동결건조기 (\(-70\mathrm{°C}\)) 에서 함량에 도달할 때까지 냉동 건조시킨 뒤 건조 중량을 측정하여 변 중의 수분함량을 계산하였다. 변의 총 지질 배설량은 Folch 등의 방법에 의해 정량하였고, 콜레스테롤은 Pearson 등의 방법에 의해 \(550\mathrm{nm}\)에서 정량하였다. 혈청 중의 total bile acid 농도 측정 혈중 total bile acid (TBA) 농도 측정은 rat total bile acid elisa kit (Cusabio, USA)를 이용하여 FLUO star OPTIMA 제품의 BMG LABTECH ELISA reader 장비로 측정하였다. 간의 UDP-glucuronyl transferase 활성 측정 간 microsome 에서 UDP-glucuronyl transferase 활성도는 Reinke 등의 방법으로 측정하였다. 시험관에 working substrate용액(\(0.05\mathrm{M}\) phosphate buffer (\(\mathrm{pH}\) 7.0) \(3\mathrm{mL}\), \(15\mathrm{mM}\) UDP-glucuronic acid \(1\mathrm{ mL}\), \(10\mathrm{ mM}\) \( \mathrm { MgCl } 2 \cdot \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 1ml, 0.2% bovin albumin \(1\mathrm{ mL}\), \(0.5\%\)(v/v) Triton X-100 \(1\mathrm{ ml}\)) \(0.8\mathrm{ mL}\)을 가하여 3분간 preincubation 시킨 후 0.15 M KCl로 현탁시킨 micosome 시료와 증류수 \(0.2\mathrm{ mL}\)를 가하여 37℃에서 20 분간 반응시킨다. 그 후 0.3 N perchloric acid \(0.5\mathrm{ mL}\)를 가하여 \(2000\mathrm{rpm}\)에서 15 분간 원심분리하여 상층액 \(0.5\mathrm{ ml}\)를 취하여 1.6 M glycine buffer (\(\mathrm{pH}\) 10.3) \(2\mathrm{ mL}\)를 가하여 \(436\mathrm{ nm}\)에서 흡광도를 측정하였다.

혈청 내 중성지방, 총콜레스테롤, \( \mathrm { HDL } \)-콜레스테롤, \( \mathrm { LDL } \) 콜레스테롤 함량과 동맥경화지수(AI)를 측정하기 위해 효소법을 사용하여 kit (Asan Co., Gyeonggi, Korea)를 이용하여 \(550\mathrm{nm}\) 과 \(500\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하고, 간조직의 총지질, 중성지방 및 총콜레스테롤 함량은 Folch 등의 방법과 Sale 등의 수정된 방법으로 측정하고, 변의 총 지질 배설량은 Pearson 등의 방법으로 정량하고, 혈중 total bile acid 농도는 rat total bile acid elisa kit 를 이용하여 FLUO star OPTIMA 제품의 BMG LABTECH ELISA reader 장비로 측정하였다.

재료 및 방법 울금 추출물 분말 제조 본 연구에 사용한 울금은 진도에서 제공받아 열풍건조기를 이용하여 85~80℃로 건조하였다. 울금은 분쇄기(대성파워 믹 서/분쇄기DA-280G, Seoul, Korea)로 분쇄한 울금 당 중량대비 6 배에 해당하는 증류수(w/v)를 가하여 95℃에서 24시간 추출한 후, 위와 같은 조건으로 3회 반복하고 상등액을 모아 여과지(Whatman No. 1)로 여과하였다. 여과한 여액은 rotary vacuum evaporator (HS-2001N, Hanshin Science CO. Korea)를 사용하여 감압 농축하고, 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)로 건조하여 사용하였다(각각의 추출물에 대한 수율은 추출 전의 시료 무게에 대한 동결 건조 후 추출물의 무게를 측정하여 나타내었음). 본 연구에서 사용한 울금 분말은 추훌 한 후 동결건조시켜 조제하였다. 실험동물 사육 및 식이조성 본 실험에 사용된 동물은 체중 \( 100 \pm 10 \mathrm { ~g } \) 내외의 Sprague-Dawley 종 수컷을 (주)바이오 제노믹스사(Bio genomics, Inc., Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험 식이 시작 전 일주일간 일반배합사료(Purina Co., Seoul, Korea)로 예비사육한 후 평균체중이 유사하도록 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 대조군과 실헙 군으로 나눈 후 Table 1 과 같이 나누어 4 주간 사육하였다. 실험기간 중 식이는 4℃ 에서 보관하였으며, 매일 일정 시간 에 공급하여 자유로이 섭취하게 하였다. 사육실의 온도는 \( 22 \pm 2℃ \), 상대습도 \( 50 \pm 10 \% \) 를 유지하였다. 식이 group은 정상군(N group)과 (1%) 고지방 · 고콜레스테롤 식이 실험군으 로 나눈 후 고지방 · 고콜레스테롤 실험군은 고지방 · 고콜 레스테롤 대조군(HF group), 고지방 · 고콜례스테롤식이 + 2.5% 울금분말 공급군(TPA group), 고지방 · 고콜레스테롤 + 5% 울금분말 공급군(TPB group)으로, 군당 10 마리로 총 4군으로 나누어 사육하였다. 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율 식이섭취량은 전 실험기간동안 매일 일정시간에 측정하였 으며, 체중은 3일에 한 번씩 일정시간에 측정하였다. 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 전 체중증가량을 같은 기간 동안의 식이섭취량으로 나누어 줌으로 계산하였다. 혈액 및 장기의 채취 사육기간 완료 후 실험동물을 12 시간 절식시키고 가벼운 ether 마취 하에서 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 그 후 즉시 간을 채취하여 생리식염수로 헹군 다음 거즈로 수분을 제거하고 무게를 측정한 후 액체질소로 급속 동결시켜 -80℃ 에 보관하였다. 분변수집 및 배설량 측정 실험기간 중 4 주째에 3 일간 대사 cage에서 분변을 수집하여 건조전의 무게를 칭량하였다. 분변은 -70℃ 급속냉동실에서 항량에 달할 때까지 건조시킨 다음 건조중량을 칭량한 후 분변 sterol 측정 시까지 -80% 냉동고에 보관하였다.

울금을 열풍건조기로 건조하고 분쇄기로 분쇄하여 증류수로 추출하고, rotary vacuum evaporator로 감압 농축하고 동결건조기로 건조하여 사용하였다. 또한 Sprague-Dawley 종 수컷을 난괴법에 의해 대조군과 실헙군으로 나누어 4주간 사육하고, 12시간 절식 후 ether 마취하에 복부대동맥으로부터 혈액과 간을 채취하여 동결시켜 -80\(^\circ \mathrm{C}\)에 보관하였다.

통계처리 모든 실험결과에 대한 통계처리는 각 실험군 별로 평균값의 차이가 있는가를 검증하기위해 분산분석(ANOVA 검증)을 수행하였으며 분산분석결과 유의성이 발견된 경우 Tukey's HSD test에 의해 군 간의 유의도를 분석하였다. 결과 및 고찰 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율 울금 분말의 농도별 실험에서 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율을 관찰한 결과는 Table 2와 같다. 체중증가량은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였으나, 울금 분말을 공급한 군에서는 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 유의적이지는 않았으나 체중이 감소하는 경향을 보였다. 식이섭취량에서는 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 증가하였고, 식이효율 또한 유사한 경향을 나타내었다. Kim 등의 보고에 의하면 울금군과 복합조성물 투여군에서 식이 섭취의 감소가 나타났는데, 이는 울금 특유의 향미 성분이 실험동물의 식욕에 영향을 주었을 가능성이 있는 것으로 보인다고 보고하였다. 따라서 본 실험 결과도 위의 보고와 비슷한 경향으로 울금의 향미성분 때문에 체중감소의 효과가 나타난 것으로 사료된다. 혈중의 중성지질 함량, 총콜레스테롤, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol 및 동맥경화지수(Al) 혈중의 총콜레스테롤 및 중성지질의 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 총콜레스테롤 함량은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였다. 울금 분말을 공급한 모든 군에서 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 모두 감소 하였고, 특히 TPB 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 보였다. 중성지질 또한 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군은 유의적으로 증가되었고, 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말 공급군 모두가 유의적으로 감소하였다. 울금의 대표적인 성분인 커큐민은 고지혈 모델에서 담즙분비 촉진을 통하여 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시키는 것으로 보고 되어있다. 이러한 결과를 볼 때, 울금 분말의 공급이 혈중의 콜레스테롤을 저하시키고 중성지질의 농도를 저하시키는데 병향을 미치는 것으로 사료된다. Yun 등의 연구에서는 명일엽과 울금 추출물의 섭취는 혈중지질을 바람직한 방향으로 변화시켜 심혈관 질환의 예방에 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다고 보고하였다. 또한 울금 및 발효울금이 혈중지질을 효과적으로 개선하였다는 Kang 등의 보고와도 유사함을 알 수 있었다. HDL-cholesterol 수준을 분석한 결과(Table 3), HDL 콜레스테롤은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 감소하였고, 울금 분말 공급군에서는 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 증가하였지만 유의적인 차이는 보이지 않았다. 반면, LDL-cholesterol은(Table 3) 고지방 · 고콜레스테롤에서 정상군에 비해 유의적으로 증가하였으나, 울금 분말 공급군에서는 고지방 · 고콜레스테롤에 비해 유의적인 차이는 없었지만 감소하는 경향을 보였다. 또한 동맥경화지수(AI)(Table 3)에서는 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤에서 유의적으로 증가되었으며 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적이지는 않았지만 감소하는 경향을 보였다. LDL-cholesterol은 헐청 중 콜레스테롤의 주된 운반형태로 동맥 내 혈관 벽에 콜레스테롤을 축적하여 동맥경화증과 심혈관계질환의 발병에 중요한 위험인자로 알려져 있다. 그러나 본 연구에서는 울금 분말을 5% 투여한 TPB 군에서는 총 콜레스테롤 감소에 비해 LDL-cholesterol 수치가 감소하는 경향을 나타내었다. Kang 등에서도 발효울금의 경우 총 콜레스테콜 및 LDL-cholesterol을 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라 HDL-cholesterol을 효과직으로 증가시켜 혈중 지질 함량의 개선효과가 뛰어난 것으로 보고되었고, Sin과 Han의 연구에서는 혈청 콜레스테롤 농도가 혈소판 웅집을 억제함으로써 동맥경화증을 예방 할 수 있다고 보고하였다. 본 실험의 결과에서도 울금 분말을 공급함으로 인해 지질 함량이 감소하는 것으로 보아 고지방 · 고콜레스테롤 식이에 의한 혈중의 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관계의 질환의 발병을 낮추는데 효과가 있을 것으로 판단된다.

본 논문은 모든 실험결과를 분산분석을 통해 각 실험군 별로 평균값의 차이가 있는지 검증하였고, Tukey's HSD test를 통해 군 간의 유의도를 분석한 결과 울금 분말의 농도별 실험에서 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율이 고지방 및 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였다. 또한 울금 공급에 의해 단백질의 효소분해가 억제되어 식이 섭취가 감소하는 것으로 추정되었다. 혈중의 총콜레스테롤 및 중성지질의 함량을 분석한 결과 울금 분말을 공급해 지질 함량이 감소하는 것으로 보아 고지방, 고콜레스테롤 식이에 의한 혈중의 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관계의 질환을 개선하는데 효과가 있을 것으로 보인다.

형질전환 공동배양을 위해 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 세척한 Agrobacterium tumefaciens 현탁액에 \( 0.5 \mathrm { ~cm } \times 0.3 \mathrm { ~cm } \) 크기로 자른 잎 절편을 넣고 10 분간 공동배양 한 후 잎 절편을 멸균된 여과지에서 10 분간 건조 시겼다. 건조된 잎 절편을 공동배양배지에서 (MS, sucrose 3 \%,2 mg/L 2,4-D) 2일간 배양한 후 재분화 선발배지 (MS, sucrose \( 3 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { NAA } , 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { BA } ) \) 로 옮기고 8주간 배양하여 신초를 형성시켰다. 형성된 신초는 PCR로 \( \operatorname { merB } \) 유전자를 확인하고 유전자가 확인된 신초돌만 뿌리 유도배지(1/2 MS, sucrose \( 1 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { IBA } \) 에 이식하여 발근시켰다. 유전자 발현 확인 항생제가 포함된 선발배지에서 자라는 식물체에 \( \operatorname { merB } \) 유전자가 도입되어 발현되는지 확인하기 위하여 PCR과 northern blot analysis를 실시하였다. 발근된 까마중 식물체의 어린잎으로부터 genomic DNA를 추출하였다. PCR 조선은 I단계: \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } 2 \) 분, 2 단계: \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } 20 \) 초, 3단계: \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 40초, 4 단계: 7 \( 2 ^ {\circ } \mathrm { C } 80 \) 초, 5 단계: \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 10 \) 분이며, 2, 3, 4단계가 34 번 반복되도록 하였다. PCR 반응에 사용된 merB 유전자의 primer는 merB-F: 5'-CGT CGA GGA AGT TAA GCA AGT CC-3', merB-R: 5'-AAC GCT CGA CTC AGG GTG TTG G-3'을 사용하였다. PCR 산물은 \( 1 \% \) 아가로스 겔에 로딩 (loading)하여 merB 유전자 증폭 밴드 유무를 확인하였다. 또한 RNA발현을 확인하기위하여 충 RNA를 추출하여 정량한 RNA \( 30 \mu \mathrm { g } \) 을 \( 1 \% \) formaldehyde 겔에 전기영동하여 나일론 membrane (Schleicher \& Schuell, Japan)으로 전이시켰다 (Turbo blotter system, Schleicher \& Schuell). 전이된 RNA를 고정시키기 위하여 UV crosslink \( \left (1200 \times \mu / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 를 2 회 실시하고 이 membrane을 DIG easy hybridization solution (Roche, Germany)으로 6 \( 8 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 정도 pre-hybridization 한 다음 PCR Dig Labeling Mix (Roche)와 제공된 제작방법에 따라 만든 probe로 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 6 시간 이상 hybridization시켰다. Membrane을 \( 2 \times \mathrm { SSC } , 0.1 \% \) SDS-buffer로 세척한 다음 Dig detection kit(Roche)와 제공된 방법으로 NBT/BCIP에 의한 발색 정도를 관찰하였다.

까마중 식물체의 잎 절편을 건조한 후 공동배양배지에서 2일간 배양한 후 재분화 선발배지로 옮겨 8주간 배양해 신초를 형성시켰다. 형성된 신초는 \( \operatorname { merB } \) 유전자가 확인된 신초들만 뿌리 유도 배지로 이식해 발근시켰고, 발근된 까마중 식물체의 잎으로부터 genomic DNA를 추출해 \( \operatorname { merB } \) 유전자 증폭 밴드 유무를 확인했다. 또한 RNA 발현을 확인하기 위해 RNA를 추출해 RNA \( 30 \mu \mathrm { g } \) 을 \( 1 \% \) formaldehyde 겔에 전기영동하여 나일론 membrane으로 전이하여 NBT/BCIP에 의한 발색 정도를 관찰했다.

결과 및 고찰 형질전환체 육성 환경정화용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가연구를 위한 형질전환 식물체를 선발하기위하여 유기수은을 무기수은으로 전환시켜서 독성을 저감시키는 organomercurial lyase 유전자 \( ( \operatorname { merB } ) \) 를 까마중에 도입하여 형질전환하였다. Agrobacterium 과 공동배양한 까마중 잎 절편을 2,4-D \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 가 첨가된 동시배양 배지에서 2일간 배양한 후 항생제가 첨가된 선발배지로 옮기는 것이 공동배양한 후 잎 절편을 곧바로 항생제가 첨가된 배지로 옮기는 것보다 캘러스 (callus) 생성과 재분화가 빠르게 일어났나. 이것은 \( 2,4- \mathrm { D } \) 가 식물체의 상처부위에서 체세포배 (somatic embryo)를 유다.하여 캘러스가 왕성하게 유도된 것으로 사료된다. 이러한 결과는 Choi 등 (1996)이 감자 (Solanum tuberosum)의 잎 절편을 2,4-D \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 가 첨가된 동시배양 배지에서 2일간 배양한 후 선발배지로 옮기는 것이 효과적이라는 보고와 같았다. 또한 배양한 Agrobacterium 균주를 원심 분리하여 배양액을 버리고 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 세척하여 잎 절편과 공동 배양한 것이 비세척 시보다 2 배정도 많은 형질전환 신초가 형성되었다. 이는 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 이 식물체 잎 조각 상처조직의 삼투압을 조절하면서 Agrobacterium의 감염성을 유지시키는 역할을 했기 때문인 것으로 보고 있으며, Choi 등 (2005)도 포플러의 잎 절편 형질전환 시 Agrobacterium 균주를 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 세척하는 것이 효과적이라고 보고한 바 있다. 재분화 선발배지 (MS, sucrose \( 3 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) NAA, \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { BA } \) 로 읆긴 잎 절편은 1 주일 후 캘러스가 형성되기 시작하여 3주후부터 신초가 재분화되기 시작하였다 (Fig. 1A, B). 재분화된 신초로부터 뿌리를 형성하는데는 \( 1 / 2 \mathrm { MS } \) 와 sucrose를 \( 1 \% \) 고 낮춘 배지가 효과적이었다 (Fig. \( 1 \mathrm { C } \) ). 발근된 까-마중을 지피포트에 옮겨 순화시킨 후 온실의 큰 포트로 이식하고 약 3개월 동안 생육시킨 후 종자를 수확하였다 (Fig. ID, E).

환경정화를 위해 형질전환 식물체를 선발하기 위해 무기수은을 유기수은으로 전환시키는 organomercurial lyase 유전자 merB를 까마중에 도입하여 형질전환하였다. 2,4-D가 첨가된 동시배양 배지에서 2일간 배양한 후 항생제가 첨가된 선발배지로 옮기는 과정에서 캘러스 생성과 재분화가 빠르게 일어났고, 이는 2,4-D가 식물체의 상처부위에서 체세포배를 유도하여 캘러스가 왕성하게 유도된 것으로 사료된다.

유전자 발현 확인 대조구 식물체 잎 절편이 백화되어 고사하는 농도의 항생제가 포함된 재분화 선발배지 (MS, sucrose \( 3 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) NAA, \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) \( \mathrm { BA } \) 에서 정상적으로 자라는 식물체는 유전자가 도입된 형질전환체라고 1 차적으로 판단을 할 수 있었다. 좀 더 명확히 유전자 도입 및 발현을 확인하기 위하여 PCR analysis를 실시하였다. 그 결과, 대조구는 증폭된 \( \operatorname { merB } \) 유전자 밴드를 찾아볼 수 없었고 5 개의 헝질전환체에서는 \( 403 \mathrm { bp } \) 의 \( \operatorname { merB } \) 유전자 단편이 증폭된 것율 확인하였다 (Fig. 2). 또한 \( \operatorname { merB } \) 유전자의 \( \mathrm { mRNA } \) 수준에서의 발현을 확인하기 위해서 northern blot 분석을 실시한 걸과, 형질전환 두 개 라인 (merBl, merB4)에서 \( \operatorname { merB } \) 유전자의 발헌을 확인 할 수 있었다 (Fig. 3). 이 결과를 바탕으로 향후 merBl, merB4 두 라인을 연구재료로. 사용 하였다. 형질전환 까마중(Solanum nigrum)의 수은 저항성 검정 \( \mathrm { PCR } \) 분석과 northern blot 분석을 통하여 유전자가 식물체에 안정적으로 삽입되고 발현되는 merBl, merB4 두 라인을 선발하였다. 이러한 분자유전학적 확인 이외에도 merB 유전자 발현에 의해서 실제로 수은에 저항성을 나타내는지 확인하기 위하여 MS 재분화 배지 (MS, sucrose \( 3 \%, 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) \( \mathrm { NAA } , 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { BA } \) 에 유기수은 제제인 MMC와 PMA를 \( 0.5 \), \( 1,2,5,10,20,40,60 \mu \mathrm { M } \) 농로로 처리하고 \( \operatorname { merBl } \), merB4 라인 까마중 잎 절편의 재분화를 유도하여 수은저항성 정도를 알아보았다. 그 결과 \( \operatorname { merB1 } , \operatorname { merB4 } \) 라인은 최고 \( 2 \mu \mathrm { M } \) 까지 MMC에 저항성을 보이며 잎 조직으로부터 재분화가 일어났다. 반면 대조구 잎은 \( 0.5 \mu \mathrm { M } \mathrm { MMC } \) 에서도 잎 절편이 흰색으로 백화되어 고사하였다 (Fig 4).

항생제 함유 재분화 선발배지에서 백화되지 않고 정상적으로 성장한 식물체는 유전자 도입이 성공적으로 이루어진 형질전환체로 판명되었다. 이를 바탕으로 merBl, merB4 두 라인을 연구 재료로 활용하였다. PCR과 northern blot 분석을 통해 merBl, merB4 라인에 유전자가 안정적으로 삽입되고 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 이들 라인은 최대 2μM의 MMC에 저항성을 보였으며, 대조구 잎은 0.5 μM MMC에서 백화되어 고사하는 결과를 보였다.

서 론 미나마타병의 원인물질로 잘 알려진 수은 \( ( \mathrm { Hg } ) \) 은 자연생태계에서 토양과 하천 등 수계에 낮은 농로로 널리 분포하고 있으나, 산업이 발달함에 따라 방출량이 늘어나고 이로 인해 자연생태계의 먹이사슬에 의한 생물학적 축적 (bioaccumulation)으로 결국 인간에게 강한 독성을 나타내게 된다 (Bizily et al.2000). 특히, 수은의 위해도는 생태계에 존재하는 형태에 따라 크게 좌우되는데, 유기수은 형태 \( \left ( \mathrm { CH } _ { 3 } \mathrm { Hg } ^ {\prime } \right ) \) 로 존재하는 것이 무기수은 형태로 존재하는 것보다 위해도가 크며, 독성은 약 200 배 이상 강한 것으로 알려져 있다 (Ruiz et al.2003). 독성이 강한 유기수은은 자연상태에서 organomercurial lyase \( ( \operatorname { merB } ) \) 에 의해 비교적 독성이 약한 무기수은으로 전환되며, 이러한 무기수은 \( \left ( \mathrm { Hg } ^ { 2 + } \right ) \) 은 수은이온 환원 유전자인 mercuric ion reductase gene \( ( \mathrm { mer } A) \) 에 의해 비독성인 금속 수은 \( \left ( \mathrm { Hg } ^ { 0 } \right . \) )형태로 전환된다 (Bizily et al. 1999). 최근에는 광범위한 오염지역 정화에 적용하기 힘든 토목학적, 물리·화학적 방법 대신 식물을 이용하여 중금속을 흡수- 무독화하거나 농-도를 저감시키기는 phytoremediation 기술이 시도되고 있다. Phytoremediation은 광산 및 공장지대등 중금속 오염이 심한 토양에 식물체를 식재하여 오염된 토양을 정화할 수 있는 친환경적 기술로 알려져 있다 (Eapen and D'Souza 2005; 김용호 2008). 그러나 중금속 오염 토양이 중금속 자체의 독성과 함께 척박한 토양의 물리성을 나타내는 경우가 많으므로 (Ok et al. 2004) 중금속 내성 식물의 생육이 저조하거나 오염지역 복원에 소요되는 기간이 배우 길다. 이런 단점을 보완하기 위하여 수은 정화관련 유전자를 식물에 도입하여 수은을 정화하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. Bizily 등(2000)은 merB 유전자를 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에 도입하고 수은 정화가능성을 조사하였고, merA와 \( \operatorname { mer } B \) 유전자를 동시에 발현시키기도 하였다. 애기장대 외에도 벼 (Oryza sativa) (Heaton et al. 2003), 담배 (Nicotiana tabacum) (Ruiz et al. 2003), 호화미초 (Spartina alterniflora) (Czako et al. 2005; Czako et al. 2006), 클로렐가 (Chlorella sp.DT) (Huang et al. 2006), 갈대 (Phragmites communis Trinius) (Seul et al. 2003) 등에 merA 또는 \( \operatorname { merB } \) 유전자를 노입한 형질전환체 연구가 이루어겼고,성 평가 밎 심사를 받아야만 하는데, 법에서는 유전자변형 생물체를 시험·연구용, 농업용, 산업용, 보건의료용, 환경정화용, 해양.수산용으로 구분하여 관련 부처별로 관리하고 있다. 유전자변형생물체의 환경위해성 평가는 유전자변형 생물체가 환경에 미치는 잠재적 위해성을 과학적으로 검증하는 것이며, 유전자변형생물체의 분자생문학적 특성, 생리. 생태적 특성, 유전·육종적 특성, 독성 및 타생물체에 대한 영향 등을 비변형생물체와 비교하여 위해성 여부를 판단하게 된다 (Kim and Kim 2003). 환경위해성 평가의 첫 단계는 형질전환된 평가대상 유전자변형생물체의 유전자 도입 및 발현과 생물학적 특성 (분류, 생리, 유전, 생태)을 확인하고 분석하는 것이다. 그 후 실험실과 온실, 격리포장에서 이루어지는 노출평가와 부작용 정도 검증과정을 거치며 최종적으로 전반적인 위해성을 판단하게 된다 (박홍재 2008).

미나마타병의 원인물질인 수은은 자연에 널리 분포하고 있지만 산업이 발달함에 따라 방출량이 늘어나고 자연생태계의 먹이사슬에 의한 생물학적 축적으로 결국 인간에게 강한 독성을 나타내게 된다. 특히 수은의 유기수은 형태가 무기수은 형태보다 위해도가 크며, 독성은 약 200배 이상 강한 것으로 알려져 있다. 최근에는 토목학적, 물리·화학적 방법 대신에 식물을 이용한 중금속을 흡수- 무독화하거나 농-도를 저감시키기는 phytoremediation 기술이 시도된다.

형질전환 까마중의 수은 저항성 검정 유전자 밭현이 확인된 형질전환 까마중의 수은저항성을 확인하기 위하여 잎을 약 \( 0.5 \mathrm { ~cm } \times 0.3 \mathrm { ~cm } \) 로 잘라서 유기수은 제제인 methylmercury (II) chloride (MMC; \( \mathrm { CH } _ { 3 } \mathrm { HgCl } \), Aldrich, Germany)와 phenylmercuric acetate (PMA; \( \mathrm { C } _ { 6 } \mathrm { H } _ { 5 } \mathrm { HgOCOCH } _ { 3 } \), Sigma, Germany)가 \( 0.5,1,2,5,10,20,40,60 \mu \mathrm { M } \) 농도별 처리된 \( \mathrm { MS } \) 재분화 배지 ( \( \mathrm { MS } \), sucrose \( 3 \%, 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { NAA } , 1 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { BA } \) )에 치상하였다. 20 일후 잎 전편의 재분화 정도를 조사함하여 수은저항성을 알아보았다. 또한 수은저항성이 확인된 까마중은 온실에서 3 개월 간 재배한 후 종자를 수학하였다. 수확한 종자는 \( 70 \% \) ethanol과 \( 2 \% \) sodium hypochlorite 용액으로 소독하여 MMC와 PMA가 각각 \( 2 \mu \mathrm { M } \) 농도로 첨가된 발아배지에 치상하였으며, 치상 후 10 일째 생육상태를 조사하였다. 형질전환 까마중의 형질전환 1 세대 \( \left (T_ { 1 } \right ) \) 종자형성과 유전자 분리비 조사 유전자 발현과 수은저항성이 확인된 까마중을 배양실에서 순화시킨 후 온실의 포트로 이식하고 약 3 개월 동안 재배하였다. 3 개월 후 화서당 열매수, 열매의 개당 종자수를 대조구와 비교하였고, 수확 후 자연 건조시킨 형질전환 1세대 \( \left ( \mathrm { T } _ { 1 } \right ) \) 종자 100 립의 건조 중량도 측정하였다. \( \mathrm { merB } \) 유전자가 후대로 안정되게 유전되는지를 확인하기 위하여 건조된 \( \mathrm { T } _ {\mathrm { i } } \) 종자를 \( 70 \% \) ethanol에 30 초, \( 2 \% \) sodium hypochlorite 용액에 20 분간 표면살균하고 멸균수로 세척한 후 물기를 제거한 다음 항생제 hygromycin (Sigma)이 첨가 발아배지 (1/2MS, 50 \( \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin)에 치상하였다. 10 일 동안 배양 \( \left (25 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \), \( 16 \mathrm { hr } \) day \( / 8 \mathrm { hr } \) dark) 한 후 발아되어 생장하는 항생제 저항성 종자와 발아하지 못하는 감수성인 종자 수를 조사하였다.

형질전환 까마중의 수은저항성을 확인하기 위해 여러 농도의 유기수은 제제를 사용한 실험을 진행하였으며, 해당 저항성이 확인된 까마중은 배양실에서 순화시킨 후 온실로 이식하여 3개월 동안 재배하였다. 이후 화서당 열매수, 열매의 개당 종자수 등을 대조군과 비교하고, 자연 건조시킨 형질전환 1세대 까마중 종자의 건조 중량을 측정하였다.

현재까지 국내에서 상업화들 위하여 승인된 유전자변형 생물체는 국내 수입 콩, 옥수수, 면화, 유채, 감자, 알팔파 등 농업용 작물이 대부분이다. 국내에서도 다양한 유전자변형 생물체 연구가 수행되고 있으나 아직 실용화 단계에는 이르지 못하고 있으며 (Woo et al. 2006), 격리포장 단계에서 환경위해성율 평가 중인 유전자변형생물체도 벼, 고추, 배추, 들깨 등 농업용이다 (김동헌 2008). 환경정화용 유전자변형 생물체는 식물수목류를 대상으로 개발단계이고, 아직 환경 위해성 평가가 이루지고 있지는 않지만 환경정화용이 환경 정화 효과 검정을 위하여 환경에 방출될 가능성에 대비하여 환경정화용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가기술 개발 연구가 필요할 것으로 여겨진다. 본 연구에서는 환경정회용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가연구를 위한 형질전환 식물체를 확보하기 위하여 생태 환경변화에 따른 유전자 변화 연구 모델식물로 이용되는 까마중에 수은 무독화 관련 유전자인 Organomercurial lyase 유전자 \( ( \operatorname { merB } ) \) 를 도입하여 형진전환체를 선발하고 그 특성을 조사하기 위한 것이다. 재료 및 방법 식물체 재료 한국생명공학연구원 식물유전체연구센터로부터 분양받은 까마중 종자를 중성세제에 5-10분 세척하고, Tween \( 20 \mathrm { TM } \)이 2-3방율 첨가된 2% sodium hypochlorite에 7 분간 침지한 후 멸균수로 세척하였다. 멸균 처리한 종자를 MS 기본 고체배지 (Murashige and Skoog 1962)에 치상하여 발아 \( (25 \pm 1 \mathrm { C } , 16 \mathrm { hr } \) day/8hr dark) 시켰다. 발아 후 l주일된 잎 절편을 Agrobacterium과 공동 배양 하였다. 균주 본 실험에 사용된 A. tumefaciens 균주는 환경정화용 관련 수은무독화 유전자인 \( \operatorname { merB } \) 유전자를 함유하고 있으며 (Choi 2007), 국립산립과학원 형질전환연구실로부터 공여 받았다. Agrobacterium tumefaciens 균주는 kanamycin \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), rifampicin \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 가 함유된 \( 50 \mathrm { ~mL } \) LB배지에서 균 농도가 \( \mathrm { OD } _ { 600 } = \) \( 0.7 \) 인 대수기까지 배양하여 한빈 원심분리한 후 \( 20 \mathrm { ~mL } \) 의 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 세척하고, 잎 절편과 공동 배양하였다.

국내에서 승인된 유전자 변형 생물체는 농업용 작물이 대부분으로 환경정화용 유전자 변형 생물체는 식물수목류를 대상으로 개발단계이다. 환경위해성 평가가 이루어지고 있지 않으므로 환경정화용 유전자 변형 생물체의 환경위해성 평가기술 개발 연구가 필요하며, 그중 Organomercurial lyase 유전자를 도입하여 형질전환 식물체를 선발하고 그 특성을 조사하기 위한 연구를 수행하고 있다.

형질전환 1 세대 끼미중 종자의 수은 저항성 \( \operatorname { merB1 } , \operatorname { merB4 } \) 두 라인의 형질전환 1 세대 종자의 수은저항성을 확인하기 위하여 유기수은 제제인 MMC와 PMA가 \( 2 \mu \mathrm { M } \) 천가된 종가 밥아배지에 치상한 결과, 형질전환체는 발아후 뿌리를 내리며 성장하였으나 대조구근 발아 후 뿌리를 내지지 못하고 결국 갈변되어 고사하였다 (Fig. 6). 이상의 결과, \( \operatorname { merB } \) 유전자가 형질전환 1 세대로 안정되게 유전되어 수은 저항성을 나타내는 두 개의 형질전환 라인(merBl, merB4)을 선발하였다. 향후 이들 두 라인은 후대번식을 봉하여 \( \operatorname { merB } \) 유전자 형질이 고정된 계통을 확보하고 유전자 전이 평가. 독성 대사산물 생산가능성 분석, 주변 생물체와의 상호작용 조사 등 다양한 환경영향평가 실혐을 수행하는데 활용할 것이다. 적요 수은은 산업화될수록 방출량이 많아지고 자연생태계의 먹이사슬에 의한 생물학적 축적에 의하여 결국 인간에게 강한 독성을 나타내게 된다. 최근 중금속 무독화관련 유전자를 도입한 유전자변형식물체를 이용하여 중금속의 독성을 제거하거나 저감하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나 유전자변형생물체는 자연생태계에 미치는 환경위해성을 평가하여 안전성을 검증한 후 환경에 방출해야만 한다. 환경정화용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가기술개발 연구에 이용하기 위한 형질전환 식물체 생산을 위하여 까마중에 유기수은 (organic mercury)을 무기수은 (ionic mercury) 으로 전환시켜서 독성을 저감시키는 organomercurial lyase \( ( \operatorname { merB } ) \) 유전자를 도입하여 형질전환 시켰다. 유전자 도입 및 발현이 확인된 2 개의 형질전환 라인 \( ( \operatorname { merBl,~ } \operatorname { merB4 } ) \) 은 유기수은제제인 MMC \( 0.5 \mu \mathrm { M } \), PMA \( 1 \mu \mathrm { M } \) 에서 저항성을 나타내었다. 또한 형질전환 1 세대 종자도 \( 2 \mu \mathrm { M } \mathrm { MMC } \) 와 PMA에 저항성을 나타내는 것을 확인하였다. 향후 이들 형질전환체를 이용하여 환경정화용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가방법 개발 연구를 수행 할 것이다.

두 개의 라인 merBl과 merB4은 유기수은 제제인 MMC와 PMA로 테스트한 후 수은 저항성을 위해 선택되었다. merB 유전자는 1세대 유전자가 안정적으로 유전돼 향후 유전자 전이 번식 및 평가는 물론 환경영향평가 실험 등에 활용될 예정이다. 유전자변형식물체는 환경 내 중금속의 독성을 제거하거나 줄이기 위해 만들어졌지만, 출시 전에 안전성을 확인해야 한다. 이들 형질전환체를 이용한 환경정화를 위한 유전자변형생물의 환경위험도 평가방법 개발 연구가 진행될 예정이다.

초록 본 연구에서는 혈전용해능이 우수한 Bacillus sp. sm26을 선별하고 신품종 기능성 콩인 노란 아가콩(YA)와 검정 아가콩(BA)을 발효시킨 발효콩(FYA, FBA)의 혈전용해 활성과 \( 70 \% \) ethanol 추출(FYAE, FBAE)에 대한 항산화 효능을 조사하였다. FYA와 FBA의 혈전용해 활성은 각각 \( 6.38 \pm 0.5 \)와 \( 6.83 \pm 0.5 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \)로 대두 발효물(FSB)보다 각각 1.3배와 1.4배 높은 것으로 나타났다. 총 페놀 함량은 FYAE와 FBAE가 각각 \( 3.40 \pm 0.44 \mathrm { mg } / \mathrm { g } , 2.45 \pm 0.20 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \)으로 나타나, 대두 발효 추출물(FSBE)에 비하여 약 2 배 이상의 높은 페놀 함량을 나타내었다. FYAE의 총 단백질과 총 당 함량은 각각 \( 0.56 \pm 0.11 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \)과 \( 2.41 \pm 0.48 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 이었으며 FYBA는 각각 \( 0.39 \pm 0.12 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \)과 \( 2.72 \pm 0.63 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { g } \)으로 나타나, FYAE가 FSBE보다 각각 4.7배와 1.7배 높은 총 단백질과 총 당 함량을 지닌 것으로 나타났다. DPPH radical 소거능은 FBAE가 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)에서 \( 79 \% \)로 가장 높게 나타났으며 2 배 높은 활성을 나타내었다. 환원력은 FBAE가 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 가장 높은 환원력을 나타내었으며 FSBE에 비해 2배 높은 활성을 보였다. 지질 과산화능은 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)일 때 FBAE는 \( 93 \% \)로 FSBE의 약 3배 높은 활성을 나타내었고 FYAE 또한 \( 80 \% \)로 2.5배 높은 활성을 보였다. 과산화 수소에 대한 소거능은 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 FBAE가 \( 82 \% \)로 FSBE에 비해 4배 높은 효과를 나타내고 FYAE의 경우 2.5배 높은 효과를 나타낸다. 이상의 연구 결과에서, 기능성 콩인 아가콩 발효물의 혈전용해 활성과 항산화 효능은 일반 콩에 높게 나타났으며 이는 앞으로 새로운 천연 기능성 식품으로서의 이용 가능성을 시사하고 있다.

혈전용해능이 우수한 Bacillus sp. sm26을 이용해 발효한 노란 아가콩(FYA)과 검정 아가콩(FBA)의 혈전용해 활성은 각각 1.3배와 1.4배 높게 나타나, 페놀 함량은 각각 약 2 배 이상 높았다. 또한, DPPH radical 소거능에서는 FBAE가 2 배 높은 활성을 보였다. 이러한 결과로 볼 때, 아가콩 발효물의 혈전용해 활성과 항산화 효능은 일반 콩보다 높으며, 이는 신 천연 기능성 식품으로서의 활용 가능성을 시사한다.

재료 및 방법 재료 일반 대두(SB)는 시중에서 판매되는 것을 구입하여 사용하였으며 육종 품종인 아가콩 3호(노란 아가콩, YA와 아가콩 4호(검정 아가콩, BA)는 경북대학교에서 제공받아 사용하였다. 발표 균주의 선별 각각의 콩을 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)의 물에 24시간 동안 침지하여 건져낸 후 30분간 물을 뺀 다음 \( 50 \mathrm{g} \)씩 담아 autoclave에서 30분간 가압증자하였다. 증자대두를 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 이하로 냉각시킨 후 혈전 용해능을 지닌 10가지의 Bacillus sp. 균주 배양액을 증자대두의 \(3\%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \)가 되도록 접종하고 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72시간 발효하였다. 발효된 콩의 혈전용해능을 Fibrin plate method로 측정하고 혈전용해능이 가장 우수한 균주를 발효 균주로 사용하였다. 발효콩 추출물의 제조 Bacillus sp. sm26 균주를 이용하여 발효시킨 콩 발효물을 \( 70 \% \) ethanol로 추출한 후 여과(whatman paper No.2)하여 얻어진 ethanol 추출액을 감압 농축하여 발효 대두 추출물 (FSBE), 발효 아가콩 3호 추출물(FYAE), 발효 아가콩 4호 추출물(FBAE)를 각각 얻었으며 이를 본 연구의 시료로 사용하였다. 총 페놀 함량 분석 총 페놀 함량은 Singleton and Rossi method을 이용하여 Folin-Ciocalteu 시약이 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 분석하였다. FSBE, FYAE, FBAE \(~40 \mathrm{mg} \) 씩을 각각 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \)에 녹인 후 96-microwell plate (Nunc, Roskilde, Denmark)에 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하고 sodium carbonate \( (0.7 \mathrm{~M}) ~80 \mu \mathrm{l} \)를 혼합한 후 Folin-Ciocalteu regent (Folin-Ciocalteu : Water \( =1: 10 \mathrm{~v} / \mathrm{v}) 100 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 15분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응 후 microplate reader (Versa Max, USA)를 이용하여 \( 765 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 페놀 함량을 계산하였다. 총 단백질 및 당 함량 분석 단백질 함량 측정은 Bio-rad사의 protein assay kit를 사용하여 정량 하였다. 각 추출물의 농도가 \( 0.1 \sim 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 증류수로 희석하고, 이 시료 \( 0.1 \mu \mathrm{l} \)와 4배 희석한 protein assay reagent \( 0.5 \mu \mathrm{l} \) 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 방치한 후 595\( \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 BSA (bovine serum albumin) standard curve를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 단백질 함량을 구하였다. 총 당 함량은 시료 \( 2 \mathrm{ml} \)를 test tube에 넣고 \(5\%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \) phenol 수용액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 넣은 후 \( 95 \% \) 황산 \( 500\mu \mathrm{l} \)를 첨가하고 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 470\( \mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡은 glucose standard curve를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 당 함량을 구하였다.

본 연구의 재료는 아가콩 3호(노란 아가콩, YA와 아가콩 4호(검정 아가콩, BA)이며 72시간 발효된 콩중 혈전용해능이 가장 우수한 균주를 발효균주로 사용하였다. ethanol 추출액을 감압 농축하여 발효 대두 추출물 (FSBE), 발효 아가콩 3호 추출물(FYAE), 발효 아가콩 4호 추출물(FBAE)을 연구의 시료로 사용하였다. 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약이 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 분석하고, 단백질 함량은 protein assay kit를 사용하여 정량하여 측정한다.

Free radical scavenging activity Free radical scavenging activity의 측정은 Brand-Williams method을 이용하여 측정 하였다. \( 6 \times 10^{-5}\) M DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) MeOH용액 \( 195\mu \mathrm{l} \)와 증류수로 희석한 추출물 \( 5 \mu \mathrm{l} \)를 96-microwell plate에 혼합하였다 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였다. 실온에서 30 분간 방치한 후 \( 515 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였고 기존의 항산화제로 알려진 BHA (butylated hydroxy anisole), BHT (butylated hydroxytoluene), ascobic acid를 대조구로 사용하였다. 시료의 항산화 효능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다. Redcing power activity Reducing power activity의 측정은 Oyaizu method을 이용하여 측정하였다. 시료 \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 Phosphate buffer ( \( 200 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} \) \( 6.6\ \)) \( 50\mu \mathrm{l} \)와 \( 1 \% \) potassium ferricyanide \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시켰다. 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였다. 반응 종료 후 반응액에 \( 10 \% \) trichloroacetic acid 용액 \( 50\mu \mathrm{l} \)를 가하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 상등액을 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 취하여 증류수 \(100 \mu \mathrm{l} \)와 \( 1 \% \) ferric chloride \( 20 \mu \mathrm{l} \)을 혼합한 후 10분간 반응시킨 뒤 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. \( \beta \)-carotene-linoleic acid activity \( \beta \)-carotene-linoleic acid activity는 Miller method을 이용하여 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{mg} \)의 \( \beta \)-carotene을 chloroform \( 500 \mu \mathrm{l} \)에 용해시킨 후 \( 20 \mathrm{mg} \)의 linoleic acid 및 \( 100 \mathrm{mg} \)의 Tween 40을 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 chloroform을 감압 농축하여 제거하고 얻어진 잔류물에 증류수 \( 50 \mathrm{ml} \)를 가하여 정용한 것을 기질액으로 사용하였다. 기질액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)와 시료 \(200\mu \mathrm{l} \)를 96-microwell plate 가하여 혼합하였다. 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였다. \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시킨 후 \( 470 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, 시료의 항산화 효능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다. Hydrogen peroxide scavenging activity Hydrogen peroxide scavenging activity의 측정은 Miller method을 이용하여 2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonicacid (ABTS)-peroxidase system에서 측정하였다. 96-microwell plate에 시료 \( 80 \mu \mathrm{l}, ~10 \mathrm{~mM} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} ~20 \mu \mathrm{l} \), phosphate buffer (\( \mathrm{pH} \) \( 5.0 \), \( 0.1 \mathrm{M}) 100\mu \mathrm{l} \)를 넣고 혼합하였다. 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응하였다. 반응액에 \( 1.25 \mathrm{mM} \) ABTS \(30\mu \mathrm{l} \)와 \(1 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) peroxidase \( 30 \mu \mathrm{l} \)를 가하고 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응하여 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며 시료의 항산화 효능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다.

본 연구에서는 Free radical scavenging activity, Reducing power activity, Hydrogen peroxide scavenging activity의 측정을 각각 Brand-Williams method, Oyaizu method, Miller method를 활용하여 수행하였다. 각각의 방법을 통해 추출물의 항산화 효능을 산출하였으며, 반응 액에 필요한 특정 물질을 첨가하고 특정 온도에서 반응 시킨 후 흡광도를 측정하였다.

결과 및 고찰 혈전용해효소 생산 균주의 선별 및 혈전용해 활성 콩 발효물의 혈전용해효소 활성을 알아보기 위하여 동아대학교 연구실에서 보관 중인 10가지 균주(Bacillus. sp LC-1, LC-3, LC-5, CKJ, #15, #18, #20, #38, BB-1, sm26 를 이용하여 대두콩(SB) 발효를 수행하였다. 그 결과, Fig. 1에 나타낸 것과 같이 Bacillus sp. sm26로 발효한 발효물의 혈전용해효소가 \( 4.80 \pm 0.3 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)로 가장 높은 혈전용해 활성을 나타내었고 이 결과를 토대로 Bacillus sp. sm 26을 이용하여 YA 및 BA를 발효시키고 발효물의 혈전용해 활성을 조사하였다. 그 결과, FYA에서는 \( 6.38 \pm 0.5 \mathrm{unit} / \mathrm{ml}, \) FBA에서는 \( 6.82 \pm 0.5 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)의 혈전용해 활성을 나타내었으며 이는 발효 대두인 FSB에 비하여 각각 1.3배와 1.4배 높은 혈 전용해 활성을 나타내었다. 한편, FSB, FYA, FBA의 형태학적인 측면에서는 큰 차이점을 나타내지 않았으며 특히 시판의 콩 발효물인 낫토와도 차이점은 발견되지 않아 아가콩이 혈전용해 효소의 생산적인 측면과 형태학적인 측면에서도 적합한 재료인 것으로 사료된다. 총 페놀, 단백질 및 당 함량 분석 페놀화합물은 구조식에 hydroxyl group을 소유하며, 공명 안정화된 구조로써 전자를 수용하는 기작으로 항산화능에 직접적으로 기여한다. 발효 추출물들의 총 단백질, 당, 페놀 함량의 정량 분석 결과는 Table 2와 같다. 항산화 효능에 깊은 관여를 하고 있는 총 페놀 함량은 FYAE에서 \( 135.9 \pm 17.8○ \) \( \mathrm{g} / \mathrm{ml}\)로 나타났으며 이는 FSBE보다 2 배 높은 함량을 지니고 있는 것으로 나타났다. 총 단백질의 함량은 FYAE가 22.5±4.6\( \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로, FSBE 보다 5배 많은 단백질 함량을 보였다. 또한, 총 당 함량은 FBAE가 \( 108.9 \pm 25.3 \mathrm{~g} / \mathrm{ml} \)로 FSBE보다 2배 많은 함량을 나타내었다. Free radical scavenging activity 추출물의 항산화 효능을 DPPH에 대한 전자 공여능(electron donation ability, \%)으로 측정하였다. 전자공여작용은 활성 라디칼에 전자를 공여하여 식품들의 지방 산화작용을 억제하는 하고, 생체에서는 활성 라디칼에 의한 세포 손상과 노화를 억제한다. 추출물의 DPPH radical scavenging 활성의 결과는 Fig. 3와 같다. 추출물의 DPPH radical scavenging 활성은 농도의존적으로 농도의 증가에 따라 활성도 증가하였고 FBAE의 농도가 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)일 때 \( 79 \% \)로 가장 높게 나타났으며 FYAE도 \( 57 \% \)로 나타나 FSB에 비해 최대 2배 가량 높게 나타났다. 대조구로 사용된 gallic acid, BHA, BHT의 경우, 추출물과 동일하게 \( 1.0 \sim 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 측정하였을 때, gallic acid와 BHA는 모든 농도에서 \( 83 \% \) 이상의 높은 활성을 나타내었고, BHT는 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 83 \% \)의 활성을 보였으나 농도가 낮아질수록 그 활성이 다른 대조구에 비해 급격히 낮아졌다. Reducing power activity 활성 산소종 및 유리기에 전자를 공여하는 능력인 환원력은 항산화능과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있는데 이는 항산화 활성에 주요한 인자로 작용한다. 일반적으로 환원력이 큰 것일수록 전자공여능이 높다고 알려져 있고 전자공여능은 phenol성 물질에 대한 항산화 효능의 지표라고 할 수 있다. 발효 콩 추출물의 환원력을 Fig. 4에 나타내었다. 추출물의 농도가 높아질수록 환원력은 증가하였으며, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 FBAE가 \( 0.85 \pm 0.23 \)로 가장 높은 환원력을 나타내었으며 이는 대조구와 비슷한 환원력을 보였다. 또한, FYAE도 \( 0.55 \pm 0.42 \)로 FSB의 \( 0.45 \pm 0.11 \) 보다 높게 나타났다. 그러나 추출물의 농도가 줄어들수록 대조구에 비해 농도 의존력이 떨어지며 환원력은 감소하는 것으로 나타났다. \( \beta \)-Carotene-linoleic acid activity 추출물의 지질과산화 억제능을 \( \beta \)-carotene이 함유된 linoleic acid emulsion계에서 측정하였다(Fig. 5). 모든 추출물들 이 농도에 의존적인 지질과산화 억제능을 지니고 있었고 특히 FBAE의 경우에는 대조구인 galic acid, BHA와 비교하여 지질 과산화 억제능이 대등하게 나타났으며 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \(93\% \)로 galic acid와 BHT보다 높게 나타났다. 또한 FSBE와 비교하면 FBAE가 FSBE보다 3배 정도 높은 활성을 나타냈고 FYAE는 2.5배 높은 활성을 나타내었다. 생체 내에서 \( \mathrm{Fe} \)과 같은 금속류는 과산화수소와 빠르게 반응하여 hydroxyl radical 을 형성함으로써 2차 산화가 진행되는데, 세포막의 지질과산화 반응이 radical에 의해 진행되고 생체 내 DNA의 손상까지 초래한다는 것을 볼 때, hydroxyl radical 소거 및 지질과산화 억제능이 우수한 FBAE와 FYAE는 2차 산화물의 생성억제제로 유효할 것으로 사료된다. Hydrogen peroxide activiy 과산화수소에 대한 추출물의 소거능 효과를 Fig. 6에 나타내었다. Hydrogen peroxide \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)는 세포에 대하여 독성물질로 작용하며 전이 금속이온과 함께 활성산소 종들을 생산하며, 체내의 항산화 방어효소들의 작용으로 물로 전환되어 분해된다. 추출물의 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서는 FBAE가 \( 82 \% \)로 이는 FSBE와 비교해 4배 높은 효과를 나타내었으며 FYAE의 경우에도 FSBE보다 2.5배 높은 효과를 나타내어 FSBE에 비해 과산화수소 소거능이 뛰어 났으며 농도 의존적으로 활성의 증가를 나타내었다. 또한, galic acid, BHA, BHT와 과산화수소 제거 효과를 비교하였을 때 FBAE의 경우 그 효과가 높은 농도에서 대조구와 비슷한 효과를 나타내었다. 이상의 결과에서 기능성 콩 발효물인 FYA와 FBA는 FSB에 비하여 높은 혈전용해 활성을 나타내었으며 발효 콩 추출물인 FYAE와 FBAE도 FSBE에 비하여 높은 항산화 효능을 지니고 있었다. 특히, FBAE는 FYAE에 비하여 항산화 효능에 깊은 영향을 미치는 총 페놀성 화합물의 함량이 적었음에도 월등한 항산화 효능을 나타내고 있음을 알 수 있었다. 이는 FBAE에 존재하는 안토시아닌이 항산화 효능에 영향을 미치고 있는 것으로 사료되며 앞으로 아가콩을 이용한 발효물이 좋은 천연 항혈전과 항산화 식품으로서 높은 이용 가능성을 시사하였다.

동아대학교 연구실에서 보관 중인 10가지 균주를 이용해 대두콩 발효를 수행하여 콩 발효물의 혈정용해효소 활성을 알아보기 실험을 진행했다. 그 결과 FYA와 FBA에서 FSB에 비해 높은 혈전용해 활성을 나타내었다. 반면 이 셋은 형태학적 측면에서는 큰 차이가 발견되지 않았다. 또, 항산화능에 직접적으로 기여하는 총 페놀과 단백질 및 당 함량면에서는 FYAE가 FSBE 보다 높은 수치를 나타내었다. 그리고 추출물의 지질과산화 억제능을 측정한 결과 FBAE와 FYAE는 2차 산화물의 생성억제제로 유효하다는 결론을 얻었다. 따라서 아가콩을 이용한 발효물이 항혈전, 항산화 식품으로 높은 이용 가능성이 있음을 알수 있다.

서 론 현대과학의 발달로 인해 건강 장수생활의 혜택이 커지면서 식품이 단지 영양공급과 기호성을 충족시키는 기본적인 목적을 넘어서 꾸준한 일상섭취를 통하여 잠재적인 질병예방 및 치유의 능력까지 갖춘 기능성에 대한 연구가 중점적으로 이루어지고 있다. 특히 노화, 암, 뇌혈관과 심혈관계 질환 등은 free radical의 생성과 관련이 있다는 사실이 밝혀짐에 따라 항산화 효과를 가지는 식품의 섭취를 통해 노화를 지연시키고 이러한 질병을 예방, 치료하고자 하는 노력이 증가하고 있는 실정이다. Free radical은 생체내의 산화적 스트레스에 의해 생성되는데 세포 구성성분과 강하게 반응하여 세포와 조직에 손상을 가하고 지속적인 DNA 손상을 주어 각종 질병을 유발하게 된다. 생체는 이러한 free radical로부터 생체를 방어할 수 있는 superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPX), catalase (CAT), glutathione reductase, glutathione-S-transferase 등의 항산화 효소를 가지고 있으나, 과도한 스트레스에 노출되어 있는 현대인에게는 더욱 효과적이고 안전한 식이성 항산화제가 필요하다. 근래에 과일과 채소 등에 포함되어 되어있는 비타민 C, 비타민 E, 폴리페놀 등과 같은 천연 항산화물질들은 순환계 질병과 암 발생율을 감소시킨다고 보고된 바 있어, 자연에 널리 분포되어 있는 천연 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 근래에 단백질과 지방질을 보충하는데 우수한 대두(Glycine max L.)는 대표적인 식물성 단백질원으로써 saponin, phyticacid, isoflavones, hemaglutinins 등의 다양한 생리활성 물질을 포함하고 있어 그 기능성에 대한 관심이 높아졌다. 과거 대두를 이용한 전통발효식품들은 육류의 섭취량이 부족한 동양에서는 중요한 단백질과 지방질의 공급원으로 고초균이 생산하는 효소에 의해 단백질과 당질이 분해되어 끈끈한 점질물이 형성되면서 특유의 맛과 냄새를 가지게 된다. 점질물은 주로 glutamic acid로 이루어져 칼슘 흡수를 돕고 탁솔이라는 항암 물질을 효율적으로 운반한다. 또한 노화 방지의 항산화 효과와 인슐린 분비를 원활히 하고 유산균 증식을 돕고 콜레스테롤 수치를 떨어뜨린다. 발효과정 중 분비되는 nattokinase는 fibrin을 강력하게 분해하는 효소로 밝혀지면서 혈전용해제로서 이용되며, 체중감소 및 혈압강하 효과 등을 나타내고 있다. 특히, 대두에 다량 함유된 isoflavone은 높은 항산화 효과 등 다양한 기능성을 지니고 있어 새로운 건강식품으로써 관심이 모아지고 있다. 한편, 황영현 등에 의해 새로이 육종 되어진 아가콩은 높은 질병 저항성과 isoflavone 함량을 지니고 있는 신품종 콩으로써 높은 항산화 활성 등을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 연구에서는 isoflavone의 함량이 일반 대두에 비해 높게 육종된 아가콩 3호(노란 아가콩) 및 4호(검정 아가콩)의 기능성을 조사하고자 혈전용해능이 우수한 Bacillus sp.의 선별과 이를 활용하여 대두, 아가콩 3호 및 4호를 발효시켜 생산된 점질물의 항산화 효과를 알아보았다.

현대 과학의 발전으로 인해 건강과 장수에 대한 이점이 커지면서 식품의 기능성 연구가 중요해지고 있다. 이제 식품은 영양 공급과 맛을 넘어서 잠재적인 질병 예방과 치유 능력을 갖추는 기능성을 강조하고 있다. 특히 노화, 암, 뇌혈관과 심혈관 질환과 같은 질병은 활성 산소 물질인 자유 라디칼과 관련이 있다는 사실이 알려져, 항산화 작용을 갖는 식품 섭취의 중요성이 증가하고 있다. 대두는 단백질 보충과 지방질 보충에 우수한 원료로 알려져 있으며, saponin, phyticacid, isoflavones, hemaglutinins 등 다양한 생리활성 물질을 포함하고 있어 그 기능성에 관심이 높아졌다. 발효 과정 중 생성되는 나토키나아제는 혈전을 분해하는 강력한 효소로 알려져 있으며, 체중 감소와 혈압 강하 효과 등을 나타냅니다. 이에 따라 이 연구에서는 isoflavone 함량이 높게 육종된 아가콩을 활용하여 혈전용해능이 뛰어난 Bacillus sp.를 선별하고, 대두와 아가콩을 발효시켜 생산된 점질물의 항산화 효과를 조사하였다.

마늘은 \( 2-4 \% \) 첨가 고콜레스테롤 식이로 사육한 흰쥐의 간의 콜레스테롤 함량을 \( 30 \% \) 지하시켰다고 보고하고 있으나 콜레스테롤 급여 시 마늘을 \( 1 \%(17) \) 및 \( 3 \%(18) \) 첨가한 경우 간의 총콜레스테롤과 중성지방의 함량에는 차이가 없었다고 보고하였다. 토끼의 경우 마늘첨가로 간 조직중의 콜레스테롤 감소가 일어난다 하더라도 간의 콜레스테롤 합성 저하보다는 neutral 또는 acidic sterol로의 전환과 관련이 있으며 이는 간의 콜레스테롤 함량을 반영하지 않는다고 하였다. 또 흰쥐 를 대상으로 마늘가루가 지방생합성에 미치는 영향을 알아보 기 위해 \( { } ^ { 14 } \mathrm { C } \) 가 label된 acetate를 사용하여 radioactivity를 측정한 결과 간 지질로부터 incorporation된 \( { } ^ { 14 } \mathrm { C } \) 가 대조군보다 마늘 첨가군에서 유의적으로 낮았으며 이 결과는 마늘이 hepatic lipogenesis를 억제하는 효과가 있음을 암시한다고 추정 하였다. 이와 같이 마늘급여에 의한 간의 지질 감소효과에 대하여 여러 선행연구에서 비슷한 결과를 보이고 있다. 이상의 결과를 종합해 보면 흑마늘 추출물 급이에 의해서 간의 지질농도의 변화는 혈액의 지질 농도의 변화만큼 큰 차이가 나타나지 않음을 알 수 있었다. 직접적인 원인은 알려겨 있지 않으나 소장의 지방소화와 홉수경로에서 흑마늘의 유기 유황화합물이 지방의 분해효소의 활성을 억제하거나, 지방의 배설을 촉진할 수 있다는 가능성에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다. 결론적으로 본 실험에서 흰쥐를 6주 동안 고지방식 이와 함께 흑마늘을 첨가하여 공급하였을 때 혈액의 지질의 농도가 크게 개선되었음을 확인할 수 있었다. 그리고 실험조건에서 흑마늘 급이량을 비례적으로 차이를 두어 급여했음에도 불구하고 각 농도에 따른 급이군들 간에 차이는 없었다. 따라서 흑마늘에 의한 고지혈증 개선작용은 간 조직의 지방합성을 억제함으로써 혈중 지질농도를 저하시킨다고 판단되며, 흑마늘을 액상형태로 지질대사에 어떠한 영향을 미치는 것에 대한 연구는 앞으로 흑마늘의 가능성 식품의 개발을 위한 새로운 시도라고 판단된다. 초록 : 흑마늘 추출물에 의한 고콜레스테롤혈증 유발 흰쥐의 지질대사의 개선효과 본 연구는 흑마늘 숙성기간 중의 흑마늘의 지표물질이라 할 수 있는 S-allylcysteine (SAC)의 함량을 측정한 다음 흑마늘 추출물이 고지방식이로 유발된 흰쥐에 미치는 영향을 조사하였다. 흑마늘을 10일, 15일 및 20일 숙성 중 S-allylcysteine의 함량은 15일 일 때가 가장 높았으며, 관능검사 결과도 숙성 15일째가 좋았다. 고지방 식이만 공급된 동물군을 정상군, 위약군 그리고 고지방식이에 흑마늘 추출물의 첨가 농도에 따라 저농도군, 중농도군 및 고농도군으로 5그룹으로 나누어 6주간 사육하였다. 정상군, 실험군 모두 체중은 지속적으로 증가하였으나 그룹 간의 유의적 차이는 없었고 흑마늘 추출물 첨가 급이군이 정상군에 비하여 체중 및 식이 효율에 유의적 차이는 없었다. 혈중 총지질은 흑마늘 추출물의 첨가 농도에 관계없이 감소하였으며, 총 콜레스테롤 및 중성지방도 흑마늘 추출물의 첨가 농도가 높을수록 유의적으로 감소하였다. 흑마늘 추출물 급이에서도 정상군에 비하여 HDL-콜레스테롤이 유의적으로 증가하였고 LDL-콜레스테롤은 감소하였다. 간의 총지방, 총 콜레스테롤 및 중성 지방의 함량은 정상군에 비하여 흑마늘 추출물을 급이한 저농도, 중능도, 고농도 군에서 모두 감소되는 경향을 나타내었다. 이상의 실험결과를 보면, 6주 동안 고지방식이로 유도된 고 콜레스테롤혈증은 동물 실험에서 흑마늘 추출물 첨가가 저농도, 중농도 및 고농도에서 혈액과 간의 중성 지방과 총콜레스테롤을 감소하는 효과가 있었으므로 체내지질 개선효과를 갖는 식품 소재로서의 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

흑마늘 추출물의 양에 따른 간의 지질농도 변화는 혈액의 지질 농도 변화보다 크지 않음을 확인하였다. 6주간 고지방식과 함께 흑마늘을 투여하면 혈중 지질 농도가 크게 개선되는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 보아, 흑마늘은 간 조직의 지방 합성을 억제하며, 혈중 지질 농도를 감소시키는 효과가 있을 것으로 추정된다. 이로부터 액상 형태의 흑마늘이 지질 대사에 미치는 영향에 대한 연구는 식품 개발에 새로운 방향을 제시할 것으로 보인다.

사육 및 식이 실험동물은 대한 바이오 코리아에 구입하여 동일한 환경에서 고형배합사료(Rat chow, 삼양사)로써 사육한 체중증가가 비슷한 Sprague-Dawley종 수컷 횐줘로, 동물사육실은 온도 \( 22 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도 \( 45 \% \) 내외로 유지시켰으며, lighting cycle은 12시간 주기로 개인별 cage로 자유롭계 물과 표준식이를 먹도록하였다. 실험식이 공급 전날 체중에 따른 난괴법으로 7 마리씩 마우스를 5 group으로 나누어 AIN-76 기본식이에 고지방식이를 공급하였고, 고지방식이의 동물실험군은 정상군(normal) 고지방식이와 유사 흑마늘 농축액 \( (2 \% \) 카라멜 색소용액)만 급이한 위약군(placebo), 그리고 고지방식이와 흑마늘 추출물의 양에 따라 저농도군(low dose), 중농도군(medium dose), 고농도군(high dose)으로 나누었다(Table 1). 흑마늘 추출물은 자연스럽고 자발적으로 섭취를 유도하기 위해서 동물이 매일 먹는 물을 통해서 공급하였다. 먼저 정확한 공급량 계산을 위해서, 실험동물의 1 주일간의 평균 물 섭취량을 측정 \( ( \mathrm { ml } / \mathrm { day } ) \) 한 후, 이 물을 매개체로 혹마늘 엑스분의 공급랑을 계산하였다. 투여랑은 사람-동물 체표면적[bodysurface area (BSA), \( \mathrm { ~m } ^ { 2 } \)] 비로 계산하였다. 즉, 성인 \( (70 \mathrm { ~kg } \)몸무게와 키 \( 173 \mathrm { ~cm } \) 를 기준)의 평균 BSA 은 약 \( 1.844 \mathrm { ~m } ^ { 2 } \) 이고, \( 300 \mathrm { ~g } \) 흰쥐의 BSA 가 약 \( 0.040 \mathrm { ~m } ^ { 2 } \) 인 것을 기준하여 계산된 사람과 흰쥐의 BSA 비가 약 46 이었다. 사람의 경우 매일 음료는 흑마늘 추출액 2 포 \( (150 \mathrm { ml } ) \) 를 섭취한다고 가정하여, 46 비율에 해당되는 \(3.26 \mathrm { ~ml } \)가 동물 섭취 당량(animal intake equivalent)이 된다. 이 실험에서는 흑마늘 추출물을 사람이 음료 형식으로 마실 수 있는 양을 기호에 따라 3 그룹으로 나누었다. 사람의 \( 75 \mathrm { ml } \) 에 해당하는 앙 \( (1.63 \mathrm { ml } / \mathrm { rat } ), 150 \mathrm { ml } \) 에 해당하는 양(3.26 ml/rat), 그리고 \( 300 \mathrm { ml } \) 에 해당하는 양( \( (6.52 \mathrm { ml } / \mathrm { rat } ) \) 을 각각 저농도군(low dose), 중농도군(medium dose), 고농도군(high dose)로 구분하여 해당 동물에 6 주간 매일 신선하게 공급하였다. 1 주일간 실험동물의 하루 평균 물 섭취랑이 약 25 \( \mathrm { ml } \) 이었고 매일 섭주하는 물 \( 25 \mathrm { ml } \) 당 상기된 해당 흑마늘 추출 물을 희석하여 공급하였다.

체중 증가가 비슷한 Sprague-Dawley종 수컷 횐쥐를 실험동물로 하여 고지방 식이와 흑마늘 추출물을 섭취하는의 양에 따라 정상군, 위약군, 저농도군, 중농도군, 고농도군의 5그룹으로 나눈 후 마시는 물을 통해 흑마늘 추출물을 희석하여 정확한 양을 공급하는 방식으로 사육 및 식이 실험을 진행하였다.

생마늘과 흑마늘의 S-allylcysteine (SAC)의 함량 비교 생마늘을 고은으로 숙성시킬 때 높은 온도에 의하여 휘발성유황화합물은 거의 대부분 소실되고 비휘발성 성분만 남게 된다. 흑마늘의 비휘발성 성분에는 페놀성 화합물, 멜라노이딘 색소, 사포닌, 무기염류 등이 있으나 흑마늘의 기능적 특성을 가지는 대표적인 지표성분이 SAC 이라고 할 수 있다. 흑마늘의 주요 성분으로 알려져 있고, 기능성도 잘 알려진 SAC 를 지표물질로 지정하고 제품의 표준화를 위하여 흑마늘 숙성기간에 따른 SAC 의 함량변화를 비교하였다. Fig. 1은 생마늘 및 흑마늘에 들어 있는 SAC의 chromatograms을 나타낸 것으로 생마늘의 SAC peak 보다 흑마늘에서의 SAC peak가 높은 것으로 나타났다. 생마늘과 흑마늘 숙성기간인 10일, 15일 및 20일 동안 숙성시 각종 흑마늘의 성분 중, 유기 유황화합물의 지표물질로 알려진 SAC의 함량을 Fig. 2 에 나타내었다. SAC의 함량을 보면 생마늘일 때 \( 30 \mathrm { ppm } \) 이었으나, 숙성 10 일, 15 일, 20 일째는 각각 \( 952 \mathrm { ppm } , 1140 \mathrm { ppm } , 746 \mathrm { ppm } \) 으로 나타났다. 생마늘에서는 SAC가 미량이었으나 숙성 과정을 거치면서 숙성 10일, 15일째까지 급격히 증가하다가 숙성 20 일째는 감소하였다. 이와 같이 숙성기간 중 SAC 의 함량 변화가 있는 것은 숙성기간에 따른 마늘의 유기유황성분 중 회발성 성분은 소실되고 수용성 성분인 SAC가 증가하다가 숙성 기간이 길어지면 그 성분도 장기간 고온에서 불안정하여 소실되는 것으로 사료된다. 따라서 흑마늘을 가공할 때 15일 동안 숙성하는 것이 관능검사 결과가 가장 좋았고, SAC 함량도 가장 높았으므로 15 일째 숙성 흑마늘을 동물실험에 사용하였다. 마늘의 주 성분인 allicin은 마늘을 다지거나 조리가공할 때 allinase에의하여 매우 불안정하고 휘발성이 강한 allicin이 생성된다. Allicin은 수용성 성분인 SAC, S-allylmercaptocystein (SAMC) 등이 생성되고, 휘발성 성분인 diallylsulfide, diallyldisulfide, diallyltrisulfide 등은 거의 소실되고 흔적 정도로 남게 된다. 흑마늘에 많이 들어있는 수용성 성분인 SAC는 항산화 항암, 인지기능향상등에 효능이 뛰어난 것으로 보고 하였다. 그리고 SAC는 열, \( \mathrm { pH } \), 빛에 안정하며 인체실험에서도 혈중 농도가 24시간 이상 지속될 정도로 지속성 유기 유황화합물 로 알려져 흑마늘의 기능성을 높이는데 큰 역할을 할 것으로 생각된다.

본 연구에서는 흑마늘의 주 성분인 SAC의 함량 변화를 관찰하였고, 이를 통해 흑마늘 제품의 표준화에 대한 연구를 수행하였다. 숙성 기간에 따른 SAC 함량의 변화를 분석한 결과, 15일 동안 숙성한 흑마늘에서 가장 높은 SAC 함량 및 최적의 관능적 특성을 보여, 이를 동물 실험에 사용하였다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 SAC가 갖는 항산화, 항암, 인지기능 향상 등의 효능에 대해 논의하였다.

따라서 흑마늘 중에 높은 함량이 들어있는 SAC은 흑마늘의 주요 기능성을 갖는 대표적인 성분으로 숙성 흑마늘 제품의 건강 기능성 지표물질로 이용이 가능하다. 체중 및 장기의 중량변화 고지방 식이로 고지혈증을 유도시킨 흰쥐에 15 일 숙성한 흑마늘 첨가식이를 6주 급이 하는 동안 체중 변화를 Table3 에 나타내었다. 정상군, 위약군 몇 실험군 등 모든 실험 동물군에서 6주 동안 실험 종료시점까지 지속적으로 체중이 증가하였다. 실험 시작한 날부터 6주째 동안 최종 몸무게를 보면 정상군은 \( 3.85 \pm 0.32 \mathrm { ~g } / \) day 이였으나, 정산군에 비하여 위약군은 \( 4.13 \pm 0.45 \mathrm { ~g } / \) day 증가하였으며, 흑마늘 추출물 저 농도군에서는 \( 4.12 \pm 0.48 \mathrm { ~g } / \) day, 중농도군이 \( 4.13 \pm 0.47 \) \( \mathrm { g } / \) day, 고농도군이 \( 4.17 \pm 0.38 \mathrm { ~g } / \) day으로 각가 증가하였다. 그러나 흑마늘의 저농도군, 중농도군, 고농도군 간에는 차이 는 없었다. 연구보고에 의하면 생마늘과 익힌 마늘은 각각 \( 3 \% \) 수준으로 첨가한 식이 실험에서 체중과 마늘 섭취량에 있어 대조군과의 유의적 차이가 없었다고 하였고 또한 흰쥐의 식이에 있어 생마늘과 가열마늘 급여군 간에도 유의적 차이가 없었다고 한 보고와 유사한 경향을 나타내었다. 본 연구에서는 실험 기간 동안 모든 실험 동물군에서 체중 이 지속적으로 증가하였고 실험군 간의 비교에서는 대조군 에 비해 실험군의 평균체중이 약간 증가하는 경향이었으나 유의적 차이는 찾아 볼 수 없었다. 고지혈증을 유도한 흰쥐 에 흑마늘을 첨가하여 급여한 흰쥐의 간, 심장, 신장의 중랑 을 측정한 결과를 Table 3에 나타내었다. 간장의 경우 정상 군에 비하여 위약군에서 증가하였으며 저농도, 중농도, 고농도로 급이한 흰쥐의 간장에서는 유의적 차이가 없었으며 심장 및 신장의 무게도 대조군에 비하여 약간씩 증가하였으나, 큰 차이는 없었다. 정상군이나 위약군에 비하여 흑마늘 추출물의 급이군의 장기 무게의 변화는 거의 없었다. 혈청 중의 지질의 함량변화 흑마늘 추출물을 저농도군, 중농도군, 고농도군 등 첨가량을 달리하여 6 주간 급여 한 후 흰쥐의 혈청의 중성지방, 총콜레스테롤, HLD-cholesterol, LDL cholesterol 함량을 측정한 결과는 Table 4 와 같다. 중성지방의 함량은 위약군이 \( 74.62 \pm \) \( 21.56 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \), 정상군의 \( 34.05 \pm 22.75 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 에 비하여 높았고 흑마늘 추출물의 급여시 저농도군 \( 45.21 \pm 4.37 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \), 중농도군 \( 45.38 \pm 18.35 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \), 고농도군 \( 43.49 \pm 17.68 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 위약군에 비하여 상당히 낮았으나 첨가농도에 따른 함량 변화는 거의 없었다.

고지방 식이로 고지혈증을 유도시킨 흰쥐에 15 일 숙성한 흑마늘 첨가식이를 6주 급이 하는 동안 체중 변화를 Table3 에 나타내었는데, 실험 기간 동안 모든 실험 동물군에서 체중 이 지속적으로 증가하였고 유의적 차이는 찾아 볼 수 없었다. 흑마늘 추출물을 저농도군, 중농도군, 고농도군 등 첨가량을 달리하여 6 주간 급여 한 후 흰쥐의 혈청의 중성지방, 총콜레스테롤, HLD-cholesterol, LDL cholesterol 함량을 측정한 결과 첨가농도에 따른 함량 변화는 거의 없었다.

식이섭취량 및 식이효율 실험기간 동안 식이섭취량은 매일 일정시각에 측정하였고 체중은 1 주일에 1 회 일정 시각에 측정하였다. 체중 증가량 \( ( \mathrm { g } ) \)은 같은 기간 동안의 총 식이섭취량 \( ( \mathrm { g } ) \)으로 나누어 식이효율을 구하였다. 혈장, 간 및 변의 지질 농도 혈장의 총 지방 농도는 Frings법으로 측정하였으며, 혈장의 중성지방 농도는 glycerol-3-phosphate oxidase(GPO)-PAP법을 이용한 분석 kit (영동제약)로 \( 546 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정(Genesys 10, spetronic, USA)하였다. 혈장 의 콜레스테롤 농도는 효소법을 이용한 분석 kit (영동 제약)를 이용하여 spectrophotometer (Genesys 10, spetronic, USA)로 \( 500 \mathrm { ~nm } \) 에서 비색정량 하였고 HDL-콜레스테롤 농도 는 LDL (Low-Density Lipoprotein) 및 VLDL (Very Low Density Lipoprotein)을 침전시킨 후 효소법로 측정하 는 분석 kit (아산제약)를 이용하여 \( 500 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정 (Genesys 10, spetronic, USA)하였다. 간의 총 지방 농도는 Bligh와 Dyer법으로 측정하였으며, 간의 중성지방과 콜레스테롤 농도는 위에서 추 출한 총 지방을 methanol로 녹여 혈장에서와 같은 방법으로 kit를 이용하여 측정하였다. 통계처리 자료의 통계처리는 SPSS (Statistical Package for the Social Science)를 이용하여 각 실험군의 평균값 \( \pm \) 표준편차로 나타냈으며 one-way ANOVA로 처리한 후 Duncan's new multiple test에 의해 실험군 간의 차이를 검증하고, \( p \) 값이 \( 0.05 \) 이하일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 결과 및 고찰 흑마늘의 제조 생마늘을 흑마늘로 숙성시킬 때 자동 숙성룸의 온도 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 상대습도 \( 90 \% \) 로 조절하여 숙성하였다. 숙성하는 동안 마늘 중의 휘발성성분은 소실되고, 마늘에 함유된 당분과 아미노산의 반응으로 갈변화가 일어나 시간 경과에 따라 흑갈색으로 변하였다. 본 실험에서는 숙성기간에 따른 풍미를 조사하여 제품의 규격기준의 표준화를 위하여 생마늘을 10 일 15 일 및 20 일 숙성 기간을 달리하여 흑마늘을 제조하였을 때 관능검사를 실시하였다. 마늘 숙성 시 숙성기간을 달리한 숙성 흑마늘의 색(color), 풍미(flavor), 외관(appearance) 및 종합적 기호도(overall acceptability)를 흑마늘 숙성을 10일, 15일 및 20일 숙성기간에 따른 관능평가를 실시한 결과 생마늘과 흑마늘 사이의 색, 외관은 유의적 차이가 있었으나 숙성기간에 따른 변화는 거의 비슷한 경향을 나타내었다(Table 2). 풍미에서는 숙성 10일, 15일 및 20일 등 숙성기간이 길어질수록 더 좋았으 며, 종합적 기호도에서도 숙성기간이 길어질수록 관능평가가 좋았다. 그러나 실제적으로 숙성 15일과 숙성 20일 시켰을 때 기호도는 비슷하였으나 실제 생산 공장에서는 경제적 생산을 위하여 숙성 15일째 흑마늘이 가장 적당하다고 생각된다.

실험기간 동안 식이섭취량은 매일 일정시각에 측정하였고 체중은 1 주일에 1 회 일정 시각에 측정하였고, 혈장의 총 지방 농도, 혈장의 중성지방 농도, 혈장의 콜레스테롤 농도, HDL-콜레스테롤 농도, 간의 총 지방 농도, 간의 중성지방과 콜레스테롤 농도의 흡광도를 측정하였다. 숙성 흑마늘의 제품 규격기준의 표준화를 위하여 본 실험에서는 생마늘의 숙성기간을 다르게 하여 흑마늘을 제조하였을 때 관능검사를 실시하였다.

본 연구는 흑마늘 숙성기간에 따른 S-allylcysteine의 함량을 조사함과 동시에 흰쥐에 고지방 콜레스테롤 식이를 급여하여 고지혈증을 유발시켜 흑마늘을 저농도, 중농도, 고농도로 구분하여 급이한 후 혈중 지질 개선효과를 조사하였다. 재료 및 방법 재료 본 연구에 사용한 마늘은 2010년 6월에 경남 남해에서 난지형 마늘을 구매하여 실힘에 사용하였다. 흑마늘의 제조 통마늘을 흐르는 물에 한 번 씻은 다음 스텐레스 제 밀폐용기에 담은 후 온도 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 90 \% \) 상태로 조걸된 항온항습 숙성실(Asung Co. Seoul, Korea)에 옮겨 10일, 15일,20 일 동안 숙성시켰다. 훅마늘 \( 150 \mathrm { ~g } \) 에 물 \( 375 \mathrm { ml } \) 를 넣은 후 환류 냉각기가 부착된 추출기에서 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 시간 추출한 후 여과한 다음 추출액 농도를 12 Brix로 조절한 후 실험에 사용하였다. HPLC에 의한 S-allylcysteine (SAC)의 분석 흑마늘 추출액의 전처리 흑마늘에 동량의 증류수를 넣어 분쇄하고 착즙한 후 착즙액을 \( 17,600 \times g \) 에서 \( 10,000 \mathrm { rpm } \) 으로 30 분간 원심분리 (HMR-2001V, Hanil Industrial Co., Inchon, Korea)하여 상층액만을 취하여 최종농도가 \( 70 \% \) 가 되도록 에탄올을 가하여 침전을 시킨 후 상층액을 농축하여 에탄올를 제거하였다. 그후 methylene chloride를 넣은 다음 약 20 분간 교반한 후 \(10,000 \mathrm { rpm } \)에서 15분간 원심분리(HMR-2001V, Hanil Industrial Co., Inchon, Korea)하여 물층과 methylene chloride층을 분리하였으며 물층을 rotary vacuum evaporator (N-H Series, Eyela, Japan)로 농축하여 methylene chloride층을 완전히 제거하였다. 분석 시 \( 0.2 \) \( \mu \mathrm { l } \) nylon membrane filter로 여과하여 사용하였다. 분석조건은 HPLC 분석방법[2]으로 이동상은 A용매[ \(20 \mathrm { mM } \) sodium phosphate monobasic dihydrate \( + 10 \mathrm { mM } \) so-dium 1-heptane-sulfonic acid, \( \mathrm { pH } 2.1 \) (adjusted with ortho-phosphoric acid \(85 \% \) ]와 B용매[A + acetonitrile \((50:50, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)] 로 하여 컬럼오븐의 온도는 \( 38 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 이동상의 유속은 분당 \( 0.4 \mathrm { ml } \)이고 UV 흡광도 \( 208 \mathrm { ~nm } \) 에서 alliin, deoxyalliin, alliicin, dipeptide와 같은 마늘 성분의 표준물질을 분석하였다.

이 연구는 흑마늘 숙성기간과 S-allylcysteine의 함량, 그리고 고지방 콜레스테롤 식이로 인한 고지혈증 유발 및 흑마늘 급여에 따른 혈중 지질 개선효과를 살펴본다. 통마늘은 스테인리스 밀폐용기에 담겨 70℃, 상대습도 90%의 조건에서 10일, 15일, 20일 동안 숙성되며, HPLC 분석방법[2]을 통해 alliin, deoxyalliin, alliicin, dipeptide 등 마늘 성분의 표준물질이 분석된다.

서 론 현대 사회는 의약의 발달로 인간의 평균수명이 늘어나고 있으나 주요 사망원인이 되는 질병은 변하고 있다. 우리나라는 수년간 눈부신 경제성장으로 생활양식이 편리해지고 식생활이 서구화 되면서 각종 만성병이 증가하고 있으며 고혈압, 동맥경화 등 혈액순환기계 질환이 주요 사망 원인이 된다. 혈액순환기계 질환의 원인은 고혈압, 당뇨병, 비만과 함께 고지혈증을 들 수 있으며 그 중에서도 콜레스테롤의 농도가 주요한 위험인자로 알려져 있다. 실제로 콜레스테롤의 수치와 건강과의 관계를 연구한 보고를 보면 혈액 중 콜레스테롤의 수치가 \( 1 \mathrm { mmol } / 1 \) 증가 할 때 마다 허혈성 뇌졸중으로 인한 사망률은 \( 20 \% \), 심근경색으로 인한 사망률은 \( 48 \% \) 증가한다고 보고 하였다. 혈청 콜레스테롤과 중성지방 농도는 시대적 변화에 따라 나라별, 연령별, 성별, 지역별로 다르게 나타나지만 특히 경제 성장이 빠른 우리나라의 경우 혈청 콜레스테롤과 중성지방 농도의 폭은 매우 넓으며, 그 평균치가 해마다 높아지고 있다. 통계에 의하면 우리나라 남자의 경우 중성지방과다가 이상 소견 순위에서 1 위를 나타내어 혈청 콜례스테 롤과 중성지방이 많이 늘어난 것을 암시하고 있다. 따라서 고지혈증과 관련하여 식품 섭취를 통한 고콜레스테롤을 조절하거나 혈청 콜레스테롤을 저하시키는 식품성분중의 기능성이 있는 식품의 섭취가 바람직하다. 마늘은 특유의 냄새와 독특한 맛으로 인하여 예로부터 향신료와 민간약으로 널리 사용되어 왔으며 최근 들어 높은 사망률을 나타내는 여러 종류의 암이나 고혈압, 동맥경화, 혈중지질 및 콜레스테롤 저하효과, 항혈전의 예방과 치료에 효능이 있다고 알려지면서 많은 연구가 진행되고 있다. 마늘의 유효성분인 allicin은 마늘 특유의 휘발성 향기 성분으로 마늘조직이 파괴될 때 allinase에 의하여 생성되며 allicin이 분해되면 diallyl sulfide, diallyl disulfide, dithiin, ajoene 등의 휘발성 성분과 S-allylcysteine (SAC), S-allylmercaptocysteine 등의 수용성 유황화합물로 분해되어 효능을 나타낸다. 마늘은 기능성은 좋으나 특유의 거북스런 냄새 때문에 즐겨먹지 못하였으나 요즘 마늘의 화학적 성분의 특성을 살린 흑마늘이 인기리에 팔리고 있다. 흑마늘은 생마늘을 높은 온도와 습도에서 장시간 동안 숙성시키면 생마늘 특유의 거북한 냄새는 사라지고 신맛, 단맛, 쓴맛, 매운 맛이 어우려져 먹기 좋은 새콤 달콤 매콤한 맛이 난다. 흑마늘은 겉은 통마늘과 같은 모양 그대로 유지하고 있으나 속이 검다고 하여 붙여진 이름이다. 흑마늘은 오랜 숙성기간을 거치면서 마늘의 당 성분과 아미노산이 비효소적 갈변반응을 일으켜 melanoidins이 생성되고 휘발성 물질은 거의 소실되며 총 phenol, 플라보노이드가 증가하고 수용성 성분인 S-allylcysteine (SAC), S-allyl melcaptocystein (SAMC) 등이 생성되어 다른 기능성을 갖는다. 흑마늘의 대표적인 수용성 유황화합물인 SAC는 항산화, 암세포 증식억제, 인지기능향상, 간보호 등의 기능성이 보고되었다.

현대 사회의 만성병인 혈액순환기계 질환의 주요 위험인자는 콜레스테롤의 농도로 알려져있고, 예로부터 향신료와 민간약으로 사용되어온 마늘은 암, 고혈압, 동맥경화, 혈중지질 및 콜레스테롤 저하효과, 항혈전의 예방과 치료에 효능이 있다고 알려지면서 많은 연구가 진행되고 있다. 생마늘을 높은 온도와 습도에서 장시간 숙성시켜 먹기 좋은 맛이 나는 흑마늘은 숙성을 통해 melanoidins, 총 phenol, 플라보노이드, SAC, SAMC 등이 생성되어 항산화, 암세포 증식억제, 인지기능향상, 간보호 등의 기능성이 있다고 보고되었다.

이와 유사한 연구에서 돈지로 고콜레스테롤을 유도한 흰쥐 에서 혈중 콜레스테롤 함량은 \( 121.3 \pm 15.3 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 및 \( 103.4 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 유의적 감소를 나타내었다고 하였고 또한 처리 조건을 달리한 마늘의 첨가 급이에도 혈첨 콜레스테롤의 저하 에 유의적 효과가 있었다고 보고하였다. 또한 고지혈증을 유도한 흰지에 고온에서 가열처리한 마늘과 생마늘을 급여한 경우를 비교한 실험에서 가열처리한 마늘을 급여한 경우 혈중 콜레스테롤의 함랑이 낮다고 보고한 바와 같이 본 실헙결 과에서도 마늘을 장기간 가뎔, 숙성하여 만든 흑마늘도 헐중 콜레스테롤의 저하를 확인한 바 숙성기간 따른 상관성이 있는 것으로 판단된다. LDL 콜레스테롤 농도는 대조군에 비하여 흑마늘 추출물 급이군에서 감소되기는 하였으나, 흑마늘 추출물의 첨가량에 따른 유의적 차이는 없었다. 여러 연구자들의 마늘을 이용한 다양한 실험에서 마늘이 고지혈증 개선작용이 있다고 보고하였다. 본 연구의 흑마늘의 중성지방이나 콜레스테롤 감소 현상은 다른 연구자들의 실험결과와 유사한 경향을 나타낸다 고 판단된다. 본 실험에서는 흑마늘 추출물을 급이한 실험군 에서는 정상군과 비슷한 경향으로 증가한 것으로 나타나 마늘의 숙성 중 마늘성분의 화학적 변화를 일으켜 다른 새로운 성분이 많이 생성된 것으로 생각된다. 고지혈증 관련 양파를 이용한 실험에서 양파의 주요 생리할성성분인 S-methylcysteine-sulfoxide를 체중 \( \mathrm { kg } \) 당 \( 200 \mathrm { mg } \) 을 \( 10 \% \) 고콜레스테롤 식이를 급이한 결과 고지혈증이 개선되었다고 하였으며, 특히 이러한 개선효과는 지방조직의 lipoprotein lipase의 활성을 억제하거나, free fatty acid의 감소에 구실을 할 것으로 보고하 였다. 또 대표적인 지방합성 효소인 glucose 6-phosphate dehydrogenase, \( \mathrm { HMG } \) CoA reductase의 훨성을 억제하는 것 으로 보고하였다. 마늘에도 S-methylcysteine sulfoxide등 수 많은 유기 유황화합물이 많이 들어있어 마늘의 고지혈중 개선효과가 있는 것으로 판단된다. 간의 지질변화 흑마늘 추출물을 저농도, 중농도 및 고농도로 6 주간 급여하여 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 간 조직 중의 총지질, 총콜레스테롤, 중성지방에 미치는 영향을 Table 5 와 같다. 간 조직의 총지방의 함량은 대조군에서 \( 32.34 \pm 9.59 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 위약군에서는 \( 140.43 \pm 23.27 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 약 6.3배 정도 높은 함량을 나타내었으나, 흑마늘 급여군인 저농도, 중농도 및 고농도에서는 가각 \( 116.51 \pm 28.03 \mathrm { mg } / \mathrm { g } , 108.56 \pm 30.41 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \), \( 106.27 \pm 29.46 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 위약군에 비하여 상당히 감소하였 다. 총 콜레스테롤은 정상군은 \( 3.92 \pm 0.24 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 이었으나 위 약군을 \( 12.65 \pm 0.63 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 약3.2배 정도 증가 하다가 흑 마늘 추출물의 첨가식이 농도인 저농도, 중농도 및 고농도 에서는 각각 \( 9.43 \pm 0.43 \mathrm { mg } / \mathrm { g } 9.40 \pm 0.28 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 범위로 유의적 감소를 나타내었으나 흑마늘 첨가식이 농도간의 차이는 없었다. 이와 같은 결과는 흑마늘 급여로 인한 체내 지질 축적 억제와 더불어 식이성 고콜레스테롤의 홉수는 방해하는 2 가지 효과가 있는 것으로 추정된다. 마늘과 고 콜레스테롤의 식이에 관한 연구에서도 마늘 첨가군이 대조군에 비해서 간조직 중의 중성지방과 총 콜레스테롤은 낮았으나 유의적 차이가 없었다고 보고하였다.

흑마늘 추출물의 첨가량과 숙성기간 따라 LDL 콜레스테롤 농도가 감소하는 것이 확인되었다. 돈지로 고콜레스테롤을 유도한 흰쥐 에서 혈중 콜레스테롤 함량은 감소되었고 처리 조건을 달리한 마늘의 첨가 급이에도 혈첨 콜레스테롤의 저하에 효과가 있었다. 또한 고지혈증을 유도한 흰지에 가열처리한 마늘을 급여한 경우 혈중 콜레스테롤의 함랑이 낮다고 보고한 바와 같이 본 실헙결과에서도 마늘을 장기간 가뎔, 숙성하여 만든 흑마늘도 헐중 콜레스테롤의 저하를 확인한 바 숙성기간 따른 상관성이 있는 것으로 판단된다. 마늘에도 S-methylcysteine sulfoxide등 수 많은 유기 유황화합물이 많이 들어있어 마늘의 고지혈중 개선효과가 있는 것으로 판단된다.

중성지질의 농도는 마늘을 첨가한 고클레스테롤 식이에 혈중 중성지질의 함량이 유의적으로 지하하였다는 연구와 고지혈증 환자에게 건조마늘을 급여하였을 때 대조군에 비하여 중성지질 농도를 저하시킨다는 보고와 본 연구는 비슷한 경향을 나타내었다. 고콜레스테롤 혈증을 유발하는 흰쥐에 마늘즙을 \( 1 \% \) 및 \( 2 \% \) 급이한 경우 유의적 감소를 나타내었다고 하였다. 그러나 마늘 첨가량과 마늘의 열처리에 의하여 혈중 지질함량은 감소할 뿐 유의성은 없다는 보고도 있다.본 실험에서는 고지방식이로 급여한 흰쥐의 중성지질이 증가하였으나 흑마늘 추출물을 저농도, 중농도 및 고농도의 모든 급여군에서 중성지질의 감소하는 경향으로 나타났으므로 흑마늘 추출물이 혈중 지질함량을 저하시키는 것으로 사료된다. 총 콜레스테롤의 농도.는 정상군이 \( 103.41 \pm 28.67 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \), 위약군은 \( 182.51 \pm 27.48 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 대조군에 비하여 약 \( 1.4 \) 배 증가하였으나 흑마늘 추출물을 지눙도, 중농도, 고농도의 단계별 급이군에서는 각각 \( 143.47 \pm 28.15 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } , 136.54 \pm 26.06 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \)및 \( 130.05 \pm 28.47 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 이었다. 이러한 결과는 총 콜레스테롤의 농도가 위약군의 경우 고지방 급이에 의하여 증가되었으나, 고지방식이와 함께 급이된 흑마늘 추출물의 첨가가 농도에 따라 감소되었음을 알 수 있었다. 혈청중의 HDL-콜레스테롤의 농도는 대조군에 비하여 흑마늘의 저농도군, 중농도군 및 고농도군에서 유의성 있게 증가하였다. 특히 위약군에서 \( 22.53 \pm 4.69 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 정상군의 \( 31.28 \pm 4.41 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 약 \( 1.4 \) 베 감소하였으나 흑마늘 추출물의 모든 첨가군에서 상당히 높은 함량을 나타내어 흑마늘 추출물이나변 콜레스테롤인 LDL의 혈관 막힘을 막아주는 역할을 하는 것으로 관단된다. 그리고 본 실험에서 LDL-콜레스테롤의 농도는 정상군의 \( 65.43 \pm 24.76 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 에 비하여 위약군의 \( 149.51 \pm 8.02 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 증가하였으나, 흑마늘 추출물을 저농도군, 중농도군 및 고농도군에서는 각각 \( 127.21 \pm 28.65 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } , 124.31 \pm 25.76 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 및 \( 124.65 \pm 27.53 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 위약군에 비하여 상당한 수준으로 감소하여 흑마늘 추출물의 첨가식이에 따라 LDL이 낮아지는 것을 알 수 있었다.

마늘 첨가가 혈중 중성지질 함량을 유의적으로 낮추는 연구 결과와, 건조마늘을 고지혈증 환자에게 급여했을 때 중성지질 농도를 줄임을 확인한 보고와 본 연구의 결과는 유사했다. 총 콜레스테롤의 농도는 위약군에서 고지방 급여로 인해 증가되었으나, 고지방식과 함께 흑마늘 추출물을 급여하면 농도가 감소되었다. 흑마늘의 저농도군, 중농도군, 고 농도군에서 혈청 중의 HDL-콜레스테롤의 농도는 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다.

효소활성에 대한 온도의 영향 효소의 최적반응 온도를 결정하기 위해 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } \) 8.0)로 녹인 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \)를 각 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위의 배양기에 넣고 4 시간 후 plate의 용해면적을 축정하여 효소의 활성을 비교하였다. 온도의 안정성은 효소액을 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 각각 30 분간 열처리 한 후 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \) 를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 동안 방치한 후 잔존 활성을 측정하였다. 효소활성에 미치는 금속 2 가 이온의 영향 정제한 효소의 활성에 대한 금속 이온의 영향을 알아보기 위하여 \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \), \( \mathrm { CoCl } _ { 2 } \), \( \mathrm { CuSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { ZnSO } 4, \) EDTA를 최종 농도가 각각 \( 1 \mathrm { mM } \) 이 되도록 혈 전용해 효소를 녹인 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer (pH7.5)에 첨가한 뒤, 효소와 금속 2가 이온이 포함 혹은 효소만 포함된 용액을 \( 100 \mu l \) 씩 paper disc에 흡입시켜 fibrin plate에 점적하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 8 시간 반응 후 효소만 포함된 용해된 면적을 \( 100 \% \) 으로하여 각각의 금속이온이 포함된 효소용액의 용해된 면적을 상대적 측정값으로 나타내었다. 결과 및 고찰 균주의 분리 및 동정 경남 김해시 일대에서 채취한 마른 볏짚으로부터 균주를 분리한 다음 이들 중 혈전용해 효소를 생산하는 균주를 선정하였다. 선정된 균주는 Gram 양성의 균주로 그 크기는 약 \( 0.49 \times 1.59 \mu \) 이었으며, 운동성이 있고 호기성이며 내생포자를 형성하였다. 최적 배양온도는 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 였고, \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 45 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 생육가능하였다. 생육 가능한 \( \mathrm { pH } \) 의 범위는 \( 5.0 \sim 9.0 \) 이였고, 생육 최적 \( \mathrm { pH } \) 는 7.0이었다. 생화학적, 생리학적 특성은 Table 1에 나타내었다. 결론적으로 이 균주의 형태학적,생화학적, 생뢰학적 녹성을 분석해본 결과 Bacillus subtilis인것으로 확인되었다.

효소의 최적 반응 온도를 확인하기 위해, 효소를 Tris-HCl buffer에서 녹인 뒤 fibrin plate에 점적하고 각기 다른 온도에서 4시간 동안 반응시켜 효소 활성을 비교하였다. 또한, 금속 이온의 영향을 알아보기 위해 다양한 금속 이온을 첨가한 후 효소의 활성을 비교하였다. 결과적으로 최적 배양온도는 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 생육 가능한 온도 범위는 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 45 ^ {\circ } \mathrm { C } \)이며, 생육 가능한 \( \mathrm { pH } \) 범위는 \( 5. 0 \sim 9 . 0 \)이고, 생육 최적 \( \mathrm { pH } \)는 7.0이었다.

분자량 측정 BK는 부탄올 농축, 투석, 에탄올 침전, DEAE Sephadex A-50 chromatography, 그리고 Sephadex \( G-75 \) gel filtration을 이용하여 정제하였다. 이 정제된 효소를 SDS-PAGE 전기영동 결과 단일 band롤 화인 할 수 있었으며, 그 분자량은 약 \( 31 \mathrm { kDa } \) 이었다(Fig. 2). Bacillus subtilis BK-17 균주가 생산하는 fibrinolytic enzyme(BK)의 분자량은 지금까지 알려진Bacillus subtilis k-54(29 kDa)와 Bacillus sp. CK11 \( 4(28 \) \( \mathrm { kDa } \) 이 생산하는 fibrinolytic enzyme과 유사하였으나, \( \mathrm { Ba } \) cillus subtilis \( \mathrm { KCK } -7(45 \mathrm { kDa } ) \), Bacillus amyloiquefaciens \( \mathrm { K } 42 \) \( (45 \mathrm { kDa } ) \) 가 분비하는 혈전분해 효소의 분자량보다 작았다. 효소활성과 안정성에 대한 pH의 영향 BK의 활성 및 안정성에 미치는 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 조사하기위해 \( \mathrm { pH } 4.0 \) 10.0까지 조정한 반응액을 이용하여 활성 및 안정성을 검토한 결과, BK의 활성은 \( \mathrm { pH } 7 과 8 \) 에서 최대였다. \( \mathrm { pH } 7 및 8 \) 에서의 활성을 \( 100 \% \) 로 하였을 때, \( \mathrm { pH } 4,5,6 \) 에서 각각 \( 50 \%, 75 \%, 95 \% \) 의 활성을 유지했으며 \( \mathrm { pH } 9 \) 와 10 에서는 각각 \( 85 \% \) 와 \( 80 \% \) 의 활성을 나타내었다. 따라서 BK는 산성에서보다 알칼리에서 더 좋은 활성을 유지하였다. 이 결과는 양등이 보고한 멸치액젓 유래의 MK와 백등이 보고한 Bacillus subtilis KCK-7 가 분비하는 fibrinolytic en-zyme과 비슷한 양상을 보였다. BK 의 \( \mathrm { pH } \) 에 대한 안정성은 활성이 보인 양상과 비슷하였다. 결론적으로 BK의 최적 활성 및 안정성을 보여주는 \( \mathrm { pH } 7과 8 \)로 나타났다. 효소의 활성 및 안정에 대한 온도의 영향 BK의 활성 및 안정성에 미치는 온도의 영향을 검토하기위해 반응온도를 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 간격으로 30 분 동안 반응시켜 BK의 상대활성 및 안정성을 표시한 결과, BK는 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 반응최적 온도를 보였다. \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 BK의 활성은 점진적으로 증가되었으며, 그 이상의 온도에서는 급격히 감소하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( \mathrm { BK } \) 의 활성을 \( 100 \% \) 로 보았을 때, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 40 \%, 80 \) 에서 \( 20 \% \) 의 활성을 보였다. 이 결과는 윤등이 보고한 Bacillus amyloliquefaciens K42가 생산하는 fibrinolytic enzyme과 백등이 보고한Bacillus subtilis KCK-7이 분비하는 fibrinolytic enzyme과 비슷한 양상을 보였다. BK의 열에 대한 안정성은 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서 아주 놓았으며, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서는 급격히 감소되었다. 이 결과 역시 윤등, 백등이 보고한 결과와 유사하였다. BK의 최적 활성 및 안정성의 온도는 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이었다.

BK는 부탄올 농축, 투석, 에탄올 침전, DEAE Sephadex A-50 chromatography, 그리고 Sephadex \( G-75 \) gel filtration을 이용하여 정제하였으며 BK의 활성 및 안정성에 미치는 \( \mathrm { pH } \)의 영향을 조사하기위해 \( \mathrm { pH } 4.0 \) 10.0까지 조정한 반응액을 이용하여 활성 및 안정성을 검토한 결과, BK의 활성은 \( \mathrm { pH } 7 과 8 \)에서 최대였다.

효소활성에 대한 금속 이온의 영향 금속이온이 첨가되지 않았을 때의 활성을 \( 100 \% \) 로 하여 그 상대적인 활성을 측정하였을 때, \( 1 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 와 \( \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \) 에 \( 100 \% \) 활성을 유지 하였으며, \( \mathrm { Zn } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Cu } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Co } ^ { 2 + } \) 에 대해서는 각각 \( 65 \%, 77 \%, 77 \%, 82 \%, 95 \% \) 의 활성을 나타내었다. 반면 동일농도의 EDTA에 의해서 \( 45 \% \) 의 활성저해를 보였다. 이러한 사실은 기존의 대두발효식품인 natto와 청국장, 된장에서 분리한 fibrinolytic enzyme이 대부분 ser-ine enzyme인 것인데 반해 본 연구의 B. subtilis BK-17이 생산하는 fibrinolytic enzyme은 metallo enzyme인 것으로 생각된다. 기질에 대한 특이성 혈전용해효소는 fibrin을 분해하는 양상에 따라 2가지로 나눌 수 있다. 그 중 하나는 혈액 중 plasminogen을 active type 인 plasmin으로 변화시켜 plasmin으로 하여금 혈전(fibrin)을 분해하도록 하는 plasminogen activator type과 이와 상관없이 효소자체가 직접 혈전을 분해시키는 direct active type이 있다. 이를 확인하기 위하여 plasminogen-rich fibrin plate와 plasminogen-free fibrin plate를 사용하였다.그 결과 본 정제효소는 plasminogen-rich fibrin plate에서 뿐만 아니라 plasminogen이 제거된 plasminogen-free fibrin plate에서도 비슷한 fibrin 분해 활성을 보였다. 그러므로 본 효소는 plasminogen을 plasmin으로 activation하여 plasmin에 의하여 혈전(fibrin)을 분해하도록 하는 plasmi-nogen activator type이라기 보다는 fibrin에 직접 활성을 가지는 것으로 생각된다. Fig. 5에 나타난 것처럼, plasminogen rich plate에서 약 \( 10 \% \) 의 활성이 더 높은 것으로 보아 다소의 plasminogen activator 역할도 할 것으로 사료된다. 첨가적으로 다양한 종류의 기질을 포함한 fibrin plate, red blood agar plate, gelatin plate, skim milk plate, casein plate등을 이용한 효소활성을 검토한 결과, Fig. 6 에 나타난 것과 같이 본 정제 효소는 fibrin plate에서만 clear zone이 형성되었지만, 나머지 plate에서는 전혀 활성을 보이지 않았다. 따라서 BK는 Fig. 6에 나타난 것처럼 fibrin을 특이적으로 분해함이 밝혀졌다.

금속 이온 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Zn } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Cu } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Co } ^ { 2 + } \)의 첨가로 효소 활성이 100%, 100%, 65%, 77%, 77%, 82%, 95%로 증가하였고, EDTA의 첨가로 45%의 활성 저해가 나타났다. 이는 natto, 청국장, 된장에서 분리한 fibrinolytic enzyme의 활성에 대해 금속 이온의 영향을 알 수 있게 한다. 또한, 혈전용해요소는 크게 2가지로 나눌 수 있는데, Plasmin이 혈전을 분해하는 타입과 효소가 직접 혈전을 분해시키는 타입이 있다.

효소활성에 대한 온도의 영향 효소의 최적반응 온도를 결정하기 위해 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0 \))로 녹인 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \)를 각 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위의 배양기에 넣고 4 시간 후 plate의 용해면적을 축정하여 효소의 활성을 비교하였다. 온도의 안정성은 효소액을 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 각각 30 분간 열처리 한 후 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \) 를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 동안 방치한 후 잔존 활성을 측정하였다. 효소활성에 미치는 금속 2 가 이온의 영향 정제한 효소의 활성에 대한 금속 이온의 영향을 알아보기 위하여 \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \), \( \mathrm { CoCl } _ { 2 } \), \( \mathrm { CuSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { ZnSO } 4 \) EDTA를 최종 농도가 각각 \( 1 \mathrm { mM } \) 이 되도록 혈 전용해 효소를 녹인 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer \( ( \mathrm { pH } 7.5) \)에 첨가한 뒤, 효소와 금속 2가 이온이 포함 혹은 효소만 포함된 용액을 \( 100 \mu l \) 씩 paper disc에 흡입시켜 fibrin plate에 점적하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 8 시간 반응 후 효소만 포함된 용해된 면적을 \( 100 \% \) 으로하여 각각의 금속이온이 포함된 효소용액의 용해된 면적을 상대적 측정값으로 나타내었다.

효소의 최적반응 온도를 결정하기 위해 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0 \))로 녹인 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \)를 각 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위의 배양기에 넣고 4 시간 후 plate의 용해면적을 축정하여 효소의 활성을 바교하고 금속 2가 이온이 포함된 효소용액이나 효소만 포함된 용액을 paper disc에 흡입시켜 fibrin plate에 점적하고 37\(^\circ \mathrm{C}\)에서 8시간 반응 후 용해된 면적을 100%로하여 금속이온이 포함된 효소용액의 용해된 면적을 상대적 측정값으로 나타냈다.

최근 급속한 시대적 변화에 대응하여 간편하고 편리한 식문화 형성으로 인하여 혈액순환 장애에 따른 심혈관계의 질환 발병률이 증가하고 있으며, 이로 인한 사망률 역시 급속히 증가되고 있다. 상처 혹은 혈전 형성 자극이 유발되면 혈관내피 세포의 변화로 지혈에 관여하는 세포내 단백질들의 분비 및 혈소판 세포 표면의 특성이 변하여 혈전형성 환경이 조성된다. 혈소판 부착 및 활성, 동시에 혈장응고 활성이 트롬빈 형성을 촉진하여 피브린이 축적된다. 일반적으로 혈관내의 피브린 축적으로 인한 혈전의 형성 및 증가로 혈액의 흐름을 방해하거나 혈관을 따라 이동하면서 뇌경색, 심근경색과 같은 질병을 유발한다. 그러므로 혈전은 혈액 순환계 질환의 대표적인 원인중의 하나이다. 혈전은 상처회복 후 프라즈민(plasmin)과 같은 혈전분해 효소(fibrinolytic en-zyme)에 의해서 분해된다. 만약 생성된 혈전이 과도하게 축적되거나 혈전용해 기작이 원활하게 작동하지 않을 경우 혈전증(thrombosis)을 유발하여 인체에 치명적인 손상을 줄 수도 있다. 따라서 혈전분해 시스템은 혈관기능 유지 및 혈관외벽의 피브린 축적의 분해에 있어서 필수적이다. 또한 병리학적 상태에서 다수의 다른 단백질 분해 효소들과 협력하여 세포외 기질들의 분해에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 프라즈민은 혈전분해 시스템에서 피브린 분해의 핵심 단백질 분해제이다. Bacillus속의 균주들은 혈전분해 효소를 포함하여 다양한 종류의 단백질 분해효소들을 분비하는 특성이 있다. 최근 한국과 일본을 중심으로 전통발효 식품에서 혈전분해능을 가진 많은 Bacillus 속의 균주들이 분리되고 있으며, 이들이 분비하는 혈전효소에 대한 연구가 진행되어오고 있다. 특히 일본의 전통대두 발효식품인 natto (nattoki-nase)와 절임 식품인 Shiokara (katsuwokinase) 에서 혈전용해 효소 생산균주를 분리하고 효소를 정제하였으며, 이의경구 투여 시 생체내의 혈전용해능을 높일 수 있다고 보고하였다. 현재 사용되고 있는 혈전분해제로는 ur-okinase (UK), streptokinase(SK), tissue type plasmninogen activator (tPA) 등이 있다. 하지만 이와 같은 제품은 반감기가 짧고, 가격이 매우 비싼 단점을 지니고있다. 또한 urokinase를 제외하고는 경구투여가 불가능한 실정이다. 따라서 이러한 단점들을 해결하고자 본 연구진은 이전 연구에서 한국인이 오랫동안 먹어오고 있는 식품인 김치 및 멸치 젓갈로부터 혈전용해 효소를 분리하고 그 활성에 대해 보고하였다. 본 연구에서는 볏짚으로부터 혈전 용해력을 가진 균주를 분리 - 동정 하고, 이 균주가 생산하는 혈전용해 효소의 특성에 대해 연구하였다. 재료 및 방법 혈전용해효소 생산균주의 분리 경남 김해 일대에서 채취한 마른 볏짚을 \( 2-3 \mathrm { ~cm } \) 의 크기로 자른 다음 분리용 배지( \( 2.0 \% \) glucose, \( 1.0 \% \) bacto peptone, \( 0.1 \% \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 0.5 \% \mathrm { NaCl } , \mathrm { pH } 7.0 \))가 들어있는 \( 18 \mathrm { ~mm } \) 시험관에 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간동안 진탕배양한 후 멸균수로 \( 10 ^ { -5 } \)까지 희석한 시료 \( 100 \mathrm { ml } \) 를 분리용 고체 배지에 도말봉으로 접종하여, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 1-2 \) 일간 배양시켰다. 생성된 동일한 col-ony들을 각 2장의 LB 평판배지(1.0 \% tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm { NaCl } , 1.5 \% \) agar)에 나누어 toothpick 하여 3 \( 7 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 배양 후 그중 한 장의 평판배지에 \( 0.6 \% \) fibri-nogen solution과 20 unit thrombin으로 조성된 배지를 중층하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 배양시켰다. 이들 중 fibrin을 분해시켜 clear zone을 형성하는 균주를 확인하고 보관중인 다른 1 장의 평판배지에서 동일한 colony를 선택하여 분리용 액체 배지에 배양하여 그 상등액에서 혈전용해 활성을 검토한 후 최종적으로 균을 선별하였다.

최근 혈액 순환 장애로 인해 발생하는 질병의 발병률과 사망률이 급속하게 증가하고 있다. 이는 간편하고 편리한 식문화 형성에 따른 결과로, 상처 혹은 혈전 형성 자극에 의해 혈관내피 세포의 변화로 혈전이 축적되어 혈액 순환계 질환을 유발하고 있다. Bacillus속의 균주들은 혈전분해 효소를 포함하여 다양한 종류의 단백질 분해효소들을 분비하는 특성이 있으며, 김치 및 멸치 젓갈로부터 혈전용해 효소를 분리하고 그 활성을 연구하고 있다.

요 약 마른 볏짚으로부터 fibrinolytic enzyme (BK)을 분비하는 균주를 분리하여 동정한 결과, Bacillus subtilis속으로 분류되었다. 분리된 균주(Bacillus subtilis BK-17)를 배양하여 그 배양액으로부터 에탄올 침전, ion exchange, gel filtration 등의 과정을 거쳐 fibrinolytic enzyme (BK)를 분리 및 정제하였다. 이 정제된 효소를 SDS-PAGE gel 전기영동한 결과 분자량은 약 \( 31 \mathrm { kDa } \) 이었다. BK의 활성 및 안정성에 대한 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 조사해본 결과, \( \mathrm { pH } \) 6~8범위에서 매우 높았고, 최적 \( \mathrm { pH } \) 는 7과 8이었다. 본 효소의 활성 및 안정성에 대한 최적 온도는 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이었으며, \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서는 안정성이 그대로 유지되었지만 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서는 현저히 감소하여 5 \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 비해 \( 20 \% \sim 40 \% \) 의 활성을 보였다. BK에 대한 활성 역시 안정성과 비슷한 양상을 보였고, 다만 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 약 \( 62 \% \) 의 활성을 보였고, 그 이후 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 지속적으로 증가하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 최대의 활성을 보였다. 실험한 금속이온들 중 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { Zn } ^ { 2 + } \) 와 \( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \) 에서 각각 \( 35 \% \) 와 \( 23 \% \) 의 저해활성을 보였지만 나머지 이온들에서는 의미 있는 영향이 없었다. 동일농도의 \( \mathrm { EDTA } \) 에 대해서는 \( 45 \% \) 의 저해활성을 보였기 때문에 \( \mathrm { BK } \) 는 metallo enzyme으로 생각된다. Fibrinogen-rich fibrin plate 와 plasminogen-free fibrin plate에서의 분해활성을 검토해 본 결과, 두 plate에서 비슷한 분해활성을 보였다. 따라서 본 효소는 plasminogen activator type 보다는 fibrin에 직접 활성을 가지는 것으로 생각된다.

마른 볏짚에서 분리된 균주 Bacillus subtilis BK-17로부터 fibrinolytic enzyme (BK)를 분비하였다. BK는 에탄올 침전, 이온 교환, 겔 여과 등의 과정을 통해 분리 및 정제되었으며, 이는 plasminogen activator type보다는 fibrin에 직접 활성을 가지는 것으로 분석되었다. BK는 \(45\%\)의 EDTA에 대한 저해활성을 보였으므로 metallo enzyme로 판명되었다. 또한, BK의 활성은 \(20^{\circ}\mathrm{C}\)에서 약 \(62\%\)를 보여주며, \(50^{\circ}\mathrm{C}\)까지 지속적으로 증가하여 이 때 최대 활성을 나타냈다.

혈전용해 활성의 측정(fibrin plate assay) Haverkata-Trass의 fibrin plate법에 따라 \( 2 \% \) gelatin 용액에 녹인 \( 0.2 \% \) fibrinogen 용액 \( 10 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.2 \mathrm { M } \) borate 완충 용-액 \( ( \mathrm { pH } 7.8 \) )에 녹인 thrombin 20 unit를 적하하여 잘 섞은 후 이를 petri-dish에 부어 fibrin막을 만들었다. 효소용액을 \( 100 \mu 1 \) 씩 paper disc 에 훕입시켜 plate에 놓고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18시간 방치 하였다. 효소에 의해 fibrin막이 용해되면 용해면적을 측정하여 상대적인 활성을 측정하였다. Fibrin plate는 plasminogen이 제거된 fibrinogen과 plasminogen이 포함된 fibrinogen을 이용하여 두 가지 방법으로 준비하였다. 분자량 측정 분리된 단백질의 분자량은 전기영동을 실시하여 결정 하였으며 전기영동은 \( 4 \% \) stacking gel 과 \( 12.5 \% \) separating gel로 이루어진 SDS-PAGE를 사용하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 2시간 동안 전기영동한 후 gel을 coomassie로 염색하였다. 분자량 측정을 위해 low molecular weight standard (Bio-rad)를 사용하였다. 효소활성에 대한 pH의 영향 효소의 활성에 미치는 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 알아보기 위해 농축한 효소를 \( 20 \mathrm { mM } \) sodium citrate buffer \( ( \mathrm { pH } 3.0,4.0,5.0) \), \( 20 \mathrm { mM } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 6.0,7.0), 20 \mathrm { mM } \)Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer ( \( \mathrm { pH } 8.0 \) ), \( 20 \mathrm { mM } \) sodium carbonate buffer \( ( \mathrm { pH } 9.0,10.0) \) 로 희석하여 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정한 다음, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였고, 최적 반응 \( \mathrm { pH } \) 는 각 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정된 효소액을 사용하여 효소활성의 \( \mathrm { pH } \) 의존성을 검토하였다.

Haverkata-Trass의 fibrin plate법을 이용하여 fibrin막을 제작하였다. 분리된 단백질의 분자량은 4%의 stacking gel과 12.5%의 separating gel로 구성된 SDS-PAGE를 통한 전기영동으로 결정하였다. 효소의 활성에 영향을 미치는 pH를 조사하기 위해 다양한 pH 조건에서 효소를 희석한 후 잔존활성을 측정하고, 효소활성의 pH 의존성을 검토하여 최적 반응 pH를 결정하였다.

혈전용해 활성의 측정(fibrin plate assay) Haverkata-Trass의 fibrin plate법에 따라 \( 2 \% \) gelatin 용액에 녹인 \( 0.2 \% \) fibrinogen 용액 \( 10 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.2 \mathrm { M } \) borate 완충 용-액 \( ( \mathrm { pH } 7.8 \) )에 녹인 thrombin 20 unit를 적하하여 잘 섞은 후 이를 petri-dish에 부어 fibrin막을 만들었다. 효소용액을 \( 100 \mu 1 \) 씩 paper disc 에 훕입시켜 plate에 놓고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18시간 방치 하였다. 효소에 의해 fibrin막이 용해되면 용해면적을 측정하여 상대적인 활성을 측정하였다. Fibrin plate는 plasminogen이 제거된 fibrinogen과 plasminogen이 포함된 fibrinogen을 이용하여 두 가지 방법으로 준비하였다. 분자량 측정 분리된 단백질의 분자량은 전기영동을 실시하여 결정 하였으며 전기영동은 \( 4 \% \) stacking gel 과 \( 12.5 \% \) separating gel로 이루어진 SDS-PAGE를 사용하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 2시간 동안 전기영동한 후 gel을 coomassie로 염색하였다. 분자량 측정을 위해 low molecular weight standard (Bio-rad)를 사용하였다. 효소활성에 대한 pH의 영향 효소의 활성에 미치는 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 알아보기 위해 농축한 효소를 \( 20 \mathrm { mM } \) sodium citrate buffer \( ( \mathrm { pH } 3.0,4.0,5.0) \), \( 20 \mathrm { mM } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 6.0,7.0), 20 \mathrm { mM } \)Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer ( \( \mathrm { pH } 8.0 \) ), \( 20 \mathrm { mM } \) sodium carbonate buffer \( ( \mathrm { pH } 9.0,10.0) \) 로 희석하여 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정한 다음, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였고, 최적 반응 \( \mathrm { pH } \) 는 각 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정된 효소액을 사용하여 효소활성의 \( \mathrm { pH } \) 의존성을 검토하였다.

Haverkata-Trass의 fibrin plate법에 따라 gelatin, fibrinogen, borate 완충 용액과 thrombin이 포함된 petri-dish에 paper disc에 훕입시킨 효소용액을 놓고 \(\mathrm{37^{\circ} C}\)에서 18시간 방치하여 fibrin막의 용해면적을 측정하여 상대적인 활성을 측정하였다. 분리된 단백질의 분자량은 전기영동하여 결정하고, 효소의 활성에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위해 농축한 효소를 다양한 pH로 조정하여 24시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였다.

미생물의 동정 선발된 균주 BK-17의 분류학적 동정을 위해 전자현미경 촬영 및 Bergey's manual of systematic bacteriology 방법에 따라 형태학적, 생화학적 특성을 조사하여 최종적으로 Bacillus subtilis로 동정하였다. 혈전용해효소의 분리 및 정제 에탄을 침전 부탄올을 사용하여 Bacillus subtilis BK-17의 배양액을 감압 evaporator로 농축하였다. 농축한 배양액을 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } \) 7.5)로 투석한 후 에 탄올로 먼저 55%가 되게 농축한 배양액과 혼합하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 방치한 후 원심분리 \( \left (12,000 \mathrm { rpm } , 20 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 침 전물을 제거하고 다시 동일한 방법으로 \( 75 \% \) 가 되게 농축한 배양액과 혼합하여 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24 시간 방치한 후 원심분리 \( \left (12,000 \mathrm { rpm } , 20 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \) 하여 수거한 침전물을 수거하여 상기 buffer에 녹인 다음 투석하여 활성을 검정하고, 다음 정제단세의 시료로 사용하였다. DEAE-A50 chromatography 투석한 조효소액을 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer ( \( \mathrm { pH } 7.5 \) ) 에 평형화된 DEAE Sephadex A-50 column \( (4 \times 15 \mathrm { ~cm } ) \) 에 흡착시키고 동일buffer로 용출하면서 비 흡착된 부분의 분획 중 혈전용해 활성이 있는 부분만을 다음 정제단계에 사용하였다. Sephadex G-75 gel filtration 전 단계에서 얻은 효소액을 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } ( \mathrm { pH } 7.5 \) ) buffer로 투석 후 동결 건조하여 Sephadex G-75로 gel filtra-tion을 행하였다. Sephadex G-75은 \( 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 이 함유된 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- HCl \( \mathrm { pH } \) 8.0) buffer로 평형화 시킨 것을 col- \( \mathrm { umn } (1 \times 120 \mathrm { ~cm } ) \) 에 충전하여 사용하였다. 시간당 \( 4.0 \mathrm { ~m } \ell \) 정도의 유속으로 1 fraction에 \( 1 \mathrm { m \ell } \) 씩 분취하여 혈전용해 활성과 단백질을 측정하여 활성 분획을 취하였다.

부탄올을 이용하여 Bacillus subtilis BK-17의 배양액을 감압 evaporator로 농축한 후, 이를 투석하여 DEAE Sephadex A-50 column에 흡착시킨 다음 동일 buffer로 용출하였다. 이 과정에서 혈전용해 활성을 갖는 부분만을 선별하여 사용하였다. 또한 Bergey's manual of systematic bacteriology를 이용해 형태학적, 생화학적 특성 조사를 통해 Bacillus subtilis로 최종 동정하였다.

\( \mathrm { AGS } \) 와 \( \mathrm { HepG } 2 \) 세포에 대한 세포독성 실험 위 연구에 대한 재료 및 방법은 이전 실험과 동일하게 실시하였다. 결과 및 고찰 화합물 \(1 \)은 negative FAB-MS에서 \( \mathrm { m/z } ~443 \) \( \mathrm { [M } \)- \( \mathrm { H] } ^ { - } \) 의 분자이 온 peak가 관측되어 분자량을 444로 길정하였다. IR 스펙트럼으로부터 수산기 \( \left (3310 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 카보닐기 \( \left (1690 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 이중결합 \( \left (1620 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \)이 있는 것으로 확인되었다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)- \( \mathrm { NMR } \)( \(400 \mathrm { MHz } \), \( \mathrm { MeOD } , \delta_ {\mathrm { H } } \)) spectrum에서 세 개의 olefin methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 7.83,1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=16.0 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -4 ; \delta_ {\mathrm { H } } 6.35,1 \mathrm { H } \right . \), d, \( \left .J=16.0 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -5 ; \delta_ {\mathrm { H } } 5.80,1 \mathrm { H } , \mathrm { s } , \mathrm { H } -2 \right ) \)이 관측되었는데, 이 때 \( J=16.0 \mathrm { ~Hz } \)으로부터 trans 구조를 갖는 이중결합이 존재함을 예상하였다. 한 개의 oxygenated methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } \right . \) \( 4.23,1 \mathrm { H } , \mathrm { m } , \mathrm { H } -3 ^ {\prime } \) ), 한 개의 oxygenated methylene proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 3.80,1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=7.2 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -7 ^ {\prime } \mathrm { a } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~3.72,1 \mathrm { H } \right . \), d, \( J=7.2 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -7 ^ {\prime } \mathrm { ~b } ) \), 두 개의 methylene proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~2.15 \right . \), \(1 \mathrm { H } \), dd, \( J=13.6,6.8 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -2 ^ {\prime } \mathrm { a } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~1.95,1 \mathrm { H } \), overlapped, \( \left . \mathrm { H } -4 ^ {\prime } \mathrm { a } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~1.83,2 \mathrm { H } , \mathrm { m } , \mathrm { H } -2 ^ {\prime } \mathrm { b } , 4 { } ^ {\prime } \mathrm { b } \right ) \), 세 개의 methyl proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~2.00,3 \mathrm { H } , \mathrm { s } , \mathrm { H } -6 ; \delta_ {\mathrm { H } } ~1.15,3 \mathrm { H } , \mathrm { s } , \mathrm { H } -9 ^ {\prime } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~0.92 \right . \), \( \left .3 \mathrm { H } , \mathrm { s } , \mathrm { H } -10 ^ {\prime } \right ) \) 이 관측되었다 그 중 \( \delta_ {\mathrm { H } } ~2.00 \)에서 관측된 methyl기는 allyl methyl기로 예상하였다. 또한 당에서 유래한 하나의 hemiacetal proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~4.35,1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=8.0 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -1 " \right ) \)과 네 개의 oxygenated methine proton signal \( \left ( \delta_ { H } ~3.34,1 \mathrm { H } \right . \), overlapped, H-3; \( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.32,1 \mathrm { H } \), overlapped, H-5; \( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.31 \), \(1 \mathrm { H } \), overlapped, H-4; \( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.10,1 \mathrm { H } \), dd, \( J=7.6,7.6 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } - \) \( 2) \), 하나의 oxygenated methylene proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.86,1 \mathrm { H } \right . \), dd, \( J=12.0,5.6 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -6 " \mathrm { a } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~3.67,1 \mathrm { H } \), dd, \( J=12.0,5.6 \) \( \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -6 ^ {\prime \prime } b \) )이 관측되었다. 이를 통해 이 화합물을 sesquiterpene monoglycoside로 예상 할 수 있었으며, 당은 육탄당으로 예상하였다. \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } - \mathrm { NMR } \left (100 \mathrm { MHz } , \mathrm { MeOD } , \delta_ {\mathrm { C } } \right ) \) spectrum에서 총 탄소수가 21개임을 확인하였으며, 이를 통해 탄소 수 15 개의 sesquiterpene에 육탄당이 하나 결합되어있는 배당체 임을 확인하였다. 당의 chemical shift \( \delta_ {\mathrm { c } } ~103.1 \left ( \mathrm { C } -1 ^ {\prime \prime } \right ), 78.1 \left ( \mathrm { C } -3 ^ {\prime \prime } \right ), 78.0 \) (C-5"), \( 75.1 \left ( \mathrm { C } -2 ^ {\prime \prime } \right ), 71.7 \left ( \mathrm { C } -4 ^ {\prime \prime } \right ), 62.8 \left ( \mathrm { C } -6 ^ {\prime \prime } \right ) \) 와 anomer proton signal 의 결합정수 \( (J=8.0 \mathrm { ~Hz } ) \)로부터 이 당이 \( \beta \)-glucopyranose임을 확인하였다. 비당부에 있어서 하나의 carboxyl \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~166.4, \mathrm { C } -1 \right ) \), 하나의 olefin quaternary \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~145.3, \mathrm { C } -3 \right ) \), 세 개의 olefin methine \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~132.6, \mathrm { C } -4 ; \delta_ {\mathrm { C } } ~132.2, \mathrm { C } -5 ; \delta_ {\mathrm { C } } ~124.5, \mathrm { C } -2 \right ) \), 두 개의 oxygenated quaternary \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~49.3, \mathrm { C } -1 ^ {\prime } ; \delta_ {\mathrm { C } } ~83.2, \mathrm { C } -8 ^ {\prime } \right ) \), 하나의 oxygenated methine \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~74.0, \quad \mathrm { C } -3 ^ {\prime } \right ) \), 하나의 oxygenated methylene \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) 77.2, \( \left . \mathrm { C } -7 ^ {\prime } \right ) \), 하나의 quaternary \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) 87.6, \( \left . \mathrm { C } -5 ^ {\prime } \right ) \), 두 개의 methylene \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~42.9, \mathrm { C } -2 ^ {\prime } ; \delta_ {\mathrm { C } } ~42.8, \mathrm { C } \right . \) - \( \left .4 ^ {\prime } \right ) \), 세 개의 methyl \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~20.8, \mathrm { C } -6 ; \delta_ {\mathrm { C } } ~19.7, \mathrm { C } -9 ^ {\prime } ; \delta_ {\mathrm { C } } ~16.3 \right . \), \( \mathrm { C } -10 ^ {\prime } \) ) carbon signal 들을 확인하였다. 부분 구조는 2D-NMR (gCOSY, NOESY, gHSQC and \( \mathrm { gHMBC } \) )를 통해 결정되었다. 인접한 수소와 탄소의 correlation을 보여주는 gHMBC 데이터에서는 두 개의 olefin methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~7.83 \right . \), H-4; \( \left . \delta_ {\mathrm { H } } ~6.35, \mathrm { H } -5 \right ) \)이 oxygenated quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) 83.1, C-8')과 cross peak를 보여 하나의 vinyl group이 C-8'에 연결되어 있음을 알 수 있었다. 또한 하나의 olefin methine proton signal \( \left . \delta_ {\mathrm { H } } ~6.35, \mathrm { H } -5 \right ) \)이 olefin quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~145.3, \mathrm { C } -3 \right ) \)과 cross peak를 보이고, 하나의 olefin methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~5.80, \mathrm { H } -2 \right ) \)이 olefin methine carbon signal ( \( \delta_ {\mathrm { C } } \) 132.6, C-4)과 cross peak를 보임에 따라 두개의 olefin methine이 공역화 되어 있음을 알 수 있었다. 하나의 oxygenated methylene proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.80, \mathrm { H } -7 ^ {\prime } \mathrm { a } \right ) \)이 각각 oxygenated quaternary carbon \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~49.3, \mathrm { C } -1 ^ {\prime } \right ) \), oxygenated quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~83.2, \mathrm { C } -8 ^ {\prime } \right ) \), methylene carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~42.8, \mathrm { C } -4 ^ {\prime } \right ) \) 과 cross peak를 보여 oxygenated methylene이 \( \mathrm { C } -5 ^ {\prime } \) 에 연결되어있고, \( O \)-linkage로 \( \mathrm { C } -1 ^ {\prime } \)에 연결되어 있음을 확인하였다. 이를 통해 이 화합물이 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside임을 알 수 있었다. 또한 anomer proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~4.35, \mathrm { H } -1 ^ {\prime \prime } \right ) \)이 oxygenated methine carbon \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~74.0, \mathrm { C } -3 ^ {\prime } \right ) \)과 cross peak를 보임에 따라 \( \beta \)-glucopyranose가 C- \( 3 ^ {\prime } \)에 연결되어있음을 확인하였다. NOESY spectrum에서는 methyl proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~2.00, \mathrm { H } -6 \right ) \)이 olefin methine signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~5.80 ~ \mathrm { H } -2 \right ) \)과 cross peak를 보이지 않음에 따라 C-2와 C-3의 이중결합을 \( E \)구조로 결정하였다. 화합물 1에 대한 \( \mathrm { CD } \) 값을 측정하였으며, 그 결과 \( 263 \mathrm { ~nm } \) 에서 positive cotton effect (CE) 가 나타났으며, \( 246 \mathrm { ~nm } \) 에서 negative \( \mathrm { CE } \) 가 나타났다. 따라서 화합물 1의 절대구조를 같은 구조의 문헌값과 비교해 \( 1 ^ {\prime } R, 3 ^ {\prime } S \), \( 5 ^ {\prime } R, 8 ^ {\prime } S, 2 E, 4 E \) 로 확인하였다. 위의 data들을 종합하여 최종적으로 화합물 1을 \( (1 ^ {\prime } R, 3 ^ {\prime } S \), \( 5 ^ {\prime } R, 8 ^ {\prime } S, 2 E, 4 E) \)-dihydrophaseic acid \( 3 ^ {\prime } \)- \( O \)- \( \beta \)-D-glucopyranoside로 구조 동정 하였다. 이 화합물은 2011년 연꽃의 씨앗으로부터 치음 분리 보고 되었으며, 꼬리겨우살이 \((L. \) tanakae \() \)로부터는 이번 실험에서 처음 분리 되었다. 이 화합물에 대한 활성은 아직까지 보고된 바 없다.

화합물 1은 negative FAB-MS에 의해 분자량을 444로 결정하였으며 IR 스페트럼에 의해 수산기, 카보닐기, 이중결합이 있는 것으로 확인되었다. 또한 이 화합물은 sesquiterpene monoglycoside인 것과 육탄당의 당을 가지고 있다고 예상할 수 있다. 또한 이 화합물의 당이 \(\beta\)-glucopyranose임을 확인하였고 결과적으로 이 화합물은 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 이다.

서 론 겨우살이란 광합성은 가능하지만 물과 영양분은 숙주 나무로부터 흡수하는 반 기생 식물이다. 겨우살이는 유럽에서 고지혈증, 암, 당뇨병을 치료하는 천연 약재로 사용되어 왔으며, 한방에서 간과 신장, 근골을 강화하는 한약재 '상기생(상기생)'도 이에 속한다. 한국에 자생하는 겨우살이로는 강원도, 경상도, 제주도 지방에서 자생하는 겨우살이(Viscum album var. coloratum), 동백나무겨우살이(Korthalsella japonica), 참나무겨우살이(Loranthus yadoriki) 세 가지와 강원도, 경상도, 제주도 산지의 낙엽활엽수에 기생해서 자라는 비교적 드문 편의 겨우살이인 꼬리겨우살이(Loranthus tanakae)가 있다. 꼬리겨우살이는 꼬리겨우살이과(Loranthaceae)에 속하는 낙엽 소관목으로, 그 꽃차례나 열매가 꼬리처럼 길게 달리는 겨우살이의 종류라는 의미로 이름 지어졌다. 꼬리겨우살이는 \( 20 \sim 40 \mathrm { cm } \) 정도로 생장하며 꽃은 \( 5 \sim 6 \)월 개화한다. 꽃의 크기는 \( 3 \sim 5 \mathrm { cm } \) 정도로 황록색을 띄며 향은 매우 미약하다. 꽃잎은 타원형 또는 좁은 난형으로 \( 3 \sim 6 \)개이다. \( 10 \sim 11 \)월에는 진한 노란색으로 \( 0.5 \mathrm { ~cm } \) 정도의 구형의 열매가 맺히는데, 이 열매는 단 맛으로 점액질의 과육에 싸여있다. 다른 겨우살이들에 비해 열매가 비교적 더 작고 진한 노란색이며 여러 개가 길게 늘어져 달리는 점과 낙엽성이라 겨울에 잎이 없다는 점에서 다른 겨우살이들과 차이를 보인다. 한방에서 사용되는 '상기생'은 바로 이 꼬리겨우살이 \( (L. \) tanakae)의 잎과 줄기이다. 다양한 한방학적, 약리학적 활성에도 불구하고 꼬리겨우살이의 활성으로는 미백, 항산화, 세포독성만이 보고되어 있으며, 분리 관련 논문은 \( 4 \)종의 flavonol rhamnoside를 분리한 문헌이 유일하다. 따라서, 꼬리겨우살이를 가지고 생리활성물질을 분리하고, 이에 대한 활성을 검증해 활용방안을 모색해보고자 본 연구를 시작하였다. 현재까지 저자 등은 꼬리겨우살이로부터 \( 10 \)종의 flavonoid, \( 2 \)종의 lignan, \( 1 \)종의 phenylethanoid 화합물을 분리 동정, 보고한 바 있다. 이번 실험에서는 식물에서 잘 보고되지 않은 화합물인 clclofarnesane sesquiterpene glucoside을 분리 동정하였기에 이에 대하여 보고하고자 한다. 재료 및 방법 실험재료 본 실험에서 사용한 꼬리겨우살이 \( (L. \) tanakae)는 강원도 정선의 농장에서 구입하였으며, 우석대학교 김대근 교수가 동정하였다. 표본시료(KFMMEL- \( 201403 \))는 경희대학교 천연물화학실험실에 보관되어 있다. 시약 및 기기 시약 및 기기는 이전 실험과 동일하게 사용하였다. CD 곡선은 Jasco spectropolarimeter type J- \( 715 \) (scan range: \( l = 200 \) - \( 450 \mathrm { ~nm } \), cell length: \( 0.1 \mathrm { ~cm } ) \)로 측정하였다.

꼬리겨우살이는 한방에서 사용되는 '상기생'이며, 강원도, 경상도, 제주도 지방에서 낙엽활엽수에 기생해서 자라는 비교적 드문 편의 겨우살이이다. 꽃은 황록색을 띄며 향은 미약하고, 열매는 노란색으로 구형의 열매가 맺힌다. 꼬리겨우살이는 미백, 항산화, 세포독성 활성이 보고되어 있으며, flavonoid, lignan, phenylethanoid 화합물을 분리 동정하였다. 본 실험에서 clclofarnesane sesquiterpene glucoside을 분리 동정했다.

Sesquiterpene glycoside 화합물들의 활성으로는 주로 간보호, 항간독성, 세포독성 활성이 보고되어 있다. 문헌 검색을 통하여 sesquieterpene 구조에서는 당이 결합 되어 있지 않을 때 보다 당이 결합 되어 있을 더 높은 수준의 세포독성 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 이에 따라 화합물 1에 대한 세포독성 활성을 기대할 수 있다고 판단하여 활성 실험을 진행하였다. 화합물 1의 Caucasian gastric adenocarcinoma cells \( ( \mathrm { AGS } ) \)와 Hepatocyte carcinoma cells (HepG2)에 대한 세포독성은 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide] colorimetric방법으르 측정하였다. 그 결과, 화합물 1은 양 세포에 대하여 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 이상에서 농도 의존적으로 유의한 세포독성을 보이는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 결론적으로, 꼬리겨우살이 ( \( L. \) tanakae \() \) 전초로부터 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } , \mathrm { ODS } \), Sephadex LH-20을 이용한 column chromatography를 반복하여 1종의 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside를 분리하였다. 또한 1D-, 2D-NMR, IR, FAB-MS, CD data를 분석하여 화합물의 구조를 동정하였다. 화합물 1은 AGS와 HepG2 cell에 대하여 농도의존적으로 유의한 정도의 세포독성을 보였다. 또한 꼬리겨우살이에서 분리한 flavonol rhamnosides 4종의 암세포에 대한 세포독성 실험 결과와 비교하였을 때, 해당 문헌의 flavonol rhamnosides 4종은 A549 (non small cell lung), SK-OV-3 (ovary), SK-MEL-2 (skin), XF498 (central nerve system), HCT-15 (colon) cultured human tumor cell lines에 대하여 유의한 정도의 세포독성을 보였고, 화합물 1은 \( \mathrm { AGS } \) 와 HepG2 cell에 대하여 농도의존적으로 유의한 정도의 세포독성을 보였으므로 시로 다른 암세포에 대해 비슷한 정도의 세포독성을 가짐을 확인할 수 있었다. 초 록 꼬리겨우살이(Loranthus tanakae) 전초를 \( 80 \% \mathrm { ~MeOH } \) 수용액으로 4회 반복 추출한 뒤, 감압 농축한 추출물을 ethyl acetate (EtOAc), \( n \)-butyl alcohol \((n \)- \( \mathrm { BuOH } ) \)과 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)층으로 계통 분획을 실시하였다. \( n \)- \( \mathrm { BuOH } \) 분획에 대하여 silica gel \( \left ( \mathrm { SiO } _ { 2 } \right ) \), octadecyl silica gel (ODS), Sephadex LH-20 column chromato-graphies를 반복실시하여 1 종의 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 화합물을 분리 및 정제하였다. 스펙트럼 데이터를 분석하여 입체 구조를 포함한 화합물의 구조를 \( \left (1 ^ {\prime } R, 3 ^ {\prime } S, 5 ^ {\prime } R, 8 ^ {\prime } S, 2 E, 4 E \right ) \)-dihydrophaseic acid 3'-O- \( \beta \)-D-glucopyranoside로 구조 동정 하였다. 이 화합물은 이번 실험을 통하여 꼬리겨우살이로부터는 최초로 분리되었다. 분리한 단일 물질은 AGS (Caucasian gastric adenocarcinoma cells)와 Hepatocyte carcinoma cells에 대하여 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 이상에서 농도 의존적으로 유의한 정도의 세포독성을 보이는 것이 확인되었다.

꼬리겨우살이 전초로부터 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 하나를 분리하여 구조를 동정하였고 분리한 flavonol rhamnosides 4종의 암세포에 대한 세포독성 실험 결과와 비교하였을 때 유의한 정도의 세포독성을 보였고, 화합물 1은 AGS와 HepG2 cell에 대하여 농도의존적으로 유의한 정도의 세포독성을 보였으므로 다른 암세포에 대해 비슷한 정도의 세포독성을 가짐을 확인할 수 있었다.

추출 및 분리 건조한 '꼬리겨우살이' 전초 \( 5.5 \mathrm { ~kg } \) 을 \( 80 \% \) methanol \( ( \mathrm { MeOH } ) \) 수용액 \( (20.5 \mathrm { ~L } ) \)으로 실온에서 24시간씩 4회 반복 추출하였다. 얻어진 여액을 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 감압농축하여 \( \mathrm { MeOH } \) 추출물 \( (629 \mathrm { ~g } ) \)을 얻었다. 얻어진 \( \mathrm { MeOH } \) 주출물은 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ~(1.5 \mathrm { ~L } ) \)와 ethyl acetate(EtOAc, \(1.5 \mathrm { ~L } \times 5) \)로 분배 추출하였고, 다시 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 층을 \( n \)-butyl alcohol\( ( n \)-\( \mathrm { BuOH } , ~1.3 \mathrm { ~L } \times 3) \)로 분배 추출하였다. 각층을 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 감압농축하여 \( \mathrm { EtOAc } \) 분획(LTE, \( 302 \mathrm { ~g } \)), \( n \)-\( \mathrm { BuOH } \) 분획(LTB, \( 79 \mathrm { ~g } \)) 및 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 분획(LTW, \( 248 \mathrm { ~g } \))을 얻었다. \( n \)-\( \mathrm { BuOH } \) 분획(LTB, \( 46 \mathrm { ~g } ) \)에 대하여 silica gel \( \left ( \mathrm { SiO } _ { 2 } \right ) \) column chromatography(c.c.) ( \( \phi ~10.0 \times 16.0 \mathrm { ~cm } , ~ \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)- \( \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)= \(16:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 14:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 12:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 10:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 8:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 6:4:1 \), 각 \( 5.3 \mathrm { L } \))를 실시하여, 총 11개의 분획(LTB-1~LTB-11)을 얻었다. 그 중에서 LTB-7 분획[ \( 1.6 \mathrm { g } \), elution volume/total volume \( ( \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } ) \) \( 0.804 \)- \( 0.810 \)]에 대하여 octadecyl \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) (ODS) c.c. ( \( \phi ~5.0 \times 7.0 \mathrm { ~cm } , ~ \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)= \( \ 1:1 \), \( ~2.2 \mathrm { ~L } \) )를 실시하여, 총 7개의 분획(LTB-7-1~LTB-7-7)을 얻었다. 그 중에서 LTB- 7-1 분획\( [869.0 \mathrm { mg } , \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } ~0.000 \)- \( 0.140] \)에 대하여 Sephadex. LH-20 c.c. \( ( \phi ~3.0 \times 50 \mathrm { ~cm } , 100 \% ~ \mathrm { MeOH } , 0.2 \mathrm { ~L } ) \)를 실시하여, 총 11개의 분획(LTB-7-1-1~LTB-7-1-1-11)을 얻었다. 그 중에서 LTB-7-1-1 분획 \( [50.0 \mathrm { mg } , \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } ~0.000 \)- \( 0.210] \)에 대하여 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) c.c. ( \( \phi ~1.5 \times 15.0 \mathrm { ~cm } , ~ \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)- \( \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)= \( 7:3:1 \), \( ~0.4 \mathrm { ~L } \))를 실시하여, 화합물 1[(\(1'R, 3'R, 5'R, 8'S, 2Z, 4E\))-dihydrophaseic acid, LTB-7-1-1-4, \(7.0~ \mathrm { mg } \), \( \mathrm { V_e / V_t } \) \(0.350 \)- \(0.445 \), \( \mathrm { R_f } = 0.30 \) (Kiesel gel \(60 \) \( \mathrm { F_ { 254 } } \) \( \mathrm { CHCl_3 } \)- \( \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { H_2 } \mathrm { O } \)= \(5:3:1 \)), TLC \( \mathrm { R_f } \)= \(0.80 \) (RP-18 \( \mathrm { F_ { 254S } } \), \( \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { { H_2 } O } \)= \(1:3 \))을 분리하였다.

본 논문은 건조한 꼬리겨우살이 전초 \( 5.5 \mathrm { ~kg } \)을 \( 80 \% \) methanol \( ( \mathrm { MeOH } ) \) 수용액 \( (20.5 \mathrm { ~L } ) \)으로 실온에서 24시간씩 4회 반복해서 추출한 후 여액을 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 감압농축해 \( \mathrm { MeOH } \)를 추출했다. 확보한 \( \mathrm { MeOH } \) 주출물은 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ~(1.5 \mathrm { ~L } ) \)와 ethyl acetate로 분배 추출했고 다시 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)층을 \( n \)-butyl alcohol로 분배 추출했다.

재료 및 방법공시재료의 처리시험에 공시한 사슴육은 체중 \( 220 \mathrm{~kg} \pm 10 \mathrm{~kg} \) 내외의 Elk 암컷 5마리를 도축하여 24시간 냉각한 후 발골하였고, 배최장근과 대퇴근을 채취하여 냉장온도로 유지하면서 실험재료로 공시하였다. 포장방법에 따른 저장성의 구명을 위한 실험에서는 함기포장(A)과 진공포장(V), 가스치환 포장 \( (\mathrm{M}, 80 \% \) \( \mathrm{CO}_{2}+20 \% \mathrm{~N}_{2} \) )을 하여 냉장온도에서 보관하면서 실험을 수행하였다.보수성의 측정보수성의 측정은 Laakkonen 등의 방법에 따라 시료 \(10 \mathrm{g} \)을 동일한 회수로 세절하여 특수 제작된 용기에 넣어 원심 분리관 속에 넣고, 완전히 밀폐하여 \( 70^{\circ} \mathrm{C} \)에서 30분간 가열한 후에 상수에서 5분간 냉각하여 20분간 원심분리 \( (1000 \mathrm{rpm}) \)를 한 후 유리된 수분을 평량하여 \( \mathrm{F}(\%) \)로 하고, 전수분은 시료 \( 10 \mathrm{~g} \) 을 동일한 횟수로 세절하여 \( 105^{\circ} \mathrm{C} \)에서 항량시까지 건조하여 측정한 수분의 량을 \( \mathrm{W}(\%) \)로 하여 산출하였다.\( W.H.C.(\%)=\frac{W(\%)-F(\%)}{W(\%)} \times 100 \)Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)의 측정Witte 등의 방법에 따라 시료 \( 20 \mathrm{g} \)에 \( 20 \% \) trichloro-acetic acid(in \( 2 \mathrm{M} \) phosphoric acid) \( 50 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 균질화(\(14,000 \mathrm{rpm}\), \( 2 \mathrm{~min}) \) 한 후 증류수로 \( 100 \mathrm{ml} \) 맞춘 다음 여과(Whatman No.1)하였다. 여액 \( 5 \mathrm{ml} \)와 \(0.005 \mathrm{M}\) 2-thiobarbituric acid 용액 \( 5 \mathrm{ml} \)를 시험관에 넣어 보관 후(암소에서 \(15\mathrm{hours}\) 보관) Spectrophotometer (Tcc-240A, Shmadzu, japan)로 \( 530\mathrm{nm} \) 파장에서 흡광도를 측정하여 다음 공식으로 계산하였다.\(TBARS(M A \mathrm{mg} / \mathrm{kg})= \) 흡광도 \( \times 5.2 \)Volatile basic nitrogen(VBN)의 측정VBN 함량은 고판의 Conway 미량확산법에 따라 세절한 시료 \( 10 \mathrm{~g} \)에 증류수 \( 90 \mathrm{ml} \) 가하여 homogenizer (IKA Works(Asia) Sdn. Bhd. T25-B, Malaysia)에서 \(14,000 \mathrm{rpm}\)으로 5분간 homogenizing 한 다음 여과지(Whatman No.1)에 여과하였다. 상기 여과액 \( 3 \mathrm{ml} \)를 conway unit 외실에 넣고, 내실에는 \( 0.01 \mathrm{N} \) 붕산용액 \( 1 \mathrm{ml} \)와 conway시약 \( (0.066 \%\) methylred : \( 0.66 \% \) bromcresol green \( =1: 1) \)을 약 \(2\sim 3\)방울 가한 후 \( 50 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 액 \( 1 \mathrm{ml} \)를 재빨리 외실에 주입하여 바로 밀폐시킨 후(단, 공시험구에는 \( 50 \% \mathrm{~K}_{2} \mathrm{CO}_{3} \) 용액을 외실에 주입하지 않는다.) \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 120분간 방치한 후 뚜껑을 조심스럽게 열고, \( 0.02 \mathrm{~N} \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \) 용액으로 내실의 붕산용액을 신속히 적정하였다. 시료를 \( \mathrm{S} \mathrm{~g} \), 공시험 측정치를 \(b~ \mathrm{ml}\), 본실험 적정치 \( \mathrm{a} \mathrm{~ml}\), \(0.02 \mathrm{~N} \mathrm{H}_{2} \mathrm{SO}_{4} \)의 표준화 지수를 \( \mathrm{F} \)라고 할때, 다음식에 의해서 VBN값을 산출하였다.\[ \begin{aligned} \text { VBN mg } \%(\mathrm{mg} / 100 \mathrm{~g} \text { sample })=&(\mathrm{a}-\mathrm{b}) \times \mathrm{F}(0.98) \times 28 \times 100 / \mathrm{S} \\ & \text { (sample의 량) } \end{aligned} \]\( 28=0.02 \mathrm{~N} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{SO}_{4}\) \(1 \mathrm{ml}\) 소모하는데 필요한 \( \mathrm{N} \) 의 양.pH 측정근막, 지방 등을 제거한 시료 \( 10 \mathrm{g} \)에 증류수 \( 90 \mathrm{ml}\) \((1: 9) \)를 넣어 homogenizer(IKA Works(Asia) Sdn. Bhd. T25-B, Malaysia)로 균질화(\(14,000 \mathrm{rpm}\), \(2 \mathrm{min}\))하여 \(\mathrm{pH}\)-meter(inoLab \(\mathrm{pH}\) Level 2, Wissenschaftlich Technische Werkstatten D-82362 Weilheim, Germany)를 가지고 3회 반복하여 측정하고 평균하였다.조직감의 측정core(직경 \( 1.27 \mathrm{~cm}) \)를 이용하여 근섬유와 평행하게 시료를 채취하여 Instron Testing Machine(Model 4443, Instron, USA)이용하여 10회 이상 측정하였다. 이때 V-blade를 이용하였으며, compression lord cell \( 50 \mathrm{~kg} \), crosshead speed는 \( 250 \mathrm{~mm} / \mathrm{min} \), chart speedsms \( 20 \times 10 \mathrm{~mm} / \mathrm{min} \)의 조건으로 실시하였다.육색측정육색측정은 근육 단면을 Minolta Chroma meter(Minolta Co. CR-300, Japan)로 Hunter \({L}^*\) (명도), \( {a}^*\) (적색도), \( b^* \) (황색도) 값을 총 3회 반복 측정하고, 이때 표준색판은 \( Y=92.4\), \(x= 0.3136\), \(\mathrm{y}=0.3196 \)으로 표준화한 다음 측정하였다.통계분석실험에서 얻어진 DATA를 SAS program을 이용하여 분산 분석 및 Duncan의 다중 검정을 실시하였다.

사슴육으로부터 배최장근과 대퇴근을 채취하여 실험재료로 공시하였고, 포장방법에 따른 저장성을 구명하고자 함기포장, 진공포장, 가스치환포장의 방식으로 냉장온도에서 보관하면서 실험을 수행하였다. 실험육의 보수성, TBARS, VBN, pH, 조직감과 육색을 측정한 후, 결과 데이터의 통계분석은 SAS 프로그램을 이용한 분산 분석과 Duncan의 다중 검정으로 하였다.

에스트로겐 유사효과의 검증 일반적으로 생물체내로 유입된 에스트로겐 유사물질은 에스트로겐을 모방하여 세포 내에 있는 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER)와 결합하여 DNA의 특정 염기서열인 estrogen responsive element (ERE)를 인식하여 결합한다. 이러한 DNA 상의 반응인자와 단백질의 결합은 그 반응인자에 의해 조절되는 유전자의 전사를 증대시켜 결국 특정 단백질의 발현을 유도하여 에스트로겐 유사물질에 의한 세포반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이 연구에서는 에스트로겐 수용체를 발현하는 것으로 알려진 인체 유방암 세포주 MCF7에 에스트로겐에 반응성을 나타내도록 고안된 CAT 리포터 플라스미드인 pCAT-ERE119-Ad2MLP를 도입한 in vitro 검출시스템을 사용하여 에스트로겐 활성을 측정하였다. 에스트로겐 반응성 리포터 플라스미드가 도입된 인체 유방암 세포주 MCF7에 스피루리나 추출시료를 최종농도 \( 500 \mu \mathrm{g}/\mathrm{ml}\), \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이 되도록 에탄올로 희석하여 세포주에 처리하였고, 구멍갈파래, 불가사리, 새우 추출시료는 최종농도 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\), \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)이 되도록 에탄올로 희석하여 세포주에 처리하였으며, 표준물질로서 \(17 \beta \)-estradiol을 최종농도 \( 10^{-8}\), \(10^{-9}\), \(10^{-10} \mathrm{M} \)이 되도록 처리하였다. Fig. 2는 에탄올만을 처리한 세포의 CAT 활성을 1로 하였을 때의 여러 농도의 해양생물유래 시료를 처리한 세포 혹은 표준물질인 \(17 \beta \)-estradiol을 처리한 세포의 CAT 활성을 비교한 결과이다. 스피루리나 추출물의 CAT 활성은 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 표준물질인 \( 17 \beta \)-estradiol의 농도 \( 10^{-8} \mathrm{M} \)과 비슷한 정도의 에스트로겐 활성 효과를 나타내었고 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서도 표준물질인 \( 17 \beta \)-estradiol의 농도 \( 10^{-9} \mathrm{M} \) 보다 높은 에스트로겐 활성 효과를 나타내었다. 또한 \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 표준물질인 \( 17 \beta \)-estradiol의 농도 \( 10^{-10} \mathrm{M} \)과 비슷한 정도의 에스트로겐 활성 효과를 나타내었다. 즉, \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)과 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 스피루리나 추출물은 에탄올을 처리한 대조군에 비해 약 3 배의 활성을 나타냈으며, 농도 \( 10^{-8} \mathrm{M} \)의 표준물질 \( 17 \beta \)-estradiol도 에탄올을 처리한 대조군에 비해 약 3 배의 활성을 나타냈다. \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도의 스피루리나 추출물은 에탄올을 처리한 대조군에 비해 약 2 배의 활성을 나타냈고, 농도 \( 10^{-10} \mathrm{M} \)의 표준물질 \( 17 \beta \)-estradiol도 역시 에탄올을 처리한 대조군에 비해 약 2 배의 활성을 나타냈다. 이 결과로 스피루리나 추출물에는 표준물질과 비슷한 효과의 에스트로겐 활성을 나타내는 에스트로겐 유사물질이 포함되어 있음이 확인되었다. 한편, 해조류인 구멍갈파래 추출물의 경우는 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)와 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \) 농도 모두에서 에탄올을 처리한 대조군에 비해 유의한 활성변화가 관찰되지 않았다. 이는 항암활성 등 여러 가지 생리활성을 가진 해조류이지만 이러한 생리활성들이 에스트로겐 유사효과에 의한 것이 아니라는 것을 확인할 수 있었다. 불가사리 추출물의 CAT 활성은 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)와 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도 모두에서 에탄올을 처리한 대조군에 비해 유의한 활성변화가 관찰되지 않았다. 이 결과로 불가사리가 steroidal gly-coside인 triterpene glycosides를 대사산물로 생산하고, 다양한 형태의 saponine을 갖고 있는 것으로 알려져 있지만 이들 사포닌이 구조적 유사성에도 불구하고 에스트로겐 유사효과를 나타내지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 새우 추출물의 CAT 활성도 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)와 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도 모두에서 에탄올을 처리한 대조군에 비해 유의한 활성변화가 관찰되지 않았다. 이 결과 역시 콜레스테롤 농도가 높은 새우의 경우에도 이들 콜레스테롤이 에스트로겐 유사효과를 나타내지 않는 다는 것을 나타내는 결과이다. 이 연구의 목표는 폐경기 이후 여성에게 에스트로겐 대체 작용을 할 수 있는 물질을 신속하고도 정확하게 탐색해 내는데 있다. 본 연구 결과로 광합성 조류인 스피루리나에 에스트로겐 유사효과를 나타내는 물질이 포함되어 있을 가능성을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 스피루리나가 가지고 있는 에스트로겐 유사물질을 이용하여 폐경기 이후의 여성에 있어서 에스트로겐 대체작용을 할 수 있는 식품을 개발할 수 있는 가능성을 보여주는 결과로 사료된다. 요약 천연물에 포함되어 있는 에스트로겐 효과를 가지는 성분의 생체 내에서의 직접적인 효과를 검정하기 위하여, 에스트로겐 수용체를 발현하는 것으로 알려진 인체 유방암 세포주 MCF7에 에스트로겐에 반응성을 나타내도록 고안된 CAT 리포터 플라스미드를 도입한 in vitro 검출시스템을 사용하여 에스트로겐 활성을 측정하였다. 이미 여러 분야에서 그 기능성의 연구가 활발히 진행되고 있는 광합성 조류인 스피루리나(spirulina)와 파래 등의 해양식물을 대상으로 에스트로겐 반응 리포터 시스템을 이용하여 에스트로겐 활성을 측정하였다. 그 결과, 스피루리나 에탄올 추출물의 CAT 활성은 \( 500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)와 \( 50 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 표준물질인 \( 17 \beta \)-estradiol의 농도 \( 10^{-8} \mathrm{M} \) 과 비슷한 정도의 에스트로겐 활성 효과를 나타내었고, \( 5 \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)의 농도에서는 표준물질인 \( 17 \beta \)-estradiol의 농도 \( 10^{-10} \mathrm{M} \)과 비슷한 정도의 에스트로겐 활성 효과를 나타내었다. 하지만 파래 추출물의 경우에는 에탄올을 처리한 대조군과 비교하여 유의한 CAT 활성 변화를 나타내지 않았다. 한편, 불가사리와 새우 등의 해양동물을 대상으로 한 실험에서는 에탄올을 처리한 대조군과 비교하여 유의한 CAT 활성 변화를 나타내지 않았다. 이 연구 결과로 광합성 조류인 스피루리나에 에스트로겐 활성을 효과적으로 나타내는 생리활성성분이 포함되어 있을 수 있다는 가능성을 확인하였다.

일반적으로 생물체내로 유입된 에스트로겐 유사물질은 에스트로겐을 모방하여 세포 내에 있는 에스트로겐 수용체(estrogen receptor: ER)와 결합하여 DNA의 특정 염기서열인 estrogen responsive element (ERE)를 인식하여 결합한다. 이 연구에서는 에스트로겐 수용체를 발현하는 것으로 알려진 인체 유방암 세포주 MCF7에 에스트로겐에 반응성을 나타내도록 고안된 CAT 리포터 플라스미드인 pCAT-ERE119-Ad2MLP를 도입한 in vitro 검출시스템을 사용하여 에스트로겐 활성을 측정하였다. 천연물에 포함되어 있는 에스트로겐 효과를 가지는 성분의 생체 내에서의 직접적인 효과를 검정하기 위하여, 에스트로겐 수용체를 발현하는 것으로 알려진 인체 유방암 세포주 MCF7에 에스트로겐에 반응성을 나타내도록 고안된 CAT 리포터 플라스미드를 도입한 in vitro 검출시스템을 사용하여 에스트로겐 활성을 측정하였다. 이 연구 결과로 광합성 조류인 스피루리나에 에스트로겐 활성을 효과적으로 나타내는 생리활성성분이 포함되어 있을 수 있다는 가능성을 확인하였다.

서 론 자연계에 존재하고 있는 천연물이나 식품에는 약효를 나타내는 성분들이 많이 있으며, 천연물 성분들의 각 분획별 생리활성 물질을 규명하는 연구가 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 육상식물에서 많이 보고되고 있는 phytoe-stogen은 성호르몬인 에스트로겐과 유사한 구조 및 기능을 가지고 있으며 배당체(glycoside) 형태로 발견된다. Phytoestrogen은 폐경기 이후의 여성에게 에스트로겐 대체 작용을 할 수 있는 것으로 밝혀져 질병예방 차원에서 많은 연구가 수행되고 있다. Phytoestrogen은 in vitro 실험에서 에스트로겐과 유사한 작용을 함으로써 여성의 에스트로겐 결핍으로 유발되는 골다공증 예방, 폐경기 증상의 완화 그리고 유방암, 전립선암, 심장질환 등의 예방에 중요한 역할을 하고, 알츠하이머 질환을 예방하는데 도움을 줄 수 있다는 연구결과가 발표된 바 있다. 그러나 지구 전체 생물의 \( 80 \% \) 이상을 차지하고 있는 해양생물에 대해서는 육상생물 만큼의 연구가 이루어지지 않아 미지의 요소가 많이 산재해 있다. 최근 해양생물의 연구가 활발히 이루어짐에 따라 다양한 생리활성물질을 포함한 유용한 성분들이 지속적으로 밝혀지고 있다. 특히, 노화방지, 암 예방, 항 혈액응고 등 생리활성기능 측면에서 관심이 고조되고 있으며 많은 연구가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 해양생물을 대상으로 에스트로겐 유사활성을 탐색하여 에스트로겐 대체물질로의 이용 가능성 여부를 확인하기 위해 연구를 수행하였다. 불가사리는 steroidal glycoside인 triterpene glycosides를 대사산물로 생산하고, 다양한 형태의 saponine을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 새우는 다량의 콜레스테롤이 함유되어 있어 콜레스테롤로부터 생성되는 에스트로겐의 존재 가능성이 높을 것으로 예상되어 실험에 이용하였다. 최근 건강식품으로 개발되어 크게 각광받고 있는 스피루리나는 여러 가지 기능성을 가진 미세 녹조류이다. 이들은 특히 단백질, 아미노산, 비타민, 페놀산 (phenolic acid), 토코페롤, 베타카로틴, 필수지방산, 탄수화물 등을 다량 함유하고 있으며, 이들 중 페놀산 (phenolic acid), 토코페롤, 베타카로틴 등은 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 스피루리나는 장내 유산균의 생육을 돕는 유익한 생리활성 물질을 생산하는 것으로도 알려져 있다. 한편, 최근 해조류에서 다양한 생리활성물질이 발견되고 있는 녹조류의 하나인 파래도 에스트로겐 유사활성 탐색 대상으로 선정하여 연구를 수행하였다. 이 연구는 해양생물을 대상으로 에스트로겐 유사활성을 가질 가능성이 높은 생물을 선정하여 본 연구에서 개발한 에스트로겐 반응성 리포터 시스템을 이용하여 대상 생물의 에스트로겐 유사효과 활성을 검증하였다. 재료 및 방법 해양생물로부터 추출물의 제조 구멍갈파래(Ulva pertusa)와 별불가사리(Asterina pectinifera)는 부산시소재 민락수변공원 앞바다에서 채집하고, 세척 후 음건하여 사용하였다. 새우(Penaeus chinensis)는 건조새우를 구입하여 사용하였고, 스피루리나(Spirulina, Kordel's Spirulina, Australia)는 순수함량 \( 100 \% \)의 제품을 사용하였다. 각 건조시료 \( 100 \mathrm{g} \)에 \( 95 \% \) 에탄올 \( 500 \mathrm{ml} \)를 첨가하여 \( 65^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3시간 동안 추출하였다. 추출액은 여과지 (GFC \( 20 \mathrm{mm} \))로 여과하고, 여액을 진공 농축한 후, 동결건조하여 추출물을 얻었다. 추출물 \( 0.5 \mathrm{g} \)을 \( 99 \% \) ethanol에 용해시킨 후 필터 (\( 0.45 \mu \mathrm{m}\))를 통과시켜 멸균하여 사용하였다. 플라스미드의 구축 Xenopus vitellogenin A2 estrogen responsive elements(ERE)가 두 번 반복된 ERE119와 전사활성을 나타내는데 ERE 영역을 요구하는 promoter로 알려진 adenovirus-2 major later promoter (Ad2MLP)의 cloning을 위해 합성된 oligonucleotide들의 sequence를 Table 1에 나타내었다. Ad2MLP에 해당하는 oligonucleotide 두 가닥을 ann-ealing하여 이중가닥 DNA로 만든 후, 이를 먼저 pCAT-Basic (Promega, USA)의 CAT 유전자 상류인 PstI과 XbaI 부위에 삽입하여 pCAT-Ad2MLP를 구축하였다. ERE119에 해당하는 oligonucleotide 두 가닥을 annealing하여 이중가닥 DNA로 만든 후, 이를 pCAT-Ad2MLP의 Ad2MLP pro-moter 상류인 HindIII와 PstI 부위에 삽입하여 pCAT-ERE119-Ad2ML을 구축하였다.

성호르몬인 에스트로겐과 유사한 구조 및 기능을 가지고 있는 Phytoestrogen은 육상식물에서 흔히 발견되며, 각종 질병을 예방하는데 도움을 준다는 연구결과가 있다. 지구 전체 생물의 80% 이상을 차지하는 해양생물에 대해서도 최근 많은 연구가 이루어짐에 따라 다양한 생리활성 물질을 포함한 유용한 성분들이 지속적으로 밝혀지고 있다. 따라서 본 연구를 통해 해양생물을 대상으로 에스트로겐 유사활성을 가질 가능성이 높은 생물을 선정하여 대상 생물의 에스트로겐 유사효과를 검증하였다.

세포배양 및 Transient Expression Assay MCF7 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 획득하였다. MCF7 세포주는 \( 10 \% \)의 Fetal Bovine Serum (FBS, Bio whittaker, USA)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Bio whittaker, USA) 배지를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO_2} \) incubator에서 배양하였다. MCF7 cell은 DMEM 배지에 subculture하여 48시간 후에 transfection하였다. 배양된 cell은 phosphate buffered saline로 2번 세척 후, FBS를 포함하지 않는 DMEM \( 2 \mathrm{ml} \)에 배양하였다. Transfection에 사용한 pCAT-ERE119-Ad2MLP 플라스미드는 Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Inc., USA)를 사용하여 분리하였다. FBS를 포함하지 않는 DMEM \( 250 \mu \mathrm{l}\)에 pCAT-ERE119-Ad2MLP DNA \( 5 \mu \mathrm{l}\)를 넣은 후 PLUS reagent (Life Technologies, USA)를 \( 5 \mu \mathrm{l}\) 첨가하여 조심스럽게 혼합한 뒤 실온에서 15분간 방치하여 Plus reagent와 DNA 혼합액 (용액 Ⅰ)을 만들었다. 그리고, Lipofectamine reagent (Life Technologies, USA) \( 5 \mu \mathrm{l}\)에 FBS를 포함하지 않는 DMEM \( 250 \mu \mathrm{l}\)를 넣어 혼합한 용액 (용액 Ⅱ)를 제조한 후, 용액 Ⅰ과 Ⅱ를 혼합하여 실온에서 방치하였다. 15분 후, 준비된 MCF7 cell에 첨가하여 3시간 배양한 뒤 \( 20 \% \)의 dextran-coated charcoal stripped FBS를 포함하는 DMEM \( 2.5 \mu \mathrm{l}\)를 첨가하였다. Transfection이 완료된 1시간 후, 시료들을 각각 \( 5 \mu \mathrm{l} \)씩 처리하였다. 각 시료의 추출물은 최종농도 \(500\),\(50\),\(5\)\( \mu \mathrm{g} / \mathrm{ml}\) 농도로 사용하였고, 표준물질로 이용된 \(17 \beta \)-estradiol(RBI, USA)은 최종농도 \( 10^{-7}\), \( 10^{-8}\), \( 10^{-9}\), \( 10^{-10} \mathrm{M} \) 로 사용하였다. 그 후, 48시간 동안 배양한 다음 세포를 회수하였고, \( -20 ^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분, \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분 동안 4회 반복하여 cell을 lysis한 후, \( 1,4000\times \mathrm{g} \)에서 5분 동안 원심분리하여 상등액 \( 200 \mu \mathrm{l} \)를 취하여 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 활성을 측정하였다. CAT 활성은 CAT-ELISA Kit (Boehringer Mannheim, USA)를 이용하여 Manual에 따라 수행하였다. CAT 활성 결과는 BCA Protein Assay Reagent kit (Pierce, Rockford, IL)를 이용해 측정한 각 추출물의 단백질함량으로 표준화시켰다. 결과 및 고찰 에스트로겐 유사물질의 수율 파래, 새우, 불가사리, 스피루리나 건조시료를 \( 100 \mathrm{g} \)을 에탄올로 추출하고, 농축한 후 동결건조하여 에탄올 추출물을 각각 \( 5.6 \mathrm{g}\), \(7.4 \mathrm{g}\), \(4.3 \mathrm{g}\), \(9.2 \mathrm{g} \)씩 얻었다. 이들의 수율은 약 \( 4 \% \sim 9 \% \)로 불가사리 추출물에서 가장 낮은 수율을 나타냈고 스피루리나 추출물에서 가장 높은 수율을 나타냈다. 이러한 결과는 사용한 시료의 물리적인 형태에 관계가 있는 것으로 판단되며 미세조류인 스피루리나의 경우는 입자가 적어서 효과적인 추출이 이루어진 것으로 사료된다.

MCF7 세포주는 American Type Culture Collection에서 획득하였고 \( 10 \% \)의 Fetal Bovine Serum을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium배지를 이용하여 \( 37^{\circ} \mathrm{C}\), \( 5 \% \) \( \mathrm{CO_2} \) incubator에서 배양, CAT 활성은 CAT-ELISA Kit를 이용하여 Manual에 따라 수행하였다. 파래, 새우, 불가사리, 스피루리나 건조시료 \( 100 \mathrm{g} \)을 에탄올로 추출, 농축한 후 동결건조하여 에탄올 추출물을 각각 \( 5.6 \mathrm{g}\), \(7.4 \mathrm{g}\), \(4.3 \mathrm{g}\), \(9.2 \mathrm{g} \)씩 얻었고 수율은 약 \( 4 \% \sim 9 \% \)로 스피루리나 추출물에서 가장 높은 수율을 나타냈다.

재료 및 방법 식물재료와 배양조건 본 실험에 사용된 식물세포배양액은 Taxus chinensis의 잎으로부터 얻은 세포주(cell line)를 이용하여 배양하였다. Taxus chinensis로부터 기원된 현탁액 세포는 \( 24^{\circ} \mathrm{C} \) 암조건에서 \( 150 \mathrm{rpm} \) 으로 교반하여 배양하였다. 현탁(suspension) 세포는 수정된 Gamborg's B5 배지, \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 10 \mu \mathrm{M} \) NAA (naphthalene acetic acid), \( 0.2 \mu \mathrm{M} \) BA (6-benzylamino purine), \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) casein hydrolysate, \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} 2 \) -[N-morpholino]ethansulfonic acid (MES)에서 배양하였다. 세포 배양은 2 주마다 새로운 배지로 갈아주었으며 생산과 배양을 연장시키기 위해 7 일과 21 일 째 되는 날에 \( 1-2 \% \) 의 maltose를 첨가해 주고 elicitor로서 배양 초기에 \( 4 \mu \mathrm{M} \) 의 \( \mathrm{AgNO}_{3} \) 를 첨가해 주었다[3]. 식물세포배양(생물반응기 부피: \( 32 \mathrm{M}^{3} \), 배양 부피: \( 25 \mathrm{M}^{3} \) ) 후 배양액으로부터 \( 4,500 \mathrm{~g} \) decanter (Westfalia, CA150 Claritying Decanter)와 10,000 g 고속원심분리기( \( \alpha \)-Laval, BTPX205GD-35CDEEP)를 이용하여 식물세포와 세포조각(cell debris)을 연속 조업으로 회수하였다. 회수한 식물 세포와 세포조각(cell debris)을 합하여 바이오매스라 하였다. 본 연구에 사용된 바이오매스는 (주)삼양제넥스로부터 제공받았다.\Paclitaxel 분석 Paclitaxel 함량 분석을 위해 HPLC system (Waters, USA)과 Capell Pak \( \mathrm{C}_{18}(250 \times 4.6 \mathrm{~mm} \), Shiseido, Japan) 칼럼을 사용하였다. 이동상은 아세토니트릴과 증류수 혼합 용액(35/65-65/35, v/v, gradient mode)을 flow rate \( 1.0 \mathrm{ml} / \) \( \min \) 으로 흘려주었다. 시료 주입양은 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 이며 \( 227 \mathrm{~nm} \) 에서 \( \mathrm{UV} \) 에 의해 검출하였다. HPLC 분석은 표준정량곡선을 이용하였으며 표준시료는 Sigma-Aldrich 제품(순도: 95\%)을 사용하였다. 흡착제 처리를 위한 시료준비 식물세포배양액으로부터 회수한 바이오매스와 메탄올의 비율을 \( 1 / 1(\mathrm{w} / \mathrm{v}) \) 로 하여 실온에서 30 분 동안 추출하여 여과하고, 바이오매스에 새로운 메탄올을 첨가하여 동일한 방법으로 4 회 반복하여 추출을 수행하였다. 추출 여액을 모아 농축기(CCA-1100, EYELA, Japan)에서 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \), 감압상태에서 농축(원액의 \( 30 \%) \) 하고 농축액에 메틸렌 클로라이드를 첨가(농축액의 \( 25 \% \) )하고 실온에서 30 분 동안 액-액 추출을 3 회 반복 수행하였다. 액-액 추출 후 상 분리(phase separation)를 통해 극성불순물은 상층인 메탄올 층으로 제거하고, paclitaxel은 하층인 메틸렌 클로라이드 층으로 회수하여 실온, 감압상태에서 농축/건조하였다. 건조된 시료를 흡착제 처리에 사용하였다. 흡착제 처리에 사용된 시료의 순도는 \( 10.6 \% \) 이었다.

Taxus chinensis 잎에서 추출한 세포주를 이용해 식물 세포 배양액을 준비하였다. 이 세포주는 \( 24^{\circ} \mathrm{C} \)의 암조건에서 \( 150 \mathrm{rpm} \)으로 교반하며, 성분으로는 수정된 Gamborg's B5 배지, \( 30 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) sucrose, \( 10 \mu \mathrm{M} \) NAA (naphthalene acetic acid), \( 0. 2 \mu \mathrm{M} \) BA (6-benzylamino purine), \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) casein hydrolysate, \( 1 \mathrm{~g} / \mathrm{L} 2 \) -[N-morpholino]ethansulfonic acid (MES)를 사용하였다.

동일한 기공크기에서 알루미나의 표면적 변화에 따른 영향 알루미나 흡착제의 물리적인 특성 중 식물유래 타르 및 왁스 성분을 포함한 불순물을 효과적으로 제거하기 위해서 적절한 기공크기가 필요함을 알 수 있었다. 이를 토대로 일정한 기공크기에서 다양한 표면적을 가지는 다공성 메조기공 알루미나를 제조하여 표면적 변화에 따른 흡착제 처리 효과를 조사하였다. 본 실험에서는 일정한 기공크기(기공지름: 3.0-3.3 nm)에서 표면적이 다른 네 종류의 알루미나(Table \( 2,3 \mathrm{~A}-1 \sim 3 \mathrm{~A}-4) \) 를 제조하여 흡착제 처리 실험을 수행하였다. 흡착제 처리를 한 후 헥산 침전을 수행한 결과를 Fig. \( 4 \mathrm{~A} \) 에 나타내었다. 알루미나 \( 3 \mathrm{~A}-1\left(172 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g}\right) \), \( 3 \mathrm{~A}-2\left(243 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g}\right) \), \( 3 \mathrm{~A}-3\left(329 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g}\right), 3 \mathrm{~A}-4\left(470 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g}\right) \) 순으로, 즉, 표면적이 증가할수록 paclitaxel 순도는 조금씩 증가함을 알 수 있었다. 반면 수율은 표면적 증가에 따라 거의 변화가 없다가 \( 3 \mathrm{~A}-4 \) \( \left(470 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g}\right) \) 에서 오히려 감소함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 흡착제의 표면적이 증가할 수록 불순물이 효과적으로 제거되어 후속 공정인 헥산 침전에서 paclitaxel 순도는 증가하는 반면 특정 표면적 이상에서는 흡착되는 paclitaxel이 많아져 paclitaxel 수율은 감소하는 것으로 판단된다. 흡착제 처리 후 흡착제에 붙은 성분들의 경향을 확인하기 위하여, 흡착제 처리 후 여과하여 흡착제를 회수하고 이를 메탄올로 세척하여 HPLC 분석을 수행하였다. Fig. 5A에 서 보는 바와 같이 표면적 변화에 따라 \( \mathrm{HPLC} \) 크로마토그램에서 피크 패턴에 차이를 보임을 확인할 수 있었다. 알루미나 \( 3 \mathrm{~A}-1\left(172 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g}\right), 3 \mathrm{~A}-2\left(243 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g}\right), 3 \mathrm{~A}-3\left(329 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g}\right) \) 에 비해 \( 3 \mathrm{~A}-4\left(470 \mathrm{~m}^{2} / \mathrm{g}\right) \) 에서 상대적으로 높은 불순물 및 paclitaxel 피크를 확인할 수 있었다. 즉, 특정 표면적 이상에서는 바이오매스 유래 타르 및 왁스 성분을 포함한 불순물 이외에도 paclitaxel이 많이 흡착되어 후속 공정인 헥산 침전에서 paclitaxel 순도와 수율에 영향을 미침을 알 수 있었다. 흡착제 처리 후 흡착제에 붙은 유기물의 양을 정량하기 위하여, \( \mathrm{TGA} \) 분석을 수행하였다[21]. Fig. \( 6 \mathrm{~A} \) 에서 보는 바와 같이 흡착제에 붙은 유기물의 양은 \( 3 \mathrm{~A}-1(15.8 \mathrm{wt} \%) \), \( 3 \mathrm{~A}-2 \) (18.7 wt\%), 3A-3 (18.8 wt\%), 3A-4 (25.5 wt\%) 순으로 나타났다. 표면적이 증가할수록 바이오매스 유래 유기물이 더 많이 흡착/제거됨을 정량적으로 확인할 수 있었다. 일반적으로 흡착제(예, 활성탄, 탄소 물질)의 표면적이 클 수록 바이오매스 유래 타르 성분 제거에 효과적인 기존의 보고들과 일치함을 알 수 있었다.

알루미나 흡착제의 물리적 특성으로 식물유래 타르 및 왁스 성분 포함 불순물의 제거를 효과적으로 하기 위해서 적절한 기공크기가 필요했다. 따라서 일정한 기공크기에서 표면적이 다른 알루미나 4가지를 제조하여 흡착제 처리 실험을 하였다. 그 결과 표면적이 증가할수록 바이오매스 유래 유기물이 더 많이 흡착/제거됨을 확인했다.

알루미나 흡착제 제조 분무열분해 공정에 의해 다공성 메조기공 알루미나를 제조하였다. 알루미늄 전구체로 aluminum nitrate \( \left[\mathrm{Al}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{3}\right. \). \( 9 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \), Aldrich]를 사용하였고, 기공 형성을 위한 주형제로는 poly (ethylene glycol)-block-Poly(propylene glycol)-block-Poly (ethylene glycol) (P123, Aldrich), cetyltrimethyl-ammonium chloride (CTAC, Aldrich), cetyltrimethyl-ammonium bromide (CTAB, Aldrich, 98\%)을 사용하였다. 분무용액은 알루미늄 전구체를 녹인 용액에 CTAC, P123/ CTAB, P123/CTAC 및 P123을 첨가하여 제조하였다. 알루미늄 전구체의 전체 농도는 \( 0.2 \mathrm{M} \) 로 고정하였다. 평균 기공 크기 \( 3 \mathrm{~nm}, 4-5 \mathrm{~nm},>10 \mathrm{~nm} \) 의 알루미나 입자는 각각 CTAC, P123/CTAB 또는 P123/CTAC, P123을 사용하여 제조하였다. 기공크기가 다른 네 종류의 알루미나(alumina I, alumina II, alumina III, alumina IV)의 특성치는 Table 1 에 나타내었다. 고정된 기공크기에서 알루미나의 표면적은 템플릿의 함량을 변화시켜 조절하였다. 알루미늄 기준 유기 템플릿 CTAC의 몰 비는 0.05-0.35, P123/CTAC의 몰 비는 \( 0.03 / 0.3-0.5, \mathrm{P} 123 \) 의 몰 비는 \( 0.03 \) 로 고정시켜 주었다. 제조한 분무용액은 초음파 액적 발생장치 (aerosol generator, 진동자 6 개, \( 1.7 \mathrm{MHz} \), 동림엔지니어링)를 이용하여 액적화를 한 다음 운반기체를 통하여 반응기내로 이동시켰다. 운반기체로는 공기를 사용하였으며, 유량은 \( 10 \mathrm{~L} / \mathrm{min} \) 으로 고정하였다. 건조부와 반응부의 반응기는 길이 \( 1200 \mathrm{~mm} \), 직경 \( 55 \mathrm{~mm} \) 인 석영관을 각각 사용하였다. 건조부를 two-zone으로 나누고 각각의 온도를 \( \mathrm{T} 1=150-300^{\circ} \mathrm{C}, \mathrm{T} 2=200-350^{\circ} \mathrm{C} \), 반응부의 온도는 \( \mathrm{T} 3=500-700^{\circ} \mathrm{C} \) 로 고정시켰다. 최종 반응부를 통과한 입자들은 테플론 필터를 이용하여 포집하였다. 제조된 분말에 잔존하는 유기물들을 없애기 위해 전기로 내에서 소성시켜 제거하였다. 전기로의 온도는 \( 550^{\circ} \mathrm{C} \) (승온 속도\( : 1^{\circ} \mathrm{C} / \mathrm{min} \) ) 공기분위기 하에서 4 시간 동안 소성시켰다. 소성 후 얻은 분말은 질소 흡착/탈착 등온선은 \( 200^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 전 처리 후 Micrometrics 사의 ASAP 2000 을 이용하여 \( -196^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 측정하였다. 상대압력 \( 0.06-0.3 \) 범위에서 흡착 데이터와 BET (Brunauer-Emmett-Teller)법을 이용하여 표면적을 계산하였다. 기공부피는 상대압력 \( 0.995 \) 에서 흡착 부피로부 터 계산하였으며 기공크기는 \( 17-3000 \AA \) 범위에서 탈착 등온 선으로부터 BJH (Barrett-Joyner-Halenda)법을 이용하여 계산하였다. 일정한 기공크기에서 다양한 표면적을 가지는 다공성 메조기공 알루미나 흡착제는 Table 2 에 나타내었다.

분무열분해 공정을 통해 다공성 메조기공 알루미나를 제조하였고, 알루미늄 전구체, poly (ethylene glycol)-block-Poly(propylene glycol)-block-Poly (ethylene glycol), cetyltrimethyl-ammonium chloride, cetyltrimethyl-ammonium bromide를 사용하여 분무용액을 만들었다. X-ray 회절 분석과 FT-IR 분광분석을 통해 흡착제의 색상, 표면 분자 구조 및 화학 특성을 분석하였다.

서 론 Paclitaxel은 주목 (yew tree)의 표피에서 발견된 diterpenoid 계열의 항암물질로 난소암, 유방암, 카포시 종양(Kaposi's sarcoma) 및 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 치료용으로 미국 FDA (U.S. Food and Drug Administration) 허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 항암제이다. 또한 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등의 적용증이 계속 확대되고 있으며, 여러 다른 치료 방법들과의 복합처방에 관한 임상실험이 진행 중에 있어 향후 paclitaxel 수요는 계속 늘어날 전망이다. Paclitaxel의 주요 생산 방법에는 세 가지가 있다. 첫째, 주목나무(yew tree)에서 직접 추출하는 방법으로 원료의 계속적인 공급이 어렵고 추출/정제에도 많은 어려움이 있으며 환경보호수인 주목나무 보호에도 적합하지 않은 방식이다. 둘째, 주목나무의 잎에서 전구체(baccatin III, 10-deacetylbaccatin III, 10-deacetylpaclitaxel 등)를 얻어 side chain을 화학적으로 결합하는 반합성 방법이다. 이 방법 역시 전구체를 주목나무에서 직접 얻어야 하므로 직접 추출의 경우와 마찬가지 문제점들을 가지고 있다. 셋째, 주목나무에서 callus를 유도하고 종균배양을 거쳐 주배양기에서 식물세포를 배양하여 얻는 방법이다. 식물세포배양방법은 기후, 환경 등의 외부 인자에 의해 영향을 받지 않고 생물반응기 내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정한 품질의 paclitaxel을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다. 그 외 방법으로 전합성 방법과 미생물 발효에 의한 생산 방법이 있으나 paclitaxel의 수율이 낮아 상업화에는 아직 어려움이 많다. 그러므로 현재 식물세포배양으로부터 여러 단계의 추출 및 정제 공정을 거쳐 높은 순도의 paclitaxel을 주로 생산하고 있다. 일반적으로 분리 및 정제 과정은 원료인 바이오매스(paclitaxel을 함유한 식물세포)로부터 paclitaxel을 먼저 유기용매로 추출하고, 전 처리(pre-purification) 공정을 거쳐 최종 정제를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있는데, 이 과정에서 특히 전 처리 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 기존의 연구들에서는 정제를 위한 전 처리 공정으로 고가의 크로마토그래피를 이용하고 있거나 전 처리 없이 추출을 거친 crude paclitaxel을 HPLC (high performance liquid chromatography) 에 의해서 바로 최종 정제하게 된다. 대체로 바이오매스로부터 유기용매를 이용하여 paclitaxel을 추출하면 순도는 \( 0.5 \% \) 이하이며, 간단한 전 처리 공정 후에도 \( 10 \% \) 정도의 순도로 매우 낮다. 이러한 시료를 바로 HPLC에 의하여 최종 정제할 경우 경제적 측면에서 많은 문제가 있으며 또한 scale-up 및 대량생산에 많은 어려움이 따른다. 따라서 전 처리 공정을 통하여 시료의 순도를 가능하면 높여 (최소 \( 50 \% \) 이상) 주어야 최종 정제, 특히 \( \mathrm{HPLC} \) 를 이용한 정제에서의 비용을 줄일 수 있다. 전 처리 공정으로 흡착제 처리 및 침전에 의해 고순도의 crude paclitaxel을 얻을 수 있는 방법이 보고되어 있다. 식물유래 타르 및 왁스 성분을 흡착제 처리로 제거한 후에 침전 공정에 의하여 높은 순도(>50\%)의 crude paclitaxel을 얻을 수 있어 매우 간단하고 편리하게 전 처리 할 수 있는 방법이다. 식물유래 타르 및 왁스 성분은 paclitaxel의 분리/정제에 많은 악영향을 미치는데, 특히 HPLC 정제 공정에서 칼럼의 충진재(resin) 수명을 단축시킬 뿐만 아니라 처리량을 감소시키고 많은 양의 유기용매 사용을 유발함으로 전 처리 공정에서 반드시 제거되어야 한다. 알루미나는 우수한 표면화학적 활성, 적절한 비표면적과 기공분포를 가지고 있 어 흡착제로 널리 사용되고 있다. 하지만 알루미나 흡착제를 이용한 식물유래 타르 및 왁스 성분 제거를 통한 항암물질 paclitaxel 정제에 관한 체계적 연구는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 분무열분해(spray pyrolysis) 공정에 의해 제조된 물리적 특성이 다른 다공성 메조기공 알루미나(mesoporous alumina) 흡착제의 성능을 조사하였다. 또한 일정한 기공크기에서 다양한 종류의 표면적을 가진 알루미나 흡착제를 제조하여 표면적 변화에 따른 흡착제 처리 효과를 조사하였다. 궁극적으로 식물세포배양에 의한 항암물질 paclitaxel 정제를 위하여, 알루미나 흡착제의 물리적 특성 변화가 흡착제 처리 효과에 미치는 영향을 자세히 조사하고자 하였다.

Paclitaxel은 diterpenoid 계열의 항암물질로 FDA 허가를 받아 난소암, 유방암, 카포시 종양 및 NSCLC 치료용으로 가장 많이 사용되고 있으며, 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등에도 적용되고 있다. Paclitaxel은 세가지 방법으로 생산할 수 있는데 현재는 식물세포배양으로부터 추출,정제를 통해 순도 높은 paclitaxe을 생산하고 있다. 전처리 공정으로 식물유래 타르 및 왁스 성분을 흡착제 처리 후에 침전 공정을 통해 높은 순도의 crude paclitaxel을 얻을 수 있다. 본 연구에서는 물리적 특성에 차이가 있는 다공성 메조기공 알루미나 흡착제의 성능을 조사하였다.

흡착제 처리 건조된 crude extract를 메틸렌 클로라이드에 \( 20 \%( \mathrm { v } / \mathrm { w } ) \) 비율로 녹이고 흡착제 (adsorbent)인 mesoporous spherical alumina를 건조된 crude extract 대비 \( 50 \%( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) 비율로 첨가하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30 분 동안 교반하며 반응시킨 후 여과하였다. 여과액은 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 감압상태에서 건조하여 헥산 침전에 이용하였다. 헥산 침전 흡착제 처리 후 건조된 시료를 메틸렌 클로라이드에 녹여 헥산에 떨어뜨려 침전을 유도하여 비극성 불순물을 제거하였다(메틸렌 클로라이드/혝산 \( = 1 / 10, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \). 헥산 침전 후 여과를 통하여 얻어진 침전물을 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 진공건조 하였다. 건조된 침전물의 순도와 수율을 측정(HPLC 분석)하여 흡착제 처리 효과를 확인하였다. TGA 분석 Thermogravimetric analysis (TGA) (SDTQ600, Shimadzu, Japan)를 사용하여 흡착제 처리 후 흡착제에 붙어있는 불순물 (유기물)의 양을 측정하였다. 온도를 변화시킴에 따른 무게의 변화를 측정하여 유기물의 양을 정량 분석하였으며 air를 주입하고 온도는 \( 800 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 변화시켰다. 결과 및 고찰 알루미나의 물리적 특성변화에 따른 영향 분무열분해 공정에 의해 물리적 특성(표면적, 기공부피, 기공지름)이 다른 네 종류의 다공성 메조기공 알루미나 (alumina I, alumina II, alumina III, alumina IV)를 제조하여 흡착제 처리 실험을 수행하였다. 네 종류의 알루미나를 사용하여 흡착제 처리와 헥산 침전을 수행하여 침전물을 여과/회수하고, \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 동안 진공 건조하여 \( \mathrm { HPLC } \) 로 분석하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 alumina I, alumina II, alumina III 순으로 기공지름이 증가할수록 paclitaxel 순도와 수율이 증가하다 alumina IV에서 다시 순도와 수율이 감소하는 경향을 보였다. Alumina III를 사용하였을 때 가장 높은 순도( 52.5 \%)와 수율( 56.8 \%)의 paclitaxel을 얻을 수 있었다. 흡착제에 붙은 불순물의 경향을 확인하기 위하여 흡착제 처리 후 여과하여 흡착제를 회수하고 이를 메탄올로 세척하여 HPLC 분석을 수행하였다. Fig. 2 에서 보는 바와 같이 alumina \( \mathrm { III } \) 이 alumina I, alumina II, alumina IV에 비하여 많은 불순물들이 흡착/제거됨을 알 수 있었다. 흡착제에 붙은 유기물의 양을 정량하기 위해 \( \mathrm { TGA } \) 분석을 수행하였다. Fig. 3 에서 보는 바와 같이 흡착제에 붙은 유기물의 양이 alumina III (30 wt \%), alumina II (23.7 wt \%), alumina IV (20.9 wt \%), alumina I (18.8 wt \%) 순으로 나타나 alumina III에 가장 많은 유기물(타르 및 왁스 성분 포함)이 흡착/제거됨을 정량적으로 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터 알루미나 흡착제의 물리적 특성에서 표면적과 기공부피 보다는 기공크기(기공지름)이 흡착제 처리 효과에 많은 영향을 미침을 알 수 있었다. 특히 적절한 기공지름 \( ( \sim 10.8 \mathrm { ~nm } ) \) 에서 식물유래 타르 및 왁스 성분을 포함한 불순물을 제거하는데 가장 효과적임을 알 수 있었다. 적절한 기공크기에서 불순물들이 효과적으로 기공 내부로 확산되어 흡착 제거되는 것으로 판단된다. 이러한 연구결과는 활성탄을 이용하여 타르 성분을 효과적으로 제거하기 위해서는 적당한 기공크기의 활성탄이 요구된다는 기존 문헌 보고와 일치하는 것으로, 불순물(타르성분)이 흡착제에 효과적으로 흡착되기 위해서는 기공크기가 매우 중요한 역할을 하기 때문이다.

Crude extract를 메틸렌 클로라이드에 20%(v/w)비율로 녹이고 mesoporous spherical alumina를 50%(w/w)비율로 첨가하여 40\(^\circ \mathrm{C}\)에서 30분 동안 교반하여 반응시킨 후, 헥산에 떨어뜨려 침전하여 비극성 불순물을 제거하고 TGA를 사용하여 유기물의 양을 측정하여 흡착제 처리 효과를 확인하였다. 결과는 알루미나 흡착제의 물리적 특성에서 표면적과 기공부피 보다는 기공크기 흡착제 처리효과가 크게 작용을 하였다고 생각한다. 활성탄을 이용하여 불순물(타르)을 제거하기 위해서는 적당한 기공크기의 활성탄이 요구된다는 기존 문헌 보고와 일치하기 때문에 불순물이 흡착제에 효과적으로 흡착되기 위해서는 기공크기가 매우 중요하다.

일정한 기공크기(기공지름: \( 4.6-5.2 \mathrm { ~nm } \) )에서 표면적이 다른 세 종류의 알루미나(Table \( 2,5 \mathrm { ~A } -1 \sim 5 \mathrm { ~A } -3 \) )를 제조하여 흡착제 처리 효과를 조사하였다. 흡착제 처리를 한 후 헥산 침전을 수행한 결과를 Fig. \( 4 \mathrm { ~B } \) 에 나타내었다. 알루미나의 표면적이 증가할수록 paclitaxel 순도가 증가하다가 5A-2 (277 \( \left . \mathrm { m } ^ { 2 } / \mathrm { g } \right ) \) 부터 거의 변화가 없었다. 반면 수율은 표면적 증가에 따라 거의 변화가 없다가 \( 5 \mathrm { ~A } -3 \left (316 \mathrm { ~m } ^ { 2 } / \mathrm { g } \right ) \) 에서 감소하였다. 흡착제 처리 후 흡착제에 붙은 성분들의 경향을 확인하기 위하여, 흡착제 처리 후 여과하여 흡착제를 회수하고 이를 메탄올로 세척하여 HPLC 분석을 수행하였다. Fig. \( 5 \mathrm { ~B } \) 에 서 보는 바와 같이 \( 5 \mathrm { ~A } -1 \left (153 \mathrm { ~m } ^ { 2 } / \mathrm { g } \right ), 5 \mathrm { ~A } -2 \left (277 \mathrm { ~m } ^ { 2 } / \mathrm { g } \right ) \) 에 비해 \( 5 \mathrm { ~A } -3 \left (316 \mathrm { ~m } ^ { 2 } / \mathrm { g } \right ) \) 에서 상대적으로 높은 paclitaxel 피크를 확인할 수 있었다. 이러한 이유는 표면적이 상대적으로 큰 \( 5 \mathrm { ~A } -3 \left (316 \mathrm { ~m } ^ { 2 } / \mathrm { g } \right ) \) 에서 특히 paclitaxel이 더 많이 흡착되어 paclitaxel 수율이 감소하는 것으로 판단된다. 흡착제 처리 후 흡착제에 붙은 유기물의 양을 정량하기 위하여, TGA 분석을 수행하였다. Fig. \( 6 \mathrm { ~B } \) 에서 보는 바와 같이 흡착제에 붙은 유기물의 양은 \( 5 \mathrm { ~A } -1 \) (20.9 wt \%), \( 5 \mathrm { ~A } -2 \) (22.7 wt \%), \( 5 \mathrm { ~A } -3(25.3 \mathrm { wt } \%) \) 순으로 나타났으며 \( 5 \mathrm { ~A } -3 \left (316 \mathrm { ~m } ^ { 2 } / \mathrm { g } \right ) \) 에서 가장 많은 유기물(타르 및 왁스 성분 포함)이 흡착/제거됨을 정량적으로 확인할 수 있었다. 8 약 바이오매스 유래 항암물질 paclitaxel 정제를 위하여, 물리적 특성이 다른 메조기공 알루미나 흡착제를 제조하여 흡착제 처리 효과를 조사하였다. 알루미나의 물리적 특성 중 표면적과 기공부피 보다는 기공크기(기공지름)이 흡착제 처리 효과에 많은 영향을 미쳤다. 특히 적절한 기공크기(기공지름: \( 10.8 \mathrm { ~nm } \) )에서 식물유래 타르 및 왁스 성분을 포함한 불순물을 제거하는데 가장 효과적이었다. 일정한 기공크기에서 흡착제의 표면적은 paclitaxel 순도뿐만 아니라 수율에 많은 영향을 미치며 흡착제의 표면적이 증가할수록 paclitaxel과 불순물(바이오매스 유래 타르 및 왁스 성분 포함)의 흡착 정도는 증가하였다. 이러한 불순물 제거 효과는 흡착제 처리 후 흡착제를 메탄올로 세척하여 HPLC로 분석한 결과와 흡착제에 붙은 유기물의 TGA 정량 분석 결과로도 확인할 수 있었다.

바이오매스에서 유래한 항암 물질 paclitaxel 정제를 위해 물리적 특성이 다른 메조기공 알루미나 흡착제를 만들어 흡착제 처리 효과를 조사했다. 그 결과 알루미나의 물리적 특징 중 표면적과 기공 부피 보다는 기공 크기가 흡착제 처리 효과에 많은 영향을 미쳤고, 균일한 기공크기에서 흡착제의 표면적은 paclitaxel 순도뿐만 아니라 수율에 많은 영향을 미쳤다. 즉, 흡착제의 표면적이 증가할수록 paclitaxel과 불순물의 흡착 정도는 증가했다.

따라서 토양 성분 분석에서는 갯벌 토양의 황산염 함량이 가장 높았지만, 실제 혐기 환경에 존재하는 초산과 젖산을 이용하는 SRB는 논토양이 평균 \( 10 ^ { 5 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \), 담수가 평균 \( 10 ^ { 4 } \) \( \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \) 그리고 갯벌에 그 이하의 균이 존재하고, 유기농 토양보다 농약 토양이, 그리고 오염담수 토양보다 청정 담수 토양의 SRB 분포가 약간 많음을 알 수 있었다. 그러나 계절적인 변화에 있어서는 큰 차이를 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 황화수소 생성 가스 크로마토그라피를 이용하여 황화수소 생성 생성량을 특정한 결과 모든 토양 시료에서 배양 3주째에 가장 높은 황화수소 값을 나타내(data not shown), 배양 3주째의 가스크로마토그래피에서 검출되는 황화수소 값을 조사하여 황화수소 생성량으로 비교하였다. 유기농 토양의 초산과 젖산을 이용한 황화수소 생성량은 각각 \( 4.58 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)과 \( 18.65 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \), 전체 \( 23.23 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)을, 관행 농법인 농약 토양의 초산과 젖산을 이용한 황화수소 생성량은 각각 \( 3.61 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)과 \( 16.20 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \), 전체 \( 19.81 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)의 황화수소를 생성하였다. 그리고 청정갯벌 토양의 초산과 젖산을 이용한 황화수소 생성량은 각각 \( 5.62 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)과 \( 13.56 \) \( ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)으로, 전체 \( 19.19 \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)을, 오염갯벌 토양은 각각 \( 25.24 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)과 \( 27.47 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)으로 전체 \( 52.71 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)의 황화수소를 생성하였다. 또한 청정담수 토양은 초산과 젖산을 이용하여 각각 \( 0.31 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)과 \( 7.03 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)으로, 전체 \( 7.35 \) \( ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)의 황화수소를 생성하였고, 오염담수 토양은 각각 \( 12.81 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)과 \( 10.74 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)으로, 전체 \( 23.55 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)의 황화수소를 생성함을 확인하였다.

본 연구에서는 토양 성분 분석을 통해 갯벌 토양의 황산염 함량이 높음을 확인하였으나, SRB 균의 분포는 논토양과 담수에서 더 높았다. 계절적 변화는 유의미하지 않았다. 가스 크로마토그래피를 이용하여 모든 토양 시료에서 3주 배양 시 최고의 황화수소 생성량을 관찰하였고, 청정갯벌 토양은 \(19.19 \mu \mathrm{mol}/\mathrm{g}\), 오염갯벌 토양은 \(52.71 \mu \mathrm{mol}/\mathrm{g}\)의 황화수소를 생성하였다.

황산염 환원세균(SRB)의 분포 유기농 토양에서 초산을 이용하는 SRB가 \( 9.33 \times 10 ^ { 4 } -2.4 \times 10 ^ { 5 } \) \( \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \), 젖산을 이용하는 SRB는 \( 9.32 \times 10 ^ { 3 } -7.49 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \)이 검출되어 유기농법 토양에 존재하는 평균 SRB는 \( 1.03 \times 10 ^ { 5 } \) \( \mathrm { MPN } / \mathrm { g } \)로 나타났고, 농약 토양에서 초산을 이용하는 SRB가 \( 3.61 \times 10 ^ { 4 } -2.40 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \), 젖산을 이용하는 SRB는 \( 3.61 \times 10 ^ { 4 } \) - \( 2.40 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \)이 검출되어 농약 토양에 존재하는 평균 SRB는 \( 1.27 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \)으로 확인되었다. 그리고 청정 담수에서 초산을 이용하는 SRB가 \( 2.40 \times 10 ^ { 4 } -3.61 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \), 젖산을 이용하는 SRB가 \( 9.31 \times 10 ^ { 3 } -3.61 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \)로 나타나 청정 담수에 존재하는 평균 SRB가 \( 2.30 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \)로 확인되었고, 오염 담수 토양에서 초산을 이용하는 SRB가 \( 2.40 \times 10 ^ { 4 } -3.61 \times 10 ^ { 4 } \) \( \mathrm { MPN } / \mathrm { g } \), 젖산을 이용하는 SRB가 \( 7.35 \times 10 ^ { 3 } -2.40 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \)으로 나타나 오염 담수에 존재하는 평균 SRB가 \( 1.92 \times 10 ^ { 4 } \) \( \mathrm { MPN } / \mathrm { g } \)로 확인되었다. 그러나 청정 갯벌과 오염 갯벌 토양의 초산과 젖산 이용 SRB는 모두 \( 3.61 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \) 미만으로 나타나 MPN으로 확인할 수 없었다.

유기농법 토양, 농약 토양, 청정 담수, 오염 담수에서 초산과 젖산을 이용하는 SRB의 수치를 조사하였다. 유기농법 토양에서의 평균 SRB는 \(1.03 \times 10^5 ~MPN/g\), 농약 토양에서는 \(1.27 \times 10^5 ~MPN/g\), 청정 담수에서는 \(2.30 \times 10^4 ~MPN/g\), 오염 담수에서는 \(1.92 \times 10^4 ~MPN/g\)로 나타났다. 그러나 청정 갯벌과 오염 갯벌 토양에서 초산과 젖산을 이용하는 SRB는 \(3.61 \times 10^4 ~MPN/g\) 미만으로 측정되어 MPN으로 확인할 수 없었다.

결 과 토양 성분 토양시료의 성분 분석 결과, 수분함량은 유기농법 토양이 농약 토양보다, 그리고 갯벌 토양 보다 담수 토양에서 더 높게 나타났고, 각 토양의 수분 함량은 장마 후인 8월에 채취한 토양에서 가장 높게 나타났다. 그리고 계절이 겨울로 갈수록 전반적으로 수분 함량은 감소하였으나 청정 지역과 오염 지역 토양간의 수분 함량 차이는 나타나지 않았다. 총 탄소는 농약과 청정 갯벌 토양에서 낮은 함량을 나타내고, 오염 지역 토양이 청정 지역 토양보다 비교적 높음을 알 수 있었으나, 수분함량의 경우처럼 계절의 변화에 따른 차이는 볼 수 없었다. 그러나 대부분의 토양에서 10월에 채취한 토양의 총 탄소 함량이 높게 나타났다. 그리고 총 유기탄소도 총 탄소와 비슷하게 관행 농법과 청정 갯벌 토양에서 낮은 함량을 나타냈고, 계절과 오염에 따른 연관성은 뚜렷하게 구분되지 않았다. 질소 성분인 암모니아의 함량은 오염 갯벌에서 비교적 높은 함량을 나타냈고, 계절적으로 논토양이 겨울로 진행 될수록 암모니아 성분이 축적되었고, 담수 토양과 갯벌 토양은 10월에 채취한 토양에서 가장 높은 함량을 나타냈다. 그리고 총 질소는 갯벌 토양보다는 논과 담수 토양에서 더 높은 함량을 나타내, 평균적으로 논토양과 오염 지역의 담수 토양에서 총 질소 함량이 높고 갯벌 토양에서 낮은 함량을 나타내었다. 총인 함량은 담수 토양과 유기농법에서 가장 높게 나타났고, 오염 토양의 총 인 함량이 청정 토양보다 비교적 높게 나타났으며, 총 인 함량도 질소 성분처럼 대부분 가을에 비교적 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 총 무기인의 함량도 총 인 함량과 비슷한 양상을 나타내 유기농법과 오염된 토양에서, 그리고 가을 토양에서 비교적 높게 나타났다. 황산염 환원에 가장 큰 영향을 주는 것으로 알려진 황산염 농도를 조사한 결과 유기농법 토양이 평균 \( 3.36 \mathrm { ~mg } / \mathrm { kg } \), 농약이 약 \( 3.32 \mathrm { ~mg } / \mathrm { kg } \), 청정 갯벌이 약 \( 34.03 \mathrm { ~mg } / \mathrm { kg } \), 오염 갯벌이 약 \( 41.01 \mathrm { ~mg } / \mathrm { kg } \), 청정 담수가 약 \( 1.59 \mathrm { ~mg } / \mathrm { kg } \), 오염 담수가 약 \( 2.50 \mathrm { ~mg } / \mathrm { kg } \)로 나타나, 갯벌 토양의 황산염 함량이 가장 높았고, 담수의 함량이 가장 낮은 것으로 확인되었다. 그러나 계절변화에 따른 연관성은 찾아볼 수 없었다.

토양 시료 분석 결과, 수분함량은 유기농법 토양에서 가장 높았고, 총 탄소는 오염된 지역 토양에서 비교적 높게 나타났다. 장마 후인 8월에 채취한 토양의 수분함량은 가장 높았다. 총 질소와 총 무기인은 논과 담수 토양에서 더 높았으며, 갯벌 토양에서는 높지 않았다. 황산염 함량은 갯벌 토양이 가장 높았다.

황산염환원 세균 수 조사 토양시료 내에 기질로 초산과 젖산을 이용하는 황산염환원 세균의 수를 most probable numbers (MPN) 방법으로 실험한 후, 그 결과를 most probable numbers calculator (version4.04; United States Environmantal protection agency, Ohio) 프로그램을 이용하여 산정하였다. 황화수소 발생량 측정 \( 1 \mathrm { ~g } \)의 토양을 \( 9 \mathrm { ml } \)의 혐기성 BCYT 배지가 들어있는 혐기배양 시험관(Bellco Glass Inc., Vineland, N.J.)에 넣고 고무마개로 닫은 후, aluminum seals로 밀봉하였다. 이 시험관에 멸균된 주사기를 이용하여 \( 20 \mathrm { ~mM } \)의 초산과 젖산을 각각 주입하였고, 모든 시험관에는 \( 2 \mathrm { ~mM } \)의 황산나트륨을 환원제 및 황원으로 첨가하였다. 이를 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 항온 배양기에서 정치배양 하면서, 매주 5주 동안 디지털 압력계(DPI 705; Druck)를 이용하여 압력을 측정하였고, GC-14B 유리 컬럼(Shimadzu)과 불꽃광검출기(FPD)가 부착된 가스크로마토그래피(GC-14B, Shimadzu, Japan)를 이용하여 황화수소 생성량을 조사하였다. 이 때, 실험조건은 운반가스로 질소를 사용하였으며 유속은 \( 13 \mathrm { ~psi } \)로 하였고, 공기와 수소는 각각 \( 5 \mathrm { ~kgf } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \)로 조정하였다. 컬럼 오븐의 온도는 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 시료 주입부는 \( 150 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 검출기는 \( 150 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 조정 하였고, 혐기시험관 내의 가스를 \( 25 ~ \mu 1 \)씩 주입한 후 생성하는 피크 면적 값을 표준 황화수소 가스를 이용한 표준곡선을 이용하여 황화수소 생성량으로 환산하였다. 황산염 환원율 측정 \( 2.5 \mathrm { ~ml } \)의 \( 10 \% \) 초산 아연이 들어있는 시험관을 장착한 시험병에 토양시료 \( 1 \mathrm { ~g } \)과 \( 1 \mathrm { ~ml } \) 의 BCYT 배지를 질소가스 충진 하에 첨가한 후, \( 2 \mathrm { ~uCi } ^ { ~35 } \mathrm { S } - \mathrm { SO } _ { 4 } { } ^ { 2- } \)를 주입하고 암소에서 2시간 배양하며 황산염을 환원시켰다. 그 후 주사기를 통해 혐기상태의 \( 6 \mathrm { ~M } \) 염산 \( 8 \mathrm { ~ml } \)과 \( 0.5 \mathrm { ~M } \) 염산에 용해된 \( 1 \mathrm { ~M } \) 염화크롬(Ⅱ) \( 8 \mathrm { ~ml } \)을 주입하고 48시간 동안 환원된 황산염을 포획한 후, trap 내에 포획된 방사성 동위원소와 시험병 내에 남아있는 환원되지 않은 \( { } ^ { 35 } \mathrm { SO } _ { 4 } ^ { ~2- } \) 동위원소 량을 액체섬광계수기(LS 6500, Beckman Coulter, Fullerton, CA)로 측정한 후, 황산염 환원율을 조사하였다.

토양시료 내의 황산염환원 세균 수를 most probable numbers (MPN) 방법으로 실험하고, 결과를 계산하였다. \(30^{\circ}C\)에서 배양하며, 디지털 압력계와 가스 크로마토그래피를 사용하여 황화수소 생성량을 조사하였다. 시험병에 토양시료, 초산 아연, BCYT 배지를 넣고 황산염을 환원시킨 후, 염산과 염화크롬을 추가하여 환원된 황산염을 포획하였다. 방사성 동위원소를 측정하여 황산염 환원율을 조사하였다.

전체적으로 초산과 젖산을 이용한 황화수소 생성량의 평균은 각각 \( 8.7 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)과 \( 15.6 \mathrm { ~ \mu mol } / \mathrm { g } \)으로 젖산을 이용할 때 황화수소 생성량이 더 많음이 확인되어 초산을 이용하는 완전 산화균보다, 발효산물을 초산까지 산화하는 불완전 산화균의 활성이 우세한 것을 확인하였다. 황산염 환원율 \( { } ^ { 35 } \mathrm { S } -S O_ { 4 } { } ^ { 2- } \)를 이용하여 황산염 환원율을 조사한 결과 유기농 토양의 SRR은 평균 \( 117.72 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \), 농약 토양은 평균 \( 122.45 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \)을 나타내었고, 계절적으로는, 유기농과 농약 토양 모두 10월 시료 토양이 각각 \( 306.54 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \)와 \( 239.52 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \)를 나타내 모든 종류의 토양에서 가장 큰 값을 나타내었다. 그리고 갯벌토양은 청정 갯벌 SRR이 평균 \( 19.39 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \), 오염 갯벌은 평균 \( 27.36 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \)을 나타냈고, 청정 갯벌 토양의 경우 10월에 \( 239.52 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \)로 가장 큰 값을 보였지만, 오염 갯벌 토양의 경우에는 8월에 \( 53.84 \) \( \mathrm { nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \)이 가장 높은 값으로 확인되었다. 담수토양의 경우 청정 담수 토양의 SRR은 평균 \( 12.11 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \), 오염 담수 토양은 평균 \( 26.88 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \)로 나타났고, 논보다는 낮았지만, 여름과 가을에는 갯벌토양과 비슷한 황산염 환원율을 나타내었다. 그리고 담수와 갯벌을 비교할 경우, 청정 담수 \(( 12.11 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } ) \)와 청정 갯벌 \(( 19.39 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } ) \), 그리고 오염 담수 \(( 26.88 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } ) \)와 오염 갯벌 \(( 27.36 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } ) \)은 서로 유사한 평균 수치를 보였고, 청정 담수 토양은 10월에 \( 26.38 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \)로 가장 높고, 오염 담수 토양은 8월에 \( 52.58 \mathrm { ~nmol } / \mathrm { g } / \mathrm { day } \)로 가장 큰 높은 것으로 확인되어 일반적으로 오염 담수지역이 청정담수 지역보다 SRR이 높은 것으로 확인되었다.

황화수소 생성에서는 초산보다 젖산이 더 효과적이며 완전 산화균보다 불완전 산화균의 활성이 더 우세했다. 황산염 환원율을 조사한 결과, 농약 토양과 유기농 토양의 SRR 모두 10월 시료 토양의 수치가 가장 컸다. 갯벌 토양에서 청정 갯벌은 10월에, 오염 갯벌은 8월에 SRR 수치가 가장 컸다. 담수토양의 SRR은 여름과 가을에는 갯벌토양과 비슷한 수치를 보였다. 담수와 갯벌을 비교하면 청정 토양과 오염 토양이 각각 서로 유사한 수치를 보였고, 일반적으로 오염 담수지역이 청정담수 지역보다 SRR이 높았다.

황화수소 생성 실험에서 기질로 초산보다 젖산을 이용할 때 황화수소가 더 많이 생성하는 것으로 보아, 이들 토양에는 초산을 이용하는 완전 산화균보다 발효산물을 초산까지 산화하는 불완전 산화균의 활성이 우세한 것으로 추정된다. 황산염 환원 반응에서 젖산이 초산으로 불완전 산화할 경우의 표준자유에너지의 변화 \( \left ( \mathrm { G } ^ { 0 \prime } \right ) \)가 \( -160.1 \mathrm { ~kJ } / \mathrm { mol } \cdot \mathrm { sulfate } \), 초산이 이산화탄소로 완전 산화할 경우 \( \Delta \mathrm { G } ^ { 0 \prime } \)가 \( -47.6 \mathrm { ~kJ } / \mathrm { mol } \cdot \mathrm { sulfate } \)이므로 완전산화보다 불완전산화가 더 자발적인 반응이다. 따라서 본 연구에서 사용한 토양의 황화수소 생성량을 볼 때 완전 산화균 보다 불완전 산화균의 활성이 우세하다는 결과는 에너지 보존 측면과 일관성이 있는 것으로 보여진다. 또 황화수소 생성량은 오염된 갯벌이 \( 52.71 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)으로 가장 높고, 논과 오염된 담수, 청정 갯벌 토양이 약 \(19.19-23.55 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)로 비슷하고, 청정담수가 \( 7.35 ~ \mu \mathrm { mol } / \mathrm { g } \)로 나타나, 황화수소 생성은 담수보다는 황산염 성분이 높은 갯벌이, 청정지역 보다는 오염된 환경에서 많이 생성하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 계절별로는 토양 내 영양소가 농축 되는 10월 토양에서 황화수소 생성이 가장 높아, 황화수소 생성은 온도보다는 영양소 성분에 의해 영향 받음을 알 수 있었다. 황산염 환원율은 황산염 농도가 높은 갯벌토양의 황산염 환원율이 높게 나타날 것이라는 예상과는 달리 논토양이 가장 높고, 담수토양이 가장 낮게, 그리고 오염된 토양이 청정한 토양보다 황산염 환원율이 높은 것으로 나타났다. 또 계절적으로는 논토양은 일반적으로 토양성분이 높게 나타나는 가을에 가장 높았고, 갯벌과 담수는 기온이 높은 8월 시료와 토양 성분들이 농축된 10월 시료에서 높게 나타나 황산염 환원율도 황화수소 생성과 같이 토양의 영양소에 영향을 받고, 또한 온도에 의해서도 영향을 받는 것을 알 수 있었다. 따라서 황산염 환원은 토양성분과 온도 등의 복합적 요인과 관계가 있을 것으로 생각된다. 일반적으로 해수에는 적당량 황산염 농도가 존재하기 때문에 해수 전체 탄소 순환의 상당부분에 황산염 환원 관여하는 것으로 알려져 있고, 이에 대한 많은 연구가 이루어졌으나 담수 환경에서의 황산염 환원 연구는 거의 진행되지 않았다. 그러나 최근 몇 년 동안의 연구 결과는 담수도 해수만큼이나 높다는 사실이 알려지고 있는데 이는 논농사 지역의 낮은 황산염 농도를 함유한 토양에서도 황산염 환원세균이 잘 적응할 수 있다는 잠재적인 가능성을 시사해주는 증거라고 생각되며 본 연구의 결과와 어느 정도 유사성이 있다고 여겨진다. 특히, 농사 지역과 담수 지역 모두 황산염 농도가 갯벌 토양보다 현저히 낮은 편이었는데도 황산염 환원율은 논토양이 담수 토양보다 높게 나타난 것은 토양 내 함유된 성분들과 벼 뿌리주변에 존재하는 미생물들 간의 유기적인 상호작용이 황산염 환원율과도 관련이 있을 것으로 추측되므로, 추후 식생과 비식생의 차이에 의한 비교 연구가 필요할 것으로 판단된다.

수소 생성은 불완전 산화균의 활성에 의해 인증된다. 황화수소 생성 실험에서 젖산이 초산보다 더 많이 생성되는 것으로 보아, 토양에는 불완전 산화균의 활성이 우세함이 추정되고, 불완전 산화가 완전 산화보다 더 자발적인 반응이라는 것이 인증되었다. 그리고 계절별로 황화수소 생성은 10월에 가장 높아, 온도보다는 영양소 성분에 의해 영향을 받는다.

토양시료 채취 유기농법, 관행농법, 청정담수, 오염담수, 청정해수, 오염해수 총 6가지 종류의 토양을 6월, 8월, 10월과 11월(12월) 총 4회에 걸쳐 채취하였다. 토양시료는 유기농과 농약, 청정, 오염담수 그리고 청정, 오염 갯벌 별로 각각 3지점의 토양에서 각 지점 별로 각각 3곳의 깊이 \( 10 \mathrm { ~cm } \) 정도의 토양을 채취한 후, 이들을 동량씩 혼합하여 각 지점의 대표적인 시료로 사용하였다. \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 유지하면서 운반된 토양은 황산염 환원균수, 황산염 환원율, 황화수소 생성량 그리고 기질 소모량 측정 실험을 위해 모두 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 보관하며 실험하였다. 토양성분 분석 토양성분은 공정시험법에 의거해 분석하였다. 토양 내 수분은 건토 중량법으로 건조기(FO-600M, Jeio tech, Korea)에서 \( 110 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간 건조한 후 무게를 측정하였고, 총 질소(total nitrogen, TN)는 Kjeldahl 법으로 측정하여 \( 0.001 \mathrm { N } \mathrm { ~H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \)로 적정하였다. 그리고 시료 내 총 인산(total phosphorus, TP)은 과염소산 분석법을 이용하여 \( 470 \mathrm { ~nm } \)에서 분광기(Lambda EZ201, Perkinelmer, USA)로 비색측정을 하여 결정하였고, 총 탄소(total carbon; TC)와 총 유기탄소(toral organic carbon, TOC)는 \( 0.05 \mathrm { ~g } \)의 시료를 탄소 측정기(SSM-500A, Shimadzu, Japan)를 이용하여 측정하였다. 그리고 총 무기인(total in-organic phosphorus; TPi)은 \( 1 \mathrm { ~g } \)의 시료를 처리하여 1-ami-no-2-naphtol-4-sulfonic acid로 발색 시킨 후 \( 440 \mathrm { ~nm } \)에서 분광기(Lambda EZ201, Perkinelmer, USA)로 측정하였고, 암모니아 (extractable ammonium; \( \mathrm { NH } _ { 4 } ^ { + } \))는 토양 시료 \( 10 \mathrm { ~g } \)을 건토화하여 침출액을 넣어 항온 배양기(SI 900R, Jeio Tech., Korea)에서 추출하고, 여과한 후 \( 0.001 \mathrm { ~N } \mathrm { ~H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \)로 적정하여 정량하였으며, 황산염 \( \left ( \mathrm { SO } _ { 4 } ^ { -2 } \right ) \)은 \( 2.5 \mathrm { ml } ~25 \% \) 질산과 \( 2 \mathrm { ml } \) acetic-phos-phoric acid, \( 0.5 \mathrm { ml } \) 황산바륨 현탁액과 \( 0.2 \mathrm { ~g } \) 염화바륨을 첨가하여 \( 440 \mathrm { ~nm } \)에서 측정, 분석하였다.

6가지 종류의 토양을 4회에 걸쳐 10cm 깊이 3지점에서 채취하여 각 지점 별로 동량 혼합하여 대표적인 시료로 사용하였다. 채취된 토양성분은 공정시험법에 의거해 분석하였는데, 수분은 건토 중량법, 총 질소는 Kjeldahl 법, 총 무기인은 분광기를 통해 분석하였다. 또한 암모니아와 황산염의 성분도 각각의 화학적 방법으로 분석하였다.

토양 성분과 황산염 환원균의 분포를 비교한 결과, 농약 토양이 유기농 토양보다, 청정 담수토양이 오염 담수토양보다 황산염 환원균의 분포가 비교적 우세한 것으로 확인되어, 토양 성분은 갯벌 토양의 황산염 함량이 가장 높지만, 토양 내 황산염 성분이 일정량 이상 존재하면 토양 내 황산염 함량보다 다른 토양 성분들의 함량이 높은 토양에 황산염 환원균이 비교적 많이 분포하는 것을 확인하였다. 또 본 실험에서 확인 된 황산염 환원균의 수가, 논토양이 평균 \( 10 ^ { 5 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \), 담수가 평균 \( 10 ^ { 4 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \), 그리고 갯벌이 평균 \( 10 ^ { 3 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \) 이하의 균이 존재하는 것으로 확인되어, 미국 플로리다 주 Everglades의 습지의 인산에 의해 오염된 지역에서 확인된 황산염 환원균 \( 1.5 \times 10 ^ { 6 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \)과, 청정지역에 존재하는 황산염 환원균 \( 9.2 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \), 독일의 Kattegat 해안 퇴적토의 균수 \( 10 ^ { 6 } \) \( \mathrm { ~MPN } / \mathrm { g } \) 보다 적게 나타났다. 따라서 이처럼 황산염 함량이 높은 갯벌 토양도 황산염 환원균의 수가 더 적게 검출된 것은 나트륨을 비롯한 해양 환경에 특이적으로 유지될 필요성이 있는 여러 가지 무기염류의 양을 조절하거나 또는 복합적인 전자공여체를 포함하여 기질로 사용된 전자공여체의 종류와 농도에 따라서 황화수소 생성이나 황산염환원이 크게 영향을 받는다는 보고처럼 배지성분과 조건들에 따라 황산염 환원균의 차이가 발생했기 때문이라 추정된다. 따라서 최근 사용되는 방사성동위원소 \( { } ^ { 35 } \mathrm { S } - \mathrm { SO } _ { 4 } ^ { -2 } \)를 이용한 T-MPN 방법과 같은 개선된 MPN 방법을 이용하여 추가적인 연구가 진행되어야 정확한 차이를 파악할 수 있을 것으로 생각된다

본 연구에서는 토양 성분과 황산염 환원균 분포를 분석하였다. 토양 성분이 더 많은 농약 토양과 청정 담수토양에서 황산염 환원균 분포가 우세하였으며, 토양 내 황산염 성분보다 다른 토양 성분들의 함량이 높은 토양에 황산염 환원균이 더 많이 분포하는 것을 확인하였다. 이는 배지성분과 조건 등에 따라 황산염 환원균의 차이가 발생하는 것으로, 이를 파악하기 위해 방사성동위원소 \( { } ^ { 35 } \mathrm { S } - \mathrm { SO } _ { 4 } ^ { -2 } \)를 이용한 T-MPN 방법을 통한 추가 연구가 필요하다.

서 론 혐기성 상태를 유지하는 물에 잠긴 토양의 유기물 분해는 매우 복잡하며 여러 미생물 군집이 관여하는 일련의 동조된 과정에 의해 일어난다. 다양한 미생물에 의해 고분자 물질이 단량체로 분해된 후, 분해된 단량체는 Clostridium, Lactobacillus, Acetobacter 속의 일차적인 발효세균에 의해 휘발성 지방산, 알콜, 초산, 개미산, 수소, 이산화탄소 등으로 발효된다. 그리고 이들에 의해 생성된 초산, 개미산, 수소, 이산화탄소는 메탄생성세균에 의해 직접 메탄으로 전환하지만, 그 외의 발효 산물들은 이차적으로 발효균들의 대사활동으로 초산이나 수소, 이산화탄소로 다시 전환된 후 메탄생성에 이용된다. 그러나 질산염, 철, 망간, 황산 등의 전자수용체가 존재하면 유기물의 혐기성 분해과정이 달라진다. 질산염이 존재하면 탈질(denitrification)과정으로 유기물이 분해되고, 철과 망간과 같은 금속이온이 존재하면 금속이온을 환원하며 에너지를 얻고, 황산염이 존재하면 최종 전자수용체로 황산염을 이용하는 혐기성 세균인 황산염 환원세균(sulfate-reducing bacteria, SRB)에 의해 황화수소를 생성하며 에너지를 획득한다. 그리고 실제 이들 과정들이 메탄 생성보다 열역학적으로 우수하므로 이 전자수용체들이 존재하면 이들을 이용하는 방향으로 분해가 진행된다. 하지만 일반적으로 혐기성 환경을 유지하는 물에 잠긴 토양은 질산염의 농도가 매우 낮고, 철과 망간 등의 금속이온은 고체 상태나 낮은 농도로 존재하기 때문에 이 두과정은 혐기성 환경의 미생물 활성에 크게 영향을 주지 못한다. 따라서 혐기환경에서 나타나는 가장 일반적인 탄소순환 과정은 메탄생성(methanogenesis)과 황산염 환원 과정이 일어난다. 보통 담수에서는 황산염의 농도가 낮아 메탄생성이 주로 일어나고, 해양과 염습지는 적당량의 황산염이 함유되어 있기 때문에 유기물 분해의 \( 70 \% \)까지 황산염 환원과정으로 진행된다. 이에 따라 해양의 황산염 환원 연구는 갯벌, 염습지를 대상으로 그 연구가 비교적 많이 진행되고 있지만, 황산염을 적게 함유하고 있는 담수 토양의 황산염 환원 연구는 거의 이루어 지지 않고 있다. 그러나 일부 연구 결과 담수도 해수만큼 황산염 환원이 많이 이루어지고 있는 것으로 확인되고 있다. 본 연구는 오염된 연못과 청정 연못, 오염된 갯벌과 청정 갯벌, 유기 농법 논과 일반 관행농법의 논토양을 채집하여 이들 토양의 화학적 성분과 토양에 따른 황산염 환원률(sulfate reduction rate, SRR)과 황산염 환원균수, 황화수소 생성량을 측정하여 담수와 해수의 혐기 환경토양, 그리고 오염된 혐기환경토양과 청정 혐기환경 토양에서의 황산염환원에 대한 상관관계가 있는지를 전체적으로 조사하고자 하였다. 재료 및 방법 토양 시료 및 사용배지 토양 시료는 유기농의 경우 친환경농법으로 인증된 충청남도 당진, 예산, 청양의 논에서, 관행농법(농약) 토양은 충북 청원과 충남 당진의 논에서, 청정담수의 토양은 주변 환경이 산으로 둘러 싸여 오염원이 적은 것으로 판단되는 충북 옥천과 영동, 충남 청양의 저수지에서, 오염담수는 오래된 낚시터와 주변 환경이 식당이나 산업단지에 인접해 있어 오염에 노출된 것으로 판단되는 충북 옥천과 대전광역시에 위치한 저수지 토양을, 그리고 청정 갯벌은 충남 서산의 구도리 주변의 갯벌 토양을, 오염 갯벌은 전남 광양의 석유화학단지 주변의 갯벌 토양을 채취하여 사용하였다. 시료 채취 시기는 논토양의 경우 벼의 생육에 따라 미생물 군집이 영향을 받으므로 모내기 직후인 6월과 장마가 끝난 후인 8월, 벼가 익어가는 10월, 그리고 추수 후인 11월에, 담수와 갯벌 토양은 6월, 8월, 10월, 12월 총 4회에 걸쳐 토양을 채취하였고, 혐기성 배양은 basal carbo-nate-yeast extract-trypticase (BCYT) 배지를 기본 배지로 사용하여 실온에서 배양하였다.

다양한 미생물 군집이 참여하여 혐기성 상태에서 토양의 유기물이 분해되는 과정이 전자수용체의 존재에 따라 달라질 수 있다. 이를 연구하기 위해 오염된 연못과 갯벌, 청정 연못과 갯벌, 그리고 유기 농법과 관행 농법에서의 논토양을 채집하여 화학적 성분과 황산염 환원률, 황산염 환원균수, 황화수소 생성량을 측정하였다. 이를 통해 담수와 해수의 혐기 환경토양, 그리고 오염된 혐기환경토양과 청정 혐기환경 토양에서의 황산염환원에 대한 상관관계를 종합적으로 탐색하였다.

따라서 논토양의 SRR이 다른 지역 토양보다 높았고, 논토양끼리의 비교에서는 큰 차이는 없었으나 농약 토양이 유기농 토양보다 약간 높게 나타났고, 담수 토양보다는 갯벌 토양에서 더 높게, 그리고 청정 지역 토양보다는 오염 지역 토양의 SRR 값이 더 높은 것으로 확인되었다. 전체적으로는 농약 토양과 유기농 토양이 가장 큰 SRR 값을 나타냈고, 그 다음으로 오염 갯벌 토양, 오염 담수 토양, 청정 갯벌 토양 그리고 청정 담수 토양의 순서로 나타났다. 토양성분과 황산염 환원율의 상관관계 본 실험에서 조사된 토양의 화학 성분들 중 특히 자연 생태계의 균의 성장을 제한하는 요소인 질소와 인의 함량이 높아 정확한 상관관계를 추정하기 어려울 것으로 판단되었다. 그러나 토양시료의 모든 성분과 SRR과의 유의성을 상관분석 프로그램으로 통계처리를 해본 결과, 6월 시료에서는 SRR과 초산산화균의 수와의 \(P \)값이 0.0536으로, 그리고 10월 시료에서는 SRR과 암모니아 농도와의 \(P \)값이 0.0429, TP와의 \(P \)값이 0.0552로, 12월 시료에서는 SRR과 암모니아 농도와의 \(P \) 값이 0.016으로 그리고 초산 산화균수와의 \(P \)값이 0.0002로 나타나 유의성이 있는 것으로 조사되었고, 일부 토양성분 특히, 질소와 인 그리고 토양에 존재하는 황산염 환원균의 수와 황산염 환원율과는 유의성이 있음을 확인하였다. 또 일반적으로 토양의 황산염 성분에 따라 황산염 환원과 그리고 황화수소 생성량이 영향을 받는 것으로 알려져 있으나, 본 실험 결과 토양 내 황산염 농도보다는 다른 토양 성분들 즉, 오염 여부가 황산염 환원과 황화수소 생성에 더욱 영향을 주는 것으로 확인되었다. 고 찰 본 실험은 담수와 해수의 청정지역과 오염지역의 토양 그리고 유기농법과 관행농법을 사용한 논토양을 계절별로 채취하여 각각의 혐기 환경에서의 토양성분, 황산염 환원세균 수, 황화수소 생성량과 황산염 환원율을 조사하여 혐기환경의 황산염 환원에 대해 종합적으로 파악하고자 하였다. 본 실험에서 각 토양의 수분 함량 분석 결과, 장마 후인 8월에 채취한 토양의 수분함량이 가장 높고 겨울로 갈수록 토양 수분 함량이 전반적으로 낮아지는 경향을 보였으나, 청정지역 토양과 오염지역 토양의 수분함량의 차이는 나타나지 않았다. 토양의 총 탄소 함량은 갯벌토양의 함량이 비교적 적고, 오염토양이 비교적 높은 것으로 나타났고 계절적인 큰 차이는 없었으나 일반적으로 가을철에 채취한 10월 토양의 함량이 약간 높은 것으로 확인되었다. 총 유기탄소 함량 역시 갯벌의 함량이 낮음을 알 수 있었으나, 계절과 오염에 따른 일반적인 경향을 파악할 수는 없었다. 그리고 농약 토양은 농약과 화학 비료를 사용하기 때문에 유기질 비료나 퇴비를 시비하는 유기농 토양보다는 토양 내 유기물이나 생명체가 적다고 보고된 것과 같이 농약 토양의 총 탄소 함량과 총 유기탄소 함량이 상대적으로 낮은 것으로 나타났다. 질소성분인 암모니아 함량은 계절적으로 논토양은 겨울로 갈수록 암모니아가 축적되었고, 담수와 갯벌의 10월 토양시료에서 가장 높은 함량을 나타냈다. 그리고 총 질소 함량은 논과 오염된 담수의 함량이 높고, 갯벌의 함량이 낮은 것으로 나타났으나, 전체적으로 김해지구 초지토양의 총 질소 함량과 비슷한 질소량을 갖고 있음을 확인하였다. 토양의 총 인과 총 무기인의 함량은 담수토양과 유기농의 함량이 가장 높고, 오염 지역의 함량이 청정지역보다 높음을 알 수 있고, 총인 함량은 질소성분처럼 일반적으로 가을에 비교적 높음을 확인할 수 있었다. 그리고 총 무기인의 함량은 총 인과 비슷하게 유기농법과 오염된 환경에서, 계절적으로는 가을에 비교적 높은 것으로 나타났다. 또 황산염 환원에 가장 큰 영향을 주는 것으로 알려진 황산염 농도를 조사한 결과, 갯벌의 황산염 함량이 가장 높고, 담수의 함량이 가장 낮은 것으로 나타났으며 계절에 따른 황산염 함량의 차이는 없는 것으로 나타났다. 이상의 결과 토양성분은 황산염 함량을 제외하고 대부분의 토양 성분이 논토양에서 높게 나타났고, 특히 관행농법인 농약을 사용한 논 보다 유기농법을 사용한 논토양의 성분들이 비교적 높게 나타나, 일반적으로 유기농법이 다양한 토양 성분을 많이 갖고 있어 작물의 생육에 유리함을 확인할 수 있었다. 그리고 오염된 담수와 갯벌을 비교할 때 대부분의 토양성분들이 청정지역보다 오염지역에 많이 함유되어 있어 주변 환경에 따라 토양 성분이 달라짐을 확인 할 수 있었다.

본 실험에서 논토양 SRR이 높고, 논토양이농약 토양과 유기농 토양의 SRR 값을 나타났다. 또한 담수토양보다는 갯벌 토양이, 청정지역 토양보다는 오염지역의 토양이 SSR값이 높았다. 본 연구를 통해 담수와 해수 그리고 오염지역과 청정지역, 유기농법과 관행농법 토양을 채취해 토양성분에 대해 알아보고자 했다. 황산염을 제외한 대부분의 토양성분은 논토양이 높게 나타났으며 유기농법이 다양한 토양성분을 함유하고 있어 작물이 자람에 있어 긍정적 영향을 줄 수 있음을 알 수 있었다.

WiDr 인체 대장암세포 증식 억제 효과 각 polymannuronate의 \( \mathrm { WiDr } \) 에 대한 암세포 중식 억제 효과는 Fig. 3과 같다. Polymannuronate의 분자량이 감소할수록, 각 polymannuronate의 농도가 증가할수록 WiDr 대장 암세포의 증식억제 효과가 증가하는 것으로 나타났다. 즉,whole molecular polymannuronate를 \( 0.25 \% \) 의 농도로 처리하였을 때, \( 48.1 \% \) 의 증식 억제율을 보였고 \( 0.25 \% \) 의 농도로 \( 40 \mathrm { kDa } \) polymannuronate를 처리하였을 때, \( 55.3 \% \) 의 증식 억제율을 보였으며 \( 10 \mathrm { kDa } \) polymannuronate를 \( 0.5 \% \) 의 농도로 처리하였을 때, \( 55.6 \% \) 의 증식 억제율을 보여 polymannuronate는 WiDr 대장암세포에 대하여 증식 억제 효과를 가진다는 것을 확인하였다. 이상으로, HT-29, DLD-1, WiDr 인체 대장암세포에 polymannuronate를 처리하였을 때 세포의 증식 억제 효과를 살펴보았다. 그 결과, HT-29 대장암세포에서 가장 효과가 좋은 것으로 나타났으며, 모든 분자량의 \( 0.25 \% \) 농도에서 \( 50 \% \) 의 증식 억제율을 가지는 것을 확인할 수 있었다. Polymannuronate가 대장암세포의 DNA 합성에 미치는 영향 각 polymannuronate를 인체 대장암세포에 처리하였을 때 각 분자량별 \( 0.25 \% \) 의 농도에서 \( 50 \% \) 의 중식억제를 보였던 HT-29세포에 \( \left [ { } ^ { 3 } \mathrm { H } \right ] \) thymidine으로 표지화시켜 세포내 DNA 합성에 어떠한 영향을 미치는 지 살펴보았다. 각 분자량별과 농도에 따른 DNA 합성정도를 Fig. 4에 나타내었다. DNA 합성율은 농도가 증가할수록 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, 분자량에 따른 차이는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 전반적인 결과에 비추어볼 때, polymannuronate로 처리한 HT-29 대장암세포의 중식 억제 효과는 DNA 합성능의 감소에 기인한 것으로 보인다. Polymannuronate가 대장암세포의 형태학적 변화에 미치 는 영향 위의 결과로부터, HT-29 대장암세포에 polymannuronate를 처리하였을 때 저분자화 될수록, 농도가 증가할수록 DNA 합성능이 감소하여 최종적으로 암세포의 증식 억제를 가진다는 것을 확인하였다. 이로 인한 대장암세포의 형태학적 변화를 살펴보고자 HT-29 대장암세포를 24-well plate에 분주하여 polymannuronate를 처리하여 현미경상에서 관찰한 것을 Fig. 5 에 나타내었다. 앞선 결과와 동일하게, 분자량이 감소할수록, 농도가 증가할수록 대장암세포의 형태의 변화 없이 세포의 증식이 지연되는 것을 확인할 수 있었다.

Polymannuronate의 분자량 감소와 농도 증가가 WiDr 대장 암세포와 HT-29 대장암세포의 증식 억제에 기여함을 확인하였다. 특히, 모든 분자량의 0.25% 농도에서 50%의 증식 억제율이 관찰되었으며, 이는 DNA 합성능의 감소를 통해 세포 증식을 지연시키는 결과를 가져왔다. 이 과정에서 세포 형태의 변화는 없었음이 확인되었다.

경제 수준의 향상과 함께 국민소득의 향상으로 동물성 식품소비량이 현저히 늘어났으며, 서구화된 식생활로 식이섬유 함량이 적은 가공식품의 섭취가 잦아짐에 따라 대장암과 같은 성인병과 비만증이 증가하게 되었다. 역학적 연구에서 육류와 대장암은 유의적인 양의 상관관계를 가지며, 고섬유식이를 하는 집단에서는 위험도가 감소한다는 것을 확인하였다. 따라서, 이를 예방하기 위하여 지질과 같은 열량원의 가치는 적은 반면 점질 다당류 식이섬유인 알긴산 등의 생리활성 물질이 풍부하게 함유되어 있는 식품인 미역, 다시마와 같은 해조류의 식이섬유에 대한 관심이 새롭게 부각되고 있다. 이러한 이유로 가공식품에는 식이섬유를 첨가하고 있고 식이섬유의 생리작용에 대한 연구가 활발후 진행되고 있다. 알긴산은 갈조류의 세포막 또는 세포간 물질로 함유되어 있는 다당류로, mannuronate와 guluronate로 구성되어 있으 며, 중금속의 체외배출작용, 이온교환반응에 의한 혈압 상숭억제작용, 혈중 콜레스테롤 저하작용, 정장 및 변비개선작용, 장내 유해미생물의 증식억제작용 및 항종양성 등과 같은 생리효과를 가진다고 알려져 있다. 특히, 알긴산의 생리효과는 분자량의 크기와 점도에 영향을 받는 것으로 알려겨 있으며, 동물실험 결과, polymannuronate가 많이 함유된 급이군에서 혈청 및 간장 콜레스테롤 저하 등 지질대사 개선이 더 효과가 있다고 하였다. 또한, 염산으로 부분가수분해하여 얻은 polymannuronate는 용해도 및 답즙산 결합능을 현저히 증가시키며, 혈청 및 간장 지질 중의 콜레스테롤 수준에 대하여 유의적인 저감효과를 보였다고 하였다. 그러나, 알긴산과 관련된 실헙은 대부분 in vivo수준이며, 세포수준에서 살펴본 실험은 거의 없 는 실정이다. 따라서, 본 연구는 polymannuronate를 부분 가수분해하여 분자량별로 제조한 \( 40 \mathrm { kDa } \), \(10 \mathrm { kDa } \) polymannuronate와 전분자량 polymannuronate가 인체 대장암세포의 증식과 DNA 합성에 어떠한 영향을 미치는지를 검토하고자 하였다. 재료 및 방법 재료 본 연구에 사용된 whole molecular-, \( 40 \mathrm { kDa } - \), \(10 \mathrm { kDa } - \) polymannuronate는 (주) KBP (경기도, Korea)에서 제공받아 실험직전에 각 세포배양액에 녹여 사용하였다. 인체 대장암 세포인 HT-29 (KCLB 30038)은 Korea Cell Line Bank (서울,Korea)에서, DLD-1 (ATCC CCL-221)과 WiDr (ATCC CCL-218)는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 분양받아 배양하여 실험에 사용하였다. 세포배양 에 사용한 Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, phosphate buffered saline (PBS), penicillin- streptomycin 등은 Gibco/BRL (Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다. Fetal bovine serum (FBS)은 Hyclone (Utah, USA) 에서, 세포 증식을 측정하기 위해 사용된 Celltiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit는 Promega (Wisconsin, USA)에서 구입하였으며, 세포 배양에 사용한 1 회용 멸균 제품은 Corning (NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. Minimum Essential Medium Eagle (MEM)등 기타실헙에 필요한 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입 하여 사용하였다.

경제 수준의 향상과 함께 동물성 식품 소비량이 증가하면서, 대장암과 비만증 등의 성인병이 증가하게 되었다. 이를 예방하기 위해 가공식품에 식이섬유를 첨가하고 있으며, 알긴산이 풍부하게 함유된 미역, 다시마 등 해조류의 식이섬유에 대한 관심이 새롭게 부각되고 있다. 본 연구에서는 polymannuronate를 부분가수분해하여 분자량별로 제조한 \(40\mathrm{kDa}\), \(10\mathrm{kDa}\) polymannuronate와 전분자량 polymannuronate가 인체 대장암세포의 증식과 DNA 합성에 어떠한 영향을 미치는 지를 검토하고자 한다.

대장암세포 배양 HT-29 대장암세포는 RPMI 1640 배양액에, DLD-1, WiDr 대장암세포는 MEM 배지에 미생물의 오염이나 증식을 억제 하기 위해 항생제 ( 100 units / mL penicillin, 100 units /mL streptomycin)와 \( 10 \% \mathrm { FBS } \) 를 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) , \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다. 세포가 \(80 \% \) 정도 자라면 PBS-EDTA로 monolayer를 씻어내고 \( 0.25 \% \) trypsin-EDTA로 부착된 세포를 분리하여 96-well plate와 24-well plate에 분주하여 실험에 사용하였다. Polymannuronate가 대장암세포 증식에 미치는 영향 측정 HT-29, DLD-1, WiDr 대장암세포에 각각의 polymannuronate를 처리하였을 때 세포의 중식에 미치는 영향을 알아보기 위해 각 대장암세포를 \( 10 \% \ FBS 가 포함된 배양액으로 희석하여 96-well plate에 40,000 cells/well의 밀도로 분주하였다. 24시간 배양한 후에 serum free media로 배양액을 교환하여 24시간 serum starvation 시켰다. 그 후 배양액에 각 polymannuronate를 \( 0.01 \% \), \( 0.1 \% \), \( 0.25 \% \), \( 0.5 \% \) 의 농도로 첨가하여 24시간 배양하였다. Celltiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit률 사용하여 ELISA plate reader (VERSA max tunable microplate reader, Molecular Devices, USA)로 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 중식정도는 대조군에 대한 실험군의 \( \% \)로 계산하였다. Polymannuronate가 대장암세포의 DNA 합성에 미치는 영향 측정 각각의 polymannuronate가 DNA 합성에 미치는 영향을 살펴보기 위해서 세포를 \( 13 \mathrm { ~mm } \) diameter cell culture coverslip을 넣은 24-well plate에 50,000 cells/well의 밀도로 분주하고, \( 10 \% \) FBS를 함유한 배양액으로 희석하여 배양하였다. 각 well 당 세포가 \( 60 \% \) 정도 자라면, SFM으로 교환하여 24시간 동안 배양한 후, 각 polymannuronate를 \( 0.01 \%, 0.1 \%, 0.25 \) \( \%, 0.5 \% \) 의 농도별로 첨가하였다. \( \left [ { } ^ { 3 } \mathrm { H } \right ] \) thymidine을 200,000 \( \mathrm { cpm } / \) wellof 농도로 첨가하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) incubater에서 24 시간동안 반응시켰다. 배양액을 제거하고 \( 5 \% \) trichloroacetic acid (TCA)를 첨가하여 실온에서 10 분간 방치한 다음, 탈이온수로 2 회 세척한 후에 \( 70 \% \) 에탄을을 첨가하여 실온에 5 분간 방치하였다. Cell culture coverslip을 cocktail solution에 넣고 liquid scintillation counter (Wallac 1409, Amersharm Phamacia Co., England)로 cpm을 측정하여 세포의 DNA 합성정도를 계산하였다.

DLD-1, WiDr 대장암세포는 RPMI 1640 배양액과 MEM 배지에 항생제, \( 10 \% \mathrm { FBS } \) , \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하고, Polymannuronate의 증식 영향을 측정하기 위해 96-well plate와 24-well plate에 분주한 HT-29, DLD-1, WiDr 대장암세포에 Polymannuronate를 첨가하여 배양하였고, Celltiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit률 사용하여 ELISA plate reader 로 흡광도를 측정하였다. 각각의 polymannuronate가 DNA 합성에 미치는 영향을 살펴보고 cpm을 측정해 세포의 DNA 합성정도를 계산한다.

Polymannuronate의 대장암세포의 형태학적 변화 측정 각각의 polymannuronate를 첨가하였을 때, 대장암세포의 형태학적 관찰 및 생존율을 육안으로 살펴보기 위해서 대장암 세포를 24-well plate에 100,000 cells/well의 농도로 분주하고 \( 10 \% \) FBS를 함유한 배양액으로 희석하여 배양하였다. 각 well 당 세포가 \( 60 \% \) 정도 자랐을 때, SFM으로 교환하여 24 시간 동안 배양한 후, 각 polymannuronate를 \( 0.01 \% \), \( 0.1 \% \), \( 0.25 \% \), \(0.5 \% \) 의 농도별로 첨가하여 24 시간 배양한 후 현미경상에서 세포의 형태와 증식정도를 관찰하였다. 실험결과의 통계처리 본 연구의 모든 분석수치는 각 실험군의 평균 \( \pm \) 표준편차로 나타내었고, 결과는 SPSS PC 프로그램(version 10.0)을 이용하여 통계 분석하였다. 각 실험군간의 유의성은 \( \mathrm { p }<0.05 \) 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 분석하였다. 결과 및 고찰 Polymannuronate가 대장암세포 증식에 미치는 영향 HT-29 인체 대장암세포 증식 억제 효과 각 polymannuronate의 HT-29세포에 대한 암세포 증식억제 효과는 Fig. 1과 같다. Polymannuronate의 분자량이 감소할수록, 각 polymannuronate의 농도가 증가할수록 HT-29 대장암세포의 증식 억제 효과가 증가하는 것으로 나타났다. 즉, whole molecular polymannuronate를 \( 0.25 \% \) 의 농도로 처리하였을 때, \( 41.0 \% \) 의 증식 억제율을 보였고 \( 0.1 \% \) 의 농도로 \( 40 \mathrm { kDa } \) polymannuronate를 처리하였을 때, \( 56.6 \% \) 의 증식 억제율을 보였으며 \( 10 \mathrm { kDa } \) polymannuronate를 \( 0.1 \% \) 의 농도로 처리하였을 때, \( 69.5 \% \) 의 증식 억제율을 보여 polymannuronate는 HT-29 대장암세포에 대하여 증식 억제 효과를 가진다는 것을 확인하였다. DLD-1 인체 대장압세포 증식 억제 효과 각 polymannuronate의 DLD-1에 대한 암세포 증식 억제 효과는 Fig. 2와 같다. DLD-1 대장암세포에 처리한 poly- mannuronate의 분자량과 농도는 증식 억제와는 관련이 없는 것으로 나타났다. 전체적인 경향을 살펴볼 때, 분자량이 감소할수록 증식율이 억제되는 것처럽 보이나, 유의적인 차이를 보이지는 않았다. 또한, \( 10 \mathrm { kDa } \) polymannuronate를 \( 0.01 \sim 0.5 \% \) 의 농도로 처리하였을 때에는 \( 48.2 \sim 57.2 \% \) 의 증식 억제율을 보였다. 즉, DLD-1 대장암세포에 polymannuronate를 처리하였을 때에는 증식 억제효과를 보이지 않는 것으로 나타났다.

Polymannuronate를 대장암 세포에 첨가하여 형태학적 변화 및 증식을 측정한 연구 결과, polymannuronate의 분자량이 감소할수록 HT-29 대장암세포의 증식 억제 효과가 증가하는 것을 확인하였고 DLD-1 대장암세포에는 증식 억제효과를 보이지 않는 것으로 나타났다.

해조류에 의한 암세포 중식억제 효과에 관한 다른 연구들을 살펴보면, 톳과 미역의 열수추출물을 쥐에게 10 일간 투여한 결과 \( 56.6 \% \) 와 \( 69.8 \% \) 의 종양 중식억제 효과를 보였다고 하였다. 미역과 다시마의 다당류 분획은 sarcoma-180 세포에 대하여 항암작용을 나타내었으며[18], 또한 Sargassum fulvellum에서 분리한 알긴산은 대식세포의 활성을 통해서 항암활성을 나타낸다고 하였다. 또한, 일본에서 주로 식용되는 Wakame(미역)과 Mekonbu(다시마)의 수용액 성분은 쥐의 유방암에 대해 강한 저해작용을 보였고, Mekonbu 수용액은 MCF-7, T-47D, MDA-MB-231 등 3가지 인체 유방암 세포의 apoptosis를 유발하여 유방암 세포에 대한 증식 억제 작용을 보였다고 하였다. 본 연구에서는, 알긴산을 부분가수분해하여 구성성분인 polymannuronate를 분리하여 HT-29 대장암세포에 처리하였을 때 DNA 합성 감소로 인하여 세포의 증식이 저해됨을 확인할 수 있었다. 알긴산에 대한 연구는 오랫동안 계속되어 왔지만, 세포수준에서 살펴본 결과는 매우 적은 수준이다. 본 연구는 알긴산을 세포수준에서 검토하였다는 점에 그 의의가 있으며, 더 나아가 대장암세포의 증식 억제 효과를 세포 신호 전달 수준에서 검토가 필요하다고 생각된다. 요약 본 연구는 whole molecular-, \( 40 \mathrm { kDa } \), \( 10 \mathrm { kDa } \) polymannuronate를 대장암세포에 첨가하였을 때 분자량과 농도에 따른 항암효과를 세포수준에서 검토하고자 하였다. 3종류의 인체 대장암세포인 HT-29, DLD-1, WiDr의 증식 억제를 살펴본 결과, HT-29 세포는 모든 polymannuronate \( 0.25 \% \) 의 농도에서 \( 50 \% \) 의 증식 억제 효과블 보였으며 저분자화 될 수록 증식 억제 효과가 중가되었다. DLD-1 세포는 저분자화 정도와 농도증가에 따른 유의적인 차이를 보이지 않았고, \( \mathrm { WiDr } \) 세포는 농도증가에 따른 유의적인 효과는 있었으나, 분자량에 의한 차이는 보이지 않았다. \( 0.25 \% \) 의 농도에서 \( 50 \% \)의 증식 억제 효과를 보인 HT-29 세포의 DNA 합성능을 살펴본 결과, 증식 억제 효과와 유사한 결과를 보였으며, 형태학적인 변화 또한 동일한 것으로 나타났다. 이상의 결과로부터 polymannuronate는 HT-29 대장암세포의 증식억제에 유의적인 효과가 있는 것으로 나타났다. 따라서 polymannuronate 는 대장암의 예방뿐 아니라 그 치료에도 도움이 되며 본 연구가 polymannuronate의 효과에 대한 기초적인 자료가 될 것으로 사료된다.

본 연구는 알긴산의 부분가수분해 과정에서 추출된 polymannuronate가 HT-29 대장암세포의 증식을 저해하는 것을 확인하였다. 이를 통해 polymannuronate가 대장암 예방과 치료에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사하였으며, 이에 대한 보다 자세한 연구가 필요하다는 결론을 내렸다.

재료 및 방법 신이추출물 제조 신이는 목련과 및 그 밖의 동속 근연 식물의 꽃봉오리를 말하는 것으로 본 실험에 사용한 신이추출물은 (주)뉴온에서 제공받아 사용하였다. 실험에 사용한 신이는 중국 사천성에서 수확하여 건조한 목련(Magnolia kobus) 꽃봉오리를 사용하였으며 추출물은 Shaanxi Jiahe Phytochem Co., Ltd. (Shaanxi, China)에서 제조하였다. 추출물은 목련 꽃봉오리를 약 \(8 \)배 중량의 \(95 \) \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 물로 \(2 \)시간씩 \(3 \)회 추출한 후, \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 농축 후, 분무건조를 거쳐 획득하여 사용하였다. 시험물질의 조제 및 투여 시험물질로 사용되는 신이 추출물(Magnoliae Flos extract, ME)은 중량 그대로를 순도 보정 없이 조제에 사용하였다. 정량의 시험물질을 전자저울을 이용하여 칭량하였고 부형제는 대한약품공업의 대한멸균증류수 주사용수를 사용하였다. 조제용기에 시험물질을 넣고 부형제를 소량씩 가하여 교반기를 이용하여 시험물질을 완전히 용해시킨 후 규정농도에 맞게 남은 부형제를 넣고 조제하였다. 조제물은 투여 당일에 매일 조제하여 투여에 사용하였다. 신이 추출물을 균일하게 용해시켜 일반적인 경구투여 반복독성 한계용량으로 사용되는 \( 1,000 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 보다 \(3 \)배 높은 \( 3,000 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)을 최고용량으로 설정하고 또 다른 농도는 \(2 \)배수 간격을 두어 \( 1,500 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)로 투여 농도를 설정하였다. 투여액량은 \( 10 \mathrm { ~mL } / \mathrm { kg } \)으로 하고 동물의 체중을 기준으로 개체 별 투여량을 산출하였다. 투여는 존데를 부착한 일회용 주사기를 이용하여 위내 강제 투여하였고, 신이 추출물은 투여 기간 동안 냉장보관 하였으며, 투여횟수 및 기간은 \(1 \)회/일, \(6 \)일/주, \(4 \)주간 진행하였다. 실험동물 실험동물은 \(6 \)주령의 암, 수컷 SD rat를 (주)오리엔트바이오에서 구입하였다. 실험동물 입수 시, 외관검사를 실시하고 전자저울로 체중을 측정하였다. \(1 \)주일간 실험실에서 순화과정을 거치고 그 기간 중에 일반증상을 관찰하여 이상이 없는 실험동물을 선택하여 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 군당 \(5 \)마리씩 배치하였다. 사육환경 실험기간 중 사육실 환경조건은 실내온도 \( 22 \pm 3 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 50 \pm 20 \% \), 환기횟수 \( 15 \)~ \(20 \)회/시간, 명암주기 \(12 \)시간(오전 \(7 \)시~오후 \(7 \)시 및 조도 \(150 \)~ \(300 \) \( \mathrm { Lux } \), 소음 \( 60 \mathrm { ~dB } \) 이하를 유지하였으며 모든 실험동물은 Polysulfone 사육상자 \( (300 \mathrm { D } \times 500 \mathrm { ~W } \times \) \( 200 \mathrm { H } \mathrm { mm } \) )에 \(2 \)~ \(3 \)마리씩 분리하여 사육하였다. 동물실험은 국제실험동물관리평가인증협회(AAALAC- \(1 \))에 완전인증을 받은 (재)경기도경제과학진흥원 바이오센터에서 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인(승인번호: \(2021 \)- \(05 \)- \(0001 \))하에 시험기관의 표준작업순서에 따라 수행하였다.

본 연구에서는 목련과 및 그 밖의 동속 근연 식물의 꽃봉오리인 신이를 사용한 추출물을 실험에 사용하였다. 추출과정은 목련 꽃봉오리를 물로 3회 추출한 후 농축 및 분무건조하여 얻은 추출물을 사용하였다. 실험에서는 신이 추출물을 최고용량으로 설정한 후 다른 농도는 일정한 간격으로 설정하였다. 실험에는 6주령의 암 수컷 SD rat를 사용하였고, 동물실험은 AAALAC-1에 인증된 기관의 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 표준작업순서에 따라 수행되었다.

사료 및 물의 급여방법 실험동물용 고형사료(Teklad Certified Irradiated Global \( 18 \% \) Protin Rodent Diet \(2918 \)C, Research Diet INC., New Brunswick, NJ, USA)는 두열바이오텍에서 공급받아 급이기에 넣고 자유섭취 하였다. 음수는 음용 상수도수를 정수시킨 후 폴리카보네이트제 물병에 넣고 멸균하여 자유섭취 하였다. 사료와 음수의 분석은 생산자로부터 공급된 성적서 및 국가공인 검사기관에서 검사한 자료를 참고하여 분석결과가 시험기관에서 정한 허용범위내에 속하는지를 확인하였다. 일반증상관찰, 체중 및 사료섭취량 측정 시험기간 중, 모든 동물에 대하여 투여 전 \( \cdot \)후 매일 \(2 \)회 일반증상의 변화 및 독성증상을 관찰하였다. 체중 측정은 군 분리 시, 투여기간 중 주 \(2 \)회 측정 및 부검 당일에 측정하였다. 사료섭취량은 투여 개시 후 \(4 \)주 동안 주 \(2 \)회 측정하였으며, 평균 사료섭취량은 사료를 급여한 후 섭취량 차이를 \(1 \)마리/ \(1 \)일 기준으로 산출하였다. 혈구분석 시험 종료 후 생존한 모든 동물을 대상으로 부검 전일 음수는 자유섭취 시키면서 절식을 진행하였다. 실험동물은 흡입마취제를 이용하여 호흡 마취 후, 개복하여 복대 동맥에서 혈액을 채혈하여 항응고제인 EDTA가 들어있는 채혈튜브(BD Caribe, Ltd., Franklin Lakes, NJ, USA)에 넣어 혈구분석기(MEK- \(6550 \) , NIHON KOHDEN, Tokyo, Japan)를 이용하여 White blood cell count (WBC), Red blood cell count (RBC), hemoglobin concentration (HGB), Hematocrit (HCT), Mean corpuscular hemoglobin (MCV), Mean corpuscular hemoglobin (MCH), Mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), Platelet (PLT), Red cell distribution width (RDW), Platelet distribution width (PDW), Mean platelet volume (MPV)를 측정하였다. 혈액생화학분석 혈구분석을 완료한 실험동물의 혈액을 \( 3,000 \mathrm { rpm } , 15 \)분간 원심분리기(Centrifuge \(5415 \)R, EPPENDORF, Hamburg, Germany)를 이용하여 원심 분리하여 얻은 혈청을 혈액생화학분석기(7020, HITACHI, Tokyo, Japan)를 이용하여 Glucose (GLU), Creatinine (CREA), Total protein (TP), Albumin (ALB), Glutamate oxaloacetate transaminase (GOT), Glutamate pyruvate transaminase (GPT), Total bilirubin (T-BIL), Cholesterol CHO, Triglyceride (TG), High density lipoprotein (HDL), Blood urea nitrogen (BUN), Low density lipoprotein (LDL), Inorganic phosphorous (IP), Lactate dehydrogenase (LDH), Direct bilirubin (D-BIL), Uric acid (UA)를 측정하였다. 부검소견 관찰 및 장기무게 측정 채혈 후 복대정맥을 절단하여 방혈하는 방법으로 도살을 실시하고, 부검소견을 관찰하였다. 부검 후 심장, 폐, 간, 비장, 신장,고환 및 난소를 적출하여 무게를 측정 후 부검 전 절식된 체중과 비교하여 상대적 장기중량을 산출하였다. 통계 처리 본 시험에서 얻은 결과는 평균 \( \pm \)표준편차로 나타냈으며, 대조군과 시험물질 투여군의 통계학적 유의성을 Student's t-test를 실행하여 \( p<0.05, p<0.01, p<0.001 \) 수준에서 검정하였다.

실험동물은 고형사료(Teklad Certified Irradiated Global \( 18 \% \) Protin Rodent Diet \(2918 \)C)를 자유섭취하였다. 실험 종료 후 생존 동물은 음수를 자유섭취하면서 절식을 진행하였고, 도살 후 부검소견을 관찰하였다. 통계학적 결과는 평균 ± 표준편차로 표현되었고, 시험물질 투여군과 대조군 간 유의성은 Student's t-test를 통해 \( p<0. 05, p<0. 01, p<0. 001 \) 수준에서 검증하였다.

서 론 해양심층수는 수심 \( 200 \mathrm{~m} \) 이상에 있는 저온수로서 저온성, 청정성, 안정성 및 부영양성 등의 자원적 특성을 가진 유용한 해수자원이다. 최근, 세계적으로 해양심층수를 이용한 개발사업이 확산되고 있는 추세이며, 미국, 일본 등 선진국에서는 10여년 전부터 해양심층수를 이용하여 대체에너지개발, 수자원, 화장품, 생수 및 식품산업 분야에 활발히 이용하고 있다. 특히 일본을 중심으로 해양심층수의 난치성 질환(심혈관계질환, 알러지 등)에 대한 의학적 효능에 대한 관심이 증가하여 연구가 진행되고 있으며 질병치료에의 응용에 대한 관심도 고조되고 있다. 국내에서도 2001년부터 동해안을 중심으로 정부 및 민간기업에 의해 해양심층수 취수사업을 추진하고 있으며, 2007년 국회 해양심층수법의 통과에 힘입어 해양심층수를 원료로 한 식품, 화장품 및 의약품 개발 등에 대한 관삼이 높아지고 있다. 난치성 질환 중 암은 다양한 방법에 의한 치료에도 불구하고 아직 완전하게 치료되지 않는 질병으로서 최근 들어 암치료보다는 예방분야에 더 큰 비중을 두고 연구를 하고 있다. 특히 발암과정(carcinogenesis)을 단계별로 억제할 수 있는 표적 효소들을 제어함으로써 암을 예방할 수 있는 물질탐색에 많은 노력을 기울이고 있다. 발암물질 대사효소는 발암물질이나 성호르몬의 활성에 관여한다. 그러므로 각 개인의 발암물질 대사의 차이는 간이나 표적조직에서의 대사효소의 활성도와 관계가 있다. 특히, cytochrome P450 효소는 외부의 발암물질을 전자친화적물질(electrophilic prod-uct), epoxides 또는 매우 독성이 강한 물질로 전환시킨다. Phase Ⅱ 효소는 화학적인 스트레스와 암 발생과정 중의 개시(initiation)단계에서 돌연변이물질, 발암물질로부터 세포를 보호하는 주요 대사이다. 즉 quinone reductase (QR)은 quinone을 환원시켜 무독하게 만들고 세포내에 유도되어 발암물질에 의해 일어나는 돌연변이와 종양화 현상을 막아주고 발암물질을 무독하게 하는 역할을 한다. Glutathione-S-transferase (GST)는 외부 이물질의 대사 과정 중 생성된 친전자성 대사산물을 glutathione과 결합하여 용해되기 쉬운 수용성 물질로 만들어 배설시키는 효소로서 유리기(free rad-ical)를 파괴하여 반응성이 높은 산소들로부터 세포를 보호한다고 보고되고 있다. Glutathione (GSH)는 다단계 발암과정 중 개시(initiation)와 촉진(promotion)단계에서 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. 즉, 개시단계에서는 발암물질 분자의 전자친화적 부위와 작용하여 독성이 강한 물질에 의한 DNA의 공격을 저해하는 역할을 하며, 촉진단계에서는 산화적 유리 라디칼의 공격을 제한함으로서 세포를 보호하는 역할을 한다. Ornithine decarboxylase (ODC)는 polyamine 생합성 과정 중 putrescine의 생성에 관여하는 효소로서 정상세포와 종양세포의 증식에 필수적이다. 또한 ODC의 유도는 암촉진 단계에도 중요한 기능을 담당하고 있어 생쥐의 여러 조직을 이용한 암촉진 실험에서 ODC 활성 유도와 발암물질의 암촉진 능력간의 밀접한 관계가 보고되었다. 본 논문에서는 동해 해양심층수가 효과적인 암발생 억제물질 연구에 활용되고 있는 생화학적 표식자(biochemical markers)인 CYP 1A2 활성, QR과 GST의 활성, GSH 함량 및 ODC 활성에 미치는 영향을 측정하여 동해 해양심층수의 암 예방 효능을 살펴보았다.

해양심층수는 수심 \( 200 \mathrm{m} \) 아래 있는 저온수로서 난치성 질환(심혈관계질환, 알러지 등)에 대한 의학적 효능 개발과 질병치료 응용 연구가 이루어지고 있다. 최근 들어 암 연구는 치료보다 예방연구가 더 활발하게 진행되고 있으며, 특히 발암과정을 단계별로 억제하는 표적 효소를 제어해서 암을 예방하는 물질탐색이 활발하게 이루어지고 있다. 본 논문에서는 동해 해양심층수가 생화학적 표식자(암발생 억제물질 연구에 쓰임)인 CYP 1A2 활성, QR, GST의 활성, GSH 함량, ODC 활성에 미치는 영향을 알아보았다.

재료 및 방법 시약 Minimum essential medium (MEM), S-MEM, antibiotics, trypan blue dye, \(\beta \)-naphthoflavone \( (\beta\)-NF), methoxyresor-ufin, 2-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (flavone), 3-4,5-dime-thylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucose-6-phosphate, chloro-2,4-dinitrobenzenc (CDNB), Na-phosphate, Na-EDTA, tert-butylhydroquinone (tBHQ), difluoromethylornithine (DFMO), EDTA, dithiothreitol, pyridoxal phosphate, L-orni-thine, glutathione (GSH) chloro-2,4-dinitrobenzene, bovine serum albumin (BSA), Tris- HCl, bicinchoninic acid protein kit는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, L-\( \left[1-{ }^{14} \mathrm{C}\right] \) ornithine은 PerkinElmer (Boston, MA, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS), dialyzed FBS는 웰진사 (Daegu, Korea)제품을 사용하였다. 시료 본 실험에 사용된 해양심층수는 동해의 해저 \(1,100\mathrm{~m}\)에서 취수하여 역삼투압 시스템으로 탈염과 농축을 하였으며, 탈염된 심층수(경도 0)와 그 심층수에 미네랄을 첨가하여 경도 4,000으로 조절된 심층수를 (주)워터비스(Seoul, Korea)로 부터 제공받아 희석하여 실험에 사용하였다. 탈염된 해양심층수와 경도 4,000의 해양심층수에 대한 미네랄의 함량은 Table 1에 나타내었다. 세포배양 계내 보존중인 Hepa 1c1c7 세포(mousc hepatoma)는 \( 10 \% \) FBS가 포함된 MEM 배지로, mouse epidermal cells, line 308은 불필수아미노산\((1\times)\), \( 5 \% \) dialyzed fetal bovine serum과 \( 0.05 \mathrm{~mM} \mathrm{~Ca}^{2+} \)이 포함된 S-MEM 배지로 하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) 배양기 \( \left(5 \% \mathrm{~CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C}\right) \)에서 배양하였고, 배양액은 2~3일 간격으로 교환해 주었다. 세포는 액체질소에 보존해 두었다가 같은 passage 번호를 가진 세포를 녹여서 사용하였으며, 세포의 생존은 trypan blue dye exclusion 방법으로 확인하였다. CYP 1A2 활성 관류법으로 \( \beta\)-NF (\(80 \mathrm{~mg} / \mathrm{ml} \) body weight, 매일 1회, 3일)을 처리한 흰쥐의 간 조직으로부터 마이크로좀의 분리는 Phol과 Fouts의 방법을 참고하여 실시하였다. CYP 1A2의 활성은 methoxyresorufin O-demethylase (MROD) 활성으로 측정하였으며 methoxyresorufin으로부터 resorufin의 형성 측정을 위하여 기질로 methoxyresorufin을 사용하였다. 양성 대조군은 flavone을 사용하였으며 결과는 대조군에 대한 각 시료들의 저해도 정도를 \(\%\)로 나타내었다. QR 활성 Hepa 1c1c7 세포를 96-well plate에 \( 0.5 \times 10^{4}\mathrm{~cells/well}\)로 접종시키고 24시간 배양 후, 해양심층수를 경도별로 포함한 새 배양액 \( 200 ~\mu \mathrm{l} \)을 각 well에 처리하였다. 시료를 48시간 처리한 Hepa 1c1c7 세포에서의 QR 활성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria의 방법을 수정하여 사용하였다. QR 활성은 분당 환원된 MTT의 흡광도와 crystal violet의 흡광도에 의해 산출하였고, QR의 활성 유도는 대조군의 QR 활성에 대한 시료에 의한 활성의 비로 계산하였다.

해양심층수를 사용하여 역삼투압 시스템으로 탈염과 농축을 진행하였고, 탈염된 심층수에 미네랄을 첨가하여 희석하여 실험을 진행하였다. 관류법으로 처리한 흰쥐의 간 조직으로부터 Phol과 Fouts의 방법을 참고하여 CYP 1A2 활성을 진행하였고, 양성 대조군은 flavone을 사용하여 저해도 결과를 \(\%\)로 나타내었고 QR 활성은 MTT의 분당 환원된 흡광도와 crystal violet의 흡광도에 의해 산출하였고, QR의 활성 유도는 대조군의 QR 활성에 대한 시료에 의한 활성의 비로 계산하였다.

결과 및 고찰 CYP 1A2의 활성 저해효과 Phase Ⅰ 약물대사 효소인 CYP 1A2는 체내 \(\cdot\) 외의 각종 유해물질, 발암이나 돌연변이를 유발시키는 여러 화학물질 (xenobiotics)의 체내 활성화를 유도하여 발암과정의 개시단계(initiation)를 유발시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 cytochrome P450 효소활성 억제효과는 암예방 효과를 의미하므로 해양심층수가 \( \beta\)-NF에 의해 유도된 CYP 1A2 효소활성 억제율을 측정한 결과, 해양심층수의 경도가 100, 200, 400, 600, 800, 1,000으로 증가함에 따라 저해율이 경도의존적으로 증가하였으며 그 저해율은 \(5.8 \sim 21.0\%\)를 나타내었다. 그러므로 해양심층수는 발암과정의 개시단계(initia-tion)를 저해할 수 있을 것으로 보인다. QR과 GST의 활성 유도효과 발암물질을 무독화시키는 phase Ⅱ 효소인 QR과 GST의 활성 유도효과를 생쥐의 간암세포인 Hepa 1c1c7 세포를 이용하여 측정함으로써 해양심층수의 암억제효과를 살펴보았다. 해양심층수를 경도 100~1,000으로 처리하였을 때 QR활성 유도효과는 대조군에 비하여 1.1~1.2배 증가하였으며, GST 활성 유도효과도 QR 활성과 유사한 중가율(1.2배)를 보였다. 결과적으로 생쥐의 간암세포인 Hepa 1c1c7 세포에서 동해 해양심층수에 의하여 QR과 GST의 활성이 최대 \( 20 \% \)까지 증가함을 측정할 수 있었다. QR과 GST 효소 유도는 활성물질을 투여함으로써 가능하며, 이러한 물질에 의해 발암이나 독성작용으로부터 생체를 보호할 수 있다. Kim 등은 암발생을 억제할 수 있는 한국산 채소를 세포 배양과 in vivo 모델 시스템에서 QR 활성의 증가를 측정하였다. Singh 등도 클로로필린이 간에서 GST 활성과 GSH 생성을 크게 증가시키는 것으로 보고하였다. 또, 일부물질의 암예방 기전이 발암물질의 활성 시스템을 억제하고 독성을 억제하는 효소의 유도와 관련이 있다고 보고하였다. Spencer 등은 마우스와 렛트의 식이에 \(0.2 \sim 0.5\%\) 농도의 dimethyl fumarate를 투여한 결과, 간, 신장 등의 각 조직에서 GST와 QR의 활성이 증가하였다고 주장하였다. 따라서, 해양심층수에 의해 간세포에서의 QR과 GST의 활성이 증가된 것으로 보아 동해의 해양심층수는 외부물질이나 대사산물에 의해 일어날 수 있는 암발생 억제 효과가 있는 것으로 사료된다. GSH 함량 해양심층수를 경도별로 Hepa 1c1c7 세포에 처리하여 GSH 생성을 살펴본 결과 경도의존적으로 증가하였으며, \( 26 \sim 40 \% \)의 증가를 나타내었다. 환원형 glutathione (GSH)는 암예방 물질의 스크린에 사용되며 반응성이 있는 대사중간물로부터 세포를 보호한다. 발암과정의 개시단계에서는 GSH의 전자친화적인 성질로 인해 외부물질이 DNA와 결합하여 암을 유발하는 것을 막아준다. 진행 \(\cdot\) 촉진의 단계에서는 산화적 유리 라디칼의 공격을 제한함으로서 발암과정을 저해할 수 있다. 보고에 따르면 aflatoxin에 의한 간종양을 가진 쥐에 많은 양의 GSH를 투여하였을 때, 종양이 감소하였고, butylated hydroxyanisole은 GSH 함량을 증가 시켜서 발암과정을 저해하였다. 또한 GSH는 외부의 독성물질이 세포내 침입했을 때 직접 반응하거나 GST에 의해 독성 물질과 결합하여 무독하게 하는 기능을 가지고 있다. GSH는 외부의 독성물질이 세포내 침입했을 때 직접 반응하거나 독성물질과 결합하여 무독하게 하는 기능을 가지고 있으므로 해양심층수에 의해 경도의존적으로 GSH의 함량이 증가되었으므로 산화물질과 기타의 독성물질을 무독화할 가능성이 있을 것으로 추측할 수 있다. ODC 활성 저해효과 Mouse epidermal cells, line 308에서 해양심층수가 TPA에 의해서 유도된 ODC 활성에 미치는 영향을 살펴본 결과, 해양심층수의 경도 800에서는 \( 20 \% \), 경도 1,000에서는 \( 35 \% \)의 저해율을 나타내었다. 한편, 경도 1,000에서는 ODC의 대표적인 저해제인 DFMO의 ODC 저해율 \( 35 \% \)와 유사한 저해율을 나타내었다. ODC는 암예방 물질 연구에 사용되는 표식자 중의 하나이고, ODC 활성의 유도는 발암물질의 암촉진 능력간의 밀접한 관계가 있는 것으로 보고되었다. 따라서 ODC 활성증가는 종양발생의 촉진단계를 자극하므로 해양심층수의 ODC 활성억제 결과에 의하면 해양심층수가 암발생 과정의 촉진(promotion) 단계를 차단하여 암예방 효과가 있을 것으로 생각된다.

해양심층수가 간세포에서의 QR과 GST의 활성을 증가시킨 것으로 보아 외부물질이나 대사산물에 의해 일어날 수 있는 암발생 억제 효과가 있는 것으로 사료되며 발암과정의 개시단계(initia-tion)를 저해할 수 있을 것으로 보인다. GSH는 외부의 독성물질이 세포내 침입했을 때 직접 반응하거나 독성물질과 결합하여 무독하게 하는 기능을 가지고 있으므로 해양심층수에 의해 경도의존적으로 GSH의 함량이 증가되어 해양심층수가 산화물질과 기타의 독성물질을 무독화할 가능성이 있을 것으로 추측할 수 있으며 또한, ODC 활성증가는 종양발생의 촉진단계를 자극하므로 해양심층수의 ODC 활성억제 결과에 의하면 암발생 과정의 촉진(promotion) 단계를 차단하여 암예방 효과가 있을 것으로 생각된다.

GST 활성 세포내 GST 활성 측정은 Habig 등의 방법을 응용하여 측정하였다. Hepa 1c1c7 세포를 96-well plate에 \( 0.5 \times 10^{4} \mathrm{~cells/well}\)로 접종시키고 24시간 배양 후, 해양심층수를 경도별로 포함한 새 배양액 \( 200 ~\mu \mathrm{l} \)을 각 well에 처리하였다. 48시간 배양 후, 세포를 세척하고 용해시켰다. 배양된 세포내에서 유도된 GST 활성 측정을 위해 \( 0.1 \mathrm{~M} \) potassium phosphate buffer (\( \mathrm{pH} ~6.5\))에 \( 2.5 \mathrm{~mM} \) glutathione (GSH), \( 1 \mathrm{~mM} \) chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)를 첨가한 혼합액을 \( 100 ~\mu \mathrm{l} \)씩 각 well에 가하고 1분간 plate shaker에서 교반한 후, 3분간 흡광도의 증가를 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), \( 380 \mathrm{~nm} \)에서 측정하였다. GSH 함량 Griffith의 방법을 변형하여 세포내 총 GSH 생성량을 측정하였다. 즉, \( 0.5 \times 10^{4} \)개의 Hepa 1c1c7세포를 \( 200 ~\mu \mathrm{l}\) MEM 배지에 부유시켜 96-well plate에 접종하였다. 24시간 배양 후, 배양액을 제거하고 해양심층수를 경도별로 처리하였다. 48시간 뒤, PBS로 세척하고 freeze-thaw cycle을 3회 반복하여 세포를 용해시킨 후, \( 40 ~\mu\mathrm{l} \) stock buffer (\(125 \mathrm{~mM}\) Na-phosphate, \( 6.3 \mathrm{~mM}\) Na-FDTA, \( \mathrm{pH} ~7.5\))를 가하고 \( 170 ~\mu \mathrm{l} \) 반응혼합물[\(6 \mathrm{~mM}\) 5,5'-dithiois-(2-nitrobenzoic acid), gluta-thione reductase solution (\(5 \mathrm{~units}\)/ \(\mu \mathrm{l}\)), NADPH-generating system {\(0.5 \mathrm{~M}\) Tris-HCl (\(\mathrm{pH} ~7.4\)), \( 150 \mathrm{~mM} \) glucose-6-phos-phate, \( 50 \mathrm{~mM} \mathrm{~NADP}^{+}\), \(100 \mathrm{~units}\) glucose-6-phosphate de-hydrogenasel}]과 반응시켰다. 상온에서 5분간 교반하면서 반응시킨 후, \(450\mathrm{~nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. GSH 함량은 GSH 표준곡선으로 계산하였고, GSH 함량의 비는 대조군에 의한 GSH 양과 해양심층수에 의해 생성된 GSH양의 비율로 측정하였다. ODC 활성 Mouse epidermal cells, line 308을 24-well tissue culture plate에 well당 \( 2 \times 10^{5} \mathrm{~cells/ml}\) 세포를 접종시키고, 18시간 후에 해양심층수(경도 0, 100, 200, 400, 600, 800 및 1,000), 그리고 양성대조군으로 \( 0.01 \mathrm{~mM} \) difluoromethyl- ornithine (DFMO)을 처리하여 6시간 동안 배양하였다. 세포를 \( \mathrm{Ca}^{2+} \), \( \mathrm{Mg}^{2+} \)-free PBS (\(\mathrm{pH} ~7.4\))로 두 번 세척한 후 frecze-thaw cycle을 실시하여 세포액의 ODC 활성은 L-[1-\(^{14} \mathrm{C}\)]ornithine에서 \([^{14} \mathrm{C}] \mathrm{CO}_{2} \) 방출에 의하여 측정하였다. 즉 L-[1-\(^{14} \mathrm{C}\)]orni-thine (\(200 \mathrm{~nCi}\)), \(0.2\mathrm{~M}\) sodium phosphate buffer (\(\mathrm{pH} ~7.2\)), \(12.5\mathrm{~mM}\) EDTA, \(50 \mathrm{~mM}\) dithiothreitol, \(5 \mathrm{~mM}\) pyridoxal phosphate와 unlabelled L-ornithine을 포함한 \( 200 ~\mu \mathrm{l} \) 반응액을 각 well에 첨가하고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 반응시키며, 방출되는 \( \mathrm{CO}_{2} \)가스를 paper disk로 모아서 radioactivity를 liq-uid scintillation counting (Beckman LS 6500, USA)으로 측정하였다. ODC 활성 억제는 TPA만 처리한 조절군에 대한 각 시료들의 저해도 정도를 percentage로 나타내었다. 세포내 총 단백질 검량 세포내 총 단백질 양은 bicinchoninic acid (BCA) protein kit를 사용하여 BSA를 표준 단백질 용액으로 이용한 표준검량선을 구하여 그 양을 산출하였다.

세포내 GST 활성 검사는 Habig 등의 방법을 활용하여 검사한다. Griffith의 방법을 바꿔 세포내 총 GSH 생성량을 검사하였다. Mouse epidermal cells, line 308을 24-well tissue culture plate에 well당 \( 2 \times 10^{5} \mathrm{~cells/ml}\) 세포를 주입하고, 해양심층수, 그리고 양성대조군으로 \( 0.01 \mathrm{~mM} \) DFMO을 처리하여 6시간 동안 배양한다. 세포내 총 단백질 양은 BCA protein kit를 활용하여 BSA를 표준 단백질 용액으로 사용한 표준검량선을 통해 그 양을 산출하였다.

결과 및 고찰 건조 및 염 처리에 따른 뿌리신장 건조 및 염 처리한 고체배지에서 치상 후 5 일간 생육시킨 동진벼의 뿌리 길이를 조사하였다. PEG 처리농도에 따른 뿌리길이는 대조구 (\(0 \%\) PEG)에 비해 \( 1 \% \)PEG 처리구는 \( 92 \% \), \( 2 \% \) PEG 처리구는 \( 67 \%, 4 \% \) PEG 처리구는 \( 14 \% \) 로 \( \)PEG 농도를 높임에 따라 신장의 억제가 관찰되었으며. 특히 \( 2 \% \) 와 \( 4 \% \) PEG 처리구에서는 현저하게 뿌리신장이 억제되었다. 한편, NaCl 처리에 따른 뿌리길이는 대조구 \( 0 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaCl} \)에 비해 \( 10 \mathrm{mM} \)NaCl 처리구에서는 \( 96 \%, 50 \mathrm{mM} \) \( \mathrm{NaCl} \) 처리구는 \( 38 \%, 100 \mathrm{mM} \)\( \mathrm{NaCl} \) 처리구는 \( 15 \% \)로 \( \mathrm{NaCl} \)처리농도를 증가시킴에 따라 대조구에 비해 뿌리 신장이 억제되었으며, 특히 \( 50 \mathrm{mM} \)과 \( 100 \mathrm{mM} \)\( \mathrm{NaCl} \)처리에서 현저한 신장억제률 보였다. 이것은 염 및 건조 스트레스에 의한 식물체 반응은 1차적으로 뿌리에서 나타나며, 이 때 생성되는 root signal에 의해 뿌리생장 뿐만 아니라 지상부의 생육변화에도 영향을 미친다. 또한, 이러한 root signal은 ABA 생청을 유도하여 잎의 기공의 개폐 뿐만 아니라 잎의 생성유도 및 신장 등을 조절하게 된다. 한편, 내염성 작물로 알려진 보리의 경우는 \( 50 \mathrm{mM}, 100 \mathrm{mM}, 150 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \)를 Hoagland 용액에 넣고 파종 후 10 일간 생육시킨 보리 유묘에 직접 관주하여 그 뿌리 신장을 확인한 결과, \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) 농도까지는 크게 변화를 보이지 않았으며 뿌리 수 또한 큰 영향을 받지 않았다. 본 실험의 결과는 염에 강한 보리에 비해 벼식물체는 \( 50 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \)이라는 상대적으로 낮은 농도에서도 생육저해가 일어나는 염 민감성 작물로 벼의 생육저해는 일차적으로 지하부의 감소와 같은 형태적인 변화에 기인되는 것으로 사료된다. 건조 및 염 처리에 따른 근단 구조의 변화 건조 및 염 처리를 한 고체배지에서 치상 후 5 일간 생육시킨 벼 식물체의 근단을 채취하여 처리에 따른 구조적인 변화를 광학현미경으로 관찰하였다. \( 4 \% \) PEG 처리한 벼식물체의 근단 표피세포 및 외피충 세포에서 화살표로 나타낸 것과 같이 methyl-lignin의 축적이 관찰되었으며 또한 수분결핍을 극복하기 위한 기작으로 표피세포를 변형시킨 근모의 발생이 관찰되었다. 한편, \( 100 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \)을 처리한 벼 식물체의 근단 표피세포에서도 근모의 발생이 관찰 되었으나, PEG 처리구와는 달리 근단 외피층 세포에서만 methyl-lignin의 축적이 확인되었으며 고농도의 \( \mathrm{NaCl} \)에 의한 세포의 수축도 관찰되었다. 염 스트레스를 받은 식물체의 뿌리에서는 세포벽의 구성물질인 셀롤로오스 함량이 감소하며 \( \mathrm{NaCl} \) 농도가 높아질수록 그 감소의 폭은 증가하는데 이것은 세포에 축적된 \( \mathrm{Na}^{+} \)과 \( \mathrm{Cl}^{-} \)이 셀롤로오스 함량을 감소시켜 세포막과 세포벽을 약화시키거나 변형시켰기 때문으로 생각된다. 본 실험에서 PEG 처리구에 비해 \( \mathrm{NaCl} \) 처리구의 뿌리생육의 저해는 \( \mathrm{Na}^{+} \)과 \( \mathrm{Cl} \)와 같은 이온에 의한 표피세포의 세포벽 약화에 기인하는 것으로 사료된다. 이러한 현상에 대해 Nible과 Rogers도 식물체는 흡수된 \( \mathrm{Na}^{+} \)과 \( \mathrm{Cl} \)을 액포에 저장시켜 세포내의 수분포텐셜을 낮추지만,과도한 염류 축적에 의해 이온독성 및 무기양분 부족으로 생육장해를 일으킨다고 보고하였다.

본 연구에서는 동진벼의 뿌리 길이를 조사하여 염 민감성 작물로서의 특징을 분석하였다. 염에 대한 처리와 건조한 환경에서 생육 시킨 후, 뿌리의 구조적 변화를 살펴보았다. 결과적으로 이러한 처리가 뿌리 생육의 저해를 일으키며, 이는 주로 이온의 영향에 의한 세포벽의 약화 때문으로 판명되었다.

재료 및 방법 공시재료로서는 국내에서 널리 재배되고 있는 일반 재배형 동진벼(Oryza sativa L. var. Dongjinbyeo)를 사용하였다.배지는 \( 0.4 \% \) agar를 넣고 잘 녹인 다음, 배양시험관에 \( 10 \mathrm { ml } \)씩 분주하여 agar 고체 배지(이후, 고체배지라 칭함)를 작성하였다. 종자는 \( 1 \% \) 차아염소산 나트륨으로 10 분간 종자표면을 살균한 후, 5 번 정도 증류수로 헹군 후, 표면 살균한 동진벼를 고체배지가 들어 있는 배양시험관에 1 립씩 치상하였다. 처리구는 \( 0.4 \% \) 한천을 넣고 pH로 교정한 대조구와 \( 1 \%, 2 \%, 4 \% \) polyethylene glycol 6000 (PEG)을 넣은 건조 처리구, \( 10 \mathrm { mM } , 50 \mathrm { mM } , 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 을 넣은 염 처리구를 설정하였다. 식물체 생육은 각 처리구별 10 반복으로 하였으며 주간 24 시간 주기, 광도 \( 2,400 \mathrm { Lux } \), 온도 \( 24 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 항온실에서 치상 후 5일간 생육하였다. 치상 후 5일간 생육시킨 식물체를 채취하여 뿌리길이를 측정하였으며, 지상부와 지하부로 나누어 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 72 시간 이상 건조시킨 후, 건물 생산량을 조사하였다. 상대 건물증( \(\%\))의 산출식은 아래와 같이 구하였다. \(\text{상대 건물중} (\%) = ( \text{처리구 건물무게} \div \text{대조구 건물무게} ) \times 100\)뿌리조직의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 \( 4 \% \mathrm { PEG } \) 처리구와 \( 100 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 처리구에서 생육시킨 벼 식물체 근단 \( 2 \mathrm { ~mm } \) 정도까지의 부분을 채취하여 FAA 고정액(formalin: acetic acid: \( 50 \% \) ethanol = 0.5: 0.5: \( 9 \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 으로 고정하였다. 조직 관찰용 절편은 채춰한 근단을 \( 4 \% \) agar 배지에 조심스럽게 넣고 포매한 후 절편용 블록을 작성하였다. 조직 관찰은 면도날을 이용하여 \( 100 \mu \mathrm { m } \) 정도의 두께로 횡단으로 제작한 후, methyl-lignin 축적에 의한 리그닌화(목질화)된 조직을 진한 녹색으로 염색하는 것이 특징인 \( 0.05 \% \) Toluidine Blue O로 염색한 다음, 증류수로 5번 정도 세척하였다. 근단 구조는 200배율로 설정한 역상현미경(IMT2-21, Olympus Ltd.)으로 관찰하였다.

공시재료로서는 국내에서 널리 재배되고 있는 일반 재배형 동진벼를 사용했고 치상 후 5일간 생육시킨 식물체를 채취하여 뿌리길이를 측정하였으며, 지상부와 지하부로 나누어 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 72 시간 이상 건조시켜 건물 생산량을 조사했다. 상대 건물중( \(\%\))의 산출식은 \(\text{상대 건물중} (\%) = ( \text{처리구 건물무게} \div \text{대조구 건물무게} ) \times 100\) 과 같으며 조직관찰은 면도날을 이용, methyl-lignin 축적에 의한 리그닌화된 조직을 진한 녹색으로 염색해서 증류수로 5번 세척했다.

건조 및 염 처리에 의한 건물 생산량의 변화 PEG및 \( \mathrm{NaCl} \)을 처리한 고체배지에 치상 후 5일간 생육시킨 동진벼의 건물 생산량을 지하부와 지상부로 나누어 조사하였다. PEG 및 \( \mathrm{NaCl} \) 처리에 의한 건물생산은 지상부와 지하부에서 모두 억제되었다. PEG 처리에 따른 지상부의 상대 건물중 \(\%\)은 \( 1 \% \) PEG 처리구에서 \( 81 \%, 2 \% \) PEG 처리구에서 \( 79 \%, 4 \% \) PEG 처리구에서 \( 10 \% \)로 감소한 반면, 지하부의 상대 건물중은 \( 1 \% \) PEG 처리구에서 \( 40 \%, 2 \% \) PEG 처리구에서 \( 32 \%, 4 \% \) PEG 처리구에서 \( 15 \% \)를 나타내었다. 한편, \( \mathrm{NaCl} \) 처리에 의한 건물 생산량은 \( \) PEG 처라구 식물체와 마찬가지로 벼 식물체의 지상부와 지하부 모두에서 생육의 억제가 관찰되었다. \( \mathrm{NaCl} \) 처리에 의한 지상부의 상대 건물중 \( (\%) \) 은 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) 처리구에서 \( 77 \%, 50 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) 처리구에서 \( 61 \%, 100 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) 처리구에서 \( 46 \% \)를 나타내었고 지하부의 상대 건물중은 \( 10 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) 처리구에서 \( 45 \%, 50 \) \( \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) 처리구에서 \( 28 \%, 100 \mathrm{mM} \mathrm{NaCl} \) 처리구에서 \( 17 \% \)로 현저한 건물생산 저해를 보였다. 일반적으로 염 및 건조 스트레스 환경에서의 잎은 수분 결핍으로 인해 기공이 폐쇄되어 \( \mathrm{CO}_{2} \) 흡수가 저해된 결과, 광합성율의 감소로 인해 물질 생산의 저하가 보고되어 있으나, 본 실험에서 건물생산의 저하는 Spollen 등의 보고와 같이 \( \mathrm{NaCl} \) 및 PEG 처리에 의한 벼 식물체 뿌리에서 root signal이 생성되어 \( \mathrm{ABA} \)와 같은 생장억제 호르몬을 유도하여 지하부 뿐만 아니라 지상부의 물질생산에 영향을 주어 결과적으로 건물 생산량이 감소한 것으로 사료된다. 지금까지의 스트레스 생리학 관련 연구에는 주로 양액 재배법이 이용되고 있을 뿐, 고체 배지를 이용한 실험법은 거의 이용되지 않고 있다. 이러한 고체배지의 이용은 공간적인 효율성을 높일 수 있을 뿐만 아니라 발아기의 스트레스에 대한 식물체 반응의 관찰과 내성 특성의 검정에 유용하다고 사료된다.

동진벼의 건물 생산량에 대한 연구를 수행하였다. PEG 및 \( \mathrm{NaCl} \)을 처리한 고체배지에서 동진벼를 치상한 후 5일 동안 생육시킨 결과, 건물생산은 지상부와 지하부에서 모두 억제되었다. 이러한 고체배지의 이용은 공간적 효율성을 높이며, 발아기의 스트레스에 대한 식물체 반응 및 내성 특성을 관찰하는 데 유용함을 확인하였다.

서 론 지난 수십 년 동안 장기이식수술, 항암치련, 후천성면역결핍증(AIDS) 및 고령화 등으로 인하여 면역능력이 저하된 환자들이 급격히 중가하고 있고, 이들 고위험 군의 경우 Candida, Aspergillus 및 Cryptococcus 등의 인간 기회감염성 병원성 곰팡이(human opportunistic fungal pathogen)에 의한 감염과 질환이 전세계적으로 지속적인 증가추세를 보이고 있다. 특히 가장 대표적인 기회감염성 곰팡이인 Candida 는 미국 병원들에서 4 번째로 혈액 배양물에서 많이검출되는 병원감염(nosocomial infection) 원인균으로서, 미국 내 전체 Candidemia (Candida 혈액감엽증) 환자의 수는 약 10,500 ~ 42,000명에 이르고, 그 사망률은 \( 29 \sim 47 \% \) 에 이르는 것으로 알려져 있다. 또한 사상성곰팡이(filamentous fungi)인 Aspergillus 에 의한 침습성곰팡이감염(invasive fungal infection)은 골수 이식 환자 사망의 주된 원인이 되고 있다. 한편 2006년의 경우 전 세계적으로 조사된 IIV-감염 환자 중에서 957,900 명의 사람들이 Cryptococcus neoformans 에 의한 뇌수막염에 걸렸고 이 중 624,700 명이 그로 인해 사망했으며, 90 일 이내에 사망하는 확률 또한 지역에 따라 적게는 \( 9 \% \) 에서 많게는 \( 70 \% \) 에 이르렀다는 결과가 발표된 바있다. 특히 sub-Sahara Africa 지역의 경우 HIV에 감염된 환자 중 cryptococcosis에 의한 사망이 말라리아, 설사병, 어린이 집단질병에 이어 4번째로 높았다. 최근에는 C.neoformans에 의한 뇌수막염이 면역기능이 정상적인 건강한 사람에게서 집단으로 발병하여 사망한 사례까지 알려져서 더 이상 곰팡이류에 의한 감염은 면역기능이 저하된 사람에게서만 발병되지 않는다는 것이 입증되었다. 앞으로 의료기술의 발달로 전 세계가 노령화 사회로 접어 들면서 면역 기능의 저하로 인한 곰팡이 감염은 점점 더 증가될 것으로 예상되고 있으나, 현재 상업적으로 널리 이용되는 항진균제의 경우 지나친 독성 및 빈번한 저항성 균주의 출현으로 광범위한 활성을 나타내면서 독성은 적은 새로운 항진균제에 대한 필요성이 증대되고 있다. 본 총설에서는 이러한 인간병원성 곰팡이인 C. neoformans의 생리학적 특성에 대해 설명하고, 그 생존, 분화, 및 병원성을 조절하는 필수 신호전달체계의 특징과 이를 이용한 새로운 항곰팡이 치료법 개발의 예를 설명하고자 한다. Cryptococcus neoformans란? C. neoformans는 담자균류(basidiomycota)에 속하는 동물 감염성 병원성 곰팡이로서, 동물 숙주 내에서 살아갈 수 있는 기생생환사(parasitic life cycle)를 갖지만 동시에 일반 자연환경에서도 살아갈 수 있는 부생성생활사(saphrophytic life cycle) 역시 가지고 있다. C. neoformans는 기본적으로 반수체(haploid) 생활사를 갖지만, 유성생식(sexual reproduction) 과정에서는 포자형성 전에 일시적으로 이배체(diploid) 생활사를 갖기도 한다. C. neoformans 분화과정에서 한가지 흥미로운 점은 \( \alpha \)-mating type과 a-mating type 사이에 일어나는 유성분화과정 이외에도 \( \alpha \)-mating type사이에서 주로 일어나는 monokaryotic fruiting이라는 분화과정이다. 전 세계에서 발견되는 대부분의 C. neoformans는 \( \alpha \)-mating type이기 때문에 monokaryotic fruiting에 의한 분화과정은 C. neoformans의 진화과정에 큰 영향을 끼친다는 것을 예상할 수 있다. C. neoformans는 인간 기회감염성 병원성 곰팡이로서 AIDS, 장기이식, 장기항암치료 등에 의해 면역력이 저하되거나 결핍된 환자들의 중추신경계에 곰팡이성 뇌수막염(fungal meningitis)을 일으킨다. C. neoformans는 토양, 나무, 새의 배설물 등과 같은 다양한 자연환경에서 광범위하게 발견되며 포자(spore)나 건조효모세포(dried yeast cell)의 형태로 호흡기를 퉁해 폐에 감염되어 곰팡이성 폐렵(fungal pneumo-nia)를 일으키거나, 이후 중추신경계로. 퍼져 뇌혈관장벽(blood-brain-barrier)을 통과한 후 뇌수막염을 일으키게 된다. C. neoformans의 대표적인 두 가지 병원성 요소는 다당류성 캡슐(polysaccharide capsule)과 멜라닌(melanin)이다. C. neoformans의 세포벽 주위를 둘러싸고 있는 캡슐은 세포의 크기를 증가시켜 대식세포(macrophage)에 의한 식세포작용 (phagocytosis)과 탈수현상(dehydration)을 저해한다. 항산화성 물질인 멜라닌은 산화, 자외선 노출, 고온 등의 스트레스 환경에 대한 강한 저항성을 갖게 함은 물론 캡슐과 마찬가지로 대식세포의 식세포작용 역시 저해하여 C. neoformans에 대한 숙주의 방어체계를 약화시킨다. C. neoformans는 A, B, C, D의 네 가지 혈청형(serotype) 가운데 serotype A(C. neoformans var. grubii) 가 전 세계적으로 가장 많이 발견되며, serotype D(C. neoformans var. neoformans)는 일부 유럽지역에서 많이 발견되는 혈청형으로서 주로 면역력이 저하된 환자들에게서 많이 발견된다. 이에 반해 serotype B와 C(C. neoformans var. gattii) 는 면역력이 저하된 사람뿐만 아니라 면역체계에 이상이 없는 건강한 사람들에게도 감염되는 것으로 알려져 있다. 따라서 최근에는 새로운 종으로 분리되어 Cryptococcus gattii로 명명되었다. 특히 C. gattii에 의한 뇌수막염은 캐나다 British Columbia 지역에서 1999년에 처음 발병한 이래 현재까지 약 160 여명의 정상인이 감염되어 그 중에서 8 명이 사망함은 물론 미국 서북부 지역까지 감염이 보고 되어 그 우려가 증가되고 있다. 현재 cryptococcosis를 치료하기 위한 약물로 polyene계열인 Amphotericin B, pyrimidine 길항제인 flucytosine, cytochrome P450을 타깃으로 하는 azole계열인 fluconazole 등이 사용되는데 대표적으로 치료율이 \( 70 \% \) 에 달하는 Amphotericin B와 flucytosine의 병행요법이 주로 사용된다. 하지만 각각의 약들은 인체에 대한 심각한 부작용과 내성을 지닌 균의 등장으로 사용상의 많은 제약이 있다. 따라서 이를 극복하기 위한 노력으로 전 세계적으로 많은 연구실에서 새로운 항크립토코쿠스 타깃 인자를 개발하기 위한 노력을 기울이고 있다. 특히 연세대학교 생명공학과의 반용선 교수 연구실에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 분자생물학적, 분자유전학적, 유전체학적, 시스템생물학적 방법을 적용하여 새로운 항진균 타깃을 찾고 가장 효과적인 약물을 개발하고자 노력하고 있다.

세계적으로 면역능력 저하 환자의 증가에 따라 Candida, Aspergillus, Cryptococcus 등의 기회감염성 병원성 곰팡이에 의한 질병이 급증하고 있다. 이런 상황은 장기이식, 항암치료, 후천성면역결핍증(AIDS), 고령화와 같은 요인으로 야기되며, 특히 노령화 사회가 확산함에 따라 곰팡이 감염은 더욱 빈번해질 것으로 예상된다. 기존의 항진균제는 독성과 저항성 균주 문제로 인해 대응이 어렵기에, 독성이 적고 넓은 활성을 가진 새로운 항진균제의 필요성이 커지고 있다. 이를 위해 전 세계의 많은 연구소에서는 항 Cryptococcus 타깃 인자 개발에 힘쓰고 있다. 특히, 인간병원성 곰팡이인 C. neoformans의 생물학적 특성과 이를 조절하는 신호전달체계의 연구가 중요하다. 이 곰팡이는 동물을 감염시킬 뿐만 아니라 자연환경에서도 번성하며, 이 두 가지 생활사를 모두 수행한다. 이러한 C. neoformans의 이중 생활사와 신호전달체계에 대한 깊은 이해를 통해, 효과적인 항진균제를 개발하는 데 도움이 될 것으로 기대된다.

C. neoformans의 Stress-activated Signaling Pathway의 연구 지구상에 존재하는 수많은 생명체들은 생명 유지를 위해서 주변환경과 다른 생물체들과 상호작용하며 적응하여 살아간다. 외부에서 감지된 자극은 다양한 신호전달체계를 통해서 신호로 전달되고, 이 신호는 생장, 분화, 생식, 대사 등 세포 내에서 매우 복잡한 활동을 조절하여 해당 환경에 적응할 수 있도록 한다. 만약 이러한 환경 반응성 신호전달체계를 정확하게 이해 하고 조절 할 수 있다면 새로운 항곰팡이제의 개발 및 여러 질병의 치료에 획기적인 도구가 될 것이다. 반용선 교수 연구실은 인간병원성 곰팡이 C. neoformans 의 환경 반응성 신호전달네트워크의 작용기작을 규명하고, 신규 곰팡이 병원성 조절 유전자 및 관련 신호전달체계의 기능을 밝히는대 초점을 두고 있다. 특히 지난 수 년간 본 연구실은 다양한 환경적 스트레스에 중추적인 역할을 하는 C. neoformans 의 HOG(High Osmolarity Glycerol response)와 Ras/cyclic-AMP(cAMP) 신호전달체계 들의 특성 규명에 많은 기여를 한 바 있다. 특히 이 두 가지 신호전달체계들은 환경스트레스 반응 이외에도. C. neoformans의 두 가지 주요 병원성인자인 캡슐과 멜라닌의 합성에 결정적인 역할을 함과 동시에, 유성생식에 의한 포자형성과정에도 매우 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀짐으로써, 이와 관련된 신규 C. neoformans 유전자의 발굴과 특성규명에 많은 노력을 기울이고 있는 중이다. 그 중 가장 최근에 발표된 연구성과는 HOG 와 Ras/cAMP 신호전달네트워크의 유전체 수준에서의 전사체 연구에 관한 것으로, 이 연구들을 동해 두 신호전달체계에서 지금까지 알려지지 않았던 새로운 특성들이 발견되었음은 물론이고 신규 HOG- 및 Ras/cAMP-의존적인 유전자들이 발굴되었다. HOG 신호전달체계에 관련된 유전자가 변이된 균주(예, \( \operatorname{hog} 1 \Delta, s s k 1 \Delta) \) 는 야생형과 비교하여 같은 환경스트레스에 대해 매우 다른 유전자 발현 양상을 보이고, 스트례스의 종류에 따라서도 유전자 발현 양상이 달라지는 것을 발견하였으며, 이를 통해 HOG pathway에 의존적으로 스트레스에 반응하는 새로운 유전자를 발견하였다. 또한 Ras/cAMP 신호전달체계의 비교전사체 연구를 통해서 많은 수의 환경스트레스 반응성 유전자들이 Ras/cAMP 신호전달체계에 의해 발현이 조절됨은 물론 실제 Ras/cAMP 변이체들이 다양한 환경스트레스에 야생형 균주보다 증가된 감수성을 보임이 밝혀졌다. 앞으로도 이러한 선행연구에서 나온 결과를 바탕으로 심도 있는 연구를 수행하여 아직도 남겨져 있는 많은 HOG 및 Ras/cAMP 신호전달체계의 비밀에 대해서 연구한다면 좋은 결과물을 얻을 수 있을 것이다. 인간 병원성 곰팡이의 또 하나 중요한 신호전달체계는 이산화탄소 \( \left(\mathrm{CO}_{2}\right) \)-감지성 신호전달경로이다. C. neoformans가 일반 자연환경에서 동물 숙주 내로 감염될 때 약 150 배의 급격한 \( \mathrm{CO}_{2} \) 의 농도 차이 \( (0.036 \% \) 에서 \( 5 \% \) 로 증가 \( ) \)를 경험하게 된다. 따라서 이러한 \( \mathrm{CO}_{2} \) 의 변화를 감지하고 이에 대한 적당한 세포반웅 및 대사를 조절하는 것은 동물병원성 곰팡이의 중요한 능력 중의 하나라고 볼 수 있다. 반용선 교수 연구실에서는 2005 년에 발표된 연구에서 C. neoformans의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 감지 및 대사과정에 중요한 역할을 하는 carbonic anhydrase 유전자(CAN2)를 발견하고 그 기능을 규명한바 있다. 흥미롭게도 CAN2 유전자는 낮은 \( \mathrm{CO}_{2} \) 농도의 일반 자연환경에서 C. neoformans가 생존하는데 필수적인 역할을 함과 동시 유성분화과정에서도 중요한 역할을 함을 밝힌 바 있다. 최근에는 CAN2 유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 균주를 개발하여 유전체수준의 전사체분석을 실시하여 \( \mathrm{CO}_{2} \) 와 carbonic anhydrase에 의해 조절되는 타깃 유전자 규명에 주력 하고 있다.

지구 상의 생명체들은 주변 환경과 상호작용하여 생존에 적응하고 있으며, 환경 반응성 신호전달체계를 통해 복잡한 활동을 조절하여 적응하고 있습니다. 반용선 교수 연구실은 인간 병원성 곰팡이인 C. neoformans의 신호전달체계를 연구하고 있으며, HOG와 Ras/cAMP 신호전달체계의 특성을 밝히고 신규 유전자를 발굴하고 있습니다. 이 연구는 항곰팡이제 개발과 질병 치료에 혁신적인 도구가 될 수 있습니다. 또한, \( \mathrm{CO}_{2} \) 감지 신호전달 경로에 대한 연구도 진행하고 있으며, \( \mathrm{CO}_{2} \) 변화에 대한 적절한 반응을 조절하는 유전자를 규명하고자 합니다. 이러한 연구를 통해 곰팡이의 병원성 조절에 대한 이해를 높이고, 더 나은 결과물을 얻을 수 있을 것입니다.

C. neoformans 전사조절인자(Transcription factor)에 대한 연구 병원성 곰팡이의 병원성결정인자(virulence factor)는 숙주 내의 특정한 환경에서 그 발현 및 생성량이 조절되며, 대부분은 곰팡이의 생존, 분화 및 병원력 조절에 큰 영향을 준다. 이러한 다양한 병원성결정인자의 발현을 가장 직접적으로 조절하는 인자가 전사조절인자(Transcription Factor, TF) 이다. 지금까지 동물식물 병원성 곰팡이에서 다양한 전사조 절인자들이 개별적으로 연구되어 왔으나 아직 이들 신호전달물질을 타깃으로 하는 항곰팡이 신약의 개발은 극히 미미한 상태이다. 그 주된 이유는 지금까지의 연구가 이미 다른 종에서 보고된 사실을 바탕으로 한 진화적으로 보전된 신호 전달의 핵심 유전자/단백질의 연구에 치중되어 이들 병원성 곰팡이의 특이적인 신호전달인자는 극히 제한적으로만 보고 되고 있기 때문이다. C. neoformans의 신호전달네트워크 내에서 중심적인 역할을 담당하는 신호전달인자들은 진화적으로 잘 보전되어 있으나, 최종적인 신호전달의 역할을 담당한 전사조절인자들의 경우는 다른 종들에게서 ortholog가 많이 발견되지 않아, 이 부분이 C. neoformans의 특이적 병원성 조절의 결정적인 단서를 가지고 있다고 유추할 수 있다. 최근의 보고에 따르면, C. neoformans에는 최소 184 개의 전사조절인자들이 존재하는 것으로 예측되었다(DBD: Trans-cription factor prediction database, www.transcriptionfactor. org). 따라서 반용선 교수 연구실에서는 전체 유전체수준에서 전사조절인자 톡이적인 focused mutant library를 구축하여, 이들의 기능적 역할을 생장, 분화, 대사 및 병원성 조절의 측면에서 분석 및 규명하여 통합적이고 종합적인 C. neoformans의 대사 및 신호전달네트워크의 구축을 목표로하여 연구를 진행하고 있다. 이러한 병원성곰팡이의 전사조절인자들의 기능을 종합적으로 규명할 수 있다면 생장, 분화, 생식, 대사 및 신호전달과 관련된 복잡하고 상호 연계성이 있는 세포내의 활동을 이해할 수 있음은 물론 장기적으로 새로운 차원의 항크립토코쿠스 및 항곰팡이 신약 개발의 초석이 될 것이다. Signaling pathway 연구를 이용한 새로운 함진균 치료법의 개발 항크립토코커스 및 항곰팡이 치료제는 개발이 상당히 어렵고, 따라서 항세균 치료제에 비하여 그 종류와 개수가 매 우 적다. 그 결정적인 이유는 곰팡이/효모가 기본적으로 인간세포와 거의 동일한 진핵세포의 구조를 가지고 있기 때문에 알려진 곰팡이 특이적인 타깃의 개수가 원핵세포인 세균의 특이적인 개수보다 훨씬 적기 때문이다. 따라서 곰팡이의 생장과 병원성 조절에 영향을 끼치는 새로운 타깃 유전자/단백질을 도출하는 것이 급선무라고 할 수 있다. 최근에 반용선 교수 연구실에서는 2009년 Eukaryotic cell 지에 발표한 논문을 통해 C. neoformans의 HOG pathway 를 타깃으로 한 새로운 차원의 항크립토코쿠스중 및 항곰팡이 치료제 개발의 가능성을 제시하였다. 이 연구에서는 HOG pathway 변이균인 \( \operatorname{hog} 1 \Delta, \operatorname{ssk} 1 \Delta, \operatorname{skn} 7 \Delta \) 변이균 및 야생형 H99균과 DNA microarray를 이용한 비교전사체분석을 실시하여 HOG pathway 타깃유전자를 규명하였다. 이 연구에서 가장 훙미로운 발견은 많은 ergosterol 합성관련 유전자들이 HOG pathway 변이체에서 그 발현이 증가하고, 실제 세포 내 ergosterol 함량 역시 증가한다는 사실이다. 따라서 HOG pathway 변이체는 ergosterol에 binding하는 Ampho-tericin B에 대한 감수성이 급격히 증가하는 현상을 발견하였다. 이러한 발견은 HOG pathway의 inhibitor와 Ampho-tericin B의 복합치료요법(combination therapy)이 매우 효과적인 Cryptococcosis의 치료제가 될 수 있다는 것을 의미한다. 또한 반용선 교수 연구실에서는 2010년에 Eukaryotic Cell 지 3월호에 스포트라이트 논문으로 선정된 Ras/cAMP pathway의 DNA microarray를 이용한 비교전사체연구를 통해 Ras/cAMP pahway를 타깃으로 한 새로운 차원의 항크립 토코쿠스중 및 항곰팡이 치료제 개발의 가능성을 제시하였다. 이 연구에서 밝혀진 흥미로운 사실은 HOG pathway와는 달리 Ras/cAMP pathway 변이균들은 ergosterol유전자의 발현과 함량과는 관계없이 매우 중가된 Amphotericin B 감수성을 보였다는 것이다. 이 때문에 HOG pathway와 Ras/ cAMP pathway의 이중변이균은 각각의 단일 변이균보다 매우 낮은 농도의 Amphotericin B에도 큰 감수성을 보였다. 또한 Azole 계열의 drug에는 resistance를 보이던 HOG pathway 변이균이 cAMP pathway 유전자가 이중변이 되었을 때는 매우 높은 감수성을 보이는 것이 관찰되었다. 이것은 IIOG 및 Ras/cAMP 신호전달체나의 주요한 단배질을 동시에 저해할 수 있는 inhibitor 들과 Amphotericin B 혹은 \( \Lambda \) zole 계 치료제의 복합치료법의 효율성을 극대화 시킬 수 있다는 것을 의미한다.

병원성 곰팡이의 병원성결정인자는 숙주 내의 특정한 환경에서 그 발현 및 생성량이 조절되며, 다양한 병원성결정인자의 발현을 가장 직접적으로 조절하는 인자가 전사조절인자는 대부분은 곰팡이의 생존, 분화 및 병원력 조절에 큰 영향을 준다.

C. neoformans 유전자의 기능규명 방법 C. neoformans 유전자의 기능규명에 가장 일반적으로 많이 사용되는 방법은 유전자 특이적 결손변이체 (targeted gene-deletion mutant) 제조와 이의 형질분선 (phenotypic analysis)이다. 일반적으로 유전자변이체를 만들기 위한 gene-disruption cassette는 타깃 유전자의 \( 5^{\prime} \) 과 \( 3^{\prime} \) 영역의 약 \( 1 \mathrm{~kb} \) 크기의 flanking region과 dominant selectable marker인 NAT(Nourseothricin acetyltransferase) 사이의 overlap PCR 을 이용해 제조한다. C. neoformans는 일반적으로 곰팡이에 사용되는 형질전환 방법으로는 효과가 없기 때문에 particle delivery system(gene-gun이라고도 불리움)에 의한 biolistic transformation 방법으로 형질전환을 하고 있다. 최근에 반용선 교수 연구실의 경우에는 비효율적인 overlap PCR의 단점을 극복하고 단기간 내에 대용량의 유전자 결손변이체를 만들기 위해, 일부 곰팡이에서 효과적으로 사용된 바 있는 split-marker transformation 방법을 최초로 C. neoformans에 도입하였다. Split-marker transformation 방법은 double joint PCR(DJ-PCR)을 이용하여 기존의 overlap PCR 방법과는 달리 NAT selectable marker를 두 조각으로 나누어 합성하는 방법으로, gene-disruption cassette를 횔씬 더 쉽고 효율적으로 제조할 수 있고, 변이체 수득율을 향상시킬 수 있음이 연구를 통해 밝혀졌다. 이러한 방법을 통해 현재 반용선 교수 연구실에는 총 842개의 유전자변이체가 제조되어 보관 중에 있으며, 최근에 Hiten Madhani 그룹(University of California, San Francisco)에 제조한 1,200여개의 유전자 변이체 라이브러리와 함께 약 2,000 여 개의 유전자변이체를 보유하고 있다. 이들 유전자 결손 변이체들은 다양한표현형질분석(phenotypic analysis)과 동물실험을 통하여 병원성조절 여부를 검증하고 있다. 이러한 개별유전자의 기능분석 이외에 유전체 수준의 유전자 발현 분석을 위해서 C. neoformans에서는 비교적 저렴한 가격(\$40/chip)으로 DNA microarray chip이 공급되고 있어, 현재 전 세계정으로 많은 전사체(transcriptome) 연구가 이루어지고 있다. 반용선 교수 연구실도 DNA microarray 분석시설을 갖추고 C. neoformans에서 제조된 다양한 유전자 변이체에 대한 비교전사체분석(comparative transcriptome analysis)을 진행하고 있다. 현재 분석에 쓰이는 DNA micro-array slide에는 Cryptococcus의 serotype A와 D genome을 이용해 만든 두 가지 종류의 slide가 있어 두 가지 serotype에 대한 연구가 모두 가능하다. 비교전사체 분석을 통해 특정 생육환경 및 스트레스 상황에 반응하는 유전자의 동정 및 유전자변이체의 전사체 발현 양상을 파악하여 정량적으로 주목할만한 변화를 보이는 유전자를 선정하는뎨, 이러한 유전자가 예측된 기능을 실제로 갖는지 확인하기 위해서는 역시 유전자변이체 제조에 의한 추가적인 형질분석이 필요하다.

C. neoformans 유전자의 기능규명을 위해 일반적으로 사용되는 방식은 유전자 특이적 결손변이체를 제조하고 형질분석을 수행하는 것으로, 유전자변이체의 제조를 위해서는 overlap PCR 방법, 혹은 최근 반용선 교수 연구실에서 도입한 split-marker transformation 방법 등을 사용할 수 있다. 또한 유전자 발현 분석을 위하여 제조된 다양한 유전자 변이체에 대한 비교전사체분석을 진행하여 주목할만한 유전자를 선정하는데, 이러한 유전자가 실제로 예측된 기능을 갖는지 확인하려면 유전자변이체 제조에 의한 형질분석이 추가적으로 필요하다.

고 찰 본 연구 결과 TBTCl 및 BPA의 단기 투여는 농도에 상관없이 등줄쥐 성체 및 새끼(F1) 수컷의 생식소중량지수나 생식소의 미세구조에 영향을 미치지 않음이 밝혀졌고, 실험용 흰쥐나 생쥐에서도 이들 화합물의 단기 투여에 의해서 번식에 이상이 발생하지 않음이 보고된 바 있다. 즉, 수컷 흰쥐에게 TBTCl \(5 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)을 단기간(10일) 투여했을 경우 생식소에 별다른 이상이 나타나지 않았다고 보고되어 있으며, 수컷 생쥐와 흰쥐에게 각각 \( 0.1,1,5,10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mouse } \) 와 \( 1,10,100,600 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { rat } \)의 BPA를 12일 동안 격일로 주사한 후 15일째에 관찰한 결과 정세포의 첨체와 핵의 형태적 이상이 성 성숙 시기에 모두 정상으로 회복되었다고 보고되어 있다. 또한 \( 300 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { g } \) 의 BPA를 출산 직후의 수컷 흰쥐에게 5일 동안 투여한 경우에도 성 성숙시기 이후의 생식소에 별다른 이상이 관찰되지 않았다. 이러한 연구 결과들로부터 등줄쥐도 생쥐나 흰쥐와 유사하게 TBTCl이나 BPA의 단기 투여에 의해서 영향을 받지 않음을 알 수 있다. 이러한 결과는 TBTCl이나 BPA의 등줄쥐 체내에서의 빠른 대사 속도와도 연관이 있는 것으로 생각되는데(Table 3), 포유류에서는 투여방법에 관계없이 BPA는 대변( \(56 \sim82 \% \)) 으로, BPA의 대사산물은 소변 ( \(13 \sim28 \% \))을 통해서 대부분 배설된다고 알려져 있다. Tanabe 등과 Watanabe 등도 해양포유류와 비교해서 육상포유류에서 유기주석 화합물이 낮게 검출되는 이유를 이들의 대사활성이 해양포유류보다 횔씬 높기 때문이라고 보고하고 있다. 본 연구에서도 TBTCl과 BPA 투여 후 4개월 후의 잔류 농도가 대조군과 대부분 유의차를 보이지 않아 투여된 화합물이 4개월 이내에 대부분 대사된 것으로 생각되었다. 한편 수컷 생쥐에게 \( 0.5,5,50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { kg } \)의 TBT를 장기간(성성숙 개시기부터 30일 동안) 투여했을 경우 모든 투여군에서 생식소중량지수가 뚜렷이 감소하고, 정자형성과정에서도 이상이 나타났으며, \( 0.5,15 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)의 TBT를 30일 동안 투여했을 경우에도 부정소, 전립선 및 정낭무게의 감소가 나타났음이 보고되어 있다. 또한 수컷 생쥐에게 BPA \( 50 \mathrm {\mu g } / \mathrm { ml } \)를 8주간 투여했을 때, testosteron이 감소하고 정세관에서 거핵세포가 관찰되었으며, 수컷 흰쥐에게 수유기부터 성 성숙시기까지 1달간 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)의 \( \mathrm { BPA } \)를 투여 했을 경우 성 성숙시기가 지연되고 정자형성과정에 영향을 준다는 연구도 있다. 즉 TBT나 BPA에 장기간 노출되었을 때는 흰쥐의 번식이 방해되는 것을 알 수 있는데, 이러한 연구결과틀로부터 등줄쥐에서도 TBT나 BPA에 장기간 노출될 경우 이들 화합물이 등줄쥐의 번식에 영향을 미칠 가능성을 배제할 수는 없다. 따라서 서론에서 언급한 Kim 등의 연구에서 보고된 야생 등줄쥐의 낮은 생식소중량지수 비율이나 정소와 부정소의 조직 이상 현상이 이들 화합물에 의해서 유발된 현상이라면 아마도 이들 화합물에 장기간 노출된 결과일 것으로 생각된다. 한편, TBTCl과 BPA의 단기투여는 F1세대의 태아 발생에 크게 영향을 미침이 밝혀졌다. 즉, 양 화합물의 투여군(BPA 투여군의 태아 생존율, \( 0 \sim7 \% \), 평균 \( 17 \% \); TBTCl 투여균의 태아 생존율, \( 67 \sim 100 \% \), 평균 \(87 \% \))에서는 대조군(태아 생존율, \( 100 \%) \)에 비해서 태아의 생존율이 낮고 임신 후 유산된 개체 (B500-4, B5000-3)가 많았으며, cannibalism의 가능성을 배제할 순 없지만 출산 후 어미에 의해 먹힌 예(T300-4, T3000-2, B5000-3)가 많았다(Table 4). 이러한 결과는 tri-n-butyltin ace-tate가 흰쥐에서 태아의 사망률을 증가시키고, \( 200 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { kg } / \mathrm { day } \)의 BPA를 투여한 어미 생쥐에서 태어난 한 배 새끼의 수가 대조군에 비해 비교적 적었으며, \(7,500 ppm \)의 BPA를 투여한 어미 흰쥐에서 태어난 새끼들에서의 사망률이 높았다는 연구와 매우 유사하다. 결론적으로, TBTCl 및 BPA를 비번식기의 성체 등줄쥐에게 고농도 또는 저농도로 단기간 투여했을 때, 이들 화합물은 체 내에 장기간 잔류하지 않으며, 부모 세대와 F1세대의 생식소중량지수 및 정소와 부정소 조직에 영향을 미치지 않으나, 고농도의 TBTCl 또는 BPA의 투여에 의해 유산율이 높아지고 태아의 수태율 및 생존율이 낮아지는 점으로부터 양 화합물이 태아의 발생에는 영향을 미칠 수 있음이 시사되었다. 한편 이들 화합물을 등줄쥐에게 장기간 노출시 등줄쥐의 번식에 영향을 미칠 가능성을 배제할 수 없으므로, 앞으로 장기간의 노출 시험을 통하여 이들 화합물이 번식에 미치는 영향을 규명하여야 할 것이다.

TBTCl과 BPA의 단기 투여는 농도에 상관없이 등줄쥐 성체 및 새끼(F1) 수컷의 생식소 중량지수나 생식소 조직에 영향을 미치지 않고 번식에 이상이 발생하지 않았으며, 15일 후 정세포의 첨체와 핵의 형태적 이상이 성 성숙 시기에 모두 정상으로 회복되었다. 그러나 성성숙 개시기부터 30일 동안 장기간 투여 했을 경우 생식소 중량지수가 뚜렷이 감소하고 정자형성과정에도 이상이 발생하였으며, 고농도로 투여시 유산율이 증가하고 태아의 수태율 및 생존율이 감소하였다. 따라서 태아의 발생에 영향을 미칠 가능성을 배제 할수 없으므로, 이들 화합물이 번식에 미치는 영향을 규명할 필요성이 있다.

서 론 내분비계장애물질로 알려져 있는 비스페늘 A (BPA)는 플라스틱인 폴리카보네이트와 에폭시 수지의 합성원료로서 캔용기의 코팅제와 치아의 보충제 등으로 사용되며, 고압과 열을 가하는 산업 공정 등에 의해 유출되어 식품 등을 오염시킨다고 알려져 있다. 또 다른 내분비계장애물질인 유기주석 화합물은 주로 선박이나 어망, 어구 등의 방오제 등에 사용되는데, 주로 해수 중에서 검출되며, 오염된 어패류 등을 통해 상위소비자에게까지 영향을 미치게 된다. 본 연구자들은 부산광역시 가덕도 대항동, 남해군 삼동면 및 산청군 지리산에서 1998년부터 2001년에 걸쳐 포획한 일부 등줄쥐에서 높은 농도의 페놀화합물(4-t-octylphenol, non-ylphenol 및 BPA)과 유기주석화합물(monobutyltin, MBT; di-butyltin, DBT; tributyltin, TBT)을 검출하였으며, 이들 등줄쥐의 대부분에서 생식소중량지수(GSI) 및 정소나 부정소 조직에 이상이 관찰된 점으로부터, 등줄쥐의 번식 이상이 페놀화합물이나 유기주석 화합물의 영향에 의한 것이라고 추론한 바 있다. 본 연구에서는 위 연구에서 검출된 화합물 중 TBTCl 및 BPA를 등줄쥐에 단기간 투여하여, 이들 화합물에 의한 단기 노출이 등줄쥐의 생식기관에 미치는 영향 및 다음 세대의 출생과 번식에 미치는 영향에 대해서 알아보고자 하였다. 재료 및 방법 등줄쥐 채집 번식 이상이 발생하지 않은 등줄쥐를 포획하기 위해서 주위에 생활 및 공업형 오염원이 없는 경기도 이천시 설성면의 농경지 부근을 포획장소로 선정하여, 등줄쥐 수컷 약 40개체를 등줄쥐의 번식기 동안 Sherman live trap으로 포획하여 이들의 생식소(정소 및 부정소)의 크기를 관찰한 결과 모두 정상적인 크기의 생식소(GSI \( 3.0 \) 이상)를 가지고 있었다. 따라서 위 장소에서 등줄쥐를 비번식기인 2002년 11월 2003년 2월에 걸쳐서 포획하여, 이 중 체중 \( 20 \mathrm { ~g } \) 이상의 성체 암·수 각각 31개체씩을 투여실험에 이용하였다. 등줄쥐는 포획 직후, 실험실로 옮겨와서 일주일간 순화시키고, 교미율을 높이기 위해 수컷 한 개체 당 각 수컷의 체중보다 약 \( 1 ^ {\sim } 2 \mathrm { ~g } \) 정도 가벼운 체중의 암컷을 선별하여, 투여 실험 직전까지 약 \( 1 ^ {\sim } 3 \)개월 동안 암·수 한 쌍씩 사육용 케이지에 넣어 실외에서 사육하였다. 사육용 사료와 물은 충분히 공급하였으며, 신선한 야채와 과일 등을 수시로 공급하여 스트레스를 최소화하였다. 야생 등줄쥐의 사육은 Oh와 Mori의 방법을 참고로 하였다. TBTCl과 Bisphenol A의 투여 본 연구에 사용된 TBTCl (tri-n-butyltin chloride)은 동경화성공업주식회사로부터 구입한 순도 \( 95 \% \)의 화합물이며, BPA는 Aldrich사에서 구입한 순도 \( 99 \% \)의 화합물로서, 이들을 corn oil (Sigma사)에 녹여 사용하였다. 시료 준비를 위해 사용한 모든 초자기구는 증류한 아세톤과 헥산으로 3회씩 세척한 후 완전히 건조시켜 사용하였다. 암·수 15쌍의 비번식기 등줄쥐를 5쌍씩 세 그룹 즉, TBTCl 300, 600 및 3,000 \(μg/kg/day \) 투여군으로 나누어 실험군별로 번식기 직전인 2003년 2월 말부터 7일간 해당 농도의 TBTCl을 대퇴부에 근육주사 하였다. 또 다른 암·수 12쌍의 등줄쥐를 암·수 4쌍씩 3 그룹, 즉 BPA 250, 500 및 5,000 \(μg/kg/day \) 투여군으로 나누어 2월 말부터 7일간 위와 같은 방법으로 주사하였다. 대조군 4쌍에게는 corn oil \( 10 \mathrm { ml } / \mathrm { kg } / \mathrm { day } \) 씩을 동일한 방법으로 주사하였다. 각 화합물의 투여 농도는 각 화합물의 대사율(TBTCl, [17,20]; BPA, [1]), 야생 등줄쥐에서의 검출된 양 및 여러 연구에서 실험용 흰쥐에 투여한 양을 근거로 설정하였다. 화합물의 투여가 끝난 2003년 3월부터 이들에게 사육용 사료와 물을 층분히 공급하면서 번식 활성기인 6월말까지 개월간 사육한 후, 수컷 등줄쥐(부모세대)의 생식소중량지수(GSI, gonadosomatic index, 체중에 대한 오른쪽 정소 및 부정소의 무게 비), 정소 및 부정소의 광학 및 전자현미경상, 각 화합물의 체내 잔류농도, 이들로부터 태어난 F1 세대들의 개체 수, 수컷 새끼들이 성체에 이르렀을 때의 생식소중량지수, 정소 및 부정소 조직의 광학 및 전자현미경상을 조사하였다. 모든 실험군와 대조군과의 유의차는 t-test를 사용하여 검정하였다.

본 연구자들은 1998년부터 2001년에 걸쳐 부산광역시 가덕도, 남해군 삼동면 및 산청군 지리산에서 포획한 등줄쥐들이 높은 농도의 페놀화합물(4-t-octylphenol, non-ylphenol 및 BPA)과 유기주석화합물(monobutyltin, MBT; di-butyltin, DBT; tributyltin, TBT)을 체내에 가지고 있다는 사실을 알게 되었다. 그래서 이 연구진들은 2002년 11월 2003년 2월에 걸쳐 번식 이상이 발생하지 않은 등줄쥐를 포획하여, TBTCl 및 BPA를 등줄쥐에 단기간 투여하여 단기 노출이 등줄쥐의 생식기관에 미치는 영향과 다음 세대의 출생과 번식에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

TBTCl 및 BPA의 잔류농도 측정 실험 종료 후 TBTCl 및 BPA를 투여한 실험군들로부터 조직학적 관찰을 위해 오른쪽 정소 및 부정소를 적출하고, 나머지 시료는 분석을 위하여 냉동 \( \left (-70 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)시켰다. 이후 분석을 위하여 모든 시료를 일본 에히메 대학의 환경과학연구소 (Laboratory of Environmental Science)로 보내어, 일본 환경성에 명기된 방법에 의하여 TBTCl 및 BPA의 잔류 농도를 분석하였다. 분석 조건 및 실험방법은 Table 1에 제시하였다. 각 시료를 균질화 하여, 이 중 \( 3 ^ {\sim } 5 \) (습중량)의 시료를 취한 후, 각각 검출하고자 하는 화합물질에 대한 적절한 유기용매를 사용하여 화합물을 추출하고, florisil-column으로 세정한 후, 가스크로마토그래피(6890 GC, 5973MSD; Agilent Technologies)를 이용하여 분석하였다. 검출한계는 \( 0.1 ^ {\sim } 6 \) \( \mathrm { ng } / \mathrm { g } \) 이었으며, 회수율은 \( 67 ^ {\sim } 108 \% \)였다. 조직학적 관찰 등줄쥐로부터 적출한 오른쪽 정소 및 부정소를 \( 1 \mathrm { ~mm } ^ { 3 } \)의 크기로 세절하여 \( 2 \% \) paraformaldehyde와 \( 2.5 \% \) gluta-raldehyde의 혼합고정액 \( ( \mathrm { pH } \) 7.4)에서 24시간 전고정한 후, \( 1.3 \% \mathrm { OsO } _ { 4 } \) 로 1시간 30 분 동안 후고정하였다. 이후 알골 탈수와 아세톤 치환과정을 거쳐 epon 812혼합액으로 포매 중합하였다. 초미세 박절기(LKB2088)로 \( 10 \mu \mathrm { m } \) 정도의 두께로 자른 후 \( 0.5 \% \) toluidine blue로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였고, \( 60 \sim 90 \mathrm { ~nm } \)의 두께로 잘라 uranyl acetate와 lead citrate로 이중 염색하여 투과전자현미경(JEOL100s)으로 관찰하였다. 결 과 TBTCl과 BPA의 단기투여가 체중에 미치는 영향을 알아보기 위하여 투여 개시부터 실험 종료까지 약 4개월간의 체중의 증가량을 비교한 결과 암수 모두 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다(Table 2). TBTCl과 BPA 투여실험 종료 후 유기주석 화합물(MBT, DBT 및 TBT)과 BPA의 수컷 체내 잔류 농도는 TBTCl \(300 \mu \mathrm { g } / \) \( \mathrm { kg } / \mathrm { day } \) 투여군에서 TBT가 대조군에 비해 높은 농도로 검출되었으나, 나머지 실험군에서는 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았고(Table 3), 생식소중량지수(GSI)는 모든 실험군에서 평균 \( 3.0 \% \) 이상 \( (3.00 \sim 3.46 \% \))으로써, 대조군 \((3.21 \%) \)과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 수컷의 정소 내 생식세포들은 정상적인 정자형성과정을 나타내고 있었고, 지지세포의 핵, 세포막 등도 대조군과의 사이에서 차이점을 나타내지 않았다(Fig.1). 또한, 부정소 내의 정자의 첨체, 미토콘드리아 및 세포막 등의 미세구조에서도 이상은 발견되지 않았다. 암컷의 임신비율은 양 화합물 투여군 모두 대조군보다 약간 낮은 비율을 나타내었으나 유의적인 차이는 없었다(Table 4). 즉 대조군의 경우 암컷 4개체 중 1개체(CON-2)가 1회 임신에 성공하였으나(평균 임신율 \( 25 \% \), TBTCl 투여군에서는 \( 300 \mu \) \( \mathrm { g } / \mathrm { kg } / \mathrm { day } \) 투여군 암컷 5개체(T300-1~5) 중 2개체(T300-2, -4)와 \(3,000 μg/kg/day \) 투여군 암컷 5개체(T3000-1~5) 중 1개체 (T3000-2)가 각각 2회씩의 임신에 성공하였고 \( (0 \sim 40 \% \), 평균 임신율 \( 20 \% \)), BPA \( 500 \mu \) \( \mathrm { g } / \mathrm { kg } / \mathrm { day } \) 투여군 암컷 4개체(B500-1~4) 중에서는 각각 1개체씩(B500-4, B5000-3)이 임신에 성공하여 이들의 임신율 \( (0 \sim 25 \% \), 평균 \(17 \%) \)은 대조군보다 약간 낮았다. 한편 출산율 및 새끼(F1)의 생존율은 양 화합물 투여군 모두 대조군보다 현저히 낮았고, 특히 BPA투여군의 생존율 \( \left (0 ^ {\sim } 67 \% \right . \), 평균 \(17 \% \)은 TBTCl 투여군의 생존율 \(67 \sim100 \% \), 평균 \(87 \% \)에 비해 현저히 낮았다. 즉 TBTCl 투여군의 경우, \( 300 \mu \mathrm { g } / \mathrm { kg } / \mathrm { day } \) 투여군 중 임신한 T300-2개체는 2회에 걸쳐 7개체의 새끼를 낳아 모두 살아 남았고, T300-4 개체의 경우도 2회에 걸쳐 7개체의 새끼를 낳았으나, 한 마리가 어미에게 먹혀 6개체가 살아남았다. TBTCl \( 3,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { kg } / \mathrm { day } \) 투여군 중 T3000-2 개체의 경우 첫 회 태어난 6개체와 두 번째 태어난 3개체 중 각각 1개체씩이 죽어 어미에게 먹혔고 7개체만이 생존했다. BPA 투여군 중 \( 250 \mu \mathrm { g } / \mathrm { kg } / \mathrm { day } \)를 투여한 4개체는 모두 임신에 실패했고, \( 500 \mu \mathrm { g } / \mathrm { kg } / \mathrm { day } \)를 투여한 B500-4 개체는 임신에는 성공했지만 출산에 실패하였고(14개의 자궁 내 배아 확인), \( 5,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { kg } / \mathrm { day } \)를 투여한 B5000-3개체의 경우는 첫 회 출산 시 태어난 6개체 중 2개체가 출산 즉시 죽어 4개체가 생존했고, 두 번째 수태된 개체들은 모두 유산되어(4개의 자궁 내 배아 확인), 새끼의 생존율이 TBTCl 투여군보다 더 낮았다. 한편, 수컷 새끼들이 성 성숙한 후 측정한 생식소중량지수는 \(3.34 \sim4.44 \% \)( \( \mathrm { N } = 16) \)로써 대조군에서 태어난 수컷 새끼의 생식소중량지수 \( (3.16 \%, 2.93 \%, \mathrm { ~N } =2) \)와 유의적인 차이를 나타내지 않았다(Table 4). 더욱이 F1세대 수컷 생식소의 광학 및 전자현미경상도 투여군과 대조군 사이에 차이가 보이지 않았다.

TBTCl 및 BPA의 잔류농도는 균질화한 시료로부터 적절한 유기용매를 사용하여 화합물을 추출하고, florisil-column으로 세정한 후 가스크로마토그래피로 분석하여 검출한계는 \(0.1 ^ {\sim } 6 \) \( \mathrm { ng } / \mathrm { g } \)였고 회수율은 \( 67 ^ {\sim } 108 \% \)였다. 조직학적 관찰을 위해 오른쪽 정소 및 부정소는 paraformaldehyde와 gluta-raldehyde의 혼합고정액에 24시간 전고정하고, 1.3% OsO4로 1시간 30분 동안 후고정하여 epon 812혼합액으로 포매 중합하여 광학현미경과 투과전자현미경으로 관찰하였다. TBTCl과 BPA의 단기투여가 체중에 미치는 영향을 알아보기 위해 4개월간 관찰한 결과 유의적 차이가 없었다.

생육억제활성올 보이는 점액세균 균주 선발 점액세균을 PDCY 배지 상에서 4일간 배양한 후, 아생균주를 멸균된 주걱으로 긁어 제거하였다. 그리고 점액세균이 제거된 배지의 중앙에 C. acutatum 균사체를 갖는 한천조각을 올려놓고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 7일 동안 배양한 후, C.acutatum의 집락의 크기를 관찰함으로써 성장이 억제되는 정도를 측정하였다. 배양추출물의 제조 및 활성조사 Amberlite XAD-16(Sigma, USA) \( 5 \mathrm{~g} \) 이 들어있는 \(250 \mathrm{mL} \) CTS 배지에서 점액세균을 5 일간 배양한 후, resin을 회수하여 흡착된 물질들을 100% methanol \( 25 \mathrm{~mL} \)로 추출하였으며, 추출한 용액은 건조한 후 다시 100% methanol \(100 \mu \mathrm{L} \)에 녹였다. 활성조사는 추출물 \( 12 \mu \mathrm{L} \)를 흡수시킨 \( 6 \mathrm{~mm} \) paper disc를 건조시킨 후 \( 1 \times 10^{6} \)개의 C. acutatum 포자가 도말된 PDA 배지 중앙에 올려놓고 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 3~5일간 배양하면서 성장이 억제되는 정도를 측정하였다. 점액세균의 분리 동정 분리 탐색된 야생 점액세균들은 이미 알려진 방법 및 기준에 따라 세포, 포자, 자실체, 집락의 형태 및 색, 색소의 생성 여부, 영양 및 16S rRNA 염기서열 비교에 의해 동정 하였다. 16S rRNA 유전자의 대부분 \( (1,530 \mathrm{bp}) \)을 포함한 DNA 조각은 점액세균으로부터 분리한 유전체 DNA를 주형으로 하고, 두개의 oligonucleotides, 5'-GAGTTT-GATCCTGGCTGAG-3'(27f)과 5'-AGAAAGGAGGTG-ATCCAGCC-3'(1525r)률 primer로 사용하여, Taq poly-merase(SolGent Co., Korea)로 증폭한 DNA 중합효소연쇄반 응(PCR)을 통해 얻어졌다. 얻어진 PCR 조각은 PCR purification kit(Bioneer Co., Korea)를 사용하여 분리한 후, PCR에서 사용된 두 primer 및 다음 primer들을 사용하여 염기서열을 결정하였다. 5'-CTGCTGCCTCCCGTA-3'(343r), 5'-TACGGGAGGCAGCAG-3'(357f), 5'-GWATTA-CCGCGGCKGCTG-3'(519r), 5'-CAGCMGCCGCGGTAA-TWC-3'(536f), 5'-ATTAGATACCCTGGTAG-3'(803f), 5'-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3'(907r), 5'-GCAACGAGC-GCAACCC-3'(1114f), 5'-CGGTGTGTRCAAGGCCC-3'(1385r). 그리고, 얻어진 염기서열은 NCBI의 Genbank에 등록하였으며, 각 균주들의 accession number는 EU 262648 (KYC1013), EU271853 (KYC1101), EU262649 (KYC1105), EU262650 (KYC1126), EU262651 (KYC1136), EU262652 (KYC1154), EU262653 (KYC1183), EU262654 (KYC1190), EU262655 (KYC1198), EU262656 (KYC1200) 이다. 염기서열은 Clustal W와 미국 NCB의 BLASTN 프로그램을 이용하여 분석하였다. 세포 및 자실체의 관찰 영양세포 및 집락의 관찰은 야생 점액세균을 PDCY 평판 배지에 접종 한 후, \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 4일 동안 배양한 후 이루어졌으며, 자실체와 포자의 관찰은 Escherichia coli MC4100이 도말된 WCX 평판배지에 야생점액세균을 접종한 뒤, \( 32^{\circ} \mathrm{C} \) 배양기에서 5 일간 배양하여 자실체 형성을 유도한 후 이루어졌다. 자실체 및 집락의 관찰은 Nikon SMZ1000 실체현미경(Nikon Co., Japan)을 사용하였으며, 세포와 포자의 관찰은 Nikon Eclipse E 600 위상차현미경 (Nikon Co., Japan)을 사용하였다.

본 논문은 점액세균을 배지에서 4일 동안 배양하고 아생균주를 제거해 점액세균 균주를 선발해 실험을 준비하였다. 활성조사는 추출물을 흡수시키고 건조한 \( 6\mathrm{~mm} \) paper disc를 C. acutatum 포자가 도말된 PDA 배지에서 배양해 성장이 억제되는 정도를 측정했으며, 분리 탐색된 야생 점액세균들의 경우 세포, 포자, 자실체, 집락의 형태 및 색, 색소의 생성 여부, 영양 및 16S rRNA 염기서열 비교에 의해 동정한 후 현미경을 사용해 자실체 집락과 세포, 포자를 관찰하였다.

점액세균 배양추출물의 고추탄저균의 성장 저해 활성 고추탄저균에 대해 성장 저해 활성을 보이는 10개 균주들이 항진균물질을 생산 분비함으로써 고추탄저균의 성장을 저해할 가능성이 높으므로 10개 점액세균들의 배양액 중 Amberlite XAD-16 resin에 홉착했다가 methanol에 의해 추출되는 배양추출물이 고추탄저균의 성장을 저해하는 활성을 보이는지 조사하였다. 그 결과 Fig. 4에서 보인 바와 같이, Myxococcus sp. \( \mathrm{KYC1136} \)의 배양추출물이 C. acutatum \( \mathrm{ACYSJ} 001 \)의 성장을 강하게 저해하는 활성을 보였으며, Myxococcus spp. KYC \( 1101, \mathrm{KYC} 1126, \mathrm{KYC} 1183 \)의 배양 추출물들도 다른 균주들에 비해 강하게 C. acutatum ACYSJ001의 성장을 저해하는 활성을 보였다(Table 2). C. acutatum ACYSJO01은 충청남도 청양군의 한 면에서 분리된 균주인데, 배양추출물들이 충남 청양군 및 아산시의 다른 고추 포장에서 분리한 균주들에 대해서도 동일한 저해활성을 보이는지 조사하여 보았다. 그 결과, C. acutatum ACYSJ001에 대해 저해활성을 보인 점액세균 균주들은 다른 C. acutatum 균주들인 ASM001, ACYJJ001, ACYTJ001, 그리고 ACYYD001에 대해서도 동일한 양상의 저해활성을 보이는 것으로 나타났다(Table 2). 이는 전체 균주 중 최소한 4균주가 항진균물질을 생산 분비함으로써 고추탄저균의 성장을 저해함을 보여주는 결과로 실험에 사용한 93 균주의 4.3%에 해당하며, Myxococcus 속 균주의 6.8%에 해당한다. 한편, PDCY 한천배지 상에서 강한 활성을 보였던 10 균주 중 KYC1013, KYC1190, KYC1200의 배양추출물들은 약한 저해활성을 보였으며, KYC1105, KYC1154, KYC1198의 배양추출물들은 전혀 저해활성을 보이지 않았다. 이러한 차이에 대해 가능한 첫째 설명으로는 먼저 배지성분과 배양조건의 차이를 들 수 있겠다. 즉, 최초 성장억제활성을 갖는 점액세균의 선별에 사용한 PDCY 한천배지는 고체배지인 반면, 배양추출물 제조에 사용한 CTS 배지는 조성이 전혀 다른 액체배지이다. 따라서 균주에 따라 PDCY 한천배지에서는 저해활성성분을 생산하지만 CTS 액체배지에서는 저해활성성분을 생산하지 않을 가능성이 있다. 또 다른 가능성은 배양추출물 제조 방식으로 인한 차이이다. 본 실험에서는 배양액 내 활성성분을 Amberlite XAD-16 resin에 흡착시켰다가 methanol에 의해 추출하는 방식으로 배양추출물을 제조하였는데, 이 경우 점액세균이 저해활성성분을 생산하였어도 저해활성성분이 resin에 흡착하지 않는 특성의 물질이거나 흡착하였어도 methanol에 의한 추출되지 않는 물질이라 면 이로부터 얻어진 배양추출물은 저해활성이 전혀 없는 것으로. 나타나게 된다. 따라서 이러한 점들을 고려할 때, Table 2에서와 같이 균주들에 따라 저해활성이 약하거나 전혀 없는 것으로 나타났어도 최초에 선별된 10 균주들은 모두 C. acutatum의 생육을 저해하는 활성을 가지고 있는 것으로 판단되며, 다만 저해활성성분의 생산조전이 다르거나 특성이 다를 것으로. 사료된다. 점액세균은 토양미생물로 유기물이 존재하는 대부분의 토양에 많이 존재하며 현재까지 전혀 인체에 해가 없는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구를 통해 얻어진 결과들은 점액세균에 의한 고추탄저병 방제의 가능성을 제시하며, 향후더 효율적인 고추탄저균 성장 억제 점액세균 균주 탐색의 방향을 제시한다. 이에 더해, 이들이 또한 점액세균이 새로운 항진규물질 탐색을 위한 좋은 생물연구소재임을 보여준다.

우리는 점액세균을 배양하여 추출물을 만들었다. 그러나, 만약 추출물에 흡착되지 않거나 메탄올에 의해 추출되지 않는 특성의 물질이 저해 활성 성분으로 생산되었다면, 얻어진 배양추출물은 저해 활성을 가지지 않을 것이다. 점액세균은 토양 미생물로 유기물이 있는 대부분의 토양에 널리 분포하며, 인체에 해로운 영향이 없다고 알려져 있다. 따라서, 본 논문에서는 점액세균을 사용하여 고추 탄저병 방제의 가능성을 탐구하였으며, 앞으로 효율적인 고추 탄저균 성장 억제를 위한 점액세균 균주의 탐색 방향을 제안하였다.

서 론 고추탄저병(pepper anthracnose)은 우리나라에서 경제 작물인 고추(Capsicum annum) 재배 시에 과실에 발쟁하는 주요 병해로 고추역병과 함께 경제적으로 큰 피해를 주고 있다[8]. 병원균은 Collectotrichum gloesporioides, C. acutatum, C. dematium, C. coccodes 등이 보고되어 있으며, 2000년 이후 우리나라 고추 포장에서 분리된 탄저균주의 약 90% 이상은 C. acutatum에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 고추탄저병의 방제는 저항성 품종 재배, 이병 식물 제거 등의 경종적인 방법과 살균제에 의한 화학적 방제가 주로 사용되고 있으며, 최근에는 미생물 농약 및 천연물 농약 등과 같은 생물학적 방제에 관한 연구도 이루어지고 있다. 이중, 방선균, Bacillus 등과 같은 미생물들은 병원균에 활성을 나타내는 항균물질을 생산해서 병원균을 직접 죽이거나 생육을 억제하는 길항미생물로써, 미생물농약으로서의 실용화 가능성에 대한 여러 연구가 이루어지고 있다. 점액세균(myxobacteria)은 우리 주변의 모든 토양에서 많은 수로 서식하고 있는 그람음성 토양세균으로, 다양한 항생물질과 가수분해 효소 등을 분비함으로써 주위의 다른 미생물을 분해하여 먹이로 섭취한다. 이에 더해, 점액세균은 인체에 무해한 비병원성 미생물로 방선균 및 Bacillus와 마찬가지로 토양에 존재하여 식물에 병을 일으키는 여러 식물병원성 곰팡이의 생육억제제로 사용될 수 있는 이상적인 조건을 갖추고 있다. 하지만 전 세계적으로 이 분야에 대한 연구가 활발하지 않은 까닭에 점액세균을 이용한 식물병원성 곰팡이의 생육억제제의 개발은 최근까지 극히 미미하다, 따라서 본 연구에서는 고추탄저병의 생물학적 방제제 개발에 사용될 수 있는 미생물을 선발하고자 고추탄저병을 유발하는 곰팡이 C. acutatum에 생육억제 활성을 보이는 점액세균 균주를 선발하고 그 툭성을 조사하고자 하였다. 재료 및 방법 사용 균주 본 연구에 사용된 점액세균들은 \( 21 \mathrm { C } \) 프론티어 미생물유전체활용기술개발사업을 통해서 분리되었으며, 국가지정연구소재은행의 하나인 점액세균은행을 통해서 관리되고 있는 균주들이다. 그리고 \( C \). acutatum ACYSJ001는 충남 청양의 고추탄저병이 발병한 밭에서 분리, rDNA ITS(internal transcribed sequence)로 동정한 균주이다. 사용 배지 및 배양 조건 야생 점액세균의 배양에는 PDCY 평판배지를 사용하였으며, C. acutatum의 배양에는 PDA(potato dextrose agar)배지를 사용하였다. PDCY 배지는 리터당 casitone \( 5 \mathrm { ~g } \), yeast extract \( 1 \mathrm { ~g } , \mathrm { CaCl } _ { 2 } 1 \mathrm { ~g } \), potato dextrose \( 2.4 \mathrm { ~g } \), agar \( 15 \mathrm { ~g } \)을 함유하고 있으며, PDA 배지는 리터당 potato dextrose \( 24 \mathrm { ~g } \), agar \( 15 \mathrm { ~g } \)을 함유하고 있다. 점액세균에 의한 자실체 형성 유도에는 \( 10 \mathrm { mM } \) 3-[N-morpholino] propanesulfonic acid (MOPS, pH 7.6), \( 0.1 \% \mathrm { CaCl } _ { 2 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } , 1.5 \% \) 한천을 함유하고 있는 \( \mathrm { WCX } \) 배지를 사용하였다. 그리고 CTS 배지는 리터당 casitone \( 5 \mathrm { ~g } , \mathrm { MgSO } _ { 4 } \cdot 7 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 2 \mathrm { ~g } , 1 \mathrm { M } \) 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES, \( \mathrm { pH } 7.6) 50 \mathrm { ml } \), 콩기름 \( 300 \mu \mathrm { L } \), 미량원소용액 \( 200 \mu \mathrm { L } \)을 함유하고 있으며, 이 때 미량원소용액은 리터당 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } 10 \mathrm { ml } , \mathrm { FeCl } _ { 3 } \cdot 6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 14.6 \mathrm { ~g } , \mathrm { ZnCl } _ { 3 } 2.0 \mathrm { ~g } , \mathrm { MnCl } _ { 2 } \cdot 4 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 1.0 g \), \( \mathrm { CuCl } _ { 2 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 0.43 \mathrm { ~g } , \mathrm { H } _ { 3 } \mathrm { BO } _ { 3 } 0.31 \mathrm { ~g } , \mathrm { CaCl } _ { 2 } \cdot 6 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 0.24 \mathrm { g } , \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { MO } _ { 4 } \cdot 2 \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } 0.24 \mathrm { ~g } \)을 함유하고 있다. 한편, 야생 점액세균만을 배양할 때는 \( 32 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였으며, C. acutatum을 배양하거나, 점액세균을 C. acutatum와 함께 배양할 때는 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. PDA 배지, casitone, yeast extract, potato dextrose, agar 등은 미국 Difco Lab.에서 구입하였고, HEPES는 미국 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. 그리고 다른 시약들은 일본 Kanto Chemical Co.에서 제조된 것을 사용하였다.

우리나라의 주요 농작물인 고추를 공격하는 고추탄저병은 경제적 손실을 유발하는 주요 병해로, 방제법으로는 저항성 품종 재배, 이병 식물 제거, 살균제 사용 등 다양한 방법이 있다. 또한, 생물학적 방제를 위한 연구도 활발히 진행 중이다. 본 연구에서는 고추탄저병을 유발하는 곰팡이인 C. acutatum의 생장을 억제하는 점액세균 균주를 선발하여 생물학적 방제제 개발에 활용하고자 하였다. 야생 점액세균의 배양은 PDCY 평판배지와 \( 32 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 온도를, C. acutatum의 배양은 PDA배지와 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 온도를 이용하였다.

고 찰어류 양식 산업에서의 질병발생은 세계적으로, 지리적으로도 많은 차이를 나타내고 있으며 항생제 사용에 따른 비용이나 관리 등이 매우 심각한 현실이다. 이미 백신이 개발되고 상용화 되고 있으나 모든 어류의 질병을 통제하지는 못한다. 더구나 치어의 경우 만족할만한 면역효과를 얻을 수 없을 뿐만 아니라 반드시 백신에 반응한다고도 할 수 없는 실정이다. 지속적인 항생물질이나 화학요법제의 경우 그 방법의 선택이 중요하며 주사에 의한 백신은 대량 사육 어류나 작은 어류의 경우 비실용적이라는 점이 지적되었으며 항생제 다량 사용이 내성균을 생성하게 되어 그 심각성은 인체에까지도 전이 된다는 점이다. Gram은 항생제 내성 미생물의 증가에 따른 문제점을 해결할 수 있는 방법으로 pro-biotic biocontrol agent로서 비병원성 세균, 이를테면 유산균을 사용하는 방법이라든지 Pseudomonas등을 이용하여 어병균에 길항 작용을 하는 미생물을 사용하여 어병균을 제어하자는 대안을 제시하였다. 또한, 이러한 목적을 달성하기 위하여 fish probiotic bacteria 를 탐색하는데 관심을 높이게 만들었다.Vibrio anguillarum 은 세계적으로 자연산이나 양식 어류의 패혈을 일으키는 주요 어병균이다. 따라서 이를 구제하기 위한 다각적인 시도도 이루어지고 있는 실정이다. 최근에는 육지 양식어류 질병을 자외선을 이용하여 물고기의 질병을 일으키는 기생충과, 곰팡이, 세균, 바이러스 등을 죽이는데 상당한 효과를 본 것으로 보고되었으며 오존을 이용한 살균소독법도 이용 가능하다.본 과정에서는 환경 친화적인 방법개발의 하나로 해양 미생물 군집 중에서 어병 균의 길항작용을 하는 미생물을 찾고자 시도한 결과 여러 종의 미생물군집들 중에서 한 종류만을 찾을 수 있었다. 이미 살아있는 어류의 여러 부위에 많은 종류의 미생물이 분포되고 있음이 입증되었으므로 본 과정에서도 여러 종류의 해산어를 대상으로 아가미, 장, 표피 등에서 분리를 시도한 결과 방어의 장내에서 추출된 가검물의 배양과정에서 B. amyloliquefaciens H41를 분리할 수 있었는데 분리에 사용한 어류는 자연산이었다. 이 분리 균만이 V. anguillarum의 생육에 영향을 미치는 것을 확인 할 수 있었는데 이러한 성과로 볼 때 자연산 어류의 부착세균 군집 중에서 어병 균의 biocontrol에 이용할 수 있는 균주의 탐색이 가능할 것으로 보였다.본 과정에서 저해능에 대한 감수성 비교를 위하여 분리균과 표준균주를 동시에 시험한 결과 분리균주는 V. anguillarum NCMB1에 저해능을 나타내었으나 B. amyloliquefaciens KCTC1724 균주는 저해능을 나타내지 않아 균마다 감수성에 대한 차이를 볼 수 있었으며 이 결과는 앞으로도 다양한 균종의 분리를 요구하는 부분이기도 하다.Westerdahl은 어류의 여러 부위를 달리하여 어병균 억제 균의 분포를 관찰하였는데 어류의 위, 위 유문부, 십이지장, 공장, 직장 등에 분포된 균총 중에서 저해 균들의 분리를 보고하였는데 각각의 부위에서는 분리된 균수가 달랐으며 특히 십이지장에서 많은 균의 분리 결과를 발표하였다. 이 같은 보고를 볼 때 어류의 장이 어병균 생육 억제 균의 분리에 도움이 될 것으로 판단되어졌으나 본 과정에서는 내장의 부위를 구분하지 않아 정확하게 어떤 부위라고 판단 할 수는 없었다. 앞으로는 부위별로 분리를 시도하면 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대되며 다양한 어종을 대상으로 분리를 시도하면 다른 어병 균에 저해를 나타내는 균의 분리도 가능 할 것으로 생각되었다.해양 세균 중에는 여러 균이 있으나 본 과정에서는 병원성이 알려져 있는 대표적인 균에만 저해능을 검토하였으나 다양한 해양 균들을 대상으로 시험해 볼 필요가 있는 것으로 사료되며 이미 보고 된 자료에서 해양 미생물들 간의 길항사례를 제시하였으며 특히 본 균이 어류의 장에서 분리되었으므로 양식 어류의 여러 병원체의 biocontrol 면에서 지속적인 균의 분리를 시도한다면 의외로 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 판단된다. Gram 등이 해산어의 정상 균총 중에서 길항작용을 하는 biocontrol 목적을 위한 가능성을 제시하였으며 본 과정에서도 시판중인 해산어를 중심으로 분리를 시도한 결과 본 분리균을 분리 할 수 있었는데 지속적인 분리를 통하여 다양한 균종의 분리를 시도해 볼 필요가 있다고 사료된다. 앞으로 본 균에 의한 생육저해 물질을 정제 과정 등을 통하여 물리화학적 성상 및 특성 등을 밝혀 볼 예정으로 이는 다음 과정에서 밝힐 예정이다.

항생제 내성 미생물의 증가에 따라 probiotic biocontrol agent로서 비병원성 세균(유산균, Pseudomonas 등) 을 이용하여 어병균에 길항 작용을 하는 미생물을 사용하여 어병균을 제어하자는 대안을 제시하였고, 본 연구에서는 fish probiotic bacteria를 탐색하고자 하였고, 환경 친화적인 방법개발의 하나로 해양 미생물 군집 중에서 어병 균의 길항작용을 하는 미생물을 찾고자 시도한 결과 여러 종의 미생물군집들 중에서 한 종류만을 찾을 수 있었다. 여러 종의 해산어를 대상으로 아가미, 장, 표피 등에서 분리한 결과, 방어의 장내에서 추출된 B. amyloliquefaciens H41이 V. anguillarum NCMB1에 저해능을 나타내었으나 다른 균주인 B. amyloliquefaciens KCTC1724는 저해능이 나타내지 않아 균마다 감수성이 다르다. 이에 본 연구에서는 병원성이 있는 대표적인 균에만 저해능을 검토하였으나 다양한 해양 균들을 대상으로 시험해 볼 필요가 있음을 확인했다.

결 과균 분리해산어의 여러 부위의 장, 피부, 아가미에서 다종의 균을 분리하여 VNSS 액체배지에서 1차로 20여종의 균을 분리한 결과 방어에서 분리된 균이 nutrient 한천 배지 상에서 V. anguilla-rum NCMB1에 대해 투명환이 생성되어 저해능력을 가지고 있다고 판단되어 이를 동정하기 위하여 미생물 자동 동정 분석기로 동정한 결과 \( 95\% \) 이상의 높은 유사값으로 Bacillus amyloli-quefaciens로 확인되어 B. amyloliquefaciens H41으로 명명하고 표준균주인 B. amyloliquefaciens KCTC1724와 특성을 비교한 후 사용하였다.저해물질 생성 확인분리 균주인 B. amyloliquefaciens H41과 표준균주인 B. amyloliquefaciens KCTC1724 균주를 paper-disk 법을 사용하여 투명환의 생성여부로 V. anguillarum 생육 저해능의 유무를 비교한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 분리 균주인 B. amyloliquefaciens H41에서 만이 투명환을 나타내어 저해능이 있는 것을 관찰할 수 있었다. 이 과정에서 배양 상등액에서는 투명환이 확인되었으나 파쇄한 균체 액에서는 확인할 수 없어 이후 배양 상등액 만을 사용하였다.다른 Vibrio spp.에 대한 저해 능B. amyloliquefaciens H41의 다른 Vibrio spp.에 대한 저해능 비교에서는 병원균으로 알려진 V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. furnissi, V. mimicus, V. vulnificus 등을 대상으로 저해능을 실험해본 결과 V. anguillarum NCMB1에만 저해 능을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다.생육 저해물질 생산에 영향을 미치는 인자균의 증식용으로는 peptone 배지를 기본배지로 하고 저해 물질의 생산에 영향을 미치는 인자로 다음과 같은 조성을 적용하였다.초기 \( \mathrm{pH}\), \(\mathrm{NaCl} \) 농도기본배지에 \( \mathrm{pH} \)를 각각 달리하여 저해 군의 특성을 비교한 결과 Fig. 2에서 나타난 바와 같이 \( \mathrm{pH} 7.5 \)에서 가장 높은 생육을 나타내었으며 생육저해물질의 활성을 측정해 본 결과, \( \mathrm{pH} 7.5 \)에서 가장 활성이 좋은 것으로 나타나 생육저해물질 생산을 위해 이후의 과정에서는 이 범위를 적용하였다.B. amyloliquefaciens H41의 생육도 및 생육저해 물질의 생산에 \( \mathrm{NaCl} \)이 영향을 미칠 것으로 판단되어 \( \mathrm{pH} 7.5 \)로 조정한 기본 배지에 \( \mathrm{NaCl} \)의 농도를 각기 달리하여 배양한 후 생육저해 균의 생육도와 생육저해물질 생산 정도를 측정하였다. Fig, 3에서 보는 바와 같이 \( 0.5 \% \mathrm{~NaCl} \) 농도일 때 저해균의 생육이 가장 높았고 \( \mathrm{NaCl} \)의 농도가 \( 1 \% \)일 때 생육저해물질의 활성이 가장 높았다. 초기 \( \mathrm{pH} \) 결과와 마찬가지로 B. amyloli-quefaciens H41 의 생육과 생육저해물질 생산조건도 큰 차이가 나타냄을 보여주었다.탄소원, 질소원기본 배지조성에서 각종 탄소원을 \( 1 \% \)씩 배지에 첨가하여 배양한 결과 Fig. 4에서 보는 것과 같이 균의 증식은 모든 탄소원의 첨가에서 비교적 다른 양상을 나타내었는데 생육과 생육저해물질 생산 모두에서 sucrose가 높은 활성을 나타내어 생육저해물질의 생산을 위한 최적 탄소원은 sucrose로 결정하였다. 따라서 sucrose를 각각의 농도별로 조절하여 배양한 결과 Fig. 5에서 나타난 바와 같이 \( 1 \% \)에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 탄소원인 sucrose를 \( 1 \% \) 포함한 기본배지에 다양한 질소원을 첨가하여 균의 생육도와 생육저해물질의 생산을 비교한 결과 Fig. 6에서 보는 바와 같이 yeast ex-tract의 첨가에서 균의 생육도 및 생육저해물질의 활성이 높게 나타나 기본 배지 외에 \( 1.5 \% \)의 yeast extract를 첨가 사용하였다.배양온도배양온도에 따른 균의 생육도는 \( 28-35^{\circ} \mathrm{C} \)으로 나타났으며 생육저해물질의 생산 온도는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)임을 Fig. 7에서 알 수 있다. 따라서 이후의 실험과정에서는 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)를 적용하였다.금속이온위에서의 최적조건으로 조절한 기본배지에 여러 가지 금속이온을 \( 0.05 \% \) 농도별로 첨가하여 배양한 결과 Fig. 8에서 나타난 바와 같이 \( \mathrm{Mg}^{+2}\), \(\mathrm{Ca}^{+2} \)를 함유하는 배지에서 활성이 나타났고 그 중에서 \( \mathrm{Mg}^{+2} \)을 함유하는 배지에서 가장 높은 활성을 나타내었다. \( \mathrm{Co}^{+2}\), \(\mathrm{Fe}^{+2}\), \(\mathrm{Hg}^{+2}\), \(\mathrm{Zn}^{+2}\), \(\mathrm{Ag}^{+2} \) 을 함유하는 배지에서는 오히려 활성이 떨어지는 것으로 나타나 이 같은 금속이온은 생육저해물질의 생산을 방해하는 것으로 나타났다. \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 \( 0.05 \% \) 단위로 조절하여 배양한 결과 \( 0.05 \% \)의 농도에서 가장 높은 활성을 얻을 수 있었다.생육도 및 생육저해물질 최고생성시간이상의 조건들을 검토하여 분리 균의 생육도 및 생육저해 물질의 생산을 위한 최적 배양 조건은 생육은 \( 1.0 \% \)의 pep-tone의 기본배지에 \( 0.5 \% \mathrm{~NaCl}\), \(1.0 \% \) sucrose, \( 1.5 \% \) yeast ex-tract, \( 0.05 \% \mathrm{~MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}\), \(\mathrm{pH} 7.0-8.0 \), 배양시간은 20시간 대였으며 온도는 \( 28-35^{\circ} \mathrm{C} \)이었음을 알 수 있었으며 생육저해 물질의 생산 최적 조건은 기본배지에 \( 1.0 \% \)의 \( \mathrm{NaCl}\), \(1.0 \% \)의 sucrose, \( 1.5 \% \)의 yeast extract, \( 0.05 \% \)의 \( \mathrm{MgSO}_{4} \cdot 7 \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \)를 첨가하여 초기배양 \( \mathrm{pH} \)를 7.5로 조절하여 \( 35^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 140 \mathrm{rpm} \)으로 진탕 배양하였을 때 Fig. 9에서 보는 바와 같이 16시간대에서 생육 저해물질의 활성이 가장 높은 것으로 나타났으며 36시간이 넘어가면서 활성이 점차 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다.

본 논문에서는 균 분리, 다른 Vibrio spp.에 대한 저해 능, 생육 저해물질 생산에 영향을 미치는 인자, 생육도 및 생육저해물질 최고생성시간 등에 대한 연구를 진행하였다. 최적조건으로 조절한 기본배지에 여러 가지 금속이온을 \( 0.05 \% \) 농도별로 첨가하여 배양한 결과 \( \mathrm{Mg}^{+2}\), \(\mathrm{Ca}^{+2} \)를 함유하는 배지에서 활성이 나타났다. 그 중에서 \( \mathrm{Mg}^{+2} \)을 함유하는 배지에서 가장 높은 활성을 나타내었다는 결과를 확인할 수 있었다.

재료 및 방법균 분리V. anguillarum의 생육 저해균주를 분리하기 위하여 해산어를 대상으로 장의 여러 부위, 지느러미, 어체 표면 등에서 다양한 가검물을 회수하여 NSS buffer와 VNSS broth로 균을 1차 배양하고, VNSS agar에 paper-disk 방법을 사용하여 V. anguillarum을 저해하는 균주를 다시 선별하였다. 저해를 나타내는 1종의 균주를 선별하여 생화학적 특성을 파악하여 1차 동정을 행한 뒤 정확한 확인을 위해 미생물 자동 동정분석기로(E-10136, Biolog Microstation, Biolog, USA)분석하였다. 분리균의 생화학적 성상은 표준 균주인 Bacillus amyloliquefaciens KCTC1724 균주를 사용하여 비교하였고 생육 저해 대상균주로는 Vibrio anguillarum NCMB1 표준균주를 사용하였다. 분리후 균 배양을 위하여 기본 배지로 peptone을 사용하였다.분리 균의 생육저해물질 생성 확인VNSS 배양배지에 분리 균을 접종하고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18-24시간 배양한 후 원심 분리 \( (3,000 \mathrm{xg} \), 10분)하여 배양 상등액을 준비하고, 균체를 초음파 파쇄기를(Sonifier 250, Branson, USA) 이용하여 파쇄하고 V. anguillarum NCMB1 균주는 nutrient broth에 \( 0.5 \% \)의 \( \mathrm{NaCl} \)을 첨가하고 \( 28^{\circ} \mathrm{C} \)에서 18-24시간 배양한 다음 다시 nutrient 한천배지에 도말한 후 paper-disk를 놓고 분리 균의 배양 상등액 및 균체 파쇄액을 투여하여 투명환의 생성여부로 생육저해 물질 생성 양성으로 판독하였다. 분리균주와 표준 균주와의 생육 저해능 비교는 분리균주와 표준균주 B. amyloliquefaciens KCTC 1724를 paper-disk 법을 사용하여 투명환의 생성여부로 V. anguillarum NCMB의 생육 저해능의 유무를 비교하였다.생육도 측정 및 생육저해물질 활성측정법V. anguillarum NCMB1균의 배양배지에 분리 균 \( 1 \% \)의 배양액을 접종하여 배양하면서 시간별로 단계적 희석을 하여 분광광도계로 (Shimazu UV-160A, Japan) \( 660 \mathrm{~nm} \)에서 생육도를 측정하고 저해물질의 활성 측정은 colony forming unit (CFU)/\(\mathrm{ml} \)로 하였으며 1 unit의 결정은 \( 50 \% \)의 생육억제를 기준으로 설정하였다.분리 균의 다른 Vibrio 속에 대한 생육 저해능병원균으로 알려진 V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. fluvialis, V. furnissii, V. mimicus, V. vulnificus 등의 Vibrio 속에 대해 분리균주가 저해능을 가지고 있는지를 paper-disk 법을 통하여 확인하였다.분리 균의 최적 생육 및 저해물질 생산조건분리 균의 최적 생육조건 및 저해물질 생산조건 점토를 위하여 기본 배지에, 배양시간, \( \mathrm{pH} \), 온도, 탄소원, 질소원을 사용하였고 금속이온농도는 \( 0 \%\), \(0.05 \%\), \(0.15 \%\), \(0.2 \% \) 등을 달리하여 최적 농도를 비교하였다.

V. anguillarum의 생육 저해균주를 분리하기 위하여 해산어를 대상으로 장의 다양한 부분, 어체 표면, 지느러미 등에서 가검물을 회수한 후 NSS buffer 와 VNSS broth로 균을 1차 배양, VNSS agar에 paper-disk 방법을 사용, 저해 균주를 재선별하였고 1종의 균주를 분류하여 생화학적 특성을 파악하고 1차 동정을 행한 후에 미생물 자동 동정분석기로 분석, 표준 균주와 분리균주의 생육 저해능 비교는 B. amyloliquefaciens KCTC 1724를 paper-disk 법을 사용하였으며 투명환의 생성여부로 V. anguillarum NCMB의 생육 저해능의 유무를 비교하였다.